FR 2025062 A1 19700904 FR 6912325 A 19690418 La présente invention concerne la diagnose et la classification du cancer, et plus particulièrement mi procède' nouveau et perfectionné de détection du cancer perinettant d'éviter les biopsies et les analyses chimiques incertaines utilisdes jusqu'à présent. La Demanderesse a établi que l'on peut maintenant mettre :1 profit la présence et la migration de cellules cancéreuses et de leurs anticorps dans le système lymphatique et dans le courant sanguin du patient, en particulier du fait que la Demanderesse a maintenant découvert que les caractéristiques des cellules oancé- reuses individuelles sont uniques en leur genre et que, après leur caractère propre, on peut leur attribuer un point d'origine dans l'organisme. Supposons par exemple que le patient ait un cancer du foie.Des cellules cancéreuses, vivantes ou mortes, vont alors se déplacer en empruntant le courant sanguin jusqu'à des sites de production d'anticorps ; et alors, quel que soit le point du corps d'où le prélèvement sanguin est effectué, le personnel de laboratoire, pourvu qu'il puisse déceler ces anticorps dans le sang, saura alors qu'en fait les cellules dangereuses proviennent du foie. Par un procédé que l'on appellera immuno-fluorescence, on peut mettre l'invention en pratique en prélevant sur le patient un échantillon de sang ; en fournissant une lame d'examen comportant des cellules cancéreuses du foie- ; en faisant réagir une portion du sérum sanguin du patient sur la lame d'essai, en laissant ainsi la gamma-globuline du sang du patient réagir avec ces cellules de l'échantillon d'essai et donc adhérer à ces cellules ; puis en faisant réagir un échantillon de globuline anti-humaine marquée par un colorant fluorescent sur la lame d'essai précitée ; et fi finalement en observant la lame résultante sous un microscope fluorescent. Ainsi, indirectement, et par deux réactions, à savoir (1) la réaction de la gamma-globuline modifiée du patient (c'est-à-dire des anticorps des cellules cancéreuses du foie) sur les cellules des lames d'essai contenant l'antigène, et (2) la réaction de la globuline anti-humaine marquée sur la globuline humaine qui s' ef- fectue à son tour sur la lame d'essai, le personnel de laboratoi- re, en lavant la lame résultante avant l'examen microscopique verra, par la fluorescence observée, que la réaction suspectée, c' est-à-dire la présence d'anticorps réagissant contre le type par ticulier de cancer présent dans le sang du patient, existe bien en fait. Dans le passé, les modes opératoires établis de diagnostic chinique ou sérologique concernant le cancer dans ses divers types ont présenté quelques motifs d'insatisfaction. Le mode opératoire le plus couramment établi de diagnose du cancer sur les diverses portions du corps est un mode opératoire de biopsie, c'est-à-dire de prélèvement d'une petite section de tissu de la zone suspecte. De tels modes opératoires sont plus traumatisants que le simple prélèvement d'un echantillon de sang. Au cours des récentes années des recherches intensives ont été effectuées sl > r l'étiologie et les divers types de cancer0 Beaucoup de travail expérimental a été effectué qui tend à indiquer que dans de nombreux cas le cancer est dû à un virus. Bien entendu, le cancer peut aussi être provoqué par la présence de substances chimiques contre lesquelles l'organisme réagit. En tout cas, la Demanderesse a vérifié, dans certains types de cancer qu'elle a étudiés, la présence d'antigènes ayant l'aspect de sable ou de granules fins à l'observation au microscope, en dif férents endroits de la cellule affectée selon le type de cancer. De tels antigènes produisent dans le courant sanguin des anticorps qui prennent la forme d'une gamma-globuline modifiée. Dtune façon décrite en détail ci-après, on fait réagir cette gamma-globuline modifiée sur des cellules d'essai pour vérifier s'il existe chez le patient le même type de cancer que celui représenté typiquement par les cellules d'essai sur une lame-cible ou lame-témoin. On produit une autre-réaction utilisant une technique d'immuno-fluores cence de façon à pouvoir observer la réaction initiale à laquelle on se fie. La Demanderesse pense que le mode opératoire de diagnostic est très commode, qu'on peut facilement s'y fier et qutil est capable d'une reproduction périodique. Elle pense qu'il s'agit là d'un progrès considérable dans la technique -par rapport aug techniques établies de diagnostic concernant le cancer.Ces procédés antérieurs concernent des procédés d' examen cytologique, des - essais sur frottis, l'essai de phosphatase acide concernant le cancer de la prostate, la détection des protéines dans l'urine,, les frottis de moelle d'os, et les essai à l'aide de radioisotopes.