Brevet FR3051196A1 (20171117)
REVENDICATIONS1. Particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins desdites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase.\n<CLM>\1\tParticule selon la revendication 1, dans laquelle la nucléase est choisie parmi le groupe constitué par les nucléases associées au système CRISPR, la nucléase du système TALEN, la nucléase du système Zn Finger et la nucléase Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo).\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence d'intérêt d'au moins deux ARNs non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase. Particule rétrovirale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt. Particule rétrovirale selon la revendication 4, dans laquelle : la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN en 3', et - la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN en 5'. Particule rétrovirale selon la revendication 5, dans laquelle les séquences d'intérêt comportent une partie codant pour le domaine catalytique de la nucléase Fokl, ou des variants de celui-ci. 3051196 67\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 1, 2 ou 4, dans laquelle la séquence d'intérêt d'au moins un des ARN non viraux encapsidés code pour une nucléase.\n<CLM>\1\tParticule selon la revendication 7, dans laquelle la nucléase est Cas9.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt et la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé correspondant à au moins un élément de reconnaissance d'un guide d'ARN.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 9, qui comporte en outre au moins un troisième ARN non viral encapsidé ayant une séquence d'intérêt correspondant à un second élément de reconnaissance d'un guide d'ARN ou à un guide d'ARN supplémentaire.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 11, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, laquelle est une particule lentivirale.\n<CLM>\1\tComposition comportant des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à\n<CLM>\1\t3051196 68\n<CLM>\1\tKit de production de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comportant : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette 5 séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, 10 (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence 15 d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence 20 d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.\n<CLM>\1\tComposition de particules susceptible d'être obtenue par le 25 procédé de fabrication des particules selon la revendication\n<CLM>\1\t19. Utilisation d'une particule selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou d'une composition selon la revendication 15 ou 18, pour transduire in vitro des cellules.\n<CLM>\1\tUtilisation selon la revendication 19, pour générer chez les 30 cellules transduites une cassure du double brin d'ADN, une mutation ponctuelle, une délétion de séquence dont invalidation de gène, une insertion de séquence ou remplacement de gène.