FR 2104935 A1 19720428 FR 7032576 A 19700908 La présente invention concerne, à titre de nouveau produit, une protéine possédant la capacité d'inhiber la synthèse d'ADN. Elle a également pour objet un procédé d'extraction de ladite protéine à partir de divers tissus lymphoïdes, Un tel produit, qui régle la prolifération cellulaire, pourrait être utilisé en thérapeutioue pour le traitement des cancers et/ou coIni:ie imzu- nodépresseur. La recherche d'inhibiteurs naturels de la division cellulaire à partir de différents tissus s'est récemment développée. Ces recherches ont pour but de conduire à une meilleure connais sance des facteurs qui réglant la prolifération cellulaire "in - - vivo" et de fournir des substances naturelles susceptibles d'ê- tre appliquées avec succès dans le traitement des cancers. A titre de références bibliographiques illustrant l'art antérieur dans ce domaine, on peut citer les articles ci-après - BARDOS T.J. GORDON H.L., CHMIEL WICZ Z.F.KUTZ R.L. et NADKARNI M.V.A. "Systematio investigation of the presence of growth-inyibitory substances in animal tissues". Cancer Res., 1968 28, 1620. - BULLOUGH W.S. et LAURENCE E.B." Mitotic control by internaI secretion :"the role of the chalone adrenalin complex". Exp. Celi Res., 1964, 33, 176. - BULLOUGH W.S. et RYTOMÖMAA T. "Mitotic homeostasis". ature (Londres) 1965, 205, 573. - BULLOUGH W.S. "Mitotic and functional homeostasis". Cancer Res.; 1965, 25 ,1683. - ECHAVE LLANOS J.M. "Liver tissue factors and cirreadian rythmus in liver regenertion". dans "Control of cellular growth n adult organisms" (Teir H. et Rytömaa R.) Londres, 1967, (Ac. Press). - NILSON G. et PHILIPSON L. "Cell growth inhibition of human cell by human tissue extracts". Exp. Cell. Res. 1968, 51, 275. - OTSUKA H. et EGYIID L.G. "Nucleic acid and protein synthesis of malignunt ascite cells in the presence of liver extract and methyl-glyoxal-bis (guanyl hydrazone)". Cancer Res. 1967, 27, 1498. - RYTOMAA T. et KIVINIEMI K., p. 106 "Regulation system of blood cell productions't dans(E. Teir and T. Rytömaa) (op.cit.). - STRONG L.C. p. 195 dans "Biological aspects of cancer and aging" Oxford, 1968 (Pergamon Praos Inc.). Les références ci-dessus montrent que des inhibiteurs de la prolifération cellulaire ont déjà été obtenus à partir du foie, de la peau, du poumon et du sang périphérique. Dans ce dernier cas, l'extraction des inhibiteurs était réalisée à partir des granulocytes. Parmi les inhibiteurs précités, une catégorie particulière est représentée par les chalones (voir par exemple W.S. Bullough "Nature" 220, p.135 et les autres articles ci-dessus relatifs aux travaux de Bullough et de ses collaborateurs). Ces chalones sont des substances de nature protéique dont le poids moléculaire varie de 4000 pour la chalone yanulocytai- re, à 35 000 pour la chalone épidermique et à 40 000 pour notre produit que nous appelerons chalone lymphocytaire. Elles se comportent comme des apoenzymes, l'adrénaline étant le co-facteur, de la chalone ép;idermique, mais ne jouant aucun rôle dans la chalone granulocytaira, sans toutefois que l'on puisse affimmor que les chalones agissent comme des apoenzymes.Sécrétées dans de nombreux tissus, dont l'épiderme , elles ont pour fonction d'in- hiber les processus de mitose. On remarque à cet égard que le taux de chalones est abaissé dans les tissus cancéteux.Dans son application, la chalone épidermique exige la présence conjointe d'adrénaline et d'une hormone de type glucocorticoide, telle te l'hydrocertisone. Ni l'adrénaline, ni l'hydrocartisone n'est antimitotique, mais elles sont toutes deux nécessaires pour que la chalone puisse exercer son activité. Ainsi, l'emploi répété de la chalone granulocytique entrain, chez le rat, une diminution marquée de la production normale de- granulocytes, ce qui provoque un abaissement de la résistance à l'infection, mais elle a pour avantage d'inhiber spécifiquement la croissance cellulaire des tissus qui peut 8Wre mise à profit pour le traitement