FR 2157743 A1 19730608 FR 7139064 A 19711029 La présente invention est relative à un procédé de préparation de ribotides par fementation et plus spécifiquement est relative à un procédé de préparation de phosphates de ribosyle de dérivés de purine 2-substituée. Les produits de la présente invention sont utiles comme médicaments. Par exemple, l'un des composés pouvant être produits dans le procédé de la présente invention est le 2-fluo roadénine-9-ss-D-ribofurannoside-5'-phosphate qui est la forme active, in vivo, de la 2-fluoroadénine ou de la 2-fluoroadénosine, qui sont des substances anti-mitotiques. Le produit inhibe la synthèse de 1'ARN E Shigeura, G.E. Boxer, S.D. Sampson & M.L. Meloni : Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 111, pa ges 713-719 (1965) g et, de plus, est un composé utile comme pro- duit intermédiaire dans la synthèse d'autres ribotides utiles. Un autre exemple est le 2-méthyladénine-9-ss-D-ribofurannoside-5'- phosphate, qui est important non seulement en tant que nucléotide dit traceur dans 1'ARN de transfert R.W. Holley, J. Apgar, G A. Everett, G.T. Madison, S,H,.Merrill & A. Zamir : Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. 28, pages 117-121 (lu63) 7, mais aussi comme produit intermédiaire dans la synthèse d'autres ribotides utiles. Jusqu'ici, il n'existait pas de procédé de préparation de ribotides utilisant des microorganismes et les autres procédés connus n'ont pas été commercialement réalisables. La présente invention vise un procédé industriel bon marché de préparation de ribotides, et en particulier de phosphates de ribosyle de dérivés de la purine-2-substituée, par fermentation en utilisant des microorganismes appartenant aux genres Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter et Micrococcus . Les ribotides s'accumulent dans le milieu de culture et peuvent & re facilement récupérés à partir de celui-ci. La demanderesse a constaté le phénomène suivant lorsqu'un certain microorganisme indiqué ci-dessus est cultivé dans un milieu en présence d'un dérivé de purine ayant la formule I suivante ou d'un riboside de celui-ci, on obtient des quantités importantes de ribotides représentés par la formule II suivante FOiiI1ULE I tNH2 C, SN RÉÙÉH H dans laquelle R est un groupe CH3 ou un atome d'halogène iOUlUIE II SrIs I ' CH m 0È M N7 R200H2 0 H H H X OH OH H dans laquelle R1 est un groupe CH3 ou un atome d'halogène et R2 désigne Les organismes utiles dans la présente invention appartiennent aux genres Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter et Micrococcus ; tous appartiennent à la classe Schizomycetes.Brevibacterium est un genre appartenant à la famille Brevibacteriaceae de l'ordre des Eubacteriales et présente généralement les caractéristiques suivantes : bâtonnets courts, non ramifiés ; généralement non mobile ; le type de mobilité des espèces mobiles est péritriche ou incertain, parfois chromogène, avec des pigments non solubles dans 11 eau, rou geâtres, orange-rougeâtre, jaunes ou bruns ; peut ou non réduire les nitrates ; le bouillon de glucose devient généralement acide ; lactose non fermenté ; l'action protéolytique varie selon les espèces ; aérobie et facultativement anaérobie ; rarement microaérophile. Corgnebacterium est un genre appartenant à la famille Corynebacteriaceae, de l'ordre des Eubacteriales et est généralement caractérisé par : batonnets droits ou faiblement incurvés avec des segments, parfois des granulations colorées irrégulièrement ; présentent fréquemmént des renflements en forme de massue ; la division par scissiparité produit des arrangements de cellules angulaires et en palissade ; non mobile, avec des exceptions parmi les pathogènes des plantes ; gram-positif, mais parfois des jeunes cellules et parfois les vieilles perdent facilement la coloration ; granulations invariablement gram-positive ; généralement tout à fait aérobies, mais il peut exister des espèces microaérophiles ou même anaérobies, réaction à la catalase positive ; peut ou non liquéfier la gélatine peut ou non produire des nitrites à partir de nitrates ; peut ou non fermenter les sucres, mais produit rarement ou m & e jamais une acidité élevée ; de nombreuses espèces oxydent le glucose complètement en C02 et H20 sans produire de gaz visible. Arthrobacter est un genre appartenant à la famille Corynebacteriaceae , de l'ordre des Eubacteriales, et présente généralement les caractéristiques suivantes : dans les cultures jeunes, les cellules apparaissent sous forme de bâtonnets qui peuvent varier en dimensions et forme depuis des formes droites jusqu'à des formes courbées, incurvées, renflées ou en massue, la division par