FR 3073047 A1 20190503 FR 1760338 A 20171102 Procédé optique d'estimation d'un volume représentatif de particules présentes dans un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est l'estimation d'un volume représentatif de particules dans un échantillon liquide, comportant notamment un liquide biologique. Une application visée est l'estimation du volume moyen de globules rouges dans un échantillon sanguin. ART ANTERIEUR De nombreux développements ont eu lieu ces dernières années dans le domaine de l'imagerie sans lentille pour des applications biologiques. Les principes de l'imagerie sans lentille ont été décrits dans le document W02008090330, présentant un dispositif pour l'observation d'échantillons comportant des cellules par imagerie sans lentille. L'échantillon est disposé entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image, également appelée hologramme, est formée de figures d'interférences entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont généralement composées d'une succession d'anneaux concentriques. Elles sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». On acquiert ainsi des images, dont le champ d'observation est nettement plus important que celui d'un microscope. Lorsque la concentration en cellules de l'échantillon est suffisamment faible, à chaque cellule peut être associée une figure d'interférences ; leur dénombrement permet la numération des cellules présentes dans l'échantillon. Mais l'hologramme ne permet pas un comptage fiable des cellules lorsque la concentration augmente. Afin de prendre en compte cette limitation, des algorithmes de reconstruction holographiques ont été développés, permettant une meilleure caractérisation des cellules biologiques observées par imagerie sans lentille. La demande de brevet W02016151248 décrit par exemple un procédé, basé sur l'acquisition d'une image par un dispositif d'imagerie sans lentille, et permettant d'identifier une cellule sanguine. Des travaux ont également été menés, avec l'objectif d'estimer le volume de cellules sanguines, et en particulier des globules rouges. La publication Roy M. et al, "low-cost telemedicine device 2 performing cell and particule size measurement based on lens-free shadow imaging technology", Biosensors and Bioelectronics 67 (2015) 715-723 décrit un procédé d'estimation du volume de globules rouges basé sur une analyse des figures de diffraction formées sur une image acquise par un capteur d'image. La mise en oeuvre d'un tel procédé s'accommode 5 difficilement d'une concentration élevée de globules rouges. En effet, lorsque la concentration augmente, les figures de diffraction se superposent, rendant difficile leur caractérisation précise. Aussi, cette méthode est principalement destinée à des échantillons sanguins très dilués. La publication Seo Set al, "High-Throughput lens-free blood analysis on a chip", Anal Chem. 2010 June 1 ; 82(11): 4621-4627 propose une méthode basée sur une reconstruction holographique 10 d'une image acquise par un capteur d'image dans une configuration d'imagerie sans lentille. La reconstruction holographique vise à obtenir une image reconstruite représentative de la phase de l'onde lumineuse se propageant entre l'échantillon sanguin analysé et le capteur d'image. L'image reconstruite présente une résolution nettement améliorée par rapport à l'image acquise par le capteur d'image, et son analyse permet une estimation du volume de globules rouges 15 présents dans l'échantillon. L'image de phase reconstruite permet d'estimer une aire de chaque globule rouge, tandis que la valeur de la phase constitue un indicateur de leur épaisseur. Ainsi, on attribue à chaque globule rouge une aire et une valeur de phase, le volume étant estimé par le produit de l'aire et de l'épaisseur, déduite de la phase mesurée en faisant une hypothèse sur la valeur de l'indice de réfraction. 20 Les inventeurs de la présente invention ont observé qu'une telle méthode présente des limitations, en particulier liées à la position des globules rouges dans l'échantillon, et/ou à leur orientation. Ils proposent une méthode plus fiable et moins contraignante pour estimer un volume caractéristique de particules sanguines, et en particulier de globules rouges. L'invention permet notamment une estimation du volume moyen des globules rouges. 25 EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé d'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt baignant dans un échantillon, ou d'estimation d'une dispersion du volume desdites particules d'intérêt, l'échantillon s'étendant selon au moins un plan, dit plan de l'échantillon, l'échantillon comportant un agent sphérisant, apte à modifier la forme des 30 particules, le procédé comportant les étapes suivantes : 3 a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un 5 plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination ; c) utilisation de l'image de l'échantillon, acquise lors de l'étape b), et d'un opérateur de propagation holographique, pour calculer une expression complexe de l'onde 10 lumineuse d'exposition en différentes positions distantes du plan de détection; le procédé comportant une étape d'estimation d'un volume représentatif des particules d'intérêt en fonction des expressions complexes calculées lors de l'étape c), ou d'un indice quantifiant une dispersion des volumes des particules d'intérêt de l'échantillon. Le volume représentatif caractérise les particules d'intérêt. Il peut s'agir d'un volume moyen des 15 particules d'intérêt, ou d'un volume médian des particules d'intérêt, ou encore du volume de chaque particule d'intérêt, prise individuellement l'une de l'autre. Dans ce dernier cas, l'invention permet d'obtenir une distribution des volumes d'intérêt. Il peut également s'agir du volume total des particules dans l'échantillon. Selon un premier mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est estimé 20 par le calcul d'une image complexe correspondant à une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition selon un plan dans lequel s'étend l'échantillon, de préférence parallèlement au plan de détection. Un tel mode de réalisation permet une estimation simple d'un volume représentatif des particules d'intérêt, basée sur une hypothèse de sphéricité de chaque particule d'intérêt, hypothèse légitime étant donné l'étape de sphérisation. Selon ce 25 premier mode de réalisation, le procédé peut comporter une formation d'une image complexe dans le plan de l'échantillon. Il peut également comporter : - une détection, à partir de l'image complexe, de régions d'intérêt, chaque région d'intérêt étant associée à une particule d'intérêt ; - une détermination d'une taille de chaque région d'intérêt ; 30 l'estimation du volume représentatif des particules d'intérêt étant effectuée en fonction de ladite taille, chaque particule d'intérêt étant considérée comme sphérique. 