FR 3069540 A1 20190201 FR 1757257 A 20170728 Protéine modifiée avec demi-vie améliorée Domaine technique La présente invention attrait au domaine des protéines thérapeutiques de fusion présentant une demi-vie plasmatique améliorée comparée aux protéines thérapeutiques non-fusionnées. En particulier l'invention concerne des facteurs de la coagulation à demi-vie plasmatique améliorée. Arrière-plan technologique Depuis de nombreuses années, les biotechnologies ont permis de développer des médicaments toujours plus innovants, notamment avec le développement des protéines recombinantes produites par des techniques de recombinaison génétique. De nombreuses protéines thérapeutiques issues des biotechnologies sont aujourd'hui utilisées pour traiter de nombreuses pathologies. Pour certaines pathologies, le traitement nécessite plusieurs administrations de protéines thérapeutiques, parfois tout au long de la vie du patient. Ces administrations répétées peuvent présenter de nombreux inconvénients, à la fois pour le confort du patient qui est soumis à des administrations répétées, pour le personnel de santé qui doit multiplier les actes médicaux, mais également pour les systèmes de santé qui prennent en charge le coût des traitements. C'est notamment le cas pour le traitement des troubles de la coagulation. La coagulation (formation d'un caillot sanguin) permet l'arrêt d'un saignement. Elle s'effectue grâce à l'action successive de nombreuses protéines circulantes activées en chaine : les facteurs de la coagulation. Elle s'effectue grâce à l'activation en chaîne (appelée « cascade de la coagulation ») d'une série de facteurs de la coagulation (numérotés de I à XIII) dont les Facteur IX (FIX) et Facteur VIII (FVIII). Le dernier maillon de cette cascade de la coagulation est la formation d'un réseau de fibrine capable de colmater la brèche vasculaire. De nombreux troubles de la coagulation ont pour origine un disfonctionnement de la cascade de la coagulation. Par exemple, l'hémophilie est une maladie hémorragique constitutionnelle causée par la déficience en facteur VIII, IX ou XI de la coagulation, sans lesquels la coagulation sanguine est impossible. Cette maladie héréditaire, transmise suivant un mode récessif est liée au chromosome X. Cette maladie touche électivement les hommes et elle est transmise par les femmes, qui sont le plus souvent asymptomatiques ou peu symptomatiques et dites conductrices. Dans 30% des cas, la maladie apparaît sans antécédent familial d'hémophilie. 2 L'hémophilie se caractérise par l'inefficacité des processus de coagulation sanguine et donc l'apparition d'importantes hémorragies provoquées ou spontanées qui peuvent devenir mortelles sans prise en charge médicale. Elle est donc considérée comme étant une maladie grave et invalidante. Il existe deux principaux types d'hémophilie : l'hémophilie A et 5 l'hémophilie B. L'hémophilie A correspond à un déficit en FVIII. L'hémophilie B correspond à un déficit en FIX rendant toute formation de caillot de sang instable voire impossible, les saignements sont alors prolongés et non contrôlés. L'hémophilie A est 6 fois plus fréquente que l'hémophilie B. L'hémophilie B touche une naissance sur 30 000 de sexe masculin environ (soit 40 à 50 naissances par an en France) soit 500 000 personnes sont atteintes 10 dans le monde, dont 5000 à 6000 en France. L'expression clinique et la gravité de la maladie sont liées à la sévérité du déficit en FIX ou en FVIII. Selon, la sévérité du déficit l'ISTH (International Society on Thrombosis and Haemostasis) distingue : 15 - l'hémophilie sévère, lorsque le taux de FVIII ou IX est inférieur à 1 °/(:), - l'hémophilie modérée, lorsque le taux de FVIII ou IX est compris entre 1 et 5 °/(:), - l'hémophilie mineure, lorsque le taux de FVIII ou IX est compris entre 5 et 40 °h. Les hémorragies du patient hémophile sévère présentent des caractéristiques spécifiques. Elles apparaissent spontanément ou suite à un traumatisme minime qui peut passer 20 totalement inaperçu. Les sites hémorragiques sont essentiellement situés au niveau des muscles, des articulations, plus rarement au niveau viscéral ou intracérébral. Le caractère pathologique de la maladie n'est ni lié à la localisation ni à l'intensité du syndrome hémorragique mais à sa durée, ce qui explique l'issue potentiellement fatale de certains traumatismes. Un hémophile sévère présente généralement entre 30 et 50 épisodes 25 hémorragiques par an, toutes gravités confondues, en l'absence de traitement préventif adapté. Le principe du traitement de l'hémophilie consiste à administrer, le facteur de la coagulation manquant : le FVIII pour l'hémophilie A ou le FIX pour l'hémophilie B. Ce type de traitement substitutif nécessite des injections intraveineuses répétées. L'administration de facteur permet de restaurer de façon temporaire les capacités de coagulation du patient. 30 Néanmoins, ces protéines, bien que très efficaces, ont un effet limité dans le temps et il est donc nécessaire de les administrer régulièrement au patient. Par exemple, chez l'hémophile sévère un traitement préventif appelé « prophylaxie » consiste à injecter le facteur de la coagulation manquant deux à trois fois par semaine, voire un jour sur deux afin d'éviter la survenue d'un saignement. Il est également à noter que ces protéines restent relativement 3 coûteuses, 0,7 à 1 euro l'unité soit 2000 à 3000 euros par injection chez un adulte de poids standard. De nouvelles protéines thérapeutiques ont donc été développées afin de palier à ces inconvénients. En particulier, des protéines recombinantes permettant d'avoir une activité 5 augmentée et/ou une demi-vie plasmatique améliorée. Ces protéines de nouvelle génération ont l'objectif de diminuer la fréquence d'administration ainsi que le coût des traitements. L'art antérieur décrit des protéines de fusion qui présentent une demi-vie plasmatique améliorée, par exemple le FIX fusionné à une autre protéine de longue demi-vie plasmatique comme l'albumine (Metzner et al., 2009; Martinowitz et al., 2013) ou la partie Fc de l'IgG1 10 (Shapiro et al., 2012 ; Powell et al., 2013). Ces protéines de fusion ont montré des résultats encourageants lors d'essais cliniques chez l'homme. Néanmoins, le gain en demi-vie plasmatique reste modeste chez l'homme et/ou l'activité thérapeutique de ces protéines de fusion est parfois altérée. Il existe donc un besoin de mettre au point de nouvelles protéines thérapeutiques qui présentent une demi-vie 15 plasmatique améliorée. Les inventeurs ont mis au point une nouvelle génération de protéine de fusion comprenant une protéine thérapeutique et le domaine B du FXIII (FXIIIB). Une telle protéine de fusion présente une demi-vie plasmatique améliorée par rapport à la protéine thérapeutique non-fusionnée au FXIIIB. 