FR 2104920 A1 19720428 FR 7032284 A 19700904 La présente invention concerne un nouveau procédé de culture des microrganismes Protocaryotes et Thallophytes. Une des caractéristiques fondamentales du procédé consiste à réaliser des substrats composés de produits, dont les mélanges, (en proportions définies) sont actifs, entre des seuils critiques, et capables, en particulier, d'augmenter le gradient d'activité des facteurs de replication et de contrôle métabolique, tout spécialement au niveau des chaînes Nucléotides porteuses et transmettrices de messages ; et, ce, dans les classes des microrganismes Frotocaryotes, Thallophytes et Paticicellulaires. La variance (entre de faibles limites) des proportions des composants du substrat selon l'invention, permet d'influencer préférentiellement : ou la pullulation, ou les facteurs de croissance et de métabolisme. Ce procédé étant avantageux, non seulement, pour ltobtention des souches, mais pour l'obtention industrielle de métabolites enzymatiques diffusibles ou extractifs, ce même substrat permet d'activer les levains et peut aussi être ajouté, de nouveau, aux levains pour accélérer les transformations enzymatiques dans les industries de Panification, Laiterie, Brasserie, Vinification, et toutes transformations enzymatiques réclamées par les industries Pharmaceutiques ou chimiques. Dans la demande de Brevet N 69-30-874 déposée le 11-9-69 le titulaire a décrit un procédé de culture de Thallophytes caractérisé en ce que la pousse des microrganismes est réalisée sur une liqueur nutritive comprenant : d'une part, à raison de 0,001 à 0,2 s en poids ( par rapport à ladite liqueur) d'un mélange constitué d'au moins les enzymes 1-6 glucosidase, lthexokinase, l'alpha et beta amylases et de Phosphorylases associées à au moins de la D*L. Ir,éthionbne et de l'acide ascorbique; et d'autre part, à raison de 0,0005 à 0,05f en poids (de ladite liqueur) d'oligoéléments se comportant comme coenzymes.L'ensemble ajouté (quelle que soit l'espèce cultivée envisagée) à son milieu de culture classique, ce qui avait permis au titulaire d'obtenir des populations (bactériennes ou levurières) de l'ordre de 106 à 108'5 germes par cm3. Alors que les techniques antérieures de culture donnaient (toutes choses égales, par ailleurs) des populations de 104 à 7 germes cm3. Le Brevet 69-30-874 reposait sur des expériences qui faisaient apparattre que, l'adjonction simple -de D.L. méthionine aux milieux de culture classique 10) augmentait nettement le métabolisme général des mycobactéries : ainsi, la méthionine se révélait facteur de croissance 20) augmentait légèrement les taux de pullulation dans le cadre des températures et PH habituels à chaque type fermentaire ; La méthionine apparait comme facteur favorable aux mitoses. C'est alors que fut poursuivie une série d'expériences pour tenter de cerner les conditions optimales, dans lesquelles, la méthionine ; d'autres amino-acides ; diverses enzymes extraites, en particulier, de céréales su d'autolysats bactériens ou de thallophytes divers ; ainsi que des milieux électrolytiques variés, pourraient être plus ouAoins actifs sur la croissance, le métabolisme et la multiplication des microrganismes Proto caryotres, Thallophytes et mycplasmes (ceux-ci cultivés sur cellules elles-mêmes activées par le milieu + méthionine)0 PREIEFLE SURIS EXPERIkENTALE A notre surprise, les conditions dans lesquelles nous avons apporté la méthionine a permis de mettre en évidence 10) que la méthionine DD ou D ou X, à condition d'être pure, est 2 à 10 fois plus active que toute méthionine d'extraction (encore liée à. des peptides). 20) que la méthionine pure répondait au-codon spécifique de séquence AUG (des ARN de transfert et de message) et se révélait le seul initiateur impératif des premières formations de séquence desdits AEX. malgré la durée de culture, la méthionine ne s'épuisait pratiquement pas et apparaissait comme catalyseur et se comportait comme facteur de réPlication. 3 ) Par contre, si à cette méthionine on ajoutait le surnageat de broyats de cellules, la méthionine se plaçait comme ler amino-acide des channes polypeptidiques et accélérait le processus métabolique et de la croissance. 