FR 3065285 A1 20181019 FR 1753311 A 20170414 1 Procédé d'acquisition d'un spectre Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est l'acquisition d'un spectre à partir d'un rayonnement lumineux émis ou diffusé par une particule, et notamment une particule biologique, en réponse à une illumination par un rayonnement lumineux. ART ANTERIEUR La spectrométrie Raman est un outil de caractérisation très répandu, basé sur l'acquisition d'un spectre d'un rayonnement diffusé, de façon inélastique, par un échantillon, dit spectre Raman, l'échantillon étant exposé à un rayonnement lumineux monochromatique incident. Un spectre Raman est généralement représenté sous la forme d'un spectre de la variation du nombre d'onde du rayonnement diffusé par l'échantillon par rapport au nombre d'onde du rayonnement lumineux monochromatique. Ce spectre représente une signature de transitions énergétiques de molécules composant l'échantillon analysé. L'intensité d'un signal de diffusion Raman est faible et de façon à acquérir un spectre Raman exploitable, le rayonnement incident doit être intense. Ce rayonnement est généralement émis par une source laser, dont la puissance est ajustée. Sous l'effet d'une exposition trop prolongée au rayonnement incident, l'échantillon analysé peut se dégrader. Cette dégradation, pas toujours perceptible à l'ceil, peut entraîner une modification structurale de l'échantillon, désignée par le terme photo-dommage, ou photo-dégradation. Ainsi, lorsqu'un échantillon a été surexposé, le spectre Raman obtenu n'est plus représentatif de la structure de l'échantillon. Il résulte de ce qui précède que l'intensité du rayonnement incident doit être suffisamment élevée pour obtenir un spectre Raman exploitable, tout en étant inférieure à un certain seuil, dit seuil d'exposition, de façon à ne pas compromettre l'intégrité de l'échantillon. Un tel compromis est difficile à établir a priori, d'une part parce que la nature de l'échantillon n'est pas connue, d'autre part parce que le seuil d'exposition peut varier entre deux échantillons de natures différentes. Outre l'intensité du rayonnement incident, la durée de l'exposition est également importante et on a constaté qu'au-delà d'une certaine exposition intégrée, un phénomène de photo- dommage apparaît. Il est donc nécessaire d'optimiser à la fois la puissance du rayonnement incident, mais également la durée de l'exposition de l'échantillon au rayonnement incident. 3065285 2 Une première approche, conservative, est d'ajuster la puissance de telle sorte qu'elle soit bien en deçà du seuil d'exposition. Mais cela peut conduire à l'obtention de spectres peu représentatifs, obtenus au cours d'une longue durée d'acquisition. L'objet de l'invention est d'adresser ce problème, par un procédé d'acquisition permettant 5 d'optimiser l'exposition d'un échantillon analysé, tout en prévenant les risques de dégradation du spectre résultant d'une exposition excessive. EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé d'acquisition d'un spectre représentatif d'une particule comportant les étapes suivantes, 10 illumination de la particule par une source de lumière; détection d'un rayonnement lumineux émis ou diffusé par ladite particule sous l'effet de l'illumination et acquisition d'un spectre à partir du rayonnement lumineux détecté; le procédé étant caractérisé en ce que l'acquisition du spectre comporte les étapes suivantes : i) acquisition d'un premier spectre élémentaire et formation d'un spectre combiné initial 15 à partir du premier spectre élémentaire ; ii) acquisition d'un spectre élémentaire dit courant ; iii) prise en compte d'un spectre de référence; iv) détermination d'un critère d'acceptation du spectre élémentaire courant, le critère d'acceptation correspondant à un écart entre le spectre élémentaire courant et le 20 spectre de référence ; v) en fonction du critère d'acceptation : acceptation du spectre élémentaire courant et mise à jour du spectre combiné par une addition du spectre élémentaire courant au spectre combiné initial ou au spectre combiné résultant d'une itération précédente; 25 ou rejet du spectre élémentaire courant ; vi) réitération des étapes ii) à vi), ou sortie de l'itération ; vii) détermination d'un spectre, représentatif de la particule, en fonction du spectre combiné obtenu lors de l'étape v) de la dernière itération. A chaque itération est associée un spectre combiné. Lors de la première itération, il s'agit du 30 spectre combiné initial établi lors de l'étape i). A partir de la deuxième itération, il s'agit du spectre combiné résultant de l'itération précédente. 3065285 3 Lors de l'étape iv), le critère d'acceptation est déterminé en fonction d'une comparaison entre le spectre élémentaire courant et le spectre de référence. La comparaison peut notamment comprendre une soustraction, un ratio, un produit de corrélation, un produit scalaire. Selon un mode de réalisation, le spectre de référence est un spectre moyen, représentatif d'une 5 moyenne de spectres élémentaires formant le spectre combiné initial ou le spectre combiné résultant d'une itération précédente. Le spectre élémentaire moyen peut alors être établi à partir d'une normalisation de spectres élémentaires formant le spectre combiné, en fonction d'une durée d'acquisition de chaque spectre élémentaire formant le spectre combiné pris en compte au cours d'une itération ou de chaque itération. 