FR 3068988 A1 20190118 FR 1771350 A 20171213 RESUME La présente invention a pour objet un extrait de fenugrec utilisé seul ou incorporé au sein d'un complément alimentaire, d'un produit cosmétique, d'une composition pharmaceutique ou d'un milieu de culture industriel pour stimuler la croissance des microorganismes bénéfiques pour le bienêtre et la santé humaine et animale. L'invention est plus particulièrement illustrée en relation avec les Lactobacilles et Bifidobactéries, ainsi que la levure Saccharomyces cerevisiae, bien qu'elle puisse s'appliquer à toutes les bactéries ayant une physiologie similaire à celle des bactéries précitées, ainsi qu'à des levures du genre Saccharomyces. ETAT DE LA TECHNIQUE De nombreux microorganismes ont un effet bénéfique sur la santé humaine et animale. Des substances alimentaires généralement composées d'oligosaccharides et polysaccharides essentiellement non amidonnés et non digestibles ou d'alcools de sucres non dégradés et non absorbés dans la partie supérieure du tube digestif, stimulent spécifiquement, principalement dans l'intestin et le vagin, un ou un nombre limité de bactéries vivantes et bénéfiques pour l'homme (essentiellement des lactobacilles et des bifidobactéries), ainsi que des levures. Ces substances sont généralement regroupées sous la terminologie de prébiotiques. La flore commensale contribue à la prévention des infections, des processus oxydatifs, ou encore améliore certaines fonctions telles que l'absorption digestive de minéraux reconnus pour leurs effets bénéfiques sur la santé, tels que le fer, le calcium, le zinc ou encore le magnésium. Il est ainsi important de favoriser la croissance et le métabolisme des microorganismes commensaux bénéfiques, au détriment des microorganismes pathogènes ou néfastes, afin d'entrainer un rééquilibrage de la composition de la flore (intestinale, vaginale, buccale, nasale, auriculaire) en faveur des microorganismes bénéfiques. Le fenugrec, dont le nom binominal est Trigonella foenum-graecum, appartient à la famille des légumineuses. Originaire d'Afrique du Nord et du bassin méditerranéen, cette plante annuelle est cultivée depuis longtemps en Asie, notamment en Inde et en Chine. Le fenugrec trouve de nombreuses applications chez l'homme ou l'animal. Il peut en particulier être utilisé traditionnellement comme tonique pour stimuler l'appétit et améliorer la digestion, comme orexigénique ou encore pour soulager l'irritation des voies respiratoires. 1 Plus récemment, les recherches et études cliniques ont montré que le fenugrec pouvait contribuer à la régulation du taux de glucose sanguin en cas de diabète. Des travaux chez la daurade royale (Sparus aurata L.) suggèrent que le fenugrec seul ou associé à des probiotiques stimulerait la réponse immunitaire (Bahi et al. 2017, Guardiola F.A. et al. 2017). Le brevet W0/2009/13 8684 décrit également des propriétés antiparasitaires contre les parasites flagellés humains et animaux H a également été prêté à des extraits de fenugrec des propriétés antibactériennes (Pangal M. et al. 2011, Aman S et al 2014) et antifongiques (Haoula R. et al. 2008). Des essais chez le porc suggèrent que le fenugrec pourrait être un substrat source de carbone pour les bactéries du genre Lactobacillus et Clostridium de classe I (Zentek J. et al. 2013), du fait de la présence de galactomannanes, augmentant ainsi de manière relativement spécifique leur nombre dans le tube digestif de l'animal (Lin B. et al. 2011). Une seconde étude menée en parallèle sur la souris a conforté le rôle des galactomannanes de fenugrec dans la régulation de la flore digestive. En particulier, les auteurs de cette seconde série de travaux ont démontré que les graines de fenugrec augmentaient le ratio Bacteroidetes : Firmicutes (Shtriker MG et al. 2017), et concluaient leur article ainsi : « les fibres digestives - pectines et galactomannanes - dérivés de