FR 3063813 A1 20180914 FR 1770238 A 20170310 1 PROCÉDÉ ET SYSTEME DE DOSAGE D'ANTIGÈNES PAR COLORATION DE GELS D'IMMUNODIFFUSION RADIALE DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [0001] La présente invention concerne un procédé de dosage d'antigènes par coloration de gels d'immunodiffusion radiale, notamment pour réaliser les essais d'activité de lots de vaccins. Elle concerne également un système de dosage adapté. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE [0002] Le dosage par immunodiffusion radiale est bien connu en soit. Le principe consiste à préparer un gel, par exemple d'agarose contenant un antisérum ayant été dirigé contre des antigènes spécifiques. Ce gel est classiquement déposé sous forme d'une couche translucide, solide à température ambiante, sur un support plan transparent rigide ou souple tel que les plaques de verre ou les films de polyester. Plusieurs puits circulaires sont aménagés dans l'épaisseur du gel afin de permettre le dépôt des échantillons et des solutions de référence. L'antigène ciblé, s'il est présent dans l'échantillon, diffuse radialement depuis le puits vers le gel et se lie aux anticorps présents dans l'antisérum jusqu'à former un réseau tridimensionnel précipitant. Ce précipité forme un anneau autour de chaque puits. La géométrie de disposition des puits et leur nombre est limité par le fait qu'elle doit permettre suffisamment d'espaces interstitiels entre chaque puits afin que les zones de diffusion ne se chevauchent pas. La surface (ou le rayon) de l'anneau est proportionnelle à la concentration d'antigène présent dans l'échantillon testé. En effectuant un étalonnage avec des solutions de référence dont on connaît la concentration en antigène, il est alors possible de quantifier de manière précise la concentration en antigène de chaque échantillon. Afin de rendre visible et mesurable les anneaux de précipitation, un traitement du gel s'avère le plus souvent nécessaire. Il subit alors après l'étape de diffusion des étapes successives de lavage, séchage, coloration, décoloration afin de faire apparaître les anneaux autour de chaque puits. [0003] De façon classique, on utilise un film souple ou une plaque de verre comme support au gel contenant l'antisérum. Le gel d'agarose est préparé extemporanément par les opérateurs le jour où les dosages sont réalisés. En fonction du nombre d'échantillon à tester, il est souvent nécessaire de préparer autant de gels que de groupe de dosages. Cette opération comporte plusieurs étapes. L'agar est mis en solution dans un milieu aqueux. Ce 3063813 2 mélange est porté à ébullition puis redescendu et maintenu à une température supérieure à 40°C de façon à ce qu'il reste sous forme liquide. L'antisérum est alors ajouté au milieu et homogénéisé. Il est ensuite délicatement versé sur le support de façon à créer une couche homogène étendue sur toute la surface du support. La périphérie du gel affleure exactement 5 la périphérie du support choisi. Ces opérations sont la plupart du temps complètement manuelles. Une fois la couche d'agarose gélifiée (donc solidifiée), l'opération suivante consiste à aménager les puits dans le gel. Là encore, cette opération est manuelle et très délicate. La manipulation du gel sur son support demande une attention très particulière. Seule la face inférieure du support peut être manipulée sans risque d'endommager l'intégrité 10 du gel. Les utilisateurs ont bien souvent recours à des outils de type emporte-pièce 'maison' raccordés à une source de vide. Chaque puits est aménagé un par un. L'opération est relativement longue (temps total de préparation situé autour de 1 à 2 heures selon le nombre de gels et donc de puits). 15 [0004] Une fois les supports prêts, l'opérateur procède au dosage des échantillons en les déposant dans chaque puits. Les gels sont alors mis en diffusion dans des conditions de temps et de température déterminées en fonction du système antigène-anticorps en jeu. Après cette étape de diffusion, les précipités sont rendus visibles par des étapes successives de lavage, séchage, coloration, décoloration du gel. Ces étapes sont également 20 longues et fastidieuses (temps post-diffusion en moyenne de 5 heures). Le colorant le plus souvent utilisé est une solution de bleu de Coomassie. Ce colorant se lie à certains acides aminés constituant les protéines. Ainsi lié, il prend une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm (visible). Avant de procéder à la coloration, le gel est préalablement rincé afin d'éliminer tous les constituants protéiques non précipités du gel (essentiellement les 25 anticorps non liés et les autres constituants de l'antisérum insérés dans le gel). Le support est placé dans des conteneurs remplis de solution de rinçage de sorte que le support baigne complètement dans cette solution. Afin d'obtenir un rinçage efficace, la solution de rinçage est renouvelée à plusieurs reprises. Le gel est ensuite sorti du bain de rinçage, toujours de façon manuelle, pour passer à l'étape de séchage. Cette phase est susceptible d'engendrer 30 une détérioration du gel. Dans certains cas, afin de garantir le remplissage, la consommation de fluide de rinçage peut s'avérer relativement élevée. [0005] Le séchage consiste à éliminer la quasi-totalité de liquide présent dans le gel. Sans cette étape de séchage, la coloration s'avère inefficace. 