FR 2225149 A1 19741108 FR 7313581 A 19730413 L'invention est relative à un sel d'héparine nouveau, utilisable comme principe actif de médicament, notamment anti-coagulant qui, tout en bénéficiant de toutes les propriétés thérapeutiques bien connues de l'héparine, est pratiquement totalement exempt des effets secondaires tels que pétéchies et hématomes qui jusqu'à ce jour en ont limité l'utilisation dans certaines applications thérapeutiques. On rappellera que les héparines commerciales ou purifiées sont souvent disponibles sous la forme de leurs sels de sodium, forme qui résulte généralement des conditions dans lesquelles ces héparines ont été produites, notamment par extraction à partir des milieux biologiques naturels qui en contiennent, et purifiées. On sait cependant que l'utilisation en thérapeutique de ces sels, dont l'activité anti-coagulante est bien connue, n'est pas dépourvue d'inconvénients. Etant donné en effet que l'héparine présente une affinité plus marquée pour le calcium que pour le sodium, l'administration d'héparinate de sodium s'accompagne d'une fixation du calcium prélevé au niveau des différents tissus de l'organisme et plus particulièrement au niveau local des parois vasculaires et capillaires. Dans le cas de l'administration sous-cutanée d'une solution à concentration élevée, l'effet de chélation du calcium est majoré aux dépens des lits capillaires voisins dont la perméabilité se trouve diminuée. Ceci a pour effet la formation de pétéchies et d'hématomes. Pour remédier à ces difficultés on a certes déjà proposé de réaliser une substitution partielle des cations sodium de ces sels d'héparine, notamment par du calcium. Les sels obtenus, qui contiennent alors déjà une proportion notable d'ions calcium, se sont effectivement révélés être d'une utilisation beaucoup plus facile en thérapeutique. Ils contiennent cependant encore des proportions notables en sodium, correspondant à des ordres de grandeur de 5 à 4% en poids environ.On a cependant constaté que ces sels mixtes, certes enrichis en calcium, sont encore capables d'induire certains des effets secondaires du type de ceux qui ont été rappelés ci-dessus, notamment dans les traitements des état d'hypercoagulabilité aigus impliquant des injections locales, par exemple par vole sous-cutanée, de doses très concentrées en héparine pour obtenir une action anti-coagulante rapide et puissante. L'invention a donc pour but de fournir un sel d'héparine qui puisse être utilisé en toutes circonstances, sans risques de voir apparaitre les effets secondaires qui ont été mentionnés. Le sel de l'héparine selon l'invention est caractérisé en ce qu'il contient au moins 10% en poids de calcium. Un sel d'héparine préféré, conforme à l'invention, a une teneur de 10,3% à 10,6 en poids de calcium et une teneur en poids de sodium inférieure à 0,1%. Pour fabriquer le sel selon l'invention, à partir d'un sel de sodium de l'héparine, tout en conservant intégralement l'actif vité anti-coagulante du sel initial, on aura avantageusement recours au procédé qui consiste, dans une première phase, à mettre en contact un sel de sodium de l'héparine avec un sel de calcium, notamment du chlorure de calcium, et à procéder ensuite, dans une seconde phase, à au moins un cycle d'opérations que représente la séparation des ions métalliques libres d l'héparinate obtenu, et une nouvelle mise en contact de l'héparinate obtenu avec le sel de calcium, jusqu'à obtenir une désodation pratiquement complète ou même totale du sel d'héparine initialement mis en oeuvre. L'élimination intermédiaire, au niveau de la phase de séparation susdite, des ions sodium permet la poursuite de la substitution des ions sodium. On observe que si la mise en contact pendant la première phase a déjà permis une substitution