scissiparité peut donner un arrangement cellulaire angulaire ; une formation de filaments courts avec bourgeonnement rudimentaire peut se produire, en particulier dans les milieux liquides plus riches ; gram-négatif ou gram variable des cellules en forme de cocci sont observées de façon caractéristique dans des cultures après un ou plusieurs jours, ces cellules persistent en tant que forme prédominante dans les cultures plus vieilles et sont gram-négatives à gram-positives on trouve également des cellules en forme de cocci plus grosses qui donnent naissance à une ou plusieurs cellules en forme de batonnets à la suite d'un transfert récent ; généralement non mobile ; croissance molle ou visqueuse sur des milieux solides; croissance dans des milieux liquides généralement peu abondante; la plupart des espèces liquéfient la gélatine ; peu ou pas d'acide à partir des hydrates de carbone ; nitrites généralement obtenus à partir des nitrates ; indole non obtenu ; aérobie la plupart des espèces présentent une croissance faible ou nulle à 370cl Micrococcus est un genre appartenant à la famille Micrococcaceae de l'ordre de Eubacteriales et présente les caractéristiques suivantes : cellules en amas irréguliers ; le groupe est considéré comme gram-positif bien que certaines espèces perdent leur pouvoir de rétention de la coloration tellement rapidement qu'elles sont fréquemment considérées comme gramnégatives ; certaines espèces sont non mobiles ou présentent des variétés mobiles ; croissance sur agar généralement abondante, certaines espèces ne forment pas de pigment mais d'autres forment des pigments jaunes, oranges ou rouges ; réaction à la Ga- talase positive, pour autant qu'on le sache ; bouillon de glu cose faiblement acide, bouillon de lactose généralement neutre gélatine fréquemment liquéfiée, mais jamais rapidement ; saprophyte, facultativement parasite ou parasite. L'invention est caractérisée par le fait qu'on ajoute un dérivé de purine de formule I indiquée ci-dessus ou le riboside de celui-ci au milieu de culture qui est fermenté par des microorganismes appartenant à l'un des genres Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter et Micrococcus, qui sont aptes à convertir les composés de formule I ou leurs ribosides en ribotides correspondants qui s'accumulent dans le milieu ou y sont ensuite récupérés. Pour déterminer si un microorganisme particulier possède cette aptitude, on emploie simplement un test de sélection. Le procédé employé comprend la culture du microorganisme proposé dans un milieu contenant un précurseur et la détermination des ribotides correspondants dans la liqueur de culture. La détermination des ribotides est effectuée par un procédé classique, par exemple, par combinaison d'une chromatographie sur papier et d'une mesure d'absorptioL UV. A titre d'exemple, on décrit ci-dessous un procédé utilisant de la 2-fluoroadénine comme précurseur. Le microorganisme proposé est cultivé dans un milieu contenant la 2-fluoroadénine pendant un certain temps. On soumet le filtrat de la liqueur de culture résultante à une chromatographie sur papier en utilisant du papier filtre Toyo NO 51A et un système de solvant acide isobutyrique : acide acétique : solution aqueuse IN d'ammoniac (10 : 1 : 5 en volume).Dans ces conditions, les valeurs de Rf du 2-fluoroadénine-9 ss-D-ribofurannoside-5'-mono- phosphate (désigné ci-après sous le nom de FAMP), du 2-fluoroa dénine-9-ffi-D-ribofurannoside-5'-diphosphate (désigné ci-après sous le nom de FADP) et du 2-fluoroadénine-9-ss-D-ribofurannoside- 5'-triphosphate (désigné ci-après sous le nom de FATP) sont respectivement de 0,45, 0,35 et 0,25.On coupe le papier filtre pour obtenir les portions correspondant à ces valeurs de Rf et on les extrait avec de l'eau chaude, On réalise les spectres d'ab- sorption W des liqueurs d'extraction résultantes et on les compare avec ceux de FAMP, FADP et FATP. Les spectres de FAMP, FADP et FATP sont identiques, présentant un maximum d'absorption à 264 mA à pH 2,0 et à 263 mS à pH 7,0 et llXOo Dans chaque cas, on observe un palier à 270 mp. Ainsi, on peut détecter FAMP, FADP et FATP, et de plus, on peut déterminer les quantités de FAMP, FADP et FADP fw- mées et accumulées dans la liqueur de culture par calcul à partir du maximum d'absorption UV. Le milieu de culture employé dans la présente invention peut titre synthétique ou naturel. Par exemple, on peut employer un milieu contenant une source de carbone, tel que le glucose, l'hydrolysat d'amidon et les mélasses, une source d'azote (par exemple urée, chlorure d'ammonium, sulfate d'ammonium et nitrate d'ammonium), une substance minérale (par