FR 2153200 A1 19730504 FR 7134435 A 19710924 La pressente invention est relative à un complexe de l'urokinase, aux médicaments contenant ce complexe de l'urokinase en tant que substance active, et à un procédé perfectionné de préparation de l'urokinase. On sait que l'urokinase est une enzyme présente dans l'urine et qui catalyse la transformation du plasminogène en plasmine, peptidase dont le rôle physiologique est de dissoudre les formations fibrineuses intravasculaires. Un défaut dans les mécanismes d'activation du plasminogène,en cas de cinétique accéléré du système de coagulation ou d'altération des parois vasculaires,conduit au maintien 3e fibrine intravasculaire qui en définitive détermine les divers syndromes thrombo-emboliques (thromboses, embolies, coagulation intra-vasculaire disséminée, etc.). L'administration d'urokinase dans ces cas pathologiques provoque une accélération de la formation de plasmine notamment au niveau des formations fibrineuses comme l'indique la littérature.L'urokinase constitue donc le traitement de choix des syndromes thrombo-emboliques et son origine humaine écarte les dangers de chocs anaphylactiques. L'administration, qui se fait en perfusion veineuse continue d'une dilution en sérum glucosé, est rendue délicate par le fait de l'instabilité de l'enzyme en solution diluée, ce qui oblige à renouveler très fréquemment la solution ou à procéder à des insections discontinues d'une solution concentrée dans la tubulure d'une perfusion mise en place de sérum glucose. La présente invention est relative à un complexe d'urokinase, d'une plus grande stabilité en solution, qui permet une administration par perfusion simple de la dilution d'enzyme stable pendant plusieurs heures, avec tous les avantages que cela présente pour le traitement. Cette invention a également pour but de fournir un procédé perfectionné pour la fabrication de l'urokinase à une échelle industrielle, dans'le but d'en réduire le coût normalement élevé, procédé qui est également particulièrement approprié à la fabrication du complexe d'urokinase selon l'invention. Le produit selon l'invention est constitué par un complexe d'urokinase et d'héparine, complexe qui dans ce qui suit sera appelé "héparinate d'urokinase", étant entendu que l'expression urokinase recouvre aussi bien l'urokinase pure que les urokinases dites purifiées, utilisées à ce jour en thérapeutique. Le procédé selon l'invention est applicable à la purification d'une solution contenant de l'urokinase impure telle qu'extraite de l'urine humaine par adsorption de celle-ci à un pH d'environ 5,6 sur un adjuvant de filtration, du genre des terres d'infusoires commercialisées par la Société John Mansville sous la désignation "hyflosupercel", et élué en milieu tamponné à pH d'environ 7,2, puis récupération du filtrat, élimination des contaminations virales éventuelles en milieu légèrement acide à pH d'environ 6,25 et chauffage à 600, refroidissement et séparation par centrifugation, récupération de la solution, acidification de celle-ci à pH d'environ 4,2 et formation d'un précipité par addition de sulfate d'ammonium, dissolution du précipité dans du soluté glucosé et dialyse pour obtenir ladite solution d'urokinase impure.Ledit procédé est caractérisé en ce que ladite solution est soumise à une chromatographie d'exclusion sur une résine du type de celle connue sous la désignation DEAE cellulose à pH 4,5, puis en ce que le surnageant et la solution de lavage de la résine, notamment à base de sulfate d'ammonium, sont soumis à une nouvelle chromatographie d'exclusion sur la même résine à pH 7, et en ce que le surnageant et la solution de lavage de la résine sont alors soumis à une purification supplémentaire, dans des conditions connues, telles que celles qui seront indiquées ci-après, pour obtenir une solution d 'urokinase purifiée. Le procédé de fabrication de l'héparinate d'urokinase est caractérisé en ce que l'on fait réagir une solution