FR 3067524 A1 20181214 FR 1755167 A 20170609 DISPOSITIF ET PROCEDE DE MICROSCOPIE MULTIPHOTONIQUE La présente invention concerne la microscopie multiphotonique. Art antérieur La microscopie multiphotonique permet d'imager les tissus biologiques à une certaine profondeur de façon non invasive avec une résolution tridimensionnelle micrométrique. Elle consiste à exciter des fluorochromes en un point focal donné avec plusieurs photons simultanément et à balayer la surface pour fabriquer une image 2D ou 3D de la réponse du tissu. La microscopie multiphotonique trouve un intérêt particulier en neurosciences. L'imagerie en profondeur d'un tissu biologique par une technique de microscopie multiphotonique est principalement limitée par trois paramètres : a) l'absorption de la lumière par le tissu et principalement par l'eau contenue dans ce dernier, b) la diffusion des photons dans le tissu, et c) la puissance du faisceau incident. Ces trois paramètres limitent en particulier la profondeur d'imagerie atteignable. Concernant le premier point, l'une des solutions pour limiter l'absorption est de choisir des longueurs d'ondes d'excitation dans les plages du spectre d'absorption présentant un coefficient d'absorption réduit. Comme cela est visible sur la figure 3 représentant le spectre d'absorption de l'eau, de manière globale, plus la longueur d'onde est élevée, plus le coefficient d'absorption de l'eau est élevé. En particulier, l'eau absorbe peu entre 700 nm et 1000 nm et présente des fenêtres autour de 1300 nm et 1700 nm dans lesquelles l'absorption est réduite. Concernant le deuxième point, la diffusion de la lumière diminue quand la longueur d'onde augmente. Concernant le dernier point, des lasers femtosecondes émettant des impulsions ultrabrèves de forte énergie sont utilisés. Il est ainsi connu d'imager les tissus biologiques par microscopie multiphotonique à l'aide d'un laser femtoseconde émettant des impulsions ultrabrèves à une longueur d'onde comprise entre 700 nm et 1100 nm. Cette longueur d'onde correspond à celle dans laquelle l'absorption de l'eau et des autres constituants des milieux biologiques est la plus faible. Cependant, la profondeur d'imagerie reste limitée par la diffusion de la lumière dans les tissus. 2 Il est également connu d'opérer avec un laser femtoseconde émettant des impulsions ultrabrèves à une longueur d'onde centrée sur 1300 nm ou 1700 nm, ce qui permet de gagner en profondeur. Les photochromes accessibles par ces techniques connues sont ceux qui sont 5 sensibles à une excitation à une longueur d'onde moitié de la longueur d'onde du faisceau incident, dans le cas de la microscopie à 2 photons, et/ou au tiers de la longueur d'onde du faisceau incident, dans le cas de la microscopie à 3 photons. Cela limite les possibilités d'imagerie à un choix limité de photochromes. Il existe donc un besoin pour perfectionner les procédés et dispositifs de 10 microscopie multiphotonique. Résumé L'invention répond à ce besoin à l'aide d'un dispositif comportant : - une source laser émettant un premier faisceau à une longueur d'onde centrale comprise entre 1010 nm et 1050 nm 15 - un générateur de supercontinuum spectral en aval de la source laser, générant un deuxième faisceau à une longueur d'onde centrale comprise entre 1670 nm et 1730 nm à partir d'une partie du premier faisceau, - un système d'amplification paramétrique optique en aval du générateur de supercontinuum spectral, générant un troisième faisceau à une longueur d'onde centrale 20 comprise entre 2545 nm et 2690 nm à partir d'au moins une partie du deuxième faisceau et d'une partie du premier faisceau, et - un générateur de seconde harmonique en aval du système d'amplification paramétrique optique, le générateur de seconde harmonique générant un quatrième faisceau à une longueur d'onde centrale comprise entre 1270 nm et 1345 nm à partir d'au moins une 25 partie du troisième faisceau. Un tel dispositif permet, à partir d'une unique source laser émettant un faisceau présentant une longueur d'onde centrale autour de 1030 nm, d'obtenir trois faisceaux présentant respectivement des longueurs d'onde centrales autour de 1030 nm, 1300 nm et 1700 nm. Le fait que les trois faisceaux soient obtenus à partir d'un seul faisceau garantit 30 qu'ils soient synchrones. Les longueurs d'onde Xi, X2 et X3 sont liées par la relation suivante : 3 1 1 1 Â1 Â3 2Â2 Par exemple si 4,4030 nm et X21303 nm alors X3,----4703 nm. Les longueurs d'ondes centrales obtenues se situent dans les fenêtres de moindre absorption de l'eau et sont peu diffusées par les tissus, en particulier pour les faisceaux de 5 longueur d'onde centrale les plus élevées, i.e. autour de 1300 nm et 1700 nm. Le système d'amplification paramétrique permet, à partir d'une pompe de longueur d'onde centrale autour de 1030 nm et d'une source de longueur