FR 2123524 A1 19720908 FR 7202946 A 19720128 La présente invention se rapporte à des dérivés d'insuline. Comme des méthodes d'ensemble pour la détection du diabetes mellitus sont introduites et comme la durée de vie normale à laquelle on peut s'attendre stallonge, l'incidence enregistrée de cette maladie augmente constamment. Le traitement actuel se compose d'un contrôle diététique, ordinairement en combinaison avec des injections d'insuline ou avec un produit pharmaceutique anti-diabétique à administration orale et, dans des cas fréquents, des in Jections une ou deux fois par jour sont nécessaires durant toute la vie du patient. Blême avec ce traitement, le niveau de sucres du sang du patient varie considérablement par rapport à la normale, ce qui nécessite un régime strict.Les produits pharmaceutiques à administration orale ne conviennent que dans des cas modérés de diabète et on considère maintenant qu'ils ont certains effets secondaires peu souhaitables. En plus des inconvénients mentionnés cidessus dans le traitement actuel, une certaine proportion de diabétiques produit des anticorps vis-à-vis de l'insuline et devient de plus en plus résistant à son action. C'est L'objet principal de la présenté invention de produire des agents thérapeutiques améliorés qui fournissent un meilleur contrôle du niveau de sucres du sang que celui obtenu par les présentes. méthodes de traitement. Dans ce but, la recherche a été poursuivie pour connaltre les propriétés de dérivés d'insuline, domaine dans lequel, malgré les efforts de nombreux chercheurs, peu de conclusions définitives avaient été atteintes jusqu a présent, principalement par suite du fait que lton n'zvait pas réussi à sépa- rer et à identifier de manière adéquate les composants individuels du mélange complexe qui résulte de l'acylationetd'autres réactions auxquelles les insulines d'origine ont été soumises. Plus spécifiquement, un des buts de la présente invention est de produire des dérivés d'insuline qui sont facilement solubles dans liteau, facilement isolés d'un mélange réactionnel, qui ont des propriétés immunologiques acceptables et qui conservent une proportion appréciable de l'activité hypoglycémique de la substance d'origine. Selon la présente invention, des dérivés d'insuline satisfaisant aux objets mentionnés ci-dessus en proportion notable sont ceux dans lesquels au moins un des aminoacides des unités d'aminoacides A1 (glycine), B1 (phénylalanine) et B29 (lysine) est transformé en un groupe aminé bloqué, ayant un substituant pouvant former un anion. De préférence, le substituant est celui qui, à l'état ionisé, porte une charge négative résultante et est ainsi exempt, par exemple, d'autres radicaux tels que des groupes aminés qui pourraient conférer un équilibre électrique d'ensemble au substituant. Avantageusement, au moins deux, et, de manière souhaitable, les trois groupes aminés indiqués sont transformés en groupes aminés bloqués par remplacement d'un ou de plusieurs atomes d'hydrogène. Les nouveaux dérivés d'insuline définis ci-dessus sont non seulement biologiquement actifs en propre mais ils sont d'un intérêt supplémentaire comme intermédiaires sur lesquels d'autres modifications chimiques de la molécule d'insuline peuvent être ef fectuées, ce qui permet de réaliser encore des progrès pour fournir une thérapeutique plus contrôlée et plus efficace telle que mentionnée précédemment. Les modifications supplémentaires auxquelles on se réfère sont, selon un autre aspect de la présente in vention, effectuées à l'emplacement des groupes hydroxyles contenus dans des unités de tyrosine dans les molécules d'insuline.Le blocage des groupes hydroxyles de la tyrosine donne ordinairement lieu à un dérivé relativement inactif mais dans lequel le blocage des groupes aminés est généralement d'une nature permanente, le blocage de la tyrosine étant conçu comme mesure temporaire, le composé retournant lentement in vivo à son précurseur biologiquement actif. Ce dernier effet a lieu par suite d'une hydrolyse chimique ou enzymatique in vivo et, selon le choix du groupe de blocage, la vitesse de retour diffèrera d'un dérivé à un autre. Le but du blocage de la tyrosine est