FR 2168988 A1 19730907 FR 7202979 A 19720128 TiP présente invention concerne, sous sa forme la plus avantageuse, U1 produit perfectionné, stabilisé et normalisé, à base de pepsine, qui est destiné à être expédié en quotités relativement grandes, par exemple en fûtes. Il est connu de normaliser la pepsine par addition de diluants très solubles, par exemple de sucre, pour formez produit doué d'activité enzymatique prédéterminée par unité de poids. De tels produits doivent entre préparés et contrôlés avec soin. On les mélange intimement pour assurer leur uniformité, ctest-à-dire leur homogénéité relative, au moment où on les emballe. Pour être utilisés avantageusement, ces produits doivent pouvoir s'écouler librement.Toutefois, au cours de ltexpédition de masses relativement grandes de ces produits, ou pendant leur stockage ou pendant une manipulation qui implique une vibration du mélange emballé d'enzyme et de diluant, il peut se produire une stratification ou une autre séparation du diluant ou de la pepsine. Ceci entraîne une perte dXuniformité, et par conséquent, une perte de la fiabilité en ce qui concerne la normalisation de la force enzymatique de portions relativement faibles prélevées périodiquement dans la grande masse, par exemple dans un fût. L'invention concerne un produit normalisé fluide, à base de pepsine,qui convient particulièrement pour l'expédition en quantités relativement grandes, par exemple en fûts, et meme en quantités plus grandes, produit qui est stabi- lisé contre la perte d'uniformité due à la stratification ou à une autre séparation de particules discrètes constituant le produit. Le produit fluide stabilisé et normalisé à buse de pepsine, conforme à l'invention, est pratique et facile à fabriquer à l'échelle irdustrielle L'invention concerne également un produit à base de pepsine dont la mouillabilité est améliorée L'invention parvient au but quelle se propose d'atteindre, au moyen d!uv1- procédé qui consiste à mélanger avec la pepsine et un diluant solide, un additif cho s- entre des composés polyhydroxyliques liquides contenant 6 ou moins de 6 atomes de carbone, et des agents tensio-actifs non lonogènes. Conformément à l'inventionf les additifs sont présents en une quantité comprise entre 0,5 et 10 , en poids sur la base du poids du mélange, lorsque 11 additif est un composé hydroxylique, et entre 0,05 et 4 % en poids sur la base du poids du mélange lorsque lradditif est l'agent tensio-actif0 tes composés polyhydroxyliques utilisés conformément à l'invention sont liquides aux températures ambiantes et comprennent 6 ou moins de 6 atomes de carbone. Ce sont le sorbitol, la glycérine, le propylène-glycol, etc. Naturellement, tout mélange de pepsine destiné à Btre utilisé dans un produit alimentaire ne doit contenir que des additifs qui peuvent entre consommés sans danger .Bien que le composé polyhydroxylique que l'on préfère utiliser/conformément à l'invention, avec la pepsine, soit la glycérine, les agents tensio-actifs non ionogènes sont très préférables aux composés polyhydroxyliques, le mono-oléate de polyoxyéthylène-sorbitanne étant l'additif auquel on attribue la plus grande préférence. tes agents tensio-actifs non lonogènes que l'on préfère utiliser comme additifs, conformément à l'invention, sont des esters partiels d'acides gras à longue chatne de dérivés polyoxyalkyléniques d'un hexatol, de préférence un anhydride d'hexatol dérivé du sorbitol. Ces derniers sont parfois appelés esters de sorbitanne. tes esters auxquels on attribue la plus grande préférence sont les mono-oléates de polyoxyéthylène-sorbitanne. Toutefois, d'autres exempies d'esters de sorbitanne hydrosolubles, que lton peut utiliser avec intérêt, conformément à l'invention, comprennent le monolaurate de polyoxyéthylène-sorbitanne, le palmitate de polyoxyéthylène-sorbitanne, le stéarate de polyoxyéthylènesorbitanne, etc.Un mono-oléate- de polyoxyéthylène-sorbitanne disponible dans le commerce y est vendu sous le nom de "TWEEN 80" 9 te monolaurate est vendu sous le nom de ttIWEEN 20", le palmitate sous le nom de 1:TWEEN 40" et le stéarate sous le tom de t'TTSEEN 60't. D'autres composés entrant dans la classe des agents