FR 2021385 A1 19700724 FR 6936319 A 19691023 69 3631 2021385 lia présente invention concerne les enzymes1'" et se rapporte plus spécialement à la modification des enzymes par fixation sur des matrices solides. l'invention concerne d'une façon plus particulière encore 5 11inaolubilisation dés enzymes par. leur fixation chimique sur des dérivés de la cellulose et elle a pour but de créer des préparations enzymatiques sous une forme telle-qu*elles puissent, être réutilisées de façon répétée et qu'elles soient plus stables à la- chaleur que l'enzyme soluble correspondant. 10 les dérivés insolubles dans l'eau de l'alpha-amylase (diastase) ont été préparés par couplage chimique de 1'enzyme avec (à) des co-polymères nitrés de ,l'acide méthacrylique, du meta-fluoranilide de l'acide méthacrylique et du divinyl-benzène (G-, Manecke et G Gunzel, Makromolekulare Chem., 51, (1962), 199 et G. Manecke, Pure Appl. 15 Chea., 4 (1962),. (507) et (b) des copolymères nitrés de l'acide méthacrylique, du 4- ou 3-fluorostyrène et du divinyl-benzène (G. Manecke et H.J. Forster, Makromolekulare Chem., 91 (1966), 136). L'activité enzymatique de la protéine fixée dans ces préparations ne dépasse pas 3$ de celle de l'enzyme libre en solution aqueuse. Par 20 ailleurs, la stabilité de ces préparations est, comme on l'a constaté, seulement du même ordre que celle des solutions aqueuses d'al-pha-amylase stockées dans des conditions similaires. On sait que, lorsqu'un enzyme est fixé surjan support insoluble, le nouveau micro-milieu de l'enzyme affecte de façon importante 25 sa stabilité, les caractéristiques hydrophiles du support tendent à renforcer la stabilité de l'enzyme fixé, tandis que des caractéristiques hydrophobes ont l'effet opposé, les supports formés par des polysaccharides tels que de la cellulose fibreuse (M.A. Mitz et L.J. Summaria, Nature, Londres, 189, (1961), 576 et W.E. Hornby, M.B. 30 Lilly et E.M. Crook, Biochem. J. §8, (1966), 420) et le dextrane réticulé (R. Axen et J. Porath, Nature, Londres, 210, (196$, 367) sont, comme on a pu le constater, particulièrement efficaces pour conférer une stabilité à l'enzyme fixé. Des échantillons de formes insolubles dans l'eau de la trypsine, 35 de la chymotrypsine, de la ribonucléase, de l'oxidase de glucose et de la ficine sont dans le commerce depuis février 1968. Ils ont été obtenus par réaction de l'enzyme approprié avec de l'hydrazide de carboxyméthyl-cellulose et ils sont vendus sur le marché par la Société Sevarac Laboratories, Ltd., Maidenhead., Berks, Grande Bretagne. BM> GRIGHAL 69.36319 2 2021385 D'une façon presque simultanée (janvier 1968), la Société Miles Laboratories, Inc. Elkhart, Etats Unis d'Amérique, a lancé sur le marché des formes insolubles dans l'eau de trypsine,- de chymotryp-sine et de papaïhe dans lesquelles les enzymes sont- fixés sur un 5 support formé par un côpolymère d'éthylène et d'anhydride maléique. R. Axen et Un but de l'invention est de permettre l'obtention- de préparations actives insolubles dans l'eau d'alpha-amylase, de bêta-amylase et de gamma-amylasé, dans lesquelles l'enzyme est "couplé chimique-15' ment avec les éthers para-diazophénoxy-hydroxy-propylique et para-isothiocyanato-phénoxy-hydrôxy-propylique dérivés de la cellulose microcristalline. " ' - - L'invention est matérialisée dans une amylase insoluble dans l'eau couplée chimiquement avec la para-diazo-phénoxy-hydroxy-pro-20 pyl- ou la para-isothio cyanato-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose. D'une façon plus particulière,•1'invention permet d'obtenir de l'alpha-, de la bêta- et de la gamïaà-amylase couplées ..chimiquement avec de la para-diàzophénoxy-hydroxypropyl-cellulose et de 1'alpha-et de la bêta-amylase couplées chimiquement avec de là para-isothio-25 cyanato-phénoxy-hydroxy-propyl-cellulose. • r . L'invention concerne encore un procédé pour la préparation d'une amylase insoluble dans l'eau, consistant à faire réagir à 0-5 °0 1* amylase en solution dans un milieu tampon, dans une gamme de pH allant de 6,3 à 8,6, avec l'éther para-diâzophé&oxy-hydroxy-30 propylique ou para-isô-thiocyanato-phéhoxy-hydroxypropylique de la cellulose. Les préparations insolubles"dans l'eau de l'alpha-, de la bêta-ou de la gamma-amylase peuvent être obtenues par réaction chimique à 0-5°0 de l'amylase en solution dans"un agent tampon,- dans une gam-35 mede pH allant de 6,3 à 7,7 (de préférence de 7,6 à 7,7) avec 1'éther para-diazophénoxy-hydroxypropylique de la cellulose. Les • groupes diazo inaltéréis du dérivé de la cellulosesont soumis à un traitement par réaction avec le bêta-naphtol ou le. phénol. De pré-"{• férencé, on utilise de la cellulose microcristalline pour la prépa- 69 36319 3 2021385 dation de cet éther et le degré de substitution des groupes éther de la cellulose peut aller de 13 à 56,2 micro-équivalents (de préférence 13 micro-équivalents) de groupes éther para-diazophénoxy-hydroxypropylique par gramme de cellulose. On peut obtenir des 5 préparations actives insolubles dans l'eau d'alpha-amylase, de bêta-amylase et de glucamylase (gamma-amylase) par ce procédé, ces préparations étant plus stables à la chaleur lorsqu'elles sont en suspension dans un agent tampon aqueux (0,02 M) que l'enzyme soluble correspondant. De préférence, l'agent tampon doit avoir le pH pour 10 lequel l'enzyme présente une activité enzymatique maximum visà-vis de son support ou substrat. Suivant une variante, on peut obtenir des préparations insolubles dais l'eau