FR 3078977 A1 20190920 FR 1852257 A 20180316 PROCEDE D'EXTRACTION D'ACIDES NUCLEIQUES La présente invention concerne un procédé d'extraction d'acides nucléiques à l'aide de support solide approprié, par exemple, à base de silice. En particulier, le procédé comprend une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l'échantillon avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l'étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l'échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon. ETAT DE LA TECHNIQUE L'essor de la biologie moléculaire a permis de faire d'immenses progrès dans le diagnostic. Ainsi, à partir d'un échantillon à tester, il est possible d'extraire et de détecter des acides nucléiques appartenant à l'hôte ou aux micro-organismes infectieux contenus dans l'échantillon. La détection, voire la quantification de ce matériel génétique permet d'établir un diagnostic par rapport à une infection microbienne ou à une présence d'oncogènes. Ceci se fait généralement en trois étapes décrites ci-dessous: 1) L'extraction d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques complexes (sang, tumeur, aliments, etc..) qui consiste à une lyse chimique ou mécanique des cellules afin d'en libérer le contenu et particulièrement les acides nucléiques. Ces derniers sont alors purifiés de manière sélective pour être ensuite amplifiés si leur quantité n'est pas suffisante pour une détection directe. 2) L'amplification des acides nucléiques purifiés par des techniques d'amplification de matériel génétique : NASBA, RT PCR, PCR... Cette étape est nécessaire quand la quantité d'acides nucléiques recueillie à partir d'un échantillon biologique est très faible ou que le test n'est pas suffisamment sensible pour une détection directe. 3) La détection des acides nucléiques amplifiés par des techniques dites en point final, en temps réel, par séquençage etc... Selon la technique de détection utilisée, cette étape peut permettre une quantification sélective des acides nucléiques cibles recherchés. 2 Pour une détection sensible et spécifique des acides nucléiques et en particulier, afin de réaliser un diagnostic le plus juste possible, il apparaît essentiel d'extraire et/ou isoler de façon efficace les acides nucléiques (ADN et ARN) des cellules. Cette étape d'extraction et/ou de purification est généralement critique car, de cette première étape, va découler 5 toute la qualité d'une série d'évènements menant au résultat final du test de diagnostic. Il est par conséquent nécessaire d'avoir une extraction des acides nucléiques aussi spécifique et efficace (en quantité, en pureté et en temps) que possible afin de ne pas perdre de l'information, ce qui peut mener à un diagnostic erroné et peut être fatal pour un patient. De nombreuses techniques ont été développées pour tenter d'extraire les acides nucléiques 10 à partir de différents échantillons biologiques. Les méthodes les plus anciennes mettent en oeuvre une multitude d'étapes consistant généralement à enrichir les cellules contenant les acides nucléiques, à lyser ces cellules, à séparer et éliminer les protéines, les membranes et autres constituants cellulaires, à purifier les acides nucléiques restants par précipitation dans des solvants organiques. Ces techniques sont coûteuses, demandent beaucoup de 15 temps et elles sont souvent impossibles à automatiser. Elles ne sont donc plus adaptées aux pratiques actuelles où l'automatisation est nécessaire notamment pour obtenir les résultats rapidement et éviter les problèmes de contamination et d'erreurs humaines, particulièrement dans les cas de sepsis « infection du sang » où le pronostic vital d'un patient est engagé. 20 Les techniques les plus récentes d'extraction d'acides nucléiques utilisent des phases solides où les cellules sont lysées dans des conditions de réactions spécifiques et les acides nucléiques libérés se lient à la phase solide. Il est bien connu dans l'état de l'art que les techniques actuelles d'extraction des acides nucléiques mettent très souvent en oeuvre des phases solides qui sont par exemple des particules enrobées de silice. La silice a la 25 propriété d'adsorber les acides nucléiques, de façon réversible, dans certaines conditions de concentration en sels et de pH, ce qui en fait un matériau très adapté à cet usage. Ces techniques sont décrites par exemple dans « Rapid and simple method for purification of nucleic acids. », Boom, Journal of Clinical Microbiology, 1990 p495 ou encore dans le brevet US 5 234 809 du même auteur. II est également connu d'utiliser des particules magnétiques enrobées de silice. La partie magnétique des particules sert le plus souvent à faciliter et à automatiser les étapes de 3 capture, de lavage et d'élution des acides nucléiques car un simple aimant permet le déplacement des particules dans le tube et le prélèvement des surnageants pour des étapes de lavage. Les rendements d'extraction des acides nucléiques en sont nettement améliorés. Ces techniques sont bien décrites dans "Magne tic particles for the separation and 5 purification of Nucleic acids" , S. Berensmeier, Applied Microbial Biotechnology 2006 73 495-504; "The use of magnetic nanoparticles in the development of new molecular detection systems", I. J. Bruce, Journal of Nanosciences and nanotechnology (2006), 6 (8). pp. 2302-2311 et dans "Optimization of influencing factors of nucleic acid adsorption onto silica-coated magnetic particles: Application to viral nucleic acid extraction from serum" , 10 Ning Sun and al., Journal of Chromatography A, 2014, 1325, 31- 39. La présente divulgation vise à fournir des procédés d'extraction d'acides nucléiques qui répondent à un ou plusieurs des critères suivants : 1) Une simplicité de mise en oeuvre, 2) Une mise en oeuvre possible sur différentes sources d'échantillons biologiques, 15 3) Une mise en oeuvre du procédé en milieu essentiellement aqueux, 4) Un bon rendement d'extraction, 5) Un niveau de pureté de l'acide nucléique après extraction élevé, 6) Une possibilité d'automatisation, 7) Une qualité d'ADN suffisante pour une étape d'amplification et/ou de détection 20 d'une séquence d'intérêt, notamment dans le cadre d'un test in vitro de diagnostic, et/ou 8) Une meilleure sensibilité de détection avec un résultat plus fiable. RE SUME La présente divulgation concerne un procédé d'extraction d'acides nucléiques à partir d'un 25 échantillon comprenant des protéines et/ou polysaccharides, ledit procédé comprenant une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l'échantillon avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l'étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l'échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de 30 l'échantillon. Dans un mode de réalisation spécifique, le réactif de masquage des fonctions 4 amines est choisi parmi des agents acylants ou alkylants. Par exemple, le réactif de masquage est choisi parmi les agents acylants de formule (I) suivante : o R)LLG (I) où R est un groupe organyle, organyloxy, ou organylamino 5 LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino. Plus spécifiquement encore, le réactif de masquage peut être un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d'acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés, et le carbonyl diimidazole. Dans un autre mode 10 de réalisation, le réactif de masquage est un anhydride choisi parmi l'anhydride acétique, l'anhydride propanoïque, l'anhydride isobutyrique, l'anhydride butanoïque ou l'anhydride benzoïque. Dans un autre mode de réalisation, le réactif de masquage est un agent alkylant choisi dans le groupe constitué par les halogénures d'alkyles, les composés diazoïques, et les 15 aldéhydes. Dans un autre mode de réalisation, le réactif de masquage est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols pour le masquage des fonctions acides carboxyliques des protéines, en combinaison avec un agent de couplage. A titre d'exemples d'agent de couplage, on peut citer les carbodiimides, par exemple l' 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide 20 (EDC), le di-iso-propylcarbodiimide (DIC) ou encore le dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, le procédé pour l'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon biologique comprend les étapes suivantes : a. la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l'échantillon biologique avec 25 un tampon de lyse, b. le traitement du lysat avec le réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon, c. la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité avec un support solide approprié, par exemple un support à base de silice, 5 d. le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et, e. le cas échéant, l'élution des acides nucléiques. Typiquement, dans le procédé défini plus haut, le support solide peut être constitué de particules de silice, notamment des particules de silice magnétique. 