FR 2088089 A1 19720107 FR 7017836 A 19700515 La présente Invention, à la réalisation de laquelle a participé monsieur René MARIAL, concerne un vaccin contre la myxomatose et sa préparation à partir d'une souche atténue du virus de la myxomatose. La myxomatose est une maladie, due à un virus du groupe Pox, pathogène pour les lapins sauvages ou domestiques et qui entralne dans la très grosse majorité des cas (plus de 80 %) la mort des animaux. Les premiers symptômes de la maladie sont une atteinte oculaire : blépharo-conjonctivite puis tuméfaction et fermeture totale des paupières. Suivent alors des oedèmes du nez, du museau, des orifices anal et génital. Enfin des nodules ou tumeurs sous-cutanées apparaissent. Les animaux maigrissent, deviennent apathiques et meurent dans les 10 à 15 jours qui suivent l'infection. Si dans certaines régions où les lapins sont considérés comme des animaux nuisibles (Australie par exemple), la myxomatose peut être considerée comme une aide à l'extermination de ces parasites qui ravagent cultures et forêts, dans les élevages de lapins, soit pour leur fourrure, soit pour la consommation humaine, cette maladie est un véritable fléau pouvant causer des pertes considérables. La préparation d'un vaccin stable et conférant une bonne immunité est donc de première importance. I1 est déjà connu de préparer des vaccins anti-myxomateux à partir de souches atténuées de virus de la myxomatose, Ainsi ic KERCHER et SAITO ont décrit une souche atténuée pouvant autre utilisée comme vaccin [ Nature 202 933 (1964) ; J. Inf. Dis. 114 417 (1964)3 , mais cette souche s'est révélée instable in vivo puisqu'elle retrouve sa virulence par passage par l'organisme du lapin [cf JACOTOT et colt, Ann. Inst. Past. 113 221 (1967)]. Actuellement le vaccin commercial le plus couramment employé en France est obtenu à partir du virus du fibrome de SHOPE[ Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 38 86 (1938)]. Cependant ce vaccin pressente encore une efficacite insuffisante. L'objet de la présente invention est la préparation d'un vaccin, actif et stable, par inoculation à une culture cellulaire d'une souche atténuée de virus de la myxomatose, La souche atténuee a été obtenue à la suite des opérations décrites ci-après (1) Isolement d'une souche de virus de la myxomatose Une souche a té isolée à partir d'un lapin provenant d'un élevage et atteint de myxomatose généralisée grave. Une tumeur sous-cutanée a été prélevée aseptiquement et broyée en présence de soluté physiologique (2 cm3 de soluté physiologique par gramme de tumeur).Le broyat ainsi obtenu a étt centrifuge à une température comprise entre O et 40C pendant 20 minutes dans une centrifugeuse tournant à 1500 tourslminute. La suspension surnageante a été recueillie et conservée à -70 C(glace carbonique). Cette suspension virale constitue le stock de la souche pathogene, appelée dans ce qui suit Souche L1. (2) Passage de la souche de virus sur membrane chorio-allantoRdienne. Pour chaque passage sur membrane chorio-allantoIdienne, une vingtaine d'oeufs embryonnés au 11ème jour d'incubation ont été utilises. Chaque oeuf est inocule avec 0,10 cm3 d'une suspension virale obtenue de la façon suivante A 1 cm3 de la suspension surnageante obtenue ci-dessus et dont on a ramené la température à OOC, on ajoute 99 cm3 d'un solvant que l'on appellera "eau tamponnée". La formule de cette eau tamponnée (pH 7,2) est la suivante phosphate monopotassique (solution à 9,08 g/litre) .... 80,4 cmd phosphate disodique (solution à 23,88 g/litre) .... 