FR 2176482 A1 19731102 FR 7209684 A 19720320 La présente invention est relative à un procédé de culture de micro-erganismes permettant de modifier le phénotype de ceux-ci et de les utiliser pour la préparation des vaccins destinés à combattre les maladies dues à ces micro-organismes. L'utilisation comme antigènes, pour la préparation de vaccins, de germes complets peut entraîner) dans le sérum des animaux3 la présence d'agglutinines ou d'autres réactions sérologiques çi interfèrent avec le diagnostic de la maladie correspondante. C'est le cas en particulier du vaccin antibrucellique, l'utilisation de Brucella non modifiées comme antigènes provoquant la forma tion d'agglutinines qui gênent le diagnostic de la Brucellose. Pour éviter cet inconvénient, on a déjà proposé d'utiliser des Brucella sous forme rugueuse qui se caractérisent par leur caractère d'agglutinabilité spontanée en sérum physiologique et en présence d'acri flavine et leur difficulté de réversion vers la forme S pathogène, aggluti nogène et agglutinable par les sérums anti correspondants (c'estXà-dire les sérums contenant les anticorps correspondants aux antigènes Brucella) On a également proposé d'utiliser des Brucella S complètes ou des extraits de Brucella sous forme S en leur additionnant du sérum immun correspondant en quantité nécessaire et suffisante pour saturer la totalité des sites agglutinogènes de l'antigène.On obtient ainsi un vaccin non agglutinogène dit vaccin de Pilet et Bonneau (Recueil de Médecine Véterinaire Ecole Alfort 1970, 146, 25-35). Cependant, ce procédé nécessite l'utilisation d'une quantité importante de sérum anti de haut titre, pour assurer la neutra lisation de tous les sites agglutinogènes. L'invention a pour objet un procédé de culture de micro organismes permettant de la modifier au cours de leur multiplication afin de leur faire perdre certaines de leurs caractéristiques, et aboutir ainsi à un phénotype différent sans modifier le génotype. En particulier, l'aptitude fondamentale de ces organismes à provoquer des réactions sérologiques parasites,accompagnant les réponses d 'immunisation, peut Titre limitée ou supprimée. Le procédé selon l'invention permet en particulier d'obtenir, à partir de Brucella hautement virulentes et agglutinogènes ou å partir de Brucella nonvEaintes et agglutinogènes, des phénotypes différents se caractérisant par la perte des agglutinabilités spécifiques en présence de sérum anti, l'appa rition d'une agglutinabilité spontanée faible et une reconversion à la forme S pathogene ou non avec récupération des caractères d'agglutinabilité par des subcultures sur milieu ordinaire. Ces derniers caracteres différencient les Brucella modifiées selon l'invention des Brucella rugueuses, type 45/20. Le procédé selon llinventionvpermettant d'obtenir des Brucella ainsi modifiées, consiste à effectuer un nombre élevé de subcultures de ces micro-organismes en présence de sérum anti-Brucella. Celui-ci est additionné au milieu de cultures en quantité telle qu'elle ne gene pas la multiplication des Brucella, mais provoque cependant une modification phénotypique. La quantité de sérum additionnée au milieu de culture peut ainsi varier de 0,5% à 20% d'un sérum antititrant 2000 U/ml. Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on décrit ci-dessous, à titre d'exemple, le procédé de culture selon l'invention, appliqué aux Brucella. Une Brucella, par exemple Brucella Melitensis de premier isolement, hautement pathogène, est cultivée sur milieu tryptose-gélose contenant 10% de sérum anti titrant 2000 U. par ml. La culture se développe normalement. On peut utiliser indifféremment des Brucella de toute origine de forme S, pathogènes ou non pathogènes, et l'on peut utiliser tous les milieux permettant une bonne culture des Brucella. On effectue de 10 à 30 subcultures successives sur milieu solide additionné de sérum anti pour stabiliser la souche. Cette souche est ensuite lyophilisée et constitue le stock d'inoculum pour la production des cultures devant servir à l'obtention des vaccins. On procede, sur ce stock, au contrôle de pureté et au contre de caractérisation de la souche : 2 subcultures en milieu gélose-tryptose permettent de récupérer une Brucella sous phase S ayant les caractéristiques sérologiques et biochimiques de la Brucella de départ. A partir du stock "inoculum", on procède à 2 à 10 subcultures en milieu nutritif, généralement liquide, additionné de sérum antispécifique afin de