FR 2219950 A1 19740927 FR 7406588 A 19740227 Bes enzymes et atres protéines biologiques fixées-sur des matrices peuvent constituer une importance croissante en teclmolo- îe et serbleït vouées à un avenir prometteur quant à leurs applications médicales et industrielles. Par exemple, comme le décrit le brevet américain i^T 3.556.945 , on peut fréquemment stabiliser les enzymes par une liaison chimique avec une macromolécule. Ceci protège souvent l'enzyme et augmente sa stabilité par rapport à l'enzyme libre dans des conditions comparables. De plus, la liaison chimique d'une protéine à une grosse molécule peut fré quemment diminuer une réponse immunologique indésirable du corps vis-à-vis de la protéine, ce qui peut permettre à la protéine, utilisée comme médicament, d'exercer son activité plus longtemps avant d'être désactivée par les systèmes iminunologiques du corps humain. Par ailleurs, on peut rendre insolubles enzymes et autres protéines, en les liant à de très grosses macromolécules insolubles. En conséquence, on peut faire passer un produit à traiter par l'enzyme ou par une autre protéine, dans une cartouche renfermant ltenzyme ou une autre protéine rendue insoluble, de façon qu'une très grande quantité de produit à traiter traverse une petite quantité d'enzyme et soit ainsi traitée sans avoir à enlever l'enzyme de la cartouche. On envisage actuellement d'utiliser des enzymes insolubles dans l'industrie, par exemple pour transformer de l'amidon en sucre, par passage de solutions d'amidon sur un lit d'enzyme amylase insolubilisée, appropriée On projette également des anplications médicales d'enzymes fixées sur des matrices : il a été suggéré qu'une 1-asparagine amidohydrolase (gdnéralement appelée I-asparaginase) insolubilisée, fixée sur une matrice, pourrait être utilisée dans le traitement du sang de malades atteints de certaines formes de leucémies pour abaisser leur taux sanguin d'asparagine à une valeur proche de zéro.Dans un tel contexte, on sait que certaines cellules tumorales rencontrées dans la Leucémie disparattront en grand nombre tandis que d'autres cellules saines persistent. Ainsi, une cartouche remplie de L-asparaginase insoluble et fixée sur une matrice permettrait d'exposer le sang à la I-asparaginase sans que l'enzyme pénètre dans le corps, et donc de traiter des cellules tumorales sanguines sensibles avec un minimum d'effets secondaires indésirables. Les méthodes connues les plus efficaces pour lier chimiquement des enzymes ou d'autres protéines à des grosses molécules ont l'inconvénient que le milieu servant de support à l'enzyme ou à la protéine doit d'abord être chimiquement activé avant d'être amené en contact avec ltenzyme. Ainsi dans cette réaction à deux étapes il y a une probabilité substantielle d'avoir des réactions secondaires indésirables. De plus, certaines techniques d'activation utilisent des produits hautement toxiques en eux-mmes. Ceci entraîne, notamment pour les produits médicaux, la nécessité d'un lavage et d'une purification très soigneuse du produit obtenu. L'invention a pour objet un milieu support qui est relativement stable et qui réagit pourtant avec la plupart des enzymes et autres protéines en une seule étape et à la température ambiante, pour former avec elles une liaison chimique. Conformément à l'invention, on fait réagir un polymère vinylique servant de support et contenant au moins une mole pour cent d'unités de carbonate de vinylène ou de ses dérivés avec une protéine ( ce terme comprenant les polypeptides et autres dérivés protéiniques) pour former un produit de réaction dans lequel la protéine est liée chimiquement aux unités de carbonate de vinylène du polymère vinylique. De façon typique, les proportions sont de 1 à 500 parties pondérales de support polymère pour 1 partie pondérale de protéine. Le carbonate de vinylène et ses polymères sont des produits bien connus décrits dans 1"'2ncyclopedia of Polymer Science and Technology", Vol. XIV, pages 498 à 504 qui renvoie à d'autres articles