FR 2236937 A1 19750207 FR 7324404 A 19730703 La présente invention concerne un procédé pour l'obtention de masses biologiques purifieespar culture aérobie de micro-organismes sur une base faite d'hydrocarbures comme source unique de carbone, en présence dQun milieu nutritif aqueux-et dun gaz renfermant de l'oxygène libre On connalt toute une se rie de procédés dans lesquels la culture de micro-organismes pour la production de masses biologiques se fait en présence de deux phases liquides, en particulier une phase liquide qui renferme, outre les micro-organismes luron cultive, les con-stituants nutritifs et les traces de sels en solution aux concentrations connues, ainsi qu'une phase hydrocarbure qui constitue la source unique de carbone1 renfermant des hydrocarbures pariffiniques à chaîne linéaire de la longueur préférentielle C1OO.OOO C229 isoles, en relations les uns avec les autres, ou qui est constituée par eux On préfère, comme source de carbone, utiliser une fraction d'huile minérale, par exemple du carburant pour Diesel, qui renferme les hydrocarbures paraffiniques sus-mentionnes en quantité suffisante pour la croissance des micro-organismes. En général le milieu de fermentation est constitue par une émulsion huile dans eau dans laquelle sont dispersées, en plus, des cellules, ainsi que des bulles d'air renfermant de l'oxygène Un procédé particulièrement avantageux pour la culture de micro-organismes consiste à ajouter des produits tensio-actifs comme produits accessoires de fermentation. On utilise en particulier les produits tensio-actifs suivants esters diacides gras, dérivés diamides d'acides gras, alcools gras ethoxyles, éther alcoy-l-polyoxyéthylénique et éther alcoyl- laryl-polyoxyethyléniqueO Ces auxiliaires de la fermentation sont ajoutés au milieu-de fermentation à raison de 0,001 à 1,0 % en poids. La fermentation se fait de la façon connue. Le produit de fermentation ainsi obtenu, dans lequel les cellules des micro-organismes montrent une grande affinité pour les gouttes d'huile adhérentes, ce qui provoque la formation et la flottation de conglomérats de cellules, gouttes d'huile, bulles de gaz et solution nutritive aqueuse, doit être traité ensuite au cours d'une opération consécutive pour l'obtention de la masse biologique. Pour ce traitement on connait des procédez dans lesquels la séparation de 1émulsion se fait de préférence par centrifugation au moyen de separateurs. Selon le degré de.pureté exigé du produit final, on fait suivre cette première séparation de toute une série d:opérations de lavage et de séparation, on extrait ensuite le produit et on le sèche. Un procédé particulièrement efficace de purification de la masse biologique cultivée, consiste à ajouter des agents tnesio-actifs pour améliorer la séparation des phases de l'émulsion en ses constituants t micro-organismes, eau et huile. On utilise ici des combinaisons de deux agents tensio-actifs non ionogènes ou d'un agent tensio-actif non ionogène et d'un agent tensio-actif anionique, ou encore d'un agent tensio-actif anionique et d'un agent cationique. Les combinaisons de deux agents tensio-actifs non ionogènes sont composées de produits d'addition de l'oxypolyphénoléthylène et de monoéthanolamide de l'oléine, ou d'un résidu de distillation d'acides gras de longueur de chalne C12... C18; l'amélioration du fractionnement des phases lors de la séparation se produisant à température élevée9 de préférence à 40 à 600C. On peut mentionner comme combinaison d'agent tensio-actif non ionogène et d'agent tensio-actif anionique, le mélange. d'oxyde de polyphénoléthylène et dgun alcool gras éthoxylé et sulfaté. Cette combinaison agit également à température élevée. A température ambiante, la séparation se fait au moyen de la combinaison d'un agent tensio-actif anionique et d'un agent tensio-actif cationique, en l'espèce le monosulfonate alcoyle et l'hydrochlorure de lauryl-amido-thylpyridinium, respectivement le méthosulfate d'une amine grasse quaternaire. Dans tous les cas la quantité totale d'agents tensio-actifs ajoutée ne dépasse pas 0,15 % pondéraux, de préférence moins de 0,1 % pondéral, rapporté à l'émulsion à séparer. Le procédé de culture de micro-organismes a l'inconvénient que les produits tensio-actifs utilisés sont modifiés plus ou moins, ou même totalement décomposes par les micro-organismes, ce qui leur fait-perdre leurs propriétés d'agir sur les surfaces de sorte que même avec récupération de toute l'eau de traitement dans la fermentation, le procédé devient moins avantageux par les appoints cpnstants en agents-tensioactifs nécessités par la consommation ou la destruction de cteux-ciO La fermentation aérobie nécessita un vif courant de gaz a travers le milieu de fermentation