20 Résumé de l'invention La présente invention vise à proposer une nouvelle génération de protéine de fusion présentant une demi-vie plasmatique améliorée. Selon un premier aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion 25 comprenant : a) une protéine thérapeutique, b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), et c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et la protéine thérapeutique. Selon un second aspect, la présente invention concerne une séquence nucléotidique codant 30 pour une protéine de fusion selon l'invention. Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention. Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne une cellule, par exemple un clone cellulaire, qui comprend une séquence nucléotidique selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. 4 Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une protéine de fusion selon l'invention, comprenant la culture d'une cellule selon l'invention dans des conditions permettant l'expression de la protéine de fusion, et éventuellement la purification de la protéine de fusion à partir de la cellule ou à partir du milieu de culture. 5 Selon un sixième aspect, la présente invention concerne une composition comprenant une protéine de fusion selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule selon l'invention. Selon un septième aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion selon l'invention pour son utilisation comme médicament. 10 Description détaillée de l'invention La présente invention découle des avantages surprenants mis en évidence par les inventeurs d'améliorer la demi-vie plasmatique d'une protéine thérapeutique en le fusionnant avec le domaine B du FXIII (FXIIIB). 15 L'invention concerne en effet une protéine de fusion comprenant : a) une protéine thérapeutique b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB) et c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et la protéine thérapeutique Protéine de fusion 20 Les protéines de fusion sont largement décrites dans l'art antérieur. Une « protéine de fusion » est une protéine obtenue par la combinaison de différentes protéines, ou partie de protéines. Les protéines de fusion peuvent également être appelées protéines chimères. Au sens de l'invention, le terme « protéine de fusion » désigne une protéine thérapeutique fusionnée à un FXIIIB. Au sens de l'invention le terme « protéine de fusion » est 25 interchangeable avec le terme « protéine de fusion thérapeutique ». La protéine de fusion selon l'invention est obtenue par la combinaison de deux protéines : une protéine thérapeutique et un domaine B facteur XIII (FXIIIB), ces dernières étant connectées via un linker peptidique. Avantageusement, la protéine de fusion selon l'invention présente une demi-vie plasmatique 30 améliorée par rapport à la protéine thérapeutique non-fusionnée au FXIIIB, de préférence la demi-vie plasmatique de la protéine de fusion est au moins 1,5 fois supérieure à la demi-vie plasmatique de la protéine thérapeutique non-fusionnée au FXIIIB. Dans un mode de réalisation particulier, la demi-vie plasmatique de la protéine de fusion est au moins 2 fois, par exemple au moins 2,5 fois, par exemple au moins 3 fois, supérieure à la demi-vie 5 plasmatique de la protéine thérapeutique non-fusionnée au FXIIIB. La fusion au FXIIIB permet d'améliorer la demi-vie plasmatique de la protéine thérapeutique. Avantageusement, la protéine de fusion selon l'invention est biologiquement active, c'est-à-dire que la partie « protéine thérapeutique » exerce une activité thérapeutique chez un 5 patient ou un animal. L'activité thérapeutique étant obtenue soit par la protéine de fusion en tant que telle, soit par la partie « protéine thérapeutique » obtenue après le clivage du linker peptidique, c'est-à-dire lorsque le linker peptidique est clivable (voir-ci-après). Avantageusement, la protéine de fusion de l'invention possède les modifications posttraductionnelles nécessaires à l'obtention d'une activité thérapeutique satisfaisante (e.g. 10 glycosylations (e.g. N-glycosylation et/ou 0-glycosylation), phosphorylation, etc.). Domaine B du FXIII (FXIIIB) Le Facteur XIII (FXIII) est une protransglutaminase plasmatique qui participe aux dernières étapes du processus de la coagulation. Le FXIII stabilise la fibrine et permet donc la constitution d'un caillot solide capable d'arrêter l'hémorragie. Le FXIII est composé de deux 15 sous-unités catalytiques A et de deux sous-unités B. Après leur synthèse et leur sécrétion dans le plasma, les deux sous-unités A et B du FXIII se lient entre elles afin de former un hétérotétramère FXIIIA2/FXIIIB2. La sous-unité A du FXIII possède l'activité transglutaminase et comprend un site catalytique de clivage par la thrombine (Fila) et une région de liaison du calcium indispensables à 20 l'activité catalytique. La sous-unité B du FXIII (80 kDa), qui n'a pas d'activité enzymatique, est importante dans le processus de stabilisation et le transport de la sous-unité A. La demi-vie plasmatique de la sous-unité B du FXIII est de 10 à 12 jours. Au sens de l'invention, le terme « domaine B du FXIII » ou « FXIIIB » désigne la sous-unité B du FXIII, un fragment de celle-ci ou un variant de celle-ci. Dans un mode de réalisation 25 particulier, le FXIIIB est dénué de son peptide signal et de son propeptide. Le FXIIIB peut dériver de n'importe quel vertébré, en particulier tout mammifère, par exemple humain, vache, mouton ou porc. Le FXIIIB peut provenir d'un animal différent de celui d'où provient la protéine thérapeutique. En particulier, le FXIIIB est un FXIIIB humain, par exemple la sous-unité B du FXIII humain de séquence SEQ ID NO :1, un fragment de celui-ci ou un 30 variant de celui-ci. Le FXIIIB est directement ou indirectement responsable de l'amélioration de la demi-vie plasmatique de la protéine thérapeutique. Un fragment de la sous-unité B du FXIII peut avoir une longueur de 10 acides aminés ou plus et peut comprendre environ 15, 20, 30, ou plus de 50 acides aminés consécutifs de la 35 séquence en acides aminés de la sous-unité B du FXIII. 6 Un variant de la sous-unité B du FXIII a au moins 50%, au moins, 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% d'homologie avec la séquence de la sous-unité B du FXIII native. Le variant peut, par exemple, comprendre des insertions, des délétions et/ou des substitutions. En particulier, le FXIIIB peut être un variant polymorphe naturel de 5 la sous unité B du FXIII humain. Par exemple, un variant de la sous-unité B du FXIII humain a au moins 50%, au moins, 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO: 1. Protéine thérapeutique Au sens de l'invention, on entend par « protéine thérapeutique », tout type de protéine ou 10 de polypeptide exerçant une activité thérapeutique chez un patient ou un animal. La protéine thérapeutique peut être une protéine de type sauvage, un variant de la protéine sauvage ou un fragment biologiquement actif de celles-ci. Le terme "variant" comprend les insertions, les délétions et les substitutions qui ne modifient pas substantiellement l'activité thérapeutique de la protéine thérapeutique. 