FR 2022200 A1 19700731 FR 6932489 A 19690924 La présente invention a trait à la fabrication d'un nouvel en azyme, Retikinonase 1. La bradykinine est bien connue comme intermédiaire ayant un rôle très important dans le développement d'inflammation. Toutefois, si cette Bradykinine peut être rendue inactive par une certaine action enzymatique, on pense que son activité in flammatoire peut être limitée ou supprimée. Il a été prêté une attention particulière au point ci-dessus et diverses études ont été effectuées pour détecter des enzymes rendant inactive la Bradykinine inflammatoire. En conséquence, il a été découvert que certains Streptomyces produisaient des enzymes décomposant la Bradykinine, dont 11un faisait effectivement preuve d1une très puissante activité anti-inflammatoire. Reconnu, en le purifiant, comme étant un enzyme nouveau, celui-ci a été baptisé Retikinonase 1. Retikinonase 1 est obtenu sous forme de solution ou de protéase solide, soit brute soit purifié La présente invention a été achevée sur la base de cette connaissance et de cette éxpérience, et elle consiste en un procédé de fabrication d'un noutel enzyme, Retikinonase 1, procédé caractérisé par l'obtention de Retikinonase I & partir du bouillon de culture après culture d'un micro-organisme producteur de Retikinonase et appartenant aux Streptomyces, -Son but est la production de l'enzyme ayant une activité anti-inflammatoire. Le Streptomyces producteur de Retikinonase 1 utilisé dans la présente invention a été isolé de l'échantillon du sol de Sigashi Kurume-Machi, Kitatama-gun, Tokyo-to, en Novembre 1965 à 1' Ins- titut de Chimie Microbienne. Le numéro de laboratoire RA603-A2 a été donné à cette souche. Cette souche présentait les caractères auivante (la description de couleur indiquée entre parenthèse a été faite conformément au manuel d'harmonie des couleurs de la *Container Corporation of America"). a) Caractéristiques microscopiques À l'examen microscopique, on observe des hyphes aériens longs et droits partant de fins hyphes ramifiés de base, et on reconnatt les verticilles primaires et secondaires. On ne voit pas de formation de spirale. La surface des spores est lisse. b) Caractéristiques de culture sur divers milieux 1) Milieu : Glycérol-gélose de Czapek (Incubation à 27 C) Croissance : au cours de son développement, passe d'incolore à brun pale. Mycelium aérien : développe des hyphes aériens blancs à blancs jaunâtres. Pigment soluble : non produit 2) Milieu : Glucose (Krainsky)-asparagine-gélose (incubation à 27 C). Croissance : Incolore Mycélium aérien : d'abord blanc pâle, mais devient ensuite gris olive clair et pousse abondamment avec un aspect cotonneux. Pigment soluble : non produit. 3) Milieu : Gélose-malate de calcium (incubation à 270C) Croissance : Incolore. Mycélium aérien : d'abord blanc à blanc grisatre, mais devient ensuite gris olive clair (Mastic 1-1/2 ec) Pigment soluble : non observé, Ne dissout pas le malate de calcium. 4) solution de peptone (renfermant 1% de nitrate de sodium) (Incubation à 2700). Croissance Incolofe. Mycélium aérien : Développe un rare mycélium aérien blanc. Pigment soluble : Produit un pigment soluble faiblement brunâtre; qui devient graduellement brun foncée On ne voit pas de réduction du nitrate. 5) Rondelle de pomme de terre (incubation à 27 C) Croissance : Brun pale. Mycélium aérien : développe un mycélium aérien blanc à gris-brunotre clair ou bien gris clair. Pigment soluble : Un pigment noir brunâtre est produit. i) Milieu : plaque amidon-gélose (incubation à 27 C) Croissance : Incolore à brun pale. Mycélium aérien : Développe un mycélium aérien blanc à gris olive clair. Pigment soluble : non produit On observe une hydrolyse de l'amidon. 7) Milieu : gélose nutritive (incubation à 270C) Croissance : Incolore à brun pale. Mycélium aérien : développe un maigre mycélium aérien blanc. Pigment soluble : un pigment brun se développe. 8) Milieu : gélose nutritive -incubation à 370 C) M8me chose que celle décrite ci-dessus en 7. 9) Milieu : sérum coagulé de Loeffler (incubation à 37 C) Croissance : plissée, incolore à brun pale. mycélium aérien : Néant. Pigment soluble : la circonférence de la pousse devient brun foncé. On observe pas de liquéfaction du sérum. (10) Tablette de gélatine (incubation à 200 C) Croissance : Incolore à brun pâle mycélium aérien : développe un mycélium aérien blanc0 Pigment soluble : devient brun clair à brun, et vire graduellement au brun foncé. On ne voit pas de liquéfaction de la gélatine. 