4 Selon un deuxième mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est estimé par le calcul d'une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition à différentes distances du plan de détection. Un tel mode de réalisation est robuste vis-à-vis de la position des particules d'intérêt dans l'échantillon. Ce mode de réalisation peut comporter les étapes 5 suivantes : d) détermination des positions planaires respectives de plusieurs particules d'intérêt dans un plan parallèle au plan de détection, chaque position planaire étant associée à une particule d'intérêt; e) à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c), calcul d'au moins une 10 grandeur caractéristique de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition à chaque position planaire, et à une pluralité de distances du plan de détection; f) formation d'un profil, représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par chaque position planaire déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une 15 particule d'intérêt ; g) estimation d'un volume représentatif des particules d'intérêt en fonction des profils formés lors de l'étape f). Selon ce mode de réalisation, l'étape c) comporte de préférence une formation d'une pile d'images complexes, chaque image complexe formant une distribution de l'expression complexe 20 de l'onde lumineuse d'exposition selon un plan de reconstruction. Chaque plan de reconstruction est de préférence parallèle au plan de détection. La formation de la pile d'images complexes peut comporter les sous-étapes suivantes : ci) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à calculer une image complexe, dite image de référence, représentative de 25 l'onde lumineuse d'exposition, dans un plan de référence; cii) application d'un opérateur de propagation à l'image de référence, de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires, à différentes distances du plan de référence selon l'axe de propagation, les images complexes secondaires et l'image de référence formant la pile d'images complexes. 30 Le plan de référence peut être le plan de l'échantillon. La formation de la pile d'images complexes peut comporter le calcul, à partir de l'image acquise, de plusieurs images complexes à différentes distances du plan de détection, selon l'axe de propagation. 5 Dans un mode de réalisation, lors de l'étape d), la position planaire de chaque particule d'intérêt est déterminée à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes. L'étape d) comporte alors les sous-étapes suivantes : di) détection de particules dans l'image complexe ; 5 dii) sélection, parmi les particules détectées, de particules d'intérêt. Selon un mode de réalisation, l'étape e), la grandeur caractéristique comprend le module ou la phase d'une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition. Selon un mode de réalisation, le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules. Lors de l'étape g), le volume moyen des particules d'intérêt est 10 estimé en appliquant une métrique à chaque profil formé lors de l'étape f), de façon à obtenir un paramètre pour chaque profil et en effectuant une moyenne des paramètres de chaque profil. Selon un mode de réalisation, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules ; lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, le 15 volume moyen des particules d'intérêt correspond à un volume globulaire moyen de l'échantillon. Selon un mode de réalisation, le procédé comporte l'établissement d'un paramètre représentant une dispersion des volumes respectifs des particules d'intérêt. Il peut également comporter une détermination d'un indice de répartition des globules rouges. 20 Selon un mode de réalisation, le procédé comporte une détermination d'une quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, le procédé peut comporter une étape de détermination d'un taux d'hématocrite à partir du volume moyen des particules d'intérêt et de la quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon. Un deuxième objet de l'invention est un dispositif pour l'estimation d'un volume représentatif 25 de particules d'intérêt disposées dans un échantillon, le dispositif comportant : une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon ; un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et un capteur d'image; 30 un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et pour mettre en oeuvre au moins l'étape c) du procédé selon le premier objet de l'invention, le processeur étant configuré pour estimer le volume représentatif des particules 6 d'intérêt à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c). Le processeur peut être configuré pour mettre en oeuvre les étapes d) à g) décrites en lien avec le premier objet de l'invention. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre 5 de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 2 montre les principales étapes d'un premier mode de réalisation de l'invention. 