FR 2086068 A1 19711231 FR 7030082 A 19700814 70 30082 i. 2086068 Les sulfates de chondroïtine À et C (CSA et CSC) sont très répandus dans les tissus humains et animaux, en particulier dans les cartilages et autres tissus conjonctifs, et bien qu'entrant dans des complexes avec les protéines ou les résidus peptidiques, 5 les mucopolysaccharides acides purs peuvent être isolés sans dégradation appréciable. Les sulfates de chondroïtine A et C contiennent tous deux de l'acide D-glucuronique, du 2-amino-2-dé soxy-D-galacto-se et des résidus acétyle et sulfate en quantités équimoléculaires. Des recherches structurales ont montré que les sulfates de chondrol-10 tine A et C diffèrent seulement par la position du groupe ester sulfate dans le résidu hexosamine. Le sulfate de chondroïtine A contient le motif récurrent acide (l ^ h)-0- ô -D-glucopyranosyl -uronique-( 1 > 3 ) -2-acé taxnido-2-désoxy-4-0-sulfo- -D-galacto- pyranose, et le sulfate de chondroïtine C contient le motif récur- 15 rent acide (l ^ 4)-0-^ -D-glucopyranosyluronique-( 1 ^ 3)-2- acétamido-2-désoxy-6-0-sulfo- -D-galactopyranose. On a maintenant découvert que des préparations purifiées de sulfate de chondroïtine A ayant une composition chimique apparemment semblable sur la base des méthodes d'analyse ordinaires peuvent différer de façon impor-20 tante par leur activité pharmacologique et physiologique. Des observations similaires ont été faites sur les préparations purifiées de sulfate de chondroïtine C. La présente invention se distingue des techniques antérieures par les points principaux suivants. Tout d'abord, ce n'est que ré-25 cemment que 11 on a constaté que CSA et CSC pouvaient être obtenus sous une forme remarquable, "active" du point de vue de la prévention de l'athérosclérose et de la récidive des accidents cardiovas-culaires chez les mammifères athéroscléreux, lorsqu'elle est administrée régulièrement et sur une période prolongée. Ce produit "ac-30 tif" doit être distingué du produit décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 405 120, qui a été essayé et que l'on a trouvé incapable de prolonger le temps de formation du thrombus plasmati-que chez le lapin six à douze heures après l'administration, comme décrit dans le procédé de la boucle de Chandler, et de prévenir 1'-35 athérosclérose chez les rats soumis au régime athérogène décrit ci-après. En général, les techniques antérieures telles qu'illustrées par le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 1,950 100 ne font état d'aucune différence entre les activités antiathéroscléreuses de diverses préparations de CSA et CSC de compositions chimiques apparera-**0 ment semblables. On pense que la découverte de la présente inven 70 30082 2. 2086068 tion représente un progrès majeur dans la technique. En second lieu, le médicament selon la présente invention doit être administré de façon essentiellement régulière et prolongée» et par suite, son utilisation se limite à une administration plus ou 5 moins périodique sur une base quotidienne pendant une période d'au moins plusieurs mois, et plus particulièrement, sur une période d'au moins plusieurs années. T1 va de soi que des interruptions occasionnelles de ce programme d'administration sont sans importance, aussi longtemps que le programme d'administration est régulier 10 lorsqu'on le considère dans son ensemble. Les spécialistes reconnaîtront facilement la différence entre un usage essentiellement régulier et prolongé, et un usage irrégulier, occasionnel ou à court terme, ce dernier ne faisant pas partie de l'invention. En bref, la présente invention vise un médicament utilisable 15 pour prévenir la formation de lésions athéroscléreuses chez les mammifères y compris l'homme, pour promouvoir le développement d'une circulation collatérale dans les régions du coeur irriguées par les branches des artères coronaires, et pour empêcher les accidents cardiaques tels qu'infarctus du myocarde, insuffisance coronaire 20 aiguë, et ischémie myocardique aigûe chez les individus de l'espèce humaine souffrant d'une maladie cardiaque ischémique, caractérisé en ce qu'il comprend un sulfate de chondroïtine biologiquement et physiologiquement "actif" choisi parmi le sulfate de chondroïtine "actif" A, le sulfate de chondroïtine "actif" G et leurs mélanges, 25 cette activité se manifestant par une prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique chez le lapin six à douze heures a-près l'administration comme décrit dans la méthode de la boucle de Chandler, le médicament étant administré de manière essentiellement régulière et prolongée par voie orale, 30 Le médicament selon l'invention est utilisable, notamment, pour empêcher l'apparition de lésions athéroscléreuses chez les mammifères, de promouvoir le développement de la circulation collatérale dans les régions du coeur alimentées par des branches des artères coronaires, d'empêcher que surviennent des accidents cardia— 35 ques tels qti• infarctus du myocarde, insuffisance coronaire aigrie, et ischémie myocardique aigûe chez 1*homme' souffrant d'une maladie cardiaque ischémique ou coronaire. D'autres buts, avantages et caractéristiques de'1'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. hO Le traitement par le CSA et le CSC comporte l'administration 70 30082 3. 