FR 2234368 A1 19750117 FR 7421574 A 19740621 La présente invention concerne des procédés de coloration et de numération des micro-organismes, et en particulier un procédé d'évaluation de l'importance de la contamination microbienne des aliments ou des matieres premieres utilisées pour la production des aliments. Cependant, le domaine d'application de l'in vention n'est pas limité aux aliments et elle s'applique a tous les cas ou il est nécessaire de dénombrer des micro-organismes par exemple dans les industries de la fermentation, la fabrication des levures, les analyses medicales et la fabrication de produits pharmaceutiques. Le procédé classique utilisé pour déterminer le nombre des micro-organismes dans un produit nécessite l'isolement des micro-organismes du produit et leur culture sur un milieu de culture placé dans une boîte. La numeration des micro-organis mes, selon cette technique de comptage des colonies, est longue et, dans les conditions ordinaires, elle nécessite environ deux jours d'incubation selon la nature et le nombre des micro-organismes à etudier, mais il n'est pas rare que l'incubation nécessite une semaine ou plus. Lorsque l'incubation est achevée, on détermine visuellement le nombre des colonies des micro-organismes sur les boites. Cette technique de comptage des colonies est par nature imprécise, les erreurs étant dues au fait que l'on ne peut recueillir tous les micro-organismes de la matiere examinée-.Certains micro-organismes sont tués pendant la prépara tonde l'échantillon avant son application au milieu de culture, et également les conditions de culture lors de l'incubation, peuvent ne pas convenir a tous les types des micro-organismes de l'échantillon. Donc, certains types peuvent ne pas former de colonies et ne sont pas évalués par cette technique. De plus, on sait qu'une colonie unique peut provenir du développement de plusieurs micro-organismes. L'inconvenient principal de la technique de comptage des colonies est le temps nécessaire à l'obtention d'un résultat. Souvent, en particulier dans le cas des aliments, la matiere étudiée s'altère pendant le temps ou on la conserve en attendant le résultat. Il convient de noter qu'il est très contraire a l'économie de conserver des quantites importantés d'aliments, souvent dans des magasins réfrigérés coûteux, pendant des durees prolongees, en attendant le résultat de la détermination de la contamination microbienne par le laboratoire. Ce stockage est particulièrement coûteux si l'examen montre finalement que la matière ne convient pas. Une autre technique couramment utilisée en technologie alimentaire consiste à colorer une préparation de l'aliment disposée sur une lame de verre en utili sant un colorant tel que le bleu de méthylène, puis a examiner au microscope le frottis coloré. L'inconvcnient de cette methode est que l'aliment lui-même se colore en formant un fond colore sur lequel il est difficile de mettre en evidence les micro-organismes. Ce procédé présente une certaine valeur pour mesurer de façon grossière la contamination d'échantillons fortement souillés par des microbes. Pour des contanlinations faibles, ce test est imprecis. On connaît, en analyse médicale, une technique qualitative de diagnostic par immuno-fluorescence (F.A.T.). Dans cette technique, on combine chimiquement un fluorochrome à l'antisérum d'un groupe détermine de micro-organismes. On mélange l'antiserum marqué au fluorochrome avec un extrait de la matière étudiée et il se produit uneréaction provoquant la fluorescence du groupe particulier de micro-organismes lorsqu'on l'éclaire. Bien que cette technique soit utile pour identifier des groupes déterminé de micro-organismes, elle est trop spécifique pour l'évaluation de la teneur microbienne générale d'un produit. Lorsque les techniques utilisent un film humide, les micro-organismes se déplacent en rendant le comptage difficile. De plus, lorsqu'on examine un film humide au microscope, des problèmes de profondeur de foyer peuvent rendre le comptage difficile. il n'existe que peu de techniques microscopiques permettant de distinguer les micro-organismes viables et non viables de façon efficace. Un autre inconvénient des procédés de numération des micro-organismes par comptage des colonies est qu'ils ne permettent que le comptage des cellules viables et qu'il n'existe pas de procéde pratique connu permettant de différencier les micro-organismes viables des micro-organismes non viables. L'invention a pour but de supprimer ou de réduire les inconvénients précites. L'invention a pour objet un procédé de coloration des micro-organismes