permettre la multiplication des germes nécessaires à l'obtention des lots industriels de vaccins. La quantité de sérum anti utilisée peut varier, pour un sérum anti,titrant2COOU par mlsde 0,5% à 20%, sans que ces quantités aient une influence sur la teneur finale en germes et sur les caractéristiques fondamentales des germes obtenus. L'invention a également pour objet la préparation d'un vaccin antibrucellique, à partir des micro-organismes modifiés par procédé décrit. Après multiplication par cultures successives en milieu additionné de sérum anti, les Brucella modifiées sont inactivées par le formol, récoltées et séparées du milieu de culture. Elles sont ensuite éventuellement traitées au laurylsulfate de sodium pour éliminer les agglutinines persistantes. La quantité de laurylsulfate à ajouter peut varier de 1"/ à 1% et est éliminée ensuite par dialyse. Les Brucella sont enfin remises en suspension dans du sérum physiologique, la concentration étant ajustée par densité optique à 10 germes par ml. Le vaccin selon l'invention ne comporte pas d'adjuvant d'immunité. Il peut être caractérisé et différencié des vaccins antibrucelli- ques existants par les critères suivants l) - Caractéristiques physicochimiques - pH : 5,2-5,5 densité optique : tube 5 à l'échelle de Browne - Analyse des composants chimiques après centrifugation, la phase liquide doit contenir - formaldéhyde libre : 0,70 -0,80"/oj - chlorure de sodium 8 8 à 9 /0O Ces caractéristiques correspondent à celles des vaccins microbiens inactivés ne comportant pas d'adjuvant de l'immunité. 2) - Caractéristiques bactériologiques : Les corps bactériens inactivés sont récupérés par centrifugation et soumis aux contrôles de caractérisation suivants a) Résistance à la lyse par le laurylsulfate de sodium Les corps bactériens récupérés par centrifugation sont remis en suspension dans du sérum physiologique contenant 15 de laurylsulfate de sodium. La concentration de germes est ajustée par densité optique une équivalence de 50 x lO9 germes par ml. Cette suspension est portée 4 h à 50 C, sous agitation permanente. Après ce temps, on mesure la densité optique. Le vaccin préparé selon le procédé est comparé à des suspensions de Brucella inactivées obtenues à partir de diverses souches de Brucella Brucella d'origine, Brucella souche B 19 et 45/20. Pourcentage de lyse après 4 h à 5O0C. Brucella d'origine 15 à 20 7 Brucella modifiée 25 à 30 % B. 19 75 à 80 % 45/20 60 à 65 % b) Recherche des anticorps antibrucella d'origine bovine ou équine par immunofluorescence. Un culot bactérien de vaccin préparé selon l'invention et selon le procédé dit Pilet-Bonneau est additionné de sérum fluorescent antiglobulines bovines ou équines et examiné, après dilution adéquate, en microscopie en lumière ultraviolette. On constate que les corps bactériens du vaccin préparé selon le procédé ditPilet-Bonneau sont fortement fluorescents alors que les Brucella modifiées selon le procédé ne fixent pas les globulines fluorescentes, de sorte que l'on a moins de 10% de corps bactériens fluorescents. 3) - Etudes sérologiques - In vitre a) Agglutinabilité spontanée ou provoquée en tubes Le culot bactérien est récupéré par centrifugation, remis en suspension, à une concentration de 10 x lO par ml, dans du sérum physiolo gique, d'une part additionné, d'autre part sans additionnde de sérum anti- brucella (10 U.T./ml). Ces suspensions sont réparties en tubes à raison de 1 ml par tube. Comme référence, on peut prendre une suspension de Brucella d'origine inactivée. Le tableau ci-dessous donne le résultat de 3 essais comparatifs. Pourcentage d1 agglutination En présence de 10 En eau U.I. de sérum anti physiologique Brucel-la d'origine 100 % o Brucella modifiée Lot 1 50 % 37 % Lot 2 25 % 50 % Lot 3 37 % 62 % Ces résultats démontrent qu'après modification, les Brucella ont perdu leur caractère d'agglutinabilité spécifique puisqu'il n'y a pas de différence significative entre l'agglutination non spécifique en sérum physiologique et l'agglutination spécifique en sérum anti. b) Agglutinabilité provoquée sur lame. On peut, en outre, comparer l'aspect d'agglutination sur lame pour les Brucella avant et après modification. Une anse de Brucella provenant d'un culot de centrifugation est émulsionnée en sérum physiologique ou en sérum antidilué. La Brucella d'origine, émulsionnée en sérum physiologique, présente un aspect trouble uniforme; émulsionnée en sérum antidilué, elle présente des floculats d'agglutination caractéristique. La Brucella modifiée.