FR 2004994 A1 19691205 FR 6909502 A 19690328 69 09502 2004994 i La présente invention concerne un procédé de fabrication de polysaccharides ayant un effet antitumoral, et formés essentiellement de restes de D-glucose réunis par des liaisons 5 Le procédé conforme à la présente invention, pour la fabrication de polysaccharides à propriétés antitumorales et formés essentiellement de restes de D-glucose réunis par des liaisons fi-(l—*5), est caractérisé par la mise en oeuvre, dans un ordre facultatif, d'une ou plusieurs des opérations ci-après. 10 a) On traite des spores , sclérotes ou nycéliums, de champignons appartenant aux îamilles Ascomycetes, Basidiomycetes et Fungi imperfecti, par l'eau ou par une solution alcaline On mélange, soit les extraits ainsi obtenus, soit le filtrat d'une culture en milieu liquide de ces champignons avec un solvant 15 organique miscible à l'eau. On recueille le précipité formé, ou bien on ajoute un acide au milieu en vue de rendre celui-ci légèrement acide et de pouvoir séparer un précipité. b) On soumet le produit à une dialyse vis-à**vls de l'eau afin de recueillir une substance non dialysable. 20 c) On fait passer le produit à travers des colonnes de résines échangeuses d'ions et on recueille l'effluent. d) On traite le liquide par un charbon actif, afin de recueillir la substance non adsorbée. Description détaillée de l'invention. 25 Les champignons utilisés dans le cadre de la présente invention appartiennent aux classes et ordres suivants: A - Ascomycetes Famille des Pyrenophoraceae, de l'ordre des Sphaeriales. Familles des Bulgariaceae, Helvellaceae et Pezizaceae 30 dans l'ordre des Pezizales. B - Basidiomycetes sous-classe des Homodasidiae Familles des Tricholomataceae, Agaricaceae, Boletaceae, Russulaceae , dans l'ordre des Aga'ricales. Familles des Clavariaceae, Cantharellaceae, Corticiaceae 35 et Polyporaceae, dans l'ordre des Aphyllophorales. Ordre des Phallales Ordre des Lycoperdales Familles des Tremellaceae et Aurlculariaceae dans la sous-classe des Heterobasldiae. 69 09502 2 2004994 C- Fungi imperfecti Dematiaceae dans l'ordre des Moniliales. Ces champignons se développent bien dans les milieux de culture usuels et produisent, dans le milieu liquide de 5 culture, les polysaccharides antitumoraux de la présente invention. Comme sources de carbone, on utilise le glucose et le saccharose. Comme sources.d'azote, on peut employer, soit des composés minéraux comme le nitrate de sodium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium et le chlorure d'ammonium, soit 10 des dérivés organiques comme l'urée et les amino-acides. Des additions de petites quantités de sels de magnésium et de phosphates comme sels minéraux au milieu de culture donnent de bons résultats. On obtient également de bons résultats par addition d'extrait de levure, de peptone ou de thiamine. Le pH optimal du milieu liqui-15 de de culture est compris entre 3 et 6, la température de culture étant d'autre part voisine de 25 à 30°C. Le milieu est cultivé pendant un temps variable suivant l'espèce de champignon, mais généralement compris entre 3 jours et 3 semaines. Pour l'extraction et la purification de la substance 20 active du milieu de culture liquide conformément à la présente invention, le milieu, une fois la culture terminée, est filtré ou centrifugé cte façon à séparer les mycéliums et le filtrat obtenu est mélangé avec un solvant organique miscible à l'eau-commeleméthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol ou l'acétone, 25 de façon à provoquer un précipité. La concentration du solvant organique introduit est de préférence comprise entre 20 et 66% en volume. Suivant les circonstances, la solution contenant le principe actif est soumise à une ou plusieurs des opérations ci-après, 30 dans un ordre facultatif, afin d'éliminer de faibles quantités d'ions minéraux et autres impuretés. A cet effet, on concentre la solution sous pression réduite, on en élimine les protéines en réglant le pH à une valeur'comprise entre 1 et 4, par addition d'un acide organique (acétique, formique, succinique ou trichlora-35 cétique) ou minéral (chlorhydrique, sulfurique ou phosphorique), la solution.est décolorée par le charbon actif, dialysée dans l'eau courante et passée sur des colonnes de résines échangeuses d'ions. Après ces opérations, on peut ajouter un solvant organique pour précipiter le principe actif. 