FR 2068728 A1 19710903 FR 6934747 A 19691010 La présente invention concerne les nucléotides, plus particulièrement des dérivés de l'acide adénosine-3',5'-mono- phosphorique cyclique et d'un de ses isomères. L'acide adénosine-3',5'-monophosphorique cyclique répond à la formule le qualificatif " cyclique" indiquant que les atomes de la partie phosphorique forment un cycle avec ceux de la partie ribosique. Ce composé est fabriqué dans les cellules de l'organisme animal à partir de l'acide adénosine-5'-triphosphorique par l'action d'un enzyme l'adényl cyclane. On ccnsidère qu'un grand nombre d'hormones utilisent l'acide adénosine-3',5'-phosphorique (en abrégé "A M P cyclique") comme messager chimique pour l'exercice de leur action, en l'espèce comme "deuxième messager" selon la terminologie de Sutherland et ses collaborateurs.L'activité biologique de l'ADS cyclique peut commodément être mise en évidence in vitro par diverses épreuves, notamment celle de ia dilatation des mélanophores dans la peau du lézard Abolis carolinensh celle de la dispersion des mélanophores dans la peau de la grenouille (Rana pipiens) et celle de l'augmentation de la quantité d'hormone thyréotrope libérée par l'hypophyse de rat. L'AMP cyclique augmente de production des corticostéroides (Haynes, Koritz, Peron, J.biol.Chem., 234,1421, (1959)).Les dérivés dibutyryles de l'1u-5P cyclique ont le même effet et peuvent remplacer l'ACTH,et chez les animaux intacts augmentent le niveau plasmatique de corticostérone (Imura et Coll.,Endocrinology 76,933,1965). Un composé doué de propriétés similaires est l'isomère dans lequel le noyau de ribose, au lieu d'être lié par son atome de carbone 1' à l'atome d'azote 9 de la purine, l'est, par le mAeme atome, à l'atome d'azote 3, les doubles liaisons du noyau purique étant déplacées en conséquence. On est convenu de nommer ce composé iso-AMP cyclique. le but de la présente invention est de procurer de nouveaux dérivés de l'AMP cyclique et l'iso-AMP cyclique qui déploient des activités biologiques similaires mais plus intensément et/ou plus sélectivement. les nouveaux dérivés se caractérisent par le fait que l'atome d'azote juxtanucléaire fixé dans la position 6 porte au moins un radical alcoylique, en particulier un radical alcoylique inférieur, s'il s'agit de l'AMP cyclique et lthydroxyle fixé en 2' dans le noyau de ribose est e-stérifié par l'acide butyrique, s'il s'agit de l'iso-AMP cyclique, l'acide ainsi constitué pouvant être salifié. L'invention a trait plus spécialement aux dérivés qui, dans la position 6, portent un radical NHCH3, , N(CH3)2, NH-n-C4H9 ou NH-t-C4H9. On peut, selon l'invention, préparer les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique à partir des dérivés mone-alcoylés et di-alcoylés en -N6 de l'acide adénosine-5'-monophosphorique (AMP) en les faisant réagir avec du p-nitro-phénol en présence de di-cyclohexyl carbo-di-imide (C6H11-N=C=N-06H11) et en traitant les esters obtènus, de préférence sous forme de sels de triéthyl-ammonium, par du tertio-butoxyde de potassium. Quant aux dérivés mono-alcoylés et di-alcoylEs de l'acide adénosine-5'-monophosphorique, qui sont nouveaux et font partie de l'invention, on peut les obtenir en faisant réagir une 6-halogéno, en particulier la 6-chloro, 9-(ribo-ss-furanosyl- 2'3'-isopropylidène)-purine evec la mono ou la di-alcoylamine appropriée et en soumettant le dérivé d'adénosine ainsi obtenu à une phosphorylation, de préférence par l'action d'oxy-chlorure de phosphore dans du phosphate de méthyle. Pour ce qui est de l'acide 2'-O-butyryl-iso-AMP cyclique, on peut, selon