FR 2035917 A1 19701224 FR 7011004 A 19700326 L'élaboration de métabolites antimicrobiens actifs par les micro-organismes, par exemple, la production d'antibiotiques par fermentation, est bien connue. De meme, de nombreux microorganismes produisent dans des conditions similaires des métabolites qui ont peu ou pas d'activité antimicrobienne. On a désormais trouvé qu'en ce qui concerne ces produits métaboliques, qui sont obtenus par culture de micro-organismes dans un procédé de fermentation et qui manquent d'activité antimicrobienne quelle qu'elle soit, on peut en améliorer la qualité ou les transformer en agents antimicrobiens actifs en traitant le bouillon brut le filtrat brut ou l'extrait cellulaire du micro-organisme par un agent halogénant comme un N-haloamide, par exemple, un N-haloamide diacide alcanolque inférieur tel que N-bromoacétamide, N-chloroacétamide ou produits analogues, un N-haloimide d'acide alcanediorque inférieur tel que N-bromosuccinimide, N-chlorosuccinimide ou les produits analogues, ou une enzyme d'halogénation comme la chloroperoxydase obtenue à partir de Caldariomyces fumaqo. On ajoute l'agent halogénant au bouillon entier, au filtrat brut ou à l'extrait cellulaire à des concentrations d'environ 1 à 5 mg/ml pour les agents chimiques et sous forme dtun extrait aqueux d'une poudre acétonique de C, fumaqo dans le cas de 1'enzyme, à environ la température ambiante, et on brasse le mélange ou on le laisse au repos pendant une durée allant jusqu'à 60 minutes. Ensuite on extrait le mélange réactionnel et on teste l'extrait au solvant pour déceler l'activité antimicrobienne par la technique bioautographique. On peut transformer les bouillons entiers, les filtrats bruts ou les extraits cellulaires de micro-organismes que l'on a produits en cultivant les micro-organismes et qui contiennent des produits métaboliques ayant peu ou pas d'activité antimicrobienne, selon cette invention, en produits qui ont une activité antimicrobienne appréciable, en traitant le bouillon entier, le filtrat brut ou l'extrait cellulaire par une source d'halogène positif .On obtient ces mélanges réactionnels bruts contenant les produits de réaction métabolique qui ont peu ou pas a d'activité intrinsèque inhibitrice de croissance vis-à-vis des micro-organismes patho en en cultivant l'une ou l'autre variété d'espèces de micro-organismes selon des techniques de fermentation convention ne îles, par exemple, en cultivant le micro-organisme à environ 250C dans des conditions aérobies submergées dans un milieu nutritif aqueux contenant une source d'azote et d'hydrate de carbone assimilable, pendant environ 2 à 5 jours. On peut soumettre à ces procédés de fermentation des microorganismes appartenant à une grande variété de genres, spécialement ceux des familles Xvlariaceae. Moniliaceae, Shaerioidaceae, Dematiaceae. Gnomoniaceae, Hvpocreaceae, Sphaeriaceae, Polyporaceae, Melanconeaceae, Tremellaceae, Piptocephalidaceae, Tuberculariaceae, Saccharomycetaceae, Mucoraceae, Aqaricaceae, EntomoPhthoraceae, Stilbaceae. SphaeroPsidaceae, Dematiaceae, Hypocreaceae, Thamnidiaceae. etc., comprenant les genres tels que streptomyces, Penicillium, Gonaderma, Omohalia. Xvlaria, Piricauda, Helicoma, Aspergillus. Syncephalostrum, Myrothecium, Botrvtris, Cercosporella, Glomerella, Gnomonia, Didymella, DiPloida, Trichothecium, Daldinia, Eidamia. Gibberella. Curvularia, Polyporus, Aqaricus, Corticium, Pizizella, Fomes, Trameles, Actinopycnidium, Absidia. Les espèces illustratives des précédentes comprennent Streptomyces chartreusis, Streptomyces viridochromogenus,Streptomvces coerulescens, Stretomvces coeruleorubidis, Streptomyces roseo chromoqenes, Sreptomyces cqaneus, Streptomyces narvullus, Penicillium waksmanii, Stilbella fimetaria, Coniotherium ulmenum, Didymella lcopersici, Botrytis allii, Aspergillus clavatus, Gliocladium fimbriatum, Cercosporella acetosellae, Daldinia concentrica. On peut obtenir les micro-organismes tels que les précédents, à partir de sources connues par des techniques conventionnelles, à partir des divers dépositaires de micro-organismes ou à partir de sources naturelles, par exemple, par isolement d'un échantillon de terre, ensemencement sur une plaque de milieu gélosé et culture dans un milieu de germination. On pratique le procédé de fermentation pour obtenir les produits d'élaboration métabolique du micro-organisme de manière conventionnelle, en suivant sensiblement le même procédé que dans la production d'antibiotiques actifs du point de vue antimicrobien tels que streptomycine, chlortétracycline, oxytétracycline, et de nombreux autres, Un échantillon prélevé dans le bouillon de fermentation ou le filtrat brut, présentant peu ou pas d'activité intrinsèque inhibitrice de croissance vis-à-vis des micro-organismes pathognes, peut etre transformé en matière activé par la méthode axe cette invention. On peuttraiter le bouillon dè fèrmentation brut, entier, obtenu de la manière précédente, par une source d'halogène positif, on peut filtrer le mélange réactionnel pour éliminer le mycelium qui s'est développé et d'autres solides et on peut traiter ce filtrat brut par une source d'halogène, ou bien on peut appliquer la source d'halogène à un extrait prelevé dans le milieu réactionnel en utilisant un solvant organique