Brevet FR3049708A1 (20171006)
REVENDICATIONS1- Méthode pour déterminer dans des échantillons biologiques complexes en résonance plasmonique de surface la concentration active d'un analyte et, facultativement des constantes cinétiques d'interaction de l'analyte avec un ligand comprenant la fourniture d'une puce de résonance plasmonique de surface sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique d'un ligand de l'analyte ; la capture par l'agent de capture d'un ligand témoin ne liant pas l'analyte à tester ; le passage de l'échantillon sur la puce injecté à un flux déterminé pendant un temps déterminé ; la régénération de la surface; la capture par l'agent de capture d'un ligand liant l'analyte à tester ; le passage de l'échantillon sur la puce injecté à un même flux déterminé pendant un même temps déterminé ; la soustraction du sensorgramme obtenu avec le ligand témoin du sensorgramme obtenu avec le ligand liant l'analyte à tester ; et le calcul de la concentration active de l'analyte et, facultativement des constantes cinétiques d'interaction de l'analyte avec le ligand, et caractérisée en ce que le ligand témoin et le ligand liant l'analyte à tester sont de masse similaire et, le ligand témoin et le ligand liant l'analyte à tester sont capturées en quantité équivalente par l'agent de capture. 2- Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'échantillon biologique complexe est sélectionné parmi le sérum, le plasma, les urines, les liquides de lavages, une ascite, les éluats de biopsies et les milieux de culture cellulaire. 3- Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'échantillon biologique complexe est le sérum ou le plasma. 3049708 37 4- Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-3, caractérisée en ce que l'échantillon est injectée à au moins deux flux différents et que la concentration active de l'analyte dans l'échantillon biologique complexe est calculée. 5 5- Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-4, caractérisée en ce que l'échantillon est injectée à différentes concentrations et que les constantes cinétiques d'interaction de l'analyte avec le ligand dans l'échantillon biologique complexe sont calculées. 10 6- Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-5, caractérisée en ce que le couple analyte-ligand est choisi parmi un couple anticorps-antigène, un couple ligand/récepteur, un couple xénobiotique/cible moléculaire. 7- Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-6, caractérisée en ce que 15 l'analyte est un anticorps anti-HLA, le ligand témoin est un antigène HLA non reconnu par l'anticorps à tester et le ligand liant l'analyte à tester est un antigène HLA cible de l'anticorps à tester. 8- Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'échantillon subit un ou 20 des traitements préalables sélectionnées parmi un traitement thermique, un traitement au dithiothréitol (DU), une étape de purification des IgG sur une résine de protéine G, une étape de concentration de l'échantillon, une étape de dialyse, en particulier avec un seuil de coupure (cut-off) de 100 kDa, et une combinaison de plusieurs de ces traitements. 25 9- Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'échantillon subit préalablement une combinaison d'un traitement thermique et d'une étape de purification des IgG sur une résine de protéine G. 30 10- Méthode selon l'une quelconque des revendications 8-9, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape préalable dans laquelle les anticorps anti-HLA dans l'échantillon sont détectés. 3049708 38 11- Kit adapté à la méthode selon l'une quelconque des revendications 8-10, comprenant une puce de résonance plasmonique de surface comprenant au moins deux ou trois pistes choisies parmi les pistes suivantes : - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes 5 HLA de classe I, par exemple spécifique de la P2 microglobuline ; - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes HLA-DO (classe II) ; - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes HLA-DR (classe II) ; et 10 - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes HLA-DP (classe II). 12- Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes 15 HLA de classe I, par exemple spécifique de la P2 microglobuline ; - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes HLA-DO (classe II) ; et - une piste sur laquelle est immobilisé un agent de capture spécifique des antigènes HLA-DR (classe II). 20