FR 2234310 A1 19750117 FR 7322696 A 19730621 "Sels d'azidotrisdialkylaminophosphonium et leur utilisation comme réactifs pour couplage peptidique" (Invention : Bertrand CASTRO et Jean-Robert DORMOY) La présente invention concerne la préparation et l'utilisation comme réactifs de couplage peptidique des composés (R'R"N)3PN3, A (I) où un atome de phosphore chargé positivement est lié à un nucléofuge pseudohalogène N3 et à trois atomes d'azote provenant d'amines secondaires, où A est un anion non nucléophile tel PF6 et où R' et R" sont des groupes allyle comportant de 1 à 5 atomes de carbone ou formant ensemble un hétérocycle à un ou deux hétéroatomes et ayant 5 à 6 chatnons. tes réactifs A et 3 ont déjà été décrits, (Cf tableau II. 1) (Cf tableau II, 2) et sont utilisés en synthèse peptidique. tes sels d'azidotrisdialkylaminophosphonium de formule (I) présentent sur le produit A l'avantage d'un rendement de couplage peptidique nettement supérieur, et d'une qualité optique parfaite des peptides synthétisés. Sur le produit B ils présentent l'avantage d'une présentation sous forme de sel solide, non hygroscopique, de manipulation et conservation aisées et d'une préparation extremement aisée ne nécessitant pas de conditions opératoires délicates et particulièrement de distillation à haute température et sous vide d'un produit contenant l'enchaînement endothermique -N3 La préparation de ces sels est réalisée au moyen de la séquence suivante La réaction des sels d'azidotrisdialkylaminophosphonium sur les carboxylates d'amino acides N-protégés conduit à la formation rapide d'acylazides, dans d'excellenetes conditions, selon l'équation La réaction peut être effectuée dans la diméthylformamide, solvant dans lequel les sels d'azidophosphonium sont solubles, ce qui est extrêmement avantageux pour coupler des peptides lourds peu solubles dans d'autres solvants.L'isolement des produits formes se fait par les méthodes classiques sans difficulté particulière. La couplage s'effectue dans d1 excellentes conditions entre TIO et 00, comme en témoignent les ré tatas consignés dans le tableau ci-Joint. L'activation est effectuée sur un mono aminoacide N-protégé et utilisé en excès. Les rendements calculés sur la base du fragment C-protégé sont alors très élevés ; ils chutent par contre si les deux fragments sont utilisés dans le rapport 1/1 ; le réactif selon l'invention est donc bien adapté à la synthèse "pas à pas" de polypeptides croissant par l'extrémité basique. Aucune interférence parasite n'est observée dans l'activation de la serine, ni dans celle de l'asparagine qui, dans le cas de A est en grande partie deshydratée en cyano-3 alanine. Les tests de racémisation de YOUNG (Cf tableau II, 9), d'ANDERSON (Cf tableau II, 10) et de WEINSTEIN (Cf tableau II, ll)-ont été effectués. Dans le premier cas, réputé le plus sensible, on t obaervé un taux de racémisation inférieur à 3 ; le taux n'est pas mesurable dans le test d'ANDERSON ; il n'est pas détectable en résonnance magnétique nucléaire sur le modèle de WEINSTEIN, préparé dans les mêmes conditions. On note donc une amélioration très sensible tant en ce qui concerne les rendements de condensation que la pureté- optique des produits par rapport à ce que l'on obtenait avec le réactif A. les exemples suivants illustrent de façon non limitative, les produits selon l'invention, leur préparation et leur emploi comme réactif de couplage peptidique. Exemple i Hexafluorophosphate d'azidotrisdiméthylamino phosphonium 8 g de brome (0,05 M) sont additionnés à 8,15 g (0,05 M) de trisdiméthylaminophosphine en solution dans 200 ml d'éther anhydre. La solution est agitée magnétiquement et refroidie au bain de glace. Quelques minutes après la fin de l'addition, 9,2 g (0,05 M) de KPF6 sont introduits + en solution dans- 200 ml d'eau. L'intermédiaire PF6 , Br-P N(CH3)2 précipite 3 il.est filtré et lavé à l'eau. Aprés séchage