FR 2035796 A1 19701224 FR 6906962 A 19690312 L'antibiotique coumermycine (précédemment dénommé sugordomycine) est produit par cultivation de Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis nov. sp., un organisme isolé d'un échantillon de sol prélevé à Matane, Gaspé, Canada. Un specimen de la culture a été déposé dans la collection de microorganismes du Département de l'Agriculture des Etats-Unis, Northern Utilrxation Research and Development Division, Peoria, Illincis, sous le No. NRRL 2938. Le procédé pour la préparation de cet antibiotique, comme décrit en détail dans le brevet belge No. 665'237, donne un complexe brut de composés antibiotiques. De ce complexe, on peut isoler au moins 5 composants actifs. Des composants actifs, celui dénommé "coumermycine A1" est le plus actif. Afin de produire la "coumermycine A1 de manière aussi efficace que possible, à partir du complexe brut, il est avantageux de séparer le complexe des bouillons et cellules de fermentation, ceci avec un rendement et une pureté optimum. Différentes méthodes ont été utilisées jusqu a ce jour pour tâcher de séparer le complexe brut des cellules et bouillon de fermentat ion. Dans l'une des ces méthodes, le bouillon de fermentation est filtré à un pH de 8,0, le filtrat est ajusté à un pu de 6,0 et extrait avec de la méthyl-isobutyl-cétone. La pâte mycélialeest extraite avec l'acétone, après quoi on évapore 11 extrait afin d'éliminer le solvant. Le concentré obtenu est extrait avec de la méthylisobutyl-cétone à un pH de 6,0. Les extraits sont combinés et lavés avec de l'eau.L'extrait aqueux contenant le complexe antibiotique est transféré dans de l'eau à un pH de 10,0, réextrait dans de l'acétate d'éthyle à un pH de 6,0, concentré et précipité avec de l'éther de pétrole Dans une seconde méthode,-le complexe brut est extrait du bouillon de fermentation à un pH de 6,0 avec un solvant immiscible à l'eau, réextrait dans de l'eau à un pH de 10,0, puis réextrait dans de l'acétate d'éthyle ou de la méthyl-isobutyl-cétone à un pH de 6,0. L'extrait est concentré et précipité avec de ltéther de pétrole. Dans une troisième méthode, le complexe peut etre isolé par deux extractions du gâteau mycélial avec un mélange acétone-dioxane, après ajustage au préalable du pH du bouillon à 5,0, puis filtration. Les extraits sont ccncentrés et extraits avec de l'acétate d'éthyle ou de la méthyl-isobutyl-cétone à un pH de 6,0. Le complexe est alors réextrait dans de l'eau à un pH de 9,0, puis réextrait avec de l'sooooe d'éthyle à un pH de 6,0, concentré et précipité. Dans une quatrième méthode, le complexe brut est extrait avec du l-butanol à partir de cellules obtenues au préalable par filtration du bouillon de fermentation à un pH de 4,0-4,5. Le pH de l'extrait est ajusté à 6-7 avec de la soude caustique, puis les sels monosodiquesdu complexe sont précipités de la solution obtenue au moyen d'éther de pétrole. Dans un autre procédé, le bouillon de fermentation est extrait avec un solvant immiscible à 11 eau à un pH de 1-7, après quoi le complexe est isolé de la phase organique par adsorption à une résine échangeuse d'ions, suivi d'élution avec du méthanol. La présente invention concerne un procédé pour la séparation d'un complexe de coumermycine des cellules d'un bouillon de fermentation de coumermycine, caractérisé par le fait que les dites cellules sont traitées avec un système de solvants aqueux, contenant un solvant organique miscible à l'eau et ayant un pH entre env. 6 et env. 9, que le milieu ainsi obtenu est filtré et que le complexe est isolé du filtrat. Un complexe antibiotique brut peut être produit par cultivation de Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis nov. sp. dans un milieu nutritif contenant des sources organiques de carbone et d'azote, de préférence des pois concassés (source de carbone et d'azote) et d'environ 0,05 k à environ 3 % de CaC0f, d'environ 0,1 % à environ 3 ffi d'un carbohydrate, par exemple un amidon ou un sucre, et- d'environ 0,1 %à 0,5 de de K2 HPO4 La cultivation est effectuée pendant environ 3 à environ 8 jours à un taux d'aération d'environ 14 à environ 280 litres/minute pour 190 litres de-milieu, à une température d(en- viron 750. La majeure partie du complexe brut de coumermycine ainsi obtenu est contenue dans le mycélium ou les cellules. Une mineure partie du complexe diffuse hors des cellules par suite des conditions de fermentation. Le complexe peut être extrait des cellules, suivant le procédé de la présente invention, soit avant soit après la séparation des cellules du bouillon de fermentation. Il est toutefois préférable de séparer les cellules du bouillon de fermentation avant d'en extraire le complexe. La séparation des