35 ldbio-dif rad-FR 3063813 3 [0006] Le séchage final est réalisé par passage du gel en étuve ou sous soufflerie. Une fois séché le gel est alors coloré. Le support est placé dans un conteneur rempli de solution de coloration de sorte que celui-ci baigne complètement dans cette solution. Il y est laissé entre 10 et 120 minutes selon les systèmes. Le gel est ensuite retiré du bain et placé dans un bain 5 de décoloration. Ce dernier traitement vise à éliminer le reliquat de colorant fixé sur la surface du gel non lié aux anneaux de précipités. Seul le colorant non lié est éliminé lors de cette étape. Le gel est placé dans un nouveau conteneur rempli de solution de décoloration et y est laissé entre 30 et 120 minutes. Cette étape est importante. Il est nécessaire d'obtenir un contraste suffisant entre les anneaux de précipités colorés en bleu et le reste du gel qui 10 idéalement redevient complètement transparent. Le gel subit un dernier séchage final afin d'éliminer tout trace de liquide et peut alors être traité pour son interprétation. [0007] Ces différentes phases sont aussi susceptibles d'engendrer une détérioration du gel. 15 [0008] Les temps de préparation et de traitement sont longs, le procédé contient de nombreuses étapes manuelles non standardisées source de nombreux facteurs de variabilité qui conduisent à des résultats peu reproductibles. [0009] Divers perfectionnements ont été apportés à cette méthode au fil du temps. Par 20 exemple, la demande de brevet EP 1 678 500 décrit un procédé de traitement d'images permettant d'optimiser l'interprétation des résultats de dosage par immunodiffusion radiale. Le procédé utilise une approche classique de dosage des échantillons sur un support recevant le gel, tel que préalablement décrit. Le perfectionnement réside non pas dans la façon de préparer les gels et de mettre en oeuvre le protocole, mais plutôt dans le traitement 25 ultérieur des films après coloration, de manière à obtenir une image digitale du résultat sur laquelle un traitement d'image permet de déterminer de façon plus précise la surface des anneaux. [0010] Le document FR2359849 décrit un procédé de préparation de films secs d'agarose 30 ou de gélose contenant des anticorps immobilisés. Ces films sont réhydratables dans le but d'effectuer des dosages de protéines par diverses techniques, en particulier par immunodiffusion radiale. Ce document précise que ce procédé a été conçu pour éviter l'utilisation de gels à l'état hydraté pour des raisons de difficulté de conservation. La déshydratation permet, selon le document, une solution attrayante et avantageuse. Cette 35 solution implique d'importantes manipulations consistant à placer les films dans des bains ldbio-dif rad-FR 3063813 4 pour les réhydrater, ainsi que pour mettre en oeuvre les différentes phases du processus de diffusion. [0011] II existe donc un besoin afin de perfectionner le procédé d'immunodiffusion radiale en 5 gel coloré afin de le rendre plus facile à mettre en oeuvre, plus reproductible, plus fiable, plus robuste, moins long et moins coûteux. [0012] Pour pallier ces différents inconvénients, l'invention prévoit différents moyens techniques. 10 EXPOSE DE L'INVENTION [0013] Pour ce faire, l'invention propose un procédé de dosage d'antigènes par coloration de gels d'immunodiffusion radiale, notamment pour réaliser les essais d'activité de lots de 15 vaccins, comprenant les étapes suivantes : - utilisation d'un boîtier prêt-à-remploi incluant une couche de gel contenant un antisérum spécifique de l'antigène ciblé et disposant d'une matrice de puits de dépôts; - dépôt d'un volume donné des échantillons et des solutions de référence de concentrations connues en antigène dans les puits; 20 - mise en diffusion du gel en plaçant le boîtier dans une chambre de diffusion dont l'atmosphère est saturée en humidité et à une température donnée pour une durée déterminée en fonction du système antigène/anticorps considéré ; - rinçage du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de rinçage ; - à la fin du temps de rinçage, la solution est retirée par déversement ; 25 - absorption de la solution de rinçage restante dans le gel à l'aide d'au moins un tampon d'absorption au format du boîtier et comportant une pluralité de couches absorbantes calibrées ; - séchage sensiblement complet du gel par flux d'air chaud ; - coloration du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de coloration ; 30 - à la fin du temps de coloration, la solution est retirée par déversement ; - décoloration du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact de la solution de décoloration ; -à la fin du temps de décoloration, la solution est retirée par déversement ; - séchage sensiblement complet du gel par flux d'air chaud. 