FR 3076711 A1 20190719 FR 1800052 A 20180115 COMPOSITION COMPRENANT L'HYDROXYCHLOROQUINE ET UTILISATION THERAPEUTIQUE La présente invention a pour objet une nouvelle utilisation thérapeutique de l'hydroxychloroquine. L'hydroxychloroquine, appartenant à la classe des amino-4 quinoléines, est un dérivé de la chloroquine. L'hydroxychloroquine à l'avantage de causer moins d'effets secondaires que la chloroquine. Aujourd'hui, l'hydroxychloroquine, vendue sous le nom commercial Plaquenile, est utilisée pour traiter et prévenir certains types de paludisme, tels que le paludisme causé par Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium malariae (P. malariae), Plasmodium ovale (P. ovale) ou encore certaines souches sensibles de Plasmodium faleiparum (P. fakiparum). Elle est notamment efficace dans le traitement des crises aïgues de paludisme et permet de retarder les rechutes. L'hydroxychloroquine est aussi utilisée pour traiter le lupus et les troubles rhumatismaux comme la polyarthrite rhumatoïde. Les cancers du sein triple-négatifs représentent environ 15-20 % des cancers du sein et sont 20 caractérisés par l'absence de récepteurs hormonaux aux oestrogènes et à la progestérone et l'absence de surexpression du facteur de croissance HER-2 en immunohistochimie Le cancer du sein triple négatif, particulièrement agressif, présente un risque de métastases plus élevé et un pronostic plus défavorable que les autres sous-types de cancer du sein. Du fait de l'absence des récepteurs hormonaux et de HER-2, le cancer triple négatif du sein 25 est plus difficile à traiter que les autres types de cancers du sein. En effet, les chimiothérapies ciblées, visant par exemple un récepteur précis, sont inefficaces et les possibilités de traitement sont limitées aux chimiothérapies habituelles qui, dans le meilleur des cas n'entraînent qu'une réponse partielle. Il existe donc un manque de thérapies ciblées et à ce jour il n'existe pas de traitement dédié 30 à ce sous- type de cancers du sein. 2 Il y a donc un besoin de nouvelles thérapies efficaces pour la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif L'un des buts de l'invention est de fournir de nouvelles compositions efficaces pour la 5 prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif Dans un premier aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant, à titre de substance active, l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-10 négatif De façon surprenante, les Inventeurs de la présente demande ont montré que l'hydroxychloroquine pouvait être utilisée efficacement pour la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif Par « traitement », on entend le moyen de soigner une pathologie déclarée, dont les 15 symptômes sont visibles. Par « prévention », on entend le moyen d'empêcher ladite pathologie de se déclarer. Dans la présente invention, le terme « cancer » et le terme « tumeur » sont utilisés indifféremment l'un de l'autre. Dans l'invention, le terme « hydroxychloroquine », aussi connu sous le nom chimique « 24(44(7-Chloro-4-quinolyl)amino)pentyl)ethylamino)ethanol » et de numéro CAS: 118-423, se réfère au composé de formule chimique (I): rOH H N N CI (I) 3 L'invention concerne également les formes énantiomériques (S) ou (R) de l'hydroxychloroquine, ou encore un mélange racémique de ces deux formes énantiomériques. Dans un aspect préféré, l'invention concerne de préférence une des deux formes énantiomèriques (S) ou (R) de l'hydroxychloroquine. 5 L'invention concerne également des sels d'hydroxychloroquine pharmaceutiquement acceptables, possédant l'activité pharmacologique souhaitée de l'hydroxychloroquine. Par « sel pharmaceutiquement acceptable », on entend un sel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, un tissu ou un organisme. 10 De tels sels comprennent, sans limitation: Des sels d'addition d'acide formés avec des acides inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires; ou formés avec des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, 15 l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, 20 l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p- toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, ou Des sels d'addition de base formés lorsqu'un proton acide présent dans l'hydroxychloroquine est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion 25 de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique. Les bases organiques comprennent la diéthanolamine, l'ethanolamine, le N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hiydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium. 4 Dans un mode de réalisation particulier, un sel pharmaceutiquement acceptable de l'hydroxychloroquine est par exemple le sulfate d'hydroxychloroquine. Selon la présente invention, l'hydroxychloroquine, ses éniantomères ou ses sels 5 pharmaceutiquement acceptables peuvent être produits par toutes les méthodes de synthèse chimique connues de l'homme de l'art. Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type agressif et hétérogène de cancers du sein cliniquement défini par l'absence de récepteurs des oestrogènes, l'absence de 10 récepteurs de la progestérone et l'absence de surexpression du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2/neu). L'expression « absence de récepteurs des oestrogènes » ou « absence de récepteurs de la progestérone » signifie que les récepteurs aux oestrogènes et les récepteurs à la progestérone ne sont pas exprimés par les cellules cancéreuses. 15 L'expression « absence de surexpression du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain » signifie que le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain est exprimé en quantité normale par les cellules cancéreuses, c'est-à-dire à la même quantité que les cellules non cancéreuses. 20 Dans la présente invention, le « cancer du sein triple négatif» peut être un cancer du sein triple-négatif primaire, un cancer du sein triple-négatif métastasé, ou encore une récidive du cancer du sein triple-négatif Ainsi, dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition comprenant l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour son utilisation 25 dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif, ledit cancer du sein triple- négatif est un cancer du sein triple-négatif primaire, un cancer du sein triple-négatif métastasé, ou une récidive du cancer du sein triple-négatif On entend par « cancer du sein triple-négatif primaire », le développement de cellules 30 cancéreuses dans le sein, sans lien avec une pathologie cancéreuse antérieure. 5 On entend par « récidive du cancer du sein triple-négatif», le cas où un nouveau cancer se développe dans un organe qui a déjà été atteint, ici le sein, par un cancer du sein triple-négatif primaire. En cas de récidive du cancer du sein triple-négatif, la présence de métastase est observée dans la totalité des cas. La récidive survient majoritairement dans les deux ans qui 5 suivent la fin des traitements. ' On entend par « cancer du sein triple-négatif métastasé », un cancer du sein triple-négatif ayant donné naissance à des métastases. On entend par « métastases », la dissémination, via les vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques, de cellules cancéreuses issues 10 d'un cancer primaire, dans d'autres organes Ainsi, la métastase est une colonie secondaire de cellules cancéreuses qui s'installent et se développent à distance du cancer initial. Etant donné que les métastases se disséminent plus fréquemment via la circulation sanguine que lymphatique, les principaux organes touchés par les métastases sont le foie et le poumon. Ces métastases peuvent être découvertes dès le diagnostic initial du cancer ou, au contraire, se 15 manifester après une période de rémission plus ou moins longue Ainsi, dans le cas de la présente invention, les métastases ont pour origine le cancer du sein triple-négatif primaire ou font suite à une récidive de cancer du sein triple-négatif. Dans un aspect particulier, la composition décrite ci-dessus peut être utilisée en 20 prévention, aux femmes ayant plus de 30 ans, aux femmes ayant un historique familial de cancer du sein triple-négatif, sans présence de marqueurs génétiques, ou encore aux femmes ayant un historique familial de cancer du sein triple-négatif, possédant les marqueurs génétiques indiquant qu'elles sont susceptibles de développer un cancer du sein triple-négatif 25 Dans un aspect particulier, la composition décrite ci-dessus peut également être utilisée en tant que traitement chez les femmes ayant été diagnostiquées comme ayant un cancer du sein triple-négatif primaire, chez les femmes ayant été diagnostiquées comme ayant un cancer du sein triple-négatif métastasé ou encore chez les femmes ayant été diagnostiquées comme ayant une récidive de cancer du sein triple-négatif 30 Selon l'invention, ladite composition contenant l'hydroxychloroquine peut être administrée par toute voie d'administration appropriée. 6 Dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique ou local. Dans le cas d'une « administration systémique », l'hydroxychloroquine est véhiculée dans l'organisme pour agir à distance de l'endroit où elle est administrée, par opposition à une 5 administration locale ou loco-régionale, notamment par opposition à une administration intratumorale. La distribution de façon systémique dans l'organisme est obtenue par toute méthode qui entraîne un passage de l'hydroxychloroquine dans les fluides extracellulaires comme par exemple le sang, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien. Dans un aspect particulier, ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le 10 mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapéritonéal, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral. Dans le cas d'une « administration locale », l'hydroxychloroquine est véhiculée dans l'organisme pour agir à l'endroit où elle est administrée. Il peut par exemple, et sans limitation, s'agir d'une administration intratumorale. 