15 Dans un mode de réalisation particulier, la protéine thérapeutique est choisie parmi une protéine impliquée dans la coagulation sanguine, un interféron, l'insuline, une hormone, une enzyme, une cytokine, un anticorps, un fragment d'anticorps, un facteur de croissance, un peptide actif. Il peut s'agir par exemple d'une protéine thérapeutique déjà connue pour avoir été fusionnée à une molécule lui confèrent une demi-vie améliorée, comme les protéines 20 thérapeutiques décrites dans « William R. Strohl, Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologies as a Strategy to Make Biobetters ; BioDrugs (2015) 29:215-239 », notamment au tableau 4 de ce document. Dans le cadre de l'invention, la protéine thérapeutique n'est pas le FXIII ou une sous-unité du FXIII. 25 Avantageusement, la protéine impliquée dans la coagulation sanguine est un facteur de la coagulation. Au sens de l'invention, le terme « facteur de la coagulation » comprend notamment le facteur IX, le facteur VII, le facteur VIII, le facteur V, le facteur de von Willebrand, le facteur X, le facteur XI, le facteur XII, le Facteur I, le Facteur II (Prothrombine), l'antithrombine, la Protéine C, la Protéine S, GAS6 ou la Protéine Z ainsi que 30 leurs formes activées. En particulier, le facteur de la coagulation est un facteur de la coagulation vitamine-K dépendant, de préférence choisi parmi le facteur VII/VII activé (FVII/FVIIa), le facteur X, le facteur II (prothrombine) et le facteur IX (FIX), de préférence le FIX. Le FIX intervient dans la coagulation en activant le Facteur X (FX) en présence de son co- 35 facteur, le FVIII. Il a un rôle primordial pour assurer la génération de la thrombine (FIIa) et 7 donc la génération de fibrine. Le FIX est une glycoprotéine de poids moléculaire de 57 kDa et qui présente une demi-vie plasmatique de 18-24 heures environ. Avantageusement, la protéine thérapeutique selon l'invention est choisie parmi les protéines présentées dans le tableau 1: Protéine thérapeutique UniProt accession number Facteur IX (FIX) comprenant peptide P00740 signal et le propeptide Facteur FVII (FVII) comprenant le peptide signal et le propeptide P08709 Facteur Vila (FVIIa) comprenant le P08709 peptide signal et le propeptide Facteur VIII (FVIII) comprenant le P00451 peptide signal Facteur FX (FX) comprenant le peptide signal et le propeptide P00742 Facteur von Willebrand (vWF) P04275 comprenant le peptide signal Antithrombine III comprenant le peptide signal P01008 Proteine C comprenant le peptide signal et le propeptide P04070 Protéine S comprenant le peptide signal et le propeptide Q08761 GAS-6 comprenant le peptide signal Q14393 Protéine Z comprenant le peptide signal et le propeptide P22891 Facteur II (FII) comprenant le peptide P00734 signal et le propeptide 5 La protéine de fusion qui comprend une protéine thérapeutique du tableau 1 pourra perdre le propeptide (s'il est présent dans sa séquence peptidique) et le peptide signal. Cette perte (clivage) a généralement lieu dans la cellule qui exprime la protéine de fusion. Ainsi, la protéine thérapeutique selon l'invention peut être choisie parmi les protéines présentées 10 dans le tableau 2 (protéines du tableau 1 sans peptide signal et propeptide (s'il est présent dans sa séquence peptidique)). 8 Protéine thérapeutique SEQ ID NO: Facteur IX (FIX) SEQ ID NO: 2 Facteur FVII (FVII) SEQ ID NO: 3 Facteur VIII (FVIII) SEQ ID NO: 4 Facteur VIII dépourvu du domaine B (BDD-FVIII) SEQ ID NO: 5 Facteur FX (FX) SEQ ID NO: 6 Facteur von Willebrand (vWF) SEQ ID NO: 7 Antithrombine III SEQ ID NO: 8 Proteine C SEQ ID NO: 9 Protéine S SEQ ID NO: 10 GAS-6 SEQ ID NO: 11 Protéine Z SEQ ID NO: 12 Facteur II (Fil) SEQ ID NO: 13 Il convient de noter que le FVIII peut être dépourvu du domaine B ou le domaine B peut être remplacé par toute séquence peptidique courte. Ces modifications du FVIII sont largement décrites dans la littérature. Au sens de l'invention, le terme « protéine thérapeutique » inclue les variants 5 biologiquement actifs et les fragments biologiquement actifs de celle-ci. Par exemple, plusieurs variants de FIX ont été décrites dans la littérature. On peut citer notamment le variant E410H (Perot E, et al., 2015), le variant R338L (Simioni P et al., 2009) ou le variant R338A (Chang 3 et al., 1998). On peut également mentionner les variants ayant une activité améliorée, tels que ceux décrits dans le document W02009/137254. 10 Liaison du FX1118 avec le fibrinogène Il est décrit dans la littérature que la sous-unité B du FXIII circule sous une forme liée au fibrinogène. Le fibrinogène est une protéine qui se retrouve en grande quantité au niveau de la plaie vasculaire. Les inventeurs ont montré que la protéine de fusion selon l'invention, peut également se lier au fibrinogène. Cette capacité à se lier au fibrinogène est 15 particulièrement avantageuse lorsque la protéine thérapeutique est un facteur de la coagulation. En effet, la protéine de fusion peut alors présenter une activité thérapeutique améliorée, comme par exemple une meilleure efficacité hémostatique. Cela s'explique par le fait que la protéine de fusion est transportée avec le fibrinogène au niveau de la plaie, ce qui favorise l'adressage de la protéine de fusion au niveau de la plaie et augmente la 20 concentration en protéine de fusion au niveau de la plaie. Cet adressage au niveau de la 9 plaie permet une meilleure coagulation et donc une activité thérapeutique améliorée du facteur de la coagulation fusionné au FXIIIB par rapport au facteur de la coagulation non-fusionné au FXIIIB. Cela se traduit par un meilleur rendement de la transformation du fibrinogène en caillot de fibrine. 5 Linker peptidique (ou bras de liaison peptidique) On entend par « linker peptidique » ou « bras de liaison peptidique », une séquence d'acides aminés qui connecte une protéine ou polypeptide à une autre protéine ou polypeptide. Dans le cadre de l'invention, le linker peptidique connecte le FXIIIB et la protéine thérapeutique. Ainsi, la protéine de fusion selon l'invention est constituée d'une seule séquence d'acides 10 aminés comprenant la séquence en acides aminés de la protéine thérapeutique, la séquence en acides aminés du FXIIIB et la séquence en acides aminés du linker peptidique. Ainsi, la protéine de fusion selon l'invention peut également être définie par la formule (I) : [Séquence en acides aminés d'une protéine thérapeutique]-[Séquence en acides aminés d'un linker peptidique]-[Séquence en acides aminés d'un FXIIIB] (I). 15 La longueur du linker peptidique est variable, en particulier elle peut aller de 2 acides aminés à 100 acides aminés, par exemple de 5 à 25 acides aminés. Dans un mode de réalisation particulier, le linker peptidique est un linker peptidique clivable. Cette propriété permet de libérer la protéine thérapeutique dans des conditions particulières ou dans un environnement particulier. 