FR 2146943 A1 19730309 FR 7127449 A 19710727 La présente invention, à la realisation de laquelle ont participé Messieurs André BEILOC, Jean FLORENT, Jean LUNEL, Madame Denise HANCY et Mousieur jean VERRIER, concerne une nouvelle auzye désign6e ci-après par le numéro 22.730 RP et son procédé de préparation. Cette nouvelle enzyrae presente un intérât tout particulier cote agent thrombolytique et elle peut être caractérisée in vitro par une activité protéolytique gémérale. L'enzyme 22,750 RP peut être obtense par culture, dans des milieux appropriés, d'un microorganisme appartenant an genre Streptomyces, identifié plus cooplètement ci-après et désign6 par l'appellation "Streptoayces venetus DS 24,288" (NRRL 3987). L'enzyme 22.750 PP obtenue selon le procédé de la présente invention contient environ 65 X de facteur actif qui a pu être identifie et obtenu, en faible quantité, à l'état pur par électrophorèse préparative sur blocs d'acétate de cellulose L'enzyme 22.750 RP selon l'invention présente les caractres physico-chimiques suivants L'amyde 22,750 RP est très soluble dans l'eau, soluble dans les n'langes hydroalcooliques et hydrmac6toniques, trs peu soluble dans les solutions concentrées de sels neutres [NaCl : (NH4) SO4] ou da polyéthylèneglycol et lasoluble dans les alcoole anaydres, l'abétone, l'hexane, l'ac6tate d'éthyle, l'éther at l'ès solavante chorés, L'enxyme 22,750 RP est une proteine qui donne les réactions classiques des prot6ines (réactions du biuret, réaction de Folin, coloration par le rouge Ponceau, le noir avide 12 3 R ou le bleu de Coomassle), L'enzyme 22-750 RP contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote, du phosphore et du soufre, Sa composition élémentaire est voisine de C Z = 44,0 H Z = 6,5 % N % = 12,5 P Z = 0,35 S % = 0,65 rt'apris son comportement en chromatographie sur gel de dextrane ou sur gel de polyacrylamide, le 22.750 RP a une masse moléculaire de 4000 # 5000. L'hydrolyse scide de l'enzyme 22.750 RP a pemmis de mettre en evidence les aminoacides suivants pour lesquels est indiquée la teneur en millimole pour 10 g de produit acide aspartique (8,5), thréonine (7), sérine (6,5), acide glutamique (5), proline (2), glycine (10,5), alanine (7,5), valine (5,5), isoleucine (2), leucine (3), tyrosine (3,5), phénylalanine (1), lysine (2), arginine (2) et histidine (1,5). L'enzyme 22,750 RP est caractériséepar les propriétés physiques données ci-après : Aspect : poudre beige (après lyophilisation) Spectre ultra-violet : (détermination à partir d'une solution à 0,02 % dans l'eau) 1% absorption à 210 nm E 1 cm = 205 1 % minimum d'abeorption à 250 mm E = 7,8 maximum d'absorption & 278 mm E = 14,1 1 cm Spectre infra-rouge (détermination à partir de comprim6s en m6lange avec KBr) Ce spectre est représente par la figure 1, dans laquelle on a porté en abscisses, d'une part les longueurs d'ondes expriae'es en microns (échelle supérieure) d'autre part les nombres d'ondes en cm- (échelle inférieure) et en ordonnées la densité optique. Dans le tableau I ci-après, on indique les principales bandes d'absorption infra-rouge pour ce produit. Tableau I 3410 tF 1445 m 940 m 3300 épt. 1385 m 810 f 3070 épt. 1330 tf 735 ept. 3015 épt. 1300 f 690 épt. 2950 m. 1235 m 650 ept. 2920 m. 1145 f 610 épt. 2860 f 1120 tf 550 F 2840 épt. 1090 épt. 480 épt. 1645 tF 1070 F 460 épt. 1535 tF 1045 m 420 épt. tF = trs forte m = moyenne tf = très faible F = forte f = faible épt. = épaulement Pouvoir rotatoire : (détermination à pattir d'une solution à 0,5 % dns l'eau) [a]23D = -10,3 # 0,3 [a]23 436 = - 17,7 # - 0,3 L'enzyme 22.750 RP peut être caractérisée par son comportement en électrophorèse sur gel d'acetate de cellulose ("Cellogel" N.D.CNETETRON) en utilisant différents tanpons : a scide citrique - phosphate disodique pE = 2,2 = O,.9 acide acétique - acétate de sodium pfl = 4,0 = 0,1 - acide diéthyl-5,5 barbiturique pH 5 8,6 p = 0,075 - soude - glycine pH - 9,6 = 0,1 La révélation peut être effectuée par des m6thodes colerim6triques ou par mesure de l'activité protéolytique. Par exemple, à pH = 4,0, le facteur actif tigre vers la cathode t il y a déplacement de 5 mm/2 heures avec une tension constante de 250 volts (intensite variant de 6 A 15 milliompères). L'activité enzymatique du 22.750 RP s'exerce sur un grand nombre de substrats de nature protéique et en particulier sur la caséine, l'hémoglo- bine, la fibrine. Elle s'exerce plus faiblement sur l'ester éthylique de la benmoylarginine et ue s'exerce pratiquement pas sur l'ester éthylique de l'acétyltyrosine. L'activité sur la caséine est déterminée selon une technique inspirée de celle de Kunitz a nise au point pour le dosage de la trypsine [H.Kunit%. Je Gen, Physiol., 30, 291 (1947)). Les peptides solubles dans I'acide trichloracétique libérés au cours de l'hydrolyse sont dosés par spectrophotometrie (megure de la densité optique à 280 nm). L'activité enzymatique peut être exprimée an unitée Kunits (U.K.) : selon la définition de Kunitz, une unité est la quantité d'ezyme qui libère asses de peptides solubles pour que la densité optique à 280 nm du filtrat