10 Les figures 3A et 3B représentent des estimations de la taille de globules rouges obtenues en mettant en oeuvre le premier mode de réalisation. La figure 3C illustre une comparaison entre les volumes globulaires moyens d'échantillons sanguins respectivement estimés selon le premier mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. La figure 3D illustre une comparaison entre les taux d'hématocrite de différents échantillons respectivement 15 estimés selon le premier mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. La figure 3E illustre l'établissement d'une calibration du premier mode de réalisation, avec et sans utilisation d'un agent sphérisant. Chaque calibration vise à établir une relation entre une dimension, donnée par le premier mode de réalisation, et un volume globulaire moyen, obtenu par une méthode de référence. La figure 3F montre une comparaison entre le volume globulaire 20 moyen en utilisant respectivement une méthode de référence et le premier mode de réalisation, avec et sans utilisation d'un agent sphérisant. La figure 4A illustre les principales étapes d'un deuxième mode de réalisation de l'invention. La figure 4B détaille l'étape 210 de la figure 4A dans un mode de réalisation particulier. La figure 4C schématise certaines étapes mentionnées sur la figure 4A. 25 Les figures 4D et 4E montrent des exemples de métriques appliquées à des profils. Les figures 5A et 5B sont des images au microscope d'un échantillon de sang respectivement sans et avec un agent sphérisant. Les figures 5C et 5D montrent des profils du module d'une expression complexe obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image formée par le capteur d'image du dispositif. 30 Chaque profil de la figure 5C correspond à un globule rouge sans ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Chaque profil de la figure 5D correspond à un globule rouge avec ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Les figures 5E et 5F représentent des 7 profils moyens calculés respectivement sur la base des profils représentés sur les figures 5C et 5D. Les figures 5G et 5H représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de chaque échantillon, exprimé en femtolitre, en fonction d'une moyenne de 5 métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges desdits échantillons. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5G ne comportent pas d'agent sphérisant. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5H comportent un agent sphérisant. Les figures 51 et 5J représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de chaque échantillon, exprimé en femtolitre, en fonction d'une moyenne de 10 métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges desdits échantillons. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 51 ne comportent pas d'agent sphérisant. Les échantillons utilisés pour obtenir la figure 5J comportent un agent sphérisant. Les figures 6A et 6B montrent des profils de la phase d'une expression complexe obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image formée par le capteur d'image du dispositif. 15 Chaque profil de la figure 6A correspond à un globule rouge sans ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Chaque profil de la figure 6B correspond à un globule rouge avec ajout d'un agent sphérisant dans l'échantillon analysé. Les figures 6C et 6D représentent des profils moyens calculés respectivement sur la base des profils représentés sur les figures 6A et 6 B. 20 Les figures 7A à 7F représentent, pour différents échantillons comportant du sang, le volume globulaire moyen de l'échantillon en fonction d'une moyenne de métriques calculées sur des profils correspondant à des globules rouges des échantillons. Les figures 7A, 7C et 7E ont été obtenues sur la base d'une pile d'images complexes, dont chaque image complexe résulte d'une application d'un opérateur de propagation holographique à partir de l'image acquise par le 25 capteur d'image. Les figures 7B, 7D et 7F ont été obtenues sur la base d'une pile d'images complexes, dont chaque image complexe résulte de l'application d'un opérateur de propagation holographique à une image complexe de référence, l'image complexe de référence ayant été obtenue par application d'un opérateur de propagation holographique à partir de l'image acquise par le capteur d'image. 30 Les figures 8A et 9A illustrent des comparaisons entre les volumes globulaires moyens respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8A, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9A, on a utilisé une deuxième métrique. 8 Les figures 8B et 9B illustrent des comparaisons entre les taux d'hématocrite de différents échantillons respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8B, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9B, on a utilisé une deuxième métrique. 5 Les figures 8C et 9C illustrent des comparaisons entre l'indice de distribution en volume des globules rouges de différents échantillons respectivement estimés selon le deuxième mode de réalisation de l'invention et selon une méthode de référence. Sur la figure 8C, on a utilisé une première métrique ; sur la figure 9C, on a utilisé une deuxième métrique. La figure 10A représente différents plans de reconstruction disposés de part et d'autre d'un plan 10 de focalisation. La figure 10B représente une comparaison de coefficients de corrélation calculés entre: - des volumes globulaires moyens estimés par une méthode de référence ; - des volumes globulaires moyens respectivement estimés par le premier mode de réalisation et par le deuxième mode de réalisation. 15 La comparaison est réalisée en modifiant la position d'un plan de focalisation, selon lequel s'étendent la majorité des particules de l'échantillon. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en 20 direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination 4X. L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment un milieu liquide 10m dans lequel baignent des particules, dites particules d'intérêt 101. Le milieu 10m peut être un liquide tampon. Il peut également comporter un liquide corporel, à l'état pur 25 ou dilué. Par liquide corporel, on entend un liquide généré par un corps vivant. Il peut en particulier s'agir, à titre non limitatif, de sang, d'urine, de liquide céphalorachidien, de sperme, de lymphe. Par particule, on entend notamment une cellule, par exemple une cellule sanguine, ou un microorganisme, par exemple une bactérie. L'invention s'applique notamment à une particule d'intérêt ayant, dans son état normal, une forme non sphérique. Dans les exemples 30 décrits ci-après, les particules d'intérêt sont des globules rouges. L'échantillon comporte également un agent dit sphérisant 10' apte à modifier la tension de surface de la membrane délimitant les particules. Sous l'effet d'un tel agent, les particules d'intérêt 101 prennent une forme sphérique, ou se rapprochant de la forme d'une sphère. Ainsi, 9 les particules d'intérêt 101 sont suffisamment souples et déformables de façon que leur morphologie puisse être modifiée sous l'action d'un tel agent. L'usage d'agents sphérisants pour déformer des globules rouges est connu, et a été décrit, dans des applications de cytométrie dans les documents US5633167, US8837803, ou US5284771. De tels agents permettent de 5 modifier la forme d'un globule rouge. Il peut notamment s'agir d'un tensioactif, par exemple un tensioactif zwiterrionique. Il peut par exemple s'agir d'un dérivé de la glycine bétaïne, par exemple un alkylbétaïne, ou un alkylamido bétaïne (par exemple de la bétaïne de cocamidopropyle CAPB), un alkyle maltoside, un alkyle glucamide. Il peut s'agir de 3-(N,NDimethyldodecylammonio)propanesulfonate. L'agent sphérisant 10, est de préférence dilué 10 dans une solution tampon neutre et isotonique, par exemple un tampon phosphate, usuellement désigné par l'acronyme PBS (Phosphate Buffer Saline). L'homme du métier peut adapter le facteur de dilution, de telle sorte que le réactif sphérisant déforme suffisamment les particules d'intérêt 101, sans les lyser. La concentration d'agent sphérisant est typiquement comprise entre 50 mg/I et 300 mg/I, préférentiellement 100 mg/I. L'échantillon peut 15 comprendre du sang total dilué dans la solution d'agent sphérisant selon un facteur de dilution compris préférentiellement entre 1/400 et 1/1200. L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Countess ® d'épaisseur e=100 L'épaisseur e de la chambre fluidique 15, et donc de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation, 20 varie typiquement entre 10 p.m et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 p.m et 500 p.m. L'échantillon s'étend selon un plan P10, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. Le réactif sphérisant est ajouté à l'échantillon avant introduction dans la chambre fluidique 15. Il peut également être ajouté postérieurement à cette introduction, ou au cours de cette 25 introduction, en étant par exemple présent à l'état sec dans la chambre fluidique 15. La concentration en agent sphérisant dans l'échantillon est adaptée par l'homme du métier en fonction de l'échantillon utilisé. L'échantillon peut comporter des particules 10j différentes des particules d'intérêt 101 que l'on souhaite analyser. Dans ce cas, le procédé comporte une étape de sélection, parmi les particules, 30 des particules d'intérêt 101. Cette étape est décrite par la suite. La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, 10 vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à un diaphragme 18, ou filtre spatial. 5 L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 um et 1 mm, de préférence entre 50 um et 500 um. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 um. Selon une autre configuration, le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif 10 représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 15 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur. De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. 20 Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière élémentaires 11k, chacune étant apte à émettre une onde lumineuse incidente 12k dans une bande spectrale 44. De préférence, les bandes spectrales 4Xk des différentes sources de lumière 11k sont différentes les unes des autres. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 25 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. 30 Le capteur d'image 16 est apte à former une image /0 selon un plan de détection P0. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de 11 propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre la chambre fluidique 15 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 p.m et 2 cm, de préférence comprise entre 100 p.m et 2 mm. On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de 5 formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans l'échantillon peuvent 10 engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : 15 - une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ; - une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection Po. Aussi, l'image /0 20 acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférences pouvant être associée à une particule de l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image /0 acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour 25 effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. Une image /0 acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit 30 en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur complexe A représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de 12 l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance I z I, dite distance de reconstruction, du capteur d'image 16. Le plan de reconstruction est de préférence le plan selon lequel s'étend l'échantillon P10, avec : A(x, y, z) = 10(x, y, z) * h, le symbole * désignant l'opérateur produit de convolution. 5 L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I z I du capteur d'image. L'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x,y,z) de l'espace, est telle que : A(x,y,z) = M(x, y, z)em(x'Y'z) (3). Il est possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase (p (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à la distance I z I, 10 avec : - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] ; - ço(x, y, z) = arg [A (x, y, z)] ; Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument. Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position planaire dans 15 un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'amplitude de l'onde lumineuse d'exposition 14 détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur 20 de propagation h permet d'obtenir une image complexe Az représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance I z I du plan de détection P0. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = O. L'image complexe Az correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction P. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle de 25 l'expression complexe A décrivant l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image Mz du module ou de la phase (pz de l'expression complexe décrivant l'onde lumineuse d'exposition 14, dans le plan de reconstruction. L'image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 s'obtient respectivement selon les expressions suivantes : 30 Mz = mod (Az) et (pz = arg(Az). L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : h(x, y, z) = -1 e j2n-Aexp x ). jAz Az 13 La propagation d'une image /0 acquise par un capteur d'image a déjà été décrite dans la publication Seo 2010, citée en lien avec l'art antérieur. Dans cette publication, une image de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 est reconstruite dans un plan parallèle au plan de détection. L'aire de chaque globule rouge, dans l'image de phase, est détectée par un algorithme 5 de seuillage. Elle est ensuite multipliée par la valeur de l'épaisseur, obtenue en divisant la phase par l'indice optique supposé connu, de façon à obtenir une estimation du volume de chaque globule rouge. Les inventeurs ont constaté que selon la méthode décrite dans cette publication, il est préférable, si ce n'est indispensable, d'attendre que les globules rouges sédimentent, de façon à ce qu'ils s'accumulent selon un même plan, selon une même orientation. En effet, les 10 globules rouges étant des particules biconcaves, l'estimation de leur volume à partir d'une image nécessite que leur orientation soit maîtrisée. A défaut, l'estimation du volume des globules rouges, peut être affectée d'une incertitude importante. Cette difficulté est amoindrie par la présence de l'agent sphérisant dans l'échantillon. Les inventeurs ont en effet constaté qu'en présence d'un tel agent sphérisant, l'obtention d'une 15 image complexe, dans un plan de reconstruction, permet une estimation correcte du volume des globules rouges, ou de leur volume moyen. La question de leur orientation ne se pose plus, puisque leur forme est sphérique. Il n'est donc pas besoin d'attendre une quelconque sédimentation. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on estime un volume moyen de particules 20 d'intérêt, en l'occurrence des globules rouges. Un tel volume est usuellement désigné par le terme volume globulaire moyen. Le procédé d'estimation suit les étapes représentées sur la figure 2. Etape 100 : acquisition d'une image /0 de l'échantillon par le capteur d'image 16. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1, est le large champ observé, 25 permettant d'adresser simultanément un grand nombre de particules. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image 16, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope. 30 Etape 110 : application d'un opérateur de propagation h à une image obtenue à partir de l'image /0 acquise lors de l'étape 100 pour obtenir une image complexe Az dans un plan de reconstruction P. De préférence, l'opérateur de propagation est appliqué à l'image acquise /0, 14 éventuellement normalisée par la valeur moyenne /0 de l'image acquise. L'application de l'opérateur de propagation, par un produit de convolution tel que précédemment évoqué, permet de former une image complexe A, dans le plan de reconstruction P. Différentes façons d'obtenir une image complexe dans un plan de reconstruction sont présentées ci-après, en lien 5 avec l'étape 210 du deuxième mode de réalisation. Le plan de reconstruction /3, peut être défini en mettant en oeuvre un algorithme de focalisation numérique, connu de l'homme du métier, consistant à effectuer différentes propagations dans différents plans de reconstruction, chaque plan étant situé à une distance de reconstruction différente du plan de détection. On établit un critère de netteté à partir de chaque image 10 complexe reconstruite. Le plan de reconstruction finalement retenu, dit plan de focalisation Pfocus, est celui pour lequel le critère de netteté est optimal. Ce plan est un plan selon lequel s'étend l'échantillon, et selon lequel s'étendent la majorité des particules d'intérêt 101 présentes dans l'échantillon. De façon alternative, le plan de focalisation est déterminé a priori. Étape 120 : formation d'une image, dite image d'observation lobs, à partir du module ou de la 15 phase de l'image complexe reconstruite. L'image d'observation lobs permet une observation des particules de l'échantillon. L'image d'observation lobs correspond à une image du module M, ou de la phase cp, de l'image complexe A, formée dans le plan de reconstruction, en l'occurrence le plan de focalisation Pfocus. Sur l'image d'observation lobs, les particules d'intérêt 101 correspondent à une région d'intérêt ROLL ayant une forme prédéterminée. Du fait de la 20 présence de l'agent sphérisant, il s'agit d'une forme circulaire, chaque particule d'intérêt 101 formant un disque. Une analyse morphologique de l'image du module ou de la phase permet de détecter chaque région d'intérêt ROLL associée à une particule d'intérêt 101. Cette étape permet également d'obtenir un nombre Ni de particules d'intérêt 101. L'échantillon peut comporter d'autres particules 10j, de formes et/ou de tailles différentes de 