FR 2227276 A1 19741122 FR 7414869 A 19740429 La présente invention est relative à une fraction de sérum sanguin et à son procédé de préparation. Plus particulièrement elle vise une fraction de sérum sanguin exempte d'agents viraux, d icro-organismes, de microplasma et de facteurs cytotoxiauess qui est particulièrement utile dans la croissance et a culture des cellules et en particulier des fibroblastes diploïdes humains. Récemment, et surtout dans la dernière décade, un important travail de recherche et de nombreux efforts ont été faits dans le domaine de la culture des cellules in vitro destinées à la recherche et la fabrication des vaccins. On connaît un certain nombre de milieux pour la culture des tissus dans lesquels on utilise divers facteurs nutritifs du genre aminoacides, protéines simples, sels minéraux, vitamines, enzymes,etc... pour obtenir un milieu défini chimiquement pour la culture des cellules. Malheureusement, les tentatives faites pour développer des cellules humaines ou animales normales in vitro à l'aide des milieux de culture connus se sont soldées par un échec complet, ou n'ont permis que de brèves périodes de croissance, ou encore ont donné lieu à une altération des cellules en cours de croissance.Pour essayer de surmonter les difficultés rencontrées antérieurement dans les milieux de culture des tissus, on a utilisé un certain nombre de techniques différentes et de milieux de culture de tissus, et on stest rendu compte que le sérum sanguin constitue un supplément important dans la composition des milieux-de culture chimiquement définis, pour apporter les facteurs de croissance nécessaires à la culture des cellules in vitro, particulièrement des cellules de mammifères. Cependant, même en utilisant du sérum sanguin comme supplément dans des milieux de culture de tissus chimiquement définis, les difficultés rencontrées dans la croissance in vitro de cellules normales de mammifères n'ont pas été entièrement vaincues. Parmi les tentatives faites antérieurement pour cultiver des cellules dans des milieux de culture de tissus in vitro, on peut citer par exemple les travaux suivants. Puck et al. décrivent (Journal of Experimental Medicine, 108, pp. 945-955 (1959)) un milieu de culture de tissus spécialisé contenant des vitamines, des aminoacides, des sucres, des enzymes, des sels minéraux et de l'eau, avec un supplément de sérum de veau pris à l'état foetal. Toutefois, ce sérum est peu répandu, difficile à obtenir, susceptible d'être contaminé au moment de sa récolte et donc de contenir des quantités sensibles de produits toxiques pour la croissance des cellules normales de mammifères. Bien que la découverte dé l'emploi du sérum de veau à l'état foetal constitue un progrès sensible dans la culture des cellules in vitro, les améliorations apportées aux milieux de culture des tissus par l'emploi de ce sérum ou de fractions de ce sérum sont également connues dans la technique. Dans le brevet des Etats-Unis N 3 122 476, Gaeta décrit un procédé de purification et de fractionnement du sérum de veaux immatures pour en éliminer la gamma globuline et d'autres substances toxiques ainsi que l'emploi de la fraction de sérum obtenue comme supplément ae milieu de culture. Le procédé consiste essentie]lement à recueillir tout le sang, à le faire coaguler et à éliminer le résidu de fibrine pour obtenir le sérum sanguin brut. Ce traitement est suivi d'une précipitation, en utilisant de 1' éthanol en ajustant le pH et en refroidissant, d'une centrifugation et d'une filtration pour séparer la gamma globuline et des substances toxiques non identifiées qui ont précipité. loutefois, le procédé décrit dans-ce brevet ne permet pas une séparation complète des produits indésirables du sérum sanguin, est limité, aux termes du brevet, à l'utilisation du sang de veaux immatures, c'est-à-dire de jeunes veaux de 1 à 4 jours, et comprend l'addition au sérum d'additifs chimiques susceptibles d'altérer les caractéristiques des constituants du sérum ou d'en provoquer la dénaturation. Dans le brevet des Etats-Unis NO 3 128 228, Michl décrit également la préparation d'un milieu de culture de tissus utilisant le sérum sanguin comme constituant du milieu. L'originalité de ce brevet tient à la présence de sérum comme constituant indispensable au milieu utilisé pour la culture des cellules. Pour obtenir ce constituant essentiel au milieu de culture et éviter la dépense due à l'utilisation de sérum de foetus de veau, on recourt à un fractionnement du sérum sanguin. Dans les grandes lignes, on prépare le sérum par coagulation du sang et séparation par centrifugation. On ajoute au sérum du sulfate d'ammonium et on sépare par filtration les protéines précipitées après un certain temps. On fait des additions