FR 3069927 A1 20190208 FR 1757554 A 20170804 La présente invention concerne le domaine de la recherche, de la bioanalyse et du diagnostic in vitro. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro de substances d'intérêt biologique ou chimique, par exemple de biomarqueurs, d'anticorps, d'ADN, d'ARN et autres composés, dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par détection de l'émission de luminescence par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes à propriétés optiques et physico-chimiques contrôlées. La détection et/ou la quantification des concentrations de biomarqueurs, d'anticorps ou d'ADN et d'ARN dans des échantillons biologiques (sang, sérum, salive, urine, liquide cérébro-spinal, etc.) sont indispensables pour le diagnostic médical. Dans le domaine de la recherche, des diagnostics in vitro ou ex vivo, de l'analyse médicale et de la bioanalyse, un certain nombre de méthodes ont été proposées pour détecter et/ou doser la présence de substances spécifiques. Ces méthodes reposent, d'une manière générale, sur l'utilisation d'une sonde mise en oeuvre pour détecter et/ou quantifier une concentration en solution. Ces sondes sont couplées à un composé de reconnaissance, ou agent de ciblage, permettant de se fixer à l'espèce moléculaire à analyser. Ce composé de reconnaissance peut être une molécule, ADN, aptamère, protéine ou anticorps. Ensuite, les sondes qui se sont fixées sur l'espèce moléculaire à analyser grâce au composé de reconnaissance peuvent être détectées au moyen d'une ou plusieurs méthodes basées par exemple sur leur luminescence, leur absorbance, leur réactivité chimique, leur radioactivité, etc. Les essais biochimiques les plus couramment mis en oeuvre sont des essais d'immuno-absorption enzymatique (en langue anglaise « Enzyme-Linked Immuno Assay » ou ELISA), qui reposent généralement sur l'utilisation de la peroxydase de raifort comme enzyme pour provoquer une réaction avec un substrat et quantifier la réaction chimique ayant lieu par mesure de l'absorbance du produit de la réaction dans la solution. Le choix du composé de reconnaissance moléculaire auquel la sonde est couplée est déterminant pour l'efficacité de ces sondes. Plus précisément, l'efficacité de ces méthodes dépend de l'affinité spécifique du composé de reconnaissance avec la substance cible. A titre d'exemples, les publications référencées [1] et [2] détaillent les caractéristiques de ces mécanismes. 2 Les sondes luminescentes mènent généralement à une détection plus sensible que les sondes détectées par leur absorbance car, dans le premier cas, les mesures de l'intensité lumineuse se font sur fond noir, tandis que, dans le deuxième, il s'agit de mesurer une variation de l'intensité lumineuse (mesures sur fond clair). 5 Parmi les autres méthodes de dosage proposées à l'heure actuelle, on peut également citer le dosage par électrochimiluminescence (ECLIA), le dosage immunologique par fluorescence (FIA) et le dosage radio-immunologique (RIA). Ces méthodes présentent toutefois divers inconvénients qui limitent leur sensibilité finale de détection, en particulier des limitations en termes de propriétés de 10 luminescence des sondes mises en oeuvre (ECLIA, FIA), des risques pour la sécurité, un équipement coûteux et la nécessité d'utilisateurs spécialisés (pas de machines automatisées) pour conduire des essais de type RIA. En particulier, les sondes luminescentes actuellement disponibles présentent plusieurs désavantages qui ne permettent pas d'exploiter pleinement leur potentiel en tant 15 que sondes de diagnostic. Parmi ces inconvénients, on peut citer par exemple le phénomène de photoblanchiment dans le cas de fluorophores organiques qui, suite à des modifications structurales irréversibles induites par l'illumination, se traduit par une disparition de la fluorescence, ou encore le phénomène de clignotement de l'émission pour les nanocristaux de semi-conducteurs, ou « quantum dots », les sondes cessant alors 20 périodiquement d'émettre et étant par conséquent inadaptées pour produire un signal constant. D'autres inconvénients résultent par exemple de la largeur du spectre d'émission des sondes luminescentes. De fait, un spectre d'émission trop large rend difficile le filtrage du signal de fond éventuellement présent, et a une incidence sur la qualité du signal et, en particulier, sur le rapport signal à bruit. Il convient également de prendre en compte, en 25 plus des facteurs optiques qui contribuent à l'efficacité de la sonde dans un test biologique, le caractère pratique et la facilité d'utilisation de la sonde. Ainsi, certaines particules, comme c'est le cas des nanocristaux de semi-conducteurs, perdent leurs caractéristiques de luminescence après congélation, ce qui représente un inconvénient pour le stockage des agents bio-conjugués. La facilité de couplage des sondes au composé moléculaire 30 permettant de cibler les molécules souhaitées est également un aspect à prendre en considération pour le choix de la sonde adéquate. Ainsi, un certain nombre de particules, dont les nanocristaux de semi-conducteurs, sont synthétisées dans des solvants organiques. 3 Il en découle qu'une utilisation pour des applications biologiques nécessite des étapes supplémentaires de préparation de la surface pour réaliser une dispersion dans l'eau de ces particules, processus qui peut être complexe à mettre en oeuvre et être peu stable dans le temps [3]. 5 Par ailleurs, les propriétés colloïdales des particules/sondes sont déterminantes pour la conduite des essais biologiques. De fait, des solutions de bonne stabilité colloïdale sont à même de fournir des milieux de bonne homogénéité pour les essais, et donc une meilleure reproductibilité au niveau des résultats de ces essais. Enfin, la complexité et le coût sont des aspects importants dans le choix des 10 sondes pour le diagnostic. Par exemple, des nanoparticules d'or, et leurs propriétés en termes de résonance plasmonique de surface, ont été proposées comme sondes de diagnostic, mais n'ont pas percé comme sondes pour le diagnostic in vitro, possiblement à cause de la complexité de la méthode de détection [4], ou éventuellement d'un coût élevé. Quant aux cristaux de semi-conducteurs, ils sont synthétisés dans des solvants organiques 15 et requièrent des procédures de dispersion en milieu aqueux, ce qui rend leur synthèse complexe et donc coûteuse. Leur fonctionnalisation avec des groupements chimiques, permettant le couplage aux composés moléculaires de reconnaissance des molécules cibles, repose en outre sur des liaisons chimiques faibles, ce qui limite par conséquent leur stabilité et est préjudiciable pour la reproductibilité des tests de détection. 20 D'autre part, les méthodes de détection in vitro actuellement disponibles ne donnent pas entière satisfaction, notamment en termes de sensibilité de détection pouvant être atteinte, afin d'élargir le champ d'application des méthodes de diagnostic in vitro, par exemple en permettant une détection plus précoce des maladies ou en permettant un 25 diagnostic sur l'évolution d'une maladie ou sur l'effet d'un traitement thérapeutique. Pour améliorer la sensibilité de détection, deux techniques commerciales d'immuno-essais ultrasensibles ont été développées. Il s'agit des méthodes développées par Quanterix et Singulex. Elles reposent sur l'utilisation de billes magnétiques 30 fonctionnalisées comme surfaces réactives pour la capture des molécules cibles. La technologie de Quanterix procède ensuite à la capture des billes individuelles fonctionnalisées avec des anticorps dirigés contre les antigènes. Chaque bille est piégée 4 dans un puit et leur analyse est faite par un test standard ELISA. Quant à Singulex, il utilise les billes pour concentrer les analytes piégés et détermine ensuite leur concentration par comptage des signaux fluorescents à l'aide d'un dispositif de détection confocale et avec un laser d'excitation qui balaie l'échantillon de manière hélicoïdale. 5 Ces deux techniques, bien qu'elles permettent d'atteindre des performances en termes de sensibilité de détection plus élevées que les technologies conventionnelles de détection discutées précédemment, sont toutefois hautement complexes et coûteuses. Elles nécessitent l'utilisation d'un appareillage spécifiquement dédié à ces techniques de détection, et non compatible avec les dispositifs actuels de diagnostic in vitro automatisés. 10 Les nanocristaux de semi-conducteurs ou « quantum dots » ont également été proposés dans des tests de détection ultrasensibles ([5], [6], [7], [8] et [9]). Toutefois, l'efficacité de ces tests est limitée par les inconvénients liés à ce type de sondes luminescentes, comme discuté précédemment : complexité et coût élevé de leur synthèse et fonctionnalisation, stabilité colloïdale non satisfaisante, pertes des propriétés de 15 luminescence après congélation. Enfin, les méthodes basées sur l'utilisation de nanoparticules d'or en exploitant des phénomènes comme la détection des plasmons de surface, le quenching de fluorescence, le dépôt d'argent sur les nanoparticules d'or etc. ([9] à [13]) permettent d'atteindre des sensibilités de détection élevées mais sont généralement hautement 20 complexes. Il demeure par conséquent un besoin de développer une méthode de détection/quantification permettant d'atteindre des performances en termes de sensibilité de détection plus élevées que les technologies conventionnelles, de type ELISA, ECLIA, 25 FIA ou RIA, et ne présentant pas les inconvénients, notamment en termes de complexité et de coût, des méthodes ultrasensibles déjà proposées. La présente invention vise précisément à proposer une nouvelle méthode de détection ultrasensible, reposant sur l'utilisation de nanoparticules luminescentes dopées par des ions de terres rares aux propriétés optiques et physico-chimiques contrôlées. 30 Ainsi, l'invention concerne, selon un premier de ses aspects, un procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par détection de 5 l'émission de luminescence par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes suivantes : (i) mise en oeuvre de particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une nanoparticule inorganique photoluminescente formée d'une matrice cristalline présentant 5 au moins 103 ions de terres rares, et couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser, dans des conditions propices à leur association avec la substance à analyser de l'échantillon, lesdites nanoparticules présentant une taille moyenne comprise entre 20 et 100 nm, et étant aptes à émettre de la luminescence après absorption d'un photon ; 10 (ii) excitation des ions de terres rares des particules associées avec la substance à analyser par un dispositif d'illumination, en particulier de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW, de préférence d'au moins 500 mW et d'une intensité d'excitation d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/cm2 ; (iii) détection de l'émission de luminescence par les particules, et 15 (iv) détermination de la présence et/ou concentration de la substance par interprétation de ladite mesure de luminescence, le cas échéant par référence à un étalon ou étalonnage. Au sens de l'invention, l'« analyse » de la substance dans un échantillon couvre l'aspect détection ou encore caractérisation qualitative de la présence ou non de 20 ladite substance, et également l'aspect dosage ou encore caractérisation quantitative de ladite substance. L'échantillon peut être un échantillon biologique, en particulier un échantillon de prélèvement humain, par exemple choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, la salive, l'urine et le liquide cérébro-spinal. 25 Il peut encore s'agir d'une solution contenant des molécules biologiques. Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre pour la détection et/ou la quantification de biomarqueurs, d'anticorps, d'ADN et/ou d'ARN dans un échantillon biologique. 30 La méthode ultrasensible selon l'invention s'avère avantageuse à plusieurs titres. 6 Tout d'abord, comme illustré dans les exemples, la méthode de l'invention permet d'atteindre une performance en termes de sensibilité de détection hautement plus élevée que les performances des techniques de détection conventionnelles de type ELISA, ECLIA, FIA ou RIA. 5 De manière avantageuse, la méthode ultrasensible de l'invention permet ainsi une détection au moins dix fois, en particulier au moins 100 fois, plus sensible que la méthode d'immuno-détection enzymatique de type ELISA utilisant les mêmes anticorps de reconnaissance et de ciblage. La méthode ultrasensible selon l'invention permet ainsi une détection et/ou une 10 quantification d'une substance d'intérêt présente dans un échantillon en une teneur strictement inférieure à 10 pM, voire même inférieure à 1 pM, voire encore inférieure à 0,1 pM, voire encore à 0,01 pm (10 fM). Ces concentrations dépendent de la molécule cible et, en particulier, de l'affinité du composé de reconnaissance, ou composé de ciblage, couplé à la sonde, mais sont comparables à celles détectables par les méthodes ultra-sensibles 15 (Quanterix ou Singulex). D'autre part, la méthode de l'invention repose sur la mise en oeuvre de nanoparticules dopées par des ions de terres rares, par exemple des nanoparticules de formule (Ai,Lnx)a(MpOq) (I) telles que définies plus précisément dans la suite du texte, telles que des nanoparticules de type YV04 :Eu ou GdVO4 :Eu, YAG :Ce, qui présentent, à 20 titre de sondes luminescentes, des propriétés particulièrement avantageuses. Des nanoparticules à base de vanadate d'yttrium dopé par des terres rares ont par exemple été décrites de façon détaillée [14] et [15]. Ces nanoparticules sont particulièrement avantageuses au regard de leur excellente photostabilité, qui autorise l'acquisition d'un signal constant et prolongé, et une 25 absence de phénomène de clignotement de l'émission. De plus, elles présentent un spectre d'émission étroit et un grand décalage de Stokes (de l'ordre de 350 nm pour les nanoparticules dopées à l'Eu) de l'émission. Ces nanoparticules contiennent également plusieurs dizaines de milliers d'ions pouvant être excités et responsables de la luminescence. L'augmentation de l'intensité d'excitation induit ainsi une augmentation de 30 la luminosité des particules, la saturation de l'émission n'étant atteinte que pour des intensités impraticables. Enfin, ces nanoparticules ne perdent pas leur luminescence après congélation. 