FR 2051557 A1 19710409 FR 7018712 A 19700522 Invention a pour objet des souches atténuées du virus de la variole du dindon Elle comprend plus particulièrement un vaccin contre la variole des volailles, qui contient des souches de ce genre. On sait, depuis à peu près 1930, qu'on peut immuniser les oiseaux de basse-cour contre le virus de la variole de la volaille en les vaccinant avec le virus de la variole du pigeon. Depuis cette découvertes on dispose de vaccins constitués d'une suspension de croûtes broyées, obtenues en appliquant le virus de la variole du pigeon sur les poitrines scarifiées de pigeons vivants. Par la suite, le même virus a été entretenu sur des cultures de cellules d'embryon de poulet (of. Doyle et coll., Vet. Rec., 1963, 75, N 13) et le vaccin correspondant a été administré selon la méthode utilisant les follicules des plumes. Néanmoins, ce vaccin n'a pas donné une protection os vraiment efficace contre des formes partioulièrement virulentes du virus infectant, comme le virus de la variole des volailles à forme diphtéroïde. On a également essayé d'utiliser des souches virulentes partiellement atténuées du virus en vue d'obtenir un vaccin plus efficace mais ces vaccins ne répondent pas aux exigences de 1'élevage moderne des volailles. Or, la Demanderesse a trouvé que, alors que l'atténuation du virus de la variole des volailles proprement dit se heurte à un échec, on peut atténuer de façon satisfaisante une souche virulente du virus de la variole du dindon par une combinais on d'opérations qui comprennent un nombre limité de passages sur des cultures de fibroblastes d'embryon de canard (appelées par la suite cultures de TDEF) et quelques isolements de clones sur des cultures identiques ou sur des cultures de fighbroblastes d'embryon de poulet (oultures de CEF) sans leucose.Par exemple, un procédé d'atténuation comportant un nombre relativement faible de passages, compris de préférence entre 4 et 7, et un ou quelques isolements de clones, de préférence soulement deux, fournit une 'souche particulièrement avantageuse aux points de vue de son pouvoir immunisant et de sa séourité d'emploi. La souche du virus de la variole du dindon qui a ê ainsi atténuée peut être associée avec un véhicule liquide ou solide vaccin. La souche atténuée du virus de la variole du dindon conforme à l'invention peut également être obtenue soit à la Wellcome Collection of Mioro-Organisms, Beckenham, Kent, Angle terre (N ON 6272), soit du Ministère de l'Agriculture, Fisheries and Food Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey (N CN 6272), soit encore à partir du vaccin vendu pour la prévention de la variole des volailles par Cooper, Mc Dougall et Robertson Ltd., Berkhamsted, Hertfordshire, sous le nom de marque "Activax" et on peut préparer un vaccin avec cette souche. il est facile d'obtenir des souches virulentes de la variole du dindon lors d'épidémies de variole dans les élevages de dindons. Le nombre de passages nécessaire pour obtenir l'atté- nuation exigée est étonnemment faible et ne dépasse pas normalement environ 15 passages Dans l'intervalle ainsi défini, on peut considérer comme un nombre de passages relativement "élevé", un nombre voisin de la limite supérieure indiquée, par exemple voisin de 14, tandis qu'un nombre de passages relativement "bas" irait seulement d'a peu près 4 à 7. On peut préparer avantageusement les cultures primaires, puis secondaires, de CEF ou de DES selon la méthode décrite par Churchill dans Res. Vet. Sci., 1968 9, 68, qui consiste à soumettre à l'action de la trypsine des embryons de poulets âgés de 9 à Il jours. Pour les primo-cultures, on aJoute 5 % de sérum de veau au milieu de croissance liquide (milieu minimum d'Eagle) contenant 10 % de bouillon au tryptose-phosphate et de o à 16 % de bicarbonate de sodium, avec addition d'antibiotiques ; pour les cultures secondaires, on ajoute 3 % de sérum de veau.On préfere, aussi