citron et de fenugrec, respectivement, modifiaient le profil de population du microbiote digestif ». Il est bien connu que les galactomannanes sont des polyosides se présentant sous forme de fibres végétales présents dans de nombreuses graines. Ils servent de réserve de carbohydrates qui sont des sources de carbone chez les légumineuses. Les galactomannanes sont présents dans l'endosperme de la graine, mais ne pénètrent pas dans l'embryon aussi appelé germe (voir par exemple le livre « Carbohydrate Reserves in Plants - Synthesis and regulation », en particulier la Figure 4 page 305). De fait, chacun s'attend à ce que les germes issus de graines de fenugrec, qui ne contiennent pas de galactomannanes, ne présentent pas les propriétés liées à ces galactomannanes, de source de carbone spécifiques pouvant être consommées par les microorganismes tels que les Lactobacillus et Clostridium de classe I et n'aient de fait pas leur croissance spécifiquement stimulée par rapport aux autres genres bactériens. DESCRIPTION DE L'INVENTION De manière tout à fait surprenante, et contrairement à ce que l'Homme de l'Art pouvait envisager sur la base des données scientifiques connues, le Demandeur a constaté et démontré que le fenugrec, et plus spécifiquement la partie germée de la graine, présentait des propriétés stimulatrices de croissance de bactéries commensales bénéfiques du système digestif humain et animal et de la sphère génitale, sans pour autant être une source de carbone pour les bactéries. Cette stimulation de croissance 2 (augmentation de la quantité de microorganismes, de la vitesse de croissance et de la viabilité) dépend de la quantité d'extrait (effet dose). Cette stimulation est spécifique des bactéries des genres Lactobacillus, Bifidobacterium ainsi que de la levure Saccharomyces cerevisiae. Selon l'invention, l'extrait est obtenu à partir de germes de graines de fenugrec par solubilisation dans un solvant aqueux ou alcoolique. En pratique, les graines de fenugrec sont mises à germer, puis les germes sont broyés en présence de solvant (eau ou éthanol). La phase liquide est ensuite collectée puis évaporée. Le résidu sec appelé par la suite S520GG peut être utilisé. Bien entendu, l'extrait ou la poudre de germes de fenugrec peut être utilisé tel quel ou plus avantageusement formulé au sein d'une composition, notamment pharmaceutique plus complexe en présence d'excipients. Il peut également être incorporé au sein d'un complément alimentaire, d'un produit cosmétique, d'hygiène, ou encore d'un milieu de culture destiné à la production de probiotiques. Les ingrédients pouvant être utilisés dans la formulation, en particulier sous forme de complément alimentaire animal ou humain, sont à titre d'exemple le blé, le mais, le soja, l'huile de soja, l'huile de palme, ou encore des sels minéraux, acides aminés, vitamines et autres sources de carbone, et plus généralement tout composé pouvant entrer dans la composition d'aliments. La plupart du temps, la composition est administrée oralement. Dans le cas de la recherche d'une activité sur la sphère vaginale, l'extrait est administré par voie vaginale à l'aide de capsules, gélules, seringues, tampons ou tout autre mode d'administration adapté. Pour une utilisation à des fins de production industrielle de bactéries bénéfiques, l'extrait de germes de fenugrec est ajouté avantageusement au milieu de culture. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples qui suivent à l'appui des figures annexées. EXEMPLES DE REALISATION Obtention de l'extrait de germes de fenugrec Avant toute utilisation, les graines de fenugrec sont lavées par immersion pendant 15 minutes dans une solution de dioxyde de chlore 2,9 g/L à pH neutre. Les graines sont ensuite rincées avec de l'eau ultra-pure. L'opération de rinçage est répétée 5 fois. 3 Les graines sont ensuite trempées pendant 18 heures dans de l'eau ultra pure à l'obscurité. Elles sont ensuite égouttées, et étalées sur une surface absorbante maintenue humide pendant 48 à 72 heures. Les germes séparés des graines sont ensuite ajoutés à de l'eau ou de l'éthanol à 50% dans un ratio 1 :2 masse :masse, et mises en agitation pendant 24 heures. La phase liquide est ensuite récoltée par centrifugation puis filtration sur membrane à 0,22 micron. La phase liquide peut ensuite être lyophilisée. Augmentation du nombre de microorganismes bénéfiques Afin de tester si l'extrait de germes de fenugrec augmentait la quantité de microorganismes bénéfiques en culture, des cultures de bactéries (Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. gasseri) ont été effectuées en présence ou non d'extrait aqueux d'extrait de germes de fenugrec à 2 mg/mL. Après 24 heures (L. adidophilus, L. casei, L. gasseri), ou 48 heures (L. gasseri), la population bactérienne a été évaluée quantitativement en absence (Figure 1, Témoin 24H) ou présence (Figure 1, Essai 24H) d'extrait de germes de fenugrec. Il est clairement apparu que les populations microbiennes étaient significativement augmentées dans des proportions allant de 10% (L. casei 24 h ; L. gasseri 48 h) à 50% (L. acidophilus 24h). L'extrait de germes de fenugrec augmente donc la quantité de bactéries cultivées après 24 heures de culture. Augmentation de la vitesse de croissance des microorganismes bénéfiques Afin de tester si l'extrait de germes de fenugrec augmentait la vitesse de croissance de microorganismes bénéfiques, une culture de Lactobacillus casei a été réalisée en présence ou non d'extrait aqueux de germes de fenugrec à 1 et 2 mg/mL. La croissance bactérienne a été suivie au cours du temps par mesure de l'absorption à 595nm (Figure 2). Il est clairement apparu qu'en présence d'extrait de germes de fenugrec à 1, 2 et 5 mg/mL. En comparant les demi-phases de croissance des bactéries cultivées, la croissance était avancée de 4 heures par rapport à la culture de bactéries effectuée en absence d'extrait de germes de fenugrec. L'extrait de germes de fenugrec augmente donc la vitesse de croissance des bactéries. Effet dose Afin de tester si l'augmentation de la vitesse de croissance et de la quantité de bactéries cultivées en présence d'extrait de germes de fenugrec dépendait de la dose d'extrait de germes de fenugrec, plusieurs expériences ont été réalisées. Dans une première série, des extraits alcooliques d'extrait de germes de fenugrec ont été ajoutés à une culture de Lactobacillus acidophilus, en absence ou présence de lmg et 2 mg d'extrait de germes de 4 fenugrec. Le suivi de la croissance bactérienne au cours du temps a permis de mettre en évidence une augmentation quantitative de la biomasse bactérienne, comme observé avec les extraits aqueux (Figure 3a). L'augmentation moyenne a été de 30% en présence d' lmg/mL d'extrait de germes de fenugrec, et de 40% en présence de 2 mg/mL d'extrait de germes de fenugrec. Afin de confirmer et affiner ce résultat, la même expérience a été réalisée avec des doses croissantes d'extrait de germes de fenugrec en solution aqueuse: 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL. L'augmentation quantitative a été respectivement de 40%, 70%, 85%, 105% et 115% par rapport au contrôle sans extrait de germes de fenugrec (Figure 3b). De plus, la prolifération bactérienne a été plus rapide, comme précédemment observé. L'effet stimulateur de croissance de l'extrait de germes de fenugrec sur les bactéries bénéfiques est donc dose-dépendant. Spécificité de genre et d'espèce Afin de savoir si l'extrait de germes de fenugrec avait un effet général sur la croissance de l'ensemble des microorganismes ou seulement sur les microorganismes bénéfiques pour l'homme et l'animal, l'extrait de germes de fenugrec a été testé sur d'autres bactéries gram positif et gram négatif ainsi que sur des levures bénéfiques ou non pour la santé animale et humaine. La