FR 2059562 A1 19710604 FR 7023803 A 19700626 La présente invention concerne un procédé pour former certains glycopeptides sulfonés et les produits ainsi obtenus en tant que produits pharmaceutiques. Dans le brevet français n" 1 544 225, on a décrit l'extraction, hors de certains organes d'animaux, de glycopeptides qui peuvent être utilisés comme médicaments et on a indiqué les principales caractéristiques physiques et chimiques de ces substances. On a maintenant trouvé que les glycopeptides peuvent être sulfonés pour donner les dérivés sulfonés correspondants. Les dérivés sulfonés mentionnés ci-dessus se sont révélés pouvoir être utilisés comme médicaments, en général dans le traitement de troubles inflammatoires et en particulier dans le traitement d'arthroses et d'ulcères gastriques et également comme agents de cicatrisation et agents de régulation de la fibrinolyse. L'invention vlse un procédé pour préparer un dérivé sulfoné d'un glycopeptide obtenu à partir de la muqueuse gastrique ou du duodénum de porcs.Le procédé comprend lthydrolyse de l'organe animal dans l'eau,l'élimination des sous-produits acides de 1 'hydrolyse, la dilution du produit resant et désiré à 11 aide d'un non-solvant pour ce produit,la mise en Suspension du produit dilué dans une base tertiaire hétérocyclique, la mise en contact de la suspension résultante avec un agent de sulfonation et le recueil du produit sulfoné résultant. Extraction L'extraction de la muqueuse gastrique ou du duodénum de porcs pour l'obtention de glycopeptides est décrit? dans le brevet précité dont la description est incorporée ici par référence. Brièvement, l'organe ou les organes animaux sont hydrolysés dans l'eau à une température comprise entre 50"C environ et 100"C environ pendant 10 à 45 minutes environ à un pH compris entre I et 10 environ. Les sous-produits acides d'hydrolyse sont ensuite éliminés du produit dthydrolyse et le produit restant et désiré est ensuite dilué à l'aide d'un non-solvant pour ce produit. A la fin du stade d'hydrolyse, il peut être commode d'effectuer la précipitation de la totalité des substances organiques ayant un caractère acide, comme par exemple les mucopolysaccharides contenant du soufre. Par conséquent, si l'hydrolyse a été conduite à un pH alcalin, on peut ramener le mélange à un pH acide en ajoutant un acide faible (par exemple l'acide acétique) de façon à provoquer la précipitation de ces substances.Le filtrat est ensuite dépouilié des impuretés protéiques par traitement par une enzyme (par exemple la papaïne ou la trypsine) dans des conditions appropriées de pH (entre 5,5 et 6,5). Il peut être commode aussi d'effectuer, avant le traitement enzymatiquè, une précipitation préliminaire de la majeure partie des impuretés protéiques par addition d'un réactif approprié, comme par exemple2l'acide trichloro-acétique. En diluant les filtrats obtenus par ces traitements à l'aide de solvants organiques (alcool ou acétone), on obtient le glycopeptide brut sous la forme d'une poudre blanche ou de couleur noisette. Les produits contiennent seulement une trace de soufre et sont caractérisés par l'absence d'acides uroniques.Des hexosamines sont présentes à raison de 40 à 50%, des amino-acides à raison de 13 à 18% et des hexoses à raison de 27 à 31%, en poids Les résultats d'analyse ci-dessus permettent de classer les produits parmi les glycopeptides, tandis que, par ailleurs, la présence d'hexosamines non accompagnées d'acides uroniques et l'absence de tous groupements contenant du soufre confèrent une particularité caractéristique à la portion polysaccharide de cette substance. Sulfonation Le glycopeptide obtenu comme décrit dans le brevet précité est mis en suspension dans une base tertiaire hétérocyclique ayant un point d'ébullition compris entre 1000C environ et 200"C