et par l'action des agents tensio-a.ctifs utilisés, de sorte qu'il se forme des mousses qui ne se détruisent que difficilement et provoquent une flottation des conglomérats cités composés de cellules, gouttes dhuî1e, bulles-de gaz de fermentation et solution nutritive aqueuse. Les micro-organismes renfermés dans la mousse ne peuvent plus être alimentés de façon adéquate en oxygène, substrat et sels, ce-qui diminue le rendement temps volume. Les agents tensio-actifs utilisés lors de la fermentation ont la propriété de former des émulsions huile dans eau stables quil est difficile de casser lors de la séparation et seulement en mettant en oeuvre des moyens teçhniques supplémentaires La couche limite d'agents tensioactifs qui stabilise les gouttes d'huile freine, en fonction de la concentration et de la nature de l'agent tensio-actif, partiellement le transfert de matière des hydrocarbures paraffiniques aux micro-organismes et par là leur alimentation par la source de carbone qui leur est nécessaireO Cet effet ne permet pas aux agents tensio-actifs sus-nommés d'exercer pleinement leur action stimulante. Certains agents tensio-actifs exercent une action variable, suivant la culture- de micro-organismes utilisés, sur la structure et le comportement à la perméation des membranes des cellules. On sait qu'on utilise de telles modifications de la perméation d'une partie pour l'obtention de matières intracellulaires5 et que par ailleurs elles sont indésirables lors de la fabrication de protéine cellulaire de haute qualité, parce qu'elles amènent à une diminution de la qualité de la masse "biologique produite. Si le procédé de séparation de l'émulsion est exécuté au moyen de séparateurs avec addition d'une combinaisonde deux agents tensio-actifs non ionogènes, il faut procéder à la séparation à une température plus élevée, de préférence entre 40 et 60 C car la combinaison en question ne-présente aucun effet de séparation à la tempe rature ordinaires Comme dans ce procédé, la majeure partie de la solution nutritive aqueuse est séparée avant la séparation proprement dite, par utilisation préférentielle de l'effet de remontée des conglo méats la proportion des hydrocarbures- non transposés augmente notablement dans le produit à traiter A condition que la température sont plus haute, la teneur en huile, élevée et que l'étage de séparation soit l'état anaérobie, les cellules absorbent encore du carbone, mais ne sont pas en état d'assurer la conversion microbienne. Les-hydrocarbures ainsi accumulés par les cellules des micro-organismes doivent être éliminés de la masse biologique par des procédés ultérieurs, par exemple par extraction. En raison de l'incidence thermique lors de la séparation, une diminution de la qualité de la masse biolo- gique est causée par une dénaturation partielle, l'extraction intensive aux solvants indïspensable ajoute une nouvelle perte en substances intracellulaires précieuses. Par ailleurs, les hydrocarbures non consommés et qui doivent être séparés, sont souillés, dans les conditions indiquées de contact intime avec les cellules des micro-organismes à température élevée, par absorption de substances intracellulaires solubles dans l'huile comme par exemple les trigycérides, la stéarine etc.... La fraction restante d'hydrocarbures subit une contamination supplémentaire par les agents tensio-actifs non ionogènes qu'on a ajoutés du fait que l'échauffement du produit avec déshydratation partielle-simultanée conduit à un enrichissement prononcé en agents tensio-actifs non ionogènes de la phase huileuse. Par ces impuretés, des émulsions eau dans huile sont stabilisées dans l'hydrocarbure non converti, ce qui met en question la valeur d'utilisation de ces fractions d'hydrocarbures. Tous les agents tensio-actifs non ionogènes, ajoutés dans ce procédé-pour la séparation, restent, ou dans la masse biologique, ou dans l'hydrocarbure non converti; ils ne sont donc pas recyclables dans le processus et doivent faire en permanence l'objet de nouvelles additions, ce qui rend le procédé très onéreux. De même l'énergie thermique amenée au produit n'est récupérable que partiellement en raison des mauvaises caractéristiques de transmission de chaleur et des différences de température relativement faibles, de sorte les dépenses en énergie sont considérables. Si l'opération de séparation de l'émulsion est effectuée au moyen de séparateurs avec addition de la combinaison décrite de l'agent tensio-actif non ionogène produit d'addition d'oxyde de polyphénoléthylène et de l'agent tensio-actif anionique alcool gras éthoxylé, sulfaté, on rencontre les mêmes inconvénients que dans le cas des agents tensioactifs non ionogènes en raison de liélévation de la température