15 Les compositions peuvent être formulées, selon la voie d'administration choisie, sous forme de solutions ou de suspensions injectables, gels, huiles, comprimés, sirop, suppositoires, poudres, granules, gélules, capsules, etc. 20 L'invention concerne également la composition définie précédemment dans laquelle l'hydroxychloroquine est en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. On entend par « excipient », toute substance non active associée au principe actif d'un médicament et dont la fonction est de faciliter l'administration, la conservation et/ou le transport 25 du principe actif jusqu'à son site d'absorption. On entend par « excipient pharmaceutiquement acceptable », un excipient non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, un tissu ou un organisme. Selon l'invention, un excipient pharmaceutiquement acceptable peut être, par exemple, et sans limitation : des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, des 30 gélifiants, des dispersants, des solubilisants, des stabilisants, des conservateurs, des édulcorants, etc. 7 La dose d'hydroxychloroquine administrée et la fréquence d'administration de ladite composition peuvent varier selon plusieurs facteurs, tels que par exemple et de façon non limitative, la gravité de la maladie, la voie d'administration, le poids du patient, l'âge du patient, ou les conditions physiques du patient. 5 Dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration à une dose d'hydroxychloroquine thérapeutiquement efficace. On entend par « dose d'hydroxychloroquine thérapeutiquement acceptable », une dose suffisante pour être que l'hydroxychloroquine soit active et entraîne un bénéfice thérapeutique, tel que par exemple, une amélioration, un soulagement ou un traitement de la maladie ou des 10 symptômes, tout en étant inférieure aux seuils toxiques. Ladite composition est en particulier formulée pour un mode d'administration à une dose unitaire de 100 mg à 1 200 mg. De «100 à 1 200 mg » s'entend de toutes les doses comprises de 100 mg à 1 200 mg, par exemple 100, 101, 102, 103, 110, 115, 120, 200, 300, 500, 600, 700, 800, 900, 1 000, 1100, 1 200 mg. 15 Dans un aspect particulier, ladite composition peut être utilisée en association avec la radiothérapie La radiothérapie fait référence à une méthode de traitement locorégional des cancers, utilisant des radiations pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se 20 multiplier. La technique et les modalités de traitement radiothérapeutique, notamment les doses de radiation délivrées, sont adaptées en fonction du cancer et du patient. Dans un second aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant, à titre de substance active, l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement 25 acceptables, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple- négatif métastasé, ladite composition étant utilisée en association avec une thérapie choisie parmi la chimiothérapie et/ou la radiothérapie. Dans la présente invention, le cancer du sein triple-négatif métastasé peut être une 30 récidive du cancer du sein triple-négatif 8 Dans ce second aspect, la présente invention a également pour objet une composition comprenant, à titre de substance active, l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la récidive du cancer du sein triple-négatif, ladite composition étant utilisée en association avec 5 une thérapie choisie parmi la chimiothérapie et/ou la radiothérapie. Tout ce qui a été exposé dans le premier aspect de l'invention peut également s'appliquer dans ce second aspect. 10 Dans un aspect particulier de ce second aspect, l'hydroxychloroquine est en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable notamment choisi parmi des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, des gélifiants, des dispersants, des solubilisants, des stabilisants, des conservateurs, des édulcorants Dans un aspect particulier de ce second aspect, ladite composition est formulée pour un 15 mode d'administration systémique ou local. Dans un aspect particulier de ce second aspect, ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapéritonéal, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral Dans un aspect particulier de ce second aspect, ladite composition est formulée pour un 20 mode d'administration à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment de 100 à 1 200 mg. La radiothérapie fait référence à une méthode de traitement locorégional des cancers, utilisant des radiations pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se 25 multiplier. La technique et les modalités de traitement radiothérapeutique, notamment les doses de radiation délivrées, sont adaptées en fonction du cancer et du patient. La chimiothérapie fait référence à un traitement médicamenteux, à l'aide d'agents chimiothérapeutiques cytostatiques et antinéoplasiques, contre le cancer. 