trichloracétique s'accroisse de 1,000 en une minute. Dans le tableam II sont rassemblés les résultats qui ont été obtenus avec l'enzyme 22.750 RP selon l'invention en comparaison avec deux enzymes protéolytiques cristallise os : la trypsine et la chymotrypaine. Tableau II Activité Réaction substrat U/g 22,750 RP Trypsine Chymotrypsine Protéolyse esséine (a) 7,000 4,000 4.800 azo-caséine (b) 15,700 13,300 3.250 gélatine (c) 1,000 4.000 100 Pibrinolyze caillot de fihrine bovine(d) 2,500 29.000 4.000 caillot de plasma de lapin(e) 4,100 2.000 2.700 caillot de plama de chien (f)200,000 20.000 10.000 Esterolyse B.R.E.E. (g) 3,000 34.000 300 A.T.E.E. (h) 500 2.000 116.000 (a) Réaction à pH = 8,0 , à 37 C - Concentration en substrat = 5 g/l (b) " " = 7,5 37 C - " " " = 12,5 g/1 (c) " " = 7,5 37 C - Sur film de gélatine (d) " " = 7,4 37 C - Concentration en fibrinogène : 10 g,l (e) " " = 7,5 37 C - " il plasma : 400 cm3/1 (f) " " = 7,4 37 C - " " " : 200 cm3/1 (g) " " = 7,7 25 C - " " substrat : 5 . 10 4M (h) " " = 7,0 25 C - " " " : 5 . 10-4 M L'activité thombolytique et fibrinolytique a été confirmée sur des animaux de laboratoire. A la z se te de mg/kg administrée par voie intra-veineuse, l'enzyme 22,750 RP protège, de façon significative, le lapin vis-à-vis de la coagulation intravasculaire induite par passage dans la jugulaire d'un fil de nylon impregné de collagène (technique inspirée de celle de J.L. David et colle, C.R. Soc. Biol., 162, 1763 (1968)]. Ces propriétés permettent l'utilisation du produit selon l'invention en thérapeutique humaine dans la prévention et le traitenent des thromboses veineuses, des embolies pulmonaires, des thromboses des artères coronaires, des artères des extrémités et des artèras cérébrales. L'organisme producteur de l'enzyme 22,750 DF appartiant au genre Streptomyces et est désigné par l'appellation "Streptomyces venetus DS 24.288" (HRRL 3987). Cet organiste a été isole d'un échantillon de terre prélevé en Inde. L'isolement de Streptomyces venetus DS 24.288 a été effectué en suivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité de terre en suspension dans de l'eau distillée sterile, à diluer la suspension à différentes concentrations, et à étaler un petit volume de chaque dilution sur la surface de boites de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques jours à 26 C. qui permet au microorganisme de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives inclinées afin d'en obtenir des cultures plus abondantes. Streptomyces venetus DS 24.288 forme des spores ovales, mesurant 0,4 à 6 1 1 à 1,2 . Ses sporophores comportent des filaments sporifères spiralés dont l'enroulement est le plus souvent de 5 à 8 tours, mais peut parfois etre un peu plus important ; ceux-ci sont assez souvent insérés isolement sur les filements qui les supportent, mais on peut observer aussi des sporophotes en grappes de quelques éléments. Par son mode de sporulation, cette souche se classe dans la section Spira de la classification de Pridham. Streptomyces venetus DS 24.238 se développe bien à 250C et à 37 C, mais pas à 50 C. il pessède la propriété de produire du pigment mélanique noir sur milieu approprié à la tyrosine, produit H2S, réduit fortement les nitrates en nitritos, hydrolyse l'amidon, liquéfie la géltine. peptonise le lait sans roagulation préalable et utilise la cellulose. La coloration de son mycélium végétatif va, suivant les milieux, du jaune au jaune brun, brun jaune ou brun foncé ; les pigments solubles qu'il produit sont en général d'un ton brun jaune plus ou moins foncé suivant les milieux, pouvant dans certaine cas atteindre le brun noirâtre. Son mycélion aérien se colore en bleu lorsque survient la sporulation. Les caractères culturaux et les proprietés biochimiques de êtreptomyces venetus DS 24.268 sont rassenblés dans le tableau III. Ce sont ceux de cultures arrivées à un bon stade de développement, c'est-à-dire d'environ 3 semaines à 25 C sauf indications contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nutritives et des bouillons habituellement utilisés pour déterminar les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses inclinées. Un certain noubre des milieux de culture enployés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinonycetes", S.A.WAKSMAN, p. 193-197, Ghronica Botanica Compang, WalthAn, Mass., U.S.A., 1950 ; dans ce cas ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été attribué dans "The Actinomycetes". Les références ou constitutions des autres milieux de culture sont les suivantes - Ref. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. PRIDHAM et col. - Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - Ref. B - K.L. JONES - Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949 - Rdf. C - Formule W-23, additionnée de 2 % de gélose - Réf. D - "Yeast Krtract Agar" - T.G. PRIONAM et col. - Antibiotics Annuel, 1956-1957, p. 950 - Réf. E-"Tomato Paste Oatmeal Agar"- T.G.Pridham et col.- Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - - Réf. F - Tielanin formation nediun" - The Actinomycetes, vol. 2, p. 333, n 42 - S.A. WANSMAN - The Willions and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Réf, G - W.E. GRUMOY et col. - Antibioties and Chem. 2, 401, 1952 - Ref. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" L T.G. PRIDHAM et col. Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 951 - Réf. I - "Substrat 1 mit iaineralischer Stickstoffquelle", p. 14 - G.F. GAHSE et col., ZUR KLAGSIFIZIERUNG DER ACTINKG YCETEN - VER GUSTV FISCHER VERLAG. JENA-1958. - Réf. J - correspond à la formule W-1, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose - Réf. K - correspond a la formule W-1, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g de glycérine - Ref. L - correspond à la fonaule W-18, où 30 g de saccharose sont remplaces par 15 g de glucose - Réf. W - correspond à la formule W-18, où le secchrose est suprimé et remplacé par de petites bandes de papier filtre immergées partiel lement dans le liquide - Réf. N - "Hanual of Hathods for Pure Culture Study of Bacteria" - de la Society of American Bacteriologists - Geneva, N.Y., II50-18 - Réf, P - "Plain gelatin" - préparé suivant les indications du "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - de la Society of American Bacteriologists - Geneva, N.Y. II50 - 18 - Réf. Q - Lait écrémé en poudre commercial, reconstitué selon les indications du fabricant - Réf. R - Hlicu indiqué pour la recherche de lpruduction de H2S pr : H.D. TRESNRR et F. DANGA- Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1950. TABLEAU III Milieux de Degré de Mycélium végétatif (M.v.) Appareil aérien Observations et culture dévelop- ou (comprenant l'ensemble Pigment soluble propriétés pement Enver@ de la culture du mycélium aérien et biochimiques de la sporulation) Gélose de Très bon Envers brun noirâtr@ Bleu grisâtre clair. Brun foncé, spores ovales me Hickey et Bien développé. allant vers surant 0,4 à 0,6/ Tresner brun noirâtre 1 à 1,8 , (Réf. A) Sporophores spi ralés, non rami fiés ou en grap pes courtes Gélose de Bon Envers brun jaune Blanchâtre à bleu Brun jaune Bennett clair (réf. B) Gélose Bon M.v. épais et plissé, Blanchâtre. A l'état Brun jaune d'Emerson brun jaune de traces (Réf. C) Gélose à Bon M.v. épais et plissé, Blanchâtre à bleu Brun orangé l'extrait de brun jaune clair levure de Pridham (Réf. D) Gélose à la Bon M.v. épais et plissé, Blanchâtre à bleu Brun jaune farine d' brun jaune clair avoine et à l'extrait de tomates de Pridham (Réf. E) Gélose glu- Assez bon M.v. épais et plissé, Blanc-grisâtre. Brun jaune cose-peptone brun jaune Très pauvrement dé (W.6) veloppé TABLEAU III (Suite) Milieux de Degré de Mycélium végétatif (M.v.) Appareil aérien Observations et culture dévelop- ou (comprenant l'ensemble Pigment soluble propriétés pement Envers de la culture du mycélium aérien et biochimiques de la sporulation) Gélose Moyen M.v. brun jaune Nul Brun jaune nutritive (W-5) Gélose tyro- @odéré Envers brun noirâtre Gris bleu Noir Formation de mésine-extrait lanine: positive, de levure (lectures effecpour forma- recommandations tion de mé- de l'auteur) lanine (Réf. F) Gélose au @odéré M.v. jaune citron Blanchâtre. A l'état Nul Solubilisation malate de de traces du malate : calcium de positive, bonne Krainsky (Réf. G) Gélose à l' Pauvre M.v. incolore à brunâtre, Blanchâtre. A l'état Jaune brunâtre ovalbumine pauvrement développé de traces faible (W-12) Gélose glu- Assez bon M.v. épais et plissé, Blanchâtre à bleuté. Brun jaune cose-aspara- jaune brun à brun jaune Assez pauvrement gine développé (W-2) Gélose gly- Assez bon M.v. épais, brun jaune Blanchâtre à bleuté. Brun jaune cérine-aspa- Très pauvremnt ragine développé (W-3) TABLEAU III (suite) Milieux de Degré de Mycélium végétatif (M.v.) Appareil aérien Observations et culture dévelop- ou (comprenant l'ensemble Pigment soluble propriétés pement Envers de la culture du mycélium aérien et biochimiques de la sporulation) Gélose amidon- Assez bon Envers brun jaune Bleu grisâtre clair Nul -Spores ovales sels minéraux mesurant 0,4 à de Pridham 0,6/1 à 1,2 . (Réf. H) Sporopheres spi ralés, non rami fiés ou en grap pas courtes. -Hydrolyse de l'amidon: posi tive Gélose amidon- Modéré Envers brun jaune Blanchâtre à bleu Brun jaune Hydrolyse de nitrate clair l'amidon: posi (W-10) tive Gélose amidon- Bon M.v. épais et plissé, Bleu grisâtre clair Brun jaune fonazote minéral brun jaune cé, allant vers de Gause noirâtre (Réf. I) Gélose syn- Bon M.v. épais et plissé, Blanchâtrte. Brun jaune thétique de brun jaune Très pauvrement Czapek au développé saccharose (W-1) Gélose syn- Bon M.v. épais et plissé, Blanchâtre. A l'état Brun jaune clair thétique de jaune brun de traces Czapek au glucose (Réf. J) TABLEAU III (suite) Milieux de Degré de Mycélium végétatif (M.v.) Appreil aérien Observations et culture dévelop- ou (comprenant l'ensemble Pigment soluble propriétés pement Envers de la culture du mycélium aérien et biochimiques de la sporulation) Gélose syn- Moyen M.v. jaune brunâtre clair Nul Jaune brunâtre thétique de clair Czepek à la glycérine (Réf. K) Bouillon Bon Voile épais. Envers jaune Blanc Jaune brunâtre Production de