FR 2025241 A1 19700904 FR 6941934 A 19691204 La présente invention est relative à un nouveau vaccin à usage vétérinaire qui permet grâce à une seule injection d'imimmuniser un animal à la fois contre la fièvre aphteuse et la brucellose, et éventuellement aussi contre la rage. On connaît déjà des vaccins permettant d'immuniser contre la fièvre aphteuse qui sont généralement préparés par inactivation d'une suspension du virus aphteux cultivé sur des cellules animales telles que, par exemple, des épithéliums linguaux de bovins. I1 est également connu de réaliser des vaccins anti-brucelliques par culture des différentes souches de Brucella, en phase rugueuse ou en phase lisse et inactivation par le formol. Jusqu'à ce jour on n'utilise par contre pas de vaccins bivalents à la fois anti-aphteux et anti-brucelliques. En effet, le vaccin anti-aphteux, qui présente de grandes difficultés de fabrication, ne peut être conservé en état d'activité que dans des conditions particulières, dont on pouvait penser qu'elles sont incompatibles avec des mélanges avec d'autres vaccins, en particulier avec des vaccins anti-brucelliques. Par ailleurs, il est bien connu qu il existe au niveau de l'organisme vacciné une concurrence antigénique, et l'on pouvait supposer, jusqu'à la présente invention, que l'administration simultanée d'antigènes anti-aphteux et d'antigènes anti-brucelliques, ne permettrait pas d'obtenir une vaccination efficace contre ces deux maladies. les expériences effectuées par la Société demanderesse ont démontré que, contrairement à ce que l'on pouvait penser, il est possible de réaliser, selon l'invention, des vaccins bivalents anti-aphteux et anti-brucelliques qui permettent dtimmuniser efficacement contre ces deux maladies par une seule et unique injection. Il résulte également des travaux effectués par la Société demanderesse qu'il est également possible d'adjoindre à ce vaccin une troisième valence permettant de vacciner simultanément contre la rage. La présente invention a pour objet un nouveau vaccin vétérinaire essentiellement caractérisé par le fait qu'il comporte à la fois une suspension aqueuse d'antigènes anti-aphteux, et une suspension aqueuse d'antigènes anti-brucelliques, de préférence en combinaison avec un adjuvant. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le vaccin bivalent est obtenu en mélangeant des antigènes antiaphteux inactivés au formol et fixés sur un gel, par exemple à base d'hydroxyde d'aluminium, et des antigènes anti-brucelliques obtenus, par exemple, par inactivation au formol d'une culture Brucella de souche Renoux H 38 ou Mac Even 45/20. Dans ce premier mode de réalisation de I1 invention, il est souhaitable de procéder à un lavage éventuellement répé té des Brucella inactivés, en vue d'éliminer ltexcès de formol, de sorte que lors du mélange de la suspension aqueuse d'antigènes anti-brucelliques et de la suspension aqueuse d'antigènes anti-aphteux, on conserve une teneur totale en formol qui permet une conservation satisfaisante de l'activité des antigènes anti-aphteux. Dans ce mode de réalisation il est également souhaitable d'ajouter en plus de l'hydroxyde dlaluminium une certaine quantité de saponine qui joue aussi un rôle d'adjuvant. Dans ce mode de réalisation de l'invention, on peut mélanger des doses vaccinantes de vaccin anti-aphteux de trois types différents, par exemple de type 0, de type A et de type C, à une dose vaccinante de vaccin anti-brucellique. Pour mettre en oeuvre l'invention, on peut utiliser des suspensions aqueuses d'antigènes anti-aphteux à une concentra- tion par ml d'au moins 10 millions de DECP (dose effet cytopathogène 50 %) sur culture de cellules primaires de rein de porc, tandis que l'on utilise des concentrations d'antigène anti-brucellique qui peuvent être, par exemple, de l'ordre de 400 milliards par ml pour le cas de la souche H 38, et d'environ 1 700 milliards par ml pour la souche 45/20. Dans un second mode de réalisation préféré de l'invention, on utilise des antigènes anti-aphteux obtenus par inactivation d'une suspension de virus aphteux à l'aide de composés dont on peut s'assurer qu'ils sont totalement fixés sur le virus ou détruits, et que l'excès en est élimine. On peut, à cet effet, réaliser l'inactivation du virus aphteux à l'aide de -propiolactone à une concentration de 0,5 à 1 /00, en maintenant le pH à une valeur légèrement basique par adjonction régulière d'un alcali qui permet de neutraliser les produits d'hydrolyse de la j3-propiolactone, On pourrait également utiliser pour réaliser une telle activation le glycide-aldéhyde ou l'acétyS-éthylène imine. Dans ce mode de réalisation on peut aussi utiliser comme valence anti-brucellique des antigènes obtenus par l'inacti- vation au formol de suspension de Brucella de souche H 38 ou 45/20, qui sont lavés et essorés à plusieurs reprises pour procéder à une élinination