FR 2094175 A1 19720204 FR 7029723 A 19700812 L'invention concerne des peptides synthétiques dotés d'une remarquable activité dans le domaine de la chimiothérapie pour la lutte contre des tumeurs, et elle concerne également des modes opératoires pour la préparation des peptides en question. En vue de réaliser une inhibition de la croissance de tumeurs aussi bien sur des êtres humains que sur d'autres animaux, des recherches approfondies se poursuivent dans de nombreux laboratoires depuis des années pour mettre au point des composés chimiques et d'autres substances actives. Bien que l'on ait enregistré quelques succès partiels à la suite de telles recherches, des tumeurs continuent à résister à la plupart des traitements connus jusqu a ce jour. On a découvert, à la suite de recherches ayant abouti à la mise au point de l'invention, que certains peptides synthétiques dont les molécules comportent certaines successions d'aminoacides possèdent une efficacité surprenante quand on les utilise pour le traitement de tumeurs. Conformément à l'invention, on a mis au point des peptides synthétiques correspondant à la formule générale suivante On a découvert que des mélanges de composés compris dans la pon tée de la formule générale ci-dessus possèdent un haut degré d'efficacité. La formule générale indiquée ci-dessus représente une molécule de m-di(2-chloroéthyl)amino-phényl-l-alanine liée par au moins une liaison peptide à au moins un aminoacide défini dans les formules spécifiées. La (ou les) liaison(s) peptide est (ou sont) alors réalisée(s) au niveau du radical amino et/ou du radical carboxyle. les conditions fondamentales sont les suivantes 1) les aminoacides unitaires, utilisés pour la synthèse d'un peptide et incorporés à la structure peptidique, m-di(2 chloroéthyl)amino-phénylalanine incluse, doivent posséder la configuration L 2) les successions peptidiques bien définies suivantes se trouvent établies a) l-prolyl . m-di ( 2-chloro éthyl) amino-phényl-l-alanine b) N,#[m-di(2-chloroéthyl)amino-phényl-L-alanyl]-L-lysine c) m-di ( 2-chloro éthyl) -amino-ph ényl-l-alanyl-L-asparagine d) p.fluoro.L-phénylalanyl-glycyl-m-di(2-chloroéthyl)- amino-phényl-L-alanyl-L-norvaline e) m-di-2-chloro éthyl) -amino-phényl-l-alanyl .l-arginyl-L-lysyl- m-di(2-chloroéthyl)-amino-phényl-L-alanyl-L-histidine. Les substances en question sont obtenues, selon l'invention, par mise en oeuvre des techniques utilisées pour la préparation des peptides, par exemple en réalisant la condensation entre le radical carboxyle d'un des aminoacides composants et le radical amino d'un autre aminoacide estérifié, en présence de dicyclohexylcarbodiinide. On peut aussi recourir à des méthodes utilisant des azides et des anhydrides N-carboxyliques Pour protéger sélectivement les radicaux fonctionnels amino, il ce comvient que le radical amino lui-mdme ait été acylé avec de l'acide formique ou avec un chlorure de carbobenzoxyle et, dans quelques cas, ait été alcoylé avec du chlorure de trityle. Les radicaux carboxyle scat protégés par estérification avec des esters de méthyle, d'éthyle, d'hexyle ou de benzyle. Finalement, les groupes de blocage sont complètement ou partiellement éliminés par hydrogénolyse catalytique, par action d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial ou d'acide chlorhydrique dans de l'éthanol, et enfin par saponification. On effectue une analyse élémentaire des composés unitaires ; des atomes de chlore liés par des liaisons covalentes et ioniques (comme dans des chlorhydrates) sont dosés séparément. Le degré de pureté des produits ainsi obtenus est déterminé par chromatographie en couche mince sur silicagel G aussi bien que par une mesure de l'activité optique. Diverses modalités de mise en oeuvre de l'invention sont mieux décrites et plus faciles à comprendre gracie aux exemples suivants qui bien entendu ne sont pas limitatifs de la portée de l'invention. Plus de 300 peptides (en plus de ceux spécifiquement décrits ici) ont été préparés et tous essayés expérimentalement pour déterminer leur activité chimiothéraneutique par mise en oeuvre des modes opératoires recommandés par le C.C.N.S.C. (Cancer Chemotherapy, National Service Center, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Canoer Chemotherapy, Report n 25, décembre 1962) en se servant, comme tumeurs d'épreuve, soit de sarcomes 180, soit d'adénocarcinomes 755. La seule variante consiste en ce que la détermination du poids de tumeurs sur des souris traitées par les substances à essayer et sur des animaux-témoins est effectuée un jour après le délai prescrit par le C.C.N.S.C. ; on a choisi ce mode opératoire parce qu'il permet l'évaluation des leucocytes au cours du jour précédent, en - de la détermination de l'hémotoxicité.Dans chaque expérience, on utilise un étalon de m-di(2-chloroéthyl)-aminophényl-L-alanine à quatre doses en progression géométrique, et chaque composé est lui aussi administré à quatre doses correspondant à la teneur du compo e en question en m-di(2-chloroéthyl)-aminophényl-L-alanine. Cons sérant l'intensité d'action par comparaison avec colle de la m-di(@ chloroéthyl,-aminophényl-m-alanine, tons les paptides sinsi prépar e classent en trois catt (a) peptides dont l'efiet, sur le modèle expérimental examiné est superieur à comme de doses équimoléculaires de i-di(2 chroroéthyl)-@@@@ @vl-l-alanine;; (b) peptides dont l'effet est gal à celui de la m-di(2-chloro éthyl)-aminophényl-L-alanine (c) peptides dont l'effet est inférieur à celui de la m-di(2 chloroéthyl)-aminophényl-L-alanine. Les recherches chimiothérapeutiques prouvent que, parmi la catégorie sus-mentionnée (a) de peptides, cinq peptides manifestent des résultats supérieurs au cours de l'expérimentation pharmacologique et les possibilités les plus prometteuses d'applications thérapeutiques en vue du traitement de la maladie néoplastique dans l'espèce humaine. Ce sont des peptides compris dans la portée de l'invention. Ci-après sont donnés différents exemples, bien entendu non limitatifs, illustrant des modes opératoires pour la préparation de cinq peptides compris dans la portée de la présente invention. Exemple I. Dichlorhydrate de l'ester éthylique de la L-prolyl-m pdi-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalaine (B). A une solution chloroformique (300 ml) contenant 40 g (0,12 mole) d'ester éthylique de la m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylala- nine, on ajoute 29,9 g (0,12 mole) de W-carbobenzoxy-L-proXine dissons dans 60 ml de chloroforme, puis 27 g (0,13 mole) de dicyclohexylcarbodiimide. On laisse réagir la solution résultante pendant trois heures à la température ambiante ordinaire (environ 200O) tout en l'agitant. On sépare par filtration et on rejette 14 g de dicy clohexylurée qui se sont formés. On concentre la solution sous vide jusqu'à évaporation complète du solvant. On fait passer le résidu huileux résultant sur une colonne contenant du silicagel G et on procède à une élution avec un mélange chloroforme:acétone (9:1).Le produit purifié, qui est de l'ester éthylique de la N-carbobenzoxy- L-prolyl-m-[di-(2-chloroéthyl) aminoj -1-phénylalanine, (A), se trouve initialement sous la forme d'une huile qui se solidifie après repos sous de l'éther de pétrole. Rendement : 45,9 g. Elimination du ~u~r~dic~l carbobenzoxz : 20 g de (A) dissous par chauffage - à environ 500C - dans 200 ml d'éthanol à 5 % dans HCl sont hydrogénés en présence de 2 g de charbon palladié et 300 mg de Fd. La réduction est terminée après 10 heures à 500C. L'addition de petites quantités de catalyseur de temps en temps est nécessaire pour éviter que le dégagement de C02 cesse. On suit la progression de la réaction d'après le dégagement de C02 et, en même temps, par chromatographie en utilisant du silicagel G et un mélange solvant butanol acide acétique:eau 4:1:5. La détection s'effectue à ltaide de en milieu acide. Après la fin de la réduction, filtration sur amia. te, précipitation du filtrat avec de l'éther anhydre, dissolution du précipité dans une petite quantité d'éthanol, on obtient 14,6 g d'un produit hygroscopique que l'on sèche dans un dessiccateur sous vide, sur P205 et NaOH. Lors de la détermination du point de fusion (P.F.} on observe que le produit se décompose au-dessus de 650C. Le produit a un indice de réfraction [&alpha;]19 = -12,5 (c = 2 ; éthanol absolu). Ie produit (B) est identifié au cours de la présente description comme étant le Produit 48/13. Exemple II. Trichlorhydrate de l'ester éthylique de la NE (2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl}-L-lysine. On forme de l'ester éthylique de la N#-{N-carbobenzoxy-m-[di (2-chloroéthyl)amino]=L-phénylalanyl}-N&alpha;-formyl-L-lysine (A) en opérant de la manière décrite ci-après. On ajoute, tout en agitant, 12,4 ml de tributylamine à une solution de 22 g de N-carbobenzoxy-M- [di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanine dans 200 ml de chloroforme, cette solution étant refroidie jusqu'à 0 C. On ajoute ensuite, goutte à goutte, 6,9 ml de chlorocarbonate d'isobutyle ; la solution ainsi obtenue est conservée trois heures à 0 C en l'agitant.On y ajoute ensuite 100 ml d'une solution chloroformique contenant 10,1 g (0,05 mole) d'ester éthylique de la N&alpha;-formyl-L-lysine Après deux heures à 50C, la solution résultante est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium, puis évaporée sous vide jusqu'à élimination complète du solvant. Le rendement en (A) est de 20,5 g ; 20 = +12,9 g (c = 2 ; CHCî3). On forme ensuite de l'ester éthylique de la N#-{m-[di-(2-chlo- rcéthyl)amino]-L-phénylalanyl}-N&alpha;-formyl-L-lysine (II). On ajoute 2 g de charbon palladié à 5 % à une suspension de 20,5 g de composé (I) à 200 ml d'éthanol absolu. La suspension résultante est hydrogénie jusqu'à cessation de dégagement de C02 (20 heures). La solution que l'on obtient est filtrée pour en séparer le charbon palladié, après quoi on chasse le solvant à partir du filtrat ; on recueils le ainsi un produit huileux (B). On forme ensuite du trichlorhydrate de l'ester éthylique de la N#-{m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl}-L-lysine. La substance huileuse (B) est reprise dans 200 mi de HCl à 5 % dans de 1' éthanol absolu ; on laisse reposer environ 18 heures à la température ambiante ordinaire (environ 200C). Après évaporation du solvant sous vide, le résidu est repris avec de l'éther éthylique anhydre, après quoi on évapore l'éther. Le rendement en produit (C) est de 17,7 g ; [&alpha;]20D = 425 (c = 2 ; N/10 HCl dans de l'éthanol). Le produit reçoit la dénomination de "Produit 48/15". Exemple III. - Acétate de m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl L-asparagine (B). On prépare de l'ester benzylique de N-carbobenzoxy-m-[di-92 chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-asparagine (A). On prépare de l'ester benzylique de N-trityl-L-asparagine par mise en oeuvre de la méthode de Amiard et Heymes (Bull. Soc. Chim. France, 1373 (1957)). On utilise de l'ester dibenzylique de l'acide N-trityl-L-aspartique (Velluz et al., Bull. Soc. Chie. France, 1464 (1956)) qui est ultérieurement transformé en N-trityl-L-aspartate d' a-benzyl e par hydrolyse partielle avec une quantité stoechiométrique d'hydroxyde de potassium 1 N (selon la méthode d'Amiard et Heymes dont la référence bibliographique est donnée ci-dessus). Ce dernier composé est converti en N-trityl-L-asparagine par l'action d'ammoniac et de dicyclohexylcarbodiimide. Une solution bouillante de 33,3 g de N-trityl-L-asparaginate de dibenzyle (Velluz et al.) dans 180 ml de dioxanne et 30 ml d'eau est traitée lentement, pendant 30 minutes, par 66 ml de KOH 1 N, après quoi on chauffe le mélange 15 minutes à reflux, on chasse le dioxanne sous vide, on dilue le résidu avec de l'eau, on acidifie avec 70 ml de HCl 1 N, on extrait par CH2Cl2, on lave les extraits organiques à l'eau, puis on les sèche, on concentre jusqu'à 100 ml, on traite par un courant de Nn3 jusqu'à pH 8-9, on traite par 16 g de dicyclohesylcarbodiimlde, on maintient à pH 8-9 avec un lent courant de NH3 pendant deux heu res, on filtre, on évapore sous vide à 300C, et on reprend le résidu par du méthanol pour obtenir 12 g d'ester benzylique de la N-trityl L-asparagine. On effectue une détritylation à l'aide d'acide chlorhydrique éthanolique. Une suspension de 20,3 g (43,8 millimoles) d' ester benzylique de la N-trityl-L-asparagine dans 44 ml de HCl m6tha- nolique I N est chauffée deux minutes dans de l'eau en agitant. On élimine le solvant par évaporation soue pression réduite, après quoi le résidu est d'abord lavé avec de l'éther éthylique anhydre, puis est dissous dans 100-150 ml d'éthanol bouillant. La solution est refroidie et est diluée avec deux volumes d'éther éthylique anhydre. Après quelques heures à 40C, il se sépare un précipité cristallin blanc de chlorhydrate de l'ester benzylique de la L-asparagine. Ce précipité est recueilli sur un filtre, lavé avec de l'éther éthyli- que anhydre et séché sous vide dans un dessiccateur sur P205 et NaOH. Rendement 10,35 g (91 %), P.F 168-700C (décomp.) ;- analyse : N = 10,75 g (calc. 10,83), Cl = 13,7 % (calc. 13,7). Par chromatographie, on obtient le produit sous forme d'une substance homogène. Une suspension froide de 10,35 g de chlorhydrate d'ester benzylique de L-asparagine dans 40 ml d'eau contenant 4,2 g de carbonate de sodium est extraite cinq fois avec des fractions de 150 ml de di chlorométhane froid. Les extraits organiques sont réunis, séchés sur Na2SO4 et évaporés sous ride jusqu'à 200 mi. Une partie aliquote de cette solution est titrée avec du perchlorate d'hydrogène dans de l' acide acétique glacial (violet cristallisé comme indicateur) afin d'é valuer la proportion de base libre (34,4 mole ;; 86 ). Cette solution est ensuite réfrigérée jusqu'à -10 C et on y ajoute, tout en agitant, 15,2 g de N-carbobeazoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phényl alanine, puis 7,9 g de N,N'-dicyolohexylcarbodiimide. On continue à agiter à 0 C pendant cinq heures, au cours desquelles il se forme une masse gélatineuse. On dilue cette masse avec deux volumes de dichlorométhane et on chauffe jusqu'au point d'ébullition. La dicyclohexylurée qui se forme est séparée par filtration, puis on évapore le filtrat à sec. Deux recristallisations du résidu à partir d'éthanol donnent 16,7 g (75 ) d'un produit blanc, (A), P.F. 140-420C, [&alpha;]20D= +19,40 (c = 2, chloroforme).Analyse : pour C32H36Cl2N406 : trouvé N 8,70, Cl 11,2 % ; calculé : N 8,71, Cl 11,0 %. On prépare ensuite de l'acétate de m-tdi-(2-chloroéthyl)amino3- L-phénylalanyl-L-asparagime (B). A un mélange de 240 ml de méthanol et 12 ml d'acide acétique glacial, on ajoute 4,5 g d'ester bonzylique de la N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L asparagine (A) et 1,3 g dr charbon palladié à 5 U/o. On soumet le m lange au passage d'un courant d'hydrogène à la température ambiante ordinaire. Après la fin de l'hydrogénolyse, ce qu'indique la cessation du dégagement de COa (environ 4 heures), on sépare le catalyseur par filtration, et le filtrat légèrement coloré résultant est maintenu pendant une nuit Q 40C.Au cours de ce temps, l'impureté celorés se sépare, de sorte que l'on obtient une solution limpide @@ filtration sur amiante. Te filtrat est concentré jusqu'à 30 ml sous v(de,à une