FR 2017790 A1 19700522 FR 6930749 A 19690910 La présente invention a pour objet une combinaison de vaccins et plus particulièrement une préparation lyophilisée de trois virus vivants de virulence atténuée, mélangés au préalable, à savoir les virus de la rougeole, des oreillons et de la rubéole. Elle concerne également les combinaisons partielles de deux seulement de ces trois virus. Un grand nombre de vaccins sont maintenant disponibles pour immuniser les personnes contre diverses maladies et, si on les administre séparément, on doit piquer plusieurs fois la peau du patient. De plus, il faut un grand nombre de médecins ou autre personnel médical, à cause du temps nécessaire à chaque injection séparée. Pour cette raison, il était jusqu'à présent courant de combiner en une seule préparation les antigènes de deux virus tués, ou davantage. Par exemple, on préparait ainsi un vaccin trivalent contre la diphtérie, la typhoïde et le tétanos. Bien que les virus tués aient été combinés avec succès, il n'était pas certain que des virus vivants puissent être combinés sans perte d'efficacité. Quelques indices ont montré que certains virus atténués vivants sont incompatibles dans une seule préparation, en particulier pendant le stockage avant utilisation. Par exemple, on a noté que les trois souches de virus contre la poliomyélite utilisées généralement, ne peuvent être combinées avec succès dans un seul vaccin. Les recherches qui ont abouti à la présente invention ont montré que les virus atténués vivants de la rougeole, des oreillons et de la rubéole peuvent être combinés pour former un vaccin trivalent, ou qu'on peut omettre de mélanger l'un quelconque de ces trois virus pour préparer trois vaccins divalents. Le virus atténué vivant séparé est préparé indépendamment des autres, conformément à des méthodes connues, puis on les mélange dans des proportions correctes pour former le vaccin divalent ou trivalent désiré et on lyophilise ensuite ce pré-mélange. Le produit pré-mélangé et lyophilisé est conditionné en flacons ou en ampoules pour une seule dose ou pour plusieurs doses. On le reconstitue au moment de l'emploi en ajoutant de l'eau stérile distillée. L'emballage doit indiquer la quantité d'eau à ajouter et le volume à injecter pour administrer la quantité minimale du virus présent. Ces quantités varient d'après les diverses unités adoptées par chaque pays. Le virus de la rougeole peut être n'importe quel virus de la rougeole atténué vivant, cliniquement acceptable. On préfère utiliser le virus de la rougeole atténué vivant d'Enders B développé dans des cultures de cellules d'embryons de poulet. La méthode utilisée pour obtenir ce virus de la rougeole atténué a été décrite dans New Eng. J. Mesa. 263, 153 (1960) et New. Eng. J. Med. 263, 230 (1960). Un vaccin contenant ce virus est disponible dans le commerce sous forme lyophilisée sous la dénomination Rubeovax. Un autre vaccin contre la rougeole qui peut être utilisé est la souche Schwartz de virus vivant qui a été atténué par le procédé décrit dans Ann. Paediat. 202, 241 (1964). Ce dernier virus est disponible dans le commerce sous forme d'un vaccin lyophilisé. Un autre virus atténué qui peut être utilisé est le virus disponible dans le commerce sous la dénomination Attenuvax (Moraten Line), qui est une préparation encore atténuée de la culture de tissus cellulaires d'embryon de poulet, Enders B. Un article dans la revue JAMA est actuellement sous presse. Le vaccin contre la rougeole utilisé doit être suffisamment non infectieux pour qu'une seule dose du produit combiné final administrée à l'homme contienne au moins 1.000 unités TOIl)50 du virus de la rougeole atténué pour satisfaire aux normes américaines, mais on peut préparer des vaccins efficaces contenant une quantité aussi faible que 20 unités. Le virus des oreillons est de préférence le virus vivant atténué qui se trouve dans le vaccin vendu sous forme lyophilisée sous la dénomination Mumpvax. Sa préparation a été décrite dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique no 479.653, déposée le 13 août 1965, et cédée à la demanderesse. Sa préparation a également été décrite dans l'article de Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123, 768 (1966). Une quantité 'suffisante de virus de la rougeole doit être présente dans le vaccin combiné pour qu'une seule dose administre au moins 5.000 unités, cela afin de satisfaire aux exigences de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique. Des quantités @ussi faibles que 317 unités, administrées en une seule dose, donnent une formation satisfaiante d'anti-corps. Le virus de la rubéole est de préférence le virus vivant atténué qui se trouve dans le vaccin actuellement en essai clinique et qui doit être vendu sous la dénomination meruvax. a préparation est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 3.401.084 publié le 10 septembre 1968.Sa préparation a égale- ment été décrite dans la revue JAMA 204, 195 (1968). une quantité suffisante ae virus de la rubéole doit. ètre présente dans le @acein combiné pour fournir en une seule dose au moins 1,000 unités @CID 50, cela afin de satisfaire aux ezigences de la @harra@cpée des Etats-Unis d'Amérique, mais à nouveau un vaccin contenant @ quantités aussi faibles que 40 unités forme une quentité satisfaisante d'anti-corps. Les exemples