FR 2207699 A1 19740621 FR 7241596 A 19721123 La présente invention concerne un procédé de purification d'extraits végétaux contenant des pigments flavoniques, et en particulier d'extraits des différents Citrus, en vue d'éliminer les contaminants macromoléculaires qui les rendent impropres en thérapeutique humaine pour les usages parentéraux. I1 est bien connu de traiter certains végétaux, par exemple les péricarpes de fruits du genre Citrus, feuille d'Hamamelis Virginiana, baies immatures de différents Rhamnus (AaygdAlinus, oléoides, saxatilis, infectoria, etc...) pour en extraire les pigments fla vomiques qui s'y trouvent en abondance. Pour ce faire, les pièces végétales sont broyées puis extraites i l'eau additionnée éventuellement d'alcools ou de cétones et por tées i une température convenable, suivant les différents modes décrits dans la littérature. Les extraits ainsi obtenus sont très impurs, et comportent ou tre les pigments flavoniques, un certain nombre de substances provenant des tissus végétaux, ainsi que des produits de dégradation desdites substances, apparues au cours des opérations d'extraction. Les pigments flavoniques peuvent être séparés de ces extraits complexes par les méthodes habituelles de la chimie des substances naturelles : partition entre solvants, chromatographie sur diffé- rents supports, précipitation par réactifs sélectifs, etc... Toutefois, il est apparu que certains contaminants accompa- gnaient les pigments flavoniques au cours des opdrztions de purification et pouvaient difficilement en Autre débarrassés, de sorte que les flavonoTdes maie ainsi purifiés ne convenaient pas i certaines utilisations de médecine humaine. Les produits purifiés présentent généralement un pouvoir pyrogène et allergène qui les exclut des formes inectables et des applications transcutanées. Les contaminants responsables de ces effets indésirables sont d'une part des protéines vdgétales, et notamment les protéines nu cléSques basiques ou histones, qui se lient aux flavonoTdes soit tirectement, soit par l'intermédiaire de certains cations divalents:: Ca++, Cu++, oligoéléments, qui forment des chélates mixtes avec les protéines et les flavonoTdes, et d'autre part, des produits de masse moléculaires élevée, apparentés aux tannins leucocyaniquea, provenant de la condensation oxydative des flavonoIdes eux es, qui s'adsorbent facilement i la fois sur les flavonotdes et les protéines, et dont la formation est pratiquement inévitable dans les premiers stades du traitement des végétaux. I1 convient d'éliminer de façon très complète ces contaminants qui exercent leurs actions biologiques parasites à l'état de trace. Un traitement des extraits bruts s'avère indispensable, avant toute opération de fractionnement. A cet effet, l'invention propose un procédé de purification des extraits vdgétaux bruts de mise en oeuvre simples et permettant d'obtenir des extraits flavoniques apyrogènes qui peuvent être utilisés tels quels ou servir de point de départ pour la séparation des pigments flavoniques. Les extraits obtenus sont directement utilisables en médecine humaine, y compris les applications pour administration parentérale ou transcutanée. Selon une première caractéristique de l'invention, le procédé de purification d'extraits flavoniques bruts, aqueux, hydro-alcooliques, consiste à faire adsorber successivement et sélectivement lesdits extraits en solution sur une rdsine complexante et échangeuse d'ions, sur une argile acide, et sur l'alumine activée, cette adsorption étant suivie d'un traitement de la solution purifiée, soit chimiquement pour en séparer les flavonordes, soit par dessication pour obtenir des poudres convertibles en formes phar maceutiques. Les trois étapes d'adsorption permettent et ont pour but d'é- limier successivement les métaux chélatants, les protéines solu- bles et enfin les tannotaes condensés. Les flavonoTdes purs pourront hêtre séparés chimiquement de la solution purifiée, par un procédé chimique connu en soi. Les poudres obtenues par dessication trouveront leur application en thérapeutique humsine. Selon un mode préféré de l'invention, la résine échangeuse d'ions est une résine à groupement actif phosphonique et l'argile acide est la montmorillonite. Selon une autre caractéristique de l'invention, après adsorption sur résine et alumine la solution est refroidie entre OOC et + 40C mise à décanter en cuve isotherme. Selon une autre caractéristique de l'invention, l'adsorption sur argile et sur l'alumine est effectuée sous courant d'azote en cuve isotherme tanche. Selon encore une autre caractérisique de l'invention, le traitement ultérieur de la solution purifiée est mise en oeuvre dans les deux heures suivant l'achèvement de la purification. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description qui va suivre et des exemples de mise en oeuvre du procédé de purification. Le procddé de purification comprend trois étapes successives d'adsorption en vue éliminer les métaux chélatants, les protéines solubles et les tannotdes condensées, des extraits flavoniques bruts, aqueux, et hydroalcooliques obtenus par des procédés classiques d'extraction. La première étape de purification consiate à fixer les oligoéléments sur une résine échangeuse d'ions appropriée par exemple la résine connue sous la dénomination commerciale de Duolite ES 63, qui est une résine phosphonique spécifique de nickel, cobalt, cuivre et zinc, à partir d'une solution aqueuse à 10 % - 15 % de l'extrait, sensiblement neutre, puis à acidifier la solution obtenue par de l'acide sulfurique jusqu'à un pH de 2, à refroidir la solution acide à 0 C et à la maintenir à cette température pendant environ 48 heures.Au cours de la conservation, il se forme un précipité complexe comprenant notamment des sulfates mixtes de protéines basiques et de calcium, ainsi que des polyuronides de faibleoondensation. La solution est convenablement centrifugée ou filtrée, puis ramenée à un pH de 7 au moyen d'une lessive de soude ou de potasse. La seconde étape de purification consiste à fixer les protéines basique s sur une argile adsorbante qui pourra être par exemple la montmorillonite. On ajoute 2 % de montmorillonite préalablement dispersé et gonflée dans l'eau et on maintien en agitation pendant 2 heures au soins. Ensuite, on sépare l'argile par centrifugation et on renouvelle le traitement une seconde fois par 1 % d'argile. Ces opérations auront lieu de préférence dans une cuve fermée par un couvercle et maintenue sous barbotage de gaz inerte tel que l'azote. La troisième étape de purification consiste à fixer les tannoïdes, sur de l'alumine activée neutre du type utilisée pour les séparations chromatographiques, à raison de 5/oo d'alumine de granulométrie 25-50 microns, dans l'extrait toujours sensiblement neutre. Le mélange solution aqueuse d'extrait-alumine est maintenu en agitation pendant 1 heure, en récipient étanche sous barbotage d'azote comme pour la seconde étape de purification. L'alumine est ensuite séparée par filtration et le traitement est renouvelé avec 2,5 # d'alumine. L'extrait obtenu est ahané à pH de 2 au moyen d'acide sulfuri- que et refroidi à 0 C et maintenu à cette température pendant 48 heures. Un précipité se forme lequel est éliminé par filtration. Le pH est ensuite ramené à 4,00 par de la potasse. La solution purifiée obtenue doit être ou bien utilisée immé- diatement pour en séparer les flavonoIdes par un quelconque procédé chimique connu ou bien employée directement à des fins thérapeutiques. Dans ce dernier cas, il est indispensable de sdcher la solution sans attendre, par nébulisation, ou encore et de prdfé- rence par lyophilisation. I1 convient de respecter qu'en aucun cas la solution purifiée ne devra être conservée plus de quelques heures, car il e'y produit rapidement des altérations qui font perdre l'avantage des traitements de purification. Le produit désséché obtenu se prete à la réalisation de toutes formes pharmaceutiques désirées : comprimés, gélules, granulés, etc... y compris les formes injectables sous réserve de mélanger peu avant l'injection le solvant physiologique et la poudre lyophilisée. Le produit séché pourra bien entendu autre converti en crèmes et pommades pour utilisation médicale et cosmétique pour autant que le contenu en eau de ces formules soit réduit au strict minimum. La poudre obtenue par dessication directe de la solution est anallergique et peu ou pas pyrogène.Les flavonoïdes, séparée par voie soit à partir de cette solution purifiée sont anallergi ques et apyrogènes.- La mise en oeuvre du procédé qui vient d'être exposé va être décrite plus en détail dans les deux exemples de réalisation qui vont suivre. EXEMPLE 1 On part d'une solution aqueuse à 12 % de matière sèche prove nuant de l'épuisement par l'eau du péricarpe d'orange. Ces solutions sont par exemple produites en iSme temps que les huiles essentielles dans les machines qui procèdent par rapage superficiel des fruits et constituent donc des eoui-produiti normaux de l'industrie agrumière. 