FR 2205538 A1 19740531 FR 7339307 A 19731106 La présente invention a trait à un support polymère, son procédé de rabrication et son application à la synthèse contrée des polypeptdai. Les polypeptides biologiquement actifs peuvent être obtenus par la condnsation progressive, selon une succession définie avec préc-ision, d'acides aminés déterminés. La fabrication classique de tels composés par condensation en solution exige on liaison avec la caractérisation du réactif son isolement dispendieux à chacune des étapes de la réaction. Brais pour les peptides à channe assez longue ce procédé ne peut pas entre mis en oeuvre ex périmentalement. Merrifield (P.3. Merrifield : J. Am. Chem.Soc.85, 2149 (1963) a décrit un procédé qui surmonte les difficultés liées à la condensation progressive selon une succession déterminée des acides aminés.Cette méthode comporte trois phases, à savoir, la fixation au moyen d'une liaison covalente du premier acide aminé sur un support polymère solide, la réaction progressive d'autres acides aminés avec formation de la channe peptidique et, finalement, la séparation du support de la channe formée et son isolement sans l'endommager. En cas de liaison covalente au support solide de la channe peptidique croissante pendant la totalité de la séquence des rOac- tions successives de condensation, la séparation des produits de chacune des étapes de la réaction de ceux des produits non entrés en réaction et des sous-produits de réaction est considérablement facilitée. Les opérations d'isolement compliquées nécessaires dans l'hypothèse d'un travail en solution sont ainsi réduites à I'élution ou la décantation des particules du support solide qui porte le polypeptide en cours de crossance. Ce procédé a notablement simplifié la synthèse des peptides, réduit le temps nécessaire pour sa réalisation, et permis son automatisation. De façon classique, on met en oeuvre pour la synthèse des polypeptides, un copolymère de styrolène-divinylbenzene, de réticulation peu dense, et activé en vue de la réaction avec le pre mier acide aminé. Cette substance présente deux inconvénients importants qui limitent sa possibilité d'application générale. Il su agit en premier lieu de la structure physique du polymère qui, en tant que xérogel, présente une dépendance notable des qualités mécaniques de la densité du réseau polymère.Les réactions de condensation des acides aminés ont lieu à l'intérieur de la masse physiquement homogène du gel dont la densité de réseau constitue la limite naturelle pour le poids moléculaire du polypeptide susceptible d'être synthétisé. Les coefficients de diffusion des composants en réaction qui doivent être amenés au lieu où se produit la réaction sur la channe en cours de croissance du polypeptide, ainsi que les coefficients de diffusion des produits de la réaction, qui, cette dernière terminée, doivent être éliminés par lavage, sont nettement plus réduits à l'intérieur du xérogel homogène que dans la solution. I1 peut en résulter un établissement plus lent de l'équilibre dans les réactions de condensation ainsi qu'une répercussion négative sur le rendement final des différents échelons de la réaction ; finalement, l'élimination par lavage de la substance, après exécution des réactions de condensations élémentaires, peut s'en trouver compliquée et prolongée. Le deuxième inconvénient du gel de styrolène résulte également de sa structure réticulée homogène. En effet, il ne peut être mis en oeuvre que dans des solvants dans lesquels le copoly mère gonfle. Etant donné qu'il s'agit exclusivement de solvants organiques, souvent de polarité réduite, il en découle automatiquement une limitation dans le choix des possibilités de réaction pour la condensation des acides aminés.Il n'est pas possible d'utiliser des systèmes réactifs aqueux. I1 faut s'attendre à ce que, dans un milieu réactif non aqueux, certains acides aminés entrent en interaction de sorption avec le support non polaire, ce qui complique encore leur séparation du système en fin de l'étape de condensation. I1 résulte de tout ceci que les divers- échelons de réaction au cours de la fixation des acides aminés n'ont pas lieu de façon quantitative, de sorte qu'après sa séparation du support, il manque certains acides aminés dans le produit