FR 2121487 A1 19720825 FR 7102262 A 19710115 La présente invention est relative à un procédé pour la préparation d'une substance bactériozlactique possédant une bonne résistance à divers antibiotiques et aux sulfamides. Récemment, du fait du développement des antibiotiques, le domaine de la chimie s'est étendu également au traitement des maladies digestives pour produire des effets spectaculaires. Cependant, on constate par ailleurs qutun usage mal controlé des antibiotiques peut faire apparattre des bactéries de la dysenterie très résistantes, augmenter certaines formes dtin- fection et décimer ou détruire les bactéries intestinales utiles. Par conséquent, le traitement aux substances bactériolacP tiques proposé par Metchinikov s'applique également au traitement et à la prévention des maladies digestives telles que la dysenterie, le salmonellosis ou autres, ainsi qu'au traitement et à la prévention de certaines infections. Le resultat de ces trait tements est bien connu. Cependant, étant donne que les bactéries lactiques utilisées pour les substances bactério-lactiques conventionnelles sont sensibles aux antibiotiques, il advient quelles deviennent inefficaces sur le plan thérapeutique quand la substance bacté- rio-lactique conventionnelle est utilisée simultanément avec des antibiotiques L'un des objets de la présente invention est de réaliser une substance bacterio-lactique résistant à divers produits, qui comprend des bactéries lactiques ne perdant pas leur activi- té en présence de divers antibiotiques ou sulfamides. Un autre objet de la présente invention est d'obtenir des bactéries lactiques offrant des résistances diverses par rapport à diverses sortes d'antibiotiques et de sulfamides. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples non limitatifs qui vont suivrez On connatt par le brevet japonais 567 370 un procédé pour fabriquer une substance contenant Streptococcus faecalis BIO-SMR, c'est-à-dire une bactérie lactique resistant à la Streptomycine ainsi qutaux antibiotiques. Cependant, on constate que dans les traitements chimithérapiques il est fréquent dfutiliser plus de deux sortes dtantibiotiques et de sulfamides, si bien qutune substance bactério-lactique du genre précité qui possède une résistance contre seulement une seule sorte d'antibiotiques est dun intéret pratique peu sensible. On a constaté que les impératifs suivants doivent être respectes pour obtenir une substance bactério-lactique présentant une valeur médicale suffisante lorsqu'on l'utilise simulas nément avec plusieurs sortes d'antibiotiques et de sulfamides0 Tout d'abord, il est nécessaire que la substance bactériolactique contienne des bactéries lactiques résistant lorsqu'elles sont mises simultanément en présence de diverses sortes d'antibiotiques et de sulfamides0 Autrement dit, la bactérie ladtique doit entre une bactérie à résistance multiple.Pour cela, il est nécessaire de sélectionner la bactérie lactique ayant la caractéristique de devenir résistante simultanément à deux ou plusieurs sortes dtantibiotiques, de façon à éviter que par exemple lorsqu'elle devient résistante à la streptomycine, il devienne difficile de la faire résister à d'autres antibio- tiques ; ou bien encore pour éviter que lorsque la bactérie lactique devient résistante aux antibiotiques autres que la streptomycine, sa résistance initiale à la streptomycine se trouve diminuée. Deuxièmement, il est nécessaire que la bactérie lactique possédant une résistance aux produits, ne puisse pas transmettre cette résistance. La raison en est que lorsque la substance bactério-lactique possède une transmissibilité de résistance, le fait de l'administrer à un patient rend résistants les virus et germes coolitis présents dans Iintestin, ce qui présente de graves inconvénients pour la guérison du malade. Troisièmement, il est nécessaire que la bactérie lactique possédant une résistance aux substances offre une résistance stable, insensible à certaines- substances particulières. La raison en est que* m8me si la bactérie lactique a acquis une résistance à différentes sortes d'antibiotiques et de sulfamides, elle perd toute valeur de médicament si cette résistance peut facilement disparattreO De plus, la bactérie lactique résistant à certaines substances particulières telles que la streptomycine montre une dépendance de la streptomycine si bien que la streptomycine devient une substance indispensable à sa croissance ; il devient alors nécessaire d'ajouter des antibiotiques dépendants, ces antibiotiques devant être prescrits et administrés en mme temps que la bactérie lactique. Quatrièmement et en dernier lieu, il est nécessaire que la substance bactério-lactique soit fabriquée sous la forme dtune poudre stable après