35 [0014] Outre une simplicité de mise en oeuvre, ce procédé permet un gain de temps, une meilleure fiabilité ainsi qu'une répétabilité et reproductibilité des résultats fortement accrue. ldbio-dif rad-FR 3063813 5 Les risques de détérioration du gel lors des phases de rinçage, absorption et séchage, coloration, décoloration sont supprimés. L'ensemble des opérations ainsi harmonisées et standardisées, rendent la technique plus simple et ergonomique. 5 [0015] L'étape de dépôt des échantillons est avantageusement effectuée à l'aide d'une pipette à déplacement positif. Cet outil permet d'effectuer un dépôt précis de façon simple et fiable, avec une grande justesse et répétabilité. [0016] De manière avantageuse, le procédé comprend par ailleurs les étapes suivantes : 10 - mise en place sur la surface libre du gel d'une plaque opaque (par exemple de couleur blanche) favorisant la prise d'images numériques et l'acquisition d'au moins une image numérique (par exemple à l'aide d'un scanner); - traitement de l'image numérique obtenue ; - calcul de la concentration en antigène pour chacun des échantillons par traitement de 15 l'image numérique obtenue. [0017] La plaque opaque permet d'optimiser la qualité de l'image obtenue qui serait autrement polluée par l'environnement derrière la boîte. 20 [0018] Le procédé prévoit avantageusement une étape (préalable) de préparation des boîtiers de dosage sous forme de lots sensiblement homogènes (par exemple de 30 à 500 boîtes) de gel contenant un antisérum spécifique déposé dans chacune des boîtes sous forme de couche d'épaisseur calibrée, c'est à dire une couche sensiblement constante déterminée en fonction de la surface de la boîte, du diamètre des puits et du volume des 25 échantillons et solutions de référence à déposer. [0019] Egalement de manière avantageuse, le procédé prévoit une étape de perçage des puits sous forme d'une matrice calibrée comprenant une phase de découpage des puits et une phase d'aspiration du gel présent dans les puits découpés de façon à libérer les puits. [0020] Selon un mode de réalisation avantageux, les boîtiers de dosage sont stockés dans un coffret de protection thermique, lui-même placé dans une chambre régulée en température. On utilise par exemple des températures se situant préférentiellement entre 2°C et 8°C. ldbio-dif rad-FR 30 35 3063813 6 [0021] De manière avantageuse, les boîtiers de dosage sont stockés à plat sur un support sensiblement horizontal, de préférence avec le fond du boîtier vers le haut. Ce mode de stockage permet d'optimiser la conservation du gel. 5 [0022] L'invention prévoit également un système de dosage d'un antigène par immunodiffusion radiale pour la mise en oeuvre du procédé d'exécution de dosage d'immunodiffusion radiale tel que préalablement décrit, et comprenant : - au moins un boîtier de dosage pourvu d'un fond sensiblement plat et de parois latérales d'une hauteur d'au moins 10 mm et plus préférentiellement d'au moins 14 mm, ledit fond 10 comportant par ailleurs les caractéristiques suivantes : o une planéité comprise entre +0,50 mm et -0,30 mm pour une longueur de 127 mm et plus préférentiellement entre +0,25 mm et -0,15 mm pour une longueur de 127 mm ; o ledit fond étant doté de caractéristiques hydrophiles de sorte que sa tension de surface soit sensiblement voisine de celle de l'eau ; 15 - des repères d'identification des puits, présents soit directement sur le fond du boîtier de dosage ou sur une plaque complémentaire ; - une couche de gel uniformément répartie sur la surface du fond du boîtier, ledit gel comprenant un antisérum adapté au dosage à effectuer ; - une pluralité de puits calibrés en diamètre agencés dans le gel ; 20 - un couvercle adapté à chacun des boîtiers de dosage de façon à fermer ceux-ci de façon sensiblement étanche ; - une chambre de diffusion, apte à loger au moins un boîtier de dosage et susceptible de contenir une atmosphère favorable à la diffusion. 25 [0023] Ce système contribue à rendre le procédé plus simple, plus rapide et plus reproductible. Il permet en outre, de réaliser les opérations de préparation des gels indépendamment des opérations de dosage. Ces opérations peuvent être facilement automatisées et réalisées sous des volumes importants, de façon à conduire à la mise à disposition de lots homogènes de plusieurs dizaines à plusieurs centaines de gels prêts à 30 l'emploi dont la durée de conservation est supérieure à 6 mois. [0024] De manière avantageuse, le système comprend par ailleurs au moins une pipette à déplacement positif dont les caractéristiques volumétriques sont adaptées aux volumes d'échantillons et de solutions de référence à placer dans les puits pour effectuer les 35 dosages. ldbio-dif