cellules du bouillon de fermentation peut etre accomplie en ajustant d'abord le pH de ce dernier à environ 2 - 5, de préférence à environ 4,0, puis séparation des cellules par filtratio. Le maintien du pH à cette valeur durant la séparation des cellules a Sux buts. Premièrement, on évite la diffusion du complexe brut hors des cellules et, deuxièmement, on cause la précipitation de la portion du complexe diffusée hors des cellules durant la procédure de fermentation, le précipité se déposant sur la surface des cellules. Ainsi, la quasi totalité du complexe formé durant le procédé de fermentation est séparée durant l'échelon d'isolation des cellules. Pour la bonne réussite du procédé de l'inventionfil n'est pas nécessaire d'effectuer la séparation des cellules du bouillon de fermentation avant que l'on n'en extraie le complexe brut. Cependant, cette ma nière de procéder donne les meilleurs rendements. Après la sX ion du milieu de fermentation, les cellules sont traitées avec une solution aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau, ceci à un pH entre très proche neutralité et légère acidité, ce qui provoque l'extraction du complexe hors des cellules. L'eau, dans la solution aqueuse, assure une meilleure séparation sélective du complexe des impuretés dans le bouillon ou associées à des cellules et, de ce fait, simplifie les procédures ultérieures nécessaires pour séparer les divers membres du complexe. Le ccmplexe peut également etre séparé des cellules après leur isolation du bouillon de fermentation, à un pH d'une légère acidité, env. 6-7, pour autant qu'il y ait suffisamment de solvants miscibles à l'eau, par exemple de tétrahydrofurane ou d'acétone, afin de dissoudre le complexe. Cependant, on préfère effectuer l'extraction du complexe à un pH basique. Dans une mise en oeuvre d'importance secondaire, le complexe peut être extrait des cellules avant leur séparation du bouillon de fermentation. Ainsi, après élimination des cellules par filtration, -le complexe se trouve dans le filtrat. Cette manière de faire est moins préférée du fait que, lorsque le complexe est séparé du bouillon, certaines impuretés difficilement éliminables peuvent lui etre associées, ce qui rend plus difficile la séparation du complexe sous forme essentiellement pure. Dans une mise en oeuvre préférée de cette version du procédé, le pH- du bouillon de fermentation est rendu alcalin, par exemple entre pH 7,0 et 9,0, de préférence entre un pH de 7,3 et de 7,8, puis un solvant miscible à l'eau du type décrit ci-dessous, par exemple l'acétone, est ajouté. Ce solvant forme, avec l'eau présente dans le bouillon de fermentation, un système d'extraction-aqueux. Les cellules sont ensuite éliminées par filtration. Le complexe peut être précipité du filtrat par ajustage du p11 à environ 2 - 5, soit avant soit après évaporation du solvant miscible à l'eau comme décrit plus en détail ci-après. Comme il ressort de ce qui précède, lorsqu'on extrait le complexe hors des cellules, soit avant soit après séparation de ces dernières du bouillon de fermentation, le pH du milieu devrait être entre environ 6 et environ 9,0, de préférence entre environ 7,3 et 7,8. On peut ajuster le pH au moyen de n importe quelle base organique ou inorganique appropriée, de préférence une base inorganique, telle qu'un hydroxyde d'un métal alcalin (par exemple l'hydroxyde de sodium) ou l'hydroxyde d'ammonium, etc.Cependant, n'importe quelle autre base, telle que les alcoylamines tertiaires inférieures, par exemple la triéthylamine, etc., peut être utilisée, pour autaitqu'elle remplisse les conditions requises, c'est-à-dire qu'elle forme un sel soluble dans l'eau ou dans un mélange d'eau et d'un solvant miscible à l'eau du type décrit ci-dessous. Les solvants organiques pouvant être utilisés pour l'extraction du complexe sont ceux qui sont essentiellement miscibles à l'eau, par exemple les solvants polaires, tels que les alcanols inférieurs miscibles à l'eau, par exemple le méthanol; l'éthanoî, le propanol, l'isopropanol, le t-butanol, etc.; des cétones simples, telles que l'acétone; des éthers miscibles à l'eau, tels que'le tétrahydrofurane, le dioxane, etc.; les glycols, tels que l'éther éthylèneglycol-dimé- thylique, 1' éther propylèneglycol-diméthylique, etc.; le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, le diméthylacétamide et d'autres solvants miscibles à l'eau. On peut également utiliser des mélanges de ces solvants.La préférence sera donnée aux alcanols spécifiés cidessus, en particulier le méthanol et ltéthanolr-à l'acétone et au tétrahydrofurane. La quantité d'eau présente dans le système de solvants d'extraction peut varier entre environ 25 à 75 parties en volume