Figure 4 reprend la liste des souches testées, ainsi que l'effet sur la croissance (quantité de biomasse) ou la vitesse de croissance de concentrations d'extrait de germes de fenugrec variant de 0,1 g/L à 4 g/L. Ces expériences ont permis de confirmer que l'extrait de germes de fenugrec avait un effet positif sur la croissance des bactéries lactiques testées du genre Bifidobacterium et du genre Lactobacillus Il n'a pas été mis en évidence d'augmentation qualitative (vitesse de croissance) ou quantitative (augmentation de la biomasse mesurée par absorbance) chez aucune de ces espèces Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Shigella boydii, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Yersinia enterolytica. Salmonella enterica serovar typhimurium et Clostridium sporogenes sont légèrement stimulés mais de manière très modérée et uniquement aux concentrations les plus fortes de 4 g/L d'extraits de germes de fenugrec. Concernant les levures, l'extrait de germe de fenugrec stimule très significativement la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae, mais pas la levure pathogène Candida albicans. L'extrait de germes de fenugrec stimule donc spécifiquement la croissance des bactéries et levures bénéfiques pour l'homme et l'animal. 5 Essais de source de carbone Dans des essais chez le porcelet, il avait été suggéré que des graines de fenugrec ajoutées à l'alimentation quotidienne pouvaient être une source de carbone pour des bactéries du genre Lactobacillus et des Clostridium de groupe I, grâce aux galactomannanes contenus dans les graines. Des essais ont donc été conduits en présence de plusieurs sources de carbone avérées (glucose, inuline, fructooligosaccharides), en présence ou absence de l'extrait de germes de fenugrec. L'extrait de germes de fenugrec a également été testé comme source unique de carbone. De manière surprenante, contrairement à ce qui était décrit précédemment chez le porcelet, l'extrait de germes de fenugrec testé seul n'est pas une source de carbone. Incorporé dans un milieu minimal sans source de carbone, l'extrait de germes de fenugrec ne permet quasiment pas la croissance des bactéries (Figure 5a, S520GG), contrairement au glucose seul (Figure 5a, GLU). Associé comme source de carbone par contre, l'extrait de germes de fenugrec stimule grandement la vitesse de croissance et la biomasse des bactéries, et ce de manière stable (Figure 5a, GLU+S520GG). Des résultats similaires sont obtenus en remplaçant le glucose comme source de carbone par des fructo-oligosaccharides (Figure 5b) ou de l'inuline (Figure 5c). Contrairement à ce qui pouvait être attendu, l'extrait de germes de fenugrec n'est pas une source de carbone, mais agit comme un « stimulant » de la croissance de bactéries, tant d'un point de vue quantitatif qu'en termes de vitesse de croissance. LEGENDES La figure 1 est une représentation graphique de l'effet de l'extrait de l'invention sur la croissance de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, et Lactobacillus gasseri. La population bactérienne est exprimée en nombre de colonies par millilitre. La figure 2 est une représentation graphique comparant l'effet de concentrations croissantes de l'extrait de l'invention sur la vitesse de croissance une culture de Lactobacillus casei au cours du temps. DO 595nm : Absorbance à 595 nm La figure 3a est une représentation graphique de l'effet de l'extrait de l'invention solubilisé dans l'éthanol sur des cultures de Lactobacillus acidophilus au cours du temps. La figure 3b est une représentation graphique de l'effet de quantités croissantes de l'extrait de l'invention solubilisé dans l'eau sur des cultures de Lactobacillus acidophilus au cours du temps. 