de réduire l'effet hypoglycémique initial lors de l'administration de la substance, en permettant ainsi d'administrer une dose plus élevée. Le retour graduel à un dérivé actif entrat- ne en conséquence une configuration plus uniforme du contrôle des sucres du sang. L'effet global visé, lorsqu'on utilise des dérivés d'insuline de cette manière, est un effet de prolongation de l'action hypoglycémique. Des dérivés fournis par la présente invention ont provoqué un effet hypoglycémique qui a persisté pendant de plus longues périodes de temps que celui de la quatrième norme internationale pour l'insuline quand on les a testés sur le cochon d'Inde. Pour plus de commodité, les principes qui s'appliquent au blocage des groupes aminés et des groupes hydroxyles seront discutés séparément. Blocage des groupes aminés Un type spécialement convenable de groupes de blocage dans les buts de la présente invention est le groupe acyle et des résultats remarquables ont été obtenus par acylation contrôlée des insulines d'origine avec des dérivés fonctionnels de diacides, tels que, par exemple, des acides dicarboxyliques, en employant les anhydrides d'acides, les halogénures d'acides ou des produits réagissants équivalents appropriés. Nombreux parmi les procédés d'acylation qui sont bien connus et utilisés de manière très générale dans le domaine de la chimie des peptides sont applicables à la préparation de dérivés selon la présente invention.L'acylation avec ces produits réagissants entralne la formation de N-substituants ayant des groupes carboxyliques libres qui s ionisent fac i- le ment pour augmenter la charge négative globale sur la molécule d'insuline. Par suite de leur charge négative renforcée, les niolé- cules du dérivé d'insuline sont moins susceptibles de former des agrégats que celles de l'insuline d'origine et, pour cette raison, sont plus facilement solubles dans des solvants aqueux. En outre, cette propriété peut également expliquer la réduction observée d'antigénicité des dérivés acylés et d'autres dérives, qui constitue une propriété très importante des nouveaux dérivés de la Dré- sente invention (antigénicité vis-à-vis des anticorps dirigés contre l'insuline). Un grand nombre de groupes acyles d'acides dicarboxyliques peut être introduit dans la molécule d'insuline mais on trouve que l'activité des dérivés s'abaisse après un certain point, en fonction d'une augmentation de dimension des groupes substituants et, pour cette raison, on préfère que les substituants ne contiennent pas plus d'environ 6 ou environ 8 atomes de carbone. Des résultats particulièrement bons sont obtenus avec des groupes acyles dérivés d'acide succinique, d'acide glutarique, d'acide maléique, d'acide monométhylmaléique et d'acide diméthylmaléique. L'acylation des insulines avec des dérivés fonctionnels d'acides dicarboxyliques, par exemple des anhydrides, est très convenablement susceptible d'être contrôlée. Si la réaction est réali see avec un excès relativement faible d'agent d'acylation, par exemple 2 à 5 moles par groupe aminé et à un pH neutre ou modérément alcalin, par exemple 7-8, la réaction se déroule, avec un rendement très élevé, avec formation du dérivé disubstitué résultant de la réaction des groupes aminés A1 et B1. Si l'excès d'agent d'acylation est augmenté fortement, par exemple jusqu a une proportion décamolaire, la réaction peut être amenée à se dérouler sur le groupe aminé B29 pour former le dérivé trisubstitué.Pour un pH dans la gamme prévue, la réaction n'est pas compliquée par l'0-acy latin des restes de tyrosine parce que des dérivés stables 0-acylés ne sont pas formés dans ces conditions. Les dérivés résultants sont insolubles à un pH acide et peuvent ainsi être facilement retirés du mélange réactionnel par précipitation, par exemple, à un pH de 5. Les produits ainsi obtenus peuvent être séparés par filtration ou centrifugation et formulés sous forme de poudres sèches facilement maniables. Les produits sont facilement solubles dans des milieux aqueux à des pli de 5 à 8, ce qui simplifie leur préparation et leur administration par comparaison avec les insulines d'origine. Dans certains cas, certains groupe acyles sont retirés