10 Selon un mode de réalisation, lors de l'étape iv), le critère d'acceptation est déterminé à partir d'une soustraction du spectre de référence et du spectre élémentaire courant, de préférence normalisée par un indicateur du bruit dans le spectre de référence et dans le spectre élémentaire courant. Le spectre de référence peut également être : 15 - le premier spectre élémentaire, acquis lors de l'étape i), ou un spectre élémentaire acquis au cours d'une itération précédente ; ou un spectre déterminé a priori. Le spectre a priori peut notamment correspondre au spectre représentatif d'une particule cible. Selon un mode de réalisation, lequel le spectre de référence comporte une ou plusieurs régions 20 d'intérêt, dites régions d'intérêt de référence du spectre élémentaire courant. Le critère d'acceptation peut alors être établi par une comparaison du spectre élémentaire courant, dans au moins une région d'intérêt sélectionnée, avec le spectre de référence. Par exemple, la région d'intérêt sélectionnée est représentative d'une bande spectrale apte à se déformer lorsque la particule est illuminée par une illumination trop importante, et au moins une région d'intérêt de 25 référence est limitrophe de ladite bande spectrale. Quel que soit le mode de réalisation, lors de l'étape v), la mise à jour du spectre combiné peut être réalisée par une somme, éventuellement pondérée : - du spectre élémentaire courant et du spectre combiné initial ou du spectre combiné résultant d'une itération précédente; 30 ou du spectre élémentaire courant, auquel un traitement est appliqué, et du spectre combiné initial ou du spectre combiné résultant d'une itération précédente. Quel que soit le mode de réalisation, lors de l'étape vi), le critère d'itération peut correspondre: - à un nombre prédéterminé d'itérations ; 3065285 4 et/ou à l'obtention d'un nombre prédéterminé de rejets de spectres élémentaires courants ; et/ou à l'obtention d'un nombre d'évènements prédéterminés dans le spectre combiné résultant de l'étape v). 5 Selon un mode de réalisation, lors de l'étape ii), chaque spectre élémentaire courant est acquis selon une même durée d'acquisition. Selon un autre mode de réalisation, au moins deux spectres élémentaires courant sont acquis selon deux durées d'acquisition différentes. Selon un mode de réalisation, suite à la première itération, l'étape ii) comporte une étape de détermination d'une durée d'acquisition du spectre courant en fonction de la valeur d'un critère 10 d'acceptation résultant de l'étape iii) d'une itération précédente, ou en fonction du rapport signal à bruit du spectre combiné résultant de l'itération précédente, ou de sa variation. Selon un mode de réalisation, la source de lumière génére un faisceau d'illumination se propageant jusqu'à la particule. Suite à la première itération, l'étape ii) comporte une étape de détermination d'une puissance du faisceau d'illumination en fonction de la valeur d'un critère 15 d'acceptation résultant de l'étape iv) d'une itération précédente. Selon un mode de réalisation, au moins deux spectres élémentaires courant sont acquis alors que la particule est illuminée selon un faisceau d'illumination de deux puissances différentes. Le photodétecteur peut être un spectromètre Raman, le spectre acquis étant un spectre Raman représentatif de la particule. Le photodétecteur peut être un spectromètre de fluorescence, le 20 spectre acquis étant un spectre de fluorescence de la particule. Un autre objet de l'invention est un dispositif d'analyse d'une particule comportant : une source de lumière; un support destiné à recevoir une particule; un photodétecteur apte à détecter un signal de réponse, émis par la particule lorsqu'elle 25 est illuminée par la source de lumière et à en former un spectre ; un processeur, configuré pour mettre en oeuvre les étapes i) à vii) du procédé selon le premier objet de l'invention, à partir d'une pluralité de spectres élémentaires acquis par le photodétecteur, pour former un spectre représentatif de la particule D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre 30 de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés aux dessins annexés listés ci-dessous. FIGURES La figure 1 représente un exemple de dispositif de spectrométrie Raman. 3065285 5 Les figures 2A et 2B représentent des signatures spectrales Raman de bactéries respectivement avant et après la dégradation de ces dernières par une surexposition à un rayonnement lumineux. La figure 3A illustre une proportion de bactéries Serratia marcescens subissant un photo- 5 dommage en fonction d'une durée de l'exposition à un faisceau lumineux. Les figures 3B à 3C sont des figures similaires à la figure 3A, et concernent respectivement les espèces Staphilococcus epidermidis, Bacillus subtilis. La figure 4 représente les principales étapes d'un procédé selon l'invention. Les figures 5A, 5B et 5C représentent l'évolution d'un spectre Raman obtenu par la combinaison 10 de spectres élémentaires d'une bactérie, chaque spectre élémentaire étant acquis à différents instants à partir d'un instant initial à partir duquel la bactérie est exposée à un faisceau d'illumination. La durée d'acquisition de chaque spectre élémentaire est de 1 seconde. La figure 5D représente l'évolution d'un critère d'acceptation calculé pour chacun des 30 spectres représentés sur les figures 5A à 5C. 15 La figure 6A représente plusieurs spectres Raman d'une même espèce de bactérie, acquis sous l'effet d'une illumination continue d'une durée de 10 secondes. La figure 6B représente différents spectres Raman de l'espèce de bactérie analysée sur la figure 6A, chaque spectre résultant d'une acquisition successive d'une pluralité de spectres élémentaires, chaque spectre élémentaire étant acquis durant une période temporelle de 1 20 seconde. Les figures 6C, 6D et 6E représentent différents spectres Raman obtenus dans des conditions analogues de celles de la figure 6B, la durée d'acquisition de chaque spectre élémentaire étant respectivement de 500ms, 200 ms et 100 ms. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 25 La figure 1 est un exemple de réalisation d'un dispositif 1 permettant la mise en oeuvre de l'invention. Une source de lumière laser 10 est apte à générer un faisceau d'illumination 12, de préférence monochromatique, se propageant jusqu'à une particule 21 à analyser, la particule étant disposée sur un support 20. Un système optique 11 permet une focalisation du faisceau d'illumination 12 sur la particule 21. Une lame semi-réfléchissante 13 renvoie le faisceau 30 d'illumination 12 selon un axe de propagation Z. Sous l'effet de l'illumination par le faisceau d'illumination 12, la particule 21 est apte à produire un rayonnement lumineux de réponse 14. Le rayonnement de réponse 14 peut être un rayonnement de fluorescence, émis par la particule sous l'effet de son illumination. Il peut également s'agir d'un rayonnement diffusé par la 3065285 6 particule, en particulier par diffusion Raman. Dans l'exemple représenté sur la figure 1, le rayonnement de réponse 14 est un rayonnement de diffusion. Il est détecté par un photodétecteur spectrométrique 30, apte à en acquérir un spectre de diffusion Raman. Dans cet exemple, le photodétecteur 30 est un spectromètre Raman fourni par Tornado Spectral Systems 5 sous la référence HyperFluxU1. Il est relié à un processeur 32, par exemple un microprocesseur, permettant la mise en oeuvre des instructions du procédé décrit ci-après. Le microprocesseur est relié à une mémoire 33 dans laquelle ces instructions sont stockées. Il peut également être relié à un écran d'affichage 34. Dans cet exemple, le spectre acquis est un spectre Raman, représentant un histogramme d'un 10 nombre d'onde a dit différentiel, représentant une différence entre le nombre d'onde o-14 du rayonnement 14 détecté par rapport au nombre d'onde o-12 du faisceau d'illumination 12. La particule 21 analysée peut être une espèce biologique telle une cellule, un microorganisme, par exemple une bactérie, une levure, un champignon, une spore. La particule 21 peut également être une molécule chimique. Elle peut être déposée sur un support 20 ou être 15 disposée dans un milieu, par exemple un milieu de culture, solide ou liquide. Dans les exemples présentés ci-dessous, l'échantillon est formé d'une goutte d'une solution aqueuse, comportant au moins une espèce à analyser. La solution aqueuse est par exemple de l'eau distillée déposée sur une lame de quartz. La solution s'évapore et l'analyse de l'espèce est effectuée après évaporation de cette dernière. 20 La puissance laser est ajustée de manière à obtenir un spectre exploitable selon une durée inférieure à 5 s, voire 1s. La puissance lumineuse du faisceau d'illumination 12 peut par exemple être de 17 mW. Elle peut également être variable. La longueur d'onde du faisceau d'illumination est de 532 nm. La figure 2A représente des spectres Raman obtenus pour trois espèces de bactéries (Proteus 25 mirobilis, Shigella flexerii, Francisella pseudomonas), respectivement désignées par les acronymes PM, SF et FP. La partie délimitée par un cadre correspond à la plage de nombre d'onde différentiel, usuellement désigné par le terme anglosaxon Raman Shift, comportant les principaux pics constituant la signature de chaque bactérie. Cette plage se situe ici entre 650 cm -1 et 1800 cm-1 ainsi qu'entre 2600 cm-1 et 3200 cm-1. 30 La figure 2B représente des spectres Raman obtenus pour ces mêmes espèces, les espèces ayant subi une surexposition (photo-dommage). Dans ce cas, le spectre Raman acquis par le 3065285 7 spectromètre ne comporte pas d'information spectrale exploitable permettant l'identification de chaque bactérie. Les inventeurs ont par ailleurs constaté que les bactéries, ou, d'une façon générale, les espèces biologiques, présentent une sensibilité différente à l'égard de la photo-dégradation en fonction 5 de leur nature. La figure 3A représente les résultats d'une étude visant à déterminer la sensibilité de la bactérie Serratia marcescens à une exposition prolongée à un faisceau d'illumination de puissance optique 17 mW. Un spectre Raman a été effectué, pour plusieurs bactéries, durant différentes durées d'acquisition. On a ensuite déterminé une proportion de bactéries ayant subi un photo-dommage. Cette détermination a été réalisée au microscope, une bactérie sur- 10 exposée n'étant plus visible ou coupée en plusieurs parties, ainsi qu'en réalisant un spectre Raman, une bactérie dégradée présentant des pics caractéristiques du Carbone. La figure 3A représente un taux de bactéries photo-dégradées, compris entre 0 et 1, en fonction de la durée de l'exposition, exprimée en secondes. Sur la figure 3A, on observe que jusqu'à une durée d'exposition de 55 secondes, seule 1 bactérie sur 10 est dégradée, ce qui correspond à un taux 15 de dégradation de 0,1. Après 60 secondes, toutes les bactéries sont dégradées, ce qui correspond à un taux de dégradation égal à 1. Des essais ont été réalisés, selon le même mode opératoire, sur les espèces de type Staphilococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia cou. Les résultats de ces essais sont respectivement présentés sur les figures 3B et 3C On observe que l'espèce Staphilococcus 20 epidermidis est particulièrement fragile, puisque le taux de dégradation est de 1 lorsque la durée d'exposition atteint 11s.Ces essais confirment que la sensibilité d'une espèce biologique à l'égard d'une surexposition varie considérablement selon sa constitution, certaines espèces étant plus résistantes que d'autres. Les inventeurs ont établi un procédé d'acquisition permettant d'obtenir une exposition optimale 25 de l'espèce analysée, sans connaissance préalable de cette dernière. Une telle exposition permet d'obtenir un spectre présentant des pics dont le rapport signal à bruit est élevé, sans dégradation de l'espèce du fait d'une surexposition. Les principales étapes de ce procédé itératif sont décrites ci-dessous, en lien avec la figure 4. D'une façon générale, ce procédé vise à acquérir successivement plusieurs spectres Si, dits spectres élémentaires, et de former progressivement 30 un spectre, dit spectre combiné Sc, en combinant les différents spectres élémentaires acquis. Chaque spectre élémentaire est acquis durant une durée d'acquisition Ti suffisamment faible de telle sorte qu'au moins un spectre élémentaire soit exploitable, en n'étant pas affecté par le 3065285 8 photo-dommage. Cette durée d'acquisition est généralement inférieure à 5 s et est de préférence inférieure à 2 s. Elle peut notamment être comprise entre 200 ms et 2s. Chaque spectre élémentaire Si peut alors être additionné de façon à former le spectre combiné Sc,i, et cela jusqu'à ce qu'un photo-dommage soit observé sur un spectre élémentaire. 