6 La figure 4 synthétise de manière schématique l'effet de concentrations variables d'extraits de germes de graines de fenugrec S520GG sur diverses souches bactériennes et fongiques, bénéfiques ou pathogènes. La figure 5 représente la croissance de Lactobacillus acidophilus en absence ou présence de différentes sources de carbone. GLU=Glucose, FOS=Fructo-oligo-saccharides, INU=Inuline, S520GG=extrait de germes de fenugrec, ES = contrôle eau. Figure 5a: Glucose additionné ou non de germes de fenugrec. Figure 5b: Fructooligosaccharides additionnés ou non d'extrait de germes de fenugrec. Figure 5c : Inuline additionnée ou non d'extrait de germes de fenugrec. CITATIONS Bahi A et al. (2017) Effects of dietary administration of fenugreek seeds, alone or in combination with probiotics, on growth performance parameters, humoral immune response and gene expression of gilthead seabream (Sparus aurata L), Fish Shellfish Immunol., 60 :50-58 Guardiola FA et al. (2017) Effects of dietary supplementation with fenugreek seeds, alone or in combination with probiotics, on gilthead seabream (Sparus aurata L) skin mucosal immunity, Fish Shellfish Immunol., 65: 169-178 W0/2009/138684 Fenugreek extract for treating human nd animal diseases involving flagellate 205 parasites Pangal M et al. (2011) In vitro antimicrobial activity of ten medicinal plants against clinical isolates of oral cancer cases, Mn. Clin. Microb. Antimicrob., 20 :10-21 Aman S et al. (2014) Antimicrobial polyphenols from small tropical fruits, tea and spice oilseeds, Food Sci. Technol. Int., 20(4) : 241-251 210 Haouala R et al. (2008) Aqueous and organic extracts of Trigonella foenum-graecum L. inhibit the mycelia growth of fungi, J. Environ. Sci., 20(12) : 1453-1457 Zentek J et al. (2013) Fenugreek seed affects intestinal microbiota and immunological variables in piglets after weaning, Br. J. Nutr., 109 (5) : 859-866 Lin B et al. (2011) Galactomann-guided preemptive vs. empirical antifungals in the persistently febrile 215 neutropenie patient: a prospective randomized study, Food Hydrocoll. 25: 180-188 7 Shtriker MG et al. (2017) Fenugreek galactomannan and citrus pectin improve several parameters associated with glucose metabolism and modulate gut microbiota in mice, Nutrition, Aug 3. pii: S0899-9007(17)30161-2. doi: 10.1016/j .n ut.2017.07.01 Chapter 14 Galactomannans as the reserve carbohydrate in legume seeds, in Carbohydrate Reserves in 220 Plants - Synthesis and Regulation (2000) AK Gupta et N Kaur Editors, Elsevier, ISBN 0080528503, 9780080528502 MATERIEL ET METHODE Préparation de l'extrait 225 Les graines de fenugrec sont lavées par immersion pendant 15 minutes dans une solution de dioxyde de chlore 2,9 g/L à pH neutre. Les graines sont ensuite rincées avec de l'eau ultra-pure. L'opération de rinçage est répétée 5 fois. Les graines sont ensuite trempées pendant 18 heures dans de l'eau ultra pure à l'obscurité. Elles sont ensuite égouttées, et étalées sur une surface absorbante maintenue humide pendant 48 à 72 heures. 230 Les germes sont séparés des graines et sont ensuite ajoutés à de l'eau dans un ratio 1 :2 masse :masse, et mises en agitation pendant 24 heures. La phase liquide est ensuite récoltée par centrifugation puis filtration sur membrane à,22 micron. La phase liquide est ensuite lyophilisée. Pour les solutions mères, 1 g de cette poudre est repris dans 5 mL d'eau stérile (concentration de 200 235 mg/mL), ou bien lorsque cela est précisé, dans de l'éthanol à 50% (concentration de 200 mg/mL). L'extrait final est indifféremment appelé extrait de germes de fenugrec ou S520G0. Culture des bactéries Les bactéries utilisées pour évaluer l'effet de l'extrait de graines de fenugrec sont Bifidobacterium breve CIP 64.69, Bifidobacterium lactis CIP 105.265, Bifidobacterium longum subsp. longum CIP 240 64.62, Bacteroides thetaiotamicron CIP 104.207, Lactobacillus acidophilus CIP 103598, Lactobacillus delbruecki CIP 101.027, Lactobacillus paracasei CIP 103.704, Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis CIP 52.62, Campylobacter jejuni ATCC 29428, Clostridium