FR 2187301 A1 19740118 FR 7320691 A 19730607 La présente invention a pour objet un procédé biologique pour préparer les 6-désoxy-tétracyclines, et se rapporte plus particulierement a la prépara tion de 1'&alpha;-6-désoxy-5-hydroxytétracycline, plus connue sous la désignation générale de doxycycline, par transformation biologique de l'anhydro-5-hydroxytétra- cycline et sa récupération subséquente. La préparation chimique des 6-désoxytétracyclines est publiée dans l'article de Stephens et al. paru dans le "Journal of the American Chemical Society", vol. 80, page 5324 (1958) et de McCormick et al., ibid, vol. 82, page 3381 (1960), ainsi que dans les brevets américains n 3 019 260, 3 069 467, et 3 200 149. Le brevet portugais nO 52.217 et la demande de brevet français n 71.24328 décrivent d'autres procédés chimiques. Les procédés chimiques pour préparer les d-6-désoxytétracycl ines comportent 3 ou 4 phases plus une phase additionnelle de purification avant de fournir les dérivés correspondants ayant une pureté suffisante pour une application cynique. Le rendement total obtenu dans la transformation de l'oxytétracycline en (C6-désoxytétracyclines , sous forme de base ou chlorhydrate, est compris entre 5 et 16 pourcent en poids. La mise en oeuvre des procédés précités entraîne des phases plus ou moins dangereuses et l'utilisation de réagents coûteux, tel que le gaz chlorhydrique anhydre, l'hydrogénation ou réduction catalytique en présence d'un métal noble. La présente invention concerne une transformation biologique qui évite tous ces inconvénients et est comparable favorablement en ce qui concerne les rendements. Selon la présente invention, on a constaté que certaines souches mutantes de Streptomyces alboflavus ont une aptitude a tranddrmer les anhydrotétracyclines en 6-désoxytétracyclines par saturation de la double liaison présente en C5a-C6. Cette transformation est accomplie par fermentation aérobique sub mergée en additionnant une anhydrotétracycline a un milieu de culture nutritif aqueux contenant des souches mutantes de genus Streptomyces, telr que le Streptomyces alboflavus et le Streptomyces lusitanus. On peut préparer aisément les anhydrotétracyclines a partir des tétracyclines par déshydratation à l'aide d'un acide minéral fort non-oxydant, tel que, par exemple, l'acide chlorhydrique. Les brevets américains nO 2 744 931 et 2 744 932 décrivent respectivement la préparation de l1anhydrochlorotétra- cycline et anhydrotétracycline. La préparation des diverses anhydrotétracyclines est décrite dans le "Journal of the American Chemical Society", vol. 74, page 4981 (1952), ibid, vol. 79, page 2849 (1957). Une variété mutante représentative du Streptomyces alboflavus, souche M-434-001, a été déposée à la "National Collection of Industrial Bacteria", Aberdeen, Grande-Bretagne, sous le n" NCIB 10588. Ce mutant constitue une descendançe directe de la souche dite "type Waksman", provenant du "Centraalbureau Voor Schimmelcultures", Baarn, Pays-Bas. Cette souche ne possédant pas de capacité de sporulation a été transformée préalablement dans une souche ayant une bonne sporulation apres l'avoir transférée, de façon alternée, sur deux milieux de culture, notamment sur l'agar de flocons d'avoine et agar de glycérine-citrate de calcium jusqu'à obtenir une colonie présentant une bonne sporulation.Après 4 sélections répétées de cette souche, ayant une capacité excellente de sporulation, dans une hotte stérile équipée avec 2 lampes à rayonnement ultraviolet "Phillips" de 30 W chacune, placées à une distance d'environ 60 cm au-dessus de la table de travail, on a trouve un mutant qui produisait environ 6500 mcg/ml d'oxytétracycline. Cette souche est identique en ce qui concerne ses caractéristiques taxonomiques à celle décrite dans le brevet français n 1 397 067 appartenant au demandeur , mais en diffère en ce qu'elle réduit le nitrate en nitrite, ce qui n'est pas le cas du Streptomyces alboflavus M-108-OX (ATCC 15388). Une culture de ce microorganisme, bien sporulée, a été conservée par mégarde sur un milieu agar-glycérine-citrate de calcium, pendant 28 mois, à une température comprise entre 180 et 280C, ce qui a provoqué la déshydratation de la culture.Composition du milieu agarglycérine-citrate de calcium Agar ... 