d'alpha- ou de bêta-amylase par réaction chimique à 0-5°C d'alpha- ou de bêta-amylase en solution dans un agent tam-15 pon (de préférence un agent tampon au borate à 0,05 M, pH 8,6) avec 1* éther para-iso-thiocyanato-phénoxy-hydroxypropylique de la cellulose. De préférence, on utilise de la cellulose microcristalline pour la préparation de cet éther et le degré de substitution des groupes éther dans la cellulose peut être de t3 à 56,2 micro-équi— 20 valents (de préférence 13 micro-équivalents) de groupes éther para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxypropylique par gramme de cellulose. On peut obtenir des préparations actives insolubles dans l'eau d'alpha-amylase et de bêta-amylase mais non pas de glucamylase (gamma-amylase) par ce procédé, ces préparations étant beaucoup 25 plus stables lorsqu'elles sont en suspension dans xat agent tampon aqueux (0,02 H) que l'enzyme soluble correspondant. De préférence, l'agent tampon doit avoir le pH pour lequel l'enzyme présente une activité enzymatique maximum vis-à-vis de son substrat. Les caractéristiques particulières de l'invention pour l'ob-30 tention d'enzymes insolubles dans l'eau résident dans le fait qu'elle peut fournir un produit ayant une rétention d'activité élevée lorsqu'on la calcule en pourcentage relativement à l'activité que la protéine de l'enzyme fixé sur le dérivé de la cellulose présenterait sous sa foime soluble initiale. le second avantage réside 35 dans le fait que le procédé suivant l'invention peut être particulièrement avantageux pour les exoenzymes tels que la bêta- et la gamma-amylase (comparer avec les préparations insolubles dans l'eau de bêta-amylase obtenues par réaction avec 1'éther para-isothiocya-nato-phénoxy-hydroxypropylique du dextrane réticulé-Sephadex qui 69 36319 4 2021385 sont enzymiquement inactives, Axen et Porath, Nature, Londres 210 (1966) 367). le troisième avantage réside dans le fait que l'utilisation de cellulose microcristalline pour la préparation de 1'éther permet d'obtenir un support hydrophile dense qui est disponible 5 sous une forme correspondant à de fines particules en vue d'une exposition par une surface maximum, tout en étant aisément récupérable après l'utilisation, par centrifugation ou filtration. Un quatrième avantage correspond à la stabilité thermique beaucoup plus grande des enzymes insolubles dans l'eau qui peuvent être obtenus par le 10 procédé suivant l'invention, par rapport à l'enzyme soluble correspondant, ce qui fournit un temps de conservation plus long et une rétention d'activité plus élevée aux températures de travail, et permet une utilisation répétée maximum de l'enzyme. Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront 15 de mieux comprendre comment l'invention peut être mise en oeuvre» EXEMPLE N° 1 On met du para-nitrophénol (69,5 g, 0,5 mole) en suspension dans une solution de soude (25 g) (0,6 mole) dans l'eau (400 ml) et on chauffe le mélange à 70°0 pour provoquer la dissolution. Lofs 20 d'un refroidissement lent jusqu'à la température ambiante, tout en agitant vigoureusement, on note la séparation de para-nitrophényla-te de sodium à l'état finement divisé. On ajoute de 1'épichlorhydri-ne (46 g, 0*5 mole) et on agite doucement la solution pendant six jours à la température ambiante, après quoi on recueille le solide 25 et on le lave sur un filtre avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il ne renferme plus de para-nitrophénylate de sodium jaune brillant. On fait dissoudre directement le solide humide blanchâtre dans l'éther (500 ml) et on jette la couche aqueuse qui se sépare. On sèche la couche éthérée avec du sulfate de magnésium et on con-30 centre, ce qui provoque la cristallisation d'un solide jaune très pâle. Une recristallisation à'partir de pétrole léger (40/60) donne de 1'éther para-nitrophénylglycidylique pur, 25,0 g (25,5$). F.67°C (E. Mari; J. Chem. Soc., (1912) 305). On place des échantillons de cellulose microcristalline (10 g, 35 "type Sigmacel 38 provenant de la Société Sigma Chemical Company, Grande Bretagne) dans quatre ballons à fond rond bouchés de 50 ml, dans lesquels on fait ensuite le vide, qu'on laisse reposer pendant une heure et qu'on remplit avec de l'azote. Après chauffage de chaque ballon à 50°C, on ajoute des parties aliquotes (20 ml) préchaufORIGINAL 69 36319 5 2021385 fées d'une solution à 10# d'éther para-nitrophénylglycidylique, puis des parties aliquotes (10 ml) d'une solution aqueuse de soude à 10$. On mélange ensuite intimement les contenus des flacons et on bouche. On effectue toutes les opérations sous une atmosphère d'a-5 zote. On maintient ensuite les flacons à 50°G. Après des laps de temps de 12, 24, 48 et 96 heuresj on transfère le mélange réaction-nel à un mortier et on le broie légèrement avec de l'acide acétique 2N avant de le mettre en suspension et d'agiter pendant trente minutes avec le même solvant (0,5 !)• On recueille alors les éthers 10 de para-nitrophénoxy-hydroxypropyl-cellulose, on les lave et on les ' broie légèrement avec de l'acétone, puis on agite avec 0,5 litre d'acétone pendant trente minutes. Après trois lavages avec de l'eau distillée (1 litre) et un autre lavage avec de l'acétone (0,5 l), on recueille les éthers jaune pâle sur un filtre et on sèche. 