FR 2196790 A1 19740322 FR 7217233 A 19720515 La présente invention est relative à un composé prend téinique doué d'activité biologique, que lton obtient à partir d'acariens. L'invention concerne plus particulièrement l'application d'un antigène à la formation d'anticorps de cti- mulation, et à la préparation d'un antisérum. On a trouvé que la poussière de ménage et les pellicules humaines et animales abritent des acariens. Parmi les di versacariens que l'on rencontre dans la poussière de ménage et les pellicules humaines et animales, le genre Dermatophagoides est le plus abondant et les espèces que l'on observe le plus souvent sont D. pteronyssinus, D. culinas et D. farinae. Les acariens du genre Glycophagus et du genre Acarus se rencontrent aussi couramment dans la poussière de ménage et les pellicules humaines. Les acariens sont plus proches parents des araignées et des scorpions que des insectes, et sont de petits organis- mes dont la taille ne dépasse pas i mm. Contrairement aux insectes, les acariens ont un corps non segmenté, portant ha.bi tuellenent 8 pattes, aux stades in,aginill et nympha.l. On a découvert que les acariens contiennent une substance capable de provoquer une réponse respiratoire allerg;que chez les etres humains et les animaux, réponse qui ressemble à de l'asthme.On a déterminé que plus de 80 % des patients atteints d'asthme al allergique montrent de telles réactions de sensibilité aux acariens, et on considère à présent que l'allergène de l'acarien est un agent responsable de l'asthme allergique. Cette découverte a entraîné la préparation d'extraits d'acariens que l'on utilise à la fois pour le diagnostic de l'allergie et le trait tement d'êtres humains et d'animaux. Les extraits d'acariens que l'on utilise dans la prati- que clinique ne sont pas définis, étant des produits bruts de macération aqueuse des acariens entiers, que l'on caractérise par les rapports de dilution poirlssvolbunie ou par les taux d'a.- zote déterminés par la methode xjenldahl. De plus, les diverses description des solutions connues d'extraits dlacartens sont dénuées d'informations caractérisant la nature de la matière active. Ainsi, bien qu'on considère l'allergène comme une protéine, on n'a trouvé aucune description de caractéristiques qui puisse en confirmer la nature protéinique.Aucun essai d'identification des protéines nta été décrit et aucune tentative n'a été faite pour en expliquer la structure chimique et physique. Outre le manque de définition des compositions contenant des allergènes d'acariens, le composé actif n'a jamais été isolé sous sa forme pure ni meme sous une forme solide, mais il a toujours été préparé sous la forme d'un mélange liquide d'extraction, protégé par un agent chimique. D'après la description des procédés d'extraction qui impliquent une macé- ration des acariens entiers, il reste douteux que l'activité de l'allergène soit le fait d'une substance unique, parce que l'acarien contient une grande variété. de composés susceptibles d'extraction, et rien n'a été tenté pour obtenir le composé sous la forme d'un extrait pur. On a constaté qu'il est possible d'extraire des acariens, au moyen du procédé de la présente invention, un composé protéinique qui réunit toutes les propriétés de l'allergène de l'acarien. De plus, on a constaté que cette protéine nouvelle peut être divisée en trois fractions, possédant chacune des propriétés d'allergène, mais différant par la grandeur moléculaire. Le composé protéinique extrait de l'acarien, appelé jusqu'à présent antigène d'acarien, est un composé homogène reproductible, doué de propriétés caractéristiques, capable de provoquer une réponse allergique et la formation d'anticorps lorsqu'il est introduit dans la pea.u et dans le système circulatoire d'un mammifère.De plus, l'exposition à l'antigène d'acarien peut provoquer une réponse asthmatique chez le mammifère sensible.L'antigène d'aca.rien peut être utilisé pour mettre en évidence une sensibilité allergique à des acariens, de meme que pour désensibiliser le patient sensible aux acariens et exercer ainsi un effet thérapeutique positif chez le patient asthmatique. Pour obtenir l'antigène d'acarien, on soumet les a.cariens à une extraction, on élimine les extraits inactifs et on en isole l'antigène d'acarien qui est formé. L'antigène d'acarien est une poudre amorphe dont la couleur va du blanc au blanc-crème, très soluble dans l'eau, la glycérine, le propylène-glycol et le polyoxaéthylène-glycol, a.yant un poids molé culaire de 200 à 800, mais il est insoluble dans les alcanols anhydres, le benzène, l'éther de pétrole, les hydrocarbures halogénés et l'acétone. L'antigène d'acarien est également soluble dans des solutions aqueuses alcooliques obtenues en mélangeant de l'eau et un alcanol inférieur de formule ROH, dans laquelle R est un groupe alkyle en C1 à C6.Le rapport de l'eau à l'alcanol liquide dans le mélange solvant doit être de 60-90 parties d'eau et 10-40 parties d'alcanol, en fonction de la longueur