FR 3071729 A1 20190405 FR 1759283 A 20171004 CIMENTS DENTAIRES DESINFECTANTS COMPRENANT DES LIPOSOMES La présente invention concerne le domaine des ciments dentaires utilisés pour le comblement pulpaire, plus particulièrement des ciments dentaires comprenant des liposomes leur conférant un pouvoir désinfectant. Etat de la technique Lorsqu'une infection des canaux pulpaires est diagnostiquée, le praticien doit procéder à une désinfection puis à un comblement de ces canaux. Le protocole de soins est réalisé en plusieurs étapes. Tout d'abord, les canaux sont désinfectés et mis en forme puis un ciment endodontique est utilisé pour obturer les canaux. Au bout d'une semaine environ, le canal est désobturé sur la moitié de sa longueur afin de poser un tenon soit immédiatement, soit 7 jours plus tard. Les canaux sont donc à nouveau partiellement en contact avec le milieu extérieur lors de la désobstruction et au moment de la pose du tenon avec un risque d'inoculation de bactéries pendant une durée d'environ 15 jours après le début du traitement. Les ciments dentaires sont utilisés à la fin d'un traitement endodontique (ou « root canal therapy »), ces ciments visent à sceller un cône de Gutta percha ou à obstruer les canaux pulpaire/pulpe pour permettre une stabilité de l'organe dentaire. Cependant, comme mentionné précédemment, il arrive fréquemment que des bactéries (rémanentes ou inoculées) se développent sous le ciment entrainant des infections qui conduisent à un échec du traitement endodontique. La solution privilégiée est alors celle du retraitement endodontique long et coûteux avec un faible taux de succès ou l'extraction de la dent conduisant à un implant, mutilant, lourd et coûteux. Pour prévenir les infections post-comblement et leurs conséquences, différentes solutions ont été proposées, comme l'irradiation aux UV ou l'ajout des composés antiseptiques dans les ciments [12]. A titre d'exemple, la demande W02006/070376 décrit un ciment endodontique comprenant des nanoparticules composées de polymères cationiques associés à des ammoniums quaternaires. Celui-ci permet l'élimination des bactéries du genre Streptococcus dans un test de contact in vitro. Le même type d'approche est décrit dans la demande W02015/004450 mais pour un ciment osseux et les auteurs proposent d'ajouter des liposomes chargés en antibiotiques. Aucune des solutions proposées dans l'art antérieur n'est efficace pour lutter contre tous les types de bactéries responsables des infections dentaires, notamment lorsqu'elles se trouvent sous forme de biofilm [13]. Une étude de 2004 a montré l'intérêt d'associer de la chlorexidine à un ciment endodontique de type agrégat de trioxyde 2 minéral (ou MTA pour « minéral trioxide aggregate ») présentant un pH de 11,5 afin d'améliorer le pouvoir désinfectant du ciment. Toutefois, si la présence de chlorexidine permet d'améliorer la désinfection des bactéries E. faecalis, l'effet sur les biofilms reste limité [12,13]. 5 Les ciments endodontiques existants à ce jour sur le marché ont généralement au mieux des propriétés antiseptiques pauvres ou autrement non existantes. Concernant les ciments osseux associés à des liposomes, le problème de désinfection est très différent du fait que (i) les contraintes (ciment de scellement) sont très différentes de celles 10 associées à un ciment dentaire (ciment d'obturation), (ii) le type de bactéries à combattre est différent et (iii) la nature du ciment est différente (ciment osseux de type PMMA versus ciment dentaire minéral). Il existe donc un réel besoin [14] de disposer d'un ciment dentaire aux propriétés 15 désinfectantes, efficace à l'encontre des bactéries responsables des infections dentaires, en particulier lorsqu'elles se trouvent sous forme d'un biofilm. Un tel ciment doit en particulier assurer une désinfection totale et durable vis-à-vis des bactéries sous forme de biofilm, et ne pas être toxique. 20 Avantages de l'invention La présente invention propose un nouveau type de ciment endodontique qui permet de désinfecter à long terme le système du canal radiculaire, le periapex et les tubuli dentinaires, grâce à l'association de liposomes au pouvoir désinfectant. 25 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis au point des compositions de ciments endodontiques contenant 30 des liposomes et ont démontré leur capacité à relarguer des antiseptiques pendant au moins 15 jours, temps qui s'écoule généralement entre la désinfection et le comblement définitif des canaux pulpaires, et jusqu'à un mois, si nécessaire en fonction du protocole thérapeutique mis en oeuvre. 35 Un premier objet de l'invention concerne un ciment dentaire comprenant des liposomes et présentant un pouvoir désinfectant vis-à-vis des bactéries responsables des infections dentaires, lesdits liposomes étant soit des liposomes chargés en agent bactéricide ou autre molécule active, soit des liposomes cationiques non chargés. 40 Les ciments dentaires selon l'invention présentent un pouvoir désinfectant vis-à-vis des bactéries responsables des infections dentaires, c'est-à-dire suffisant pour les éliminer, et en particulier celles qui résistent au pH élevé (pH=12) induit par les ciments à base d'hydroxyde de calcium, et qui sont responsables des infections post-comblement. 3 Par « pouvoir désinfectant » au sens de l'invention, on entend la capacité d'une substance à inhiber ou tuer les micro-organismes indésirables en altérant leur structure, ou leur métabolisme, indépendamment de leur état physiologique afin de réduire leur 5 nombre. Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer le pouvoir désinfectant d'un ciment endodontique, notamment la méthode du test de contact direct (ou « direct contact test ») et la méthode de diffusion en milieu gélosé (test de diffusion dans de l'agar, ou 10 « agar diffusion test »). Pour la méthode du test de contact direct, le pouvoir désinfectant est évalué par mesure de la densité optique d'une solution contenant des bactéries. (par exemple à 650nm pour E. faecalis). Moins la densité optique est élevée, moins il y a de bactérie dans la solution et plus la substance est désinfectante. 