15 On effectue la réduction de 1'éther de para-nitrophénoxy-hy- droxypropyl-cellulose par mise en suspension d'échantillons de 2 g dans une solution à 5¥> de chlorure titaneûx dans 200 ml d'acide chlorhydrique 6N à 100°0, pendant cinq minutes. On recueille les • chlorhydrates d'éther de para-amino-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose 20 sur un filtre et on les lave avec de l'acide chlorhydrique 21f jusqu'à ce qu'ils ne renferment plus de chlorure titaneùx en excès. Après avoir broyé légèrement dans ion mortier avec de l'eau distillée, on lave les échantillons trois fois avec 0/5" litre d'eau distillée puis, finalement, avec 500 ml d'acétone avant de les recueil-25 lir sur un filtre et de les sécher. - •• On détermine le degré d'éthérification par titrage des chlorhydrates de para-amino-phénoxy-hydroxypropyl-ceilulose avec une solution aqueuse de soude. ' Degré de substitution de la para-amino-phënoxy-hydroxypropyl-30 cellulose. * Temps de réaction de 1'éther jieqd'éther pàra-amino-phénoxy-pâra-nitrophénylglycidylique hydroxypropylique par gramme avec la cellulose (h) de cellulose 12 13,0 24 ' \ 20,7 48 31,0 96 . 56,2 On place des échantillons de 100 mg de quatre dérivés de la cellulose préparés comme indiqué précédemment dans des tubes à essai bouchés conjointement à des parties aliquotes de 5 ml d'acide chlo- €AD ORIGINAL 35 69 36319 6 2021385 r hydrique (.IN). On place les tubes dans un bain de glace et on agite magnétiquement pendant quinze minutes, puis on ajoute des parties aliquotes (4 ml) d'une solution-glacée de nitrite de sodium. Après encore quinze minutes, on centrifuge les tubes, on jette la 5 partie qui surnage, on ajoute des parties aliquotes (15. ml) de solution tampon phosphatée glacée (0,075 M, pH-7,6-7,7) et on agite magnétiquement les tubes pendant quinze minutes. On répète trois fois le cycle de lavage..Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute des parties aliquotes (1 ml) d'une solution 10 d'alpha-amylase à 0,5# (cristalline, ex Bacillus subtilis, provenant de la Société Sigma Chemical Company) dans une solution tampon phos-- phatée (0,075 M, pH 7,6r7,7) et on agite magnétiquement les tubes à 0-5°C pendant dix-huit.heures; à ce moment on ajoute des parties aliquotes (5 ml) d'une solution glacée de bêta-naphtol (0,1#) dans 15 l'acétate de sodium saturé. Après encore quinze minutes, on soumet les dérivés d'alpha-amylase insolubles dans l'eau à cinq cycles de lavage avec une solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9» 15 al) et 15 ml d'une solution de chlorure de sodium (0,5 M) dans la même solution, tampon. On lave finalement deux fois. 3-e s dérivés d'alpha-20 amylase avec la solution tampon phosphatée (0,02. M, pH/6,9). . résultats Groupe jaeq de-grou- mg de protéi- . Unités # d'acti- Préparation fonction- pe fonction-.• ne fixée/ d'enzy- vité con- us nel actif nel actif/g 100 mg de dé- me+/mg servé par dans la cellulose rivé . de pro- l'enzyme ; P_„ liaison ... téine après le Protéine fixée couplage - para- '13,0 1,04 54,0 60 ' 1 diazo-phénoxy- 20,7 1,09 40,8 53 2 hydroxy- 31,3 1,46 33,7 . 38 - 3 propyle, 30 pH 7,6- 56,2 1,66 . 33,3 37 4 7,7 + Une unité d'alpha-amylase est celle qui libère .du sucre réducteur en une quantité équivalente.à.1 mg de maltose en trois minutes à 20°C. ■35 ■- BXBi'iPLE. CT° 2 . On place des échantillons (100 mg) des quatre - dérivés de la cellulose préparés dans l'exemple dans des tubes à" essai bouchés conjointement à dés"parties aliquotes (5 ml).d'acide.chlorhydrique (1N). On place-les tubes dans-Tin bain de glace et on .agite magnéti«A0 ORIGINAL 69 36319 2021385 quement pendant quinze minutes, puis on ajoute des parties aliquotes (4 ml) d'une solution glacée de nitrite de sodium. Après encore quinze minutes, on effectue la centrifugation des tubes, on jette la partie qui surnage, on ajoute des parties aliquotes (15 ml) de 5 solution tampon phosphatée glacée (G,02 H, pH 6,3-6,4) et on agite magnétiquement les tubes pendant quinze minutes. On répète trois fois le cycle de lavage. Une fois que les produits de lavage terminaux ont été décantés, on ajoute des parties aliquotes (l ml) d'une solution d'alpha-amylase à 0,5# (cristalline, ex Bacillus 10 subtilis, provenant de la Société Sigma Chemical Company) dans une solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,3-6,4) et on agite magnétiquement les tubes à 0-5°C pendant dix-huit heures, puis on ajoute des parties aliquotes (5 ml) d'une solution glacée de bêta-naphtol (0r0t#) dans l'acétate de sodium saturé. Après encore quinze minu-15 tes, on soumet les dérivés d'alpha-amylase insolubles dans l'eau à cinq cycles de lavage avec une solution tampon phosphatée (0,02 Mr pH 6,9, 15 ml) et 15 ml d'une solution de chlorure de sodium (0,5 M) dans la même solution tampon. On lave finalement deux fois les dérivés d'alpha-amylase avec une solution tampon phosphatée (0,02 M, 20 pH 6f9). RESULTAIS Groupe fonc- jieq de grou- mg de pro- Unités d'en- # d'activi- Pré-tionnel ac- pe fonction- téine fi- zyme+/mg té retenu para-tif dans la nel actif/g xée/100 mg de protéine par l'enzy- tion liaison de cellulose de dérivé fixée me après ET0 2^ protéine - couplage ________ para-diaao-phénoxy-hydroxy-propyle pH 6,3-6,4 30 + Une unité d'alpha-amylase est celle qui libère une quantité de sucre réducteur équivalente à 1 mg de maltose en trois minutes à 20°C. EXEMPLE N° 3 On incorpore sous agitation magnétique des échantillons (100 mg) 35 des quatre éthers de para-arnino-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose préparés dans l'exemple N°1 à une bouillie avec des parties aliquotes (0,5 ml) de solution tampon phosphatée (3,5 M, pff 6,S).. On ajoute des parties aliquotes (0,2 ml) d'une solution à 10# de thiophosgène dans le tétrachlorure de carbone et on poursuit l'agitation pendant 15,0 0,79 45,7 5t 5 20,7 0,83 31,5 35 6 3t ,3 1,47 15,9 18 7 56,2 1,50 14,5 16 8 BAD ORSQiNAL 69 36319 8 2021385 vingt minutes, puis on ajoute de nouvelles parties aliquotes (0,2 ml) de la solution de thiophosgène. Après encore vingt minutes, on lave une fois les éthers de para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose avec de l1acétone (15 ml), deux fois avec une solution de 5 bicarbonate de sodium (0,5 H, 15 ml) et deux fois avec une solution tampon au borate (0,05 M, pH 8,5* 15 ml). Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute des parties aliquotes (t ml) :.'une solution d'alpha-amylase à 0,5# (cristalline, ex Bacillus subtilis, Sigma Chemical Company) dans une solution tampon atû borate 10 (0,05 M, pH 8,5) et on agite magnétiquement les tubes à 0-5°C pendant dix-huit heures. On soumet les dérivés d'alpha-amylase à cinq cycles de lavage avec une solution tampon phosphatée (0,01 M, pH 6,9, 15 ml) et du chlorure de sodium (0,5 H, 15 ml) dans la même solution tampon. On lave finalement deux fois le dérivé d'alpha-15 amylase avec la solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9)* KSSULTÀTS Groupe fonc- jieq de grou- mg de pro- Unités d'en- # d'activi- Pré-tionnel actif pe fonction- téine fixée/ zyme+/mg té retenu pa-dans la liai- nel actif/g 100 mg de de protéine par l'enzy- ra-son protéine de cellulose dérivé fixée me après tion 2q - - ; couplage K° para-isothio-cyanato-phé-noxy-hydroxy-propyle pH 8,5 25 + Une unité d'alpha-amylase est celle qui libère du sucre réducteur selon une quantité équivalente à 1 mg de maltose en trois minutes à 20°C. BXMLE 4 On prépare 100 mg de chlorhydrate de para-amino-phénoxy-hydroxy-30 propyl-cellulose (20,6 jxeq de liaison éther/g) comme décrit dans l'exemple N°1 et on les place dans un. tube à essai bouché, puis on agite magnétiquement pour obtenir une bouillie dans une solution tampon phosphatée (3,5 M, pH 6,8, 0,5 ml). On ajoute 0,2 ml d'une solution de thiophosgène à 10# dans le tétrachlorure de carbone et 35 on poursuit l'agitation pendant vingt minutes, puis on ajoute encoie une autre partie aliquote de 0,2 ml de solution de thiophosgène. Après agitation pendant encore vingt minutes, on ajoute 15 ml d'acétone et on récupère la para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose solide par centrifugation. On répète deux fois le cycle 13,0 1,36 47,4 53 9 20,7 1,42 36,6 42 10 31,3 1,49 21,1 23 11 56,2 1,50 22,4 25 12 4IAD ©R^S&AL 69 36319 9 202Î385 de lavage avec 15 ml d'une solution de bicarbonate de sodium (0,5 M) et deux fois avec une solution tampon au borate (0,5 M» pH 8,6, 15 ml). Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute une solution de bêta-amylase (cristalline, ex patate douce, 5 Sigma Chemical Company, 5 ml) dans.une solution tampon au borate (0,05 M, pH 8,6, 1 ml) et on permet au couplage de se produire tout en agitant doucement par voie magnétique pendant quarante-huit heures à 0-5°C. On soumet le dérivé de bêta-amylase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage alternés avec une solution tampon à 10 l'acétate (0,02 M, pH 4,8, 15 nil) et une solution de chlorure de sodium (1,0 M, 15 ml) dans la même solution tampon. Après deux autres lavages avec une solution tampon à l'acétate (15 ml) et une décantation finale des produits de lavage, on remet le dérivé de bêta-amylase en suspension dans la même solution tampon (10 ml). 15 EXEMPLE N° 5 On lave deux fois de la para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxy-propyl-cellulose préparée comme indiqué ci-avant avec une solution de bicarbonate de sodium (0,5 M, 15 ml) et deux fois avec une solution tampon au borate (0,05 M, pH 8,6, 15 ml). Après décantation 20 des produits de lavage terminaux, on ajoute une solution de gamma-amylase (glucamylase, ex Aspergillus niger, partiellement purifiée par le processus par l'amidon décrit par Cameron dans Proc. Ciba jPoundation Symposium, J. et A. Churchill Press, Londres 1967, 177; 5 mg de protéine) dans une solution tampon au borate (0,05 M, pH 25 8,6, 1 ml) et on permet au couplage de se produire tout en agitant par voie magnétique pendant quarante-huit heures à 0-5°C. On soumet le dérivé de gamma-amylase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage alternés avec une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5, 15 ml) et une solution de chlorure de sodium (1,0 M, 15 ml) 30 dans la même solution tampon. Après deux autres lavages avec la solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4»5». 15 ml) et décantation finale des produits de lavage, , on remet le dérivé de gansna-amylase en suspension dans la même solution.tampon (10 ml)„ (Yoir tableau page suivante). 35 EXEMPLE N° 6 Du chlorhydrate de para-amino-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose (100 mg, 20,7 ueq de liaison éther/g) préparé comme décrit dans l'exemple N°1 est agité magnétiquement à 0°C avec de l'acide chlorhydrique (1N, 5 ml). On ajoute une solution de nitrite de sodium 69 36319 2021385 Préparation ïï® Unités d'enzyme+/mg de protéine libre 499,9 RESULTAIS. mg de protéine fixée /100 mg de dérivé 5 13 (Ex.4) 14 (Ex.5) 28,2 + Une unité d*amylase 10 réducteur selon une (bêta-amylase) ou à trois minutes. 