relativement importante des ions sodium de l'héparinate initialement mis en oeuvre par des ions calcium, une seule remise en contact du sel mixte obtenu, après élimination des ions libres du milieu, avec une quantité suffisante du sel de calcium, notamment du chlorure de calcium, pourra être suffisante pour réaliser la désodation pratiquement complète de l'héparinate initial. Par exemple, il est possible, partant d'une solution de sel d'héparine contenant 8,75% de calcium, de réaliser une désodation pratiquement complète de ce sel, après séparation des ions métalliques libres du milieu, par remise en contact de ce sel d'héparine avec une quantité de chlorure de calcium correspondant à un apport de 10S en poids de calcium vis-à-vis de lthéparinate. Celuici contient, à l'issue de cette opération, environ 10,5% en poids de calcium. Par remise en contact d'une solution du même héparinate à 8,75% de calcium avec une quantité de chlorure de calcium ne correspondant qu'à un apport de 3% en poids de calcium, on obtient déjà un héparinate contenant 10,2% de calcium. L'opération de séparation considérée dans la susdite seconde phase peut être effectuée de toutes façons en soi connues. De préférence on aura cependant recours à une opération de dialyse, notamment contre de l'eau déminéralisée, ou à une précipitation sélective de l'héparinate obtenu, notamment en milieu hydroalcoolique ne dépassant de préférence pas 70" GL. Si l'on a recours à la dialyse, notamment contre de l'eau déminéralisée, elle doit normalement être poussée pendant un temps suffisant pour réaliser l'élimination pratiquement complète des ions sodium libérés après la première mise en contact. Cette opération de dialyse peut éventuellement être réalisée simultanément avec cette première mise en contact, si l'on prend soin d'opérer avec un excès de sel de calcium, de façon à séparer du milieu de réaction les ions sodium libérés de celui-ci au fur et à mesure de leur libération, de sorte que l'on obtient, dès cette première mise en contact, lors de la mise en oeuvre de quantités déterminées, par exemple, de sel sodique de l'héparine et de chlorure de calcium, une désodation de l'héparine initiale plus poussée que celle qui peut être obtenue par la mise en oeuvre des memes quantités de réactifs, mais sans dialyse simultanée. La dialyse peut éventuellement n'etre démarrée qu'au moment où une substitution partielle, par exemple de 6%, de sodium par du calcium, aura déjà été réalisée, c'est-à-dire au moment où la compétition entre les ions sodium et calcium qui empêchent la substitution de se poursuivre devient importante. Par exemple, pour obtenir un sel d'héparine contenant 8,75% de calcium, on pourra mettre en contact l'héparinate de sodium initial avec une quantité de chlorure de calcium correspondant à un apport de 12% de calcium, la dialyse étant démarrée lorsque la quantité de calcium fixée sur l'héparine aura atteint 6%, environ 16 heures après la mise en contact du sel de sodium de l'héparine avec le chlorure de calcium, la dialyse étant alors poursuivie pendant '6 heures. Si l'on a recours à la méthode de précipitation, le précipité d'héparinate obtenu est remis en dissolution dans l'eau distillée et remis en présence d'ions calciques, notamment sous for me de chlorure de calcium. Ainsi peut-on obtenir aisément, par exemple à partir de la solution d'héparinate mixte de sodium et de calcium ayant un taux de 8,75 en calcium obtenue dans les conditions sus-indiquées, un sel de calcium de l'héparine pratiquement exempt d'ions sodium, par simple précipitation de l'hé- parinate mixte en milieu hydro-alcoolique, par redissolution de ce précipité dans l'eau et par apport à la solution aqueuse obtenue d'une quantité de chlorure de calcium correspondant à un apport de 3% en calcium