FR 2233024 A1 19750110 FR 7420999 A 19740617 La présente invention concerne des préparations pour diagnostic, et particulièrement des préparations de ce type convenant à l'utilisation au cours de la réaction d'hémagglutination passive pour sêrodiagnostic de la syphilis (T.P.H.A.). En d'autres termes, l'invention concerne principalement des préparations destinées à être utilisées comme agent a essai pour le diagnostic du Treponema p-athoghne, (nom commun : syphilis). Ces dernières quarante années, de nombreuses réactions d'hémagglu. tination pour diagnostic de la syphilis ont été proposées, et mises en oeuvre, avec un succès limité. Ces dernières années, une réaction d'hémagglutination passive pour sérodiagnostic de La syphilis s'est révélée etre moyennement réussie, et a été suggérée par T. RathlevX dans World Health Organisation VDT/RES.77.65; Tomizawg et Kasamatsu ont confirmé la sensibilité élevée de cet essai particulier (Jap. J. Med. Sci. Biol. 19, 305) ainsi que Rathlev (Brit. J. Vener. Pis. 43, 181). Ces travaux se sont traduits par l'apparition de réactifs commerciaux utilisés dans le domaine de la sérologie des maladies vénériennes. Ainsi que cela sera expliqué ci-dessous, les préparations pour diagnostic selon l'invention diffèrent profondément des propositions de Rathlev. Les propositions de la technique antérieure utilisent les érythrocytes de mouton, et particulièrement du mouton nourri sur champ après récolte, associés au tréponème pale. En pratique, les préparations pour diagnostic résultantes se sont révélées entre insuffisamment fiables, en raison de la fréquence de résultats non valables. Ce défaut a été en partie supprime par l'emploi préalable de réactifs d'adsorption, mais cette opération complique essai, et en augmente la durée. Les efforts de la demanderesse ont porté sur l'obtention d'un test pathologique simple et rapide, conduisant a une diagnose du Treponema pathogène5 avec une fiabilité notablement améliorées en ce qui concerne les résuItaLspositifs et négatifs, et pouvant se présenter sons la forme d'un coffret pour réaction d'hémagglutination passive pour sérodiagnostic de la syphilis, destiné a etre utilisé dans un laboratoire pathologique. Ce but a été atteint par la demanderesse, selon l'invention. Tout d'aboré l'invention propose des érythrocytes d'oiseaux traites è l'acide tannique. Un autre objet, qui constitue un autre aspect, de l'invention, est de proposer une préparation pour diagnostic convenant à une utilisation au cours de la réaction T.P.H.A., et utilisant des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique. Un troisième objet de l'invention est de proposer une préparation pour diagnostic convenant à une utilisation au cours d'une réaction T.P.H.A., utilisant des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique, associés à un antigène du Treponema. Un quatrième aspect de l'invention est un coffret pour réaction d'hémagglutination passive pour sérodiagnostic de la syphilis (T.P.H.A.) comprenant une première ampoule contenant une préparation pour diagnostic constituée d'érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique, et associés à un antigène du Treponema; une seconde ampoule contenant une préparation pour diagnostic constituée d'érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique, non associés à un antigène du Treponema, mais par ailleurs pratiquement identiques aux érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique contenus dans la première ampoule; et contenant enfin des instructions permettant d'effectuer une réaction d'hémagglutination passive T.P.H.A., au moyen des contenus de ces deux ampoules. On notera que la différence importante entre l'invention est les propositions de la technique antérieure concerne l'utilisation dtéry throcytes d'oiseaux traités à ll-acide tannique, au lieu des érythrocytes de mouton proposés antérieurement. La demanderesse a découvert que l'utilisation d'érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique coflduit à une amélioration majeure en ce qui concerne la fiabilité de la réaction par rapport à la réaction effectuée avec des érythrocytes de mouton, ceci étant le résultat d'importants travaux impliquant la séparation d'érythrocytes d'origines différentes.La demanderesse a découvert de façon surprenante que la fiabilité de la