11) Milieu : Lait (incubation à 370C) Croissance : développement brun foncé à noir brunâtre. Mycélium aérien : il n'en pousse pas. Pigment soluble : un pigment brun foncé est produit. Une peptonisation se produit après coagulation du lait, et est comparativement forte. 12) Milieu : tyrosine-gélose (incubation à 270 C) Croissance : Incolore Mycélium aérien : développe un mycélium aérien blanc. Pigment soltible : au fur et à mesure de son développement, vire au noir. La tyrosinase est positive. 13) Solution de CZAPEK renfermant de la cellulose comme unique source de carbone (incubation à 270 C) Elle pousse, mais de décompose pas. 14) Utilisation de sources de carbone dans un milieu basique, PRDHAM-GOTTLIEB (Incubation à 270C) En utilisant de l'amidon, de la dextrine, du glycérol, du glucose, du maltose et mannose, le développement est bon. Le raffinose et le galactose donnent une croissance faible. Mais il est difficile dénéterminer si le fructose est utilisé ou non. Le sacharose semble pas être utilisé. L'inositol, le lactose, le mannitol,-le rhamnose, l'inuline, le sorbitol, le dulcitol le xylose, l'arabinose et la salicine ne sont pas utilisés. Condition optimum de croissance : pH ,6,5 -7,5 ; température re, 27 à 29 C; aérobie. Toutefois, elle pousse même dans les conditions suivantes : pH,5,5-9,0; température 20 -37 C; anaérobie. Comme montré par les caractéristiques décrites ci-dessus la souche MA603-A2 appartient au genre Streptomyces, et ses caractéristiques peuvent être résumées comme suit : formation de verticilles ; pas de spirale; structure lisse de la surface des spores ; croissance , incolore à brun pale, mycélium aérien blanc à gris olive clair; type chromogène.- Cette souche semble entre "Streptomyces griseus" du point de vue de latcroissance sur les divers genres de milieux et de l'apparence superficielle hyphes aériens mais apparemment elle en diffère puisque ses hyphes ont une formation de verticilles et sont de type cbromogène. Par conséquent, comme résultat de la comparaison d'espèces connues ayant ces caractéristiques"Streptomyces verticillatus" (Waksman, Actimomycetes -2 281 ; Joual of Bacteriology 81, 70 (1961) est considéré comme étant l'espèce la plus semblable et la comparaison de cette espèce avec la souche n MA603-A2 ressort comme suit MA603-A2 Streptomyces Verticillatus Surfaces des spores Lisse Lisse Formation de verticilles + + Couleur de mycélium aérien Blanc à gris Blanc à gris foncé olive clair ou vert grisâtre. Mélanine + + Liquéfaction gélatine - rapide Coagulation et peptonisation du lait + + Hydrolyse de l'amidon l + Réduction du nitrate - rapide Antibiotiques produits faible Comme les deux souches sont très semblables, sauf en ce qui concerne la liquéfaction de la-gélatine et la réduction du nitrate, elles ne sont pas considérées comme des espèces différentes. La souche MA603-A2 peut entre identifiée comse une variété de "Streptomyces verticillatus", et a donc été appelée par les inventeurs "Streptomyces verticillatuss variété zytgenes". Cet organisme est actuellement déposé sous le nflméro d'enregistrement de micro-organisme 231 Kohatau-ken-kin-ki à l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Agence des Sciences Industrielles et de la Technologie, Ministère du Commerce Interna @e l'Industrie, JAPON. ce qui concerne l'organisme produisant ) Retikinonase 1 rces verticillatus, variété zymogenesU décrit ci-dessus un exemple, et non seulement ce Streptomyces mais aussi tous autres Streptomyces produisant le nouvel enzyme retikinonase 1 peuvent être employés dans le présent procédé, soit en souches naturelles soit en souches mutées. Retikinonase 1 est une protéine ayant une activité protéolytique, et on considère quelle a une fonction liée au dévelop- pement et à l'existence de Streptomyces. Pour cette raison, même s'il y avait une différence de productivité de cet enzyme, il est raisonnable de considérer que la production pourrait titre faite largement par les organismes appartenant aux Streptomyces. En conséquence, une fois les caractéristiques et l'activité de Retikinonase 1 nettement définies, il est facile pour les spécialistes dans ce domaine de trouver cet enzyme dans des cultures d'un