de la leucémie, d'autant que les chalones sont spécifiques d'un tissu mais non d'une espèce. Bien que les chalones offrent des perspectives intéressantes, leur champ d'application pratique se trouve limité. En-premier lieu, la substance active est instable. Les fractions utilisées jusqu'à présent sont des extraits d'épiderme peu purifiés, car des tentatives de purification plus pousses aboutissent à l'inactivation des chalones. ainsi, la substance active peut dis paraître pendant sa préparation! De plus les- quantités présentes sur l'épiderme et dans les tissus sont très faibles. La fraction chaloniqua ne peut être repérée que par référence à une constante d!élution avec une resine particulière. On se heurte donc à des difficultés supplémentaires pour l'isolement des fractions actives. L'invention a pour objet une nouvelle protéine possédant une importante action inhibitrice sur la synthèse de l'ADN, dans le tissu lympholde. Un autre objet de l'invention est un inhibiteur d'AflN pouvant être commodément obtenu sous forme d'extraits aqueux provenant de lymphocytes humains et de rate de boeuf. Dans la description ci-après, on indique les détails de mise en oeuvre du procédé d'extraction et de caractérisation de la substance. D'une façon générale, on part d'une suspension de lympilo- cytes humains ou de cellules de rate de boeuf. Après séparation du sérum, les cellules sont suspendues dans l'eau distillée; la suspension est ensuite homogénéisée et centrifugée. Le surnageant est alors dialysé contre de l'eau déionisée, et le précipité senaré. La solution obtenu par dialyse constitue un extrait aqueux qui peut etre soumis à un fractionnement alcoolique. te choc hypotonique auquel les cellules sont soumises après suspension dans l'eau distillée est l'élément capital pour l'ex- traction de la fraction active, seul le surnageant obtenu après ce choc hypotonique faisant l'objet des traitements ultérieurs. Les extraits aqueux provenant de lymphocytes humains et de rate de boeuf se sont avéres posséder, dans la même fraction alcoolique, une inportante action inhibitrice sur la synthèse de l'ADN dans des lignées cellulaires établies, obtenues à partir de sang périphcrique de donneurs normaux et de patients atteints de leucémie aigüe lymphoblastique. Ni la synthèse de l'ARN, ni celle. des protéines n'a paru être inhibée. Un contrôle effectué à la fin de chaque expérience par des colorants vitaux n'a pas permis dc retrouver de différences dans la mortalité cellulaire entre les cellules incubées avec les extraits aqueux ou certaines des fractions alcooliques provenant de tissus lynpho ïdes. L'activité de l'inhibiteur de division cellulaire est mesu rée "in vitro" par la diminution d'incorporation de thymidine tritiée dans différentes lignées cellulaires. La substance responsable de l'inhibition possède les caractéristiques d'une protéine comme le montrent sa sensibilité à la trypsine et son spectre d'absorption. Seuls des acides aminés ont pu Qtre retrouvés après hydrolyse acide. Les rcsultats de la filtration sur une resine échangeuse du type disponible sur le marche sous la dénomination "Sephadex" indiquent que la protéine responsable de l'action inhibitrice a un poids moléculaire proche de 45.000. te fractionnement alcoolique a permis de concentrer 100 fois l'action inhibitricô de l'extrait aqueux dialysé. Cependant, l'électrophorèse sur gel de poîyacrylamide montre: que la purification n'est que partielle.L'électrophorèse sur gel de polyscrylamide permet de récupérer l'activité du produit dans une seule bande protéique. D'une façon générale, l'électrophorèse préparative est un moyen efficace de purification du produit. Il est important de signaler que la protéine obtenue est totalement solublc dans l'eau et qu'en solution aqueuse les protéines actives ont un pH proche de 7. Les références bibliographiques indiquées dans l'introduc- tion de la présente description montrent l'intér8t des inhibiteurs d'origine cellulaire. D'autres références