20 Lorsque la protéine thérapeutique est un facteur de la coagulation, le linker peptidique est de préférence un linker peptidique clivable par une protéase impliquée dans la cascade de la coagulation. Le terme « protéase » désigne une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques covalentes. Les protéases comprennent, de façon non limitative, les serine protéases, les cysteine protéases, les protéases aspartiques, la thréonine et les 25 métalloprotéases. Avantageusement, le linker peptidique est clivable par une sérine protéase choisie parmi le facteur lia (Fila), le facteur Xa (FXa), le facteur XIa (FXIa) et/ou le facteur VIIa (FVIIa). La présence d'un linker peptidique clivable est particulièrement avantageuse puisqu'une fois que le facteur de coagulation est activé pendant la coagulation, soit par clivage protéolytique 30 du zymogène (comme pour le FIX), soit par contact d'un facteur déjà pré-activé protéolytiquement à un second polypeptide (comme la liaison de FVIIa au facteur tissulaire), il n'est plus souhaitable de maintenir une longue demi-vie plasmatique du facteur de coagulation activé car cela pourrait entrainer des complications thrombotiques ou une diminution de l'activité du facteur de la coagulation activé. L'utilisation d'un linker peptidique 35 clivable tel que décrit ci-dessus permet donc d'obtenir un facteur de la coagulation à demi- 10 vie plasmatique améliorée qui, après activation ou après disponibilité d'un cofacteur, présente une demi-vie plasmatique comparable à celle du facteur de la coagulation activé qui n'est pas fusionné au FXIIIB. Un linker peptidique clivable comprend au moins un site de clivage par une protéase 5 impliquée dans la cascade de la coagulation. Le linker peptidique clivable peut par exemple comprendre deux sites de clivage par une protéase impliquée dans la cascade de la coagulation. Chaque site de clivage peut être clivé par une même protéase impliquée dans la cascade de la coagulation ou par deux protéases distinctes. Avantageusement, le linker peptidique clivable comprend un seul site de clivage par une protéase impliquée dans la 10 cascade de la coagulation. Dans un mode de réalisation particulier, le linker peptidique clivable comprend une ou plusieurs séquence(s) d'acides aminés clivable(s) par une protéase choisie parmi le FXa, le FXIa, le FVIIa-FT, le Fila, par exemple le linker peptidique clivable comprend une ou plusieurs séquence(s) choisie parmi celles présentées dans le tableau 3 ci-dessous. Protéase Séquence d'acides aminés clivable SEQ ID NO: FXa RLVGGQE SEQ ID NO : 14 FXa TRIEGRIV SEQ ID NO : 15 FXIa, FVIIa-TF KLTRAETV SEQ ID NO : 16 FXIa, FVIIa-TF DFTRVVGG SEQ ID NO : 17 Fila GPRSFL SEQ ID NO : 18 15 Avantageusement, le linker peptidique clivable est choisi parmi le linker peptidique clivable de séquence SEQ ID NO :19 et le linker peptidique clivable de séquence SEQ ID NO : 20. Ces linkers peptidiques clivables sont particulièrement avantageux lorsque la protéine thérapeutique est un facteur de la coagulation, par exemple le FIX. 20 Les variants et les fragments des linkers peptidiques clivables décrits ci-dessus sont compris dans la présente invention à partir du moment où ils restent clivables par une protéase impliquée dans la cascade de la coagulation. Le terme "variant" comprend les insertions, les délétions et les substitutions. Dans un mode de réalisation particulier, le linker peptidique connecte le C-terminal du 25 facteur de la coagulation et le N-terminal du FXIIIB. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le facteur de la coagulation est le FIX car une telle construction permet la maturation complète du FIX lui permettant de perdre son propeptide et son peptide signal avant la sécrétion par la cellule. 11 Dans un mode de réalisation préféré, la protéine de fusion comprend : a) un FIX, de préférence un FIX de séquence UniProt accession number P00740 ou de séquence SEQ ID NO :2; b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), de préférence un FXIIIB de séquence SEQ ID 5 NO : 1 ; et c) un linker peptidique clivable, de préférence un linker peptidique clivable de séquence SEQ ID NO : 19 ou SEQ ID NO :20 , qui connecte le FXIIIB et le FIX. Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la protéine de fusion selon l'invention a au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% 10 ou 100% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO: 21 (FIX-IYa-FXIIIB avec linker peptidique clivable comprenant TRIEGRIV, avec propeptide et avec peptide signal) ou SEQ ID NO: 22 (FIX-IYa-FXIIIB avec linker peptidique clivable comprenant TRIEGRIV, sans propeptide et sans peptide signal) Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, la protéine de fusion selon 15 l'invention a au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO: 23 (FIX-LIIa-FXIIIB avec linker peptidique clivable comprenant GPRSFL, avec propeptide et avec peptide signal) ou SEQ ID NO: 24 (FIX-LIIa-FXIIIB avec linker peptidique clivable comprenant GPRSFL, sans propeptide et sans peptide signal) 20 Séquence nucléotidique L'invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion selon l'invention. La séquence nucléotidique peut être une séquence d'acide ribonucléique (ARN) ou une séquence d'acide désoxyribonucléique (ADN), de préférence la séquence nucléotidique est une séquence d'ADN. 25 En particulier, la séquence nucléotidique selon l'invention est un ADN complémentaire (ADNc). L'ADNc est particulièrement avantageux car il présente une taille réduite par rapport à l'ADN génomique. L'ADNc peut comprendre un ou plusieurs intron(s) permettant d'augmenter la stabilité des ARNs correspondants. Le choix du ou des intron(s) et son positionnement dans la séquence d'ADNc est à la portée de l'homme du métier. 30 Avantageusement, la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention est optimisée pour améliorer l'efficacité de traduction de la protéine de fusion. L'optimisation d'une séquence nucléotidique ne présente pas d'obstacle particulier pour l'homme du métier qui peut aisément mettre en oeuvre l'enseignement de l'art antérieur. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique selon l'invention est une 35 séquence nucléotidique ayant au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, 12 au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO: 25 (séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion de séquence SEQ ID NO: 21) ou une séquence nucléotidique ayant au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO: 26 (séquence 5 nucléotidique codant pour la protéine de fusion de séquence SEQ ID NO: 23). Vecteur La présente invention concerne également un vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention. Au sens de la présente invention, le terme « vecteur » doit être pris dans son sens le plus 10 large. En particulier, un « vecteur » désigne un véhicule utilisé pour introduire une séquence nucléotidique dans une cellule, pour son expression, pour sa réplication et/ou pour son intégration dans le génome de ladite cellule. Les différents types de vecteurs sont largement connus de l'homme de l'art et tous types de vecteurs peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. 