FR 2028886 A1 19701016 FR 7002162 A 19700121 70 02162 1 2028886 5 La présente invention est relative à un procédé de production d'acide citrique. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de production d'acide citrique qui consiste à inoculer une levure accumulant l'acide citrique, appartenant au genre Candida, capable 5 d'utiliser des hydrocarbures et incapable d'utiliser de l'acide citrique, au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de carbone principale, au moins un hydrocarbure paraffini que normal contenant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, après quoi on fait incuber la culture à un pH compris entre envi-10 ron 2 et 7 jusqu'à ce que l'acide citrique soit sensiblement accumulé dans le bouillon de culture et on récupère l'acide citrique dans ce bouillon. L'acide citrique fait l'objet d'une grande demande et est utilisé, par exemple, comme agent acidulant dans des 15 boissons et dans des sirops pharmaceutiques. En ce qui concerne la production d'acide citrique par fermentation, des procédés dans lesquels on utilise des micro- . organismes tels que les moisissures du genre Pénicillium,Asper-gillus , etc.., sont bien connus et ont été souvent cités . dans 20 la littérature. Toutefois, ces procédés dépendent invariablement de l'utilisation de sucres et d'autres sources de carbone coûteur-ses, et les périodes de fermentation sont très longues, par exemple de 5 à 12 jours. Par ailleurs, il a été décrit que diverses levures sont 25 capables d'accumuler de l'acide citrique dans un milieu contenant des hydrocarbures. Cependant, de telles levures consomment graduellement l'acide citrique à mesure qu'il est produit au cours de la fermentation et le rendement final dépend de l'équilibre entre la 3P production et la consommation d'acide citrique. C'est pour cette raison que le rendement en acide citrique par rapport aux sources de carbone utilisées n'a jamais été aussi satisfaisant qu'on le désirait. La demanderesse a étudié depuis longtemps le métabolisme 55 des levures du genre Candida et a réussi â isoler certains mutants qui sont dépourvus d'aptitude à utiliser l'acide citrique et sont capables d'utiliser des hydrocarbures pour produire et accumuler de l'acide citrique avec un bon rendement. La présente invention est le résultat de telles études. BAD ORIGINAL 02162 2 2028886 La production de l'acide citrique par le procédé de la présente invention offre de nombreux avantages. Tout d'abord, le rendement est extrêmement élevé. On suppose que ce rendement amélioré provient de la suppression de 5 la production d'autres acides organiques, principalement de l'acide isocitrique, acide qui, en d'autres conditions, serait produit en une quantité presque aussi importante que l'acide citrique, aux dépens d'une consommation de l'acide ci trique recherché. Le second avantage de ;ce procédé réside dans 10 le fait que la fermentation est effectuée en ion temps relativement court. Troisièmement, il est extrêmement facile de déterminer le moment de la récolte et la fermentation peut être exécutée sans risque d'une fermentation trop poussée, car l'acide citrique, une fols produit, n'est pas consommé par l'organisme. 15 L'importance de ces avantages est considérable dans le contrôle de la fermentation. De plus, en raison des concentrations inha-bituellement faibles en autres acides organiques formés comme sous-produits, l'isolement de l'acide citrique sous une forme purifiée, à partir de la culture, est grandement facilité. Selon 20 la présente invention, le rapport de l'acide citrique à l'acide isocitrique n'est actuellement pas inférieur à 9:1 La présente invention a donc pour objet un procédé de production d'acide citrique avec vin bon rendement. Dans le procédé objet de la présente invention, le 25 contrôle de la fermentation et la purification de l'acide citrique recherché se trouvent facilités. On atteint facilement les buts susmentionnés en inoculant une levure accumulant de l'acide citrique et appartenant au genre Candida, levure qui est capable d'utiliser des 50 hydrocarbures et qui est incapable d'utiliser de.