bien pour les cultures primaires que pour les cultures secondaires les cultures en tubes roulants (roller tubes), car celles-ci donnent les cellules sous une norme fournissant des titres viraux élevés. On peut obtenir avantageusement des oeufs embryonnés, en vue des cultures CEF, à partir d'un lot d'élevage qui se montre indemne de bronchite infectieuse, d'encéphalomyélite aviaire, de virus CELO et GhL, de leucose, de Mycoplasma gallisepticum et de Salmonella pullorum, en vue d'éviter autant que possible la contamination par ces germes. On utilise de préférence des cultures secondaires pour la production de plages, car elles donnent des cultures "monolayer" (à couche unique) plus ormes que ne le font les cultures primaires. On réalise la séparation de clones, entre autres, selon les procédés classiques décrits dans la littérature. Ces procédés comprennent généralement l'inoculation à la culture de cellules appropriée, sur lame, d'une suspension du virus suffisamment diluée pour qutil se produise des plages isolées. On opère alors une sélection entre les plages pour les opérations ultérieures, en fonction de leur aspect et d'un nombre limité d'épreuves et de titrages ayant pour but de confirmer que la souche choisie est exempte de contamination par d'autres microorganismes et quelle possède un pouvoir antigénique suffisant. On peut, par exemple, effectuer une épreuve d'homogénéité en créant un certain nowbre de plages et en observant leurs différences morphologiques et dimensionnelles. Il est préférable d'opérer un nouveau clonage de la souche virale obtenue et sélectionnée de cette manière, après un unique passage sur culture de CEF ou de DEF. Dans tous les cas, le clonage est complété par un passage final sur culture de CEF ou DEF. Bes titres viraux sont calculés à partir des dilutions les plus hautes provoquant entre 10 et 20 pustules par membrane et ils sont exprimés en "unités pustulogènes" par ml (désigné par la suite par l'abréviation pfu/ml). Dans le cas du titrage par plages, les titres sont calculés à partir des plus hautes dilutions donnant entre 10 et 40 plages par lame, et le titre est exprimé sous la forme d'unités de formation de plages par ni. Il est avantageux d'effectuer les titrages en faisant des dilutions, graduées suivant des puissances de 10, du virus dans des solutés tamponnés (on utilise généralement des phosphates comme taqmpone) et en inoculant, par exemple, 0,1 ml de chaque dilution dans la membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de dix oeufs embryonnés âgés de 9 ou 10 jours, ou bien sur deux lames de cultures secondairex de cellules, dans le cas du titrage par plages. On fait ensuite incuber les oeufs à 37 , généralement pendant 5 jours, avant d'examiner la présence de lésions pustuleuses sur les membranes chorio-allantoldiennes. On peut évaluer le pouvoir pathogène de souches virales, atténuées selon le procédé de l'invention, par inoculation d'une suspension du virus, dont le titre va d'environ a à 105 unités pustulogènes (pfu) par millilitre. Des procédés commodes d'évaluation des propriétés antigéniques des souches consistent à effectuer des tests de neutralisation ou à produire directement une infection in vivo en inoculant, par voie sous-cutanée, des dilutions des virus d'épreuve virulents en plusieurs points des empalmures des ailes des oiseaux. Le nombre des points d'inoculation où se forment des lésions peut être enregistré au bout d'un délai de 6, 8 et 15 jours. Les vaccins conformes à l'invention contiennent d'environ 102 à 107 pfu/ml, et, de préférence, plus de 104 pfu/ml, de la souche atténuée du virus de la variole du dindon, en suspension dans un milieu acceptable du point de vue thérapeutique. On administre à chaque volaille d'à peu près 0,03 à 0,08 ml de vaccin, en utilisant le procédé "des empalmures d'ailes, si l'on désire une administration rapide et facile, et le procédé "des follicules des