2086068 10 20 orale du composé par ingestion quotidienne de 0,5 à 10 g, un tiers de la dose quotidienne étant habituellement prise avant ou après chaque repas. La durée du traitement va du court terme (environ trois mois) à l'administration continue pendant toute la vie du malade. Le Demandeur a découvert qu'il existe des variations considérables dans le temps de formation du thrombus plasmatique entre divers lots de sulfate de chondroïtine A douze heures après l'administration intraveineuse, en dépit du fait qu'ils ne se différencient pas sur la base des essais normalisés suivants : i^ssai Azote Soufre Rotation optique pH de la solution à 1$ Résidu de combustion Hexosamine Acide hexuronique Viscosité spécifique 1 Couleur (solution à 20 £) Pyrogène Stérilité Métaux lourds Procédé Kjeldahl Schoniger Pharmacopée des E.U.A. (U.S.P.) XVII, p. 911 Classique U.S.P. XVTI, p. 885 Elson-Morgan X Dische (Carbazole) * Oswald Nos propres ^ (a) D Gamme 2,5 à 3,5 4. 5 à 6 pH 6 à pH 7 moins de 3 32 à 35 36 à 39 Û 10 cps moins de 0,2 de densité optique satisfait a l'essai ii M moins de 20 ppm spécifications U.S.P. XVII, p. 863 U.S.P. XVII, p. 829 U.S.P. XVII, p. 877 x Methods of Enzymology, Volume II, Edité par Sidney P. Colowick et Nathan 0. Kaplan, Academic Press, New York, 1957, P- 93-101 xx La densité optique est déterminée à ''+20 rn^u sur un spectro-photomètre Beckman Jr. Modèle B. Aucun des essais précédents ne différencie le CSA biologique-ment et physiologiquement "actif" et le CSC biologiquement et physiologiquement "actif" du produit inerte. L'activité biologique et; physiologique du CSA et du CSC peut être déterminée comme suit, Lorsqu'on détermine leur activité biologique et physiologique de prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique par le procédé de la boucle de Chandler, codifié par Morrison et al « 'J. Atheroscler. Res. , 8; 31°, 1968) des préparations de sulfate de chondroïtine A purifiées comparables, sur la base de la batterie d'essais ci-dessus, donnenr., sur des lapins soumis à l'essai douze BAD ORIGINAL. 70 30082 2086068 heures après l'injection, les temps moyens suivants clé formation du thrombus plasmatique : Echantillon essayé. Sérum physiologique CSA, lot N° A - 6 CSA-, lot N° A - 10 CSA, lot N° B - 3 CSA, lot N° B - 7 Temps moyen de formation du thrombus plasmatique 12 heures après l'injection (minutes) 12 ,2 ^9,6 h6,k 1 h, 1 16,7 31,6 52,1 13,6 18.1 15.2 22,8 CSA, lot N° B - 9 CSA, lot N° C - 1 CSA, lot N° C - 2 CSA, lot N° C - h CSA, lot N° W - 2101 CSA, lot N° W - 164 Les essais ont été effectués sur des lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande pesant de 2 à 2,5 kg. Le temps de formation du 5 thrombus plasmatique était déterminé pour chaque animal avant l'injection, et de nouveau douze heures après l'injection. Le sulfate de chondroïtine A était dissous dans le sérum physiologique et dilué à une concentration de 80 mg/1. On administrait, aux témoins recevant le sérum physiologique et aux lapins recevant les solu-10 tions de sulfate de chondroïtine A une injection intraveineuse des solutions ci-dessus dans la veine auriculaire à la dose de 1 ml par kg de poids corporel. Dans chaque groupe, on a utilisé un minimum de six lapins. Les injections de sérum physiologique n'ont provoqué aucune modification importante des temps de formation du thrombus 15 plasmatique par rapport aux valeurs observées avant l'injection lorsque les échantillons de sang étaient prélevés douze heures a~ près 1'injection. Cependant, le tableau ci-dessus montre qu'un certain nombre de préparations de sulfate de chondroïtine À donnent lieu à une augmentation hautement significative des temps de forma-20 tion du thrombus plasmatique douze heures après l'injection par rarport aux témoins ayant reçu ie sérum physiologique, tandis que d'autres ne présentaient à cet égard qu'une activité faible ou rit L-le, Il est intéressant de noter que l'héparine, qui est extrêmement active pour prolonger le temps de formation du thrombus plasmatique 25 dans des échantillons de sang prélevés quinze minutes après l'in.jec- bad original 70 30082 5- 2086068 tion intraveineuse, ne donne lieu à aucune prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique dans des échantillons de sang prélevés six à douze heures après l'injection. On a découvert cependant, que des échantillons de sulfate de chondroïtine A qui don-5 naient lieu à une prolongation marquée du temps de formation du thrombus plasmatique dans des échantillons de sang prélevés douze heures après l'injection, n'avaient pas d'effet de prolongation notable du temps de formation du thrombus plasmatique par rapport aux valeurs observées avant l'injection dans des échantillons de sang 10 prélevés quinze minutes après l'injection. Il s'est également avéré que, dans le cas du sulfate de chondroïtine C, des préparations purifiées de ce produit, qui étaient semblables sur la base des essais chimiques ci-dessus, différaient de façon marquée par leur activité de prolongation du temps de for-15 mation du thrombus plasmatique des lapins, dans des échantillons de sang prélevés douze heures après l'injection. En général, les préparations de sulfate de chondroïtine A purifiées, de sulfate de chondroïtine C purifiées ou de mélanges des deux, qui donnent lieu à une augmentation d'au moins 80 $ du temps 20 de formation du thrombus plasmatique des lapins douze heures après l'injection dans les conditions indiquées ci-dessus, par rapport aux valeurs