émulsionnée en eau physiologique, présente un aspect trouble uniforme; émulsionnée en présence de sérum anti, elle présente également un aspect trouble uniforme. c) Saturation des sites agglutinants Le procédé Piîet-Bonneau, de préparation de vaccins non agglutinogènes, permet de déterminer la quantité de sérum anti suffisant et juste nécessaire pour saturer les sites agglutinogènes d'une Brucella. Ce procédé peut Titre appliqué aux Brucella, avant et après modification. On constate alors qu'il faut de très faibles quantités de sérum anti pour saturer les quelques sites agglutinogènes restant sur les Brucella modifiées - Pour la Brucella d'origine, il faut 500 à 700 U.I. pour saturer les sites agglutinogènes de 7 x 109 Brucella. - Pour la Brucella modifiée, il faut 1 à 15 U.I. pour saturer 7 x î09 Brucella modifiées. Un sérum titrant 2000 U. est dilué de 1/2 en 1/2 et mélangé avec des suspensions de Brucella d'origine et modifiées; après réaction, on sépare le culot microbien et on procède à nouveau au titrage du pouvoir agglutinant. Le tableau ci-dessous donne le titre du sérum avant et après adsorption sur Brucella d'origine et sur Brucella modifiée. Dilution Titre du Titre après adsorption par de sérum sérum Brucella d'origine Brucella modifié 2 000 U/ml dilué Titre Titre % fixé Titre Titre % fixé restant fixé restant fixé 1/2 1000 1 000 O * 1 000 0 0% 1/4 500 250 250 50% 500 0 0% 1/8 250 125 125 50% 250 0 0% 1/16 12s 31 93 75% 125 O 0% 1/32 60 8 54 87% 60 0 0% 1/64 30 4 27 87% 16 16 50% 1/128 16 2 14 87% 16 8 50% 1/256 8 8 100% 8 4 50% 1/512 4 4 100% 4 2 50% 1/1024 2 2 100% * Les titrages se faisant par dilutions en tube, une différence de 1 tube correspond à la perte de la moitié du titre initial. Aussi, dans le cas ci-dessus (titre du sérum dilué : 1 000 U),- on peut simple ment dire que la Brucella d'origine a fixe moins de 500 U (entre O et 500 U.-I.). Le raisonnement est identique pour les valeurs négatives (0%) trouvées pour les Brucella modifiées. On peut donc déduire de ces divers essais que les Brucella modifiées selon le procédé ont perdu la plus grande partie de leurs sites agglutinogènes, et, par conséquent, ces Brucella ne doivent pas provoquer la formation d'anticorps agglutinants à la suite de leur injection dans l'organisme. En conclusion le vaccin préparé àpartir de Brucella modifiées selon le procédé de l'invention se différencie des vaccins connus par les caractéristiques suivantes -L'état inactivé le différencie du vaccin de type B. 19. - L'absence d'adjuvant le différencie des vaccins inactivés classiques de types 45/20 ou H.38 (vaccin de Renoux). - La sensibilité à la lyse par le laurylsulfate de sodium per met de vérifier le caractère modifié des Brucella par rapport aux autres Brucella. - L'absence d'anticorps anti-Brucella décelables par les globulines fluorescentes permet de différencier le vaccin de celui préparé selon le procédé dit Pilet-Bonneau. - In vivo Chez les lapins Le vaccin préparé selon le procédé avec ou sans traitement ultérieur au laurylsulfate est comparé à un vaccin avec la Brucella d'origine. Les anticorps agglutinants sont recherchés dans le sérum des lapins, 3 semaines après vaccination. On obtient les résultats suivants 50 x 10' Brucella d'origine Vaccin modifié (50 x 109 germes) 3.750 U.I. Vaccin modifié et traité au laurylsulfate 10 U.I. (50 x 10 germes) Chez les bovins Des lots de 5 bovins reçoivent une dose de vaccin préparé selon le procédé et traité ou non par le laurylsulfate. Les anticorps agglutinants sont recherchés dans le sérum 3 semaines après vaccination. On obtient les résultats suivants Vaccin non traité 60 U I par laurylsulfate Vaccin traité par laurylsulfate 6 U.I. Une expérience a été re lisée sur un lot de 32 bovins inoculés 3 fpis consécutivement avec le vaccin non traité par le laurylsulfate. Le graphique ci-joint donne l'évolution moyenne des anticorps agglutinants et des anticorps incomplets décelés par le test de COOMBS, chez les animaux ayant subi une première vaccination V1 au temps To, une seconde V2, deux mois après, et une troisième V3, douze mois après. Ce vaccin préparé à partir de Brucella modifiées selon l'invention, et non traité au laurylsulfate de sodium se caractérise donc - d'une part par sa faible réactivité en anticorps agglutinants, la disparition des agglutinines se faisant toujours dans le délai prescrit de 3 mois; - d'autre part, par une réactivité marquée en anticorps incomplets (réaction de COOMBS) surtout après le deuxième rappel. Ces caractéristiques sont spécifiques du vaccin modifié selon l'invention. Elles le différencient de façon indiscutable des vaccins agglutinogènes (vaccins type B. 19, vaccins type H.38). 