FR 2132761 A1 19721124 FR 7212288 A 19720407 L'inventio a pour objet des procédés d'obtention d'un mélance de substances vasoactives des feuilles de Ginkqo biloba. Elle vise écalement de nouveaux médicaments à base de ce mélance. Le ginkgo (Gink@o biloba L; syn.Salisburia adinantifolia Smith) appartient aux arbres, du point de vue phylogénétique, les plus vieux qui existent encore auj urd'hui. Il est considéré comme Farfaitement résistant aux parasites et aux maladies. Ses feuilles ont une action insecticide. Cette action est attribuée en partle à la teneur élevée en acide des feuilles. Cn sait que ces feuilles contiennen également des alcools aliphatiques, des cétones ainsi que des ginkgolides et des flavonoïdes (cf.Koji Nakanishi, The Chemistry of @@tural Products, Butterworths,Londres, vol.4 (1967), page 89). Parmi les flavonoïdes, le Ginkgo biloba L. contient la gallocatéchine, la galloépicatéchine, les prodelphinidines, les glycosides de flavones et les biflavones. La demande de brevet allemande N 1 767 Cgb décrit un procédé pour extraire un mélange de substances vasoactives des feuilles de Ginkgo biloba, procédé caractérisé en ce que les feuilles vertes fraîches ou séchées de Ginkgo biloba sont extraites au moyen d'une cétone ou d'un alcool alichatique inférieur hydraté,à une température d'environ 40 4 100 C, cet extrait est ensuite à son tour extrait au moyen d'un solvant lipophile non miscible à l'eau à une température d'environ 15 à 50 C et, si nécessaire, la phase organique hydrate est extraite sous pression réduite. Le produit ainsi obtenu est ensuite confectionné.On a constaté que l'extrait des feuilles de Ginkgo biloba obtenu par ce procédé et dont les substances lipophiles ont été éliminées, contient des glycosides de nature principalement ph-nolique, entre autres,les clycosides de la quercétine, de l'isoquercétine, du kaempférol @-rhamnoside, de lutéoline et de sitostérine. Comme le procédé est appliqué dans des conditions très modérées, les substances végétales qui se trouvent dans le produit obtenu, qui présente des propriétés thérapeutiques ont essentiellement gardé leur forme oricinelle. La phase organique aqueuse extraite peut être employée sans autre purification comme préparation charmaceutique, sous forme liquide par exemple, ou sous forme de comprimés ou de dra oées, et adminis@rée oralement. @n Mraticue, le procédé est appliqué de la façon suIvante: Les feuilles sont soumises à l'extraction pendant l à 5 heures environ, sous pression normale ou, de préférence, sous une légère surpression, à une température variant entre 40 et 10"C, de préférence entre 60 et 18L0C. L'extraction terminée, l'extrait est séparé des feuilles, par exemple au filtre-presse.De préférence; les feuilles sont broyées et extraites au moyen d'une cétone ou d'un alcool aliphatique inférieur ayant une teneur en eau d'environ LO à 50v . L'extrait hydraté ainsi obtenu est ensuite extrait à son tour au moyen d'un solvant lipophile pratiquement non miscible à l'eau à une température d'environ 15 à 50 C. A cet effet, il est préférable d'employer comme solvant un hydrocarbure aliphatique inférieur halogéné, tel que par exemple le chlorure de méthylène, le chloroforme ou le tétrachlorure de carbone. De préférence on utilise comme solvant le tétrachlorure de carbone. L'extrait hydraté obtenu par ce procédé convient à la fabrication de préparations pharmaceutiques à administrer par voie orale mais ne convient pas à la fabrication de préparations pharmaceutiques injectables. Dans ce cas, il faut d'abord éliminer de l'extrait des substances de nature inconnue qui nuisent à la stabilité des préparations pharmaceutiques injectables. On y parvient grâce à un développement du procédé qui consiste à faire réagir l'extrait hydraté obtenu par extraction au moyen d'un solvant lipophile avec du sulfate d'ammonium et à extraire ensuite la solution au moyen d'un solvant organique