FR 2028036 A1 19701009 FR 6900403 A 19690114 La présente invention concerne un milieu de culture pour l'obtention d'amylases et de protéases à l'aide de bactéries du-genre Bacillus subtilis en immersion et un procédé de trai- tement du milieu.fermenté pour obtenir un produit finiO On connaît l'utili~sation des farines de céréales s farine de soja, d'haricots, de pois, comme sources de matières premières dans les milieux de culture producteurs d'amylases et de protéases; on connatt aussi l'utilisation des tourteaux de coton ou d'arachides, du son de blé, des- amidons, de la farine de pommes de terre, de la partie soluble de la drêche provenant de la -fabrication de l'alcool de céréales, de la levure, etc.. Ces composants du milieu présentent l'inconvénient de mener à de bas rendements correspondant au maximum à 100 unités SEB/ml, certains composants comme les farines de eéréales, les haricots, les pommes de terre, etc0. étant en outre des produits chers et largement utilisés dans l'alimentation -humaineO Pour 8trie transformés en produits finis, les milieux fer mentés doivent subir des opérations telles que concentration sous vide à basse température, précipitations avec des solvants ou des sels, purifications par dialyse ou passage sur des échan gears- d' f vies d'élutions, les solutions obtenues étant concentrées puis atomisées ou séchées. Ces opérations permettent d'obtenir des produits concentrès (3000-10000 unités SKB/g) qui sont ultérieurement dilués au niveau désiré suivant les divers domaines d'application0 Dans le cas de l'utilisation des préparations enzymatiques sous forme diluée, comme par exemple dans le secteur zootechniqueS les procédés mentionnés présentent les inconvénients suivants : ils entrainent la perte de quelques-uns des -facteurs biologiquement actif qui existent dans le milieu de culture, ils impliquent la transformation en produit fini en deux, trois stades et nécessitent pour l'élimination de l'eau dumi- lieu fermenté un appareillage compliqué tant en ce qui concerne sa construction que son entretien -(centrifugeuses, concentrateurs sous vide à haute vitesse et grande capacitéS atomiseurs, études de séchage ou cylindres fonctionnant dans un courant d'air ou sous vide), tandis que le produit concentré obtenu: sous forme sèche nécessite une série d'opérations ulté rieures avant d'être incorporé dans les fourrages. : broyages homogénéisation avec des diluants, tamisage, granulation et mé lange avec le fourrage, La présente invention élimine les inconvénients mentionnés par le fait qu'on utilise un milieu de culture contenant de la farine et du tourteau de-tournesol, le tourteau ayant aussi le r8le d'agent anti-mousse-grâce à sa teneur en huile (environ 20 %); dans le cas de l'utilisation des enzymes dans la nourri ture animale, les composants du milieu constituent des supports et des diluants des enzymes tandis que pour le conditionnemel1ù, le milieu est absorbé intégralement sur un- support à grande Ca- pacité d'imbibition, préférablement un fourrage (par exemple du son de blé) et séché dans un courant d'air chaud, en lit fluidi sé ou dans un séchoir pneumatique à une température convenable. Quelques exemples d'application de l'invention sont donnés ci-après : 10- Dans un fermenteur de 500 1 de capacité, on introduit 15 kg de farine de tournesol, 3,750 kg de tourteau de tournesol, 6,125 kg de farine de mais, 250 1 d'eau et 200 ml de NaOH à 40 %. Après la stérilisation, le pH doit être de 6,9 - 7,20 La stérili sation dure 30 mnO à 1200 C sous agitation mécanique en admet- - - tant endant 15 mn de la vapeur d' eau- directement par tous les raccords d'admission de l'appareil et en continuant la stéri lisation pendant les autres 15 mn. à l'aide de la chemise à vapeur seule. après le refroidissement du milieu-de culture à 370 C, on ensemence soit avec 1,5 1 d'inoculum végétatif d'une souche sélectionnée de Bacillus subtilis forme-R,- cultivée pen dant 18-22 heures en immersion dans le même milieù que celui servant à la fermentation, soit avec 250 ml de suspension dans du sérum physiologique du même micro organisme cultivé à 370 a pendant 24 heures sur gélose nutritive à 2 % (4 --vases d'Erlenmer de 500 ml contenant chacun 15 ml de milieu)0 Tant à la prépara tion de l'inoculum végétatif -qu'à la réalisation du processus de fermentation, on utilise les mêmes paramètres de culture, à savoir : température 370 C, pression 0,2-0,5 atm, aération 1 1 d'air/l de milieu/minute, agitation~-180-tours/mnç A partir de la vingtième heure de culture on préleve des échantillons pour vérifier l'activité enzymatique jusqu'à ce que cette dernière soit constante pendant un intervalle de 2 heures. Après 24 heures de fermentation, on a atteint 170 unités SKB/ml et 5 unités gélatinolytiquesXmlO Les unités SKB représentent le nombre de grammes d'amidon soluble (Lintner) qui, en présence de béta-amylase sont dextrinisés par 1 gramme de préparation enzymatique au cours de 60 mn à 300 C et sous un pH de 5,7 (solution de phosphate 0,2 N-acide citrique 0,1 