à au moins 400C nécessaire.Les alcools gras éthoxylés sulfatés présentent une forte tendance à former des mousses et une sont dégradables que partiellement par les micro-organismes qu'on veut cultiver, de sorte que lors du retour de la phase aqueuse séparée dans la phase de séparation dans le fermenteur, on rencontre des problèmes difficilement maîtrisables de mousses, d'instabilités hydrodynamiques et, finalement de diminution du rendement volume-temps. De plus les deux agents tensio-actifs peuvent amoindrir l'action stimulatrice de l'agent tensio-actif ajouté à la fermentation, s'ilsretournent dans le circuit. Si, pour ces raisons, ce retour de l'eau de traitement au fermenteur est exclu, le procédé devient très onéreux par le prix de l'eau et des eaux usées. Si l'opération de séparation de l'émulsion est effectuée au moyen de séparateurs avec addition d'une combinaison d'un agent tensio-actif anionique et d'un agent -tensio-actif cationique, la séparation peut s'effectuer à la température ambiante. Un retour de l'eau de séparation renfermant les agents tensio-actifs à la fermentation est exclu en raison de l'action fortement toxique des agents tensio-actifs cationiques sur les micro-organismes .Dans ce procédé également, les agents tensio;actifs utilisés doivent être renouvelé constamment et par ailleurs l'économie du-procédé est affectée par le coût de l'eau et celui des eaux usées Tous les agents tensio-actifs utilisés jusqu'a présent, seuls ou en combinaison, ont l'inconvénient de ne pouvoir servir efficacement que pour la fermentation ou pour la séparation de sorte que, pour llobtention de la masse biologique, on doit avoir recours à deux procédés séparés non accordés l'un à l'autre. L'invention a pour but de lier la phase de fermentation et celle de la séparation, un cycle de processus homogène et d'augmenter le rendement par temps-volume. Ltinvention a pour but de résoudre le problème de la mise au point d'un procédé réunissant en une seule opération les deux étapes fermentation et séparation par l'emploi de combinaisons adaptées d'agents tensio-actifs, agissant efficacement tant au cours de la fermentation que lors de la séparation. On a trouvé que l'utilisation d'une combinaison d'agents tensio-actifs constitué d'un agent tensioactif non ionogène du type produit d'addition oxyde d'éthylèneoxyde de propylène et d'un agent tensio-actif anionique du type des alcoylsulfonates de sodium ou des alcoylsulfates de sodium augmente le rendement en temps-volume lors de la préparation de masses biologiques par voie microbienne à partir d'hydrocarbures. L'agent tensio-actif non ionogène du type produit d'addition oxyde d'éthylène-oxyde de propylène exerce son. effet de préférence lors de la fermentation; il est bien soluble dans l'eau et il est ajouté sous forme de solution aqueuse au milieu de fermentation conjointement avec les autres produits de départ et les produits auxiliaires. Par ce moyen on obtient, tout en maintenant constants les autres paramètres de fermentation tels que chargement, intensité du courant gazeux et autres, une croissance plus forte des cellules que dans les fermentations avec agents tensio-actifs connues, ce qui équivaut à une augmentation correspondante du rendement par temps-volume. On ajoute au fermenteur une quantité d'agent tensioactif non ionogène telle que sa concentration dans la phase aqueuse du milieu de fermentation soit d'au moins O,lg/kg. L'action des produits d'addition oxyde d'éthylène-oxyde de propylène dépend de façon décisive de la longueur de chaîne et du rapport des deux composants, oxyde d'éthylène et oxyde de propylène. Les meilleurs rendements en tempsvolume ont été obtenus avec des produits d'addition composés de 15 à 20 molécules d'oxyde de propylène et 25 à 30 molécules d'oxyde d'éthylène, ce qui correspond à un poids moléculaire moyen de 1750 à 2250. Ces produits d'addition sont préparés d'une façon connue. Ces produits d'addition ne sont pas toxiques pour les micro-organismes à cultiver meme si on opère à des concentrations élevées en agent tensio-actif en solution aqueuse, de sorte qu'une régulation du processus en ce qui concerne le dosage de l'agent tensio-actif n'est pas nécessaire. De plus, ces agents tensio-actifs non ionogènes du type produit d'addition oxyde de propylène-oxyde d'éthylène ne sont pas irritants pour les micro-organismes de sorte qu'iln"y a pas de déversement de substances intracellulaires dans la solution nutritive aqueuse environnanteç Par ailleurs ces produits d'addition ne sont pas dégradés par les micro-organismes qu'on cultive; ils ne sont pas non plus modifiés dans leur structure chimique, seule une faible partie des agents tensio-actifs est retenue par absorption sur les