FR 2201079 A1 19740426 FR 7233704 A 19720922 La présente invention a pour objet un procédé de préparation de virus purifiés1 ainsi que les virus, antigènes et vaccins obtenus selon ce procédé. On sait que d'une manière générale, les suspensions virales, comme par exemple les vaccins viraux, présentent une teneur non négligeable en protéinq non viraleset il n'a pas été possible jusqu'à présent d'obtenir par des procédés simples et économiques se prétant à la fabrication industrielle, applicables de manière universelle à n'importe quel virus, des v-accins viraux ou autres suspensions virales pratiquement pures. I1 en résulte que les vaccins ou autres sources d'antigènes viraux utilisés jusqu'à présent, entraident à des degrés divers des risques d'effets secondaires indésirEs en raison de la présence de ces protéines étrangères. La présente invention se propose de fournir un procédé de préparation d'antigènes viraux sous forme de vaccin, de solutions destinées à Gtre conditionnées en vaccin ou de toutes autres solutions, dans lesquelles les antigènes obtenus acnt pratiquement purs. Ce procédé est simple, économique, applicable de manière universelle à n'importe quel virus vivant ou inactivé, il se prdte a des applications industrielles et couvre toute la gamme des virus humains et animaux et les vaccins correspondants. nans un pe-mi.sr modz dn mise en oeuvre, le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que l'on prépare, dans un premier temps, d'une manière dépendant de la taille du virus et de la méthode qui a servi à l'obtenir, un concentré brut conte riant les virus et les impuretés protéiques, cellulaires ou bactériennes provenant des grands volumes de suspensions virales initiales et que dans un deuxième temps, on introduit dans un rotor de centrifugeuse de type zonal c'est-à-dire entièrement creux, le rotor étant à l'arret, un volume de ce concentré viral compris entre 40 % et 90 % du volume du rotor préalablement stérilisé, puis après avoir mis le rotor en rotation à une vites se compris entre 2000 et 5000 tours par minute, on introduit successivement par la périphérie du rotor tournant au moins deux coussins de liquides de densités différentes par ordre de densité croissante, puis après avoir rempli complètement le rotor on l'accélère à une vitesse suffisante pour réaliser la séparation des virus et des impuretés, et enfin, après avoir ramené la vitesse du rotor entre 2000 et 5000 tours par minute, on introduit par la périphérie un liquide de densité égale ou supérieure au contenu du rotor, pour décharger le rotor par son conduit central, à la suite de quoi l'on recueille les fractions contenant le virus débarrassé des impuretés. Par rotor zonal on entend des rotors tels que par exemple le rotor B XIV ou le rotor B XV, ou le rotor B XXIX, ou d'autres commercialisés par différentes firmes telles que M.S.E. en Grande-Bretagne, Beckman aux U.S.AP Sorvall aux U.S.A, Electronucleonics aux U.S.A. Dans ce premier mode de mise en oeuvre, on peut avantageusement utiliser, pour chasser le liquide hors du rotor, une solution de saccharose par exemple du saccharose à 60 % permettant de décharger le rotor par son conduit central. Dans un second mode de mise en oeuvre, l'invention se carac térise par le fait que l'on prépare dans un premier temps, d'une manière variable selon la taille du virus, et la méthode de culture qui a servi à l'obtenir, un concentré brut, contenant les virus et les impuretés protéiques, cellulaires ou bactériennes, provenant des grands volumes de suspensions virales initiales, et que dans un deuxième temps, on introduit dans un rotor à godets oscillants ou un rotor angulaire de grand volume, un volume de concentré viral brut compris entre 40 % et 90 % du volume du godet dans les godets ainsi prAalablement stérilisés, à l'arrOt, on fait descendre à l'aide d'un capillaire rigide relié à une pompe a-.u moins deux coussins de liquides de densités différentes par ordre de densité croissante, on bouche hermétiquement les godets et on les place dans le rotor, on accélère le rotor de plus en plus rapidement jusqu'S obtenir une vitesse suffisante permettant la séparation et la purification du virus d'avec les impuretés, on arrête le rotor et on récupère d'une manière en soi connue, le contenu des godets. Par rotor angulaire on peut par exemple utiliser le rotor MSE NO 59.597. De façon préférée, la première étape de préparation du concentré du premier et du second mode de mise en oeuvre de 1' in- vention fait appel à une centrifugation différentielle continue; ou à une ultra-filtration. Dans l'un et l'autre mode de mise en oeuvre de l'invention, la densité du premier coussin doit titre inférieure à la densité des particules virales mais tclle que tout en permettant le pas- sage des virus elle bleue la migration d'une majorité d'impuretés. En outre, la viscosité du premier coussin doit outre ajustée d'une manière à permettre le passage ds virus mais suffisante pour bloquer la diffusion à la migration des impuretés plus petites que les virus. Le liquide constituant ce coussin peut entre avantageusement une solution de saccharose. On peut cependant aussi utiliser d'autres liquides, par exemple des solutions de tartrate bipotassique. Le deuxième coussin doit entre d'une densité et dune viscosité suffisantes pour arrête les virus ou tout au moins pour freiner au maximum leur sédimentation à la périphérie. Ce deuxième coussin peut dtre également de mGme nature que le premier, par exemple du saccharose à une concentration convenable. Le volume de chacun des