environ. Des bases typiques comprennent la pyridine et les méthyl-pyridines, éthylpyridines et diméthyl-pyridines. On préfère la pyridine anhydre Les glycopeptides sont insolubles dans cette der nière, de sorte qu'ils s'y trouvent en suspension. Des agents de sulfonation utilisables comprennent l'acide chlorosulfonique, l'acide sulfurique, l'oléum et des produits d'addition de i'anhydride sulfurique avec des composés organiques comme la pyridine et le dioxanne. On effectue la sulfonation en mélangeantia suspension de glycopeptide et l'agent de sulfonation à une température comprise entre -40 et O"C environ et en lews mettant ensuite en contact à une température comprise entre 50 et 80"C environ et de préférence à 75 C environ pendant 4 à 8 heures environ, et de préférence pendant 5 heures environ. La quantité d'agent de sulfonation peut varier entre 400 et 600% en poids environ par rapport au gîydopep tide et elle est depréférence de l'ordre de 500% en poids. A la fin de la réaction de sulfonation, le produit sulfoné est recueilli par filtration et les impuretés de nature basique ou acide sont éliminées par dialyse ou par tràitement par des résines échangeuses d'ions. Sels sulfonés Le glycopeptide sulfoné (qu'on appellera aussi ci-après SGLP) est ensuite transformé en un sel de sodium correspondant à l'aide d'hydroxyde de sodium et le sel de sodium est précipité par dilution de sa solution aqueuse à l'aide de solvants appropriés, comme l'acétone ou le méthanol. Selon une autre particularité de l'invention, le SGLP est transformé en d'autres sels à l'aide d'autres métaux alcalins ou d'ammoniac ou de métaux alcalino-terreux ou métaux lourds. Les sels du SGLP sont obtenus à partir du même SGLP provenant de la réaction de sulfonation, par neutralisation par un hydroxyde de métal alcalin ou alcalino-terreux ou par l'hydroxy- de d'ammonium, ainsi qu'à partir du sel de sodium de SGLP par double échange avec un sel de métal alcalino-terreux ou de métal lourd. Les sels obtenus par neutralisation du SGLP par un hydroxyde de métal sont isolés en traitant la solution aqueuse à l'aide d'un agent de précipitation comme l'acétone ou le méthanol. On a trouvé qu'on obtient des résultats particulièrement avantageux quand, avant la précipitation, on ajoute une petite quantité de 3 à 7 pour cent en poids environ, par rapport au poids de l'hydroxyde, d'un acétate ou d'un halogénure du même métal que celui dont l'hydroxyde a été utilisé pour la neutralisation du SGLP. Des métaux qui sont particulièrement utilisables à cet effet sont le potassium, le lithium, le calcium, le baryum, le strontium et l'ammonium. La réaction de double échange entre le sel de sodium de SGLP et des sels d'autres métaux est conduite dans une solution aqueuse, l'anion du sel considéré étant constitué de préférence d'un acétate ou d'un halogénure. On peut conduire aussi la réaction de double échange en faisant passer une solution aqueuse de sel de sodium de SGLP à travers une colonne de résine échangeuse fortement cationique qui a été préalablement salifiée à l'aide du métal dont on veut obtenir le sel.La solution obtenue par percolation est ensuite traitée par un agent de précipitation, comme l'acétone ou le méthanol, de préférence apres l'addition d'une quantité assez petite d'un acétate ou d'un halogénure du même mé tal que celui dont on désire le sel comme mentionné -ci-dessus, Sont particulièrement utilisables pour cette réaction de double échange, les métaux suivants : zinc, calcium, baryum, strontium, cuivre, nickel, cobalt, magnésium, bismuth, or et aluminium. Dans lé tableau suivant, on donne certains résultats d'analyse qui sont caractéristiques pour le sel de sodium de SGLP préparé comme ci-dessus, correspondant à des matières ayant le plus bas et le plus haut degré de sulfonation: s % = 