FR 3075965 A1 20190628 FR 1763079 A 20171222 Procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf en fonction d'au moins une caractéristique de fluorescence. 1. DOMAINE TECHNIQUE Le domaine de l'invention est celui de l'aviculture. Plus précisément, l'invention concerne une technique (procédés et systèmes) non invasive de détermination de la fertilité d'un oeuf et/ou du sexe de celui-ci (c'est-à-dire le genre, mâle ou femelle, de l'embryon contenu dans l'oeuf si celui-ci a été fécondé). 2. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE On connaît depuis de nombreuses années, dans le domaine avicole, la problématique récurrente de la détermination de la fertilité et du sexe des oeufs avant leur éclosion. Traditionnellement, le sexage s'effectue sur les poussins d'un jour par une intervention humaine, principalement via deux techniques : l'observation des plumes et l'observation du cloaque. Bien qu'efficaces, un inconvénient majeur de ces deux techniques est qu'elles interviennent trop tard dans le cycle de production. Par exemple, pour les poules pondeuses, il faut 21 jours d'incubation pour séparer les femelles des mâles (ces derniers étant éliminés). En résumé, ces techniques traditionnelles sont chronophages et posent des problèmes de coût et d'éthique. Les travaux actuels sur le sujet sont donc orientés vers des techniques de sexage in-ovo, c'est-à-dire la détermination du sexe de l'embryon dans l'oeuf (avant éclosion) avec l'objectif d'être au plus tôt lors de l'incubation, voire avant. En effet, la détermination du genre des embryons à un stade précoce de l'incubation permet d'améliorer la production avicole, avec à la fois un gain de temps et un gain financier. Une première technique connue est décrite dans le document de brevet US6029080, qui propose une méthode de détermination utilisant la résonance magnétique nucléaire pour observer les organes reproducteurs de l'embryon dans l'oeuf. Cette technique permet de trier les oeufs en trois catégories: ceux contenant un embryon mâle, ceux contenant un embryon femelle et les oeufs clairs (non fécondés). Mais cette technique d'observation n'est praticable qu'après refroidissement de l'oeuf, afin de minimiser les mouvements de l'embryon. Un inconvénient de cette technique est que le refroidissement de l'oeuf engendre des perturbations dans le développement futur de 2 l'embryon. Un autre inconvénient est qu'elle intervient tard dans le développement de l'embryon. Encore un autre inconvénient réside dans la mise en oeuvre relativement coûteuse d'une telle technique, induisant un frein à son développement industriel. Une deuxième technique connue est décrite dans le document de brevet 5 US2011/0144473, qui décrit l'utilisation de la spectroscopie UV. Cette technique consiste à émettre une onde dans l'ultraviolet de manière à provoquer une auto-fluorescence d'une région du germe (blastoderme). Pour déterminer le sexe de l'embryon, on calcule puis on compare un coefficient de décroissance à une base de données, suite à l'observation de la décroissance de l'auto-fluorescence après arrêt de 10 l'émission de l'onde UV. Cependant, un inconvénient de cette technique est qu'elle requiert un accès au blastoderme par un prélèvement invasif. Une troisième technique connue, basée sur l'utilisation de la spectroscopie IR sur le germe, est décrite dans l'article suivant : G. Steiner et al., « Gender Determination of fertilized unincubated chicken eggs by infrared spectroscopic imaging », Analytical and 15 Bioanalytical Chemistry, 2011, Vol 400, n°9, p. 2775-2782. Cette méthode, également invasive, consiste en l'introduction d'une sonde dans la région du germe pour effectuer un prélèvement, afin d'en caractériser les cellules constitutives par une spectroscopie infrarouge. Une quatrième technique connue, elle aussi invasive, est décrite dans les 20 documents W02016000678A1 et DE102016004051B3. Il est proposé un appareil de mesure et un procédé de traitement des données pour déterminer le sexe d'un embryon d'oiseau de manière optique dans l'oeuf. Pour cela la coquille d'oeuf est découpée et un vaisseau sanguin de l'embryon est repéré grâce à un système optique de repérage (« tracking »). Ce vaisseau sanguin est ensuite éclairé par un laser. Au sein de la lumière 25 réémise par le vaisseau sanguin, on mesure (grâce à un capteur) soit le signal Raman seul (W02016000678A1), soit le signal de fluorescence et le signal Raman (DE102016004051B3), et le(s) signal(ux) mesuré(s) est(sont) comparé(s) à des valeurs seuils pour classer le signal optique en fonction du sexe de l'embryon. L'inconvénient majeur de cette quatrième technique est qu'elle est invasive. Elle nécessite donc une 30 étape de découpe de la coquille et un moyen de refermer la coquille après la mesure. Ceci engendre des coûts, rend le procédé peu industrialisable et induit un grand risque 3 de contamination bactériologique de l'oeuf. Ensuite la détection de vaisseaux sanguins par un système spécifique peut être relativement longue (plusieurs dizaines de secondes), ce qui est peu compatible avec une industrialisation du procédé, avec des rendements élevés. De plus, l'éclairement direct de l'embryon par un laser est une 5 approche à l'éthique discutable. Enfin, la mesure nécessite que les vaisseaux sanguins de l'embryon soient développés, impliquant une discrimination au plus tôt à 3,5 jours après le début de l'incubation. Un inconvénient majeur des deuxième, troisième et quatrième techniques connues est donc qu'elles sont invasives : elles nécessitent soit l'introduction 10 d'instruments et le prélèvement de cellules dans le germe, soit l'éclairement direct de l'embryon par un rayonnement lumineux (ex : laser) pouvant possiblement l'endommager. Ces opérations induisent des risques de contaminations et de surmortalité embryonnaire en plus d'une mise en oeuvre complexe (découpe, prélèvement, etc.) et chronophage. Il a donc été proposé des techniques non invasives. 