vis-à-vis du poids de l'héparine initialement engagée. Enfin il va-de soi que l'on peut associer les deux modes de séparation, notamment procéder à une opération de dialyse du milieu d'abord, puis précipiter l'héparinate pour le séparer du milieu de réaction, l'héparinate précipité étant alors repris en solution et remis en contact avec le sel de calcium. On obtient donc facilement dans tous les cas un héparinate de calcium ayant une teneur en ions calciques comprise entre 10,3% et 10,6% et une teneur en sodium inférieure à 0,1%. On a constaté que, de façon heureuse, l'activité anti-coagulante de l'héparine initialement mise en oeuvre est intégralement conservée dans le produit final. L'utilisation thérapeutique de cet héparinate de calcium entièrement désodé est avantageuse, en ce qu'il peut être administré par injections locales, notamment sous-cutanées, à des doses très concentrées. Il est ainsi possible de tirer un profit maximum de la grande activité anti-coagulante de l'héparine, tout en évitant chez les patients les inconvénients qui ont été brièvement rappelés plus haut. Au surplus l'administration par voie sous-cutanée d'une solution à concentration élevée est particulièrement intéressante car elle permet d'obtenir un effet retardé de l'action anti-coagulante de l'héparine et ainsi d'éviter les perfusions ou les injections répétées par voie intraveineuse. La description de l'invention pourra encore être complétée par la description d'un mode opératoire préféré et d'exemples de fabrication d'un héparinate de calcium pratiquement exempt de sodium. MODE OPERATOIRE GENERAL On décrit tout d'abord dans ce qui suit un mode operatoire général préparé pour la production d'héparinate de calcium pratiquement complètement exempt de sodium, à partir d'héparine sous la forme de son sel de sodium. L'héparinate de sodium est mis en solution dans de l'eau distillée pour obtenir 15.000 à 20.000 uI ml, soit à une concentration de 10 à 12,5 % ; la température est maintenue entre 10 et 40"C, de préférence 25 C. Sous agitation on introduit dans la solution d'héparine une quantité de calcium, sous forme de chlorure de calcium, comprise entre 10 et 40%, de préférence 2% en calcium du poids de l'héparine mise en oeuvre. On amène le pH du milieu à 7,5 par CaO ; on laisse sous agitation pendant 8 à 24 heures, de préférence 16 heures, en maintenant la température à 250C. Au bout de ce temps, on effectue une dialyse pendant 6 heures. Le dialysat est recueilli et filtré sur une plaque d'amiante. Le dialysat filtré est ramené à un Ph compris entre 4 et 7,5, de préférence 6,5 par addition d'acide chlorhydrique. On effectue alors une addition d'alcool éthylique neutre de force 960GL, à raison de 1,5-partie d'alcool pour 1 partie de dialysat ; on laisse au repos pendant 2 à 6 h et on recueille l'héparinate formA dans de l'alcool neutre de force 99,50 GL. On procède alors à un broyage et une agitation simultanés. L'héparinate mixte calciumsodium obtenu après filtration est dissous dans la quantité d'eau distillée nécessaire à l'obtention d'une solution renfermant 15.000 à 20.000 UI/ml.On ajoute alors sous agitation et à la température de 250C une quantité de calcium sous forme de chlorure de calcique, comprise entre 3 et 15 en calcique, de préférence 10 %. On laisse sous agitation de 8 à 24 h, de préférence 12 h, en maintenant le pH vers 7,3J par addition de Ca (OH)2 ou d'HCl 2 N. Après les 12 heures d'agitation, on répartit la solution d'héparinate de Ca++ dans des boyaux de dyalise et on dyalise environ 6 h contre de l'eau déminéralisée apyrogène, à température ambiante. Le dialysat obtenu a une conductivité de 10.000 p Mhos à 250C et un pH de 7,2. On ajuste le pH à 5,5 par de l'acide chlorhydrique 2 N > on ajoute 3 /oo d'un agent bacikiostatique nonsti- tué