FR 3068987 A1 20190118 FR 1756709 A 20170713 PROCEDE DE PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE BI-PHASIQUE DE BACTERIE La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture gélosé - ci-après abrégé par « gélose » - pour cultiver les bactéries en conditions d'aérobiose. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un tube de culture de bactéries destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose, ainsi qu'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube et un procédé io de culture de bactéries aérobie ou anaérobie avec un dit milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube. Lors de l'incubation des géloses ensemencées par des cultures bactériennes en aérobiose, les inventeurs ont observé une déshydratation des géloses au bout de 72 heures d'incubation. Or, certaines bactéries ont un temps de croissance plus long, 15 supérieur à 72 heures, et qui peut aller jusqu'à 28 jours. Cette déshydratation réduit considérablement la possibilité d'une incubation longue de ces géloses empêchant ainsi les microbiologistes de réaliser des cultures de bactéries à croissance lente car la déshydratation des géloses entraine une inhibition systématique de la croissance bactérienne. En effet, lors de la déshydratation de la gélose, il y a une perte d'eau du 20 milieu de culture solide, ce qui a tendance à concentrer les éléments composants le milieu de culture tel que le sel par exemple. A une concentration trop importante, le sel tel que NaCI devient un inhibiteur car peu de bactéries sont halotolérantes. Par exemple, les bactéries halophiles peuvent tolérer une concentration de sel (NaCI) jusqu'à 200 g/L alors que les bactéries non halophiles ne peuvent tolérer qu'une 25 concentration de 5 g/L. Cette conséquence peut ainsi entrainer une inhibition de la croissance bactérienne. Ce problème de déshydratation n'intervient qu'en aérobiose car les cultures anaérobies sont cultivées dans des boites fermées hermétiquement, empêchant ainsi 30 l'évaporation et la déshydratation des milieux. Au contraire, les cultures aérobies sont 2 cultivées à l'air libre, favorisant une perte d'eau des milieux, lors de leur incubation dans des enceintes à 37°C. On entend ici par « aérobiose », une atmosphère d'incubation qui est de l'air ou qui contient de l'oxygène à teneur réduite par rapport à l'air. 5 Dans W02014/064359. et W02015/162377, on a décrit des milieux de culture enrichis en agents antioxydants à savoir l'acide urique, l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium qui permettent d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes : - les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et - les bactéries microaérophiles du type citées ci-dessus. Parmi les bactéries à croissance lente, on peut citer par exemple Mycobacterium genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tuberculosis (2-3 semaines), Bartonella quintana (21 jours environs), Bartonella henselae (21 jours environs), Methanobrewbacter smithll (9-15 jours), ainsi que toutes les bactéries anaérobies strictes que l'on peut cultiver en aérobie (environ 5 jours minimum). Actuellement, pour éviter cette déshydratation, les laboratoires incubent les géloses en chambre humide. Pour cela, des jarres en plastiques sont utilisées et un papier imbibé d'eau est ajouté dans la jarre dans laquelle les géloses ont été mises à incuber. La jarre est fermée hermétiquement et l'humidité reste ainsi prisonnière dans la jarre. Le problème de cette technique est le cout engendré par l'achat de ces jarres ainsi que place qui leur est consacré dans les étuves, ce qui peut être pénalisant lorsqu'il y a beaucoup de géloses à incuber. Pour pallier à cette déshydratation des milieux lors de leur incubation en aérobie, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet de réhydrater en 3 permanence la gélose. Pour cela, les inventeurs ont élaboré un milieu de culture biphasique comprenant une gélose inclinée superposée à un milieu hydratant et un procédé de fabrication de cette gélose inclinée bi-phasique. On connait des milieux de culture bi-phasique mais qui sont utilisés pour 5 améliorer la croissance des mycobactéries, et ainsi diminuer le temps nécessaire pour la détection et augmenter son pourcentage de détection. Un milieu biphasique a été décrit pour la culture du complexe Mycobacterium tuberculosis [1]. Un autre milieu biphasqiue permet de détecter le complexe Mycobacterhen avhen notamment dans le sang des patients atteints du VIH [2]. La phase solide du milieu est constituée du io milieu 7H11 supplémenté en acide oléique albumine agar et la phase liquide est constituée d'un bouillon de BHI (Brain Heart Infusion). Dans les deux cas, ils comprennent un milieu liquide nutritif superposé par-dessus un milieu de culture solide ce qui empêche de réaliser une culture par ensemencement de bactérie sur milieu solide pour identifier la croissance de colonies sur milieu de culture solide. 