FR 2097008 A1 19720303 FR 7027583 A 19700727 L'invention a pour objet des produits permettant d'augmenter le taux de L-tyrosine dans le sang, les humeurs et les tissus, soit que cette augmentation s'avère ellemême souhaitable, soit qu'on la recherche en vue de la production, dans l'organisme, de produits de son ' métabelisme tels que la Dopa, la Dopamine, la noradrénaline, l'adrénaline ou encore l'une des hormones du corps thyroïde (thyroxine). En conséquence, l'invention intéresse, entre autres les sujets souffrant de troubles nutritionnels ainsi que ceux qui sont atteints de la maladie de Parkinson, d'états de choc traumatique ou de dysfonctionnements thyroidiens. Les produits qui font l'objet de l'invention sont les médicaments qui constituent les composés chimiques autres que la tyrosine elle-même et possédant le radical trivalent sous la forme dextrogyre, lévogyre ou racémique, ces composés étant destinés à être administrés à un être vivant du règne animal, en particulier à un homme, et cela en quantité suffisante pour provoquer une augmentation appréciable du taux de Tyrosine dans au moins l'un des tissus du groupe constitué par le sang, les humeurs et les organes. I1 s'agit notamment des esters, amides et estersamides des D, L et DL-tyrosines, des DL et DL-phénylalani- nes, de leurs esters, amides et esters-amides ainsi que des sels dans lesquels le cation ou l'anion provient d'un de ces composés. Les amides dont il s'agit sont ceux qui engagent l'azote de l'acide aminé et non son carboxyle. Sont plus particulièrement utilisables les composés répondant à la formule dans laquelle R1 = H ou OH R2 = H ou CH3CO R3 = H ou C2H5 la tyrosine elle-meme (R1 = OH, R2 = R3 = H) étant exclue ; les composés peuvent être sous la forme de sels dans lesquels soit le cation soit l'anion provient de l'amino-acide. Les composés utilisés sont plus particulièrement le h-tyrosinate d'éthyle, les D, L et 3L-phénylalanines ainsi que leurs esters éthyliques et la N-acétyl tyrosine. En tant que composés chimiques ces corps sont connus. Il est surprenant de constater, que si l'administration de la L-tyrosine elle-même par la voie orale ne conduit qu'à une augmentation minime de la L-tyrosinémie, celle d'un de ses dérivés choisis dans les classes déjà citées ou encore de phénylalanine sous forme d'amino-acide ou des dérivés indiqués ci-dessus aboutit au phénomène recherché. On exposera ci-après l'expérimentation à laquelle la Demanderesse s'est livrée ; les températures sont en degrés centigrades. CONDITIONS J) 'AJ)MINISoeRATION Les produits essayés ont été administrés par la voie orale, en une seule dose, à des animaux préalablement mis à jeun pendant 24 heures afin que soit obtenue une tyrosinémie initiale stable et indépendante des conditions d'alimentation. MEEHODES DE DOSAGE Les dosages de L-tyrosine dans le sang total et les organes ont été effectués par deux méthodes indépendantes qui ont conduit à des résultats parfaitement concordants. La première est une méthode enzymatique dérivant de la technique de LA DU et ses collaborateurs (Pediatrics, volume 31 (1963) pages 39 à 46) 3 la seconde est une méthode spectrofluorimétrique dérivant de la technique de WONG et ses collaborateurs (Clinical Chemistry, volume 10, (1964) pages 1098 à 1104). Des modifications ont été apportées aux techniques de base décrites dans la littérature à dessein d'en améliorer l'efficacité.Les modes opératoires utilisés sont décrits ci-dessous A - Dans le sang total a - Méthode enzymatique 4 ml de sang total sont déprotéinisés par 2 mol d'une solution aqueuse 0,93 molaire d'acide perchlorique pendant 24 heures à 40. Après centrifugation, 1,5 ml du liquide surnageant est additionné de 0,5 ml d'une solution aqueuse 0,63 molaire de phosphate tripotassique et de 2 ml de solution tampon arséniate-borate (molaire en arséniate, trois fois molaire en borate et ajustée à pH 6,5).Après repos de 30 minutes au bain de glace pour précipiter le perchlorate de potassium, ce précipité est éliminé par centrifugation et 2 ml de liquide surnageant sont prélevés pour le dosage et introduits dans une cuve de spectrophotomètre en silice, de 1 cm de chemin optique. La densité optique de la solution est mesurée aux 3 lon gueurs d'onde suivantes; 303 mn, 323 m 345 m par rapport à une solution de référence contenant les mêmes constituants sauf le sang. Ces valeurs