dans des conditions fortement acides et, en conséquence, il faut bien faire attention lorsqu'on récupère les produits par le procédé décrit. Comme on l'a indiqué ci-dessus, au moins un et de préférence deux des groupes aminés de l'insuline sont bloqués par des radicaux substituants formant des anions. Les autres groupes aminés dans la molécule d'insuline peuvent être laissés sans substituant ou, si on le désire, bloqués avec des groupes de la même nature ou d'une nature différente, c'est-à-dire ne contenant pas nécessairement des radicaux formant des anions, par exemple, le radical acéstyle, le radical carbamyle, un radical carbamyle N-substitué, par exemple le radical N-méthylcarbamyle et d'autres radicaux N-alkylcarbamyles. On prévoit, en outre, que des dérivés contenant un grand nombre de groupes de blocage dans la même molécule peuvent être souhaitables pour obtenir des effets de prolongement optima dus à une résistance améliorée à l'aminopeptidase.En outre, l'utilisation de mélanges de dérivés qui permettent l'optimisation des effets ou un autre contrôle avantageux de la thérapeutique est prévue selon la présente invention. On a trouvé que des produits typiques fournis selon la présente invention, par exemple, les dérivés di- et tri-succinyliques possédaient une activité hypoglycémique initiale comparable mais ordinairement moindre que celle des insulines d'origine. Ceci permet d'utiliser des doses plus élevées et, par suite de la tendance des dérivés à persister plus longtemps dans l'organisme, l'ef- fet est celui d'un prolongement de l'action hypoglycémique. Blocage des groupes hydroxyles Les dérivés d'insuline contenant des groupes O-acyles sur un ou plusieurs restes'de tyrosine, en plus d'un ou de plusieurs groupes Acyles, sont également considérés selon la présente invention. Ordinairement, l'0-acylation exigera des conditions différentes de la N-acylation. Ainsi, les quantités de produit réagissant exigées sont d'ordinaire supérieures à celles exigées pour la N-acylation et des excès molaires de l'ordre de 10-50 peuvent être nécessaires pour une réaction complète sur la tyrosine. Egalement, les pH de réaction sont plus élevés, par exemple environ 9, et on doit bien faire attention à la labilité potentielle des composés d'O-acyltyrosine à ces pH élevés, si bien que le pH du mélange réactionnel est abaissé dès que le degré exigé de réaction s'est produit.En outre, avec l'0-acylation, différents groupes d'acylation peuvent être exigés pour avoir de meilleurs résultats. Ainsi, tel qu'indiqué ci-dessus, des groupes succinyles et certains autres groupes, qui sont d'excellents groupes de blocage sur l'azote, ne sont pas suffisamment stables comme groupes de blocage sur ltoxy- gène. Comme l'0-acylation entraîne presque invariablement un dérivé inactif, il est essentiel, pour que l'activité s'exprime, que le groupe de blocage sur l'oxygène soit retiré in vivo. En conséquence, le choix du produit réagissant de blocage sera déterminé par le degré désiré de stabilité des groupes hydroxyles bloqués. Les groupes acétyle et glutaryle, par exemple, sont, pour ces raisons, préférés aux groupes succinyles. Des radicaux cycliques, qui offrent un empêchement stérique vis-à-vis de l'hydrolyse et, en conséquence qui fournissent un retard dans le retour à une substance active, sont également intéressants, par exemple le groupe cyclopropanecarbonyle et cyclobutylcarbonyle. De plus, il y a quatre restes de tyrosine dans la molécule d'insuline, et le blocage partiel et le blocage complet de la tyrosine sont compris dans le domaine de la présente invention. L'acylation de la tyrosine ou autre forme de blocage peut être facilement contrôlée en mesurant la diminution du pic d'absorption caractéristique de la tyrosine à environ 275 millimicrons.Par exemple, un dérivé N-trisubstitué peut être acylé par incrément et la réaction terminée quand la réduction d'absorption indique que le degré désiré de substitution a eu lieu. Quand des restes de tyrosine sont acylés, on trouve que deux groupes hydroxyles sont facilement bloqués, tandis que les deux autres sont d'un accès plus difficile. Des variantes à l'acylation sont possibles pour le blocage