sporogenes CIP 100.651, Clostridium perfringens ATCC 13124, Enterococcus faecium CIP 102.379, Enterococcus hirae ATCC 8043, Escherichia cou i CIP 53.126, Listeria monocytogenes ATCC 19115, 245 Propionibacterium acnes ATCC 6919, Salmonella enterica ser. typhimurium CIP 103.799, 8 Staphylococcus aureus CIP 4.83, Shigella boydii CIP 52.48, Vibrio alginolyticus CIP 103.336, Vibrio cholerae CIP 106.973, Yersinia enterolytica ATCC 23715, Saccharomyces cerevisiae UMIP 1181.79, Candida albicans UMIP 48.72. Les bactéries sont cultivées en milieu MRS à 37°C. La composition du milieu MRS est la suivante : Gélose Bouillon Peptone 10 g 10 g Extrait de viande 10 g 8 g Extrait de levure 5 g 4 g Glucose 20 g 20 g Acétate de sodium trihydraté 5 g 5 g Citrate d'ammonium 2 g 2 g Tween 80 1 g 1 g Hydrogénophosphate de potassium 2 g 2 g Sulfate de magnésium heptahydraté 0,1 g 0,2 g Sulfate de manganèse tétrahydraté 0,05 g 0,05 g Agar 15 g Eau qsp (quantité suffisante pour) 1 1 pH = 6,2 250 Culture en absence ou présence de différentes sources de carbone Le milieu minimum contenant tous les ingredientes essentiels pour les tests de sources de carbone est constitué comme suit : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L Dipotassium phosphate monobasique 2 g/L Sulfate de magnesium 0,2 g/L Tween 80 1 g/L Cystéine 0,5 g/L Acétate de sodium 5 g/L Eau qsp (quantité suffisante pour) 900 mL Pour ces tests, les concentrations des défférentes sources de carbone ajoutées sont : glucose (GLU) : 5 255 g/L; fructo-oligosaccharides (FOS) : 5 g/L; inuline (INU) : 1 g/L; extrait de germes de fenugrec (5520GG) : 2 g/L. Dénombrement des microorganismes Les bactéries (105 ufc/mL = unités formant des colonies par millilitre) sont mises en présence de quantités croissantes d'extrait de germes de fenugrec dans un bouillon MRS en anaérobie. Après 24 ou 9 260 48 heures de culture à 37°C, la suspension bactérienne est diluée en milieu MRS à une dilution connue, puis la dilution est étalée sur gélose MRS. Après 48 heures, les colonies sont comptées ; lorsque ce nombre est compris entre 30 et 300, le nombre de colonies est multiplié par le facteur de dilution afin d'avoir la charge bactérienne initiale (en ufc/mL). Les données sont traitées à l'aide d'ExcelTM (MicrosoftTM). 265 Cinétiques de croissance bactérienne Les bactéries (105 ufc/mL = unités formant des colonies par millilitre) sont mises en présence de quantités croissantes d'extrait de germes de fenugrec dans un bouillon MRS en anaérobie. La croissance à 37°C des bactéries est mesurée par absorbance de la densité optique à 595 nm pendant 48 heures, à l'aide d'un automate de mesure FluostarTM (BMG Labtech) qui effectue les mesures toutes 270 les heures. Les données sont traitées à l'aide d'ExcelTM (MicrosoftTM) 'o REVENDICATIONS1/ Utilisation d'un extrait de fenugrec pour stimuler spécifiquement la croissance de microorganismes 275 commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir de germes préalablement séparés de la graine après germination 3/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que les microorganismes commensaux et probiotiques sont des bactéries lactiques des genres Lactobacillus et 280 Bifidobacterium, ainsi que des levures du genre Saccharomyces. 4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait stimule la vitesse de croissance des microorganismes commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 5/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait stimule 285 l'obtention de la quantité de biomasse des microorganismes commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un milieu de culture industriel. 7/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au 290 sein d'un complément alimentaire. 8/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un produit d'hygiène ou de cosmétique. 9/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un médicament. 11