complète du formol ayant servi à 1 'inactivation. On peut également utiliser des valences anti-brucelliques constituées par des suspensions aqueuses de Brucella de souche Buck 13 B -vivantes ou inactivées. Dans ce mode de réalisation, il est préférable de disperser la phase aqueuse contenant en suspension les antigènes vivants, dans une phase huileuse jouant le rôle d'adjuvant. Cette phase huileuse peut, par exemple, être constituée par une huile minérale telle que.l'huile de paraffine, une huile végétale telle que l'huile d'olive, lthuile d'arachide ou l'huile de noyau, ou une huile animale telle que la lanoline. L'huile utilisée doit être, de préférence, peu oxydable ou elle doit contenir des anti-oxydants tels que la vitamine E. La dispersion de la phase aqueuse dans l'huile peut s'effectuer à la manière connue sous forme d'émulsion eaudans-l'huile réalisée à l'aide d'émulsionnants conventionnels tels qu'un ester de propylène-glycol et d'acide gras, du monooléate de sorbitol, du mono-oléate de manitol, du mono-oléate de propylène-glycol, des esters de propylène-glycol et d'acide gras, etc... Dans un mode de réalisation préféré, émulsion huileuse de la suspension aqueuse d'antigènes est à son tour dispersée à l'aide d'un émulsionnant de type huile-dans-l'eau, dans une autre phase aqueuse continue contenant des antigènes. On obtient, de cette manière, à l'aide d'une phase huileuse dont le volume est relativement faible par rapport à celui des deux phases liquides, les avantages présentés par le conditionnement huileux des vaccins, et les facilités d'injection des vaccins en phase aqueuse. Dans ce second mode de réalisation de l'in- > ention qui fait appel à l'utilisation des virus aphteux inactivés à l'aide d'une substance qui peut totalement être éliminée, si elle n'est ni fixée au virus, ni décomposée, il est possible d'ajouter l'antigène anti-rabique qui permet d'obtenir un vaccin trivalent rendant possible l'immunisation simultanée contre la fièvre aphteuse, contre la brucellose et contre la rage. À cet effet, on peut utiliser des antigènes constitués par une suspension du virus de la rage, éventuellement inactivés, obtenus par des cultures sur des cellules primaires ou sur des souches de lignée cellulaire telles que, par exemple, des lignées de cellules dérivées de jeunes hamsters. Dans le but de mieux faire comprendre l'invention, on va en décrire maintenant à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif, plusieurs modes de réalisation décrits dans les exemples suivants : Exemple 1 Pour préparer un vaccin bivalent selon l'invention, on opère de la manière suivante a) ?réaration de la valence aphteuse. On cultive un virus aphteux sur épithéliums de bovins selon le procédé de Frenkel en utilisant six litres de milieu de culture par kilo d'épithélium. En fin de culture, on prélève le liquide surnageant dont le titre par ml. en DECP50 (dose d'effet cytopathogène dans 50 % des cas) est d'au moins sur sur cultures de cellules primaires de reins de porc. On ajoute 1 % d'une solution de saponine. On procède à l'inactivation de la suspension virale ainsi obtenue par l'adjonction de 0,05 % de solution de formol à 40 %. On inactive pendant 48 heures. Le pH a été ajusté à 8,2 par addition de soude 0,5 N. On ajoute ensuite un gel d'hydroxyde d'aluminium homogé néisé et tamponné dans la proportion d'une partie de gel pour trois parties de suspension de virus. On prépare de cette manière séparément trois suspensions d'antigène à l'aide de virus aphteux de type O, de type À et de type C. b) Preparation de la valence brucellique. On réalise une culture en phase rugueuse de Brucella abortus souche Nac Even 45/20, qui permet d'obtenir une suspension de Brucella ayant une concentration de 1 700 mil liards de germes par ml. Ces bactéries sont inactivées par adjonction de 0,5 % de solution de formol à 40 % que l'on laisse agir pendant une semaine à 370a. La suspension d'antigène est ensuite centrifugée puis lavée plusieurs fois à l'eau, ce qui permet d'obtenir une suspension à une concentration de I 700 milliards de Brucella par ml, qui est exempte de traces de formol libre. Les trois antigènes aphteux sont mélangés puis subissent une concentration par décantation et élimination de 20 % de liquide surnageant. c) Préparation du vaccin bivalent. On ajoute à lasuspension de Brucella abortus ainsi obtenue un volume de suspension d'antigène anti-aphteux équivalent à celui du liquide surnageant éliminé de la suspension de Brucella. D'après les expériences qui ont été effectuées, l'inoculation de 5 ml du mélange ainsi obtenu, permet d'immuniser efficacement un bovin contre la fièvre aphteuse de type 0, À et C, et la brucellose. Exemple 2 Pour préparer un vaccin trivalent selon l'invention on opère de la manière suivante a) Préparation de la valence aphteuse On cultive un virus aphteux sur épithélium de bovin, selon