FR 2023010 A1 19700807 FR 6938554 A 19691107 La présente invention concerne une composition pour analyse sous forme de préférence d'un coffret de réactifs et un procédé pour la détermination des lipoprotéines dans les liquides aqueux, qui peut, entre autres, etre utilisé comme moyen de pronostiquer les risques d'artériosclérose. Le procédé est rapide et peut entre réalisé dans un laboratoire ayant peu d'équipement technique. On sait que l'infarctus du myocarde apparat chez des sujets dont les teneurs en graisse ou lipoïdes du sérum sont élevées. Ces lipoïdes sont principalement constitués de cholestérol et.de triglycéride et se trouvent toujours combinés avec une protéine constituant ainsi les lipoprotéines. tes lipoprotéines qui sont intéressantes ici ont une structure correspondant à celles des micelles. Elles consistent en des particules sphériques ayant un noyau contenant des quantités variables de cholestérol et de triglycéride entouré d'une enveloppe de protéine. Ces lipoprotéines consistent pratiquement en trois fractions séparées désignées arbitrairement, c'est-à-dire les chylomicrons (CM); les pré- ss -lipoprotéines (pre- ss) ou lipoprotéines de très faible densité (LTFD) et les F -lipoprotéines ( 9 ) ou lipoprotéines de faible densité (LFD).Les chylomicrons, que l'on ne juge pas dangereux dans le domaine due l'artériosclérose, ont un diamètre supérieur à 900 X et un contenu important en triglycéride, leur densité étant la plus faible des lipoprot6- ines citées c'est-à-dire, environ 0,95. Leur couronne ou enveloppe est constituée de ce qu'on appelle la protéine A. tes pré- ss -lipoprotéines ont un fragment constitué de quantités pratiquement égales de cholestérol et de triglycéride et une couronne ou enveloppe constituée de protéine A et de protéine B. Ces substances ont une dimension de 250-900 et une densité d'environ 1,0. On pense que le cholestérol contenu dans les pré -lipoprotéines provoque le début de l'artériosclérosew Les ss -lipoprotéines ont une densité d'environ 1,05 et une dimension d'environ 190-250 . La couronne est constituée de protéine B et le fragment lipidique est constitué essentiellement de cholestérol. On considère également que les ss -lipoprotéines sont dangereuses pour les vaisseaux sanguins.En recherchant la présence dans le sérum des deux dernière9 lipoprotéines c'est-àdire les pré- ss -lipoprotéines et ss-lipoprotéines, et en déterminant leur teneur, on peut dans une certaine mesure pronostiquer les risques d'un début d'infarctus du myocarde. De nombreuses méthode ont été proposées pour cette détermination, telles que des différences de solubilité, l'ultracentrifugation, des réactions immunologiques spéciales et l'aspect électrophorétique. Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de laboratoire complexe et prennent beaucoup de temps e La séparation fondée sur les différences de solubilité des lipoprotéines ne donne pas des résultats exacts, et il existe un risque que les lipoprotéines très sensibles et labiles soient détruites par le traitement par les solvants.Le principe de l'ultracentrifugation repose sur la densité des différentes lipoprotéines. Ctest une méthode prenant beaucoup de temps, nécessitant souvent une durée de centrifugation de -plusieurs jours, et qui ne peut pas être réalisée dans un laboratoire n'ayant qu un équipement simple. ta technique immunochimique nécessite la préparation longue et coûteuse d'un antisérum et ne permet pas de fractionner les trois types de lipoprotéines. La séparation par électrophorèse, qui repose sur la charge de la couronne de protéine des différentes lipoprotéines, ne donne pas de résultat quantitatif précise Comme il a été dit, cette couronne est constituée de protéines A et B. Les chylomicrons en raison de leur grand diamètre ne peuvent pas migrer, alors que les p-lipoprotéines et les pré- p -lipoprotéines migrent à des vitesses différentes car leurs couronnes