FR 2001977 A1 19691003 FR 6903732 A 19690214 La présente. invention concerne un procédé pour la production de l'acide amino-6-pénicilliçue (6-APA) par dégradation enzymatique d'une pénicilline et un procédé pour la production de pénicillines et surtout de pénicillines hypoallergisantes. Elle concerne aussi un procédé pour la production, la purification et l'isolement d'une préparation enzamatiiue capable d'éliminer les chaînes latérales de certaines pénicillines lors ae la formation de 6-PA. En partie culier elle se rapporte a la production d'une préparation enzyma- tique à partir de Escherichia coli et à son utilisation pour la production de 6-APA à partir de la benzypénicilline. On sait que de nombreux microorganismes, à la fois des bactéries et des champignons, produisent des enzymes qui peuvent hy- drolyser la liaison amide des pénicillines en position 6 et Qui sont généralement appelés amidases ou acylases de pénicilline (J.M.T. Hamiltoniller,Bactériological Reviews 30 (1966) 761). Dans la production industrielle actuelle de 6-APA, on utilise de préférence des suspensions de cellules de E-Coli contenant une acylase ou une amidase. Toutefois, ces procédés présentent de nombreux inconvénients. Puisque l'enzyme est essentiellement intracel lulaire > la pénicilline doit d'abord, par nécessité, pénétrer dans les corps des cellules pour réagir avec enzyme, ce qui conduit à une réaction plus lente. La souche utilisée peut aussi contenir d'autres enzymes qui inactivent la pénicilline, ou l'acide 6-APA formé, en coupant la liaison bêta-lactame ou qui peut contaminer la culture de cellule avec les organismes que produisent de tels enzymes.Comme l'acylase constitue seulement une tres petite partie du volume de la cellule, un procédé utilisant tous les organismes a aussi un inconvénient pratique car il nécessite de grandes quan tités de produit qui sont inactifs dans le procédé. Un autre inconvénient rencontré par l'utilisation de la totalité des organismes est que 1'-on doit ajouter une étape supplémentaire aux séries de procédés conduisant à la production de pénicillines semi-synthétiques, à savoir, la séparation (par exemple, par filtration) des organismes du liquide réactionnel dans lequel la chaîne latérale initiale est séparée des pénicillines de biosynthèse, Un nouvel inconvénient est la perte de l'acide pénicillique pro voquée en partie par l'adsorption sur les cellules, et en partie par des dégradations provoquées par les substances produites pendant le métabolisme de la cellule.Encore un. autre facteur susceptible de donner naissance à des problèmes liés à l'utilisation des cellules dans leur totalité pour la préparation de l'acide amino- 6-pénicillique à partir des pénicillines biosynthétiques, est que la spiration de l'acide des autres produits de la réaction d'éli rinatlon est très difficile.Ainsi Batc-eler et ses collaborateurs ((Lancet I, (1968) 1175) ont signalé que le 6-APA obtenu par l'usage des cellules entières peut contenir des impuretés de type protéique susceptibles de mettre en luire des réactions allergiques dangereuses chez l'homme et l'animal. Quand on prépare des pénicillines à partir de 6-APA ainsi contaminé les impuretés peuvent être retenues dans les produits et être responsables de nombreuses réactions allergiques observées avec ces pénicillines (G.T. Steward, Amer. Heart- J. (196S) 429).Pour éliminer ces impuretés, l'acide amino-6-pénicillique, ou les pénicillines préparées à partir de celui-ci, doit être soumis à des procédés de sé paration supplémentaires comprenant par exemple la dialyse ou la filtration sur gel (Brevet canadien n 771 662). Ainsi de grandes proportions de 6-APA ou de pénicilline sont perdues comme le démontre la récupération de seulement 12% de benzylpénicilline (Brevet britannique n 1 078 847) et de 56% de phénoxyméthylpénicilline (brevet britannique n 1 114 311.). On peut éviter tous ces obstacles en utilisant une préparation d'enzyme purifié ou exempt de cellules selon la presente invention. Ainsi les 6-APA formés en utilisant une préparation d'enzyme purifié ou exempt de cellules selon la présente invention pour couper la liaison amide en position-6 des pénicillines sont obtenus avec de bons rendements et sont pratiquement exempts d'impuretés de type protéique. Quand l'acide 6-APA préparé de cette façon est acylé, on obtient des pénicillines hypo-allergisantes avec de bons rendements sans aucune purification supplémentaire. Dans la littérature, plusieurs tentatives de préparation d'enzyme purifié à partir de souches de E.Coli ont été décrites. Borkar et ses collaborateurs (Hindustan Antibiotics Bull. 4 (1961 48, 152) traitent des cellules en suspension dans un tampon phosphate, avec des ondes ultrasonores et effectuent une purification répétée 25 fois par précipitation fractionnée et chromatographie sur colonne. Hoît et Stewart (rature 2C1 (1964) 824) obtiennent une preparation enzymatique de faible pureté par dessiccation par évaporation de la glace et par dialyse du bouillon de culture filtré. Szentirmai ( Acta Microb, Acad. Scient. Hung. 12 (1966) 395) réalisent une purification répétée 40 fois d'un enzyme de E-Coli par précipitation au sulfate d'ammonium , suivie de l'adsorption sur gel de phosphate de calcium et chromatographie sur cellulose DEAE d'un extrait tamponé au phosphate de cellules de E.coli traitees avec des ondes ultrasonores. Sakaguchi et Marao (Brevet japonais nO 26 050/64) obtiennent un rendement moyen pour une préparation d'enzyme purifiée à partir de E-coli, par extraction des cellules avec du tampon borate pendant une durée prolongée, ou pendant un temps eilns:court simultanément avec un traitement par ondes ultra sonores. A partir de l'ex- trait, on peut obtenir l'enzyme sous forme solide après précipitation avec le sulfate d'ammonium, dialyse et dessiccation par évaporation de la glace.Johnson et Hardcastle (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 297 546) obtiennent une solution d'enzyme de E.coli en traitant la culture de cellule avec un ammonium quaternavire, séparation des cellules par filtration et mise en suspension de celles-ci dans l'eau pendant quelques heures; ensuite on sépare les cellules par filtration puis on traite le filtrat avec du carbone actif. On sait de plus que les enzymes contenus dans les cellules bactériennes peuvent être libérés par expulsion, à haute pression des suspensions de cellules à travers un petit orifice. Duerre et Ribi (Appl. Microbiol. 