FR 2033404 A1 19701204 FR 7006764 A 19700225 La présente invention concerne un procédé continu de réaction enzymatique et plus particulièrement un procédé pour effectuer d'une manière continue une réaction enzymatique en utilisant diverses enzymes afin de produire diverses substances. Un but de la présente invention est de produire et d'obtenir facilement et économiquement de grandes quantités de substances d'une manière continue sur une échelle industrielle en utilisant de petites quantités d'enzyme. Diverses substances utiles ont été produites par diverses réactions enzymatiques en utilisant des enzymes obtenues à partir de tissus animaux et végétaux, de cellules de microorganismes, etc. Par exemple, la plupart des substances#obtenues par cette méthode à propos du dédoublement d'un Dlamino-acide ou de la transformation biochimique de stéroïdes sont économiquement d'une grande valeur. Toutefois, il y a eu de nombreuses difficultés dans les réactions enzymatiques à l'échelle industrielle. Par exemple, en ce qui concerne les enzymes utilisées dans la réaction enzymatique, la disponibilité de la matière première peut être limitée, ou une purification compliquée peut être nécessaire comme traitement préalable dans la réaction enzymatique, ou encore il peut être réellement impossible de récupérer et de réutiliser les enzymes après la fin de la réaction, parce que les enzymes sont utilisées sous la forme d'une solution aqueuse.Même si la réaction enzymatique est effectuée en dépit de ces difficultés, il est nécessaire d'utiliser un traitement ultérieur compliqué pour éliminer du produit désiré les impuretés protéiniques qui résultent de la préparation de l'enzyme. Ces problèmes ont limité sérieusement l'utilisation industrielle des réactions enzymatiques. Afin de surmonter ces difficultés dans l'utilisation industrielle de réactions enzymatiques, des méthodes ont été mises au point récemment pour conduire la réaction enzymatique en utilisant une enzyme soluble dans l'eau préparée en fixant chimiquement ou en adsorbant physico-chimiquement diverses enzymes sur des supports insolubles dans l'eau. Par exemple, on connaît une méthode pour "lactumer" l'acide glutamique (brevet Japonais publication No 13 785/66) et une méthode-pour le dédoublement Dl d'amino-acides (brevets E.U.A. N2 3.243.356 et 3.386.888), etc., inventées par la demanderesse.Des réactions continues utilisant une telle enzyme insoluble permettent la production de grandes quantités de la substance désirée en utilisant seulement une petite quantité de la préparation d'enzyme. De plus, la séparation et la purification du produit désiré après la réaction sont relativement simplifiées. Toutefois, même dans ces méthodes, il faut utiliser une préparation d'enzyme présentant une haute pureté quand on forme l'enzyme insoluble par fixation chimique ou physico-chimique. De plus, non seulement un traitement préalable compliqué est nécessaire pour purifier la protéine enzymatique, mais encore la réaction enzymatique exige une période bien plus longue en raison du fait que la-réaction est conduite dans un système hétérogène, et de très grandes quantités d'enzymes insolubles sont nécessaires. Ainsi, il existe encore des inconvénients qui n'ont pas été résolus jusqu'ici. Après la mise au point de réactions avec des enzymes insolubles, la demanderesse a continué ses études en vue de trouver des méthodes plus efficaces pour conduire des réactions enzymatiques continues. On a maintenant trouvé que divers problèmes dans la mise en oeuvre industrielle des réactions enzymatiques peuvent être résolus avec une réaction enzymatique continue en utilisant une membrane d'ultrafiltration, et on dispose ainsi d'un nouveau procédé très efficace pour des réactions enzymatiques continues. Selon la présente invention, on conduit la réaction enzymatique dans une membrane non poreuse d'ultrafiltration d'un gel de dextrane réticulé-en laissant réagir ensemble une substance de départ et une enzyme dans une solution aqueuse. On laisse passer à travers la membrane la substance désirée formée par la réaction en appliquant une différence de pression de part et d'autre de cette membrane de façon que le produit soit séparé de la protéine enzymatique. En'même temps que le produit est séparé, on ajoute une quantité supplémentaire de substance de départ au système de réaction sous la forme d'une solution aqueuse. De cette mani#ère, la réaction enzymatique est effectuée d'une manière continue ; la substance de départ est ajoutée au système de réaction ; et, le produit est séparé du