5 Etape 100: illumination de l'espèce par le faisceau d'illumination 12. La puissance du faisceau d'illumination peut être modifiée entre deux acquisitions successives. Etape 110 : acquisition d'un premier spectre S1, dit spectre premier spectre élémentaire, durant une première durée d'acquisition T1 déterminée. Cette durée doit être suffisamment courte pour éviter toute dégradation de l'espèce examinée lors de cette première acquisition. Elle peut 10 notamment être comprise entre 100 ms et 5s, et est de préférence comprise entre 200 ms et 2s. Etape 120: constitution d'un spectre dit spectre combiné initial So=0, à partir du premier spectre élémentaire. Il peut notamment s'agir d'une simple relation d'égalité, de telle sorte que lors de la première itération, So=0 = S. 15 Les étapes 130 à 160 sont alors réalisées de façon itérative. Les étapes 110 et 120 sont des étapes d'initialisation de ce procédé itératif. Le rang de l'itération est désigné par l'indice i. Après l'étape 120, l'indice i prend la valeur 2. A chaque itération correspond un spectre combiné 5c,i_1, issu d'une itération précédente. Lors de la première itération, il s'agit du spectre combiné initial 5o=0. 20 Etape 130: acquisition d'un spectre élémentaire Si, dit spectre élémentaire courant. Le terme courant désigne le spectre élémentaire acquis lors de l'itération i. Chaque spectre élémentaire Si peut être acquis dans les mêmes conditions d'acquisition que le premier spectre élémentaire Si, la puissance optique du faisceau d'illumination 12 étant inchangée et la durée d'exposition Ti étant comprise dans la même plage de valeur, voire identique, à la première durée 25 d'acquisition T1. En variante, la puissance Pi du faisceau d'illumination 12 au cours d'une acquisition i peut être modulée, en étant augmentée ou diminuée. Il en est de même de la durée d'exposition Ti. Ces aspects sont plus largement décrits par la suite. Etape 140 : définition d'un critère d'acceptation Ci du spectre élémentaire courant Si acquis lors 30 de l'étape 130. 3065285 9 Il s'agit d'évaluer la pertinence du spectre élémentaire courant Si, de façon soit à l'accepter, c'est-à-dire à le prendre en compte dans les étapes ultérieures, soit à le rejeter. Cette étape prend en compte un spectre de référence S'f. Au cours de cette étape, on compare le spectre élémentaire courant Si au spectre de référence S'f de façon à former un critère d'acceptation 5 Ci associé au spectre élémentaire courant Si. Le critère d'acceptation Ci représente un écart du spectre élémentaire courant Si par rapport au spectre de référence S'f. Lorsque cet écart est trop important, le spectre élémentaire courant est rejeté. On estime que lorsque le spectre élémentaire courant se distingue du spectre de référence, le spectre élémentaire courant est probablement affecté par une photo-dégradation et il est préférable de ne pas le prendre en 10 compte. Des exemples de critères d'acceptation sont indiqués par la suite. Dans cet exemple, le spectre de référence S'f est formé par un spectre, dit spectre moyen, noté mi, formé par une moyenne de plusieurs spectres élémentaires S S acquis au cours des itérations précédentes. Cet exemple est détaillé par la suite. Le spectre de référence S'f peut être également formé par un spectre élémentaire courant 15 Si_2 acquis au cours des itérations précédentes. Il peut en particulier s'agir du spectre élémentaire S acquis au cours de l'itération précédente. Le critère de comparaison Ci permet alors de déterminer un écart apparaissant entre le spectre élémentaire courant et le ou les derniers spectres élémentaires courant acquis. Le spectre de référence S'f peut être un spectre prédéterminé, par exemple un spectre 20 représentatif d'une particule cible dont on souhaite vérifier si elle correspond à la particule analysée. Le critère de comparaison peut alors quantifier une corrélation entre le spectre de référence S'f et le spectre élémentaire courant Si, par exemple par le biais d'un produit scalaire entre les deux spectres. Le spectre de référence S'f peut également être formé par une ou plusieurs régions d'intérêt 25 ROI rep dites de référence, du spectre élémentaire courant Si. Dans ce cas, le critère d'acceptation peut correspondre à un écart entre le spectre élémentaire courant Si, dans une région d'intérêt sélectionnée ROIS, avec les régions d'intérêt de référence RO/ref du spectre élémentaire courant. Autrement dit, selon cette variante, la critère d'acceptation comporte une comparaison entre une (ou plusieurs) région d'intérêt sélectionnées ROIS du spectre 30 élémentaire courant avec une (ou plusieurs) régions d'intérêt de référence RO/ref du spectre courant RO/ref. Par exemple, une région d'intérêt sélectionnée ROIS correspond à une bande 3065285 10 spectrale dans laquelle un pic, ou une déformation du spectre, peut apparaître lors de l'apparition d'un photo-dommage. Les régions d'intérêt de référence RO/'f peuvent s'étendre de part et d'aire de la région d'intérêt sélectionnée. La comparaison du spectre élémentaire courant, entre la région d'intérêt sélectionnée ROIS et les régions d'intérêt de référence ROI'f 5 permet une détecter l'apparition d'un pic, ou d'une déformation, résultant de l'apparition d'un photo-dommage. Le critère d'acceptation Ci peut être formé par une combinaison de plusieurs critères d'acceptation élémentaires, chaque critère d'acceptation élémentaire résultant d'une prise en compte d'un spectre de référence différent. 10 [tape 150: mise à jour du spectre combiné. En fonction de la valeur du critère d'acceptation Ci déterminée lors de l'étape 140, relativement au spectre de référence S'f, le spectre élémentaire courant Si est soit accepté, soit rejeté. Dans le cas où il est accepté, le spectre combiné Sc,i est mis à jour par une somme, éventuellement pondérée, du spectre combiné obtenu au cours l'itération précédente i - 1. Ainsi, Sc,i = + piSi, (1) où pi est un terme 15 de pondération. Le terme de pondération est généralement égal à 1. Le spectre élémentaire courant Si peut faire l'objet d'un traitement avant d'être ajouté au spectre combiné Sc,1_1 issu de l'itération précédente. Des exemples de traitement possibles sont par exemple un lissage et/ou une soustraction de la ligne de base. Lorsque la puissance Pi du faisceau d'illumination 12 évolue entre les différentes itérations, le spectre élémentaire peut 20 être corrigé par une fonction de correction fi prenant en compte ladite puissance. Une telle fonction de correction permet notamment une normalisation du spectre acquis par rapport à une valeur de puissance prédéterminée, par exemple une valeur unitaire. Une telle normalisation est décrite dans le détail par la suite. Lorsque le spectre élémentaire courant Si est rejeté, le spectre combiné So n'évolue pas et 25 demeure tel qu'il était avant l'acquisition de ce spectre élémentaire courant : = (1'). Par comparaison du spectre élémentaire courant Si avec un spectre de référence S'f, on entend en particulier une opération mettant en oeuvre une soustraction, ou un ratio, la soustraction ou le ratio pouvant être normalisés. Il peut également s'agir de l'établissement d'une grandeur traduisant une corrélation entre les deux spectres, par exemple par le biais d'un 30 produit scalaire entre des vecteurs représentant respectivement le spectre élémentaire courant et le spectre de référence. 