FR 2001354 A1 19690926 FR 6902530 A 19690205 L'antibiotique coumermycine (précédemment dénommé sugordomycine) est produit par cultivation de StrePtomyces hazeliensis var. hazeliensis nov. sp., un organisme isolé d'un échantillon de sol prélevé à Matane, Gaspé, Canada. Un specimen de la culture a été déposé dans la collection de microorganismes du Département de l'Agriculture des Etats-Unis, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, sous le No. RL 2938. Le procédé pour la préparation de cet antibiotique, comme décrit en détail dans le brevet belge No. 665.237, donne un complexe brut de composés antibiotiques. De ce complexe, on peut isoler au moins 5 composants actifs et une fraction inactive. Des composants actifs, celui dénommé "coumermycine A," est le plus actif. Celui-ci est le composé totalement méthyl-pyrrold de formule générale les différentes méthodes utilisées précédemment pour séparer la coumermycine A1 du complexe brut ont donné un produit d'une pureté de 75 % seulement. La présente invention a naintenant trait à un procédé dans lequel la coumermycine A1 est séparée sous forme pure, d'une pureté de 98% ou plus, à partir d'un complexe brut de composés antibiotiques, en utilisant un procédé d'extraction liquide frac tisonné. Un complexe antibiotique brut peut être produit par culture de Streptomyces hazeliensis var. hazeliensis nov. Sp. dans un milieu nutritif contenant des sources organiques de carbone et d'azote, de préférence des pois concassés (source de carbone et d'azote) et d'environ 0,05 % à environ 3 %'dé CaCO3, d'environ 0,1 % à environ 3 % d'un carbohydrate, par exemple un amidon ou un sucre, et d'environ 0,1 - à 0,5 % de h HP040 La culture est effectuée pendant environ 3 à environ 8 jours à un taux d'aération d'environ 14 à environ 280 litres/minute pour 190 litres de milieu, à une température d'environ 20 à environ 350, Le complexe antibiotique brut obtenu est ensuite isolé de la bouillie de fermentation. Cette isolation peut être accomplie par plusieurs méthodes. Par exemple, l'une de ces méthodes consiste à acidifier la bouillie avec un acide minéral, par exemple l'acide phosphorique, à un pH d'environ 2 à 7, puis à filtrer le milieu acidifié, à mettre le gâteau de filtration obtenu en suspension dans un solvant organique, par exemple un alcanol inférieur, à filtrer ou centri fuger la bouillie obtenue, à neutraliser le filtrat ou extract résultant avec un alcali jusqu'à un pH d'environ 6 à 7, à éliminer le solvant afin d'obtenir un concentré, à précipiter le complexe antibiotique brut avec un solvant non polaire, puis à récupérer le précipité.Une autre technique consiste à éliminer, par filtration, les cellules contenant le complexe du milieu de fermentation, à acidifier le filtrat avec un acide minéral, à un pH d'environ 1 à 7, à mettre en contact le filtrat acidifié avec un solvant non miscible à l'eau, à séparer la phase aqueuse, à éliminer le solvant immiscible à l'eau afin d'obtenir le complexe antibiotique brut, ou dans une autre alternative, la solution de solvant immiscible à l'eau peut Btre passée à travers un adsorbant, par exemple une résine échangeuse disions ou du charbon animal activé, afin d'adsorber le complexe antibiotique brut qui peut alors entre récupéré par élutionsavec un solvant tel que le méthanol. les cellules éliminées originalement par filtration sont alors extraites avec un solvant organique tel qu'un alcanol inférieur, le solvant éliminé laissant derrière lui un complexe antibiotique brut pouvant être combiné avec le complexe obtenu à partir du filtrat susmentionné. les complexes antibiotiques bruts ainsi obtenus peuvent etre purifiés par différentes méthodes. Par exemple, l'une des méthodes consiste à mettre en suspension le complexe dans de l'acétone et à le traiter avec assez d'acide minéral afin d'obtenir un pH d'environ 2 à 6. La substance insoluble résultante est alors éliminée par filtration et le gâteau de filtration est lavé avec de l'acétone. le filtrat et le liquide de lavage combinés sont alors évaporés sous vide jusqu'à l'obtention dJun concentré. le concentré est alors ajouté à un mélange d'eau et de benzène, et on obtient une suspension de substances solides dans 2 phases liquides. La suspension, qui est le complexe acide, est