30 Dans un aspect particulier, un agent chimiothérapeutique est notamment choisi parmi : 9 - Les agents inhibant la synthèse de l'ADN, par exemple, la gemcitabine, la capecitabine, la cyclophosphamide, le 5-fluorouracil ou les anthracyclines telles que la doxorubucine ou l'epirubicine - Les agents inhibiteurs de microtubules, par exemple, l'eribuline, le vinorelbine, les 5 taxanes tels que le paclitaxel ou le docétaxel Les sels de platine tels que par exemple le carboplatine ou le cisplatine - Les inhibiteurs de la poly-ADP-ribose-polymérase-1 (PARP), par exemple, l'Olaparib, le talazoparib, le velipariv, ou encore PJ-34 Les inhibiteurs du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), par 10 exemple, le bevacizumab, le sunitinib, ou le sorafenib - Les inhibiteurs du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), par exemple, le cetuximab ou le panitumumab Les inhibiteurs du récepteur du facteurs de croissance des fibroblastes (FGFR) tel que, par exemple, le lucitanib 15 Les inhibiteurs de la voie de signalisation PI3K/Akt, par exemple, l'ipatasertib ou le BK_M120 - Les inhibiteurs de la voie de signalisation mTOR, par exemple, l'évorolimus ou le temsirolimus Les inhibiteurs du récepteur des androgènes, par exemple, le bicalutamide, 20 l'enzalutamide, l'abiraterone acetate, l'enobosarm ou le GTx-024 Les inhibiteurs de tyrosine kinases, par exemple, l'imatinib ou le dasatinib - Les inhibiteurs des des enzymes Janus kinases (JAK), par exemple, le ruxolitinib Les inhibiteurs de T-sécrétase, par exemple, le nirogacestat ou PF-03084014 Les inhibiteurs du récepteur Trop-2, par exemple, le sacituzumab ou isactuzumab 25 govitecan Les agents immunothérapeutiques, tels que par exemple, les anticorps anti-PD-1 (pembrolizumab, nivolumab), les anticorps anti-PDL1 (atezolizumab, avelumab), ou encore des thérapies adjuvantes par le biais du mécanisme immunitaire cellulaire 30 Dans un autre aspect particulier de l'invention, ladite composition comprenant l'hydroxychloroquine et l'agent chimiothérapeutique peuvent être combinés au sein d'une même composition, ou être utilisés sous forme de compositions séparées, administrables de manière simultanée ou séparée dans le temps, en thérapie anti-tumorale. 10 On entend par « compositions séparées », deux compositions distinctes, l'une comprenant l'hydroxychloroquine et l'autre comprenant l'agent chimiothérapeutique. L'expression « administrable de manière simultanée » signifie que les 2 compositions sont administrées en même temps. 5 L'expression « séparée dans le temps » signifie que les 2 compositions sont administrées indépendamment l'une de l'autre, par exemple, avec un décalage dans le temps. Les figures et les exemples suivants illustrent l'invention, sans en limiter la portée. La Figure 1 représente la viabilité de la lignée cellulaire MDA-MB-231 en fonction de 10 la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 correspond à une concentration de 10-10 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire MDA-MB231 correspond au modèle de tumeur du sein triple négatif Cette lignée cellulaire est traitée 15 avec le docétaxel (SOC1) à des doses de 10-11 M, 10-10 M 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, et 10-6 M, ou avec l'hydroxychloroquine (HCQ), à des doses de 10-11 M, 100 M, 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, et 10-6 M La Figure 2 représente la viabilité de la lignée cellulaire MDA-MB-231 en fonction de la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et 20 la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 correspond à une concentration de 10-10 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire MDA-MB231 correspond au modèle de tumeur du sein triple négatif Cette lignée cellulaire est traitée avec du 5-Fluorouracile (SOC2) à des doses de 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, et 10-4 25 M, ou avec l'hydroxychloroquine (HCQ), à des doses de 10-11 M, 10-io M, 10-9 M, 10-8 M, 10- 7 M, et 10-6 M. La Figure 3 représente la viabilité de la lignée cellulaire HeLa en fonction de la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 30 correspond à une concentration de 10-10 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire HeLa 11 correspond au modèle de tumeur de l'utérus. Cette lignée cellulaire est traitée avec le docétaxel (SOC1) à des doses de 5.10-1° M, 5.10-9 M, 5.10-8 M, 5.10-7 M et 5.10-6 M ou avec hydroxychloroquine (HCQ) à des doses de 5.10-1° M, 10-10 