25 celles des particules d'intérêt 101. L'analyse morphologique de l'image du module ou de phase permet de discriminer les particules d'intérêt 101 des autres particules 10j. Étape 130: Estimation du volume V1 de chaque particule d'intérêt 101. A partir de la détection, sur l'image d'observation lobs, de chaque région d'intérêt ROLL associée à une particule d'intérêt 101, on détermine une dimension di de la région d'intérêt, par exemple 30 le diamètre, ce qui permet une estimation du volume Vi de la particule d'intérêt 101 associée, en se basant sur l'hypothèse selon laquelle la particule d'intérêt est sphérique. La dimension di peut être initialement obtenue en pixels puis convertie en p.m en se basant sur un facteur de 15 calibration, déterminé au cours d'une phase de calibration avec des particules sphériques de volumes connus, ou déterminés par une méthode de référence. L'hypothèse de sphéricité des particules d'intérêt est validée par la présence de l'agent sphérisant 10, dans l'échantillon. Étape 140 : Détermination de paramètres statistiques. 5 Le terme paramètre statistique désigne un paramètre caractérisant la distribution statistique du volume des particules ou caractérisant la distribution statistique des dimensions di déterminées lors de l'étape 130. Il peut en particulier s'agir d'une valeur moyenne, d'une valeur médiane ou d'un paramètre de dispersion, par exemple l'écart type a. Cette étape peut permettre de déterminer des paramètres statistiques des volumes V1 des 10 particules d'intérêt 101 estimés lors de l'étape 130. On peut par exemple déterminer le volume moyen V des particules d'intérêt 101 à partir des volumes V1 estimés lors de l'étape 130. Alternativement, on détermine une dimension moyenne d des particules, c'est-à-dire une moyenne des dimensions di de chaque particule d'intérêt 101, puis on détermine le volume moyen V partir de la dimension moyenne, en prenant en compte une fonction de calibration 15 effectuée avec des échantillons de calibration. Le volume moyen des particules d'intérêt dans les échantillons de calibration est connu, en étant par exemple déterminé par une méthode de référence. Une telle calibration est représentée sur la figure 3E, décrite par la suite en lien avec les essais expérimentaux. Lorsque les particules d'intérêt 101 sont des globules rouges, on obtient ainsi un volume 20 globulaire moyen (VGM). On peut également calculer un indicateur de dispersion de la dimension di des particules d'intérêt, l'indicateur de dispersion étant par exemple l'écart type a des dimensions di. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, on peut ainsi déterminer un indice de répartition (IDR) des globules rouges. Le passage entre l'indicateur de dispersion de la dimension dl des particules d'intérêt et l'indice de répartition peut être réalisé 25 en se basant sur une calibration. La calibration permet d'établir une fonction de calibration reliant l'indicateur de dispersion, par exemple a, avec l'IDR d'échantillons de calibration dont l'IDR est connu. L'étape 140 peut également comprendre l'établissement d'une distribution des volumes estimés ou des dimensions di des particules d'intérêt, et l'estimation d'un paramètre de dispersion 30 d'une telle distribution, par exemple une largeur à mi-hauteur ou une largeur à 1 dixième de la hauteur. Lorsque les particules d'intérêt sont des globules rouges, cela permet de déterminer 16 un ratio usuellement désigné par l'acronyme anglosaxon RDW (Red blood cells Distribution Width). Étape 150: Détermination de ratios volumiques Au cours de cette étape, on estime le volume total occupé par les particules d'intérêt 101 dans 5 le champ d'observation et on effectue un ratio entre le volume total des particules d'intérêt 101 sur le volume d'échantillon dans le champ d'observation du capteur d'image 16. Lorsque les particules d'intérêt 101 sont des globules rouges, on peut ainsi déterminer l'hématocrite (Ht) dans l'échantillon. Le volume total des particules d'intérêt peut être obtenu en multipliant le volume moyen des particules d'intérêt, résultant de l'étape 140, par le nombre Ni de particules NixVGM 10 d'intérêt 10i, établi lors de l'étape 120 : Ht = , où V représente le volume de l'échantillon. Ce premier mode de réalisation a été testé sur des échantillons sanguins, les résultats étant commentés par la suite, en lien avec les essais expérimentaux et les figures 3A à 3F. Un tel procédé est cependant sensible à la détermination du plan de focalisation Pfo',, dans lequel 15 est reconstruite l'image complexe. Il suppose également une certaine coplanarité des particules d'intérêt. Les inventeurs ont mis au point un deuxième mode de réalisation, permettant une estimation du volume représentatif de particules d'intérêt, à partir de l'image /0 acquise par le capteur d'image 16. Les principales étapes de ce procédé sont décrites en lien avec la figure 4A. Le 20 procédé est schématisé sur la figure 4C. Dans cet exemple, le volume représentatif est le volume moyen des particules d'intérêt. Étape 200 : acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image I. Cette étape est similaire à l'étape 100 précédemment décrite. Étape 210 :obtention d'une pile d'images complexes. Au cours de cette étape, on applique 25 l'opérateur de propagation h à une image obtenue à partir de l'image /0 acquise lors de l'étape 200 pour obtenir une pile d'images complexes Az à différentes distances du plan de détection Po. Comme précédemment évoqué, l'opérateur de propagation peut être appliqué à une image représentant la racine carrée .F3 de l'image acquise /0, éventuellement normalisée par la valeur moyenne /0 de l'image acquise. 