Brevet FR3038915A1 (20170120)
REVENDICATIONS1. Utilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules d'une souche de champignon pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique, ladite variation étant déterminée par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique et dans laquelle le degré de sensibilité correspond soit à un phénotype sensible, soit à un phénotype résistant, soit à un phénotype intermédiaire de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique.\n<CLM>\1\tUtilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules d'une souche de champignon pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon la revendication 1, et de la variation éventuelle du nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon, pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique, ladite variation éventuelle du nombre de cellules étant déterminée par rapport au nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans laquelle ledit champignon est un champignon unicellulaire\n<CLM>\1\tUtilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules d'une souche de champignon selon les revendications 1 et 2, ledit champignon étant un champignon unicellulaire : - dans laquelle le phénotype résistant de ladite souche de champignon vis-à-vis dudit antifongique est déterminé par une augmentation du taux de chitine inférieure à 10 % ou une diminution du taux de chitine ou un taux de chitine stationnaire, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans laquelle le seuil minimal de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, 3038915 142 notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% ; ou - dans laquelle le phénotype intermédiaire de ladite souche de champignon vis-à- 5 vis dudit antifongique est déterminé soit par une augmentation du taux de chitine de 10% à une valeur inférieure à 20%, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, soit par une augmentation du taux de chitine supérieure ou égale à 20% par 10 rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et par une diminution du nombre de cellules de moins de 0,3 log ou un nombre de cellules stationnaire, par rapport au nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans laquelle le seuil minimal de cellules dans ladite 15 population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% et éventuellement dans laquelle le seuil minimal de diminution du nombre de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon est 20 d'au moins 0,3 log, notamment 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ; 2 ; 2,1 ; 2,2 ; 2,3 ; 2,4 ; 2,5 ; 2,6 ; 2,7 ; 2,8 ; 2,9 ; 3; OU - dans laquelle le phénotype sensible de ladite souche de champignon vis-à-vis 25 dudit antifongique est déterminé par une augmentation du taux de chitine supérieure ou égale à 20% par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et par une diminution du nombre de cellules d'au moins 0,3 log par rapport au nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence 30 d'antifongique, et dans laquelle le seuil minimal de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% et dans laquelle le seuil minimal de diminution du nombre de cellules dans ladite population de 3038915 143 cellules de ladite souche de champignon est d'au moins 0,3 log, notamment 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ; 2 ; 2,1 ; 2,2 ; 2,3 ; 2,4 ; 2,5 ; 2,6 ; 2,7 ; 2,8 ; 2,9 ;\n<CLM>\1\t5\n<CLM>\1\tUtilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules d'une souche de champignon pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 1 à 3, dans laquelle la variation éventuelle du taux de chitine est déterminée par fluorescence, notamment 10 par une méthode de microscopie à fluorescence, plus particulièrement par la microscopie automatisée à haut contenu d'images (HCA) et dans laquelle la variation éventuelle du taux de chitine est déterminée notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, notamment le Calcofluor White. 15\n<CLM>\1\tUtilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules d'une souche de champignon pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 1 à 4, dans laquelle l'antifongique est choisi parmi le groupe des antifongiques dépourvu des polyènes tels que l'amphotéricine B et la nystatine, et dépourvu des antifongiques à action directe sur 20 la chitine, plus particulièrement : - parmi le groupe comprenant ou étant constitué des antifongiques azolés tels que le fluconazole, le voriconazole, le posaconazole, l'itraconazole et l'isavuconazole, ou autres molécules inhibitrices de la synthèse de l'ergosterol tels que les allylamines dont la terbinafine ou morpholines ; 25 - ou parmi les échinocandines, l'échinocandine étant plus particulièrement choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué de l'anidulafungine, de la caspofungine et de la micafungine.\n<CLM>\1\tUtilisation de la variation éventuelle du taux de chitine dans une population de cellules 30 d'une souche de champignon pour déterminer le degré de sensibilité de ladite souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 1 à 5, dans laquelle le champignon est une levure, et dans laquelle la population de cellules de levures est choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué des genres Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Trichosporon, Rhodotorula, Malassezia, et plus 3038915 144 particulièrement dans laquelle la levure du genre Candida est choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué des espèces : Candida albicans, C. glabatra, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. dubliniensis, C. keftr, C. lusitaniae, C. zeylanoides, C. rugosa, C. inconspicua, C. norvegensis, C. guilliermondii, C. utilis. 