la culture de la bactérie lactique, de façon que la vitesse de croissance de cette bactérie dans le médium de culture soit élevée. Généralement, la bactérie lactique qui est devenue résistante aux substances offre une diminution de vitesse de croissance très spé@aculaire au sein du médium de culture ; par conséquent, il est nécessaire de sélectionner la bactérie lactique parmi celles dont la vitesse de croissance ne diminue pas lorsqu'apparatt la caractéristique de résistance. Le résultat des essais relatifs à la sélection de la bactérie lactique compte tenu des quatre exigences précitées pour conférer ensuite à la bactérie lactique une résistance à divers ses substances, montre qu'une bactérie lactique satisfaisante peut être obtenue par le procédé ci-dessous.Ce procédé selon l'invention consiste à sélectionner un échantillon possédant une résistance aux sulfamides, parmi divers echantillons de bactéries lactiques du genre Streptococcus faecallis ; oncultive cet échantillon dans chaque milieu contenant de la streptomycine (ci-après désignée en abrégé nSM"), du chloramphénicol (ci-après appelé par abréviation "CM"), de la tétracycline (ci-après appelée wTCft), -de l'érythromycine (ci-après appelée tEM") et de la pénicilline aminobenzoyle (ci-après appelée "ABPC"). La culture s'effectue de façon que l'échantillon soit cultivé successivement dans chaque milieu contenant des antibiotiques ci-dessus, en procédant dans l'ordre SM, CM, TC, EM et ABPC, en utilisant le procédé de la plaque de gélose à gradient de produits, et la technique du transfert répété en présence d'une concentration subinhibitoire d'un antibiotique ; la combinaison de ces deux procédés confère à l'échantillon la résistance voulue contre ces produits, Suivant ce procédé, l'échantillon acquiert une résistance contre la kanamycine, la fradiomycine, l'oléandomycine, la licomycine, la leucomycine, la pénicilline G, la céphaloridine, la gentamicine, la spiramycine, la bicilline, la s-xìcitline, l'oracilline, la staphoilline, la staphcil- line V, la méthocilline S, la staphcilline A êt la-natacilline en plus des produits SM, CM, TC, EM et ABPCv La présente invention est basée sur les constatations qui précèdent. L'échantillon mère utilisé selon la présente invention pour le traitement de bactéries lactiques possédant une résistance à diverses sortes d'antibiotiques et dc sulfamides est une bac térie résistant aux sulfamides qui appartient au groupe streptococcus faecaiis comme mentionné ci-dessus et on désignera cet échantillon mère sous la dénomination "BIO" (voir brevet Japonais 567 370). Le procédé pour conférer à cet échantillon EIG la résistance aux divers antibiotiques précités comprend les étapes suivantes a) Premièrement, on cultive par la méthode de la bande, cet échantillon dans un milieu de lactose, de carbonate de calcium précipité et d'agar ou de gélose (ci-après désigné en abrégé comme "milieu Ca LA) contenant SM, pendant 72 heures à une température de 370C, suivant le procédé de la plaque a gélose à gradient de substance b) On sélectionne plusieurs colonies cultivées sur place et possédant la plus forte concentration de SM parmi celles c- se sont développées sur la plaque et on inocule chacune de ces colonies au milieu Ca LA contenant une plus forte concentrat-oti de CM pour cultiver par la méthode de la bande et ensuite c) On cultive par transferts successifs cette culture de 16 à 17 fois au moyen de la technique du transfert répété en présence d'une concentration subinhibitoire d'un antibiotique (SEl). On constate qu lo procédé qui vient d'hêtre décrit permet d'obtenir un échantillon BIO possédant une forte résistance contre SM. De plus, lorsqu'on effectue de façon répétée les transferts successifs précités de cultures dans l'ordre CM TC, EM et ABPC en utilisant le procédé de la plaque de gélose avec gradient de -substances, et la technique du transfert répété en présence d'une concentration subinhibitoire dtun antibiotique, on peut isoler une bactérie lactique possédant une--resistance multiple aux médicaments, susceptible d'être utilisée pour la présente invention0 Dans l'exposé qui va suivre, cette bactérie lactique sera désignée comme échantillon BIO-4Rv Cet échantillon a été déposé sous le numéro 184 à l'Agence Industrielle de Science et de Technologie, Institut de Recherches sur la Permentation, qui est l'Organisme Japonais autorisé pour le dépot des bactéries0 En effectuant les cultures précitées avec transferts succes- sifs, on effectue ces transferts de 30 à 40 fois dans le cas de CM, de 40 à 50 fois dans le cas de TC, environ de 16 à 17 fois dans le cas de EM, et de 20 à 30 fois dans le cas de ABPC. Ensuite, on peut obtenir les bactéries possédant une forte résistance à chaque