FR 2150799 A1 19730413 FR 7229567 A 19720818 Le présente invention est relative à un procédé pour produire un vaccin contre la maladie équine que constitue l'anémie infectieuse du cheval. Plus particulièrement, selon l'un de ses aspects1 la présente invention fournit un procédé pour le passage en continu de cellules leucocytaires de cheval afin de préparer un milieu de culture pour un virus de l'anémie infectieuse du cheval qui ait des propriétés antigéniques supérieures. Un autre des aspects de l'invention consiste à fournir un procédé complet de fabrication d'un nouveau vaccin pour l'immunisation des chevaux contre l'anémie infectieuse équine et à définir en outre les moyens de son utilisation pour immuniser les chevaux. L'anémie infectieuse équine (AIE) que l'on croit généralement n'affecter que les chevaux, a constitué un problème considérable aux Etats-Unis, particulièrement dans les régions côtières du Golfe du Mexique. Du fait que la maladie peut être transmise par le transfert de matière infectée apportée par les insectes suceurs de sang, de même que par des instruments contaminés, les effets de la maladie se sont le plus sévèrement fait sentir dans les régions subtropicales du Sud et du Sud-Ouest des Etats-Unis. La maladie peut prendre diverses formes. La forme aiguë aboutit généralement à la mort de l'équin infecté, bien qu'il puisse survenir une rémission de la maladie sous une forme semi-aiguë ou une forme chronique.Sous ces formes, la maladie est généralement débilitante pour l'animal infecté, mais ne produit généralement pas une mort immédiate. Même des animaux qui ont apparemment recouvré la santé restent infectés toute leur vie. Ces animaux qui sont porteurs de la maladie à l'état latent peuvent ne montrer aucun des signes cliniques de la maladie, mais ils possèdent néanmoins le virus à l'état virulent présent dans leur sang et leurs tissus, à tout moment, et de ce fait servent de réserve pour une transmission continuelle de la maladie aux chevaux sains. L'anémie infectieuse équine est une infection à virus lent comme on peut le remarquer d'après la période d'incubation prolongée chez les chevaux, qui est de 9 à 50 jours. Cette période d'incubation prolongée caractérise peu d'autres maladies à virus. Plusieurs chercheurs ont réussi à développer le virus de 1'AIE dans des cultures primaires de leucocytes de cheval. Cependant ces systèmes de culture présentent des limites dans la mesure où l'effet cytopathique du virus dans ces systèmes est minime. D'autres travaux sur le virus de 1'AIE dans des cultures primaires de leucocytes de cheval ont indiqué qu'il y a deux antigènes associés au virus de 1'AIE (Moore et al, "The immunologic Properties Associated with Equine Infectious Anemia : Recent Findings", J.A.C.M.A., Vol. 155, nO 2, 331-335, July 15, 1969). Ceux-ci semblent consister en un virus et une protéine anormale, ou en ce qui a été caractérisé par l'expression antigène de fixation du complément. Ces observations ont conduit à l'hypothèse que le virus de 1'AIE comprend une particule virale entouree par une enveloppe virale secondaire de protéine anormale. L'anticorps de cet antigène à protéine anormale ou à enveloppe virale secondaire parait être à déplacement lent et faiblement neutralisant, alors qu'il est admis que l'anticorps de la particule virale privée de la protéine anormale possède les caractéristiques d'un anticorps à déplacement rapide d'effet neutralisant élevé. La réaction d'immunité naturelle a lieu, au moins principalement sur l'enveloppe virale secondaire, et n'attaque pas la particule virale avec une vitesse et un effet suffisants pour empêcher l'extension de l'infection. Des efforts pour développer une culture de cellules susceptible d'être un support pour la culture du virus de 1'AIE ont eu pour résultats le développement d'un procédé pour le passage continu de cellules leucocytaires de cheval et un milieu de support pour cette culture.Moore et al ont rapporté un tel procédé dans lequel on a trouvé que les cellules leucocytaires de cheval peuvent être soumises à un passage continu, utilisant un milieu de culture qui contient du sérum de mouton ("A method for the Continuous Culture of Peripheral Horse Leukocytes,Am.J.Vet. Res., 31, 463-468, March 1970). Bien que l'utilisation de sérum de mouton, comme indiqué dans cette publication, offre un procédé de culture continu, le nombre des cellules qui se développent au-delà de la culture primaire est petit et la possibilité de poursuivre le procédé de passage continu au-delà de quatre ou cinq passages est hasardeuse et non reproductible, bien qu'une de ces cultures ait subi successivement quatorze passages. Environ 10 à 15 pour cent seulement des cultures produites à l'aide de ce procédé ont donné une quelconque multiplication, et une dégénérescence des cellules dans la culture survient souvent au cours d'une période de quatre à sept jours. Lorsque ces études ont commencé, aucun traitement efficace de l'anémie infectieuse équine n'avait été proposé ni de procédé efficace d'immunisation n'avait été atteint. Par exemple, Kono et al avaient rapporté une tentative de mise au point d'un vaccin à virus atténué pour le traitement de 1'AIE. (Voir "Immunization of Horses Against Equine Infectious Anemia (EIA) With an Attenuated EIA Virus", Nat.Inst. Anim. Hlth.Quart .10, 113-122, 1970).Cependant, les résultats rapportés par cet ouvrage indiquent que le vaccin s'est révélé inefficace lorsqu'il était inoculé aux chevaux soumis à des virus de souche sauvage. On a donc dû recourir à des procédés indirects et peu concluants de contrôle de cette maladie en réalisant des programmes de désinsectisation, d'aseptie appropriée des aiguilles hypodermiques et des équipements chirurgicaux, d'isolement des animaux infectés et autres procédés analogues. Un objet de la présente invention consiste à réaliser un vaccin efficace contre l'anémie infectieuse équine. Donc, grâce à la présente invention, on réalise un procédé et un milieu de culture qui permettent le passage continu, sûr et reproductible de cellules leucocytaires de cheval qui possèdent une durée de maintien satisfaisante. On obtient également grâce à la présente invention un procédé et un milieu de culture à passage continu pour la culture d'un virus de 1'AIE à propriété antigénique supérieure. On obtient également, gracie à la présente invention, un procédé et un vaccin à virus inactivé pour l'immunisation de chevaux contre l'infection par la maladie appelée anémie infectieuse équine. On a trouvé que le virus de 1'AIE peut être cultivé dans des cultures à passage continu de leucocytes de cheval, de même que dans des cultures primaires de leucocytes de cheval comme il a été précédemment rapporté. La courbe de développement de ce virus indique cependant que la vitesse de développement du virus de 1'AIE était tout à fait lente. De façon typique, trois ou quatre jours après inoculation dans une culture de leucocytes de cheval à passage continu, le titre viral dans la culture était minime.Le virus était, de façon typique, libéré en une certaine quantité au cinquième jour suivant l'inoculation,le titre viral maximum étant atteint au sixième ou au septième jour qui suit l'inoculation. A cet égard, le virus de 1'AIE diffère des autres virus équins qui normalement arrivent à maturité en un ou deux jours. On a également trouvé que le virus de 1'AIE de souche sauvage peut être cultivé pour produire un virus infectant dans des cultures de leucocytes de cheval, à passage continu, et que le conditionnement du virus dans ces cultures à passage continu se révèle permettre au virus d'infecter d'autres lignées de cellules équines. Du fait de cette nature lente observée pour le développement du virus, il est devenu nécessaire de développer une culture et un milieu de culture de cellules à passage continu qui de façon substantielle puissent maintenir des cultures de cellules pendant six à huit jours afin que les cultures ayant reçu l'inoculation du virus puissent être valablement comparées avec des cultures de vérification pour déterminer si le virus cultivé dans la culture montre un effet cytopathique (ECP) sur les cultures ayant reçu l'inoculation. Lorsque les cultures subirent une dégénérescence spontanée avant six à huit jours, il devint impossible de valablement conclure si la dégénérescence observée dans les cultures ayant reçu l'inoculation était spontanée ou de savoir si elle provenait de l'effet cytopathique du virus. Dans les efforts faits conformément à l'invention pour développer une culture possédant une durée de maintien suffisamment longue, on a observé que les cellules subissaient une dégénérescence d'un type qui était calqué sur la dégénérescence provoquée par le défaut de certains aminoacides, notamment l'arginine, la cystine et l'histidine. On a de ce fait découvert que les milieux de culture de base enrichis par ces aminoacides et comportant du sérum de mouton, fournissent un milieu de culture fiable pour le passage continu de leucocytes de cheval qui possède une durée de maintien suffisamment longue pour permettre le dévelqt pement et la maturation du virus de 1'AIE. On a également trouvé que lorsque le virus de souche sauvage est passé dans le milieu à culture continue de leucocytes de cheval de la présente invention, on obtient un virus supérieurement antigénique qui peut autre transformé en un vaccin efficace pour l'immunisation des chevaux contre 1'AIE. Après ce passage continu, le virus cesse apparemment de reproduire 1 second antigène de protéine anormale ordinairement associé au virus de souche sauvage. Ce même antigène supérieur n'est cependant pas produit, par le passage du virus dans les cultures primaires de leucocytes de cheval. Donc, la culture à passage continu, de la présente invention, produit un