Brevet FR3051195A1 (20171117)
REVENDICATIONS1. Puce microfluidique de culture cellulaire qui contient un module central (104) comprenant : - une unité centrale (105), laquelle contient - un support constitué d'une membrane non résorbable (1), comportant une face supérieure (2) et une face inférieure (3), perforé par au moins une perforation (4), ledit support (1) étant composé notamment de plastique bioimprimé, de polycarbonate, de plastique de culture tissulaire, de verre ou de SU8, - une membrane poreuse nanostructurée en 3D (5), comportant une face supérieure (6) et une face inférieure (7), et comportant au moins une protubérance (8), ladite au moins une protubérance comportant une face externe (9) et une face interne (10) et formant une structure en relief du coté de la face supérieure (6) de la membrane nanostructurée en 3D (5), ladite protubérance étant notamment en forme de dôme creux présentant une base circulaire (13), ladite face inférieure (7) de ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) étant positionnée de façon solidaire sur ladite face supérieure (2) dudit support (1), et ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) et la au moins une protubérance (8) étant composées de matériaux appropriés pour la culture de deux types de cellules distincts ; - un socle (106), ladite unité centrale (105) étant intégrée dans ledit socle (106), et formant un tout avec ledit socle (106).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon la revendication 1, dans laquelle ladite au moins une perforation (4) du support (1) présente 3051195 82 une section (11) de forme circulaire au niveau de la face supérieure du support (1) (section supérieure de la perforation) présentant un diamètre dl (diamètre supérieur dl de la perforation) et un axe (x) passant par le centre de ladite section supérieure (11) de la perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), et une section (12) de forme circulaire au niveau de la face inférieure (3) du support (1) (section inférieure de la perforation) présentant un diamètre d2 (diamètre inférieur d2 de la perforation) et un axe (w) passant par le centre de ladite section inférieure de la perforation et perpendiculaire audit support (1), dans laquelle lesdits axes (x) et (w) sont confondus, le diamètre dl étant d'une valeur supérieure ou égale à 10 itm à une valeur inférieure ou égale à 500 pm, et le diamètre d2 étant d'une valeur supérieure ou égale à 10 1..tm à une valeur inférieure ou égale à 500 µm, tel que la valeur du diamètre d2 est supérieure ou égale à la valeur du diamètre dl, et dans laquelle ladite base circulaire (13) de ladite protubérance (8) présente un diamètre d3 (diamètre d3 de la base circulaire de la protubérance), ledit diamètre d3 de la protubérance (8) étant d'une valeur de 10 µm à une valeur de 500 jam, et étant d'une valeur inférieure, égale ou supérieure à dl, et ladite protubérance a une hauteur de 1 à 600 jam, plus particulièrement de 1 à 300 itm, plus particulièrement de 50 à 300 Inn, plus particulièrement de 50 lam.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 et 2, dans laquelle ladite face interne (10) de ladite au moins une protubérance (8) est en totalité ou en partie en regard de ladite au moins une perforation (4) dudit support (1), et notamment en totalité en regard de ladite au moins une perforation (4) dudit support (1) : - lorsque la valeur du diamètre supérieur dl de ladite au moins une perforation (4) est supérieure ou égale à la valeur du diamètre d3 de ladite au moins une protubérance (4), et que l'axe (y), passant par le centre de ladite base circulaire (13) et perpendiculaire 3051195 83 audit support (1), et l'axe (x), passant par le centre de la section supérieure (11) de ladite perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), sont confondus; ou - lorsque la valeur du diamètre supérieur dl de ladite au moins une perforation (4) est supérieure à la valeur du diamètre d3 de ladite au moins une protubérance (8), et que l'axe (y), passant par le centre de ladite base circulaire (13) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (x), passant par le centre de la section supérieure (11) de ladite perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), sont distincts l'un par rapport à l'autre d'une distance d'une valeur inférieure ou égale à [(valeur de dl - valeur de d3)/2].\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 3, dans laquelle la face externe (9) de ladite protubérance (8) supporte au moins une cellule adhérente, ladite au moins une cellule adhérente étant en particulier une cellule stromale, et dans laquelle la face interne (10) de ladite protubérance (8) supporte au moins une cellule adhérente, ladite au moins une cellule adhérente étant en particulier une cellule épithéliale, et plus particulièrement, ladite face externe (9) de ladite protubérance (8) supporte un premier ensemble de cellules adhérentes au stade de la confluence, ledit premier ensemble étant un ensemble de cellules stromales, et ladite face interne (10) de ladite protubérance (8) supporte un deuxième ensemble de cellules adhérentes au stade de la confluence, ledit deuxième ensemble étant un ensemble de cellules épithéliales.