tel que n-butanol, acétate d'éthyle, éther, éthanol, méthanol, diméthylsulfoxyde, chloroforme, etc..., ou associations de ces solvants. Sinon, on peut éliminer le solvant organique par évaporation, par exemple, et on redissout dans un milieu aqueux les solides obtenus pour faire un traitement par une source d'halogène. Comme il est indiqué précédemment, les sources d'halogène positif ou agents d'halogénation que l'on peut utiliser, selon cette invention, comprennent les N-haloamides, par exemple, N-haloamides d'acides alcanovques inférieurs tels que N-bromo acétamide, N-chloroacétamide, et les N-haloimides, par exemple N-haloimides d'acides alcanedioîquesinférieurs tels que N-bromosuccinimide, N-chlorosuccinimide, N-iodosuccinimide, ou une enzyme d'halogénation telle que la chloroperoxydase obtenue à partir de Calaariomyces fumaqo. On peut cultiver l'organisme sous forme d'une culture statique sur milieu de Czapek-Dox pendant 7-20 jours. On prépare l'enzyme sous forme d'un extrait aqueux d'une poudre acétonique du micro-organisme.En plus de 11 enzyme, il est nécessaire d'avoir du peroxyde d'hydrogène et du bromure de potassium dans le milieu réactionnel. On obtient les meilleurs résultats avec le N-bromosuccinimide, le N-bromoacétamide et la chloroperoxydase, qui ont la préférence, en particulier les deux premiers. On ajoute l'agent ou les agents d'halogénation au bouillon entier, au filtrat brut ou à l'extrait cellulaire à des concentrations d'environ 0,1 à 50 mg d'agent d'halogénation par ml de produit de fermentation, de préférence d'environ 1 à 5 mg/ml à une température comprise dans la gamme d'environ 200 à 400C, de préférence à la température ambiante. On laisse le mélange réagir pendant une période de temps de l'ordre d'environ I à 60 minutes, avec ov sans agitation. flatibuellement une agitation à la température ambiante, par exemple, environ 250, pendant environ 15 minutes est suffisante. Ensuite on extrait le milieu réactionnel avec un solvant organique tel qus n-butanol, acétate d'éthyle, chlosoforme, méthylisobutylcétone, n-hexane, etc..., cu un mélange de ces solvants organiques. On examine extrait au solvant quant à l'activité antimicrobienne, par exemple, par la méthode d'essai des disques de la technique de dilution en stries sur plaque d'agar ou par application de la technique bioautographique en utilisant, par exemple. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruciinosa, Escherichia coli ou Candida albicans comme organismes d'essai. Ainsi, par exemple, des bouillons obtenus à partir de Stretomvces cvaneua, Streptomyces viridochromosenes ou Streptomyces chartreusis, lorsqu'on les a traités par le N-bromosuccinimide, produisent des substances inhibitrices vis-à-vis de S. aureus, E. coli, et C. albicans. Les bouillons obtenus à partir de Stilbella fimetaria, Stretomvces coerulescens ou Streptomvees coeruleorubidis et traités par le meme agent inhibent C. albicans. non Les bouillons,traités provenant des memes sources ne manifestent pas cette action inhibitrice. On peut isoler la matière antimicrobienne contenue dans l'extrait par les méthodes usuelles de chromatographie et au solution en utilisant la cellulose ou les dérivés de la cellulose, l'alumine, le gel de silice, etc... Les métabolites microbiens chimiquement halogénés obtenus par la méthode de cette invention, sont des agents antimicrobiens utiles dans la lutte contre les infections bactériennes ou fongiques et on peut les utiliser de la même manière que la tétracycline ou l'amphotéricine B, par exemple. On peut les utiliser contre une variété de micro-organismes responsables d'infections chez diverses espèces de mammifères, par exemple, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, etc... Par exemple, on peut les administrer par voie orale à diverses espèces d'animaux, par exemple, à la souris à raison d'environ 5 à 25 mg/kgZ'jour, de préférence en 2 à 4 doses séparées, sous l'une ou l'autre des formes posologiques orales conventionnelles, ou bien par voie topique dans des crèmes en quantités équivalentes. On peut les utiliser comme désinfectants de surface. On peut disperser environ 0,1 à 1,0% en poids de l'une ou l'autre de ces substances sur un solide inerte ou dans un liquide tel que l'eau et on peut les appliquer sous forme d'une poudre ou d'une pulvérisation ou les incorporer dans un savon ou un autre agent de nettoyage tel qu'une composition détergente solide ou liquide.On peut utiliser cettedernière, par exemple, dans le nettoyage général, dans le nettoyage des hangars de laiterie ou les laiteries, dans les équipements de manutention de l'alimentation ou de traitement de l'alimentation. Les exemples suivants illustrent l'invention. Toutes les températures sont exprimées avec taéchelle centigrade. Exemple 1 On fait une culture de Stilbella fimetaria (CBS) dans approdYimativement 50 ml de milieu aqueux contenant, pour 1000 ml, 30 grammes de farine de soja de procédé d'extraction, 50 grammes de gXutoseF et 7 grammes de carbonate de calcium, dans une fiole Erlenmeyer de 250 mi. On agite la fiole sur un agitateur rotatif (280 cycles par minute) à 250C, pendant une période de quatre jours. Ensuite on ajuste le bouillon à pH3 avec HCI 6 N et on centrifuge. A 5 mi du surnageant acidifié on ajoute 12,5 mg