FR 2053003 A1 19710416 FR 7022126 A 19700616 La présente invention a pour objet un procédé de marquage biologique des sujets humains ou animaux vaccinés contre une maladie contagieuse ou infectieuse en vue de les différencier des sujets naturellement infectés par ladite maladie. Dans de nombreux cas, la vaccination déclenche chez les sujets vaccinés l'apparition d'anticorps spécifiques agglutinines, précipitines sensibilisatrices, anticorps aller giques, etc. tellement identiques à ceux provoqués par llinfec- tion naturelle que les réactions biologiques spécifiques ou les réactions physicochimiques ne permettent pas de distinguer les sujets vaccinés des sujets infectés. En médecine humaine, les fiches, les registres, les carnets de santé individuels ne permettent de pallier qu'en partie ces inconvénients. En médecine vétérinairesil nten va pas de même du fait de mouvements fréquents consécutifs aux échanges commerciaux et aux migrations d'une exploitation à l'autre en raison de leur spécialisation dans l'élevage. La médecine humaine fait appel surtout à la prophyla xie médicale pour lutter contre les maladies contagieuses; la pro phylaxie sanitaire se limite à l'isolement, la quarantaine et la désinfection. La médecine vétérinaire opère par les mêmes voies, prophylaxies médicale et sanitaire, maib cette dernière est plus radicale puisqu'elle impose fréquemment l'abattage de tous les animaux infectés ou même simplement suspects. Ainsi, en ce qui concerne la prophylaxie de la tuber culose chez les bovins, le mode de dépistage le plus courant est l'emploi de la tuberculine. Cette réaction est en général le critère absolu en matière de rédhibition. Elle est également le critère en matière de prophylaxie sanitaire et tout particulière ment depuis la promulgation de la loi du 7 juillet 196) et de ses décrets d'application qui instaure contre le tuberculose une prophylaxie collective obligatoire avec dépistage systématique des animaux réagissant à la tuberculine, leur abattage et la recons titution des cheptels à partir d'animaux non réagissants reconnus indemnes Le vaccin ECG ( Calmette et Guérin) a été expérimenté en médecine vétérinaire; cependant une telle vaccination présente un inconvénient majeur.Les sujets vaccinés par le BCG réagissent àlsQuberuEneexactement comme les sujets infectés naturellement par le bacille de Koch. La positivité de la réaction chez-les animaux vaccinés gaine considérablement l'application des règles de rédhibition et plus encore dans la mise en oeuvre de la prophylaxie sanitaire collective, celle-ci implique comme règle formelle lUabattage de tous les bovins qui présentent une réaction positive à la tubercu line. De la sorte, même les animaux vaccinés sont considérés comme contaminés. On en est venu, dans la majorité des pays) à déconseiller l'emploi du BCG, et plusieurs d'entre eux-en sont m"eme arrivés à le prohiber, alors qu'un marquage biologique des animaux vaccinés permettrait de les différencier des animaux atteints d'infection naturelle. Une autre maladie qui affecte principalement les bovins est la Brucellose, maladie contagieuse à l'homme et grave aussi par les pertes importantes qu'elle cause à l'économie du pays. Cette maladie présente ce caractère particulier que les jeunes animaux sont peu ou pas réceptifs avant l'Sge de la puberté. Au fur et à mesure qu'ils avancent dans la période de puberté, ils deviennent de plus en plus réceptifs. Le maximum de sensibilité est atteint à l'age adulte et est particulièrement marqué en période de gestation. Pour déceler les animaux infectés, il existe de nombreuses réactions plus ou moins sensibles et plus ou moins simples à exécuter. La plus simple et la plus aisément praticable dans les laboratoires courants est la séro-agglutination lente. Les Brucella-contiennent parmi leurs antigènes constitutifs des substances agglutinogènes qui, au cours de l'infection même latente, provoquent chaz les sujets infectés l'apparition dans leurs humeurs et leur sérum d'un anticorps appelé agglutinine. La mise en présence du sérum de ces animaux et d'une suspension de Brucella entrasse à des taux variables l'agglutination de celle-ci. Cette réaction, malgré certaines défaillances, est la plus pratique pour le dépistage de la Brucellose, permettant des investigations sur une très grande échelle C'est cette méthode qui a été adoptée par les services sanitaires vétérinaires comme critère de l'infection