rad-FR 3063813 7 [0025] Egalement de manière avantageuse, le fond des boîtiers est transparent aux longueurs d'ondes voisines de 598 nm et est doté d'un indice de réfraction supérieur à 1,55. [0026] Le fond des boîtiers a de préférence une dureté telle que la valeur E du module de 5 Young est supérieure à 3. [0027] Le système prévoit avantageusement au moins un tampon d'absorption, adapté pour absorber le liquide résiduel présent dans le gel après l'étape de rinçage, le tampon comprenant une pluralité de couches absorbantes superposées, dont une couche externe, 10 en matériau absorbant et résistant au déchirement, formant un support pour les autres couches absorbantes, préférentiellement à base de fibre synthétique, dont la stabilité dimensionnelle est assurée par une propriété d'allongement à la rupture comprise entre 10 et 25%. 15 [0028] De manière avantageuse, le tampon comprend deux couches internes absorbantes, de caractéristiques d'absorption différentes, chacune des deux couches étant constituée d'une pluralité de sous-couches de matériaux absorbants. [0029] De manière avantageuse, le système prévoit une plaque opaque favorisant la prise 20 d'image numérique dont les dimensions correspondent sensiblement à celle de la couche de gel à analyser. [0030] Le système comporte avantageusement une tête de lecture numérique (scanner ou caméra ou autre), apte à effectuer une capture d'image numérique de la surface du gel, et 25 éventuellement un sous-système de traitement d'image, adapté pour effectuer un traitement d'image des images numériques des gels de dosage afin de déterminer les concentrations en antigène pour chacun des échantillons présents dans les différents puits du boîtier de dosage. 30 DESCRIPTION DES FIGURES Tous les détails de réalisation sont donnés dans la description qui suit, complétée par les figures 1 à 4, présentées uniquement à des fins d'exemples non limitatifs, et dans lesquelles: -la figure 1 illustre un organigramme fonctionnel présentant de façon successive les 35 différentes étapes pour la mise en oeuvre du procédé. -la figure 2 montre un exemple de boîtes d'immunodiffusion radiale susceptible d'être utilisée ldbio-dif rad-FR 3063813 8 avec un système de dosage selon l'invention ; -la figure 3 illustre la mise en oeuvre de l'étape de séchage à l'aide d'un tampon absorbant ; -la figure 4 est une représentation schématique d'un exemple de tampon absorbant. 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION PROCEDE DE DOSAGE La figure 1 illustre les principales étapes du procédé de dosage d'antigènes par coloration de 10 gels d'immunodiffusion radiale. Ce procédé est utilisé en particulier afin de réaliser les essais d'activité de lots de vaccins. Tout d'abord, à l'étape 10, on met à disposition un boîtier incluant une couche de gel contenant un antisérum spécifique de l'antigène à doser. Des boîtiers prêts à utiliser sont 15 avantageusement préparés en amont, tel que décrit plus loin. La couche de gel disposée dans le boîtier forme une matrice de puits de dépôts servant à loger les solutions de références et les échantillons à doser. A l'étape 11, on dépose dans les puits un volume donné des échantillons et des solutions de 20 référence de concentrations connues en antigène. On dépose de préférence au moins trois références et plus préférentiellement quatre à six références dans les puits de chaque boite de dosage. L'étape de dépôt des échantillons est de préférence effectuée à l'aide d'une pipette à déplacement positif de volume adapté. Les quantités déposées sont par exemple de 20 micro-litres par puits. 25 [0031] L'étape 12 consiste en une mise en diffusion du gel en plaçant le boîtier dans une chambre de diffusion. On utilise de préférence une chambre de diffusion dont l'atmosphère est saturée en humidité et à une température donnée. La diffusion est chronométrée pour une durée déterminée en fonction du système antigène/anticorps considéré. La température 30 de diffusion est par exemple entre 2°C et 50°C et plus préférentiellement entre 4°C et 37°C. Cette température est atteinte par exemple en plaçant la chambre de diffusion dans une enceinte à température contrôlée. La durée de diffusion est établie en fonction du type de test, et peut être de 16 heures à 48 heures. 35 [0032] L'étape 13 concerne le rinçage du gel. Le rinçage est mis en oeuvre par ajout dans le boîtier d'un volume exact de la solution de rinçage, de façon à ce que le gel soit ldbio-dif rad-FR 3063813 9 complètement recouvert par la solution de rinçage. La solution peut être de l'eau à l'état pur ou déionisée, ou tout autre solution telle que par exemple une solution de chlorure de sodium à 0,9%. Plusieurs rinçages successifs peuvent être réalisés, simplement en vidant le boîtier et en le remplissant à nouveau. L'opération ne nécessite pas de contact ni préhension 5 du gel par un outillage particulier ou par un opérateur, et la solution de rinçage est simplement versée dans le boîtier. Le procédé peut également inclure une agitation de la plaque afin d'accélérer le processus de rinçage du gel. A la fin du temps de rinçage, la solution est retirée par déversement. Suite à ce déversement, il reste en général une certaine quantité de fluide dans le gel, qu'il faut également retirer par absorption. 