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 4, comportant au moins deux protubérances (8) et dans laquelle la distance entre deux protubérances contigües est d'une valeur 1, ladite valeur 1 étant de 10 à 100 lm, plus particulièrement de 50 à 100 lam, et comporte un nombre maximal de protubérances (8) pour une surface de l'unité centrale de 1 cm2 égal à la formule (d3/2)2 (1 + d3) - it (d3/2)2 3051195 84 où 1 est la distance entre deux protubérances (8) contigües, ladite valeur 1 étant de 10 à 100 itm, plus particulièrement de 50 à 100 pm, et où d3 est le diamètre de la base circulaire (13) de ladite protubérance (8).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 5, dans laquelle la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) est constituée d'au moins une couche d'un polyélectolyte choisi parmi le poly(sodium 4-styrènesulphonate) (PSS) , le poly(éthylèneimine), le poly(chlorure de diallyldimethylammonium), le poly(chlorure de acrylamide-co-diallyldimethylammonium), le chlorure de diallyldiméthyllammonium, le poly(hydrochlorure d' allylamine) (PAH), l'acide polyanetholesulfonique, l'acide polyacrylique, l'acide polystyrène-alt-maléique, le sulfate de polyvinyle, l'acide polyvinylsulfonique, l'acide poly(2-acrylamido-2- méthyl-l-propanesulfonique), le polyacide 2-acrylamido-2-méthyl-l- propanesulfonique -co-acrylonitrile), l'acide poly 4-styrènesulfonique, le poly(acide 4- styrènesulfonique-co-acide maléique), le sel de sodium de 4-styrènesulfonique hydraté, et dans laquelle lorsque ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) est constituée d'au moins deux couches successives, une couche constituée d'un un polyélectrolyte chargé positivement est en alternance d'une couche constituée d'un polyélectrolyte chargé négativement, ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) étant en particulier constituée 1 à 150 couches successives de polyélectrolyte, et plus particulièrement ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) étant constituée de 15 couches successives de poly(sodium 4-styrènesulphonate) (PSS) et/ou de poly(allylamine hydrochloride) (PAH), en alternance l'une de l'autre.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 6, qui contient un module inférieur (107) solide, comportant - une unité inférieure (108) laquelle contient une face supérieure, une face inférieure et au moins une face latérale, et comprenant au moins un canal (14) de forme tubulaire comportant un orifice supérieur (15) de diamètre d4 présentant un axe (t) passant par le centre dudit orifice 3051195 85 supérieur (15) et perpendiculaire audit support (1), et un orifice inférieur de diamètre d5 (16), - un socle (109), ladite unité inférieure (108) étant intégrée dans ledit socle (109), et formant un tout avec ledit socle (109), ladite unité inférieure (108) et ledit socle (109) sont composés notamment de plastique bioimprimé, de polycarbonate, de plastique de culture tissulaire ou de SU8, ladite valeur du diamètre d4 dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) étant supérieure ou égale à la valeur du diamètre d5 dudit orifice inférieur (16) dudit canal (14) et ladite valeur du diamètre d4 étant supérieure ou égale à la valeur du diamètre inférieur d2 de ladite au moins une perforation (4). ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108) comportant ledit orifice supérieur (15) du au moins un canal, et ledit orifice inférieur (16) débouchant, lui-même ou par des moyens intermédiaires (17), à l'extérieur dudit socle (109).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 7, dans laquelle ledit module inférieur (107) et ledit module central (104) sont assemblés tel que l'orifice supérieur (15) du au moins un canal (14), de ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108), s'ouvre sur au moins une desdites perforations (4) dudit support (1) de ladite unité centrale (105), et l'orifice inférieur (16) du au moins un canal (14), débouche lui-même à l'extérieur de la puce, ou via un moyen intermédiaire constitué par un réservoir (17) apte à récupérer des liquides et permettant un acheminement à l'extérieur de la puce via un canal de sortie (18) débouchant à l'extérieur du socle (109) dudit module inférieur (107), ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108) et ladite face inférieure dudit support de ladite unité centrale (105) ayant une forme et une surface identique entre elles, et ladite unité inférieure (108) et ladite unité centrale (105) étant assemblées par des éléments de fixation (204) situés respectivement sur chacun des socles du module inférieur (109) et du module central (106), de façon à assembler de manière étanche 3051195 86 ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108) et ladite face inférieure dudit support (3) de ladite unité centrale (105).