3065285 11 [tape 160: Réitération ou sortie d'algorithme. Tant qu'un critère d'arrêt d'itération n'a pas été atteint, le procédé réitère les étapes 130 à 160, en incrémentant l'indice d'itération i, de façon à permettre une mise à jour du spectre combiné So à l'aide d'un nouveau spectre élémentaire courant Si. Lorsque le critère d'arrêt d'itération a été atteint, le procédé passe l'étape 170. 5 Le critère d'arrêt d'itération peut être un nombre Ni prédéterminé d'itérations i. Le critère d'arrêt d'itération peut également être établi en fonction du critère d'acceptation Ci calculé lors de l'étape 140. Ainsi, le critère d'arrêt d'itération peut être considéré comme atteint lors du rejet d'un spectre élémentaire courant Si. Autrement dit, tant que chaque spectre élémentaire courant est accepté, les itérations se poursuivent et le spectre combiné So est mis à jour à 10 chaque itération, par la combinaison avec chaque spectre élémentaire courant Si. Lorsqu'un spectre élémentaire courant est rejeté, on considère que l'espèce observée subit une photodégradation. A partir de cet instant, on considère que le spectre élémentaire courant Si n'est plus représentatif de l'espèce analysée 21 et la constitution du spectre combiné Sc,i s'arrête. Le critère d'arrêt d'itération peut également être atteint lorsque plusieurs spectres élémentaires 15 successifs sont rejetés, par exemple 2 ou 3 spectres élémentaires successifs. Le critère d'itération peut également correspondre à un nombre maximal de détections comptabilisées dans un ou plusieurs pics du spectre combiné. [tape 170 : A partir du spectre combiné Sc,i obtenu lors la dernière itération, c'est-à-dire lors de l'étape 150 précédent ladite étape 170, on établit un spectre S représentatif de de l'espèce 20 analysée 21. Ce spectre peut être obtenu par une simple relation d'égalité, de telle sorte que S= On a ainsi constitué un spectre S de l'espèce analysée par une combinaison progressive de spectres élémentaires Si. La durée d'acquisition cumulée de ce spectre est : T = Ei Exemples de critère d'acceptation 25 Comme précédemment indiqué, le critère d'acceptation Ci associé à chaque spectre élémentaire courant Si représente un écart de chaque spectre élémentaire courant Si par rapport à spectre de référence S'f. Le spectre de référence peut être le spectre élémentaire S acquis lors de l'itération précédente ; un spectre moyen mi, calculé en effectuant une moyenne de spectres élémentaires 30 formant le spectre combiné Sc; le spectre combiné Sc, ce dernier étant ramené à la durée d'acquisition Ti du spectre courant Si. 3065285 12 Selon un exemple, le spectre de référence S'f est un spectre mi dit moyen, obtenu par une moyenne de l'ensemble des i - 1 spectres élémentaires S1 ...S1_1 formant le spectre combiné, précédemment à l'acquisition du spectre élémentaire courant Si. Ainsi, on peut établir un critère d'acceptation Ci de telle sorte que : 5 1 Ci = (2) .\icrs2k,i+crm2 ,k,i K est le nombre de canaux considérés dans la somme. Il peut s'agir de l'ensemble des canaux du spectre ou de certains d'entre eux ; k désigne chaque canal; Skj et mic,i désignent respectivement la valeur, à un canal k, du spectre élémentaire 10 courant Si et du spectre moyen m1; as,k,i et arn,k,i désignent respectivement l'écart type, à un canal k, du spectre élémentaire courant Si et du spectre moyen mi. Chacun de ces écart-type sont déterminés en considérant les canaux situés dans un voisinage Vk du canal k. Le voisinage Vk représente un nombre de canaux Nv k voisins du canal k. Le nombre de 15 canaux Nvk est par exemple égal à 7, s'étendant de part et d'autres du canal k. Lorsque les durées d'acquisition des spectres élémentaire S S sont identiques, la valeur mk,i, en chaque canal k, du spectre moyen mi peut être : mkl = EiTASki (3). Lorsque les durées d'acquisition des différents spectres élémentaires sont variables, la valeur mk,i, en chaque canal k, du spectre moyen mi peut être : 201 norm (4) Mk,i = 2, - S - j=1 k,j Ser est un spectre normalisé, prenant en compte une durée d'acquisition unitaire, avec, lorsque la puissance du faisceau lumineux est constante : çnorm = ri.-1 _1 ç iç% Lorsque la puissance du faisceau lumineux varie selon les spectres élémentaires, on peut établir 25 une fonction de correction de façon à obtenir, à partir de chaque spectre mesuré, un spectre normalisé dont chaque canal k prend la valeur Ser = -1 MS/ci) (6), où fj est une Ti fonction de correction établie expérimentalement, prenant en compte la puissance Pj du faisceau d'illumination 12 lors de l'acquisition d'un spectre élémentaire S. La fonction de correction peut être établie au cours d'une phase de calibration sur un objet de calibration, en 3065285 13 modulant la puissance du faisceau d'illumination 12 sur l'objet de calibration et en comparant les spectres obtenus.. Précisons que la somme établie dans l'équation (2), ou dans l'équation (7) ci-dessous peut être restreinte aux canaux présents dans une ou plusieurs régions d'intérêt ROI du spectre. Ces 5 régions d'intérêt peuvent avoir été prédéterminées. Une autre expression du critère d'acceptation est : 1 (7) = -KEk +C" m2 ,k,i où : Stc,i est la valeur moyenne, au canal k, d'un spectre lissé St, obtenu après application 10 d'un lissage à chaque spectre élémentaire Si, ladite valeur moyenne étant calculée en