M, 5.10-9 M, 10-9 M, 5.10-8 M, 10-8 M, 5.10-7 M, 10-7 M. 5 La Figure 4 représente la viabilité de la lignée cellulaire HL-60 en fonction de la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 correspond à une concentration de 1010 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire HL-60 10 correspond au modèle de leucémie. Cette lignée cellulaire est traitée avec du docétaxel (SOC1) à des doses de 10-11 M, 10-1° M, 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M et 10-5 M ou avec l'hydroxychloroquine (HCQ), à des doses de 10-11M, 10-10 M, 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, et 10-6 La Figure 5 représente la viabilité de la lignée cellulaire MDA-MB-231 en fonction de 15 la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 correspond à une concentration de 10-10 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire MDA-MB231 correspond au modèle de tumeur du sein triple négatif Cette lignée cellulaire est traitée 20 avec le docétaxel (SOC1) à des doses de 10-11 M, 10-10 M, 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, et 10-6 M, ou avec un mélange de docétaxel et d'hydroxychloroquine (SOC 1 + HCQ), à des doses de 10- 11 M, 10-10 M, 10-9 M, 10-8 M, io-7 M, et 10-6 M chacun (dose à dose). La Figure 6 représente la viabilité de la lignée cellulaire MDA-MB-231 en fonction de la concentration du traitement appliqué. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage et 25 la concentration est exprimée en échelle logarithmique, logio, c'est-à-dire que l'abscisse -10 correspond à une concentration de 10-10 M, l'abscisse -8 correspond à une concentration de 10- 8 M et l'abscisse -6 correspond à une concentration de 10-6 M. La lignée cellulaire MDA-MB231 correspond au modèle de tumeur du sein triple négatif Cette lignée cellulaire est traitée avec le docétaxel (SOC1) à des doses de 10-10 M, 5.10 M, 10-9 M, 5.10-8 M, 10-8 M, 5.10-7 M, 30 10-7 M, 5.10-6 M, et 10-6 M ou avec un mélange de docétaxel et d'hydroxychloroquine (SOC1 + HCQ), à des doses de docétaxel de 10-10 M, 5.10-9 M, 10-9 M, 5.10-8 M, 10-8 M, 5.10-7 M, 10- M, 5.10-6 M, et 10-6 M et à une dose fixe d'hydroxychloroquine de 5.10-8 M. 12 Exemple 1: Test de viabilité cellulaire Différentes lignées cancéreuses ont été utilisées: - des cellules adhérentes, telle que la lignée MDA-MB-231, modèle de tumeur du sein 5 triple négatif, et la lignée HeLa, modèle de tumeur de l'utérus - des cellules en suspension, telle que la lignée HL-60, lignée cellulaire d'origine myéloïde et modèle de leucémie. Les cellules sont ensemencées à la densité de 10 000 cellules par puits de plaque 96 puits (à l'exception des Hs 578T qui sont ensemencées à 2 500 cellules par puits). Les cellules 10 adhérentes sont ensemencées 24 heures avant le traitement alors que les cellules en suspensions sont mises en plaque 2 à 4 heures avant le traitement. Différentes molécules, seules ou en association deux à deux, ont été testées. Les traitements sont réalisés en triplicats pour chacune des conditions à savoir, pour les traitements seuls: Docétaxel à 9 concentrations (10-6M; 5.10-6M; 10-7 M; 5.10-7 M; 10-8M; 5.10-8M; 10-9 15 M; 5.10-9M; 10-10M) ou à 6 concentrations (10-6M; 10-7M; 10-8M; 10-9M; 1040 M ; io-iim) 5-Fluorouracile (5-FU) à 6 concentrations (104 M; 10-5M; 10-6M ; 10-7M; 10-8M ; 10- %4) Hydroxychloroquine (HCQ) à 9 concentrations (10-6M; 5.10-6M; 10-7M; 5.10-7M; 10- 20 8 M; 5.10-8M; 10-9M; 5.10-9M; 10-10 M) ou à 6 concentrations (10-6M; 107M; 108M; 10-9m; 10'°M; lem) Ainsi que pour les co-traitements: Docétaxel + HCQ en dose à dose - 5-FU + HCQ en doses combinées (10-4M de 5-FU + 10-6M d'HCQ; 5.10-4M de 5-FU 25 + 5.10-6M d'HCQ, etc. jusqu'à 10-8M de 5-FU + 1040 M d'HCQ) Les contrôles sont eux aussi présents au moins en triplicats et correspondent à la concentration en solvant présente dans chacun des puits tests à savoir 0,1% DMSO (solvant du Docétaxel et du 5-FU) ou 0,1% H20 (solvant de l'HCQ). Les plaques sont alors incubées 48h dans l'incubateur à 37°C, 5% CO2, 95% humidité. Un 30 test de viabilité cellulaire est alors réalisé avec la technique MTS qui évalue la viabilité grâce à 13 l'activité déshydrogénase des mitochondries des cellules vivantes (CellTiter 96AqueaousOne Solution, G3581, Promega). Dix (10) à 20iiL de solution MTS sont ajoutés par puits puis les plaques sont incubées dans l'incubateur à 37°C, 5% CO2, 95% humidité pendant 1 à 4 heures. L'absorbance à 490nrn est enfin mesurée par spectrophotométrie. 