FR 2126081 A1 19721006 FR 7106147 A 19710223 La présente inyention concer@@ une méthode de préparation de pan@réatine ayant des activités a@ylolytiques, protéolytiquez et lipolytiques élevées, et d'élimination des bactéries nuisible@ dans cette prép@r@tion tout en maintenant lesdites activités. La portion exocrine de la glande panoréas sécrète un liquide légère@ent alcalin dans le con@uit pancréatique et fina le@ent dans le duodenu@. Ce ju@ pancréatique qui est tr@nsporté ver@ le duodenun du trypsinogène et du chymotrypsinogène qui, quand ils sont activés, provoquent l'hydrolyse des protéines en peptides ; de l'@@ylase qui tr@nsforme l'amylose en dextrines et sucres ; et de la lipase qui transforme les grai : ses en leurs molécules constitutives, glycérine et acides gras.Le trypsinogène est activé par une séc@étion du duodonum appelée entéroki n@se. L@ chymotrypsinogène, de so@ c@té, est activé par la trypsine. @es enzymes diastatiques et lipolytiques sont essentiellement autoactiv@nts quand ils sont sécr@tés dans le corps. La paneréatine con@iste essentiellement en pancréa@ séché, dégraissé. La pancréatine est une poudre amorphe, de coloration crème ayant une faible odeur car@ctéristique mais non désagr able. L@ pancréatine est préparée à partir de pan créa@ frais ou congelé, généralement d'origine porciue, bi@n que le pancréas de boeuf puisse aussi être utilisé, mais il est moins actif. Hormal@ment, les @landes pancréas sont hachées et broyées avec du duodenum de porc, qui est ajouté pour activer les en@ymes protéolytiques dans le pancréas.Alternativement, l'activité protéolytique e@t parfois établie dans la préparation de pancréatine par @ddition de trypsine active. Le mélange est maintenu à un@ tempér@ture rel@tivement basse pendant plu sieur@ jours pour permettre l'activation. @n@uite le pancréas est dégrai@sé et séché, généralement par @échage sous vide à la température ambiante. @n raison ce non influence directe sur la digestion, la pano@@@tine est utilisée dans de nombreuses parties du monde co@me adjuv@nt digestif. De plus, l@ pancréstine est utilisé@ comme agent thér@peutique pour les humains souffrant d'une déficience d'enzymes paneréatiques dans l'intestin, déficience qui peut @tre causée par une retombée chronique de pancréatite ou de mucoviscidose. Comme l'@fficacité de la pancréatine pour le trait@@ent de ceux qui souffrent de déficiences pancréstiques dépend de son activité, on a établi des standards minim@ d'activité.Le National For@@lary dispose que la pancréatine ne tr@nsforme pas moins de 25 fois son poids d'amidon de pomme de terre standard en hydrates de carbone so@@bles et pas moins de 25 fois son poids de caséine en protéoses. Voir National For@ulary, XII, page 287 et premier supplément, page 13. @ien que le National Formulary ne donne pas de standard mini@@@ pour l'activité lipolytique et que la pancréatine accessible dans le commerce contionne des quantités variables et souvent faibles de lipase active, il serait bien entendu désirable d'avoir de la paneréatine d'astivité lipolytique élevé@. L'addition d'iome calcium aux en@ymes pancréatiques pour augmenter leur activité est connue depuis de nombreuses années. Voir par exemple les 40 mes. Annales de Biochinie et Biophysique 481 - 490 (1960) en ce qui cencerne la lipase ; J.H. Northrop et coll., Crystalline emaymes 133 (2ème édition, 1948) concernant le trypsinogène @ et Pederation Proceedings, American Secioty of Biological Chemists 254 - 255 (Mars 1957) concernant l'amylase. Ce phénomène a été expliqué par quelque fonction de l'ion calciun qui, dans les essais déerits, dérivait du chlorure de