Brevet FR3074812A1 (20190614)

REVENDICATIONS1. Méthode de criblage d'une séquence de conditions de culture d'intérêt pour l'obtention d'une caractéristique d'intérêt, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : (a) la fourniture d'une pluralité de capsules, chacune desdites capsules comprenant : - un coeur comprenant une phase interne comprenant au moins une cellule vivante, ladite cellule vivante n'étant pas une cellule souche embryonnaire humaine obtenue par destruction d'un embryon ; et - une enveloppe comprenant une phase externe, encapsulant totalement le coeur à sa périphérie ; (b) la séparation aléatoire de la pluralité de capsules fournie à l'étape (a) en une pluralité de sous-ensembles, (c) la culture de la pluralité de sous-ensembles de capsules dans une pluralité de conditions de culture différentes, lesdits sous-ensembles de capsules étant cultivés dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture externe comprenant un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes, lesdites capsules étant cultivées pendant une période appropriée pour permettre auxdits marqueurs de s'adsorber sur lesdites capsules, (d) la récupération et le regroupement de la pluralité de sous-ensembles de capsules suivis de la séparation aléatoire de la pluralité de capsules ainsi regroupées en une pluralité de nouveaux sous-ensembles, (e) la culture de la pluralité de nouveaux sous-ensembles de capsules dans une pluralité de conditions de culture différentes, lesdits nouveaux sous-ensembles de capsules étant cultivés dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture externe comprenant un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes, lesdites capsules étant cultivées pendant une période appropriée pour permettre auxdits marqueurs de s'adsorber sur lesdites capsules, (f) optionnellement, la répétition des étapes (b) à (e) de manière itérative, (g) l'identification et la sélection, au sein de la pluralité de capsules, de capsules d'intérêt présentant, suite à la mise en oeuvre des étapes (b) à (f), au moins une caractéristique d'intérêt, et (h) l'identification de la ou des séquence(s) de conditions de culture à(aux) laquelle(s) les capsules d'intérêt identifiées à l'étape (g) ont été exposées, au moyen des 37 marqueurs adsorbés sur lesdites capsules, la(les)dite(s) séquence(s) de conditions de culture ainsi identifiées étant une (des) séquence(s) de conditions de culture d'intérêt pour l'obtention de ladite caractéristique d'intérêt. 5\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon la revendication 1, dans laquelle l'enveloppe comprend au moins un polyélectrolyte à l'état gélifié, de préférence le polyélectrolyte étant un polyélectrolyte réactif aux ions multivalents, en particulier un alginate.\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque la revendication 1 ou 2, dans laquelle la 10 cellule vivante est sélectionnée dans le groupe constitué des cellules procaryotes, telles que des bactéries ; des archées ; des cellules eucaryotes en particulier choisies parmi des cellules animales, en particulier les cellules de mammifères, les cellules souches et les cellules d'insectes, des cellules végétales, des levures ou des champignons ; et leurs mélanges. 15\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la cellule vivante est une cellule non-adhérente en suspension dans la phase interne de la capsule. 20\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la cellule vivante est une cellule adhérente.\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le coeur des capsules est monophasique, ou comporte une goutte intermédiaire d'une phase 25 intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de la phase externe, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d'une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire, les cellules vivantes étant présentes dans la phase interne et/ou la phase intermédiaire. 30\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le marqueur est une particule colloïdale de polymère ou de silice encapsulant ou sur laquelle est greffé un fluorophore ou un oligonucléotide, ou des protéines marquées ou étiquetées avec un tag détectable. 35\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le marqueur est sélectionné dans le groupe constitué de billes magnétiques à la surface 38 desquelles sont greffées des sondes d'ADN ou des sondes d'ARN, de fluorophores encapsulés dans des véhicules de polymère ou de silice, de quantum dots, et des protéines marquées ou étiquetées avec un « tag » détectable. 5\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la caractéristique d'intérêt est choisie parmi l'expression d'une molécule d'intérêt par les cellules vivantes présentes dans la capsule, un niveau de biomasse d'intérêt présent dans la capsule, la présence dans la capsule d'une cellule ou d'un ensemble de cellules présentant une morphologie d'intérêt et la présence dans la capsule de cellules 10 présentant une fonction d'intérêt.\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, comprenant une étape pré-(a) de préparation des capsules fournies à l'étape (a) comprenant les sous-étapes suivantes : 15 (il) ) la mise en contact d'une première solution comprenant au moins une cellule vivante et d'une deuxième solution liquide comprenant au moins un polyélectrolyte à l'état liquide, (iii) la formation d'une goutte double comprenant une phase interne formée de la première solution et une phase externe liquide formée de la deuxième 20 solution liquide, ou (i2) la mise en contact d'une première solution et d'une deuxième solution, au moins une solution parmi les première et deuxième solutions comprenant au moins une cellule vivante, et d'une troisième solution liquide comprenant au moins 25 un polyélectrolyte à l'état liquide, (ii2) la formation d'une goutte triple comprenant une phase interne formée de la première solution, d'une phase intermédiaire formée de la deuxième solution et une phase externe liquide formée de la troisième solution liquide, 30 (iii) l'immersion de la goutte double ou de la goutte triple dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de la phase externe liquide, ce par quoi on obtient la phase externe gélifiée, et (iv) la récupération des capsules formées. 35\n<CLM>\1\tMéthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le(s) marqueur(s) est/sont adsorbé(s) sur l'enveloppe des capsules au moyen de liaison 39 faibles, de préférences électrostatiques, optionnellement au moyen d'un intermédiaire, par exemple figuré par au moins un polymère chargé positivement, notamment la polylysine.