virus transformé privé de l1enve- loppe virale secondaire, mais capable d'infecter d'autres tissus équins. Cette souche infectante de virus privée de l'antigène de protéine anormale peut alors être transformée en un vaccin à virus tué ou inactivé. De préférence, le vaccin est préparé par inoculation dans une culture de rein équin d'un virus à propriété antigénique supérieure, en évacuant le virus de la culture et en l'inactivant au moyen de béta-propiolactone. Le vaccin est formulé avec un adjuvant de gel aqueux et est injecté par voie intramusculaire. Pour faciliter l'explication de la présente invention, on peut se référer au dessin annexé dont les figures représentent des courbes d'élution par filtration du gel de cultures de virus existantes, ou de cultures développées dans diverses circonstances. La figure 1 représente une courbe d'élution par filtration du gel de virus de 1'AIE après huit passages successifs dans des cultures primaires de leucocytes de cheval indiquant la présence de deux pics d'antigènes; la figure 2 représente des courbes d'élution du gel d'un virus de 1'AIE après passages multiples à travers des cultures continues de leucocytes de cheval selon l'invention; la figure 3 représente des courbes d'élution de gels d'un cheval porteur du virus de 1'AIE et d'un cheval normal non infecté, préparés à partir de plasma de cheval, indiquant la présence de deux antigènes dans le cheval porteur. L'invention est exposée ci-dessous plus en détail spécialement en ce qui concerne la réalisation d'un milieu de culture amélioré pour passage en continu de leucocytes de cheval, la culture d'un virus infectant, à propriété antigénique supérieure, et la création d'un vaccin, et du procédé d'immunisation de chevaux contre 1'AIE. Lorsque Moore et al ont fait un rapport sur le procédé de culture en continu pour le passage de leucocytes de cheval (voir ci-dessus, Am. J. Vet Res. de Mars 1970), le milieu décrit pour l'utilisation comprenait 40% de sérum due mouton, 59,5 % de milieu que l'on trouve dans le commerce sous le nom de "milieu 199", 0,5% d'hydrolysat de lactalbumine et de petites quantités d'antibiotiques pour empêcher l'infection des cellules pendant le passage. On a trouvé que le sérum de mouton allié à un milieu de culture de cellules de base enrichi avec un mélange d'aminoacides tels que la L-arginine, la L-cystine et la L-histidine offrait des résultats grandement améliorés et permettait la culture des couches de cellules de leucocytes de cheval par un procédé de passage continu. Les milieux de base contenant d'environ 150 à environ 200 mg par litre de L-arginine, environ 75 à 100 mg par litre de L-cystine et 40 à 60 mg par litre de L-histidine, donnent d'excellents résultats. Par exemple les milieux de base du type utilisé pour le développement de leucocytes humains enrichis à ces taux se comportent très bien. Les couches de cellules montrent une longévité se prolongeant jusqu'à 21 jours et peuvent subir des passages de façon sûre.On a égalementtrouvé que, alors que Moore et al rapportaient des résultats non satisfaisants lorsqu'ils avaient utilisé du sérum de mouton qui avait été entreposé plus de 30 ou 40 jours, l'élément nutritif utilisé dans le milieu de culture de la présente invention peut être utilisé avec du sérum de mouton, que l'on trouve dans le commerce et qui a été stocké indéfiniment. Le sérum d'agneau peut être substitué au sérum de mouton. On doit remarquer que les cultures de leucocytes de cheval peuvent être cultivées en utilisant un sérum animal autre que le sérum de mouton, mais les résultats sont bien moins sûrs. De façon typique, l'utilisation d'un autre sérum ne maintiendra pas la culture au-delà d'un ou deux ou au plus quatre passages. Cependant, si la culture de leucocytes de cheval est développée et passée quatre à six fois dans le milieu contenant 40% de sérum de mouton et 60% de solution nutritive enrichie en aminoacides, les passages ultérieurs peuvent être poursuivis en utilisant un taux réduit de sérum de mouton, de façon typique un taux d'environ 20 %, ou du sérum d'un autre animal au taux de 20%. Le sérum bovin foetal est une exception et, à un taux de 20%, s'est révélé être excellent pour le passage continu des leucocytes de cheval. Des taux inférieurs de sérum peuvent être employés, mais le pourcentage des cellules qui vont persister à se développer après le passage diminue considérablement.Par exemple, la chute à un taux de 20 % du sérum (sérum de mouton ou sérum bovin foetal) après le quatrième passage continue à donner une culture, de laquelle 80% des cellules vont passer; si le taux du sérum est ensuite réduit à 10%, environ 40 à 50 % seulement des cellules vont passer. Des antibiotiques tels que la pénicilline, la streptomycine, ou analogue, peuvent être ajoutés en petites quantités (par exemple respectivement 200 unités/ ml et 200 pg/ml) à la solution nutritive. La seule exigence essentielle est que ces antibiotiques inhibent le développement des organismes indésirables sans inhiber le développement de la culture de leucocytes. Donc, conformément à l'un des aspects de la présente invention, on réalise un milieu de culture, pour créer une culture de cellules leucocytaires de cheval, à passage continu, qui comprend un milieu nutritif de base enrichi avec un mélange en aminoacides de L-arginine, L-cystine, et L-hystidine, ainsi que du sérum de mouton à un taux d'environ 40%. On fournit également un procédé pour créer le passage continu de cellules leucocytaires de cheval qui comporte l'utilisation de ce milieu. De plus, l'invention comprend le maintien des passages continus de cellules leucocytaires de cheval à l'aide d'un milieu nutritif similairement enrichi, ainsi qu'avec du sérum animal de préférence du sérum de mouton ou du sérum bovin foetal à un taux réduit d'environ 20 % du milieu de culture. Les taux de sérum et d'aminoacides dans le mélange d'aminoacides ne sont pas critiques, mais sont indiqués pour des résultats optimum. On a observé que les cultures primaires de leucocytes de cheval développées à partir de différents animal montrent des vitesses de développement différentes, des durées de maintien différentes,etc.Par exemple, les taux de concentration de L-arginine, L-cystine et L-histidine donnés ci-dessus sot considérés comme facultatifs. I1 a été trouvé que des cultures leucocytaires provenant de chevaux particuliers donnent d'excellents résultats avec des concentrations inférieures de ces ami noacides. Cependant, les concentrations accrues de ces aminoacides n'ont jamais donné lieu à l'observation d'in'nisition du développement de la culture. En particulier, en ce qui concerne les concentrations d'aminoacides, il apparait que le défaut d'un aminoacide particulier dans le mélange d'aminoacides enricnissant le milieu de base a pour effet une dégénérescence caractéristique des cultures de leucocytes de cheval. Ainsi, le défaut de L-arginine dans une culture de leucocytes de cheval a donné lieu à l'observation d'un arrondissement et d'un regroupement des cellules. Le défaut de L-cystine provoque l'aspect vitreux des cellules qui sont-légèrement rétrécies et fixées en place bien que non notablement arrondies. Le dé-faut de L-histidine produit un effet semblable à celui du défaut de L-arginine, cependant, le regroupement des cellules se présente en grappes telles que celles du raisin et les cellules ne présentent pas de signe de développement. Donc, conformément à la présente invention, les concentrations de L-arginine, L-cystine, et L-histidine peuvent être convenablement réglées à des taux optimum pour chaque culture de leucocytes comme le comprendra l'homme de l'art. Les milieux de base de culture de cellules qui peuvent être enrichis avec le mélange d'aminoacides pour fournir une solution nutritive utilisable dans les milieux de culture de leucocytes de cheval selon la présente invention sont connus. Les milieux de cette nature contiennent de façon typique un certain nombre d'aminoacides, de même que des vitamines, des sels inorganiques, d'autres éléments nutritifs tels que la bactopeptone ou les sucres organiques (par exemple,le dextrose) de même qu-'un indicateur de pH et un tampon. Des milieux connus de culture utilisables pour le développement de leucocytes humains et enrichis avec un mélange d'aminoacides- ont donné d'excellents résultats. Les milieux de base disponibles dans le commerce qui peuvent être ainsi enrichis comprennent : le milieu 199, milieu essentiel minimum (Eagle, H., Science, 130, 432, 1959) le milieu RPMI 1629 et le milieu RPMI 1640. Les observations de Moore et al (ci-dessus, Am.J. Vet. Res., March 1970) restent valables pour les milieux de culture conformément à la présente invention pour ce qui concerne le pH. La valeur du pH du milieu est importante pour la conservation de cette culture à passage continu. A des valeurs de pH inférieures à 6,7 la couche de cellule se détériore rapidement. La valeur optimale de pH du milieu pour l'implantation de la culture est d'environ 7,2 à 7,3. A des valeurs de pH supérieures à 7,3 les cellules n'adhèrent pas au verre et dégénèrent rapidement. Cependant pour le développement de la culture un pH optimal d'environ 7,6 à 7,8 s'est révélé souhaitable. En formulant la solution nutritive utilisée dans le milieu selon l'invention, il est préférable de réaliser tout d'abord un mélange en solution d'aminoacides constitué par de la L-arginine, de la L-cystine et de la L-histidine, en des proportions appropriées de façon que lorsqu'une petite quantité de mélange d'aminoacides est ajoutée au milieu (qui peut contenir un ou plusieurs des aminoacides) la teneur désirée des trois aminoacides soit obtenue. Lors de la préparation du mélange d'aminoacides, il est préférable de dissoudre tout d'abord la Lcystine dans la