15 Une cinquième technique connue, non invasive, est décrite dans le document de brevet US2013/0044210. Elle consiste en une analyse hyper-spectrale (c'est-à-dire de l'infrarouge moyen au proche UV) d'un spectre optique en réflexion de l'oeuf, en soustrayant la réponse spectrale de la coquille et en détectant les composants biologiques de l'oeuf. Cette technique permet de déterminer, dès le deuxième jour (J2 d'incubation), 20 si l'oeuf est fécondé et, au douzième jour (J12 d'incubation), le genre de l'embryon. Un inconvénient majeur de cette technique est qu'elle nécessite une correction des mesures très importante, avec la soustraction du signal de la coquille seul (soustraction de sa réponse spectrale) et des perturbations environnementales (lumière, humidité, etc.). Il y a donc beaucoup d'informations non discriminantes à supprimer ce qui rend le procédé 25 peu industrialisable. En outre, chaque oeuf doit être posé sur un support spécifique, maintenant une distance connue entre la source de rayonnement, le détecteur et l'oeuf. Ceci rend également cette technique difficilement industrialisable. Une sixième technique connue, également non invasive, est décrite dans le document de brevet WO 2016/005539. Ce document détaille l'utilisation de la réponse 30 spectrale de la coquille pour y rechercher des informations moléculaires apparaissant lors de l'incubation de l'oeuf (développement embryonnaire). Deux modes de 4 réalisation sont décrits : la spectroscopie Raman et la spectroscopie ATR (spectroscopie infrarouge à réflexion totale). Un inconvénient de cette sixième technique est qu'elle ne peut pas être envisagée avant l'incubation (puisqu'elle s'appuie sur des informations moléculaires apparaissant lors de l'incubation). Un autre inconvénient est qu'une sonde 5 de type Raman induit un signal de faible intensité contenu dans une quantité importante d'informations non-discriminantes à éliminer. Une septième technique connue, également non invasive, est décrite dans le document de brevet W02017094015A1. Elle propose une modification génétique sur un des chromosomes sexuels des races aviaires (Z ou W) afin de rendre les oeufs d'un des 10 sexes (soit mâle, soit femelle) bioluminescents lors du développement de l'embryon pendant l'incubation. Ceci permet le classement des oeufs suivant le sexe du futur poussin. La modification génétique consiste en l'ajout d'un gène (luciferase) permettant la génération d'une molécule bioluminescente par l'embryon. Cette bioluminescence est ensuite mesurée de manière non-invasive. La présence ou non du signal bioluminescent, 15 permet de déterminer le sexe de l'embryon dans l'oeuf non éclos à partir du premier jour du développement embryonnaire (J1 d'incubation). L'inconvénient majeur de cette septième technique est qu'elle requiert une modification génétique donc la création d'espèces aviaires spécifiques. Par conséquent, en plus de poser des problèmes du point de vue de l'acceptation éthique, cette technique n'est pas valide sur toutes les souches 20 aviaires actuelles (non modifiées) et pose des problèmes de conformité vis-à-vis de la réglementation car les nouvelles espèces créées sont considérées comme des OGM. On notera que les techniques connues non invasives utilisent des substances discriminantes qui apparaissent au cours de l'incubation de l'oeuf. Ainsi, celles sans modification génétique (les cinquième et sixième ci-dessus) ne sont pas utilisables avant 25 le jour J2 ou J3 d'incubation, et celle avec modification génétique (la septième ci- dessus) n'est utilisable qu'à partir du jour J1 d'incubation. 3. OBJECTIFS L'invention, dans au moins un mode de réalisation, a notamment pour objectif de pallier ces différents inconvénients de l'état de la technique. 30 Plus précisément, dans au moins un mode de réalisation de l'invention, un objectif est de fournir une technique de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un 5 oeuf, qui à la fois soit non invasive, ne nécessite pas de modification génétique et soit plus simple à mettre en oeuvre (et donc plus facilement industrialisable) que les techniques connues précitées. Un autre objectif, dans au moins un mode de réalisation de l'invention, est de 5 fournir une telle technique qui permette une discrimination avant et/ou pendant l'incubation. Un autre objectif, dans au moins un mode de réalisation de l'invention, est de fournir une telle technique qui soit fiable. 4. RÉSUMÉ 10 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est proposé un procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf comprenant une coquille, comprenant les étapes suivantes : obtention d'au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille ; et prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de ladite au moins 15 une caractéristique de fluorescence. Le principe général de l'invention consiste donc à utiliser au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille d'oeuf, pour déterminer de manière in-ovo si l'oeuf est fécondé et le cas échéant le sexe du futur poussin. Cette approche tout à fait nouvelle et inventive résulte de la découverte par les 20 inventeurs que la fluorescence de la coquille, avant ou pendant l'incubation de l'oeuf, est différente d'un oeuf à l'autre du point de vue de son intensité et de son évolution dans le temps, et que ces caractéristiques de fluorescence sont, in fine, reliées à la fécondation de