d'urokinase purifiée avec une solution d'héparine, de préférence en milieu acidifié, notamment à pH 4,2, et que l'on recueille le précipité obtenu, notamment par centrifugation. Une solution d'urokinase purifiée peut être obtenue en recourant notamment à la mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention indiquée dans ce qui suit - traitement de l'urine humaine amenée à pH 5,6 par l'acide acétique avec un adjuvant de filtration tel que celui commercialisé sous la marque "hyflosupercel" - extraction à 4"C de l'urokinase adsorbée sur l'hyflosuper- cel, en traitant l'adjuvant de filtration avec une solution tamponnée à pH 7,2 de phosphate disodique 0,32 M et de chlorure de sodium 2,2 M et séparation par filtration de l'hyflosupercel celui-ci est lavé avec un volume égal de solution tampon - les solutions (filtrat et eaux de lavage) sont réunies, portées à pH 6,25 avec de l'acide phosphorique 0,5 N ; on élimine, si besoin, les éventuelles contaminations virales notamment par chauffage à 600C pendant 10 heures ; on refroidit brusquement à 4"C et on laisse reposer 1o heures ; on élimine le précipité formé par centrifugation - au surnageant, amené préalablement à pH 4,2 avec de acide chlorhydrique 5 N, on ajoute du sulfate d'ammonium pour atteindre les 2/3 de la saturation en ce sel, en maintenant la température entre 5. et 8 "C - on recueille le précipité formé, qui continent l'urokinase, on le dissout dans deux parties d'eau glucosée à raison de 18 grammes de glucose par litre et on soumet la solution à une dialyse JUsqU'à obtenir une résistivité de 40.000 microhms ; on sépare l'insoluble par centrifugation et on dialyse le surnageant jusqu'à obtenir un dialysat de résistivité égale à 22.000 microhms - traitement du dialysat avec de la DEAE cellulose (diéthylaminoéthyl cellulose) à pH 4,5 à raison de 25 g pour 14.000.000 d'unités CTA d'urokinase ; on agite 30 minutes, filtre et lave la résine avec une solution de sulfate d'ammonium de résistivité de 15.000 microhms et de pH 4,5 - addition de DEAE cellulose à pH 7 à ltéluat et au lavage, à raison de 65 g pour 14.000.000 d'unités CTA d'urokinase à 2-40C, on ajuste à pH 6,6-6,8 ; on agite 30 minutes, ajoute de l'eau pour amener la résistivité à 9.000 microhms, ajuste le pH à 7 et filtre; on lave ensuite la résine avec une solution de sulfate d'ammonium de résistivité de 9.000 microhms à pH 7 - après avoir été ramenée à pH 6,2, la solution est agitée pendant 1 heure à 4 C au contact de kaolin (lequel a été obtenu par mise en suspension de kaolin lavé dans trois fois son volume d'eau distillée, cette suspension ayant été portée à l'autoclave pendant 90 minutes à 1200C puis décantée et le kaolin séparé et séché au four à 2000C) - après centrifugation à froid, on sépare le kaolin et on le suspend dans une solution d'un tampon phosphate 0,05 M pH 6,2 ; on agite pendant 30 minutes et on sépare le kaolin par centrifugation ; cette dernière opération de lavage peut être répétée plusieurs fois - le kaolin est mis en suspension dans une solution contenant 75 g de chlorure d'ammonium par litre d'ammoniaque à 4 p. 100, et agitée pendant 30 minutes. Le kaolin, séparé du surnageant par Cen- trifugation,est soumis à la même opération d'élution deux autres fois - les surnageants sont réunis et additionnés de S04H2 N/10 pour obtenir un pH de 3,5 et d'une solution à 350 grammes par litre de sulfate d'ammonium - le précipité recueilli par centrifugation à froid est mis en suspension et dialysé contre une solution tampon phosphate pH 6,2, 0,05 M pendant 18 heures à + 4"C - cette solution dialysée est filtrée sur une colonne de résine connue dans le commerce sous la désignation IRC 50, de diamètre 5 cm et de 60 cm de haut, équilibrée avec le tampon phosphate 0,05 M, pH 6,2 ; la colonne est lavée par ce même tampon jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de précipité par 5 % d'acide trichloacétique - la colonne d'IRC 50 est éluée par