11 (1964) 467), en étudiant d'autres types d'enzymes que les amidases de pénicilline, trouvent dans l'obser- vation de E-coli qu'une pression élevée, au dessus de 1034 kg/cm2 doit être utilisée pour obtenir la libération maximale des enzymes. A de telles pressions, toutefois, les parois des cellules sont aussi fragmentées et de grandes parties de la substance cellulaire sont solubilisées. Frazer (Nature 167 (1951) 33) trouve que les cellules de E.coli peuvent être disloquées, à une-petite échelle, quand elles sont chassées d'une bombe par une pression de gaz de 35 à 62 kg/em2. Nous avons maintenant trouvé q;e l'acylase de pénicilline intra-cellulaire dans E-coli peut être extraite de l'or- ganisme dans l'eau, sur une grande échelle de production, après que les cellules, ou leurs suspensions dans l'eau ou un mélange d'eau et de solvants organiques, soient rapidement libérées par l'appli 2 cation d'une pression d'au moins 35 kg/cm mais ne dépassant pas la pression pour laquelle apparaît une destruction excessive de la cellule. Ainsi, la présente invention dans l'un de ces appacts fournit un procédé de production pour la préparation d'acylase de pénicil line à partir de E-coli, comprenant la fermentation, d'une manière connue; d'une souche de E-coli produisant un tel enzyme, le prélèvement du liquide cellulaire et l'expulsion rapide de la substance cellulaire à travers un orifice étroit ou une fente par application d'une pression d'au moins 35 i-g/cm2, mais ne dépassant pas la pression pour laquelle apparaît une destruction excessive de la cellule Jusqu'à des pressions de 200 kg/cm2, les cellules ne sont pas totalement détruites.La substance expulsée est ensuite agite avec de l'eau, éventyuellement avec addition d'un solvant organique et/ou une base, telle que l'hydroxyde de sodium ou la triéthylamine, pour dissoudre l'enzyme. Dans une réalisation de la présente invention l'élimination du liquide de culture et l'expulsion de la substance cellulaire sont effectuées simultanément dans un séparateur centrifuge autonettoyant, fonctionnant à une température comprise entre 0 et 500 c, de préférence entre 15 et 400C, température à laquelle la substance cellulaire séparée est expulsée par intermittence en 0,05-1,0 sec., de préférence en 0,1 - 0,5 sec., à travers une fente périphérique d'une largeur de 0,1-1,5 mm, de préférence 0,3 - 0,7 mm par application d'une pression de 35 à 140 kg/cm, de préférence 62 à 77 kg/cm, Si c'est désirable, le bouillon est saturé avec un solvant organique ayant une faible solubilité dans 11 eau, comme l'acétate de butyle, l'acétate d'isobutyle ou l'acétate d'amyle pour tuer l'organisme, et pour aider l'opération de séparation. De la ême manière on peut, si c'est désirable, laver la substance cellulaire avec de l'eau dans le séparateur. Le produit cellulaire expulsé est agité entre 10 et 500 c, de préférence entre 20 et 40 C pendant C,10 à 5,0 heures, convenablement 0,25 à 3,0 heures et de préférence 0,25 à 1 heure, avec un agitateur efficace pour dissoudre l'enzyme, et si possible avec addition à une concentration de 1,0 - 5,0% d'un solvant organique non miscible à l'eau comme la méthylisobutylcétone, l'acétate de butyle, l'acétate d'isobutyle, l'acétate d'amyle, le benzène, le toluène ou le chloroforme.Pour faciliter l'extraction de l'enzyme à partir de la substance cellulaire expulsée, on peut ajouter au mélange une base minérale, telle que de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque, ou une base organique tertiaire telle que la triéthylamine ou la l-éthyl- pipéridine, pour ajuster et maintenir le pH à une valeur comprise entre 6,5 et 9,0 et de préférence entre 7,0 et 8,5. La solution d'enzyme ainsi obtenue peut, si possible, après dilution avec l'eau, être litérée de toute substance cellulaire restante et d'autres impuretés solides par dos procédés classiques tels que la filltration ou la contrifugation, et éventuellement en conbinant les deux procétés ot sl scssitle avec addition d'agents qui aident la décolsratior, ls elarificatlon et la filtratïon comme le carbone actif, l'alumine, la poudre de cellulose, la terre d'infusoire ou d'autres sgents siolides faiblement adscrtants.Une méthode pr férentielle est d'enlever la plupart du produit cellulaire par centrifumation st de filtrer le lioide surnageant, en peut ottenir une purification supplémentaire de l'enzyme en acidifiant la solution aqueuse 3 un p compris entre 3,0 et ,3, de pré- férence entre X,0 et 5,0, en enlevant le produit inactif précipité par filtration et en réajustant le pH à Ba valeur initiale, L'acylase de pénicilline contenue dans la cellule litre et, si on le désire, les solutions aqueuses partiellement purifiées ci- dessus citées peuvent être précipitées par traitement des solutions avec des agents, commo les tannins, qui forment avec les protéines des complexes faiblement solubles. Dans une forme préférentielle de ce procédé, la solution enzyme est traitée à un pH compris entre 4 et 6, convenablement à pH 4, - 5,5, avec du tannin à une concentration finale de 300 à 90C ppm en présence d'agents de chélation comme l'acide éthylènediamine -tétracétique, qui forment des complexes avec les ions fer.Le complexe enzyme-tannin formé peut être isolé de façon classique, par exemple par filtration ou centrifugation. il peut être lavé, séché et dbarraasê de l'eau, par exemple par dessiccation, spécialement par dessiccation par évaporaticn de la glace, ou par traitement avec es solvants organiques miscibles à l'eau comme l'acétone. Le complexe au tannin est une forme appropriée à la conservation et au transport de l'enzyme. On peut aussi utiliser directement pour l'élimination de la chaîne latérale des pénicillines, telles cue la benzylpénicilline. L'acylase de pénicilline contenue dans le précipité de tannin peut être libérée en solution aqueuse par dissolution du complexe dans l'eau È pE 7 - 9, de préférence 7,5 - 2,5. Ou encore on peut traiter le complexe avec un mélange d'eau d'un solvant non miscitle à l'eau comme le n-tutanol à pH 4-7, de préférence 4,5 - 5,5 Une troisième méthode d'élimination du tannin consiste à traiter le complexe enzyme-tannin, en suspension dans l'eau avec un échan eur d'ion anionique, comme la cellulose-DEAE qui fixe le tannin et libère l'enzyme dans l'eau.Les quantités d'eau nécessaires à ces opérations sont beaucoup plus faibles que cellesprésentes dans les solutions initiales d'enzyme et de cette façon on atteint une concentration importante de l'activité enzymatique. Dans un autre aspect de l'invention, l'acylase de pénicilline contenue es ntin-zorte quelle solution citée ci-dessus peut être cencentrée et puridiée l'aide d'un échangeur d'ion. Dans une forre Préférentielle, l'enzyme est adsorbé sur un échangeur d'ion ca tonique à structure non serrée corame le Séphadex-SER, la carboxyméthylcellulose ou le OM-SephadexR en faisant passer la solution d'enzyme ajustée à pH=335 - 6, de préférence à pH 4,0 - 5,0, travers la colonne de l'échangeur. Ou encore, on peut ajouter l'é- changeur à la solution d'enzyme agité e. On peut libérer l'enzyme de l'échangeur 'ion par solution è pH 6,0 - F,O avec des solutions fiablement tamponées, comme l'acétate d'ammonium 0,2 M ou l'acétate de trinydroxyméthylammonium. En vue d'obtenir des préparations plus pures de l'enzyme, on peut enlever les ions minéraux et les impuretés de bas poids moléculaire des solutions d'enzyme par dialyse aqueuse. Ou encore, les solutions, si c'est nécessaire après concentration par évaporation, à une température inférieure à 50 C, jusqu'à obtenir une concentration convenable de 25 - 100mS de poids sec par ml., sont soumises à la filtration sur gel. Les solutions aqueuses d'enzyme ainsi obtenues à chacun des stades précédents sont très convenables pour être utilisées directerrent pour l'élimination des channes latérales des pénicillines naturelles, spécialement pour éliminer la chaîne latérale de ben ylpébnicilline. Dans u