FR 2054547 A1 19710423 FR 7012868 A 19700409 La présente invention concerne de nouvelles enzymes hydrolytiques de valeur et leurs procédés de préparation, dtisole- ment et de purification. L'invention se rapporte plus particulièrement à des enzymes protéolytiques que l'on obtient par la culture d'une souche de Streptomyces globisporus récemment découverte et à des procédés pour la récupération des produits désirés par la culture de cet organisme. L'organisme est désigné ci-après sous le nom de souche Astra 19. Selon un autre aspect, l'invention couvre-l'utili-sationgdes enzymes protéolytiques dans divers domaines de la technologie. Des exemples de telles applications sont l'application des produits de l'invention comme ingrédients dans les compositions détergentes, comme agents pour la lyse des cellules et l'utilisé sation des produits pour la solubilisation des biopolymères. Les domaines particuliers de la technologie cités plus haut où les enzymes de la présente invention peuvent trouver des ap-. plications intéressantes ne sont que des exemples illustratifs des domaines d'applications possibles et il va de soi que des enzymes présentant les propriétés inattendues et-très intéressantes décrites plus en détail dans ce qui suit peuvent avoir de nombreuses autres applications technologiques, qui entrent toutes dans le cadre de l'invention. Le microorganisme servant à la production des enzymes de la présente invention a été isolé à partir d'un échantillon de sol prélevé à Sodertalje en Suède. Les particularités taxonomiques de l'organisme ont été étudiées selon le "Manual of Déter- minative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition, Baltimore, Williams & Wilkins 1957 et "The Actinomycetes" de Selman A. Waksman, vol. II, Baltimore, Williams & Wilkins 1961 et se sont révélées caractéristiques de celles de l'espèce Streptomyces globisporus. Une étude de la littérature n'a pas permis de. trouver des souches connues de 3treptomyces globisporus qui répondent de façon satisfaisante aux caractéristiques décrites présentement et par conséquent l'organisme de la présente invention est considéré comme une nouvelle souche. L'étude taxonomique des microorganismes a été effectuée selon les méthodes décrites dans les ouvrages "Manual of Determinative Bacteriology de Bergey , 7ème édition, Baltimore, Williams & Wilkins 1957 et "The Actinomycetes de Selman A. Waksman, vol. II, Baltimore, Williams & Wilkins, 1961. Les résultats obtenus ont été les suivants Croissance végétative colonies plates, incolores Pas de formation de pigments ou formation de pigments diffusibles légèrement jaunes. Mycélium aérien bien développé, en particulier sur agar synthétique tel qu'un agar d'amidon-KNO3. Le mycélium aérien est pulvérulent, blanc, quelquefois légèrement jaune. avec un ton gris lorsque les spores sont formées. Les sporophores sont droits, ramifiés. Les spores sont sphériques avec un diamètre de o,8 à 1 micron. Le lait est rapidement peptonisé en donnant une réaction légèrement alcaline. La gélatine se liquéfie lentement. L'amidon est hydrolysé. La croissance est moyenne sur cellulose. La croissance est bonne sur sucrose et glucose. On n' a pas observé de propriétés antagonistes. Sur les pommes de terre il ne se forme que des traces de mycélium aérien à 280 mais une sporulation abondante a lieu à 220. A toutes les températures d'étudeg la croissance devient brune mais on fl' a pas observé de pigments solubles. On a trouvé que le microorganisme de la souche Astra 19,cul- tivé sur des milieux organiques, était capable de produire plusieurs enzymes hydrolytiques comme les protéases, les amylases et les lipases Certaines de ces enzymes peuvent être très utiles dans divers domaines technologiques. C'est ainsi que certaines des enzymes peuvent être utiliséss ocmme ingrédients dans des compositions agents pour que certain enzymes peuvent être uti- liséXss comme agents pour la lyse des cellules et que ymères. L enzymes peuvent servir à la solubilisation des biopolymères. La préparation d'enzyme peut également être utilisée dans le trai tement des aliments par exemple pour la modifvication du gluten ganisme de la cuisson.Certaines protéases produites par ltor- qui con en cause > . qui sont stables aux températures élevées et qui conviennent particulièrement comme ingrédients dans des comme positions détergentes, présentent un intérêtr particyulier. La stabilité et l'activité de ces protéases semblent indépendantes de la concentration en ions calciums Ca2+, et en autres ions présents dans une solution ~contenant les protéases- et il est lair que de telles propriétés sont particulièrement avantageuses pour l'utilisation envisagée des protéases comme additifs à des compositions détergentes.Une autre propriété des protéases qui est spécialement appréciée pour l'tutilisation prévue comme additifs à des compositions détergentes est leur pH optimal passablement élevé. Selon un aspect plus large du procédé qui peut être utilisé de façon appropriée pour la production des enzymes de la présente invention, l'organisme en question est cultivé dans des conditions d'immersion aérobie au sein d'un milieu nutritif approprié. Il est préférable que le milieu-nutritif renferme une source de carbone, d'azote et de sels minéraux assimilables. On peut faire varier dans de larges limites les conditions de croissance telles que durée, température et concentration en ion -hydrogène sans s'écarter du cadre de l'invention. A l'issue de la période de croissance, les enzymes ou la matière intéressante peuvent ctre récupérées à partir de la bouillie par un certain nombre de méthodes telles que centrifugation de la bouillie, dialyse de la solution et séchage par atomisation de la solution résultante. Une grande variété de substances peut servir de sources de carbone dans le milieu nutritif. Celles-ci peuvent être solubles ou insolubles dans L'eau, la seule condition étant que les composés utilisés soient facilement assimilables par l'organisme. Comme exemples, on peut citer les pentoses tels que ltarabinoseg le xylose et le ribose; les monosaceharides tels que le mannose, le lévulose et le galactose; les dissacharides tels que le tréha lose, le maltoses le lactose, le cellobiose et le sucrose,les polysaccharides tels que amidon, les alcools supérieurs tels que le glycérol, le mannitol, le sorbitol et lrinositol etdes sources diverses telles que l'alcool éthylique et le carbonate de calcium. L'azote sous une forme assimilable peut être apporté par des protéines animales ou végétales par la farine de sojas la caséine, les peptones, les polypeptides ou les aminoacides. L'ajustement du pH peut s'effectuer à laide de n'importe quelle base appropriée telle que hydroxyde de sodium3 un tampon au phosphate, le citrate de sodium, l'acétate de sodium ou toute autre substance appropriée