une solution à pH 8,2 tampon phosphate 0,2 M dans laquelle sont dissous 75 g par litre de chlorure d'ammonium ; l'éluat est recueilli dans un collecteur de fraction placé dans une enceinte à + 4 C - les fractions contenant l'activité sont précipitées par le sulfate d'ammonium (350 g/litre) à pH 3,5.Le précipité recueilli par centrifugation est ranis en solution à pH 7, dilue suffisamment pour obtenir une résistivité de l'ordre de 20.000 microhms i - la solution d'urokinase ainsi obtenue peut être encore pu rifiée davantage par l'intermédiaire d'une dialyse dans les conditions- usuelles pour obtenir finalement une urokinase purifiée qui peut être lyophilisée. On peut également, conformément à un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, utiliser directement la susdite solution pour la formation de l'héparinate d'urokinase en procédant comme suit. On ajoute à cette solution de l'héparine, par exemple à raison de 50.000 unités d'héparine par 14.000.000 d'unités CTA d'urokinase ; on amène le pH à 4,2 par l'acide phosphorique 0,5 N ; on maintient au repos pendant une heure à la température de 4"C ; on centrifuge, recueille le culot de centrifugation avec une solution de 10 g/litre de chlorure de sodium à raison de 100 ml de solution par 14.000.000 d'unités CTA d'urokinase et on lyophilise pour obtenir de l'héparinate d'urokinase anhydre. L'héparinate d'urokinase est un complexe se présentant sous forme d'agrégats et dont le poids moléculaire est fonction de ce lui de l'héparine utilisée et des impuretés d'origine protéinique accompagnant l'urokinase. Dans ce complexe, la proportion d'héparine est très négligeable par rapport à celle de l'urokinase. En effet, ''héparine, grâce à ses nombreux groupements fonctionnels acides, peut fixer de nombreuses molécules d'urokinase. L'héparinate d'urokinase est soluble à pH 7 et précipite lorsqu'cn acidifie la solution jusqu'à pH 4. Con peut retrouver chacun des constituants du complexe en le détruisant en milieu NaCl/HCl. On obtient alors un précipité constitué par l'urokinase tandis que héparine passe en solution. Cn peut décrire encore ci-après un exemple complet de fabrication d'héparinate d'urokinase : on notera que toutes les opérations qui suivent sont effectuées à 4 C. 1 - Collecte 1.CCO litres d'urine sont recueillis sur phénol. La quantité de phénol mise en oeuvre à cet effet est telle qu'à la fin de la collecte, la concentration en phénol soit au minimum de 0,5 %. Far addition d'acide acétique, le pH de l'urine ainsi collectée est ajusté à 5,8. 2 - Adsorption de l'urokinase contenue dans l'urine sur l'hyflo- supercel Cn ajoute au mélange 5 kg d'hyflosupercel.et, dans une cuve de Grignard à double enveloppe refroidie à 4"C, on le soumet à une agitation pendant 3 heures. La poudre d'hyflosupercel est recueillie par filtration sur filtre presse et on obtient 17 kg d'une pâte contenant 12 kg d'eau. 3 - Extraction de l'urokinase adsorbée sur l'hvflosupercel La pâte obtenue est additionnée de 960 g de chlorure de sodium cristallisé et de 17 litres d'une solution tamponnée à pH 7,2 obtenue en ajoutant dans 1.CO ml d'eau déminéralisée, 10,8 g de phosphate disodique et 80 g de Nazi. La résistivité de la solution tampon est de 84.0CC microhms à 15 C. Après 30 minutes d'agitation, la poudre d'hyflosupercel est séparée du mélange par filtration sur un entonnoir du type Buchner de 2GC m de diamètre, garni d'une toile par exemple en fibres synthétiques de polyester, comme celles commercialisées sous la marque Tergal. Cn laisse déposer la poudre et on termine la filtration en opérant sous une dépression de 500 mm de mercure. Avant que la poudre ne soit complètement sèche, on la lave avec 10 litres de la solution tampon. En réunissant filtrats et solutions de lavage, on obtient un volume de 30 litres. L'activité en urokinase de la solution ainsi obtenue est de 6 millions d'unités CTA. 4 - Précipitation de l'urokinase contenue dans la solution tampon