FR 2092743 A1 19720128 FR 7021940 A 19700615 L'extraction des flavonels a dt4ja' été décrite dans plusieurs brevets anterieurs, comme, par exemple, le brevet français 958589 demandé le 1er juillet 1918, le brevet français 1056922 danandé le 9 Mai 1951, ainsi qui le brevet français 1427100 dendé le 11 décembre 1964. IL s'agit en fait d'extractiens effectées par 11 eau ou tin solvant organique, généralement à chaud, et conduisint à l'obtention de produits bien délimités chimiquement, dont la structure est celle des hydroxyflavanediols3,4 "sous leurs formes les moins polyniérisées, comprenant, en particulier, le monomère ct les dimère, trimère, tétramère, et pantamère" (brevet français 1427100). Or, des travaux récents LACAZE (P.), Recherches sur les anthocyanogènes oligomères de la vigne et du vin, Thèse de Pharmacie, Bordeaux, (1970) - WEINGES (N.), Procyanidin aus Fr- chten, Justus Liebigs Ann. Chem. (1968), 711, 184 etc...] ent montré que la composition des mélanges de substances flavaniques que renfermont les végétaux était en réalité beaucoup plus complexe : la présence de flavanols-3 (composés catéchiniques) a été décelée pPr des méthodes de laboratoire telles que la chromatographie sur papier et il a été constaté que lesdits mélanges, loin de contenir exclusivement des formes monomères ou oligomères d'un seul constituant, comprenaient, outre ces formes homogènes, des copolymères de deux ou plusieurs structures flavanoliques ou oli gomères hétérogènes formés de 2 & . 5 5 molécules condensées. Ces divers monomères et oligomères présents dans les végétaux constituent dans leur ensemble un groupe homogène que l'on désigne sous le terme d'oligomères flavanoliques. Leur extraction global, qui n'a jamais été réalisée jusqu'alors, et qui est l'un des buts de la présente invention, s'avère tout à fait souhaitable au point de vue technologique, et elle constitue un progrès intéressant sur les techniques antérieures, puisque l'on dispose alors d'une préparation représentant finalement l'état dans lequel ces diverses substances existent dans le végétal. De plus, on dispose maintenant de procédés analytiques permettant une estimation de l'importance relative des divers constituants, et l'on peut, en conséquence, définir d'une manière satisfaisante la composition des différents extraits obtenus. Un premier objet de l'invention est donc un procédé d'extraction des oligomères flavanoliques totaux des végétaux, @@@etérisé en ce qu'en effectine l'extrmation au moye d'un mélange d'ceu et d'au moins une eétone dans les propertions d'entiron un volume d'eau pour 0,2 à 2 voluaes de la cétone, à le @upérerten ambierie, on ce qu'on chrum la déton de la solu tion obsenun pur dis@llation stum pu@2ession réduits, en de qu'en sjoute à la solution c@@une ob@@une du chlorure de sodium josqu'à s@@uration pour provopuer la précipitation des tenins condensés que l'on sépare par filtration, en ce qu'on extrait les oligotères flavanoliques de leur solution aqueuse au moyen d'un solvent organique non misaible à l'eau saturée de chlorure de sodium, dans lequel 3.es oligomères flavanoliques sont olubles et ne risquent pas de dénaturer ceux-ci, en ce qu'on déshydrate la solution organique obtenue d'oligoxères flavanoliques, en ce qu'en précipite des derniers on ajoutent à leur solution organique un liquide miseible en toutes proportions audit solvant orga:nique d'extrac tion mais dans lequel lesdits oligomères sont insolubles, et cn ce c'on recusille le précipité obtenu et le sèche. Dans le procédé selon l'invention, le solvent d'extrac- tion essentiellement utilisé est donc un mélange d'eau et d'au moins une cétone, telle que l'acétone, le dioxannc, la méthylé thylcetone, etc..., dans des proportions telles que l'extraction fournisse les cueilleurs rendements.On a observé, en effet, que ces oligomères flavanoliques, bien que partiellement solubles dans l'eau et les cétones prises séparément, étaient beaucoup plus solubles dans le mélange comportant environ 0,2 à 2 volumes de cétone pour 1 volume d'eau, notamment les oligomères hétérogènes, au point que l'extraction avec un tel mélange de solvants pet se faire à température ambiante, ce qui évite toute