qui amène le pH dans les limites requises. La température du milieu nutritif pendant la fermentation de la moisissure peut etre avantageusement maintenue entre environ 26 et 30 C. Le temps nécessaire à la production d'une quontit; maximel d'enzymes protéolytiques peut varier dans d larges limites en fonction de la nature des ingrédienti partieuliers utilisés dans le milieu nutritif. Cependant, on considèrc nabituellement comme convenable unt duréd d'enviren 75 à enviren 160 heures. Des agents anti-nousse peuvent etr ajeutés au milieu de fer mentation. Comme exemples d'agents ar-ti-mousse on peut citer l'huile de soja, l'huile de ricin, des huiles suifonées le saindoux, l'huile de ricin bromée. Ainsi qu'il a été mentionné plus haut, la nouvelle souche de Streptomyces globisporus présentement décrite peut être cultivée dans un milieu de culture pour produire des enzymes hydrolytiques. Le milieu de culture peut être l'un quelconque des nombreux milieux connus de l'homme de l'art étant donné que l'organisme en question est capable d'assimiler de nombreuses sources d'énergie. Pour réaliser une bonne économie de production et obtenir un rendement maximal en enzymes, on donne cependant, la préférence à certains milieux de culture. Par exemple, les sources d'hydrates de carbone actuellement préférées dans le milieu de culture sont le sucrose, l'amidon, le glucose,la dextrine, les mélasses et similaires. Les sources d'azote préférée. sont 1 farine de soja, la levure de bière, la liqueur de mais, la caséine, la farine de poisson "Scotaferm" mise sur le marché par la Société Distillers, le produit "Pharmamédiae" et similaires. Comme sels organiques nutritifs pouvant être incorporés au milieu, on peut citer les sels capables de fournir des ions tels que des ions ammonium, sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphate, chlorure, sulfate, nitrate et similaires.Des oligoéléments essentiels peuvent également être incorporés au milieu de culture. Ces oligoélements sont habituellement présents sous forme d'impu retés dans d'autres constituants du milieu de culture. Pour une croissance et une production maximales de la souche Astra 19 le milieu de culture devra être ajusté, avant l'inoculation, à un pH entre environ 6- et environ 7,5, de préférence à un pH de 6,8. Le pH à la fin de la période de croissance dépend des substances-tampons présentes et du pH initial. On suit aisément le taux de production de protéases dans le milieu de culture pendant la période de croissance de l'organisme en contrôlant des échantillons pour leur activité caséinolytique. Les déterminations de caséinase sont décrites plus en détail ciaprès. Le produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique résultant dé la culture de la souche Astra 19 présente les caractéristiques ci-après. a) il est un mélange de protéines; b) il est soluble dans l'eau, dans les solutions salines et dans des solutions-tampons conventionnelles; c) il est stable et conserve son activité enzymatique à la température ambiante pendant plus d'un an sous la forme de poudre sèche; d) son spectre d'absorption ultra-violet est caractéristique des protéines renfermant des amino-acides aromatiques; e) il exerce une action protéolytique sur la caséine, l'hé- moglobine et la gélatine; f) il présente un optimum protéolytique à pH 9-10 avec la caséine comme substrat; g) il est capable d'hydrolyser l'ester éthylique de la N- tosyl-L-arginine (TAEE); h) il recèle une activité protéolytique induite par la chaleur; i) il renferme, en plus des enzymes protéolytiques des estérases9 des lipases et des amylases;; j) la ou les enzymes thermostables peuvent être précipitées par des solvants organiques ou du sulfate d'ammonium; k) ses stahilité. et activité sont essentiellement indépendantes de la concentration en ions calcium d'une solution à température élevée; 1) le mélange présente un optimum de température avec la caséine comme substrat à environ 600G à pH 7,4 et un optimum de température à environ 500C à pH 9; m) le mélange présente un optimum de température aux environs de 500C à pH 7,4 avec du TAEE comme substrat. On se sert des expressions "produit brut", "premier précipité acétonique" et "deuxième précipité acétonique " que l'on rencontre dans la présente description pour désigner les divers produits obtenus lors de l'isolement et de la purification de la préparation enzymatique résultant de la culture de la souche Astra 19 et qui sont définis par la manière selon laquelle ils sont pré-parés comme il est décrit dans l'exemple 8. La présente invention sera illustrée au moyen des tableaux qui suivent et des dessim annexés. Les légendes relatives aux diverses figures de ces dessins se trouvent à la fin de la description. Le tableau 1 indique le pH optimal de l'activité protéolytique. a) du produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique; b- du premier précipité acétonique et c) du deuxième précipité acétonique. Les mesures de l'activité protéolytique ont été effectuées à 570C à l'aide de caséine comme substrat et à 40 C à l'aide de l'ester éthylique de N-#- tosyl-L-arginine (en abrévation TAEE) Tableau 1 pH optimal de l'activité protéolytique Pourcent d'activité protéolytique maximale Caséine comme substrat LAEE comme substrat pH Produit Premier précipité Deuxième précipité Produit brut brut acétonique acétonique 4,0 4 590 5 6,0 n8 44 36 15 7,0 61 55 64 45 8,0 81 78 76 92 8,5 95 9,0 100 97 95 100 10,0 89 100 100 55 10,5 42 11,0 31 69 47 Le tableau 2 indique la stabilité thermique à pH 7,4 et à pH 9,0 a) du produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique, b) du premier précipité acétonique, et c) du deuxième précipité acétonique. Les échantillons ont été mis à incuber sans substrat pendant 70 minutes au pH et à la température indiqués. La détermination de l'activité protéolytique a été ensuite effectuée à une tempéra ture de 37 C à l'aide de caséine comme substrat. Tableau 2 Stabilité à la chaleur Température Pourcent d'activité maximale pH @.4 pH 9,0 Prcduit Premier Prcduit Premier Deuxième @r@ @récipité @@@t précipité précipité @@niq@@ acétonique acétoniqu 20 @@@ @@@ @@ 98 100 37 94 99 73 100 76 50 7 95 1, c7 52 60 @ 82 10 66 50 70 5 78 6 57 45 80 13 77 2 5 31 90 2 2 5 100 3 0 2 Le tableau 3 indiqu la température optimale aux pH 7,4 et 9,0. a) du produit brut obtenu après isolement de la pré paration enzymatique. b) du pr@mier précipité acétonique c) du deuxième précipité acétonique Pour les mesures d'activité à pH 7,4 et 9,0 on s'est servi de caséine c@mme substrat. La durée de la détermina tion de l'activité était de 15 minutes. Le TAEE a également été utilisé comme substrat à pH 7,4. Tableau 3 Température optimale de l'activité protéolytique Temp. Pourcent de l'activité maximale C Caséine comme substrat TAEE comme substrat pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 Produit Premier Deuxième Produit Premier Deuxième Produit Premier Deuxième brut précipité précipité brut précipité précipité brut précipité précipité acétonique acétonique acétonique acétonique acétonique acétonique 20 29 14 6 35 8 10 39 53 48 37 28 15 45 46 25 50 40 49 69 77 50 76 51 100 100 66 100 100 92 100 60 100 77 96 70 76 52 39 100 58 70 80 93 70 77 87 57 0 29 0 80 84 100 72 79 100 55 @ 90 30 53 56 27 35 15 100 10 14 14 7 9 0 Le tableau 4 montre la relation entre l'activité protéolytique, la durée et la température pour l'incubation du produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique. L'activité protéolytique est mesurée par absorption de la lumière à 280 nm qui est proportionnelle à l'activité protéolytique. On a effectué l'essai en portant à incubation l'échantillon d'essais 10 mg par ml.,pendant le nombre de minutes indiquées, après quoi l'activité protéolytique 2 été mesurée sur une partie aliquote du mélange d'incubation à pH 7,4 avec la caséine comme substrat. Tableau 4 Relation entre la stabilité thermique, le temps d'incubation et la température. Densité optique de la substance soluble dans l'acide trichlor- acétique Température o) C) 500C 600C 650C 7000 75 C Temps d'incu station (min) ~ 0 1,505 1,364 1,456 1,389 1,318 5 1,540 1,236 1,299 1,042 0,612 10 1,505 1,191 1,075 0,708 ' 0,242 15 1,495 1,193 0,930 0,504 0,217 17 1,475 1,102 0,885 0,443 445 0,212 20 1,550 1,103 0,833 0,397 0,197 22 1,513 1,060 0,871 0,353 0,165 25 1,540 1,110 o,838 0,320 09173 27 1,517 1,059 0,838 09299 0,172 30 1,613 1,100 0,802 0,314 0,181 32 1,478 1,063 0,743 0,297 o,181 35 in523 1,064 o,698 0,255 0,180 37 1,490 1,038 0,662 0,240 0,164 40 1,558 1,039 0,676 0,240 09164 42 - - 0,574 0,210 0,136 45 1,548 1,053 0,581 0,254 0,184 47 - - 0,529 0,218 09133 50 1,520 0,996 0,539 0,196 0,151 52 - - 0,501 0,202 0,149 55 1,468 1,003 0,499 0,195 0,125 60 1,525 - - - Le tableau 5 montre 13 relation entie l'activité protéoly- tyque , le temps et le pH à 6500 pour le produit brut. Le tampon utilisé pour l'incubation était le tampon universel dénommé Teorell - Stenhagen. On a effectué l'essai en portant à incubation l'échantillon, 10 mg par ml, pendant le nombre de minutes indiqué. au pH prévu, après quoi l'activité protéolytique a été mesurée à pH 7,4 sur une partie aliquote du mélange d'incubation avec la caséine comme substrat par absorption de la lumière à 280 nm, qui est proportionnelle à l'activité protéolytique. Tableau 5 Relation entre l'activité protéolytique, la durée diincu- bation à 65 C pour le produit brut Densité optique de la substance soluble dans l'acide trichloracétique PH MM pH-4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Temps d'i ration (min) 0 0,471 0,501 0,526 0,540 0,525 0,201 0,180 5 0,127 0,456 0,462 0,450 0,136 0,094 0,069 10 o, 078 0 > 405 o, 418 o,338 0,112 o,og7 0,072 15 logo71 - 0,370 0,262 0,115 0,091 O,q62 17 0,068 0,342 0,350 0,265 0,092 0,064 0,062 20. 0,.056 ou312 ou334 0,219 0,084 0, 075 0,074 22 0,058 0,301 0,303 0,194 0,078 0,066 0,063 25 0,050 0,278 0,282 0,18? 0,067 0,082 o,os4 054 27 0,043 0,274 0,277 0,166 0,082 0,075 0,058 30 o,o3T 0,270 0,252 0,134 0,093 0,076 0,052 52 oxo51 0,257 0,241 0,144 ou115 0,078 0,044 35 0,025 0,242 0,231 0,158 0,105 0,083 0 > 026 37 0,022 0,230 0,218 u,117 Or105 logo78 0 > 054 40 o,o3g 0,219 0,215 ou105 il 101 o, 086 0,043 42 0,048 0,224 0,210 0,113 0,092 0,077 0,032 45 0,034 0,209 0,188 0,116 ogog, 0,084 0,043 47 0,034 0,200 0,180 0,106 0,086 0,072 0,037 50 0,027 0,212 0,171 0,104 0,089 C,065 0,040 52 0,050 0,209 0,142 0089 0,084 0,075 0,031 55 o,o33 0,216 Q,142 0081 0,070 0,054 0,040 Le tableau 6 montre la milité du pH du produit brut et du premier preolpité dcétonique purifié ultérieurement par chroma graphie par échange d'ions sur DEAE cellulose (voir tableau 9) avec le composé CH3 COOHN4 0,01 M à pH 7,2 comme éluant. Les préparations enzymatiques pnt été mises à l'ineubation pendant 30 mn. à 37 C dens un tampon Teorell-Stenhagen ajusté au pH désiré. A la fin de l'ineubation, les échantillons ent été mélangés à un tampen au phosphete de pH 7,4 et l'aetivité résiduelle a été déterminés par digestion de la ceséine. Tableau 6 Stabilité du pH du produit brut et du premier précipité acétonique Pourcent de l'activité maximale pH Produit Premier précipité acétonique brut élué à partir de DEAE cellulose 2 4 99 3 4 97 4 37 90 5 70 92 6 97 93 7 100 100 8 93 96 9 90 95 10 50 95 11 14 86 De tableau 7 indique la température optimale des fractione thermestables 16, 18 et de la fraction non thermostable 31 obtenues par séparation iscélectrique (voir figure 2 et figure 3). De la caséine a' pH 7 n été utilisée comme substrat pour les dé- terminetions de l'aetivité. Tableau 7 Tempéreture optimale des fractions obtenues par sépara tien isoélectrique Poureent de l'activité maximale Température fraetion 16 fraction 18 fraetion 31 C fig. 3 fig.3 fig.2 37 6 5 5 50 12 13 13 60 47 37 44 70 70 70 100 80 100 100 38 90 37 31 100 23 27 Le tabean 8 indique le pH optimal des fraetions thermostables 16, 18 et dc la fraction non thermostable 51 obtenues par séparation isoalectrique (voir figure 2 et figure ))-. De la caséine à pH 7,4 a été utilisée comme substrat peur les détèrmi- nations de l'aetivité. Tableau 8 pH optimal des fraetions obtenues par séparetion isoélectrique Pourcent de I activité maxiraIe pH fraction 16 fraction 18 fraction 31 figure 3 figure 5 figure 2 6 7 32 95 67 8 45 92 74 9 9 100 100 80 10 54 83 86 - 11 58 - 76 100 La figure la montre les résultats de filtration sur gel de 300 mg du produit brut obtenu après isolement de la préparation enzymatique à l'aide de la résine échangeuse "Sephadex G-50" 2 x 112 cm. L'élution a été effectuée avec H20 à raison de 2 fractions de 435 ml chacune par heure. La figure lb. montre les résultats de la filtration sur gel de 500 mg du premier précipité acétonique provenant du produit brut ayant subi un traitement thermique. Les figures la et lb montrent que la substance fractionnée par filtration sur gel. du premier précipité acétionique renferme une substance protéolytique absente dans la substance brute. Cette découverte prouve que le chauffage de la substance brute, outre qu'elle dénature les enzymes protéolytiques et d'autres protéines, provoque la manifestation d'une activité protéolytique avec différentes propriétés. Les résultats des tableaux 4 et 5 montrent que le chauffage du produit brut à 65 700C et à pH 7-8 pendant un certain intervalle de temps augmente légèrement son getivqué protéolytique comparativement é une période de chauffage plus courte de la solution enzymatique brute. Purification du produit stable à la chialeur On a filtré 2,7 g du premier précipité acétonique, dissous dans 55 ml de tampon9 à travers unt colonne remplie de 50g de DEAE cellulose équilibrée avec NH4CH3COO 0,01 