FR 2017267 A1 19700522 FR 6929890 A 19690902 1 2017267 69 29890 L'invention concerne la production d! amyloses de poids moléculaires élevés, à partir d'amidons de diverses origines ; elle vise plus particulièrement l'obtention d'amylose au départ de l'amidon du maïs riche en amylose ou de l'amidon provenant des 5 pommes de terre ou des patates "douces. L'invention comprend, plus particulièrement, un procédé dans lequel 1'amylopectine, présente dans les amidons naturels, est scindée par l'action de l'a-gluco-sidase-1,6. L*amylose, qui se trouve dans les divers amidons natu-10 rels, est une matière très utilisée dans la pratique ; elle présente un haut degré de polymérisation, de' l'ordre de 1 000 ou plus, ce qui constitue un des éléments de son utilité : en effet, la résistance à la flexion des films de tels amyloses est excellente, notamment de l'ordre de 1 400 imités Schopper. Or, la pré-15 sence d'amylopectine fait "baisser considérablement la résistance à la flexion des films d'amylose ; ainsi, avec 50 % d'amylopectine, cette résistance tombe vers 200, etelle est au-dessous de 100 pour les amidons ordinaires contenant environ 80 % d'amylopectine. Il y a donc intérêt à éliminer le plus possible l'amy-20 lopectine des amyloses de haut degré de polymérisation. Or, les procédés connus jusqu'à présent fournissent des amyloses trop riches encore en amylopectine, ou conduisent à l'obtention d'amyloses de bas poids moléculaire„ ou encore ne donnent 1'amylose pur de degré de polymérisation- élevé qu'avec tin rendement faible. 25 La présente invention permet au contraire l'obtention d'amyloses de degré de polymérisation élevé, avec bon rendement, pratiquement exempts d'amylopectine. Le nouveau procédé rend possible l'obtention d'un" amylose de propriétés très voisines de celles des amyloses naturels. 30 Le procédé suivant l'invention s'applique tout parti culièrement aux amidons renfermant environ 20 à 50 % d'amylopectine à côté d'amyloses de degré de polymérisation élevé. Il se traduit par la décomposition des parties ramifiées de l'amylopectine, et par la transformation de cette dernière en amylose. 35 Le nouveau procédé suivant l'invention consiste à géla tiniser une suspension aqueuse d'amidon à un pH supérieur à 5, à chaud, sous un courant de gaz inerteà refroidir la suspension à une température de 45° à 60° C, à faire agir à cette température une a-glucosidase-1,6 drorigine bactérienne, et à séparer ensuite 40 par précipitation 1'amylose résultant. a 2017267 69 29890 La préparation des e&symes,, convenant à la présente invention, est décrite dans la demande de brevet français n° FV 69.09811 intitulé "Procédé pour la préparation d'a-1,6-glucosi-dases", au nom de la Société dite Hayashibara Company. Selon la 5 nature des bactéries qui ont contribué à la formation de la glu-cosidase, cette dernière présente un optimum da pE. différent ; aussi, dans la réalisation de la présente invention, en tient-on compte, et le pH est convenablement ajusté au moment de l'addition de glucosidase, comme on le verra plus loin. 10 La première étape du procédé, à savoir la gélatinisa- tion de l'amidon, est effectuée à chaud, mais à la température la plus basse possible et dans une atmosphère de gaz inerte tel qu'azote ; on évite ainsi l'abaissement de poids moléculaire de 1 *amylose obtenu. 15 La concentration en amidon, dans la suspension aqueuse» est de préférence relativement faible, notamment de 1 à 10 %, et de préférence 2 à 5 %• En effet» pour des concentrations dépassant 15 %» la gélatinisation est souvent difficile. Les températures préférées sont d'environ 100° à 130° C. 20 L'amidon, une fois gélatinisé, " est aussitôt refroidi à une température de 45° à 60° C. On lui ajoute alors la propor-.tion adéquate d'enzyme que l'on laisse réagir pendant un à deux jours à un pH de 4,5 à 6. Conformément à un trait important de l'invention, les 25 conditions particulières de température et de pH sont adaptées à la nature de 11 enzyme utilisé. Ainsi, lorsque 1'enzyme provient du Lactobacille, la température du milieu est réglée à 55° C et le pH à 6, au moment de 1'addition de l'enzyme, après quoi la température est ramenée à 45° C. Pour l'enzyme du Pseu&omona les 30 pH de 4,5 à 5,5 sont préférables. Ls traitement du milieu gélatinisé par 1'a-glucosidase-1,6, ou isoanylase, conduit à la précipitation d'amylose à longues chaînes. Le précipité est soumis à la centrifugation, puis il est lavé avec une faible quantité d'eau tiède et finalement 35 séché 0 Le liquide srcœa&geant est - reeoncentr.