FR 3070046 A1 20190215 FR 1757574 A 20170808 MILIEU DE CULTURE POLYVALENT POUR BACTERIES ANAEROBIES EN AEROBIE La présente invention concerne un milieu de culture polyvalent pour bactéries anaérobies en aérobie dans des flacons d'hémoculture. Les bactéries anaérobies sont des bactéries sensibles à l'oxygène. Il existe les bactéries anaérobies strictes (extrêmement sensible à l'oxygène), qui ne doivent en aucun cas être au contact de l'oxygène pour avoir une croissance, et les bactéries aéro-anaérobies tolérantes, qui peuvent être exposées à une faible concentration en oxygène, sans que leur croissance ne soit inhibée. Cette sensibilité à l'oxygène est liée au fait qu'il manque à ces bactéries des systèmes enzymatiques. Ces derniers permettent normalement la détoxification des espèces réactives de l'oxygène ; l'absence de cette détoxification conduit à une action toxique de l'oxygène sur ces bactéries. Pour permettre la croissance de ces bactéries anaérobies strictes ou aéroanaérobies tolérantes, des procédés de culture « sans oxygène » ont été mis en place [1]. Raccourcir le délai pour le diagnostic des bactériémies reste un défi majeur pour les microbiologistes. La fiabilité et la rapidité du diagnostic sont des éléments clés pour une amélioration de la prise en charge des patients. A cet égard, malgré la commercialisation de nombreux systèmes moléculaires, la culture en milieu de culture liquide demeure à ce jour le standard optimal dans le diagnostic des bactériémies dans des échantillons cliniques de prélèvement de fluide ou secrétions corporels tel que échantillon de selles, de crachats, de secrétions vaginales, ou échantillons sanguins. Il repose sur l'incubation de deux flacons en contenant, pour bactéries anaérobie et respectivement aérobie dans des systèmes de culture automatisés détectant la croissance bactérienne. Actuellement, le diagnostic hospitalier des bactéries anaérobies se fait le plus généralement en culture liquide dans des flacons de culture en milieu liquide contenant une atmosphère anaérobie, c'est-à-dire une atmosphère qui ne contient pas d'oxygène, où l'oxygène atmosphérique est remplacé par de l'azote, en utilisant un procédé de dégazage. Les bactéries anaérobies et aérobies sont cultivées dans des flacons de culture différents, à savoir qu'on réalise l'incubation de deux flacons, 2 anaérobie et aérobie dans des systèmes de culture automatisés détectant la croissance bactérienne. Afin de minimiser le nombre de flacons à prélever pour diagnostiquer une bactériémie ou pour cultiver des bactéries dans le cadre de la recherche, les 5 inventeurs ont cherché à fournir un milieu de culture liquide qui permettrait à la fois la croissance des bactéries aérobies et des anaérobies en atmosphère aérobie. Il a été récemment rapporté la mise en évidence de la croissance en atmosphère aérobie d'espèces de bactéries strictement anaérobies comprenant un milieu de culture de base supplémenté par des composés antioxydants [2]. lo Dans W02014/064359 et W02015/162377, on a décrit des milieux de culture enrichis en agents antioxydants à savoir l'acide urique, l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium qui permettent d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries anaérobies strictes ou des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment 15 des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air. Les meilleurs résultats décrits dans WO 2015/162377 concernaient des milieux de culture supplémentés en un mélange d'antioxydants incluant l'acide urique. 20 Après avoir testé les milieux de culture supplémentés par des composés antioxydants décrits dans W02014/064359 et W02015/162377 sous forme liquide pour hémoculture, les inventeurs ont remarqué que certaines bactéries anaérobies, incluant des bactéries parmi les plus communément retrouvées en pratiques hospitalières, n'avaient pas de croissance en aérobie, à savoir Bacteroides fragilis, 25 Bacteroldes nordi,, Bacteroldes thetabtaomicron, Clostndium beifeinnckii, Clostridium butyricum, ClostndlUm massilloamazontensis, ClostndlUm Irregulare, finegoldia magna, PropionibactenUm acnes et PropionibactenUm awdum. Sur la base des mélanges de composés antioxydants décrits antérieurement, le meilleur mélange apparaissait être la combinaison de hydrosulfure de sodium 30 (Na25), L-Cystéine, acide ascorbique, acide urique et glutathion. Mais, les milieux de 3 culture pour bactéries anaérobies supplémentés par ce mélange de composés antioxydant ne permettaient pas la croissance des bactéries anaérobies difficiles à cultiver en aérobies décrites ci-dessus. En outre, selon la présente invention, les inventeurs ont recherché un 5 nouveau milieu de culture liquide polyvalent pour les cultures de bactéries aérobies et anaérobies en atmosphère aérobie en l'absence d'acide urique car celui-ci présente des propriétés de dilution réduite ce qui se traduit par des taux de dissolution en solution aqueuse non reproductibles de façon déterminée quantitativement d'échantillon à échantillon. 