20 g Citrate de calcium 5 g Phosphate dipotassique 0,5 g Chlorure d'ammonium... 0,5 g Glycérine 10 g Eau 1 1 pH 6,9. Après cette période, on a ajouté 5 ml d'eau stérilisée et 3 sphères de verre aussi stérilisées. On a agité le tube et on a ensemencé des botes de Pétri contenant de l'agar de flocons d'avoine. Après incubation à 28 C, il ne s'est développé que 5 colonies, et toutes ont perdu leur capacité de produire de l'oxytétracycline. Ensuite, on a soumises colonies à des sélections répétées comme indiqué ci-dessus et on a réalisé un premier essai pour vérifier leur capacité de produire de l'oxytétracycline. Les souches qui n ont pas provoqué une zone d'inhibition ont été soumises à une sélection additionnelle et aussi à un essai de contrôle pour vérifier leur capacité de transformer l'anhydro-5-hydroxytétracycline. Cet essai consistait à ensemencer dans une ligne étroite des boîtes de Pétri contenant soit de l'agar glycérine-citrate de calcium, soit des flocons d'avoine, tout en plaçant un petit cristal d'anhydro-5-hydroxytétracycline à une distance d'environ 1 cm de l'extrémité de la culture linéaire. Ensuite, on a incubé les boîtes à 280C et on les a observées sous lumière ultraviolette directe, filtrée à travers un verre de cobalt. On a choisi ensuite les colonies qui ont produit une fluorescence jaune dans l'agar entre le cristal non-fluorescent de l'anhydro-oxytetracycline et la culture. Les boîtes présentant une fluorescence bleuâtre ou sans fluorescence ont été rejetées. On a procédé ensuite à la fermentation des souches ayant provoqué une fluorescence jaune dans des flacons Erlenmeyer, sous agitation rotative, à 280C. Après incubation pendant 48 heures, on a ajouté 500 mcg/ml d'anhydro-oxytétracycline et on a soumis les aliquotes à la chromatographie en couche mince (la plaque chromatographique a été recouverte de terre de silice suspendue dans l'eau contenant 0,5 % de tétraacétate d'éthylènediamine et 5 Z de glycérine phase stationnaire : tampon McIlvaine à pH 3,7 contenant 5 Z de glycérine ; phase mobile : acétate d'éthyle saturé par le tampon Ncllvaine à pH 3,7 contenant 5 Z de glycérine), et on a comparé avec les chromatogrammes de doxycycline, oxytétracycline et anhydro-oxytétracycline faits simultanément.Après 7 sélections répétées, on a choisi les souches M-434-001 et M-111, lesquelles possédaient la propriété de transformer plus de 50 pourcent de l'anhydro-oxytétracy- dinde ajoutée en -6-désoxy-5-hydrytétracycline. Ces deux souches ont été déposées à la "National Collection of Industrial Bacteria" sous les n NCIB 10588 et 10589 respectivement. Ces souches possédaient également la propriété de transformer les anhydrotétracyclines autres que l'anhydro-oxytétracycline dans les- 6-désoxytétracyclines correspondantes. Dans un essai parallèle on a obtenu de la meme façon une autre souche mutante n partant du Streptomyces lusitanus (NCIB 9585 - ATCC 15842). Ce mutant ne produisait pas de chlorotétracycline mais était capable de transformer les anhydrotétracyclines en 6-désoxytétracyclines, et a été dénommé M-15842 NBK1O. Il est à noter que beaucoup d'autres souches ont été examinées afin de trouver celles qui avaient la capacité enzymatique de transformer les anhydrotétracyclines. Toutefois, seules les souches ayant subi une déshydratation accidentelle ont donné un résultat satisfaisant. Le mutant Streptomyces alboflavus NCIB 10588 présente une surface de spores lisse lorsqu'on l'observe sous le microscope électronique, les spores sont ovoïdes mesurant de 0,7 à 1,0 microns par 1,0 à 1,6 microns, les sporophores sont "Retinaculum Apertum" selon la classification de Pridham. On indique ci-après les caractéristiques d'une culture bien sporulée de Streptomyces alboflavus M-434-001 (NCIB 10588), après incubation à 260C pendant 18 jours dans différents milieux de culture Milieu de gélatine de composition Extrait de viande... 