pertinentes;à cet égard sont les suivantes - LASALVIA E."Regulation of liver regeneration by specific and non specific inhibitors", "Nature", in press. - RYTOMAA T. and KIVINIENI K."Control of DNA duplication in rat chloroleukaemia by means of the granulocytic chaiene". Europ. J. Cancer, 1968, 4, 595. fie tels inhibiteurs sont capables de régler "in situ" ou par-un mécanisme humoral les cellules susceptibles d'entrer en cycle. tas propriétés de la protéine proposée par l'invention peuvent être mises à profit dans l'homeostase du tissu lymphatique. te nouveau produit peut ainsi tre appliqué dans le traitement de certains cancers ou comme immunodépresseurs. On illustrera maintenant l'invention plus en détail. Extraction et purification partielle de l'inhibiteur d'LflN Deux extraits ont été préparés à partir d'une suspension de lymphocytes humains, provenant de deux donneurs normaux, à l'aide du séparateur de cellules sanguines IB. Chaque suspension contenait 2x1010 lymphocytes et 1,8 x 1010 érythrocytes pour 150 ml. tes opérations qui suivirent la séparation des lymphocytes ont été effectuées à 40C. tes cellules ont été séparées du sérum par centrifugation à 10 000 tours/minutes vendant 30 minutes.Puis clles ont été lavées 2 fois dans 150 ul d'une so- lution saline physiologique et resuspendues dans 150 ml d'eau distillée. Ju bout d'une pleure, la suspension a été homogénéi sée pendant une minute avec un homogénéisateur disponible sur le marché sous la dénomination "Ultra-Turrax". après 30 minutes, l'homogénéisat fut alors soumis à une centrifugation à 17 000 tours/minute pendant 15 minutes. Le surnageant ainsi obtenu a été dialysé contre de l'eau déionisée pendant 24 heures. Le pré- cipité formé lors de la dialyse fut éliminé par centrifugation. Cette solution ainsi obtenue est conserve après lyophilisation afin d'être testée comme extrait aqueux de lymphocytes humains (en abréviation AEHL) ou afin d'être soumis à un fractionnement alcoolique. Dans les conditions décrites, on a obtenu 1 mg d'extrait aqueux (en abréviation AE)/ 107 cellules sous forne de poudre sèche. Ce dernier extrait a cté dissous dans de l'eau distillée et de l'éthanol 96% fut ajouté goutte à goutte.Lorsque la concentration en éthanol atteignit 5a;, la suspension fut centrifugée à 10 000 tours/minute pendant 20 minutes et le précipité séché par évaporation à température ambiante puis conserve à 4 C. A ce surnageant on a également ajouté 96% d'éthanol gouttc à goutto jusqu'à une concentr@tion de 75% Cette fraction a été traits dc la même façon que la fraction éthanol 50% et le surnageant évaporé sous vide à 40 C.Les trois précipités ont été lyophilisés et dissous dans du milieu de culture au moment de l'utilisation. tes trois fractions alcooliques ainsi obtenues seront désignées par les abréviations respectives F1 (fraction 0-50%), F2 (50-75%) et F3 (+ 75%). Etant donné que les érythrocytes sont des contominants obligatoires des suspensions lymphocytaires, on a prépré éga lament des extraits aqueux de globules rouges (en abréviation AERO) provenant des mêmes donneurs et par la même technique que précédemment. On a opéré de la même maniere que ci-dessus pour préparer un extreit aqueux de fibroblastes humains de la lignée WI-38 et un autre extrait provenant de rate de boeuf. Dans ce dernier cas, après dissection de la rate, ls cellules s de la pulpe cnt été suspendues dans une solution saline physiologique à une concentration de 9.107 cel/ml puis lavées et extraites comme précédemment. Caractérisation chimique tes spectres ultraviolets de chaque échantillon ont été effectués ä plusieurs dilutions. tes principales valeurs caractéristiques dans chaque cas sont entre 220 et 300 mu une extinction graduelle cn fonction de l'augmentation de la longueur d'onde avec un pic d'absorption compris entre 270 et 290 mp. t'électrophorèse a été réalisée sur gel de polyscrylamide avec un tampon tris glycocolle à pH 8,2 (220 volts et 4 milli ampèrcs par tube). Les protéines ont