FR 2107833 A1 19720512 FR 7133725 A 19710920 71 33725 i 2107833 Cette invention concerne un procédé de préparation d1 insecticides qui consiste à soumettre un micro-organisme à des traitements spécifiques. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé 5 de préparation d'insecticides microbiens dans lequel on retire à des micro-organismes appartenafit à l'espèce Bacillus thurin-giensis et à ses homologues le pouvoir de prolifération des spores tout en maintenant l'activité biologique des toxines protéiques cristallines appelées- toxines qui sont produites dans les 10 cellules desdits micro-organismes, ce qui fait que l'on utilise les toxines protéiques microbiennes pour tuer les insectes nuisibles. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'insecticides microbiens, caractérisé en ce que seul le pouvoir de prolifération des spores desdits micro-organismes est supprimé et 15 en ce que leurs toxines microbiennes, qui présentent une activité insecticide, sont utilisées comme ingrédients actifs. Récemment, les effets directs et indirects nocifs des produits chimiques pour l'agriculture sur l'homme et le bétail, ainsi la contamination du lait par le HCB ou le DDT, sont devenus 20 un sérieux problème social. Du fait de cet état de chose, la lutte contre les insectes nuisibles à l'aide de micro-organismes capables de tuer ces insectes a présenté un intérêt croissant en raison de la nocivité des produits vis-à-vis des mammifères, des poissons et des oiseaux. 25 Les micro-organismes appartenant à l'espèce Bacillus thurin- giensis et leurs homologues présentent les avantages mentionnés ci-après. (1) Ils agissent sélectivement sur les insectes nuisibles, n'rntpas d'actions nocives sur les mammifères et les récoltes, ne contami- 30 nent pas l'environnement, n'entraînent l'apparition d'aucun inconvénient pour la flore et la faune, et conviennent donc tout à fait du point de vue sécurité. (2) Ils sont très peu aptes à développer un phénomène de résistance des insectes. 35 (3) Ils peuvent être utilisés en mélange avec des épandagcs et des produits chimiques pour l'agriculture sans que soient dégradées leur activité et celle des produits chimiques pour l'agriculture. Des préparations microbiennes contenant des micro-organismes 40 de l'espèce Bacillus thuringiensis et leurs homologues seus la 71 33725 2 2107833 forme de liquides, de poudres ou de poussières mouillables ont déjà été fabriquées et vendues pour la lutte contre les insectes nuisibles dans divers pays. On utilise ces préparations pour lutter contre les insectes nuisibles pour les récoltes "horticoles, 5 les pâturages, les arbres fruitiers, les légumes, les plantations de tabac et de coton, et contre les insectes nuisibles pour les forêts, etc. ; on utilise le fait que les cristaux protéiques produits dans les cellules desdits micro-organismes manisfester.t une toxicité élevée vis-à-vis des larves de nombreux insectes 10 appartenant à l'ordre des Lépidoptères. Toutefois, dans les pays d'élevage du ver à soie parmi lesquels le Japon on désire que les insecticides microbiens soient utilisés sans aucun danger pour la sériciculture. Les préparations de Bacillus que l'on trouve dans le commerce ont une action destructrice sur les vers 15 à soie, qui ne sont pas nuisibles, et n'ont donc été utilisées que dans les régions où on ne fait pas du tout de sériciculture. Cependant, puisque la société demande que l'environnement soit protégé de la contamination on souhaite avoir un lien pour faire une lutte intégrée contre les insectes nuisibles qui soit un 20 procédé d'application de préparations microbiennes ne donnant aucun effet nocif sur les vers à soie. La présente invention a été réalisée comme le résultat d'une série de recherches effectuées pour établir la relation entre les deux problèmes mentionnés ci-dessus. 