3,7 - 14,5 C = = 42,5 - 22,7 H X = 6,65 - 3,55 0% = 39,15 - 45,65 N % - 5,35 - 3,0 Na % = 2,68 - 10,6 Hexosamines % = 31,7 - 18 Hexoses % = 24,7 - 14 CH3CO % = 8,28 - 4,7 Protéines % = 14,2 - 8,8 Acides uroniques = néant Le constituant protéique a la composition suivante (% en poids) Acide aspartique 2,18 Thréonine 33,68 Sérine 10,62 Acide glutamique 5,87 Proline 22,96 Glycine 2,49 Alanine 5,36 Valine 5,16 Isoleucine 1,46 Leucine 4,25 Lysine 2,02 Hystidine 2,13 Arginine 1,82 Dans les essais effectués sur des animaux de laboratoire, on a trouvé que les dérivés sulfonés de glycopeptide sont actifs dans les domaines suivants a) inhibition de l'oedème local provoqué dans la patte du rat par la carraghénlne, la sérotonine et le kaolin ; l'activité se-manifeste déjà à 3,25 mg/kg, par voie intrapéritonéale b) inhibition des papules intradermiques à 12,5 mg/kg, par voie endopéritonéale ; c) augmentation de la vitesse de rétablissement des fonctions des membres avec l'arthrite par AgN03, à 12,5 mg/kg par voie endo péritonéale d) augmentation de la vitesse de cicatrisation de plaies d'expérimentation à 6,25 mg/kg, par voie endopéritonéale et à 12,5 mg/kg, par voie sous-cutanée e) inhibition de l'ulcère par ligature du pylore et par l'hydrocortisone, à 12,5 mg/kg par voie endopéritonéale et à 50 mg/kg par voie orale ;; f) réduction de l'activité peptique du suc gastrique, "in vivo" ou "in vitro" g) augmentation de l'activité fibrinolytique comme déterminé par les méthodes du temps de lyse de l'euglobuline, des plaques de fibrine selon Astrup et la méthode thrombo-élastographique cette activité se manifeste à 500 gamma/kg h) réduction du cholestérol et des- triglycérides plasmatiques après traitement prolongé chez le rat. Aucune preuve de toxicité ne s'est manifestée chez les rats et les souris après un traitement unique à 3 g/kg par voie orale ou après administration prolongée pendant 6 mois à raison de 100 mg/kg/jour. Les exemples non limitatifs suivants montreront bien comment l'invention peut être mise en oeuvre Exemple 1 1 gramme de glycopeptide d'extraction obtenu comme décrit dans l'Exemple 5 du brevet précité est mis en suspension dans 20 cm3 de pyridine anhydre. La solution est refroidie~àndis qu'on l'agite à -15 C et elle est traitée lentement par 5,3 g d'acide chlorosulfonique. Après avoir effectué l'addition, on termine la réaction en chauffant pendant 6 heures à 600C, puis on laisse refroidir et le précipité résultant est recueilli par filtration et ensuite lavé au méthanol.Le produit est ensuite dis 3 sous dans 50 cm d'eau et la solution résultante est portée au pH 10 par addition de NaOH normal, filtrée de nouveau, le pH du filtrat est réglé à 6 par addition d'acide acétique et la solution est dialysée pendant 48 heures contre de l'eau distillée à la température ambiante, avec un diaphragme de cellulose régénérée. A la fin de l'opération de dialyse, la solution est filtrée et le filtrat est lyophilisé. Production : O,900 gramme. Analyse : S = 4,8 S ; N = 5,15-% ; Na.= 3,46 % ; Hexoxamines = 30,4 % ; Hexoses = 23,6 % ; Acides-uroniques = néant ; Groupes. acétyle = 7,95 % ; Protéines = 13,5 %. Exemple 2 1 gramme du glycopeptide d'extraction mentionné dans l'Exem- 3 ple 5 est mis en suspension dans 20 cm de pyridine anhydre. La suspension est refroidie à -40 C tandis qu'elle est agitée et elle est traitée lentement par 5,3- g d'acide chlorosulfonique. Après avoir effectué l'addition, on termine la réaction en chauffant le mélange réactionnel pendant 6 heures à 60 C, puis on le laisse refroidir et le précipité résultant est recueilli par fil 3 tration. On dissout le précipité dans 50 cm d'eau, le produit est précipité par dilution au méthanol (150 cm ) et recueilli de nouveau par filtration. Le précipité mentionné en dernier lieu est dissous une fois 