successives de sulfate d'ammonium et on recueille la fraction active du sérum sous forme du précipité.Pour éliminer ?e sulfate d'ammonium servant à la précipitation, on dialyse le précipité et on clarifie la solution. Le sérum fractionné obtenu est lyophilisé et contient essentiel lement de l'albumine et une alpha globuline spécifique ayant une certaine mobilité électrophorétique. Ce produit fractionné est ensuite employé dans un milieu de culture de tissus, mais malheureusement, même avec ce fractionnement, ce sérum ne peut servir efficacement pour la culture de fibroblastes humains diploïdes et contient encore des produits pouvant nuire à la croissance de cellules normales de mammifères. Dans le brevet des Etats-Unis NO 3 429 867, Bozicevich dé crit un sérum de veau sans gamma globuline convenable pour les cultures de tissus et de cellules. Le procédé de préparation de ce sérum comprend la séparation de l'englobuline, l'acidification à un pH de 4,5 - 5,3 pour précipiter l'albumine, l'alpha globuline et la bêta globuline pour laisser la gamma globuline en 50- lution. Les constituants sont ensuite séparés et uniformément distribués dans un milieu aqueux faiblement alcalin ayant un pH voisin de celui du sérum sanguin normal.Bien que ce procédé permette d'éliminer la gamma globuline présente dans le sérum sanguin, et que ce brevet autorise l'utilisation de tout le sang des veaux, quel que soit leur âge, sans avoir à recourir au sérum de foetus de veau, le procédé n'élimine pas complètement divers agent s viraux et facteurs cytotoxiques pour fournir un sérum pu rifié de mammifères pouvant servir de façon désirable à la crois sance de cellules normales de mammifères. Les brevets des Etats-Unis NO 3 382 227, 3 555 001, 3 074 851, 3 664 994 et 3 706 660 sont également relatifs au fractionnement du sérum sanguin en vue d'obtenir des constituants particuliers du sérum sanguin. Ces brevets utilisent généralement pour ce fractionnement une adsorption chromatographique ou une précipitation chimique. La technique de purification et de séparation par adsorption chromatographique ne permet pas une résolution complète du sérum en fractions purifiées et est extrêmement lente, ce qui rend peu intéressante industriellement la séparation chromatographique. De même le fractionnement par précipitation chimique ne sépare pas complètement le sérum en ses divers constituants puis que la précipitation chimique est spécifique pour une portion ou fraction particulière du sérum. En outre, la technique de précipitation chimique nécessite l'addition d'un réactif chimique, que l'on doit ensuite éliminer après le fractionnement, ou qui peut avoir un effet d'altération sur les constituants mêmes du sérum. On voit, d'après ce qui précède, qu'il existe de nos jours un bon nombre de techniques permettant de préparer un sérum sanguin pouvant servir avantageusement comme supplément dans un milieu de culture de tissus. Bien que ces techniques cùnstituent un progrès par rapport à l'emploi d'un sérum sanguin brut ou non purifié, elles ne permettent pas d'obtenir une fraction de sérum complètement purifiée, en quantité abondante, d'un prix de revient peu élevé, et entièrement débarrassée de divers agents toxiques et facteurs cytotoxiques. Parmi les divers buts de la présente invention on peut citer notamment les suivants - fournir une fraction de sérum sanguin animal exempte d'impuretés toxiques du type agents viraux, microplasma et bactériophages; - fournir une telle fraction de sérum animal par un procédé non coûteux pouvant partir de toute une gamme de sources de sérum; - fournir une fraction de sérum sanguin ne renfermant pas de restes de produits ajoutés susceptibles d'avoir un effet toxique ou une action d'inhibition sur la croissance des cellules de mammifères dans un milieu de culture de tissus contenant cette fraction de sérum;; - fournir une fraction de sérum sanguin pouvant être préparée pratiquement à partir de n'importe quelle source de sang animal indépendamment de l'âge de l'animal et de la présence dans le sang des animaux adultes des gamma globulines qui s'y trouvent normalement; - fournir une fraction purifiée de sérum sanguin exempte d' agents viraux, de micro-organismes, de microplasma et de facteurs cytotoxiques et renfermant de plus un constituant du sérum sanguin total ayant une activité favorisant la mitose, nécessaire à la croissance continue des cellules normales de mammifères, notamment des cellules diploïdes humaines et particulièrement des fibroblastes diploldes humains;; - isoler les constituants du sérum sanguin actifs sur la mitose et favorisant la croissance et recueillir la fraction du sérum sanguin où se trouve concentrée l'activité mitogène. Ces divers buts ainsi que d'autres apparaîtront mieux