19,6 cm3 soluté physiologique à 8,5 g/litre de chlorure de sodium q.s.p. 5000 cm3 Ce solvant est ensuite stérilisé par chauffage à 120C à l'autoclave pendant 30 minutes.La suspension virale obtenue est donc une dilution au 1/100, mais on pourrait aussi bien opérer avec des dilutions au 1/1000. Les oeufs sont mis en incubation à 370C pendant 3 jours. On prélève alors aseptiquement les membranes, on les broye avec 2 cm3 d'eau tamponnée par membrane, pn centrifuge à froid- (0-40C) pendant 20 minutes et on recueille la suspension surnageante que l'on conserve à -700C. Cette suspension surnageante dont on ramènera la température à OOC lors de l'inoculation suivante servira à inoculer la série d'oeufs enbryonnés prévus pour le second passage et ainsi de suite. Contrôles : A chaque passage, on fait un contrôle de stérilité sur bouillon de viande et bouillon au thioglycolate. A chaque fois une goutte de suspension surnageante est verse dans le milieu nutritif et les tubes sont mis en incubation à 370C pendant 8 jours. Après un certain nombre de passages, généralement tous les 10 passages, on contrôle: a) le titre infectieux. On l'évalue en diluant la suspension virale suivant les puissances successives de 10, dans de l'eau tamponnée, puis en inoculant des oeufs embryonnés (0,1 cm3 de chaque dilution par oeuf). Après incubation à 370C pendant 3 jours on note la proportion d'oeufs infectés (porteurs de lésions chorio-allantoidiennes). La dilution infectante 50 Z (DI50) est la dilution de suspension virale qui provoque l'infection de 50 % des oeufs. Cette Dl50 est calculée par la méthode de REED et ENCRE, Ann. J. Hyg. 27, 493 (1938). b) rulence de la souche, Cette virulence est étudiée sur 4 à 6 lapins, malus et femelles, pesant de 2,5 à 3 kg. De Qh1 à 0,5 cm3 de suspension virale sont inoculés par voies intradermique ou sous-cutanée. Les animaux sont surveillés pendant 30 jours. On note les signes locaux légers ou étendus de myxomatose, les signes oculaires, l'atteinte des oreilles, l'atteinte ano-génitale et éventuellement la date dc la mort (en jours après l'infection). Trois degrés de gravité rendent compte de la virulence de la souche - réaction locale (faible ou intense) - réaction générale (légère ou grave) - réaction générale avec mort. Au cours des passages, le titre infectieux pour ltoeuf embryonné croit régulièrement : au premier passage la DI50 était de 10 2, au-50ème passage 10-2,8, au 110ème passage 10 4, au 140ème passage 10-5 et au 170ème passage 10 5'3. La virulence, en revanche, décroit avec les passages. Jusqu'au 120ème passage, l'inoculation du virus provoquait la mort des lapins. irais du 120ème passage jusqu'au 160ème passage, seules des réactions générales graves ont été notées. Du 170ème passage jusqu'au 200ème passage, on a noté des réactions générales légères : ctest-à-dire que les animaux étaient encore atteints de myxomatose généralisée. Des passages successifs sur membrane chorio-allantoSdienne d'oeuf embryonné n'ayant pas entratné une baisse suffisante de la virulence pour le lapin, la souche virale déjà atténuée a été passée sur culture primaire de cellules de reins de lapins. I1 est évident qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer exactement 200 passages sur membrane chorio-allantodienne avant de passer sur cellules de reins : tout nombre conpris entre 150 et 250 peut convenir. 3) Passage de la souche sur cellules de reins de lapin en culture primaire. Des cultures cellulaires sont préparées par trypsination de reins prélevés chez des foetus issus de lapines "Fauve de Bourgogne" au 28ème jour de gestation. Le milieu de culture est le suivant 111 lieu de Eagle [Science 130, 432 (1959)] 90 % Sérum de veau décomplémenté 10 % et à ce mélange stérilisé par filtration sur filtre bactériologique on ajoute Pénicilline 100 unités/cm3 Streptomycine 100 Hg/cm3 La culture est effectuée dans des flacons plats en matière plastique (surface 25 cm2) contenant 6 cm3 d'une suspension cellulaire de 5 x 105 à 1 x 106 cellules par cm3 du milieu de culture.Les flacons sont incubés à 37eC,Au bout de 4 à 5 jours de culture, on obtient une couche monocellulaire