FR 2106412 A1 19720505 FR 7131748 A 19710902 L'inventicn a poux objet ;jii procédé de préparatiaon de deux polypeptides dotés d'une activité biologique notable dans le "test du tibia", les polypeptides obtenus grâce à ce procédé ainsi que leurs dérivés ou homologues inférieurs.Les produits que que l'on décrira ci-après sont : - le mouotétracontapeptide L-glutamyl-L-thréonyl-L-glutaminyl-Llysyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-séryl-L-valyl-L-phénylalanyl-L-alanyl-L-asparaginyl L-séryl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosyl-glycyl-L-alanyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-séryl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-aspartyl-L-leucyl L-leucyl-L-lysyl-L-aspartyl-L-leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-glycyl L-isoleucyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-leucine ;; - et le ditriacontapeptide L-méthionyl-glycyl-L-arginyl-L-leucyl L-glutamyl-L-aupartyl-L-prolyl-L-séryl-glycyl-L-arginyl-L-thréonylglycyl-L-glutaminyl-L-isoleucyl-L-phénylalanyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-thréonyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-lysyl-L-phénylalanyl-L-apartyl L-thréonyl-L-asparaginyl-L-séryl-L-histidyl-L-asparaginyl-L-aspartyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-leucine, - ainsi que les intermédiaires servant à leur préparation. Le procédé selon l'invention pour la préparation de ces deux polypeptides est basé sur les métnodes et rections générales suivantes utilisées dans la synthèse des polypeptides. Pour la protection des groupes amine des aminoacides, on peut itiliser les groupements benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, 2-(p-blphénylyl-2-propyloxycarbonyle, o-nitrophénylsulfényle, tosyle et d'autros qui sont communément utilisés dans la chimie des polypeptides. Pour le protection du groupe carboxyle, on peut utiliser les groupes benzyle, p-nitrobenzyle, t-butyle et les autres groupes communément utilisés à cet effet. L'élimination de ces groupements, qui sera décrite en détail dans les exemples donnés plus loin peut e 1aire selon les procédés connus dans la littérature, par exemple, selon les cas le raite- ment par les acides fluorhydrique, chlorhydrique, bromhydrique, trifluoracétique et l'hydrogénation catalytique.Pour la condensation des aminoacides, on peut utiliser les méthodes qui mettent en jeu la N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, l'azide, l'ester p-aitrophénylique, l'ester de N-hydroxysucclaimide et les autres corps qui servent communément à ce genre, oie réactions0 L'isolement et la purifl- cation des polypeptides décrits dans l'invention s'effectuent aussi selon les techniques connues de la chimie des protéines, par exemple la filtration sur gel, la chromatographie par échange ionique, l'électrophorèse préparatoire, la distribution à contre-courant etc... En particulier, le procédé de l'invention peut s'appliquer comme suit On prépare synthétiquement les deux polypeptides par la méthode de synthèse des peptides en phase solide de Merrifield (J. Am. Cnem. Soc. 85, 2149, 1963 : Advan. Enzymol. 32, 221, 1969). La protection des groupes amine des aminoacides s'effectue au moyen du groupement t-butyloxycarbonyle (Boc).Les groupes fonctionnels des chaînes latérales des aminoacides sontprotégés de la façon suivante : au moyen du groupe benzyle dans le cas de l'acide aspartique, de 11 acide glutamique, de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine, au moyen du groupe benzyloxycarbonyle dans le as de la lysine, au moyen du groupe nitro dans le cas de l'arginine, au moyen au groupe dinitrophényle dans le cas de l'histidine (F. Chillemi et R.B. Merrifield, Biochemistry, 8, 4333, 1969) et par formation du