au dessicateur, on obtient 18,4 g de produit qui est dissous dans 200 ml d'acétone (distillée sur KMri04) Aprés addition de NaN3 en excès (5 g# # 0,075 M) la solution est abandonnée une nuit sous agitation à température ambiante.NaBr formé et l'excès de NaN3 sont alors filtrés, l'acétone est évaporée sous vide et l'on obtient 14,6 g (83 % par rapport à la trisdiméthylaminophosphine de départ) de produit que lton peut recristalliser dans le mélange acétone - éther et que l'analyse montre être de l'hexafluorophosphate d'azidotrisdiméthylamino phosphonium présentant les caractéristiques suivantes F 2,79 ppm ; J = 11 Herz Le dosage du brome dans le produit, brome pouvant résulter de l'échange d'anion lors de la dernière étape (Br remplaçant PF6) a permis de deceler une trace de celui-ci, inférieure à 1,5 %. en poids. L'analyse centésimale correspond à moins de 1 X à la composition stoechiométrique. Le sel obtenu est solide (F et de conservation aisée ; il est soluble dans l'acétone, l'acétonitrile et ylformamide. Le perchlorate correspondant explose au choc même humide et ne doit pas être préparé. Exemple 2 Hexafluorophosphate d'azido-trisdiéthylaminophosphonium 8 g de brome (0,05 M) sont additionnés à 12,34 g de trisdiéthylaminophosphine (0,05 M) en solution dans 200 ml d'éther anhydre. La solution est agitée magnétiquement et refroidie dans un bain de glace. Quelques minutes après la fin de l'addition, 8,15 g (0,05 M) de NH4PF6 sont introduits en solution dans 200 mi d'eau. Sous bonne agitation, l'intermédiaire précipite ; il est filtré et lavé à l'eau puis à l'éther. Après séchage au dessicateur (sur P205) le produit est dissous dans 200 ml d'acétone (distillée sur KMn04). Après addition de Nabi en léger excès (4 gSr 0,06 M) la solution est abandonnée une nuit sous agitation à température ambiante.NaBr formé et l'excés de NaN3 sont alors filtrés, l'acétone est évaporés sous vide et l'on obtient 15,2 g (70 % par rapport à la phosphine de départ) de produit que l'on peut recristalliser dans le mélange acétone - éther et qui présente les caractéristiques physiques suivantes -1 F Exemple 3 Hexafluorophosphate d' azido-trispyrolidino phosphonium 4 g de brome (0,025 M) sont additionnés à 6,025 g de trispyrolidino phosphine (0,025 M) en solution dans 100-ml d'éther anhydre. La solution est agitée magnétiquement et refroidie dans un bain de glace Quelques minutes après la fin de l'addition 4,2 g (0,025 M) de NH4PF6 sont introduits en solution dans 100 ml d'eau. Sous bonne agitation, l'intermédiaire précipite ; il est filtré et lavé à~l'eau, puis à l'éther. Après séchage au dessicateur, le produit est dissous dans 100 mi d'acétone (distillée sur KMnO4) ; après addition de NaN3 en léger excès (2 g or 0,03 M) la solution est laissée une nuit à température ambiante sous agitation.L'excés de NaN3 et NaBr formé sont filtrés ; l'acétone est évaporée sous vide et l'on obtient 13,5 g (80% par rapport à la phosphine de départ) de produit recristallisable dans le mélange acétone - éther et qui présente les caractéristiques physiques suivantes F # 195 C ; IR : #N3 = 2178 cm-1 Exemple 4 : Hexafluorophosphate d'azido-trismorpholinophosphonium 4 g de brome (0,025 M) sont additionnés à 7,23 g (0,025 M) de tris-morpholinophosphine en suspension dans 100 ml d'éther anhydre. La solution est agitée magnétiquement et refroidie dans un bain de glace. Quelques minutes après la fin de l'addition, 4,2 g (0,025 M) de NH4PF6 sont introduits en solution dans 100 mi dteau. Sous bonne agitation, l'intermédiaire précipite ; il est filtré et lavé à l'eau puis à éther. Après séchage au dessicateur, le produit est dissous dans 100 ml acétone (distillée sur KMnO4) ; aprés addition de NaN3 en léger excès (2 g # 0,03 M) la solution est abendonée une nuit à température ambiante sous agitation.Le NaBr formé et l'excès de NaN3 sont alors filtrés, l'acétone est évaporés sous vide et