réaction est déterminée de façon décisive par l'origine des erythrocytes, mais il n'existe aucun doute sur Le fait que les travaux effeetués par Ia demanderesse, et concernant le choix d'érythrocytes d'oiseaux, conduisent à une amélioration majeure (essai spécifique rapide). Afin de permettre une meilleure compréhension de l'invention > la demanderesse décrit ci-dessous et à titre d'exemples non limitatifs des préparations pour diagnostic préparées selon l'invention, et convenant à l'utilisation pour la réaction d'hémagglutination passive pour sérodiagnostie de la syphilis (T.P.H.A.), l'explication détaillée du mode d'emploi des prépa rations pour diagnostic (afin de realiser une réaction de dépistage et une réaction quantitative) étant également fournie.Ainsi que cela sera expliqué de façon plus détaillée dans ce qui suit, au cours de la description du mode opératoire des essais, il est nécessaire d'utiliser pour des résultats complets, à ta fois une préparation pour cellules d'essai compre- nant des amtigène du Treponema, et une préparation pour cellules de contrôle identique à La la précédente, sauf en ce qu'elle ne contient pas d'antigène du Treponeia. On trouvera dans ce qui suit, en conséquence, un mode de préparation d'au antigène du Treponema. la demanderesse préfère utiliser la souche de Treponema connue sous le nom de Treponema pallidum de Nichol. Ou prépare l'antigène par inoculation de lapins. La demanderesse a considéré qu'il, était commode d'utiliser 6 animaux pour chaque programme d'essais. On inocule tout d'abord, dans chaque testicule de grands lapins mâles adultes, une suspension de concentration convenable (correspondant par exemple à 100 Treponema apparaissant simulatnément dans le champ d'un microscope d'objectif 4,2 na environ, l'observation se faisant en champ sombre), le voluse étant de 1,0 mi Chaque animal subit ensuite les traitements suivants :: inoculation par 0,3 mi d'acétate de cortisone répon- dant aux normes de la pharmacopée britannique, à raison de 25 mg/ml, par jour, pendant 9 joure, par voie intramusculaire, la régime alimentaire de l'animal consistant journallement au çhoux. Au hout du 9ème jour, ou sacrifie les animaux et l'on conserve leurs testicules dans un milieu de culture convenavle, par exemple le milieu T.P.I.. On lave les testicules dasa, ce milieu (de préférence contre le milieu T.P.I.), et on Les dissèque afin de dégager une surface importante. On lave les testicules par le milieu T.P.I. afin d'obtenir des Treponema, permettant d'inocular immédiatement d'autres animaux, les suspensions étant secouées avec précaution afin d'obtenir une libération suffisante de Treponema; il est également possible d'opérer le lavage par une solution saline d'azide de sodium, afin d'obtenir les Treponema destinée à la préparation d'antigènes, les suspensions étant secouées vigoureusement dans la solution saline du type oxide, afin d'obtenir une libération maximale. Dans ce dernier cas, on centrifuge les suspensions rassemblées, a des vitesses de centrifugation reLativement faibles", a-fin de séparer les impuretés solides. Les fluide surnageant est récupéré, vérifié du point de vue de sa pureté, par un examen microscopique, et l'on en effectue une culture afin de déceler les contaminants possibles. On stocke le fluide récupéré à 4 C, jusqu'à ce que l'on en obtienne un volume suffisant. On centrifuge ensuite les suspensions de Treponema à vitesse élevée, afin de réaliser une sédimentation des Treponema, et l'on jette, le fluide qui surnage. On remet en suspension les Treponema dans une suspension saline du type azide, et l'on effectue 6 fois une centrifugation, afin de les laver très soigneusement. On effectue enfin une dernière mise en suspension des Treponema dans de l'eau distillée, en concentration correspondant à l'opacité du tube de Brown n04, et on les rompt dans la suspension, en utilisant pendant 10 mn des ultrasons, tout en refroidissant le conteneur par de l'eau courante. On ajoute de l'acide dè sodium, jusqu'à obtention d'une concentration finale de 1 : 1000. Les différentes récoltes d'antigènes peuvent présenter des efficacités différentes, de l'une à l'autre, et la demandèresse a donc jugé préférable de choisir, pour chaque--obtention, l'état de dilution le plus approprié. On choisit différentes dilutions d'une obtention