l'oeuf et en particulier au sexe du futur poussin. Plus précisément, la coquille d'oeuf (comprenant la cuticule) est constituée principalement de carbonate de calcium ainsi que 25 de nombreuses autres molécules organiques ou inorganiques (ex : sucres, protéines, hormones, etc.). Les types de ces autres molécules, et surtout leurs quantités, sont différents d'un oeuf à l'autre, suivant de nombreux paramètres physico-chimiques propres à la conception de l'oeuf (géniteurs, saisonnalité, etc.), et en particulier suivant le sexe du futur poussin pour les oeufs fécondés. Ces autres molécules sont soit contenues 30 initialement dans la coquille (avant incubation) ou apparaissent dans la coquille pendant 6 le développement de l'embryon (pendant l'incubation) par échange/migration entre l'intérieur et l'extérieur de l'oeuf. La solution proposée présente de nombreux avantages : - elle est non-invasive ; 5 - elle ne nécessite pas de modification génétique ; - le phénomène physique mesuré (fluorescence) est plus intense que celui habituellement mesuré (phénomène Raman par exemple), donc le système mettant en oeuvre le procédé peut être moins sensible pour une efficacité égale (le temps d'acquisition peut donc être réduit par rapport à une mesure Raman et 10 le coût du dispositif industriel final peut également être réduit) ; - la mesure et son traitement sont rapides et compatibles avec un procédé industriel de masse ; - la détermination de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf (mâle ou femelle) est possible avant incubation. 15 Selon une caractéristique particulière, l'étape d'obtention comprend : a) pour au moins une mesure associée à un point de mesure, sur ou dans la coquille, et une longueur d'onde d'excitation : a-1) collecte d'un signal optique émis par la coquille ; a-2) acquisition d'un spectre d'intensité du signal optique collecté ; et 20 b) calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, en fonction dudit spectre. De cette façon, la solution proposée est simple à mettre en oeuvre et facilement industrialisable. Selon une caractéristique particulière, dans l'étape a) : 25 les sous-étapes a-1) et a-2) sont exécutées pour une pluralité de mesures associées chacune à un couple distinct comprenant un point de mesure et une longueur d'onde d'excitation ; et la sous-étape a-2) est suivie d'une sous-étape a-3) de combinaison des spectres acquis lors des différentes exécutions de la sous-étape a-2), pour obtenir un 30 spectre global ; 7 et dans l'étape b), le calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence est réalisé en fonction dudit spectre global. La prise en compte d'une pluralité de mesures permet d'améliorer la précision de la ou les caractéristiques de fluorescence obtenues, et donc la qualité de la prédiction 5 finale (fertilité et/ou sexe de l'oeuf). Selon une caractéristique particulière, l'étape b) comprend : b-1) calcul d'une ligne de base de fluorescence dudit spectre ; et b-2) calcul de type « aire sous la courbe » pour ladite ligne de base de fluorescence ou au moins une zone de ladite ligne de base de fluorescence, pour obtenir une 10 valeur d'intensité de fluorescence (I.'). De cette façon, la solution proposée est simple à mettre en oeuvre et facilement industrialisable. Selon une caractéristique particulière, l'étape a) est réalisée pour chacun d'une pluralité d'instants de mesure, permettant d'acquérir un dit spectre pour chacun des 15 instants de mesure. En outre, l'étape b) comprend : pour chacun des spectres, les sous-étapes b-1) et b-2), pour obtenir une valeur d'intensité de fluorescence (I.') ; et calcul d'au moins une caractéristique additionnelle de fluorescence, en fonction des valeurs d'intensité de fluorescence obtenues pour lesdits spectres. 20 La prise en compte de mesures consécutives dans le temps permet d'obtenir des caractéristiques de fluorescence supplémentaires, et donc d'améliorer encore la qualité de la prédiction finale (fertilité et/ou sexe de l'oeuf). Selon une caractéristique particulière (liste non exhaustive), ladite au moins une caractéristique additionnelle de fluorescence appartient au groupe comprenant : 25 une intensité de fluorescence initiale (Ii.) ; une intensité de fluorescence maximale (Imax) ; une intensité de fluorescence minimale (Li.) ; une intensité de fluorescence moyenne (Imoy) ; et une vitesse de décroissance de fluorescence (T). 30 Dans une première implémentation particulière, l'étape de collecte est précédée d'une étape d'excitation optique de la coquille. 8 Grâce à l'excitation optique de la coquille, la collecte du signal optique émis par la coquille peut être effectuée avec un appareil ayant une moins forte sensibilité. Dans une deuxième implémentation particulière, l'étape de collecte n'est pas précédée d'une étape d'excitation optique de la coquille, et le signal optique collecté est 5 un signal de luminescence. Dans cette variante, on collecte le signal optique émis naturellement par la coquille (thermoluminescence, chimiluminescence, etc.). On s'affranchit donc d'un appareil d'excitation optique de la coquille. En contrepartie, le signal de luminescence ainsi collecté est de faible intensité par rapport au signal de fluorescence collecté dans la 10 première implémentation, ce qui nécessite un appareil de collecte ayant une très forte sensibilité. Selon une caractéristique particulière, l'étape a-1 de collecte d'un signal optique émis par la coquille comprend une collecte par spectrométrie Raman. De cette façon, on peut utiliser des appareils existants de spectrométrie Raman. 