1,5 g Peptone............. 2,5 g Gélatine 80 g Eau distillée... 500 ml pH 6,2 (avant stérilisation) Aucune sporulation ou pigment, croissance faible. Agar de tyrosine (milieu de formation de mélanine selon Ettlinger) Extrait de levure - 1 g L-tyrosine 1 g NaCl 8,5 g Agar 16 g Eau du robinet... 1000 ml Bonne sporulation, léger pigment rose après 2 jours d'incubation lequel ne devient plus intense qu'au bout de 4 jours, couleur des spores "en masse" perle (ou "shell tint") (2ba). Milieu de pompe de terre On lave une carotte de pomme de terre (0 1,5 cm par 3-6 cm de hauteur) au moyen d'une solution de Na2C03 à 10 Z et on stérilise dans un tube à essai avec 1,5 cc d'eau distillée. Pigment diffusible clair brun-jaunâtre, bonne sporulation perle (ou "shell tint") (3ba). Milieu de Bennett de composition Extrait de levure... 0,5 g Extrait de viande 0,5 g Caséine hydrolysée 1 g Glucose 5 g Agar- ... 10 g Eau distillée... 500 ml Bonne sporulation, couleur des spores "en masse" ivoire foncé (2cb), pigment diffusible brunâtre. Milieu de glycérine-asparagine de composition Glycerine 5 g Asparagine -0,25 g Extrait de viande... 1 g K2HP04 0,25 g Agar- .............. 7,5 g Eau distillée....... 500 ml pH 6,9 (après stérilisation) Croissance très bonne, bonne sporulation perle (ou "iell tint") (2ba), pigment diffusible jaune clair. Milieu de Czapek-Dox de composition Glucose 20 g NaNO3............... 1 g K2HPO4.............. 0,5 g MgSO4.7H20.......... 0,25 g KCl 0,25 g FeSO4 un cristal de petite taille Eau distillée 500 ml Agar- ... 7,5 g pH 7,1 (après stérilisation) Croissance faible, absence de sporulation. Milieu d'Emerson de composition Extrait de levure... 2 g Amidon soluble 7,5 g K2HPO4.............. 0,5 g MgSO4.7H20.......... 0,25 g Agar- .............. 10 g Eau distillée....... 500 ml pH 7 (après stérilisation) Croissance faible avec même sporulation, léger pigment marron. Agar d'Amidon-Czapek-Dox de composition Amidon soluble...... 5 g NaNO3............... 1 g K2HP04 4... 0,5 g MgSO4.7H20.......... 0,25 g KCl................. 0,25 g FeSO4 un cristal de petite taille Agar- ... 7,5 g Eau distillée... 500 ml pH 7 (après stérilisation) Bonne croissance et même sporulation (2db), pigment jaune clair. Flocons d'avoine On fait bouillir 60 g de flocons d'avoine en bain-marie avec 800 ml d'eau pendant 15 minutes. On filtre ensuite à travers une gaze et on ajoute 20 g d'agar et de l'eau pour compléter à 1 litre. On règle le pH à 6,3 à l'aide d'hydroxyde de sodium à 15 %. Croissance très bonne et même sporulation de couleur "naturelle" (2dc) (ou "string"), pigment diffusible brun foncé. Milieu de Peptone-Extrait de Levure-Fer de composition Bacto-peptone 15 g Proteose-peptone "Difco" 5 g Citrate ferrique d'ammonium . 0,5 g Phosphate dipotassique 1 g Thiosulfate de sodium 0,08 g Bacto-agar.......... 15 g Extrait de levure... 1 g Eau distillée 1000 ml Bonne sporulation "blanche ostre" (b); léger pigment couleur de "fumé" lequel devient moins prononcé au bout de 10 jurs. La souche NCIB 10589 présente des caractéristiques taxonomiques semblables. Toutes les désignations de couleurs et les numéros de code correspondant ont été prises dans le "Color Harmony Manual" (Container Corp. of America - 3ème. édition). Le milieu de culture convenable pour la fermentation contient une source d'azote assimilable, une source de carbone et des sels minéraux favorables au développement du microorganisme. La fermentation aérobique submergée est un procédé trivial et a lieu à une température comprise entre 240 et 380C, mais de préférence entre 26 et 28 C. On peut ajouter les anhydrotétracyclines au début de la fermentation, mais de préférence au bout de 36 à 60 heures, sous forme d'une suspension fine aqueuse stérile ou de solution dans le diméthylformamide. En vue d'obtenir des résultats industriels satisfaisants, on doit soumettre le microorganisme à la technique utilisée dans l'industrie de fermentation d'antibiotiques, à des sélections répétées et adapter la composition des milieux de culture à chaque souche nouvellement sélectionnée pour obtenir des