Brevet FR3051253A1 (20171117)
REVENDICATIONS1. Méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, ladite méthode comprenant au moins une étape b) comprenant les sous-étapes suivantes : - blA) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat 10 marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, 15 - conversion de la concentration ou l'activité d'enzyme utilisée pour chaque mélange de l'étape blA), en activité anti-enzyme, de préférence par la simple soustraction correspondant à: Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un 20 mélange donné à l'étape blA), en %), puis - b1B) construction de la courbe indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue pour chaque mélange de l'étape blA), ladite courbe correspondant à la courbe de calibration universelle. 25\n<CLM>\1\tMéthode de dosage d'au moins un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, ladite mesure étant obtenue par 30 - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, - suivi du marquage au cours du temps, puis 3051253 32 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire; et b) conversion de la mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage. 5\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape c) de conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur est réversible ou irréversible.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que la mesure de l'étape a) est obtenue par : - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat chromogène, ladite solution de substrat chromogène pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, - suivi de la densité optique au cours du temps, de préférence entre 50s et 80s, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, de préférence entre 50s et 80s.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 1 ou 3 à 5, caractérisée en ce que l'étape b1B) comprend la construction d'une droite de calibration répondant à l'équation suivante où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est nulle.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'étape b) comprend : bl) la construction d'une droite de calibration répondant à l'équation suivante 3051253 33 où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon 5 est nulle, puis b2) la conversion d'au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage, à l'aide de la droite obtenue en 111). 10\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'étape bl) comprend les étapes suivantes : blA) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou 15 d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis 20 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, et b1B) construction de la droite indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en blA).\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que la concentration ou l'activité 25 d'enzyme utilisée pour chaque mélange de l'étape blA) est convertie, préalablement à l'étape b1B), en activité anti-enzyme par la simple soustraction correspondant à : Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un mélange donné à l'étape blA), en %). 30\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma 3051253 34 pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule, de préférence de plasma pauvre en plaquettes.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que la conversion de 5 l'étape c) se fait à l'aide d'un abaque obtenu en effectuant une régression non linéaire de l'équation suivante, sur des échantillons dont les couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) sont connus : où : - AntiEnzyme (%) est l'activité anti-enzyme ; 10 - Mo est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon ; - i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur.\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 3 à 11, caractérisée en ce que l'étape c) comprend les étapes suivantes: 15 cl) construction d'un abaque de conversion spécifique de chaque inhibiteur, puis c2) conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur à l'aide de l'abaque obtenu en cl).\n<CLM>\1\tMéthode selon la revendication 12 et selon la revendication 7, 8 ou 9, caractérisée en ce 20 que l'étape cl) comprend les étapes suivantes: clA) au moins 2 mesures de l'activité anti-enzyme, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'un échantillon biologique comprenant une concentration connue dudit inhibiteur, avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou 25 d'activité fixe connue et une solution de son substrat marqué, chaque mesure utilisant une concentration d'inhibiteur différente, et ladite solution d'enzyme étant de préférence ajoutée en dernier lieu, - suivi du marquage au cours du temps, - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, qui correspond à l'activité 30 enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, puis 3051253 - conversion de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire en activité antienzyme, grâce à la droite obtenue en bl), puis c1B) construction de l'abaque indiquant la concentration en inhibiteur en fonction de l'activité anti-enzyme, avec les mesures obtenues en clA).\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que l'enzyme de la coagulation sanguine est choisie parmi les facteurs de coagulation, la kallikréine et la plasmine, de préférence choisie parmi les facteurs IIa, Xa et la plasmine. 10\n<CLM>\1\tMéthode selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine est choisi parmi l'antithrombine, les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides comme le fondaparinux, le danaparoïde sodique, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine, la désirudine, la bivalirudine, l'argatroban, le dabigatran, le 15 rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le darexaban, l'otamixaban, le melagatran, le ximelagatran et l'antiplasmine.\n<CLM>\1\tUtilisation d'une méthode selon l'une des revendications 2 à 15, pour quantifier le besoin en composé anti-inhibiteur. 20