d'onde centrale autour de 1700 nm, qui tombe dans une fenêtre de moindre absorption de l'eau, de générer une longueur d'onde complémentaire autour de 2600 nm, correspondant au double de 1300 10 nm, qui est aussi dans une fenêtre de moindre absorption de l'eau. Ainsi, il est tout à fait remarquable et inédit qu'un seul faisceau incident de longueur d'onde centrale autour de 1030 nm permette, de façon simple, de générer deux faisceaux de longueurs d'ondes centrales différentes tous deux dans des fenêtres de moindre absorption de l'eau. Les faisceaux peuvent être utilisés de manière dissociée ou combinée. Par 15 exemple deux ou trois des faisceaux sont combinés pour imager un tissu biologique en profondeur par microscopie multiphotonique. De par les longueurs d'ondes et faisceaux pouvant être utilisés, de nombreuses possibilités d'excitation des photochromes sont offertes. De préférence, le premier faisceau aune longueur d'onde centrale comprise entre 20 1020 nm et 1040 nm, mieux sensiblement égale à 1030 nm. De préférence, le deuxième faisceau a une longueur d'onde centrale comprise entre 1695 nm et 1710 nm, mieux sensiblement égale à 1703 nm. De préférence, le troisième faisceau a une longueur d'onde centrale comprise entre 2590 nm et 2620 nm, mieux sensiblement égale à 2606 nm. 25 De préférence, le quatrième faisceau a une longueur d'onde centrale comprise entre 1295 nm et 1310 nm, mieux sensiblement égale à 1303 nm. De préférence, le premier faisceau est composé de trains d'impulsions chacune d'une durée inférieure ou égale à 500 fs. Le fait que la durée de l'impulsion soit très faible permet au générateur de supercontinuum spectral de générer facilement le deuxième 30 faisceau. En effet, plus la durée des impulsions du premier faisceau est faible, plus le faisceau incident voit son spectre élargi par le générateur de supercontinuum spectral. 4 De préférence, la source laser est un laser fibre dopé Ytterbium, le premier faisceau présentant des trains d'impulsions de durée inférieure ou égale à 400 fs et présentant une énergie par impulsion supérieure à 40 1.1.1. Un tel laser permet d'obtenir facilement le deuxième faisceau avec le générateur de supercontinuum spectral et la puissance du laser 5 permet de disposer d'une puissance élevée pour l'amplification du deuxième faisceau dans le système d'amplification paramétrique optique. De préférence, le dispositif comporte un séparateur de faisceaux en amont du générateur de supercontinuum spectral pour séparer le premier faisceau en deux parties, la première partie du premier faisceau permettant de générer le deuxième faisceau. 10 Cette partie du premier faisceau utilisée pour la génération du deuxième faisceau présente une énergie par impulsion comprise de préférence entre 2 1.1J et 4 1.1J et/ou présente une puissance qui représente entre 5 % et 10 % de celle du premier faisceau. Par exemple, la première partie du premier faisceau représente 8% du faisceau initial. De préférence, le générateur de supercontinuum spectral est une matériaux 15 solide transparent, notamment du verre, des fibres ou des cristaux, ou mieux un cristal YAG (Grenat d'yttrium et d'aluminium). Un cristal YAG permet notamment d'avoir un trajet du faisceau en son sein qui est court, notamment de l'ordre du centimètre, ce qui facilite la réalisation d'un dispositif compact. De plus, le cristal YAG supporte mieux qu'une fibre un faisceau d'entrée de forte puissance, ce qui est préférentiellement le cas ici. 20 Le système d'amplification paramétrique optique peut comporter au moins un amplificateur paramétrique optique. De préférence, le système d'amplification paramétrique optique comporte au moins deux amplificateurs paramétriques optiques successifs, le premier amplificateur paramétrique optique amplifiant ladite au moins une partie du deuxième faisceau, à partir du 25 deuxième faisceau généré par le générateur de supercontinuum spectral et d'une partie du premier faisceau, et le deuxième amplificateur paramétrique optique générant le troisième faisceau à partir d'au moins une partie du deuxième faisceau amplifié par le premier amplificateur paramétrique optique et d'une partie du premier faisceau. Le deuxième amplificateur paramétrique optique présente alors en entrée une partie de premier faisceau 30 et un deuxième faisceau de forte puissance, ce qui lui permet de générer un deuxième faisceau et un troisième faisceau de forte puissance. Le fait d'utiliser deux amplificateurs paramétriques optiques permet d'avoir un bon rendement d'amplification, ce qui permet 5 d'avoir des premier, deuxième et troisième faisceaux en sortie qui présentent chacun une forte puissance. De préférence, le deuxième amplificateur paramétrique optique est d'une dimension axiale plus grande que le premier amplificateur paramétrique optique, la partie 5 du premier