FR 2210393 A1 19740712 FR 7245168 A 19721219 L'invention concerne un procédé semi-synthétique de préparation de la vincristine. Les alcaloïdes cytostatiques ae Vinca rosea L. (Catharantus rosens G. Don), à savoir la vinblastine et la vincristine sont connus depuis une dizaine d'années et ils se sont révélés, sur la base d'études cliniques, les agents cytostatiques chimiothérapiques les plus efficaces. Ce sont surtout les résulta's obtenus avec la vincristine qui sont remarquables, car ce composé possède par exemple une action salvatrice dans la leucémie aigüe de lrenfant (Haggard, M.E. : Vincristine therapy for acute leukemie in Children 3 Cancer Chemother, Reports, 52, 477/1968). On sait que la vincristine n'est présente qu'en faible quantité dans le spectre d'alcaloldes très complexe de Vinca rosea L. On ne peut pas séparer plus de 0,1 % de vincristine du mélange total d'alcaloldes qui contient environ 70 espèces d'al caloies, ce qui signifie que-le rendement est d-'environ 3 a' 5 mg de vincristine par kg de plante sèche. Les procédés décrits dans le brevet US nO 3.205.220 et dans le brevet hongrois nO 160.967 permettent de séparer la vincristine dans la proportion ci-dessus. Compte-tenu de l'importance thérapeutique incalculable de la vincristine, plusieurs études ont été et sont effectuées dans le monde entier en vue de sa préparation dans des quantités plus élevées et à un prix inférieur. Comme on le sait, la N-déméthyl vinblastine, produit de décomposition commun de la vinblastine et de la vincristine, peut être formylée suivant des procédés connus en donnant la vin cristine (brevet US N 3.354.163). Dans ce brevet, il est indiqué que la vinblastine peut être oxydée en N-déméthyl-vinblastine par une opération d'oxydation biologique utilisant une peroxydase en présence de peroxyde d'hydrogène, et que le produit déméthylé peut à son tour être formulé d'une manière connue en -soi en donnant la vincristine. Mais ce brevet ne donne pas d'exemple de cette synthèse, et on ne peut en tirer davantage de directives concernant l'oxydation biologique de la vinblastine et le rendement en produit. A l'occasion d'études sur l'oxydation de l; vinblastine, la demanderesse a trouvé, de façon inattendue, que si l'on oxyde la vinblastine ou un de ses sels d'addition, de préférence le sulfate, par l'acide chromique ou un de ses sels àbasse température. le troupe N-méthyle de la vinblastine peut être transformé arec- tement e groupe forirrle. Cette oxydation sélective est en contradiction avec les indication du brevet PrS N 3.354.163 et ne pouvait être prévus par les spécialistes car la molécule de vinblastine contient plusieurs groupes qui sont beaucoup plus sensibles à l'oxydation que le groupe N-méthyle. En conséquence, l'invention concerne un procédé semisynthétique de préparation de la vincristine, caractérisé en ce qu'on oxyde la vinblastine ou un de ses sels de préférence le sulfate, par l'acide chromique ou un de ses sels à basse température, en ce qu'on neutralise ou alcalinise le mélange réactionnel et on sépare le produit par extraction, en ce qu'on évapore l'extrait à sec, en ce qu'on formyle éventuellement le résidu sec, en ce qu'on isole du produit la vincristine et éventuellement aussi la N-déméthyl-vinblastine, et en ce qu'on transforme si on le désire le (s) produit (s) en leurs sels, de préférence en sulfates. On peut si nécessaire purifier les sels par recristallisation. Conformément à l'invention, on procède comme suit : on dissout la vinblastine ou son sel, de préférence le sulfate, dans un solvant ou mélange de solvants organiques, de préférence dans un mélange d'acide acétique glacial et d'acétone, on refroidit le mélange à une température inférieure à OOC, de préférence - 30 à - 90 C, on ajoute à la solution de vinblastine une solution organique, de préférence une solution dans l'anhydride acétique d' acide chromique ou d'un sel de l'acide chromique, préalablement refroidi à la température de la solution de vinblastine en agitant énergiquement et en refroidisant, puis on laisse reposer le mélange réactionnel pendant un maximun de 15 minutes, de préférence 8 minutes.On ajoute ensuite au mélange avec précautions de l'hydroxyde d'ammonium à une température de - 40 à - 5O0C pour ajuster le pH à 8-9, on dilue le mélange à l'eau et on extrait le mélange aqueux en plusieurs portions