1,75 Unités d'en-z±me+/mg de protéine fixée 126,0 # d'activité retenu par l'enzyme après couplage 25,1 0,96 inactif inactif est considérée comme celle libérant du sucre quantité équivalente à 1 mg de maltose à 20°0 1 mg de glucose à 45 °C (gamma-amylase) en (2#, 4 ml) pré-refroidie à 0°C et on poursuit l'agitation pendant quinze minutes. On lave quatre fois la para-diazo-phénoxy-hydroxy-15 propyl-cellulose avec une solution tampon phosphatée (0,075 M, pH 7,6-7,7, 15 ml) à 0°C. Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute une solution de bê'ta-amylase (cristalline, ex patate douce provenant de là Société Sigma Chemical Company, 5 mg) dans une solution tampon phosphatée (0,075 M, pH 7,6-7,7, 1 ml) et 20 on permet au couplage de se produire sous une agitation magnétique douce pendant quarante-huit heures à 0-5°C. On ajoute ensuite une solution de phénol (0,01#, 5 ml) dans une solution aqueuse saturée d'acétate de sodium à 0°C. Après encore quinze minutes d'agitation, on récupère le dérivé de-bêta-amylase insoluble dans l'eau par cen-25 trifugation. Après avoir jeté la partie qui surnage, on soumet le dérivé à un lavage comme décrit pour le dérivé de la bêta-amylase préparé par couplage isothiocyanato (exemple N°4) et on met en suspension dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,8, 10 ml). 30 BMELE N° 7 • On lave quatre fois de la para-diazo-phéhoxy-hydroxypropyl-cellulose préparée comme indiqué ci-àvant avec une solution tampon phosphatée (0,075 M, pH 7,6-7,7, 15 ml) à 0°C. Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute line solution de gamma-35 amylase (ex Aspergillus niger, partiellement purifiée, 5 mg àe protéine) dans une solution tampon phosphatée (0,075 M, pH 7,6-7,7, 1 ml) et on permet au couplage de se produire tout en agitant doucement par voie magnétique pendant' quarante-huit heures à 0-5°C. On ajoute ensuite une solution de phénol (0,01#, 5 ml) dans une 69 36319 2021385 solution saturée d'acétate de sodium à 0°C. Après encore quinze minutes d'agitation, on récupère le dérivé de gamma-amylase insoluble dans l'eau par centrifugation. Après avoir rejeté la partie qui surnage, on soumet le dérivé au processus de lavage décrit pour 5 le dérivé de gamma-amylase préparé par couplage isothiocyanato (exemple N°5) et on met en suspension dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5, 10 ml). resultats Prép. Enzyme Unités d'en- mg de protéi- Unités d'en- fo d'activité N° zyme+/mg de ne fixée/100 zyme/mg de retenu par protéine mg de dérivé protéine l'enzyme après libre fixée couplage 15 (Ex.6) 499,9 4,24 83,3 16,6 16 (Ex.7) 28,2 1,25 5,01 17,7 + Une unité d'amylase est considérée comme celle qui libère du * ^ sucre réducteur selon une quantité équivalente à 1 mg de maltose à 20°C (bêta-amylase) ou à 1 mg de glucose à 45°C (gamma-amylase) en trois minutes. exemple n° s On met en suspension un échantillon d'alpha-amylase insoluble 20 dans l'eau (préparation 2, 20 mg) dans une solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9» 2 ml) et on laisse incuber à 45°C. On prélève des parties aliquotes (0,2 ml) à des temps 0, 0r125, 1, 2, 4 et 7 jours et on introduit directement au moyen d'une pipette dans une solution d'amidon agitée magnétiquement (10 ml, 1#) dans une solu-^ tion tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9) à 45°G. On détermine ensuite l'activité de l'échantillon d^alpha-amylase insoluble dans l'eau par échantillonnage périodique et titrage des produits de digestion avec le réactif au dinitrosalicylate selon Berofeld (Hethods in Enzymology (1955) 149)« Par suiteT le pourcentage d'activité ini-tial demeurant dans la préparation d'alpha-amylase insoluble dans l'eau est déterminé. On effectue une incubation témoin au cours de laquelle on remplace l'alpha-amylase insoluble dans l'eau par une solution d'une quantité équivalente d'alpha-amylase libre dans une solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9, 2 ml). On maintient un échantillon de suspension de bêta-amylase insoluble dans l'eau à couplage diazo(préparation 15) à 40°C pendant sept jours et on détermine son activité à certains intervalles, vis-à-vis d'une solution d'amidon agitée magnétiquement, comme dé 69 36319 2021385 10 crit précédemment. On effectue une incubation témoin au cours de laquelle on remplace la suspension de bêta-amylase insoluble dans l'eau par une solution de bêta-amylase libre dans une solution tampon à l'acétate (0,02 K, pH 4»8). On calcule ainsi le pourcentage des activités initiales demeurant après divers laps de temps. On répète 1'expérience à 50°C pendant un® période d'incubation de quatre jours. On détermine la stabilité du dérivé de vamca-amylase (préparation 16) par des expériences analogues effectuées sur une période d'incubation de quatre jours à 50°C et 60°C et sur une période d'incubation de deux jours à 70°G. RESULTATS Enzyme Mode de Temp. i» de rétention d'activité _______ couplage ______ 3 heures 1 .jour 2 jours 4 .jours 7 jours 15 oexa- amylase Néant 40° C . 88 59 48 31 12 Diazo- 4Û°0 : 91 : ' 81 73 57 41 Néant 50°C 40 : 20- - - _ - Diazo- 50°G 74 44 25 - - 20 gammà— amyla.se Néant 50°C 85 63 46 36 Diazo- 50°G 89 68 55 44- - Néant 60°G 45 29 . 