-l'acide citrique , au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de.carbone principale, au moins un hydrocarbure paraffinique normal ayant 9 à. 20 atomes de carbone dans la molécule, après quoi on fait incuber la culture à un pH d'environ 2 à 55 environ 7 jusqu'à ce que l'acide citrique soit accumulé en quantité notable dans le bouillon de culture, et on récupère dans ce dernier l'acide citrique accumulé de cette manière. A titre de souches-mères à partir desquelles les mutants précités du genre Candida peuvent être obtenus, on peut 40. citer par exemple les levures Candida lipolytica, Candida BAD ORIGINAL 70 02162 2028886 parapsilosis, Candida brumptil, Candida infcermedia, Candida trôpicalis, Candida guilliermondii, etc., ainsi que certaines levures isolées naturellement. On fait appel à une mutation spontanée ou induite pour 5 obtenir les mutants désirés qui sont incapables d'utiliser l'acide citrique et qui sont capables d'utiliser les hydrocarbures susmentionnés comme source ionique de carbone en vue de produire de l'acide citrique. En vue de la mutation, on peut faire appel, par exemple, à uneradiation ultraviolette, à un traitement par le 10 cobalt 60, aux rayons X et à d'autres rayonnements à haute énergie, ou à un traitement chimique par des mutagènes tels que NaNOg* HgOg, la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine, 1'acry-flaviné, etc.. Dans la présente invention, quand un organisme cesse de 15 se développer dans les conditions mentionnées ci-dessous, on dit que cet organisme est "dépourvu d'aptitude à utiliser l'acide citrique", bien qu'il existe encore une possibilité de développement lors d'une incubation plus poussée. (1) Milieu £ 20 Citrate trisodique 0,05 NHjjNO^ 0,1 NH^Cl 0,1 KHgPO^ - 0,1 25 MgSO^THgO 0,05 Agar-agar 2,2 pH 6,5 On peut ajouter des éléments nutritifs nécessaires 30 pour le développement, comme une vitamine, des amino-acides, des constituants d'acide nucléique, etc.., au cas où les micro-organismes exigent de telles substances pour leur développement. (2) Conditions de culture Incubation à 28°C pendant 2 jours. 35 Certains de ces mutants n'ont pas la capacité d'absorber l'acide citrique dans leurs cellules et d-'autrés exigent certains éléments nutritifs tels que diverses vitamines, des amino-acides, des constituants de l'acide nucléique, etc..» et même de tels mutants peuvent être utilisés dans la mise en 40 oeufore de la présente invention, à condition qu'ils perdent BAD ORIGINAL 70 02162 ^ 2028886 leur aptitude à utiliser l'acide citrique et qu'ils conservent 11 aptitude à utiliser des hydrocarbures comme source de carbone unique pour produire l'acide citrique. Certains des mutants susmentionnés et leurs caracté-5 ristiques microbiologiques sont donnés dans le tableau qui va suivre par comparaison avec des souches-mères. B\D ORIGINAL ^4 O O N> Tableau —* O K> Souche-mère Candida lipolytica Candida sp. IPO Candida sp. IPO Candida tropicalis Candida sn. 164 IPO 1437 (ATCC 20114) 14èl 1462 IPO 0589 (ATCC 20115) IPO 1460 Mutant No. 3andida lipolytica Candida sd.~. Candida st>. Candida tronicalis Candida sd. 164 L-36 IPO 1463 H-22 IFO 1464 PRZ-3 IPO 1465 9M IFO 1505 K-l IPO 1504 Extrait de malt, 25°C, 3 jours Colonie circulaire k elliptique; pseudo-mycélium; nycélium vrai Colonie circu-7 laire à elliptique; pseudo-mycélium; mycélium vrai Colonie circulaire à elliptique ; bourgeonnante; pseudo-mycélium; mycélium vrai Colonie circulaire à elliptique, bourge onnante; pseudo-mycélium ; mycélium vrai Colonie circulaire à elliptique, bourgeonnante; pseudo-mycélium; mycélium vrai Malt incliné 25°C, 3 jours Colonie elliptique, nycélium vrai Colonie elliptique, pseudo-mycélium; mycélium vrai Circulaire h elliptique; vrai mycélium et pseudomycélium Circulaire à elliptique; vrai mycélium et pseudomycélium Circulaire à elliptique; vrai mycélium et pseudomycélium Extrait de