des groupes hydroxyles et des résultats supérieurs ont été obtenus par la carbamylation qui est convenablement réalisée, par exemple, par réaction avec un cyanate de métal alcalin. Pour tenir compte du problème de l'instabilité des groupes O-carbamyles à des pH supérieurs (par exemple 8) et de l'instabilité du produit réagissant à des pH inférieurs (par exemple 6), le pH est généralement diminué par étape durant la réaction (par exemple en commençant à 8 et en finissant à 6). Des groupes carbamyles N-substitués peuvent être également introduits. La carbamylation est une réaction prenant relativement beaucoup de temps et on trouve en pratique qu'un mélange à l'équilibre est obtenu, dans lequel il est rare d'obtenir plus d'environ 70 ffi de la proportion théorique maxima du blocage. Les procédés et les groupes utilisés seront déterminés partiellement par des considérations d'isolement des produits mais principalement en se référant à la vitesse exigée d'enlèvement du groupe ou des groupes in vivo ; ce dernier point peut être facilement testé par des expériences d'hydrolyse in vivo qui simulent des conditions physiologiques en permettant l'adaptation du produit final selon les exigences des patients particuliers. Les composés de la présente invention sont convenablement manipulés et formulés sous forme de poudres précipitées à un pH acide. Dans une telle forme, les dérivés sont au point iso-électrique. Cependant, des sels physiologiquement acceptables des dérivés peuvent être utilisés si on le désire. Comme avec les insulines d'origine, le zinc peut être présent sous une certaine forme dans les dérivés. Les dérivés d'insuline selon la présente invention peuvent être formulés sous forme de préparations pharmaceutiques de la même manière que les insulines d'origine et peuvent être utilisés de manière clinique à des niveaux de dose inférieurs, comparables ou supérieurs. Ainsi, la dose quotidienne normale d'insuline est de 20 à 80 unités internationales par jour pour les adultes et, pour les patients résistants, de plus de 200 unités et, dans certains cas, de plus de 500 unités d'insuline standard. Les dérivés de la présente invention peuvent être préparés sous forme de solutions, de suspensions ou des préparations séchées par congélation. Une formulation de solution typique est à un pH neutre ou physiologique et contient 0,1)6 % en poids/volume d'acétate de sodium, 0,7 ffi en poids/volume de chlorure de sodium et 0,1 $ d'hydroxybenzoate de méthyle en poids/volume dans de l'eau exempte de produits pyrogènes. La présente invention est applicable à toutes les insulines et en particulier aux insulines de porcs et des bovins qui ont été utilisées en clinique pendant de nombreuses années pour le traitement de diabètes et d'autres désordres. Elle est également applicable à des insulines synthétiques de ce type et aussi à de l'insuline humaine synthétique. La présente invention est illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 Préparation d'a-N,N'-8-N"-trisuccinylinsuline Succinylation 500 mg d'insuline sont mis en suspension dans 12 ml de tampon phosphaté 0,5M, pH 7,2 (41,6 mg/ml) et, dans cette suspension, on ajoute directement 250 mg d'anhydride succinique solide (excès décamolaire d u p r o d u i t réagissant par groupe aminé). Le mélange réactionnel est agité en continu à la température ambiante pendant 20 heures. On observe que la solution claire (après réaction) demeure homogène quand le pH est réglé à 5 > 5. Changement de salinité du mélange réactionnel par (i) ou (ii) (i) Le mélange réactionnel total est passé à travers une colonne de produit dit Sephadex R (15C x 1,5 cm), en éluant avec un tampon en acétate-pyridine 0,05 M, pIl . Les dérivés d'insuline sont bien séparés des produits de décomposition du réactif. Les dérivés sortent dans un volume relativement grand de l'éludant de choix mais conviennent encore à la chromatographie. (ii) A titre de variante, les dérivés d'insuline sont précipités à 40C par acidification du mélange réactionnel jusqu'à un pli de 3,8 avec de l'acide acétique glacial. Le précipité est alors lavé deux fois avec de l'eau froide distillée, préalablement acidifiée jusqu a un pli de 4 