7 Les nanoparticules photoluminescentes à base de terres rares ont déjà été proposées à titre de sondes luminescentes dans diverses applications [16]. Par exemple, Dosev et al. [17] tirent profit des propriétés de luminescence de nanoparticules luminescentes de Eu :Gd203 par excitation de la matrice Gd203, pour la 5 détection de microstructures de protéines déposées sur un substrat. Quant à Yi et al. [18], ils utilisent des phosphores à conversion ascendante (« up-conversion ») de photons de nature NaYF4:Yb,Er, qui absorbent deux photons proche-IR pour l'émission d'un photon dans le visible. Des nanoparticules photoluminescentes à base de terres rares ont également 10 déjà été mises en oeuvre pour la détection de particules uniques ainsi que pour le suivi de molécules uniques, en tirant profit de l'absence de clignotement pour la détection de particules uniques, par rapport aux nanoparticules de semiconducteurs ou Quantum Dots ([19] et [20]). Toutefois, il n'était nullement prévisible que ces nanoparticules à base d'ions lanthanides puissent être utilisées pour la détection et la quantification ultra-sensible 15 de biomolécules, dans le cas d'une détection d'ensemble de biomolécules. En effet, en dehors de l'absence de clignotement, les propriétés de luminescence des nanoparticules luminescentes à base de terres rares sont considérées comme inférieures à celles des Quantum Dots. Dans ces particules, en particulier celles constituées d'une matrice d'oxyde métallique où certains ions sont substitués par des ions de terres rares, l'excitation de la 20 luminescence peut se faire soit par excitation de la matrice suivie d'un transfert de l'énergie vers les ions de terres rares luminescents, soit par excitation directe dans le visible des ions de terres rares luminescents. Concernant l'excitation de la matrice, sa bande d'absorption se situe en général dans l'UV ce qui présente deux inconvénients : peu de lasers sont disponibles actuellement à ces longueurs d'onde et les lasers existants sont 25 volumineux et onéreux ; et, à ces longueurs d'onde l'absorption, les biomolécules absorbent et émettent fortement, ce qui peut produire des signaux parasites. Concernant l'excitation directe des ions de terres rares, le coefficient d'extinction pour une nanoparticule est plus faible que celui des Quantum Dots mais peut être comparable à celui d'un fluorophore organique efficace [16]. De plus, les pics d'absorption directe des ions de 30 terres rares dans le visible sont en général très étroits spectralement, ce qui impose l'utilisation d'un laser étroit spectralement pour une excitation efficace directe des ions terres rares luminescents. Ce type de laser, en particulier sous forme de diode laser 8 compacte et peu onéreuse, n'était pas disponible pour les longueurs d'onde concernées pour l'excitation directe des ions de terres rares luminescents, jusqu'à très récemment. Yuan et al. [21], dans un article de revue, présentent des tests biologiques de luminescence résolus en temps avec mise en oeuvre de nanoparticules à base de 5 lanthanides. Les sondes luminescentes à base de lanthanides sont des particules comprenant des complexes de lanthanide, ce qui limite le nombre d'ions lanthanides par particule pour un volume de particule donné, ou des nanoparticules à « up-conversion ». Par exemple, dans les publications mettant en oeuvre des nanoparticules comprenant des complexes de lanthanides, les nanoparticules de faible diamètre (8-9 nm) contiennent 10 seulement entre 3000 et 5000 ions [28]. Seules des nanoparticules de tailles bien plus importantes, en particulier supérieure à 100 nm, peuvent contenir de l'ordre de 30 000 ions ou plus [22] et [23]. De même, Corstjens et al. [24] utilisent des nanoparticules à « up-conversion » pour la détection in vitro de l'IFN-gamma dans des cellules mononucléées du sang 15 périphérique humain. Les nanoparticules à « up-conversion » sont adaptées pour l'imagerie de tissus en profondeur (en général, excitation dans le proche IR de l'Yb' où les tissus absorbent peu par rapport au visible). En revanche, du fait que l'excitation nécessite l'absorption de deux photons, des intensités d'excitation importantes sont nécessaires et le nombre de photons émis est relativement faible. 20 Des complexes ou chélates de lanthanides sont également proposés à titre de sondes luminescentes pour des immuno-essais dans les publications [23], [25], [26] et [27]. Cependant, ces complexes ou chélates ne contiennent typiquement qu'un seul ion lanthanide ou, au mieux, quelques (moins de dix) ions lanthanides. Enfin, on peut encore citer la publication Zhou et al. [28] qui propose une 25 méthode de détection de sensibilité améliorée à partir de nanoparticules inorganiques dopées par des lanthanides, à l'issue d'un protocole complexe de dissolution des nanoparticules et de détection de l'émission des micelles contenant les lanthanides ainsi formées. Quant au document EP 1 282 824, il décrit la mise en oeuvre de nanoparticules 30 luminescentes inorganiques, modifiées en surface, à titre de sondes pour détecter une substance biologique ou autre substance organique. La méthode de détection proposée dans 9 ce document repose sur le principe de détection ELISA. Cependant, ce document ne propose nullement leur mise en oeuvre pour une détection ultra-sensible. On peut encore citer le document US 7 550 201 qui propose la mise en oeuvre de nanoparticules inorganiques dopées par des ions lanthanide, notamment pour leur 5 application en diagnostic. Ce document ne propose toutefois nullement leur mise en oeuvre pour une méthode de détection ultra-sensible. Egalement, les publications Son et al. [36] et Nichkova et al. [37] proposent la mise en oeuvre de nanoparticules Eu :Gd203 comme alternative aux fluorophores organiques à titre de sondes pour la détection de l'ADN et pour la détection d'acide 10 phénoxybenzoïque, respectivement. Cependant, ces documents ne suggèrent nullement leur mise en oeuvre pour une détection ultra-sensible. Ainsi, il n'a jamais été proposé de tirer profit de nanoparticules photoluminescentes telles que définies précédemment, combinant des propriétés optiques et physico-chimiques spécifiques, dans une méthode de détection ultra-sensible selon 15 l'invention. Ces nanoparticules photoluminescentes peuvent être obtenues par des méthodes de synthèse conventionnelles, connues de l'homme du métier. Alternativement, de manière avantageuse, comme détaillé dans la suite du 20 texte, les inventeurs ont développé une nouvelle voie de synthèse de nanoparticules dopées par des ions terres-rares mettant en oeuvre des cations tétraalkylammonium en surface des nanoparticules, et permettant d'accéder à une stabilité améliorée des nanoparticules en milieu aqueux et, avantageusement, à une meilleure reproductibilité de leur synthèse et des étapes ultérieures de fonctionnalisation et de couplage à un agent de ciblage. 25 Enfin, la méthode ultra-sensible de l'invention s'avère particulièrement avantageuse en termes de facilité de mise en oeuvre et de coût, en comparaison aux technologies ultra-sensibles discutées précédemment. Avantageusement, et contrairement aux technologies complexes développées par Quanterix et Singulex, elle met en oeuvre un appareillage de détection de faible 30 encombrement, de coût limité et dont chaque élément est aisément disponible à l'achat, pour l'excitation et la mesure de luminescence émise par les nanoparticules, comme détaillé dans la suite du texte, et ne requiert aucun élément d'appareillage spécifiquement 10 dédié à la méthode de détection ultra-sensible de l'invention. Avantageusement, elle est ainsi compatible avec une intégration dans un dispositif d'analyse automatisé, moyennant une adaptation d'ergonomie limitée. La méthode de l'invention est en outre adaptée pour des analyses multiplexées. 5 Ainsi, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre pour la détection et/ou la quantification simultanée d'au moins deux substances différentes dans un échantillon, suivant une procédure présentée plus loin (Figure 22). Egalement, comme détaillé dans la suite du texte, il est possible de tirer profit de la durée d'émission longue (supérieure à 1 las, voire supérieure à 10 las, voire supérieure 10 à 100 las), des particules de l'invention pour effectuer une détection résolue en temps, en particulier une détection retardée de l'émission. Une mesure de la luminescence résolue en temps a par exemple été décrite dans le document WO 03008974. La méthode ultrasensible de l'invention permet avantageusement d'effectuer une détection de luminescence résolue en temps, en utilisant du matériel peu sophistiqué et peu onéreux, en particulier un 15 hacheur mécanique, un photomultiplicateur classique et un convertisseur A-D de 100 kHz, comme décrit dans la suite du texte. L'invention concerne, selon un autre de ses aspects, l'utilisation du procédé défini précédemment à des fins de diagnostic in vitro. Avantageusement, la possibilité par 20 la méthode ultra-sensible, de détecter des teneurs ultra faibles de certaines substances dans des échantillons biologiques permet, par exemple, l'utilisation de la méthode de l'invention pour une détection plus précoce des maladies, ou encore un diagnostic sur l'évolution d'une maladie ou sur l'effet d'un traitement thérapeutique. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention concerne un ensemble de 25 diagnostic in vitro, comprenant au moins : - des particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une nanoparticule inorganique photoluminescente telle que définie précédemment, lesdites particules étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, 30 apportés par des molécules, par exemple l'acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou 11 molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance à analyser ; ou lesdites particules étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser ; et 5 - un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : . un dispositif d'illumination, de préférence de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW voire d'au moins 500 mW, et un montage optique de mise en forme du faisceau laser permettant d'obtenir une intensité d'excitation au niveau de l'échantillon d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/ cm'; 10 . un appareil de détection de l'intensité lumineuse émise par les particules. Un tel ensemble de diagnostic in vitro permet la mise en oeuvre aisée d'une méthode de détection et/ou de quantification ultra-sensible selon l'invention, par exemple pour doser des biomarqueurs ou anticorps dans un échantillon biologique. Les maladies pouvant être diagnostiquées avec l'ensemble de diagnostic in 15 vitro de l'invention ne sont pas limitées et comprennent toutes maladies révélées par la présence d'un marqueur spécifique de la maladie, du type molécule d'intérêt biologique (protéine, acide nucléique...), pour lequel il existe un ou des partenaire(s) de liaison spécifique (ligand, anticorps, acides nucléiques complémentaires, aptamères, ...). A titre d'exemples, on peut citer les maladies infectieuses (bactériennes, 20 parasitaires, ou virales, telles que le SIDA), les maladies inflammatoires et auto-immunes, les maladies cardiologiques, neurologiques, ou oncologiques (par exemple, les cancers solides tels que le cancer du sein ou de la prostate). Le procédé de détection ultra-sensible de l'invention n'est pas limité aux applications précitées. Il peut ainsi être mis en oeuvre pour une détection d'ADN d'OGM 25 dans des semences, par exemple, ou pour la détection d'un polluant ou d'un pathogène dans de l'eau ou dans des aliments destinés à la consommation. Les applications du procédé de détection ultra-sensible selon l'invention peuvent ainsi s'étendre des domaines immunologiques à la génétique moléculaire ou à la détection d'ADN et d'ARN, comme illustré dans les figures 24 et 25 annexées. Il peut être 30 utilisé pour marquer un ou plusieurs brins d'ARN d'un prélèvement biologique, avec un fragment partiellement complémentaire sonde lié à une nanoparticule, puis les détecter par hybridation sur des fragments complémentaires d'une autre région greffés sur un substrat 12 solide, suivant une approche voisine des puces à ADN, de type Affymetrix. Un intérêt de l'invention réside alors dans l'absence d'étape d'amplification habituellement nécessaire pour ces approches. Dans la suite du texte, on désignera plus simplement sous l'appellation 5 « nanoparticule », la nanoparticule inorganique photoluminescente formée d'une matrice cristalline dopée par des ions de terres rares. On emploie par ailleurs le terme « particule » pour désigner une particule comprenant au moins ladite nanoparticule, par exemple étant formée de ladite nanoparticule, à la surface de laquelle peuvent être localisés, selon une variante de 10 réalisation, des cations tétraalkylammonium, et couplée par un ou plusieurs agents de ciblage de la substance à analyser, comme détaillé dans la suite du texte. D'autres caractéristiques, variantes et avantages du procédé selon l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description, des exemples et des figures qui suivent, 15 donnés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. Dans la suite du texte, les expressions « compris entre ... et ... », « allant de ... à ... » et « variant de ... à ... » sont équivalentes et entendent signifier que les bornes sont incluses, sauf mention contraire. 20 PARTICULES LUMINESCENTES DE L'INVENTION Comme indiqué précédemment, le procédé de détection ultra-sensible selon l'invention repose sur la détection de l'émission de luminescence de particules 25 photoluminescentes comprenant, en particulier étant formées, d'une nanoparticule inorganique photoluminescente présentant des propriétés optiques et physico-chimiques spécifiques, et couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser. Nanoparticule inorganique photoluminescente 30 Les propriétés des nanoparticules mises en oeuvre vont conditionner la sensibilité pouvant être atteinte par la méthode de l'invention. 