30 Selon une première variante, on applique l'opérateur de propagation h à l'image /0 en considérant successivement différentes distances de propagation zi...zn entre le plan de 17 détection et l'échantillon. On obtient ainsi autant d'images complexes A zi....11,7, que de distances de propagation. Les distances de propagation sont telles que des images complexes sont formées entre le plan de détection et l'échantillon, voire au-delà de l'échantillon. Cette première variante peut présenter un inconvénient lié à la qualité des images complexes 5 reconstruites, ces dernières étant affectées d'un bruit de reconstruction, usuellement désigné par le terme "twin image", signifiant image jumelle. La présence d'un tel bruit est dû au fait que l'image acquise /0 ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique incomplète, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse 14 10 collectée sur le capteur d'image 16. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique a fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse à laquelle le capteur d'image est exposé. Ce type d'algorithme permet de limiter le bruit de reconstruction affectant l'image complexe reconstruite. 15 Aussi, selon une deuxième variante, représentée sur la figure 4B, au cours d'une étape 212, on applique un algorithme de reconstruction holographique afin de former une image complexe dite de référence A'f dans un plan de référence P'f. Le plan de référence est un plan avantageusement perpendiculaire à l'axe de propagation Z, et/ou parallèle au plan de détection Po. Il s'agit de préférence d'un plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. En effet, c'est 20 généralement dans ce plan que la résolution spatiale d'une image complexe reconstruite est optimale, un tel principe étant à la base des algorithmes de focalisation numérique précédemment évoqués. Selon une première possibilité, l'échantillon est illuminé successivement ou simultanément dans différentes bandes spectrales Ailk, et on acquiert, dans le plan de détection P0, une image 25 /0(Ailk) représentative de chaque bande spectrale. L'algorithme permet d'obtenir une image complexe A'f (A4) de l'échantillon 10, dans le plan de référence, dans chaque bande spectrale Ailk. Les images complexes ainsi obtenues peuvent être combinées, par exemple en effectuant une moyenne, en chaque pixel, de leur module et de leur phase, ce qui permet de former l'image de référence A'f. Alternativement, l'image complexe de référence est une image complexe 30 Are f (Ailk) dans une bande spectrale Ailk. Un tel algorithme a été décrit dans la publication S. N. A. Morel, A. Delon, P. Blandin, T. Bordy, O. Cioni, L. Hervé, C. Fromentin, J. Dinten, and C. Allier, "Wide-Field Lensfree Imaging of Tissue Slides," in Advanced Microscopy Techniques IV; 18 and Neurophotonics 11, E. Beaurepaire, P. So, F. Pavone, and E. Hillman, eds., Vol. 9536 of SPIE Proceedings (Optical Society of America, 2015) ainsi que dans la demande de brevet FR1554811 déposée le 28 mai 2015, et plus précisément dans les étapes itératives 100 à 500 décrites dans cette demande. On a montré que l'utilisation de deux ou trois bandes spectrales différentes 5 permet d'obtenir une image complexe de référence Aref présentant une bonne qualité de reconstruction. Selon une deuxième possibilité, qui correspond à une variante préférée, l'image complexe de référence Aref est calculée en se basant sur une image /0 acquise de l'échantillon lorsque ce dernier est illuminé dans une seule bande spectrale 4X. L'image complexe de référence peut 10 être obtenue en utilisant un algorithme itératif tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ladite demande de brevet. Enfin, l'image complexe de référence Aref peut être obtenue, à partir de l'image acquise, par le biais d'autres algorithmes de reconstruction connus, un exemple étant décrit dans 15 US2012/0218379. La coordonnée Zref, selon l'axe Z, du plan de référence P'f est déterminée soit a priori, notamment lorsque la position de l'échantillon est maîtrisée par rapport au capteur d'image 16, soit par le biais d'un autofocus numérique, en se basant sur un critère de netteté de l'image de référence A'f, cette dernière étant d'autant plus nette que le plan de référence correspond au 20 plan dans lequel se trouvent les particules. Le critère de netteté peut être appliqué à l'image du module M'f ou de la phase de l'image (p'f de référence. L'image complexe Aref est désignée comme étant une image de référence, car elle sert de base à l'obtention, au cours d'une étape 214, d'images complexes A'f,,, dites secondaires, le long de l'axe de propagation Z. Au cours de cette étape, l'image complexe de référence Aref est 25 propagée selon une pluralité de distances de reconstruction z, en utilisant un opérateur de propagation h tel que précédemment défini, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes, dites secondaires, A'f,z reconstruites aux différentes distances z du plan de référence P'f. Ainsi, cette étape comprend la détermination d'une pluralité d'images complexes A'f,z telles que : 30 A -ref,z = Aref * hz avec zi REVENDICATIONS1. Procédé d'estimation d'un volume représentatif de particules d'intérêt (101) baignant dans un échantillon, l'échantillon s'étendant selon au moins un plan, dit plan de l'échantillon (P10), l'échantillon comportant un agent sphérisant, apte à modifier la forme des particules, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (I0) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14) dite d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination ; c) utilisation de l'image de l'échantillon (In), acquise lors de l'étape b), et d'un opérateur de propagation holographique, pour calculer une expression complexe (A(x, y, z)) de l'onde lumineuse d'exposition (14) en différentes positions distantes du plan de détection; le procédé comportant une étape d'estimation du volume représentatif (V, V1) des particules d'intérêt (101) en fonction des expressions complexes calculées lors de l'étape c) 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen (V) desdites particules d'intérêt. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel l'étape c) comporte une formation d'une image complexe (11,), correspondant à une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition (A(x, y, z)) dans le plan de l'échantillon (P10). 