de la chaîne allylique carbonée que l'on utilise. Pour obtenir une solution de l'antigène d'acarien dans un mélange aqueux alcoolique préféré, par exemple, on constate que l'antigène d'acarien se dissout dans un solvant contenant 80 parties d'eau et 20 parties d'éthanol (volume/volume). La teneur en humidité de l'antigène d'acarien est inférieure à 1 % et le composé séché conserve ses propriétés biologiques lorsqu'il est conservé dans un récipient fermé pendant des périodes prolongées de temps. L'antigène d'acarien a la composition chimique élémentaire suivante : carbone 50 % + 5 % hydrogène 7 % + 1 % oxygène 22 % + 3 % ; azote 17 % + 3 % soufre 1,2 % + 0,6 ruz Le pH d'une solution contenant l'antigène d'acarien, à une concentration de 1 mg % dans de l'eau distillée, se situe entre 6 et 7, lorsqu'on le détermine par potentiométrie. L'antigène d'acarien donne un résultat positif dans les essais suivants de recherche des protéines : essai au biuret, essai à la ninhydrine, essai xanthoprotéique et essai de Millon. Une solution à 1 mg % d'antigène d'acarien dans de l'eau distillée est précipitée par la solution d'essai au chlorure d'aluminium, la solution d'essai au chlorure de zinc et la solution d'essai au nitrate d'argent. L'acide tannique à 1 %, l'acide phosphotungstique à 1 % et l'acide trichloracétique à 1 % forment tous des précipités lorsqu'ils sont ajoutés à des solutions de l'antigène d'a-carien. Le point isoélectrique de l'antigène d'acarien, déterminé en milieu acide acétique-acé tate de sodium, montre que le point isoélectrique pour l'antigène d'acarien se situe entre les pH 4 et 5. Le spectre infrarouge et le spectre ultraviolet de l'antigène d'acarien sont caractéristiques du composé. Lorsque l'antigène d'acarien est soumis à une chromatographie en couche mince dans laquelle un gel de silice sert de support chromatographique en particules de 250 microns et que le système de solvants qui s'écoule est un mélange de butanol, d'acide acétique et d'eau dans les proportions de 5:1:4 parties en poids, respectivement, on obtient trois bandes. La solution révélatrice est le réactif à la ninhydrine, consistant en 0,3 % de ninhydrine dans 100 ml de butanol et 3 ml d'acide acétique cristallisable.Les valeurs de R f des trois bandes séparées sont les suivantes Valeurs de Gamme des Couleur de Intensité Bande Rf valeurs de R f l'essai à la des bandes ninhydrine A 0,16 0,14-0,18 orangé (teinte forte rosâtre) B 0,28 0,25-0,30 rose faible C 0,41 0,375-0,430 rose orangé moyenne On obtient l'antigène d'acarien par extraction d'acariens avec un solvant convenable. On peut utiliser une culture pure d'acariens d'une seule espèce, ou bien une culture mixte. L'antigène d'acarien, une fois extrait,est purifié et séché. le rendement en antigène est pratiquement quantitatif, parce que les matières résiduelles sont dénuées d'activité d'allergène. La première étape du procédé de préparation de l'antigène d'acarien consiste à obtenir une culture convenable d'acariens.On y parvient de la meilleure façon en faisant incuber l'acarien avec des matières alimentaires convenables jusqu'à ce que la colonie ait acquis une densité suffisante pour permettre une extraction rentable. Naturellement, on peut utiliser une seule espèce d'acariens dans le procédé d'extraction, mais ceci n'est pas économique et n'est pas désirable du point de vue technique, en raison des très petites dimensions de l'équipement et des difficultés opératoires qui sont nécessaires. Pour le développement des acariens, le milieu de cul ture est de préférence un milieu qui contient une certaine concentration en vitamines B, et une levure, des pellicules épidermiques, des pellicules humaines et des poudres de céréales préparées.En pratique, on peut trouver commode d'uti liser les produits préparés pour ltalimentation des animaux, qui sont enrichis en vitamines et substances minérales, par exemple les aliments solides pour jeunes chiens, qui sont vendus sous diverses marques commerciales et qui contiennent des céréales, des vitamines et des suppléments minéraux. Les aliments particuliers qu'il convient d'utiliser comme milieux de culture sont nombreux et variés, mais ils sont bien connus des spécialistes en ce domaine. On peut utiliser l'une quelconque des espèces d1aca- riens dont on dispose, comme indiqué ci-dessus, bien quson préfère les espèces suivantes, poupes raisons pratiques : D. pteronyssinus, D. culinae, D. farinae, A. siro, G. domesticus, E. mayrei, I. putrescenticie. Dans la culture des acariens, on préfère utiliser une forte humidité, et on a trouvé qu'une humidité de 80 % est optimale. Lorsqu'on a obtenu une densité de culture suffisante, ce dont on s'assure par examen visuel se basant sur le fait qu'il y a davantage d'acariens que de substances nutritives, on sépare les acariens des particules alimentaires. Cette opération de séparation peut etre conduite selon un processus de flottation dans lequel les acariens et le produit alimentaire sont ajoutés à un solvant