consistant a traiter chimiquement une préparation renfermant des micro-organismes pour modifier les sites récepteurs de colorant des micro-organismes et à colorer par un colorant la préparation traitée. On peut effectuer la modification des sites récepteurs du colorant selon un ou plusieurs des traitements chimiques suivants de l'échantillon (1) méthylation; (2) estérification; (3) hydrolyse; (4) oxydation, et (5) traitement par le dioxyde de soufre. On peut effectuer les traitements (1) et (2) ci-dessus en traitant l'echan- tillon sur la plaque support avec une solution éthérée de diazométhane ou avec un ester sulfurique, de préférence dans des conditions contrôlées de durée, de température et de piCI, Cn peut effectuer les traitements (3) et (4) ci-dessus en traitant l'échantillon sur la plaque support par un acide tel que l'acide chlorhydrique, perchlorique, periodique, sulfurique ou nitrique ou avec un agent oxydant.De préférence, on regle les conditions de durée, de température et de pH du trai tement On peut effectuer le traitement (5) en exposant l'échantillon sur la plaque support à l'action d'une solution de dioxyde de soufre ou d'un de ses sels capables de libérer du dioxyde de soufre ou d'une solution de chlorure de thionyle. On utilise de préférence des conditions contrôlées de durée, de temperature et de pH du traitement. Entre les stades du procédé, on peut laver l'échantillon sur la plaque par de l'eau ou une solution tampon, de préférence dans des conditions contro lées de durée, de température et de pH. On peut réaliser la préparation en appliquant un echantillon liquide à la plaque support telle qu'une lame pour microscopie, une pellicule plastique ou une plaque ou une bande opaque. Pour effectuer la numeration des micro-organismes, on applique un volume connu d'échantillon à une surface connue de la plaque support. Apres application de l'échantillon à la plaque, on laisse le liquide s'évaporer à la température ambiante ou à température élevée. En pratique, on applique un volume unitaire d'échantillon liquide sur une plaque support et on laisse le liquide s'évaporer soit naturellement, soit en chauffant. On peut ensuite fixer les cellules des micro-organismes sur la lame en la chauffant ou en la plongeant dans un solvant tel que T'alcool, l'acétone, une solution d'acétone et d'alcool, une solution d'alcool et d'acide acétique et du formaldéhyde, puis en séchant la preparation fixée. De préférence, bien que cela ne soit pas indispensable, le colorant est un fluorochrome, des exemples de colorants appropries etant la lissamine-rhodamine B, l'orangé d'acridine, la primuline, le bleu de méthylène-, l'acriflavine, l'éosine Y, l'auramine, la rhodamine B, la rhodamine 3G, la fluorescéine et la thionine. On peut effectuer la coloration simplement en plongeant la plaque portant l'échantillon dans une ou plusieurs solutions d'un ou plusieurs colorants, en retirant la plaque, en la lavant pour éliminer l'excès de solution de-colorant et en séchant la plaque dans l'air ou en la chauffant. On peut effectuer la coloration dans des conditions contrôlées de duree, de température, de pH et d'éclairement On examine la préparation colorée au microscope pour compter ou étudier les micro-organismes. En choisissant de façon appropriée les divers stades et le fluorochrome, on peut obtenir une préparation colorée dans laquelle les micro-organismes viables et les micro-organismes non viables presentent une fluorescence à des longueurs d'onde différentes, ce qui permet, non seulement de compter les cellules vivantes, (comme dans le cas de la technique classique de comptage des colonies), mais également les cellules non viables. Le comptage des cellules non viables est important, car il indique les antécédents microbiologiques de l'échantillon. Par exemple dans le cas où un fabricant a stérilisé un aliment souille, le comptage classique des colonies montre l'absence de micro-organismes viables. Le procedé de l'invention révèle qu'à un moment donné, l'aliment a contenu de nombreux micro-organismes. Pour-compter les micro-organismes de l'échantillon, on peut explorer visuellement au microscope la zone de la préparation colorée de haut en bas et de gauche à droite. Sinon, on peut compter les micro-organismes en utilisant un système d'analyse d'image comportant un détecteur photomultiplicateur fournissant une lecture digitale des unités tels que les micro-organismes présentant une fluorescence-pour une longueur d'onde donnée. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit d'un exemple non limitatif, illustrant un mode de réalisation de l'invention. EXEMPLE 1. a) on grave une zone de 10 mm de côté sur des lames de verre (76 x 25 mm x 0,8-1,0 mm). b) sinon la zone d'application gravée peut mesurer 40 mm x 2,5 mm. 2. On plonge les lames pendant une nuit dans une solution fraîche à 2% de détergent RBS 25. En utilisant des gants de caoutchouc, on brosse doucement les lames dans la so-lution puis on les rince soigneusement dans l'eau frcide, puis dans l'eau chaude. On sèche les lames dans une étuve chaude sur des égouttoirs pendant 10 à 15 mn. On doit manipuler les lames avec précaution sans que les doigts viennent au contact de la zone gravée. 3. a) on excise aseptiquement des morceaux de viande pesant 10 g dans un morceau plus gros, on les ensemence avec des micro-organismes et on les -agite pendant deux minutes a la main, dans un volume total de solution de Ringer de 100 ml; b) on introduit 10 microlitres de 1 '-échantillon bien mélangé au centre de la zone gravee et on l'étale soigneusement en utilisant un fil fin recti ligne, de façon à recouvrir complètement la zone gravée; c) on laisse sécher la préparation pendant 15 minutes à 200C; d) on fixe dans l'alcool éthylique à 96% pendant 10 mn à 20 C; e) on égoutte et on laisse secher pendant 10 minutes à 20 C; f) on colore avec de l'acriflavine à 0,01% dans du tampon phosphate M/15 à pH 7,2 pendant 10 minutes à 200C;; g) on rince doucement à l'eau courante pendant 15 secondes; h) on egoutte et on laisse sécher pendant 10 minutes à 20 C. 4. On examine la préparation avec un microscope Orthoplan Leitz en utilisant un objectif spécial en fluorite X40/0,85 conyenant à des étalements fluores cents non recouverts, avec un grossissement total de 500 X. On utilise comme source lumineuse une lampe haute pression à vapeur de mercure HB 200 en effectuant l'éclairage incident avec une unité Ploem avec des filtres d'excitation BG12 3 mm et BG 38. On utilise le miroir Ploem n 3 avec le filtre d'arrét K530. On doit effectuer la coloration dans une pièce faiblement éclairée. Si la lame n'est pas destinee à être examinee immédiatement et doit être examinée ultérieurement, on doit la conserver à l'obscurité. La lumière solaire ou artificielle peut provoquer un affaiblissement de la reaction de la preparation. Les cellules viables de l'échantillon présentent une fluorescence orange, tandis que les cellules non viables sont vertes. On compte les cellules visuellement en utilisant la technique d'exploration suivante Selon le nombre des bactéries présentes dans l'échantillon, le nombre des champs a examiner est generalement compris entre 16 et 40. Les raisons du choix de cette gamme du nombre des champs sont expliques ci-après.Un passe d'un champ à l'autre sans regarder pour que le choix des champs se fasse au hasard. On peut calculer le nombre moyen d'organismes par champ en connaissant le nombre total de bactéries comptees et le nombre de champs observés. On mul tiplie cette valeur par 982 pour obtenir le nombre total de bactéries dans 10 uQ. On détermine le degre de précision de chaque calcul en utilisant les "Tables of Schedules of Precision" de Cassel. Des exemples de résultats figurent dans les tableaux ci-apres ainsi que les résultats obtenus pour le même échantillon par comptage des colonies. Les tableaux 1 à 4 montrent les résultats obtenus par comptage des colonies et comptage microscopique (cellules à fluorescence orange) d'échantillons de viande ensemencés par diverses souches expérimentales. La colonne A indique le comptage moyen des colonies par gramme et la colonne B la déviation standard de cette valeur. La colonne C montre le nombre calcule de micro-organismes viables obtenu selon la technique de l'invention et la colonne D indique l'intervalle de confiance pour le coefficient de confiance de 90% correspondant à cette valeur. La colonne E indique le nombre de micro-organismes comptés et le nombre de champs examinés. La répétition des comptages des plaques montre une distribution normale des micro-organismes dans les champs microscopiques correspondant à la formule de Poisson et qu'on peut identifier de façon approximative à la distribution normale lorsqu'on compte plus de 15 micro-organismes. L'intervalle de confiance (colonne D) permet de prévoir avec une probabilité de 90% les limites des valeurs "vraies" des micro-organismes par gramme à partir de la valeur observee (colonne C). On voit que plus le nombre de micro-organismes comptés est élevé, plus la valeur de l'intervalle de confiance pour un coefficient de confiance de 90% est faible, et plus la précision de la technique est grande. La reproductibilité du procede de l'invention