des témoins ayant reçu une injection de sérum physiologique, sont "actives" pour inhiber ou prévenir l'apparition de l'athérosclérose. On ne prétend nullement que l'activité de prolonga-25 tion du temps de formation du thrombus plasmatique de ces préparations, consécutive à leur administration intraveineuse, soit liée à l'activité antiathérogène obtenue après administration orale. L'essai de prolongation du thrombus est simplement utilisé comme système de sélection pour déceler les préparations ayant une activité 30 antiathérogène. Il a été observé que chaque préparation de sulfate de chondroïtine purifié A ou C ou de mélange des deux qui présente une activité antiathérogène dans les conditions indiquées ci-dessous, est également active pour prolonger le temps de formation du thrombus plasmatique de lapins, douze heures après l'injection, d'-35 une valeur supérieure d'au moins 80 $ à celle des témoins ayant reçu une injection de sérum physiologique. Les résultats indiquent ainsi que les préparations les plus actives pour prolonger le temps de formation du thrombus plasmatique de lapins dans les conditions d'essai ci-dessus possèdent également l'activité antiathérogène la hO plus élevée. Par contre., les préparations purifiées de sulfate de 70 30082 6. 2086068 chondroïtine A et/ou C qui ont une activité antiathérogène faible ou nulle sont invariablement celles qui sont incapables de prolonger de façon importante le temps de formation du thrombus plasmatique des lapins par rapport aux témoins ayant reçu l'injection de 5 sérum physiologique dans les conditions indiquées ci-dessus. Les différences d'activité de diverses préparations de sulfate de chondroïtine A et C purifié peuvent résulter de différences dans le procédé de préparation aussi bien que de différences dans le produit de départ. Le Demandeur a remarqué que des échantillons de 10 sulfate de chondroïtine purifié A préparés à partir du même produit de départ différaient de façon significative par leur effet sur le temps de formation du thrombus plasmatique douze heures après l'injection, suivant le procédé utilisé pour préparer le sulfate de chondroïtine A. Le Demandeur a aussi remarqué que les procédés qui 15 fournissent des produits très actifs suivant le protocole d'essai ci-dessus aboutissent, lorsqu'on les applique à certains produits de départ, à des préparations inactives, bien que la batterie de tests chimiques indiquée ci-dessus ne puisse mettre en évidence de différences entre les diverses préparations. 20 Un protocole expérimental pour faire apparaître l'athérosclé rose dans l'aorte et les artères coronaires des rats a été mis au point, consistant à alimenter de jeunes rats pendant six semaines avec un régime purifié contenant du cholestérol, complété par 1,25 millions d'unités USP de vitamine (Viosterol) par kg de ration. 25 Des rats alimentés avec un régime similaire, mais en omettant soit le cholestérol, soit les 1,25 millions d'unités US? de vitamine D^, ne présentaient pas de lésions. La répartition et l'aspect microscopique de ces lésions sont très semblables à ceux observés chez les humains présentant des lésions athéroscléreuses dans ces tissus. 30 XI s'est avéré que l'administration orale de préparations purifiées de sulfate de chondroïtine A et C ou de mélanges des deux, qui sont actives pour la prolongation du temps de formation du thrombus des lapins, comme indiqué ci-dessus, sont très actives pour réduire ou prévenir l'apparition de lésions athéroscléreuses, du fait du régi-35 me athérogène indiqué ci-dessus. On décrira dans ce qui suit les conditions expérimentales utilisées pour provoquer l'athérosclérose, et les résultats obtenus avec une préparation biologiquement et physiologiquement "active*5 de sulfate de chondroïtine purifié A. 40 La ration de base utilisée est un régime hautement purifié bad original 70 30082 7. 2086068 constitué de : saccharose, 61 °s; caséine pour essais exempte de vitamines, 2k huile de coton, 10 mélange de sels de Hubbell, Mendel et ïakeman, 5 et les vitamines suivantes par kg de régime : chlorhydrate de thiamine, 10 mg; riboflavine, 10 mg; chlorhy-5 drate de pyridoxine, 10 mg; pantothénate de calcium, 6O mg; acide nicotinique, 100 mg; acide ascorbique, 200 mg; biotine, 1 :ng; acide folique, 10 mg; acide paraaminobenzoïque, 200 mg; inositol, 400 mç; vitamine > 150 microgrammes; 2—méthvl-1,4-naph.toquinone, 5 mg; chlorure de choline, 2 g; vitamine A, 5000 unités USP; vitamine D,,, 10 500 unités USP; et acétate d1alpha-tocophérol, 100 mg. Les vitamines sont ajoutées à la place d'une quantité égale de saccharose. Cinquante-quatre rats mâles de la souche Long-Evans pesant en moyenne 1^5 g (de 136 à 155 g) et cinquante-quatre rats femelles de la souche Long-Evans pesant en moyenne 1k6 g (de 138 à 156 g) sont 15 choisis pour l'expérience suivant s Les animaux sont divisés en cinq groupes de poids comparable. Les groupes I, IX et III sont constitués par six animaux de chaque sexe. Les groupes IV et V sont constitués par dix-huit animaux de chaque sexe. Le groupe I est alimenté avec la ration de base ci-20 dessus. Le groupe II est alimenté avec la ration de base plus 1 % de sulfate de chondroïtine A purifié (lot N° 9008). Cette dernière préparation donne un temps de formation du thrombus plasmatique de 48,8 minutes douze heures après l'injection chez le.lapin, contre un temps moyen de formation