FR 2014689 A1 19700417 FR 6924767 A 19690721 La présente invention concerne un nouveauprocédé de synthèse des pénicillines, et plus particulièrement, un nouveau procédé de synthèse enzymatique des pénicillines demi-synthétiques, ayant la formule chimique générale suivante : dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle ou acyle ou cycloalkyle ou aralkyle, ces radicaux étant éventuellement halogénés, ou un groupe de formule dans laquelle R3, R4, et R5, identiques ou différents sont choisis parmi les atomes d'hydrogène, de chlore, de brome, d'iode ou de fluor, les groupes nitro ou sulfamyle et les radicaux dialkylamino dans lesquels les groupes alkyle ont 1 à 6 atomes de carbone, monoalkylamino ayant 1 à 6 atomes de carbone, acylamino ayant 1 à 6 atomes de carbone, acylaminoalkyle dans lesquels le groupe acyle a de 1 à 6 atomes de carbone et le groupe alkyle de 1 à 8 atomes de carbone, alkoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, alkylthio ayant 1 à 6 atomes de carbone, alkylsulfonyle-ayant i. à 12 atomes de carbone, carboalkoxy ayant i à 6 atomes de carbone, cycloalkyle dont le cycle est en 05 > C6 ou R2 représente un atome dthydrogène ou un radical alkyle, cycloalkyle, aryle, aralkyle ces radicaux étant éventuellement halogénés; R1 et R2 peuvent salement faire partie d'un cycle aliphatique comportant de 5 à 7 atomes de carbone.A représente le résidu organique d'un composé carbonylique, formant avec l'atome d'azote contigu un radical aldiminique ou cétiminique-, et plus particulièrement A peut être représenté par le groupement. R6 - C - (R7)n - R8 dans lequel R7 est un radical divalent du type' alkylène, arylène, alkénylénique, n est un nombre entier compris entre 0 et 6 et dans lequel R6 et Re, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical allylique, aryliquce, aralkylique, cycloalkylique, acetonyle, phénylacétonyle, ou carboalkylique ayant 1 à 6 atomes de carbone. Le procédé de synthèse de la présente invention est caractérisé par le fait que l'acylation de l'acide 6-aminopénicillanique avec un acide carboxylique substitué.a lieu, en présence de l'enzyme pénicilline-ss-amidase, selon la réaction chimique suivante R2 t R1 - C- - COOH + 6APA + péni ciiline-p-amidase t n A R2 S CH3 c - CO - NH R1 - N cOOHH3+ H20 N N, '3 n A où R1, R2 et A ont le même sens précité. Les pénicillines indiquees étaient préparées jusqu'à maintenant, par la réaction dgune pénicilline ayant le groupe a-aminique libre (comme par exemple-ltampicilline) avec un composé carbonylique dans les conditions' générales indiquées pour les préparations des bases de Schiff (par exemple Brit. Pat. 1081093), ou bien, dans quelques cas, de la réaction des bases de Schiff sous forme d'anhydride mixte avec le 6APA (voir : E.Dane et T. Dockner; Angew. Chem. 76 (N8) 342 (1964). Toutefois ces procédés demandaient l'utilisation des pénicillines ayant un groupe a-aminique libre, ou bien on devait effectuer la réaction d'acylation du 6APA avecl'anhydride mixte de la base de Schiff de lta-aminoacidee Dans les deux cas, les méthodes chimiques ont démontré qutil y a formation de produits secondaires, et il est souvent difficile d'obtenir le produit demandé suffisammént pure On sait depuis longtemps que les pénicillines peuvent être préparées par fermentation de la culture de certains microorganismes dans des milieux de culture convenables, donc elles peuvent Etre isoléesslon des procédés d'extraction habituels et connus. Toutefois, le procédé de fermentation est limité à la préparation des seules pénicillines naturelles, telles que par exemple la benzylpénicilline, la