5\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique comprenant une étape de détermination de la variation éventuelle du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique par rapport au taux 10 de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, dans lequel ledit degré de sensibilité correspond à un phénotype sensible, résistant ou intermédiaire.\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une 15 souche de champignon, vis-à-vis d'un antifongique selon la revendication 7, comprenant une étape de détermination de la variation éventuelle du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique et dans lequel ledit champignon est 20 un champignon unicellulaire.\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon, ledit champignon étant un champignon unicellulaire, vis-à-vis 25 d'un antifongique selon les revendications 7 et 8, comprenant une étape de détermination de la variation éventuelle du taux de chitine de la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et une étape de détermination de la variation éventuelle du nombre de 30 cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation du nombre de cellules étant déterminée par rapport au nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique. 3038915 145\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 9 : 5 - dans lequel ledit degré de sensibilité correspond à un phénotype résistant et ledit procédé comprend une étape de détermination de la variation éventuelle du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation éventuelle étant une augmentation du taux de chitine inférieure à 10% ou une diminution du taux de chitine ou un taux 10 de chitine stationnaire, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans lequel le seuil minimal de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 15 80%, 85%, 90%, 95% et 100%; ou - dans lequel ledit degré de sensibilité correspond à un phénotype intermédiaire et ledit procédé comprend soit une étape de détermination de la variation du taux de chitine dans la 20 population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation étant une augmentation du taux de chitine de 10% à une valeur inférieure à 20%, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d' antifongique, 25 soit une étape de détermination de la variation du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation étant une augmentation du taux de chitine supérieure ou égale à 20%, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et une 30 étape de détermination de la variation éventuelle du nombre de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation étant une diminution du nombre de cellules de moins de 0,3 log ou un nombre de cellules stationnaire, par rapport au nombre de cellules dans une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans 3038915 146 lequel le seuil minimal de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% et éventuellement dans lequel 5 le seuil minimal de diminution du nombre de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon est d'au moins 0,3 log, notamment 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ; 2 ; 2,1 ; 2,2 ; 2,3 ; 2,4 ; 2,5 ; 2,6 ; 2,7 ; 2,8 ; 2,9 ; 3; ou - dans lequel ledit degré de sensibilité correspond à un phénotype sensible et ledit 10 procédé comprend une étape de détermination de la variation du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation étant une augmentation du taux de chitine supérieure ou égale à 20%, par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique et une étape 15 de détermination de la variation du nombre de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique, ladite variation étant une diminution du nombre de cellules d'au moins 0,3 log par rapport au nombre de cellules d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique, et dans lequel le seuil minimal de cellules 20 dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon présentant une augmentation du taux de chitine est d'au moins 10%, notamment 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% et dans lequel le seuil minimal de diminution du nombre de cellules dans ladite population de cellules de ladite souche de champignon est d'au moins 0,3 25 log, notamment 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ; 2 ; 2,1 ; 2,2 ; 2,3 ; 2,4 ; 2,5 ; 2,6 ; 2,7 ; 2,8 ; 2,9 ;\n<CLM>\1\t11. Procédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 10, dans 30 lequel la variation éventuelle du taux de chitine dans la population de cellules de ladite souche de champignon en présence d'antifongique par rapport au taux de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique est déterminée par méthode de fluorescence, notamment par une méthode de microscopie à 3038915 147 fluorescence, plus particulièrement par la microscopie automatisée à haut contenu d'images (HCA) et comprenant notamment une étape de marquage fluorescent des cellules de ladite souche de champignon permettant la détermination de la variation éventuelle du taux de chitine, ladite étape de marquage fluorescent des cellules de 5 ladite souche de champignon étant notamment effectuée à l'aide de Calcofluor White.