FR 2215946 A1 19740830 FR 7403925 A 19740206 L'invention concerne un procédé d'inactivation de virus permettant -de supprimer le caractère infectieux de ceux-ci tout en conservant leurs propriétés antigéniques, en particulier un procédé d'inactivation des virus du groupe des myxovirus. On connait divers moyens pour diminuer ou supprimer le caractère infectieux de virus, ctest-d-dire leur aptitude à provoquer une maladie, pour que ceux-ci puissen.t être utilisés dans des vaccins. A cette fin on peut par exemple atténuer, ctest-à-dire affaiblir la souche virale par des passages répétés qui altèrent le virus e-n lui faisant perdre pratiquement tout son pouvoir pathogène mais sans qu'il perde son aptitude à induire une réaction immunogénique suffisante. Cependant, le caractère immunogéne d'un virus atténué est souvent insuffisant et il y a toujours le risque que le virus retrouve sa virulence. Un autre procédé connu est l'inactivation par des agents chimiques ou physiques qui attaquent et altèrent les constituants fondamentaux, protéiques et autres, des virus, en les empêchant ainsi de se multiplier. Par exemple, on a montré que certains virus du groupe des myxovirus peuvent tre inactivés en suspension aqueuse par mise en contact de la suspension avec de ltéther diéthylique ou un solvant halogéné, en présence d'un émuisifiant hydrophile tel que le mono-oléate de polyoxy-éthylène-sorbitanne. Selon ce procédé, la couche externe du Virus se fragmente, l'activité d'hémagglutination étant maintenue ou même accrue.Cependant, certaines autres propriétés du virus, qui sont également reliées au propriétés antigéniques peuvent.être détruites, par inadvertance,ce qui peut tre la cause de certains résul- tats décevants de vaccinations avec ces vaccins. On sait également que la formaline, qui inactive les myxovirus et de nombreux autres-types de virus, dénature nécessairement les constituants .protéiques de ces organismes. Par exemple, dans le cas du virus de "Sendai", on supprime ainsi une partie importante de la propriété- hémolytique. En conséquence, bien que 11 activité hémagglutinante qui est habituellement associée aux propriétés immunogéniques des myxovirus et de certains autres virus soit en général conservée sans ces procédés d'inactivation, la suppression totale ou partielle de l'action hémolytique ou de certaines autres activités antigéniques peut tre responsable de l'in- suffisance de protection qui a été observée avec certains vaccins obtenus par inactivation selon les procédés connus et préférés. Apostolov, k., (J. Gen,Virol.,l972, 15, 227-234) a démontré récemment que l'hémolyse est associée à une fine couche granulaire dénommée couche nanogranulaire". Cette couche nanogranulaire, qui est la plus interne des couches entourant les composants centraux du virus, peut lyser la membrane d'un globule rouge et se fondre avec celle-ci après fixation par l'intermédiaire d'épines de-la surface du virus. Ce phénomène est suivi du passage des composants internes du virus dans le globule rouge puis expulsion de l'hémoglobine par les lésions de la partie instable de la membrane. Ainsi, on pense que la couche nanogranulaire joue un rôle très important dans l'hémolyse et peut, en conséquence, être responsable de certaines des propriétés antigéniques du virus. On considère donc comme souhaitable que la couche nanogranulaire et tous les autres composants protéiques qui sont habituellement détruits par l'action d'agents chimiques restent intacts après l'inactivation. Or la demanderesse a trouvé que lton pouvait inactiver totalement par un traitement à la chaleur un virus qui a été préalablement lyophilisé en présence d'un stabilisant protéinique. Ce traitement convient à tous les types de virus, pourvu qu'ils soient lyophilisables. On rencontre par exemple fréquemment des difficultés au cours de la lyophilisation des picornavirus et en conséquence il est recommandé de ne pas appliquer le procédé d'inactivation de l'invention à ce type de virus. La Demanderesse a également découvert que, lorsque le procédé d'inactivation selon l'invention est appliqué à des virus possédant une couche nanogranulaire, le virus est inactivé alors que la couche reste intacte. Ceci est particulièrement avantageux pour les virus capables d'hémolyse, puisque activité hémolytique associée