Brevet FR3052462A1 (20171215)
REVENDICATIONS1. Variant d'une ADN polymérase de la famille polX capable de synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, ou d'un fragment fonctionnel d'une telle polymérase, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en M330, T331, G332, G333, F334, K338, H342, D343, V344, D345, F346, A397, D399, D434, V436, A446, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, F456, E457, R458, R461, N474, E491, D501, Y502, 1503, P505, R508, N509 et A510, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1, ledit variant étant capable de synthétiser un brin d'ADN et/ou un brin d' ARN.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 1 ou 2, ledit variant étant un variant de Pol IV, Pol p., ou de la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT).\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N°1, préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% d'identité avec la séquence selon SEQ ID N°1.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, dans lequel au moins une mutation consiste en une substitution, une délétion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acide aminé.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant comprenant au moins une mutation d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en T331, G332, G333, F334, D343, L447, L448, G449, W450, G452, Q455, E457, R461 et R508, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1. 3052462 29\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant présentant au moins une mutation d'un résidu dans au moins une région semi-conservée de séquence 5 (i) XiX2GGFRiR2GKX3X4 (SEQ ID N°4), dans laquelle Xi représente un résidu choisi parmi M, I, V, L X2 représente un résidu choisi parmi T, A, M, Q X3 représente un résidu choisi parmi M, K, E, Q, L, S, P, R, D X4 représente un résidu choisi parmi T, I, M, F, K, V, Y, E, Q, H, S, R, D 10 (ii) XiX2LGX3X4GSRiX5X6ER2 (SEQ ID N°5) dans laquelle Xi représente un résidu choisi parmi A, C, G, S X2 représente un résidu choisi parmi L, T, R X3 représente un résidu choisi parmi W, Y 15 X4 représente un résidu choisi parmi T, S, I X5 représente un résidu choisi parmi Q, L, H, F, Y, N, E, D ou 0 X6 représente un résidu choisi parmi F, Y (iii) LX1YX2X3PX4X5RNA (SEQ ID N°6) Xi représente un résidu choisi parmi D, E, S, P, A, K 20 X2 représente un résidu choisi parmi I, L, M, V, A, T X3 représente un résidu choisi parmi E, Q, P, Y, L, K, G, N X4 représente un résidu choisi parmi W, S, V, E, R, Q, T, C, K, H X5 représente un résidu choisi parmi E, Q, D, H, L.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 7, ledit variant 25 présentant - au moins une substitution d'un résidu à au moins une position Ri, R2 et/ou K de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°4 ; et/ou - au moins une substitution d'un résidu à au moins une position S, R1 et/ou E de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°5 ; et/ou 3052462 - une délétion du résidu à la position X1 et/ou au moins une substitution au niveau des positions R et/ou N de la région semi-conservée de séquence SEQ ID N°6.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes, ledit variant comprenant une substitution d'un résidu à au moins une position 5 sélectionnée dans le groupe consistant en K338, H342, A397, S453, E457, R461, N474, D501, Y502, 1503, R508 et N509, ou un résidu fonctionnellement équivalent, préférentiellement une substitution d'un résidu à au moins une position sélectionnée dans le groupe consistant en A397, E457, R461, N474, D501, Y502 et 1503, ou un résidu fonctionnellement équivalent, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1. 10\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon la revendication 9, dans lequel les substitutions sur les positions K338, H342, A397, S453, E457, R461, N474, D501, Y502, 1503, R508 et N509 sont sélectionnées parmi le groupe consistant en K338A/C/G/S/T/N, H342A/C/G/S/T.N, A397R/H/K/D/E, S453A/C/G/S/T, E457G/N/S/T, N474S/T/N/Q, D501A/G/X, Y502A/G/X, 1503A/G/X, R508A/C/G/S/T, N509A/C/G/S/T.. 15\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le variant comprend ou présente une substitution, délétion, combinaisons de substitutions et/ou de délétions listées dans le tableau 1, les positions indiquées étant déterminées par alignement avec SEQ ID N°1.\n<CLM>\1\tVariant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une des revendications 20 précédentes, ledit variant étant un variant de la TdT de séquence SEQ ID N°1 et comprenant en outre une substitution des résidus compris entre les positions C378 à L406, ou les résidus fonctionnellement équivalents par les résidus H363 à C390 de la polymérase Polµ de séquence SEQ ID N°2, ou les résidus fonctionnellement équivalents.\n<CLM>\1\tAcide nucléique codant un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une 25 des revendications 1 à\n<CLM>\1\t14. Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication\n<CLM>\1\t15. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 13 ou une cassette d'expression selon la revendication\n<CLM>\1\t3052462 31\n<CLM>\1\tCellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 13 ou une cassette d'expression selon la revendication 14 ou un vecteur selon la revendication\n<CLM>\1\t17. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 13, d'une cassette d'expression selon la revendication 14, d'un vecteur selon la revendication 15 ou d'une cellule selon la 5 revendication 16, pour produire un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-12.\n<CLM>\1\tProcédé de production d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-12, selon lequel on cultive une cellule hôte selon la revendication 16 dans des conditions de culture permettant l'expression de l'acide nucléique 10 codant ledit variant, et optionnellement on récupère ledit variant ainsi exprimé à partir du milieu de culture ou desdites cellules hôtes.\n<CLM>\1\tUtilisation d'un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-12, pour synthétiser une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, à partir de nucléotides modifiés en 3'-OH. 15\n<CLM>\1\tUtilisation selon la revendication 19, pour synthétiser un brin d'ADN ou un brin d'ARN.\n<CLM>\1\tProcédé de synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice, selon lequel on met en contact un brin amorce avec au moins un nucléotide, préférentiellement un nucléotide modifié en 3'-OH, en présence d'un variant d'une ADN polymérase de la famille poD( selon l'une quelconque des revendications 1-12. 20\n<CLM>\1\tKit pour la synthèse enzymatique d'une molécule d'acide nucléique sans brin matrice comprenant au moins un variant d'une ADN polymérase de la famille polX selon l'une quelconque des revendications 1-12, des nucléotides, préférentiellement des nucléotides modifiés en 3' -OH, et optionnellement au moins une amorce nucléotidique.