de réaction résultant, ce qui peut avoir une influence très négative sur son efficacité biologique.Selon la présente invention, le support polymère est constitué par un gel hydrophile qui, à c8té de groupes fonctionnels hydrophiles, contient des noyaux aromatiques, ce support étant activé par une ehlorométhylation au moyen de formaldéhyde et de gaz chlorhydrique. Le gel formé à partir de copolymères d'acrylates dthydroxyalcoyle, de méthacrylates d'hydroxyalcoyle, d'amides d'acide acrylique ou d'amides d'acide méthacrylique avec un comonomère réticulant du type acrylate ou méthacrylate et avec un troisième et, le cas échéant encore un quatrième autre monomère, monomères dont la molécule contient un noyau aromatique lequel est activé par chlo rométhylation. Cosse monomère réticulant du type acrylate et. méthacrylate, on peut utiliser des diacrylates d'alcoylène, des diméthacrylates d'alcoylène, des acrylates ou des méthacrylates de polyalcools et des acrylates ou des méthacrylates de dihydroxyou polyhydroyyéthers ou des sucres alcooliques ainsi que des amides bisacryliques ou le divinylbenzène. Selon un autre de ces aspects la présente invention est relative au procédé de fabrication du gel support ne présentant pas les propriétés négatives des gels de polystyrolène homogènes utilisés normalement jusqu'à ce jour ainsi que sa mise en oeuvre en vue de la synthèse contrée des polypeptides.Selon l'invention, les supports sont préparés par copolymérisation hétérogène en suspension d'acrylates ou de méthacrylates monomères hydrophiles avec un monomère réticulant en présence d'un troisième monomère dont la molécule contient un noyau aromatique, comme par exemple l'acrylate de phényle, le méthacrylate de phényle, l'anilide d'acide acrylique ou d'acide mAthacrylique, l'acrylate ou le mAtha- crylate d'éthoxyphényle, le styrolène et autres substances simi- laires.Des gels supports, présentant des propriétés semblables, peuvent également autre obtenus à partir de copolymères macroporeux en suspension, préparés selon le brevet Français au Nom de la Demanderesse délivré le 12.6.1972 sous le nO 71 42005 lesquels sont ultérieurement transformés à l'aide de composés contenant un noyau aromatique, par exemple à l'aide d'acides aromatiques, leurs chlorures et anhydrides, des isocyanates aromatiques, des halophénylsilanes ou des composés aromatiques époxydes, qui forment avec le groupement hydroxyle dans le polymère des composés de condensation.Finalement, on peut également préparer les supports par des réactions de polymérisation ayant fait l'objet de la demande de brevet français nO 73 30015 déposé le 17 Août 1973 au nom de la Demanderesse par diazotation des polymères formés et leur association avec un composant aromatique passif. Les polymères créés doivent présenter l'aptitude à la chloron6thyla- tion par l'intermédiaire de laquelle ils sont activés en vue de la réaction avec le premier groupement aminé. Lors de la mise en oeuvre de la polymérisation hétérogène en suspension, il se produit des gels à structures macroporeuses qui se distinguent par une résistance mécanique et une résistance à l'hydrolyse élevées. On peut les fabriquer sous forme de particules sphériques de grosseur uniforme et leur surface spécifique se situe entre 5 et 500 m2/g. Au cours de ltactivation par chlorométhylation ne réagit que la partie des noyaux aromatiques qui est exposée, au niveau de la surface du copolymère, à l'action de la formaldéhyde et du gaz chlorhydrique. En raison de la valeur importante de la surface spécifique de ces gels, leur capacité est également suffisamment élevée par comparaison avec les substances supports homogènes.La réaction de synthèse des peptides a lieu au niveau de la surface solide du copolymère, lequel, du fait de ses propriétés d'aérogel, ne gonfle que peu ou pas du tout, permettant ainsi l'utilisation au choix d'un quelconque solvant organique polaire ou non polaire. Sont également supprimées toutes les difficultés liées au lent établissement des équilibres de réaction, contrôlé par la diffusion dans le gel, ainsi que les difficultés attachées à la diffusion des produits hors de la zone de réaction. L'obJet de la présente invention sera exposé plus en détail ci-après à l'aide de quelques exemples de