FR 2017514 A1 19700522 FR 6930277 A 19690905 La présente invention est relative à de nouveaux com plexes d'enzymes ayant une activité de cellulase améliorée. De nombreux mycètes sont connus pour posséder la faculté de décomposer la cellulose et cette activité peut être attribuée à la libération extérieure d'un complexe d'enzymes. L'isolement de ce complexe et la séparation de ses composants ont indiqué que les divers enzymes en présence agissent synergiquement. Particulière nient, un composant a été détecté, du fait de sa présence essen tielle à la décomposition des formes hautement organisées de cel lulose, telles qu'elles se trouvent normalement dans les matières cellulosiques fibreuses. Il a été désigné par CL (Selby & Maitland Biochem. J. (1967) 104, 716). Les composants restants qui agissent en synergie avec Cl, sont désignés collectivement par Cv et possè dent, par exemple, une activité de carboxyméthyl-cellulase et de cellobiase.Bien que la demanderesse ne désire pas être liée par des considérations théoriques, elle suppose que.le composant Cl agit sur la structure cristalline du B-l,4-glucane présent dans les matières fibreuses cellulosiques, telles que le coton, causant la division en chaines individuelle s qui deviennent ainsi sujettes à l'attaque par d'autres enzymes du complexe. Cependant, le compo sant C1 ne semble pas capable de solubiliser une telle cellulose et les autres composants du type cellulase sont donc nécessaires pour parvenir à cette fin. Les recherches de ces composants du type cellulase ont été effectuées principalement sur une préparation à partir du Tri choderma viride et de son proche parent T.koningii. La derr.anderes- se a maintenant trouvé qu'un complexe enzymatique similaire peut être obtenu à partir de certaines souches de Penicillium funiculo sum et, par ailleurs, que le composant Cl de ce complexe avait la caractéristique d'une stabilité thermique remarquablement plus élevée que celle-obtenue à partir du T.viride.Etant donné que le composant Cl est essentiel à l'attaque des celluloses fibreuses se rencontrant naturellement, dans lesquelles la cellulose est dans sa forme cristalline étroitement dense et qu'au surplus une bonne stabilité therniique est spécialement désirable dans une préparation enzymatique destinée à etre utilisée par la décomposition indus trielle de la cellulose, ce nouveau complexe de cellulase possède des avantages remarquables sur celui que l'on obtient a partir du T.viride au point de vue de l'utilisation pratique. Le nouveau complexe de cellulase ou les composants de celui-ci, et spécialement le composant C1, sont particulièrement utilisables, par exemple, pour la production de monosaccharides, tels que le glucose, à partir de celluloses fibreuses et plus spécialement pour la modification de la structure de matières cellulosiques fibreuses par exposition relativement courte à la cellulase. En particulier, il est possible d'améliorer ltextractibilité de matières telles que la protéine des végétaux ou de sources microbiennes, ou d'améliorer la valeur nutritive des matières alimentaires pour animaux.La cellulase peut être également utilisée pour l'enlèvement de matières cellulosiques d'un effluent La haute stabilité thermique de ce nouveau composant C1 ne rend pas seulement le complexe entier particulièrement utile dans les applications industrielles, en évitant toute nécessité d'adopter des conditions de températures réglées avec précision, mais augmente aussi l'action synergique du constituant Ci avec des enzyme venant d'autres sources.Ainsi, par exemple, tandis que le composant Ci et les composants du type cellobiase du nouveau complexe de cellulase provenant de P. funiculosum sont spécialement thermostables, lz composant carboxUrméthylcellulase n'est pas aussi thermostable que celui venant du TOviride. Des mélanges du composant C provenant du P.funiculosum et du Cx provenant du T.viride ou simplement du complexe entier de cellulase de P.funiculosum et du complexe entier de cellulase de T.viride, possèdent, ainsi coton a pu le constater, une stabilité thermique globale ex traordinaire. D'autres complexes enzymatiques sont encore bien équipés pour des processus de dégradation particuliers, mais il leur manque la capacité initiale d'attaquer la cellulose cristalline ou les syst.'nfles ?-l, 4-glucane apparentés; cette capacité peut être conférée par mélange avec le complexe de cellulase de P. funiculosum ou le composant C1 isolé à partir de ce complexe, 1 Il est à noter que l'expression "haute stabilité thermique" utilisée au sujet du nouveau composant C désigne la stabilité thermique par rapport au composant C1 en provenance d'autres sources, notonir.ient du T.viride; ce n'est pas le cas, en fait, que le composant Cl soit ie composant le plus theimostable du complexe.C'est ltarlélioration de la stabilité thermique du nouveau composant CL et en particulier l'obtention d'un composant Ci thermiquement stable à 600C et à pH 4,5 qui ont une signification spéciale. Les propriétés physiques de certains des composants isolés du nouveau complexe de cellulase-seront maintenant décrites. Les procédés pratiques d'isolement seront ensuite décrits. Poids moléculaires Les composants individuels ont été examiné s sur une colonne calibrée de Sephadex G-75 par le procédé décrit par Selby & Maitland (Bioch. J. (1965), 94, 578). Les poids moléculaires estimés par ce mode opératoire ont été les suivants Cl : 57.500, cellobiase : 160.000 et carboxyméthylcellulase : 15.500. Ces chiffres peuvent être comparés à ceux trouvés pour les composants C1 (56.000), cellobiase (40.000) et carboxyméthyl cellulase (33.000 et 12.600) de la cellulase de T.viride. Stabilité au pH du composant C1 Des échantillons de C ont été maintenus à différentes valeurs ae pH à 400C durant 4 h, réajustés au pH 4,5 et essayés quant à leur pouvoir d'agir en synergie avec un mélange de cellobiase et de carboxyméthylcellulase de la nouvelle cellulase; les activités résiduelles ont été mesurées par des,agrégation de plaques de cellulose de bagasse/ agar (Savory, Mather, Maitland et Selby, Chem. & Ind. (1967), 153) dans lesquelles la seule source de carbone était Ae la cellu lose Whatman ou de la cellulose de bagasse délignifie et extraite à l'alcali, ces celluloses étant broyées au broyeur à boulets.Le composant Cl était relativement stable à un pH de 2,75 à 7,0. Stabilité thermique du composant Cl Des essais préléminaires dans lesquels des échantillons de C1 à pH 4,5 ont. été chauffés à 600C, 650C, 70 C ont montré une stabilité thermique inattendue (6 h) à 60 C. L'allure de la perte d'activité à 650C est montrée à la figure 1 des dessins ci-joints. A la figure 1, le temps à 650C est indiqué en abscisse et la proportion d'acti vité'restante en ordonnée. Des résultats comparatifs avec le C1 du T.viride ont montré que ce C1 était un peu moins stable à 600C que le C1 de la nouvelle cellulase l'est à 65 C. Le comportement des composants à ltélution, à la filtration sur gel et à la concentration isoélectrique sont aussi carac téristiques. Lorsque des milieux à base de dextrane ont été utilisés, il a d'abord été nécessaire d'enlever la dextranase; ceci a été effectué tar traitement à pH 3,5 à l'aide de diéthylaminoéthyl Sephadex EAE Sephdex (équilibré à pH 3,5 avec un tampon 0,01 M de succinate)J. Elèvement de la dextranase : Un échantillon (10 ml) d'une solution à 3% de la nouvelle préparation de cellulase a été dialysé, ajusté à un pH 3,5 et amené à passer à travers une colonne (25 x 1,8 cm) de DEAE-Sephadex équilibré à l'aide d'un tampon 0,01 M de succinate à pH 3,5. La dextranase a été mesurée par solubilisation d'un échantillon de Sephadex G-75 à pH 4,5 à 400C durant 18 h [Sephadex (10 mg) plus la fraction contenant l'enzyme (0,1 ml) plus le tampon 0,01 M de succinate (0,-4 ml; pH 4,5)J. La dextranase a été convenableltient éliminée de la solution de cellulase sans perte des autres activités. a) Elution avec gradient sur DEAE Sephadex. Une colonne (25 x 1,8 cm) de DEAE Sephadex a été équilibréed'abord avec du tampon 0,01 M de succinate à pH 3,6 et ensuite à pH 4,8. Un échantillon de la nouvelle cellulase dont on a enlevé la dextranase, a été concentré, dialysé (volume final 6 ml) et introduit dans la colonne à pH 4,8; il a été élué avec un gradient de tampon se terminant à pH 3,6. La carboxyméthylcellulase, la cellobiase et la densité optique ont été mesurées à 280 m. Les résultats sont montrés à la figure 2 des dessins ci-annexés.A la figure 2, les symboles ont les significations suivantes : A= cellobiase, B= pH, C= carboxyméthylcellulose, D= densité optique, E= densité optique à 280 mt, F= activité de carboxyméthylcellulase (unités x l02), G= activité de cellobiase et H= nombre fractionnaire (2,95 ml). Le composant cellobiase était encore actif vis-à-vis de la cellulose et cette activité a été accrue par addition de carboxyméthyl cellulase, qui elle-même manquait d'activité sur de la cellulose. b) Concentration isoélectrioue. Un échantillon (3 ml) de la nouvelle cellulase dont on avait enlevé la dextranase a été placé au centre d'un gradient de pH (3 à 6) dans une colonne (115 ml) d'acide aminocarboxylique (Vesterberg et Svensson, Acta Chem. Scand (1966) 20, 820). Les frictions s'écoulant de la colonne à la fin de l'essai ont été examinées quant à la densité optique à 280 m, au pH, à la cellobiase et à la carboxyméthylcellulase. Les résultats sont montrés à la figure 3 des dessins ci-annexés. A la figure 3, les symboles ont les significations suivantes A=cellobiase, B=pH, C=carboxymthylcellulase, D=densité optique, E=densité optinue à 280 m , Activité de carboxyr,lPthylcellulase tXn8éslf 10 2), G=activité de cellobiase et H=nombre fractionnaire La cellobiase avait un pH isoé'ectrique de 4,35; celui de la carboxyméthylcellulase était de 5,9, tandis que celui du composant C1 était de 4,05. Un essai comparatif utilisant le composant Cl préalablement isolé de T.viride a montré un même pH isoélectrique. c) Filtration de gel sur Sephadex G-75 Une solution (5 ml) de la cellobiase obtenue après élut ion avec gradient selon le procédé (a) a été éluée à travers une colonne (43 x 25 cm) de Sephadex G-75; le tampon d'élution était 0,01 M en NaCl et 0,005 n en NaN3. La cellobiase était bien séparée d'un composant de moindre importance, optiquement dense (comme le montre la figure 4 des dessins ci-annexés), lequel s'est montré etre du Ci par son aptitude à solubiliser la cellulose, quand il agit en synergie avec la cellobiase et la carboxymethylcellulase mélangées.A la figure 4, les symboles ont les significations suivantes : A=cellobiase, B=composant C1, CI carboxyméthylcellulase, D= densité optique à 280 m, E= activité de cellobiase (M unités), F= activité de carboxyméthylcellulase(unités x 102) et G=nonbre fractionnanre (3 ,45ml) Les propriétés du complexe total de cellulase ont été recherchées et les résultats sont donnés ci-dessous. a) Conditions optimales activité de l'enzyme. Les effets du pH et de