niamidon-ni- brun à brun jaune trites: fortement trate positive (W-19) Bouillon de Modéré Voile blanc-jaunâtre Nul Nul ou tardif, Production de ni Czapek au jaune faible trites: fortement saccharose positive (W-18) Bouillon de Modéré Voile bianc-jaunâtre Nul Nul ou tardif. Production de ni Czapek au jaune faible trites: fortement glucose positive (Réf. L) Bouillon de Modéré Voille blanchâtre. Modé- Bleu grisâtre clair. Nul -Production de ni Czapek à la rément dévaloppé, Modérément développé trites:fortement cellulose sur le voile et sur le positive. (Réf. M) papier émergeant du -Utilisation de la bouillon cellulose:positive Bouillon nu- Bon Anneau bien développé, Blanchâtre. A l'état Brunâtre Production de nitritif nitraté jaunâtre de traces trites: fortement (Réf. N) positive TABLEAU III (suite) Milieux de Degré de Mycélium végétatif (M.v.) Appareil aérien Observations et culture dévelop- ou (comprenant l'ensemble Pigment soluble propriétés pement Envers de la culture du mycélium aérien et biochimiques de la sporulation) Culture sur Bon M.v. très épais et très Blanchâtre. A l'état Noir pomme de plissé, brun jaune foncé de traces terre (W-27) Gélation pure Bon Colonie centrale épaisse Blanchâtre. Pauvre- Jaune brun à Liquéfaction à 12 % à la surface. ment dévaloppé. brun jaune rapide de la (Réf. F) M.v. jaune brun gélatine Lait écrémé 1) à 25 C Bon Anneau brun jaune clair Nul Peptonisation (Réf.Q) sans coagula tion. pH passant de 6,2 à 6,6 en 1 mois 2) à 37 C Bon Anneau brun foncé Nul Production de H2 S sans coagula tion. pH passant de 6,2 à 6,@ en 1 mois Gélose de Bon M.v. brun noirâtre Nul Noir, abondant Production de H2S Tresner et poaitive, (lactu Dange res effectuées se (Réf. R) lon les rocomman dations des au teurs). Streptozyces venetus DS 24.288 présente un enseuble de caractères qui ne cotncident exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites. En considérant les espèces dont la description est donnée par S.A. WAKSMON dans "The Actinomycetes" (vol. 2, The Williams and Willdas Compsay, Baltimore, 1961), S. venetus DS 24.238 prendrait place dans la "Série Virido chromogenes" décrite page 19 de cet ouvrage, étant donné ses propriétés de produire du pigment mélanique, de montrer un mycélium aérien sporulé bleu, un mycélium végétatif brun clair à brun foncé, de former des pigments solubles allant de jaune brun à brun jaune ou brun très foncé suivant les cas sur milieux synthétiques ou organiques, et de présenter des sporophores spiralés. Il ne peut toutefois être assimilé à aucune des trois espèces citées par S.A. WAKSWAN cossue constituant cette sériez à savoir : étreptomyres virido- chrocogenes, Streptomyces chertreusis et Streptomyces cyaneus. D'une part il ne peut être identifié à S. cyaneus qui forme sur milieux gélosés un mycélim, végétatif coloré en bleu, ce qu'il ne fait janais ; en outre et contrairement à S. venetus DS 24.238, S. cyaneus n'utilise pas la cellulose et ne réduit pas les nitrates en nitrites. D'autre part il ne peut non plus être assimilé à S. chartreusis qui donne un pigment soluble vert-jaune à noir sur gélatine et ne donne pas de pigment soluble sur gélose nutritive ni sur pomme de terre, tandis que S. venetus DS 24.238 donne un pigmant soluble brun jaune sur gélatine ainsi que sur gélose nutritive et un pigment soluble noir sur pomme de terre. Enfin il se différencie essentiellement de S. viridochronogenes par le fait que ce dernier forme d'une manière caractéristique sur un certain nombre de milieux du mycélium végétatif prenant une teinte vert très foncé, pouvant mêne atteindre le vert noirâtre (en particulier sur gélose synthétique nitratée au saccharose, sur gélatine et sur gélose nutritive) ; S. venetus DS 24,280 forme un mycélium végétatif qui reste dans tous les cas dans une gamme de tons allant de jaune brun à brun jaune et ne se teinte jamais de vert, de même qu'il ne produit jamais de pigment soluble vert foncé. En outre, S. viridochromogenes ne réduit pas les nitrates en nitrites, alors que S. venetus DS 24.283 le fait d'une manière particulièrement forte et rapide, aussi bien sur les milieu synthétiques que sur les milieux organiques. S.A. WAKSMAN rapporte aussi au 8'groupe viridochronogenes" un certain nombre de souches décrites par GAUSZ et col. (zur Klassifizierung der Actinomyceten, G. Fischer, Jena, 1950) : en le comparant à ces dernieres, qui constituent la plus gronde partie de la Série Coerulescens de GAUSE, S. venetus DS 24,288 se situerait dans le dernier groupe qui comprend les souches dont le myoéliem végtatif sur gélase smiden-azots minéral de est de couleur foucéde et qui comprend seulement deux aspèces : Actinomyces (Straptomyces) viridochromoganes et Actinomytes (Streptomyces) coeruleofuscus. 