FR 2227278 A1 19741122 FR 7315523 A 19730427 La présente invention est relative à l'Qsolement sépara tir de la secrétine et de la cholécystokinine-pancréatozymine à l'état de grande priorité à partir de leurs-mélenges.Chacun des produits ainsi séparés possède se haute activité d'hormone intestinale sur le tractus digestif et a donc une utilité Dour le traitement médical, en particulier pour le diagnostic de diverses maladies du pancréas et de la vésicule biliaire. Un certain nombre de procédés ont déjà été proposés pour séparer la secrétine et la cholécystokinine-paneréatozymxne (désignée dans la suite, par l'abvéviatiDn, CCK-PZ) à partir de leur mélange, utilisant par exemple l'une des méthodes ci-après :: a) isolement de la secrétine à partir d'une solution aqueuse du mélange par adsorption sélective de la secrétine sur acide biliaire et récupération de la CCK-PZ dans la liqueur mère résiduelle (Journal of Physiology, 102,115 (1943) ; b) extraction de la secrétine dans le mélange à l'aide de méthanol et récupération de la CCK-PZ dans le résidu (brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3.013.944) ; c) extraction de la secrétine dans le mélange à l'aide d'isopropanol aqueux et récupération de la CCK-PZ dans le résidu (brevet japonais publié N 89533/70) ; et d) extraction de la secrétine dans le mélange à l'aide de n-butanol et récupération de la CCK-PZ dans le résidu ( Gastroenterology, 3,108 (1946). Même si tous ces procédés connus ont un rendement acceptable pour la séparation et l'isolement de ces deux substances à partir de leur mélange, il apparatt qu'ils restent inefficaces pour fournir chacune d'elles entièrement exempte de l'autre. Il est bien connu que la secrétine a essentiellement pour fonction de stimuler la secrétion par le pancréas de suc pencréatique exempt d'enzyme, tout en produisant une faible secrétion de bile par le foie , alors que la CCK-PZ a pour fonction essentielle de stimuler la production par le pancréas d'un suc pancréatique riche en enzyme, ainsi que la sécrétion de bile par le foie. Quant à la secrétion d'acide gastrique, il a été reccnent decouvert que la secrétine a un effet inverse de celui de la CCK PZ : cette dernière stimule la secrétion d'acide gastrique, tandis que la secrétine inhibe 13 production d'acide gastrique par la gastrine. En raison de ces activités différentes et/ou inverses caractérisant ces deux hormones intestinales dans le tractus digestif, on rencontre de sérieuses difficultés lorsqu'on désire utiliser l'une de ces substances contaminée par l'autre en vue d'un traitement médical et particulièrement pour le diagnostic de certaines maladies du tractus digestif. I1 est donc particulièrement souhaitable de pouvoir disposer de chacune de ces- deux hormones séparées à l'état de pureté, sans cette contamination par l'autre hormone. A la suite.d'une étude approfondie des caractéristiques de ces hormones intestinales , la demanderesse a découvert que la CCK PZ est relativement stable en milieu aqueux à un pH de l'ordre de 9-10, ou plus, qu'elle s'adsorbe bien sur une résine anionique lorsqu'on la tient dans un milieu aqueux ayant un pH ajusté de préférence entre 9 et 12, et contenant éventuellement une concentration ionique relativement faible d'un électrolyte, et qu'on met cette solution au contact de la résine, la CCK-PZ ainsi adsorbée par la résine pouvant être ensuite désorbée en traitant la résine par un milieu aqueux caractérisé 1) par un pH égal ou même supérieur à 9 et une forte concentration ionique , 2) par un pH inférieur à 9 et éventuellement une faible concentration ionique ou 3) par un pH inférieur à 9 et une forte concentration ionique.On constate encore, d'une façon inattendue, que la secrétine , comme la CCK-PZ, est relativement stable à un pH compris entre 8,5 et 10, ou plus, et qu'elle n'est pas adsorbée par une résine anionique dans les conditions où la CCK-PZ est adsorbée par une telle résine. Comme la description qui va suivre le montrera explicitement l'invention repose sur ces observations des caractéristiques