5 Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum. Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, l'étape de capture est effectuée en présence d'agents chaotropiques. Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, 10 le procédé d'extraction ne comprend pas l'utilisation de protéases pour l'élimination des protéines. Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, aucun solvant organique n'est ajouté avant ou pendant l'étape de capture des acides nucléiques. 15 Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, le procédé comprend une étape supplémentaire de détection d'acides nucléiques d'intérêt, notamment par amplification des acides nucléiques extraits. La présente divulgation vise également des kits d'extraction d'acides nucléiques comprenant au moins 20 i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini ci-dessus, ii. un support solide approprié, par exemple à base de silice, pour l'extraction des acides nucléiques, iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions amines et/ou 25 acides carboxyliques à l'aide du réactif, iv. le cas échéant, un agent de couplage. 6 La présente divulgation concerne en outre l'utilisation d'un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini plus haut, pour l'inhibition de nucléase. Par exemple, la nucléase à inhiber est comprise dans un lysat obtenu par lyse d'un échantillon biologique, par exemple, en vue 5 d'une amplification ou détection d'un acide nucléique dans l'échantillon. DEFINITIONS Par « extraction », on entend une technique permettant d'isoler des acides nucléiques à partir d'un échantillon quel qu'il soit, par exemple, l'isolement d'ADN et/ou d'ARN à partir de cellules eucaryotes, procaryotes, animales humaines, de micro-organismes ou 10 d'un tissu. Ainsi, l'extraction à partir d'échantillon biologique au sens de l'invention inclut en général, la lyse des cellules et la purification des acides nucléiques à partir du lysat. La purification comprend elle-même la capture des acides nucléiques sur un support solide approprié, de préférence à base de silice, le lavage suivi éventuellement de l'élution des acides nucléiques. La capture consiste à adsorber les acides nucléiques sur le support solide 15 et l'élution, lorsqu'elle a lieu, consiste à la désorption ou libération de ces derniers du support solide. Par « échantillon », on entend tout type d'échantillon comprenant au moins des acides nucléiques, et des agents inhibiteurs de l'extraction des acides nucléiques, tels que des protéines et/ou polysaccharides. L'échantillon peut avoir diverses origines comme les 20 échantillons d'origine alimentaire, environnementale, humaine, vétérinaire ou cosmétique. Tous ces échantillons, s'ils ne sont pas liquides, sont préalablement traités pour être sous forme liquide. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer, de façon non-exhaustive, un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages, etc.), de viande, de poisson, d'oeuf, de 25 fruit, de légume, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Bien évidemment, ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats plus élaborés ou des matières premières non transformées ou partiellement transformées. Un échantillon alimentaire peut également être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que des tourteaux, des farines animales. - 7 Tel qu'indiqué précédemment, l'échantillon peut être d'origine environnementale et peut consister, par exemple, en un prélèvement de surface, d'eau, etc. L'échantillon peut également consister en un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, pouvant correspondre à des prélèvements de fluide biologique (urine, sang total 5 ou dérivés tels que sérum ou plasma, crachat ou salive, pus, liquide céphalo-rachidien, etc.), de selles (par exemple diarrhées cholériques), de prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaies, d'organes, de tissus ou de cellules isolées, d'échantillons d'écouvillonnage, des prélèvements ou lavages broncho-alvéolaires, des biopsies. Cette liste n'est évidemment pas exhaustive. 10 Le terme « échantillon » se réfère en général à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d'une ou plusieurs entités aux fins d'analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange, de dilution ou encore de broyage, en particulier si l'entité de départ est à l'état solide. 15 L'échantillon analysé est, en général, susceptible de - ou suspecté de - contenir au moins des acides nucléiques représentatifs de la présence de microorganismes, d'un état du patient (par exemple immunosuppression, grossesse...) ou d'une maladie à détecter, caractériser ou suivre. Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon comprend des protéines de point 20 isoélectrique inférieur à 8, voire inférieur à 7. En particulier, dans un mode de réalisation plus particulièrement spécifique, l'échantillon comprend au moins l'une des protéines suivantes : l'albumine sérique humaine (HSA), le fibrinogène, les immunoglobulines, notamment les IgG, et l'hémoglobine. Par un « micro-organisme », on entend tout ou partie d'une bactérie, d'un champignon, 25 d'une levure, d'un protozoaire ou d'un virus. Par « acides nucléiques », on entend de l'ADN ou de l'ARN de tous types : ADN génomique, ADN complémentaire, ARN messager, ARN complémentaire, ARN de transfert, ARN mitochondrial, ADN de chloroplaste, ARN ribosomal, ADN plasmidique, 8 ADN ou ARN viral, microARN, snoARN, siARN, ARNi, sous forme monocaténaire ou bicaténaire. Par « protéines », on entend toute molécule comprenant au moins une chaine polypeptidique, caractérisé par un enchainement de résidus d'acides aminés liés entre eux 5 par des liaisons peptidiques. Cela inclut en particulier, les peptides et les polypeptides et tout polypeptide modifié ou ses dérivés issus de modifications post-traductionnelles ou autres, leurs produits de dégradation, notamment par dégradation enzymatique, les lipoprotéines, etc. Par « support solide approprié », on entend tout support à même de participer à l'extraction 10 des acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique. Dans un mode préféré, il s'agit de support comprenant ou constitué de silice ou d'un de ces dérivés (silicate, verre, silice modifiée avec des groupements organiques...), magnétique ou non, et à même de participer à l'extraction des acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique. Il peut s'agir également de support à base de papier, de cellulose, ou de magnétite pure, ou autres 15 polymères connus pour leurs utilisations dans l'extraction des acides nucléiques. Il peut s'agir d'au moins un support plan, un support creux, une galette, une aiguille, une membrane, une plaque, une feuille, un cône, un tube, des fibres, une bille, une particule... Le support solide est de préférence une bille ou une particule ou une membrane. Le support solide est de préférence magnétique. 20 Dans un mode de réalisation du procédé d'extraction d'acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique, le procédé comprend les étapes suivantes : a) la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l'échantillon biologique avec un tampon de lyse, b) le traitement du lysat avec un réactif de masquage des fonctions amines et/ou 25 acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides du lysat, c) la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité sur un support solide approprié, d) le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et l'élution des acides nucléiques. 9 La présente divulgation vise également l'utilisation d'un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides dans un procédé d'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon biologique à l'aide de support solide appropné. 