69 09502 3 2004994 Pour extraire le principe actif des "Spores des sclérotes • et/ou des mycéliums- ces matériaux de départ sont agités énergi-quement dans l'eau ou dans une solution alcaline, soit à la température ambiante, soit à une température supérieure. Les 5 matériaux peuvent être broyés ou homogénéisés afin d'améliorer 1 extraction. Comme solution alcaline, on peut employer une solution de soude ou de potasse caustiques de concentration inférieure à 5 N. L'extrait est neutralisé, concentré, et éventuellement purifié, et le polysaccharide (principal actif) à action 10 antitumorale est obtenu comme dans le cas de filtration de la culture. Dans certains cas, l'extrait alcalin est neutralisé, précipité par un solvant organique, puis soumis à une dialyse ou à une élimination de sels par résines échangeuses d'ions. On peut répéter ces opérations en vue d'obtenir un polysaccha-15 ride (principe actif) de pureté plus élevée. Le principe actif obtenu conformément à l'invention est une poudre blanche ou blanc-grisâtre et non hygroscopique, constituant une substance à poids moléculaire élevé qui ne traverse pas une membrane semi-perméable. Il se dissout lentement dans 20 l'eau, mais est insoluble dans la plupart des solvants organiques. Sa solution aqueuse est neutre, et relativement stab.e aux acides, aux alcalis et à la chaleur. Par hydrolyse de la substance par un acide et examen par chromatographie sur papier des produits de cette hydrolyse, on constate que les sucres de bases sont 25 principalement formés de glucose. Le produit est donc essentiellement un glucane, mais, suivant les cas, il peut également contenir une petite quantité de xylose, de mannose et de galactose. La substance présente les propriétés générales des polysaccharides: elle donne des réactions positives de Molisch, de Bial, de Dubois, 30 Dische, au tryptophane-acide sulfurique, et à l'anthrone. La réaction à la ninhydrineest négative. Elle est également négative avec la liqueur de Fehling et 1*iode-amidon. Le polysaccharide suivant l'invention subit une hydrolyse partielle par incubation avec le P-(l—'^-glucanase (Reese et Mandel, 35 Car. J.Microbiol., 5.173 (1959) et l'on peut donc le corsidérer comme un glucane dont; la chaîne principale est formée de restes D-glucose à liaison P-(l—*3). On peut identifier dans l'hydrolysat la présence de gentibiose, ce qui permet de conclure à la présence de chaînes latérales fH 1—>6). On peut obtenir par la méthode classique 69 09502 4 20.04994 10 15 20 25 les dérivés méthyle, acétyle, carboxyméthyle,acide sulfoniqué et acide phosphorique de ce polysaccharide, ainsi que des produits partiellement hydroly sés,par traitement par des enzymes, des acides ou des bases. Ces produits présentent des solubilités à l'eau et des viscosités différentes de sels du polysaccharide original, mais ils possèdent tous une activité antitumorale. L'activité antitumorale du principe actif obtenu conformément à l'invention a été étudiée en utilisant une forme solide du sarcome 180 chez la souris. Pour chacune des expérienœs sur animaux, on a utilisé deux groupes de souris pesant chacune environ 20 g. Chaque groupe était formé de dix souris, un groupe servant de témoin, c'est-à-dire ne recevant pas de traitement. Dans chaque groupe, les ani- r maux ont reçu une inoculation de 5. 10 cellules de sarcome 180 par voie sous-cutanée dans l'aine droite. Les animaucdu groupe traité ont reçu, 24 heures après l'inoculation, une dose intrapéritonéale de produit suivant l'invention, puis une dose tous les jours suivants avec un total de 10 fois, J^u bout de 25 jours, la tumeur a été extraite et on a étudié son poids moyen, l'augmentation moyenne de poids de l'animal, le taux d'inhibition de la tumeur, le nombre de tumeurs ayant régressé, et la mortalité des animaux. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. Ce tableau permet de constater que la substance suivant l'invention administrée à des doses de 2 à 15 mg par kg, possède un taux d'inhibition d'environ 90$ vis-à-vis de la forme solide du sarcome l80. D'autre part, la tumeur a régressé chez la majorité des animaux. TABLEAU 1 Souche 50 35 Ie série d'expériences Témoin - Cochliobolus sativas,C " " ,W Cladosporium fluvàm,A Carboxymethyl pachyman Sclerotinia sclerotiorum Glucane dégradé par des enzymes préparé à partir* de Sclerociria Sclerotiarur ; - 2,1 2 1,6 2 1,8 5 2,0 25 1,9 10 *2,4 2 1,9 Changement de poids moyen (g) Mortalité Taux c&ihi- bition % 0/10 0/10 0/10 0/10 0/9 0/10 0/10 'Nombre de régressions (%) ■95 90 85 82 96 84 0 60 50 40 33 50 40 69 09502 5 2004994 Souche Dose (mg/kg) Changement de poids moyen (g) Mortalité Taux d'inhibition m Nombre de régressions^ 2esérie d'expériences Témoin - 2,3 0/10 - 0 Sclerotinia sclerotianjm, C 5 2,0 0/10 95 50 " "A 10 1,5 0/10 93 50 Cortcium centrifugum,A 2 2,1 0/10 90 30 Flammulina velutipes,W 10 1,6 0/10 93 50 " " , A 10 2,1 0/10 94 50 Pholiota nameko,W, 5 2,6 0/10 80 30 " " , A 10 2,0 0/10 90 40 Tricoloma aggregatum,A 10 1,5 0/10 80 30 A: Extrait alcalin C: Filtrat de culture W: Extrait aqueux 15 Etant donné que l'incubation "in vitro" des cellules de la tumeur pendant 3 heures environ dans une solution aqueuse du polysaccharide à haute concentration ne détruit pas ces cellules, ce polysaccharide est différent des agent anticancéreux dits cyto-toxiques utilisés médicalement, qui détruisent directement les 20 cellules des tumeurs. On peut donc penser que le polysaccharide • déclenche la production d'une substance par un organe de l'animal d'expérience, et par suite, accroît spécifiquement la résistance de l'animal contre la tumeur. Sur un plan général, les polysaccharides présentent une très faible toxicité et l'un des caractères 25 essentiels du polysaccharide de l'invention est sa toxicité extrêmement faible. Une administration intrapéritonéale, même de 1000 mg par kg à des souris n'a tué aucun des animaux. Une injection quotidienne intrapéritonéale 1,5 ou 25mg4cgcia polysaccharide à des rats n'a provoqué aucune diminution apparente du poids, ni aucune 30 mortalité. En d'autres termes, la substance suivant l'invention présente chez l'animal une action antitumorale, à une dose égale à celle des agents anticancéreux cytotoxiques et antagonistes existants, médicalement utilisés-. Elle présente de plus une toxicité extrêmement faible et possède ainsi de grands avantages pour 35 le traitement du cancer. Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois lui apporter aucune limitation. Exemple 1 Un milieu liquide contenant 3 % de saccharose, 0,1 % d'extrait de levure, 0,3 % de nitrate de sodium, 0,1 % de phosphate 69 09502. 6 2004994 monopotassique dihydrogéné, 0,05 % de sulfate de magnésium et; 0,05 % de chlorure de potassium, est ensemencé par Sclerotinia sclerotiorurn et le mélange est cultivé dans un flacon avec agitation, de façon à préparer 3Û0 ml d'une culture d'ensemence-5 nient. Cette culture est versée dans 15 litres du même milieu et cultivée à 28°C pendant 160 heures avec aération au moyen de 15 litres d'air par minute' et agitation à 300 tours/mn. Le mycélium est séparé par centrifugation. On mélange le filtrat avec un volume égal de méthanol, on recueille le précipité et on le 10 dissout dans l'eau. On précipite à nouveau cette solution aqueuse par le méthanol et on recueille 16,5 g d'une poudre blanche. Exemple 2 Dans 500 ml d'une solution de soude caustique 2N, on place le mycélium humide (280 g) de Sclerotinia sclerotiorurn 15 obtenu par le procédé de l'exemple 1„ Le mélange est agité et déchiqueté à fond dans un homogénéiseur, et laissé au repos à la température ambiante pendant 24 heures„ On sépare le mycélium, on règle le pH du filtrat à la valeur 2 par addition d'acide acétique et on sépare par filtration le produit insoluble ainsi 20 précité,, Le filtrat est dialyse par l'eau courante pendant 3 jours. La solution non dialysable est concentrée sous pression réduite. On ajoute un volume égal de méthanol et on recueille le précipité forméo Celui-ci est dissous dans l'eau et reprécipité par addition de méthanol. On obtient 2,5 g d'une poudre blanche amorphe. 