Brevet FR3039166A1 (20170127)
REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo pour produire des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes, comprenant : a) la culture d'une population isolée de cellules CD34*CD41d" de progéniteurs de MK dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la thrornbopoïétine (TPO), en présence d'un antagoniste de récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par coculture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des 10 MK portant des proplaquettes ; et b) la collecte de ladite population de cellules comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape a) de culture est 15 effectuée pendant 5 à 9 jours.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu de culture sans erum comprend 20 à 100 ng/ml de TPO. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, lequel procédé comprend, avant l'étape a) : a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste de 25 récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+CD41dim ; et al) l'isolation desdites cellules CD34+CD4ldim à partir de ladite population de cellules. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 4, dans lequel le milieu de culture sans sérum de l'étape a0) comprend 10 à 30 pg/m1 de LDL, 25 à 100 ng/ml de SCF, 40 à 50 ng/ml de TPO, 20 à 30 ng/ml d'IL-6 et 20 à 30 ng/ml d'IL-9. 35\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'étape a0) de culture est effectuée pendant 6 à 8 jours.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque aes revedications 1 à 6, dans lequel, dans les étapes a) et a0), indépendamment, l'antagoniste d'AhR est un-composé de formule (I) ,R -,geet .2 1 R4 L est choisi parmi -NR5a(C1-102-3-, -NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5,(CH2)2S-, -NR5aCH2CH(CM1)- et - NR5aCH(CH3)CH2- ; où R5a et R5b sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4; Ri est choisi parmi les radicaux thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, 10 pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle ; où lesdits thiophényle, furanyle, benzimidazolyle, isoquinolinyle, imidazopyridinyle, benzothiophényle, pyrimidinyle, pyrazolyle, pyridinyle, imidazolyle, pyrrolidinyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrrolyle et thiazolyle de R1 sont éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi halogéno, cyano, alkyle en C1 à C4, halogénoalkyle en C1 à C4, alcoxy en C1 à C4, - 15 S(0)0-2R8a, et -C(0)0R8a, où R5a est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4 R2 est choisi parmi -S(0)2NR6aReb, -NR6,C(0)NR6bRec, phényle, pyrrolopyridinyle, indolyie, thiophényle, pyridinyle, triazolyle, pyrazolyle, et indazolyle ; où R6b et R6, sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à 20 C4; et ledit phényle, pyrrolopyridinyle, indolyle, thiophényle, pyridinyle, triazolyle, oxoimidazolidinyle, pyrazolyle, ou indazolyle de R2 est éventuellement substitue Of 1 à 3 radicaux indépendamment choisis parmi hydroxy, halogéno, méthyle, méthoxy, 25 amino, -0(CH2)nNR7aR7b, -0S(0)2NR7aR7b et -NR7aS(0)2R7b ; OÙ R7a and R7b sont indépendamment choisis parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en Cl à C4; R3 est choisi parmi l'hydrogène et les radicaux alkyle en C1 à C4 et biphényle ; et R4 est choisi parmi les radicaux alkyle en C1 à Clo, alcényle en Ci à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et 30 benzyle, où lesdits alkyle en C1 à C10, alcényle en C1 à C4, oxétanyle, tétrahydrofuranyle, cyclohexyle, (oxopyrrolidinyl)éthyle, tétrahydropyranyle, phényle, et benzyle de R4 peuvent 3039166 27 être éventuellement substitués par 1 à 3 radicaux indépendamment chesis pare hydroxy, alkyle en C1 à C4 et halogénoalkyle en C1 à C4-\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendibâtini '1 à 7, dans lece.101,4ans l'étape a) et/ou a0), l'antagoniste d'AhR est StemRegenin 1 (SRI).\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'étape a) et/ou l'étape a0) sont effectuées par co-culture avec des hMSC.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel lesdites hMSC sont obtenues par un procédé comprenant : I) l'isolation de cellules mononucléaires de moelle osseuse (BM-MNC) à partir d'un sujet humain par gradient de densité Ficoll ; ii) l'ensemencement des BM-MNC isolées dans un milieu de culture comprenant 5 à 15 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de facteur 2 de croissance des fibroblastes (FGF-\n<CLM>\1\t, iii) la culture des cellules ensemencées pendant deux jours, la mise au rebut des cellules non adhérentes et l'ensemencement des cellules adhérentes collectées ; iv) la culture des cellules adhérentes dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2, avec remplacement du milieu de culture deux fois par semaine par du milieu de culture frais jusqu'à confluence ; et v) la récolte des hMSC, l'ensemencement et la culture des cellules récoltées jusqu'à confluence dans un milieu de culture comprenant 10 % de sérum de veau foetal et 0,5 à 5 ng/ml de FGF-2.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui comprend en outre la sélection de cellules CD41/CD61+ et CD42c+ à partir de la population cellulaire collectée comprenant des plaquettes et/ou des MK portant des proplaquettes.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, qui comprend en outre le lavage des plaquettes et/ou des mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et la mise en suspension des cellules lavées dans un tarr1pon de perfusion.\n<CLM>\1\tProcédé pour produire des cellules progénitrices de mégacaryocytes (MK), comprenant : 28 a0) la culture de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans un milieu de culture sans sérum comprenant de la lipoprotéine de basse densité (LDL), du facteur des cellules souches (SCF), de la TPO, de l'IL-6 et de l'IL-9, en présence d'un antagoniste de récepteur d'hydrocarbures aromatiques (AhR) ou par co-culture avec des cellules stromales mésenchymateuses humaines (hMSC), pendant un temps suffisant pour obtenir une population de cellules comprenant des cellules CD34+C041de ; et al) l'isolation desdites cellules CD34+CD41dim à partir de ladite population de cellules.\n<CLM>\1\tProcède- selon la revendication 13, dans lequel l'étape a0) est effectuée 10 comme défini dans les revendications 5à\n<CLM>\1\t15. Population cellulaire es_sentiellement pure de progéniteurs de mégacaryocytes (MK), dans laquelle au moins 80 % des cellules dans la population sont des cellules CD34+CD41d", laquelle population cellulaire peut être obtenue par le procédé de la 15 revendication 13 ou\n<CLM>\1\t16. Composition comprenant une population cellulaire de plaquettes et/ou de mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes et un tampon de perfusion pour utilisation en transfusion, dans laquelle ladite utilisation comprend la préparation de plaquettes et/ou de 20 mégacaryocytes (MK) portant des proplaquettes par un procédé selon la revendication 12.