FR 2119909 A1 19720811 FR 7128138 A 19710730 71 28138 1 2119909 La présente invention concerne d'une façon générale l'extraction de substances utiles d'hyphes de myeètes, ou champignons comestibles et elle concerne, plus particulièrement, un procédé nouveau et perfectionné pour extraire d'hyphes de myeètes comes-5 tibles certaines substances possédant une activité thérapeutique; parmi les myeètes de ce type, la variété la plus importante est probablement le "Shiitake" qui est une appellation courante au Japon pour des Lentinus edodes appartenant à la catégorie des Basidiomycetes, qu'on trouve en abondance en Asie orientale. 10 Alors que les "cueillettes de champignons" constituent sim plement un mets très apprécié dans les civilisations occidentales, les habitants des pays orientaux savent depuis longtemps que certaines espèces de champignons comestibles ont un effet curatif pour un grand nombre de maladies et d'affections chez l'homme. En 1~ particulier, la culture chinoise antique était probablement la plus avertie de ce fait, comme on peut le constater par de nombreux écrits qui font ressortir la valeur thérapeutique des "Shiitake"et d'autres myeètes comestibles. Cependant malgré tous leurs effets bénéfiques, les substan-20 ces utiles, que l'on étudiera en détail, par la suite, ont été extraites jusqu'alors uniquement par un procédé séculaire de décoction, selon lequel on fait bouillir les organes de fructification des myeètes comestibles pendant une durée déterminée. L'extrait liquide ainsi obtenu n'est pas aussi efficace qu'il devrait 25 l'être. De plus, les organes de fructification des champignons comestibles ne sont pas disponibles en grosses quantités, ou au mieux peuvent être obtenus à un prix élevé, si bien que l'extraction des ingrédients utiles ne se fait pas normalement à l'échelle industrielle. 30 En conséquence, la présente invention a pour objet un procé dé nouveau et perfectionné pour l'extraction de substances utiles des hyphes d'un mycète comestible, procédé selon lequel on cultive les hyphes de mycète comestible dans un milieu nitritif préparé, on pulvérise les hyphes conjointement avec le milieu nutritif yi en particules fines, à peu près à l'instant où les hyphes commencent la fructification, on charge les particules fines dans de 1 eau pour former une suspension, on filtre la suspension pour la débarrasser de substances indésirables et on obtiaat ainsi un extrait du mycète comestible. 40 Bien que le présent procédé soit applicable à des myeètes 71 28138 2 2119909 comestibles variés, le champignon "Shiitake" déjà cité est probablement le plus approprié en raison des ingrédients dans l'extrait qu'il fournit, comme on l'étudiera en détail par la suite. Un avantage supplémentaire est que le "Shiitake" peut être cultivé artifi-b ciellement dans des conditions relativement faciles. On sait que les membranes des cellules des hyphes du "Shiitake" et de certains autres myeètes comestibles sont composées principalement de bêta-lT3-glucane et de chitine et que les membranes des cellules sont dissoutes dans les bêta-1,3-glucanase et 10 chitinase, qui sont les enzymes produites dans les cellules des hyphes pendant les processus métaboliques de ces dernières. D'autres essais effectués par la demanderesse ont démontré que la concentration des substances thérapeutiquement efficaces, y compris des enzymes indiquées, dans les cellules des hyphes des champignons 15 comestibles est la plus prononcée au stade de la transformation des hyphes secondaires en organes de fructification. Bien que les raisons exactes de ce fait ne soient pas connues, on déduit des connaissances acquises qu'il en est vraisemblablement ainsi par suite de la plus forte activité métabolique des cellules des hy-20 phes à ce stade particulier. En conséquence, l'invention envisage d'extraire les substances utiles des hyphes de myeètes comestibles et non pas des organes de fructification. Ce mode opératoire est doublement avantageux car les extraits obtenus des hyphes sont plus efficaces sur 25 le plan thérapeutique que ceux provenant des organes de fructification, et en outre, les hyphes sont beaucoup moins coûteuses que les organes de fructification. On peut cultiver les hyphes désirées pour le procédé selon l'invention dans des milieux nutritifs tels que des bûches, des 30 sciures agglomérées, des bagasses et divers liquides. On a démontré expérimentalement que les hyphes qui ont été cultivées dans les trois milieux solides ci-dessus sont plus aptes au traitement pour obtenir les extraits ayant l'action désirée. On peut préparer les divers milieux nutritifs, qu'on utilise pour la mise en oeuvre 35 de l'invention, exactement comme on le faisait dans le passé. Cependant, en ce qui concerne la culture dans les sciures, le rapport de la sciure aux enveloppes de grains de riz doit être d'environ 9 : 1 pour procurer les mei Lleurs résultats, au lieu du rapport 7 : 3 qu'on utilisait jusqu'à présent. 