40) La N-Formyl-éthionine se révélait aussi facteur d'accélération du métabolisme et de la croissance, et non de la pullulation. DEUXIEME SERIE EXPERIMENTALE 10) Lorsque la méthionine se trouve associée aux électrolytes, selon le Brevet 69-30-874, l'activité métabolique est accrue de 20 à 30%. 20) Mais si l'on ajoute 0,5 à 5 ppm de magnésium et 0,05 à 0,1 ppm de lithium : l'activité s'accroît de 30 à 40%. LA TROISIEME SERIE t'EXPERIENCES montrait que l'adjonction d'autres amino-acides était sans grande influence, sauf la Tryptophane (correspondant aux codons UGG et UGA) et la valine (correspondant aux codons GUU ; GUC ; GUA ; GUG.) qui accéléraient les métabolismes et la croissance. ( Probablement en facilitant l'apparition de fin de séquences UAA UAG). LA QUÂTRIEME SERIE I) 'EXPERIENCES était destinée à rechercher l'influence du degré d'hydratation des ARS et DNA (de façon à connattre les seuils critiques optima). Selon les degrés d'hydratation : D.H. voici les résultats obtenus : UH 4596 45% ) Les chaînes APN ont une structure désordonnée, ) incompatible avec la vie, 45 ) stable, des chaînes. flH ) compatible avec la vie. Puis, brusquement seuil critique : 65% ) hyperactivité métabolique ) avec division des chaises ) réplication intense, la situation s'effectuant à 20 moles d'eau par Nucléotide. CINQUIEME SERIE EXPERIMENTALE qui devait permettre d'apprécier l'action des Electrolytes, selon le Brevet 69-30-874, et l'action éventuelle d'autres Electrolytes ; il en résulte que l'action favorable de transfert des liaisons Hydrogène se situe toujours entre PH 4,8 et PH 6,8. Le cation NA est indispensable à la stabilité de l'hélice ARN. l'activité est préférentielle lors de la présence d'ions Kg+ et li. LA SIXIE SERIE D'EXPERIENCES devait déterminer les marges critiques de conductivité de l'eau en fonction des électrolytes et de la température. On constate entre 100 et 700 : 10) que la courbe de conduetivité est linéaire, avec Eau + NaCl. 20) Par contre, elle devient poissonnienne avec le composé électrolytique, selon le Brevet 69-30-874, avec brusque accroissement entre 200 et 300. 30) Cette courbe est encore améliorée entre 20 et 450, si l'on ajoute à ce composé électrolytique les ions kg++ et Li, selon le présent Brevet. Ces six premières séries d'exemples expérimentaux de préparation du milieu, selon l'invention, permettaient de déterminer les paramètres physico-biologiques d'action de la méthionine DL et de la N-formyl-méthionine ainsi que les marges critiques optimales des électrolytes (selon le Brevet 69-3C-874 auxquels on avait ajouté ils++ et Li). C'EST A LA SEPTILME SERIE aXPERIh"2NTALE qu'il appartenait de déterminer la composition du milieu nutritif destiné à compléter le composé selon la présente invention. 10) I1 fallait apporter un capital de nutriments équilibrés, non détériorés (donc actifs) et d'obtenir cet apport par des moyens suffisamment simples et peu onéreux pour être industrialisables. 20) L'objectif étant d'obtenir le meilleur Anabolisme et le maximum de mitoses des Protocaryotes ou Thallophytes mis en culture et fournissant à ces cultures des nutriments qui n'obligent pas les microrganismes à consacrer trop d'énergie aux Désynthèses, et trop peu, aux synthèses. 30) Ce milieu-nutriment devant conserver un maximum d'enzymes Synthétases et de complexes E.T.P. Phosphorylants. 40) Les cultures selon l'invention devant servir particulièrement aux fermentations de produits végétaux cérdaliens, (très riches en robustes Polymères glucido-saccharidiques) et aux produits lactés riches en Polypeptides (castine). Les multiples essais de la septième série expérimentale ont permis de résoudre ces quatre impératifs sus visés, en mélangeant les surnageats extraits centrifugés de cellules éclatées des espèces ci-après définies, selon les proportions ci-après énoncées 10) Cellules de levures et de lactobacillus éclatées (préférentiellement par ultra-sons); centrifugations; on recueille le surnageat qui, déshydraté, repré- sentera 196 à 2S, en poids, du mélange final de surna geats. 