15 Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur est un vecteur d'expression. Un « vecteur d'expression » est capable d'exprimer une séquence nucléotidique qui est fonctionnellement lié à des séquences régulatrices, telles qu'un promoteur, qui sont capables d'effectuer l'expression de la séquence nucléotidique. Un vecteur d'expression peut donc inclure des séquences promotrices et terminatrices, et peut facultativement comprendre une ou 20 plusieurs origines de réplication, un ou plusieurs marqueurs de sélection, un amplificateur, un signal de polyadénylation. Les vecteurs d'expression sont généralement dérivés d'ADN plasmidique ou viral, ou peuvent contenir des éléments des deux. Ainsi, un vecteur d'expression peut être une construction d'ADN ou d'ARN recombinant, tel qu'un plasmide, un phage, un virus recombinant ou un autre vecteur qui, lors de l'introduction dans une cellule 25 hôte appropriée, conduit à l'expression de la séquence nucléotidique désirée. Un vecteur d'expression peut être réplicable dans des cellules eucaryotes et/ou des cellules procaryotes, et peut rester épisomal ou peut s'intégrer dans le génome de la cellule hôte. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le vecteur est un vecteur viral. Des exemples de vecteurs viraux comprennent les vecteurs adénoviraux, rétroviraux, herpétiques 30 et leurs dérivés. Les vecteurs viraux sont connus pour être particulièrement adaptés à la thérapie génique. Cellule L'invention concerne également une cellule (ou cellule hôte) comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. En particulier, la cellule selon 13 l'invention a été transfectée, infectée ou transformée par une séquence nucléotidique et/ou un vecteur selon l'invention. N'importe quel procédé de transfection bien connus de l'homme du métier peut être utilisé pour préparer une cellule selon l'invention, par exemple la transfection par lipofection ou la 5 transfection à l'aide de précipité de phosphate de calcium ou électroporation. Au sens de l'invention, on entend par « transformation », l'introduction d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte, de sorte que la cellule hôte est capable d'exprimer la séquence nucléotidique introduite pour produire la protéine souhaitée. En particulier, la cellule hôte selon l'invention est capable d'exprimer la protéine de fusion de l'invention. 10 Des exemples de cellules hôtes comprennent, sans limitation, des cellules procaryotes (telles que des bactéries) et des cellules eucaryotes (telles que des cellules de levure, des cellules de mammifères, des cellules d'insectes, des cellules végétales, etc.). Des exemples spécifiques comprennent E. coli, Kluyveromyces ou Saccharomyces, des lignées cellulaires de mammifères (par exemple Vero, CHO, 3T3, BHK, COS, Huh-7, etc.) ainsi que des cultures 15 cellulaires primaires ou établies de mammifères (par exemple des lymphoblastes, des fibroblastes, des cellules embryonnaires, les cellules épithéliales, les cellules nerveuses, les adipocytes, etc.). On peut également citer des lignées cellulaires comme par exemple 5P2/0- Ag14 (ATCC CRL1581), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), CHO DHFR, YB2/0 (ATCC CRL1662) ou Huh-7 (ATCC CCL-185). 20 II peut également s'agir d'une cellule souche prélevée chez un patient, par exemple une cellule mésenchymateuse. Les cellules souches peuvent notamment être utilisées en thérapie génique ou en thérapie cellulaire, soit autologue soit hétérologue. Procédé de préparation L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine de fusion, en 25 particulier un facteur de coagulation selon l'invention, comprenant la culture d'une cellule selon l'invention dans des conditions permettant l'expression de la protéine de fusion, et éventuellement la purification de la protéine de fusion à partir de la cellule ou à partir du milieu de culture. Les cellules sont cultivées dans des conditions adaptées au type de cellule utilisé et qui 30 permettent l'expression et la sécrétion de la protéine de fusion, ou tout du moins des conditions qui ne sont pas de nature à empêcher l'expression, la maturation et la sécrétion de la protéine de fusion. Chaque étape du procédé selon l'invention peut être mise en oeuvre sans difficulté par l'homme de l'art. Par exemple, la protéine de fusion peut être purifiée par des techniques 14 largement décrites dans l'art antérieur, comme par exemple la chromatographie échangeuse d'ion ou la chromatographie d'affinité. Composition L'invention concerne également une composition comprenant une protéine de fusion selon 5 l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule selon l'invention. En particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une protéine de fusion selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le choix du véhicule pharmaceutiquement acceptable est à la portée de l'homme du métier 10 et permet d'administrer la composition pharmaceutique à l'homme ou l'animal (ou le patient). Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées pour une administration topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intraartérielle, intramusculaire, sous-cutanée ou intraoculaire. 15 La forme des compositions pharmaceutiques, la voie d'administration, la posologie et le régime dépendent de l'état du patient à traiter, de la gravité de la pathologie, ainsi que de l'âge, du poids et du sexe du patient. Indications thérapeutiques L'invention concerne également une protéine de fusion selon l'invention pour son utilisation 20 comme médicament. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une protéine de fusion comprenant : a) un facteur de la coagulation, b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), et 25 c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et le facteur de la coagulation, pour son utilisation dans le traitement des troubles de la coagulation. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne une protéine de fusion comprenant : a) un facteur IX (FIX), 30 b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), et c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et le FIX, pour son utilisation dans le traitement de l'hémophilie B. 15 Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne une protéine de fusion comprenant : a) un facteur FVII/VIIa (FVII/FVIIa), b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), et 5 c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et le FVII/FVIIa, pour son utilisation dans le traitement de l'hémophilie A ou B. L'invention est illustrée dans les exemples ci-dessous, qui illustrent l'invention sans en limiter la portée. Bibliographie 10 Chang J, Jin J, Lollar P, Bode W, Brandstetter H, Hamaguchi N, Straight DL, Stafford DW. Changing Residue 338 in Human Factor IX from Arginine to Alanine Causes an Increase in Catalytic Activity. J Biol Chem 1998; 273: 12089-94. Dargaud Y, Spronk HMH, Leenders P, Hemker HC, Ten Cate H. Monitoring platelet dependent thrombin generation in mice. Thromb Res 2010; 126: 436-41. 