coussins doit titre compris entre 5 et 30 % du volume du rotor. La différence de densité cntre les deux coussins est de préférence sup6rieui-e ou égale à 0,05. La durée de la centrifugation assurant la purification du virus dépend des c?racttristique. virales, elle est généralement comprise entre 1 heure et 18 heures, le temps étant fonction de la taille et0ia densité des particules virales et pouvant entre facilement déterminée par l'horde de l'Art à l'aide de calculs usuels. La centrifugation est en général réalisée d une température comprise entre 5 et 200 c. La vitesse de la centrifugation assurant la purification du virus dépend d'une part des caractéristiques du rotor, d'autre part de la taille et de la densité des particules virales. Là aussi la vitesse peut facilement entre déterminée par l'homme de 1 'Art pour chaque cas particulier en effectuant les calculs usuels dans la technique de la centrifugation. A titre indicatif la vitesse est généralement de l'ordre de 25000 tours par minute pour les rotors de type zonal et de l'ordre de 20000 tours par minute pour les rotors à godets ou les rotors angulaires. Le procédé selon l'invention permet tout particulièrement d'effectuer la pu~.ficetion du vaccin anti-grippal, du vaccin anti-variolique, ou du vaccin anti-poliomyélitique. Toutefois le procédé applique également à la purification industrielle du vaccin anti-rabique, du vaccin anti-aphteux et de tout vaccin viral quelque soit le groupe auquel le virus appartent Peur mieux faire comprendre le caractère nouveau et intéressant de la présente invention il importe de souligner les faits suivants : Le procédé diffère des procédés habituels utilisant un rotor zonai, et in peut être mis en oeuvre avec des rotors d'un autre types et en particulier des rotors angulaires classiques. Le volume de l'échantillon utilisé est environ égal au 3/4 du volume du roter zonal, quel que soit le groupe de virus à purifier, c'està-dire sans commune usure avec ltéchantillon ae seulement 50 è 103 mi que l'on reeommande d'utiliser traditionnellement pour obtenir de bons résultats. Le procédé présente en outre l'avantage considérable de permettre de supprimer l'overlay, recommande habituellement paur permettre à l'échantillon de se situe dans une zone de gravité plus importante. Le procédé permet de plus de ne pas nécessiter un deuxième cycle d'ultra-centrifugation. Contrairer-ent à ce qui est possible dans la technique classique, l'échantillon est introduit dans le rotor zonal à l'arrêt et pas nécessairement à l'intérieur de la centrifugeuse. I1 résulte dc cela un avantage particulièrement important qui est la diminution de l'usure des joints de la tête de changement du rotor et l'impossibilité à ce moment de toute formation de brouillard viral. Ce procédé consiste à charger l'échantillon en premier, d'une manière simple, contrairement à la technique classique, où il est chargé par une opération délicate, après le gradient de densité. En outre. l'on n'utilise pas de gradient de densité préformée, mais simplement en général deux coussins de densités différentes. Ces coussins se transforment rapidement par diffusion en gradient non linaire d forme idéale. La centrifugation réalisée dns le procédé n'est pas une centrifugation zonale, mais une centrifugation différentielle sur un premier coussin de densité et de viscosité telle que les virus ne sont pas arrentés, contrairement aux impuretés moins denses ou moins rapides que les virus. Le rôle du deuxième coussin est simplement d'arrêter le virus purifié ou sinon de le ralentir. De plus, le procédé selon l'invention assure une centrifugation discontinue du rotor zonal, contrairement à toutes les méthodologies écrites jusqu'à présent qui prévoient d'utiliser des centrifugeuses en continu à haute vitesse en gradient de densité. Par rapport à ces procédés antérieurs, le procédé selon l'invention présente les avantages suivants I1 nécessite un appareillage nettement moins couteux et plus simple à manipuler. I1 permet une plus grande souplesse d'utilisation, en ce sens que des cycles de purification peuvent être facilement programmés la nuit ou successivement 24 h sur 24, contrairement aux autres procédés qui ne peuvent pas fonctionner plus de 10 heures en continu. Le procédé est plus polyvalent que les procédés connus car il peut être appliqué de la même manière et aussi efficacement à tous les groupes de virus, petits ou gros, contrairement aux autres procédés qui ne permettaient pas d'avoir en même temps une purification, ou un débit ou un rendement suffisant avec les petits virus, comme le virus polio par exemple. De plus, la qualité de la purification et le rendement du procédé selon l'invention sont toujours voisins de 100 %. Le procédé selon la présente demande présente en outre par rapport aux méthodes chimiques de concentration et purification les avantages suivants 1. Les rendements obtenus par ces méthodes chimiques sont généralement beaucoup plus faibles. 2. Les méthodes chimiques peuvent faire appel à des composés dont certains ne seraient pas souhaitables en médecine humaine ou animale, en raison de leur toxicité. En effet, le problème de leur élimination totale pose souvent de grandes difficultés. 