FR 2224118 A1 19741031 FR 7312750 A 19730405 Argument s Il s'agit d'un produit du type antigène destiné à permettre le diagnostic sérologique du cancer i sa préparation consiste à prélever du sang de cancéreux atteints de cancers de types différents, dans des veino-tubes liquides, chacun de ces prélèvements étant gardé plusieurs semaines ou plusieurs mois, puis à l'ensemencer dans du bouillon nutritif contenant de la vitamine B 12, à le mettre en culture et à le lyophiliser. Domaine de l'invention s La présente invention est du domaine de la détection, ou diagnostic, des maladies et vise plus particulièrement une méthode et ses moyens de mise en oeuvre pour détecter les affections cancéreuses è l'aide de réactions immunologiques. Art antérieur : Le cancer de l'homme, fléau redoutable que notre époque moderne a mis douloureusement en lumière, n'a pas manqué de susciter un effort considérable de recherches dans la voie de son diagnostic. On sait en effet que, pour cette maladie notamment, une détection et un traitement précoces sont la meilleure garantie de succès du traitement. Ainsi s'est-an intéressé très tôt à l'examen des tissus lésés pour y déceler la présence d'anomalies cytologiques, preuves ou présomption de la maladie. Une telle méthode, dite de biopsie, est bien entendu d'une grande sûreté lorsque la réponse de l'examen est positive ; bais cet examen ne peut tre que local ; donc, d'une réponse négative de l'examen sur des tissus prélevés sur un certain organe, on ne peut déduire qu'aucune affection n'est présente sur quelqu'autre organe. Ainsi par exemple une tumeur au cerveau ne saurait tre révélée par l'examen d'un frottis utérin ; plus, on conçoit que la généralisation d'un tel examen à l'ensemble des organes d'un individu pose des diffi cultés pratiques considérables, ce qui se traduit par un coût élevé du diagnostic. Aussi les recherches récentes dans ce domaine se sontelles orientées vers des méthodes de diagnostic basées sur l'exament des tissus sanguins ou lymphatiques, avec l'idée que ces tissus pourraient contenir des indices d'une affection localisée en un point quelconque de l'organisme pourvu que ce point soit en relation sanguine ou lymphatique avec l'ensemble de l'organisme. De plus, les chercheurs ont songé à utiliser les réactions antigè nes-anticorps, ou immunologiques, pour caractériser la présence ou l'absence de tels indices d'affection. On connait assez bien aujourd'hui le mécanisme réactionnel de certains de ces couples ; on sait que l'apparition dans l'organisme de certains corps, dits antigènes, tels que des protéines ou des polyosides, en particulier bactériens, provoque la formation plus ou moins spontanée de substances dites anticorps, aptes à inhiber une éventuelle toxicité des antigènes ; on sait aussi que la spécificité réactionnelle de ces couples est très élevée, autrement dit que le caractère positif d'une réaction est hautement significatif de la correspondance des couples en présence ; on sait enfin que la sensibilité réactionnelle est, elle aussi, élevée pourvu que le rapport des concentrations respectives des composants des couples soit entre certaines limites, autrement dit que le caractère négatif d'une réaction est assez significatif de la non-correspondance des couples en présence pourvu que l'on ait pris la précaution d'explorer une certaine plage du rapport des concentrations. Ainsi, très récemment, des chercheurs ont mis au point une technique basée sur les considérations précédentes et selon laquelle on met en présence du sérum sanguin d'un sujet examiné, avec un tissu ayant été le siège d'une affection cancéreuse. Si des anticorps sont présents dans le sérum du sujet examiné, ils réagiront avec eux et se fixeront sur les antigènes correspondants supportés par le tissu affecté ; la fixation est mise en évidence au moyen d'une globuline anti-humaine marquée au moyen d'un colorant fluorescent ; une telle méthode de diagnostic est dite d'im munofluorescence ; elle a comme avantage de permettre une-locali- sation assez précise de l'affection cancéreuse, en supposant toutefois que l'affection de tels organes ou tissus déterminés entrai- ne bien la formation d'antigènes particuliers à cet organe ou à ce tissu. Elle présente cependant l'inconvénient d'exiger la mise en oeuvre de moyens, tels que des plaques supportant les tissus