15 Martinowitz U, Lubetsky A. Phase I/II, open-label, multicenter, safety, efficacy and PK study of a recombinant coagulation factor IX albumin fusion protein (rIX-FP) in subjects with hemophilia B. Thromb Res 2013; 131, Supplement 2: 511-4. Metzner HJ, Weimer T, Kronthaler U, Lang W, Schulte S. Genetic fusion to albumin improves the pharmacokinetic properties of factor IX. Thromb Haemost 2009; 102: 634-44. 20 Powell JS, Pasi KJ, Ragni MV, Ozelo MC, Valentino LA, Mahlangu JN, Josephson NC, Perry D, Manco-Johnson MJ, Apte S, Baker RI, Chan GC, Novitzlw N, Wong RS, Krassova S, Allen G, Jiang H, Innes A, Li S, Cristiano LM, et al. Phase 3 Study of Recombinant Factor IX Fc Fusion Protein in Hemophilia B. N Engl J Med 2013; 369: 2313-23. Shapiro AD, Ragni MV, Valentino LA, Key NS, Josephson NC, Powell JS, Cheng G, Thompson 25 AR, Goyal J, Tubridy KL, Peters RT, Dumont JA, Euwart D, Li L, Hall.n B, Gozzi P, Bitonti AJ, Jiang H, Luk A, Pierce GF. Recombinant factor IX-Fc fusion protein (rFIXFc) demonstrates safety and prolonged activity in a phase 1/2a study in hemophilia B patients. Blood 2012; 119: 666-72. Simioni P, Tormene D, Tognin G, Gavasso S, Bulato C, Iacobelli NP, Finn JD, Spiezia L, Radu 30 C, Arruda VR. X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua). N Engl J Med 2009; 361: 1671-5. 16 Pérot E, Enjolras N, Le Quellec S, Indalecio A, Girard G, Negrier C, Dargaud Y. Expression and characterization of a novel human recombinant factor IX molecule with enhanced in vitro and in vivo clotting activity. Thromb Res 2015; 135: 1017-24. 5 Légende des figures La Figure 1 est une représentation schématique d'une protéine de fusion FIX-FXIIIB selon l'invention. Il est représenté (i) l'activation du FIX en FIXa (libérant le peptide d'activation (AP) et séparant la chaine légère (LC) et la chaine lourde (HC) par le complexe facteur tissulaire (TF)/facteur VII activé (FVIIa) ou par le facteur XI activé (FXIa) et (ii) le clivage de 10 la protéine de fusion au niveau du linker peptidique (linker) par le FXa ou le Fila. La Figure 2 est un graphique représentant les taux de sécrétion en pg/mL d'un facteur IX non-fusionné au FXIIIB (FIXwt), et de deux protéines de fusion : (i) FIX fusionné au FXIIIB via un linker peptidique clivable par le FXa (FIX-D(a-FXIIIB) et (ii) FIX fusionné au FXIIIB via un linker peptidique clivable par le Fila (FIX-LIIa-FXIIIB). Les protéines sont sécrétées par 15 des cellules Huh-7 après transfections transitoires. La Figure 3 est un Western Blot obtenu pour les surnageants des cellules transfectées avec l'ADNc du FIX (FIXwt), l'ADNc de FIX-D(a-FXIIIB et l'ADNc de FIX-LIIa-FXIIIB en utilisant un anticorps anti-FIX (A) ou anti-FXIIIB (B). Le BenefixC) (FIX recombinant commercial) est également utilisé comme témoin. 20 La Figure 4 est un Western Blot montrant le clivage du FIX-D(a-FXIIIB à une concentration de 0,02 nM des concentrations en FXa allant de 0,22 à 5,45 nM. La Figure 5 est un graphique rendant compte de la capacité coagulante estimée par des mesures de taux de génération de thrombine par unité de temps (ETP) effectuées sur des prélèvements de sang de souris hémophiles B injectées par les molécules FIXwt, FIX-D(a- 25 FXIIIB ou BenefixC). La Figure 6 est un graphique représentant la pharmacocinétique (demi-vie) in vivo chez le rat non-hémophile d'un FIX-D(a-FXIIIB et d'un FIXwt. La Figure 7 représente des Western Blots réalisés lors de mesures d'affinité entre le fibrinogène et les molécules FIXwt et FIX-LXA-FXIIIB. 30 17 Exemples Exemple 1: production des protéines de fusion FIX-LIIa-FXIIIB et FIX-LXaFXIIIB L'ADNc de la sous-unité B du FXIII humain (SEQ ID NO :1) a été cloné et inséré en aval de 5 l'ADNc du FIX (UniProt accession number P00740). Ces deux ADNc ont été connectées par une séquence nucléotidique codant pour : 1. Soit un linker peptidique clivable de séquence SEQ ID NO :19 comprenant un site de clivage par le FXa (ci-après ADNc de FIX-IYa-FXIIIB), 2. Soit un linker peptidique clivable de séquence SEQ ID NO : 20 comprenant un site de 10 clivage par le Fila (ci-après ADNc de FIX-LIIa-FXIIIB). Ces deux constructions d'ADNc ont pour séquence nucléotidique respective SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO: 26. Ces constructions d'ADNc (ADNc de FIX-IYa-FXIIIB (SEQ ID NO : 25) et ADNc de FIX-LIIaFXIIIB (SEQ ID NO: 26) ont chacune été insérées dans le plasmide d'expression eucaryote 15 pcDNA3.1 (Invitrogen) afin d'obtenir des nouveaux plasmides (i.e. plasmides intégrant soit l'ADNc de FIX-IYa-FXIIIB, c'est-à-dire plasmide pcDNA-FIX-IYa-FXIIIB, soit l'ADNc de FIXLIIa-FXIIIB, c'est-à-dire plasmide pcDNA-FIX-LIIa-FXIIIB). Un plasmide intégrant seulement le FIX sauvage (VVT) a également été construit (plasmide pcDNA-FIXwt). Ces nouveaux plasmides ont été préalablement séquences et vérifiés. 20 La lignée cellulaire Huh-7 (ATCC CCL-185) a été utilisée pour tester l'expression des plasmides obtenus. Pour cela, les cellules Huh-7 ont tout d'abord été cultivées dans un milieu HYQ (Thermo Scientific, Logan, Utah), complémenté avec 10 °h de serum de veau foetal (FBS) (Perboscience, Brebières, France), 1% de PS (pénicilline, streptomycine), 1% of LGlutamine, et 5 pg/mL de vitamine K1 (Roche, Neuilly-sur-Seine, France) à 37°C en 25 atmosphère humide à 5% de CO2 dans des plaques 6-puits à une densité de 5x105 cellules/puits. Les cellules Huh-7 ont ensuite été transfectées avec 1 pg par puit de vecteur recombinant pcDNA-FIXwt ou pcDNA-FIX-IYa-FXIIIB ou pcDNA-FIX-LIIa-FXIIIBà l'aide d'X-tremGENE 9 (Roche, Neuilly-sur-Seine, France) selon les instructions du fournisseur. 30 Les cellules transfectées ont été cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus. Les cellules ainsi cultivées ont sécrété les protéines correspondantes à l'ADNc transfecté, puis ces protéines ont perdu leur propeptide et leur peptide signal pour donner soit la protéine de fusion FIX-IYa-FXIIIB (ci-après FIX-IYa-FXIIIB), soit la protéine de fusion FIX-LIIa-FXIIIB (ci-après FIX-LIIa-FXIIIB), soit le FIXwt. La séquence peptidique de FIX-IYa-FXIIIB est SEQ 35 ID NO : 22 et la séquence peptidique de FIX-LIIa-FXIIIB est SEQ ID NO: 24. 18 Les taux de protéines sécrétées dans les surnageants de culture ont été mesurés 36h après la transfection à l'aide d'un kit ELISA anti-FIX (AsserachromIX, Asnières, France) et comparés au taux obtenu avec des cellules Huh-7 transfectées avec l'ADNc du FIX (i.e. FIXwt). Les moyennes des taux de sécrétion des 6 puits sont présentées dans la Figure 2. 