- La présente technique utilisant un procédé d'anticorps fluo- rescent offre de nombreux avantages. En premier lieu, un degré élevé de spécificité et de sensibilité pour révéler la-présence d'une tumeur dangereuse peut maintenant être atteint ; en outre, les colorants fluorescents purs nécessaires sont maintenant très reproductibles et sûrs, enfin, les résultats se sont avéré spécifiques. La Demanderesse pense que son mode opératoire va surclasser la plupart, sinon la totalité des autres modes opératoires, en raison de la mise à disponibilité d'un processus peu coûteux permettant de déceler vraiment et rapidement le type de maladie cancéreuse. lie procédé permet également des dépistages massifs dans la population, par simple examen du sang, pour déceler à un stade précoce des états cancéreux possibles et éventuellement l'origine de ces états. Puisque la gamma-globuline ne peut traverser la membrane cellulaire de cellules vivantes, il est important que les lames d'essai utilisées comportent des cellules cibles qui soient fixées (c' est-à-dire mortes). On sait bien entendu que de nombreuses substances chimiques provoquent le cancer. Cependant, les carcinogènes chimiques se dénombrent maintenant par centaines. Il y a de nombreux insecticides, matières plastiques synthétiques et leurs polymères, produits du pétrole, substances chimiques présèntes dans la fumée de cigarette, hydrocarbures polycycliques dont on sait qu'ils provoquent le cancer. Au cours des récentes années, la relation des virus avec le cancer a fait ltobJet d'une étude progressivement croissante, et lton a passé de façon très complète en revue les effets de virus qui provoquent la leucémie et des tumeurs. li'un des outils récents le plus important utilisé est celui fondé sur l'aptitude des virus à transformer in vitro des cellules normales en cellules cancéreuses ; de telles cellules transformées-, implantées dans des animaux appropriés, vont produire un cancer transplantabLe. En outre, de telles cellules transformées se sont avéré posséder de nouveaux antigènes cellulaires que l'on peut déceler par fixation de complément, par des essais cytotoxiques et des essais dsimmuno-fluores- cence.- il y a lieu de noter qu'avec 11 avènement du micrascope électronique, au cours de ces dernières années, on la decelé des particules du type virus dans certaines cellules cancéreuses. clepen- dant, ces cellules ne donnent pas de virus infectieux et la nature des particules demeure inconnue. Voir le "Journal of Bacteriology", volume 91, pages 1366-1368. Donc, un but principal de la-présente invention est de fournir une technique utilisant une lame-cible ou lame témoin pour la diagnose du cancer et pour déterminer le type de cancer en cause. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de détection du cancer qui est facile à mettre en oeuvre, ne nécessitant pour l'essai qu'un échantillon de sang du patient. Un autre but de l'invention est de fournir une technique de diagnose du cancer dans laquelle, grâce à l'utilisation d'une couche contenant des cellules d'essai dont la nature cancéreuse est connue, et en outre, grâce à l'utilisation d'une technique d'immuno-fluorescence, on peut faire se réaliser une réaction ob servable Un but supplémentaire consiste à utiliser les postulats fondamentaux de l'immunologie et de la production d'anticorps, en association ou combinaison avec la démonstration par la Demanderesse du fait que la production d'anticorps dans le cas du cancer permet de d'identifier le type cancer et le point d'origine du trouble can- céreux, pour effectuer à partir d'un échantillon de sang du patient la diagnose d'un état cancéreux, en signalant non seulement la présence, mais aussi la source des cellules cancéreuses. D'autres buts et avantages de l'invention ressortiront de la description complète et précise de l'invention qui va suivre. Il est bien connu que divers états et diverses substances influent sur les cellules de l'organisme, produisant des substances ou antigènes étrangers dans la structure des cellules individuelles. On travaille beaucoup dans le domaine de la recherche concernant le cancer, et quelques savants ont eu l'idée que certains types de cancers sont provoqués par des virus qui forment des antigènes ou deviennent des antigènes dans les cellules individuelles. L'invention