traitant du carbonate de vinylène. La structure du carbonate de vinylène est la suivante où R est l'hydrogène. Des dérivés appropriés du carbonate de vinylène sont les composés où R est un radical hydrocarboné monovalent n'ayant pas plus d'environ 8 atomes de carbone, tels que les radicaux méthyle, éthyle, isopropyle, 2-éthylhexyle, n-heptyle, cyclopentyle, allyle, phényle, tolyle, benzyle ou xylyle.Le support polymère utilisé suivant l'invention est avantageusement un homopolymère de carbonate de vinylène, c'est-à-dire un polymère viny lique consistant essentiellemellt en unités Toutefois, des copolymères vinyliques du carbonate de vinylène ou de zes dérivés avec un ou plusieurs produits oléfiniques tels aune:: acétate de vinyle, chlorure de vinyle, chlorure de vi nylidène,vinyl pyrrolidone, acrylonitrile, acrylamide, acide acrylique, acide méthacrylique, méthacrylate de méthyle, styrène, éthyl allyl,éther, isobutyl vinyl éther, éthylène, propylène, divinyl benzène, allyltriméthoxysilane, phtalate de diallyle, butadiène, isoprène, sulfure de méthyl vinyle,thiolacétate de vinyle, cyclohexadiène, acétylène, tétrafluoroéthylène, ou avec tout autre produit contenant une insaturation aliphatique, peuvent constituer des produits utiles comme milieu de support pour des enzymes ou d'autres protéines, suivant l'invention. I1 est généralement avantageux qu'au moins 50 moles pour cent, et généralement 80 moles pour cent, du polymère support soient des unités de carbonate de vinylène, mais ceci n'est pas une nécessité absolue puisaue,suivant 11 invention, on peut utiliser des produits ayant une moindre concentration en carbonate de vinylène ou utiliser les dérivés précités de carbonate de vinylène. On peut préparer des homopolymères et copolymères de carbonate de vinylène par des techniques connues de polymérisation vinylique qui utilisent des catalyseurs formant des radicaux libres tels que le peroxyde de benzoyle ou l'azo-bis-isobutyronitrile. On peut préparer aussi des homopolymères et copolymères de carbonate de vinylène par exposition à une irradiation actinique telle que des rayons y ou X dans des conditions appropriées. On peut aussi greffer du carbonate de vinylène libre ou un de ses dérivés sur des polymères tels que du polybutadiène par irradiation garlma, pour former des produits utilisables, suivant l'invention. I1 est avantageux que la proportion de polymère support soit d'environ 10 à 80 parties pondérales pour 1 partie de protéine à lier, notamment lorsqu'au moins 50 moles pour cent du polymère support sont des unités de carbonate de vinylène. On peut utiliser de plus grandes quantités de polymère support lorsque le polymère contient moins de 50 moles pour cent de carbonate de vinylène. On peut aussi préparer des polymères contenant du carbonate de vinylène à partir de produits qui n'ont pas de "squelette" vinylique mais qui ont des groupes vinyliques ramifiés susceptibles de réagir, par des mécanismes à radicaux libres, avec du carbonate de vinylène pour former des produits éauivalents pour le but de l'invention aux polymères obtenus par polymérisation de groupes vinyliques.Des exemples de tels produits sont des copolymères polysiloxane contenant des unités diméthylsiloxane et des unités méthyl vinyl siloxane; des polyesters insaturés de diols tels que l'éthylène glycol, ou d'aryldiols tels que le résorcinol ou l'hydroquinone, ayant réagi avec des diacides insaturés tels que l'acide maléique ou fumarique, des polyamides insaturés tels que le produit de réaction de l'hexaméthylène diamine avec l'acide maléique ou fumarique, ou des produits analogues. On peut ensuite faire réagir de tels polymères ayant des groupes aliphatiques insaturés avec du carbonate de vinylène ou l'un de ses dérivés par un mécanisme approprié à radicaux libres, pour former des produits utilisables, suivant l'invention. les protéines qui réagissent avec les polymères vinyliques décrits ci-dessus sont généralement les enzymes, bien que les anticorps, les hormones