à la couche nanogranulaire de certains virus peut même être améliorée par le traitement. Ceci est quelque peu surprenant puisque différents auteurs (Kohn, A., Virol., 1965, 26, 228 et Apostolov, K., J. Gen. Virol., même publication) ont montré que la propriété hémoly tique est plus sensible au traitement thermique que la propriété d' hémagglutination. La présente invention a aussi pour objet un procédé d'inactivation d'un virus qui comprend la lyophsslisation du virus en présence d'un- stabilisant protéique et le chauffage à une température élevée de la préparation de virus et du stabilisant ainsi obtenue, pendant un temps. suffisant pour que l'inactivation soit totale. La température précisé utilisée dépend du type de virus à inactiver mais elle est avantageusement de l'ordre de 50 à 1500C, de préférence 90 à 1250C, -et le temps pendant lequel la préparation est soumise au chauffage dépend de la température à laquelle l'inactivation est effectuée, le temps étant évidemment moins long pour une température plus élevée que pour une température plus basse, pour l'inactivation du virus. Cependant, si la température est choisie entre 90 et 1250C, le temps sera notablement inférieur à lssheure, par exemple de l'ordre de 5 à 35 minutes. Les stabilisants protéiques qui conviennent pour être utilisés selon le procédé de l'invention comprennent un mélange composite par exemple SPGA, de saccharose, de phosphate, de glutamine et,ce qui est le plus important, d'albumine (vide Bovarnick, M.R.,J. Bacteriol., 1950, 59, 509). Cepèndant, il faut remarquer que ce mélange SPGA peut ne pas convenir à des températures supérieures à 1150C car le sucre se caramélise. Des mélanges composites analogues ne contenant pas de sucre et dont l'albumine est remplacée par d'autres protéines, par exemple la caséine, peuvent également convenir, qu'ils contiennent ou non le phosphate ou la glutamine. Les stabilisants protéiques préférés sont les lysates de protéines qui comprennent de la-gélatine dégradée thermiquement ou par l'action d'un acide, par exemple "Sol-U-Pro", et qui peuvent être utilisés en présence ou non de sorbitol. La quantité de stabilisant protéique qui convient est normalement au moins étale à O,irg par unité d'hémagglutination, par exemple 1 à 30 g par unité d'hémagglutination dans le cas du virus de Sendai, environ 25 mg par unité d'hémagglutination dans le cas du virus de la rougeole et environ 3mg par unité d'hémagglutination dans le cas du virus de la grippe. Un excès de stabilisant protéique, par exemple de plusieurs fois les quantités indiquées, n'est pas considéré comme nuisible. L'invention concerne également les virus qui ont été inactivés par le procédé décrit. Les virus que l t on peut lyophiliser sont les myxovirus et les adénovirus. Les myxovirus en particulier comprennent les orthomyxovirus tels que M. influenzae-A, M. influenzae- B et M.influenzae-C et M. multiformae (virus de la maladie de Newcastle) et les paramyxovirus tels que M.parainfluenzae-l(par exemple la souche connue sous le nom de virus de Sondai), M,parainfluenzae-2 (virus.des laryngotrachéobronchites aigues), M.parainfluenzae-3 (virus dthémadsorption), M. parainfluenzae-4 (virus M.25), M. pestigalli (virus de la peste aviaire), M.parotidis (virus des oreillons), le virus de la rougeole, le virus de la maladie de carré, le virus de la peste bovine, et le virus syneytial respiratoire. Comme il a été indiqué précédemment, l'inactivation selon l'invention préserve la couche nanogranulaire tout en inactivant le myxovirus lui-mEme. En conséquence, ce procédé donne un myxovirus inactivé ayant une couche nanogranulaire pratiquement intacte. Habituellement les virus sont cultivés sur des oeufs fertilisés ou des cultures de cellules et sont obtenus sous forme exempte de cellules par des procédés de purification convenables. Le milieu qui contient le virus, pratiquement exempt de débris cellulaires et d'autres conta- minants, contient habituellement des agents de réglage du pH et de l'osmolalité de la solution, tels que des tampons et des sels minéraux, par exemple des solutions de phosphate ou des solutions salines et de véronal respectivement. La concentration en virus vivants de la suspension est habituellement mesurée par des tests d'hémagglutination. Ceux-ci impliquent des dilutions