6. venetus DS 24.288 diffère de l'espèce S. viridethromogenes assentiellement par la coloration vert foncé que peut prendre le mycéliue végétatif de ce dernier sur un certain nombre de milieux que S.A. WAKSMAN a cités dans sa description. On peut noter de plus dans la description donnée par GAUSE et col. que S. viridochromogenes produit également un mycélim vigétatif prenant une teinte vert foncé sur lait, sur gélose à l'amidon, sur poense de terre, sur gélose amidon-azote minéral de GAWSE et ne produit pas de pigent soluble sur ce dernier milieu; comparativement 8. venetus DS 24.288 ne donne en aucun cas de mycélium végétatif vert foncé sur ces milieux et produit un pigeent soluble brun jaune foncé sur gélose amidon-azote minéral de GAUSE.La formation d'un pigment soluble vert foncé sur gélatine, citée par GAUSE dans le cas de S, viridochromogenes manque dans le cas de S. venetus DS 26,288. S. venetus DS 24.288 ne peut pas etre identifié à S. coeruleofuscus qui, contrairement à lui, ne réduit pas les nitrates et n'utilise pas la cellulose; de plus S. coeruleofuscus ne donne pas de pigment soluble sur milieu organique gélosé ni sur poste de terre, alors que S. venetus Ds 24.288 donne régulièrement, sur tous les milieux organiques essayés un pigment soluble brun jaune, et sur pomme de terre un pigment soluble noir. La capacité de S. venetus DS 24.288 à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer son développement a été déterminée suivant le principe de la m6thode de Pridham et Gottlieb (J, of Bact. 56, 107-114, (1948); le degré de développement a été observé sur le milieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de carbone raspectivement essayées, soit SO4(NH4)2 par les diverses sources d'azote respectivment essayées. Les résultats sont indiqués dans le tableau N. TABLEAU TV Sources de carbone Utilisation Sources d'azote Utilisation essayées assayées D-Ribose positive NO3Na positive L-Arabim positive N02Na positive L-Arabinose positive SO4(NH4)2 positive L-Rhammose positive PO4H(NH4)2 positive D-Glucose positive Adénine positive D-Galactose positive Adénosine positive D-Fructose positive @ Urée positive positive l-Asparagine positive Tableau IV (suite) Sources de carbone Utilisation Sources d'azote Utilisation essayèes essayées L-Sorbose négative Glycocolle positive Lactose positive Sarcosine n6gative Haltose positive DL-Alanine positive Saccharose positive DL-Vallne positive Tréhalose positive Acide DL-aspartique positive Cellobiose positive Acide L-glutmique positive Boffinose positive L-Arginine positive Dextrine positive L-Lysine positive Inuline négative DL-Serine positive Amidon positive DL-Thréonine positive Glycogène positive Taurine négative Glycérol positive DL-Phénylalanine positive Srythritol négative L-Tyrosine positive Adonitol positive DL-Proline positive Dulcitot négative L-Hydroxyproline positive D-Ilannitol positive L-Histidine positive D-Sorbitol négative L-Tryptophane positive Inositol positive Bétaïne positive Salicine positive mais lente Le procédé de préparation de l'enzyme 22.750 RP consiste essenticllement à cultiver Streptomyces venetus DS 24,288 ou ses mutents sur un nilieu et dans des conditions appropriées et à séparer ensuite l'enzyme 22.750 RP formée au cours de la culture. La culture de Streptomyces venetus DS 24.288 peut être effectuée par toutc néthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, mais cette dernière est à préférer pour des raisons de comiodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont maintenant d'un usage courant dans l'industrie des fementations. On peut en particulier adopter la marche suivante pour la conduite des opérations Streptomyces venatus DS 24,288 - stock culture sur gélose culture en fiole agitée culture incoulum en fermenteur culture de production en fermenteur Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance et des épaississants, tous ces éléments pouvant être apportés sous forne de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses. Clone sources de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le lactoses les dextrines, l'emidon, les mélasses ou d'autres substances hydrocarbonées comme les sucres alcools tels que le glycérol ou le mannitol, ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique, tartrique, ... Certaines huiles annales ou végétales corme l'huile de lard ou lthuile de soja peuvent avantageusement remplacer ces différentes sources hydrocarbonées, ou leur être adjointes. les sources convenables d'azote assinilable sont extrêmement variées, Elles peuvent être des substances chimiques tros simples comme les nitrates, les sels minéraux ou organiques d'emmonium, l'urée, les acides aninés. Elles peuvent être aussi apportées par des substances compleres contenant principalement l'azote sous forme protidique : castine, lactAlbunine, gluten et leurs hydrolyvats, farines de soja, d'arachide, de poisson, extrait de viandes de levure, distiller's solubles, corn-steep. Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir en effet tempon ou usutralisant, coome les phosphtes alcalins ou alcalinoterreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D'eut:es apportent l'équilibre ionique nécessaire au développemetn du btreptomyces venetus DS 24.288 et à l'élaboration de l'enzyme 22.750 RP, comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins ou alcalino-terreux. Enfin certains agissent plus spécialement comme activateurs des réactions métaboliques de Streptemyces venetus DS 24.288 : ce sont les sels de fer, de cobalt. Parmi les épaississants, les plus habituellement employés sont l'amidon, le carboxyméthylcellulose, la gélose. Le pH du milieu de fermentation au début de la culture doit être compris entre 6,0 et 7,8, de préférence entre 6,4 et 7,5. La température optimale pour la fermentation est de 25-28 C, oyais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 4000. L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 2 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particuli8rement bien. Le rendement maximal en enzyme 22.750 RP est obtenu après i à 7 jours de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé. L'enzyme 22.750 RP peut être isolée des moûts de fermentation par filtration du moût en présence d'un adjuvant de filtration, concentration du filtrat sous pression réduite, acidification du filtrat à un pH voisin de 4, filtration puis dialyse du filtrat contre un courant d'eau distillée puis précipitation de l'enzyme 22.750 RP par addition d'acétone au dialysais L'enzyme 22.750 RP ainsi obtenue peut être ensuite purifiée par des méthodes physico-chimiques usuelles. Plus prticulièrement, les méthodes de purification utilisées consistent à dissoudre l'enzyme dans de l'enu distillée puis à précipiter l'enzyme par addition de solvants dans lesquels l'enzyme est insoluble. L'enzyme 22.750 RP peut également être purifiée par chromatographie sur différents supports tels que la cellulose en poudre, par dialyse ou par électrophorèse préparative. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent cornent l'invention peut être mise en pratique. Exemple i On charge dans un fermenteur de 170 litres - peptone ... 600 g - extrait de viande ... 600 g - glucose hydraté ... 1200 g - huile de soja ... 120 cm3 - chlorure de sodium ... 600 g - eau. de ville complément pour 110 litres Le pH est ajusté à 7,50 par addition de 120 cm3 de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122 C pendant 40 minutes. Après refroidissement le volute du bouillon est de 120 litres, du fait de la condensation de la vapeur pendant la stérilisation et le pH est égal à 7,0* On ensemence avec 200 cm3 d'une culture en erlemmeyer agité de Streptomyces venetus Ds 24,288. La culture est développée à 26 C pendant 28 heures en agitant et en aérant avec de l'air stérilisé en vue d'ensemencement de la culture productrice. La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes - corn-steap (50 Z d'extrait sec) ... 8 kg - huile, de sofa @@ 6 litres - sulfate d'ammonium ... 0,8 kg - chlorure de cobalt hexahydroaté ... 0,008 kg - eau de ville complément pour 360 litres Après avoir ajusté le pH à 6,40 par addition de 450 cm3 de soude 10 N, on ajoute - carbonate de calcin ... 2 kg puis on stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 12200 pendant 40 minutes. Agrès refroidissentent, le volume du bouillon est de 390 litres du fait de la condensation de la vapeur pendant la stérilisation. il est complété à 400 litres par addition de 10 litres d'une solution aqueuse stérile contenant - glucose hydraté ... 4 kg Le pH est alors 6gl à 6,60. On ensemence avec 40 litres de le culture inoculum en fermenteur de 174 litres décrite ci-dessus. La culture est effectuée a 26 C, pendant 116 heures, en agitant à l'aide d'une turbine tournant à 260 t/mm et en aérant avec un volume d'air stérilisé de 35 m3/h. Le pH final du milieu est de 6,80 et le volume du moût de 380 litres. L'activité protéolytique du moût est de 0,4 U.K./cm3. Exemple 2 3 litres de moût préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 1 et titrant 0,4 U.K./cm3 sont placés dans une cuve munie d'un agitateur. On y ajoute 18 kg d'adjuvant de filtration, lc mélange est filtré sur filtre-presse et le gateau de filtration est lavé par 100 litres d'eau. On obtient ainsi 400 litres de filtrat titrant 0,35 U.K./cu3. Le filtrat est concentré sous pression réduite à une température de 35 C. On obtient 30 litres de concentrat titrant 3,77 U.K./cm3. le pH du concentrat est ajusté à 4,0 par addition de 450 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N puis on ajoute 300 g d'adjuvant de filtration. On filtre puis lave le gâteau de filtration par 2 litres d'eau. Le concentrat clarifié est refroidi à 4 C et dialysé pendant 7 heures contre un courant d'eau distillée à cette même température. Dans le dialysat obtenu (37 litres), maintenu à 4 C, on ajoute sous agitation 111 litres d'acétone préalablement refroidie à 10 C puis on agite encore pendant 10 à 15 minutes après la fin de l'addition du solvant. Le précipité actif est recueilli par filtration, lavé à l'acétone froide, séché sous pression réduite (20 non de mercure) pendant 24 heures à une température voisine de 3000. On obtient ainsi 997 g de produit titrant 97 U.K./g. Exemple 3 1915 g de produit brut préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 2 et titrant 97 U.K./g sont dissous dans 40 litres d'eau distillée Dans la solution ainsi préparée on ajoute lentement, sous agitation, 9,6 kg de sulfate d'ammouium cristallisé (quantité