Brevet FR3068987A1 (20190118)

REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique (1) conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube de culture de bactéries (2), destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles : a.1) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (al) de son axe (XX') par rapport à la verticale, et a.2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche (1-1) du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse, telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube, et b.1) on coule dans ledit récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée (al) de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale pour former une deuxième couche (1-2) de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure (1a) de la dite deuxième couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, de préférence parallèlement à la surface supérieure de la première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'aux étapes a.1) et 30 b.1), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier 19 milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre (1a) de la deuxième couche s'étend depuis le fond (2a) du récipient jusqu'à proximité du bord supérieur (2b) du récipient. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'aux étapes a.1) et b.1), le dit récipient est un tube (2), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe (Xe) du tube d'un angle a2 de 50 à 75° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure (1a) de la deuxième couche solide (1-2) après l'étape b.2) d'un angle al 10 de 15 à 40° par rapport à l'axe (XX') dudit tube.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit 15 premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 3 et 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu contenant un (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que et le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa-carraghénane, de préférence avec l'amidon, K2HP et CaCl2, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme 5 deuxième agent gélifiant.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou io des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar.\n<CLM>\1\tMilieu de culture biphasique (1-1 - 1-2) contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube (2) de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé 15 en ce qu'il comprend : - une première couche (1-1) d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et 20 - une deuxième couche (1-2) d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée (al) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de 25 dite bactérie en conditions d'aérobiose.\n<CLM>\1\tProcédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture conditionné dans un dit récipient selon la revendication 11 dans lequel on ensemence la surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, en conditions d'aérobiose, avec une dite bactérie, puis 21 laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe ()OE') disposé verticalement.