FR 3075372 A1 20190621 FR 1762390 A 20171218 Dispositif et procede d'observation d'un echantillon avec un systerne optique chromatique Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de ('invention est l'imagerie d'echantillons transparents ou translucides, notamment d'echantillons biologiques, pour obtenir une information relative a la structure de rechantillon et une information !lee a la fluorescence de rechantillon. ART ANTERIEUR L'application de la microscopie a des echantillons fluorescents est une technique tres courante d'observation, en particulier dans le domaine de la biologie ou du diagnostic medical. Selon cette technique, rechantillon est dispose dans un plan focal objet d'un objectif, optiquement couple a un capteur d'image. On illumine rechantillon selon une longueur d'onde d'excitation, induisant une fluorescence de rechantillon, de fagon a former une image de fluorescence. On illumine egalement rechantillon selon une longueur d'onde n'induisant pas de fluorescence, de fagon a former une image visible, representant la structure de rechantillon. L'image de fluorescence et ('image visible sont frequemment superposees. Un probleme se pose lorsque rechantillon est transparent ou translucide. Ce cas de figure est assez frequent lors de ('observation d'echantillons dans le domaine de la biologie, par exemple lorsque rechantillon comporte des cellules ou des microorganismes. L'image visible nest alors pas exploitable, ou pas suffisamment exploitable pour obtenir une information precise quant a la structure de rechantillon. II existe cependant des methodes d'observations permettant l'obtention dune image exploitable d'un echantillon transparent ou translucide. En effet, lorsque rechantillon est legerement defocalise par rapport au systeme optique, il est possible de former une image, dite defocalisee, de rechantillon. rechantillon etant illumine par une onde lumineuse incidente, ('image defocalisee comporte une information relative au dephasage de l'onde lumineuse incidente par rechantillon. A partir de ('image defocalisee, il est possible d'appliquer des algorithmes de reconstruction holographique, de fagon a obtenir une image, dite reconstruite comportant une information relativement precise quant au dephasage produit par rechantillon. Cette technique est designee par le terme microscopie de phase. L'image reconstruite permet generalement d'obtenir une information exploitable quant a la structure de rechantillon. Des 2 exemples d'exploitation dune image defocalisee sont par exemple decrits dans W02016075279 ou W02016097092. Les inventeurs ont developpe un dispositif et un procede d'observation d'un objet, de conception simple et peu onereux, permettant ('observation d'un echantillon fluorescent, 5 particulierement adaptee a des echantillons transparents ou translucides. D'autres avantages et caracteristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de realisation de ('invention, donnes a titre d'exemples non limitatifs, et representes sur les figures listees ci-dessous. EXPOSE DE L'INVENTION 10 Un premier objet de ('invention est un procede d'observation d'un echantillon fluorescent, s'etendant selon un plan, dit plan d'echantillon, rechantillon comportant un agent fluorescent apte a emettre une onde lumineuse de fluorescence, dans une bande spectrale de fluorescence, lorsqu'il est illumine par une onde lumineuse d'excitation, dans une bande spectrale d'excitation, le procede comportant les etapes suivantes : 15 a) illumination de rechantillon a l'aide dune premiere source de lumiere, selon une premiere bande spectrale d'illumination, la premiere bande spectrale d'illumination s'etendant dans la bande spectrale d'excitation et acquisition dune premiere image de rechantillon, dans la bande spectrale de fluorescence, a l'aide d'un capteur d'image; b) illumination de rechantillon a l'aide dune deuxieme source de lumiere, selon une 20 deuxieme bande spectrale, en dehors de la bande spectrale de fluorescence, rechantillon s'etendant entre la deuxieme source de lumiere et le capteur d'image, et acquisition dune deuxieme image de rechantillon, dans la deuxieme bande spectrale, a l'aide du capteur d'image ; le capteur d'image etant couple a un systeme optique, dispose entre le capteur d'image et 25 rechantillon, le systeme optique etant tel que : - dans la bande spectrale de fluorescence, le plan focal objet du systeme optique est confondu avec le plan de l'echantillon; - dans la deuxieme bande spectrale, le plan focal objet du systeme optique est decale par rapport au plan de rechantillon, le decalage etant superieur a 20 p.m ou a 30 p.m de telle 30 sorte que: - la premiere image est une image focalisee de rechantillon, representative dune fluorescence de rechantillon ; 3 - la deuxieme image est une image defocalisee de rechantillon, representative dune structure de rechantillon. On dispose alors d'un procede bimodal d'observation d'un echantillon, tirant profit de ('utilisation d'un systeme optique chromatique, et permettant de realiser une premiere image 5 de rechantillon selon une modalite de fluorescence et une deuxieme image de rechantillon selon une modalite de type microscopie holographique. Le decalage est ci) aux aberrations chromatiques du systeme optique. La deuxieme image peut notamment etre une image representative de la phase dune onde lumineuse dite d'exposition, a laquelle est exposé le capteur d'image lors de ('acquisition de la deuxieme image. 