la température sur l'activité de la nouvelle cellulase vis-à-vis d'une fornie hautement organisée de cellulose (coton) et vis-à-vis d'un déchet cellulosique typi quement àgvricole (bagasse traitée par l'alcali) ont été mesurés. Des fractions (1 ml) dtune solution à 1% de la nouvelle cellulase ont été mises à incuber durant 3 jours à diverses valeurs de pH et de température avec des échantillons (5 mg) de matière cellulosique. Pour les deux matières les conditions optimales de solubilisation étaient approximativement 400C et pH 4,5. b) Effet d'un pH inadéquat sur l'activité subséouente de la cellulase. Une solution (0,2) de nouvelle cellulase a été dialysée et maintenue à 400C durant 3 h à différentes valeurs de pH. Celui-ci a été réajusté à 4,5 et l'activité résiduelle a été mesurie vis-à-vis de coton et vis-à-vis de bagasse extraite par l'alcali. soins de 20 de l'activité vis-à-vis du coton or-t été perdus entre pH 3,8 et 6,5 et moins de 206xi de l'activité vis-àvis de la bagasse entre pH 3,3 et 6,4. c) Stabilité thermique de la nouvelle préparation de cel iulase Dans un essai préliminaire, des solutions (1, pH 4,5) de la nouvelle cellulase ont été chauffées à 500C, 60 C, 700C et 8p0C durant 10 à 30 minutes. Les activités résiduelles ont été mesurées par désagrégation de plaques de cellulose de-bagasse/ agar. L'activité s'est largement maintenue'à 600C, mais 'a disparu à 700C. Une solution (1%; pH 4,5) de la nouvelle.cellulase a, dès lors, été chauffée à 600C durant des périodes allant jus qutà 6 heures et essayée quant à I) l'aptitude à solubiliser un fil de coton; II) l'aptitude à solubiliser de la bagasse extraite à l'alcali; III) l'aptitude à produire des zones de transparence ou de désa grégation sur des plaques de cellulose de bagasse/agar; IV) l'activité de-la cellobiase; V) l'activité de la carboxyméthylcellulase; les -ésultats sont montrés à la figure 5 des dessins ci-annexés, dans laquelle A= cellobiase, B= essai sur plaque, C= carboxyméthylcellulase, D= solubilisation de bagasse extraite par un alcali, E= solubilisation de coton, F = temps de chauffage à 600C en heures et G= proportion de l'activité initiale. Le nouveau complexe de cellulase peut être préparé par culture aérobie de certaines souches de P. funiculosum sur un milieu nutritif contenant de la cellulose comme source prédominante d'hydrates de carbone, suivie d'une élimination du mycélium et de l'isolement du complexe enzymatique de la solution. Toutes les souches du P. funiculosum ne produisent pas le nouveau complexe et les microorganismes concernés sont le mieux définis comme souches cellulolytiques du P. funiculosum proùuisant de la cellulase contenant un-composant C1 thermiquement stable à 600C et à pH 4,5. Des sources de P. funiculosum particulièrement appropriées sont la souche IMI 134.755 et ses mutants, tels que DII 134.756. La souche IIiI 134.756 a été obtenue par irradiation au moyens de rayons ultra-violets d'une suspension aqueuse contenant environ 106 spores dans 2 rnl de liquide, de façon à tuer environ 99% des spores. Les spores survivantes ont été repiquées sur de l'agar nutritif de croissance et finalement séparées. Les cultures mycéliennes individuelles ont été propagées sur farine d'avoine/agar et testées pour leur activité cellulolytique. -Bien qu'il ntait pas été prouvé que des souches produites par cette voie ont réellement mute, les produits d'un tel procédé sont appelés ici "mutants" pour la commodité de l'exposé. Le milieu nutritif de fermentation contiendra une source d'azote qui sera depréférence une source organique complexe, telle qu'une liqueur de macération de mais ou de la peptone. La phase initiale de croissance produit de l'acide et il est nécessaire de fournir un moyen de réglage du pH dans le milieu pour prévenir une chute exagérée du pH. Lorsque, par exem pîe',de la craie (environ 1%) est employée comme moyen de réglage du pH, celui-ci est initialement d'environ 6,0,tombe à 4,0 et'5 et remonte jusqu'à sa valeur de départ ou à uiie valeur plus haute. La cellulase est produite surtout durant la phase-d'ascension du pH et doit être récoltée avant que le pH atteigne 7,0. Pour un rendement max 'mal, l'équilibre optimal de la source d'azote et du tampon peut être déterminé facilement par voie expérimentale. Lorsqu'on utilise de la craie comme tampon, elle est de -préféren- ce présente à une concentration de 0,5 à î,s% poids/volume, bien que des concentrations plus fortes, tout en ne produisant pas d'accroissement de rendement ne soient pas préjudiciables La concentration de la source d'azote doit fournir de préférence, de'0,04 à 0,15 de N(poids/volume)et avantageusement environ 0,09% de N (poids/volume). La source de carbone et d'énergie est à prédominance cellllosique, afin d'inciter à la production de 'cellulase à forte concentration en-C1. La demanderesse a trouvé effectivement que l'utilisation de sources d'hydrates de carbone riches en xylane produit des complexes de cellulase possédant une teneur réduite en C1, bien qu'ayant- une teneur fortement augmentée en xyîanase puissante comme décrit ci-dessous. Le substrat cellulosique est de préférence, de la cellulose de bois, du coton ou de la bagasse traitée à l'alcali. Le traitement à l'alcali de la bagasse a principalement pour but de ramollir la structure cellulosique du composant. I1 peut être effectué, par exemple, en utilisant un hydroxyde de métal alcalin ou plus économiquement de la chaux. La concentration d'hydrate de carbone est, de