exemple, dihydrogénophosphate de potassium, hydrogénophosphate dipotassique, sulfate de magnésium, chlorure de sodium , sulfate ferreux, sulfate de manganèse et carbonate de calcium) De plus, dans certains cas, on peut ajouter au milieu une substance naturelle contenant de l'azote, telle que de l'extrait de levure, de la peptone, de l'extrait de viande, de la farine de poisson, de la liqueur de trempage de mais, etc.Lorsqu'on emploie une souche exigeant un élément nutritif, des substances qui satisfont à cette condition doivent, bien str , être présentes dans le milieu. On peut ajouter les composés de formule I ou leurs ribosides au milieu mentionné ci-dessus avant ou pendant le processus de fermentation. On peut ajouter le composé en une seule fois, de façon intermittente pendant la fermentation ou de façon continue pendant la période de fermentation. On peut employer lesdits composés ou leurs ribosides en concentration variées et on préfère une concentration comprise entre 0,5 mg/ml et 10 mg/ mi. On effectue la fermentation dans des conditions aérobies, par exemple par culture par secousses, par culture submergée avec aération-agitation, etc. On effectue de préférence la culture à une température comprise entre 20 et 400C et à un pH compris entre 4,0 et 9,5. Cependant ces conditions de température et de pH ne sont pas limitatives et peuvent varier selon le microorganisme spécifique employé. On préfère faire pousser le microorganisme dans un milieu d'ensemencement avant de l'utiliser pour l'inoculation du milieu de culture. Le milieu d'ensemencement est incubé dans des conditions favorables de croissance pendant une durée suffisante pour développer une population convenable d'organismes, typiquement pendant environ 24 heures. On utilise ensuite le milieu d'ensemencement pour inoculer le milieu de culture. On effectue alors la fermentation jusqu'à ce qu'une quantité considérable de ribotides désirés soit formée et accumulée dans le milieu résultant, habituellement en 1 à 5 jours. Quand la culture est terminée, on isole les ribotides accumulés dans le milieu de culture par des moyens connus tels que l'adsorption sur une résine échangeuse d'anions fortement basique, suivie d'une élution. La mise en oeuvre de certains modes de réalisation spécifiques de l'invention est illustrée à l'aide des exemples représentatifs suivants. EXEMPLE 1 Dans cet exemple, on cultive une souche de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 dans un milieu d'ensemencement contenant 2 % de glucose, 1 % de peptone, 1 % d'extrait de levu re, 0,3 % de NaCl et 30 pg/l de biotine à 300C pendant 24 heures. On inocule la culture d'ensemencement ainsi préparée en une quantité égale à 10 * du volume du milieu de fermentation, dans un Erlenmeyer de 250 ml contenant 20 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante : 100 g de glucose, 6 g d'urée, 10 g de KH2 PO4, 10 g de K2HP04, 10 g de NgSO4. 7H20, 0,1 g de CaC12.2H20, 30 pg de biotine et 10 g d'extrait de levure dissous dans l'eau pour obtenir un volume total de 1 litre.0n ajuste le milieu de fermentation à pH 8,0 avec Na0H et avant l'inoculation, on le stérilise dans un autoclave à une pression de 1 kg/cm pendant 10 minutes. Après une fermentation de 72 heures, on ajoute au milieu de la 2-fluoroadénine à une concentration de 2 mg/ml et on continue la culture pendant encore 48 heures. Par suite, 0,80 mg/ml de FAMP, 1,41 mg/ml de FADP et 1,74 mg/ml de FÂTP sont formés et accumulés dans la liqueur de fermentation. Pour isoler les produits accumulés, on adsorbe les ribotides de 2-fluoroadénine contenus dans la liqueur de fermentation sur une résine Dowex I (forme acide formique)(marque de fabrique de Dow Chemical, E.U.A.), qui est une résine échangeuse d'anions fortement basique du type styrène et on élue ensuite les fractions avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium. On ooncentre à scissité chacune des fractions ainsi obtenues pour récupérer les ribotides de 2-fluoroadénine. Les quantités de chacun des ribotides obtenus à partir d'un litre de liqueur de fermentation sont les suivantes FAMP 220 mg FADP 450 mg FATP 510 mg EXEMPLE 2 Dans cet exemple, on effectue la culture de la même façon que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise de la 2fluoroadénosine à la place de la 2-fluoroadénine. Par suite, 0,50 mg/ml de FAMP, 1,21 mg/ml de FADP et 0,82 mg/ml de FATP sont formés et accumulés dans la liqueur de culture. EXEMPLE 3 Dans cet exemple, on effectue la culture de la même façon que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise une souche d'Arthrobacter sp. ÂTCC 21085 comme souche d'ensemencement, à la place