solution en utilisant suffisamment d'acide chlorhydrique (par exemple, de 1'HCl à 0,1 N). Après quoi la L-histidine est dissoute et enfin la L-arginine. La nature fortement basique de la L-arginine suffit à élever le pH du mélange au voisinage du point de neutralité.Un ajustement final du pH peut être fait à l'aide d'une addition d'acide chlorhydrique ou d'une solution de bicarbonate de soude. En variante, les trois aminoacides peuvent être ajoutés directement au milieu pour atteindre les teneurs désirées. La difficulté d'un tel procédé réside naturellement dans le fait qu'il est nécessaire de mesurer ces acides par milligrammes; la préparation d'un mélange d'aminoacides permettrait à de tels milieux de base d'être modifiés rapidement de façon répétée. Exemples Pour arriver à obtenir le milieu nutritif modifié de la présente invention, un certain nombre de cultures de leucocytes de cheval à passage continu ont été testées. Les cultures à passage continu sont préparées à partir de cultures primaires de leucocytes de cheval qui sont préparées selon le procédé et les-processus décrits par Moore et al (c'està-dire : "Equine Infectious Anemia IV, Nature of the Preciptinogen Found in Horses with EIA", Southwest Vet.l9, p.217, 1966; Equine Infectious Anemia-A Diagnostic Problem", Proc. U.S. Live- stock San A.,70, 255-260, 1966). Après l'établissement de la culture primaire, le procédé suivant est utilisé pour le passage continu. Le fluide est enlevé par décantation des couches de cellules et remplacé par 0,5 ml. de 0,05% de pronase dans une solution saline tamponnée de Hanks pour chaque millilitre de fluide de culture extrait. La culture est ensuite soumise à une incubation avec agitation intermittente à la température ambiante pendant 3 à 5 minutes. Lorsque les cellules commencent à glisser de la surface du verre, l'enlèvement peut etre effectué en repoussant le fluide de pronase contre la zone de multiplication cellulaire avec une seringue. La suspension est alors décantée dans un tube centrifuge contenant un mélange diluant de 0,1 ml de sérum de veau pour chaque partie de 5 à 10 ml de suspension cellulaire et un volume égal de milieu nutritif. Le sérum de veau est une source de protéine pour dénaturer la pronase et protéger les cellules leucocytaires. La suspension diluée est centrifugée à 2000 g pendant 10 minutes et le surnageant est retiré.Les cellules sont ensuite mises en suspension dans un milieu de culture comprenant 40 % de sérum de mouton et 60 % de milieu nutritif en quantité suffisante pour constituer une concentration de 300.000 cellules par ml et sont placées dans des récipients de culture, c'est-à-dire des tubes Leighton ou des bouteilles en plastique de culture de tissus. Un certain nombre de milieux nutritifs sont testés en utilisant ce procédé pour tenter de l'améliorer par rapport au milieu décrit par Moore et al (Am. J. Vet. Res., March 1970, ci-dessus) qui était essentiellement du sérum de mouton, en une proportion de 40%, 59,5% de milieu 199 et 0,5% d'hydrolysat de lactalbumine .Au début,des résultats quelque peu améliorés bien qu'hasardeux ont été obtenus dans un milieu similaire, où l'on avait remplacé le milieu 199 par le milieu RPMI 1629 et le milieu RPMI 1640. La poursuite des expériences a donné les résultats suivants.Le milieu nutritif A est le milieu RPMI 1629; le milieu B est le milieu RPMI 1640; le milieu C est- le milieu essentiel minimum (Eagle). Les formes lévogyres des additifs aminoacides ont été utilisées. Milieu Exemple Sérum Elément nutritif Résultats nO de mouton A 30% - B 30% égénérescence spontanée 1 40 % après 5 à 7 jours 2 40 % A 60 % ,Mêmes résultats que ci-dessus 3 40 % A 60 % +smg/î9a'îanine 4 40 % A 60 % +25mg/1 d'isoleucine Mêmes résultats que 5 40 po A 60 % +25mg/1 de phénylalanine dans l'exemple 2 avec le milieu A 6 40 % A 60 % +25mg/1 de proline seulement. 7 40 % A 60 % +25mg/l de tryptophane 8 40 % A 60 % +25mg/l de thréonine ... Toxique pour les 9 40 % A 60 % +25mg/l de tyrosine ... > dO 10 40 % A 60 % +50mg/l d'arginine La dégénérescence Isurvient mais l'ef et de regroupement let d 'arrondissement est éliminé. Comme résultat de ces tests, il apparaît que la L-arginine élimine au moins un type de dégradation. Bien que le milieu RPMI 1640 contienne de l'arginine à un taux assez élevé, la différence entre le milieu RPMI 1629 et le milieu RPMI 1640 n'avait pas été remarquée précédemment. Pour déterminer les taux optimum de L-arginine d'autres tests ont été poursuivis avec des cellules leucocytaires à passage continu provenant de deux chevaux. Milieu Exemple n Sérum Elément nutritif Résultats Cheval R de mouton 11 40 % A 60 /t50 mg/l d'arginine 12 40 % A 60 3,6+lOOmg/l d'arginine 13 40 % A 60 atl50mg/l d'arginine Proportion optimale Cheval P 14 40 % A 60 9t50mg/l d'arginine 15 40 % A 60 0/l00mg/1 d'arginine Proportion optimale 16 40 % A 60 /St150mg/1 d'arginine Comme pour l'ex.15 Dans les exemples 11 à 16, cependant la dégénérescence survint sous forme de cellules apparaissant fixées sur place et légèrement rétrécies. Du fait que le milieu RPMI 1629 ne contenait pas de Cystine, cet aminoacide a été ajouté. Exemple 17 - Dans une série d'essais similaires aux exemples 11 à 16, utilisant les cellules à passage continu du cheval R et du cheval P et chacun étant testé avec un milieu contenant 40 % de sérum de mouton et 60 % de milieu A (RPMI 1629) enrichi avec 25, 50 et 100 milligrammes par litre de L-cystine, les résultats ont montré que les cellules du cheval R donnaient les résultats opti mum à des concentrations de L-cystine de 100 mg/l, tandis que les cellules du cheval P se développaient de façon également bonne avec 50 mg/l. La concentration plus élevée de cystine ne gênait pas le développement des cellules du cheval P.La dégénérescence sous forme de regroupement et d'arrondissement était à nouveau remarquée, toutefois, bien qu'elle soit éliminée par une addition de L-arginine (ces cultures de cellules utilisées ont été soumises à plus de quatre passages et de là la remarque que des taux de sérum réduits n'affectaient pas les cultures). Milieu Exemple n Sérum Elément nutritif Résultats 18 mouton 30% A 700/o+50 mg/l Dégénérescence: 7 à d'arginine et 50mg/1 9 j. après 3 à 4 de cystine passages paraissant similaires à un défaut d'arginine. 19 mouton 30% A 60%+10% de HLA Inférieurs à ceux (hydrolysat de de l'exemple 18. lactalbumine) 20 mouton 12% )- 85 / 50mg/l d'ar- Développement pas porc 3% ) ginine et 50mg/l bon de cystine 21 mouton 20% A 80%+100 mg/l d'ar- Résultats excellents ginine et 50mg/1 avec le cheval P,mais de cystine plus faibles avec le cheval R 22 mouton 20% A 80 /F150 mg/l d'ar- Excellents pour les ginine et 100 mg/l deux souches de de cystine cellules à travers quatre passages 23 mouton 20% A 80%+150mg/l d'ar- Pas de dégénérescen ginine,lOOmg/l de ce pendant 8 jours cystine,20mg/l de ly- mais développement sine et 20 mg/l del' ralenti du fait de histidine. l'excès de lysine. 24 mouton 20% A 8O/0l50mg/1 d'ar- Excellent dévelop ginine, lOOmg/l de pement des deux cystine et 20mg/1 souches, pas de d'histidine. dégénérescence pen dant 8 jours. 25 bovin foetal Comme à l'ex.24 Excellent dévelop 20% pement dans les deux souches,pas de dégénérescence pendant 8 jours. 26 bovin foetal C 8O%+50mg/l d'argi- Résultats équiva 20% nine, 50mg/1 de cys- lents de ceux de tine et 20mg/1 d'his- l'ex.25 tidine Du fait que les milieux testés contenaient certains des acides du mélange d'aminoacides, on doit remarquer que les résultats des exemples 24, 25 et 26 ont été atteints avec une concentration totale d'acides suivante:: Milieu A enrichi Milieu C enrichi ex. 24 et 25 exemple 26 L-arginine 192,1 mg/l 176,4 mg/l (42,1 mg/l en (126,4 mg/l an tant que L-argi- tant que L-argi nine HC1) nine HC1; L-cystine 50 mg/l 74 mg/l L-histidine 40,9 mg/l 61,9 mg/l (20,9 mg/l en (41,9 mg/l en tant que L-his- tant que L-histi tidine HC1 H20) dine HC1 H20) Il devrait apparaître que l'inhibition du développement et la détérioration des cellules leucocytaires de cheval proviennent en premier lieu de l'absence des aminoacides :L -arginine, L-cystine et L-histidine et qu'un milieu de base de type satisfaisant pour la culture de cellules leucocytaires humaines enrichi par ces aminoacides agirait de façon satisfaisante pour permettre le passage continu afin de cultiver des couches de cellules montrant un temps de maintien de plus de huit jours au moins. Comme on peut le voir d'après les données ci-dessus, différentes souches de cellu les leucocytaires de cheval de différents animaux exigent des teneurs optimales différentes en ces aminoacides.Mais comme minimum général, la solution nutritive enrichie de façon minimale pour le passage continu de leucocytes de cheval conformément à la présente invention doit contenir environ 140 mg/l de L-arginine, 50 mg/l de L-cystine et 40 mg/l de L-histidine, en même temps que d'autres aminoacides, des vitamines, des sels inorganiques, et analogues, présents dans le milieu de culture de leucocytes humains tels que le milieu essentiel minimum (Eagle), le milieu 199, le milieu RPMI 1629, le milieu RPMI 1640 ou les milieux analogues. Les aminoacides enrichissants peuvent être présents sous forme de base libre, ou de sel, par exemple de sel d'acide chlorhydrique. Les concentrations maximum qui paraissent nécessaires pour toute souche de leucocytes de cheval sont d'environ 200 mg/l de L-arginine,- 100 mg/l de L-cystine et 60 mg/l de L-histidine.Cependant, on comprend que l'enseignement de la présente invention donne à l'homme de l'art le moyen de composer de façon satisfaisante des milieux pour des cultures à passage continu de leucocytes de cheval, et que les leucocytes, à passage continu, de différents chevaux peuvent montrer des besoins en ces aminoacides différant légèrement. Conformément à un second aspect de la présente invention, on a trouvé que les cultures leucocytaires de cheval à passage continu rapportées par Moore et al (Am.J.Vet. Res., March 1970, voir ci-dessus) sont sujettes à l'infection par le virus de souche sauvage de 1'AIE. Comme il est fait remarquer plus haut, le milieu amélioré de la présente invention est de préférence utilisé pour développer des cultures à passage continu bien que celles rapportées précédemment soient également sujettes à l'infection. On a trouvé, conformément à l'invention, que le virus de 1'AIE, qui a été conditionné par de multiples passages dans des leucocytes de cheval en culture continue, présente un caractère modifié à deux égards: 1. Le virus de 1'AIE qui a été conditionné par au moins une certaine quantité de passages dans des cultures leucocytaires de cheval, à passage continu, est susceptible d'infecter d'autres tissus équins, tandis que le virus de souche sauvage isolé directement d'un cheval infecté n'infectera apparemment pas d'autres cultures de tissus que les cultures primaires de leucocytes de cheval et les cultures à passage continu. 