FR 2070840 A1 19710917 FR 7045037 A 19701214 L'invention concerne un procédé pour la culture de levures appartenant au type Genus Candida ou Genus Saccharomyces. Plus particulièrement l'invention concerne un procédé pour la culture de ces levures dans un milieu contenant du méthanol des sources d'azote, des sels inorganiques et des sources de vitamines et elle consiste donc à fournir un procédé pour la fabrication de protéines de levures bon marche et non toxiques par l'assimilation du méthanol comme seule source de carbone L'invention concerne également à titre de produits industriels nouveaux, les protéines de levures non toxiques obtenues par les procédés conformes à celles décrites ci-dessus Jusqu9à maintenant, il était connu qu'en plus des levures capables assimiler des saccharides, certaines levues qui sont utilisables comme sources de protéines, étaient capables d'assiniiler des paraffines normales.Mais comme les paraffines norma-les obtenues à partir du pétrole sont encore chères et comme il y a un risque que les substances proteiques obtenues soient contaminées par des substances toxiques qui résultent de l'emploi de paraffines normales, les paraffines normales ne sont pas utilisées jusqu n à présent comme sources de carbone dans la production des protéines de levures à l'échelle commercile Etant donne ces circonstances l'inven-teur a effectué des recherches pour de nouvelles levures qui ont abouti à la mise au point de levures nouvelles isolées a partir de la nature capables de produire des protéines de levure non toxiques en assimilant du méthanol produit en grande quantité à partir de gaz nature. bon marché.Ces levures ont été identifiées comme appartenant au type de Genus Candida ou Genus Saccharomyces. Les levures appartenant à Genus Candida sont désignées par levures "N-16" et "N-17", et les levures appartenant au type Saccharomyces sont désignées comme levures "H-1" et "H-2". Généralement, les levures qui assimilent le méthanol sont peu usuelles et, à l'exception de celles décrites ici, les levures connues comme assimilant le méthanol sont les espèces qui appartiennent au type Genus Kloeckera ou Genus Torulopsls (Agrtcultural and Biological Chemistry, Vol. 33, n 10, p 1519 (1969), et Genus Torulopsis (Résumé écrit d'une conference au Symposium de Japanese Agricul- tural Chemistry, p 344 (1970). Il est clairement entendu que chacune de ces levures décrites appartient à un genus différent en taxonomy de celles decrites dans la présente invention. Les caractéristiques micrologiques des levures "N-16" "H-1" et "H-2" sont les saivantes Caractéristiques taxonomiques des levures qui assimilent le methanol N-16 N-17 H-1 H-2 1. Propriétés morphologiques Forme ovale ou d" ronde dO elliptique Dimension 2-3,5 x 3-7 # d 1,3-3,1 # d Reproduction bourgeonnage d d multilatéral Pseudomycelium formé, type d non formé d candida Ascospore non formé dO spores ronds d0 ou ovales Protubérance non formée dO souvent dO formées 2 propriétés de cult res- Gaz fermentation fermentation basse basse, gaz après forma tion de pelli cules Croissance en formation de d formation d'anneaux aurface pellicules Trouble très trouble dO d0 # dO Précipité compact d granuleux ou en bloc Couleur non coloré dO dO dO 3. Observations d'une colonie géant Croissance abondante dO dO dO Caractéristiaue de la circonfé rence ondulée dO dO dO Forme de la nontée élevée d d d Caractéristioue de la surface douce d d do Brillance sombre sombre sombre sombre Etat butyrique buty- butyrique sombre rique buty rique Couleur laiteux lai- laiteux légère- lai teux ment rose teux 4 Propriétés physiologiques pH optimal 4 - 5 4 - 5 4 - 5 4- 5 t temperature opti male vers 300C vers 300C vers 280C vers 280C pH pour croissance 2 - 9 2 - 9 2 - 9 2 - 9 température maxi male pour crois sance 40 C 44 C 33 C 33 C assimilation de nitrate de potas sium + + coagulation du lai i réduction du tournesol osmotolérance toiérants au sels d d hydrolyse gelatine non liquéfiée d d besoins en vita mines biotine nécessaire d d pigments caroté- non produits dO dO noides décomposition arbutine production d'ami dons test à l'urée fermentation glucose + + + + galactose saccharose + + + + maltose lactose raffinuse assimilation des sources d'azote peptone + + + + sulfate d'ammonium + + + + asparagine + + + + urée + + + + assimilation de source de carbone glucose + # + + fructose . + + + + galactose - - + + mannose + + + maltose - - - saccharose + l + + lactose - - = xylose + + + t ribose + + arabinose - - amidon soluble - - glycérol + + + + mannitol + - + + sorbitol + - + + éthanol + + n-propanol - - dérosine - - méthane - - formaldéhyde - - - formiate acétate + + - succinate - malate - glycolate - oxalate - - monométhylamine (Note les signes "d0' se rapportent au texte de la même ligne qui précede ce signe et non au texte de la ligne au-dessus) Comme décrit ci-dessus, les levures N-16 et N-17 appartiennent au même genus et elles sont aussi classées parmi les levures asporogènes à cause de leur impossibilité de former des ascospores. On considère aussi que les levures cidessus appartiennent au genus Candida car elles ne montrent pas la formation de pigments caroténoides ou la formation d' arthrospores mais présentent la formation de pseudomycelium dans les bourgeons multilatéraux Il a été pourtant démontré que ces levures N-16 et N-17 ne correspondent pas aux espèces connues de Genus Candida en ce qui concerne la comparaison de leurs propriétés de fermentation oxydante de différents saccharides, l'assimilation de diffférents produits, y compris les nitrates, l'aptitude à décomposer l'arbutine, les besoins en vitamines, la forme du pseudomycelium et autres, en accord avec les critères donnés dans Lodder J. et N.J. Kreger-Van Rij Les levures, une étude taxonomique" (1952), "La levure, étude taxonomique" (1952) et "Classification et identification des levures" (1969) par Hiroshi Iizuka et Shoji Goton On considère en conséquence que les levures "N-16" et "N-17s' sont des espèces nouvelles de Genus Candida Les levures "H-1" et "H-2" appartiennent au meme genus et sont classées parmi les levures sporogènes à cause de la formation d'asccspores.On considère aussi que ces levures appartiennent au Genus Saccharomyces car elles montrent la propagation de bourgeons, la formation de spores non aiguilles, aucune formation de mycelium, la présence de cellules qui deviennent '!ascus", les bourgeons multilatéraux, les parois douces de spores et la présence de spores ovales.On a démontré, pourtant, que ces levures '7H-i" et "H-2" ne sont conformes à aucune des espèces connues de Genus Saccharomyces lorsqu'on compare leurs propriétés en détail avec les critères donnés dans les traités ci-dessus mentionnes On peut donc considérer les levures "H-1" et "H-2" comme des espèces nouvelles de Genus Saccharomvces Conformément au procédé de cette invention, les protéines de levures sont produites lorsqu'on ensemence un milieu de culture qui contient du méthanol, des sources d'azote, des sels minéraux et des sources de yitamines avec une des levures ci-dessus et lorsqu'on cultive la levure par voie aérobie,-cé qui provoque l'assimilation du méthanol par la levure Les dessins annexés sont des graphiques qui montrent la courbe de croissance, par exemple la relation entre la croissance des cellules de levures et le temps de culture, conformément à la présente invention. - la figure 1 est un graphique qui montre la relation entre la croissance des cellules de levure et le temps de culture dans le cas dune levure "N N-16". - la figure 2 est un graphique qui montre la relation entre la croissance des cellules de levure et le temps de culture dans le cas d'une levure "N-17" - la figure 3 montre les graphiques qui représentent la relation entre la croissance des cellules de levure et le temps de culture dans le cas de levures "H-1" et "H-2". Les sources d'azote utilisées dans la composition du milieu de culture comprennent les sels d'ammonium tels que le sulfate et le chlorure dCammnoium9 le nitrate de sodium, l'urée et analogues. Les sels inorganiques comprennent le phosphate diacide de potassium, le sulfate de magnésium, le sulfate ferreux le chlorure de calciums etc Les sources de vitamine utilisables comme facteurs de croissance sont de préférence la biotine, mais on peut utiliser d!autres substances contenant de la biotine, comme les extraits de levures, les liqueurs de trempage de mais9 les melasses etc On a trouve, en outre, que l'addition de thiamine chlorhydrate au milieu en tant que source de vitamine favorise considérablement la croissance des levures Le pH du milieu est ajusté par de lám- moniaque aqueux, comme décrit. en détail ci-dessous. La température de culture peut étre comprise entre 4 et 400C, la température préférée étant de 25-300C Le méthanol utilisé en tant que source de carbone peut être ajouté au milieu avant la culture à la concentration de 1-3%O