5 Les étapes de ce procédé sont décrites plus en détail ci-après. Etape de Lyse L'étape de lyse consiste à casser les cellules de l'échantillon (parois et membranes de la cellule) afin de libérer les acides nucléiques. Il existe plusieurs méthodes de lyse : On peut citer notamment, la lyse mécanique (par exemple avec des billes et/ou un matériau abrasif), 10 chimique, enzymatique ou par choc thermique. Dans un mode de réalisation spécifique, on lyse les cellules par voie chimique par mise en contact de l'échantillon avec un tampon de lyse. Le tampon de lyse doit être à la fois efficace pour casser les membranes des cellules et suffisamment doux pour ne pas dégrader les acides nucléiques. 15 Le tampon de lyse peut comprendre par exemple un détergent et le cas échéant un agent de chélation. Le pH est généralement maintenu entre 4 et 8, par exemple entre 6 et 8, à l'aide d'un tampon approprié, par exemple le Tris HC1, éventuellement dans des concentrations comprises entre 10 et 100 mM. Le détergent peut être choisi parmi les Tween, les tritons, le SDS et autres détergents 20 communément utilisés à des concentrations comprises entre 0,05 et 20%. Eventuellement, le tampon de lyse contient des réactifs pour l'inactivation des nucléases, et/ou l'élimination des protéines, par exemple des protéases telles que la protéinase K. D'autres enzymes peuvent également être utilisées comme les enzymes lytiques (hydrolase, zymolase ...) pour digérer la paroi des levures et des champignons. 25 Dans un mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse ne comprend pas de réactifs pour l'élimination des protéines et notamment, des protéases. En effet, les inventeurs ont montré que le réactif de masquage des fonctions amines et/ou carboxyliques utilisé dans le 10 procédé d'extraction selon la présente divulgation permet avantageusement également une inhibition de l'activité enzymatique des nucléases éventuellement libérées dans le lysat. Dans un mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse comprend également des agents chaotropiques. Les agents chaotropiques interfèrent avec les interactions intramoléculaires 5 faibles (non-covalentes), comme les liaisons hydrogène, les forces de van der Waals et les forces hydrophobes. Parmi les agents chaotropiques, on peut citer l'urée, les sels de guanidine comme le chlorure ou le thiocyanate de guanidinium et le perchlorate de lithium. Ils sont généralement utilisés en concentration allant de 1 à 6 M, en particulier pour le GuSCN et le GuHC1. 10 Dans un autre mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse ne comprend pas d'agents chaotropiques. On peut aussi ajouter des agents de chélation tels que l'EDTA ou des composés similaires, par exemple entre 5 et 50 mM et/ou des composés réducteurs tels que le DTT (dithioérytréitol) ou du TCEP (Tri carboxy éthyle phosphine) ou du bêta-mercaptoéthanol à des 15 concentrations comprises par exemple entre 0,5 et 100 mM. Le tampon de lyse peut comprendre en outre des solvants organiques tels que des alcools (éthanol, isopropanol ...). Dans un mode de réalisation préféré cependant, le tampon de lyse ne comprend pas de solvants organiques. Les caractéristiques chimiques d'un échantillon doivent être prises en compte lors de 20 l'optimisation du tampon de lyse. Par exemple, l'acidité d'un échantillon (ex. certains échantillons de sol) peut endommager les acides nucléiques et peut donc être neutralisée pour garantir un rendement correct en acides nucléiques. L'échantillon est mis en contact avec le tampon de lyse pendant un temps suffisant pour permettre la lyse des cellules sans dégrader les acides nucléiques, par exemple entre 0 et 15 min. 25 Le traitement de l'échantillon ou du lysat avec le réactif de masquage Une caractéristique essentielle du procédé d'extraction d'acides nucléiques selon la présente divulgation concerne l'étape de traitement du lysat à l'aide d'un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou 11 polysaccharides de l'échantillon. Cette étape de traitement peut être réalisée par ajout du réactif de masquage dans le lysat, après l'étape de lyse. Alternativement, le réactif de masquage est compris directement dans le tampon de lyse, l'étape de lyse et de traitement de l'échantillon étant concomitantes. L'objectif est de neutraliser les fonctions chargées 5 des protéines et/ou polysaccharides susceptibles d'affecter le rendement d'extraction à l'aide de support solide, de préférence à base de silice. En effet, dans les exemples qui suivent, les inventeurs ont démontré l'impact des biomolécules sur le rendement d'extraction, et notamment des protéines et/ou polysaccharides d'échantillons biologiques dans des procédés d'extraction à l'aide de supports solides, tels que des particules enrobées 10 de silice. Les protéines et/ou polysaccharides peuvent notamment interagir avec les billes de silice et/ou les acides nucléiques via leurs fonctions chargées, et notamment leurs fonctions amines et/ou acides carboxyliques. Les inventeurs ont alors eu l'idée d'utiliser des réactifs de masquage de ces fonctions chargées, et notamment des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines 15 et/ou polysaccharides afin de bloquer cet effet inhibiteur des biomolécules. Par « réactif de masquage », on entend par conséquent tout composé chimique à même de réagir (de préférence de façon irréversible) avec au moins certaines fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides présents dans un lysat d'un échantillon biologique de façon à modifier ainsi les propriétés de polarité, de point isoélectrique, et/ou 20 de charge de ces protéines et/ou polysaccharides. Dans un mode de réalisation spécifique, le réactif de masquage est choisi parmi des agents acylants ou alkylants, permettant de masquer les fonctions amines des protéines ou polysaccharides. De préférence, l'agent acylant ou alkylant doit pouvoir masquer les fonctions amines des protéines ou polysaccharides en milieu aqueux. 25 Typiquement, un agent acylant utilisable comme réactif de masquage dans le procédé d'extraction d'acides nucléiques est de formule (I) suivante : 0 R).LLG (I) où R est un groupe organyl, organyloxy ou organylamino; 12 LG est un groupe partant. Par « groupe partant », on entend un atome ou un groupe qui, au cours de la réaction d'acylation, se détache de l'atome de carbone auquel il est lié. Dans un mode de réalisation, LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par 5 les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino. Dans un mode de réalisation particulier, le réactif de masquage peut être un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d'acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés et le carbonyl diimidazole. Parmi les esters activés, on peut citer l'acétate de tétra ou pentafluorophényle, l'acétate de 10 nitrophényle, le trifluoroacetate de pentafluorophényle, et les esters de Nhydroxysuccinimide tel que l'acétate de N-hydroxysuccinimide. Parmi les halogénures d'acide, on peut citer les chlorures d'acide tels que le chlorure d'acide acétique, propanoïque, isobutyrique, butanoïque ou benzoïque. Parmi les chloroformiates, on peut citer le chloroformiate de 9-fluorénylméthyle (Fmoc-C1). Parmi les anhydrides, on peut 15 citer l'anhydride acétique, propanoïque, isobutyrique, butanoïque, benzoïque, maléique, succinique ou phtalique. Parmi les esters de carbonate activés, on peut citer le dicarbonate de di-tert-butyle (Boc20). Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le réactif de masquage est l'anhydride acétique ou sa forme sèche, l'acétate de N-Hydroxy succinimide. 20 Dans un autre mode de réalisation spécifique, on peut choisir un agent alkylant dans le groupe constitué par les halogénures d'alkyles, les sulfates d'aryle, les aryl diazo méthyle, les triazènes et les aldéhydes. Parmi les halogénures d'alkyles, on peut citer l'iodure de méthyle, d'éthyle ou de propyle, ou encore le bromure de méthyle. Parmi les composés aryl diazométhyle, on peut citer la méthyl diazopyridine (W02010012949A1). Parmi les 25 aldéhydes, on peut citer le formol et l'acétaldéhyde. Dans un mode de réalisation, le réactif acylant ou alkylant est utilisé en combinaison avec un catalyseur connu de l'homme du métier. Dans le cas d'une acylation avec l'anhydride acétique, on peut par exemple utiliser la 4-Diméthylaminopyridine (DMAP) comme catalyseur. 