Brevet FR3068989A1 (20190118)

REVENDICATIONS1- Enzyme PTE mutée de séquence SEQ ID : 2, dérivée de la parathion hydiolase ayant la séquence SEQ ID NO: 1, laquelle enzyme PTE mutée présente au moins 90% d'identité avec la SEQ ID NO : 1 et contient au moins les 7 mutations suivantes par rapport à la séquence SEQ ID NO: 1: - Substitution de la thréonine T par la proline P, en position 13, - Substitution de l'isoleucine I par la valine V, en position 14, Substitution de l'alanine A par la sérine S, en position 60, - Substitution de la sérine S par l'arginine R, en position 79, - Substitution de la tyrosine Y par l'histidine H, en position 124, - Substitution de l'isoleucine I par la valine V, en position 218, - Substitution de la glutamine Q par l'arginine R, en position 258, et enzyme mutée présentant un pourcentage d'identité d'au moins 90 % avec la susdite séquence SEQ ID NO: 2, sous réserve de la présence des 7 susdites mutations dans ladite séquence de l'enzyme mutée. 2- Enzyme PTE mutée selon la revendication 1, dans laquelle au moins 2 acides aminés choisis parmi les acides aminés occupant les positions suivantes sont mutés : - Acide aminé en position 45, Acide aminé en position 48, Acide aminé en position 74, Acide aminé en position 100, - Acide aminé en position 141, Acide aminé en position 153, Acide aminé en position 177, - Acide aminé en position 201, Acide aminé en position 222, Acide aminé en position 225, 28 Acide aminé en position 235, - Acide aminé en position 238, - Acide aminé en position 239, - Acide aminé en position 240, - Acide aminé en position 242, Acide aminé en position 271, Acide aminé en position 276, Acide aminé en position 277, - Acide aminé en position 287, Acide aminé en position 310, les positions étant définies par rapport à la séquence SED ID NO : 1, en particulier dans laquelle les mutations aux susdites positions sont choisies parmi la liste suivante : - En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, - En position 48: substitution de l'alanine A par la valine V ou la méthionine M, En position 74 : substitution de l'isoleucine I par la cystéine C ou l'alanine A, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E ou la valine V, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, - En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, - En position 177: substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, - En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G ou la glutamine Q, En position 225 : substitution de l'histidine H par la tyrosine Y, - En position 235 : substitution de la serine S par la méthionine M, En position 238 : substitution de la l'alanine A par la valine V ou la sérine S, En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, En position 240 : substitution de la leucine L par la méthionine M, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, En position 271 : substitution de la leucine L par la thréonine T, En position 276 : substitution de la serine S par la leucine L, En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, 29 : En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S, - En position 310 : substitution de la praline P par la sérine S. 3- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 2 mutations, en position 225 et\n<CLM>\1\t4- Enzyme PTE mutée selon la revendication 2, de séquence SED ID NO: 3, dans laquelle les au moins 2 mutations sont les suivantes : - En position 225 : substitution de l'histidine H par la tyrosine Y, - En position 271 : substitution de la leucine L par la thréonine T. 5- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 8 mutations, en position 74, 100, 222, 225, 238, 240, 242 et 276, en particulier de séquence ID NO : 4 dans laquelle les au moins 8 mutations sont les suivantes : En position 74 : substitution de l'isoleucine I par la cystéine, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par la valine V, En position 222 : substitution de l'histidine H par la gluta mine Q, - En position 225 : substitution de l'histidine H par la tyrosine Y, - En position 238 : substitution de l'alanine A par la valine V, En position 240: substitution de la leucine L par la méthionine M, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, En position 276 : substitution de la sérine S par la leucine L. 6- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 9 mutations, en position 45, 48, 100, 141, 153, 222, 242, 287 et 310, en particulier de séquence ID NO : 5 dans laquelle les au moins 9 mutations sont les suivantes : 30 En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la valine V, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, - En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, - En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S, En position 310 : substitution de la proline P par la sérine S. 7- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 11 mutations, en position 45, 48, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 242, 277 et 287, en particulier de séquence SED ID NO : 6, dans laquelle les au moins 11 mutations sont les suivantes : En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la valine V, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, - En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, - En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, - En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, - En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 8- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 12 mutations, en position 45, 48, 74, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 242, 277 et 287 en particulier de séquence SED ID NO : 7, dans laquelle les au moins 12 mutations sont les suivantes : 31 _ En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la valine V, En position 74 : substitution de l'isoleucine I par l'alanine A, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, - En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, - En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, - En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, - En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 9- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 13 mutations, en position 45, 48, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 238, 239, 242, 277 et 287 en particulier