Brevet FR3051555A1 (20171124)
REVENDICATIONS1. Procédé de détection par cytométrie en flux de la présence de cellules plasmocytaires normales et de cellules plasmocytaires tumorales dans un échantillon 5 de cellules d'un patient, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) la mise en contact dudit échantillon de cellules avec : - un marqueur de la chaîne K un marqueur de la chaîne X, et un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 et un marqueur de CD138, chacun des trois marqueurs émettant un signal différent, 10 - un ou plusieurs marqueur(s) de cellules plasmocytaires tumorales, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent desdits trois premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s) de CD de cellules plasmocytaires normales, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des 15 quatre premiers signaux, b) la détection des cellules plasmocytaires caractérisées par : - un signal positif avec un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138, et - un signal positif avec un marqueur de la chaîne K ou un marqueur de la chaîne X, 20 c) la détection des cellules plasmocytaires tumorales parmi les cellules plasmocytaires détectées à l'étape b) avec au moins un des critères suivants: - signal positif avec au moins un marqueur spécifique de cellules plasmocytaires tumorales, et/ou - un signal négatif ou significativement réduit avec au moins un marqueur de 25 cellules plasmocytaires normales, d) l'analyse des résultats obtenus lors des étapes b) et c) et la détermination de la présence de cellules plasmocytaires normales et de cellules plasmocytaires tumorales. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que : - les CD spécifiques de cellules plasmocytaires normales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement CD19, CD27, CD45 et CD81 plus préférentiellement CD19, 35 CD27, et 3051555 26 les CD spécifiques de cellules plasmocytaires tumorales du procédé selon l'invention sont choisis parmi : CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement CD56, CD117, CD200.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédente, dans lequel le marqueur CD38 ou CD138 est respectivement un anticorps anti-CD38 ou anti-CD138 conjugué au fluorochrome PE-Cy5.5, le marqueur de ta chaîne K est l'anticorps anti10 chaîne I( conjugué au fluorochrome PE-CF594 et le marqueur de ta chaîne X est un anticorps anti-chaîne X conjugué au fluorochrome FITC.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les marqueurs CD19 et CD27 sont des anticorps anti-CD19 et anti-CD27 conjugués au fluorochromes PE-Cy7, 15 et les marqueurs CD56, CD117 et CD200 sont des anticorps anti-CD56, anti-CD117 et anti-CD200 conjugués aux fluorochrome PE.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre la détermination de l'index de prolifération des plasmocytes tumoraux 20 comprenant les étapes suivantes : A. mise en contact dudit échantillon de cellules avec un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement deux marqueurs, de prolifération cellulaire, émettant un signal différent des autres marqueurs utilisés; B. détection des plasmocytes tumoraux en prolifération par analyse du signal 25 émis par ledit ou lesdits marqueur(s); C. détermination du pourcentage de cellules tumorales et de plasmocytes normaux étant en phase S ; D. optionnellement détermination de la diploïdie (GO/G1 ou G2/M) lorsque au moins un du ou desdits marqueur(s) de prolifération cellulaire est un marqueur 30 de l'ADN.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'échantillon de cellules est choisi parmi des cellules de la moelle osseuse, du sang, du sérum, d'un extrait sanguin, des PBMCs, du liquide céphalorachidien, du liquide pleural et des ganglions lymphatiques, et préférentiellement de la moelle osseuse 35 d'un patient. 3051555 27\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit patient est atteint de gammapathie monoclonale. 5\n<CLM>\1\tProcédé de diagnostic in vitro ou de suivi de gammapathie monoclonale, à partir d'un échantillon de cellules d'un patient comprenant les étapes suivantes :\n<CLM>\1\tla mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, et\n<CLM>\1\tmise en évidence d'un risque de développer une gammapathie monoclonale : a) si la proportion de cellules plasmocytaires tumorales parmi les cellules leucocytaires totales, d'après les résultats de l'analyse de l'étape d) du procédé selon l'invention, dépasse un seuil prédéfini à partir de résultats obtenus par le procédé selon l'invention sur des sujets contrôle sains; et/ou b) si le nombre de plasmocytes tumoraux par unité de volume dépasse un seuil prédéfini.