calcium. Ainsi, il est si@nalé par Tauber, Chemistry and T@@hnology of ensymes, 26, (1949) que la lipase paneréatique est fortement activée par le chlorure de calcium. Le même auteur, à la page 147, décrit la conversion autocatalytique du trypsinogène en trypsine en présence d'ion calcium apporté par l'addition de chlorure de calcium. L'autocatalyse du trypsinogène en présence de CaCl2 0,02 M est encore décrite par Dixon et @ebb, Enzymes, 546 (1958). Il apparaîtrait en con@équence à l'homme de l'art que le chlorure de calcium devrait @tre efficace pour activer la paneréatine. Contrairement à cette attente, la Demanderesse a trouvé que le chlorure de calcium produit de la pancréatine qui n'a ni l'@ctivité anylolytique minimale, ni une activité lipolytique mesurable. Comme un sel soluble ne produisait pas les résultat@ désirés, on a essayé un sel de calcium fortement insoluble, l'hydroxyde de calcium.Cet hydroxyde a une solubilité de 0,185 parties dans 100 parties d'eau à 0 C contre une solubilité de 59,5 parties pour CaCl2 (hydrophilite), selon Lange, Handbook of Chemistry [dixième édition révisée (1967)]. Comme on le voit dans le Tableau 1, les activités produites par l'hydroxyde de calcium, quoique peut-@tre légèrement supérieures à celles produites par le chlorure de calcium, ne conviennent pas à des buts commerciaux. Ainsi, il apparaissait comme pou probable qu'il puisse exister n, sel do calcina capable d'augnenter l'activité de la pancr@atine et, même si un tel sel devait exister, la solubilité - contrairement à ce qu'on pouvait attendre normalement- ne constitue pas une base pour prédire quel sel ce pourrait être. T A B L @ A U I @ de sel p@r poids @el @ctivité @ctivité ctivité de Pancréas @mylolytique Protéolytique @ipolytique 3,@@@ CaCl2 néant 1:131 nésnt 2,@@@ Ca(OH)2 1:25 1:85 1180 unités/gra@@@ 4,35 Ca(CH@COO)2.H2O 1:150 1:146 3150 unités/gra@@@ 0,747 CaSO4.2H2O 1:193 1:192 3380 unités/gra@@@ 1Ce pourcentage correspo@d à l'addition le 25 cc de solution de sel 5@ ou de suspension à une livre (454 grammes) de parcréas. 2Ce pourcentage est proche de la limite de solubilité du sulfate de calciu@. Les textes auxquels on se réfère dans le Tableau I ont été effectués sur du pancréas de porc activé avec du ducdenum, dégroi@sé et séché sous vide à la temp@rature ambiante. Les proc@d@s suivis pour décerminer les activités smylolytiques et protéolytiques ét@ient les e@@@is st nd rd pour le pouvoir @i- gentif de l'amidon et de la caséine décrits dans le Mational For@@lary, ci-dessus. Tel qu'utilisée dans le présent mémoire, une unité d'activité lipase libère une quantité d'acide gres équivalant à un centirètre eube de NaOH alcoolique à 0,05 N d'un centimètre cube d'huile d'olive dans les conditions suivantes : la pancréatine à essayer est dissoute dans l'eau distillée froide et, si nécessaire, homogénéisée dans un mélangeur du type @aring pendant environ une @nute. La solution est amenée à contenir une quantité de pancréatine qu'on estime correspondre à une unité d'activité par cc. (On a trouvé que les solutions sont stables pendant au moins deux heures quand on les conserve au réfrigé rateur).Des solutions ainsi@préparées, on pipette des quantités de 0,4, 0,6 et 0,9 @@ dans des fioles de 100 cc et le volume dans chaque fiole est complété à 1 cc avec de l'eau distillée. On prépare aussi un témoin en utilisant un cc d'eau distillée. On ajoute alors à chaque fiole 5 cc de sels biliaires à 0,5% dans un tampon au phosphate à pH 7,8. Le tampon phosphate est formé en dissolvant 4,@4 g de phosphate de potassium monobasique (KH2@@4) dans une quantité d'eau suffisante pour avoir 500 ml de solution