alors filtrée et le précipité est mis en suspension dans du méthanol chaud qui, après refroidissement, est séparé par filtration, laissant ainsi un solide qui représente le complexe acide. Dans une autre méthode de purification du complexe, le sel de bensylamine du complexe est préparé par dissolution de ce dernier dans un solvant organique tel que le n-butanol et traite ment avec un excès de benzylamine, après quoi le sel de benzylaune du complexe précipite. Ce sel précipité est séparé par fil traction et le complexe acide est obtenu par traitement avec un acide minéral aqueux, suivi par extraction du complexe acide à partir du système aqueux au moyen d'un solvant organique non miscible ou seulement légèrement miscible à l'eau.Le solvant immiscible est alors éliminé et le résidu est précipité par exemple au moyen d'un mélange diaud de méthanol et de benzène. Le complexe brut pent aussi Otre purifié par distribution entre un solvant organique et une solution-tampon aqueuse d'un pH d'environ 6,8 à 11. Le complexe dans la solution-tsmpon aqueuse peut être isolé par acidification, par exemple avec un acide minéral, à un pH d'environ 2 à 5. La suspension résultante peut Outre extraite avec un solvant organique immiscible ou seulement légèrement miscible avec liteau, et le complexe est récupéré à partir du solvant organique, par exemple par évaporation du solvant. le procédé de l'invention a trait à la séparation et à l'isolation de coumermycine Â1 à partir du complexe résultant de ces techniques d'isolation et de purification. Dans le cas usuel, il n'y a pas plus de 50 % en poids de coumermycine A1 dans le complexe. Le procédé de l'invention comprend l'introduction d'une phase de solvant organique dans le haut d'une colonne d'extraction fractionnée liquide-liquide, une phase tampon aqueuse au bas de cette même colonne et le complexe, dissous dans un solvant adéquat, dans le milieu de la colonne. La phase de solvant organique est plus lourde que la phase aqueuse et traverse la colonne du haut en bas, dissolvant la coumermycine A1 à partir du complets. La phase de solvant aqueuse monte dans la colonne et dissous les portions restantes du complexe.Ainsi, la phase de solvant organique lourde extrait la coumermycine Â1 désirée, qui est prélevée au bas de la colonne et séparée sous forme de coumermycine A1 d'une pureté d'environ 98 %. La colonne d'extraction peut titre choisie parmi les nombreuses colonnes connues, L'une de celles-ci est la colonne d'extraction ulti-stades appelée communément colonne d'extraction de Scheibel et qui est décrite dans le brevet américain BO 2.850.362, ou une colonne d'extraction rmilti-stades à plaques alternatives telle que décrite dans Â.I. On. E Journal, Volume 5, N0 4, pages 446-452, décembre 1959. Cette dernière est utilisée de préférence dans le procédé de l'invention. En pratique, les colonnes utilisées sont celles usuellement nécessaires pour I' échange de substances dans un appareillage à contact liquide-liquide. Ce sont des colonnes verticales dans lesquelles l'énergie pour l'échange intensif des substances entre les deux phases est appliquée à l'aide de moyens mécaniques. ;'énergie peut Btre fournie par des agitateurs rotatifs. Comme exemples de tels appareils, on peut citer l'extracteur de Scheibel suspentionné et d'autres. Un autre moyen d'appliquer l'énergie nécessaire pour le mélange intense entre les deux phases sont les plaques alternatives de la colonne d'extraction également décrite ci-dessus0 Dans la colonne d'extraction multi-stades à plaques alternatives, un nombre de plaques sont arrangées en série. Les plaques alternatives sont montées sur un arbre central actionné par un simple mécanisme au haut de la colonne. Les variations de vitesse rendent possible opérer avec un spectre de vitesses allant d'environ 100 à 3 000 mouvements par minute.Une mise en oeuvre appropriée de l'invention consiste à utiliser une colonne à plaques alternatives comme décrite ci-dessus, le rytbme des plaques allant d'environ 150 à environ 300 mouvements par minute. Dans cette colonne d'extraction, après mélange intense dans l'immé- diate proximité d'une plaque alternative, les particules de composition similaire peuvent se combiner (agglomération) et aller ensemble à proximité de