dont la densité diffère de celle de l'acarien et du produit alimentaire. Ainsi, par exemple, les acariens qui ont un poids spécifique inférieur à 1,30, flottent lorsqu'ils sont mélangés avec un solvant dont la densité est supérieure à 1,30, tandis qu'ils s'enfoncent si la densité du solvant est inférieure à 1,30. De même, les particules alimentaires ont généralement une densité supérieure à 1,30 et, par conséquent, elles s'enfoncent dans un solvant ayant une densité comprise entre 1,30 et 1,40. En plus de l'utilisation d'un solvant de flottation pour séparer les acariens des particules alimentaires, on peut procéder à une séparation dans l'air, selon laquelle les acariens et les particules alimentaires sont amenés à s'écouler à contrecourant avec de l'air dont la pression est réglée pour mainte nir un courant d'air sfffisant pour permettre aux particules alimentaires plus lourdes de se sédimenter, tandis que les acariens plus légers restent en suspension et sont traînés dans le courant d'air. Un troisième procédé de séparation des acariens des substances alimentaires consiste en un triage manuel qui utilise des tamis de porosité échelonnée, pour séparer les particules du mélange.Le procédé particulier à utiliser pour séparer les acariens du milieu nutritif dépend de l'importance du lot que l'on prépare et de la préférence de l!opérateur. Lorsque les acariens ont été séparés du milieu nutritif, on les dégraisse en les traitant avec un solvant de dégraissage inerte vis-à-vis de antigène des acariens. On peut utiliser avantageusement des solvants tels que les hydrocarbures halogénés, le benzène dérivé du pétrole, et les alcanes supérieurs tels que, par exemple, lthexane, lloctane et le décane. Les acariens dégraissés sont ensuite séchés et transformés en poudre. L'étape de transformation en poudre peut consister en une pulvérisation, un écrasement ou un broyage.La grosseur des particules de la poudre de broyage des acariens doit eAtred1au moins 0,250 m, pour que llextraction de l'antigène des acariens soit optimale, bien qu'on puisse utiliser un plus grand diamètre des particules, par exemple de 0,42 à 0,84 mm, de même que des particules de 0,149 mm ou dpun diamètre encore plus petit. La poudre brute d'acarien est ensuite extraite avec un solvant aqueux et, bien qu'on puisse utiliser l'eau distillée comme solvant, on peut juger préférable d'ajuster la pression osmotique du solvant avec des sels solubles ionisants, par exemple le chlorure de sodium, le chlorure de potassium et le chlorure de n.. magnésium. Ainsi, on peut utiliser comme solvant pour l'extraction, une solution à 0,9 ffi de chlorure de sodium et la solution de Ringer. Un solvant préféré dlextraction con- tient 4,5 g de phosphate monosodique, 5 g de phosphate disodique, 4 g de chlorure de sodium, dissous dans la quantité suffisante d'eau pour ajuster le volume à 1 litre. Le rapport du solvant d'extraction à la poudre brute d'acarien ntest pas dé terminant, mais une gamme préférée va de 20 volumes de solvant aqueux d'extraction par partie en volume de poudre brute d'aca rien, à 200 volumes de solvant aqueux par partie en volume de la mme poudre brute. L'extraction peut'être effectuée par de simples techniques de macération ou de percolation. On peut trouver désirable de mouiller tout d'abord la poudre brute d'acarien avec le solvant choisi, avant de commencer l'étape d'extraction, et on peut y parvenir par une lévigation de la quantité désiréesse poudre brute d'acarien avec un volume égal du solvant d'extraction que l'on choisit. On constate que l'extraction de la poudre brute d'acarien est pratiquement terminée en moins d'1 heure. Dans certaines conditions, on peut trouver désirable d'utiliser des périodes d'extraction plus longues ou plus courtes. Ainsi, par exemple, si lton utilise un procédé d'écoulement continu pour la préparation de l'antigène d'acarien, on peut trouver qu'une quantité d'antigène d'acarien satisfaisante du point de vue économique est extraite en moins d'une demi-heure de traitement avec le solvant, et que l'amélioration du rendement d'extraction ne justifie pas l'augmentation du coût d'une plus longue durée d'extraction. Par contre, on peut juger nécessaire, pour certaines opérations, d'arriver à un épuisement à peu près quantitatif de l'acarien, auquel cas on peut utiliser une plus longue durée d'extraction. Lorsque l'extraction est terminée, la matière solide est séparée du solvant d'extraction par tout moyen convenable, par exemple par filtration ou centrifugation. Le solvant limpide est alors placé dans un tube de dialyse en "cellophane" ou un tube de dialyse en viscose. On peut ajouter à la solution d'extrait une petite quantité d'un agent antiseptique de conservation, inerte du point de vue pharmaceutique vis-à-vis de l'antigène protéinique, par exemple 0,5 à 1 ffi de phénol ou de chlorobutanol et on peut dialyser le mélange vis-à-vis d'eau distillée pour éliminer les substances extraites de faible grandeur moléculaire. Le contenu