FR 2168159 A1 19730831 FR 7201658 A 19720119 La présente invention a pour objet un produit enzymatique qui présente une activité d'endopeptidase analogue à celle de la thrombine et qui peut être utilisé en médecine tant humaine que vétérinaire, à des doses faibles, comme agent hémostatique et, à des doses plus élevées, comme agent anticoagulant. Ce produit enzymatique est également utilisable comme réactif pour exécuter des examens sanguins in vitro sur des échantillons de sang humain ou de sang d'autres mammifères. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du produit enzymatique. L'invention se rapporte aussi à des préparations pharmaceutiques et à un réactif contenant le produit enzymatique en tant que principe actif. Conformément au brevet britannique NO 1.094.301, on obtient à partir du venin d'Ancistrodon rhodostoma une enzyme qui présente une activité anticoagulante analogue à celle de la thrombine et qui possède les propriétés suivantes : à l'état pur elle consiste en une protéine pratiquement incolore; elle est adsorbée par un échangeur d'anions faiblement basique, par exemple la di- ou triéthyl-aminoéthylcellulose; elle est soluble dans une solution physiologique de chlorure de sodium; elle présente une mobilité électrophorétique de 3,9 x 10 volt/ml/sec dans un tam- pon phosphatique 0,1-molaire à pH 7; elle possède, à l'état monomère, un poids moléculaire de 40000 au minimum (déterminé par ultracentrifugation); elle présente un coefficient de sédimentation de S20W = 3,4 svedberg à une concentration de 4,86 mg/ml; elle possède un volume spécifique partiel d'environ 0,7 à une concentration de 4,86 mg/ml; elle exerce in vivo une activité biologique anticoagulante analogue à celle de la thrombine; et elle n'est pas sensiblement inhibée dans l'espace de 5 minutes par du diisopropylfluorophosphate de molarité 1 x On a trouvé qu'il était possible d'obtenir, à partir du venin de Bothrops atrox ou de tout autre genre de serpent dont le venin est susceptible de donner une réaction croisée immunologique avec le venin de Bothrops atrox, un produit enzymatique qui, d'une part, à des doses faibles adéquates, exerce une activité hémostatique et, d'autre part, à des doses plus élevées, exerce une activité inhibitrice sur la coagulation du sang humain et du sang d'autres mammifères, in vivo, en éliminant le fibrinogène de la circulation sanguine sans affecter sensiblement l'hémostase. Ce produit enzymatique est utilisable comme anticoagulant sanguin. Par rapport à l'enzyme décrite dans le brevet britannique N0 1.094.301, le produit enzymatique conforme à la présente invention présente plusieurs avantages qui seront mentionnés ci-après. Le produit enzymatique conforme à l'invention est caractérisé par les propriétés suivantes (a) il exerce une activité d'endopeptidase analogue à celle de la thrombine, (b) il comprend un constituant peptidique et un constituant hydrate de carbone, le constituant peptidique comprenant un ou plusieurs polypeptides de poids moléculaire compris entre environ 18000 et 55000 (déterminé par la méthode d'ultracentrifugation équilibrée), (c) il présente une teneur en hydrate de carbone (sucre neutre) d'environ 2 à 10 % en poids, calculée par rapport à la teneur en protéine, (d) il est pratiquement insoluble dans l'eau distillée mais facilement soluble dans de la solution physiologique de chlorure de sodium, (e) il réagit avec le phénol et ses dérivés pour former des complexes difficilement solubles ou insolubles dans l'eau, (f) il provoque la coagulation du fibrinogène par l'élimination sélective des fibrinopeptides A du fibrinogène sans détachement des fibrinopeptides B, (g) il présente une activité thrombinique correspondant à environ 30 à 450 unités de thrombine NIH par mg de sa teneur en protéine, (h) il dégrade l'ester méthylique de tosyl-arginine et la gélatine, mais non pas l'ester méthylique de lysine, l'ester éthylique de phénylalanine, la N-acétyl-méthionine, la N-acétyltyrosine, la leucylglycine et la caséine, (i) il n'est pas inhibé par l'héparine, les héparinoides, l'hirudine, les antithrombines et l'inhibiteur de peptidase polyvalent selon KuNITZ (voir J. Gen. Physiol. 19, 991-1007, 1936), (k) il est inhibé à une concentration d'environ 5 mg par ml, dans la mesure d'environ 95 ide son activité de coagulation et d'estérase, par le fluorophosphate diisopropylique de molarité 2,5 x 10-3 à pH8 dans l'espace de 2 heures, (1) il est compétitivement inhibé par l'ester méthylique de tosylarginine et complètement inhibé par l'anticorps présent dans le sérum antibothrops, (m) il ne se lie pas à la fibrine et, par conséquent, n'est pas inactivé par celle-ci, (n) il possède une demi-vie biologique sensibleent plus longue que celle de l'héparine, (o) il provoque la formation d'un dérivé fibrinique qui réagit avec le fibrinogène en excès pour former un complexe fibrine-fibrinogène non polymérisable, (p) il agit sur le fibrinogène de manière à provoquer la formation d'une fibrine dont les propriétés physico-chimiques sont différentes de celles de la fibrine produite par l'action de la thrombine, en ce qu'elle est rapidement hydrolysée par des enzymes fibrinolytiques, par exemple la plasmine, même en présence du facteur XIII activé et d'ionicalcium et qu'elle est soluble dans de l'urée aqueuse 5E, et (q) il provoque in vivo une défibrinogénation et une fibrinolyse secondaire sans donner lieu à des effets secondaires hémorragiques et thrombo-emboliques. Conformément à l'invention, le produit enzymatique défini ci-dessus est obtenu par un procédé qui consiste à faire agir sur une solution aqueuse du venin de Bothrops atrox ou de tout autre genre de serpent dont le venin est susceptible de donner une réaction croisée immunologique avec le venin de Bothrops atrox le phénol ou un dérivé de celui-ci pour former un