comprennent respectivement la protéine B et la protéine A et B. Oes différentes lipoprotéines après migration, sont identifiées sur le papier d'électrophorèse à l'aide de colorants ayant de l'affinité pour les lipides. ta méthode d'électrophorèse sur papier nécessite environ 20 heures, et ne peut être utilisée que pour mettre en évidence la présence de lipoprotéines dans le sérum.Donc, cette technique ne peut pas servir à la détermination quantitative des différentes lipoprotéindes Selon le présent procédé, cependant, une détermination quantitative exacte de la teneur et du type des lipoprotéines présentes dans le sérum est obtenue dans un temps très court et en utilisant des réactifs faciles à. obtenir et un équipement simple, te procédé. de la présente invention repose sur le fait que les lipoprotéines se rassemblent sur certains produits polymères tels que la polyvinylpyrrolidone (PVP). Ce rassemblement ou floculation est cumulatif et quantitatif selon la concentration du polymère et de la lipoprotéine particulière, et les agrégats ou floculats obtenus peuvent etre facilement séparés du serum restant. Lateneur d'une lipoprotéine spécifique dans un échantillon peut donc, après une opération très simple, être lue directement sans qu'il soit nécessaire de détruire le floculat. On peut utiliser comme polymère, tout polymère neutre linéaire ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000. On peut citer comme polymères convenables le Eve, le dextrane, le polyéthylène glycol, le polypropylène glycol ou I'héparine. La polyvinylpyrrolidone est le polymère préférable, et des résultats supérieur sont obtenus en l'utilisant. Il est préférable d'utiliser le polymère avec un sel métallique et de préférence un halogénure de métal alcalin tel que le chlorure de lithium, le bromure de lithium, le chlorure de sodium, le bromure de sodium, et le chlorure de potassium. Pour des raisons d'économie et de facilité d'obtention-, on accorde la plus grande préférence au chlorure de sodium. ta Demanderesse a trouvé plus avantageux d'augmenter la teneur en sel lorsque la concentration en polymère augmente. En pratique une teneur en sel d'environ ;iQà 18 % convient lorsqu'on utilise l'un quelconque des polymères cités. A une concentration de 14 % en chlorure de sodium, parexemple, des lipoprotéines citées se rassemblent en un spectre. Selon la présente invention, il est apparu de façon surprenante à la Demanderesse qu'en utilisant des concentrations différentes du même polymère avec divers échantillons de sérum ou d'un autre liquide, on peut floculer ou rassembler respectivement les trois fractions différentes de lipoprotéines quantitativement et de façon sélective En ajoutant environ 1% à 5 % de polymère (en poids par volume de polymère dans le sérum), de préférence entre environ 2 % à 4 %, s' un sérum frais, les chylomicrons, c'est-à-dire, les lipoprotéine s ayant un diamètre de particule supérieur à 900 A, floculent quantitativement, alors que les autres lipoprotéines ne sont pas modifiées. Si la concentration du polymère augmente à une valeur d'environ 5 % à 9 %, toutes les lipoprotéines ayant un diamètre de particule supérieur à 250 A floculent, c'est-à-dire les pré- 13 -lipoprotéines et les chylomicrons. A des concentrations en polymère supérieures à environ 9 % les p -liFoprotéines floculent également, une telle floculation ayant lieu à des concentrations allant jusqu'à 20 % ou plus. Cette dernière concentration en polymère peut varier dans la gamme proposée; cependant la Demanderesse a trouvé que 12 % à 13 % de polyvinylpyrrolidone peuvent floculer ou rassembler les p -lipoprotéines quantitativement et constituent la gamme de concentration préférable.Comme il a été dit, l'utilisation d'une quantité d'environ 10 % à 18 % de sel métal avec le polymère convient bien pour rassembler le spectre total de lipoprotéines0 Le rassemblement quantitatif se réalise en