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 8, dans laquelle ledit orifice supérieur (15) dudit au moins un canal (14) débouche sur une seule perforation (4) dudit support (1), et dans laquelle ladite perforation (4) dudit support (1) est en totalité en regard dudit orifice supérieur (15) dudit au moins un canal (14) : - lorsque la valeur du diamètre inférieure d2 de ladite perforation (4) est égale à la valeur du diamètre d4 dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14), et que l'axe (w), passant par le centre de ladite section inférieure (12) de la perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (t), passant par le centre dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) et perpendiculaire audit support (1), sont confondus, ou - lorsque la valeur du diamètre inférieure d2 de ladite perforation (4) est inférieure à la valeur du diamètre d4 dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14), et que l'axe (w), passant par le centre de ladite section inférieure (12) de la perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (t), passant par le centre dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) et perpendiculaire audit support (1), sont confondus, ou distincts l'un par rapport à l'autre d'une distance d'une valeur inférieure ou égale à [ (valeur de d4 - valeur de d2) /2].\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 9, dans laquelle ledit module inférieur (107) comporte au moins deux canaux (14), et dans laquelle chacun des orifices supérieurs (15) des au moins deux canaux (14) débouche sur une perforation (4) - et les au moins deux orifices inférieurs (16) des au moins deux canaux (14) débouchent à l'extérieur de la puce respectivement à au moins deux emplacements distincts, - ou les au moins deux orifices inférieurs (16) de l'ensemble des au moins deux canaux (14) débouchent sur un même moyen intermédiaire constitué par un réservoir (17) apte à récupérer des liquides et permettant un acheminement à l'extérieur de la puce via un canal de sortie (18) débouchant à l'extérieur du socle (109) dudit module inférieur (107). 3051195 87\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 6, qui contient un module supérieur (101) comprenant : - une unité supérieure (102) solide et creuse, laquelle est constituée d'une surface pleine définissant un volume ouvert (chambre) (203), et les bords de la surface pleine étant aptes à être en contact avec ladite unité centrale (105) dudit module central (104) et délimitant la surface de l'ouverture dudit volume ouvert ; - et un socle (103), ladite unité supérieure (102) étant intégrée dans ledit socle (103), et formant un tout avec ledit socle (103). et dans laquelle ladite unité supérieure (102) et ledit socle (103) sont notamment composés de plastique bioimprimé, de polycarbonate, de plastique de culture tissulaire ou de SU8.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 6 et selon la revendication 11, dans laquelle ladite unité supérieure (102) dudit module supérieur (101) et ladite unité centrale (105) dudit module central (104) sont assemblées de sorte que ladite surface de l'ouverture de ladite unité supérieure (102) est positionnée au-dessus de ladite face supérieure (6) de la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) de ladite unité centrale (105), pour former un espace clos délimité par ladite surface pleine de ladite unité supérieure (102) et ladite face supérieure (6) de la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5), ladite surface de l'ouverture et ladite face supérieure (6) ayant une forme et une surface identiques entre elles, ladite unité supérieure (102) dudit module supérieur (101) et ladite unité centrale (105) dudit module central (104) étant assemblées par des éléments de fixation (201,204) situés sur chacun des socles (103,106) du module supérieur (101) et du module central (104), de façon à assembler de manière étanche ladite surface de l'ouverture de ladite unité supérieure (102) et ladite face supérieure (6) de la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) de ladite unité centrale (105), 3051195 88 et avantageusement ladite au moins une face pleine de ladite unité supérieure (102) présente deux orifices débouchant respectivement sur un canal entrée/sortie (202), permettant audit espace clos de communiquer avec l'extérieur de ladite puce microfluidique via lesdits canaux entrée/sortie (202) qui débouchent à l'extérieur du socle (109).