FR 2160250 A1 19730629 FR 7140810 A 19711115 Le principe de l'action thérapeutique repose sur les données immunologiques récentes concernant le r81e de cellules immunocompétentes de la paroi intestinale. En effet, il a été démontré que le contact de la muqueuse avec l'antigène provoque un certain nombre de réactions spécifiques et non spécifiques. Il y a forte réaction cellulaire avec formation d'anticorps appartenant aux immunoglobulines h, du type sécrétoire, assurant l'immunité locale. Par ailleurs, le passage dans le système lymphatique de l'antigène conduirait à une réponse classique du type IgM-IgG. Les diverses colopathies d'origine microbienne s'accompagnant de diarrhées pourraient bénéficier de ce concept thérapeutique. La présente invention consiste dans l'introduction en thérapeutique humaine, sous les formes pharmaceutiques convenables, de substances à action immunisante obtenues à l'état soluble à partir de plusieurs germes pathogènes rencontrés dans la pathologie gastro-intestinale. afin de préserver l'équilibre avec la flore microbienne, les substances immunisantes ont été associées avec une quantité nécessaire de poudre lyophilisée de lait fermenté par un microorganisme saprophyte de l'organisme. Conformément à l'invention, le nouveau médicament réunit à la fois les antigènes bactériens et les éléments nécessaires la reconstitution de la flore intestinale. Les substances immunisantes sont obtenues après action lytique d'un acide aminé tel que le glycocolle sur des suspensions bactériennes obtenues selon les règles usuelles en bactériologie, représentées par Escherichia Coli (111 : B4) s 5 scherichia Coli (55 : B5) S 6 Escherichia Coli (26 :B6) s 7 Escherichia Coli (127 : B8) S 12 Escherichia Coli (86 : B7) S 243 Streptococcus Groupe 3 S 9 Staphylococcus Aureus S 108 Pseudomonas Pyocyanea S 76 Proteus Vulgaris ss 28 Entérobacter kérogènes S 118 Les différents aminolysats sont soumis à une filtration bactériologique, à l'adjonction d'un conservateur, d'un stabilisant, et mélangés entre eux dans des proportions déterminées avant d'être lyophilisés. Les substances destinées à la reconstitution de la flore intestinale sont également soumises à la lyophilisation et sont représentées par le lait écrémé fermenté par un microorganisme tel que Lactobacillus heidophilus, d'origine humaine, antibiorésistant. Le mélange de deux poudres se fait à l'abri de l'humidité, à parties égales, avant d'incorporer les excipients nécessaires à la forme pharmaceutique. Les conservateurs utilisés sont le merthiolate, les p. hydroxybenzoate de méthyle ou de propyle. Comme stabilisants, on utilise généralement le tétracémate disodique, l'acide ascorbique. PROCEDE DE FLBRICATION 1 - CHOIX ET CU1UURE DU OU DES GERMES MICROBIENS Ce choix a été dicté par le souci de se rapprocher des conditions pathologiques humaines. Nous avons retenu la famille d'Escherichia Coli, appartenant au groupe de gastro-entérites infantiles, pour l'intérêt que présente une immunothérapie préventive et curative en médecine humaine et en particulier en pédiatrie. Le rôle pathogène du Staphylococcus doré par son entérotoxine est bien connu, comme par ailleurs celui des autres groupes retenus (Streptococcus Groupe D, Pyocyanique, Entérobacter Aérogènes). Ces microorganismes sont responsables de manifectations pathologiques du tractus digestif, soit par une action toxique propre, soit au cours de perturbations de la flore intestinale normale. Les germes sont cultivés selon les méthodes usuelles en bactériologie dans des conditions de culture convenant le mieux à leur développement. Le ou les germes sont recueillis en phase active de croissance, selon les méthodes connues, de façon à réaliser une ou, selon les espèces, microbiennes, des suspensions aqueuses contenant les germes vivants considérés. 