autre Streptomyces0 Une forte productivité de Retikinonase 1 peut être obtenue par la méthode classique, à savoir par sélection de souches fortement productives et recherche de milieux et conditions de culture appropriés pour ces souches0 Par'exemple, la culture de monospores, irradiation par rayons ultra-violets ou rayons I, le traitement avec des substances mutagènes, etc0.. sont utiles, pour obtenir des souches fortement productives. Ces méthodes sont semblables à la méthode habituelle de production d'antibiotiques ou d'enzymes. Selon la présente invention, des organismes producteurs de Retikinonase 1 qui appartiennent aux Streptomyces sont cultivés par la méthode habituelle de production d'antibiotiques ou d'enzymes. Dans ces cas-là, des spores ou des mycéliums sont ensemencés dans un milieu convenable et cultivés dans des conditions aérobies. En ce qui concerne la méthode de culture, une culture solide ou bien une culture liquide est admissible, mais la culture liquide sous aération et agitation est avantageuse pour produis cet enzyme industriellement. En ce qui concerne les sources de nutrition, on peut emilo- yer les substances ordinairement utilisées pour la culture d'actionomycetes. Les composés carbonés qui peuvent être assimilés sont utilisables comme sources de carbone ; par exemple : amidon dextrine, glucose, maltose, saccharose, lactose, glycérine, huiles végétales ou animales et mélasses sont employées0 Comme sources d'azote, on emploie par exemple la farine de soja, la farine d'arachide, la farine de graines de coton, l'extrait de viande soluble de distillation, le peptone, la chair de poisson, ltex- trait de levure, l'infusion de maTs, les composés ammoniacaux, le nitrate et les amino-acides.En outre, on peut ajouter si nécessaire du phosphate , du magnésium, du calcium, du potassium, du manganèse, du zinc et autres sels métalliques0 La température d'incubation peut etre convenablement réglée dans les limites où le micro-organisme producteur se développera et ou le Retikinonase i sera produit, mais il est souhaitable qu' il soit incubé entre 250 et 35 C.La durée d'incubation peint varier avec les conditions de culture, à savoir, de 2 à 10 jours, et doit être arrêtée suffisamment à temps pour récolter la production maximum de Retikinonase. le Retikinonase 1 est recueilli du bouillon de culture ainsi obtenu, et cet enzyme est facilement dissous dans l'eau. il existe principalement dans une partie liquide du milieu, mais également dans le mycélium de l'organisme. En ce qui concerne Retikinonase 1 existant dans le milieu liquide, par exemple, on peut précipiter l'enzyme à environ pH 6 à 8 par semi-saturation ou saturation avec du sulfate d'ammonium, du chlorure de sodium ou dtautres sels solubles dans l'eau, ou bien on peut le précipiter en ajoutant des solvants solubles dans l'eau tels que le méthanol léthanol, et l'acétone.Dans ce cas-là, la méthode au sulfate d'ammonium a l'avantage d'éviter une dénaturation. Le sédiment est dissous dans l'eau et les substances impures à faible poids moléculaire peuvent être éliminées par dyalyse en employant contre l'eau une membrane semi-perméable. En outre, en.appliquant la différencie d'affinité d'adsorption à l'adsorbant ou à l'agent de filtration du gel, les impuretés à faible poses moléculaire ou les substances colorées peu" vent être effectivement séparées par les méthodes usuelles telles que chromatographie, par absorption, chromatographie par échange d'ions, ou filtration du gel.Du Retikinonase 1 brut solide. est obtenu par le procédé d'évaporation du de lyophilisation sous vide à partir de la solution d'enzyme préparée par les méthodes ci-dessus0 A partir de la solution de Retikino@ase a brut, ou de ce produit solide brut, obtenus par le mode opératoire aus-mention- né, on peut purifier le Retikinonase 1 par la méthode habituell ment employée pour la purification de protéines, enzymes, @te@@. par exemple en employant un adsorbant ou un agent de filtration de gel Par exemple, Retikinonase 1 est adsorbe par un adsorbant tel que la CM-cellulose ou la DEAE-cellulose, et est élué sepa- rément avec du chlorure de sodium aqueux, du formte d1 ammonium aqueux, ou autres, en concentration graduellement croissante. Il est également élué séparément par la méthode utilisant un agent de filtration de -gel tel que Sephadex ou Biogel. Eh