3. Ces méthodes ne sont pas spécifiques à tous les types de virus. En effet, chaque virus existe sous divers types antigéniques dont certains sont très passagers, le renouvellement des diverses formes antigéniques d'un virus donné, (grippe polio par exemple) conduisant inévitablement à des transformations des propriétés chimiques de ce virus. Toutes méthodes chimiques de purification s'appuyant sur les propriétés chimiques des virus risquent donc de devoir être modifiées légèrement ou complètement, suivant l'importance des mutations ou évolutions, ce qui implique une modification constante de ces méthodes. Au contraire, les propriétés physiques d'un virus sont treks stables dans le temps, ce qui permet pour le virus grippal, le virus polio ou le virus aphteux par exemple, une méthode physique de purification identique pour tous les types et soustypes. De façon à mieux faire comprendre l'invention, on va maintenant donner sans aucun caractère limitatif, plusieurs exemples du procédé selon l'invention. EXEMPLE N0 I PROCEDE INDUSTRIEL DE FABRICATION DE VACCIN ANTI GRIPPAL HAUTEMENT PURIFIE PREPARATION DES LOTS DE SEMENCE A partir des souches de virus Grippe de types A et B, sélectionnées par des méthodes sérologiques appropriées et approuvées par le Laboratoire National des Actions de Santé, sont préparés des lots de semence. Les différentes souches de virus sont cultivées sur oeufs de poule embryonnés (provenant d'élevages indemnes de virus des leucoses aviaires) : après incubation, les liquides allantoiques sont récoltés, homogénéisés et lyophilisés en une seule charge de lyophilisation, en ampoules scellées, conservées ensuite à une température assurant la conversation du virus semence. Le lot de semence doit satisfaire à toutes les épreuves de contrôles, prévues au dossier technique de visa et conformes aux normes édictées par le Laboratoire National des Actions de Santé. PREPARATION DES SUSPENSIONS MONOVALENTES DE VIRUS GRIPPE CONCENTRES (et INACTIVES EVENTUELLE.MENT) Culture du virus A partir des lots de semence de souches Grippe de types A et B, sont obtenues des cultures brutes de virus, constituées par des liquides allantoiques d'oeufs de poule embryonnés, inoculés, incubés et récoltés selon des méthodes classiques de l'ovoculture. Concentration du virus. Les liquides allantoiques contenant le virus sont clarifiés et ScuLaiS à une centrifugation appropriée pour sédimenter les virions à la périphérie de bols de centrifugeuses (Sharples par exemple). Ces sédiments de virus sont remis en suspension par une solution de citrate de sodium de molarité pouvant se situer de 0,01 M à 0,4 M, mais de préférence 4125 M, sous un volume représentant entre le 1/10 e et le 1/50 e du volume initial, soit un facteur de concentration de 10 à 50 fois, mais de préférence 30 fois. Eventuellement, Inactivation du virus. Les suspensions concentrées ainsi obtenues, après homogenéisation et clarification par centrifugation à basse vitesse peuvent être inactivées à ce stade par le formaldéhyde ou bien sont d'abord soumises à l'opération de purification. PURIFICATION DES SUSPENSIONS MONOVALENTES DE VIRUS par CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE NON CONTINUE SUR COUSSINS DE SACCHAROSE a) Cas d'une purification en rotor zonal B XV Chaque cycle de centrifugation permet de purifier 1200 ml de suspension de virus monovalents. Cette purification s'effectue selon le schéma suivant -: - Désinfection du rotor B XV par lavage à l'éthanol à 950 et séchage sous une hotte stérile à air laminaire. - Introduction de 1200 ml de suspensions de virus monovalents dans le rotor arrêté, sous une hotte stérile, à un débit maximum. - Accélération du rotor à 3000 t/mn. - Introduction à la périphérie du rotor et successivement de 370 ml saccharose 34 % (p/p en tampon PBS pH 7,2), . 100 ml saccharose 60 % (p/p en tampon PBS pH 7,2), à un débit de 1200 ml/h avec une pompe appropriée. - Centrifugation de 3 heures à 25000 t/mn à +50 C. - Décélération du rotor à 3000 t/mn. - Récolte du contenu du rotor, en introduisant à la périphérie avec une pompe appropriée, une solution de saccharose 60 % (p/p en PBS) refroidie à + 50C. Les fractions sont recueillies sous une hotte stérile. - Analyse au gradient de saccharose par réfractométrie et éventuellement de ltenregistrement U.V en continu à 2 longueurs d'onde. b) Cas d'une purification en rotor angulaire (6 X 250 ml) Chaque cycle de centrifugation permet de purifier 1020 ml de suspension de virus monovalents. Cette purification s'effectue selon le schéma suivant - Remplissage des godets préalablement stérilisés de la façon suivante Introduction de l'échantillon en premier puis à l'aide d'un capillaire rigide relié à une pompe, l'on fait descendre le premier coussin et enfin le deuxième coussin de densité supérieure qui repoussent l'échantillon vers le sommet. Dans cet exemple, le contenu détaillé des godets est le suivant Echantillon 1020 ml (6 X 170 ml) ler coussin saccharose 34 % en PBS pH 7,2 360 ml (6 X 60 ml) 2ème coussin saccharose 60 % en PBS pH 7,2 120 ml (6 X 20 ml) - Puis les godets sont bouchés hermétiquement avec précaution pour éviter les remélanges. - Le rotor est alors accéléré très régulièrement et très précautionneusement surtout au début de laaccélération. Les conditions de centrifugation sont les suivantes 20000 t/mn ; 3 heures ; + 50C. - Le rotor est enfin arrêté et le contenu des godets est récupéré en perçant le fond du godet et en receuillant successivement les différentes fractions du godet. On met en pool les fractions contenant de 35 à 52 % de saccharose (p/p en PBS) et 100 % de virions. Ceci donne un volume de 150 à 200 ml de virus purifié, concentré de 7 à 8 fois par rapport à la suspension brute de virus concentrés. Cette suspension est très opalescente, mais complètement transparente. On effectue ensuite l'inactivation du virus purifié par le formaldéhyde