25 Au moment de la formation des spores, les micro-organismes pré-cités et leurs homologues produisent dans les cellules des spores et des toxines cristallines, qui sont rhcmbiques ou bien, dans certains cas, fusiformes ou carrées. Les toxines produites par lesdits micro-organismes sont des cf-endotoxines (toxines 30 cristallines facilement dénaturées par la chaleur), des p-exoto-xines (toxines résistant à la chaleur hors des cellules) et des a-exotoxines (phospholipase C). Les c-toxines sont des toxines cristallines et ont une action telle que lorsqu'elles sont absorbées par les insectes de l'ordre des Lépidoptères, elles engen-35 drent des symptômes de toxicité aiguë, qui font que les insectes voient tout d'aboidleur appétit diminuer et ensuite deviennent inactifs avec paralysie générale et désordres intestinaux et finissent par mourir. En outre, les toxines ont une action similaire aussi bien sur les vers à soie" et entraînent l'affai-40blissement des vers à soie, de sorte que ces micro-organismes 71 33725 3 2107833 sont des germes pathogènes terribles pour l'industrie de la sériciculture . Les préparations contenant lesdits micro-organismes comme ingrédients actifs ont des propriétés telles que non seulement 5 elles manifestent l'action mentionnée précédemment au moment de leur pulvérisation, mais encore les micro-organismes prolifèrent, après leur application, dans le corps des insectes qui viennent d'être tués par l'action desdites toxines, et leur activité s'étend alors à d'autres individus. Puisque les prépa-10 rations ont de tels effets secondaires, tertiaires et analogues augmentant dans l'ordre, on en déduit que même lorsque les préparations ont été appliquées à des zones qui sont très éloignées d'une culture de mûrier où se trouve donc cultivée la nourriture des vers à soie, elles sont facilement transportées 15 à l'environnement dans lequel sont élevés des vers à soie, ceci en raison du vent et de la pluie, des déplacements des insectes et des animaux, et de la rentrée des récoltes horticoles. On prévoit donc que si des micro-organismes vivants, qui ont été privésde leur capacité de prolifération, sont utilisés une 20 fois ils engendrent des troubles irrévocables. On sait que lorsque des micro-organismes comme Bacillus thuringiensis sont soumis à un traitement physique tel que chaleur ou application d'ultrasons,ou à un traitement chimique par le phénol, le chlorure mercurique, la formaline, l'éthanol, 25 l'oxyde d'éthylène ou l'eau oxygénée, les cellules végétatives et les spores sont privées de leur pouvoir de prolifération. Cependant, on n'est pas parvenu à savoir si lesv -endotoxines maintenaient encore ou non leurs activités même après lesdits traitements. Il semble qu'un traitement par une grande quantité 30 de ces produits chimiques inactive leurs activités. Dens la préparation d'insecticides microbiens, il faut que les microorganismes utilisés satisfassent les deux conditions suivantes, à savoir que les spores soient privées de leur pouvoir germina-tif et que lescf -endotoxines maintiennent leurs activités. 35 Les insecticides microbiens préparés selon la présente inven tion sont des préparations de toxines protéiques microbiennes qui ont surmonté les inconvénients des insecticides classiques de ce type, et ont les avantages d'être facilement produits en grandes quantités et d'être inoffensifs pour.les mammifères, 40 les poissons et les oiseaux, et ces insecticides microbiens sont 71 33725 4 2107833 utilisés pratiquement en mélange avec un agent tensio-actif. En outre, étant donné que les micro-organismes utilisés dans la présente invention ont été privés de leur pouvoir de prolifération, les préparations n'entraînent pas d'infection secondaire 5 et n'ont pas d'effets nuisibles sur les vers à soie à moins qu'elles soient utilisées au voisinage d'une culture de mûrier où est cultivée la nourriture destinée aux vers à soie, et qu'elles manifestent leurs effets avec succès parce qu'êlles sont utilisées principalement dans la lutte contre les insectes nuisibles de 10 l'ordre des Lépidoptères qui sont sensibles auxdites toxines. Les exemples d'insectes nuisibles de l'ordre des Lépidoptères qui sont sensibles comprennent les arpenteuses de la luzerne, les chenilles des agrotis des moissons courantes, les chenilles communes des choux, les chenilles de leucanie, les chenilles 15 de la betterave (Spodottera exigua), les chenilles du chêne de Californie, les papillons du choux (Plutella maculipennis), les Pyraustes (Pyrausta nubilalis), les chenilles d'arctia, les chenilles mangeant le parenchyme des feuilles de vigne, les papillons Porthetria dispar, les papillons du chêne, les larves 20 de Diaphania nitidales, les larves d'Heliothis virescens, les chenilles de Peridroma nsscgarj-tosa, les larves de Diacrisia virgi-nica, les chenilles du tabac, les larves d'Horoona coffearia, etc. Pour examiner les conditions où Bacillus thuringiensis et 25 ses homologues sont amenés dans un état tel que leurs activités insecticides soient conservées, les présents inventeurs ont cultivé lesdits micro-organismes et ont