Brevet FR3051482A1 (20171124)
REVENDICATIONS1 - Procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique humain comprenant des acides nucléiques totaux, comportant les 5 étapes suivantes : - extraction des acides nucléiques totaux dudit échantillon biologique - séquençage haut débit desdits acides nucléiques totaux - traitement informatique des données de séquençage 10 consistant à o dénombrer le nombre total de séquences o filtrer lesdites séquences en fonction d'un score de qualité o filtrer des séquences humaines par alignement de 15 séquences avec les séquences du génome de référence humain caractérisé en ce que lesdites étapes de traitement informatique comprennent en outre : - une étape initiale de calibration consistant à 20 caractériser une pluralité d'échantillons de référence dont la concentration en micro-organisme est connue, et à enregistrer une matrice correspondant à la profondeur déterminée par ladite caractérisation, et la concentration en micro-organisme connue correspondante 25 - une étape de masquage de 0 à 5% des nucléotides du génome de référence d'au moins un micro-organisme par rapport aux nucléotides totaux dudit génome de référence, lesdits nucléotides masqués correspondant à des séquences de faible complexité 30 - le filtrage des séquences d'au moins un micro-organisme par alignement de séquences non humaines avec les 3051482 42 séquences du génome de référence d'au moins un microorganisme d'au moins un échantillon de référence le calcul de la profondeur de séquençage du génome de référence d'au moins un micro-organisme - la validation de l'homogénéité de la couverture du génome d'au moins un micro-organisme consistant à calculer l'écart-type de la profondeur de séquençage du génome à la référence dudit génome d'au moins un micro-organisme - la détermination d'un indicateur de la quantification d'au moins un micro-organisme fonction de ladite profondeur de séquençage du génome de référence 2 - Procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de calcul de la profondeur de séquençage du génome de référence d'au moins un micro-organisme comprend un traitement de normalisation de la profondeur par rapport au nombre total de séquences issues du séquençage. 3 - Equipement pour la détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comporte un calculateur commandé par un programme d'ordinateur pour la réalisation des traitements de : - calibration initiale consistant à caractériser une pluralité d'échantillons de référence dont la concentration en micro-organisme est connue, et à enregistrer une matrice correspondant à la profondeur déterminée par ladite caractérisation, et la concentration en micro-organisme connue correspondante - masquage de 0 à 5% des nucléotides du génome de référence d'au moins un micro-organisme par rapport aux nucléotides totaux dudit génome de référence, lesdits nucléotides 3051482 43 masqués correspondant à des séquences de faible complexité - filtrage des séquences d'au moins un micro-organisme par alignement de séquences non-humaines avec les séquences 5 d'au moins un génome de référence dudit micro-organisme d'au moins un échantillon de référence - calcul de la profondeur de séquençage dudit génome de référence - la validation de l'homogénéité de la couverture du génome 10 d'au moins un micro-organisme consistant à calculer l'écart-type de la profondeur de séquençage du génome à la référence dudit génome d'au moins un micro-organisme - détermination d'un indicateur de concentration en microorganisme fonction de ladite profondeur de séquençage du 15 génome de référence. 4 - Programme d'ordinateur commandant un calculateur d'un équipement pour la détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il commande la 20 réalisation des traitements de : - calibration initiale consistant à caractériser une pluralité d'échantillons de référence dont la concentration en micro-organisme est connue, et à enregistrer une matrice correspondant à la profondeur 25 déterminée par ladite caractérisation, et la concentration en micro-organisme connue correspondante - masquage de 0 à 5% des nucléotides du génome de référence d'au moins un micro-organisme par rapport aux nucléotides totaux dudit génome de référence, lesdits nucléotides 30 masqués correspondant à des séquences de faible complexité - filtrage des séquences d'au moins un micro-organisme par alignement de séquences non-humaines avec les séquences 3051482 44 du génome de référence dudit micro-organisme d'au moins un échantillon de référence - calcul de la profondeur de séquençage du génome de référence 5 - la validation de l'homogénéité de la couverture du génome d'au moins un micro-organisme consistant à calculer l'écart-type de la profondeur de séquençage du génome à la référence dudit génome d'au moins un micro-organisme - détermination d'un indicateur de concentration en micro- 10 organisme fonction de ladite profondeur de séquençage du génome de référence. 5 - Kit pour la détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique conformément au procédé selon la revendication 1 caractérisé 15 en ce qu'il comprend : une pluralité de tubes contenant chacun une dilution d'au moins une séquence d'ADN d'un génome de référence d'au moins un micro-organisme dans un ADN contrôle - un tube contenant de l'ADN contrôle 20 - la séquence nucléotidique du génome de référence d'au moins un micro-organisme dont 0 à 5% des nucléotides sont masqués, lesdits nucléotides masqués correspondant à des séquences de faible complexité. 6 - Application du procédé de détermination de la présence et 25 quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 1 à la détermination de la concentration d'un parasite. 7 - Application du procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un 30 échantillon biologique selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit parasite est un organisme procaryote. 3051482 45 8 - Application du procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit parasite est un virus. 5 9 - Application du procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit parasite est un organisme eucaryote. 10 - Application du procédé de détermination de la présence et 10 quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 6 pour le diagnostic prénatal caractérisé en ce que ledit parasite est un cytomégalovirus. 11 - Application du procédé de détermination de la présence et 15 quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 6 pour le diagnostic d'un cancer induit par le virus Epstein Barr et/ou le suivi d'un traitement anticancéreux caractérisé en ce que ledit parasite est un virus Epstein Barr. 20 12 - Application du procédé de détermination de la présence et quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon biologique selon la revendication 6 pour le suivi d'une greffe caractérisé en ce que ledit parasite est un virus cytomégalovirus. 25 13 - Kit pour le diagnostic prénatal mettant en oeuvre le procédé conforme à la revendication 1 caractérisé en ce que ladite séquence du génome de référence d'au moins un microorganisme est un cytomégalovirus dont jusqu'à 0,06% des nucléotides sont masqués. 30 14 - Kit pour le suivi d'une greffe mettant en oeuvre le procédé conforme à la revendication 1 caractérisé en ce que 3051482 46 ladite séquence du génome de référence d'au moins un microorganisme est un cytomégalovirus. 15 - Kit pour le diagnostic d'un cancer induit par le virus Epstein Barr et/ou le suivi d'un traitement anticancéreux 5 mettant en oeuvre le procédé conforme à la revendication 1 caractérisé en ce que ladite séquences du génome de référence d'au moins un micro-organisme est un virus Epstein Barr.