phénoxyméthylpéniciîline, la 4 2 penténylpénicilline, la n-amylpénicilline > etc... Sur la base des recherches de F.R.Batchelor et collç (Nature - vol. 183.257 de 1959) les pénicillines naturelles pouvaient être hydrolisées, en présence de micro-organlsmes à même de produire un enzyme dénomme pénicilline-ss-amidase, ou acide 6-aminopenicillanique (6APA) d'où on pouvait successivement obtenir de nouvelles pénicillines par acylation chimique. La disponibilité du 6APA, en tant qu'intermédiaire chimique, a permis ainsi la production de nouvelles pénicillines définies : semi-synthétiques, ayant des propriétés supérieures, dgun certain point de vue, à celles des pénicillines naturelles. On a constaté successivement que la séparation enzymatique des pénicillines naturelles en 6APA et en acide carboxylique est un procédé reversible; ce fait a été donc exploité pour la préparation de quelques pénicillines, en faisant réagir le 6APA avec un acide carboxylique en présence de micro-organismes produisant l'enzyme penicilline-R-amidase. Naturellement, comme tous les enzymes, la-pénicilline-ss- amidase, a une spécificité vis-à-vis de substances particulières pour la formation du support indispensable à la reaction enzymatique. Par conséquent, le nombre des pénicillines jupon peut obtenir par synthèse enzymatique est considérablement limité par le fait que seulement très peu diacides carboxyliques peuvent constituer le support des enzymes intéressés dans la réaction d'acylation du 6APA. D'autre part, on a aussi trouvé que quelques ddrivés (esters, thioesthers, amides), des a-aminoacides sont à même de former, même avec des rendements très bas, des pénicillines ayant le groupe a-amino libre (US Pat. 3.079.307). La demanderesse a trouvé, avec surprise, qu'on peut utiliser avec succès dans la réaction dtacylation enzymatique du 6APA des dérivés des a-aminoacides indiqués dans la formule (2). Les bases de Schiff des aminoacides sont utilisées sous forme de sels hydrosolubles, comme par exemple : sels de Na, K,ammonium, Ca, trialkylammoniques, qui sont facilement incorporés dans la molécule du 6APA en présence de pénicilline-ss-amidase, en agissant ainsi comme des supports pour les enzymes, selon la réaction précitée. Les bases de Schiff utilises dans le présent procédé pour l'acylation enzymatique du 6APA, sont préparées selon les méthodes connues, de la réaction de ltaminoacide avèc le composé carbonylique demandé, dans des solutions aqueuses ou alcooliques, La présente invention a pour objet l'acylation enzymatique du 6APA avec les composés définis dans la formule 2, en présence de pénicilline-ss-amidase et en présence de préparations enzymatiques de toute origine, ngimporte laquelle, en obtenant la formation de nouvelles pénicillines, indiquées dans la formule 1. Pour la synthèse enzymatique de ces pénicillines, peuvent être utilisés les micro-organismes produisant la pénicilline ~amidase, choisis parmi ceux susceptibles dtattaquer le groupe amidique en position 6 de la pénicilline, avec la formation du 6APA. Ceci d'ailleurs peut être mis en évidence par la propriété de ces micro-organismes doinactiver la pénicilline G de 20% dans les 24 heures à une température de 280C, en déterminant la formation d'une solution où la pénicilline G peut être inactivée du moins en partie, en additionnant à la solution du chlorure de phénylacétyle. Ces micro-organismes comprennent les champignons, les levures et les bactéries, et peuvent être choisis, par exemple parmi les genres suivants - Alternatia - Aspergillus - Botrytis - Cephalosporium - Cryptococcus - Emericellopsis - Epicoccum - Epiolermophiten - Fusarium - Mucor - Penicillum - Phoma - Trichoderma - Trichiphiton - Trichosporon - Streptomyces - Aerobacter - Alcaligenes - Bordetella - Cellulomonas - Corynebacterium - Erwinia - Escherichia - Flavobacterium - Micrococcus - Proteus - Pseudomonas - Salmonella - Sarcina - Xantomonas - Nocardia - Torulopsis - Rhodutorula - Arthrobacter Les micro-organismes mentionnes peuvent être utilisés pour la synthèse enzymatique des pénicillines selon la présente invention, soit sous forme de cellules recueillies-du bouillon de la culture, soit des micro-organismes recouvrés à la fin de la production industrielle du 6APA, soit comme cellules acétoniques, soit comme cellules adsorbées sur des supports inertes, et enfin sous forme d'extraits cellulaires (préparations enzymatiques). Au cours de l'acylation enzymatique de 6APA selon la présente invention, le rapport des réactifs (6APA-agent acylant de la formule 2) peut varier largement, sans préjuger lisse de la réaction; toutefois, pour obtenir un rendement élevé, il est opportun dtutiliser ltagent acylant en excès par rapport à la quantité moléculaire correspondante de 6APA. Un avantage particulier de la présente invention est représenté par la possibilité dtutiliser pour la synthèse des pénicillines, directement une solution de 6APA, obtenue de lthy- drolyse des pénicillines , sans qutil soit nécessaire dtisoler ou purifier préalablement le 6APA. Dans ce cas, il est préférable, mais pas essentiel, d'éloigner l'acide carboxylique (qui stest formé avec le 6APA), par exemple par extraction avec des solvants organiques. La synthèse enzymatique des pénicillines selon la pré- sente invention consiste donc dans la réaction d'un dérivé d'un acide carboxylique (formule 2) avec le 6APA en solution aqueuse, ou bien avec une solution résultant de l'hydrolyse des pénicillines en présence de micro-organismes producteurs de pénicilline-ss- amidase, ou dtun préparé enzymatique, à une température compatible avec la stabilité du système enzymatique et de la pénicilline qui stest formée. Cette température est comprise entre 20 et 450C, de préférence entre 28 et 380C, Comme tout procédé enzymatique, l'acylation du 6APA est sensible aux variations du pH. Pour Pour obtenir des pénicillines selon la présente invention, l'acylation doit être.réalisée à des pH compris entre 4,5 et 9,1, de préférence entre 5,5 et 8. A la fin de la réaction, la pénicilline qui s'est formée peut être séparée de la solution par les procédés habituels. Un autre avantage de la présente invention est que le produit peut être réalisé en continu, faisant passer une solution de 6APA (ou le bouillon d'hydrolyse de pénicilline) contenant le dérivé du composé -défini dans la formule 2, sur une couche solide constituée de cellules ou enzymes résultant des préparations cellulaires adsorbées sur un support inerte convenable, comme par exemple terres activées, charbon actif, acide silicique differemment hydratés, oxyde d'aluminium, différemment hydraté, gel de silice, gel de phosphate calcique, etc... Particulièrement le procédé, objet de la présente invens tion, présente un intér8t particulier pour la préparation de l'antibiotique bien connu; la-amino-benzylpénicilline (ampicilline), avec des rendements élevés. L'ampicilline est préparée par synthèse, par acylation chimique du 6APA. Le procédé est réalisé selon les méthodes habituelles dans la synthèse des peptides, et présente des difficultés consi érables Les méthodes consistent généralement dans la protection du groupe a-aminique de la phénylglycine, par exemple par acylation avec tester benzylique de l'acide chloroformique; et