molaire à pH 7,4. On a collecté des fractions de 10 ml. Après arrêt de l'élution de la substance douée d'une activité protéolytique et absorbant dans l$U.V., la faible force ionique a été augmentée à l'aide de NH4CH3COO 0,1 M et on a élué une certaine quantité de substance protéolytique absorbant dans l'U.V. Après élution d'une très faible quantité de substance protéolytique absorbant dans l'ultraviolet, sont le pH a été abaissé jusqu'à pH 5,5. Les résultats/rassemblés dans le tableau 9. Tableau 9 Fraction Poids 37 C,pH 7,4 Activité résiduelle unités après chauffage pen caséine/mg dant 30 mn à 70 C Substance de départ ler précipité acétonique 2700 mg 0,3 65 % Eluée avec NH4CH3COO 0,01 M à pH 7,4 première fraction 430 mg 0,4 90 % Eluée avec NH4CH2COO 0,01 M à pH 74 déuxième fraction 135 mg 0,6 85 % Eluée avec NH4CH2COO 0,01 M à pH 7,4 3 320 mg 0,05 5 % Eluée avec NH4CH3COO 0,01 M à pH 5,5 ( 20 mg 77 % Le produit brut et la première fraction du produit élué à partir de DEAE cellulose à pH 7,4 avec NH4CH3COO 0,01 molaire ont été étudiés par séparation isoélectrique avec un gradient de pH de 3 à 10. Les résultats sont indiqués sur les figures 2 et 3. Le produit brut , figure 2, eontient plusieurs enzymes doués d'une activité protéolytique. On compte au moins sept enzymes actives vis à vis de la caséine à pH 7. Trois d'entre elles sont prédominantes, l'une possédant un point isoélectrique à 5, l'autre à 5,5 et la troisième à pH 10 à 11. La substance migrant vers un pH compris entre 4 et 6 renferme des enzymes thermostables. La substance purifiée par chromatographie par échange d'ions est essentiellement constituée de deux enzymes thermostables ayant des points isoélectriques de 5,2 et 5,7 (figure 5). Le pH optimal et la température optimale de ces deux fractions 16 et 18 (figure des préparations enzymatiques et de la fraction thermolåbile 31 (figure 2) sont indiqués dans les tableaux 7 et 8. Il ressort des figures 2 et 3 qu'il ne se produit pratiquement pas de dégradation de la substance thermostable à 7000 mais que toute l'activité de l'enzyme thermolabile disparalt dans les mêmes conditions. On a étudié l'influence des ions cobalt (Co+) sur l'activité protéolytique des diverses fractions obtenues par concentration isoélectrique du produit brut et l'activité enzymatique de telles fractions vis à vis de divers substrats synthétiques. Les fractions provenant des séparations isoélectriques ont été dialysées pendant une nuit. On s'est servi de quantités ap propriétés de fractions dialysées pour déterminer l'aetivité à pH 7,4 et à pH 10 vis à vis du benzoyl-D,L argininenaphtylamide (BANA), du carbobenzoxy-glycine-L-leucylamide (en abréviation Z-gly-L-leu-amide, de la carbobenzoxy-L-glutamyl-L-tyrosine (en abréviation Z-glu-L-tyr),de l'ester carbobenzoxy-L-leucyl-p-nitrophénylique (en abréviation ester de Z-leu-p-nitro-phé), de la oarbobenzoxy-glyeine-L-phénylaanine,(en abréviation Z-gly-L-phé) de la L-leucine-glycine (en abréviation L-leu-gly) et de la caséine. Avec le BANA comme substrat, les mesures étaient essentiellement celles décrites par Reidel et Wünsch Seit - Phys.chem. 316 61 (1959) et par Blackwood et Mandl. Anal. Biochem.2 370 (1961) Avec les substances L-leu-gly-, Z-gly-L-phe, Z-glu-L-tyr, Z-gly-L-leu-amide comme substrats, les mesures ont été faites par réaction à laninhydrine des produits d'incubation après 30 minutes d'incubation à 37 C de la solution d'enzyme et du substrat approprié. Comme témoins, on a utilisé l'enzyme plus la solution de ninhydrine plus le substrat. Avec l'ester de Z leu-p-nitro-phé, les mesures ont été faites par détermination de la densité optique à 405 nm de l'in cubat d'enzyme et de l'ester pendant 15 minutes.Comme témoins, on s'était servi de solutions ne contenant pas l'enzyme. La concentration en Co+ était de 0,1 molaire. On a ajouté 0,1 ml de cette solution à la solution d'cnzyme. On a laissé repo ser ce mélange pendant 10 minutes avant addition du substrat Les résultats sont rassemblés dans le tableau 10. Tableau 10 2+ Activité avec et sans Co des fractions obtenues par concentration isoélectrique du produit brut (figure 2) Fraction Caséine Caséine Bz-Dl- Z-gly-L-leu- Z-L-glu-L- Z-L-leu- Z-gly-L- L-leu-gly N du pH 7,4 pH 10,0 arg- NH2 tyr-OH nitrophé- phe-OH OH tube napht-NH2 +Co## +Co## nol +Co## +Co## +Co## 7-9 (I) 30 12 82 0 100 0 7 14 10 0 0 17 60 12-13(II) 195 44 12 325 1560 80 183 72 90 7 4@ 0 0 15-16(III) @08 275 6 465 2340 25 58 15 75 5 20 0 1350 18-19(IV) 393 245 4 530 1990 635 1090 115 11@ 105 283 70 650 24-26(V) 52 29 6 0 225 17 2 27 28 0 10 5 10 28-29(VI) 61 55 14 0 40 0 10 120 135 0 0 0 80 30-32(VII) 154 122 0 0 57 0 12 380 325 10 10 320 455 Il ressort du tableau 10 que l'activité vis à vis de la caséine à pH 7,4 est la plus élevée dans les fractions IV et III mais qu'une activité se manifeste dans tcutes les fractions. L'activité vis à vis de la caséine à pH 10 est le plus élevée dans la fraction III et est également élevée dans la fraction IV. Dans la fraction I on observe une activité vis à vis du benzoyl- DL-arginine-naphtylamide qui nc se trouve que drrns le produit brut. L'activité vis à vis de l'ester Z-L-leucyl-p-nitrophényli- que qui n'est pas affectée par le Co2 mais inhibée par le FMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle) est présente dans toutes 1cs fractions mais est la plus élevée dans la fraction VII. L'aeti- vité vis à vis de la L-leueine-giyeine qui nécessite Co+ ou Me21 (des ions métalliques bivalents) est exaltée par Co2+ est est la plus élevée dans la fraction III.L'activité dans la fraction VII n'est pas aussi fortement influencée par Co+ L'activité vis à vis de la Z-gly-L7phénylalanine qui est fortement affectée par Co est la plus élevée dans la fraction IV. Cette activité ne se manifeste que dans le produit-brut. L'activité vis à vis de la Z-L-glu-L-tyrosine qui nécessite Me2+ et est quelque peu rehaussée par Co+, so manifeste dans la fraetion IV. L'activité protéolytique neutre, par exemple l'activité vis à vis de la Z-gly-L-leu-NH2, qui est très fortement rehaussée par Co est à peu près la mme dans les fractions II, III et IV mais et la plus élevée dans la fraction II. Les différents pics obtenus par séparation isoélectrique présentent essentiellement les activités suivantes Fractions N 7 - 9 . activité vis à vis du benzoyl-D,L arginine-naphtylamide Fraetions N 12-13 aetivité vis à vis de la Z-gly-L-leu NH2 Fractions N 15-16 . activité vis à vis de la L-leu-gly et de la Z-gly-L-leu-NH2 Fractions NO 18-19 activité vis à vis de la Z-gly-L-phé- nylalanine Fractions N 30-32 activité vis à vis du L-leu-p-N02 On a étudié l'effet sur l'activite caséinolytique en ajoutant divers métaux et inhibiteurs au produit brut et aux préparations enzymatiques thermostables.La préparation enzymatique dissoute dans 3 ml de tampon était mise à incuber