et en dissolvant 4,73 g de phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4) dans une quantité suffisante d'eau pour avoir 500 ml de solution ; des solutions résultantes on mélange 10 cc de la solution de phosphate de potassium monobasique et 90 cc de la solution de phosphate de sodium dibasique. Le pH est alors mesuré et ajusté à 7,8. La solution de sels biliaires est préparé@ en dissolvant 0,500 g d'extrait de bile de boeuf en poudre dans un volume suffi@@nt volume suffisant de tampon au phosphate pH 7,8 pour avoir 100 ml de solution. @ chaque fiole on ajoute alors 1 cc d'huile d'olive au moyen d'une seringue ce 1 cc. Le mélange est alers agité à 37 C pendant @0 minutes à environ @C vibrations par ni@@te. Après la période de digestion, on ajoute à chaque fiole 5 gouttes d'POl concentré pour arr@ter l'action enzymatique puis 20 cc de benz@ne (qualité réactif, exempt de thiophène). Les fioles sont agitées pendant une ninute puis abandonnées au repos jusqu'à sépar@tion en deux phases. Une quantité aliquote de 10 cc de la couche benzénique supérieure est pipetée dans une fiole d'@rlenmeyer de 50 ml, puis on ajoute à chaque fiole 1 cc d'alcool méthylique et 3 gouttes d'indicateur phénolphtaléine. Le contenu de chaque fiole est titré avec NaOH à 0,05 dans l'alcool méthylique. On note le volume pour chaque inconnue et pour le témoin. L'activité lipase pour chaque échantillon inconnu est c@lculée en divisant deux fois la différence entre le volume titré dans l'inconnu et le volume titré dans le témoin par le poids en grammes de l'échantillon dans chaque fiole de digestion. Les trois valeurs obtenues doivent @tre d'aocord à meise de 5% près avec la moyenne pour indiquer la linéarité de la réponse. La moyenne des trois valeurs est utilisée pour désigner la puissence et est exprimée en unités par gramme. Une autre déficience dans la technique de préparation de la pancréatine est qu'on n'a mis au point auoune méth@de pour éliminer de façon s@re les bactéries nuisibles, principalement du genre @almonella. Il est possible d'in@@tiver ces bact@ries pathogènes en chauffant la pancréatine à une température suffisamment élevée. Jusqu'à présent, toutefois, le résultat malhoureux d'une telle opération de chauffage a été une désaetivation substantielle, par exemple jusqu'à 90@ des enzymes pancréatiques. En conséquence, un objet de la présente in@ention est de fou@nir une @éthode de préparation de la pancréat@ne qui conduit à un produit ayant des activités protéolytiques, amylolytiques et lipolytiques élevées. Un autre objet est de fournir une méthode de préparation de la pancréatine qui @@t exem@te de b@ctéries nuisibles et qui a également des activités protéolytiques, amylolytiques et lipolytiques élevées. La Demanderesse a trouvé qu'on obtient d'excellents résultats dans l'activation de la pancréatine avec le sulfate de calcium qui est presque insoluble dans l'eau, et avec l'acé t@te de c@lcium qui est presque aussi soluble que le chlorure de calcium.La solubilit@ de CaSO4.@H2O est @e 0,225 parties dans 100 parties d'eau à 0 C et la solubilité de Ca(C2H3@@).H2O est de 5- parties dans 100 parties d'eau à O C, d'après @ange cité ci-des@us. @omme ou peut le voir dans le @@bleau I, dans les conditions indiqu@es, la présence de sulf@te ou d'@cétate de calci@m produit une activité amylolytique et protéolytique de six à huit fois la "force @@" (1 : @5) et fournit une activité lipolytique remarquable. Ce qui eat p@rticulière@ent surpren@nt et inattendu, c'est le fait que non seulement le sulfate ou l'acét@te de calcium augmente l'@ctivité de la p@ncréatine m@is que l@ sub@@ance contenant l'un