pour la prophylaxie collective d'éradication, de même que pour le choix des animaux indemnes destinés au repeuplement et également pour la rédhibition. La Brucellose est comme la tuberculose une maladie réputée contagieuse. Une prophylaxie sanitaire collective est à l'épreuve et sera sous peu instaurée sur tout le territoire français. Pour lutter contre la Brucellosegil existe également des vaccins vivants non virulents dont les résultats sont jugés satisfaisants. Malheureusement ces vaccins provoquent chez les animaux vaccinés l'apparition des mêmes anticorps que chez les animaux malades et en particulier des agglutinines post-vaccinales, que les méthodes actuellement connues ne permettent pas de distinguer, ni simplement, ni d'une manière probante, des agglutinines postinfectieuses consécutives à une infection naturelle. Ceci est particulièrement accentué quand on utilise le vaccin à la période la plus favorable, c'est-à-dire chez l'adulte deux mois environ avant le début de la première gestation. De même que la Brucellose est plus agressive chez les adultes que chez les jeunes, de même le vaccin a une action plus marquée au fur et à mesure que le bovin avance en Avant quatre mois , l'immunité est de faible qualité et les agglutinines très fugaces; Passé 8 mois, l'immunité est meilleure mais la persistance des agglutinines risque de mettre les animaux hors commerce pour une assez longue durée. A 30 mois, l'immunite est encore plus grande, mais les agglutinines persistent pendant plusieurs années (2 ans au moins). C'est pourquoi les hygiénistes proposent la vaccination vers 6-7 mois; l'immunité n'est peut^etre pas parfaite mais dans ce cas,vers 18 à 20 mois, les agglutinines ont généralement disparu. On a également proposé d'employer comme vaccin des-sou- ches virulentes de Brucella dénuées de pouvoir agglutinogène. Plusieurs souches de ce type sélectionnées parmi les souches R (Rough) ne possèdent pas ou peu d'agglutinogène comme les souches S (Smooth). Mais expérimentées, elles ont montré en général qu après injection, il apparaissait chez les vaccinés des variantes génétiques (S) aggiutinogènes et de plus ces souches virulentes ou plus virulentes que le 319 classique pouvaient provoquer des avortements. On a alors pensé à utiliser ces souches R mais inactivées; toutefois dans ce cas leur pouvoir immunisant est très diminue et pour l'accrottre il est nécessaire de les mélanger avec un bon adjuvant huileux sans cependant obtenir des résultats aussi satisfaisants sue le plan de l'immunité qutavec la souche classique efficace Bol9 , Enfin employées à 50 mois, de telles souches peuvent provoquer l'apparition d'agglutinines d'une manière d'autant plus importante que le sujet a déjà,été vacciné à 6-7 mois par le 319. On voit donc tout llintérSt qu'il y aurait à ajouter aux vaccins brucelliques un marqueur biologique. Ce moyen d'identification: des animaux vaccinés permettrait de se libérer de l'obsession de la présence d'agglutinines post-vaccinales. Les hygiénistes pourraient choisir les vaccins les plus actifs sans se soucier de leur pouvoir agglutinogène. Ils pourraient les employer à l'age optimal de leur peine effi cacité. Voire, en cas de risque imminent, chez les vaches en gestation, pour assurer une immunité plus intense et plus durable sans craindre que, par effet de rappel, le taux des agglutinines, considérablement accru, ne soit une gAene pour la prophylaxie. Le marquage biologique des animaux vaccinés serait également intéressant dans le cas des maladies infectieuses ou contagieuses autres que la tuberculose et la Brucellose à chaque fois qu'un vaccin est utilisé pour la prophylaxie et qu'il est difficile d'assurer l'identification des sujets vaccinés par des réactions biologiques soit que celles-ci prêtent à confusion avec les réactions de dépistage de la maladie, soit que ces réactions sont difficiles à mettre en oeuvre et tres couteuses, comme c'est le cas pour la rage, et la maladie de Carré. I1 pourrait s'appliquer à toutes les maladies légalement réputées contagieuses, notamment en vue de prophylaxies collectives généralisées ainsi qu'aux autres maladies prévues au tableau A de l'Office International des épizooties. Les maladies contagieuses ne sont pas un souci uniquement pour la France. Elles préoccupent également tous les pays soucieux de protéger leur cheptel et pour cela ouvrent ou ferment leurs frontières avec circonspection selon l'état