Brevet FR3074501A1 (20190607)

REVENDICATIONS1.- Utilisation d'un milieu de culture et/ou d'isolement comprenant un extrait sterile d'une culture bacterienne d'une bact6rie du genre Eggerthella, pour l'isolement et/ou la culture pure d'une archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal. 2.- Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le milieu comprend en outre un ou plusieurs compos6s apportant des acides amines tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l'extrait de levure. 3.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1ou 2, dans laquelle le milieu comprend en outre du coenzyme M. 4.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, dans laquelle le milieu comprend en outre du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H20, du NH4CI, du CaC12.2H20, de l'acetate de sodium, de Ia Cysteine-HCI, de Ia resazurine, une solution d'oligoelements de Widdel, une solution de selenite-tungstate, du Na2S a 2% et/ou du NaHCO3 a 10%. 5.- Utilisation selon rune quelconque des revendications 1 a 4, dans laquelle la bacterie du genre Eggerthella est choisie parmi Eggerthella lenta ou la souche Eggerthella sp. Eg01-Mx05 deposee selon le Trait6 de Budapest, le 13 juillet 2017, aupres du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numero DSM 32565. 6.- Procede d'isolement d'une archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal comprenant : a) ('inoculation d'un echantillon biologique susceptible de comprendre une archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal, de preference un echantillon de selles animales ou humaines, en conditions anaerobies sous une atmosphere gazeuse contenant du dihydrogene H2 dans des conditions mesothermiques dans un milieu de culture comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H20, du NH4CI, du CaCl2.2H20, de ('acetate de sodium, de la Cysteine- HCI, de Ia resazurine, une solution d'oligoelements de Widdel, une solution de selenite- tungstate, (ii) du Na2S a 2% et NaHCO3 a 10%, un mélange de vitamines, auquel est 21 ajoute (iii) un ou plusieurs composes apportant des acides amines tel que du Biotrypcase, de Ia peptone et/ou des casamino acides, et de l'extrait de levure, et (iv) des composes methyles tels que des methylamines ou du methanol ; b) le- remplacement du milieu de culture de l'etape a) par un milieu de culture 5 identique appauvri en compos6s apportant des acides amines et dans lequel des vitamines sort ajoutees ; c) la detection d'un enrichissement positif en une archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du glade commensal dans ledit echantillon inocule, en particulier par microscopie, production de methane et consommation d'H2, PCR, qPCR ou 10 sequengage ; et d) Ia realisation de series de dilutions liquides ou par la technique des roil tubes dudit enrichissement positif obtenu a latape c) en utilisant un milieu tel que defini a latape a) ou b) auquel est ajoute un extrait sterile d'une culture bacterienne d'une bact6rie du genre Eggerthella tel que d6fini dans l'une quelconque des revendications 1 a 5, jusqua 15 l'obtention d'un clone d'archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade cornmensal. 7.- Procede d'isolement selon la revendication 6, comprenant en outre une etape c') entre latape c) et latape d) dans laquelle le milieu de culture comprenant ('echantillon 20 biologique est flit& de preference sur un filtre dont la taille des pores est d'au moins 0,45 pm, le filtrat obtenu a l'issu de cette 6tape c') 6tant par Ia suite utilise lors de latape d) pour realiser les series de dilution. 8.- Procede d'isolement selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 dans 25 lequel Ia determination de robtentiort d'un clone d'archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal est realisee par microscopie, production de methane et consommation d'H2, PCR, qPCR ou sequengage. -9.- Methode de culture d'une archee de l'ordre des Methanomassiliicoccales du 30 Glade commensal, pure ou presente dans un consortium microbien, comprenant : a) 'Inoculation soit d'un echantillon biologique comprenant une arch6e de l'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal, de preference un echantillon de selles animales ou humaines dans un milieu de culture, soit d'une archee pure de l'ordre des Methanomassiliicoccales comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du 35 NaCI, du MgSO4.7H20, du NH4CI, du CaC12.2H20, de ('acetate de sodium, de la Cysteine- HCI, de Ia resazurine, une solution d'oligoelements de Widdel, une solution de selenite- 22 tungstate, Na2S a 2% et/ou NaHCO3 a 10%, auquel est ajoute (ii) un ou plusieurs composes apportant des acides amines tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de I'extrait de levure, (iii) des composes methyles tels que des methylamines ou du methanol et (iv) un extrait sterile d'une culture bacterienne de la 5 bacterie du genre Eggerthella, tel que defini dans l'une quelconque des revendications 1 a 5, b) le placement de l'inoculum obtenu a retape a) en conditions anaerobies sous une atmosphere gazeuse comprenant du dihydrogene K2, et c) une incubation dans des conditions mesothermiques, pour atteindre une phase 10 de croissance exponentielle avec degagement de methane en au moins 2 jours, de preference pas plus de 15 jours.\n<CLM>\1\tMethode selon Ia revendication 9, dans laquelle le milieu comprend en outre du coenzyme M. 15 11.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, procede selon rune quelconque des revendications 6 a 8, ou methocle selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle ou dans lequel rextrait sterile d'une culture bacterienne d'une bacterie du genre Eggerthella est un filtrat bacterien d'une bacterie du genre Eggerthella. 20 12.- Utilisation selon la revendication 11, procede selon la revendication 11, ou methode selon la revendication 11, dans laquelle ou dans lequel le filtrat bacterien d'une bacterie du genre Eggerthella est prepare selon le procede comprenant a) la culture d'une bacterie du genre Eggerthella dans un milieu tels que par 25 exemple les milieux conventionnels ATCC 260 ou 1490 et DSMZ 78 ou 209, ledit milieu comprenant du Biotrypcase, de l'extrait de levure, de la peptone, des acides anilines, de l'extrait de viande, de rhernine, et/ou de la vitamine K1 ou K3, et des sucres simples ; b) ('incubation du milieu de culture comprenant ladite bacterie a une temperature de 20 a 40°C, de preference a 37°C, pendant au moins 1 jour, de preference pas plus de 30 15 jours ; c) la filtration du milieu de culture comprenant ladite bacterie, de preference a ('aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont Ia taille des pores est de 0,2 pm; et d) la recuperation du filtrat obtenu a l'issu de retape c). 35 23\n<CLM>\1\tUtilisation selon I'une quelconque des revendications 1 a 5 et 11 a 12, procede selon I'une quelconque des revendications 6 a 8 et 11 a 12, ou methode selon I'une quelconque des revendications 9 a 12, dans lequel ou dans laquelle ('archee de I'ordre des Methanomassiliicoccales du Glade commensal est une archee Methanomethylophilus 5 alvus, en particulier une archee Methanomethylophilus alvus Mx-05, souche deposee selon le Traite de Budapest, le 18 septembre 2017, aupres du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numero DSM32684.