Brevet FR3051192A1 (20171117)
REVENDICATIONS1. Protéine de fusion comprenant tout ou partie du domaine lectinique d'une galectine fusionné avec une molécule d'intérêt, avec un site de clivage par protéase inséré entre les deux.\n<CLM>\1\tProtéine de fusion selon la revendication 1, où la partie du domaine lectinique est le domaine CRDsAT d'une galectine, de préférence le domaine CRDsAT comprenant la SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t3. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, où le site de clivage est un site de clivage par la protéase TEV.\n<CLM>\1\tVecteur d'expression d'une protéine de fusion telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit vecteur comprenant les éléments suivants liés de manière fonctionnelle : a) un promoteur placé en 5' des éléments b), c) et d) ; b) une séquence codant pour le domaine lectinique d'une galectine ou une partie dudit domaine ; c) un site de clonage recevant une séquence codant pour une protéine d'intérêt ; d) des signaux de terminaison de la transcription ; et dans lequel un site de clivage par protéase est localisé entre la séquence b) et le site de clonage c). Vecteur d'expression selon la revendication 4, où la séquence b) est placée à proximité du site de clonage c), en 3' du promoteur.\n<CLM>\1\tVecteur d'expression selon la revendication 4 ou 5, où la séquence b) code pour le domaine CRDsAT d'une galectine, de préférence le domaine CRDsAT comprenant la séquence SEQ ID NO :\n<CLM>\1\t305 1 1 9 2 23\n<CLM>\1\tVecteur d'expression selon l'un quelconque des revendications 4 à 6, où le site de clivage par protéase est un site de clivage par la protéase TEV.\n<CLM>\1\tVecteur d'expression selon l'une des quelconques revendications 4 à 7, où ledit vecteur est le vecteur d'expression pCARGHO dérivé du vecteur pET20b(+) et comprenant les éléments suivants : une origine de réplication en position 1944 ; un promoteur T7 en position 797-813 un site de fixation au ribosome (RBS) en position 742-747 ; la séquence du CRDsA-r en position 242-736 ; une séquence site de reconnaissance TEV en position 221-241 ; un site de clonage multiple en position 159-215 ; un terminateur T7 en position 26-72 ; une origine F1 en position 3694-4149 ; et un gène bla dé résistance à l'ampicilline en position 2705-3562.\n<CLM>\1\tProcédé de production d'une protéine d'intérêt purifiée, ledit procédé comprenant : a) préparation d'un vecteur d'expression tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 à 8 ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression ; c) la culture de ladite cellule hôte ainsi transformée dans des conditions permettant l'expression de la protéine de fusion dans le milieu de culture ; et d) la purification de la molécule d'intérêt.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape de purification d) est réalisée par : 3051192 24 (i) liaison de la protéine de fusion via le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence sur une colonne de résine d'agarose ou de sepharose greffée avec des molécules de lactose ; (ii) clivage par protéase de la protéine d'intérêt ; (iii) élution de la protéine d'intérêt ; (iv) séparation de la protéase et de la protéine d'intérêt.\n<CLM>\1\tProcédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape de purification d) est réalisée par : (i) liaison de la protéine de fusion via le domaine lectinique de la galectine ou partie dudit domaine sur un support de chromatographie greffé avec des molécules de lactose, de préférence sur une colonne de résine d'agarose ou de sepharose greffée avec des molécules de lactose ; (ii) élution de la protéine de fusion ; (iii) clivage par protéase de la protéine d'intérêt en solution ; (iv) séparation de la protéase et du domaine lectinique ou partie dudit domaine, de la protéine d'intérêt.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, où l'étape de séparation (iv) est réalisée par chromatographie d'échanges d'ions ou chromatographie d'exclusion stérique.\n<CLM>\1\tProcédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, où l'étape d'élution est réalisée avec une solution de lactose.\n<CLM>\1\tDomaine CRDsAT comprenant la séquence en acides aminés SEQ ID NO : I.