l'invention, le préparer. par acylation directe de l'acide, de préférence sous la forme de son sel de tri-éthyl ammonium. On peut, en particulier, opérer avec un excès d'anhydride butyrique, en présence de pyridine, à la température ambiante. Les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique peuvent être utilisés dans l'industrie aux mêmes fins que l'AMP cyclique, notamment pour les recherches biochimiques et pharmaceutiques. Les exemples suivants, non limitatifs, où les températures sont en degrés centigrades, illustrent la préparation des nouveaux dérivés. EXEMPLES 1 à 4 : 4 a) Acides N6-alcoyl-adénosine-5'-phosphoriques (N6-n-butvl-AMP). La substance de départ est la 9-(ribo-p-furanosyl- 2',3'-isopropylidène)-ó-chloro-purine; elle a été préparée d'après Hampton et Maguire, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1961, p. 150 et d'après Zemlicka et Sorm, Czech. Pat. No 110 944, 1964. 50 mg de ce produit sont chauffés 15 heures à 800, en solution dans 1 ml de n-butylamine anhydre. On évapore sous 'vide jusqu'à siccité; on reprend par du chloroforme, on évapore à siccité sous vide et on répète plusieurs fois cette opération. le résidu est ensuite séché I heure sous un vide-poussé et dissous dans 1 ml de méthanol absolu; on introduit 0,5 g de gel de silice "Merok" (0,05 - 0,20 mm) et on évapore à siccité.Le solide est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice de 155 mm de longueur et de 8 mm de diamètre. On élue par un mélange de chloroforme et de méthanol (90:10 en volume) en collectant des fractions de 1 ml. La 9-(ribo-ss-furanosyl-2',3'-isopropylidène)-6-n-butyl amino-purine est contenue dans les fractions n 7 à 13. On obtient, après évaporation à siccité, 37 mg d'une substance amorphe chromatographiquement homogène (Rf. 0,75 sur couche mince de silice dans du n-butanol saturé d'eau). 467 mg du produit précédent, séché sous un vide poussé durant 2 heures à la température ordinaire, sont dissous dans 3,3 ml de phosphate de méthyle. La température étant maintenue à 0 , on introduit 0,47 ml d'oxychlorure de phosphore et on laisse reposer 5 à 6 heures. L'excès de réactif est détruit par addition de 20 g de glace pilée. Après une demiheure d'agitation, on ajuste le pH à 1,5 au moyen d'ammoniaque concentrée. On chauffe ensuite 50 - 60 minutes à 80-90Q, ce qui permet d'enlever par hydrolyse le groupe isopropylidène. Après avoir amené le pH à 7,0 au moyen d'ammoniaque concentrée, on agite 10 minutes en présence de 10 g de noir animal actif (obtenu suivant Hurst et Becking, Can. J. Biochem. Physiol. 41, 1963, page 469) et traité par lavage à l'acide. Le noir animal recueilli par filtration et lavé au moyen de 100 ml d'eau est traité par 400 ml d'un mélange d'ammoniaque concentrée, d'eau et de méthanol (15:35:50 en volume) ce qui permet l'élution du nucléotide adsorbé. On évapore à siccité, on reprend par de l'eau et à pH 2,0 au moyen d'acide sulfurique 0,5 M. On concentre ensuite à environ 2 ml. Après addition d'alcool puis d'acétone et séjour à 0 , on obtient 310 mg de N6-n-butyl-AMP cristallisé. le produit analytiquement pur fond à 155-158 et se montre homogène à la chromatographie. b) D'autres dérivés N6-alcoylés de l'AMP ont été préparés de la même façon. Le tableau suivant indique quelques uns des caractères des divers dérivés. T A B L E A U I Dérivés N6-alcoylés de l'AMP. Rf dans divers systèmes Substituants en Point de # max de dissolvants N6 fusion (m ) # max A monoéthyl 184-1850 268 16900 0,21 0,30 0,33 diméthyl 225-230 274 18400 0,30 0,37 0,61 n-butyl 155-158 266 14000 0,50 - 0,75 t-butyl - - 270 