répétées de la suspension de virus, jusqu'à ce que la dernière dilution qui correspond à une hémagglutination de 50 % pour un même volume d'une suspension à 0,5 % d'érythrocytes soit déterminée. L'inverse de cette valeur est le titre d'hémaggluti nation. On peut également définir la concentration en virus par la mesure de certaines autres activités virales, telles que les activités infectieuses ou de fixation du complément. Ces pocédés peuvent être plus avantageux soit lorsque le virus n'agglutine pas les hématies, soit lorsque la concentration en virus n'est pas mesurée normalement par hémagglutination-. La quantité de virus actifs présents dans un échantillon est exprimée ici en unités d'hémagglutination qui est la valeur du titre tel que défini précédemment. Le stabilisant protéique peut Titre ensuite mélangé en quantités convenables avec la suspension de virus et placé dans des récipients convenables, par exemple des ampoules ou des flacons de verre. La suspension obtenue peut ensuite être lyophilisée selon les procédés connus. Par exemple, la suspension peut être congelée à une vitesse d'environ 1OC/mi- nute, jusqu a une température finale de l'ordre de -30 à -40 C. La chambre est ensuite mise sous vide et, dès que la pression atteint 0,03 à 0 > 05 torr, on porte la température à 0-, -10 C et on effectue un premier séchage pendant 10 à 20 heures. On élève ensuite la température de la chambre jusqu'à 25-350C et on effectue un second séehage pendant 2 à 10 heures puis on ferme le récipient sous vide. La préparation lyophilisée de virus et de stabilisant peut Autre ensuite chauffée dans un bain liquide ou dans tout autre dispositif convenable de chauffage afin que le virus soit inactivé. Le virus ainsi obtenu peut constituer le vaccin primaire ou peut être utilisé tel quel après les essais convenables. Eventuellement, le-vaccin peut être ultérieurement amélioré par purification ou concentration par des procédés connus. La Demanderesse a découvert que ces vaccins, inactivés par chauffage, ont des propriétés très avantageuses de conservation, c-omparés aux autres vaccins dont les virus ont été inactivés chimiquement. Par exemple, les virus traités à la formaline, qui sont des composants habituels de nom- breux vaccins, subissent souvent une décomposition partielle après environ 2 ans, en raison dtune action retardée nuisible du formaldéhyde résiduel. Par ailleurs, les virus lyophilisés inactivés par la chaleur peuvent être conservés pendant un temps relativement long, sans décomposition notable. Cette invention comprend donc également un vaccin pour l'homme et les animaux contre des infections dues à des virus pathogènes virulents, vaccins qui comprennent des particules d'un virus approprié inactivé par le procédé défini précédemment, immunogène-s vis-à-vis de la maladie considérée, associée à un véhicule acceptable pour une utilisation pharmaceutique. Les particules virales peuvent donc être associées par simple mélange à un véhicule convenable qui peut votre solide, liquide ou gazeux et qui est avantageusement inerte ou acceptable du point de vue médical, soit avant conserovation, de préférence à température réduite, soit immédiatement avant utilisation. Le véhicule peut également eAtre un récipient fermé qui contient les particules virales. Eventuellement, le vaccin peut comprendre d'autres substances pharmacologiquement actives et il est, de préfé- rence, présenté sous forme de doses unitaires ou multiples qui correspondent à une dose efficace pour le ou les individus à vacciner. Dans le cas de l'administration par la voie parentérale, le vaccin doit être sous forme de dose unitaire ou multiple, en suspension aqueuse ou non, qui peut contenir des antioxydants, des tampons et des solutés qui rendent le vaccin isotonique avec le sang. Eventuellement, ce mélange peut également comprendre des stabilisants, des agents de mise en suspension et des épaississants. Dans le cas de l'administration par la voie orale, les particules virales peuvent être présentées avec des diluants et d'autres véhicules. Bien que les voies d'administration énumérées ci-dessus soient celles le plus fréquemment utilisées, elles n'excluent pas nécessairement les autres possibilités qui sont, par exemple, les administrations par voie rectale et l'application locale. Cependant, les