E). L'unité gélatinolytique représente la quantité d'enzyme qui produit la liquéfaction d'un gramme de gélatine dans les conditions suivantes : substrat gélatine à 5 ffi tamponné 1:1 avec une solution tampon de phosphate 0,2 X, pH = 7,0, tempé- rature de l'hydrolyse 300 C, durée 90 mn, suivie par le maintien des échantillons pendant 30 mn à 0 C. Pour le calcul, on prend en considération ltéchantillon dans lequel a eu lieu la liquéfaction de la gélatine dans les conditions mentionnées. Le milieu fermenté contenant les concentrations enzymatiques mentionnées est traité par divers procédés pour Strie transformé en produits enzymatiques concentrés ou dilués, selon la nécessité. Afin d'obtenir un produit d'usage zootechnique, on a procédé comme suit 20 kg de milieu fermenté ont été homogénéisés avec 20 kg de son de blé. Le matériau semi-solide obtenu a été introduit dans un séchoir pneumatique discontinu0 Dans la par tie inférieure de l'appareil pénètre un jet d'air chaud à 45-500 C qui pousse avec pression le matériau humide vers la partie supérieure du sac de toile fixé au corps de l'appareil de sorte qu'à l'intérieur de l'appareil les particules de matériau se trouvent en mouvement continuo Après 45-60 mn, on a obtenu 19,700 kg de préparation enzymatique à 170 unités SEB/g (alpha-amylase), 5 unités gélatinolytiques/g et 3-4% d'humidité0 la préparation obtenue, broyée et homogénéisée est utilisée telle quelle dans les fourrages combinés. En humectant pour la seconde fois en proportion de 0,8-1 part pour 1 part de son de blé et en séchant dans les mimes conditions, on obtient un produit à 340-360 unités SKB/g, 10-12 unités gélatinolytiques et 3-4% d'humidité, En appliquant la procédure décrite, on peut obtenir des préparations de concentrations croissantes selon le nombre d'humectations. Exemples : - 3 humectations 460 - 480 unités SEB/g - 4 humectations 630 - 660 unités SKB/g - 5 humectations 780 - 800 unités SIIB/g Le rendement en activité enzymatique du produit fini, calculé par rapport à la concentration enzymatique du milieu fermenté est de 94-96 %, les pertes enregistrées étant dues seulement aux manipulations. 20- En travaillant dans les mêmes conditions mais sur un milieu contenant seulement de la farine et du tourteau de tour- nesol, on obtient des rendements inférieurs, environ 120 unités SKB/ml et 4 unités gélatinolytiques/ml. l'invention présente les avantages suivants - on utilise, au lieu des matières premières d'usage alimentaire, la farine de tournesol, une matière première peu onéreuse étant un déchet industriel à usage limité (seulement comme fourrage); - on utilise le tourteau de tournesol qui, à part l'apport en facteurs nutritifs et sels minéraux, remplace d'une manière avantageuse l'huile de tournesol par son rôle d'agent antimousse;; - on peut utiliser les composants du milieu comme support et diluant dans le cas de l'utilisation de la préparation en zootechnie, - on réduit le nombre des phases technologiques du traitement du milieu conformément aux technologies actuelles - l'appareillage utilisé pour l'élimination de l'eau est de construction simple et facile à entretenir - on assure la conservation des principes actifs qui peuvent se dégrader au cours du traitement sous l'action des agents physiques ou chimiques - on peut diluer sur un support solide, successivement soit le même principe actif, soit différents principes aetifs obtenus par biosynthèse (enzymes, vitamine B2, lysine, etc...); ; - en cas de l'utilisation du produit en zootechnie, comme adjuvant an fourrage9 le procédé confère au produit des proprietés granulométriques qui le rendent supérieur aux produits obtenus selon la technique antérieure, par le fait qu'il possède comme support des principes actifs, le fourrage lui-même ou un élément dudit fourrage; - on peut utiliser aussi d'autres supports, par exemple de la sciure de boise - REVENDICATIONS 1.- Milieu de culture pour la préparation d'amylases et de protéases bactériennes, carac-térisé en ce qu'il est constitué par de la farine et du tourteau de tournesol, seuls ou associés à la farine de mais, le tourteau ayant aussi le rale d'agent anti-mousse grâce à l'huile qu'il contient, les composants du milieu constituant des supports et des diluants des enzymes, dans le cas de l'utilisation des enzymes dans la nourriture animale. 2.- Procédé pour le traitement du milieu fermenté selon la revendication 1, en vue de l'obtention des produits finis destinés au secteur zootechnique, caractérisé en ce que l'on dilue et sèche les composants biologiquement actifs des milieux de culture par l'absorption de toute la masse fermentee à la surface et dans la masse du support0 3.- Procédé pour le traitement des milieux fermatés selon la revendication 2, caractérisé en ce que lgon utilise comme support pour la dilution et le sechagetdes composants naturels utilisés couramment dans la composition de mélanges fourragers et contenant des celluloses, hemicelluloses, pectines, etc... aptes à absorber dans leur masse les milieux fermenté s0