FR 2215202 A1 19740823 FR 7301348 A 19730115 La présente invention concerne un vaccin diminuant ou empêchant la carte dentaire des surfaces lisses des dents, un procede de sa preparation, des empoules ou autres récipients son emant des doses unitaires ou multiples de vaccin et un traitement vaccinal. La mise en évidence d'anticorpe et de substances bacté ricides 'ans la salive a stimule l'intérêt sur leurs rapports possible: avec la résistance aux caries chez l'homme. On a signalé diverse: tentative de techniques dtianu- nisation pour diminuer la fréquence et l'inTensité des caries dentaires chez l'animal de laboratoire. En 1972, V. Ross, F. Krasnov et J. Samet (J.D.R. 7337) ont inoculé des la@ins avec de B. acidophilus mort. Les sérume présentaient une agglutination à un degré plus ou moins impor tant La salive des lapins contenait des agglutinines dans 7 cas sur 14, le titre étant bien inférieur à celui observé dans les sérums. Les auteurs indiquaient : "Si les données existantes faisant penser que B. acidophilus cnnstitue un fac- teur étiologique des caries dentaires sont confirmées, les présentes expériences contribueront à la preuve expérimentale favorable aux tentatives de prophylaxie et de traitement par vaccination. En 1932, P. Jay et Coll. (J. Am. D.A. 20,2130) ont pré pare des filtrats de 40 souches orales de B. acidophilus isolées de carie dentaires. On a observe dans le filtrat une substance provoquant des réactions cutanées. Dais deux cas, les reac- tions cutanées négatives étaient associées à des agglutinines de B. acisophilus dans le sérum sanguin après utilisation d'un vaccin polyvalent contre B. acidophilus. En 1933, P. Jay et Coll. déclaration en conclusion d'une série d'expériences: "On peut généralement mettre en évidence des agglutinines -le Bacillus acidophilus dans les rus sanguins des sujets ne présentant pas de caries.Le titre des agglutinines de B. acidophilus dans Les sérums sanguine de certains sajetz receptifs s'élève à la valeur de sujets ne présentant pas de caries, nar administra- tion d'un vaccin contenant la phase R de B. acidophilus Lors qu'on opère ainsi, il se forme généralement un abcès au point d'inoculation". En 1942, J.P. Canby et J. L. Bernier (J. Am. D. A. 29206) ont realisé des etudes du comportement antigénique de 24 souches de Lactobacillus acidophilus de dentine cariée et obtenu des résultate quantitatife de vaccination avec L. acidophilus sur cet organisme dans la bouche. Ils signalaient: "Le comportement antigénique des membres de ce groupe d'organismes présente une complexité déroutante comme le montrent les testes d'agglutination oroisés". Ils ont montré que la vaccination des êtres hiiaains avec des vaccins préparés à partir des souches de L. acidophilus semblait "stimuler la production d'une substance ayant des propriétés d'inhibition de la croissance de L. acide poilus dans la bouche". Ils concluaient lus le petit nombre de cas étudiées ne leur permettait pas de tirer des conclusions des résultats obtenues. En 1943, V. Dietz N,B. williams et W. Lawton (J. Am. D. A. 30 839) ont comparé la force de agglutinines de lactobacilles dans le sang de 15 sujets trèn réceptife aux caries at te 15 sujets non réceptifs aux caries.Aucune diffé- rence n'a pu être mise en évidence.. les titres les plus élevés s'accompagnaient d'un comptage négatif des lactobacilles dans la salive indépendamment des caries Les faibles titres en agglutinines dans les deux groupes ne s'accompagnient pas de façon homogène de numérations salivaires élevées. Ils concluaient "Les titres sanguins élevés de nos résultats semblent indiquer plus particulièrement une faible fréquence des lactobacilles dans la bouche plutat ue constituer un indice de l'existence de caries. En 1944, N. Williams (J.3.R. 23 403) a inoculé des sujets humains avec des organismes de diverses souches de lactobacilles tués par la chaleur ou vivants. La vaccination a augmenté les titres en agglutinine sanguine pour les souches utilisées dans les vaccins, le maximum étant atteint environ 2 semaines après vaccination. Après cette période, les titres s'abaissent et 5 mois après les dernières injections, ils sont voisins des valeurs observées chez les sujets non vaccins. Les comptages salivaires-des lactobacilles pendant une durée de 4 ois ont montré que 15 des 20 sujets (75 %) du groupe immunise présentaient une diminution apparente des comptages salivaires moyens. L'dialyse statistique indiquait que seulement 5 des 20 sujets (25%) pouvaient être considérés comme présentant des diminutions supérieures aux diminutions aléatoires Les comptages moyens den lactobacilles des témoins pré sentaient des changements correspondant aux limites des variations aléatoires. Les résultats semblaient indiquer que l'immunisation conduite dans cette étude n'avait pas d'effet constant sur le nombre des lactobacilles pouvant être cultivés à partir de la cavité orale.Milliams indiquait : "Mous savons si peu de choses sur la famille des'lactobacilles, que les souches des organismes utilisés peuvent ne pas avoir été les souches préférables". En 1960, R. J. Fitzgerald et P. H. Ke.es (Journal of The Aericain Dental Assn. o1,9) ont provoqué des caries chez le hamster par infection orale avec une souche de Streptococcus isolée par raclage de la plaque d'une molaire cariée d'un hamster maintenu à un régime expérimental favorisant les caries. L'isolement d'un micro-organisme spécifique qu'on pouvait rendre responsable du début des caries renforçait les tentatives de lutte contre cette,maladie par vaccination. Cependant, depuis les premiers travaux de Fitzgerald, de nombreux micro-organismes se sont révélés capables de provoquer des caries chez le-s animaux de laboratoires. Parmi ces micro-organisas s figurent entre autres, otrept, Liquefaciens (D 329), trept- Faecalis (ND 547), Strept. sp. FAI et lacto- bacillus Casei (ND 465). Il apparaft que trop peu de chercheurs ont fait la distinction entre l'étiologie des caries des surfaces lisses des dents et les caries des sillons creux et craquelures des dents. le choix de l'animal de laboratoire peut également donner une image fausse des caries ; les contours des molaires des hamsters, par exemple, favorisent le développement de caries des surfaces lisses de la dents tandis que les molaires du rat, avec leur sillon profond, favorisent le développement -de caries des sillons. les caries dentaires constituent ne maladie dont l'étio- logie est complexe et dépend de nombreux facteurs. Pour que la carie se développe, il doit exister un phénomène biologique divergent constitué de trois conditions liées entre elles. Ces conditions sont les suivantes A. la cavité orale doit contenir des micro-organismes gant une activité génératrice de caries ; B. un substrat nutritif approprié favorisant la formation de caries capable de permettre la croissance des organismes générateurs de caries doit Autre prisent dans la cavité orale; et C. la bouche doit comporter des dents qui présentent une résistance non optimale aux caries, par suite soit directement de raisons de composition, de morpholozie ou de position soit indirectement par suite de oaractaristiRues salivaires telles que la composition, le pH, le pouvoir tampon, le débit, la visoosité et la teneur en divers facteurs antibactériens. La génétique joue un r le important relativement à certains de ces facteurs. Des recherches gnotobiotiques ont permis de conclure que les caries ne se développent pas chez les animaux exempts de germe en l'absence totale de bactéries. La complexité de la flore orale fait que plusieurs types d'organismes générateurs de caries peuvent coexister dans la cavité orale. Comme précédemment indiqué, on doit distinguer entre les caries qui se produisent sur les surfaces lisses des dents et les caries qui se développent dans un sillon, un creux ou un défaut de la surface de la dent. Une condition préalable essentielle du développement des caries de la surface lisse d'une dent est la formation d'une plaque dentaire de prépare. la nature adhérente de la plaque maintient les organismes générateurs de carie contenus dans la plaque- en rapport intime avec la surface de la dent.On peut résumer le début du processus de carie par le schéma suivant - [Micro-organismes (X0) + substrat approprié (SA)] Tempe donné (T) qui, par métabolisme, forme un déchet acide qui provoque une augmentation locale de la concentration en ions hydrogène (t) au contact de la surface de l'émail de la dent, c 'est-à-dire la flèche dirigée vers le haut indiquant une augmentation de la concentration en ions hydrogène. La durée nécessaire à l'apparition de la réaction est obtenue de deux façon différentes. Dans les caries de surface lisse, la plaque de précarie msintientle micro-organisme métabolisant au contact de la dent. Dans un creux ou un sillon, ltorganise et le substrat peuvent autre protSgés de l'enlè- vement par la salive par les contours du creux ou du sillon. Donc, la formation d'une plaque de précarie ne constitue pas un élément précurseur indispensable à la formation des caries des sillons. De nombreux organismes observées dans la bouche sont capables de réaliser les réactions correspondant au schéma Donc, théoriquement, l'un quelconque de ces organismes peut amorcer des caries sur des sillons. D'autre part, peu de micro-organismes oraux sont capables de simuler la formation d'une plaque dentaire de précarie. On peut distinquer ces organismes par l'aptitude à produire, a partir du saccharose, par l'intermédiaire de certaines enzymes exocellulaires, des polymères de polysaccharides compleres qu'on connaît en pratique sous le nom de dertranes. Da fraction a pour effet de former une substance gemmeuse adhérente qui, avec les micro-organismes et une grande diversité de com posants étrangers, constitue le conglomérat connu'sous le nom de plaque dentaire. On peut résumer la formation de la plaque dentaire de précarie, de la façon suivante : 1. Certains types d'organismes à pouvoir générateur de caries potentiel sont au repos pendant une durée miniiale au contact de la pellicule organique de la dent. 2. Les organismes commencent à métaboliser certains co:nposants de la pellicule. 