complexe difficilement soluble ou insoluble dans l'eau et à décomposer le complexe obtenu pour libérer le produit enzymatique. Un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention consiste (1) à préparer une solution aqueuse isotonique du venin à un PH compris entre environ 4,5 et 7, (2) soit (a) à soumettre la solution isotonique à une précipitation saline fractionnée pour d'abord éliminer des substances inactives et ensuite précipiter une fraction contenant le produit enzymatique, à disperser cette fraction dans de l'eau distillée, à ajuster le PH de la solution à environ 3-4, à chauffer la solution pendant un temps variant entre quelques minutes et environ 2 heures à des températures d'environ 30 à 50 C, à éliminer les protéines précipitées et à ajuster le PH de la solution résiduelle à environ 4 à 6, ou (b) à ajuster le PH de la solution isotonique à environ 3 à 4 et à chauffer la solution pendant un temps variant entre quelques minutes et environ 2 heures à des températures comprises entre environ 30 et 500C, à éliminer les protéines précip-tées, à ajuster le p11 de la solution résiduelle à environ 4,5 à 7, et à soumettre la solution à une précipitation saline fractionnée pour d'abord éliminer des substances inactives et ensuite précipiter une fraction contenant le produit enzymatique actif, à disperser cette fraction dans de l'eau distillée et à ajuster le p11 de la solution à environ 4 à 6, et (3) à ajouter du phénol ou un dérivé de celui-ci à la solution obtenue selon (a) ou (b) pour précipiter un complexe insoluble contenant le produit enzymatique, et soit (c) à décomposer le complexe par traitement avec de l'acide acétique dilué dans un solvant organique polaire et à isoler le produit enzymatique libéré, insoluble, ou (d) à traiter le complexe en milieu aqueux avec une base à p11 7,5 à 8,5 environ et à isoler le produit enzymatique par ultrafiltration, dialyse ou filtration sur gels, et à soumettre le produit enzymatique obtenu à une purification plus poussée. Le venin utilisé comme matière de départ pour la préparation du produit enzymatique selon l'invention est de préférence celui de Bothrops atrox. Dans la littérature, on trouve d'autres dénominations pour cette espèce de serpent : par exemple Coluber atrox LINNÀEUS (Sys. Nat. Ed. 10, 1:222, 1758), Bothrops atrox LINNAEUS (Duméril, Bibron et Duméril, Erpét. gén. 7:1507, 1854), Lachesis Lanceolatus BOUIENGER (Cat. Snak. Brit. Mus., 3:535, 1896), Lachesis atrox LINNÀEUS (Boulenger, Cat. Snak. Brit. Mus., 3:537, 1896), Bothrops atrox atrox LINNAEUS (J.A. Jeters, Bull. Mus. comp. Zool., Cambridge, Mass., 122:509, 1960), et Bothrops moojeni EOGE (A.R. Hoge, Mem. Inst. Butantan, 32:126, 1965). On peut également utiliser le venin d'autres espèces de serpents du genre Bothrops, par exemple le venin de Bothrops jararaca.De ma nière générale, on peut utiliser le venin de tout genre de serpent susceptible de donner une réaction croisée immunologique avec le venin de Bothrops atrox0 Une définition et une explication du terme "réaction croisée immunologique" se trouve par exemple dans "Einfuhrung in die Immunchemie und Immunologie" par E.Â. SABAE, Springer Verlag 1971, pages 1 et ss, Ci-après, on décrite de façon plus détaillée comment on peut mettre en oeuvre le procédé conforme à l'invention. On dissout du venin de serpent lyophilisé, par eXemple de Bothrops atrox, dans de la solution physiologique de chlorure de sodium à un PH d'environ 4,5 à 7. On débarrasse la solution des matières non dissoutes par centrifugation ou filtration. On ajuste le PH de la solution de venin de façon à ce qu'elle soit faiblement acide, par exemple à environ 3 à 4, en y ajoutant un acide minéral, par exemple de l'acide chlorhydrique ou sulfurique, ou un acide organique, par exemple l'acide acétique. On chauffe la solution acidifiée, tout en l'agitant, afin de précipiter des protéines non actives sans qu'il y ait perte de substance active0 La quantité du précipité formé est fonction du temps de chauffage et de la température ainsi que du p11 de la solution.A PH 3 un temps de chauffage de quelques minutes, par exemple de 10 minutes à 300C, est suffisant. À p11 3,5 il convient de prolonger le temps de chauffage à 1 heure, à 300C, ou à 30 minutes, à 4000. A p11 4 on peut prolonger le temps de chauffage jusqu'à environ 2 heures et élever la température jusqu'à environ 5000. les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation. On ajuste le filtrat à un p11 d'environ 4,5 à 7, de préférence à environ 6,5, et on le soumet à une précipitation saline fractionnée pour éliminer d'abord une fraction de substances inactives et ensuite précipiter la fraction comprenant le principe actif. Cette précipitation fractionnée peut être effectuée à 1'aide de sels alcalins ou alcalino-terreux ou d'ammonium d'acides minéraux, par exemple de chlorure ou de sulfate de sodium, de chlorure ou de sulfate de magnésium ou de chlorure ou de sulfate d'ammonium.Lorsqu'on utilise du sulfate d'ammonium à PH 6,5, à une température d'environ 200C, la fraction inactive précipite à environ 40 % de saturation et la fraction active précipite à environ 55 % de saturation. lorsqu'on utilise d'autres sels, valeurs de PH et températures de précipitation, les pourcentages de saturation varieront également. La fraction active est éliminée de la liqueur-mère par centrifugation et ensuite dissoute dans de l'eau distillée. Le PH de la solution est ajusté à environ 4 à 6, de préférence/environ 5,0. Le principe actif est précipité sous forme d'un complexe par addition à la solution d'environ 7 % en poids de phénol ou d'une quantité correspondante d'un dérivé phénolique.A titre de dérivés phénoliques, on peut utiliser des acides phénolcarboxyliques, par exemple l'acide salicylique, des alcoylphénols, par exemple l'o-, m- ou p-crésol, des