avec de l'acide acétique. Le rendement en dérivés d'insuline dans le précipité est supérieur à 90 . Le précipité est dissous dans 5 ml d'acétate de pyridine, à un pH de 6, pour la chromatographie. Purification des dérivés d'insuline La solution de dérivés d'insuline est appliquée à une colonne de diéthylaminoéthyl-Sephadex A-25 (95 x 1ss5 cm). L'élution est réalisée initialement avec 60 ml d'acétate de pyrkneG,05 M > pli 5,5, avant que l'on applique un gradient linéaire de NaCI jusqu'à la concentration limite de 2,0 M.Le dérivé disuccinylé est séparé par élution du gel du produit dit A 25 d'abord pour une molarité de NaCl de 0,475 ; on sépare le dérivé trisuccinylé pour une molarité de 0,6. La séparation des dérivés de cette manière est facilement réalisée sans utiliser d'urée 7 M dans l'éluant et le rendement en dérivés est supérieur à 90 . Caractérisation des dérivés Le dérivé d'insuline pur obtenu est soit réglé au point de vue salinité avec une colonne de produit dit Sephadex G-15 soit précipité comme préalablement. Un lavage ultérieur du précipité avec de l'éthanol froid à 95 ,% suivi d'éther diéthylique (deux fois) avant séchage dans un dessicateur sous vide entralne la formation d'une poudre blanche qui est alors caractérisée par (1) digestion trypsique à un pH de 9,5 avec un rapport trypsine traitée par la T.P.C.K./substrat de 1/7 pour la libération d'alanine B-5O (T.P.C.K. = L-(1-tosylamido-2-phényl)éthyl- chlorométilylcétone ) . (ii) électrophorèse d'acétate de cellulose et formation de taches avec le produit dit Pancean S. (iii) carbamylation avec KCNO pour la détermination quantitative de groupes terminaux -0XH2. (iv) électrophorèse sur gel en forme de disque (acrylamide). En utilisant ce procédé de préparation, les rendements en dérivés tri- et di-succinylés sont respectivement 90 > 6 et 9,) %. On ne peut pas détecter de groupes d'extrémité terminaux -NH2 pour l'un ou l'autre dérivé. L'alanine libre peut être libérée par digestion trypsique à partir du dérivé disuccinylé et aucune alanine n'est libérée à partir de la trisuccinylinsuline. Les deux dérivés peuvent entre séparés par électrophorèse. EXEMPLE 2 Préparation d'a-N,N'-disuccinylinsuline Afin de préparer spécifiquement la disuccinylinsuline, les conditions réactionnelles de succinylation décrites dans l'exemple 1 sont ainsi modifiées : excès trimolaire d'anhydride acétique par groupe aminé et réaction pendant quatre heures à la température ambiante. Le mélange réactionnel est désalifié par précipitation et le dérivé d'insuline dissous dans un tampon à pH 8, puis on le laisse reposer à la température ambiante pendant 20 heu res avant la purification. EXEMPLE 9 Préparation d'a-N-succinylphénylalanineinsuline, d'&alpha;-N-succinyl- glycineinsuline, d'-N-succinyllysineinsuline et dla-N-succinyl- glycine-#-N-succinyllysineinsuline Ces dérivés sont préparés, avec ceux des exemples 1 et 2, par l'utilisation de conditions différentes de réaction de succinylation, les divers dérivés étant séparés par voie chromatographique. Réaction de l'insuline avec l'anhydride succinique De l'insuline cristalline de bovins (200 mg, contenant 0,3)6 ss de zinc) est dissoute dans 10 ml du produit HC1 tris M > pH 8,6 [tris = tris(hydroxyméthyl)-aminométhane]. Dans ce produite on ajoute de l'anhydride succinique (2G,4 mg, équivalent à un excès dimolaire par groupe aminé). Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant trois heures. Les dérivés d'insuline sont désalifiés par filtration sur gel sur une colonne ()5 x 2,5 cm) du produit dit Sephadex G-25 (qualité grossière) dans de l'acétate de N-éthylmorpholine 0,1 , pli 8,5, et isolés par lyophilisation. Séparation chromatographique des dérivés d'insuline Le mélange séché par congélation est dissous dans 5 ml du produit HC1 tris O,lM, pH 7, contenant de l'urée BM (libérée du cyanate par acidification) et ajouté à une colonne de produit dit DEAE (diéthylaminoéthyl) Sephadex A-25 (95 x 1,5 cm) qui est équilibrée et développée initialement avec 200 ml du tampon indiqué ci-dessus. On applique alors un gradient linéaire de NaCl jus qu'd une concentration limite de 0,2 M en faisant passer du tris 0,1 M, pli 7 contenant de