bouillant entre 60 et 100 C et possédant une certaine solubilité dans l'eau. On a constaté que le diéthylcétone et en particulier la méthyléthylcétone convenait tout particulièrement à ce genre d'opération. L'extrait de méthyléthylcétone obtenu est, après séchage au moyen du sulfate de sodium anhydre par exemple,concentré, sous pression réduite de préférence. Le résidu est ensuite complètement extrait au moyen d'un alcool aliphatique inférieur, de préférence au moyen d'éthanol. Il reste en opérant ainsi un résidu non dissous. L'extrait d'alcool est filtré et concentré, de préférence sous pression réduite. Le résidu est séché sous pression réduite à une température d'environ 30 à 6C"C, de préférence à environ 5"C, et finement pulvérisé. Il est avantageux de faire réagir l'extrait hydraté avec du sulfate d'ammonium jusqu'à une saturation d'environ 15 à 30%, de préférence d'environ zC'S. Pour pr-parer une solution injectable, la poudre ainsi obtenue est par exemple dissoute à 5% dans l'eau et amenée à un pH de 7,5 au moyen d'ur solution aqueuse d'hydroxyde de métal alcalin, de préférence u moyen de soude caustique O, 1 n. Cette solution est ensuite diluée dans l'eau, par exemple avec 9 fois son volume d'une solution à environ 4% de sorbitol. Cette solution est injectable et reste également claire après stérilisation pendant 15 minutes à liO C. Il s'cst révélé par la suite que l'emploi des solutions injectables, pour des perfusions par exemple, est limité. Les solutions employées pour faire des perfusions sont souvent utilisées comme solutions mixtes, mélangées à d'autres solutions pour perfusion. Lorsqu'on les emploie comme solutions mixtes, des précipitations se forment souvent, surtout lorsque les solutions contzen- nent des sels aminés. Ces précioitations proviennent de ce que les prodelphinidines forment avec les amines des complexes peu solubles. C'est pourquoi l'extrait ci-dessus décrit doit être, pour pouvoir être employé comme solution pour perfusion, épuré jusqu'à ce que les polyphénols indésirables soient éliminés.Ce probl-me a été résolu par l'invention. L'invention a donc poJr objet un procédé pour cbtenir un lange de substances vasoactives à partir des feuilles de Ginkgo biloba par extraction des feuilles vertes fraîches ou séchées de Ginkno biloba au moyen d'une cétone ou d'un alcocl hydraté aliphatique inférieur, à une température d'environ 4G à 100 C,à extraire ensuite cet extrait à son tour au moven d'un solvant lipophile non miscible à l'eau à une température d'environ 15 à 50 C, à faire réagir l'extrait hydraté avec du sulfate d'ammonium, à extraire la solution au moyen de méthyléthylcétone, à évaporer l'extrait de méthyléthylcétone, puis a le diluer dans un alcool aliphatique inférieur éventuellement hydraté, procédé qui est caract-rist nar le fait que la solution alcoolique ainsi obtenue est ou a) traitée avec un composé de plomb, de préférence de l'hydroxyde de plomb récemment préparé, que le précipité ainsi formé est séparé, que 1.a solution alcoolique est concentrée, mélangée avec du sulfate d'ammonium et extraite au moyen de la méthyléthylcétone,la phase alcoolique et de méthyléthylcétone qui se forme est séparée, la phase aqueuse est extraite au moyen de a méthyléthylcétone, la phase alcoolique et de méthyléthylcétone qui se for est séparée et combine avec la hase alcoolique et de méthyléthylcétone obtenue plus haut, les phases alcoolique et de méthyléthylcétone combines sont mélangées avec du sulfate d'ammonium, la phase aqueuse qui se forme est séparée, Is physe alcoolique et de méthyléthylcétone est concentrée après le séchage ou bien b) taitée ave un polyamide pulvérulent t haut poids moléculaire, de préférence un polymère du caprolactame tel que celui connu sous le nom de Nylon 6, les résidus solides sont éliminés par filtration et le filtrat est concentré,le résidu obtenu selon a) ou b) est dissous dans l'éthanol, le précipité qui se forme est séparé et la solution est concentrée Les exemples qli suivent expliquent en détail cette invention. EXEMPLE 1. 