15 Dans le cas de la méthode de diffusion en milieu gélosé, le pouvoir désinfectant est évalué par la mesure de la zone d'inhibition (en mm). Plus la zone d'inhibition est grande, plus le pouvoir désinfectant est élevé. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les ciments dentaires 20 présentent un pouvoir désinfectant évalué comme suit : soit en mesurant la concentration en bactéries à 7 jours en utilisant la méthode de test de contact direct, cette concentration en bactéries étant inférieure à 105CFU/mL, de manière préférée inférieure à 104 CFU/mL, et de manière tout à fait préférée inférieure à 1000 CFU/mL. Ce test peut être réalisé sur bactéries 25 planctoniques ou sur biofilm bactérien. soit en mesurant une zone d'inhibition en utilisant la méthode de diffusion en milieu gélosé 24 h à 48 h après inoculation des bactéries et placement des ciments endodontiques, la zone d'inhibition étant supérieure à 9 mm, de manière préférée supérieure à 12 mm. 30 Les bactéries responsables des infections dentaires, notamment retrouvées dans les canaux pulpaires comprennent les souches Streptococcus, Actinomyces, Enterococcus et Pro pionibacterium, et en particulier Enterococcus faecalis qui résiste à des pH supérieurs à 11,5. Jusqu'à 12 espèces différentes peuvent être retrouvées dans ces canaux. 35 Par « ciment dentaire » au sens de l'invention, on entend tout type de ciment approprié pour obstruer un canal dentaire ou une chambre pulpaire de manière provisoire ou permanente. Les ciments dentaires les plus couramment utilisés sont à base d'hydroxyde de calcium ou de silicate de calcium mais tout ciment à base de disilicate ou 40 trisilicate de calcium, d'hydroxyapatite, de silicone, d'oxyde de zinc-eugénol, de résine, d'alginate et/ou de collagène peut également être employé. En particulier, des ciments commerciaux dépourvus de pouvoir désinfectant peuvent être utilisés pour préparer les ciments selon l'invention. A titre d'exemple, on peut citer les ciments commerciaux 4 SealapexTM et ApexitTM, BIOROOTT" RCSTM, MTAT", Pulp canal sealerTM, AH 26TM, IROOTT" SP, TOTAL FILLT"... Un ciment provisoire particulièrement simple peut être constitué uniquement 5 d'hydroxyde de calcium et d'eau ou préparé à base de ces deux composants. Dans le cadre de la présente invention, le ciment est utilisé comme matrice (ou support) dans laquelle les liposomes sont ajoutés. 10 Dans un mode de réalisation préféré, le ciment utilisé est à base d'hydroxyde de calcium ou à base de minéraux appartenant aux biocéramiques. Les liposomes associés au ciment dentaire peuvent être de nature différente. Leurs propriétés, seules ou en association avec des composés actifs de type agent bactéricide 15 ou toute autre molécule active, confèrent un pouvoir désinfectant au ciment selon l'invention. Les liposomes particulièrement appropriés sont composés de lipides cationiques, neutres ou anioniques comprenant des entités chimiques chargées choisies parmi: 20 ALN-TEG-Chol: 8-(cholest-5-en-3B-xyloxy)-3,6-dioxaoctanyl alendronate, CHEMS: Cholesterol hemisuccinate, Chol: Cholesterol, Con-A: Concanavalin A, 25 DC-Chol: 3-13[N(N1N1-dimethylaminoethane-carbamoyl] cholesterol, DCP: Dicetyl phosphate, DDAB: Dimethyldioctadecylammoniumbromide, DMPC: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPG: 1,2-dimyristoyl-sn glycero- 3-phospho-(1'-rac-glycerol), 30 DOPC: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPE: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DODAB (bromure de diméthyldioctadécylammonium): DOTAP: 1,2-dioleoy1-3-trimethylammonium-propane, DPPA: 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate, 35 DPPC: 1,2-dipalmitoyl-snglycero- 3-phosphocholine, DPPG: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), DPTAP: Dipalmitoyl trimethylammoniumpropane, DSPC: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPE: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine, 40 PC: Phosphatidylcholine, PEG: Poly(ethyleneglycol), PI: Phosphatidylinositol, PS: Phytosphingosine, 5 SA: Stearylamine, EPC : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine DODAc, 1 ,2-dimyristoyloxypropy1-3-dimethyi-hydroxyethyl ammonium DMRIE, 2,3-dioleoyloxy-N-(2(sperminecarboxamide)ethyl)-N,N- dimethyi-1 5 propananninium DOSPA.dioctadecylamidoglycylspermine DOGS, 1 ,2-dimethyl-dioctadecylammoniumbromide DDAB, 2-dioley1-3-N,N,N- trimethylaminopropanechloride DOTMA, 1 ,2-dimyristoy!-3- trimethylammoniumpropane DMTAP, 1 ,2-distearoyi-3- trimethylammoniumpropane 10 DSTAP, 1 ,2-Dioleoy1-3-dimethylammonium- propane phospatidylchoiine, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, phosphatidic acid, 15 phospatidylglycerol, phospatidylserine phospatidyiinositol DOBAQ : N-(4-carboxybenzy1)-N,N-dimethy1-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1 -aminium Phospholipon 90G 20 phytosphingosine Dans un premier mode de réalisation, les liposomes sont chargés en agent bactéricide ou autre molécule active. Ces liposomes peuvent être cationiques, neutres ou anioniques. Ils sont chargés directement ou indirectement avec un antiseptique. Les liposomes 25 peuvent être chargés après leur formation (chargement actif), ou pendant leur formation (chargement passif). Par « agent bactéricide », on entend au moins un agent bactéricide, mais il peut également s'agir d'une association de plusieurs agents bactéricides. L'agent bactéricide 30 peut être choisi parmi tous les antiseptiques et/ou les antibiotiques locaux ayant démontré une action bactéricide. Il peut en particulier être choisi parmi les composés cités dans la classe ATC D08 de la classification établie par l'OMC et qui correspond aux « antiseptiques et désinfectants ». Parmi les antiseptiques appropriés pour un usage en dentaire, on peut citer l'oxyde de cuivre, l'oxyde de zinc, argent, la chlorhexidine, le 35 triclosan , iode de PVP, le QPEI, le chitosan, la nisine, le Na0C1, les polymères cationiques, le fluorure et le bromure... Par « autres molécules actives », on entend au sens de l'invention toute molécule ayant un effet bactéricide, batériostatique ou une autre activité complémentaire à l'agent 40 bactéricide en tant que tel. 6 L'encapsulation des antiseptiques ou d'autres molécules actives dans les liposomes permet une protection de ces derniers contre l'inhibition provoquée par les fluides biologiques, mais aussi un relargage contrôlé et efficace dans le temps. 5 Les liposomes permettent une meilleure pénétration du biofilm bactérien [10 ;11] et donc une meilleure efficacité antibactérienne. En effet, ils peuvent fusionner avec les parois du biofilm et ainsi délivrer les molécules actives au coeur du biofilm, en plus de déstabiliser mécaniquement les membranes bactériennes. 10 Dans un mode de réalisation préféré, les liposomes sont des liposomes cationiques et la molécule active est un antiseptique comme la chlorexidine. Dans un autre mode de réalisation préféré, les liposomes sont des liposomes cationiques et la molécule active est un antibiotique comme un antibiotique de la famille de la 15 pénicilline, par exemple l'amoxicilline. Dans un autre mode de réalisation préféré, les liposomes sont des liposomes cationiques et les molécule actives sont une association antibiotique/antiseptique, par exemple nisine/tétracycline. Dans un autre mode de réalisation préféré, les liposomes sont une association de liposomes de nature différente (cationique, neutre, anionique) et les molécules actives sont un antibiotique et/ou un antiseptique. Dans un deuxième mode de réalisation, les liposomes sont cationiques et ne sont pas chargés. Lorsque les liposomes cationiques ne sont pas chargés en molécules actives, leur 30 pouvoir désinfectant repose sur leur capacité à fusionner avec les biofilms. En fusionnant avec les parois du biofilm et des membranes bactériennes, ils désorganisent le biofilm mais aussi les membranes bactériennes conduisant à la destruction des bactéries. 35 Quelque soit le mode de réalisation considéré, l'ajout de liposomes dans les ciments dentaires est particulièrement intéressant pour la désinfection bactérienne du fait que les liposomes sont affins pour les bactéries et peuvent diffuser dans le réseau canalaire pulpaire, les tubuli dentinaire et le péri-apex. Les liposomes permettent une diffusion plus contrôlée de l'agent antiseptique ou batéricide que si cet agent se trouvait seul dans 40 le ciment. 20 25 Dans tous les cas, que les liposomes soient chargés ou non, leur taille doit être suffisamment petite pour leur permettre de pénétrer dans les canaux et tubuli. La taille 7 des tubuli varie généralement entre 100 nm et 3200 nm, avec une moyenne à 800-1200 nm Ainsi, la taille des liposomes utilisés dans la présente invention peut varier entre 20 et 5 8000 nm. Dans un mode de réalisation particulier, leur taille est inférieure à 6000 nm, de manière préférée comprise entre 600 nm et 50 nm, voire entre 400 nm et 50 nm, de manière plus préférée inférieure à 300 nm et de manière tout à fait comprise entre 100 nm et 200 nm, par exemple de 150 nm. 10 Les propriétés des ciments désinfectants varient en fonction de la combinaison choisie : nature du ciment, nature et concentration des liposomes et nature et quantité de molécule active. A cet égard, un ciment désinfectant à usage dentaire sera différent d'un ciment désinfectant à usage osseux. De plus, la nature du ciment ainsi que la nature et la taille des liposomes peuvent influencer la diffusion des liposomes et donc le relargage 15 des molécules actives à l'extérieur du ciment au contact de la dent. Il est important de maitriser ces paramètres pour contrôler la quantité d'antiseptiques ou autre molécule active relarguée in fine. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le ciment est à base d'hydroxyde de 20 calcium ou de biocéramiques, et les liposomes sont de type « liposome DOPE », « liposome EPC » ou « liposome DODAP », tels que définis dans la partie expérimentale (Exemple 4. Section 2.). Dans un autre mode de réalisation préféré, le ciment dentaire comprend un copolymère 25 séquencé de type Pluronic, en tant que surfactant. Les surfactants favorisent la distribution homogène des liposomes dans le ciment. Des ciments particulièrement préférés sont les suivants : Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Sealapex® avec des liposomes de 30 type DOPE Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Apexit® avec des liposomes de type EPC Ciment à base de silicate de calcium de type Total fill® avec des liposomes de type DODAP 35 Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un ciment dentaire tel que défini précédemment comprenant : a) la préparation de liposomes dont la taille est comprise entre 8000 nm et à 20 nm, b) le mélange desdits liposomes avec un ciment dentaire dans une proportion 40 comprise entre 0,5 et 30%, de préférence comprise entre 1% à 5% de liposomes (poids/poids) 8 Dans un mode de réalisation préféré, un surfactant est ajouté à la préparation de liposomes, avant mélange avec le ciment. Celui-ci évite le phénomène de miscellisation et permet ensuite le mélange entre une base de ciment hydrophile et des liposomes hydrophobes. 5 Parmi les surfactants adaptés à cet usage, on peut citer les pluronics L31, L61, F68, F127, L43, L44, L62, L64, P85, P84, P104, P123. L'ajout de surfactant favorise la distribution homogène des liposomes dans le ciment et permet une bonne reproductibilité de la qualité des produits, et en particulier pour 10 atteindre la qualité requise pour la spécification des produits à usage dentaire. Lorsque les liposomes sont chargés en molécules actives (antiseptiques ou autre), le procédé comprend en outre une étape l'inclusion (ou de chargement) de ces molécules dans les liposomes avant mélange des liposomes avec le ciment. 15 Le pourcentage de liposomes inclus dans le ciment peut être compris entre 0,5 et 30% en poids, plus particulièrement inférieur à 20%, typiquement compris entre 1% et 10%, de préférence entre 1% et 5% en poids. De manière tout à fait préférée, ce pourcentage sera compris entre 2% et 4%, mais peut varier en fonction de la taille des liposomes et 20 de leur charge en antiseptique. Dans tous les cas, le pouvoir désinfectant du ciment doit être maitrisé. Un troisième objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ciment dentaire tel que défini précédemment pour le comblement dentaire, en particulier du canal radiculaire, 25 du periapex et/ ou des tubuli dentinaires. Les ciments endodontiques tels que définis précédemment peuvent être utilisés pour un comblement temporaire ou permanent en fonction du protocole de soin suivi par le dentiste. Grace à leur pouvoir désinfectant, ils permettent d'éviter une infection 30 profonde des canaux dentaires, difficile à soigner et qui nécessite une nouvelle intervention thérapeutique. Un quatrième objet de l'invention concerne une méthode d'évaluation du pouvoir désinfectant d'un ciment dentaire consistant à : 35 i) disposer, dans un récipient à deux compartiments, a) une solution comprenant des souches bactériennes susceptibles d'être responsables d'une infection dentaire dans le compartiment inférieur b) une couche de ciment dentaire dont on souhaite tester le pouvoir disinfectant dans le compartiment supérieur, 40 les deux compartiments étant séparés par une membrane percée de pores dont le diamètre est compris entre 8000 nm et 50 nm ; ii) incuber le récipient à 37°C pendant une durée choisie ; iii) évaluer la présence de bactéries dans le compartiment inférieur. 9 Cette expérience peut être réalisée en préparant des récipients à deux compartiments séparés par une membrane présentant des pores de diamètre approprié. Il est aussi possible d'utiliser des dispositifs commerciaux tels que les plaques Transwell® vendues 5 par la société Corning®. Le diamètre des pores de la membrane est choisi à façon. Pour reproduire le diamètre des tubuli, il sera choisi entre 50 et 8000 nm, de préférence entre 300 et 800 nm et manière plus particulière entre 50 nm et 400 nm. 10 Le temps d'incubation sera généralement compris entre 2h et 48h. L'homme du métier saura adapter ce temps selon les protocoles classiques de microbiologie. L'évaluation de la présence de bactéries sera réalisée par l'une des techniques de 15 microbiologie connue de l'homme du métier, par exemple en mesurant la densité optique de la solution par spectrométrie. Ce test est particulièrement pertinent pour évaluer le pouvoir désinfectant d'un ciment à usage dentaire puisque les nanopores de la membrane miment, du fait de leur taille, les 20 tubuli dentaires. Si les bactéries sont éliminées, cela suggère que le ciment sera efficace pour désinfecter les tubuli. Enfin ce test pourra être utilisé pour mesurer le pouvoir désinfectant du ciment endodontique soit vis-à-vis de bactéries planctoniques, soit vis-à-vis d'un biofilm 25 bactérien, en fonction des bactéries qui seront ajoutées à la solution placée dans le compartiment inférieur. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée 30 de la présente invention. DESCRIPTION DES FIGURES 35 Figure 1: Schéma d'un récipient adapté à la méthode d'évaluation de pouvoir désinfectant d'un ciment dentaire. Figure 2 : Représentation de la répartition de la taille des liposomes formés. 40 Figure 3 : Représentation de la cinétique de relargage de ciments comprenant différents types de liposomes chargés en rhodamine. (A) Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Sealapex® (B) Ciment à base d'hydroxyde de calcium de type Apexite . Les types de 10 liposomes utilisés sont illustrés comme suit : DOPE : carré ; EPC : triangle ; DODAP : losange ; contrôle sans liposome : rond. Figure 4: Représentation du pourcentage de relargage de la rhodamine contenue dans 5 les ciments en fonction du type de liposomes à 15 jours. Ctl = contrôle sans liposome. PARTIE EXPERIMENTALE 10 Exemple 1 : préparation des ciments comprenant des liposomes 1 - Préparation des liposomes 15 Les liposomes ont été formés à partir des différents lipides d'intérêt décrits précédemment en utilisant différentes techniques classiques : sonication ou hydratation d'un film lipidique [9]. Dans tous les cas, les solvants organiques résiduels ont été éliminés pour récupérer une poudre pure, dont le total a été ensuite remis en suspension dans un solvant 20 biologiquement compatible (généralement de l'eau) pour générer des liposomes. Ceci a été obtenu grâce à des techniques d'évaporation, ce qui n'est pas nécessaire si le détergent liposomal est acheminé dans la phase aqueuse dans une concentration minimale satisfaisante. Pour la présente preuve de concept, des réactifs de moyenne à haute qualité ont été nécessaires (>97,0% de pureté). Pour préparer les ciments à usage 25 dentaire, cela devra être amélioré à un minimum> 99,0% de pureté (purification par HPLC). Un des protocoles utilisés suit, avec une adaptation, les protocoles précédemment publiés [1, 2,9]. 30 Dans la préparation des liposomes, un rapport (poids / poids) de la combinaison désirée de lipides a été réalisé par pesée précise du lipide détergent donné avant leur mélange dans un grand ballon à fond rond. A cela, 5 ml de solvant organique (chloroforme, qualité HPLC) ont été ajoutés et la suspension a été mélangée par vortex jusqu'à 35 dissolution complète des lipides. Le même ballon a été attaché à un kit d'évaporation rotatif, augmenté d'une pompe à vide avec une rotation à une révolution par seconde. Le système a été maintenu à une température constante généralement de 60 ° C par bain d'eau, cette température étant déterminée par la transition de phase du mélange lipidique d'intérêt. 40 Lors de l'élimination de tout solvant organique, de l'eau désionisée MQ stérilisée a été ajoutée pour donner une concentration de 5 mg.mL-1. La suspension a ensuite été maintenue pendant encore 30 minutes pour permettre la formation de liposomes. 11 Ensuite, la suspension a été prélevée et extrudée dix fois sous 8 bars de pression d'azote à travers une extrudeuse de type Lipex. Ensuite, le mélange a été extrudé un deuxième tour de dix fois à travers des membranes en polycarbonate de 400 nm et un troisième 5 tour de membranes en polycarbonate de 10 fois à travers 100 nm pour permettre une plus grande homogénéité dans la gamme de taille des liposomes. Enfin, la suspension a été centrifugée à 100 000 g pendant une heure (à 4° C) pour avoir un culot de liposomes et éliminer l'excès d'eau en préparation pour le chargement. 10 Dans ces essais, les liposomes ont été préparés à partir de DOPE, EPC, DODAP et PEG. 2- Inclusion des composés bactéricides Le composé bactéricide est chargé dans les liposomes par des voies actives ou passives, 15 en fonction des propriétés chimiques du lipide détergent et du composé chimique en question. Les études précédemment publiées ont examiné le chargement liposomique avec l'antibiotique sulfate de gentamicine pour former un ciment osseux, en trouvant un indice thérapeutique amélioré de l'antibiotique, ainsi qu'une plus grande accumulation sur les sites d'intérêt [2]. Une étude connexe a examiné le chargement de 20 l'amphotéricine B antifongique dans les liposomes pour générer un ciment osseux pour un traitement actif [3]. Les antiseptiques particulièrement intéressants sont l'oxyde de cuivre, la chlorhexidine, le triclosan, l'iode de PVP et la nisine, dont chacun peut être chargé selon les protocoles 25 publiés précédemment. Ceux qui ont été chargés par des moyens actifs (généralement ceux de nature hydrophile) ont été ajoutés par l'utilisation d'un gradient généré de l'extérieur, en particulier en modifiant le pH [4] ou électrochimiquement [5, 6]. Le chargement passif de composés chimiques est un processus plus simple, et ici, les composés chimiques de choix ont été dissous dans la phase solvant / organique, en cas 30 de nature hydrophobe ou dissous dans la phase aqueuse si hydrophiles. Dans tous les cas, la concentration des échantillons liposomaux a été considérée à toutes les étapes pour aider à maintenir le mélange à des niveaux qui tiennent compte de la valeur CMC (concentration critique de miscellisation). Dans l'étude des lipides, la CMC 35 est la concentration au dessus de laquelle la solution va commencer à générer des micelles tensioactives. Généralement, la CMC est déterminée par le désagrégement hydrophobe-hydrophile dans l'échantillon, de sorte que plus il est important, plus la CMC est basse. La base chimique de la molécule lipidique affecte également la CMC par ses longueurs de segments, grâce à quoi des segments plus longs donnent une CMC plus 40 faible. Tous ces facteurs ont été pris en considération pour la présente étude. 3 - Détermination de la taille et de l'homogénéité des liposomes 12 La technique de diffraction laser a été utilisée pour déterminer le diamètre moyen des liposomes chargés et pour confirmer que les liposomes ne sont pas endommagés que leur taille est de l'ordre de 100 à 150 nm. Cette analyse, présentée à la Figure 2, est réalisée à l'aide d'un analyseur de taille de particules Beckman Coulter N4 Plus, dans des 5 conditions correspondant à celles publiées précédemment [2]. Une fois les liposomes chargés, un surfactant (2% poids/poids) dépendant de la nature des liposomes choisi a été ajouté. Ainsi, différents types de surfactant ont été utilisés tels que : Pluronics L31, L61, F68, F127, L43, L44, L62, L64, P85, P84, P104, P123. 10 4 - Mélange des liposomes avec le ciment et analyse du produit résultant Une fois les nanoparticules liposomales formées, elles ont été intégrées dans le ciment choisi, mélangées et préparées pour les essais. Ces techniques suivent, avec l'adaptation 15 indiquée, les travaux précédemment publiés [2]. Dans ces essais, les ciments utilisés sont les ciments commerciaux Sealapex® et Apexit®. Après la préparation des liposomes, le ciment définitif est obtenu par le mélange de la solution liposomale avec le ciment pour obtenir une concentration finale en liposome de 20 3% (poids/poids). Le ciment définitif peut être obtenue de manière alternative par l'incorporation des liposomes lyophilisés dans la poudre du ciment endodontique. La technique de microscopie électronique à transmission a été utilisée pour visualiser le 25 mélange de liposome / ciment, afin de mieux comprendre la dispersion liposomale dans la matrice. La technique peut être effectuée comme suit, en préparant un rapport 1: 1 des nanoparticules de liposomes avec de l'acétate d'uranyle aqueux à 4% p / v et en incubant le mélange pendant 60 minutes. Les liposomes ont été concentrés par centrifugation comme ci-dessus et remis en suspension dans 10 ml d'un ciment donné, 30 ou le même volume d'eau que le témoin. La suspension a encore été diluée à une concentration finale de 10% v / v et 10 ,u L ajoutés à un film de carbone Formvar supporté sur une grille de nickel à 400 Mesh (EM Systems Support Ltd). Le support a été séché à l'air et un contrôle de chaque ciment non dilué a également été réalisé. Les réseaux de nickel sec ont été analysés par microscopie électronique à transmission de 35 80 kv (Philips CM12 TEM) et les images enregistrées pour analyse. Exemple 2 : Etude de la libération des molécules chargées dans les liposomes 40 Les expériences décrites ici concernent la détection de la libération des molécules encapsulées dans les liposomes et l'évaluation du pouvoir antiseptique du ciment endodontique formé. Les essais ont été effectués avec des mélanges de ciments 13 contenant au volume final chacun de 0%, 1% et 3% (poids / poids) de liposomes chargés. 1 - Relargage de nanoparticules 5 a. Relargage simple Les ciments endodontiques utilisés dans ses expériences sont commercialement disponibles. Il s'agit des ciments Sealapex® et Apexit®. Ils ont été préparés 10 conformément aux instructions du fabricant. Pour chaque ciment endodontique le volume final de chaque formulation de nanoparticules liposomales est de 0%, 1% et 3%. Le ciment a été appliqué au fond du puits d'une plaque 96 puits en triplicat. Après prise complète du ciment, 1 mL de PBS 15 pH 7.2 a été versé dans chaque puits, puis prélevé et remplacé par une solution fraiche selon la cinétique suivante : 4 h, 8 h, 12h, 24h, 36h, 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours. Une première étude de relargage a été réalisée en utilisant des ciments comprenant des 20 liposomes chargés en rhodamine, sans ajout de surfactant. Les résultats de cette étude sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous : ils montrent un relargage de la rhodamine dans des quantités relativement faibles. PI L « se finale relarguéu % de la dose de déi), t 0,0875484 O, I »30%8 KlOti 0,1342 0,2684 30800' 0,04554 0,09108 0,02R6i 0,0S772 epc 72h 'dose Ilf1Me relarguee en de la dose de de.part 0,0319 0'0638 Biodentine 0,0302 0,0604 0,1291 0,2582 Apexit 0,1086 0,2172 434400% DOPE 72h do..,e ne relarguée en , de la dose de depart 0,0214 0,0428 3iodentinc., 0,08266 0,16532 3,30640% sealapex 0,1347 0,2694 5.38800% 25 0,107012 0,214024 14 Ces résultats ont conduit les inventeurs à améliorer la préparation de ciment par l'ajout d'un surfactant à la solution liposomale avant mélange avec le ciment. Les ciments utilisés dans la suite de l'étude comprennent un surfactant. 5 b. Relargage au travers d'une membrane poreuse Le ciment a été placé dans le compartiment supérieur de l'insert Transwell® sur la membrane poreuse (400 nm). Après le temps de prise du ciment, le compartiment inférieur a été rempli de 3 fluides différents : de l'eau, du liquide physiologique ou du 10 liquide dentaire artificiel (liquide céphalo-rachidien artificiel). La présence de liposomes a été mesurée par spectrophotométrie à 1 h, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h, 2 semaines et 3 semaines. La même expérience a été réalisée avec des souches E. Faecalis placées dans le 15 compartiment inférieur (voir Transwelle insert test). Trois souches de E. Faecalis ont été utilisées: une de ATCC 29212 et deux autres, RW35 et RN44 (voir ci-dessous la méthode de culture et d'identification). 20 Exemple 3: Evaluation des propriétés antibactériennes des ciments comprenant des liposomes 1 - Test de contact direct 25 L'efficacité antibactérienne des nanoparticules a été testée contre E. faecalis un agent pathogène intracanalaire commun et résistant. Pour étayer l'effet antibactérien des nanoparticules, elles ont été testées après immobilisation. Pour définir le mode d'action, l'effet a encore été évalué dans la suspension bactérienne. 30 a. Préparation de la suspension bactérienne E. faecalis a été cultivé pendant une nuit dans 5 mL de bouillon de perfusion de cerveau-coeur (BHI, Difco, Detroit, MI, USA), à 37 °C dans des conditions d'aérobies. Les 4 ml supérieurs ont été transférés dans un tube à essai neuf et centrifugés pendant 10 min à 35 4 165 x g. Le surnageant a été éliminé et les bactéries ont été remises en suspension dans 5 ml de PBS et agitées pendant 10 s. La densité optique de la suspension bactérienne est ajustée à 650 nm, ce qui correspond à une transmittance de 90 T (0,5 échelle Mc Farland : 1,5 10.8 CFU /mL 40 b. Effet antibactérien des liposomes immobilisés L'effet antimicrobien de surface du ciment endodontique incorporant des liposomes 0%, 1% ou 3% (poids / poids) a ensuite été évalué. Une plaque de microtitrage (plaque à 15 fond plat de 96 puits, Nunclon, Copenhague, Danemark) a été positionnée verticalement et les parois latérales de 8 puits ont été revêtues de quantités similaires du matériau (10mg) testé selon la procédure décrite ci-dessus. 10 uL de la suspension bactérienne ont été ajoutés sur la surface de chaque ciment et 5 dans des puits vides. Après inoculation (à 37°C à saturation en humidité) pendant 2, 5, 20 et 60 minutes, 240uL de PBS ont été ajoutés dans chaque puits. Après agitation pendant 1 minute à l'aide d'une pipette, la solution résultante a été transférée et diluée en série. La survie bactérienne a été mesurée par la culture d'aliquot de 20uL des solutions transférées sur des plaques Triptic soy agar après une dilution en série par un 10 facteur 10. Après une incubation pendant 24h à 37°C, les colonies sur la plaque ont été comptées et le CFU/mL a été calculé. La présence de bactéries a été mesurée par spectrophotométrie (à 1 h, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h, 2 semaines et 3 semaines). 15 2. Test en Transwelle insert Une membrane avec des pores de 400 nm a été utilisée pour évaluer la diffusion des liposomes à travers de ces nanopores ; ces nanopores simulent, du fait de leur taille, les tubili dentinaires. 20 Dans une plaque 96 puits, le compartiment supérieur a été rempli avec 10 mg de ciment comprenant des liposomes ou non, et le compartiment inférieur a été rempli avec une solution comprenant les souches bactériennes. Trois souches de E. Faecalis ont été testées, il s'agit des souches ATCC 29212, RW35 et 25 RN44. L'évaluation du pouvoir désinfectant à été mesurée de la même manière que dans le test de contact direct. 30 3. Test de diffusion dans l'agar Un test complémentaire a été réalisé pour démontrer le pouvoir désinfectant de notre ciment endodontique comprenant des liposomes et le comparer à celui des ciments sans liposomes (qui présentent un pouvoir désinfectant limité, notamment sur le biofilm 35 dentaire). Le test a été réalisé dans une plaque de pétri rempli d'une couche de 10 mL d'agar de Muller Hinton stérilisé. Des puits de 4 mm de diamètre ont été formés dans cette couche d'agar pour contenir les ciments endodontiques réalisés dans les mêmes conditions que ci-dessus. 40 Dans cette expérience, l'activité antibactérienne a été évaluée contre les souches de Pseudomonas aeruginosa, Enteroccus faecalis, Staphylococcus aureus et Escherichia coll. 16 Les souches bactériennes ont été cultivées à 37 °C pendant 24 h dans le milieu MH agar pour produire une turbidité de 0,5 sur l'échelle de Mc Farland correspondant à une concentration de 10.8 CFU/mL. Une couche contenant ces bactéries ont été déposées de sorte à recouvrir les ciments fraichement mélangés. Les plaques ont été conservées 2 h 5 à température ambiante et incubées à 37 °C pendant 24 h. Un suivi a été réalisé à 4 h, 8 h, 12h, 24h, 36h, 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours : la zone d'inhibition en mm est mesurée avec un pied à coulisse (test visuel). 4. Test de contact direct modifié (biofilm) 10 Ce test permet de démontrer le pouvoir désinfectant d'un ciment endodontique contre un biofilm bactérien (forme majoritaire des bactéries dans le canal pulpaire.). Le biofilm à été formé sur des tranches d'incisives bovines de 4 mm x 4mm x 1,5 mm (largeur x longueur x épaisseur) utilisant un disque diamanté à faible vitesse sous irrigation. 15 Les échantillons sont trempés dans de l'EDTA à 17 % pendant 3 minutes pour enlever la boue dentinaire puis stérilisés à 121°C pendant 20 min. Une souche standard de E. faecalis (ATCC 51299) est utilisée pour la formation du biofilm bactérien. La culture de E. faecalis est effectuée dans les mêmes conditions que précédemment. Les tranches de dent bovine sont placées dans des puits d'une plaque 24 20 puits. On ajoute dans chaque puits 220 III, d'inoculum, on complète ensuite le puits avec 1,8mL d'une solution stérile de BHI. Les puits sont cultivés à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 14 jours. Le surnageant est complètement changé tous les 48 h par une solution stérile fraiche de BHI. Les ciments endodontiques préparés dans les conditions précédemment citées sont 25 disposés sur les coupes de dent bovine recouvertes de biofilm. Les échantillons de dent/ciment endodontiques sont placés dans une nouvelle plaque 24 puits, et conservé à 37°C avec 5% de CO2 pendant 2,7 et 14 jours. Après ces périodes d'incubation les biofilms restants sont transférés dans des tubes contenant 1mL de solution saline. Les tubes sont agités avec un sonicateur ultrasons 30 pendant 30 secondes à 40 W pour détacher les biofilms. La mesure du nombre de bactérie (CFU/mL) est effectuée comme précédemment décrit. Exemple 4: Evaluation du pourcentage de relargage des molécules contenues dans les liposomes mélangés au ciment 35 1 - Objectif de l'expérience L'expérience qui suit a pour objectif d'évaluer le pourcentage de relargage d'une molécule fluorescente (rhodamine) incorporée dans des liposomes mélangés à un 40 ciment endodontique. En pratique, elle a consisté à comparer i) le relargage obtenu à partir de 10mg de ciment comprenant 3% de liposomes (en poids) contenant de la rhodamine (ce qui correspond à l'ajout en poids de 1% de lipides dans le ciment) versus 17 ii) le relargage obtenu avec un ciment ne comprenant pas de liposome mais seulement de la rhodamine (fluorescence seule). Les ciments de base utilisés dans cette expérience sont les ciments commerciaux 5 Apexite, Sealapexe et Bioroote RCS. Les liposomes ont été préparés à partir des lipides suivants : EPC, DOPE, DODAP. 2 - Préparation des liposomes 10 Les liposomes ont été préparés selon la méthode décrite ci-dessus. L'expérience a été réalisée avec les compositions suivantes : « liposome DOPE» ( DOPE, HSPC) , « liposome DODAP » (DODAP, PC, Cholesterol), « liposomes EPC » ( EPC, HSPC ) dans des proportions respectives suivantes ( 5 :2 :3 ratio molaire) , ( 3 :7 ratio poids) , ( 35 :65 15 ratio poids) Une solution de rhodamine (0,04 nMol) est utilisée pour hydrater le film lipidique et obtenir des liposomes contenant des molécules fluorescentes (chargement des liposomes). 20 3 - Préparation du ciment comprenant les liposomes chargés en rhodamine Après l'obtention des liposomes, ces derniers sont mélangés avec du surfactant Pluronic L31 à 2% w/w. 25 La solution de liposomes fluorescents préparée précédemment a ensuite été incorporée aux différents ciments testés, 100mg d'un ciment donné ont été mélangés avec 1mg de lipides. 10 mg du mélange lipide/ciment est ensuite disposé en triplicat dans des puits d'une plaque de 96 puits. Pour préparer le ciment contrôle « sans liposome », la solution de rhodamine a été 30 incorporée directement dans les ciments dans les mêmes proportions que celles utilisées pour les ciments contenant des liposomes (même quantité de rhodamine contenue dans le ciment). Les mélanges ainsi obtenus ont été placés dans un incubateur à 37°C saturé en humidité. 35 4 - Méthodes d'analyse utilisées Cinétique d'étude du relargage : Après prise complète du matériau ( soit environ 4 heures), 1mL de PBS (pH 7.2) a été ajouté dans chaque puits puis enlevé et remplacé par une solution fraîche surnageant 40 selon la cinétique suivante : 4h, 8h, 12h, 24h, 36h, 48 h puis 1 fois par 24 h pendant 15 jours. Taille des liposomes : 18 La mesure de la taille des liposomes a été réalisée selon la méthode décrite ci-dessus. Nous avons aussi mesuré la taille des liposomes après relargage par le ciment. Dosage fluorescence : 5 La solution de rhodamine sert d'étalon pour le dosage de la fluorescence. Au moment de réaliser le dosage, les surnageants ont été prélevés dans chaque puits et transférés respectivement dans un puits d'une autre plaque utilisée pour le dosage. Le dosage est réalisé par spectrophotométrie (Plaque reader BIOTEK). 