par un solvant organique, de préférence par 1 chlorure de méthylène, jusqu'à obtention d'une réaction des a algides n On dissout la vincristine brute dans le benzène, et on fait passer la solution à travers la colonne. On effectue l'élution avec un mélange 2 : 1 et 1 : 1 de benzène et de chloroforme. Les al caloides présents dans les diverses fractions sont identifiés par chromatographie sur papier ou sur couche mince, et on rassemble les fractions contenant la vincristine ou la N-déméthyl-vinblastine, respectivement. On évapore à sec les fractions rassemblées. Si on le désire, on transforme respectivement la vincristine et la N-déméthyl-vinblastine ainsi obtenues en leurs sels, de préférence les sulfates. On peut si nécessaire purifier les sels par recristallisation. Conformément à un procédé préféré de l'invention, on formyle le résidu sec contenant de la vincristine obtenu en traitant le mélange réactionnel après l'opération d'oxydation, par un mélange d'acide formique et d'anhydride acétique. Dans cette réaction, la N-déméthyl-vinblastine, présente comme impureté dans le résidu sec, se transforme en vincristine. On neutralise ensuite le mélange réactionnel, on l'extrait par du chlorure de méthylène, on rassemble les extraits, les lave à l'eau, et les évapore à sec sous pression réduite, ce qui donne la vincristine sous forme de résidu sec. On purifie par chromatographie le produit ainsi obtenu, et on le transforme si on le désire en un sel, de préférence en sulfate. On peut purifier le sel par recristallisation si nécessaire. tes exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Ezzemple I On dissout 10 g (0,011 mole) de sulfate de vinblastine dans 2200 ml d'acétone et on ajoute à la solution 500 ml d'acide acétique glacial. On refroidit le mélange à -600C. En même temps, on dissout 4,96g (0,0494 mole) dacide chromique dans 1860 ml d'anhydride acétique, on refroidit la solution à - 60 C, et l'a joute goutte à goutte à la solution de sulfate de vinblastine en agitant énergiquement. Au bout de 8 minutes d'agitation, on ajoute goutte à goutte au mélange réactionnel 4400 ml d'hydroxyde d'arso- nium concentré à une température de -40 à - 500C, pour ajuster le pH à o. Au cours de cette opération, la température de la solution ne doit pas dépasser + 500G. On dilue le mélange alcalin obtenu par 10 1 d'eau et on l'extrait par le chlorure de méthylène jusqu"à obtention d'une réaction des alcaloïdes négative. On ras semble les extraits au chlorure de méthylène et les lave par 2 x 3000 ml d'eau pour éliminer l'acétate d'ammonium formé dans l'opération de neutralisation. On sèche la solution dans le chlorure de méthylène et on l'évapore à sec sots pression réduite.On obtient 8,5 g de vincristine brute, amorphe, contenant comme impureté de la N-déméthyl-vinblastine. On dissout la vincristine brute, amorphe obtenue dans 30 ml de benzène, et on fait passer la solution à travers une colonne d'oxyde d'aluminium imprégné de benzène. On commence ltélution avec 1300 ml de benzène, après quoi on utilise comme agent d'élution 5500 ml d'un melange de benzène et de chloroforme, et on termine ltélution avec 4250 ml d'un mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme. On recueille l'effluent en fractions de 250 ml. On soumet les diverses fractions à la chromatographie sur papier ou sur couche mince.L'impureté de N-déméthyl-vinblastine, formée cotte sous-produit au cours de l'oxydation, peut être éluée par le mélange 2 : 1 debenzène et de chloroforme, tandis que la vincristine apparaît dans le mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme. On combine les fractions contenant les mêmes alcaloSdes, identifiées par chromatographie sur papier ouchromatographie en couche mince, et les évapore à sec sous pression réduite. On obtient 5,9 g de vincristine amorphe, et 2,7 g de N-déméthyl-vinblastine amorphe. On dissout la N-déméthyl-vinblastine amorphe dans 27 ml d'éthanol sec, et on ajuste le pH de la solution à 4,0 par de 1' acide sulfurique éthanolique à 1 % pour précipiter le sulfate de N-déméthyl-vinblastine sous forme cristalline. On dissout les 2,5 g de sulfate de N-déméthyl vinblastine obtenus dans 15 ml de méthanol et on ajoute à la solution 60-ml d'éthanol sec. On laisse reposer le mélange pendant 1 heure à la température ambiante, après quoi/filtre le sulfate de N-déméthyl-vinblastine