ressort de l'examen de l'expérience 1 du tableau 1, des experiences 1, 2 et 3 du tableau 2, des expériences 1 et 4 du tableau 3 et de 1expérience 1 du tableau 4, où l'on compte deux préparations ou plus pour chaque échantillon. La méthode de comptage des colonies semble donner une variation plus faible, exprimée par la déviation standard, que le procédé de l'invention. Cependant, la déviation standard et l'intervalle de confiance pour le coefficient de confiance de 90% ne sont pas comparables. il convient de noter que la précision du comptage des plaques a eté accrue artificiellement par l'utilisation de 5 répétitions, ce qui n, existe pas dans les opérations de routine du controle de la qualité. Beaucoup d'échantillons presentent une corrélation étroite entre le comptage moyen des colonies et la numération selon la technique de l'invention, la numération étant toujours comprise entre les valeurs correspondantes du comptage des colonies +la déviation standard. De façon générale, la numération selon l'invention est supérieure au comptage des colonies correspondant. Ceci peut s'expliquer par les raisons suivantes: a) le procédé de l'invention evalue les micro-organismes séparément, tandis que les colonies peuvent provenir d'un seul micro-organisme ou d'un groupe de bactéries; b) une certaine proportion des cellules viables ont tendance à ne pas se developper dans les milieux de culture en laboratoire, mais se développent dans les aliments. Ceci concerne particulierement les bactéries altérées ou les spores bactériennes. Ces éléments sont encore viables et sont comptés par le procédé de l'invention. TABLEAU 1 Numération des colonies Numération selon le procédé de l'invention E. coli A moyenne/gramme B déviation C nombre/gramme D intervalle de E nombre de bactéries standard confiance pour un et de champs comptés coefficient de confiance de 90% 11,2 x 106 #1,34 (#12%) 190 : 17 Expèrience 1 11,4 x 106 #0,7 10,0 x 106 #1,20 (#12%) 158 : 16 2 7,8 x 106 #0,9 9,0 x 106 #1,07 (#12%) 179 : 20 3 5,25 x 106 #0,4 7,2 x 106 #1,08 (#15%) 123 : 25 4 2,08 x 106 #0,14 2,9 x 106 #0,53 (#18%) 73 : 25 5 1,31 x 106 #0,2 3,1 x 106 #0,75 (#24%) 52 : 17 6 1,15 x 106 #0,13 1,3 x 106 #0,51 (#39%) 24 : 19 Viande témoin 1,0 x 102 TABLEAU 2 Numération des colonies Numération selon le procédé de l'invention Ps.Fluo- A moyenne/gramme B déviation C nombre/gramme D intervalle de E nombre de bactéries rescen standard confiance pour un et de champs comptés coefficient de confiance de 90% 2,17 x 106 #0,36 (#15%) 107 : 40 Expérience 1 1,92 x 106 #0,28 1,60 x 106 #0,32 (#20%) 65 : 32 8,6 x 105 #2,3 (#27%) 38 : 48 2 1,17 x 106 #0,30 9,7 x 105 #3,1 (#32%) 24 : 27 4,5 x 105 #1,24 (#27%) 31 : 39 3 3,2 x 105 #0,18 4,25 x 105 #1,51 (#31%) 26 : 34 Viande témoin 1,5 x 103 TABLEAU 3 Numération des colonies Numération selon le procédé de l'invention Staph.A moyenne/gramme B déviation C nombre/gramme D intervalle de E nombre de bactéries aureus standard confiance pour un et de champs comptés coefficient de confiance de 90% Expérience 1 1,32 x 106 #0,27 1,95 x 106 #0,30 (#18%) 78 : 24 1,92 x 106 #0,38 (#22%) 54 : 17 1,66 x 106 #0,39 (#28%) 37 : 30 2 4,28 x 105 #0,65 5,85 x 105 #2,28 (#45%) 15 : 29 3 1,62 x 105 #0,39 1,32 x 105 - ( 50%) 8 : 36 4 3,47 x 104 #0,73 2,64 x 104 - ( 50%) 4 : 23 2,00 x 104 - ( 50%) 3 : 23 Viande témoin 6,0 x 102 TABLEAU 4 Numération des colonies Numération selon le procédé de l'invention Bacillus sp.A moyenne/gramme B déviation C nombre/gramme D intervalle de E nombre de bactéries standard confiance pour un et de champs comptés coefficient de confiance de 90% 1,58 x 105 - ( 50%) 6 : 38 Expérience 1 5,9 x 104 #1,8 1,97 x 105 - ( 50%) 6 : 28 5,4 x 104 - ( 50%) 2 : 36 2 4,2 x 104 #0,6 3,96 x 104 - ( 50%) 2 : 45 Viande témoin 2 x 103 On a également étudié des préparations humides et d'autres techniques de coloration de préparations fixées pour réaliser le comptage des microorganismes selon des techniques microscopiques, mais elles se sont révélées, de façon génerale, inférieures à--la technique décrite.Les préparations humides, et en particulier celles réalisées avec de l'orange d'acndine dans differents tampons nu milieux, peuvent convenir à des recherches portant sur le développement des bactéries ou des levures ou a des études sur les bactériophages. Cependant, les difficultés de préparation des lames, ainsi que les difficultés associées à la profondeur de foyer et à la mobilité, rendent cette technique moins appropriée à l'exploration automatique et aux techniques de comptage. Les comptages microscopiques des produits de lavage de la viande ou des végétaux