considérant les canaux situés dans un voisinage Vk du canal k du spectre lissé St. -1 1 est la valeur moyenne, au canal k, d'un spectre lissé moyen mi, obtenu par le calcul d'une moyenne de spectres lissés SI respectivement obtenus en appliquant un lissage à chaque spectre élémentaire à chaque spectre élémentaire Si_ La valeur 15-/ moyenne mic,i est calculée en considérant les canaux situés dans un voisinage Vk du canal k du spectre lissé moyen m. Le spectre lissé moyen rr/1 s'obtient, à partir des spectres lissés SI en mettant en oeuvre l'une des équations (3) à (5). as2,1,,i est un écart-type de bruit, calculé en considérant les canaux situés dans un voisinage Vk du canal k, d'un spectre dit de bruit S'i. Le spectre de bruit S'i est obtenu, 20 à partir du spectre élémentaire Si et du spectre lissé St, par exemple par une soustraction selon l'expression : S'i = - Sil (8). /2 s,k,i peut être estimé par l'expression suivante : 1 ais2,k,i = EJEVkSij,k2 (9) Nvk 25 est l'écart type de bruit moyen, calculé en considérant les canaux situés dans un voisinage Vk du canal k, d'un spectre de bruit moyen m'i. Le spectre de bruit moyen est obtenu, à partir du spectre moyen mi et du spectre lissé moyen m, par exemple par une soustraction, selon l'expression : m'i = mi - rr/1 (10). 3065285 14 /2 1 0-/2S k1 peut être estimé par l'expression suivante m,k,i = -EjEVkMj,k2 (11) ' NVk L'homme du métier sera à même de définir d'autres critères d'acceptation que ceux décrits en lien avec les expressions (2) et (7). Par ailleurs, les expressions (2) et (7) peuvent s'appliquer à des spectres de référence S'f 5 différents du spectre moyen mi. Lorsque le critère d'acceptation Ci dépasse un certain seuil, préalablement déterminé, le spectre élémentaire courant Si est rejeté. Lorsque le critère d'acceptation Ci est inférieur audit seuil, le spectre élémentaire courant Si est accepté et combiné au spectre combiné résultant de l'itération précédente. 10 Selon un mode de réalisation, la durée d'acquisition Ti d'un spectre élémentaire courant Si est déterminée en fonction de la valeur du critère d'acceptation établi lors de l'itération précédente. En fonction de cette valeur, la durée d'acquisition peut être augmentée ou diminuée. Par exemple, si le critère d'acceptation se rapproche du seuil de rejet, la durée d'acquisition peut être diminuée. 15 Selon un mode de réalisation, la puissance Pi du faisceau d'illumination 12, lors de l'acquisition d'un spectre courant Si, est déterminée en fonction de la valeur du critère d'acceptation établi lors de l'itération précédente. En fonction de cette valeur, la puissance du faisceau d'illumination 12 peut être augmentée ou diminuée. Par exemple, si le critère d'acceptation se rapproche du seuil de rejet, la puissance du faisceau d'illumination peut être diminuée. La 20 puissance du faisceau d'illumination peut également être modulée selon une séquence prédéfinie. La modulation de la puissance du faisceau d'illumination est particulièrement intéressante lorsque la particule analysée peut être une bactérie à l'état de spore ou non sporulée. Les inventeurs ont constaté que l'obtention d'un spectre Raman exploitable pour une spore 25 nécessite une puissance d'illumination relativement faible, tandis que l'obtention d'un spectre Raman exploitable pour une bactérie non sporulée nécessite une puissance plus importante. Dès lors, lorsque la particule examinée est inconnue, il est pertinent d'effectuer des premières acquisitions selon en appliquant une puissance relativement faible, par exemple 7 mW, puis d'augmenter progressivement la puissance au fur et à mesure des itérations, par exemple 12 30 mW, puis 20 mW, puis 40 mW. 3065285 15 La modulation du temps d'acquisition et/ou de la puissance peuvent également être déterminées, au cours de chaque itération, en fonction d'un rapport signal sur bruit du spectre combiné mis à jour au cours de l'itération précédente. Selon un mode de réalisation, lorsqu'un spectre élémentaire courant est accepté, il subit un 5 lissage avant d'être additionné au spectre combiné résultant de l'itération précédente Ainsi, le spectre combiné, résultant de chaque itération, s'obtient par l'addition d'un spectre élémentaire courant lissé, l'expression (1) étant remplacée par : S1 = + Sil (12). Au- delà d'un simple lissage, le spectre courant peut subir d'autres traitements connus de l'homme du métier avant d'être ajouté au spectre combiné Sc,1_1, par exemple une suppression de la 10 ligne de base. Les figures 5A à 5C illustrent des spectres élémentaire Si étant acquis durant une durée d'acquisition Ti de 1 seconde, sur une bactérie de type Sarratia marcescens. Sur la figure 5A, on a représenté 10 spectres élémentaires de 1 seconde respectivement acquis entre un instant initial t = Os et t = 1s, entre t = 1s et t = 2s, entre t = 2s et t = 3s...t = 9s et t = 10s. 15 On observe que chaque spectre élémentaire est répétitif. Ainsi, entre les dix premières secondes d'exposition, la bactérie ne subit pas de photo-dégradation. Sur la figure 5B, on a représenté 10 spectres élémentaires de 1 seconde respectivement acquis entre les instants t = 10s et t = 11s, entre t = 11s et t = 12s, entre t = 12s et t = 13s...t = 19s et t = 20s. On constate que les spectres se dégradent peu à peu, notamment à partir de t = 15s, 20 témoignant d'une photodégradation. Sur la figure 5C, on a représenté 10 spectres élémentaires de 1 seconde respectivement acquis entre les instants t = 20s et t = 21s, entre t = 21s et t = 22s, entre t = 22s et t = 23s...t = 29s et t = 30s. Ces spectres ne sont plus exploitables. On a représenté, sur la figure 5D, l'évolution du logarithme du critère d'acceptation, tel que 25 défini en lien avec l'expression (2), sur la base des spectres élémentaires représentés sur les figures 5A à 5C. Lorsque ce logarithme dépasse -0.1, ce qui correspond à la douzième acquisition, on considère que les spectres élémentaires ne sont pas plus représentatifs de la bactérie analysée. Aussi, pour obtenir un spectre représentatif de la bactérie, il convient d'accumuler les spectres élémentaires acquis entre t = Os et t = 12s. 30 L'avantage du procédé est que la durée