particulières de ces deux hormones intestinales. Conformément à l'invention, la secrétine et la CCK-PZ peuvent être presque complétement séparées l'une de l'autre à partir de leurs mélanges en mettant le mélange au contact d'une résine anionique dans un milieu aqueux amené à un pH convenable pour que la CCK-PZ soit adsorbée par la résine , en séparant la liqueur mér.e en vue d'une retirer la secrétine d'une façon classique, et en éluant la CCK-PZ par traitement de la résine où elle se trouve adsorbée à l'aide d'un autre milieu aqueux dont on a préalablement ajusté le pH et/ou la concentration ionique aux valeurs convenables pour obtenir cette élution. I1 est évident que le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre selon plusieurs modes différents, selon les caractéris tiques de la résine anionique à employer , sans sortir du domaine de l'invention. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé, on part d'une solution aqueuse de secrétine et de CCK-P7 amenée à pH 9,0, ou plus, que l'on verse d'abord sur une colonne de résine anionique convenable, cette solution aqueuse pouvant avantageusement avoir une concentration ionique relativement faible. On collecte l'effluent de la colonne pour récupérer la secrétine qui s'y trouve contenue. On peut laver la colonne de résine avec une certaine quantité de tampon aqueux, analogue à celui qui a servi à dissoudre le mélange initial, de manière à éliminer la liqueur-mère résiduelle restant sur la résine. Le liquide de lavage peut être combiné àleffluent précédent en vue de récupérer la secrétine. On traite ensuite la colonne avec l'un des milieux aqueux mentionnés, capables de libérer la CCK-PZ de la résine, afin d'éluer cette hormone. Dans I'élution séparative des deux substances sur colonne de résine anionique, selon le procédé indiqué ci-dessus, on peut utiliser la technique d'élution dite avec gradient, ou la technique d'élution par stades. Dans un autre ode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on recueille séparément la secrétine et la CCK-PZ en raisant passer graduellement un seul et même milieu aqueux d'élution dont on a préalablement ajusté le pH au voisinage de 9 et la concentration ionique à une valeur convenable. Dans ce procédé on recueille principalement la secrétine dans les fractions d'effluent obtenues dans les premiers stades de l'élution, la CCK-PZ étant retirée des fractions recueillies en fin d'élution. Au lieu d'opérer avec une colonne de résine comme dans les procédés d'isolement décrits précédemment, l'invention peut être mise en oeuvre par un procédé en discontinu en introduisant une résine anionique, sous agitation,dans une solution aqueuse renfermant un mélange de secrétine et de CCK-PZ. Pour obtenir une adsorption sélective de la CCK-PZ, le milieu aqueux doit avoir un pH de 9,0, ou davantage , et avoir éventuellement une concentration ionique relativement faible. On filtre ensuite l'ensemble pour séparer la résine. On récupère la CCK-PZ adsorbée sur la résine, par élution à l'aide d'un des milieux aqueux convenables recommandés précédemment pour désorber la CCK-PZ. Par ailleurs, on sépare la secrétine du filtrat par une technique classique. Quant au mélange de secrétine et de CCK-PZ à traiter par le precédé selon l'invention, il peut s'agir de n'importe quelle substance, pourvu qu'elle contienne de la secrétine et de la CCK-PZ, comme par exemple les extraits que l'on obtient en traitant l'intestin grêle des mammifères avec un acide, l'eau , un solvant organique ou un milieu analogue ; on peut traiter aussi, la secrétine et la CCK-PZ ayant un certain degré de pureté s comme les produits obtenus par les procédés connus a), b), c), et d) cités. Les résines anioniques préférées aux fins de l'invention sont les résines du type polystyrène comme l'Amberlite IRA 400, fournie dans le commerce par ROHM et HAAS Company, la résine Dowex 1 fournie par DOWCHEMICAL COMPANY, et les dérivés de la cellulose destinés à l'échange ionique, du type TEAE cellulose, les dérivés réticulés du dextrane comme les