faisceau en entrée du deuxième amplificateur paramétrique optique étant d'une plus forte puissance que celle en entrée du premier amplificateur paramétrique optique. Ceci permet d'augmenter le rendement du système d'amplification paramétrique optique. De préférence, le dispositif comporte un séparateur de faisceaux en amont du système d'amplification paramétrique optique pour séparer la deuxième partie du premier 10 faisceau en deux parties, l'une de ces parties constituant la pompe du premier amplificateur paramétrique optique et l'autre de ces parties constituant la pompe du deuxième amplificateur paramétrique optique. Par exemple, les énergies sont réparties de la manière suivante, lorsque le premier faisceau présente une énergie par impulsion de 400, la pompe du premier amplificateur est de 40, ce qui représente environ 10 % du premier faisceau, et 15 la pompe du deuxième amplificateur est de 33 1.1J, ce qui représente environ 82 % du premier faisceau. De préférence, le dispositif comporte au moins un étireur en aval du générateur de supercontinuum spectral et en amont du système d'amplification paramétrique optique et au moins deux compresseurs en aval du système d'amplification paramétrique optique. De 20 préférence les compresseurs et étireurs sont constitués de verre ou de cristaux. Un cristal ou un verre permettent notamment d'avoir un trajet court du faisceau en leur sein, notamment de l'ordre du centimètre. Par exemple, l'étireur est en silicium. Le premier compresseur permet de comprimer le deuxième faisceau et est de préférence de dispersion de signe inverse à l'étireur. Le premier compresseur peut être en silice. Le deuxième compresseur permet de 25 comprimer le troisième faisceau et est, de préférence, de dispersion de même signe que l'étireur. Le deuxième compresseur est de préférence en amont du générateur de seconde harmonique. Le second compresseur peut être en silicium. La présence de l'étireur, du système d'amplification paramétrique optique et des compresseurs permet d'avoir une amplification à faible dérive de fréquence, et de diminuer les pertes et les trajets des 30 faisceaux. L'étireur permet un accord de la durée des impulsions du deuxième faisceau constituant le signal du système d'amplification paramétrique optique à celle de la partie du premier faisceau constituant la pompe du système d'amplification paramétrique optique et 6 les compresseurs permettent après le système d'amplification paramétrique optique de retrouver, pour le deuxième faisceau et le troisième faisceau, des faisceaux présentant des trains d'impulsions de forte énergie. De préférence, l'étireur permet d'avoir un deuxième faisceau présentant des 5 trains d'impulsions d'une durée comprise entre 200 fs et 400 fs pour être adapté à la durée du premier faisceau. De préférence, le dispositif comporte au moins un étireur en aval du générateur de supercontinuum spectral et en amont du système d'amplification paramétrique optique, un étireur entre les deux amplificateurs paramétriques optiques et au moins deux 10 compresseurs en aval du système d'amplification paramétrique optique, un compresseur pour le deuxième faisceau et un compresseur pour le troisième faisceau, de préférence en amont du générateur de seconde harmonique. De préférence, les compresseurs sont configurés pour compenser sensiblement le ou les étirements du ou des étireurs et obtenir des impulsions pour les second et troisième 15 faisceaux d'une durée après compression comprise entre 50 fs et 100 fs, de préférence sensiblement égale à 70 fs. Le ou les amplificateurs paramétriques optiques peuvent comporter un cristal non-linéaire ayant une susceptibilité non-linéaire d'ordre deux et permettant un accord de phase paramétrique entre les premier et second faisceaux, de préférence un cristal de PPLN 20 (Periodically Poled Lithium Niobate), de KTA (Potassium Titanyle Arsenate) ou de BBO (Beta Barium Borate), . Le générateur de seconde harmonique peut être un cristal non-linéaire ayant une susceptibilité non-linéaire d'ordre deux et permettant un accord de phase de doublement de fréquence du troisième faisceau, de préférence un cristal d'AGS (Silver Thiogallate) ou de 25 PPLN. Le dispositif peut comporter une ou plusieurs lignes à retard. De telles lignes à retard permettent d'ajuster les phases des différents faisceaux, et d'obtenir des impulsions synchrones dans le système d'amplification paramétrique optique et de facto en sortie. Une première ligne à retard peut être située sur le trajet en aval du premier amplificateur 30 paramétrique optique et permet d'accorder la longueur d'onde du second faisceau amplifié dans ledit amplificateur. Cette ligne à retard peut être situé sur le trajet du premier faisceau constituant la pompe ou du second faisceau constituant le signal, de préférence sur le premier 7 faisceau constituant la pompe. L'accordabilité entre la pompe et le signal est favorisée par l'utilisation de l'étireur qui étale temporellement les longueurs d'onde du deuxième faisceau. Une seconde ligne à retard peut être située sur le trajet en aval du second amplificateur paramétrique optique, et permet d'optimiser le rendement dudit amplificateur. 