10 [0033] A cette fin, l'étape 14 concerne l'absorption du fluide résiduel restant imprégné dans le gel. Pour améliorer l'efficacité, la rapidité et la précision de cette étape, on utilise au moins un tampon d'absorption au format de la boîte. Le tampon utilisé est décrit plus loin. 15 [0034] Pour retirer complètement toute trace de fluide encore présente, on effectue ensuite un séchage sensiblement complet du gel par flux d'air chaud, à l'étape 15. [0035] L'étape suivante (étape 16), prévoit une coloration du gel. Cette étape est effectuée par ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de coloration. L'opération ne 20 nécessite pas de contact ni préhension du gel par un outillage particulier ou par un opérateur, et la solution de coloration est simplement versée dans le boîtier. A la fin du temps de coloration, la solution est retirée par déversement. On utilise par exemple une solution à base de bleu de Coomassie. Les temps de contact sont variables selon les tests à effectuer. 25 [0036] A l'étape 17, une décoloration du gel est effectuée. Cette étape consiste en l'ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de décoloration. L'opération ne nécessite pas de contact avec le gel, la solution de décoloration est simplement versée dans le boîtier. A la fin du temps de décoloration, la solution est retirée par déversement. Grâce à la boîte de 30 dosage, les étapes de rinçage, coloration et décoloration sont effectuées sans risque de fausse manipulation du support. Ceci améliore très significativement l'ergonomie du test et limite de façon importante les risques de détérioration du gel. Ce procédé permet également d'économiser en volume de solutions de lavage, coloration et décoloration. 35 [0037] Pour s'assurer que le gel est en bon état pour les prises d'images numériques, on procède à l'étape 18 au séchage complet du gel par flux d'air chaud. Le séchage doit être ldbio-dif rad-FR 3063813 10 complet, de sorte que le gel devienne translucide et particulièrement fin. Il est alors complètement solidaire du fond du boîtier. Le temps de séchage varie par exemple entre 5 et 30 minutes. 5 [0038] L'étape 19 permet notamment d'optimiser la prise des images numériques. Elle consiste en la mise en place sur la surface libre du gel d'une plaque opaque favorisant l'acquisition d'images numériques. On utilise de préférence une surface blanche équipée d'un support facilitant les manipulations. Ensuite au moins une image numérique est réalisée. 10 [0039] L'étape 20 prévoit le traitement des images numériques obtenues, et enfin, l'étape 21 prévoit le calcul de la concentration en antigène pour chacun des échantillons par traitement de l'image numérique obtenue. 15 [0040] Tel que mentionné préalablement, on prévoit avantageusement une phase préalable à la réalisation des essais pour préparer des lots de boîtes prêtes-à-1' emploi. Cette phase consiste à préparer des boîtes de dosage sous forme de lots sensiblement homogènes (par exemple de 30 à 500 boîtes) de gel contenant un antisérum spécifique déposé dans chacune des boîtes sous forme de couche calibrée. La préparation en lots importants permet 20 d'assurer une homogénéité du milieu réactif qui est ainsi identique pour l'ensemble des boîtes d'un même lot. [0041] Des puits sont ensuite préparés dans chacune des boîtes. Pour ce faire, les puits sont percés selon un agencement en forme d'une matrice calibrée. On effectue tout d'abord 25 une phase de découpage des puits et une phase d'aspiration du gel présent dans les puits découpés de façon à libérer ces derniers. Cette phase est avantageusement mise en oeuvre avec l'aide d'un emporte-pièce sensiblement circulaire unique pour tous les puits, de façon à bien standardiser leurs diamètres. On utilise avantageusement un robot à déplacement XYZ. Un système d'aspiration permet de récupérer les portions découpées de gel. 30 [0042] Après préparation, les boîtes sont stockées dans un coffret de protection thermique, lui-même placée dans une chambre régulée en température, par exemple une température autour de 2°C à 8°C. Les boîtes de dosage sont stockées avec le fond sensiblement horizontal à plat, de préférence avec le fond et le gel vers le haut. 35 SYSTEME DE DOSAGE ldbio-dif rad-FR 3063813 11 [0043] L'invention prévoit également un système de dosage d'un antigène par immunodiffusion radiale pour la mise en oeuvre du procédé de dosage par immunodiffusion radiale tel que préalablement décrit. Ce système comprend une pluralité d'éléments, présentés dans ce qui suit. 5 [0044] Tel que montré à la figure 2, le système comporte au moins une