l'un obtient 9,76 g (82 % par rapport à la phosphine de départ) de produit recristallisable dans le mélange acétone éther et qui présente les caractéristiques physiques suivantes F Exemple 5 Utilisation du sel d'azidotriadiméthylaminophosphonium en couplage peptidique synthèse de Bz-L-Leu-Gly-OEt A une solution de 0,822 g,de benzoyl-L-Leucine (3,75.10 3M) et de 0,379 g de triéthylamine (3,75.10-3M) dans 20 ml de diméthylformamide, maintenue sous agitation entre -10 et OaC, 1,313 g (3,75.10-3M) du réactif 1 sont ajoutés en quelques minutes.Après 30 à 45 minutes, 0,349 g 2,5.10-3M) de- chlorhydrate du glycinate d'éthyle puis 0,632 g de triéthylamine (6,25.10-3M) sont introduits. La solution est laissée 12 à 16 heures sous agitation à température inférieure à 0 C. La diméthylformamide est alors évaporée sous vide et le résidu passé sur colonne de silice en éluant à l'acétate d'éthyle pur. On obtient par recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle - éther de pétrole, 0,648 g de Bz-Leu-Gly-OEt (81 %). F = 156-157 ; &alpha;D25 33,2 (C = 3.1 ; EtOH) Il est également possible d'isoler le produit par une méthode classique. Après évaporation de la diméthylformamide, le résidu est repris à l'acétate d'éthyle. Cette phase est lavée avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3, d'HCL à 5 % puis à l'eau jusqu'à neutralité. Le solvant est alors évaporé et le produit brut est recristallisé dans le solvant adéquat. Les peptides ainsi isolés ne sont pas toujours homogènes en chromatographie sur plaque de silice. Cette méthode a été employée lorsque le peptide est élué trop lentement ; et ne peut être séparé correctement (Ex : Z-Asn-Gly-OEt). Dans la plupart des cas, le peptide synthétisé migre en tete et la chromatographie sans extraction préalable permet d'isoler un produit trés pur. De la atome façon ont été synthétisés les di et tripeptides consignés dans le tableau I. Exemple 6 Synthèse de Z-L-Met-Gly-OEt A une solution de 1,064 g de Z-L-Méthiomine (3,75.10-3 @ M) et de 0,379 g (3,75.10-3 -M) de triéthylamine dans 20 ml de diméthylformamide maintenue sous agitation entre -10 et 0 C, 1,313 g (3,75.10-3 M) du réactif 1 sont ajoutés en quelques minutes. Après 30 à 45 minutes, 0,549 g (2,5.10-3 3 M) de chlorhydrate du glycinate d'éthylè, puis 0,632 g de trièthylamine (6,25.10-3 M) sont introduits dans le mélange reactiobnel. la solution est laissée 12- à 16 heures sous agitation à température inférieure à 0 C. La diméthylformamide est alors évaporée sous vide à température inférieure à 50 C et le résidu passé sur colonne de silice on éluant à l'acétate d'éthyle pur. On obtient par recristallisation dans le mélange acétate d'éthyle - éther de pétrole 0,725 g-de Z-L-Met-Gly-OEt (92 k). F = 96-970 ; &alpha;D = -17,9 (C = 4.5 ; EtOH) Exemple 7 Synthèse de Z-L-Val-Gly-OEt 1,258 g de Z-L-Valine (3,75.10-3 M) et 0,379 g (3,75.10-3 M) de triéthylamine en solution dans 20 ml de diméthylformamide sont maintenus sous agitation entre -10 C et 0 C ; 1,313 g (3,75.10-3 3 M) du réactif 1 sont ajoutés en quelques minutes. Après 30 à 45 minutes 0,349 g (2,5.10-3 3 M) de chlorhydrate du glycinate d'éthyle puis 0,632 g (6,25.10-3 3 M) de triéthylamine sont additionnés au mélange réactionnel. La solution est laissée 12 à 16 heues sous agitation à température inférieure à 0 C. La diméthylformamide est alors évaporée sous vide à température inférieure à 50 C et le résidu est chromatographié sur colonne de silice en éluant à l'acétate d'éthyle pur, 0,816 g de Z-L-Val-Gly-OEt (97 % ) sont obtenus par recristallisation dans le mélange acétate Ci éthyle - éther de pétrole. F = 165-1670C ; 25 = 25,5 (C = 1.0 ; EtOH) Les exemples 8 à 17 dont les résultats sont rassemblés à coté des exemples 5 à 7 dans le tableau I, illustrent les propriétés de la même méthode avec le réactif de couplage peptidique, de divers di et tripeptides. L'indication sur le même