Brevet FR3050997A1 (20171110)
REVENDICATIONS1. Plasmide pour la modification d'une séquence cible d'ADN chromosomique d'une souche bactérienne par recombinaison homologue, comprenant les éléments suivants : (\n<CLM>\1\tune origine de réplication thermosensible, (\n<CLM>\1\tun acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, (3) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle d'un promoteur inductible sur milieu riche.\n<CLM>\1\tPlasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'origine de réplication thermosensible est de type théta et comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:1, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d'identité avec SEQ ID NO:1.\n<CLM>\1\tPlasmide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant la protéine cytotoxique comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:2, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d'identité avec SEQ ID NO:2.\n<CLM>\1\tPlasmide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur sur milieu riche est un promoteur inductible à l'arabinose et comprend la séquence SEQ ID NO:3, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d'identité avec SEQ ID NO:3.\n<CLM>\1\tPlasmide selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant : (\n<CLM>\1\tune origine de réplication thermosensible de type théta de séquence présentant entre 90% et 100% d'identité avec SEQ ID NO:1, (2) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, (3) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique de séquence présentant entre 90% et 100% d'identité avec SEQ ID NO:2, sous 3050997 2 contrôle d'un promoteur inductible sur milieu riche en présence d'arabinose, de séquence présentant entre 90% et 100% d'identité avec SEQ ID NO:3. 5\n<CLM>\1\tPlasmide selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant en outre (4) deux fragments d'acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d'ADN chromosomique flanquant les extrémités 5' et 3' respectivement d'une séquence cible à modifier, et le cas échéant (5) un acide nucléique comprenant une séquence de remplacement de la séquence cible à modifier. 10\n<CLM>\1\tProcédé de modification d'une séquence cible d'ADN chromosomique d'une souche bactérienne comprenant, a) la transformation d'une souche bactérienne avec un plasmide selon l'une des revendications 1 à 6, 15 b) la culture de ladite souche transformée sur milieu sélectif à une température permissive, c) le cas échéant, la conservation des souches transformées dans un milieu approprié pour la congélation, d) la culture des souches transformées sur milieu solide riche sélectif à une 20 température non-permissive, pour la sélection des clones ayant intégré le plasmide dans leur génome, e) le repiquage des clones positifs obtenus à l'étape d) et leur culture sur milieu non sélectif et à température non-permissive, dans des conditions permettant l'induction de ladite protéine cytotoxique. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne est une souche Gram-négative, par exemple Escherichia coli. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisé en ce que la modification génomique est une délétion de la séquence cible ou sa substitution par une séquence de remplacement ou l'ajout d'une séquence hétérologue. 3050997 3\n<CLM>\1\tSouche bactérienne comprenant un plasmide selon l'une des revendications 1 à 6.