préférence, de l'ordre de 0,5 à 7,5% et avantageusement d'environ 1 à 2,5% poids/volume. La culture est, de préférence, effectuée par fermentation aérobie submergée utilisant une aération limitée. Dans des récipients de fermentation de 5 litres, un débit d'environ 1 litre/ min. d'air est optimal. L'âge de la culture utilisée comme inoculum paraît affecter le rendement en cellulase et l'âge optimal semble être- de l'ordre de 4 semaines. La température de de fermentation est optimalement de 25 à 30 C, par exemple d'environ 27 C. La fermentation produit habituellement une activité optimale de cellulase après environ 5 jours et, comme indiqué plus haut, ellé s'accompagne d'une élévation du pH. A l'activité opti- maie, la cellulase est récoltée par élimination des matières inso- lubles, par exemple par filtration,de de préférence, par centrifuga- tion, en utilisant, par exemple, une centrifugeuse à débit con- tinu. La séparation s'effectue avantageusement deux étapes, le pH étant ajusté à environ 4 avant la seconde clarification.La cellulase: peut alors être isolée de .de la-solution par précipitation à l'aide d'un solv"'ant': organique miscible à l'eau, tel qu'un alcool par exemple l'éthanol ou de préférence une cétone, telle-que- l'acétone. Le traitenlent s'effectue, de préférence, à froids par exemple à environ 5 C. L'isolement des constituants individueis peut s'effec- tuer psr- les procédé-s' classiques de fractionnement généralement appliqués aux enzymes et S d'autres protéines.Parmi ces procédés, on peut citer la filtration sur - ge,1, par. exemple en utilisant. des matières du type dextrane réticulées, telles que le Sephadex et ses dérivés et avantageusement le Sephadex G75; pour éviter la dégradation de tests dextranes par le composant du type dextranase puissant présent dans le complexe, ce dernier doit d'abord être. enlevé en utilisant un milieu échangeur d'ions légèrement basi- que, tel, que le DEAE Sephadex, à un pH non optimal pour ltactivi- te de la dextranase. D'autres matières gélifiées utilisables sont les polyacrylamides et les gels verre poreux. La chromatogra- milieu sur des milieux échangeurs d'ions, particulièrement ceux å base de matières du type dextrane réticulées, par exemple le DEAE Qephadex, peut aussi être avantageusement utilisée pour l'élution à l'aide d'un gradient de tarnpon. Lorsqu'on utilise le DEAE. Sephadex, le gradient de tampon est. avantageusement compris entre 5,35 et 3,5. Des milieux échangeurs d'ions acides peuvent aussi être utilisés, par exemple le sulfoéthyl (S 3 ) Sephadex et le carboxyméthyl (C M) Jephadex. Un autre procédé de fractionnement est l'électrophorèse et en particulier la focalisation ou concentration isoélectrique par exemple en utilisant une colonne d'acide polyaminocarboxyli que sous un potentiel électrique par lequel les composants sont sépares en bandes stables selon leur valeur de pH isoélectrioue. Une combinaison de procédés de fractionnement peut être avantageuse, bien que les composants enzymatiques provenant du P. funiculosum semblent se séparer plus facilement que ceux provenant du T.viride. Comrne indiqué antérieurement, les procédés ci-dessus rendent possible la séparation des composants cellobiase, carboxyméthylcellulase et C1, si on le désire, mélangés à d'autres substances actives. Quand le milieu nutritif utilisé pour la fernientation contient une proportion sensible d'un xylane, comme par exemple, lorsque le xylane de bagasse est employé, la demanderesse a trouvé que le complexe d'enzymes résultant est particulièrement riche en un composant de xylanase. Elle a trouvé, en fait, zone par une telle utilisation de xylane dans le milieu nutritif, activité de la xylanase peut être accrue 28 fois. L'exemple suivant est donné seulement à titre dtillus- tration Isolement de la souche active de P. funiculosum a) Procédé de mutation Une suspension de spores dans de l'eau stérile et des dilutions de 10, 100, 1000 fois celle-ci ont été examinees dans un hémocytomètre. Des échantillons de la suspension oui contenaient approximativement 106 spores dans 2 ml de liqueur ont été irradiés durant 5 à 7 minutes dans des boîtes de petri stériles dans une enceinte stérile, à'une distance d'environ 25,4 cm d'une lampe Philips TUV/15w. Ces conditions ont été choisies pour tuer environ 99 des spores. Chaque plaque était couverte d'eau stérile (e m). Un échantillon de 1 ml de liqueur a été prélevé et additionné à de l'eau stérile (9 ml).A ce moment cette suspension devait contenir environ 103 spores vivantes. Des fractions (0,1 ml) ont été étalées sur la surface d'une plaque d'agar stérile contenant des substances nutritives. choisies comme encourageant une croissance compacte(pour la composition voir ci-dessous . La plaque a été incubée à 250C et examinée journellement. vers que les spores vivantes individuelles avaie,lt poussé suffisamment pour pouvoir être distinguées, elles ont été prélevées et propagées sur des milieux de culture inclinés distincts à base d'vgar et de farine d'avoine. Composition de l'agar nutritif KH2P04 : (5,0 g) MgS04.7H20 : (0,5 g) Résidus solubles de distillerie : (10 g) Craie : (5,0 g) Liqueur de macération de mais : (3,85 g; - 1 gN) (NHg)2 S04 : (t,7 g; = 1 gN) dans 1 litre d'agar à 2% contenant des traces des éléments suivants Fe++ (5sppm); Zn (5 ppm); Mon++ (5 ppm); Co++ (2 ppm) b) Préparation pour l'activité cellulolytique Chacune des souches isolées a été propagée en culture agitée sur un milieu de liqueur de macération