13 Les nanoparticules inorganiques de l'invention sont formées d'une matrice cristalline présentant au moins 103 ions de terres rares. Les ions de terre rares dans les nanoparticules de l'invention ne sont pas sous forme de complexes ou chélates d'ions de terres rares, formés d'ions de terres rares en 5 combinaison avec des ligands organiques appropriés, comme par exemple décrits dans la publication Yuan et al. [21]. De préférence, les nanoparticules de l'invention comprennent entre 1000 et 6 000 000 ions de terres rares, en particulier entre 5 000 et 500 00 et plus particulièrement entre 20 000 et 100 0000 ions de terres rares. 10 Les nanoparticules de l'invention peuvent être dopées par des ions de terres rares de même nature ou de natures différentes. Il peut plus particulièrement s'agir d'ions lanthanides choisis parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le praséodymium (Pr), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb), le cérium (Ce), l'holmium (Ho), le terbium (Tb), le 15 prométhium (Pm), le thulium (Tm) et leurs mélanges. En particulier, les ions lanthanides peuvent être choisis parmi Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb et leurs mélanges, et en particulier Eu. Selon un mode de réalisation particulier, les nanoparticules inorganiques de l'invention sont de formule (I) suivante : 20 (Ai,Lnx)a(MpOq) (I) dans laquelle : - M représente un ou plusieurs éléments susceptibles de s'associer avec l'oxygène (0), et éventuellement avec d'autres cations, pour former un composé cristallin ; - Ln correspond à un ou plusieurs ion(s) lanthanide(s) luminescent(s) ; 25 - A correspond à un ou plusieurs ion(s) constituant(s) de la matrice cristalline dont les niveaux électroniques ne sont pas impliqués dans le processus de luminescence ; - 0 fou f -> d étant permises). Le fait que la transition électronique liée à l'absorption est « interdite » se traduit par une faible largeur spectrale du pic d'absorption et par un faible coefficient d'extinction de ces nanoparticules en solution. 5 De fait, même si des particules photoluminescentes formées d'une matrice cristalline dopée par des ions de terres rares ont déjà été mises en oeuvre, elles sont généralement utilisées au travers une excitation de leur matrice cristalline, cette dernière absorbant généralement bien plus fortement que les ions absorbants. Toutefois, la matrice cristalline absorbant généralement dans l'UV, la mise en oeuvre d'une excitation de la 10 matrice cristalline présente plusieurs inconvénients : d'une part, des lasers émettant dans l'UV sont peu disponibles dans le commerce, souvent onéreux et peu compacts et, d'autre part, l'excitation dans l'UV est susceptible de provoquer simultanément l'excitation d'autres biomolécules pouvant être présentes dans l'échantillon à analyser. De plus, l'absorption et la diffusion par les substrats solides utilisés (verres, plastiques, ...) durant la 15 mesure sont connues pour absorber significativement dans l'UV et, par conséquent, pour induire des signaux parasites d'amplitude importante. Le dispositif d'illumination laser peut également comprendre un montage optique, en particulier un système d'au moins une lentille, disposé sur la trajectoire du faisceau laser de manière à contrôler la taille du faisceau au niveau de la zone du support 20 présentant les particules associées à la substance à analyser. Le procédé de l'invention, qui repose sur une excitation directe des ions de terres rares des nanoparticules, permet avantageusement de s'affranchir des inconvénients liés à une excitation de la matrice cristalline. 25 Par ailleurs, comme évoqué précédemment, l'utilisation d'une forte puissance et d'une forte densité d'excitation selon l'invention n'est pas préjudiciable à l'émission de luminescence par les nanoparticules mises en oeuvre selon l'invention qui ne sont pas sujettes à des phénomènes de saturation ou de photodégradation. 30 De préférence, le laser est monochromatique, d'une largeur spectrale comparable à la largeur spectrale du pic d'absorption des ions lanthanides luminescents. L'excitation est réalisée dans le visible ou dans le proche infra-rouge. 38 L'excitation peut être par exemple réalisée à la longueur d'onde de 465 nm pour des particules de type Y0,6Eu0,4VO4. Le montage optique de mise en forme du faisceau laser peut comporter, de manière classique, un système de collimation et de diminution de la taille du faisceau laser, 5 par exemple à l'aide de lentilles, en particulier de deux lentilles, comme décrit en exemple 3. Il permet alors de contrôler la zone illuminée au niveau de la zone du support présentant les particules associées à la substance à analyser de façon à obtenir une intensité appropriée (par exemple 10 W/cm2) et une illumination dont les dimensions sont voisines ou plus petites que celles du spot de dépôt (par exemple 1 mm de diamètre). 10 L'excitation en étape (ii) peut être plus particulièrement opérée avec un faisceau d'excitation laser orienté de sorte à former un angle d'incidence avec la verticale du support présentant en surface lesdites particules associées à la substance à analyser, supérieur ou égal à 550 pour une illumination à grande angle de l'échantillon ; en particulier inférieur à 60° dans le cas d'une mesure effectuée en milieu aqueux sur un 15 substrat de verre ou de plastique. L'utilisation d'un grand angle d'incidence pour le faisceau laser d'excitation permet de réduire le volume de milieu excité au-dessus de la surface, et ainsi de réduire les signaux parasites. 20 Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention met en oeuvre une excitation des particules par onde évanescente, en particulier à l'aide d'un montage d'illumination laser de type TIRF (fluorescence par réflexion totale interne). Ceci est permis par la réalisation d'un angle d'incidence du faisceau excitateur supérieur ou égal à 61°, en particulier compris entre 61° et 63°, dans le cas d'une interface 25 verre/eau entre le support et l'échantillon à analyser. Il appartient à l'homme du métier d'opérer les ajustements nécessaires au dispositif de détection pour obtenir cette incidence pour une excitation par onde évanescente. Comme illustré en figure 13, il peut comporter notamment un parallélépipède 30 d'indice de réfraction supérieur à celui de la solution de réaction, par exemple, proche de celui du matériau utilisé pour le support, permettant un angle d'incidence du faisceau excitateur supérieur à l'angle critique de l'interface substrat solide/échantillon, en 39 particulier supérieur ou égal à 61° dans le cas d'une interface verre/solution aqueuse, de sorte à obtenir une réflexion totale du faisceau à l'interface support/échantillon et une excitation par onde évanescente des particules associées à la substance à analyser. 5 Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, dans le cadre de la mise en oeuvre de particules à durée de vie d'émission longue (en particulier présentant une durée de vie d'émission supérieure ou égale à 1 las, en particulier supérieure ou égale à 50 las), il est possible d'utiliser une détection résolue en temps de l'émission, en particulier une détection retardée du signal émis par les particules photoluminescentes. 10 L'homme du métier est à même d'adapter le système de détection mis en oeuvre pour permettre une exploitation de l'émission de luminescence résolue en temps. Pour ce faire, un hacheur mécanique (4) peut être par exemple placé sur le trajet du faisceau laser incident, comme illustré en figure 13. Le principe de fonctionnement d'un tel hacheur mécanique et les méthodes 15 d'analyse du signal obtenu pour isoler le signal de luminescence des nanoparticules sont décrits plus précisément dans l'exemple 3.2 qui suit. L'utilisation d'un hacheur mécanique et d'une fréquence de détection du signal par le photomultiplicateur du dispositif de détection de 100 kHz permet de s'affranchir de la fluorescence parasite. Une telle détection résolue temporellement permet ainsi avantageusement de 20 limiter la contribution au signal de luminescence d'espèces parasites présentes dans l'échantillon (sérum, sang, etc.) ou dans les substrats solides utilisés (verre, plastique, etc.), en séparant temporellement des signaux de luminescence parasites du signal émis par les nanoparticules, car ces signaux parasites ont généralement des durées de vie caractéristiques inférieures à 1 las, voire inférieures à 100 ns, voire inférieure à 10 ns. 25 Il est entendu que les différents modes de réalisation particuliers décrits ci-dessus peuvent être combinés pour réaliser différentes variantes de mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention. En particulier, la détection résolue en temps et une excitation des 30 nanoparticules par onde évanescente (montage TIRF) peuvent être mis en oeuvre conjointement, comme illustré en figure 13, ou non. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le procédé de détection ultrasensible selon l'invention combine avantageusement une excitation des nanoparticules par onde évanescente, en particulier à l'aide d'un montage d'illumination laser de type TIRF, et une détection résolue en temps de l'émission, en particulier une détection retardée de 5 l'émission (mise en oeuvre de nanoparticules à longue durée d'émission, utilisation d'un hacheur). Ainsi, avantageusement, dans un procédé selon l'invention, la durée de vie d'émission par les nanoparticules est supérieure ou égale à 1 las, en particulier supérieure ou à égale à 50 las, la détection de l'intensité lumineuse en étape (iii) comprenant une 10 détection résolue en temps de l'émission, en particulier une détection retardée de 1 ' émission. La combinaison de ces deux modes permet avantageusement d'éliminer l'émission due aux particules en solution, autres que celles à analyser immobilisées à la surface du support, ainsi que toute émission d'espèces parasites présentes dans 15 l'échantillon (sérum, sang, etc.) ou dans les substrats solides utilisés (verre, plastique, etc.). Une telle variante de réalisation est particulièrement avantageuse, en ce qu'elle permet de s'affranchir de certaines étapes classiques pour la préparation des échantillons à analyser, et en particulier d'étapes de rinçage et/ou de centrifugation, par exemple, dans le cas d'un rinçage lors de l'analyse pour éliminer les substances (molécules, protéines, 20 peptides, etc.) contenues dans du sérum de sang, autres que celles concernées par l'analyse à effectuer (rinçage permettant d'aller de la phase 2 à la phase 3 indiquées dans la figure 1) ou pour éliminer les particules qui ne se sont pas fixées sur la surface du support et restent en solution lors de la phase 4 indiquée dans la figure 1) ou, par exemple, des étapes de centrifugation précédant l'analyse proprement dite, telle qu'illustrée dans la figure 1, pour 25 éliminer les cellules sanguines dans les prélèvements de sang, étapes qui sont généralement longues et effectuées manuellement, en particulier pour les étapes de centrifugation. La détection de l'émission de luminescence peut être opérée par mesure de l'intensité lumineuse émise à une longueur d'onde de luminescence des particules 30 photoluminescentes mises en oeuvre. A titre d'exemple, dans le cas de la mise en oeuvre de nanoparticules Y1,EuSO4, l'intensité lumineuse émise peut être mesurée à la longueur d'onde de luminescence de Eu', à savoir 617 nm. 41 Le dispositif de détection de l'intensité lumineuse peut comprendre un détecteur unique, en particulier de type photomultiplicateur, photodiode, photodiode à avalanche, ou un détecteur de type réseau de dispositifs photosensibles consistant en une surface 2D de pixels de détection tel qu'une caméra CCD ou EM-CCD ou caméra CMOS. 5 Un dispositif de détection 2D permet de mesurer simultanément le signal d'émission de nanoparticules provenant des différentes zones correspondant à différents échantillons et/ou différentes substances à analyser sur la surface du support et ne nécessite pas de déplacement du support ou du faisceau d'excitation. De préférence, le dispositif de détection de l'intensité lumineuse comprend un 10 détecteur unique, en particulier un photomultiplicateur, ce qui permet de réaliser un dispositif de détection moins onéreux. Il peut également comprendre un montage optique, en particulier un système d'au moins une lentille à grande ouverture numérique, pour focaliser l'émission de luminescence vers le détecteur, en particulier vers le photomultiplicateur. 15 Des filtres interférentiels peuvent également être placés sur le trajet du faisceau émis pour éliminer spectralement les signaux parasites. La détection peut être opérée en réflexion, vers le bas, comme représenté schématiquement en figure 12-a, autrement dit du côté de la face du support recevant le faisceau d'excitation laser. 20 Alternativement, elle peut être opérée en transmission, vers le haut, comme représenté schématiquement en figure 12-b. La collection de la luminescence par le haut est préférée dans le cas d'une excitation en onde évanescente, de façon à éviter le passage des photons de luminescence à travers le parallélépipède permettant la réalisation de l'onde évanescente. 25 ANALYSE DE LA MESURE DE LUMINESCENCE Le procédé de l'invention comprend enfin une étape (iv) de détermination de la présence et/ou de la concentration de la substance par interprétation de la mesure de luminescence. 30 Il est entendu que le système de détection selon l'invention peut comprendre en outre tout moyen permettant d'analyser l'émission de luminescence, par exemple un convertisseur permettant d'enregistrer et d'exploiter le signal de luminescence. 