malt, 25°C, 17 jours Colonie circulaire ou elliptique, spectrale, nycélium fragmenté, sèche, plissée, formée en 2-3 jours; pas, de pellicule Colonie ovale à elliptique; mycélium vrai, pas de pellicule formée; anneau de levure Colonie circulaire à elliptique; mycélium vrai; pellicule mince Colonie circulaire à elliptique; pellicule mince occasionnellement formée, anneau de levure Colonie circulaire à elliptique; pas de pellicule; croissance en surface U) to O K> CD 00 Extrait de malt, 25°C, 37 jours « Sédiment observé le 17è et le 37è jours Anneau de levure pouvant se détacher; pas de pellicule Anneau de levure; ilôts ie sédimentation; pellicule milieu trouble Anneau de levure; par d'ilôt de sédimentation; pellicule Pellicule mince; anneau de levure Gélose ' du . malt, 17°C, 1 mois Colonie jaune peu transparente, sèche, virant au brun Colonie blanche ou jaune; sèche; pellicule Dolonie blanche du jaune; sèche; pellicule Jaune pâle ou blanc à jaune; colonie sèche Colonie jaune trouble; légèrement plissée; humide Mutant Candida lioolytica Candida st>. Candida sd. Candida tronicalis Candida sp. 64K-1 L-36 IFO 146? H-22 IFO 1464 FRZ-3 IFO 1465 9H IFO 1505 IFO 1504 Fermentation Glucose - + + + - Galao-tose - + + • + - Maltose - + + 4* - Lactose - - - + - Sucrose - i '-v* + + ^ + - Assimilât ;lon Glucose + H- + + + Galactose - + + + Maltose - + + + + Lactose - - - - - Sucrose + + + - o o K) Utilisation du nitrate de potassium - - - - - Lait tourne- solé Peptonisé Bleu Bleu Bleu Bleu t Décomposition de l'es-curine + + + + + Production d'acide + + . + + - O K5 cx> 00 00 o 70 02162 2028886 Le milieu à Utiliser dans le procédé selon la présente invention doit être légèrement modifié selon les mutants particuliers utilisés mais des sources de carbone peuvent être avantageusement constituées par des alcanes normaux ayant 9 à 20 5 atomes de carbone dans la molécule, comme le n-nonane, le n-undécane, le n-dodécane, le n-tétradécane, le n-pentadécane, le n-hexadécane, le n-heptadécane, le n-octadécane, le n-nonadécane, le n-eicosane, etc., ainsi que leurs mélanges, et des fractions d'hydrocarbures telles que le gas-oil, le gas-oil lourd, le 10 kérosène, etc. Les hydrocarbures sont généralement utilisés en des quantités telles que , dans le cas d.'hydrocarbures paraffiniques normaux, ayant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, le milieu de culture en contienne environ 3 à 20# (volume/volume). 15 Etant donné que de tels hydrocarbures se dissolvent difficilement dans l'eau, on les introduit dans un milieu de culture aqueux en agitant ou en secouant en vue d'obtenir une suspension contenant des particules très fines. Si on le désire, un agent de suspension , par exemple un agent tensio-actif du 20 type du monostéarate de polyoxyéthylène sorbitan - peut être utilisé De tels hydrocarbures constituent par eux-mêmes des sources de carbone satisfaisantes mais, si on le désire, des sources de carbone courantes telles que des hydrates de carbone 25 (par exemple le glucose) peuvent être utilisées conjointement avec les hydrocarbures. En ce qui concerne les sources d'azote nécessaire, on peut utiliser divers sels minéraux d'ammonium tels que NH^Cl, (NH4)2S04, (NH4)2HP04, NH^OH, NH^NO^, etc.., l'urée, les 30 sels d'ammonium de divers acides organiques, par exemple l'acétate d'ammonium et des substances azotées organiques telles que la levure séchée, l'extrait de levure, l'extrait de viande, la farine de poisson, la farine de soja-, la liqueur de macération du mais, la peptone, etc.. Ces sources d'azote peuvent 35 être utilisées isolément ou en combinaison. En plus de telles sources de carbone et d'azote, le milieu à utiliser peut encore contenir, si nécessaire, n'importe lequel des sels minéraux qui sont couramment utilisés, par exemple les sels de fer, de manganèse, de magnésium et de calcium et 40 divers éléments nutritifs qui pourraient être nécessaires pour BAD ORIGINAL 70 02162 10 2028886 le développement du mutant. Le pH du milieu peut être