15200 0,51 0,66 0,75 * Système de dissolvants. A : alcool-acétate d'ammonium 0,5 M (5 : 2 en vol.);- B : isopropanol-ammoniaquo concentrée eau (6:3:1 en vol.); C : isopropanol-sulfate d'ammonium à 1 % (2:1 en vol.) EXEMPLES 5 à 8 : a) Acide N6, N6-diméthyl-adénosine-3',5'-phospho rique (N6-diméthyl-AMP cyclique) et ses sels. 150 mg d'acide N6-diméthyl-adénosine-5'-phosphorique (N6-diméthyl-AMP) sont dissous dans un mélange de 2,5 ml de diméthylformamide et de 2,5 ml de pyridine anhydres. On ajoute 0,112 ml de tri-n-butylamine, 556 mg de p-nitrophénol et 825 mg de dicyclohexyl-carbodi-imide (DCHC). Le nucléotide passe complètement en solution après 5 à 10 minutes d'agitation. On laisse reposer 24 heures à la température ordinaire. Par chromatographie sur papier (système A du tableau I), on décèle, en quantités approximativement égales, de l'ester p-nitro-phénolique du dérivé de l'AMP et du pyrophosphate symétrique correspondant. On évapore jusqu'à siccité sous vide et on reprend le résidu dans 10 ml d'eau. Après filtration , on extrait à 5 reprises, chaque fois avec 10 ml d'éther, pour enlever le p-nitrophénol et la DOHO en excès. La solution aqueuse est versée sur une colonne (40 cm de long ur et 2,8 cm de diamètre) de DEAE-cellulose, sous forme de bicarbonate. Après lonne au moyen de 500 ml d'eau bidistillée, on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl-ammonium 0,1M (pH 7,5); on emploie au total 3 litres du mélange.On recueille des fractions de 20 ml. L'ester p-nitrophénolique du N6-diméthyl-AMP (rendement 45 %) est contenu dans les fractions N 56-78; #max-274m ; max=22000. Par évaporation à siccité, on obtielst le sel de triéthylammonium qu'on sèche durant plusieurs heures sous un vide poussé, à la température ordinaire. le sel de triéthyl-ammonium (107 mg) est dissous dans 4 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. On ajoute 1 ml d'une solution 1 M de t-butoxyde de potassium dans de l'alcool t-butylique anhydre, ce qui produit la formation du nucléotide cyclique avec libération de p-nitrophénate. Au bout de 3 h à la température ordinaire, on agite avec 2 g de Dowex 50 (forme NH4+); on filtre après addition de 10 ml- d'eau. On lave ensuite la résine avec de-ltammoniaque 0,2 N jusqu'à élution complète du nucléotide cyclique. La solution ammoniacale est évaporée sous vide et on fractionne comme indiqué précédemment sur une colonne de DEAE-cellulose. les fractions No 58 à 82 contiennent le nucléotide cyclique.Elles sont réunies et évaporées à siccité. On reprend par du méthanol et évapore de nouveau à siccité. On dissout ensuite dans 0,5 ml de méthanol anhydre, on ajoute 2 ml d'une solution 0,5 M de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre et complète enfin la précipitation du sel de sodium du nucléotide cyclique par addition de 5 ml d'acétone anhydre. On recueille 39 mg de produit par centrifugation. On le lave à l'acétone A partir d'une solution aqueuse concentrée du sel de sodium, on peut précipiter le nucléotide cyclique sous forme de sels de métaux lourds, par exemple comme sel d'argent par addition de nitrate d'argent en faible excès.Par iécomposition de ce sel en suspension aqueuse au moyen d'hydrogène sulfuré, on obtient une solution de l'acide libre. Par neutralisation au moyen de bases minérales ou organiques on obtient les sels correspondants du nucléotide cyclique. b) Les dérivés N6-monométhylique, N6-n-butylique et N6-t-butylique de l'AMP cyclique ont été préparés de la même façon. Le tableau II indique quelques uns des caractères des divers dérivés. T A B L E A U II Dérivés N6-substitués