40 Bien qu'un milieu nutritif inoculé avec une culture d'ense 71 2Ô138 3 2Î19909 mencement du mycète comestible désiré puisse être conservé dans les conditions usuelles, on a démontré expérimentalement que les hyphes développées dans cette culture doivent être soumises à un changement rapide de température et/ou d'humidité à un moment propice. afin de stimuler et accélérer la croissance ou les processus métaboliques. Les changements préférés de l'environnement auxquels on soumet les hyphes seront étudiés en détail par la suite, notamment dans certains des exemples du procédé selon 1' invention. Etant donné que les hyphes qui sont sur le point de donner des organes de fructification contiennent les substances utiles en des concentrations maximales, comme on l'a déjà dit, il est essentiel ou au moins hautement souhaitalble que les hyphes soient traitées à cet instant précis. Cet instant critique peut être déterminé par certains signes évidents. Tout d'abord un milieu nutritif qui contient des hyphes suffisamment évoluées vire au blanc dans les parties narginales immédiatement avant la formation d'organes de fructification. En second lieu, en ce qui concerne les "Shiitake" et certaines espèces voisines, on constate une sorte de phénomène de gonflement sur les couches d'hyphes lorsque les hyphes se sont suffisamment développées dans le milieu nutritif. On pulvérise alors les hyphes développées au degré voulu du champignon comestible choisi, conjointement avec le milieu nutritif, pour former des particules fines, ce què l'on peut effectuer par des moyens appropriés quelconques. On introduit les matières pulvérisées dans de l:eau distillée et stérilisée à un pH d environ .0. On charge la suspension ainsi préparée dans un récipient hermétique, on chauffe et on filtre pour obtenir l'extrait désiré. Pour réaliser les meilleurs résultats, le chauffage de la suspension doit se faire en deux stades successifs, dont le premier est à une température d'environ 30 à 35° C pendant une heure et dont le second est à une température d'environ K-j à 55°C pendant de une à deux heures. Le premier stade de chauffage accélère la production des bêta-1,3-glucanase, chitinase et autres enzymes d'hyphes, alors que le second stade de chauffage sert à stimuler les activités de ces enzymes. On peut mélanger l'extrait liquide ainsi obtenu avec une quantité appropriée de sulfate d'ammonium, pour provoquer la précipitation des substances utiles contenues dans l'extrait. On 71 28138 4 2119909 dissout les précipités recueillis dans de l'eau distillée et stérilisée et on soumet cette nouvelle solution à une dialyse à 1' aide d une membrane semi-perméable, pour éliminer le résidu de sulfate d ammonium. Cette membrane semi-perméable doit être telle 5 qu'elle laisse passer des particules dont la masse moléculaire ne dépasse pas environ 1000 De plus, on doit régler avec soin la proportion de sulfate d'ammonium ajouté au filtre. On a -'émontré expérimentalement qu'on obtient les meilleurs résultats si l'on mélange environ 584 g de sulfate d'ammonium avec environ :.000 ml 10 du filtrat. Une analyse de l'extrait obtenu à partir d'hyphes de "Shiitake" par le procédé décrit fait ressortir la présence des ingrédients suivants : 40 enzymes, y compris les bêta-1,3-glucanase et chitinase, 18 amino-acides, les vitamines B^ et B-^, l'ergostéri-15 ne, des polysaccharides et des polypeptides. Cependant, il est vraisemblable que les extraits contiennent d'autres substances utiles encore inconnues. Dans ce qui suit, on présente seulement quelques uns des résultats qui ont été obtenus par l'utilisation d'un extrait pro-20 venant des hyphes de "Shiitake" selon l'invention : 1. Une femme âgée de 42 ans, souffrant depuis des années d' uee tension artérielle élevée maximum 21 et minimum 16 cm de Hg) a pris 100 ml de l'extrait, trois fois par jour avant les repas. Au bout de quatre jours, sa tension est descendue à un maximum de 25 16 et à un minimum de 10, après quoi la tension s'est stabilisée dans cet intervalle. 