3. Si on introduit du saccharose ou s'in est présent au voisinage immédiat des organismes, ils élaborent des enzymes exocellulaires qu'on appelle en pratique des dextrane-sucrases. lez enzymes sont capables de synthétiser des polysaccharides complexes polymères (dextranes) à partir des motifs glucose et fructose les molécule de saccharose. *. lies dextranes réunissent les organismes, le substrat, etc. à la surface de la dent. 5. Les organismes peuvent commencer un métabolisme à l'intérieur de la plaque dentaire Un des buts de l'invention est un vaccin combattant.de façon efficace la carie dentaire des surfaces lisses des dents chez l'homme. L'invention concerne également un vaccin empêchant ou limitant de façon efficace la formation d'une plaque dentaire de précarie sur les surfaces lisses des dents. L'invention concerne étalement un traitement vaccinal qui réduit, minimise ou empêche l'apparition des caries dentaires sur les surfaces lisses des dents. L1invention repose en partie sur l'isolement et la mise en évidance de l'importance d'un Streptococcus oral qui est tou jours pressent dans la plaque dentaire de précarie sur les tr- facos lisses des dents. Ce Streptococcus, qu'on appelle ici Streptococcus SSC, est caractérisé ciiaprès. il convient de moter qu'il existe de nombreuses souches de Streptococcus SSC. Le vaccin selon l'invention contient comme antigène ou comme partie d l'antigène, au moins un des constituants (a) à (d) suivants (a) Streptococcus SSC, (b) une partie queleonque, en particulier les parois cellulaires d'un Streptococeu SSC oral quelconzae, (c) une enzyme relativement brute de type dextranesucrase qu'on peut obtenir à partir des liquides de culture d'un Streptococcus SSC oral quelconque, et (d) une ou plusieurs enzyme de type glucosyltransfé- rase particulièresqu'o;1 peut isoler des liquides de culture d'un Streptococcus SSC oral quelconque. Donc, on peut préparer le vaccin à partir d'un Strepto- coccus SSC oral ou à partir d'une partie d'un tel organisme ou à partir d'enzymes présentes dans les liquides de culture d'un tel organisme. Un traitement par le vaccin stimule la production d'anticorps, si bien que ces anticorps, qui sont contenus par la salive, interfèrent probablement avec l'aptitude de Streptococcus 3JC à devenir ou à demeurer un commensal permanent de la cavité buccale et/ou probablement interfèrent avec l'aptitude de Strepto crocus SSC à produire certaines enzymes extracellulaîres (dextrane-sucrases ou glucosyltransférases particulières). En empê chant ces enzymes de synthétiser des dextranes à partir du saccharose, on réduit, inhibe ou empêche la formation de la plaque dentaire de précarie sur les surfaces lisses des dents. En résumé, le vaccin stimule les anticorps salivaires contre soit Streptococcue SSC, soit les enzymes de type glucosyltransférase produits par Streptococcus SSC. L'isolement et la caractéristique des Streptococcus oraux appelés ici Streptococcus SSC vont maintenant être décrits. -On a réalisé 246 isolements de l'organisme à partir de plaques dentaires de 246 malades présentant de caries actives affectant les surfaces lisses des dents. Caractéristiques en culture. Culture sur gélose Mitis Salivarius (Difco B 298) a) A 37 C sous stmosphère constituée de 95 de d'azote et de 5 , de CO er o4 heures. b) Cn isole 5 o 6 colonies de chaque boîte et on les transfère immédiatement sur un bouillon pour Streptocoques contenant 0,4 % (p/v)de glucose et 0,35 % de (v/v) de Tween 80 (voir Jordan, Fitzgerald et Bowler, J. D. R. 39 116). c) On incube en anaérobie, puis n maintient sur gélose au sang, des cultures pures obtenues par culture alternée sur gélose au sang et gélose Mitis Salivarius. On repique chaque isolement toutes les quatre semaines. Tous les isolements sont constitués de cocci G ram positif immobiles, catalase négatifs, sous forme de chaînes courtes ou mo-ennes dans les cultures en bouillon. Aucun isolement ne produit de gaz dans les milieux glucosés. Variation de la morphologie des colonies. Sur gélose au sang en anaérobiose, 234 isolements forment des cnlnnies blanches circulaires ou irrégulières mesurant de 0,5 à 1,0 mm. Les colonies sont protubérantes ou pulvinées et leurs- surfaces sont Ils ses. Les colonies sont dures et cohérentes et adhèrent à la surface des géloses. 12 isolements (4,8 %) ont une élévation convexe et une forme circulaire. Ils sont mous et glutineux lorsqu'on les touche avec un fil de platine. 223 isolements conservent une morpiiologie de colonie rugueuse sur gélose MItis Salivarius anaérobie. 7 présentent des colonies mucoides et 14 des colonies lisses. Dans les 7 isolements muccidas, le diamètre des colonies est de 1 à 2 mm et les colonies ont l'aspect d'une goutte de gomme. (Voir Chapman G. H. 1944 J. 3act. 48 113). Les colonies sont translucides en lumière réfléchie et transmise Les colonies des 14 isolements à colonie lisse ont des tailles comprises entre 0,5 et 1,5 mm. Elles sont de forme circulaire et convexe à pulvinée et leur surface est lisse et opaque. Tous les isolements (246) produisent des caries chez des hamsters albinos, On obtient en moyenne 240 caries pour 8,9 chez les témoins. Des techniques utilisant des anticorps fluorescents montrent que tous les isolements présentent une relation série logique. Les caractères physiologiques figurent dans le tableau 1: TABLEAU 1 Caractéristiques Nombre Pourcentage d'isolements du total pH final après 48 heures en bouillon au saccharose pH 4,0-4,3 246 100% pH 4,4 O O en bouillon glucosé pH 4,0-4,3 246 100 % pH 4,4 O 0 Réaction dans le lait tournesolé. Réduction avant caillage O O Acide caillé 246 100% Précipité dense dans le saccharose après addition d'une partie de méthanol 246 100 Hydrolyse de l'esculine 220 89 % Réaction sur gélose au sang aérobie + 10 % C02 &alpha; 12 5 % s. 180 73 % Y 36 15% Culture à pH 9,6 0 0 Culture à 100C 0 0 à i 450C 0 0 TABLEAU 1 (suite) Culture dans NaCl à 4 231 93% " " NaCl à 6,5 0 0 Culture sur gélose au sang (10%) 237 96% Culture sur gélose au sang avec 0,04 % de tellurite 0 0 @@cuction du bleu de m thylène 0 0 Formation d'amide à partir de: D(-) Sorbitol 240 97% Lyotose 246 100% Inuline 246 100% D(-)Mannitol 246 100% D(-) Mannose 246 100% Glycérol 0 0 D(+) Xylose 0 0 D(-) Arabinose 0 0 Dulcitol 0 0 Tréhaloze 246 100% On cultive en masse 10 isolement représentatifs de Streptococcus SSC, on les lyophilise et on les utilise dans tous les travaux ultérieurs. Les isolements représentatifs ont appelés Streptococcus SSC MS1 à Streptococcus SSC-MS10. Le micro-organisme appelè ici Streptococcus SSC a des caractéristiques identiques à celles de la souche NGT 10449 de la National Collection of Type Cultures, Londres, Grande- Dretagne. Cette souche if 10449 est décrite comme étant "une souche représentative de Streptococcus mutans isolé par Dr. z. Sims en 1965 à partir de la couche la plus profonde de la dentine carie". Par conséquent, l'appellation 3treptococcus SSC, et ses abréviations otrept. z et J SSC qu'on peut rencontrer ci-après, peuvent être remplacées par "Streptococcus mutans NCTC 10449". On peut préparer le vaccin pour diminuer l'apparition des caries dentaires sur la surface lisse de dents, à partir de Strept. SSC vivant, atténué ou mort ou à partir d'une partie quelconque de cet organisme, en particulier de sa paroi cellulaire. La demanderesse a également découvert qu'on peut préparer le vaccin à partir de l'enzyme présente dans les liquides de culture de Strept. SSU, soit sous forme d'une enzyme de type dextrane-sucrase vivante, soit sous forme d'une ou plusieurs enzymes de type glucosyltransférase distinctes isolées du liquide de culture. Le vaccin peut être un vaccin simple ou monovalent ou peut être un vaccin multivalent produit à partir de a eux isolements de Strept. SSC ou plus. De plus, le vaccin peut être un vaccin complexe-ou mixte dans lequel le composant antigénique peut autre constitué de deux ou plus antigènes choisis parmi (1) un Jtrept. SSC quelconque, (2) une partie d'un Strept. SSC quel contre, (3) une enzyme de type glucosyltransférase particulière, et (4) une enzyme de type dextrane-sucrase brute, les enzymes (3) et (4) étant présentes dans le liquide de culture d'un Strept. SSC ou d'un isolement correspondant. Bien entendu, on peut réaliser le vaccin avec une permutation mathématique ou une combinaison quelconque des antigènes (1), (2), (3) et (4). Le vaccin peut être un vaccin autogène, auquel cas l'antigène du vaccin est un Strept. 