la plaque suivante. Il apparaît de ce qui a été dit précédemment que les colonnes d'extraction utilisables dans le but de l'invention possèdent différents orifices d'entrée et de sortie pour les liquides. L'orifice d'entrée près de la base de la colonne permet l'ad- mission du liquide plus léger (la phase tampon aqueuse) et celui au haut de la colonne permet l'échappement du liquide plus léger. Par contre, le liquide plus lourd (la phase de solvants organiques) est admis au haut de la colonne et en sort à un orifice près de sa base. Pendant l'opération, la totalité de la phase lourde à proximité d'une plaque alternative coule de haut en bas en direction de la plaque alternative suivante sous l'influence de la plaque alternative à proximité immédiate et de sa plus grande densité. La phase légère coule de bas en haut, d'une plaque alternative à l'autre, sous l'influence de ces dernières et du fait de sa plus faible densité. Les plaques alternatives provoquent un morcellement des gouttelettes, en dispersion dans la phase, en gouttelettes ayant des dimensions nettement plus petites. Ces dernières tendent à s'agglomérer et sont de nouveau morcelées par la plaque suivante.Ceci se répète à travers toute la colonne0 Alors que la phase plus lourde descend la colonne, la coumermycine À1 y est dissoute à partir du complexe. Finalement, la phase lourde contenant la coumermycine A1 en dissolution atteint l'orifice au bas de la colonne et s'en échappe. La présente invention se distingue des procédés déjà connus pour la séparation de coumermycine à partir d d'un complexe brut en ce qu'on sépare le principe le plus actif du complexe brut, c'est-à-dire la coumermycine A12 avec de hauts rendements et à un bon degré é de pureté. Dans les procédés connus, il faliait faire appel à des procédures complexes à contrecour2nt de Craig nécessitant une multiplicité de tubes allant jusqu'à 200 tubes, et parfois considérablement davantage. Les avantages du point de vue commercial d'une technique d'extraction évitant un nombre énorme de tubes sont évidents. C'est la découverte qu'une unique colonne d'extraction utilisant un système de solvants permet l'extraction de la coumermycine A1 à partir du complexe brut de coumermycine, qui est à la base de la présente invention. La phase de solvants organiques, pour qu'elle soit effective dans le procédé d'e traction liquide fractionné de la présente invention, doit étre un bon solvant pour l'antibiotique désiré. Àdditionnellement, la phase de solvants organiques doit extraire uniquement la coumermycine A1 désirée, c'est-à-dire le coefficient de distribution de la coumermycine À1 doit être relativement favorable en direction de la phase de solvants organiques sous les conditions de l'extraction. Un solvant d'extraction typique remplissant les conditions ci-dessus est préparé par saturation mutuelle, à la température à laquelle le procédé d'extraction a lieu, d'une solution aqueuse tamponnée, de préférence une solution contenant des quantités adéquates de NHP04, ayant un pH d'environ 8,0 à environ 8,8, de préférence 8,2, et un volume égal de 1:1, d'un hydrocarbure halogéné, de préférence de chloroforme, et un alcanol ayant 3 à 9 atomes de carbone, de préférence l'isopropanol, et séparation des phases résultantes. La température du procédé d'extraction ainsi décrit peut varier dans de larges limites. Cependant, la clé pour l'obtention de la séparation désirée des composés bruts avec de bons rendements réside dans le fait que, si d'autres facteurs sont variés, tels que par exemple le pH ou la relation des solvants, un ajustement correspondant de la température en déviation des limites préférées sera fait afin d'assurer de bons résultats.Sous des conditions préférées, les températures varieront dienviron 200 à environ 300. Cependant, étant donné que le coefficient de distribution dans la phase de solvants des différents composants du complexe brut de coumermycine varie sensiblement avec la température, il est important de veiller à ce que la température soit constante sur la colonne entière. À titre d'illustration, la température lors de la procédure d'extraction devrait être maintenue de préférence à 250, c'est-à-dire que cette température devrait régner au long de toute la colonne. I1 est évident