substance médicamenteuse. Les degrés de résistance ainsi obtenus pour itéchantillon BIO-4R de bactérie lactique, sont indiqués dans le tableau ci-dessous face à chaque substance, en degrés par rapport à ltéchantillon mère (BIO) SM plus de 2000 fois CM 1000 fois TC 100 fois EM 500 fois KM 33 fois F 100 fois ABPC 30 fois Oléandomycine 15 fois Lincomycine 10 fois Leucomycine plus de 50 fois Pénicilline GK 20 fois Céphaloridine 20 fois Gentamicine 40 fois Spiramycine 250 fois Bicilline V2 32 fois Syncilline 32 fois Oracilline 160 fois Staphcilline plus de 5 fois Stapheilinne V plus de 32 fois Méthocilline S plus de 5 fois Staphcilline A plus de 5 fois Natacilline 320 fois Ainsi, on observe un degré de plus de 200 fois la résis- tance à SA d'un échantillon de staphylococcus-209PO Le milieu de plaque agar-agar à gradient de substance (milieu Ca LA) étant utilisé dans la présente invention pour conférer à l'échantillon BIO de bactérie lactique une résistance à différents types de médicaments est préparé de la façon suivante Extrait de viande 10 g Peptone 10 g Sel (Nacl) 2 g Lactose 20 g Extrait de levure 20 ml Carbonate de calcium précipité 10 g Agar-Agar 14 g Le mélange de la composition précitée est dissous d'tirs 1000 mî d' CM, TC, EM et ABPC est ensuite inoculé dans une bouteille à une petite quantité d'un milieu lacté jusqu'à un total de l'ordre de 10 à 15, puis on cultive pendant une longue durée à une tempéra ture de 37 C.Le lait solidifié de culture est ensuite sélectionné parmi ces cultures puis à nouveau inoculé dans un nouveau milieu lacté pour une nouvelle culture, Après plusieurs transferts successifs de cette culture plus de 10 fois, on sélectionne l'échantillon possédant la meilleure capacité de développement en milieu lacté. A l'aide de cette culture successive par transferts, l'échantillon qui avait seulement de 50 à 60 % de taux de croissance au moment de la première culture en milieu lacté g accuse finalement un taux de croissance de 100 ?k tandis que la période de solidification du lait devient régulièrement de l'or~ dre de 2 à 3 Jours. L'échantillon I3IO-4R de bactérie lactique obtenu par ce procédé se développe facilement en milieu lacté quand on le cultive dans un milieu dont le composant principal est du lait en poudre écrémé, ce qui permet par conséquent une pulvérisation facile par séchage et projection. La technique de la culture de bactéries lactiques par séchage et pulvérisation pour préparé rer un médicament bactério-lactique stable en poudre, est décrite dans le brevet japonais numéro 502 315. Ce principe consiste à pulvériser au moyen dtun séchoir pulvérisateur9 la culture préparée en cultivant l'échantillon de bactérie lactique précité qui possède une résistance face à plusieurs substances, dans un milieu contenant une forte concentration de lait écrémé. Généralement, on ajoute un véhicule à la poudre ainsi obtenue pour former un médicament bactério-lactiqueO Des essais ont été ansuite effectués pour confirmer la résistance multiple et les essais du médicament bactério-lactique obtenu selon l'invention. Par administration orale du médicament selon l'invention en même temps que SM, avec absorption quotidienne sur une souris, on nta pu observer aucune augmentation anormale de bactéries analogues à des levures dans les excréments de l'animal. Au contraire, si l'on n'avait administré que SM à la souris, la teneur en bactéries du genre des levures aurait considérablement augmenté dans les excréments0 De plus, lorsqu'une souris traitée par administration orale de SM et EM est soumise à l'attaque dtun échantillon salmonella entéritidis No 11, la mortalité atteint de 80 à 100 Pour mieux fixer les idées, on va maintenant décrire plus en détail un exemple dont il est bien entendu qu'il ne limite nullement l'objet de l'invention. Exemple On inocule un échantillon BIO de Streptococcus~faecalis au milieu de Ca LA de la plaque de gélose inclinée préparée comme indiqué ci-dessus et additipnnée de SM. On cultive cet échantillon par la méthode des bandes pendant 72 heures à une température de 370C suivant le procédé de la plaque de gélose inclinée à gradient de substances0 Après culture, la colonie développée jusqu'à obtenir une concentration maxima de SM est sélectionnée parmi les colonies développées sur la plaque. On soumet cette colonie de façon répétée à des cultures de transfcrts successives en utilisant le même type de milieu. Après cette culture par transferts successifs effectuée 16 fois, on obtient la bactérie lactique possédant la meilleure résistance à SM. Deuxièmement, cette bactérie lactique à haute résistance contre SM est soumise 30 fois à une culture par transferts successifs à la manière précédemment indiquée, en utilisant le milieu