10 Le procede peut comporter une etape c) d'application d'un operateur de reconstruction holographique a partir de la deuxieme image, de fagon a obtenir une image reconstruite de rechantillon dans un plan de reconstruction, et notamment dans le plan de rechantillon. La deuxieme bande spectrale peut etre ecalee, par rapport a la bande spectrale de fluorescence, d'au moins 150 nm et de preference d'au moins 200 nm. 15 De preference, le capteur d'image, le systeme optique et rechantillon sont fixes entre ('acquisition de la premiere image et ('acquisition de la deuxieme image. De preference, dans la deuxieme bande spectrale, le plan focal objet est decale dune distance inferieure a 1 mm du plan de rechantillon, et de preference dune distance inferieure a 500 p.m du plan de rechantillon, cette distance etant de preference inferieure a 250 p.m. 20 La premiere source de lumiere peut etre disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon et comprenant le capteur d'image. Alternativement, la premiere source de lumiere peut etre disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon et comprenant la deuxieme source de lumiere. Les etapes a) et b) sont de preference realisees successivement, l'etape a) etant realisee avant 25 l'etape b) ou reciproquement. De preference, dans la deuxieme bande spectrale, le decalage du plan focal objet du systeme optique est superieur a 50 p.m. II est de preference inferieur a 1 mm, voire 500 p.m. II peut etre compris entre 50 p.m et 250 p.m, la plage 50 p.m - 150 p.m etant preferee. Un deuxieme objet de ('invention est un dispositif d'observation d'un echantillon fluorescent, 30 rechantillon etant apte a emettre une onde lumineuse dans une bande spectrale de fluorescence lorsqu'il est illumine selon une bande spectrale d'excitation, le dispositif comportant : 4 - une premiere source de lumiere, configuree pour emettre une onde lumineuse dans une premiere bande spectrale, s'etendant dans une bande spectrale d'excitation de rechantillon ; - une deuxieme source de lumiere configuree pour emettre une onde lumineuse selon 5 une deuxieme bande spectrale, s'etendant en dehors la bande spectrale de fluorescence; - un capteur d'image, optiquement couple a un systeme optique; - un support, destine a recevoir rechantillon, de telle sorte que rechantillon s'etende selon un plan, dit plan d'echantillon, ce dernier etant dispose entre le systeme optique 10 et la deuxieme source de lumiere ; - le systeme optique definissant : - dans la bande spectrale de fluorescence, un premier plan focal objet, confondu avec le plan de l'echantillon; - dans la deuxieme bande spectrale, un deuxieme plan focal objet, distant du plan 15 de rechantillon, d'au moins 20 p.m, ou d'au moins 30 p.m ; de telle sorte que le capteur d'image est configure pour acquerir : - une image nette de rechantillon, dans la bande spectrale de fluorescence, lorsque ce dernier est illumine par la premiere source de lumiere; - une image defocalisee de rechantillon, dans la deuxieme bande spectrale, lorsque 20 rechantillon est illumine par la deuxieme source de lumiere. La distance entre le premier plan objet et le deuxieme plan objet est de preference inferieure a 1 mm, et de preference inferieure a 500 p.m ou a 250 p.m. Le dispositif peut comprendre un processeur, apte a appliquer un operateur de reconstruction holographique a une image acquise par le capteur d'image, de fagon a reconstruire une image 25 representative de rechantillon, dans un plan de reconstruction distant d'un plan de detection selon lequel s'etend le capteur d'image, et de preference dans le plan de rechantillon. Le dispositif peut comporter un filtre, s'etendant entre rechantillon et le capteur d'image, presentant une bande passante dite de fluorescence, correspondant a la bande spectrale de fluorescence. Le filtre permet de filtrer tout ou partie de l'onde lumineuse selon la bande 30 spectrale d'excitation. Le filtre peut presenter une bande passante auxiliaire, distincte de la bande passante de fluorescence, correspondant a tout ou partie de la deuxieme bande spectrale. La bande passante de fluorescence du filtre presente avantageusement une largeur de bande inferieure a 100 nm. 5 La premiere source de lumiere peut etre disposee dans un demi-espace delimits par le plan de rechantillon et comprenant le capteur d'image. La premiere source de lumiere peut etre disposee dans un demi-espace delimits par le plan de rechantillon et comprenant la deuxieme source de lumiere. 5 FIGURES La figure 1A represente un dispositif de ('invention selon une premiere configuration. La figure 1B represente le dispositif represente sur la figure 1A selon une deuxieme configuration. La figure 1C est une variante du dispositif represente sur les figures 1A et 1B. 10 La figure 1D illustre trois plans focaux objet d'un systeme optique espaces les uns des autres, a chaque plan focal correspondant une bande spectrale. La figure 2A montre differentes images de fluorescence, progressivement defocalisees. La figure 2B est une evolution d'un rapport signal a bruit (axe des ordonnees) des images illustrees sur la figure 2A, en fonction dune distance de defocalisation (axe des abscisses), 15 exprimee en p.m. Les figures 3A a 3D illustrent un exemple de mise en oeuvre d'un procede d'observation d'un echantillon : la figure 3A est une image defocalisee de rechantillon. La figure 3B est une image de fluorescence de rechantillon. La figure 3C est une image, dite image de phase, de rechantillon, obtenue par application d'un operateur de reconstruction holographique a ('image 20 defocalisee de rechantillon. La figure 3D est une superposition entre ('image de phase et de ('image de fluorescence de rechantillon. La figure 4 montre les principales stapes d'un procede selon ('invention. Les figures 5A, 5B et 5C montrent respectivement des images de phase, de fluorescence ainsi que des images de phase et de fluorescence superposees, les images etant regulierement 25 acquises durant un intervalle temporel de 75 h. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS Les figures 1A et 1B representent un dispositif permettant la mise en oeuvre de ('invention. Le dispositif comporte une premiere source de lumiere 11 et une deuxieme source de lumiere 12. La premiere source de lumiere 11 est configuree pour emettre une premiere onde lumineuse 41 30 dans une premiere bande spectrale 44 La deuxieme source de lumiere 12 est configuree pour emettre une deuxieme onde lumineuse 42clans une deuxieme bande spectrale 442- La deuxieme onde lumineuse A2 se propage selon un axe de propagation Z. Dans cet exemple, la premiere onde lumineuse 41 se propage parallelement a la deuxieme onde lumineuse 42, mais cette 6 condition nest pas necessaire, comme decrit en lien avec la figure 1C. La premiere bande spectrale 4X1 et la deuxieme bande spectrale 4X2 sont respectivement centrees autour dune premiere longueur d'onde Xi et autour dune deuxieme longueur d'onde X2. Le dispositif comporte un support d'echantillon 10s configure pour recevoir un echantillon 10, 5 de telle sorte que rechantillon soit maintenu sur le support 10s en s'etendant selon un plan, dit plan d'echantillon P1o. L'echantillon 10 est un echantillon que l'on souhaite caracteriser. II comprend notamment un milieu liquide 10m dans lequel baignent des particules 10p. Le milieu 10m peut etre un liquide tampon. II peut egalement comporter un liquide corporel, a l'etat pur ou dilue. Par liquide corporel, on entend un liquide genere par un corps vivant. II peut en 10 particulier s'agir, a titre non limitatif, de sang, d'urine, de liquide cephalorachidien, de sperme, de lymphe. Par particule, on entend notamment une cellule, par exemple une cellule sanguine, ou un microorganisme, par exemple une bacterie. L'echantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique d'epaisseur100 p.m. L'epaisseur de la chambre fluidique 15, et donc de rechantillon 10, 15 selon l'axe de propagation Z, varie typiquement entre 10 pm et 1 cm, et est de preference comprise entre 20 p.m et 500 p.m. L'echantillon peut etre un echantillon solide transparent ou translucide. II peut par exemple s'agir dune fine lame de tissu biologique, par exemple dune lame d'anatomopathologie, ou encore d'un extrait sec d'un liquide, par exemple d'un liquide biologique. 20 L'echantillon comporte un agent fluorescent 10f, ou fluorophore. II peut s'agir d'un agent exogene, ajoute a rechantillon prealablement a son observation, ou d'un agent endogene, naturellement present dans rechantillon. Lorsqu'il est illumine dans une bande spectrale d'excitation 4a,e, ('agent fluorescent 10f &net une onde lumineuse de fluorescence Af dans une bande spectrale de fluorescence 4Xf. Un agent fluorescent exogene est generalement ajoute a 25 ('objet, de maniere a se fixer specifiquement sur des cibles, par exemple une certaine categorie de cellules, ou plus generalement sur des structures biologiques d'interet, par exemple un noyau dune cellule, une base d'ADN, une cellule cancereuse, ou une structure biologique comportant un ligand apte a se greffer preferentiellement avec ('agent fluorescent. L'agent fluorescent utilise peut etre du vert d'indocyanine, ou ICG (acronyme anglais signifiant IndoCyanine Green). 30 Dans ce cas, la bande spectrale d'excitation 4Xe est comprise entre 750 nm et 800 nm, la bande spectrale de fluorescence 4X,f etant comprise entre 820 nm et 870 nm. L'agent fluorescent utilise peut etre du DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Dans ce cas, la bande spectrale d'excitation 7 4X, est comprise entre 350 nm et 400 nm, la bande spectrale de fluorescence (ou bande spectrale de fluorescence) AXf etant comprise entre 430 nm et 530 nm. Le DAPI est connu pour se fixer sur certaines bases d'ADN. Son utilisation permet par exemple de localiser l'ADN dans une cellule. On peut egalement utiliser un marqueur Hoechst, dont les proprietes optiques sont 5 proches du DAPI, mais etant moins toxique. Un des objectifs du dispositif 1 est ('observation de rechantillon 10 selon une modalite de fluorescence. Aussi, la premiere bande spectrale 4X1 correspond a la bande spectrale d'excitation 4Xe de ('agent fluorescent 10f present dans rechantillon 10. La distance D entre la deuxieme source de lumiere 12 et rechantillon 10 est de preference 10 superieure a 1 cm. Elle est de preference comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la deuxieme source de lumiere, vue par l'echantillon, est consideree comme ponctuelle. Cela signifie que son diametre (ou sa diagonale) est preferentiellement inferieur au dixieme, mieux au centieme de la distance entre rechantillon et la source de lumiere. Sur la figure 1A, la premiere source de lumiere 11 et la deuxieme source de lumiere 12 sont des diodes 15 electroluminescentes. Elles peuvent etre associees a un diaphragme 14, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de preference entre 50 p.m et 500 p.m. Dans cet exemple, le diaphragme a un diametre est de 150 p.m. Selon une autre configuration, le diaphragme peut etre remplace par une fibre optique, dont une premiere extremite est placee face a chaque source de lumiere et dont une deuxieme extremite est placee 20 en regard de l'echantillon 10. Le dispositif represents sur les figures 1A et 1B comporte egalement un diffuseur 13, dispose entre les sources de lumiere et le diaphragme 14. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage des sources de lumiere par rapport a l'ouverture du diaphragme 14. La fonction d'un tel diffuseur est de repartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumiere elementaire 11 selon un cone d'angle a. De 25 preference, ('angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. Alternativement, la premiere et/ou la deuxieme source de lumiere peuvent etre une source laser, telle une diode laser. Lorsqu'une source de lumiere est une diode laser, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur. Dans l'exemple represents sur la figure 1A, rechantillon 10 est dispose entre la premiere source 30 de lumiere 11 et le capteur d'image 30. Cela nest cependant pas necessaire. Dans l'exemple represents sur la figure 1C, la premiere source de lumiere 11 est disposee dans un demi-espace delimits par le plan de rechantillon P10 et comportant le capteur d'image 30. 8 De preference, la premiere bande spectrale 4X1 et/ou la deuxieme bande spectrale 4X2 ont une largeur de bande inferieure a 200 nm, voire 150 nm ou 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur a mi-hauteur de la bande spectrale. Selon un autre mode de realisation, le dispositif comporte une source de lumiere, dite source 5 de lumiere principale, de large bande spectrale, de type source de lumiere blanche. L'illumination de rechantillon par la premiere bande spectrale 4X1 et par la deuxieme bande spectrale 4X2 est respectivement obtenue en disposant un premier filtre passe bande, definissant la premiere bande spectrale, et un deuxieme filtre passe bande, definissant la deuxieme bande spectrale, entre la source de lumiere principale et rechantillon. La premiere 10 source de lumiere 11 est obtenue par ('association de la source de lumiere principale et du premier filtre passe bande. La deuxieme source de lumiere 12 est obtenue par l'association de la source de lumiere principale et du deuxieme filtre passe bande. La largeur des premiere et deuxieme bandes spectrales sont respectivement determinees par les bandes passantes respectives des premier et deuxieme filtres passe bande. 15 L'echantillon 10 est dispose entre la deuxieme source de lumiere 12 et un capteur d'image 30. Ce dernier s'etend de preference parallelement, ou sensiblement parallelement au plan Pio selon lequel s'etend rechantillon 10. Le terme sensiblement parallelement signifie que les deux elements peuvent ne pas etre rigoureusement paralleles, une tolerance angulaire de quelques degres, inferieure a 20° ou 10° etant admise. Dans cet exemple, rechantillon s'etend selon un 20 plan Pio, perpendiculaire a l'axe de propagation Z. La premiere source de lumiere 11 peut etre disposee : - dans un demi-espace delimits par le plan de rechantillon P10 et comprenant la deuxieme source de lumiere 12 - ou dans un demi-espace delimits par le plan de rechantillon P10 et comprenant le 25 capteur d'image 30. Le capteur d'image 30 est configure pour former une image de rechantillon selon un plan de detection P30. Dans l'exemple represents, le capteur d'image 30 comporte une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de detection P30 s'etend de preference perpendiculairement a l'axe de propagation Z de la deuxieme onde lumineuse incidente 42. Dans l'exemple 30 represents, le capteur d'image 30 est un capteur CMOS IDS UI-1942LE-M comportant 3840 par 2748 pixels, la taille de chaque pixel etant de 1.67 pm x 1.67 p.m. 9 Le capteur d'image 30 est optiquement couple a rechantillon 10 par un systeme optique 20. Dans ('exemple represents, le systeme optique comporte un objectif 21 et une lentille de tube 22. Le systeme optique 20 est chromatique : pour un meme plan focal image, en ('occurrence confondu avec le plan de detection P30, la position du plan focal objet varie en fonction de la 5 longueur d'onde. Ainsi, lorsque deux longueurs d'onde sont ecartees de 100 nm, les plans focaux objets correspondant respectivement a chaque longueur d'onde sont espaces d'au moins 10 pm, et de preference d'au moins 20 pm, ou30p.m, voire 50 pm. Dans cet exemple, ('objectif 21 est un objectif Motic CCIS EF-N Plan Achromat 10x, d'ouverture numerique 0.25. II est optiquement couple a une lentille 22, cette derniere etant a l'origine des aberrations 10 chromatiques du systeme optique 20, resultant a l'espacement entre les plans focaux objet en fonction de la longueur d'onde. La lentille est, dans cet exemple, une lentille Thorlabs LBF254- 050N-BK7 Best Form Lens, diametre 1 ", f = 50 mm. La figure 1A represente le dispositif dans une premiere configuration selon laquelle rechantillon est illumine, par la premiere source de lumiere, dans la premiere bande spectrale 44 qui 15 correspond a la bande spectrale d'excitation 4Xe de ('agent fluorescent 10f. Sous l'effet de cette illumination, ('agent fluorescent &net une onde de fluorescence 4f, dans la bande spectrale de fluorescence 4Xf. L'objectif 20 est dispose de telle sorte que dans la bande spectrale de fluorescence 4Xf, le premier plan focal objet P1 corresponde au plan Pio selon lequel s'etend rechantillon 10, ce qui correspond au plan selon lequel est emis l'onde lumineuse de 20 fluorescence 4f. Le plan focal image conjugue du premier plan focal objet Pi est le plan de detection P30. Ainsi, selon cette configuration, le capteur d'image 30 acquiert une premiere image Ii nette de rechantillon, cette image etant representative de la fluorescence de rechantillon 10. Elle permet d'observer une distribution spatiale de ('agent fluorescent dans rechantillon. 