ou par l'éther. a) par le formaldehXde 0J02 % Après un séjour de 48 heures à la température ambiante, et d'une semaine à environ + 40C, le virus est totalement inactivé et la suspension ainsi préparée, totalement stérile sur le plan microbien ou fungique, peut se conserver ssus de deux ans sous cette forme concentrée. b) par l'éther Le pool de virus purifié est dilué deux fois en PBS pH 7,2 et additionné de Polysorbate 80 à 0,1% en final. Un volume d'éther sensiblement égal est alors ajouté à + 4 C sous agitation forte et continue. Après 1 heure, une centrifugation à + 40C de 10 minutes à 1000 t/mn permet de séparer, puis de récolter la phase aqueuse contenant les éléments immunogènes. Celle-ci est alors soumise à un deuxième traitement exactement identique, puis à un vide modéré et enfin à un barbotage d'azote stérile. Lorsqutaucune trace d'éther n'est plus décelable, le virus est totalement inactivé et pourra être filtré sur membrane stérilisante de porosite 0,45 à 0,22 uau moment choisi. MELANGE POLYVALENT DES VACCINS MONOVALENTS PURIFIES Les vaccins monovalents purifiés des souches de virus inactivés de types A et B correspondant à la formule préconisée pour la campagne en cours, sont alors convenablement dilués en tampon PBS de pH 7,2 pour obtenir la quantité d'antigène nécessaire par dose exprimée en unités hémagglutinantes internationales. PREPARATION DE VACCIN ADJUVE Le vaccin étant débarassé de toute protéine provenant de l'oeuf, il pourra être réalisé un mélange polyvalent de vaccin contenant ou non un adjuvant, gel d'alumine par exemple. CRITERES IMMUNOLOGIQUES DE LA PURETE DU VACCIN AINSI PREPARE Deux méthodes très sensibles sont possibles pour différen;cier un vaccin Grippe préparé selon le procédé précédent d'un vaccin Grippe non purifié. a) Recherche du pouvoir anaphylactogène du vaccin sur cobayes Des cobayes sont inoculés en I.P. au jour O et au jour 2 avec le vaccin à étudier (1 ml/kg). Au jour 21, l'injection I.V d'une dilution convenable d'extrait d'oeuf ne doit provoquer aucun symptôme allergique chez le cobaye (rougeurs, toux, grattages, asphyxie ou mort). b) Test sur lapins Des lapins reçoivent les injections suivantes de vaccin à étudier Jour O : S.C et I.D. 0,5 mi vaccin en émulsion dans 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund (en plusieurs points). Jour 20 : 1 ml I.V. Jour 21 : 1 ml I.V. Jour 22 : l ml I.V. Jour 30 : 1 ml I.V. Jour 40 : Saignée et analyse des sérums en immunodiffusion double en gélose. Ces immunsérums de lapin ne doivent présenter aucune ligne de précipitation avec un extrait d'oeuf, une solution d'ovalbumine, ou un sérum de poule dilués ou non. Aux propriétés pharmacologiques, bien connues des vaccins grippaux s'ajoute l'absence pratiquement de tout risque d'effets secondaires en raison de la pureté du vaccin selon l'invention. CRITERES PHYSICO-CHIMIQUES de la PURETE du VACCIN AINSI PREPARE. L'examen en microscopie électronique ne permet pas de distinguer autre chose que des virions normaux, non agrégés et en parfait état de conservation. Une analyse par ultracentrifugation analytique ou en gradient de densité ne permet pas de détecter de pics d'impuretés de coefficient de sédimentation inférieurs à 500 unités Svedberg. STABILITE du VACCIN AINSI PREPARE Un vaccin purifié par ce procédé est stable pendant plus de deux ans à + 40C, sans qu'apparaisse aucun agrégat visible à l'oeil nu. Le procédé selon l'exemple I a été mis en oeuvre dans son intégralité avec succès pour la purification des groupes de virus suivants et aux vaccins correspondants - myxovirus (Influenza), - paramyxovirus (Rougeole, Oreillons) - Herpès virus (Herpès hominis) - arbovirus (Fièvre jaune), - rhabdovirus (Rage, Stomatie vésiculaire), qu'ils soient obtenus par les techniques de l'ovoculture ou des cultures cellulaires. Dans le cas cs virus contenus dans les surnageants de culture cellulaire, la concentration de la suspension virale peut être avantagusement effectuée par ultrafiltration (voir exemple ne3). Une concentration de 50 fois est suffisante pour rendre industriel le procédé et ramener le volume de 60 litres à 1,2 litre. Une telle concentration n'entraine ni précipitation protéique, ni dénaturation. Le rendement en virions est de 100 %. Il faut veiller cependant à ce que ces surnageants de culture ne contiennent qu'un minimum ( 4 0,2 %) de protéines suraåoutéas (albumine, sérum, etc ...) car celles-ci, lors de l'étape de concentration, gêneraient. EXEMPLE NO 2. PROCEDE INDUSTRIEL DE PREPARATION DE VACCIN ANTIVARIOLIQUE HAUTEMENT PURIFIE ET STABILISE Le vaccin antivariolique conventionnel est fabriqué à partir d'une souche de virus vaccinal répondant a des normes internationales d'innocuité et d'efficacité. Ce virus vaccinal est traditionnellement cultivé par scarification de la peau de genisse et la suspension virale ainsi obtenue est particulièrement difficile à purifier par les divers procédés industriels actuellement connus. Toutes les préparations de vaccin actuelles contiennent encore outre les virus indispensables, des protéines d'origine animale pouvant en particulier avoir une action enzymatique néfaste sur la durée de conservation du vaccin, de, nombreux débris cellulaires et une quantité de bactéries contaminantes, pouvant jouer un râle dans les divers incidents post vaccinaux qui ont été décrits. Le procédé selon l'invention permet d'apporter une haute pureté, inconnue jusqu''ici pour ce vaccin, une stabilité accrue, un excellent rendement et une production à grande échelle. L'invention s'applique cependant également aux suspensions de virus vaccinal produites en cultures cellulaires pour lesquelles une concentration préalable par centrifugation différentielle en continu serait possible. 