dans la description qui va suivre. L'invention a principalement pour objet une fraction de sérum sanguin favorisant la mitose et exempte d'agents viraux et de facteurs cytotoxiques. Cette fraction de sérum comprend des constituants du sérum sanguin, particulièrement de la bêta globuline, ayant un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000. Elle a également pour objet de préparer une telle fraction de sérum sanguin purifiée exempte d'agents viraux et de facteurs cytotoxiques. Ce procédé comprend les opérations suivantes : 1) élimination des constituants d'un sérum sanguin brut ayant un poids moléculaire supérieur à environ 300 000 et 2) élimination des constituants du sérum ayant un poids moléculaire inférieur à environ 50 000, pour obtenir en définitive une fraction de sérum sanguin ayant un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000. Le procédé selon l'invention consiste donc dans ses grandes lignes à fractionner le sérum sanguin pour isoler une partie de ce sérum ayant un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000. Dans ce procédé, le produit de départ est un sérum sanguin brut débarrassé de la fibrine, du fibrinogène et des divers corpuscules du sang, par exemple par coagulation du sang suivie de la séparation du sérum sanguin brut par le fractionnement décrit plus haut. Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé comprend les étapes suivantes t I - élimination des produits coagulables tels que fibrine, fibrinogène et cellules adsorbées, 2 - dilution du sérum brut avec de l'eau, de préférence désionisée ou distillée, et clarification du sérum dilué pour le débarrasser des particules qu'il renferme, 3 - dialyse du sérum clarifié précédemment, avec élimination des sels dissous et séparation des englobulines, 4 - fractionnement du sérum obtenu en (3) pour obtenir une portion de sérum purifiée, par élimination des constituants de ce sérum ayant un poids moléculaire supérieur à environ 300 000 et des constituants ayant un poids moléculaire inférieur à environ 50 000 et 5 - concentration de la fraction purifiée provenant de (4). Le procédé servant à préparer le produit selon l'invention comprend généralement, comme on l'a vu, une série de traitements physiques au cours desquels le sérum est fractionné et purifié. Les produits de départ- employés dans le procédé selon l'invention peuvent être du sérum sanguin provenant de n'importe quelle source animale, notamment de mammifères tels que chevaux, vaches, chiens, lapins, humains, etc... Pour obtenir le sérum sanguin, le sang est recueilli par exemple dans un abattoir, et on le laisse simplement reposer et coaguler. Par exemple, une durée convenable pour cette coagulation peut être de l'ordre de 1 à 18 heures, à une température approximativement comprise entre 0 et 150 C. Après coagulation, on sépare le coagulum du liquide surnageant. On peut à cet effet opérer par centrifugation avec une centrifugeuse Sorval. On peut aussi, après la coagulation séparer le coagulum du sérum par filtration en utilisant par exemple un filtre-presse du type employé en industrie.D'une façon générale on peut recourir à n'importe quel moyen classique permettant de séparer le sérum du coagulum pourvu que les produits qui ont coagulé se trouvent éliminés pour laisser un sérum sanguin brut. Par cette coagulation et cette séparation on se débarrasse des résidus de fibrine et des cellules du sang. Si on le désire on peut simplement décanter le sérum du coagulum pour obtenir le sérum brut. Toutefois, pour recueillir le sérum d'une façon efficace et complète, il est avantageux de centrifuger ou de filtrer. Lorsqu'on a obtenu le sérum brut, on peut le diluer, avec de l'eau désionisée ou déminéralisée, et le sérum peut alors devenir trouble par précipitation partielle des englobulines. Un rapport de dilution convenable peut être compris entre 5:1 et 20:1 en volume d'eau par rapport au sérum brut. Pour clarifier le sérum brut et éliminer ce trouble, on centrifuge le sérum ou on le filtre comme il a été décrit plus haut, et on obtient alors un sérum brut dilué, clarifié ou limpide. Puis, si on le désire, on peut dialyser ce sérum et le lyophiliser. Bien que ceci ne soit pas nécessaire, ce traitement est préférable, car on peut ainsi utiliser le sérum sous une forme plus concentrée ce qui augmente le rendement du procédé. Le liquide surnageant ayant traversé le filtre ou recueilli après centrifugation, obtenu sous forme dialysée ou reconstitué après lyophilisation, est soumis à une ultra-filtration, en employant par exemple comme filtre une membrane ou un filtre en fibre creuse. Une façon convenable d'effectuer cette ultra-filtration consiste à utiliser des membranes ultra-filtrantes du type membranes de Diaflo (produit fourni