plumes", si on souhaite une protection plus sûre. La présente invention comprend donc aussi un vaccin destiné à l'immunisation des oiseaux de basse-cour contre la variole des volailles, vaccin qui comprend une souche du virus de la variole du dindon atténuée ou ne présentant pas de pouvoir pathogène pour les volailles et qui est mise en suspension dans un milieu aqueux pour usages thérapeutiques, tel qu'un soluté éventuellement tamponné, par exemple aux concentrations définies plus haut. Il est préférable de lyophiliser la suspension de la souche de virus atténuée de la variole du dindon en présence d'un agent stabilisant, par exemple de la gélatine dégradée ou du sorbitol, de façon à obtenir un produit déshydraté qu'on scelle dans un récipient stérile convenant pour un stockage prolongé. Comme agents stabilisants utilisables dans la présente invention, on citera ceux qui sont essentiellement composés de mélanges de polypeptides, provenant généralement de la dégradation ou hydrolyse partielle de protéines telles que la gélatine. Une préparation très satisfaisante peut contenir, approximativement, 30 % de polypeptides ayant un poids moléculaire inférieur à 5.000, 10 % dont ce poids est compris entre 5.000 et 10.000, 42 % dont ce poids va de 10.000 à 100.000, 8 % dont ce poids va de 100.000 à 200.000, et 8 % dont le poids moléculaire est supérieur à 200.000. Il va de soi que les spécialistes peuvent envisager l'utilisation d'une grande variété de préparations analogues, contenant ces polypeptides et des polypeptides analogues, sans pour autant sortir du cadre de la présente invention. En vue de faciliter son administration, le vaccin, liquide ou desséché, est présenté sous forme de doses unitaires contenant une quantité de matériel antigénique suffisante pour vacciner au moins plusieurs centaines de volailles. L'exemple qui suit a pour but d'illustrer la présente invention. Exemple Une souche du virus de la variole du dindon, isolée lors de l'apparition spontanée de la maladie, et aimablement fournie par Mr. Lsursen-Jones B.O.C.M., aylesbury, Buckinghamshire, provoque une infection généralisée quand on l'inocule aux volailles avant atténuation. On la fait passer deux fois sur des oeufs embryonne's de façon à obtenir une masse de virus que l'on utilise pour effectuer des essais de protection croisée. Après 3 passages sur des cultures primaires de fibroblastes d'embryon de canard (DEF), obtenues à partir d'embryons âgés de 12 jours, on répartit le virus en clones, d'abord en prélevant des plages à partir des dilutions limites sur DEF, puis par clonage sur des cultures de cellules de fibroblastes d'embryons de poulets exempts de leucose (CEF), un nouveau passage sur la même culture de cellules, de manière à obtenir une souche atténuée à nombre de passages relativemoont bas. Dans une autre expérience, on prépare un virus de la variole du dindon ayant subi un nombre relativement élevé de passages. Après 14 passages sur oultarede DEF, on sépare le virus en clones, on le fait passer une fois sur une ure de CEF, on lui fait subir un nouveau clonage, puis on le fait passer une dernière fois sur une oulture de CEP pour obtenir un virus ayant subi de nombreux passages. Tous les oeufs embryonnés utilisés pour les cultures de CEF sont obtenus à partir de volailles d'élevage exemptes de bronchite infectieuse, d'encéphalonyélite aviaire, de virus CELO et GAL, de leucose, de mycoplasme galliseptioum et de Salmonella pullorum.Les cultures primaires et secondaires de fibroblastes d'embryons de poulets (CES) sont préparées de la manière décrite par Churchill. l'es cultures de fibroblastes d D embryons de canaxde (Def) sont préparées de la même manière, sauf que l'on utilise des embryons âgés de 12 jours our les cultures primaires. Quand on utililise des cultures en tubes roulants, on ensemence des flacons cylindriques de 250 ml avec 107 cellules CEP secondaires dans 50 mi d'un milieu