autre aspect de la présente invention, l'enzyme prépare comme précédemment est isolé de la solution aqueuse À l'état solide par dessiccation par évaporation de la gla- ce, dessiccation par flottation ou par pulvérisation, par concentration sous vide ou par précipitation selon des procédés connus. L'opération d'isolement conduit à un enzyme solide possédant une activité spécifique élevée et qui est une fore très adaptée à la conservation et au transport. L'utilisation d'un tel solide, les préparations d'enzyme soluble dans l'eau ont aussi de nombreux a ventages techniques , permet de travailler avec des solutions plus concentrées que celles utilisées par les procédés connus qui utilisent des suspensions de cellule. La méthode recommandée pour isoler l'enzyme consiste soit en une dessiccation par évaporation dê a lace de la solution d'en zyme à une température comprise entre -10 et +500C, de préférence entre 0 et 300C, soit en un séchage par flottation dans un courant d'air de 10 à 550C,de préférence entre 35 et 45 C. Les enzymes purifiés et les solutions d'enzymes obtenues selon cette invention sont très convenables et avantageuses pour la production d'acide amino-6-pénicillique par enlèvement de la chaîne latérale des pénicillines, spécialement celle de benzylpénicilline. Les rendements et les puretés des produits sont bien meilleurs que ce qu'on obtient par des procédés connus, en utilisant des suspensions de cellules de E-coli. On a également découvert que l'acide amino-6-pénicillique pré paré selon l'invention contient très peu, s'il y en a, d1impuretés de type protéique à propriétés allergisantes obtenues quand on utilise des suspensions de cellules de E-coli pour sa production. Ceci est d'une grande importance industrielle car il est ainsi possible de préparer des pénicillines à propriétés hypo-allergisantes directement à partir de 6-APA préparé selon l'invention, sans aucun procédé de purification supplémentaire. Des exemples de pénicillines à propriétés hypo-allergisantes que l'on peut préparer de cette façon sont : l'alpha-phénoxyéthylpénicilline, l'alphaphénoxypropylpénicilline, la diméthoxy-2,6-phénylpénicilline,l'(o- chlorophényl-3±méthyl-5-isoxazolyl-4-pénicilline, l'alpha)carbonylbenzylpénicilline, l'alpha-azidobenzylpénicilline et 1 'alpha- aminobenzylpénicilline. On peut aussi utiliser l'acylase de pénicilline de E-coli pour éliminer la chaîne latérale des esters pénicilliniques, spécialement des esters de benzylpénicilline. On a maintenant découvert que les préparations d'enzymes obtenues selon l'invention sont très appropriées à ce procédé et sont plus effieaces que les suspensions de cellules de E-coli précédemment utilisées. En outre, on a également découvert que les préparations d'enzymes selon l'invention sont supérieures aux suspensions de cellules antérieurement utilisées dans la synthèse enzymatique des pé nicillines à partir de l'acide amino-~6-pénicillique et du dérivé précédent à chaîne latérale (W.K.Kaufmann et Collaborateurs, Antimicrobial Agents 1960, I). Les préparations d'enzyme purifié obtenues selon l'invention sont des produits de départs convenables pour la modification chimique de l'enzyme conduisant à des produits à meilleures propriétés en ce qui concerne l'activité et/ou la réalisation techni que. Ainsi l'enzyme peut réagir avec des substances polymériques actives, telles que par exemple des polysaccharides traités avec le bromure de cyanogne pour donner des produits dans lesquels l'enzyme est fixé sur un support polymérique. L'activité enzymatique est conservée dans de tels produits qu'on peut avantageusement utiliser pour la fragmentation des pénicillines et qu'on peut récupérer à partir de la solution réactionnelle par des moyens simples, par exemple par filtration.La préparation d'enzyme polymérique peut aussi être utilisée dans des colonnes pour la production en continu de 6-APA en faisant passer la solution des pénicillines a travers la colonne. La préparation et la purification de produit enzymatique, exempt de cellules, la préparation de l'acide amino-6-pénicillique à partir de pénicillines naturelles (par exemple la benzyl pénicilline) et la préparation de pénicillines synthétiques à partir d'acide amino-6-pénicillique sont illustrées dans les exemples suivants. Exemple I - Production de cellules bactériennes de E-coli De la liqueur de blé macéré (3 kg), de l'huile de soja (135ml), de la paraffine (12 ml) et du cétanol (3 ml) dans l'eau (150 ml) est ajustéeà pH = 6,0 avec de la soude à 45% (165 ml) et ensuite stériliséeà 1240C pendant 30 minutes dans une cuve à fermentation de graine. La solution est ensemencée avec 100 ml d'une culture de 20 à 24 heures de E-coli (Astra 1339) et mise en incubation à 250C avec barbotage d'air et agitation pendant 18 heures. De la liqueur de blé macéré (300 kg), de l'huile de soja (13,8 kg) de la paraffine (1,22 kg), du cétanol (0,3kg) de l'acide phényla-cétique (21 kg) et du chlorure de sodium (112 kg) dans l'eau (140001 ) est ajustéeà pH = 6,6 avec de la soude à 45% (40kg) et la solution est stérilisée dans une cuve de fermentation à 1240C pendant 30 minutes. La solution est refroidie et ensemencée avec la culture de graine ci-dessus mentionnée et ensuite mise en incubation à 250 C, avec barbotage d'air et agitation, 24 heures après l'incubation et quand le pH atteint 8,2, les cellules bactériennes sont tuées par addition d'acétate de butyle (180 1) et le mélange est ensuite refroidi. Exemple 2 - Isolement et purification de l'acylase a) Pour isoler la masse bactérienne le mélange est séparé dans un séparateur centrifuge auto-nettoyant (De Laval, type BRPX 213 - 358) La pâte de cellule bactérienne est recueillie en portions de 100 à 120 kg. A chaque portion on ajoute 3% de méthylisobutylcétone et le mélange est ensuite homogénéisé au moyen d'un agitateur Ultra Tuttax (type 110/2N) pendant 25 minutes. La quantité totale de la sasse bactérienne est de 325 kg. L'analyse de l'enzyme dans les diffrentes étapes de produc- tion donne les chiffres suivants en unités d'acylase déterminantes de la quantité d'enzyme restante durant l'étape concernée (une unité d'acylase correspond à la quantité d'enzyme capable de frag- mentation, en 1,5 heure à ph = U)5 et é 37 C une quantité de benzylpénicilline équivalente à 1 mg d'acide amino-6-pénicillique): Production de la culture de fermentation 5 U/ml. Liquide surnageant 0,35 U/nl. Liquide s'écoulant du séparateur centrifuge 0,28 U/ml. Pâte de cellule bactérienne 211 U/g. Liquide surnageant dans la pâte avant homogénéisation 75 U/g. Liquide surnageant dans la pâte après homogénéisation 123 U/g. b) la pâte de cellule bactérienne obtenue comme dans l'exemple 2a est utilisée dans les essais de solubilisation de l'enzyme A 100 g. de la pâte de cellule, on ajoute 100 nil d'eau déionisée. La suspension obtenue a un pH de 5,9 et elle est soumise à une série de traitements comme suit I - La suspension est centrifugée à 5000 G (force centrifuge mesurée en quantité de pesanteur) pendant 20 minutes et on détermine l'activité enzymatique dans le liquide surnageant. 