micro-organismes et doit donc être remplacée continuellement. L'action des agents tensio-actifs non ionogènes dans la fermentation se manifeste par l'établissement au degré optimum dedispersion de toutes les phases dispersées. Ainsi la phase gazeuse nécessaire à la fermentation aérobie est divisée en bulles de gaz extremement petites ce qui entraîne une augmentation sensible de la vitesse d'échange de l'oxygène avec les micro-organismes. Delta même façon, on obtient une dispersion stable, de la- phase hydrocarbure, suffisante pour une alimentation adéquate des micro-organismes en C, et qui ne crée par de difficultés lors de la séparation ultérieure des phasesO-Grace à -ce pouvoir dispersant des produits d:addition oxyde de propylène-oxyde d'éthylène, les conglomérats mentionnés plus haut sont fractionnés, ce qui diminue leur tendance à émerger prématurément au cours de la fermentation et garantit une bonne homogénéité du milieu de fermentation.Tous ces effets amènent une meilleure alimentation des micro-organismes par les constituants nécessaires à leur croissance ,G oxygène, hydrocarbures paraffiniques ainsi- que les sels nutritifs et les- sels à l'état de traces, et, par là5 une augmentation de la vitesse de croissance. Le liquide aqueux alimentaire épuisé -est séparé du milieu de fermentation prélevé du fermenteur par utilisation de la différence naturelle de densité, de façon connue. Ce liquide nutritif aqueux séparé renferme la majeure partie des agents tensio-actifs non ionogènes et il est ramené dans le fermenteur. Le produit restant se compose, en partie, de solution nutritive aqueuse épuisée et des agents tensioactifs non ionogènes quelle renferme, de la totalité des hydrocarbures non convertis et de la masse biologique produite. Le produit ainsi obtenu peut être séparé par addition de 0,1 à 5,0 g/kg d'un agent tensio-actif anionique du type alcoylsulfonate de sodium de longueur de chaîne C12.000 C20, ou du type alcoylsulfate de sodium-, à température ordinaire, en ses trois phases- : fraction hydrocarbures, fraction solution nutritive aqueuse, et fraction cellules de micro-organismes,-' dans le champ de gravitation. immédiatement après-addition-de l'agent tensio-actif anionique, il se produit une diminution rapide de la viscosité du produit, de sorte que ce produit présente des propriétés rhéologiques considérablement améliorées et un pouvoir de séparation extrêmement favorable.Ces propriétés positives du produit ainsi traité sont obtenues par l'action combinée de l'agent tensio-actif anionique et l'agent tensioactif non ionogène qui. est resté dans le produit. Elles permettent une separation complète des phases par séparation à la température ordinaire. L'opération de séparation s'effectue de la façon connue; soit comme séparation de trois phases unique, soit par la succession de deux séparations de deux phases. Dans ce dernier cas on séparera de préférence d'abord l'hydrocarbure non transformé, et ensuite- la solution nutritive épuisée aqueuse des cellules des micro-organismes. La phase aqueuse épuisée, isolée lors de la séparation, qui renferme l'agent tensio-actif non ionogène et l'agent tensio-actif anionique est ramenée, comme deuxième eau de retour, au fermenteur. On a été surpris de constater, lors de cette opération, que bien qu'on conserve la pleine capacité de transfert du système de fermentation, une action marquée de suppression de la mousse se produit du fait de la combinaison d'agents tensio-actifs ionogènes et non ionogènes. Cette action destructrice de mousse devient particulièrement active, si on alimente le fermenteur en deux endroits séparés dlun côté avec la première eau de retour, obtenueaen mettant à profit la différence de densité naturelle, et renfermant la majeure partie de l'agent tensio-actif non ionogène, et d'un autre côté la deuxième eau de récupération; obtenue lors de la séparation et renfermant les agents tensio-actifs non ionogènes et anioniques.- -Cette réintroduction Se fait de préférence près du fond du fermenteur pour la première eau de retour, et à la surface du milieu de fermentation pour la deuxième eau de récupération.Au cours d'une certaine durée de séjour, l'agent tensio-actif anionique est dégradé par les micro-organismes et doit par conséquent être rajoute pour rétablir la concentration indiquée avant le début.de la sépara tion. Les pertes en agents tensio-actifs non iono-gènes inhérentes au procédé, peuvent être compensées à un endroit quelconque du circuit d'opération, de préférence à 17entrée au fermenteur Ltavantage de l'invention estbasé sur le fait que l'agent tensio-actif non ionogène agit surtout au cours de la fermentation, mais exerce également une action très favorable sur le comportement à