Brevet FR3040396A1 (20170303)
REVENDICATIONS1. Procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, comprenant les étapes suivantes : i) culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase issu d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés, afin d'obtenir au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, ii) mélange d'au moins un échantillon obtenu à l'étape i) avec une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, puis iii) congélation du mélange obtenu à l'étape ii).\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le saccharide est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le saccharide est un disaccharide choisi parmi le tréhalose et le saccharose.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'alcanediol C3-05 est choisi parmi le propane-1,2-diol, le pentane-1,5-diol et le butane-2,3-diol. 3040396 27\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la sérum albumine humaine est présente en quantité comprise entre 2 et 10% en poids par rapport au poids total de composition, de préférence entre 2.5 et 6% en poids. 5\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le saccharide est présent en concentration comprise entre 0.05M et 1M, de préférence entre 0.07M et 0.5M. 10\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition utilisée à l'étape ii) comprend : a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et 15 c) du DMSO et de la L-cystéine, de préférence respectivement en quantité comprise entre 2 et 15% en poids, et en concentration comprise entre 0.5mM et 2mM.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition utilisée à l'étape ii) comprend : 20 a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et c) du coenzyme Q10 et du propane-1,2-diol, de préférence respectivement en quantité comprise entre 0.007 et 0.1% en poids, et en quantité comprise entre 3 et 25 10% en volume.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la congélation iii) est effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C. 30\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la congélation iii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu en ii) dans un 3040396 28 récipient immergé dans un mélange d' isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en 5 ce que la congélation iii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé.\n<CLM>\1\tUtilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, 10 b) au moins un saccharide, et c) au moins deux ingrédients choisis parmi le DMSO, la L-cystéine, le coenzyme Q10 et les alcanediols en C3-05, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de lymphocytes infiltrant la tumeur, ledit échantillon étant obtenu par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la 15 tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase issu d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin 20 l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 11, ou utilisation selon la revendication 12, dans lequel la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence se fait en présence au moins de cellules 25 nourricières allogéniques irradiées non proliférantes.\n<CLM>\1\tProcédé de cryoconservation selon l'une des revendications 1 à 11 ou 13, ou utilisation selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence se fait par co-culture 30 avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de cellules B transformées par le virus d'Epstein Barr, de préférence la lignée LAZ388, toutes non proliférantes.