13 Dans un autre mode de réalisation, le réactif utilisé est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols, pour le masquage des fonctions acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides, en combinaison avec un agent de couplage. L'agent de couplage est utilisé pour activer les fonctions acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides 5 en formant des esters activés. Ces esters activés réagiront ensuite avec un nucléophile choisi parmi les amines, les alcools et les thiols. Le nucléophile peut être présent sur la protéine et/ou le polysaccharide (amine, alcool ou thiol d'un acide aminé de la protéine et/ou du polysaccharide) ou dans le milieu, comme dans le cas d'un tampon nucléophile, par exemple le Tris. 10 L'agent de couplage peut par exemple être choisi parmi les carbodiimides, parmi lesquels on peut citer le 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC), le di-isopropylcarbodiimide (DIC) et le dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Les carbodiimides peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres réactifs tels que le Nhydroxysuccinimide et les triazoles, parmi lesquels on peut citer le 1-hydroxy- 15 benzotriazole (HOBt) et le 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt). Le réactif de masquage peut aussi être bi-fonctionnalisé ou multifonctionnalisé afin d'établir des ponts entre les résidus réactifs des protéines (composés pontants tels que les bis aldéhyde, les bis ester N-Hydroxysuccinimide, les bis chlorure d'acides et leurs dérivés. 20 Par exemple, un agent acylant tel que l'anhydride acétique peut être utilisé dans des concentrations comprises entre 0,01 M et 1,8 M, par exemple entre 0,1 M et 1,0 M, par exemple entre 0,2 et 0,6 M. La concentration du réactif de masquage utilisé pour le traitement de l'échantillon pourra être ajustée en fonction de la concentration en protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon, du réactif de masquage utilisé, de la source de 25 l'échantillon et des conditions de lyse utilisées. Le temps d'incubation du lysat, ou de l'échantillon en cours de lyse lorsque l'étape de lyse et de traitement sont concomitantes, en présence du réactif de masquage est généralement compris entre 1 seconde et 30 minutes, mais préférentiellement inférieur à 10 minutes. 14 Dans un mode de réalisation, on procède à une étape de contrôle de l'acidité du lysat traité, par exemple avec de la soude (NaOH), en particulier afin d'obtenir un pH du lysat traité de préférence compris entre 5 et 7. On obtient à l'issue de l'étape de traitement un lysat traité comprenant des protéines et/ou 5 polysaccharides modifié(e)s. En particulier, une partie au moins des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides est masquée après traitement. La capture L'étape de capture consiste à mettre le lysat traité en présence de support solide, par exemple un support solide à base de silice, dans des conditions permettant l'adsorption des 10 acides nucléiques (extraction en phase solide des acides nucléiques). Le support à base de silice, par exemple, des billes ou particules de silice, permet de séparer les acides nucléiques, retenus par adsorption sur la silice, des autres contaminants cellulaires (membranes, protéines traitées par le réactif de masquage, ...). Dans un mode de réalisation spécifique, on ajoute au lysat traité une quantité suffisante de 15 billes ou particules de silice. De préférence dans ce mode de réalisation avec billes de silice, les conditions permettant l'adsorption des acides nucléiques comprennent la présence d'agents chaotropiques, tels que le chlorure de guanidinium ou du thiocyanate de guanidinium en milieu tamponné entre pH 4 et pH 8, par exemple à l'aide de composés organiques comme les sels de TRIS (Tri (hydroxy éthyle) amino méthane)), les sels 20 d'acétate, de phosphate, de citrate, ou de MES (« morpholino éthane sulfonic acid »). On peut ajouter également un détergent, de préférence le triton X100 ou un de ces analogues (Tergitol, tween, Bridj, Nonidet, Ecosurf ....). Dans un autre mode de réalisation, ledit détergent est contenu dans le tampon de lyse. Le support à base de silice est de préférence chargé négativement entre pH 5.0 et pH 8.0. 25 Dans un mode de réalisation particulier, on n'utilise pas d'agents chaotropiques ou d'alcools lors de l'étape de capture par adsorption sur le support solide. On utilisera alors un support approprié, en particulier un support aminé. 15 A titre d'exemples de billes ou particules de silices utilisables pour l'étape de capture, on peut citer les particules comprises dans les kits suivants : NucliSENS easyMAG Magnetic Silica (BioMérieux), le Film Array (BioMérieux/Biofire Diagnostic), des kits Qiasymphony (Qiagen) et des Kit Magnapure (Roche). 5 Dans un autre mode de réalisation, le support solide à base de silice est une colonne d'extraction avec membrane de silice. A titre d'exemple, on peut citer les kits commercialisés sous les noms Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen), DNeasy Blood et Tissue Kit (Quiagen). On dépose le lysat traité sur la colonne avec membrane de silice, on centrifuge pour faire passer le lysat à travers la colonne. Les acides nucléiques 10 sont retenus sur la colonne et les protéines, polysaccharides et autres débris cellulaires passent à travers la colonne. D'autres supports à base de silice et leurs utilisations pour l'extraction d'acides nucléiques sont décrits notamment dans les articles suivants : Cady, et al. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures. Biosensors and Bioelectronics 19, 59-66 (2003) ; 15 A. Melzak, C. S. Sherwood, R. F. B. Turner, C. A. Haynes. Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J Colloid and Interface Science 181, 635644 (1996) ; Tian, et al. Evaluation of Silica Resins for Direct and Efficient Extraction of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format, Analytical Biochemistry 283, 175-191 (2000) ; Wolfe, et al. Toward a microchip-based solid-phase 20 extraction method for isolation of nucleic acids. Electrophoresis 23, 727-733 (2002). Dans un autre mode de réalisation, on utilise des particules de silice magnétique. Les particules de silice magnétique peuvent être maintenues par un aimant lors des étapes de lavage et, le cas échéant, d'élution suivant la capture. Ce mode de réalisation est particulièrement préféré pour une automatisation du procédé d'extraction. Des exemples de 25 particules magnétiques utilisables sont notamment le kit commercialisé sous le nom NucliSENS easyMAG Magnetic Silica (BioMérieux). Le lavage et l'élution Après l'étape de capture, on peut procéder à une ou plusieurs étapes de lavage en présence d'un tampon de lavage, permettant l'élimination des éléments contaminants sans détacher 16 les acides nucléiques du support. L'étape de lavage peut par exemple comprendre une étape de lavage dans un tampon de lavage approprié, par exemple une solution faiblement chargée en sel contenant éventuellement un alcool et/ou une étape de lavage en présence d'un alcool afin d'éliminer les sels. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, au 5 moins une étape de lavage est effectuée. Le cas échéant, on peut procéder ensuite à une étape d'élution. L'étape d'élution consiste à libérer les acides nucléiques retenus sur le support solide. On utilise en général un tampon à pH basique, par exemple un pH compris entre 8 et 10, et de faible force ionique, tel que du tampon Tris ou borate. Alternativement, on procède directement à l'étape de détection 10 ou d'amplification après les étapes de capture et de lavage. Cette détection et/ou amplification est réalisée directement sur le support solide approprié ayant capturé les acides nucléiques purifiés sans étape d'élution préalable. De préférence, ceci se fait sur une bille ou une particule ou une membrane et de façon plus préférentielle encore sur une particule magnétique ou non. 15 Les acides nucléiques ainsi purifiés par le procédé décrit ci-dessus (avec ou sans étape d'élution) sont utilisables en particulier pour des applications d'amplification et de détection in vitro. Les étapes supplémentaires d'amplification et/ou de détection L'invention est particulièrement appropriée pour la préparation des acides nucléiques en 20 vue de la détection d'acides nucléiques d'intérêt dans un échantillon (test de détection in vitro), notamment suite à l'amplification d'un acide nucléique d'intérêt. L'invention vise donc un procédé de détection d'une séquence d'acides nucléiques d'intérêt dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant : (i) l'extraction des acides nucléiques d'un échantillon biologique susceptible de 25 contenir une séquence d'acides nucléiques d'intérêt, (ii) la détection de la séquence d'acide nucléique dans l'extrait d'acides nucléiques. Selon un mode particulier, l'étape (ii) de détection comprend une étape d'amplification de la séquence d'acide nucléique d'intérêt. 