dans le commerce par Amicon Corp.) en utilisant un dispositif à cuvette agitée, du type Modes 402 fourni dans le commerce par Amicon Corp. (Boston). En utilisant une série de membranes ultra-filtrantes, on peut séparer le sérum brut en une fraction de sérum ayant un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000. En d'autres termes, il est possible, par ultra-filtration du sérum brut d' éliminer les constituants du sérum brut ayant un poids moléculaire supérieur à 300 000 à l'aide d'une membrane ultra-fil- trante capable de retenir les constituants qui possèdent un poids moléculaire supérieur à 300 000 environ, telle qu'une membrane de Diaflo ZM 300, ce qui a donc pour effet de séparer du sérum les produits ayant un poids moléculaire supérieur à 300 000. La fraction désirée est alors la portion du sérum qui traverse la membrane ultra-filtrante. De même, on pourra éliminer le constituants ayant un poids moléculaire inférieur à environ 50 000 par ultra-filtration du sérum à travers une membrane retenant les constituants ayant un poids moléculaire égal ou supérieur à 50 000 environ par exemple une membrane de Diaflo TM 30. La fraction désirée est retenue par la membrane et on rejette les produits traversant la membrane. En éliminant ainsi les constituants du sérum brut qui sont retenus sur une membrane ne laissant passer que des produits de poids moléculaire inférieur à 300 000 environ et en retenant les constituants du sérum qui sont arrêtés par une membrane laissant passer des produits de poids moléculaire inférieur à 50 000 environ, il est possible d'obtenir une fraction de sérum renfermant des constituants dont le poids moléculaire est approximativetaent compris entre 50 000 et 300 000.Une telle fraction de sérum caractérisée par cette gamme de poids moléculaires est purifiée de tous agents viraux, micro-organismes, microplasma et bactériophages qui ont un poids moléculaire supérieur à 300.000. De meme, on se débarrasse de produits du type IgM (que l'on considère comme une forme de gamma globuline ayant un poids moléculaire d'environ 750 000,et qui se fixe à la surface des cellules et nuit-à la croissance cellulaire quand on utilise du sérum dans un milieu de culture de tissus) ainsi que de la portion C1 de la chaîne du complément ayant un poids moléculaire d'environ 450 000 qui active le pouvoir cytolytique du complément. De même, ltélimination de la fraction de poids moléculaire inférieur à 50 000 environ permet de se débarrasser de produits qui nuisent à la croissance cellulaire et ont sur elle un effet toxique. On considèr-e que ces produits comprennent des endotoxines de faible poids moléculaire, l'acide lactique ou l'acide pyruvique, des sels minéraux, des peptides cytotoxiques résultant de la dégradation de protéines, etc.. La séparation du sérum brut par untra-filtration pour obtenir une fraction de sérum contenant des constituants ayant un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000 permet donc d'éliminer les produits ayant un effet nuisible quand on emploie la fraction de sérum purifiée comme constituant d'un milieu de culture de tissus. On sait que la présence d'agents viraux dans un milieu de culture de tissus peut avoir pour effet l'altération des caracsé- ristiques cellulaires, par exemple en les faisant passer de l'état diploïde à l'état hétéropolde. il est donc désirable de disposer d'un milieu de culture dont les constituants n'affectent pas sensiblement les caractéristiques cellules au cours de la croissance cellulaire. L'élimination des agents viraux, etc.. du sérum pour obtenir une fraction de sérum purifiée permet d'utiliser cette fraction comme constituant d'un milieu de culture dans lequel on cherche à cultiver des cellules normales de mammifères sans qu' elles soient affectées ou altérées par la présence d'agents viraux quelconques capables de modifier les caractéristiques des cellules notamment des cellules humaines.De même, l'élimination des microorganismes du sérum permet d'utiliser la fraction de sérum purifiée comme constituant d'un milieu de culture dans lequel les cellules ne risquent pas d'être affectées par les endotoxines générées par les micro-organismes comme sous-produits de leur processus métabolique Si on le désire, le fractionnement peut se faire par séparation du sérum en une fraction caractérisée par une gamme de poids moléculaire approximativement comprise entre 50 000 et 100 000 à 150 000, en utilisant les techniques d'ultra-filtration décrites et des membranes ultra-filtrantes appropriées.Bien qué l'on obtienne ainsi une coneentration de l'activité mitogène dans une gamme plus étroite de poids moléculaires, cette pratique n'est pas avantageuse du point de vue commercial en raison de l'accroissement du temps de