25 Exemple 3 Dans 400 ml d'une solution normale de potasse caustique, on place 100 g (poids à l'état humide) du mycélium de Sclerotinia sclerotiorium obtenu conformément à l'exemple 1. On chauffe le mélange à 60°C pendant 30 minutes pour effectuer une extraction 30 à- ohaud. On sépare le mycélium par filtration, on règle le,filtrat au pH 2 par addition d'acide chlorhydrique et on sépare par filtration le produit insoluble formé. Le filtrat est dialysé à nouveau dans l'eau courante pendant 4 jours et on concentre à 250 ml la solution non dialysable, à laquelle on ajoute 350 ml d'isopropanol. 35 On recueille le précité formé, on le dissout dans l'eau et on reprécipite par 1"isopropanol. On obtient l,2"g d'une poudre amorphe d'un blanc-grisâtre. BAD ORJG?\'.*X 69 09502 7 2004994 Exemple 4 On ensemence par Cochliobolus sati.Srus un milieu de culture identique à celui de l'exemple 1, de façon à préparer 300 ml de culture d'ensemencement. Cette culture est introduite g dans 15 litres du même milieu et cultivée dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Le mycélium est séparé par centrifugation, la solution surnageante est concentrée sous pression réduite et on ajoute'un volume égal d'éthanol. On recueille le précipité formé, on le dissout dans l'eau et on chauffe 10 en préserca de charbon actif. On filtre le mélange, on ajoute de l'éthanol au filtrat pour reprécipiter le produit et 1'on recueille 9,5 g d'une poudre blanche légèrement grisâtre. Exemple 5 Dans un homogénéisemv on agite énergiquement un mé-15 lange de 370 g de mycélium humide de Cochliobolus setivas, obtenu conformément à l'exemple 4, avec ion litre d'eau.' On maintient le mélange à 100°C pendant 2 heures tout en agitant. On sépare le mycélium par filtration, on règle le pH du filtrat à la valeur 3 par addition d'acide acétique et on sépare par filtration le 20 précipité formé. Le filtrat est concentré sous pression réduite, placé dans une poche de'Cellophane" et dialysé dans l'eau courante pendant 24 heures. La solution non dialysable restée dans la poche est précipitée par addition d'un volume égal de méthanol et on recueille 3,1 g d'une poudre blanc-grisâtre. 25 Exemple 6 On stérilise à 120°C pendant 15 minutes 500 ml d'un milieu de culture conter.ant 3,0 % de glucose, 0,3 % de nitrate de sodium, 0,1 % de phosphate monopotassique, 0,5 % de sulfate de magnésium,. 0,5 % de chlorure de potassium, 0,1 % d'extrait de 30 levure et 0,05 % de sulfate ferrique. On ensemence ce milieu par des mycéliums de pholiota nameko. Après culture du milieu, on sépare les mycéliums et on concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'à 200 ml. On ajoute à cette solution 120 ml de méthanol, on sépare le précipité et on le dissout dans l'eau. La 35 solution est placée dans une poche de "Cellophane", dialysée dans l'eau courante pendant 3 jours. La solution non dialysable restée dans la poche est concentrée sous pression réduite, on précipité pa* le méthanol, on receullle le précipité et on le lave avec du méthanol déshydraté. Après séchage, on obtient un poids de préci-40 pités de 0,3 g, sous forme d'une poudre blanche amorphe. 69 09502 8 2004994 Exemple 7 On traite conformément à l'exemple 6, Lentinus edodes et Flammulina velutipes de la famille des Trichoemotaceaes. On obtient respectivement 0,2 et 0,9 S d'une poudre blanche amorphe. 