17 Par conséquent, l'invention vise également un procédé d'amplification d'un acide nucléique comprenant (i) la mise en oeuvre d'un procédé d'extraction d'acide nucléique sur un support approprié tel que décrit plus haut, et (ii) une étape d'amplification d'acide nucléique à l'aide d'une ADN polymérase. 5 Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé d'amplification est mis en oeuvre à l'aide d'une ADN polymérase, telle que la Taq polymérase, la Pfu polymérase, la T7 polymérase, le fragment Klenow d'ADN polymérase d'E. cou i et/ou une transcriptase inverse, ou tout autre polymérase. Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec le précédent, le procédé 10 d'amplification est une réaction d'amplification en chaine par polymérase (réaction PCR), bien connue de l'homme du métier. Le protocole PCR comprend par exemple, 20 à 40 cycles, chaque cycle comprenant au moins (i) une phase de dénaturation de l'ADN à amplifier à une température généralement comprise entre 90°C et 95°C, (ii) une phase d'hybridation des amorces avec l'ADN à amplifier à une température généralement 15 comprise entre 55°C et 65°C et (iii) une phase d'extension à une température généralement comprise entre 68°C et 75°C. Des variantes de procédés d'amplification nucléique par PCR peuvent également être mises en oeuvre. On citera en particulier la PCR emboitée (Nested PCR), les PCR quantitatives (ou qPCR), semi-quantitatives ou temps réel, les PCR « error-prone », ou la 20 PCR après transcription inverse (RT-PCR). Il est également possible de mettre en oeuvre d'autres techniques d'amplification telles que LAMP, NASBA, TMA, RPA, LCR, RCR, 3SR, RCA, SDA ou toutes techniques d'amplification des acides nucléiques connues de l'homme du métier. Les kits d'extraction d'acides nucléiques 25 L'invention vise également des kits d'extraction d'acides nucléiques ou trousses comprenant au moins i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que décrit aux paragraphes précédents, 18 par exemple un agent acylant et de préférence, l'anhydride acétique ou sa forme sèche, l'acétate de N-Hydroxy succinimide, ii. un support solide approprié pour l'extraction des acides nucléiques, iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions 5 amines et/ou acides carboxyliques à l'aide du réactif, et/ou iv. le cas échéant, un agent de couplage. Le kit d'extraction peut comprendre en outre des tampons, des contrôles et/ou une notice d'instructions de mise en oeuvre. Dans un autre mode de réalisation particulier, le kit peut comprendre notamment les 10 éléments suivants : i. un agent de couplage, par exemple, l'EDC, ii. un support solide approprié, à base de silice pour l'extraction des acides nucléiques, par exemple des billes de silice, et notamment des billes de silice magnétique, et au moins l'un des éléments optionnels suivants : 15 iii. un tampon de lyse comprenant du Tris ou un autre tampon nucléophile, iv. un ou plusieurs tampons de lavage, et/ou, y. éventuellement, un tampon d'élution, vi. éventuellement, un catalyseur. Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend une colonne avec membrane de 20 silice comme support solide à base de silice. Ces kits sont utiles notamment pour la mise en oeuvre du procédé d'extraction tel que décrit aux paragraphes précédents. Le procédé selon la présente divulgation sera mieux compris à l'aide des exemples détaillés ci-dessous et au regard des figures annexées. DESCRIPTION DES FIGURES 25 Figure 1: Inhibition de la capture de l'ADN sur support solide par certaines protéines en conditions chaotropiques 19 Figure 2: Inhibition de la capture de l'ADN sur support solide par certains polysaccharides en conditions chaotropiques Figure 3: Inhibition de la capture de l'ADN sur support solide par des polymères mono fonctionnels modèles. 5 Figure 4: A. Extraction des acides nucléiques contenus dans un échantillon de sang en utilisant le kit d'extraction easyMAG (BioMérieux) et un traitement préalable du lysat avec de l'anhydride acétique (Ac20) ou de l'acide acétique (AcOH) (capture dans 3M GuHC1 + 1% Triton et lavages à l'éthanol). B. Mesure de la quantité d'acides nucléiques par analyse chromatographique. 10 Figure 5: Analyse par HPLC d'éluats d'extraction d'un mélange d'ADN et d'ARN soumis ou non à de l'anhydride acétique. Haut : Eluat issu de l'extraction d'un mélange de 10 jig d'ADN et ARN et de 5,2 mg de protéines en présence d'anhydride acétique. Bas : Eluat issu de l'extraction d'un mélange de 10 jig d'ADN et ARN. Figure 6: Courbe de détection par fluorescence (RFU) de l'amplification en temps réel des 15 acides nucléiques du virus CMV dans le sang par PCR. Les courbes de la Figure 6 correspondent respectivement à l'amplification témoin réalisée après extraction sans matrice biologique (triangles), avec matrice biologique sans traitement à l'anhydride acétique (croix) et avec matrice biologique avec traitement à l'anhydride acétique (ronds). Figure 7: Sensibilité de la détection du virus CMV dans le sang, sans ou avec un 20 traitement à l'anhydride acétique Ac20 préalable à l'extraction (Ct) : A gauche : 10'4 copies de CMV dans le Tris HC1, Au centre : 10'4 copies de CMV dans le sang, A droite : 10'4 copies de CMV dans le sang + Ac20. Figure 8: Extraction d'ADN en présence d'un mélange d'hémoglobine et d'albumine sérique humaine sur colonne avec membrane de silice avec et sans traitement avec Ac20. 25 A gauche (gris foncé) : sans traitement Ac20, à droite (gris clair) : avec traitement Ac20 Figure 9: Chromatogramme correspondant à un oligonucléotide intègre (A), le même oligonucléotide en présence de nucléase Pl et donc dégradé (B) et le même 20 oligonucléotide en présence de nucléase P1 et d'anhydride acétique montrant une bien meilleure stabilité de l'oligonucléotide en raison de l'acylation de la nucléase (C). EXEMPLES Conditions générales 5 Les conditions générales pour l'analyse des composés utilisés dans les exemples ci-après sont décrites ci-dessous: Les analyses LC-MS ont été effectuées avec une chaîne HPLC WATERS Alliance 2795 équipée d'un détecteur à barrette de diodes PDA 996 (Waters), d'un détecteur par spectrométrie de masse ZQ 2000 (Waters), d'un logiciel Empower version 2. Le 10 spectromètre de masse ZQ 2000 possède une source d'ionisation Electrospray. Les ionisations ont été réalisées en mode positif avec une tension de cône de 20V et une tension au niveau du capillaire de 3,5kV. Les conditions utilisées pour les analyses HPLC sont les suivantes (conditions A et B): Conditions Eluant A Gradient linéaire Eluant B Eluant C A A :Eau milliQ 98%/ 0%/ 2% ->93%/5%/2%en4 min -> 93% / 5% / 2% en 1 min -> 86% / 12% / 2% en 5 min -> 86% / 12% / 2% en 9 min - > 8% / 90% / 2% en 1 min -> 98% / 0% / 2% en 3 min B : ACN Colonne Waters XTerra MS phase inverse C18 (2.5 um, 4.6x300mm), 30°C, débit 1 ml/min, détection à 260 nm C : Formiate d'ammonium 500 mM, pH 7 B A :Eau milliQ 78%/ 20%/ 2% ->26%/72%/2%en31 min -> 3%! 95% /2% en 9 min -> 78% / 20% / 2% en 20 min B : ACN Colonne Waters XBridge C4 (3.5 pm, 4.6x150 mm), 30°C, débit 1 ml/min, détection à 260 nm C : TFA 500 mM, pH 1 21 Exemple la : Démonstration de l'effet inhibiteur des composés protéiques du sang pour la capture des acides nucléiques sur support solide (particules de silice magnétique utilisées à pH 7) Pour tenter d'améliorer les performances de l'extraction des acides nucléiques sur support 5 solide à base de silice, les inventeurs ont supposé qu'il fallait en premier lieu tenter d'augmenter les performances de l'étape de capture. Pour démontrer l'effet inhibiteur à l'étape de capture des composés les plus représentés dans le sang vis-à-vis de l'extraction des acides nucléiques, une solution de 2000 contenant 231.1g d'acides nucléiques (ADN de sperme de saumon 20Kb) dans GuHC1 4 M, 10 50 mM Tris pH 7 est préparée. Des quantités croissantes de protéines ont été ajoutées à ce mélange (entre 0 et 3001.1g) afin de simuler un lysat cellulaire en conditions chaotropiques tel qu'il se produit dans des conditions d'extraction des acides nucléiques. Pour chaque expérience, des particules de silice magnétique (50111 à 20 mg/m1 dans l'eau, 1 15 mg, easyMAG, bioMérieux, Marcy l'étoile, France) ont été ajoutées et on a mesuré par spectrophotométrie UV à 260 nm la quantité résiduelle d'ADN après 3 min d'agitation. Connaissant la quantité d'acides nucléiques introduite et la quantité adsorbée, on peut alors facilement