FR 2117801 A1 19720728 FR 7045830 A 19701218 La présente invention concerne les procédés microbiologiques d'obtention de produits concentrés contenant des caroténoides, procédés appliqués à la préparation de produits fourragers, ainsi que de produits alimentaires et médicamenteux. On connaît déjà des procédés d'obtention de produits concentrés contenant des caroténoides, par culture aérobie de microorganismes producteurs de caroténoides, par exemple: Rhodotorula gracilis, Riiodotorula rubra, Sporobolomyces, Mycobacterium, etc., sur des milieux nutritifs contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux, de substances biologiquement actives, d'agents de croissance des microorganismes et de précurseurs des caroténoides. Au cours de la fermentation il y a propagation des cellules microbiennes et biogenèse des caroténoides, la vitesse de formation desquels retarde considérablement sur la vitesse d'accumulation des cellules microbiennes. L'incubation dure 7 à 18 jours.A l'issue de la fermentation on isole le produit visé Les inconvénients desdits procédés résident dans la durée considérable de la fermentation, ce qui augmente le danger de pénétration de microflore étrangère dans le milieu, dans le matériel encombrant (fermenteurs spacieux et nombreux), et dans la forte consommation d'énergie électrique. Les procédés indiqués ne permettent pas de créer les conditions optimales différenciées pour la culture des microorganismes et la synthèse des caroténoides. La présente invention est destinée à supprimer les inconvénients précités. Conformément à cet objectif, l'invention vise, en modifiant les opérations technologiques et en choisissant judicieusement les cc--ditions appropriées de réalisation du processus de biogèè;e des caroténoides dans les cellules microbiennes, à réduire la durée de la fermentation et les aires d'implantation du matériel grâce à la réduction du volume et de la quantité des appareils mis en jeu, ainsi qu'à diminuer la consommation d'énergie électrique. La solution consiste en ce que dans le procédé microbiologique d'obtention de produits concentrés contenant des caroténoides, par culture aérobie de microorganismes producteurs sur un milieu nutritif contenant-des sources de carbone, d'azote, de sel minéraux, de substances biologiquement actives, de précurseurs de caroténoides, jusqu'à l'accumulation maximale des cellules microbiennes dans le milieu de fermentation, avec récupération ultérieure du-produit visé, selon l'invention on concentre les cellules microbiennes en séparant partiellement le bouillon de culture jusqu a ce que la teneur du milieu en cellules microbiennes atteigne au moins 50 g/i (en calculant en matière sèche) et en maintenant la culture, en vue de promouvoir la biogenèse des précurseurs des caroténoldes, à une température de 28 à 350C et un pH de 5 à 7, tout en distribuant de l'air débité à raison de 80 à 150 mg de 02 par litre et par minute pendant le temps requis pour l'obtention du produit visé, en fonction de sa destination et du microorganisme producteur choisi. Pour réduire les pertes en matières solides des cellules microbiennes au cours de l'accumulation des caroténoides, on a intéret à ajouter aux cellules concentrées 0,5 à 5%, en poids, de substances contenant du carbone. Pour obtenir des caroténoides purifiés, on lave à l'eau les cellules concentrées et on y ajoute 0,5 à 1,5 %, en poids, de chlorure de sodium. En vue de promouvoir la synthèse des caroténoldes et d'enrichir le produit visé en substancesbiologiquement actives, on introduit dans la masse concentrée de cellules un mélange d'éléments - traces Co, Cu, Mn, Zn, I, Mo, Fe. Lesdits élémentstraces sont engagés sous forme de sels dans les proportions pondérales suivantes par rapport à 100 g de cellules microbiennes sèches (en g): CoCO3.............................0,0001 à 0,01 CuSO4.............................0,0001 à 0,01 MnSO4.............................0,0001 à 0,05 iFeS04 0, 001 - 0,01 ZuSO4 0,0001 à 0,01 XI 0,0001 à 0,05 (NH4)2MoO4.......................0,0001 à 0,001. Lesdits éléments-traces peuvent être incorporés directement dans la masse concentrée de cellules, ou bien après l'introduction de substances contenant du carbone ou après l'innn} duction du chlorure de sodium. Le procédé conforme à l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante. La culture d'un microorganisme producteur de caroténoides, par exemple: Rhodotorula gracilis, Rhodotorula rubra, Sporobolomyces, Mycobacterium, ou d'autres espèces, est incubée par trans-inoculations successives des milieux de culture jusqu'a l'obtention de la végétation d'ensemencement nécessaire. Be milieu nutritif pour cette dernière présente la même composition que le milieu nutritif pour la fermentation et contient des sources de carbone à raison de 1 à 10% en poids, d'azote à raison de 0,04 à 0,4% en poids, de sels minéraux à raison de 0,05 à 0,5% en poids, de substances biologiquement actives, d'agents de croissance des microorganismes et de précurseurs de caroténoides jusqu'à 4% en poids. Le milieu nutritif ainsi préparé est stérilisé pendant 1 heure à une température de 115 à 1200C, La culture de semence est conduite à une température de 28 à 350C et un pH de 5,0 à 6,0, tout en distribuant de l'air débité à raison de 80 à 120 mg de 02 par litre de milieu et par minute. On procède ensuite à la fermentation. Dans un fermenteur stérilisé on charge le milieu nutritif ayant la composition précédement indiquée et stérilisé au préalable pendant 60 mn à la température de 1200G. Cela fait, on introduit 3 à 10%, en poids, de semence et on conduit la culture à une température de 28 à 350C et un pH de 5 à 7, tout en distribuant de l'air débité à raison de 80 à 150 mg de 02 par litre de milieu et par minute jusqu'à l'accumulation maximale des cellules microbiennes, que l'on détermine par analyse pondérale ou par examen microscopique. La fermentation dure 12 à 48 heures. On concentre ensuite la culture enenséparant partiellement le bouillon de fermentation jusqu a ce que le milieu contient 50 à 200 g de cellules microbiennes par litre (en calculant en matière solide), puis on le maintient, en vue de promouvoir la synthèse des caroténoides, à une température de 28 à 3500 et un pH de 5 à 7, tout en distribuant de l'air débité à raison de 80 à 150 mg de 02 par litre de milieu et par minute pendant un laps de temps s'étendant de 6 heures à 7 j ours. On sèche la masse de cellules qui en résulte et on obtient ainsi un produit concentré contenant de 30 à 5.000 @ @g de caroténoides par gramme. lie procédé de culture peut être effectué en continu. Dans ce cas, la quantité de cellules microbiennes contenues dans le milieu reste invariable quand le débit d'amenée du milieu est compris entre 0,08 à 0,66 heure Pour réduire les pertes en matières solides des cellules microbiennes au cours de la synthèse des caroténoides, il est rationnel d'ajouter à la masse concentrée 0,5 à 5, en poids, de substances contenant du carbone, par exemple du saccharose. Pour obtenir des caroténoides purifiés, on lave la masse concentrée en vue d'éliminer les restes du milieu nutritif, puis ajoute 0,5 à 1,5, en poids, de chlorure de sodium. En vue de promouvoir la synthèse des caroténoides et d'enrichir le produit visé en substances biologiquement actives, on introduit dans la masse concentrée un mélange d'éléments traces Co, Cu, Fe, Mn, Zn, I, Mo. On peut en outre incorporer du vanadium dans ledit mélange d'éléments-traces. Ces éléments-traces sont engagés sous forme de sels dans les proportions pondérales suivantes par rapport à 100 g de masse sèche (en g): CoCO3 0,0001 à 0,01 CuSO4.............................0,0001 à 0,01 MnSO4.............................0,0001 à 0,05 ZnSO4.............................0,0001 à 0,01 PeSO4 0,001 à 0,01 XI 0,0001 à 0,05 (EH4)2MoO4 0,0001 à 0,001 lie procédé conforme à l'invention permet de réduire la durée de la fermentation, ce qui écarte partiellement le risque de pénétration de microflore étrangère dans le milieu, de réduire les aires d'implantabnn du matériel grâce à la diminution de son volume et de la quantité des appareils mis en jeu, ainsi que de réduire la consommation d'énergie électrique et d'air. lie procédé proposé offre la possibilité d'assurer les conditions optimales pour la propagation et la croissance des cellules microbiennes et pour le phénomène de caroténogénèse, ce qui permet d'améliorer la quantité du produit visé. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs suivants de mise en oeuvre du procédé microbiologique d'obtention de produits concentrés contenant les caroténoides. Exemple 1. En vue de l'obtention de l'inoculum, on ensemence succes vivement, à partir d'un tube d'essai, une culture de Rhodotorula gracilis 320 dans des flacons, puis dans un inoculateur sur an milieu nutrifif aqueux constitué des ingrédients suivants dans les prooortloes suivantes (% en poids): mélasse............................... 8 phosphate diammonical O,2 le reste étant de l'eau La mélasse contient les ingrédients suivants en (% en poids): saccharose 44 à 50 sucre interverti 0,5 à 2 raffinose 1 à 3 substances contenant de l'azote 1,5 à 2 y compris:: aminoacides bioactifs 0,45, amides 0,02 aneurine (vitamine B1) 0,00013 riboflavine (vitamine B2) 0,000014 acide nicotinique O,Q051 acide pantothénique 0,00013 acide folique ; O,0021 pyridoxine (vitamine B6)..............0,00054 biotine (vitamine B7).................0,0000035 le reste étant de l'eau. La culture de semence est réalisée par fermentation submergée pendant 24 à 72 heures à chaque étape, à une température de 300C et un pH égal à 5, le débit d'air distribué étant de 8mg de 02 par litre de milieu et par minute dans les flacons et de 100 mg de 02 par litre de milieu et par minute dans l'inoculateur. On procède ensuite à la fermentation.On stérilise un fermenteur de 3000 1 pendant une heure avec de la vapeur vive à une température de 1200C,après quoi on y charge 2.000 1 d'un milieu nutritif aqueux ayant la meme composition que le milieux nutritif pour la culture de semence et stérilisé au préalable pendant une heure à une température de 1200C.Après le refroidissement du milieu nutritif à une température de 30 C, on introduit dans le fermenteur 10%, en poids de semence et on conduit la culture pendant 24 heures à une température de 300C et un pH de 5,0, tout en distribuant de l'air débité à raison de 120 mg de 02 par litre de milieu et par minute. A l'issue de la fermentation le milieu contient 20 g par litre de cellules de levure (en calculant en matière sèche). On épaissit ensuite la liqueur de culture dans un séparateur jusqu'à ce que le milieu contienne 100 g de cellules par litre (en calculant en matière sèche). Le rendement en masse concentrée est de 409 1. lia masse concentrée obtenue est placée dans un fermenteur de 700 1 de capacité et est maintenue pendant 48 heures à une température de 300C et un pH égal à 5,5, tout en distribuant de l'air débité à raison de 130 mg de 02 par litre de milieu et par minute. Le produit obtenu est séché dans un sécheur-atomiseur jusqu a une humidité résiduelle de 5 à 8%, la température de l'air admis dans le sécheur étant de 140 à 1500C. On obtient ainsi un produit concentré contenant 120 ~ g de caroténoides par gramme. Le rendement en produit visé est de 35 kg. Exemple 2. Les opérations de préparation du milieu nutritif, de culture de semence, de fermentation et d'épaississement de la liqueur de culture dans un séparateur sont effectuées comme dans l'exemple 1. La masse concentrée de cellules microbiennes obtenue en quantité de 400 1 est lavée dans 2.000 litres d'eau, puis est concentrée jusqu'à ce qu'elle contienne 100 g de cellules microbiennes par litre (en calculant en matière sèche). On ajoute à la masse concentrée 4 kg de saccharose et on réalise la production de caroténoides comme dans l'exemple 1. Le rendement en produit visé est de 40 kg. La teneur du produit final en caroténoîdes est de 130 S;g par gramme. Exemple 3. lies opérations de préparation du milieu