19 5 - Diazo- 60°C 60 : 33 24 17 - . Néant ■ 70°G 7 - ■ - 25 Diazo- 70 °C 22 15 : 11 - - - alpha- amylase Néant 45°C 18 0 Diazo- 45° G 87 66 47 33 21 30 35 EXEMPLE N° 9 On effectue le stockage de suspensions (10 mg/ml) d'alpha-amylase insoluble dans l'eau (préparations I;°1, 2, 3 et 4) dans une solution tampon phosphatée (0,02 M, pH 6,9) pendant quatre mois à 0-5°C. On détermine ensuite l'activité des préparations et on calcule le pourcentage de l'activité initiale qui a été conservé. Rétention d'activité au stockage des dérivés d'alpha-amylase insolubles dans l'eau. Enzyme Prép. N° I«iode de couplage alpha-amylase 1 2 3 4 Diazo- > d'activité initiale demeurant après quatre mois 66 62 73 71 BAD ORIGINAL 69 36319 2021385 On effectue le stockage de suspensions de bêta-amylase insoluble dans l'eau (préparations N°13 et 15) dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4f8) et de gamma-amylase (préparation UC16) dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5) pendant trois 5 mois à 0-5°C. On détermine ensuite l'activité des préparations et on calcule le pourcentage par rapport à l'activité initiale « Rétention d'activité au stockage de dérivés de bêta- et de gamma-amylase insolubles dans l'eau. Enzyme Prép. Mode de couplage % d'activité restant après sto-n N° ckage pendant trois mois à 0-5°C Isothio- cyanato- 89 Diazo 100 Diazo 100 EXEMPLE H° 10 Préparation du 1,2-époxy-3-(para-nitrophénoxy)propane (éther gly-cidyl-para-nitrophénylique) On met en suspension du para-nitrophénol (695 g» 5 moles) dans une solution de soude (250 g, 6 mole) dans l'eau (4 litres) et on 20 chauffe le mélange à 70°C pour effectuer la dissolution. Lors d'un, refroidissement lent à la température ambiante tout en agitant vigoureusement, du para-nitrophénylate de sodium à l'état finement divisé se sépare. On ajoute de 11épichlorhydrine (460 g, 5 moles) et on agite la solution dans un récipient en acier inoxydable d'une 25 capacité de 5 litres à la température ambiante, après quoi on recueille le solide et on le lave dans un broyeur à boulets rotatif C160 t/mn) avec de l'eau distillée, jusqu'à ce qu'on ne trouve plus de para-nitro-phénylate de sodium Jaune brillant. On fait dissoudre le solide humide blanchâtre directement dans l'éthanol (400 30 ml) et on concentre, ce qui provoque la cristallisation d'un solide jaune très pâle (350 g). Préparation de 1'éther 2-hydroxy-3-(para-nitrophénoxy)-propylique et du chlorhydrate d'éther 3-(para-ami.rio-phénoxy)-2-hyd.roxypro-pylique de la cellulose. 35 On place un échantillon de cellulose microcristalline /fi 50 g) type Sigmacell 38 vendu par la Société Sigma Chemical Company, Grande Bretagne/ dans un ballon à fond rond bouché d'une capacité égale à 1 litre, on fait le vide et on remplit avec de l'azote. Après lavage de chaque flacon à 50°C, on ajoute 300 ml de solutiob. Bêta- amylase 13 Bêta- amylase 15 Gamma- ,_ amylase 16 » o 69 36319 h 2021385 préchauffée d1 éther para-nitrophényl-glycidylique (préparée comme indiqué ci-avant, 10$ dans le toluène), puis 150 ml de soude en solution aqueuse ( 10fô). On mélange ensuite intimement le contenu du ballon et on bouche. On effectue toutes les opérations sous une 5 atmosphère d'azote. On maintient les ballons à 50°C. Après quarante huit heures, on transfère le mélange réactionnel à un broyeur à boulets et on broie pendant dix minutes à 160 t/mn avec de l'acide acétique (2 N) avant mise en suspension et agitation avec le môme solvant (1 litre). On recueille 1'éther de para-nitrophénoxy-hydro-10 xypropyl-cellulose (éther 2-hydroxy-3-(3-nitrophénoxy)-propylique), on lave avec de l'acétone, puis on agite avec de l'acétone pendant trente minutes. Après trois lavages avec de l'eau distillée et un autre avec de l'acétone, on recueille 1*éther jaune pâle et on sèche. 15 On effectue la réduction de la para-nitro-phénoxy-hydroxypro pyl-cellulose par mise en suspension de 120 g dans une solution 1 st de chlorure titaneux ( 12,5/&) dans l'acide chlorhydrique (6N, 2.400 ml) à 100°C pendant dix minutes. On recueille le chlorhydrate de para-amino-phénoxy-hydroxypropyl-cellulose (chlorhydrate d*éther 20 3-(para-aminophénoxy)-2-hydroxypropylique de la cellulose) sur un filtre et on lave avec de l'acide chlorhydrique (2N) jusqu'à ce qu'on ne trouve plus de chlorure titaneux en excès. On lave trois fois l'échantillon avec de l'eau distillée, puis finalement avec de l'acétone avant de le recueillir sur un filtre et de le sécher. 25 Préparation de dérivés de gamma-amylase insolubles dans l'eau par couplage de gamma-amylase avec des éthers 3-(para-ami no-phénoxy)- 2- hydroxypropyliques de la cellulose convertis en composés diazo. On place des échantillons (25 g) du dérivé de la cellulose préparé comme indiqué ci-avant dans des béchers conjointement à des parties aliquotes (1,25 litre) d'acide chlorhydrique (2N). On place les béchers dans un bain de glace et on agite pendant quinze minutes puis on ajoute des parties aliquotes (1 litre) d'une solution glacée de nitrite de sodium (2%). Après encore quinze minutes, on effectue la centrifugation du contenu, on jette la fraction qui sur-nage, on ajoute des parties aliquotes (1 litre) de solution tampon phosphatée glacée (0,075 M, pH 7,6-7,7) et on agite le contenu pendant quinze minutes. On répète trois fois le cycle de lavage. Après le lavage final, on ajoute des parties aliquotes (200 ml) de solutions de préparations de gamma-amylase du commerce. «AD ORIGINAL 69 36319 15 2021385 10 15 20 Groupe A - Enzyme dialyse, activité 71 unités/mg de protéine (Agidex,. Glaxo). Groupe B - Comme ci-avant, mais activité 132,2 unités/mg de protéine Groupe C - Enzyme du commerce non dialysé (llovo) activité 88,4 uni-tés/ng de protéine» Dans chaque groupe, on prépare des solutions ayant diverses concentrations en protéine dans des solutions tampons à l'acétate (0,075 M, pH 4»5) pour fournir des concentrations en protéine comprises