par le méta Crésol, puis on filtre le dialysant sur de l'amiante. L'héparinate de calcium est précipité de la solution par addition de 1,5 partie d'alcool éthylique neutre de force 96 GL, après 2 h de repos. L'héparinate de calcium est recueilli dans 10 volumes d'alcool éthylique neutre de force 99,5 GL, broyé, filtré, lavé sur Btlchner à l'alcool éthylique neutre 99,5 GL. L'héparinate de calcium désodé obtenu est ensuite séché sous vide à 0,1 Torr à la température de 450C. On peut ainsi obtenir aisément, notamment à partir d'une héparine Codex sous sa forme de sel de sodium dont la composition est indiquée ci-dessous, un héparinate de calcium ayant Une actitivé anticoagulante de l'ordre de 160 UI/mg, Une teneur en calcium de l'ordre de 10,6 , Une teneur en sodium de 1'ordre de 0,05 %. Dans les exemples dont la description suit, l'héparine mis en oeuvre initialement répond aux normes suivantes Aspect : conforme Solution à 5 % : limpide Métaux lourds : Néant Protéines : néant Azote total : 2,2 % Soufre : 10,7 ffi Activité anticoagulante : 166 UI/mg (selon : Apyrogène (selon les normes con Substances pyrogènes : Apyrogène formes aux méthodes générales d'analyse de la Pharmacopée Fran çaise 8e ed.,page 1615) Substances histaminiques : néant Teneur en ammonium : (0,1 ss Teneur en calcium : Teneur en sodium : 11 > 5 % Teneur en potassium : 0,5 % Teneur en magnésium : EXEMPLE I 100 g héparine Codex répondant aux normes sus-indiquées et titrant 160 UI/mg, soit au- total 16.000.000 UI sont dissous dans 800 ml d'eau distillée ; la conductivité est de 22.000 tu Sous à 250C, le pli de 7. Sous agitation on ajoute l'équivalent de 12 g de calcium sous forme de Cl2CaJ 2H20 PM, soit 44 g de CaCl2, 2 H20 ; la conductivité est de 50.000 Mhos, le pH de 5. On ajoute 200 mg de CaO pour ajuster le pH à 7,5) on laisse sous agitation 16 h.La température étant maintenue à 25 GC après ce temps d'agitation, on répartit la solution en boyaux de précision connus sous la désignation NOJAX, à raison de 300 ml par boyau ; on met les boyaux en présence de 6 litres d'eau déminéralisée, dont la résistivité est 1000 K#/cm et on laisse en contact 6 h. On obtient 1600 ml de dialysat dont la conductivité est de 20.000 Mhos et ayant un pH 7. Le dialysat est filtré sur BUchner préalablement décontaminé par passage dans l'eau javellisée, puis lavé à l'eau déminéralisé apyrogène et une nouvelle fois décontaminé dans de l'eau phénolée à 3 /oo et lavé à neutralité par de lteau déminéralisée aporygène. La filtration s'effectue sur un disque d'amiante connu sous la désignation ERS 2, préalablement lavé par une solution d'HCl 5 N et lavé à neutralité par de l'eau déminéralisée apyrogène. La filtration demande 1 h, un lavage est effectué sur le disque d'amiante par 250 ml d'eau déminéralisée. Les filtrat et lavage sont réunis ; on obtient 1900 ml qui sont ramenés à pH 6,5 par quelques gouttes d'acide chlorhydrique 2 N et on ajoute sous agitation 28050 ml d'alcool éthylique neutre de force 960 GL ; on laisse au repos 2 h puis on recueille l'hépa- rinate mixté de calcium-sodium obtenu dans 1000 ml d'alcool dthy- lique 99,50 GL ; on effectue un léger broyage dans l'alcool à l'aide d'un broyeur Ultra-Turax, on filtre sur BUchner, sous légère dépression et on essore au maximum. On reprend l'héparinate mixte de calcium-sodium, dans 800 ml d'eau distillée et sous agitation. On ajoute l'équivalent de 10 g de calcium sous forme de chlorure de calcium, soit 36,7 g de CaC12, 2 H20 ; on ajuste le pH à 7,3 par CaO (environ 100 mg), puis on laisse sous agitation 16 h à la température de 25 C. Après ce temps d'agitation, la solution est de nouveau mise en dialyse dans les memes conditions que précédemment, pendant 6 heures. Le dialysat (1500 ml) a une conductivité de 10.000 p Mhos et un pH de 