FR 2028700 A1 19701016 FR 6901342 A 19690124 La présente invention, à la réalisation de laquelle ont participé MM. BAR?HELESfY Pierre et HAGEMANN Guy, a pour objet un nouveau sel d'antibiotique. Elle concerne plus particulièrement un nouveau sel de paromomycine. Elle a spécifiquement pour objet la N-(sulfobenzoyl) N'-(51-nftrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine. L'invention s'étend également à l'application de ce composé comme médicament ainsi qu a son procédé de préparation. Ce composé est doué de propriétés antibactériennes à large spectre. I1 agit aussi bien vis-à-vis des bactéries Gram+ que Gram~-. I1 possède également une action favorable à l'encontre des champignons pathogènes tels que Candida ou des protozoaires tels que Trichomonas Ces propriétés permettent son utilisation en thérapeutique humaine ou animale, par exemple pour le traitement des infections vaginales à bactéries, à champignons ou à Trichomonas, ou pour le traitement des infections intestinales provoquées par des bactéries Gram + ou Gram -, des champignons lévuriformes ou des amibes. Enfin ce composé peut être employé comme médicament, à titre complémentaire, dans un traitement anthelmintique. Le procédé de préparation est caractérisé essentiellement en ce que l'on fait réagir un sel hydrosoluble de N-(sulfobenzoyl) N' (5'-nitrofurfurylidène) hydrazine sur un sel hydrosoluble de paromomycine. On forme ainsi par double décomposition un sel très peu soluble dans l'eau que l'on recueille, lave jusqu a élimination des ions de départ et sèche. La N-(sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine se présente sous forme d'un produit solide jaune peu soluble dans l'alcool et l'acétone, très peu soluble dans l'eau et insoluble dans l'étherf et le bénzène; son pouvoir rotatoire est de / & 20 = +20,3 (c = 1%, diméthylformamide) A titre de mode d'exécution préféré, on emploie comme sel hydrosoluble de paromomycine, un sel d'acide minéral et en particulier le sulfate. On emploie comme sel hydrosoluble de g-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'nitrofurfurylidène) hydrazine, un sel de métal alcalin et en particulier les sels de lithium ou de sodium. La réaction est effectuée en milieu aqueux. Elle peut également être effectuée en milieu organique aqueux (éthanol aqueux, dioxane aqueux, pyridine aqueuse, diméthylformamide aqueux. L'exemple suivant illustre le procédé. Il va de soi que l'invention s'étend également aux compositions pharmaceutiques dont la partie active comprend de la N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfuryl- idène) hydrazine, sel de paromomycine et un ou plusieurs autres principes actifs doués d'action antibactérienne ou d'action adsorbante ou d'action antitoxique comme par exemple la polyvinylpyrrolidone pontée obtenue par polymérisation de la vinylpyrrolidone en milieu alcalin, commercialisée sous le nom de marque "Polyclar" ou le polymère de caprolactame commercialisé sous le nom de marque "Divergan SZ 9010". Mode opératoire A une solution,refroidie dans un bain d'eau glacée,de 8,2 g (0,01 mol.) de sulfate de paromomycine dans 100 cm3 d'eau, on ajoute, goutte à goutte, une solution de 17,2 g (0,05 mol.) de sel de lithium de la N-(m-sulfobenzoyl) N t5-furfurylidène) hydrazine dans 200 cm3 d'eau en maintenant la température en dessous de +10 C ; on agite pendant vingt-cinq minutes, filtre, lave le précipité à l'eau et sèche sous vide à température ambiante ; on obtientvainsi 18,3 g de N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine (Rendement : 71 *). Ce composé résulte de la salification des cinq fonctions aminées de la paromomycine par la