42 L'interprétation de la mesure de la luminescence peut être effectuée par référence à un étalon ou étalonnage préétablis. Plus précisément, la quantité de la substance à analyser dans l'échantillon peut être déterminée par référence à une courbe d'étalonnage préétablie au moyen de mesures 5 réalisées avec des échantillons à quantité connue en ladite substance, de préférence dans des conditions identiques à celles de l'étude de l'échantillon, ces conditions identiques incluant notamment le solvant et le pH du milieu. De manière avantageuse, comme illustré en exemple 3, le procédé ultrasensible selon l'invention permet de détecter et de quantifier une substance d'intérêt dans 10 un échantillon en une teneur strictement inférieure à 10 pM, en particulier inférieure à 1 pM, voire inférieure à 0,1 pM, ou encore inférieures à 0,01 pM (i.e. 10 fM). De fait, il permet une détection au moins dix fois, en particulier au moins 100 fois, voire 1000 fois plus sensible que la méthode d'immuno-détection enzymatique de type ELISA, utilisant les mêmes anticorps de reconnaissance et de ciblage. 15 ENSEMBLE DE DIAGNOSTIC IN VITRO L'invention concerne encore, selon un autre de ses aspects, un ensemble de diagnostic in vitro, comprenant au moins : - des particules luminescentes formées en tout ou partie d'une nanoparticule 20 inorganique photoluminescente telle que définie précédemment, lesdites particules étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l'acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou 25 molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance à analyser ; ou lesdites particules étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser ; - un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : 30 . un dispositif d'illumination laser d'une puissance d'au moins 50 mW voire d'au moins 500 mW, et un montage optique de mise en forme du faisceau laser permettant 43 d'obtenir une intensité d'excitation au niveau de l'échantillon d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/ cm' . un appareil de détection de l'intensité lumineuse émise par les particules. L'ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention peut comprendre en outre 5 un support adéquat pour l'immobilisation de la substance à analyser dudit échantillon, comme décrit précédemment. Il peut s'agir d'un support dont la surface a été passivée et fonctionnalisée avec un agent de ciblage de la substance à détecter/quantifier, par exemple avec un premier anticorps, comme décrit précédemment. 10 Dans une première variante de réalisation, l'ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention peut comprendre des particules photoluminescentes selon l'invention déjà couplées à un agent de ciblage, en particulier à des anticorps, appelés « anticorps de révélation » pour les distinguer des anticorps de capture immobilisés au niveau du support. 15 Les particules couplées à l'agent de ciblage peuvent être obtenues comme décrit précédemment. Dans une autre variante de réalisation, le kit peut comprendre des particules qui ne sont pas couplées à un agent de ciblage, à partir desquelles l'utilisateur ou le praticien 20 pourra préparer les particules couplées à un ou plusieurs agents de ciblage pour une mise en oeuvre dans la méthode ultra-sensible selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, l'ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention peut ainsi comprendre plusieurs récipients comprenant, de manière isolée, lesdites particules non couplées d'une part et, d'autre part, un ou plusieurs agents de 25 ciblage. Alternativement, l'ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention ne comprend pas d'agent de ciblage, l'utilisateur ou le praticien pouvant obtenir séparément l'agent de ciblage, par exemple biotinylé, de son choix, par tout fournisseur compétent. La préparation des particules couplées aux agents de ciblage implique dans le 30 cadre de cette variante de réalisation le mélange des particules non couplées selon l'invention avec l'agent de ciblage, dans des rapports de concentrations prédéterminés par le contenu des récipients dans le cas de la présence de l'agent de ciblage au sein de 44 l'ensemble diagnostic in vitro selon l'invention, ou déterminé par l'utilisateur, par exemple comme décrit en exemple 1. Les particules non couplées à un agent de ciblage mises en oeuvre dans un 5 ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention peuvent être notamment des particules couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage, par exemple biotinylé, par exemple un anticorps biotinylé. D'autres couples de molécules peuvent être envisagées pour ce type de 10 couplage, par exemple haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, tels que digoxygénine (DIG)/anticorps anti-DIG, sucre/lectine et polynucléotide/complémentaire de polynucléotide. Alternativement, les particules non couplées à un agent de ciblage mises en oeuvre dans un ensemble de diagnostic in vitro selon l'invention peuvent être notamment 15 des particules fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance à analyser, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, comme par exemple l'acide citrique ou du polyacide acrylique. A titre d'exemples, les particules peuvent être fonctionnalisés avec du citrate 20 ou du polyacide acrylique, la préparation des particules couplées aux agents de ciblage impliquant l'activation des fonctions carboxyliques, comme décrit en exemple 1, suivie du mélange des particules non couplées avec l'agent de ciblage. Il est entendu que la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules peut comporter plus d'une couche. Par exemple, comme évoqué précédemment, les particules 25 de l'invention peuvent comporter une couche de préparation ou stabilisation de la surface des nanoparticules, telle qu'une couche de silice, suivie d'une couche de fonctionnalisation par des groupements chimiques actifs, telle qu'une couche constituée d'APTES (aminopropyltri éthoxy sil ane). 30 Les exemples et figures présentés ci-dessous sont uniquement donnés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. FIGURES Figure 1 : Représentation schématique du principe de détection des biomolécules : surface fonctionnalisée avec un anticorps de capture (phase 1) ; mise en contact de l'échantillon à analyser (phase 2), lavage (phase 3) et association des particules 5 photoluminescentes couplées à un agent de ciblage (ici un anticorps) avec la substance immobilisée à la surface du support suivie d'un lavage pour éliminer les particules non immobilisées (phase 4) ; Figure 2 : Représentation schématique d'un dispositif de détection selon l'invention, composé notamment d'une source laser 1, d'un système de collimation et de 10 diminution de la taille du faisceau laser 2, d'un miroir 3 pour orienter le faisceau laser, d'un support 6 pour les échantillons, et d'un système de détection des photons émis comportant une lentille à grande ouverture numérique 10 et un photomultiplicateur 12; Figure 3 : Images obtenues par microscopie électronique à transmission (MET) des nanoparticules obtenues selon l'exemple 1 (Barre d'échelle : 60 nm (figure 3a) et 5 nm 15 (figure 3b), respectivement) ; Figure 4 : Histogramme de taille des nanoparticules déterminé à partir d'images de MET pour un ensemble d'environ 300 nanoparticules selon l'exemple 1 ; Figure 5 : Diffractogrammes des rayons X obtenus pour les nanoparticules synthétisées selon l'exemple 1 (trait noir), et 3 (trait gris) ; 20 Figure 6: Représentation schématique des nanoparticules de l'invention fonctionnalisées avec du citrate (figure 6a) ou avec du polyacide acrylique (PAA) (figure 6b). A des fins de clarté, une seule molécule de citrate ou de PAA est représentée. Il est entendu que chaque nanoparticule peut comporter sur sa surface de nombreuses molécules de citrate ou de PAA. 25 Figure 7 : Représentation schématique des réactions pour le couplage d'une nanoparticule selon l'invention avec la streptavidine, selon l'exemple 1 ; Figure 8 : Représentation schématique du couplage des nanoparticules couplées avec la streptavidine, avec un anticorps biotinylé ; Figure 9 : Représentation schématique de l'utilisation d'un hacheur mécanique 30 rotatif pour l'obtention d'une illumination périodique, et profil temporel de l'intensité d'excitation obtenue. Dans le cas du profil temporel illustré, l'intensité d'excitation obtenue augmente ou baisse de façon progressive à cause de la taille finie du faisceau et du 46 temps nécessaire à la pale du hacheur mécanique pour dévoiler ou cacher la totalité du faisceau d'excitation ; Figure 10 : Signaux obtenus en mode d'excitation par onde évanescente (TIRF) à l'issue d'un demi-cycle de fermeture du hacheur avec de l'eau pure (a), des 5 nanoparticules (goutte de concentration en ions vanadate de 3 mM) dans de l'eau (b) et dans du sérum (c) : signal brut (Figure 10-a) et signal de luminescence en détection retardée (détection restreinte à 150 las après le début d'occultation du faisceau d'excitation) (Figure 10-b) ; Figure 11 : A gauche : modélisation de la luminescence avec un système à 2 10 niveaux. A droite : signal moyenné émis par des nanoparticules (Y0,6Eu0,4VO4) déposées sur une lamelle, collecté au cours de 500 cycles d'ouverture-fermeture (cercles) du hacheur, comparé à son ajustement (ligne pleine), déterminant la quantité de nanoparticules. Résultats obtenus en mode d'excitation HI-LO (i.e. le faisceau d'excitation formant un grand angle avec la verticale sur le support de l'échantillon) ; 15 Figure 12 : Représentation schématique d'un dispositif de détection selon l'invention, avec détection de l'émission vers le bas (Figure 12-a), et détection de l'émission vers le haut (Figure 12-b) ; Figure 13 : Représentation schématique d'un dispositif de détection selon l'invention, avec hacheur du faisceau laser 4 et excitation en réflexion interne totale (à 20 l'aide d'un parallélépipède de plexiglas 13 d'indice de réfraction supérieur ou égal à celui du matériau qui sert de support d'échantillon) ; Figure 14 : Courbe de calibration de l'appareil de détection selon la variante 2, avec hacheur et avec excitation par onde évanescente, suivant le protocole décrit en exemple 3.2.ii (Figure 14-a) ; et selon la variante 3, sans hacheur et sans excitation par 25 onde évanescente, suivant le protocole décrit en exemple 3.2.ii. (Figure 14-b) ; Figure 15 : Détection d'insuline recombinante en solution par un kit ELISA (ABCAM Réf. ab100578). La limite de détection indiquée par le fournisseur du kit est de 9 pM (50 pg/mL) ; Figure 16 : Détection d'insuline recombinante en solution jusqu'à des 30 concentrations de 9 fM (0,05 pg/mL) avec la variante 1 de l'appareil de détection décrite en exemple 3 (temps d'acquisition : 30 s ; lecture du signal toutes les 100 ms). Dans l'encart, le signal correspondant à une concentration égale à zéro a été soustrait ; 47 Figure 17 : Détection d'insuline recombinante en solution jusqu'à des concentrations de 9 fM (0,05 pg/mL) avec la variante 2 de l'appareil de détection décrite en exemple 3, sans hacheur et sans excitation par onde évanescente (temps d'acquisition : 1 s; lecture du signal toutes les 10 jas); 5 Figure 18 : Détection d'insuline recombinante en solution jusqu'à des concentrations de 9 fM (0,05 pg/mL) avec la variante 2 de l'appareil de détection décrite en exemple 3, avec hacheur et avec excitation par onde évanescente (temps d'acquisition : 1 s; lecture du signal toutes les 10 jas); Figure 19 : Détection d'insuline dans différents échantillons de sérum sur 10 plaque multipuits suivant la variante 1 de l'appareil de détection décrite en exemple 3 (temps d'acquisition : 30 s ; lecture du signal toutes les 100 ms) ; Figure 20 : Détection de TSH recombinante en solution jusqu'à des concentrations de 3,2 fM suivant la variante 1 de l'appareil de détection décrite en exemple 3 avec hacheur (temps d'acquisition : 1 s ; lecture du signal toutes les 10 jas); 15 Figure 21: Evolution du signal de luminescence détecté suivant la variante 1 de l'appareil de détection en fonction du temps d'incubation avec les conjugués anticorpsnanoparticules suivant l'exemple 4; Figure 22 : Schéma du principe du multiplexage spatial ; Figure 23 : Représentation schématique des deux « spots » de nanoparticules 20 formés suivant l'exemple 5, et signal de luminescence détecté pour les différentes localisations ; Figure 24 : Représentation schématique de la détection et quantification d'ADN/ARN à l'aide des particules selon l'invention couplées à de l'ADN simple brin. De l'ADN simple brin partiellement complémentaire au brin à détecter est fixé sur un support. 25 Ensuite, l'échantillon contenant l'ADN ou l'ARN à détecter est incubé avec le support fonctionnalisé (gauche). Après rinçage, les particules couplées à de l'ADN simple brin, partiellement complémentaire à la partie non appariée de l'ADN ou ARN à détecter, sont incubées avec le support (milieu). Après rinçage, seules les nanoparticules immobilisées sur la surface du support après appariement avec l'ADN ou ARN à détecter sont présentes 30 (droite). Elles peuvent être détectées et quantifiées comme décrit dans le texte. 48 Figure 25 : Représentation schématique de la détection et quantification d'ADN/ARN à l'aide des particules selon l'invention couplées à des molécules de streptavidine. (a) Cette variante de détection/quantification de l'ADN ou ARN utilise un 5 ADN simple brin « de reconnaissance » couplé à une molécule de streptavidine à chaque bout à fixer sur le support de détection, l'ADN ou ARN simple brin à détecter et un ADN simple brin partiellement complémentaire à l'ADN couplé à une molécule de biotine. L'ADN couplé à la streptavidine est, avec sa partie non complémentaire à l'ADN couplé à la biotine, au moins partiellement complémentaire à l'ADN à détecter. 10 (b) La surface du support est passivée avec du PEG et fonctionnalisé avec de la biotine. L'ADN couplé à une streptavidine à chaque bout se fixe sur la surface du support fonctionnalisée. Ensuite, suite à une incubation avec l'ADN à détecter, celui-ci s'apparie avec l'ADN immobilisé sur la surface du support. Après rinçage, les biotines restant sur la surface sont passivées avec de la streptavidine. L'ADN « de révélation » fixé à une biotine 15 est incubé avec la surface et s'apparie avec la partie complémentaire de l'ADN couplé à deux molécules de streptavidine. (c) Après rinçage, les particules de l'invention couplées à des molécules de streptavidine sont incubées avec la surface et se fixent sur l'ADN simple brin « de révélation » via l'interaction avec la biotine. 