de N-bromosuccinimide. On fait tourner le mélange réactionnel sur un mélangeur Vortex et on le laisse reposer à la température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite on extrait la préparation par 1 ml de n-butanol.On extrait de la meme manière avec 1 mi de n-butanol une aliquote de 5 ml de surnageant acidifié auquel on n'a pas ajouté de N-bromosuccinimide pour qu'il serve de témoin non traité. On prépare de la même manière des aliquotes de 5 ml de milieu non fermenté : on en fait réagir une evec le N-bromosuccinimide, on ne fait pas réagir l'autre. Ensuite on examine les quatre extraits au n-butanol quant à leur activité antimicrobienne, par la méthode routinière des disques par incubation sur des plaques contenant de l'agar et ensesl.eacet5 avec un ou trois organismes test : Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli et Candida albicans.L'extrait de surnageant de la fermentation acidifié, traité par le N-bromosuccinimide manifeste une inhibition de la croissance de Candida albicans tandis que les extraits de surnageant de fermentation acidifiés, non traités et les surnageants du milieu non fermenté , acidifiés , traités et non traités ne manifestent pas d'activité inhibitrice de croissance vis-à-vis de l'un ou l'autre des trois organismes test. Exemple 2 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Streptomvces cvaneus (ATCC 21378). Le surnageant de la fermmntation acidifié, traité par le NBS, manifeste une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli, et Candida albicans, tandis que les extraits du surnageant du bouillon de fermentation-de l'organisme,acidifiés, non traités, et les surnageants du milieu non fermenté, acidifiés non traités et traités ne présentaient pas d'activité inhibitrice de la croissance vis-à-vis de l'un ou l'autre des trois organismes test. Exemple 3 On suit le procédé de 1'Exemple 1 en remplaçant Stibella fimetaria par Didymella lycopersici (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide manifeste une inhibition de la croissance de Staphvlococcus aureus 209P. Exemple 4 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant StiTbella fimetaria par Botrytis allii (ATCC 9435). Seul l'extrait de surnageant de fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide manifeste une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P. Exemple 5 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant StUbella fimetaria par Streptomyces roseochromoqenes.Seul l'extrait de surnageant de fermentation, acidifié,tsit per leN-bromosuccinimide manifeste une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli, et Candida albicans. Exemple 6 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par AsPergillus clavatus (ATCC 20198). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli et Candida albicans. Exemple 7 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Asperqillus penicilloides (ATCC 20199) . Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de StaPhylococcus aureus 209P. Exemple 8 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant-Stilbella fimetaria par Coniotherium ulmenum (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par lo N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 9 On suit le procédé de 11 Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Coniotherium olivaceum (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 2092. Exemple 10 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Coniotherium concentricum (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide, présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P et Candida albicans. ExemPle 11 On suit le procédé de l'Exemple 1 mais en substituant Stilbella fimetaria par Coniotherium rosarum (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 12 On suit le procédé de l'Exemple 1 en substituant Stilbella fimetaria par Coniotherium minitans (Imperial Mycological Inst., AngleeennLSeul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente l'inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 13 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Coniotherium pitvophilum (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente 1' inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 14 On suit le procédé de l'Exemple 1 en substituant Stilbella fimetaria par Streptomyces coerulescens (ATCC 19896). Seul extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 15 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Streptomyces parvullus (aTCW 12434). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P. Exemple 16 On suit le procédé de 1'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Gliodadium fimbriatum (ATCC 10098) Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus. Exemple 17 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Strentomyces diastaticus (NRRL 2650). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus. Exemple 18 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Streptomvces hawaiiensis (ATCC 12236). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida aibicans. Exemple 19 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Strettomvees airbus (NRRL B-71685), seul ul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P. Exemple 20 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Streptomyces coeruleorubidis (ATCC 13740). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 21 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stlbella fimetaria par Streptomvees-viridochromoqenes (NRRL B-1511). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Streptomyces aureus 209P, Escherichia coli et Candida albicans. Exemple 22 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Penicillium waksmanii (ATCC 10516). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P. Exemple 23 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Streptomvces chartreusis (NRRL2287). Seul l'extrait de su langeant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromc,succinimide présente une inhibition de la croissance de Candira albicans. Exemple 24 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Cercosporella acetosellae (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 25 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant Stilbella fimetaria par Daldinia concentrica (CBS). Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromosuccinimide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 26 On suit le procédé de l'Exemple 1 en remplaçant le N-bromosuccinimide par 12,5 mg de N-bromoacétamide. Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromoacétamide présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 27 On suit le procédé de l'Exemple 6 en remplaçant 12,5 mg de N-bromosuccinimide par 19,2 mg de N-bromoacétamide. Seul l'extrait de surnageant de la fermentation, acidifié, traité par le N-bromoacétamide présente une inhibition de la croissance de Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli et Candida albicans. Exemple 28 On prépare une enzyme d'halogénation en broyant 6 g de poudre acétonique de Caldariomyces fumaqo (ATCC 16373) avec 60 grammes de sable lavé à l'acide et 150 ml d'eau distillée, pendant 5 minutes, puys en centrifugeant. Le surnageant limpide résultant constitue alors la solution d'enzyme. A 3 ml de cette préparation d'enzyme on ajoute 1 ml d'eau distillée, 2 ml de solution de phosphate de potassium 0,3 M (pH 3, O) et 5 mi du surnageant de fermentation acidifié (Stilbella fimetaria) tel que préparé dans l'Exemple 1. On constitue de la même manière un mélange réactionnel en remplaçant les 5 ml de surnageant de fermentation acidifié par 5 ml de milieu non fermenté acidifié. En outre, on réalise des réactions témoin dans lesquelles on supprime our à tour les constituants (enzyme, peroxyde d'hydrogène, bromure de potassium, surnageant de fermentation acidifié, et milieu non fermenté acidifié) et on les remplace par un égal volwne d'eau distillée. On agite les divers milieux réactionnels sur une secoueuse rotative (286 cycles par minute) à 250C pendant 30 minutes, et ensuite on les extrait par 2 ml de n-butanol. On examine ces extraits quant à leur activité inhibitrice de croissance comme dans l'Exemple 1. Seul l'extrait du mélange réactionnel contenant tous les constituants en présence de surnageant de fermentation acidifié présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. Exemple 29 On suit le procédé de l'Exemple 28 en-substituant 5 ml de surnageant de fermentation acidifié d'AsPerqillus clavatus (AToe 20198) à celui de Stilbella fimetaria. Seul l'extrait du mélange réactionnel contenant tous les constituants en présence de surnageant de fermentation acidifié présente une inhibition de la croissance de Candida albicans. REVENDICATIONS 1. Un procédé pour communiquer une activité antimicrobienne à un bouillon de fermentation contenant des constituants, sensiblement inactifs du point de vue antinscroblen, obtenus à partir d'un micro-organisme par tarmentation, qui consiste à traiter le bouillon de fermentation entier, le filtrat brut obtenu à partir de ce dernier ou l'extrait cellulaire dudit micro-organisme par une source d'halogène positif, et à en séparer la matière active du point de vue antimicrobien. 2. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme est une espèce de Streptomyces, Stilbella, Didsmella, Asperqillus, Coniotherium, Gliocladium, Penicillium, Cercosporella ou Daldinia. 3. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme est une espèce de Streptomyces. 4. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel la source d'halogène est un N-haloimide, un N-haloamide ou une enzyme d'halogénation. 5. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel la source d'halogène est un N-haloamide d'acide alcanoique inférieur. 6. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel la source d'halogène est un N-haloimide d'acide alcanediolque inférieur. 7. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel la source d'halogène est une chlorqperoxydase. 8. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel la source d'halogène est le N-bromoacétamide ou le N-bromosuccinimide. 9. Un procédé selon la revendication 3, dans lequel la source d'halogène est le N-bromosuccinimide. 10. Une matière active du point de vue antimicrobien toutes les fois qu'elle est préparée par un procédé tel qu'il est décrit dans l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 9. 11. Une composition active du point de vue ti-jerapeutique comprenant comme ingrédient actif un produit selon la revendication 10.