2 - PRODUOTION DES SUBSTANCES TNUMNISANTES SOUS FORME D'UX LYSAT MICROBIEN. Après centrifugation des cultures bactériennes, les culots sont lavés deux fois avec de l'eau distillée stérile. Ils sont ensuite remis en suspension dans une solution aqueuse de glycocolle à 10 %. La dilution finale doit mesurer au photomètre une densité optique égale à 1,1. Les suspensions ainsi préparées sont portées à l'étuve à 370C pendant six à dix jours, selon le germe considéré. a) Groupe d'Escherichia Coli Durée de séjour à 370C - 6 jours DENSITES OPTIQUES Jours S 5 S 6 S 7 S 12 S 243 111 : B4 55 : B5 26 : B6 127 : B8 86 : B7 0 1,10 1,10 1,10 1,10 1,10 1 0,77 0,63 0,77 0,75 0,70 2 0,48 0,64 0,60 0,58 0,60 3 0,32 0,31 0,30 0,30 0,30 4 0,31 0,32 0,27 0,28 0,27 5 0,27 0,24 0,24 0,22 0,24 6 0,20 0,22 0,22 0,20 0,22 b) Groupe de Streptococcus Groupe D Staphylococcus Aureus Proteus Vulgaris Entérobacter #erogènes Pseudomonas Pyocyanea Durée de séjour à 370C - 10 jours DENSITES CPTIQUES Strepto- Staphylo Proteus Entero- Pseudo- ottepto- Stapnyil- Proteus Entero- Pseude Jour coccus coccus Vulgaris bsoter monas Groupe D Aureus Aerogenes Pyocyanes S 19 S 108 S 28 S 118 S 76 O 1,10 1,10 1,10 1,10 1,10 1 0,80 0,88 0,71 0,90 0,96 2 0,78 0,90 0,54 0,78 0,92 3 0,74 0,52 0,37 0,72 0,86 4 0,56 0,40 0,36 0,55 0,66 5 0,20 0,32 0,36 0,50 0,58 6 0,12 0,30 0,35 0,50 0,50 7 0,10 0,26 0,33 0,47 0,45 8 0,10 0,24 0,33 0,39 0,40 9 0,06 0,24 0,33 0,34 0,40 10 0,06 0,24 0,30 0,34 0,40 Les numérations effectuées sur des suspensions aqueuses mesurant une D.O. . 1,1 ont donné pour - Escherichia Coli (S 5 - S 6 - S 7 - S 12 - S 243) = 100 milliards de germes par ml - Streptococcus Groupe D S 19 ........ = 1 million de germes par ml - Staphylococcus Aureus S 108 .............= 10 millions de germes par ml - Proteus Vulgaris S 28 ........... . = 1 million de germes par ml - Entérobacter Aérogènes S 118 ............ 2 10 millions de germes par ml - Pseudomonas Pyocyanéa S 76 ....... 2 10 millions de germes par ml 3 - PRODUCTIOR DES SUBSTANCES D'EQUILIBRE ET DE REMPIA CEMENT DE LE FLORE INTESTINALE SOUS PORMR DE LAIT FERMENTE Le lait frais écrémé ou reconstitué à partir du lait en poudre convient à cet usage. La fermentation s'effectue de la manière suivante 1) Préculture Le microorganisme est conservé par le procédé lyophile dans une ampoule de 1 ml scellée sous vide. Le contenu d'une ampoule est repris par 0,5 ml du milieu liquide bacto-microinoculum broth et sert à ensemencer un ballon contenant 150 ml du milieu liquide bacto-microinoculum broth. Après séjour de vingt heures à 370C, la densité optique est égale à 0,88, correspondant à 108 germes par millilitre. 2) Culture Le lait utilisé pour la fermentation est enrichi d'extrait de levure à raison de 10 pour 1000. La stérilité est assurée par un autoclavage à 1150C pendant trente minutes. Le lait ainsi préparé est ensemencé avec la préculture à raison de 5 ml pour 100 ml de lait. la fermentation lactique s'effectue à 370C pendant vingt heures. Le lait coagulé peut être directement congelé ou lyophilisé. L'acidité peut être neutralisée par l'hydroxyde de magnésium ou de phosphate trisodique jusqu'à un pH voisin de 6,5. 3) Le microorganisme choisi est un Lactobacillus Licidophilus, d'origine humaine. Il présente les caractères culturaux et biochimiques décrits dans le BERGEY'S manual of determinative bactériology. Il a été rendu résistant à plusieurs antibiotiques par passages en milieu liquide.L'antibiogramme effectué sur milieu solide, à l'aide de disques de papier de l'Institut Pasteur, donne les résultats suivants (Tablem I) TABLEAU I ANTIBIOGRAMME DE LA SOUCHE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ANTIBIOTIQUE DIAMETRE DE LA ZONE D'INHIBITION (mm) Penicilline O Oxacilline O Cephalotine O Cephaloridine O Streptomycine O Neomycine O Kanamycine 17 Gentamycine 29 Chloramphenicol O Thiophenicol O Fucidine O Aureomycine O Tetracycline 0 DHCTétracycline 0 Pristinamycine 28 Staphylomycine 27 Erythromycine 0 Oleandomycine O Eitasamycine O Lincomycine O Polymyxine O Colimycine O Rifamycine 18 4 - FABRICATION lu MEDICAMENT Le médicament est composé d'un mélange de poudres, à parties égales, provenant de la lyophilisation du lait fermenté et des lysats glycocolliques. a) Préparation et lsophilisation des lysats glycocolliques La formule est la suivante lysat glycocollique d'êscherichia Coll S 5 ...... 