Brevet FR3072972A1 (20190503)

REVENDICATIONS1. Procédé de préparation in vitro d'un équivalent de papille dermique comprenant au moins une étape de mise en culture de fibroblastes issus de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive sur un support comprenant un milieu de culture nutritif B exempt de sérum pendant une période de temps suffisante pour permettre auxdits fibroblastes de se détacher dudit support et de se regrouper pour former au moins un sphéroïde ; la surface dudit support utilisé ne permettant pas l'adhésion des cellules.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 dans lequel ledit milieu de culture nutritif comprend de 500 à 1500 mg/L, d'acides aminés, de 2 à 18 mg/L de vitamines, de 1500 à 4500 mg/L de glucose, de 8750 à 10000 mg/L de sels inorganiques, de 2 à20 }tg/mi d'insuline, de 2 à 20 ng/ml d'hydrocortisone, et éventuellement de 0,2% à 2% en volume d'antibiotiques et/ou d'antimycotiques. 15-\n<CLM>\1\tProcédé. selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lesdits fibroblastes sont cultivés pendant au moins 3 jours, de préférence pendant au moins 4 jours, encore mieux entre 4 et 21 jours. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel la surface dudit support est neutre et hydrophobe. 5.. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel lesdits fibroblastes sont ensemencés en Un nombre d'au moins 6000 cellules/cm2, de'préférence d'au. moins 25 14000 cellules/cW, et encore mieux en un nombre compris, entre 23800 et. 47600 cellules/em2-. 6, Procédé selon l'une. quelconque des revendications 1 à 5 comprenant en outre préalablement à l'étape de .mise en culture desdits fibroblastes les étapes préliminaires 30 suivantes : a. isoler un follicule pileux en phase anagène à. partir d'un prélèvement de scalp ; b. récupérer les fibroblastes de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive à l'aide d'une microdissection de la papille dermique et/ou -de la gaine conjonctive ; 26 c. effectuer une amplification desdits fibroblastes de la papille dermique et/ou de la gaine conjonctive dans un milieu de culture nutritif A constitué de DMEM Glutamax, de 20% en volume de sérum foetal de veau (SVF), 1% en volume d'acides aminés non essentiels, et éventuellement 1% en volume d'antibiotiques 5 et/ou d' antimycotique.\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de papille dermique susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à\n<CLM>\1\t10\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de papille dermique selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'il présente une activité phosphatase alcaline positive.\n<CLM>\1\tUtilisation d'un équivalent in vitro de papille dermique selon l'une quelconque des revendications 7 à 8 et de cellules épithéliales prolifératives pour la préparation d'un équivalent in vitro de follicule pileux.\n<CLM>\1\tProcédé de préparation in vitro d'un équivalent de follicule pileux comprenant au moins une étape de culture de cellules épithéliales prolifératives en présence d'au moins un équivalent de papille dermique tel que défini selon la revendication 7 ou 8 pendant une période de temps suffisante pour permettre une différenciation desdites cellules épithéliales prolifératives en kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 10, dans lequel les cellules épithéliales prolifératives sont ensemencées en un nombre d'au moins 2000 cellules/cm2, de préférence d'au moins 6000 cellules/cm2, et encore mieux en un nombre compris entre 6000 et 10000 cellules/cm2 .\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel les cellules épithéliales prolifératives sont cultivées pendant au moins 3 jours, de préférence pendant au moins 5 jours, encore mieux entre 5 et 20 jours.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 comprenant en outre une étape préliminaire d'amplification desdites cellules épithéliales prolifératives en présence d'une quantité efficace d'un inhibiteur de ROCK. 27\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de follicule pileux susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 -à\n<CLM>\1\t15. Equivalent in vitro de follicule pileux selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il 5 est constitué d'un équivalent de papille dermique présentant une activité phosphatase alcaline positive et de kératinocytes positifs pour les marqueurs K85 et K35.\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de follicule pileux selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il présente une structure tubulaire pleine de diamètre allant de 100 à 250gm, et de 10 longueur allant'de 500 à 2500gm.\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de follicule pileux' selon l'une des revendications 14 à 16 pour son utilisation dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'un état de pilosité réduite. 15\n<CLM>\1\tEquivalent in vitro de follicule pileux selon l'une des revendications 14 à 16 pour son utilisation dans le traitement de l'alopécie.\n<CLM>\1\tUtilisation d'un équivalent in vitro de-. follicule pileux selon l'une des revendications 14 20 à 16 pour l'identification de composés modulateurs de la pousse des poils et/ou des cheveux.\n<CLM>\1\tProcédé de criblage d'au moins un composé modulateur de la pousse des poils et/ou des 25 cheveux comprenant une étape (a) de mise en contact dudit composé à. tester avec un équivalent in vitro de follicule pileux selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit composé sur au moins un paramètre de l'équivalent in vitro de follicule pileux et une étape (c) de sélection dudit composé modifiant ledit paramètre.