et composés analogues puissent aussi être liés à ces polymères. On peut aussi lier aux polymères suivant l'invention, des protéines qui renferment certains constituants non pro téiniques tels que ions métalliques, polysaccharides, groupes porphyrines, adénine-dinucléotide, acide ribonucléique, phospholipides et analogues. De tels composés rentrent dans la définition des protéines, suivant l'invention, puisqu'ils contiennent une quantité prédominante de polypeptide ou protéine et qu'ils sont chimiquement liés au milieu de support du type sus-décrit contenant des unités de carbonate de vinylène.On peut aussi lier au support, suivant l'invention, des fragments de polypeptide ou de protéine tels que les fractions actives de molécules enzymatiques Des exemples de produits contenant des protéines qu'on peut lier chimiquement, suivant l'invention, sont des enzymes tels que la phosphopyruvique transphosphorylase, transméthylase, amine oxydase, glutamique oxalacétique transaminase, glutamique pyruvique transaminase, lipoxydase, peroxydase, catalase, glucose oxydase, uréase, glutaminase, asparaginase, streptokinase, urokinase, arginase, phosphatase, lécithinase, cholinestérase, lipase, dextranase, pectinase, maltase, alpha-amylase, amyloglucosidase, kératinase, bromeline, chymotrypsine, trypsine, pepsine, ficine, papaine et chymopapaine. D'autres enzymes appropriés comprennent les protéases du type de la rennine produitem ar les organismes du genre Mucor miehei et Mucor pusillus, utilises dans la préparation du fromage; des protéases alcalines telles celles produites par les organismes du genre Bacillus subtilis , du type licheniforme; l'amylase telle que celle produite par Bacillus amyloliquefaciens; et l'enzyme sérine-déshydratase qui peut autre utile contre certains types de cellules tumorales en les privant de sérine; acide aminé essentiel pour ces cellules tumorales. D'autres substances protéiniques qu'on peut lier aux polymères vinyliques, suivant l'invention, comprennent des hormones comme l'insuline et les diverses hormones hypophysaires; les protéines des gamma-globulines, par exemple les anticorps G, M, A, D et E ; et d'autres facteurs sanguins tels que le facteur anti hémophiliaue; les facteurs de coagulation; des anticorps spécifiques tels que les anticorps de l'hépatite, de la grippe, de la poliomyélite, de la rougeole, des oreillons et de la rage;des antigènes appropriés tels que les antigenes de l'hépatite, de la poliomyélite, de la rougeole, des oreillons, de la grippe ou de la rage, pour leur purification ou la stimulation de réactions antigène-anticorps, l'antigène étant maintenu sous forme insoluble pour ampêcher son entrée dans le corps et les conséquences dommageables qui en résulteraient; et des protéines humaines telles que l'hémo- globine ou l'albumine. Après avoir choisi la protéine appropriée pour la faire réagir avec un polymère vinylique approprié contenant du carbonate de vinylène ou un de ses dérivés, on peut simplement combiner les deux produits, typiquement & la température ambiante ou à une température inférieure, et les mélanger doucement, la réaction a généralement lieu spontanément. Si la protéine à lier au milieu support est de nature instable, on effectue avantageusement la réaction à des températures réduites, par exemple d'environ 5 C. I1 est généralement avantageux d'effectuer la réaction de liaison aux alentours du pH neutre, par exemple à un rH de 5 à 9, puisqutil n'est généralement pas nécessaire d'opérer dans des conditions acides ou basiques. Comme déjà indiqué, il n'est pas nécessaire que le polymère vinylique soit activé, et le polymère est généralement stable dans des conditions ambiantes sèches. Toutefois s'il est en contact avec l'humidité pendant de longues périodes, les unités de carbonate de vinylène s'hydrolysent pour former des unités vinylène-diols. De façon typique, on greffe la protéine sur le milieu support polymère en utilisant des proportions molaires du polymère vinylique et de la protéine