de l'AMP cyclique Rf dans divers systèmes Substituants # max** # max** de dissolvants* en N6 A B C monométhyl 270 17000 0,58 0,49 0,75 diméthyl 274 20000 0,88 0,78 0,76 n-butyl 269 18200 0,75 0,83 0,82 t-butyl 272 18200 0,70 0,80 0,83 * Les systèmes de dissolvants sont les mêmes que dans le tableau I ** Mesures effectuées à pH 7,0 EXEMPLE 9 : Acide 2'-O-butyryl-iso-adénosine-3',5'-phophorique (2'-O-butyryl-iso-AMP cyclique) La préparation connue de l'acide iso-adénosine- 3',5'-phosphorique (iso-AMP cyclique) comporte un fractionnement sur colonne de DEAE-cellulose qui fournit le nuléotide cyclique sous la forme d'une solution de son sel de triéthyl-ammonium. Ce sel, soigneusement Desséché (25 mg) est dissous dans 0,75 ml de pyridine anhydre. On ajoute 0,375 g d'anhydride butyrique et on laisse reposer 6 heures à la température ordinaire. La majeure partie de la pyridine est chassée par évaporation sous vide; l'anhydride butyrique en excès est ensuite décomposé par addition de 0,35 ml d'eau à QO. On évapore à siccité sous un vide poussé. Le résidu est maintenu encore 12 heures sous un vide poussé à la-température ordinaire. On reprend par 10 ml d'eau et on verse sur une colonne de DEAE-cellulose de 15,5 cm de longueur et de 0,8 cm de diamètre. On lave d'abort au moyen ie 300 ml d'eau et on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl-ammonium 0,1 M (pH '7,5). On recueille des fractions de 20 ml. Le dérivé monobutyrylé est contenu dans les fractions No 56 à 78 qui sont réunies et lyophilisées. Le résidu est repris par 0,2 ml de méthanol anhydre; on ajoute 1 ml d'une solution 0,5 M de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre et on complète par addition de 5 ml d'acétone anhydre la précipitation du sel de sodium de l'acide 2'-0-butyryl-iso AS cyclique qui est recueilli par centrifugation et lavé à l'acétone anhydre.On en otient 13 mg; Amax~ 278 m; max= 12800; Rf 0,80 dans le système éthanol-acétate d'ammo- nium 0,5 M (5:2 en vol.) sur papier Whatman 1. le maximum observé dans le spectre W est pratiquement identique à celui du spectre de l'iso-AMP cyclique de départ, ce qui exclut la présence en 1!16 du reste butyryle; ce dernier ne peut alors se trouver qu'en 2'. On oUtient le même produit si la-durée de réaction de l'iso-AMP avec de l'anhydride butyryque en présence de pyridine est prolongée jusqu'à 8 jours, ce qui montre la faible réactivité du groupe amino N6. On a recherché tout d'abord comment les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique se comportaient en présence d'hypophyses de rats mises en incubation selon une technique connue (M. Saffran et A.V. Schally, J. Biochem. of Physi9l., Canada, 33, 408, 1955). Après une heure d'incubation à 38 dans du milieu de Krebs-Ringer additionné de eicarbonate de sodium et de glucose, les hypophyses de rats qui ont été en présence des nouveaux dérivés ont produit plus d'hormone thyréotrope que les hypophyses servant de témoin, la teneur des produits d'incubation en hormone thyréntrope après dilution a été déterminée par la méthode de McKenzie (J.M.McKenzie, Endocrinology, 63, 372, 1958). Bes- résultats sont consignés dans le tableau ci-après où les abréviations en tete de colonne signifient respectivement: Réponse selon McKenzie pourcentage d'augmentation de la radio activité du sang en coups au compteur par minute et par ml de sang,après 2heures Réponse covar réponse calculée par covariance après transformation en logarithmes décimaux Dunnet Signif. Stat. signification statistique : non significatif, + significatif (p = 0,05), ++ très significatif (p = 0,01) TSH