Brevet FR3073050A1 (20190503)

REVENDICATIONS1. Procédé de microscopie à fluorescence à super-résolution comprenant les étapes suivante : a) éclairer un échantillon (E) contenant des émetteurs fluorescents photoconvertibles au moyen d'un premier faisceau lumineux (FL1) à une première longueur d'onde et d'un deuxième faisceau lumineux (FL2) à une deuxième longueur d'onde, la première longueur d'onde étant choisie de manière à activer lesdits émetteurs fluorescents en provoquant leur 0 conversion d'un premier état vers un deuxième état différent du premier, la deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente (FLF) des émetteurs fluorescents dans leur deuxième état ; et b) acquérir une séquence d'images (IM) de ladite émission 15 fluorescente au moyen d'un système d'imagerie (SI) comprenant un capteur d'images matriciel (CIM) ; caractérisé en ce que : - ledit deuxième faisceau lumineux est pulsé, l'intervalle temporel entre deux impulsions successives étant supérieur au temps de vie 2 0 de fluorescence des émetteurs fluorescents; - et en ce qu'il comprend également une étape de comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards d'arrivée desdits photons par rapport aux impulsions (IL2) dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale 25 permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; et - en ce que l'intensité du premier faisceau lumineux est choisie de telle sorte que, pendant le temps d'acquisition d'une dite image, un émetteur fluorescent individuel (EFI) au plus soit activé en moyenne dans une 3 0 région de l'échantillon correspondant à un dit ensemble de pixels du capteur d'images matriciel. 19\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 dans lequel ladite étape de comptage de photons comprend : c) diriger une portion de ladite émission fluorescente vers un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP), ledit ou 5 chaque détecteur de la matrice (DCP) étant associé à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; et d) utiliser le ou les détecteurs à comptage de photons pour mesurer des retards d'arrivée (Mi, Ott) de photons de fluorescence par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 2 comprenant également les étapes suivantes : e) utiliser la séquence d'images acquise lors de l'étape b) pour construire une image à super-résolution en localisant lesdits émetteurs 15 fluorescents individuels ; f) utiliser les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour calculer des temps de vie de fluorescence, et les associer aux émetteurs fluorescents individuels localisés lors de l'étape e) ; 20 les étapes e) et f) étant mises en oeuvre au moyen d'un processeur électronique (PR).\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 3 dans lequel ladite étape e) comprend une localisation desdits émetteurs fluorescents individuels par 25 estimation des centres de tâches de diffraction (TD) présents dans les images acquises lors de l'étape b).\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 3 ou 4 comprenant également une étape g) de corrélation spatio-temporelle entre les 30 images acquises lors de l'étape ID} et les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour associer lesdites durées de vie de fluorescence auxdits émetteurs fluorescents individuels. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 2 à 5 dans lequel ladite matrice de détecteurs à comptage de photons comprend une pluralité de dits détecteurs (DCP) agencés suivant une pluralité de lignes et de 5 colonnes.\n<CLM>\1\tAppareil de microscopie à fluorescence à super-résolution comprenant : - une première source de lumière (SL1) adaptée pour 10 émettre un premier faisceau lumineux (FL1) à une première longueur d'onde, ladite première longueur d'onde étant choisie de manière à activer des émetteurs fluorescents en provoquant leur conversion d'un premier état vers un deuxième état différent du premier ; - une deuxième source de lumière (SL2) adaptée pour 15 émettre un deuxième faisceau lumineux (FL2) à une deuxième longueur d'onde, différente de la première, ladite deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente des émetteurs fluorescents dans leur deuxième état ; - un système optique (MD1, L1, MD2, OBJ) configuré pour 20 diriger le premier et le deuxième faisceau lumineux vers un échantillon (E) ; - un système de détection optique (SI, SCP) configuré pour acquérir une séquence d'images (IM) de fluorescence dudit échantillon ; caractérisé en ce que : - ladite deuxième source de lumière est une source pulsée, 25 l'intervalle temporel entre deux impulsions successives de cette source étant supérieur au temps de vie de fluorescence des émetteurs fluorescents ; et en ce que le système de