constituent les blancs d'échantillon. On ajoute ensuite dans la cuve 0,2 ml d'une solution aqueuse à 5 mg/ml de venin lyophilisé de Crotalus adamanteus (préalablement centrifugéé et parfaitement limpide). Après 45 minutes à température ambiante, les densités optiques aux 3 mêmes longueurs d'onde sont à nouveau mesurées, par rapport à la solution de référence précédente additionnée de venin.Les solutions étalons sont constituées par des solutions pures de L-tyrosine, de L-phénylalanine et de i tryotophane de titre exactement connu et voisin de 35 Fg/ml dans une solution aqueuse 0,31 molaire d'acide perchlorique, qui sont soumises au meme mode opératoire que ci-dessus à partir du prélèvement de liquide surnageant de déprotéirisation A chaque longueur d'onde, les densités optiques finales sont diminuées des 10/11 des densités optiques des blancs correspondants (le coefficient 10/11 provenant de la dilution amenée par l'addition de venin. Les valeurs ainsi obtenues pour les essais et pour les étalons servent à constituer un système de trois équations du premier degré à trois inconnues dont les solutions sont les concentrations en L-tyrosine, L-phénylalanine et L-tryptophane de l'échantillon de sang analysé. Ces concentrations sont exprimées en g par mi de sang total. Dan-s les cas où les teneurs du sang en acides aminés dosables sont trop élevées pour être correctement mesurées, le mode opératoire est appliqué à des prises aliquotes plus faibles de surnageant de déprotéinisation, complétées à 1 b - Méthode spectrofluorimétrique L'échantillon de sang total est déprotéinisé par addition d'un égal volume de solution aqueuse à 100 g/l d'acide trichloracétique. Après 30 minutes, le précipité est éliminé par centrifugation et 0,2 ml de liquide surnageant sont prélevés pour le dosage. A cette prise d'essai est ajouté 1 ml de réactif à l nitroso -naphtoi (qu'on obtient en mélangeant 10 volumes de solution éthanolique d'-nitroso (3-naph- tol à 2 mg/ml, 15 volumes de solution aqueuse de nitrite de sodium à 6,9 mg/ml et 15 volumes d'acide nitrique 3 N).La solution obtenue est incubée 25 minutes à 550 puis diluée par 5 ml d'eau et extraite par 10 mi de dichloro-éthylène. La phase aqueuse est centrifugée, laissée au repos pendant 35 minutes dans un bain de glace puis examinée au spectrofluorimètre SuiINCO-BOWEB , au couple de longueurs d'onde 470 mp /560 m . Des solutions étalon de L-tyrosine de concentrations exactement connues -et comprises entre 0 et 20 mcg/ml sont traitées de la mebme façon que l'échantillon de sang et servent à construire la droite d'étalonnage. On calcule la concentration en L-tyrosine de l'échantillon de sang en se référant à cette droite et on l'exprime en pg/ml. B - Dans les organes a - Méthode enzymatique Un fragment d'organe de poids frais connu est introduit, dès prélèvement, dans un volume convenable d'une solution diluée d'acide perchlorique et homogénéisé à l'aide d'un homogénéiseur à tissus tournant à grande vitesse, par exemple un broyeur ULTRA TURRAX, de telle façon que la concentration finale du produit homogénéisé soit 0,31 molaire en acide perchlorique. Après 24 heures d'attente à 4 la partie insoluble est éliminée par centrifugation et une portion aliquote du liquide surnageant est prélevée, complétée à 1,5 ml à l'ai- de de solution aqueuse 0,31 molaire d'acide perchlorique et soumise au même mode opératoire que le liquide surnageant de déprotéinisation du sang. b - Méthode spectrofluorimétrique La même technique de préparation que pour le dosage enzymatique est utilisée, sauf que l'acide perchlorique est remplacé par l'acide trichloracétique à une concentration telle que le produit homogénéisé final contienne 50 mg/ml d'acide trichloracétique. Une portion aliquote, inférieure ou égale à 0,2 ml de liquide surnageant, est prélevée pour le dosage après avoir été complétée à 0,2 ml à l'aide de solution d'acide trichloracétique à 50 mg/ml, suivant le mode opératoire décrit pour le sang. EX1;,E DE RéSULTATS Les tableaux suivants montrent quelques exemples des résultats obtenus avec quelques corps appartenant aux classes précédemment définies. En tAete de chaque tableau figurent le nom du produit employé et la dose administrée en millimoles par kg de poids corporel. A titre indicatif, la dose la plus couramment utilisée de 2,76 millimoles/kg correspond à 500 mg/kg de tyrosine. Tous