de ce qui précède que la présente invention n'est pas limitée au spectre de températures préférées susmentionné. Comme il découle de ce qui précède, le système de solvants pour 11 extraction comprend une phase lourde et une phase légère. La phase lourde est une phase organique et contient de préférence 74,5 % en poids de chloroforme, 23,25 % en poids d'isopropanol et 2,25 % en poids d'eau. la phase légère est la phase aqueuse et a un pH d'environ 8,0 à environ 8,8 et contient 1,5 % en poids de chloroforme, 15 % en poids d'isopropanol et 83,5 % en poids d'eau. la phase aqueuse sert de solution-tampon.Evidemment, d'autres substances organiques peuvent entre utilisées pour former de telles phases, par exemple des alcanols contenant 4 à 9 atomes de carbone, tels que le n-octanol, le n-butanol, le n-pentanol, etc.., des esters tels que les acétates d'alcoyle inférieurs, tels que l'acétate de n-butyle, l'acétate d'éthyle, etc., et des éthers tels que l'éther diéthylique, l'éther méthyléthylique, etc... Il est apparent de ce qui précède que les coefficients de distribution, c'est-à-dire la concentration des substances extraites dans la phase organique divisée par la concentration des substances extraites dans la phase aqueuse, varient sensiblement suivant la température et la concentration. Cependant, le coefficient de distribution de la coumermycine A1 relativement à celle de la conmernycine ~ , second en importance dans le complexe, est d'une valeur relativement constante de 2,5. Etant donné que la concentration des composés varie sur toute la longueur de la colonne d'extraction, les coefficients de distribution des composés clé, c' est-à-dire de la coumermycine Â1 et 4, varient donc d'un bout à l'autre de la colonne d'extraction. Par conséquent, la relation de solvants adéquate à utiliser pour une séparation opti wom de la coumeriycine Â1 de tous les autres constituants dans le complexe doit être déterminée d'une manière empirique. I1 est vident que des calculs théoriques, y compris l'utilisation d'un ordinateur, peuvent être utilisés pour estimer la relation adéquate sous des teipératures et concentrations données, mais en fin de coopte des essais conventionnels doivent titre effectués afin de déteriimer la relation de solvants adéquate pour obtenir l'optimum quant à la séparation, la purification et la récupération de coumermycine A1 sous les conditions prescrites. Le coefficient de distribution, Qui est également une fonction du pH, varie de façon marquée avec les changements de pH. Des valeurs allant d'environ 8,0 à environ 8,5 sont considérées optimum pour le procédé de l'invention. À un pH au-dessous de 7, la sélectivité tombe abruptment, et à haut pH, c'est-à-dire audessus de 8,8, les composés ont tendance à devenir chimiquement instables. Ainsi, le procédé de l'invention est avantageusement mis en oeuvre à un pH situé dans les limites d'environ 8,0 à environ 8,5 dans la phase aqueuse des différents secteurs de la colonne d'extraction. Selon le procédé de la présente invention, le composé inactif est séparé de la fraction active avant l'isolation de la coumermycine À1 . Ceci peut être accompli soit par extraction liquide fractionnée soit par cristallisation campe décrit ci-dessuo Exemple 1 1 kg du mélange d'antibiotique brzt obtenu selon un procédé de fermentation connu, dans lequel l'organisme ERRL 2938 est cultivé et le produit isolé, est dissous dans environ 170 litres d'un solvant composé de 23w25 % dtisopropanol, de 74,5 % de chloroforme et de 2,25 % d'eau en poids. La solution est filtrée et ensuite concentrée à 50 litres.Durant la concentration, la majeure partie du chloroforme est éliminé par distillation, puis de l'iso- propanol est introduit dans le récipient de façon à maintenir un volume de 50 litres. On maintient la température à environ 25 en diminuant graduellement la pression. On filtre et lave avec de lJisopropanol. Les eaux-mères sont mises de cOté et 750 g (base sèche) de solide monillé sont redissous pour former une solution à 3 - 4 % en poids/volume dans le meme solvant de chloroforme, dtisopropanol et d'eau utilisé pour la cristallisation antérieure. Cette solution est utilisée pour approvisionner la colonne à extraction fractionnée. Cette dernière est une colonne à plaques