5 Les concentrations en FIX-D(a-FXIIIB et FIX-LIIa-FXIIIB sont plus faibles que celle du FIXwt. Cela s'explique par la taille des ADNc qui codent pour les protéines de fusion comprenant chacune environ 1350 acides aminés. Leur synthèse est ainsi plus complexe pour la machinerie cellulaire des cellules Huh-7 que celle du FIXwt dont le précurseur est constitué de seulement 461 acides aminés. Les deux protéines de fusion ont présenté des activités 10 coagulantes normales (voir Exemple 3). Les mêmes surnageants cellulaires ont également été analysés par une électrophorèse SDSPAGE suivie d'une révélation par western blot en utilisant des anticorps anti-FIX (Figure 3A) ou anti-FXIIIB (Figure 3B). Les protéines de fusion ont été visualisées sous la forme d'une bande correspondant au poids moléculaire attendu soit environ 150 kDa. 15 Résultats : Les analyses de western blot ont révélé la présence de protéines de fusion clivées dans les surnageants des cellules transfectées par l'ADNc de FIX-LIIa-FXIIIB, avec une bande correspondant au FIX révélée par l'anticorps anti-FIX (Figure 3A) et une bande correspondant au FXIIIB (environ 80 kDa) révélée avec l'anticorps anti-FXIIIB (Figure 3B). 20 Ces bandes sont le résultat du clivage de la protéine de fusion FIX-LIIa-FXIIIB au niveau du linker peptidique. Cela s'explique par la présence de traces de thrombine (Facteur lia) dans le milieu de culture des cellules Huh-7 (Sérum de veau foetal) qui clive la protéine de fusion FIX-LIIa-FXIIIB lorsqu'elle est sécrétée. 25 Exemple 2: Etude de la fonctionnalité du linker clivable et de la demi-vie de FIXLXa-FXIIIB Une grande quantité de FIX-D(a-FXIIIB a été produite et purifié par chromatographie échangeuse d'ions de façon à réaliser des études sur 1) la fonctionnalité du linker clivable par le FXa et 2) des mesures de constantes pharmacocinétiques (demi-vie) chez le rat et la 30 souris. Le FIX-LXa-FXIIIB (à une concentration finale de 0,02 nM) a été incubé avec des concentrations croissantes en FXa (à une concentration finale allant de 0,22 nM à 5,45 nM) pendant 1h à 37°C. Le mélange a ensuite été analysé par électrophorèse SDS-PAGE suivie d'un western blot utilisant un anticorps anti-FIX. 35 Les résultats sont présentés dans la Figure 4. 19 Résultats : Les résultats ont confirmé que la protéine de fusion FIX-IYa-FXIIIB est bien clivée par le FXa. Les résultats ont également montré que l'intensité de la bande correspondant au FIX libéré du linker et du FXIIIB, à environ 60 kDa, est proportionnelle à la quantité de FXa 5 utilisée. Le clivage s'effectue même à des concentrations très faibles en FXa, ce qui est particulièrement avantageux pour obtenir un FIX pleinement actif. Exemple 3 : activités coagulantes de FIX-LIIa-FXIIIB et FIX-LXa-FXIIIB Les FIXwt et FIX-IYa-FXIIIB ont été produits par un clone cellulaire Huh-7. Les FIX secrétés 10 dans le milieu de culture ont été purifiés par passage sur une colonne échangeuse d'ions. Les éluats ont été dialysés et concentrés dans du tampon Tris 20mM, NaCI 0,15m, pH 7,4. Dans cet exemple, l'activité de coagulation (FIX:C) normale d'un FIX de type sauvage non-modifié est considérée comme étant à 100 UI/dL, à la concentration de 5 pg/ml. Cette valeur correspond à 100% d'activité du FIX. 15 L'activité de coagulation des FIX de cet exemple a été déterminée à l'aide de la technique dite de temps de céphaline activée (TCA) (ou Pr- ou aPTT en anglais pour « activated partial thromboplastin time ») qui est un test semi-global de la coagulation sanguine qui met en oeuvre un coagulomètre. L'activité des FIX dans les fractions purifiées a été évaluée par méthode chronométrique sur 20 le coagulomètre DestinyMaxC) (Tcoag, Bray, Irlande). Les surnageants ou les fractions purifiées ont été dilués puis supplémentés de plasma déficient en FIX (Immuno, Illkirch, France). Le réactif du kit MDAC) PlatelinC) LS (Tcoag) contenant des phospholipides et de la silice micro ionisée (activateur) a été ajouté au mélange. Après 3 minutes d'incubation à 37°C, la réaction de coagulation a été déclenchée par ajout de la solution MDAC) Platelin C) 25 LS - CaCl2 25 mM et le temps de coagulation a été mesuré sur le coagulomètre. L'activité du FIX a été déterminée à partir d'une gamme standard réalisée avec un plasma humain contrôle (Precision Biologic, Darmouth, Canada). Résultats : Les activités spécifiques ont été déterminées en fonction de la concentration en protéine 30 testée considérée comme ayant une activité de 100 UI/dL ou encore considérée comme active à 100%. Les activités spécifiques molaires ont été déterminées en fonction du poids moléculaire des protéines testées, les poids moléculaires utilisés pour les calculs étaient de 57 kDa pour le FIXwt et de 137 kDa pour le FIX-IYa-FXIIIB. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. 20 Protéine FIX:C FIX:C Votage Activité Activité testée (UI/dI) lue (UI/dI) d'activité spécifique molaire pour calculée UI/mg spécifique 0,5pg/mL pour (UI/nmol) 5pg/mL FIXwt 19,7 +/- 3,6 197 197 394,4 +/- 71,4 22,49 +/- 4,1 FIX-LXa- 79,9 +/- 799 799 1600 +/- 362,4 219,1 +/-49,7 FXIIIB 18,1 p-value 07004 0,004 0,004 0,004 0,05), avec une ETP d'environ 300 nM.min. Ces ETP sont significativement supérieures à l'ETP observée pour les souris hémophiles B non-injectées (p=0,002). Ces ETP ont été néanmoins inférieures à l'ETP obtenue avec la molécule commerciale (BenefixC)) qui a été préparée dans des conditions différentes. 15 En résumé, les protéines FIX-IYa-FXIIIB et FIXwt ont été injectées à des souris hémophiles B à des taux antigéniques équivalents. Les résultats d'ETP permettent de conclure que leurs capacités à générer de la thrombine sont équivalentes. Les résultats d'ETP permettent également de conclure que les vélocités sont analogues pour les deux molécules (données non présentées). 20 Exemple 5 : Etude pharmacocinétique Après purification des FIXwt et FIX-IYa-FXIIIB produits par des clones de cellules CHO, les fractions ont été concentrées et diluées dans une solution stabilisante dite solution d'injection. Cette solution [10X] était composée de saccharose 10 g/I - glycine 60 g/I - NaCI 25 10 g/I. Trois groupes de 5 rats non-hémophiles se sont vus administrer des quantités équivalentes en FIX par voie intraveineuse à savoir 500 pl d'une composition comprenant : - Groupe 1 (5 rats) : 200 pg de FIX-IYa-FXIIIB dans une solution d'injection; - Groupe 2 (5 rats) : 200 pg de FIXwt dans une solution d'injection ; et - Groupe 3 (5 rats) : une solution d'injection seule (Groupe contrôle). 30 L'injection a été effectuée sur les rats placés dans un appareil de contention prévu pour les injections intraveineuses. La queue a été nettoyée avec de la chlorhexidine 0,05 °h. Une aiguille de 0,6 mm de diamètre (26 gauges) (habituellement utilisée en pédiatrie), surmontée d'une seringue pré-remplie de la composition à administrer, a été installée dans une veine caudale latérale. La composition a été injectée lentement. 25 Des échantillons de sang ont été prélevés à différents intervalles de temps. Le nombre de prélèvements de sang a été fixé à 4 voire 5 sur une période de 24 à 72 h, le volume sanguin de chaque prélèvement ne dépassait pas 200 pl. Les produits n'ont jamais entrainé de réaction inflammatoire, anaphylactique ou des pertes de poids importantes. 5 Les concentrations en FIX-1Ya-FXIIIB et en FIXwt de chacun des échantillons de sang ont été mesurées avec un kit ELISA anti-FIX (Asserachrom IX, Diagnostica Stago, Asnières, France), sachant que le kit ELISA utilisé ne reconnait pas le FIX de rat. Les concentrations ont été converties en pourcentage de la concentration théorique attendue en FIX. Les résultats sont présentés dans la Figure 6. 