2 - On soumet la suspension à l'homogénisation au moyen d'un agitateur Ultra Turrax pendant 5 minutes. Fendant ce traitement l'échantillon est refroidi dans un bain de glace de façon à éviter des températures plus hautes que 35 C dans l'échantillon. L'échantillon est ensuite centrifugé comme dans I et on détermine l'activité dans le liquide surnageant. 3 - Le pH de la suspension est ajusté à 8,5 avec NaOH, avec agitation, après quoi l'échantillon est homogénéisé et centrifugé comme ci-dessus et on détermine l'activité dans la phase surnageante. 4 - On ajoute 3% de méthylisobutylcétone à la suspension dont le pH est ajusté comme dans l'expérience 3. L'échantillon est ensuite soumis à l'homogénéisation et à la centrifugation conme ci- dessus et l'activité de l'enzyme est déterminée dans la phase sur nageante. On peut démontrer le procédé de solubilisation par le tableau suivant. Solubilisation de l'enzyme U/g % du total Suspension bactérienne 106 100 Liquide surnageant obtenu à partir de I. 29 28 " 2. 62 59 " 3. 73 69 " 4. 83 78 c) La pâte bactérienne homogénéisée ( 175 kg, activité 190 U/g) est diluée avec de l'eau (175 kg) et de l'Hyflo (22,7 kg), de la Célite 505 (22,7 kg) et du Fibrale (10,2 kg) sont ajoutés avec agitation du mélange. La phase aqueuse est séparée par filtration sur un filtre Funda et ce qui est aggloméré sur le filtre est lavé avec de l'eau (50 1). La solution globale (29D kg) a une activité de 48 U/g. B) La pâte bactérienne homogénéisée (1 kg, activité 212 U/g) est dilue avec de l'eau (2,0 1), ajustée à pH = 8,5 au moyen de soude 0,5 I (200 ml) et ensuite agitée à 200C pendant 30 minutes. Le mélange est centrifugé à 13 200 G (Serwall, Type RC-2, Centrifugeuse réfrigérée automatique superrapide) pendant 30 minutes à OOC. Le liquide surnageant est décanté, clarifié par filtration ce qui donne 2,7 kg de solution ayant une activité de 50 U/g. La mise en suspension du dépôt dans l'eau (1 1), deux fois pendant 5 minutes à pH -8,5, suivie de la centrifugation, donne une solution d'enzyme supplémentaire (2 kg, activité 11 U/g). Ceci correspond à un rendement total de l'activité d'acylase soluble dans l'eau de 74%. e) Une solution limpide d'acylase (2 kg, activité 50 U/g), obtenue comme dans l'exemple 2d, est lyophilisée ce qui donne 98,5 g d'acylase solide ayant une activité de 950 U/. f) Une solution limpide d'acylase (2 kg, activité 50 U/ml) obtenue comme dans l'exemple sd, est séchée par pulvérisation ce qui donne 92 r; d'acylase solide ayant une activité de 920 U/g. g) Une solution limpide d'acylase (lkg, activité 52 U/ml) selon l'exemple 2d est dialyse pendant C heures contre de l'eau courante du robinet. La solution dialysée est lyophilise ce oui donne 20,5g d'acylase solide , d'activité de 2400 U/g. h) Une solution d'acylase limpide (245 kg, activité 48 U/g) obtenue selon exemple 2c, est agitée et ajustée à pK = 4,5 au moyen d'aci de acétique 9 M (2,2 kg). On poursuit l'agitation pendant 1 heure et ensuite on filtre le mélange; la solution limpide est ajustée à pH = 8,0 avec de l'ammoniaque 7 M (h,5 kg) durant l'agitation. Après 1 heure, le mélange est filtré et la solution est ajustée à pH = 5 au moyen d'acide acétique 9 W (2,0 kg). L'activité de la solution (220 k) est de 47,5 U/g. i) Le liquide surnageant (500 g, activité 52 U/g ) obtenu comme dans l'exemple 2 d, est ajusté à pH=4 et agité pendant 15 minutes à OOC de façon à précipiter les impuretés protéiques. Après centrifugation et ajustement du pH à 7,5, la solution limpide obtenue (500 g, activite 40 U/g) est dialysée contre de l'eau du robinet pendant une nuit et séchée par évaporation de la glace pour donner 4 g ayant une activité de 4,900 Utg. j) La pâte bactérienne homogénéisée (lkg, activité 128 U/g) est centrifugée à 13.200 G (Serwell, Type RC-2, Centrifugeuse réfrigérée automatique super-rapide) pendant 30 minutes à OOC. Le liquide surnageant (500 g, activité 80 U/g) est décanté , clarifié par filtration et utilisé tel quel pour la fragmentation enzymatique de la pénicilline pour produire l'acide amino-6-pénicillique. Exemple 3 : Préparation de l'acylase avec le tannin. La solution d'acylase fractionnée en pH selon l'exemple 2 h) (185 kg, activité 47,5 U/g) est agitée et traitée avec l'acide éthylènediaminetétraacétique (50 g) puis par une solution de tannin (166 g) et de sulfite de sodium (55 g) dans liteau (5,5 1). Après agitation pendant 1 heure, on ajoute de la Celite 505 (1,5 kg) et du sulfite de sodium (700 g) et la suspension est filtrée ce qui conduit à 3,950 g de précipité mouillé de solide tannin-acylase avec une activité de 1930 U/g. Exemple 4- Récupération de l'acylase à partir du précipité de tannin. a) Le précipité mouillé tannin-acylase selon l'exemple 3 (30,4 g, activité 1930 U/g) est traité avec de l'acétone froide (30 ml, -10 C à -300C) qu'on ajoute lentement avec agitation. Après que le précipité se soit pratiquement dissolus, on ajoute en une seule fois une quantité supplémentaire d'acétone froide (200 ml) et le mélange est filtré. Le solide est lavé à l'acétone froide et séché à l'air à la température ambiante pendant une nuit. On obtient 15,4 g, et une activité de 3650 U/g. b) Le précipité mouillé tannin-acylase (3750 g, activité 1930 U/g) selon l'exemple 3 est mis en suspension dans de l'acétate d'ammonium 0,1 molaire, à pH = 5,0 (5,0 1) et du butanol (2,5 1). On ajoute du sulfite de sodium (50 g) et on ajuste le pH à 5,0 au moyen d'acide acétique. On poursuit l'agitation pendant 20 minutes et on filtre le mélange. On sépare la phase aqueuse (6,650 ml, activité 800 U/ml). c) La solution d'acylase (lOOOml ,activité 48 U/ml), fractionnée en pH comme dans l'exemple 2 h, est traitée avec du tannin suivant l'exemple 3. On filtre le précipité tannin-acylase et on le met en suspension avec agitation dans du tampon acétate d'ammonium 0,1 M > a pH = 8,0 (100 ml). On poursuit l'agitation pendant 1 heure et le pH est contrôlé et ajusté à 8,0. On filtre le mélange, ce qui donne 100 ml d'une solution d'acylase contenant 220 U/ml. d) Le précipité mouillé tannin-acylase en suspension dans une solution tampon, pH = 8, (100 ml). comme dans l'exemple 4 c, est traité avec la DEAE-cellulose (2 g, capacité 1,0 meq./g). On alite le mélange pendant 15 minutes et on le filtre ce qui donne une solution d'acyase (9Oml) contenant 494 U/ml. e) Le précipité mouillé tannin-acylase (36,6g, activité 1250 U/g) obtenu comme dans l'exemple 3, est mis en suspension dans du tampon acétate d'ammonium 0,2M, pH = 8 (150 ml) et ajusté à pH = 8,0. Après agitation pendant 10 minutes, on ajoute du butanol (60 ml) puis de l'acide acétique 9 M à pH = 5,0. On poursuit l'agitation pendant 10 minutes et on filtre le mélange. On sépare la couche aqueuse (166 ml, activité) 140 U/ml). Exemple 5 - Lyophilisation du précipité tannin-acylase Le précipité humide tannin-acylase (86,1 g, activité 1600 U/g) obtenu comme dans l'exemple 3 est refroidi à -300C et séché sous vide à 250C et sous 0,1 - 0,2 Torr. On obtient 28,5 g d'un produit sec avec une activité de 2,340 U/g. Exemple 6 - Isolement de l'enzyme par séchage a) séchage par pulvérisation. La solution limpide d'acylase obtenue comme dans l'exemple 2h (51, activité 47,5 U/ml) est séchée par pulvérisation à une température d'air de 110 - 1150C à l'intérieur, et de 70 - 750C à l'ex- térieur, durant une