Brevet FR3077296A1 (20190802)

REVENDICATIONS1. Dimère d'un variant du facteur X caractérisé en ce que ledit variant du facteur X est fusionné au niveau de l'extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage..\n<CLM>\1\tDimère selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37, éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal.\n<CLM>\1\tDimère selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment scFc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :42.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation 15 T366Y ou Y407T.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le variant du facteur X comprend une séquence mutée de SEQ ID NO :1, et comprend en outre à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide 20 différent du propeptide naturel du facteur X.\n<CLM>\1\tDimère selon la revendication 5 caractérisé en ce que ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend une mutation A, B, ou C, dans laquelle : la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID 25 NO :1 par la séquence DFLAEGLTPR, la mutation B consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1. 30\n<CLM>\1\tDimère selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend la mutation B. 1\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées. 5\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 et SEQ ID NO :16.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X 10 est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que ledit variant du facteur X comprend, entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO :1, une séquence correspondant à la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que ledit variant du facteur 20 X comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : a. le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis b. la séquence SEQ ID NO :5, puis c. ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1, puis 25 d. au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que ledit variant du facteur X comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : 30 a. le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis b. la séquence SEQ ID NO :5, puis c. la séquence SEQ ID NO :11, puis 2 d. au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 5 à 13, caractérisée en ce que ledit variant du 5 facteur X a la séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43.\n<CLM>\1\tAcide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour ledit variant du facteur X selon l'une des revendications 5 à\n<CLM>\1\t10\n<CLM>\1\tAcide nucléique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :41 et SEQ ID NO :44.\n<CLM>\1\tCassette d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 15 ou\n<CLM>\1\t15\n<CLM>\1\tVecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression selon la revendication\n<CLM>\1\t19. Cellule recombinante comprenant l'acide nucléique selon la revendication 16, ledit acide nucléique étant préférentiellement compris dans le vecteur selon la revendication\n<CLM>\1\t20. Dimère selon l'une des revendications 1 à 14 pour son utilisation en tant que médicament.\n<CLM>\1\tDimère selon l'une des revendications 1 à 14 pour son utilisation pour traiter les troubles hémorragiques.\n<CLM>\1\tProcédé de production dudit variant du facteur X du dimère selon l'une des revendications 5 à 14 comprenant : a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence encore une cellule CHO, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et un polynucléotide codant pour l'enzyme furine, ; 3 b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : - la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, 5 - la concentration du surnageant, - la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification dudit variant du facteur X par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d' aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X, f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l'étape e), la purification dudit variant du 10 facteur X par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc.\n<CLM>\1\tProcédé de production dudit variant du facteur X du dimère selon l'une des revendications 5 à 14, comprenant : 15 a) l'expression de deux vecteurs d'expression, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule-hôte, de préférence une cellule CHO, l'un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme furine, de préférence encore une cellule HEK, l'un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et 20 l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage ; b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; 25 d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : - la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, - la concentration du surnageant, - la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification dudit variant du facteur X par passage du surnageant de production obtenu 30 en c) ou d) sur une colonne d' aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X, f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l'étape e), la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc. 4\n<CLM>\1\tMéthode d'augmentation de l'activité coagulante du variant du facteur X selon les revendications 5 à 14 comprenant : la production dudit variant du facteur X selon les revendications 5 à 14, une étape de dimérisation dudit variant du facteur X selon les revendications 5 à\n<CLM>\1\t5\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 24, ledit variant du facteur X selon les revendications 5 à 14 étant fusionné au niveau de l'extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, et ladite étape de dimérisation correspondant au rapprochement des fragments Fc ou scFc lors de la maturation de la protéine 10 au cours de sa biosynthèse intracellulaire.\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 25, ledit facteur de coagulation étant le variant du facteur X de séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43. 5