1. La pulpe vaccinale récoltée sur une génisse est mélangée avec deux litres de tampon Mac Ilvaine pH 7,2, contenant de l'Azide de sodium. Cette suspension est broyée le plus finement possible à +40C, pendant deux heures puis clarifiée par centrifugation à 2000 g pendant 30 minutes. On récolte alors ainsi le surnageant n01. Le culot est repris et agité dans 0,8 litre de tampon par les ultrasons. Chaque fraction de 100 ml est soumise aux ultrasons pendant 1 minute à une puissance de 150 watts. Cette suspension (où un certain nombre de virions ont été remis en solution par ce traitement) est à nouveau clarifiée par centrifugation à 2000 g pendant 30 minutes. On obtient ainsi le surnageant nO 2. Les surnageants nO 1 et 2 sont mélangés et soumis au traitement ultrasonore suivant dans une cellule de traitement en continu, réfrigérée. Puissance ultrasonore : 150 watts. Débit : ajusté de sorte que chaque partie soit soumise à 2 mn de ce traitement. Cette suspension est alors additionnée d'une solution stérile de saccharose (60 % p/p en Mac Ilvaine pH 7,2) de façon à atteindre une concentration en saccharose de 20 % (p/p). On obtient un volume d'environ 4 litres. On effectue ensuite la clarification par filtration successivement sur - Gaze stérile - préfiltre (type AP 25 Millipore'-. - Membrane 8p puis 3 ; 1,2 p, et enfin 0,8 p (type Millipore R par exemple). Les diamètres des filtres employés sont avantageusement de 293 mm pour éviter les colmatages. Un rincage des filtres en final par une solution de saccharose 20% (p/p) en tampon Mac Ilvaine pH 7,2, puis le passage du point de bulle sur chaque filtre permettent un rendement final d'au moins 80 % en virions. On obtient à ce stade exactement 5 litres de suspension vaccinale clarifie, débarrassée d'une bonne partie des débris cellulaires et des bactéries. Cette suspension est congelée en 5 lots de 1 litre qui seront purifiés un à un dans l'étape suivante PURIFICATION par CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE NON CONTINUE sur COUSSINS DE SACCHAROSE a) avec un rotor zonal B XV Le chargement du rotor B XV est effectué de la même manière que dans l'exemple n01 et l'exemple n 3. Les données particulières à cet exemple sont les suivantes Concentré viral précédent 1000 ml ler coussin saccharose 35% p/p en Mac Ilvaine pH 7,2 300 ml 2e coussin saccharose 45% en Mac Ilvaine pH 7,2 100 ml 3e coussin saccharose 55% p/p en Mac Ilvaine pH 7,2 270 ml Puis le rotor est accéléré à 25 000 t/mn à +50C pendant 1 h 30 mn ; après quoi il est ramené à 3000 t/mn pour le déchargement qui s'opère de la même manière que dans l'exemple n01. b) avec un rotor angulaire (6 X 250 ml) Le remplissage et le déchargement des godets s'effectue de la même manière que dans l'exemple n01 ou n03. Les données particulières à cet exemple sont les suivantes Concentré viral précédent 1020 ml (6 X 170 ml) ler coussin saccharose 35% p/p en tampon Mac Ilvaine pH 7 300 ml (6 x 50 ml) 2e coussin saccharose 55% p/p en tampon Mac Ilvaine pH 7,2 180 ml (6 x 30 ml) Condition de centrifugation : 20 000 t/mn ; 1 h 30 mn ; +50c. Le virus vaccinal se trouve concentré et hautement purifié dans la région du gradient de saccharose allant de 40% à 50% (p/p), débarrassé des petites molécules, et macromolécules non virales restées dans le surnageant, débarrassé de la majorité des bactéries et debris cellulaires concentrés dans la dernière partie du gradient.Le rendement en virions est de 100% pour ce stade. Le pic de virus vaccinal purifié est récolté, ajusté à une concentration de saccharose finale de 45% (p/p) si besoin est. I1 peut alors être conservé de nombreuses années à -200C sans autre traitement, ou alors dilué dans différents milieux pour réaliser un vaccin. Dans toutes ces opérations le tampon Mac Ilvaine pH 7, 2 peut être remplacé par le tampon PBS pH 7,2. CRITERE DE PURETE D'UN VACCIN ANTIVARIOLIQUE PURIFIE OBTENU PAR CE PROCEDE L'observation au microscope électronique permet de vérifier la présence de virions en parfait état de conservation, non agrégés et très concentrés. Il nty a aucun débris cellulaire de taille égale ou supérieure aux virions, il peut exister des traces de débris plus petits qui sont probablement d'origine virale ou cellulaire. Une analyse par ultracentrifugation analytique ou en gradient de densité ne permet pas de détecter des pics dtimpure- tés de coefficient de sédimentation de tordre des protéines habituelles ou même inférieur à 500 unités Svedberg. Aucune particule de taille supérieure à 0,8 u n'est visible à l'oeil nu, à la loupe ou au microscope optique dans une telle préparation. Ce vaccin peut encore contenir entre O et 10 germes bactériens par ml, tous inférieurs à une taille de 0, 8 p CRITERES DE STABILITE D'UN VACCIN ANTIVARIOLIQUE PURIFIE OBTENU PAR CE PROCEDE Sous sa formule liquide, ce vaccin purifié à un délai de conservation supérieur ou au moins égal à toute préparation vaccinale conventionnelle actuellement commercialisée. Lorsqu'on réalise la lyophilisation dans un milieu convenable, la lyophilisation du produit ne fait perdre aucune activité significative au vaccin purifié et le produit peut alors être conservé au moins 1 mois à 370C sans pertes significatives. CRITERES IMMUNOLOGIQUES D'UN VACCIN ANTIVARIOLIQUE PURIFIE OBTENU PAR CE PROCEDE Le vaccin purifié, ainsi préparé, donne sur la peau scarifiée des animaux sensibles des lésions