compris dans une gamme étendue permettant le développement des mutants choisis et, généralement, on préfère un pH compris entre 2 et 7 et parti-5 culièrement entre 3 et 6. Si, au cours de la culture, le pH diminue sous l'effet de l'acide citrique produit, il est judicieux d'ajuster le pH du milieu de temps à autre pour l'amener dans l'intervalle précité tout en continuant la culture. A cet effet, on peut ajouter de temps à autre aujmilieu de culture vin 10 agent neutralisant tel que, par exemple, CaCO^, Ca(0H)g, NH^OH, NaOH ou NagCO^ . Dans une variante , pour obtenir une action adéquate de tamponnement du milieu, on peut ajouter CaCO^ de façon préliminaire en une quantité déterminée selon la réduction possible du pH. 15 La température d'incubation peut varier dans une cer taine mesure en fonction du mutant particulier utilisé et elle généralement comprise entre 20 et 35°C, particulièrement entre 25 et 30°C. Etant donné que le procédé objet de la présente invention est généralement mis en oeuvre dans des conditions 20 aérobies, il est approprié de faire appel à un procédé de culture avec agitation dans lequel on utilise une cuve. A ce sujet,s'il faut éliminer la mousse, il est judicieux d'ajouter des agents anti-mousse connus tels que des dérivés du polyoxy-propylène, de l'huile de soja, de l'huile de silicone, de l' 25 huile de lard, etc.. On récupère l'acide citrique accumulé de cette manière dans le bouillon de culture par des procédés connus per se tels qu'une filtration,une centrifugation, un chauffage, une précipitation, une cristallisation, une décoloration et vin séchage, 30 ainsi qu'une chromatographie sur colonne, ces procédés pouvant être utilisés seuls ou en combinaison. Selon les besoins, on ajuste le pH du bouillon de culture. A titre d'exemple, quand le bouillon de culture contient du citrate de calcium insoluble, il est désirable d'acidifier le bouillon avec de l'acide 35 chlorhydrique pour solubiliser ce sel, après quoi on procède à une séparation. Si on le désire, après avoir séparé le liquide de culture des cellules de levure, on le neutralise avec de la soude caustique, du -carbonate de calcium, du lait de chaux , 40 etc.. On laisse reposer la solution ainsi obtenue à la température BAD ORIGNAL 70 02162 2028886 ambiante (environ 15 à 30°C) ou en chauffant, puis on la filtre ou la centrifuge et on la sèche, ae qui donne du citrate de calcium sous forme d'une poudre blanche. Si nécessaire, on purifie encore la poudre d'une façon connue, par exemple par 5 neutralisation, etc.. Si la poudre est;un mélange d'acide citrique et d'acide isocitrique (+) , on peut effectuer la séparation , par exemple, de la manière suivante. La poudre dissoute dans de l'eau très chaude est soumise à une filtration par aspiration, ce qui 10 donne des sels de calcium d'acide citrique, après quoi on neutralise et on filtre. On concentre le filtrat jusqu'à obtention d'un sirop qu'on soumet à une chromatographie sur une colonne de gel de silice, en utilisant un mélange de n-butanol et de chloroforme comme solvant d'élution, ce qui donne des fractions 15 différentes contenant de l'acide citrique et de l'acide (+)-isocitrique. L'acide citrique et l'acide (+)-isocitrique sont respectivement mesurés par la méthode à la pentabromoacétone /" Seikagaku 27, 72 (1955)J et parla méthode enzymatique 20 f Hethods of Enzymatic Analysis (Verlag Chemie) 318, GUnther Sieber J. On comprendra mieux les modes de mise en oeuvre préférés de l'invention à la lect>ure des exemples non limitatifs qui vont suivre. Dans la totalité de l'exposé , les pourcentages 25 sont donnés en poids par volume et les rendements sont calculés en poids d'acide citrique produit par poids d'hydrocarbures paraffiniques normaux consommés. La relation entre les parties en poids et les parties en volume est identique à celle qui existe entre les grammes et 30 les millilitres. Les numéros"IPO" placés après les noms des levures du tableau ainsi que dans les exemples sont des numéros