ou l'autre sel peut être chauffée à une tompérature suffisante pour in@ctiver les bactéries pathogènes sans perte substantielle d'activité. Le Tableau Il montre les activités de trois échantillons de pancréatine de porc préparée à partir d'un seul lot de pancréas de porc, et de deux échantillous de pancr@@tine de boeuf d'un seul lot de p@@creas de boeuf qui co@tenaient du sul- f@te de calcium ou de l'acet@te de calci@m et ont éte chau@fés à @@@@ pondant @@ @eures dans une @tuve à vi@e. T A B L E A U II Type de % de sel par peids Sel Activité Activité Activité pancréas de Paneréas Amylolytique Protécolytique Lipolytique Poro 0,72 CaSO4.2H2O 1:193 1:142 2230 unités/gramme Poro 0,02 CaSO4.2H2O 1:220 1:136 1980 unités/gramme Poro 1,4 Ca(CH3OOO)2.H2O 1:175 1:159 2200 unités/gramme Beauf 0,72 CaSO4.2H2O 1:35 1:74 Beauf 0,72 Ca(CH3COO)2.H2O 1:18 1:67 Om veit enoers dans le second exemple du Tableau II que le sulfate de caleium en quantité de 0,02% on poids du pameréas donne des activités qui sent, dans l'ensemble, quel que peu inférieures à celles produites par 0,72 % de sulfate de calcium.Bien que 0,02% ne doive pas @tre considéré comme un mini@@@, en ponse que des @@@@@@trations inférieures à cette valeur @@ demneront pas les résultats désirés. Comme le compren dra l'homme de l@rt, l'activité de la paneréatine dépend, dans une grande mesure, de la qualité du produit de départ. En conséquence, il peut être pessible d'activer de façon adéquate, du paneréas de très haute qualité avec moins de 0,02% de sulfate de calcium et inversement un pancréas de mauvaise qualité peut demander des quantités nettement plus élevées de sel. Il y a lieu, on outre, de remarquer que 0,02% correspondent à 200 parties par million ou un décigramme par livre. Quand em censidère que la paneréatine est préparée par lets de plusieurs sentaines de livres, en pout renoontrer des diffieultés em essayant de sombiner uniformément des quantités inférieures à un désigranne par livre ; par conséquent, les in dieations contesues dans le présent mémoire, à savoir que la méthode comprend l'addition d'au moins environ 0,02% de sulfate ou d'a@étate de calcium par poids de panoréas, doivent être interprétées à la lumière de ce qui précède. En général, la pancréatine est préparée à partir de paneréas frais ou comgelés d'origine poreine. Les glandes pan créas sent hachées jusqu'à une taille de partioules d'enviren 3,2 mm à 6,4 mm, bien que des partioules plus grandes ou plus petites puissent être présentes. On ajoute du duedenum de pers ha@hé en quantité égale à environ 10% du poids du pancréas pour astiver les onsymes protéolytiques. Selen la présente invention, en ajoute du sulfate ou de l'acétate de calcium en quantité égale ou supérieure à environ 0,02% @n poids du pancréas. On a trouvé qu'un intervalle préféré de concentration du sulfate de ealcium est de 0,35 à 0,77% on poids du pancréas. On peut ajou ter avantageusement de l'acétate de calcium en quantité quel que peu plus élevée. Om ajoute fréquemment de l'aoétone au mélange d'acti vation pour secreftre @@ fluidité et parce que l'asétone enerse une astion bactériestatique bienfaisente pendant l'@ération. Le mélange d'activation de @ameréas, dued@@@@ et sulfate ou aeétate de calcium est maistenu à une température de O à 27 C pendant un temps peuvant aller de 6 houres à plusiours jours, @@- lom la température utilisée. Ordinairement l'astivation est offectuée à @uviron 4 C pendant 70 houres. Bien @@@@@@@, le mélange peut @tre exemimé à des intervalles réguliers pour déterminer le moment où l'activation est terminée.Quand l'astivation est complète, le pancréas est dégraissé