phénols halogénés, par exemple l'o-, mou p-chlorophénol, des acides phénolcarboxyliques alcoylés ou halogénés, par exemple des acides crésolcarboxyliques et des acides chlorophénylcarboxyliques, ou des sels d'acides phénolcarboxyliques et de leurs dérivés, par exemple le salicylate de sodium et les sels sodiques des acides crésolcarboxyliques. On peut aussi utiliser des résines phénol-formaldéhyde contenant des groupes phénoliques libres, par exemple l"'Àmberlite" XE 97.La quantité de composé phénolique requise pour précipiter le complexe correspond, en règle générale, à la limite de solubilité du composé phénolique ou, dans le cas d'acides, à la limite de solubilité de l'acide libre. Le complexe insoluble du principe actif ainsi formé est isolé par centrifugation et peut ensuite être décomposé de l'une des deux manières (c) et (d) décrites ci-après :: (c) On lave le complexe plusieurs fois avec une solution à 0,1-0,5 % d'acide acétique dans un solvant polaire. le complexe est ainsi décomposé et le composé phénolique se dissout, alors que le principe actif forme un résidu insoluble. À titre de solvants polaires, on peut utiliser, par exemple, des alcanols ayant une chaine carbonée de par exemple C1 à C4, des dialcoylcétones de formule R1 - CO - R2, dans laquelle t et R2 représentent des groupes alcoyle dont la chaîne carbonée contient par exemple C1 à C4, et des dialcoyléthers R1 - 0 - R2, dans laquelle R1 et R2 représentent des groupes alcoyle dont la chaîne carbonée contient par exemple C2 à C3. (d) On dissout le complexe comprenant le principe actif lié au composé phénolique dans de l'eau à un p11 d'environ 7,5 à 8,5, de préférence à 8,0. On peut ajusteur le p11 à l'aide d'un hydroxyde alcalin, d'un acétate alcalin, d'un citrate alcalin, d'un carbonate ou bicarbonate alcalin, d'un phosphate di- ou trialcalin ou d'un autre tampon basique, ou d'ammoniaque ou d'hydroxyde d'ammonium. On filtre la solution sous atmosphère d'azote à travers un ultrafiltre dont les pores sont de dimension telle que le principe actif, c'est-à-dire le produit enzymatique, est retenu sur le filtre, alors que le composé phénolique passe à travers le filtre sous forme dissoute. À titre d'ultrafiltres, on peut utiliser des filtres "Diaflo" NO UM-05, UM-2, UM-l0 et PM-10 (les filtres "Diaflo" sont constitués par des membranes en polymères synthétiques; fournisseur X0ICON, Oosterhout rm.B,~7, Pays-Bas). On lave le principe actif retenu sur le filtre plusieurs fois avec de l'eau distillée afin d'éliminer des résidus de composé phénolique et, en même temps5 de concentrer le principe actif. Le produit enzymatique ainsi obtenu possède une activité d'environ 10-15 unités thrombiniaues NIE par mg de substance sèche (degré de pureté I). Ce produit donne toutefois lieu à la formation de 3 lignes de précipitine dans l'immunophérogramme et de 4 zones protéiniques dans le phérogramme acrylamidique et présente une couleur jaune. le produit enzymatique présentant un degré de pureté I est en outre caractérisé par une activité thromboplastique. Pour obtenir un produit plus pur, on peut dissoudre le produit enzymatique présentant un degré de pureté I dans un tampon constitué par du phosphate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (pH 6,0/0,02-molaire) pour obtenir une solution à 5 % et soumettre cette solution à une chromatographie sur une colonne de DEAE "Sephadex" A-50 (DOLE = diéthylaminoéthyle; "Sephadexw est une marque déposée désignant des polydextranes; fournisseur : CIA, Upsala, Suède) prélablement transformé dans sa forme PO,, et équilibré avec du tampon 1RIS-phosphatique (PH 6,0/0,02-molaire). On procède à la chromatographie en chargeant la solution du produit enzymatique sur la colonne, en éliminant des substances inactives par lavage de la colonne avec une quantité correspondant à 4 fois son volume de tampon TRIS-phosphatique (PH 6,0/OgE-mo- laire) L-'PRIS ~ tris(hydrow =éthyl)aminométhane 7 et en dissolvant ensuite le produit enzymatique par élution avec une quantité correspondant à 2 fois le volume de la colonne de tampon TRISphosphatique (PH 6,0/024-molaire). On sépare les sels d'avec l'éluat actif par centrifugation.Par lyophilisation du filtrat on obtient un produit enzymatique présentant un degré de pureté II qui correspond à une activité d'environ 100 à 200 unités thrombiniques NIH par mg de la teneur du produit en protéines. L'immunophérogramme révèle une seule ligue de précipitine alors que le phérogramme acrylamidique présente deux zones0 On peut obtenir le produit enzymatique sous forme cristalline en laissant reposer le concentré exempt de sels, obtenu par ultrafiltration, à plus 20C pendant 48 heures, en recueillant les cristaux par centrifugation, avec refroidissement et-en lavant les cristaux avec de l'-eau distillée glacée.On obtient ainsi des cristaux sous forme de plaquettes rectangulaires qui se torana forment en particules amorphes, rapidement lors du séchage sous vide et graduellement lors du séchage à 'air On obtient ainsi un produit enzymatique présentant une activité de plus d'environ 200 unités thrombiniques NIH par mg de sa teneur en protéines (de- gré de pureté III). Le produit enzymatique présentant un degré de pureté II apparaît comme une substance homogène dans l'électrophérogramme sur papier, l'électrophérogramme sur membrane, le chromatogramme sur gel, le chromatogramme sur échangeur d'ions et dans l'immunodiffusogramme selon OUCHTER-LOHNY. On peut toutefois séparer une fraction polypeptidique pharmacologiquement inactive d'avec la fraction active en soumettant le produit enzymatique présentant un degré de pureté II à une chromatographie sur gel et en utilisant un mélange d'un acide carboxylique aliphatique et d'eau ou un mélange d9une solution aqueuse d'un tampon avec un solvant orpanique miscible à 1 'eau comme