la séparation du produit qui sort de la fermentation en combinaison avec 19agent tensio actif anionique, et que, par ailleurs l'agent tensio-actif anionique devient surtout actif lors de la séparation, mais agit également lors de la fermentation comme inhibiteur de mousse. L'application du procédé selon l'invention présente l'avantage que l'effet dFaccroissement remarquablement grand du rendement entemps-volume, provoqué par agent tensio-actif) non ionogène peut être combiné à d'autres moyens d'intensification du processus de fermentation, par exemple à l'augmentation de la quantité de matière introduite ou à l'élévation de la pression partielle d'oxygène du gaz qui alimente le fermenteur; les-effets des mesures prises selon l'invention s'additionnent à celles connues. La masse biologique ainsi obtenue se -caractérise par la haute qualité des protéines, elle ne renferme Que de faibles quantités dlagent tensio-actif et- de restes d'hydrocarbures a adhérents. Ceci est obtenu du fait que les temps de contac-t avec la phase hydrocarbures au cours de la séparation sont peu prolongés et que tout traitement thermique est exclu Pour l'élimination des faibles restes d'hydrocarbures, une extraction aux solvants de courte durée suffit. Un autre avantage du procédé selon liinven- tion consiste dans les très bonnes qualités d'utilisation du mélange d'hydrocarbures non utilisé. Quand on les sépare immédiatement, sans traitement intermédiaire en présence de cellules de micro-organismes,les hydrocarbures ne renferment pas ou seulement de très faibles quantités d'agents tensioactifs et de substances intracellulaires, ce qui exclut les troubles par formation d'émulsions stables eau dans huile. Du fat que le circuit de la phase aqueuse renfermant les agents tensio-actifs non ionogènes est fermé la quantité d'eaux usées est faibles De plus l'utilisation du procédé selon l'invention se caractérise par une consommation d'eau moindre et une économie en dépenses pour l'énergie. L'invention est expliquée ci-dessous par deux exemples d'application. EXEMPLE 1 Dans un récipient à fermentation d'un volume brut de 5P0 1, équipé d'un agitateur efficace et d'un dispositif d'introduction d'air dans le fond du récipient, on cultive en continu une levure du genre Candida lipolytica. Dans le récipient de fermentation se trouvent 200 kg de milieu de fermentation renfermant, outre les micro-organismes, une solution aqueuse nutritive ainsi qugune fraction hydrocarbure. Ce milieu de fermentation occupe un volume d'environ 400 1 dans le récipient de fermentation en raison des bulles de gaz qui y sont accumulées, ce qui correspond à une densité moyenne d'environ 500 kg/m3. Le dosage continuel de toutes les matières premières et produits accessoires s'effectue en quantités telles, que la durée de séjour moyen du milieu de fermentation est de 4 h, ce qui veut dire que l'alimentation totale est de 50 kg/h. On ajoute en continu une quantité de 10 kg/h de carburant Diesel dans le récipient de fermentation de sorte que la fraction représentant la phase huileuse dans le milieu de fermentation est de 20 % en poids. Le carburant Diesel utilisé distille entre 200 et 2800 C et a un point de figeage de -50C; il renferme dans la proportion de 15 % en poids des hydrocarbures paraffiniques en -chaîne droite dé C1OOOOO C22 nécessaires à la croissance des micro-organismes en tant que source de carbone. Dans un recipient à solution nutritive pourvu d'un agitateur et d'un volume de 200 1 brut, on prépare en discontinu le concentrat nutritif nécessaire à la croissance des micro-organismes par dissolution des sels nutritifs et des olégo-éléments , dans de lveau pure. Ce concentrat de solution nutritive renferme les constituants inorganiques mentionnés ci-dessous aux concentrations suivantes NH4Cl 5,0 g/kg H3PO4 7,5 g/kg EC1 5,0 g/kg MgS04 0 7 H20 2,5 g/kg FeCl3 0,06 g/kg ZnS04 . 7 H20 0,10 g/kg MnSO4 . 4 H20 0,10 g/kg CuSO4 . 5 H20 0,01 g/kg L'addition de ce concentrat de solution nutritive dans le récipient de fermentatioh se fait de façon continue à raison de 6 kg/h. Les besoins restants pour le maintien d'une durée de séjour de 4 H en moyenne, sont couverts par de l'eau de récupération des opérations suivantes, soit 34 kg/h. Par une régulation adéquate du processus, la température de fermentation est maintenue à 320 C; la valeur du pH de la solution aqueuse est maintenu à 4,5 par dosage d'eau ammoniaquée et la masse de remplissage est maintenue -constante à 200 ka. Par l'agitateur, on introduit dans le milieu de fermentation une puissance de 1 kW; le débit d'air est de 20 m3/h. La phase aqueuse du milieu de fermentation renferme un agent tensio-actif non ionogène du type produit d'addition oxyde de propylène-oxyde