Brevet FR3041655A1 (20170331)
REVENDICATIONS1. Souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feru- loyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1, et au moins une copie supplémentaire du gène ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence protéique SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 et en ce que lesdites copies supplémentaires des gènes fcs et ech sont intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31.\n<CLM>\1\tSouche Amycolatopsis selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites co- pies supplémentaires des gènes fcs et ech sont placées sous la dépendance du promoteur fort ermE*associé à un site d'association du ribosome.\n<CLM>\1\tProcédé d'obtention d'une souche Amycolatopsis dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, comprenant au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feru- loyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute sé- quence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1, et du gène ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et en- core plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 et dont les- dites copies supplémentaires des gènes fcs et ech sont intégrées spécifiquement au niveau du site d'intégration du phage (pC31, comprenant les étapes suivantes : a. amplification par PCR des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coAHydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore 3041655 20 plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2, isolés d'une souche Amycolatopsis ; b. construction d'un vecteur portant les séquences protéiques obtenues à l'étape a., à partir du plasmide pSET152 ; 5 c. transformation par électroporation de la souche Escherichia coli ET12567 avec un plasmide conjuguant comprenant tous les gènes codant la machinerie de conjugaison dont l'origine de conjugaison oriT rendue non fonctionnelle, et le vecteur construit à l'étape b. ; d. sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées à l'étape c. par 10 culture sur un milieu contenant la néomycine et une bêta-lactamine ; e. conjugaison interspécifique entre les souches Escherichia coli ET12567 transformées et sélectionnées aux étapes c. et d. et la souche Amycolatopsis Zyl 926 déposée au CABI Bioscience sous le numéro IMI 390106 le 2 mars 2003, par mise en co-culture ; 15 f sélection des souches Amycolatopsis Zyl 926 ayant intégré au moins une copie supplémentaire du gène fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et au moins une copie supplémentaire du gène 20 ech codant l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 selon l'étape e., par culture sur un milieu contenant de l'apramycine.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend une étape sup- 25 plémentaire b'. entre les étapes b. et c., d'amplification et de clonage du promo- teur fort ermE* ayant pour séquence la séquence nucléique SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au moins 90%, et de préférence au moins 95%, à la séquence SEQ ID NO : 6 dans le vecteur construit à l'étape b., ledit promoteur ermE* est associé à un site d'association du ribosome. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le plasmide conjuguant de l'étape c. est le plasmide pUZ8002.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la bêtalactamine de l'étape d. est l'ampicilline. 3041655 21\n<CLM>\1\tSouche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 3 à\n<CLM>\1\t8. Souche Amycolatopsis sp. selon l'une des revendications 1 à 2 ou 7 choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro I-4922, la souche déposée à la 5 CNCM sous le numéro I-4923, et la souche déposée à la CNCM sous le numéro I- 4924.\n<CLM>\1\tCassette d'intégration caractérisée en ce qu'elle comprend : i. une cassette d'expression des gènes fcs codant la Feruloyl-coA-Synthétase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 1 ou toute séquence identique 10 à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 1 et ech codant l'Enoyl-coAHydratase/Aldolase ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 2 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 2 ; 15 ii. des moyens permettant l'intégration de la cassette dans le génome de la souche Amycolatopsis Zy1926, comprenant le gène int du phage (pC31 ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 3 ou toute séquence identique à au moins 80%, de préférence au moins 90%, et encore plus de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 3 et le site attP de fixation du phage 20 (pC31 ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 4 ; iii. des moyens de sélection des souches Escherichia coli ET12567 transformées comprenant la néomycine et une bêta-lactamine ; iv. des moyens de sélection des souches Amycolatopsis Zy1926 ayant intégré ladite cassette d'intégration, comprenant un marqueur de résistance à 25 l'apramycine.\n<CLM>\1\tCassette d'intégration selon la revendication 9, caractérisée en ce que les gènes fcs et ech codant la Feruloyl-coA-Synthétase et l'Enoyl-coA-Hydratase/Aldolase de la cassette d'expression sont placés sous la dépendance du promoteur ermE* ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO : 6 ou toute séquence identique à au 30 moins 90%, et de préférence au moins 95% à la séquence SEQ ID NO : 6, ledit promoteur ermE* étant associé à un site d'association du ribosome.\n<CLM>\1\tCassette d'intégration selon l'une des revendications 9 à 10, caractérisée en ce que la bêta-lactamine est l'ampicilline. 3041655 22\n<CLM>\1\tUtilisation dans un procédé de production de vanilline d'une souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 selon l'une des revendications 1 à 2 et/ou 7 à\n<CLM>\1\t13. Procédé de production de vanilline caractérisé en ce que la réaction de bioconver- 5 sion est réalisée dans un milieu comprenant une souche Amycolatopsis sp. dérivée de la souche Amycolatopsis Zyl 926 selon l'une des revendications 1 à 2 et/ou 7 à 8.