agent éluant.Pour cette chromatographie, on peut utiliser des gels soit hydrophobes soit hydrophiles. À titre d'exemples de gels hydrophiles, on peut citer les gels polydextraniques, par exemple les produits "Sephadex" (fournisseur : PHAREACIA, Upsala, Suède), les gels polyacrylamidiques, par exemple les produits "Bio-Gel" (fournisseur : Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie), et les gels d'agarose ou d'agar, par exemple les produits "Sepharose" (fournisseur : PHhRtACIAs Suède). Il convient d'effectuer la chromatographie sur gels à une concentration d'ions hydrogène constante, par exemple dans une gamme de p11 comprise entre environ 2 et 9, de préférence à un p11 d'environ 2-6.A titre d'acides carboxyliques, on peut utiliser par exemple des acides monocarboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée et contenant de 1 à 4 atomes de carbone. Comme tampons solubles dans des mélanges d'eau et de solvants, on peut utiliser des tampons courants, par exemple des formiates, des acétates, des phosphates, des citrates et des carbonates de bases inorganiques, telles que des métaux alcalins ou l'ammonium, ou de bases organiques, telles que la pyridine et le tris(hydroxyméthyl)aminométhane.On utilise de préférence des tampons qui n'absorbent pas de radiations dans 1'W et qui sont volatils dans le vide, par exemple le formiate d'ammonium ou l'acétate d'ammonium, étant donné qu'il est avantageux de suivre le cours de la chromatographie par des évaluations densitométriques des éluats et de concentrer les éluats par lyophilisation. On peut utiliser les acides carboxyliques aliphatiques à des concentrations d'environ 5 à 95 % en volume dans 11 eau. Lorsqu'on utilise des gels hydrophiles pour la chromatographie, la concentration en acide carboxylique est de préférence comprise entre environ 5 et 50 % en volume. Si l'on utilise des tampons aqueux, on ajoute un solvant organique miscible à l'eau variant entre environ 5 et 95 % en volume. En cas d'utilisation de gels hydrophiles, la concentration du solvant est de préférence comprise entre environ 10-50 % en volume.Comme solvants miscibles à l'eau, on peut utiliser des alcanols présentant une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée et contenant de 1 à 5 atomes de carbone, des cétones telles que l'acétone, la diéthyl-cétone ou la méthyl-éthylcétone, des alcoylamines, telles que la mono-, di- ou tri-méthyl-, éthyl- ou propylamine, ou des uréthanes tels que l'éthyluréthane0 Etant donné que les éluats sont de préférence concentrés par lyophilisation, il convient d'utiliser des solvants qui sont volatils dans le vide et qui ne réduisent pas sensiblement le point de congélation de la solution. A titre d'exemples, on peut citer le tert.-butanol et le cyclohexanol. Les produits enzymatiques résultant de la chromatographie sur gels décrite ci-dessus présentent une activité biologique variant entre environ 200 et 400 unités thrombiniques NIH par mg de leur teneur en protéines (degré de pureté III). Le produit est exempt en grande partie ou totalement de la fraction inactive. Les termes "degré de pureté Il" et "degré de pureté III" ont la signification suivante Degré de pureté II = environ 100 à 200 unités thrombiniques NIH; Degré de pureté III = environ 200 à 400 unités thrombiniques NIH, ces unités étant exprimées par mg de teneur en protéines du produit enzymatique. Les valeurs de 11 analyse des acides aminés du produit enzymatique varient, selon le degré de pureté de celui-ci, entre les limites indiquées ci-après. L'analyse des acides aminés a été effectuée en soumettant le produit enzymatique à une hydrolyse à l'aide d'acide chlorhydrique d'un point d'ébullition constant, à 1100C, pendant 22 à 72 heures dans une atmosphère d'azote. Acides aminés Micromoles Par mg de constituant peptidique Acide aspartique 1 - 1,3 Thréonine 0,35 - 0,55 Sérine 0,4 - 0,5 Acide glutamique 0,65 - 0,75 Praline 0,55 - 0,9 Glycine 0,65 - 0,9 Alanine 0,4 - 0,65 Cystine 1/2 0,35 - 0,6 Valine 0,45 - 0,6 Méthionine 0,1 - 0,2 Isoleucine 0,45 - 0,75 leucine 0,45 - 0,65 Tyrosine 0,3 - 0,5 Phénylalanine 0,3 - 0,45 Histidine 0,2 - 0,25 Lysine 0,45 - 0,65 Àrginine 0,3 - 0,45 À titre d'exemple, on donne les valeurs de l'analyse des acides aminés pour À = un produit enzymatique présentant un degré de pureté II B = un produit enzymatique présentant un degré de pureté III (ctest-à-dire un produit ayant une teneur sensiblement réduite en substances inactives). Acides aminés Micromoles par mg de constituant peptidique À B Acide aspartique 1,05 - 1,1 1,17 - 1,25 Thréonine 0,35 - 0,41 0,42 - 0,54 Sérine 0,43 - 0,45 0,41 - 0,5 Acide glutamique 0,67 - 0,7 0,66 - 0,71 Proline 0,58 - 0,76 0,79 - 0,87 Glycine 0,67 - 0,76 0,76 - 0,9 Alanine 0,41 - 0,5 0,63 - 0,64 Cystine 1/2 0,47 - 0,6 0,35 - 0,42 Valine 0,47 - 0,55 0,55 - 0,6 Méthionine 0,17 - 0,2 0,13 - 0,17 Isoleucine 0,45 - 0,55 0,65 - 0,72 Leucine 0,46 - 0,47 0,6 - 0,64 acides aminés (suite) iiicromoles tar mg de constituant peptidique. À B Tyrosine 0,33 - 0,5 0,3 - 0,36 Phénylalanine 0,33 - O,43 0,33 - 0,38 Histidine 0,2 - 0,22 0,21 - 0,23 Lysine 0,5 - G, > 4 0,48 - 0,53 krginine ,3 - 0,4 0,32 - 0,36 Le constituant carbohydrate du produit enzymatique selon l'invention est très probablement combiné au moins partiellement à un polypeptide sous forme de glycopeptide. La teneur du produit enzymatique en carbohydrates (sucres neutres) a été déterminée selon la méthode dite d'orcinol ( v. l.F. ewitt, Biochem. J. 31, 360 [1937]). Le produit enzymatique présentant un degré de pureté III (c'est-à-dire le produit ayant une teneur fortement réduite en substances inactives) contient un constituant peptidique ayant un poids moléculaire apparent d'environ 38000 à 55000 alors que le constituant peptidique du produit enzymatique ayant un degré de pureté II présente un poids