système, tandis que la protéine enzymatique est retenue dans le système de réaction.Ainsi, on peut transformer une grande quantité de substance de départ en produit désiré en utilisant une très petite quantité de préparation d'enzyme. les avantages du présent procédé sont qu'une grande quantité de substance de départ peut être traitée par une petite quantité d'enzyme et que la solution du produit séparée ne contient pas d'impuretés provenant de la préparation d'enzyme, ce qui simplie la purification du produit. De plus, la présente invention fournit une technique nouvelle pour les réactions enzymatiques ayant l'avantage supplémentaire que la préparation d'enzyme utilisée dans la réaction n'a pas besoin d'être une préparation hautement purifiée, car des préparations d'enzymes brutes peuvent être utilisées. Comme membrane d'ultrafiltration, on peut utiliser une membrane semi-perméable synthétique préparée en mettant sous la forme d'une pellicule un gel de dextrane réticulé, par exemple la membrane vendue sous la dénomination Diaflo (fabriquée par Amicon Corp. Etats-Unis d'Amérique) et une membrane perméable, par exemple la membrane vendue sous la#dénomination Cellulose Tubing (fabriquée par Visking Co., Etats-Unis d'Amérique), et qui est une membrane en vessie de porc.La membrane de gel non poreuse est essentiellement différente d'un microfiltre poreux ou d'articles du même genre.Ainsi, elle ne présente pas l'inconvénient de se boucher comme le ferait une membrane poreuse, et elle ne subit pas non plus de changement dû à l'allongement, etc, parceque la filtration est effectuée par une différence de vitesse de diffusion à travers la membrane selon la présente inventions Ainsi, seul le produit de masse moléculaire peu élevée passe à travers la membrane et peut entre efficacement séparé de la protéine enzymatique de masse moléculaire élevée dans le système de réactioneParmi les diverses membranes semi-perméables disponibles, se trouvent celles ayant des degrés variables de réticulation ou des propriétés électriquement neutre est très utilisable pour la réaction enzymatique continue de la présente invention, car la plupart des produits des réactions enzymatiques ont des masses moléculaires peu eievéeso La membrane doit être biologiquement inactive et chimiquement stable, et elle peut alors être utilisée à de nombreuses reprises à moins qu'elle ne soit physiquement endommagée. La préparation d'enzyme utilisée selon l'invention peut être une préparation purifiée ou une préparation d'une pureté médiocre. Par exemple, un extrait liquide de cellules de microorganismes ou de tissus animaux ou végétaux peut être utilisé sans purification supplémentaire. Dans certains cas, même la cellule, etc, peut être utilisée telle quelle. Parmi les impuretés contenues dans la préparation d'enzyme brute, les composés de masse moléculaire peu élevée peuvent être facilement éliminés à travers la membrane avant le début de la réaction en traitant la préparation dans des conditions qui ne réduisent pas l'activité de l'enzyme, par exemple en lavant avec une solution tampon appropriée.De plus, les composés macromoléculaires non filtrables éventuellement présents ne sont pas entraînés dans le produit séparé du système de réaction par filtration et n'entraînent pas ainsi de difficultés de pollution. Toutefois, si ces composés macromoléculaires gênent la réaction enzymatique désirée ou catalysent des réactions secondaires de décomposition du produit désiré, il sera avantageux de purifier la préparation d'enzyme par un traitement de purification, La réaction enzymatique peut être conduite typiquement entre 20 et 50 0 et à un pH de 5 à 10, c'est-à-dire dans les conditions optimales pour la réaction enzymatique particulière. Toutefois pour augmenter la stabilité de la membrane, la température est de préférence relativement basse, et avantageusement inférieure à 3000 environ.En ce qui concerne la concentration de la substance de départ, la réaction est conduite aux concentrations utilisées habituellement dans les réactions enzymatiques ordinaires, mais dans certains cas,il est possible dans la présente réaction continue, d'utiliser une concentration relativement forte, par exemple d'environ 100 mg/cm3, parce qutil y a moins de possibilité d'inhibition du produit, etc. Quand une co-enzyme ou l'équivalent est nécessaire dans la réaction, celle-ci peut être favorisée par l'addition de la co-enzyme, etc., à la solution de la substance de départ qui est ajoutée continuellement. Le produit désiré est facilement isolé de la solution séparée du