3 de plus dans l'eau (50 ) et la solution est' traitée tandis qu'on l'agite, pendant une demi-heure, par un mélange de résines 3 échangeuses d'ions constitué de 25 cm de la résine connue sous 3 la désignation "résine IR 120"et 25 cm de la résine connue sous la désignation "résine IRA 410" Les résines sont éliminées par filtration, le pHest réglé à 6 par addition de solution normale de NaOH et la solution est concentrée sous pression réduite à un volume'de 15-cm3. Le produit est précipité par dilution par 60 cm de méthanol, après addition à la solution de Q,5 g d'acétate de sodium hydraté.Le précipité est recueilli sur un filtre, lavé au méthanol, puis à l'éther et séché sous vide sur P205. Analyse : S = 3,7 % ; N = 5,35 % ; Na = 2,68 ; ; Hexosamines = 31,7 % ; Hexoses = 24,7 % ; Acides uroniques = néant ; Groupes acétyle = 8,28'% ; Protéines = 14,2 %. Exemple 3 2 g du glycopeptide -20 C et traitée lentement, tandis qu'on l'agite par 10,6 g d'acide chlorosulfonique. Après avoir effectué l'addition, on termine la réaction en chauffant pendant une heure tout èn agitant et pendant deux heures sans agiter,- à une tempé rature de 65cl. Le solvant est séparé par décantation et le précipité gélatineux résultant est repris dans du méthanol et ensuite recueilli sur un filtre. Le produit est séché sous vide à 50"C, dissous dans l'eau (50 cm 3) et traité tandis qu'on l'agite par 25 cm3 de résine échangeuse d'ions IR 120 pendant 30 minutes.La résine est éliminée par filtration et le filtrat subit le même traitement par 25 cm3 de résine échangeuse IRA 410. Cette dernière résine est éliminée par filtration et le pH de la solution est réglé à Il à l'aide d'une addition d'une solution de soude normal. Le filtrat est porté au pH 6,5 par traitement par du CH3COOH 2N, puis on ajoute 0,2 g d'acétate de sodium hydraté, la liqueur est 3 concentrée sous pression réduite à un volume de 20 cm et le produit est précipité par dilution par 80 cm3 de méthanol. Le produit est recueilli sur un filtre, lavé à l'alcool et à l'éther, puis séché sous vide à 50 C. Production : 3 g. Analyse : S = 14,65% ; N = 3,05% ; Na = 10,63% ; Hexosamines = 18% ; Hexoses = 14% ; Acides uroniques = néant ; Groupes acétyle = 4,7% ; Protéines = 8,8%. Exemple 4 Un glycopeptide d'extraction est soumis à une sulfonation selon l'un des Exemples 1 à 3. Une solution aqueuse du glycopeptide sulfoné acide, telle qu'elle est obtenue par traitement du mélange de réaction, est réglée au pH 6 à l'aide d'hydroxyde de baryum. Ensuite, elle est 3 concentrée sous pression réduite à un volume de 15 cm ; on ajoute 0,5 g de BaC12 et on la dilue de nouveau à l'aide de 60 cm3 de méthanol pour obtenir un précipité constitué du sel de baryum du glycopeptide sulfoné. Analyse : Ba = 23,95% ; S = 10,67%. Exemple 5 10 g d'un sel de sodium de glycopeptide sulfoné (S = 13,6%), 3 obtenu comme décrit à l'Exemple 3, sont dissous dans 100 cm d'eau et traités par une solution aqueuse normale d'acétate de zinc. 3 Ensuite, la solution est diluée par 400 cm de méthanol et on ob- tient un précipité constitué du sel de zinc du glycopeptide sulfoné. Analyse : Zn = 8,9% ; S = 11,70%. Exemple 6 Dans une colonne en verre de 80 cm de hauteur, on introduit 55 cm3 d'une résine échangeuse fortement cationique, dite AMBER LITE IR 120, qui a été activée par des méthodes connues, et on fait passer à travers cette résine I litre de solution à 1% de AlCl3.6H20, en une heure environ. On lave ensuite soigneusement la colonne en laissant passer 3 à travers elle 500 cm d'eau distillée en une demi-heure. On fait ensuite passer à travers la colonne une solution qui contient 20 g de sel de sodium de glycopeptide sulfoné (obtenu 3 comme à 1'Exemple 3 ; S = 13,6 h) dans 800 cm d'eau distillée en 4 heures environ. 