FR 2192144 A1 19740208 FR 7325114 A 19730709 L'invention concerne un procédé de titrage des isoenzymes, et, en particulier, des iscenzyrnes présentes dans un liquide. Les protéines qui catalysent les réactions chimiques dans les cellules vivantes et qui sont habituellement connues sons le ncn d'enzymes, sont classées selon leur pouvoir ca taiytique spécifique plutôt que d'après leur structure molé- culaire. Les différentes structures moléculaires sous lesquelles une protéine particulière peut exister en conservant sa spécificité enzymatique sont connues sous le nom d'isoenzymes. Certaines isoenzymes sont spécifiauesd'un organe ou d'une maladie. Par exemple, on a isclé au. moins cinq isoenzymes de la phosphatase alcaline,et on distingue habituellement ces isoenzymes d'après la partie particulière du corps dont elles dérivent, c'est-à-dire les os, le foie, le placenta, les intestins et-les reins. Une sixième phosphatase alcaline existe également, et est appelée isoenzyme de Regan. Les études faites sur l'isoenzyme de Regan montrent qu'elle a une structure identique à celle de l'isoenzyme placentaire; cependant, les corclusions de ces études n'ont pas été tirées et cette sixième isoenzyme est encore désignée distinctement comme l'isoenzyme de Regan. L'isoenzymes de Regan réagit t avec les anticorps de l'isoenzyme placentaire. L'observation la plus frappante en ce qui concerne l'isoenzyme de Regan est qu'elle existe dans les cellules cancéreuses en croissance. En général, une augmentation de l'activité de l'isoenzyme de Regan dans le sérum indique un étant cancéreux. La libération progressive d'une isoenzyme provenant d'une humeur, d'un tissu ou. d'un organe particulier, dans le sang indique une lésion ou une maladie de cette partie du corps. Cette libération progressive provoque un accroissement de l'activité enzymatique du Sérum pour l'enzyme correspondant à l'iso enzyme libérée. La valeur normale de l'activité enzymatique dans le sérum étant comprise dans une plage relativement large, dans de nombreux cas,un titrage de l'activité totale de l'en- zymc ne donne nas une indication précise'de cette libération. Cependant, certaines isoenzymes provenant de régirons particulières du corps, ou étant spécifiques de certaines maladies, le titrage d'une iscezyme peut présenter des anomalies caractéristiques du lieu particulier de lésion ou de maladie avant que l'activité totale enzymatique-augmente de façon significative. En outre, l'identification de l'isoenzyme spécifique responsable de l'augmentation de l'activité enzymatique peut indiquer le lieu de la lésion ou de la maladie. Actuellement, les isoenzymes sont habituellement détectées par affinité avec un substrat, inactivation par la chaleur, électrophorèse ou inhibition chimique différentielle. Ces procédés ne sont pas avantageux pour les applications cliniques, demandent du temps et généralement ne sont pas assez spécifiques pour être utilisés dans un diagnostic. Des procédés immunochimiques mettant en oeuvre la précipitation d'anticorps sont connus, ces procédés comprenant les titrages enzymatiques avant et après l'introduction de l'anticorps de précipitation et l'isolement du complexe anticorpsisoenzyme insoluble. Cependant, dans de nombreux cas, les anticorps de précipitation n'ont pas été isolés, c'est-à-dire que le complexe vlticorps-isoenzyme est soluble dans le liquide d'essai et quten conséquence, il n'existe pas de titrage immunologique connu. Selon une variante, si le complexe soluble peut être précipité dans le liquide d'essai par une réaction ultérieure avec des composés supplémentaires, on obtient un titrage efficace.Dans le cas présent, l'utilisation de ces conposés supplémentaires donne des précipités uniquement après un temps relativement long, généralement de l'ordre de 1 à 7 jours. Selon l'invention, la polymérisation des anticorps d'une isoenzyme spécifique et l'utilisation ultérieure des anticorps insolubles obtenus dans la réaction antigène-anticorps est un procédé de titrage immunochimique simple et très spécifique qui nécessite généralement moins d'une heure d'incubation.L'invention concerne un procédé de titrage dtur échantillon liquide, par exemple d'humeur ou d'un extrait de tissu, d'une isoenzyme spécifique et en particulier d'une isoenzyme de la phosphates alcaline, ce procédé comprenant la préparation d'un enti-sérum qui contient les anticorps de l'isoenzyme, l'insolubilisation des anticorps, l'utilisation du polymère d'an ticorps ainsi obtenu dans une réaction immunochimique avec l'isoenzyme de l'échantillon et le retrait du précipité résultant qui comprend le complexe isoenzyme-anticorps polymère.Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend, en outre, des titrages enzymatiques de référence de l'échantillon avant et après la réaction immunochimique et le retrait ultérieur du complexe d'isoenzyme et de polymère d'anticorps, puis la détermination de la variation de l'activité enzymatique. Selon un autre mode de réalisation qui est une variante du précédent, le procédé comprend, en outre, un titrage enzymatique de référence du précipité qui contient le produit de la réaction immunochimique entre le polymère d'anticorps et l'isoenzyme spécifique cherchée et la détermination directe de l'activité isoenzymatique.La polymérisation des anticorps de ltisoenzyme est, de préférence, mise en oeuvre par mélange du sérum qui con- tient les anticorps avec du chloroformiate d'éthyle, la solution étant maintenue à un pH compris entre 2,2 et 8,5. Le procédé de titrage immunochimique décrit dans le présent mémoire est basé sur les propriétés antigéniques dis- tinctes que présentent certaines isoenzymes. La préparation du sérum qui contient les anticorps sépcifiques,désigné ci-après par anti-sérum, est donc une caractéristique essentielle du procédé de l'invention. Ces anti-sérums peuvent être obtenus par plusieurs procédés. Les méthodes d'induction de la synthèse des anticorps spécifiques dars les cellules animales hotes sont plutut des recettes que des procédés scientifiques. Ceci vient en partie du fait que les mécanismes de synthèse des anticorps scnt très peu connus. L'induction de la synthèse d'an ticorps spécifiques est suette à variation,par exemple en ce qui concerne la composition d'antigène, les additifs, l'espè ce animale hôte utilisée et les iodes opératoires de 1 t injec- tion de l'antigèns et de l'extraction du sérum. Les procédés peuvent être très simples pu très complexes. Toutes les techniques satisfaisantes connues d'induction de la synthèse d'an ticorps spécifiques des isoenzymes cherchées peuvent entre utilisées dans le cadre de l'invention. WJe procédé de l'invention peut s'app iquer généralement aux isoenzymes dont les anticorps 'ot pas été isolés. Par exemple, les anti-sérumsdes isoenzymes de la phosphatase alca- line qui ont été isolées jusqu'à présent ne donnent que des réactions d'inhibition partielle et de non-précipitation dans le -sérum. On n'a pas réussi à obtenir des précipités du produit de la réaction immunochimiqne dans les 24 heures. L'invention décrit un procédé de titrage immunochimique qui, dans le cas des isoenzymes de la phosphatase alcaline, diminue le temps nécessaire à l'analyse quantitative et le ramène à moins de une heure.On obtient ce résultat par polymérisation des anticorps dans l'anti-sérum et utiiisation du polymère d'anticorps obtenu pour la précipitation de l'isoenzyme cherchée. Il est surprenant que, lors de la polymérisation des anticorps de l'isoenzyme selon le procédé de l'inyention, le polymère d'anticorps obtenu, non seulement conserve une activité immunochimique notable, mais est aussi capable de précipiter l'isoenzyme de l'échantillon liquide. La polymérisation des anticorps dans l'anti-sérum implique la réaction des groupe carboxy et amino terminaux et la formation de liaisons amides. Cette réaction est la suivante RCOOH + H2NR' # RCONHR' dans laquelle R et R' représentent la structure résiduelle de la protéine complexe des anticorps analogues. Cette réaction n'est pas spontanée dans le cas des anticorps.En conséquence ce, l'introduction d'un agent activateur est nécessaire à la for matin d?un complexe avec un anticorps pour que celui-ci réagisse spontanément avec un autre anticorps et donne un po- lymère d'anticorps Tous les réactifs connus capables d'induire la synthèse de liaison amide entre un groupe carboxy terminal et un groupe amino terminal, conviennent à ce procédé de polymérisation. Ces réactifs sont divers carbodiimldes, chloroformiates et chlorures d'acyle.Le choix d'un réactif particulier parmi