Brevet FR3050448A1 (20171027)
REVENDICATIONS1. Une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon la revendication 1, selon laquelle le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, selon laquelle le site externe du domaine A est constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p.\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 3, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. 20\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 4, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon la revendication 5, selon laquelle le peptide a été inséré entre deux 25 acides aminés consécutifs de la séquence Ki381139E140C141G1425143, lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO: 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques. 30 15\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 6, selon laquelle le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses). 3050448 45\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 7, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9).\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 8, selon laquelle la séquence d'acides 5 aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t10. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 9, selon laquelle l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se 10 termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel : a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ; b. M est la séquence X1GSLX5X6GX8LX10 (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, la séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO: 37), dans laquelle X1 et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO :\n<CLM>\1\tet, c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).\n<CLM>\1\tLa nanoparticule selon la revendication 10, selon laquelle la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchainement d'acides aminés du type I-M-T.\n<CLM>\1\tUn vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet 13, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, 3050448 46 respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou 5 SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).\n<CLM>\1\tUne cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique selon la revendication\n<CLM>\1\t10\n<CLM>\1\tUne cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence 15 d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet [3, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchainement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre 20 total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses, de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée 25 entre 0 et 5 (bornes incluses).\n<CLM>\1\tUn procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline telles que définies selon l'une des revendications 1 à 10, selon lequel : a. On cultive des cellules hôtes telles que définies selon la revendication 13 ou 14 dans 30 des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline. 3050448 47\n<CLM>\1\tUn procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel : a. On clarifie un broyat de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; 5 b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans 10 l'éluat au moyen d'une solution biphasique ; e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. 15\n<CLM>\1\tUne composition immunogène comprenant des nanoparticules selon l'une des revendications 1 à\n<CLM>\1\t18. Une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un 20 assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet (3 du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la 25 séquence d'acides aminés du premier feuillet p.\n<CLM>\1\tLa composition immunogène selon la revendication 17 ou 18, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). 30\n<CLM>\1\tLa composition immunogène selon la revendication 19, selon laquelle la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.\n<CLM>\1\tUn monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré dans sa séquence d'acides aminés un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). 3050448 48\n<CLM>\1\tLe monomère d'encapsuline selon la revendication 21, selon lequel le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet 13 du domaine A et de la séquence 5 d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet p.\n<CLM>\1\tUne séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline selon la revendication 21 ou\n<CLM>\1\t10\n<CLM>\1\tLa séquence d'acide nucléique selon la revendication 23, qui est la séquence SEQ ID NO : 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t15\n<CLM>\1\tUn vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 23 ou 24.