ensuite complètement supprimé le pouvoir de prolifération des spores et des cellules végétatives par des traitements chimiques et physiques. Comme 30 résultat les inventeurs ont obtenu les indications suivantes. La concentration du produit chimique ajouté au milieu, la durée du traitement physique appliqué aux cellules et la durée de contact du produit chimique avec les cellules ont une relation avec la suppression du pourvoir de prolifération et l'inactiva-35 tion des toxines. Pratiquement, les toxines sont également inactivées dans les cas d'un traitement chimique à concentration élevée et d'un traitement physique de longue durée, de sorte qu'il est nécessaire et suffisant de trouver pour la préparation d'un insecticide microbien non-infectieux un point où la concentration 40en produit chimique nécessaire pour supprimer la capacité de 71 33725 5 2107833 prolifération chevauche la concentration nécessaire pour amener le micro-organisme en un état tel que la toxicité soit conservée. C'est-à-dire que lorsque l'on cultive Bacillus thuringiensis dans certaines conditions, les cellules végétatives prolifèrent 5 pendant Jun certain temps. Cependant lorsqu'il s'est écoulé un certain temps la croissance atteint son maximum pour donner lieu à la formation de spores et la production de toxines. Ensuite les spores et les toxines sont libérées par les cellules dans le milieu en raison de l'autolyse des cellules. Cependant 10 lorsqu'on fait une culture de plus longue durée la décomposition des toxines est initiée par l'action d'une protéase. Par conséquent, on arrête la culture lorsque la production de toxines est devenue maximale, et on soumet la liqueur de la culture à un traitement par l'eau ojiygénée. Le pouvoir germinatif des spores 15 diminue lorsque la concentration en eau oxygénée augmente, mais lorsque la concentration en eau oxygénée augmente encore les toxines protéiques commencent à être inactivées. A ce stade, les présents inventeurs ont trouvé que même lorsque les spores sont privées de leur pouvoir de propagation, les f-endotoxines sont 20 actives. Les inventeurs ont en outre trouvé la concentration minimale en produit chimique nécessaire pour faire une préparation qui est utilisable comme insecticide microbien et la concentration maximale en eau oxygénée qui n'inactive pas les «T -endotoxines. Sur la base des découvertes précédentes, les 25 inventeurs ont réussi à préparer un insecticide microbien n'ayant pas d'effet nocif sur les vers à soie. Selon la présente invention, l'activité des^" -endotoxines est conservée lorsque la quantité d'eau oxygénée n'est pas supérieure à environ 5 % en poids sur la base du poids de la suspension constituant la 30 culture, et le pouvoir de prolifération des spores est supprimé par une dose d'eau ojygénée qui n'est pas inférieure à environ 0,5 % en poids. Dans la production d'insecticides microbiens à grande échelle, la concentration minimale dans le traitement et la durée de 35 traitement capable d'amener les micro-organismes pré-cités, ceci sans considération de leur type et de leur état, dans un état tel que leur pouvoir de prolifération ait été complètement supprimé et que seules leurs toxines soient actives, sont non seulement plus faibles pour inactiver les toxines mais sont 40 également économiques. Par conséquent, cette concentration de 71 33725 e 2107833 traitement et cette durée de traitement minimales sont les conditions de traitements optimales. Les inventeurs ont également trouvé les autres conditions optimales, par exemple dans le cas de la /î-propiolactone au moins 0,25 % en poids par rapport au poids 5 de la suspension constituant la culture et dans le cas des ultrasons au moins 20 minutes à 20 KHz. La présente invention est illustrée plus en détail ci-après avec référence à un exemple, mais l'exemple ne constitue qu'un mode de réalisation du traitement consistant à amener les micro-10 organismes dans un état tel que leur pouvoir de prolifération a été supprimé et que seules les toxines conservent leur activité, et il n'est pas nécessaire de dire que le champ de l'invention n'est pas limité à l'exemple. Exemple 15 On a isolé des micro-organismes appartenant au type Bacillus thuringiensis de corps morts d'insectes recueillis dans les champs et ensuite on les a cultivés. On a soumis séparemment ces micro-organismes et ces micro-organismes stockés à des essais de toxicité de la manière suivante. 