calculer la quantité d'ADN adsorbée sur les particules et donc le rendement de capture. Un contrôle négatif a été réalisé à chaque fois sur la solution d'ADN et de 20 protéines. Les courbes sont normalisées par rapport à la référence sans inhibiteurs. On voit sur la Figure 1 que, dès l'ajout de quelques ltg de protéines, on réduit de façon drastique la capture de l'ADN jusqu'à l'inhiber totalement dans le cas d'une centaine de ltg de HSA (Human Serum Albumine) par exemple. L'effet inhibiteur semble être en partie lié au point isoélectrique des protéines, avec 25 respectivement par ordre d'inhibition, l'albumine sérique humaine (HSA) qui a un point isoélectrique de 4,8, le fibrinogène de 5,8, l'hémoglobine et l'immunoglobuline de 7, et le lysozyme de 11,3. Plus les biomolécules sont acides et plus elles entrent en compétition avec la capture de l'ADN. Il est à noter cependant que bien que les groupements acides 22 soient les plus compétiteurs, les groupements amines le sont également (Cf exemple 2 pour compléments à ce sujet). Cet exemple met ainsi en évidence l'effet inhibiteur des composés du sang sur le rendement d'extraction des acides nucléiques, et plus particulièrement les composés 5 protéiques qui sont chargés négativement et positivement. On constate que les composés parmi les plus compétiteurs sont ceux présents en grande quantité dans le sang (l'albumine sérique humaine, le fibrinogène, les immunoglobulines et l'hémoglobine). Exemple lb : Démonstration de l'effet inhibiteur des composés polysaccharides pour la capture des acides nucléiques sur support solide (Particules de silice magnétique 10 utilisées à pH 7) L'expérience de l'exemple la a été réalisée avec d'autres composés comme des polysaccharides chargés soit positivement soit négativement à la place des protéines. Là encore, on met en évidence un effet inhibiteur des polysaccharides sur le rendement d'extraction des acides nucléiques (voir Figure 2). 15 Exemple 2 : Rôle de la charge et de la composition chimique des protéines sur l'inhibition de la capture des acides nucléiques sur support solide Afin de mieux comprendre le phénomène d'inhibition de la capture des acides nucléiques sur support solide, la même expérience que celle décrite dans l'exemple 1 a été réalisée mais en utilisant des composés modèles poly-acides carboxyliques, poly-amines ou poly- 20 alcools au lieu des protéines correspondantes (Figure 3). On y voit très clairement que les poly-acides carboxyliques sont plus inhibants que les poly-amines, elles-même beaucoup plus inhibantes que les poly-alcools ou que les composés neutres. Il faut quelques dizaine de lag de ces composés pour inhiber à 50% la capture de l'ADN. Ceci est cohérent par rapport à ce qui a été observé précédemment avec les protéines dans 25 l'exemple 1 ou les polysaccharides dans l'exemple lb. L'effet inhibiteur des fonctions amines et acides carboxyliques des protéines et polysaccharides sur la capture des acides nucléiques dans un échantillon biologique est donc certainement très marqué : A titre d'exemple, un échantillon de sang pourrait contenir 23 entre 200 et 500 mg/m1 de protéines. Ainsi, dans les conditions réelles d'une extraction d'acides nucléiques à partir de 2041 de sang, l'échantillon pourrait comprendre au moins entre 40 et 100 de mg de composés « inhibiteurs » de la capture des acides nucléiques. Exemple 3 : Effet inhibiteur d'une forte concentration en protéines pour l'extraction 5 des acides nucléiques, le rendement d'élution de l'ADN et la pureté de l'ADN extrait (particules de silice magnétique utilisées à pH 7) Bien que l'effet compétiteur des protéines soit déjà remarquablement négatif dans les conditions de l'exemple précédent, ces conditions sont pourtant bien en deçà de la quantité de protéines qui serait réellement apportée par 2041 de sang (50 mg environ). Afin de de 10 se rapprocher de la réalité, les inventeurs ont réalisé une autre expérience où cette fois, on ajoute ou non, l'équivalent de 5 mg de protéines (mélange d'immunoglobuline, de HSA et d'hémoglobine en concentration similaire à ce que l'on pourrait trouver dans un vrai échantillon de sang) au 2041 de solution de lyse. La solution de lyse correspond respectivement à 231.1g d'ADN dans 2041 de GuHC1 ou de 15 GuSCN 3 M, 50 mM Tris pH 7, 1% Triton X100, ou au tampon de lyse easyMAG (bioMérieux, Marcy l'étoile, France) dilué à 3M. A ces solutions, on ajoute 1 mg de particules de silice magnétique (easyMAG, bioMérieux, Marcy l'étoile, France). On mesure le rendement total d'extraction de l'ADN par dosage par spectrophotométrie UV à 260 nm des acides nucléiques contenus dans l'éluat, i.e, après 20 capture sur les particules de silice magnétique, lavage des particules avec le réactif de lavage « Wash buffer 2» easyMAG, et élution avec le réactif d' élution « Elution buffer 3 » de l'easyMAG, à 70°C pendant 5 min. 24 Rendement d'extraction total (capture et elution en °A) (ratio 260/280) GuHCI 3M GuHSCN 3M Lysis Buffer eMAG + triton + triton 3M ADN (23 ug) 58% 62% 56% (2) (2) (2) ADN (23ug) 1% 4% 6% + Mélange de protéines (5000 pg ) (1.2) (1.6) (1.6) Tableau 1: Rendement d'extraction de 23 1.1g d'ADN en présence ou non d'inhibiteurs protéiques. Les chiffres entre parenthèses indiquent le ratio 260/280 nm de l'éluat. On observe, comme dans les exemples précédents, une chute brutale du rendement 5 d'extraction. Quelles que soient les conditions de lyse, on passe d'un rendement d'extraction de l'ADN (capture, lavage, élution) de 60% environ, à moins de 6% quand on ajoute des protéines dans le milieu. La pureté des acides nucléiques extraits est également très affectée puisque la présence de protéines abaisse le ratio 260/280 représentatif de la contamination en protéines dans 10 l'éluat final de 2 à moins de 1.6 en moyenne (voir Tableau 1). Ceci traduit donc une très forte concentration en protéines dans l'éluat. Cette expérience démontre sans ambiguïté que les composés protéiques, et notamment les composés protéiques du sang, utilisés à une concentration similaire à celle rencontrée dans une extraction standard, impactent très fortement la capture des acides nucléiques par effet 15 compétitif Par voie de conséquence, le rendement d'extraction global et la pureté des acides nucléiques s'en trouvent affectés. Exemple 4 : Augmentation du rendement d'extraction de l'ADN par l'utilisation d'un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques en présence d'une forte concentration de protéines (utilisation de particules magnétiques à pH 7) 20 Les inventeurs ont réalisé la même expérience que celle décrite dans l'exemple 3 ci-dessus mais en ajoutant cette fois un traitement à l'anhydride acétique ou à l'EDC préalable à la mise en contact avec les particules de silice magnétique. 25 Pour cela, on incube 23 1.1g d'ADN (10 ul d'ADN à 2.3 g/1) avec 5000 ltg de protéines (25 pl d'un mélange à 150 g/1 de Hb, 50 g/1 de HSA et 3 g/1 de fibrinogène dans du Tris-HC1 50mM pH7 en concentration similaire à ce que l'on pourrait trouver dans un vrai échantillon de sang) dans une solution de 200111 de GuHC1 ou de GuSCN, 50 mM Tris pH 5 7, 1% Triton X100, ou de tampon de lyse easyMAG à des concentrations telles que l'on se retrouve pendant l'extraction à 3M en sels chaotropiques. On ajoute suffisamment d'anhydride acétique ou d'EDC pour être à 0.3M dans la solution. On laisse réagir 5 min, on neutralise avec quelques pl de soude 10 M afin de restaurer un pH de 7 (dans le cas de l'anhydride acétique seulement) et on ajoute 1 mg de particules de 10 silice magnétique que l'on incube sous agitation pendant 15 min avant de les laver et d' éluer les acides nucléiques purifiés comme décrit dans l'exemple 3. Le rendement total d'extraction est calculé par rapport aux 23 lag d'ADN initiaux et à la quantité d'acides nucléiques obtenus dans l'éluat. Le dosage est effectué par spectrophotométrie UV à 260 nm. 15 On a montré sur le tableau 2 que la présence de protéines pendant l'extraction diminue considérablement le rendement d'extraction de l'ADN ainsi que son ratio 260/280 nm (de 60% à 5% et de 2 à 1,6 environ quelles que soient les conditions). Cependant, une pré-incubation du lysat avec l'anhydride acétique ou l'EDC (respectivement Ac20 ou EDC dans le tableau 2 ci-dessous), avant ajout des particules de silice magnétique, restaure 20 significativement les performances d'extraction de l'ADN à la fois en quantité (à hauteur de 20% environ) mais aussi en pureté (à hauteur de 1,8 environ). Ceci démontre l'effet bénéfique du masquage préalable des protéines sur l'extraction d'ADN par un support solide dans des conditions similaires à celles que l'on trouverait dans un protocole d'extraction des acides nucléiques type. 25 De manière générale, le GuHSCN, qui possède un pouvoir dénaturant plus important que le GuHC1, permet un meilleur rendement de capture de l'ADN en présence de protéines. Cependant la présence d'EDTA dans le LB diminue le ratio 260/280, tandis que le Triton X-100 lui aussi présent dans le LB a un effet très bénéfique. 