ces différents groupes de composés dépend des limites imposées par la stéréochimie et de la stabilité des composés activés pendant la réaction. D'après ces deux exigences, les réactifs utilisés le plus Eouvent sont le di- cyclohexylcarbodiimide, le chloroformiate d'éthyle, le chloroformiate d'isobutyle et le chlorure de pivaloyle. Il faut remarquer que tcus les composés qui réagissent avec les protéines peuvent etre utilisés dans le procédé de l'invention. Selon l'invention, il est essentiel que le polymère d'anticorps obtenu conserve son activité immunochimique. La méthode de titrage décrite est basée sur l'insolubilisation des isoenzymes spécifiques par une réaction immunochimique avec des anticorps polymérisés. En conséquence, il est impératif que la polymérisation des anticorps mette en oeuvre des sites n'ayant pas de réactivité immunochimique, dans la mesure du pcssible. Les sites actifs des anticorps doivent etre protégés de la réaction dans la plus grande mesure possible. Il semble que le choix des sites puisse être obtenu par réglage du pH du milieu. En général, à pI1 neutre, la plupart des sites actifs réagissent, tandis que, lorsque l'acidité augmente progressivement, les sites actifs sont protégés pen- dant la réaction de polymérisation. Cependant, à un moment donné, un accrcissement de l'acidité provoque la dénaturation de la protéine de l'anticorps.En conséquence, il existe une valeur optimale de l'acidité du milieu dans lequel la polymérisation des anticorps est induite et pour laquelle les sites actifs sont pratiquement protégés. La plage de pH qui convient correspond généralement aux valeurs comprises entre 2,2 et 8,5, de préférence entre 4 et 5 dans le cas du chloroformiate dréthyle. Lorsque le pH est supérieur à 5, l'activité immu- nochimique du polymère est inhibée-et lorsque le pH est inférieur à 4, la protéine est dénaturée, 'la valeur du pH est surveillée continuellement, en particulier dans les cas où l'agent de polymvorisatioll est un chloroformiate ou un chlorure d'acyle et où il se dégage du gaz chlorhydrique. L'utilisation d'un tampon est également avantageuse. Dans le cas d'un dégagement de gaz chlorhydrique, l'utilisation d'un tampon et le réglage avec une base non seulement maintiennent le pH dans la plage optimale de valeurs mais également déplacent l'équilibre de la réaction en faveur de la formation du complexe activé, par élimination d'un sous-produit. Be polymère d'anticorps précipité est de préférence éliminé de la solution de réaction par filtration ou centrifugation et conservé dans une solution tampon sous forme de suspension. Bien que la réaction de polymérisation soit de préférence mise en oeuvre en milieu acide, l'activité immunochimique diminue de 50 % en 24 heures si le polymère d'anticorps reste en solution au meme pH. Pendant.la conservation, le pH doit de préférence être de l'ordre de la neutralité, généralement compris entre 6,5 et 7,5. Be tris(hydroxylméthyl)- aminométhane est un tampon intéressant. 'les suspensions de polymère d'anticorps conservées dans ce tampon sont pratiquement stables en ce qui concerne leur activité immunochimique.Le polymère d'anticorps peut également être sous forme d'une poudre sèche, dont la stabilité est encore améliorée. L'addition des anticorps polymérisés à un échantillon liquide provoque une réaction immunochimique entre le polymère d'anticorps et l'lsoenzyme spécifique de ces anticorps. La quantité d'anticorps polymérisés ajoutée à l'échantillon liquide est de préférence telle que la presque totalité de l'isoenzyme spécifique recherchée présente dans l'échantillon liquide soit insolubilisée par réaction immunochimique. Une quantité de polymère d'anticorps capable d'inhiber environ quatre fois la quantité normale d'activité de l'isoenzyme suffit généralement. Ces quantités préférées de polymère d'anticorps sont obtenues par titrage d'échantillons dont l'activité est connue, par exemple dtisoenzyme pure cu de Sérums provenant d'un lot préalablement titré par un procédé tel que l'inactivation par la chaleur. En outre, le mélange réaction nel est de préférence incubé sous agitation qui favorise la réaction avec l'isoenz-me recherchée. Be produit de la réaction immunochimique qui comprend l'isoenzyme spécifique cher- chée associée au polymère