20 Dans un tube à essai on a mis 10 ml. d'un milieu constitué de 1 litre d'eau distillée, de 10 g. de peptone, de 10 g. d'extrait de viande et de 3 g. de chlorure de sodium et ajusté à pH 7,2. Après avoir stérilisé le milieu, on a ensemencé le milieu avec du mycélium des souches pré-citées et on a soumis la 25 culture à une agitation pendant 72 heures. Ensuite, on a recueilli les spores et les pour obtenir des matières sèches. On a dilué ces matières à l'eau distillée jusqu'à obtention d'une concentration de 2 % (en poids), et on a agité suffisamment la dilution résultante et ensuite on l'a pulvérisée uniformément sur des feuilles de mûrier. On a 35 donné les feuilles de mûrier à manger à 20 vers à soie qui étaient au second jour du second stade larvaire,pour étudier les pouvoirs toxiques de la souche. Les résultats obtenus sont ceux représentés dans le tableau 1. Comme le montre ce tableau, les souches diffèrent dans leur action toxique. 40 Ensuite on a introduit dans un flacon de 3 litres, pour -4 Tableau 1:Relation entre les types de souche et leur action uj toxique sur les vers à soie. U-> KJ en Nombre Nombre d'insectes tués ) ) Souche d'insectes à Après Après Après Après ) ( 11 essai 2 h. 9 h. 24 h. 72 h. ) \ B. thuringiensis, sotto 20 0 0 5 15 ) ( " (A) 20 20 - - ) j " (B) 20 0 1 7 12 ) ( " (C) 20 0 0 2 7 ) j " (D) 20 0 0 0 0 l ( " (E) 20 20 - - ) ( " (F) 20 20 - - ; ( " (G) 20 0 0 6 13 ) | " (H) 20 0 12 8 0 j SJ o ■^4 00 UJ Cx> 71 33725 8 2107833 agitation, 500 ml. d'un milieu liquide composé de 5 g/1 de I^HPO^, de 5 g/1 de KE^PO^ de 0,0002 g/1 de chlorhydrate de thiamine, de 0,05 g/1 de MgSO^, de 0,3 g/1 de MnSO^, de 0,01 g/1 de FeSO^, de 0,05 g/1 de CaCl2, de 1,5 g/1 de Na-NH4P04, de 3 g/1 de citrate 5 de Na et de 10 g/1 de Casamino-acides. Après avoir stérilisé le milieu, on a soumis sé£>aremment les souches (A), (E) et (F), qui avaient le pouvoir toxique le plus élevé de ceux représentés dans le tableau 1, à une culture sous agitation dans le milieu à 27°C. pendant 96 heures. Après avoir confirmé, à l'aide d'un 10 microscope à contraste de phases, le fait qu'il y avait eu formation suffisante de toxines cristallines on a interrompu la culture et on a soumis les matières à un traitement destiné à supprimer la capacité de prolifération des spores. Comme agent traitant, on a ajouté de l'eau oxygénée en des quantités corres-15 pondant à 0,065 %, 0,125 %, 0,25 %, 0,50 %, 0,75 %, 1 %, 2 %, 3 % et 5 %. (en poids) par rapport au poids de la suspenssion constituant la culture. Après avoir laissé au repos le mélange constituant-la culture pendant 24 heures, on a prélevé 1 ml. du mélange de culture et on l'a ensemencé dans 10 ml. d'un milieu d'essai 20 stérilisé et 24 heures après on a recherché la présence et l'absence de cellules survivantes dans le milieu. Les résultats obtenus sont ceux qui sont indiqués dans le tableau 2. Il ressort de ces résultats que lorsqu'on a ajouté 0,5 % en poids d'eau oxygénée au milieu on n'a pas trouvé de cellules survivantes au 25 bout de 24 heures. 71 33725 9 2107833 Tableau 2 Résultats des essais de suppression de la capacité de prolifération à l'aide d'eau oxygénée. ( Concentration _( d'eau ( oxygénée Souche (A) Souche (E) Souche (F) Degré de stabilisation j des -toxines ) j 5 - - - + j ( 3 - - - ++ ) ( 2 - - - ++ | 10( 1 - - - ++ ) [ 0,75 - - - ++ ^ ( 0,50 - - - ++ ) [ 0,25 - - + ++ l ( 0,125 + + + ++ ) 15j 0,065 + + + ++ c ( o ( + + + ++ ) Note : Dans les colonnes de la "Souche (A)", de la "Souche (E)" et de la "Souche (F)", le signe - veut dire 20 "destruction " et le signe + veut dire "survie". Dans la colonne "Degré de stabilisation des -toxines" le signe + signifie que l'efficatité des Etant donné que l'on a noté la présence d'aucune spore survivante lorsqu'on a ajouté 0,5 % ou plus d'eau oxygénée, on a soumiscbaque souche à un traitement de suppression de la capa-cité de prolifération à l'aide de 0,5 % d'eau oxygénée, et on a recueilli les spores par centrifugation (5°C., 7.000 t.p.m., 30 minutes), on les a lavées plusieurs fois dans l'eau distillé et ensuite on les a séchées sous pression réduite pour obtenir des matières sèches. On a dilué les matière sèches ainsi obtenues, 25 dépourvues de la capacité de prolifération, à l'eau distillée jusqu'à une conceotration de 2 % et on a pulvérisé uniformément la préparation résultante sur des feuilles de mûrier que l'on a ensuite données à manger à des vers à soie au quatrième stade larvaire . Il en a résulté la confirmation que la préparation pouvait