caractéristiques du seul virus vaccinal et une réponse immunitaire au moins égale aux vaccins traditionnels. Ce procédé selon l'exemple 2 s'applique intégralement à la purification de toute suspension de poxvirus, obtenue par les techniques - d'ovoculture, - ou de culture sur organe ou animaux, - ou de cultures cellulaires. Pour ces virus, la durée de la centrifugation est comprise entre 1 heure et 1 heure trente minutes. EXEMPLE iI0 3 FROCEDE INDUSTRIEL DE FABRICATION DE VACCIN ANTI POLIOMYELIT IQUE HAUTEMENT PURIFIE Le virus polio est traditionnellement produit cn cultures cellulaires. Les surnageants de culture sont récoltés débarrassés des débris cellulaires par centrIfugation différentielle et filtrés sur membranes de porosité bien définie égale à 0,22r. C'est à partir de cette suspension vIrale, virulente ou inactivée, dépourvue de tout germe microbien ou fungique que l'on effectue la première étape ae concentration. Cette concentration est réalisée par ultrafiltration sur un appareillage industriel, par exemple l'ultrafiltre AMICON 1 D ou TC 5 D équipé de membranes de type AMICON # pu 30. Une concentration de 100 fois de la suspension virale est en général suffisante pour l'industrialisation du procédé. Ceci permet par exemple de ramener un volume initial de 120 litres à un volume concentré désiré de 1,2 litre. Une telle concentration par ultrafiltration est rapidc et n'entraine ni précipitation protéique, ni dénaturaticn. Le rendement en virions est de 100 %. La deuxième étape de purification est alors entreprise. a) avec un rotor zonal B XV Le chargement du rotor B XV est effectué de la meme manière que dans l'exemple n 1 et l'exemple n 2. Les données particulières à cet exemple sont les suivantes Concentré viral brut 1200 ml ler coussin saccharose 40 % p/p en PBS 270 ml 2e coussin saccharose 60 % p/p en PBS 200 ml Puis le roter est accéléré à 25 000 t/mn à + 5 C pendant la nuit ou une durée de ' heures. Ensuite le rotor est ramené à une vitesse de 3000 t/mn et le déchargement du rotor commence de la même manière que dans les exemples précédents. Ceci permet d'éliminer les impuretés protéiques situées dans le surnageant, par la partie centrale du rotor. Lorsque l'effluent qui ressort par la partie centrale atteint une concentration minimum de 50 % (p;p) en saccharose, le rotor est arrêté. Son contenu est récupéré en l'agitant soigneusement de façon à remettre en suspension le culot de virions situé encore sur la paroi périphérique du rctor. On recueille ainsi 1670 ml d'une suspension virale très purifiée de concentration en saccharose voisine de 60 % (p/p). Elle contient 100 % des virions initiaux, totalement débarrassés des impuretés protéiques non virales. Le saccharose peut être éliminé par dialyse et cette suspension virale inactivée par les méthodes connues puis diluée pour donner le vaccin final d'activité désiree. b) avec un rotor angulaire (6 X 250 ml) Le remplissage des godets s'effectue de la même manière que dans les exemples r. 1 et nO 2. Les données particulières à cet exemple sont les suivantes Concentré viral précédent 1020 ml (6 X 170 ml) ler coussin saccharose 40 % p/p en PBS pH 7,2 360 ml (6 X 60 ml) 2e coussin saccharose 60 % p/p en PBS pH 7)2 120 ml (6 X 20 ml) Condition de centrifugation : 20000 t/mn : 15 heures ; +50C. Après centrifugation, le surnageant des godets est éliminé le premier par aspiration, jusqu'à la zone du gradient contenant 50 % de saccharose. Le virus hautement concentré et purifié se trouve en partie dans le fond du gradient et en partie sur la meme paroi/du tube do il est remis en suspension par agitation. Ce pool de virus est ensuite dilué à 1 litre et inactivé suivant la méthode habituelle si besoin est. CRITERES DE PURETE ET DE STABILITE D'UN VACCIN ANTIPOLIO MYELITIQUE VALISE PAR CE PROCEDE L'observation en microscopie électronique ne permet de déceler que des virions, dans un excellent état de conservation, non agrégés et très concentrés, a l'exclusion de tous débris cellulaires. Une analyse par ultracentrifuGation analytique ou en gradient de densité ne permet pas de détecter de pics d'impuretés de coefficient de sédimentation de l'ordre de protéines habituelles ( Les sérums hyperimmuns préparés par immunisation de lapins avec une telle préparation virale purifiée, ne contiennent aucune trace d'anticorps anticellulaires. Par anticorps anticellulaires, on entend des anticorps donnant une ligne de précipitation en immunodiffusion double en gélose contre un antigène extrait des cellules témoins, ayant servi à cultiver le virus. La stabilité d'une telle préparation virale purifiée est au moins égale à celle d'une préparation non purifiée dans un même milieu de conservation et quelle que soit la température. Le procédé selon l'exemple 3 qui conjugue la concentration par ultrafiltration puis la purification par centrifugation différentielle non continue sur coussins de densités différentes a été appliquée avec succès, et de la même manière pour la purification des suspensions de virus suivants ou leurs vaccins correspondants. Ce sont les virus qui ont une densité supérieure ou égale à 1,29 ';/cm3 et qui de ce fait peuvent traverser un coussin de saccharose 60 % (p/p) dans un champ centrifuge. C'est le cas en particulier des - Picornavirus Enterovirus (virus polio par exemple) Rhinovirus (Fièvre aphteuse par exemple) - Papovavirus - Réovirus - Adenovirus - Virus végétaux - Bactériophages RFVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication industrielle de virus, antigènes ou vaccins purifiés, caractérisé par le