3C isolé de la bouche du receveur ou une enzyme de type dextrane-sucrase ou glucosyltransférase obtenue à partir d'un ou plusieurs liquide de cul ture correspondant à un isolement d'un Strept. SSC. Le vaccin peut contenir un adjuvant et de plus ou sinon un conservateur. Bien entendu, tout adjuvant et conservateur utilisé doit convenir en pharmacie et ne doit pas avoir d'effet nuisible sur l'antigène ou tout autre composant du vaccin. Bien entendu, le vaccin ne contient pas nécessairement un adjuvant ou un conservateur. te vaccin peut, en plus de l'antigène, contenir un ou plusieurs autres agents médicinaux ou thérapeutiques à condition que ces agents n'aient pas d'effets nuisibles sur les autres composants ou sur l'action du vaccin. En particulier, le vaccin peut contenir une dose préalablement déterminée ou mesurée d'un anesthésique local tel que la lignocaine. te vaccin peut être sous forme d'une dose unitaire ou d'une dose multiple prête à l'emploi, par exemple sous forme d'une composition liquide dans des ampoules ou des récipients scellés en verre ou similaire. Il est pratique que chaque dose unitaire corresponde à un volume de 1 ml ou 1,5 ml, mais bien entendu ce volume peut être supérieur ou inférieur. L'antigène du vaccin, qu'il soit sous forme de Streptococcus SSC ou sous forme d'une partie de l'organisme ou sous forme d'une ou plusieurs enzymes dérivant des liquides de culture de cet organisme, peut être lyophilisé ou séché d'autre façon et on peut reconstituer le vaccin immédiatement avant l'emploi, par exemple en ajoutant un milieu liquide approprié, tel qu'une solution saline stérile (chlorure de sodium à 0,85 % p/v) ou une solution d'anesthésie locale. Une dose unitaire de vaccin préparée à partir de Strept. SSC vivant, atténué ou mort, peut par exemple contenir 1' équi- valent de 1 x 106 å. 2 xl o12 unités de formation de colonies (u.f.c.), chaque dose unitaire étant de préférence sous forme liquide et ayant en pratique un volume de 1 ml. On a préparé des vaccins contenant des doses aussi faibles que 2 x 106 u.f.c. par ml ou aussi élevées que 2 x 1012 u.f.c. par ml. Bien entendu, la concentration de l'antigène dans le vaccin peut être inférieu re à I x iO6 u.f.c. par ml ou supérieure à 2 x 1012 u.f.c. par ml. De préférence, une dose unitaire de vaccin sous forme liquide contient 2 x 109 u.f.c. + 10 %. Lorsque l'antigène du vaccin est une enzyme relativement brute de type dextrane-sucrase obtenue à partir des liquides surnageants de culture de Strept. SSC, on a préparé des doses unitaires de vaccin contenant de 0,25 mg à 100 mg de dextranesucrase. Il est pratique que ces doses unitaires soient sous forme d'une solution ayant un volume de 1 à 1,5mol. La quantité particulière de dextrane-sucrase dans une dose unitaire varie avec l'activité de la dextrane-sucrase. De façon appropriée, une dose unitaire a une activité (comme défini ci-après) de 500 à 5 000 unités de dextrane-sucrase (UDs). Une dose unitaire appropriée a une activité d'environ 1 000 UDS, par exemple de 900 à 1.100 UDS. Comme précédemment indiqué, le vaccin peut également être constitué d'une ou plusieurs glucosyltransférases purifiées et distinctes isoles des liquides de culture de Strept. SSC et on a préparé des doses unitaires de vaccin contenant de 0,05 mg à 100 mg d'une ou plusieurs glucosyltransférases distinctes. On prépare ces doses sous forme de solutions, la dose unitaire ayant de préférence un volume de 1ml. Ici encore, une dose unitaire de vaccin préparée à partir d'une ou plusieurs glucosyltransférases distinctes a de préférence une activité de 500 à 5 000 UDS. Une dose unitaire pratique a une activité d'environ 1 000 UDS. Une dose unitaire d'un vaccin complexe peut, par exemple, renfermer 2 x 106 u.f.c. à 2 x 1012 u.f.c. de Strept.SSC et de 0,05 mg à 100 mg d'enzyme, qu'il s'agisse de dextrane-sucrase ou d'une glucosyltransférase distincte, obtenues à partir de liquides de culture de Strept. SSC. De façon pratique, les doses individuelles de vaccin (par exemple antigène + adjuvant + conservateur) sont sous forme d'ampoules scellées stériles contenant 1 à 1,5 ml de vaccin. On a préparé des ampoules contenant des quantités aussi faibles que 0,1 ml de vaccin à aussi élevées que 100 mi de vaccin (ampoule multidose) On injecte de préférence la dose de vaccin par voie sous cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. On préfère injecter dans la bouche car on a observé qu'il se produit dans ce cas une formation plus rapide d'anticorps dans la salive que lorsqu'on réalise l'intection en dehors de la bouche.On préfère particulièrement injecter la dose de vaccin, qui est de 1 ml à 1,5 ntl, dans le sillon buccal de la muqueuse orale dans les quatre quadrants de la bouche. De préférence, la quantité de vaccin injectée dans chacun des quatre quadrants est pratiquement la même, c'est-à-dire environ 0,25 ml dans le cas d'une dose de 1 ml. Le type de traitement avec le vaccin peut varier de fa gon importante. En général, on réalise l'injection de 2 à 4 doses - c contenant chacune environ px109 u.c.f. ou environ 100 UDS. Bien entendu, le nombre des doses et la dose totale d'antigène peuvent être plus élevés. L'invention est illustrée par les éxemples suivants donnés à titre illustratif mais nullement lkimitatif. EXEMPLE 1: (a) On cultive la souche de Strept. SSC#MS2 pendant 1824 heures à 370 C dans un bouillon coeur-cervelle. (b) On ensemence 1 ml de la culture de Strept. SSC MS2 à la surface de flacons de Blake contenant une couche mince de bouillon coeur-cervelle auquel on a ajouté 2 % de gélose. On incube les fichons de Blake pendant 24 heures à 370 C et on recueille les cellules dans une solution saline stérile (NaCl à 0,85 yc p/v). (c) Qn lave les cellules 3 fois avec une solution saline stérile (0,85 %) en les centrifugeant et en les remettant en suspension. (d) On met les cellules en suspension dans une solution saline stérile (0,85 %) contenant G,6 % de formaline et on incube pendant une nuit à la temperature ambiante pour tuer les cellules. (e) On lave à nouveau les cellules dans la solution saline stérile et on détermine la stérilité de la suspension mère en ensemençant des portions de 0,1 ml dans 10 tubes de milieu fluide au thioglycolate BBL et en incubant à 37 C pendant 10 jours. (f) On ajoute du merthiolate comme conservateur à la suspension mère stérile à une concentration finale de 1/10 000. Standardisation de l'antigène pour l'immunisation. (g) On soumet l'antigène stérile (produit du stade (f)) à un traitement sonique pendant 5 minutes à l'intensité la plus faible provo usant la rupture des ahanes cellulaires. (h) On dilue alors la suspension mère soumise au traitesent sonique avec une solution saline de merthiolate (c'est-à aire une solution saline stérile à 0,85 % contenant du merthiolate à la concentration de 1/10 OCO) pour obtenir 4 x 10 u.f.c. en utilisant une courbe néphélométrique de McFarland préalablement standardisée avec un colorimètre Klett-Summerson muni d'un filtre de 420 m . (i) On prépare la suspension antigéniques finale pour l'injection an diluant, dans le rapport de 1/1, avec la solution saline de merthiolate pour obtenir uiie suspension finale correspondant à 2 x 109 u.f.c. par ml. Protocole d'immunisation (correspondant à un procédé). On administre la première Injection constitue au total de 0,5 ml (1 x 109 u.f.c.) dans la muqueuse orale en plusieurs sites sous forme de la suspension dans la s-olution saline de merthiolate du stade (i). On administre des doses semblables le 7ème et le 14ème jour, et, le 21ème jour on injecte dans la muqueuse buccale, au total 1 ml (2 x 109 u.f.c.) d'antigène. On administre une injection de rappel (1 ml = 2 x 109 u.f.c.) le 120ème jour. Trois jours après cette injection de rappel, on met en évidence dans la salive une augmentation nette du taux de production des anticorps. EXEMPLE 2 (a) On cultive, comme dans les stades (a) et (b) de l'exemple 1, les cellules de la souche de Streptococcus SSC précédemment appelée MS1 et on les recueille dans de l'eau dis tillée stérile. On lave les cellules trois fois dans l'eau