TEAE Sephadex et QAE sephadex, fournis dans le commerce par Pharmacia Inc. I1 faut blezi noter que le procédé selon l'invention permet d'obtenir la secrétine sous une forme pure non contaminée, c'està-dire renfermant moins de 0,1% en poids de CCK-PZ, la CCK-PZ étant recueillie par ailleurs pratiquement exempte de secrétine. Dans la pratique, quand on traite par le procédé par exemple un produit brut de départ ne renfermant les deux substances qu'en proportions très faibles, on obtient de la secrétine contaminée par tout au plus 0,1 de CCK-PZ et de la CCK-PZ pratiquement exempte de secré tine. Les substances obtenues par le procédé possédent leur aetivité hormonale caractéristique remarquable sur le tractus digestif spécifique et, en conséquence, elles conviennent particulièrement pour le traitement médical des maladies particulières de ces organes. Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention. EXEMPLE I On active par une technique classique une quantité équivalent à 80 grammes de QAE Sephadex A-25, on la tamponne soigneusement avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium 0,01 M à pH 9,0 et on charge la résine ainsi traitée dans une colonne tubulaire en verre de 90 cm de longueur et de 2,5 cm de diamètre. On dissout dans 50 ml d'eau distillée 1,9 grammes d'un mélange de secrétine (titrant 155 unités Crick,Harper et Raper par mg) et de CCK-PZ (titrant 7ss7 unités Ivy Dog par mg). On rend la solution alcaline à pH 9,0 à l'aide d'ammoniaque aqueuse 0,1 N et on centrifuge pour séparer les insolubles. On obtient ainsi une solution elaire que I'oniGerse sur la colonne de résine. On développe successivement par la technique d'élution avec gradient en utilisant 3 litres de solution tampon de formiate d'ammonium O,2M à pH 8,0 avec un débit de 80 ml/heure. On collecte séparément l'élut par fractions de 20 ml. Les caractéristiques des fractions d'effluent sont portées graphiquement sur la Fig. 1 annexée dans laquelle le numéro des fractions est en abeisses. Sur la Fig. 1, le trait plein a traduit les concentrations (échelle I d'ordonnées) de peptide dans les fractions respectives, mesurées par densité optique à 280 R (D.O. 280) ; le trait pointillé b donne les quantités en ul ( échelle II d'ordonnées) de suc pancréatique sécrété par le pancréas des rats, en l'espace de 25 minutes, par injection intraveineuse de 20ul de chaque fraction aliquote d'effluent et enfin la courbe c donne la longueur de contraction en mm (échelle III d'ordonnées) de la vésicule biliaire de cobayes auxquels on a administré par voie intraveineuse 20ul de chaque fraction d'effluent. Les expériences sur animaux, pour déterminer la réponse pancréatique du rat et la contractilité de la vésicule biliaire du cobaye ont été effectuées par les méthodes décrites dans la littérature (Japanese J. Pharmacol.21,325 (1971) et Svensk.Farm.Tidskr., 68 ,351 (1964). Sur la Fig. 1, chacun des effluents (A), de la 10e à la 30e fraction incluse, correspondant à la courbe b , présente l'activité propre de la secrétine et chacun des effluents (B) de la gOe à la 110e fraction incluse, correspondant à la courbe c , présente donne l'effet de contraction de la vésicule biliaire chez le cobaye. On lyophilise séparément les effluents (A) et (B) . On dissout séparément les substances séches obtenues dans une petite quantité d'eau et on fait passer les solutions sur Sephadex G-25 nour éliminer le sel présent et on lyophilise chacun des effluentes. On recueille ainsi a) 90,8mg de secrétine purifiée ayant une acti- vité en secrétine correspondant à 2506 unités Crick,Harper et Raper par mg, et pratiquement exempte de CCK-PZ (l'activité en CCK-PZ étant inférieure à 0,1 unité Ivy Dog par mg); la quantité de subs tance,obtenue (90,1 mg) correspond à unrendement de 75 % par rapport à la secrétine initialement contenue dans le mélange et unités b) 67,5 mg de CCK-PZ ayant une activité de 83 tvy Dog par mg, sans aucune activité caractéristique de la sécrétine.Le produit recueil li.