du tube de dialyse est ensuite vidé et le solvant est évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu que l'on obtient constitue l'antigène d'acarien.L'antigène d'acarien ainsi obtenu est conservé dans des récipients clos et il est stable pendant de longues périodes de temps. Un autre procédé d'isolement et de récupération de l'antigène d'acarien consiste à le précipiter avec une solution de chlorure d'aluminium 0,5 M ou du sulfate de zinc, après son extraction de la poudre brute d'acarien. Le précipité de complexe métallique d'antigène d'acarien est recueilli par centrifugation, lavé à l'eau distillée, puis mis en suspen sioq(lans une solution 0,2 M de phosphate mono-ammonique. Le mélange est agité puis centrifugé pour isoler le phosphate d'aluminium ou le phosphate de zinc qui est insoluble. La solution surnageante limpide est ensuite dialysée vis-à-vis dteau distillée en utilisant une membrane de dialyse en "cellophane" ou viscose. L'antigène d'acarien, après purification, est récupéré par élimination du solvant aqueux sous pression réduite. A la place des solutions de chlorure d'aluminium ou de sulfate de.zinc que l'on utilise pour précipiter l'antigène d'acarien extrait, on peut utiliser l'un quelconque des composés de métaux lourds tels que les sels solubles de plomb, d1ar- gent ou de baryum, ou des solutions précipitant les protéines, par exemple l'acide tannique, l'acide phosphotungstique et l'acide trichloracétique. Chacun des agents mentionnés ci-dessus possède certains avantages dans des procédés particuliers adoptés pour l'isolement de l'antigène d'acarien après son extraction. Un autre procédé permettant d'obtenir 1' antigène d'acarien sous la forme pure consiste à utiliser une technique d'adsorption, puis à isoler l'antigène d'acarien adsorbé de la surface de l'agent d'adsorption. A ces fins, on peut utiliser du gel d'alumine, du kaolin, du gel de silice ou les résines échangeuses d'ions, du type polyamine. Lors de l'isolement de l'antigène d'acarien par un procédé d'adsorption, on peut procéder à l'adsorption en ajoutant la quantité appropriée de matière adsorbante choisie à la solution aqueuse d'extrait contenant l'antkène d'acarien, et séparer la substance adsorbante choisie en meme temps que l'antigène d'acarien. L'antigène d'acarien est ensuite isolé de la matière adsorbante par élution. La solution a.queuse d'extrait contenant l'antigène d'acarien peut aussi Autre amenée à passer à travers une colonne de la matière adsorbante choisie, cette opération étant suivie de l'élution de l'antigène adsorbé d'acarien de la substance adsorbante. La solution éluante que l'on utilise pour isoler l'antigène d'acarien de la substance adsorbante peut être une solution-tampon de phosphate monosodique et de phosphate disodique, une solution de phosphate mono-ammonique 0,2 M, une solution-tampon d'acide acétique à l'acétate de sodium ou tout autre solvant d'éluvion acceptable du point de vue pharmaceutique. L'antigène d'acarien élué est ensuite débarrassé par dialyse de la solution-tampon et le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner l'antigène actif acarien, à l'état sec. Selon l'invention, l'antigène d'acarien est appliqué dans la formation d'un antisérum qui est intéressant pour la normalisation des préparations d'antigène d'acarien. Les préparations d'anticorps d'allergène que lton utilise pour le diagnostic et la désensibilisation sont définies par la dilution des substances allergènes susceptibles d'extraction, par unité de volume, ou par la teneur en azote de la solution, cette teneur en azote étant liée à la quantité de protéine d'allergène en solution. A l'heure actuelle, on ne dispose pas de méthode biologique de normalisation pour le contrôle de qualité des préparations manufacturées ou pour le dosage de la substance active aux fins de l'administration précise, dans des opérations cliniques. On a trouvé qu'une méthode pratique, précise, sensible et reproductible de détermination de l'activité de la substance antigène douée d'activité biologique en solution, peut être effectuée au moyen d'un antisérum préparé avec l'antigène respectif. Cet antisérum est spécifique de l'antigène et forme par floculation un précipité qui reflète quantitativement la quantité d'antigène. en solution. Dans la préparation de cet antisérum, l'antigène est injecté de façon répétée, à de faibles doses, à un mammifère, par exemple un lapin, un cobaye, un singe, en une période de 2 à 4 semaines, puis l'animal récepteur est saigné. On laisse le sang se coaguler, on sépare le caillot du sérum et le sérum contient alors les anticorps relatifs à l'antigène spécifique, et constitue un antisérum. On détermine quantitativement le titre en anticorps de l'antisérum en utilisant un étalon de référence, par exemple l'antigène isolé ou une concentration connue d'antigène en solution, que lton choisit comme étalon. Le titrage de l'antigène est effectué par addition de volumes égaux d'antisérum et de concentrations connues