distillée par centrifugation et remise en suspension. (b) On remet les cellules en suspension dans de l'eau distillée contenant 0,6 % de formaline et on incube pendant une nuit pour tuer les cellules. (c) On lave à nouveau les cellules trois fois dans l'eau distillée, on conduit les tests de stérilité comme dans l'exemple 1 (stade e). (d) On ajoute à la solution du merthiolate comme conservateur pour obtenir une concentration finale de 1/10 000. (e) On soumet la suspension mère à un traitement sonique asepUque pendant 10 minutes avec une faible intensité. (f) On dilue la suspension soumise au traitement sonique avec de 1'eau distillée contenant du merthiolate à la concentration de 1/10 000, pour obtenir un équivalent de 2 x 109 u.f.c. par ml, en utilisant une ourbe néphélométrique de McFarland préalablement standardisée avec un colorimètre Klett-Summerson n'uni d'un filtre de 420 m/u. (g) On soumet à nouveau la suspension à un traitement sonique pendant 10 minutes. (n) On chauffe à 45 C au bain-marie 1 l de la suspension mère. On ajoute à la suspension 0,75 % (pXv) de Carbopol 934 (polymère carboxyvinylique) ou de Carbopol 940 ou 941. Après une heure d'a,itation, on ajoute 0,5 % (p/v) de carbonate de sodium à la su3pension.et on poursuit l'agitation pendant 2 heures. (i) On verse la suspension dans des récipients en verre bouchés azurant une capacité de 50 ml au plus et on expose pendant 30 minutes à l'effet de la vapeur saturée dans un autoclave à 115-116 C. (j) On determine la stérilité de chaque portion comme dans l'exemple 1, stade (e). (k) Dans des conditions d'aseptie strictes, on répartit le vaccin dans des récipients pour dose unitaire et pour dose multiple. Protocole d ' immunisation. On administre la première injection, correspondant au totale à 1 ml (2 x 109 u.f.c.) dans plusieurs sites de la muqueuse orale. On administre une seconde injection de la meme dose le 14ème jour. On administre une injection de rappel (même dose) le 60ème jour. Trois jours après cette injection de rappel, on peut mettre en évidence dans la salive une augmentation nette du taux de production des anticorps. EXEMPLE 3 (vaccin autogène): Dans cet exemple, on isole l'organisme, qui est une souche de Streptococcus SSC, chez un malade particulier et on prépare le vaccin à partir de cette souche. On isole l'organisme en culture pure, on le cultive en masse, on le recueille et on le lave soigneusement. On met les organismes en suspension dans une solution saline stérile. On determine le nombre approximatif dbrganismes par ml dans la suspension. On peut utiliser une suspension d'organismes vivants, atténués ou morts .pour fabriquer les vaccins autogènes. On peut préparer une dose quelconque ou une série de doses, constituzes d'un certain nombre d'organismes (exprimé en millions) dans des volumes de 1 ml enréalisant des dilutions appropriées, soit dans une solution saline stérile (à 0,85%), soit dans une solution saline phénolée (0,85 ss de chlorure de sodium + 0,5 % de phénol) à partir de la suspension d'origine. On dilue une portion de la suspension dans la solution saline stérile avec des quantités complémentaires de solution saline stérile (0,85 %) pour obtenir un vaccin renfermant environ 2 x 109 u.f.c. par ml. On dilue l'autre portion avec la solution saline phénolique pour obtenir un vacîin autogène atténué contenant environ 2 x 109 u.f.c. par ml. On peut préparer des vaccins multivalents en utilisant plusieurs Stretococcus SSC isolés. Dans ce cas, on doit obtenir des cultures pures des organismes et préparer des suspensions standardisées séparées. On combine des concentrations appropriées de chacune de ces suspensions dans la préparation finale. EXEMPLE 4 On isole en culture pure deux organismes ou plus cons titrant des souches différente de Streptococcus SSC, on les cultive en masse, on les recueille et on les lave soigneusement. On prépare des suspensions standardisées individuelles des organismes dans une solution saline stérile (d 0,85 ). On réunit les suspensions individuelles en quantités pratiquement égales pour * tenir au total de 1 x 106 à 2 x 1012 u.f.e. par ml, de préférence d'environ 1 z 109 à environ 2 x 109 u.f.c. par ml. On reprend cet exemple en utilisant une solution saline phénolique (0,85 % de chlorure de sodium + 0,5 de phénol) au lieu de la solution saline stérile (0,85 % de chlorure de sodium). EXEMPLE 5: On reprend le mode opératoire de l'exemple 1 jusqu'au stade (i) si ce n'est qu'on utilise la souche de otreptococcus SSC MS3 au lieu de la souche MS2 et qu'on utilise comme conservateur du thiomersal au lieu du merthiolate. On ajoute la suspension antigénique à une suspension aaline d'hydroxyde d'alu minium. Chaque dose finale ne doit pas renfermer plus de 15 mg d'hydroxyde d'aluminium. EXEMPLE 6: On reprend l'exemple 5, si ce n'est qu'on remplace l'hydroxyde italuminium par du phosphate d'aluminium. EXEMPLE 7: On reprend l'exemple 2 jusqu'au stade (g) et on réalise ensuite les stades suivants : (h) On ajoute une solution d'alun de potasse à la suspension mère pour obtenir un précipité. (i) On sépare le précipité et on le lave soigneusement trois fois avec de liteau distillée, puis on le remet en suspen ion dans l'eau distillée. (j) On traite 1 1 de suspension comme dans le stade kh) de l'exemple 2. (k) On stérilise et on remplit des récipients du vaccin, comme dans les stades (i), (j) et (k) de l'exemple 2. Comme précédemment indiqué, les vaccine peuvent renfermer des enzymes de type dextrane-sucrase comme seuls composants antigéniques ou comme composants antigéniques partiels, les enzymes de type dextrane-sucrase utilises dans la préparation des vaccins étant obtenues à partir des liquides surnageants de culture d'une ou plusieurs souches de otreptococcus s On détermine l'activité dextrane-aucrasique en mesurant la libération des sucres réducteurs, selon la méthode de M. Somogyi, 1945, J. Biol. Chem. 160 61. On exprime l'activité dextrane-sucrasique en. unités dextrane-sucrases (UDS), qui est la quantité d'enzyme transformant 1 mg de saccharose en dextrane en I heure, en libérant 0,52 mg de fructose dans des conditions standard (voir H. Soepsell et Tsuchiya 1952, J. Bact. 63 293). On peut obtenir la dextrane-sucrase utilise pour préparer les vaccins contre les carie., à partir des liquides surnageants de culture de Streptococcus SSC, de diverses façons. Cinq procédés appropriés d'obtention des enzymes de type dextrane-sucrase vont maintenant être décrits. Procédé 1 On ajuste à pE 7 avec de l'hydroxyde sodium 401 de milieu aqueux contenant 1 % d'extrait de levure, 0,5 % de phosphate ammoniacal disodique, 0,1 % de phosphate monopotassique, 0,5 , de sulfate de magnésium heptahydraté et 10 % de saccha rose, puis on stérilise à la vapeur sous une pression de 1 bar pendant 30 minutes, près ensemencement avec une culture en croissance active de l'organisme choisi, qui est Streptococcus MS2, on incube à 25 C pendant 17 heures.On refroidit à 00C la culture pic 5,6) et on ajoute lentement en agitant de l'étha- nol (2 160 ul, concentration finale 35 % v/v). On prend soin de maintenir la température à 0-10C pendant cette opération et toutes les opérations suivantes. Après une heure, on recueille un précipité gommeux fonce par centrifugation (2 000 tr/ mn), on le dissout dans 500 ml de tampon citrate 0,1 M à pH 6,0 et on centrifuge á 5 000 tr/mn pendant 30 minutes pour obtenir une solution enzymatique ne contenant pas de cellules. On ajoute 2 500 ml de tampon citrate 0,1 M à pH 6,0, pour obtenir une solution contentant eniron 1,5 unité par ml.On isole la dextrane-sucrase de cette solution en dissolvant dans 200 ml d'eau le précipité obtenu pendant la nuit par addition de 1 1 d'éthanol (concentration finale 25 % v/v). Après clarification par centrifugation à 5 000 tr/mn, on lyophilise la solution surnageante et on la conserve à OCC sous forme d'une poudre brune (4,06 3). Procédé 2 On cultive Streptococcus SSC MS2 dans des flacons de 2 1 sur un milieu saccharose-peptone-sels semblable à celui utilisé par H.J. Koepsell et H.M. Tsuchiya (1952 J. Bact. 63 293) et H.M. Tsuchiya et Coll. (1952 J. Bact 64 521), mais en rempla çant l'infusion de mars par de La peptone (bactopeptone de DiSco Labs. Inc. Detroit, Michigen). En utilisant un inoculum de 5 % provenant d'un lot précédent, on obtient une bonne croissance en environ 16 heures à 250C. Le pH s'abaisse d'une valeur initiale d'environ 7,2 à une valeur finale d'environ 5,5, sans qu'on essaie de maintenir le pH constant par addition d'alcali. La teneur finale en dextrane-sucrase est généralement de 80 à 100 UDS par ml. Lorsque la teneur en enzyme atteint un pic, on arrôte la fermentation en ajoutant une petite quantité de toluène, on ajuste le pH à environ 7,0 avec une solution aqueuse d'hydro- de de sodium pour précipiter les produits étrangers et on élimine les bactéries par centrifugation avec un centrifugeur Servall Angle type SS-1A, ou pour les lots plus importants, par filtration à travers un filtre Sparkler. Après élimination des bactéries, on réajuste le pH de la solution enzymatique à environ 5,0 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium et On précipite l'enzyme en ajoutant 400 g/l de sulfate d'ammonium. On conduit la précipitation dans une pièce froide à 50C. La précipitation par l'éthanol, comme décrit H.M. Tsuchiya en 1935, J.Am.Chem.Soc. 772412 précipite plus de dextrane que la précipitation par le sulfate d'ammonium et, par conséquent, donne une préparation enzymatique moins pure. On centrifuge les préci pités enzymatiques, on lave avec une solution froide (40 % p/v) de sulfate d'ammonium et avec de l'éthanol froid, puis on redissout dans du tampon acétate à pH 5,2. Les préparations enzymatiques ainsi préparées renferment généralement environ 200 UDS/ mg en poids sec. Procédé 3 : On produit l'enzyme en utilisant Streptococcus SSC MISS, selon le procédé de J. Cybuloka et R. Pakula (1963, Exp. Med. Microbiol. 