2. Un homme âgé de 40 ans, dont les amygdales avaient un aspect blinc par suite de l'amygdalite dont il souffrait, a pris 200 ml de 1 extrait et il a été entièrement guéri au bout de 24 30 heures. 3. Un homme de 36 ans dont lerhume avait fait monter la température à environ 39°C a pris 200 ml de l'extrait, trois fois par jour, avant les repas. En 24 heures sa fièvre est tombée. 4. Un homme de 41 ans souffrant d'un eczéma vésiculaire 35 grave, a effectué des applications locales de l'extrait, quatre fois par jour. En deux jours l'eczéma a disparu et n'est pas réapparu. 5. Un homme de 42 ans souffrant d'un grave cancer de l'estomac a pris 50 ml de l'extrait, trois fois par jour, pendant 30 40 jours et, à l'expiration de ce laps de temps, on a constaté des 71 28138 5 2119909 signes d'amélioration sans qu'on puisse présenter à lTheure actuelle d'explication concluante de ce phénomène). 6. Après chauffage à une température d'environ 30 à 33 °C et séchage jusqu'à une teneur en humidité de 20 $, on a ajouté ^ à un aliment destiné aux animaux une petite quantité d'une culture contenant des hyphes de "Shiitake" correctement développées. Les parois des cellules des Eumycètes qui s'étaient développées dans l'aliment ont été dissoutes par les activités de bêta-1,3-glucanase et de chitinase introduites par la culture ajoutée, ce 0 qui a pour effet de protéger les animaux contre les maladies infectieuses possibles. Il semble également que les enzymes indiquées, dont les activités ont été accélérées par la chaleur intestinale des animaux, ont dissous les corps des cellules des Eumycètes en amino-acides qui jouent un rôle important dans le 5 métabolisme et la croissance des tissus de l'animal. 7. Des essais ont démontré que les activités des bêta-1,3-glucanase et chitinase dans une culture contenant des hyphes de "Shiitake" correctement développées et qui ont été traitées sensiblement de la façon décrite, détruisent certains myeètes indé- 0 sirables dans le sol quand la culture est mélangée avec ces produits. On sait également que les enzymes stimulent le développement des bactéries et des micro-organismes utiles contenus dans un tel sol. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans 5 aucunement en limiter la portée : EXEMPLE 1 On a versé dans un récipient convenable 1 kg d'un milieu nutritif contenant de la bagasse et de J.1 eau distillée, à un pH d'environ ;:,0 dans un rapport tel que le taux d'humidité soit 30 compris entre environ 60 et 63 fo, puis on a chauffé en autoclave à 121 °C pendant 20 minutes pour stériliser. On a inoculé au milieu nutritif stérilisé une culture d'ensemencement de "Shiitake" et on a laissé au repos pendant 60 jours dans une chambre à air conditionné dans laquelle on a maintenu une température sensible-3i' ment constante d'environ 2f>°C. Pourréaliser le changement désiré de la température, on a transféré la culture dans une chambre dans laquelle la température était comprise entre environ 4 et 8°C. Après une période de 72 heures au repos dans cette chambre à basse température, on a plongé la culture avec son récipient dans -0 de l'eau à une température d'environ 5°C pendant 24 heures. Dès 71 28138 D 2119909 qu'on a constaté le phénomène de gonflement dont il a été fait mention plus haut des hyphes de "Shiitake" qui couvraient à ce moment toute la surface du milieu, on a pulvérisé en particules fines les hyphes, conjointement avec une partie du milieu de 5 culture. A 300 g de ces particules, on a ajouté environ 1000 ml d'eau distillée et stérilisée à un pH d'environ 3,0. On a chauffé la suspension ainsi obtenue, d'abord à environ 30 °C pendant une heure et ensuite à environ 50°C pendant deux heures, dans un récipient hermétiquement clos. On a filtré sous pression la sus-10 pension à travers un tissu et ensuite on a dialysé à l'aide d'un filtre à membrane dont les pores avaient une dimension d'environ 0,45 micron pour obtenir ainsi environ 600 ml d'un extrait liquide contenant les substances utiles. EXEMPLE 2 15 On a répété fidèlement le procédé de l'exemple 1 , mais en remplaçant le milieu nutritif décrit par un autre milieu qui contenait les sciures d'un arbre feuillu et des enveloppes de graines de riz, dans un rapport d'environ 9 ' 1 et dont l'humidité était réglée à environ 60 à 65 fo par addition d'eau distillée à 20 un pH d'environ 5,0. On a ainsi obtenu 620 ml d'extrait liquide. EXEMPLE 3 On a inoculé à une bûche de chêne japonais ;Quercus glandu-lifera) une culture d'ensemencement de "Shiitake" et on a cultivé dans des conditions ordinaires. A peu près au moment où les 25 hyphes propagées ont commencé