sanitaire du cheptel du pays exportateur et effectuent des barrages non seulement aux animaux qui en proviennent mais aussi aux produits d'origine animale qui peuvent en Atre tirés (viandes, abats, peau, os, etc.). Grâce à la présente invention, on peut encore reconnattre les produits en provenance d'animaux vaccinés. Quelques centimètres cubes de sang ou de sérosité ou de liqueur de macération des sous-produits peuvent permettre de retrouver les anticorps spécifiques des marqueurs biologiques comme chez les animaux eux mamies. La présente invention concerne donc un procédé de marquage biologique des sujets humains ou animaux vaccinés en vue de les distinguer des sujets atteints d'-fection naturelle, procédé selon lequel on administre auxdits sujets, en mAme temps que le vaccin, un antigène marqueur susceptible de provoquer une réponse biologique spécifique de la part de ces sujets avec apparition d'un anticorps correspondant qui sera le témoin de la vaccination, permettant ainsi de différencier celle-ci de l'infection naturelle. Cet antigène marqueur ne doit correspondre à aucun de ceux qui constituent l'arsenal antigénique ni de l'agent de la maladie, ni du vaccin. I1 ne doit pas être choisi parmi les antigènes qui pour les besoins thérapeutiques ou prophylactiques pourraient être administrés à l'espèce à vacciner pour guérir ou prévenir une autre maladie à laquelle elle pourrait être exposée. Les anticorps dont l'apparition est provoquée-par cet antigène marqueur ne doivent pas exister naturellement, sinon d'une manière exceptionnelle, chez l'espèce à vacciner. Ces anticorps doivent pouvoir etre détectées par. des réactions biologiques simples et faciles à interpréter qui ne risquent pas de compliquer les méthodes de dépistage. Ces antigènes marqueurs peuvent être de provenances diverses; par exemple ils peuvent être d'origine microbienne, tels que la toxine du bacille diphtérique utilisée sous forme d'anatoxine diphtérique, absorbée sur un support d'hydroxyde d'aluminium, de phosphate d'aluminium, de phosphate de calcium ou sur toute autre substance adjuvante telle que Latex, exci- pients gras, etc. L'immunité antidiphtérique peut être aisément décelée soit par réaction de Schïck, soit par floculaticn, scit par des réactions de précipitation en milieu gélifié. L'antigène marqueur peut également être d'origine végéta le. Les végétaux peuvent fournir toute une gamme de toxines - l'Abrine extraite de 1'Abrus precatorlus ou Jeriquity, - La Ricine extraite de Ricinus communis ou autres variétés de ricin, - la Crotine extraite de Croton tiglium - la RDbine extraite de l1Ecorce du robinier (Robinier pseudo acacia). Ces subtances irritantes sont comme la toxine diphtérique des- toxines dermotoxiques et dermonécrotiques. Comme elle, on peut-les transformer en anatoxines et les anticorps correspondants antiabrine, antiricine, etc. peuvent astre mis en évidence par des réactions dermiques et des réactions sérologiques de floculation, de précipitation, etc. On peut également ajouter à cette liste la saponine et certaines toxines extraites de papilionacées (phaseolus, pisum, Vicia, etc). Enfin de nombreux vétégaux contiennent des protéines qui par injection comme antigènes peuvent provoquer des anticorps antiprotéines spécifiques (protéine de la noix de Para, Edestine du chanvres Gliadlne du seigle, Zéine, Hordéine, etc.). On peut y ajouter les enzymes végétaux, par exemple l'amylase du malt d'orge pour obtenir une antiamylase. L'antigène marqueur peut egalement astre d'origine animale. Les animaux peuvent fournir des toxines utilisables comme antigènes, telles que venins des différentes espèces de serpents, d'insectes, de poissons (vives), d'actinies, de mollusques, etc. On peut ajouter le sérum d'anguille, ainsi que certaines protéines animales. L'antigène marqueur peut Aetre associé au vaccin de différentes manières 10) Lorsque le vaccin est à l'état liquide, l'antigène marqueur s'il est compatible, peut tre mélangé avec le vaccin dans la même ampoule; dans le cas contraire, il peut être conditionné en ampoule séparée et, soit injecté en mélange avec le vaccin, soit injecté simultanément avec ce dernier. 20) Lorsque le vaccin est à l'état lyophilisé, le "marqueur" peut être lyophilisé en mélange avec le vaccin, et remis en solution par un soluté, ou bien il est présenté dans l'ampoule de soluté et sert à dissoudre le lyophylisat de vaccin. 