température d'exeédant pas 35 C, et la solution résiduelle est lentement diluée, en agitant continuellement, avec de l'éther jusqu'à obtention d'un trouble persistant. Par repos à froid, il se forme un précipité cristallin blanc (B), identifié aussi comme étant le Produit 48/22, que l'on recueille sur un filtre, lave à l'éther -t sèche dans un dessiccateur sur P205. Rendement 2,6 g (77 ) P.F. 126-7 C ; [&alpha;]20D = +28,4 (c-2 ; HCl 1 N).Chromatographie en couche mine (silicagel G de Merck ; BuOH:EtOH:H2O:EtCOOH 10:5:5:2) on ne décèle qu'une seule tache à l'aide d'une solution diluée de XMnO4. Analyse : trouvé N 11,76, Cl 14,7 % ; calculé pour C19H28Cl2NO6: N 11,69, Cl 14,8%. Il est intéressant de consulter l'ouvrage de Greenstein et Winitz : Chemistry of the Amino Acids" (chimie des aminoacides), J. Wiley & Sons, New York, 1234 (1961). Exemple lV.- Trichlorhydrate de l'ester éthylique de la p-fluoro l'-phénylalanyl-glycyl-m- di- ( 2-chloro éthyl) aminoJ - L-phénylalanyl-L-norvaline. (F). On forme l'ester éthylique de la N-carboxy-m-[di-(2-chloroéthyl) amino]-L-phénylalanyl-L-norvaline (A). 20,6 g (0,1 mole) de dicyclo- hexylcarbodiimide dans 50 ml de chloroforme sont ajoutés à une solution contenant 14,5 g (0,1 mole) d'ester éthylique de la L-norvaline et 43,90 g (0,1 mole) de N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]- L-phénylalanine dans 150 ml de chloroforme à 20 C. Après trois heures, de la dicyclohexylurée qui s'est formée est éliminée par filtra tion, puis on évapore le solvant jusqu a son élimination complète à partir du filtrat. On reprend le résidu avec de l'éther éthylique anhydre ; on évapore ensuite l'éther. Le rendement en (A) est de 50 g. Elimination du radical carbobenzoxy : On traite 50 g de produit (A), en agitant, par 100 ml d'une solution saturée d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique ; on maintient l'agitation pendant trois heures à la température ambiante ordinaire (environ 200 C). On rend ultérieurement le bromhydrate insoluble en versant la solution dans de l'éther éthylique anhydre. On obtient la base en dissolvant le bromhydrate dans de l'eau, en neutralisant la solution avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis en procédant à une extraction de la base à l'aide de chloroforme (200 ml). La solution chloroformique, titrée à l'aide d'acide perchlorique dans de l'acide acétique, contient 0,075 mole de dipeptide (B). On prépare de la manière suivante l'ester éthylique de la Ncarbobenzoxy-glycyl-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L norvaline (C). 15,5 g (0,075 mole) de dicyclohexylcarbodiimide dans 50 ml de chloroforme sont ajoutés, en agitant, à 200C, à 200 ml d'une solution chloroformique contenant 0,075 mole de dipeptide (B) et 15,7 g (0,075 mole) de N-carbobenzoxy-glycine. La réaction résultante dure pendant environ trois heures. Après élimination, par filtration, de la dicyclohexylurée qui s'est formée et qui s'est séparée de la solution résultante, on évapore le filtrat jusqu'à élimination complète du solvant. Le produit huileux (D) est repris avec de l'é- ther éthylique anhydre. Le rendement est de 45 g. Elimination du radical carbobenzoxy : On traite 40 g du produit (C) par 100 ml d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique et on maintient agité à la température ambiante ordinaire pendant trois heures. Ultérieurement, on rend le bromhydrate insoluble en versant la solution dans de l'éther éthylique anhydre. On obtient la base en dissolvant le bromhydrate dans de l'eau, en traitant par une solu tion saturée de bicarbonate de sodium, et en procédant à une extraction par du chloroforme (200 ml). La solution chloroformique est séchée sur sulfate de sodium puis titrée à l'aide d'acide perchlorique dans de l'acide acétique. Elle contient 0;05 mole de tripeptide (D). On prépare ensuite l'ester éthylique de la N-formyl-p-fluoro L-phénylalanyl-glycyl-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-Lnorvaline (E). Pour cela, 10,3 g (0,05 mole) de dicyclohexylcarbodiimide dans 100 ml de tétrahydrofuranne sont ajoutés, en agitant à la température ambiante ordinaire, à une solution contenant 0,05 mole de tripeptide (D) et 10,5 g (0,05 mole) de N-formyl-p-fluoro-L-phé- nylalanine dans 500 ml de tétrahydrofuranne. On poursuit la réaction pendant quatre heures. Après filtration et élimination de la di cyclohexylurée qui s'est formée, on évapore le filtrat et on reprend le résidu avec de l'éther éthylique anhydre. On évapore ensuite l'é- ther. Le rendement en produit (E) est de 25 g. Elimination du radical formule : On dissout 17 g de composé (E) dans 250 ml de HCl à 5 % dans de l'éthanol, et on laisse la solution reposer 18 heures à la température ambiante ordinaire. Le produit cristallise spontanément à partir de la solution. La filtration du produit s'effectue d'abord par lavage avec une petite quantité d'alcool froid, puis par lavage avec de l'éther éthylique anhydre. Le rendement en produit (F) ci-dessus, est de 15 g ; le produit est caractérisé par [&alpha;]20D = +39,6 (c = 1,5 ; HCl à 5 fio dans de l'éthanol). Ce produit est ci-après désigné par la dénomination : Produit 161/11. Exemple V.