15 Selon une caractéristique particulière, ladite étape b) comprend en outre : b-3) une extraction de pics Raman à partir dudit spectre, consécutivement ou simultanément au calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, et la prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf est fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence et d'au moins une caractéristique desdits pics Raman. 20 Ainsi, en couplant une ou plusieurs caractéristiques Raman avec une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence, on améliore les performances de la solution proposée. Selon une caractéristique particulière, l'étape a-1) de collecte d'un signal optique émis par la coquille comprend une collecte directe avec un appareil dédié à la mesure de la fluorescence. 25 De cette façon, on peut utiliser des appareils existants de mesure de fluorescence, notamment des appareils capables de fournir des cartographies spectrales et/ou 3 dimensions de la fluorescence, apportant plus d'informations qu'un simple spectre, et permettant donc d'améliorer la qualité de la prédiction finale (fertilité et/ou sexe de l'oeuf). 30 Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé un système non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf comprenant une coquille. 9 Ce système comprend des moyens d'obtention d'au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille, et des moyens de prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence. Avantageusement, le système comprend des moyens de mise en oeuvre des 5 différentes étapes du procédé tel que décrit précédemment (dans l'un quelconque de ses différents modes de réalisation). 5. LISTE DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, donnée à titre d'exemple indicatif et non limitatif, et des dessins 10 annexés, dans lesquels : - la figure 1 présente la structure simplifiée d'un oeuf fécondé ; - la figure 2 est une vue en coupe de la structure de la coquille d'un oeuf; - la figure 3 présente un système de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf, selon un mode de réalisation générique de l'invention ; 15 - la figure 4 présente un système de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf, selon une première implémentation particulière du mode générique de la figure 3; - la figure 5 présente deux spectres Raman moyens obtenus avec le système de la figure 4, l'un pour des « oeufs mâles » et l'autre pour des « oeufs femelles », ainsi 20 que les lignes de base de fluorescence extraites de ces deux spectres Raman ; - la figure 6 illustre un découpage en six zones des deux lignes de base de fluorescence de la figure 5, en vue d'un calcul de type « aire sous la courbe » différencié pour chaque zone ; - la figure 7 illustre deux courbes d'évolution dans le temps de l'intensité de la 25 fluorescence, l'une pour des « oeufs mâles » et l'autre pour des « oeufs femelles » ; - la figure 8 illustre un exemple de cartographie de fluorescence ; - la figure 9 présente un organigramme d'un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention ; 30 - la figure 10 présente un exemple plus détaillé de l'étape 92 de la figure 9 ; et - la figure 11 présente un exemple plus détaillé de l'étape 93 de la figure 9 ; et 10 la figure 12 présente la structure d'un dispositif d'analyse selon un mode de réalisation particulier de l'invention. 6. DESCRIPTION DÉTAILLÉE Sur toutes les figures du présent document, les éléments et étapes identiques sont 5 désignés par une même référence numérique. La figure 1 illustre un oeuf 1 comprenant une coquille 10 et un contenu intérieur, ce dernier comprenant lui-même l'albumine 2, le vitellus 3 et le disque germinal 4. La figure 2 détaille la structure de la coquille 10, qui comprend une superposition de six couches, à savoir (en partant de l'albumine 2) : une membrane 10 coquillère interne 11, une membrane coquillère externe 12, une couche mamillaire 13, une couche palissadique 14 (traversée par les pores 17), une monocouche de cristaux verticaux (15) et enfin une cuticule 16 (enveloppant l'ensemble des couches minérales). Comme déjà mentionné plus haut, la coquille d'oeuf 10 est constituée principalement de carbonate de calcium ainsi que de nombreuses autres molécules 15 organiques ou inorganiques (ex : sucres, protéines, hormones, etc.) (dont certaines sont à titre illustratif référencées 5 sur la figure 1). Les inventeurs ont découvert que les types de ces autres molécules 5, et surtout leurs quantités, sont différents d'un oeuf à l'autre suivant de nombreux paramètres physico-chimiques propres à la conception de l'oeuf (géniteurs, saisonnalité, etc.), et en 20 particulier suivant le sexe du futur poussin pour les oeufs fécondés. Ces autres molécules sont soit contenues initialement dans la coquille (avant incubation) ou apparaissent dans la coquille pendant le développement de l'embryon (pendant l'incubation) par échange/migration entre l'intérieur et l'extérieur de l'oeuf. En d'autres termes, les inventeurs ont découvert que la fluorescence de la 25 coquille, qui est émise par ces autres molécules 5, avant ou pendant l'incubation de l'oeuf, sont différentes d'un oeuf à l'autre du point de vue de son intensité et de son évolution dans le temps, et que ces caractéristiques de fluorescence sont, in fine, reliées à la fécondation de l'oeuf et en particulier au sexe du futur poussin. La solution proposée est basée sur cette découverte, avec l'utilisation du signal 30 (optique) de fluorescence émis par la coquille d'oeuf pour déterminer de manière in-ovo si l'oeuf est fécondé et le cas échéant le sexe du futur poussin. 