10 Résultats : Les courbes obtenues ont permis de calculer les constantes pharmacocinétiques. La demi-vie du FIXwt a été estimée à 4 h (ce qui correspond à la demi-vie décrite dans la littérature) alors que la demi-vie du FIX-1Ya-FXIIIB a été estimée à 10 h. La demi-vie de FIX-1Ya-FXIIIB est donc 2,5 fois supérieure à la demi-vie du FIXwt. 15 Une amélioration similaire de la demi-vie de FIX-1Ya-FXIIIB a également été observée chez la souris non-hémophile (résultats non-présentés). Exemple 6 : Etude de l'affinité du FIX-LXa-FXIIIB avec le fibrinogène humain Le FIX-1Ya-FXIIIB a été produit et purifié par chromatographie échangeuse d'ions puis à 20 l'aide d'une colonne d'immunoaffinité (IXselect, GE Healthcare, Velizy-Villacoublay, France) de façon à réaliser des études sur la liaison entre le FIX-IYa-FXIIIBet le fibrinogène. Ces mesures ont été comparées à celles obtenues en utilisant le FIXwt ou le FXIII plasmatique purifié commercial (FibrogamminC), CSL Behring, Marburg, Allemagne). La méthode a été décrite dans Byrnes et al., 2016. 25 Le FIX-IYa-FXIIIB ou le FIXwt (20 pg/ml) ou le FXIII (contenant du FXIIIA et du FXIIIB, FibrogamminC), CSL Behring, Marburg, Allemagne) ont été incubés à la concentration de 20 pg/ml en présence de fibrinogène (ClottafactC), LFB Biomédicaments, Les Ulis, France) dilué à 1mg/m1 dans 250 pl de tampon Hepes 0,02 M, NaC1 0,15M, pH 7,4 pendant 20 min à température ambiante. 30 Le fibrinogène a ensuite été précipité à l'aide de glycine (à la concentration finale de 165 mg/mi) pendant une heure à température ambiante. Le culot protéique enrichi en fibrinogène a été séparé des autres facteurs par une centrifugation à 13000 rpm pendant 20 min à température ambiante. Nous avons appelé « C » le culot et « S » le surnageant obtenus à l'issu de cette centrifugation. Le culot C a été repris par 20p1 de tampon Hepes. Le 35 culot C, le surnageant S et le milieu d'incubation initial I ont été dilués dans un tampon 26 Laemmli, bouillis à 90°C pendant 5 min et déposés sur un gel d'acrylamide 7,5%. Après une migration électrophorétique, les protéines ont été transférées sur une membrane et visualisées en utilisant révélation un anti-FIX polyclonal généré chez le lapin (anti-FIX) ou un anticorps anti FXIIIB polyclonal (Atlas Antibodies, Stockholm, Suède) nommé anti-FXIIIB. 5 Résultats : La Figure 7 montre les révélations issues de Western Blots effectués après incubations et précipitations en présence de glycine en utilisant soit l'anticorps anti-FXIIIB (Figure 7A) soit l'anticorps anti-FIX (Figure 7B). Dans la Figure 7A, le fibrinogène a été préalablement incubé en présence de FXIII 10 plasmatique (I4). Après précipitation et centrifugation, la présence de FXIIIB dans le culot C4 enrichi en fibrinogène montre que la molécule a été retenue par ce dernier pendant l'incubation. Par ailleurs, le surnageant S4 est totalement dépourvu de FXIIIB ce qui démontre que le FXIIIB a été complètement retenu par le fibrinogène dans les conditions in vitro préétablies ci-dessus. 15 Lorsque le fibrinogène a été incubé en présence de FIX-IYa-FXIIIB, la protéine de fusion a été détectée dans le culot C3, bande de 150 kDa visible avec l'anticorps anti-FXIIIB (Figure 7A) et avec l'anticorps anti-FIX (C7, Figure 7B) signifiant ainsi que la protéine de fusion a été significativement retenue par le fibrinogène. La protéine de fusion n'a pas été détectée dans le surnageant comme le montrent les pistes S3 (Figure 7A, révélation avec un anticorps anti- 20 FXIIIB) ou S7 (Figure 7B, révélation avec un anticorps anti-FIX). Après précipitation du fibrinogène issu du mélange utilisant le FIXwt, la révélation par l'anticorps anti-FIX de la piste correspondant au culot C6 (Figure 7B) montre que le FIXwt n'a pas été retenu par le fibrinogène, le FIXwt est présent uniquement dans le surnageant S6 (bande visible à 75 kDa). Aucune bande correspondant au FIXwt n'a été détectée avec 25 l'anticorps anti-FXIIIB. Cependant dans toutes les pistes de la Figure 6A révélées avec l'anticorps anti-FXIIIB, un signal protéique (bande B) de 100 kDa environ a systématiquement été observé même dans le témoin contrôle sans FIX ni FXIII. Ce signal a été considéré comme non spécifique ou alors il pourrait correspondre à des traces de FXIIIB présentes dans la préparation de fibrinogène ClottafactC), produit d'origine plasmatique. Il 30 n'existe pas de tels signaux non-spécifiques lorsque la membrane a été révélée par l'anticorps anti-FIX (Figure REVENDICATIONS1. Protéine de fusion comprenant : a) une protéine thérapeutique choisie parmi une protéine impliquée dans la coagulation sanguine, un interféron, l'insuline, une hormone, une enzyme, une cytokine, un anticorps, un fragment d'anticorps ou un facteur de croissance, b) un domaine B du facteur XIII (FXIIIB), et c) un linker peptidique qui connecte le FXIIIB et la protéine thérapeutique. 2. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1, dans laquelle le linker peptidique est un linker peptidique clivable. 3. Protéine de fusion selon la revendication 2, dans laquelle le linker peptidique clivable est un linker peptidique clivable par une protéase impliquée dans la cascade de la coagulation, de préférence une protéase choisie parmi le facteur lia (FIIa), le facteur Vila (FVIIa), le facteur Xa (FXa) et/ou le facteur XIa. 4. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la protéine thérapeutique est un facteur de la coagulation, de préférence un facteur de la coagulation vitamine-K dépendant, de préférence un facteur de la coagulation vitamine- K dépendant choisi parmi le facteur VII/VIIa (FVII/FVIIa), le facteur VIII (FVIII) ou le facteur IX (FIX). 5. Protéine de fusion selon la revendication 4, dans laquelle le facteur de la coagulation vitamine-K dépendant est le FIX. 6. Protéine de fusion ayant au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 24. 7. Séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 7. 28 9. Cellule comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou un vecteur selon la revendication 8. 10. Procédé de préparation d'une protéine de fusion selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 6, comprenant la culture d'une cellule selon la revendication 9 dans des conditions permettant l'expression de la protéine de fusion, et éventuellement la purification de la protéine de fusion à partir de la cellule ou à partir du milieu de culture. 10 11. Composition comprenant une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, un vecteur selon la revendication 8 ou une cellule selon la revendication 9. 12. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation 15 comme médicament. 13. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, pour son utilisation dans le traitement des troubles de la coagulation, de préférence dans le traitement de l'hémophilie. 20 14. Protéine de fusion selon la revendication 6, pour son utilisation dans le traitement de l'hémophilie B.