traitement. Be fractionnement dans une gamme de poids moléculaire comprise entre 50 000 et 300 000 environ non seulement est avantageux commercialement par la durée limitée du traitement, mais aussi suffit entièrement à fournir une fraction de sérum exempte d'agents viraux, de facteurs cytotoxiques, etc... Lorsqu'on le désire, la fraction de poids moléculaire 50 000300 000 peut être concentrée simplement en éliminant l'eau de cette fraction. Ceci peut être obtenu par ultra-filtration du produit en utilisant une membrane ultra-filtrante laissant passer les produits ayant un poids moléculaire inférieur à 50 000 mais retenant ceux dont le poids moléculaire est supérieur à cette valeur. Cette concentration peut se faire en plaçant la fraction de sérum dans une cellule d'ultra-filtration contenant un tamis moléculaire laissant passer les produits de poids moléculaire inférieur à 50 000 environ et en appliquant au système une pression, par exemple à l'aide d'un gaz inerte comme l'azote. Cette pression oblige l'eau à traverser le tamis ce qui a pour effet d'éliminer l'eau et de concentrer les constituants désirés.Cette opération n'est pas essentielle dans le procédé selon l'invention, mais dans certaines applications où l'on désire utiliser une fraction conc-entrée de sérum cette méthode de concentration peut servir avantageusement. Â titre de variante, la fraction de sérum de poids moléculaire 50 000 - 300 000 peut être lyophilisée par une technique connue classique, le produit étant conservé à l'état lyophilisé et reconstitué plus tard au moment de l'emploi à l'aide de solutions de NaCl (0,15 M) ou d'un autre sel. On peut aussi congeler la fraction de sérum selon l'invention et la conserver dans cet état congelé. Be produit peut être mis sur le marché sous forme de la fraction de sérum telle quelle, comme lyophilisant ou sous forme congelée. La fraction de sérum de poids moléculaire 50 000 - 300 000 peut être ensuite utilisée comme supplément dans la préparation d'un milieu de culture de tissus, ee qui est tout à fait avantageux dans la croissance des cellules de mammifères, en particulier des cellules normales de mammifères. Il est apparu que cette fraction de sérum contient les facteurs essentiels nécessaires à la culture de tissus des cellules normales de mammifères, en particulier des fibroblastes diploides humains. L'activité de croissance est concentrée dans cette fraction, les autres fractions éliminées qui ont des poids moléeulaires supérieurs ou inférieurs n'ayant presque aucune activité. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une fraction de sérum ayant une activité biologique élevée et d'avoir cette fraction avec des rendements d'activité biologique élevés, par exemple de l'ordre de plus de 90 % et généralement plus près de 100 % de 1' activité biologique. Les techniques de fractionnement utilisées antérieurement n' avaient pas permis d'obtenir le degré de résolution permis par le procédé selon l'invention et ne donnaient généralement qu'un produit ayant une activité réduite en particulier dans la croissance des fibroblastes diploïdes humains. Comme il a été indiqué, la fraction de sérum selon l'inven- tion peut être employée de façon convenable comme constituant actif dans des milieux de culture de tissus bien connus dans la technique, comme ceux qui sont décrits dans les brevets des Etats-Unis NO 3 122 476 et 3 128 228. La fraction de sérum selon l'invention s'est révélée particulièrement avantageuse pour la croissance de cellules diploïdes nécessitant du sérum comme constituant du milieu de culture. Les exemples ci-après illustrent l'invention. Exemple 1 On utilise du sérum de veau frais obtenu en faisant coaguler du sang entier de veau, en séparant le sérum et en le rassemblant. On dialyse le sérum obtenu à une température de 40 C, contre 200 volumes d'eau distillée pendant une durée de 48 heures. On sépare les englobulines précipitées par centrifugation et on lyophilise le liquide surnageant. On reconstitue le lyophilisant avec NaCl 0,15 M, à pH 6,8, pour obtenir une concentration de 6 mg/ml et on le soumet à une ultra-filtration sur membrane de Diaflo avec l'appareil à cellule agitée NModel 402" (8micron Corp.) déjà mentionné. On fraction le sérum en cinq gammes de poids moléculaires en utilisant des membranes ultra-filtrantes appropriées: plus de 300 000 (Diaflo ZM 3D0); 300 000 - 100 000 (Diaflo XM 100 A); 100 000 - 50 000 Diaflo XG 50); 50 000 - 30 000 (Diaflo PM 30) et 30 000 - 10 000 (Diaflo UM 10). Les cellules d'ultra-filtration sont montées en série en ordre décroissant des poids moléculaires, comme l'indiquent Zipilivan et al. dans Anal. Biochem. 