de mais-bagasse, choisi pour stimuler la production de cellulase.Les souches prometteuses ont été sélectionnées (1) par leur acceptation de ce milieu de croissance et (2) par leur production, quand elles y croissent, de liqueurs contenant de la cellulase. La cellulase a été testée sur des plaques cellulose-agar minéral (Savory, Mather, Maitland et Selby, Chem. et Ind'. (i967), 153) dans lesquelles la seule source de carbone était soit de la cellulose de Whatman, comme décrit, ou de la bagasse délignifiée extraite à l'alcali, l'une et l'autre broyées au broyeur à boulets. Entretien de la souche Des milieux de culture inclinés à base de farine d'avoine et d'agar ont été inoculés avec une suspension de spores obtenue à partir d'une culture inclinée antérieure et mis à l'incubation durant 2 semaines à 270C, puis en cas de sporution complète (ce qui est montré habituellement par la teinte rose de l'agar) durant 2 à 4 semaines à 50C. Les milieux de culture inclinés d'agar ont été préparés comme suit Composition des milieux de culture inclinés de farine d'avoine-agar De l'avoine sèche (Quaker Oat,30 g) a été pulvérisée en poudre fine et mise en suspension dans de l'eau distillée (2 1). Cette suspension a été bouillie durant 1 h et ensuite filtrée à travers 3 ou 4 épaisseurs de mousseline. Le volume a été ramené à 1 litre et de l'agar (20 g) y a été ajouté. Le tout a été alors traité à la vapeur d'eau (stérilisateur sans excès de pression) durant 30 min. pour dissoudre l'agar. Après déversement, les milieux de cultur- inclinés ont été stérilisés durant 20 minutes sous une pression de 6,8 kg. Préparation de la suspension de spores. Quatre milieux de culture inclinés de farine d'avoine et d'agar ont été chacun irrigués à l'aide d'eau stérile (5 ml). La suspension de spores résultante a été dilués 400 ml. Elle contenait environ 5 x 109 spores. Préparation de cellulose de bagasse pour le milieu de croissance et pour l'essai de solubilisation. De la bagasse a été broyée dans un moulin a marteaux à travers pour passer/un tamis de 1 mm de maille-. Elle a-ensuite été mélangée avec du MaOH à 4% dans la proportion de 1 g de bagasse pour 10 ml de liqueur et-abandonnée une nuit à la température ambln- te. Le produit a été lavé d'abord avec de l'eau, ensuite avec de l'acide acétique dilué et finalement encore avec de l'eau. Ce traitement a enlevé la majeure partie du xylane de la bagasse. Le rendement était d'environ 60%. Milieu de croissance à base de bagasse et de liqueur de macération de mais. Liqueur de macération de mais 25 g Craie 10 g Bagasse extraite à l'alcali 25 g pour un litre Le milieu a été stérilisé durant 120 min. à 0,35 kg/cm2 d'excès de pression, le pH de la post-stérilisation était d'environ 6. Préparation de cellulose de bagasse pour essais sur plaques. La bagasse a d'abord été délignifiée par traitement au chiorite. De la bagasse broyée (100 g) a été dispersée das de l'eau (3 1) à 700C et de l'acide acétique glacial (12 ml). Ensuite du chlorite de sodium à 325o (100 ml) a été ajouté. Après 30 minutes à 700C, de nouvelles quantités d'acide (12 ml) et de chlorite de sodium à 32% (loeml) ont été ajoutées. Cette addition a j'té encore répétée après 30 minutes. Après la troisième addition (30 minutes) le produit a été lavé à fond avec de l'eau et traité à la soude caustique à 4%. Le rendenlent a été de 50ss Fermentation : La bagasse traitée à l'alcali (750 g poids à sec) a-été agitée avec de l'eau (40 1) durant 12 h et ensuite ajoutée à une quantité supplémentaire d'eau (40 1) dans un récipient (189 litres) de fermentation. La suspension a été stérilisée à SOC durant 30 minutes,à 900 durant 30 minutes et ensuite à 1200 durant 120 minutes.Après refroidissement elle a été agitée pendant 18 h à 20-25 (la quantité de bagasse utilisée a donné moins que la concentration optimale trouvée au cours des essais à petite échelle, mais a été choisie à cause des difficultés rencontrées dans la stérilisation des suspensions de bagasse à cette échelles De la liqueur te macération de mais L2,5 kg; 2,5% N (poids/volume)J a été mélangée à de l'eau (10 1) et ajoutée à le bagasse. Le pH était dans le domaine 4,3 - 4,5 à cette phase. Le mélange a été stérilisé par chauffage à 500C durant 30 min., à 900C durant 30 brin. et ensuite à 1200C durant 90 min.De la craie (Sturcal F; 500 g) en suspension dans de l'eau distillée (3,5 1) 9 été stérilisée à 1200C durant 6 h, puis ajoutée à la bagasse/liqueur de macération de mais refroidie et mélangée par agitation à raison de 350 tours/min. durant 1 h. La vitesse d'agitation a été réduite à 250 tours/min. et le milieu 9 été inoculé avec 5 x 109 spores de la souche 2GI 134.756 de P.funiculosum. Le milieu de fermentation a été incubé à 270, agité à 250 tours/min. et aéré à raison de 0,028 à 0,056 m3 par minute. Lj croissance a débuté après 2 jours. Elle était bien établie après 3 jours; l'activité de la cellulase dans le liquide surnageant était maximale après 5 jours environ sous ces conditions de croissance. et s'est produite au moment où le pH, étant tombé, a recommencé ê s'élever. Isolement : La liqueur de fermentation a été récoltée et clarifiée par un seul passage à travers une centrifugeuse à écoulement continu pour donner approximativement 2,3 kg de substance solide. Le pH de la liqueur clarifiée a été ajusté à 4,0 par addition d'acide chlorhydrique tout en agitant rapidement et la température a été ramenée à 50C. La liqueur froide a été re-clarifiée par un passage supplémentaire à