10 Selon la présente invention, les inventeurs ont donc recherché un nouveau milieu de culture liquide polyvalent pour les cultures de bactéries aérobies et anaérobies en atmosphère aérobie en l'absence d'acide urique et présentant en outre des propriétés améliorées de croissance notamment vis-à-vis des bactéries anaérobies fastidieuses communément rencontrées telles que Bacteroides fragllis, 15 Bacteroldes nordi,, Bacteroldes thetabtaomicron, Clostndium beifeinnckii, Clostridium butyricum, ClostndlUm massilloamazontensis, ClostndlUm Irregulare, finegoldia magna, PropionibactenUm acnes et Propionibacterium awdum. Pour ce faire, les inventeurs ont testé un grand nombre de combinaisons de divers composés antioxydants rapportés ci-après (cf tableau 2) qui ont permis de 20 définir de manière surprenante un milieu de culture liquide supplémenté en composés antioxydants présentant des propriétés de croissance de bactéries anaérobies en aérobie améliorées par rapport à la combinaison de hydrosulfure de sodium (Na25), L-Cystéine, acide ascorbique et glutathion avec ou sans acide urique, à savoir le mélange de 7 composés antioxydants suivants : hydrosulfure de sodium 25 (Na25), L-Cystéine, acide ascorbique, glutathion, et trois antioxydants supplémentaires, à savoir la catalase, l'ubiquinol et l'acide lipoïque. Ces milieux ont été testés pour la culture des 13 bactéries anaérobies fastidieuses incluant les bactéries anaérobies citées ci-dessus et 20 bactéries aérobies les plus communément rencontrées en routine hospitalière décrites ci-après. 30 La présente invention fournit un milieu de culture liquide polyvalent pour culture en atmosphère aérobie de bactéries anaérobies ou bactéries aérobies 4 comprenant un milieu de culture de base pour bactéries aérobies et anaérobies caractérisé en ce qu'il comporte en outre le mélange de composés antioxydants suivants: hydrosulfure de sodium (Na2S), L-Cystéine, acide ascorbique, glutathion, catalase, ubiquinol et acide lipoïque. 5 Plus particulièrement, le milieu de culture selon l'invention comprend les dits composés antioxydants aux quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : - Hydrosulfure de sodium : au moins 0,25 g (0,025%), de préférence de 0,25 g à 0,5 g (0,025 à 0,05 °/0) - L-Cystéine : au moins 0,25 g (0,025%), de préférence de 0,25g à 0,5 lo g (0,025 à 0,05 °/0) - Acide ascorbique : au moins 0,5 g (0,05%), de préférence de 0,5 à 1 g (0,05 à 0,1 0/0) - Glutathion : au moins 0,1 g (0,01%), de préférence de 0,1 à 0,5 g (0,01 à 0,05 °/0) 15 - Catalase : au moins 0,06 g (0,006%), de préférence de 0,06 à 0,16 g (0,006 à 0,016 °/0) - Ubiquinol : au moins 0,06 g (0,006%), de préférence de 0,06 à 0,16 g (0,006 à 0,016 °/0) - Acide lipoïque : au moins 0,01 g (0,001%), de préférence de 0,01 à 0,015 20 g (0,001 à 0,0015 °/0) Plus particulièrement encore, le milieu de culture selon l'invention comprend les composants nutritifs suivants dans le dit milieu de culture de base : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisies parmi un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, 25 - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - au moins un sucre, et - au moins un sel de métaux choisis parmi K, Mg, Na et Ca, de 5 préférence NaCI, - ainsi que - au moins une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, de préférence K2HPO4 ou NaHCO3 pour ajuster le pH à 7,5, et 5 - au moins une vitamine ou facteur de croissance. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie comprenant des composants nutritifs choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une 10 peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base est un milieu acellulaire choisi parmi un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et un milieu acellulaire 15 comprenant un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie anaérobie, notamment un milieu comprenant des composants choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de 20 tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base est un milieu conventionnel de culture de bactéries anaérobies tel que les milieux dits bouillon de type coeur-cervelle, milieux Columbia à 5% de sang de mouton ou milieu Schaedler 25 tels que décrits ci-après. D'autres milieux conventionnels appropriés sont les milieux Brucella ou Wilkins-Chagren. De tels milieux de culture acellulaires sont bien connus de l'homme de l'art. On peut utiliser en particulier des milieux de culture polyvalents pour microorganismes anaérobies, notamment le milieu de Schaedler, ledit milieu étant 6 complémenté en composés hydrocarbonés, de préférence de l'amidon et de(s) sucre(s), et en dit(s) composé(s) antioxydant(s). Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base est un milieu de culture liquide pour culture de bactéries anaérobies dans un échantillon sanguin, 5 selle, crachat ou sécrétion vaginale. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base comprend les composants nutritifs suivants: - Hydrolisat de caséine ; - Protéose peptone ; 10 - Extrait de levure ; - Chlorure de sodium (NaCI) ; et - Glucose, et - un facteur de croissance : a-cétoglutarate. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture de base comprend les 15 composants suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : - Hydrolisat de caséine: 15 g (1,5 °/0) - Proteose peptone: 15 g (1,5 °/0) - Extrait de levure: 10 g (1 %) 20 - a-cétoglutarate : 2 g (0,2 0/0) - Chlorure de sodium (NaCI) : 5 g (0,5 °/0) - Glucose: 10 g (1 0/0) - Dipotassium phosphate (K2HPO4) : 0,83 g (0,083 °/0) - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,5 g (0,05 °/0) 25 - L-Cystéine : 0,5 g (0,05 °/0) 7 - Acide ascorbique : 1 g (0,1 0/0) - Glutathion : 0,1 g (0,01 °/0) - Catalase : 0,16 g (0,016 °/0) - Ubiquinol : 0,16 g (0,016 %) 5 - Acide lipoïque : 0,010 g (0,001 °/0) Le pH de la solution étant ajusté à 7,5±0,2 avec du KOH 10M. La présente invention a également pour objet un procédé de culture in vitro d'une bactérie aérobie ou anaérobie sous atmosphère aérobie avec un milieu de culture selon l'invention. 