30, 91-98 (1969). On effectue l'ultrafiltration à 40 C et on fait passer environ 10 volumes de NaCl 0,15 M dans la série des cellules de Diaflo reliées entre elles jusqu'à ce que la solution de Bacul soit pratiquement exempte de tout constituant du sérum, comme on le confirme spectroscopiquement par l'absence de toute absorption U.V. à 220 et 280 nm. On dialyse ensuite chacune des cinq fractions contre de l'eau distillée à 40 C et on les lyophilise. On confirme la valeur du poids moléculaire des constituants séparés précédemment en utilisant d'une part une technique de filtration en gel (à l'aide de "Bio-Gel P 200", produit fourni par Calbiochem Co.) selon une méthode décrite par Piez dans Anal. Biochem. 26, 305-313 (1968), et en effectuant d'autre part une électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium polyacrylami de (sans mercaptoéthanol) selon la méthode décrite par Weber et al. dans J. Biol. Chem. 244, 4406-4416 (1969). Dans ces deux opérations on a recours à une courbe du logarithme du poids moléculaire d'étalons connus en fonction soit de l'élution ( Ve/Vo pour P-200), soit de la mobilité électrophorétique, en se servant de "Blue Dextran 2000 N (produit fourni par IJCB Company), de transferrine purifiée, d'albumine, d'ovalbumine et de la chalane bêta de la gélatine soluble dans 11 acide comme étalons dans la détermination par la technique de filtration, et d'albumine, d'ovalbumine et de myoglobine dans la mesure par électrophorèse. Afin de montrer que la fraction de sérum 50 000 - 300 000 selon l'invention est exempte d'agents viraux et de facteurs cy totoxiques on utilise les fractions séparées précédemment pour préparer des milieux de culture de tissus. On utilise pour la culture deux lignées de fibroblastes diploïdes humains provenant de tissu pulmonaire d'embryon (WI - 38) et d'une biopsie cutanée prélevée sur un adulte (GW?). Par ailleurs, en vue d'une culture on transforme des fibroblastes WI-38 en fibroblastes hétéroploI- des par incubation avec un virus Su40. On utilise comme milieu de culture le "milieu essentiel minimum" (ME avec comme suppléments de la glutamine (2 mmoles), de la streptomycine (90 unités/ml), de la pénicilline (90 unités/ml) et soit du sérum brut (6,6 mg/ml) soit du sérum fractionné. Dans une série de tubes de Beighton on ensemence environ 4.104 cellules/cm2. Après incubation à 370 C pendant une nuit dans le milieu normal (contenant le sérum brut) on rince les cultures de façon répétée avec plusieurs portons de solution a'parle équilibrée en sel pour éliminer à la fois le sérum et les cellules qui n'ont pas adhéré à la surface de verre. On ajoute chacune des fractions de sérum séparées précédemment à du milieu "REM" et on se sert de chaque milieu ainsi supplémenté pour repiquer généralement 3-5 cultures de cellules. On renouvelle ensuite trois fois par semaine le milieu de culture. On compte chaque jour le nombre de cellules par cm2, en utilisant un microscope inversé avec un oculaire à micromètre du type décrit par Raffek al. dans J. Cell. Physiol., 74, 235-243,(1969). D'apres la pente de la parie linéaire de la courbe logarithmique du nombre de cellules en fonction du temps d'incubation (couvrant une période de 120 heures), on calcule la vitesse de croissance comme le "Temps de Génération de Populationw en heures dans les termes décrits par Raff et al. dans l'article cité ci-dessus. Le résultat est exprimé par ailleurs en pourcentage d'accroissement de population par 24 heures ou "2aux de croissance ". Les deux- tableaux ci-après donnent le taux de croissance % pour les cellules WI-38, GWF et WI-38 transformées par SV à diverses concentrations, en présence de sérum brut ou des fractions de sérum séparées comme il a été indiqué. TABLEAU I Milieu de culture avec serum brut Concentration du sérum brut Taux de croissance %1/ % en volume WI-38 2 j GWF 3 ~/ - wI-38 modifié par SV40 4 j -- - - 0,0 0 0 18 + 0,5 0,625 15 + 0,4 15 + 0,5 26 + 1,5 1,25 20 + 0,5 18 + 0,4 23 + 1,3 2,5 31 + 1,8 31 + 1,6 31 + 1,3 5,0 43 + 1,5 39 + 1,5 46 + 1,7 7,5 51 + 2,7 49 + 2,2 38-+ 2,2 10,0 73 + 3,6 71 + 2,4 75 + 3,7 20,0 67 + 2,9 63 f 1,8 - - 30,0 20 + 2,1 17 t 0,5 - - 40,0 Détache Détaché - - 50,0 Détaché Détaché - - 1) Moyenne et écart type; les moyennes différant de plus de 2 va leurs d'écart type sont statistiquement différentes (p Sibroblastes diploïdes normaux provenant de poumon d'embryon humain. 3) Fibroblastes diploïdes normaux provenant d'une biopsie cutanée sur humain adulte. 