été colorées par 1' "Amido-black 10B". Hydrolyse et chromatographie : l'échantillon obtenu à par tir de la solution alcoolique 75, o a été hydrolysé dans H2S043N à 105 C pendant deux heures puis neutralisé par du BaCO3. ta présence de monosaccharides, d'acides aminés, d'osamines et des bases azotées a été recherchée par chromatographie. Sensibilité aux protéases : on a utilisé la trypsine cristallisée ; les échantillons ont été incubés à une concentration de 1 mg/ml pendant 20 heures à 30 C dans un tampon phosphate, le rapport enzyme-substrat étant de 1/80 (mg/ml). La suspension a été laissée 20 heures afin d'inactiver la trypsine. Poids moléculaire : une évaluation a été effectuée sur une colonne de 2,2 x 60 cm de résine "Sephadex G 75" selon la méthode d'Andrews P. # "Estimation of the molecular weight of proteins by Sephadex gel-filtration" Biochem. J. 1964, 91.222 7 L'élution a été réalisée à 4 C avec une solution de Hanks.tes étalons du poids moléculaire ont été la pepsine, la tr=ypsine, le serum-albumine bovine et l'ovalbumine. Une caractérisation chimique plus poussée a été effectuée sur la fraction alcoolique F3. Lorsque la fraction F3 est stockée et lyophilisée à - 200C, elle garde son activité inhibitrice pendant un mois. Elle perd 80% de son activité quand elle est chauffée 15 minutes à 70 C; incubée avec la trypsine, elle la perd- totalement. On n'a retrouvé dans l'hydrolysat de la fraction F3 que des acides aminés. te spectre d'absorption de F3 réalisé avec un appareil Beckmann DU contre un témoin d'eau distillée, a montré, entre 200 et-300 mu, une extinction graduelle en fonction de l'augnen- tation de la longueur d'onde et un pic d'absorption entre 270 et 290 mu. L'étude électrophorétique sur gel de polyacrylamide de la fraction F3 a permis d'observer au moins deux bandes dans la zone des albumines ct ds alpha-globulines. te pH de F3 était de 6,9. La filtration par gel de "Sepha- dex G 75" a permis de récupérer les 95% de l'activité de F3 dans un seul pic dont le poids moléculaire était de 45.000 +4500 d'après le volume d'élution. En plus des caractéristiques chimiques ci-dessus, qui définissent une protéine, la nouvelle substance activa de l'invention a été étudiée quant à son pouvoir d'inhibition de l'ADN, d'une part, de l'inhibition de la transformation des lymphocytes humains par la PHA. Culture de cellules Les lignées suivantés ont été utilisées : une lignée établic originaire de lymphocytes de sang périphérique normal (LNH6) $ROSENFELD C., MACIERA-COELHO A., VENUAT A.M.,JASMIN C. et TUAN T.Q. "Einetics of the establishment of human peripheral blood cultures" J. Nat. Cancer Inst 1969, 2, 43 deux lignes établies provenant du sang de leucémie aigüe lymphoblastique : Saroul (BELPOMME D., LE BORGME DE KAOUEL C., PAINTRAND M., GRANDJON D., VENUAT A.M., NAVA C., do THOYER C., de GROUCHY J., de THE G. et MATHE G. "Aspects morphologiques de plusieurs lignées permanentes (ICI) établies à partir de sang leucémique humain ; étude ultrastructurale et chromosomiaue des cellules avant et après passage, en lignée continue". "Rev. Franc. Etud. elin. biol. 1969, 14, 848), et SKI2 # CLARCKSON B. STRIPE A. et de MARVEN E. "Continuous culture of seven new cell lines (SK-L-1-7) from patients with acute leukaemia", Cancer, 1967, 20, 926 7 et une lignée provenant de poumon ambryonnaire humain (WI-38) #HAYFLICK L. The Limitez "in vitre" life-time of humas diploid cells strains". Exp. Cell. Res. 1965, 37, 614 7. Les cultures ont été opérées à 37 C dans le milieu 1640 (DIFCO, II.S.A.) additionné de 20% de sorum foetal de veau. Ces cultures ont été entretenues en les diluant: deux fois par saline afin de réduire la concentration cellulaire à 5.105 cellules/ml Mesure des synthèses d'ADN, d'ARN et des protéines Dans ces expériences, 106 cellules ont étc suspendues dons 4,5 cm3 de milieu nutritif à la concentration indiquée dans les expériences respectives. Après une incubation de 3 heures, on a ajouté la thymidine tritiée (H3-Tdr) d une