(67,5mg) correspond à un rendemnt de 83 à partir de la CCK-PZ contenue dans le mélange initial. Exemple 2 On active d'une façon classique une quantité équivalant à grammes de TEAE cellulose sèche, on la tamponne soigneusement avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium 0,005 M à pH 9,0 et on lave à grande eau.On verse la substance dans une colonne tubulaire en verre de 30 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre. On dissout dans 5 ml d'eau distillée 100 mg de mélange de sécrétine (titrant 339 unités Crick; Hayer et Raper par mg) et de CCK-PZ (titrant 10 unités Ivy Dog par mg). On rend la solution alcaline à pH 9,5 avec une solution aqueuse d'ammoniaque 0,1 N et on centrifuge pour éliminer les insolubles. On obtient une solution claire que l'on verse sur la colonne préparée précédemment. On commence par développer la colonne avec 300 ml d'une solution aqueuse tampon de formiate d'ammonium 0,005 005 M, à pH9,0,puis au bout de 18 heures avec 180 ml d'une solution aqueuse tampon de formiate d'ammonium 0,02M à pH9,0 et finalement, au bout de 12 heu- res, avec 100 ml d'une solution aqueuse tampon de formiate d'ammonium 0,2 M à pH 9,0, le débit étant dans chaque cas de 15 ml/heure. On collecte l'éluat par fractions séparées de 5 ml. Les caractéristiques des fractions éluées sont représentées graphiquement sur la Fig.2 annexée où le numéro des fractions est porté enabeisses Sur la Fig.2, la courbe d en trait plein donne les concentrations % (échelle IV d'ordonnées) de peptide dans chacune des chacune des fractions correspondantes, obtenues par mesure de le densité optique à 225.r1r(D.0.225); ; la courbe e,- en pointillé, donne les quantités en ul (échélle V d'ordonnées) de suc pancréatique secrété en 25 minutes par le pancréas de rats ayant reçu 20 ul des fractions respectives, par voie intraveineuse, et finalement, la courbe f donne la longueur de contraction en mm (échelle VI d' ordonnées) de la vésicule biliaire de cobayes ayant rçu par voie intraveineuse 40 ul des fractions respectives d'effluent.Les expériences sur animaux, ont été effectuées en suivant les méthodes citées à l'exemple 1. On lyophilise séparément les fractions N010 à 20 (incluse) réunies qui présentent sur la Fig.2 l'activité propre à la sécrétine (courbe e) et les fractions N030 à 42 (incluse) qui ont l'effet de contraction de la vésicule biliaire (courbe f). On otbient ainsi respectivement 10,5 et 8,7 mg des deux substances. La première possède une activité en secrétine correspondant 2 230 unités Crick, Harper et Raper par mg, et la seconde une activité en CCK-PZ de 101 unités Ivy Dog par mg. On détermine par ailleurs que chacune des substances n'est contaminée par l'autre que dans la proportion maximum de 1 partie en poids pour 2 000. Les quantités isolées correspondent respectivement a un rendement de 70% en secrétine et 88% en CCK-PZ par rapport à l'activité initiale de ces substances dans le mélange de départ. EXEMPLE 3 On active par un procédé classique une quantité équivalant à 70 grammes de QAE Sephadex A-25 à l'état sec (résine anionique d'ammonium quaternaire, fournie dans le commerce par Pharmacia Inc ) et on la tamponne entièrement avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium 0,01 M à pH 9,0. On verse la résine activée dans une colonne de 2,5 x 100 cm et on.fait passer dessus 200 ml d'une solution aqueuse d'ammoniaque 0,01 N. On dissout dans 200 ml d'eau distillée 5 grammes d'un mélange de secrétine titrant 12 unités Crick, Harper et Raper par mg) et de CCK-PZ (titrant 0,5 unité Ivy Dog par mg).et on alcalinise la solution à pH 9,0 avec de l'ammoniaque aqueuse 0,5 N. On centrifuge pour séparer les insolubles. On verse la solution claire obtenue sur la colonne précédemment préparée. On développe par élution avec gradient de concentration en utilisant successivement 2 litres d'une solution aqueuse tampon de formiate d'ammonium 0,01 M à pH 9,0 et 2 litres d'une solution aqueuse tampon de formiate d'ammonium 0,01 M à pH 7,0, en utilisant des débits de 60 ml/heure. L'éluat est collecté en fractions séparées de 10 ml. Les caractéristiques