é et- refroidi en vue de la récupération de la majeure partie de 1'amylose. Ainsi, la liqueur provenant de la décomposition enzymatique peut être concentrée sous vide jusqu'à environ 1/3 à 1/4 de son volume, ce qui permet de récupérer la majeure partie de 1'amylose. 40 Au cours des travaux de réalisation.de 1'invention, le BAD ORIGINAL 3 2017267 69 29890 degré de polymérisation était déterminé par la méthode d'oxydation au périodate. Pour 1'amylose (I) précipité au cours de la réaction, c'est-à-dire avant la concentration de la liqueur, on trouvait des degrés supérieurs à 700 ; 1'amylose (II), précipité 5 à la suite de la concentration de la liqueur, présentait un degré de polymérisation moyen compris entre 100 et 200. La ramification était déterminée selon la méthode de SMITH (J. Am. Chem. Soc. 78 5907» 1956» et Methods in Carbohy-drate Chemistry, V 251, 1965, Academic Press) qui a montré que 10 1'amylose (I) présente une structure en chaînes linéaires, sans ramification, tandis que 1'amylose•(II) présente un coefficient de ramification voisin de 1, ce qui indique la présence d'un petit nombre de ramifications restantes. D'autre part, on trouve aussi une preuve de l'absence de ramifications dans le fait que 15 l'amylose obtenu, saccharifié avec de la @.-amylase, en solution diluée, donne du maltose à 100 %. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 20 Une suspension aqueuse à 5 % d'un amidon de maïs puri fié, riche en amylose, est chauffée à 100° C sous agitation, à pH 6, en vue de la gélatinisation. Elle est ensuite portée à 130° C pour 20 mn, et agitée sous un courant d'azote, pour achever la gélatinisation. On la refroidit ensuite rapidement à 45° C, et 25 son pH est aussitôt ajusté à 4,5» On ajoute alors de l'enzyme du pseudomonas, à raison de 50 unités par gramme d'amidon ; l'en.zyme est un produit purifié par relargage et précipité dans l'alcool. Le milieu, additionné d'enzyme, est maintenu à 45° G, sous agita-30 tion, pendant 1 jour et demi. Pendant ce temps il' se forme un précipité blanc. Après les 36 heures de réaction, 1'amylose précipité est séparé par centrifugation, puis remis en suspension dans la même quantité d'eau tiède et centrifugé à nouveau, pui séché sous vide à la température ambiante. . 35 On obtient ainsi, avec un rendement de 40 %, une première fraction d1amylose (I). La liqueur initiale, séparée du précipité, est concentrée, sous pression réduite, à la moitié.de son volume, et elle est ensuite maintenue pendant 12 heures à une température de 0 à 5° 0 ; le 40 précipité qui se forme est séparé, lavé à l'eau tiède et séché. 69 29890 4 2017267 On obtient ainsi, avec un rendement de 30 %, une seconde fraction d1amylose (II), le rendement étant exprimé par rapport à l'amidon de départ. La détermination du degré de polymérisation, à l'acide périodi-5 que, donne la valeur de 780 pour l'amylose (I) et 130 pour l'amylose (II). La méthode de SMITH indique l'absence complète de ramification dans l1 amylose (I), et une ramification par molécule, en moyenne, pour 1'amylose (II). 10 L'hydrolyse avec de la 0-amylase, à 55° C, sur line solution à 0,5 % et pH 6, pendant 12 heures, conduit à un rendement de 100 % en maltose dans le cas de 1'amylose (I) et 85 % pour l'amylose(rQ EXEMPLE 2 Une suspension identique à celle de l'exemple 1 est 15 gélatinisée de la même façon, sous un courant d'azote ; elle est ensuite refroidie à 60° C et son pH est ajusté à 5»5» après quoi on lui ajoute 50 unités de l'enzyme du Lactobacille par gramme d'amidon. ïout en agitant, on rëfroidit la suspension à 45° C, et on lui ajoute, par gramme d'amidon, 20 unités de pullulanase pro-20 duite de l'Âérobacter. L'enzyme utilisé était relargué au sulfate d'ammonium. Le milieu est maintenu, sous agitation, à 45° C, pendant un total