FR 2129947 A1 19721103 FR 7110130 A 19710323 La présente invention concerne une protéase faiblement alcaline, produite par des moisissures, utilisable comme médicament pour des traitements chirurgicaux et orthopédiques. La Demanderesse a trouvé qu'une protéase faiblement alcaline d'origine mycétienne pouvait être utilisée en médecine et en chirurgie et qu'on pouvait obtenir cette protéase en cultivant des souches d'Aspergillus en milieu liquide ou solide pour former une solution d'une protéase brute, solution que l'on fait ensuite passer sur une couche d'une résine échangeuse d'anions du type acétate, contenant une amine tertiaire comme radical échangeable, en vue d'éliminer les impuretés qui accompagnent la protéase brute, après quoi on ajoute un solvant à l'effluent pour précipiter la protéase puis on cristallise la protéase faiblement alcaline à partir d'une solution du précipité. En ce qui concerne l'action anti-inflammatoire des protéases,Innerfield et Martin ont signalé les premiers l'action thérapeutique de la trypsine chez un malade atteint d'un oedème douloureux. A la suite de cette observation, on a étudié l'action anti-inflammatoire de la chymotrypsine produite par le pancréas bovin, ainsi que quelques protéases d'origine microbienne comme la streptokinase (SE), la streptodornase (SD) la nargase et la pronase-P, de même que d'autres protéases d'origine végétale, comme la papalne et la bromelaine. Plus récemment, certaines protéases d'origine bactérienne sont passées au premier plan et plusieurs d'entre elles ont déjà été mises dans le commerce en vue de leur utilisation en médecine. I1 importe de noter, cependant, que la protéase faiblement alcaline d'origine mycétienne, qui est obtenue par culture de souches d'Aspergillus en milieu liquide ou solide, diffère des protéases antérieurement connues, indiquées plus haut. En effet, la Demanderesse a constaté que la protéase faiblement alcaline d'origine mycétienne (qui sera appelée dans ce qui suit "Seaprose S") présente une action anti-inflammatoire quand elle est atministrée à faible dose par la voie orale à des malades atteints d'affections inflammatoires. Un mode de réalisation préféré de l'invention est illustré par l'exemple ci-dessous En utilisant Aspergillus melleus comme moisissure on prépare du Koji (groupe d'enzymes comprenant la protéase faible- ment alcaline brute) puis on extrait le Koji à l'eau dans un récipient d'extraction et on filtre l'extrait obtenu sur un filtre-presse, ce qui donne un extrait limpide. On ajoute, tout en agitant, extrait limpide à trois fois son volume d'éthanol (à 95 % en volume), après quoi on laisse reposer le mélange pendant 4 à 5 heures, jusqu a précipitation complète de I'enzyme, qu'on lave avec de l'méthanol à 95 ffi en volume. On obtient ainsi une protéase brute comprenant une protéase faiblement alcaline. On dissout 1 kg de cette protéase brute dans 20 litres d'eau pour former une solution aqueuse à purifier et on fait passer la solution sur une résine échangeuse d'anisons du type acétate, garnissant une colonne, à un débit de 15 litres par heure. On obtient la résine échangeuse d'anions du type acétate en mettant dans la colonne 5 litres d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique (vendue sous le nom de marque déposée "Amberlite" IRA-9D, fabriquée par la firme Rohm & Haas) puis en faisant passer dans la colonne 10 litres d'une solution 0,5 N d'acide -acétique pour convertir la résine faiblement basique en résine du type acétate. On mélange l'effluent ainsi obtenu avec 45 litres d'éthanol à 95 %, on maintient le mélange à une température de -15 pour provoquer la précipitation de la protéase faiblement alcaline puis on dissout le précipité dans 6 litres d'eau, on refroidit la solution à 50 et on lui ajoute, à une température de -15 , 1,5 litre d'acétone, jusqu'à ce qu'il apparaisse un léger trouble. On conserve alors le mélange.jusqu'au lendemain dans une chambre froide à -15 . On amène à son terme la cristallisation de la protéase faiblement alcaline en ajoutant lentement au mélange 0,2 litre d'acétone à -15" par jour, jusqu a ce que la concentration de l'acétone atteigne environ )0 %. On obtient 300 g de protéase faiblement alcaline cristallisée, soit un rendement de 70 %. La Demanderesse a également trouvé que l'on pouvait modifier le mode préféré de mise en oeuvre de l'invention en utilisant les souches d'Aspergillus oryzae ou d'Aspergillus sojas et l'une quelconque des résines échangeuses d'anions du type acétate qui sont préparées à partir de