3 ) Lorsque le vaccin est à l'état adsorbé sur un excipient gras ou sur un adjuvant, le marqueur peut être soit incorporé à l'exci- pient ou encore être présenté à part et incorporé lui-mme dans le mme excipient pour être injecté dans les mêmes conditions que les vaccins liquides. Dans tous les cas il est avantageux dÇadsorber l'antigène marqueur, soit sur de l'hydroxyde d'aluminium, du phosphate d'aluminium ou sur du phosphate de calcium,etc. A titre d'exemple non limitatif, à un vaccin Brucellique, on peut associer, comme antigène marqueur, de l'anatoxine diphtérique adsorbée sur du phosphate de calcium, les bovins- n'étant pas sensibles à la diphtérie. La proportion d'anatoxine est comprise entre 40 et 60 unités. Un tel vaccin combiné provoquera chez l'animal auquel il est injecté 1'apparition,d 'une part des anticorps brucelliques dont les agglutinines et, d'autre partdunanticorps témoin qui est l'antitoxine diphtérique. L'immunité antidiphtérique est aisément décelable sur l'animal ainsi vac-ciné, par la réaction de Schick ou par floculation ou précipitation. On peut ainsi le différencier d'un animal malade ou d'un animal indemne non vacciné d'après le tableau qui suit Cas Présence d'agglu- Présence d'anti- Conclusion tinines toxine diphtérique I + + Animal vacciné II + - Animal infecté III ' - Animal indemne non vacciné IV - + Animal vacciné qui a perdu ses agglutini nes Comme autre exemple non limitatif, on peut associer au vaccin BCG, comme antigène marqueur, de l'anaricine, en quantité correspondant à 2000doses mortelles de ricine. L'injection de ce vaccin combiné provoque chez l'animal l'apparition d'une part des anticorps tuberculeux allergisant à la tuberculine et d'autre partd'unanticorps témoin qui est l'antiricine que l'on peut déceler par les méthodes sérologiques courantes. Ceci permettrait de lever l'interdiction de l'emploi du BCG. Le choix de l'antigène marqueur à affecter au vaccin contre une maladie déterminée pourra faire l'objet de conventions décidées au niveau des organismes sanitaires nationaux ou internationaux. R E V E N D I C A T I O N S 1. Vaccin permettant de différencier les sujets humains ou animaux vaccinés des sujets atteints d'infection naturelle, caractérisé en ce qu'il est associé à au moins un antigène marqueur susceptible de provoquer une réponse biologique spécifique de la part des sujets humains ou animaux vaccinés, avec apparu tion dtun anticorps correspondant qui sera le témoin de la vaccination, 2o Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène marqueur est une anatoxine d'origine microbienne, telle que l'anatoxine diphtérique 30 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène marqueur est une anatoxine'végétale dérivée notamment de labrJine, de la ricine, de la crotine, de la robine, de la saponine, ou dtextraits de papilionacées. 4. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que antigène marqueur est une protéine végétale, notamment la protéine de noix de para, l'Edestine du chanvre, la gliadine du seigle, la zéine, lthordéine. 50 Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène marqueur est un enzyme végétal tel que l'amylase du malt d'orge. 6. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que antigène marqueur est une toxine animale, notamment les venins de serpents, d'insectes, de poissons, d'actinies, de mollusques0 7. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que antigène marqueur est le sérum d?anguille. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène marqueur est une protéine animale. 90 Vaccin selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que antigène marqueur est adsorbé sur un support tel que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, le phosphate de calcium, les excipients gras et analogues. 10. Vaccin brucellique associé à de l'anatoxine diphtérique adsorbée sur du phosphate de calcium dans la proportion de 40 à 60 unités ilo Vaccin antituberculeuz-B C G associé à de ltanaricine en quantité corresmondant à 2000 doses mortelles de ricine. 12. Procédé de marquage biologique des sujets humains ou animaux vaccinés en vue de les distinguer des sujets atteints d'infection naturelle, caractérisé en ce que IPon administre auxdits sujets, en même temps que le vaccin, au moins un antigène marqueur susceptible de provoquer une réponse biologique spécifique de la part de ces sujets avec apparition dtun anticorps correspondant qui sera le témoin de la vaccination.