4) Souche WI-38 transformée par culture avec i06 unités/ml de vi rus SV40 (Simian Virus40) pour 10 dédoublements en cellules karyologiquement hétéroploldes. Comme on peut le voir en examinant les résultats présentés ci-dessus dans le Tableau 1, les cellules normales diplordes ont besoin de sérum sanguin comme constituant du milieu de culture. Les cellules transformées par le virus SV40 ntont pas besoin de la présence de sérum sanguin dans le milieu de culture. Ceci démontre que le sérum est un constituant essentiel d'un milieu de culture des cellules diploïdes. On peut aussi constater que l'augmentation des concentrations de sérum sanguin a pour effet d'augmenter le taux de croissance, le maximum étant atteint pour une concentration de 10 % en volume. Pour des valeurs supérieures à 10 % le taux décroît ce qui traduit la présence de facteurs cytotoxiques dans le sérum. Le Tableau 2 ci-après donne les résultats obtenus en utilisant comme constituant du milieu de culture l'une ou l'autre des diverses fractions préparées selon l'invention. TABLEAU 2 Milieux de culture avec fractions de sérum Supplément ajouté au milieu Taux de croissance % 1) WI-38 GWF O 0 Sérum 10 % (6,6 mg/ml)2) 73 + 3,6 71 t 2,4 Fractions isolées (6 mg/ml) I. > 300 000 (51 %) (*) O O II. 300 000 -100 000 (30 %) (*) O O III. 100 000 -50 000 (12 %) (*) 96 t 1,1 92 t 2,8 IV. 50 000 -30 000 (5 % (*) O O V. 30 000-10 000 (2 % (*) O O 1) Moyenne et écart type; les moyennes différant de plus de 2 va leurs d'écart type sont statistiquement différentes ( p (*) Pourcentage de macromolécules de sérum total non dialysables. En examinant les résultats réunis dans le Tableau 2, on constate que la fraction ayant un poids moléculaire compris -entre 100 000 et 50 000 contient essentiellement toute l'activité mitogène du sérum. Les fractions contenant des constituants ayant un poids moléculaire supérieur à 100 000 environ, ou inférieur à 50 000 environ, n'ont aucune activité mitogbne favorisant la croissance des cellules diploides. On constate d'après les résultats indiqués ci-dessus, que la fraction de sé-rum de poids moléculaire 50 000 - 100 000 environ permet une amélioration surprenante du taux de croissance en comparaison avec le sérum brut non fractionné. Exemple 2 On répète les opérations de fractionnement et de purification du sérum de veau décrites à l'exemple 1 mais en isolant cette fois une fraction de poids moléculaire compris entre 50 000 et 300 000 environ. En vue de déterminer l'activité mitogène de cette fraction, en comparaison avec le sérum brut non fractionné, on répète les cultures de cellules décrites à l'exemple 1, en utilisant le sérum fractionné ou le sérum brut, et on détermine le taux de croissance % de fibroblastes diploïdes (WI-38 et GWF) avec-la fraction de sérum 50 000 - 300 000, pour diverses coneentrations. Les résultats obtenus avec cette fraction de sérum sont donnés dans le Tableau 3 ci-après. TABLEAU 3 Milieux de culture avec fraction de sérum 50 000 -300 000 Concentration du milieu en fraction Taux de croissance % (1) de sérum (mg/ml) WI-38 GWF 0,5 27 t 2,2 25 t 1,7 1,0 44 t 3,8 49 + 3,0 1,5 52 t 1,9 61 t 9,4 2,0 2) 78 t 4,7 75 + 5,6 3,0 2) 83 t 5,0 86 t 3,7 6,0 2) 96 + 1,1 92 + 2,8 12,0 2) 96-t 1,4 96 t 7,0 1) Moyenne et écart type; les moyennes différant de plus de 2 va leurs d'écart type sont statistiquement différentes (p v 0,05). 2) 'les concentrations de 2,0; 3,0; 6,0 et 12,0 mg/ml de sérum fractionné correspondent respectivement à des concentrations de sérum brut de 10 %, 15 %, 30 % et 60 %. Les résultats ci-dessus montrent qu'en employant une concentration de fraction de sérum de 2 mg/m' de milieu de culture on obtient un taux de croissance % des fibroblastes diploïdes humains comparable à celui qui est enregistré avec 6,6 mg/ml de sérum brut. Ces résultats montrent qu'une concentration nettement inférieure de fraction de sérum 50 000 - 300 000 peut hêtre utilisée pour obtenir pratiquement le meme taux de croissance % que celui fourni par le sérum brut. On remarque en outre que les fortes concentrations de fraction de sérum (c'est-à-dire des concentrations égales à -15 56, 30 % et 60 % par rapport au sérum brut) avec un poids moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000, ntin- hibent pas la croissance des fibroblastes diploïdes humains à la différence de ce ou'on observe avec les fortes concentrations de sérum brut non fractionné. Ces résultats confirment l'augmentation surprenante de l'ac activité mitogène par l'utilisation de la fraction de sérum caractérisée par une gamme de poids moléculaire comprise entre 50 000 et 300 000 environ et l'élimination dans les fractions de sérum des facteurs nuisant à la croissance des cellules, en particulier des fibroblastes diploïdes humains. Les résultats donnés précédemment mon+rent que le fractionnement du sérum permet une concentration des constituants du sérum qui ont une activité mitogène, l'élimination des agents viraux capables d'altérer la croissance cellulaire quand on utilise le sérum comme constituant d'un milieu de culture, et l'élimination des facteurs cytotoxiques inhibant la croissance cellulaire lorsqu' on