N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5-nitrofurfurylidène) hydrazine. Analyse Calculé : S * 6,9 Trouvé : 6,8 Spectre U.V. max. à 366 m E 1 % 1cm = 432 max. à 273,5m E 1 % 1cm = 269 A la connaissance de la Société demanderesse, ce composé n'est pas décrit dans la littérature. Le produit de départ, le sel de lithium de la N-(m-sulfobenzoyl) '-(5-nitrofurfurylidène) hydrazine, est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet français no 1 526 955. La N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine, est utilisée par voie buccale, ou par voie locale en application topique sur la peau et les muqueuses ou par voie rectale. Elle peut se présenter sous forme de comprimés, de comprimés enrobés, de capsules, de poudre aromatisée, de granulés, d'émulsions, de sirops, de suppositoires, d'ovules, de comprimés intravaginaux,de pommades, de crèmes, de collyre, de gouttes nasales ou auriculaires, de collutoire et de poudres topiques en pulvérisations. La posologie utile s'échelonne entre 100 et 500 mg par prise et 300 mg à 7 g par jour chez l'adulte en fonction de la voie d'administration. Les formes pharmaceutiques telles que comprimés, comprimés enrobés, capsules, poudre aromatisée, granulés, émulsions, sirops, suppositoires, ovules, comprimés intravaginaux, pommades, crèmes, gouttes nasales ou auriculaires, collyre, collutoire et poudres topiques, sont préparées selon les procédés usuels. Etude pharmacologique du médicament objet de l'invention 1 ) Activité in vitro : L'activité antibactérienne, déterminée en milieu liquide, est la suivante (après 24 heures d'incubation à 37OC) les concentrations minima inhibitrices (C.M.I.) sont évaluées en-g/ml. Souches bactériennes C.M.I. en Rg/ml Staphylococcus aureus Oxford 5 hémolytique L.W. 1 clinique 5 Streptococcus hemolyticus 40 Bacillus subtilis 2 Escherichia coli 30 " " pathogène (g.e.i.) 100 Elebsiella pneumoniae 5 Salmonella typhimurium 20 Proteus mirabilis 40 Pseudomonas pyocyanea 200 Candida albicans 200 Les C.M.I. ne varient pas sensiblement après quarante-huit heures de séjour à l'étuve à 37"C (effet bactéricide). L'activité antiamibienne in vitro a été vérifiée vis-à-vis de cultures d'Entamoeba histolytica - arrêt de la culture : 2,5 Rg/ml - action amibicide : 2,5 Rg/ml (dans les mêmes conditions, le sulfate de paromomycine est amibicide à la même dose de : 2,5 yg/ml). L'activité du produit étudié s'étend donc aux bactéries Gram et Gram, aux champignons lévuriformes et aux protozoaires. 20) Activité in vivo. par voie générale A) Action sur les ataShylococeiesexPérimentales chez la souris a) dans une première expérience, sur des séries de 14 souris d'un poids moyen de 21-22 g, infectées par voie intraveineuse en administrant 0,2 ml d'une culture de dix-huit heures de staphylococcus aureus souche L.W., très fortement hémolytique, l'effet thérapeu- - tique du produit étudié a été comparé à celui des doses correspondantes de sulfate de paromomycine et de m-sulfobenzoyl hydrazine du 5-nitrofurfural sel de sodium (que l'on appellera par la suite composé A), les produits étant administrés par voie sous-cutanée, une fois par jour (sous 0,25 ml d'eau distillée), la première dose étant injectée vingt minutes avant l'inoculation.Le pourcentage de mortalité des animaux de chaque série était le suivant Mortalité Mortalité après après 24 heures 7 jours - lot témoin (-souris inoculées) : 100 % 100 * - lot traité par le sulfate de paromomycine - 0,13 mg/souris (en base) 42,8 78 * - lot traité par le composé A (sel de sodium) - 0,36 mg/souris 50 % 85,7 % - lot traité par le produit étudié :: - 0,5 mg/souris 28,5 * 42,8 % Le nombre d'animaux survivants était donc nettement plus