10 Plus particulièrement, on réalise une culture d'une dite bactérie dans un échantillon de sang, selle, crachat ou sécrétion vaginale. Plus particulièrement encore, on réalise une culture d'une dite bactérie anaérobie stricte fastidieuse choisie parmi Akkermansia muctehtla, Bacteroides fragllis, Bacteroides nordi, Bacteroides thetaiotaomicron, ClostndlUm beijeinnckii, 15 ClostndlUm butyricum, ClostndlUm massilioamazoniensis, ClostndlUm irregulare, Finegoldia magna, PropionibactenUm acnes et PropionibactenUm aveum, Prevotella denticola et Prevotella histicola. Plus généralement, le milieu selon la présente invention permet aussi la culture de bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et 20 notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air en l'absence de milieu de culture spécifique tel qu'un milieu selon la présente invention. On distingue donc parmi les bactéries sensibles à l'oxygène : 25 - les bactéries microaérophiles c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver sous une atmosphère comprenant la concentration d'oxygène ambiante qui est de environ 21%, notamment entre 1% et 20%, le plus communément à environ 2-2,5%, et 8 - les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures aux concentrations de microaérophilie, notamment strictement inférieure à 1%, le plus communément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Pour cultiver les bactéries 5 anaérobies strictes, en l'absence de milieu de culture spécifique tel qu'un milieu selon la présente invention, il faut soit les cultiver dans des étuves ne comportant pas d'oxygène, soit dans des tubes qui ont été désoxygénés et elles ne poussent alors qu'au fond du tube. Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les io bactéries extracellulaires, c'est-à-dire des bactéries qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Parmi les bactéries cultivables en atmosphère microaérophile, on distingue plus particulièrement, les bactéries intracellulaires, mais aussi des bactéries extracellulaires. On entend ici par «bactérie intracellulaire», une bactérie qui a la 15 capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte. Les bactéries intracellulaires, ayant la faculté de croître dans certaines conditions dans des milieux acellulaires, sont dénommées "bactéries intracellulaires facultatives". On entend ici par : - «bactérie intracellulaire facultative », une bactérie qui a la capacité de 20 se multiplier au sein d'une cellule hôte en milieu acellulaire, et - «bactérie extracellulaire », une bactérie qui n'a pas la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte et se cultive exclusivement en milieu acellulaire. On entend ici par «milieu de culture acellulaire», un milieu de culture qui ne comprend pas de cellules entières notamment qui ne comprend pas de cellules hôtes 25 entières au sein desquelles la dite bactérie peut se multiplier, lorsque ladite bactérie est intracellulaire ou intracellulaire facultative. On comprend que les cellules entières doivent être vivantes pour permettre une multiplication de la bactérie en leur sein. Plus particulièrement, la présente invention concerne la culture de bactéries anaérobies et la culture de bactéries microaérophiles intracellulaires. 9 Plus particulièrement encore, on peut cultiver la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à la tension maximale tolérée en l'absence de composé antioxydant pour un même niveau de croissance dans une même durée de culture. 5 En pratique, plus particulièrement encore, on peut cultiver la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à 2.5% et inférieure ou égale à 20% Avantageusement toutefois, on cultive lesdites bactéries selon la présente invention dans une atmosphère comprenant une teneur en oxygène supérieure à io 5%, notamment dans de l'air contenant 5% de CO2 (soit une teneur en oxygène inférieure à 16%). De préférence, on cultive lesdites bactéries selon la présente invention dans une atmosphère d'air. Les bactéries anaérobies peuvent être des bactéries anaérobies strictes ou 15 bactéries anaérobies facultatives aussi dénommées aéro-anaérobies c'est-à-dire des bactéries anaérobies qui tolèrent de l'oxygène mais n'en n'ont pas besoin pour croitre ou bactéries aérobies qui supportent l'absence d'oxygène pour croitre. Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les autres bactéries anaérobies strictes appartenant aux genres Acidarninococcus, Alistipes, 20 Anaerococcus, Anaerosalibacter, Arnazonia, Atopobiurn, Bifidobacteriurn, Blautia, Bacteroides, Barnesiella, Clostridiurn, Collinsella, Dielrna, Eggerthella, Fin egoldia, Flavonifractor, Fusobacteriurn, Gordonibacter, Guyana, Holdernania, Odoribacter, Parabacteroides, Parvirnonas, Prevotella, Peptostreptococcus, Peptoniphilus, Porphyrornonas, Prevotella, 25 Solobacteriurn, Tissierella, Turicibacter, Rurninococcus et Veillonella. Parmi les bactéries anaérobies facultatives, on cite plus particulièrement les autres bactéries anaérobies facultatives appartenant aux genres Actinoinyces, Aerococcus, Aerornonas, Aneurinibacillus, Bacillus, Bartonella, Cedecea, Citrobacter, Corynebacteriurn, Derarnbacter, Eikenella, Enterobacter, 30 Enterococcus, Escherichia, Eubacteriurn, Gardnerella, Gernella, Granulicatella, Hafnia, Haernophilus Kingella, Klebsellia, Lactobacillus, Lactococcus, 10 Lysinibacillus, Morganella, Paenibacillus, Pasteurella, Pediococcus, Propionibacteriurn, Proteus, Pro videncia, Serra tia, Raoultella, Rothia, Staphylococcus, Streptococcus et Weissella. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront 5 mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative. La figure 1 représente la comparaison de la croissance des bactéries anaérobies dans les trois milieux A, B et C testés à l'exemple 3. Afin de comparer l'efficacité des différents milieux testés ci-après de culture, 10 on a réalisé la culture de 10 bactéries anaérobies et 20 bactéries aérobies les plus communément rencontrées en routine hospitalière en utilisant les méthodes de références (utilisation des flacons anaérobies pour cultiver les bactéries anaérobies et les flacons aérobies pour cultiver les bactéries aérobies). La liste de ces bactéries ainsi que leurs conditions de cultures sont détaillées dans le tableau 1 ci-après. Ces 15 souches sont dans la collection de souches du laboratoire, la CSUR (Collection de Souches de l'Unité Rickettsies). Tableau 1. Liste des microorganismes utilisés dans cette étude Bactéries aérobies Staphylococcus aureus P412 Enterobacter aerogenes P455 Escherichla coli P430 Klebsiella oxytoca P1603 Streptococcus agalactiae P4162 Serrai-fa marcescens P587 Enterococcus faecalis P2282 Proteus mirabilis P2711 Bactéries anaérobies Bacteroldes nord!! P3192 Propiontbacterkim awdum P3346 Clostndum irregulare P1913 Clostndum massilloamazoniensis P1360 Clostndum butyricum P344 Clostndum beifennckii P883 Bacteroides thetalotaomicron P575 Propiontbacterkim acnes P637 11 Pseudomonas aeruginosa P2378 Streptococcus mitis P4157 Staphylococcus epidermidis P4227 Morganella morganii P4358 Citrobacter freundll P4462 Enterobacter cloacae P4822 Baallus circulans P655 Neisseria meninigites P782 Streptococcus pneumoniae P3582 Staphylococcus hominis P3863 Aanetobacter boumant' P1976 Haemophilus influenzae P4027 Finegoldia magna P588 Bacteroides fragilis P444 Akkermansia muaniphila P4531 et P3284 Prevotella histicola P1055 Prevotella denticola P1023 Pour tester la croissance des bactéries dans les différents milieux, en atmosphère aérobie, les inventeurs ont vidé des flacons d'hémoculture et les ont remplis avec le milieu de culture. Une fois le mélange homogène et les poudres 5 dissoutes, le milieu a été filtré à travers un filtre de 0,2 pm d'épaisseur, afin de le stériliser. 40 millilitres de ce milieu a ensuite été transféré dans chacun des flacons de culture, contenant une atmosphère aérobie. . Afin d'ensemencer les flacons de culture avec les bactéries, les inventeurs ont dilué pour chaque bactérie une colonie, ce qui correspond à environ 106 bactéries, io dans 1 millilitre du même milieu de culture. Après avoir vortexé le tube contenant ce mélange, afin de diluer correctement la colonie dans le liquide, les inventeurs ont injecté le millilitre dans le flacon de culture à l'aide d'une seringue et d'une aiguille stérile et ont mis le flacon à incuber à 37°C pendant 72 heures pour les bactéries anaérobies et 24 heures pour les bactéries aérobies. Le même protocole a été réalisé 12 pour chaque bactérie. Un millilitre de milieu contenant 106 bactéries ayant été introduit dans un flacon de culture de 40 millilitres, la quantité finale de bactéries dans le flacon de culture est de 2,5x104 bactéries. Les bactéries aérobies utilisées pour réaliser cette étude sont cultivées et 5 repiquées sur le milieu gélosé Columbia agar + 5% de sang de mouton incubées dans une étuve maintenue à température constante de 37°C sans ajout de CO2. Les bactéries anaérobies ont été cultivées sur ce même milieu et déposées dans des jarres anaérobies équipées de générateurs d'anaérobiose. Après leur croissance, les bactéries aérobies et anaérobies ont été identifiées par spectrométrie de masse de 10 type MALDI-TOF comme précédemment décrit [4]. Les inventeurs ont étudié la croissance des souches de bactéries aérobies, et des souches de bactéries anaérobies, du tableau 1, dans 3 milieux liquides différents. Pour l'inoculation des bactéries dans les flacons d'hémocultures, les inventeurs ont réalisés des suspensions bactériennes de chacune des souches testées. Pour 15 cela, 1 mL de chaque milieu de culture respectivement a été distribué dans chaque tube eppendorf, sachant qu'il y a trois tubes eppendorf par bactérie (un tube pour chaque milieu différent). Pour chaque bactérie, une colonie, correspondant à environ 106 bactéries, a été introduite dans le tube eppendorf contenant 1 mL du milieu de culture. Les 20 inventeurs ont vortexé le tube afin d'obtenir un mélange homogène de la colonie dans le milieu de culture. Ils ont ensuite inoculé la bactérie dans le flacon de culture à l'aide d'une seringue et d'une aiguille stérile. Le flacon de culture a ensuite été mis à incuber pendant 72 heures à 37°C. Ce protocole a été réalisé pour chacune des bactéries et chacun des milieux. 