comprend le nouveau concept d'éviter des procédures chirurgicales pour obtenir un échantillon d'une partie infectée et suspecte ; au contraire, il faut simplement disposer d'un échantillon du sang du patient qui, par interaction avec les lamescibles ou lames-témoins ci-des-sus décrites, peut fournir la preuve du type et de la source de la maladie en cause. On notera que l'on produit tout d'abord une série de lamescibles pour essai de diagnostic, l'une comprenant des cellules cancéreuses du foie ; une autre, de cancer du sang ;-une autre de cancer du colon ; une autre encore de cancer du cerveau, de canut des intestins, etcO Ces lames individuelles vont servir à des essais et sont de préférence produites à partir de tissus cancéreux connus selon les enseignements décrits dans la demande de brevet français, dépcsée ce mtme jour par la même Demanderesse et intitulée "Lame à culture de tissu cancéreux et procédé pour sa fabrication". Ainsi, si l'on suppose qu'un patient a un cancer du foie, ou un type particulier de cancer, celui qui appliquera le mode opératoire que l'on va maintenant décrire va choisir la lame d'essai sur laquelle adhère ïe même type de cellules de cancer du foie. Puis on prélève un échantillon de sang du patient, et l'on en obtient le sérum. Une prémisse fondamentale est qu'une maladie provoquant une altération de la composition des cellules va stimuler la production d'anticorps. Dans le cas du cancer l'antigène est identifié comme une matière étrangère présente dans la substance des cellules de la tumeur, par exemple.La production d'anticorps dans le sang crée une immunité qui se manifeste par une modification spéciale de la gamma-globuline présente dans le sang et qui correspond uniquement au cancer spécifique présent ; ainsi, la gamma-globuli- ne d'un patient ayant une maladie particulière, et qui en est ainsi modifiée, devient réactive de façon spécifique, liée à cette immunité, pour combattre la présence de la substance étrangère ayant provoqué la maladie. lie stade suivant consiste à fournir de la globuline antihumaine. il est bien connu que si l'on injecte de la globuline humaine, provenant d'un être humain, à un animal tel qu'une chèvre, un lapin ou un cheval, la globuline de l'animal va se modifier et devenir ce qu'on sait être une globuline anti-humaine. L'animal développe ainsi une immunité contre la globuline humaine, et cette immunité se reflète dans la gamma-globuline anti-humaine qui est produite. Des échantillons de sang prélevés sur l'animal vont donc contenir ce qu'on sait être de la globuline anti-humaine. lie stade suivant consiste à séparer et marquer cette globuline anti-humaine ainsi acquise. Par marquage, on entend l'addi- tion d'un colorant fluorescent comme l'isothiocyanate de fluorescéine ou l'isothiocyanate de sodium ou même la Rhodamine B. Une globuline anti-humaine ainsi marquée est disponible dans le commerce. lie stade suivant consiste à faire réagir sur les cellules cibles de la lame d'essai le sérum sanguin du patient pour une pé riode d'incubation de 30 minutes environ, On lave ensuite la lame. Si le patient est infecté de la même maladie que celle représentée par les cellules-cibles, la gamma-globuline immunisée du patient, mise en présence/la lame-cible, va réagir et donc "coller" aux cellules présentes sur la lame. Cette réaction, cependant, ne peut se déterminer au microscope. Mais en utilisant la gamma-globuline anti-humaine marquée, on peut déterminer cette présence. Donc, on fait réagir ensuite la gamma-globuline anti-humaine marquée, pendant une période d'incubation de 30 minutes environ, avec la lame sur laquelle la gamma-globuline du patient a d'abord été disposées' La gamma-globuline anti-humaine marquée va alors réagir avec la gamma-globuline modifiée "collant" aux cellules de la lame, de sorte que le colorant fluorescent va demeurer sur la lame. On lave ensuite la lame une seconde fois et on l'examine au microscope o La fluorescence du colorant peut s'observer aisément pour indiquer la présence d'une réaction faisant partie dune réaction en deux stades, à savoir une réaction entre la gamma-globu- line anti-humaine marquée et la gamma-globuline modifiée du patient ou celle de la gamma-globuline du patient et les cellules se trouvant sur la lame d'essai. Ce mode opératoire est connu comme une réaction dtimmuno-fluorescence indirecte. Supposons que le patient n'ait pas le type de cancer recherché, c'est-à-dire le même que celui des cellules se trouvant sur la lame. Dans ce cas, lorsqu'on met