d'acquisition d'un spectre n'est pas fixée initialement et est optimisée de manière à maximiser le nombre de spectres élémentaires représentatifs de la 3065285 16 bactérie. Ainsi, contrairement à l'art antérieur, la durée d'acquisition cumulée T s'auto-ajuste, l'acquisition étant stoppée lors de la détection d'une photo-dégradation à partir d'un ou plusieurs spectres élémentaires. Le procédé décrit ci-avant a été testé sur des bactéries de type Bacillus subtilis. On a représenté, 5 sur la figure 6A, 4 spectres Raman acquis selon un procédé de l'art antérieur, la durée d'acquisition étant fixée initialement à 10s. Sur la figure 6B, on a représenté 5 spectres réalisés, parmi lesquels : deux spectres correspondent à une accumulation de 17 spectres élémentaires de durée 1s, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 17s; 10 un spectre est obtenu par une accumulation de 9 spectres élémentaires de durée 1s, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 9s; un spectre est obtenu par une accumulation de 8 spectres élémentaires de durée 1s, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 8s; un spectre est obtenu par une accumulation de 7 spectres élémentaires de durée 15 1s, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 7s; Le rapport signal sur bruit SNR de chaque spectre S. Une expression possible du rapport signal à bruit est : EkER01 1(4)2 SNR = 1 (12) 1+2EltER012(5.1 où : 20 est le contenu de chaque canal k d'un spectre lissé SI obtenu par lissage du spectre S résultant de l'accumulation des spectres élémentaires ; k est contenu de chaque canal d'un spectre S' obtenu une soustraction du spectre lissé SI du spectre S ROli et RO/2 désignent respectivement des régions d'intérêt du spectre, 25 comportant Ki_ et K2 canaux. Sur la figure 6C, on a représenté 5 spectres obtenus en accumulant des spectres élémentaires de durée 500 ms. un spectre est obtenu par une accumulation de 57 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 28.5s; 30 un spectre est obtenu par une accumulation de 37 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 18.5s; 3065285 17 un spectre est obtenu par une accumulation de 29 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 14.5s; un spectre est obtenu par une accumulation de 20 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 10s; 5 un spectre est obtenu par une accumulation de 6 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 3s, ce dernier présentant un faible rapport signal sur bruit par rapport aux précédents spectres élémentaires. Sur la figure 6D, on a représenté 5 spectres obtenus en accumulant des spectres élémentaires de durée 200 ms. 10 un spectre est obtenu par une accumulation de 83 spectres élémentaires de durée 200 ms, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 16.6 s; un spectre est obtenu par une accumulation de 66 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 13.2 s; un spectre est obtenu par une accumulation de 61 spectres élémentaires, ce qui 15 correspond à une durée cumulée d'accumulation de 12.2 s; un spectre est obtenu par une accumulation de 55 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 11 s; un spectre est obtenu par une accumulation de 23 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 4.6 s, ce dernier présentant un 20 faible rapport signal sur bruit par rapport aux précédents spectres élémentaires. Sur la figure 6E, on a représenté 4 spectres obtenus en accumulant des spectres élémentaires de durée 100 ms. : un spectre est obtenu par une accumulation de 208 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 20.8 s; 25 un spectre est obtenu par une accumulation de 84 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 8.4 s; un spectre est obtenu par une accumulation de 50 spectres élémentaires, ce qui correspond à une durée cumulée d'accumulation de 5s; un spectre est obtenu par une accumulation de 16 spectres de durée 200 ms, ce qui 30 correspond à une durée cumulée d'accumulation de 1.8 s. Ces figures illustrent la nécessité d'optimiser le nombre de spectres élémentaires à accumuler et la durée d'acquisition de chaque spectre élémentaire, de façon à obtenir des spectres dont le 3065285 18 rapport signal sur bruit est optimal. On observe ici que l'accumulation d'un trop grand nombre de spectres élémentaires de faible durée d'acquisition, en l'occurrence 100 ms, conduit à l'obtention de spectres présentant un rapport signal sur bruit peu satisfaisant. Cela provient du bruit de lecture de chaque spectre élémentaire, se cumulant sur le spectre combiné, et cela 5 d'autant plus que le nombre de spectres élémentaires combinés est important. Sur ce type de bactérie, des durées d'acquisition élémentaires de 500 ms ou 1 s conduisent à des résultats optimaux en termes de rapport signal sur bruit, dès lors que la durée cumulée d'acquisition dépasse 7s. Par ailleurs, on observe que le rapport signal sur bruit de spectres, acquis selon l'invention, est proche du rapport signal sur bruit d'un spectre acquis selon une 10 durée d'acquisition comparable. On sait qu'à durée d'acquisition égale, un spectre obtenu par une sommation de plusieurs spectres élémentaires présente un rapport signal à bruit plus faible qu'un spectre acquis au cours d'une seule acquisition. Cependant, les essais expérimentaux précédemment décrits montrent que la différence est négligeable, sous réserve d'un rapport signal sur bruit suffisant de chaque spectre élémentaire, notamment eu égard au bruit de 15 lecture. L'invention a été exposée en relation avec l'analyse de bactéries mais elle pourra s'appliquer à toute autre espèce biologique, voire à toute autre particule sensible à une surexposition. Par ailleurs, elle peut également s'appliquer à l'acquisition de spectres de fluorescence, le rayonnement 14 détecté par le photodétecteur étant un rayonnement de fluorescence dont on 20 acquiert le spectre (confirmer que c'est opportun). Dans ce cas, la source de lumière 10 est une source apte à émettre un faisceau d'illumination 12 apte à entraîner l'émission d'un rayonnement de fluorescence 14 par l'espèce analysée. L'invention trouvera en particulier son application dans le suivi de cultures