d'autres termes, Retikinonase 1 est facilement soluble dans l'eau et purin par l'application de méthodes familières telles que dissolution, adsorption, distribution, filtration du gel, lavage, dialyse lyophilisation et concentration, sur la base des caractéristiques d'une protéine basique qui est insoluble dans des solvants organiques. Les caractéristiques physiques et chimiques de Retikinonase 1 obtenu par la méthode de la présente invention sont les suivantes. Cet enzyme est préparé par le procédé de lyophilisations 1) Valeur analytique(valeur expérimentale) C : 44 - 45 % E t 6 - 7 % H e 9,5-10,5 % S , 2,45 % Cendre : 2,63 % Yaleur analytique d'éléments traités par la technique de séchage sous vide sur du pentoxyde de phosphore n 100 C pendant 3 heures. c : 45, 16% H : 6,25 % N : 13,66 %. 2) Poids moléculaire Le poids moléculaire de Retikinonase 1 a de plus d dix mille à environ plusieurs disaines de nille (par la méthode de filtration du gel). 3) foint de fusion Retikinonase 1 ne présente pas un point de fusion ou point de décomposition netO 4) Spectre d'absorption ultra-violets Le spectre d'absorption ultra-piolets de $etikinonase est montré dans la figure 10 #max : 275 - 278 # #1% - 11,0(en solution aqueuse) 1 cm. 5) Spectre d'absorption infra-rouges Le spectre d'absorption d'infra-rouges de Retikinonase 1 mesuré en comprimé de KBe est comme montré Figure 2 avec bandes d'absorption aux nombres d'onde de 3.380, 2.930, 1.650, 1.530, 1.405, 1.345, 1.270, 1.145 et 1.080-1.010 cm-1, et est la courbe d'absorption indistincte caractéristique d'une protéine. 6) Solubilité dans les solvants Retikinonase 1 est facilement dissous dans i2eau, mais est insoluble dans des solvants organiques comme le méthanol, l'éthanol, le n-butanol, l'acétate d'éthyle, l'acétate butyle, le benzène, l'éther éthylique, le chloroforme et l'éther de pé-trole. 7) Réactions de couleur Retikinonase 1 est positif dans ltessai i ninhydrine, essai au triuret et les essais au ponceau 3 R. 8) Distinction de basicité, acidité et neutralité Le point disoélectrique mesuré par élcetrophorèse est plus que pH 7 et montre une nature de protéine basique. 9) Couleur du produit Retikinonase I est une poudre incolore. 10) Mode d'action Retikinonase 1 est un enzyme à activité anti-inflamma- toire, rendant inactive la Bradykinine. 11) Spécificité des substrats Chaque substrat a été dissous dans une solution tampon de Tris-HCl de munière à ce que la concentration devienne 1/400 M, et 1 @ne. d'une solution aquause de Retikinenase 1 (12 /omc) a été ajoutée à 1 cme de la solution de substrat. Après incubaeion à 37 C pandamt @@ be@@es, elle a été solidifiée par lyop@ill@@tion et appliquée @@ La ehromategraphie en couche mince) de gel de zili@e H après addit on de 0,1 cme de méthanol à 50% (solvent de développement, @-butanol : acide acétique :eau = 4:2:1, développement de la oculeur par ninhydrine). Les résul tats obtenus sont les auivants. TABLEAU Spécificités des substrats de Retikinonase Substrats Retiki- Substrats Retikinonase 1 nonase 1 D, L-Ala-Gly-Gly - Cbz-Glu-Phe D, L-Ala-Leu - Cbz-Gly-Leu Gly-Gly - Cbz-Gly-Phe Gly-Leu e Cbz-Gly-Pha-NH2 + Gly-Phe - Cbz-Gly-Pro-Leu-Gly Gly-Phe-NH2 - Cbz-Phe-Tyr Leu-Leu - Cbz-Try-Leu-NH2 + Ac-D, L-Met - Z-Gly-Leu-NH2 + N-Ac-D, L-Try - Z-Gly-Pro-Leu N-Ac-D, L-Try-OEt - Z-Pro-Leu-NH2 + Nota- + = hydrolysé - = non hydrolysé 1 cmc d'une solution aqueuse de Retikinonase 1 (10&gamma;/cme ) est ajouté à 1 cmc d'une solution aqueuse pH::7,6 de Bradykibnine (300&gamma;/cme), et quand ce mélange est mis à réagir à 37 C pendant 20 heures, les liaisons de peptides qui -(intéressent les groupes amino des deux phénylalanines) sont hydrolys6s pour donner trois genres de peptides, à savoir arginylpropylprolylglyeine, phényl alanylseryl-proline, at phénylalamylarginine. 12) pH optimum et stabilité du pH (figure 4) 1 cmo de tampon Tris-HCl 0,1 M renfermant 1 % de caséine (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5) est ajouté à 1 cmc d'une solution aqueuse de Retikinonase 1 (5&gamma;/cmc), et après réaction à 38 C pendant 20 minutes, on ajoute 3 cmc diacide trichloracétique. Après centrifugation, son fluide surnageant est mesuré à 280m#pour son absorbance extinction optique, ) et ensuite on calcule la valeur réduite avec la valeur témoin. Le pH optimum de l'activité protéolytique de Retikinonase 1 pour la caséine est aux environ de 7,7 et il est admis que l'intervalle de pH stable est de 6,5 à 8,5. 