élevé dans la série traitée par le produit étudié que dans les séries traitées avec des doses correspondantes de composé Â ou de paromomycine (sulfate) ; l'examen macroscopique des reins des animaux morts à partir du 4ème jour ou sacrifiés le 8ème jour de l'expérience montrait l'absence totale de lésions rénales dans la série traitée au produit étudié, alors que tous les animaux de la série témoin présentaient des lésions importantes, et que quelques lésions apparaissaient dans les séries traitées au composé A oa b la paromomycine.L'effet thérapeutique du produit étudié était donc nettement supérieur à celui des composés entrant dans la combinaison. b) dans une seconde expérience, des souris infectées dans les mêmes conditions que ci-dessus par une culture de staphylococcus aureus souche L.W. ont été traitées pendant 10 jours soit par le chloMhrdrate de tétracycline (per os), soit par le produit étudié (par voie sous- cutanée), une fois par jour.Le pourcentage de mortalité des animaux de chaque série était le suivant Mortalité Mortalité après au 11è 24 heures jour - lot témoin (souris inoculées) 68 ffi 72 % - lot traité par la tétracycline 1 mg/souris (en base) per os O O - lot traité par le produit étudié 1 mg/souris S.C. O O Alors qu'on observait des lésions rénales chez la plupart des animaux de la série témoin, les souris des séries traitées par la tétracycline ou le produit étudié étaient toutes exemptes de lésions L'effet thérapeutique du produit étudié administré par voie souscutanée était donc aussi satisfaisant que celui d'une dose égale de tétracycline administrée par voie orale. B) Action sur des infections expérimentales à germes Gram négatif, chez la souris Dans des infections expérimentales provoquées chez la souris (séries de 10 animaux) par inoculation d'une culture d'Escherichia Coli ou de Salmonella typhi d'origine clinique, l'effet thérapeutique observé après administration d'une dose unique, par voie souscutanée, de produit étudié ou de la dose correspondante de composé A (sel de lithium) ou de paromomycine (sulfate) était le suivant Produit étudié Composé A Sulfate de (sel de lithium) paromomycine Infections à 2 mg 80 % 1,5 mg 10% 0,72 mg 100 colibacilles 1 mg 34 % 0,75 0 0,36 mg 5,4% Infections 4mg 100% 3mg 13% 1,44 mg 100% 2mg 100% 1,5 2% 0,72mg 90% bacilles typhiques 1mg 81% 0,75 0 0,36 mg 61% Vis-à-vis de ces infections expérimentales peu sensibles au composé A, aux doses utilisées, l'effet thérapeutique du produit étudié est en moyenne équivalent à celui de la paromomycine à la dose correspondant à celle contenue dans la combinaison ; dans le cas des infections typhiques, on observe une certaine synergie, nettement visible en particulier aux doses de 1 à 2mg de produit étudié, étant donné que les doses correspondantes du composé A n'ont pas d'action et que celles de la paromomycine ont un effet plus faible. C) Conclusion Les expériences précédentes montrent que dans l'ensemble le produit étudié présente, par voie sous-cutanée, une efficacité thérapeutique supérieure à celle des deux substances actives entrant dans la combinaison, administrées aux doses correspondantes. Cet effet de synergie, observé particulièrement vis-à-vis d'infections à staphylocoques et à bacilles typhiques, peut être attribué à un certain effet de protection apporté par la N-(m-sulfobenzoyl) '-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine contre le stress initial dss à l'infection. 