période de 1 heure. quantité obtenue 85 g, activité 380 U/g. b) séchage par flottation. On mélange de la poudre de cellulose (îOÔg) avec la solution d'acylase selon l'exemple 4b)(200 g, activité 162 U/g). Le mélange résultant est séché par flottation dans un courant d'air à 40 C pendant 90 mn. On récupère 93 2 g d'une poudre blanche qui a une activité de 284 U/g. Exemple 7 - Purification de l'acylase active par chromatographie d'échange d'ions a- La solution d'acylase ( 5000 ml, activité 48 U/ml), obtenue comme dans l'exemple 2c, est ajustée à pN = 4,6 au moyen d'acide acétique 9 i. Après avoir été laissé au froid pendant la nuit, le mélange est filtré et la solution limpide e est introduite dans une colonne échangeuse d'io (Séphadex C 50R sulfoéthyle, diamètre 8 cm, longueur 15 cm, dans l'acétate d'ammonium 0,1 Il à pH = 4,6). Cn lave la colonne avec le tampon acétate d'ammonium, pH = 4,6 (650ml) L'acylase est éluée avec le tampon acétate d'ammonium 0,2 M à pH = 8,0. On obtient 640 ml avec une activité de 326 U/ml. b) Une solution purifiée d'acylase 5,550 ml, activité 800-U/ml) obtenue selon l'exemple 4b, est ajustée à pH = 4,6 et traitée de la même façon que dans l'exemple 7a. On obtient 2350 nil avec une activité de 1610 U/ml. c) La solution d'acylase, purifiée sur Séphadex - SE comme c'est décrit dans l'exemple 7b(250 ml, activité 1610 U/ml) est refroidie à - 40 C et séchée sous vide à 0,1 - 0,2 torr à une température de 250 C. On obtient 2,11 g d'acylase purifiée avec une activité de (190 000 U/g. d) La solution d'acylase , purifiée comme dans exemple 7b (230 ml, activité 1610 U/ml) est concentrée par évaporation sous vide à un volume de 24 ml. 15 nil de la partie concentrée, activité 15 000 U/ml, est mise dans une colonne de Sephadex G75R (diamètre 2,5 cm, longueur 100 cm). L'acylase est éluée avec de l'eau déio- nisée. On obtient 108 ml d'acylase, d'activité 1710 U/ml. La des- siccation par évaporation de la glace de cette solution donne 1,8g avec une activité de 92 500 U/g. e) La préparation d'acylase (72 mg) obtenue à partir de la colonne de Sephadex G:50 sulfoethyle selon l'exemple 7a et séchée par évaporation de la glace est dissoute dans un tampon phosphate ae sodium 0,005: à pH = 6,30 (2,7 ml) et dialysée contre le même tampon et ensuite introduite dans une colonne contenant de la carboxymé- thylcellulose (Whatman CM-32, faible capacité 1 meq/lg; longueur de- la colonne 13,5 cm, diamètre 0,9 cm) préalablement équilibrée avec le tampon. On élue la colonne avec les tampons suivants tampon phosphate de Ma 0,005 M pH =6,30 (environ 17 ml) tampon phosphate de Na 0,02 M pH =6,35 (environ 17 ml) et tampon phosphate de Na pH = 6,35. On recueille des fractions de 1,3 ml et on mesure l'extinction à 280 m/u. On élue l'activité totale de l'enzyme avec le tampon 0,1 M et elle contient seulement 10% de la teneur initiale en protéine. On trouve environ 90% de l'extinction totale comme protéine inactive dans les fractions contenant le tampon 0,005M- f Une solution obtenue selon l'exemple 2 h(100 ml) est dialysée contre de l'eau distillée et ensuite contre du tampon phosphate 0,005 K à pH = 6,0 pendant 24,5 heures. On ajoute de la diéthylaminoéthyl cellulose (12,5 mg/ml) (Whatman DE - 32, de faible capacité 1,0 meq/g) équilibrée avec le tampon ci-dessus mentionné. La cellulose échangeuse d'ions est séparée après 30 minutes. On n'observe aucune diminution de l'activité de l'acylase mais l'ex- tinction à 280 m/u est seulement 10% de la valeur précédente. L'enzyme actif est ensuite adsorbé par la- carboxyméthylcellulose (whatman CM-32), traité avec HCl et lavé ou équilibré avec de l'acétate de sodium 0,005 M à pH = 5,5. Dans les deux cas on a utilisé deux quantités différentes d'échangeur d'ion, à savoir res pectivement 12,5 mg et 3,2 mg/ml. Après séparation de l'échangeur d'ion, l'enzyme actif est élué après dispersion de l'échangeur d'ion dans l'eau par augmentation du pH jusqu'à 6 - 7 et de la force ionique, par addition du tampon phosphate 0,1 M. Le rendement est d'environ 80%. g) Une solution obtenue selon l'exemple 2 h (100 ml) est dialysé contre de l'eau distillée et ensuite contre du tampon phosphate 0,005 M à pH = 6,0 pendant 22 heures. On traite deux fois la solution avec de la diéthylaminoéthyl cellulose (Whatman DE - 32) (12,4 mg/ml) équilibrée avec le tampon ci-dessus mentionné. La solution est ensuite traitée avec le même échangeur d'ion (13 mg/ml) sous forme OE sans perte d'activité de l'acylase. L'échangeur d'ion est sépar 30 minutes après l'addition. Après la dernière addition, le pH augmente jusqu'à 8,31. L'enzyme est ensuite adsor b coflplètement après addition de l'échangeur d'ion sous forme CH (50 mg/ml) . Le pE est de- 9,11. Après séparation de l'échangeur d'ion es dispersion de celui-ci dans l'eau, l'enzyme est élue en ajustant le pH à environ 6. Le rendement est supérieur à 60, et la pureté de l'enzyme mesurée comme le rapport de l'activité à l'extinction à 280 m/u est augmentée20 fois. h) Une solution obtenue selon l'exemple 2c (100 ml) est partiellement désalée par dialyse avec de l'eau distillée pendant une heure et ensuite traitée avec la carboxyméthylcellulose sous forme (Whatman CH - 32, de faible capacité ionique = 1 meq/g) (environ 40 mg/ml . L'échangeur d'ion est séparé et l'acylase adsorbée est éluée par augmentation du pH à environ 6 et de la force ionique par addition de tampon phosphate. i) Le procédé suivant l'exemple 7h est répété mais on utilise comme produit de départ une solution obtenue selon exemple 2h. j) Une solution (100 ml) obtenue selon l'exemple 2c est partiellement désalée et déprotéinisée par traitement avec environ 25 mg/ml de carboxyméthyl cellulose (Whatman CM-32) sous forme H4 et ensuite avec la même quantité de diéthylaminoéthvlcellulose (Whatman DE32) sous forme OH . On contrôle le pH pour le maintenir entre 5 et 7. (On peut répéter le traitement mais il faut le stopper avant que des quantités importantes d'acylase soient absorbées). L'enzyme est ensuite adsorbé par la carboxyméthylcellulose et élué comme dans exemple 7h. k) Une solution obtenue selon l'exemple 2c (100 ml) ou 2h est traitée comme dans l'exemple 7j, sauf qu'on n'utilise pas de diéthylaminoéthylcellulose. Exemple 8 - Concentration et purification de l'acylase active par ultrafiltration. Une solution obtenue selon l'exemple 2c (10 ml) et partiellement désalée et déproténéisée par traitement avec un échangeur d'ion comme c'est décrit dans l'exemple 7 j, mais en omettant la dernière étape comprenant l'adsorption par la carboxyméthylcellulose, est diluée avec de l'eau distillée (40 ml) et filtrée sous pression à travers une membrane qui retient totalement les molécules oyant une masse moléculaire supérieure à 50 000 (membrane Diaflo de Aminco Corporation, Cambridge, Mass.USA). La partie concentrée (2 ml) contenant la majeure partie de l'acylase est desséchée par évaporation de la glace. Exemple 9 - Précipitation de l'acylase active au moyen de sulfate d'ammonium. a) A une solution purifiée d'acylase cotenue comme dans l'exemple 4b, (1000 ml , activité 358 U/ml), on ajoute du sulfate d'ammonium (570 g). Le mélange est agité jusqu'à dissolution du sel. Après l'avoir abandonné