Brevet FR3050992A1 (20171110)
REVENDICATIONS1. Protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale, optionnellement le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X.\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 10\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend au moins une mutation A, A', B, C ou C', dans laquelle : la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, 15 la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, 20 la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C' consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID 25 NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 30\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend la mutation B.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le propeptide est un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur X. 3050992 43\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le propeptide est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 et SEQ ID NO :16.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le peptide signal de 10 séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend, 15 entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO :1, une séquence intermédiaire.\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence intermédiaire est la 20 séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du 25 propeptide naturel du facteur X, puis - la séquence SEQ ID NO :5, puis - ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend, de 30 l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis - la séquence SEQ ID NO :5, puis - la séquence SEQ ID NO :11. 3050992 44\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :25.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle est fusionnée au niveau de l'extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37, éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal.\n<CLM>\1\tProtéine selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fragment scFc de type 15 sauvage a la séquence SEQ ID NO :42.\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'elle a la séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43. 20\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation T366Y ou Y407T.\n<CLM>\1\tAcide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour la protéine selon l'une des 25 revendications 1 à\n<CLM>\1\t20. Acide nucléique selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35. 30\n<CLM>\1\tCassette d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 19 ou\n<CLM>\1\t22. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend l'acide nucléique selon la revendication 19 ou\n<CLM>\1\t3050992 45\n<CLM>\1\tVecteur d'expression selon la revendication 22, pour son utilisation comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique.\n<CLM>\1\tCellule recombinante comprenant l'acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, ou le vecteur selon la revendication\n<CLM>\1\t25. Protéine selon l'une des revendications 1 à 18 pour son utilisation en tant que médicament. 10\n<CLM>\1\tProtéine selon l'une des revendications 1 à 18 pour son utilisation pour traiter les troubles hémorragiques.\n<CLM>\1\tProcédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 10 à 18, comprenant : a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence en présence de vitamine K; b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant, -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X.\n<CLM>\1\tProcédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 10 à 18, 30 comprenant : a) l'expression de deux vecteurs d'expression, l'un comprenant un acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, dans une cellule-hôte, de préférence une cellule HEK, de préférence en présence de vitamine K; 3050992 46 b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, 5 -la concentration du surnageant, -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X.