moléculaire apparent d'environ 28000 à 550000 le produit enzymatique à l'état de pureté II contient apparemment un constituant qui active le facteur XIII. À l'état de pureté poussée (degré de pureté III) le produit enzymatique présente la séquence d'acides aminés suivante (déterminée par la méthode de dégradation d'Edman décrite dans "Proteins Sequence Determination", S.B. Needleman, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, New York, 1970, p. 211 et ss.), à partir de l'extrémité N-terminale : valine > isoleucine > glycine > glycine --+ acide aspartique ', acide glutamique. Le produit enzymatique conforme à l'invention est exempt de neurotoxines produisant des effets préjudiciables sur le système nerveux, de protéases génératrices de bradykinine (la bradykinine provoque une réduction de la tension artérielle), de phospholipases (qui ont une activité hémolytique et provoquent des troubles rénaux), d'oxydases d'acides aminés et de phosphatases. Le produit enzymatique conforme à l'invention peut être utilisé comme réactif ou agent auxiliaire dans des examens phy siologiques de coagulation sanguine in vitro, par exemple dans des examens de la transformation du fibrinogène en fibrine en présence d'héparine et d'antithrombines, dans des examens relatifs aux fibrinopeptides, à des structures fibrinogéniques pathologiques, à des produits de dégradation du fibrinogène, et aux facteurs VIII et IIII. Administré en doses modérées in vide, le produit enzzma- tique conforme à l'invention provoque une réduction des temps de saignement et de coagulation dans des animaux de laboratoire, de même que chez des patients présentant un état d'hémostase normal ou pathologique. Administré en doses modérées par voie intraveineuse à des être humains sains, le produit enzymatique provoque la formation in vivo de complexes solubles fibrinogène-fibrine dans la circulation sanguine, ce qui est démontré par le résultat positif du test de cryofibrine et de paracoagulation dans le plasma et par les analyses N-terminales de fractions plasmatiques. Le produit enzymatique conforme à l'invention est, par con- séquent, utilisable comme hémostatique. Lorsque le produit enzymatique conforme à l'invention est administré à des doses plus élevées à des chiens, on observe une défibrinogénation rapide ainsi qu'unie fibrinolyse secondaire et 'apparition de produits de dégradation du fibrinogène dans le sang. La défibrinogénation et la fibrinolyse se produisent sans que l'on observe des symptômes de chocs, de thrombocytopénie, et en l'absence de complications thrombo-emboliques ou hénorragiques. Des essais cliniques effectués sur des malades atteints de thromboses des veines des jambes ou des veines rétiniennes ont montré que le produit enzymatique conforme à l'invention se particulièrement bien à une thérapeutique défibrinogénante et fibrinolytique. A la connaissance des inventeurs, le produit enzymatique conforme à l'invention ne saurait être remplacé par aucun produit comparable dans son application spécifique comme réactif. Bien que la coagulase de thrombine obtenue à partir d'une enzyme staphylococcique soit également une enzyme thrombinique qui ne subit pas d'inhibition par les antithrombines, cette coagulase détache de la molécule de fibrinogène aussi bien le peptide A que le peptide B, alors que le produit enzymatique conforme à l'invention ne détache que le peptide A. Par rapport aux produits hémostatiques connus ayant une activité thrombinique, le produit enzymatique conforme à l'invention présente l'avantage majeur de pouvoir être administré par injection. Administrés par voie parentérale, la thrombine, la coagulase de thrombine et les agents générateurs de thrombine, tels que les thromboplastines complètes et le venin de la vipère Russel, provoquent des symptômes thrombo-emboliques et la throm bocytopénie et ne peuvent, par conséquent, être appliqués que lo calmement, Appliqué à des doses supérieures dans le traitement défibrinogénant de troubles thrombo-emboliques, le produit enzymatique conforme à l'invention agit comme anticoagulant et provoque simultanément une fibrinolyse.Grace à l'élimination et la dégradation d'une majeure partie du fibrinogène, le sang perd son pouvoir de coagulation à la suite du processus de défibrinogénation. En outre, les produits ae dégradation du fibrinogène formés à la suite de la fibrinolyse exercent une activité inhibitrice sur la coagulation. Après quelques jours de traitement (par exemple 2-3 jours), le taux des produits de dégradation du fibrinogène est si faible que la tendance au saignement n'est pas augmentée. On n'observe pas de thrombocytopénie pendant la phase de défibrinogénation, et la tendance au saignement n'est pas sensiblement augmentée chez les patients à un taux de fibrinogène de 0,01-0,05 g par 100 ml de plasma. Ces patients peuvent subir des interventions chirurgicales sans être sujets à un saignement dangereux. Le fait que le produit enzymatique conforme à l'invention n'affecte pas sensiblement l'hémostase constitue un grand avantage par rapport aux anticoagulants du groupe héparinique et du groupe dicoumarolique qui inhibent la synthèse de divers facteurs de coagulation dans le foie et affectent sensiblement les processus hémostatiques. Grâce à son activité anticoagulante prononcée, le produit enzymatique conforme à l'invention est particulièrement utile pour empêcher la formation de thrombi dans les interventions chirurgicales. Jusqu'à ce jour, aucune résistance au produit enzymatique selon l'invention n'a été observée chez des patients auxquels ce produit a été administré par voie intraveineuse. Par rapport à l'anticoagulant décrit dans le brevet britannique NO 1.094.301, le produit enzymatique conforme à l'invention présente certains avantages substantiels. Administré à des doses comparables, le