emploie le sérum dans un milieu de culture comme supplément à des concentrations élevées. En outre, pour obtenir un taux de croissance % de 70 ffi il faut utiliser 6,6 mg/ml de sérum brut lyophilisé, alors qu'il suffit de 2,0 mg/ml -de la fraction du sérum de poids moléculaire 50 000 - 300 000 environ. En outre, on obtient des résultats similaires en utilisant du sérum d'origine humaine ou animale, comme du sérum de cheval, de vache adulte, de veau à l'état ae foetus et de lapin. Les fractions de sérum de poids moléculaire 50 000 - 300 000 environ pré parées avec d'autres sources de sérum en opérant conformément à l'invention présentent toutes pratiquement les mêmes propriétes et la même activité mitogène. Ces résultats montrent clairement cue le sérum est un constituant nécessaire d'un milieu de culture de tissus pour activer la mitose des fibroblastes diploïdes humains, ce qui n'est pas nécessaire pour les cellules hétéroploldes. Pour cultiver efficacement des cellules diploldes sans a]tération, il est nécessaire que le sérum servant de constituant des milieux de culture soit exempt d'agents viraux capables d'altérer les cellules et d'agents cytotoxiques inhibiteurs de la croissance et de la multiplication cellulaire.L'invention présente un avantage considérable en ce qu'elle permet d'obtenir ce constituant nécessaire des milieux de culture, en particulier des fibroblastes humains diploïdes, ces cellules pouvant être cultivées en évitant pratiquement l'effet d'inhibition dû à l'utilisation du sérum brut, ou les altérations cellulaires provoquées par la présence d'agents viraux naturellement contenus dans le sérum non fractionné et non purifié. En outre, le procédé selon l'invention permet d'utiliser, comme produit de départ, du sérum provenant de toute une gamme de sources possibles, sans la nécessité qui s'imposait antérieurement de recou rir à du sérum de foetus ou de très jeunes animaux. Le procédé selon l'invention évite les inconvénients 1iés aux techniques antérieures d'isolement et de purification utilisées pour les pro téines sériques mettant en oeuvre des fractionnements à l'aide de sels minéraux et d'alcool qui ne résolvent pas les constituants d'une façon efficace, et les inconvénients propres aux séparations chromatographiques avec échange d'ions ou électrophoréticues sous haute tension donnant lieu à une destruction de l'activité biologique et des caractéristiques physicochimiques de a protéine contenue dans le sérum. Le procédé selon l'invention, qui n'utilise pratiquement que des traitements physiques, peut être conduit aisément et on peut obtenir facilement un produit purifié. Revendications 1 - Fraction de sérum sanguin exempt d'agents viraux et de facteurs cytotoxiques, ayant une activité mitogène c'est-à-dire favorisant la mitose cellulaire, caractérisée en ce qu'elle comprend des constituants du sérum sanguin ayant un poids-moléculaire approximativement compris entre 50 000 et 300 000. 2 - Fraction de sérum selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une fraction de sérum de mammifère, tel que du sang de cheval, du sang de boeuf ou du sang humain. 3 - Fraction de sérum selon la revendication 1, caractérisée en ce que le poids moléculaire de ses constituants est approximativement compris entre 50 000 et 150 000. 4 - Procédé pour préparer une fraction de sérum selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on élimine d'un sérum sanguin a) les constituants de poids moléculaire supérieur à 300 000 environ et b) les constituants de poids moléculaire inférieur à- 50 00Ç environ, pour obtenir la fraction présentant une gamme de poids moléculaires comprise entre 50 000 et 300 000 environ. 5 - Procédé sélon la revendication 4, caractérisé en ce qu' on élimine les constituants de poids moléculaire supérieur à 150 000 environ. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le sérum est du sérum de sang de mammifères tel que du sang de cheval, du sang de boeuf ou du sang humain. 7 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'élimination des constituants de poids moléculaire supérieur à 300 000 ou inférieur à 50 000 environ se fait par ultra-filtration. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'ultra-filtration est effectuée avec une membrane ultra-filtrante ou un filtre en fibre ultra-filtrante. 9 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le sérum sanguin traité est du sérum brut obtenu à partir de sang dont on retire la fibrine, le fibrinogène et les cellules. 10- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le sérum brut est encore soumis, avant fractionnement, à une dialyse contre de l'eau, à une lyophilisation et à une reconstitution du sérum lyophilisé pour donner le sérum prêt pour le fractionnement.