mU milli-unités d'hormone thyréotrope mg. hyp. par mg d'hypophyse T A B L E A U Dose en Réponse Répon Traitement milli- selon se Dunnet Signif. TSH mU TSH mU moles McKenzie Covar. stat. total mg/hyp. Témoin - 140% 2,31 - - 30,0 2,94 AMPc 5 316% 2,59 4,53 x x 76,5 5,71 di-méthyl-AMPc 3 298% 2,62 4,94 x x 70,5 5,73 mono-méthyl-AMPc 3 250% 2,54 3,66 x x 54,0 4,20 Témoin - 137% 2,25 - - 20,0 1,90 AMPc 3 347% 2,66 5,36 x x 60,0 4,65 t-butyl-AMPc 1 186% 2,39 1,81 n.s. 26,0 2,05 n-butyl-AMPc 1 302% 2,60 4,57 x x 46,0 3,98 mono-méthyl-AMPc 1 270% 2,51 3,41 x 40,0 2,95 O-butyryl-iso-AMPc 1 275% 2,56 4,13 x x 42,0 2,94 Témoin - 135% 2,00 - - 20,0 1,69 n-butyl-AMPc 1 223% 2,23 3,77 x x 31,0 2,77 t-butyl-AMPc 1 164% 2,08 1,28 n.s. 23,0 1,92 AMPc 3 243% 2,26 4,24 x x 37,0 3,44 O-butyryl-iso-AMPc 1,5 170% 2,13 2,10 n.s. 24,0 2,00 II ressort de ce baL)ieau que les nouveaux derivés de l'AMP acyclique, sauf le dérivé N6-tertio-butylique, ont donné lieu à des augmentations significatives de la libération d'hormone thyréotrape même à la dose d'une milli-molécule alors que l'AMP cyclique lui-même n'a pas encore d'effet à cette dose. La moindre activité du dérivé tertio-butylique, dans cette épreuve, par comparaison avec le dérivé n-butylique paraît attribuable à l'encombrement stérique, le radical nbutylique étant catéuniforme alors que le radical t-butylique est compact. En revanche dans l'épreuve de l'action sur les mélanophores du lézard Anolis, le dérivé tertio-butylique et le dérivé butylique normal se comportent à peu près de la même façon. Les concentrations minimales qui ont donné des réponses positives dans cette épreuve ont été les suivantes AMPc 1 milli-mole dérivé mono-méthylique 0,43 milli-mole dérivé diméthylique 0,56 milli-mole dérivé n-butylique 0,26 milli-mole dérivé t-butylique 0,28 milli-mole REVENDICATIONS 1.- Les dérivés de l'acide adénosine-3',5'-mono- phosphorique qui répondent à la formule dans laquelle les symboles R1 et R2 désignent chacun, indépen- damment, un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyl-ique, la signification R=R2=H étant exclue, l'hydroxyle lié au phosphore pouvant être- salifié. 2.- Ceu des dérivés spécifiés sous 1, pour lesquels les groupes alcoyliques peuvent représenter les symboles R1 et R2 sont des groupes aicoyliques inférieurs. 3.- Les dérivés N6-monométhylique, N6,N6-diméthylique, N6-butylique normal et N6-butylique tertiaire de l'acide adénosine-3',5'-monophosphorique et leurs sels. 4.- Un procédé de préparation d'un des dérivés définis dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé N6-mono-alcoylé ou N6,N6-di-alcoylé de l'acide adénosine-5'-monophosphorique avec du p-nitro-phénol en présence de di-cyclohexyl carbo-diimide et on traite les esters obtenus, de préférence sous forme de sel de triéthyl-ammonium, par du tertio-butoxyde de potassium. 5.- Le dérivé 2'-O-butyrylique de l'acide iso-adénosine-3',5'-monophosphorique et ses sels. 6.- Un procédé de préparation du composé spécifié sous 5, caractérisé par le fait qu'on soumet de l'acide iso adénosine-3',5'-monophosphorique de préférence sous la forme de son sel de triéthyl-ammonium, à l'action d'un agent de butyrylation. 7.- Un procédé selon la revendication 6, dans lequel on opère avec de l'anhydride butyrique en excès, en présence de pyridine, à la température ambiante. 8.- Les dérivés de l'acide adénosine-5'-mmnophospho- rique qui répondent à la formule dans laquelle R1 et R2 ont les significations indiquées sous 1 ou 2, plus spécialement les dérivés N6-monométhylique, N6 ,N6-diméthylique, N6-butylique normal et N6-tertio-butylique.