15 Les inventeurs ont ainsi emprisonné la phase liquide hydratante du premier milieu sous la phase solide du deuxième milieu car lorsque la phase liquide est disposée dessus la phase solide, la surface libre d'ensemencement des bactéries aérobies par-dessus la gélose inclinée de la couche inférieure diminue voire disparait totalement en cas d'étalement du milieu de culture liquide sur toute la surface de la 20 gélose lors de l'inclinaison du tube de culture. Ceci empêche d'observer la croissance de colonies de la bactérie ensemencée en surface du milieu de culture solide. Par ailleurs, pour les bactéries anaérobies incubées en aérobie, la présence de liquide à la surface de la gélose et plus précisément au fond du tube, favorise une croissance de ces bactéries anaérobies dans le liquide, plutôt qu'à la surface de la gélose de la 25 deuxième couche. En effet, une certaine condition d'anaérobiose s'installe au fond du tube dans le liquide où l'oxygène est moins présent. Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles : 4 a.1) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (cd) de son axe (XX') par rapport à la verticale, et 5 a.2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, et b.1) on coule dans le récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu io de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (cd) de son axe (XX') par rapport à la verticale pour former une deuxième couche de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier 15 milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure de la dite deuxième couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient de préférence parallèlement à la surface supérieure de la première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de 20 dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie solide formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient. On comprend que : - à l'étape a.1) ou b.1), si le premier ou deuxième milieu est apte à être gélifié 25 et à l'état coulable, cela signifie qu'il contient alors au moins un agent gélifiant et qu'il se trouve à cette étape à une température à laquelle - après avoir été chauffé pour être rendu coulable - il n' a pas encore suffisamment refroidi pour prendre en masse ou devenir trop visqueux pour être coulé, et - à l'étape a.2) ou b.2), le premier ou deuxième milieu apte à être gélifié, a 30 refroidi et pris en masse de façon suffisamment visqueuse pour adhérer à la surface 5 du récipient de sorte la surface supérieure de la première couche garde une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient quelle que soit l'inclinaison du récipient; et - al et a2 sont des angles complémentaires tel que al + a2=90°, et 5 - Si à l'étape a.1), le dit premier milieu aqueux est un liquide ne contenant pas d'agent gélifiant, à l'étape a.2) il est congelé et après l'étape b.2) il redevient liquide après décongélation au bout d'un certain temps à température supérieure à la température de congélation. De façon connue, un milieu de culture gélosé ou un milieu aqueux gélifié 10 contient de 5 à 20% d'agents gélifiants. En pratique, le dit récipient contenant le premier milieu contenant un agent gélifiant le cas échéant est soumis à un autoclavage en le chauffant à une température 121°C pendant 15 min qui permet de le stériliser et lui confère cette propriété de gélification lors du refroidissement après coulage à 56°C. 15 Selon la présente invention, on a découvert que la première couche de premier milieu aqueux liquide a pour effet une réhydratation progressive au cours du temps de la deuxième couche de milieu de culture solide selon le but de la présente invention. Aux étapes a.1) et b.1), l'inclinaison du récipient permet : 20 - d'une part de garantir une épaisseur uniforme de la deuxième couche et donc une réhydratation homogène de celle-ci, et - d'autre part, augmenter la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche et donc améliorer sa réhydratation par celle-ci, et - enfin, offrir une plus grande surface de travail apte à être ensemencée par 25 des bactéries à cultiver sur la surface libre inclinée de la deuxième couche. On comprend que l'axe dudit récipient s'entend d'un axe de symétrie des parois latérales du récipient en élévation par rapport au fond, de préférence le dit récipient étant un récipient à fond plat et les parois latérales du récipient sont en 6 élévation perpendiculairement au fond plat du dit récipient comme l'axe du dit récipient. On peut citer en particulier comme récipient de culture, un récipient de forme telle que la surface de contact de la deuxième couche avec les parois du récipient est 5 supérieure, de préférence au moins le double par rapport à : (a) d'une part, la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche, et/ou (b) d'autre part, la surface de contact de la première couche avec les parois du récipient. 