sulfoxyde dans le cas de la méthionine0 On effectue la synthèse de façon graduelle en partant dans les deux cas de la t-butyloxycarbonyl-leucyl-résine. On utilise l'acide chlorhydrique 1 N dans l'acide acétique pour éliminer le Troupe Boc des aminoacides; la triéthylamine en solu tion dans I chloroforme pour la neutralisation et la N, N'-dicy- clohexylcarbodiimide (DCCI) pour les réactions de condensation Pour parvenir aux rendements de réaction les plus élevés possibles, on utilise cans chaque cas un excès au coefficient 5 de Boc-amiIlo- acide. On répète les réactions de condensation dans le cas des aminoacides suivant : arginine, lysine, histidine, tyrosine et méthionide. Pour la Boc-asparagine et la Boc-glutamine, on utilise la méhode de l'ester p-nitrophénylique. Pour éliminder le groupe Boc de la glutamine, on opère une acidolyse au moyen d'acide trifluoracétique afin d'éviter la formation éventuelle d'acide pyroglutamique (H. Takashima, V. du Vigneaud, R.B. Merrlfield, J. Am. Chem. Soc. 90, 1323, 1968 ; M. Manning, J; AmO Chem. Soc. 90, 1548, 1968)o On sépare les peptides finaux du support solide au moyen d'acide fluorhydrique anhydre en présence d'anisol selon Sakakibara (Bull $Chem. Soc. Jap. 40, 2164, 1967). Par ce traitement, on élimine en outre tous les groupes protecteurs présents, à ltexception de de ceux de l'histidi- ne et de la méthionine; on élimine ensuite le groupe dinitrophényle de l'histidine par thiolyse au moyen de 2-mercaptoéthanol, ce qui réduit aussi le sulfoxyde de méthionine à l'état de méthionine0 Enfin, on purifie les peptides libres ainsi obtenus par distribution à contre-courant. Les deux polypeptides possèdent une activité somatotrope notable comme le montre le test de l'augmentation d'épaisseur du cartilage tibial chez le rat (FoSo Greenspan, C.H.Li, M.E. Simpson et M.H. Evans, Endocrinology, 5, 455, 1949); leur mélange possède en outre, pour le test susdit, une action synergique remarquable On donnera maintenant plusieurs exemples, uniquement à titre d'illustration de 11 invention, sans aucune intention limitative. Exemple 1 Boc-L,leucyl-résine On déshydrate sous vide 3,0 g (12 millimoles) de Boc-leucine-H20 en présence d'anhydride phosphorique. On dissout le résidu huileux obtenu dans 30 ml d'éthanol anhydre et on ajoute 1,5 ml (10,8 millimoles) de triéthylamine anhydre et 5,2 g (12 millimoles) de résine chlorométhylée (2,) millîrnoles de Cl/g, grosseur maximale 60 microns. On agite la suspension sous reflux pendant 48 heures, on la filtre, on la lave et on fait sécher sous videz On obtient 6,4 g de Boc-leucyl-résine (0,94 millimoles de leucine par gramme de résine). Exemple 2 Boc-Glu (OBzl)-Thr(Bzl)-Gln-Lys(Z)-Sér(Bzl)-Asn-Leu-Glu-Leu-Arg(NO2) Sér(Bzl)-Val-Phé-Ala-Asn-Sér(Bzl)-Leu-Val-Tyr(Bzl)-Gly-Ala-SéR(Bzl) Asn-Sér(Bzl)-Asn(OBzl)-Val-Tyr(Bzl-Asp(OBz)-Leu-Leu-Lys(Z)-Asp (OBzl)Leu-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Gly-Ile-Glu(OBzl)-Thr(Bzl)-Leu-résine On place 0,55 w (0,50 millimole) de Boc-Leu-résine dans un récipient de réaction monté sur un agitateur mécanique du type décrit précédemment par Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149, 196)) On élimine le groupe Boc en traitant pendant 50 minutes par l'acide chlorhydrique 1 N dans l'acide acétique.On lave la résine à trois reprises à l'acide acétique, à trois reprises à l'éthanol et à trois reprises au chloroforme et ensuite on la neutralise par traitement à la triéthylamine à 10 % dans le chloroforme pendant 10 minutes0 On lave convenablement la résine au chloroforme et au chlorure de méthylène, on la met en suspension dans 4 ml de chlorure de méthylène contenant 0,46 g (1,50 millimole) de Boc-Thr(Bzl)-OH. Au bout de 10 minutes, on ajoute 2 ml de chlorure de méthylène contenant 0,31 g (1,50 millimole) de N,N-dicyclohexylcarbodiimide et on continue la réaction de condensation pendant 3 heures.On lave à trois reprises la Boc-Thr(Bzl) Leu-résine obtenue avec du chlorure de méthylène, à trois reprises avec de l'acide acétique et on répète trente-neuf fois le cycle d'opérations ci-dessus avec le Boc-aminoacide approprié pour obtenir la monotétra contapeptide-résine protégée. Chaque cycle est identique à celui qu'on a décrit pour la thréonine, si ce n' est que pour la Boc-Glu et la Boc-Asn, on condense en passant par l'ester p-nitrophénylique en utilisant la diméthylformamide comme solvant (excès de réactif au coefficient 4, durée de réaction 8 heures). On élimine le groupe Boc de la glutamine en traitant par l'acide trifluoracétique pendant 15 minutes à la température ambiante. On obtient 2,50 g de monotétracontapeptide-résine protégée. Exemple 3 H-Glu-Thr-Gln-Lys-Sar-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Sér-Val-Phé-Ala-Asn- Sér-Leu-Val-Tyr-Gly-Ala-Sér-Asn-Sér-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys- Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Glu-Thr-Leu-OH e On met en suspension 2,50 g de monotétracontapeptide-résine protégée dans 25 ml d'acide fluorhydrique anhydre et dans 2,5 ml d'anisol en utilisant l'appareil décrit par Sakakibara (bulle Chem. Soc. Jap. 40, 2164, 1967)o On agite le mélange pendant une heure à 00C puis on élimine' l'acide fluorhydrique du récipient de réaction par distillation, on traite le résidu à plusieurs reprises par l'acétate d'éthyle et on fait sécher sous vide. On sépare le peptide libre de la résine en traitant à plusieurs reprises par l'acide acétique à 80 %, on traite pendant une heure à pH 8 en milieu aqueux et, finalement, on purifie par dis tribu- tion à contre-courant (130 transferts dans le mélange alcool butylique secondaire-acide dichloracétique à l,, 1:1, K = 15; 150 transferts dans le mélange tétrachlorure de carbone-chloroformeméthanol-ammoniaque 0,02 N, 5:5:8:2,.K = 7,7)o On obtient 250 mg du produit qui apparatthomogène à l'électròphorèse sur papier à pH 2 (tampon s acide formique 1,5M, acide acétique 2M, 1:1), RHis 0,11 ;[&alpha;]25 = 18- (c = 1, acide acétique à 80 %). Analyse des aminoacides : Asp=5,76 (6), Thr=1,82 (2), Sér=4,87 (5), Glu=6,20 (6), Gly=2,25 (2), Ala=2,05 (2), val=2;97'(3), Ile-l,04 (1), Leu=8,34 (8), Tyr=1,68 (2), Phé=0,84 (1), Lys-1,81 (2),Arg= 0,81 (1). Exemple4 Boc-Mét(O)-Gly-Arg(NO2)-Leu-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Pro-Sér(Bzl)-Gly Arg(N02 )-Thr(3zl )-Gly-Glu-Ile-Phé-Lys (Z)-Glu-Thr(3z1) Tyr(Bzl) Sér(Bzl)-Lys(Z)-Phé-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Asn-Sér(Bzl)-His(Dnp)-Asn Asp(OBzl)-Asp(OBzl)-Ala-Leu-résine. On place 0,55 g (0,50 millimole) de Boc-Leu-rdsine dans un réacteur installé sur un agitateur mécanique du type décrit par Merrifield (J. As. Chem. Soc. 85, 2149, 1963). L'élimination du groupe Boc, les lavages et la neutralisation s'effectuent comme indiqué à l'exemple 3. On met la résine en suspension dans 4 ml de chlorure de méthylène contenant 0,28 g (1,50 millimole) de Boc-Ala-OH ; au bout de 10 minutes, on ajoute 0,31 g (1,50 millimole) de N,N-dicyclohexylcarbodiimide dissoute dans 2 ml de chlorure de méthylène.On lave la Boc-Ala-Leu-résine obtenue avec du chlorure de méthylène et de l'acide acétique et on répète le cycle 30 fois avec un Boc-aminoacide approprié de manière à obtenir la ditriacontapeptide-résine protégée (2,25 g). Egalement dans la synthèse de ce peptide, pour Gln et pour Asn on utilise dans les réactions de condensation la méthode de l'ester p-nitrophénylique et on élimine le groupe Boc de la Gln par acidolyse au moyen d'a- cide trifluoracétique. Exemple 5 H-Mét-Gly-Arg-Leu-Glu-Asp-Pro-Sér-Gly-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-Lys