votes préférées d'administration du vaccin sont les voies parentérale et orale, l'administration plus particulièrement préférée est celle par voie parentérale. L'invention concerne en outre la prévention ou le traitement d'une maladie des animaux et de l'homme, qui comprend l'administration à lth8te d'une-dose efficace d'un vaccin tel que défini. - Exemples d'exécution de l'invention. EXEMP 1: On prépare une souche de virus de Sondai M34996 de la manière décrite par Apostolov, K. et al (J. Gen. Virol., 1972, 15, 227-234), mais après concentration le virus obtenu à partir du liquide allantoIdien de 100 oeufs n'est pas congelé mais mis en suspension dans 4 ml de soluté physiologique tamponné de véronal (préparé par dissolution de 0,375 g de barbitone sodique, 0,575 g d'acide diéthylbarbiturique, 8,5 g de chlorure de sodium, 0,17 g de chlorure de magnésium hexahydraté et 0,03 g de chlorure de calcium dans l'eau distillée et ajustement du volume de la solution à 1 litre) à la température de 4 C. On mélange 1 ml de la suspension de virus avec 39 ml d'une solution à 5 % (en poids/volume) de 'tSol-U-Pro" dans de l'eau distillée (à 40C) et on met 1 ml des échantillons de la suspension de virus ainsi obtenue dans des flacons de verre. On place ces flacons dans une chambre à lyophiliser (modèle EF6, Edwards High Vacuum Ltd., Crawley, Angleterre).sur des étagères refroidies au préalable (-400C) et on refroidit à raison de 1 C/mn jusqu a ce que la température atteigne -35 C. On met ensuite la chambre sous vide et dès que la pression atteint 0,03 à 0,05 torr, on porte la température à -50C et on effectue le séchage primaire pendant 16 heures.On porte ensuite la température à 300C et on effectue un séchage secondaire pendant 6 heures, après quoi on ferme les flacons sous vide avec des bouchons de caoutchouc. Finalement, on immerge les flacons dans un bain d'eau à 1000C pendant 20 minutes, puis on mesure les activités hémolytiques (HL), infectieuses et d'hémagglutination (HA) du virus. On détermine ces activités sur un échantillon d'une suspension de virus, avant lyophilisation, à titre de comparaison. VIRUS VIRUS témoins f traités Autre HA 1024 1024 Activité HL 0,38 38 L'activité HL est exprimée par la valeur de la densité optique de l'hémoglobine à 415 nm. On examine les propriétés infectieuses des virus par inoculation dans la cavité allantoSdienne de poulets âgés de 10 Jours. Après 5 jours d'incubation à 350C, il n'y a pas trace d'infection. EXEMPLE 2 On prépare un virus de Sondai qu'on lyophilise, qu on chauffe et qu'on soumet aux essais décrits dans l'exemple 1, en utilisant un milieu SPGA (préparé par addition de 94,7 g de saccharose, 0,7 g de phosphate monopotassique, 1,6 g de phosphate dipotassique, 1,2 g de glutamate monosodique, 12,7 g d'albumine de bovin, et 1,3 ml d'une solution à 1 % de rouge de phénol, à 1 litre d'eau distillée, agitation et passage en solution puis filtration), à la place de la solution à 5 % en poids/volume, de"Sol-U-Pro" dans l'eau distillée. VIRUS VIRUS témoins traités Titre HA 1024 1024 Activité HL o,î4 0,25 L'examen des propriétés infectieuses comme dans l'exemple 1 est négatif. EXEMPLE 3 On propage des virus de la rougeole de la souche Edmonston dans des cellules de Vero (couches de cellules de reins de singe vert transSormées) en présence d'un milieu de Eagle et de serum de veau à 2 % (en volume/volume), lorsque L'effet cytopathologique observé sur les cellules st maximal, (au bout de 8 jours d'incubation à une température Le 370cl on prélève le milieu surnageant quton centrifuge (11 fois à fO4G pendant 30 minutes) afin de recueillir le virus.On remet en suspension le culot de centrifugation qui contient les virus dans 20 ml de milieu de Eagle (210C) et on mélange ultérieurement cette suspension avec 1 ml d'une solution à 25 % (en poids/volume) de"Sol-U-Protr dans l'eau distillée à 210C. On place 1 ml des échantillons de cette suspension de virus ainsi obtenue dans des flacons de verre que lton place dans une chambre de lyophilisation sur des étagères préalablement refroidies (-400C) et on refroidit à raison d'1 C/minute, jusqu'à ce que la température atteigne -350C. On met ensuite la chambre sous vide et dès que la pression atteint 0,03 à 0 > 05 torr, on porte la température à -50C et on effectue le premier