\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 11, dans lequel ledit antifongique est choisi parmi le groupe des antifongiques dépourvu des 10 polyènes tels que l'amphotéricine B et la nystatine, et dépourvu des antifongiques à action directe sur la chitine, plus particulièrement : - parmi le groupe comprenant ou étant constitué des antifongiques azolés tels que le fluconazole, le voriconazole, le posaconazole, l'itraconazole et l'isavuconazole, ou autres molécules inhibitrices de la synthèse de l'ergosterol tels que les 15 allylamines dont la terbinafine ou morpholines ; - ou parmi les échinocandines, l'échinocandine étant plus particulièrement choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué de l'anidulafungine, de la caspofungine et de la micafungine. 20\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 12, dans lequel ledit champignon unicellulaire est une levure, et dans lequel la population de cellules de levures est choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué des genres Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Trichosporon, Rhodotorula, 25 Malassezia, et plus particulièrement dans lequel la population de cellules de levures du genre Candida est choisie parmi le groupe comprenant ou étant constitué des espèces : Candida albicans, C. glabatra, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. dubliniensis, C. kefyr, C. lusitaniae, C. zeylanoides, C. rugosa, C. inconspicua, C. norvegensis, C. guilliermondii, C. utilis. 30\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 13 comprenant une étape de mise en présence dudit antifongique et des cellules de ladite souche de champignon, avant l'étape de détermination de la variation éventuelle du 3038915 148 taux de chitine, ladite étape de mise en présence est inférieure ou égale à 48h, notamment d'une durée de 6,5h à 24h, et dans lequel ladite étape de mise de présence est effectuée à une température de 30 à 35°C. 5\n<CLM>\1\tProcédé de détermination du degré de sensibilité d'une population de cellules d'une souche de champignon, ledit champignon étant un champignon unicellulaire, vis-à-vis d'un antifongique selon les revendications 7 à 14, comprenant : a. une étape de mise en présence des cellules de ladite souche de champignon 10 avec un gradient de concentrations d'antifongique variant de 0,0009 à 130 lig/mi, à une température de 30 à 35°C pendant une durée inférieure ou égale à 48h, notamment une durée de 6,5h à 24h, pour obtenir un mélange de cellules de ladite souche de champignon avec l'antifongique ; b. une étape d'addition du marqueur fluorescent Calcofluor White au mélange de 15 cellules de ladite souche de champignon et d'antifongique obtenu précédemment, pour obtenir un mélange de cellules de ladite souche de champignon marquées au Calcofluor White et d'antifongique; c. une étape de quantification du taux de chitine par microscopie à fluorescence automatisée à haut contenu d'images, des cellules de ladite souche de 20 champignon marquées dans le mélange obtenu à l'étape précédente ; d. une étape de détermination de la variation éventuelle du taux de chitine dans le mélange de cellules de ladite souche de champignon marquées au Calcofluor White et d'antifongique, en fonction des concentrations en antifongique dans la population de cellules de ladite souche de champignon, par rapport au taux 25 de chitine d'une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique ; et dans le cas où ladite variation éventuelle du taux de chitine est une augmentation du taux de chitine supérieure ou égale à 20%, la susdite étape d est suivi d' e. une étape de dénombrement des cellules dans le mélange de cellules de ladite 30 souche de champignon marquées au Calcofluor White et d'antifongique; puis d' f. une étape de détermination de la variation éventuelle du nombre de cellules en fonction de la concentration en antifongique dans la population de cellules de 3038915 149 ladite souche de champignon, par rapport au nombre de cellules dans une population de cellules de ladite souche de champignon en absence d'antifongique ; lorsque ladite variation du taux de chitine de la susdite étape d. est une augmentation du taux 5 de chitine inférieure à 10% ou une diminution du taux de chitine notamment inférieure à 20% ou un taux stationnaire il est déduit que ladite souche de champignon est de phénotype résistant ; lorsque ladite variation du taux de chitine de la susdite étape d. est une augmentation de 10 % à une valeur inférieure à 20%, il est déduit que ladite souche de champignon est de phénotype 10 intermédiaire ; lorsque ladite variation du taux de chitine de la susdite étape d. est une augmentation d'une valeur supérieure ou égale à 20%, et que ladite variation du nombre de cellules de la susdite étape f. est une diminution de moins de 0,3 log, il est déduit que ladite souche de champignon est de phénotype intermédiaire ; 15 lorsque ladite variation du taux de chitine de la susdite étape d. est une augmentation d'une valeur supérieure ou égale à 20%, et que ladite variation du nombre de cellules est une diminution d'au moins 0,3 log, il est déduit que ladite souche de champignon est de phénotype sensible.