11 On présente maintenant, en relation avec la figure 3, un système 30 de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf 1, selon un mode de réalisation générique de l'invention. Le système 30 comprend : 5 - des moyens (31) d'éclairement de la coquille de l'oeuf, permettant de stimuler l'émission de la fluorescence de la coquille ; - des moyens (32) de collecte du signal optique réémis par la coquille (comptage des photons collectés en fonction de leur énergie, de façon à calculer un spectre d'intensité du signal optique collecté) ; 10 - des moyens (33) d'analyse du signal optique collecté (spectre), permettant d'obtenir une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille (intensité, évolution dans le temps, etc.) ; et - des moyens (34) de prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de la ou les caractéristiques de fluorescence (par exemple par comparaison à des 15 paramètres seuils préalablement définis). La figure 9 illustre les étapes du procédé mis en oeuvre par le système 30 précité, à savoir : éclairement de la coquille de l'oeuf (étape 91), collecte du signal optique réémis par la coquille (étape 92), obtention d'une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille par analyse du signal optique collecté (étape 93), et 20 prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de la ou les caractéristiques de fluorescence (étape 94). Par « fluorescence de la coquille » on entend dans ce cas la lumière réémise par la coquille (après une excitation optique) avec un décalage (par exemple vers le rouge) par rapport à la longueur d'onde du signal lumineux d'excitation. 25 Dans une variante, le système 30 ne comprend pas les moyens (31) d'éclairement de la coquille de l'oeuf. Dans ce cas, les moyens de collecte et d'analyse comptent et analysent les photons émis naturellement par la coquille (thermoluminescence, chimiluminescence, etc.). Le signal collecté, qualifié de « luminescence », est de plus faible intensité que dans le cas où la coquille est éclairée, 30 ce qui nécessite des appareils de mesure ayant une plus forte sensibilité. 12 Dans la suite de la description, on présente en détail deux manières particulières d'obtenir la ou les caractéristiques de fluorescence de la coquille (c'est-à-dire d'implémentation des moyens de collecte 32 et d'analyse 33) : l'une basée sur l'utilisation d'un spectromètre Raman, l'autre sur l'utilisation d'un appareil de 5 spectroscopie dédié à la mesure de la fluorescence (fluorimètre classique, microscope à fluorescence, etc.). A) Implémentation avec un spectromètre Raman A-a Description de la procédure de collecte et de l'appareillage On présente maintenant, en relation avec la figure 4, un système 40 de 10 détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf 1, selon une implémentation particulière du mode générique de la figure 3. Dans cette première implémentation, la ou les caractéristiques de fluorescence de la coquille 1 sont extraites de mesures effectuées avec un équipement 41 (par exemple le modèle « i-Raman Plus » (marque déposée) de la société BWTek) intégrant un 15 spectromètre Raman 41a et un dispositif d'éclairement 41b. Dans cette première implémentation, on utilise la spectroscopie Raman afin de déterminer la fertilité et/ou le sexe d'un oeuf. Il est clair cependant que des variantes de cette première implémentation peuvent être envisagées, avec tout type de spectroscopie permettant d'obtenir la réponse spectrale d'au moins une portion d'au moins une couche 20 de la coquille, la seule condition étant que la fluorescence puisse être calculée (déduite, extraite) de cette réponse spectrale. L'oeuf est éclairé par un dispositif d'éclairement 41b contenant par exemple une source de lumière monochromatique (exemple Laser) dans l'UV/Visible ou IR, par exemple à 532 nm, focalisé sur la coquille de l'oeuf 1 par un système optique de type 25 sonde en contact 44. Une fibre optique 42 relie le dispositif d'éclairement 41b et la sonde en contact 44. Dans des variantes, il est également possible d'utiliser une ou des sondes sans contact, ou encore un ou des systèmes de microscope optique (objectif) avec ou sans contact. 30 Le signal optique réémis par la coquille de l'oeuf est collecté par le spectromètre Raman 41a, via la sonde en contact 44 et la fibre optique 42. Dans une variante, le signal 13 optique réémis par la coquille de l'oeuf est collecté via une autre sonde et une autre fibre optique (par exemple dans le cas où le spectromètre Raman 41a n'est pas intégré dans le même équipement que le dispositif d'éclairement 41b). A partir du signal collecté, le spectromètre Raman 41a génère un spectre qui est 5 transmis, par un lien filaire (câble 45) ou sans fil, à un ordinateur (calculateur) 43. A partir du ou des spectres qu'il reçoit, l'ordinateur 43 calcule une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille et prédit à partir de celle(s)-ci la fertilité et/ou le sexe de l'oeuf. En d'autres termes, l'ordinateur 43 réalise les fonctions des moyens d'analyse et de prédiction référencés 33 et 34 sur la figure 3. 10 En résumé, comme illustré sur la figure 10, l'étape 92 de collecte comprend, pour chaque mesure (associée à un point de mesure et une longueur d'onde d'excitation), la collecte d'un signal optique émis par la coquille (étape 921) et l'acquisition d'un spectre d'intensité du signal optique collecté (étape 922). Pour chaque mesure, associée à un point de mesure (sur ou dans la coquille) et 15 une longueur d'onde d'excitation, l'excitation (i.e. l'éclairement) et la collecte des photons peuvent être effectuées simultanément ou l'une après l'autre. En outre, elles peuvent être réalisées au même endroit ou délocalisées l'une par rapport à l'autre. Dans tous les cas, le spectromètre Raman 41a délivre un spectre pour chaque mesure. 