un temps maximal d'environ 2 à 3 heures à la température ambiante. La Demanderesse a également trouvé que le rassemblement a lieu plus rapidement à des températures modérément élevées. Par exemple, un rassemblement total a lieu en un temps maximal d'environ 20 à 30 minutes à 37 C. Il est préférable d'utiliser du sérum frais dans le procédé de la présente invention. Si le sérum est vieux, c'est-à-dire a plus d'environ 2 jours, les particules sont devenues plus petites et par conséquent ces particules nécessitent une concentration en polymère plus importante pour leur précipitation quantitative. De façon à pallier cet effet on peut ajouter un inhibiteur des enzymes produisant la diminution. Un enzyme important de ce groupe est ltacyltransférase, qui peut etre inhibé par le méthyl maléamide par exemple. De façon à obtenir une telle inhibition, le méthyl maléamide est ajouté à une concentration de 0,05 M. Lorsqu'on réalise le procédé de la présente invention on prélève quatre échantillons du même sérum. A ces échantillons, on ajoute respectivement, le polymère, de préférence en solution, à la concentration souhaitée en floculant ou rassemblant ainsi de façon cumulative et quantitative les chylomicrons, pré- J -lipoprotéines et p -lipoprotéines. Les échantillons sont alors incubés pendant le temps nécessaire à un rassemblement ou floculation complète, après quoi les agrégats sont distribués dans des récipients convenant à la centrifugation, tels que des tubes capillaires, et centrifugés dans une centrifugeuse de laboratoire pour amener la séparation de l'agrégat d'une part et du sérum ou autre liquide, d'autre part.Il est préférable que l'échantillon ne soit pas soumis à la chaleur pendant la centrifugation; par conséquent, cette opération devra être réalisée à la température du laboratoire ou à des températures inférieures de telle sorte que les lipoprotéines ne soient pas détruites. L'agrégat de polymère et lipoprotéine ainsi séparé s'est montré proportionnel de façon cumulative à la teneur et au type de lipoprotéine dans le sérum. Donc, la teneur relative des diverses fractions de lipoprotéine dans le sérum peut être déterminée par simple lecture de la hauteur de l'agrégat dans la colonne ou dans le capillaire ou bien peut être calculée comme suit : La hauteur de l'agrégat dans le capillaire est d'abord corrigée par un facteur de dilution, qui est égal à la quantité totale de l'e'chantii lon divisée par la quantité de sérum présente dans l'échantillon, et ensuite par un facteur de capillaire. te facteur de capillaire est égal à 1 lorsque le capillaire est rempli avec l'échantillon jusqu'à 100 mm, c'est-à-dire que la mesure de l'agrégat de polymère-lipoprotéine est donnée en volume %.Lorsque la hauteur de remplissage du capillaire est autre, le facteur de capillaire sera égal à 100 divisé par la hauteur de l'échantillon dans le capillaire. La hauteur de l'échantillon ainsi corrigée est alors multipliée par un facteur de lipoprotéine et l'on obtient une valeur directe de lipoprotéine en pourwentage en volume. te facteur de lipoprotéine est égal à 1/4 pour les chylomicrons, 1/7 pour les pré- p -lipoprotéines et 1/9 pour les ss -lipoprotéines. tes formules suivantes précisent les calculs volume total de Hauteur corrigée = hauteur réelle x x l'échantillon 100 volume du sérum hauteur de dans l'échantillon l'échantillon dans le capi- laire Pourcentage en volume de chylomicrcn = hauteur corrigée CM x 1/4 Pourcentage en volume de pré- 2 -lipoprotéine = (hauteur corrigée CM + pré- 0 -hauteur corrigée CM) x 1/7 Pourcentage en volume de p -lipoprotéine = (hauteur corrigée CM + pré- p + ss - hauteur corrigée CM + pré- ) x 1/9. La hauteur de l'agrégat dans le capillaire peut être lue de façon arbitraire ou peut, par exemple, être déterminée en utilisant un micromètre sur support rigide Dans ce dernier cas il est possible de lire avec une précision de 0,01 mm au