fait que dans un premier temps, on prépare un concentré brut contenant les virus et les impuretés protéiques, cellulaires cu bactériennes provenant des grands volumes de suspension virales initiales et qude}00 deuxième temps, on introduit dans un rotor préalablement stérilisé de centrifugeuse de type zonal, le rotor étant à l'arrêt, un volume de ce concentré viral compris entre 40 % et 90 % du volume du rotor, puis qu'après avoir mis le rotor en rotation à une vitesse comprise entre 2000 et 5000 tours par minute, on introduit successivement dans la périphérie du rotor tournant, au moins deux coussins de liquide de densités différentes par ordre de densité croissante, la densité du premier coussin étant inférieure à celle des particules virales mais suffisante pour bloquer la migration de la majorité dc-:s impuretés et la densité du dernier coussin supérieure ou égale à celle des particules virales, puis qu'après avoir rempli complètement le rotor, on l'accélère à une vitesse suffisante pour réaliser la séparation des virus et des impuretés, et enfin, qu'après avoir ramené la vitesse du rotor entre 2000 et 5000 tours par minute, on introduit par la périphérie un liquide de densité égale ou supérieure au contenu du rotor, pour décharger le rotor par son conduit central, à la suite de quoi on recueille les fractions contenant le virus débarsst des impuretés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise un rotor choisi parmi les rotors B XIV, B XV ou B XXIX. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on décharge le rotor à l'aide d'une solution de saccharose de densité supérieure à la densité contenue dans le rotor. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la vitesse de la centrifugation est de ordre de 25goy tours par minute. 5. Procédé de fabrication industrielle de virus, d'antigènes ou vaccins purifiés, caractérisé par le fait que dans un premier temps on prépare un concentré brut, contenant les virus et les impuretés protéiques, cellulaires ou bactériennes provenant des grands volumes de suspension virale initiale et que dans un deuxième temps, on introduit dans un rotor du type à godets oscillant ou du typc ari-ulaire un volume de concentrc viral brut compris entre 40% tst g0% du volume du godet préalablement stérilisé, le rotor tant à l'arrêt, qu'on fait ensuite descendre à l'aide d'un capillaire rigide relié à une pompe au moins deux coussins de liquides de densités différentes par ordre de densité croissante, la densité du premier coussin tant inférieure à celle des particules virales mais suffisante pour bloquer la migration de )a majorité des impuretés et la densité du dernier coussin supérieure ou égale à celle des particules virales, que l'on bouche ensuite hermétiquement les godets, qu'on les place dans le rotor, qu'on accélère graduellement le rotcr jusqu'à une vitesse suffisante permettant la séparation et la purification du virus d'avec les impuretés, qu'on arrête le rotor et qu'on récupère le contenu des godets. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on utilise un rotor MSE N 59.597. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6,, caractérisé par le fait que la vitesse maximum de centrifugation est de l'ordre de 20000 tours par minute. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que dans le premier temps , on effectue une centrifugation différentielle continue des suspensions virales initiales. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 8, caractérisé par le fait que dans le premier temps, on effectue une ultra-filtration des suspensions virales initiales. 10. Procédé selon l'une quelconquP des revendications i à 9, caractérisé par le fait que la différence de densité entre le premier et le second coussin est égale au moins 0,05. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que le coussin est constitué d'une solution de saccharose. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à ll, caractérisé par le fait que le volume de chaque coussin est compris entre =, et 30% du volume du rotor. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que la durée de la centrifugation est comprise ntre 1 heure et 18 h-ures. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que la centrifugation est réalisée à une température comprise entre 5 et 200C. 15. Procédé de fabrication industrielle de virus antigènes ou vaccins purifiés de la grippe, selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4 et 8 à 14, caractérisé par le fait que l'on purifie un concentré de virus grippal en introduisant environ 1200 ml de concentré dans un rotor B XV arrêté, qu'on accélère le rotor à environ 3000 tours par minute, que l'on introduit successivement à la périphérie du rotor environ 370 ml de saccharose à 34%, puis environ 100 de saccharose à 60%, que l'on effectue ensuite une centrifugation de trois heures à environ 25000 tours par minute, que l'on décélère le rotor à environ 3000 tours par minute, et que l'on récolte ensuite le contenu du rotor par introduction périphérique d'une solution de saccharose à au moins 60%. 16. Procédé de fabrication industrielle de virus antigènes ou vaccins purifiés de la grippe selon l'une quelconque des revendications 5 à 14, caractérisé par le fait que dans un rotor angulaire à godets de 1500 ml, on introduit environ 1020 ml de suspension de virus concentré qu'on introduit ensuite dans les godets un premier coussin d'environ 360 ml de saccharose à 34% puis un deuxième coussin d'environ 120 ml de saccharose à 60% et qu'on accélère très régulièrement le rotor jusqu'à une vitesse de 20000tours minute, maintenus pendant environ trois heures à la suite de quoi on arrête le rotor et on récolte le contenu des godets. 