cristallin qui s'est séparé. On obtient 2,2 g (0s0024 mole ) de sulfate de N déméthyl-vinblasstine. Rendement 20 %.On libère la base à partir d'un échantillon du sulfate de N-déméthyl-vinblastine obtenu, et 1'identifie d'après les données suivantes point de fusion 212 - 2150C (Boetins) ()20 = + 15,80 (C=1, dans le chloroforme) La N-déméthyl-vinblastine, formée au cours de l'oxyda- tion de la vinblastine ou d'un de ses sels, peut être formylé par les procédés connus peur donner la vincristine ou un de ses sels. On dissout les 5,9 g de vincristine amorphe obtenus dans 60 ml d'éthanol sec, et on acidifie la solution par l'acide sulfurique éthanolique à 1 %' jusqu'à pH 4,0 pour obtenir le sulfate de vincristine cristallin. un dissout les ),bg ae sulfate ae vin- cristine obtenus dans nu ml ae méthanol et on ajoute à lu soutim i2U ml d'êthanol sec.Un laisse reposer le mélange a' la tenipératu- re ambiante pendant 1 neure et on filtre le sulfate de vincristine cristallin qui s'est separé. un obtient- ),g (u,uù55iaole)de sulfate de vincristine - Rendement : 50 %. (i)2D0 = + 11 à + 120 (C = 1, dans l'eau) Rf -- 0,30 (apparaît avec une couleur bleu vif) Le produit est identifié sur la base de son spectre IK, qui comporte une très forte bande d'absorption à 5,94 microns, comparé au spectre IR de la vinblastine.. Les examens en chromatographie sur couche mince sont effectués sur adsorbant d"bxyde d'aluminium G.Merck". On utilise comme agent d'élution du chloroforme contenant 0,5 % de méthanol, et le développement s'effectue avec de l'acide phosphorique concentré contenant 1 % de sulfate céri-ammonique. Exemple .2 On dissout 5 g (0,0055 mole) de sulfate de vinblastine dans 1100 ml d'acétone, après quoi on ajoute à la solution 250 ml d'acide acétique glacial à 99,5 % (distillé sur acide chromique et ne contenant pas de matières oxydables). On refroidit le mélange à - 600C. En même temps, on dissout 2,48g (û,0297mole) d'acide chromique dans 930 ml d'anhydride acétique, on refroidit la solution à -600-C, et on I'ajoute à la solution de sulfate de vinblastine en agitant.On agite le mélange réactionnel pendant 8 minutes, après quoi on ajuste le pH du mélange à 9,0 en y ajoutant goutte à goutte de l'hydroxyde d'ammonium concentré à une température de -40 à -500 C. Au cours de cette opération, la température du mélange ne doit pas dépasser + 500 C. On dilue le mélange alcalin par 5000 ml d'eau, et l'extrait par 3 x 1000 ml de chlorure de méthylène jusqu'à obtention d'une réaction des alcaloïdes négative. On rassemble les phases chlorure de méthylène et les lare avec 2 x 1500 ml d'eau pour éliminer l'acétate d'ammonium formé au cours de l' opération de neutralisation.On sèche la solution dans le chlorure de méthylène et l'évapore à sec sous pression réduite. On dissout le résidu dans un mélange de 75 ml d'acide formique concentré et de 12,5 ml d'anhydride acétique, et on laisse reposer le mélange la température ambiante pendant 5 minutes. On dilue la solution acide avec de l'eau à 3 fois son volume, on l'alcalinise (pH = 9) par l'hydroxyde d'ammonium concentré en refroidissant, et on ex trait l'alcaioide par 3 x 100 ml de chlorure de méthylène. On ras semble les solutions dans le chlorure de méthylène, on les sèche et les évapore à sec sous pression réduite.On dissout le résidu sec contenant la vincristine dans 20 ml de belazne et on fait pas ser la solution dans une colonne d'oxyde d'aluminium de degré d'activité IV - V, imprégné de benzène. On commence l'élution avec 500 ml de benzène, après quoi on utilise comme agent d'élution 1000 ml d'un mélange 9 : 1 ae benzène et de chloroforme, 700 ml d'un mélange 8,5:1,5 de benzène et de ehloroforme,et 2300 ml d'un Tnelange 8 2 de beuzeffine et de chloroforme.On commence l'élution avec 500 ml de benzène, puis on utilise comme éluant 1000 ml d'un mélange 9 : 1 de benzène et de chloroforme, 00 ml d'un mélange 8,5 : 1,5 de benzène et de chloroforme, et 2300 ml d'un mélange -8 : 2 de benzène et de chlo roforme. On termine l'élution avec un mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme. On rassemble l'effluent en fractions de 250 ml. Le benzène et les mélanges 9 : 1 et 8,5 : 1,5 de benzène et de chloroforme servent à séparer les substances adsorbées. L'alca lotte commence à apparattre dans les fractions obtenues avec la -première portion du mélange 8 : 2 de benzène et de chloroforme. On rassemble ces fractions et les évapore à sec sous pression ré duite, ce qui donne 5 à 10 % de sous-produit par rapport au poids du sulfate de vincristine final. Ce sous-produit est formé au cours de l'oxydation. La vincristine commence à apparaître avec la seconde portion du mélange 8 : 2 de benzène et de chloroforme, et l'élution de la vincristine se termine avec le mélange 1 : 1 de benzène et de chloroforme. On rassemble les fractions contenant la vincristine, identifiées par chromatographie sur couche mince et sur papier, et on les évapore à sec sous pression réduite. On dissout les 3,8 g de résidu sec obtenus dans 40 ml d'éthanol sec, et on acidifie à pH 4,0 avec de l'acide sulfurique éthanolique à 1 50, la vincristine se sépare sous forme de sulfate. On filtre le précipité qui se forme, le dissout dans 30 ml de méthanol, et on ajoute 120 ml d'éthanol sec à la solution. Au bout d'une heure de repos, le sulfate de vincristine se sépare sous forme cristalline. On filtre le produit, le lave et le seche. On obtient 3,5 g (0,0039 mole) de sulfate de vincristine. Rendement : 70 ,0. Les constantes physiques du produit sont identiques à celles données dans l'exemple 1. REVENDICATIONS 1. Procédé semi-synthétique de préparation de la vincristine, caractérisé en ce qu'on oxyde la vinblastine ou un de ses sels, de préférence le sulfate, par l'acide chromique ou un de ses sels à basse température, puis on neutralise ou alcaIiEtse le mélange réactionnel et on sépare le produit par extraction, on évapore l'extrait à sec, on formyle éventuellement le résidu 'sec, on isole du produit la vincristine, et éventuellement la N-déméthyl-vinblastine, et on transforme éventuellement le(s) produit(s) en leurs sels, notamment en sulfates. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'oxydation dans un solvant ou un mélange de solvants organiques, et notamment dans un mélange 4 : 1 d'acétone et d'acide acétique glacial. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'oxydation avec de l'acide chromique ou un de ses sels, dissous dans un solvant ou mélange de solvants organiques, notamment dans de l'anhydride acétique. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'oxydation à- une température inférieure à OOC, notamment de -30 à - 90 C. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'après l'oxydation, on ajuste le pH du mélange à 7-9 par une solution concentrée d'hydroxyde d1ammo- sium, opération au cours de laquelle la température de la solution est maintenue à un maximum de+50 C. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'on extrait le mélange neutre ou alcalin par un solvant ou un mélange de solvants organiques, notamment par le chlorure de méthylène. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on formyle le résidu sec par un mélange d'acide formique et d'anhydride acétique. 8. Procédé suivant-l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on isole par séparation chromatographique la vincristine et la N-déméthyl-vinblastine éventuellement formée comme sous-produit. 9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 8, caractérisé en-ce qu'on effectue la séparation chroma tographique sur une colonne d'oxyde d'aluminium, en ce qu'on fait passer le résidu sec en solution benzénique sur la colonne, en ce qu'on effectue ltélution par du-benzène et par un mélange 2 : 1 de benzène et de chloroforme, et en ce qu'on rassemble les effluents contenant des produits identiques et les évapore à sec. 10. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on isole la vincristine du résidu sec formylé par séparation chromatographique. 11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 10, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation chromatographique sur une colonne d'oxyde d'aluminium, et en ce qu'on fait passer le résidu sec sur la colonne en solution benzénique, en ce qu'on effectue l'élution avec du benzène et des mélanges benzène-chloroforme dans les proportions successives 2 : 1, 8,5 1,5, 8 : 2 et 1 : 1, et en ce qXon évapore à sec les fractions contenant de la vincristine. 12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on forme le sel en ajoutant de l'acide sulfurique, notamment de l'acide sulfurique éthanolique à 1 % à la solution éthanolique du résidu sec obtenu en évaporant le (s) éluat (s) à sec.