tensio-actifs, au sens où cette expression est utilisée conformément à l'invention, comprennent les dérivés liquides de composés polyhydroxyliques, par exemple leurs esters d'acides gras à longue chaîne. Des exemples de ces composés comprennent le monolaurate de propylène-glycol, le monostéarate d'éthylène- glycol, le monopalmitate de propylène-glycol, le monooléate de sorbitanne, le monostéarate de sorbitanne, le monolaurate de sorbitanne, le monopalmitate de sorbitanne, le monomyristate de propylène-glycol, le monostéarate de glycérine, le monooléate de glycérine, le monomyristate de glycérine, le monolaurate de glycérine, etc. Bien que la plupart des applications des produits normalisés de pepsine impliquent l'utilisation de la pepsine en dispersions aqueuses et bien que l'additif utilisé pour formuler un produit à base de pepsine, conformément à l'invention, pour un tel usage, soit un additif soluble dans lteau, il n'est pas essentiel que additif et, notamment, l'agent tensioactif, soient hydrosolubles.D'une façon générale, des agents tensio-actifs non ionogènes, des esters complexes et des ester-éthers, en particulier les ester-polyéthers, sont intéressants. tes agents tensio-actifs préférés comprennent ceux dont les polyalcools de départ sont de préférence des alcools hexahydroxyliques, des oxydes d'alkylène, de préférence des oxydes d'éthylène5 et des acides gras. te caractère hydrophile des agents tensio-actifiest dd aux groupes hydroxyle et oxy alkylène, tandis que la portion lipophile est apportée par les acides gras à longue channe utilisés. tes substances du commerce du type "SPLXT" qui sont moins solubles dans liteau et dont l'intérêt est limité conformément à l'invention, sont des esters partiels des acides gras usuels (laurique, palmitique, stéarine et oléique) et d'anhydrides d'hexatol (hexatanes et hexides), dérivés de sorbitol. Les substances du type "TWEEN" dérivent des produits "SPAN " par addition de c-.aSnes polyoxyéthyléniques à des hydroxydes non estérifiés. il y a lieu de remarquer que les produits "SPAN " tendent à entre solubles dans les ailes et dlspersibles ou insolubles dans l'eau, tandis que les produits "TWEEN" sont solubles dans Liteau ou s'y dis persent bien. te "Merck Index" (8ème édition, page 973) indique que le produit "Tl EEN 80" est admis en pharmacie, où on l'appelle "Polysorbate 80".Pour l'utilisation des produits "SPAN't et "TWEEN't dans des formulations pharmaceutiques, voir Jowdy, "Carolina J. Pharm.", volume 33, pages 465-467 (1952). Toutefois, comme indiqué ci-dessus, les agents tensio-actifs hydrosolubles sont préférables à utiliser conformément à l'invention, dansa fôrmulation de produits à base de pepsine , destinés à entre utilisés dans des systèmes aqueux. te mono-oléate de polyoxyéthylène (20) sorbitanne (par exemple "Polysorbate 80"), constitue un-agent tensio-actif très préférable. L'expression diluant solide utilisée ci-dessus désigne tous les sucres solides granulaires ou en poudre tels que les mono-saccharides, les di-saccharides et leurs mélanges, tels quels ou additionnés de saccharose, de glucose, de fructose, de lactose, etc. Dans certaines applications, on peut utiliser comme diluant solide du chlorure de sodium granulaire. tes substances solides très solubles dans l'eau constituent le diluant préféré. Selon une forme préférée de réalisation de l'invention, lorsque l'additif est initialement dispersé sur un diluant solide tel qutun sucre, son efficacité d'amélioration de la mouillabilité du mélange résultant de pepsine est augmentée à un haut degré. Par exemple, on obtient des résultats analogues de mouillabilité avec 10 à 20 ffi de la proportion de l'additif qui doit être présente dans des mélanges non dilués de pepsine et d'additif pour des résultats analogues de mouillabilité. L'expression "fraction étroite de grosseur des particules't est utilisée dans le présent mémoire pour désigner, de préférence, une fraction de matière en particules qui traverse un certain tamis de numéro N et est retenuebar un tamis de N "N + n". N est un nombre donné et n est un nombre maximal égal à 30 et de préférence au maximum égal à 20. Par exemple, une fraction