25 Sur la figure 1, on rapporte les résultats de la croissance des bactéries anaérobies en aérobie. Après 72 heures d'incubation, les inventeurs ont mesuré la densité optique (DO) de chaque flacon de culture. Pour avoir une mesure objective, ils ont fait le témoin sur du milieu de culture non inoculé, afin de mettre en évidence la croissance bactérienne. 13 La DO a été mesurée pour chacune des bactéries dans chacun des milieux. Par exemple, pour le milieu testé, le témoin ou zéro a été fait avec ce même milieu non inoculé, puis la mesure de DO a été faite pour chacune des bactéries. Le témoin est toujours fait avec le milieu qui a été introduit dans la culture dont on veut 5 mesurer la DO. L'appareil de mesure (Fisher scientific, Illkirch, France) ne permet pas de mesurer des DO au-delà de 2 qui correspondent à des fortes croissances de bactéries. Exemple 1 Les inventeurs ont testé différents antioxydants, ainsi que différents mélanges 10 et sélectionné le mélange décrit ci-dessus, dans la formule du milieu de culture selon l'invention. Afin de sélectionner le meilleur mélange d'antioxydants, les inventeurs ont testé un total de 13 antioxydants. Dans un premier temps, les inventeurs ont testé le mélange de base 15 d'antioxydants, déjà connu, à savoir l'hydrosulfure de sodium (Na2S), la L-Cystéine, l'acide ascorbique et le glutathion, avec la peroxydase. Puis, ce même mélange avec la super oxyde dismutase et enfin avec l'oxydase. Cependant, les inventeurs n'ont pas observé d'amélioration dans la croissance des bactéries anaérobies en aérobie. Ils ont alors testé 6 autres antioxydants avec le mélange de base décrit ci-20 dessus. Pour cela, ils ont expérimenté 58 combinaisons différentes de tous ces antioxydants (cftableaux 2A-2C ci-après). Ils ont testé ces mélanges en milieu liquide, sur des plaques de culture 24 puits (Greiner Bio-One International, Kremsmünster, Autriche) avec plusieurs bactéries aérobies et anaérobies dont la bactérie finegolcha magna, car c'est la 25 bactérie qui avaient montré le plus de difficulté à croitre lors des tests réalisés dans le laboratoire sur le milieu VersatrekTM avec antioxydants. Pour chaque plaque, les inventeurs ont utilisé trois puits comme témoin négatif, ces puits contenaient 1 mL du milieu R-medium avec les antioxydants de base mais sans bactéries et trois puits contenant 1 mL du même milieu mais avec 14 ensemencement de la bactérie finegolcha magna pour montrer qu'il n'y avait pas une croissance optimale de cette bactérie dans le mélange initial. De plus, pour avoir un témoin positif, les inventeurs ont dupliqué chaque plaque et ont mis le duplicata en condition d'anaérobie, les bactéries testées étant anaérobie stricte. 5 Afin de tester chaque antioxydant et différentes combinaisons de ces antioxydants, les inventeurs ont préparé des solutions mères des 6 antioxydants testés en plus du mélange d'antioxydants de base. Du milieu R-medium avec les antioxydants de base a été distribué dans chaque puits et à ces puits, un certain volume de la solution mère de chaque 10 antioxydant, correspondant à la concentration souhaitée, a été ajouté dans les puits. La répartition des antioxydants dans les puits a suivi le tableau 2. Le volume de R-medium avec les antioxydants de base, ajouté dans les puits est la différence entre les 1 mL, souhaité comme volume final et les volumes des antioxydants ajoutés. En effet, pour ne pas créer de biais, les inventeurs ont souhaité que le volume final, 15 après ajout des antioxydants, dans chaque puits soit de 1 mL Les solutions mères des 6 antioxydants ont été préparées dans les quantités et proportions pondérales suivantes: - Catalase : Dissolution de 100 mg de catalase dans 100 mL d'eau distillée. Obtention d'une solution mère à une concentration de 1 g/L. Pour obtenir une 20 concentration finale, dans chaque puits, de 160 mg/L, 160 pL de la solution mère ont été ajoutée dans les puis concernés. - Ubiquinol : Dissolution de 100 mg d'ubiquinol dans 100 mL d'eau distillée. Obtention d'une solution mère à une concentration de 1 g/L. Pour obtenir une concentration finale, dans chaque puits, de 160 mg/L, 160 pL de la solution mère ont 25 été ajoutée dans les puis concernés. - BHT: Dissolution de 50 mg de BHT dans 10 mL d'éthanol car le BHT n'est pas soluble dans l'eau. Obtention d'une solution mère à une concentration de 5 g/L. Pour obtenir une concentration finale, dans chaque puits, de 100 mg/L, 20 pL de la solution mère ont été ajoutée dans les puis concernés. 30 - Vitamine E : Dissolution de 10 mg de vitamine E dans 10 mL d'éthanol car la vitamine E n'est pas soluble dans l'eau. Obtention d'une solution mère à une 15 concentration de 1 g/L. Pour obtenir une concentration finale, dans chaque puits, de 100 pM soit 43 mg/L, 43 pL de la solution mère ont été ajoutée dans les puis concernés. - Acide lipoïque : Dissolution de 100 mg d'acide lipoïque dans 10 mL 5 d'éthanol car l'acide lipoïque n'est pas soluble dans l'eau. Obtention d'une solution mère à une concentration de 10 g/L. Pour obtenir une concentration finale, dans chaque puits, de 100 mg/L, 10 pL de la solution mère ont été ajoutée dans les puis concernés. - NAD : Dissolution de 10 mg de NAD dans 10 mL d'eau distillée. Obtention 10 d'une solution mère à une concentration de 1 g/L. Pour obtenir une concentration finale, dans chaque puits, de 15 mg/L, 15 pL de la solution mère ont été ajoutée dans les puis concernés. Les inventeurs ont mesuré le pH de chaque solution mère et l'ont ajusté au pH de 7,3±0,2 quand cela était nécessaire. 