100 q de feuilles vertes de Ginkgo biloba grossièrement broyées sont extraites dans un extracteur à recyclage au moyen de 380 litres d'acétone à 60% pendant 5 heures à environ 55"C et, après refroidissement,filtrées sous environ 100 atm. La solution est ensuite aaitée avec 5V litres, 4û litres et 30 litres de tétra chlorure de carbone,et les phases sont à chaque fois séparées. 35 kg de sulfate d'ammonium sont dissous dans la phase acétonique aqueuse. Cette solution est mélangée avec 35 litres de méthyléthyl- cétone. Après avoir mélangé soigneusement, la phase de méthyléthylcétone et d'acétone qui se forme est séparée. On ajoute de nouveau 26 kg de sulfate d'ammonium solide en mélangeant. Après filtrage des solides, le filtrat obtenu est concentré sous pression réduite à une concentration de 2C à 60% en poids de résidu sec. Le concentré obtenu est ensuite dilué avec de l'éthanol dénaturé à 50% jusqu'à une concentration finale de 10% de résidu sec. Sous agitation, on fait arboter de l'azote dans la solution d'éthanol à îoe, ains obtenue et en même temps on la mélangée avec 1G litres d'une suspension d'hydroxyde de plomb dont la préparation est décrite ci-après. Il se forme un précipité brun clair qui est séparé par filtr@ge a travers des couches de filtres ap propriétés ou par essorage. Four obtenir le mélange de substances actives désiré, on réduit la solution d'éthanol, de préférence sous pression réduite, à la moitié de son volume.La solution ainsi concentrée est agitée avec 10 kg de sulfate d'ammonium et 10 litres de méthyléthylcétone. La phase d'éthanol et de méthyléthylcétone qui se forme est séparée te la a phase aqueuse. La phese a@ueuse est mélanoée avec à litres de méthyléthylcétone et acitée. La phase d'éthanol et de méthyléthylcétone qui se forme est combinée avec la @hase d'éthanol et de méthyléthylcétone obtenue en l'asitant avec litres de méthyléthylcétone.Les phases d'éthanol et de méthyléthylcétone réunies sont agitées en ajoutant 4 kg de sulfate d'ammonium. La phase aqueuse qui se forme est séparée. La phase d'éthanol et de méthyléthylcétone qui reste en surface est séchée sur 0,8 kq de sulfate de sodium et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu tenace est dissous dans 45 litres d'éthanol dénaturé. Le précipité qui se forme après li heures de repos est séparé. Le filtra t de couleur claire est concentré scus pression réduite. Le résidu est séché à 50 c sous pression réduite et pulvérisé. A partir de 100 kg de matières preminres végétales on obtient 1,2 kg de mélange de substances actives conforme à l'invention. Préparation de la suspension d'hydroxyde de plomb: 5 kg d'acétate de plomb [Pb(OCOCH3)2, 3H2O] sont dissous dans 50 liires d'eau complètement désalée, dans laquelle on a auparavant fait barboter de l'azote. Cette solution est mélangée en quelques minutes dans un récipient approprié avec une solution de 1 kq à'hydroxyde de sodium dans B litres d'eau en agitant et en faisant barboter constamment de l'azote. Lorsque i'on cesse d'aciter il se forme un précipité d'hydroxyde de plomb qui se dépose sur le fond du récipient.La phase aqueuse presque clair qui reste en surface est prélevée u l'aide d'un siphon et le précipité d'hydroxyde de plomb est lavé à deux reprises avec à chaque fois eO litres d'eau dans laquelle on a fait barboter de l'azote. Eventuellement, on peut utiliser de plus grandes quantités d'eau jusqu'à ce que la dernière eau de lavaae indique un pH entre 7 et 8. Le précipité d'hydroxyde de plomb est réduit, avec de l'éthanol dénaturé à 5O,, à 1C litres de volume final. XEMPLE 2. Au concentré à 10 d'extrait de ginkgo préparé selon l'exem le l, on ajoute en agitant et en faisant barboter de l'azote 12 litres d'une solution à 10% d'acétate de plomb (Pb(OCOCH3)2, 3H Cl dans