d'éthylène composé, en moyenne, de 17 molécules d'oxyde de propylène et de 22 molécules d'oxyde d'éthylène, préparé de façon connue par polyaddition, a une concentration de-0,4 g/kg. A cette concentration de 19agent tensio-actif, la tension superficielle de la solution nutritive aqueuse est d'environ 40 dyn/cm. La quantité d'agent tensioactif non ionogène nécessaire pour le maintien de cette concentraction, de 3 à 4 g/h, est renfermée dans le concentrat de sels nutritifs et elle est complétée continuellement. On prélève en continu 50 kg/h de milieu de fermentation dans le fermenteur; celui-ci- contient, à côté du carburant Diesel déparaffiné et de la solution nutritive aqueuse épuisée, les cellules de levure cultivées à une concentration de 16 g HTA/kg, ce qui correspond à une productivité (rendement temps-volume) de 4 g-HTS/kg/h. Le milieu de fermentation prélevé du fermenteur est amené- en continu à un séparateur. Dans. ce récipient de séparation, on separe le milieu de fermentation en deux couches, en mettant à profit l effet naturel d:émergence des flocons, après une période de tranquillisation de 20 minutes. La couche inférieure est constituée essentiellement par la solution nutritive aqueuse épuisée et renferme l'agent tensioactif non ionogène. Elle est ramenée dans le fond du récipient de fermentation à raison de 25 kg/h de façon continue et constitue la première eau de récupération. Le produit restant, renfermant la masse biologique cultivée, le carburant Diesel usé ainsi que des restes de phase aqueuse adhérente, est conduit dans un séparateur à trois phases. Avant la séparation, on ajoute au produit un agent tensio-actif anionique du type alcoylsulfonate de sodium dont la longueur de chaîne est de 14 à 18 atomes de C, à une concentration de 0,25 g/kg, en solution aqueuse, ce qui permet d'obtenir un abaissement considérable de la viscosité. Dans un séparateur à trois phases le produit ainsi préparé est séparé complètement, en une opération, en ses trois constituants. La phase légère est composée du carburant Diesel déparaffiné séparé et représente une quantité de 8 kg/h. Celui-ci renferme encore des traces des agents tensio-actifs ajoutés et il est absolument exempt de gouttelettes émulsionnées. Cette fraction hydrocarbure est composée encore d'environ 5 % en poids d'hydrocarbures paraffiniques, elle a un point de figeage de -200 C et peut être utilisée sans autre traitement comme carburant Diesel. La phase moyenne est composée en majeure partie des agents tensio-actifs anioniques résiduels ainsi que des agents tensio-actifs non ionogènes restants. De plus cette phase moyenne dont l'importance est de 9 kg/h renferme environ 1 % en poids de carburant Diesel émulsionné et des quantités insignifiantes de cellules de levure. Cette phase moyenne est réintroduite comme 2ème eau de récupération en haut du récipient à fermentation. En répartissant régulièrement cette phase moyenne sur la surface du milieu de fermentation, on obtient une diminution marquante de la mousse dont il ne reste que des quantités insignifiantes. On recueille comme phase lourde dans le séparateur à trois phases, une bouillie de levures à une concentration de il à 12 % de levure sèche, pesant 7 kg/h et renfermant en outre environ 0,5 % en poids de ca-rburan-t Diesel adhérent. Cette bouillie de levures est amenée tout d'abord à un séchoir à cylindres où elle est sechée jusqu'à une teneur en ea-u de 10 % en poids. Dans le dispositif suivant d9extrac- tion aux solvants, se forme un-produit final en quantité de 0,8 kg/h qui est un concentrat de protéines renfermant--de- 55 à 60 % en poids de protéine brute et des restes d'hydrocarbures à raison de 0,1 % en poids. Dans l'ensemble du processus, la-récupération de la phase aqueuse se fait à 85 %, les pertes en agents tensio-actifs, non ionogènes sont également faibles. L'agent tensio-actif anionique.est complètement décomposé par les micro-organismes lors de son retour au récipient de fermentation et on doit en rajouter constamment en quantité voulue En l'absence d'agent tensio-actif non ionogène dans le récipient de fermentation, en respectant tous les autre-s paramètres de la fermentation, on n'a obtenu que des concentrations en mas-se biologique de 10 g HTS/kg9 co-rrespondant à une pro-ductivité de 2,5-g HTS/kg/h seulement Ceci veut dire que l'introduction de l'agent tensio-actif non ionogène dans la fermentation, provoque un accroissement-de la vitesse de croissance des cellules de levure et du rendement en temp.s-volume de 60 5'. EXEMPLE 2 Dans un récipient de fermentation dun volume trut de 25QO. l muni d'un système d'agitation puissant et d'un dispositif d'entrée d'air par le fond, on cultive en continu une levure du genre Candida guillermondi sur une n-paraffine.comme. source de C. Dans le récipient de fermentation se -trouvent lOaO kg d'un milieu de fermentation composé de cellules de levure, d'une solution nutritive aqueuse ainsi que d'hydrocarbures, occupant un volume. d'environ 2Q00. 