Le pH de la solution est ajusté à 4,2 par addition d'acide chlorhydrique 5 N. On ajoute 13,5 kg de sulfate d'ammonium (450 g par litre de solution) et on agite jusqu'à dissolution complète du sel. Le mélange est laissé au repos pendant 12 heures. Le précipité qui s'est formé est recueilli par centrifugation. On utilise à cet effet une centrifugeuse commercialisée sous la marque Alfa Laval du type B 1424 F. On obtient 30 g de précipité humide, on ajoute au précipité 60 ml d'une solution aqueuse renfermant 18 g de glucose par litre d'eau. Le mélange est alors dialysé jusqu'à ce que la résistivité finale de la solution renfermant l'urokinase soit de 22.000 microhms. On active la dialyse par agitation. La solution dialysée est clarifiée par centrifugation. L'activité de la solution obtenue est de 5.850.000 unités CTA d'urokinase. 5 - Adsorption de l'urokinase sur DEAE cellulose et séparation par élution a) On ajoute 100 g de DEAE cellulose à la solution clarifiée précédente et on amène le pH à 4,5. Apres 30 minutes d'agitation, on sépare la DEAE cellulose par filtration sur un entonnoir Buchner de 150 mm de diamètre, en cpérant sous un vide modéré pour empêcher la formation de mousse. La DEAE cellulose est lavée à deux reprises avec une solution de sulfate d'ammonium à résistivité de 15.000 microhms, à pH 4,5. Le volume utilisé pour chaque lavage est égal à celui de la DEAE cellulose et représente environ 250 ml. Pendant la filtration de la solution de lavage on maintient la fiole à vide dans un bain de glace. L'activité du filtrat est de 5.9CO.OOO unités CTA. b) Le filtrat obtenu, de pH 4,5, est additionné de 250 g de DEAE cellulose et amené à pH 6,7. La résistivité est abaissée par dilution avec de l'eau jusqu'à 9.C00 microhms. Après 30 minutes d'agitation, on sépare la DEAE cellulose par filtration sur un entonnoir Buchner de porcelaine, de 150 mm de diamètre. Au fur et à mesure de la filtration, on amène le pH des filtrats recueillis à S par addition d'acide sulfurique 5 N. Cn lave la pEAE cellulose avec une solution de sulfate d'ammonium, de résistivité 9.C00 microhms, à pH 7, jusqu'à l'obtention d'un filtrat incolore. Les filtrats et solutions de lavage sont réunis et ajustés à pH 5. L'activité en urokinase de la solution obtenue est de 6.CCC.CCC d'unités CTA. 6 - Adsorption de l'urokinase sur kaolin et séparation par élution On prépare du kaolin ccmme suit 1 kg de kaolin est lavé et mis en suspension dans 3 litres d'eau distillée. On laisse le mélange pendant 90 minutes à 12000 dans 1 'autoclave. Après avoir laissé déposer les matières en suspension, on sépare le kaolin puis on le met à sécher au four à 200"C. La solution obtenue au cours de la dernière étape titrant 6.000.000 d'unités CTA est amenée à un pH de 6,8, puis, après addition de 65 g de kaolin préparé de la manière sus-indiquée, à un pH de 6,2 . Le mélange est soumis à l'agitation durant une heure. Le kaolin est ensuite séparé par centrifugation à froid et mis en suspension dans un litre d'une solution de phosphate 0,05M tamponnée à pH 6,2. Après 30 minutes d'agitation, on sépare le kaolin par centrifugation. Les 65 g de kaolin sont mis en suspension dans 500 ml d'une solution contenant 75 g de chlorure d'ammonium par litre d'ammoniaque à 4 p. 100, et agités pendant 30 minutes. Le kaolin, séparé du surnageant par centrifugation, est soumis à la même opération d'élution deux autres fois. Les surnageants obtenus lors des centrifugations sont réunis et additionnés d'acide sulfurique 0,1 N pour obtenir un pH de 3,5. En réunissant les surnageants obtenus lors des centrifugations, on obtient 1.400 ml d'éluat. Le pH de l'éluat est amené à 3,5 par addition d'acide sulfurique 0,1 N. Cn ajoute alors 49C g de sulfate d'ammonium (350 g par litre d'éluat). On recueille le précipité formé par centrifugation à froid et on le met en suspension dans l'eau. Cn effectue alors pendant 18 heures une dialyse contre une solution de phosphate