concentration finale de 0,1 C/ml, ayant une activité spécifique (a.s.) de 14 C/nM. L'BD a été extrait 30 minutes plus tard. L'ARN a été mesuré en ajoutant de l'uridine tritiée (U3-TdR) avec une activité spé- eifique de 5,2 C/mM, à une concentration finale de 1 -C/ml. Les précurseurs de l'ARN et des protéines ont été ajoutés, pendant 30 minutes, une, 2,3,4,5 et 6 heures après l'addition des extraits respectifs. L'extraction de l'ADM, de l'ARN et des protoines a été réalisée de la manière décrite par LEVINE E.M BECKER Y. BOONE C.W. and EAGLE H. "Contact inhibitions macromolecular synthesis, and polytribosomes in cultured human diploid fibroblasts" Proc. Nat. Acad. Sci. 1965, 53,713. Dans ces trois cas, les précipités acido-insalubles ont été dissous dans un ml de soluène, puis ajoutés à 12 ml de liquide de scintillation et 3 ml d'éthanol. La radioactivité a été mesurée dans un compteur à scintillation liquide. D'autres essais ont été effectués, qui montrent l'action des extraits conformes à l'invention dans l'inhibition de la transformation des lymphocytes humains par la PHA et leur effet immunodépresseur chez la souris, l'effet immunodépresseur étant vraisemblablement du à un blocage de la multiplication des lymphocytes, spécifique de ces cellules, sans que l'on doive considérer cette théorie comme impérative. Cette seconde série d'essais a comporté trois tests a savoir un test de transformation des lymphocytes, un test de "cellules fornatrices de plaques" et de rejat des greffes de peau et détermination de la spécifité par ne sure simultanée de la synthèse d'ADN dans le foie et la rate d'animaux traités par l'inhibiteur conforme à l'invention. Test de transformation des lymphocytes Des lymphocytes humains provenant de donneurs normaux ont été obtenus à l'aide d'un séparateur de cellules sanguines IBr La suspension lymphocytaire a été ramenée à una concentration de 106 cellules viables par ml dans du milieu 1640 additionné de 20% de scrub de veau embryonnaire, et répartie par volumes de 5 ml dans des flacons plastiques Falcon. Les cultures ont slors été divisées an quatre groupes : le premier groupe a reçu dc la PHA (M) Difco à raison de 0,05 ml/culture; le deuxième a reçu la même dose de PHA et de l'extrait F3 (0,075mg/culture) dilué dans 0,025 ml d'une solution saline physiologique; le troisième groupe à F3 à la dose exprimée sans PHA, et le quatrième groupe n'a reçu que seulement 0,025 nl de la solution saline, sans PHA ou F3. tes cultures ont été incubées a 37 C pendant 3 jours. Elles ont alors reçu 1 C/ml de thymidine, activité spécifique (a.s.) 14 C/mM. rente minutes plus tard, 1'ADN a été extrait comme décrit dans le test précédent et dissous dans un ml de soluène, et la radioactivité a été mesurée comme précédem ment. On a également, dans les mêmes conditions que pour le deuxième groupe, étudié l'effet d'additions de diverses quantités de F3. Test de cellules formatrices de plaques" Des souris F1 (DBA2 X C 57 B1G) mâles âgées de 3 mois ont été réparties au hasard en 3 groupes et ont rvçu par voie intrépéritqnéale, 0,5 ml d'une suspension de globules rouges de mouton (GRM) à 20% le jour 0. t'extrait F3 a té administré à l'un des groupes par voie veine use à raison de 1,6 mg en protéine sous un volume de 0,5 ml les jours 0, 1,2 et 3. Du serum albumine bovine (SAB) a été administré- suivant le lime protocole au second groupe d'animaux, le troisième groupe servant de témoin. Les animaux ont été sacrifiés le jour 4, les rates pr-- levées et les cellules productrices d'anticorps ont été détec- tées et énumérées selon la technique de Jerne et Nordin "Plaque formation in ager by single entibody producing cells", Science, 1963, 140, 405. A 2 ml d'agarose (Industrie Biologique Française) à 0,6% dans le liquide de Hanks on a ajouté 0,1 ml de la suspension splénique à une concentration de 10 cellules par ml et 0,1 ml d'une suspension de GRM à 20%. Le tout a été rapidement étalé dans une boîte de Petri sur une sous-couche d'agarose à 