réalisation, ces exemples n'ayant bien entendu aucun caractère limitatif. EXE;buPL;E I Préparé selon le procédé, obJet du brevet français nO 7142005 du 12.6.72 au nom de la Demanderesse, par la copolymérisation hétérogène en suspension de 20 parties en poids d'anilide d'acide méthacrylique, de 40 parties en poids de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle et de 40 parties en poids de diméthacrylate d'éthylène en présence d'un solvant inerte (alcool laurique, cyclohexanol), le copolymère hydrophile macroporeux ainsi obtenu a constitué le matériau support de base qui a été activé par chlorométhylation. A cet effet, on a mélangé deux partiesen poids de ce gel, 24 parties en poids de chlorure de zinc et 12 parties en poids d'acide chlorhydrique concentré avec 10 parties en poids de formaldéhyde en solution aqueuse à 38%. La suspension obtenue a été chauffée à 500C et parcourue pendant 5 heures par un courant de gaz chlorhydrique. La suspension a été ensuite recueillie par filtration, successivement lavée avec 100 parties en poids d'eau et 100 parties en poids de méthanol et séchée pendant 12 heures sous vide au-dessus de P205 et de NaOH. La teneur en chlore du copolymère ainsi activé se montait selon analyse à 5,93h. 2 parties en poids du copolymère activé par chlorométhylation ont été mises en suspension dans une solution de 0,456 partie en poids de o-nitrobenzènesulfénylglycine et 0,25 partie en poids de triéthylamine dans 8 parties en poids de diméthylformamide, puis agitées à 250C pendant 120 heures. Après dilution avec 50 parties en poids de diméthylformamide, le gel a été successivement lavé avec du méthanol, de l'eau, du méthanol et du dichlorométhane, puis séché sous vide.L'analyse visant les acides aminés a fourni après l'hydrolyse une teneur de O,25mmole glycine 1 partie en poids du gel avec le o-nitrobenzènesulfénylglycine a été lavé pendant 15 minutes sur un filtre en verre avec 50 parties en poids de O,lm-HCl dans un mélange de méthanol et de dichlorométhane (1 : 1) puis lavé au dichlorométhane pur. Par mesure de la densité optique du filtrat sous 384ni, on a déterminé la séparation quantitative (0,25mmole/g) du groupement de protection o-nitrobenzène-ulfényle. L'acide aminé a été extrait de son sel par élution avec une solution de 1,2 parties en poids de triéthylamine dans 10 parties en poids de dichlorom6- thane,après quoi le gel a été lavé au dichlorométhane pur. Le gel a ensuite été mis en suspension dans 10 parties en poids de dichlorométhane et la suspension ayant été mélangée avec 0,12 partie en poids de o-nitrobenzènesulfénylalanine et 0,105 partie en poids de dicyclohexylcarbodiimide, ce mélange a été agité à 2500 pendant 30 minutes.Après filtrage de la suspension, le po polymère avec le peptide fixé a été lavé au dichlorométhane, séché sous vide au-dessus de P205 et on a déterminé la teneur des acides aminés fixés. La séparation du peptide de son support polymère a été réalisée à l'aide de gaz bromhydrique dans l'acide trifluoracétique. 0,2 partie en poids du copolymère peptidique a été mélangé dans 3 parties en poids d'acide trifluoracétique anhydre et, à OOC, pendant une heure, du gaz bromhydrique sec a été introduit dans la suspension. Après évaporation, le produit séparé a été retiré du support par lavage et purifié par voie chromatographique. EXEMPLE 2 On a réalisé la synthèse d'une manière analogue à celle de l'exemple 1, avec cette différence cependant que, pour la fixation sur le support, on a utilisé au lieu de o-nitrophénylsulfé nylglycine, 0,175 partie en poids de tert-butyloxycarbonylgly- cine. Après l'hydrolyse, l'analyse relative aux acides aminés a révélé une teneur de 0,24 mmole de glycine par gramme de copolymère. On met en suspension dans 5 parties en poids d'acide trifluoracétique 0,5 partie en poids de copolymère de tert.