l'urée 8 M et NaC1 0,2 M (250 ml) dans un récipient de mélange contenant 250 ml du tampon de départ. Le débit est 15 ml par heure. Avec ce mode opératoire de chromatographie, on obtient six dérivés d'insulin2, tel qu'indiqué dans le tableau suivant. Molarité de NaCl Composé Groupes NH2 par la- Rendement substitués (1) quelle on ltélution M Insuline - - 40 &alpha;-N-succinylphénylalanineinsu line (B1 substitué) Phe - 14 -N-succinyllysineinsuline (B29 substitué) Lys - 3 a-N-succinylglycineinsuline (A1 substitué) Gly - 12 a-N,N'-disuccinylinsuline (A1B1 substitués) Phe, Gly 0,12 12 &alpha;;-N-succinylglycine-#-N-succi- nyllysineinsuline (A1B29 subs- Gly, Lys 0,13 8 titués) &alpha;-N,N'-#-N"-trisuccinylinsuline (A1B1B29 substitue Gly, Phe, Lys 0,2 7 (1) les groupes &alpha;-NH2 libres sont déterminés comme pour le procé dé de caractérisation (iii) de l'exemple 1, tandis que les groupes #-NH2 sont déterminés comme pour le procédé de carac térisation (i) de exemple 1. EXEMPLE 4 Préparation d'&alpha;-N,N'-#-N"-triglutarylinsuline Ce dérivé est préparé en utilisant de l'anhydride glutarique par un mode opératoire exactement analogue à celui décrit dans l'exemple 1 pour le dérivé trisuccinylique. EXEMPLE 5 Préparation d' a-N,N' -disuccinyl-6-N" -carbamylinsuline De la disuccinylinsuline pure est carbamylée à un pli de 8 avec KCNO 0,5 M. Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 12 heures et puis désalifié par passage à travers une colonne de produit dit Sephadex G-15 (15 x 1,5 cm) avec un tampon phosphaté 0,05 M, pH 9. On ne peut pas libérer l'alanine libre du dérivé résultant par une digestion trypsique. Dans un mode opératoire à titre de variante, le tampon utilisé dans la désalification est de l'acétate de N-éthylmorpholine à 0,1 % à un pH de 8,5. EXEMPLE 6 Préparation d'&alpha;-N,N'-#-N"-trisuccinylinsuline O-acétylée De l'a-N,N'-8-N't-trisuccinylinsuline (6 mg), préparée selon l'exemple 1, est dissoute dans du tampon tris 0,5 M (pH 9,0, 5 ml) et est traitée par anhydride acétique suivant des portions successives de 5 > 5 > 5,5, 10, 10, 10 microlitres, à la température am biante, en agitant bien après chaque addition. La réaction est con trônée après chaque addition en mesurant l'absorption spectrale à 275 millimicrons. On estime que le produit final est substitué approximativement à 80 ,% sur les groupes hydroxyles.Le produit est précipité par réglage du pH de la solution à 4,0 avec de l'acide acétique et est récupéré par centrifugation. Le produit, lorsqu'il est testé in vitro par hydrolyse à un pli de 7,4 et à )7 C, a une période d'environ 14 heures. EXEMPLE 7 Préparation du dérivé O-glutarylique d'a-N,N' --N"-trisuccinylinsu- line L'a-N,N'--N"-trisuccinylinsuline (6 mg) est dissoute dans un tampon phosphaté 0,25 M (pH 8,0, 5 ml) et traitée avec une solution d'anhydride glutarique dans le dioxane (50 % en poids/ volume) dans des portions successives de 1, 1, 1, 3, 3, 5, 5, 10, 10 microlitres et la réaction surveillée comme on l'a décrit dans l'exemple 6. Le produit est précipité par réglage du pH de la solution à 5 ou moins avec de l'acide chlorhydrique et est récupéré par centrifugation. La période correspondante (voir exemple 6) est environ 7 heures. EXEMPLE 8 O-carbamylation d'&alpha;-N,N'-#-N"-trisuccinylinsuline De l'-N,N'-eN-trisuccinylinsuline (200 g) est dissoute dans une solution aqueuse d'urée 8 M et on ajoute du cyanate de potassium jusqu'à une concentration de 2 M. On laisse la réaction se poursuivre à la température ambiante à un pH de 8,0 pendant une heure, à un pH de 7,0 pendant 4 heures, à un nli de 6,5 pendant 2 heures et puis à un pH de 6,0 pendant une heure, le pH étant mairtenu à la valeur exigée, lorsque ltexpérience continue, par l'addr- tion automatique d'acide acétique.Le mélange réactionnel est alors acidifié jusqu'à un pH de 4,5 par l'addition d'acide chlorhydrique, dilué cinq fois avec de liteau et on le laisse reposer à 4 C toute la nuit. Le précipité formé est soumis à une rotation et redissous dans une solution aqueuse à 0,1 ss d'acétate de pyridine à un pH de 6,0. La désalification est effectuée avec une colonne (40 x 2,5 cm) du produit dit Sephadex G-25 en utilisant de l'acétate de pyridine à 0,1 ffi à un pH de 6,0 comme éludant, l'élution étant réalisée à 4 0C. Immédiatement, l'élution de la protéine à partir de la colonne est achevée, les fractions sont combinées et le produit isolé sous forme sèche par lyophilisation. Le degré de carbamylation est aux alentours de 50 > %, tel qu'évalué par la mesure de la densité optique à 200 nm. La période de décarbamylation du produit, à un pH de 7,4 et à 37 C, dans un tampon physiologique est de 75 minutes avec retour complet de l'absorption de tyrosine de la trisuccinylinsuline. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Dérivé d'insuline, caractérisé en ce qu'au moins un des groupes aminés des unités d'aminoacides A1 (glycine), B1 (phé nylalanine) et B29 (lysine) est transformé en un groupe aminé bloqué, ayant un substituant pouvant former un anion. 2 - Dérivé d'insuline selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substituant porte une charge négative résultante lorsqu'il est ionisé. 5 - Dérivé d'insuline selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le substituant est un groupe acyle dérivé d'-un diacide. 4 - Dérivé d'insuline selon la revendication 3, caractérisé en ce Que l'acide est un acide dicarboxylique. 5 - Dérivé d'insuline selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'acide est l'acide succinique. 6 - Dérivé d'insuline selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'au moins deux des groupes aminés indiqués sont substitués. 7 - Dérivé d'insuline selon la revendication 6, caractérisé en ce qutil est N-trisubstitué. 8 - Dérivé d'insuline selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'un ou deux des groupes aminés indiqués sont carbamylés ou N-alkylcarbamylés. 9 - A titre de produits industriels nouveaux a) A1 mono-succinylinsuline b) B1 mono-succinylinsuline c) B29 mono-succinylinsuline d) A1, B1 di-succinylinsuline e) A1, B1 > B29 tri-succinylinsuline f) A1 > B1 > B29 tri-glutarylinsuline g) A1, A1J B;, N-di-succinyl-B29 N-carbamylinsuline 10 - Dérivé d'insuline selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il a, en outre, au moins un des groupes hydroxyles de la tyrosine bloqué par un substituant qui peut être libéré in vivo pour rétablir le groupe hydroxyle libre. 11 - rivé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le substituant de blocage des groupes hydroxyles est un groupe acyle. 12 - Dérivé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le substituant de blocage des groupes hydroxyles est un groupe carbamyle ou un groupe carbamyle N-substitué. 15 - Dérivé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que deux (ou davantage) des groupes hydroxyles sont substitués. 14 - Dérivé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que tous les substituants de blocage des groupes hydroxyles sont des groupes carbamyles ou des groupes carbamyles N-substitués. 15 - Préparation pharmaceutique convenant à l'administration parentérale, à a c t i v i t é nypoglycémique, caractérisée en ce qu'ellecomprend, comme constituant actif, un dérivé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16 - Procédé de préparation d'un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler une insuline avec un acide dicarboxylique ou un dérivé fonctionnel de cet acide par réaction avec un ou plusieurs groupes aminés. 17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la réaction est effectuée dans des conditions telles que le dérivé est, de manière prédominante, un dérivé disubstitué. 18 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la réaction est effectuée dans des conditions telles que le dérivé est, de manière prédominante, un dérivé trisubstitué. 19 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'une réaction ultérieure est effectuée pour bloquer des groupes aminés non protégés et pour introduire des groupes de blocage dans une ou plusieurs unités hydroxyles de la tyrosine. 20 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que le produit est séparé du mélange réactionnel par précipitation à un pH acide. 21 - A titre de produits industriels nouveaux, dérivés d'insuline préparés par un procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 20.