de séquence SED ID NO: 8, dans laquelle les au moins 13 mutations sont les suivantes : En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substi-tution de l'alanine A par la méthionine M, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, - En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, - En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, En position 238 : substitution de l'alanine A par la sérine S, - En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, - En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, - En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, - En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 32 10- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 14 mutations, en position 45, 48, 74, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 238, 239, 242, 277 et 287 en particulier de séquence SED ID NO : 9, dans laquelle les au moins 14 mutations sont les suivantes : - En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, - En position 48 : substitution de l'alanine A par la méthionine M, En position 74 : substitution de l'isoleucine I par l'alanine A, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, - En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, - En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, - En position 238 : substitution de l'alanine A par la sérine S, En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, - En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, - En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 11- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 14 mutations, en position 45, 48, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 235, 238, 239, 242, 277 et 287 en particulier de séquence SED ID NO: 10, dans laquelle les au moins 14 mutations sont les suivantes : En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la méthionine M, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, - En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, - En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, 33 - En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, - En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, - En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, - En position 235 : substitution de la sérine S par la méthionine M, - En position 238 : substitution de l'alanine A par la sérine S, En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, - En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 12- Enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, possédant au moins 15 mutations, en position 45, 48, 74, 100, 141, 153, 177, 201, 222, 235, 238, 239, 242, 277 et 287 en particulier de séquence SED ID NO: 11, dans laquelle les au moins 15 mutations sont les suivantes : - En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la méthionine M, En position 74: substitution de l'isoleucine I par l'alanine A, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, - En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, - En position 235 : substitution de la sérine S par la méthionine M, - En position 238 : substitution de l'alanine A par la sérine S, - En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S, 34 - Ou en particulier de séquence SED ID NO: 12, dans laquelle les au moins 15 mutations sont les suivantes : - En position 45 : substitution de la lysine K par l'alanine A, En position 48 : substitution de l'alanine A par la méthionine M, En position 74: substitution de l'isoleucine I par la cystéine C, En position 100 : substitution de la phénylalanine F par l'acide glutamique E, - En position 141 : substitution de la thréonine T par l'asparagine N, En position 153 : substitution de la lysine K par l'arginine R, - En position 177 : substitution de la glycine G par l'acide aspartique D, En position 201 : substitution de l'acide aspartique D par la glycine G, En position 222 : substitution de l'histidine H par la glycine G, En position 235 : substitution de la sérine S par la méthionine M, - En position 238 : substitution de l'alanine A par la sérine S, En position 239 : substitution de la leucine L par le tryptophane W, En position 242 : substitution de l'isoleucine I par l'asparagine N, En position 277 : substitution de la tyrosine Y par le tryptophane W, En position 287 : substitution de l'arginine R par la sérine S. 13- Enzyme PTE mutée de séquence SEQ ID NO: 2 selon la revendication 1, dans laquelle : L'acide aminé en position 45 est différent de l'alanine A, L'acide aminé en position 48 est différent de la valine V et de la méthionine M, L'acide aminé en position 74 est différent de la cystéine C et de l'alanine A, L'acide aminé en position 100 est différent de l'acide glutamique E et de la valine V, L'acide aminé en position 141 est différent de l'asparagine N, L'acide aminé en position 153 est différent de l'arginine R, L'acide aminé en position 177 est différent de l'acide aspartique D, L'acide aminé en position 201 est différent de la glycine G, - L'acide aminé en position 222 est différent de la glycine G et de la glutamine Q, - L'acide aminé en position 225 est différent de la tyrosine Y, - L'acide aminé en position 235 est différent de la méthionine M, - L'acide aminé en position 238 est différent de la valine V et de la sérine S, 35 L'acide aminé en position 239 est différent du tryptophane W, - L'acide aminé en position 240 est différent de la méthionine M, - L'acide aminé en position 242 est différent de l'asparagine N, - L'acide aminé en position 271 est différent de la thréonine T, L'acide aminé en position 276 est différent de la leucine L, L'acide aminé en position 277 est différent du tryptophane W, L'acide aminé en position 287 est différent de la sérine S, L'acide aminé en position 310 est différent de la sérine S. 14- Utilisation d'au moins 7 mutations, notamment de 7 mutations, pour augmenter l'activité catalytique phosphotriestérase (PTE) de l'enzyme de séquence SEQ ID NO : 1 capable d'hydrolyser les composés organophosphorés, en substituant dans la séquence SEQ ID NO: 1: l'acide aminé en position 13 par la proline P, l'acide aminé en position 14 par la valine V, l'acide aminé en position 60 par la sérine S, l'acide aminé en position 79 par l'arginine R, l'acide aminé en position 124 par l'histidine H, l'acide aminé en