travers la centrifugeuse à écoulement continu et 3 volumes d'acétone à -200C ont été ajoutés. La solution a été maintenue une nuit entre 2 et 50C, le liquidesurna- geant a été décanté et le précipité solide récupéré par centrifugation. Une poudre friable a été obtenue en broyant le solide sous dicétone à -200C. Le produit final a été obtenu par filtration sur verre fritté ou sur papier-filtre. Le rendementétait d'environ 280 g (0,3%) de préparation brute d'enzyme sèche. La préparation brute a été alors purifiée et séparée pour donner le composant C1 purifié par les procédés décrits plus haut. Synergie entre le composant C1 et d'autres composants du nouveau système de cellulase et d'autres svstèmes de cellulase. Des échantillons du cornposant Cx purifié provenant de la nouvelle cellulase ont été ajoutés à des échantillons des composants Ci provenant de la nouvelle cellulase et du Trichoderma viride; les solutions de Cx provenant des deux organismes ont été ajustées pour avoir les mêmes activités en cellobiase et en carboxyméthylcellulase. La solubilisation de coton produite par chaque mélange et par diverses dilutions de ceux-ci a été mesurée et il a été trouvé que le composant C1 de la nouvelle cellulase pouvait agir en synergie avec le composant Cx du T.viride. Compatibilité de la cellulose avec d'autres préparations de cellulase déficientes en activité C La préparation commerciale japonaise Amano AP3 présente une haute e activité en carboxyméthylcellulase et une certaine acti- vité en cellobiase, mais son action cellulolytique est relativement faible.Sur une plaque de cellulose de bagasse-agar, on La obtenu des zones de transparence ou de désagrégation mal définies qui suggéraient une diffusion du système enzymatique avec solubi- lisation incomplète du substrat en suspension. L'addition d'une solution de la nouvelle cellulase a conduit à la production de zones claires.Il a été montré par un second essai dans lequel un échantillon de composant C1 purifié de la nouvelle cellulase était utilisÉ que cet effet était dû à l'activité additionnelle de C1 fournie par la nouvelle cellulase. Les ones mal définies produites par la préparation AP3 utilis seule ont été remplacées par des zones claires bien définies, auand C1 a été ajouté; le composant Ci seul a produit une légère transparence visible. XEJIPLE 2. Culture de P. funiculosum sur xylanede bagasse Agents nutritifs - Liqueur de macération de mais (C.S.L.) (Glaxo Labora- tories Ltd.) - Craie Sturcal (John and E. Sturge Ltd.) - Xylane - préparé par précipitation au moyen de l'acide acétique du xylane produit lorsque de la bagasse est extraite par ld soude caustique à 4. Un milieu (50 ml) contenant 2,5 de liqueur de macération de mais, 1,4% de xylane de bagasse et 0,5% de craie a été inoculé par des spores de la soucne SiI 134.756 de P.funiculosum et mis à croître en culture agitée à 270C durant 6 à 7 jours. Mode opératoire de l'essai Des fractions (0,10 ml) de la solution à essayer ont été mélangées avec environ 3,5% de xylane (3,0 ml) à un pH de 5,5 et mises a incuber à 400C durant 30 minutes. De la soude caustique à 60Mo poids/poids a été ajoutée et la viscosité de la solution résultante a été mesurée au visccsiii-iètre à écoulement caFillaire. On a procédé à un étalonnage en utilisant la cellulase commerciale japonaise Meicelase-P (Meiji Saika Kaisha) à des concentrations allant de 0,01 à 10,0%. Rendement en xylanase Une culture de P.funiculosum cultivée sur un milieu bagasse/liqueur de macération de mais avait une activité de xylanase équivalant à environ 0,3% de Meicelase-P. Par contre, une culture développée sur le milieu xylane -liqueur de macération de mais décrit plus haut a montré une activité de xylanase équivalant à 8s3,Cf de Meicelase-P, soit un accroissement d'activité d'un facteur de 28. Identification morphologique des souches 2fII 134.755 et 134.756 de Penicillium funiculosum IDE 134.755 Thom Des colonies poussent modérément bien à 250C sur agar de Czapek, en atteignant un diamètre de 3 à 4 cm en 7 jours. La croissance est variée, montrant des secteurs radialement plissés; à surface finement filarnenteuse, mais avec des zones visqueuses ressemblant à du cuir mouil eLe bord est diffus présentant un dégradé allant du blanc/au vert gris-pale; dans la colonie principale, la colonie est rosatre et jaune dans la zone humide au centre. De nombreuses goutelettes rougeâtres colorent la colonie dans la zone sub-oentrale. Le verso est incolore à blanc au bord, devenant irrégulièrement rouge avec la zone du dessous du mycelium- ayant l'aspect de cuir blanc à blanc pale avec un halo de pigment blanchâtre diffusant dans l'agar. Il n'ya pas d'odeur. Les colonies sur malt-agar croissent légèrement plus vite que sur l'agar de Czapek en atteignant un diamètre de 4,5 5 cm en 7 jours à 25 C: ces colonies sont légèrement ondulées radialement au centre, avec une surface filamenteuse, un bord et un centre ayant l'aspect de cuir mouillé. Le bord est incolore devenant blanc pâle, vert dans un secteur et rouge au centre, avec des goutelettes rouges dans le secteur vert. L'envers est incolore sur le bord et rouge au centre, la couleur étant plus intense dans le secteur vert; la couleur ne diffuse pas sensiblement dans l'agar. Il n'y a pas d'odeur. La croissance est très filamenteuse avec des structures de conidies prenant naissance à la surface des cordons des hyphes ou des houppes, bien que certaines proviennent du feutre de base. Il y a des chaînes de conidies