à 50C. pendant 2 h. le précipité formé est filtré. On obtient 52,5 g de composé humide ayant une activité de 5 610 U/g. b) Le composé humide obtenu comme dans l'exemple 9a (47,0 g, activité 5160 U/g) est séché à l'air à 250C. pendant une nuit. On obtient 19,85 g, d'activité 7580 Ulgi Exemple 10 - Purification de l'acylase active par dialyse La solution d'acylase (11 ml, activité 48 U/ml) obtenue selon l'exemple 2c est dialysée contre de l'eau déionisée pendant une nuit. La solution dialysée est lyophilisée comme dans l'exemple 5. On obtient 0,06 g d'une activité de 8000 U/g. Exemple 11 - Purification de l'acylase active par filtration sur uel. Une solution d'acylase, obtenue suivant l'exemple 4b (150g, activité 166 U/g) est concentrée par évaporation sous vide jusqu'à un volume de 9 ml, soumise à la filtration sur gel sur une colonne de Séphadex G75R de 3x80 cm et éluée avec de l'eau déionisée. L'activité (21200 U) est récupérée dans 80 ml contenant 15,2% du produit introduit, mesurée sur la base de l'adsorption à 280 m/u. Exemple 12 - Combinaison de 1'acylase de E.coli avec des polymères a) Une solution d'agarose (Sépharose 4B, 4%, 2,5 ml) est filtrée, et le solide humide isolé est agité pendant 8 minutes à pH = 11,5- 12,0 dans une solution aqueuse glacée de bromure de cyanogène (5%, 2 ml). On récupère le gel solide par filtration et on le lave bien sur le filtre avec de l'eau glacée et du borax 0,18 glacé. On le met ensuite en suspension dans le borax 0,1 M (4 ml) et on l'agite avec l'acylase de E.coli (activité 159 000 U/g; 0,106g) obtenue selon l'exemple 7d, pendant 24 h. à +40 c. Le mélange est filtré et le produit solide récupéré est lavé complètement sur le filtre avec de l'eau pour donner 1,2 g de polymère humide qui a une activité spécifique de 679 U/g. b) Le sphadex G25R (0,100g) est agité pendant 8 heures à pH=11,5- 12 avec du bromure de cyanogène aqueux glacé (5% 2 ml) et filtré. Le gel récupéré est bien lavé avec de l'eau glacée et du Borax 0,1 glacé (4 ml). L'acylase de E.coli (activité 159 000 U/g; 0,106g) obtenue selon l'exemple 7d, est ajoutée et le mélange est agité pendant 24 h à +40 c. Ensuite on ajuste le mélange à pH = 7,5 et on filtre. Le produit solide est bien lavé sur le filtre avec de l'eau pour donner 0,3 g de polymère d'activité spécifique 212 U/g. c) On répète l'expérience b avec du DEAE-Sephadex A50R (O,lg) au lieu de Sephadex G2 R On obtient 1,25 g de polymère humide, d'activité spécifique de 435 U/g. d) On répète l'expérience b en remplaçant le Séphadex G25R par de la poudre de cellulose (Macherey, magel et Cie, MN-300; 0,1g). On obtient 0,35 b de polymère, d'activité spécifique 261 U/g. Exemple 13 - Production de l'acide amino-6-pénicillique A une solution d'enzyme (283 -, activité 42 U/g), on ajoute une solution de benzyl-pénicilline (20g) sous forme de sel de po- tassium dans l'eau (317 ml). Le mélange est mis en incubation à 370C et le pH est maintenu à 7,Z par addition périodique de soude 2,5 N. Après 6 heures, le mélange réactionnel contient 10,7 g d'acide amino-6-Pénicillique (92%) et on le filtre. On ajuste le pE de la solution à 3 avec de l'acide chlorhydrique 5 X et on extrait avec un demi volume de méthylisobutylcétone pour enlever la benzylpénicilline résiduelle et la chaîne latérale d'acide phenylacétique, qui est éliminée durant la formation de l'acide amino-6-pénicillique. Après l'extraction, la solution aqueuse est séparée de la méthylisobutylcétone. On ajuste le pH de la solution aqueuse à 7,5 et on réduit le volume à 120 nil sous vide. La solution concentrée est refroidie à 50C et filtrée.Quand la solution filtrée est acidifiée à pH = 4,3 avec l'acide chlorhydrique 5 N, l'acide amino-6pénicillique cristallin précipite. Après filtration, les cristaux sont lavés avec un peu d'eau froide puis de l'acétone sèche et séchés sous vide pour donner 8,84g d'acide amino-6-pénicillique. La pureté du produit est de 85% et le rendement total calculé d'après la benzyl-pénicilline est de 72%. Exemple 14- Préparation de l'acide amino-6-pénieilique a) A une solution d'enzyme (375g , activité 33 > 8 U/g) obtenue comme dans l'exemple 2c, on ajoute de la benzylpénicilline sous forme de sel de potassium (21g) dissous dans l'eau (325 ml). La solution est mise en incubation à 37 C et le PH est maintenu à 7,8 par addition périosique de soude 2,5N. Après 6 heures, la solution est refroidie à 100C et extraite pH=2 avec de la méthylcétone (200 ml) pour éliminer la benzylpénicilline résiduelle et la chaîne latérale d'acide phényl acétique, qui est éliminée durant la formation de l'acide aminc-é-pénicillique, près extraction, la solution aqueuse est séparée de la méthylisobutylcétone. Le pH de ia solution aqueuse est ajusté à pH=7,5 et le volume est réduit à 113 ml sous vide. La solution concentrée est refroidie à 5 C et filtrée, Quand la solution filtrée est acididfiée à pH=4,3 avec l'acide chlorhydrique 5N, l'acide amino-6-pénicillique précipite. Après filtration, les cristaux sont lavés deux fois avec de l'eau froide (5 ml) puis avec de l'acétone sèche (deux fois avec 5 ml) et séchés sous vide pour donner 8,51g d'acide amino-6pénicillique. La pureté du produit est de 99% et le rendement total calculé d'après la benzylpénicilline est de 69% D'une façon analogue, on prépare l'acide amino-6-pénicillique en utilisant une préparation d'enzyme préparée selon les exemples précédents.Le rendement et la pureté de l'acide obtenu sont donnés dans le tableau I suivant.(pages suivantes) Exemple 15 - Préparation de l'ester p-nitrobenzyle de l'acide amino-5-pénicillique Une solution d'enzyme (1E,6 g , activité 1610 U/) obtenue comme dans l'exemple 7 b est diluée avec de l'eau (700 ml) et du méthanol (120 ml) et ajusté à pH = 7,8 par addition de soude 0,1 molaire. On ajoute une solution de benzylpénicillate de p-nitrobenzyle (3,1 g, 6,6 moles) dans le méthanol (60 ml). Le mélange est agité à 37 C et maintenu à pH = 7,8 par addition de soude 0,1 molaire. Après 2 heures, le mélange est refroidi et extrait avec de l'acétate d'thle (50C ml). La couche acide est préparée et extraite avec une portion supplémentaire d'acétate d'éthyle (250ml) Les couches organique s sont rassemblées et séchées avec du sulfate de sodium anhydre pendant 1 heure.Après filtration, on sépare la solution organique en 2 parties égales. L'une est concentrée sous vide à la température ambiante pour donner l'ester p-nitrobenzyle exempt d'acide amino-6-pénicillique sous forme d'un résidu huileux (1,1 g). On trouve que le produit contient dans son spectre I.R. des bandes à 3250, 1756 et 1720 cm ce qui indique la présence respective d'un groupe NH2, d'un cycle bêta-lactame et d'un groupe ester. On ajoute de l'acide benzènesulfonique (0,58 ) dissous dans l'acétone (20 ml) à l'autre partie de la solution d'acétate d'éthyle oui est ensuite concentrée sous vide à un volume d'environ 30 ml. Par addition d'éther (10 ml) et en laissant reposer pendant une nuit à la glacière l'acide benzènsulfonique, le sel d'amino-6- pénicillate de p-nitrobenzyl (3,8 g) se dépose sous forme de cristaux blancs, qui a un point de fusion de 148 - 151 C. Exemple 16 - Préparation de l'acide (D-alpha-azido-phénylacétamido) -6-pénicillique A