FR 2048003 A1 19710319 FR 7023878 A 19700626 L'invention a pour objet un nouveau procédé de fabrication de bufadiénolidegénines, comme par exemple l'hellébrigénine ; la scillarénine A et la scilliglaucosidine, de formule générale I dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène et R2 un groupe hydroxyle ou R1 et R2 représentent conjointement une liaison double et X représente le groupe méthyle ou formyle, par élimination fermentative du radical constitué par le rhamnose ou le glucosidorhamnose dans des bufadiénolideglucosides de formule générale II dans laquelle les radicaux R1, R2 et X ont les significations susindiquées et R représente un radical rhamnosido ou glucosidorhamnosido. Le procédé de fabrication conforme à l'invention de bufadiénolidegénines de formule I, par traitement fermentatif de bufadié nolide-rhamnosides de formule générale 11, consiste a utiliser des ou analogue enzymes produits par une souche CHBS 220 d'Aspergillus niger/ isolée à partir du sol. Cette souche est déposée dans le "Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn/Pays-Bas" sous le n 380 69. Les bufadiénolidegénines formées par élimination fermentative du radical R dans des composés de formule générale II ont déjà été décrites et on les a déjà fabriquées suivant différentes voies. Ainsi, on a obtenu la scillarénine A à partir de proscillaridine A par coupure acide au moyen de gaz chlorhydrique dans de l'acétone brevet belge n23.921) ou par dissociation enzymatique au moyen de ferment de champignon 889 (Penicillium spec.; A. Stdl et autres, Helv. Chim. Acta 34, 2308 /19517 ); en outre, on a obtenu l'hellébrigénîne à partir d'hellébrine et de desglucohellébrine par coupure acide au moyen de gaz chlorhydrique dans de l'acétone (demande de brevet allemand publiée n 1 176 794) ou par dissociation enzymatique au moyen de clarase (S.U.Kupchan et autres, Tetrahedron Letters 1968, 149); enfin on a obtenu la scilliglaucosidine à partir du scilliglaucosidine-a-D-glucoside et du scilliglaucosidine-B-D-glucoside par coupure acide au moyen d'acide sulfurique (A. toll et autres, Helv. Chim. Acta 36, 1534 g9537) ou par dissociation enzymatique au moyen d'un ferment de champignon C 1290 (H. Lichti, A.V. Wartburg, Helv. Chim. Acta 43, 1966 /1960/ ) Toutefois, on a trouvé de façon surprenante que seule l'en zyme formeepar la souche d'Aspergillus niger, déposée à l'endroit susindiqué sous le n CBS 380 69, produit chez tous les bufadiénolideglucosides une élimination quantitative du sucre avec formation des génines correspondantes et ceci avec de bons rendements et par une fermentation de durée relativement courte. Grade d cette enzyme, on obtient donc le premier procédé pour l'élimination fermentative de restes de sucre R dans des composés de formule générale II qui soit universellement utilisable pour tous les bufadiénolideglucosides. Pour l'élimination fermentative des restesglucosido ou glucosidorhamnosido dans des composés de formule II, on utilise l'enzyme d'une souche d'Aspergillus niger isolée à partir du sol. Cette souche a été cultivée sur l'agar Czapek (constitué par 3 g de nitrate de sodium, 1 g d'hydrogénophosphate dipotassique, 0,5g de sulfate de magnésium 7 H20, 0,5g de chlorure de potassium, 0,Olg de sulfate de fer-II-7 H20, 30g de saccharose et 15g d'agar pour un litre d'eau) durant 7 jours sous une lumière diffuse et à une température comprise entre 20 et 240C. Les caractéristiques de la souche sont représentées dans le tableau suivant et décrites d'une façon plus détaillée avec réfé rence au dessin annexé dans lequel - la figure 1 représente une cellule podalique - la figure 2 représente un stérigma, et - la figure 3 représente une conidie Croissance, Forme Coloration Aspect Remarques Colonie sur Agar Bord droit,mince Conidies, denses au centre, puis diffu7 jours 40 mm de diamètre ses, zone périphé10 jours 50 mm de diamètre rique (3-5 mm) sans conidies Mycélium tellurique s'enfonçant profondément Blanc-jaunâtre Velouté dans le substrat Blanc (1 A 1-1 A 2) Mycélium aérien Blanc (1 A 1) Pas d'exsudat Face inférieure Ocre clair (2 A 3) Pas de dépôt de pigment dans le substrat Phase de conidies Têtes Sphériques 40-45 Olive-foncé (3 F 3 - 3 F 4) Vésicule Sphériques 20-25 Incolore Sterigmata 2 phases : Incolore Primaire : 4-5 Secondaire : 5-6 