2 ) Graines de céréales prégermées, éclatées, centrifu gées, incorporation du surnageat (78à85). 30) Amandes et fèves ayant subi le même traitement, sur nageat 1 et 4 > . 40) Farine de pomme de terre, même préparation, surna geat 4 à 696. 50) Caséine de laits préalablement fermentés, 5 à 9S, en poids, de l'ensemble des surnageats. Ces 5 surnageats sont mélangés après avoir été séparément déshydratés ; ils forment une poudre sèche, hydrosoluble qui sera introduite dans le composé Amino-Acide, vitaminique, électrolytique déjà décrit. Ce mélange de surnageats contient des Ribosomes et des kitocondries des cellules éclatées sus décrites.Ce mélange sec de surnageats entrant dans la composition du composé selon l'invention sera appelé, dans la suite du texte de ce Brevet (et pour simplification) : Surnageant Enzymo-Protéique sec, il contient des Hydrolases ; Transférases ; des Oxydoréductases; Cytases ; Phosphorjlases ;Kinases ; ainsi que les indispensables transporteurs d'hydrogène et d'électrons les Di et Triphosphopyridines appelées DPN et TPNH ( ou bien selon la nouvelle nomenclature) NAD et NADP, Pyrophosphorées ainsi que de Ribosomes et de lkitocondries qui vont avoir une influence déterminante sur l'activation souhaitée, selon l'in- vention, sur les codes de transfert et de message des microrganismes dont on veut, selon l'invention, accroStre les capacités de métabolisme et de réplication. Les formules générales selon l'invention seront les suivantes - Formule A préférentielle pour la croissance, - Formule B préférentielle pour la réplication, chacune des formules A et B ayant cependant simultanément pouvoirs de réplication et de croissance. A - méthionine DL ................ 2 gr. à 5 gr. - générateur de N-Formyl-\éthionine ................ 2 gr zéro - Tryptophane ................ 2 gr 2 gr - Valine ................ 0,5gr 3 gr - milieu électrolytique ................ 5 gr 10 gr (selon Brevet 69-30-874 (+ Magnésium ................ 0,05gr G,02gr (+ Lithium ................ 0,005gr O, lgr - Surnageat Enzymo-Vitaminique sec ................ 10 gr 15 gr - Alpha Amylase e . 2 gr 3 gr - Bêta Amylase C,3gr 1 gr - Acide Ascorbique 1 gr 0,5gr 24,855gr. 39,62gr. Ainsi, selon les buts recherchés, ces formules vont pouvoir être ajoutées aux milieux classiques, dans quatre circonstances générales très différentes : a) Soit pour obtenir des souches robustes, actives, à savoir une dose de 20 à 30gr. de la formule B pour 100 litres de bouillon de culture ou 50gr. de la formule A selon le but poursuivi. b) Pour obtenir des levains on ajoute à nouveau la formule A 50gr. ou la formule B 40gr. à 100kg. de pâte à levain selon le but recherché (croissance ou réplication). c) Si lton veut fermenter, grâce au levain, une pâte de panification ou une infusion de brasserie, on ajoute pour la 3ème fois le composé selon l'invention mais à raison de 15gr. à 20gr. pour 100kg. de pâte à pain, ou 20 à 60gr. pour l00litres d'infusion de céréales de brasserie. Le fait qu'en présence du composé les pâtes subissent aussitôt l'attaque enzymatique en des points où les germes ne sont pas encore répandus prouve la puissance de diffusion du composé selon l'invention0 d) Dans le cas industriel où lton veut réaliser une fermentation très poussée qui est destinée à recueill-ir des enzymes (d'extraction ou de diffusion), en somme, dans les cas où l'ob- tention d'enzymes est le but industriel recherché, on pourra, selon les cas, utiliser des doses de 3 à 5 fois supérieures pour 100kg. de produit base à traiter. Ainsi l'invention consiste à réunir en un composé (ne conprenant aucune substance de synthèse, ni de substances toxiques à l'échelon animal, végétal ou humain) les matières stimulant croissance et réplication des petits organismes protocaryotes et thallophytes dont ùne multitude d'espèces sont utilisées de plus en plus pour obtenir des fermentations contrôlées industrielles, le composé étant établi en fonction des paramètres physiques biologiques ; enzymatiques correspondant à une optimalisation des rendements en croissance et réplication, et aussi, en production enzymatique active sur le milieu environnant à traiter, Le composé, selon l'invention, du fait