5 Exemple 8 Le mycélium de pholiota nameko obtenu conformément à l'exemple 6 est placé dans "100 ml d'une solution binormale de soude caustique. On agite le mélange dans un homogénéiseur à la température ambiante pendant 1 heure environ.On laisse le mélange repo-10 ser pendant 20 heures, on sépare le mycélium par filtration et on règle le pH du filtrat à la valeur 3 PaF l'acide acétique. On élimine par filtration la partie insoluble, on place le filtrat dans une poche de Cellophane et on le dialyse dans l'eau courante pendant 2 jours. On fait passer la solution non dialysable à tra-15 vers des colonnes de résines ioniques, l'une fortement acide et l'autre fortement basique (Amberlite IR-120 et IRA-410., de la Société Rohm et Haas). L'effluent est concentré sous pression réduite, on ajoute un volume égal de •réthanol à la solution concentrée et on recueille le précipité formé. Ce précipité est 20 dissous dans l'eau, reprécipité par le méthanol et on recueille 350 ng d'une poudre blanche amorphe. Exemple 9 On stérilise à 120°C pendant 15 mn 2 litres du milieu de culture décrit dans l'exemple 6. On ensemence ce milieu avec 25 Cladosporium flavum et on le cultive par agitation dans un flacon à 28°C pendant 5 jours. Le mycélium ainsi obtenu est placé dans 500 ml d'une solution binormale de soude caustique et on agite énergiquenent le mélange dans un homogénéiseur. On laisse le mélange au repos pendant 24 heures à la température ambiante, 30 de façon que l'extraction soit complète, on filtre pour séparer le mycélium et on règle le pH du filtrat à la valeur 4 par addition d'acide acétique. On sépare par filtration le précipité, on concentre le filtrat sous pression réduite et on ajoute à la solution concentrée un volume égal de méthanol. Le précipité formé est séparé par filtration et dissous dans l'eau. On fait passer la solution sur des colonnes d'Amberlite IR-120 et de IRA-410. On précipite l'effluent par le méthanol et on recueille 2,5 g d'une poudre grise amorphe. bad original ô9 09502 9 2004994 Exemple 10 On agite dans un homogénéiseur un mélange de 500 g dé Pholiota nameko commercial avec 3,5 litres de solution normale de soude caustique et on laisse le mélange au repos à la tempé-^ rature ambiante^pendant 24 heures. Le mélange est traité comme dans l'exemple 8 et on recueille 4 g d'une poudre amorphe. Exemple 11 On place dans 3 litres d'eau 300g de spores de Flammu-lina velutipes du commerce, et on agite le tout dans un homogénéi-10 seur. Le mélange est chauffé à 80-l00°C pendant 3 heures. On le laisse-refroidir* on le filtre, on ajoute 1,5 1 d'eau au résidu et on recommence l'extraction. L'ensemble des filtrats est concentré à 1 litre. On ajoute 1,5 litre de méthanol et on recueille le précipité. Celui-ci est dissous dans l'eau, on ajoute du charbon -|_5 actif, on chauffe et on filtre. On précipite à nouveau le filtrat par le méthanol et on recueille 1,5 g d'une poudre blanche amorphe. Exemple 12 On ajoute 400 ml d'une solution 3N de potasse caustique au résidu de l'extraction obtenu conformément à l'exemple 10 20 et on agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures. La solution obtenue après filtration est neutralisée par l'acide chlorhydrique, on sépare le précipité et on dialyse le filtrat dans une poche de Cellophane plongée dans l'eau courante pendant 3 jours. On règle à 3,5 par l'acide acétique le pH de la solution non dialy-25 sable, on la laisse au repos une nuit et on sépare le précipité formé par filtration; le filtrat est concentré à 200 ml, on reprécipite par le méthanol et on obtient 0,7 g d'une poudre blanche amorphe. Exemple 13 30 On broie finement dans un homogénéiseur un mélange de 500 g de spores de Pholiota nameko du commerce avec 2 litres d'eau. On filtre, et on extrait à nouveau le résidu par 1,5 litre d'eau. L'ensemble des filtrats est concentré sous pression réduite à 900 ml, on ajoute 600 ml d'acétone et on sépare le précipité formé. On 3c dissout celui-ci dans l'eau, on ajoute du charbon actif et on chauffe le mélange. On filtre la solution, on ajoute de l'acétone au filtrat de façon à obtenir un précipité. On recueille 2,3 g d'une poudre amorphe d'un blanc légèrement grisâtre. 