FR 2207700 A1 19740621 FR 7241597 A 19721123 La présente invention concerne un procédé de séparation et de purification de flavonoTdes à partir d'extraits végétaux flavoni-ques bruts, par exemple des extraits de péricarpe de Citrus. I1 est connu de traiter certains végétaux, par exemple les péricarpes des fruits du genre Citrus, les feuilles d'Hamamélis Virginiana, les baies immatures de différents Rhamnus (Aaygdalinus, oléoIdes, saxatilis, infectoria, etc...) pour en extraire les pig mentis flavoniques qui s'y trouvent en abondance. A cet effet, les pièces végétales sont broyées puis extraites à l'eau additionnée éventuellement -d'alcools et/ou de cétone et portées ensuite à une température convenable suivant divers modes de traitement décrits dans la littérature. Toutefois, les extraits obtenus sont très impurs, et compor- tent, outre des pigments flavoniques, un certain nombre de substances provenant des tissus végétaux. I1 est donc impératif de séparer les pigments flavonoldes de tous les matériaux étrangers avant d'envisager leur cristallisation. Cette séparation peut s'opérer suivant divers traitements échange liquide-liquide, chromatographie sur différents supports, etc... Les flavonotdes étant toutefois très sensibles aux actions thermiques, à l'oxygène et à la lumière, ces méthodes de séparation entratnent généralement des pertes substantielles de produit ainsi que la formation de sous-produits provenant des structures naturelles par transpositions et isomérisations diverses. L'invention a pour but de pallier les inconvénients précités en proposant un procédé de séparation et de purification de flavo noises, de mise en oeuvre aisée, de prix de revient peu élevé et permettant, à partir d'extraits bruts, d'obtenir des flavonoTdes avec un haut degré de pureté tout en réduisant au minixua les pertes en produit et l'apparition de sous-produits dérivés. A cet effet, et selon une première caractéristique de l'invention, le procédé de séparation et de purification conforme à l'invention comprend les étapes successives de traitement suivantes déminéralisation des extraits végétaux flavoniques bruts, dessication des extraits déminéralisés, dispersion du produit desséché dans un solvant organique anhydre, formation au sein de la solution anhydre de complexes ammoniés insolubles de flavonordes, et régénération des flavonotdes à partir desdits complexes ansoniés. Lors de la déminéralisation, les extraits végétaux sont débarrassés des métaux complexants et après formation des complexes aimoniés, les flavonotdes sont séparés par précipitation, ce qui évite un séjour prolongé en solution diluée, et un contact avec des réactifs agressifs, et diminue le nombre total des étapes nécessaires pour aboutir à l'isolement des produits purs. Selon une autre caractéristique de l'invention les solvants organiques annydres contiennent au moins un alcool et/ou au moins un cétone ou leurs mélanges. Selon des modes de réalisation préférés, l'alcool est choisi dans le groupe comprenant : le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et sa teneur en eau est inférieure à 1 /oo. Selon une autre caractéristique de l'invention, on fait précipiter les complexes amioniés des flavonoSdes par barbotage d'aniio- niac désséché sur tamis moléculaire. Selon encore une autre caractéristique de l'invention, la régénération des flavonoSdes consiste en une dissociation des eomple- xes smmoniés formés par des acides et/ou des échangeurs d'ions. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description qui va suivre et des exemples de mise en oeuvre décrits. les extraits végétaux bruts flavoniques sont d'abord traités par centrifugation et filtration sur kieselguhr avant l'étape de déminéralisation. Cette étape de déminéralisation a pour but d'éliminer cosplè- tendent des extraits bruts, tous les sels dissous et les ions for ripant des complexes avec les flavonoTdes : Ca , Mg++, Co++, Zn++, etc... la déminéralisation totale est réalisée par passage unique de l'extrait en solution aqueuse à 12 % de matière sèche, sensi- bleient neutre, sur deux colonnes dchangeuses d'ions montées en série. la preiière colonne sera par exemple garnie d'une résine échan geuse complexante, telle que la résine phosphonique connue sous la dénomination commerciale Duolite ES 63, dans le but d'éliminer Ca++, Cu++ et tous les autres oligoéléients. La