C,05 M tamponnée à pH 6,2. L'activité en urokinase de la solution obtenue est de 4.8CC.CCO unités CTA. 7 - Filtration du dialysat sur une colonne de résine La solution dialysée est filtrée sur une colonne de résine du type Amberlite IRC 50, de 4 cm de diamètre et de 60 cm de haut, équilibrée préalablement avec la solution de phosphate 0,05 M tamponnée à pH 6,2. Lorsque l'éluat s'est écoulé de la colonne, on lave la résine avec la solution tampon jusqu'à ce que l'addition d'acide trichloracétique à 5 % ne provoque plus la formation de précipité dans les fractions recueillies. Pour éluer l'urokinase, on utilise une solution tampon de phosphate 0,2 M, de pH 8,2, renfermant 75 g de chlorure d'ammo nitim par litre de solution. L'éluat est recueilli dans un coflec- teur de fractions. Les tubes contenant l'activité sont précipités par le sulfate d'ammonium à pH 3,5 pour précipiter l'urokinase présente, à raison de 350 g de sulfate d'ammonium par litre d'é iuat, soit 158 g pour les 450 ml d'éluat obtenus. Le précipité est recueilli par centrifugation puis remis en solution à pH 7, dilué suffisamment pour obtenir une résistivité de l'ordre de 20.000 microhms. L'activité en urokinase de la solution est de 4.950.000 unités CTA. 8 - Précipitation de l'urokinase avec l'héparine On ajoute dans la solution obtenue 50.000 unités d'héparine apyrogène et on amène le pH à 4,2 par addition d'acide phosphorique 0,5 N. On laisse floculer le précipité qui se forme, pendant 30 minutes, puis on le recueille par centrifugation. Le surnageant possède une activité inférieure à 25 unités CTA/ml. Le précipité est dissous dans 20 ml d'une solution de 30 g de chlorure de sodium par litre dont le pH est ajusté à 7,3. L'activité en urokinase de la solution est de 200.000 unités CTA/ml, ce qui correspond à un total de 4.000.000 unités CTA et à un rendement aux environs de 66 %, calculé par rapport à l'urokinase. Cn obtient l'héparinate d'urokinase à l'état sec en procédant à une lyophilisation de la susdite solution. L'héparinate d'urokinase donne lieu à des solutions stabilises dans les milieux de perfusion usuels, tels que les solutions de sérum glucosé à 5 %, comme il résulte des essais comparatifs dont les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous. On compare les variations en fonction du temps de l'activité, à une température de 22"C, de solutions d'héparinate d'urokinase, d'une part, et d'urokinase, d'autre part, dans le sérum glucosé à 5 X. Urokinase dans le éparinate de Iuro Temps sérum gluccsé 5%: Perte kinase dans le sérum Pert titres en unité I glucosé 5%: titres % CTA ien unité CTA Au départ 250 30C Après 2 h. 175 30 250 16,6 Après 4h30 180 30 250 16,6 Après 5h30 175 30 250 16,6 Après 24 h 150 40 250 16,6 Après 48 h 120 120 52 250 16,6 L'examen des résultats réunis dans ce tableau met en évidence que l'activité de l'héparinate d'urokinase dans une solution conforme à celles utilisées pour les perfusions intra-veineuses se stabilise rapidement alors que les solutions semblables de l'urokinase non engagée dans un complexe avec l'héparine se dégradent progressivement. L'héparinate d'urokinase présente des propriétés thérapeutiques notamment fibrinolytiques de grand intérêt, ainsi qu'il ressort des expérimentations pharmacologiques qui ont été effectuées chez l'animal d'expérience et des études cliniques réalisées chez 1 'homme. On a ainsi été amené à observer l'action de l'héparinate d'urokinase administré par perfusion sur des caillots de fibrine. I - Résultats des expérimentations pharmacoloqiques chez le chien Selon la technique décrite par E. VAIREL et R. COURBIER dans "Rôle de la paroi artérielle dans la physiologie de la fibrinolyse" in "Rôle de la paroi artérielle dans l'athérogénèse1,, Edit. CNRS, Paris 1967, part II, p. 561-569, on a provoqué une obstruction chez vingt chiens, par caillot intra-artériel. Après contrôle artériographique, on traite la moitié de ces animaux avec une solution