altération sous forme d'une polymérisation de degré élevé des flavanols extraits sensibles à la chaleur tels que les flavanols-3. Le choix des solvants et leur mode de mise en oeuvre permet en outre d'extraire l'ensemble des flavanols d'un végétal en respectant leur proportion relative telle qu'elle existe dans la plante, sans qu'il y ait disparition de l'un ou l'autre de ces composants, comme ce pouvait être le cas avec les techniques antérieures. Le progrès de la présente invention sur les méthodes antérieures réside donc finalement dans une extraction qualitativement et quantitativement plus complète de l'ensemble des oligomères flavanoliques des végétaux, amélioration qu'il est p@@@@hle de @@o en évldance @@@ les presédés analytiques dédrit plus loir. D @bus, les extraits @@@@nus sont plus stables que les enterite @@éraieur, d'une part parce qu'ils sont préparés à froad, d'a@@ part perce que la oligomèrs hétérogères qu'ils cont' une nut à façon netialle ont une structure s'opposant à la polpré@@ion @@@, qui est la @ause sa entielle d'altération de ces ex@@@@@@. Cette stabilité est impopiaute perce que ces extraits de @@ares oligomères flavoliques sont utiles essentiellement @n tant que médiermants, omme les flavenoides en général, et que les pol@ères sont ierctifs et même dangereux. En vue de l'utilisation thér@@tique des extr@@@, un autre avantage considérable du precéfé suivant l'invention est l'extraction sans altération des fl-vanole-à, que lion estine actuellement être les flavanols thér@ique ent les gl@@ actifs. Le @élange de reivants auivant l'invention dissout égalemant des t@@@ns cond@@@@ér. Mais il est facile d'éliminer ces dor@@ an @@sant tour d'abord is cétone et en saturant la solution aquase résidualle par du chlorure de sodium, selon un procédé dégà lergement smployé; on peut alors séparer les tanins par fileration. On obtient enauite les oligomères flavanoliques en solution dans un solvant org@@ique par extraotion au moyen de tous solvants ou de tous mélanges de solvants non miscibles à l'eau saturés de chlorure de sodium, dans lesquels ces produits sont solubles et qui ne risquent pas de les dénaturer. On a ainsi utilisé avec profit l'acétate d'éthyle, mais on peut tout aussi bien employer, par exemple : l'acétate de méthyle, l'acétate de propyle, le butanol, l'isobutanol, l'alcool isoamylique, etc.. et les mélanges de ces solvants. De leur solution organique, convenablement déshydratée, les oligemères flavanoliques peuvent alors être obtenus à l'état pulvérulent par précipitation à l'aide d'un liquide ou d'un mélange de liquides miseibles on toutes proportions au solvant organique d'extraction mais dans lequel ces produits sont insolubles, tels que : éther éthylique, éther de pétrole, hexane, heptane, benzène, chloroforme, trichloréthylène, etc.. et les mélanges de ces solvants. L'extrait ainsi préparé est desséché par un procédé ap proprié évitent toute dénaturation, coaure par example : l'exposition au raponnement infra-rouge, le séelage sous pression réduite dans une étuve à une température inférieure à 40 C, le séchage dans un desdocateur sous pression réduite en présence d'anhydride phosphorique. L'invention a également pour objet les extraits d'oligomères flavanoliques totaux des végétaux, obtenus par le procsédé décrit ci-dessus, pour leurs applications autres que thérapeutiques. Les produits ainsi obtenus à partir de divers végétaux se présentent sous forme de poudre très solubles dans l'eau, à peine colorées en jaune chamois, jaune orangé, ou jaune rosé. Ils contiennent des mélanges en proportions diverses, mais définies pour chaque puante, do flavanols-3(+) catéchine, (-) épicatéchine, (-) catéchine, (+) épicatéchinc, de flavanols-3,4 ou leucoanthocyanes leucosanthocyanidol, leucocyanidol, leucodelphinidol] et d'oligomères homogènes et hétérogènes de ces flava-nols formés de 2 à 5 molécules identiques ou différentes. Ils ne contiennent pas de produits hautement polymérisés. Pour définir les extraits ainsi préparés, on détermine leur composition. Pour cela, on utilise avec profit la chromato- graphie sur colonne. Par chromatographie sur colonne de "Sephadex" (gel de dextrane) par exemple, il