15, 187) et on purifie partiellement par élution sur de l'hydroxyapatite (R. Dedonder et Coll. 1963), Bull. Soc. Chim. Biol. 45,477). Procédé 4 On ajuste,à pH 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium, 140 ml d'un milieu aqueux contenant 1 % d'extrait de levure, 0,.5 fa de phosphate d'ammonium disodique, 0,1 % de phosphate monopotassique, 0,05 ss de sulfate de magnésium heptahydraté, 2 X de saccharose et .70 ffi de maltose, on stérilise à la vapeur sous une pression d'un bar pendant 30 minutes et on réajuste le pH à 7,0 en conditions stériles. Après ensemencement avec l'organisme choisi, qui est Streptococcus SSC S4, on incube à 2500 pendant 30 à 36 heures, jusqu'à ce que le pH de la culture soit de 5,9.On sépare les cellules bactériennes par centrifugation et on ajoute 47 mi d'éthanol (concentration finale 25 % v/v) aux li- quides de culture en maintenant la température à 0 C dans cette opération et les opérations ulterieures. Après une heure, on centrifuge la suspension et on rejette le précipité qui contient 6 % de la dextrane-sucrase présente à l'origine dans la culture, déterminée selon le procédé standard en présence de 100 mg de maltose. On rejette de même, après centrifugation de la suspen- sion obtenue en rajoutant 15 ml d'ethanol (concentration finale 30% v/v), un précipité correspondant à 25 à de l'activité dextrane-sucrasique d'origine. On refroidit le liquide surna ayant à -20 C et on rajoute lentement en agitant 80 ml d'éthanol (concentration finale 50 % v/v). On maintient la suspension à -20 C pendant une heure et on centrifuge à -18 C pendant 20 minutes (2 000 tr/mn). on dissout le précipité dense dans 40 ml de tampon citrate 0,05 M (PH 5,0) et on dialyse pendant 48 heures contre du tampon strate 0,05 M (pH 5,0 ; 2 x 2 litres) à o C dans un tube de dialyse, puis on lave soigneusement avec de l'eau distillée et du tampon citrate-0,05 M (pH 5,00. On lyophilise alors la solution sous forme d'une poudre (0,702 g). procédé 5 On cultive sur bouillon coeur-cervelle, un isolement de Streptococcus SSC MS7, dans un fermenteur de 5 1 à 370C pendant 18 heures. On maintient le pH constant à.6,0 et on utilise une atmosphere à 5% de dioxyde de carbone et 95% d'azote. Au bout de 18 heures, on centrifuge la culture à 10 000 x g pendant 5 minutes à 40 C. oh rejette alors les cellules et on traite le liquide surnageant avec une solution froide de sulfate d'ammonium (53 % v/v). Après 8 heures, on filtre le liquide et le précipité à travers un filtre en verre fritté (D3 : D4) et on rejette le filtrat. on dissout le précipité dans du tampon phosphate 0,005 M (pH 6,0) et on dialyse contre le même tampon. On rejette le liquide surnageant et on traite les dextranesucrases dialysées avec une solution d'acétone à 87 % v/v à -200C. On centrifuge la solution à 20 000 x g pendant 10 minutes à 400 C. On dissout alors le sédiment dans du tampon phosphate 0,001 M (pH 6,0) et on lyophilise. Divers procédés de préparation de vaccin contre les caries utilisant comme composants antigéniques, une enzyme de type dextrane-sucrase obtenue à partir des liquides surnageants de culture d'une 8Ouche isolée de Streptococcus SSC, vont maintenant être décrits. Exemple 8 En utilisant le procédé 4 de préparation de la dextranesucrase, on constate qu'un litre de milieu de culture ensemencé svec Streptococcus --SSC MS6 produit finalement 7,5 g de dextrane sucrase. L'activité de l'enzyme est de 200 UDS/mg. (a) On ajoute 0,5 g de dextrane-sucrase dans 15 récipients contenant 100 il de solution saline stérile à (0,85 %) contenant du merthiolate comme.conservateur à la concentration finale de 1/10 000. (b) On agite le contenu des récipients au bain-marie à 40 C pendant 6 heures dans des conditions strictement aseptiques. (c) On réalise des tests de stérilité comme dans l'exemple 1. (d) On remplit du vaccin, des récipients pour dose unitaire de 1 ml ou des récipients pour dose multiples en conditions aseptigues, Chaque dose finale de vaccin contient 5 mg de dextrane sucrase ayant une activité qui est dans cet exemple d'environ 1 OCO UDS par dose Protocole d'immunisation. On injecte une dose de 1 ml le premier jour et on répète la dose le 14ème jour. On administre une autre dose le 21ème jour et une dose de rappel le 120ème jour. Toutes les injections sont réalisées dans la muqueuse bucale. On met en évidence une augmentation brusque du taux de production des anticorps dans la salive, trois jours après l'injection de rappel, c'est-à-dire le 123ème jour, ExELE 9 On prépare une quantité semblable d'enzyme comme indiqué dans l'exemple 8, mais en utilisant Strept. SSC MS8 au lieu de MS6. (a) On ajoute 0,5 g de dextrane-sucrase dans 15 récipients contenant 100 ml d'eau distillée stérile auxquels on aajouté du merthiolate comme conservateur à la concentration finale de 1/10 000. (b) On agite soigneusement les récipients au bain-marie à 40 C pendant une heure On ajoute à chaque récipient 0,5 % p/v de Carbopol 940 ou de Carbopol 941 ou de Carbopol 934. On poursuit l'agitation pendant encore une heure, (c) A chaque récipient, on ajoute 0,3 % de carbonate de sodium et on poursuit l'agitation pendant encore 2 heures, (d) on conduit alors des tests de stérilité sur le contenu de chaque récipient, comme décrit dans l'exemple 1. (e) On remplit du vaccin, dans des conditions -d'aseptie, strictes, des récipients individuels ou des récipients pour dose multiple, Chaque dose finale de 1 ml de vaccin contient 5 mg de dextrane-sucrase ayant une activité d'envirpn 1 000 UDS par dose. EXEMPLE 10 On reprend l'exemple 8 jusqu'au stade (b), si ce n'est qu'on utilise du thiomersal comme conservateur au lieu de merAio- latte Ensuite (c) A chaque récipient de vaccin, on ajoute une suspension d'hydroxyde d'aluminium dans une solution saline stérile. Chaque dose finale de 1 ml de vaccin ne doit pas contenir plus de 15 mg d'hydroxyde d'aluminium. (d) On conduit des tests de stérilité comme dans l'exemple 1, après quoi, on conditionne le vaccin EXEP"PI.E 11 On reprend l'exemple 10, en utilisant du phosphate d'aluminium au lieu d'hydroxyde d'aluminium. EXER,PIE 12 On prépare un vaccin multivalent mixte. En utilisant Strept. SSC MS2, on reprend les stades -(a) à (g) de l'exemple 1 pour obtenir une suspension mère ayant reçu un traitement sonique, On prépare de la dextrane-sucrase ayant une activité de 200 UDS/mg à partir de Strept. SSC MS6.comme décrit dans l'exemple 8 et on ajoute 0,5 g de dextrane-sucrase dans une série de récipients contenant chacun 100 ml de la suspension mère soumise à un traitement sonique, après quoi, on ajoute du merthiolate à la concentration de 1/10 000. On reprend alors les stades (b), (c) et (d).de l'exemple 8. La formation et l'importance de polysaccharides bactériens extracellulaires dans l'étiologie des caries ont été étudiées en détail par Fitzgerald et Jordan, 1968 "The art science of caries research". Ed. P.S. Harris, Academy Press. New York, et New-brun, 1967, Odontol, Rev, 18 373. L'aptitude à la synthèse de glucanes insolubles est une propriété constante des streptocoques provoquant les caries des surfaces lisses, désignés ici sous le nom de Strept. SSC. Les enzymes responsables de cette synthèse sont classées selon la Commission Internationale des Enzymes comme -étant des glucosyltransférases et atpartiennent au sous-groupe des hexosyltransférases E C 2.4.1.x.L'identification finale de chaque glucosyltransférase permet de connaître la liaison précise synthétisée, Cependant, la réaction générale qu'elles catalysent pet être représente sous la forme suivante Saccharose + (glucane)n --------- (glucane)n, + fructose où un motif glucosyle est transféré sur un glucane polymère en croissance (glucane)n pour former une molécule de polymère en croissance plus grande (glucane)n et une molécule de fructose est libérée pour craque molécule de saccharose utilisée.Un amorceur est