-butyl oxycarbonylglycyle et on laisse reposer cette suspension pendant 30 minutes à la température ambiante. Après filtrage, le polymère a été soigneusement lavé au dichlorométhane Jusqu a élimination totale de l'acide trifluoracétique. EXEMPLE 3 La synthèse a été réalisée d'une manière analogue à celle de l'exemple 1, avec cette différence que, pour la fixation d'autres acides aminés, on a utilisé au lieu du procédé au carbodiimide celui au N-hydroxysuccinimide. A une suspension de 1 partie en poids de copolymère de glycyle dans 10 parties en poids de dichlorométhane, on a aJouté 0,17 partie en poids d'ester N-hydro- xysuccinimique d'o-nitrobenzènesulfinylalanine et on a agité le mélange réactionnel pendant une heure à la température ambiante. Le polymère comportant un dipeptide fixé et protégé, a été isolé par filtrage et a été successivement lavé trois fois sur le filtre avec 20 parties en poids de dichlorométhane, aspiré et séché sous vide au-dessus de P205 et NaOH. EXEMPLE 4 La synthèse a été réalisée d'une manière analogue à l'exemple 1, avec cette différence que pour séparer le peptide du support polymère, on a utilisé de l'acide fluorhydrique. Dans un appareillage en Téflon, on a distillé de l'acide fluorhydrique, dans 0,2 partie en poids de copolymère peptidique et la suspension a été agitée à OOC pendant 30 minutes. Après distillation complète de l'acide fluorhydrique, le produit a été éliminé du support par lavage au moyen de 20 parties en poids d'eau et purifié ainsi que précisé dans l'exemple 1. EXEMPLE 5 La synthèse a été réalisée d'une manière analogue à l'exemple 1, avec cette différence que le peptide a été séparé du support polymère avec de l'ammoniac méthylique en tant qu'amide. On met en suspension 0,2 partie en poids de copolymère peptidique dans 10 parties en poids à OOC de methanol saturé au gaz ammoniac et on laisse reposer dans un récipient fermé en agitant de temps en temps, pendant 48 heures à 250C. Après filtrage et lavage au méthanol, on a obtenu dans le filtrat la peptidamide avec un groupement aminé protégé et le processus de traitement est poursuivi en fonction de la nature du groupement de protection. EXEMPLE 6 On a réalisé la synthèse d'une façon analogue à l'exemple 1, avec la différence que le peptide a été séparé au moyen d'ammoniac liquide comme forme d'amide. Dans un autoclave en acier, on distille 10 parties en poids d'ammoniac sec dans 0,2 partie en poids de copolymère peptidique . Après échauffement à la température ambiante on laisse reposer le mélange pendant 44 heures. Après nouveau refroidissement à -4000, on ouvre l'autoclave, on laisse évaporer l'ammoniac et on obtient le produit par extraction du résidu au moyen de méthanol. EXEMPLE 7 On réalise la synthèse d'une façon analogue à l'exemple 3, avec la différence que, comme support, on a utilisé le copolymère macroporeux obtenu à partir de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (50%), de diméthacrylate d'éthylène (40ss) et de styrol (10%). EXEMPLE 8 On réalise la synthèse du support d'une façon analogue à celle de l'exemple 1, avec la différence que, dans la copolymérisation, on a introduit ensemble 40 parties en poids d'acrylate de 2-hydroxyéthyle et 40 parties en poids de diacrylate d'éthylène dans 20 parties en poids d'acrylate de phényle. EXEMPLE 9 On procède à la synthèse du support d'une façon analogue à celle de l'exemple 1 avec la différence que, comme monomères, on fait usage de méthacrylamide, de méthylene-bis-acrylamide et de méthacrylate de phenoxyéthyle EXEMPLE 10 On prépare le support d'une façon analogue à celle de l'exemple 9, avec la différence qu'au lieu de méthacrylamide on fait usage d'acrylamide. EXEMPLE 11 Le support polymère a été préparé par copolymérisation de méthacrylate de 2aminoaIcoy1e avec la méthylène-bis-acrylamide et le phénoxyméthacrylate. EXEMPLE 12 On réalise la synthèse d'une façon analogue à celle de l'exe- ple 11, avec la différence qu'au lieu de méthacrylate d'axinoéthy- le, on utilise l'acrylate d'aminoéthyle. EXEMPLE 13 Le support est préparé d'une façon analogue à celle de l'exemple 9, avec la différence que, comme monomères, on met en oeuvre la -méthylméthacrylamide, le diméthacrylate de tétraéthylènegly- col et l'anilide d'acide acrylique. kXEiPLE 14 La synthèse de support est réalisée d'une façon analogue à celle de l'exemple 1, avec la différence que comme monomère réticulant, on utilise une pentaerythrite méthacryloylée. EXEMPLE 15 La synthèse du support est réalisée d'une façon analogue à celle de l'exemple 14, avec la différence que, comme monomère réticulant, on emploie le divinylbenzbne. EXEMPLE 16 On prépare le support polymère par polymérisation de 60 parties en poids