30) Activité in vivo contre les infections intestinales L'effet de protection du produit étudié contre les effets des infections intestinales a été déterminé par la méthode de l'anse intestinale ligaturée chez le rat : des rats mâles albinos de 80 g sont soumis à une diète semi-lactée vingt-quatre heures avant l'intervention et maintenus à ce régime pendant les vingt-quatre heures de l'expérience. Après anesthésie à l'éther , on procède à une laparotomie et-ligature d'une anse intestinale sur une longueur de 7 centimètres ; on injecte ensuite dans l'anse intestinale la culture du germe choisi, en présence ou non de l'antibiotique, puis on procède à l'autopsie des animaux vingt-quatre heures plus tard. On note : - l'augmentation de volume de l'anse ligaturée (v) - la présence de liquide dans cette anse (L) - la réaction inflammatoire (R), d'après l'aspect plus ou moins hémorragique de l'intestin. A) Infections à staphylocoques On injecte dans l'anse intestinale ligaturée 0,5 ml d'une culture de dix-huit heures en milieu Oxoid no 2 (Nutrient broth) de staphylocoques entérotoxiques (souche E. 58), seule (série témoin) ou mise en contact pendant trois heures avec l'antibiotique.Les observations sont les suivantes (séries de 4 rats de 80 g), la notation se faisant de + à tttt selon l'importance du test positif ou par - dans le cas d'une observation négative Observations sur l'anse intestinale Rats Traitement effectué après 24 heures - Péritonite v R 1 ++++ +++ + +++ + 2 Témoins inocules par +++ lll +++ + 3 0,5 ml de culture +++ +++ +++ 4 +++ +++ + 5 ++ ++ 6 0,5 ml de culture + 2,5 mg - - - 7 de produit étudié + + - 8 +++ lll + 9 0,5ml de culture - - + 10 + 0,9 mg de sulfate de + + - 11 0,5 paromomycene (soit: ++ ++ +++ 12 0,67 mg en base) - - 13 0,5 ml de culture + + 14 + 1,83 mg de composé A - - - - 15 (sel de lithium) - - + 16 ++ ++ ++ Cette expérience montre l'effet favorable du produit étudié, qui, en dépit de son insolubilité dans l'eau, agit au moins aussi bien que les substances actives entrant dans la combinaison mais administrées sous forme de sels hydrosolubles. Dans une autre expérience, effectuée dans des conditions identiques, le produit étudié a été associé à un adsorbant intestinal : le polycaprolactame (Divergan SZ 9010). A cet effet le polycaprolactame (Divergan SZ 9010) seul ou associé au produit étudié a été mis en contact avec une culture de dix-huit heures de staphylocoques entérotoxiques E.58 pendant trois heures, et le mélange a été ensuite injecté dans l'anse intestinale ligaturée chez le rat.Les animaux sacrifiés vingt-quatre heures après l'intervention,l'autopsie permet de faire les observations suivantes: Observations sur Etat général l'anse intestinale Rats Traitement effectué des animaux après 24 heures avant l'auzopsie Péritonite V L R 1 témoins inoculés Etat général médiocre ++++ ++++ ++++ ++++ 2 3 animaux morts (pattes +++ +++ +++ +++ 3 par 0,5 ml de postérieures en exten- ++++ ++++ ++++ +++ 4 culture. sion) entre la 9ème ++++ ++++ ++++ ++ 5 et la 20ème heure. +++ +++ +++ ++ 6 +++ +++ +++ ++ 7 0,5 ml de culture Bon état général. - - - 8 +2,5 mg de produit Pas de mortalié - - - 9 étudié ++ ++ - 10 +++ +++ + ++ 11 0,5ml de culture Assez bon état général ++ ++ + 12 +15 mg de poly- 2 animaux morts à la ++ ++ - ++ 13 caprolactame 16ème heure + + + + "Divergan SZ 9010" 14 0,5 ml de culture + + - 15 + 15 mg de poly - - - 16 caprolactame Très bon état général. - - - 17"Divergan SZ 9010" Pas de mortalité. - - - +2,5 mg de produit étudié Ces résultats montrent que le produit étudié est très bien toléré par l'anse intestinale ligaturée et qu'il possède une très bonne efficacité comme antiseptique intestinal : lorsqu'il est associé à un adsorbant intestinal tel que le polycaprolactame ou (Divergan SZ 9010) le produit étudié conserve son efficacité antibactérienne in situ, et l'on observe un excellent effet