can céreux de référence, qui constituent plus l'équipement d'un centre spécialisé que celui des laboratoires d'analyses biologiques. Définition générale de l'invention : L'intention du demandeur est de fournir à de tels laboratoires d'analyses usuelles un moyen simple et sûr de diagnos- tic d'une affection cancéreuse. En cas de réponse positive, des examens ultérieurs du genre de ceux mentionnés ci-dessus permettront la localisation de l'affection. L'idée de l'invention repose sur l'observation, qui a fait l'objet d'un certain nombre de communications et de publications du demandeur (voir notamment"le cancer de l'homme"DELTA EDITIONS 1969), qu'une affection cancéreuse de quelque type qu'elle soit s'accompagne de l'apparition dans le sang du malade de couples antigènes-anticorps. Le demandeur a mme tout lieu de penser que les affections cancéreuses de quelque tissu ou organe que ce soit sont la conséquence de l'existence dans l'organisme de formes végétatives primordiales ou probactériennes porteuses de caractère antigénique. L'apparition de ces formes dOe en fait à leur multiplication postulerait un parasitisme latent du sang de tout organisme ; et selon la faculté de réponse en anticorps, ou auto-défense de chaque sujet, ces formes pourraient se déve lopper et provoquer les affections cancéreuses. Ainsi, à un organisme sain correspond un fort potentiel d'auto-défense (grande quantité d'anticorps) et à un organisme affecté correspond un potentiel d'auto-défense augmenté sauf à la phase terminale de l'affection. L'idée de l'invention repose encore sur l'observation que du sang, et notamment du sang de cancéreux extrait de l'organisme, donc séparé des centres générateurs d'anticorps, peut tre le siège du développement de ces formes primordiales et qu'en outre après repiquage et culture dans un milieu et dans des conditions appropriés, le développement polymorphe de ces formes se poursuit. Ces formes restent à leur stade initial corpusculaire, porteuses d'un caractère antigénique actif. L'invention, dans son principe, réside dans un procédé de préparation d'un milieu antigénique et dans des méthodes d'uti lisation de ce milieu à des fins de diagnostic comportant notamment une référence à. des tables de résultats permettant de conclure à la réactivité, se traduisant normalement par une agglutination des éléments corpusculaires ou à l'inhibition en cas de forte réactivité avec la sérum des cancéreux, dans des conditions de simplicité et d'exactitude satisfaisantes. Elle réside aussi dans le milieu lui-mme en tant que produit. Elle réside enfin dans une méthode d'utilisation du milieu à des fins de diagnostic cancérologique. Procédé de préparation du milieu antiqénique : Selon la présente invention, un tel procédé consiste à : /séparément A-prélever en veino-tudes liquoides une quantité de 10 à 15 ml de sang provenant de patients atteints d'une affection cancéreuse d'un certain type, quatre prélèvements d'origine différente étant l'optimum. B-garder le sang pendant au moins deux semaines à la température ambiante (22 C environ). C-ensemencer 1 à 2 ml de chacun de ces prélèvements dans 10 ml de bouillon nutritif ordinaire, additionné d'un facteur de croissance tel que la vitamine B 12 à raison de 1 à 2 y par tube de culture. Laisser incuber quatre à six jours à. 37 C environ. D-après ce temps d'incubation, agiter chaque tube et laisser reposer le contenu soixante minutes pour permettre la sédimentation de débris globulaires. Prélever la partie surnageante (1 à 2 cm du fond) et la transvaser dans un ballon de verre ; le contenu des différents tubes constitue un mélange de l'ensemble (en pratique, 50 à 100 ml). Répartir, stérilement, en flacons par quantité de 2ml et lyophiliser dans un délai de vingt-quatre heures. On aura soin, au cours de cette opération, de traiter les produits dans les meilleurs conditions d'aseptie. On pourra aussi, à l'issue du stade D ci-dessus, vérifier comme il est indiqué plus loin la qualité antigénique du milieu antigène reconstitué. Reconstitution du milieu antigénique Pour reconstituer le milieu contenu dans un flacon on doit lui. ajouter 2 ml d'eau tamponnée à pH 8, environ 60 minutes avant l'emploi. L'antigène ainsi reconstitué devra tre utilisé dans les vingt quatre à quarante huit heures suivant la reconstitution, après quoi son pouvoir antigénique