position 218 par la valine V, l'acide aminé en position 258 par l'arginine R, afin d'obtenir une enzyme PTE mutée, notamment de séquence SEQ ID NO: 2, qui possède une activité catalytique d'hydrolyse des composés organophosphorés améliorée en comparaison de l'activité catalytique de l'enzyme de séquence SED ID NO:\n<CLM>\1\t15- Utilisation d'au moins 7 mutations selon la revendication 14, combinées à des mutations supplémentaires pour augmenter l'activité catalytique phosphotriestérase (PTE) de l'enzyme de séquence SEQ ID NO: 1 capable d'hydrolyser les composés organophosphorés, en effectuant dans la séquence SEQ ID NO : 1 au moins deux substitutions choisies parmi les substitutions de : 36 l'acide aminé en position 45 par l'alanine A, l'acide aminé en position 48 par la valine V ou la méthionine M, l'acide aminé en position 74 par la cystéine C ou l'alanine A, l'acide aminé en position 100 par l'acide glutamique E ou la valine V, l'acide aminé en position 141 par l'asparagine N, l'acide aminé en position 153 par l'arginine R, l'acide aminé en position 177 par l'acide aspartique D, l'acide aminé en position 201 par la glycine G, l'acide aminé en position 222 par la glycine G ou la glutamine Q, l'acide aminé en position 225 par la tyrosine Y, l'acide aminé en position 235 par la méthionine M, l'acide aminé en position 238 par la valine V ou la sérine S, l'acide aminé en position 239 par le tryptophane W, l'acide aminé en position 240 par la méthionine M, l'acide aminé en position 242 par l'asparagine N, l'acide aminé en position 271 par la thréonine T, l'acide aminé en position 276 par la leucine L, l'acide aminé en position 277 par le tryptophane W, l'acide aminé en position 287 par la sérine S, l'acide aminé en position 310 par la sérine S. afin d'obtenir une enzyme PTE mutée qui possède une activité catalytique d'hydrolyse des composés organophosphorés améliorée en comparaison de l'activité catalytique de l'enzyme de séquence SED ID NO :\n<CLM>\1\t16- Utilisation d'au moins 7 mutations selon la revendication 14, combinées à des mutations supplémentaires pour augmenter l'activité catalytique phosphotriestérase (PTE) de l'enzyme de séquence SEQ ID NO: 1 capable d'hydrolyser les composés organophosphorés, en effectuant dans la séquence SEQ ID : 1 au moins 2 substitutions afin d'obtenir une enzyme mutée de séquence choisie parmi les suivantes : SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, 37 SEQ ID NO :6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t17- Utilisation d'au moins 7 mutations selon la revendication 14, en combinaison avec 8 mutations supplémentaires selon la revendication 16, pour augmenter l'activité catalytique phosphotriestérase (PTE) de l'enzyme de séquence SEQ ID NO: 1 capable d'hydrolyser les composés organophosphorés, lesdites 8 mutations supplémentaires consistant en la substitution dans la séquence SEQ ID NO: 1 de : l'acide aminé en position 74 par la cystéine C, l'acide aminé en position 100 par la valine V, l'acide aminé en position 222 par la glutamine Q, l'acide aminé en position 225 par la tyrosine Y, l'acide aminé en position 238 par la valine V, l'acide aminé en position 240 par la méthionine M, l'acide aminé en position 242 par l'asparagine N, l'acide aminé en position 276 par la leucine L, afin d'obtenir une enzyme PTE mutée de séquence SEQ ID NO: 4 qui possède une activité catalytique d'hydrolyse des composés organophosphorés améliorée en comparaison de l'activité catalytique de l'enzyme de séquence SED ID NO:\n<CLM>\1\t18- Utilisation d'au moins une enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et possédant une activité catalytique phosphotriestérase (PTE) capable d'hydrolyser les composés organophosphorés : pour la décontamination de sols pollués par des composés organophosphorés, ou pour la décontamination d'une surface, de la peau, des muqueuses ou des cheveux contaminés avec des composés organophosphorés, ou pour la prévention ou du traitement d'un empoisonnement interne ou externe par ingestion ou inhalation d'un composé organophosphoré, ou 38 pour le contrôle de la pollution des eaux polluées par des composés organophosphorés, ou pour la destruction de stocks d'agents neurotoxiques, ladite au moins une enzyme PTE mutée étant préférentiellement choisie parmi les enzymes mutées de séquence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO : 12, seules ou en combinaisons entre elles. 19- Kit pour la décontamination de surfaces, de la peau ou des muqueuses, des cheveux, contaminés avec des composés organophosphorés, de tissus, de filtres ou de peintures, ledit kit comprenant au moins une enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ayant une activité de catalyse des composés organophosphorés et ladite au moins une enzyme mutée étant préférentiellement choisie parmi les enzymes mutées de séquence SEQ ID NO 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, seules ou en combinaisons entre elles. 20- Composition phytosanitaire comprenant comme principe actif au moins une enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et possédant une activité de catalyse des composés organophosphorés, ladite au moins une enzyme mutée étant préférentiellement choisie parmi les enzymes mutées de séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, seules ou en combinaisons entre elles. 21- Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une enzyme PTE mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et possédant une activité de catalyse des composés organophosphorés, ladite au moins une enzyme mutée étant préférentiellement choisie parmi les enzymes mutées de séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO 9, SEQ 39 ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, seules ou en combinaisons entre elles ; en combinaison d'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 22- Enzymes PTE mutées selon la revendication 1 à 13, possédant une activité de catalyse des composés organophosphorés, ladite au moins une enzyme mutée étant préférentiellement choisies parmi les enzymes mutées de séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO: 12, seules ou en combinaisons entre elles, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des empoisonnements par contact, inhalation ou ingestion de composés organophosphorés. 40