Brevet FR3044685A1 (20170609)
REVENDICATIONS1. Puce microfluidique (1) comprenant au moins une cellule (11) de cristallisation à dialyse, ladite cellule (11) comprenant : un support (1111) en PMMA un premier étage comprenant un réservoir (111) délimité au moins en partie par ledit support (1111) et par une paroi externe (1112) de la cellule, ledit réservoir (111) étant en communication fluidique avec un canal d'entrée et un canal de sortie d'une solution permettant la mise en oeuvre du procédé de cristallisation, un second étage comprenant une chambre de dialyse (113) délimitée au moins en partie par une paroi interne (1113) de la cellule sans contact avec le support (1111) et par une membrane de dialyse (112) formant une interface entre le réservoir (111) et la chambre de dialyse (113), la paroi interne (1113) comprenant au moins une portion d'un seul tenant dans laquelle la périphérie de ladite membrane (112) est maintenue scellée.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique (1) selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chambre de dialyse contient une solution de molécule à cristalliser et en ce que la chambre de dialyse est scellée par une couche de polymère en PMMA (1115).\n<CLM>\1\tPuce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'il existe un espace entre les parois externes (1112) et internes (1113) débouchant sur une surface principale (1114) de la puce et en ce que cet espace, en surface de la puce, est connecté via un raccord au système de contrôle des écoulements des fluides (1116),\n<CLM>\1\tPuce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la membrane de dialyse est en cellulose, avantageusement en cellulose regénérée.\n<CLM>\1\tPuce microfluidique (1) selon la revendication 1, caractérisée en ce que le volume de la chambre de dialyse est compris entre 0,1 et 1 pL. 3044685 37\n<CLM>\1\tPuce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs cellules de cristallisation à dialyse alignées en lignes et colonnes. 5\n<CLM>\1\tProcédé de préparation d'une puce microfluidique (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - Réaliser deux blocs structurés en polymère réticulé perméable à l'air PL pour obtenir les tampons 3D en ledit polymère PL de la partie haute qui définira la 10 chambre de dialyse et de la partie basse de la puce qui définira les canaux et le(s) réservoir(s), Sur le bloc structuré avec les canaux et le(s) réseivoir(s) déposer une ou plusieurs membrane(s) de dialyse sèche(s), - Placer le bloc structuré sans canaux en coïncidence avec le bloc structuré 15 avec les canaux de manière à prendre en sandwich la membrane, Déposer une résine photosensible NOA81® sur 3 côtés entre les deux blocs structurés puis initier la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer la partie supérieure du bloc structuré avec l'assemblage en résine réticulée en décollant le tout du bloc structuré du bas, 20 - Refermer la partie visible (sans PL) avec une lamelle de PMMA, Finaliser la réticulation de ladite résine NOA81®, - Retirer le dernier bloc structuré\n<CLM>\1\tDispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser qui comprend 25 - Au moins une puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à6 - Au moins un moyen d'ajout agencé pour ajouter dans la chambre de dialyse une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser et éventuellement au moins un tampon 30 Au moins un moyen d'ajout / prélèvement agencé d'agent de cristallisation et/ou d'additif(s) et/ou tampon(s) dans les canaux menant à la chambre du réservoir - Au moins un moyen de contrôle de la composition chimique de la solution dans le réservoir, par exemple un moyen de dosage, de variation de la concentration des tampons, des agents de cristallisation et des additifs 3044685 38 - Au moins un moyen de contrôle et de variation de la température de la puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes - Eventuellement au moins un moyen de mesure de la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 5 - Au moins un moyen d'acquisition d'images\n<CLM>\1\tProcédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) On ajoute une solution S1 comprenant la molécule à cristalliser 10 dans la chambre de dialyse (113) de la puce microfluidique (1) telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 6 puis on l'encapsule. b) Le cas échant, on injecte en continu une solution S2 dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), ladite solution S2 contenant 15 uniquement le tampon, la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar. c) On injecte en continu une solution S3 de cristallisation, dans les canaux de ladite puce microfluidique (1), la pression d'injection au niveau du canal microfluidique est maintenue inférieure à 400 mbar ; 20 La solution S3 de cristallisation contient au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs, et éventuellement un tampon. Lorsque l'étape b) du procédé est mise en oeuvre, la solution S3 comprend le tampon de la solution S2 et au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs 25 additifs.\n<CLM>\1\tProcédé de cristallisation selon la revendication 9, caractérisé en ce que lors de l'étape a) la chambre de dialyse est encapsulée par dépôt d'une lamelle de PMMA, puis revêtement KAPTON®. 30\n<CLM>\1\tProcédé de cristallisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, caractérisé en ce que Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse, comprenant ladite molécule à cristalliser, est à une 35 première température T1 et à une concentration C1 de la molécule à 3044685 39 cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous-saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la température ; lors de l'étape 5 b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, les cas échéant en plus du tampon au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou 10 plusieurs additifs à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule 15 à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser ; et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) on augmente la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser, 20 e) s'il y a la formation de trop nombreux cristaux pendant l'étape c), la température de la cellule de cristallisation (11) peut-être augmentée à une température >T2 de telle manière que la molécule à cristalliser se retrouve dans la zone de sous-saturation, juste en dessous de la courbe de solubilité, à nouveau et que l'excès de petits cristaux soient complètement dissout. Quelques cristaux sélectionnés, de tailles 25 supérieures vont subir une dissolution partielle en évitant la dissolution complète et vont ensuite croitre dans la zone métastable par la baisse de température à la température T2 f) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la 30 concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2, g) On abaisse la température de la cellule de cristallisation (11) à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de dialyse (113) se situent toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à 35 cristalliser 3044685 h) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C3 5 i) On répète éventuellement les étapes f) à h) j) On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape h) ou i) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ.\n<CLM>\1\tProcédé de cristallisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, 10 caractérisé en ce que Lors de l'étape a), le cas échéant lors de l'étape b), la solution contenue dans la chambre de dialyse est à une température constante T de la cellule de cristallisation (11) et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de sous- 15 saturation (en dessous de la courbe de solubilité) du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et le cas échéant en additif ; lors de l'étape b), le tampon présent dans la solution S2 diffuse dans la solution contenue dans la chambre de 20 dialyse et la molécule à cristalliser se trouve toujours dans ladite zone de sous-saturation Lors de l'étape c), ladite solution de cristallisation S3 contient, le cas échéant en plus du tampon, au moins un agent de cristallisation et le cas échéant un ou plusieurs additifs à une concentration P1 dans le réservoir de la cellule de 25 cristallisation, de manière à ce que l'agent de cristallisation et le cas échéant l'additif diffuse dans la solution contenue dans la chambre de dialyse et de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser et qu'apparaissent des germes de la 30 molécule à cristalliser ; - Pour obtenir la nucléation spontanée contrôlée des cristaux la procédure suivante est employée : à l'aide du système de contrôle des écoulements des fluides la solution de cristallisation S3 est injectée en flux continu avec un gradient de concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant 3044685 41 d'additif de manière à ce qu'à la concentration P1 seulement quelques cristaux se forment. et le procédé comprend ensuite les étapes successives suivantes : d) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et le échéant de 5 l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser e) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier 10 point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte étant alors la concentration C2 f)On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans 15 la cellule de cristallisation (11) se situent toujours dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, g) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et le cas échéant de l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure 20 constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution contenue dans la chambre de dialyse atteinte est la concentration C3, h) On répète éventuellement les étapes d) à f) i)On récupère la puce contenant les cristaux obtenus à l'issue de l'étape g) ou h) pour l'expérience de diffraction aux rayons X in situ. 25