le drivé carbobenzyloxy ainsi obtenu est transformé successivement en un anhydride mixte réactif, utilisé pour ltacylation du 6APAX Dans la phase finale de la synthèse, on transforme le groupe protecteur de lamine par hydrogénation catalytique. Selon le procédé spécifique, objet de la présente invention, lta-amino-benzylpdnicilline peut entre préparée plus facilement et avec des rendements supérieurs, par rapport à ceux obtenus par les procédés de la chimie des peptides, par l'acylation enzymatique du 6APA. On utilise la réaction d'une base de Schiff de la d(-)phénylglycine, par exemple celle formée avec lester acétique ou avec le benzoylacétone, avec le 6APA, en présence de microorganismes producteurs de pénicilllne-P-amidase; à la fin de la réaction enzymatique, le groupe protecteur (ester acétoacétique ou benzoylacétone) est éliminé de la manière habituelle, Les pénicillines obtenues selon la présente invention sont actives envers les micro-organismes: Gram-positifs et Gram-négatifs, et peuvent être utilisées dans la thérapeutique humaine ou comme additifs alimentaires. Les exemples non limitatifs suivants illustrent le procédé de la présente invention. EXEMPLE 1 Des cellules d'Escherichia coli (ATCC 9637) ont été cultivées b la température de 300C dans un bouillon ayant la composition suivante Corn Steep (desséché) 0,15 % Peptone 0,20 % Hydrolisat de caséine 0,15 % Di-sodium hydrophosphate o, 18 % Di-potassium hydrophosphate o,îa % Huile de vaseline 0,002% Ammonium phénylacétate 0,02 % b pH 6,8 - 7,0 dans un récipient b fermentation de laboratoire, sous agitation (580 t.p.m.) barbotage dtair (6,5 - 7,5 litres/h par litre), pendant 9 heures. Ensuite les cellules sont recueillies par centrifugation, rinces ensuite deux fois avec du sérum physiologique. On pèse entre temps 15,1 g de d(-)-phOnylglycine dans un ballon et on y ajoute 5,6 g de KOH dissous dans 100 ml de mOtha- nol; à la solution on additionne ensuite 10 ml de fonnaline 40 %. On conserve la solution à 700C pendant 2 h et ensuite on distille le méthanol sous vide léger. On dissout le résidu sec dans 100 ml dteau, on ajoute une solution de 21,6 g-de 6APA (dans 100 ml d'eau à pH 7,0) et on corrige le pH de la solution obtenue à 7. A la solution on ajoute ensuite 300 ml dtune suspension cellulaire de Escherichia coli, recueillie de la manière précitée, contenant 10 g de cellules (poids sec). On porte dans un fermentateur de laboratoire et le mélange est conservé à la température de 300C sous agitation et légère aération. Après 3 heures de réaction, dans un échantillon prélevé on observe la présence de D(-)-méthimino-benzylpénicilline, évidenciée par chromatographie, et une activité microbiologique de 4300 UI/ml, exprimée comme pénicilline G sel sodique, contre Sarcina lutea. EXEMPLE 2 En partant de 15,1 g de d(-)phénylglycine et de 5 g dtaldéhyde acétique on prépare le sel potassique de la base de Schiff correspondante utilisée dans l'acylation enzymatique du 6APA dans les conditions indiquées dans exemple 1. On obtient la D(-) &alpha;-acétaldimino-benzylpénicilline, évidenciée par chromatographie sur couche mince (gel de silice). EXEMPLE 3 De façon analogue à l'exemple 1, en utilisant 10,6 g d'aldéhyde benzoSque, on obtient la d(-)a-benzaldiminobenzyl- pénicilline, évidenciée par chromatographie sur couche mince EXEMPLE 4 De façon analogue à l'exemple 1, en utilisant 10 g d'aldéhyde furoSque, on obtient la d(-)a-furfuraldiminobenzylpénicilline, évidenciée par chromatographie sur couche mince, EXEMPLE 5 On dissout 15,1 g de d(-)phénylglycine dans 100 ml de méthanol contenant 5,6 g de KOH; à la solution