continue du type épithélial. Le milieu de culture est alors rejeté et remplacé par 6 cm3 de milieu neuf. Chaque flacon est alors ensemencé avec 0,1 cm3 de la suspension surnageante obtenue après le dernier passage sur membrane chorio-allantoI- drenne. Les flacons sont mis à incuber à 37 C. Dès l'apparition de l'effet cytopathogène, en général au bout de 3-4 jours, le liquide de culture est prélevé et conservé à -700C pour passage ultérieur. Contrôles : Pour chaque passage on contrôle a) la stérilité du liquide. L-a méthode employée est la meme que celle décritc sous (2)* b) la présence du virus. On examine les inclusions cytoplasmiques dans les cellules du flacon ayant servi à la culture après coloration par le tiay- Grunwald-Giessa. Généralement tous les 5 passages on contrôle c) le titre infectieux. Le titre est éva ué non plus sur membrane chorio- allantoïdienne d'oeuf embryonné comme sous (2) mais en culture cellulaire. La dilution infectante 50 % en culture de tissu (DICT50) est la dilution de suspension virale qui produit des lésions cytopathogènes dans 50 7. des cultures cellulaires. Elle est aussi calculée par la méthode de Reed et tfuench. d) la virulence de la souche. Le test est le même que celui sous (2) mais les lapins reçoivent toujours 0,3 cn3 de suspension virale par voie intradermique ou sous-cutanée. On a effectué 160 passages (dernière souche RL 160) en culture primaire de cellules de reins de lapin et on a noté (i) que la virulence pour le lapin diminuait entre le 30ème et le 40ème passage : la réaction, générale jusqu'alors, devient une simple réaction locale et (ii) que le titre infectieux croissait avec le nombre de passages. La DICT50, qui est de 10-2 au poème passage, passe à 10-3 au 90ème passage et atteint 1015 au 115ème passage. Un contrôle particulier a été effectué après les premiers passages: les souches ont été inoculées sur membrane chorio-allantoTdienne d'oeuf embryonné pour vérifier si elles continuaient de provoquer des lésions. Alors que le développement est normal lors des 60 premiers passages, les lésions deviennent très fines au-delà. Après le 93ème passage, aucune lésion n'a pu être décelée : la souche ne se développe donc plus sur membrane chorioallantoïdienne. Après 160 passages an culture primaire de cellules de reins de lapin, on apoursuivil,atténuation du virus par passages de la souche sur lignée cellulaire de reins de -lapin. Cette étape intermédiaire en culture-primaire n'est pas obligatoire et on pourrait passer directement de la culture sur membrane chorio-allantoIdienne à la culture en lignée cellulaire. L'important est de faire un nombre de passages suffisant pour obtenir l'atténuation de la souche virale. (4) Passage de la souche sur cellules de reins de lapin en lignée cellulaire. La lignée cellulaire a été isolée à partir de reins de foetus de lapin. Elle permet d'obtenir des cultures de cellules du type épithélial par passages successifs sur le meme milieu nutritif que celui décrit sous (3). Les flacons plats en matière plastique (surface 25 cm2) contiennent 6 cm3 d'une suspension cellulaire de 200.000 cellules par cm3 (au lieu des 5 x 105 à 1 x 106 des cultures primaires) dans le milieu déjà décrit. Ils sont ensemencés comme précédemment par 0,1 cn3 du liquide de culture obtenu après le dernier passage en culture primaire (RL 160). Les flacons ensemencés ont été divisés en deux séries : une série a été incubée à 320C et la deuxième à 37 C. Lors des passages successifs, la température d'incubation de chaque série est restée la mêc. Contrôle : On effectue les mêmes contrôles que sous (3) (contrôles a), b), c > et d)), ct on y ajoute un contrôle du pouvoir immunogènes Quatre à 6 lapins Fauve de Bourgogne, pesant de 2,5 à 3 kg, reçoivent chacun 0,5 cm3 de suspension virale par voie intradermique. Entrelo et 30 jours après l'inoculation, on