- Ester méthylique de la m-di-(2-chloroéthyl)amino3 -I~ phénylalanyl-L-arginyl-Llysyl-m- di- ( 2-chloro éthyl) ami- no]-L-phénylalanyl-L-histidine. Le produit su3-spécifié, auquel on a attribué aussi la dénomination Produit 210/B, est obtenu par copulation ou condensation des deux composés intermédiaires fondamentaux, le dipeptide et le tripeptide (Section D ci-après). L'exemple décrit dans la Section A con cerne la préparation du dipeptide partiellement protégé qu'est la N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-N#-nitro- L-arginine. L'exemple décrit dans la Section B concerne la réaction de copulation entre les di- et tri-peptides convenablement déprotégés pour aboutir au pentapeptide libre qu'est l'ester méthylique de la m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-lysyl-m Edi-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-histidine après élimination des groupes de blocage.L'exemple décrit dans la Section c concerne la préparation du tripeptide partiellement protégé qu'est l'ester méthylique de la N-#-carbobenzoxy-L-lysyl-m-[di-(2-chloroé- thyl)amino]-L-phénylalanyl-L-histidine. Section A : N-carbonbenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phényl alanyl-N#-nitro-L-arginine. Une solution de 44 g (0,1 mole) de N-carbobenzoxy-m-pdi-(2- chloroéthyl)amino]-L-phénylalanine et 23- g (0,1 mole) d'ester méthylique de N#-nitro-L-arginine dans 300 ml de chlorure de méthylène est ajoutée à une solution de 23 g (0,11 mole) de dicyclohexylcarbo diimide dans 300 ml de chlorure de méthylène. On agite le mélange pendant trois heures à la température ambiante ordinaire. Il s' est formé et séparé, à partir du mélange réactionnel, de la dicyclohexylurée que l'on recueille sur un filtre ; à partir du filtrat, on chasse le solvant par évaporation sous pression réduite. L'épais résidu huileux résultant est solidifié par traitement avec de l'éther éthylique, et est recristallisé à partir d'éthanol. Elimination du radical ester éthylique : On ajoute 11 ml (0,011 mole) d'une solution de NaOR 1 N à une solution de 6,5 g (0,01 mole) d'ester méthylique de N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L phénylalanyl-N#-nitro-L-arginine dans 30 ml de méthanol. On laisse la solution reposer 90 minutes à la température ambiante ordinaire. On la refroidit à l'aide d'un bain de glace, puis on neutralise l'hydroxyde de sodium avec 11 ml de HCl 1 N. Le liquide surnageant résultant est séparé par décantation. Le produit gommeux résultant qui subsiste est dissous dans une petite proportion d'éthanol absolu et est précipité par de l'éther anhydre. On obtient ainsi une suspension très fine que l'on centrifuge ensuite. On décante le solvant tandis que le produit blanc résultant ainsi séparé est repris avec de l'éther et est recueilli sur un filtre. Section B : Ester méthylique de la m-[di-(2-chloroéthyl')amino]- L-phénylalanyl-L-histidine. 16,9 g d'ester méthylique de la l'-histidine, dissous dans 100 ml de chloroforme, sont ajoutés à 44 g de N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chlo roéthyl)amino] -L-phénylalanine et 22 g de dicyclohexylcarbodiimide. La dicyclohexylurée qui se forme est recueillie sur un filtre. On évapore le solvant à partir du filtrat, et on fait cristalliser le résidu à partir d'acétate d'éthyle. Après élimination du radical carbobenzoxy à l'aide d'un traitement par HBr dans de l'acide acétique ou par mise en oeuvre du mode opératoire décrit dans l'exemple IV ci-dessus, on libère le dipeptide à partir du bromhydrate résultant à l'aide d'une solution de bicarbonate de sodium. Section C : Ester méthylique de la N6-carbobenzoxy-L-lysyl-m- di(2-chloroéthyl)amino-L-phénylalanyl-L-histidine. 16 g d'ester méthylique de la m-di-(2-chloroéthyl)amino-L phénylalanyl-L-histidine, dissous dans 200 ml de chloroforme, sont ajoutés à la température ambiante ordinaire à 7,2 g de dicyclohexyl- carbodiimide et 10,8 g de L N&alpha;-formyl-N#-carbobenzoxy-L-lysine dans 200 ml de chloroforme. La dicyclohexylurée qui se forme est séparée et est filtrée.Le filtrat est évaporé à sec, on reprend le résidu avec de l'éther, et on filtre. Après élimination du radical formule par traitement avec HCl dans de l'alcool méthylique, par mise en oeuvre du mode opératoire décrit dans l'exemple IV ci-dessus, le tripeptide est libéré à partir du chlorhydrate résultant par traitement par une solution de picarbonate de sodium. Section D : Hexachlorhrdrate de l'ester méthylique de la m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L arginyl-L-lysyl-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L phénylalanyl-L-histidine. 