une solution d'enzyme (283 g, activité 42 U/g) on ajoute une solution de benzylpénicilline (20 g) sous forme de sel de potassium dans l'eau (317 ml). Le mélange est mis en incubation à 37 C et le pH est maintenu à 7,8 par addition périodique de soude 2,5 N. Après 6 heures, le mélange réactionnel contient 10,7g d'acide amino-6-pénicillique (92%) et il est filtré. La solution est refroidie à 5 C et acififiée à pH = 3,0 avec de l'acide sulfurique 10 N. La méthylisobutylcétone (300 ml) contenant du chlorure de D-alpha-azidophénylacétyle (62 m) est ajoutée durant l'agitation. On poursuit l'agitation pendant 30 minutes et on maintient le pH à 3,0 par addition périodique de soude 2,5 IT. Le mélange réactionnel est filtré sur de la Célite 505 (10 g) et la méthylisobutylcétone est séparée de la phase aqueuse. La solution de méthylisobutylcétone est séchée sur du sulfate de sodium anhydre (25 g) . Après filtration l'acide (D-alpha- azidophénylacétamido)-6-pénicillique est précipité sous forme de sel de sodium par addition de 41 ml d'une solution 2N du sel de sodium de l'acide éthyl-2-caproîque dans la méthylisobutylcétone. Le sel de sodium de l'acide (D-alpha-azido-phénylacétamido)- 6-pénicillique est filtré. Les cristaux sont lavés avec 50 ml de méthylisobutylcétone et séchés sous vide à 500C pour donner une quantité de 16,5g. La pureté du produit est de 96% et le rendement total calculé sur la benzyl-pénicilline est de 75%. D'une façon analogue, le sel de sodium de l'acide (D-alphaazido-phénylacétamido)-6-pénicillique est préparé en utilisant d'autres préparations d'enzyme préparées selon les précédents exemples. Le rendement et la pureté de la pénicilline sont donnés dans le tableau II suivant. Tableau I Enzyme Acide amino-6-pénicillique Exemple Benzylpénicilline préparé masse activité rendement pureté rendement* sel de potassium comme dans g U/g g % % g l'exemple 14 b 21 3 6,5 1600 10,1 98,2 82 14 c 21 4a 4,2 2920 9,8 96,0 78 14 d 500 4b 450 800 261,3 98,5 89 14 e 21 5 5,4 2340 7,55 97,0 60 14 f 21 7a 145 87 9,9 100 81 14 g 2100 7b 780 1610 1064 100 88 14 h 21 7c 0,1 128000 9,3 98,0 75 14 i 21 7d 0,11 116500 10,35 100 85 14 j 21 9b 5,4 2400 9,1 100 75 14 k 21 10 2,4 6000 8,82 100 72 14 l 21 9a 0,9 14000 9,23 100 76 * corrigé pour la pureté Tableau II Enzyme Acide (D-alpha-azido-phényl-acétamido)-pénicilliq@ Exemple Benzylpénicilline Préparé comme quantité activité rendement pureté rdt. * sel de potassium dans l'exemple g U/g g % % g 16b 21 3 6,3 1600 18,9 95,8 81 16c 21 4a 4,2 2920 18,0 94,0 76 16d 21 5 5,4 2340 16,2 89,7 65 16e 21 7a 145 87 20,4 95,8 87 16f 21 7b 6 1890 19,7 96,6 86 16g 21 7c 0,1 128000 18,5 96,0 79 16h 21 9b 5,4 2400 20,5 92,7 85 16i 21 10 2,4 6000 18,5 95,5 79 16j 21 9a 0,9 14000 20,0 91,4 82 # corrigé pour la pureté. Exemple 17 - Synthèse enzymatique de la benzylpénicilline On dissout le 6-APA (175 mg) et l'acide phénylacétique (111 mg) dans le tampon phosphate de potassium (10 ml) à pH = 7,0. L'acylase préparée comme dans l'exemple 7c (3,6 mg, activité 128000 U/g) est dissoute dans l'eau (5 ml) et ajoutée à la premisère solution prépare. Le pH est ajusté à 5,0 avec P04H31 M et la solution est mise en incubation à 37aC. Le pH est maintenu à 5,0 et après 4 heures, la solution est refroidie et analysée par chroma togràphie sur papier. 30 de 6-APA est converti en benzylpénicil- line. Exemple 18 - Essais antigéniques. niéthode : L'anaphylaxie cutanée passive chez les cochons d'Inde essentiellement selon de Weck et collaborateurs, Int. Arch. Aller gy 33 (1968) 335-567-L'antisérw de 6-APA de lapin est produit par injections scus-cut2nées répétées de 6-APA brut en plus des injections par la même voie d'un produit de fixation d'un échantillon dialysé de 6-APA.Dans les essais d'hemiagglutination passive, cet antisérum présente un titre de 1/8096. On injecte 1 ml de cet antisérum de 6-APA par voie intraveineuse dans un cochon d'IAde blanc. Vingt quatre heures plus tard, 0,1 ml d'une solution saline à 5% de bleu d'Evans est administré par voie intraveineuse, suivie une heure plus tard par l'administration intradermique de 0,1 ml contenant 4 mg de 5-APA préparé selon les exemples 14d, 14g et 14i respectivement. Sur une quatrième position sur le dos de l'animal on donne de la meme façon un échantillon de 6-APA préparé de façon classique en utilisant des cellules de E-coli. Les échantillons de 6-APA sont injectés immédiatement après leur dissolution. A titre de contrôle, on injecte par voie intradermique O,lml de purgatif normal. On répète la même opération sur un second cochon d'Inde, sauf qu'on remplace l'antisérum de 6-APA par 1 mi de la solution purgative administrée par voie intraveineuse. Deux heures après les injections intradermiques, l'éten- due du bleuissement aux endroits d'injection est déterminée et on l'exprime comme le produit de 2 diamètres perpendiculaires. Résultats Chez les deux./animaux , celui insensibilisé et celui passivement sensibilisé, tous les échantillons de 6-APA provoquent l'éta- lement du colorant qui est plus prononcé qu'à l'endroit de l'injection de purgatif. Cependant, comme le montre le tableau 3, ltéchantillon classique de. 6-APA provoque une réaction plus forte chez l'animal sensibilisé. La même chose, bien qutà un bien moindre degré, est obtenue paur le 6-APA obtenu selon l'invention. Tableau 3 Produit de deux diamètres perpendiculaires ( m2) des taches bleues provoquées par l'injection intradermique de 4 mg des composés indiqués. 6-APA selon Animal Animal Différence l'exemple N sensibilisé non sensibilisé Préparé par utilisation de cellules de E.coli 256 110 146 14d 132 120 22 a4g 195 169 26 14i 156 169 13 Solution saline 12 12 Les résultats montrent qu'un échantillon de 6-APA, préparé par des méthodes classiques, diffère des autres échantillons de 6-APA en ce qui concerne l'aptitude à mettre en lumière la réaction anaphylaxique cutanée passive. Ceci est une expression de l'antige- nicité réduite dans 6-APA selon la présente invention, comparé à 6-APA préparé par des méthodes classiques, en utilisant la totalité des cellules de E-coli. REVENDICATIONS 1 - Un procédé pour la production d'une acylase de pénicilline exempte de cellules. qui comprend - la fermentation d'une souche de Escherichia coli produiun tel enzyme, - la séparation de l'enzyme intracellulaire, à des températures contrôlées allant de 0 C à 500 C > à partir du liquide de culture du microorganisme par expulsion rapide du produit cellulaire à travers une fente ou un orifice, à partir d'une pression d'au moins 35 kg/cm2, mais ne dépassant pas la pression pour laquelle une destruction excessive de la cellule se produit. - l'agitation du produit cellulaire expulsé dans I'eau, de 10 à 500C pendant 0,10 à 5,0 heures pour dissoudre enzyme, - et ensuite, l'extraction de l'enzyme du produit cellulaire inactif en solution aqueuse. 2 - Un procédé, selon la revendication I, dans lequel la 2 pression appliquée est de 35 à 140 kg/cm 3- Un procédé selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel le produit cellulaire est expulsé entre 0,05 et 1,0 seconde. 