Brevet FR3040175A1 (20170224)
REVENDICATIONS1. Procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes : (a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ; (b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ; (c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ; (e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e).\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, comprenant en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail.\n<CLM>\1\tProcédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte les cassures double brin en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ pulsé.\n<CLM>\1\tProcédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1, PhosphoDNAPK, MDC1.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 4, dans lequel on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel on procède à une contre- coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN).\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel : 3040175 20 - A l'étape (e) la concentration de travail est une concentration de référence Cref préalablement déterminée, On détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de 5 micronoyaux (MN) On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2AX(24, Cref) et NMN(t, 24h), o et si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) 5 2, ou bien si NMN(24h, Cref) 5 0.5%, 10 alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I», o si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) >8, ou bien NMN(24h, Cref) > 10% , alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de 15 Groupe III », o pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ».\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite concentration de travail est une concentration de référence Cref déterminée par un procédé 20 dans lequel : (y) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en plusieurs fractions ; (vi) On applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou 25 biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du pM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ; 30 (vii) On détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ; (viii) On détermine : o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NpH2AX(t, C)), (cette détermination se faisant de 3040175 21 préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI), o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)), o l'écart-type o sur ces mesures respectives, sachant que ces mesure sont être effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne), o la concentration de référence dite Cref en tant que la concentration qui donne : NpH2AX(24h, Cref) + 20 = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2a = 0,5%.