17. Procédé de fabrication industrielle de vaccins contre la grippe, selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait qu'on inactive la suspension purifiée par le formaldehyde pendant quelques jours à la température amtiante puis qu'on assure la conservation à environ + 40C. 18. Procédé de fabrication de vaccins de la grippe selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait que l'on dilue environ deux fois le virus purifié, et que l'on ajoute du polysorbate 80 puis un volume d'ether sensiblement égal, à température abaissée sous agitation forte et continue, à la suite de quoi, on effectue une centrifugation d'environ dix minutes à environ 1000 tours par minute, que l'on récolte la phase aqueuse et que l'on soumet cette phase à un nouveau traitement identique, puis à un vide modéré et enfin à un barbotage d'azote stérile. 19. Procédé de fabrication de virus,antigènes ou vaccins purifiés contre la grippe selon l'une quelconque des revendicatiors 1 à 18, caractérisé par ie fait que dans le premier temps, on effectue la culture du virus sur liquides allantolques d'oeufs de poules embryonnés, les liquides allantoiques récoltés étant ensuite clarifiés puis centrifugés à la suite de quoi les sédiments de virus sont remis en suspension sous un volume compris entre 1/10e et 1/50e du volume initial. 20. Procédé de fabrication de virus, antigènes ou vaccins purifiés de la variole selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 8 à 14, caractérisé par le fait que l'on charge dans un rotor B XV environ 1000 ml de concentré viral, à la suite de quoi on introduit, le rotor étant mis en rotation, un premier coussin d'environ 300 ml de saccharose à 35%, puis un second coussin d'environ 100 ml de saccharose à environ 45% puis un troisième coussin d'environ 270 ml de saccharose à environ 55%, à la suite de quoi le rotor est accéléré à environ 25000 tours par minute, pendant environ 1 heure 30, à la suite de quoi sa vitesse est ramené à environ 30CO tours par minute pour le déchargement. 21. Procédé de fabrication de virus, antigènes ou vaccins purifiés de la variole selon l'une quelconque des revendications 5 à 14, caractérisé par le fait que dans un rotor angulaire de 1500 ml on introduit dans les godets environ 1020 ml de concentré viral, suivi d'un premier coussin d'environ 300 ml de saccharose à 35%, puis environ 180 ml d'un second coussin de saccharose à 55X, à la suite de quoi on effectue une centrifugation à environ 20000 tours par minute, pendant environ une heure trente. 22. Procédé de fabrication industrielle de virus, antigènes ou vaccins purifiés de la variole selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, 20 et 21, caractérisé par le fait que dans le premier temps on récolte une pulpe vaccinale sur génisse, que l'on mélange cette pulpe avec du tampon de façon a réaliser ne suspension qui est ensuite broyée finement puis clarifiée par centrifugation, que l'on récolte le surnageant, que l'on reprend le culot et qu'on l'agite dans du tampon, que l'on effectue une nouvelle centrifugation de ce culot, qu'on récupère le nouveau surnageant, qu'on l'ajoute au surnageant précédent et qu'on soumet le mélange des surnageants aux ultra-sons à la suite de quoi on ajoute audit mélange une solution de saccharose à environ 60%, le mélange étant ensuite filtré pour obtenir le concentré. 23. Procédé de fabrication industrielle de virus, antigènes ou vaccins purifiés de la poliomyélite selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 8 à 14, caractérisé par le fait que l'on introduit dans un rotor B XV à l'arrêt environ 1200 ml de concentré viral brut, suivi , à faible vitesse d'un premier coussin d'environ 270 ml de saccharose à 40% puis d'un second coussin d'environ 200 ml de saccharose à 60, que l'on accélère le rotor à environ 25000 tours par minute, pendant une durée d'environ 15 heures, qu'après avoir amené le rotor à une vitesse de 3000 tours par minute, on décharge le rotor et que lorsque les fractions ressortant par la partie centrale ont une concentration d'au moins 50%, en saccharose, on arrête le rotor et on récupère son contenu. 24. Procédé de fabrication industrielle d'un virus ou d'un vaccin purifié de la poliomyélite selon l'une quelconque des revendications 5 à 14, caractérisé par le fait que l'on utilise un rotor angulaire de 1500 ml dans lequel on introduit tout d'abord environ 1020 ml de concentré viral suivi d'.un premier coussin de 360 ml environ de saccharose à environ 40, puis d'un second coussin d'environ 120 ml de saccharose à environ 60%, que l'on effectue une centrifugation à environ 20000 tours par minute pendant environ 15 heures à basse température, et qu'après centrifugation on élimine le surnageant des godets par aspiration jusqu'à une zone de gradient contenant environ 5C% de saccharose à la suite de quoi on récupère le virus concentré et purifié dans les godets. 25. Procédé selon l'une quelconque des revcndications 23 et 24, caractérisé par le fait que dans le premier temps, après avoir récolté le surnageant des cultures cellulaires de la poliomyélite débarré des débris cellulaires par centrifugation différentielle; puis ultra-sons, on effectue une ultra-filtration à une concentration environ au moins 100 fois de la suspension initiale pour obtenir le concentré. 26. Virus, antigènes ou vaccins purifiés obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25.