par une méthede clasedque, par exemple par lavage avec l'a@@tone. De façon tout à fait inattendue, on a trouvé que le pameréas dégraissé contement du sulfate ou de l'acétate de ealeium peut être expesé à une température suffisamte pour inastiver les bastéries pathegènes qui y sout présentes, partioulièrement celles du genre @@l@@@@l- la, sans perte notable d'astivité. En conséquem@@, le tisau peut finalement être séché à une température suffisante pour inastiver les ba@téries pathegèmes, c'est-à-dire em général audessus de 75 C et de préférem@@ à 82 C. Alternativement, après une opération de chauffage pour tuer les bastéries nuisibles, le produit peut @tre lyephilisé. Ensuite, le produit séché est finement broyé jusqu'à une taille déterminée de partioules et empaqueté pour la vente ou bien est re@ueilli pour un traitement ultérieur, par exemple pour l'extraction de certaine enzynes. Les enrsetéristiques, prinsipes et avantages de l'invention seront mieux @ompris à la lesture des exemples qui suivent. - EXEMPLE I A 318 kg de pancréas de pore hashé, en ajoute 2 275 g (0,7@6 % on poids) de CaSO4.2H2O om suspension dans 17,5 litres d'eau dé@ionisée. Une fois que la suspension de sulfate de calcium est inti@ement mélangée avec le paneréas, en ajoute 31,@ kg de duedenum de pors haché et on mélange intime@ent. Finalement, en ajoute 66,3 litres d'acétone et on mélangs. Le mélange est conservé pendant 5 jours à une température de 4 C environ pour @@mpléter l'activation. Puis la paneréatine est dégraissée on lavant la masse avec une quantité d'@cétone suffis@nte pour déshydr@ter et dégraisser le tissu.Le tissu imprégné d'acétone est en@ite chauffé sous vide jusqu'à ce que la température de la m@sse atteigne 82 C. Le vide est alors cassé et la tempé r@ture du pro@uit est maintenue à 82 C sous pression atmosphérique pendant trois heures. Le produit est exposé à l'atmosphère pend@n@ cette opér@tion @our que l'humidité de l'air provoque la destruction des bact'ries Selmonella. Puis l'étuve à vide est refroidie à @@ C et maintenue sous vide à cette tem pér@ture pendant une heure. Le pancréas séché est alors retiré de l'étuve et soumis à une opération de broyage.Les essais standard d'activité selon ce qui est exposé plus haut montrent que le pro uit séché a une activité amylolytique de 1 : 175, une activit protéolytique de 1 : 159 et une activité lipolytique de 2210 unités/gra@@e. Les essais pour Salmonella, d'un type approuvé pour l'U@. Food and Drug Administr@tion, sont entièrement négatifs. - E@@@@@@ II - Deux quantités de 318 kg sont prises dans un même lot de pancréas de porc. A l'une de ces quantités on ajoute 2 275 g (0,716 ; en poids) de CaSO4.2H2O en suspension dans 17,5 litres d'@@u désionisée. On n'ajoute pas de sel à l'autre partie. Les deux portions sont traitées comme dans l'Exem@le I sauf que la tempér@ture est msintenue à 82 C sous pression atmosphérique pendant 6 heures. Les résultats des essais standards, présentés dans le Fableau III, montrent que la portion sans sulfate de calciu@ a environ @@@ de moins d'activité protéolytique et lipolytique et environ 5@ de moins d'activité amylolytique. @@@@@@@ III Activité Pancréatine avec sulf@te Pancréatine de calcium sans sulfate de calcium @@@@téolytique : 190 1 : 158 Lipolytique 910 920 amylolytique 1 : 208 1 : 200 On a décrit un node type de mise on pratique de l'invention avec des modifications, mais d'autres medifications peuvent être apportées par l'homme de l'art pour adapter l'invention à des nécessités individuelles et à des qunlités particulières de produits de départ sans sertir de l'esprit et du domeine de la présente