maximum. On peut également utiliser une méthode de mesure plus précise en utilisant un appareil avec des lentilles grossissantes et un collimateur permettant une lecture précise. Avec un tel appareil il est également possible de faire des lectures avec une précision d'au moins 0,01 mm. Le malade dont on examine le sérum pour l'étude des lipoprotéines devra être à jeun depuis environ 12 heures avant le prélèvement de sang, de façon à éviter toute anomalie de la quantité de chylomicrons telle que, par exemple, celle que l'cn pourrait rencontrer après un repas riche en graisses. te tableau suivant indique les valeurs normales en lipoprotéine que lton-rencontre approximativement chez les sujets sains.Lorsque la teneur en pré- p -lipoprotéines et/ou ss -lipoprotéines dépasse ces valeurs un risque d'infarctus du myocarde se dessine, Chylomicron pré- ss - ss -lipo ~~~~~~~~~~~ lipoprotéine protéine lipoprotéine en mg % 100 150 400 hauteur de l'agrégat de lipoprotéine centrifugé à une hauteur de capillaire de 60 mx O O - 0,5 1,5 Selon la présente invention il est donc possible en un temps très court, et en utilisant un équipement simple et des modes opératoires simples, de déterminer de façon quantitative les lipoprotéines et de prévoir ainsi l'éventualité d'un infarctus du myocarde, L'avantage d'un tel procédé est que les centres médicaux et les médecins en clientèle peuvent réaliser cette détermination avec un équipement facile à obtenir et limité. Selon une forme de réalisation de la présente invention, une détermination plus précise des pré- /3 -lipoprotéines peut être réalisée en traitant deux échantillons séparés de façon à obtenir une floculation ou un agrégat des pré- p -lipoprotéines dans deux gammes différentes de dimension. Comme il a été dit, les pré- p - o lipoprotéines ont une dimension particulaire de 250 A à 900 A.En traitant un échantillon par une concentration de-polymère d'environ 5 % à 7 %, on les rassemble ou flocule les pré- ss -lipoprotéines ayant une dimension particulaire comprise dans la gamme de 400 à 900 , alors qu'en traitant un second échantillon par une concentration de polymère d'environ 7 % à 9 % on produira également la floculation ou agrégation des pré- ss -lipoprotéines de dimension particulaire comprise entre 250 à 400 . La détermination est alors réalisée de façon analogue à celle indiquée précédemment. Le facteur lipoprotéique est égal à 1/6 pour les plus grosses pré- P -lipoprotéines et à 1/8 pour les plus petites Certains praticiens ont trouvé que cette nouvelle division des pré- ss -lipoprotéines peut être utile pour le diagnostic de cer- taines anomalies lipoprotéiques chez les malades. La présente invention est illustrée mais non limitée par les exemples suivants, dans lesquels tous les pourcentages sont exprimés en poids par volume. EXEMPLE 1 Un échantillon de sang a été prélevé chez un malade à jeun depuis 12 heures. te sérum dudit échantillon a été divisé en trois portions de 2 ml chacune. On a ajouté respectivement à ces frac tions un ml de solution aqueuse de chlorure de sodium à 14 %, ayat ci-après une concentration de (PVP) indiquée dans le tableau X Après deux heures à la température ambiante, ces trois solutions ont été distribuées dans des tubes capillaires, en remplissant lesdits tubes jusqu'à une hauteur de 60 mm par capillarité. tes capillaires ont été bouchés et centrifugés pendant 40 minutes à 4000 tours/minute (environ 3500-4500 g). tes tubes capillaires ont été retirés, et la hauteur de l'agrégat polymère/lipoprotéine séparé a été mesurée dans chaque tube à l'aide d'un microscope étalonné. tes valeurs mesurées et les concentrations calculées pour les li poprotéines figurent dans le tableau ci-apres. EXEMPLE 2 On a ajouté du méthyl máléamide à une concentration de 0,5 M à un échantillon de sang d'un malade qui, à l'examen, semblait courir un certain risque d'infarctus du myocarde. Le sérum de cet échantillon