1000 litres de solution à 10 % d'extrait sec soigneusement fil très sur kieselguhr, dont le pH doit Stre compris entre 6,5 et 7,5 sont mis on percolation sur une colonne de 100 litres de rési- ne DUOLITE ES 63, préalablement saturée en ions Na+, à la vitesse de 200 litres par heure. La solution imprégnant la résine est déplacée par un volume équivalent d'eau. On obtient ainsi 990 litres de solution débarrassée de teus les métaux lourds. La solution obtenue est refroidie aux environs de 0 C au moyen d'un échangeur à plaque puis acidifiée ;jusqu'à un pH de 2 exactement mesurée, ce qui nécessite environ 6 litres d'acide sulfurique concentrée. La solution est ainsi introduite en chambre froide ou cuve isotherme dans laquelle on la maintient durant 48 heures. Un pré cipité correspondant à environ 50 kg de poids humide se dépose au fond de la cuve. Le précipité est séparé par décantation et lavé par 100 litres d'eau puis reséparé par décantation. Les liqueurs décantées sont filtrées sur Kieselguhr et portées dans une cuve à plafond mobile munie d'un agitateur au fond de la cuve. On neutralise à pH7 ce qui nécessite environ 7 kg de soude en pastilles. On établit ensuite un courant d'azote au moyen d'un poreux dispersant et on introduit sous agitation 100 litres d'une dispersion contenant 20 kg de montmorillonite. On maintien l'agitation pendant 2 heures, puis on laisse reposer 2 heures. Une nouvelle agitation permet de réaliser une autre suspension et 1 'argile séparé dans une essoreuse centrifuge. Le liquide clair recueilli est admis dans une cuve identique dans laquelle on introduit, après saturation à l'azote 50 litres de dispersion contenant 10 kg de montiorillonite. On maintient sous agitation pendant 2 heures puis on laisse reposer pendant 2 heures. On reforme une nouvelle suspension par agitation et on sépare l'argile dans une essoreuse centrifuge. Les argiles séparés par l'essoreuse sont assemblés et lavés par 100 litres d'eau puis à nouveau séparés à l'essoreuse centrifuge. L'eau de lavage des argiles est réunie aux liqueurs principales. Pendant les périodes d'agitation et de décantation, les barbotages d'azote sont interrojnpu; et le plafond mobile est rendu étanche au moyen de son joint pneumatique. Les liqueurs sont réunies dans une cuve de mEme type et on crdé une agitation maximale ainsi qu'un barbotage d'azote, on ajoute alors 5 kg d'alumine activée pour chromatographie, broyée et tamisée Jusqu'd une granulométrie de 20 - 50 microns, préalablement dispersées de 25 litres d'eau. On maintient sous agitation pendant une heure puis on arrSte l'agitation et on filtre en recueillant la solution filtrée dans une cuve identique. On ajoute alors 2,5 kg d'alumine et on main- tient sous agitation à nouveau pendant 1 heure. L'agitation est arrêtée et on effectue une filtration. A la sortie du filtre la solution recueillie est refroidie à 20C dans un échangeur à plaque puis recueillie dans une cuve isotherme. La solution est amenée à un pH de 2,00 (+ 0,05) ce qui nécessite environ 4 litres d'acide sulfurique concentré. La solution est maintenue 48 heures à cette température sous un léger barbotage d'azote. Il se forme un dépit dense représentant environ 30 kg humide qu'on sépare par filtration en recueillant la solution filtrée dans une cuve munie d'une injection permanente d'azote. La solution encore froide est neutralisée jusqu'à un pH de 5,00 (+ 0,05) ce qui nécessite environ 5 kg de soude en pastilles. La solution toujours froide et saturée d'azote est immédiatement concentrée sous vide de 10-20 torrs, à une température ne dépas sant pas 400 C, exactement mesurés, jusqu'à une teneur en matière sèche de 25 %. Cette solution doit présenter un pH de 4,00 (± 0,05) ce pH étant au besoin ajusté par l'acide sulfurique ou soude. La solution est immédiatement congelée et lyophilisée, ou, à ddfaut, atomisée. Pour l'atomisation, on ajoute un volume égal de méthanol, afin de diminuer les actions thermiques subies par le produit. De plus, il convient d'opdrer en atomiseur muni d'un dispositif de refroidissement de la poudre et d'ensachage continu. En cas de lyophilisation, leude d'étuve à lyophiliser sera cassé par de l'azote après dessication du produit, afin de saturer le produit en azote. En cas d'atomisation le produit refroidi obtenu sera placé sous cloche à vide et maintenu une demi-heure sous 5-10 torrs, après quoi, le vide sera cassé à l'azote, afin d'éliminer toute trace d'oxygène occlus. Dans les deux cas les