d'a.ntigène en solution pour former un précipité. Le poids de précipité ou le volume de sédiment dans un tube de mesure exprime avec précision la teneur quantitative en anticorps de l'antisérum. Ainsi, par exemple, si la quantité produite de précipité est de 0,05 mg, ou si une hauteur de sédiment de 1 mm résulte du mélange de l'antisérum et de la solution d1antigène, cette valeur peut être liée à la quantité d'antigène présent dans la solution connue, ce qui donne un antisérum normalisé. Ce dernier est alors prêt à être utilisé dans le controle de qualité des solutions d'antigène préparées en vue du diagnostic et de la désensibilisation clinique. En pratique, une quantité mesurée de la solution manufacturée d'antigène que l'on doit utiliser cliniquement est mélangée avec 1 ml d'antisérum et on détermine le poids ou le volume du précipité formé. Une méthode pratique consiste à mélanger les solutions correspondantes dans un tube à alésage normalisé, portant à sa surface extérieure une graduation en millimètres, ce qui permet de déterminer aisément le volume de précipité. Après mélange de llantisérum avec la solution inconnue d'antigène, le mélange est laissé au repos à la température ambiante pendant une période drau moins 4 heures, puis le tout est centrifugé pour donner un culot uniforme. Le volume de précipité est ensuite mesuré à l'aide des traits de repère portés par le tube.Cette valeur est alors en relation avec la solution d'essai manufacturée inconnue, et indique avec précision l'activité de la solution correspondante d'antigène, en unités d'antigène par millilitre de solution. On obtient ainsi une mesure précise de activité de la solution d'essai pour un diagnostic et/ou de la solution de désensibilisation clinique. Tout antigène capable de provoquer la formation d'anticorps chez le mammifère, peut être utilisé pour la préparation d'un antisérum destiné à la normalisation de solutions respectives d'antigène, et on eut utiliser, pour la formation d'un antisérum, des antigènes tels que le pollen responsable du rhume des foins, le pollen d' Ambrosia, ie pollen de rose, diverses espèces de graminées, des fibres animales, la fourrure animale, la laine, le cuir, les allergènes d'origine alimentaire, par exemple des produits lactés, le chocolat, des produits-dérivés de poissons, de meme que d'autres allergènes capables de provoquer la formation d'anticorps chez des animaux. D'une manière analogue, l'antigène obtenu à partir des acariens peut & re utilisé pour préparer un antisérum à l'antigène d'acarien, auquel cas le procédé décrit pour la formation des anticorps est utilisé chez des lapins, des singes, des hamsters, et des cobayes. L'antisérum obtenu après la saignée de l'animal et la coagulation du sang est ensuite soumis à un essai de détermination de l'activité des anticorps avec un poids connu antigène d'acarien, et la valeur est exprimée par la concentration ed antigène d'acarien par millilitre. Après sa normalisation, l'antisérum à l'antigène d'acarien est preAt à être utilisé pour le titrage de préparations contenant 11 antigène d'acarien ou l'extrait en solution obtenu à partir des acariens.Cette opération est conduite par addition de volumes connus d'antisérum à l'antigène d'acarien à un volume mesuré de la solution aqueuse inconnue contenant 11 antigène d'acarien. Le volume de précipité formé est une détermination précise du pouvoir biologique des propriétés antigènes de l'ingrédient actif de l'antigène d'acarien manufacturé ou de l'extrait d'acariens. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. Exemple t. On prépare un élevage d'acariens dans un récipient correct. Bien qu'on puisse utiliser l'un quelconque des acariens des genres Dermatopharroides, Glycophaaus et Acarus, ou leurs mélangez le genre Dermatophagoides constitue un genre d'acarien convenable pour ltélevage. Le milieu nutritif peut être une levure ou une poudre préparée enrichie pour l'alimentation des animaux, par exemple des aliments pour jeunes chiens, ou un mélange de ces milieux.Les daphnies'séchées constitueAt un milieu nutritif particulièrement intéressant pour la culture de l'acarien D. farinae, la poussière de ménage, la farine de poisson et les pellicules de desquamation de la peau humaine étant également des milieux nutritifs intéressants à utiliser pour le développement des acariens, notamment lorsqu'on ajoute certaines quantités de levure. On ajoute un mélange de D. pteronyssinus, D. culinae et D. farinae 'in mélange nutritif contenant 50 parties de farine de polisson, 30 parties de daphnies séchées, 10 parties de levure de brasserie et 10 parties de pellicules de peau humaine. Le mélange est mis à incuver à une température d'environ 25oC et à une humidité relative de 80 , pendant une période d'environ 6 semaines. Lorsque l'examen visuel de la culture en cours d'incubation indique qutil y a plus d'acariens que de substances nutritives, on sépa.re les acariens du milieu nutritif. Pour séparer les acariens du milieu