2. Le virus de l'AIE qui a été conditionné par le passage dans des cultures leucocytaires de cheval à passage continu ne révèle pas la présence d'un second antigène qui a été caractérisé comme étant une protéine anormale. On a observé que le virus de 1'AIE est comparativement lent à mûrir dans toute culture de tissus. L'effet cytopathique n'est habituellement pas du tout évident avant le quatrième jour qui suit l'inoculation et n'est complet et concluant qu'à partir du sixième au huitième jours après inoculation. Lors de la préparation de cultures, pour démontrer la sensibilité des cultures leucocytaires de cheval, à passage continu, au virus de 1'AIE de souche sauvage, on a utilisé le procédé défini ci-dessus. Le milieu employé était 50% de milieu 199, 40% de sérum de mouton et 10% d'hydrolysat de lactalbumine. La substitution du milieu 199 par du milieu RPMI 1640 dans les dernières parties de l'expérience a donné un développement cellulaire un peu plus satisfaisant dans ces dernières cultures. Les cultures ont été infectées en inoculant la culture, avec ou bien du plasma provenant d'un cheval infecté ou bien avec une culture à passage continu qui avait été infectée et ensuite soumise à un passage dans des leucocytes de cheval à passage continu. Le développement du virus dans les cultures à passage continu a été réalisé par inoculation de la culture,après le développement d'un effet cytopathique suffisant (au moins un effet cytopathique de 50% , aux environs du cinquième ou du sixeme jour après l'inoculation) le virus étant séparé de la culture en congelant rapidement la culture à -200C. c'ans de l'azote liquide ou analogue et ensuite en permettant une décongélation lente à température ambiante pour provoquer la rupture des parois cellulaires de la culture.On suppose que le virus de 1'AIE est orienté très directement par rapport à la cellule elle-meme dans la mesure où il a été nécessaire de répéter cette opération de congélation-décongélation retardée à plusieurs reprises dans le but d'obtenir une suspension de virus d'un titre viral q-timum. Plus d'un cycle est nécessaire et de façon typique, trois cycles de congélation-décongélation sont nécessaires pour libérer le virus en une concentration satisfaisante. A la suite de la libération du virus par ce procédé, la culture est centrifugée pour séparer les débris de cellules de la suspension virale surnageante. Ce surnageant pourraient ensuite être utilisé pour inoculer d'autres couches de cellules pour le passage du virus ou pour l'inoculer à des chevaux afin de détecter les signes cliniques de 1'AIE. Exemples - Une culture primaire de leucocytes ayant subi huit passages qui s'est révélée contenir précédemment un virus infectieux de souche Texas a été passée sept fois dans des leucocytes de cheval à passage continu. Un effet cytopathique est remarqué du cinquième au sixième jours après le passage initial et après des passages ultérieurs un effet cytopathique de 70 à 80 % survint au cinquième ou sixième jour. Des fluides provenant du quatrième passage sont inoculés à un cheval A non-infecté. Le cheval a montré un développement de signes cliniques de 1'AIE au neuvième jour après l'inoculation. Le plasma prélevé sur le cheval le premier et le cinquième jours avant l'inoculation n'a pas provoqué d'effet cytopathique dans une culture leucocytaire de cheval à passage continu, mais le plasma recueilli le neuvième jour après l'inoculation (jour du premier signe clinique consistant en une élévation de la température) a provoqué un effet cytopathique typique dans les leucocytes de cheval à passage continu. Le fluide du quatrième passage utilisé pour être inoculé au cheval A est à nouveau passé dans les leucocytes de cheval à passage continu et la suspension virale filtrée à travers un filtre à pores de 5Omu de diamètre.Lorsque ce filtrat a été inoculé au cheval D, des signes cliniques sont apparus et le plasma, après inoculation, a provoqué un effet cytopathique dans les cultures leucocytaires de cheval à passage continu tandis que le plasma prélevé avant inoculation n'avait eu aucun effet cytopathique. En tant que contrôle, une culture primaire à huit passages de leucocytes de cheval, semblable à celle infectée dans l'exemple ci-dessus a été passée six fois dans des leucocytes de cheval à passage continu et le fluide de culture résultant a été inoculé à un cheval D non-infecté. Le cheval n'a montré aucun signe clinique et ni le plasma de préinoculation ni celui de postinoculation du cheval D, n'a provoqué d'effet cytopathique dans des leucocytes de cheval à passage continu. I1 a également été démontré que le virus de 1'AIE de souche Illinois peut être développé et soumis au passage dans des cultures à passage continu pour produire un virus infectieux. Après 5 passages du virus de 1'AIE de souche Illinois dans des leucocytes de cheval à passage continu, le fluide de culture est filtré à travers un filtre à pores de 50m; de diamètre. Le cheval C auquel a été inoculé le filtrat a montré des signes cliniques de 1'AIE et le plasma de ce cheval a produit un effet cytopathique dans des leucocytes de cheval à passage continu, tandis que le plasma de pré-inoculation n' avait pas produit un tel résultat. La souche illinois est apparue comme provoquant un effet cytopathique dans des cultures continues environ 24 à 36 heures plus tôt que ne le fait la souche Texas. Bien que le virus de 1'AIE isolé provenant de chevaux infectés produise un effet cytopathique dans des cultures primaires ou à passage continu de leucocytes de cheval, aucune trace de virus n'a été trouvée dans d'autres tissus équins lorsq'-a'on y a inoculé du plasma infecté par 1'AIE. Cependant, il a été trouvé qu'en conditionnant le virus de 1'AIE par de multiples passages dans un milieu de leucocytes de cheval en culture continue, que le virus infectera alors d'autres tissus équins tels que des cellules aortiques de cheval des cultures de rein équin, de testicule équin, et la lignée cellulaire dermique équine CCL 57. Le milieu amino-acide enrichi décrit ci-dessus a été trouvé extrêmement valable pour des cultures équines en développement qui doivent développer avec succès le virus infectieux de 1'AIE. I1 apparait que la mesure du nombre de passages de leucocytes de cheval à passage continu à travers lesquels le virus est conditionné élargit le nombre des types de cultures de tissus que le virus peut infecter. Un minimum d'environ quatre passages dans un milieu de culture continue de leucocytes de cheval est nécessaire pour obtenir un titre viral satisfaisant d'environ 105 à 106. A ces taux de titre, le virus de 1'AIE passé à travers des cultures continues de leucocytes de cheval infectera d'autres cultures de cellules équines. I1 a été vérifié, avec d'autres virus, que de passer à plusieurs reprises le virus dans des cultures de cellules convenables augmente souvent le nombre de types de cellules susceptibles d'être infectées par le virus. I1 a été trouvé, conformément à la présente invention que le virus de souche Illinois passé 5 fois dans un milieu continu de leucocytes infectera des cultures de cellules aortiques de cheval. Ces cultures de cellules aortiques de cheval sont apparues comme les plus sensibles à l'infection, étant donné que d'autres passages ont été nécessaires pour infecter le rein équin, le testicule équin et la lignée CCL 57 de cellules dermiques équines.La sensibilité de ces cultures indique qu'un large éventail de cultures de cellules équines peut être infecté par le virus de 1'AIE conditionné par passage à travers les cultures continues de leucocytes de cheval selon la présente invention. Le procédé de passage continu utilisé est semblable à celui présenté ci-dessus. Le milieu pour un tel passage conditionnant est,de préférence, la solution nutritive enrichie en L-arginine, L-cystine et L-histidine, de la présente invention ainsi qu'avec 20 à 40% en poids de sérum de mouton. Lorsqu'une couche de cellules complètement développée a subi l'inoculation, le taux de sérum dans le milieu peut être réduit à aussi peu que 10%, pour fournir un milieu d'entretien. Le contrôle est naturellement fourni par ce même milieu d'entretien.Comme signalé ci-dessus, les taux inférieurs de sérum de mouton peuvent être utilisés lorsque les cultures de cellules à passage continu ont été soumises au passage environ quatre fois ou plus.Cependant, il faut remarquer que bien que le milieu nutritif de la présente invention soit préféré pour à la fois soumettre au passage les leucocytes de cheval à culture continue et pourconditionner le virus afin de le rendre apte à attaquer d'autres cellules, d'autres milieux de base tels que