système de réaction par filtration, et purifié par les diverses techniques couramment utilisées dans ce domaine0 'impor- te quelle enzyme peut être utilisée, du moment qu'elle est relativement stable dans les conditions de la réaction continue l'in- vention est illustrée par référence à des exemples particuliers, mais des résultats similaires peuvent être obtenus avec d'autres enzymes et d'autres substances de départ. - la figure 1 est une vue en coupe d'un récipient de réaction utilisable conformément à la présente invention - la figure 2 est une vue en coupe d'un récipient tenant la pression utilisable dans l'invention et relié au récipient de réaction de la figure i. Dans le récipient de réaction représenté sur la figure 1, la référence 1 désigne une sortie pour le filtrat de produit, 2 est une plaque de fond consistant en une plaque poreuse pour supporter une membrane semi-perméable, 3 est une membrane semiperméable synthétique ayant une surface de filtration de 43mm de diam~tre formée d'un gel de dextrane hautement réticulé vendu sous la désignation "Diaflo membrane UM-2t par l'Amîcon Corp., (Etats-Unis d'Amérique), 4 est une entrée pour une solution tampon ou une solution de substance de départ à partir d'un récipient sous pression, 5 est une soupape de sûreté, 6 est un couvercle muni d'un agitateur magnétique, 7 est une paroi latérale résstant à la pression, 8 est une enveloppe pour de l'eau chaude de chauffage, 9 est une entrée pour l'eau chaude, 10 est une sortie pour l'eau chaude, il est une barre d'agitateur et 12 est un agitateur.la capacité du récipient de réaction est de 60cm3 environ. Dans le récipient sous pression de la figure 2, la référence 1 désigne une solution tampon ou une solution de susbtance de départ, 2 est une paroi latérale résistant à la pression,3 est une entrée pour la solution tampon ou la solution de substance de départ,4 est une entrée pour de l'azote gazeux provenant d'un cylindre d'azote, 5 est une sortie pour une solution tampon ou une solution de substance de départ (qui est reliée à l'entrée 4 de la figure 1) et 6 est une soupape de sdreté. Exemple 1 On prépare une suspension de 10 g de cellules de Pseudomonas cruciviae (ATCC 21283) ayant une activité enzymatique de déshydratation de l'acide L-glutamique dans 50 cm3 d'une solution tampon 0,05 M de tris (hydroxyméthyl)aminométhane à un pH de 8,0 et une solution d'extrait obtenue à partir de cette suspension par traitement par ultrasons est placée dans le récipient de réaction représenté sur la figure 1. L'entrée 4 du récipient de réaction est reliée à la sortie 5 du récipient tenant la pression représenté sur la figure 2 au moyen d'un tuyau résistant à la pression, et on place dans ce récipient 500 cm3 d'une solution tampon 0,05 M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane à un pH de 8,0.Tandis qu'on effectue une agitation dans le récipient de réaction, on applique une pression de 4,5 kg/cm2 à l'entrée 4 du récipient tenant la pression à l'aide d'un cylindre d'azote, et on ferme le détendeur du cylindre. Immédiatement, un filtrat contenant seulement les composés de masse moléculaire peu élevée s'écoule par la sortie 1 de la figure 1 et la solution tampon est introduite dans le récipient de réaction par l'entrée 4, de façon que la solution d'enzyme soit lavée. Par ce lavage, les composés de masse moléculaire peu élevée dans le liquide extrait obtenu par le traitement par ultrasons des cellules de Pseudomonas cruciviae sont complètement éliminés. Après lavage pendant 4 heures, on relâche la pression. Ensuite, on place dans le récipient tenant la pression une solution aqueuse de substance de départ préparée en dissolvant 1 kg d'acide L-glutamique dans 10 litres d'eau et en réglant le pH à 8,0, et on fait passer de l'eau chaude-dans l'enveloppe du récipient de réaction tout en continuant l'agitation. On applique de nouveau une pression de 4,5 kg/cm2 au récipient tenant la pression et on effectue simultanément l'introduction de la solution de substance de départ dans le récipient de réaction et l'évacuation de la solution de produit par filtration et on reeueille la solution effluente contenant le produit acide L-pyrroîidonecarboxylique. Après 3 jours de conduite continue de la rew@~tion continue, la solution effluente est concentrée sous pression réduite et le résidu est recristallisé à partir d'éthanol pour donner 820 g d'acide L-pyrrolidonecarboxylique d'une haute pureté. La solution d'enzyme restant dans le récipient de réaction a encore une activité enzymatique et peut être utilisée de nouveau. Exemple 