l'eau. Le précipité qui se forme est séparé par filtrage ou par essorace. La solution d'éthanol est réduite à la moitié de son volume sous pression réduite, mélangée avec 10 kg de sulfate d'ammonium et 12 litres de méthyléthylcétone et agitée vigoureusemant. la phase de méthyléthy cétone et d'éthanol qui se forme est séparée. La phase aqueuse restante en surface, est à nouveau mélangée avec 10 litres de méthyléthylcétone et agitée.La phase d'éthanol et de méthyléthylcétone qui se forme est combinée avec celle obtenue auparavant. Les phases d'éthanol et de méthyléthylcétone reunies sont mélangées aver 4 kg de sulfate d'ammonium et agitées vigoureusement. La phase aqueuse qui se forme est séparée. Après séchage de la phase d'éthanol et de méthyléthylcétone sur 0,8 kg de sulfate de sodium, la solution claire est évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 15 litres d'éthanol dénaturé. Le précipité qui s'est formé après 12 heures de repos est séparé. Le filtrat est concentré sous pression réduite te. Le résidu est séché à 500C sous pression réduite. On obtient ainsi 1,1 kg du mélange de substances actives selon cette invention. EXEMPLE 3. Le concentré obtenu selon l'exemple l et ayant une teneur de 20 à 60% de résidu sec est réduit avec de l'éthanol dénaturé à une teneur de 10%. Cette solution d'éthanol est mélangée avec 1 kg de poudre de Nylon 6 ayant une granulation inférieure à 0,3mm et agitée pendant l heure, puis les solides sont filtrés. Le filtrat est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 15 litres d'éthanol dénaturé. Le précipité qui se forme après 12 heures de repos est séparé par filtration et le filtrat est concentré sous pression réduite. On obtient ainsi 1,5 kg du mélange de substances actives conforme à l'invention. Le mélange de substances actives obtenu par le procédé conforme à l'invention ne contient pas de polyphénols indésirables mais les glycosides de flavones et les glycosides de stérol- des. Le mélange de substances actives est parfaitement soluble dans l'eau et se prête à la préparation de solutions injectables ou administrables par perfusion. Le mélange de substances actives extraites du Ginjgo biloba s'emploie avantageusement dans le traitement des troubles de l'irrigation artérielle périphérique, de la claudication intermittente et des troubles vasculaires. La dose journalière varie entre 50 et 2OOmg. Les essais pharmacologiques, dont les résultats sont rapportés ci-après, et qui ont été réalisés à l'aide du susdit mélange mettent en évidence les avantageuses propriétés thérapeutiques de ce dernier. A) Effets sur les vaisseaux périphériques: 1. Examen du volume d'écoulement sur une oreille de lapin isolée selon GAUTHELET,GADDUt; et KWIATKCUSKI: a)il se produit une augmentation du volume d'écoulement dépendant de la dose administrée, correspondant à une vasodilatation périphérique; b) l'augmentation du volume d'écoulement périphérique dépendant de la dose administrée apparaît également si l'on a auparavant administré de l'adrénaline. 2. Examen du volume d'écoulement sur des vaisseaux sanguins isolés selon FURCHGCTT et BHADRAKON : a) l'extrait de ginkgo n'a aucun effet sur l'aorte de lapin isolée; b) par contre, l'extrait de ginkgo tonifie la veine cave isolée du lapin. 3. Examen de la perméabilité canillaire selon NBROSE et EDS : l'extrait de ginkgo entraîne un ralentissement variable selon la dose administrée de l'augmentation de la perméabilité capillaire provoquée chez les lapins par le chloroforme. 4. Examen de L'effet produit sur ltoedème inflammatoire: l'extrait de ginkgo n'a qu'un faible effet, indépendant de la dose administrée sur l'oedème de la patte de rat provoqué par la carraghénine. B) Effet spasmolytioue sur les muscles lisses in vitro: 1. Examen sur l'iléon du cochon d'inde: a) preuve de l'effet tonifiant obtenu avec des doses supérieures à b) effet préventif sur les spasmes déclenchés par le chloride de baryum; c) effet curatif sur le spasme déclenché par le chloride de baryum; e) effet préventif sur le spasme déclenché par l'histamine; f) effet anti-bradykinine semblable à celui provoqué par Ia quercétine. 