de 40 heures. Le liquide résultant est alors concentré au 1/3 de son volume, 25 sous vide, et il est refroidi à une température de 0 à 5° 0 pendant une nuit. Le précipité formé est remis en suspension dans 3 fois le volume d'eau froide, puis il est séparé par centrifuga-tion et séché sous aération à 40° C. L'amylose est ainsi obtenu avec un rendement de 80 % par rapport 30 à l'amidon sec de départ ; son degré moyen de polymérisation est de 520. EXEMPLE 3 De l'amidon de maïs, riche en amylose, est soigneusement lavé à l'eau et tamisé sous la forme d'une suspension aqueuse à 35 3 % ; il est gélatinisé à 100° C, avec agitation, et la gélatinisation est achevée ensuite par un chauffage de 30 mn sous la près- O sion de 1,5 kg/cm . Le liquide est ensuite refroidi rapidement à 60° G, et le pH est ajusté à 5i5 ; toujours à 60° G on ajoute une solution d'enzyme 30 du Lactobacille relargué, à raison de 50 unités/g d'amidon. 5 2017267 29890 Sous agitation vigoureuse, le tout est refroidi à 4-5° C, pendant 1 heure et demie, pour être ensuite maintenu à cette• même Le précipité formé est centrifugé, lavé avec une faible quantité 5 d'eau, et séché. On obtient ainsi une première fraction d'amylose (I), avec ■un rendement de 43 Le liquide restant est concentré et refroidi, ce qui conduit à une seconde fraction d'amyloàe (II), avec un rendement de 30%. Le degré de polymérisation est de 580 pour I1amylose (I), et de 10 160 pour l'amylose (II). La méthode de SMITH indique l'absence de ramifications dans l'amylose (I), et environ 1 ramification par molécule pour 1'amylose(II) L'hydrolyse avec de la P-amylase de l'amylose (I) conduit à un rendement de 99 % en maltose contre un rendement de 80 % dans le 15 cas de l'amylose (II). On voit donc que c'est un amylose de grande pureté qui a été obtenu ; cela est encore confirmé par l'analyse qui indique une teneur en azote correspondant à moins de 0,1 % de protéine, le résidu de calciaation étant de 0,09 % 20 L'intérêt de l'obtention d'amylose pratiquement exempt d'amylopectine, suivant 1'invention, est illustré par le graphique ci-après qui donne la résistance à la flexion E de l'amylose (Schopper, double pli), en fonction de la teneur en amylopectine. S 1400. 1000. 500. 300. 100. 20 40 60 80 100 % d'amylopectine 69 29890 6 2017267 BB¥B13I0A1!IGMS 1» Procédé pour la préparation d5amylose à poids moléculaire élevé ç par gélatinisation de l'amidon et décomposition subséquente de 1®amylopectine par de l'a-glucosidase-1,6, caractérisé en ce que la gélatinisation a lieu à une température de 100° à i30° C, sous atmosphère inerte lorsqu'elle dépasse 140°C5 à un. pH préféré de 5s5 à 6, et que la solution obtenue est ensuite refroidie à une température de 45° à 55e C, et additionnée d'a-glucosidase-1»6 d'origine bactérienne, le pH du milieu étant alors ajusté à la valeur optimale correspondant à l'enzyme utilisé. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement enzymatique dure un à deux jours à un pH de 4,5 à 6 selon la nature de 1'enzyme« 5» Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que 1'a-glucosidase-1,6 provient d'une bactérie telle qu1Aér obacfcsr, Pseudomonas, Lactobacille ou Escherichia. 4. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le pH préféré est de 6 pour l'enzyme du Lactobacille, et de 4,5 à 5,5 pour celui du Pseudomonas. 5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en c® que 1'amidon traité est un amidon de maïs, de pommes de terre ou de patates douces, riches en amylose, de préférence purifié o 6. Procédé suivant une des revendications *1 à 5* caractérisé en ce que l'amidon utilisé contient moins de 50 % d'amylopectine, et plus particulièrement 20 à 40 %. 7- Procédé suivant une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu©, avant ou après la séparation de la première fraction d'amylose précipité, la liqueur est concentrée et refroidie, en vu© de la précipitation d'une nouvelle fraction d3amylose. 8. Nouveau produit industriel, constitué par de l'amylose eactrait ds- 1'anidon , caractérisé en c© que son degré de polymérisation est d ® environ 500 à 800, et qui ne contient pratiquement pas de ramifications. BAD ORIGINAL