20 Après rinçage, les particules immobilisées sur la surface peuvent être détectées et quantifiées comme décrit dans le texte. Il est également possible d'utiliser un ADN « de reconnaissance » couplé à une seule molécule de streptavidine à l'un de ses deux bouts. Dans ce cas, les ADN « de reconnaissance » sont fixés à la surface du support par un seul de leurs deux bouts, comme dans la variante 1. 25 EXEMPLES EXEMPLE 1 Préparation des particules luminescentes 1.1. S nthèse des nano s articules Yo oEuo 4Y04 30 Comme source d'ions de métavanadate V03-, on utilise du métavanadate d'ammonium NH4V03, l'orthovanadate V043- étant obtenu in situ suite à une réaction avec 49 une base, ici l'hydroxyde de tétraméthylammonium, N(CH3)40H. Des nitrates d'yttrium et d'europium ont été utilisés comme sources d'ions y3+ et Eu'. Une solution aqueuse de 10 mL de NH4V03 à 0,1M et 0,2 M de N(CH3)40H (solution 1) est fraichement préparée. 5 Un volume de 10 mL d'une autre solution de Y(NO3)3 et de Eu(NO3)3 à 0,1 M en ions (Y" + Eu') est ajoutée goutte à goutte à l'aide d'un pousse seringue dans la solution 1 à un flux de 1 mL/min. Le rapport en concentration molaire entre Y(NO3)3 et Eu(NO3)3 est choisi en fonction du rapport entre ions y3+ et Eu' souhaité dans la nanoparticule, typiquement le 10 rapport molaire y3+ :Ed+ est de 0,6 : 0,4. Dès l'ajout de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3, la solution devient diffusante et apparaît blanche/laiteuse sans formation de précipité. La synthèse se poursuit jusqu'à l'ajout total de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3. 15 La solution finale de 20 mL doit à présent être purifiée pour éliminer l'excès de contre-ions. Pour ce faire, des centrifugations (typiquement trois) à 11000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) pendant 80 minutes suivies chacune d'une redispersion par sonification (Branson Sonifier 450 fonctionnant à 50 % à une puissance de 400 W) sont utilisées jusqu'à atteindre une conductivité strictement inférieure à 100 p.S.cm-1. 20 La conductivité est mesurée à l'aide d'un conductimètre de chimie. La synthèse des nanoparticules Y0,6Eu0,4VO4 à la surface desquelles sont immobilisés les cations tétraméthylammonium peut être schématisée comme suit : NH.N0 + 2 (N(CH,).)OH V043- +2 N(CH, + NH4+ N(CH 1 H + 0.6 Y(NO,) +0.4 Eu(NO, -1>Y' ,VO, N(CH,):.' + NH ,1 + 3N0,- Deux essais de synthèse (« synthèse 1» et « synthèse 2 ») sont effectués. 25 Résultat L'observation visuelle de la solution de nanoparticules selon l'invention, après avoir été laissée au repos pendant 16 heures dans un flacon, montre une solution uniformément diffusante. 5 La solution finale reste très stable dans l'eau, même après plusieurs mois dans le pH final de la synthèse (environ pH 5). La solution reste stable y compris dans le milieu de synthèse (avant l'élimination de l'excès de contre-ions), de force ionique pourtant élevée (>0,1 M). Le potentiel zêta des nanoparticules est déterminé avec un appareil DLS-Zeta 10 Potential (Zetasizer Nano ZS90, Malvern). Les résultats des potentiels zêta mesurés pour les nanoparticules des deux synthèses sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après. Synthèse 1 Synthèse 2 Conductivité (uS/cm) 93 80 lill 4,81 4,96 Potentiel zêta Ç -33,3 -34,6 TABLEAU 1 15 Pour les observations par microscopie électronique à transmission (MET), des solutions diluées de nanoparticules sont déposées sur une grille en carbone. Les observations sont réalisées à l'aide d'un microscope Philips CM30 fonctionnant à 300 kV avec une résolution de 0,235 nm. L'observation des nanoparticules par MET (figure 3) montre que les 20 nanoparticules sont de forme ellipsoïde allongée. Les dimensions des nanoparticules sont déterminées à partir d'images de MET pour un ensemble d'environ 300 nanoparticules (figure 4). Les nanoparticules de l'invention présentent une longueur du grand axe, notée a, comprise entre 20 et 60 nm, avec une valeur moyenne d'environ 40 nm, et une longueur du petit axe, notée b, comprise entre 10 et 30 nm, avec une valeur moyenne d'environ 20 nm. 25 Les images de MET (figure 3) ne permettent pas de distinguer des plans cristallins, ce qui est probablement attribuable au fait que la nanoparticule est constituée de plusieurs cristallites de taille plus faible que la taille de la nanoparticule. La nature 51 majoritairement cristalline et polycristalline des nanoparticules est confirmée par des expériences de diffraction de rayons X. Le diffractogramme des rayons X obtenu à l'aide d'un diffractomètre Philips 5 X-pert avec la raie Kal du Cuivre (X=1,5418 À), est représenté en figure 5. L'intensité diffractée est enregistrée en utilisant un détecteur X' Celerator area detector (PANalytical). La longueur de cohérence dans une direction cristallographique et donc la taille moyenne des cristallites constituant la nanoparticule dans cette direction cristallographique peut être estimée à partir de la largeur des pics dans le diffractogramme RX par application 10 de la formule de Scherrer. Les valeurs de longueur de cohérence obtenues pour les différentes directions cristallographiques sont comprises entre 3 et 40 nm. La longueur de cohérence dans au moins une direction cristallographique étant inférieure à la dimension de la nanoparticule dans cette direction, on peut en déduire que les nanoparticules sont d'une cristallinité imparfaite (polycristallinité, défauts ou porosité). Dans la direction (200) (Fig. 15 3, pic à 20-25°), la longueur de cohérence est de 10,2 nm, légèrement plus faible que la longueur de cohérence pour les nanoparticules de l'exemple 3 (11,1 nm). 1.2. Couplage des nanoparticules avec la protéine streptavidine i.a. Greffage du citrate à la surface des nanoparticules 20 A l'issue de la synthèse des nanoparticules selon l'exemple 1.1., on prélève 250 !IL de particules Y0,6Eu0,4VO4 de concentration 5 mM en ions vanadate, on centrifuge la solution de nanoparticules à 17 000 g pendant 30 minutes.. On prélève le culot et on le disperse dans 1 mL d'une solution d'eau distillée contenant l'ion citrate (concentration 0,2 M). 25 La solution est ensuite sonifiée pendant 5 minutes dans un bain de glace, centrifugée à 17 000 g pendant 30 minutes et le culot est récupéré et redispersé dans de l'eau distillée. Cette étape est répétée 3 fois. A l'issue de ce greffage, les particules sont dispersées dans de l'eau distillée, solvant dans lequel elles sont stables. 30 La fonctionnalisation des nanoparticules par du citrate peut être remplacée par une fonctionnalisation par du PAA (par exemple de degré de polymérisation compris entre 52 3 et 10000), en mettant en oeuvre un sel de PAA, comme par exemple un sel de sodium ou d'ammonium. i.b. Greffage de PAA à la surface des nanoparticules 5 A l'issue de la synthèse des nanoparticules selon l'exemple 1.1., on prélève 500 !IL de particules Y0,6Eu0,4VO4 de concentration 10 mM et on centrifuge la solution de nanoparticules à 17 000 g pendant 30 minutes. On prélève le culot et on le disperse dans 1 mL d'une solution d'eau distillée contenant le PAA de poids moléculaire 1800 Da (concentration 75 mM). 10 La solution est ensuite sonifiée pendant 5 minutes, centrifugée à 17 000 g pendant 30 minutes et le culot est récupéré et redispersé dans de l'eau distillée. Cette étape est répétée 3 fois. A l'issue de ce greffage, les particules sont dispersées dans de l'eau distillée, solvant dans lequel elles sont stables. 15 En figure 6, sont représentés de manière schématique les nanoparticules de l'invention fonctionnalisées avec (a) du citrate et (b) du polyacide acrylique. ii. Couplage des nanoparticules avec la streptavidine On centrifuge les nanoparticules (NPs) greffées avec les ions citrate ou avec le 20 PAA à 16 000 g pendant 1 heure, puis le culot est récupéré. Le couplage des nanoparticules greffées en surface par du citrate avec la streptavidine est opéré suivant le protocole suivant : 1. Préparer fraichement une solution mixte de EDC 1/Sulfo-NHS 2 25 (concentration 30 et 30 mg/mL, respectivement) dans du tampon MES 3 (pH 5-6). 2. Disperser par sonification (bain ultrasons) le culot des NPs dans 250 !IL de la solution préparée en étape 1. Les pertes lors des centrifugations étant faibles, la concentration en ions vanadate reste de l'ordre de 5 mM, ce qui donne une concentration en nanoparticules de 48 nM. 30 (La concentration en vanadate des solutions de nanoparticules a été déterminée par dissolution des particules dans un milieu acide suivie d'une détermination colorimétrique de la concentration en ions vanadate, telle que décrite dans la référence [34] Abdesselem et al., ACS Nano 8, 11126-11137 (2014). La 53 concentration molaire en nanoparticules a été déterminée à partir de la concentration en ions vanadate, comme décrit dans la référence [35]. 3. Incuber à 37°C pendant 30 min sous agitation (plateau agitateur). 4. Préparer une solution de streptavidine (SA) de 100 nM dans du tampon 5 phosphate pH 7,4 avec NaC1 à 10 mM. Diluer la solution de streptavidine jusqu'à atteindre une concentration déterminée par le nombre de protéines greffées par nanoparticule souhaité (pour un rapport streptavidine : NPs de 1:1, 5:1 et 10:1, choisir, respectivement des concentrations de 4,8 nM, 24 nM et 48 nM). Rajouter 250 !IL de cette solution à la solution de nanoparticules. 10 5. Laisser incuber entre 2 et 4h à température ambiante. 6. Rajouter 1 mL de PBST 4 et vortexer. 7. Faire une centrifugation de 6 500 g pendant 30 min et récupérer le culot pour éliminer les protéines non couplées aux NPs. Enlever totalement le surnageant. Redisperser les NPs couplées aux protéines dans lmL de PBST et sonifier au bain à 15 ultrasons. Répéter cette étape deux fois. 8. Récupérer les NPs couplées aux protéines dans 250 !IL de PBS 5 avec 1 % de BSA6. 9. Garder à 4°C pour utilisation immédiate ou aliquoter et garder à -80°C. 20 Le couplage des nanoparticules avec la streptavidine est représenté schématiquement en figure 7. Matériel mis en oeuvre pour l'essai de fonctionnalisation : 1 N-(3-Dimethylaminopropy1)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 25 (sigma, cat# E1769). 2N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (Sulfo-NHS) (sigma, cat# 56485). 32-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (10mM, pH 5-6). 4 Tampon phosphate salin pH 7,4 (10 mM NaC1)+ 0,05% Tween 20 (PBST). 5 Albumine de sérum de boeuf (B SA) (sigma, cat# A3059). 30 6 Tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4, 10 mM NaC1). 54 Le nombre de molécules de streptavidine (SA) par nanoparticule (NP), noté R, caractérisé à l'issue du protocole de couplage, est déterminé via le dosage de la streptavidine par la méthode dite de BCA, selon le protocole détaillé ci-dessus. 5 Protocole de caractérisation du rapport streptavidine : nanoparticules (SA :NPs) i. Dosage de la SA par la méthode dite de BCA Principe 10 En milieu alcalin, les protéines réduisent Cu2+ en Cu. Le sel de l'acide bicinchoninique (BCA) forme un complexe coloré avec les ions Cu2+. Ce complexe est quantifiable grâce à son absorption à 562 nm. Mode opératoire 15 Kit de test BCA de chez ThermoFisher (PierceTM BCA Protein Assay Kit Cat. Num. 23225) - Préparation du réactif du test Cu2+/BCA selon le protocole du kit ThermoFisher. - Préparation de la SA pour la courbe d'étalonnage. Pour la courbe de 20 calibration, le test est réalisé trois fois. Tubes Concentration finale en SA (ug/mL) A 2000 B 1500 C 1000 D 750 E 500 F 250 G 125 H 25 I 0 = blanc TABLEAU 2 : concentration en streptavidine des solutions d'étalonnage 25 30 Le mode opératoire est le suivant : - Prendre une plaque de 96 puits. Mettre 25 !IL de chaque tube d'étalon A à I (de concentration connue en SA) ou de protéines conjuguées aux nanoparticules à doser dans les puits correspondants. - Rajouter 200 !IL du réactif du test Ce/BCA dans chaque puits. Homogénéiser, couvrir et laisser incuber 30 min à 37°C. - Lire les absorbances (A) à 562 nm en fonction de la concentration finale en tenant compte de la dilution. Etablir la relation d'étalonnage A= f (Concentration SA en 1.1g/mL) par régression linéaire. La concentration des protéines conjuguées aux nanoparticules à doser est déduite à partir de l'équation de la régression linéaire obtenue avec la courbe d'étalonnage. ii. Caractérisation du rapport SA : NPs 15 La concentration massique de la streptavidine obtenue avec le test de BCA est convertie en concentration molaire via la formule suivante : [SA]massique (g/L) [SA]molaire(m°1eS/L) = Masse Molaire (g/mole) Pour obtenir le rapport (R) du nombre de SA: NPs, nous appliquons enfin R [SA]molaire [NPs]molaire Le tableau 3 ci-dessous rassemble les valeurs obtenues pour les différents rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules de départ. Rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules 1:1 5:1 10:1 Nombre déterminé de molécules de streptavidine par nanoparticule à l'issue du couplage 0,97 3,8 9,29 25 TABLEAU 3: Caractérisation du couplage nanoparticule-streptavidine pour différents rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules. 5 10 20 l'équation suivante : 56 Comme il ressort des résultats présentés dans le tableau 3, le nombre de molécules de streptavidine par nanoparticule après couplage, est du même ordre que le rapport de concentration dans les solutions initiales, et indique ainsi un couplage de très bonne efficacité. 