avec 0,1 ml d'une solution de 0,1 M du métal à contrôler, respectivement avec de l'acide éthylénediamine tétracétique (0,1 M) ou EDTA, avec une solution de fluorure de phénylméthylsulfonyle (0,5) ou avec 0,1 ml d'une solution de "Trasylol". La durée d'incubation était de 10 mn à 37CC. On a ensuite ajouté 3 ml d'une solution de caséine et déterminé l'activité protéolytique. Les résultats sont consignés dans le tableau 11. L'activité a été comparée à celle d'échantillons-témoins sans substance ajoutée. Comme tampon on s'était servi de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 0,2 M à pH 7,4 et 10. Tableau 11 Effet des métaux et inhibiteurs sur i1 activité caséinolytique Changement d'activité protéolytique (pourcent) Substance Tampons à pH 7,4 Tampon à pH 10 ajoutée Produit Premier préci que tonique Mn+ à 0,03 M -30 -10 -80 -50 Zn+ à 0,03 M -50 -20 -70 -20 Co+ à 0,03 M -30 -10 -50 -50 Ca2+ à 0,03 M +0 +0 -10 -10 Mg à 0,03 M +0 +0 +0 +40 0,1 ml de "Trasylol" -10 10 +0 0-,03 M d'EDTA -80 -20 -80 +0 0,1 ml de fluorure de méthylphénylsulfonyle ( ,5%) =30 -70 -10 -10 EDTA + fluorure de phénylméthylsulfonyle -90 -80 -80 -50 L'activité protéolytique vis à vis de la caséine a été essentiellement déterminée suivant Bergkvistg Acta Chem. Sand.17 (1963) 1521-1540.On a mis en suspension 15 g de caséine (caséine Hammarsten5Merck) sous agitation vigoureuse, dans 400 ml d'eau. On a ajouté de l'hydroxyde de sodium jusqu'à dissolution. Le pH a été ajusté à la valeur désirée et la solution a été diluée avec de l'eau à 500 ml. On a mélangé 3 ml de solution de caséine dans des tubes à essais avec 5 mi de tampon Teoreli-Stenhagen (Biochemisches Taschenbuch ed. moyen H.M. Springer Verlag (1956) 651) au pH désiré. Les séries de tubes de comparaison ont été équilibrés à la température appropriée dans des bains d'eau Une quantité appropriée d'enzyme dissoute a été introduite dans une des séries de tubes à essais. On a prélevé immédiatement à la pipette 2m à partir d'une série de tubes et on les a introduit dans 5 ml. d'acide trichloracétique à 10%. L'autre jeu de tubes a été porté à 1'incuhation pendant exactement 50 minutes, après quoi 2 ml ont été prélevés et ajoutés à 5 ml. d'acide trichloracétique à 10%. Après un temps de repos d'au moins 30 minutes à la température ambiante, les tubes ont été centrifugés et filtrés à travers dc petits entonnoirs bouchés à l'aide d'un tampon en coton lâche. On a mesuré la densité optique à 280 nm des résidus de centrifugation filtrés. L'activité de l'enzyme exprimée en unités de caséine par mg (CU par mg) est obtenue dc la manière suivante Densité optique de l'échantillon incubé moins la densité optique de l'échantillon non incubé divisée par la quantité d'Gn- zyme dans les tubes à essais (exprimée en mg). Pour l'étude de la stabilité de l'enzyme, l'enzyme a été dissoute dans le tempon et mise à incuber sans caséine pendant une durée et à une température préréglées. Les déterminations de la caséine ont été ensuite faites au pH et à la température désirés. Pour la détermination de l'activité protéolytique avec l'ester éthylique de la N-# -tosyl-L-arginine (TAEE) comme substrat, on a utilisé les constituants chimiques suivants dans la solution finale. TAEE à une concentration 0,05 molaire et NaC1 à 0,9% La quantité de solution d'enzyme ajoutée était de 0,2 ml et le volume de la solution d'essai était de 10 ml. Le titrage a été exécuté avec NaOI1 0,05 molaire au moyen d'un appareil de titrage automatique Radiometer type TTA4. La filtration sur gel a été réalisée à l'aide de colonnes ttSephadex" dans les conditions précisées dans les légendes ciaprès. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 A chacune des trois séries de flacons Erlenmeyer de 500 ml ont été ajoutés 100 ml de l'un des milieux suivants T Sucrose 24 g "Pharmamédia" 20 g KH2P04 1D95 g Eau du robinet 1000 ml II Farine de maïs 20 g Farine de soja 20 g KH2PO4 13,5 g Eau du ropinet 1000 ml III Amidon 30 g Sang de beau@ séché par pulvérisation 15 g KH2PO4 13,5 g E@u du rchin@t 1000 ml IV farine de sej@ 35 g Amidon 24 g KH2PO4 13,6 g V "Actiferment" 25 g Sucrose 35 g KH2PO4 13,6 g VI farine de soja 24 g Gélatine 10 g Sucrose 20 g KH2PO4 13,6 g VII Liqueur de maïs 30 g VIII Farine d'avoine 30 g KH2PO4 13,6 g IX Farine de soja 15 g Liqueur de maïs 40 g KH2PO4 13,6 g X "Scotaferm" 50 g Mélasse 40 g H2O ajouté à 1000 ml pH 6,3 avant stérili s@tion du milieu de culture. L @@econs ont été @ut@cl @vés à 120 pendant 20 minutes après @@ustem @@ @u pH à 6,8. Après refr@idissement, les flacons ont été @nsemenc@s d'une suspension aqueuse de l'erganisme indiqué dans le ta@le@u 12 @@tenu à partir du milieu nutritif clas- sique à b@se d'ag@@. L'in@u@ation @ été pratiquée a une température de 26-3@ C a été @rrêtée après 113 heures ou après que l'activité protéolytique avait passé par un maximum. Les résultats sont indiqués dans le tableau 12. Tableau 12 Organisme Activité exprimée en unités de easéine par ml de solution renfermant le composant ther stable, obtenu à partir du milieu N I II III IV V VI VII VIII IX X Souche Astra 19 4,6 s,0 0,1 0,8 0,2 0,3 0,2 4,6 0,3 7,5 Exemple 2 (A) Ond ajusté du "Pharmam dia" (100 g) du suerose (150 g), KH2PO4 (70 g), de l'émulsion anti-mousse RD (1ml), du saindoux (10 ml), de l'huile do paraffine (2,6 ml) et ducéta- nol (o,4 g), dans de l'eau du robinet (5 l), à pH 698 avec de l'hydroxyde de sodium (15 ml) et stérilisé pendant 50 minutes à 1240 dans une cuve de fermentation.Le milieu nutritif n été ensemencé à 28 C, avec aération et sous agitation pendant 24 heuress, à l'aide de 100 ml d'une eulture de Streptomyees globisporus de 24 heures (B) Du produit "Pharmamedia" (1000g) , du sucrose (1500g), KH2PO4 (700g), de l'émulsion anti-mousse RD (5 ml) du saindoux (40 mi), de l'huile dc paraffine (6 ml) et du cétanol (4 g) dans de l'eau du robines (50 1) ont été ajustés à pH 6,8 avec de l'hydroxyde de sediam à 45% (150 ml) et la solution a été stérilisée dans une @@ à @ermentarier pendant 30 minutes à 124 C Le milieu nterien a été refroidi et ensemencé à l'aide de la cultare susrlentionnée et ensuite mis à ineuber à 28 C avec agitation et aération.Après 140 heures, lorsque l'activité protéolytique avait été évaluée à 6.1 CU/ml, le bouillon de fermentation a été refroidi. Exemple 3 (A) Du produit "Pharmamédia" (100 g), du suerese (150 g) KH2PO4 (70 g), de l'émulsion anti-mousse RD (1 ml), du saindoux (17 ml), de l'huile de paraffine (2,6 ml) et du cétanel (0,4 g) dans de l'eau du robinet (5 1) ont été ajustés à pH 6,8 avec de l'htydroxyde de sodium (15 ml) et stérilisés pendant 30 minu tes à 124 C dans une cuve de du- fermentation. Le milieu nutritif a été ensemencé avec 100 mi d ' d'une culture de Streptomyces gle- bisporus de 24 heures et mis à ineuber, avec aération et agita- tion, pendant 24 heurès à 28 C. (B) Du produit "Pharmemedia" (3000 g), du sucrose (4500 g), KH2PO4 (2100 g), de l'émulsion anti-mousse RD (15 ml) du saindoux (120 ml), de l'huile de paraffine (18 ml) et du cétanol (12 g) dans de l'eau du robinet (150 ml) ont été ajustés a pH 6,8 avec de l'hydroxyde de sodium à 45% (environ 450 ml) et stérilisés pcndant 30 minutes à 12400. Le milieu nutritif a été refroidi, ensemence à l'aide de la culture susmentionnée et ensuite mis à i incubation à 28 C avec agitation et aération. Après 156 heures, lorsque l'activité protéolytique avait été évaluée à 5,5 CU/ml, on a refroidi le bouillon de fermentation. Exemple 4 L'essai de fermentation a été effectué selon l'exemple 2 (B). Après 140 heures, l'activité protéolytique avait été évaluée à 5,2 CU/ml et le bouillon de fermentation a été refroidi. Exemple 5 - Isolement de la préparation enzymatique Pour l'isolement de la préparation enzymatique à partir du bouillon de fermentation obtenu dans/l'exemple 2, le bouillon a été séparé dans un séparateur centrifuge et, après la séparation, la solution a été clarifiée dans un filtre-presse Seitz 3/1250. La solution limpide (45 l ,activité de 6,0 CU/ml) a été évaporée dans un évaporateur en couche mince à 1500 jusqu'à 8 1 et une activité de 34 CU/ml. La solution a été dialysée contre de l'eau du robinet pendant 24 heures et séchée par atomisation en fournissant 210g doués d'une activité de 0,9 CU/mg. Exemple 6 Pour l'isolement de la préparation enzymatique à partir du bouillon de fermentation obtenu dans l'exemple 3 le bouillon a été séparé dans un séparateur centrifuge et, après la sépara tion, la solution a été clarifiée dans un filtre-presse Seitz 5/1250. La solution limpide (120 1, activité de 4,8 CU/ml) a été évaporée à 1500 dans un évaporateur à couche mince jusqu'à 1755 1 et une activité d 58 CU/ml. La solution a été refroidie et de l'acétone (13 l) à une température de -10 C a été ajoutée sous agitation. Agrès agitation pendant 30 minutes, la matière précipitée a été éliminée par centrifugation dans une centrifugeuse Sharpies. La solution limpide a été évaporée dans un évaporateur en couche mince à 15 C jusqu'à 11,8 i t une activité de 60,5 OU/ml. La solution a été séchée par atomisation en fournissant 525 g doués d'une activité de 0,50 CU/mg. Exemple 7 Pour l'isolement de la préparation enzymatique à partir du bouillon de fermentation obtenu dans l'exemple 4, le bouillon a été séparé dans un séparateur centrifuge et, après la séparation la solution a été clarifiée dans un filtre-presse Seitz 3/1250. La solution limpide (137 1, activité de 5,2 CU/ml) a été évaporée à 1500 dans un évaporateur en couche mince jusqu a 16 1 et une activité de 47s5 CU/ml. La solution a été refroidie jusqu'à environ +10 C et de/l'acétone (8 1) à une température de -10 C a été ajoutée sous agitation. Après agitation pendant 50 minutes, la matière précipitée a été éliminée par centrifugation dans une centrifugeuse Sharples. La solution limpide a été évaporée dans un évaporateur en couche mince à 10-15 C jusqu'à 8,3 1 et à une activité de 81,5 CU/ml. Après déssalement sur "Sephadex" G 25 grossier dans une colonne K 100/100 (Pharmacia, Uppsala, suède), le volume a été réduit à 2,3 1 à +15 C dans un évaporateur en couche mince. L'ac tivité était de 286 CU/ml. La solution a été séchée par atomisation en fournissant 289 g doués d'une activité de 1,9 CU/mg. Temple 8 - Préparation du constituant thermostable 25 g d'un échantillon de filtrat de culture de souche Astra 19, séché par atomisation et désigné par "produit brut" dans cette description, ayant une activité protéolytique de 0,56- unité de caséinexpar mg, ont été dissous dans 500 ml d'H20 à 60 C et maintenus à cette température pendant 50 minutes. Après refroidissement, la solution a été centrifugée. La couche surnageante a été mélangée à 1000 ml d'acétone refroidie à la glace. Le précipité désigné par "premier précipité acétonique" dans la description a été éliminé par centrifugation. A la solution surnageante limpide on a ajouté une quantité supplémentaire de 750 ml d'acétone et on a centrifugé le mélange résultant. Le pré cipité ainsi obtenu est désigné dans la description par deuxième précipité acétonique". Les précipites ont été dissous dans de l'eau et lyophilisés. Les résultats obtenus au cours des essais sur les deux précipités acétoniques; sur un échantillon de fil trait de culture séché par pulvérisation et désigné par "produit brut" et sur un produit brut mis à l'incubation pendant 50 minutes à 60 C sont consignés dans le tableau 15. Ememple 9 - Prépartion d'un composantg thermostable On -a repris le mode opératoire de l'exemple 83 en utilisant 10 g, d'échantillon de filtrat de culture séché par atomisation et on les portant à l'ineubation à 65 C Les résultets obtenus sont rassemblés dans le tableau 13. Tabloau 13 Subatance Poids Aetivité Aetivité protéoly- protéolitiqu tique totale CU Produit brut de l'exemple 8 25 g 0,56 CU/mg 14 000 Produit brut de l'exemple 9 10 g 0,56 CU/mg 5 600 Produit brut de l'exemple 8 mis à l'ineubation pendant 50 minutes à 60 C 25 25 g par 500 ml 7,8 CU/ml 3 900 Produit brut de l'exemple 9 mi à l'incubation pendant 30 minutes à 65 C 10 g par1,6 CU/ml 800 Premier préeipité acétonique, exemple 8 5,6 g 0,39 CU/mg 2 200 Premier précipité acétonique, oxemple 9 3,9 g 0,26 CU/mg 1 000 Deuxieme préaipité aeétonique, exemple 8 3,2 g 0,5 CU/mg 1 800 Deuxième précipité acétonique, Exemple 9 1,@ g 0,1 CU/mg 150 I ressert du tableau 13 que le chauffage de la solution de protéase brute pendant 30 minutes à 65 C provoque une perte considérable de l'activité protéolytique totale. Dans les essais enregistrés dans le tableau, la perte d'activité effective est d'environ 85%. L'activité résiduelle peut être récupérée par préeipitation après addition d'acétone par exemple. Le puemier préeipit@ peétionique s'enrichit en aetivité protéolytique peéesatant une température optimale plus élevée et, jusqu'à un eertain point une stabilité thenmique meilleure que ole deaxième peéeipité acétonique ainsi que le mél @nge de protéase @ue comme @@ @@@paraf à l' examen des tablenun 2 et qui mettent évidenes ees propriétés qu premier @éeipisé acétonique. Le tatleau 1 monere que le pH optimal mesuré par rappore que le pH optimal mesuré par rapport à la caséine een identique pour la produie trut, pour le produie brut, pour le premier préeipite @@@@@@enique et pour le deuxième préeipité acétonique. La valeur op@@@@@@@ semble/se situer entre pH 9 et 10. Outre l'acétone, on peut également utiliser pour la pré- eipitation de la préparation enzymatique thermostable d'autres solvants organiques tells qu l'éthanol, le propanol et d'autres alcools et similaires ainsi que des--els comme le sulfate d'ammo- nium et analogues. La période de chauffage pour la solution aqueuse du mélange d'enzymes peut s'étendre jusqu'à