du thrombus plasmatique de 13,2 minutes 25 chez les témoins ayant reçu le sérum physiologique, les essais étant effectués dans les conditions précédemment décrites. Le groupe III est alimenté avec la ration de base plus 1 fa de cholestérol + 0,5 $> d'acide cholique. Le groupe IV est alimenté par la ration de base plus 1,5 de cholestérol + 0,5 % d'acide cholique + 1,25 30 million d'unités USP de vitamine par kg de régime; le groupe V est alimenté avec le même régime que le groupe IV, mais reçut en outre un supplément de 1 de sulfate de chandroïtine A purifié (lot N° 9008). Les suppléments d'essai sont incorporés à la ration de base à la place d'une même quantité de saccharose. Les animaux 35 sont gardés dans des cages métalliques dont le fond est constitué par un grillage surélevé (trois rats par cage) et les divers régimes ainsi que l'eau leur sont fournis ad libitum. Les animaux sont nourris quotidiennement, et toute la nourriture non-consommée vingt-quatre heures après avoir été apportée est jetée. Les rats sont pe-'(-O sés une fois par semaine pendant la durée de l'expérience. bad original 70 30082 r. 2086068 Après six semaines de cette alimentation, les rats sont anes-thésiés au pentobarbital sodique, et l'on prélève du sang de leur coeur dans une seringue héparinée. Les foies sont excisés, épongés, pour éliminer le sano en excès, pesés et stockés dans un congéla-5 teur jusqu'à leur analyse. Les lipides sont extraits des foies par le procédé de Thompson et al. (Brit. J. Nutrition, 3 s 50, 19^9), et le cholestérol total ainsi que le cholestérol libre sont déterminés sur le foie et le plasma par une variante de la méthode de Schoenheimer et Sperry, décrite par Nieft et Deuel (J. Biol. Chem., 10 177 ' 1^3, 1949)» A l'autopsie, les coeurs et l'aorte sont fixés dans le formol à 10 ^ tamponné. Les coeurs sont divisés en trois parties, à savoir la partie supérieure, la partie moyenne et la partie basale, et les aortes sont coupées transversalement au niveau de la crosse et au niveau mi-thoracique. On prépare des coupes 15 congelées sur les échantillons ci-dessus, à 16-20 microns d'épaisseur et on les colore par le rouge "Oil-Red-O" pour mettre en évidence les lipides, et effectue une contre—coloration par l'hémato-xyline. On prépare dix coupes transversales sur chaque partie du coeur et à travers les parties crosse et mi-thoracique de l'aorte. 20 On examine les coupes au microscope et on les classe en tenant compte de la fréquence et de la gravité des lésions athéroscléreuses . Le tableau X résume la fréquence et la répartition des lésions athéroscléreuses dans les artères coronaires et dans l'aorte de 25 rats des divers groupes. TABLEAU I. Effets d'une préparation de sulfate de chondroïtine A "active" sur la fréquence et la répartition des lésions athéroscléreuses dans les artères coronaires et l'aorte de rats soumis à un régime athérogène par hypervitaminose D. Rats mâles. Nombre de rats par groupe Poids corporel initial, g Poids corporel final (x), g Observations histologiques : Fréquence de l'athérosclérose coronaire (y) Nombre moyen d'artères affectées par rat dans les parties suivantes du coeur : basale moyenne apicale Fréquence de l'athérosclérose aortique (?■>) Pourcentage d'animaux par groupe présentant des lésions dans les parties suivantes de l'aorte, et nombre total par rat affecté intracardiaque crosse mi-thoracique Régimes non-athérogènes Groupe I Groupe II Groupe III 6 145,3 362,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6 145 ,3 365,7 0,0 0,0 0,0 .0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6 145,3 371,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Régimes athérogènes Groupe IV Groupe Y 18 145,6 131,1 100,0 4,2 3,5 2,4 94,4 18 145,6 158,9 16,7 0,5 0,1 0,2 0,0 44,4 (2,0)** 0,0 88,9 (2,1)** 0,0 66,7 (1,3)** 0,0 O u> o o 00 K> eo K> O OO O" o cr- 00 ? a o 2 o z É Rats femelles. Nombre de rats par groupe Poids corporel initial (g) Poids corporel final (*) (g) Observations histologiques : Fréquence de l'athérosclérose coronaire ('/;) Nombre moyen d'artères affectées par rat dans les parties suivantes du coeur : basale moyenne apicale Fréquence de l'athérosclérose aortique (°/o) Pourcentage d'animaux par groupe présentant des lésions dans les parties-suivantes de l'aorte, et nombre total par rat affecté intracardiaque crosse mi-thoracique TABLEAU'I (suite) Régimes non-athérogfenes Régimes afahérogènes Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV . Groupe V 6 146,5 240,8 0,0 . G s0 0,0 0,0 0,0 0,0 0 .0 o 146,5 229,3 0,0 0,0 o, o 0,0 0,0 0 j o U j 0 0,0 6 146.5 259.6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 o,o C 0 x Essai interrompu au bout de six ue/naines d'alimentation. xx La gravité des lésions a oté évej.uée h or la naes 5'une échel xxx Deux des rats de ce groupe sont mores en cours d'expérimente:,tion groupe sont basées sur les seize animaux survivants. 