rendements élevés constants. La quantité d'anhydrotétracycline ajoutée est de 1 à 8 g/l, et la durée totale de fermentation de 90 à 150 heures. Une fois la fermentation achevée, on acidifie le milieu fermenté à l'aide d'acide chlorhydrique, on filtre et on extrait le mycélium avec du diméthylformamide en solution aqueuse à 30-70 Z et contenant de l'acide chlorhydrique concentré. On précipite ensuite les 6désoxytétracyclines du filtrat, sous forme de sels d'addition acides, chélates de métal ou complexes moléculaires. On sépare alors les 6-désoxytétracyclines du précipité ainsi obtenu, suivant les méthodes usuelles.On utilise de préférence les 3-hydroxy-2-naphtylates, les méthylène-5,5-disalicylates, les 5sulphosalicylates ou bien les complexes de N,N'-dibenzyléthylènediamine ou de N'N-dibenzyléthylènediimine pour réaliser la précipitation, bien que l'hexa- métaphosphate de sodium puisse egalement s'employer à cet effet. On peut isoler les d-6-désoxytétracyclînes en état pur à partir du pré cipité brut ainsi obtenu, suivant les techniques connues. Le brevet français n 2 148 660 appartenant as demandeur décrit la méthode préférée de cette purification. Les exemples qui suivent servent à illustrer leocédé objet de l'inventison, mais sont donnés sans intention limitative. Exemple 1 Tous les milieux se préparent à l'aide d'eau du robinet. On ensemence 30 ml du milieu stérilisé de la composition suivante Liqueur de macération de maïs... 10 g Sucre 15 g (NH4) 2HP04 2 g KH2P04 2 g MgSO4.7H20... 0,25g Eau ....... 1 1 pH réglé à 6,6. avec 0,5 ml d'une suspension en eau sterile de spores d'une souche, préalablement sélectionnée, de Streptomyces alboflavus M-434-001 (NCIB 10588) et on incube dans un ballon Erlenmeyer, sous agitation rotative, à 28 C pendant 24 heures. On ensemence ensuite une série de ballons Erlenmeyer de 300 ml, contenant chacun 30 ml d'un milieu- de culture stérile de la composition Liqueur de macération de maïs... 30 g Sucre 12,5 g CaCl2... 9,5 g (NH4)211P04 2,6 g Eau 1 1 pH réglé à 6,34 avec 1 ml de la préculture précitée et on incube à 280C, sous agitation, pendant 54 heures. Au bout de cette période, on y ajoute sous des conditions stériles,0,6 ml d'une solution de chlorhydrate d'anhydro-oxytétracycline dans du diméthylformamide (concentration 250 mg/ml), et on procède a l'incubation des cultures pendant 48 heures. On retire une partie aliquote d'un des ballons sous des conditions stériles, on règle le pH à 1,5 à l'aide d'acide chlorhydrique à 1 Z, et on fait l'analyse chromatographique en couche mince tout en utilisant un échantillon de référence d' -6-désoxy-5-hydroxytétracycline (doxycycline). Toutes les parties aliquotes présentent la tache distincte au même Rf que le doxycycline. Après une incubation additionnelle de 48 heures, on réunit le contenu des ballions, on acidifie jusqu'à pH 0,1 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré et on filtre, On lave les solides qui contiennent le mycélium avec un mélange de diméthylformamide, eau et acide chlorhydrique concentré (1:1:1), on filtre et on ajoute ce lavage au premier filtrat. Au filtrat clair, on ajoute ensuite de l'acide 5-sulfosalicylique, ce qui précipite alors le sulfosalicylate impur. On filtre et on lave avec du méthanol en solution aqueuse (60 Z), de l'acétone et de l'éther. Le produit est formé essentiellement d'&alpha;-6-désoxy-5-hydroxytétracycline, E1 cm1% 185 à 349m (dans du méthanol contenant 1Z d'acide chlorhydrique concentré), correspondant à une pureté de 83 %, 58 % de la quantité totale de l'anhydro-5-hydroxytétracycline ayant été transformée en Q-6-désoxy-5-hydroxytétracycline . On ajoute au produit ainsi obtenu 2,5 fois son poids de diméthylformamide en solution aqueuse à 70 % et puis 2 fois son poids d'acide chlorhydrique concentré. On chauffe le mélange à 680C et on le maintient à une température comprise entre 680 et 720C, pendant 30 minutes. On refroidit le mélange rapidement et on y ajoute 0,5 fois le poids du produit d'acide sulfosalicylique et on maintient à 150C, sous agitation, pendant 2 heures. On sépare le