nutritif, d'incubation de la semence, de fermentation et d'épaississement de la liqueur de culture dans un séparateur sont effectuées comme dans l'exemple 1. On introduit dans 4001 de masse concentrée de cellules microbiennes ainsi obtenue des élémentstraces sous forme de sels pris dans les proportions pondérales suivantes (en g): CoCO3.................................0,04 CuSO4.................................0,3 MnSO4.................................0,14 ZnS04 0,3 FeS04 0,3 KI...................................0,014 (NH4)2MoO4 0,03 et on réalise la production de carotènoides comme dans l'exemple 1. Le rendement en produit visé est de 40 kg.La teneur du produit final en caroténoides est de 150 g par gramme. Exemple 4. On conduit les opérations comme dans l'exemple 1 jusqu'à l'obtention de la masse concentrée de cellules microbiennes. On lave cette dernière en quantité de 400 1 dans 2.000 1 d'eau, puis on concentre jusqu a une teneur en masse microbienne de 150 g par litre (en calculant en matière sèche) pour obtenir ainsi 270 1 de masse microbienne concentrée, à laquelle on ajoute 2,1 mg de chlorure de sodium, et on conduit l'opération de synthèse des caroténoides comme dans l'exemple 1. Le rendement en produit visé est de 38 kg. La teneur du produit final en caroténoides de 120 g par gramme. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'on été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci sont exécutées selon l'esprit de l'invention. REVENDICAIONS 1.-Un procédé microbiologique d'obtention de produits concentrés contenant des caroténoides, par incubation aérobie de microorganismes producteurs appropriés sur un milieu nutritif aqueux contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux, de substances biologiquement actives, d'agents de croissance des microorganismes, et de précurseurs des caroténoides, jusqu'à l'accumulation maximale des cellules microbiennes dans le milieu de fermentation, avec isolement subséquent du produit visé, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on concentre les cellules microbiennes en e séparant partiellement le bouillon de fermentation jusqu'à ce que le milieu de fermentation contienne au moins 50 g de cellules microbiennes par litre de milieu (en calculait en matière sèche), après quoi on maintient la liqueur de culture, en vue de promouvoir la synthèse des caroténoldes, à une température de 28 à 350C et un pH de 5 à 7, tout en distribuant de l'air débité à raison de 80 à 150 mg de 02 par litre de milieu et par minute pendant le temps requis pour l'obtention du produit final, en fonction de la destination de celui-ci et du microorganisme producteur choisi. 2.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit dans la masse concentrée de cellules microbiennes 0,5 à 5%, en poids, de substances contenant du carbone. 3.- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on lave à l'eau la masse concentrée de cellules microbiennes et qu'on y introduit 0,5 à 1,5 %, en poids, de chlorure de sodium. 4.- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on introduit dans la masse concentrée de cellules microbiennes un mélange d'éléments-traces Co, Cu, Fe, Mn, Zn, I, No. 5.- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits éléments-traces sont utilisés sous forme de sels dans les proportions pondérales suivantes rapportées à 100 g de cellules microbiennes sèches (en grammes) CoCO3 ....................... 0,0001 à 0,01 CuSO4 ....................... 0,0001 à 0,01 MnSO4 ....................... 0,0001 à 0,005 ZnSO4 ....................... 0,0001 à 0,01 FeSO4 ....................... 0,001 à 0,01 KI ...................... 0,0001 à 0,05 (NH4)2MoO4 ............................. 0,0001 à 0,001 6.- lies produits concentrés contenant des caroténoides, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé suivant l'une des revendications 1 à 5. 7.- Produits fourragers alimentaires ou médicamenteux, caractérisés en ce qu'ils sont préparés au moyen des produits concentrés selon la revendication 6.