1,2% dans une solution saline tamponnée. Après une heure d'incubation à 37% on a ajouté 7 ml de complément de cobaye dilué au 1/10 et on a poursuivi l'incubation pendant 30 minutes. Les moyennes et leurs intervalles de confiance à 95% ont été calculées et les comparaisons effectuées go l'aide du test de Student. Etude comparative de la synthèse d'AflN dans le foie et la rate de souris soumises à une dose unique de F3 10 souris F1 (DBA2 X C57 B. 16) ont reçu , par voie intrapéritonéale, 3,5 ng de l'extrait F3 dilués dans 1 ml d'une solution saline physiologique et 2 C/g de poids corporel de H3-TdR. Cette dernière a été simultanément njectée à 1C témoins. Deux heures plus tard, les animaux ont été sacrifiés et les rates et foies prélevés, après quoi 1'ADN de ces organes a éto" extrait et la radioactivité mesurée selon la même technique que précédem- ment. Les dessins annexés illustrent les résultats obtenus. Ces dessins sont des diagrammes dans lesquels Fig. 1 est un graphique sur lequel on a ports, en ordonnées (en % relatifs), la quantité de thynidine tritiée H3-UdR incorporée par des cellules SKL2,et sur la ligne des abscisses, l'indication des cultures utilisées dans la mesure des synthèses d'hDN et d'ARN selon le premier test ci-dessus décrit avec la quantité en mg d'extrait aqueux de lymphocytes humains (AEHL) qui y sont ajoutées, le témoin T n'ayant pas reçu d'extrait. Fig. 2 est un graphique analogue à la figure 1 comportant, en ordonnées (en % relatifs), la quantité de H3-TdR incorporée par des cellules SKL2, en présence de 10 mg, par culture, dos deux extraits AEHL, par rapport à un témoin T sans addition d'extrait. Fig. 3 est un graphique analogue sur lequel on a porté, en ordonnées, la quantité (% relatifs) en H3-TdR incorporée par des cellules Saroul en présence de différents extraits indiqués en abscisses et d'un témoin T. Fig. 4 est un graphique analogue à celui de la figure 3, ou d'autres extraits sont indiqués en abscisses, ainsi qu'un témoin T. Fig. 5 est un graphique illustrant l'effet des fractions alcooliques F1 , F2 et F3 provenant des extraits AEHL, SEBS, et AEBS, sur la synthèse d'ADn, la quantité (%) de H3-TdR incorporée étant porte en ordonnées et les extraits en abscisses,ainsi au'un témoin T. Fig. 6 est un graphique illustrant l'effet de la fraction alcoolique F3 provenant de l'extrait AEJ3-S sur la synthèse d'ADN, d'iRN et des protéines. Les teu-s en heures sont portés en abscisses. Les courbes obtenues sont tracées en traits pleins, alors que les courbes témoins apparaissent on pointillés Fig.7 est un graphique, analogue à ceux des figures 1 à 5, sur lequelon a porte, en ordonnées, la quantité (@ relatifs) de H3-TdR incorporée par des cultures sou@ises au test de trausformation des lymphocytes par la PHA, avec les diverses aditions prévues. Fig. 8 est un graphique analogue montrant l'influence de l'action de diverses doses do. F3 dans ce même test. Fig. 9 est un graphique anslogue relatif au test de synthèse d'ADN dans le foie et la rate de souris. ta figure 1 montre la corrélation entre la dos-e d'extraits aqueux utilisée et l'inhibition de la synthèse d'ADN obtenue après 3 heures d'incubation sur la lignde Saroul. Les valeurs obtenues representent le pourcentage d'inhibition par rapport aux témoins auxquels est attribuez une incorporation do 100%. Avec la lignée SKL2, les résultats ont été sensiblement identiques. Deux AEHL ont été testés simultanément et à la même dose. ta figure 2 montre que l'inhibition obtenue avec une dose de 10 mg de AEHL par culture a été sensiblement la même pour les deux donneurs. Etant donné que la suspension de lymphocytes utilisée contenait un certain pourcentage de globules rouges, on a aussi testé un estrait aqueux de globules reuges (AERC). Un extrait aqueux AE WI-38 a également été étudié. Dans cette expérience, la quantité d'extrait test@e provenant des lymphocytes, des globules rouges et des fibroblastes a été obtenue à partir de la mêne quantité de cellules. ta figure 