2 On utilise un récipient de réaction ayant la même structure qu'à l'exemple 1 et une capacité de 400 cm3 environ et une membrane semi-perméable ayant une surface de filtration de 76 mm de diamètre. Une liqueur d'enzyme brute préparée par extraction de 20 g de cellules d'Alcaligenes faecalis possédant une activité d'acylase envers les B-amino-acides à l'aide d'une solution 0,001 M de tampon phosphate à un pH de 7,0 est lavée à l'aide de la même solution tampon à raison d'environ dix fois son volume, et de la même manière qu'à l'exemple 1. Une solution aqueuse préparée en dissolvant 1,5 kg de N-acétyl-DL-méthionine dans 4 litres d'eau et en réglant le pH à 7,0 est placée dans un récipient tenant la pression et une réaction continue est conduite comme à l'exemple 1 à une température de réaction de 370C et sous une pression de 6,0 kg/cm2.La solution effluente contenant de la L-méthionine et de la N-acétyl D-méthionine est passée directement à travers une colonne garnie d'une quantité suffisante de résine échangeuse d'ions fortement acide vendue sous la désignation "Diaion SKg A (type H) (fournie par la firme Mitsubishi Xasei Co., Ltd. Japon). La solution de substance de départ est consommée en une période de 24 heures environ et la résine échangeuse d'ions est lavée à l'eau et éluée à l'aide d'une solution aqueuse 2N d'ammoniac. L'éluat est concentré et on obtient 39q g de L-méthionine en refroidissant la solution concentrée. La solution d'enzyme dans le récipient de réaction conserve son activité et peut etre utilisée de nouveau. Exemple 3 Un extrait liquide (correspondant à 20 g de cellules) de cellules de Micrococcus lvsodeikticus (ATCC 4698) ayant une activité d'histidase et 500 g de L-histidine (10 mg/cm3) sont utilisés comme solution d'enzyme et substance de départ, respectivement, de la même manière qu'à l'exemple 2, et la réaction continue est conduite à une température de réaction de 37QC et à un pH de 7,2. La solution effluente contenant l'acide urocanique produit est passée à travers la résine échangeuse d'ions fortement basique vendue sous la désignation "Dowex 1 x 2" (type Cl). Après achèvement de la réaction continue, la couche de résine est lavée à l'eau, éluée à l'aide d'acide chlorhydrique 0,5 N, et l'éluat est concentré. En réglant ka 4,5 le pH de la solution concentrée, on obtient 421 g d'acide urocanique sous la forme de cristaux aciculaires. Revendications 1. Un procédé pour conduire une réaction enzymatique caracté risé en ce qu'on conduit cette réaction dans un milieu aqueux de réaction contenant au moins une enzyme et au moins une subs tance de départ, le milieu aqueux étant immédiatement adjacent à une membrane semi-perméable non poreuse qui est à peu près imperméable à l'enzyme, mais perméable au produit de la réaction, de façon que ce produit soit séparé de l'enzyme. 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse de substance de départ est ajoutée continuel lement au milieu aqueux de réaction et que le produit est évacué continuellement à travers la membrane. 3. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une différence de pression est maintenue de part et d'autre de la membrane. 4. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'une pression positive est maintenue sur le milieu aqueux de réaction au moyen d'un gaz inerte sous pression. 5. Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution aqueuse de substance de départ est ajoutée par des moyens sensibles à la vitesse d'évacuation du produit, de façon que la vitesse d'addition de la substance de départ soit main tenue à peu près égale à la vitesse d'évacuation du produit. 6. Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les moyens sensibles à l'évacuation du produit comprennent un réci pient fermé tenant la pression contenant la solution de substance de départ ; un récipient de réaction fermé contenant le milieu aqueux de réaction ; le récipient tenant la pression étant en communication avec le récipient de réaction par un conduit dé bouchant au-dessous du niveau de la solution de substance de départ dans le récipient tenant la pression ; et, un moyen pour maintenir une pression à peu près constante dans le récipient tenant la pression et dans le récipient de réaction. 7. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le membrane est une pellicule de gel de dextrane 8o Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est une pellicule d'un gel de dextrane hautement réticulé. 90 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane est une pellicule de membrane perméable.