nutritif contenant par millilitre 105 unités formant des pustules (pfu) de la souche virale.Immédiatement après l'ensemencement, on met les flacons en rotation, ce qui permet aux cellules de s'attacher et de se multiplier sur toute la surface des parois. Le procédé de titrage sur la membrane chorio allantoidienne (CAM) s'est montré le plus sensible, suivi par la méthode des plages sur cultures de fibroblastes d'embryon de poulet puis par la méthode des plages sur cultures de fibroblastes d'embryon de canard (Tableau II). On utilise les cultures secondaires de fibroblastes d'embryons de poulets et de canard lorsqu'elles sont âgées de 24 heures, et l'on inocule 0,1 mi de virus à chaque lame. Après avoir laissé l'adsorption se faire pendant 15 minutes, on recouvre les cultures d'un milieu nutritif contenant 1 % de gelose Bacto. Lorsque des plages sont apparues, 5 à 10 jours après l'inoculation, on ajoute 2 ml d'un milieu de recouvrement contenant 1/1.000 de rouge neutre. La nature de l'effet cytopathique (CPE), le titre jusqu'auquel les virus se multiplient, ainsi que la morphologie des plages sont examinés sur les cultures de fibroblastes d'embryons de poulets et de canards. On examine la croissance de la souche virale à faible nombre de passages, dans les cultures en tubes roulants de fibroblastes d'embryons de poulets, en titrant le liquide de la culture de tissus 24, 48 et 72 heures après l'ensemencement. On effectue des comparaisons entre les sensibilités des méthodes de titrage par les plages et sur la membrane chorio- allantoidienne. On évalue par les deux procédés des dilutions de virus suivant des puissances de 10. Pour examiner la protection apportée par chaque souci montre l'injection d'épreuve effectuée avec des souches homologues et hétérologues, on vaccine trois groupes constitués chacun de 12 volailles âgées de 10 à 12 semaines, par scarification au niveau de lgempalmure, respectivement avec la variole du dindon, la variole de la-volaille et la variole du pigeon. Au bout de 30 jours, on regroupe les 36 volailles en 3 nouveaux groupes constitués de 4 oiseaux de chacun des groupes vaccinés. On ajoute à chaque groupe deux volailles sensibles non-vaccinées, puis on inocule à ces nouveaux groupes l'une ou l'autre des souches virales. Le virus de la variole du pigeon est également obtenu sous la forme de croûtes séchées prélevées sur des pigeons infectés, provenant des Central Veterinary Laboratories, Weybridge, où la souche avait été utilisée pendant un grand nombre d'années pour la production de vaccin contre la variole de la volaille. On le fait passer à trois reprises sur la membrane chorlo-allantoidienne d'oeufs embryonnés, lorsqu'on l'utilise pour l'inoculation d'épreuve, puis encore à neuf reprises sur culture de fibroblastes d'embryons de poulets, lorsqu'on l'utilise comme vaccin. On exécute l'épreuve en inoculant, par vois souscutanée, 0,1 ml de dilutions suivant des puissances de 10, de virus d'épreuve de la variole de la volaille, en six points différents des empalmures alaires de chaque oiseau. Be nombre des points d'inoculation où se forment des lésions est enregistré 6, 8 et 15 jours plus tard. Be virus de la variole des volailles entièrement virulent est obtenu sous la forme de croûtes desséchées provenant des Central Veterinary Laboratories, Weybridge. Lorsqu'on l'utilise pour les inoculations d'épreuve dans les tests de protection croisée et les expériences de vaccination, on fait passer le virus à trois reprises sur oeuf, en vue d'obtenir une réunion de matériel ayant un titre de 105,6 unités formant des pustules par ml (pfu/ml). Lorsqu'on l'utilise pour les études en cultures de cellules, on le fait passer d'abord sur des oeufs, après quoi on lui fait subir trois passages sur culture de fibroblastes d'embryon de poulet. On utilise les deux "niveaux" de passages du virus de la variole du dindon, dans des expériences ayant pour but de déterminer leur utilisabilité comme souches vaccinales. 