15 Les inventeurs ont préparé une suspension de la bactérie finegolcha magna concentrée à 104 et ont prélevé 100 pL de cette solution qu'ils ont introduit dans chacun des puits, afin d'obtenir une concentration bactérienne finale de 103 bactéries par millilitre. Ils ont ensuite incubé les boites témoin positif en anaérobie et les plaques testées en aérobie, durant 72h et à 37°C. 20 Après 72 h d'incubation, les inventeurs ont observé les plaques et sélectionné la combinaison en antioxydants qui avait entrainé la turbidité la plus importante du milieu liquide. Ils n'ont pas mesuré de manière quantitative la croissance bactérienne, ils se sont basés sur une observation d'un trouble éventuel reflétant la croissance bactérienne. Certains autres puits ont montré un léger trouble 25 mais rien de comparable à la turbidité surprenante de la combinaison la plus favorable sélectionnée des 7 antioxydants du tableau 2B avec ajout de - catalase, ubiquinol et acide lipoïque au mélange de base d'antioxydants, déjà connu, à savoir l'hydrosulfure de sodium (Na2S), la L-Cystéine, l'acide ascorbique et le glutathion . La combinaison la plus favorable à la croissance de cette bactérie a été le 30 mélange antioxydants de base comprenant les antioxydants, l'hydrosulfure de 16 sodium (Na2S), la L-Cystéine, l'acide ascorbique et le glutathion, combiné avec les 3 antioxydants supplémentaires : l'ubiquinol, la catalase et l'acide lipoïque. Tableaux 2A-2C : Combinaisons des différents antioxydants, avec pour milieu de base le R-medium avec les 4 antioxydants de base (hydrosulfure de sodium 5 (Na2S), L-Cystéine, acide ascorbique, glutathion) (3 tableaux 2A, 2B et 2C, chaque tableau représentant une plaque). Dans les tableaux 2A à 2C : - BHT = Butylhydroxytoluène - NAD = Nicotinamide adénine dinucléotide 10 Le BHT est un antioxydant synthétique, E321 listé comme antioxydant au Codex alimentarius. [5]). Le NAD est un antioxydant endogène Co-Enzyme 1 A de Niacine présent dans toute cellule vivante de mammifère. Tableau 2A = ajout de 2 antioxydants Témoin Témoin Témoin Base R- Base R- Base R- négatif négatif négatif medium sans medium sans medium sans acide urique acide urique acide urique avec avec avec F.magna F.magna F.magna Catalase Ubiquinol BHT Vitamine E NAD Acide 160 mg/L 160 mg/L 100 mg/L 100 p.M soit 15 mg/L lipoïque 43 mg/L 10 mg/L Catalase Catalase Catalase Catalase Catalase Ubiquinol Ubiquinol BHT Vitamine E NAD Acide BHT lipoïque Ubiquinol Ubiquinol Ubiquinol BHT BHT BHT Vitamine E NAD Acide Vitamine E NAD Acide lipoïque lipoïque 15 17 Tableau 2B = ajout de 3 ou 4 antioxydants Témoin Témoin Témoin Base R- Base R- Base R- négatif négatif négatif medium sans medium sans medium sans acide urique acide urique acide urique avec avec avec F.magna F.magna F.magna - Vitamine E - NAD - Vitamine E - Catalase - Ubiquinol - BHT - Catalase - Ubiquinol - Catalase - Ubiquinol - NAD - Catalase - Ubiquinol - Acide lipoïque - BHT - Acide lipoïque - Vitamine E - NAD - Ubiquinol - Ubiquinol - Ubiquinol _ Ubiquinol - Vitamine E - NAD - Ubiquinol - Vitamine E - Ubiquinol - NAD - BHT - BHT - NAD - BHT - Acide - Acide lipoïque - Acide lipoïque - Vitamine E lipoïque - Catalase - Ubiquinol - Catalase -BHT - Catalase - BHT - Catalase - Ubiquinol - BHT - Ubiquinol -BHT - Vitamine E - Acide lipoïque - Acide lipoïque -BHT - Vitamine E - NAD - Vitamine E - Vitamine E - NAD - Vitamine E-NAD - Acide lipoïque - Acide lipoïque Tableau 2C = ajout de 5 antioxydants Base R- Base R- Base R- medium sans medium sans medium sans Témoin Témoin Témoin négatif négatif négatif acide urique acide urique acide urique avec avec avec F.magna F.magna F.magna - Ubiquinol - Ubiquinol - BHT - Catalase - Catalase - BHT - Vitamine E - Vitamine E - Catalase - Ubiquinol - Ubiquinol - NAD - NAD - NAD - Ubiquinol - BHT - BHT - Acide - Acide - Acide - BHT - Vitamine E - NAD lipoïque lipoïque lipoïque - Vitamine E - Acide lipoïque - Acide lipoïque 18 - NAD - Catalase - Catalase - Ubiquinol - Acide - Ubiquinol - Vitamine E - Vitamine E lipoïque - NAD - BHT - BHT - Catalase - Acide - NAD - NAD - Ubiquinol lipoïque - Acide - Acide - Vitamine E Vitamine E lipoïque lipoïque - BHT Exemple 2 Afin de démontrer que cette meilleure croissance des bactéries anaérobies testées, en aérobie, était due seulement au mélange d'antioxydants et non pas au 5 milieu de culture de base utilisé, les inventeurs ont testé l'ancienne version d'antioxydants (hydrosulfure de sodium (Na2S), L-Cystéine, acide ascorbique, glutathion) dans le milieu VersatrekTM commercialisé (société 12a, Montpelier, France) et la nouvelle version d'antioxydants dans ce même milieu (hydrosulfure de sodium (Na2S), L-Cystéine, acide ascorbique, glutathion, catalase, ubiquinol et acide 10 lipoïque. Concernant le milieu VersatrekTM + 4 antioxydants de l'art antérieur, les flacons VersaTREKTm supplémenté (société 12a, Montpelier, France) ont été supplémentés en composés antioxydants conventionnels suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 25 mL : 15 - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,25 g (0,025 °/0) - Acide urique : 0,2 g (0,02 °/0) - Acide ascorbique : 0,5 g (0,05 °/0) - Glutathion : 0,05 g (0,005 °/0) Concernant le milieu Versatrek + 7 antioxydants selon l'invention, les flacons 20 VersaTREKTm supplémenté (société 12a, Montpelier, France) ont été supplémentés en composés antioxydants conventionnels suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : 19 - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,5 g (0,05 °/0) - Acide urique : 0,4 g (0,04 °/0) - Acide ascorbique : 1 g (0,1 °/0) - Glutathion : 0,1 g (0,01 °/0) 5 - Catalase : 0,16 g (0,016 °/0) - Ubiquinol : 0,16 g (0,016 °/0) - Acide lipoïque : 0,010 g (0,001 °/0) Les bactéries anaérobies citées précédemment ont été testées dans ces deux milieux et incubées à 37°C pendant 72h et les inventeurs ont pu observer une io meilleure croissance de ces bactéries dans le mélange milieu Versatrek + 7 antioxydants. Les inventeurs ont pu en déduire que le milieu nutritionnel de base utilisé importe peu, si le mélange des 7 antioxydants est ajouté au milieu, les bactéries anaérobies auront une meilleure croissance en aérobie. 15 Exemple 3 : Tests comparatifs sur la croissance de bactéries anaérobies fastidieuses courantes. On évalue ci-après les performances de croissance des différents milieux de culture en culture incubés dans une étuve à 37°C, à savoir le milieu du flacon universel de culture selon la présente invention et des milieux connus comparatifs 20 comprenant un milieux de culture en aérobie et anaérobie classiques BD BACTECTm à base de bouillon Trypticase soja enrichi ( milieu A sur la figure 1) et un milieu de flacons d'hémoculture VersaTREKTm supplémenté avec des antioxydants décrits ci-après ( mileu B sur la figure 1) (référence 191401, VersaTREK REDOX 1 aérobie de la société 12a, Montpelier, France) [3]. 25 Le milieu de culture selon l'invention dénommé « R medium » ( milieu C sur la figure 1) comprend les composants suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : Milieu de base: 20 - Hydrolisat de caséine: 15 g (1,5 °/0) - Proteose peptone: 15 g (1,5 °/0) - Extrait de levure: 10 g (1 0/0) - a-cétoglutarate : 2 g (0,2 %) 5 - Chlorure de sodium (NaCI) : 5 g (0,5 °/0) - Glucose: 10 g (1 0/0) - Dipotassium phosphate (K2HPO4) : 0,83 g (0,083%) Composés antioxydants : - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,5 g (0,05 °/0) io - L-Cystéine : 0,5 g (0,05 °/0) - Acide ascorbique : 1 g (0,1 °/0) - Glutathion : 0,1 g (0,01 °/0) - Catalase : 0,16 g (0,016 °/0) - Ubiquinol : 0,16 g (0,016 %) 15 - Acide lipoïque : 0,010 g (0,001 °/0) Les deux autres milieux testés, à savoir les flacons de culture anaérobies BD BACTECTm et les flacons VersaTREKTm supplémenté (société 12a, Montpelier, France) supplémentés en composés antioxydants conventionnels suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 25 mL : 20 - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,25 g (0,025 °/0) - Acide urique : 0,2 g (0,02 °/0) - Acide ascorbique : 0,5 g (0,05 °/0) - Glutathion : 0,05 g (0,005 °/0) 21 Les résultats ont montré que pour un même temps d'incubation, la DO mesurée pour les bactéries anaérobies incubées en atmosphère aérobie est supérieure avec le milieu de culture de la présente invention ( milieu C de la figure 1), par rapport aux milieux VersaTREKTm supplémenté en antioxydants (milieu B de la 5 figure 1), et le flacon de culture avec le milieu de culture anaérobie BD BACTECTm ( milieu A de la figure 1), utilisé communément comme montré sur la figure 1. La figure 1 représente les DO illustrant la croissance des bactéries anaérobies dans les trois milieux A, B et C testés à 72h d'incubation à 37°C pour les 10 bactéries anaérobies fastidieuses suivantes communément rencontrées en pratiques 10 hospitalières : Bacteroides nordit, PropionibactenUm aveum, Clostndum Irregular, Clostndum massilloamazoniensis, Clostndum butyricum, Clostndum beifennckii, Bacteroides thetabtaomicron, PropionibactenUm acnes, finegoldia magna et Bacteroides fragllis. Des résultats similaires ont été obtenus pour les bactéries aérobies dans les 15 trois milieux testés. Exemple 4 : Test de croissance de différentes autres bactéries fastidieuses retrouvées chez l'homme dans la cavité orale ou le tractus gastro-intestinal Le milieu de culture de la présente invention R medium et le milieu VersatekTM supplémenté restent identiques à ceux décrits dans l'exemple 3. 20 Les inventeurs on testés 2 souches de Prevotella: P. dent-kola et P. histicola et 2 souches d'Akkermansia muaniphila P3284 et P4531. Ces bactéries sont anaérobies strictes et sont retrouvées chez l'homme dans la cavité orale ou le tractus gastro-intestinal. De la même façon que décrit précédemment, les inventeurs ont réalisés des 25 suspensions bactériennes de chacune des souches testées. Pour cela, 1 mL de milieu de culture a été distribué dans chaque tube eppendorf, sachant qu'il y a un tube eppendorf par bactérie. Pour chaque bactérie, une colonie, correspondant à environ 106 bactéries, a été introduite dans le tube eppendorf contenant 1 mL du milieu de culture. Les 22 inventeurs ont vortexé le tube afin d'obtenir un mélange homogène de la colonie dans le milieu de culture. Ils ont ensuite inoculé la bactérie dans la bouteille d'hémoculture à l'aide d'une seringue et d'une aiguille stérile. Le flacon de culture a ensuite été mis à incuber pendant 5 jours à 37°C. 5 Les 4 souches des 3 bactéries ont eu une croissance dans le milieu selon l'invention R-medium et pas de croissance dans le milieu VersatekTM supplémenté décrit à l'exemple 3. 