boîte de dosage 1 pourvue d'un fond 2 sensiblement plat et de parois latérales 3 d'une hauteur d'au moins 10 mm et plus préférentiellement d'au moins 14 mm. 10 [0045] On utilise avantageusement un boîtier plastique rectangulaire ou carré avec couvercle, préférentiellement aux dimensions normalisées (format SBS 127,76 mm x 85,48mm) ou au format 120mm x 120 mm. La hauteur des parois est avantageusement de 10 à 20mm, et préférentiellement entre 14 et 18 mm. 15 [0046] Le fond 2 comporte certaines caractéristiques de planéité et d'hydrophilie, à savoir une planéité comprise entre +0,50 mm et -0,30 mm pour une longueur de 127 mm et plus préférentiellement entre +0,25 mm et -0,15 mm pour une longueur de 127 mm, et des caractéristiques hydrophiles de sorte que sa tension de surface soit sensiblement voisine de celle de l'eau. Par exemple, la tension de surface est prévue entre 30 et 90 dynes/cm et plus 20 préférentiellement entre 40 et 80 dynes/cm. [0047] La tension de surface optimale du support permet que l'étalement du gel soit uniforme et régulier lorsqu'il est délivré dans la boîte, favorise l'adhésion du gel au fond de la boîte lorsqu'il est solidifié et également lors des phases de rinçage, de coloration et de 25 décoloration. Elle permet enfin que le gel adhère au support de façon quasi-irréversible et sans distorsion une fois coloré et séché. [0048] Pour faciliter l'identification des puits 4 lors de la phase de dépôts des échantillons et des standards, des repères d'identification des puits sont présents soit directement sur le 30 fond de la boîte de dosage soit sur une plaque complémentaire. La plaque complémentaire d'identification peut aussi servir de support. [0049] On retrouve dans chaque boîte, une couche de gel uniformément répartie sur la surface du fond de la boîte, ledit gel comprenant un antisérum adapté au dosage à effectuer. 35 ldbio-dif rad-FR 3063813 12 [0050] Le boîtier permet de loger par exemple un volume de gel entre 18 et 30m1, plus préférentiellement entre 22 et 28m1. En fonction de la géométrie de la boîte, on obtient un gel d'épaisseur entre 1,5 et 2,5 mm de hauteur. 5 [0051] Une éventuelle étiquette d'identification permet d'identifier les boîtes en relation avec les lots testés. Une date d'expiration est avantageusement indiquée sur les boites. Ces étiquettes permettent de faciliter les étapes ultérieures d'identification et réduit ainsi les risques d'erreur. 10 [0052] Pour loger les références et les échantillons, une pluralité de puits calibrés en profondeur et en diamètre sont agencés dans le gel. [0053] A titre d'exemple non limitatif, le diamètre des puits se situe entre 3 et 4 mm, et la hauteur des puits se situe de 1,5 à 2,5 mm, soit un volume de dépôt entre 10 et 25 15 microlitres. [0054] Le nombre de puits peut varier par exemple de 30 à 50. On prévoit un entraxe horizontal et vertical entre 11 et 15mm de sorte à former préférentiellement une matrice de huit colonnes par six lignes ou de sept colonnes par sept lignes. 20 [0055] Chaque boîte comporte un couvercle adapté de façon à fermer de façon sensiblement étanche et assurer une bonne conservation du gel dans la durée. [0056] Pour faciliter la prise des images numériques, le système prévoit une plaque opaque. 25 Cette plaque, présente par exemple une surface blanche favorisant l'acquisition d'image numérique. Les dimensions correspondent sensiblement à celle de la couche de gel à analyser. [0057] Le système comporte avantageusement une chambre de diffusion, apte à loger au 30 moins une boîte de dosage et susceptible de contenir une atmosphère favorable à la diffusion. Une chambre de diffusion peut contenir plusieurs boîtes de dosage, comme par exemple 3 à 10 boîtes, et préférentiellement 4 à 6 boîtes, permettant de traiter simultanément plusieurs boîtes ou pour faciliter leur manipulation lors d'essais groupés. ldbio-dif rad-FR 3063813 13 [0058] Le fond des boîtiers est transparent aux longueurs d'ondes voisines de 598 nm et est doté d'un indice de réfraction supérieur à 1,55. Le fond des boîtiers comporte une dureté telle que la valeur E du module de Young est supérieure à 3. 5 [0059] Le système comprend par ailleurs au moins une pipette à déplacement positif dont les caractéristiques volumétriques sont adaptées aux volumes d'échantillons et de solutions de référence à placer dans les puits pour effectuer les dosages. [0060] Le système de dosage comprend par ailleurs au moins un tampon d'absorption, 10 adapté pour absorber le liquide de rinçage présent dans le gel lors de l'étape de rinçage. TAMPON D'ABSORPTION (par capillarité) : 15 [0061] La figure 4 est une représentation schématique en coupe d'un exemple de réalisation d'un tampon 5. Le tampon 5 prévoit un agencement multicouche. Dans l'exemple illustré, le tampon comprend trois couches 7, 8 et 9 de composition (fibre naturelle type cellulose, fibre synthétique type polyester, polypropylène ou un mélange de celles-ci), d'épaisseur, de 20 grammage et de vitesses d'absorption différents. [0062] Chacune des couches est composée d'une ou de plusieurs sous-couches de matériaux absorbants (de deux à six sous-couches au total et préférentiellement quatre ou cinq sous-couches au total). 