de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle avec 40 parties en poids de diméthacrylate d'éthylène. Après lavage et séchage complet du copolymère, on procède à la réaction de condensation des groupements hydroxyles libres dans le copolymère au moyen de chlorure de benzoyle. A cet effet, on laisse réagir 10 parties en poids du polymère avec 25 parties en poids de chlorure de benzoyle. Après lavage et séchage, le produit benzoylé a été activé par chlo romé thylati on. EXEMPLE 17 On laisse réagir dans 20 parties en poids de benzène, 10 parties en poids du support polymère de l'exemple 16 avec 5 parties en poids d'isocyanate de phényle. Le produit de réaction est lavé, séché et activé par chlorométhylation. EXEMPLE 18 On laisse réagir à 400C le support polymère selon l'exemple 16 dans une solution au benzène avec le diphénylchlorosilane, les proportions en poids des produits réactifs étant les mêmes que celles de l'exemple 17. Le produit lavé et séché a été activé par chlorométhylation EXEMPLE 19 On prépare d'une façon analogue à celle de l'exemple 16 le copolymère de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle avec le diméthacrylate d'éthylène, avec la différence cependant que, comme troisième comonomère, on introduit 5 parties en poids de méthacrylate de p-acétaminophénoxyéthyle. Le copolymère obtenu est hydrolysé à 100 C avec une lessive de soude à 1* puis, après lavage au moyen de 0,1 n-NaN02 et 0,1 n-HCl, il est diazoté. Le gel diazoté est associé à 10 parties en poids de )?-naphtol et le support ainsi préparé est activé selon l'exemple 1 par chlorométhylation. REV NDICsTIONS 1) Support polymère pour la synthèse contrée de polypeptides à base de copolymères d'acrylates et de méthacrylates, caractérisé en ce qu'il est constitue d'un gel hydrophile qui contient à c3té de groupement hydrophiles fonctionnels des noyaux aromatiques, ce support de base étant activé par une réaction de chlorométhylation au moyen de formaldéhyde et de gaz chlorhydrique. 2) Support polymère selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est formé de copolymères d'acrylates d'hydroxyalcoyle, de méthacrylates d'hydroxyalcoyle, d'acrylates d'aminoalcoyle, de méthacrylates d'aminoalcoyle, d'amides de l'acide acrylique ou d'amides de l'acide méthacrylique avec des comonomères réticulants du type acrylate ou méthacrylate et un troisième et, le eas échéant, un autre monomère, lesquels contiennent dans leur molécule un noyau aromatique, ce dernier étant activé par chlorométhylation. 3) Support polymère selon la revendication 2, caractérisé en ce que les comonomères réticulants du type acrylate ou méthacrylate sont des diacrylates d'alcoylène, des méthacrylates d'alcoylène, des acrylates ou des méthacrylates de polyalcools et des acrylates ou des méthacrylates de dihydroxy-ou polyhydroxyéthers ou des sucres alcooliques ainsi que les amides bisacryliques et le divinylbenzène. 4) Support polymère selon la revendication 2, caractérisé en ce que les troisièmes respectivement autres monomères, contenant dans leur molécule un noyau aromatique, sont l'anilide d'acide acrylique ou acide méthacrylique, l'acrylate de phényle, le méthacrylate de phényle, le méthacrylate de phénoxyalcoyle ou le styrolène. 5) Support polymère selon la revendication 2, caractérisé en ce que les groupements fonctionnels aromatiques sont introduits au moyen d'une réaction consécutive de condensation des groupements hydroxyles dans le dit support, au moyen de composés dont la molécule contient un noyau aromatique. 6) Support polymère selon la revendication 5, caractérisé en ce que les composés dont la molécule contient un noyau aromatique, sont des acides aromatiques, leurs anhydrides ou chlorures, des isocyanates aromatiques, des phénylsilanes halogénés ou des > composés aromatiques époxydes. 7) Support aromatique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par copolymérisation d'un monomère du type acrylate ou méthacrylate, formant un sel de diazonium, par voie d'association avec un composant passif de caractère aromatique lequel est susceptible d'être activé ultérieurement par chloromé thylation. 8) Support polymère pour la synthèse de polypeptides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support présente une structure macroporeuse.