18 18 110,3 (16)*** 138,2 100,0*** 16,7 2,7 2 j 8 2,7 xxx 100,0 87,5 (2,0) 100,0 93,8 (1,6) e allant de 0 à 4. Les données de a 0,2 0,1 0,0 27,8 ■^l O UJ o o 00 K> H O XX XX 27,8(1,2)1 ?7,8(1,2)* 11,3(1,5)* hO O 00 o o o- œ 70 30082 ii. 2086068 Ces observations indiquent que l'administration orale d'une préparation biologiquement "active" de sulfate de chondroïtine A à la dose de 1 Une observation supplémentaire, et qui paraît être remarquable 20 du point de vue des formes de médication auxquelles on attribue une activité antiathérogène est que l'activité antiathéroscléreuse des préparation "actives" de sulfate de chondroïtine A et C n'est associée à aucun effet décelable, de la part de ces préparations, sur la diminution des teneurs en cholestérol du plasma et du foie, ni 25 de la teneur en lipides totaux du foie. L'augmentation de la teneur en cholestérol du plasma et du foie et en lipides totaux du foie, chez les rats soumis à un régime athérogène avec hypervitaminose D additionné de 1 $ d'une préparation "active" de sulfate de chondroï tine A ou C, était tout aussi marquée chez les rats ayant reçu ces 30 derniers suppléments que chez les rats soumis au régime athérogène sans sulfate de chondroïtine A ou C. L'efficacité des préparations biologiquement "actives" de sulfate de chondroïtine A et C pour la promotion du développement de la circulation collatérale dans les régions du coeur alimentées par 35 des branches des artères coronaires est mise en évidence par les données suivantes : On alimente des rats avec le régime athérogène (groupe IV) indiqué ci-dessus (c'est-à-dire la ration de base additionnée de 1,5$ de cholestérol, 0,5 $ d'acide cholique et 1,25 million d'unités USP kO de vitamine Dg par kg de nourriture). Ces rats présentent une réduc 70 30082 12. 2086068 tion importante du nombre des branches des artères coronaires, tel que déterminé par comptage effectif des branches des artères coronaires dans les coupes transversales pratiquées dans les trois parties du coeur (basale, moyenne et apicale) par rapport à celui 5 trouvé chez les rats ayant reçu un régime non-athérogène (f^roupes I, II et III). Cet effet concerne les branches des artères coronaires, et non les artères coronaires principales. Lorsque des rats sont soumis au régime athérogène indiqué ci-dessus, mais reçoivent en outre une préparation "active" de sulfate de chondroïtine A à 10 la dose de 1 $ dans ce régime (groupe V), le nombre de ramifications des artères coronaires augmente jusqu'à une valeur proche de celle des rats soumis aux régimes non-athérogènes (groupes I, II et III). Des observations analogues ont été faites tant pour les rats mâles que pour les rats femelles. Les résultats sont résumés 15 dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II. Effets d'une préparation "active" de sulfate de chondroïtine A sur le nombre de branches des artères coronaires de rats soumis à un régime athérogène avec hypervitaminose D (*). Hombre d'animaux par groupe ' Section basale Section moyenne Section apicale Groupe de régime artère principale branches artère principale branches artère principale branches Rats mâles Régimes non-athérogènes Groupe I Groupe II Groupe III 6 6 6 4,7 5,3 3,5 25,3 28,2 23,0 6,0 6,5 5,0 31,6 33,0 27,5 3,8 4,5 3,8 26,0 28,0 23,0 Régimes athérogones Groupe IV Groupe V 18 18 3.7 4.8 14.8 20.9 5,5 5,7 20,0 27,3 3,3 3,6 15,6 22,8 Rats femelles Régimes non-athérogènes Groupe I Groupe II Groupe III 6 6 6 5.2 4,0 4.3 20,0 25,3 27,7 5,2 5,7 5,0 28,3 32,5 30,0 4.2 3.3 4,0 25,3 26,2 25,5 ■ Régimes athérogènes Groupe IV Groupe V 18 18 3,2 4,0 11,7 21,4 4,8 5,6 18.0 29.1 3,2 4,1 14,5 22,1 w L'expérience a été interrompue au bout de six semaines d'alimentation. -•4 O UU o o oo ho H UJ K> O 00 O" o o 00 70 30082 14. 2086068 Il semblerait que dans les conditions de l'essai ci-dessus, dans lequel il s'est produit une réduction du nombre des branches des artères coronaires chez les rats ayant reçu un régime athérogène, l'administration simultanée d'une préparation "active" de sul-5 fate de chondroïtine A à la dose de 1 $ dans la nourriture ait pour résultat une augmentation très significative du nombre des branches des artères coronaires. Dans la mesure où l'augmentation du nombre des branches d'artères coronaires dans une région donnée du coeur peut être associée à un accroissement de la circulation dans cette 10 région du coeur, il semblerait que les préparations "actives" de sulfate de chondroïtine A aient pour effet de favoriser le développement de la circulation collatérale dans les régions du coeur alimentées par les branches des artères coronaires. D'autres études ont montré que les préparations "actives" de sulfate de chondroïti-15 ne C sont également actives à cet égard, tandis que les préparations de sulfate de chondroïtine A et C qui étaient "inactives" pour la prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique chez les lapins dans les conditions d'essai précédemment indiquées sont sans effet pour empêcher la réduction du nombre de branches 20 d'artères coronaires chez les rats soumis à un régime athérogène avec hypervitaminose D. L'efficacité des préparations "actives" de sulfate de chondroïtine A et C pour la prévention des accidents cardiaques (tels qu'infarctus du myocarde, insuffisance coronaire aigiie et ischémie 25 myocardique aigiie) chez les sujets humains souffrant d'une maladie cardiaque ischémique coronaire est mise en évidence par les résultats suivants : L'expression "maladie ischémique coronaire" (ICD) utilisée ici décrit une insuffisance du courant sanguin vers le myocarde. Il ex-30 prime non seulement la présence d'une maladie artérielle coronaire (l'athérosclérose "silencieuse" met en jeu les artères coronaires chez la majorité des adultes de l'Amérique du Nord), mais aussi la progression du processus d'athérosclérose vers le stade d'une anomalie pouvant être révélée par l'examen clinique et/ou par électro-35 cardiographie. Cent-vingt malades souffrant d'une ischémie coronaire révélée par les électrocardiogrammes et l'histoire clinique, telle qu'angine de poitrine et/ou anciens infarctus du myocarde, ayant été traités pour ces états pendant des périodes allant de six mois à vingt ans, ont été répartis en deux groupes de soixante, as-40 sortis aussi étroitement que possible du point de vue âge, sexe et 70 30082 15. 