bactériennes, dans le contrôle d'échantillons biologiques ou dans le contrôle d'échantillons prélevés dans 25 l'environnement, dans l'industrie agroalimentaire ou d'autres domaines industriels. REVENDICATIONS1. Procédé d'acquisition d'un spectre (S) représentatif d'une particule (21) comportant les étapes suivantes, illumination de la particule (21) par une source de lumière (10); détection, par un photodétecteur (30), d'un rayonnement lumineux (14) émis ou diffusé par ladite particule (21) sous l'effet de l'illumination et acquisition d'un spectre (S) à partir du rayonnement lumineux détecté ; le procédé étant caractérisé en ce que l'acquisition du spectre comporte les étapes suivantes : i) acquisition d'un premier spectre élémentaire (Si) et formation d'un spectre combiné initial (Sc,i=0) à partir du premier spectre élémentaire ; ii) acquisition d'un spectre élémentaire (Si) dit courant ; iii) prise en compte d'un spectre de référence (S'f); iv) détermination d'un critère d'acceptation (Ci) du spectre élémentaire courant (Si), le critère d'acceptation correspondant à un écart entre le spectre élémentaire courant (Si) et le spectre de référence (S'f); v) en fonction du critère d'acceptation (Ci): - acceptation du spectre élémentaire courant (Si) et mise à jour du spectre combiné (Sc,i) par une addition du spectre élémentaire courant (Si) au spectre combiné initial (Sc,i=0) ou au spectre combiné (Sc,i_i) résultant d'une itération précédente; - ou rejet du spectre élémentaire courant (Si); vi) réitération des étapes ii) à vi), ou sortie de l'itération ; vii) détermination d'un spectre (S), représentatif de la particule (21), en fonction du spectre combiné obtenu (Sc,i) lors de l'étape v) de la dernière itération. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le spectre de référence (5'f) est un spectre moyen (mi), représentatif d'une moyenne de spectres élémentaires (Si ...S) formant le spectre combiné (Sc,i=o) initial ou le spectre combiné (Sc..) résultant d'une itération précédente. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le spectre élémentaire moyen (mi) est établi à partir d'une normalisation de spectres élémentaires formant le spectre combiné, en fonction d'une durée d'acquisition (Ti) de chaque spectre élémentaire (S1 ...S1_1) formant le spectre combiné (Sc,i_i) pris en compte au cours de chaque itération (i). 3065285 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel lors de l'étape iv), e critère d'acceptation (Ci) est déterminé à partir d'une soustraction du spectre de référence et du spectre élémentaire courant (Si), de préférence normalisée par un indicateur du bruit dans le spectre de référence (mi) et dans le spectre élémentaire courant (Si). 5 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le spectre de référence (S'f) est le premier spectre élémentaire (S1), acquis lors de l'étape i), ou un spectre élémentaire (S1 ...Si_i)acquis au cours d'une itération précédente. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le spectre de référence (S'f) est un spectre déterminé a priori. 10 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le spectre de référence (S'f) comporte une ou plusieurs régions d'intérêt, dites régions d'intérêt de référence (R0/'f) du spectre élémentaire courant (Si). 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le critère d'acceptation (Ci) est établi par une comparaison du spectre élémentaire courant, dans au moins une région d'intérêt sélectionnée 15 (R04), avec le spectre de référence (S'f). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel lors de l'étape y), la mise à jour du spectre combiné (Sc) est réalisée par une somme, éventuellement pondérée : - du spectre élémentaire courant (Si) et du spectre combiné (Sc,i,..0) initial ou du spectre combiné (Sc,_) résultant d'une itération précédente; 20 - ou du spectre élémentaire courant (Si), auquel un traitement est appliqué, et du spectre combiné (S) initial ou du spectre combiné (Sc) résultant d'une itération précédente. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape vi), le critère d'itération correspond : 25 à un nombre prédéterminé d'itérations ; et/ou à l'obtention d'un nombre prédéterminé de rejets de spectres élémentaires courants (Si); et/ou à l'obtention d'un nombre d'évènements prédéterminés dans le spectre combiné (Sc,i) résultant de l'étape v). 3065285 21 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape ii), chaque spectre élémentaire courant (Si) est acquis selon une même durée d'acquisition (Ti) ; 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel suite à la première 5 itération, l'étape ii) comporte une étape de détermination d'une durée d'acquisition du spectre courant (Ti), en fonction de la valeur d'un critère d'acceptation (C1_1) résultant de l'étape iii) d'une itération précédente. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière (11) générant un faisceau d'illumination (12) se propageant jusqu'à la particule, suite à 10 la première itération, l'étape ii) comporte une étape de détermination d'une puissance (Pi) du faisceau d'illumination (12) en fonction de la valeur d'un critère d'acceptation (C1_1) résultant de l'étape iv) d'une itération précédente. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le photodétecteur (30) est un spectromètre Raman, le spectre acquis (S) étant un spectre Raman 15 représentatif de la particule. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le photodétecteur est un spectromètre de fluorescence, le spectre acquis (S) étant un spectre de fluorescence de la particule. 16. Dispositif (1) d'analyse d'une particule (21) comportant : 20 - une source de lumière (10) ; un support (20) destiné à recevoir une particule (21) ; - un photodétecteur (30) apte à détecter un signal de réponse, émis par la particule lorsqu'elle est illuminée par la source de lumière (10) et à en former un spectre ; - un processeur (32), configuré pour mettre en oeuvre les étapes i) à vii) du procédé objet 25 d'une quelconque des revendications précédentes, à partir d'une pluralité de spectres élémentaires (Si,Si) acquis par le photodétecteur, pour former un spectre (S) représentatif de la particule.