26 Rendement d'extraction total (capture et elution en %) (ratio 260/280) GuHCI GuHCI 3M GuHSCN GuHSCN Lysis 3M + triton 3M 3M Buffer + triton eMAG 3M ADN (23 ug) 54% 58% 62% 62% 56% (2) (2) (2) ADN (23ug) 0,8% 1% 2% 4% 6% Mélange de protéines (5000 "tg ) (1,08) (1.2) (1.2) (1.6) (1.6) ADN (23ug) 20% 23% 9% 23% 15% + Mélange de protéines (5000 gg ) (1.7) (1.7) (1.4) (1,9) (1.9) + Ac20 (0.3M) ADN (23ug) Mélange de protéines (5000 lig ) 24% 22% + EDC (03M) (1.5) ND (1,7) ND ND Tableau 2: Rendement d'extraction de 23 ltg d'ADN en présence ou non d'inhibiteurs protéiques et avec ou sans anhydride acétique (Ac20) ou EDC, et dans différentes conditions de lyse. Les chiffres entre parenthèses indiquent le ratio 260/280 nm de l'éluat 5 Exemple 5 : Amélioration de l'efficacité de l'extraction des acides nucléiques dans le sang (extraction avec des particules magnétiques à pH 7) Afin de démontrer les effets bénéfiques du masquage des protéines par un réactif, avec un vrai échantillon biologique, nous avons extrait les acides nucléiques de 2041 de sang en utilisant des particules de silice magnétiques (bioMérieux) et un protocole légèrement 10 modifié utilisant du GuHC1 3M, Tris HC1 50 mM pH 7, 1% de triton pour l'étape de lyse, du Tris HCL 50 mM pH 7 à 50% ethanol pour les lavages et le tampon EasyMAG EB3 (bioMérieux) pour l'élution finale. L'échantillon de sang a été soumis pendant l'étape de lyse à un traitement à l'anhydride acétique 0,3 M ou à l'acide acétique 0,3M pendant 5min, avant d'être neutralisé par 15 adjonction de quelques pl de soude (en comparaison avec un échantillon de référence non traité). 27 Suite à ce traitement, les particules magnétiques ont été ajoutées et le lysat mis sur l'easyMAG en suivant le protocole d'extraction du fournisseur (bioMérieux). La quantité d'acides nucléiques présente dans le sang est mesurée par spectrophotométrie UV (Nanodrop, Thermofischer). On constate de façon remarquable sur la Figure 4 A que le 5 protocole utilisant le réactif de masquage fonctionne également sur un échantillon de sang : Dans les conditions utilisées, l'absence de traitement à l'anhydride acétique ne conduit qu'à 0,7pg d'acides nucléiques (pureté de 0,9) alors que le traitement à l'anhydride acétique conduit à plus de 51.1g d'acides nucléique (pour une pureté supérieure à 1.9). En expérience de contrôle, un traitement à l'acide acétique ne démontre aucune amélioration, 10 ce qui montre que l'effet de l'anhydride acétique est lié à son pouvoir acylant. En effet, l'acide acétique n'est pas un agent acylant et ne peut masquer les fonctions réactives des protéines. Il peut y avoir une multitude de composés co-extraits avec les acides nucléiques qui pourraient fausser le ratio 260/280. Afin de s'affranchir éventuellement des erreurs 15 inhérentes à la mesure de densité optique par spectrophotométrie UV d'un éluat issu de l'extraction d'un échantillon biologique, nous avons soumis ces éluats à une hydrolyse totale avec de la nucléase P1 et de la phosphatase alcaline. Les hydrolysats ont été analysés par HPLC de façon à ne pas être gênés par les protéines et l'aire correspondant aux nucléosides (DNA et RNA) a été mesurée sur les 20 chromatogrammes par intégration des massifs correspondant aux nucléosides. Les résultats obtenus montrent que l'échantillon de sang traité préalablement avec l'anhydride acétique contient 12 fois plus d'acides nucléiques que l'échantillon non traité ou traité à l'acide acétique (qui est non acylant) (Figure 4B). Exemple 6 : Amélioration de l'efficacité de l'extraction des acides nucléiques dans le 25 sang (Extraction avec particules magnétiques à base de silice à pH 5.5) La même expérience que celle décrite dans l'exemple 5 a été réalisée mais en changeant les conditions d'extraction des acides nucléiques (solutions tampons différentes). A 133pt d'une solution de sang sont ajoutés 237 !IL de tampon de lyse (6M GuHC1, 15 % Triton, AcONa, pH 5,5) et 61.1E, 12111 ou 24pL d'Ac20 . Le milieu est incubé sous agitation 28 pendant 3 à 5 min au au thermomixeur à 25°C et 500 tpm avant de rectifier le pH à 5,5 si nécessaire par adjonction de quelques 1.1.1 de NaOH 10M. Par exemple 3 !IL, 4.5 et 6.8 !IL de NaOH sont ajoutés respectivement pour 6pL, 12pt et 24pt d'Ac20. Le lysat est additionné aux particules de silice magnétiques afin d'extraire les acides nucléiques. Les 5 solutions de lavages (3 fois 741 Wash Buffer 1X) précèdent l'étape d'élution qui s'effectue dans une solution de 70pt de Tris HC1 sous agitation à 1400 tpm, à 70°C en 5 minutes. Les lysats sont soumis à l'action d'enzymes d'hydrolyse des acides nucléiques comme décrit dans l'exemple 5 afin de déterminer la quantité d'acides nucléiques extrait. Les résultats obtenus montrent que l'ajout du réactif de masquage (anhydride acétique) en 10 présence de sang permet de doubler la quantité d'acides nucléiques extrait. On observe un optimum dans ces conditions aux alentours de 61.1.1 d'anhydride acétique pur. A cette concentration et en présence de 15% de Triton dans le tampon de lyse, la quantité d'acide nucléique éluée est globalement multipliée par deux. Le ratio rA/(rA+dA) montre que l'ARN est majoritairement présent dans l'éluat à 70 % contre 10 % sur la 15 nanoparticule, indiquant qu'il est élue préférentiellement. Exemple 7: Le traitement de l'ADN par l'anhydride acétique dans les conditions du procédé selon la présente divulgation n'altère pas la structure chimique des nucléosides Afin de démontrer la sélectivité de réaction de l'anhydride acétique vis-à-vis des acides 20 nucléiques, les inventeurs ont réalisé l'expérience suivante : Après incubation pendant 10 min d'un mélange de 92mg de d'ADN dans 3641 de GuHC1 3,3M, Tris HC1 50 mM pH 7 en présence d'anhydride acétique à 0.6M (24p1), l'ADN a été purifié par cartouche d'ultrafiltration (Ultracel YM-50) afin d'éliminer l'anhydride acétique qui absorbe partiellement en UV. Cet échantillon a été ensuite soumis à une lyse 25 totale avec un mélange de nuclease P1 et de phosphatase alcaline avant d'être analysé par HPLC (Conditions A). Les résultats obtenus montrent que l'hydrolysat d'ADN en présence d'anhydride acétique ou non, a exactement le même profil. On n'y décèle que les nucléosides attendus et aucun nucléoside acyle. Une recherche de nucléoside acyles par spectrométrie de masse a été également réalisée sans mettre en évidence ces produits. Ces 29 résultats montrent que la réaction d'acylation avec l'anhydride acétique est bien sélective et n'affecte pas les acides nucléiques extraits. Exemple 8 : Démonstration que la structure de l'ADN et de l'ARN ne sont pas affectée lors du traitement par l'anhydride acétique dans des conditions d'extraction 5 des acides nucléiques La même démonstration que dans l'exemple 7 a été réalisée en utilisant cette fois un mélange d'ADN et d'ARN qui a été mis en présence ou non de l'anhydride acétique puis extrait à l'aide de particules de silice magnétique. Une hydrolyse enzymatique de ces éluats a permis de confirmer sans aucune ambiguïté qu'il n'y a pas de modifications chimiques 10 des nucléosides suite à l'action de l'anhydride acétique (voir Figure 5). Ainsi, on peut en conclure que les acides nucléiques ainsi extraits devraient être amplifiables par PCR ou par toute autre réaction d'amplification enzymatique de matériel génétique. Exemple 9 : Le traitement à l'anhydride acétique d'un échantillon de sang permet de détecter le virus CMV avec plus de sensibilité 15 Un échantillon de 200111 de sang contenant du virus CMV (Cytomégalovirus en culture) à hauteur de 10e4 copies est ajouté à 800 pl de tampon de lyse (6M GuHC1, 15 % Triton, AcONa, pH 5,5) auquel on ajoute 9111 d'anhydride acétique pur et, facultativement liai de NaOH 10M, après quelques minutes de réaction. On réalise un témoin avec du sang où il n'y a pas de traitement préalable à l'anhydride 20 acétique, et un autre sans échantillon sanguin, correspondant à 63 pl de Tris HCL pH7 contenant 10e4 