inutile au transfert, car la saccharose se comporte apparemment comme un accepteur et un donneur de glucose, Les polysaccharides -sont des constituants importants des plaques dentaires de précarie. De nombreux chercheurs, en particulier Wood, 196?, Arch. Oral. Biol. 12, 1959 ; Gibbons & Keyes, 1969, Arch. Oral. Biol. 14 721, et Gibbons et Fitzgerald, 1969, J. Bact. 98 341, signalent la dextrane-sucrase obtenue à partir des streptocoques oraux et indiquent qu'une enzyme est responsable de la synthèse du dextrane.Cependant, les polysaccharides formés par ces organismes sont hétérogènes du point de vue chimique et morphologique. la demanderesse à découvert qu'on peut isoler plusieurs glucosyltransférases distinctes (au moins 4) des liquides surnageants de culture de streptococcus SSC. les glucosyltransférases diffèrent par leurs points isoélectriques, leur pH optimum, leurs Km constantes de Michaelis etc, ce qui justifie de les considérer comme des enzymes distinctes. On peut utiliser l'une de ces glucosyltransférases distinctes ou leur totalité comme antigène dans la préparation de vaccins contre les caries selon l'invention. On obtient les glucosyltransférases particulières à partir des liquides surnageant. de culture d'isolement de streptoccocus SSC de la façon suivante : On cultive l'organisme choisi dans un fermenteur de laboratoire de 5 litres avec un-régulateur automatique-de pH réglé à 6,0 avec un courant continu de 0,5 1/mn de 95 ffi d'azote et dé 5 % de dioxyde de carbone. On agite à 400 tr/mn pendant les additions d'hydroxyde de sodium 2N. Lorsque la production d'acide a cessé, on recueille le liquide de culture surnageant par centrifugation à 25 000 x g pendant 15 minutes à 4 C. On conduit tous les stades de purification entre 40 et 6 C. On ajoute 2 litres d'eau distillée au liquide de culture surnageant pour abaisser sa force ionique et faciliter l'absorption On ajoute une suspension de 250 ml - 275 ml d'hydroxyapatite et on constate une agglutination de l'hydroxyapatite. On agite le mélange en continu pendant plusieurs heures et on laisse sédimenter la suspension pendant une nuit, puis on sépare le liquide surnageant, On lave le sédiment trois fois avec du tampon phosphate 0,01 M à pH 6,0 pour éliminer les matières non absorbés, On garnit alors une colonne de 2,5 cm de diamètre de l'hydroxyapatite.Lorsqu'on élue la colonne obtenue de façon progressive en utilisant du tampon phosphate 0,2 M et 0,5 M à pH 6,0, on observe l'apparition de l'activité enzymatique sous forme de deux pics suivant le stade d'utilisation du tampon phosphate 0,2 N et un autre pic après le stade d'utilisation du tampon phosphate 0,5 M. La proportion d'activité dextrane-sucrasique récupérée dans l'ensemble de chaque stade est d'environ 15 pour le stade utilisant le tampon 0,2 M et d'environ 18% pour le stande utilisant le tampon 0,5 M. Dans un autre exemple, on utilise un gradient d'élution linéaire (tampon phosphate 0,05 z à pH 6,0 à tampon phosphate 0,4 M à pH 6,8), en observant trois pics enzymatiques séparés. Le premier pic qui est le plus petit apparaît pour une concentration de. phosphate 0,08 M qui coïncide avec la majeure partie des protéines. Le second pic enzymatique apparaît à la concentration de 0,12 M du phosphate. Le troisième pic, qui est le pic principal d'activité, est élué pour la concentration de 0,17 M du phosphate, il correspond à la meilleure purification et représente un rendement d'environ 15 % par rapport à l'activité de départ. Le tableau 2 correspond à un exemple de purification. Par chromatographie sur hydroxyapatite, avec une élution progressive (tampon phosphate 0,2 N et 0,5 M), on obtient deux ensembles qui représentent au total une réduction au 1/10 du volume du filtrat de culture et une récupération d'environ 43 % de l'activité. Par focalisation isoélectrique ultérieure des deux ensembles on obtient jusqu'à 7 pics d'activité glucosyltransférasique. TABLEAU 2 Purification de glucosyltransférases de Streptococcus SSC. Technique Volume Enzyme unités Proteines activés Rendement ml. UDS/ml totales mg/ml spécifique Filtrats de :culture :5100 : 3,0 : 15180 : 18 : 0,17 : 100 % : : Absorbé sur hydroxy apatite 13050 86% chromato graphie sur hydroxyapa tite :éluat 0.2M: 385 :8,5 : 3273 : 1,2 : 7,08 : 21,6 %: (Fr. 33-100): sulfate 0,5M: 223 :14,75 : 3290 : 0,8 : 18,44 21,7 %: :(Fr. 101-140) : ::: : : : : :focalisation :isoélectrique: de l'éluat : : :0,2M :Ensemble : 58 : 5,65 : 58 : 3,1 : 180 : 0,02 : 155 @ 1,2 %: :Ensemble :2Ip 4,2 : 70 : 4,25 : 298 : 0,14 : 30.36 : 2,0% Ensemble 3 : : restant 132 2,6 343 0,15 17,33 2,3% éluat 0,5M ensemble :Ip.6,03, : : : : : :5,85 et : :5,65 : 67 : 6,25 : 419 : 0,02 :312,5 : 2,8% (Fr.25-34) Ensemble 2 Ip 5,4 6 7,25 44 0,10 72,5 0,3% (Fr. 36) Ensemble Ip. 5,0 : 68 : 9,75 : 663 : 0,12 :81,25 : 4,0% (Fr. 39-47) N.B. Fr = fraction (fr 6 ml); Ip = point isoélétrique. Les glucosyltransférases ayant des points isoélectriques de 4,2 ; 4,6 et 5,6 prédominent dans l'ensemble correspondant à la concentration de 0,2 M. Les glucosyltrasférases principales de l'éluat à 0,5 M ont un point isoélectrique de 5,0 à 5,6. Les proportions relatives des glucosyltransférases sont résumées dans le tableau 3 TABLEAU 3 Pourcentage évolué de l'activité totale après Ip de focalisation isoélectrique l'ensemble Eluats 0,2M Eluats 0,5M Eluats combinés 4,2 40 # 16,9 2 # 2,5 21 # 22,4 4,58 17 # 6,7 1 # 2,0 9 # 10,3 5,00 7 # 3,0 60 # 20,7 34 # 32,1 5,4 2 # 5,0 1 # 3,8 5,65 26 # 15,6 25 # 20,5 25 # 17,1 5,8 4 # 1,7 3 # 6,0 4 # 4,4 6,03 4 # 3,2 6 # 9,0 5 # 6,7 Certaines propriétés des glucosyltransférases principales de Strept. SSC MS2 figurent dans le tableau 4. TABLEAU 4 Point Isoélec- pH optimal Constante de Nom de l'enzyme trique Michaelis 4,24 6,0 7,23 X1 5,00 7,0 0,98 X2 5,65 6,0 3,37 X3 6,03 5,0 4,43 X4 On a examiné les produits formés par les glucosyltransférases particulières pour les caractériser plus complètement. Pour cela, on introduit dans des fracticns de chaque pic, du saccharose 0,125 M dans du tampon phosphate à pH 6,8. Chaque fraction forme un polysaccharide insoluble dans l'eau mais on peut mettre en évidence des différences d'aspect des polysaccharides. Après lavage, on détermine la composition en hydrate de carbone des polysaccharides. le glucose est le seul sucre mis en évidence. les autres propriétés des glucosyltransférases nommées X1 h X4 de Strept. SSC MS2, mises en évidence, figurent dans le tableau 5. TABLEAU 5 Enzyme Ip de Aspect du hydrate Nombre de bandes de l'ensemble polysac- de car- l'électrophorèse sur gel charide bone d'acrylamide insolubre consti tutif. bandes bandes enzymatiques protéiques X1 4,24 floconnen glucose 2 7 X2 5,00 trouble glucose 2 2-6 X3 5,65 gélifié glucose 1-2 1-4 X4 6,03 floconnen glucose 2 3 Les glucosyltransferases particulières ainsi isolées de l'éxtrait de dextrane-sucrase relativement brut peuvent être utilisées pour la préparation du vaccin. EXEMPLE 13 on Prépare un vaccin en utilisant comme antigène, la glucosyltransférase précédemment indiquée X3. Cette glucosyltrans- férase 13 a une activité de 20 UDS par mg, On prépare 100 doses de vaccin de la façon suivante (a) On ajoute 0,5 g de l'enzyme 13 à 100 Ml de solution saline stérile à 0,85 % (b) On agite la suspension au bain-marie à 40 C pendant 30 minutes en ajoutant du merthiolate comme conservateur à une concentration de 1/10 000. (c) On teste la stérilité de la solution comme dans l'exemple 1. (d) On introduit le vaccin dans des récipients individuels ou multidoses. EXEMPLE 14 On prépare une des souches de Streptococcus SSC comme dans les stades (a) et (b) de l'exemple 1 et on recueille les cellules dans une solution stérile de chlorure de sodium 0,85 M p/v. On lave les cellules trois fois dans la solution saline stérile en centrifugeant et en mettant en suspens ion. On remet les cellules lavées trois fois en suspension dans la solution saline stérile à 0,85 % et on les soumet à un traitement sonique suffisamment intense pour rompre les parois cellulaires, puis on centrifuge la solution sounise aulraitement sonique de façon à sédimenter et séparer les parois cellulaires.On prépare des doses de vaccin en réalisant, comme dans les exemples précédents, des dilutions appropriées de la fraction de paroi cellulaire dans une solution stérile à 0,85 % de chlorure de sodium et en ajoutant du merthiolate à la suspension à la concentration de 1/10 000. Bien entendu, on pourrait réaliser de nombreux autres exemples de vaccins différents en tenant compte des combinaisons et permutations d'antigène bactérien, d'antigène de paroi cellulaire, d'enzyme antigénique de type dextrane-sucrase et de chacun des quatre types distincts de glucosyltransférase antigéniques. Egalement, on peut incorporerfdans les préparations ou les vaccins un conservateur quelconque convenant en pharmacie à condition qu'il n'ait pas d'effet nuisible sur un quelconque autre compostant. On