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 6 et selon les revendications 11 et 12, comportant un module supérieur (101), un module central (104) et un module inférieur (107), et dans laquelle les susdits modules sont assemblés tel que ladite surface de l'ouverture de ladite unité supérieure (102) dudit module supérieur (101) est positionnée au-dessus de ladite face supérieure (2) de la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) de ladite unité centrale (105) dudit module central (104), et l'orifice supérieur (15) du au moins un canal (14), de ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108) dudit module inférieur (107), s'ouvre sur au moins une desdites perforations (4) dudit support (1) de ladite unité centrale (105), ladite surface de l'ouverture de ladite unité supérieure (102) et ladite face supérieure (2) de la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) de ladite unité centrale (105) ayant une forme et une surface identiques entre elles, ladite face supérieure de ladite unité inférieure (108) et ladite face inférieure dudit support (3) de ladite unité centrale (105) ayant une forme et une surface identiques entre elles, et ledit module supérieur (101), ledit module central (104) et ledit module inférieur (107) étant assemblés par des éléments de fixation (201,\n<CLM>\1\tsitués sur chacun des socles respectifs (103, 106,\n<CLM>\1\tnotamment dans laquelle ladite face interne (10) de ladite protubérance (8) est en totalité en regard dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) : lorsque ladite face interne (10) de ladite au moins une protubérance (8) est en totalité en regard de ladite au moins une perforation (4) dudit support (1) : 3051195 89 - tel que lorsque la valeur du diamètre supérieur dl de ladite au moins une perforation (4) est supérieure ou égale à la valeur du diamètre d3 de ladite au moins une protubérance (4), et que l'axe (y), passant par le centre de ladite base circulaire (13) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (x), passant par le centre de la section supérieure (11) de ladite perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), sont confondus; ou - tel que la valeur du diamètre supérieur dl de ladite au moins une perforation (4) est supérieure à la valeur du diamètre d3 de ladite au moins une protubérance (8), et que l'axe (y), passant par le centre de ladite base circulaire (13) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (x), passant par le centre de la section supérieure (11) de ladite perforation (4) et perpendiculaire audit support (1), sont distincts l'un par rapport à l'autre d'une distance d'une valeur inférieure ou égale à [(valeur de dl - valeur de d3)/2] ; et lorsque ladite perforation (4) dudit support (1) est en totalité en regard dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) : tel que l'axe (y), passant par le centre de ladite base circulaire (13) de ladite protubérance (8) et perpendiculaire audit support (1), et l'axe (t), passant par le centre dudit orifice supérieur (15) dudit canal (14) et perpendiculaire audit support (1), sont confondus, ou distincts l'un par rapport à l'autre d'une distance inférieure ou égale à [(valeur de d4 valeur de d3)/2] lorsque la valeur de d4 est supérieure à la valeur de d2.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication d'une puce microfluidique de culture cellulaire selon les revendications 1 à 6, dans lequel la fabrication de ladite unité centrale (105) dudit module central (104) comprend : - une étape d'extrusion d'une solution de polymère résorbable (22), à travers la au moins une perforation (4) dudit support (1) pour former au moins une nanostructure 3D (23) du côté de ladite face supérieure (2) dudit support (1), ladite au moins une nanostructure étant notamment en forme de dôme, suivi de 3051195 90 - une étape de polymérisation de ladite solution de polymère résorbable pour rigidifier ladite au moins une nanostructure 3D (23), ladite au moins une nanostructure 3D (23) formant un moule en polymère résorbable (22) du côté de ladite face supérieure dudit support après polymérisation, suivi par - une étape d'application d'au moins une couche continue d'au moins un polyélectrolyte recouvrant la face supérieure (2) dudit support (1) et la surface dudit moule en polymère résorbable (22), pour constituer la membrane poreuse nanostructurée en 3D (5), par - une étape de dissolution dudit moule en polymère résorbable pour obtenir ladite face inférieure (7) de ladite membrane poreuse nanostructurée en 3D (5) positionnée de façon solidaire sur ladite face supérieure (2) dudit support (1) et ladite face interne (10) de la au moins une protubérance (8) positionnée en totalité en regard de ladite au moins une perforation (4), ledit polymère résorbable (22) étant en particulier choisi parmi le chitosan, l'agarose et l'alginate.