3 contre que les extraits aqueux de globules rouges et de cellules WI-38 à le dose de 10 mg/culture n'ont pas inhibé la synthèse de l'ADN dans la lignée Saroul, mais l'addition de AEHL a produit une incorporation de 43% des valeurs témoins.L'action de l'Ae de rate de boeuf (AEBS) a été comparée avec celle de l'AEHL à la même dose de 10 mg/culture, comme le contre le figure 4. ta fraction responsable de l'inhibition de la synthèse d'ADN paraît être plus sctive dans les lymphocytes de la rate de beouf que dans les lymphocytes humains. Contraimement aux lymphocytes humains concentr@s direc- tement par le séperateur IBM dans le sdrun, pour obtenir un AEBS il est nécessaire de laver le broyat original dans une solution de NaCl (9 0/00). Après une première centrifugation de ce matériel en selu- tion de NaCl, le surnageant e été dialysé et lyophilisé. La solution saline ainsi obtenue (SEBS) a été également testée. Elle s'est avérée très active comme inhibiteur de la synthèse de l'ADN (figure 5), moins active cependant que 1' AEBS. La purification de cette substance a permis de montrer que le facteur actif se trouvait dans la même fraction que pour extrait aqueux de lymphocytes humains La figure 5 montre l'inhibition obtenue avec les 3 fractions alcooliques 0 - 50% (F1), 50 - 75% (F2) et+75% (F3) provenant de AEHL et de AEBS et également du surnageant obtenu après avoir lavé les extraits de rate de boeuf (SEBS). L'action de F3 a été également étudiée simultanément sur les synthèses d'ARN et des protéines. Ces expériences out été effectuées sur des cultures de la lignée Saroul par pulses de 30 minutes à une 2,3,4,5 et 6 heures, en présence de précurseurs respectifs, après addition de F@ originaire de l'AEBS (figure 6). L'inhibition de la synthèse d'ADN est apparue dès la première heure et a augmenté jusqu'à la fin de l'expérience. En revanche, les synthèses d'ARN et des protéines n'ont pas été inhibées pendant toute la durée de l'expérience. Les résultats ci-dessus montrent que la fraction Drotéi- que extraite selon l'invention possède la capacité d'inhiber la synthèse d';N "in vitro" sur diverses lignées cellulaires. tes résultats du test de transformation des lymphocytes soht donnés par les figures 7 et 8. L'addition de F3 aux cultures de lymphocytes a révélé une action inhibitrice de la transformation des lymphocytes humains, sous l'influence dc la PHA, mesurée par l'incorporation de H3-TdR. La figure 1 montre que l'incorporation e H3-TdR est 63% de celle des témoins T (premior groupe) dans les cultures ayant reçu simuftanément 0,075 mg de F3 par culture et la PHA au début de l'expérience. L'inhibition obtenue semble bie-n être en corrélation avec la dose de F3 . ta figure 8 montre que l'incor- poration de H3-TdR dans des cultures qui ont reçu respectivement 0,3, 0,6 et 1,2 mg de F3/culture est de 36%, 27, ct et 21,5% de la valeur des témoins T. L'influence de l'extrait F3 sur la réponse immunitaire aux GR) (test de "cellules formatrices de plaques") apparaît au tableau I ci-après qui, montre que l'administration de F3 durant le développement de la réponse immunitaire aux GRM entraîne une diminution significative (P = 0,01) du nombre de cellules formant des plaques (CFP) pour 106 cellules spléniques par rapport au nombre observé chez les animaux ayant reçu ue protéine du même origine animale que F3. Cette différence est également significative (P )(0,05) quand on compare la réponse des animaux ayant reçu les GRM et F à celle des animaux ayant reçu les GRM seuls. TABLEAU I : : : : :Traitement : Nombre de : CFP/106 cellules : Valeurs de P : (1) : souris : spleniques au 4ème : : : par :jour moyenne + : : groupe terreur standard : : : : : GRM : 10 : 830 # 325 : : : : : :GRM+SAB : 10 : 1030 # 406 : 0,05 : : : : :GRM + F3 : 9 : 470 # 153 : 0,01 . . . . (1) les animaux reçoivent les GRGi par voic i.p. le jour O; 1,6 ng an protéine de F3 ou de SAB les jours C,1,2 et 3 par vol i.v. Enfin 1'incorporation de thymidine dans la rate des animaux