13) Température optimum pour l'activité protéolytique(Fig.3) 1 cmc de solution molaire au 1 de Tris-HCl, renfermant 1 % de caséine (pH7,0) est ajouté à 1 cme d'une solution aqueuse de Retikinonase 1 (5 Y/cmc), et après avoir fait réagir ce mélange à 300,400, 45 , 550,600 et 70 C pendant 20 minutes, on obtient l'absorbance optique conformément à la méthode décrite en 12). Les résultats obtenus sont tel que mentrés sur la figure 3, et la température optimum d'activité protéolytique de Retikinonase 1 pour la caséine est envfron 55 C. 14) Stabilité thermique 1 cme d'une solution aqueuse de Retikinonase 1 (5&gamma;/cme)est chauffé à 30 , 40 , 30 , 60 et 70 C pendant 10 minutes, et une fois qu'elle est refroidie on ajoute 1 cme de solution molaire au 1/10 de Tris-HCl (pH 7,0) renfermant 1 % de caséine, et on fait réagir à 37 C pendant 20 minutes. Ensuite, on obtient l'absorbance optique conformément à la méthode décrite en 12). Les résultats obtenus sont tel que montrés dans la figure/5; l'activité protéolytique de Retikinonase 1 ne se perd pas du tout au-dessous de 50 C pendant 10 minutes. Les résultats obtenus de la même manière en ajoutant 0,001 M d'acétate de calcium à la solution aqueuse d'enzyme décrite cidessus sout comme montré par la ligne pointillée de la figure 5 il est évident que l'ion de calcium a une action de protection pour Retikinouase 1. 15) Effets d'iens métalliques 0,1 cmc de solution molaire au 1 de sel métallique est ajou- té à 0,9 cme d'une solution aqueuse de Retikinonase 1 (8&gamma;/cme) après quoi, on laisse reposer pendant 20 minutes à la tempéra- ture du laboratoire, puis on ajoute 1,0 cmc de solution de tampon de Tris-HCl renfermant 1 % de caséine (pH 7,0), et on fait réagir le mélange à 37 C pendant 20 minutes. Conformément à la méthode décrite en 12), on obtient l'activité réaiduelle de l'enzyme, et on calcule le pourcentage d'activité résiduelle dû à l'ion métallique. Les résultats sont les suivants. Ions métalliques % activité résiduelle i03 18 CaCl2 99 CoCl2 64 CuSO4 4 FeSO4 58 HgCl2 2 Ions métalliques % activité résiduelle LiSO4 98 MgCl2 100 MnCl2 86 NaNo2 92 ZnSO4 47 16) Effet de réactifs chimiques Conformément à la méthode décrite en 15), on cal- cule l'activité résiduelle influencée par les réactifs chimi- ques. Ses résultats sont les suivants Réactifs % activité résiduelle 'u- chloroacétophénone 100 Acide p-chloromercurybenzoique 89 Acétate de ionoiodine 47 L-cystine 97 Acide tétracétique d'éthylènediamine 0 8-hydroxiquinoline 100 Diisopropylfluorophosphate 92 Sulfate laurique de sodium 95 Iode O Glutathione 65 Glutathione -SSG 62 N-brojosuccinimide 50 Bromure de- cyanogène 94 Hydroxilamine-HCl 94 Permanganate de potassium 2 (Knhibiteur : trypsine de pomme de terre 100 #0,1 cme d'inhibiteur trypsine de pomme de terre (180 &gamma;/cmc) a été employé 17) Electrophorèse Avec une solution tampon molaire au 1 de phosphate (pH : 7,0) contenant 0,1 mole de chlorure de sodium par litre, Retikinonase 1 est déplacé de 0,7 cm vers la cathode quand il a été développé par ponceau 3R après électrophorèse à 8 MA et 75 V sur Separax ( film d'acétate cellulosique de 8 cm de large et 6 cm de long, fabriqué par la Joko Sangyo Co,, okyo) pendant 1 heure. 18) Analyse dssnmino-acides. L'analyse d'amino-acides de l'hydrolysat de Retikinonase 1 (acide chlorhydrique distillant à point fixe à 110 C pendant 20 heures) a montré de l'acide asparatique, de la thréomine, de la sérine, de l'acide glutamique, de la proline, de la glycine de l'alanine, de la valine, de la méthionine, de l'isoleucine de la leucine, de la-tyrosine, de la phényl-alanine, de la lysine, de l'ammoniac, de l'histidine et une petite quantité de cystine. La comparaison de Retikinonase 1 avec des enzymes apparentés connus a été décrite comme suite : Retikinonase 1 diffère de la pronase produite par 'Streptomyces griseus" comme suit : la pronase a une très large spécificité de substrats pour divers genres de peptides (Journal of Biochemistry, Vol. 48, N0 6, P. 906, 1960). La spécificité de substrats de Retikinonase 1 n'est pas aussi large. La valeur analytique de Pronase est : C:52X0% Hg 6,8 % ; N: 14, 8% ; l trace, cendre 0,8%, et son point isoélectrique est pH 5,0 -5,5 (Journal of Biochemistry, Vol .46, N0 12, P. 