\n<CLM>\1\tProcédé de suivi in vitro de l'évolution de la maladie d'un patient atteint d'une gammapathie monoclonale, à partir d'un premier et d'un second échantillon de cellules du patient, comprenant les étapes suivantes : i) la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 7 dans un premier échantillon de cellules du patient ii) la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 7 dans un second échantillon de cellules du patient, ledit second échantillon ayant été prélevé après le prélèvement dudit premier échantillon, et iii) la comparaison de l'analyse des résultats de l'étape d) obtenus avec le premier et le second échantillon, et iv) le suivi de l'évolution de ladite gammapathie monoclonale dudit patient d'après les résultats de l'analyse de l'étape iii).\n<CLM>\1\tComposition comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne K et un marqueur de la chaîne X, émettant chacun un signal différent, 3051555 28 - un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138, ledit marqueur émettant un signal différent des deux premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux 5 marqueurs, de CD spécifiques de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement les marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, 10 chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux, et - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD spécifiques de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi les 15 marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des 20 quatre premiers signaux.\n<CLM>\1\tUtilisation d'une composition comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne I( et un marqueur de la chaîne 2t. émettant un signal différent, 25 - un marqueur choisi parmi : un marqueur de CD38 et un marqueur de CD138, ledit marqueur émettant un signal différent des deux premiers signaux, - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs de CD de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi 30 les marqueurs de CD19, CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement les marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux, et 3051555 29 - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, 5 CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des quatre premiers des signaux, 10 pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à\n<CLM>\1\t12. Kit pour mettre en oeuvre te procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins : - un marqueur de la chaîne x, et un marqueur de la chaîne ?, émettant chacun un 15 signal différent ; - un marqueur de CD38 ou un marqueur de CD138 émettant un signal différent des deux premiers signaux; - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs de CD de cellules plasmocytaires normales sélectionnés parmi tes marqueurs de CD19, 20 CD27, CD45, CD81, CD5L, CD11a, CD16b, CD24, CD36, CD52, CD68, CD79a, CD80, CD82, CD84, CD99 et CD163, préférentiellement tes marqueurs de CD19, CD27, CD45 et CD81, plus préférentiellement un marqueur de CD19 et un marqueur de CD27, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des trois premiers signaux; et 25 - un ou plusieurs marqueur(s), préférentiellement au moins deux marqueurs, plus préférentiellement au moins trois marqueurs de CD de cellules plasmocytaires tumorales sélectionnés parmi les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, CD28, CD1D, CD2BP2, CD32c, CD47, CD59, CD109, CD229, CD300a et CD320, préférentiellement les marqueurs de CD56, CD117, CD200, CD20, et CD28, plus 30 préférentiellement un marqueur de CD56, un marqueur de CD117 et un marqueur de CD200, chacun de ces un ou plusieurs marqueur(s) émettant un signal différent des quatre premiers signaux.\n<CLM>\1\tKit selon ta revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un 35 marqueur de prolifération cellulaire sélectionné parmi: 3051555 30 des analogues de bases de type BrdU et un anticorps anti-BrdU conjugué à l'APC ou EdU et un azoture couplé à un fluorochrome, préférentiellement l'Alexa Fluor® 647 ; et/ou des marqueurs de protéines du cycle cellulaire actif, par exemple un 5 anticorps anti-Ki67 conjugué à un fluorochrome, préférentiellement l'Alexa Fluor 647®; et/ou des marqueurs d'acides désoxyribonucléiques (ADN), tel que le DAPI, PI, colorant Hoeschst (33342 ou 33258), chacun du ou desdits marqueur(s) de prolifération cellulaire émettant un signal 10 différent des signaux émis par les autres marqueurs présents dans ledit kit, en particulier différent des cinq premiers signaux.