de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. Par suite, les quantités de ribotides de 2-fluoroadénine formées dans la liqueur de culture sont les suivantes FAMP 0,71 mg/ml FADP 1,61 mg/ml PÂTP 1,32 mg/ml EXEMPLE 4 Dans cet exemple, on effectue la culture de la m8- me manière que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise une souche de Corynebacterium sp. ATCC 21084 comme souche d'ensemencement à la place de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872.Par suite, les quantités de ribotides de 2-fluoroadénine formées dans la liqueur de culture sont les suivantes 1,1 1,1 mg/ml FADP 0,82 mg/ml FÂTP 0,90 mg/ml EXEMPLE 5 Dans cet exemple, on effectue la culture de la mê- me façon que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise une souche de Micrococous sodonensis ÂTCC 15932 comme souche d'ensemencement à la place de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872.Par suite, les quantités de ribotides de 2-fluoroadénine formées dans la liqueur de culture sont les suivantes FAMP 1,20 mg/ml FADP 0,73 mg/ml FAIY 0,53 mg/ml EXEMPLE 6 Dans cet exemple, on effectue la culture de la m- me façon que dans l'exemple 1, sauf quton utilise de la 2-méthyladénine à la place de la 2-fluoroadénine.Par suite, 1,20 mg/ml de 2-méthyladénine-9--D-ribofurannoside-51 -monophosphate (désigné ci-après sous le nom de MANP), 1,10 mg/ml de 2-méthyladé nine-9--I)-ribofurannoside-5 -diphosphate (désigné ci-après sous le nom de MADP) et 1,80 mg/ml de 2-méthyladénine-9-ss-D-ribofu- rannoside-5'-triphosphate (désigné ci-après sous le nom de NATP) sont formés et accumulés. On adsorbe 1 litre de la liqueur de culture, après élimination des cellules microbiennes, sur la résine Dowex I (forme acide formique), une résine échangeuse d'anions fortement basique du type styrène et on élue ensuite les fractions avec une solution aqueuse de formiate d'ammonium. On concentre à siccité les fractions ainsi obtenues pour récupérer les ribotides de 2-méthyladénine. Les quantités obtenues sont les suivantes 360 360 mg MÂDP 330 mg MATP 540 mg EXEMPLE 7 Dans cet exemple, on effectue la culture de la mê- me façon que dans l'exemple 6, sauf qu'on emploie la 2-méthyladénosine à la place de la 2-méthyladénine.Par suite, les quantités de ribotides de 2-méthyladénine formées dans la liqueur de culture sont les suivantes MAMP 0,58 mg/ml MADP 1,10 mg/ml MATP O,60 mg/ml EXEMPLE 8 Dans cet exemple, on effectue la culture de la même façon que dans l'exemple 6, sauf qu'on emploie respectivement comme souches d'ensemencement, des souches de Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter citreus ATCC 11624 et Micrococcus sodonensis ATCC 15932 à la place de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. Par suite, les quantités de ribotides de 2-méthyladénine formées dans la liqueur de culture sont indiquées dans le tableau ci-après. TABLEAU Quantité de ribotides de 2-méthyl Souches utilisées adénine formé (mg/ml) MAMP MADP MATP Corynebacteriui sp, ATCC a1084 0,60 1,14 1,32 Arthrobacter citreus ATCC 11624 1,20 0,87 1,64 Micrococcus sodonensis ATCC 15932 1,13 0,68 0,72 Par conséquent, on reconnaîtra que le procédé de la présente invention est un procédé industriel économique de préparation de ribotides. REVENDICATIONS 1 - Procédé de préparation de ribotides de purine 2-substituée caractérisé par le fait qu'il comprend la culture d'une souche d'un microorganisme appartenant au genre : Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter ou Micrococcus, capable de produire des ribotides dans un milieu nutritif dans lequel se trouve un dérivé de purine 2-substituée ou un riboside de celui-ci, l'accumulation desdits ribotides dans ce milieu de culture et leur récupération à partir de celui-ci. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdits ribotides de purine 2-substituée, sont de formule générale dans laquelle R1 est un groupe CH3 ou un halogène, R2 désigne et que ledit dérivé de purine 2-substituée est de formule générale dans laquelle R1 est un groupe CH3 ou un atome d'halogène. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Brevibacterium ammoniagenes. 4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Arthrobacter sp. ATCC 21085 5 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Corynebacterium sp. ATCC 21084 6 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Micrococcus sodonensis ATCC 15932. 7 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Arthrobacter citreus. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé par le fait que ledit dérivé de purine 2-substitué est présent dans ladite culture en une concentration comprise entre 0,5 mg/ml et 10 mg/ml.