2086068 observations cliniques et résultats de laboratoire. Le tableau III compare les deux groupes. TABLEAU III. Etat avant l'étude de soixante malades souffrant d'ischémie coronaire traités par le CSA, et de soixante malades témoins. Age moyen Angine, (ans) (nombre) Hommes CSA témoins 66 66 15 19 Infarctus du myocarde Hyper-antérieur tension (nombre) (nombre) 7 12 6 8 Reçoivent un traitement anticoagulant (nombre) 6 7 N ombre total de malades 16 25 Femmes CSA témoins Total CSA témoins 6k 67 65 66 25 20 '+0 39 6 3 13 15 20 19 26 27 3 3 Q 10 kk 35 6o 60 Les deux groupes de malades ont été choisis au hasard, dans l'ordre dans lequel ils se présentaient dans la clinique pratique. 5 L'ensemble des régimes thérapeutiques auxquels ils étaient soumis avant l'essai furent poursuivis ou étendus. Ils comprenaient des régimes pauvres en sodium, pauvres en cholestérol, une limitation éventuelle de la consommation de sucre, des vasodilatateurs des coronaires, de l'artère cérébrale ou des artères périphériques, des 10 calmants, des anticoagulants par voie buccale, des suppléments vi-taminiques et/ou alimentaires (tels qu'huiles et graisses hautement insaturées), des extraits thyroïdiens et des hormones sexuelles femelles. Les deux groupes ne différaient que sur un point : les sujets du groupe II recevaient quotidiennement une préparation "acti-15 ve" de sulfate de condroitine A. Ceux du groupe I n'en recevaient pas. Au cours de la première année de l'étude, les sujets du groupe II reçurent quotidiennement 1,5 à 10 g d'une préparation "active" de sulfate de chondroïtine A, tout d'abord sous forme de poudre, puis sous forme de comprimés contenant 0,5 S de sulfate de chon-20 droïtine A purifié par comprimé. Au cours de la deuxième et de la troisième année de l'étude, la dose de sulfate de chondroïtine A 70 30082 16. 2086068 "actif" administrée fut de 1,5 g ou 3 g par jour sous forme de comprimés. Le sulfate de chondroïtine A avait été préparé à partir de cartilage de trachée de boeuf. Chaque lot de sulfate de chondroxti-5 ne A avait été soumis à un essai d'activité sur la prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique, comme indiqué précédemment, et seules les préparations jugées "actives" par cet essai biologique ont été utilisées pour les essais. Des examens de laboratoire sur les systèmes hémopoiétique, 10 hépatique, rénal et autres furent pratiqués sur les deux groupes de malades, et, dans le groupe IX, ces examens furent habituellement effectués tous les mois ou tous les deux mois pendant la première période de deux ans, puis tous les quatre mois pendant la troisième année de la période d'étude du traitement. Ces examens 15 étaient les suivants : numération globulaire complète, vitesse de sédimentation, analyse d'urine, iode lié aux protéines, triiodo- 131 thyronine marquée à l'I , sodium, potassium, turbidité au thymol, transaminase glutamique oxalacétique du sérum, transaminase gluta-mique pyruvique du sérum, bilirubine du sérum (directe et indirec-20 te), calcium, phosphore, créatinine, glucose, protéines totales, albumine, glubuline, azote de l'urée, acide urique, phosphatase alcaline, floculation de la céphaline, cholestérol et béta-lipo-protéine. En outre, on fit à chaque malade des radiographies du thorax 25 et des électrocardiogrammes au repos. La plupart des malades subirent des électrocardiogrammes après exercice; des examens ophtalmologiques furent pratiqués par des ophtalmologistes qualifiés dans tous les cas. Des photographies de la microcirculation dans les vaisseaux de la conjonctive furent prises sur vingt-sept malades. 30 La fréquence d'états risquant d'entraîner des accidents coro nariens, tels qu'obésité, hypercholestérolémie, hyperlipémie, hyperbétalipoprotéinémie, hypertension, consommation de tabac, diabète sucré était à peu près la même dans les deux groupes de malades, aucune prépondérance de l'un quelconque des facteurs ci-dessus 35 n'ayant été observée dans l'un ou l'autre des groupes. Sur la base des observations cliniques ou des examens de laboratoire, on n'a pu observer aucun effet néfaste de l'administration de sulfate de chondroïtine A sur aucun des sujets, pendant la période d'observation de trois ans. 40 Le tableau IV donne les détails de la mortalité et de la mor- BAD ORIGINAL 70 30082 17. 