1645,1959). Le point isoélectrique de Retikinonase 1 est supérieur à pH 7,0 parce que Retikinonase 1 se déplace vers la cathode par l'électrophorèse (pH 7,0), et la valeur de teneur en azote de cet enzyme est 13,66 % et est plus basse que pronase. Quand les fractions de protéases neutre (R--I-a et F2) de Pronase avec le pH optimum 7,5 à 8,0 sont chauffées pendant 10 minutes à 60 C, l'activité résiduelle est 89 % et 95 % (Résumé de conférence au 19ème Symposium de Chimie des Enzymes,Avril 1968 Kanazawa, P.168) respectivement, mais Retikinonase 1 est beaucoup plus instable en comparaison de R-F-I-a ou F2 de Pronase, et 1' activité résiduelle de Retikinonase 1 est inférieure à 20% quand il est chauffé à 60 C pendant 10 minutes. Retikinonase 1 se différencie du prozyme produit par Actino- myces S1033 (Réunion annuelle de la société de Chimie Agricole à Sapporo en 1964) comme suit : La valeur analytique du prozyme est C: 45,53% ; H:6,67% ; N:16,05% ; S: 1,00; cendre :0,63% mais la teneur en azote de Retikinonase 1 est 13,66%. En ce qui concerne les effets de divers ions métalliques et réactifs chimiques pour l'activité protéolytique du prozyme , l'activité résiduelle avec glutathione réduit, diisopropylfluorophosphate, AgNO3, et COC12, est respectivement 100% ; 5% ; 0% et 100% ; mais celle de Retikinonase 1 est respectivement 65% ; 92%; 18% et 64%, et par conséquent on trouve beaucoup de différences. Retikinonase 1 diffère de la protéase neutre produite par "Streptomyces naraensis" (Journal of Biochemistry, Vol. 62, P. 353-364, 1967) comme décrit ci-dessous @ Cette protéase neutre est une protéine acide se déplaçant vers l'anode sous électrophorèse à pH 7,0 dans une solution tampon de phosphate. Sa température optimum pour l'hydrolyse de caséine est 40 C. Au contraire, Retikinonase 1 se déplace vers la cathode sous électrophorèse à pH 7,0 dans une solution tampon de phosphate et sa température optimum pour lthydrolyse de caséine est d'environ 5500. Retikinonase 1 diffère de la Kératinase produite par "Strep- tomyces Fradiae" (Biochimica Biophysica jacta, Vol. 77 P 73 et 87, 1963 ; Journal of Bactériology, Vol. 77, P. 251, 1959). Keratinase est une protéase alcaline avec pH optimum supérieur à 9, et diffère de Retikinonase 1. "Streptomyces fradiae" produit la fraction de I-a, I-b et II de protéase alcaline, et en outre, la fraction de III et IV de protéases neutres, outre une protéase semblable à Keratinase (Biochimica Biophysica Acta, Vol. 139, P 382, 1967). Le pH optimum des protéases III et IV pour la ca- séine est 6,5 à 9, et leur activité résiduelle à l'acide téra- acétique d'éthylènediamine est supérieure à 30 %, respectivement, mais l'activité résiduelle de Retikinonase 1 à l'acide tetra- acétique d'éhtylènediamine est 0%. Retikinonase 1 est analogue aux protéines neutres, kinonase AI, AIII, et BI, produites par "Streptomyces Kinolteus" en ce qu concerne le pH optimum, la température optimum, la spécificité des substrats et les effets d'ions métalliques et de réactifs chimiques (Chemical Pharmaceutical Bulletin, Vol. 17,P.714 1969). Toutefois, Kinonase LI et AIII se sont déplacées de 5cm, vers la cathode et BI s'est déplacée de 0,2cm vers l'anode quand l'électrophorèse, a été réalisée à 8 mA et 75 V avec du Separax (8cm de large et 6 cm de long) ; en employant une solution tampomolaire au 1/10 de phosphate de pH 7,0 renfermant 0,1 M de chlorure de sodium, Retikinonase 1 s'est déplacé d'environ 0,7 cm vers la cathode. D'après les faits décrits ci-dessus, Retikinonase 1 diffère évidemment de tous les autres enzymes connus jusqu'ici, et par conséquent Retikinonase 1 obtenu par la présente invention est un enzyme nouveau- Retikinonase 4 obtenu par la présente invention a une activité anti-inflammatoire très puissante, et sert au traitement de diverses maladies de l'homme et des animaux. Des cas d'expériences sur alimaux concernant l'effet thérapeutique de Retikinonase 1 pour a l'inzlammation sont de- crit@ ci-après. Chaque concentration de Retikinonase 1 a été injectée intra-péritonéalement à des groupes de trois rats de race Donryu (poids du corps, 8 à 9 g) et au bout d'une heure 0,05 cmc de Carrageenine (Lot 52825), fabriqué par Marine Colloids, Inc) dissous dans une solution saline physiologique a été injectée sous la peau de leurs pattes de derrière, et au bout de 4 heures l'effet a été jugé en mesurant l'augmentation d'épaisseur de l'oedème.Comme témoin, on a employé &alpha; -chymotrypsine, et les résultats sont montrés ci-dessous : Echantillon Concentration Pourcentage de limitation mg/kg rat de l'oedème Retikinonase 1 5 " " 1,25 74 " " 0,31 51 &alpha; -chymotrypsine 100 67 L'activité protéolytique de Retikinonase 1 obtenu par la présente invention a été mesurée par la méthode décrite ci-après. 