d'acces-. sion respectifs à l'organisme "Institutè for Fermentation" à Osaka, Japon. BAD ORIGINAL 70 02162 12 2028886 Exemple 1 On utilise une culture de Candida lipolytica L-j56 (IPO 1463) provenant de Candida lipolytica IPO 1437 et on l'inocule dans 10 parties en volume d'un milieu aqueux stérilisé (pH 6,0) qui contient un mélange d'hydrocarbures composé en 5 majeure partie d'une n-paraffine ayant 13 à 15 atomes de carbone (2#), de NH4C1(0,2#), de KHgPO^ (0,05*), de MgSO^HgO (0,05*), MnSO^^HgO (0,001*),PeS02f,7H20 (0,001*) et CaCO^ (0,5*) et on fait ensuite incuber à 28°C, tout en agitant et en aérant pendant 48 heures. On introduit 10 parties en volume de la pré-culture 1° résultante dans 100 parties en volume dlttiimilieu contenant une n-paraffine ( comme ci-dessus) (6*), NHj^Cl (0,2*), KHgPO^ (0,01*), MgSO^ÏHgO (0,05*), MnSO^^HgO (0,001*), FeS04,7H^0 (0,001*), de la levure séchée (0,1*) et CaCO^ (0,5*), et on fait incuber le milieu inoculé à 28°C, en aérant et en agitant. 3-5 Le deuxième jour et le troisième jour, on ajoute respectivement 0,5* de CaCO^ et 3* de CaCO^ , dans des conditions aseptiques, pour ajuster le pH du milieu, puis on poursuit la culture pendant 5 jours au total. On donne ci-après les rendements de l'acide citrique produit et accumulé dans le bouillon et de 20 l'acide isocitrique, dont la concentration est la plus élevée parmi tous les acides organiques constituant des sous-produits, et on donne en même temps des rendements correspondants pouvant être obtenus quand on cultive la souche-mère . 25 30 Acide citrique Acide isocitrique Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Souche-mère 22,8 mg/ml 38* 27 mg/ml 45* Mutant 69,8 mg/ml 115,4* 1,36 mg/ml 2,1* BAD ORiOMNAi 02162 13 2028886 •On fait encore incuber une partie de la culture ci-dessus pendant 3 jours soit 8 jours au total, à la fin desquels l'accumulation d'acide citrique par le mutant atteint 69,1 mg/ml . Par contre, l'accumulation obtenue avec la souche-mère tombe à 13,2 mg/ml . Le 5ème jour de culture, on prélève 100 parties en volume de la culture et on aj,uste le pH à 2 par addition de HC1-3N, suivie d'une centrifugation pour éliminer les cellules. On ajuste le pH du fluide surnageant à 6,8 avec Na0H-5N et on chauffe à 100°C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le fluide, on récupère le sédiment par filtration et on le laisse sécher dans un courant d'air. Le procédé donne du citrate de calcium contenant 6,3 parties en poids d'acide citrique. On met le sel en suspension dans 40 parties en volume d'eau et on le neutralise avec HgSO^-SN. On ajoute au fluide surnageant une partie en poids de charbon activé, après quoi on filtre. On concentre le filtrat^résultant sous pression réduite, jusqu'à obtention d'un sirop de concentration faible. (Si l'hydroxyde de calcium précipite, on le sépare par filtration au cours de la concentration). On laisse le concentré reposer dans un réfrigérateur, et on obtient ainsi 5,7 parties en poids de cristaux d'acide citrique(sous forme d'anhydride citrique). Exemple 2 On utilise un mutant n'utilisant par d'acide citrique H-22 (IPO 1464) dérivé de Candida sp. IPO 1461 (ce mutant possède également une propriété de non utilisation de l'acide L-làûtique) pour inoculer 100 parties en volume d'un milieu stérilisé (pH 6,5) contenant un mélange de n-paraffines (8*) à 12-18 atomes de carbone (pureté de 92*), NH^Cl (0,3*), KHgPO^ (0,01*), MgS04,7Hg0 (0,05*), FeSO^HgO (0,05*) et CaCO^ (0,05*). On fait incuber le tout à 28°C pendant 3 jours, en ajoutant de temps à autre une solution à 14* de NH^OH pour garder la couleur vert jaunâtre du milieu (c'est-à-dire un pH de 4 à 5). Les résultats sont donnés ci-dessous, ainsi que les résultats qu'on obtient en utilisant la souche-mère. BAD ORIGINAL 70 02162 i4 2028886 * Acide citrique Acide isocitrique [sous-produit le plus abondant Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Souche-mère 49 mg/ml 61,2* 52 mg/ml 65* Mutant 112 mg/ml 138* 1,3 mg/ml 1,7* 10 On fait encore incuber une partie de la culture ci-dessus pendant 2 jours et, à la fin de cette 'période, le rendement en acide citrique , avec le mutant, est de 109 mg/ml. Il est intéressant de noter que le chiffre correspondant pour la souche-mère est de 25,4 mg/ml seulement. Le 3ème jour, on recueille la culture ci-dessus et on la filtre pour éliminer les organismes. On ajuste !