d'anticorps est insoluile, et, en conséquence, le retrait de l'isoenzyme spécifique de ltéchan- tillon liquide, oar filtration ou centrifugation, est possible. La détermination de activité enzymatique totale de l'enzyme correspondant à l'isoenzyme titrée, avant et après la réaction immunochimique avec les anticorps polymérisés,donne la quantité relative de l'isoenzyme spécifique par rapport aux anticorps , par différence. Selon mie variante, l'activité té enzymatique du produit insoluble de la réaction peut être mesurée directement par titrage enzymatique de ce produit et non du surnageant liquide. Un titrage de ce type implique l'in- troduction du précipité dans un solvant q?ai contient un substrat.La réaction immunochimique de l'isoenzyme et du polymère d'anticorps implique une certaine inhibition de l'activité enzymatique par empêchement stérique. Le facteur d'inhibition est fonction de l'enzyme et de la structure du polymère d'an- ticorps particuliers utilisés et peut être facilement calculé pour chaque cas particulier d'isoenzyme et de polymère d'anticorps à partir d'un titrage de référence mettant en oeuvre des échantillons dont l'activité isoenzymatique est connue. Ce procédé direct est intéressant pour le titrage de-quantités relativement faibles d'isoenzymes, puisque une détermination par différence implique un pourcentage élevé d'erreur. Le titrage de l'isoenzyme de Regan de la phoshatase alcaline est généralement de ce type. Le titrage d'activité enzymatique peut être réalisé par utilisation de tous les procédés connus, par exemple des techniques spectrophotométriques qui mettent en oeuvre un support de phosphate de Fara-nltrophényLe et qui sont appliquées à la phosphatas e alcaline. 'les échantillons liquides qui peuvent être titrés selon le procédé décrit dans le présent mémoire sot les humours et les extraits de tissus animaux et humains. Ces humeurs et ces extraits de tissus sont, par exemple, l'urrne, le sérum, le liquide amniotique et les extraits placentaires. les titrages du sérum sont particulièrement Intéressants dans les diagnostics médicaux, comme indiqué précédement. Le sang vient en contact intime avec les parties du corps dont les isoenzymes dérivent. Une maladie ou une lésion de ces parties du corps provoque une libération progressive dans le sang d'isoenzyme éventuellement spécifique de cette zone, comme par exemple dans le cas des isoenzymes de la phcsphatase alcaline. Cette libération est iracile à détecter comme uii accroissement du taux d'isoenzymes dans le sérum, grâce au procédé de titrage de l'invention. Le procédé de ltinvention a de nombreux avantages par rapport aux procédés connus de titrage des isoenzymes, an particulier des isoenzymes de la phosphatase alcaline. Le procédé de titrage immunochimique de l'invention est simple, très spécifique et rapide et ne nécessite environ que 30 inn, et donne des résultats précis, fiables et reproductibles. Ce procédé peut être mis en oeuvre par un personnel rela-tivement peu spécialisé et l'appareil le plus complexe qu'il nécessite est un spectrophotomètre. lies exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1 Cet exemple concerne la préparation de l'anti-sérun On fait à des lapins une première injection d'isoenzyme placentaire de la phosphatase alcaline purifiée en solution saline, mélangée à un volume égal d'additif total de Freund. La concentration de cette première injection est de 0,5 mg/cm3 de protéine. On injecte 0,1 cm3 dans chaque coussinet des pattes. On fait des injections de rappel par voie intraveineuse, dans l'oreille, au bout de 21, 23, 56, 58, 91 et 93 jours. Les injections de rappel contiennent une solution saline d'isoenzyme placentaire purifiée sans additif, et correspondent à un volume de 0,2 cm3 par lapin, à raison de 1 mg/ cm3 de protéine. On fait des prises de sang au bout de 33 et 68 jours et on vide complètement l'animal de son sang au bout de 103 jours. Exemple 2 Cet exemple décrit la préparation d'un polymère d'anticorns On dissout 0,5 cm3 d'antisérum placentaire de phos- pha-t;ase alcaline de lapin dans 5 cm3 d'un tampon à l'acétate 0,2 M à pH 4-,5. On place la solution dans un bécher de 10 cm3 à agitateur magnétique et on ajoute 0,25 cm3 de chloroformiate d'éthyle sous agitation constante. On maintien constamment