pour 100 parties du système de solvant, selon les solvants organiques utilisés etle pH auquel la réaction est effectuée. Par exemple, si l'on choisit le méthanol ou l'éthanol,on utilisera un volume d'environ 25 parties à environ 50 parties d'eau et environ 75 parties à environ 50 parties, de préférence environ 70 parties, de méthanol ou d'éthanol. Il a été observé q'une polarité croissante du solvant miscible à l'eau exigera une concentration croissante de ce solvant dans le système d'extraction aqueux. Cependant, il est évident que le procédé peut remplir son but avec d'autres relationseau:solvant organique dans le système de solvant. La quantité d'eau présente influence les résultats obtenus lors de la procédure d'extraction du complexe. Ainsi, si l'on utilise une quantité insuffisante d'eau lors de l'extraction à un pH alcalin, le complexe antibiotique n'est pas extrait èomplètement des cellules, ou des substances non désirées sont coextraites. Il est évident que, bien que la quantité d'eau nécessaire peut changer, la quantité qui est nécessaire pour mener å bien le procédé de l'invention peut être facilement déterminée par I'homme du métier.Par l'utilisation du système de solvant faisant l'objet de la présente invention et l'ef- ficiente séparation sélective de la coumermycine brute qui en résulte, on peut extraire environ 90 % ou davantage de substance active des cellules Dans la variante moins importante du. procédé, c'est-à-dire lorsque le complexe est séparé des cellules avant que celles-ci soient séparées du bouillon, il est préféré d'utiliser un solvant choisi parmi les suivants: t-buta-nol ,. acétone, tétrahydrofurane ou dioxane,ou des mélanges de ceux-ci. Après séparation du complexe antibiotique des cellules de la manière décrite cidessus, le milieu résultant est acidifié à un pH d'environ 2 à environ 5 (de préférence entre environ 7,5 et environ 4,1), avantageusement avec un acide minéral dilué. Le solvant organique présent peut être partiellement éliminé, avant ou après l'ajusta- ge du pH, par évaporation-sous pression réduite. En acidifiant,le complexe -- est rendu insoluble dans le milieu d'extraction et il - précipite. Le complexe perd sa solubilité en solution aqueuse de solvants organiques lorsque le milieu qui le contient a un pH entre 2 et environ 5.Ainsi, en réduisant la relation solvant organique: eau, par évaporation du solvant ou par addition d'eau, on peut obtenir de bons rendements en produits bruts sous forme pure. Il est évident, de ce qui précède, que la séparation des cellules à.un pH acide ou l'XyDation du complexe à un pH acide peuvent être accomplies au moyen d'un acide minéral dilué, par exemple un acide halogèns-hydrique, tel que l'acide chlorhydrique ou bromhydrique, l'aces sulfurique, l'acide polyphosphorique etc. Le constituant principal du complexe brut est la coumermycine Al. Sa séparation des autres membres du complexe brut peut être effectuée selon des techniques connues. Exemple l 3,785 litres d'un bouillonsde fermentation de coumermycine sont ajustés à un pH de 7,5-7,8 avec de l'hydroxyde diammonium, puis 1,89 litres d'acétone sont ajoutés sans isolation préalable des cellules. Le mélange est remué à la température ambiante pendant une heure, puis filtré . Le filtrat contient le complexe brut en so lution; il présente 90 % de l'activité du bouillon entier. Le complexe est précipité par évaporation de la majeure partie de 1 'acé- tone du filtrat et fixation du pH de ce dernier à 4,0-au moyen d'acide chlorhydrique 6M.On ajoute un aide de filtration constitué de terre de diatomées(Célite 535), puis filtre le mélange, lave le gâteau de filtration avec du méthanol, après quoi on élue l'antibiotique du gâteau de filtration au moyen de tétrahydrofurane. Le résidu obtenu après évaporation du solvant est un complexe, duquel on peut isoler la coumermycine A1. Exemple 2 500 g d'un gâteau de filtration contenant l'aide de filtration et les cellules préalablement isolées d'un bouillon de coumermycine sont mis en suspension, tout en étant remués pendant ane heure, dans un solvant composé de 750 ml de méthanol et 750 ml d'eau, à un pH de 7,9 (ajusté'et maintenu avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré). La suspension est alors filtrée. Le filtrat est acidifié au pH 3,9 avec de acide chlorhydrique 6M, ce qui donne un précipite de complexe brut, que l'on filtre ensuite. Pour faciliter cette filtration, on ut-ilise un aide de filtration de terre de diatomées (Célite 535). Le gâteau de filtration qui en résulte, qui est lavé 2 fois par resuspension dans du méthanol absolu, contient le complexe de coums-rmy- cine présentant 85 à 95 % de l'activité antibiotique du bouillon de fermentation