69 09502 10 2004994 Exemple 14 Dans un homogénéiseur, on broie 500 g de Flammulina velutipes commercial avec 4 litres d'une solution binormale de soude caustique. On agite le mélange à la température ambiante 5 pendant 2 jours de façon à effectuer l'extraction. On filtre le mélange, on extrait à nouveau le résidu par 2 litres d'une solution binormale de soude caustique et on réunit les deux extraits. L'extrait neutralisé est placé dans une poche de Cellophane et dialysé par l'eau courante pendant 2 jours. On règle à 3,5 par 10 l'acide acétique le pH de la solution non dialysable et on sépare le précipité formé par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite jusqu'à 1,5 litre. On ajoute à cette solution concentrée 500 ml d'isopropanol, on sépare le précipité et on le redissout dans l'eau. On le reprécipite par l'isopropanol et on 15 recueille 4,1 g d'une poudre blanche amorphe. Exemple 15 On agite dans un homogénéiseur pendant 1 heure à la température ambiante un mélange de 20 g de "Buklin" (mycélium de Poria cocos) avec 400 ml d'une solution 3N de soude caustique. 20 On filtre ce mélange et on amène le filtrat à un état de légère alcalinité par l'acide acétique. Le filtrat est ensuite dialysé. A la solution dialysable, on ajoute un volume égal" de méthanol et on obtient 11g d'une poudre blanche. Celle-ci est un polysaccharide dénommé "pachyman". On dissout 10 g de ce produit dans 25 260 ml de solution normale de soude caustique, on ajoute en plusieurs fois 12 g au total d'acide monochloracétique à la température ambiante et agite le mélange pendant 1 heure. On le chauffe ensuite à 55°C, température qui est maintenue pendant 3 heures. On amène au pH 6,0 par l'acide acétique et on sépare 30 Par filtration le précipité formé. Le filtrat est dialysé pendant 2 jours. A la solution non dialysable, on ajoute 3 volumes"d'étha-nol et on recueille 11,2 g du sel de sodium du carboxyméthyl-pachyman. 69 09502 îi 2004994 REVEHDICflTIOWS 1. Procédé de fabrication de polysaccharides à action anti-tumorale et formée principalement de restes de D-glucose réunis par des liaisons $-(l—>3), caractérisé par la mise en oeuvre, 5 dans un ordre facultatif, des opérations suivantes: a) On soumet à une extraction par l'eau ou par une solution alcaline, à la température ambiante ou à une température plus élevée, les spores, les sclérotes, les mycéliums de champignons choisis dans les familles suivantes: Pyrénophoracées, 10 Bulgariacées, Felvellacées, Pézizacées, Tricholomatacées, Agari-cacées, Boletacées, Russulacées, Clavariacées, C?ntharellacées, Corticiacées, Polyporacées, Phallales, Lycoperdales, Tremillacées, Auriculariacées et Demeliacées; on mélange avec un solvant organique miscible à l'eau, soit les extraits obtenus, soit un filtrat 15 d'une culture des champignons en milieu liquide; on sépare le précipité formé, ou bien on acidifie légèrement là solution résultant de l'extraction et on sépare le précipité résultant de l'acidification; b) On soumet le produit à une dialyse vis-à-vis de l'eau, 20 afin de recueillir une substance non dialysable; c) On fait passer le produit à travers une ou plusieurs colonnes de résines échangeuses d'ions et on recueille l'effluent; d) On traite le produit par le charbon actif et on recueille la partie non adsorbée» 25 2. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on obtient, par une méthode connue, les dérivés méthyle, acétyle, carboxyméthyle, acide sulfonique ou acide phosphorique du polysaccharide, et on obtient des produits partiellement hydrolyses par traitement par des enzymes, des acides ou des alcalis, 30 3„ Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on effectue l'extraction par une solution alcaline pu moyen d'une solution d'un hydroxyde alcalin de concentration égale ou inférieure à 5N. 4» Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel on 35 utilise comme solvant miscible à l'eau, le méthanol, l'éthanol, le propanol, 1'isopropanol ou l'acétone. 5. Procédé conforme à la revendication 1, dans lequel ou utilise pour l'acidification de la solution résultant de l'extraction l'un des acides: chlorhydrique, sulfurique, phosphori-40 que, formique, acétique, trichloracétique„ BAÛ ORIGINAL