diminue considérablement. Modes d'utilisation de l'antigène à des fins de diagnostic Le demandeur recommande deux modes d'utilisation à des fins de diagnostic cancérologique du milieu antigénique de l'invention : une première dite"méthode au latex"dont le principe est déjà connu dans le domaine des tests immunologiques pour détecter d'autres maladies que le cancer, et une seconde dite "de réaction corpusculaire"qui relève plus particulièrement de la présente invention. -a-la méthode au latex : On répartit dans des tubes à hémolyse et dans l'ordre indiqué successivement : -l'antigène (éventuellement antigène reconstitué) : 0, 05 ml -le sérum à tester dilué au dixième en doses croissant par 0, 05 ml : 3, 4,5,6,7,8 gouttes (doses tableau I) ; on laisse les mélanges ainsi formés quinze minutes au bain-marie à 45 C -la suspension au latex : 0, 50 ml La suspension au latex est composée de la façon : -eau tamponnée à pH S : 18 ml (le tampon Titrisol convenant) -Glycocolle en solution concentrée 2 ml -Suspension de latex : 0, 3 ml (le latex et le Glycocolle fournis par l'Institut Pasteur pour la recherche des facteurs rhumatoides conviennent). Des lectures sont faites après 30,45,60 et 90 minutes de séjour au bain-marie à 45 C (temps de réaction TR du tableau I). On rappelle que si le sérum étudié provient d'un organisme malade ayant développé des anticorps en quantité élevée, l'agglutination est inhibée et n'a pas lieu. Suivant l'importance de l'agglutination, les résultats sont notés : +++ ++ + + ~ Le tableau suivant peut tre utilisé comme référence : TABLEAU I sérum sain sérum de cancéreux X 45 60 90 h. 45 60 90 6 h. doses mn mn mn doses mn mn mn 3 + +++ +++ clair 3--+ trouble 4 +++ clair 4---trouble 5 + + +++ clair 5---trouble 6 clair 6-trouble 7--+ trouble 7---trouble trouble trouble La clarification du milieu est due à la sédimentation des agglutinats. Des doses doubles de sérum et de réactif sont avantageusement utilisées, en particulier pour les lectures au photomètre. On notera cependant que la méthode au latex peut ap- peler les critiques suivantes : les suspensions de latex sont instables et le latex provenant de maisons différentes peut, mme en présence de sérum de sujet sain, ne présenter aucune agglutination. -b-la méthode de réaction corpusculaire Cette méthode, d'une plus grande simplicité que la première, est préférée par le demandeur pour la régularité de ses résultats.~ On répartit dans des tubes à hémolyse : -le sérum à étudier en doses croissantes de 3,4,5,6 gouttes -une solution aqueuse tamponnée à pH 8 à raison de 5 gouttes par tube -le milieu antigénique reconstitué à raison de 2 gouttes par tube (milieu reconstitué avec 2 à 5 ml d'eau pH 8 d'après la valeur antigénique qui sera déterminée pour chaque lot lyophilisé, l'ag glutination devant correspondre approximativement à celle connue pour un sérum sain d'après le tableau II) Les tubes sont placés pendant 30,60 et 90 minutes au bain-marie à 45 C. A partir de 30 minutes, on constate une opacification du tube ayant reçu 3 gouttes de sérum et cette-opacification est nettement plus marquée avec les sérums sains qu'avec les sérums de cancéreux. Puis, au cours du séjour au bain-marie, cette opaci fication gagne les autres tubes de sérums sains. Il s'agit d'une floculation, accompagnée dans les premiers tubes d'un certain degré d'agglutination, facilement observable avec un miroir con cave (ces deux phénomènes ne sont pas forcément coexistants). Après un séjour de 90 minutes au bain-marie, les sérums sains ne laissent plus, en principe, apparaître de trouble résiduel par suite d'une sédimentation des agglutinais, tandis qu'un trouble résiduel sera l'indice d'un sérum de cancéreux. Le tableau suivant peut tre utilisé comme référence : TABLEAUII sérum sain sérum de cancéreux après : après : doses 30 m 60 m 90 m doses 30 m 60 m 90 m 3 + +++ +++ 3-+ + 4 + ++ +++ 4--+ 5-+ + 5--- 6- 6-- Dans les tubes de sérums sains, le sédiment peut tre cent fois plus important que dans les tubes de sérums de cancéreux où il est le plus souvent inexistant par suite d'une lyse. Il s'agit dans ce cas d'une agglutination-lyse par coexistence de ces deux phénomènes. Vérification de la qualité de l'antigène : Pour chaque lot préparé à partir d'un mélange de plu sieurs sangs tel que décrit plus haut, la qualité de l'antigène est vérifiée