1 cmc de la solution d'enzyme à essayer est ajouté à 1 cm de solution tampon molaire au 1/10 de Tris-HCl (pH 7,0) et après incubation à 38 C pendant 20 minutes on ajoute 3 cm d' acide trichloroacétique à 5 %.Cette solution est centrifugée à 4.000 t. p . m. pendant 15 minutes, et l'absorbance optique de son fluide surnageant est mesurée à 280@. Et mEme temps, comme témoin la solution d'enzyme inactivée à 8000 pendant 5 minutes est mesurée pour son absorbance optique par les mêmes techniques que celles décrites ci0-dessus, et 1 qui est la différence des deux absorbances est fixé comme unité. Une unité d'activité protéolytique correspond à 20 unités de tyrosine (conversion par méthode de Folin). EXEMPLE 1 Cent cmc d'un milieu liquide (pH 7,0) consistant en amidon 1%, glucose/1%, Prorich 1%, K2HPO4 O, 1%, NaCl 0,3%, MgSO4O, 1% CuSO4 0,007%, FeSO4 0,01%, MnCl2 0,08%, et ZnSO4 0,02% ont été placés dans chaque flacon d'agitation de 500 cmc et ont été stérilisés à la vapeur à 120 C pendant 20 minutes. Après refroidissement 11Streptomyces verticillatusu var. zymogenesw a été ensemencé dans ce milieu et cultivé à 28 C pendant 48 heures sur une secoueuse (120t. p. m. et 8 cm d'amplitude). 2 cmc ont été ensemencés dans un milieu ayant les mêmes constituants que décrits ci-desaus,dans 100 flacons, et cultivés avec agitation à 28 C. Au bout de 67 heures, ces bouillons de culture de 100 flacons ont été recueillis, et on a obtenu par filtration 8,2 1. de filtrat de bouillon. Selon la méthode de test de l'activité protéolytique décrite ci-dessus, le filtrat de culture qui avait été dilué à 1/10 présentait une absorbance optique de 0,717 tandis que le témoin, c'est-à-dire le filtrat de culture chauffé à 80 C pendant 5 minutes, montrait une absorbance de 0,135. Si la valeur , 0,582, de la différence des deux absorbances était convertie en activité de Retikinonase 1, elle serait équivalente à 116 unités de tyrosine par cmc. 4,1 kg de sulfate d'ammonium ont été ajoutés à ce filtrat. Après repos à OOC pendant 1 heure et centrifugation à 4.000 t.p.m. , Retikinonase 1 a été obtenu comme sédiment.Ce sédiment a été dissous dams 200 cmc d'eau et dyalisé dans un tube de cellophane contre de l'eau courante pendant 16 heures à froid, et on a obtenu par lyophilisation du dyalisat 8,8 g. de poudre contenant le Retikinonase 1,, brut. EXEMPLE 2 Trois grammes de la poudre renfermant Retikinonase I et obtenue dans l'exemple 1 ont été dissous dans 30 cmc d'eau, et une chromatographie par gradients a été effectuée avec de l'eau (250 cmc)' et du NaCI 1N 4250 cmc) dans une colonne de 2,4 cm de diamètre et de 25 cm de haut, remplie de DEAE~cellulose et l'éluat a été fractionné, en portion de 17,3 cmc chacune, Retikinonase 1 a été principalement élué dans les fractions 6 à 10 . Après que chaque fraction dans un tube de cellophane ait été dyalisée pendant 2 heures contre de l'eau renfermant une une trace d'acétate de calcium, NaCl a été éliminé et on a ensuite obtenu par lyophilisation 650 mg. de poudre séchée contenant Retikinonase 1. EKEMPLE 3 Quinze litres d'un milieu (pH 7,6) consistant en amidon 1%, glucose 1%, Pr@rich 2%, K2HPO4 0,1%, NaCl 0,3%, MgSO4 0,1%, CuSO4 0,007%, FeSO4 0,01%, MnCl2 0,08%, ZnSO4 0,02%, et un agent anti-moussant (huile de silicium) ont été placés dans un pot de fermentation inoxydable d'un volume de 25 1. et ont été stérilisés à la vapeur à 120 C pendant 30 minutes. Après refroidissement 400 cmc de la graine d'ensemencement de "Streptomyces verticillatus" var. zymogenes" préalablement cultivée dans le même milieu de culture à 28 C pendant 48 heures ont été ensemencés et ensuite cultivés sous aération de 20 1. par minute et agit@tion à 3.000 t.p.m. à 2@ C, pendant 42 heures, et en a obtenu 12,7 1. de bouillon de culture (pH 6,8). Ce filtrat de culture a montré une absorbance optique de 0,940 une fois dil@é à 1/10 conformément à la méthode de test de l'activité potéolytique décrite précédemment, et