nouveau produit enzymatique exerce une action physiologique, c'est-à-dire une action défibrinogénante, d'une durée sensiblement plus longue.Alors que l'anticoagulant dé crit dans le brevet britannique NO 1.094.301 doit être administré 4-6 fois à raison de 60 unités par 60 kg de poids du corps dans l'espace de 24 heures (1 unité = la quantité de produit enzymatique qui provoque la coagulation du fibrinogène humain dans le mê- me temps qu'une unité NIE de thrombine; NIH = National Institute of Health), une seule dose de 14 unités au plus du produit enzymatique conforme à l'invention suffit pour maintenir un adulte humain dans un état de défibrinogénation pendant 24 heures. l'activité du produit enzymatique conforme à l'invention est déterminée et indiquée sur la base de son action thrombinique sur le fibrinogène humain. Une unité du produit enzymatique conforme à l'invention est équivalente à la quantité qui provoque la coagulation d'une solution de fibrinogène dans le meme temps qu'une unité NIH de thrombine étalon. A l'état purifié, le produit enzymatique conforme à il- invention est facilement soluble dans des solutions salines diluées, alors qu'il est peu soluble dans l'eau distillée. On peut le précipiter à partir de ses solutions aqueuses par l'action de sels ou de solvants organiques miscibles à l'eau. I1 se fixe réversiblement sur des échangeurs d'ions basiques et forme des complexes insolubles dans l'eau avec le phénol et ses dérivés. En outre, il se distingue par une résistance élevée à la chaleur et une stabilité remarquable en présence d'acides. lorsque le produit enzymatique conforme à l'invention est utilisé comme agent hémostatique, il convient de l'administrer à des doses journalières d'environ 0,25 à 1,5 unités NIE par 60 kg de poids du corps. En tant qu'anticoagulant, le produit enzymatique est administré, par exemple à des doses journalières d'environ 2-100 unités NIE, de préférence d'environ 7-14 unités NIH, par 60 kg de poids du corps. La présente invention concerne également une préparation pharmaceutique contenant le produit enzymatique conforme à 1 'in- vention comme principe actif. Lorsque cette préparation doit être utilisée comme anticoagulant, elle contient par exemple environ 10-500 microgrammes, de préférence environ 100 microgrammes, du principe actif par dose unitaire. I1 convient alors de dissoudre le produit enzymatique dans un milieu aqueux utilisable pour 1'administration parentérale. Conformément à une forme de conditionnement adaptée aux besoins pratiques, ladite préparation pharmaceutique est mise en ampoules contenant 2 ml de solution a queuse du produit enzymatique.Cette solution peut contenir environ 0,9 % de chlorure de sodium, environ o,3-0,5 co de phénol et environ 0,01-0,2 k de gélatine partiellement hydrolysée (comme stabilisateur) et présenter un PH d'environ 5,0-8,0, de préférence de 6,5. L'invention concerne, en outre, un réactif utilisable pour effectuer des examens de sang humain et de sang d'autres mant- mifères. Ce réactif est caractérisé en ce qu'il contient le produit enzymatique conforme à l'invention comme principe actif. Ce réactif peut être utilisé dans des examens de la formation de la fibrine ou dans la détermination d'anomalies dans la formation de la fibrine, dans la détermination du taux de fibrinogène en présence d 'héparine, dans la détermination rapide de la fibrine et des produits de dégradation de la fibrine dans le plasma, et, de manière générale, comme substitut de la thrombine dans les tests de coagulation du sang. Pour les besoins pratiques, il convient de conditionner le réactif conforme à l'invention sous forme d'une préparation comprenant, par exemple, 10-50 microgrammes de produit enzymatique lyophilisé, 1 mg de gélatine partiellement nydrolysée (comme stabilisateur), 2 mg de p-hydroxybenzoate de méthyle, 8,5 mg de NaCl et de la glycine ad 34 mg. Il convient de dissoudre cette préparation dans 1 ml d'eau distillée. Exemple le On dissout 20 g de venin de Bothrops atrox dans 1000 ml d'une solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium et on centrifuge la solution pendant 10 minutes à 3000 tours par minute. On rejette le précipité. On ajuste le centrifugat à pE 3,5 à 1'aide d'acide acétique dilué, on le chauffe à 300C pendant 1 heure sur un bain-marie et on le soumet de nouveau à une centrifugation. On rejette le résidu, on ajuste le p11 du centrifugat à 6,5 à 1'aide de NaOH et on ajoute de la solution aqueuse à 0,9 % de chlorure de sodium pour obtenir un volume de 1000 ml. Tout en agitant, on ajoute à cette solution 570 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium. On laisse reposer le mélange pendant 1 heure à la température ambiante et on élimine le précipité par centrifugation. On ajoute 552 ml de solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium au centrifugat. Après 1 heure on soumet de nouveau le mélange à une centrifugation. Le centrifugat est ree- té. On dissout le précipité dans 100 ml d'eau distillée et ajuste le PE de la solution à 5,0 à l'aide d'acide acétique dilué.On ajoute 7,7 ml de phénol à 90 5"o à la solution, tout en agitant celle-ci. On laisse reposer le mélange pendant 15 heures à la température ambiante. On isole le produit enzymatique par centre fugation. le centrifugat est revente. On lave le précipité 2 fois avec 10 ml d'eau saturée avec du phénol. Après une nouvelle centrifugation, on reprend le résidu dans 50 ml d'éthanol contenant 1 % d'acide acétique. On agite le mélange pendant 1 heure et ensuite on le soumet à une filtration sur un filtre en verre fritté. On lave le produit retenu sur le filtre plusieurs fois avec des portions de 20 ml d'éthanol et le sèche ensuite dans le vide. On obtient ainsi 2-2,5 g de produit enzymatique présentant une activité thrombinique d'environ 10-12 unités NIE par