on ajoute 13,5 g d'acétoacétate dcéthyle et on conserve à 600C pendant 2 heures, et ensuite on distille le méthanol sous vide léger. Le résidu solide est dissous dans 1-00 ml dVeau et à la solution on ajoute une solution préparée en dissolvant 21,6 g de 6APA dans 100 ml d'eau, en portant le pH à 7,5 avec du NaOH iO%. Le pH de la solution obtenue est ensuite corrigé à 6,5 avec de l'acide acétique et on y ajoute 15 g de matière cellulaire de Escherichia coli (en poids sec) dispersée dans 400 ml seau, pr8pa- rée selon la manière indiquée dans exemple 1. On porte ensuite dans un fermentateur de laboratoire et le mélange est conservé sous agitation et légère aération à 3O0C pendant e ho On centrifuge ensuite du matériel cellulaire et la solution est refroidie à OOC et acidifiée avec HCl 5% jusqu'à pH 1,5. On maintient le même pH à 0 pendant 20 minutes et on extrait deux fois avec 100 ml de méthylisobutylcétone (MIBC). La solution aqueuse extraite est portée à pH 4,5 avec une solution de NaOH à 10%; après une conservation en frigo pendant 12 heures, cristallisent 18 g de D(-)a-aminobenzylpénicilline tri-hydrate. Des eaux-mères on peut obtenir ultérieurement du pro- duit cristallin dalpicilline par concentration et successive cristallisation. EXEMPLE 6 On cultive des cellules dAerobacter Aérogènes (ATCC 13529) dans un bouillon ayant la composition suivante dipotassium monohydrophosphate 0,7 % monopotassium dihydrophosphate 0,3 % sodium citrate di-hydrate 0,05% Mg sulfate anhydre ammonium sulfate 0,1% sulfate ferrique hydrolysé de caséine 0,15% corn steep (poids sec) glucose 0,1 % ammonium phénylacétate 0,02% à pH - 7,0 à la température de 300C sous agitation dans un fermentateur de laboratoire (550 t.p.m.) et aération (6 litres/h) par litre), pendant 16-19 heures0 On recueille ensuite les cellules par centrifugation; on les rinces deux fois avec du sérum physiologique. Pour lVhydrolyse enzymatique de la benzylpénicilline, on a dissous 100 g de benzylpénicilline sel sodique dans 10 litres de tampon phosphate à pH 7,8. A la solution on a ajouté 80 g (poids sec) de cellules de Aérobacter aérogènes; la suspension a été conservée sous agita tion avec aération (5 litres/h par litre) pendant 24 heures, à la température de 37 C. Pendant cet intervalle la concentration de la benzyl- pénicilline s'est réduite de 8,5, par rapport à la valeur de début, selon l'indication d'un test microbiologique. Du mélange de réaction enzymatique on a recueilli les cellules, rincées deux fois avec 800 ml d'eau, en ajoutant leeau de lavage à la solution limpide, et ensuite deux fois avec la solution tampon à pH 6,5. La solution aqueuse obtenue a été refroidie à 0 w5 C, acidifiée avec HCl 10% à pH 1,5 et extraite deux fois avefl 2 litres de MIBC (méthylisobutylcétone). La solution extraite a été portée ensuite à pH 7 et traitée avec les mêmes cellules recueillies à la fin de l'hydrolyse de la benzylpdnicilline. A la suspension ont été ajoutes 125 g de sel potassique de l'acide d(-)a-méthimino-phénylacetique (comme résidu sec obtenu de l'évaporation sous vide du méthanols en partant de iao g de d(-)phénylglycine, 67 g de KOH, 1200 ml de méthanol et 100 ml de formaline 40%); le pH du mélange a été corrige à 6,5. Le mélange a été conservé à 320C sous agitation et légère aération pendant 24 heures et ensuite centrifugé; la solution clarifiée a été refroidie à 5 C, additionnée de 2 litres de MIBC et acidifiée avec HCl io% jusqu'à pH 20 Après 10 minutes d'agitation, la phase organique a été sépare, lavée deux fois avec 1 litre d'eau, traitée avec 200 ml d'eau; sous agitation et refroidissement, le