7,2 ; ce dernier est ramené à 5,5 par de l'acide chlorhydrique 2 N et on ajoute alors 4,5 g de méta Crésol. La solution est filtrée sur disque d'amiante EKS 2 préparé dans les conditions décrites plus haut.Le filtrat avec lavage (1700 ml) est additionné de 2550 ml d'alcool éthylique neutre de force 960 GL sous agitation manuelle. Après 2 h de repos l'héparinate de calcium est recueilli dans 1000 ml d'alcool éthylique neutre de force 99,50 GL et broyé dans l'alcool avec un agitateur Ultra-Turax. L'héparinate de calcium est filtré sur Puchner, essoré, lavé par 200 mi d'alcool éthylique 99,50 GL, puis séché sous vide de 0,1 Torr à la température de 450C. On obtient 102 g d'héparinate de calcium titrant : 155 UI/mg, soit 15.800.000 UI-Rendement 99 %. La teneur en calcium sur produit anhydre est de : 10,4 % La teneur en sodium sur produit anhydre est de : 0,05 % EXEMPLE II 10.000 g d'héparine Codex titrant 160 UI,/mg, soit au total 1.600.000.000 UI sont dissous dans 80 litres d'eau distillée. La conductivité est de 22.000 M Mhos à 2500 , le pH est de 7. Sous agitation on ajoute ltéquivalent de 1200 g de calcium sous forme de chlorure de calcium, 2 H2O, soit 4.400 g ; la conductivi- té du milieu est de 50.000 p Mhos, le pH dé 5. On amène le pH à 7,5 par addition de 20 g d'oxyde de calcium, on laisse sous agitation 16h. La température étant maintenue à 25 C après ce temps d'agitation, on répartit la solution en boyaux Nojax de précision à raison de 300 ml par boyau ; on met les boyaux dans un bain de 600 litres d'eau déminéralisée apyrogène, de résistivité 1000 K5-/cm et on laisse en contact 6 h. Le dialysat, dont la conduc tivité est de 20.000 Mhos, représente un volume de 160 litres, le pH est de 7. Le dialysat est filtré sur BUchner inox préalablement décon- taminé par passage dans l'eau javellisée, puis lavé à l'eau déml- néralisée apyrogène et une nouvelle fois décontaminé dans de l'eau phdnolée à 3"/,, et enfin lavé et neutralisé par de l'eau dém.inéra- lisée apyrogène. La filtration s effectue sur un disque d'amiante EKS 2, préalablement lavé par une solution d'XCl 5 N, et lavé à neutralité par de lleau déminéralisée apyrogène. La filtration demande 12 h, un lavage est effectué sur le disque d'amiante par 25 litres d'eau déminéralisée apyrogène. Le filtrat et le lavage sont réunis ; on obtient 185 litres qui sont ramenés à pH 6,5 par de l'acide chlorhydrique 2 N et on ajoute sous agitation 277,5 litres d'alcool éthylique neutre 960GL, on laisse au repos 2 h, puis on recueille manuellement l'héparinate mixte de calcium-sodium obtenu, dans 100 1 d'alcool éthylique 99,50 GL. On reprend l'héparinate mixte de calcium-sodium, dans 80 1 d'eau distillée et sous agitation on ajoute ltéquivalent de 1000 g de calcium, soit 3.670 g de C12Ca, H2O. On ajuste le pH à 7,3 par de l'oxyde de calcium (environ 1000 mg) puis on laisse sous agitation 16 h à la température de 25 C.Après ce temps d'agitation, la solution est de nouveau mise en dialyse dans les menes conditions que précédemment pendant 6 h. Le dialysat (150 litres) a une conductivité de 10.000 p Mhos et un pH de 7,2. Ce dernier est ramené à 5,5 par de l'acide chlorhydrique 2 N et on ajoute alors 450 g de méta Crésol. La solution est filtrée sur disque d'amiante EKS 2 préparé dans les conditions décrites plus haut. La solution résultant de la réunion du filtrat et du lavage (170 litres) est additionnée de 255 litres d'alcool éthylique neutre de force 960 GL sous agitation manuelle. Après 2 h de repos, l'héparl- nate de calcium est recueilli dans 100 litres d'alcool éthylique neutre de force 99,50 GL et broyé dans l'alcool avec un agitateur Ultra-Turax.L'héparinate de calcium est filtré sur Biichner, essors lavé par 200 ml d'alcool éthylique 99,5 GL, puis séché sous vide de 0,1 Torr à la température de 45 C. On obtient 10.300 g d'hépa- rinate de calcium titrant : 155 Ui/mg, soit au total 1.600.000.000 UI, Rendement : 100 ss Teneur en calcium : 10,4 % Teneur en sodium : 0,04 ss L'héparinate de calcium pratiquement complètement désodé selon l'invention possède une activité anti-coagulante remarquable, comme le montre le compte-rendu d'essais pharmacologiques qui suit, etqpi en fait un principe actif de médicament de grande valeur. 