copies de CMV puis mélangé à 237 pl de tampon de lyse. Les acides nucléiques contenus dans le lysat sont ensuite extraits et purifiés comme décrit dans l'exemple 6. L'éluat est ensuite soumis à une amplification par PCR en temps réel en utilisant un kit RGene CMV (kit CMV 69-003B : lot 1005408010, BioMérieux, Marcy 25 L'Etoile, France) et un thermocycleur (CFX96 TouchTM de BioRad) permettant de déterminer la sensibilité de détection des acides nucléiques extrait exprimé en nombre de cycle de PCR (Ct). Ce nombre est fonction de la concentration en acides nucléiques, plus il est bas et plus il est facile de détecter les acides nucléiques de l'agent pathogène car la 30 concentration initiale en acides nucléiques est élevée. Il y a un facteur d'échelle de 10 entre chaque Ct (échelle logarithmique). Les courbes de la Figure 6 correspondent respectivement à l'amplification témoin réalisée après extraction sans matrice biologique (triangles), avec matrice biologique sans 5 traitement à l'anhydride acétique (croix) et avec matrice biologique avec traitement à l'anhydride acétique (ronds). Le nombre de cycles de PCR est donc à 34Ct quand le virus CMV a été extrait sans matrice biologique, puis passe à 38 Ct quand la même quantité d'acides nucléiques est extraite d'un échantillon contenant du sang. Ceci montre que les inhibiteurs contenus dans la matrice biologique sont responsables de la perte de plus de 10 99,9 % des acides nucléiques initiaux. Le nombre de Ct repasse à 34 soit équivalent à un échantillon sans matrice quand l'échantillon à préalablement été traité avec l'anhydride acétique. Ces données montrent une remarquable amélioration de la sensibilité de la détection en présence d'une matrice biologique. La Figure 7 est une autre représentation de la Figure 6 avec la précision sur les Ct. 15 Exemple 10. Amélioration de l'extraction des acides nucléiques en présence d'une forte concentration en protéines par l'utilisation d'anhydride acétique (Utilisation d'une colonne d'extraction avec membrane de silice) Dans cet exemple, les inventeurs ont utilisé un support d'extraction des acides nucléiques différent des particules de silice magnétique, afin de démontrer que l'anhydride acétique à 20 également un intérêt dans d'autres technologies d'extraction comme les colonnes d'extraction à base de membrane de silice. 10 ug d'ADN de sperme de saumon (20 1d3) sont mélangés à 3041 d'une solution de GuHC1 3M, 50 mM AcO-Na pH 5,5 et 30% d'éthanol avec des concentrations croissantes d'un mélange d'hémoglobine et d'albumine sérique humaine à hauteur de 25 0,300,600,1200,1800 et 2400 tg (avec un ratio hémoglobine / HSA de 3/1). Ce mélange est traité ou non avec 41 d'anhydride acétique pendant quelques minutes (10) sous agitation au thermomixer. Le mélange est neutralisé avec 1 1.1.1 de NaOH 5M afin de rétablir le pH à 5,5. 31 Le mélange est déposé sur une colonne QiaQuick (Qiagen, Heiden, Allemagne) et centrifugée 6 minutes à 13 200 rpm. La colonne est lavée 3 fois avec 204L de MES 50 mM pH 5,5 / 80% Ethanol en centrifugeant à 13200rpm pendant 3 minutes 5 Les acides nucléiques immobilisés sont alors élues avec 2041 de tampon borate pH 8,5 à 3mM une première fois, puis cette solution est repassée afin d'éluer la totalité des acides nucléiques. L'éluat est soumis à une hydrolyse enzymatique puis les acides nucléiques extraits sont quantifiés par analyse chromatographique. 10 On observe sur la Figure 8 une amélioration notable de la quantité d'ADN extraite quand l'échantillon a été soumis à l'anhydride acétique. Exemple 11 : Démonstration que l'utilisation de l'anhydride acétique selon l'invention permet aussi l'inhibition des nucléases Un oligonucléotide modèle de 60 bases (1 nmole) est mis en présence de 0,01 unité de 15 nucléase Pl dans 441 d'eau et 2111 de MES 500 mM pH 4.7 en rajoutant ou non 6 pl d'anhydride acétique pur. Les résultats sont présentés sur la figure 9. On constate par rapport à l'oligonucléotide de contrôle n'ayant subi aucun traitement (chromatogramme A) que dans le cas où il n'y a pas d'anhydride acétique, l'oligonucléotide est immédiatement hydrolysé par la nucléase (chromatogramme B). En revanche, dans le cas 20 où l'on a rajouté l'anhydride acétique, il n'y a que très peu de dégradation de l'oligonucléotide (chromatogramme C). Ceci démontre donc que l'anhydride acétique permet l'inactivation REVENDICATIONS1. Procédé d'extraction d'acides nucléiques à partir d'un échantillon comprenant des protéines et/ou polysaccharides, ledit procédé comprenant une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l'échantillon avec un support solide approprié, par exemple un support solide à base de silice, caractérisé en ce que, avant l'étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l'échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif de masquage des fonctions amines est choisi parmi des agents acylants ou alkylants. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est choisi parmi les agents acylants de formule (I) suivante : 0 R)LLG (I) où R est un groupe organyle, organyloxy, ou organylamino LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino.4. 5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d'acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés, et le carbonyle diimidazole. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un anhydride choisi parmi l'anhydride acétique, l'anhydride propanoïque, l'anhydride isobutyrique, l'anhydride butanoïque ou l'anhydride benzoïque. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un agent alkylant choisi dans le groupe constitué par les halogénures d'alkyles, les composés diazoïques, et les aldéhydes. 33 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols pour le masquage des fonctions acides carboxylique des protéines, en combinaison avec un agent de couplage. 5 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent de couplage peut être choisi parmi les carbodiimides, par exemple l'1-éthyle-3-(3- diméthylaminopropyle)carbodiimide (EDC), le di-iso-propylcarbodiimide (DIC) et le dicyclohexylcarbodiimide (DCC). 10 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes pour l'extraction d'acides nucléiques d'un échantillon biologique et comprenant les étapes suivantes : a. la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l'échantillon biologique avec un tampon de lyse, b. le traitement du lysat avec le réactif de masquage des fonctions amines et/ou 15 acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon, c. la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité avec un support solide approprié, par exemple un support solide à base de silice, d. le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et, e. le cas échéant, l'élution des acides nucléiques. 20 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le support solide approprié est constitué de particules de silice, notamment des particules de silice magnétique. 25 11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'étape de capture est effectuée en présence d'agents chaotropiques. 30 13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il ne comprend pas l'utilisation de protéases pour l'élimination des protéines. 14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu'aucun solvant organique n'est ajouté avant ou pendant l'étape de capture des acides nucléiques. 34 15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire de détection d'acides nucléiques d'intérêt, notamment par amplification des acides nucléiques extraits. 5 16. Kit d'extraction d'acides nucléiques comprenant au moins i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini à l'une des revendications 1 à 8, 10 ii. un support solide approprié pour l'extraction des acides nucléiques, par exemple un support solide à base de silice, iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques à l'aide du réactif, iv. le cas échéant, un agent de couplage. 15 17. Kit d'extraction d'acides nucléiques selon la revendication 16, caractérisé en ce que le réactif de masquage est l'anhydride acétique ou sa forme sèche, l'acétate de NHydroxy succinimide, 20 18. Utilisation d'un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini à l'une des revendications 1 à 8, pour l'inhibition de nucléase. 19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que la nucléase est 25 comprise dans un lysat obtenu par lyse d'un échantillon biologique, par exemple, en vue d'une amplification et/ou détection d'un acide nucléique dans l'échantillon.