nutritif, on peut procéder par tamisage en utilisant des tamis dont la porosité est progressive, et dont les pores ont une grosseur suffisante pour retenir les acariens tout en laissant passer la substance nutritive en poudre. Si l'on désire utiliser ce procédé de séparation des acariens de la substance nutritive, cette substance doit d'abord tre broyée en particules plus petites que les acariens, dont la taille se situe généralement entre 200 et 500 microns. Les acariens restent à la surface du filtre poreux pendant que les substances nutritives le traversent. En utilisant un ensemble de deux filtres dont la porosité couvre la gamme de taille des acariens, on obtient un taux d'isolement des acariens du milieu nutritif d'au moins 80 . Les acariens séparés sont ensuite mis en suspension dans 25 ml d'éther, en vue du dégraissage. On utilise un solvant de dégraissage tel que le pétrole, le benzène, l'éther ou le chloroforme, l'éther étant le solvant préféré. On sépare les acariens du solvant de dégraissage à laide d'un entonnoir de Buchner, avec un léger effet de succion. Les acariens sont ensuite lavés avec deux portions de faible volume de solvant de dégraissage, puis ils sont séchés à l'air. Les acariens séchés sont alors pulvérisés en une poudre dont les particules ont un diamètre égal ou inférieur à 0,250 mm, au moyen d'un mortier et d'un pilon ou d'un broyeur méca nique convenable, suivant le volume d'acariens que l'on doit pulvériser. il y a lieu de remarquer que les acariens ont un poids extrêmement faible et qu'environ 1000 acariens pèsent entre 1 et 2 mg. La poudre d'acarien est ensuite extraite à l'aide d'un solvant correct. L'extraction de la poudre d'acarien peut etre effectuée au moyen d'une colonne de percolation, avec recyclage éventuel du produit percolé. Pour la conduite de l'extraction par percolation, on garnit avec la poudre d'acarien une colonne de verre qui peut contenir des perles de verre comme interfaces de séparation, le cas échéant. Le solvant d'extraction est ensuite versé par la partie supérieure de la colonne, etssn le laisse ensuite s'infiltrer dans la colonne par gravité, à un débit d'une goutte par minute. Lorsqu'on utilise la technique de percolation, le rapport préféré de la poudre d'acarien au solvant est de 1 volume d'acarien par 50 volumes de solvant d'extraction par percolation que l'on utilise. Le produit de percolation est recueilli dans un récipient correct en verre, et le solvant est éventuellement recyclé.L'étape de recyclage peut être répétée plusieurs fois, suivant le pourcentage de produit d'extraction que l'on compte obtenir. A la fin de 11 étape de percolation, l'extrait limpide est recueilli et placé dans un sac de dialyse en cellophane ou en viscose. Le sac de dialyse est alors traité à l'eau distillée pour éliminer les impuretés extraites solubles dans l'eau, de grandeur moléculaire inférieure. Un moyen simple de s'assurer de la fin du processus de dialyse consiste à s' as- surer qu'aucun trouble ne se forme lorsque quelques gouttes de réactif au nitrate d'argent sont ajoutées au liquide en cours de dialyse. Le contenu du tube de dialyse est alors vidé dans un récipient de verre et évaporé à sec sous pression réduite, sans chauffage. Le résidu constitue l'antigène d'acarien qui est forme. L'antigènqdlacarien formé est une poudre amorphe allant de la couleur blanche à la couleur crème, soluble dans l'eau, dans la glycérine, dans le propylène-glycol et dans le potyoxy- éthylène-glycol, de poids moléculaire compris entre 200 et 800, et insoluble dans les alcanols anhydres, le benzène, l'éther de pétrole, l'éther diéthylique, les hydrocarbures halogénés et l'acétone. Lorsque on mélange une petite portion, par exemple 0,1 mg, de l'antigène d'acarien ainsi obtenu, avec 2 gouttes de solution à 10 % d'hydroxyde de sodium, et qu'on ajoute à ce mélange 2 gouttes de solution à 0,5 % de sulfate de cuivre, il se développe une couleur rougeâtre-pourpre qui indique que le test au biuret pour la recherche des protéines est positif. On ajoute à un autre échantillon de antigène d'acarien formé, par exemple un échantillon de 0,01 mg d'antigène, une goutte diacide nitrique concentré, et il se forme un précipité bla.nc qui vire au jaune par chauffage, en donnant une réaction xanthoprotéique positive.On obtient d'une fasoianalogue des résultats positifs dans la réaction de Millon et le test de Hopkins-Cole pour la recherche des protéines, lorsque ces essais sont effectués avec 19 antigène d'acarien. L'analyse chimique élémentaire de l'antigène d'acarien ainsi formé est la suivante carbone 50 % + 5 % hydrogène 7 % + 1 % oxygène 22 % + 3 % azote 17 % + 3 % soufre 1,2 % + 0,6 % Le pH d'une solution contenant 1 mg %0 d'antigène d'acarien dissous dans de l'eau distillée se situe entre 6 et 7. On prépare une solution-mère d'antigène d'acarien contenant 0,25 mg % d'antigène d'acarien dans 1 ml d'eau distillée et on ajoute à cette solution-mère 0,5 ml de solution d'hydroxyde de sodium 1 N et 0,5 ml de