4. Procédé selon la revendication 3, comportant : - une détection, à partir de l'image complexe, de régions d'intérêt (ROLL), chaque région d'intérêt étant associée à une particule d'intérêt (101) ; - une détermination d'une taille de chaque région d'intérêt ; l'estimation du volume représentatif (V) des particules d'intérêt (101) étant effectuée en fonction de ladite taille, chaque particule d'intérêt étant considérée comme sphérique. 31 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape c) comporte le calcul d'une expression complexe (A(x, y, z)) de l'onde lumineuse d'exposition (14) à différentes distances (z) du plan de détection, le procédé comportant également les étapes suivantes : d) détermination des positions planaires (xi, y1) respectives de plusieurs particules 5 d'intérêt (101) dans un plan parallèle au plan de détection (P0), chaque position planaire étant associée à une particule d'intérêt; e) à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape c), calcul d'au moins une grandeur caractéristique (M, (p) de l'onde lumineuse d'exposition (14), à chaque position planaire (xi, yi), et à une pluralité de distances (z) du plan de détection (P0); 10 f) formation d'un profil (Mi(z), (pi(z)), représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation (Z) et passant par chaque position planaire (xi, yi) déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une particule d'intérêt ; g) estimation du volume représentatif (V) des particules d'intérêt (101) en fonction de 15 chaque profil (Mi (z), (pi(z)) formé lors de l'étape f). 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape c) comporte une formation d'une pile d'images complexes, chaque image complexe formant une distribution de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition (14) selon un plan de reconstruction. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel lors de l'étape c), la formation de la pile d'images 20 complexes comporte les sous-étapes suivantes : ci) à partir de l'image acquise (I0) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h), de façon à calculer une image complexe (A'f), dite image de référence, représentative de l'onde lumineuse d'exposition (14), dans un plan de référence (P'f); 25 cii) application d'un opérateur de propagation (h) à l'image de référence (A'f), de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires (A'f,,i...A'f,,n), à différentes distances (z1 zn) du plan de référence (P'f) selon l'axe de propagation (Z), les images complexes secondaires et l'image de référence formant la pile d'images complexes. 30 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le plan de référence (Pre f ) est le plan de l'échantillon (P10). 32 9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la formation de la pile d'images complexes comporte le calcul, à partir de l'image acquise (In), de plusieurs images complexes (A zi...A,n) à différentes distances (z1 zn) du plan de détection (P0) selon l'axe de propagation (Z). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel dans l'étape d), la 5 position planaire (x1, y1) de chaque particule d'intérêt est déterminée à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'étape d) comporte les sous-étapes : di) détection de particules (10i, 10) dans l'image complexe ; dii) sélection, parmi les particules détectées, de particules d'intérêt (101). 10 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, dans lequel lors de l'étape e), la grandeur caractéristique comprend le module (M) ou la phase ((p) d'une expression complexe (A) de l'onde lumineuse d'exposition (14). 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel le volume représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules, et dans lequel 15 lors de l'étape g), le volume moyen (V) des particules d'intérêt (101) est estimé en appliquant une métrique à chaque profil (Mi(z),(pi(z)) formé lors de l'étape f), de façon à obtenir un paramètre (p1) pour chaque profil et en effectuant une moyenne (75) des paramètres de chaque profil. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le volume 20 représentatif des particules d'intérêt est un volume moyen desdites particules, et dans lequel les particules d'intérêt étant des globules rouges, le volume moyen (V) des particules d'intérêt correspond à un volume globulaire moyen (VGM), de l'échantillon. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant également l'établissement d'un paramètre représentant une dispersion des volumes des particules 25 d'intérêt (101). 16. Procédé selon la revendication 15 dépendant de la revendication 14, le procédé comportant la détermination d'un indice de répartition des globules rouges (IDR). 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une détermination d'une quantité (Ni) de particules d'intérêt (101) dans l'échantillon. 33 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel les particules d'intérêt étant des globules rouges, le procédé comportant une étape de détermination d'un taux d'hématocrite (Ht) à partir du volume moyen des particules d'intérêt et de la quantité de particules d'intérêt dans l'échantillon. 5 19. Dispositif pour l'estimation du volume représentatif de particules d'intérêt (101) disposées dans un échantillon (10), le dispositif comportant : une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière 10 (11) et un capteur d'image (16) ; un processeur (20), configuré pour recevoir une image (In) de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et pour mettre en oeuvre au moins l'étape c) du procédé objet de l'une quelconque des revendications précédentes, le processeur étant configuré pour estimer le volume représentatif des particules d'intérêt à partir des expressions complexes calculées lors de l'étape 15 c). 20. Dispositif selon la revendication 19, dans lequel le processeur est configuré pour mettre en oeuvre les étapes d) à f) du procédé objet de l'une quelconque des revendications 5 à 18.