telles qu'il y ait un excès de carbonate de vinylène libre une fois que- toute la protéine est liée chimiquement au carbonate de vinylène. On pense que les protéines réagissent avec les unités de carbonate de vinylène ou ses dérivés par l'intermédiaire d'un groupe contenant un hydrogène actif tels que les groupes amines, sulfhydryle ou acide carboxylique sans pour cela vouloir restreindre l'invention à un mécanisme réactionnel particulier. Ainsi, l'unité polymère du type carbonate de vinylène où R est tel que précédemment décrit, réagit avec une fraction de protéine contenant un hydrogène actif, pour lier chimiquement la protéine au polymère suivant la formule suivante : où R' est le polymère contenant les unités de carbonate de vinyle ne et ss" est la protéine, liée au polymère par un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre. En général, le poids moléculaire du support polymère doit être supérieur à celui de la protéine à lier et il est avantageusement au moins égal à deux fois celui de la protéine, soit typiquement au moins égal à 30.000. l'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de plusieurs exemples non limitatifs de modes de réalisation de l'invention. EXEMPLE 1 On purifie du carbonate de vinylène (fabriqué par Aldrich Chemical Company) en le chauffant à reflux avec 175 mg de borohydrure de sodium, à feu doux pendant 1 heure. On distille ensuite le carbonate de vinylène et on obtient un produit ayant un point d'ébullition de 5JQC sous une pression d'environ lOmm d Eg. Le rendement est de 6,5 de liquide incolore ressemblant à de l'eau, qu'on conserve sous atmosphère d'azote. Dans un tube è essai, on place 7 g de 2,2'-azobis(isobutyronitrile) et 2 ml de carbonate de vinylène purifié. On chasse le gaz de ce nélange en le congelant puis en le faisant fondre sous vide plusieurs fois. On ferme ensuite hermétiquement le tube à chaud sous vide et on le place dans un four à 60 C pendant 4 jours On dissout le polymère qui se présente comme un bloc mou brunâtre, dans du diméthylformamide. On ajoute de l'eau à la solution de polymère/diméthylformamide, ce qui fait précipiter le polymère. On filtre le polymère et on le sèche. le rendement est d'environ 20, par rapport au rendement théorique. Le produit a un faible poids moléculaire comme l'indique sa solubilité dans le méthanol. Dans une solution de 1 mg (20G unités internationales) de L-asparaginase dans 5 ml de tamr,on aqueux de phosphate de sodium d'un pH de 6,5 ,on ajoute 50 mg du polymère de carbonate de polyvinylène de faible poids moléculaire, et on laisse le mélange pendant environ 11 heures à la température ambiante. On lave ensuite le produit résultant trois fois avec de l'eau distillée et on le remet en suspension dans 5 ml du même tampon de phosphate. L'analyse respective de polymère et du surnageant de lavage montre que la suspension de polymère a une activité notable pour décomposer l'asparagine (1,26 unité, internationale par 0,1 ml), tandis que la solution de lavage n'a aucune activité de décomposition de l'asparagine. le produit polymère est un complexe chimiquement lié de carbonate de olyvinylène et de 1-asparaginase. Exemple 2 On redistille sous pression réduite le mélange d'eau et de diméthylformamide restant dans l'exemple l après précipitation du polymère de faible poids moléculaire. On obtient ainsi du carbonate de polyvinylène ayant un point d'ébullition de 360C sous une pression de 0,25 mm d'Fg. On place 1,2 ml de ce produit dans un tube contenant 25 mg de 2,2'-azobis (isobutyronitrile). On fait barboter de l'azote dans le tube puis on chasse les gaz du mélange liquide par congélation et fusion répétées, sous pression réduite. On ferme ensuite hermétiquement le tube à chaud sous vide et on le place dans un four à 69 C pendant 18 heures. On dissout la masse polymère obtenue dure, cassante, dans du diméthylformamide et on forme un précipité par l'addition de méthanol.On filtre le précipité et on le sèche à l'air. Cn obtient, avec un bon rendement, du