dans une gamme allant de 210 à 2040 mg de"protéine/200 ml. On agite magnétiquement les suspensions à 0-5°C pendant quarante-huit heureg puis on ajoute des parties aliquotes (1,25 litre) d'une solution glacée de bêta-naphtène (G,01$) dans lracétate de sodium (10$). Après encore quinze minutes, on soumet les dérivés de gamma-amylase insolubles dans l'eau à cinq cycles de lavage avec une solution tampon à l'acétate (0,02M, pH 4,5» 1 litre) et une solution de chlorure de sodium (1 M, 1 litre) dans la même solution tampon. On lave finalement deux fois" les dérivés de gamma-amylase avec une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5). RESULTATS Concentra- Protéine Prép.N0 Groupe A tion en pro- fixée mg/g téine appli- de dérivé quée. mg " " 25 30 17 18 ' 19 Groupe B 20 21 22 Groupe C 23 24 25 1275 1624 2040 210 324 508 503 1085 1810 6,3 16,75 7,05 18,45 15,8 18,45 16 17,25 8,3 Unités d'en-zyme/mg de protéine fixée 17,6 20,6 13,4 13 17 21 $ d'activité retenu 23 28,4 17,4 10,8 14,4 19,6 11,7 15,3 19 12.2 16.3 ■22,2 Une unité de gamma-amylase libère dès sucres réducteurs selon une quantité équivalente à 1 ju. mole de glucose en une minute à 45°C EXEMPLE IT° 11 35 On lave quatre fois de la para-diazo-phénoxy-hydroxypropyl- cellulose (100 mg) préparée comme décrit dans l'exemple 1ST° 1 avec une solution tampon phosphatée (C,075 M, pH 4,5, 15 ml) à 0°C.Après décantation des produits de lavage terminaux, on ajoute une solution de gaiana-amylase (ex Aspergillus niger, préparation du commer-40 ce 0,04 ml) dans une solution tampon à l'acétate (0,075 M, pH 4,5, 69 3631 2021385 1 bîI) et on permet au couplage de se faire tout en agitant doucement rendant des laps d® temps allant de douze à seisante-douss heures « '' ; —. '-■ ~:i. ;t . - . • • r. ù '• :• • • :.... . •. • • • ... / s in.\ - > ! .■ t b y U û P h~ I > ; - *•' V.-L JL-."!/. ' jli l.v 7 'J ..j .UP„ ù _ L-- -.l'c _..... - r kit -' - 7- ~ 0._ _/ •!=" " « •;i:lI.uloss (100 e^; préparée* cci::;:.e décrit dans l'exemple l^'IO £"•:-c tion tan-pou piy:spl:u L-^e (Cs!V'f k, pli 4*5» 1? cl) k. «'.;0Or Apr^s c des pi/oâuitrf âo 1s "£.ce to^ainaur - on ajoute une solution no as6 {--z .U pré. --.ration "brute du coBi:..&r-e©, 0$C4 Li.) aa.is (a) une solution tanpcn pnosphatéo (C,C75 7-ïs pH 7*6» 1 ffil)s L0 : w ",ui6 sclutici. t impoli à (0,075 a, pH 4,5, 1 ai) » et on perret au couplage is se produire tout en agitant doucement, un effectue ensuite 1 "addition du bêta-naphtène et les lavages cotane décrit dans l'exemple îJ°10o idbuiTÀffS 25 Prép. Solution taupon Activité : Protéine fixée 17° unités d'en- mg/g de solide syme/mg de Protéine fixée 30 Phosphate pK 7,6 4,6 14,9 31 Acétate pH 4,5 6,4 11,45 30 EZEnPLB 11° 13 On procédé comxe décrit dans l'exemple IT°11 , en réalisant un couplage pendant quarante-huit heures, mais toutefois avec le stade de rédaction suivant :- Cn effectue la rédaction de la para-nitro-phénoxy-hyuroxypro-35 pyl-cellulose par mise en suspension de 1 g dans une solution tampon au citrate (pH 5,8, 0,65 K, 30 ml) avec 25 ml d'une solution de chlorure titaneux (12,5?") et on agite à la température ambiante pendant quarante-huit heures. BAD ORIGINAL* 69 36319 17 2021385 maimiTa Prép. Méthode de réduction Activité : mg de protéine/ H° unités d'en- g de solide zyme/mg de - protéine fixée 5 32 Exemple N° 11 (HGl) 5,0 18,75 33 Exemple 13 (Citrate) 2,8 18,9 E2Eï On ajoute des échantillons de gamma-amylase insoluble dans l'eau (activité totale 100 unités, 12,5 mg de protéine/g de dérivé) 10 en suspension dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5, 10 ml) dans un récipient sous agitation dont la température est maintenue à 60°C et qui contient des solutions de maltose dans une solution tampon à l'acétate (0,005 M à 0,5 M, 250 ml) et on mesure la vitesse initiale de la réaction produisant le glucose, en sur-15 veillant les concentrations en glucose par la méthode de Dalqvist, Biochem. J., 80, (1961) 547, pour déterminer le glucose. RESULTATS 20 Exp. Hf Concentration initiale en maltose Vitesse de réaction initiale me de glucose/ml/heure a 0,005 1,9 b 0,01 2,7 c 0,01 3,2 d 0,02 3,3 e 0,05 4,4 f 0,1 5,7 g 0,1 5,1 h 0,2 6,0 i 0,5 6,7 25 exemple n° 15 On applique des suspensions de gamma-amylase insoluble dans 30 l'eau (préparation 21, 21,0 unités/mg de protéine fixée, 18,45 mg de protéine/g de dérivé) dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5) selon diverses concentrations à des suspensions d'amidon de blé (20$ p/v) dans une solution tampon à l'acétate (300 ml), dans un récipient chemisé (60°C), sous agitation. On suit 35 la production des sucres réducteurs par la méthode de réduction au ferrocyanure (Hagedorn-Jonson) et les résultats obtenus à partir de la pente de la courbe au temps zéro. 69 36319 18 2021385 RESULTATS 10 15 Exp« N° Concentration en enzyme appliqué 20 25 Protéine fixée, mg Activité, unités Vitesse de réaction initiale, mg de sucre réducteur/ ml/heure d 4 84 8 k 8 168 9 1 15,5 338 17 m 23,5 494 22 n 31,5 662 39 o 39,5 830 42 EXEMPLE N°16 On applique des suspensions contenant 1,5 g de gamma-amylase insoluble (préparation 17, 17,6 unités/mg de protéine, 6,3 mg de protéine/g de dérivé) dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5, 20 ml) à des suspensions d'amidon de blé (10, 20, 30$) dans une solution tampon à l'acétate (280 ml), dans un récipient chemisé (60°C), sous agitation. RESULTATS Exp. Activité de l'enzyme appliaué Concentration en amidon p/v $ Vitesse de réaction initiale mg