le milieu 199, le milieu RPMI 1629, le milieu RPMI 1640 ou des milieux analogues peuvent également être utilisés. Le passage du virus environ quatre fois au moins dans les leucocytes de cheval, à passage continu, apparaît nécessaire afin de conditionner le virus pour infecter d'autres cultures de tissus équins. En tout cas, quatre passages au moins sont de préférence utilisés dans le but d'obtenir un titre viral suffisant pour des inoculations ultérieures à des cultures d'autres tissus. Le nombre de passages nécessaires pour développer le virus infectieux dans les cultures de tissus équins autres que les leucocytes de cheval de cultures primaires ou à passage continu varie selon la culture de tissus a infecter et parait différer selon la souche de virus (par exemple les souches Texas, Illinois, ou Wyoming, etc.) que l'on a cherché 9 conditionner. Exemples - Une culture de cellules aortiques dz cheval est préparée à partir d'une portion d'aorte équin, liée aux deux extrémités et retirée de façon aseptique du cheval lors de l'autopsie. L'aorte est- placée dans une chambre stérilisée et est coupée longitudinalement entre les artères intercostales. Le caillot de sang est retiré et la surface interne est lavée 3 fois avec le milieu 199 en enlevant les liquides de lavages par aspiration. La surface interne de l'aorte est humidifiée avec le milieu complet ci-dessous. L'aorte est doucement grattée avec le bord arrière d'un scalpel. Les cellules retirées par le grattage et mises en suspension dans une petite quantité de milieu, sont retirées par aspiration avec une seringue stérile. La suspension de cellules concentrées est diluée avec un milieu complet jusqu'à dilution d'approximativement 105 cellules/ml. Dans ces expériences, le milieu complet consiste en 70 ml de milieu 199 IX, 10 ml de 5% d'hydrolysat de lactalbumine HIA dans de l'eau distillée, et 20 ml de sérum de mouton. Lors du 6ème passage, le milieu 199 est remplacé par du milieu RPMI 1640. Des cultures leucocytaires de cheval, à passage continu, ont été cultivées--comme ci-dessus. Lorsque les couches complètes de cellules ont été développées, les cultures ayant reçu l'inoculation et les cultures de contrôle ont toutes été placées dans un milieu d'entretien, où le taux de sérum de mouton était de 10 %. Les cultures de testicule et de rein équins ont été développées de manière standard. Par exemple, le rein de cheval a été retiré aseptique ment et le tissu cortical a été séparé et aminci à l'aide d'un bord tranchant. Après avoir soumis les tissus à la trypsine,les cellules ont été séparées par centrifugation,nettoyées de la trypsine et mises en suspension dans un milieu de 400 ml de milieu essentiel minimum enrichi d'aminoacides selon la présente invention et l'exemple 26 ci-dessus, 100 ml de sérum bovin foetal, 50 ml d'une solution contenant 0,5% d'hydrolysat de lactalbumine, 4 ml de L-glutamine et de petites quantités d'antibiotiques, pénicilline et streptomycine. Ce milieu a été utilisé tant pour les cultures de rein que pour celles de testicule. Le tableau suivant montre que le conditionnement du virus de 1'AIE dans les leucocytes de cheval à passage continu est nécessaire pour produire une souche de virus susceptible d'infecter d'autres cultures de tissus équins.Les inoculations indiquées sont celles des diverses cultures de cellules qui sont signalées. Exemples nO Inoculation Culture Résultat 27 Plasma infecté 6ème passage de Pas d'effet cyto cellules aorti- pathique dans la ques de cheval culture aortique primaire ou après 3 passages dans la culture aorti que. 28 Fluide de cul- Leucocytes de Pas d'effet cy ture provenant du cheval,à pas- topathique. 3ème passage dans sage continu les cellules aor tiques de l'ex.27 29 Plasma infecté Leucocytes de Effet cytopathi cheval à pas- que en 5 à 6 jours sage continu 30 Filtrat de 50m,u 6ème passage Pas d'effet cyto de virus de 1'AIE de cellules aor- pathique remarqua Texas cultivés dans tiques de ble au niveau du des cultures de leu- cheval lerpassage;effet cocytes de cheval à cytopathique si passage continu milaire à celui de l'ex.29,après le second passage. 31 5ème passage du 6ème passage Pas d'effet cyto virus Illinois de de cellules pathique remarquer 1'AIE en continu aortiques ble au niveau du de cheval premier passage; effet similaire à celui de l'ex. 29 après le se cond passage. 32 Virus de 1'AIE de Rein équin Léger effet cyto souche Texas culti- pathique au 4ème vé dans 8 cultures jour,100% d'ef primaires et 11 fet cytopathique cultures de leuco- au cours du 6ème cytes de cheval à jour. passage continu NO Inoculation Culture Résultat 33 Virus de l'AIE Testicule Léger effet cy Texas cultivé équin topathique au 4ème dans 8 cultures jour;maximum 80% primaires et 11 d'effet cytopathique cultures de leu- au cours du 7ème jour. cocytes de che val à passage continu 34 Virus de 1'AIE Lignée CCL 57 Léger effet cytopa cultivé dans 8 de cellules thique au 4ème jour; cultures primai- dermiques é- 50 % d'effet cyto res et 11 cultu- quines pathique au cours du res à passage 6ème jour. continu de leuco cytes de cheval 35 Virus de 1'AIE Rein équin Pas d'effet cytopa Texas,cultivé thique après 3 passa dans 8 cultures ges dans du rein équin primaires et 6 cultures à pas sage continu de leucocytes de cheval 36 Fluide de culture Leucocytes de Pas d'effet cytopa provenant du 3ème cheval à pas- thique. passage dans le sage continu rein de l'ex.35 Comme on peut le voir d'après les résultats ci-dessus, des passages en nombre accru du virus sur des leucocytes de cheval en continu permet au virus d'infecter un plus grand nombre de types de tissus équins. I1 apparaît également que certaines cultures de tissus équins sont plus résistantes à l'infection que d'aF tres. Cependant, le développement d'un virusde 1'AIE susceptible d'infecter d'autres tissus est d'une grande importance pour la culture d'un vaccin de 1'AIE. Bien qu'un vaccin puisse être formulé à partir d'un virus développé dans des cultures leucocytaires de cheval à passage continu, la nature antigénique des cellules leucocytaires elles-mêmes pourrait aboutir à la création d'un anticorps antilymphocytaire dans les chevaux inoculés par le vaccin.D'autres cultures de cellules équines telles que le rein équin offrent un milieu bien préférable pour la formulation finale du vaccin définie ci-dessous, du fait de leur antigénicité réduite. Le passage multiplié du virus de 1'AIE sur des cultures de leucocytes de cheval à passage continu, produit une autre modification du virus de 1'AIE, en plus de celle le rendant infectieux pour d'autres tissus équins. Après le conditionnement du virus de 1'AIE par de multiples passages à travers des leucocytes de cheval à passage continu, le virus présente des signes qu'il ne contient qu'un seul antigène. Cependant le plasma de chevaux infectés et le virus de 1'AIE développé dans des cultures primaires de leucocytes de cheval montrent la présence de deux antigènes, le second antigène ayant été identifié comme un revêtement viral secondaire d'une protéine anormale comme définie ci-dessus. La figure 1 est une courbe d'élution de gel prise à 260 mu sur des fluides de culture de cellules qui sont le résultat de 8 passages de virus de l'AlE dans des cultures primaires de leucocytes de cheval. Les courbes d'élution de gel ont été obtenues en utilisant des cultures primaires de leucocytes de cheval. Les courbes d'élution de gel ont été obtenues en utilisant ce-s fluides de culture primaire concentrés par de la polyvinylpyrrolidone à l'aide de la technique rapportée par Moore et al (J.A.V.M.A., July 15, 1969, voir ci-dessus) et les courbes sont similaires à celles rapportées par Moore et al dans cet article. Les éluats ont été rassemblés dans des quantités de 5 ml contrôlees au spectrophotomètre.La différence dans la forme de la courbe rapportée par Moore et al et celle apparaissant dans la figure 1 est due à la longueur d'onde de contrôle utilisée. La longueur d'onde de 260 mu utilisée pour produire la courbe d'élution de gel des figures 1 à 3 rend minimale la hauteur du second pic représentant la protéine anormale. La fraction 1 représentée dans le graphique A de la figure 1 montre le caractère des particules virales, tandis que la fraction 2 est composée de protéines de tailles variables. La fraction 3, en traits discontinus serait atteinte si la courbe d'élution était prolongée et a été rapportée par Moore et al comme étant principalement une fraction d'aminoacides. Cette fraction n'est pas antigénique pour les chevaux et a été rapportée comme existant dans un milieu de culture leucocytaire normal. La figure 2 représente deux courbes d'élution de gel à 260 mu réalisées comme celles de la figure 1 à partir de fluides de culture de cellules infectées. La courbe B représentée en trait plein a été obtenue à partir de fluides concentrés après que le virus ait subi 8 passages dans des cultures primaires de leucocytes de cheval et six passages dans des leucocytes de cheval à passage continu. La courbe C en traits interrompus recouvre virtuelle ment la courbe B et a été obtenue à partir de fluides de culture de cellules concentrées après que le virus de 1'AIE ait été passé 8 fois dans une culture primaire de leucocytes et 11 fois dans une culture de leucocytes de cheval à passage continu.Ces courbes d'élution de gel représentent un grand pic, de fraction A, des particules virales mais ne montre pas de signe d'une seconde fraction dans la zone du pic de protéine anormale obtenu dans la courbe de la figure 1 du virus soumis seulement au passage dans les cultures primaires. Un pic aminoacide mineur a été décelé dans chacune des courbes C et B et a été identifié comme fraction 3. Des courbes d'élution de gel ont été établies a partir de concentrations de plasma de cheval porteur