5 Plus la viabilité cellulaire est diminuée, plus le nombre de cellules cancéreuses tuées est important et donc plus le traitement appliqué est efficace pour lutter contre le cancer du sein triple-négatif, la leucémie ou le cancer de l'utérus selon la lignée cellulaire considérée. La figure 1 montre que l'hydroxychloroquie diminue la viabilité cellulaire de la lignée 10 MDA-MB -231 de façon plus efficace que le docétaxel, traitement de référence dans le traitement du cancer du sein triple-négatif. En effet, la viabilité cellulaire est de 0% lorsque les cellules sont traitées avec une dose de 10-6 M d'hydroxychloroquine alors qu'elle est de 50% environ lorsque les cellules sont traitées avec le docétaxel à la même dose. De la même façon, la figure 2 montre que l'hydroxychloroquie diminue la viabilité 15 cellulaire de la lignée MDA-MB-231 de façon plus efficace que le 5-Fluorouracile, autre traitement de référence dans le traitement du cancer du sein triple-négatif. En effet, la viabilité cellulaire est de 0% lorsque les cellules sont traitées avec une dose de 10-6 M d'hydroxychloroquine alors qu'elle est de 70% environ lorsque les cellules sont traitées avec la même dose de 5-Fluorouracile. 20 En revanche, la figure 3 montre que l'hydroxychloroquine n'a pas d'effet significatif sur la viabilité cellulaire de la lignée HeLa alors que le docétaxel administré à une dose de 10-8 M entraîne une diminution de la viabilité cellulaire de 50% et de 100% lorsqu'il est administré à une dose de 5.10-6 M. De la même façon, la figure 4 montre que l'hydroxychloroquine réduit de manière moins 25 efficace la viabilité cellulaire de la lignée HL-60. En effet, la viabilité cellulaire est d'environ 90% lorsque les cellules sont traitées à une dose de 10-8 M d'hydroxychloroquine alors qu'elle est d'environ 20% lorsque les cellules sont traitées à une dose de 10-8 M de docétaxel. Ces résultats montrent que l'efficacité de l'hydroxychloroquine sur la viabilité cellulaire dépend de la nature de la lignée cellulaire utilisée Ainsi, l'hydroxychloroquine a un effet 30 spécifique sur la lignée cellulaire MDA-MB-231, c'est-à-dire sur le cancer du sein triple- négatif. 14 La figure 5 montre que l'association docétaxel + hydroxychloroquine diminue la viabilité cellulaire de la lignée MDA-MB-231 de façon plus efficace que le docétaxel seul ou l'hydroxychloroquine seule. En effet, la viabilité cellulaire est d'environ 50% lorsque les cellules sont traitées avec une dose de 10-7 M d'hydroxychloroquine et 10-7 M de docétaxel 5 alors qu'elle est de 75% environ lorsque les cellules sont traitées avec l'hydroxychloroquine seule à une concentration de 10-7M et de 85% lorsque les cellules sont traitées avec le docétaxel seul à une concentration de 10-7 M. La figure 6 montre que l'association docétaxel + hydroxychloroquine (à dose fixe de 5.10-10 M) diminue la viabilité cellulaire de la lignée MDA-MB-231 de façon plus efficace que 10 le docétaxel seul. En effet, la viabilité cellulaire est d'environ 30% lorsque les cellules sont traitées avec une dose de 10-6 M de docétaxel et 5.10-10 M d'hydroxychloroquine alors qu'elle est de 60% environ lorsque les cellules sont traitées avec le docétaxel seul à une concentration de 10-6 M. 15 Exemple 2 : Modèle expérimental in vivo Les expériences ci-après sont réalisées avec la lignée cellulaire MDA-MB231 (lignée humaine exprimant le gène rapporteur Luciférase), modèle de tumeur du sein triple négatif Ces cellules sont greffées à des souris de façon sous cutanée ou grâce à une injection intracardiaque. Les greffes sous cutanées permettent d'évaluer l'impact des traitements sur la tumeur primaire. Le 20 modèle de greffe par voie intracardiaque permet de générer des métastases majoritairement dans les poumons, l'os et le cerveau (et éventuellement dans d'autres organes). Ces métastases sont détectables par imagerie de bioluminescence entre 3 et 4 semaines après l'injection (Arpel et al., 2016 Oneotarget). Le suivi dans le temps de l'évolution du nombre et de la taille des métastases se fait pour chaque souris. L'objectif principal est d'établir une courbe de survie des 25 animaux. Concernant les greffes intracardiaques, les cellules ont été détachées avec une solution d'EDTA (Versene) permettant une dissociation cellulaire non enzymatique douce. Les cellules ont ensuite été lavées et comptées afin d'obtenir 105 cellules dans 100 iLit de PBS. Le PBS contenant les cellules a ensuite été injecté dans le ventricule gauche de souris nude (âgées de 8 30 semaines) à l'aide d'une aiguille de 26G x 1/2 avec une seringue de 1 mL. Les souris ont été initialement anesthésiées avec 3% d'isoflurane en association avec un mélange air/02 et elles 15 ont été maintenues sous anesthésie avec 1,5% d'isoflurane en association avec un mélange air/02 pendant la chirurgie. Les animaux sont répartis différents groupes expérimentaux : 5 groupes de 8 animaux 5 maximum, et plus généralement 4 groupes de 10 animaux ou tout autre combinaison avec un maximum de 40 animaux. Expérience n°1 : Détermination de la dose efficace sur tumeur primaire Cette expérience comporte exceptionnellement 5 groupes de 10 animaux. 