Brevet FR3069644A1 (20190201)

REVENDICATIONS1. Méthode pour mesurer l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) introduction, dans un premier contenant : d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) G, d'une source de GDP et/ou d'une source de GTP, d'un premier ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, et d'un second ligand de la protéine Galpha marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, lesdits ligands étant capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha vide ou à la protéine Galpha pleine ; b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et d'une molécule capable de moduler l'activation du RCPG ou (ii) dans le premier contenant, d'une molécule capable de moduler l'activation du RCPG; d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ; e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une augmentation ou une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant une modulation de l'activation du RCPG.\n<CLM>\1\tMéthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) introduction, dans un premier contenant : d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) G, d'une source de GDP et/ou d'une source de GTP, d'un premier ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, et d'un second ligand de la protéine Galpha marqué par un second membre du couple de 36 partenaires de RET, lesdits ligands étant capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha vide ou à la protéine Galpha pleine ; b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; 5 c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à tester ; d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ; e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une augmentation ou une 10 diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant une capacité de la molécule à moduler l'activation du RCPG.\n<CLM>\1\tMéthode pour détecter l'apparition ou la disparition d'une protéine G vide ou d'une protéine G pleine dans une préparation de récepteur couplé à une protéine G (RCPG), 15 ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) introduction, dans un premier contenant : d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) G, - d'une source de GDP et/ou d'une source de GTP, 20 - d'un premier ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, et d'un second ligand de la protéine Galpha marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, lesdits ligands étant capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha vide ou à la protéine 25 Galpha pleine ; b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et d'une molécule capable de moduler l'activation du RCPG ou (ii) dans le premier contenant, d'une molécule capable de moduler l'activation du RCPG; 30 d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ; e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une augmentation ou une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant une apparition ou une disparition de la protéine G vide ou de la protéine G pleine. 37\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle on utilise aux étapes a) et c) une source de GDP et des ligands capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha vide. 5\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle on utilise aux étapes a) et c) une source de GDP et des ligands capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha pleine.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle on utilise 10 aux étapes a) et c) une source de GTP et/ou de GTP non-hydrolysable/lentement hydrolysable et des ligands capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha vide.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle on utilise 15 aux étapes a) et c) une source de GTP et/ou de GTP non-hydrolysable/lentement hydrolysable et des ligands capables de se lier spécifiquement, soit individuellement soit en association, à la protéine Galpha pleine.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle 20 ladite protéine Galpha est choisie parmi la protéine Galphai1, Galphai2, Galphai3, Galphao1, Galphao2, Galphaq, Galpha12, Galphal3, Galphas, Galphaz, Galphat1, Galphat2, Galpha11, Galpha14, Galpha15, Galpha16 et Galphagus, de préférence choisie parmi la protéine Galphai1, Galphai2 et Galphai3. 25\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le premier ligand et le second ligand sont choisis parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le 30 premier ligand est un peptide et le second ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le premier ligand et le second ligand sont des anticorps ou des fragments d'anticorps. 38\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 11, dans laquelle le premier ligand est un peptide de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-His-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Ar g (SEQ ID No:\n<CLM>\1\t(peptide KB1753) et le deuxième ligand est un anticorps anti-Galphai. 5\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 6 à 12, dans laquelle la source de GTP est un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable, de préférence choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS), Gpell-lp et GppCp. 10\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le premier ligand et le second ligand sont chacun marqués par un membre d'un couple de partenaires de RET, l'un des membres du couple étant un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur et l'autre membre du couple étant un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). 15\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 14, dans laquelle le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les 20 proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les 25 allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. 30\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 14, dans laquelle le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase. 39\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 17, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le 5 nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.