formant des amas enchevêtrés. Têtes des conidies Celles-ci sont typiquement bi-verticillées symétripues, présentant une apparence tout à fait symétrique, mais fréquemment porteuses de phialides et de metulae à différents niveaux. Il y a aussi quelques têtes fragmentaires présentes. Les têtes sont typiques pourvues de metulae et des phialides, mais dans certains cas avec trois niveaux, soit avec un conidiDphore central croissant pour produire une seconde couche de metulae, 30it avec une ramification occasionnelle. Les metulae sont souvent au nombre de 5, mais occasionnellement plus nornbreuses et sans tête, parfois une seule branche courte portant seulement des phalides. Conidiophores Ces derniers sont lisses et de longueur très variable, tout à fait courts lorsqu'ils naissent sur des yphes rampants ou des petites touffes, longs à 7 à 20 , mais souvent plus longs, quand ils proviennent de grands cordons ou du feutre de base; ils peuvent alors atteindre jusqu'à 150 4 ou plus. Ils sont bien uniformes en diamètre, habituellement de 2,5 à 3 u. - Metulae 7 - 1l R 2 à 2,5 R lancéolées Phialides : sont approximativement parall-èlef, graduellement effilées vers l'extrémité, le plus souvent de 9-12 x 2 . Les conidies sont presque sphériques à très légèrement elliptiques, unies à très finement rugueuses, donnant parfois l'impression de présenter un point aux deux extrémités, 2,6 3,2 x 2,2 - 2,8 i. Des conidies plus grandes occasionnelles sont nettement elliptiques et atteignent jusqu' 6 x 4 0 Penicillium funiculosum 'Ml 134.756 de Thom Des colonies sur agar de Czapek croissent modérément bien à 250C atteignant un diamètre de 3 - 4 cm en 7 jours. La croissance est variée montrant des secteurs radialement plissés, à surface finement filamenteuse, mais avec des zones visqueuses ressemblant à du cuir mouillé. Le bord est diffus, présentant un dégradé allant du blanc au bleu pale, gris-vert à vert plus foncé ou rostre au centre.Le verso est blanc au bord, avec des zones irrégulières teintées de rosâtre au rouge-marron, vers le centre et une zone de pigment blanchâtre diffusant dans l'agar. Il nty a pas d'odeur. Les colonies sur nwlt-agar croissent plus vigoureusement que sur agar de Czapek, atteignant un diamètre de 4,5 - 5 cm en 7 jours à 250C, légèrerrlent ondulées au centre, fortement filamenteuses, avec un bord ayant l'aspect-du cuir mouillé et des secteurs ayant l'aspect du cuir mouillé, blanc papale à blanc devenant rosâtre et vert au centre, avec de nombreuses goutelettes rosâtres. Le verso est incolore au bord et rouge au centre, ne diffusant pas sensiblement. I1 n'y a pas d'odeur. Les colonies sont filamenteuses avec des zones plus ve butées sur les bords, les conidiophores naissent le plus souvent sur les~hyphes rampantes ou sur des cordons d'hyphes, bien que quelques unes proviennent du feutre de base. Têtes de conidies Celles-ci sont habituellement régulières avec plus ou moins les mêmes couches de metulae et de phialides, souvent 5 metulae, mais avec des têtes plus petites et certaines plus grandes. Conidiophores Lisses, ils sont de longueur variable : courts, quand ils proviennent d'hyphes rampantes et de cordons de hyphes, mais plus longs, jusqu'à 150 à 200 ti ou -davantage lorsqu'ils proviennent de gros cordons ou du feutre de base. Ils ont un diamètre plus ou moins uniforme, le plus souvent de 2,5 - 3 u. Metulae Elles ont parfois une longueur légèrement variable, celles qui sont au centre étant plus longues, 10-13 x 2 -2,5 4 Phialides Celles-ci sont au nombre de 5 à 8; elles sont effilées, lancéolées et approximativement parallèles, 10-12 x 1,8-2,2 . Les conidies sont courtes, ovales, lisses à très finement rugueu ses 2,5-3 x 2-2,5 . Digestion de papier-filtre macéré (a) Préparation du substrat Des bandes de papier-filtre découpées en bandelettes de 1,27 cm de large ont été pesées de manière à obtenir des échantillons de 50 mg et placées dans des tubes à essai. On a ensuite ajouté de l'hydroxyde de sodium (4S, 10 ml) à chacun des échantillons qui ont été abandonnés jusqu'au lendemain. Le jour suivant, les tubes à essai ont été bouchés et agités pour disperser les fibres. Les fibres ont été séparées par filtration sur un tampon de laine de verre, laves avec de l'acide acétique 0,1 , puis avec de l'eau et enfin avec une solution tampon de pH 4,5. Les échantillons ont été séchés par compression, placés dans des flacons a incubation et portés à 0,2 g par addition de la même solution tampon à chaque échantillon. Toutes les solutions tampons utilisées contenaient 0,03% poids/poids d'azide sodique, pour maintenir la stérilité. (b) Digestion Deux échantillons contenant 4,8 ml d'une solution à 1% de complexe de cellulase de Penicillium funiculosum selon l'inven- tion (produit par précipitation à l'acétone) tamponnée à pH 4,5 ont été incubés à 550C pendant 6,5 jours, après quoi la cellulose résiduelle a été séparée par filtration sur un, tampon de laine de verre. Le résidu a été lavé avec de l'ammoniac 0,1N, puis avec del'eau, après quoi il a été dissous dans du bichromate de potassium dans de l'acide sulfllrique à 50% volume/volume (0,36 N). Les échantillons ont ensuite été titrés avec du sulfate ammonique ferreux en solution 0,2 E et les titres ont été comparés à un étalon ne contenant pas de cellulose et un témoin contenant de la cellulose, mais pas d'enzyme. (c) Résultats Calculs : % de solubilisation = 100 - go de cellulose restante = 100 T étta1Onn T échantillon x.100) fio étalon - T témoin Le titrage