invention. Revendications 1. Procédé pour préparer sous forme de poudre sèche une composition thérapeutique de pancréatine ayant une activité protéolytique, amilolytique et lipolytique qui consiste à ajouter à du pancréas de porc ou de boeuf pulvérisé une solution aqueuse contenant un sel inorganique : sulfate de calcium ou acétate de calcium, la dite solution aqueuse contenant environ 5,5 % d' au par rapport au poids de pancréas pulvérisé et du sel en quantité comprise entre 0,02 % et 1,4 %, à ajouter un activateur pour le trypsino gène et chymotrypsinogène du pancréas grâce auquel l'activité protéolytique est établie, à maintenir le mélange à une tempé rature comprise entre environ OOC et 2joC pendant une periode pouvant aller jusqu'à 7 jours, à laver ledit mélange avec de l'acétone, à chauffer le mélange lavé à une température comprise entre 480C et 83 C et ainsi déshydrater le mélange et inactiver les bactéries pathogènes. 2. Procédé pour préparer sous forme de poudre sèche une composition thérapeutique de pancréatine ayant une activité protéolytique, amilolytique et lipolytique, qui consiste à ajouter à du pancréas de porc ou de boeuf pulvérisé un milieu aqueux contenant un sel inorganique choisi parmi le sulfate de calcium et l'acétate de calcium, ladite composition aqueuse contenant de l'eau en quantité voisine de 5,5 fio par rapport au poids de pancréas pul vérisé et le sel en quantité comprise entre environ 0,02 fio et 1,4 %, à ajouter du duodénum de porc pulvérisé au mélange de pancréas en quantité voisine de 10 r par rapport au poids de pancréas pulvérisé, à maintenir ledit mélange à une température comprise entre OOC et 270C pendant une période pouvant aller jusqu'à 7 jours, à laver ledit mélange avec l'acétone, à sécher ledit mélange lavé à une température comprise entre 480G et 83 C, ce qui déshydrate le mélange et inactive les bactéries pathogènes. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'activa teur est la trypsine active. 4. Une composition thérapeutique sous forme de poudre sèche ne contenant pas de bactéries pathogènes et ayant une activité protéolytique, amilolytique et lipolytique préparée par le procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement en un mélange de pancréas de porc ou de boeuf pulvérisé avec un activateur pour le trypsinogène et le chymotrypsinogène du pancréas grâce auquel l'activité protéolytique est établie, et entre environ 0,02 et 1,4 % par rapport au poids de pancréas d'un sel choisi parmi le sulfate de calcium et l'acétate de calcium, afin de former un mélange d'activation, ladite addition de sel étant faite sous forme d'une solution aqueuse pour fournir un milieu aqueux audit mélange d'activation pendant la période de maintien de l'activation. 5. Une composition thérapeutique sous forme de poudre sèche exempte de bactéries pathogènes et ayant une activité protéolytique, amilolytique et lipolytique préparée selon le procédé de la re vendication 1, caractérisée en ce qu'elle consiste essentielle ment en un mélange de pancréas de porc ou de boeuf pulvérisé et de duodénum de porc pulvérisé dans un rapport d'environ 10:1 et d'un sel choisi parmi le sulfate de calcium et 17acétate de calcium en quantité comprise entre environ 0,02 % et 1,4 % par rapport au poids de pancréas, et qui est le résultat du mélange des solides pulvérisés avec une solution de sel aqueuse contenant environ 5,5 % d'eau, suivi de la déshydratation du mélange à une température comprise entre 490G et 82 OC. 6. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'activateur pour le trypsinogène et le chymotryspsinogène du pancréas est la trypsine active.