25 Selon cette configuration, un filtre optique 15, dit filtre d'excitation, peut etre dispose entre la premiere source de lumiere 11 et rechantillon 10. Le filtre d'excitation 15 permet d'ajuster la premiere bande spectrale AX,1 de telle sorte que l'onde lumineuse M illuminant rechantillon corresponde a tout ou partie de la bande spectrale d'excitation Un filtre optique 16, dit filtre de fluorescence, peut etre dispose entre rechantillon 10 et le 30 capteur d'image 30. Le filtre de fluorescence 16 permet de limiter l'onde lumineuse detectee par le capteur d'image 30 a la bande spectrale de fluorescence 4Xf. Cela permet notamment d'eviter un parasitage de ('image acquise par le capteur d'image par de la lumiere parasite ne 10 provenant pas de la fluorescence de rechantillon. Le filtre optique 16 presente une bande passante de fluorescence, correspondant a la bande spectrale de fluorescence 4Xf. II peut egalement s'agir un filtre multi-bandes, dont la bande passante inclut a la fois la bande spectrale de fluorescence 4Xf et une deuxieme bande spectrale 4X2, decrite ci-apres. Par filtre multi- 5 bandes, on entend un filtre dont la bande passante inclut des bandes passantes distinctes et espacees les unes des autres. II peut egalement s'agir d'un filtre passe haut, laissant passer les longueurs d'onde situees au-dela de la bande spectrale d'excitation 4Xe et bloquant les longueurs d'onde dans la bande spectrale d'excitation. Selon une autre configuration, representee sur la figure 1B, rechantillon est illumine par la 10 deuxieme source de lumiere 12, dans la deuxieme bande spectrale 4X2, cette derniere etant differente de la bande spectrale de fluorescence 4Xf de l'agent fluorescent 10f. De preference, la deuxieme bande spectrale est centree sur une longueur d'onde X2, qui est decalee d'au moins 100 nm, voire 150 nm ou meme 200 nm de la longueur d'onde centrale Xf de la bande spectrale de fluorescence. II est en effet preferable que la bande spectrale de fluorescence 4Xf et la 15 deuxieme bande spectrale 4X2 ne se superposent pas, ou de fawn marginale. Par exemple, plus de 80%, ou plus de 90%, des intensites lumineuses emises respectivement dans chacune de ces bandes spectrales ne se recoupent pas. En considerant que chaque bande spectrale est delimitee par une borne inferieure et une borne superieure, definissant la largeur a mi-hauteur de la bande spectrale, it est preferable que la borne superieure dune bande spectrale soit 20 distante, d'au moins 50 nm, voire d'au moins 100 nm, de la borne inferieure dune autre bande spectrale. L'objectif 20 est tel que dans la deuxieme bande spectrale 4X2, le deuxieme plan focal objet P2 est decals par rapport au premier plan focal objet Pi, ce dernier correspondant au plan Pio selon lequel s'etend rechantillon 10. Le plan focal image, conjugue du deuxieme plan focal objet P2, 25 est le plan de detection P30. Ainsi, selon cette configuration, le capteur d'image 30 acquiert une deuxieme image 12 defocalisee de rechantillon 10, dans la deuxieme bande spectrale 4X2. Sur la figure 1B, on a represents le deuxieme plan focal objet P2, ainsi que le plan de rechantillon P10, ce dernier etant confondu avec le premier plan focal P1. Selon cette configuration, le capteur d'image 30 est exposé a une onde lumineuse 4'2, dite one lumineuse d'exposition. L'image 30 acquise comporte des figures d'interference, pouvant egalement etre designees par le terme "figures de diffraction", formees par : 11 - une partie de la deuxieme onde lumineuse A2 emise par la deuxieme source de lumiere 12, et ayant traverse rechantillon sans interagir avec ce dernier ; - des ondes de diffraction, formees par la diffraction dune partie de la deuxieme onde lumineuse A2 dans rechantillon. 5 La deuxieme image 12 acquise par le capteur d'image 30 comporte des figures d'interferences (ou figures de diffraction), representatives de rechantillon 10, ou des particules 10p composant ce dernier. De fagon plus generale, la deuxieme image acquise 12 par le capteur d'image 30 est representative de la structure de rechantillon. Un processeur 32, par exemple un microprocesseur, est apte a traiter la deuxieme image 12 10 acquise par le capteur d'image 30. En particulier, le processeur est un microprocesseur 32 relie a une memoire programmable 33 dans laquelle est stockee une sequence d'instructions pour effectuer les operations de traitement d'images et de calculs decrites dans cette description. Le processeur 32 peut etre couple a un ecran 34 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 30 ou calculees par le processeur 32. 15 La deuxieme image 12 acquise par le capteur d'image 30 selon la deuxieme configuration, defocalisee, ne permet pas d'obtenir une representation precise de l'echantillon observe. De fagon usuelle dans le domaine de l'holographie, on peut appliquer, a la deuxieme image 12, un operateur de reconstruction holographique h, de fagon a calculer une expression complexe A representative de l'onde lumineuse 4'2,a laquelle est exposé le capteur d'image, et cela en tout 20 point de coordonnees (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan, dit de reconstruction /3,, situe a une distance I z I, dite distance de reconstruction, du capteur d'image 30. Le plan de reconstruction est de preference le plan P10 selon lequel s'etend rechantillon 10. L'expression complexe A(x, y, z) au point de coordonnees (x,y,z) s'obtient a partir de la deuxieme image 12, par un produit de convolution selon requation: 25 A (x, y, z) = /2 (X, y, z) * h, le symbole * designant l'operateur produit de convolution. Les coordonnees (x, y) designent une position planaire dans un plan radial perpendiculaire a l'axe de propagation Z. La coordonnee z designe une coordonnee selon l'axe de propagation Z. Avant ('application de l'operateur de reconstruction, la deuxieme image 12 peut etre normalisee ou subir un pre-traitement avant la convolution par l'operateur de reconstruction. 