qui avaient reçu 3,5 mg de F3 s'est montré diminuée, sans que celle dans le foie des mêmes animaux ait été notablement influencée. En effet, comme le montre la figure 4, au temps indiqué, ces rates avaient incorporé 51% de la valeur des rates témoins, alors que l'incorporation de thymidine dans 1 foie atteignait encore 86% de la valeur des foies témens. Ces résultats montrent quc la fraction F3 purifiée par le fractionnement alcoolique d'extrait de rate de boeuf a une ac- tion dépressive sur la réponse immunitaire de souris aux globu- les rouges de moutons. Le nombre de CFP/106 cellules spléni que s, plus élevé chez les animaux traités par la SAB que chez les témoins ne recovant que les GRM,montre que la dépression de la réponse chez les animaux traités par F3 ne peut autre attribuée à cet effet dc compétition antigénique. L'effet sur l'incorporation de thymidine tritiée dans les rates et les foies d'animaux traités par F3 par rapport à ccllc d'animaux témoins permet de penscr que l'inhibitour a une action sélective "in vivo," sur la synthèse de l'ADN du tissu lympho ïde. Le test de transformation des lymphocytes humains ',in vitro", sous l'influence de le PHA, a montré que cotte substance ne présente pas de specificité d'espèce, étant donnés son origine ct son effet sur les cellules immunocompétentes nurines et humaines; ceci est en accord- ave-c la addition des inhibiteurs de type "chalone". L'invention n'est pas limitée par les exemples d'application particuliers ci-dessus. t'homme de l'art-peut en effet lui apporter de multiples variantes sans sortir du cadre des revendications ci-après. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'un inhibiteur de la synthèse d'ADN caractérisé en ce qu'on sépare le sérum et les cellules de lymphocytes humains ou de rate de boeuf, disponibles sous forme de suspensions, qu'on met en suspension lesdites cellules dans l'eau distillée, qu'on homogénéise ladite suspension, qu'on la centrifuge, en obtenant un liquide surnageant, qu'on dialyse le dit liquide contre de l'eau déionisée et qu'on sépare le précipité pour iseler un extrait equeux contenant l'inhibiteur dési 2. Procédé selon 15 revendicetion 1, caractérisé cc ce pour les cellules de rate de boeuf, les cellules sont suspendues dans une solution saline physiologique, lavées, puis sounisos à l'extraction. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'on opère à une température inférieure à 10 C, notamment à 4 C environ. 4. Procédé selon llune quelconque des revendications 1 i v caractérisé dn ce que l'extrait aqueux est soumis à une extraction alcoolique à l'éthanol. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on ajoute goutte à goutte de l'éthanol jusqu'à une concentration de 50%, qu'on sépar@ un preni r précipité et un premier liquide surnageant,qu'en ajoute à ce dernier de l'éthanol jusqu'à une conce@- tration de 75%, qu'on sépare un deuxième précipité et un deuxième liquide surnageant, lequel est évaporé sous vide, ce qui cenduit à trois précipités qu'on lyophilise et qui correspondent respectivement à trois fractions thamoliques F1 , F2 et F3. 6. Procédé selon la revendication 5, earactérisé en ce qu'on purifi@ la fraction F3 par électrepherèse préparetive sur gel de polyacrylanide. 7. Extrait aqueuz obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Fractions alcooliques obtenues à partir dudit extrait aqueux par le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 9. frotéine extraite de la fraction elcoolique F3 pr éloctrophorèse préparative sur gel de polyacrylanide conformement au procédé de la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle présente un poids noléculeire de l'ordre de 45 000 qu'elle perd totalement son activité par action de la trypsine, qu'ell@ ne révèle que des acides aminés à la chromatographie sur papier, et que -son spectre d'absorption possède un pic entre 270 et 290 mp, laditc protéine étant totalement soluble dans l'eau, la solution aqueuse obt@nue ayant un pH voisin de 7.