environ 2 heures à une température d'enviren 55 - 75 C. Ce processus de chauffage provoque une aetivité protéolytique que/l'on ne trouve pas dans la preparation enzymatique initiale. Compatibilité de la préparation enzymatique avec des compositions détergentes On n utilisé trois compositions détergentes disponibles sur le marché ; l'une renfermant des perborates et environ 40 à 50% (en poids) de phosphate, autre environ 7 (en poids) de phosphate et pas de perborate et la troisième étant un détergent au savon renfermant environ 5% (en poids) de phosphate Le pH optimal de l'activité protéolytique, la stabilité du pH de l'ac- tivité protéolytique, la température optimale de l'activité protéolytique et la termostabilité de la préparation enzymatique à base de produit brut ont été étudiées. A pH dptimal de l'aetivité caséinolytique de la prepa- ration enzymatique à base de produit brut associée à des compo- sitions détergentes. on a préparé les salutiens sunvantes : une sclution renfermant 5 g de composition détergents ans 100 ml d'ezu (solution détergente). Une solution renfermant 5 mg de préparation enzymatique à base de produit brut par ml d'eau (solution enzymatique). Une solution à 3% de caséine. Le pH a été ajusté à l'aide d'une solution tampon Teorell Stennhagen. On a mélangé 2 ml de solution tampon au pH désiré et 1 ml de solution détergente à 3 ml, de solution de caséine. La solution résultante a été chauffée à 37 C, après quei en a ajouté 0,1 ml de la solution onzymatique et mesuré l'activité caséinolytique. A titre de comparaison, oe: a examine une solution c -blanc ne contenant pas de détergent. Les résultats sont rassem- blés dans le tableau 1.4. Tableau 14 Activité caséinolytique de la préparation enzymatique à base de produit brut associée à une composition détergente Activité caséinolytique, pourcent d'activité maximale, de la composition détergente avec une teneur en phosphate de 40-50 7 % 5 ss Solution à blanc 6,0 70 58 55 n8 6,5 82 60 70 82 74 91 61 7,5 5 88 90 8,0 92 90 95 82 8,5 100 93 9,0 92 100 99 100 9,5 92 100 10,0 80 45 85 89 10,5 45 55 11,0 9 31 B. Stabilité du pH de la préparation Lnzymatique à base de produit brut associée à des compositions détergentes On a utilisé des solutions identiques à celles de l'essai A ci-dessus et incorporé 2 ml de solution tampon et 1 ml de solution détergente.On a ensuite ajouté 0,1 ml de la solution enzymatique et la solution ainsi obtenue a été portée à l'incubation pendant 30 minutes à 37 C, après quoi l'activité caséinolytique a été mesurée à pH 7,4 et à 37 C. Les résultats sont indiqués dans le tableau 15. Tableau 15 Influence du pH sur la stabilité de la préparation enzymatique à base de produit brut associée aux compositions détergentes pH Activité caséinolytique,% de l'activité maximale,de la composition détergente avec une teneur en phosphate de 40 - 50% 7 % 5 % Solution à blane 5 6 7 4 790 9 12 4 -4,0 14 54 91 37 5,0 87 65 70 6,0 100 99 100 97 7,0 60 85 91 100 8,0 55 100 42 93 9, o 30 63 25 90 10.0 27 28 20 50 11,0 27 23 18 14 C.Température optimale de l'activité caséinolytique de la préparation enzymatique à base de produit brut associée aux compositions détergentes La La solution détergente et la solution de caséine utilisées dtaient identiques à celles décrites sous A) ci-dessus. On a utilisé une solution enzymatique à base de produit brut contenant 3 mg de préparation enzymatique à base de produit brut. L'ajustement du pH a été effectué à l'aide d'un tampon au phosphate 0,2 m pour le réglage à pH 7,4 et à l'aide d'un tampon Teorell Stenhagen pour le réglage à pH 9,0. On a mélangé 2 ml de solution tampon et 1 ml de solution détergente à 5 ml de solution de caséine et chauffé pendant 5 mn dans un bain d'eau jusqu'à la température désirée. On a ensuite ajouté 0,1 ml de solution d'enzyme et déterminé l'activité caséi nolytique. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 16. Tableau 16 Température omtimale de l'activité caséinolytioque de la préparation à base de produit brut associée aux compositions détergentes Temp. Activité caséinolytique, % de l'activité maximale, de la 0,0 composition détergente avec une teneur en phosphate de 40 - 50 % 7 % 5% solution à blanc pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 20 18 28 20 54 56 30 29 35 37 D9 - 58 47 86 45 76 28 45 50 70 96 71 95 52 50 77 100 60 100 87 100 -100 87 82 100 70 70 87 100 71 95 100 100 80 77 80 82 85 78 65 99 85 78 D.Thermostabilité de la préparation enzymatique à base de produit brut associée aux compositions détergentes ~ On a utilisé des solutions identiques à celles de l'essai C. On a mélangé 2 nil de solution tampon et 1 ml de solution déter gente avec 0,1 mi de solution d'enzyme et la solution résultante a été mise à l'incubation pendant 30 minutes à la température désirée, après quoi l'activité caséinolytique a été déterminée à 5700. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 17. Tableau 17 Thermostabilité de la préparation enzymatique à hase de produit brut associée aux compositions détergentes Temp. Aetivité caséinolytique, % de l'aetivité maximale, de la C composition détergente avec une teneur en phosphate de 40 - 50% 7 % 5 % Solution à blane pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 pH 7,4 pH 9,0 20 100 100 100 100 100 100 57 56 71 99 71 84 55 95 74 D3 25 54 7C 55 47 54 87 13 6G 3 2 31 21 15 22 20 10 70 5 2 15 10 4 7 15 7 80 2 û 4 0 2 0 13 2 E.On a mesuré l'activité caséinolytique relative de la préparation enzymatique à base de produit brut associée aux compositions détergentes comparativement à l'activité caséinolytique obtenue sans aucune addition de composition détergente. Les ré- sultats sont rassomblés dans le tableau 18. Tableau 18 Aetivité easéinolytique relative de la préparation enzymatique à base de produit brut Type de détergent Aetivité caséinolytique Teneur en phosphate de 40-50% relative contenant du perborate 89 Teneur en phosphate de 7% 107 Teneur en phospnate de 5% (détergent au savon) 130 Sans addition de détergeants 100 Les resul@ate d'essals figurant aux tableaux 14-18 montrent qes la @@aretion enzymetique de la présente invention est compatibls ves des esmpesititns detergentes à teneur en pnespnate élevée (48 à @% pelas) ainsi qu@a teneur en phosphate faible (5 à 10% en poies) pouvant egalement contenir des perberates comme azuranes optiques. Le r@@ultats montrent également que la préparation oneymatique est compatible avec des détergents à bass de e@von. La thermes@abilité semble être légèrement affeetée ger @@@@ tgen@ur élevée en phosphate eu en perberate mais la température optimale, comme le montre lu- tableau 16, n'est par sensiblement affectée par la présence de compositions détergentes. Légende des figures Les figures a et 1b sont des diagrammes dans lesquels on a porté en ordonnées la densité optique et en bascisses les fraetions isolées. Figure la) filtration sur gel de 300 mg de préparation brute Figure 1b) filtration sur gel de 500 mg du premiemier pré eipité acétonique de la préparation brute chauffée. absorption W ..... aetivité caséinolytique à 70 C ±±- incubation é 70 C, activité caséinolytique é 70 C La figure 2 est un diagramme montrant la séparation isoélectrique de la préparation enzymatique brutes la densité optique étant portée en ordonnées sur l'axe de gauche, les pH sur l'axe de droite ct les fractions en abscisses. absorption W .