mélange hétérogène a été porté à pH 6,5. La phase aqueuse a été reprise et extraite deux fois avec 200 ml d'éther; la solution aqueuse a été lyophilisée; on a obtenu 58 g du sel sodique de la d(-)&alpha;-méthimino-benzylpénicilline, avec un titre iodométrique de 81 %. EXEMPLE 7 Des cellules de Escherichia coli (ATCC 9637) sont culti vées dans un fermentateur de laboratoire de 10 litres, dans 5500ml de milieu de culture indiqué dans l'exemple 1. Après 42 heures de fermentation à 370C, on y ajoute sous agitation 250 g de gel de phosphate de Ca à 10 % de substance sèche, préparée selon Theorel et Akeson: Biochemical Preparations - vol, 6 page 57 - Ed. C.Sç Vesting-J. Willey & Sons N.Y. 1958. Après 15 minutes dtagitation, le mélange a été filtré et le matériel solide a été dispersé dans 500 ml d'une solution à pH 7,0 contenant 5 g de 6APA et 12 g de résidu sec obtenu, comme indiqué dans l'exemple 5, en partant de d(-)phénylglycine, potasse ou ester acétoacétique en solution méthanolique. La suspension a été ensuite portée dans une colonne avec thermostat à la température de 30oC; après 24 heures, on fait passer dans la colonne, du bas en haut, à une vitesse de 16-18 ml/h la même solution à pH 7,0, où ton a dispersé la préparation enzy- matique adsorbée en gel de phosphate de Ca. 10 jours après, sont recueillis 3 850 ml de solution présente dans l'ensemble à concentration de 12 mg/ml de N-(3-carboxyéthyl-#2-propényl)d(-)&alpha;-amino-benzyl-pénicilline ayant la formule chimique suivante : REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de pénicillines semi-synthétiques de formule générale dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle ou acyle ou cycloalkyle ou aralkyle, ces radicaux étant éventuellement halogénés, ou un groupe de formule dans laquelle R3, R4, et R5, identiques ou différents sont choisis parmi les atomes dthydrogène, de chlore, de brome, diode ou de fluor, les groupes nitro ou sulfamyle et les radicaux dialkylamino dans lesquels les groupes alkyle ont 1 & 6 atomes de carbone monoalkylamino ayant 1 à 6 atomes de carbone, acylamino ayant 1 à 6 atomes de carbone, acylaminoalkyle dans lesquels le groupe acyle a de 1 à 6 atomes de carbone et le groupe alkyle de 1 à g atomes de carbone, alkoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, alkylthîo ayant 1 à 6 atomes de carbone, alkylsulfonyle ayant 1 à 12 atomes de carbone, carboalkoxy ayant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkyle dont le cycle est en C5, C6 ou C7; R2 représente un atome dthydrogène ou un radical alkyle, cycloalkyle, aryle, aralkyle, ces radicaux étant éventuellement halogénés; R1 et R2 peuvent également faire partie d'un cycle ali- phatique comportant de 5 à 7 atomes de carbone.A représente le résidu organique dgun composé carbonylique, formant avec atome d'azote contigu un radical aldiminique ou cétiminique, et plus particulièrement A peut être représenté par le groupement R6 - C - (R7)n 8 dans lequel R7 est un radical divalent de type aikylène, aryle, alkényldnique, n est un nombre entier compris entre O et 6 et dans lequel R6 et Rg, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkylique, arylique, aralkylique, cycle alkyliqus, acétonyle, phénylacétonyle ou carboalkylique ayant 1 à 6 atomes de carbone, caractérise en ce que lton fait réagir acide 6-aminopénicillanique avec un acide carboxylique de formule générale en présence de pénicilline-ss-amidase ou d'un micro-organisme susceptible de produire, in site, un tel enzyme. 2. Médicaments contenant, en tant que principe actif, les pénicillines semi-synthétiques préparées selon la revendication 9.