Brevet FR3048780A1 (20170915)
REVENDICATIONS1. Procédé de diagnostic et/ou de suivi et/ou de pronostic et/ou théranostique in vitro de troubles hépatiques à partir d'un échantillon biologique issu d'un individu, dans lequel procédé on détermine la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet/ou la présence et/ou la concentration de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet ADH1A (SEQ ID N° 1).\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon la revendication 1 dans lequel procédé on détermine la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire, préférentiellement d'au moins deux marqueurs supplémentaires, et encore plus préférentiellement d'au moins trois marqueurs supplémentaires, lesdits marqueurs étant sélectionnés dans le groupe constitué par : ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), FABP1 (SEQ ID N° 11), GSTA1 (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet ALTI (SEQ ID N° 13).\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel on détermine au moins la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire sélectionné parmi ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7).\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel on détermine au moins la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet ADH1A (SEQ ID N° 1), d'une part, et des marqueurs ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7).), d'autre part.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le marqueur BHMT est le variant de séquence BHMT1 (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet/ou la combinaison des variants de séquence BHMT1 (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7).\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on détermine en outre la présence et/ou la concentration du marqueur CK18.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on utilise pour ladite détermination de la présence et/ou de la concentration desdits marqueurs des peptides signatures présents dans lesdits marqueurs.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon la revendication 7, dans lequel lesdits peptides signatures sont générés à partir desdits marqueurs par un procédé de digestion, de préférence enzymatique.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon la revendication 7 ou 8, dans lequel la présence et/ou la concentration: 3048780 29 a. de la combinaison des marqueurs ADH1A (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet ADH1B (SEQ ID N° 2), si elle est selectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi INEGFDLLHSGK (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet FSLDALITHVLPFEK (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tb. du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature peptide signature AAVLWEVK (SEQ ID N° 17), c. du marqueur ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi FNLDALVTHTLPFDK (SEQ ID N° 20), IDDDANLER (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou IIGIDINSEK (SEQ ID N° 19), d. du marqueur ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi DVDPGEHYILK (SEQ ID N° 25), TIGIIGAPFSK (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou EGLYITEEIYK (SEQ ID N° 26), e. du marqueur BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), AIAEELAPER (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou EAYNLGVR (SEQ ID N° 22), f. du marqueur BHMT1 (SEQ ID N° 5), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), g. de la combianison des marqueurs BHMT1 (SEQ ID N°5) et BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), si elle est sélectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi AIAEELAPER (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou EAYNLGVR (SEQ ID N° 22), h. du marqueur FABP1 (SEQ ID N° 11), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi AIGLPEELIQK (SEQ ID N° 27), FTITAGSK (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou TWQLEGDNK (SEQ ID N° 29), i. du marqueur GSTA1 (SEQ ID N° 12), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature LHYFNAR (SEQ ID N° 30), j. du marqueur ALTI (SEQ ID N° 13), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi ALELEQELR (SEQ ID N° 34), LLVAGEGHTR (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou KPFTEVIR (SEQ ID N° 36), sachant que ALTI (SEQ ID N° 13), s'il est sélectionné, est plus particulièrement déterminée par la présence du peptide signature ALELEQELR (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tou LLVAGEGHTR (SEQ ID N° 35).\n<CLM>\1\tProcédé in vitro dans lequel on dose au moins un desdits marqueurs (dit « marqueur sélectionné »), dont au moins un marqueur ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet/ou la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N°\n<CLM>\1\tet ADH1A (SEQ ID N° 3048780 30 1), par l'intermédiaire d'au moins un peptide signature caractéristique dudit marqueur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes suivantes : a) l'approvisionnement d'un échantillon biologique prélevé sur un individu à un temps to, b) l'ajout d'une quantité connue d'une protéine isotopiquement marquée homologue du marqueur sélectionné dans l'échantillon biologique obtenu à l'étape a), c) le traitement de l'échantillon biologique pour extraire au moins une partie des protéines abondantes ou au moins une partie des glycoprotéines, d) le traitement de l'échantillon après extraction d'au moins une partie des protéines abondantes ou des glycoprotéines pour générer des peptides protéolytiques, de préférence par digestion, étant entendu que parmi les peptides protéolytiques obtenus se trouvent les peptides signatures des marqueurs sélectionnés, e) le dosage quantitatif par spectrométrie de masse d'au moins un peptide signature généré à partir du marqueur sélectionné, f) la détermination d'un rapport de l'abondance du peptide signature isotopiquement marqué, ajouté à l'étape b), sur l'abondance du peptide signature non marqué issu de l'échantillon biologique, g) le calcul à partir du rapport obtenu à l'étape f) et de la quantité connue de ladite protéine isotopiquement marquée ajoutée à l'étape b), de la concentration dudit marqueur sélectionné dans l'échantillon.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape c) est effectuée par déplétion et préférentiellement par glycodéplétion.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le procédé est effectué à un temps to et à un temps t1 supérieur à to, et comprend après l'étape g), la comparaison de la concentration du marqueur sélectionné dans l'échantillon entre t1 et to.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'étape d) est effectuée par digestion enzymatique, de préférence par l'emploi de trypsine ou d'un mélange d'EndolysC et de trypsine.\n<CLM>\1\tProcédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le trouble hépatique est une insuffisance hépatique aiguë ou une stéatohépatite.\n<CLM>\1\tUtilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 pour évaluer la toxicité de molécules (candidats médicaments, médicament, xénobiotique) préalablement administrées à l'individu dont est issu ledit échantillon biologique.