4) - Caractérisation antigénique. a) Contrôle de l'activité antigénique sur souris du vaccin préparé selon l'invention. Des lots de 10 souris sont vaccinés par la voie intrapéritonéale et sous-cutanée avec des doses variables de vaccin antibrucellique injecté sous un volume de 0,3 ml; soit 0,3 ml d'une dose contenant 10.109 U.I. par ml, puis 1/3, 1/9 et 1/27 de cette dose. L'antigénicité est comparée à celle d'une suspension des mêmes doses de Brucella d'origine, non modifiées (vaccin référence). L'épreuve est faite 15 jours après la vaccination par inoculation intrapéritonéale de 50.000 germes de la souche 544. Les souris sont sacrifiées 8 jours après et on procède à une évaluation qualitative de l'infection allant de O à tt+t, et une évaluation quantitative par numération sur un broyat de ltensemble des rates d'un même lot. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous O 0,3ml de 1 dose 43m1de 1/3 dose 0,3ml de 1/9 dose 0,3 ml 1/27dose Témoin souris vaccin vaccin vaccin vaccin vaccin vaccin vaccin vaccin infec réfé- selon réfé- selon réfé- selon l'ils réfé- selon l'in- tion rence l' in- rence vention rence vention rence vention ven tion 1 0 O 0 O 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 + 3 0 0 0 0 0 0 0 0 + 4 0 0 0 0 0 0 + O 5 0 0 0 0 0 0 + 0 6 0 0 0 0 0 0 + 0 ++ 7 0 0 0 0 0 0 + + 8 0 0 0 0 0 0 + 9 0 0 + O O O O 10 0 O ++ O 0 + nombre non non mwen de déter- déter- 0 120 400 1600 70 .000 Brucella 0 90 miné miné par g de rate b) Comparaison de l'antigénicité des Brucella modifiées ou non, et traitées ou non par le laurylsulfate de sodium. Les souris sont vaccinées d'après le meme protocole que dans ltexpérience précédente et les résultats de l'évaluation qualitative de l'infection sont exprimés dans le tableau ci-dessous. Influence du traitement au laurylsulfate sur llantigénicité des Brucella Dilution Brucella normale Brucella modifiée des Culot après Culture totale Culot après Culture totale traitement au avant traitement traitement au avant traitement vaccins laurylsulfate laurylsulfate Pur 1/3 1/9 l7 Pur 1/3 119 1/27 Pur 1/3 1/9 1/27 Pur 1/3 1/9 1/27 1 0 0000000 000 0 0000 2 0 0 0 0 0 000 0 0 0 + 0 0 0 0 3 0 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 4 0 ++ O + O 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 5 0 + 0 0 + 0 + + + 0 d O -Ft Pouvoir aggluti- 4.000 30.000 10 3.750 nant (lapin) Par conséquent, le procédé décrit dans l'invention (culture en présence de sérum anti, inhibiteur des antigènes agglutinants, et traitement par le laurylsulfate) ne modifie pas les propriétés antigéniques des Brucella. REVENDICATIONS 1 - Procédé de culture de micro-organismes permettant de modifier le phénotype de ceux-ci sans modifier le génotype, procédé caractérise par le fait qu'on soumet le micro-organisme à des subcultures successives sur milieu additionné de sérum anti correspondant. 2 - Procédé de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que les micro-organismes sont les bactéries Brucella et qu'on effectue de 10 à 30 subcultures. 3 - Procédé de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce qu on additionne au milieu de culture, de 0,5 à 20% de sérum antibrucella titrant 2000 U/ml. 4 - Procédé de préparation d'un vaccin antibrucellique, caractérisé en ce que, après avoir multiplié les Brucella sur milieu addi- tionné de sérum anti selon l'une des revendications 2 et 3, on recueille les Brucella modifiées et les nactive par un procédé connu en soi et notam- ment par le formol. 5 - Procédé selon la revendication 4,caractérisé en ce qu on traite la suspension de Brucella modifiées, inactivées, par 10/cl à 1% de laurylsulfate de sodium, pour éliminer les agglutinines restantes. 6 - Vaccin antibrucellique du type vaccin inactivé et ne contenant pas d'adjuvant d'immunité, caractérisé par la presence dans ce vaccin, d'une très faible quantité d'anticorps antibrucella, décelés par immunofluorescence, par l'absence de pouvoir agglutinogène décelé aussi bien in vitro (par l'agglutination spécifique en présence de sérum anti) qu'in vivo (très faible réactivité en anticorps agglutinants) et par une antigénicité comparable à celle des vaccins préparés à partir de Brucella non modifiées.