10 Elle a pour but de rechercher l'efficacité de l'hydroxychloroquine. Trois des cinq groupes de souris ont reçu ce traitement trois fois par semaine aux concentrations de lmg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, un groupe de souris a reçu ce traitement une fois par semaine à la concentration de 10mg/kg une fois par semaine. Le dernier groupe de souris a reçu le véhicule de l'hydroxychloroquine (le sérum physiologique) trois fois par semaine (groupe contrôle). 15 Les traitements sont administrés aux souris par voie intra-péritonéale lorsque les tumeurs ont atteint la taille minimale de 100 mm3 et ce, pour une durée de 4 semaines. La taille des tumeurs est évaluée tous les trois jours par mesure au caliper et une fois par semaine par imagerie de bioluminescence. Pour la détection de bioluminescence, 100 iaL d'une solution de luciférine à une concentration de 30 mg/mi a été injectée, une fois par semaine, par 20 voie intrapéritonéale à chaque souris. L'acquisition a été effectuée pendant 5 minutes en utilisant un Live Imaging system (NightOwl, Berthold). Expérience n°2 : Détermination de l'effet d'une combinaison de traitement sur tumeur primaire Cette expérience a pour objectif de rechercher l'impact de l'hydroxychloroquine sur la tumeur 25 primaire en utilisant le mode d'administration (meilleure dose efficace, meilleure chronologie d'administration) déterminé dans l'expérience 1. Dans cette expérience, l'hydroxychloroquine est comparé à un traitement classiquement utilisé pour le traitement du cancer du sein triple négatif, le paclitaxel, administré à la dose de 10 mg/kg une fois par semaine pendant 4 semaines ou 20 mg/kg tous les jours pendant 5 jours. En 16 effet, le paclitaxel est connu pour induire des effets anti-tumoraux sur la lignée MDA-MB231 choisie. Par ailleurs, étant donné, qu'il n'existe pas de traitement de référence pour le traitement des métastases de cancer du sein triple négatif, le choix s'est porté ici sur le paclitaxel, 5 habituellement utilisé en clinique en cas d'échec thérapeutique. L'expérience a été réalisée sur 4 groupes de 10 souris : Un groupe contrôle recevant un mélange de véhicules - Un groupe recevant l'hydroxychloroquine Un groupe recevant le Paclitaxel 10 - Un groupe recevant à la fois l'hydroxychloroquine et le paclitaxel Les traitements sont administrés par voie intra-péritonéale lorsque les tumeurs ont atteint la taille minimale de 100 mm3 et ce, pour une durée de 4 semaines. La taille des tumeurs est évaluée tous les trois jours par mesure au caliper et une fois par semaine par imagerie de bioluminescence. 15 Expérience n°3 : Détermination de l'efficacité du traitement sur les métastases Cette expérience a pour objectif de rechercher l'impact de l'hydroxychloroquine sur les métastases en utilisant le mode d'administration (meilleure dose efficace, meilleure chronologie d'administration) déterminé dans les expériences 1 et 2. 20 Dans cette expérience, composée de 3 groupes de 12 souris, l'hydroxychloroquine est comparé au produit initial chloroquine administré selon les mêmes critères de dose et de fréquence que l'hydroxychloroquine. Les traitements sont administrés par voie intra-péritonéale lorsque les animaux présentent au moins une métastase (quelle que soit sa localisation anatomique) mesurable par imagerie de bioluminescence et ce, pour une durée de 4 semaines. 25 La taille des métastases est alors évaluée une fois par semaine par imagerie de bioluminescence. La survie des animaux suite à l'arrêt des traitements a été évaluée. 17 Expérience n°4 : Challenge de l'efficacité de l'HYDROXYCHLOROQUINE par rapport à un premier traitement de référence Cette expérience permet de rechercher l'impact de l'hydroxychloroquine sur les métastases en utilisant le mode d'administration (meilleure dose efficace, meilleure chronologie 5 d'administration) déterminé dans les expériences 1, 2 et 3. Dans cette expérience, l'hydroxychloroquine est comparé à un traitement standard, le Paclitaxel, administré à la dose de 10 mg/kg une fois par semaine pendant 4 semaines ou 20 mg/kg tous les jours pendant 5 jours. Par ailleurs, étant donné, qu'il n'existe pas de traitement de référence pour le traitement des 10 métastases de cancer du sein triple négatif, le choix s'est porté ici sur le paclitaxel, habituellement utilisé en clinique en cas d'échec thérapeutique. L'expérience a été réalisée sur 4 groupes de 10 souris : - Un groupe contrôle recevant un mélange de véhicules Un groupe recevant l'hydroxychloroquine 15 - Un groupe recevant le Paclitaxel - Un groupe recevant à la fois l'hydroxychloroquine et le paclitaxel Les traitements sont administrés par voie intra-péritonéale lorsque les animaux présentent au moins une métastase (quelle que soit sa localisation anatomique) mesurable par imagerie de bioluminescence et ce, pour une durée de 4 semaines. La taille des métastases est