leur administre par voie intradermique ou sous-cutanée 0,2 cm3 du surnageant recueilli sous (t) non dilué (suspension de souche virale pathogène L1). On surveille les animaux pendant 30 jours au moins. Cette suspension de souche virale pathogène diluée au 1/1000 tue habituelle 100 Z des lapins témoins en 20 jours. On effectue 72 passages tant à 320 qu'à 37 C. La perte de -virulence pour le lapin est quasi-totale dès le 50ème passage. Les souches atténuées obtenues après le 72ème passage tant à 320 qutà 37*0, souches que l'on appellera dans ce qui suit RL 232 (320) et RL 232 (370) selon la température à laquelle elles ont été incubées, sont stables. Des passages successifs sur lapin montrent qu'elles conservent leur- avirulence ce qui est un avantage par rapport à la souche atténuée deliac KERCHER et SAITO. Ces souches, commi toutes les souches obtenues par passages ultérieurs sur cellules de reins de lapin, sont convenables pour la préparation du vaccin anti myxomatrux. Préparation du vaccin Le procédé de préparation du vaccin selon l'invention consiste à inoculer une culture cellulaire par l'une des souches virales atténuées décrite ci-dessus, à laisser incuber le milieu puis à recueillir la suspension virale et la répartir en ampoules prêtes à l'emploi. Dans la pratique, la culture cellulaire est préparée à partir de cellules de reins de lapin (lignée cellulaire RL) cultivées dans un milieu de culture approprié. Comme milieu de culture on emploie de préférence le milieu de Eagle [Science 130 432 (1959)] additionné de sérum dc veau décomplémenté (clest-à-dire chauffé à 56 C pendant 30 minutes) et de substances antibiotiques pour éviter la prolifération de cultures bactériennes parasites. On procède de façon à obtenir une couche monocellulaire dans un récipient approprié par incubation pendant 4 à 7 jours à 370C. On inocule alors ces cultures avec une dilution du virus choisie de manière à obtenir un effet cytopathogène maximal après 2 à 3 jours d'incubation à 37 C ou à 32 C selon la souche utilisée. On récolte alors la suspension virale après centrifugation à froid.La suspension virale peut alors être répartie directement en ampoules ou peut autre diluée par addition d'une quantité appropriée d'un liquide injectable avant répartition. Lc titre infectieux dlune bonne préparation est de l'ordre dc 5 x 105 particules infectantes par cm3. Le dénombrement des particules est fait selon une méthode voisine de la méthode dc B.L. PADGETT et colle Virology 17 462 (1962). Le vaccin ainsi préparé peut êtrc utilisé pour immuniser des lapins contre la myxomatose. Les exemples suivant s, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut etre mise en pratique. Exemple 1- On prépare le milieu suivant Milieu de Eagle ... 83,5 cm3 Sérum de veau décomplémenté ... 15 cm3 Glutamine (solution à 2 % p/v) ... 1 cm3 Bicarbonate de sodium (solution à 2,8 % p/v) , 0,5 cm3 Pénicilline G ... 10.000 U.I. Sulfate de streptomycine ... 10 mg On filtre sur filtre bactériologique. Des flacons de Roux dc 600 cm3 reçoivent 60 cm3 d'une suspension cellulaire de cellules de reins de foetus de lapin (lignée cellulaire RL) contenant 105 cellules par cm3 de milieu nutritif décrit ci-dessus. Les flacons sont bouchés au caoutchouc et incubés à 37 C pendant 3 jours. On remplace le milieu nutritif existant dans le flacon par 60 cm3 du milieu neuf, On continue l'incubat ion pendant 2 jours. La couche cellulaire est alors bien développée. On rejette le liquide surnageant. On prépare alors une suspension concentrée de la souche virale atténuée RL 232 (32 ) amenée à OOC. Cette suspension est préparée en ajoutant 0,1 cm3 dc la suspension virale RL 232 (32 ) à 9,9 cm3 du milieu de culture décrit ci-dessus. On place dans chaque botte de Roux 6 cm3 de cette suspension et on lui ajoute 54 cm3 de milieu nutritif. Les bottes