23 BIBLIOGRAPHIE (1) Strobel H. Basic laboratory culture methods for anaerobic bacteria. In : Jonathan R. Mielenz, editor. 2009 p 247-248 5 (2) N. Dione, S. Khelaifia, B. La Scola, J.C. Lagier, D. Raoult. A quasi-universal medium to break the aerobic/anaerobic bacterial culture dichotomy in clinical microbiology. G. Greub, editor. Clin Microbiol Infect. 2016 Jan;22(1):53-8. January 2016. (3) Grégory Dubourg, Elodie Guilhot, Saber Khelaifia, Enora Tomei, Jean-Paul io Casalta, Pierre-Yves Lévy, Hervé Tissot-Dupont, Didier Raoult.. Evaluation of the Versatrek universal vial in the diagnosis of bacteremia: a preliminary report. (submitted). (4) Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier PE, Rolain JM, Raoult D. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix- 15 assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009 Aug 15;49(4):543-51. (5) Codex alimentarius, normes alimentaires internationale. CAC/GL REVENDICATIONS1. Milieu de culture liquide polyvalent pour culture en atmosphère aérobie de bactéries anaérobies ou bactéries aérobies comprenant un milieu de culture de base pour bactéries aérobies et anaérobies caractérisé en ce qu'il comporte en outre le mélange de composés antioxydants suivants: hydrosulfure de sodium (Na2S), LCystéine, acide ascorbique, glutathion, catalase, ubiquinol et acide lipoïque. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les dits composés antioxydants aux quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : lo - Hydrosulfure de sodium : au moins 0,25 g (0,025%), de préférence de 0,25 g - L-Cystéine : - Acide ascorbique : 15 - Glutathion : - Catalase : 20 - Ubiquinol : - Acide lipoïque : à 0,5 g (0,025 à 0,05 °/0) au moins 0,25 g (0,025%), de préférence de 0,25 g à 0,5 g (0,025 à 0,05 °/0) au moins 0,5 g (0,05%), de préférence de 0,5 à 1 g (0,05 à 0,1 0/0) au moins 0,1 g (0,01%), de préférence de 0,1 à 0,5 g (0,01 à 0,05 °/0) au moins 0,06 g (0,006%), de préférence de 0,06 à 0,16 g (0,006 à 0,016 °/0) au moins 0,06 g (0,006%), de préférence de 0,06 à 0,16 g (0,006 à 0,016 °/0) au moins 0,01 g (0,001%), de préférence de 0,01 à 0,015 g (0,001 à 0,0015 °/0) 25 3. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les composants nutritifs suivants dans le dit milieu de culture de base : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisies parmi 5 un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - au moins un sucre, - au moins un sel de métaux choisis parmi K, Mg, Na et Ca, de préférence NaCI, - ainsi que - au moins une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, de préférence K2HPO4, ouNaHCO3 pour ajuster le pH à 7,5, - au moins unes vitamine ou facteur de croissance. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit milieu de culture de base est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie comprenant des composants choisis parmi un extrait de broyat ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notamment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou glucose, un sel NaCI et/ou Na2PO4. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture de base est un milieu de culture liquide pour culture de 26 bactéries anaérobies dans un échantillon sanguin, selle, crachat ou sécrétion vaginale. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de culture de base comprend les composants nutritifs suivants: 5 - Hydrolisat de caséine ; - Protéose peptone ; - Extrait de levure ; - Glucose, - Chlorure de sodium (NaCI) ; et 10 - un facteur de croissance : a-cétoglutarate. 7. Milieu de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend 15 les composants suivants dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L : - Hydrolisat de caséine: 15 g (1,5 %) - Proteose peptone: 15 g (1,5 °/0) - Extrait de levure: 10 g (1 0/0) - a-cétoglutarate : 2 g (0,2 °/0) - Chlorure de sodium (NaCI) : 5 g (0,5 °/0) - Glucose: 10 g (1 %) 20 - Dipotassium phosphate (K2HPO4) : 0,83 g (0,083 °/0) 27 - Hydrosulfure de sodium (Na2S) : 0,5 g (0,05 °/0) - L-Cystéine : 0,5 g (0,05 °/0) - Acide ascorbique : 1 g (0,1 °/0) - Glutathion : 0,1 g (0,01 %) 5 - Catalase : 0,16 g (0,016 °/0) - Ubiquinol : 0,16 g (0,016 °/0) - Acide lipoïque : 0,010 g (0,001 °/0) Le pH de la solution étant ajusté à 7,5±0,2 avec du KOH 10M. 8. Procédé de culture in vitro d'une bactérie aérobie ou anaérobie sous 10 atmosphère aérobie avec un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Procédé de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on réalise une culture d'une dite bactérie dans un échantillon de sang, selle, crachat ou sécrétion vaginale. 10. Procédé de culture selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que on 15 réalise une culture d'une dite bactérie anaérobie stricte choisie parmi Akkermansia muaniphila, Bacteroides fragllis, Bacteroides nordi, Bacteroides thetalotaomicron, Clostndkim beifeinnckii, Clostndkim butyricum, Clostndkim massilloamazonfensis, Clostndkim Irregulare, finegoldia magna, Propionibacterkim acnes et Propionibacterium avidum, Prevotella dentkola et Prevotella histicola. 20