20 Par ailleurs, il est possible d'effectuer plusieurs mesures pour le même oeuf (et donc d'obtenir plusieurs spectres correspond à un même instant), en jouant sur les deux paramètres suivants : le point de mesure (sur ou dans la coquille) et la longueur d'onde d'excitation. Ainsi, pour une même longueur d'onde d'excitation, il est possible d'effectuer des mesures en plusieurs points de mesure, situés dans une même zone de la 25 coquille de l'oeuf (équateur, pôle, etc.) ou dans différentes zones de la coquille de l'oeuf. Il est également possible, pour au moins un couple comprenant un point de mesure donné et une longueur d'onde d'excitation donnée, d'effectuer plusieurs mesures consécutives dans le temps (et donc d'obtenir plusieurs spectres correspondant à des instants différents), pour le même oeuf. Ceci permet d'avoir des informations sur 30 l'évolution du signal de fluorescence au cours du temps. Pour cela, l'oeuf est par exemple éclairé pendant un temps tins., fixe (valeur : par exemple de zéro à plusieurs 14 minutes) puis plusieurs mesures (par exemple de une à plusieurs dizaines) d'une durée tin' (par exemple de 1 fs à plusieurs minutes) sont collectées avec un temps tpause (Par exemple de quelques ms à plusieurs minutes) entre deux mesures successives. Pour chaque mesure, le signal optique collecté et fourni au spectromètre Raman 5 41a comprend l'émission Rayleigh, l'émission Raman et l'émission de fluorescence. Dans le spectromètre Raman 41a, les photons collectés sont filtrés (par un filtre optique) pour éliminer le signal Rayleigh (étape optionnelle), puis dispersés par un dispositif optique (du type réseau de diffraction ou prisme par exemple) suivant leur longueur d'onde (énergie) sur un capteur comptant les photons pour chaque longueur d'onde (par 10 exemple un CCD ou un photomultiplicateur). En sortie de ce capteur, on dispose donc, pour chaque mesure, d'un spectre d'intensité du signal optique collecté. A-b Description de l'analyse des données On présente maintenant en détail les fonctions d'analyse et de prédiction réalisées par l'ordinateur 43. 15 Les données recueillies par l'ordinateur sont des spectres d'intensité du signal optique (axe des y; proportionnel au nombre de photons/seconde) en fonction de la longueur d'onde des photons ou du décalage Raman en nombre d'onde « Rshift » (axe des x). Le décalage Raman est typiquement dans la gamme 100 à 4000 cm'. Les données utiles sont par exemple plus spécifiquement comprises entre 400 et 1800 cm' . 20 La figure 5 présente deux spectres Raman moyens obtenus avec le système de la figure 4, l'un (référencé 51) pour des « oeufs femelles » et l'autre (référencé 52) pour des « oeufs mâles ». La figure 5 présente également les lignes de base (« baseline ») de fluorescence extraites de ces deux spectres Raman 51, 52 ; elles sont référencées 53 et 54 respectivement. 25 Comme illustré sur la figure 11, pour un spectre donné (correspondant à une ou plusieurs mesures, comme détaillé ci-après), l'étape 93 d'obtention de caractéristique(s) de fluorescence de la coquille comprend : - étape 932: calcul de la ligne de base de fluorescence du spectre ; et - étape 933: calcul de type « aire sous la courbe » pour la ligne de base de 30 fluorescence (ou, dans une variante, pour au moins une zone de la ligne de base de fluorescence), pour obtenir une valeur d'intensité de fluorescence (Les). En 15 d'autres termes, la valeur d'intensité de fluorescence correspond à l'aire sous la ligne de base de fluorescence (ou sous une portion de celle-ci) et ne tient donc pas compte des pics Raman. La figure 6 illustre un découpage en six zones (référencées 61 à 66) des deux 5 lignes de base de fluorescence (référencées 53 et 54) de la figure 5, en vue d'un tel calcul de type « aire sous la courbe » différencié pour chaque zone. La valeur d'intensité de fluorescence des oeufs femelles est supérieure à celle des oeufs mâles, permettant leur discrimination dans l'étape 94. Comme mentionnés plus haut, dans certaines mises en oeuvre, plusieurs mesures 10 sont effectuées pour un instant t, conduisant à l'obtention d'une pluralité de spectres. Dans ce cas, l'étape 93 comprend une première étape 931 d'obtention d'un spectre global par combinaison de cette pluralité de spectres (par exemple par soustraction, addition, combinaison linéaire, etc.). Comme mentionnés également plus haut, dans certaines mises en oeuvre, 15 plusieurs mesures sont effectuées à des instants consécutifs (tl, t2, etc.), avec obtention d'un spectre (simple ou global pour chaque instant). Dans ce cas, les étapes 931, 932 et 933 sont réalisées pour chaque instant, permettant d'obtenir une valeur d'intensité de fluorescence (1i.) pour chaque instant. Puis, dans une étape 934, l'ordinateur calcule une ou plusieurs caractéristiques additionnelles de fluorescence, en fonction des valeurs 20 d'intensité de fluorescence successives dans le temps. En effet, le suivi de l'évolution dans le temps de l'intensité de fluorescence permet d'extraire de nombreuses caractéristiques comme par exemple : une intensité de fluorescence initiale (Ii.), une intensité de fluorescence maximale (I.), une intensité de fluorescence minimale (I.), une intensité de fluorescence moyenne (1.y), une vitesse 25 de décroissance de fluorescence (T), etc. La figure 7 illustre deux courbes d'évolution dans le temps de l'intensité de la fluorescence, l'une (référencée 72) pour des « oeufs mâles » et l'autre (référencée 71) pour des « oeufs femelles ». La ou les caractéristiques de fluorescence (1i., Ln, Loy, T, etc.) sont 30 ensuite utilisées dans l'étape 94 de prédiction. 