Mais comme le méthanol risque litre perdu par évaporation pendant la culture et comme une concentration trop élevée dans le milieu tend à diminuer la vitesses de croissance de la levure, il est préférable deajouter le méthanol par fractions pendant toute la période de culture pour maintenir constamment dans le milieu une faibleconcentration en méthanol Conformément a ce qui précéde, la présente invention rend possible la production facile de concentrations de cellules supérieures à 1 % par l'addition au milieu des fractions de méthanol et le maintién du pH du milieu vers environ 5 par addition d'ammoniaque aqueux On considère comme une caractéristique de l'invention que la levure mise en oeuvre permet la séparation facile des cellules de levures développées du bouillon de culture après que celie-ci est terminée. Le rendement en cellules de levures est généralement supérieur à 0,5 g de matière sèche par g de méthanol mis en oeuvre et les cellules brutes ainsi obtenues contiennent généralement plus de 50 % environ de protéines brutes, ce qui indique qu'elles sont utilisables comme source de protéines La description ci-dessus indique que la présente invention permet la production de protéines de levures totalement dénuées de toxicité à bas prix de revient en utilisant comme seule source de carbone du méthanol qui est disponible en grandes quantités et à faible prix à partir de gaz naturels. L'invention est illustrée en outre par les exemples ci-après qui ne sont donnés qu'à titre dgillustra- tion et ne doivent pas tre considérés comme limitant l'invention Dans ces exemples, le rendement en cellules de levures est donne sur la base de la matière sèche. Exemple 1 Une fiole conique de 1 litre est remplie de 300 ml d'un milieu de culture qui est composé de 10 g de méthanol, 3 g de sulfate d ammonium., 2 g de phosphate acide de potassium, 0,4 g de sulfate d ammonium5 0,01 g de sulfate ferreux, 0,01 g de chlorure de calcium, 10 #g de biotine et i litre d'eau (ce milieu étant appelé ci-après "milieu basique'); on ensemence avec la levure N-17 On poursuit la culture en agitant pendant-4 jours à une température de 300C et l'on obtient 0,24g de cellules de levure pour 100 ml de bouillon de culture.Les cellules contiennent 44 % de protéines brutes Exemple 2 Un milieu de culture composé d'une solution de sels inorganiques, de 3 g de sulfate d'ammonium9 2 g de phosphate diacide de potassium, 0,4 g de sulfate de magnésium, 0,01 g de sulfate ferreux et 0901 g de chlorure de potassium dans 1 litre d'eau, pH 598, et une quantité appropriée de méthanol (milieu appelé ci-après "milieu deficient en biotine") est additionné de 0,01 g d'un extrait de levure et de 1 mg/l de chlorhydrate de thiamine.Un litre du milieu de culture obtenu est introduit dans un appareil à fermentation de 3 litres de faibles dimensions et 100 ml de levure N-16 cultivée dans le milieu basique sont ajoutés en tsnt qu'ensemencement, on fait fermenter à 300C en aérant et agitant Pendant la période de culture on ajoute cinq fractions de 2 g de méthanol par litre de milieu de culture aux temps indiqués sur la figure 1 par les flèches, la quantité totale de méthanol ajouté étant de 10 g On ajoute également de l'ammoniaque aqueux (5.6 % pour maintenir le pH du milieu vers 5 La figure 1 montre un graphique qui explicite la courbe de croissance de la levure N-16 cultivée sous ces conditions.Le rendement en cellules de levures était dans ce cas de 3,35 g lorsqu'on utilise 10 g de méthanol Les cellules contiennent 50 % de protéines brutes Exemple 3 On place dans un incubateur, à faible dimension de 3 litres, un litre du milieu de culture déficient en biotine auquel on a ajouté 0,1 % de liqueur de trempage de mais, et on ensemence par 100 ml de levure N-16 cultivée au préalable dans le milieu basique. La levure est ensuite cultivée de la même manière qu'a l'exemple 2 à une température de 300C en agitant et aérant. La figure 2 représente un graphique qfli montre la courbe de croissance de la culture de la levure N-16 sous ces donditions. Le rendement en cellules de levures était de 3,8 g pour 10 g de méthanol mis en oeuvre.Les-cellules contiennent 52 % de protéines brutes. Exemple 4 Un litre de milieu de culture déficient en biotine additionné de 0,05 % de mélasses est introduit dans un petit incubateur de 3 litres et, après ensemencement par de la levure N-17, est fermenté comme à l'exemple 2 sous agitation et aération. Le rendement en cellules