les essais présentés dans ces tableaux ont été réalisés chez le rat. Les valeurs indiquées sont les moyennes des valeurs individuelles obtenues avec au minimum 3 animaux soumis aux mêmes conditions expérimentales. TABLEAU L-tyrosine (2,76 millimoles/kg) Temps après Sang Foie Rate Rein administration g O (témoins) 17 16 18 29 30 minutes 50 27 38 53 1 heure 51 55 41 58 2 heures 47 37 44 65 3 heures 55 27 39 55 4 heures 40 31 32 70 5 heures 22 24 22 34 TABLEAU II Tyrosine (1 millimole/kg) Temps après administration üuuscle O (témoins) 15 31 17 22 30 minutes 28 39 34 29 1 heure 30 45 27 31 2 heures 28 38 39 38 3 heures 19 34 35 31 4 heures 21 34 38 33 5 heures 18 31 21 30 TABLEAU III L-tyrosinate d'éthyle (1,38 millimoles/kg) Temps aptes Sang Foie Rate Rein Muscle administration O (témoins) 17 26 36 31 24 5 minutes 87 115 96 60 40 15 minutes 147 129 132 91 102 30 minutes 208 127 170 153 127 45 minutes 157 71 106 94 116 90 minutes 72 47 88 62 75 3 heures 37 30 68 51 47 TABLEAU IV N-acétyi-L-tyrosinate d'éthyle (2,76 millimoles/kg) Temps après administration Sang Foie Rate Rein Muscle O (témoins) 17 28 33 26 29 30 minutes 34 39 61 57 36 1 heure 36 42 79 43 51 1 heure 30 43 45 93 30 52 2 heures 36 38 83 31 42 3 heures 40 42 80 35 46 4 heures 40 45 98 26 42 TABLEAU V L-phénylalànine (2,76 millimoles/kg) Temps après administration Sang Foie Rate Rein O (témoins) 16 24 32 23 30 minutes 114 155 1v1 112 1 heure 198 159 158 121 2 heures 143 213 164 154 3 heures 70 64 90 74 4 heures 73 59 94 66 5 heures 50 41 70 36 TABLEAU VI Ci-phênylalanine (2,76 millimoles/kg) Temps agrès administration Sang Foie Rate Rein uscle O (témoins) 12 20 27 19 30 minutes 27 28 48 27 36 1 heure 27 32 55 29 49 2 heures 38 33 66 34 69 3 heures 52 55 83 48 87 4 heures 57 54 95 57 108 5 heures 39 36 67 41 75 TABLEAU VII DL-phénylalanine (2,76 millimoles/kg) Temps après administrationMuscle O (témoins) 14 34 32 39 25 30 minutes 62 95 84 70 57 1 heure 53 95 98 70 76 2 heures 61 90 97 73 82 3 heures 47 86 120 80 79 4 heures 55 81 102 80 109 5 heures 38 41 80 58 62 TABLEAU VIII L-phénylalaninate d'éthyle (2,76 millimoles/kg) Temps apres administration Sang Foie Rate Rein Muscle O (témoins) 15 32 35 35 24 15 minutes 101 165 103 79 49 30 minutes 100 126 92 81 69 1 heure 143 137 130 118 113 2 heures 102 75 112 87 85 3 heures 47 46 65 53 50 4 heures 35 50 55 49 30 Les essais effectués chez le rat et cités ci-dessus ont été confirmés chez le chien et ont conduit à des résultats t tout à fait concordants. Par ailleurs, les mimes produits ont été essayés à diverses doses ! l'aspect qualitatif du phé- nomène observé reste le même à toutes les doses essayées (de 1/10 à 1,5 fois la dose standa d de 2,76 millimoles/kg) mais les teneurs maximales en tyrosine sanguine ou organique en fonction des doses administrées présentent une courbe effet/dose de type classique. Ces résultats montrent que, dans tous les cas, les dérivés de la tyrosine ou de la phénylalanine appartenant aux classes citées ci-dessus permettent d'obtenir des élévations des concentrations en L-tyrosine très significatives dans le sang et dans les organes. Les valeurs présentées dans les tableaux I et II correspondant respectivement à la L et à la Tyrosine sont données à titre de comparaison. Le tableau I montre que l'administration orale d'une dose unique de 500 mg/kg de L-tyrosine ne permet d'obtenir que des taux maximums de L-tyrosine dans le sang ou les organes de l'ordre de trois fois les taux physiologiques normaux. Les valeurs obtenues avec la Styrosine (tableau II) - après correction pour les doses - sont encore plus faibles. Au contraire, les teneurs en L-tyrosine du sang et des organes, après administration de L-tyrosinate d'éthyle (tableau 1II) à une dose égale à la moitié de la dose de L-tyrosine (tableau I), sont de l'ordre de douze fois le taux normal pour le sang et de cinq fois pour les organes, ce qui est considérable. L'augmentation des taux de L-tyrosine est extrêmement rapide après administration - environ 40 % du tauxxmaximum dès 5 minutes - et de durée relativement brève. Néanmoins, le taux après 3 heures est encore plus de deux fois le taux normal. L'administration de N-acétyl L-tyrosinate d'éthyle (tableau IV) conduit à des taux qui ne sont que de l'ordre de deux fois les taux normaux mais qui sont remarquablement stables dans le temps. L'administration de