le té@@@@ c'est-à-dire le filtrat de oulture chauffé à 80 C pendant 5 minutes, présentait une absorbance optique de 0,186. Quant la valeur 0,754 - différence entre ces deux valeurs - a été co@ver- tie en activité de Retikinonase 1, elle a été équivalente à l'activité de 147 unités par @ns de tyrosine dans le filtrat de eu@- ture. @e filtrat a été ajusté a pH 7,2 et on a ajouté 120 @@ de charbon de bois activé, et en a agité.Après rep@s perdant 1 heure, le @@@rbe@ de bois a été éliminé par filtration. @e filtrat a été évaporé @@@@@@@@@@@@@@@@s vide à 30 -35 C. @a gra@ me et demi sulfate @'@@@@@@@@ a été ajouté au conceutré à freid.Le pré@ipité résultant a été récupéré par centrifugation à 4.000 t.p.@. @e préci@ité a été is@ous dans 300 cmc d'@@@ dyalisé contre le l'eau @@@@@te d@@@ un tube de @@@ phane p@@@ da@t @ @@@@@@@ àbe@@@@@@ r@@@@@ @@@@@@@ obtenu p@r philis@tion @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ br@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ Retikinonas @@@@@@@@@ tage de récu@@@@@tion a @@@@@@@@@@@@@@@@ EXM@@@@@PLE 4- Un gramme de pondre contenant @@ikinonase 1 et obtenue dans P@xemple 3 a été dissous @@@ 10 cmc d'eau et pruifiè sur une colonne de 1,8 @@ de dia@ètre et de 90 cm de haut, @ emplie de DEAE-cellulose ejustée à un pH 7,0 avec une solution tampon Tris-Hcl. Cette colonne a été lavée avec 160 cmc d'eau et élué avec une solution de NaCl de concentration croissante par gradients emplcyant eau (250 cmc)-NaCl 1N (250 cmc). @'éluat a été fractionné en portions de 16 cmc chacune et une petite auaa- tité de Retikinonase 1 est apparue dans les fractions 4-6; mais Retikinonase 7 a été élué surtout dans les fractions 16-20. Chaque fraction a été dialysée dans un tube de cellophane contre de l'eau pendant 3 heures, et on a obtenu de ce dyalisat par lyophilisation, 180 mg. de poudre séchée contenant Retikinonase 1. EXEMPLE 5 Cent cinquante mge de la poudre contenant Retikinonase 1 obtenue ci-dessus dans l'exemple 4 ont été dissous dans 5 cmc d'eau, et la filtration du gel a été effectuée sur une colonne de 1,8 cm de diamètre et de 90 cm de haut en Sephadex G 75.Retikinonase sur 1-a colonne a été élué avec de l'eau en fractions, chacune de 11,6 cc., et Retikinonase I purifié (23mg.) a été récupéré des fractions 6 et 7 par la lyophilisation. EMEMPLE 6 Le milieu composé de K2HP04 0,1 %, NaCl 0,3%, MgSO4 0,1% CuSO4 0,0007%, FeSO4 0,01%, MnCl2 0,08%, et ZnSO4 0,02% a été utilisé comme milieu de base. La productivité de Retikinonase 1 dans 500 cmc. de flacons d'agitation en employant 16 genres de milieux combinés avec des sources de carbone et dtazote pour le milieu de base a été mesurée pour. du bouillon cultivé, de 48 à 120 heures suivant la méthode décrite précédemment, comme montré dans le Tableau 1 annexé ; les résultats indiqués par l'absorbance optique sont montrés dans le tableau ci-après - TABLEAU 1 Constituants Culture n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Glycérine 2 2 2 2 Glycol 2 2 2 2 Amidon 1,0 1,0 1,0 1,0 Glucose 1,0 1,0 1,0 1,0 Lactose 2 2 2 2 Prorich 2 2 2 2 (Ajinomoto Co.) Farine de Soja 2 2 2 2 (Nisshin Co) Infusion de Ma@s 2 2 2 2 Extrait de Viande 1 1 1 1 Peptone 1 1 1 1 Milieu de base:K2HPO 0,1 % , NaCl 0,3% , MgSO4 0,1 % , CuSO4 0,007%, FeSO4 0,01%, MnCl2 0,08 %, ZnSO4 0,02 %. La teneur pour chaque composant est indiquée en pourcentage. -TABLEAU N 2 - 48 heures 72 heures 96 heures 120 heures Milieu n pH absorbance pH absorbance pH absorbance pH absorbance 1 6,0 0,020 6,8 0,083 7,2 0,057 7,3 0,060 2 6,5 0,085 6,6 0,103 7,0 0,100 7,6 0,054 3 6,4 0 7,0 0,028 7,2 0,038 7,2 0,038 4 6,2 0 6,8 0 6,9 0,015 8,3 0 5 6,1 0,118 6,8 0,184 7,4 0,201 7,7 0,208 6 5,5 0,094 6,7 0,171 6,9 0,183 7,0 0,194 7 5,7 0,045 5,9 0,080 7,0 0,100 7,1 0,124 8 6,4 0,0@0 6,8 0,057 7,3 0,057 7,3 0,091 9 5,8 0,231 7,2 0,531 7,4 0,540 7,4 0,490 10 6,0 0,189 6,8 0,320 7,2 0,292 7,2 0,301 11 5,6 0,136 7,0 0,268 7,2 0,334 7,8 0,308 12 6,8 0,096 7,1 0,198 7,8 0,106 8,0 0,143 13 6,4 0,081 6,9 0,141 6,9 0,148 6,9 0,204 14 6,5 0,100 6,5 0,154 7,0 0,080 7,2 0,080 15 6,4 0,073 7,2 0,069 7,3 0,091 7,3 0 16 6,7 0 6,7 0 7,2 0 7,3 0 REVENDICATIONS Procédé de préparation d'un nouvel enzyme, Retikinonase 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un genre de Streptomyces produisant Retikinonase 1 et à extraire Retikinonase 1 de la substance cultivée