étroite préférée de grosseur des particules est une fraction qui traverse un tamis N 40 (N = 40) et est retenue sur un tamis N 60 (n=20). tes numéros de tamis mentionnés ci-dessus appartiennent à la série U.S. Sieve, et leurs équivalents seront définis plus loin. Dans les exemples suivants, tous les pourcentages sont exprimés en poids sur la base du poids de la composition, sauf indication contraire. Tous les poids sont exprimés en parties en poids. Exemple 1 te but de cet exemple est d'illustrer un procédé nouveau de normalisation de l'activité de mélanges de pepsine. Un lot de pepsine purifiée lyophilisée (non normalisée) est divisé par tamisage en fractions / gamme étroite de grosseur des particules : 20-40, 40-60, 60-80 tes tamis NO 20, 40, 60 et 80 ont respectivement des ouvertures de maille de 0,84 mm, 0,42 mm, 0,250 mm et 0,177 mm. te premier numéro de chaque ensemble représente le numéro du tamis à travers lequel la fraction passe; le second numéro représente le numéro du tamis sur lequel la fraction est retenue. Chacune des fractions résultantes de grosseur de particules de pepsine est soumise à une analyse pour déterminer l'activité de la pepsine conformément à la méthode décrite dans "The National Formulary XIII", "Am.Chem. Assoc.", page 294, et on renvoie à cette description. te taux d'activité d'un échantillon particulier, par exemple 1:20 000, implique que 11 échantillon expérimenté ne digère pas moins de 20 000 fois son propre poids d'albumine fratchement coagulée et désintégrée, en 2,5 heures à 11 dans de l'eau acidulée avec de l'acide chlorhydrique. tes termes et expressions "activité", "activité de pepsine" ou "activité enzymatique" utilisés dans le présent mémoire,désignent l'activité enzymatique mesurée par la méthode indiquée ci-dessus. On tamise du sucre granulaire pour obtenir des fractions déterminées de grosseur de particules sensiblement identiques aux fractions correspondantes de grosseur de particules des poudres de pepsine indiquées ci-dessus. On ajoute du glycérol à chacune des fractions de sucre granulaire, en quantité suffisante pour qu'il en ait 10 ffi en poids sur la base du poids du sucre. Une portion de chaque mélange correspondant de sucre et de glycérol est ajoutée à une fraction correspondante de pepsine ayant la même granulométrie.La quantité de mélange de sucre et de glycérol qui est ajoutée à la fraction correspondante de poudre de pepsine est la valeur calculée de la quantité suffisante pour diluer la fraction de pepsine à un degré tel que le mélange résultant de pepsine, d'additif et de diluant ait une force enzymatique prédéterminée, sur la base du poids du mélange résultant. Ce mode opératoire a été appelé "normalisationn dans le présent mémoire.On a constaté que chacune des fractions granulométriques normalisées conformément au procédé décrit dans cet exemple est aisément mouillable dans liteau. En fait, dans chaque cas, lorsque la poudre améliorée est ajoutée à de l'eau, elle est mouilléeimmédiatementS elle s'abaisse dans l'eau et elle se disperse en une période de temps qui est à peu près la moitié de celle qui est requise pour une quantité analogue de pepsine non améliorée de meme grosseur de particules. tes mélanges normalisés de pepsine produits conformément à l'exemple 1 décrit ci-dessus sont normalisés de façon précise par rapport à l'activité enzymatique, même dans le cas de produits dont les particules sont relativement petites, par exemple ceux qui sont retenus sur un tamis NO 80, comme défini ci-dessus. En outre, dans chaque cas, on constate que le diluant reste uniformément dispersé dans la pepsine sèche, malgré les vibrations subies pendant la manutention et le transport, dans les opérations commerciales. te mélange normalisé conserve une activité enzymatique uniforme et 'thomogène'dans toute la masse du mélange. De plus, le procédé de normalisation de pepsine illustré dans l'exemple 1 permet de produire, de vendre et d'utiliser des compositions enzymatiques dont la grosseur des particules est très étroitement définie, et la formulation de l'enzyme comme ingrédient dans d'autres compositions0 Exemple 2 On fractionne de la pepsine non lyophilisée en portions