Brevet FR3041974A1 (20170407)
REVENDICATIONS1. Equivalent de derme in vitro comprenant des cellules de type SKP et des fibroblastes dermiques inclus dans une matrice de collagène, selon un ratio compris entre 1/100 (1 sphère de cellules de type SKP pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère de cellules de type SKP pour 10000 fibroblastes).\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ratio de cellules de type SKP et de fibroblastes dermiques est de 1/100 (1 sphère de cellules de type SKP pour 100 fibroblastes).\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que les fibroblastes dermiques et les cellules de type SKP sont d'origine humaine.\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel, lorsque les cellules de type SKP sont des cellules SKP-like, les fibroblastes dermiques et les cellules SKP-like sont d'origine autologues.\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la matrice de collagène est du collagène de type I d'origine bovine.\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend, outre le collagène de type I, du collagène de type III et/ou d'autres fibres élastiques.\n<CLM>\1\tProcédé d'obtention d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes suivantes : 3041974 26 a) Une suspension de fibroblastes dermiques cultivés jusqu'au 20'' passage, à une concentration de 100000 à 500000 fibroblastes / ml dans du milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal est 5 préparée extemporanément, b) Des sphères de cellules de type SKP d'une taille au moins égale à 50 }gym sont préparées en suspension dans du milieu de culture DMEM/HAM F12, 3 :1, supplémenté en facteurs de croissance EGF et FGF2 et en mélange 10 d'hormones B27®, c) Pour la préparation des équivalents de derme, une solution de collagène de concentration comprise entre 1 et 10mg/ml, est mélangée à du DMEM 1g/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal, puis les fibroblastes 15 dermiques humains normaux (100000 à 500000 / ml) de l'étape a) et les sphères de cellules de type SKP obtenues à l'étape b), sont ajoutés, afin d'obtenir un ratio compris entre 1/100 (1 sphère pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère pour 10000 20 fibroblastes) et enfin un volume suffisant d'une solution de soude (NaOH) 1N est ajoutée au mélange pour amener le pH à 7, d) La solution obtenue à l'étape c) est déposée dans des puits puis recouverte avec du milieu de culture DMEM lg/L 25 supplémenté avec 5 à 10% sérum de veau foetal.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 dans lequel les cellules de type SKP de l'étape b) sont des cellules SKP-like. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 7 dans lequel les fibroblastes dermiques de l'étape a) et les cellules SKPlike sont des cellules autologues. 3041974 27\n<CLM>\1\tUtilisation d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, pour réaliser des études scientifiques. 5\n<CLM>\1\tUtilisation d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, pour évaluer l'efficacité de principes actifs cosmétiques.\n<CLM>\1\tl'utilisation d'équivalents de derme selon l'une des 10 revendications 1 à 6 pour réaliser des études en 3 dimensions des cellules de type SKP en fonction du type de donneurs.\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, 15 comprenant en outre un équivalent d'épiderme constitué d'au moins une couche supérieure de cellules épidermiques, l'équivalent de derme surmonté de l'équivalent d'épiderme constituant ainsi un équivalent de peau multicouche. 20\n<CLM>\1\tEquivalent de derme selon la revendication 13, dans lequel l'équivalent d'épiderme comprend des kératinocytes et des mélanocytes.\n<CLM>\1\tUtilisation d'un équivalent de derme selon la 25 revendication 14, pour étudier l'influence de la composition cellulaire du derme sur la pigmentation de l'épiderme.