30 L'operateur de reconstruction h a pour fonction de decrire la reconstruction de la lumiere entre le capteur d'image 30 et un point de coordonnees (x, y, z), situe a une distance I z I du capteur d'image. L'expression complexe A de l'onde lumineuse d'exposition 4'2, en tout point de 12 coordonnees (x, y, z) de l'espace, est telle que : A(x, y, z) = M (x, y, z)eMx'Y'z) ou M(x, y, z) et (p (x, y, z) designent respectivement le module et la phase de l'onde lumineuse d'exposition 4'2, au point de coordonnees (x, y, z). On a alors : - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] ; 5 - y, z) = arg [A (x, y, z)] ; Les operateurs abs et arg designent respectivement le module et l'argument. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement representatifs de la phase et de ('amplitude de l'onde lumineuse d'exposition detectee par le capteur d'image 30. Le produit de convolution de la deuxieme image 12 par 10 l'operateur de reconstruction h peut permettre d'obtenir une image complexe Az representant une distribution spatiale de ('expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'etendant a une distance I z I du plan de detection P30. L'image complexe Az correspond a une image complexe de rechantillon dans le plan de reconstruction P. Elle represente egalement une distribution spatiale bidimensionnelle de 15 ('expression complexe A decrivant l'onde d'exposition 4'2 Un tel procede, designe par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image Mz du module ou de la phase (pz de ('expression complexe decrivant l'onde lumineuse d'exposition 4'2, dans le plan de reconstruction. L'image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 4'2 s'obtient respectivement selon les expressions suivantes : 20 M, = mod (As) et (p, = arg(Az). L'operateur de reconstruction est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : xI h(x,y, z) = jAz e_an- Aexp(jn- Az )- Des exemples de reconstructions holographiques sont decrits dans la publication Seo S et al, "High-Throughput lens-free blood analysis on a chip", Anal Chem. 2010 June 1 ; 82(11): 462125 4627, ou encore dans le document W02017162985. Lorsque rechantillon est transparent, ('image reconstruite est de preference une image de la phase (pz de ('expression complexe de l'onde lumineuse 4'2 parvenant au capteur d'image 30. Lorsque le plan de reconstruction est un plan selon lequel s'etend rechantillon Pio, une telle image donne une representation visuelle relativement precise de la structure de rechantillon. 30 Ainsi, ('invention permet d'obtenir une premiere image Ii representative de la fluorescence de rechantillon, et une deuxieme image 12 qui, apres reconstruction holographique, est 13 representative de la structure de rechantillon 10. Un aspect remarquable de ('invention est qu'entre ('acquisition de la premiere image et ('acquisition de la deuxieme image, ni rechantillon 10, ni le capteur d'image 30, ni le systeme optique 20 ne sont deplaces. Cela evite le recours a des moyens de deplacement et de positionnement du systeme optique. On peut ainsi acquerir 5 successivement une premiere image et une deuxieme image de rechantillon en activant successivement la premiere source de lumiere 11, puis la deuxieme source de lumiere 12. Lorsqu'on acquiert la premiere image 11, it est preferable que la deuxieme source de lumiere 12 soit eteinte, de fawn a eviter ('apparition de lumiere parasite sur la premiere image. II est egalement souhaitable que la premiere source de lumiere 11 soit eteinte lorsqu'on acquiert la 10 deuxieme image 12. De preference, la premiere image et la deuxieme image sont acquises sequentiellement. Le dispositif 1 permet une observation bimodale de rechantillon de fawn simple, ne necessitant aucun ajustement d'un plan focal du systeme optique 20 entre les deux modalites. Le temps de pose de la premiere image peut etre plus long que le temps de pose de la deuxieme image, car l'intensite de l'onde lumineuse de fluorescence est generalement faible. 15 Lorsqu'on utilise un filtre optique multi-bandes, tel que precedemment decrit, tous les composants du dispositif, y compris rechantillon 10, peuvent etre fixes, aucun mouvement n'etant a prevoir entre ('acquisition de la premiere image 11 et de la deuxieme image 12. Cela permet une commutation rapide entre ('acquisition de la premiere image et ('acquisition de la deuxieme image. 20 La figure 1C montre une configuration permettant egalement ('acquisition dune deuxieme image. Alors que dans la figure 1B, le plan focal objet P2 dans la deuxieme bande spectrale 4X2 est dispose entre rechantillon et le systeme optique 20, dans la figure 1C, le plan focal objet P2 est dispose entre rechantillon 10 et la deuxieme source de lumiere 12. Sur la figure 1D, on a represents trois plans focaux objet d'un objectif 20 convenant a une mise 25 en oeuvre de ('invention. L'objectif comporte trois plans focaux objets Pa, Pb, Pc, chaque plan focal correspondant respectivement a une bande spectrale bleue (par exemple 450 nm ± 20 nm), verte (par exemple 550 nm ± 20 nm) et rouge (par exemple 650 nm ± 20 nm). La distance entre deux plans focaux adjacents est par exemple comprise entre 50 pm et 100 p.m. De preference, le systeme optique chromatique 20 est configure de telle sorte que deux plans 30 focaux objets correspondant respectivement a deux bandes spectrales espacees de 100 nm, sont distants l'un de l'autre d'au moins 20 p.m, voire au moins 30 p.m ou au moins 50 p.m. 14 La figure 2A montre des images d'un echantillon fluorescent successivement acquises en eloignant progressivement rechantillon du premier plan de focalisation P1. Le decalage par rapport au premier plan P1, exprime en urn, est indique sur chaque image. Sur chaque image, on a calcule un rapport signal sur bruit SNR relatif a chaque image. Le rapport signal sur bruit 5 correspond a rintensite maximale, sur l'image, divisee par une estimation d'un niveau de bruit sur l'image. La figure 2B montre revolution du rapport SNR en fonction du decalage par rapport au premier plan objet Pi. Cela