est possible de séparer les divers constituants flavanoliques au moyen d'un solvant d'élution constitué par exemple par une solution aqueuse d'un sel minéral et en particulier le chlorure de sodium par exemple 0,065 M. L'élution des divers flavanols est suivie par enregistrement de la densité optique des éluats à 280 nm. Par planimétrie des pics ainsi obtenus, on évalue ensuite la proportion de chaque constituant. Les fractions ainsi délimitées sont alors soumises à une chromatographie bidimensionnelle sur couche mince de cellulose et identifiées grâce à des témoins authentiques internes et externes, par des réactions d'hydrolyse ou de dégradation et par 11 étude des spectres infra-rouges et des spectres de masse de leurs dérivés acétylés et méthylés. Tous les végétaux qui renferment des dérivés flavanoliques peuvent être traités par la méthode générale décrite ci-dessus, mais avec deux variantes suivant la consistance de la drogue à partir de laquelle l'extraction est pratiquée: 1 Si la substance se présente sous forme d'un produit relativement sec (racJnes, écorces, etc...) la pulvérication permet d'obtenir une poudre qui sera traitée par lixiviation au moyen du mélange cétore-eau. 20 Si la substance possède un taux d'humidité élevé (pulpe de fruit, feuilles charnues, etc...) le broyage se fera au sein rneme de la cétone. La quantité d'eau ajoutée devra tenir compte de celle qui est présente dans les tissus pour obtenir la proportion globale la mieux adaptée à la nature de chaque végétal. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux végétaux comme par exemple : Vigne, Pommier, Pin, Aubépine, Fraisier, Myr- tille, Groseiller, Noyer, Noisetier, Ronce, Cacao, Kola, Quinquina, Hamamelis, Combretum, Marron d'Inde, Arachide, Eucalyptus, etc... A titre d'exemples non limitatifs, on décrira l'application de ce procédé à quatre végétaux. I1 peut être étendu e. tous les autres végétaux contenant des dérivés flavanoliques. Les figures I à 9 ci-annexées représentent les diagram- mes d'élution d'une colonne de "Séphadex" des extraits totaux d'oligomères flavanoliques obtenus suivant les exemples 1, 3 et 4 respectivement. Femple I 1 kg de rafles de raisin blanc (grappe, pépins et pellicules de la baie de Vitis vinifera) est finement broyé en présence de 500 ml d'acétone et d'une quantité d'eau tenant compte du taux d'humidité de la matière première de telle sorte que la proportion globale soit de 3 volumes d'eau pour 2 volumes dtacétone. Après un contact de quelques heures avec ou sans agitation, la bouillie homogène ainsi obtenue est filtrée et le résidu solide est remis en suspension dans 500 ml de mélange eau-acétone (3/2). On le laisse macérer avec ou sans agitation pendant 1 heure ou plus, puis on filtre la bouillie formée. Cette opération est renouvelée jusqu'à ce que les quantités extraites de produits recherchés deviennent négligeables, ce qui est contrôlé par spectrophotométrie dans l'ultra-violet à 280 nm. Les solutions acétoniques réunies sont alors évaporées sous pression réduite à une température inférieure à 500C afin de chasser l'acétone. A la solution aqueuse ainsi obtenue, on ajoute du chlorure de sodium en quantité suffisante pour la saturer. On attend quelques heures la formation d'un précipité abondant de tanins condensés et on filtre. Le filtrat limpide est alors épuisé à plusieurs reprises chaque fois par 250 ml d'acétate d'éthyle jusqu'à ce que la dernière extraction n'enlève plus de produits recherchés, le contrôle étant offectué par spectrophotométrie comme susindiqué. Los diverses fractions d'acétate d'éthyle sont réunies et séchées sur sulfate de sodium desséché et concentrées sous pression réduite à environ 1/5 du volume primitif. Cette solution concentrée est ensuite versée dans quatre à cinq fois son volume de chloroforme. Il se forme un précipité qui est recueilli par filtration, lavé & chloroforme et séché par séjour dans un dessiceteur sous pression réduite en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 2 à 5 g d'oligomères flavanoliques du raisin blanc sous forme d'une poudre blanc jaunâtre. Elle est définie par sa composition schématisée par le diagramme d'élution d'une colonne de "Séphadex" (voir figure 1). Cette composition est indiquée dans le tableau 1 ci-après. T A B L E A U I Compo- %en @@ sant poids A 21,6 (-) épicatéchine B 24,5 (+) catéchine C 43,2 dimère flavanolique D 10,7 dimère flavanolique Exemple 2 On opère dans des conditions rigoureusement identiques à celles de l'exemple I en partant de rafles de raisin rouge. Le produit final a la même composition mais il est très légèrement coloré en rose par des traces d'anthocyanes. Exemple 3 1 kg d'écorce de pin maritime (Pinus maritimus) est réduit en poudre fine et humecté avec une quistité suffirante (environ 1 litre) d'un mélange d'eau et d'acétune (dans la proportion de 3 volumes d'eau pour 2 vol@@rs d'a@éttre) pour obtenir une poudre humide convenable pour une livintion. Après un contest de qualques heures, la poudre dixiviée avec ce même mélange eau-acétone (3/2) de telle sorte que le solvent recueilli en fin d'opération se contier@ pratiquement plus de produit recherché 9contrôle par spectroynotométrie dans l'ultra-vialet à 280 cm). La quantité de solvant nécessaire pour cette opération est comprise entre 3 et 5 litres. La solution acétonique est alors évaporée sous pression réduite à une température inférieure à 50 C afin de chasser l'acétone. A la solution aqueuse ainsi obtenue, on ajoute du chlorure de sodium en quantité suffisante pour la saturer. On attend quelques heures la formation d'un précipité abondant de tenirs condensés et on filtre. Le filtrat limpide ent alors épuisé à plusieurs paprises chaque fois par 250 ml d'acétate d'éhyle jusqu'à ce que la dernière extraction n'onlève plus de produits recherchés (même contrôle que précédemment). Les diverses frestions d'acétate d'éthyle sont réunies et séchées sur du sulfate de sodium désséché et sont concentrées sous pression réduite à environ 1/5 du volun primitif. Cette solution concentrée est ensuite versée dans quatre à cinq fois son volume de chloroforme. Il se forme un préeipité qui est recueilli par filtration, lavé au chleroforme et séché par séjour dans un dessincateur. sous pression réduite en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 4 à 6 g d'oligomères flavanoliques du pin sous forme d'une poudre blanche à peine rougeâtre. Sa composi- tion est schématisée par le diagramme d'élution d'une colonne de "Séphadex" (voir figure 2). Elle est indiquée dans le tableau 2 ciaprès. T A t T. E A U 2 Compo- % en sant poids Nature A traces (-) épicatéchine B 12,7 (+) catéchine C 49,1 dimère flavanolique D 38,2 dimère flavanolique Exemple 4 1 kg de parties ligneuses de pomme (Pirus malus) (pédoncule, pellicule externe, carpelles, pépin, accompagnés d'une proportion variable de pulpe résiduelle), est finement broyé en présence de 500 ml d'acétone et d'une quantité d'eau tenant compte du taux d'humidité de la matière première de telle sorte que la proportion soit de 3 volumes d'eau pour 2 volumes d'acétone.Après un contact de quelques heures, la bouillie ho morène ainsi obtenue est filtrée et le résidu solide est remis en suspension dans 500 ml du mélange eau- cétone (3/2) puis filtré. Cette opération est renouvelée jusqu'à ce que les quantités extraites de produits recherchés deviennent négligeables (contrôle par spectrophotométrie dans l'ultra-violet à 280 nm). Les solutions acétoniques réunies sont alors évaporées sous pression réduite à une température inférieure à 500C afin de chasser l'acétone. A la solution aqueuse ainsi obtenue, on ajoute du chlorure de sodium en quantité suffisante pour la saturer. On attend quelques heures la formation d'un précipité abondant de tanins condensés et on filtre. Le filtrat limpide est alors épuisé à plusieurs reprises chaque fois par 250 ml d'acétate d'éthyle jusqu'à ce que la dernière extraction n'enlève plus de produits recherchés. Les diverses fractions d'acétate d'éthyle sont réunies et séchées sur sulfate de sodium desséché et sont concentrées sous pression réduite à environ 1/5 du volume primitif (même contrôle que précédemment). Cette solution concentrée est ensuite versée dans quatre à cinq fois son volume de chloroforme. I1 se forme un pré cipité qui est recueilli par filtration, lavé au chloroforme et séché par séjour dans un dessi@cateur sous precsion réduite en présence d'anhydride phosphorique. On obtient ainsi 1 à 3 g d'oligomères flavanoliques de la pomme sous forme d'une poudre blanche à peine jaunêtre. Sa compsition, définie par son diagramme d'éjution d'une colonne de "Séphedex" (voir figure 3) est indiquée dans le tableau 3 ciaprès. TABLEAU 3 Compo- %en N a t u r e sant poids A 24,1 (-) épicatéchine B 24,3 (+) catéchine C 51,6 dimère flavanolique R E V E N D I C A T I O N S 1.