5 De préférence, la part du premier faisceau envoyée en sortie du dispositif présente une énergie par impulsion supérieure à 0,5 1.1J, par exemple sensiblement égale à 1,5 0. De préférence, le deuxième faisceau amplifié par le système d'amplification paramétrique optique présente des trains d'impulsions de durée comprise entre 50 fs et 100 10 fs et une énergie par impulsion supérieure à 1 1.1J, par exemple sensiblement égale à 2,5 0. De préférence, le quatrième faisceau présente des trains d'impulsions de durée comprise entre 50 fs et 100 fs et une énergie par impulsion supérieure à 0,2 1.1J, par exemple sensiblement égale à 0,4 0. Le dispositif peut comporter un ou plusieurs filtres permettant de séparer les 15 longueurs d'ondes non désirables des longueurs d'ondes voulues en entrée ou sortie de certains composants du dispositif Ces filtres sont avantageusement des miroirs dichroïques, qui permettent de laisser passer la lumière à certaines longueurs d'ondes et de réfléchir la lumière à d'autres longueurs d'ondes. Ces miroirs dichroïques peuvent être orientés à 450 du faisceau incident à filtrer. Le dispositif peut notamment comporter de tels filtres en sortie 20 des premier et deuxième amplificateurs paramétriques. L'invention a également pour objet un procédé d'imagerie par microscopie multiphotonique comportant l'étape consistant à exciter un ou plusieurs chromophores dans un tissu à partir d'au moins un faisceau, mieux d'une combinaison de faisceaux de longueur d'onde centrale entre 1010 nm et 1050 nm, entre 1270 nm et 1345 et/ou comprise entre 1670 25 nm et 1730 nm, obtenus en sortie d'un dispositif selon l'invention, tel que défini ci-dessus. Les trains d'impulsions des différents faisceaux sont émis dans le tissu de façon synchrone. Il est avantageux de combiner les faisceaux obtenus en sortie du dispositif Par exemple, un photochrome peut être excité par un photon à 1300 nm et un photon à 1700 nm 30 simultanément, équivalent à une excitation par un photon à 737 nm, ou par un photon à 1300 nm et deux photons à 1700 nm simultanément, équivalent à une excitation par un photon à 514 nm, ou par trois photons à 1700 nm, équivalent à une excitation par un photon à 567 8 nm. Ceci permet d'élargir le champ des photochromes accessibles par microscopie multiphotonique. De préférence, l'excitation du ou des photochromes se fait à partir d'une combinaison de deux faisceaux à une longueur d'onde centrale comprise pour l'un entre 5 1280 nm et 1320 et comprise pour l'autre entre 1650 nm et 1750 nm. En variante, l'excitation du ou des photochromes se fait à partir d'une combinaison de trois faisceaux à une longueur d'onde centrale comprise pour la première entre 1010 nm et 1050 nm, comprise pour la deuxième entre 1280 nm et 1320 et comprise pour la troisième entre 1650 nm et 1750 nm. 10 L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de celle-ci, et à l'examen du dessin annexé, sur lequel : - la figure 1 représente de façon schématique un dispositif selon l'invention, - la figure 2 illustre la notion de longueur d'onde centrale, et d'un faisceau 15 laser, - la figure 3 est un spectre d'absorption de l'eau en fonction de la longueur d'onde, - la figure 4A est une image d'un tissu obtenu par génération de troisième harmonique, et 20 - la figure 4B est une image du tissu de la figure 4A obtenue par microscopie à 3 photons. Dispositif Un exemple de dispositif 10 selon l'invention est représenté à la figure 1. Ce dispositif 10 comporte une source laser pulsée 12 émettant un faisceau 14 25 comportant des trains d'impulsions ultracourtes à une fréquence de répétition d'environ 1,25 MHz. Les impulsions présentent une longueur d'onde centrale ki autour de 1030 nm et une durée inférieure ou égale à 400 fs, de préférence comprise entre 250 fs et 400 fs, par exemple sensiblement égale à 350 fs. Comme cela est illustré sur la figure 2, la longueur d'onde centrale X, est définie 30 par la longueur d'onde pour laquelle le maximum de l'intensité spectrale de l'impulsion est atteint. Le faisceau 14 est séparé en deux faisceaux 16 et 18 par un séparateur 20, par exemple un miroir semi-transparent disposé à 450 du faisceau incident. 