5 1.3. Couplage des nanoparticules couplées à la streptavidine (Nanoparticules-SA) avec des anticorps biotinylés Les nanoparticules couplées avec la streptavidine sont ensuite couplées à un anticorps biotinylé, spécifique de la substance à doser (insuline ou hormone 10 thyréostimuline (TSH), comme illustré de manière schématique en figure 8. Le protocole de couplage est le suivant. Entre 10 et 50 pgimL d'anticorps biotinylés sont mis au contact des nanoparticules-SA en excès pendant 1 h à l'aide d'une roue tournante afin de favoriser la diffusion et l'interaction entre la biotine et la streptavidine. La concentration d'anticorps 15 est choisie de sorte à avoir 100 fois plus de molécules de streptavidine greffées sur les particules que d'anticorps biotinylés. Ainsi, il est certain que tous les anticorps vont se fixer sur les nanoparticules-SA et il n'y a pas besoin d'étape d'élimination des anticorps non fixés. Pour des nanoparticules (NP) couplées à des molécules de streptavidine à un rapport SA:NP de 10:1, la concentration d'anticorps est donc 10 fois plus faible que la 20 concentration des nanoparticules. Alternativement, il est également possible de coupler directement des anticorps aux nanoparticules greffées avec des ions citrate. Dans ce cas, le même protocole que ci-dessus est à utiliser en remplaçant la solution de streptavidine par une solution d'anticorps. 25 Les particules luminescentes ainsi préparées, comprenant les nanoparticules photoluminescentes Y0,6Eu0,4VO4 couplées à un anticorps de ciblage de la substance à analyser (NPs-Ac), peuvent être mises en oeuvre pour détecter et/ou quantifier ladite substance dans un échantillon biologique. 30 57 EXEMPLE 2 Préparation du support à la surface duquel est immobilisée la substance à analyser i. Préparation du support de type lamelles de verre 5 Dans un premier temps, on prépare un support formé de lamelles de verre dont la surface est préalablement nettoyée, passivée et fonctionnalisée avec des anticorps biotinylés (anticorps de capture). Le protocole de nettoyage, passivation et fonctionnalisation des lamelles de verre est le suivant. La fonctionnalisation peut se faire soit par « printing » soit par dépôt 10 de gouttes à l'aide d'un spotter. Nettoyage des lamelles - Lavage des lamelles dans de l'eau désionisée avec du détergent Hellmanex II à 4% (Hellma) dans un bac à ultrasons chauffant à 40-50°C pendant 15 minutes. 15 - Rinçage des lamelles à l'eau désionisée dans un bac à ultrasons chauffant à 40-50°C pendant 15 minutes. - Rinçage à l'éthanol absolu dans un bac à ultrasons chauffant à 40-50°C pendant 15 minutes. - Séchage dans un flux de N2 OU sous hotte aspirante pendant 10-15 min. 20 - Juste avant la fonctionnalisation de la surface de verre, nettoyer les lamelles une par une dans un Plasma cleaner (Harrick Plasma, model PDC-002) pendant 2 minutes à intensité médium. Passivation des lamelles 25 La molécule de passivation utilisée est un silane-polyéthylène glycol (PEG) avec du PEG de 10 kDa, commercialisé par la Société Laysanbio sous la référence M-SIL5K. La passivation comporte uniquement une étape de silanisation du verre. Plus le PEG sera long, plus la passivation résultante sera meilleure. 30 Le protocole de passivation est le suivant : - Dissoudre le PEG à 10 mg/mL dans de l'éthanol absolu (Et0HAbs, concentration molaire 2 mM ou 1 mM suivant la taille du PEG respectivement 5 kDa ou 10 58 kDa). Pour bien dissoudre les PEG les plus longs à 10 mg/mL, il faut parfois chauffer quelques minutes à 40°C. - Quelques secondes avant utilisation, rajouter dans cette solution un peu d'H20 et d'acide acétique (AcAc) pour avoir les proportions v/v/v : Et0HAbs/ H20 / AcAc : 5 95/5/0,2. - Au fond d'une boite hermétique poser un carré de parafilm, puis déposer dessus une goutte -30 !IL de la solution préparée ci-dessus, puis la lamelle de verre (issue du plasma cleaner) par-dessus pour prendre la goutte en sandwich. Mettre un petit réservoir d'éthanol dans la boite hermétique pour saturer l'air en éthanol et pour que les 301.1L ne 10 sèchent pas. Laisser incuber pendant la nuit. - Rincer à l'eau désionisée, puis sécher dans un flux d'azote. Pour finir, mettre les lamelles 5 min sur plaque chauffante à 110 °C. Fonctionnalisation par « printing » de streptavidine et anticorps biotinylés 15 Le protocole de fonctionnalisation des lamelles préalablement passivées par les anticorps biotinylés est le suivant. - Couper un timbre de PDMS (polydiméthylsiloxane) de dimensions correspondant à la surface que l'on souhaite fonctionnaliser. - Poser le timbre sur une surface plane. Incuber sur le timbre -15-30 !IL de 20 streptavidine à 20 1.1g/mL dans un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) pendant 1 min. - Rincer immédiatement à l'H20 (à la pissette) et passez sous un flux d'N2 (10 sec). - Retourner le tampon et poser sa surface encrée sur la lamelle pendant 1 min. - Enlever le tampon en faisant attention à ne pas le traîner sur la surface. 25 - Après la fonctionnalisation de la lamelle de verre avec de la streptavidine, incuber la quantité nécessaire (1-10 i.tg/mL dans du tampon bicarbonate pH 7.4) en anticorps biotinylés pendant 2h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. - Enlever la solution d'incubation d'anticorps puis laver avec 100 !IL de tampon PBS à 3 reprises. 30 - Rajouter 100 !IL de BSA 5% w/v (5 g dans 100 mL) PBS et laisser incuber durant 1 h. 59 Fonctionnalisation par spotter La fonctionnalisation par spotter est réalisée avec l'appareil SPRi-Arrayer de Horiba selon le protocole du fournisseur en utilisant une aiguille de diamètre 500 i.tm pour le dépôt de gouttes contenant les anticorps (1-10 1.1.g/mL dans du tampon bicarbonate pH 5 7,4). ii. Immobilisation de la substance à analyser des échantillons à la surface du support Le protocole est le suivant. 10 - Ajouter les échantillons à doser (insuline en solution, insuline dans du sérum ou TSH en solution) dans chaque puits et laisser incuber 2 heures. Ce temps est le même que celui indiqué pour les tests classiques d'ELISA correspondants. - Après 2 heures d'incubation, enlever la solution puis laver avec 100 !IL de tampon Wash (PB S 0,2 % Tween 20 2X) à 3 reprises. 15 EXEMPLE 3 Détection et quantification ultra-sensible 3.1. Association des particules luminescentes avec la substance à analyser Le protocole est le suivant : 20 - Ajouter les nanoparticules couplées aux anticorps biotinylés préparés comme décrit en exemple 1 et laisser incuber pendant 1 heure. Le temps d'incubation nécessaire pour maximiser le signal lors de la mesure de luminescence peut être préalablement déterminé, comme décrit en exemple 4. - Après 1 heure d'incubation, enlever la solution puis laver avec 100 !IL de 25 tampon Wash (PB S 0.2 % Tween 20 2X) à 4 reprises. - Rajouter 100 !IL de PBS et faire la mesure de luminescence, comme décrit ci-après. 3.2. Mesure de luminescence 30 i. Montage expérimental pour la mesure de la luminescence Le montage de détection est le suivant. Il est représenté schématiquement en Figures 2 et Figures 12 et 13. Le dispositif de détection est composé d'une source (1) laser 1 W de longueur d'onde de 465 nm (ML-6500-465, Modulight ou F465-HS-1W, Laser2000), d'un système de collimation et de diminution de la taille du faisceau laser (2) constitué de deux lentilles (deux lentilles bi-convexes 01/2" de f =100 mm et de f=30 mm (Thorlabs)), 5 éventuellement d'un hacheur mécanique (4) (MC2000B-EC, Thorlabs), d'un support (6) de lames pour les échantillons, et d'un système de détection des photons émis. Pour collecter la luminescence émise par les nanoparticules dans l'échantillon, sont utilisés une lentille à grande ouverture numérique (10) (lentille bi-convexe, 0 =50,8 mm, f=100 mm (Thorlabs)) et deux filtres interférentiels 620±14-25 (FF01-620/14-25, 10 Semrock) pour éliminer spectralement les signaux parasites et un photomultiplicateur (12) (PMM02, Thorlabs). Un convertisseur analogique-digital (NI9215, National Instrument) permet d'enregistrer le signal grâce à un logiciel Labview. Tous les éléments de détection sont situés sur un même axe. Ainsi, le montage 15 est à la fois plus ergonomique et plus simple à régler. Un système de translation du support des lames (Z8253, KCH301 Thorlabs) a été mis en oeuvre afin de pouvoir observer plusieurs échantillons biologiques successivement par balayage (scanning). Détection résolue temporellement pour la mesure de la quantité de 20 nanoparticules en présence de signaux parasites Un hacheur mécanique peut être placé sur le trajet du faisceau laser pour créer des créneaux d'excitation laser afin d'éliminer les signaux parasites. En effet, lors de l'illumination de l'échantillon biologique par le faisceau laser, il est possible que d'autres molécules que les nanoparticules d'intérêt émettent de la fluorescence. L'utilisation d'un 25 hacheur mécanique et d'une fréquence de détection du signal par le photomultiplicateur de 100 kHz (une acquisition du signal toute les 10 las) permet de s'affranchir de cette fluorescence parasite. Il est ainsi possible du fait de la durée d'émission longue par les particules de l'invention, de faire une détection résolue en temps de l'émission, en particulier une 30 détection retardée de l'émission, comme décrit en détails ci-après. Une illumination modulée dans le temps permet de limiter la contribution au signal de luminescence d'espèces parasites présentes dans l'échantillon (sérum, sang ...) 61 ou dans les substrats solides utilisés (verre, plastique ...). En effet, les nanoparticules utilisées (YV04 :Eu ou GdVO4 :Eu par exemple) peuvent être placées (par illumination à 465 nm) dans un état excité de durée de vie longue, de l'ordre de quelques centaines de ps, par rapport aux durées de vie des fluorophores usuels, qui se situent dans le domaine 5 nanoseconde. Ceci permet la séparation temporelle des signaux de luminescence parasites du signal émis par les nanoparticules. La mise en oeuvre de la modulation peut se faire par l'utilisation d'un hacheur mécanique rotatif, de façon à obtenir une illumination périodique, à des fréquences comprises entre 100 et 1000 Hz. La figure 9 représente, de manière schématique, le profil 10 temporel d'illumination obtenu par hachage mécanique du laser d'excitation Le signal modulé obtenu est l'alternance d'une phase de déclin (fermeture du hacheur) et d'une phase de retour de luminescence (ouverture du hacheur) de l'ensemble des émetteurs présents dans l'échantillon. Le déclin/retour du signal de luminescence est déterminé par deux paramètres distincts : (i) les durées de vie des états excités des 15 émetteurs, et (ii) la dynamique d'occultation/de dévoilement du faisceau excitateur par le hacheur mécanique. La figure 10-a présente des exemples de déclin de luminescence après initiation de la fermeture du hacheur (t=0). L'analyse numérique a posteriori du signal permet d'isoler le signal dû aux nanoparticules, suivant par exemple les deux méthodes suivantes. 20 Méthode 1 : Détection retardée. Dans la phase de déclin de luminescence, la contribution des émetteurs parasites est concentrée aux temps courts, où l'occultation du faisceau excitateur n'est pas encore complète (figure 10-a). En supprimant cette partie (Figure 10-b, détection restreinte 25 à 170 ps après le début de l'occultation du faisceau d'excitation par la pale du hacheur), on obtient un signal dû exclusivement aux nanoparticules (superposition des courbes (b) et (c), la contribution de la fluorescence parasite de la lamelle, du sérum et de l'eau est éliminée), ce qui permet donc une estimation de leur nombre malgré la présence d'autres émetteurs. 30 62 Méthode 2 : Détection résolue en temps La luminescence des nanoparticules et des fluorophores parasites peut être modélisée par un système à deux niveaux (Figure 11). En ce cas, la forme du signal de luminescence PL(t) peut être déterminée à partir des caractéristiques des émetteurs : 5 PL(t) = lapN* = G Kt), k, N, (p] où I(t) est le profil temporel d'excitation ; N est le nombre total d'émetteurs d'un type et N* est le nombre d'émetteurs sur l'état excité ; k son taux de désexcitation ; cp son rendement quantique ; en résolvant numériquement le système d'équations différentielles résultant du modèle. 10 Le signal total peut alors s'écrire, PL(t) = G [1 (t), kNp, NNp, (pNp] F [1 (t), kF, NF, (p F] + B G où les indices NP et F désignent respectivement les nanoparticules et les fluorophores parasites et BG le signal de fond. L'ajustement du signal enregistré par cette fonction permet alors de déterminer 15 les différents paramètres, notamment NNP et kNp (Figure 11). Celui-ci est robuste, dans la mesure où kNp « kF. La détermination du nombre de nanoparticules accrochées à la surface NNP est alors effectuée sans ambigüité, malgré la présence d'émetteurs parasites dans l'échantillon, contribuant au signal brut. En pratique, la cinétique d'occultation mécanique de l'illumination aux fréquences utilisées (100-1000 Hz) est significativement plus lente 20 que le déclin de fluorescence des émetteurs parasites kF 109 s-1, de sorte que F [1 (t), kF, NF, cf) F]- K . 1 (t) . La mesure de NNP est alors effectuée par la méthode suivante : (i) détermination expérimentale du profil temporel d'illumination I(t)/I(0) par la mesure de l'autofluorescence d'un échantillon de calibration sans nanoparticules ; (ii) mesure du 25 signal de luminescence de l'échantillon cible et (iii) ajustement non-linéaire (méthode des moindres carrés) de ce signal par une fonction PL(t) = M. -1(0 + G [1 (t) , kNp, NNp, (pNp] 1(0) B G . Cet ajustement permet l'identification des paramètres M, kNp et (pNpNNp à un facteur multiplicatif instrumental près : ce dernier paramètre indique alors, pour des conditions de détection fixées, la quantité de nanoparticules déposées à la surface. 