1/ Souche vaccinale ayant subi un nombre de passages relative ment élevé. Pouvoir pathogène. Par clarification au niveau des empalmures, on inocule à vingt poules adultes pondeuses la souche ayant subi un grand nombre de passages, ayant un titre de 104s9 p-tu/ml, et on les laisse en compagnie de 10 poules n'ayant pas reçu d'inoculation. On observe les oiseaux pendant 40 jours, pour voir s'il ne stest pas produit de lésions secondaires et si l'inåection ne s'est pas propagée aux contacts sensibles. On enregistre la production des oeufs dans les deux groupes pendant toute cette période. lode d'administration. On compare de la manière suivante la vaccination par scarification des follicules des plumes avec celle effectuée par inoculation au niveau de l'empalmure. au moyen d'une souche ayant subi un grand nombre de passages, ayant un titre de 103,6 pfu/ml, on vaccine 10 volailles par inoculation au niveau de l'empalmure, et 10 autres par scarification des follicules. On soumet ces oiseaux, ainsi qu'un groupe sensible, à une inoculation d'épreuve à 11 aide de virus de la variole de la volaille, par incision de l'empalmure, 24 jours plus tard. Comparaison avec la vaccination par inoculation du virus de la variole du pigeon. On compare l'immunité conférée par le virus de la variole du dindon, administré'par incision de l'em- palmure, avec celle conférée par le virus de la variole du pigeon, administré au niveau des follicules des plumes. On vaccine 40 volailles, en deux groupes de 20, puis on leur injecte, ainsi qu'à 18 volailles sensibles, du virus de la variole de la volaille, par incision au niveau de l'empalmure. 2/ Souche vaccinale ayant subi un nombre de passages relati vement faible. Pouvoir pathogène. On vaccine un groupe de 10 poulets âgés de trois mois, par incision au niveau des empalmures, à l'aide de la souche virale n'ayant subi que peu de passages, ayant un titre de 103,8 pfu/ml, et on les laisse en contact avec 10 oiseaux du même âge, n'ayant pas subi d'inoulation. On inocule par incision de l'empalmure, du virus de la variole de la volaille virulent, puis, au bout de 38 jours, on fait une injection d'épreuve, avec le même virus, aux deux groupes, ainsi qu'à 14 poulets non-vaccinés. On examine l'ensemble des animaux aux points de vue des réactions primaires, des réactions secondaires et de la contamination des contacts. Sécurité d'emploi chez le poussin. Pour étudier ses possibilités d'emploi sur le poussin, on utilise une souche ayant subi peu de passages, ayant-un titre viral de 105'7 pfu/ml, pour vacciner 10 poussins agés de 2 semaines. On leur inocule, 24 jours plus tard, une souche virulente du virus de la variole de la volaille, ainsi qu'à 5 poussins non-vaccinés. On continue lrobservation pendant encore 3 semaines. Résultats a) Etude en cultures de cellules Au bout de trois passages, les 3 souches virales produisent le même effet oytopathique, aussi bien sur les oultures de fibroblastes d'embryon de canard que sur celles d'embryon de poulet. En fonction du titre de l'inoculum, l'effet cytopathique commence à se manifester de 1 à 4 jours apres l1inoculation, les cellules devenant arrondies et rétractiles. Plus tard, les cellules se détachent de la surface et ceci est rapidement suivi d'une cytolyse. Les titres des virus cultivés sur le tissu de canard sont légèrement inférieurs à ceux obtenus sur tissu de poulet (Tableau I). Avec des cultures en tube roulant de fibroblastes embryon de poulet, la souche à faible nombre de passages monte à un titre de 106,8 pfu/ml en 72 heures. Il n'a pas été possible d'étendre les observations au-dele de ce temps, étant donné qu1un grand nombre de cellules avaient commence à se détacher du verre. La morphologie des plages provoquées par les trois souches virales sont nettement différentes, aussi bien sur les cultures de cellules de canard que sur celles de poulets Dans