poudres obtenues seront conditionnées sous coussin d'azote et préservées par des charges désséchantes. La poudre ainsi obtenue peut être utilisée directement en thérapeutie : elle correspond au produit que la Propharmacopée désigné comme "CitroflavonoTde". Elle n'est pas allergique et elle peut se révéler apyrogène si l'extrait brut n'a subit aucun début de fermentation. La solution concentrée sous vide à 25 % pourra également Strie utilise comme matière première dans un circuit d'extraction de flavonotdes par échange liquide-liquide ou précipitation sélective, à condition que le stockage intermédiaire soit effectué sous injection permanente d'azote et ne dure pas plus de 2 heures. EXEMPLE 2 1000 kg de baies immatures de Rhamnus amygdalinus sont broyée jusqu'à une granulation de 1-2 mm dans un moulin en métal inoxydable et reçus à la sortie du broyeur dans 500 litres d'eau à 950C. Le mélange eau-baies broyées est maintenu à 950C par injection directe de vapeur filtrée et déshuilée. La tasse est ensuite chargée dans un percolateur de 2000 litres calorifugé et la percolation est effectuée sous pression par 2000 litres d'eau à 1100C. Le jus du percolateur est détendu et immédia- tement refroidi à 200C dans un échangeur à plaque puis concentré sous vide à 10-20 torrs, à la température maximale de 400C, de façon à en ramener le volume à 1000 litres. On centrifuge et on filtre le concentré obtenu qui contient environ 10 % de matières dissoutes et présente un pH variant de 5,5 à 6,0. Ces 1000 litres de concentré de Rhaxnue sont ensuite traités exactement comme les 1000 litres d'extrait flavonique de Citrus de l'exemple 1, en respectant point par point toutes les étapes. La poudre obtenue, riche en dérivés du kaempferol, peut servir directement en thérapeutie pour ses propriétés notamient diurétiques. Elle peut également servir comme matière première pour l'isolement du kaempférol et de ses dérivés par les procédé. habituels. L'isolement des produits purs peut aussi s'effectuer à partir de la solution finale à 25 % de matière sèche, sous les mêmes r*- serves que pour l'exemple précédent. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits mais englobe toute variante. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification d'extraits végétaux flavoniques, caractérisé en ce qu'il consiste à faire adsorber successivement et sélectivement lesdits extraits en solution sur une résine complexante échangeuse d'ions, sur une argile acide, et sur l'alumi- ne activée, cette adsorption étant suivie d'un traitement de la solution purifiée, soit chimiquement pour en séparer les flavonot- des, soit par dessication pour obtenir des poulies convertibles en formes pharmaceutiques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite résine est une résine à groupements actifs phosphoniques. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que ladite argile est la montmorillonite. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce qu'après adooqiion sur résine et alumine, la solution recueillie est refroidie entre 0 C et 40C et mise à décanter en cuve isotherme. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que l'adsorption précitée sur argile et sur alumine activée est effectuée sous courant de gaz inerte en cuve isotherme étanche. 6, Procédé selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'après adsorption sur alumine activée, la solution est maintenue sous barbotage de gaz inerte dans la cuve isotherme pour décanstation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précéden- tes, caractérise en ce que ledit gaz inerte est l'azote. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement ultérieur de la solution purifiée est mie en oeuvre dans un intervalle de 2 heures après achèvement de la purification. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit traitement comprend une concentration de la solution purifiée et une dessication du concentré en poudre. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la dessication précitée est effectuée par atomisation ou lyophiliga- tion. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la poudre obtenue est refroidie et ensachée en continu. 12. Composition pharmaceutique comprenant dans sa formulation des extraits purifiés par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 13. PlavonoTdes purs apyrogènes caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par le procédé à partir d'extraits purifiés selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.