Brevet FR3075372A1 (20190621)

REVENDICATIONS1. Procede d'observation d'un echantillon fluorescent (10), s'etendant selon un plan (Pio), dit plan de rechantillon, rechantillon comportant un agent fluorescent (10f) apte a emettre une onde lumineuse de fluorescence (4f), dans une bande spectrale de fluorescence (4Xf), lorsqu'il est illumine par une onde lumineuse d'excitation (4e), dans une bande spectrale d'excitation (4Xe), le procede comportant les etapes suivantes : a) illumination de rechantillon (10) a l'aide dune premiere source de lumiere (11), selon une premiere bande spectrale d'illumination (AXI), la premiere bande spectrale d'illumination s'etendant dans la bande spectrale d'excitation (4Xe) et acquisition dune premiere image de rechantillon (11), dans la bande spectrale de fluorescence, a l'aide d'un capteur d'image (30) ; b) illumination de rechantillon (10) a l'aide dune deuxieme source de lumiere (12), selon une deuxième bande spectrale (4X2), en dehors de la bande spectrale de fluorescence, rechantillon s'etendant entre la deuxieme source de lumiere (12) et le capteur d'image (30), et acquisition dune deuxieme image de rechantillon (12), dans la deuxieme bande spectrale, a l'aide du capteur d'image (30); le capteur d'image (30) etant couple a un systeme optique (20), dispose entre le capteur d'image et rechantillon (10), le systeme optique (20) etant tel que : - dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), le plan focal objet du systeme optique (Pi) est confondu avec le plan de rechantillon (Pio); - dans la deuxieme bande spectrale (4X2), le plan focal objet du systeme optique (P2) est decale par rapport au plan de rechantillon (Pio), le decalage etant superieur a 20 p.m ; de telle sorte que : - la premiere image (11) est une image focalisee de rechantillon, representative dune fluorescence de rechantillon ; - la deuxieme image (12) est une image defocalisee de rechantillon, representative dune structure de rechantillon.\n<CLM>\1\tProcede selon la revendication 1, comportant une etape c) d'application d'un operateur de reconstruction (h) a partir de la deuxieme image (12), de fawn a obtenir une image reconstruite de rechantillon (As, Ms, (/),) dans un plan de reconstruction (Pz). 17\n<CLM>\1\tProcede Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel la deuxieme bande spectrale (4X2) et decalee, par rapport a la bande spectrale de fluorescence (4Xf), d'au moins 150 nm et de preference d'au moins 200 nm.\n<CLM>\1\tProcede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel le capteur 5 d'image (30), le systeme optique (20) et rechantillon (10) sont fixes entre ('acquisition de la premiere image (11) et ('acquisition de la deuxieme image (12).\n<CLM>\1\tProcede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel dans la deuxieme bande spectrale (4X2), le plan focal objet (P2) est decale dune distance inferieure a 1 mm du plan de rechantillon, et de preference dune distance inferieure a 500 p.m. 10\n<CLM>\1\tProcede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel : - la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant le capteur d'image (30) ; - ou la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant la deuxieme source de lumiere (12). 15\n<CLM>\1\tProcede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel les etapes a) et b) sont realisees successivement, l'etape a) etant realisee avant l'etape b) ou reciproquement.\n<CLM>\1\tDispositif (1) d'observation d'un echantillon fluorescent (10), rechantillon etant apte a emettre une onde lumineuse (44 dans une bande spectrale de fluorescence (4Xf) lorsqu'il est illumine selon une bande spectrale d'excitation (4Xe), le dispositif comportant : 20 - une premiere source de lumiere (11), configuree pour emettre une onde lumineuse dans une premiere bande spectrale (AXI), s'etendant dans une bande spectrale d'excitation (4Xe) de rechantillon ; - une deuxieme source de lumiere (12) configuree pour emettre une onde lumineuse selon une deuxieme bande spectrale (4X2), en dehors de la bande spectrale de 25 fluorescence (4Xf) de rechantillon ; - un capteur d'image (30), optiquement couple a un systeme optique (20); - un support (10s), destine a recevoir rechantillon, de telle sorte que rechantillon s'etende selon un plan (P1o), dit plan d'echantillon, ce dernier s'etendant entre le systeme optique (20) la deuxieme source de lumiere (12) ; 30 - le systeme optique (20) definissant : 18 dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), un premier plan focal objet (Pi), confondu avec le plan de rechantillon (Pio); dans la deuxieme bande spectrale (4X2), un deuxieme plan focal objet (P2), distant du plan de rechantillon (P10), d'au moins 20 p.m ; 5 de telle sorte que le capteur d'image (30) est configure pour acquerir : - une image nette de rechantillon (11), dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), lorsque ce dernier est illumine par la premiere source de lumiere (11); - une image defocalisee de rechantillon (12), dans la deuxieme bande spectrale (4X2), lorsque rechantillon est illumine par la deuxieme source de lumiere (12). 10\n<CLM>\1\tDispositif selon la revendication 8, dans lequel la distance entre le premier plan objet (Pi) et le deuxieme plan objet (P2) est inferieure a 1 mm, et de preference inferieure a 500 p.m.\n<CLM>\1\tDispositif selon Tune quelconque des revendications 8 ou 9, comportant un processeur (32), apte a appliquer un operateur de reconstruction holographique (h) a une image acquise par le capteur d'image (20), de fawn a reconstruire une image representative de rechantillon (Az, Mz, 15 (Pz), dans un plan de reconstruction (13,) distant d'un plan de detection (P30) selon lequel s'etend le capteur d'image (30), et de preference dans le plan de rechantillon (P10).\n<CLM>\1\tDispositif selon Tune quelconque des revendications 8 a 10, comportant un filtre (16), s'etendant entre rechantillon (10) et le capteur d'image (30), presentant une bande passante, dite de fluorescence correspondant a la bande spectrale de fluorescence (4Xf). 20\n<CLM>\1\tDispositif selon la revendication 11, dans lequel le filtre (16) presente une bande passante, distincte de la bande passante de fluorescence, correspondant a la deuxieme bande spectrale (4X2).\n<CLM>\1\tDispositif selon la revendication 11 ou la revendication 12, dans lequel la bande passante de fluorescence du filtre (16) presente une largeur de bande inferieure a 100 nm. 25\n<CLM>\1\tDispositif selon Tune quelconque des revendications 8 a 13, dans lequel : - la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant le capteur d'image (30) ; - ou la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant la deuxieme source de lumiere (12). 30