Brevet FR3045383A1 (20170623)
REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur, comprenant les étapes suivantes : A) le mélange d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape A) comprend les étapes suivantes : Al) optionnellement, la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 315 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin comprenant éventuellement de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) 20 isophthalamide, en anaérobiose, A3) optionnellement, le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération en anaérobiose, ou l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A2) ou A3), 25 A5) la récupération de l'anneau bactérien ou du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien ou du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges. 30\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, comme étape A6), les étapes suivantes en anaérobiose : 3045383 29 a) centrifugation de l'anneau bactérien remis en suspension dans un tampon salin ou du surnageant obtenu en A5), à une accélération comprise entre 3000 et 4000xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, b) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape a), et remise en suspension dans un 5 tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 200 et 500xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, c) récupération du surnageant obtenu à l'issue de l'étape b), et remise en suspension dans un tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 3000 et 10 4000xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, d) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape c), et e) le mélange du culot récupéré en d) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lyophilisation de l'étape B) est réalisée en conditions suivantes : B1) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, B2) le chargement du mélange congelé obtenu en B1) dans un lyophilisateur pré- refroidi à une température comprise entre -50°C et -30°C, à pression atmosphérique, puis B3) au moins une étape de dessiccation primaire du mélange chargé en B2) comprenant l'abaissement de la pression jusqu'à une valeur comprise entre 80 et 200 1..tbar, puis l'augmentation de la température des étagères jusqu'à une valeur comprise entre -20°C et +25°C, en appliquant une vitesse de chauffage comprise entre 0,2 et 0,5 °C/min, puis B4) la dessiccation secondaire du mélange obtenu en B3) comprenant l'abaissement de la pression à une valeur inférieure ou égale à 80 1..tbar, et l'élévation de la température des étagères à une valeur comprise entre +25°C et +35°C, à une vitesse de chauffage comprise entre 0,1 et 0,3 °C/min, et l'y maintenir entre 8 et 15 heures. 3045383 30\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le tampon salin est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, de préférence à une concentration comprise entre 7 et 15g/l. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: Al) la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, 10 A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin additionné d'une solution aqueuse comprenant de l'iodixanol ou du 5(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, ledit tampon salin étant de préférence une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, en anaérobiose, 15 A3) le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A3), pendant une durée comprise entre 40 et 50 minutes, à une température comprise entre 2°C et 6°C, à une vitesse comprise entre 13000 et 16000 x g, A5) la récupération de l'anneau bactérien formé à l'issue de l'étape A4), en 20 anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la préparation d'un gradient continu d'iodixanol formé par congélation-décongélation de l'étape Al) est réalisée selon les étapes suivantes : A\n<CLM>\1\ta) congélation d'une solution d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- 30 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide à une température comprise entre -70°C et -100°C pendant au moins 12 heures ; puis 3045383 31 A1.b) décongélation de la solution obtenue en A1.a) à température ambiante pendant 2 à 4 heures, afin d'obtenir un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une des revendications 1 à 5 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en anaérobiose: A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin, 10 A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération du mélange obtenu en A2), A5) la récupération du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), A6) le mélange du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de 15 préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la centrifugation séquentielle à faible accélération de l'étape A4) est réalisée à une accélération comprise entre 200 et 500xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise 20 entre 20 et 30°C.\n<CLM>\1\tLyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, pour son utilisation dans la transplantation de microbiote fécal autologue ou allogénique, ou pour traiter les dysbioses intestinales. 25\n<CLM>\1\tUtilisation d'un lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comme outil de recherche, de préférence en génomique fonctionnelle, en métaprotéomique ou en immunologie.