de levures est de 3,0 g pour 10 g de méthanol mis en oeuvre. Les cellules contiennent 45 % de protéines brutes. Exemple 5 Le résidu de la distillation de l'alcool à partir de mélasses comme matières premières est ajouté à raison de 0,1 No à un milieu de culture déficient en biotine, et on cultive la levure N- 16, dans le milieu obtenu de la même manière qu'à l'exemple 2,dans un petit incubateur en aérant et agitant. Le rendement en cellules de levure et de 3,1 g pour 10 g de méthanol mis en oeuvre. Les cellules contiennent 46 % de protéines brutes. Exemple 6 300 ml d'un milieu de culture composé de 10 g de méthanol, 3g de sulfate d'ammonium, 2 g de phosphate diacide de potassium, 10 )A,g de biotine et îlitred'eau de mer (pH 5,8) sont introduits dans une fiole conique de un litre et ensemencés par la levure N-16. La levure est cultivée sous agitation pendant quatre jours à une température de 300 C et donne 0,26 g de cellules de levure pour 100 ml de bouillon de culture. Le rendement en cellules obtenu par culture de la même levure dans un milieu basique, comme contrôle, était de 0,24 g pour 100 ml de bouillon de culture. Exemple 7 200 ml de milieu basique sont introduit dans une fiole conique de un litre et ensemencés par la levure H-lo On cultive sous agitation 4 jours à 30 C et l'on obtient 0.,25g de cellules par 100 ml de bouillon de culture. De la même maniere le milieu basique est ensemencé avec la levure H-2, puls cultive pendant 4 jours à 300C et donne 0926 g de cellules par 100 ml de bouillon. La teneur en protéines brutes est de 41 % pour la levure H-1 et de 39 % pour la levure H-2. Exemple 8 On ajoute au milieu de culture déficient en biotine 10 #g/1 de biotine , -,5 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,025 % de liqueur de trempage de mais Deux frac tions du milieu obtenu sont introduites séparément dans deux petits incubateurs de 3 litres et ensemencés par 100 ml de levures H-1 et H-2, respectivement, qui avaient été cultivées dans un milieu basique. Les levures sont alors cultivées à 300C en agitant et aérant.Cinq fractions de 2 g de méthanol par litre de milieu de culture sont ajoutees à chaque culture pendant le temps de culture, aux moments indiques par des flèches sur la figure 3, la quantité totale de méthanol ajouté étant de 10 g On ajoute également de l'ammoniaque aqueux9 5,6 %, pour maintenir le pH à environ 5. Le graphique de la figure 3 montre les vites- ses de croissance de chacune des levures H-1 et H-2 cultivées aux conditions ci-dessus. Les rendements en cellules étaient de 3e7 g (H-1) et 395 g fH-2) pour 10 g de méthanol mis en oeuvre. La teneur en protéines brutes était de 42 % pour la levure H-1 et de 41 % pour la levure H-2. Exemple 9 Un litre de culture défi ci ente en biotine additionné de 091 % de liqueur de trempage de mais est introduit dans un petit incubateur de 3 litres Après ensemencement par la levure H=I, on cultive de la meme manière qu'à l'exemple 8 en aérant et agitant. Le rendement en cellules est de 393 g pour 10 g de méthanol Les cellules contiennent 40 % de protéines brutes. Exemple 10 Un litre de milieu de culture déficient en biotine additionné de 0,05 % de mélasses est introduit dans un incubateur de 3 litres. Après ensemencement par la levure H-23 la levure est cultivee comme à 1 exemple 8 en aérant et agitant Le rendement en cellules es-t de 392 g pour 10 g de méthanol, leur teneur en protéines brutes de 38 % Blen entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés à partir desquels on pourra prévoir diaut.res modes et d autres formes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'inven- tion R E V E N D I C A T I O N S 1 ) Procédé de culture de levures capable d'assimiler le, méthanol, caractérisé en ce qu'on cultive une levure,qui appartieitau type genus choisi dans les groupes de genus Candida et genus Saccharomyces ,dans un milieu de culture qui contient du méthanol, des sources d'azote, des sels inorganiques et des vitamines des sources. 20) Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la culture de la levure est effectuée à un pH compris entre 3 et 7,voisin de -5. 30) Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la culture de la levure est effectuée à une température comprise entre 40 et 400C, voisine de 300 C. 4 ) A titre de produits industriels nouveaux, les protéines de levures non toxiques obtenues par les procédés conformes à ltune quelconque des revendications précédentes.