9 Le faisceau transmis 16 est envoyé dans un générateur de supercontinuum spectral 22 tel qu'un cristal YAG. Le générateur de supercontinuum spectral 22 délivre en sortie un faisceau 24 présentant des trains d'impulsions d'une durée inférieure ou égale à 100 fs, par exemple autour de 70 fs, et un spectre de longueur d'onde élargi s'étendant au 5 moins de 1030 nm à 1800 nm. Ce faisceau 24 traverse un étireur 26 de sorte que la durée des trains d'impulsions du faisceau étiré 29 soit d'une durée comprise entre 200 fs et 400 fs, étant par exemple sensiblement égale à 250 fs. Le faisceau 18 réfléchi par le séparateur 20 est à nouveau séparé en deux 10 faisceaux 28 et 30 par un séparateur 32, constitué par exemple par un miroir semi-transparent incliné à 450 du faisceau incident. Une ligne de retard 33 est placée sur le trajet du faisceau réfléchi 18 en amont du séparateur 32, étant réglée de telle sorte que le faisceau 28 réfléchi par le séparateur 32 et le faisceau étiré 29 soient sensiblement synchrones. 15 Les faisceaux 28 et 29 sont envoyés sur un miroir dichroïque 34 orienté à 450 du faisceau incident 29. Le miroir dichroïque 34 permet de filtrer en transmission le faisceau étiré 29 à une longueur d'onde centrale k2 autour de 1700 nm en un faisceau transmis 31 et de transmettre en réflexion le faisceau 28, de sorte à combiner ces deux faisceaux 28 et 31 en 20 un faisceau 36 en entrée d'un amplificateur paramétrique optique 38. Ainsi, ce faisceau 36 présente une composante pompe de longueur d'onde centrale Xi et une composante signal de longueur d'onde centrale X2. Les trains d'impulsions des deux composantes dans le faisceau 36 en entrée sont synchrones et les impulsions ont une durée semblable. 25 L'amplificateur paramétrique optique 38 génère en sortie un faisceau 40 comportant trois composantes : - une composante pompe de longueur d'onde centrale i, résidu du faisceau 28, - une composante signal de longueur d'onde centrale k2, et - une composante complémentaire de longueur d'onde centrale k3 autour de : 1 1 1 nm 1030 1700 30 soit sensiblement égale 2600 nm ± 10 nm. 10 Le faisceau 40 est débarrassé de ses composantes de longueurs d'ondes centrales Xi et X3 par des miroirs dichroïques successifs 42 et 44 pour former un faisceau 46 ne présentant qu'une seule composante de longueur d'onde centrale X.2 autour de 1700 nm. Le miroir 42 rejette par réflexion à 45° la composante Xi et transmet les 5 composantes X.2 et X.3. Le miroir 44 réfléchit la composante X.2 et transmet la composante X3 Le faisceau 46 réfléchi par le filtre 44 traverse un étireur 48 choisi pour que la durée des trains d'impulsions en sortie soit comprise entre 200 fs et 400 fs, par exemple sensiblement égale à 250 fs. Le faisceau étiré 49 en sortie de l'étireur 48 est envoyé sur un miroir dichroïque 10 58 puis dans un amplificateur paramétrique optique 54. Le miroir 58 est orienté à 45° du faisceau incident 49 et le transmet. Le faisceau 30 transmis par le séparateur 32 est à nouveau divisé par un séparateur 50 en deux faisceaux 52 et 53. Seul le faisceau réfléchi 52 est conservé pour être envoyé sur le miroir dichroïque 58 puis dans un amplificateur paramétrique optique 54. Le 15 séparateur 50 permet de diminuer la puissance du faisceau 52. Comme cela est illustré, une ligne à retard 56 est placée sur le trajet du faisceau 30 vers le séparateur 50, étant réglée de telle sorte que les faisceaux 52 et le faisceau 49 soient sensiblement synchrones à l'entrée de l'amplificateur paramétrique optique 54. Le miroir dichroïque 58 permet de combiner le faisceau étiré 49 et le faisceau 52 20 au sein d'un faisceau 60 à l'entrée de l'amplificateur 54. Ce faisceau 60 présentant donc une pompe de longueur d'onde centrale Xi et une composante signal de longueur d'onde centrale X3. Les trains d'impulsions des deux composantes de longueur d'onde Xi et X2 dans le faisceau 60 sont synchrones et les impulsions ont une durée semblable. L'amplificateur paramétrique optique 54 génère en sortie un faisceau 62 25 comportant trois composantes : - une pompe de longueur d'onde centrale Xi, résidu du faisceau 28, - une composante signal de longueur d'onde centrale X.2, et - une composante complémentaire de longueur d'onde centrale X.3. Les amplificateurs paramétriques optiques 38 et 54 et l'étireur 48, ainsi que les 30 miroirs dichroïques 42, 44, 50 et 58 et la ligne de retard 56 peuvent faire partie d'un système d'amplification paramétrique 37 intégré. 11 Les trois composantes du faisceau 62 en sortie de l'amplificateur paramétrique optique 54 sont séparées par des miroirs dichroïques 64 et 66 en trois faisceaux 68, 70 et 72 présentant des longueurs d'ondes centrales Xi, k2 et k3 respectives. Le miroir 64 est placé à 450 du faisceau incident 62, transmet la composante k3 5 et réfléchit les composantes Xi et k2 Le miroir 66 est placé à 450 du faisceau incident réfléchi par le miroir 64, transmet la composante ki et réfléchit la composante X,2 Le faisceau réfléchi 70, de longueur d'onde centrale k2, est comprimé par un compresseur 74 de sorte à compenser les effets sur le faisceau 70 des étirements effectués par les étireurs 26 et 48. 