Brevet FR3075821A1 (20190628)

REVENDICATIONS1. Procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa, comprenant les étapes suivantes : a) la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, et de préférence entre 4 et 8 jours, pour générer des graines germées, b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence en acide nucléique comprenant un gène d'intérêt, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant : - optionnellement au moins une étape de sonication et - au moins une étape d'incubation sous vide, d) la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c).\n<CLM>\1\tProcédé de production d'une protéine recombinante comprenant les étapes a) à d) selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce que lors de l'étape b) ledit gène d'intérêt code une protéine recombinante, et en ce que ledit procédé comprend en outre une étape e) de récolte des tissus végétaux produits lors de l'étape d), suivie d'une étape f) d'extraction de la protéine recombinante, à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les variétés suivantes Lactuca sativa var. longifolia, Lactuca sativa var. capitata et Lactuca sativa var. crispa.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les cultivars suivants Lactuca sativa var. longifolia « Ballon », Lactuca sativa var. capitata « Pierre Bénite », 32 Lactuca sativa var. capitata « Blonde de Paris », Lactuca sativa var. capitata « Florine », Lactuca sativa var. capitata « Kamikaze », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde paresseuse », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde d'hiver » Lactuca sativa var. capitata « Appia», et Lactuca sativa var. 5 crispa « Sanguine ».\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape c) de traitement mécanique du mélange comprend la sonication du mélange, à une fréquence supérieure à 10 kHz, de préférence à une fréquence 10 comprise entre 20 et 60 kHz et de façon plus préférentielle entre 50 et 60 kHz, pendant une durée comprise entre 10 et 300 secondes, de préférence comprise entre 30 et 60 secondes.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que 15 l'étape c) comprend une étape d'incubation sous vide du mélange, ladite incubation sous vide étant réalisée par l'application d'une pression comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, pendant une durée comprise entre 5 et 30 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes, ladite incubation sous vide étant suivie par 20 l'incubation du mélange à pression atmosphérique pendant une durée comprise entre 10 et 30 minutes.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape c) comprend l'application au mélange, successivement de : 25 i) une étape de sonication entre 20 et 60 kHz, et de préférence à 50 kHz, pendant 30 à 60 secondes, ii) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression Pl, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 30 hPa, iii) une étape d'incubation sous vide à la pression P1 pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence pendant 10 à 20 minutes, 33 iv) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P1 à la pression atmosphérique PO, y) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de 5 préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 h Pa, vi) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, vii) une incubation à pression atmosphérique PO pendant 10 à 30 minutes, 10 de préférence pendant 20 minutes.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape c) comprend en outre, entre les étapes vi) et vii), au moins une étape de mise sous vide, comprenant successivement : 15 - une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, - une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la 20 pression atmosphérique PO.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'étape c) comprend en outre, entre les étapes vi) et vii), une ou deux étapes de mise sous vide, comprenant chacune successivement : 25 - une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, - une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la 30 pression atmosphérique PO. 34\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, comprenant les étapes suivantes : a) la mise en condition de germination des graines de Lactuca sativa, pendant 3 à 11 jours, de préférence pendant 4 à 8 jours, à l'obscurité, à 5 une température comprise entre 10 et 22°C, pour générer des graines germées présentant au maximum un stade deux cotylédons ; b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence codant au moins une protéine recombinante, pour 10 obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant successivement : - une sonication à 50 kHz pendant 30 secondes, - une première étape comprenant successivement : une étape pendant 15 laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression Pl, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, préférentiellement entre 15 et 20 hPa, une incubation à la pression P1 pendant une durée de 10 à 20 minutes puis une étape pendant laquelle la pression appliquée au mélange varie de P1 à la 20 pression atmosphérique PO, - au moins une, et de préférence une, deux ou trois étapes, comprenant chacune successivement : une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2 comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus 25 préférentiellement entre 15 et 20 hPa, puis une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, et - une incubation à la pression atmosphérique PO pendant 20 minutes, d) la mise en condition de culture, à l'obscurité, des graines germées obtenues lors de l'étape c) pendant 2 à 21 jours, de préférence pendant 8 30 à 10 jours, plus préférentiellement pendant 9 jours, permettant l'expression de ladite protéine recombinante, e) la récolte des tissus végétaux et f) l'extraction de ladite protéine recombinante à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).