15 ml Lysat glycocollique d'Escherichia Coli S 6 .......... 15 ml Lysat glycocollique d'Escherichia Coli S 7 ..... 15 ml Lysat glycocollique d'Escherichia Coli S 12 ..... 15ml Lysat glycocollique d'Escherichia Coli 3 243 ... 15ml Streptococcus groupe D S 19 .................. 15 ml Staphylococcus Aureus S 108 .................... 15 ml Pseudomonas Pyocyanea S 76 .................... 3 ml Proteus Vulgaris S 28 ............................. 3 ml Entérobacter kérogènes S 118 ...................... 3 ml Merthioste .................................... 2,85 mg le mélange ainsi obtenu est filtré sur filtre Seitz (filtre W 7) et sur membranes Millipore successivement à 0,8 - 0,45 - 0,22 . Ce liquide contenant les substances immuni- santes est soumis à la lyophilisation. La poudre obtenue est conservée à l'abri de l'humidité et de la chaleur. b) Lyophilisation du lait fermenté La lyophilisation s'effectue aisément, après la coagulation du lait par le Lactobacillus Acidophilus. La poudre obtenue est également conservée à l'abri de l'humidité et de la chaleur. c) Le mélange à parties égales et l'adjonction des excipients nécessaires se font à l'abri de l'humidité, selon la formule préférentielle - lysat glycocollique lyophilisé * 0,250 g - lait fermenté lyophilisé .................. 0,250 g - conservateur ................................ 0,0625 mg - axcipient sromntisé q-s.p....................... 1,30 g Les formes pharmaceutiques choisies peuvent être réalisées soit en sachets, gélules, comprimés, granulés, soit en soluté buvable. IDENTIFICATION ET CONTROLE L'identification des antigènes bactériens dans le médicament terminé comme dans la poudre contenant les substances immunisantes s'effectue selon la technique de déviation du complément de Kolmer à l'aide des sérums spécifiques. Lactobacillus Acidophilus, le microorganisme vivant contenu dans le médicament terminé, comme dans la poudre lyophilisée de lait fermenté, est identifié microscopiquement après coloration de gram, et après isolement sur un milieu de culture favorable à son développement. Les contrôles supplémentaires effectués tant sur le produit.fini que sur les matières premières ont pour but de démontrer l'innocuité, l'absence de germes vivants autres que le Lactobacillus scidophilus et le nombre de germes vivants. Celuici est de l'ordre de 4 milliards de germes vivants au gramme. PROPRIETES PHARMKCOLOGIQUES 10- IMUNISATION DE IL SOURIS, PAR VOIE ORALE On administre, par voie orale, à des souris mâles de 18, 20 g, de race Swiss, sous un volume de 0,5 ml, une quantité de la poudre contenant les substances immunisantes, pendant quinze 3 ours. Le vingtième jour de l'essai, un prélèvement sanguin a été effectué afin de rechercher les anticorps anti-Escherichia Coli (026 B6) S 7, germe virulent pour la souris, provoquant la mort de l'animal dans les quarante huit heures après une injection sous-cutanée de 109 germes environ. Cette recherche nous a semblé intéressante car nous avons procédé par la suite à l'inoculation expérimentale. La recherche des anticorps a été effectuée par a) la réaction d'agglutination sur lame, b) la réaction de déviation du complément (technique de Kolmer), c) le test au latex, d) l'hémagglutination directe. Le TABLEAU II résume les résultats obtenus. T A B L E A U II IMMUNISATION LE 20ème JOUR ANIMAUX ANIMAUX NON IMMUNISES INMNISES Agglutination positive positive sur lame (sérum non dilué) (sérum dilué su 1/4 Réaction de + @ + + + Komer Test au latex. négative positive sérum dilué au 1/2) Hémagglutination négative positive directo (sérum dilué au 1/20 2 - PROTRCTION DE DE SOURIS IMLUNISEE FAR VOIS CRRLE CONTRE UNE INFECTION EXPERIMENTALE après une immunisation