particulière d'antigène, afin de préparer une-série de cellules pour essai, destinées à etre utilisées au cours du mode opératoire de l'essai approprié. On utilise ensuite ces préparations au cours d'un essai quantitatif (décrit ci-après), utilisant à la fois des sérums de contrle d'essai positif et d'essai négatif standards. La dilution correcte à retenir est celle pour laquelle on obtient une sensibilité maximale, au cours de l'essai positif, et une spécificité maximale au cours de l'essai négatif. Préparation d'érythrocytes d'oiseaux On filtre du sang d'oiseaux frais citré sur de lamoussélme, afin d'éli- miner la totalité des caillots et on le lave dans une solution saline jusqu'à ce que l'on obtienne un fluide surnageant limpide. On enlève la couche blanche de cellules. On prépare les cellules lavées de façon uniforme; en coneentration de 7%, par une solution saline tamponnée au phosphate, à pH 7,2. On prépare un volume égal de formaline à 7% dans une solution saline tamponnée au phosphate, à pH 7,2 (7 ml de formaline solution de formaldéhyde à 37-40%] + 30 ml d'agent de dilution).On ajoute la formaline aux globules rouges d'oiseaux préparéscommeci-dessus en deux étapes : on mélange tout d'abord 25% du volume de formaline, soigneusement, avec les globules rougeS et l'on-effectue une incubation à 370C pendant, une heure, au bain-marie. On ajoute ensuite la solution restante de formaline, et l'on effectue une incubation de l'ensemble à 37 C, pendant 18 heures, en mélangeant fréquemment durant les premières trois ou quatre heures. On centrifuge ensuite la suspension de globules rouges, et l'on-jette le liquide surnageant. On répète ces opérations, ce qui correspond à au moins 10 lavages par la solution saline. On prépare, à partir des globules rouges, une suspension à 10%, en utilisant une solution saline d'azide à 0,1%.Il est nécessaire de faire subir à la suspension préparée d'érythrocytes des essais comparatifs par rapport à une suspension classique afin de s'assurer que la suspension préparée présente les mêmes propriétés, aussi bien vis-à-vis dtun sérum positif que d'un sérum négatif. Préparation dune formulation-pour essai La suspension ainsi préparée d'érythrocytes d'oiseaux ayant subi un traitement au formol est un produit stable, et peut etre préparée à l'avance, puis répartie en quantités appropriées pour la préparation de formulations pour essais et contrôles. Pour plus de fiabilité, chaque fraction est traitée à l'acide tannique (ainsi que cela sera décrit ci-apri9, puis fractionnée en deux portions, utilisées respectivement pour la préparation d'une formulation pour essai, et pour 1a préparation de cellules de- contr8le. Une partie des érythrocytes d'oiseaux ainsi préparés ayant subi le traitement à la formaline est diluée et subit un traitement par l'acide tannique au moyen d'acide tannique à 0,005%. Après un lavage et une centrifugation, les cellules ayant subi le traitement à l'acide tannique sont associées à l'antigène du Treponema, dans une dilution convenable (déterminée par voie d'expérience, comme cela a été expliqué ci-dessus), à 370C, dans une solution saline tamponnée à pH 5,4 Après avoir été lavées, les cellules sont mises de nouveau en suspens ion dans du sérum animal de conservation, (faible dilution), préparé afin de conduire à une vitesse de sédimentation convenable, lorsque l'on effectue la réaction d'hémagglu- tination du Treponema.La demanderesse a découvert selon l'invention que le choix du sérum animal n'a pas grande importantce, bien qu'au niveau de la production, la demanderesse utilise du sérum de lapin à 1,5%. Les essais semblent cependant indiquer qu'il est possible d'utiliser d'autres sérums animaux, en dilution appropriée. Comme expliqué ci-dessus on effectue des préparations aussi bien pour les utiliser au cours d'essais à grande échelle, qu'au cours d'essais à petite échelle, et l'on utilise un pourcentage plus élevé de cellules pour la préparation des essais à gronde échelle, que pour les préparations destinées aux essais à petite échelle, ceci afin d'obtenir un motif visuel facilement lisible, au cours de la réaction d'hémagglutination. Préparation d'une formulation pour contrôle La préparation d'une formulation pour contrôle est semblable à celle d'une formulation pour essai, et est effectuée au moyen de la