résines échangeuses d'anions telles que les produits "Amberlite" IRA-400, -410, -900 et -910 ou "T)owex"-1 et -2. On peut obtenir ces résines en copolymérisant le styrène avec le divinylbenzène, en faisant réagir le copolymère formé avec l'éther chlorométhylique pour fixer le radical chlorométhylique , puis en faisant réagir le produit obtenu avec une amine secondaire ou tertiaire, ce qui donne la résine échangeuse d'anions contenant un radical d'amine tertiaire ou un radical ammonium quaternaire. On a déterminé l'action thérapeutique de la protéase faiblement alcaline cristallisée , obtenue par le présent procédé, ainsi que ses caractéristiques physiques et chimiques. Il s'agit d'une enzyme douée d'une action anti-inflammatoire, de couleur blanche soluble dans l'eau et insoluble dans l'acétone et dans l'alcool très concentrés, ayant un pH optimum de 7,0 à 8,5 pour l'activité et de 5,0 à 9,0 pour la stabilité, un poids moléculaire de 30400 et une activité de 2000 unités/mg ; le site actif est la sérine et la molécule contient dix sept autres amino-acides comme éléments constitutifs. On observe des phénomènes de nature inflammatoire chez des malades atteints d'affections diverses. Suivant les cas, on constate une altération des cellules des tissus, une augmentation de la perméabilité des capillaires sanguins, le blocage des ganglions lymphatiques, la libération de cellules par réaction à l'inflammation, ou une infiltration ou une granulation des tissus. On peut produire expérimentalement des phénomènes inflammatoires de ce tgenre et on observe alors la modification de la perméabilité des capillaires, la formation de granulomes et des réactions immunitaires. On a étudié l'action anti-inflammatoire de la protéase faiblement alcaline cristallisée en employant un agent inflammatoire couramment utilisé pour cet essai, comme la carraghénine, le dextranne ou l'huile de croton. L'agent inflammatoire est injecté dans les membres postérieurs de rats ou de cobayes pour provoquer des oedèmes et on utilise la protéase faiblement alcaline cristallisée pour en évaluer l'action contre l'oedème. Les essais sont effectués de la manière décrite dans les exemples suivants, qui ont pour but d'illustrer la présente invention. EXEMPlE 1 Pour étudier l'action anti-inflammatoire de la Seaprose S, on utilise comme agents inflammatoires l'huile de croton et la carraghénine et, comme animaux d'épreuve, des rats de souche Wistar pesant de 100 à 150 g. On répartit neuf rats en trois groupes (appelés respectivement, par la suite, premier, deuxième et troisième groupe). On dissout la Seaprose S dans de l'eau purifiée, on dissout lthuile de croton dans de l'huile d'olive pour préparer une huile à 1 % et on dispose la carraghénine dans un soluté physiologique pour obtenir une suspension à 0Z5 yó de cette substance. On injecte la solution de Seaprose S dans la cavité abdominale des rats appartenant aux premier et second groupes , à raison de 5 ou 10 mg par kg de poids corporel et, à titre comparatif, on injecte du soluté phsio- logique dans la cavité abdominale des rats appartenant au troisième groupe. Après un délai de 30 minutes, on injecte par voie sous-cutanée l'huile de croton à 1 % et la suspension de carraghénine à 0,5 % dans les membres postérieurs des rats, à raison de 0t1 ml par animal, respectivement. On mesure les dimensions de la zone oedémateuse chez les rats ayant reçu le médicament et on les compare avec celles de l'oedème des rats témoins. L'action anti-inflammatoire de la Seaprose S est exprimée par le pourcentage d'inhibition de l'oedème par rapport aux témoins.Les résultats de ces essais sont indiqués dans le Tableau I. (Voir tableau I, page suivante) TABLEAU I Agents Dose de Taux d'inhibition inflamma- protéase . (m /kg) heures 0,5 1 2 3 4 5 4 24 26 48 toires (%) 5 75,0 '77 ol 57 5 62 1 82,2 85,7 13,6 22,2 Huile de croton à 1% 10 83,8 86,7 86,7 86,7 90,4 95,7 17,7 5,9 Suspension, 1 41,1 , 7,2118,7 23,6 37,639,î'26,3 i de carraghé nine à 0,5% 10 31,3 52,3 71,1 64,5 68,5 57,0 Ces résultats montrent que l'inhibition de l'oedème par la Seaprose S va de 57,5 à 87,5 7o à la dose de 5 mg/kg quand on utilise pour provoquer l'inflammation 0,1 ml d'huile de croton à 1 %, et que l'inhibition dépasse 83,8 % pour une dose de 10 mg/kg.Quand on utilise comme agent inflammatoire 0,1 ml de la suspension à 0,5 % de carraghénine, une dose de 10 mg/kg de Seaprose S produit une inhibition de l'oedème de 71,1 % au bout d'un délai de 3 heures après l'injection de l'agent inflammatoire. Il a également