1) - Injection par voie sous-cutanée chez le lapin 3 lapins reçoivent en injection sous-cutanée 1.000 ui/kg d'héparinate de calcium désodé. Sur chaque animal, des échantillons de sang sont prélevés à l'artère centrale de l'oreille après respectivement 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes après l'injection, puis toutes les heures pendant 12 heures. Un dosage d'héparine et la mesure de la coagulabilité globale ont permis d'observer qu'il existe, dès la quinzième minute après l'injection, une héparinémie décelable et capable d'influencer la coagulabilité globale chez le lapin. Cette héparinémie est efficace jusqu'à la huitième heure. 2) - Injection par voie intraveineuse chez le lapin Trois lapins, à jeûn depuis 24 heures, reçoivent par voie intraveineuse (veine marginale de l'oreille) 300 ui/kg d'héparinate de calcium désodé, soit environ un tiers de la dose dthépa- rine administrée par voie sous cutanée dans l'expérimentation précédente. Un prélèvement pour les contrôles biologiques est pratiqué 5 minutes, 1 heure, 3 heures, 4 heures et 5 heures après l'injection. On constate que par voie intraveineuse une dose environ trois fois plus faible que celle qui a été utilisée par voie sous-cutanée entraine dans les minutes qui suivent l'injection, et pendant 1 à 2 heures, une héparinémie élevée (supérieure à 1,1 ui/ml) mais qui disparait dès la quatrième heure. L'héparinate de- calcium désodé est particulièrement indiqué dans le traitement de tous les états d'hypercoagulabilité, notamment ceux qui s'accompagnent d'embolies, de thromboses artérielles et veineuses, d'infarctus du myocarde, et plus généralement de tous les états impliquant un traitement anti-coagulant et tout particulièrement des états dans lesquels de hautes concentrations en héparine sont désirables, et ce toujours sans risques d'accidents hémorragiques locaux. L'administration de l'héparinate de calcium peut être réalisée sous forme d'une solution,notamment dans du sérum glucosé, a/ par voie sous-cutanée . à titre préventif, 500 ui, 2 fois par 24 heures pen dant 7 à 10 jours, . à titre curatif, en fonction de l'état du malade, de 13.500 à 20.000 ui, 2 fois par 24 heures aussi long temps que l'état thrombolytique du malade l'exige b/ par voie intraveineuse de 20 à 40.000 ui harmonieusement répartis sur les 24 heures, en perfusion réglée de préférence c/ par voie intramusculaire 5 à 10.000 ui, 3 fois par semaine. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Héparinate de calcium ou héparine calcique pratiquement totalement exempt d'ions de sodium. 2. Héparinate de calcium ou héparine calcique selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa teneur pondérale en calcium est égale ou supérieure à 10% en poids total du sel. 3. Héparinate de calcium ou héparine calcique selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa teneur pondérale en calcium est de l'ordre de 10,3 à 10,6% en calcium et sa teneur en sodium est inférieure à 0,1% du poids total du sel. 4. Héparinate de calcium ou héparine calcique complètement exempt d'ions sodium. 5. Médicament à base de l'héparinate de calcium oulhéparine calcique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Médicament selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une solution injectable par voie souscutanée, intraveineuse ou intramusculaire.