deuxième partie de la fraction mentionnée ci-dessus, mais on n'utilise pas dans ce cas la dilution d'antigène, que l'on remplace par une quantité identique de solution saline tamponnée à pH 6,4. La demanderesse préfère proposer des coffrets pour diagnostic consistant en deux ampoules de préparation pour essai, et en une ampoule de préparation pour contrale, et contenant également des instructions écrites permettant de mettre en oeuvre l'essai considéré. Dans un but de commodité d'emploi, les réactifs sont présentés sous la forme d'une préparation liquide prête à l'emploi après que l'on ait secoué cette préparation, et la demanderesse propose deux présentations (une pour essai à grande échelle et une pour essai à petite échelle) chacune correspondant à des dilutions différentes, et ce afin que l'on puisse facilement effectuer l'essai en utilisant le mode opératoire courant dans les laboratoires pathologiques. Les réactifs conservés sous la forme d'une suspension sont stables pendant au moins 4 semaines, lorsqu'on les conserve à 4 C, dans des conditions classiques de laboratoire, bien que l'on envisage la possibilité de préparationsophiliséesdestinées à être conservées plus longtemps ou à être transportées aux fins d'exportation.Des travaux se poursuivent en vue de découvrir les formes de préparation les plus appropriées à une conservation prolongée à 11 état lyophilisé. Réaction d'hémegglutination passive pour sérodiagnostic de la svphilis (T.P.H.A.) Il est possible d'effectuer cet essai soit à titre de dépistage ce qui conduit à une réaction négative, une réaction positive, ou une réaction incertaine, soit de façon quantitative. On effectue l'essai de dépistage. systématique au moyen d'une plaque d'hémagglutination correspondant aux normes de l'Organisation Mondiale de la Santé, utilisant une simple dilution du sérum du patient, le degré de dilution étant 1 : 30, mélangée à la. préparation pour essai à grande échelle, dans la proportion de 3 à 2. En ce qui concerne l'essai de dépistage à petite échelle correspondant, on utilise une plaque normalisée du type microtitre dont ie fond affecte une forme et U,' et' l'on mélange -iine- sisple-dilution- du sérum du patient, le taux de dilution étant de 1 : 20 > avec la préparation pour essai à petite échelle, la proportion étant de 1 à 3. Pour'effectuer un essai quantitatif, on utilise 2, 4, etc. dilutions du sérum du patient, et l'on effectue ensuite des mélanges avec les préparations pour essai, dans des proportions identiques à celles utilisées pour les essais de dépistage. Lorsque l'on effectue ces essais, on agite modérément les préparations pour diagnostic et le sérum du patient, ensemble, afin de les mélanger de façon homogène, et on laisse la sédimentation se développer pendant 30 à 40 mm, ce qui forme des motifs dans le fond des plaques. Ces motifs peuvent être facilemment lus à l'oeil nu, et traduits en résultat positif , négatif ou incertain, de la manière suivante Réaction uêgative : se traduit par un dépôt de cellules sous forme d'un anneau régulier ou semblable à un bouton. Réaction positive : répartition uniforme d'un fin déport granulaire, qui recouvre le fond de la plaque, Réaction incertaine ; dépôt granulaire comme dans le cas d'une réaction positive, mais moins prononcé, et en forme d'anneau irrégulier de cellules. Des réactions de Prozone peuvent se produire de façon très occasion nielles et doivent être traduites par un résultat incertain au cours d'un essai de dépistage, et par un résultat fortement positif au cours d'un essai quantitatif. Que la réaction soit incertaine ou positive, le sérum du patient doit être vérifié à la mé'e dilution, avec la préparation pou contrôle, afin de prouver que l'on a obtenu des résultats valables. La demanderesse a découvert selon l'invention que le choix des érythrocytes d'oiseaux au lieu des érythrocytes de mouton utilisés dans la technique antérieure réduit considérablement le nombre de résultats non valables obtenus.Si un résultat non valable est obtenu, on effectue un nouvel essai avec une quantité supplémentaire de sérum réactif, que l'on mélange tout d'abord avec la préparation pour contrôle, Ceci permet d'éviter l'action de facteurs d'agglutination conduisant à un résultat positif faux, pouvant être présents dans le sérum du patient, car ces facteurs