en contact la gamma-globuline du patient avec la lame, il nty aura pas d'adhérence de la gammaglobuline aux cellules de la lame puisqu'il ne se produira pas de réaction. Par suite, lorsqu'on lave après la lame, il ne restera pas de gamma-globuline du patient adhérant aux cellules de la lame; Par conséquent, lorsqu'on fait passer sur la lame la gamma-globuline anti-humaine marquée, il n'y aura présence d'aucune gammaglobuline humaine sur laquelle puisse adhérer la gamma-globuline marquée. Donc, après le lavage subséquent, il n'y aura pas présence de la gamma-globuline marquée de sorte qu'on ne verra pas de fluorescence sur la lame lavée. La Demanderesse a nettement établi par une expérimentation étendue le fonctionnement satisfaisant de la technique ci-dessus décrite pour l'identification d'au moins un cancer, à savoir le mélanome malin. En outre, des essais initiaux dans le domaine du cancer du foie, des intestins et de Itépendymome, se sont révélés hau tement favorables et positifs à l'égard de la thèse de la présente découverte. L'invention ainsi décrite est, pense-t-on, une contribution fondamentale à l'art de la diagnose du cancer et de l'isolement de la source de tumeur maligne, L'invention peut entre mise en pratique pour la diagnose séparée des cancers du foie, du poumon, du colon, du cerveau, des seins, du col de l'utérus, des ganglions lymphatiques, de la peau, etc. il va de soi que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et qu' elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS lo Procédé de diagnose du cancer, caractérisé par le fait quil comprend des stades de fourniture dune lame d'essai contenant à sa surface des cellules de cancer cible ou témoin d'un type connu, d'obtention du sérum sanguin d'un patient, de réaction de ce sérum sur ces cellules de cancer cible de la lame d'essai, et finalement de réaction d'une globuline anti-humaine marquée sur ces cellules cancéreuses cibles ou témoins. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, après le stade de réaction du sérum du patient sur les cellules du cancer cible de la lame d'essai, il y a un stade supplémentaire consistant à laver la lame d'essai. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, après le stade de réaction finale de la globuline anti-humaine marquée sur les cellules cancéreuses cible, il y a un stade supplémentaire de lavage de la lame d'essai. 4. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que, après le stade de réaction du sérum du patient sur les cellules de cancer cible, il y a un stade supplémentaire de lavage de la lame d'essai, et après le stade de la réaction finale de la globuline anti-humaine marquée sur les cellules de cancer cible, il y a un stade supplémentaire de lavage de la lame d'essai. 5. Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que le stade de réaction de la globuline anti-humaine marquée sur les cellules de cancer cible comprend la réaction d'une gamma-globuline anti-humaine, marquée par un colorant fluorescent, sur ces cellules de cancer cible. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade de réaction de la globuline anti-humaine marquée sur ces cellules de cancer cible comprend la réaction de globuline antihumaine, marquée par un colorant fluorescent, sur ces cellules de cancer cible, et ensuite le procédé comprend le stade supplémentaire d'observation de cette lame d'essai dans un microscope du type à fluorescence. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade de réaction du sérum sur les cellules de cancer cible de la lame dressai s1 effectue pendant une période dtincubation qui dure nominalement 30 minutes. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade de réaotion de la globuline anti-humaine marquée sur les cellules de cancer cible s1 effectue pendant une période dtincuba- tion qui dure nominalement 30 minutes. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction du sérum sur les cellules de cancer et la réaction de la globuline anti-humaine constituent des stades de périodes d'incubation qui durent nominalement 30 minutes chacune. 100 Procédé de diagnose du cancer, caractérisé en ce qutil comprend les stades de fourniture d'une lame d'essai contenant à sa surface des cellules de cancer cible ou témoin de type connu, l'obtention du sérum sanguin d'un patient, la réaction de ce sérum sur les cellules de cancer cible de la lame d'essai et finalement la réaction de gamma-globuline anti-humaine, marquée par un colorant fluorescent, sur ces cellules de cancer cible ou témoin.