2. Examen sur le duodénum du lapin: aucun effet sur le péristaltisme n'a pu être prouvé. 3. Examen sur l'utérus du rat: l'extrait de ginkgo a un certain effet inhibiteur sur la contraction de l'utérus du rat provoquée par le sérotonine. C) Effet sur le système neuro-veqétatif: (essais effectués sur des chiens beagle) 1. Examen de la tension artérielle: a) dansXl'emploi intraveineux sur un chien ayant subi une vagotomie sur un seul côté, l'administration de doses allant jus qu'a. 1LOjug/kg, n'a aucun effet sur la tension artérielle. Des doses supérieures à rCog/kg entraînent une baisse de la tension artérielle de courte durée sans relation apparente entre la dose et l'effet. b) en cas d'administration orale de doses jusqu'à 2 mg/kg aucun effet ne se fait sentir sur la pression artérielle. 10 mgi kg peuvent déclencher une nette baisse de la tension artérielle pouvant durer jusqu'à 4 heures. 2. Examen de la respiration: jusqu'à 2 mg/kg, aucun effet sur la respiration. Des doses supérieures entraînent une légère augmentation du rythme respiratoire. 3. Examen du rythme cardiaque et de l'électrocardiogramme: en employant des doses allant jusqu'à 5 mg/kg, aucun effet sur le rythme cardiaque et l'électrocardiogramme. Aucun examen n'a été fait avec des doses plus fortes. 4. Examen du fonctionnement des reins: il est prouvé qu'il se produit un effet à deux phases: diminution initiale de la quantité d'urine, suivie d'une excretion d'urine plus importante. 5. Examens divers: a) l'extrait de ginkgo n'a aucune influence sur lthypoten- sion déclenchée par excitation mécanique du nerf vague; b) l'hypertension déclenchée par l'obturation de la carotide n'est pas non plus influencée; c) augmentation de l'hypotension provoquée par l'acétylcholine, mais seulement à fortes doses; d) légère augmentation de l'hypertension causée par ltadré- naline, mais seulement à fortes doses. D) Effet produit sur le système nerveux central (essais effectués sur des souris) 1. Examen de la motilité spontanée selon BOISSIER: dans l'emploi intramusculaire et l'administration par voie orale de doses allant jusqu'à 5 mg/kg, aucune influence ne se manifeste sur la motilité. A très fortes doses, on observe une diminution de la motilité. Examen au test de traction selon JCULOU COURVCISIER: Le comportement normal des animaux n'est nullement influence. 3.Examen au test des 4 taches-selon BOISSIER et SIMON ARON: des déviations par rapport à la norme ne se constatent qu'à très fortes doses. 4. Examen pour déceler une éventuelle augmentation de puissance de l'anesthésie à l'hexobarbital: on n'observe aucune trace d'un tel effet. 5.Examen pour déceler une éventuelle influence sur l'hypo- thermie par la réserpine selon BCISSIER: On n'observe aucune trace d'un tel effet. 6. Examen de l'effet anticholinerqique produit sur le système nerveux central selon LEVY: une inhibition de l'effet produit par l'oxotrémorine ne peut être prouvée. 7. Examen de l'effet analgésique selon SIEGMUND et CADMUS: Les résultats des essais sont comparables à ceux obtenus avec des antipyrétiques et des analgésiques connus. Mais il ne faut pas surestimer les résultats étant donné que la méthode d'examen ne permet de tirer des conclusions que sous réserve. E) Effet sur la diurée ( essais effectués sur des chiens beagle): ce n'est qu'à partir de doses supérieures à 300 g/kg que l'on peut observer une augmentation de la quantité d'urine d'environ 10%. F) Effet sur le foie et la bile: 1. Examen de l'effet cholécystocinétique. ce n'est qu'à partir de doses superreures à 25 mg/kg qu'un effet cholécystocinétique se produit chez le cochon d'inde. Examen de l'effet anti-cholécystocinétique: aucun effet anti-cholécystocinetique n'a été constaté. 