été observé que, à cette dose, la Seaprose donne une inhibition de l'oedéme qui est comparable au résultat de ltessai comparatif au bout d'un délai de 48 heures après l'injection de 0,1 ml de la suspension à 0,5 % de carraghénine. EXEMPLE 2 On examine l'action inhibitrice de la Seaprose S sur l'oedème provoqué par l'albumine de l'oeuf, sur des groupes de cinq cobayes. Dans la cavité abdominale des cobayes appartenant au premier et au deuxième groupes on injecte par la intra-péritonéale une solution de Seaprose S à raison de 1 ou 2 mg/kg effet à titre comparatif, on injecte du soluté physiologique dans la cavité abdominale de cobayes d'un troisième groupe. bu bout de 30 minutes on injecte, par voie sous-cutanée de l'albumine doeuf à 20 % dans la région tibio-tarsienne, ceci à raison de 0,1 ml par animal. Toutes les heures on observe l'évolution de l'oedème. On évalue aussi , de la même manière que pour la Seaprose S, l'action de la bromélaine, de l'a-chymotrypsine et de la varidase sur l'oedème provoqué par l'albumine de l'oeuf. Les résultats des essais sont indiqués dans le tableau II. TABI;EAU II Agents Augmentation du volume des inflamma- Agents anti-inflammatoires membres postérieurs (en %) toires au bout de 1h 2h 3h 4h 5 h (%) Témoin (soluté physiologi- 38 1 431 47 5o 51 que) Seaprose S 1 mg/kg 8 1 9 9 10 12 Seaprose S Albumine : 2 mg/kg 4 7 8 8 3 d'oeuf à Bromé laine 3 20 % 1 mg/kg 35 i 40| 37 40 40 a-chymotrypsine(10.000 unitités)31 i 33 31 30 32 Varidase 1 mg/kg 12 12! 13 13 15 il ressort nettement de ces résultats que dans l'essai comparatif pour lequel on a utilisé du soluté physiologique, il se produit chez le cobaye une augmentation de volume de 38 % une heure après l'injection d'albumine d'oeuf. Cette augmentation de volume doit être comparée avec celle de 4 à 12 % qui se produit quand on utilise la Seaprose S comme agent anti-inflammatoire. L'action anti-inflammatoire de la Seaprose S est aussi à comparer à celle des autres agents anti-inflammatoires du tableau II. Les exemples I et 2 montrent que la Seaprose S exerce une très forte inhibition sur les oedèmes expérimentaux d'animaux ; on peut donc fonder sur elle de grands espoirs quant à son utilisation clinique comme agent anti-inflammatoire, par rapport à d'autres types d'enzymes anti-inflamma- toires. On a récemment beaucoup utilisé certaines enzymes en thérapeutique et de l'utilisation locale en chirurgie, on est passé au traitement général. Le traitement généralisé a été appliqué pour la première fois en médecine interne lorsqu'on a injecté de la trypsine aux malades par voie scus-cutanée. La trypsine a également été administrée aux malades par la voie orale pour un traitement généralisé, ainsi que l'a signalé Martin. Ja Seaprose S est actuellement utilisée en thérapeutique dans les domaines de la chirurgie courante et de la chirurgie réparatrice. L'effet de l'enzyme est illustré par l'exemple suivant EXEMPLE 3 On a administré, en trois ou quatre prises quotidiennes, de six à douze comprimés contenant la Seaprose S à 49 malades, hospitalisés ou ambulatoires, qui étaient soumis à un traitement chirurgical. Ces malades étaient répartis en un premier groupe (13 malades) ayant une inflammation avec suppuration, en un deuxième groupe (15 malades) présentant des cicatrices avec induration, en un troisième groupe (15 malades) souffrant dthémorroides et de colite et en un quatrième groupe (6 malades) souffrant d'une douleur à l'expectoration à la suite d'une anesthésie intra-trachéale. On a administré également des comprimés contenant la Seaprose S, trois fois par jour, à raison de six à douze, la dose totale étant de 18 comprimés, à des malades hospitalisés ou non, qui n 'étaient pas en traitement chirurgical. Ces malades étaient répartis en un premier groupe (6 malades) ayant une inflammation avec suppuration, en un deuxième groupe (7 malades) présentant des cicatrices avec induration, et en un troisième groupe (5 malades) souffrant d'hémorrides et de colite. Les effets thérapeutiques des comprimés utilisés pendant le traitement chirurgical sont indiqués au tableau III et leurs effets, quand il n'y a pas de traitement chirurgical, sont indiqués au tableau IV. TABLEAU III Degré de W Très ef- ffi- neffi- Nombre de ction ! ficace cace cace malades Effet (%) sur IInflammatiol I avec suppura- I O 9 i 4 13 69s2 tion Cicatrices avec induration | I Hémorroides et 2 10 3 15 80,0 colite I Douleur à l'ex pectoration après O 5 1 6 83,3 anesthésie intra trachéale t Total | 2 37 | 10 49 eloyenne 79,6 TABLEAU IV