solution d'acide acétique 1 N. Le volume du mélange est ensuite ajusté à 2,5 ml avec de l'eau distillée. On place dans une série de 5 tubes exactement 0,5 ml de la solution-mère indiquée ci-dessus. On ajoute au premier tube exactement 0,44 ml d'eau distillée et 0,013 ml d'acide acétique 0,1 N. On ajoute au tube no 2 0,44 ml d'eau distillée et 0,025 ml d'acide acétique 0,1 N. On ajoute au tube no 3 0,40 ml d'eau distillée et 0,5 ml d'acide acétique 0,1 N. On ajoute au tube no 4 0,35 ml d'eau distillée et 1,0 ml d'acide acétique 0,1 N et on ajoute au tube no 5 0,25 ml d'eau distillée et 2,0 ml d'acide acétique 0,1 N. Les mélanges contenus dans les tubes sont mélangés soigneusement et observés après 30 minutes de repos. Le trouble est plus grand dans les tubes no 3 et no 4 et il diminue dans les tubes no 5 et no 2. Il n'y a pas de trouble dans le tube no 1. Le pH des tubes respectifs est le suivant : tube no 1, pH 5,2 ; tube no 2, pH 4,9 ; tube no 3, pH 4,6 ; tube no 4, pH 4,3 ; tube no 5, pH 4,1. Sur la base du degré d'opacité que l'on trouve, le point isoélectrique de l'antigène d'acarien extrait, déterminé dans le système acétate de sodium-acide acétique, se situe entre 4 et 5, la valeur moyenne du point isoélectrique correspondant à un pH de 4,6. Par chromatographie en couche mince sur gel de silice de l'antigène d'acarien, effectuée en utilisant un système de solvants à base de butanol-acide acétique-eau, on obtient trois bandes ayant les voleurs de R f correspondantes suivantes Valeur de R f Bande A 0,16 Bande B 0,28 Bande C 0,41 Par développement avec le réactif à la ninhydrine à 0,3 % de ninhydrine dans 100 ml de butanol et 3 ml d'acide acétique cristallisable, la bande A prend une couleur orangé e avec une nuance rosâtre, la bande B prend une couleur rose et la bande C prend une couleur rose orangé. La bande A a une forte intensité ; la bande B a une faible intensité et la bande C a une intensité moyenne. Exemple 2. On ajoute un élevage de l'acarien G. domesticus à un milieu nutritif à base de levure de brasserie et on fait incuber le tout à la température ambiante et à une humidité relative de 80 %, pendant une période de 4 à 8 semaines. Lorsque l'examen visuel de l'élevage d'acarien après incubation indique une densité suffisante d'acariens, c'est-à-dire qu'il y a davantage d'acariens présents que de milieu nutritif, on sépare les aca riens de la levure. On ajoute le mélange d'acariens et de milieu nutritif à un litre d'iodure de 1-octyle, de densité 1,33. Les acariens, étant moins denses que le solvant, surnagent, et la levure, étant plus lourde, tombe au fond. Lorsque la séparation des acariens est terminée, la phase supérieure est versée avec soin par décantation dans un entonnoir de Buchner garni d'un papier-filtre, puis elle est séchée à l'air. Les acariens séchés sont recueillis à la surface du papier-filtre et broyés en une poudre fine. On peut utiliser tout dispositif correct de broyage, par exemple un broyeur à billes ou un mortier et un pilon. On fait ensuite macérer la poudre d'acarien avec de l'eau distillée dans un rapport préféré de 1 partie en volume de poudre d'acarien à 200 parties en volume d'eau.La macération est conduite à la température ambiante pendant une période de 30 minutes à 4 heures, selon le degré d'extraction que l'on désire et la grosseur des particulesde la poudre d'acarien que l'on utilise. Les particules solides sont séparées du solvant par filtration ou centrifugation. Les matières solides séparées sont lavées avec deux portions de 10 ml de solvant et les liqueurs de lavage sont ajoutées au reste du solvant d'extraction. On ajoute ensuite du sulfate d'ammonium à la solution d'extraction, jusqu'à saturation, et on met le tout de coté. Au bout de 1 à 2 heures, un trouble est formé par la séparation de matière solide et le mélange est centrifugé. La solution surnageante limpide est mise de côté en vue d'obtenir un second lot de composé précipité. On répète la. séparation de matière solide de la solution d'extraction saturée de sulfate d'ammonium, et on rassemble la matière solide. Le composé solide est dissous dans 10 ml d'eau distillée et la solution est placée dans un tube de dialyse en "cellophane" ou viscose. La solution indiquée ci-dessus, contenue dans le sac de dialyse, est alors dialysée vis-à-vis d'eau distillée, de manière à éliminer les impuretés consistant en sulfate d'ammonium. Lorsque l'eau de dialyse est exempte d'ions sulfate, le tube de dialyse est ouvert et son contenu est versé dans un récipient convenable, puis le solvant est chassé sous pression réduite à la température ambiante, et le résidu est séché. Le résidu sec constitue l'antigène d'acarien formé, et correspond au produit que l'on obtient dans l'exemple 1 ci-dessus. Exemple 3. A la place des genres d'acariens indiqués dans les exemples 1 et 2 ci-dessus, on peut utiliser tout représentant de l'ordre des organismes appelés acariens. On utilise les milieux nutritifs appropriés, connus comme étant préférés