30 Variantes du montage expérimental Les nanoparticules sont excitées : 63 . soit en utilisant un fort angle d'incidence (angle entre la direction de propagation du faisceau laser et la verticale au support de l'échantillon) compris entre 60° et 63° (comme représenté schématiquement en Figure 12), . soit en utilisant un montage d'illumination de type TIRF (fluorescence par 5 réflexion totale interne) notamment à l'aide d'un parallélépipède de plexiglas 13 d'indice de réfraction supérieur ou égal à celui de la lame de verre qui sert de support d'échantillon (comme représenté schématiquement en Figure 13). Cette configuration permet d'obtenir un angle d'incidence sur l'interface verre/eau ou verre/sérum supérieur à 61,04° ce qui produit une réflexion totale du faisceau à cette interface et une excitation par onde 10 évanescente des nanoparticules ancrées à la substance à analyser. Trois variantes du montage expérimental ont été utilisées. Variante 1 : Détection en réflexion (vers le bas) sans hacheur (sauf lorsque cela est précisé) et sans excitation par onde évanescente (Figure 12-a). Dans la majorité des cas, 15 le temps d'acquisition est fixé à 30 s avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 100 ms. Le diamètre de la lentille de collection est de 30 mm au lieu de 50,8 mm. Variante 2 : Détection en transmission (vers le haut) (Figure 12-b). Il est possible d'effectuer des mesures avec ou sans hacheur et avec ou sans excitation par onde évanescente. Le temps d'acquisition est fixé à 1 s avec une valeur de voltage enregistrée 20 toutes les 10 ùs. Cette variante comporte le système de translation du support des lames (Z8253, KCH301 Thorlabs). Variante 3 : Montage transportable avec détection en transmission (vers le bas). Il est possible d'effectuer des mesures avec ou sans hacheur et avec ou sans excitation par onde évanescente. Le temps d'acquisition est fixé à 1 s avec une valeur de voltage 25 enregistrée toutes les 10 ùs. Pour chaque concentration d'échantillon à détecter, plusieurs mesures (N mesures, N supérieur ou égal 5) à différentes positions de la lamelle sont effectuées. Chaque mesure est la moyenne de 100 000 valeurs enregistrées pendant 1 s avec un taux 30 d'acquisition de 100 kHz (1 valeur de voltage enregistrée toutes les 10 ùs) sauf dans le cas de la variante 1 du montage expérimental où le temps d'acquisition était de 30 s avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 100 ms. 64 La valeur du signal indiquée sur les graphes et sa barre d'erreur correspondent, respectivement, à la moyenne des N mesures et à leur écart-type. Dans la plupart des cas, la valeur du signal pour une concentration de la molécule à détecter égale à zéro, a été soustraite à toutes les valeurs mesurées pour les différentes concentrations. Ainsi la valeur 5 du signal pour une concentration égale à zéro, apparaît à zéro. Cependant, l'écart-type indiqué permet de se prononcer sur la capacité à détecter une concentration donnée. Typiquement, on considère que la limite de détection est déterminée par la concentration générant un signal égal à 3 fois l'écart-type du signal obtenu à concentration nulle (« blanc »). La limite de quantification est déterminée par la concentration générant un 10 signal 10 fois supérieur à cet écart-type à concentration nulle. Pour les expériences réalisées avec une excitation en onde évanescente, une collection de la luminescence par le haut est préférable. En effet, la luminescence émise par l'échantillon vers le bas est réfractée vers des grands angles par le parallélépipède en plexiglas et, de ce fait, une plus faible fraction est collectée par la lentille de collection en 15 présence du parallélépipède permettant de réaliser l'excitation en onde évanescente. Calibration de l'appareil de détection Préalablement aux mesures, l'appareil de détection a été calibré avec des nanoparticules en solution, suivant les variantes 2 (détection vers le haut avec hacheur et 20 avec excitation par onde évanescente) et 3 (détection vers le bas, sans hacheur et sans excitation par onde évanescente). Le protocole de calibration est le suivant : Les lamelles de verres sont activées au préalable au plasma cleaner. - dépôt d'une solution de nanoparticules diluée dans du PBS de concentration 25 connue sur la lamelle de verre ; - incubation pendant 2 heures ; - rinçage au moins 3 fois avec de l'eau ultra-pure. Le temps d'acquisition est fixé à 1 s avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 10 ps. 30 Les courbes de calibration de l'appareil de détection obtenues suivant les deux variantes sont représentées en Figure 14-a et 14-b. iii. Résultats des essais de détection/quantification Détection et quantification d'une substance dans un échantillon La concentration d'une substance dans un échantillon est détectable lorsque le signal obtenu est au moins trois fois supérieur à l'écart-type du signal pour un échantillon 5 de même composition contenant une concentration nulle de la substance. Pour réaliser la quantification de la substance à analyser (i.e. déterminer sa concentration), le protocole suivant doit être mis en oeuvre : i) réaliser une série de mesures de calibration avec la substance à analyser à différentes concentrations connues, par exemple à partir de substances obtenues dans le 10 commerce ou à partir d'une purification. Dans la mesure du possible, les échantillons de calibration doivent être préparés avec la même composition que les échantillons à mesurer ou avec une composition la plus proche possible. Faire un ajustement des points obtenus (signal en mV versus concentration de la substance à analyser) ; ii) réaliser les mesures des échantillons à analyser (obtention de la valeur du 15 signal en mV) ; iii) attribuer à chaque échantillon mesuré une valeur de concentration de la substance à partir du signal mesuré (en mV) et à partir de la courbe de calibration réalisée en étape i) et son ajustement. La concentration d'une substance dans un échantillon est quantifiable lorsque 20 le signal obtenu est au moins dix fois supérieur à l'écart-type du signal pour un échantillon de même composition contenant une concentration nulle de la substance. Détection de l'insuline Les échantillons analysés sont soit des solutions d'insuline recombinante dans 25 du PBS + 5% de BSA ou d'insuline dans du sérum (échantillons fournis par Cerba Specimen Services avec des concentrations d'insuline déterminées préalablement par des techniques de référence). Pour les échantillons d'insuline recombinante en solution dans du PBS + 5% de BSA, l'insuline recombinante fournie par le kit ELISA pour les expériences de 30 calibration associées a été utilisée. Les différents échantillons ont été préparés par dilutions successives selon le protocole indiqué par le fournisseur du kit. 66 Pour les échantillons d'insuline dans du sérum, les solutions ont été utilisées telles quelles pour les plus fortes concentrations. Des échantillons de très faibles concentrations n'étant pas disponibles, ils ont été préparés en diluant dans du PBS + 5% de BSA les échantillons contenant les concentrations les plus faibles disponibles. 5 Détection par ELISA A titre de comparatif, la détection de l'insuline recombinante a été opérée en solution par un kit ELISA dans une plaque de 96 puits. Les conditions expérimentales suivies sont celles indiquées par le fournisseur du kit ELISA. L'absorbance du puits qui 10 n'a pas été incubé avec de l'insuline (concentration zéro) a été soustraite des valeurs d'absorbance mesurées pour les puits ayant été incubés avec les différentes concentrations d'insuline. Deux puits ont été utilisés pour chaque valeur de concentration et l'écart-type pour ces deux mesures est indiqué comme la barre d'erreur dans la figure 15. La concentration la plus faible mesurée est de 187 pg/mL (ou 33 pM). L'écart-type pour la 15 concentration zéro est de 0,0035. La valeur d'absorbance mesurée pour la concentration 187 pg/mL (ou 33 pM) est de 0,0085, juste en dessous de la valeur limite de 0,0105 égale à 3 fois l'écart-type déterminé pour la concentration zéro. Selon les spécifications du fournisseur (ABCAM Réf ab100578), la détection par un kit ELISA classique ne permet pas de détecter des concentrations en-deçà de 50 pg/mL (ou 9 pM) (Figure 15). 20 Détection ultra-sensible selon l'invention - La Figure 16 montre le signal obtenu pour des échantillons d'insuline recombinante en solution pour différentes concentrations, la concentration la plus faible étant de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), avec la variante 1 de l'appareil de détection. Le temps 25 d'acquisition est de 30 secondes, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 100 ms. Dans l'encart de la Figure 16, le signal sans insuline a été soustrait. La concentration minimale pouvant être détectée est ainsi 1000 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) en utilisant les mêmes anticorps que le kit ELISA. 30 - La Figure 17 montre le signal obtenu pour des échantillons d'insuline recombinante en solution pour différentes concentrations, la concentration la plus faible 67 étant de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), avec la variante 2 de l'appareil de détection (détection par le haut), sans hacheur et sans excitation par onde évanescente. Le temps d'acquisition est de 1 seconde, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 10 las. La concentration minimale détectée est ainsi 1000 fois plus faible que la 5 concentration détectable par ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) en utilisant les mêmes anticorps que le kit ELISA. - La Figure 18 montre le signal obtenu pour des échantillons d'insuline recombinante en solution pour différentes concentrations, la concentration la plus faible 10 étant de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), avec la variante 2 de l'appareil de détection (détection par le haut), avec hacheur et avec excitation par onde évanescente. Le temps d'acquisition est de 1 seconde, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 10 las. La concentration minimale détectée est ainsi 1000 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) en utilisant les mêmes anticorps 15 que le kit ELISA. - La Figure 19 montre le signal obtenu pour des échantillons de sérum contenant de l'insuline (échantillons fournis par CERBA Specimen Services et dilués dans du PBS + 5% BSA pour les concentrations les plus faibles. Pour obtenir les échantillons 20 aux concentrations les plus faibles, l'échantillon contenant de l'insuline à environ 8 pM a été dilué sur plaque multipuits IBIDI, avec la variante 1 de l'appareil de détection. Le temps d'acquisition est de 30 secondes, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 100 ms. La concentration minimale détectée est de 9 fM (ou 0,05 pg/mL), soit 1000 fois 25 plus faible que la concentration détectable par ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) en utilisant les mêmes anticorps que le kit ELISA. Détection de la TSH Les échantillons analysés sont des solutions de TSH recombinante de poids 30 moléculaire 15 639 Da dans du PBS + 5% de BSA. Les anticorps utilisés sont ceux du kit ABCAM Ref. ab 100660. 68 Détection ultra-sensible selon l'invention La Figure 20 montre le signal obtenu pour des échantillons de TSH recombinante en solution pour différentes concentrations, la concentration la plus faible étant de 3,2 fM (1,4 fg/mL), avec la variante 1 de l'appareil de détection avec hacheur. Le 5 temps d'acquisition est de 1 seconde, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 10 1.1S. En comparaison, la concentration minimale pouvant être détectée par le kit ELISA est selon le fournisseur typiquement moins de 4 pg/mL. Ainsi, la concentration minimale détectée selon l'invention est plus de 1000 fois plus faible que la concentration 10 détectable par le kit ELISA. EXEMPLE 4 Ajustement du temps d'incubation Le temps d'incubation nécessaire pour maximiser le signal dans le cas de la 15 détection de l'insuline recombinante en solution (50 pg/mL d'insuline) peut être préalablement déterminé par des mesures de luminescence obtenues pour différents temps d'incubation entre les supports d'échantillon comportant la substance à analyser (ici l'insuline recombinante) immobilisée sur leurs surfaces (immobilisation effectuée selon le protocole décrit en exemple 2ii) et les conjugués anticorps-nanoparticules (obtenus selon le 20 protocole décrit en exemple 1 avec 10 i.tg/mL d'anticorps), étape effectuée selon le protocole décrit en exemple 3.i. Les mesures ont été faites avec la variante 1 de l'appareil de détection décrite en exemple 3. Le temps d'acquisition est de 30 secondes, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 100 ms. 25 La Figure 21 représente l'évolution du signal de luminescence détecté en fonction du temps d'incubation. Il apparaît nécessaire de laisser incuber les nanoparticules couplées aux anticorps avec la surface sur laquelle est immobilisée la substance à analyser (ici l'insuline 30 recombinante) pendant 45 minutes minimum pour maximiser le signal de luminescence détecté. Ce temps nécessaire peut varier selon la substance à analyser et l'anticorps utilisé. 69 EXEMPLE 5 Expérience de multiplexage spatial Pour illustrer la possibilité d'effectuer une détection "multiplexée" selon le procédé de l'invention (schéma de principe du multiplexage spatial représenté en Figure 5 22), l'expérience suivante a été réalisée. Deux zones ou « spots » contenant des nanoparticules ont été créés en déposant deux gouttes de deux solutions de nanoparticules telles qu'obtenues suivant le protocole décrit en exemple 1 (partie 1.1, nanoparticules telles qu'obtenues après synthèse) de deux concentrations différentes (4 mM et 8 mM) sur des lamelles en verre nettoyées suivant le 10 protocole décrit en exemple 2. Ici les gouttes contenant les nanoparticules ont été laissées sécher avant le début des mesures de luminescence, sans étape de rinçage. Le schéma en Figure 23 indique le diamètre du faisceau laser au niveau de l'échantillon selon la direction de déplacement (3 mm), le diamètre (2 mm) et la distance entre les deux « spots « de nanoparticules (1 mm). 