thérapeutique, nettement supérieur à celui du polycaprolactame seul (qui agit par fixation des toxines bactériennes) et un peu supérieur à celui du produit étudié utilisé seul à la même dose. B) Infections à Candida albicans On injecte dans l'anse intestinale ligaturée 0,5 ml d'une culture de Candida albicans (souche NRRL. Y.477), seule (série témoin) ou mise en contact quatre heures avec le produit étudié, - seul ou associé à un adsorbant -intestinal : le polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar AT). Les rats sont sacrifiés vingt-quatre heures après l'intervention, et l'autopsie permet de faire les observations suivantes Observations sur Rats Traitement effectué l'anse intestinal Liquide NQ ! après 24 heures péritonéal V L R 29 ++++ ++++ ++ 30 Témoins innoculés par ++++ ++++ +++ ++ 31 0,5 ml de culture ++++ ++++ ++++ +++ 32 ++++ ++++ ++ +++ 33 0,5 ml de culture ++ ++ + + 2,5 mg de N-(m-sulfo- ++ ++ - - 34 benzoyl) N'-(5'-nitro- ++ ++ + ++ - 35 36 sel de paromomycine + + 37 ++ ++ - 38 0,5 ml de culture ++++ ++++ - 39 + 15 mg de polyvinylpoly + + - - 40 pyrrolidone ++ ++ - - 41 0,5 ml de culture - - - 42 + 15 mg de polyvinylpoly- + + - 43 pyrrolidone +++ +++ - 44 + 2,5 mg de produit étudié + + - Ces résultats montrent que le produit étudié exerce une bonne action protectrice contre l'infection provoquée par une culture de Candida albicans dans l'intestin; l'action inhibitrice vis-à-vis de cette culture est complétée par une action protectrice contre l'action inflammatoire (réaction hémorragique de la muqueuse) provoquée par cette culture dans l'anse intestinale ligaturée. Lorsque le produit étudié est associé à un adsorbant intestinal, il conserve son activité in situ vis-à-vis de l'infection à Candida, et l'on observe un très bon effet thérapeutique, supérieur dans l'ensemble à celui du polyvinylpolypyrrolidone seul (qui agit par fixation des toxines) et un peu supérieur à celui du produit étudié utilisé seul à la même-dose. Conclusions La N- (m-sulfobenzoyl) N' - (5 '-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine permet d'assurer dans l'intestin une bonne protection contre les effets d'infections locales à staphylocoques ou à Candida albicans ; son action se traduit par une réduction du volume, de la réaction inflammatoire et de l'exsudat liquide, de l'anse intestinale ligaturée chez le rat. L'association de ce composé à un adsorbant intestinal tel que le polyeaDrolactame ou la polyvinylpolypyrrolidone permet de cumuler les effets de protection et d'améliorer l'effet thérapeutique global. REVENDICATIONS 1 ) La N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine de formule paromomycine 20) Les médicaments à base de N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine. 3 ) Les compositions pharmaceutiques comportant de la N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine, sel de paromomycine et un ou plusieurs principes actifs doués d'action antibactérienne, adsorbante ou antitoxique. 40) Un procédé de préparation du sel de paromomycine tel que défini au 1 ) caractérisé en ce que l'on fait réagir en milieux aqueux un sel hydrosoluble de N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5'-nitrofurfurylidène) hydrazine sur un sel soluble de paromomycine, recueille le sel très peu soluble formé que l'on lave et sèche. 5 ) Un mode d'exécution selon 40) caractérisé en ce que le sel hydrosoluble de paromomycine est un sel d'acide minéral et en particulier le sulfate. 60) Un mode d'exécution selon 4 ) caractérisé en ce que le sel hydrosoluble de N-(m-sulfobenzoyl) N'-(5 '-nitrofurfurylidène) hydrazine est un sel de métal alcalin et en particulier ceux de lithium ou de sodium.