10 Le faisceau transmis 72, de longueur d'onde centrale X3, est envoyé sur un compresseur 76 de sorte à compenser les effets sur le faisceau 72 des étirements effectués par les étireurs 26 et 48 puis sur un générateur de seconde harmonique 78. Ce dernier génère un faisceau 80 présentant deux composantes, à savoir une composante présentant une longueur d'onde centrale X3, résidu du faisceau 72 comprimé, et une composante présentant 15 une longueur d'onde centrale X4 moitié de X3, c'est-à-dire autour de 1300 nm. Le faisceau 80 est filtré de sa composante de longueur d'onde centrale k3 par un miroir dichroïque 82 placé à 450 du faisceau incident 80 et le faisceau transmis 86 ne présente que la composante de longueur d'onde centrale kLi. Ainsi le dispositif 10 permet d'obtenir, à partir d'un unique faisceau 14 20 présentant une longueur d'onde centrale ki autour de 1030 nm, trois faisceaux 68, 84 et 86 présentant des longueurs d'ondes centrales i,k2 et kLi respectivement autour de 1030 nm, 1700 nm et 1300 nm, les trois faisceaux obtenus ayant des impulsions synchrones de fréquence de répétition de l'ordre de 1,25 MHz. Dans un exemple de mise en oeuvre, on réalise un prototype en utilisant comme 25 source laser 12 une source laser fibrée dopée à l'Ytterbium présentant des trains d'impulsions d'énergie supérieure ou égale à 400 constituée par un laser industriel de type Satsumae de la société Amplitudes Systeme. Le générateur de supercontinuum spectral 22 est un cristal YAG. Les étireurs 26 et 38 sont des cristaux de silicium d'épaisseurs respectives 30 d'environ 1 mm et 2 mm, ou 2 mm et 1 mm. Les amplificateurs paramétriques optiques 38 et 54 peuvent comporter chacun un cristal de PPLN. De préférence, l'amplificateur paramétrique optique 54 est d'une plus 12 grande épaisseur que l'amplificateur paramétrique optique 38 pour permettre un meilleur rendement. Par exemple, l'amplificateur paramétrique optique 38 est un cristal de PPLN d'épaisseur sensiblement égale à 1 mm et l'amplificateur paramétrique optique 54 est un cristal de PPLN d'épaisseur sensiblement égale à 3 mm. 5 Le compresseur 74 est une plaque de verre d'épaisseur d'environ 75 mm. Le compresseur 78 est un cristal de silicium d'épaisseur d'environ 5 mm. Le générateur de seconde harmonique 78 est un cristal d'AGS ou de PPLN. Les lignes à retard 33 et 56, les séparateurs de faisceaux 20, 32 et 50, et les miroirs dichroïques 34, 42, 44, 58, 64, 66 et 82 sont de type classique et connus. 10 Dans un tel prototype, la puissance du faisceau 16 correspond à entre 5% et 10% celle du faisceau 14, celle du faisceau 28 correspond à entre 5% et 30% celle du faisceau 14 et celle du faisceau 52 correspond à entre 60% et 90% celle du faisceau 14. Avec un tel dispositif, la puissance du faisceau 68 obtenu correspond à entre 2% et 20% celle du faisceau 14, le faisceau 84 présente des trains d'impulsions d'une durée 15 d'environ 65 fs et d'énergie supérieure à 1 nJ et le faisceau 86 présente des trains d'impulsions d'une durée d'environ 85 fs et d'énergie égale à environ 0,1 n.J. Procédé de microscopie multiphotonique Les faisceaux 68, 84 et/ou 86 générés par le dispositif décrit précédemment en relation avec la figure 1 peuvent être combinés pour former un faisceau présentant des 20 composantes de longueurs d'ondes centrales i,k2 et X4. Le faisceau formé peut être utilisé dans un microscope multiphotonique. Avant la combinaison des différents faisceaux 68, 84 et/ou 86, ces derniers peuvent chacun passer ou non par une ligne à retard permettant d'ajuster finement la synchronisation des faisceaux dans le cas où ils ne seraient pas totalement synchrones au 25 niveau de l'échantillon. Ceci peut permettre de compenser les différents chemins optiques de chacun de ces faisceaux entre la source et le microscope. Comme cela est illustré sur la figure 3, les longueurs d'ondes i,k2 et k4 se situent dans les fenêtres de moindre absorption de l'eau, et présentent une bonne pénétration dans les tissus, ce qui permet d'exciter les fluorochromes en profondeur. 30 Cette excitation peut se faire avec un ou plusieurs photons simultanés d'une même longueur d'onde ou de différentes longueurs d'ondes. 