mg de substance sèche. On reprend le produit brut dans 40 ml de tampon TRIS-- phosphatique (p11 6,0/0,02-molaire) et l'agite pendant 15 minutes. On applique le centrifugat limpide, à une vitesse de 0,8-1,0 ml/ min., sur une colonne de 200 ml de DEAE-"Sephadex" équilibré par du tampon TRIS-phosphatique et on procède à l'éluvion avec 800 ml de la meAme solution de tampon. On rejette la première fraction éluée. Ensuite, on élue le principe actif à l'aide de 400 ml de tampon TRîS-phosphatique (molarité 0,o4). On concentre l'élut contenant le principe actif, sous pression, sur un ultrafiltre 11ÀMIC0N1UM-10 et le lave jusqu'à ce qu'il soit exempt de sels0 On sèche le concentrat dans le vide sur P205 ou par lyophilisation. On obtient ainsi 200-250 mg de produit enzymatique présentant une activité d'environ 100-150 unités thrombiniques NIE par mg de sa teneur en protéines (degré de pureté II). On peut obtenir le produit enzymatique sous forme de cristaux. A cet effet, ou soumet le concentré débarrassé des sels à une concentration supplémentaire jusqu'à obtention de 5 ml de solution. Cette concentration est également effectuée à l'aide d'un ultrafiltre. La solution est ensuite filtrée à travers un filtre en verre fritté G-4. On laisse reposer la solution à +20C pendant 24 heures dans un réfrigérateur. On obtient ainsi des cristaux sous forme de plaquettes rectangulaires.On isole les cristaux par centrifugation à 0-2 C, on les lave plusieurs fois avec des portions de 0,5 ml d'eau distillée, en refroidissant avec de la glace, et on les sèche sur P205. On obtient ainsi 45 mg d'un produit incolore présentant une activité d'environ 150-200 unités thrombiniques NIH par mg de sa teneur en protéines0 Eremple 2. On dissout 20 g de venin de Bothrops atrox dans 1000 ml d'une solution aqueuse à 0,9 % de NaCl et on ajuste le p11 de la solution à 6,5. Après addition de 670 ml de solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium à la solution, on laisse reposer le mélange à 200C pendant 1 heure et le soumet ensuite à une centrifugation. On ajoute une quantité supplémentaire de 552 ml de solution saturée de sulfate d'ammonium au centrifugat. Après 1 heure, on sépare le précipité- par centrifugation et le dissout dans 100 ml d'eau distillée. On ajuste la solution à p11 3,5 à l'aide d'acide acétique dilué et la chauffe ensuite pendant 1 heure à 300C, On élimine le précipité par centrifugation.On ajuste le centrifugat à p11 5,0 et, après addition de 3 ml de m-crésol, on le laisse reposer à la température ambiante pendant 15 heures. On isole le précipité par centrifugation, le lave 2 fois avec des portions de 10 ml d'eau saturée avec du m-crésol et le dissout dans 50 ml d'eau distillée ajustée à p11 8,0 par du NaOE 1N. Après élimination des substances non dissoutes par centrifugation, on filtre la solution à travers un ultrafiltre "AMICON" UM-10. On lave le résidu avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'on ne détecte plus de crésol dans les eaux de lavage par réaction avec le chlorure ferrique.On reprend le résidu dans 20 ml de tampon TRIS-phosphatique (PH 6,0/0,02-molaire). Après élimination des substances non dissoutes par centrifugation, on applique la solution, à une vitesse de 0,8-1 ml/min, sur une colonne de 200 ml de DEAE-"Sephadex" A-50 équilibré avec le même tampon. On lave la colonne avec 800 ml de tampon ERIS-phosphatique (PH 6,0/0,02-molaire). Ensuite, on élue la substance active avec 400 ml de tampon TRIS-phosphatique (PH 6,0/0,04-molaire). On concentre l'éluat actif sur un ultrafiltre "AMICON"UM-10, sous pression, et on lave le concentré jusqu a ce qu'il soit exempt de sels. Le concentré peut être utilisé directement pour préparer une solution stérile prête à être injectée par voie intraveineuse. D'autre part, on peut sécher ce concentré dans le vide. Après séchage, on obtient environ 200 mg d'un produit enzymatique présentant une activité de 120-160 unités thrombiniques NIE par mg de sa teneur en protéines. Temple 3e On charge une colonne présentant une section de 1,8 cm2 et une longueur de 92 cm avec du WSephadex" G-100. On équilibre le gel de "Sephadex" avec de l'acide acétique aqueux à 10 %. On applique sur la colonne une solution de 6,26 mg du produit enzymatique obtenu selon l'Exemple 1 (degré de pureté II) dans 0,3 ml d'acide acétique aqueux à 10 %. On fait passer de l'acide acétique aqueux à 10 % à travers la colonne, sous forme de courant ascendant, à une vitesse de 5,6 ml/heureO Deux zones absorbant dans 1'W (280 m) se forment. L'éluat correspondant à la première zone est lyophilisé. On obtient ainsi 4,25 mg de produit enzymatique présentant une activité de 200-250 unités thrombiniques NIE par mg de sa teneur en protéines. REVENDICATIONS. 1. Produit enzymatique caractérisé par les propriétés suivantes (a) il exerce une activité semblable à celle de la thrombine, (b) il comprend un constituant peptidique et un constituant hydrate de carbone, le constituant peptidique comprenant un ou plusieurs polypeptides d'un poids moléculaire n'excédant pas 55000 (déterminé par la méthode d'ultracentrifugation équilibréeX (c) il est pratiquement insoluble dans l'eau distillée mais facilement soluble dans de la solution physiologique de chlt rure de sodium, (d) il forme avec des composés phénoliques des complexes peu solubles ou insolubles dans l'eau, (e) il provoque la coagulation du fibrinogène par l'élimination sélective de fibrinopeptide À du fibrinogène sans détachement de fibrinopeptide B, (f) il dégrade 11 ester méthylique de tosylarginine et la gélatine, mais non pas 11 ester méthylique de lysine, l'ester éthylique de phénylalanine, la N-acétylméthionine, la N-acétyltyrosine, la leucylglycine et la caséine, (g) il n'est pas inhibé par l'héparine, les héparinoi- des, l'hirudine, les antithrombines et l'inhibiteur de peptidase polyvalent selon EUNITZ, et (h) il n'est pas fixé et, par conséquent, n'est pas inactivé par la fibrine. 