les deux types de tissus, les plages dues à la variole du pigeon sont petites et nettement délimitées, tandis que celles dues à la variole du dindon et à celle de la volaille sont de grandes dimensions et ont des bords mal limités es plages de la variole de la volaille sont plus grandes et présentent un aspect plus "floconneux" que celles provoquées par la variole du dindon. b) Expériences de vaccination 1/ Vaccin provenant d'une souche ayant subi un nombre relati- vement élevé de passages. Pouvoir pathogène. La ponte dans le groupe vacciné ne subit pas de modifications, alors qu'elle est fortement diminuée dans le groupe auquel on a inoculé la variole de la volaille (Tableau III). L'infection ne s'étend pas aux volailles nonvaccinées et on n'observe pas de lésions secondaires dans le groupe ayant reçu l'inoculation, mais on observe à la fois une extension de la maladie et des lésions secondaires dans le groupe auquel on a inocule la variole de la volaille (Tableau IV). Mode d'administration. Qud on utilise -un virus ayant subi un grand nombre de passages, est le procédé d'acministration dans les follicules des plumes qui assure la plus forte immunité à l'inoculation de la variole de la volaille (Tableau V). Comparaison avec la vaccination par le virus de la variole du pigeon. Le vaccin provenant d'un virus ayant subi un grand nombre de passages, administré par incision de 1'empalmure confère une résistance supérieure à celle obtenue par scarification des follicules avec le virus de la variole du pigeon (Tableau VI). 2/ Vaccin proVenant d'une souche ayant subi un faible nombre de passages. Pouvoir pathogène. On compare le virus atténué avec le virus de la variole de la volaille, les deux étant inoculés par incision de l'empalmure. Des lésions primaires graves apparaissent chez tous les poulets auxquels on a inoculé le virus de la variole de la volaille, alors qu'il ne se produit dans les groupes vaccinés qu'une réaction bénigne localisée (Tableau VIT). Des lésions secondaires et leur généralisation se produisent chez tous les poulets ayant reçu le virus de la variole des volailles mais sur aucun de ceux auxquels on a inoculé le virus n' ayant subi que peu de passages. En outre, le virus de la variole du poulet s'est répandu et a provoqué des lésions de la crête et de la tête de 4 des 10 poulets non vaccinés mis en contact, 24 heu res après la mise en contact. On n'a pas observé d'extension aux oiseaux non-vaccinés mis en contact avec ce groupe. Quand on les soumetà l'injection d'épreuve, tous les animaux ayant reçu le virus de la variole des volailles et ceux vaccinés avec les souches ayant subi un faible nombre de passages présentent une solide immunité1 tandis que ceux du groupe témoin non-vacciné et sensible présentent de graves lésions généralisées. bes poulets non-vaccinés en contact avec le groupe vacciné sont tous sensibles à l'injection d'épreuve, tandis que 9 sur 10 des oiseaux en contact avec le groupe ayant reçu le virus de la variole acquièrent l'immunité. Séourité d'emploi chez le poussin Chez les 10 poussins, âgés de 2 semaines, qui ont reçu une souche ayant subi un faible nombre de passages et présentant un titre élevé, il apparaît des lésions vaccinales primaires bénignes, mais les animaux restent en bonne santé et il ne se produit pas de lésions généralisées. Quand on les soumet à l'injection d'épreuve, les oiseaux vaccinés montrent une solide immunité, tandis que des lésions graves et généralisées se développent chez les poussins témoins sensibles. c) Conclusions. On peut donc conclure que les souches du virus de la variole du dindon, atténuées ou non-pathogènes, conviennent bien pour la vaccination, car elles donnent une immunité satisfaisante contre l'attaque du virus de la variole de la volaille virulent, on peut les utiliser sans risque sur des poussins âgés seulement de deux semaines, en particulier la souche ayant subi un faible nombre de