de 1'AIE et à partir de plasma d'un cheval non-infecté pour réaliser respectivément les courbes D et E. te plasma du cheval porteur a montré un grand pic de fraction 1 de même qu'un second pic de fraction 2 qui a été identifié comme une protéine anormale. Le plasma du cheval noninfecté n'a'montré aucun pic identifié comme étant l'une quelconque de ces fractions Ces courbes montrent qu'après le passage du virus de 1'AIE dans des leucocytes de cheval à passage continu, le virus est modifié.La protéine anormale ou seconde fraction., normalement associée au virus et produite dans les cultures primaires, n'est plus produite après au moins quelques passages continus. I1 est nécessaire de passer le virus de 1'AIE environ quatre ou cinq fois au moins pour obtenir un titre viral suffisant de 105 à 106 pour permettre l'analyse, les essais et l'observation du virus. I1 ne parait pas que la disparition de la protéine anormale affecte la nature infectieuse du virus du fait que les courbes, après six ou onze passages continus, sont très semblables bien que la première culture n'infectait pas le rein équin tandis que le faisait la dernière. Conformément à cet aspect de l'invention, on réalise un procédé pour produire un virus de 1'AIE à propriété antigénique supérieure, identifiable par le fait d'aucune présence discernable de protéine anormale, en soumettant le virus de 1'AIE à un passage à travers une culture continue de leucocytes de cheval du type décrit ci-dessus. Les milieux utilisés pour le passage continu de ce virus sont tels que décrits ci-dessus. Répétons que les milieux enrichis avec certains aminoacides tels que définis ci-dessus sont préférés, bien que le passage du virus utilisant d'autres-milieux de base réussisse de même à fournir un virus à propriété antigénique supérieure. Conformément à un autre aspect de la présente invention, un vaccin de virus tués pour l'immunisation de chevaux contre 1'AIE est préparé en cultivant le virus passé sur des leucocytes de cheval à passage continu dans un milieu de culture de cellules possédant un minimum d'antigénicité à l'égard des chevaux, en tuant le vaccin avec de la béta-propiolactone et en combinant le vaccin obtenu avec un adjuvant compatible. Pour préparer le vaccin, une culture de rein équin primaire subit l'inoculation d'un virus de 1'AIE élevé en pool, passé sur des leucocytes de cheval à passage continu et possédant un titre viral de 105 ou supérieur. D'autres cultures de cellules telles que celles de testicule équin, des leucocytes de cheval à passage continu, des cellules aortiques de cheval, ou analogues peuvent être utilisées. I1 est particulièrement souhaitable de choisir une culture de cellules qui aient un minimum d'antigénicité à l'égard des chevaux et qui, naturellement soient infectées par le virus de 1'AIE. De ce fait, les effets antigéniques potentiels, particulièrement des cellules aortiques de cheval et des leucocytes à passage continu rendent ces cultures moins favorables pour la formation du vaccin.L'inoculation dans la culture est effectuée à un dosage d'environ 0,1 ml de pool de virus par millilitre de fluide de culture. Le milieu utilisé pour le développement du virus dans la culture choisie est de préférence le milieu nutritif enrichi d'aminoacide de la présente invention, avec environ 20% de sérum de mouton ou de sérum bovin foetal. Le virus peut être soumIs aux passages nécessaires pour faire monter le titre viral. Après environ trois à quatre jours dans le passage final, le milieu est changé comme dans la pratique générale, mais est remplacé par un milieu dépourvu de sérum de mouton antigénique ou de sérum bovin foetal et comprenant du milieu nutritif ainsi qu'une petite quantité d'hydrolysat de lactalbumine, de façon typique 0,5 ml par 100 ml de milieu. Ceci diminue encore l'effet antigénique inutile sur le cheval ayant subi l'inoculation. Après environ 6 à 7 jours ou lorsque 90 % ou plus des cellules montrent un effet cytopathique, le virus est moissonné à l'aide de congélations et décongélations répétées comme décrit ci-dessus pour obtenir une séparation optimum du virus des cellules de culture. Un échantillon de pool de virus est testé et si le titre viral de 105/0,1 ml ou plus est obtenu, le pool est traité pour tuer le virus. Il a été trouvé que le virus peut etre tué par addition d'environ 0,5 à 1 partie de béta-propiolactone pour 1000 parties de pool de virus. L'antigène inactivé reçoit alors une vérification de stérilité standard convenable, après quoi les échantillons sont souhaitablement inoculés à des cultures leucocytaires de cheval à passage continu dont l'effet cytopathique est contrôlé. Si aucun effet cytopathique n'apparaît, la suspension de virus tués est combinée avec une quantité égale d'un adjuvant compatible. On doit remarquer que certains adjuvants bien connus tels que l'adjuvant complet de Freund peut avoir des effets defavorables sur les chevaux. Le vaccin de la présente invention a été testé avec un adjuvant à émulsion huile-dans-l'eau de même qu'avec un adjuvant de gel aqueux comprenant une suspension d'hydroxyde d'aluminium non-réactif. Cet adjuvant aqueux comprend une suspension aqueuse à 2 % d'hydroxyde d'aluminium (calculé en oxyde d'aluminium) précipitée à partir d'une solution de chlorure d'aluminium par addition d'un excès d'hydroxyde d'ammonium et lavée à l'eau. exemples - Un pool de virus a été préparé en faisant passer 8 fois le virus de 1'AIE dans des leucocytes primaires de cheval, 6 fois dans des leucocytes de cheval à passage continu et 6 fois dans des cellules aortiques de cheval. Des tests ont été faits pour assurer l'efficacité d'un agent satisfaisant pour tuer ou inactiver le virus. La chaleur est souvent utilisée et on a trouvé que 0,3%de formaline inactivait le virus de 1'AIE. La béta-propiolactone a été rapportée comme un agent inactivant pour le virus de la maladie de Newcastle et le virus de la rage d'embryon de canard. Un échantillon de 100 ml de suspens ion de virus a été chauffé à 560C pendant 90 minutes tandis qu'un second échantillon de 100 ml a été traité avec 0,3% de formaline (0,3 cc/lOO ml de fluide de culture de tissus) pendant 28 jours. De petites quantités ont été retirées de chaque échantillon et injectées dans des tubes de Le ight on contenant des cultures de leucocytes de cheval à passage continu à un dosage de 0,25 ml 0,50 ml, et 1,0 ml de pool de virus par tube. Les cultures inoculées par l'échantillon traité à la chaleur n'ont montré aucun effet cytopathique. Les cultures des tubes ayant reçu 1,0 ml de de virus traité à la formaline ont montré un effet cytopathique au bout de 5 jours tandis que celles des tubes ayant reçu des taux inférieurs ont montré des traces douteuses d'effet cytopathique après 5 jours. Un contrôle de stérilité standard dans chaque antigène inactivé a été fait par inoculation du virus dans des tubes d'Agar et de sang bovin, d'Agar tryptose et d'Agar de Sabaroud au dosage de 0,5 ml par tube. Aucune colonie de bactéries n'a été observée dans l'un quelconque des tubes après quatre jours. La béta-propiolactone a été utilisée pour traiter le virus du même pool. Une partie par volume de propiolactone a été ajoutée à 100 parties de pool de virus et des tests de stérilité et de sécurité ont été exécutés comme ci-dessus. Aucune trace de bactérie n'a été trouvée dans le test de stérilité et aucun effet cytopathique n'a été décelé dans le test de sécurité. Pour déterminer la concentration sûre minimale de béta-propiolactone pour inactiver complètement le virus, des pools de virus de titres viraux divers sont préparés et sont traités avec des quantités décroissantes de béta-propiolactone. A des concentrations en volumes de 1 partie pour mille et 1 partie pour deux mille, la béta-propiolactone (BPL) a inactivé avec succès le virus de 1'AIE à des taux titrant 10 à 106 comme il est confirmé par l'absence d'effet cytopathique dans les leucocytes de cheval à passage continu.A un taux de concentration de une partie de BPL pour 4000 de suspension de virus, l'effet cytopathique apparait dans les cultures à passage continu à un taux titrant 10 . I1 apparait donc que 0,5 à 1 partie pour 1000 de BPL doit inactiver le virus à des taux dont les titres peuvent être augmentés. Par sécurité, une concentration d'environ 1 partie pour 1000 de BPL est préférée. L'antigénicité du virus tué avec ces agents divers a été comparée par la formulation d'un vaccin de virus inactivé à l'aide d'un adjuvant, en parties égales.Les adjuvants employés sont l'adjuvant d'hydroxyde d'aluminium en gel aqueux, ci-dessus, et un adjuvant-émulsion huile-dans-l'eau. Des chèvres ont reçu à deux reprises l'inoculation de 10 ml de chaque vaccin expérimental, les i,soculations étant espacées de 29 jours. (Les inoculations ont été également faites sur deux chèvres avec le vaccin ne contenant aucun adjuvant, le dosage étant seulement de 5 ml). Les chèvres ont été saignées 28 jours après la seconde injection et le sérum obtenu a été testé par comparaison avec ceux de chevaux positifs connus, dans un test standard à l'anticorps fluorescent pour déterminer la réponse antigénique provoquée par le vaccin. Le test l'anticorps fluorescent sur les chèvres avant la pre mièvre inoculation n'a indiqué aucun anticorps qui aurait pu réagir avec le virus de 1'AIE provenant de chevaux infectés connus. Les résultats sont donnés ci-dessous. Chèvre Exemple Agent Adjuvant Test à l'anticorps NO inactivant Résultat 37 chaleur Emusion O 38 chaleur Emulsion 1:5 39 BPL (N-propio- Emulsion 1:160 lactone) 40 BPL Emulsion 1:320 41 .BPL Aqueux 1:40 42 BPL Aqueux 1:80 43 BPL Aucun 1:10 44 BPL Aucun 1:20 45 Formaline Emulsion O 46 Formaline Emulsion O Immédiatement après la seconde saignée, les chèvres ont reçu l'inoculation d'une troisième dose de