1 et ayant une. densité moyenne de 500 kg/m? environ. Le dosage en continu de toutes les matières premières et adjuvants introduits dans le récipient de fermentation se fait en quantités telles que la durée de séjour moyenne du milieu de fermentation est de 3,4 heures, ce qui correspond à un.débit de passage de 300 kg/h. Comme unique source de carbone, on utilise de l'huile de paraffine, composée uniquement d'hydrocarbures paraffiniques en chaîne linéraire de C.2..... C 18 Cette huile de paraffine est introduite en continu dans le récipient de fermentation à raison de 20 kg/h, la quantité totale d'huile de paraffine se composant de 12 kg/h huile fraîchement introduite et de 8 kg/h d'huile de ré-cupération provenant de la séparation. Dans un récipient à solution nutritive équipé d'un agitateur d'un volume brut de -200 1 on prépare de façon discontinue le concentrat de sels nutritifs nécessaire à la croissance des micro.-.organismes par dissolution des sels nutritifs et oligo-éléments appropriés dans de l'eau pure. Le concentrat renferme les constituants inorganiques énumérés ci-dessous avec leur concentration: NH4C1 -5,0- g/kg H3P04 11,0 g/kg KC1 7,5 g/kg MgSO4 . 7 H20 4,0 g/kg FeS04 0,' g/kg Zens04 0 7 H20 0,2 g/kg MnSO4 4 H20 0,2 g/kg CuSO4 e 5 H20 0,02 g/kg L'addition de ce concentré de sels nutritifs se fait en continu dans le récipient de fermentation à une vitesse de dosage de 50 kg/h. Les besoins restants en eau, pour maintenir la durée moyenne de séjour de 3,4 heures, sont de 230 kg/h.et sont couverts par les eaux de récupération des stades suivants du procédé. Par une régulation adéquate du procédé, la température de fermentation est maintenue à 32C C, le pH a 4,5 au moyen d'eau ammoniacale, et la masse de remplissage du récipient de fermentation à 1020 kg. Par le dispositif d'agitation on introduit dans le milieu de fermentation une puissance de 7 kW. La quantité totale de gaz, introduite dans le fermenteur par le dispositif de passage d'air, est de 80 m3/h. Elle se compose de 50 m?/h d'air et de 30 m3 d'oxygène pur. Les deux gaz sont mélangés avant leur introduction dans le récipient de fermentation, de sorte que la quantité d'oxygène dans le gaz introduit est d'environ 50 % en volumes. La phase aqueuse du milieu de fermentation renferme, à une concentration de 0,5 g/kg, un agent tensio-actif non ionogène du type produit d'addition oxyde de propylèneoxyde dPethylène, composé, en moyenne, de 15 molécules d'oxyde de propylène et 23 molécul.es d'oxyde dUéthylèneg et préparé par polyaddition de façon connue, ce qui donne une tension superficielle de la solution aqueuse environ 39 dyn/cm. La quantité de 35 .... 40 g/h d'agent tensio-actif non ionogène nécessaire au maintien de cette concentration est amenée sous forme de solution aqueuse en continu au récipient de fermentation par une conduite deeau de récupération. On prélève, de façon continue9 300 kg/h dans le récipient de fermentation. Ce milieu de fermentation prélevé renferme, à côté d'un reste de 2,7 % en poids environ d'huile de paraffine non utilisée et de la solution nutritive aqueuse épuisée, les cellules de levure cultivée à une concentration -de 34 g HTS/kg, ce qui correspond à une productivité de 10 g HTS/kg/h. Le milieu de fermentation, prélevé en continu dans le récipient de fermentation, arrive dans un séparateur où, après un temps de tranquillisatXon-de 20 minutes en moyenne, il est séparé en-deux couches en utilisant l'effet naturel d'émergence des flocons La couche inférieure, composée essentiellement de la solution nutritive aqueuse -avec l'agent tensio-actif qu'elle renferme, est ramenée, en continu, à raison de 170 kg/h, au fond-du récipient de fermentation. Le produit restant, renfermant la masse biologique cultivée, l'huile de paraffine non utilisée, ainsi que la pha-se aqueuse adhérente, est amene en continu à raison de 13D kg/h à un séparateur à-deux phases. On ajoute au produit avant son introduction dans le séparateur, un agent tensio-actif anionique du type des alcoylsulfonatés de longueur de chaîne C10GOOO Cl6 à la concentration de 1 g/kg, en continu et en solution aqueuse, ce qui provoque une baisse sensible de la viscosité. Dans le premier séparateur à deux phases on sépare, tout d'abord, en continu9 la phase huileuse de la suspension aqueuse de levure restante. On sépare à ce moment 8 kg/h d'huile de paraffine non utilisée renfermant encore des traces d'eau et qu'on réintroduit dans le récipient de fermentation