25 [0063] Afin d'assurer un bon maintien de l'ensemble et pour faciliter les manipulations du tampon, on prévoit avantageusement un corps externe 10, entourant les multiples couches. Ce corps peut lui-même être constitué de matériau absorbant, mais plus rigide, de façon à assurer le maintien des couches intérieures. Des ailettes de préhension 6 sont prévues dans 30 la continuité du corps 10 pour faciliter la prise en main et les manipulations du tampon. Les ailettes sont prévues pour se prolonger au-delà des parois du boîtier dans lequel l'absorption a lieu. Le corps et l'ensemble des couches sont dimensionnés de façon à bien s'insérer dans la boîte d'immunodiffusion radiale. On prévoit par exemple une surface de tampon sensiblement inférieure à la surface de la boîte d'immunodiffusion. 35 [0064] La couche 7, située à la base du tampon, forme la couche externe, qui est la seule en contact direct avec le milieu dans lequel l'absorption doit être effectuée. On prévoit de ldbio-dif rad-FR 3063813 14 préférence une couche absorbante à surface lisse en fibre synthétique, résistante au déchirement, de sorte qu'elle serve de support/fond au système multicouche. [0065] La couche 8 prévoit de une à deux sous-couches de papier absorbant en cellulose de 5 grammage compris entre 50 et 800 g/m2 (préférentiellement entre 150 et 500 g/m2), de vitesse d'absorption compris entre 30 et 1200 sec/7,5cm hauteur et préférentiellement entre 80 et 600 sec/7,5cm hauteur. Les vitesses d'absorption indiquées sont en relation avec le taux de Klemm VVicking (« Klemm wicking rate test ») bien connu dans le domaine des tests d'absorption. 10 [0066] La couche 9 prévoit deux à trois sous-couches de papier absorbant en cellulose de grammage compris entre 50 et 800 g/m2 (préférentiellement entre 400 et 800 g/m2), de vitesse d'absorption compris entre 30 et 1200 sec/7,5cm hauteur, et préférentiellement entre 30 et 200 sec/7,5cm hauteur. 15 [0067] Les matériaux utilisés sont des matériaux de haute qualité, non pelucheux, sans additifs, produits avec de l'eau ultra pure, garantissant une homogénéité de sa capillarité sur l'ensemble de sa surface. 20 [0068] Tel qu'illustré, le tampon comporte avantageusement une masse calibrée 11 (optionnelle), permettant de favoriser l'absorption du fluide. Une telle masse est avantageusement comprise entre 200 g et 1000 g. TETE DE LECTURE NUMERIQUE 25 [0069] Le système de dosage comprend avantageusement une tête de lecture numérique, apte à effectuer une capture d'image numérique de la surface du gel de dosage coloré. Il peut aussi comprendre un sous-système de traitement d'image, adapté pour effectuer un traitement d'image des images numériques des surfaces du gel de dosage afin de déterminer les concentrations en antigène pour chacun des échantillons présents dans les 30 différents puits de la boîte de dosage. ldbio-dif rad-FR REVENDICATIONS1. Procédé de dosage d'antigènes par coloration de gels d'immunodiffusion radiale, notamment pour réaliser les essais d'activité de lots de vaccins, comprenant les étapes suivantes : - utilisation (10) d'un boîtier prêt-à-l'emploi incluant une couche de gel contenant un antisérum spécifique de l'antigène ciblé et formant une matrice de puits de dépôts ; - dépôt (11) d'un volume donné des échantillons et des solutions de référence de concentrations connues en antigène dans les puits ; - mise en diffusion (12) du gel en plaçant le boîtier dans une chambre de diffusion dont l'atmosphère est saturée en humidité et à une température donnée pour une durée déterminée en fonction du système antigène/anticorps considéré ; - rinçage (13) du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de rinçage ; - à la fin du temps de rinçage, la solution est retirée par déversement ; - absorption (14) de la solution de rinçage restante dans le gel à l'aide d'au moins un tampon d'absorption au format du boîtier et comportant une pluralité de couches absorbantes calibrées ; - séchage sensiblement complet (15) du gel par flux d'air chaud ; - coloration (16) du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact d'une solution de coloration ; - à la fin du temps de coloration, la solution est retirée par déversement ; - décoloration (17) du gel par ajout dans le boîtier d'un volume exact de la solution de décoloration ; -à la fin du temps de décoloration, la solution est retirée par déversement ; - séchage sensiblement complet (18) du gel par flux d'air chaud. 2. Procédé de dosage selon la revendication 1, dans lequel l'étape de dépôt des échantillons est effectuée à l'aide d'une pipette à déplacement positif. 3. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant par ailleurs les étapes suivantes : - mise en place (19) sur la surface libre du gel d'une plaque opaque favorisant l'acquisition d'images numériques et acquisition d'au moins une image numérique ; - traitement de l'image numérique obtenue (20) ; - calcul de la concentration en antigène (21) pour chacun des échantillons par traitement de l'image numérique obtenue. ldbio-dif rad-FR 3063813 17 4. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant par ailleurs une étape de préparation des boîtiers de dosage sous forme de lots sensiblement homogènes de gel contenant un antisérum spécifique délivré dans chacune 5 des boîtes sous forme d'une couche calibrée. 5. Procédé de dosage selon la revendication 4, comprenant une étape de perçage des puits sensiblement circulaires sous forme d'une matrice calibrée comprenant une phase de découpage des puits et une phase d'aspiration du gel présent dans les puits découpés de 10 façon à libérer les puits. 6. Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel, avant utilisation, les boîtiers de dosage sont stockés dans un coffret de protection thermique, lui-même placé dans une chambre régulée en température. 15 7. Procédé de dosage selon la revendication 6, dans lequel les boîtiers de dosage sont stockés à plat sur un support sensiblement horizontal, de préférence avec le fond du boîtier vers le haut. 20 8. Système de dosage d'un antigène par immunodiffusion radiale pour la mise en oeuvre du procédé d'exécution de dosage d'immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant : - au moins un boîtier de dosage pourvu d'un fond sensiblement plat et de parois latérales d'une hauteur d'au moins 10 mm et plus préférentiellement d'au moins 14 mm, ledit fond 25 comportant par ailleurs les caractéristiques suivantes : o une planéité comprise entre +0,50 mm et -0,30 mm pour une longueur de 127 mm et plus préférentiellement entre +0,25 mm et -0,15 mm pour une longueur de 127 mm ; o ledit fond étant doté de caractéristiques hydrophiles de sorte que sa tension de surface soit sensiblement voisine de celle de l'eau ; 30 - des repères d'identification des puits, présents soit directement sur le fond du boîtier de dosage ou sur une plaque complémentaire ; - une couche de gel uniformément répartie sur la surface du fond du boîtier, ledit gel comprenant un antisérum adapté au dosage à effectuer ; - une pluralité de puits calibrés en diamètre agencés dans le gel ; 35 - un couvercle adapté à chacun des boîtiers de dosage de façon à fermer ceux-ci de façon sensiblement étanche ; ldbio-dif rad-FR 3063813 18 - une chambre de diffusion, apte à loger au moins un boîtier de dosage et susceptible de contenir une atmosphère favorable à la diffusion. 9. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon la revendication 8, comprenant par 5 ailleurs au moins une pipette à déplacement positif dont les caractéristiques volumétriques sont adaptées aux volumes d'échantillons et de solutions de référence à placer dans les puits pour effectuer les dosages. 10. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 ou 9, 10 dans lequel le fond des boîtiers est transparent aux longueurs d'ondes voisines de 598 nm et est doté d'un indice de réfraction supérieur à 1,55. 11. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 à 10, dans lequel le fond des boîtiers comporte une dureté telle que la valeur E du module de 15 Young est supérieure à 3. 12. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 à 11, comprenant par ailleurs au moins un tampon d'absorption (5), adapté pour absorber le liquide résiduel présent dans le gel après l'étape de rinçage, le tampon (5) comprenant une 20 pluralité de couches absorbantes (7, 8, 9) superposées, dont une couche externe (7), en matériau absorbant et résistant au déchirement, formant un support pour les autres couches absorbantes. 13. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon la revendication 12, dans lequel 25 le tampon comprend deux couches internes (8, 9) absorbantes, de caractéristiques d'absorption différentes, chacune des deux couches étant constituée d'une pluralité de sous-couches de matériaux absorbants. 14. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 à 13, 30 comprenant une plaque opaque favorisant la prise d'image numérique dont les dimensions correspondent sensiblement à celle de couche de gel à analyser. 15. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 à 14, comprenant par ailleurs une tête de lecture numérique, apte à effectuer une capture d'image 35 numérique de la surface du gel. ldbio-dif rad-FR 3063813 19 16. Système de dosage par immunodiffusion radiale selon l'une des revendications 8 à 15, comprenant par ailleurs un sous-système de traitement d'image, adapté pour effectuer un traitement d'image des images numériques des gels de dosage afin de déterminer les concentrations en antigène pour chacun des échantillons présents dans les différents puits 5 du boîtier de dosage. ldbio-dif rad-FR