montre que l'image de fluorescence Ii doit etre preferentiellement acquise lorsque rechantillon est dispose dans le plan focal objet du systeme optique correspondant a la bande spectrale de fluorescence. Un decalage, meme minime, est 10 prejudiciable a la qualite de l'image de fluorescence obtenue. La mise en oeuvre de ('invention peut etre resumee sur les figures 3A a 3D. Dans cet exemple, rechantillon est compose de neurones marques au DAPI. La figure 3B montre une image de fluorescence de rechantillon (4Xf centree sur 452 nm), dite premiere image Ii, le dispositif etant configure comme decrit en lien avec la figure 1A, la source de lumiere etant une diode 15 electroluminescente emettant dans l'UV. La figure 3A montre une deuxieme image de rechantillon, defocalisee, acquise alors que le dispositif est dispose comme decrit en lien avec la figure 1B, dans une bande spectrale 4X2 centree sur 543.5 nm et de largeur spectrale 2.1 nm. Dans cet exemple, le plan focal objet de rechantillon, dans la deuxieme bande spectrale 44 est distant de 50 p.m du plan focal objet de rechantillon dans la bande spectrale de fluorescence 4Xf 20 du DAPI. La deuxieme image de rechantillon a fait ('objet d'un algorithme de reconstruction holographique, selon le procede decrit dans la demande de brevet W02017162985, et plus particulierement dans les stapes 110 a 160 decrites dans cette derniere. La reconstruction a ete effectuee dans le plan selon lequel s'etend rechantillon, ce dernier etant confondu avec le plan focal objet Pi de la premiere modalite. On a represents, sur la figure 3C, ('image de phase de 25 ('expression complexe calculee dans le plan de rechantillon. Les differentes structures neuronales apparaissent nettement. Ainsi, ('image de phase permet d'obtenir une information exploitable quant a la structure de rechantillon. La figure 3D est une superposition de ('image de phase representee sur la figure 3C avec ('image de fluorescence obtenue sur ('image 3B. Cela permet de mettre en evidence le marquage des 30 noyaux des neurones par le DAPI. La figure 4 illustre les principales stapes du procede : - etape 100 : disposition de rechantillon sur le support d'echantillon ; 15 - etape 110: illumination de rechantillon dans la premiere bande spectrale et acquisition dune premiere image 11 de rechantillon, correspondant a la modalite de fluorescence ; - etape 120 : illumination de rechantillon dans la deuxieme bande spectrale, et acquisition dune deuxieme image 12 de rechantillon, defocalisee ; 5 - etape 130 : a partir de la deuxieme image, application d'un operateur de reconstruction holographique pour obtenir, de preference, une image de phase de rechantillon, pour obtenir une information structurelle de rechantillon ; - etape 140 : superposition de l'image de fluorescence et de l'image resultant de reconstruction holographique. 10 L'ordre chronologique selon lequel sont mises en oeuvre les etapes 110 et 120 est indifferent. Dans un autre essai experimental, des cellules vivantes de type MDCK (Malin-Darby Canine Kidney), cultivees dans un incubateur, ont ete marquees avec agent fluorescent Hoechst 33342, specifique de l'ADN. Six heures apres le marquage, on a acquis une premiere image de fluorescence de rechantillon. L'echantillon etait alors illumine dans le proche UV, pour emettre 15 une onde lumineuse de fluorescence dans Ia bande spectrale 4Xf centree sur 452 nm. On a egalement acquis deuxieme image defocalisee de rechantillon, en eclairant ce dernier dans une deuxieme bande spectrale 4X2 centree sur 543.5 nm et de largeur de bande 2.1 nm. A cette deuxieme bande spectrale correspond un plan focal objet distant de 60 pm du plan focal objet correspondant a Ia longueur d'onde de fluorescence de l'agent fluorescent. On a appliqué le 20 procede decrit en lien avec les figures 3B et 3C a l'image defocalisee de rechantillon, de fawn a obtenir une image de phase, representative de Ia structure de rechantillon. On a ensuite superpose l'image de fluorescence et l'image de phase. Ce mode operatoire a ete renouvele plusieurs fois, a intervalle regulier, sur une duree totale de 75 heures. Les figures 5A, 5B et 5C representent respectivement les images structurelles de rechantillon (images de phase), les 25 images de fluorescence de rechantillon ainsi que les superpositions image de fluorescence sur image structurelle. Le dispositif, par ('absence reglage des plans focaux entre deux acquisitions d'images selon des modalites differentes, est compact et peut etre aisement dispose a l'interieur d'un incubateur. II permet une observation d'un echantillon en disposant d'un champ d'observation important. 30 Ce champ d'observation peut par exemple s'etendre sur une surface de 4 mm2, ce qui permet une observation simultanee d'un grand nombre d'especes REVENDICATIONS1. Procede d'observation d'un echantillon fluorescent (10), s'etendant selon un plan (Pio), dit plan de rechantillon, rechantillon comportant un agent fluorescent (10f) apte a emettre une onde lumineuse de fluorescence (4f), dans une bande spectrale de fluorescence (4Xf), lorsqu'il est illumine par une onde lumineuse d'excitation (4e), dans une bande spectrale d'excitation (4Xe), le procede comportant les etapes suivantes : a) illumination de rechantillon (10) a l'aide dune premiere source de lumiere (11), selon une premiere bande spectrale d'illumination (AXI), la premiere bande spectrale d'illumination s'etendant dans la bande spectrale d'excitation (4Xe) et acquisition dune premiere image de rechantillon (11), dans la bande spectrale de fluorescence, a l'aide d'un capteur d'image (30) ; b) illumination de rechantillon (10) a l'aide dune deuxieme source de lumiere (12), selon une deuxième bande spectrale (4X2), en