Brevet FR3042506A1 (20170421)
REVENDICATIONS1. Outil génétique permettant la transformation par recombinaison homologue d'une bactérie solvantogène du genre Clostridium caractérisé en ce qu'il comprend : - un premier acide nucléique codant au moins Cas9, dans lequel la séquence codant Cas9 est placée sous le contrôle d'un promoteur, et - au moins un deuxième acide nucléique contenant une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement d'une portion de l'ADN bactérien ciblée par Cas9 par une séquence d'intérêt, et en ce que i) au moins l'un desdits acides nucléiques code en outre un ou plusieurs ARN guides (ARNg), ou ii) l'outil génétique comprend en outre un ou plusieurs ARN guides, chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l'enzyme Cas9 et une séquence complémentaire de la portion ciblée de l'ADN bactérien.\n<CLM>\1\tOutil selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codant le ou lesdits ARN guides est précédée d'un promoteur et en ce que ledit promoteur ou le promoteur contrôlant Cas9 est un promoteur inductible.\n<CLM>\1\tOutil selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la portion ciblée de l'ADN bactérien comprend un gène essentiel ou une portion de gène essentielle à la survie bactérienne.\n<CLM>\1\tOutil selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la bactérie solvantogène du genre Clostridium est sélectionnée parmi C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum et C. tyrobutyricum.\n<CLM>\1\tOutil selon la revendication 4, caractérisé en ce que lorsque la bactérie solvantogène est C. acetobutylicum ladite bactérie C. acetobutylicum est la souche ATCC824, et lorsque la bactérie solvantogène est C. beijerinckii ladite bactérie C. beijerinckii est la souche DSM 6423.\n<CLM>\1\tOutil selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine Cas9 comprend la séquence SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t7. Outil selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le promoteur de Cas9 est un promoteur inductible.\n<CLM>\1\tOutil selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt code au moins un produit favorisant la production de solvant, typiquement au moins une enzyme impliquée dans la conversion des aldéhydes en alcool, une protéine membranaire, un facteur de transcription, ou une combinaison de ceux-ci.\n<CLM>\1\tOutil selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que chacun des acides nucléiques présent au sein de l'outil appartient à une cassette d'expression distincte ou à un vecteur, par exemple un plasmide, distinct. 3042506 29 10.Procédé pour transformer par recombinaison homologue une bactérie solvantogène du genre Clostridium, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'introduction dans la bactérie d'un outil génétique selon l'une des revendications 1 à\n<CLM>\1\t11.Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 5 a) l'introduction dans la bactérie d'un outil génétique selon l'une des revendications 1 à 9 comprenant au moins un promoteur inductible, et b) l'induction de l'expression du promoteur inductible permettant de modifier génétiquement la bactérie.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs étapes 10 additionnelles, postérieures à l'étape b) lorsqu'elle est présente, d'introduction d'un énième acide nucléique codant i) une matrice de réparation distincte de celle(s) déjà introduite(s) et ii) un ou plusieurs ARN guides permettant leur intégration dans une zone ciblée du génome de la bactérie, chaque étape additionnelle étant précédée d'une étape d'élimination de l'acide nucléique codant la matrice de réparation préalablement introduite, et de préférence d'élimination du/des ARNs guides 15 ou séquences codant le/les ARNs guides préalablement introduits. 13.Bactérie solvantogène du genre Clostridium transformée à l'aide du procédé selon l'une des revendications 10 à\n<CLM>\1\t14. Kit pour transformer une bactérie du genre Clostridium ou pour produire au moins un solvant à l'aide d'une bactérie du genre Clostridium comprenant les éléments de l'outil génétique tels que 20 décrits dans l'une des revendications 1 à 9 et éventuellement un ou plusieurs inducteurs adaptés au(x) promoteur(s) inductible(s) sélectionné(s) utilisé(s) au sein de l'outil. 15.Utilisation de l'outil génétique selon l'une des revendications 1 à 9, du procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, ou d'une bactérie transformée selon la revendication 12, pour permettre la production d'un solvant ou d'un mélange de solvants à l'échelle industrielle, de préférence 25 d'acétone, de butanol, d'éthanol, d'isopropanol ou d'un mélange de ceux-ci, typiquement d'un mélange isopropanol/butanol.