précipité cristallin par filtration, on le lave avec du méthanol en solution aqueuse à 60 % et on le sèche. On suspend alors le produit sec résultant dans 2,5 fois son poids d'éthanol, en solution aqueuse à 80 % et on ajoute une quantité stoechiométrique équimoléculaire d'un mélange de triéthylamine et éthanol en proportions égales.Une fois la cristallisation de la base libre amorcée, on ajoute de l'éthanol à raison de 4 fois le poids du produit. On récupère la base libre par filtration, et on lave d'abord avec de ltéthanol et ensuite avec de l'acétone et de l'éther. On dissout alors le monohydrate d' -6-désoxy-5 hydroxytétracycline ainsi obtenu (point de fusion 175 - 1770C, E lZcm 420 à 268 m et 331 à 349 m ) dans 1,7 fois le poids d'un mélange de 10 d'éthanol, T7 5 d'eau et 2 d'acide chlorhydrique concentré en solution aqueuse. A cette 17 17 solution, on ajoute le poids de la base libre d'une solution de gaz chlorhydrique en éthanol à 17 Z, en fournissant l'hémihydrate hémiéthanolate de doxycycline, pharmaceutiquement pur, avec un rendement total de 41,4 %.Point de fusion 210 C, E1 cm1% 373 à 268 m et 292 à 349 m , #&alpha;#D -105 (c=1 dans du méthanol contenant 1 Z d'acide chlorhydrique concentré. La courbe d'absorption du spectre en infrarouge est identique à celle d'un échantillon de référence. Exemple 2 On répète l'exemple 1, excepté que l'on utilise le microorganisme Streptomyces lusitanus, souche M-15842-NBK10. Le rendement total est de 38,9 Z exprimé en doxycycline pure. Exemple 3 On répète l'exemple 1, mais on ajoute au filtrat acidifié de l'acide 3hydroxy-2-naphtalique au lieu de l'acide 5-sulfosalicylique, et on élève lentement le pH à l'aide de NaOH à 10 %, jusqu'à obtenir une précipitation complète. Le rendement total est de 40,7 Z exprimé en doxycycline base. Exemple 4 On répète l'exemple 1 jusqu'à obtenir la base libre, mis en ajoutant de l'anhydrotétracycline au lieu d'anhydro-oxytétracycline. On peut ainsi isoler 1'&alpha;-6-désoxytétracycline sous forme de base pure avec un rendement de 33,5 %. E1 cm1% 333 à 350 m . REVENDICATIONS 1. Procédé de transformation biologique des anhydrotétracyclines en les 6 désoxytétracyclinés correspondantes, caractérisé par le fait qu'on ajoute une anhydrotétracycline à un milieu de culture nutritif aqueux, au début ou pendant la fermentation aérobique submergee par une souche du genus Streptomyces, laquelle possède la capacité de saturer par des atomes d'hydrogène la double liaison en C5a-C -C6, puis on continue la fermentation jusqu a ce qu'une partie substantielle de l'anhydrotétracycline soit transformée en la 6-désoxytétracycline correspondante, et sépare ensuite la 6-désoxytétracycline formée du moût fermenté. 2. Procédé pour la transformation biologique de l'anhydro-5-hydroxytétracycline en 1'OI -6-désoxy-5-hydroxytétracycline , caractérisé par le fait qu'on ajoute l'anhydro-5-hydroxytétracycline à un milieu nutritif aqueux, au début ou pendant la fermentation aérobique submergée par une souche mutante du Streptomyces alboflavus (NCIB 10588, NCIB 10589), on continue la fermentation jusqu'S ce qu'une partie substantielle de l'anhydro-5-hydroxytétracycline soit transformée en un mélange des isomères -6 et ss-6 de la 6-désoxy-5-hydroxytétracycline lequel contient essentiellement l'isomère d-6, et on récupère ensuite 1' -6-désoxy-5-hydroxytétracycline formée du mout fermenté. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par à une valeur de pH compromise entre 0 là 1.5 le tait qu'on acidifie le mout fermente le filtre et recupere la 6-desoxy- tétracycline formée par la formation des dérivés insolubles ou très peu solubles dans l'eau, notamment les nouveaux 3-hydroxy-2-naphtylates, les nouveaux méthylène-5,5-disalicylates, ainsi que les complexes moléculaires avec la N,N'-dibenzyléthylènediamine, la N,N'-dibenzyléthylènediimine et 1 'hexaméta- phosphate de sodium, et purifie le précipité brut ainsi obtenu en le transbr- mant en dérivés d' &alpha; ;-6-désoxytétracyclines ayant une pureté suffisante pour application thérapeutique, par moyen de procédés connus.