seconde colonne sera garnie d'une résine mixte anion-cation, par exemple et de préférence la résine connue sous la dénomination commerciale Bio Rad AG 11 AB résine retardatrice d'ions), dans le but de soustraire tous les sels minéraux libres. les extraits totalement déminéralisés sont désséchés par ato misation ou mieux, par lyophilisation. La poudre obtenue est ensuite dispersée dans un solvant stric tement anhydre : alcools, cétones, et leurs mélanges, puis portée à reflux pendant une demi-heure et refroidie. On recueille le solvant par soutirage et filtration. Les flavonotdes libres se trouvent dans la phase organique, la phase insoluble comprenant notamment des mucilages, des sucres, des acides organiques et éventuellement des protéines. L'étape originale du procédé consiste en la formation des com- plexes ammoniés des flavonoïdes à partir de cette solution organique filtrée. En effet, les flavonoïdes possédant sur l'un des cycles, une structure orthodiphénol sont susceptibles de contracter des bai- sons hydrogènes avec un groupement ammoniac ou aine primaire pour former des complexes ammoniés lâchee. La formation d'un tel complexe diminue la solvatation aboutissent ainsi à une ineolubilisation dans les alcools et les cétones. Pour former ces complexes ammoniée, on fait barboter dans la solution filtrée précédemment obtenue, du gaz ammoniac désséché sur tamis moléculaire. Il se forme un précipité jaune clair de complexe flavonoïde-ammonium que l'on recueille par filtration ou essorage centrifuge de façon connue en soi. Ce précipité de complexe peut autre désséché sous vide et con- servé comme produit intermédiaire. En effet, dans leur forme sèche, les complexes flavonoTdes- ammonium sont très stables et peu hygroscopiques, sont générale- lent facilement hydrosolubles, et les solutions aqueuses ne sont que légèrement alcalines. Le complexe flavonoïde-ammonium peut donc entre directement utilisé en thérapeutique humaine, son titre en flavonoldes étant généralement supérieur à 80 %,- et ses propriétés ne présentent aucun risque d'intolérance. An peut également à partir de complexes ammonites isoler les flavonoïdes à l'état pur. Pour ce faire, le complexe flavonoïde-aimonium est placé en suspension, dans du méthanol anhydre contenant 2 % d'acide formique et le tout est porté à reflux pendant une demi-heure. On refroidit et filtre, puis on passe la solution filtrée sur une colonne garnie d'une résine retardatrice d'ions ÂG 11 A 8, préalablement 'qui librée au méthanol, afin d'éliminer le formiate d'eanoniu- et l'acide formique libre. On recueille ainsi une solution néthanolique de flavonoïdes que l'on sèche dans une étuve à vide à une température ne dépassant pas 500C en fin d'opération. On obtient une poudre de flavonotdes de pureté supérieure à 95 ffi utilisable en thérapeutique humaine. Il convient de noter que Si l'extrait de Citrus de départ a été préparé avec les soins nécessaires, les flavonoIdes obtenus par le présent procédé sont apyrogènes et anallergiques. Bien entendu, les flavonoides purifies peuvent également ser vir pour la préparation de toute. sortes de dérivés d'himi-Syn- thèse. Les conditions de mise en oeuvre vont être données quantita vivement en référence aux exemples qui vont suivre. EXEMPLE 1. On part d'une solution aqueuse à 12 % de matière sèche provenant de l'épuisement par l'eau du péricarpe d'orange. Ces solutions sont par exemple généralement produites en même temps que les huiles essentielles dans les machines procédant par rapage superficiel des fruits et constituent donc des sous-produits normaux de l'industrie agrueière. On traite par percolation 1000 litres de solution à 10 * d'extrait sec soigneusement filtrée sur kieeelguhr, dont le pH doit être compris entre 6,5 et 7,5 à un débit de 200 litres par heure, sur deux colonnes arrangées en série. La première colonne contient 100 litres de résine Duolite ES 63, ou toute résine équivalente, préalablement saturée en ions Na+. La seconde colonne contient 150 litres de résine Bio-Rad ÂG 11 A8, retardatrice d'ions, ou toute résine équivalente préalablement rincée à l'eau dégioni- suée. Pour déplacer les solutions d'extraits imprégnant les résines, on emploie 100 litres d'eau désionisée : on recueille ainsi 100 litres de solution d'extrait entièrement déminéralisée, même des métaux à ltétat de trace habituellement