calculée pour obtenir une solution à 33 % de la saturation en sel). On continue d'agiter pendant 20 minutes après la fin de l'addition du sel puis on centrifuge à 1300 G. Le précipité obtenu est éliminé. Dans le surnageant, on ajoute lentement, sous agitations 5 kg de sulfate d'ammonium cristallisé (quantité calculée pour obtenir une solution à 52 Z de la saturation en sel). On agite encore pendant 15 minutes après la fin de l'addition du sel puis on laisse reposer pendant 1 heure. On centrifuge à 1800 G. Le précipité actif est recueilli, repris par 1 litre d'eau distillée et la solution obtenue est dialysée à travers une membrane de cellophane pendant 24 heures à 4 C contre 40 litres d'eau distillée. Le dialysat est lyophilisé; on obtient 70 g de produit titrant 1200 U.IC.lg. D'après l'analyse électrophorétique ce produit contient environ 13 e; de facteur actif. Exemple 4 102 g de produit préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 3 et titrant 1200 U.K./3 sont mis en solution dans 4100 cm3 d'eau distillée et on ajuste le pH de la solution à 3,0 par addition de 66 cm3 de soude N. Dans la solution ainsi obtenue on ajoute lentement, sous agitation > i,25 kg de polyéthylèneglycol 1500. On agite encore pendant 15 minutes après la fin de l'addition de l'agent précipitant. On laisse ensuite reposer pendant 15 minutes puis on centrifuge pendant 15 minutes à 12.000 @ à 4 C. Le précipité actif est mis en solution dans 700 cm3 d'eau distillée et la solution obtenue (800 cm3) est refroidie à 400. On y ajoute lentement, sous agitation, 4 litres d'isopropanol refroidi à -60 C. La précipité actif est recueilli par centrifugation pendant 15 minutes à 3000 G à -10 C, puis séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) en présence de P205 à une température voisine de 20 C. On obtient ainsi 30,7 g de produit titrant 1600 U.K.ig et contenants d'aptès l'analyse électrophorétique, 20 % environ de facteur actif. Exemple 5 10 g de produit préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 4 et titrant 1600 U.K.ig sont mis en solution dans 400 cm3 d'eau distillée et le pH de la solution est ajusté à 8,0 par addition de 3 cm3 de soude N. Dans la solution ainsi obtenue, on ajoute lentement, sous agitation, 26,6 cm3 d'une solution aqueuse à 6 Z de lactate de diazino-6,9 éthoxy-2 acridine, Après 15 minutes d'agitation supplémentaire puis 1 heure de repos à 4 C, on centrifuge pendant 10 minutes à 12.000 G à 4 C. Le précipité inactif obtenu est éliminé. La solution surnageants est concentrée sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 2500 jusqu'à un volume de 25 cm3. On la refroidit alors à 4 C et on y ajoute lentement, sons sgitation, 250 cm3 d'isopropanol refroidi à -60 C. Le précipité actif est recueilli par centrifugation pendant 15 minutes à 12,000 z G à -10 C, puis séché sous pression réduite (0,2 En de mercure) en, présence de P2O5 à une température voisine de 20 C. On obtient ainsi 4,7 g de produit titrant 2240 U.K./g et contenant, d'après l'analyse électropborétique, 37 % environ de facteur actif. Exemple 6 200 as de produit préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 5 et titrant 2240 U.K./g sont mis en solution dans 3 cm3 de tempon phosphate 0,01 m à pH 6,5 et on ajoute 3 cr3 d'isopropanol et 4 g de cellulose en poudre pour chromatographie. La pato ainsi obtenue est placée sous une épaisseur régulière au sommet d'une colonne de cellulose. La colonne a 3 cm de diamètre et contient 80 g de cellulose dans un mélange volune à volume d'isopropanol et de tampon phosphate 0,01 il de pH = 6,5 (ce qui représente une hauteur de 39 on). On élue par un mélange tampon phosphate-isopropanol, en faisant croître de façon linéaire la proportion dc tampon dans le mélange ; le débit est de 35 cm3/heure. L'éluat est recueilli par fractions de 20 cm3 environ et sa densité optique est mesurée en continu par un analyseur "UVICURD L.K.B." à 230 nia. Le diagramme obtenu présente un premier pic très dissynétrique puis, bien séparé, un deuxième pic symétrique correspondant à une concentration en tanpon comprise entre 78 % et 92 %. L'analyse électrophorétique montre que seul ce deuxième pic contient le facteur actif. On regroupe les fractions correspondant à ce deuxième pic (fractions 53 à 70, soit 415 cm3), on élimine l'alcool par évaporation sous pression réduite (2 mn de mercure), puis on dialyse contre 10 litres d'eau distillée pendant 24 heures à 40C et on lyophilise. On obtient ainsi 43 me de produit titrant 6400 U.K./g et contenant, d'après l'analyse électrophorétique, 55 % environ de facteur actif. Exemple 7 3 g de produit préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 4 et titrant 1600 U.K./g sont mis en solution dans 40 ca3 de tanpon véronal p11 = 2,6 = 0,0375 et cette solution est dialysée à travers une mambrene dc cellophane pendant 48 heures contre 10 litres de ce même campon à 4 C. La solution est alors clarifiée par centrifugation pendant 15 minutes à 12.000 G à 40C puis déposée au sorbet d'une colonne L,K.B., de type PORATE, pour électrophorèse préparative contenant 1,3 kg de