dehors de la bande spectrale de fluorescence, rechantillon s'etendant entre la deuxieme source de lumiere (12) et le capteur d'image (30), et acquisition dune deuxieme image de rechantillon (12), dans la deuxieme bande spectrale, a l'aide du capteur d'image (30); le capteur d'image (30) etant couple a un systeme optique (20), dispose entre le capteur d'image et rechantillon (10), le systeme optique (20) etant tel que : - dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), le plan focal objet du systeme optique (Pi) est confondu avec le plan de rechantillon (Pio); - dans la deuxieme bande spectrale (4X2), le plan focal objet du systeme optique (P2) est decale par rapport au plan de rechantillon (Pio), le decalage etant superieur a 20 p.m ; de telle sorte que : - la premiere image (11) est une image focalisee de rechantillon, representative dune fluorescence de rechantillon ; - la deuxieme image (12) est une image defocalisee de rechantillon, representative dune structure de rechantillon. 2. Procede selon la revendication 1, comportant une etape c) d'application d'un operateur de reconstruction (h) a partir de la deuxieme image (12), de fawn a obtenir une image reconstruite de rechantillon (As, Ms, (/),) dans un plan de reconstruction (Pz). 17 3. Procede Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel la deuxieme bande spectrale (4X2) et decalee, par rapport a la bande spectrale de fluorescence (4Xf), d'au moins 150 nm et de preference d'au moins 200 nm. 4. Procede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel le capteur 5 d'image (30), le systeme optique (20) et rechantillon (10) sont fixes entre ('acquisition de la premiere image (11) et ('acquisition de la deuxieme image (12). 5. Procede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel dans la deuxieme bande spectrale (4X2), le plan focal objet (P2) est decale dune distance inferieure a 1 mm du plan de rechantillon, et de preference dune distance inferieure a 500 p.m. 10 6. Procede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel : - la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant le capteur d'image (30) ; - ou la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant la deuxieme source de lumiere (12). 15 7. Procede selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans lequel les etapes a) et b) sont realisees successivement, l'etape a) etant realisee avant l'etape b) ou reciproquement. 8. Dispositif (1) d'observation d'un echantillon fluorescent (10), rechantillon etant apte a emettre une onde lumineuse (44 dans une bande spectrale de fluorescence (4Xf) lorsqu'il est illumine selon une bande spectrale d'excitation (4Xe), le dispositif comportant : 20 - une premiere source de lumiere (11), configuree pour emettre une onde lumineuse dans une premiere bande spectrale (AXI), s'etendant dans une bande spectrale d'excitation (4Xe) de rechantillon ; - une deuxieme source de lumiere (12) configuree pour emettre une onde lumineuse selon une deuxieme bande spectrale (4X2), en dehors de la bande spectrale de 25 fluorescence (4Xf) de rechantillon ; - un capteur d'image (30), optiquement couple a un systeme optique (20); - un support (10s), destine a recevoir rechantillon, de telle sorte que rechantillon s'etende selon un plan (P1o), dit plan d'echantillon, ce dernier s'etendant entre le systeme optique (20) la deuxieme source de lumiere (12) ; 30 - le systeme optique (20) definissant : 18 dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), un premier plan focal objet (Pi), confondu avec le plan de rechantillon (Pio); dans la deuxieme bande spectrale (4X2), un deuxieme plan focal objet (P2), distant du plan de rechantillon (P10), d'au moins 20 p.m ; 5 de telle sorte que le capteur d'image (30) est configure pour acquerir : - une image nette de rechantillon (11), dans la bande spectrale de fluorescence (4Xf), lorsque ce dernier est illumine par la premiere source de lumiere (11); - une image defocalisee de rechantillon (12), dans la deuxieme bande spectrale (4X2), lorsque rechantillon est illumine par la deuxieme source de lumiere (12). 10 9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel la distance entre le premier plan objet (Pi) et le deuxieme plan objet (P2) est inferieure a 1 mm, et de preference inferieure a 500 p.m. 10. Dispositif selon Tune quelconque des revendications 8 ou 9, comportant un processeur (32), apte a appliquer un operateur de reconstruction holographique (h) a une image acquise par le capteur d'image (20), de fawn a reconstruire une image representative de rechantillon (Az, Mz, 15 (Pz), dans un plan de reconstruction (13,) distant d'un plan de detection (P30) selon lequel s'etend le capteur d'image (30), et de preference dans le plan de rechantillon (P10). 11. Dispositif selon Tune quelconque des revendications 8 a 10, comportant un filtre (16), s'etendant entre rechantillon (10) et le capteur d'image (30), presentant une bande passante, dite de fluorescence correspondant a la bande spectrale de fluorescence (4Xf). 20 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel le filtre (16) presente une bande passante, distincte de la bande passante de fluorescence, correspondant a la deuxieme bande spectrale (4X2). 13. Dispositif selon la revendication 11 ou la revendication 12, dans lequel la bande passante de fluorescence du filtre (16) presente une largeur de bande inferieure a 100 nm. 25 14. Dispositif selon Tune quelconque des revendications 8 a 13, dans lequel : - la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant le capteur d'image (30) ; - ou la premiere source de lumiere (11) est disposee dans un demi-espace delimite par le plan de rechantillon (P1o) et comprenant la deuxieme source de lumiere (12). 30