pour y servir à nouveau de source de carbone pour les micro-organismes. Comme phase leudes 122 kg/h d:une suspension aqueuse de levure à environ 7-5 5', qui renferme encore des traces d'huile- de paraffine non séparée, quittent continuellement le premier séparateur à deux pha.ses.et parviennent dans un deuxième séparateur à deux phases. Dans celui-ci s'effectue une deuxième concentration de la suspension de levure en bouillie. Lors de cette opération on sépare 60 kg/h d'eau, renfermant en plus une faible quantité de masse biologique, la majeure partie de l'agent tensio-actif anionique ajouté, ainsi que l'agent tensio-actif non ionogène restant.Cette eau de traitement est ramenée comme deuxième eau de récupération dans le haut du récipient de fermentation où elle arrive par une tuyauterie circulaire -munie de buses. Ceci assure une répartition régulière de la deuxième eau de récupération à la surface du milieu de fermentation et garantit en même temps une bonne action anti-mousse de sorte qu'on n-e décèle que peu de mousse. Une quantité de 62 kg/h de concentrat de levure à 16 % de substance sèche est évacuée en continu du deuxième séparateur à deux phases. Ce concentré de levure est introduit tout d'abord dans un sécheur atomiseur pour y être séché jusqu'à une teneur en eau de 8 5'. Lors de l'extraction aux solvants suivante on obtient le produit final 10 kg/h de concentrat dé protéines renfermant plus de 60 5' en poids de protéine brute dans la substance sèche et une teneur résiduelle en hydrocarbures de 0,1 % en poids. Dans l'ensemble du processus, la récupération de la phase aqueuse est d'environ 82 5', les pertes en agent tensio-actif non ionogène sont également faibles. L'agent tensio-actif anionique est totalement dégradé par les microorganismes lors de sa réintroduction dans le-récipient de,' fermentation et doit donc être complété à la proportion voulue. En l'absence d'agent tensio-actif non lonogène tous les autres paramètres de fermentation restant égaux, on n'a trouvé des concentrations de 20 g HTS/kg, correspondant à une productivité de 5,9 g HTS/Kg, correspondant à une productivité de 5,9 g HTS/kg. Ceci veut dire qu'on a obtenu par l'utilisation de l'agent tensio-actif-non ionogène, un accroissement de la vitesse de croissance des cellules de levure de 70 5'. Bien entendus l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 10) Procédé pour l'obtention d'une masse biologique purifiée par culture aérobie et en continu de microorganismes sur hydrocarbures constituant la source de carbone unique, en présence d'un milieu nutritif aqueux et d'un gaz renfermant de l'oxygène libre, caractérisé en ce qu'on fait passer une combinaison d'un agent tensio-actif non ionogène et d'un agent tensio-actif anionique en circuit fermé dans le milieu en fermentation et au cours de la séparation, l'agent tensio-actif non ionogène étant un produit d'addition d'oxyde de propylène et d'oxyde d'éthylène, composé de 15 à 20 molécules d'oxyde de propylène et de 20 à 25 molécules d'oxyde d'éthylène; l'agent tensio-actif anionique étant un alcoylsulfonate de sodium à longueur de chaîne C12 à C20 ou un alcoylsulfate de sodium à longueur de chaîne C1O à c î6 20) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'agent tensioactif non ionogène dans la solution nutritive aqueuse du milieu de fermentation est d'au moins 0t1 g. 3 ) Procédé selon la revendication 1, caracterisé en ce que l'agent tensio-actif non ionogène est une combinaison non dégradablé par les micro-organismes qu'on cultive. 40) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'agent tensioactif anionique, rapportée au poids du produit à purifier, est de 0,1 g/kg à 5,0 g/kg. 50) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que-l'agent tensio-actif anionique est une combinaison dégradable par les micro-organismes cultivées dans le récipient de fermentation. 60) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif anionique est ajouté immédiatement avant la séparation au produit à séparer. 70) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séparation s'effectue à température ordinaire. 80) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séparation des phases se fait au moyen d'un sépateur à trois phases en hydrocarbure, solution aqueuse de l'agent tensio-actif et cellules de micro-organismes 9") Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la phase aqueuse retourne au fermenteur. 100) Procédé selon la revendication 9, caracterisé en ce que 17agent tensio-actif anionique est ramené, de préférence par le haut, dans le récipient de fermenstation 11 ) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la phase hydrocarbure obtenue lors de la séparation est retournée au fermenteur.