- Extrait d'oligomères flavanoliques totaux des végétaux, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélabge de flavanols-3 et d'oligonères flavanoliques fourrés de 2 à 5 molécules identiques ou différentes, dont les plus irniortantes sont les dimères répondant à la formule dans laquelle les noyaux A, B, A', B' peuvent comporter chacun un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes hydroxy et méthoxy et représentés globalement par R, l'extrait contenant tous les oligomères flavanoliqucs présents dans le végétal dont il est issu et dans les proportions où ils se trouvent dans celui-ci 2.- Procédé d'extraction des oligomères flavanoliques totaux des végétaux suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction au moyen d'un mélange d'eau et dlau moins une cétone dans les proportions d'environ un volume d'eau pour 0,2 à 2 volumes de la cétone, à la température ambiante, en ce qu'on chasse la cétone de la solution obtenue par distillation sous pression ré- duite, en ce qu'on ajoute à la solution aqueuse obtenue du chlorure de sodium jusqu'à saturation pour provoquer la précipitation des tanins condensés que l'on sépare par filtration, en ee qu'on extrait les oligomères flavanoli-ques de leur solution aqueuse au moyen d'un solvant organique non miscible à l'eau sature de chlorure de sodium, dans lequel les oligomères flavanoliques sont solubles et ne risquant pas de dénaturer ceux-ci, en ce qu'on déshydrate la solution organique obtenue d'oligomères flavanoliques, en ce qu'on précipite ces derniers en ajoutant à leur solution organique un liquide miscible en toutes proportions audit solvant organique d'extraction mais dans lequel lesdits oligomères sont insolubles , et en ce qu'on recueille le précipité obtenu et le sèche. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la cétone employée est choisie parni l'acétone, le dioxanne, la méthyléthylcétone et les mélanges de ces cétones. 4.- Procédé suivant a revendication 2 ou 3, caract risé en ce que le solvant organique d d'extraction des oligomères flavanoliques à partir de leur solution aqueuse est choisi Farci l'acé- tate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate de propyle, le bu tanol;; l'isobutand, l'alcool isoamylique et les mélanges de ces solvants 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le liquide employé pour précipiter les olIgomè- res flavanoliques dans leur solution organique est choisi parmi l'éther éthylique, l'éther de pétrole, l'hexane, l'heptane, le benzène, le chloroforme, le trichloréthylène et les mélanges de ces solvants 6.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérise en ce que le précipité d 'oligomères flavanoliques est séché par exposition à un rayonnement infra-rouge, par chauffage à une température inférieure à 40 C sous pression réduite dans une étuve à vide, ou au moyen d'un agent desséchant sous pression réduite dans un dessiccateur à vide. 7.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que, lorsque la matière végétale traitée est sèche, on la réduit en poudre et la traite par lixiviation au moyen du mélange eau-cétone. 8.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que, lorsque la matière végétale a un taux d'humidité élevé, on la broie au eein même de la cétone, on ajoute une quantité d'eau qui est fonction de celle déjà présente dans la matière végétale, on laisse macérer, on sépare par filtration la liqueur d'extraction, on remet en suspension et fait à nouveau macérer le résidu de filtration dans le mélange eau- cétone, on filtre à nouveau et on renouvelle les opérations de mise en suspensi?r., macération et filtration juscutà ce que l'extraction des dérives flavanoliques soit pratiquement complète.