vaccin. Un autre essai à l'anticorps fluorescent après 38 jours a donné une réponse positive de l'anticorps pour les chèvres des exemples 39 à 42. Par conséquent, la béta-propiolactone est l'agent préféré pour l'inactivation du virus de 1'AIE, du fait qu'il possède le minimum d'effet défavorable sur l'antigénicité du virus tué. L'immunisation des chevaux est réalisée conformément à l'invention en injectant le vaccin aux chevaux par voie intramusculaire. De multiples inoculations sont de préférence entreprises, pour établir au moins deux réponses d'anticorps chez l'équin vacciné. Par conséquent, il est préférable d'administrer le vaccin en deux inoculations, de préférence séparées par au moins deux semaines environ, bien qu'il soit préférable d'espacer les inoculations l'une de l'autre d'au moins quatre semaines. Une réponse sérologique positive des chevaux vaccinés a été démontrée par des études de neutralisation de sérum sur plasma et des études à l'anticorps fluorescent sur des leucocytes de chevaux ayant été inoculés. De plus, une courbe d'élution sous forme de gel pris sur un cheval ayant reçu lrinjection d'une grande quantité de vaccin n'indique qu'un seul pic d'anticorps correspondant à une particule virale interne, et aucun pic d'anticorps correspondant à un antigène de protéine anormale. Un vaccin (exemples 41 à 63) a été préparé à partir du virus de 1'AIE de souche Texas soumis à des passages répétés sur une culture de leucocytes de cheval à passage continu et développé dans une culture de rein équin préparée comme ci-dessus tandis qu'un autre (Ex.64 à 74) a été préparé dans une culture aortique. L'inactivation du virus a été réalisée avec de la béta-propiolactone. Les cultures de contrôle qui n ont pas été infectées par le virus mais qui ont été, pour le reste, préparées de manière identique ont été utilisées comme contrôles de la vaccination des chevaux. L'inoculation a été faite à l'aide de deux doses de 10 cc de vaccin consistant en 5 cc d'antigène inactivé et 5 cc de l'adjuvant indiqué. Les inoculations ont été faites aux chevaux par voie intramusculaire et espacées l'une de l'autre par quatre semaines. Les chevaux ont été soumis à 1 millilitre de virus possédant le taux de dosage indiqué d'infection minimum (d.i.m.) des souches Wyoming et Texas. On a trouvé préférable d'inoculer aux chevaux un vaccin préparé à partir d'une souche de virus différente de celle à laquelle le cheval pouvait être exposé. En conséquence,dans certains cas, l'inoculation aux chevaux d'un vaccin préparé à partir d'au moins deux souches de virus permet une immunisation optimum. Des résultats sont donnés ci-dessous. L'adjuvant émulsion est un adjuvant émulsion huile-dans-l'eau préparé à l'aide d'huile blanche médicinale à laquelle on se réfère ci-dessus,alors que l'adjuvant aqueux est du gel d'hydroxyde d'aluminium non réactif dont il est question ci-dessus. Exemple et Agent Adjuvant Résultats Cheval NO d'attaque et et dosage ~~~~~~~~ ~~~~~~~~~ 47 Wyoming Emulsion Tous les chevaux ont pré d.i.m. 1000 senté des signes cliniques bénirs à modérés caractéristiques de 1'AIE chronique. 48 Texas,d.i.m. Emulsion dO 1 million 49 Texas,d.i.m. Emulsion dO 1 million 50 Wyoming,d.i.m. Emulsion dO 1000 Exemple NO Agent d'at- Adjuvant Résultats taque et do sage 51 Wyoming,d.i.m. Aqueux Pas de signes cliniques 1000 pendant 1 an. 52 Texas, d.i.m. Aqueux Signes cliniques bénins 1 million 53 Wyoming,d.i.m. Aqueux Pas de signes cliniques 1000 pendant 1 an 54 Texas,d.i.m. Aqueux Signes cliniques bénins 1 million 55 Texas,d.i.m. Culture Signes cliniques sérieux. 1 million de contrô- Mort le 65ème jour le+aqueux 56 Wyoming,d.i.m. Culture Mort le 21ème jour. de contrô 1000 ie+aqueux 57 Texas,d.i.m. Culture de Signes cliniques sérieux; 1 million contrôle+ Mort le 71ème jour aqueux 58 Wyoming,di.m. Culture de Mort le 23ème jour 1000 contrôle+ aqueux 59 200 ml de sang Pas de Pas de signe clinique de l'ex.51 pré- vaccin levé 60 jours après l'attaque 60 200 ml de sang Pas de Pas de signe clinique de l'ex.53 pré- vaccin levé 60 jours après l'attaque 61 wyoming, d.i.m. 10% de Signes cliniques sérieux 1000 Dextran D après 15 jours. dans un sérum physiologi que salin 62 wyoming,d.i.m. Culture de Signes cliniques sérieux 1000 contrôle+ après 20 jours + adjuvant Dextran D 63 Wyoming,d.i.m. Emulsion Signes cliniques bénins 1 million au 15ème jour 64 Texas,d.i.m. Emulsion Signes cliniques bénins 100 millions au 15ème jour. 65 Texas,d.i.m. Emulsion Signes cliniques bénins 100 millions au 14ème jour 66 Texas, d.i.m. Emulsion Signes cliniques bénins 100 millions au 16ème jour 67 Wyoming,d.i.m. Contrôle Mort le 14ème jour 1 million Emulsion Exemple NO Agent d'at- Adjuvant Résultats taque et do sage 68 Texas,d.i.m. Contrôle + Mort le 28ème jour 100 millions Emulsion 69 Wyoming,d.i m. Contrôle Signes cliniques sérieux 1 million (pas d'ad- au 14ème jour;élévation juvant ) de température pendant 6 jours, mort aux environs du 50ème jour. 70 Texas,d.i.m. Contrôle Signes cliniques sérieux 100 millions (pas d'ad- en 8 jours, mort au 30ème juvant) jour. 71 Texas,d.i.m. Aqueux Signes cliniques bénins 100 millions le 18ème jour 72 Texas,d.i.m. 100 millions Aqueux Signes cliniques bénins le 18ème jour 73 Texas,d.i.m. Antigène/ Signes cliniques bénins 100 millions pas d'ad- le 14ème jour.Mort après juvant 30 jours. 74 Texas,d.i.m. Antigène/ Signes cliniques bénins 100 millions pas d'ad- le 15ème jour. juvant Les tests ci-dessus indiquent que l'adjuvant de gel aqueux parmi ceux testés a fonctionné le mieux dans le vaccin et est de beaucoup préférable. Bien que les chevaux n051 et 53 paraissent immunisés par le vaccin, il est clair que le vaccin peut être vaincu par une inoculation massive de virus infectieux. Mais même dans ces cas, bien que se soient développés des signes cliniques les chevaux vaccinés ne sont pas morts comme ceux ayant subi le contrôle. Conformément à ce qui précède, on réalise un procédé et un milieu pour le développement de cultures de leucocytes de cheval à passage continu et un procédé pour le développement d'un virus de 1'AIE dans des tissus équins autres que les cultures primaires ou que les cultures continues de leucocytes de cheval. Un procédé est de plus fourni pour le développement d'un virus de 1'AIE à propriété antigénique supérieure , de même qu'un procédé de vaccination pour l'immunisation des chevaux. On comprend que les procédés standard de laboratoire et les tests utilisés par les virologues peuvent être utilisés dans la pratique de ces inventions. Par exemple, on comprendra que les pratiques standard de changement de milieux de culture tous les trois ou quatre jours lorsque les cultures se développent ou que le virus se développe soient souhaitabiement adoptées dans la mise en pratique de la présente invention. On comprend en outre que certaines modifications des procédés et matériels utilisés sont ici possibles, en particulier on peut faire varier les milieux utilisés selon les préférences de l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture de cellules équines, caractérisé par le fait qu'il comprend -un milieu de culture de cellules de base enrichi avec des aminoacides pour obtenir au moins environ 140 mg de L-arginine, 50 mg de L-cystine, et 40 mg de L-histi dine par litre dudit milieu de base, lesdits aminoacides étant sous forme de base libre ou de sel; et -au moins environ 20% en volume de sérum de mouton ou de sérum bovin foetal, par rapport au volume total dudit milieu de culture de cellules équines. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit milieu de base est un milieu de type utilisable pour le développement de cultures de leucocytes humains. 3. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il est adapté pour initier le développement d'une culture continue de leucocytes de cheval, à partir d'une culture primaire de leucocytes de cheval, ledit sérum étant du sérum de mouton présent en une quantité d'environ 40% en volume par rapport audit milieu équin de culture. 4. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que ladite L-arginine est présente en une quantité d'environ 140 à 200 mg par litre, ladite L-cystine s'y trouvant en une quantité d'environ 50 à 100 mg par litre et ladite L-histidine en une quantité d'environ 40 à 60 milligrammes par litre. 5. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il est adapté pour le passage continu de cultures de cellules leucocytaires de cheval qui ont subi le passage à quatre reprises au moins d'une culture primaire de leucocytes de cheval, le sérum de mouton ou le sérum bovin foetal s'y trouvant en une quantité de 20 % en volume. 6. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que ledit milieu de base est choisi dans le groupe formé par le milieu 199, le milieu essentiel minimum, le milieu RPMI 1629 et le milieu RPMI 1640. 7. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comprend des constituants antibiotiques en une petite quantité suffisante pour empêcher l'infection de la culture. 8. Procédé pour la production d'un virus antigénique de l'anémie infectieuse équine capable d'infecter des cultures de cellules équines autres que primaires ou des cultures de cellules leucocytaires de cheval à passage continu, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à - inoculer à une culture de cellules leucocy taire équine un virus de l'anémie infectieuse équine de souche sauvage; - cultiver ledit virus dans ladite culture de cellules leucocytaires équines jusqu'à l'apparition d'un effet cytopathique sensible; - récupérer ledit virus à partir dudit milieu de culture de cellules leucocytaires équines;; - inoculer ledit virus à une culture de cellu les leucocytaires de cheval à passage continu et soumettre ledit virus à de multiples passages de leucocytes de cheval, chaque passage étant effectué après qu'un effet cytopathique substantiel se soit produit dans la culture leucocytaire de cheval à passage continu infectée; et - récupérer ledit virus infectieux à partir de ladite culture leucocytaire de cheval, à passage con tinu. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit passage dudit virus est continué jusqu'à l'obtention d'un titre viral de 105 ou supérieur dans la culture leucocytaire à passage continu. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé par le fait que ledit passage dudit virus est continué pendant au moins quatre passages dans des leucocytes de cheval à passage continu. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par le fait que la séparation dudit virus est réalisée par les étapes consistant à - congeler à plusieurs reprises ladite culture infectée de leucocytes de cheval à passage continu et décongeler ladite culture lentement après chaque étape de congélation; - séparer les débris de cellules de ladite culture du surnageant; et - recueillir ledit virus à partir du surnageant. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé par le fait que ladite culture de cellules leucocytaires équines est une culture primaire de cellules leucocytaires de cheval. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé par le fait que ladite culture de cellules leucocytaires équines est une culture de cellules leucocytaires de cheval à passage continu. 14. Procédé pour la production d'un virus de l'anémie infectieuse équine à propriété antigénique supérieure se distinguant par l'absence d'un antigène de protéine anormale, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à - inoculer à une culture à passage continu de cellules leucocytaires de cheval un virus de l'anémie infectieuse équine de souche sauvage et faire passer ledit virus dans des cultures à passage continu de cellules leucocytaires de cheval pour obtenir un titre viral d'environ 105 au moins; et - recueillir ledit virus du dernier passage de la culture de cellules leucocytaires de cheval. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que la séparation dudit virus est réalisée par des étapes consistant à - congeler à plusieurs reprises ladite culture de cellules ayant subi le dernier passage, chaque étape de congélation étant suivie par une décongélation lente de ladite culture; - séparer les débris de cellules de ladite culture du liquide surnageant; et - recueillir ledit virus dudit liquide surnagea:t. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé par le fait que lesdites cultures à passage continu de cellules leucocytaires de cheval sont maintenues dans un milieu comprenant au moins 20% en volume de sérum de mouton ou de sérum bovin foetal dans un mileu nutritif de base contenant au moins environ 140 mg par litre de L-arginine, 50 mg par litre de L-cystine et 40 mg par litre de L-histidine. 17. Virus antigénique de l'anémie infectieuse équine caractérisé par le fait qu'il est obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 16. 18. Procédé de préparation d'un vaccin permettant d'immuniser les chevaux contre l'anémie infectieuse équine, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à - inoculer à une culture à passage continu de cellules leucocytaires de cheval un virus de souche sauvage; - faire passer ledit virus dans des leucocytes de cheval à passage continu pour obtenir un virus se distinguant par l'absence d'un antigène de protéine anormale; - recueillir ledit virus -de ladite culture; - inactiver ledit virus par un traitement avec de la béta-propiolactone pour obtenir un antigène inactivé;et - formuler ledit antigène inactivé avec un adjuvant compatible pour obtenir ledit vaccin. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait que ledit passage est continué pour obtenir un virus de l'anémie infectieuse équine capable d'infecter des cultures de cellules équines autres que les cultures primaires ou que les cultures à passage continu de leucocytes de cheval, et par le fait qu'il comprend les étapes supplémentaires consistant à - inoculer ledit virus récupéré à partir de ladite culture à passage continu de leucocytes de cheval dans une culture de cellules équines à propriété antigénique minimale; et - recueillir ledit virus depuis ladite culture à propriété antigénique.minimale avant l'inactivation du virus. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 et 19, caractérisé par le fait que ledit virus est inoculé à une culture de cellules de rein équin. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 et 19, caractérisé par le fait que ledit virus est inoculé à une culture de cellules de testicule équin. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, caractérisé par le fait que la séparation dudit virus est réalisée par les étapes consistant à - congeler à plusieurs reprises la culture de cellules soumise au dernier passage, chaque congélation étant suivie par une décongélation lente de ladite culture; - séparer les débris de cellules dudit liquide surnageant, et - recueillir ledit virus dudit liquide surnageant. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, caractérisé par le fait que ledit passage dudit virus est effectué dans une culture à passage continu de leucocytes de cheval, maintenue dans un milieu de culture comprenant au moins environ 20% de sérum de mouton ou de sérum bovin foetal, ainsi qu'un milieu de base de culture de cellules et qu'il comprend les étapes consistant à -changer le milieu de culture pour ledit passage continu de leucocytes de cheval pour l'achèvement du développement des cellules pendant le dernier passage; et -remplacer le milieu de culture par un milieu de culture de cellules ne comportant pas de sérum animal antigénique. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisé par le fait que ledit virus est inactivé par l'adjonction de béta-propiolactone à une suspension dudit virus en une quantité correspondant à environ 0,5 à 1 partie de béta-propiolactone pour 1000 parties de suspension de virus. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 24, caractérisé par le fait que l'adjuvant est un gel aqueux comprenant un hydroxyde d'aluminium. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que ledit adjuvant est formulé avec des volumes égaux d'antigène inactivé. 27. Procédé de préparation d'un vaccin utilisable pour l'immunisation des chevaux contre l'anémie infectieuse équine, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant a - inoculer à une culture à passage continu de leucocytes de cheval un virus de l'anémie infectieuse équine de souche sauvage; - passer ledit virus en passage continu sur des leucocytes de cheval pour obtenir un titre viral d'au moins 105 d'un virus se distinguant par sa capacité d'infecter des cultures de cellules équines autres que des cultures de cellules primaires ou que des cultures à passage continu de cellules leucocytaires de cheval, et par l'absence d'un antigène de protéine anormale; - recueillir ledit virus dudit milieu de culture à passage continu de leucocytes de cheval;; - inoculer ledit virus recueilli à une culture de cellules équines à propriété antigénique minimale pour infecter ladite culture de cellules; -recueillir ledit virus de ladite culture de cellules à propriété antigénique minimale; -ajouter de la béta-propiolactone à une suspension dudit virus en une quantité suffisante pour inactiver le virus et réaliser un antigène inactivé; -formuler ledit antigène inactivé avec un adjuvant constitué par un gel aqueux comprenant de l'hydroxyde d'aluminium. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que ladite culture de cellules équines à propriété antigénique minimale est une culture de rein équin. 29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 et 28, caractérisé par le fait que ledit passage dudit virus sur ladite culture à passage continu de leucocytes est effectué en utilisant un milieu caractérisé par le fait qu'il comprend au moins 20 % de sérum de mouton ou de sérum bovin foetal dans un milieu de culture de cellules de base du type convenant au développement de leucocytes humains, et par le fait qu'il comprend l'éta- pe consistant à - remplacer le milieu, avant l'achèvement de ladite culture de virus dans ladite culture de cellules équines à propriété antigénique minimale, par un milieu dépourvu de sérum animal antigénique. 30. Vaccin caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon l'une quelconque des revendications 18 à 29. 31. Vaccin contre l'anémie infectieuse équine inactivé, utilisable pour l'immunisation des chevaux contre l'anémie infectieuse équine, caractérisé par le fait qu'il comprend - une suspension d'antigènes inactivés obtenue par le passage à plusieurs reprises du virus de l'anémie infectieuse équine sur une culture à passage continu de leucocytes de cheval pour obtenir un titre viral d'au moins 105 du virus de l'anémie infectieuse, se distinguant par l'absence d'antigène de protéine anormale, ledit virus étant inactivé avec de la béta-propiolactone; et - un adjuvant compatible. 32. Vaccin selon la revendication 31, caractérisé par le fait qu'il comprend, en volumes égaux, de l'antigène inactivé et un adjuvant constitué par un gel aqueux comprenant une suspension aqueuse d'hydroxyde d'aluminium. 33. Procédé d'immunisation d'un cheval contre l'anémie infectieuse, caractérisé par le fait qu'ici comprend l'inoculation audit cheval du vaccin selon l'une quelconque des revendications 31 et 32. 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé par le fait que ledit cheval reçoit une inoculation à deux reprises au moins pour produire deux réponses distinctes d'anticorps. 35. Procédé selon la revendication 34, caractérisé par le fait que lesdites inoculations sont espacées d'au moins quatre semaines.