pendant quinze jours, par voie orale, des souris albinos, les différents lots sont infectés par voie sous-cutanée, avec une souche virulente d'Escherichia Coli 0 26 B6 correspondant à 109 germes par animal. Cette étude a dté faite comparativement à deux lots témoins, l'un non immunisé, l'autre recevant par voie orale sous un volume de 0,5 ml, une solution aqueuse de glycocolle à 10 % pendent quinze jours. La mortalité des animaux a été observée pendant six jours. Les résultats figurent dans le TABLEAU III. T A B L E A U III POURCENTAGE DE LS MORTALITE Animaux non immunisés 1 2 3 4 5 6 Animaux recevant la solution glycocollique 0 80 80 80 80 80 Animaux immunisés 0 10 20 20 20 20 Deux lots de souris ont été utilisés pour cet essai, l'un servant de témoin, l'autre d'essai, ayant reçu au préalable, la veille de l'essai, 0,100 g/kg du médicament. 3 - EFPFET SUR L'IMMUNITE NON SPECIFIQUE Le test choisi est celui préconisé par Halpern et Coîl, basé sur le pouvoir phagocytaire des cellules du système réticulo-histocytaire. après injection de particules de carbone sous forme d'encre dite de Chine (marque Pélikan), le pouvoir est mesuré quantitativement et exprimé en valeur (K) Selon la formule log T - log Ti T 1- T2 VALEUR DU (K) INDEX PEAGOCYTAIRE HEURES 24 48 72 Lot témoin 0,0122 0,0150 0,0150 Lot traité 0,0314 0,0230 0,0230 Cet essai montre une stimulation intense après vingt quatre heures, tendant A régresser à partir de la 48ème heure. PROPRIETES THERAPEUTIQUES Le médicament a été utilisé sous forme de sachets dont la composition est la suivante - lysats glycocolliques lyophilisés* de Escherichia Coli ) Streptococcus Groupe D ) Staphylococcus Aureus ( ....... 0,250 g Pseudomonas Pyocyanéa ( Proteus Valgaris Entérobacter Aérogènes ) - lait fermenté Lactobacillus Acidophius lyophilisé.................................. 0,250 g - éthylmercurithiosalicylate de sodium ................. 0,0625 mg - excipient aromatisé q,s.p ............................. 1,30 g Détail de l'excipient Sucre blanc officinal Lactose Extrait de vanille Arôme poudre framboise Arôme poudre fraise * Les lysats sont obtenus par action de glycocolle à 10 96 sur des suspensions microbiennes, de titre variable suivant le germe, puis mélangés dans les proportions suivantes avant d'être lyophilisés Titre de la suspension 100 milliards/ml - lysat d'Escherichia Coli S 5 13,16 mi n - lysat d'Escherichia Coli S 6 13,16 ml n - lysat d'Escherichia Coli S 7 13,16 ml n - lysat d'Escherichia Coli S 12 13,16 ml " - lysat d'Escherichia Coli S 243 13,16 mi 7 million/ml - lysat de Streptococcus Groupe DS19 13,16 ml 10 millions/ml - lysat de Staphylococcus Aureus S 108 12,16 ml 10 millions/ml - lysat de Pseudomonas Pyocyanéa S 76 2,63 ml 1 million/ml - lysat de Proteus Vulgaris S 28 2,63 ml 10 millions/ml - lysat d'Entérobacter Aérogènes S 118 2,63 ml 100 ml de mélange de lysats correspondent à 10 g de lyophilisat. 50 malades atteints de diarrhée ont été traités à raison de 2 ou 3 sachets par jour pendant une durée de cinq à quinze jours. L'analyse des cas traités montre une action bénéfique (disparition des manifestations cliniques) notamment dans les ; - diarrhées toxiques ou infectieuses - colites - diarrhées après antibiotique - diarrhées post-opératoires. Dans tous les cas, le médicament a été très bien toléré. Exemples d'observations cliniques Observ. No 1 Nicole P. 37 ans - Selles liquides impérieuses le matin surtout après ingestion de plats en sauces, de vin ou de crudités. Digestion lente Ballonnements post-prandial. - 3 sachets par jour pendant 15 jours. - arrêt rapide de la diarrhée qui ne se reproduit pas malgré un écart volontaire de régime. - bonne tolérance. Observ. No. 2 Bernard P. 32 ans. - Ulcère duodénal ayant saigné en mars 70. Depuis quelques mois nausées le matin avec selles irréguliè- res à tendance diarrhéique malgré régime strict. - 3 sachets par jour pendant 12 jours. - arrtt rapide de la diarrhée - selle régulière