détection optique est également configuré pour effectuer un comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards d'arrivée (At1, At2) desdits photons par rapport aux impulsions 30 (IL2) dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel. 21\n<CLM>\1\tAppareil selon la revendication 7 dans lequel le système de détection optique comprend : - un système d'imagerie (SI) configuré pour acquérir ladite 5 séquence d'images de fluorescence dudit échantillon ; - un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP) agencé de manière à recevoir une portion d'une émission fluorescente dudit échantillon, ledit ou chaque détecteur (DCP) de la matrice étant associé audit ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images 10 matriciel ; et - un circuit électronique (CMR) associé audit détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons, configuré pour mesurer des retards d'arrivée de photons arrivant sur ledit ou chaque dit détecteur par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux.\n<CLM>\1\tAppareil selon la revendication 8 comprenant également un processeur électronique (PR) configuré pour : - recevoir en entrée la séquence d'images de fluorescence acquise par ledit capteur d'images matriciel et l'utiliser pour construire une 20 image à super-résolution en localisant, dans les images de la séquence, des émetteurs fluorescents individuels ; - recevoir en entrée des mesures de retard obtenues par ledit circuit électronique et les utiliser pour calculer des durées de vie de fluorescence ; et 25 - associer lesdites durées de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés.\n<CLM>\1\tAppareil selon la revendication 9 dans lequel ledit processeur électronique est configuré pour localiser lesdits émetteurs 30 fluorescents individuels par estimation des centres de tâches de diffraction (TD) présents dans les images acquises par ledit capteur d'images matriciel. 22\n<CLM>\1\tAppareil selon l'une des revendications 9 ou 10 dans lequel ledit processeur électronique est configuré pour associer lesdits temps de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés en effectuant une corrélation spatio-temporelle entre les images acquises par 5 ledit capteur d'images matriciel et les mesures de retard obtenues par ledit circuit électronique.\n<CLM>\1\tAppareil selon l'une des revendications 9 à 11 dans lequel ledit ou lesdits détecteurs à comptage de photons sont des diodes à 10 avalanche à photons individuels.\n<CLM>\1\tAppareil selon l'une des revendications 9 à 12 comprenant une dite matrice de détecteurs à comptage de photons. 15\n<CLM>\1\tAppareil selon la revendication 13 dans lequel ladite matrice de détecteurs à comptage de photons est une matrice de diodes à avalanche à photons individuels non contigus, l'appareil comprenant également une matrice de microlentilles convergentes (MML) contiguës comprenant une dite microlentille agencée en regard de chaque diode à avalanche à photons individuels de la matrice, chaque dite microlentille étant optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel.\n<CLM>\1\tAppareil selon l'une des revendications 9 à 12 comprenant une pluralité de dits détecteurs à comptage de photons (DCP), l'appareil comprenant également un faisceau de fibres optiques (FF) agencé de telle façon qu'une première face d'extrémité de chaque fibre optique soit optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel, un dit détecteur à comptage de photons étant agencé en regard d'une deuxième face d'extrémité de chaque dite fibre optique. 23\n<CLM>\1\tProduit programme d'ordinateur comprenant des instructions exécutables par un ordinateur pour, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur : - recevoir en entrée une séquence d'images (IM) 5 d'émission fluorescente d'un échantillon (E) contenant des émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels, acquise au moyen d'un système d'imagerie (SI) comprenant un capteur d'images matriciel (CIM) ; - recevoir en entrée des retards d'arrivée (Ati, At2) de photons de ladite émission fluorescente par rapport à des impulsions d'un 0 faisceau lumineux pulsé, lesdits photons étant détectés par un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP), ledit ou chaque détecteur de la matrice (DCP) étant associé à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; - utiliser ladite séquence d'images pour construire une 15 image à super-résolution de l'échantillon en localisant lesdits émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels ; et - utiliser les retards d'arrivé des photons de ladite émission fluorescente pour calculer des temps de vie de fluorescence et les associer auxdits émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels. 20