par l'espèce particulière d'acariens, pour l'élevage des acariens, des exemples de ces matières comprenant des céréales, la levure, les pellicules animales, les pellicules de desquamation, la poussière de ménage, les produits préparés pour llalimentation des animaux, les aliments à base de poisson, et les daphnies séchées. Les autres étapes étant les mêmes, l'antigène acarien que l'on obtient correspond en tous points à celui de exemple 1. Exemple 4. Lorsqu'on désire préparer un antisérum relatif à l'antigène d'acarien, on injecte de petites quantités de l'antigène d'acarien à un lapin, un singe, un cobaye ou un hamster. Ainsi, on administre au lapin australien de la race "Jack", une injection quotidienne de 10 parties par million d'antigène d'acarien dissous dans 0,02 cm3 d'eau distillée, pendant une période d'une semaine. Au cours de la deuxième semaine, on effectue une seconde série d'injections d'antigène d'acarien en utilisant 20 parties par million d'antigène par 0,02 ml de solution. On laisse reposer l'animal pendant environ 10 jours et on procède à une troisième série d'injections d'antigène d1aca- rien, de préférence sous la forme de trois injections quotidiennes successives, contenant chacune 100 parties par million d'antigène d'acarien par 0,02 ml. Après une nouvelle période de repos, on saigne l'animal et on laisse le sang se coaguler. On sépare le caillot du sérum et on recueille le sérum dans des récipients en verre stérilisés. Le sérum contient les anticorps relatifs à l'antigène d'acarien. Le sérum peut être normalisé par mélange de 0,25 ml du sérum recueilli avec 0,25 ml de solution normale d'antigène d'acarien préparée avec une quantité connue dudit antigène dissous dans de l'eau distillée. Une quantité préférée d'antigène d'acarien à des fins de nor malisation, correspond à une concentration de 10 parties par million de cet antigène par millilitre de solution. Le mélange est laissé au repos pendant environ 16 heures dans un tube gradué de centrifugeuse, puis il est centrifugé pour rassembler le précipité formé. La hauteur du précipité formé reflète la concentration des anticorps présents dans l'antisérum et peut être exprimée en fonction du poids d'antigène d'acarien présent dans la solution de titrage. En pratique,on doit utiliser une série de concentrations pour obtenir une gamme de valeurs, permettant d'effectuer une mesure exacte de la concentration en anticorps dans le sérum. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un antisérum relatif à l'antigène d'acarien, caractérisé par le fait qutil consiste a) à administrer à un mammifère une première série d'injec- tions quotidiennes répétées d'une solution du composé d'un antigène d'acarien dans un solvant acceptable du point de vue pharmaceutique, b) à laisser reposer le mammifère pendant une période d'un ou plusieurs jours, c) à administrer au mammifère une seconde série dtinjections quotidiennes contenant chacune une solution du composé suivant la revendication 1 et un véhicule acceptable du point de vue pharmacettique, d) à laisser reposer le mammifère, e) à recueillir son sang, f) à laisser son sang se coaguler et g) à en isoler l'antisérum formé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que antigène d'acarien est une protéine ayant les particularités suivantes : a) couleur blanc à blanc-crème ; b) réaction positive à l'essai au biuretà l'essai xanthoprotéique et à l'essai de Millon ; c) solubilité dans 11 eau, la glycérine et le propylène-glycol, mais insolubilité dans le benzène, l'é- ther de pétrole, l'éther éthylique et les solvants hydrocarbonés halogénés ; d) précipitation en solution aqueuse par le chlorure d'aluminium, le chlorure de zinc, le nitrate d'argent, l'acide tannique, l'acide phosphotungstique et l'acide trichloracétique ; e) 45 à 55 % de carbone, 6 à 8 % d'hydrogène, 19 à 25 % d'oxygène, 14 à 20 % d'azote et 0,6 à 1,8 % de soufre ; f) point isoélectrique compris entre pH 4 et pH 5 ; g) première, deuxième et troisième bande chromatographiques par chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange de butanol/eau/acide acétique comme solvant, la première bande ayant une valeur de Rf de 0,16, la deuxième bande ayant une valeur de R f de 0,28 et la troisième bande ayant une valeur de R f de 0,4 ; h) après développement au réactif à la ninhydrine des bandes chromatographiques mentionnées, la première bande a une forte intensité, avec une couleur orangé rosâtie, la deuxième bande a une faible intensité avec une couleur rose et la troisième bande a une intensité moyenne avec une couleur orangé rosâtre ; i) réaction allergique positive du tissu en cas d'administration intracutanée à un mammi fère allergique à l'antigène d'acarien et j) stimulation de la formation d'anticorps de l'antigène d'acarien par administration systémique à un mammifère. 3. Antisérum pouvant être obtenu par le procédé des revendications 1 ou 4. Utilisation de l'antisérum selon la revendication 3 pour le dosage d'antigènes d'acarien.