Brevet FR3045070A1 (20170616)
REVENDICATIONS1. Procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient, dans lequel procédé: (a) on isole des cellules nucléées cibles constituant l'échantillon cellulaire ; (b) on irradie ledit échantillon cellulaire avant ou après l'étape (a) avec une dose absorbée D d'un rayonnement ionisant, (c) on récupère les fractions cytoplasmiques et nucléaires de l'échantillon cellulaire ; (d) on détermine sur les fractions cytoplasmiques et/ou nucléaires dudit échantillon cellulaire, soit : (dl) la quantité de substrat nucléaire phosphorylé par la protéine ATM activée à au moins un temps d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, de préférence à au moins un temps d'observation t2 après irradiation avec une dose absorbée D, (d2) l'activité kinase par la quantification de pATM phosphorylée à au moins un temps d'observation t sélectionné parmi t= t1, t2 ; (e) on détermine au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : - le grade de sévérité de la réaction tissulaire post-radiothérapie du patient selon la classification CTCAE, en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); - la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (.0; et où - tl est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de cassures double-brin (CDB) reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50 % des CDB sont réparées dans des fibroblastes témoins issus de patients radiorésistants et le temps au bout duquel 30 % des CDB sont réparées dans des lymphocytes ou lymphoblastes témoins issus de patients radiorésistants; - t3 est une valeur fixe qui représente z fois t2, où z est compris entre 1,1 et 8, et de préférence compris entre 1,2 et\n<CLM>\1\t2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel à l'étape (dl) la quantité de substrat phosphorylée par la protéine ATM activée est détectée par spectrométrie de masse.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel : (i) on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant, si à un instant d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, et préférentiellement à t2, la relation qPID,,,' z qPPcyto est valable, (ii) on considère que l'échantillon est très radiosensible, si à un instant d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, et préférentiellement à t2, la relation qP/Dcyto > qPIDnu, est valable. où 3045070 24 - qPPcyto correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction cytoplasmique de l'échantillon cellulaire, - qP/:',.,', correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction nucléaire de l'échantillon cellulaire. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la quantité de la protéine pATM activée est détectée dans le cytoplasme et le noyau cellulaire par un test ELISA. 10\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon cellulaire est choisi parmi : un échantillon sanguin comprenant des lymphocytes ou des lymphoblastes et un échantillon issu d'une biopsie.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les dites-cellules 15 nucléées cibles sont choisis parmi : des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant est déterminée 20 sur des lymphoblastes et des lymphocytes issus de cellules sanguines et dans lequel - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM max nuc z 0,3 ng par million de cellules, on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM max nuc\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans lequel on détermine le grade de sévérité de la réaction tissulaire post-radiothérapie selon la classification 30 CTCAE selon la formule : 10 (BA I X PATMmax nuc - pATMmax nuc grade CTCAE = 5 - --c In où pATM max nuc désigne la quantité nucléaire maximale en ng de pATM par million de cellules dans des fibroblastes, A est une constante entière ou décimale qui 35 représente la quantité maximale de pATMmax nuc atteinte pour un échantillon radiorésistant, et qui appartient à l'intervalle [0,25 ,1] ng par million de cellule. B est une constante d'ajustement entière ou décimale qui appartient à l'intervalle [200 ,300] C est une constante d'ajustement décimale qui appartient à l'intervalle [0,1, 0,3] et qui 40 correspond à l'inverse d'un nombre de foci pATM. 3045070 25\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel on détermine des Intervalles de pATMmax nue en ng par million de cellules dans des fibroblastes et les grades CTCAE correspondants : Grades CTCAE pATMmax nuc (en ng par million de cellules) 0-1 ..k0,25 2-3 20,07 et\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie de patient et dans lequel - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM max nuc Z 0,25 ng par 10 million de cellules, on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM max nuc