Brevet FR3040999A1 (20170317)
REVENDICATIONS1. Procédé in vitro de génotypage d'un ou plusieurs polymorphismes de nucléotide simple (SNP) dans un échantillon acide nucléique, ledit procédé comprenant : a) l'amplification d'une ou plusieurs régions de l'acide nucléique contenant le ou les SNP à génotyper, les produits d'amplification comprenant un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, et b) l'analyse des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) à l'aide d'un dispositif de test à flux latéral comprenant une zone réactionnelle comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant 10 une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP à génotyper, l'obtention d'un signal au niveau du site d'immobilisation d'une sonde indiquant que l'acide nucléique comprend le variant allélique spécifique de la sonde.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, dans lequel l'amplification est réalisée par 15 PCR asymétrique, de préférence par LATE-PCR.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'amplification simultanée de plusieurs régions de l'acide nucléique est réalisée par PCR multiplexe. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits d'amplification sont marqués en 5', de préférence par l'utilisation d'amorces marquées en 5' durant l'amplification.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les 25 produits d'amplification sont marqués par un composé coloré, luminescent, fluorescent, phosphorescent ou radioactif, par une enzyme ou le premier membre d'un couple ligand/anti-ligand, de préférence par une biotine. 3040999 32\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif de test à flux latéral comprend une matrice poreuse comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, 5 (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et (iii) la zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits d'amplification, et (iv) optionnellement, une zone de contrôle de migration des réactifs en aval de la zone réactionnelle, et/ou (v) optionnellement, une zone de marquage comprenant un substrat ou partenaire de liaison spécifique du marqueur des produits d'amplification capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration et en amont de la zone d'application des produits d'amplification, et/ou (vi) optionnellement, un tampon absorbant disposé en aval de la zone réactionnelle ou de la zone de contrôle lorsque celle-ci est présente, les différentes zones de la matrice poreuse étant en communication de fluide avec la ou les zones adjacentes et le tampon absorbant étant en communication de fluide avec la matrice poreuse.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits d'amplification sont analysés directement à l'aide du dispositif de test à flux latéral sans étape de purification ni dénaturation préalable.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'analyse comprend (i) le dépôt des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) sur le dispositif de test à flux latéral 3040999 33 ii) l'application d'un tampon de migration sur ledit dispositif, iii) l'incubation du dispositif jusqu'à la détection dans la zone réactionnelle des signaux générés directement ou indirectement par le marqueur des produits d'amplification et/ou la détection d'un signal dans la zone de contrôle de migration 5 lorsque celle-ci est présente, et iv) la lecture et l'interprétation des résultats.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la matrice est en nitrocellulose, polyester, fibres de verre, fibres de cellulose, polyether 10 sulfone (PES) et/ou ester de cellulose.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la matrice est une membrane de nitrocellulose. 15\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le tampon de migration comprend un système tampon permettant de conserver un pH neutre, un ou plusieurs tensio-actifs et/ou un ou plusieurs agents dénaturants qui déstabilisent les liaisons hydrogènes. 20\n<CLM>\1\tKit comprenant un dispositif de test à flux latéral tel que défini dans la revendication 6, et au moins un couple d'amorces permettant d'amplifier une région génomique contenant un ou plusieurs SNP, et optionnellement un tampon de migration, des réactifs pour l'amplification, de préférence des dNTP, une polymérase et/ou un tampon, et/ou une notice expliquant l'utilisation dudit kit. 25\n<CLM>\1\tKit selon la revendication 12, comprenant un ou plusieurs couples d'amorces permettant d'amplifier une ou plusieurs régions génomiques contenant un ou plusieurs SNP associés à des systèmes d'antigènes érythrocytaires, de préférence les systèmes DUFFY, MNS et/ou KIDD. 3040999 34\n<CLM>\1\tKit selon la revendication 12 ou 13, comprenant une ou plusieurs amorces sélectionnées dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1 à\n<CLM>\1\t5\n<CLM>\1\tUtilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour génotyper un ou plusieurs SNP selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1à 11.