Brevet FR3075224A1 (20190621)

REVENDICATIONS1. Methode de diagnostic in vitro de la presence d'une vaginose bacterienne chez une patiente, caracterisee en ce qu'on determine la presence d'une vaginose bacterienne si I'on detecte la presence d'une 5 archaea methanogene de l'espece Methanobrevibacter smithii dans un echantillon de prelevement de secretion vaginale de la dite patiente par detection de Ia presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii contenue dans l'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretion 10 vaginale de la dite patiente.\n<CLM>\1\tMethode selon la revendication 1 caracterise en ce qu'on determine Ia presence de Methanobrevibacter smithii en detectant la presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smith,' presente en une seule 15 copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smith'', ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii presentant une taille inferieure a 150 nucleotides.\n<CLM>\1\tMethode selon la revendication 1 ou 2 caracterisee en ce qu'on realise les etapes suivantes : 20 a) on effectue ('amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii dans I'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretion vaginale, b) on effectue Ia detection de fragments amplifies de ladite 25 sequence specifique de Methanobrevibacter smithii de preference par sequencage, par electrophorese sur gel d'agarose ou a ('aide de sondes marquees specifiques de la dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii de sequences distinctes de celles des dites amorces d'amplification, et 39 c) on determine la presence d'une vaginose bacterienne si la concentration de fragments d'ADN de Ia dite sequence specifique de Methanobrevibacter smithfi dans ledit echantillon de prelevement de secretions vaginales est superieure ou egale a 101 copies/mL.\n<CLM>\1\tMethode selon la revendication 2 ou 3 caracterise en ce qu'on realise des reactions d'amplification et de quantification d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'ADN extrait de l'echantillon a tester, de preference une sequence specifique de i'albumine humaine.\n<CLM>\1\tMethode selon ('une des revendications 2 a 4 caracterisee en ce 10 que ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithfi comprend ou est tiree d'un des fragments suivants : - le fragment des positions 334632 a 334687 du gene ARN 16S ribosomal de reference GenBank NC 009515.1 ; 15 - le fragment des positions 1734995 a 1735069 du gene mcrA de Ia proteine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides amines et de 16,942 Da de reference GenBank AAW80308.1 ; - le fragment des positions 876305 a 876370 du gene rpoB de la proteine RNA polymerase subunit B de M. smithfi de 186 acides amines et 20 de 20,836 Da de reference GenBank ABYV02000000.\n<CLM>\1\tMethode selon la revendication 4, caracterisee en ce que ladite sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester comprend le fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gene de l'albumine humaine de reference Genebank M12523.1. 25\n<CLM>\1\tMethode selon ('une des revendications 2 a 6 caracterise en ce qu'on met en oeuvre les etapes suivantes dans lesquelles : a) on realise une extraction de l'ADN total contenu dans l'echantillon de prelevement de secretion vaginale par une methode apte a ('extraction de l'ADN des archaea methanogenes, et 40 b) on realise une reaction d'amplification enzymatique de type PCR de I'ADN d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, dans I'ADN extrait desdits echantillons a tester, a l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte amplifier ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, e,t c) on verifie si les amplifiats eventuels de I'ADN extrait desdits echantillons a tester, comprennent une dite sequence specifique a l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une sequence specifique de ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii et encadree par les sequences des dites amorces.\n<CLM>\1\tMethode selon la revendication 7 caracterise en ce qu'on realise des reactions de co-amplification et de quantification en mettant en oeuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse specifiques respectivement d'une part de ladite sequence specifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester, de preference une sequence specifique de l'albumine humaine, et ladite sequence specifique de l'albumine humaine comprenant une sequence de dite sonde encadree par des sequences aptes a servir comme de dites amorces dans une reaction d'amplification du type PCR de ladite sequence specifique de l'albumine humaine.\n<CLM>\1\tMethode selon l'une des revendications 1 a 8, caracterise en ce qu'on determine la presence d'une vaginose bacterienne si, dans I'ADN 25 extrait d'un echantillon de secretion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectees : a) Ia concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est superieure ou egale a 101 copies/ml, et b) Ia concentration Cm en dit fragment d'ADN specifique de 30 Methanobrevibacter smithii est superieure ou egale a 10' copies/mL. 41\n<CLM>\1\tMethode selon l'une des revendication 3 a 9 caracterise en ce qu'on realise une methode d'extraction de l'ADN total contenu dans le prelevennent de secretion vaginale incluant ('extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithll dans laquelle on realise les etapes suivantes : 5\n<CLM>\1\ton effectue Ia sonication de l'echantillon de secretion vaginale, et\n<CLM>\1\ton effectue une lyse enzymatique dans le dit echantillon.\n<CLM>\1\tMethode selon l'une des revendication 3 a 10 caracterise en ce que ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene 10 Methanobrevibacter smithll est choisie parmi les sequences suivantes incluant des sequences sondes (soulignees) encadrees par des sequences amorces (en gras) ou leurs sequences reverses et complementaires pour les amorces anti-sens: - pour Ia sequence 16S ARNr ; SEQ.ID. n°2 = 15 5'CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' ; - pour Ia sequence du gene mcrA ; SEQ.ID.n°3 = 5'- GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAA CAMCATGGACACWGTCCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA-3' ; et 20 - pour la sequence rpoB ; SEQ.ID. n°4 = 5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3'.\n<CLM>\1\tMethode selon l'une des revendications 8 a 11 caracterise en ce que ladite sequence de I'exon 12 du gene de l'albumine humaine 25 specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester comprend la sequence du listage de sequence suivante ou la sequence complementaire: 42 SEQ.ID. n°1 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG TAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3'\n<CLM>\1\tMethode selon rune des revendications 11 a 12 caracterise en 5 ce qu'on met en oeuvre les jeux d'amorces et de preference de sondes choisis le cas echeant parmi les sequences suivantes du listage de sequence annexe a Ia presente description, ou respectivement leurs sequences complementaires : - Pour le gene 16S ARNr : 10 Amorce 5': SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3' Amorce 3': SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' Sonde: SEQ.ID. n°7 = 5'- CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3' - Pour le gene mcrA : Amorce 5':SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3' 15 Amorce 3':SEQ.ID.n°9 =5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3' - Pour le gene rpoB : Amorce 5':SEQ.ID.n°11=5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3' Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3' 20 Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3' - Pour I'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Amorce 3':SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'\n<CLM>\1\tTrousse de diagnostic pour Ia mise en oeuvre d'une methode de diagnostic selon rune des revendications 1 a 13, caracterisee en ce qu'elle comprend au moins : 43 - des reactifs permettant ('extraction de l'ADN total contenu dans un echantillon de prelevement de secretion vaginale incluant l'ADN de Methanobrevibacter smithii, ainsi que - un jeu d'amorces specifiques d'au moins une sequence d'ADN 5 specifiques de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll et de preference, au moins une sonde specifique de la dite sequence specifiques de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, et - des reactifs de mise en oeuvre d'une reaction d'amplification d'ADN de type PCR. 10\n<CLM>\1\tTrousse de diagnostic selon la revendication 14 comprenant : - au moins un jeu d'amorces et de sondes de sequences choisies parmi les 3 jeux de sequences SEQ.ID.n°5 a 7, SEQ.ID.n°8 a 10 et SEQ.ID. n°11 h13, et - au moins un jeu d'amorces et de sonde de sequences SEQ.ID.n°14 15 616.