Brevet FR3068362A1 (20190104)

REVENDICATIONS1. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Crerecombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. 100\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t6. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3,1adite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, 101 notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Crerecombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO: 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 et 6, contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Crerecombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété, le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, de manière à ce que - ledit site A et ledit site B sont différents, et - ledit site C est identique audit site A ou audit site B ; en particulier tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A; ou tels que 102 ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, ou tels que ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 3 à 7, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène ropl 61 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène ropl6I délété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène ropl6I délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO :5, lox P SEQ ID NO :12 et lox 2272 SEQ ID NO :68, 103 ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement : - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène ropl 61 délété en particulier tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 3, 5 à 8, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène rop16I est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase, au locus dudit gène ropl6I délété, ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène ropl 61 délété 104 tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68; ou tels que ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 à 9, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO:\n<CLM>\1\t11. Souche mutante selon l'une des revendications 3 à 10, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi une souche dans laquelle o le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO:\n<CLM>\1\t- une souche dans laquelle le gène mic /, le gène mic 3 et le gène ropl 61 sont délétés, et comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène ropl6Idélété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène ropl6I délété, étant flanqué en amont par un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, dans laquelle 105 o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et o ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque en amont ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène ropl6I délété, est le site lox 2272 SEQ ID NO :68.\n<CLM>\1\tSouche mutante selon l'une des revendications 2 ou 4, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P SEQ ID NO : 12 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t13. Utilisation in vitro d'une souche mutante selon l'une des revendications 1 à 4 et 12, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue.\n<CLM>\1\tSouche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 12, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou immunostimulant.\n<CLM>\1\tSouche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes micl , mic3 et ropl 61 sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène ropl 6I délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes mic/ et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène ropl 6I délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de 106 recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes micl, mic3 et ropl 61 délétés, de telle façon que : - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété (site A), - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété, o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène ropl6I délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène ropl6I délété (site D), et - d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène rop16I (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, 107 ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Crerecombinase définis de la manière suivante : - le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène ropl6I délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène ropl 61 délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mici délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 - ledit site C correspond à un site lox N, SEQ lD NO : 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène ropl6Idélété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 - ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.