de sang a été divisé en trois fractions de deux ml chacune, auxquelles- on a ajouté, respectivement, un ml de solution aqueuse à 17 % bromure de lithium. avant une concentration - ci-anrès en polyvinylpyrrolidone figurant dans le tableau /.Les échantillons ont été incubés pendant 20 minutes dans un bain-marie à 370C après quoi ils ont été refroidis et distribués en tubes capillaires, en remplissant lesdits tubes sur une hauteur de 100 mm et centrifugés pendant 20 minutes à 8000 tours/minute avec refroidissement. La hauteur de l'agrégat dans chaque tube a été lue à l'aide d'un microscope étalonné. Les concentrations en lipoprotéines et les valeurs mesurées figurent dans le tableau ci-après. Dans les exemples 1 et 2 le polymère FVP utilisé était acheté sous la dénomination "Plasdone K-29-32't à la General Aniline and Film Corporation. Ce polymère a un poids moléculaire de 80.000 au maximum et une dimension de polymère d'environ 800 à 1200 . EXEMPLE 3 Dans un examen de routine d'un sujet, un échantillon de sang a été prélevé, dont le sérum a été divisé en trois fractions de 4 ml chaque, auxquelles on a respectivement ajouté deux ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 13 % contenant du dextrane ci-après à des concentrations figurant dans le tableau / ("dextrane T 70", Pharmacia, Suède; poids moléculaire moyen 71.000). Selon le procédé de l'exemple 2, des indications sur le profil lipoprotéique du sujet ont été obtenues après environ 45 minutes et elles figu rent au tableau ci-après. EXEMPLE 4 Le procédé de l'exemple 3 a été repris, en utilisant un autre sérum et en utilisant du "dextrane 80" (Pharmacia Suède), au lieu du "dextrane U 70", en solution aqueuse de chlorure de sodium à 14 %. Le dextrane 80 a un poids moléculaire moyen de 75.000 tes valeurs obtenues figurent dans le tableau ci-après. TABLEAU Concen- facteur facteur tration de dilu- capilen PVP, tion : laire : en % dans volume 100 l'échan- hauteur total hauteur hau- hau Lipopro- tillon de l'a- volume du de l'é- teur teur LP, % LP en Ex. téine grégat sérum en chantil- corri- LP corri- facteur en vo- mg % en mm ml lon en mm gée gée LP lume 100 I CM 4 0,40 3/2 1,0 CM 1,0 1/4 0,25 240 60 CM + pre- ss 8 0,76 3/2 100 1,9 LTFD 0,9 1/7 0,13 130 60 CM+pre-ss 12 2,29 3/2 100 5,7 ss 3,8 1/9 0,42 430 + ss 60 II CM 3 0,76 1,5 100 1,1 CM 1,1 1/4 0,28 270 1,0 100 CM+pre- ss 7 1,40 1,5 100 2,1 LTFD 1,0 1/7 0,14 140 1,0 100 CM+pre- ss 13 4,8 1,5 100 7,2 ss 5,1 1/9 0,57 600 + ss 1,0 100 III CM 4 1,40 6 100 2,1 CM 2,1 CM 2,1 1/4 0,53 500 4 100 CM+pre- ss 9 1,86 6 100 2,8 LTFD 0,7 1/7 0,10 100 4 100 CM+pre- ss 16 3,60 6 100 5,4 ss 2,6 1/9 0,29 300 + ss 4 100 IV CM 3 0,26 0,75 100 0,64 CM 0,64 1/4 0,16 150 0,5 60 CM+pre- ss 8 0,40 0,75 100 1,0 LTFD 0,36 1/7 0,05 50 0,5 60 CM+pre- ss 14 1,28 0,75 100 3,2 ss 2,2 1/9 0,24 250 + ss 0,5 60 HEVENDIGATI0S 1 Goffret de réactifs pour a détermination quantitative des chylomicrons, pré- P -lipoprotéines et '-lipoprotéines dans des liquides aqueux, caractérisé par le fait qu'il est constitué de plusieurs quantités séparées d'un polymère linéaire neutre ayant; un poids moléculaire supérieur à 30.000, lesdites quantités ayant une teneur variable en polymère pour obtenir une concentration finale en poids de polymère par volume de liquide étudié (a) d'environ 1 % à 5 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et (b) d'environ 5 % à 20 % de polymère pour déterminer les chylomicrons, pré- p -lipoprotéines et p -lipoprotéines. 2. Coffret de réactifs selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité (b) est subdivisée en des quanti- tés séparées de polymère pour fournir (c) une concentration d'environ 5 à 9 % du polymère pour déterminer les chylomicrcns et pré- ss -lipoprotéines et (d) une concentration d'environ 9 % à 20 % de polymère pour déterminer les chylomicrons, les pré-)% -lipopro- téines et les K -lipoprotéines. 