2o Produit enzymatique selon la revendication 1 caractérisé en ce que, après avoir été soumis à une hydrolyse à 1100C pendant 22 à 72 heures à l'aide d'acide chlorhydrique à point d'ébullition constant, il présente l'analyse d'acides aminés suivante Acides aminés Micromoles par mg de constituant peptidisue Acide aspartique 1 - 1,3 Thréonine 0,35 - 0,55 Sérine 0,4 - 0,5 Acide glutamique 0,65 - 0,75 Praline OX55 - 0,9 Glycine 0,65 - 0,9 Alanine 0,4 - 0,65 Acides aminés (suite) Micromoles Par mg de constituant peptidique Cystine 1/2 0,35 - 0,6 Valine 0,45 - 0,6 Méthionine 0,1 - 0,2 Isoleucine 0,45 - 0,75 Leucine 0,45 - 0,65 Tyrosine 0,3 - 0,5 Phénylalanine 0,3 - 0,45 Histidine 0,2 - 0,25 Iysine 0,45 - 0,65 Arginine 0,3 - 0,45 3. Produit enzymatique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il présente une teneur en hydrates de carbone (sucres neutres) d'environ 2-10 % en poids, par rapport à sa teneur en protéines. 4. Produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le constituant peptidique présente un poids moléculaire d'environ 18000 à 55000. 5. Produit enzymatique selon la revendication 4, caractérisé en ce que le constituant peptidique présente un poids moléculaire d'environ 28000 à 55000. 6. Produit enzymatique selon la revendication 4, caractérisé en ce que le constituant peptidique présente un poids moléculaire d'environ 38000 à 55000. 7. Produit enzymatique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés suivante, à partir de l'extrémité N-terminale de la chaîne : valine b i soleucine y glycine + glycine ', acide aspartique ', a cide glutamique. 8. Produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour autant qu'il est obtenu à partir du venin de Bothrops atrox ou de tout autre genre de serpent dont le venin est susceptible de donner une réaction croisée immunologique avec le venin de Bothrops atrox. 9. Procédé pour la préparation d'un produit enzymatique conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait agir sur une solution aqueuse du venin de Bothrops atrox ou de tout autre genre de serpent dont le venin est susceptible de donner une réaction croisée immunologique avec le venin de Bothrops atrox, un composé phénolique pour former un complexe peu soluble ou insoluble dans l'eau et qu'on décompose le complexe pour libérer le produit enzymatique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste à (i) préparer une solution aqueuse isotonique du venin à un PH compris entre environ 4,5 et 7, (2) soit (a) soumettre la solution isotonique à une précipitation saline fractionnée pour d'abord éliminer des substances inactives et ensuite précipiter une fraction contenant le produit enzymatique, à disperser cette fraction dans de l'eau distillée, à ajuster le PH de la solution à environ 3-4, à chauffer la solution pendant un temps variant entre quelques minutes et environ 2 heures à des températures d'environ 30 à 50"C, à éliminer les protéines précipitées et à ajuster le PH de la solution résiduelle à environ 4 à 6, ou (b) ajuster le PH de la solution isotonique à environ 3-4 et à chauffer la solution pendant un temps variant entre quelques minutes et environ 2 heures à des températures comprises entre environ 30 et 500C, à éliminer les protéines précipitées, à ajuster le p11 de la solution résiduelle à environ 4,5 à 7, et à soumettre la solution à une précipitation saline fractionnée pour d'abord éliminer des substances inactives et ensuite précipiter une fraction contenant le produit enzymatique actif, à disperser cette fraction dans de l'eau distillée et à ajuster le PH de la solution à environ 4-6, et (3) ajouter du phénol ou un dérivé de celui-ci à la solution obtenue selon (a) ou (b) pour précipiter un complexe insoluble contenant le produit enzymatique, et soit (c) décomposer le complexe par traitement avec de l'acide acétique dilué dans uniolvant organique polaire et à isoler le produit enzymatique libéré, insoluble, ou (d) traiter le complexe en milieu aqueux avec une base à p11 7,5 à 8,5 environ et à isoler le produit enzymatique par ultrafiltration, dialyse ou filtration sur gels, et à soumettre le produit enzymatique obtenu à une purification plus poussée. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la purification du produit enzymatique est effectuée par chromatographie sur un échangeur d'ions basique. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les précipitations salines fractionnées sont effectuées à 1'aide de sels alcalins, alcalino-terreux, ou d'ammonium d'acides minéraux. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les précipitations -salines fractionnées sont effectuées à 1'aide de sulfate d'ammonium à un pH d'environ 6,5. 14. Procédé selon la revendication 9, caractérisé. en ce qu'on utilise, à titre de composé phénolique, le phénol, un acide phénolcarboxylique, un alcoylphénol, un phénol halogéné, un acide phénolcarboxylique alcoylé ou halogéné, ou un sel d'un acide phénolcarboxylique. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on utilise le phénol, un crésol ou le salicylate de sodium. 16. Procédé selon la revendication 9, caractérisé entre qu'on purifie le produit enzymatique par chromatographie sur gels en utilisant des gels de polydextranes, de polyacrylamides, d'agarose ou d'agar et des mélanges d'acides carboxyliques aliphatiques avec de l'eau ou des mélanges de tampons aqueux avec des solvants organiques miscibles à l'eau comme agents éluants. 17. Préparation pharmaceutique comprenant un produit enzymatique conforme à la revendication 1. 18. Réactif utilisable pour des examens in vitro de sang humain et de sang d'autres mammifères, caractérisé en ce qu'il comprend un produit enzymatique conforme à la revendication le