15 Les mesures sont effectuées avec la variante 2 du montage expérimental décrite en exemple 3 (détection vers le haut, avec hacheur et sans excitation par onde évanescente). Grâce au système de déplacement motorisé du porte-échantillon, le signal émis par les nanoparticules a été détecté à plusieurs localisations : avant le premier « spot » (position 1), dans le premier « spot » (position 4), entre les deux « spots » (position 6), 20 dans le deuxième « spot » (position 7) et enfin après le deuxième « spot » (position 9). Pour chaque position du faisceau laser excitateur, le temps d'acquisition est de 1 seconde, avec une valeur de voltage enregistrée toutes les 10 las. La Figure 23 représente le signal de luminescence détecté pour les différentes localisations précitées. Les deux pics de localisations et d'amplitudes différentes montrent 25 la possibilité de différencier des dépôts spatialement organisés, comme cela est nécessaire pour une mesure multiplexée. Références [1] Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; 30 [2] Mas on, Fluorescent and Luminescent Probes for Biological ActiviC). A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis, Second Edition, Academic Press, 1999; [3] Medintz et al., Nat. Mat., 2005, 4, pp. 435-446; [4] Nam et al., Science, 2003, 301, pp. 1884-1886; [5] H. Li et al., Analyst, 2011, 136, pp. 1399-1405 ; [6] Z. Cao et al., Anal. Chim. Acta, 2011, 698, pp. 44-50; 5 [7] Pisanic et al., Analyst, 2014, 139(12), pp. 2968-2981 ; [8] Geissler et al., Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49(8), pp. 1396-1401 ; [9] Howes et al., Bionanotechnology, 2014, 346(6205), pp.53-63 ; [10] Giljohann et al., Angewandte Chem, 2010, 49, pp. 3280-3294; 10 [11] De La Rica et al., Nature Nanotechnology, 2012, 7, pp. 821-824; [12] Zhu et al., Anal. Chem., 2013, 85(2), pp 1058-1064; [13] Cordeiro et al., Diagnostics, 2016, 6(4):43; [14] Riwotzki et al., J. Phys. Chem. B, 1998, 105, pp. 12709-127; [15] Huignard et al., Chem. Mater., 2000, 12, pp. 1090-1094; 15 [16] Bouzigues et al., ACS Nano, 2011, 5(11) pp. 8488-8505; [17] Dosev et al., J. Biomed. Opt., 2005, 10(6), 064003 ; [18] Yi et al., Nano Letters, 2004, 4(11), pp. 2191-2196; [19] Beaurepaire et al., Nano Letters, 2004, 4(11), pp. 2079-2083 ; [20] Turkcan et al., Biophysical Journal, 2012, 102, pp. 2299-2308; 20 [21] Yuan et al., Trends in Analytical Chemistry, 2006, 25(5), pp.490-500 ; [22] Tang et al., Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(3), pp. 408-413 ; [23] Hârmâ et al., 2001, Clinical Chemistry, 47(3), pp. 561-568; [24] Corstjens et al., Clinical Biochemistry, 2008, 41(6) pp. 440-444; [25] Hemmilâ et al., Analytical Biochemistry, 1984, 137(2), pp. 335-343 ; 25 [26] Jiang et al., Journal of Fluorescence, 2010, 20(1), pp 321-328; [27] Tanja et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, 380(1), pp 24- 30 ; [28] Zhou et al., Angewandte Chimie, 2014, 126(46), pp. 12706-12710; [29] Riwotzki et al. J. Phys. Chem. B, 1998, 102, 10129; 30 [30] Meza et al. J. Phys. Chem. A, 2014, 118, 1390; [31] Dordevic et al. J. Res. Phys., 2013, 37, 47 ; [32] Casanova et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 12592; 71 [33] Giaume et al., Langmuir, 2008, 24, pp. 11018-11026; [34] Abdesselem et al., ACS Nano, 2014, 8(11), pp. 11126-11137; [35] Casanova et al., Appl. Phys. Lett, 2006, 89, 253103 ; [36] Son et al., Journal of Nanoscience and Nanotechnology, vol. 8, 2463- 5 2467, 2008; [37] Nichkova et al., Anal. Chem. 2005, 77, REVENDICATIONS1. Procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d'une substance d'intérêt biologique ou chimique dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par détection de l'émission de luminescence par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes suivantes : (i) mise en oeuvre de particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une nanoparticule inorganique photoluminescente formée d'une matrice cristalline présentant au moins 103 ions de terres rares, et couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser, dans des conditions propices à leur association avec la substance à analyser de l'échantillon, lesdites nanoparticules présentant une taille moyenne comprise entre 20 et 100 nm, et étant aptes à émettre de la luminescence après absorption d'un photon ; (ii) excitation des ions de terres rares des particules associées avec la substance à analyser, par un dispositif d'illumination, en particulier de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW, de préférence d'au moins 500 mW, et d'une intensité d'excitation d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/cm2 ; (iii) détection de l'émission de luminescence par les particules, et (iv) détermination de la présence et/ou concentration de la substance par interprétation de ladite mesure de luminescence, le cas échéant par référence à un étalon ou étalonnage. 2. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la substance à analyser dudit échantillon en étape (i) est préalablement immobilisée à la surface d'un support, ladite surface étant passivée de manière à ce que lesdites particules luminescentes ne s'y fixent pas en l'absence de la substance à analyser. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, pour la détection et/ou la quantification d'une substance d'intérêt présente dans l'échantillon en une teneur strictement inférieure à 10 pM, en particulier inférieure à 1 pM, voire inférieure à 0,1 pM, ou encore inférieure à 0,01 pM. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est un échantillon biologique, en particulier un échantillon de 73 prélèvement humain, et plus particulièrement choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, la salive, l'urine et le liquide cérébro-spinal. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détection et/ou la quantification de biomarqueurs, d'anticorps, d'ADN et/ou d'ARN 5 dans un échantillon biologique. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit agent de ciblage est choisi parmi un anticorps polyclonal ou monoclonal, un fragment d'anticorps, un nanobody, un oligonucléide, un peptide, une hormone, un ligand, une cytokine, un peptidomimétique, une protéine, un carbohydrate, une protéine 10 modifiée chimiquement, un acide nucléique modifié chimiquement, un carbohydrate modifié chimiquement qui cible une protéine de surface cellulaire connue, un aptamère, un assemblage de protéines et d'ADN/ARN ou un chloroalcane utilisé par les marquages de type HaloTag, en particulier est un anticorps ou fragment d'anticorps. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 15 lequel le produit entre le taux de dopage en ions de terres rares et le rendement quantique de l'émission par la nanoparticule est maximisé, en particulier dans lequel la nanoparticule présente une cristallinité imparfaite. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules présentent une durée de vie d'émission supérieure ou égale à 20 5 las, en particulier supérieure ou égale à 10 las, notamment supérieure ou égale à 20 las, voire supérieure ou égale à 50 las. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules présentent une taille moyenne supérieure ou égale à 25 nm, en particulier supérieure ou égale à 30 nm, notamment comprise entre 30 et 60 nm. 25 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les ions de terres rares sont des ions lanthanides choisis parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le praséodymium (Pr), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb), le cérium (Ce), l'holmium (Ho), le terbium (Tb), le prométhium (Pm), le thulium (Tm) et leurs mélanges, en particulier choisis parmi Eu, Dy, Sm, Nd, 30 Er, Yb et leurs mélanges, et en particulier Eu. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules sont de formule (I) suivante : 74 (Ai _,Ln,),(Mp0q) (I) dans laquelle : - M représente un ou plusieurs éléments susceptibles de s'associer avec l'oxygène (0), et éventuellement avec d'autres cations, pour former un composé cristallin, 5 en particulier M représente un ou plusieurs éléments choisis parmi V, P, W, Mo, As et Al; - Ln correspond à un ou plusieurs ion(s) lanthanide(s) luminescent(s), en particulier tels que définis en revendication 10; - A correspond à un ou plusieurs ion(s) constituant(s) de la matrice cristalline dont les niveaux électroniques ne sont pas impliqués dans le processus de luminescence, en 10 particulier choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La), le bismuth (Bi) et leurs mélanges, notamment A représente Y ou Gd et de préférence A représente Y; - 0 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les nanoparticules étant de formule : A1,LnSO4(i_y)(PO4)y (II) dans laquelle : 20 . A est choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y; . Ln est choisi parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ; 25 . 0 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel lesdites nanoparticules de formule (II) présentent en surface des cations tétraalkylammonium, en particulier des cations de formule NR4+ avec R, identiques ou différents, représentant un groupe Ci-C6- 30 alkyl, en particulier C1-C4-alkyl, plus particulièrement C1-C3-alkyl, et notamment choisis parmi les cations tétraméthylammonium, tétraéthylammonium, 75 tétrapropylammonium, tétrabutylammonium et leurs mélanges, de préférence lesdits cations tétraalkylammonium sont des cations tétraméthylammonium. 14. Procédé selon la revendication précédente, lesdites nanoparticules étant de formule (II') 5 Ai,LnxV040-ye04)y (NR4)z ) dans laquelle : . A est tel que défini en revendications 12; . Ln est tel que défini en revendications 12; . 0 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites nanoparticules sont de formule Y1,EuSO4, dans laquelle 0 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 20 lequel les nanoparticules présentent à l'issue de leur synthèse un potentiel zêta, en valeur absolue, notée IQ, en milieu aqueux à pH de 5, supérieur à 30 mV. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 16, dans lequel l'étape (i) comprend au moins les étapes suivantes : (a) disposer d'un support dont la surface est préalablement passivée et 25 fonctionnalisée avec un agent de ciblage de la substance à détecter/quantifier, par exemple un premier anticorps monoclonal, dit anticorps de capture ; (b) mettre en contact ledit échantillon à analyser avec le support de l'étape (a) dans des conditions propices à l'association de ladite substance avec l'agent de ciblage ; et (c) mettre en contact les particules photoluminescentes couplées à au moins un 30 agent de ciblage avec ledit support issu de l'étape (b) pour associer les particules avec ladite substance immobilisée à la surface du support. 76 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, dans lequel ledit support est de type lamelles, plaques multi-puits, microplaques, gels membranes, bandelettes ou microcanaux. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 18, dans lequel 5 l'excitation en étape (ii) est opérée avec un faisceau d'excitation laser orienté de sorte à former un angle d'incidence avec la verticale du support présentant en surface lesdites particules associées à la substance à analyser, supérieur ou égal à 550 . 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 19, comprenant l'excitation des particules par onde évanescente, en particulier à l'aide d'un montage 10 d'illumination laser de type TIRF, permettant un angle d'incidence du faisceau excitateur supérieur ou égal à 61° dans le cas d'une interface verre/eau entre le support et l'échantillon à analyser. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la durée de vie d'émission par les nanoparticules est supérieure ou égale à 1 las, 15 en particulier supérieure ou à égale à 50 las, la détection de l'intensité lumineuse en étape (iii) comprenant une détection résolue en temps de l'émission, en particulier une détection retardée du signal émis par les particules photoluminescentes. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détection et/ou quantification simultanée d'au moins deux substances différentes dans 20 un échantillon. 23. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel les substances à analyser dudit échantillon sont immobilisées en des zones prédéfinies et distinctes à la surface d'un support, ladite surface étant passivée de manière à ce que les particules photoluminescentes ne s'y fixent pas en l'absence des substances à analyser. 25 24. Procédé selon la revendication 22 ou 23, mettant en oeuvre au moins deux types de nanoparticules ayant des longueurs d'ondes d'émission distinctes et couplées à des agents de ciblage de chacune des substances à analyser. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif d'illumination laser en étape (ii) comprend un montage optique, en 30 particulier un système d'au moins une lentille, disposé sur la trajectoire du faisceau laser de manière à contrôler la taille du faisceau au niveau de la zone du support présentant les particules associées à la substance à analyser. 77 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détection de l'émission de luminescence en étape (iii) est opérée par un dispositif de détection de l'intensité lumineuse comprenant un détecteur unique, par exemple de type photomultiplicateur, photodiode, photodiode à avalanche, ou un 5 détecteur de type réseau de dispositifs photosensibles consistant en une surface 2D de pixels de détection tel qu'une caméra CCD ou EM-CCD ou caméra CMOS. 27. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif de détection comprend un montage optique, en particulier un système d'au moins une lentille à grande ouverture numérique, pour focaliser l'émission de luminescence vers le 10 détecteur, en particulier vers le photomultiplicateur. 28. Utilisation du procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, à des fins de diagnostic in vitro. 29. Ensemble de diagnostic in vitro comprenant au moins : - des particules photoluminescentes formées en tout ou partie d'une 15 nanoparticule inorganique photoluminescente telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 et 8 à 16, lesdites particules étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l'acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou 20 couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance à analyser ; ou lesdites particules étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance à analyser ; et 25 - un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : . un dispositif d'illumination, de préférence de type laser, d'une puissance d'au moins 50 mW voire d'au moins 500 mW, et un montage optique de mise en forme du faisceau laser permettant d'obtenir une intensité d'excitation au niveau de l'échantillon d'au moins 1 W/cm2, de préférence d'au moins 10 W/ cm' 30 . un appareil de détection de l'intensité lumineuse émise par les particules. 78 30. Ensemble de diagnostic selon la revendication précédente, comprenant au moins un support adéquat pour l'immobilisation de la substance à analyser dudit échantillon.