moyen obtenu pour l'étalon a été de 45,8 ml Le titrage moyen obtenu par le témoin a été de 15,0 ml Les échantillons ont donné des titrages de 29,0 et 29,2 ml, ce qui correspond à une solubilisation de 45,79$ Des essais silssilaires effectués avec la préparation japonaise de cellulase Amano Ap3 et avec de la Meicellase à la même concentration ont donné des titrages de 18,9 et 18,7 ml ainsi que de 26,4 et 26,4 ml respectivement, ce qui correspond à des solubilisations moyennes de 12,34 et 37,02 respectivement. Une digestion à l'aide d'un mélange 50:50 de la préparation Amano Ap3 et de 5,sIeicellase à la même concentration totale en enzyme a donné une solubilisation réduite de 30,85%. Une digestion à l'aide d'un mélange 50:50 de la préparation Amano Ap3 et de la cellulase suivant l'invention, mais à la même concentration totale en enzyme a donné une solubilisation accrue de 47,74%, ce qui montre qu'unie synergie a eu lieu. REVEND ICAT IONS 1- Des composants C1 des complexes de cellulase dérivés de souches de Penicillium funiculosum, caractérisésen ce qu'ils possèdent -a) une stabilité thermique à pH 4,5 d'environ 6 heures à 60 C,l'ac- tivité de solubilisation de l'amidon ayant une demi-vie de 20 à 40 minutes environ à 650C; b) un poids moléculaire d'environ 57.500, tel que mesuré par la méthode de Selby et Maitland (Biochem.J(1965) 94, 578); c) ) une stabilité au pH à400C entre pH 2,75 et 7,0; et d) un pH isoélectrique de 4,05 tel que mesuré par la méthode de Vesterberg et Svensson (Acta Ghem.Scand.(I966) 20, 820). 2. 2. - Un composant C1 suivant la revendication 1, dérivé de la souche I4I 134.755 de P.funiculosum ou de ses mutants. 3- un composant Cl suivant la revendication l, dérivé. de la souche IMI 134.756 de P.funiculosum. 4- Un composant C1 suivant la revendication a3 conjointement avec avec un ou plusieurs composants choisis parmi/les composants res- tants de cellulose du complexe de cellulase dérivé d'une souche de Penicillium funiculosum, (b) le composant Cx d'un complexe de cellulase dérivé d'un organisme différent et (c) le composant C1 du complexe de cellulase dérivé dudit organisme différent. 5- Un mélange à base de cellulase suivant la revendication 4 dans lequel le complexe de cellulase ou les composants de celui-ci dérivés d'un organisme différent sont dérivés du Trichoderma viride ou du Trichoderma koningii 6- Un procédé pour la préparation d'un mélange à base de cellulase suivant la revendication 4 dans lequel on cultive en milieu aérobie une souche cellulolytique de P.funiculosum produisant de la cellulase contenant un composant C1, thermiquement stable à 600C et à pH 4,5, sur un milieu nutritif pour celui-ci, contenant de la cellulose comme source prédominante d'hydrate de carbone,puis on élimine le mycélium et on isole le complexe enzymatique du milieu. 7- Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel la souche du P.funiculosum est la souche IMI 134.755 ou un de ses mutants. 8- Un procédé suivant la revendication 7, dans lequel la souche du P.funiculosum est la souche IMI 134.756. 9- Un procédé suivant la revendication 6,dans lequel le milieu nutritif contient (a) une source d'azote, et (b) un moyen de réglage du pH. IO- Un procédé suivant la revendication 9, dans lequel le moyen de réglage du pH est la craie. ll- Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel la cellulose utilisée est de la cellulose de bois, du coton ou de la bagasse traitée à l'alcali. I2- Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel la coincez tration en hydrate de carbone du milieu nutritif est de 0,5 à 7,5 ss poids/volume. 13- Un procédé suivant la revendication I2 dans lequel la concentration en hydrate de carbone du milieu nutritif est de 1% à 2,5 I4- Un procédé suivant la revendication 9, dans lequel la source d'azote dans le milieu nutritif est à raison de 0,04 à-O,I5 ffi de N poids/volume. I5- Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel la celui lase est isolée de la solution par un solvant organique miscible à l'eau choisi parmi les alcools et les cétones. I6- Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel le mélange à base de cellulase utilisé pour la préparation du composant C1 selon la revendication l est soumis à un fractionnement par un ou plusieurs procédés choisis parmi la filtration sur gel, la chromatographie sur échangeur d'ions et l'électrophorèse. I7- Un procédé suivant la revendication I6, dans lequel la filtration sur gel est effectuée en utilisant des matières à base de dextrane réticulées, des polyacrylamides ou des gels poreux de verre, la chromatographie sur échangeurs d'ions est effectuée sur des milieux échangeurs d'ions à base de matières du type dextrane réticuliées et l'électrophorèse comprend la focalisation isoélectrique. I8 Une variante du procédé suivant la revendication 6, dans laquelle le milieu nutritif utilisé pour la fermentation contient une proportion sensible de xylane, ce qui permet la production d'un mélange à base de cellulase riche en composant de xylanase. I9-La souche IMI In4.755 de Penicillium funiculosum et ses mutants 20-La souche IMI Il.756 de Penicillium funiculosum et ses mutants. 2I-Un procédé pour la prolifération de la souche I34.755 ou Ion4.756 de Penicillium funiculosum, dans lequel ledit organisme est cultivé sur un milieu nutritif. 22- Un procédé de dégradation de formes hautement organisées de cellulose, dans lequel on traite ces formes avec un mélange à base de cellulase suivant la revendication 4 ou 5.