peut également incorporer dans les préparations, un adjuvant quelconque contrôlé et sans danger. Parmi les conservateurs appropriés figurent le phénol, des esters de l'acide p-hydroxybenzoque, le formaldéhyde, le propylèneglycol, l'acide benzotque et son sel de sodium, l'hexachlorophène, les germicides quaternaires, le thiomersal, le merthiolate et le glycérol. Parmi les adjuvants appropriés figurent les solutions de chlorure de sodium l'alun de potassium, la protamine, le phosphate d'aluminium, l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate de calcium et diverses huiles en mélange ou séparées et des esters synthétiques d'acides gras supérieurs. Bien entendu, les préparations des vaccins peuvent renfermer des composants autres que l'antigène avec ou sans conservateur ou adjuvant. En particulier, les préparations peuvent contenir un anesthésique local tel que la lignocaine, de l'amethocaîne (chlorhydrate de tétracaine,) de l'amylocaine et de la benzocalne On a réalisé des préparations constituées par les vaccins des exemples 1 à 13 avec de la lignocatne comme anesthésique local. On doit conduire tous les stades de préparation des vaccins dans des conditions strictement aseptiques en réalisant des tests réguliers pour mettre en évidence la stérilité du vaccin à tous les stades importants de la fabrication. On trouvera une revue détaillée des tests de stérilité utilisés dans : World Health Org. Tech. Report Serv 1960, 200 et Appendix 44 "Spec. for quality control of pharmaceutical preps". "International Pharmacopoia" pub. W.H.O. Genève 1967. Les doses de vaccin doivent être placées dans des récipients en verre ou en une autre matière qui ne réagisse pas avec les constituants du vaccin Les récipients sont de préférence claire, incolores ou légèrement ambrés. les récipients doivent de préférence être fermés par fusion ou par application d'autres bouchages appropriés. Les récipients multidoses doivent de préférence permettre le prélèvement du contenu sans qu'on retire ou détruise le bouchage. le bouchage des récipients multidoses doit de préférence permettre la pénétration d'une aiguille pointue sans que des fragments de bouchage se détachent lors du prélèvement. très prélèvement, la fermeture doit refermer le récipient en l'isolant des souillures extérieures. Si les récipients pour dose unique comportent des bouchons, ceux-ci doivent être réalisés en un caoutchouc synthétique approprié ou en plastique. Les bouchons doivent résister à l'huile si le vaccin est préparé dans une base huileuse. les anticorps sont des protéines sériques ou salivaires spécialisées, les immunoglobulines, r'immunoglobuline Igi est secrétée de façon préférentielle dans la salive. L'IRA sécrétée diffère de l'IgA sérique en ce qu'elle comporte un composant extraprotéique. Les immunoglobulines sont produites dans les tissus lymphotdes de l'organisme. te mécanisme de formation des anticorps est encore incertain. Selon la nature de l'antigène, on peut mettre en évidence un anticorps dans le sérum ou la salive plusieurs jours après la première injection d'une dose minimale d'antigène. Le titre de l'anticorps s'élève ensuite progressivement jusqu'à un pic faible, diminue lentement et finalement disparait.Si on administre une seconde injection de l'antigène, alors que les anticorps du premier stimulus sont encore présents, on observe une faible chute du titre, suivie d'une élévation rapide à un pic bien plus élevé que celui obtenu par une seule injection. Après le second stimulus, les anticorps disparaissent encore plus lentement qu'après le premier. L'élévation rapide du titre de l'anticorps après une telle injection de rappel indique sans doute que les cellules produisant l'anticorps ont été activées par le premier contact avec l'antigène et peuvent donc répondre de façon plus efficace et plus rapide lorsqu'elles rencontrent l'antigène pour la seconde fois. Une des caractéristiques qui détermine l'efficacité d'un antigène comme stimulus de la production d'anticorps est sa vitesse d'absorption et d'élimination du point d'administration. En général, la réponse par formation d'anticorps est bien plus importante et bien plus soutenue si l'antigène est absrobé lentement à partir du site d'injection. Pour cette raison, on utilise des adjuvants dans les préparations immunisantes pour retarder l'absorption. Dans le cas d'un vaccin contre les caries selon l'invention, les observations cliniques montrent que l'utilisation de solution anesthésique locale comme véhicule de l'antigène, retarde l'absorption des antigènes lorsqu'on les injecte dans la muqueuse orale. On a conduit une série d'expériences concernant le vaccin, et certaines vont être résumées ci-après. EXPERIENCES - Ces expériencea correspondent à un essai clinique de trois ans du vaccin contre les caries. la population choisie pour l'étude est constituée d'enfants âgés de 5 ans à5 ans au début de l'expérience0 On utilise au total 120 enfants, 60 formant le groupe témoin et 60 recevant le vaccin. Au départ, on choisit pour chaque groupe, 72 enfants, pour tenir compte des pertes de toute nature et le tableau 6 montre le nombre d'enfants examinés chaque année dans les deux groupes. TABT]EAU 6 Nombre d'enfants étudiés chaque ennée Au dé- 2ème 3ème Présents à tous les part. année année examens Etude : 72 : 64 : 60 : 60 Témoins : 72 : 68 : 60 : 60 Au début de l'essai, tous les participants ont reçu des instructions concernant l'hygiène orale. - Ces instructions ont été confirmées par des rappels réguliers de l'importance d'une hygiène orale correcte. On a réalisé des examens cliniques et radiographiques à 6 mois d'intervalle environ. On a maintenu des conditions d'examen standardisées pendant la période de l'essai. On a déterminé les caries dentaires selon les standards établis par D. Jackson (1950, British Dental Journal, 88 207) et par G. Slack et Coll. (1958, British Dental Jouranl, 104 399). On a classé la propreté orale selon les valeurs : bonne, faible ou médiocre en fonction de la quantité de débris sur les dents antérieures, On a réalisé des radiographies des premières molaires de tous les sujets immédiatement après examen clinique. On a lu les radiographies dans des conditions standards, indépendamment des indications cliniques. On a déterminé les cavités approximatives des premières molaires à partir des radiographies en les notant de la façon suivante Y1 ' cavité-limitée à l'émail y2 = cavité impliquant l'émail et la dentine Y3 = cavité impliquant l'émail, la dentine et la pulpe, Tous les types de cavité radiologique ont été additionnés. Chaque membre du groupe d'essai a reçu une première injec tion le 13 mai 1969, une seconde injection de rappel le 13 juin 1969, une troisième injection le 22 juin 1??0, une quatrième injection le 14 juillet 1971 et une cinquième injection le 7 juillet 1972. On a réalisé les examens cliniques et radiographiques à ces cinq dates et également aux dates intermédiaires du 13 Novembre 1969, 12 janvier 1971 et 3 janvier 1972. Chaque dose était de 1 ml et répartie de façon approximativement égale en 0,25 ml dans quatre points de la muqueuse orale, comme précédemment indiqué dans l'expérience E. La composition du vaccin pour 1 ml était la suivante Antigène de type dextrane-sucrase 0,025 g Lignocaine, HCl. B.P. 0,01 g Epinéphrine U.S.P, 0,000005 g Métabisulfite de sodium B,P. 0,001 g Chorure de sodium B.P. 0,006 g p-hydroxybenzoate de méthyle B.P. 0,001 g Hydroxyde de sodium B.P. et phosphate disodique q 8 p. pH 6,9 Eau injectable q.s.p. 1,0 ml La dextrane-sucrase utilisée dans le vaccin était obtenue comme décrit dans l'exemple 8 (procédé 4). Chaque dose de 1 ml de vaccin, c'est-à-dire chaque injection correspondait à environ 1 000 unités UDS. On a déterminé l'augmentation progressive des caries de chaque sujet présent aux examens pendant la durée de 3 ans. On a noté toutes les dents et surfaces présentes et ne présentant pas de caries au premier examen et qui ont été ensuite cariées, obturées ou extraites. Les dents présentes au départ et les dents apparues pendant l'étude ont été analysées séparément. On a comparé le groupe d'essai et le groupe témoin en ce qui concerne (a) L'âge, (b) Les dents exemptes de carie (c) Les dents permanentes existantes. (d) Les dents cariées et obturées. (e) Les dents cariées, manquantes, obturées, (f) Les surfaces cariées, obturées. (g) Les surfaces cariées, manquantes, obturées. Les résultats de ce travail expérimental présentés ici ne concernent que l'attaque progressive des types de dents indi viduels. On a déterminé l'analyse de l'attaque progressive de quatre urfaces lisses des premières molaires permanentes ainsi que l'attaque progressive sur les creux et les sillons des premières molaires permanentes. Enfin, on a étudié l'attaque progressive des surfaces médianes distales et buccales des incisives centrales supérieures définitives. li. quatre surfaces lisses des prenières