16 Une étape optionnelle (non représentée) peut être effectuée préalablement à l'étape 94, qui consiste à simplifier la ou les données (réduction des données), par exemple avec une fonction de réduction dimensionnelle comme l'analyse en composante principale (ACP), afin d'extraire l'information d'intérêt pour une utilisation dans l'étape 5 94. Deux exemples de réalisation de l'étape 94 de prédiction sont détaillés ci-dessous (prédiction en utilisant seulement les caractéristiques de fluorescence dans le premier exemple, et prédiction en utilisant les caractéristiques de fluorescence et l'information Raman dans le second exemple). 10 A-b-1 Méthode 1 : prédiction avec seulement les caractéristiques de fluorescence Comme déjà décrit plus haut, lors d'une série de mesures sur un oeuf, le système calcule l'aire sous la ligne de base de fluorescence (donc sans prendre en compte l'information Raman contenu dans les pics de faible largeur spectrale) pour chaque mesure, par exemple à l'aide d'équations mathématiques d'ajustement, ce qui permet 15 d'évaluer l'intensité de la fluorescence de cette mesure (I.') et/ou en fonction du temps sur les valeurs d'intensité de fluorescence obtenues à différents instants. Par exemple, dix mesures consécutives permettent d'obtenir l'évolution dans le temps de la fluorescence, montrant les différences entre un oeuf « femelle » et un oeuf « mâle » (figure 7). 20 L'aire sous la courbe peut être calculée sous toute la ligne de base de fluorescence (et donc pour tout le spectre) ou sous des zones particulières de la ligne de base (et donc pour une partie du spectre). L'utilisation d'une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence (réduite ou non), comparées à des valeurs seuils, permet de classer les oeufs dans la bonne catégorie (non- 25 fécondé, mâle ou femelle). Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d'apprentissage, par exemple avec une des méthodes suivantes : - méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; - méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PLS, PLSDA) ou de 30 régression pénalisée (LASSO, Ridge ou elastic net) ; 17 - modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov Chain Monte-Carlo), modèles mixtes) ; - etc. Dans le cas d'utilisation des valeurs d'intensité de fluorescence (I.'), celles 5 obtenues sur l'ensemble de la courbe ou sur les zones situées sur la droite de la figure 6 (zones 65 et 66, figure 6) sont les plus informatives. A-b-2 Méthode 2: prédiction avec les caractéristiques de fluorescence et l'information Raman Dans la deuxième méthode de prédiction, on ajoute l'information Raman à celle 10 de la fluorescence. Le signal Raman, comme le signal de fluorescence est caractéristique des molécules présentes sur et dans la coquille. Par conséquent, les pics Raman contiennent également des informations sur la fertilité de l'oeuf et/ou le sexe du poussin même si ces pics Raman sont de faible intensité et de petites largeurs spectrales comparées à la fluorescence. Le signal Raman peut donc être un complément optionnel à 15 la fluorescence pour la prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf. Dans le cadre de cette deuxième méthode, deux types de procédures peuvent être employées ayant chacune leur pertinence en fonction d'un contexte particulier (nombre d'oeufs à traiter/heure, précision souhaitée, etc.). A-b-2-i Première procédure 20 La première procédure réside, dans un premier temps, en l'extraction de l'information de fluorescence comme dans la méthode 1 (étapes 931 à 934, figure 11). Ensuite (étape 935, figure 11), l'information Raman est extraite après soustraction de la ligne de base de fluorescence d'un spectre unique, ou d'un spectre brut global, ou de la moyenne ou de la médiane des spectres bruts ou globaux 25 consécutifs (suppression de l'information de fluorescence). Les pics Raman seuls, contenus dans le signal optique et qui sont caractéristiques de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf, sont ensuite obtenus par des méthodes mathématiques de sélection de variables qui peuvent être basées par exemple sur : - les moindres carrés partiels (exemple la fonction « splsda ») ; 30 - la régression pénalisée (exemple « Lasso ») ; - la sélection pas à pas (exemple « stepwise » avec « package caret ») ; 18 - les forêts aléatoires (« Random forest ») ; . etc. Les variables d'intérêt Raman ainsi obtenues, et les paramètres de fluorescence (obtenus par la méthode 1) sont ensuite comparés à des valeurs seuils permettant 5 l'affectation de l'oeuf dans la catégorie non-fécondé, mâle ou femelle. Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d'apprentissage, par exemple avec une des méthodes suivantes : - méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; 10 - méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PLS, PLSDA) ou de régression pénalisée (LASSO, Ridge ou elastic net) ; - modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov Chain Monte-Carlo), modèles mixtes) ; . etc. 15 A-b-2-ii Deuxième procédure La deuxième procédure consiste à extraire les informations de fluorescence (aussi appelées caractéristiques de fluorescence ou encore variables d'intérêt de fluorescence) et les informations Raman en même temps à partir d'un spectre brut unique, ou d'un spectre brut global, ou de la moyenne ou de la médiane des spectres 20 bruts ou globaux consécutifs, mesuré(s) sur un oeuf, avec par exemple une méthode de réduction de dimension comme l'ACP. Les informations de fluorescence et Raman sont ensuite comparées à des valeurs seuils permettant l'affectation de l'oeuf dans la catégorie non-fécondé, mâle ou femelle. Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d'apprentissage avec 25 soit : - des méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; - des méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PLS, PLSDA) ou de régression pénalisée (LASSO, Ridge ou elastic net) ; 30 - des modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov Chain Monte-Carlo), modèles mixtes) ; 19 - etc. B) Mesure avec un fluorimètre B-a Description de la procédure de collecte et de l'appareillage Une deuxième implémentation particulière du mode générique de la figure 3 5 consiste en la mesure de fluorescence réémise par la coquille d'oeuf directement avec des appareils dédiés à l'acquisition de la fluorescence (simple ou multiphoton). Ces appareils contiennent un ou des dispositifs d'éclairement polychromatique (ex : lampe Xe), monochromatique constant (ex : Laser) ou monochromatique accordable (ex : Laser suivi d'un oscillateur paramétrique optique (0P0)). L'éclairement sur la coquille (ou 10 son environnement proche) est focalisé (c.-à-d. spot lumineux ponctuel) (exemple : objectif ou microscope confocal) ou non (c.-à-d. spot lumineux avec une large surface), en mode continu ou en mode pulsé pendant la mesure. La collecte du signal de fluorescence est effectuée par un dispositif optique avec : collecte du signal (fente, objectif), séparation des photons suivant leur énergie 15 (sauf ci caméra CCD) (monochromateur, réseau, prisme), et comptage par un capteur des photons (barrette CCD, photomultiplicateur, caméra CCD). L'analyse peut donc être effectuée sur différents types de surface/volume, unique ou multiple, tel que : - au moins une localisation sur une petite surface de la coquille ( REVENDICATIONS1. Procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf comprenant une coquille, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : obtention (92, 93) d'au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille ; et prédiction (94) de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape d'obtention comprend : a) pour au moins une mesure associée à un point de mesure, sur ou dans la coquille, et une longueur d'onde d'excitation : a-1) collecte (921) d'un signal optique émis par la coquille ; a-2) acquisition (922) d'un spectre d'intensité du signal optique collecté ; et b) calcul (93) de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, en fonction dudit spectre. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel, dans l'étape a) : les sous-étapes a-1) et a-2) sont exécutées pour une pluralité de mesures associées chacune à un couple distinct comprenant un point de mesure et une longueur d'onde d'excitation ; et la sous-étape a-2) est suivie d'une sous-étape a-3) (931) de combinaison des spectres acquis lors des différentes exécutions de la sous-étape a-2), pour obtenir un spectre global ; et dans lequel, dans l'étape b), le calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence est réalisé en fonction dudit spectre global. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel l'étape b) comprend : b-1) calcul (932) d'une ligne de base de fluorescence dudit spectre ; et 23 b-2) calcul (933) de type « aire sous la courbe » pour ladite ligne de base de fluorescence ou au moins une zone de ladite ligne de base de fluorescence, pour obtenir une valeur d'intensité de fluorescence (I.'). 5 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel l'étape a) est réalisée pour chacun d'une pluralité d'instants de mesure, permettant d'acquérir un dit spectre pour chacun des instants de mesure, et dans lequel l'étape b) comprend : pour chacun des spectres, les sous-étapes b-1) et b-2), pour obtenir une valeur 10 d'intensité de fluorescence (I.') ; et calcul (934) d'au moins une caractéristique additionnelle de fluorescence, en fonction des valeurs d'intensité de fluorescence obtenues pour lesdits spectres. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ladite au moins une caractéristique 15 additionnelle de fluorescence appartient au groupe comprenant : une intensité de fluorescence initiale (Ii.) ; une intensité de fluorescence maximale (Imax) ; une intensité de fluorescence minimale (Li.) ; une intensité de fluorescence moyenne (Imoy) ; et 20 une vitesse de décroissance de fluorescence (T). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel l'étape de collecte est précédée d'une étape (91) d'excitation optique de la coquille. 25 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel l'étape de collecte n'est pas précédée d'une étape d'excitation optique de la coquille, et dans lequel le signal optique collecté est un signal de luminescence. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans lequel l'étape a-1 de collecte d'un signal optique émis par la coquille comprend une collecte par spectrométrie Raman. 24 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite étape b) comprend en outre : b-3) une extraction (935) de pics Raman à partir dudit spectre, consécutivement ou simultanément au calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, 5 et dans lequel la prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf est fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence et d'au moins une caractéristique desdits pics Raman. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans lequel l'étape a-1) 10 de collecte d'un signal optique émis par la coquille comprend une collecte directe avec un appareil dédié à la mesure de la fluorescence. 12. Système non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un oeuf comprenant une coquille, caractérisé en ce qu'il comprend : 15 des moyens (32, 33) d'obtention d'au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille ; et des moyens (34) de prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l'oeuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence.