FR 3067349 A1 20181214 FR 1755214 A 20170612 Nouveaux agents mono et di-antennes complexants hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants La présente invention a pour objet des agents complexants ou ligands hydrosolubles, des complexes de lanthanide obtenus à partir de ces agents complexants, et l'utilisation de ces complexes de lanthanide pour marquer des molécules et les détecter par des techniques de fluorescence en temps résolu. Etat de la technique Les complexes de lanthanide ont vu leur utilisation augmenter de manière très importante depuis une vingtaine d'années dans le domaine des sciences de la vie. Ces composés fluorescents présentent en effet des caractéristiques spectroscopiques intéressantes, qui en font des marqueurs de choix pour détecter des molécules biologiques. Ces composés fluorescents sont particulièrement appropriés pour être utilisés en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fôrster resonnance energy transfer »), dont l'application pour étudier les interactions entre biomolécules est exploitée de manière commerciale par plusieurs sociétés, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La durée de vie relativement longue des complexes de lanthanides permet également d'effectuer des mesures de fluorescence en temps résolu, c'est-à-dire avec un délai après excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interférences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette dernière caractéristique est d'autant plus utile que le milieu de mesure se rapproche d'un milieu biologique, qui comprend de nombreuses protéines dont la fluorescence pourrait interférer avec celle des composés étudiés. De nombreux complexes de lanthanide ont été décrits. Latva et al par exemple, ont divulgué 41 complexes d'Eu(III) et de Tb(III), dont ils ont étudié la luminescence (Journal of Luminescence 1997, 75, 149). Le composé 39 en particulier, est constitué d'un cycle 1,4,7-triazacyclononane (ci-après « TAON »), dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores dérivés de phényléthynylpyridine. Bien que le rendement quantique du complexe constitué de ce chromophore et d'Eu(III) soit considéré comme bon par les auteurs, ce complexe n'est pas adapté au couplage avec une biomolécule. Par ailleurs, l'utilisation de ce composé en milieu aqueux peut être problématique puisqu'il est très hydrophobe. Enfin, l'absorption de ce complexe est optimale à 315 nm, alors que la longueur d'onde d'excitation souvent utilisée dans les lecteurs de plaques pour les dosages biologiques est plutôt à 337 nm. D'Aléo et al ont décrit la synthèse de complexes de lanthanide constitués de trois ligands dérivés de l'acide dipicolonique (Inorganic Chemistry 2008, 47, 10258). L'un de ces ligands (L1) est constitué d'une molécule d'acide dipicolinique substituée par un groupe phényléthynyl, lui-même portant un éther-oxyde de polyéthylèneglycol (ci-après « PEG >>) sur le groupe phényle. D'après les auteurs, le groupe PEG confère à ce produit une bonne solubilité en milieux aqueux et dans les solvants 2 organiques. Toutefois, ces complexes ne sont pas suffisamment stables en milieu aqueux et ne sont pas utilisables dans une réaction de bioconjuguaison. Plusieurs autres complexes de lanthanide ont été divulgués et certains sont exploités de manière 5 commerciale : on peut citer en particulier les cryptates macropolycycliques de lanthanide (EP-A-0 180492, EP-A-0 321 353, EP-A-0 601 113, WO 2001/96877, WO 2008/063721), les complexes de lanthanide comportant un motif dérivé de la coumarine lié à un motif diéthylènetriamine penta-acide (US 5,622,821), et ceux comprenant des dérivés de pyridine (US 4,920,195, US 4,761,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, 10 US 5,202,423, US 5,324,825). La demande de brevet WO 2013/011236 décrit des agents complexants de formule : CHR Oh rom 2 IN> Chromi ijY c 15 Dans cette demande les inventeurs envisagent des complexes comportant trois chromophores afin d'augmenter la brillance. De plus pour rendre hydrosoluble ces complexes, les inventeurs utilisent des groupements PEG. Bien que ces groupements PEG soient neutres d'un point de vue « charge globale >>, ils confèrent aux complexes des propriétés d'adsorption sur le plastique et le verre ce qui rend peu aisée leur utilisation dans un dosage immunologique. 20 La demande de brevet WO 2014/111661 décrit des agents complexants, comprenant trois groupes chromophores, représentés par la formule : Chrom3 Chroml Chrom2 25 Dans cette demande, les inventeurs ont remplacé les groupements PEG par des groupements chargés : anioniques ou cationiques. Ces complexes sont parfaitement solubles et ne s'adsorbent plus sur le plastique ou le verre. Ces complexes présentent des structures en étoile assez volumineuses et possèdent des propriétés de brillance très élevées. 3 La demande de brevet WO 2014/162105 concerne des complexes de lanthanide comprenant au moins deux groupes bétaïne sur la partie organique leur conférant des propriétés intéressantes en terme de solubilité dans l'eau et les milieux biologiques. Ces groupes solubilisants sont présentés comme permettant de limiter les phénomènes d'adsorption non spécifique avec les cellules vivantes. 5 En revanche ces complexes possèdent trois chromophores identiques ou différents ce qui comme dans la demande WO 2014/111661 génère des structures en étoile assez volumineuses et de bonnes propriétés de brillance. Les demandes de brevet WO 201 4/1 47288 et WO 2016/066641 décrivent des complexes de TAON 10 possédant des coefficients d'absorption molaires élevés. Ces complexes présentent une brillance elévée mais possèdent également trois chromophores. Les inventeurs cherchent les complexes les plus brillants possibles afin d'avoir un transfert d'énergie optimal (FRET). Les structures en étoile des complexes est encore une fois volumineuses et leur brillance est importante. 15 L'introduction de trois chromophores sur un macrocycle de type triazacyclononane n'est pas toujours un avantage puisque les chromophores sont des synthons provenant d'une synthèse longue et fastidieuse. La présence de trois chromophores dans un complexe de TAON augmente la taille de la molécule ce qui augmente les emcombrements stériques avec les biomolécules. Néanmoins, plus le nombre de chromophores est important plus la brillance est élevée, puisque ce paramètre dépend du 20 rendement quantique et du coefficient d'absorption molaire (epsilon) de la molécule. En introduisant trois chromophores sur une molécule, la brillance est augmentée. Dans la présente invention nous avons découvert qu'il n'y a pas de corrélation entre la brillance d'un complexe et sa capacité à détecter une cible biologique dans un immunoessai basé sur du FRET en 25 temps résolu dans lequel le complexe est utilisé comme donneur d'énergie. Cette invention vise à palier aux incovénients de l'art antérieur, c'est-à-dire de simplifier la synthèse en introduisant un ou deux chromophores, de réduire les encombrements stériques et finalement de disposer d'une sonde fluorescente ayant au moins les mêmes performances en terme de transfert d'énergie. 30 La présente invention vise donc à fournir des complexes de lanthanide fluorescents présentant une brillance inférieure à celle des composés de l'art antérieur lorsqu'ils sont excités aux alentours de 337 nm mais dont la capacité à détecter une cible biologique dans un immunoessai basé sur du FRET en temps résolu est comparable voire meilleure que celle des analogues portant trois chromophores. Ces complexes sont d'autre part dotés d'une bonne solubilité en milieu aqueux, d'un spectre d'émission 35 adapté à leur utilisation dans des expériences de FRET, ainsi que d'une bonne praticité pour le marquage de biomolécules puisqu'ils sont de plus petite taille. 4 AGENTS COMPLEXANTS Les agents complexants selon l'invention sont les composés de formule (I) : Chronn3 rN (I) Chronn2 N Chronni dans laquelle : 5 - Chromi, Chrom2 et Chrom3 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe de formule : (la) (lb) L1-CO-R G-L1 1:(IN Ri1\1 (Ic) OU (Id), étant entendu que le composé de formule (I) comprend (nécessairement) (i) un ou deux groupes 10 choisis parmi les groupes (la) et (lb) et (ii) au moins un groupe L1-00-R ; - R est un groupe -0R2 ou -NH-E ; - R1 est un groupe -002H ou -P(0)(OH)R3; - R2 est H ou un (01-04)alkyle ; - R3 est un (01-04)alkyle, de préférence un méthyle ; un phényle éventuellement substitué par 15 un groupe -S03-, ce dernier étant de préférence en position méta ou para ; ou un benzyle ; - L1 est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r - éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène, un atome d'azote et un atome de soufre ; un groupe -CH=CH- ; un groupe -CH=CH-0H2- ; un groupe -0H2-CH=CH- ; ou un groupe PEG ; - L2 est un groupe de liaison divalent ; 20 - G est un groupe réactif ; 5 E est un groupe -CH2-(CH2)5-CH2-S03- ou -(CH2)5-N+Alk1Alk2A1k3, ou une sulfobétaïne ; r est un entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 3 ; s est 0, 1 ou 2 ; A1k2, A1k3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1-C6)alkyle. 5 Par groupe PEG on entend un groupe polyéthylène glycol de formule -CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3, y étant un nombre entier allant de 1 à 5. Par sulfobétaïne on entend un groupe choisi parmi : 10 R4 I + SO3- R4 avec R4 qui représente un (C1-C6)alkyle, de préférence un méthyle ou éthyle, et t qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, et de préférence qui est égal à 1 ou 2, la sulfobétaïne de formule -(CH2)2N+(CI-13)2-(CI-12)3- S03- étant préférée. 15 En fonction du pH, les groupes -S03H, -CO2H et -P0(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc dans la suite du texte également les groupes -S03-, -0O2- et -PO(OH)0, et vice-versa. Une première famille préférée d'agents complexants est constituée des composés de formule (I) où 20 Chromi est un groupe de formule (la) et Chrom2 et Chrom3 sont chacun un groupe de formule (Ic), identique ou différent. Dans un mode de réalisation, Chrom2 et Chrom3 sont identiques. Dans un autre mode de réalisation, qui peut être combiné au mode de réalisation précédent, R1 est un groupe - CO2H ou -P(0)(OH)R3dans lequel R3 est un (C1-C4)alkyle ou un phényle. 25 Une deuxième famille préférée d'agents complexants est constituée des composés de formule (I) où Chromi et Chrom2 sont chacun un groupe de formule (lb), identique ou différent, et Chrom3 est un groupe de formule (Id). Dans un mode de réalisation, Chromi et Chrom2 sont identiques. Dans un autre mode de réalisation, qui peut être combiné au mode de réalisation précédent, R1 est un groupe -CO2H ou -P(0)(OH)R3dans lequel R3 est un (C1-C4)alkyle ou un phényle. 30 Parmi ces deux familles préférées, des sous-familles préférées sont celles où les agents complexants comprennent une ou plusieurs des caractéristiques ci-après : - R2 est H ; - L1 est est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r- éventuellement interrompu par au moins un 35 atome choisi parmi un atome d'oxygène et un atome de soufre, et r = 2 ou 3; un groupe - CH=CH- ; un groupe -CH=CH-CH2- ; ou un groupe -CH2-CH=CH- ; 6 E est un groupe -CH2-(CH2)5-CH2-S03- avec s = 0 ou 1 , -(CHI-N+Alk1Alk2A1k3 avec Alki, A1k2 A1k3, identiques ou différents, représentant un (C1-C4)alkyle et s = 0 ou 1 ; ou un groupe de formule : R4 I + SO3- R4 5 dans laquelle R4 est un (C1-C4)alkyle et t est 1 ou 2. Dans un mode de réalisation de l'invention, lorsque les agents complexants de formule (I) comprennent plusieurs groupes E, au plus l'un de ces groupes représente une sulfobétaîne. 10 Le groupe réactif G porté par un bras d'espacement L1 ou L2, permet de coupler les composés selon l'invention avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine. Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. 15 Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Typiquement, le groupe réactif est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est respectivement mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe 20 réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. De préférence, le groupe réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un 25 aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester 30 d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)- propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules : 7 0 0 NH)-(CH2) NOS NH)-(CH2)-NCO W 0 NH2 0 NH)-(CH2) NH)-(CH2)-N3 V W W 0 M V W 0 NH)-(CH2) S S Ar NH)-(CH2)-SH Cl N=( CI dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 5 De manière préférée, le groupe réactif G est une amine (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -0O2Me, -0O2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir 10 réagir avec une espèce nucléophile. 0 NH)-(CH2) NH-Ar W C)11 NH (CH2)-N 0 NH)-(CH2) W NOS NCO S03- NH)-(CH2) W NH)-(CH2) 0 NH)-(CH2) W il ° NH)-(CH2) V W NH)-(CH2) =CH W NH)-(CH2)-NH- 'N 8 Le groupe réactif G est lié à l'agent complexant via un bras d'espacement L1 ou L2, constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent. En particulier, le bras d'espacement L2 peut être choisi parmi : une liaison directe; 5 un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-020, de préférence en C1-08, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ; un groupe cycloalkylène en 05-08 ; un groupe arylène en 06-014; lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) 10 carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en Cl -C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : -(CH2) n ;-(CN 2)n-0-(01-1 2)m-0-(CH 2)p- ; 15 0 -(0H2)n-0-(0H2)m-0-(0H2)p-NH-L(CH2)q 20 0 0 0 -(CH2)n-NHIL(CH2)m-LL ; (CH2)n-NH1L(CH2)m- ; 0 S (CH2)p- 0 0 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m S -(CH2)n-NH N-(CH2)p- (CH2)m- 0 (CH2)m-N 0 -(CH2)n-NH S (CH2)p- 0 -(CH2)p-NHJ-L(CH2)m-N) >i 9 o -(CH2)n-NH- . -(CH2) n-NH-(CH2) m.-L(CH2)n- . [s03_ 0 -(CH2), I NHIL(0H2)m dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un 5 nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. Dans les groupes de formule (la), le groupe -L2-G est de préférence constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -0O2Me, -0O2tBu), une amine (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de 10 succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, et d'un bras d'espacement L2 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule : 0 SO3 0 (CH2), I NHIL(CH2)m -(CH2)n-NH-L(CH26- ; où n, m, sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant 15 de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. COMPLEXES L'invention concerne également les complexes de lanthanide constitués d'un atome de lanthanide 20 complexé par un agent complexant tel que décrit ci-dessus, le lanthanide étant choisi parmi : Eu3+, Sm3+, Tb3+, Gd3+, Dy3+, Nd3+, Er3+. De préférence, le lanthanide est Tb3+ ou Eu3+ et de manière encore plus préférée Eu3+. Ces complexes sont préparés en faisant réagir les agents complexants selon l'invention avec un sel 25 de lanthanide. Ainsi la réaction entre un équivalent d'agent complexant et 1 à 5 équivalents de sel de lanthanide (europium ou terbium sous forme de chlorures, d'acétates ou de triflates) dans un solvant (acétonitrile, méthanol ou autre solvant compatible avec ces sels) ou un tampon conduit au complexe correspondant après quelques minutes d'agitation. 30 Comme indiqué précédemment, les complexes fluorescents obtenus présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à 10 environ 337 nm ou lampe flash. De plus la répartition des bandes de leurs spectres d'émission est centrée autour de 620 nm conférant ainsi aux complexes des propriétés exceptionnelles et très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). Du fait de la grande stabilité de ces 5 complexes dans les milieux biologiques contenant des cations divalents (Mn2+, Ca2+, Mg2+...) ou de l'EDTA, leur luminescence reste excellente comparée aux complexes portant trois chromophores de l'art antérieur. CONJUGUES 10 Les agents complexants et complexes de lanthanide selon l'invention comportant un groupe G, sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation des complexes de lanthanides pour le marquage de molécules d'intérêt (protéines, anticorps, enzymes, hormones etc...). 15 L'invention concerne également les molécules marquées par un complexe selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un complexe selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un complexe selon l'invention et une molécule choisie 20 parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme (en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisées sous les dénominations Snaptag et Cliptag)), un chloroalcane (substrat de l'enzyme commercialisée sous la dénomination Halotag), le coenzyme A (substrat de l'enzyme commecialisée 25 sous le nom ACPtag ou MCPtag). SYNTHESE La stratégie générale concernant la préparation des agents complexants (ligands) et des complexes selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après (schéma 1 : mono-antenne et schéma 30 2 : di-antenne), et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale. Schéma 1 5 A partir du macrocycle triazacyclononane mono protégé Boc 1, ont été introduits les deux motifs pyridinyles qui seront utilisés pour accrocher les deux groupements solubilisants. Le groupement protecteur Boc est supprimé puis l'antenne (chromophore) est ajoutée sur le macrocycle conduisant ainsi au ligand 3. L'hydrolyse des esters (carboxylates et phosphinates) a été réalisée de manière classique en utilisant des conditions basiques. Ceci permet ensuite d'incorporer l'atome d'europium 10 formant ainsi les complexes 5. A partir de ces complexes, sont introduites les deux fonctions hydrosolubilisantes. Enfin après déprotection du groupement protecteur Boc porté par l'antenne (chromophore), les complexes sont fonctionnalisés (7) afin qu'ils puissent être conjugués sur des biomolécules. 11 °2R2 L,!c Ms 0 Q:? Boc 1 Z = PMe(0), PPh(0), CO Li, L2 = linker , R2 = alkyl E = groupe solubilisant Grp-fonct = groupe fonctionnel i_c°2R2 N 1) TFA OR1 2) Chrom-L2-NHB0c N N. Boc N -oR L R202 d 2 E uC 13 ORi Base, Solvant Li-002R2 1) Déprotection du NH2 (Boc) 2) Introduction du groupe fonctionnel NHBoc Agent de couplage NH2-E N-Grp-fonct 7 0_t2 12 Schéma 2 5 Les systèmes di-antennes sont obtenus en utilisant une stratégie analogue mais en inversant l'ordre d'introduction des motifs pyridinyles et du chromophore. Cette fois les antennes sont introduites en premier lieu pour conduire aux composés 8. Après suppression du groupement Boc, le dernier motif pyridinyle a été introduit. La suite est identique à savoir hydrolyse des fonctions esters (carboxylates et phosphinates), formation du complexe d'europium, introduction des deux fonctions 10 hydrosolubilisantes (cette fois ces fonctions sont portées par les chromophores) puis incorporation du groupement fonctionnel conduisant ainsi à la famille di-antenne 13. 1) Préparation des briques pyridinyles Les schémas ci-après (3-11) décrivent les différentes voies synthétiques permettant de disposer de 15 dérivés pydininyles trifonctionnels : 1) TFA y 2) MsONiz OR Base, Solvant L-Y Z CR N N Chroni 9 EuCI3 OH OMe Agent de couplage NH2-E --Grp-fonct 1) Déprotection de NH2 (Boc) 2) Introduction du groupe fonctionnel Eu3' N N Chrorn"- 0,z H 13 12 Boc NH HN L_/ Z = PMe(0), PPh(0), CO Y = NHBoc, CO2tBu L = linker R= alkyl E = groupe solubilisant Grp-fonct = groupe fonctionnel 8 Base, Solvant 13 en position 2 la fonction complexante (acide carboxylique ou acide phosphinique), en position 4 une fonction qui permet soit d'introduire le groupe hydrosolubilisant (fonction ester méthylique) ou bien une fonction qui permet d'incorporer le groupe fonctionnel (fonction amine protégée et fonction ester tert-butylique) 5 et enfin en position 6 une fonction methyl alcool qui est convertie en mésylate correspondant afin de pouvoir réagir avec les amines du cycle TAON. HON (ICO2Me Pd(OAc)2, Et3N HO CO2Me )n MsCI, DCM, TEA Pd/C 10%, H2 Me0H CO2Me )n Ms0 X 14a, Y = I, X = CO2Me 15a, n = 0, Y= I, X= CO2Me, 68% 16a, n = 1, X= CO2Me, 98% 17a, n = 1, X= CO2Me, 82% 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 15b, n = 1, Y= I, X= CO2Me 16b, n = 2, X= CO2Me 17b, n = 2, X= CO2Me 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et 15c, n = 0, Y= Br, X= PMe(0)0Et 16c, n = 1, X= PMe(0)0Et 17c, n = 1, X= PMe(0)0Et 15d, n = 1, Y= Br, X= PMe(0)0Et 16d, n = 2, X= PMe(0)0Et 17d, n = 2, X= PMe(0)0Et 15e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)0Et 16e, n = 1, X= PPh(0)0Et 17e, n = 1, X= PPh(0)0Et 15f, n = 1, Y= Br, X= PPh(0)0Et 16f, n = 2, X= PPh(0)0Et 17f, n = 2, X= PPh(0)0Et MsCI, DCM, ).» TEA 18a, n = 1, X= CO2Me 18b, n = 2, X= CO2Me 18c, n = 1, X= PMe(0)0Et 18d, n = 2, X= PMe(0)0Et 18e, n = 1, X= PPh(0)0Et 18f, n = 2, X= PPh(0)0Et 10 Schéma 3 Les synthèses des synthons 14a-c ont été décrites précédemment (cf. demandes WO 2013/011236 et WO 2014/111661). A partir de ces synthons, la série des composés 17a-f a été obtenue par une séquence de trois réactions : réaction de Heck permettant de créer la liaison 15 carbone-carbone entre le dérivé de la pyridine et l'alcène. Cette procédure a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP-A-2 002 836. La réduction de la double liaison par hydrogènation catalytique suivie de la réaction de mésylation conduit aux composés 17a-f. Alternativement la double liaison peut être conservée pour rigidifier le système et d'imposer une orientation apicale des groupements hydrosolubilisants (18a-f). 20 Y HONx HO CO2tBu J )n CO2tBu )n MsCI, DCM, TEA ( ICO2tBu % Pd(OAc)2, Et3N CO2tBu n Pd/C 10%, H2 Me0H 14 111.- EI°N X Ms0NIX / 14a, Y= I, X = CO2Me 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et 19a, n = 0, Y= I, X= CO2Me, 19b, n = 1, Y= I, X= CO2Me 19c, n = 0, Y= Br, X= PMe(0)0Et 19d, n = 1, Y= Br, X= PMe(0)0Et 19e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)0Et 19f, n = 1, Y= Br, X= PPh(0)0Et 20a, n = 1, X= CO2Me, 20b, n = 2, X= CO2Me 20c, n = 1, X= PMe(0)0Et 20d, n = 2, X= PMe(0)0Et 20e, n = 1, X= PPh(0)0Et 20f, n = 2, X= PPh(0)0Et 21a, n = 1, X= CO2Me, 21 b, n = 2, X= CO2Me 21c, n = 1, X= PMe(0)0Et 21d, n = 2, X= PMe(0)0Et 21e, n = 1, X= PPh(0)0Et 21f, n = 2, X= PPh(0)0Et MsCI, DCM, TEA 22a, n = 1, X= CO2Me 22b, n = 2, X= CO2Me 22c, n = 1, X= PMe(0)0Et 22d, n = 2, X= PMe(0)0Et 22e, n = 1, X= PPh(0)0Et 22f, n = 2, X= PPh(0)0Et Schéma 4 Les composés 21a-f et 22a-f (schéma 4) sous forme ester tert-butylique (analogues de la série 17 et 5 18) ont été obtenus en suivant la même stratégie et en utilisant l'alcène correspondant. NHBoc NHBoc ) n MsCI, DCM, )) )n TEA HON MsON Y % Pd(OAc)2, Et3N HON I x NHBoc (INHBoc n n ' HO-N Pd/C 10%, H2 Me0H 14a, Y = I, X = CO2Me 23a, n = 0, Y= I, X= CO2Me, 24a, n = 1, X= CO2Me, 25a, n = 1, X= CO2Me, 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 23b, n = 1, Y= I, X= CO2Me 24b, n = 2, X= CO2Me 25b, n = 2, X= CO2Me 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et 23c, n = 0, Y= Br, X= PMe(0)0Et 24c, n = 1, X= PMe(0)0Et 25c, n = 1, X= PMe(0)0Et 23d, n = 1, Y= Br, X= PMe(0)0Et 24d, n = 2, X= PMe(0)0Et 25d, n = 2, X= PMe(0)0Et 23e, n = 0, Y= Br, X= PPh(0)0Et 24e, n = 1, X= PPh(0)0Et 25e, n = 1, X= PPh(0)0Et 23f, n = 1, Y= Br, X= PPh(0)0Et 24f, n = 2, X= PPh(0)0Et 25f, n = 2, X= PPh(0)0Et MsCI, DCM, TEA 26a, n = 1, X= CO2Me 26b, n = 2, X= CO2Me 26c, n = 1, X= PMe(0)0Et 26d, n = 2, X= PMe(0)0Et 26e, n = 1, X= PPh(0)0Et 26f, n = 2, X= PPh(0)0Et Schéma 5 10 Les composés 25a-f et 26a-f (schéma 5) sous forme NHBoc (analogues de la série 17 et 18) ont été obtenus en suivant la même stratégie en utilisant l'alcène correspondant. 15 o Y >\01NH2 Pd(OAc)2, Cs2CO3 dioxane, 100°C, Xphos HON I x 14a, Y = I, X = CO2Me 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et BocHN HON I 27a, X= CO2Me, 27b, X= PMe(0)0Et 27c, X= PPh(0)0Et MsCI, DCM, BocHN TEA i\ns()N X 28a, X= CO2Me, 28b, X= PMe(0)0Et 28c, X= PPh(0)0Et Schéma 6 Les composés 28a-c (sans chaîne carbonée) analogues de la série 25 ont été préparés selon une 5 stratégie analogue. L'introduction du groupement NHBoc a été réalisée par exemple en utilisant la méthode décrite dans l'article de revue Tetrahedron Letters 2010, 51, 4445. OY OH OH 63% Me02C N CO2Me HOY THF, DIAD, PPh3 70°C, 16 h H2SO4, Me0H Reflux, 16h I HO2C N CO2H 29 30 31a, Y = CO2Me 31b, Y = CO2tBu 31c, Y = NHBoc, 99% NaBH4 Me0H, CH2Cl2 MsCI, DCM, TEA I I rN CO2Me r-N CO2Me 0Ms OH 33a, Y = CO2Me 32a, Y = CO2Me 33b, Y = CO2tBu 32b, Y = CO2tBu 33c, Y = NHBoc 32c, Y = NHBoc Schéma 7 10 Les dérivés pyridinyles sur lesquels sont intercalés en position 4 un atome d'oxygène entre le linker aliphatique portant la fonction (CO2R ou NHBoc) et le noyau aromatique (pyridine), ont été préparés selon la méthode décrite dans le schéma 7. L'acide chélidamique 29 a été estérifié sous forme de diester méthylique puis le linker portant la fonction a été introduit en utilisant une réaction de 15 Mitsunobu (procédure décrite par exemple dans Organic Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183). La mono-réduction en utilisant du borohydrure de sodium permet d'obtenir les composés 32a-c sous forme de monoalcool qui sont ensuite convertis en dérivés mésylés correspondants 33a-c. Y 0°C OY 16 m-CPBA CHCI3 \ le.NCO2Me 35 CO2H CO2Me Me0H, H2SO4 34 CO2Me t\l±CO2Me ô- 36 0 0 1) )..L F3C 0 CF3 2) H20 CO2Me CO2Me 0Ms 38 MsCI, DCM, CO2Me TEA rN CO2Me OH 37 Schéma 8 La fonction ester méthylique en position 4 peut être fixée directement sur le noyau aromatique 5 (pyridine). Dans ce cas, il est nécessaire de partir du composé 34 commercial qui est d'abord estérifié. La pyridine est oxydée ensuite en présence de m-CPBA conduisant au dérivé N-oxyde correspondant 36. La fonction N-oxyde réagit facilement avec l'anhydride trifluoroacétique qui subit un réarrangement pour conduire après hydrolyse à la fonction méthyle alcool en position 6. Ce dernier est mésylé dans les conditions classiques conduisant ainsi au composé 38. 10 P-v H-1 -0Et Catalyseur Et3N, PhMe 1- X= Me, Catalyseur = Pd(dpp0C12 X= Ph, Catalyseur = Pd(PPh3)4 CO2Et ,0 N P,' bEt 41a, R = Me 41b, R = Ph m-CPBA CHCI3 C1021-1 Et0H CO2Et H2SO4 I , NBr N Br 39 40 LMsCI, DCM, r( I ,0 N P,' TEA OEt 0Ms 44a, R = Me 44b, R = Ph CO2Et I ,0 OH bEt 43a, R = Me 43b, R = Ph 0 0 CO2Et 1) Â TL F30 00F3 bEt 42a, R = Me 42b, R = Ph 3) H20 CO2Et Schéma 9 Les dérivés phosphinates 44a-b analogues ont été préparés en utilisant le composé 39 qui est 15 d'abord estérifié puis converti en ester de phosphinate 41a-b. La suite de la séquence réactionnelle est identique à celle utilisée pour la synthèse du composé 38. 17 mCPBA CHCI3 H2SO4 NO2 /1 Et0H H2SO4 NO2 I , HNO3 N-(--0O2Et Ô- 0 0 1) F3CÂOÂCF3 2) H2O NO2 CO2Et 49 48 , I /-`f\l'CO2H Ô- 63% 55% N CO2H N-(--0O2E1 36% Ô- 47 OR I 46 OR ("N syOR MsCI, DCM, TEA HS OH 0 0 I (NCO2Et 0Ms N OH CO2Et 58% 51a, R = Et 50a, R = Et 51b, R = tBu 50b, R = tBu Schéma 10 Les dérivés 51a-b ont été préparés selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 10. Dans 5 cet exemple les fonctions ester sont introduites en utilisant le thioglycolate d'éthyle ou de tert-butyle. NO2 9 NO2 mCPBA CHCI3 I Fi-Pi "-Ri ,0 /.`N Br OEt Ri/ OEt 39 Catalyseur Et3N, PhMe R1= Me, Catalyseur = Pd(dppf)Cl2 52a, R1 = Me R1= Ph, Catalyseur = Pd(PPh3)4 52b, R1 = Ph OR2 0 MsCI, DCM, TEA ,0 0Ms Etd 56a, R1 = Me, R2 = Et 55a, R1 = Me, R2 = Et 54a, R1 = Me 56b, R1 = Ph, R2 = Et 55b, R1 = Ph, R2 = Et 54b, R1 = Ph 56c, R1 = Me, R2 = tBu 55c, R1 = Me, R2 = tBu 56d, R1 = Ph, R2 = tBu 55d, R1 = Ph, R2 = tBu Schéma 11 10 Les analogues phosphinates 56a-d sont préparés selon la voie de synthèse décrite dans le schéma 11. HS NO2 P"° 0- ROEt 53a, R1 = Me 53b, R = Ph 0 0 1) F3CÂOÂCF3 2) H20 NO2 ,0 (`N /P\' OH OEt 18 2) Préparation des chromophores OCO2Me Ms0 Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF a- MsCI, THF Et3N HO 14a, Y = I, X = CO2Me 57a, X = CO2Me 58a, X = CO2Me 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 57b, X = PMe(0)0Et 58b, X = PMe(0)0Et 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et 57c, X= PPh(0)0Et 58c, X = PPh(0)0Et Schéma 12 Les chromophores 58a-c (schéma 12) et 60a-c (schéma 13) ont été préparés selon les protocoles 5 détaillés dans les demandes WO 2013/011236 et WO 2014/111661. ONHBoc ONHBoc ONHBoc Ms0 HO Y HON I Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF MsCI, THF Et3N 14a, Y = I, X = CO2Me 59a, X = CO2Me 60a, X = CO2Me 14b, Y = Br, X = PMe(0)0Et 59b, X = PMe(0)0Et 60b, X = PMe(0)0Et 14c, Y = Br, X = PPh(0)0Et 59c, X= PPh(0)0Et 60c, X = PPh(0)0Et Schéma 13 3) Synthèse des complexes mono-antenne 19 1_,CO2R L.c°2R 1) TFA Ms(DN Z 2) Chrom-NHBoc 60a-c Py N N, Boc N Li Z RO2d 71. NH N. MeCN, K2CO3 Boc 61a, Py = 38, Z = CO2Me, L1 = 0, R = Me 62a, Z = CO2Me, L1 = 0, R = Me 61b, Py = 44a, Z = PMe(0)0Et, L1 = 0, R = Et 62b, Z = PMe(0)0Et, L1 = 0, R = Et 61c, Py = 44b, Z = PPh(0)0Et, L1 = 0, R = Et 62c, Z = PPh(0)0Et, L1 = 0, R = Et 61d, Py = 17a, Z = CO2Me, 1-1 = -(CH2)2-, R = Me 62d, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)2-, R = Me 61e, Py = 17b, Z = CO2Me, 1-1 = -(CH2)3-, R = Me 62e, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)3-, R = Me 61f, Py = 17c, Z = PMe(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, R = Me 62f, Z = PMe(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, R = Me 61g, Py = 17d, Z = PMe(0)0Et, L1 = -(CH2)3-, R = Me 62g, Z = PMe(0)0Et, L1 = -(CH2)3-, R = Me 61h, Py = 17e, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, R = Me 62h, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, R = Me 611, Py = 17f, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)3-, R = Me 621, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)3-, R = Me 61j, Py = 33a, Z = CO2Me, L1 = -0(CH2)3-, R = Me 62j, Z = CO2Me, L1 = -0(CH2)3-, R = Me 61k, Py = 51a, Z = CO2Me, L1 = SCH2, R = Et 62k, Z = CO2Me, L1 = SCH2, R = Et 611, Py = 56a, Z = PMe(0)0Et, L1 = SCH2, R = Et 621, Z = PMe(0)0Et, L1 = SCH2, R = Et 61m, Py = 56b, Z = PPh(0)0Et L1 = SCH2 R = Et 62m, Z = PPh(0)0Et, L1 = SCH2, R = Et 61n, Py = 18a, Z = CO2Me, L1 = -CH=CH-, R = Me 62n, Z = CO2Me, L1 = -CH=CH-, R = Me 61o, Py = 18b, Z = CO2Me, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me 62o, Z = CO2Me, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me 61p, Py = 18c, Z = PMe(0)0Et, L1 = -CH=CH-, R = Me 62p, Z = PMe(0)0Et, L1 = -CH=CH-, R = Me 61q, Py = 18d, Z = PMe(0)0Et, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me 62q, Z = PMe(0)0Et, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me 61r, Py = 18e, Z = PPh(0)0Et, L1 = -CH=CH-, R = Me 62r, Z = PPh(0)0Et, L1 = -CH=CH-, R = Me 61s, Py = 18f, Z = PPh(0)0Et, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me 62s, Z = PPh(0)0Et, L1 = -CH=CH-CH2-, R = Me EuC13 64a, Z = CO2-, L1 =0 64b, Z = PMe(0)0- = 0 64c, Z = PPh(0)0-, L1 = 0 64d, Z = CO2-, L1 = 64e, Z = CO2-, L1 = 64f, Z = PMe(0)0-, L1 = 64g, Z = PMe(0)0-, L1 = 64h, Z = PPh(0)0-, L1 = 641, Z = PPh(0)0-, L1 = 64j, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3- 64k, Z = CO2-, L1 = SCH2 641, Z = PMe(0)0-, L1 = SCH2 64m, Z = PPh(0)0-, L1 = SCH2 64n, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, 64o, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, 64p, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-, 64q, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, 64r, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-, 64s, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, 63a, Z = CO2-, L1 =0 63b, Z = PMe(0)0- L1 = 0 63c, Z = PPh(0)0-, L1 = 0 63d, Z = CO2-, L1 = 63e, Z = CO2-, L1 = 63f, Z = PMe(0)0-, L1 = 63g, Z = PMe(0)0-, L1 = 63h, Z = PPh(0)0-, L1 = 631, Z = PPh(0)0-, L1 = 63j, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3- 63k, Z = CO2-, L1 = SCH2 631, Z = PMe(0)0-, L1 = SCH2 63m, Z = PPh(0)0-, L1 = SCH2 63n, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, 63o, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, 63p, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-, 63q, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, 63r, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-, 63s, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Schéma 14 20 A partir du macrocycle TAON mono protégé Boc sont condensés les dérivés conduisant aux composés 61a-s. Le macrocycle est déprotégé et le chromophore c identiques à ceux portés par les Py) est introduit sur le ligand. Les fonctions esters (série 63) et l'europium est complexé dans les différents ligands pour conduire 5 complexes 63a-s. pyridinyles (Py) orrespondant (Z sont hydrolysées à la série des HATU, D1PEA IN» DMSO, NH2-E" 64a, Z = CO2-, = 0 64b, Z = PMe(0)0- Li= 65a-E1 Z = CO2-, = 64c, Z = PPh(0)0-, = 65a-E2, Z = CO2-, = 64d, Z = CO2-, = = 65a-E3, Z = CO2-, 64e, Z = CO2-, = = 65a-E4, Z = CO2-, 64f, Z = PMe(0)0-, = = 64g, Z = PMe(0)0-, = 65a-E5, Z = CO2-, 64h, Z = PPh(0)0-, Li = 65b-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = 64i, Z = PPh(0)0-, 64j, Z = CO2-, 64k, Z = 641, Z = PMe(0)0-, 64m, Z = PPh(0)0-, 64n, Z = CO2-, 64o, Z = CO2-, 64p, Z = PMe(0)0-, 64q, Z = PMe(0)0-, 64r, Z = PPh(0)0-, 64s, Z = PPh(0)0-, = = Li = SCH2 = SCH2 Li = SCH2 = -CH=CH-, = -CH=CH-CH2-, = -CH=CH-, = -CH=CH-CH2-, = -CH=CH-, = -CH=CH-CH2-, El, n = O} E2, n = 1 E3 = E4, n = O1 E5,n=1 - 65c-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = 65d-E1_5, Z = CO2-, L1 = 65e-E15, Z = CO2-, L1 = 65f-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = 65g-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = 65h-E15, Z = PPh(0)0-, L1 = 651-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = 4CH2)3- 65j-E1_5, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3- 65k-E", Z = CO2-, L1 = SCH2 651-E1_5, Z = PMe(0)0-, Li = SCH2 65m-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = SCH2 65n-E1_5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, 650-E1.5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, 65p-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-, 65q-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, 65r-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-, 65s-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Schéma 15 10 Sur la série 64a-s, les composés sont rendus solubles dans les milieux aqueux par l'introduction de deux groupements hydrosolubilisants : ces groupements sont soit de nature anionique (sulfonates) soit neutre (zwitterion : sulfo-bétaines), soit de nature cationique (ammonium quaternaire). 21 65a-E1 Z = CO2-, Li = 65a-E2, Z = CO2-, = 65a-E3, Z = CO2-, = 65a-E4, Z = CO2-, = 65a-E5, Z = CO2-, = 65b-E1.5, Z = PMe(0)0, Li = 65c-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = 65d-E1.5, Z = CO2-, Li = -(CH2)2- 65e-E1.5, Z = CO2-, Li = -(CH2)3- 65f-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = 65g-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = 65h-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = 65i-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = 65j-E1.5, Z = CO2-, L1 = 65k-E1.5, Z = CO2-, L1 = SCH2 651-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = SCH2 65m-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = SCH2 65n-E1.5, Z = CO2-, Li = -CH=CH-, 650-E1.5, Z = CO2-, Li = -CH=CH-CH2-, 65p-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-, 65q-E1.5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, 65r-E1.5, Z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-, 65s-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-0H2-, El, n = 0 } 'Llt.S03- E2, n = 1 n E3 = 3 / E4, n = 0 } ,271.71,ru\r, E3, n = 1 66a-E1 Z = 002-, = 66a-E2, Z = CO2-, = 66a-E3, Z = CO2-, = 66a-E4, Z = CO2-, = 66a-E5, Z = CO2-, = 66b-E1.5, Z = PMe(0)O L1 = 66c-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = 66d-E1.5, Z = CO2-, L1 = 66e-E1.5, Z = CO2-, Li = -(CH2)3- 66f-E1.5, Z = PMe(0)0-, Li = 66g-E1.5, Z = PMe(0)0-, Li = -(CH2)3- 66h-E1.5, Z = PPh(0)0-, Li = 66i-E1.5, Z = PPh(0)0-, Li = -(CH2)3- 66j-E1.5, Z = CO2-, Li = -O(0H2)3- 66k-E15, Z = CO2-, L1 = SCH2 661-E1.5, Z = PMe(0)0-, Li = SCH2 66m-E1.5, Z = PPh(0)0-, L1 = SCH2 66n-E1.5, Z = G02, L1 = -CH=CH-, 66o-E1.5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, 66p-E1.5, Z = PMe(0)0-, Li = -CH=CH-, 66q-E1.5, Z = PMe(0)0-, Li = -CH=CH-CH2-, 66r-E1.5, Z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-, 66s-E1.5, Z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-0H2-, Schéma 16 5 Enfin le groupement Boc est éliminé en présence d'acide trifluoroacétique ce qui conduit aux complexes de l'invention qui sont fonctionnalisés NI-12. 22 4) Synthèse des complexes di-antennes La synthèse des complexes di-antennes est décrite dans les shémas 17-20. Boc 0Ms MeCN, K2CO3 a- NH HN L_/ 58a, Z = CO2Me 58b, Z = PMe(0)0Et 1 58c, Z = PPh(0)0Et Me02C0 1) TFA y 2) MsC)N1 Z Py N un \ ,N N. uhrom Boc L1 Chrom 66a, Z = CO2Me 67a, Py = 28a, Z = CO2Me, L1 = 0, Y = NHBoc 66b, Z = PMe(0)0Et 66c, Z = PPh(0)0Et 67b, Py = 28b, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = CO2Me, L1 = 0, Y = NHBoc 67c, Py = 28c, Z = CO2Me, L1 = 0, Y = NHBoc 67d, Py = 25a, Z = PMe(0)0Et, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 67e, Py = 25b, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67f, Py = 25c, Z = PMe(0)0Et, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 67g, Py = 25d, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67h, Py = 25e, Z = CO2Et, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 67i, Py = 25f, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67j, Py = 21a, Z = CO2Me, 1-1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 67k, Py = 21b, Z = PMe(0)0Et, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 671, Py = 21c, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 67m, Py = 21d, Z = PMe(0)0Et, Z = PMe(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 67n, Py = 21e, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 670, Py = 21f, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 67p, Py = 33b, L1 = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 67q, Py = 33c, L1 = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 67r, Py = 51b, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 67s, Py = 56c L1 = SCH2, Y = CO2tBu 671, Py = 56d, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 67u, Py = 22a, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67v, Py = 22b, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 67w, Py = 22c, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67x, Py = 22d, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 67y, Py = 22e, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67z, Py = 22f, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 67aa, Py = 26a, 67ab, Py = 26b, 67ac, Py = 26c, 67ad, Py = 26d, 67ae, Py = 26e, L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc 67af, Py = 26f, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc 5 Schéma 17 La synthèse commence par la réaction d'alkylation sur le TAON monoprotégé avec les trois types de chromophores : carboxylate, méthyl phosphinate et phényl phosphinate. Le groupement protecteur 10 Boc est éliminé et les pyridines correspondantes portant les Z identiques aux chromophores sont introduites sur le dernier site d'alkylation du TAON conduisant aux composés 67a-af. 23 1) LiOH 2) EuCI3 Me02C0 C N , N Cnrom 67a, Z = CO2Me, Li = 0, Y = NHBoc 68a, Z = CO2-, Li = 0, Y = NHBoc 67b, Z = PMe(0)0Et, Li = 0, Y = NHBoc 68b, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, Li = 0, Y = NHBoc 67c, Z = PPh(0)0Et, Li = 0, Y = NHBoc 68c, Z = CO2-, Li = 0, Y = NHBoc 67d, Z = CO2Me, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68d, Z = PMe(0)0-, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, Li = -(CH2)2-, 67e, Z = CO2Me, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68e, Z = CO2-, Li Y = NHBoc 67f, Z = PMe(0)0Et, Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68f, Z = PMe(0)0-, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67g, Z = PMe(0)0Et, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68g, Z = CO2-, Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc 67h, Z = PPh(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68h, Z = CO2-, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67i, Z = PPh(0)0Et, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68i, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 67j, Z = CO2Me, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68j, Z = CO2-, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 67k, Z = CO2Me, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 68k, 681, Z = PMe(0)0-, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 671, Z = PMe(0)0Et, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68m, Z = CO2-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 67m, Z = PMe(0)0Et, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 68n, 680, Z = PMe(0)0-, Z = PMe(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 67n, Z = PPh(0)0Et, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68p, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 67o, Z = PPh(0)0Et, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 68q, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 67p, Z = CO2Me, Li = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 68r, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 67q, Z = CO2Me, Li = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 68s, Li = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 67r, Z = CO2Et, Li = SCH2, Y = CO2tBu 68t, Li = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 67s, Z = PMe(0)0Et, Li = SCH2, Y = CO2tBu 68u, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 67t, Z = PPh(0)0Et, Li = SCH2, Y = CO2tBu 68v, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 67u, Z = CO2Me, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 68w, Li = SCH2, Y = CO2tBu 67v, Z = CO2Me, Li = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 68x, Li = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67w, Z = PMe(0)0Et, Li = -CH=CH-, Y = CO2tBu 68y, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 67x, Z = PMe(0)0Et, Li = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 68z, 68aa, 68ab, 68ac, 68ad, 68ae, 68af, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67y, Z = PPh(0)0Et, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu Li = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 67z, Z = PPh(0)0Et, 67aa, Z = CO2Me, 67ab, Z = CO2Me, 67ac, Z = PMe(0)0Et, 67ad, Z = PMe(0)0Et, 67ae, Z = PPh(0)0Et, Li = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu Li = -CH=CH-, Y = CO2tBu 67af, Z = PPh(0)0Et, Li = -CH=CH-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu Li = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc Li = -CH=CH-, Y = NHBoc = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc Li = -CH=CH-, Y = NHBoc L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc Li = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc Li = -CH=CH-, Y = NHBoc Li = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc Schéma 18 5 Les ligands sont hydolysés et l'atome d'europium est introduit dans le macrocycle conduisant à la série 68. E21, n En E3 = E4, n = 0 E5, n = 1 } 24 H E,N1(0 0 HATU, DIPEA DMSO, NH2-E1-5 Eu) N rOM Z N Eu3. ) --N N Cnrom 68a, Z = CO2-, L1 = 0, Y = NHBoc 69a-E1_5, Z = CO2-, Li = 0, Y = NHBoc 68b, Z = PMe(0)0-, L1 = 0, Y = NHBoc 69b-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = 0, Y = NHBoc 68c, Z = PPh(0)0-, Li = 0, Y = NHBoc 69c-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = 0, Y = NHBoc 68d, Z = CO2-, Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc 69d-E1_5, Z = CO2 , L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68e, Z = CO2-, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 69e-E1_5, Z = CO2, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68f, Z = PMe(0)0-, 1-1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 69f-E15, Z = PMe(0)0-, Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68g, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 69g-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68h, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 69h-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = -(CH2)2-, Y = NHBoc 68i, Z = PPh(0)0-, Li = -(CH2)3-, Y = NHBoc 69i-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 68j, Z = CO2-, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 69j-E1, Z = CO2-, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68k, Z = CO2-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 69k-E1_5, Z = CO2-, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 681, Z = PMe(0)0-, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 69I-E1, Z = PMe(0)0-, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68m, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 69m-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 68n, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 69n-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 68o, Z = PPh(0)0-, 1-1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 69o-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 68p, Z = CO2-, Li = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 69p-E1_5, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 68q, Z = CO2-, Li = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 69q-E1_5, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 68r, Z = CO2-, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 69r-E1_5, Z = CO2-, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 68s, Z = PMe(0)0-, Li = SCH2, Y = CO2tBu 69s-E1_5, Z = PMe(0)0-, Li = SCH2, Y = CO2tBu 68t, Z = PPh(0)0-, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 69t-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = SCH2, Y = CO2tBu 68u, Z = CO2-, Li = -CH-CH-, Y = CO2tBu 69u-E1_5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 68v, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 69v-E1_5, Z = CO2-, Li - -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 68w, Z = PMe(0)0-, Li - CH-CH , Y = CO2tBu 69w-E1_5, Z = PMe(0)0-, Li = -CH=CH-, Y = CO2tBu 68x, Z = PMe(0)0-, Li - CH-CH CH2 , Y - CO2tBu 69x-E1_5, Z - PMe(0)0-, Li = -CH=CH-CH2-, Y = CO2tBu 68y, Z = PPh(0)0-, Li --CH=CH-, Y = CO2tBu 69y-E1_5, Z - PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 68z, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y - CO2tBu 69z-E15 Z = PPh(0)0-, L1 - -CH-CH-CH2-, Y = CO2tBu 68aa, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, Y - NHBoc 69aa-E1_5, Z = CO2-, L1 - -CH-CH-, Y = NHBoc 68ab, Z = CO2-, Li - CH-CH CH2 , Y - NHBoc 69ab-E1, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc 68ac, Z = PMe(0)0-, L1 - -CH=CH-, Y = NHBoc 69ac-E1_5, Z = PMe(0)0-, Li = -CH=CH-, Y = NHBoc 68ad, Z = PMe(0)0-, Li - CH-CH CH2 , Y - NHBoc 69ad-E1_5, Z - PMe(0)0-, L1 - CH=CH-CH2-, Y = NHBoc 68ae, Z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-, Y - NHBoc 69ae-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li - -CH=CH-, Y = NHBoc 68af, Z = PPh(0)0-, Li = -CH-CH-CH2-, Y = NHBoc 69af-E1_5, Z = PPh(0)0-, Li = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc Schéma 19 5 Les groupements hydrosolubilisants (E1-E5) sont ensuite introduits sur les deux chromophores (schéma 19). Ils sont de natures anioniques, neutres ou cationiques. 25 H EE21, nn E3 = E4, n = 0 } E5, n = 1 TFA o Z N Eu .--N N 3' CnrOM Li Y 69a-E1_5, Z = CO2, L1 = 0, Y = NHBoc 70a-E1_5, Z = CO2-, L1 = 0, Y = NH2 69b-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = 0, Y = NHBoc 70b-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1_1 = 0, Y = NH2 69c-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = 0, Y = NHBoc 70c-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = 0, Y = NH2 69d-E1_5, Z = CO2, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 70d-E1_5, Z = CO2, L1 = -(CH2)2-, Y = NH 69e-E1_5, Z = CO2, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 70e-E1_5, Z = CO2-, L1 = -(CH2)3-, Y = NH2 69f-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 70f-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = NH2 69g-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 70g-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1_1 = -(CH2)3-, Y = NH2 69h-E1_5, 60j-E1_5, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, L1 = -(CH2)2-, Y = NHBoc 70h-E1_5, Z = PPh(0)0-, Z = PPh(0)0-, Z = CO2-, 1-1 = -(CH2)2-, Y = NH2 Y = NH Y = CO2H 1-1 = -(CH2)3-, Y = NHBoc 70j-E1_5, 1-1 = -(CH2)3-, 1-1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu L1 = -(CH2)2-, 69k-E1_5, Z = CO2-, 1-1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 70k-E1_5, Z = CO2, 1-1 = -(CH2)3-, Y = CO2H 691-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 70I-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -(CH2)2-, Y = CO2H 69m-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 70m-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = -(CH2)3-, Y = CO2H 69n-E1_5, Z = PPh(0)0-, 1-1 = -(CH2)2-, Y = CO2tBu 70n-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1= -(CH2)2-, Y = CO2H 69o-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2tBu 700-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -(CH2)3-, Y = CO2H 69p-E1_5, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3-, Y = CO2tBu 70p-E1_5, Z = CO2-, 1-1 = -0(CH2)3-, Y = CO2H 69q-E1_5, Z = CO2-, L1 = -0(CH2)3-, Y = NHBoc 70q-E1_5, Z = CO2-, 1-1 = -0(CH2)3-, Y = NH2 69r-E1_5, Z = CO2-, L1 = SCH2, Y = CO2tBu 70r-E1_5, Z = CO2-, L1 = SCH2, Y = CO2H 69s-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = SCH2, Y = CO2tBu 70s-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1-1 = SCH2, Y = CO2H 69t-E1_5, Z = PPh(0)0-, 1-1 = SCH2, Y = CO2tBu 70t-E1_5, Z = PPh(0)0-, 1-1 = SCH2, Y = CO2H 69u-E1_5, Z = CO2, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 70u-E1_5, Z = CO2-, L1 - CH=CH-, Y = CO2H 69v-E1_5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y - CO2tBu 70y-E1_5, Z = CO2-, L1 - CH-CH CH2-, Y = CO2H 69w-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-, Y = CO2tBu 70w-E1_5, Z - PMe(0)0-, L1-CH=CH-, Y = CO2H 69x-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1_1 - CH-CH CH2 , Y - CO2tBu 70x-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = CO2H 69y-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1= -CH=CH-, Y = CO2tBu 70y-E1_5, Z = PPh(0)0-, CH=CH-, Y = CO2H 69z-E1_5 Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y - CO2tBu 70z-E1_5 Z - PPh(0)0-, L1 - CH-CH CH2-, Y = CO2H 69aa-E1_5, Z = CO2-, L1 = -CH=CH-, Y = NHBoc 70aa-E1_5, Z = CO2, L1 CH-CH-, Y = NH2 69ab-E1_5, Z = CO2, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NHBoc 70ab-E1_5, Z = CO2, CH=CH-CH2-, Y = NH2 69ac-E1_5, Z = PMe(0)0-, 1_1 = -CH=CH-, Y = NHBoc 70ac-E1_5, Z - PMe(0)0-, CH=CH-, Y = NH 69ad-E1_5, Z = PMe(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y - NHBoc 70ad-E1_5, Z - PMe(0)0-, 1_1 - CH-CH CH2-, Y = NH2 69ae-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-, Y - NHBoc 70ae-E1_5, Z - PPh(0)0-, L1-CH=CH-, Y = NH2 69af-E1_5, Z = PPh(0)0-, 1_1 - CH-CH CH2 , Y - NHBoc 70af-E1_5, Z = PPh(0)0-, L1 = -CH=CH-CH2-, Y = NH2 Schéma 20 Pour finir le groupement Boc ou ester de tertbutyle est ensuite éliminé en présence d'acide trifluoro- 5 acétique pour conduire aux composés 70a-af (schéma 20). Pour montrer l'efficacité de l'invention à savoir qu'après marquage d'un anticorps les complexes mono-antenne sont aussi efficaces que les complexes tri-antennes, le complexe 66d-E2 a été fonctionnalisé sous forme d'ester de NHS en utilisant les techniques classiques connues de l'homme 10 de l'art. La synthèse du complexe tri-antenne correspondant a également été réalisée en utilisant la même fonctionnalisation sous forme d'ester de NHS. Un lot anticorps a été marqué en utilisant d'une part le complexe 66d-E2 et le complexe TAON tri-antenne. Deux essais HTRF ont été réalisés et de façon surprenante, les performances des deux immunoessais sont identiques c'est-à-dire que la sonde fluorescente mono-antenne présente une capacité de FRET comparable à celle qui possède 15 trois antennes. 26 PARTIE EXPERIMENTALE Abréviations utilisées : AcOEt : acétate d'éthyle 5 AcOH : acide acétique Boc : tert-butyloxycarbonyle CCM : chromatographie en couche mince 0D0I3 : chloroforme deutéré 0s003 : carbonate de césium 10 Cul : iodure de cuivre(I) CH2Cl2/DCM : dichlorométhane DIAD : azodicarboxylate de diisopropyle DIPEA: diisopropyléthylamine DMF : diméthylformamide 15 DMSO : diméthylsulfoxyde Et : éthyle Et3N/TEA : triéthylamine ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif Et0H : éthanol 20 HATU : (0-(7-azabenzotriazol-1-y1)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate) H2SO4 : acide sulfurique HNO3 : acide nitrique HPLC : chromatographie liquide à haute performance LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse 25 LiOH : hydroxyde de lithium LnCI3 : chlorure de lanthanide m-CPBA : acide métachloroperbenzoïque Me : méthyl MeCN : acétonitrile 30 Me0H : méthanol MgSO4 : sulfate de magnésium Ms : mésyle MsCI : chlorure de mésyle NaCI : chlorure de sodium 35 NaH : hydrure de sodium Pd(dppf)Cl2 : bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) Pd(PPh3)4 : tetrakis(triphénylphosphine)palladium(0) Pd/C : Palladium sur charbon Pd(OAc)2 : acétate de Palladium(II) 40 Ph: phényle 27 PPh3 : triphénylphosphine PtF: point de fusion Py : pyridine Rf : front de solvant 5 TA : température ambiante tBu : tertiobutyle TEA : triéthylamine TFA : acide trifluoroacétique THF : tétrahydrofurane 10 TMS : triméthylsilyle Ts : tosyle TSTU: tétrafluoroborate de 0-(N-Succinimidy1)-1,1,3,3-tétraméthyluronium UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse Xphos : 2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropylbiphényle 15 Chromatographie Les chromatographies sur couches minces ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck 60 F284 sur feuille d'aluminium ou sur des plaques d'oxyde d'aluminium neutre Merck 60 F254 (type E) sur feuille d'aluminium. 20 Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils : - HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge 018, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm. 25 - HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. 018, 5 lm: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été réalisées sur un appareil Waters Acquity HClass avec comme détecteur soit un detecteur UV à barette de diode de 30 type PDA, soit un détecteur masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray mode positif : tension de capillaire à 3,2 KV - tension de cône à 30 V. Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées sur gel de silice Merck 60 (0.040-0.063 mm). Les chromatographies sur colonne d'alumine ont été réalisées sur oxyde d'aluminium Sigma-Aldrich, neutre, activé, Brochmann I. 35 28 Gradient A Colonne Waters Acquity C18, 300 Â, 1,7 lm, 2,1 x 50 mm - A / eau 0,1% acide formique B / acétonitrile 0,1% acide formique t = 0 min 5% B -t = 0,2 min 5% B - t = 5 min 100% B - 0,6 mL.min- 5 Gradient B Colonne Waters Xbridge C18, 5 lm, 50 x 150 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 10 c/0 B - t = 19 min 60 % B - 100 mL.min-1 Gradient C Colonne Waters Acquity C18, 300 Â, 1,7 lm, 2,1 x 50 mm - A / eau 5 mM acétate d'ammonium B / 10 acétonitrile t= 0 min 5% B - t = 0,2 min 5% B - t = 5 min 100% B - 0,6 mL.min-1 Gradient D Colonne Waters Xbridge C18, 5 lm, 20 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - t = 19 min 60 % B - 20 mL.min-1 Gradient E 15 Colonne Waters Xbridge C18, 5 lm, 20 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 c/0 B - t = 19 min 40 % B - 20 mL.min-1 Gradient F Colonne Waters Xbridge C18, 5 lm, 20 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 6 B / acétonitrile t = 0 min 2 c/0 B - t = 19 min 40 % B - 20 mL.min-1 20 Spectroscopie - Résonance magnétique nucléaire Les spectres RMN (1H, 13C et 31P) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d'une sonde de mesure BBFO, multi noyaux de diamètre de 5 25 mm, de gradient Z et de lock2H. Les déplacements chimiques (ô) sont exprimés en partie par million (ppm). Les abréviations suivantes sont utilisées : s : singulet, se : singulet élargi, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : doublet dédoublé, td : triplet dédoublé, qd : quadruplet dédoublé, ddd : doublet de doublet dédoublé. - Spectrométrie de masse (LRMS) 30 Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Waters ZQ 2000 simple quadipôle à source multimode ESI/APCI équipé de colonne Waters XBridge C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm. - Spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse QStar Elite (Applied Biosystems 35 SCIEX) équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (API) assistée pneumatiquement. L'échantillon a été ionisé en mode electrospray positif dans les conditions suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d'orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de nébulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute résolution (HRMS) a été obtenu avec un analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a été effectuée en triplicata avec un double étalonnage interne. 40 29 Exemples: Composé 1 : le composé 1 a été préparé selon la procédure décrite dans les demandes WO 2013/011236 et WO 2014/111661. 5 Composés 14a-14c : les composés 14a-14c ont été préparés selon la procédure décrite dans les demandes WO 2013/011236 et WO 2014/111661. Composé 15a : dans un ballon de Schlenk de 100 mL le composé 14a (440 mg, 1,5 mmol) a été 10 solubilisé dans du DMF anhydre (10 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté la tri(o-tolyl)phosphine (91 mg, 0,3 mmol), Pd(OAc)2 (33,7 mg, 0,15 mmol), la TEA (0,314 ml, 2,252 mmol) puis l'acrylate de méthyle (0,203 mL, 2,252 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 70 °C pendant 5 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression 15 réduite, dilué dans AcOEt (50 mL), lavé avec de l'eau (2 x 50 mL) puis de l'eau saturée en NaCI (50 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant DCM/Me0H de 100/0 jusqu'à 99/1 pour conduire au composé 15a (233 mg, 62%) sous forme de poudre blanche. 20 Composés 15b-15f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a en utilisant les alcènes correspondants. Composé 16a : dans un ballon de 50 mL le composé 15a (233 mg, 0,927 mmol) a été solubilisé dans du Me0H (10 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le Pd/C 25 10% (23,69 mg, 0,022 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA avec un barbotage de dihydrogène pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été filtré sur filtre nylon 22 lm, évaporé à sec pour conduire au composé 16a (231 mg, 98%) sous forme de poudre blanche. 30 Composés 16b-16f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a. Composé 17a : dans un ballon de 100 mL le composé 16a (231 mg, 0,912 mmol) a été solubilisé dans du THF anhydre (30 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel placé dans 35 un bain de glace a été ajouté la TEA (0,127 mL, 0,912 mmol) puis le MsCI (72 IL, 0,912 mmol) en une seule fois. Le mélange a été réchauffé à TA et agité pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans du DOM (50 mL), lavé avec de l'eau (2 x 25 mL) puis de l'eau saturée en NaCI (20 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et 30 concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 17a (249 mg, 82%) sous forme de poudre blanche. Composés 17b-17f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour 5 la synthèse de 16a. Composés 18a-18f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. 10 Composés 19a-19f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a. Composés 20a-20f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a. 15 Composés 21a-21f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. Composés 22a-22f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour 20 la synthèse de 17a. Composés 23a-23f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 15a en utilisant les alcènes correspondants. 25 Composés 24a-24f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 16a. Composés 25a-25f: Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. 30 Composés 26a-26f : ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. Composé 27a-c: les composés 27a-c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : 35 Tetrahedron Letters 2010, 51, 4445. Composés 28a-28c: ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. 40 Composé 29 : ce composé est disponible commercialement. 31 Composé 30 : le composé 30 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Dalton Transactions 2010, 39, 707. 5 Composés 31a-31c: les composés 31a-31c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Organic Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183. Composés 32a-32c: les composés 32a-32c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175. Composés 33a-33c: les composés 33a-33c ont été préparés selon la procédure décrite dans l'article : Journal of Organic Chemistry 2010, 75, 7175. Composé 34 : ce composé est disponible commercialement. Composé 35 : le composé 35 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Bioorganic Chemistry 2014, 57, 148. Composé 36 : le composé 36 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Carbohydrate 20 Research 2013, 372, 35. Composé 37 : le composé 37 a été préparé selon la procédure décrite dans WO 2014/111661. Composé 38 : le composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse 25 de 17a. Composé 39 : ce composé est disponible commercialement. Composé 40 : le composé 40 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Bioorganic 30 Chemistry 2014, 57, 148. Composé 41a-b : les composés 41a-b ont été préparés selon la procédure décrite dans la demande WO 2014/111661 en utilisant le catalyseur correspondant. 35 Composé 42a-b: les composés 42a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 36. Composé 43a-b : les composés 43a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 37. 10 15 40 32 Composé 44a-b : les composés 44a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 17a. Composé 45 : disponible commercialement. 5 Composé 46 : le composé 46 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Chemistry - A European Journal, 2014, 20, 3610. Composé 47: le composé 46 (0,313 g, 2,04 mmol) a été dissous dans H2SO4 (11 mL) à TA puis la 10 solution a été refroidie dans un bain de glace. A ce mélange a été ajouté goutte à goutte HNO3 (9,7 mL) et la solution a été chauffée à 100 °C pendant2 j. Le mélange a été refroidi à TA puis versé dans de la glace pilée (100 g). Après 1 h, la phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 (3 x 50 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur MgSO4 et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un mélange de solvant (CH2Cl2-AcOH, 98/2) pour 15 conduire à un solide blanc (224 mg, 56%). Rf (CH2C12/AcOH, 98/2) = 0.38; PtF: 147°C; RMN1H (400 MHz, CDCI3, Ô): 16.49 (s, 1H, COOH), 9.08 (s, 1H, H3), 8.36 (s, 1H, H5), 2.75 (s, 3H, py-CH3); RMN 130 (101 MHz, CDCI3, Ô): 159.4 (COOH), 152.4 (06), 144.4 (C4), 138.7 (02), 123.1 (Ce), 121.7 (C3), 18.4 (py-CH3); MS Calculée pour C7H7N205199,036. Trouvée 199,035 [M+H]. 20 Composé 48: le composé 47 (2,9, 14,7 mmol) a été dissous dans du Me0H anhydre (3 mL) à TA. A cette solution a été ajouté H2SO4 (200 gL) goutte à goutte et la solution a été chauffée à 65°C pendant 3 j. La solution a été refroidie à TA et le solvant a été éliminée sous pression réduite. Au residu a été ajoutée H20 (30 mL) et la solution a été extraite avec AcOEt (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavée avec une solution de bicarbonate de sodium à 5% (2 x 20 mL), puis avec une 25 solution de saumure saturée (20 mL). Après séchage sur MgSO4, le solvant a été filtré, éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 48 qui a été utilisée dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (57 mg, 76%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3, Ô): 8.33 (d, 1H, 4J 3.1, H5), 8.19 (d, 1H, 4J 3.1, H3), 4.02 (s, 3H, CH3C0), 2.57 (s, 3H, py-CH3);RMN 13C (100 MHz, CDCI3, Ô): 160.8 (COOMe), 152.7 (C6), 142.1 (C4), 140.5 (C2), 121.4 (Ce), 119.3 (C3), 53.8 (OCH3), 18.3 (py-CH3); MS 30 Calculée C8H9N205213,051. Trouvée 213,050 [M+H]. Composé 49: à une solution de composé 48 (114 mg, 0,54 mmol) dans du CHCI3 (10 mL) a été ajouté à TA de l'anhydride trifluoroacétique (1,48 mL, 10,8 mmol). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 5 h sous atmosphère inerte. Après cette période, la réaction a été refroidie à TA puis le 35 solvant a été éliminé sous pression réduite. A l'huile jaune, ont été ajoutés Et0H (3 mL) et H20 (3 mL) et la solution a été agitée à TA pendant 2 h. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite et la phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 (3 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur MgSO4 et évaporées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant Hexane/AcOEt, 70/30 à 50/50 pour conduire 40 au composé 49(74 mg, 65%). Rf (CH2C12/Me0H, 95/5) = 0.67; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, Ô): 8.68 (d, 33 1H, 4J 2.1, H3), 8.37 (d, 1H, 4J 2.1, H5), 5.06 (s, 2H, CH2OH), 4.06 (s, 3H, CH300); RMN 130 (100 MHz, CDCI3, Ô): 164.3 (COOMe), 163.6 (06), 155.3 (C4), 149.7 (02), 116.4 (C5), 116.3 (C3), 64.5 (CH2OH), 29.5 (CO2C1-13)- 5 Composé 50a: à une solution de composé 49(21,6 mg, 0,102 mmol) dans du DMF anhydre (1 mL) ont été ajoutés du NaH (17 mg, 0.708 mmol) et du thioglycolate d'éthyle (35 gL, 0.320 mmol) sous atmosphère inerte et à TA. Le mélange a été agité à TA pendant 2 h sous atmosphère inerte. Le solvant a été ensuite éliminé sous pression réduite et à l'huile jaune ont été ajoutés du Me0H (5 mL) et H2SO4 (200 gL). La solution a été chauffée à 65°C pendart 72 h sous argon. Le solvant a été 10 éliminé sous pression réduite et H20 (10 mL) a été ajouté au résidu, et la solution aqueuse a été extraite avec AcOEt (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été rassemblées et séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant comme éluant CH2C12-Me0H, 98/2 conduisant ainsi au composé 50a (8.2 mg, 25%). Rf (DCM/Me0H, 95/5) = 0.35; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, Ô): 7.88 (d, 1H, 4J 1.9, H5), 7.63 (d, 15 1H, 4J 1.9, H3), 4.69 (s, 2H, CH20H), 4.02 (s, 2H, CH2S), 3.96 (s, 3H, CH300), 3.76 (s, 3H, CH300); RMN 130 (100 MHz, CDCI3, Ô): 170.7 (COOMe), 166.4 (COOMe), 163.3 (02), 152.3 (C4), 147.8 (06), 121.2 (C5), 121.1 (C3), 65.1 (CH2OH), 53.3 (CO2ÇH3), 48.5 (CO2ÇH3), 33.6 (SC1-12). Composé 50b: le composé 50b a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la 20 synthèse de 50a. Composé 51a: à une solution de composé 50a (8,2 mg, 0,03 mmol) dans du THF anhydre (2 mL) ont été ajoutés de la triéthylamine (12,5 gL, 0,09 mmol) et du MsCI (3,5 gL, 0,045 mmol). Cette solution a été agitée à TA pendant 3,5 h. Après cette période, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le 25 résidu a été dissous dans du CH2Cl2 (20 mL). La phase organique a été lavée avec H20 (3 x 10 mL), séchée sur MgSO4, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire de façon quantitative au composé 51a. Rf (DCM/Me0H, 95/5) = 0.8; RMN 1H (400 MHz, CDCI3, Ô): 7.95 (d, 1H, 4J 1.5, H5), 7.52 (d, 1H, 4J 1.5, H3), 5.35 (s, 2H, CH20M5), 3.98 (s, 2H, CH2S), 3.82 (s, 2H, 000H3), 3.77 (s, 2H, 000H3), 3.14 (s, 3H, SCH3). 30 Composé 51b : le composé 51b a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 51a. Composés 52a-b : les composés 52a-b ont été préparés selon les mêmes procédures que celle 35 utilisées respectivement pour la synthèse de 14b et 14c. Composés 53a-b : les composés 53a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 46. 34 Composés 54a-b : les composés 54a-b ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 49. Composés 55a-d : les composés 55a-d ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée 5 pour la synthèse de 50a. Composés 56a-d : les composés 56a-d ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 51a. 10 Composé 57a: le composé 57a a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 57b en utilisant la pyridine 14a. Composé 57b : au dérivé bromé 14b (103 mg, 0,35 mmol) a été ajouté du THF anhydre (1 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés 15 du dérivé acétylénique (80 mg, 0,42 mmol) et de la TEA (0,24 mL, 1,75 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du Pd(dppf)Cl2 (30 mg, 0,035 mmol) et du Cul (7 mg, 0,035 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 18 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à TA et le solvant a été éliminé sous 20 pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (DCM / Me0H 0 à 3 % par incréments de 0,1 °/0) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 57b (122 mg, 87%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) : 7,98 (s I, 1H), 7,50 (s I, 1H), 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,88 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,99 (s I, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 1,76 (d, J= 14,9 Hz, 3H), 1,26 (t, J= 6,9 Hz, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) : 168,9; 161,0 (d, 25 J= 19 Hz), 158,8; 153,3 (d, J= 155 Hz), 133,8; 132,9 (d, J= 12 Hz), 128,1 (d, J= 22 Hz), 124,2; 115,1; 115,0; 95,7; 85,6; 65,2; 64,3; 61,3 (d, J= 5 Hz), 52,5; 16,5 (d, J= 4 Hz), 13,5 (d, J= 104 Hz); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) : +39,5. HRMS (ESI+) calculée pour C201-122NNa06P [M+Na], m/z 426,1082 trouvée: 426,1063. Rf = 0,44 (silice; DCM - Me0H 90:10). 30 Composé 57c: le composé 57c a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 57b en utilisant la pyridine 14c. Composé 59a : une solution de dérivé acétylénique (0,864 g, 3,1 mmol) et de dérivé iodé 14a (0,735 g, 2,5 mmol) dans un mélange de THF anhydre (20 mL) et de TEA (20 mL) a été dégazée sous 35 agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (22 mg, 0,031 mmol) et du Cul (12 mg, 0,063 mmol). La réaction a été agitée à TA pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du DCM (2 x 25 mL). Les 40 phases organiques ont été réunies, lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) 35 puis avec une solution saturée de NaCI (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur MgSO4. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (DOM / Me0H 98/2) pour conduire au composé 59a sous forme d'un solide blanc (0,91 g, 82%). PtF :143-144°C. RMN1H (500 MHz, CDCI3) Ô: 8,04 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 5 2H), 6,86 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 4,83 (d, J= 5,4 Hz, 2H), 4,75 (s, 1H), 4,01 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,31 (td, J= 6,1; 6,1 Hz, 2H), 1,96 (m, J= 6,1 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). RMN 130 (125 MHz, CDCI3) Ô: 165,4; 160,8; 160,1; 156,2; 147,3; 134,1; 133,8; 125,8; 125,4; 114,9; 113,9; 95,9; 85,4; 66,1; 64,8; 53,2; 38,1; 29,7; 28,6. HRMS (ESI+) calculée pour C24H28N206 [M+H], m/z 441,2020, trouvée: 441,2021. Rf = 0,32 (silice, DOM - Me0H 96:4). 10 Composé 59b : au dérivé bromé 14b (200 mg, 0,68 mmol) a été ajouté du THF anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique (260 mg, 0,75 mmol) et de la TEA (5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du Pd(PPh3)4 (79 mg, 0,068 mmol) et du Cul (13 mg, 15 0,068 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à TA et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du DOM (25 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (25 mL) puis avec de l'eau (25 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée 20 puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (DOM / Me0H 0 à 5 % par incréments de 1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 59b (220 mg, 66 %). HRMS (ESI+) calculée pour C25H34N206P [M+H], m/z 489,2149 trouvée: 489,2152. Rf = 0,35 (silice, DOM - Me0H, 95:5). 25 Composé 59c: au dérivé bromé 14c (142 mg, 0,4 mmol) a été ajouté du THF anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique (147 mg, 0,4 mmol) et de la TEA (5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,04 mmol) et Cul (7,6 mg, 0,04 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous 30 atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à TA et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du DOM (25 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (25 mL) puis avec de l'eau (25 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie sur 35 colonne de silice (DOM / Me0H 0 à 3 % par incréments de 0,5 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 59c (154 mg, 70%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) : 8,01 (dd, J = 6,4; 2,0 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,4; 12,4 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,39 (td, J = 8,4; 4,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,73 (s, 1H), 4,69 (s, 2H), 4,08 (qd, J = 5,6; 4,8 Hz, 2H), 3,97 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,26 (m, 2H), 1,92 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H, 1,31 40 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 130 (100 MHz, 0D013) :160,3 (d, J = 18 Hz), 159,8; 156,0; 153,2 (d, J = 36 164 Hz); 133,7; 133,0 (d, J= 11 Hz); 132,6 (d, J= 5 Hz); 132,3 (d, J= 10 Hz); 129,6 (d, J= 138 Hz); 128,6 (d, J= 18 Hz); 128,5 (d, J= 9 Hz); 123,8 (d, J= 3 Hz); 114,7; 113,8; 96,0; 85,3 (d, J= 2 Hz); 79,3; 65,9; 63,8; 61,9 (d, J = 6 Hz); 37,9; 29,5; 28,4; 16,6; RMN 31P (162 MHz, CDCI3) Ô: +25,6. HRMS (ESI+) calculée pour C30H36N206P [M+H], m/z 551,2306 trouvée: 551,2305. Rf = 0,24 (silice, 5 DOM - Me0H, 95:5). Composé 60a : A une solution d'alcool 59a (195 mg, 0,44 mmol) dans du THF anhydre (7 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la TEA (0,2 mL, 148 'mol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goutte du MsCI (67 III_ 0,84 mmol). L'avancement de la réaction a été 10 suivi par CCM. Après 5 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du DCM (10 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (2 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (240 mg, quantitatif). Le produit 60a était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. LRMS (ESI+) calculée pour 15 C25H31 N2O8S [M+H] , m/z 519,1801, trouvée: 519,13. Rf = 0,6 (silice, DOM - Me0H 96:4). Composés 60b-c: les composés 60b-c ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 60a. 20 Composés 61a-c : les composés 61a-c ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 61d. Composé 61d : à une solution de composé 1(81 mg, 0,353 mmol) dans du THF anhydre (10 mL) ont été ajoutés le composé 17a (234 mg, 0,706 mmol) en solution dans du MeCN anhydre (10 mL) puis le 25 carbonate de potassium (195 mg, 1,413 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 60 °C pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite, dilué dans du DOM (50 mL), lavé avec de l'eau (25 mL x 2) puis de l'eau saturée en NaCl (25 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut a été 30 purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant DCM/Me0H de 96/4 jusqu'à 90/10 pour conduire au composé 61d (67 mg, 27%) sous forme de poudre blanche. Composés 61e-s : les composés 61e-s ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 61d. 35 Composés 62a-c : les composés 62a-c ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 62d. Composés 62d: dans un ballon de 25 mL le composé 61d (67 mg, 0,096 mmol) a été solubilisé dans 40 du DOM (500 g) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté du TFA (500 37 gL, 6,53 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite pour conduire à une poudre blanche (57 mg) qui a été utilisée dans la suite de la procédure. Dans un ballon de 100 mL le composé 60a (76 5 mg, 0,147 mmol) et la poudre blanche obtenue précédemment à partir de deux lots réunis (87,4 mg, 0,122 mmol) ont été solubilisés dans du MeCN anhydre (30 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le carbonate de potassium (16,92 mg, 0,122 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à 65 °C pendant 1 mit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été 10 concentré sous pression réduite, dilué dans du DOM (50 mL), lavé avec de l'eau (2 x 40 mL). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 62d (10,8 mg, 10,6 gmol, 9%) sous forme de poudre blanche. Composés 62e-s : les composés 62e-s ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée 15 pour la synthèse de 62d. Composés 64a-c : les composés 64a-c ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 64d. 20 Composés 64d : dans un ballon de 50 mL le composé 62d (10,8 mg, 10,57 grnol) a été solubilisé dans de l'eau (4 mL) pour donner une suspension incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté LiOH (1,291 mg, 0,053 mmol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient A). Après cette période, la déprotection était totale. Le pH du mélange réactionnel a été ajusté a 7 avec du HCI 1M. Au mélange réactionnel (composé 25 63d) a été ajouté du chlorure d'europium hexahydrate (5,81 mg, 15,85 grnol) en une seule fois. La réaction a été agitée à température ambiante pendant 1 h, après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient B) et a conduit au composé 64d (6,32 mg, 5,74 grnol, 54%) sous forme de poudre blanche. 30 Composés 64e-s : les composés 64e-s ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 64d. Complexe 65d-E2 : dans un ballon de 25 mL le composé 64d (6,32 mg, 5,74 grnol) a été solubilisé dans du DMSO anhydre (1 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été 35 ajouté l'acide 3-amino-1-propanesulfonique (3,29 mg, 22,96 'mol), la DIPEA (4 gL, 23 grnol) puis le HATU (6,75 mg, 17,2 grnol) en une seule fois. La réaction a été agitée à TA pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (gradient D) et a conduit au complexe soluble 65d-E2 (5,87 mg, 4,37 gmol, 76%) sous forme de poudre blanche. 40 38 Complexe 66d-E2: dans un ballon de 25 mL le complexe 65d-E2 (5,64 mg, 4,2 'mol) a été solubilisé dans du TFA (200 g) pour donner une solution jaune. La réaction a été agitée à TA pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (gradient C). Après cette période, la déprotection était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite puis purifié par 5 HPLC préparative (gradient E) et a conduit au complexe 66d-E2 (2,16 gmol, 51%) sous forme de poudre blanche. Le spectre UV, le chromatogramme et le spectre de masse du complexe 66d-E2 sont respectivement représentés aux figures 1 à 3. 10 Les agents complexants constitués d'un macrocycle TAON, portant un ou deux chromophores de type phényléthynylpyridine, forment des complexes stables avec les lanthanides, et peuvent être utilisés pour produire des conjugués fluorescents de molécules d'intérêt. Les complexes de lanthanide selon l'invention présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur 15 rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. De plus la répartition des bandes de leurs spectres d'émission est centrée autour de 620 nm conférant ainsi aux complexes des propriétés exceptionnelles et très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). Du fait de la grande 20 stabilité de ces complexes dans les milieux biologiques contenant des cations divalents (Mn2+, Ca2+, Mg2+...) ou de l'EDTA, REVENDICATIONS1. Agent complexant de formule (I) : Chronn3 rN N Chronn2 N / Chronni dans laquelle : - Chromi, Chrom2 et Chrom3 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe de formule : (la) (lb) L1-CO-R R1 N' OU étant entendu que le composé de formule (I) comprend (i) un ou deux groupes choisis parmi les groupes (la) et (lb) et (ii) au moins un groupe L1-CO-R ; - R est un groupe -0R2 ou -NH-E ; - R1 est un groupe -CO2H ou -P(0)(OH)R3; - R2 est H ou un (C1-C4)alkyle ; - R3 est un (C1-C4)alkyle, de préférence un méthyle ; un phényle éventuellement substitué par un groupe -S03-, ce dernier étant de préférence en position méta ou para ; ou un benzyle ; - L1 est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r- éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène, un atome d'azote et un atome de soufre ; un groupe -CH=CH- ; un groupe -CH=CH-CH2- ; un groupe -CH2-CH=CH- ; ou un groupe PEG ; 40 - L2 est un groupe de liaison divalent ; - G est un groupe réactif ; - E est un groupe -CH2-(CH2)5-CH2-S03- ou -(CH2)5-N+Alk1Alk2Alk3, ou une sulfobétaïne ; - r est un entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 3 ; 5 - s est 0, 1 ou 2 ; A1k2, A1k3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1-C6)alkyle. 2. Agent complexant selon la revendication 1, dans lequel Chromi est un groupe de formule (la) et Chrom2 et Chrom3 sont chacun un groupe de formule (Ic), identique ou différent. 3. Agent complexant selon la revendication 2, dans lequel Chrom2 et Chrom3 sont identiques. 4. Agent complexant selon la revendication 1, dans lequel Chromi et Chrom2 sont chacun un groupe de formule (lb), identique ou différent, et Chrom3 est un groupe de formule (Id). 5. Agent complexant selon la revendication 4, dans lequel Chromi et Chrom2 sont identiques. 6. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel R1 est un groupe -CO2H ou -P(0)(OH)R3dans lequel R3 est un (C1-C4)alkyle ou un phényle. 7. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L1 est est une liaison directe ; un groupe -(CH2)r- éventuellement interrompu par au moins un atome choisi parmi un atome d'oxygène et un atome de soufre, et r = 2 ou 3 ; un groupe -CH=CH- ; un groupe - CH=CH-CH2- ; ou un groupe -CH2-CH=CH. 8. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel E est un groupe -CH2-(CH2)5-CH2-S03- avec s = 0 ou 1 ; -(CH2)5-N+Alk1Alk2A1k3 avec Alki, A1k2 A1k3, identiques ou différents, représentant un (C1-C4)alkyle et s = 0 ou 1 ; ou un groupe de formule : R4 I (-.,YN - '(-r SO3- t R4 30 dans laquelle R4 est un (C1-C4)alkyle et t est 1 ou 2. 9. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe réactif G est choisi parmi : un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un 35 diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un 10 15 20 25 41 halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)- propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules : 5 0 IJL NH ')4CH2)-NCS w /v o NH ,CH2)-NH2 w tv 0 CH2)-SH NH w \ /y o NH ,CH2)-NHAr w /y o -NhecH2tNc0 ,11 o NHp .2)w-3 H2tS-S-Ar o --N1-1)4C 0 N>ECI-12)-N - w /v Cl 0 H N=( NH/ ,CH2)-N-(\N2 N y w ( 0 )C(-NH 0 - '-Nhe CH2 )w 0 -NH ),v(CH NOS NCO 503- Cl dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 10 10. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L2 est choisi parmi : une liaison directe; un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-020, contenant éventuellement une ou plusieurs 15 doubles ou triples liaisons ; un groupe cycloalkylène en 05-08 ; un groupe arylène en 06-014; 42 lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore, ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5 groupes alkyle en C1-08, aryle en 06-014, sulfonate ou oxo. 5 - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : -(CH2) , ;-(CH 2)n-0-(CH 2),-0-(CH 2)p- ; -(CH2)n-0-(CH2)m-0-(CH2)p-NH-L(CH2)q 0 0 0 -(CH2)n-NHIL(CH2)mIL ; (CH2)n-NHIL(CH26- SO3 0 0 -(CH2)n NH1-(0H2)m -(CH2) n-NH-(0H2) .-11-(CH2)n- . 15 dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. 11. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe -L2-G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une amine, 20 un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, 0 (CH2)m-N> 0 S (CH2)p- -(CH2)n-NH ;-(CH 2)n-NH- ; -(CH2)n-NH-L(CH2)m-N S (CH2)p- 0 0 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m S 10 -(CH2)n-NH N-(CH2)p (CH2)m- II 43 et d'un bras d'espacement L2 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule : 0 -(CH2)n-NH-L(CH26- ; où n, m sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier 5 allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. 12. Complexe de lanthanide comprenant un agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes et un lanthanide. 10 13. Complexe de lanthanide selon la revendication 13, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi : Eu3+, Sm3+, Tb3+, Gd3+, Dy3+, Nd3+, Er3+, de préférence le lanthanide est Eu3+ ou Tb3+. 14. Conjugué obtenu par réaction entre (i) un complexe de lanthanide selon l'une des 15 revendications 12 et 13 comprenant un groupe G et (ii) une molécule d'intérêt comprenant un groupe fonctionnel, ledit groupe fonctionnel formant une liaison covalente avec l'un des atomes du groupe G. -(CH2)n SO3 0 NHIL(CH2)m