le pH de la solution et on le règle par addition de NaOH 1 N. Environ 5 mn après l'addition du chloroformiate d'éthyle, la solution devient trcuble et, très rapidement, il se forme un précipité lourd.Après agitation pendant encore 30 mn, on laisse la solution reposer à la température ambiante pendant 1 heure, puis on la centrifuge à 3000 tr/mn pendant 15 mn. On lave le précipité trois fois avec 15 cm3 d'un tampon tris(hy droxyméthyl)-aminométhane 0,1 M à pH 7,2 et on le centrifuge à 12 000 tr/mn pendant 15 mn, après chaque lavage. On remet ensuite le précipité an suspension dans 5 cm de tampon. Exemple 3 Cet exemple décrit les procédés de titrage immuno chimique A. On ajoute 5 mm3 d'antisérum placentaire de phosphatase alcaline pclymérisé de lapin à chacun de 12 échantillons de 0,3 cm3 de sérum de femme enceinte. On place chaque mélange dans une petite fiole de matière plastique à bouchon filtrant, et on agite pendant 30 mn. On filtre ensuite chaque mélange en renversant la bouteille et en pressant modérément. On soumet le surnageant filtré à un titrage enzymatique de la phosphatase alcaline, le phosphate ae paranitrophényle étant utilisé comme substrat, et on lit la variation d'absorption à 404 mm. On soumet un volume de chacun des échantillons de sérum qui n'ont pas été mélangés avec leur antisérum polymérisé à un titrage enzymatique identique et on calcule la différence d'activité. On mesure également l'activité isoenzymatique placentaire du sérum non traité, par inactivation à la chaleur, à titre comparatif. On obtient les résultats suivants Echantillon Titrage immunochimique, Inactivation thermique, N unités internationales/ unités interna litre tionales/litre 1. 44,1 44,8 2 12,0 5,3 3 51,2 57,6 4 121,5 119,8 5 41,9 30,4 6 72,0 68,8 7 78,4 76,8 8 38,7 44,8 9 17,1 18,1 10 8,5 11,1 6,8 5,3 12 6,4 6,3 B.On répète le mode opératoire décrit dans le procédé A, mais avec 12 échantillons de liquide amniotique et on obtient les résultats suivants Echantillon Titrage immunochimique, Inactivation thermique, N unités internationales/ unités internationales/ litre litre 1 2,1 3,2 2 4,0 2,6 3 4,0 5,8 4 2,7 2,6 5 3,8 4,8 6 5,1 6,9 7 4,8 5,8 8 1,4 3,2 9 2,2 3,7 10 2,7 7,4 11 3, 6,4 12 7,5 6,9 Il faut remarquer que le procédé d'inactivation par la chaleur n'est pas spécifique de l'isoenzyme placentaire, sauf dans le cas de fluides dont toutes les autres isoenzymes sont sensibles à la chaleur.Lorsque l'activité enzymatique détectée est faible, des petites quantités d'isoenzyme de phosphatase alcaline stables à la chaleur, autres que l'iso enzyme placentaire, modifient le résultat obtenu pour l'activité. C. On répète le mode opératoire décrit dans le procédé A et on l'applique à 12 échantillons d'extrait placentaire dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,01 M à pH 7, mais on obtient les valeurs comparatives par une méthode colorimétrique mettant en oeuvre le phosphate de para-nitrophényle. On peut utiliser cette méthode à titre de comparaison, puisque l'isoenzyme placentaire est la seule isoenzyme de la phosphatase alcaline présente dans les extraits placentaires. Echantillon Titrage immunochimique, Colorimétrie, N unités internationales/ Unités internationales/ litre litre 1 201 201 2 151 146 7 125 116 4 103 98 5 75 68 6 52 56 7 26 28 8 15 18 9 89 86 10 109 112 103 110 12 180 175 D. On ajoute 5 mm d'antisérum placentaire alcalin de phosphatase polymérisé de lapin à chacun de 12 échantillons de 0,3 cm de sérum canoéreux, ce sérum ayant été chauffé à 60 C pendant 10 mn pour que les isoenzymes parasites soient inactivées. On place chaque mélange dans une petite fiole de matière plastique à bouchon filtrant, et on agite pendant 30 mn.On filtre ensuite chaque mélange en retournant la fiole et en pressant modérément. On met en suspension le précipité filtré dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane à pH 7 et on le soumet à un titrage enzymatique de la phosphatase alcaline avec du phosphate de para-nitrophényle utilisé comme substrait. On soumet un volume de chacun des échantillons de sérum qui n'ont pas été mélangés avec l'anti-sérum polymérisé à un titrage enzymatique identique, et on calcule la différence d'activité. Le facteur d'inhibition qui résulte de la réaction immunochimique est calculé en