suivants illustrent la présente invention ; dans ces exemples, il importe peu que chaque virus scit un de virulence atténuée ou un produit reconst@@ue @@@@@@ @@ @ de l'eau à une préparation lyophilisée de cette préparation culiere. Dans une variante, on peut mélanger cette préparation liqueide de enaque virus atténué, en utilisant le liqueide @lune ^réparation reconstituée ou qui vient autre atténuee pour mettre en suspension ie virus lyophilisé. Exemple 1 On prépare un vaccin trivalent administrable en une seule dose afin qu'il contienne les quantités minimales suivantes. Virus Titrage exigé aux U.S.A. - Rougeole 1.000 unités - Oreillons 5.000 unités - Rubéole 1.000 unités (proposé actuellement mais provisoire). On mélange des solutions des trois virus atténués en quanvités relativement suffisantes pour obtenir le titrage ci-dessus. Après avoir mélangé convenablement, puis avoir titré chaaue virus et après avoir ajusté ie titrage si nécessaire, on répartit le mé lange dans des flacons contenant 0,5 à 1,0 ml et on les lyophilise pour les stocker ou les transporter vers l'endroit de leur utilisation. On reconstitue en général les virus lyophilisés, pour une elle dose urique, en ajoutant suffisamment c eau stérile pour obtenir une quantité totale de 0,5 à ,0 ml, malus pour compenser le liquide qui peut rester dans le flacon et l'aiguille, on ajout de l'eau stérile jusqu'à ce qu'on obtienne un volume @@tel de 0,7 @@ ml. A des fins commerciales, on pe@@ fabriquer une @éparation pour plusieurs doses et la mettre dans des flacons conve@ant par @xemple pour dix doses séparées par flacon. Pour compenser les pertes dues à la quantité restant dans le flacon et l'aiguille hypodermique @@@ dans le pistolet à jets, un flacon de dix doses contient, en fait, généralement une quantité de virus pour 11 des et on ajoutera de l'eau pour constituer 11 doses L'exemple 1 donne les quantités minimales établies pour la rougeole et les oreillons et celles qu'on a te@@e d'établir pour la rubéole, mais on peut utiliser des quantités supérieures de chaque virus.Toutefois, il est possible que la quantité minimale adoptée aux Etats-Unis d'Amérique soit diminuée dans ltavenir, car il est connu qu'on obtient une quantité satisfaisante d'anti-corps avec un nombre inférieur d'unités pour chaque virus. Dans les autres pays, on peut considérer, pour des rai@ore éconemiques, qu'une quantité nettement inférieure par dose d@nne des résultat sati@faisants. @'inrention peut être @'se e@@@@@@@@@@@@@@@@@@ quantité minimale suivante de chaque virus, car des ess@@@ @@@@@ @@ ont mis en évidence que ces unités relativement faibles donnent une formation satisfaisante d'anti-corps. Exemple 2' Virus Quantité minimale par dose - Rougeole 20 unités TOID50 - Oreillons 317 " ' - Rubéole 40 D'autres exemples de vaccins combinés dans lesquels chacun des trois virus est présent en quantité comprise entre celles des exemples 2 et 1 sont évidents et font partie de l'invention. Comme précisé ci-dessus, l'invention comprend également des vaccins divalents contenant seulement deux des trois virus cités ici. Des exemples de ces virus sont donnés ci-après. Exemple 3 On omet d'incorporer le virus de la rougeole de l'exemple 1 ou 2. Exemple 4 On omet d'incorporer le virus des oreillons de l'exemple 1 ou 2. Exemnle 5 On omet d'incorporer le virus de la rubéole de l'exemple 1 ou 2. Pour montrer l'efficacité de la préparation de l'exemple 1, on l'administre à des enfants et on obtient les résultats suivants. Tableau 1. Action sérologique de vaccins vivants combinés obtenue sur des enfants non vaccinés. FORMATION D'ANTICORPS Combinaison Rougeole (HI)* Oreillons (neut.)* Rubéole (HI) Transformation M.G Transformation M.G. Transformation M.G. ** *** ATTENUVAX (rougeole) + 28/28 51 26/28 8 28/28 134 MUMPVAX + (100 %) (93 %) (100 %) MERUVAX (rubéole) ATTENUVAX (rougeole) + 37/38 69 37/38 7 - MUMPVAX (97 %) (97 %) RUBEOVAX (rougeole) + 13/13 61 10/13 5 - MUMPVAX (100 %) (77 %) (HI) * = Inhibition d'hémagglutination ; neut. = neutralisation. Transformation ** = Changement de l'état non vacciné à l'état vacciné. M.G. *** = Moyen géométrique du titrage d'anticorps. Revendncations Procédé de préparation d'un vaccin de virus atténués vivants, polyvalent et lyophilisé, contenant au moins deux des virus at ténués de la rougeole, des oreillons et de la rubéole, dans lequel (1) on mélange les combinaisons de virus désirés, au moins un de ces virus atténués tant sous forme liquéfiée, (2) on ajuste le titre du mélange par addition d'un ou de plu@ sieurs de ces virus de façon que chaque ose unitaire de 0,5 à 1::0 ml contienne au moins 20 unités @@@@ de virus de la rou geole, 317 unités TCID50 du viru@ des @reillons @@@@ unites TCID50 du virus de la rubéole, @@@ @@@@@@ di@@s @e rélange en doses unitaires et @4) on réalise @@e lyophilisation. Vaccin polyvalent contenant au mo@ns deux virus atténués vivan@s en quantités relatives telles qu'une seule dose administre au moins 20 unités TCID50 du virus de la rougeole, 317 unités TCID50 du virus des oreillons et 40 unités TCID50 du virus de la rubéole. Vaccin selon la revendication 2, dans lequel le nombre minimal d'unités du virus de la rougeole est de 1.000, celu@ du virus des oreillons de 5.000 et celui da virus de 1."- la rubéole de 1.000. Vaccin selon la revendication @ @ui @e tr@uv@ @@@@ forme ly