cellulose dans du tampon véronal p2 = ,6 u = 0,075 (ce qui représence une hauteur de 66 cm). On applique alors aux bornes de l'appareil une tension de 500 volts (anode en haut) ; l'intensité du courant est voisine de 0,46 A : la température à l'intérieur de la colonne est maintenu aux environs de 20 C par circulation en continu dans la double paroi d'un liquide de rofroidissement à 4 C. Des la premilre heure de l'électrophorèse des impuretés colories migrent dans le compartiment anodique ; on élimine le tamon coloré et on le remplace par du tampon frais, en répétant cette opération autant de fois qu'il est nécessaire ; l'élimination de ces pigments est à peu près totale après 6 heures d'élactrophorèse.On réduit alors la tension à 400 volts (I = 0,32 A) et on met en route une élution à contre-courant dans le bas de la colonne, avec un débit de 250 cra/heure ; l'éluat est recueilli par fractions de 50 cm3 environ et sa densité optique est gesurée en continu par un analyseur "UVICORD L.K.D." à 280 mm. après 15 heures à ce régime en remonete la tension à 500 volts (I = 0,40 A) en ramenant le débit de l'élution à contre-courant à 125 cm3/hemre. après 10 beures, seit 31 hevres après le débet de l'opération, on arrate l'électrophorèse et on élue directeaent de haut en bas par du véronal avec oa débit de 210 cm3/heurs. La diagramme obtenu présente un premier petit pic (vers la 23ème heure d'électrophorèse) puis 3 pics importants imparfaitement séparés. L'analyse électrophorétique montre que seul le 3ème pic contient le facteur actif. On regroupe les fractions correspondant à ce 3ème pic éoit 1425 cm3), on concentre à 400 cm3 par évaporation sous pression réduite (2 ma de nercure) puis on dialyse 3 fois pendant 24 heures contre, chaque fois, 50 litres d'eau distillée à 4.0. Le solution dialysée est concentrée à 10 cm3 par évaporation sous pression réduite (2 mm de mercure), puis refroidie à 4 C. On y ajoute lentement, sous agitation 100 cm3 d1isopropanol refroidi à -60.0. Le précipité actif est recueilli par centrifugation 10 minutes à 12.000 G à -10 C, puis séché sous pression réduite (0,2 um de mercure) en présence de P205 à une temp6rature voisine de 20 C. On obtient ainsi 276 me de produit titrant 7000 U.K./g et contenant, d'après l'analyse électrophorétique, 65 Z environ de facteur actif. Les compositions médicinales contenant le produit selon l'invention en présence d'un ou plusieurs diluants et pouvant filtre anployées par voie intra-veineuse constituent un autre objet de la présente invention. Les compositions pour administration intra-veineuse peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses. Couse solvant ou véhicule, on peut enployer des solutions aqueuses diluées de propyleneglycol, de polyéthylèneglycol ou de glucose. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisantst par irradiation ou par chauffages Elles peuvent également être préparées sous fones de compositions stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable. Les doses a utiliser dépendent de l'effet thérapeutique recherché et de la durée du traitement : elles peuvent être comprises entre 10 et 100 mg de produit actif par jour pour un adulte en une ou plusieurs injections. D'une façon générale, le médecin déterminer la posologie qu'il astime la plus appropriée en fonction de l'âge, du poids et des différents facteurs propres au sujet à traiter. L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention Exemple On dissout 1 g de l'enzyme 22.750 RP dans 100 cm d'eau, La solution obtenue est filtrée sur filtre bactériologique. On la réparti@ aseptiquement en ampoules à raison de 5 cm par a@poule puis lyophilise. Au moment de l'emploi, on dissout le contenu de l'ampoule dans 5 soluté injectable par voie intra-veineuse. R E V E N D I C A T I O N S 1 - 3 fibrinolytique 22.750 HP contenant 65 Z de facteur actif caractérisé en ce qu'elle est une substance protéique très soluble dans l'eau, soluble dans les mélangeshydroalcooliques et hydroacétoniques, très peu soluble dans les solutions concentrées de seuls neutres ou de polyéthylène- glycol, insoluble dans les alcools anhydres, l'acétone, I'hexane, l'acétate d'éthyle, l'éther et les solvants chlorés qu'elle contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'arote, du phosphore et du soufre, qu'elle absorba dans l'U.V. en slution aquense à 210 mm (E1% 1cm = 205), 250 mm (E1% 1cm = 7,8) et zà 278 mm (E1% 1cm = 14,1) et qu'elle un pouvoir totatoire spécifique de [a]23 D = -10,3 # 0,3 (C = 0,02 ; eau) 2 - Procédé de préparation de l'enzyme selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cultive en aérobiose Streptomyces venetus DS. 24288 (tmrl 3987), ou ses mutants producteurs, sur un milieu classique convenable et sous les conditions habituelles pour ce genre de culture, puis sépare et purifie l'enzyme formée au cours de la culture. 3 - Composition pharmaceutique utilisable en thérapeutique humaine caractérisée en ce qu'elle renferme comme produit actif le produit selon la revendication 1 en association avec tout autre produit lui-même inerte ou physiologiquement actif.