être toxique pour les vers à soie au point d'entraîner 71 33725 10 2107833 leur mort dans les deux à trois heures et que les toxines trouvées dans les cellules étaient dans un état actif. On a obtenu les mêmes résultats que précédemment dans les cas où l'on a effectué le traitement à l'aide de 0,5 à 0,75 % d'eau oxygénée, 0,25 % 5 de p-propiolactone, 0,1 % de chlorure mercurique ou à l'aide des ultrasons ( 20 minutes à 20 KHz ). D'autre part, on a fait avec la souche (A) exposée dans le tableau 1, une culture agitée à 27°C. pendant 96 heures dans 500 ml. d'un milieu liquide composé de 5 g/1 de K^HPO^, de 5 g/1 10 de KH2P04, de 0,0002 g/1 de chlorhydrate de thiamine, de 0,05 g/1 de MgS04» 0,03 g/1 de MnS04# de O,01 g/1 de FeS04» de 0,05 g/1 de CaC^# de 1,5 g/1 de Na-NH4P04, de 3 g/1 de citrate de Na et de 10 g/1 de Casamino-acides (pH 7,2), ensuite on l'a soumise à un traitement de suppression de la capacité de prolifération 15 en utilisant 0,5 % d'eau oxygénée, on l'.a laissée reposer pendant 24 heures et ensuite on l'a traitée de la même manière que précédemment pour obtenir un mélange sec de spores et de toxines avec un rendement de 2,7 g. pour 2,5 litres de liquide de culture. On a dilué ce mélange à l'eau distillée jusqu'à 2 0 obtention d'une concentration de 2 % et on l'a pulvérisé uniformément sur de la nourriture destinée à des chenilles de pins (larves), des chenilles communes de choux (larves) et aux hespérie du riz (larves) pour étudier l'activité insecticide dudit mélange sur les insectes nuisibles. Les résultats obtenus sont ceux 25 indiqués dans le tableau 3. Tableau 3 Effets insecticides d'une préparation à 2 % de micro-organismes soumise à un traitement par 0,5 % d'eau oxygénée. ( Nom de 1'insecte Nombre d'inaectes à l'essai Nombre d'insectes tués au bout de Proportion ) d'insectes ) tués ) (%) ) 2 h. : 6 h. : 24 h. : 30 h. : 50 h. \ Chenille du pin (larve) 25 0 0 4' 9 12" 100 l : Chenille commune du chou ï (larve) 30 4 9 17 0 0 100 \ Hespérie du riz (larve) 20 0 6 14 0 0 100 J 71 33725 12 2107833 Il ressort du tableau 3 qu'un insecticide microbien que l'on a préparé en retirant à un micro-organisme sa capacité de prolifération, possède une action insecticide sur les insectes nuisibles. En outre, l'insecticide microbien est exempt d'infection secondaire 5 et est donc un insecticide utile n'ayant pas d'effet nocif sur les vers à soie. On a administré par voie orale les matières sèches pré-citées à des souris à raison de 3 g/kg, mais l'on n'a observé ni empoisonnement ni dé-aardxe d'ordre physiologique chez les souris. 71 33725 13 2107833 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un insecticide microbien, caractérisé en ce que l'on prépare l'insecticide en utilisant un micro-organisme capable de produire des toxines pour les insectes, et que l'on retire au micro-organisme la capacité de prolifération 5des spores tout en en conservant l'activité insecticide. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on effectue la suppression de la capacité de prolifération des spores en traitant par le pèroxyde 10l'activité insecticide. 3. Procédé selon la revendication 2 , dans lequel la concentration du peroxyde d'hydrogène destinée à supprimer la capacité de prolifération des spores n'est pas inférieure à environ 0,5 % en poids et celle destinée à maintenir l'activité des «T-endoto- 15xines n'est pas supérieure à environ 5 % en poids sur la base du poids de la suspension constituant la culture. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme capable de produite les toxines est Bacillus thuringiensis. 5. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la concentration 20 de la /3-propiolactone est au moins égale à 0,25 % en poids sur la base du poids de la suspension constituant la culture. 6. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la durée du traitement par les ultrasons est au moins égale à 20 minutes à 20 KHz. 25 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'insecticide microbien contient des «^-endotoxines comme ingrédient actif. 8. Insecticide contenant comme ingrédient actif les toxines insecticides d'un micro-organisme capable de produire des toxines pour les insectes et des spores dépourvues de la capacité de 30prolifération afin d'éliminer le danger d'une infection secondaire des vers à soie par celles-ci. 9. Insecticide selon la revendication 8, dans lequel l'insecticide microbien est utilisé en mélange avec un agent tensio-ac-tif.