3,Examen de la cholérnse chez le chien anesthésié; aucun effet cholérétique n'a pu être prouvé. L'extrait de ginkgo a donc des propriétés toniques manifestes sur les veines (veine cave isolée du lapin) et des effets antagonistes sur les diverses substances qui déclenchent des spasmes dans les muscles lisses. Il en résulte une très nette augmentation du volume d'écoulement dans les vaisseaux péripheri- ques (oreille perfusée). Il est particulièrement remarquable que ces effets de l'ex- trait de ginkgo se manifestent non seulement à l'état physiologique, mais aussi après l'emploi des adents chimiques ayant un effet modérateur tels que les amines des catéchol, l'acétylcholine, le sérotonine et le bradykinine. Ces effets sur les vaisseaux vaso-moteurs périphériques dont quelques-uns jouent également un rôle dans la pathologie des vaisseaux sont complétés par des qualités vaso-protectrices dans la région des capillaires. On donne ci-après, à titre d'illustration, un exemple de formulation des médicaments conformes à l'invention. EXEMPLE 4. Préparation d'une solution en ampoule-s: 50 kg de solution contiennent: 175 g de mélange de substances actives conforme à l'invention, 1,5 kg d'alcool à 95% 1,4 à 1,6 kg de 0,1 n NaOH 2 kg de sorbitol par injection jusqu'à 50 kg d'eau appropriée à l'injection. Cette solution est traitée selon les méthodes pharmaceutiques usuelles, mise en ampoules conformément à la réglementation en vigueur et stérilisée. -REVEI4DICATICNS- 1.- Procédé d'obtention d'un mélange de substances vasoactives à partir de feuilles de Ginkgo biloba par extraction des feuilles vertes fraîches ou séchées de Ginkgo biloba au moyen d'une cétone ou d'un alcool hydraté aliphatique inférieur, à une température d'environ 40 d 1C6 , extraction de l'extrait obtenu au moyen d'un solvant lipophile non miscible à l'eau à une température d'environ 15 à 5C C, réaction de ltextrait hydraté avec du sulfate d'ammonium, extraction de la solution au moyen de méthyléthylcétone, évaporation de l'extrait de méthyléthylcétone, puis dilution dans un alcool aliphatique inférieur éventuellement hydraté, ledit procédé étant caractérisé par le fait que la solution alcoolique ainsi obtenue est traitée avec un composé de plomb, ou un polyamide pulvérulent à poids moléculaire élevé et qu'après élimination respectivement du précipité ainsi formé ou des rési- dus solides, le filtrat ou la solution alcoolique est concentré. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la susdite solution alcoolique obtenue après traitement de la solution alcoolique initiale avec un composé de plomb, filtration et concentration, est mélangée avec du sulfate d'ammonium et extraite au moyen de la méthyléthylcétone, la phase d'alcool et de méthyléthylcétone qui se forme est séparée, la phase aqueuse est extraite au moyen de la méthyléthylcétone, la phase d'alcool et de méthyléthylcétone qui se forme est séparée et combinée avec la phase d'alcool et de méthyléthylcétone obtenue plus haut, les phases d'alcool et de méthyléthylcétone combinées sont mélangées avec du sulfate d'ammonium, la physe aqueuse qui se forme est séparée, la phase d'alcool et de méthyléthylcétone est concentrée après séchaqe. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le composé de plomb est de l'hydroxyde de plomb fraîchement préparé. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que le concentré obtenu est dissous dans l'éthanol, le précipité qui se forme est séparé et la solution est concentrée. 5.- Préparations pharmaceutiques notamment vasoactives, caractérisées par le fait qu'elles contiennent un mélange des substances actives obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ainsi que des diluants et des excipients auxiliaires usuels. Préparations pharmaceutiques selon la revendication 5, caractérisées par le fait qu'elles sont administrées par perfusion ou par injection.