Conidiophore Longueur: 250-600 Développement à par Diamètre: 10-12 Incolore tir de la cellule Epaisseur de membrane podalique, à membraenviron : 1 ne épaisse (20-30x40-45 ) Conidie Rond 3,5-4,00 Brun foncé Verrues en cônes (3 E 5) arrondis disposées sur la surface selon l'équateur On peut cultiver la couche de champignons de façon connue en soi à des températures comprises entre 32 et 40"C dans des cristallisoirs sur un substrat solide qui contient des matières premières à base de pectine telles que des copeaux de betteraves, le marc de pommes et des produits analogues, en outre de l'azote et du phosphore à l'état combiné et qui présente une teneur en eau comprise entre 40 et 50 %. Au bout de trois à quatre jours, on extrait les cultures avec de l'eau, soit après un séchage ménagé, soit à leur état d'humidité normale. A partir du produit d'extraction, on peut isoler le support de l'activité enzymatique par relargage, par exemple avec du sulfate d'ammonium. Après séchage et broyage du précipité, on obtient une poudre de coloration grise. Pour le dédoublement fermentatif des bufadiénolideglucosides on peut utiliser aussi bien cette poudre que l'extrait aqueux lui-même. On effectue la fermentation, soit en solution aqueuse lorsqu'on met en oeuvre beaucoup d'eau, soit en suspension lorsqu'on met en oeuvre une faible quantité d'eau. On maintient le pH de la solution avantageusement à une valeur comprise entre 5,5 et 7. Le rapport substrat : enzyme- peut varier entre 1:2 et 1:4 et la température avantageusement entre 30 et 450C. Le procédé de fermentation est applicable non seulement à des bufadiénolideglucosides purs, mais aussi à des extraits de drogues contenant ces glucosides. Ainsi, on peut par exemple fabriquer de l'hellébrigénine avec un bon rendement à partir d'un extrait de~drogue contenant environ 10X d'hellébrine obtenu de son côté à partir de la drogue Helleborus niger. Il en est de même pour un extrait contenant environ 40 à 50 X de scilliglaucosidine-d-l-rhamnoside provenant du traitement de la scille maritime Scilla maritima L Les exemples suivants sont destinés à décrire l'invention -d'une façon plus détaillée. EXEMPLE 1 Le 3B,i4B-dihydroxybufa-4,20,22-triénolide (scillarénine A). On mélange 50 g de 3B-d-l-rhamnosido-3B,i4B-dihydrobufa- 4,20,22-triénolide et 100 g du produit de précipitation de l'enzyme avec 20 g de sable fin et 75 g d'acétate de sodium, on ajoute une faible quantité d'eau et on broie le mélange énergiquement dans un mortier. On ajoute à la bouillie formée 300 ml d'eau et on agite la suspension durant quatorze jours en la maintenant à à la température de 400C et à un pH compris entre 5,8 et 6,5. On suit l'élimination de rhamnose par chromatographie en couche mince.Quand la réaction est terminée, on filtre la suspension sur 20 g de célite-545, on extrait le filtrat trois fois avec, chaque fois, 300 ml d'un mélange de chloroforme et d'éthanol dans le rapport 8:1, on réunit les extraits, on les sèche et on évapore jusqu'à siccité, puis on traite le résidu par chromatographie sur une colonne de silicagel (0,2-0,5 mm) en vue d'en éliminer le peu de 14ss-hydroxy-3-oxo-bufa-4,20,22-triénolide qui s'est formé en même temps. On effectue l'élution au moyen de mélanges chloroforme/acétone qui varient dans la proportion de 9:1 jusqu'à 5:1 Rendement 29,0 g (80 % de la théorie); P.F. 245-2500C. EXEMPLE 2 .- Le 3ss,14ss-dihydroxy-19-oxobufa-4,20,22-triénolide (scilliglaucosidine). a) Fabrication à partir de 3ss-d-l-rhamnosido-3ss,14ss-dihy- droxy-19-oxobufa-4,20,22-triénolide. On dissout 750 mg de 3ss-d-l-rhamnosido-3ss,14ss-dihydroxy-19- oxobufa-4,20,22-triénolide dans 1500 ml d'eau distillée, on ajoute îg du produit de précipitation de l'enzyme et on laisse reposer durant dix-huit jours à 40 C. On suit la progression de la réaction par chromatographie en couche mince. On essore la partie du produit final qui se sépare par cristallisation, on concentre le filtrat jusqu'à un faible volume et on sépare par filtration la nouvelle fraction de précipité. On dissout les précipitiés réunis dans de l'acétone et on les recristallise par addition de n-hexane. Rendement: 425 mg (77,5 X de la théorie) de 3ss,14ss-dihydroxy-19- oxo-bufa-4,20,22-triénolide de P.F. 242-2470C. b) Fabrication à partir d'un résidu sec d'extraction de drogue