complexés avec les flavo notiez, dans une cuve à plafond mobile. Cette solution est déso oxygénée par dispersion fine de 1500 litres d'azote gazeux au mo- yen d'un poreux inoxydable. L'extrait désionisé est ensuite concentré sous vide de 10 à 20 torrs, à une température inférieure à 400C effectivement mesu- rée, jusqu'd une teneur en matière sèche de 25 %. La solution est immédiatement congelée et lyophilisée, ou à défaut, atomisée. Peur l'atomisation, on ajoute un égal volume de méthanol, afin de diminuer les actions thermiques subies par le produit, et il convient de plus d'opérer dans un atomiseur muni d'un dispositif de refroidissement de la poudre et d'ensachage continu. Pour la lyophilisation, le vide de étuve à lyophiliser est cassé à l'azote après dessication du produit, afin de saturer la poudre en azote. pour l'atomisation, la poudre refroidie obtenue est placée sous cloche à vide et maintenue une desi-heure sous 5-10 torrs, le vide est ensuite cassé à l'azote afin d'éliminer toute trace d'oxygène occlus. Dans l'un et l'autre cas, on obtient environ 100 kg de poudre. Les 100 kg d'extraits déminéralisés sont dispersés dans 1000 litres d'un mélange à parties égales de méthanol-acétone stricte- ment anhydres (teneur an eau inférieure à 1 /oo) dans un réacteur muni d'une jaquette chauffante, d'un agitateur et d'un condensateur à reflux. On porte à reflux pendant une demi-heure, on laisse refroidir et décanter, on soutire et on filtre le solvant que l'on reçoit dans une cuve munie d'un disperseur poreux inoxydable à sa partie inférieure et d'un agitateur. Par l'intermédiaire du poreux, on fait barboter dans la solution du gaz ammoniac desséché par passage sur une colonne contenant 50 litres de tamis moléculaire A 3 granulé, préalablement activé à 3000C. On inJecte ainsi 2 kg de gaz ammoniac. Il se forme un précipité de couleur jaune alair à jaune vif et l'on vérifie que la liqueur surnageante ne précipite plus par barbotage d'ammoniac. On recueille le précipité dans une essoreuse centrifuge muni d'un tambour filtrant en toile de nylon et l'on lave le précipité avec 100 litres de mélange solvant frais sur le tambour tournant à bas régime. Le précipité lavé est réparti sur les plateaux chauffants d'une étuve à vide et desséché sous 10-20 torrs à une tempé- rature de 500C en fin de séchage. Le vide est cassé à l'azote et l'on obtient 15 à 25 kg de complexe flavonoïde-ammonium sec, suivant la teneur de l'extrait de Citrus mis en oeuvre. La poudre titre au moins 80 * de flavonotdes et est directement utilisable en thérapeutique humaine. 25 kg de complexe flavonoïde-ammonium sec sont dispersés dans 250 litres de méthanol anhydre de teneur en inférieur à 2 /oo, et placés dans un réacteur chauffant muni d'un agitateur et d'un condensateur à reflux. On ajoute 5 litres d'acide formique et on chauffe à reflux pendant une demi-heure. Après refroidissement et décantation, on soutire et filtre le solvant. On percole ensuite à un débit de 100 litres par heure sur une colonne contenant 50 litres de résine Bio-Rad AG 11 A8 retardatrice d'ions, préalablement rincée à l'eau désionisée et équilibrée en présence de méthanol anhydre. La solution imprégnant la résine de la colonne est déplacée au moyen de 25 litres de méthanol anhydre et la solution est ensuite concentrée sous vide de 10-20 torrs de façon à réduire son volume à 75 litres, puis répartie sur les plateaux chauffants d'une étuve à vide. On sèche sous vide de 10-20 torrs en ne dépassant pas la tem pdrature de 500C en fin de cycle, température effectivement mesurée dans le produit. Le vide dtant cassé à l'azote, on recueille ainsi 20 à 23 kg de poudre suivant la nature de ltextrait de Citrus de départ. Ce produit final titre au moins 95 ffi de flavonoIdes et répond par sa composition à la définition du produit désigné par la propharmacopée comme "Citroflavonotdes", mais il s'agit là de citro flavonoSdes très purifiés puisque les citroflavonoides fabriqués suivant les procédés connus titrent à 25 % de flavonoIdes. Ces citroflavonoedes de degré supérieur sont utilisables directement en thérapeutique humaine ou encore pour la synthèse de dérivés. EXEMPLE 2 1000 kg de baies immatures de Rhamnus Amygdalinus sont broyés Jusqu'à une granulométrie de 1 à 2 mm dans un moulin en métal inoxydable et reçus à la sortie du broyeur dans 500 litres d'eau à 950C. Le mélange