sont mises à incuber à 32t pendant 3 jours. Au bout de ce temps l'effet cytopathogne est très marqué 60 à 80 % des cellules sont détruites. On prélève le liquide et le centrifuge à 40C(2000 tours/minute) pendant 20 minutes. On prélève le liquide surnageant que l'on répartit en ampoules stériles à raison de 1 cm3 de suspension virale par ampoule. On scelle à la flamme et on conserve les ampoules à -70 C. Au moment de l'emploi, on dégivre les ampoules et on administre 0,5 cm3 de vaccin par animal (administration intradermique.) Exemple 2 On opère comme dans l'exemple précédent mais on ensemence chaque flacon de culture cellulaire avec 6 cm3 d'uns suspension virale préparée en ajoutant 0,1 cm3 de la suspension RL232 (37 ) à 9,9 cm3 du milieu de culture décrit à l'exemple 1. On ajoute 54 cm3 de milieu nutritif et on met en incubation à 37 C pendant 3 jours. On prélève ensuite le liquide comme il est indiqué dans l'exemple précédent et on le repartant cn ampoules stériles à raison de 1 cm3 par ampoule. Les ampoules sont scellées et conservées à -700C. Exemple 3 Vaccination de lapins avec la souche RLq (32 ) 9 lapins Fauve de Bourgogne, males et femelles, pesant environ 3 kg, sont répartis en 2 groupes. Les 6 premiers lapins reçoivent chacun, par voie intradermique, 0,5 cm3 du liquide contenu dans une ampoule-préparée selon l'exemple 1 [souche RL232 (320)] . Trente jours après la vaccination, les 6 lapins vaccinés ct les 3 lapins non vaccinés reçoivent par voic sous-cutanée 0,2 cm3 de la suspension de la souche virale pathogène L1. 30 jours après, tous les animaux du groupe vacciné sont vivants ct n'ont présenté aucun signe de maladie généralisée dors que les 3 animaux du groupe non vaccinés sont morts de myxomatose généralisée entre les allène et 15ème jours. Exemplc 4 Vaccination de lapins avec la souche RL 232 (37 0) 14 lapins Fauve de Bourgogne, maies et femelles, pesant entre 2,5 et 3 ka, sont répartis en 2 groupes. Les 7 premiers lapins reçoivent chacun par voie intradermique 0,5 cm3 du liquide contenu dans une ampoule préparée selon l'exemple 2 [souche RL 232 (37 )]. Chaque lapin du deuxième groupe reçoit 1 cm3 d'un vaccin commercial (préparé à partir de virus dc SHOPE) également par voie intradermique. Un mois après la vaccination, 4 lapins dc chaque groupe reçoivent par voie sous-cutanée 0,2 cm3 de la suspension dc la souche virale pathogène L1. Les animaux sont surveillés pendant 30 jours. Au bout de 30 jours, tous les animaux du premier groupe sont vivants alors que 3 des 4 animaux du deuxième groupe sont morts de myxomatose généralisée entre les 15ème et 20ème jours. Dcux mois après la vaccination, les 3 lapins restant de chaque groupe reçoivent par voic sous-cutanée 0,2 cm3 dc la suspension virale pathogène L1. Au bout dc 20 jours 2 des 3 lapins du deuxième groupe sont morts de myxomatose, Au bout de 30 jours, les 3 lapins du premier groupe et le dernier lapin du deuxième groupe sont vivants. En résume 7 lapins 7 lapins vaccin RL 232 (3r) vaccin commercial Eprewe avec Lt 1 mois après vaccination (4 lapins) O morts/4 3 morts/4 Epreuve avec L1 2 mois après vaccination (3 lapins) 0 mortsl3 2 norts/3 L'immunisation conférée par le vaccin selon l'invention est donc supérieure à celle obtenue avec un vaccin commercial préparé à partir du virus de SHOPE. R E V E N D I C A T I O N S 1 - Procédé de préparation d'un vaccin anti-myxomateux,caractérisé en ce qu'on inocule à une culture cellulaire un virus atténué de la myxomatose obtenu à partir d'un virus pathogène par passages successifs sur membrane chorio allantoidienne d'oeuf erlbryonné puis sur culture de cellules de reins de lapin jusqu'à disparition totale de la virulence pour le lapin, on incube le milieu de culture et on recueille la suspension virale. 2 - Vaccin anti-nyxomatcux préparé par le procédé selon la revendication 1.