séchage pendant 16 heures. On porte ensuite la température à 300met on effectue un second sechage pendant 6 heures, puis on ferme les flacons sous vide, -avec des bouchons de caoutchouc. On chauffe ensuite les flacons qui contiennent les virus lyophilisés à 11000C pendant 15 minutes dans un stérilisateur, puis on mesure les activités hémolytiques (HL), infectieuses et d'hémagglutination (HA) du virus. On détermine également ces activités, à titre de comparaison, sur un échantillon de la suspension de virus, avant lyophilisation. VIRUS VIRUS témoins traités Activité HL 0,019 0,027 On mesure l'activité infectieuse du virus par titration de dilutions répétées du virus dans une quantité normalisée de cellules de Vero, en tubes. Le point final correspond au tube dont l'effet cytopathologique est de 100 % pour la dilution la plus élevée. Dans ce cas, le virus de la rougeole ne présente pas d'activité infectieuse après le traitement thermique. EXEMPLE 4 On cultive une souche pour vaccin du virus de la grippe WRL 55 (composition antigénique H3N2, avec le type dthémagglutinine de 1972) dans la cavité allantoidienne d'embryons de poulets âgés de 10 Jours, pendant 54 heures à 35"C. On récolte le liquide allantoidien qu'on clarifie par centrifugation à 2.000 tours/mn pendant 15 minutes, qu'on filtre sur un filtre "Millipore" de 0,8 m et qu'on dilue dans un tampon de phosphate contenant 5 % (en poids/ volume) de "Sol~U-Pro" et 7v5 % (en poids/volume) de sorbitol.On lyophilise par volumes de 6 ml contenus dans des flacons de verre de 24 ml de capacité, dans une chambre à lyophiliser (Edwards High Vacuum Modèle L20) dans les conditions décrites dans exemple 1, mais le premier et le deuxième séchages durant respectivement 16 et 32 heures. On mesure la stabilité de lthémaglutiline du produit lyophilisé qu'on exprime par (i) son activité antigénique et (2) son activité immunogène. 1. Stabilité thermique de l'activité antigénique des hémagglutinines. On place les flacons de virus lyophilisés dans un bain d'eau bouillante et on retire les échantillons immédiatement, au bout de 15 minutes et au bout de 30 minutes. On réhydrate ces échantillons avec 6 ml d'eau distillée par flacon et on réalise les essais suivants On mesure leur activité infectieuse par inoculation de 0,2 ml des échantillons dans la cavité allantoidienne d'embryons de poulets âgés de 10 Jours. Après incubation pendant 30 Jours à 360C, on recueille le liquide allantoidien et on détermine la présence d'hémagglutinine avec des érythrocytes de volaille. On calcule l'activité infectieuse de façon habituelle, à partir de la proportion de liquides allantoidiens qui contiennent de l'hémagglutinine. Le titre d'hémagglutination du matériel sec est mesuré par titrage sur une plaque d'agglutination en matière plastique avec une solution à 0,5 % d'érythrocytes de volaille. La spécificité antigénique de l'hémagglu- tinine est determinée par examen dans un essai d'hémagg,lutination- inhibition utilisant des sérums spécifiques de furet. On prépare ces sérums contre A/Engl/42/72 et A/Hong Kong/68 ces souches virales ont toutes deux une structure H3N2 et leurs hémaglutinines sont très proches, mais sont respectivement des types 1972 et 1968 On utilise comme témoin pour chacun de ces essais un virus n1 avant pas subi de chauffage. On obtient les résultats qui sont indiqués dans le tableau I. ESSAI Virus non VIRUS chauffes à 1000C chauffés 15 minutes 30 minutes Ech. A Ech. B Ech. A Ech. B Activité infec- 107,1 10 tieuse 1071 10 10 10 10 Titre (DIE50/2 ml) Hémagglut i- nation Titre (IIAU/ml) 16 12 -16 16 16 Spécificité 1972 1972 1972 1972 1972 antigenique H3N2 H3N2 H 3N2 H3N2 H3M2 Ces résultats montrent qu'un chauffage a 1000C nendant 15 à 30 minutes à ltétat lyophilisé, conduit à une perté des propriétés infectieuses du virus, mais que le titre d'hémagglutination et l'aptitude de l'hémagglutinine à réagir avec un antisérum spécifique dans les essais d'héma- gglutination-inhibition ne sont pas modifiés. 