additionné de CM ; puis on obtient la bactérie lactique résistant à SM et CM Troisièmement, cette bactérie lactique résistant à SM et CM est soumise 40 fois à des cultures par transferts successifs suivant le procédé précité, en utilisant un milieu additionné de TC, puis la bactérie lactique ainsi obtenue possède une résistance à SM, CM et TCo quatrièmement, cette bactérie lactique résistant à SM, CM et TC est soumise 16 fois à des cultures par transferts successifs à la manière précitée, en utilisant un milieu additionné de EM d'où on retire une bactérie lactique résistant à la fois à SM, CM, TC et EM. Finalement, cette bactérie lactique résistant à SM, CM, TC et EM est soumise 20 fois à une culture par transferts successifs à la manière précitée, en utilisant un milieu additionné de ABPC d'où l'on retire la bactérie lactique (BIO-4R) possédant, non seulement une résistance contre SM, CM, TC, EM et ABPC, mais encore contre une large variété d'antibiotiques et de sulfamides. On a constaté que le degré de résistance contre les nombreux ses variétés de médicaments précitées atteint sa valeur limite par application des cultures par transferts successifs de 16 à 17 fois pour le cas de SM, 30 à 40 fois pour le cas de CM, 40 à 50 fois pour le cas de TC, 16 à 17 fois pour le cas de EM, et 20 à 30 fois pour le cas de ABPC. L'échantillon bactério-lactique BIO-4R possédant une résisz tance multiple ainsi obtenu par le procédé précité est ensuite inoculé au milieu lacté (environ 15 ml) qui avait été préparé en y mélangeant 2000 g/ml de SM, 15 g/ml de CM, 10 g/ml de TC, 100 g/ml de EMt et 20 g/ml de ABPC. On sélectionne ensuite l'é- chantillon possédant la meilleure aptitude à solidifier le lait. Cet échantillon ainsi sélectionné est soumis à plusieurs reprises au processus précité de 10 à 15 fois pour obtenir un échan- tillon possédant une capacité stable de solidification du lait, c'est-àdire une aptitude élevée au développement en milieu lacté. L'écnantillon ainsi obtenu est ensuite cultivé dans un milieu contenant approximativement 18 % de lait écrémé pendant environ 96 heures, puis la bactérie lactique étant suffisamment développée, on pulvérise la culture au moyen d'un pulvérisateur séchoir à fonctionnement instantané, une température comprise entre 70 et 1000 C. Après pulvérisation, on peut aJouter par mélange un véhicule quelconque, constitué par exemple par dif férentes sortes d'enzymes, de vitamines ou d'aromates. H @ U V E L L E S R E V E N D I @ T @ @ @ @ 1 - Prcoédé pour 1 préporation b'un médi@ement @ialactique @@tivé possédant une résistance simultanément à la streptomyc@ns, at à @u moins quatre autres produits antibiotiques et sulf@@ides, concistant à utiliser la méthode de la plaque de gélose à grodient de subetances, einsi que la technique cos transferts succeasi s , voc culture des h@otéries dans un milieu de leit écrémé avant pulvérisation de la culture au moyen d'un pulvérisateur séchoir, caractérisé en ce que l'échantillon comporte au départ une bactérie appartenant à strept@@@ous faecalis , tandis que la technique des transferts successifs s'effectue an présence d4une concentration subinhibitoire d'un antibiotique tel que streptomycine , chloramphénicol, totracyciine , érythromycine et pénicilline aminobenzyle , ces cinq antibiotiques étant enfin présente dans le milieu lacté de la culture par transferts successifs 2 - Procédé suivant la revendication 4 , où la résistance à la streptomycine est obtenue au moyen de cultures par transferts successifs , carac taris en ce que ces cultures sont effectuées de 6 à 7 fois. 3 - Procédé suivant les revendications 1 et 2 , caractérisé en ce que les cultures par transferts successifs sont effectuées de 30 à 40 fois pour obtenir la résistance au chloramphénicol 4 - Procédé suivant les revendications 1 , 2 et 3 , caractérisé en ce que les cultures par transferts successifs sont effectues de 40 à 50 fois pour obtenir la résistance à la tétracycline. 5 - Procédé suivant les revendications 1 , 2 , 3 et 4 , caractérisé en ce que les cultures par transferts successifs sont effectuées de 16 à 17 fois pour obtenir la résistance à l'érythromycine. 6 - ProcÉdé suivant les revendications 1 , 2 , 3 , 4 et 5 , caractérisé en ce que les cultures par transferts successifs sont effectuées de 20 à 30 fois pour obtenir la résistance à la pénicilline aminobenzyle. 7 - Procédé suivant les revendications ' , 2 , 3 , 4 , 5 et 6 , carac térisé en ce que les cultures par transferts successifs sont effectuées de 10 à 15 fois environ en milieu lacté. O - Médicament bactério-lactique activé possédant une résistance multiple à d'autres medicaments , caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé suivant les revendisations 1 à 7.