des fractions collectées sont représentées graphiquement sur la Fig. 3 annexée, sur laquelle les numéros des fractions sont portés en abcisses. Sur la Fig. 3, la courbe , en trait plein, donne les concentrations en poids % (échelle VII d'ordonnées) de peptide contenues dans les fractions éluées correspondantes, mesurées par la densité optique à 280 pl (échelle VIII d'ordonnées) de suc pancréatique secrété en 25 minutes par le pancréas de rats ayant reçu en injection intraveineuse 100 pl des fractions correspondantes et la courbe i donne la longueur de contraction en mm (échelle IX d'ordonnées) subie par la vésicule biliaire de cobayes ayant reçus par injection intraveineuse 100 1 de chacune des fractions correspondantes.Dans les expériences sur les animaux mentionnés, on a utilisé les mêmes méthodes que dans les exemples précédents. On réunit séparément les fractions n 48 a 70 inclusivement qui présentent une activité zen secrétine (courbe h) et les fractions N0212 à 264 inclusivement qui ont un effet de contraction sur la vésicule biliaire, comme le montre la courbe i. Les deux lots de fractions réunies sont acidifiés séparément à pH 3,5 avec HC1 3N et relarguées à l'aide de NAc1 à saturation. On sépare les précipités, et on les redissout dans une petite quantité d'eau et on poursuit le traitement comme à l'exemple 1, pour éliminer les sels présents. On obtient ainsi a) 49,4 mg de secrétine ayant une activité en secrétine correspondant à 911 unités Crick, Harper et Raper par mg avec une activité en CCK-PZ de 0,3 unité Ivy Dog par mg ; le rendement correspond à 75% par rapport à la quantité initiale de secrétine contenue dans le mélange de départ ; et b) 40 mg de CCK-PZ ayant une activité en CCK-PZ correspondant à 45 unités Ivy Dog par mg, sans aucune activité en secrétine. Ce rendement correspond à 72% par rapport à la quantité initiale de CCK-PZ contenue dans le mélange de départ. REVENDICP IONS 1 - procédé de séparation de la secrétine et de la cholécysto kinine-pancréatozymine à partir de leurs mélanges caractérisé en ce qu'on met le mélange dans un milieu aqueux dont le pH est réglé entre 9 et I2 environ, en contact avec une résine échangeuse d-'anions afin d'adsorber sélectivement la cholécystokinine-pancréato- zymine > on recueille cette dernière à partir de la résine et on recueille la secrétine dans la liqueur-mère restante. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu aqueux renferme une faible concentration ionique d'électrolyte. 3 - Procédé selon la revendication 1 > caractérisé en ce qu'on recueille la cholécystokinine-pancréatozymine à partir de la résine échangeuse d'anions sur laquelle elle est adsorbée en mettant cette dernière au contact d'un milieu aqueux à pH inférieur à 9,0 environ. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on recueille la cholécystokinine-pancréatozymine à partir de la résine échangeuse d'anions en mettant cette dernière au contact d'un milieu aqueux contenant une forte concentration ionique en électrolyte. 5 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu aqueux contient en outre une concentration ionique variable en électrolyte. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu aqueux a un-pH variable. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu aqueux est mis au contact de la résine échangeuse d'anions chargée dans une colonne. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'opération est effectuée en discontinu. 9 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'opération est effectuée par une méthode d'élution avec gradient. IO - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'opération est effectuée par une méthode d'élution par stades. 11 - Procédé selon,la revendication 1, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'anions est choisie parmi des composés aminotertiaires et des composés d'ammonium quaternaire. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le composé d'ammonium quaternaire est un dextrane réticulé possédant des groupes diéthyl-2-hydroxypropyl-ammonium.