eau-baies broyées est maintenu à cette température par inJection directe de vapeur filtrée et déshuilée. La masse est ensuite chargée dans un percolateur de 2000 litres calorifugé, et la percolation a lieu sous pression avec 2000 litres d'eau à 1100C. Le Jus sortant du percolateur est détendu et immédiatement refroidi jusqu'à 2OOC dans un échangeur à plaque puis concentré sous vide de 10-20 torrs, à une température maximale de 400C de façon à en ramener le volume à 1000 litres. Après centrifugation et filtrage le concentré obtenu contenant environ 10 % de matières dissoutes, présente un pH compris entre 5,5 et 6,0. Ces 1000 litres d'extraits sont traités exactement comme les 1000 litres d'extraits de l'exemple précédent, en respectant toutes les conditions opératoires jusqu'au stade de l'atomisation et lyophilisation qui fournit 80 à 100 kg de poudre. La poudre obtenue est dispersée dans 1000 litres de méthanol, ou éventuellement isopropanol, et le tout chauffé à reflux sous agi ta- tion pendant une demi-heure. Après refroidissement et décantation on soutire et filtre le solvant que l'on admet dans une cuve munie d'un agitateur et d'un disperseur de gaz en métal inoxydable poreux, à sa partie inférieure. On injecte par le poreux environ 3 kg de gaz ammoniac desséché comme dans l'exemple précédent, ce qui provoque l'apparition d'un précipité de couleur jaune-orangé. Le précipité essoré et lavé sur essoreuse par 1000 litres d'alcool frais est séché en une étuve à vide comme précédemment en observant les mimes précautions. On obtient ainsi 40 à 50 kg de complexe flavonotdes-emmonium sec de teneur minimale 90 % en dérivés du kaempférol, et qui peut éga liement être utilisé directement en thérapeutique humaine. 25 kg de ce complexe flavonoTdes-aimonium sont traitée par le méthanol et l'acide formique comme il a été décrit dans l'exemple 1, en vue de dissocier le complexe pour en libérer les flavonotdes. On obtient 23 à 24 kg de poudre titrant 96 à 98 % de n avonot- des principalement : kaempférol, méthyl 7 -kaempférol, méthyl-quercetène, quercetol, sous forme aglycones ou hétérosides, ainsi que des traces d'anthraquinones. Cette poudre est utilisable en thérapeutique humaine et pour la préparation de dérivés de synthèse. Elle peut encore autre utilisée comme colorant dans l'industrie alimentaire. L'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits lassis englobe toute variante. REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation et de purification de flavonotdee à partir d'extraits végétaux flavoniques bruts, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de traitement suivantes déminéralisation desdits extraits, dessication des extraits démi ndralisés, dispersion du produit désséché dans un solvant organique anhydre, formation au sein de la solution anhydre de complexes am montés insolubles de flavonotdes et régénération des flavonordes à partir desdits complexes anoniés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit solvant organique anhydre contient au moins un alcool et/ou au moins une cétone ou leurs mélanges. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit alcool est choisi dans le groupe comprenant : le méthanol, 1'méthanol, l'isopropanol et en ce que oea teneur en eau est inférieure à 1 0/oc 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite cétone est l'acétone de teneur en eau inférieure à 1 0/cl. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précéden- tes, caractérisé en ce qu'on fait précipiter les complexes ammonites de flavonoIdes par barbotage de gaz ammoniac désséché sur tamis moléculaire. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la régénération des flavonoides consiste à dissocier les complexes ammonites formés, par des acides et/ou des échangeurs d'ions. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit acide est l'acide formique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la déminéralisation a lieu sur résines échangeuses d'ions et en ce que la dessication consécutive est obtenue par congélation et lyophilisation ou atomisation. 9. Composition pharmaceutique comprenant dans sa formulation des dérivés ammoniés de flavonoides ou des flavonoides eux-mêmes obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. Colorant alimentaire à base de flavonoides purifiés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.