à former un organe de fructification, on les a pulvérisées conjointement avec la bûche. A 1 kg de particules ainsi obtenues, on a ajouté 1000 ml d'eau distillée et stérilisée à un pH d'environ 5,0. On a traité la suspension de la façon décrite dans l'exemple 1 et on a obtenu environ 30 700 ml d'extrait liquide. EXEMPLE 4 On a mélangé 1000 ml de l'extrait liquide de "Shiitake" obtenu selon l'un des exemples 1 à 3 avec environ 584 g de sulfate d'ammonium. On a laissé la solution au repos pendant 24 heures à 35 la température ambiante et on a ainsi provoqué la précipitation de substances utiles qui étaient contenues dans l'extrait liquide. On a recueilli les précipités par filtration, on les a rincés à trois reprises avec une solution presque saturée de sulfate d! ammoàium, en effectuant une filtration entre les rinçages succes-40 sifs. On a chargé 10 g des précipités (à l'état humide) ainsi 71 28138 7 2119909 traités dans environ 100 ml d'eau distillée et stérilisée ayant uh pH d'environ 3,0. On a dialysé la solution à l'aide d'une membrane serai-perméable et on a ainsi obtenu environ 35 ml de solution exempte de sulfate d'ammonium et contenant les substances 5 utiles. On a mélangé cet échantillon avec de l'eau distillée et stérilisée et on a dialysé de nouveau pour achever la stérilisation. On a administré ce produit aux patients dont il a été question dans la description. Bien que l'invention ait été décrite en détail à l'aide d' 10 exemples de certains modes de réalisation particuliers, il va de soi qu'il ne s'agit que d'exemples non limitatifs et que des modifications peuvent leur être apportées sans sortir du cadre de 1'invention. 71 28138 8 ' 2119909 REVENDICATIONS 1. Procédé pour 11 extraction de substances utiles des hyphes d'un mycète comestible, caractérisé en ce qu'on cultive les hyphes de mycète comestible dans un milieu nutritif préparé, on 5 pulvérise les hyphes conjointement avec le milieu nutritif en particules fines à peu près à l'instant où ces hyphes commencent la fructification, on charge les particules fines dans de l'eau pour former une suspension, on filtre la suspension pour la débarrasser de substances indésirables et on obtientainsi un ex- 10 trait du mycète comestible. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on soumet le milieu nutritif à un changement rapide de température et d'humidité, pour accélérer la croissance des hyphes contenues dans ce milieu. 15 3- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu' on soumet le milieu nutritif contenant des hyphes correctement développées à un changement rapide depuis la température ambiante jusqu'à me température comprise entre 4 et 8°C 'environ et on plonge ce milieu dans de l'eau. 20 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on chauffe ladite suspension dans un récipient hermétiquement fermé avant la filtration, pour accélérer ainsi la production et l'activité des enzymes dans les hyphes pulvérisées. 5- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu' 25 on chauffe d'abord la suspension à une température d'environ 30 à 35°C pendant -une heure environ et ensuite à une température d' environ 45 à 55°C pendant de une à deux heures environ. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on mélange en outre l'extrait liquide obtenu avec une quantité 30 prédéterminée de sulfate d!ammonium, pour provoquer ainsi la précipitation des substances utiles, on recueille les précipités, on les dissout dans de l'eau et on dialyse la solution pour la débarrasser des restes du sulfate d'ammonium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 3^ caractérisé en ce que le milieu nutritif est choisi parmi la ba- gasse, les sciures et les bûches. 8. Procédé selon la revendication J, caractérisé en ce qu' on utilise les sciures en mélange avec des enveloppes de graines de riz, le rapport des sciures aux enveloppes de riz, dans le mi- 40 lieu nutritif ainsi obtenu., étant d'environ S : 1. 71 28138 9 2119909 9- Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 8, caractérisé en ce que le mycète comestible appartient à la famille des Basidiomycètes et est connu au Japon sous le nom de "Shiitake". 10. Extraits obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. caractérisés en ce qu'ils sont administrés à des fins thérapeutiques par voie orale ou par application locale desdits extraits sur des patients souffrant de certaines maladies, notamment d'une tension artérielle élevée, d'amygdalite, de rhume avec fièvre, d'eczéma et de certaines variétés de cancer.