fonction du fait que l'activité de l'isoenzyme complexée diminue de 30 . On utilise à titrage comparatif une méthode d'inactivation par la chaleur.On obtient pour l'isoenzyme de Regan les résultats suivants Echantillon Titrage immunochimique Inactivation ther N Unités internationales/ mique, unités inter litre litre ~~~~~~~~~~~ nationales/litre 1 2,5 2,8 2 0,23 0,27 3 0,34 0,40 4 0,69 0,81 5 1,1 1,53 6 2,8 3,1 7 1,5 2,7 8 0,9 1,6 9 0,72 0,81 10 0,30 0,35 11 0,42 0,51 12 0,89 0,97 E.On répète le mode opératoire décrit dans le procédé D et on l'applique à 12 échantillons de sérum de femme enceinte dont on détermine l'activité isoenzymatique placentaire, et on obtient les résultats suivants Echantillon Titrage immunochimique, Inac-tivation thermique, N0 unités internationales/ unités internationales/ litre litre 1 27,1 23,7 2 11,5 14,9 3 42,1 38,1 4 14,3 13,4 5 46,8 46,6 6 37,5 36,8 7 40,0 35,7 8 43,7 37,3 9 22,0 18,4 10 32,7 29,8 11 58,5 49,4 12 32,3 30,1 F. On répète le mode opératoire décrit dans le procédé D et on l'applique à 12 échantillons d'extrait placentaire dans un tampon de tris (hydroxyméthyl)-aminométhane 0,01 M à pH 7, mais on obtient les valeurs comparatives par une méthode colorimétrique, comme précédemment. Echantillon Titrage immunochimique, Colorimétrie, N Unités internationales/ Unités internationales/ litres litre 1 122 115 2 104 105 3 112 99 4 51,2 50,1 5 56,0 53,0 6 25,6 27,3 7 27,2 31,4 8 18,1 17,1 9 20,8 19,7 10 19,7 17,2 11 8,9 9,3 12 10,7 9,5 Il va de soi que l'invention nta été décrite qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et qu: on pourra apporter toute variante sans sortir de son cadre Rk;VENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un polymère dtanticorps d'une isoenzyme spécifique, caractérisé par la réaction de ces anticorps avec un réactif capable dtinduire la formation de liaisons amide entre des groupes carboxy et des groupes amino. 2. A titre de composé nouveau, le polymère obtenu par le procédé selon la revendication 1. 3. Procédé de précipitation d'une isoenzyme spécifique, caractérisé par la polymérisation des anticorps de cette isoenzyme et la réaction immunochimique du polymère obtenu avec Irisoenzyme spécifique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polymère d'anticorps est le produit obtenu par réaction de ces anticorps et d'un réactif capable dtinduire la formation de liaisons amide entre des groupes carboxy et amino. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 4, caractérisé en ce que le réactif est le chloroformiate d'éthyle et la réaction a lieu en solution, le pH de la solution étant maintenu entre environ 2,2 et 8,5. 6. Procédé de titrage dans un échantillon liquide d'une isoenzyme spécifique, comprenant l'isolement de l'isoenzyme spécifique de l'échantillon liquide et soit le titrage enzymatique de l'échantillon liquide avant et après l'isolement de l'isoenzyme spécifique et le calcul par différence de ltac- tivité enzymatique de cette isoenzyme contenue dans l'échan- tillon liquide, soit le titrage enzymatique de l'isoenzyme spécifique après son isolement et la mesure directe de l'activité enzymatique de cette isoenzyme, procédé carcctérisé en ce que l'isoenzyme spécifique est isolée de l'échantillon liquide par réaction de cet échantillon liquide et d'un polymère d'anticorps spécifique de l'isoenzyme et formation d'un précipité qui contient un produit de la réaction immunochimique du polymère d'anticorps et de n'importe laquelle des isoenzymes spécifiques présentes dans l'échantillon liquide,et le précipité est isolé de l'échantillon liquide, 7. Procède selon la revendication 6, caractérisé en ce que la quantité isolée de polymère d'anticorps qui réagit avec lté- chantillon liquide peut précipiter pratiquement toute l'iso- enzyme spécifique présente dans l'échantillon liquide. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'échantillon liquide est une humeur ou un extrait de tissu, par exemple du sérum. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3 et 6, caractérisé en ce que l'isoenzyme spécifique est une isoenzyme de la phosphatase alcaline. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'isoenzyme spécifique delaphosphatase alcaline est l'isoenzyme placentaire, l'isoenzyme du foie ou l'isoenzyme de Regan.