quotidienne. - tolérance parfaite. Observ. No. 3 Jean L. 45 ans. - colites vraies avec selles diarrhéiques (3 à 4 par jour). - 3 sachets par jour pendant 8 jours. - excellent résultat. - tolérance parfaite. Observ. No. 4 Juliette L. 53 ans. - a ingéré à plusieurs reprises de la Rovamycine à la suite d'accidents dentaires. Chaque fois diarrhées rebelles de plus en plus difficiles à arrêter. - 3 sachets par jour pendant 10 jours. - résultats excellents, diarrhée stoppée en 48 h. - tolérance parfaite. REVENDICATIONS i - Médicament constitué de substances à action immunisante provenant de germes pathogènes rencontrés dans la pathologie gastro-intestinale, associées à des éléments nécessaires à la reconstitution de la flore intestinale, caractérisé en ce que les substances immunisantes sont obtenues après action lytique d'un acide aminé sur des suspensions bactériennes gastro-intestinales, les différents aminolysats résultants étant soumis à une filtration bactériologique, à l'adjonction d'un conservateur, d'un stabilisant, d'un adjuvant éventuel nécessaire puis mélangés entre eux dans des proportions déterminées avant d'être lyophilisés, tandis que les éléments destinés à la reconstitution de la flore intestinale sont également soumis à une lyophilisation, le mélange en parties égales des aminolysats et des éléments destinés à la reconstitution de la flore intestinale, tous deux sous la forme de poudres, se faisant à l'abri de l'humidité avant d'incorporer les excipients nécessaires à la forme pharmaceutique. 2 - Médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide aminé utilisé est le glycocolle. 3 - Médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les suspensions bactériennes obtenues selon les règles usuelles en bactériologie qui sont des lysats glycocolliques sont repré sentées par - Escherichia Coli (111 : B4)................ S 5 - Escherichia Coli ( 55 : B5) S 6 - Escherichia Coli ( 26 : B6) ....................... O S 7 - Escherichia Coli (127 : B8) .................. S 12 - Escherichia Coli ( 86 : 37) ................ S 243 - Streptococcus Groupe D 19 - Staphylococcus liures .................................. S 108 - Pseudomonas Pyocyanéa ...................S 76 - Proteus Vulgaris .......................... 28 - Enterobacter Aerogènes ........................ S 118 4 - Médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les élé ment s destinés à la reconstitution de la flore intestinale sont représentés par le lait écrémé fermenté par un microorganisme d'origine humaine antibiorésistant. 5 - médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le microorganisme d'origine humaine antibiorésistant fermentant le lait est Lactobacillus Acidophilus. 6 - médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les conservateurs utilisés sont soit le merthiolate, soit les p. hydroxybenzoate de méthyle ou de propyle. .7 7 - Médicament constitué de substances à action immuni- sante suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les stabilisants sont soit le tétracémate disodique, soit l'acide ascorbique. 8 - médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, présenté sous les formes pharmaceutiques telles que sachets, gélules, comprimés, granulés, solutés buvables, caractérisé en ce que sa composition est la suivante - lysats glycocolliques lyophilisés de Escherichia Coli ( Streptococcus Groupe D ( Staphylococcus Aureus ( Pseudomonas Fyocyanéa ) 0,250 g Proteus Vulgaris Enterobacter kérogènes - lait fermenté par Lactobacillus Acidophilus lyophilisé ............... 0,250 g - éthylmercurithioselicylate de sodium .... 0,0625 mg - excipient aromatisé, q.s.p 1, 30 g 9 - Médicament constitué de substances à action immunisante suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il montre une action bénéfique (disparition des manifestations cliniques), notamment dans les - diarrhées toxiques ou infectieuses - colites - diarrhées après antibiotique - diarrhées post-opératoires.