alternatives de 7,62 cm de diamètre et de 7 mètres de long. Le liquide est pompé dans le centre de la colonne à une vitesse de 40 g/heure (base sèche). Le système de solvants organiques ayant une composition de 23,25 % d'isopropanol, de 74,5 % de chloroforme et de 2925 % d'eau est introduit dans le haut de la colonne à une vitesse de 120-133 mg/minute. Le solvant aqueux tamponné ayant un pH de 8,5 à 8,6 et une composition de t,5 % de chloroforme, 15 % dtisopropanol et 83,5 % de tampon de phosphate dilué est introduit dans le bas de la colonne d'extraction à une vitesse de 400 ml/ minute. Le solvant aqueux estrait tous les composés non-désirés et une petite quantité de coumermycine A1 durant la montée dans la colonne, puis déborde vers un récipient agité. Là, il est neutralisé continuellement à un pH de 6,2-6,4 au moyen dtun courant d'acide phosphorique à 10 ffi afin de prévenir l'isomérisation de la substance en solution. Le solvant organique descend la colonne, extrait la coumermycine A1 et coule dans un récipient agité contenant un peu de solvant aqueux préalablement ajusté à un pH de 5,5 à 5,7. Ce tampon aqueux neutralise continuellement le courant quittant la colonne à l'extrémité inférieure afin de réduire l'isomérisation du produit à un minImum. Le produit est récupéré des courants de solvants organiques comme suit Le pH de la couche-tampon est ajusté à 5,5-5,90 La couche organique est séparée, lavée avec une solution aqueuse ayant une composition essentiellement identique à la couche aqueuse utilisée dans la colonne d'extraction mais sans Na2HP040 La couche organique est ensuite concentrée à 10 litres, la bouillie obtenue est filtrée et lavée avec de l'isopropanol. La coumermycine A1 ainsi obtenue est séchée dans un four à vide à 35-400; sa pureté est de 97 %. Exemple 2 Le procédé de l'exemple 1 est répété, excepté qu'on utilise du tétrahydrofurane afin de dissoudre le mélange d'antibiotiques introduit dans le centre de la colonne en lieu et place du mélange chloroforme-isopropanol. Le produit récupéré est la coumermycine A1 d'une pureté de 97 %. REVENDICATIONS 1.- Procédé pour l'isolation de coumermycine A1 essentiellement pure, à partir d'un complexe prélevé d'une culture de fermentation, caractérisé en ce dugon sépare ladite coumermycine À1 au moyen d'une extraction liquide fractionnée en utilisant comme solvant un système de solvants organiques et de solution aqueuse tamponnée. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit le complexe de coumermycine brut dans une colonne d'extraction liquide-liquide, introduit une phase de solvants organiques par un orifice près du haut de la colonne, introduit une phase aqueuse tamponnée ayant un pi d'environ 8 à environ 8,8 dans la colonne par un orifice au bas de celle-ci et transfère, à l'intérieur, les composants du produit brut entre la phase organique et la phase aqueuse au moyen d'énergie fournie par des moyens mécaniques dans la colonne. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la colonne employée est une colonne d'extraction à plaques alternatives et que les moyens fournissant l'énergie sont les plaques alternatives. 4.- Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que le système de solvants est constitué par les phases mutuellement saturées formées par équilibrage d'un mélange d'un alcanol ayant de 3 à 9 atomes de carbone, un hydrocarbure halogéné et une solution aqueuse tamponnée. 5.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'bydrocarbure halogéné est le chloroforme, et l'alcanol est l'isopropanol. 6.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le procédé est mis en oeuvre à un pH entre environ 8 et environ 8,8, la température de la colonne étant maintenue constante entre environ 200 et environ 300 sur toute la longueur de la colonne0 7.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le procédé est effectué à une température d'environ 250 et à un pH d'environ 8 à environ 8,5. 8.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que la phase organique contient 23,25 % en poids d'isopropanol, 74,5 % en poids de diloroforme et 2,25 % en poids d'eau. 9.- Procédé suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que la phase aqueuse tamponnée contient 1,5 ss de chloroforme et 15 % d'isopropanol.