2086068 bidité des cent-vingt malades étudiés au cours de la période d'étude de trois ans. TABLEAU XV. Accidents cardiaques aigus survenus chez soixante malades traités par le CSA et soixante malades témoins souffrant d'ischémie coronaire pendant une période d'étude de trois ans. Infarctus du myocarde Insuffisance coronaire mortels non mortels aigiie -ji Hommes CSA témoins 2 4 O 6 O 4 Ischémie myocardique O O xx Total 2 14 Femmes CSA témoins 1 2 O 4 1 4 o 5 2 15 Total CSA témoins 3 6 O 10 r 8 0 5 4 29 X Hospitalisé xx Hospitalisés, passager 5 + Décès Dans le groupe I des soixante malades qui n'avaient pas reçu de CSA, il se produisit les accidents cardiaques aigus suivants s 1 - Infarctus du myocarde - mortel = 6 cas 2 - Infarctus du myocarde - non mortel = 10 cas 10 3 - Insuffisance coronaire aigiie ou ischémie coronaire aigiie - (non mortelles) = 8 cas 4 - Ischémie myocardique (non mortelle) : 5 cas Tous les malades ci-dessus furent hospitalisés, à l'exception de deux cas mortels d'infarctus du myocarde qui furent diagnosti-15 qués par un médecin autre que l'auteur, et décrits comme tels sur les certificats de décès. Chez les malades pour lesquels fut posé à l'hôpital le diagnostic d' "insuffisance coronaire aigiie" ou d' "infarctus du myocarde imminent", chaque malade fut d'abord admis et traité dans l'unité de soins pour insuffisance coronaire ai-20 giie d'un hôpital général. Sur les six cas mortels d'infarctus du myocarde, quatre étaient des hommes de 76, 71» 65 et 56 ans respec- 70 30082 18. 2086068 tiveinent. Les deux malades femmes frappées d'un infarctus du myocarde mortel avaient respectivement 65 et 79 ans. Trois malades moururent au cours de la première année d'observation, les autres moururent au cours des deux années suivantes d'observation et de traite— 5 ment par le régime thérapeutique général décrit ci-dessus. Sur les six cas d'infarctus du myocarde (mortel), quatre malades présentaient des antécédents d'angine de poitrine chronique. Huit malades survécurent aux infarctus du myocarde, parmi lesquels deux eurent deux accidents chacun, de sorte qu'il y eut dix 10 cas d'infarctus du myocarde non mortel. Sur ces huit malades, cinq étaient des hommes et trois des femmes. Leurs âges allaient de 49 à 83 ans, la moyenne étant de 68 ans. Aucun ne reçut de traitement anticoagulant avant l'attaque. Cinq malades avaient eu précédemment un infarctus du myocarde. 15 XI y eut huit cas (sept malades, sur lesquels un cas double) d'insuffisance coronaire aigiie. Tous ces malades furent admis dans les unités de soins pour insuffisance coronaire aigiie d'hôpitaux, le médecin effectuant l'admission posant pour certains d'entre eux le diagnostic d'infarctus du myocarde "menaçant" ou "imminent", 20 d'angine de poitrine "prolongée" ou d' "état angineux". Les sept malades guérirent tous de leur insuffisance coronaire aigiie, mais deux malades furent atteints ultérieurement d'infarctus du myocarde massifs, l'un douze mois plus tard (non mortel), et l'autre vingt-et-un mois plus tard (mortel). Le premier de ces deux malades fut 25 hospitalisé deux fois pour insuffisance coronaire aigiie. Cinq malades atteints d'ischémie myocardique furent hospitalisés pour des symptômes douloureux attribuables à leur système car-diovasculaire. Cependant, ceux-ci n'étaient pas suffisamment graves et les modifications de 1'électrocardiogramme et des enzymes du 30 sang n'étaient pas suffisamment critiques pour nécessiter leur admission dans une unité de soins pour insuffisance coronaire aigiie. Ces malades furent donc gardés en traitement dans les services de soins de l'hôpital général. Ces cinq malades étaient toutes des femmes; leurs âges allaient de 55 à. 75 ans, la moyenne étant de 65 Dans le groupe XI, sur les soixante malades souffrant d'insuffisance coronaire qui avaient reçu du CSA actif, il se produisit les accidents cardiaques aigiis suivants : 1 - Infarctus du myocarde - mortel = 3 cas 35 ans. 40 2 - Infarctus du myocarde - non mortel = O cas 70 30082 19. 2086068 3 - Insuffisance coronaire aigiie (à son terme ) = 1 cas h - Ischémie myocardique = O cas. Deux des malades frappés d'infarctus myocardique mortel étaient des hommes, le troisième était une femme. Ils étaient âgés 5 respectivement de 68, 77 et 65 ans. Pour le premier malade frappé d'infarctus du myocarde mortel, sur lequel l'autopsie fut effectuée, on avait cessé d'administrer le CSA deux mois avant la mort. Le deuxième malade de cette catégorie avait pris du CSA par intermittences pendant un an, puis avait 10 cessé un an avant sa mort. Le troisième malade (femme) frappé d'infarctus du myocarde mortel présentait une hypertension persistante qui était souvent difficile ou impossible à maîtriser. Chez la femme qui mourut d'insuffisance coronaire à son "terme, et de défaillance cardiaque congestive, il s'agissait des complications termi-15 nales à la suite d'une hémorragie cérébrovasculaire massive chez un malade souffrant de fibrillation et de palpitations chroniques. Trois de ces quatre malades avaient des antécédents d'angine de poitrine chronique. Certains malades du groupe traité par le CSA subirent des pé-20 riodes fréquentes d'interruption brève du traitement par le CSA, par suite d'un manque d'approvisionnement, d'infections "grippales" intermittentes des voies respiratoires supérieures ou gastrointestinales, ou de cas d'indisposition alimentaire. Celles-ci furent de courte durée (de quelques jours à quelques semaines au maximum). 25 Jusqu'à ce jour, il ne s'est produit aucun autre accident car diaque chez les soixante malades traités par le CSA, en dehors des quatre malades ci—dessus. A strictement parler, deux de ces quatre malades ne peuvent être considérés valablement comme des cas d'incapacité du CSA à prévenir un accident cardiaque aigu, puisque dans 30 un des cas (infarctus du myocarde mortel chez l'homme de 77 ans), le malade avait cessé de prendre le CSA un an avant sa mort, et que, dans un second cas, le malade est mort en fait d'un accident cérébrovasculaire massif, la défaillance cardiaque étant apparue comme une complication finale. 