alors évaluée 20 une fois par semaine par imagerie de bioluminescence. Expérience n°5 : Challenge de l'efficacité de l'HYDROXYCHLOROQUINE par rapport à un deuxième traitement de référence Cette expérience a pour but de rechercher l'impact de l'hydroxychloroquine sur les métastases en utilisant le mode d'administration (meilleure dose efficace, meilleure chronologie 25 d'administration) déterminé dans les expériences 1, 2 et 3. Dans cette expérience, l'hydroxychloroquine est comparé à un traitement standard, le Trastuzumab ou le Lapatinib, administrés à la dose de 5 mg,/kg par semaine Par ailleurs, étant donné, qu'il n'existe pas de traitement de référence pour le traitement des métastases de cancer du sein triple négatif, le choix s'est porté ici sur le Trastuzumab ou le 30 Lapatinib, habituellement utilisés en clinique en cas d'échec thérapeutique. 18 L'expérience a été réalisée sur 4 groupes de 10 souris : Un groupe contrôle recevant un mélange de véhicules Un groupe recevant l'hydroxychloroquine Un groupe recevant le Trastuzumab ou le Lapatinib 5 - Un groupe recevant à la fois l'hydroxychloroquine et le Trastuzumab ou l'hydroxychloroquine et le Lapatinib Les traitements sont administrés par voie intra-péritonéale lorsque les animaux présentent au moins une métastase (quelle que soit sa localisation anatomique) mesurable par imagerie de bioluminescence et ce, REVENDICATIONS1. Composition comprenant l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif. 2. Composition pour son utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ledit cancer du sein triple-négatif est un cancer du sein triple-négatif primaire, un cancer du sein triple-négatif métastasé, ou une récidive du cancer du sein triple-négatif. 3. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'hydroxychloroquine est en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable notamment choisi parmi des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, des gélifiants, des dispersants, des solubilisants, des stabilisants, des conservateurs, des édulcorants 4. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique ou local 5. Composition pour son utilisation selon la revendication 4, dans laquelle ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapéritonéal, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral 6. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration à une dose unitaire thérapeutiquement efficace, et notamment de 100 à 1 200 mg. 1 20 7. Composition comprenant l'hydroxychloroquine ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein triple-négatif métastasé, ladite composition étant utilisée en association avec une thérapie choisie parmi la chimiothérapie et/ou la radiothérapie 8. Composition pour son utilisation selon la revendication 7, dans laquelle le cancer du sein triple-négatif métastasé est une récidive du cancer du sein triple-négatif 9. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, dans laquelle l'hydroxychloroquine est en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable notamment choisi parmi des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, des gélifiants, des dispersants, des solubilisants, des stabilisants, des conservateurs, des édulcorants 10. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique ou local 11. Composition pour son utilisation selon la revendication 10, dans laquelle ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le mode d'administration sous-cutané, intraveineux, intrapéritonéal, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral 12. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment de 100 à 1 200 mg. 13. Composition pour son utilisation selon la revendication 7, dans laquelle ladite chimiothérapie est effectuée à l'aide d'au moins un agent notamment choisi parmi les agents inhibant la synthèse de l'ADN, les agents inhibiteurs de microtubules, les sels de platine, les inhibiteurs de la poly-ADP-ribose-polymérase-1 (PARP), les inhibiteurs du 2 21 facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), les inhibiteurs du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), les inhibiteurs du récepteur du facteurs de croissance des fibroblastes (FGFR), les inhibiteurs de la voie de signalisation PI3K/Akt, les inhibiteurs de la voie de signalisation mTOR, les inhibiteurs du récepteur des androgènes, les inhibiteurs de tyrosine kinases, les inhibiteurs des enzymes Janus kinases (JAK), les inhibiteurs de T-sécrétase, les inhibiteurs du récepteur Trop-2, les agents immunothérapeutiques, ou encore des thérapies adjuvantes par le biais du mécanisme immunitaire cellulaire 14. Composition pour son utilisation selon la revendication 7 contenant l'hydroxychloroquine et un agent chimiothérapeutique sous une forme adaptée pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie anti-tumorale 3