tableau, des résultats obtenus dans la fabrication de ces divers produits et de ceux publiés à ce jour dans la litérature (cf, références du tableau II) montre les qualités des produits préparés selon le procédé de l'invention qui sont supérieures ou égales à celles des produits antérieurement décrits. TABLEAU I Constantes physiques des di et tripeptides péparées selon la procédé de l'invention, comparées à celles données dans la littérature pour les mêmes produits. Constantes obtenues Constates relevées dans la littérature Ex. Produit fo Rdt % Point de &alpha;D(b) C Solvent Ref. F &alpha;D C Solvant n (a) fusion 5 Bz-Leu-Gly-Oet 81 156-157 -33,2 3.1 EtOH (9) 156,5-157 -34 3.1 EtOH 6 Z-Met-Gly-OEt 92 96-97 -17,9 4.5 EtOH (3) 96-97 -18,6 4.5 EtOH 7 Z-Val-Gly-OEt 97 165-167 -25,5 1.0 EtOH (4) 164-165 -16,7 1.0 EtOH 8 Z-Als-Gly-OEt 97 98-99 -23,4 1.0 EtOH (3) 97-98 -24,0 1.0 EtOH 9 Z-Phe-Gly-OEt 93 110-112 -16,5 2.0 EtOH (3) 112 -16,7 5.0 EtOH 10 Z-Ser-Gly-OEt 81 102-104 -5,5 1.0 EtOH (3) 106-107 -5,9 1.0 EtOH 11 Z-Asn-Gly-OEt 92 188-190 -5,0 1.0 DMF (3) 188-189 -4,4 1.0 DMF 12 Z-Pro-Gly-Oet 96 huile 13 Z-Pro-Gly-OH 123-124 -63,8 5.0 MeOH (5) 122-123 -63,2 5.0 MeOH 14 Z-Gly-Tyr-OEt 84 124-126 +19,8 3.0 EtOH (6) 125-127 +19,2 3.0 EtOH 15 di-Z-N-O-Tyr Tyr-OEt 56 175-178 -8,8 1.0 EtOH (7) 178-179 16 Z-Phe-Als-Gly 86 137-139 -24,5 1.0 EtOH (8) 135-137 -26,0 EtOH OEt 17 Z-Gly-Phe-Gly 90 116-119 -12(c) 2.0 EtOH (12) 118-119 -13,5 2.0 EtOH OEt (a) Rendements calculés par rapport au fraquement C protégé (b) &alpha;D mesurée à température comprise entre 20 et 30 C (pouvoir rotatoire) (C) 1 g de ce produit en solution à 2 % dans l'éthanol ne précipite pas de racémique au bout de 48 h à 0 C. TABLEAU II : Références bibliographiques 1) B. CASTRO, J.R. DORMOY, Tet. Lett. 4747 (1972) 2) S. YAMADA, K. NINOMIYA and T. SHIOIRI, J. Am. Chem. Soc. 94, 6203 (1972) 3) S. YAMADA, Y. TAKEUCHI, Tet. Lett. 3595 (1971) 4) E. SCHNABEL, Aun. Chem. 688, 238 (1965) 5) N. GRASSMANN, E. WUNSCH, Chem. Ber. 91, 449 (1958) 6) R.W. YOUNG, K.H. WOOD, J. JOYCE, J. Am. Chem. Soc. 78, 2126 (1956) 7) H. NEUMANN, Y. LEVIN, A. BERGER, E. KATCHALSKI, Biochem. J. 73, 33 (1959) 8) 0. GOFFREDO, L. - BERNARDI, G. BOSISIO, F. CHILLEMI, Gazz. Chim. Ita. 95, 172 (1965) 9) M.W. WILLIAMS, G.T. YOUNG, J. Chem. Soc. 881 (1963) 10) G.W. ANDERSON, R.W. YOUNG, J. Am. Chem. Soc. 74, 5307 (1952) 11) B. WEINSTEIN, A.E. PRITCHARD, J. Chem. Soc. 1015 (1972) 12) J.C. SHEEHAN, G.P. HESS, J. Am. Chem. Soc. 77, 1067 (1955) REVENDICATIONS 1) Sels d'azidotrisdialkylaminophosphonium de formule (R'R"N)3#N3, A où R' et R" sont des groupes alkyle comportant 1 à 5 atomes de earbone ou forment ensemble un hétérocycle à 5 ou 6 chainons à 1 ou 2-hétéroatomes, et Alun monoanion. 2) produit selon la revendication 1 ou R' = R" = CH3 et A = PF6 3) produit selon la revendication 1 où R' = R" = C H et A = PF6 4) produit selon la revendication 1 de formule 5) produit selon la revendication 1 de formule 6) procédé de préparation des produits selon l'une des revendications 1 à 5 consistant à faire réagir à une température comprise entre 0 C et 100 C, une partie drazidure de sodium sur une partie de (R'R"N)3#-Hal, A , où Hal est un atome d'halogène et A un monoanion, dans un solvant. 7) procédé de préparation selon la revendication 6 pour les sels où Hal = Br, A = Br et où le solvent utilisé est une cétone aliphatique à la température ambiante. 8) procédé de préparation selon la revendication 6 pour les sels où Hal = Br, A = 3r et où le solvant utilisé est l'acétonitrile à la température ambiante. 9) Utilisation des composés selon l'une des revendications 1 à 5 dans les réactions consistant à créer une fonction amide par perte d'eau entre une chaîne possédant une fonction acide carboxylique-et une chaîne possédant une fonction amine. 10) Utilisation des composés selon l'une des revendications 1 à 5 pour le couplage peptidique.