Brevet FR3069927A1 (20190208)

REVENDICATIONS1. Procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par détection de l'émission de luminescence par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes suivantes : (i) mise en oeuvre de particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une nanoparticule inorganique photoluminescente formée d'une matrice cristalline présentant au moins 103 ions de terres rares, et couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser, dans des conditions propices à leur association avec la substance à analyser de l'échantillon, lesdites nanoparticules présentant une taille moyenne comprise entre 20 et 100 nm, et étant aptes à émettre de la luminescence après absorption d'un photon ; (ii) excitation des ions de terres rares des particules associées avec la substance à analyser, par un dispositif d'illumination, en particulier de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW, de préférence d'au moins 500 mW, et d'une intensité d'excitation d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/cm2 ; (iii) détection de l'émission de luminescence par les particules, et (iv) détermination de la présence et/ou concentration de la substance par interprétation de ladite mesure de luminescence, le cas échéant par référence à un étalon ou étalonnage.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication précédente, dans lequel la substance à analyser dudit échantillon en étape (i) est préalablement immobilisée à la surface d'un support, ladite surface étant passivée de manière à ce que lesdites particules luminescentes ne s'y fixent pas en l'absence de la substance à analyser.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, pour la détection et/ou la quantification d'une substance d'intérêt présente dans l'échantillon en une teneur strictement inférieure à 10 pM, en particulier inférieure à 1 pM, voire inférieure à 0,1 pM, ou encore inférieure à 0,01 pM.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est un échantillon biologique, en particulier un échantillon de 73 prélèvement humain, et plus particulièrement choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, la salive, l'urine et le liquide cérébro-spinal.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détection et/ou la quantification de biomarqueurs, d'anticorps, d'ADN et/ou d'ARN 5 dans un échantillon biologique.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit agent de ciblage est choisi parmi un anticorps polyclonal ou monoclonal, un fragment d'anticorps, un nanobody, un oligonucléide, un peptide, une hormone, un ligand, une cytokine, un peptidomimétique, une protéine, un carbohydrate, une protéine 10 modifiée chimiquement, un acide nucléique modifié chimiquement, un carbohydrate modifié chimiquement qui cible une protéine de surface cellulaire connue, un aptamère, un assemblage de protéines et d'ADN/ARN ou un chloroalcane utilisé par les marquages de type HaloTag, en particulier est un anticorps ou fragment d'anticorps.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 15 lequel le produit entre le taux de dopage en ions de terres rares et le rendement quantique de l'émission par la nanoparticule est maximisé, en particulier dans lequel la nanoparticule présente une cristallinité imparfaite.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules présentent une durée de vie d'émission supérieure ou égale à 20 5 las, en particulier supérieure ou égale à 10 las, notamment supérieure ou égale à 20 las, voire supérieure ou égale à 50 las.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules présentent une taille moyenne supérieure ou égale à 25 nm, en particulier supérieure ou égale à 30 nm, notamment comprise entre 30 et 60 nm. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les ions de terres rares sont des ions lanthanides choisis parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le praséodymium (Pr), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb), le cérium (Ce), l'holmium (Ho), le terbium (Tb), le prométhium (Pm), le thulium (Tm) et leurs mélanges, en particulier choisis parmi Eu, Dy, Sm, Nd, 30 Er, Yb et leurs mélanges, et en particulier Eu.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules sont de formule (I) suivante : 74 (Ai _,Ln,),(Mp0q) (I) dans laquelle : - M représente un ou plusieurs éléments susceptibles de s'associer avec l'oxygène (0), et éventuellement avec d'autres cations, pour former un composé cristallin, 5 en particulier M représente un ou plusieurs éléments choisis parmi V, P, W, Mo, As et Al; - Ln correspond à un ou plusieurs ion(s) lanthanide(s) luminescent(s), en particulier tels que définis en revendication 10; - A correspond à un ou plusieurs ion(s) constituant(s) de la matrice cristalline dont les niveaux électroniques ne sont pas impliqués dans le processus de luminescence, en 10 particulier choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La), le bismuth (Bi) et leurs mélanges, notamment A représente Y ou Gd et de préférence A représente Y; - 0\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les nanoparticules étant de formule : A1,LnSO4(i_y)(PO4)y (II) dans laquelle :\n<CLM>\1\tA est choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y; . Ln est choisi parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ;\n<CLM>\1\t0\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 12, dans lequel lesdites nanoparticules de formule (II) présentent en surface des cations tétraalkylammonium, en particulier des cations de formule NR4+ avec R, identiques ou différents, représentant un groupe Ci-C6- 30 alkyl, en particulier C1-C4-alkyl, plus particulièrement C1-C3-alkyl, et notamment choisis parmi les cations tétraméthylammonium, tétraéthylammonium, 75 tétrapropylammonium, tétrabutylammonium et leurs mélanges, de préférence lesdits cations tétraalkylammonium sont des cations tétraméthylammonium.