Brevet FR3051197A1 (20171117)
REVENDICATIONS1. Particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 1, comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les séquences d'intérêt des au moins deux ARN non viraux encapsidés sont identiques.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN.\n<CLM>\1\tParticule selon la revendication 4, dans laquelle la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé code pour une protéine immunomodulatrice.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, comportant en outre un troisième ARN non viral encapsidé.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.\n<CLM>\1\tParticule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, 3051197 58 laquelle est une particule lentivirale.\n<CLM>\1\tParticule lentivirale selon la revendication 9, dans laquelle : le domaine de liaison est la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2, 5 la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige- boucle de MS2, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du 10 bactériophage MS2.\n<CLM>\1\tParticule lentivirale selon la revendication 9, dans laquelle : le domaine de liaison est la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7, la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige- 15 boucle de PP7, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage PP7. 20\n<CLM>\1\tComposition comportant des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à\n<CLM>\1\t13. Kit de production de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comportant : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, 25 pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence 30 d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication d'un kit selon la revendication 13, comportant : (i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette 35 séquence est insérée une séquence d'encapsidation 3051197 59 (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et 5 (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, 10 pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence 15 d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 4 à 11, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : 20 (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une 25 séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, 30 (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.\n<CLM>\1\tProcédé de fabrication selon la revendication 16, dans lequel le surnageant est clarifié, puis éventuellement concentré et/ou purifié.\n<CLM>\1\tComposition de particules susceptible d'être obtenue par le procédé 35 de fabrication des particules selon l'une des revendications 16 ou\n<CLM>\1\t3051197 60\n<CLM>\1\tUtilisation d'une particule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ou d'une composition selon la revendication 12 ou 18 pour transduire in vitro des cellules du système immunitaire.