réagissent sur la préparation de contrôle seule, ne contenant pas d'antigène. Si l'on élimine tout d'abord de tels facteurs au moyen de la préparation pour centrale, la dilution de, sérum peut subir un nouvel essai effectué au, moyen de la préparation, pour essai, ce qui, conduit à un résultat valable. La demanderesse a découvert en pratique que lorsqu'on utilise Les préparations antérieures obtenues à partir d'érythtocytes du mouton, on provoque un très grand nombre de réactions positives fausses de ce type, ce qui fait que pour obtenir un quelconque degré de fiabilité, il est nécessaire de traiter de cette manière pratiquement chaque sérum.Au contraire, lorsque l'on utilise les préparations pour diagnostic selon l'invention. on ne fait appel à cette technique que très rarement. Des essais comparatif s de préparations pour diagnostic, préparées selon l'invention, ont montré en pratique que les produits présentent une haute sensibilité et une haute specificité, et peuvent être recommandés pour un usage général, en tant que produits pour essais de dépistage dlanticorps spécifiques pathologiques du Treponema. Le mode opératoire utilisant les préparations pour diagnostic selon l'invention peut être mis en oeuvre parallèlement à des essais plus classiques et moins spécifiques, permettant de diagnostiquer la syphilis, ou peuvent être utilisés en tant qu'essai rapide permettant d'écarter les résultats positifs faux obtenus avec les essais classiques, moins spécifiques, permettant un diagnostic de la syphilis. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs et procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de iw'in- vention. R E V E N D I C A T I O N S I. Préparation diagnostique convenant à l'utilisation au cours de la réaction d'hémagglutination passive pour sérodiagnostic de la syphilis, caractérisée en ce qu'elle contient des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique 2. Préparation diagnostique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique, associés à des antigènes du Treponema. 3. Préparation diagnostique selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'antigène du Treponema est obtenu par rupture des cellules de Treponema. 4. Préparation diagnostique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la rupture est réalisée au moyen de 11 énergie d'ultrasons. 5. Préparation diagnostique selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'on obtient le Treponema destiné à la production d'antigènes à partir des testicules de lapins inoculés par une souche de Nichol de Treponema pallidum. 6. Préparation diagnostique selon lrune quelconque des revendications 1 à 5 > caractérisée en ce que les érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique sont obtenus par l'addition d'acide tannique dilué à une suspension d'érythrocytes d'oiseaux traités à la formaline. 7. Préparation diagnostique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les érythrocytes d'oiseaux traités à 1 lfacide tannique sont mis en suspension dans un sérum animal de conser- vation, à l'état dilué. 8. Préparation diagnostique selon l'une quelconque des reven dicationsî à 7, caractérisée en ce qdelle est sons forme lyophilisée. 9. Coffret pour réaction d'hémagglutination passive pour séro- diagnostic de Ia syphilis, caractérisé en ce qu'il comprend une première ampoule contenant une préparation diagnostique contenant des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique, associés à des antigènes du Treponema, une seconde ampoule contenant une préparation diagnostique contenant des érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique non associés à des antigènes du Treponema, mais identiques par ailleurs aux érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique contenus dans la première ampoule, et les instructions permettant d'effectuer ladite réaction au moyen des deux ampoules. 10. Coffret selon la revendication 9, caractérisé en ce que la première ampoule contient une préparation diagnostique selon l > une quelconque des revendications 2 à 8. 11. A titre de produit industriel nouveau, les érythrocytes d'oiseaux traités à l'acide tannique. 12. Erythrocytes selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'on les obtient par traitement d'érythrocytes d'oiseaux à la formaline puis à l'acide tannique à 0,003%.