10 5 - Résultats Les résultats de cette étude sont présentés aux Figures 2 et 3. Ont été intégrés dans différents types de ciment, soit des liposomes encapsulant de la 15 rhodamine, soit de la rhodamine non encapsulée. Relargage de la rhodamine : Les résultats montrent que les ciments endodontiques qui intègrent des liposomes ont un relargage supérieur en quantité et en durée comparée aux ciments qui n'intègrent 20 pas des liposomes (les courbes marquées d'un rond correspondent au ciment sans liposomes). Cette propriété est particulièrement intéressante en endodontie, car pour une élimination bactérienne efficace il faut un relargage suffisant en quantité et durable dans le temps [10; 11]. Ainsi, ces résultats montrent que l'intégration de liposomes permet de libérer jusqu'à 19,43% de la quantité de rhodamine incorporée dans le 25 ciment versus 1,67% quand la rhodamine n'est pas encapsulée dans des liposomes. Par ailleurs, la totalité de la quantité de rhodamine libérée dans les ciments sans liposomes intervient dans les 24-48h, après ces temps le ciment ne relargue que très peu de substance fluorescente. La présente innovation permet donc un relargage diffus sur une durée longue 15 jours. Le ciment développé permet d'atteindre une 30 concentration d'inhibition/bactéricide minimale constante dans le temps, contrairement au ciment endodontique sans liposome qui atteignent cette concentration pendant 24h (le relargage les jours suivants ne permet pas d'atteindre localement la concentration minimale d'inhibition). Enfin, les résultats montrent que la combinaison ciment + liposomes encapsulant de la 35 rhodamine permet un relargage supérieur à celui de la combinaison rhodamine + ciment quelque soit le type de ciment et le type de liposomes utilisés. Néanmoins, les profils de relargage diffèrent en fonction des lipides utilisés et des ciments. Enfin, nous retrouvons les mêmes profils de relargage que dans les précédentes études associant un ciment osseux et des liposomes [1]. Par ailleurs, la formulation peut être 40 modulée en fonction de l'objectif à atteindre, en modifiant la nature des lipides, la nature de l'antiseptique et la nature de ciment endodontique. 19 En conclusion, les liposomes ont été incorporés avec succès au ciment endodontique pour permettre un relargage contrôlé (en quantité et en durée) d'une molécule d'intérêt. Cette innovation pourrait jouer un rôle important dans la diminution des infections endodontiques post-traitement qui concernent 44% à 77% des dents traitées. 5 L'amélioration de la désinfection par cette innovation permettrait moins de complications cardiovasculaires (infarctus) et respiratoires (sinusites) et une réduction des coûts liés à l'échec du traitement endodontique (antibiotiques, couronne, implant, etc...). 10 Références bibliographiques [1] Ayre, N.W., Birchall, J.C., Evans, S.L. and Denyer, S.P. A novel liposomal drug delivery 15 system for PMMA bone cements. J Biomed Mater Res Part B. 2015;00B:000-000. [2] Ayre, NW. Novel approaches to the development of PMMA bone cernent. Thesis, PhD. 2013. Cardiff University. 20 [3] Cunningham, B., McLaren, A.C., Pauken, C. and McLemore, R. Liposomal formulation increases local delivery of amphotericin from bone cernent: a pilot study. Clinical Orthopaedics and Related Research. 2012;470:2671-2676. 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GuerreiroTanomaru, Antibiofilm activity, pH and solubility of endodontic sealers , Int Endod J. 2013 Aug;46(8):755-62. 20 [14]HARALD M ERIKSEN, LISE-LOTTE KIRKEVANG Endodontic epidemiology and treatment outcome: general considerations ; REVENDICATIONS1. Ciment dentaire caractérisé en ce qu'il comprend des liposomes et qu'il présente un pouvoir désinfectant vis-à-vis des bactéries responsables des infections dentaires, lesdits liposomes étant soit des liposomes chargés en agent bactéricide ou autre molécule active, soit des liposomes cationiques non chargés. 2. Ciment dentaire selon la revendication 1 dans lequel le pouvoir désinfectant est évalué par la mesure de la concentration en bactéries à 7 jours en utilisant la méthode de test de contact direct, cette concentration en bactéries étant inférieure à 105CFU/mL, de manière préférée inférieure à 104 CFU/mL, et de manière tout à fait préférée inférieure à 1000 CFU/mL, et ledit pouvoir bactérien étant évalué soit sur bactéries planctoniques, soit sur biofilm bactérien. 3. Ciment dentaire selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel les ciment dentaire est un ciment à base d'hydroxyde de calcium, de silicate de calcium, de disilicate ou trisilicate de calcium, d'hydroxyapatite, de silicone, de oxyde de zinc, d'eugénol, de résine, d'alginate et/ou de collagène. 4. Ciment dentaire selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les liposomes ont une taille comprise entre 20 nm et 8000 nm. 5. Ciment dentaire selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un 25 surfactant. 6. Procédé de préparation d'un ciment dentaire tel que défini à l'une des revendications 1 à 5 comprenant : a) la préparation de liposomes dont la taille est comprise entre 20 nm et à 8000 30 nm, b) le mélange desdits liposomes avec un ciment dentaire dans une proportion comprise entre 0,5% à 30% de liposomes (poids/poids). 7. Procédé selon la revendication 6, comprenant en outre l'ajout de surfactant à la 35 préparation de liposomes avant mélange avec le ciment. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, dans lequel la préparation des liposomes comprend une étape de chargement desdits liposomes en antiseptiques et/ou autres molécules actives. 40 9. Ciment dentaire tel que défini à l'une des revendications 1 à 5, pour son utilisation dans la prévention des infections post-comblement, en particulier du canal radiculaire, du periapex et/ ou des tubuli dentinaires. 22 10. Méthode d'évaluation du pouvoir désinfectant d'un ciment dentaire tel que défini à l'une des revendications 1 à 5, consistant à: i) disposer, dans un récipient à deux compartiments, 5 a) une solution comprenant des souches bactériennes susceptibles d'être responsables d'une infection dentaire dans le compartiment inférieur, b) une couche de ciment dentaire dont on souhaite tester le pouvoir disinfectant dans le compartiment supérieur, les deux compartiments étant séparés par une membrane percée de pores dont le 10 diamètre est compris entre 50 nm et 8000 nm ; ii) incuber le récipient à 37°C pendant une durée choisie ; iii) évaluer la présence de bactéries dans le compartiment inférieur.