Brevet FR3048000A1 (20170825)
REVENDICATIONS1. Une cassette d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-bindIng site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène.\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'oncogène est choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, Firim2, N- Myc, TAL1, Fil-1, MLL, C cycline 191, RET, PML, Abi ou C-Myc, en particulier l'oncogène est N-Myc.\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la région promotrice minimale du promoteur inductible est Issue du gène Sox2 et est définie par la séquence SEQ ID NO :12, ou un dérivé de celle-ci.\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite au moins une séquence régulatrice GBS comprend ou consiste en la séquence GBS 1 (SEQ ID NO :15) ou GBS2 (SEQ ID NO :16) du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci.\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de l'oncogène est Issue du gène Sox2 et comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 17, ou un dérivé de celle-ci. 3048000 40\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène est issue du gène Sox2 et comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18, ou un dérivé de celle-ci 5\n<CLM>\1\tLa cassette d'expression selon l'une quelconques des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t8. Un vecteur comprenant la cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à\n<CLM>\1\t9. Une cellule hôte transformée par la cassette d'expression telle que définie à 10 l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou par le vecteur tel que défini à la revendication 8, de préférence la cellule hôte transformée est un progéniteur neuronal.\n<CLM>\1\tUn procédé d'amplification cellulaire comprenant une étape de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux transformés par une 15 cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans un milieu de culture approprié.\n<CLM>\1\tLe procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape a), une étape de transformation desdits progéniteurs neuronaux par ladite cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque 20 des revendications 1 à 7 ou par le vecteur tel que défini selon la revendication 8,\n<CLM>\1\tLe procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il vise à l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend en outre une étape de : 25 b) différenciation Induite par une modification de la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a) des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les oligodendrocytes, ladite modification de composition dudit milieu de culture utilisé à l'étape a) pouvant consister en le retrait de tous les facteurs mitogènes dudit milieu de culture. 3048000 41\n<CLM>\1\tLe procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il vise en outre le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) Mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) avec au 5 moins un composé, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et e) Identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entralné un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d).\n<CLM>\1\tUne utilisation de la cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur tel que défini à la revendication 8 ou de la cellule hôte transformée telle que définie à la revendication 9 pour le criblage 15 de composés perturbateurs endocriniens, en particulier de composés perturbateurs endocriniens des neurones à GnRH.\n<CLM>\1\tUn kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et éventuellement un vecteur telle que défini à la 20 revendication 8 et/ou une cellule hôte transformée telle que définie à la revendication 9.