qu'il est toujours associé à des germes vivants, peut hêtre successivement réintroduit comme stimulateur en compositions et proportions analogues aux 4 étapes essentielles utilisables : souches, levains, milieux sur levains et milieux d'obtention d'enzymes d'extraction ou de diffusion. les applications industrielles concernent - les industries créant ou entretenant des souches, - les industries pharmaceutiques produisant des bouillons de culture pour réalisations d'antibiotiques, de vaccins, de médi caments pouvant influer sur l'équilibre de la flore intestinale ou sur l'améloration de la digestion, ou encore la production d'aliments prédigérés diététiques. - les industries produisant des levures ou levains destinés à Brasserie, panification, vinification, produits laitiés fermen tés. - les industries incorporant les déchets de levain aux engrais biologiques, - les industries de boulangerie, de fabrication de yaourts, les brasseries. - les industries chimiques ayant besoin de produire ou d'utiliser de grandes quantités d'enzymes nécessaires à la tannerie ou à la synthèse de certains plastiques ou la fabrication de tous produits de synthèse où l'usage d'enzymes est préférable à tous catalyseurs chimiques. I1 s'avère nue le Drix de revient du composé selon l'in vent ion est souvent bien moins élevé etrpTus actir que tout système industriel destiné à obtenir par d'autres voies unzésultat approché. Dans de nombreux cas dont celui des enzymes de catalyse aucun système connu n'est actuellement comparable0 Ce composé ne comporte aucune substance nuisible à la vie cellulaire, aucune substance de synthèse, aucune substance non biodégradable. REVENDICATIONS Produit composé caractérisé a) en ce que son adjonction à doses infimes ( 50 à lOOppm) aux milieux habituels de culture des Protocaryotes et Thallophytes est nécessaire et suffisante, b) pour déclancher une hyperactivité des facteurs de croissance, réplication, mitose de ces microrganismes, c) par impact sur les médiateurs de transfert et message (ARN-DNA), grâce au codon spécifique AUG et accessoirement par les codons UGG ; UGA ; d'une part, et les codons GUU GUA ; GUC et GUG d'autre part. 2/ Selon 1, les propriétés du produit sont impérati vement liées aux composants et à leur procédé de préparation. La composition est caractérisée par la coprésence, en proportions définies 10) d'électrolytes et oligo-éléments choisis comme co-enzymes, selon le Brevet 69-30-874 du titulaire, auxquels on ajoute Mg++et Li, 20) de Dl méthionine ; N-Formyl-Méthionine ; Tryptophane ; Valine, 30) de mélangeS en proportions définies, de surnageats de centrifugation rapide de cellules éclatées de levures ; graines de céréales prégermées ; fèves ; amandes ; farine de pomme de terre ; caséine de lait préfermenté au lactobacillus et contenant Polysomes et mitochondries des cellules précitées, choisies pour leur concentration en enzymes du groupe synthétases et phosphorylantes. 3/- Selon les revendications 1 et 2, les propriétés du milieu électrolytes - oligo-éléments ; Mg et Li ; sont caractérisées a) en ce qu'elles favorisent l'action de DL méthionine, en tant qu'initiateur impératif des premières séquences nucléotides amino-acides, à savoir facteur de réplication et mitose b) favorisent l'action de N-Formyl-éthionine ou ses générateurs par accélération des synthèses amino-acides et enzymes, à savoir facteur de croissance c) ces avantages étant déterminés en ce que les électrolytes permettent de fixer le degré optimal d'hydratation des chaînes nucléotides, la bonne structuration des hélices nucléotides et la conductivité optimale de l'eau aux températures de 180 à 420, enfin parce qu'elles favorisent les molécules de transport d'hydrogène et d'électrons, entre PH 4,8 et 6,8. 