Degré de Très ef- Effi- Ineffi- Nombre de l'action ficace cace cace malades Effet ( SUT \\ I Inflammation avec suppura- f O 4 2 6 oxo,6 tion Cicatrices avec induration 0 6 1 7 85, Hémorroïdes et o O 4 1 5 80,0 'colite Ni moyenne Total O 14 4 18 77,7 En ce qui concerne les effets thérapeutiques obtenus gracie à la Seaprose S, la Demanderesse a abouti aux conclusions suivantes 1.) Les effets thérapeutiques sur l'oedème et la suppuration qui apparaissent dans des affections inflammatoires telles que les abcès et les plaies contuses ont été examinés et on a conclu que la SeaproseS est efficace pour le traitement des inflammations récentes de tissus mous. 2.) On a opéré plusieurs malades dont certains étaient atteints de mastopathie et d'autres d'une tumeur des ganglions sous-maxillaires pour enlever les parties malades et on a ensuite examiné l'action de la Seaprose S sur la cicatrice opératoire. On a constaté que la Seaprose S accélère la disparition de l'induration. 3.) On a constaté que la Seaprose S a une action inhibitrice sur l'oedème qui se produit sur les muqueuses in testinales des malades atteints d'hémorroedes et de colite. L'examen rectoscopique, en particulier, montre une remarquable amélioration de l'inflammation du rectum. 4.) On a constaté que la Seaprose S entraîne un soulagement de la douleur à l'expectoration qui suit une anesthésie intra-trachéale. 5.) On n'observe pas de symptômes anormaux ni de réaction fâcheuse en ce qui concerne le temps de saignement et le temps de prothrombine. Ainsi qu'il ressort du tableau III, parmi les 49 malades sur lesquels on a examiné 11 action thérapeutique des comprimés contenant la Seaprose S, trente-neuf ont montré une réaction favorable, c'est-à-dire en moyenne 79,6 %. En particulier, l'effet thérapeutique chez deux malades atteints d'inflammation du colon est remarquablement élevé. Par ailleurs, comme il ressort du tableau IV > il a été constaté que lteffet thérapeutique des comprimés contenant la Seaprose S, utilisés Cans traitement chirurgical, s'exerce chez quatorze malades sur dix-huit, soit en moyenne 77,7 %. La tuméfaction des organes assurant les mouvementis, comme les os, les articulations et les tissus mous, est une variété des oedèmes inflammatoires chirurgicaux, qu'il est important de supprimer par un traitement ultérieur. La Seaprose S a donc été examinée pour le traitement de malades. Les maladies, au nombre de trente-trois, ont été classés en trois groupes : le premier comporte huit malades souffrant de contusions, le deuxième, cinq malades souffrant d'entorses ou de déformations articulaires et le troisième, dix malades présentant une tuméfaction posttraumatique. La Seaprose S est mise sous forme de comprimés, en contenant chacun 5 mg (2000 u/mg)et les comprimés sont administrés aux malades à raison de six à douze par jour, pendant une durée allant de 5 à 22 Jours. Les résultats du traitement sont indiqués dans le tableau V ci-dessous. TABLEAU V Groupes Nombre de malades Résultats Effet Excel- j Bons Moyens (%) lents 1er 8 3 2 3 62,5 2e 5 2 2 1 80,0 3e 10 2 5 3 70,0 Total 23 7 9 7 En; moyenne On a entre autre étudié l'action de la Seaprose S dans le traitement de treize malades présentant un oedème post-traumatique récent et de dix malades présentant une tumé faction post-traumatique récente mais on ne peut donner les résultats du traitement d'une manière précise par suite de l'impossibilité d'entreprendre un traitement témoin chez 1 'homme. On est cependant en droit de penser que les résultats qui sont indiqués dans le tableau 5 montrent que la Seaprose S a un effet dans le traitement médical aussi bien qu'en chirurgie corrective. REVENDICATIONS 1.- Protéase faiblement alcaline, produite par des moisissures, pouvant être utilisée comme agent enzymatique anti-inflammatoire dans des traitements chirurgicaux et orthopédiques. 2.- Protéase faiblement alcaline, pouvant être utilisée comme agent enzymatique anti-inflammatoire dans des traitements chirurgicaux et orthopédiques, protéase qui est obtenue par culture de souches d'Aspergillus sur un milieu de culture liquide ou solide de façon à former une solution de protéase brute, puis passage de cette solution à travers une couche de résine échangeuse d'anions du type acétate, contenant une amine tertiaire, pour éliminer les impuretés, addition d'un solvant à l'effluent pour précipiter la protéase et cristallisation de la protéase faiblement alcaline à partir d'une solution du précipité. 3.- Médicament contenant une protéase selon la revendication 1 ou 2.