contenant environ 40-50 % de 3ss-d-l-rhamnosido-3ss,14ss- dihydroxy-19-oxobufa-4,20,22-triénolide. On dissout 800 mg d'extrait de drogue à environ 50-60 X dans 500 ml d'eau distillée, on ajoute lu du produit de précipitation de llenzyme et on laisse reposer durant dix-huit -jours à 40 C. Après concentration de la solution réactionnelle jusqu'à environ 150-ml, on l'épuise avec du chloroforme. On concentre les extraits chloroformiques réunis jusqu'à un faible volume et on ajoute de ltéther jusqu'à l'apparition d'un léger trouble. I1 se sépare alors par cristallisation 240 mg de 3ss,14ss- dihydroxy-19-oxobufa-4,20,22-triénolide de P.F. 240-2430C. EXEMPLE 3 Le 3ss,5ss,14ss-trihydroxy-19-oxobufa-20,22-diénolide (hellébrigénine). a) Fabrication à partir de 3ss-d-l-rhamnosido-3ss,5ss,14ss- trihydroxy-19-oxobufa-20,22-diénolide. On dissout 4 g de 3ss-d-l-rhamnosido-3ss,5ss,14ss-trihydroxy-19- oxobufa-20,22-diénolide dans deux litres d'eau distillée et on ajuste la solution avec un tampon d'acétate de sodium à un pH de 5,75. Après addition de 4g du produit de précipitation de l'enzyme, on laisse la solution reposer durant dix-huit jours à 40"C. On essore la partie du produit final qui s'est alors séparée par cristallisation et on sépare du filtrat, après l'avoir concentré, une nouvelle fraction de produit final. Après recristallisation dans un mélange méthanol/eau, on obtient 2,2 g (82X de la théorie) de 3ss,5ss,140-trihydroxy-19-oxobufa-20,22-diénolide de P.F. 229 2320C. b) Fabrication à partir de 3ss-(4'-glucosido)-d-1-rhamnosido- 3ss,5ss,14ss-trihydroxy-19-oxobufa-20,22-diénolide (hellébrine). On dissout 2g d'hellébrine dans un litre d'eau distillée, on ajoute 2g du produit de précipitation de l'enzyme et on laisse reposer durant quatorze jours à 40"C. On évapore ensuite la solution réactionnelle jusqu'à siccité et on épuise le résidu avec du chloroforme. On sèche les extraits chloroformiques réunis, on concentre jusqu'à un faible volume et on ajoute de l'éther jusqu'à l'apparition d'un léger trouble, puis on laisse reposer pour cristallisation. Rendement : 1 g (37X de la théorie) de 3ss,5ss,14ss-trihydroxy-19- oxobufa-20,22-diénolide de P.F. 226-2310C. c) Fabrication à partir d'un résidu sec d'extraction de drogue contenant environ lOX;dthellébrine. On agite,dans 10 litres d'eau distillée durant environ 3 heures, 200g d'un résidu sec d'extraction de drogue contenant environ 10% d'hellébrine, on enlève le précipité par filtration et on ajoute au filtrat 30g du produit de précipitation de l'enzyme, en amenant le pH à une valeur comprise entre 5,3 et 6,5. Au bout d'un repos de quatorze jours à 40 C, la réaction est terminée. On enlève par filtration le précipité formé qui consiste en une sapo genine, on extrait le filtrat huit fois avec des portions de 1,5 litre chacune de chloroforme et on évapore jusqu'à siccité les extraits chloroformiques réunis et séchés. Après dissolution du résidu sec dans de l'acétone, on amorce la cristallisation par addition d'éther jusqu'à l'apparition d'un trouble. On purifie l'hellébrigénine brute, ainsi obtenue, par chromatographie sur une colonne de A1203, Woelm, neutre, de degré d'activité 1, à l'aide de chloroforme/éthanol dans le rapport de 99:1 à 90:60 Rendement 4,37 g de 3ss,5ss,14ss-trihydroxy-19-oxobufa-20,22-diéno- lide de P.F. 230-2310C. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication de bufadiénolidegénines de formule générale dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène et R2 un groupe hydroxyle ou R1 et R2 représentent conjointement une liaison double et X représente le groupe méthyle ou formyle, lequel procédé est caractérisé en ce qu'on dédouble par un processus fermentatif des bufadiénolideglucosides de formule générale dans laquelle les radicaux R1, R2 et X ont les significations sus indiquées et R représente un radical constitué par le rhamnose ou le glucosidorhamnose à l'aide d'enzymes formées par la souche CHBS 220 d'Aspergillus niger , ou analogue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue le dédoublement fermentatif en milieu aqueux à des valeurs de pH comprises entre 5,5 et 7,0 et à des températures comprises entre 30 et 45"C. 3. Bufadiénolidegénines, caractérisées par le fait qu'elles sont obtenues par mise en oeuvre du procédé selon les reven- dications 1 et 2