2. Stabilité thermique des propriétés immunogènes de lthémagglutinine. On étudie également les propriétés immunogènes de lthémagglutinine chauffée. On prépare un autre lot de vaccins 1lRL55 exactement comme décrit précédemment. On chauffe 44 flacons de vaccin dans un bain d'eau bouillante pendant 15 minutes et on conserve le même nombre de flacons comme témoins non chauffés. On réhydrate les échantillons avec 6 ml d'eau distillée par flacon, puis on concentre 200 fois par centrifugation dans une centrifugeuse Spinco W27 à 26000 tours/minute pendant 1 heure. On obtient des culots de centrifugation qu'on remet chacun en suspension dans 0,9 ml de solution tamponnée. au phosphate. Le tableau II indique les résultats obtenus. T A B L E A U II ESSAI Chauffage à 1000C Vaccin d'ori- Vaccin concen gine tré Hémagglutina- non-chauffés 16 1920 tion Titre (HAU/ml) chauffés 16 2560 Activité infectieuse non chauffés îo685 Titre DIE50/2 ml) chauffés On mesure l'activité immunogène de la matière concentrée par injection intramusculaire de 0,3 ml d'échantillon à des poulets âgés de 5 semaines (3 poulets par concentration). On prélève, 3 semaines plus tard, des échantillons de sang, et on détermine l'activité des sérums par des essais dthémagglutination-inhibition en utilisant le virus homologue comme antigène. Aux erreurs expérimentales près, on n'observe pas de différences entre les activités immunogènes des échantillons de virus soumis ou non au traitement thermique. EXEMPLE 5 On répète le mode opératoire décrit dans les exemples 1 et 2 dans le cas d'infections par le virus de l'hépatite canine. On réhydrate le virus inactivé et on l'injecte à des cobayes. Après plusieurs jours, on saigne les cobayes et on analyse leur sérum par des essais de neutralisation destinés à mettre en évidence la présence d'anticorps ce qui donne un résultat positif REVENDICATIONS 1.- Procédé d'inactivation de virus, caractérisé en ce qu'on lyophilise le virus en présence d'un stabilisant protéinique et on chauffe la préparation du virus et du stabilisant ainsi obtenue a une température élevée pendant un temps suffisant pour que l'inactivation soit totale. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on chauffe entre 50 et 1500 C. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on chauffe entre 90 et 1250C pendant 5 S 35 minutes. 4.- Procédé selon la revendication 3) caractérisé en ce qu'on chauffe a 1000C pendant 20 minutes. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise un stabilisant à base d'un lysat protéique qui comprend de la gélatine dégradée par un acide. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise un stabilisant à base d'un lysat de protéines qui comprend de la génatine dégradée par la chaleur. 7.- Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce.qu'on utilise comme stabilisant un lysat protéique en présence de sorbitol. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à- 4, caractérisé en ce qu'on utilise un mélange d'albumine, de sucre, de phosphate et de glutamine. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'on utilise de 1 pg à 30 mg de stabilisant protéique par unité d'hémagglutination. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédents, caractérisé en ce qu'on traite un adénovirus. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on traite un myxovirus. 12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on traite un myxovirus capable d'hémolyse. 13. Vaccin ppur la protection de l'homme et d'animaux contre des infections dues à des virus pathogènes virulents, caractérisé en ce qu'il comprend des particules d'un virus approprié qui a été inactivé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ayant une activité immunogène vis-a-vis de la maladie considérée, associées à un véhicule acceptable pour une utilisation pharmaceutique. 14.- Virus inactivé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à~12. 15.- Myxovirus inactivé, caractérisé en ce qutil a une couche nanofflranulaire sensiblement intacte. 16.- Virus- selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est capable dthémolyse. 17* Virus de Sondaï selon l'une quelconque des revendications 14 à 16. 18.- Virus de la souche M34996 selon la revendication 17. 19.- Virus de la rougeole selon l'une quelconque des revendications 14 à 16. 20.- Virus de la souche Edmonston selon la revendication 19. 21.- Virus de la grippe selon la revendication 14 ou 15. 22.- Virus selon la revendication 21, de la souche WRL55 ayant une composition antiaénique H3N2 avec le type d'hémagglutinine 1972. 23.- Virus de l'hépatite canne infectieuse selon la revendication 14.