de sucre réducteur/ml/heure P 155 10 3 155 20 20 r 155 30 35 30 EXEMPLE N° 17 On applique des suspensions contenant 0,43 g de gamma-amylase insoluble (préparation 22) dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5» 20 ml) à des suspensions d'amidon de blé qui ont-, été préalablement hydrolysées par un acide jusqu'à un équivalent de dextrose (D.E.) égal à 12$, neutralisées et dissoutes dans une solution tampon à l'acétate (0,02 M, pH 4,5, 280 ml) à 60°C. RESULTATS 35 Exp. Concentration ini- N° tiale en amidon (pré-hydrolyse) s 10 t 20 u 30 Vitesse de réaction initiale mg de sucre réducteur/ml/heure 40 50 52 Temps jusqu'à un D.E. de 96$, heures 6 24 18 69 36319 19 2021385 laaaaa n° is Ce effectue la o€:ïferifugation cle swspenaioas de préparations ei:r; Lz-xiq;-;:. î'alpla- et ô* 1-S ts-aiC/lase \l'c3» 15, 11 et \y) et ci; ;(;îtç lus rractioas rnr; s-^nasenl-c On ajoute ',ae pertio aliq-jo-■l fte i-x .: .1 ^ "1 r5 c:-i t 1- vs*r? la solution tai..v-o» ap= ri'-;-■;ri: ir ? ;;npio ~î:-:rl rrr " c. ' ■ ;r~o.;;vJ:iq--i£ le prcd"il le la :: 1" ' . " ' c.ïrtrii" \r; A.-' . 1;'. "' ransfe^é '-::&V-iv>î :.r-l • -•. • 1 . ■.. . :~c; •: nlw : . .- : - >ïsi rsaeiiii di.= h iulj ro ir servir d-s ténor:* au lô-rcr; ^liCc Cn 10 lo r^né^iuv^rK.ri lt produit d& la Des modifications peuvent être appointées aux modes de mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, 25 sans s'écarter de l'invention. BAD ORIGINAL1 69 36319 20 2021385 Enzyme alpha-amylase A.0.D.520 nm Temps utilisé i» d'activité restant "bêta-amylase & 0.D.520nm Temps utilisé fo d'activité restant alpha-amylase A 0.D.520 nm Temps utilisé % d'activité restant bêta-amylase A 0.D.520 nm Temps utilisé e/î> d'activité restant Prép. 15 11 13 RESULTATS Mode de couplage, couplage diazo Solution tampon phosphatée 0,02M pH 6,9 1,90 1,04 0,92 0,87 0,77 0,71 0,70 0,68 1 2 3 4 5 6 7 8 55 48,5 46 40,5 37 37 36 couplage diazo acétate 0,02H pH 4,8 0,98 0,53 0,44 0,37 0,32 0,37 0,24 0,22 1 2 3 4 5 6 7 8 54 45 38 32,5 27,5 24,5 22,5 Isothiocyanato phosphate 0,02HpH 6,9 1,65 1,22 1,12 1,01 0,93 0,86 0,81 0,76 1 2 3 4 5 6 7 8 73 SI 61 56 52 49 46 Isothiocyan?"feQ acétate 0,02HpH 4,8 1,49 0,78 0,62 0,54 0,50 0,45 0,40 0,36 1 2 3 4 5 6 7 8 52 42 36 33,5 30 27 24 69 36319 21 2021385 ;-:EI VEHBICATIO lî 3 1.- Procédé pour la préparation d'une amylase insoluble dans l'eau, caractérisé en ee qu'on fait réagir à 0-5®C 1'amylase dissoute dans une solution tampon, dans une .gamme de pH allant de 6,3 5 à 8,6, avec 1'éther para-diazo-phénoxy-kydroxypropylique ou para-i s othio cyanato-phénoxy-hydroxypropylique de la cellulose. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait dissoudre l'alpha-, la bêta- ou la gamma-amylase dans une solution tampon, dans une gamme de pH allant de 6,3 à 7,7, et 10 on fait réagir à 0-5°C avec 1*éther para-diazo-phénoxy-hydroxy-propylique de la cellulose. 3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la gamme de pH est comprise entre 7>6 et 7,7. 4.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce 15 qu'on soumet les groupes diazo inaltérés du dérivé de la cellulose à un traitement par réaction avec du bêta-naphtol ou du phénol. 5.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise de la cellulose microcristalline pour la préparation de 1*éther, le degré de substitution des groupes éther dans la cel- 20 lulose étant compris entre 13 et 56,2 jieq de groupes éther para-diazo-phénoxy-hydroxy-propylique par gramme de cellulose. 6.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait dissoudre de l'alpha- ou de la bêta-amylase dans une solution tampon à un pH de 8,6 environ, et on fait réagir à 0-5°0 25 avec 1*éther para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxypropylique de la cellulose. 7.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la solution tampon est une solution tampon au borate à 0,05 M, pH 8,6. 30 8.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise de la cellulose microcristalline pour la préparation de 1'éther, le degré de substitution des groupes éther dans la cellulose étant compris entre 13 et 56,2 peq de groupes éther para-isothiocyanato-phénoxy-hydroxypropylique par gramme de cellulose. 35 9.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on prépare 1'éther para-diazophénoxy-hydroxy-propylique de cellulose à partir du chlorhydrate de 1'éther 3-(para-aminophénoxy)-2-hydroxypropylique de cellulose par traitement avec une solution de nitrite de sodium acidifiée juste avant l'utilisation pour cette 40 application. 69 36319 2021385 10.- Procédé suivant la revendication 9» caractérisé en ce qu'on prépare le chlorhydrate d'éther 3-(para-aminophénozy)-2-hydroxypropylique de cellulose par réduction d*éther 2-hydroxy-3-(para-nitrophénoxy)propylique de la cellulose en utilisant du chlo- 5 rure titaneux en présence d'acide. 11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise, au lieu de l'acide, une solution tampon au citrate. 12.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on prépare 1'éther 2-hydroxy-3-(para-nitrophénoiypropylique de 10 la cellulose par réaction de cellulose avec de 1'éther glycidyl-para-nitrophénylique sous une atmosphère d'azote, en présence d'une hase. 13.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on convertit 1'éther 3-(para-aminophénozy)-2-hydroxypropylique 15 de la cellulose en éther 2-hyârozy-3-(para-isothiocyanatophénoxy) propylique de la cellulose par traitement avec du thiophosgène dans le tétrachlorure de carbone.