13 Par exemple, dans le cas où l'excitation est effectuée par deux photons simultanés de longueur d'ondes X, et 4, l'excitation est équivalente à celle de deux photons de même longueur d'onde : 2 1 1nm Vi 5 Par exemple, dans le cas où l'excitation est effectuée par trois photons simultanés de longueur d'ondes X, et xj, c'est-à-dire dont au moins deux photons sont de même longueur d'onde, l'excitation est équivalente à celle de trois photons de même longueur d'onde longueur d'onde : 3 2 1nm 10 Ou 3 1 2nm A titre d'exemple, différentes combinaisons d'excitation avec deux photons de longueurs d'ondes Xi, k2 ou k4 ou trois photons de longueur d'onde i,k4 ou k2 sont réalisées dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous. On a indiqué à chaque fois la longueur d'onde 15 équivalente. Tableau 1 : excitation deux photons à une ou deux couleurs parmi ki=1030, k4=1300, k2=1700 nm. Photon 1, 1030, 1030, 1300, 1300, 1300, 1700, photon 2 (nm) 1030 1300 1700 1300 1700 1700 Photon équivalent pour une excitation à 2 photons (nm) 1030 1149 1283 1300 1473 1700 Photon équivalent pour une excitation à 1 photon (nm) 515 574 641 650 736 850 20 14 Tableau 2 : excitation trois photons à deux couleurs (X1=1030nm, k4=1700nm). Photon 1, photon 2, 1030, 1030, 1030, 1700, photon 3 (nm) 1030, 1030, 1700, 1700, 1030 1700 1700 1700 Photon équivalent pour une excitation à 3 photons (nm) 1030 1186 1397 1700 Photon équivalent pour une excitation à 1 photon (nm) 343 395 466 567 Tableau 3 : excitation trois photons à deux couleurs (X4=1300nm, X.2=1700nm). Photon 1, photon 2, 1300, 1300, 1300, 1700, photon 3 (nm) 1300, 1300, 1700, 1700, 1300 1700 1700 1700 Photon équivalent pour une excitation à 3 photons (nm) 1300 1411 1542 1700 Photon équivalent pour une excitation à 1 photon (nm) 433 470 514 567 5 Des mêmes tableaux peuvent être effectués pour une excitation avec quatre photons et ainsi de suite. Le nombre de longueurs d'ondes équivalentes atteignable est bien plus grand dans le cadre de l'invention que dans le cadre d'une excitation avec plusieurs photons simultanés de même longueur d'onde. 10 Ces longueurs d'ondes équivalentes vont dans l'invention du visible à l'infrarouge. La microscopie multiphotonique telle que décrite ci-dessus permet donc d'exciter une plus grande diversité de photochromes émettant du visible à l'infrarouge et d'obtenir des images de tissus avec de multiples contrastes en fonction des photochromes 15 excités. Un exemple d'utilisation des faisceaux obtenus pour réaliser une microscopie multicouleur est décrit ci-dessous. 15 Exemple Des faisceaux de longueurs d'ondes centrales X2, sensiblement égale à 1700 nm, et X4, sensiblement égale à 1300 nm, sont obtenus simultanément à l'aide du dispositif tel que décrit en relation avec la figure 1. 5 Ces faisceaux sont envoyés simultanément sur un échantillon de moelle épinière embryonnaire de poulet marquée en fluorescence. Plusieurs images sont obtenues simultanément. Les photons de longueur d'onde X4 permettent de générer une première image, illustré sur la figure 4A, obtenue par génération de troisième harmonique permettant une 10 visualisation de la morphologie du tissu sans fluorescence. Les photons de longueur d'onde X4 permettent également de générer une deuxième image obtenue par microscopie à 3 photons, dans laquelle les fluorochromes excités réémettent dans le vert. Les photons de longueur d'onde X2 permettent de générer une troisième image 15 obtenue par microscopie à 3 photons, dans laquelle les fluorochromes excités réémettent dans le rouge. Les deuxième et troisième images sont combinées sur la figure 4B pour former une seule image en deux couleurs. Le dispositif selon l'invention permet donc de générer des faisceaux de 20 différentes longueurs d'ondes pouvant être utilisés ensemble pour réaliser de l'imagerie multiphotonique. Il est alors possible d'obtenir REVENDICATIONS1. Dispositif (10) comportant : - une source laser (12) émettant un premier faisceau (14) à une longueur d'onde centrale X1 comprise entre 1010 nm et 1050 nm, - un générateur de supercontinuum spectral (22) en aval de la source laser (12), générant un deuxième faisceau (31) à une longueur d'onde centrale 21,2 comprise entre 1670 nm et 1730 nm à partir d'une partie (16) du premier faisceau (14), - un système d'amplification paramétrique optique (37) en aval du générateur de supercontinuum spectral (22), générant un troisième faisceau (72) à une longueur d'onde centrale X3 comprise entre 2540 nm et 2690 nm à partir d'au moins une partie du deuxième faisceau (31) et d'une partie (28) du premier faisceau (14), et - un générateur de seconde harmonique (78) en aval du système d'amplification paramétrique optique (37), le générateur de seconde harmonique (78) générant un quatrième faisceau (86) à une longueur d'onde centrale X4 comprise entre 1270 nm et 1345 nm à partir d'au moins une partie du troisième faisceau (72). 2. Dispositif selon la revendication 1, le premier faisceau (14) ayant une longueur d'onde centrale X1 comprise entre 1020 nm et 1040 nm, mieux sensiblement égale à 1030 nm. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, le deuxième faisceau (31) ayant une longueur d'onde centrale 21,2 comprise entre 1695 nm et 1710 nm, mieux sensiblement égale à 1703 nm. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le troisième faisceau (72) ayant une longueur d'onde centrale X3 comprise entre 2590 nm et 2620 nm, mieux sensiblement égale à 2606 nm. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le quatrième faisceau (86) ayant une longueur d'onde centrale k4 comprise entre 1295 nm et 1310 nm, mieux sensiblement égale à 1303 nm. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le premier faisceau (14) étant composé de trains d'impulsions de durée inférieure ou égale à 500 fs. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, la source laser (12) étant un laser fibre dopé Ytterbium, le premier faisceau (14) présentant des 17 impulsions de durée inférieure ou égale à 400 fs et présentant une énergie par impulsion supérieure à 40 0. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le générateur de supercontinuum spectral (22) étant une fibre à effet non-linéaire ou mieux un 5 cristal YAG. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'amplification paramétrique optique (37) comportant au moins un amplificateur paramétrique optique (38). 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système 10 d'amplification paramétrique optique (37) comportant au moins deux amplificateurs paramétriques optiques (38, 54) successifs, le premier amplificateur paramétrique optique (38) amplifiant ladite au moins une partie du deuxième faisceau, à partir du deuxième faisceau (31) généré par le générateur de supercontinuum spectral (22) et d'une partie du premier faisceau (28), et le deuxième amplificateur paramétrique optique (54) générant le 15 troisième faisceau (72) à partir d'au moins une partie du deuxième faisceau (49) amplifié par le premier amplificateur paramétrique optique (38) et d'une partie du premier faisceau (52). 11. Dispositif selon la revendication précédente, le deuxième amplificateur paramétrique optique (54) étant d'une dimension axiale plus grande que le premier 20 amplificateur paramétrique optique (38), la partie du premier faisceau (52) en entrée du deuxième amplificateur paramétrique optique (54) étant d'une plus forte puissance que celle en entrée du premier amplificateur paramétrique optique (38). 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant au moins un étireur (26) en aval du générateur de supercontinuum spectral (22) et en amont 25 du système d'amplification paramétrique optique (37) et au moins deux compresseurs (74, 76) en aval du système d'amplification paramétrique optique (37), un premier compresseur (74) pour comprimer le deuxième faisceau (70) et un deuxième compresseur (76) pour comprimer le troisième faisceau (72), le deuxième compresseur (76) étant de préférence en amont du générateur de seconde harmonique (78). 30 13. Dispositif selon la revendication 10 ou 11, comportant au moins un étireur (26) en aval du générateur de supercontinuum spectral (22) et en amont du système d'amplification paramétrique optique (37), un étireur (48) entre les deux amplificateurs 18 paramétriques optiques (38, 54) et au moins deux compresseurs (74, 76) en aval du système d'amplification paramétrique optique (37), un compresseur (74) pour le deuxième faisceau (70) et un compresseur (76) pour le troisième faisceau (72), de préférence en amont du générateur de seconde harmonique (78). 5 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et 13, le ou les amplificateurs paramétriques optiques (38, 54) comportant un cristal non-linéaire ayant une successibilité non-linéaire d'ordre deux et permettant un accord de phase paramétrique entre les premier et second faisceaux, notamment un cristal de PPLN (Periodically Poled Lithium Niobate), de KTA (Potassium Titanyle Arsenate) ou de BBO (Beta Barium Borate). 10 15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le générateur de seconde harmonique (78) étant un cristal non-linéaire ayant une successibilité non-linéaire d'ordre deux et permettant un accord de phase de doublement de fréquence du troisième faisceau, notamment un cristal d' AGS (Silver Thiogallate) ou de PPLN.. 16. Procédé d'imagerie par microscopie multiphotonique comportant l'étape 15 consistant à exciter un ou plusieurs chromophores dans un tissu à partir d'un ou mieux d'une combinaison de faisceaux de longueur d'onde centrale entre 1010 nm et 1050 nm, entre 1280 nm et 1345 et/ou entre 1670 nm et 1730 nm, obtenus en sortie du dispositif (10) selon l'une quelconque des revendications précédentes. 17. Procédé selon la revendication précédente, l'excitation du ou des 20 chromophores se faisant à partir d'une combinaison de deux faisceaux à une longueur d'onde centrale comprise pour l'un entre 1280 nm et 1345 nm et comprise pour l'autre entre 1670 nm et 1730 nm. 18. Procédé selon la revendication précédente, l'excitation du ou des chromophores se faisant à partir d'une combinaison de deux faisceaux à une longueur d'onde 25 centrale comprise pour la première entre 1010 nm et 1050 nm, comprise pour la deuxième entre 1270 nm et 1345 nm et comprise pour la troisième entre 1670 nm et 1730 nm.