carbonate de polyvinylène de poids moléculaire élevé comme le montre son insolubilité dans le méthanol. On fait réagir pendant une nuit plusieurs échantillons de 1 mg de L-asparaginase dans 5 ml de tampon de phosphate de sodium, à des pH différents, avec des échantillons du carbonate de polyvinylène préparé ci-dessus. Les quantités de polymère et les températures réactionnelles sont indiquées dans le tableau donné ciaprès. Lorsque la réaction est terminée, on lave les échantillons trois fois avec de l'eau distillée et on les remet en suspension dans 1C ml de tampon du type indiqué dans le tableau. On évalue les activités de décomposition de la T-asparabine pour le produit polymère solide et pour la solution surnageante de lavage. les résultats sont indiqués dans le tableau dans la colonne intitulée "Activité". T A B L E A U Poids de poly- Tampon utilisé mère de carbo- dans la dans la re- Température (Unités internationales pour 0,1 ml) nate de vi- réaction mise en sus- de réaction pension de la suspension Du surnageant de polymère 10 mg Phosphate 6,5 Phosphate 6,5 22 C. 0,225 0,363 20 mg Phosphate 6,5 Phosphate 6,5 22 C. 0,310 0,000 50 mg Phosphate 6,5 Phosphate 6,5 22 C. 0,245 0,000 20 mg Phosphate 5,7 Tri 8,6 5 C. 0,686 0,000 20 mg Phosphate 6,5 Tri 8,6 5 C. 0,657 0,010 20 mg Phosphate 7,4 Tri 8,6 5 C 0,696 0,020 On peut penser que, dans le cas particulier de la Iasparaginase, plus de 10 parties pondérales de carbonate de polyvinylène par partie pondérale de I-asparaginase sont nécessaires pour donner une liaison complète de la L-asparaginase.Par ailleurs, des températures réactionnelles d'environ 50C (généralement de O à lO0C) améliorent l'activité de la L-asparaginase par ml de suspension de polymère. EXEMPLE 3 On prépare une dispersion de 1 g de carbonate de polyvinylène insoluble dans le méthanol dans un tampon de phosphate de sodium d'un pH de 6. On ajoute 10 mg de sérine-déshydratase et on abandonne le mélange à 100C pendant 10 heures .I1 se forme un produit d'addition chimiquement lié, de carbonate de polyvinylène et de sérine-déshydratase, qui est insoluble dans l'eau mais néanmoins actif quant à la décomposition de la sérine. Bien entendu, Invention n'est nullement limitée aux exemples décrits; elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. -REVENDICATIONS 1.- Procédé pour lier chimiquement une molécule polymère et une protéine caractérisé en ce qu'on amène en contact intime (a) 1 à 500 parties pondérales d'un polymére support contenant au moins une mole pour cent d'unités polymères de formula: où R est choisi dans le groupe formé par l'hydrogène et les radicaux hydrocarbonés monovalents n'ayant pas plus de 8 atomes de carbone, et (b) une partie pondérale de protéine, ladite protéine étant ainsi chimiquement liée audit polymère par lesdites unités. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère consiste en au moins 80 moles pour cent des unités polymères précités où R est l'hydrogène. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise 10 à 80 parties pondérales de polymère support pour 1 partie de protéine. 4.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la protéine est une enzyme. 5.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la L-asparagine amidohydrolase 6.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la sérine-déshydratase. 7.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le polymère est essentiellement un Iiomopolymère de carbonate de vinylène. 8.- Composition caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine chimiquement liée à un polymère par au moins une fraction représentée entre les parenthèses de la formule où R' est ledit polymère support relié à ladite fraction par un atome de carbone, et R" est ladite protéine reliée à ladite fraction par un atome choisi dans le groupe formé par l'oxygène, l'azote et le soufre. 9.- Composition suivant la revendication @, caractérisée en ce qu'elle est préparée suivant le procédé décrit dans l'une des revendications 1 à 7.