la L-phénylalanine (tableau V) conduit à des taux de L-tyrosine également très élevés (au maximum douze fois le taux normal dans le sang, cinq à neuf fois dans les organes), très précoces (sept fois le taux normal dans le sang après 30 minutes) et durables (trois fois le taux normal dans le sang après 5 heures). L'administration de D-phénylalanine (tableau VI) conduit à des taux maximums de l'ordre de quatre fois et demie le taux normal dans le sang. Ce maximum est atteint tardivement - après 3 à 4 heures - et est assez persistant plus de trois fois le taux normal entre 2 et 5 heures. Ces résultats montrent sans équivoque que les animaux supérieurs peuvent métaboliser des acides aminés de la série D et les transformer en acides aminés de la série L. L'administration de DL-phénylalanine (tableau VII) conduit à des résultats intermédiaires entre ceux qui ont été obtenus avec la L et avec la D-phénylalanine respectivement. Les concentrations maximums de L-tyrosine sont atteintes précocement et correspondent à la consommation rapide de la fraction de produit de la série L. La décroissance des taux est ensuite particulièrement lente car la D-phénylalanine contenue dans la forme racémique est à son tour utilisée avec le retard mis en évidence dans les essais rapportés dans le tableau VI. L'administration du L-phénylalaninate d'éthyle (tableau VIII) conduit à des résultats voisins de ceux qui sont obtenus avec la L-phénylalanine elle-meme. Ces résultats montrent cono que le choix judicieux de l'un des corps appartenant aux classes citées ci-dessus ou une combinaison de deux de ces corps ou plus permettent d'obtenir des taux sanguins et organiques de L-tyrosine dont la valeur absolue et l'évolution dans le temps, après administration, peuvent autre réglées avec précision dans une large gamme, en fonction du but thérapeutique recherché. On peut en particulier associer dans une même forme galénique de la L ou de la DL-phénylalanine et du L-tyrosinate d'éthyle. Sans limiter l'invention, on indiquera, à titre d'exemples, les formules galéniques suivantes (comprimés) Formule 1: L-tyrosinate d'éthyle 575 mg Cellulose microcristalline 340 mg Stéarate de magnésium 5 mg Formule 2 DL-phénylalanine 500 mg Cellulose microcristalline 296 mg Stéarate de magnésium 4 mg Formule 3 IIL-phénglalanine 250 mg L-tyrosinate d'éthyle 288 mg Cellulose microcristalline 318 mg Stéarate de magnésium 4 mg La dose quotidienne peut être chez l'adulte 500 à 6000 mg de principe actif. V 13 N D I C A T I O il S 1.- Au titre de médicament, un composé de la classe constituée par les esters, amides et esters-amides des D, L et DL-tyrosines, les D, L et DL-phénylalanines, leurs esters, leurs amides et leurs esters-amides, ainsi que les sels dans lesquels le cation ou l'anion provient d'un de ces composés, les amides étant ceux où l'azote de l'acide aminé est engagé. 2.- Au titre de médicament, un composé de la classe constituée par les esters, amides et esters-amides des D, L et DL-tyrosines et des D, L et DL-tyrosines ainsi que les sels dans lesquels le cation ou l'anion provient d'un de ces composés, les amides étant ceux où l'azote de l'acide aminé -est engagé. 3.- Au titre de médicament un composé dextrogyre, lévogyre racémique répondant à la formule dans laquelle R1 représente H ou OH R2 représente H ou CH3CO R3 représente H ou C2H5 exception faite de la tyrosine elle-merle (R1 = OH, R2 = Z3 = H). 4.- .u titre de médicament un composé dextrogyre, lévogyre ou racémique répondant à la formule dans laquelle 1 représente H ou OH représente H ou CH3CO R3 représente H ou C2H5 sous la réserve que R2 et R3 ne désignent pas tous deux H. 5.-- Un sel de composé conforme à la revendication 3, le cation ou l'anion du sel étant fourni par ledit composé. 6.- Un sel de composé conforme à la revendication 4, le cation ou l'anion du sel étant fourni par ledit composé 7.- médicament caractérisé par le fait qu'il com- prend au moins un composé du groupe constitué par le L-tyro- sinate d'éthyle la N-acétyl-tyrosine, la la D-phénylalanine, la L-phénylalanine et la DL-phényl alanine g conjointement avec un excipient pou l'administration orale. 8.- iiiédicament caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un composé du groupe constitué par le L-tyrosinate d'éthyle et la iZ-acétyl -tyrosine, conjointement avec un excipient pour l'aininistration orale.