Brevet FR3078075A1 (20190823)

REVENDICATIONS1. Méthode d'estimation de la toxicité d'un échantillon aqueux comprenant les 5 étapes successives suivantes : - répartition de différentes fractions de l'échantillon aqueux d'un milieu à tester dans au moins huit cellules de mesure, de préférence au moins dix cellules de mesure, renfermant chacune une souche microbienne unique, non pathogène, lesdites souches microbiennes appartenant à un panel de différentes souches 10 microbiennes présentant des profils de résistance toxicologique décroissants, chaque souche microbienne étant préalablement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (Ind-Rob) vis-à-vis de molécules ou de conditions fréquemment rencontrées dans ledit milieu à tester; 15 - placement des cellules de mesure dans une enceinte thermostatée ; - suivi de l'inhibition de l'activité respiratoire microbienne de chaque fraction d'échantillon pendant une durée donnée, d'au moins 15 minutes, de préférence au moins une heure, le résultat final et/ou les résultats cinétiques relatifs à chaque fraction, fournissant des informations sur l'activité respiratoire des 20 microorganismes, - détermination d'un indice de toxicité globale (Ind-TOX) de l'échantillon aqueux en présence de chaque souche microbienne, en tenant compte des indices de robustesse de chacune des souches. 25\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque cellule de mesure est préparée selon les étapes successives suivantes : - isolement et culture de la souche microbienne sélectionnée, et mise en place de celle-ci dans ladite cellule, - conditionnement dans ladite cellule avec ajout d'un agent protecteur de la 30 souche microbienne vis-à-vis de la lyophilisation, - puis lyophilisation de la souche microbienne et conservation. 15\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la phase de lyophilisation est précédée d'une phase de congélation dans une gamme de température allant de -20°C à -80°C, la lyophilisation ayant lieu à une température inférieure à -40°C sous une pression inférieure à 0,10 mbar.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le suivi de l'activité métabolique des microorganismes est effectué au moyen d'un capteur d'oxygène, redox ou de pH présent dans la cellule de mesure.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'un marqueur de l'activité métabolique des bactéries, tel qu'un marqueur fluorescent et/ou coloré de l'activité respiratoire des dits microorganismes est ajouté dans chaque cellule de mesure, le suivi de l'activité respiratoire desdits microorganismes étant effectué par spectrophotométrie.\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le marqueur de l'activité métabolique des bactéries est la résazurine.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les différentes souches microbiennes sélectionnées, notamment pour une évaluation de toxicité d'un échantillon d'effluent d'eaux usées urbaines ou industrielles ou d'eaux naturelles, font partie d'un panel de souches bactériennes choisies parmi : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Enterobacter helveticus, Proteus mira buis, Budvicia aquatica, Zoo gloea resiniphila, Rhizobium radiobacter, Thauera linaloolentis, Bosea vertrisii, Comamonas testosteroni, Comamonas denitrificans, Arthrobacter aurescens, Staphylococcus sp, Acinetobacter towneri, Rhodococcus rhodochrous, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Variovorax paradoxus, Staphylococcus auricularis, Sphingobium yanoikuyae, Cupriavidus necator, Paracoccus denitrificans, Bacillus subtilis subtilis, Paracoccus pantotrophus, Bacillus funiculus, Bacillus 16 mycoides, classées par ordre décroissant de résistance à la toxicité.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les résultats individuels des mesures d'activité 5 métabolique tels que les cinétiques d'activité respiratoire de chacune des souches, par rapport à un témoin, sont exprimés en taux d'inhibition (Tx_Inh) de ladite souche, et lesdits résultats individuels sont regroupés en donnant une empreinte toxicologique de l'échantillon. 10\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque souche microbienne étant initialement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (allant de 0 à 1), un indice toxicologique global de l'échantillon est calculé selon la formule (I) suivante : r1(Ind Rob, xTx_Inh ) IndTOX = 15 ri_i(Ind_Rohn) (I) avec X: nombre de souches microbiennes testées Ind TOX: Indice de toxicité globale Ind Robn: Indice de robustesse de la souche n 20 Tx_Inhn: Taux d'inhibition de la souche n\n<CLM>\1\tKit pour réaliser l'évaluation de la toxicité d'un échantillon aqueux, ledit kit comprenant : - au moins huit cellules de mesure, de préférence dix cellules de mesure, 25 chacune renfermant une souche microbienne unique, non pathogène, et lyophilisée en présence d'un agent de protection, - de préférence une cellule de mesure témoin pour l'échantillon et une cellule de mesure témoin par souche microbienne, - un marqueur d'activité métabolique desdites bactéries, tel qu'un marqueur 30 fluorescent et/ou coloré, et 17 - une notice détaillée de mise en oeuvre de la méthode conforme à l'une des revendications précédentes.\n<CLM>\1\tKit selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules de mesure 5 sont des flacons en verre, fermés, de préférence sous la forme de tubes individuels ou agencés en microplaques.\n<CLM>\1\tUtilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour l'estimation de la toxicité d'un effluent d'eaux usées urbaines, d'effluent de 10 l'agro-alimentaire ou de l'industrie, d'eaux pluviales, d'eaux de ruissellement, d'eaux de surface ou souterraine, ou d'eaux marines.\n<CLM>\1\tUtilisation selon la revendication 12, pour le suivi de filières de traitement ou d'épuration, ou une surveillance environnementale. 15