le procédé Frenkel en utilisant 6 litres de milieu de culture par kilo d'épithélium. En fin de culture-on prélève le liquide surnageant dont la DECP 50 (dose d'effet cytopathogène dans 50 % des cas) est d'au moins 107 sur cultures de cellules primaires de rein de porc. On procède à l'inactivation de la suspension virale ainsi obtenue par adjonction de 0,06 % de -propiolactone. On conserve pendant 7 heures à 250C et pendant une nuit à 40C, tan- dis que l'on maintient le pH à 7,5 par adjonction de soude 0,5 N. On prépare de cette manière séparément trois suspensions d'antigènes à l'aide de virus aphteux, de type 0 de type A, et de type C. b) Préparation de la valence brucellique On réalise une culture en phase lisse dè Brucella abortus de souche Renoux H 38, ce qui permet d'obtenir une suspension de Brucella ayant une concentration de 900 milliards par ml. Ces bactéries sont inactivées par adjonction de 0,5 % de solution de formol à 40 % que l'on laisse agir pendant une semaine à 370cl La suspension d'antigène est ensuite centrifugée, puis lavée plusieurs fois à l'eau, ce qui permet d'obtenir une suspension à une concentration de 900 milliards de Brucella par ml, qui est exempte de trace de formol libre. c) Préparation de la valence rage. On procède à l'inoculation à l'aide d'un virus rabique fixe d'une suspension de cellules de lignée NIL placée dans un milieu de culture Mac Pherson-Stoker, que l'on met dans une étuve à 37 C. Après un temps de culture compris entre 48 et 60 heures, on obtient un-liquide virulent qui est centrifugé, puis inactivé par adjonction de P-Lopiolactone dilué à 1 pour 4 000, que l'on laisse agir pendant 24 heures à OOC, puis pendant 2 heures à 3?oC. La suspension de chacune des cinq valences précitées (valences aphteuses 0, À et C,-valence brucellique et valence de la rage) sont ensuite isolément dispersées dans une phase huileuse constituée par de l'huile de vaseline Codex et contenant 8 % en poids d'un émulsionnant eau-dans-l'huile constitué par du mono-oléate de sorbitol. Chaque émulsion eau-dans-l'huile s'effectue à raison d'un volume de suspension aqueuse d'antigène pour 2,3 volumes de phase huileuse. Chacune des phases huileuses ainsi obtenues est à son tour dispersée dans la meme suspension aqueuse d'antigène à raison d'un volume de phase huileuse pour 2,3 volumes de dispersion aqueuse d'antigènes. Cette dispersion s'effectue en réalisant une émulsion huile-dans-l'eau obtenue en ajoutant à la phase aqueuse continue 2 % en poids d'un émulsionnant huile-dans-l'eau constitué par un dérivé polyoxy éthyléné de mono-oléate de sorbitol. Pour procéder à l'obtention du vaccin polyvalent on procède au mélange des cinq émulsions huile-dans-l'eau ainsi obtenues. Ce mélange étant effectué à raison de 3,3 volumes de va lence aphteuse 0, de 3,3 volumes de valence aphteuse A, de 3,3 volumes de valence aphteuse C. de d volumes de valence brucellique, et de 2 volumes de valence de la rage. D'après les expériences qui ont été effectuées, une inoculation de 15 ml du mélange ainsi obtenu permet d'immuniser effi ment un bovin contre la fièvre aphteuse de types 0, A et C, la brucellose et la rage. R E Y E N D I C A 2 I O N S REVENDICATIONS I.- Vaccin permettant d'immuniser simultanément contre la fièvre aphteuse et la brucellose, caractérisé par le fait qu'il comporte à la fois une suspension aqueuse d'antigènes anti-aphteux et une suspension aqueuse d'antigènes anti-brucelliques. 2.- Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il contient, en outre, un adjuvant. 3.- Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il est réalisé à l'aide d'antigène nes anti-aphteux inactivés au formol et d'antigènes anti-brucelliques constitués par des bactéries de souche Renoux H 38 ou Mac Even 45/20 inactivées au formol, ces antigènes étant fixés sur un gel tel qu'un gel d'hydroxyde d'alumine. 4.- Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que le vaccin est réalisé à t aide de virus aphteux inactivés par un composé dont la partie qui n'est pas fixée sur le virus peut être éliminée, et à l'aide d'antigènes anti-brucelliques de préférence exempts de formol libre 5.- Vaccin selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il contient, en outre, un antigène anti-rabique. 6.- Vaccin selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé par le fait qu'il est constitué par des suspensions d'antigènes dans une phase aqueuse dispersée dans une phase huileuse à l'aide d'un émulsionnant, sous la forme d'une émulsion eau-dans-l 'huile. 7.- Vaccin selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'émulsion huileuse est elle-même dispersée sous forme d'une émulsion huile-dans-l'eau dans une phase aqueuse continue contenant un antigène. 8.- Vaccin selon la revendication 7, caractérisé par le fait que les phases aqueuses continue et discontinue contiennent chacune un type d'antigènes.