7,18 g d'ester méthylique de la N#-carbobenzoyx-L-lysyl-m-[di- (2-chloroéthyl)amino]-L-pninylalanyl-L-histidine, dans 100 ml de chloroforme, sont ajoutés a 7 g de N-carbobenzoxy-m-[di-(2-chloroéthyl) amino]-L-phénylalanyl-N#-nitro-L-arginine et à 2,3 g de dicyclchexylcarbodiimide. Après dissolution, on laisse séjourner le mélange réactionnel résulant pendant 24 heures à la température ambiante ordinaire. La d syclohexylurée qui s'est formée est sépa -e et filtrée. On évapo à sec le filtrat et on applique le résidu du à une colonne contenar du silicagel G. On utilise comme éluant un mélange chloroforme:éthoncl 9:1. Le produit est ensuite recristallisé à partir d'éthanol Le rendement est de 6,1 g. Elimination des redic@@ de blecage : NO2-carbobenzoxy : On dis and G g de l'ester céth@@@@e de la N-carbonbenzoxy-m-[d-(2-chlore éthyl)amino]-L-phécyl@@@@@ N# mitro-nrginyl-N#-carbobenzoxy-L- lysyl-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-histidine dans 60 ml de HCl à 5 % dans du méthanol. On effectue l'hydrogénation après introduction d'environ 0,5 g de charbon palladié + 0,1 g de Pd tout en agitant et en maintenant la température à 40-500C. Après 24 heures, on filtre au travers d'amiante, on évapore le filtrat à sec, on reprend le résidu avec une petite quantité de méthanol et on précipite avec de l'éther anhydre ; on filtre en lavant soigneusement avec de l'éther anhydre, et on sèche sous une lampe.Le rendement en produit (Produit A) est de 4,7 g. I1 se décompose audessus de 1100C ; son analyse donne les résultats suivants calculé trouvé Cl % 28,4 28,91 Cl-% 17,0 16,89 N % 14,6 14,20 Section E : Ester méthylique d'un pentapeptide. 4,7 g d'hexachlorhydrate de l'ester méthylique de la m-[di-(2- chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-lysyl-m-[di-(2-chloroéthyl)amino]-L-phénylalanyl-L-histidine sont dissous dans 20 ml d'alcool méthylique et traités par une solution équimoléculaire de CH3COONa dans de l'alcool méthylique. Il se forme du chlorure de sodium que l'on élimine par filtration ; à partir du filtrat, on sépare le produit par précipitation à l'aide d'éther anhydre.Rendement 3,2 g ; P.F. : décomposition au-delà de 6O0C. [&alpha;]20D = -11,9 (c = 1 dans de l'alcool méthyliqu. Analyse calculé trouvé 17,72 17,12 Cl % 13,8 14,13 NaCl fo - 0,8 Essais expérimentaux et cliniques : on procède à des essais chinimo- thérapeutiques par mise en oeuvre du mode opératoire recommandé par le C.C.N.S.C., lequel mode opératoire est décrit d'une manière succincte ci-dessus (à la fin de la description, avant l'exemple I), page 3.A des fins thérapeutiques, on considère qu'il convient, au lieu d'utiliser un unique peptide, de préparer un mélange des peptides sus-mentionnés, désignés ci-dessus par les dénominations abrégées 48/13, 48/15, 48/22, 161/11, 210/3, en doses équilibrées d'une manière telle qu'il se trouve 30 mg de m-di-(2-chloroéthyl)amino-phényl-L-alanine dans 1 ml de solution. En dépit d'un tel mode opératoire, il subsiste encore la possibilité, pour des applications en thérapeutique humaine, d'un effet favorable sélectif (dans le cas d'une tumeur sélectivement sensible à un seul peptide) amoindri ; toutefois, en raison de la difficulté de prédire la sensibilité réelle d'une tumeur donnée à un peptide défini, la présence de plusieurs peptides, dotés de sélectivités différentes, accroît la possibilité d'un effet thérapeutique favorable. Autrement dit, avec un mélange de peptides, le spectre antitumoral d'une préparation se trouve élargi. Des exemples de l'effet antitumeur, aussi bien expérimentaux que cliniques, sont donnés dans les Tableaux ciaprès. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. Tableau I Effet antitumeur des cinq peptides faisant l'objet de l'invention ; épreuve sur Sarcome 180. Animaux : souris. Six souris par groupe d'essai. Le traitement commence 24 heures après l'implantation. Eventail des doses : en progression géométrique. Une dose quotidiennement pendant 7 jours. Les doses sont exprimées en mg de m-di-(2-chloroéthyl) amino-phényl-L-alane contenus dans les composés injectés. Les animaux sont sacrifiés le neuvième jour. Les poids des tumeurs des animaux d'essais sont comparés à ceux constatés sur des animaux-témoins. Les résultats sont exprimés en pourcentages de diminution des poids de tumeurs sur les animaux traités par comparaison avec les animaux-témoins. Variations % Com- Nombre Doses de Morta- Pourcentage de Poids Nombre posé C o m p o s é s d'es- m-L-SL lité régression de la de leun sais en mg/kg morts/ des tumeurs rate cocytes total 6/1 m-di-(2-chloroéthyl) amino-phényl L-alanine (abrév. m-L-SL)= étalon > 100 2,8 0 -22,59#9,21 -36,75 " > 200 4 0 -48,34#3,73 -49,81 " > 200 5,6 0 -69,75#8,96 -70,43 -69,14 " > 200 7,84 ~ 4 % -78,97#10,54 -76,24 " > 200 10,98 ~17 % -88,54#6,49 -84,07 48/13 L-Pro.m-L-SL.OEt.2HCl 3 2,8 0/18 -54,75 -55,13 " 3 5,6 0/18 -80,43 -80,79 -79,34 " 3 7,84 4/18 -91,64 -90,38 " 3 10,98 8/18 -95,96 -95,27 48/15 N# (m-L-SL).L-Lys.OEt.2HCl 3 2,8 0/18 -37,38 -43,68 " 3 4 0/18 -69,74 -65,28 " 3 5,6 0/18 -69,95 -70,25 -72,37 " 3 7,84 0/18 -80,73 -77,41 " 3 10,98 2/18 -92,41 -82,15 48/22 m-L-SL.L-Asn.OH.Ac-OH 3 4 0/18 -64,36 -72,73 " 3 5,6 0/18 -80,96 -83,25 -69,50 " 3 7,84 0/18 -82,81 -84,21 " 3 10,98 2/18 -93,04 -88,99 Tableau I (suite et fin) Com Nombre Doses de Morta- Pourcentage de Variations % posé C o m p s é s d'es- m-L-SL lité régression Poids Nombre n sais en mg/kg morts/ des tumeurs de la de leu total rate cocytes 161/11 p.F.L-Phe.Gly.m-L-SL.L-Norval 2 4 0/12 -61,37 -67,94 OEt.HCl " 2 5,6 0/12 -80,38 -80,86 -57,61 " 2 7,84 0/12 -90,26 -92,82 " 2 10,98 3/12 -95,14 -93,78 210/@ m-L-SL,L-Arg.L-Lys.m-L-Sl.L-His. 3 2,8 0/18 -39,58 -26,94 OMe " 2 4 0/12 -53,69 -33,65 " 7 5,6 0/42 -66,48 -53,61 " 7 7,84 0/42 -72,83 -69,62 -59,26 " 7 10,98 0/42 -84,67 -75,41 " 2 15,37 2/12 -91,78 -84,82 Tableau II Effet antitumeur de mélanges de peptides. Sytèmes d'essais : Sarcome 180 (Sa 180) et adénocarcinome 755 (Ca 755). Les souris sont sacrifiées le douzième jour. Une dose quotidiennement pendant sept jours. Toutes les autres conditions expérimentales sont les memes que pour le Tableau I Doses Régression des Mortalité Diminution % du Diminution du nombre Composés (mg/kg) tumeurs (%) (morts/total) poids de la rate des leucocytes en m-L-SL Sa 180 Ca 755 Sa 180 Ca755 Sa 180 Ca 755 Sa 180 Ca 755 700.119 4 -45,65 -86,44 0/6 0/6 -45,83 -25,45 5,6 -70,37 -90,76 0/6 0/6 -62,50 -54,46 -56,17 -49,47 7,84 -81,64 -92,07 0/6 1/6 -73,15 -74,11 10,98 -92,26 -93,38 1/6 2/6 -86,11 -79,91 700.120 4 -66,25 -88,43 0/6 0/6 -62,04 -31,25 5,6 -79,12 -92,94 0/6 0/6 -73,61 -64,29 -57,99 -50,65 7,84 -81,27 -93,94 0/6 1/6 -77,78 -75,00 10,98 -92,67 -94,84 3/6 3/6 -86,11 -73,21 700.416 4 -53,20 0/6 -26,25 5,6 -77,43 0/6 -65,62 -70,81 7,84 -84,46 0/6 -76,87 10,98 -93,48 2/6 -85,00 Table III Effet du mélange de peptides (48/13 + 48/15 + 48/22 + 161/11 + 210/B) sur quelques patients humains atteints de maladies néoplastiques. Doses : une demi-ampoule ou une ampoule (1 ampoule = 1 ml = 30 de m-di-(2-chloroéthyl) amino-phényl L-alanine dans l'asssociation des peptides sus-mentionnés) dissoute dans 250 ml de glucose à 5 %. Administration : phléboclyse lente (durée de la phléboclyse : de 70 à 80 minutes) tous les deux jours ou à intervalles plus espacés (deux à trois jours entre deux administrations consécutives) selon le degré de tolérance des individus. Résultats avec le mélange de peptides Ini- Diagnostic et état Traitements tiales Age Sexe au début du traite- antérieurs Total ment par le mélange de mg Effets de peptides injec- Remarques tés * G.P. 38 F. Maladie de Hodgkin pas de trai- 240 Disparition de la fi- Diminution des tement anté- èvre et du gonflement leucocytes = 42 % rieur des ganglions lym- hématies ; pas de phatiques modification F.M. 68 F. Maladie de Hodgkin 180 guérison clinique diminution des (4 semaines de trai- leucocytes de tement) 10000 à 4000/mm Disparition de la fièvre le 7ème jour B.M. 32 F. Maladie de Hodgkin 120 Disparition complète Diminution des des lymphomes leucocytes = 33 % P.P. 25 M. Maladie de Hodgkin 270 Amélioration clinique Disparition de la (localisation médi- et radiologique fièvre le 7ème jour astinale) lndice Katz : avant 80, après 25 D.A. 59 F. carcinome ovarien Leukeran 90 Amélioraction frappan- Leucopénie jusqu'à inopérable ; plusieus Endoxan te de l'état général 2000 leucocytes masses dans le bassin Réabsorption d'effu- par mm . Pas de et le mésentère. As- sions. Remarquable changements dans cite apparente et diminution d'oedème ; les thrombocytes abondante effusion perte de poids = 10 kg ni dans les héma pleurale à droite ties Tableau III (suite) Résultats avec le mélange de peptides Diagnostic et état Ini- Age Bexe au début du traite- Traitements Total tiales ment par le mélange antérieurs de mg Effets de peptides injec- cliniques Remarques tés * G.N. 66 F. Métastases péritonés- 105 Remarquable amélio- Diminution des les diffuses après lation leuoccytes par mm carcinome ovarien = 62,5 % ; valeur finale des hématies 4 800 000 S.G. 61 F. Microcytome pulmonai- Rayons X 210 Amélioration frappan- Diminution de la vi re avec métastases de Chloramine te avec disparition tesse de sédimenta la peau et du médias- Endoxan de l'oedème et des tion. Diminution des tin Tem métastases médiasti- leucocytes = 25 % Methotrexate nales Hématies : pas de Prednisolone modification D.M. 64 M. Métastases dans le Methotrexate 180 Diminution frappante Diminution des leu foie de microcytomes des métastases dans cocytes = 60 % pulmonaires le foie S.S. 63 M. Microcytomes du pou- 180 Disparition complète Diminution de leu mon droit avec méta- de la douleur. Pas cocytes = 40 % stases lymphoglandu- d'effet prouvé sur Hématies 4 200 000 laire. Douleur thora- la tumeur Poids : non modifié cique continue M.G. 65 M. Tumeur du poumon 120 Nette amélioration Pas de modification gauche prouvée radiologique- des leucocytes ment F.G. 63 M. Tumeur pulmonaire 150 Diminution de 90 % en Disparition de la avec cellules non- 3 semaines de la ma@@ fièvre ; diminution différenciées de la tumeur (radio- des leucocytes 33 % logiquement prouvée) Augmention de poids de 3 kg Tableau III (suite) Résultate avec le mélange de peptides Diagnostic et état Total Ini au début du traite- Traitements de mg Effets tiales Age Sexe ment par le mélange antérieurs injec- clinique de peptides tés * Remarques T.G. 63 M. Tumeur médiastinale 120 Disparition de la Amélioration de l'é du poumon droit symptomatologie morbi- tat général. Augmen de. Amélioration de tation de poids 2,5 kg l'image radiologique Pas de modification pulmonaire leucocytaire. M.F 62 