Gln-Thr-Tyr-Sér-Lys-Phé-Asp-Thr-Asn-Sér-His-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-OH On met en suspension 2,25 g de la ditriacontapeptide-résine protégée dans 23 ml d'acidefluorhydrique anhydre et dans 2,3 ml danisol. Ensuite, on procède comme à l'exemple 3. Après avoir séparé le polypeptide de la résine, on le traite par le mercaptoéthanol, d'abord pendant 2 heures à pH 8 et ensuite pendant 24 heures à pH 7. On purifie le produit par distribution à contre-courant : on exécute 300 transferts dans le mélange alcool butylique secondaire-acide dichloracétique 1:1, K = 0,28. On obtient 400 mg du produit qui apparaît homogène à l'électrophorèse sur papier à pH 2 (tampon : acide formique 1,5 M, acide acéti que 2M, 1:1), RHis = 0,31;[&alpha;]@25 = -31 (c = 1, acide acétique à 80 %. Analyse des aminoacides : Asp=6,19 (6), Thr=3,19 (3), Sér=3,20 (3), Glu=2,83 (3), Pro=l,OO (1), Gly=2,81 (3), Ala=1,18 (l), Mét= 0,78 (1), Ile=0,96 (1), Leu=2,33 (2), Tyr=0,86 (1), Phé=2,21 (2), Lys=2,23 (2), His=1,16 (1), Arg=1,88 (2). REVENDICATIONS 10/ Procédé de préparation de deux polypeptides biologiquement actifs présentant la séquence suivante dtaminoaci- des - le monotétracontapeptide L-glutamyl-L-thréonyl-L-glutaminyl-L- lysyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-séryl-L-valyl-L-phénylalanyl-L-alanyl-L-asparagi nyl-L-séryl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosyl-glycyl-L-alanyl-L-séryl-L- asparaginyl-L-séryl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-aspartyl-L-leucyl-L-leucyl-L-lysyl-L-aspartyl-L-leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl glycyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-leucine;; et le ditriacontapeptide L-méthionyl-glycyl-L-arginyl-L-leucyl-L- glutamyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-séryl-glycyl-L-arginyl-L-thréonyl- glycyl-L-glutaminyl-L-isoleucyl-L-phénylalanyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-thréonyl-L-tyrosyl-L-séryl-L-lysyl-L-phénylalanyl-L-aspartyl L-thréonyl-L-asparaginyl-L-séryl-L-histidyl-L-asparaginyl-L-aspar tyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-leucine, procédé caractérisé en ce que l'on condense un aminoacide de façon connue avec un corps choisi entre un autre aminoacide et un polypeptide de manière à obtenir le polypeptide présentant la séquence désirée d'aminoacide, on élimine ensuite les groupes protecteurs de façon connue et finalement on purifie le produit obtenu. 20/ Nouveau monotétracontapeptide obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 et présentant la séquence suivante : L-glutamyl-L-thréonyl-L-glutaminyl-L-lysyl-L-séryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-glutaminyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arrinyl-L-séryl-L-valyl L-phénylalanyl-L-alanyl-L-asparaginyl-L-séryl-L-leucyl-L-valyl-Ltyrosyl-glycyl-L-alanyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-séryl-L-aspartyl Lvalyl-L-tyrosyl-L-aspartyl-l-leucyl-l- L-leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-glycyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L thréonyl-l-leucine, 30/ Nouveau ditriacontapeptide obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 et présentant la séquence suivante L-méthionyl-glycyl-L-arginyl-L-leucyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-séryl-glycyl-L-arginyl-L-thréonyl-glycyl-L-glutaminyl-L-isoleucyl-L-phénylalanyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-thréonyl-L-tyrosyl-Lséryl-L-lysyl-L-phénylalanyl-L-aspartyl-L-thréonyl-L-asparaginyl L-séryl-L-histidyl-L-asparaginyl-L-aspartyl-L-aspartyl-L-alanyl-Lleucine. 4 / Les homologues inférieurs caractérisés en ce qu'ils dérivent des deux polypeptides des revendications 2 et 3.