passages, et on a constaté quelles ne contaminent pas les volailles sensibles mises en contact. TABLEAU I Titre viral des souches cultivées Virus Fibroblastes d'embryon Fibroblastes d'embryon de canard, en pfu/ml de poulet, en pfu/ml Variole des volailles 104,5 105,8 Variole du dindon (souohe à faible nombre de passages) 105,4 106,2 Variole du dindon (souche à grand nombre de passages) 106,0 106,4 Variole du pigeon 106,0 106.2 TABLEAU II Comparaison de la sensibilité des titrages par plages et sur oeufs. Titre sur membrane Titre sur Titre sur Virus chorio-allantoï- fibroblastes fibroblastes dienne en pfu/ml d'embryon de d'embryons poulet, en de canard, unités for- en unités mant plage formant plage Variole des volailles 105,0 104,8 104,1 Variole du pigeon 104,8 104,4 104,0 Variole du dindon îo4,6 1O4,2 14,O (souches à faible nombre de passages) 104,6 104,2 104.0 TABLEAU III Epreuves de neutralisation Indices de neutralisation VIRUS Variole des @ Variole du Variole du Sérum volailles dindon pigeon Variole des 1,6 1,4 0,8 volailles 1,6 1,4 0,8 Variole du dindon 1,2 1,0 0,5 Variole du pigeon 0,9 0,6 2,2 érum négatif 0,0 0,0 0,0 TABLEAU IV Réactions à la vaccination avec le virus de la variole des volailles et avec la souche à grand nombre de passages. Oiseaux Oiseaux Oiseaux Oiseaux en con vaccinés GROUPE tact non vaccinés GROUPE en con avec le I vaccinés avez le II taet non virus de 'virus de vaceinés la vario- la variole le des du dindon volailles Nombre de volailles 20 10 20 10 Lésion grave chez bénigne primai- tous les -- chez tous es sujets les su jets éné- ali station es lé sions 18 5 0 0 TABLEAU V Réactions à l'injection d'épreuve faite avec le virus virulent des volailles, après vaccination avec une souche à nombreux passages selon deux méthodes différentes. Méthode de vaccination 10 oiseaux témoins 10 oiseaux vaccinés par 10 oiseaux vacc n s non vaccinés incision de ltempalmure par la méthode des follicules des plume ++++ +++ SIE - ++ + ++++ - ++ - ++ + ++ + + + ++++ + + ++ SIE = sacrifié - = pas de lésions = lésions très graves = lésions graves ++ = lésions modérées + = lésions bénignes TABLEAU VI Gravité des lésions après injection d'épreuve avec le virus virulent de la variole des volailles. Vaccination avec le virus Vaccination avec le virus Oiseaux de la variole du dindon de la variole du pigeon témoins (souche ayant subi de par scarification des non nombreux passages) inci- follicules vaccinés sion de l'empalmure oiseaux sans lésions 3 ; oiseaux sans lésions 12 avec des lésions 2 avec des lésions bénignes bénignes 1 avec des lésions 8 avec des lésions modérées modérées 1 mort (cause indéter- 4 avec des lésions 12 oiseaux avec minée) graves des lésions grave 3 morts (cause 6 avec des lésio indéterminée) très graves TABLEAU VII Réactions à la vaccination, par incision de l'empalmure, avec le virus de la variole des volailles et la souche à faible nombre de passages, et résistance à la variole des volailles. GROUPE I GROUPE II GROUPE III Vaccinés avec Oiseaux en Vaccinés avec Oiseaux en Témoins le virus de contact la souche à contact non la variole non vacci- faible nombre non vacci- vaccinés des volailles nés de passages nés de la variole du dindon Nombre d'oi seaux 10 10 10 10 14 Lésions pri maires 10 - 10 Généra lisa tion lésions 10 4 0 0 Immunié à l'é preuve 10 9 10 0 Sensibi lité à l'épre pe O 1 0 10 14 R~V~NDIC~TIONS 1.- Procédé d'atténuation d'une souche virulente du virus de la variole du dindon, caractérisé par l- fait que l'on fait passer lo virus en série, un nombre de fois limité, sur s cultures de fibroblastes d'embryons de canard, on clone la souche du virus sur cultures de fibroblastes d'embryon do canard ou de poulet puis on procède à un passa g final sur une cultures de flbroblastes d'embryon de poulet ou de canard pour que l virus perde son pouvoir pathogène mais conserve son pouvoir immunisant. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un nombre de passages sur culture de fibrobastes d'embryon de canard compris approximativement entre 4 et 15. p.- Procédé selon ls revenèication 2, caractérisé en ce clu'il comprend un nombre de passages compris approximativement entre 4 et 7. 4.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend un nombre de passages voisin de 14. 5.- Procédé solon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs étapes de clonage. 5.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte deux étapes de clonage. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à , caractérisé en ce que le passage final s'effectue sur culture de fibroblastes d'embryon do poulet. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, caractérisé en ce que les cultures de cellules sont des cultures en tub roulant. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications j à 8, caractérisé en c que les cultures de cellules sont des cultures seeondaires. 0. - Prouédé eolon l'une queleonque des revendieations , a 9, caractérisé an ce qu les culture de fibroblas ts d'embryon de poulet sont obtenues à partir d'oiseaux d'élevage exempts de loucose, 11.- Procédé selon la revondieation 10, caractérisé en ce que lis cultures de fibroblastes d'embryon de poulet sont obt@nucs à partir d'oiseaux d'élevage exempts de bronchite infectieuse, d'oncéphalomyélite aviaire, de virus CELO et GAL, de @ycoplasma gallisepticum ct de @almonella pullorum. 12.- Procédé de préparation d'un vaccin, caractérisé par le fait que l'on atténue une souche du virus de la variol du dindon par une méthode selon l'une quelconque des revondications wl à 11 et on associe la souche atténuée avec un véhicule pour usages pharmaceutiques. 13.- Procédé de préparation d'un vaccin, caractérisé par le fait que l'on mélange une souche atténuée du virus de la variole du dindon, déposée sous le N CN 6272, avec un véhicule pour usages pharmaccutiques. 14.- Procédé selon l'une des revendications 12 et 1v, caractérisé en ce que le vaccin contient approximativement de 102 à 107 unités formant des pultules par millilitre d la souche atténuée. 15.- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le vaccin contient plus de 104 unités formant des pustules par millilitre de la souche atténuée. 16.- Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que le véhicule est un véhicule aqueux. 17.- Procédé selon la revendication 16, caractérisé on ce que le véhicule est un soluté, tamponné ou non au phosphate. 18.- Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que le véhicule contient un excipient de lyophilisation. 19.- Procédé selon la ravendieation 18, caractérisé en ce que l'excipient contient un agent stabilisant. 20.- Procédé selon la revendication 19, caractérisé en co que le stabilisant est constitué par de la gélatine dégradée ou par du sorbitol. 21.-Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que le produit desséché est mis dans un récipient stérile scellé convenant pour un stoc kage de longue durée. 22.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 21, caractérisé en ce que le vaccin est conditionné ous forme de doses unitaires contenant suffisamment de matériel antigénique pour vacciner au moins plusieurs centaines de volailles. 23.- Vaccin contre la variole des volailles comprenant une souche du virus d la variole du dindon qui a été atténuée par un procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 11, présenté dans un véhicule pour usages pharma ceutiques sous forme de doses unitaires contenant suffisamment de matériel antigénique pour vacciner au moins plusieurs centaines de volailles. 24.- Vaccin contre la variole des volailles compre- nant la souche atténuée du virus de la variole du dindon N CN 6272, présenté dans un véhicule pour usages pharmaceutiques sous forme d doses unitaires contenant suffisamment de matériel antigénique pour vacciner au moins plusieurs centaines de volailles.