sur un des flacons avant et après lyophilisation à l'aide d'un sérum sain. La réponse doit tre très proche de celle de la colonne"sérum sain"du tableau II. Cette réponse détermine une dilution plus ou moins grande de l'antigène lyophilisé avec 2 à 5 ml d'eau pH 8. Remarque générale concernant les méthodes a et b citées supra ainsi que la vérification de la qualité de l'antigène : L'examen en vue d'un diagnostic doit tre effectué dans le délai maximal de quatre jours après le prélèvement du sang d'un patient soumis au diagnostic (le sérum du sang étant conservé à 4'C.). Le sérum conservé au congélateur à-20 C est utilisable pendant plusieurs semaines. Dans tous les cas, il est préférable de se servir comme témoin d'un sérum sain ayant la mme date que le sérum suspect. Présentation pratique des moyens de mise en oeuvre du test avec la méthode de la réaction corpusculaire : Il s'agit, selon l'intention du demandeur, de fournir à tout laboratoire d'un service d'hôpital ou à un laboratoire d'analyses usuelles des moyens commodes de pratiquer le test pouvant confirmer ou orienter un examen clinique. Le milieu réactif de l'invention est présenté sous forme lyophilisée dans des flacons de 18 ml contenant chacun la quantité nécessaire pour effectuer plusieurs tests (3 à 7 séries de huit tubes) en l'utilisant dans les deux à trois jours suivant sa reconstitution. Dans le cas de la réaction au latex, une ampoule de 2 ml suffit. La solution tamponnée pH 8 préparée d'avance et accompagnant le réactif est utilisable pendant plusieurs semaines. Le mode d'utilisation est joint à ces produits. Avec la première méthode, le demandeur a pu vérifier que sur 90% des sujets examinés un diagnostic selon la méthode était exact ; avec la seconde méthode, un diagnostic exact est obtenu dans 95% des cas ; ces résultats montrent clairement l'in- tért, compte tenu de la grande facilité de mise en oeuvre, du milieu antigénique de l'invention et de la méthode de mise en oeuvre. REVENDICATIONS 1.-Procédé de préparation d'un milieu antigénique propre à permettre la détection d'une affection de nature cancéreuse d'un organisme, comportant les étapes suivantes : -A-prélever séparément en veino-tube liquide le sang d'un certain nombre de sujets atteints d'affection cancéreuse ; -B-laisser incuber à 22 C pendant au moins deux ; -C-prélever 1 à 2 ml de chaque prélèvement et le porter dans un milieu nutritif additionné d'un facteur de croissance ; laisser incuber quatre à six jours à 37"C environ ; -D-mélanger le contenu de tous les tubes de culture en ne prélevant, après agitation et repos d'une heure, que la partie surnageante à un ou deux cm du fond ; répartir stérilement en flacons le mélange ainsi constitué et lyophiliser. 2.-Procédé selon la revendication 1, caractérisé : -en ce que le nombre de sujets sur lesquels ont été effectués les prélèvements de sang est de trois à cinq. 3.-Procédé selon la revendication Z, caractérisé : -en ce que le dit nombre de sujets est de préférence quatre. 4.-Procédé selon la revendication 1, caractérisé : -en ce que le facteur de croissance est la vitamine B 12. 5.-Procédé selon la revendication 4, caractérisé : -en ce que la vitamine B 12 est additionnée à raison de un à deux y pour 10 ml de milieu nutritif. 6.-Milieu antigénique préparé selon le procédé d'une des revendications 1 à 5. 7.-Milieu selon la revendication 6, caractérisé en outre : -en ce qu'il est présenté à l'utilisateur accompagné d'une quantité suffisante d'eau tamponnée à pH 8 environ, nécessaire pour reconstituer le milieu lyophilisé. 8.-Méthode d'utilisation en vue d'un diagnostic sérologique du cancer, d'un milieu antigénique préparé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée par les étapes suivantes : -reconstitution par mélange du milieu lyophilisé avec de l'eau tamponnée à pH 8 environ. -puis une heure environ après la reconstitution précédente, adjonction d'un sérum à diagnostiquer. 9.-Méthode selon la revendication 8, caractérisée en outre s -en ce que la conclusion d'un diagnostic positif est déduite du fait qu'après un maintien pendant environ 90 minutes à 45 du milieu reconstitué et auquel a été ajouté un sérum à diagnostiquer, l'agglutination est peu importante ou absente et. qu'il persiste un trouble résiduel, ces aspects étant appréciés par comparaison avec un sérum de sujet sain.