définies de la façon suivante (î) portion traversant un tamis N 10 (2,00 mm) et retenue sur un tamis N 20 (0,84 mm) ; (2) portion traversant un tamis N 20 et retenue sur un tamis N 40 (0,42 mm) ;; (3) portion traversant un tamis N 40 et retenue par un tamis N 80-(0,177 mm) (4) fraction traversant un tamis N 80 et retenue sur sur un tamis N0 100 (0,149 mm) ; et (5) portion traversant un tamis N 100. On tamise du saccharose en cristaux, en portions de granulométrie analogue. On mélange umpoids égal de chaque fraction respective de saccharose avec chaque portion granulométrique respective correspondante de pepsine après que la fraction de sucre a été mélangée intimement avec du ItTWEEN 80" (mono-oléate de polyoxyéthylène (20) sorbitanne). On trouve que les quantités de "TWEEN 80" qui confèrent aux fractions respectives une mouillabilité estimée égale à celle que l'on observe pour la fraction granulométrique 10-20 avec 0,05 % d'agent tensio-actif, sont les suivantes : 0,3 % pour la fraction granulométrique de 20-40 ; 0,7 % pour la fraction granulométrique de 40-80 ; 1,2 % pour la fraction granulométrique de 80-100 et 2 C/o pour les matières traversant le tamis N 100.On observe que des mélanges de pepsine et de diluant, conformément à la présente invention, sont capables de résister à de longues périodes de vibration sans qu'une stratification ni un autre fractionnement mécanique de la pepsine et de l'additif altèrent l'hcrnogénéité,c1est-à-dire la stabilisation p:qysique du mélange de pepsine et de diluant par rapport à l'activité. Néanmoins, le mélange reste fluide pendant toute la durée de l'essai. tes échantillons de pepsine des formes préférées de réalisation de cet exemple ont une mouillabilité très supérieure à celle d'éckantilloxs non améliorés, comme indique dans l'essai de mouillabilité conduit/dans ltexemple 1. On observe que la poudre de pepsine améliorée conformément à 1' invention,par addition de proportions relativement faibles de polyol ou d'agents tensio-actifs non ionogènes a une bien plus faible tendance à absorber l'humidité de l'air, absorption qui se traduit par la consistance pateuse d'une poudre apparemment "sèche". Il est préférable que l'agent tensio-actif soit utilisé comme additif, parce que,dans certains cas, des produits normalisés de pepsine, améliorés conformément à 11 invention, avec une proportion de glycérol proche du maximum indiqué, ont une fluidité réduite après un stockage prolongé. Aucun inconvénient de ce genre n'a été observé dans le cas de produits renfermant des agents tensio-actifs. te diluant solide peut entre mélangé avec la pepsine en une quantité de 5 à 95 % en poids du mélange résultant, suivant l'activité normalisée requise. L'agent tensio-actif non ionogène auquel on a recours comme additif est utilisé en une quantité efficace comprise entre 0,05 et 4 . t'additif polyhydroxylique est de préférence utilisé en une quantité comprise entre 0,05 et 10 %, notamment entre 0,5 et 5 % lorsqu'il est utilisé sous la forme du diluant du type d'un sucre. REVERmICATIOITS 1. Procédé de stabilisation d'un mélange de pepsine et de diluant en particules, caractérisé par le fait qu'on ajoute au mélange, en association intime avec lui, un additif choisi entre un composé polyhydroxylique liquide et un agent tensioactif non ionogène, la quantité de cet additif étant suffisante pour que sa proportion soit comprise entre 0,5 et 10 % en poids sur la base du poids du mélange résultant lorsque l'additif est un composé polyhydroxylique, cet additif étant présent en une quantité comprise entre 0,05 et 4 ffi lorsque l'additif est un agent tensio-actif non ionogène. 2. Produit stabilisé en particules, à base de pepsine, caractérisé par le fait quI il contient de la pepsine en particules, un diluant en particules et un additif liquide choisi entre un composé polyhydroxylique liquide et un agent tensio-actif non ionogène, l'additif étant présent en une quantité comprise entre 0,5 et 10 ffi lorsqu'il est un composé polyhydroxylique et étant présent en une quantité comprise entre 0,05 et 4 0 lorsqu'il est un agent tensioactif non ionogène. 3. Procédé de préparation d'un produit de pepsine, en particules uniformes, caractérisé par le fait qui consiste à mélanger avec un diluant, un additif choisi entre un composé polyhydroxylique et un agent tensio-actif non ionogène, et à disperser de façon homogène cet additif sur le diluant pour obtenir un mélange d'additif et de diluant, puis à mélanger la combinaison résultante d'additif et de diluant avec de la pepsine en particules pour obtenir un mélange sensiblement homogène des ingrédients. 4. Procédé de préparation d'un produit stabilisé et normalisé de pepsine en particules, caractérisé par le fait qu'il consiste à analyser un produit de pepsine en particules pour déterminer son activité enzymatique; à mélanger des ingrédients avec cette pepsine en particules, ces ingrédients comprenant un diluant solide et un additif liquide, et étant ajoutés en une quantité suffisante pour réduire l'activité enzymatique du mélange résultant, sur la base du poids de ce mélange, à un taux prédéterminé, l'additif étant choisi entre des composés polyhydroxyliques et des agents tensio-actifs non ionogènes, additif étant inclus en une quantité suffisante pour que sa proportion soit comprise entre 0,5 et 10 ss sur la base du poids du mélange résultant lorsqu'il est un composé polyhydroxylique, et en quantité de 0,05 à 4 % lorsqu'il est un agent tensio-actif non ionogène. 5. Procédé de normalisation et de stabilisation d'un produit de pepsine en particules, caractérisé par le fait qu'il consiste à fractionner le produit de pepsine en particules de manière à obtenir une fraction de pepsine en particules de granulométrie relativement étroite ; à fractionner un additif en particules pour obtenir une fraction d'additif de granulométrie Xcomprise/sensiblement dans les mêmes limites que la fraction de pepsinejen particules;à analyser la fraction de pepsine en particules pour déterminer son taux d'activité enzymatique ; à ajouter à la fraction de pepsine en particules des ingrédients comprenant la fraction de diluant et un additif, ces ingrédients étant ajoutés en une quantité suffisante pour que le mélange résultant ait un taux prédéterminé d'activité enzymatique, l'additif étant choisi dans le groupe comprenant des composés polyhydroxyliques et des agents tensioactifs non ionogènes,cet additif étant utilisé en une quantité suffisante pour que sa proportion soit comprise entre 0,5 et 10 % en poids sur la base du poids du mélange résultant lorsqu'il est un composé polyhydroxylique, et en quantité suffisante pour que sa proportion soit comprise entre 0,05 et 4 0 en poids sur la base du poids du mélange résultant lorsqu'il est un agent tensio-actif non ionogène. 6. Procédé de normalisation et de stabilisation d'un produit de pepsine , caractérisé par le fait qu'il consiste à tamiser un produit lyophilisé de pepsine en particules pour obtenir une fraction de pepsine en particules de granulométrie relativement étroite, à préparer une quantité de diluant en particules choisi dans le groupe comprenant le saccharose, le glucose, le lactose, le chlorure de sodium et leurs mélanges. les particules de ce diluant étant comprises dans des limites granulométriques relativement étroites, sensiblement les mêmes que celles de la fraction de pepsine, à mélanger avec le diluant un additif qui est un ester partiel d'acide gras à longue chatne de dérivés polyoxyalkyléniques de sorbitol, de manière à obtenir un mélange de diluant et d'additif ; à analyser cette fraction de pepsine en particules pour déterminer son activité enzymatique ; à ajouter à la fraction de pepsine en particules une quantité suffisante de mélange de diluant et dtadditif pour obtenir un taux prédéterminé d'activité enzymatique du mélange formé de pepsine stabilisée et normalisée, l'additif étant utilisé en une quantité suffisante pour que sa proportion soit comprise entre 0,05 et 4 % en poids sur la base du poids du mélange résultant de pepsine stabilisée et normalisée. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé par le fait que l'additif est choisi entre le mono-oléate de polyoxyéthylène-sorbitanne, le palmitate de polyoxyéthylènesorbitanne, le stéarate de polyoxyéthylène-sorbitanne et le mono-oléate de polyoxyéthylène-sorbitanne.