ne posent pas de gros problèmes en ce qui concerne la fluorescence du fond et la dissimulation physique des micro-organismes fluorescents. Cependant, d'autres aliments tels que le lait ou la poudre d'oeuf entratnent une fluorescence du fond si importante que le comptage est difficile selon la technique standard. Des durées de fixation brèves dans alcool, suivies d'un traitement par l'acide acetique à 2% éliminent cette fluorescence du fond. Malheureusement, ce traitement provoque également 1 'élimination par lavage de nombreux micro-organismes. Des expériences complémentaires avec immersion de la préparation dans un bac de Coplin rempli d'eau pendant 1 mn après traitement par un melange d'alcool et d'acide acétique pendant 30 minutes, indiquent qu'après modifications, la technique de l'invention s'applique avec succès aux aliments à base de lait et d'oeufs. La technique de l'invention a montré que des cultures âgées, renfermant en particulier des bâtonnets gram-négatifs présentent une fluorescence orange brillante avec des cellules fluorescentes vert terne. Des cultures de bactéries gram-négatives stérilisées par ébullition à 100"C pendant 30 minutes présentent une fluorescence vert terne uniforme. Ce passage de la fluorescence orange à la fluorescence verte est lié à la.viabilité des cultures. Alors que des cultures âgées de Staphylococcus aureus présentent à la fois des cellules fluorescentes oranges et vertes, le traitement par la chaleur d'une culture jeune par ébullition pendant 30 minutesypuis coloration, donne à tous les organismes une fluorescence orange.Un traitement préalable de la préparation par des solutions tampons supprime ces fausses réactions de "cellules viables1,. Les différences des réactions entre les bacteries gram-negatives et grampositives vis-à-vis des fluorochromes illustrent les différences importantes de composition entre les deux groupes. Un avantage de l'invention est la rapidité d'obtention des résultats. Dans le procédé de l'invention, la coloration nécessite moins d'une heure, tandis que le comptage classique des colonies nécessite plusieurs jours d'incubation. On peut également utiliser un instrument d'exploration optique rapide pour compter ou détecter les cellules fluorescentes. En réglant la sensibilité aux longueurs d'onde d'un tel instrument, on peut déterminer séparément les cellules viables et les cellules non viables. Bien entendu, 1'invention n'est pas limitée à l'exemple donné ci-dessus, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles a l'homme de l'art, suivant les applications envisagées, et sans s'écarter pour cela de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- @rocede de coloration de micro-organismes, caractérise en ce qu'on fait reagir les micro-organismes avec un coloriant, au moins un des composants réagissant ayant été modifie chimiquement pour permettre cette réaction. 2.- Procédé de coloration de micro-organismes, caractérise en ce qu'on traite chimiquement une préparation renfermant les micro-organismes pour modifier les sites récepteurs de colorant des micro-organismes, et on colore par un colorant la préparation traitée. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérise en ce que le traitement chimique est une méthylation, une estérification, une hydrolyse, une oxydation ou un traitement par le dioxyde de soufre. 4.- Procéde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on réalise la préparation renfermant les micro-organismes en appliquant un échantillon liquide à une plaque support et en évaporant le liquide de la plaque. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on fixe l'échan- tillon à la plaque support par chauffage ou par traitement dans un solvant. 6.- Procéde selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le colorant est un fluorochrome. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on choisit le colorant parmi la lissamine-rhodamine B, l'orangé d'acridine, la primuline, le bleu de methylene, l'acriflavine, l'éosine Y, l'auramine, la rhodamine B, la rhodamine 3G, la fluorescéine et la thionine. 8.- Procéde de numération de micro-organismes dans un échantillon, carac térisé en ce qu'il comprend : l'application d'un échantillon liquide ou d'un extrait liquide d'un échantillon à une plaque support, l'évaporation du liquide de l'echantillon, a fixation de l'échantillon, le traitement chimique de l'échantillon fixé pour modifier les sites récepteurs de colorant des microorganismes, la coloration par un colorant de l'échantillon traite et le comptage des micro-organismes en examinant au microscope l'échantillon colore.