et duquel la coumermycine h peut être isolée. Exemple 3 14000 litres d'un bouillon de fermentation de coumermycine sont ajustés au pH 4 au moyen d'acide sulfurique dilué, mélangés avec un aide de filtration de terre de diatomé puis filtrés. Le gâteau de filtration obtenu est mélangé avec 1300 litres de méthanol et 550 litres d'eau, le mélange homogénéisé et le pH ajusté à 7,8 avec de l'hydroxyde d'ammonium ou un alcali dilué. La suspension est remuée pendant environ 3 heures, puis filtrée. Le gâteau de filtration est lavé avec un mélange de 100 litres de méthanol et 300 litres d'eau. Les filtrat et eaux de lavage combinés contiennent le complexe avec, essentiellement, toute l'activité antibiotique du bouillon de fermentation. Exemple 4 Les cellules obtenues par précipitation à partir de 4 litres de bouillon de fermentation acidifié sont traitées avec un mélange de 0,5 litre d'acétone et 1,0 litre d'eau à un p11 de 7,7, puis filtrées et lavées avec de l'acétone aqueuse. Les filtrat et eaux de lavage combinés contiennent le complexe avec environ 90 % de ltactivité antibiotique du bouillon. Exemple 5 Un bouillon de fermentation de coumermycine d environ 14000 litres est ajusté au pH 4 avec de l'acide sulfurique 18N, mélangé avec un aide de filtration de terre de diatomées(Célite 535), puis filtré. Le gâteau de filtration est alors mélangé avec 1300 litres de méthanol et 550 litres d'eau. Le mélange est homogénéisé et le pH ajusté à 7,8 au moyen d'hydroxyde d'ammonium. La suspension est remuée pendant environ 3 heures et filtrée, après quoi le gâteau est lavé avec un mélange de 100 litres de méthanol et 300 litres d'eau. Les filtrat et eaux de lavage combinés sont mélangés avec un aide de filtration de terre de diatomées remués vigoureusement et acidifiés au pH 3,9 avec de l'acide sulfurique 5N. On laisse le précipité formé se poser. Le liquide surnageant est éliminé par décantation et la suspension restante filtrée par centrifugation. Le gâteau obtenu est lavé avec 25 litres de méthanol et séché. Les gâteau de filtration contient le complexe d'antibiotique brut et la terre de diatomées. 3,785 litres d'acétone sont ajoutés par 0,453 kg de gâteau de filtration obtenu. La suspension est remuée vigoureusement pendant environ 30 minutes, puis filtrée par centrifugation. Le filtrat résultant est évaporé à un petit volume et le complexe est précipité sous forme acide par addition de Skellysolve B (essentiellement du n-hexane, point d'ébullition 60-68 ). Revendications 1. Procédé pour la séparation d'un complexe de coumermycine à partir de cellules d'un bouillon de fermentation de coum.ermycineS caractérisé par le fait que ces cellules sont traitées avec un système de solvants aqueux contenant un solvant organique miscible à 1'eau et ayantun pH d'environ 6 à environ 9, que le milieu ainsi obtenu est filtré et que le complexe est isolé du filtrat. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le bouillon de fermentation est ajusté à un pH entre environ 2 et environ 5, que le milieu ainsi obtenu est filtré afin d'éliminer les cellules du bouillon de fermentation, que les cellules sont traitées avec un système de solvants aqueux contenant un solvant organique miscible à lteauet ayantun pH entre environ 6 à environ 9, que le milieu ainsi obtenu est filtré et que le complexe est isolé du filtrat. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que le bouillon de fermentation est ajusté à un pH d'environ 4. 4. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que le système de solvants aqueux a un pH entre environ 7,3 et environ 7,8. 5. Procédé suivant ltune des revendications l à 4, caractérisé par le fait que le solvant organique miscible à l'eau utilisé est un alcanol inférieur, une simple cétone, un éther miscible à l'eau, un glycol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le diméthylacétamide, ou un mélange de ces solvants. 6. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le solvant organique miscible à l'eau utilisé est le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le t-butanol, l'acétone, le tétrahydrofurane, le dioxane, l'éther éthylèneglycoldiméthylique, l'éther propylèneglycol-diméthylique, le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, le diméthylacétamide, ou un mélange de ces solvants. 7. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le complexe est isolé du filtrat en ajustant le pH du filtrat à environ 2 à environ 5 et que l'on sépare le complexe précipitant par suite de l'ajustement du pH. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé par le fait que le pH du filtrat est ajusté à environ 4. 9. Un complexe de coumermycine obtenu suivant le procédé des revendications 1 à 8.