Brevet FR3040789A1 (20170310)
REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade II ou III, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient, (ii) comparaison du niveau d'expression obtenu a l'étape (i) avec une valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive, ladite quantification étant effectuée par la mesure de la fluorescence émise en temps résolu par un couple de partenaires de FRET mis en contact avec ladite coupe d'échantillon de tissu, le premier membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un premier ligand capable de se lier à un premier domaine de la protéine EGFR, le second membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un second ligand capable de se lier à un second domaine de la protéine EGFR, lesdits premier et second domaines de la protéine EGFR étant différents, ledit couple de partenaires de FRET étant constitué d'un composé fluorescent donneur et d'un composé fluorescent accepteur.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR, et en ce que les dits premier et second domaines de la protéine EGFR sont localisés dans la partie intracellulaire de cette protéine.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un au moins des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second ligand. 3040789 26\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second ligand. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'elle comprend une étape d'homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire. 10\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre postérieurement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. 15\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre préalablement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. 20\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la coupe d'échantillon de tissu est sous forme de cryosection ou bien d'une coupe enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde (coupe FFPE).\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau 25 d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une cryosection de la coupe d'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, b) Incubation, 30 c) Lavage, d) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 3040789 27 e) Transfert en microplaques, f) Lecture du signal de FRET.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau 5 d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une coupe de l'échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, 10 c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lavage, f) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 15 g) Transfert en microplaques, h) Lecture du signal de FRET.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une coupe de l'échantillon de 20 tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 25 d) Transfert en microplaque, e) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, f) Incubation, g) Lecture du signal de FRET. 30 3040789 28\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une cryosection de l'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 5 b) Transfert en microplaque, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lecture du signal de FRET. 10\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de normalisation du signal de FRET par une valeur représentative de la quantité de matériel biologique présent dans la coupe d'échantillon de tissu. 15\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation de la coupe d'échantillon de tissu avec un agent de marquage émettant un signal proportionnel à la quantité de matériel biologique présent dans l'échantillon, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à cet agent de 20 marquage.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent de l'ADN, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à la fluorescence de cet agent de marquage. 25\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de normalisation comprend : - la mise en oeuvre de moyens informatiques pour l'acquisition de l'image d'une deuxième coupe de l'échantillon de tissu, cette deuxième coupe étant adjacente à 30 la coupe d'échantillon de tissu destinée à être mise en contact avec le couple de partenaires de FRET, et 3040789 29 - l'analyse de cette image pour déterminer une valeur représentative d'un paramètre choisi parmi : le nombre de noyaux de cellules présents dans ladite deuxième coupe; le nombre de cellules présentes dans ladite deuxième coupe ; la surface des noyaux des cellules présentes dans ladite deuxième coupe. 5\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'analyse de ladite image est effectuée par un logiciel mesurant la surface des noyaux des cellules présents dans ladite deuxième coupe, la valeur obtenue étant utilisé pour normaliser le signal de FRET. 10\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate de terre rare.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 19, caractérisé en que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate d'europium ou de terbium. 15\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, les fluorophores connus sous la 20 dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa » et le nitrobenzoxadiazole.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands sont des anticorps capable d'inhiber la liaison des 25 anticorps de lapin D38B1 et C74B9 à la protéine EGFR de plus de 75 %.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands capables de se lier à la protéine EGFR sont les anticorps de lapin D38B1 et C74B9. 30 3040789 30\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le risque de récidive est un risque de récidive métastatique.