35 Un autre malade de ce groupe décéda. Il s'agissait d'une femme âgée de 62 ans, chez laquelle l'autopsie révéla un astrocytome cérébral malin. Cette malade présentait déjà des symptômes cérébraux lorsqu'on instaura le traitement par le CSA; elle avait déjà été hospitalisée deux fois pour examen diagnostique cérébral et 40 pour examen neurologique général. Ceux-ci ne purent mettre en évi 70 30082 20. 2086068 dence la lésion cérébrale qui se révéla ultérieurement lors de l'intervention chirurgicale pre-mortem et à l'autopsie. Sur les soixante malades témoins, il y eut un total de vingt-neuf accidents cardiaques sur la période d'observation de trois 5 ans, contre un total de quatre accidents cardiaques chez un groupe comparable de malades ayant reçu quotidiennement des doses orales d'une préparation de sulfate de chondroïtine A "active". Préparation du CSA "actif". Une des matières premières utilisables pour la préparation de 10 sulfate de chondroïtine A "actif" est la trachée de boeuf. On se procure ce produit aux abattoirs, aussitôt que possible après l'abattage des animaux. On le congèle ensuite jusqu'à son traitement. Au cours du traitement, il est débarrassé des tissus qui l'encombrent et il est finement broyé. Ce tissu broyé est dégraissé avec 15 cinq parties d'acétone. On effectue deux extractions pour réduire la teneur en graisse à 1 $ environ, ou moins. Le produit dégraissé est séché et rebroyé. On en prépare une solution à " $ dans tin tampon à l'acétate de calcium 0,1 M contenant 1 $ de papaïne, avec en plus du chlorhydrate de cystéine 0,005 M et du versénate disodique 20 0,005 M comme activateurs enzymatiques. Le mélange tout entier est maintenu à 62°C i 3°C pendant vingt-quatre à trente heures, en agitant doucement. La trachée est ainsi solubilisée à 85-95 $ environ. On décante le liquide surnageant et on le précipite par deux volumes d'acétone. On décante l'acétone surnageant. Le produit restant 25 est dissous dans une solution saline isotonique, de manière à obtenir une solution à 3-5 On ajoute cette dernière à une solution saturée de permanganate de potassium, par portions de 2 à 5 ml, en agitant constamment, chaque portion étant ajoutée jusqu1 à disparition totale de la coloration pourpre. Suivant les matières premiè-30 res utilisées au départ, ceci exige de 50 à 200 ml de solution de permanganate de potassium pour 2,70 kg de produit brut de départ. Lorsque la coloration persiste longtemps (c'est-à-dire plus de cinq minutes) entre le moment de l'addition et celui de la décoloration, on cesse l'addition de permanganate. On abandonne alors la 35 solution une nuit pour permettre la floculation du bioxyde de manganèse, et l'achèvement des réactions pouvant se produire. On sépare le bioxyde de manganèse par centrifugation ou filtration sur un papier filtre grossier. Le gâteau de bioxyde de manganèse est lavé avec un supplément de solution saline isotonique. Dans cer-40 tains cas, l'addition d'une faible quantité de formaldéhyol e ou -le BAD ORIGINAL 70 30082 21. 2086068 méthanol provoque la floculation du bioxyde de manganèse, que l'on précipite ensuite par un volume d'acétone. Le précipité huileux résultant est recueilli par décantation, on évapore le solvant ou bien on dissout le gâteau dans la quantité d'eau minima, et on ob-5 tient le produit final par lyophilisation. A la chromâtographie sur papier, il apparaît comme du sulfate de chondroïtine A essentiellement pur. La courbe d'absorption spectrophotométrique dans 1'infra-rouge est caractéristique du sulfate de chondroïtine A. / \ 2k Les mesures de pouvoir rotatoire donnent des valeurs de (a)^ de 10 -24°, la teneur en azote est de 3,3 Préparation du CSC "actif". Une des matières premières pour la préparation du sulfate de chondroïtine C "actif" est le cartilage de requin. Ce produit, fourni sous forme desséchée, est broyé et dégraissé par trois à 15 cinq parties d'acétone. Une extraction est habituellement suffisante. Ce cartilage de requin extrait est ensuite traité comme indiqué ci-dessus pour la trachée de boeuf séchée après le stade du dégraissage. 70 30082 22. 2086068 - REVENDICATIONS. - 1 - "Un médicament utilisable pour prévenir l'apparition de lé sions athéroscléreuses chez les mammifères y compris l'homme, pour promouvoir le développement de la circulation collatérale dans les 5 régions du coeur irriguées par les branches des artères coronaires et pour prévenir les accidents cardiaques tels qu'infarctus du myocarde, insuffisance coronaire aigiie et ischémie myocardique aigiie chez les humains souffrant d'une maladie cardiaque ischémique, caractérisé en ce qu'il comprend un sulfate de chondroïtine biolo-10 giquement et physiologiquement "actif choisi parmi le sulfate de chondroïtine A "actif", le sulfate de chondroïtine C "actif" et leurs mélanges, cette activité se manifestant par une prolongation du temps de formation du thrombus plasmatique chez les lapins six à douze heures après l'administration, comme décrit dans le procédé 15 de la boucle de Chandler, le médicament étant administré de manière esséntiellement régulière et prolongée par voie orale. 2 — Un médicament suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est présenté pour l'ingestion par voie orale de 0,5 à 10 g du principe actif par jour»