3. Un coffret selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la quantité (c) est subdivisée en des quantités séparées de polymère pour fournir (e) une concentration d'environ 5 à 7 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et les pré- ss -lipoprotéines ayant un diamètre d'environ 400 à 900 et (f) une concentration d'environ 7 à 9 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et les pré- ss -lipoprotéines ayant un diamètre d'environ 250 à 900 . 4. Un coffret selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3 caractérisé par le fait qu'un sel métallique est associé au polymère. 5. Un coffret de réactifs selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le sel métallique est un halogénure de métal alcalin et que ce sel/présent à une concentration d'environ 10 % à 18 % du poids du liquide examiné. 6. Un coffret de réactifs selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le sel métallique est le chlorure de sodium, 7. Un coffret selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, caractérisé par le fait que ledit polymère est la polyvinylpyrrolidone. 8. Coffret de réactifs selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdites quantités de polymère sont sous forme de solutions aqueuses de ce polymère. 90 Procédé pour la détermination quantitative des lipopro téires dans des liquides aqueux à examiner, caractérisé par le fait qu'il comprend la mise en contact de quantités séparées desdits liquides à examiner avec plusieurs quantités séparées d'un polymère linéaire neutre ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000, lesdites quantités ayant une teneur variable en polymère pour obtenir-une concentration finale en poids de polymère par volume de liquide à examiner de (a) environ 1 % à 5 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et (b) environ 5 /0 à 20 % de po polymère pour déterminer les chylomicrons, les pré- w -lipoprotéines et les t -lipoprotéines, amenant lesdites lipoprotéines et ledit polymère à former des agrégats, la séparation de cet agrégat d'avec la portion dudit liquide examiné et la détermination de la teneur en agrégat dans chaque portion du liquide examiné. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la quantité (b) est subdivisée en quantités séparées de polymère pour fournir (c) environ 5 % à 9 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et les pré- ss -lipoprotéines et (d) environ 9 à 20 % de polymère pour déterminer les chylomicrons, les pré- a -lipoprotéines et les /3-lipoprotéines. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la quantité (c) est subdivisée en quantités séparées de polymère pour fournir (e) environ 5 % à 7 % de polymère pour déterminer les chylomicrons et les pré- P -lipoprotéines ayant un diamètre d'environ 400 à 900 et (f) environ 7 % à 9 96 de polymère pour déterminer les chylomicrons et les pré- ss -lipoprotéines ayant un diamètre d'environ 250 à 900 . 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9, 10 et 11, caractérisé par le fait qu'un sel métallique supplémentaire est ajouté au liquide à étudier pour favoriser l'agrégation. 13 Procédé selon la revendication 12 caractérisé par le. fait que le sel métallique est un halogénure de métal alcalin et est présent à une concentration d'environ 10 % à 18 % en poids 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que ledit halogénure de métal alcalin est le chlorure de so doum, 150 Procédé selon l'une quelconque des revendications 9, 10 et 11, caractérisé par le fait que ledit polymère est la polyvinylpyrrolidone. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9, 10 et Il caractérisé par le fait que l'on soumet le liquide à examiner et l'agrégat à une centrifugation pour obtenir leur séparation. 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que la centrifugation est réalisée en tube capillaire et que la hauteur de l'agrégat est lue directement dans ledit tube capilulaire