molaires permanentes, c'est-à-dire les surfaces médianes, distales, linguales et buccales des premières molaires. Pendant la période de l'essai, les quatre premières molaires permanentes étaient présentes ou ont apparu dans la bouche du chacun des sujets. Le groupe d'essai est constitué de 60 sujets et le groupe témoin de 60 sujets. Surfaces totales du groupe témoin : 60 x 4 x 4 a 960. Surfaces totales du groupe d'essai : 60 x 4 x 4 = 960. B. Surfaces buccales, distales et médianes des incisives centrales supérieures. Pendant la période de l'essai, les deux incisives supérieures définitives étaient présentes ou ont apparu dans la bouche d-e chaque sujet. Le groupe d'essai et le groupe témoin- sont constitués chacun de 60 sujets. Surfaces totales du groupe témoin : 60 x 2 x 3 = 360 Surfaces totales du groupe d'essai : 60 x 2 x 3 n 360 C. Creux et sillons de chaque première molaire définitive. Chaque sujet possédait quatre molaires permanentes et on a considéré, dans cette étude, la surface d'emboitement. Donc, surfaces totales du groupe témoin : 60 x 4 z 1 n 240 surfaces totales du groupe d'essai : 60 x 4 x 1 - 246 Etude A Dans le groupe témoin, 960 surfaces lisses étaient à l'étude et, à la fi de l'essai de 3 ans, 130 surfaces étaient cariées. Donc (130 x 100)/960 soit 13,54 % de toutes-les surfaces étudiées étaient cariés. Dans le groupe d'essai 960 surfaces lisses étaient étudiées et, à la fin de l'essai de 3 ans, 8 surfaces étaient cariées. Donc, (8x100)/960 soit 0,38 /c de toutes les surfaces étudiées était cariés. onc, si l'on compare le groupe d'essai et le groupe témoin, la diminution des caries est d'environ93 %. Etude B Dans le groupe témoin, 360 surfaces étaient étudiées, et, à la fin de la troisième année d'essai, 30 surfaces étaient cariées. Donc, (30 x 100)/360 soit 8,3 % de toutes les surfaces étudiées étaient cariées. Dans le groupe d'essai, 360 surfaces étaient étudiées et, à la fin des trois années d'essai, 2 surfaces étaient cariées. Donc, (2 x 100)/360 soit 0,55 C0 de toutes les surfaces étudiées était carié. Ceci correspond à une diminution d'environ 93 % des surfaces cariées par rapport au groupe témoin. Etude C Dans le groupe témoin, 240 surfaces étaient étudiées et, à la fin des trois années d'essai, 87 surfaces étaient cariées. Donc, (87 x 100)/240 soit 36,2 ak de toutes les surfaces étudiées étaient cariés. Dans le groupe d'essai, 240 surfaces étaient étudiées, à la fin des trois années d'essai, 16 surfaces étaient cariées. Donc (16 x 100)/240 soit 6,6 % des surfaces étudiées étaient cariés, ce qui correspond à une diminution d'environ 82 % par rapport au groupe témoin. Donc, pour les dents indiquées des 60 sujets du groupe témoin, 247 cavités ont apparu pendant la période de 3 ans, 130 cavités étant situées dans l'une ou l'autre des quatre surfaces. lisses des premières molaires permanentes, 30 cavités étant sur la surface médiane, distale ou buccale des incisives centrales supérieures définitives et 87 cavités étant sur les creux et sillons des premières molaires définitives. Ceci correspond à 4,11 cavités par sujet. Pour les dents correspondantes des 60-sujets constituant le groupe vacciné, au total 26 cavités ont apparu pendant la période d'essai de 3 ans, soit en moyenne 0,43 cavité par sujet. Dans le groupe témoin, au total 1260 surfaces étaient étudiées pendant les 3 années d'expérience. Dans le groupe d'essai, 1560 surfaces autotal étaient étu- diées pendant les 3 années, et 26 cavités se sont développées pendant cette durée. Les 26 surfaces cariées constituaient 1,6 % des 1560 surfaces étudiées au total. la diminution totale du nombre des cavités apparaissant dans le groupe d'essai par rapport au groupe témoin est d'environ 89,8 yO. Par suite du risque de choc anaphylactique, on ne doit jamais administrer des antigènes avant d'avoir établi que le sujet n'y est pas hypersensible. On a donc conduit des essais d'hypersensibilité avant d'administrer en clinique une dose de vaccin à un sujet humain. On a étudié au total sur 200 personnes environ l'hypersensibilité immédiate ou retardée. On n'a observé de réaction dans aucun cas. Dans chacun des cas, on utilisait un test cutané et un test conjonctival. REVENDT CATI ONS 1 - Vaccin caractérisé en ce que son antigène est choisi parmi le groupe constitué par (1) un streptococcus SSC oral quelconque, (2) une partie quelconque d'un streptococcus SSC oral quelconque (3) une enzyme de type dextrane-sucrase obtenue à partir du liquide de culture d'un streptococcus SSC oral quelconque et (4) une enzyme de type glucosyltransférase particulière isolée d'un liquide de culture d'un streptoccocus SSC oral quelconque. 2 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme au moins un constituant choisi parmi les adjuvants et les conservateurs. 3 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme un antigène d'au moins deux des groupes (1), (2) (3) et (4). 4 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène appartient au groupe (2) et est constitué par les parois cellulaires du streptococcus SSC. 5 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène est au moins un constituant du groupe (4) 6 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène est l'enzyme de type dextrane-sucrase (3). 7 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé er ce qu'il renferme en plus de l'antigène, un agent médicinal ou thérapeutique. 8 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme un agent anesthésique local. 9 - Vaccin suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent anesthésique est un agent utilisé en art dentaire. 10 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous forme d'un vaccin Isultivalent renfermant des antigènes dérivant d'au moins deux isolements de streptococcus SSC. 11 - Vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène est un streptococcus SSC vivant, atténué ou mort et en ce que la dose unitaire de vaccin renferme environ 1 x 106 à 2 x 1012 unités de formation de colonie. 12 - Vaccin suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la dose unitaire renferme environ 2 x 109 + 10 % d'unités de formation de colonie. 13 - Vaccin suivant la revendication ,2, caractérisé en ce que la dose unitaire de vaccin a un volume d'environ 0,75 ml à environ 1,5 mi. 14 - vaccin suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène est constitué d'au moins un composant choisi parmi les groupes (3) et (4) et en ce que la dose unitaire de vaccin a une activité dextrane-sucrasique d'environ 500 à environ 5 000 unités. 15 - Vaccin suivant la revendication 14, caractérisé en ce que la dose unitaire de vaccin a une activité dextrane-sucrasique d'environ 900 à environ 1 100unités. 16 - Vaccin suivant la revendication 9, caractérisé en ce eue l'agent anesthésique et de la linocaine, 17 - Vaccin utile pour réduire la fréquence des caries dentaires sur les surfaces lisses des dents, caractérisé en ce qu'il renferme comme antigène actif, au moins un constituant chisi parmi le groupe composé par (1) Streptococcus mutans (NCTC 10449), (2) les parois cellulaires de Streptococcus mutans (NCTC 10449) et (3) une enzyme obtenue à partir des liquides de culture de streptococcus mutans (r.CTC 10449) et capable de produire un polysaccharide à partir du saccharose. 18 - Ensemble formant récipient, caractérisé en ce que le récipient est constitué d'une seringue à usage unique, en ce qu'il renferme plusieurs doses de vaccin et qu'il est fermé par une membrane pouvant tre-perforée avec une aiguille hypodermique et qui se referme d'elle-même lorsqu'on retire l'aiguille. 19 - Procédé de préparation d'un vaccin efficace pour inhiber les caries dentaires sur les surfaces lisses des dents, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un streptoccocus SSG oral, à séparer l'enzyme de type dextrane-sucrase ou une enzyme de type glucosyltransférase particulière des liquides de culture, à diluer l'enzyme de telle sorte que la dose-unitaire de vaccin ait une activité dextrane-sucrasique de 50 à environ 5 000 unités. 20 - Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que la dilution est telle que l'activité dextrane-sucrasique de la dose unitaire de vaccin soit comprise entre environ 900 et envrion 1 100 unités 21 - Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on incorpore au vaccin au moins un composant choisi parmi les adjuvants et les conservateurs. 22 - Procédé de préparation d'un vaccin efficace pour inhiber la carie dentaire des surfaces lisses des dents, caractérisé en ce qu'il consiste à diluer un streptococcus SSC vivant, atténué ou mort avec un milieu liquide, de façon qu'une dose unitaire de vaccin renferme environ 2 x 106 à environ 2 x 1012 unités de formation de colonie. 23 - Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce que la dilution est telle que la dose unitaire de vaccin renferme environ 2 x 109 # 10% unités de formation de colonie.