• filtrat au pH 7 en ajoutant Cav(QH)g et on le fait bouillir sous une pression légèrement réduite pendant 30 minutes. Après refroi- 20 dissement, on récupère le sédiment par filtration et on le traite de la même manière que dans l'exemple 1. Ce procédé donne 9,3 parties en poids de cristaux d'acide citrique(sous forme d'anhydride citrique). 25 Exemple 3 On cultive Candida sp. FRZ-3 (IPO 1465), dérivé de Candida sp. IPO 1462, de la même manière que dans l'exemple 2, et, le troisième jour de la culture , on analyse la culture 30 pour connaître sa teneur en acide citrique et en acide isocitrique constituant le sous-produit. Les résultats sont donnés ci-dessous BAD ORIGINAL 70 02162 15 2028886 Acide citrique Acide isocitrique Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Rendement Rendement * par rapport à la source de carbone Souche-mère 31,5 mg/ml 39,4* 39 mg/ml 48,7* Mutant 86 mg/ml 107,5* 0,8 mg/ml 1,0 * On fait encore incuber la culture pendant 3 jours, après quoi le rendement en acide citrique par le mutant est de 84 mg/ml. C'està-dire qu'il reste sensiblement le même qu'au 3ème jour. Par contre, le rendement de la souche-mère tombe à 19 mg/ml. Le jfême jour de la culture, on recueille 100 parties en volume de la culture du mutant et on effectue le traitement décrit dans l'exemple 2, ce qui donne 7,4 parties (sous forme d'anhydride citrique) de cristaux d'acide citrique,en poids. 20 Exemple 4 On .cultive Candida sp. K-l (IPO 1504) (dérivé de Candida sp 164 , IPO 1460) et Oandida tropicalis 9M (IPO 1505) (dérivé de Candida tropicalis, IPO 0589) de la même manière 2^ que dans l'exemple 2 et, le troisième jour de la culture , on analyse les cultures pour déterminer leur teneurs en acide citrique et en acide isocitrique. Les résultats sont donnés ci-dessous, par comparaison avec ceux que donnent les souches-mères. BAD ORIGINAL 02162 16 2028886 Acide citrique Acide isocitrique Rendement Rendement % par rapport à la source de carbone Rendement Rendement % par rapport à la source de carbone Candida sp. K-1 (IFO 1504 ) 8l mg/ml 100,1# 9 mg/ml 11,2# Candida sp. 164 (IPO 1460 ) 32 " 30 16 " 20 Candida tropicalis (IBO 1505 ) 88 " 110 2 " 2,5 Candida tropicalis (IPO 0589 ) 46 ■ 57» 5 32 M 40 70 02162 17 2028886 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'acide citrique, caractérisé par le fait qu'il consiste à inoculer une levure accumulant l'acide citrique et appartenant au genre Candida, qui est capable d'utiliser des hydrocarbures et incapable d'utiliser de l'acide 5 citrique, au sein d'un milieu de culture aqueux contenant, comme source de carbone principale, au moins un hydrocarbure paraffini que normal contenant 9 à 20 atomes de carbone dans la molécule, à faire incuber la culture à un pH compris entre environ 2 et 7 jusqu'à ce que l'acide citrique soit accumulé en quantité 10 notable dans le bouillon de culture, et à récupérer l'acide citrique accumulé dans ce bouillon. 2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la température d'incubation est comprise entre 20 et 35° C. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le 15 pH du milieu de culture est compris entre 3 et 6. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la levure est Candida lipolytica. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la levure est Qandida tropicalis. 20 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la levure est Candida sp. H22 IPO 1464. 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la levure est Candida sp. FRZ-3 IPO 1465. 8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la 25 levure est Candida sp. 164 K-1 IPO 1504.