-.-.-.- activité caséinolytique à 60 C. ±±±± ineubation à 70 C , activité caséinolytique à 6000. - - - pU La figure 3 est un diagramme de séparation isoélectrique de la substance thermostable purifiée par chromatographie sur DEAE cellulose. La substance éluée avec NH4CH3COO 0,01 molaire a été utilisée pour la séparation isoélectrique. La densité optique est portée en ordonnés sur l'axe de gauche, le pH en ordonnées sur l'axe de droite et les fractions en abscisses. ~~~~~~ aosorption W .-.-.-.-.- activité easéinolytique, 60 C ±±±± ineubation à 70 C, aetivité caséinolytique à 60 C PH REVENDICATIONS 1 - Mélange d'enzymes hydrolytiques présentant les caractéristiques suivantes a) il est un mélange de protéines; b) il est soluble dans l'eau, dans les solutions salines et dans les solutions-tampons conventionnelles; c) il est stable ut conserve son activité enz-nmatique à la température ambiante pendant plus d'un an sous la forme de poudre scelle; d) son spectre d'absorption ultra-viet est caractéristique des protéines renfermant des amino-acides aromatiques3 e) il exerce une action protéolytique sur la caséine, l'hémoglobine et la gélatine; f) il présente un optimum protéolytique à pH 9-10 avec la caséine comme substrat;; g) il est capable d'hydrolyser lester éthylique de la N- i tosyl-L-arginine (TAEE) , h) il recèle une activité protéolytique capable d'être provoquée par la chaleur; i- il renferme, en plus des enzymes protéolytiques, des estérases, des lipases et des amylases; j) une ou des enzymes thermostables sont précipites à l'aide de solvants organiques ou de sulfate d'ammonium k) il possède une stabilité et une activité essentiellement indépendantes de I concentration en ions calcium d'une solution à température élevé;; l) il présente un optimum de température avec de la caséine comme substrat à environ Go c à pH 7,4 et- un optimum de tempéra- turc à environ 50 C à pH 9j m) il presented un optimum de température aux environs de 50 C à pH 7,4 avec du TAEE comme substrat. 2 - Procédé pour la production d'un mélange enzymatique hydrolytique selon l- revendication 1 qui consiste à le soumettre à une fermentation, dans des conditions d'immersion aérobies, dansle milieu nutritif d'une nouvelle variété de Streptomyces globisporus présontant les propriétés morphologiques suivantes: a) croissance végétative. colonies plates, incolores; pas de formation de pigments ou formation de pigments diffusibles légèrement jaunes; b) mycélium aérien bien développé un particuliev sur agar synthétique tel q'un agar d'amidon-KNO3. c) le mycélium aérien est pulvérulent, blane,parfois légèrement jaune avec un ton gris lorsque les spores sont formées; d) les sporophores sont droits et forment des ramifications5 e) les spores sont sphériques avec un diamètre de 0,8 à 1 micron; f) le lait est rapidement peptonisé en donnent une réaction légèrement alcaline g) la gélatine se liquéfie lentement,' h) l'amidon esthydrolysé; i) la croissance est moyenne sur cellulose; j) la croissance est bonne sur sucrose et glucoses k) il n'a pas été observé de propriétés antoganistes;; 1) sur les pommes de terre il ne se forme que des traces de mycélium aérien à 28 C mais une- sporulation abondante a lieu à 22 C m) la croissance devient brune mais nn n'observe pas de pigments solubles. 7 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient des sources assimilables de car bone d'azote et de sels inorganiques. 4 - Procédé selon l'une des revendications 2 ou 5, caractérisé en ce que le pH au début de la fermentation est de 6 à 795. 5 - Procédé' selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pH au début de la fermentation est de 6,8. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation entre 26 et 30 C 7-Mélange d'enzvmes hvdrolvtiques obtenu par le proqédé selon 1 une queleonque des revendications 2 à 6 - Procede pour 1 lsolement d'une fraction d'enzyme protéolytique douée d'une stabilité thermique élevée caractérisé en ce qu'on chauffe une solution aqueuse du mélange enzymatique selon l'une des revendications 1 ou 7 jusqu'à environ 55-75 C. pendant une durée allant jusqu'à 2 heures environ et qu'on préci pite une fraction protéolytique thermiquement stable à partir de la solution par addition d'un solvant organique ou d'un sel 9 - Enzyme protéolytique thermiquement stable obtenue par lue procédé conforme à la revendication 8. 10 - Procédé pour l'isolement d'une fraction d'enzyme protéolytique douée d'une stabilité thermique élevée, caractérisé en ce qu'on soumet un mélange enzymatique tel que revendiqué dans l1une des revendications 1, , 7 ou 9 à une filtration sur gel en ujtilisant une dextrane modifiée présentant un domaine de fractionnement pour peptides et protéines globulaires d'un poids moléqulaire de 1500 à 30 000 et qu'en élue la dextrane modifiée avec de l'eau. 11 - Procédé pour l'isolement d'une fraction d'enzyme protéolytique douée d'une stabilité thormique élevée caractérisé en ce qu @ on met une solution de I fraction d'enzyme selon la revendication 9 en contaet avec de la diéthylaminoéthyl celluose et qu'on élue la diéthylaminoétjnyl cellulose avec de l'acétate d'ammonium à pH 7,4. 12 - Fraetion enzymatique pretéloytique thermiquement stable obtenue par un procédé selon la revendication 11. 13 - - Procédé pour l'isolement d'une fraction d'enzyme protéolytique douée d'une stabilité thermique élevée caractérisé en ce qu'on soumet un mélange d'enzymes selon l'une des revendications 1 ou 7 à un séparation isoélectrique et qu'on récupère la fraction éluée à pH 4 - 6. 14 - Procédé pour l'solement d!une fraction d'enzyme protéolytique douéàe d'une stabilite thermique élevée caractérisé en ce qu'en soumet le m lange d'enzymes selon la revendication 12 à une séparation isoélectrique t qu'on récupère la fraction éluée à pH 3,2. 15 - Procédé pour l'isolement d 'une fraction d'enzyme protéolytique douée d'une stabilité thermique élevéc caractérisé en ce qu'on soute t le mélange d'enzymes selon la revendication 12 à une séparation isoélectrique et qu'en récupère la fraction lue à pH 5,7. 16 Fraetions d'enzyme protéolytique tghermiquement stables obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 15 14 OU 15. 17 - Composieion détergente contenant une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 7, 9, 12 ou 16