3 On lave ensuite la colonne à l'aide de 500 cm d'eau distil lée, puis on combine les eaux de lavage et les éluats obtenus précédemment. La solution est concentrée sous pression réduite à 3 un volume de 600 cm j on ajoute 0,5 g de AlCl3.6H20 et on dilue 3 la solution à l'aide de 1200 cm d'acétone pour obtenir un précipité constitué du sel d'aluminium du glycopeptide sulfoné. Analyse : Al = 3,5 ; ; S = 11,22 %. Exemple 7 100 g d'un sel de sodium de sulfonate de glycopeptide (14% de S), préparé comme décrit à l'Exemple 3, sont dissous dans 3 1000 cm d'eau tiède et on verse la solution dans 1000 cm d'une solution de nitrate de bismuth de molarité 1/3 dans l'acide acétique glacial. 3 On ajoute ensuite 2000 cm de méthanol (1 volume). Le préci- pité résultant est centrifugé et lavé trois fois chaque fois par 3 broyage dans 1500 cm d'un mélange 3 : 1 de méthanol et d'acide acétique glacial et centrifugation. Ensuite, le précipité est lavé de nouveau trois fois de la même manière en utilisant 1500 cm3 d'acétone chaque fois. La poudre (128 g) qui est obtenue est séchée sous vide et ensuite dissoute de nouveau dans 15 volumes d'eau (1920 cm3) pour donner une solution acide (pH 4,5). On ajoute une solution aqueuse normale de soude caustique pour former une solution ayant un pH de 6,5 et on obtient ensuite un précipité en ajoutant 1,5 volume d'acétone à la solution. Le précipité est centrifugé et lavé trois fois à l'aide d'un mélange 2 : 1 d'eau et d'acétone, en centrifugeant chaque fois, et il est ensuite lavé trois fois à l'acétone. Finalement, le précipité est séché sous vide pour donner 120 g de produit. Analyse : S = 8 h ; Bi = 29%. Exemple 8 Un sel d'or correspondant au sel de bismuth dans l'Exemple 7 est préparé selon le mode opératoire de ce dernier exemple, à ceci près qu'on utilise une solution 0,3 M de nitrate aurique dans 1' acide acétique glacial. En utilisant des modes opératoires analogues à ceux décrits dans les exemples précédents, on obtient les sels suivants de SGPL Sel de magnésium du glycopeptide sulfoné Analyse : Mg = 4,0% ; S = 12,07% Sel de cobalt du glycopeptide sulfoné Analyse : Co = 7,85% ; S = 11 28% Sel de nickel du glycopeptide sulfoné Analyse : Ni = 8,0% ; S = 11,13 h Sel de cuivre du glycopeptide sulfoné Analyse : Cu = 7,9% ; S = 11,5% Sel de calcium du glycopeptide sulfoné Analyse : Ca = 7,05% ; S = 12,7%. Comme il va de soi, et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'application, non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant été plus particulièrement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un produit sulfoné d'un glycopeptide provenant de la muqueuse gastrique ou du duodénum du porc, selon lequel a) on hydrolyse l'organe de l'animal dans l'eau à une température comprise entre environ 50 et environ 1000C pendant un temps compris entre environ 10 et environ 45 minutes à un pH de 1 à 10 environ b) on élimine les sous-produits acides d'hydrolyse obtenus par l'hydrolyse de a) c) on dilue le produit de b) à l'aide d'un non-solvant pour ce produit de façon qu'un glycopeptide soit précipité d) on met en suspension le produit de c) dans une base tertiaire hétérocyclique ayant un point d'ébullition compris entre environ 100 et environ 2000C e) on met en contact la suspension résultante de d) avec un agent de sulfonatipn choisi parmi l'acide sulfurique, l'oléum, l'acide chlorosulfonique et un produit d'addition de l'anhydride sulfurique avec un composé organique, à une température comprise entre environ -40 et environ OOC et ensuite à une température comprise entre environ 50 et environ 800C et on recueille le produit sulfoné résultant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la base de d) est la pyridine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de sulfonation de e) est l'acide chlorosulfonique. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le temps de contact avec l'agent de sulfonation dans e) est compris entre environ 4 et environ 8 heures. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit sulfoné formé en e) est dialysé. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit sulfoné formé en e) est mis en contact avec une résine échangeuse d'ions choisie parmi les résines anioniques, les résines cationiques et les mélanges d'une résine anionique et d'une résine cationique. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit sulfoné recueilli en e) : f) est mis à réagir avec un hydroxyde choisi parmi les hydroxydes de métaux alcalins, les hydroxydes de métaux alcalino-terreux et l'hydroxyde d'ammonium, de façon que le produit sulfoné soit transformé en son sel de métal alcalin, de métal alcalino-terreux ou d'ammonium correspondant, et g) le produit résultant est mis en contact avec de l'acétone ou de l'alcool méthylique de façon que ce sel soit précipité. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'une quantité assez petite d'un acétate ou d'un halogénure ayant le même cation que l'hydroxyde est dissoute dans l'acétone ou dans l'alcool méthylique. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'hydroxyde de f) est l'hydroxyde de sodium et que le sel de g) est un sel de sodium. 10. Procédé selon la revendication-9, caractérisé en ce qu'une solution du sel de sodium est traitée par un halogénure ou un acétate d'un métal choisi parmi le zinc, le calcium, le baryum, le strontium, le cuivre, le nickel, le magnésium, l'aluminium et le cobalt et qu'on précipite le sel de métal résultant à l'aide d'acétone ou d'alcool méthylique. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on fait passer une solution aqueuse du sel de sodium à travers une résine échangeuse cationique ayant comme cation un métal choisi parmi l'aluminium, le zinc, le magnésium, le nickel, le cuivre, le calcium, le baryum et le cobalt, on met en contact la solution recueillie à la sortie de la résine avec une quantité assez petite d'un acétate ou d'un halogénure du métal choisi et on précipite le sel de métal résultant à l'aide d'acétone ou d'alcool mEthy- lique. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le non-solvant de c) comprend de 1 à 3 volumes environ d'acétone, d'alcool méthylique ou d'alcool éthylique pour chaque volume du produit de b). 13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la quantité d'acétate ou d'halogénure est comprise entre 3 et 7% environ en poids. 14. Sel d'un glycopeptide sulfoné selon la revendication 1, le cation du sel étant choisi parmi les métaux alcalins, les métaux alcalino-terreux, les métaux lourds et l'ammonium. 15. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du sodium. 16. Sel de sodium selon la revendication 15 ayant la composition approximative suivante en pourcentages en poids S 3,7 - 14,5 C 42,5 - 22,7 H 6,65 - 3,55 0 39,15 - 45,65 N 5,35 - 3,0 Na 2,68 - 10,6 Hexosamifles 31,7 - 18 Hexoses 24,7 - 14 CH3CO 8,28 - 4,7 Protéines 14,2 - 8,8 et qui est pratiquement exempt de phosphore et d'acides uroniques. 17. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du calcium. 18. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du baryum. 19. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du magnésium. 20. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est de l'aluminium. 21. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du zinc. 22. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du cuivre. 23. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du nickel. 24. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est du cobalt. 25. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que. le cation est du bismuth. 26. Sel selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cation est de l'or.