M. Caroinome sclide in- Télé-cobalto- 300 Amélioration alinique Alopécie (réversi filtrant de la vessie thérapie. Pas (3 mois) ble). Pas d'autres avec cellules non- de chimio- troubles. différenciées. thérapie Type III F.R. 54 M. Carcinome anaplasti- Télé-cobalto- 660 Pas d'effet Nausées avec vômis que infiltrant de la thérapie. sements ; alopécie vessie. Type III Thiotepa totale. Tous effets Mitomycine C secondaires réversi bles. R.F. 77 M. Tumeur hétéroplasti- Rayons X 180 Amélioration signifi- Pas de modification que de la vessis avec cative d'un patient des hématies. Dimi métastases osseuses dont l'état était nution de la vitesse très grave de sédimentation. Diminution des leu cocytes = 52 % S.A. 58 M. Carcinome papillaire Résection en- 300 Régression partielle Nausées, anorexie. de la vessie. Type II doscopique. (500 %). Contrôle Alopécie (réversi Stade T1 avec cellu- Mitomycine B cytoscopique après 5 ble). les de transition. mois : le patient est apparemment guéri. Tableau III (suite) Résultats avec le mélange de peptides Diagnostic et état Ini- au début du traite- Traitements Total tiales Age Sexe ment par le mélangs antérieurs de mg Effets de peptides injec- cliniques Remarques tés * C.B. 63 M. Caroinome prostatique Orchiestomie 300 Amélioration subjecti- Pas d'effets secon infiltrant. Stade T4. Oestrogènes ve. Régression totale daires. Métastases lymphati- Endoxan des métastases ques multiples. Type III. S.B. 69 M. Carcinome prostatique Oestrogènes 180 Amélioration de l'état Diminution des leu avec métastases os- Methotrexate clinique. Disparition cocytes = 68 % seuses. Chimiothérapie de la douleur combinée (Tem-Endoxan Thiotepa Prednisolone) G.M. 70 F. Tumeur mammaire avec 105 Remarquable améliora- Diminution de leu métastases de la tion des lésions de cocytes = 62,5 % peau ulcérée la peau G.B. 52 F. Nodule mammaire hété- 105 Disparition des dou- Amélioration de roplastique gauche leurs mammaires et au l'état général. après mammectomie niveau du foie Pas de modification droite pour des méta- des leucocytes stases d'un carcino me du foie A.E. 60 F. Réticulo-sarcome de 135 Pas d'amélioration. Température (38,5) la rate. Etat très Décès de la patiente commence à baisser grave le 21ème jour le 3ème jour; elle est en moyenne 37 C du 5ème au 37ème j. puis s'élève jusqu'à 38-39 C jusqu'au décès. Tableau III (suite et fin) Résultate avec le mélange de peptides Diagnostic et état Ini- au début du traite- Traitements Total Effets tiales Age Sexe ment par le mélange antérieurs de mg cliniques Remarques de peptides injec tés * B.W. 63 M. Réticulo-saroome. Moutarde à 180 Disparition complète On observe l'absen Plusieurs lymphomes l'azote des lymphomes ce totale de lympho cervicaux, axil- mes après 19 jours laires, inguinaux de traitement bilatéraux M.A. 62 F. Carcinome pancré- 60 Etat non-modifié Nombre de leucocytes atique avant : 5000 après : 2500 G.A. 72 M. Tumeur gastrique 195 Remarquable diminu- Nombre de leucocytes avec métastases tion de la masse avant : 6000 ; hépatiques néoplastique le 5ème jour 16000 ; du 10ème au 14ème j. 12000 ; le 27ème j. 4000. Disparition de la fièvre le 14ème jour * Exprimé en milligrammes de m-di (2-chloroéthyl)-amino-phényl-L-alanine se trouvant dans le mélange de peptides utilisé Revendicat ions 1. Composé possédant la formule générale suivante 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa molécule comporte la succession peptidique suivante : ester éthylique de la L-prolyl . m-di ( 2-chloroéthyl) -amino-L-phénylalanine. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa molécule comporte la succession peptidique suivante : ester éthyle que de la N,#{m-[di(2-chloroéthyl)-amino]-L-phényl-alanyl}-L-lysine. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa molécule comporte la succession peptidique suivante : ester éthylique de la m-di ( 2-chloroéthyl ) -amino-phényl-L-alanyl-L-asparagine . 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa molécule comporte la succession peptidique suivante : ester éthylique de la p-fluoro.L-phénylalanyl-glycyl-m-di(2-chloroéthyl)-amino- phényl-l-alanyl-l-norvaline 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa molécule comporte la succession peptidique suivante : ester méthylique de la m-di(2-chloroéthyl)-amino-phényl-X-alanyl.L-arginyl > - lysyl-m-di(2-chloroéthyl)-amino-phényl-L-alanyl-L-histidine. 7. Composition caractérisée en ce qu'elle contient un mélange de composés possédant la formule général-e spécifiée dans la revendication 1. 8. Composition caractériste en ce qu'elle contient un mélange des composés respectivement spécifiés dans les revendications 2, 3, 4, 5 et 6. 9. Procédé pour le traitement de tumeurs sur des animaux, y compris des êtres humains, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à administrer, à un hôte, une quantité pharmacologique d'un composé selon la revendication 1. 10. Procédé pour le traitement de tumeurs sur des animaux, y compris des êtres humain, caractérisé en ce qu'il consiste eussent: ellement à administrer, à un hôte, une quantité pharmacologique d'ane composition selon la revendication 8.