d'héparinate d'urokinase titrant 50.000 unités CTA, en perfusion intraveineuse durant 90 minutes, les animaux non traités servant de témoins. A la fin de la perfusion, on effectue une artériographie de contrôle puis on pratique une artériotomie du segment de l'artère obstruée. On constate chez les animaux traités une lyse complète du caillot qui obstruait l'artère. Au contraire, chez les animaux témoins l'artériographie de contrôle, puis l'artériotomie, montrent la persistance de l'obstruction artérielle. II - Résultats des essais cliniques On a étudié l'action de préparations d'héparinate d'urokinase en solution dans du sérum physiologique sur des malades atteints de troubles circulatoires divers conduisant à la formation de caillots oblitérants. L'héparinate d'urokinase est administrée par perfusion intraveineuse, pendant 24 heures, à la dose de 50.000 à 100.000 unités CTA/h. Les observations et les résultats obtenus sont rapportés ciaprès : - chez un malade atteint de longue date d'artérite et dont la fourche aortique est constituée par une prothèse en dacron, ledit traitement a permis d'obtenir à deux reprises en 8 à 12 heures la lyse des caillots obstruant la prothèse - chez un malade atteint de thrombose rétinienne, traité en perfusion pendant une heure, avec une solution d'héparinate d'urokinase titrant 100.000 unités CTA, puis pendant les heures suivantes avec une solution titrant 50.000 unités CTA, on a constaté par contrôle ophtalmoscopique la lyse de la thrombose 8 h après le début du traitement - chez un malade à l'état général précaire dont l'examen phlébographique révèle une phlegmatia alba dolens grave du membre inférieur, on constate par administration de 50.000 unités CTA/h d'héparinate d'urokinase, une régression complète des phlegmatia alba dolens en 18 heures. Un examen phlébographique pratiqué au bout de 48 heures permet d'établir que le thrombus qui obstruait la veine fémorale profonde de son origine poplitée à sa terminaison iliaque a été lysé. Il ressort de l'examen de ces résultats que l'héparinate d'urokinase constitue un remarquable agent thrombolytique, conduisant dans des délais relativement courts à la libération d'un segment artériel ou veineux obstrué par des caillots. Dans tous les essais qui viennent d'être décrits, la stabilité de lthéparinate d'urokinase mis en solution, fut telle qu'il ne fut en aucun cas nicessair de régénérer le milieu perfuse en urokinase pendant toute la durée les opérations de perfusion. L'intérêt du complexe conforme à l'invention est encore accru du fait qutil est bien toléré par l'organisme, que son utilisation n'a pas de retentissement sur les facteurs de coagulation du sang circulant et qu'il ne provoque pas d'occident ou incident hémor-- ragique. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement indiqués ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Complexe d'urokinase et d'héparine. 2. Application d'un complexe d'urokinase et d'héparine en tant que médicament, notamment thrombolytique. 3. Application selon la revendication 2, caractérisée en ce que le complexe d'urokinase et d'héparine est administré à l'homme par perfusion intraveineuse. 4. Application selon la revendication 3, caractérisée en ce que le complexe d'urokinase et d'héparine est administré par perfusion à raison de 50.000 à 100.000 unités CTA/h. 5. Procédé d'obtention d'un complexe d'urokinase et d'hépatine, caractérisé en ce que l'on fait réagir une solution d'urokinase avec une solution d'héparine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la réaction est mise en oeuvre en milieu acidifié. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ce pH est de l'ordre de 4,2. 8. Solution pour perfusion, caractériséeen ce qu'elle résulte de la dissolution de l'héparinate d'urokinase dans un milieu de perfusion. 9. Solution selon la revendication 8, caractérisée en ce que le milieu de perfusion est constitué par une solution de sérum glucosé.