4 - Un procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le produit cellulaire est expulsé à travers une fente périphérique ou un orifice d'une largeur de 0,1 à 1,5 mm. 5- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la séparation du liquide cellulaire et du produit cellulaire est réalisée en tuant le microorganisme cellulaire par saturation suffisante du bouillon de culture avec un solvant organique possedant une faible solubilité dans l'eau et choisi dans le groupe composé d'acétate de butyle, d'acétate dtisobutyle et d'acétate d'amyle. 6 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la dissolution de l'enzyme est effectuée en agitant le produit cellulaire expulsé dans I'eau, avec addition d'un solvant organique non miscible à l'eau et choisi dans le groupe composé de méthylisobutylcétone, d'acétate de butyle, d'acétate d'isobustyle, d'acétate d'amyle, de benzène, de toluène et de chloroforme. 7 - Un procédé s-elon la revendication 6 dans lequel la concentration du solvant organique non miscible à l'eau est de 1 à 5%. 8 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 7 dans lequel l'arrachement de l'enzyme dissous du produit cellulaire inactif en solution aqueuse est facilité par l'addition d'une base minérale, choisie dans le groupe de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque. 9 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'arrachement de l'enzyme dissous du produit cellulaire inactif en solution aqueuse est facilité par l'addition d'une base organique tertiaire choisie dans le groupe composé de triéthylamine et de N-éthylpipéridine. 10 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel l'enzyme extrait est purifié en acidifiant la solution aqueuse de l'enzyme et le produit cellulaire inactif à un pH compris entre 3,0 et 6,0 et en éliminant le produit cellulaire inactif précipité par filtration avec réajustement ultérieur du pH à sa valeur initiale. 11.- Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel l'enzyme extrait est précipité de la solution aqueuse se de cellule libre à pH 4 à 6 avec du tannin en présence d'agents de chélation qui forment des complexes avec les ions fer et le complexe enzyme-tannin formé est isolé par filtration ou centrifugation. 12.- Un procédé selon la revendication Il dans lequel l'a. cylase de pénicilline contenue dans le précipité de tannin est libérée en solution aqueuse par dissolution du complexe isolé dans l'eau à un pH compris entre 7 et 9 inclusivement. 13 - Un procédé selon la revendication 11, dans lequel l'a cylase de pénicilline contenue dans le précipité de tannin est libérée en solution aqueuse par dissolution du complexe isolé dans un mélange d'eau et de n-butanol a' pH 4 à 7. 14 - Un procédé selon la revendication 11, dans lequel l'acylase de pénicilline contenue dans le précipité de tannin est libérée en mettant en contact le complexe isolé en suspension dans l'eau avec la DEBE - Cellulose, qui fixe le tannin. 15 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel l'enzyme extrait est concentré et purifié en faisant passer une solution de l'enzyme, ajustée à pH 3,5 à 6, à travers une colonne d'un échangeur d'ion cationique à structure non serrée ou en ajoutant l'échangeur à la solution d'enzyme agitée après quoi l'acylase est libérée de l'échangeur d'ion par solution entre pH = 6,0 et 8,0 avec des solutions de tampon faible choisi dans la ciasse composèe d'acétate d'ammonium 0,2M et d'acétate de trinydroxyméthylammonium. 16 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel les ions minéraux et les impuretés de faible masse moléculaire sot éliminés de la solution d'enzyme par dialyse contre de l'eau. 17 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel les ions mineraux et les impuretés de faible masse molécyulaire sont limins de la solution d'enzyme par évaporation de la solution, à une température inférieure à 500C, jusqu'à une concentration de 25 à 100 mg de poids sec par ml et après on la soumet à une filtration sur gel. 18 - Un procédé, selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel l'enzyme purifié est modifié chimiquement par réaction avec une substance polymérique active. 19- n Un procédé selon la revendication 17 > dans lequel la substance polyurique active est un polysaccharide traité avec du bromure de cya.nogène. 2D - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 19 dans lequel l'isolement de l'enzyme purifié a l'état solide est réalisé par dessiccation par évaporation de la glace de la solution d'enzyme, à une température comprise entre 10 et + 50 C. 21 - Un procédé suivant l'une des revendications 1 à 19 dans lequel l'isolement de l'enzyme purifié à l'état solide est réalisé par séchage par flottation de la solution d'enzyme dans un courant d'air entre 10 et 55 C. 22 ) Une solution aqueuse d'acylase de pénicilline exempte de cellules faite par le procédé de l'une des revendications 1 à 19 et servant à éliminer les chaînes latérales de pénicilline naturelle et les chaînes latérales d'ester pénicilliques. 23- Un procédé pour la production d'acide amino-6-pénicillique comprenant la dégradation enzymatique d'une pénicilline naturelle par une solution aqueuse d'une acylase de pénicilline exempte de cellules préparée selon l'une des revendications 1 à 21. 24 - Un procédé selon la revendication 22 dans lequel la pénicilline naturelle est la benzyl-pénicilline, 25- - Un procédé pour ia production d'esters de l'acide ami no-6-pénicillique comprenant la dégradation enzymatique d'un ester de la pénicilline par une solution aqueuse d'acylase de pénicilline exempte de cellules préparée selon l'une des revendications 1 à 21. 26 - Un procédé selon la revendication 25 dans lequel l'es- ter pénicillique est le vbenzypénicillate de ptnitrobenzyle. 27 - Un procédé pour la synthèse enzymatique de pénicillines comprenant la réaction entre l'acide amino-6-pénicillique et un précurseur à chaîne latérale en solution aqueuse d'une acylase de pénicilline exempte de cellules préparée selon l'une des revendications 1 à 21. 28 - Un procédé pour la production de pénicillines hypoallergisantes comprenant l'acylation de l'acide amino-6-pénicillique préparé par dégradation enzymatique d'une pénicilline naturelle par une solution aqueuse d'une acylase de pénicilline exempte de cellules préparée selon l'une des revendications 1 à 21. 29 - Un procédé selon la revendication 27 dans lequel on prépare 1 'alpha-phénoxyéthylpénicilline hypo-allergisante. 30 - Un procédé suivant la revendication 28, dans lequel on prépare l'alpha-phénoxypropylpénicilline hypo-allergisante. 31 - Un procédé suivant la revendication 28, dans lequel on prépare la diméthoxy-2,6-phénylpénicilline hypo-allergisante. 32 - Un procédé suivant la revendication 28, dans lequel on prépare 1' (o- chlorophényl)-3-méthy1-5-isoxazoly1-4-pénicilli- ne hypo-allergisante. 33 - Un procédé selon la revendication 28, dans lequel on prépare l'alpha-carbonylbenzylpénicilline hypotallergisante 39 - Un procédé suivant la revendication 28, dans lequel on prépare l'alpha-azidobenzyl-pénicilline hypo-allergisante. 35 - Un procédé suivant la revendication 28 dans lequel on prépare 1' alpha-aminobenzylpénicilline hypo-allergisante. 36- - Un procédé suivant l'une des revendications 27 et 28, dans lequel on prépare la benzylpénicilline hypo-allergisante.