4 - Selon les revendications 1,2 et 3, La fraction du composé "mélange de surnageats de centrifugation de cellules éclatées" est caractérisée a) par la prédominance des enzymes du groupe synth6- tase et anabolisant favorables à la croissance et la réplication; b) la coprésence d'enzymes E.T.P. phosphorylantes, de D.P.N. et T.P.N.H, caractérisent la facilité donnée ainsi, aux germes en culture, pour effectuer l'immédiate utilisation des amino-acides formés dans ce milieu pour augmenter, la croissance; la réplication ; la mitose0 c) L'ensemble de ces enzymes démontre son pouvoir extrême de diffusion dans la masse des "substrat-nutriments" qui sont ainsi déjà enzymatiquement attaqués, à longue distance des foyers de bactéries de culture : propriété qui prépare le métabolisme des protocaryotes ettallophytes à leur croissance et leur pouvoir de pullulatign. 54Selon les revendications 1, X, 3, 4, La présence de kinases, amylases et acides ascorbique tient à la nécessité de disposer d'enzymes agissant sur les milieux à fermentation industrielle et qui sont essentiellement végétaux : farines ; levains ; infusions, et mouts de brasserie ; industries de la cellulose ; engrais ; vinification. Les caséines de laits préfermentés agissant préférentiellement en laiterie, fromagerie, tannerie. L'ensemble étant efficace globalement lors qu'il s'agit d'épuiser, à fond, un substrat, pour en extraire le maximum de produits enzymatiques destinés, par exemple, à la catalyse ou la synthèse chimique, i/- SelQn les revendications 1, 2,3,4,5, Le composé, tel qu'il est défini, présente l'avantage de pouvoir être indépendamment et successivement réintroduit au cours des 4 opérations fondamentales suivantes 10) aux taux de 5 à 200 ppm, dans les milieux habituels destinés à produire des souches 20) réintroduit avec la souche aux doses de 50 à lOOppm, pour les pâtes, motets ou infusions destinés à former des levains; 30) réintroduit à dose de 20 à 300 ppm avec le levain dans les pâtes ou moûts , solutions applicables aux boulangeries, brasseries, laiteries;; 40) réintroduit enfin à dose de 100 à 600 ou 800ppm dans les substrats que l'on veut épuiser,par fermentation, pour obtenir uniquement les enzymes à destinde industrielle (enzymes de diffusion ou d'extraction). 7/- Selon les revendications 1 à 6, Le produit,composé selon l'invention, est caractérisé par le fait que ses formules A et B sont toutes deux valables pour accroître les gradients de réplication ; mitose ; croissance; métabolisme. La formule A préférentielle, efficace, dans le domaine métabolisme et croissance. la formule B préférentielle pour favoriser réplication des channes nucléotides et mitose. L'une et l'autre formules utilisables selon le but de l'utilisation, aussi bien dans les technologies fondamentales de création de souches ; création de levains ; fermentation de substrats sur levains ; fermentation pour extraction d'enzymes0 Du fait que certaines souches sont préférentiellement plus actives, selon qu'elles pullulent mieux ou qu'elles croissent et assimilent mieux. 8 - Selon les revendications 1 à 7 Le produit est caractérisé par son action avanta geuse' dans les industries concernées par les problèmes fermentaires, soit pour obtenir des souches, soit pour relancer les souches dans des substrats, soit pour extraire des substrats fermentés, des métabolites en majorité enzymatiques et catalytiques. Dans les industries pharmaceutiques pour obtenir antibiotiques et ferments. Dans les industries alimentaires et diététiques pour obtenir des aliments facilement assimilables (parce que le procédé leur a permis de bénéficier d'une prédigestion nUméta- bolique, enzymatique). exemples ; boulangerie, levurerie, laiterie, vinification, brasserie. Dans les industries de productioIs enzymatiques destinées aux catalyses et synthèses (tannerie, détersifs, plastiques). Dans les industries concernées par les coversions d'énergie : piles biologiques ; paracondusteurs ; systèmes intégrateurs ; transduction des signaux. Sont bien entendu revendiqués les produits ayant des caractères nouveaux dépendant de la nécessité d'utiliser le composé selon l'invention, ou bien, ses procédés d'obtention, pour réaliser des substances polymérisées, dépolymérisées ou catalysées par le composé définé par l'invention0 9 - Selon les revendications 1 à 8, composé est caractérisé en ce qu'il - est exempt de substances nuisibles à la vie cellulaire, - est exempt de produits artificiels (synthèses non biochimiques), - exempt de toutes substances non biodégradables.