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication précédente, lesdites nanoparticules étant de formule (II') 5 Ai,LnxV040-ye04)y (NR4)z ) dans laquelle : . A est tel que défini en revendications 12; . Ln est tel que défini en revendications 12; . 0\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites nanoparticules sont de formule Y1,EuSO4, dans laquelle 0\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 20 lequel les nanoparticules présentent à l'issue de leur synthèse un potentiel zêta, en valeur absolue, notée IQ, en milieu aqueux à pH de 5, supérieur à 30 mV.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 16, dans lequel l'étape (i) comprend au moins les étapes suivantes : (a) disposer d'un support dont la surface est préalablement passivée et 25 fonctionnalisée avec un agent de ciblage de la substance à détecter/quantifier, par exemple un premier anticorps monoclonal, dit anticorps de capture ; (b) mettre en contact ledit échantillon à analyser avec le support de l'étape (a) dans des conditions propices à l'association de ladite substance avec l'agent de ciblage ; et (c) mettre en contact les particules photoluminescentes couplées à au moins un 30 agent de ciblage avec ledit support issu de l'étape (b) pour associer les particules avec ladite substance immobilisée à la surface du support. 76\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, dans lequel ledit support est de type lamelles, plaques multi-puits, microplaques, gels membranes, bandelettes ou microcanaux.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 18, dans lequel 5 l'excitation en étape (ii) est opérée avec un faisceau d'excitation laser orienté de sorte à former un angle d'incidence avec la verticale du support présentant en surface lesdites particules associées à la substance à analyser, supérieur ou égal à\n<CLM>\1\t20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 19, comprenant l'excitation des particules par onde évanescente, en particulier à l'aide d'un montage 10 d'illumination laser de type TIRF, permettant un angle d'incidence du faisceau excitateur supérieur ou égal à 61° dans le cas d'une interface verre/eau entre le support et l'échantillon à analyser.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la durée de vie d'émission par les nanoparticules est supérieure ou égale à 1 las, 15 en particulier supérieure ou à égale à 50 las, la détection de l'intensité lumineuse en étape (iii) comprenant une détection résolue en temps de l'émission, en particulier une détection retardée du signal émis par les particules photoluminescentes.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détection et/ou quantification simultanée d'au moins deux substances différentes dans 20 un échantillon.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication précédente, dans lequel les substances à analyser dudit échantillon sont immobilisées en des zones prédéfinies et distinctes à la surface d'un support, ladite surface étant passivée de manière à ce que les particules photoluminescentes ne s'y fixent pas en l'absence des substances à analyser. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 22 ou 23, mettant en oeuvre au moins deux types de nanoparticules ayant des longueurs d'ondes d'émission distinctes et couplées à des agents de ciblage de chacune des substances à analyser.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif d'illumination laser en étape (ii) comprend un montage optique, en 30 particulier un système d'au moins une lentille, disposé sur la trajectoire du faisceau laser de manière à contrôler la taille du faisceau au niveau de la zone du support présentant les particules associées à la substance à analyser. 77\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détection de l'émission de luminescence en étape (iii) est opérée par un dispositif de détection de l'intensité lumineuse comprenant un détecteur unique, par exemple de type photomultiplicateur, photodiode, photodiode à avalanche, ou un 5 détecteur de type réseau de dispositifs photosensibles consistant en une surface 2D de pixels de détection tel qu'une caméra CCD ou EM-CCD ou caméra CMOS.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif de détection comprend un montage optique, en particulier un système d'au moins une lentille à grande ouverture numérique, pour focaliser l'émission de luminescence vers le 10 détecteur, en particulier vers le photomultiplicateur.\n<CLM>\1\tUtilisation du procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, à des fins de diagnostic in vitro.\n<CLM>\1\tEnsemble de diagnostic in vitro comprenant au moins : - des particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une 15 nanoparticule inorganique photoluminescente telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 et 8 à 16, lesdites particules étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l'acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou 20 couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance à analyser ; ou lesdites particules étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser ; et 25 - un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : . un dispositif d'illumination, de préférence de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW voire d'au moins 500 mW, et un montage optique de mise en forme du faisceau laser permettant d'obtenir une intensité d'excitation au niveau de l'échantillon d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/ cm'\n<CLM>\1\tun appareil de détection de l'intensité lumineuse émise par les particules. 78\n<CLM>\1\tEnsemble de diagnostic selon la revendication précédente, comprenant au moins un support adéquat pour l'immobilisation de la substance à analyser dudit échantillon.