10 Sur des boites de Pétri, cette condition n'est pas vérifiée. On peut citer en particulier comme récipient de culture qui permette d'obtenir une gélose inclinée, tout récipient de préférence cylindrique et à fond plat, plus long que large, c'est à dire dont les parois latérales sont plus hautes que la largeur de la paroi de fond au-dessus de laquelle elles s'étendent. 15 Plus particulièrement, aux étapes a.1) et b.1), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre de la deuxième couche s'étend depuis le fond dudit récipient jusqu'à proximité du bord supérieur du récipient. 20 Ceci permet que la surface de contact du deuxième milieu avec le récipient soit supérieure à celle du premier milieu et qu'ainsi l'adhérence de la deuxième couche solide sur les parois du récipient soit suffisante pour garantir que le premier milieu liquide ne déborde par-dessus la deuxième couche du dit milieu de culture en cours d'utilisation. 25 Plus particulièrement encore, ledit récipient est un tube et aux étapes a.1) et b.1), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu est de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe (XX') du tube d'un angle al de 50 à 75° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure de la deuxième couche solide après l'étape b.2) d'un angle ce de 15 à 40° par rapport à l'axe du tube. 7 Ces quantités des premier milieu et deuxième milieu et angle d'inclinaison permettent en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond du tube jusqu'à proximité du bord supérieur du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 à 50 mL et de 14 à 20 cm de hauteur et 1.5 à 2.5 cm de diamètre. 5 De préférence, les surfaces supérieures des deux couches de milieux ont le même angle d'inclinaison respectivement par rapport à la verticale et à l'horizontale. Ceci permet d'obtenir une épaisseur constante de la deuxième couche et ainsi éviter que la gélose supérieure ne s'affaisse du fait d'un poids localement excessif vis-à-vis de la quantité relativement réduite de liquide de la couche inférieure. 10 Dans un mode de réalisation, le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant. A l'étape a.2), ce premier milieu ne contenant pas de gélifiant est congelé à l'azote liquide à -196°C ou à -80°C, la congélation est tellement importante, de sorte que le temps que le deuxième milieu soit coulé et se solidifie, la première couche congelée n'a pas le 15 temps de fondre. Selon un autre mode de réalisation, le dit premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie. Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de 20 croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. Ainsi, en plus d'hydrater le deuxième milieu, cela permet de lui apporter les nutriments et/ou facteurs de croissance qui ont pu être consommés par les bactéries sur la gélose. Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu contenant un 25 (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. Plus particulièrement encore, le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) 30 confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la 8 température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse. Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa-carraghénane, de 5 préférence avec l'amidon, K2HPO4 et CaCl2, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme deuxième agent gélifiant. Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) lo deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar. La présente invention a également pour objet un milieu de culture biphasique contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture 15 de bactérie, de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé de préparation selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend : - une première couche d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée d'un 20 angle al par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et - une deuxième couche d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée par rapport à 25 l'axe (XX') du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de dite bactérie en conditions d'aérobiose. La présente invention a également pour objet un procédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture biphasique 30 conditionné dans un dit récipient selon l'invention dans lequel on ensemence la 9 surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, avec une dite bactérie en conditions d'aérobiose, puis laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe (XX') disposé verticalement. D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lumière 5 de la description détaillée des exemples de réalisations suivants. La figure 1 représente schématiquement un tube de culture rempli d'un milieu de culture diphasique selon l'invention. Les inventeurs ont utilisé des tubes en verre stérile (tube à essai) standard à fond plat 20 mL et de 14.5 cm de hauteur (L) et 1.6 cm de diamètre (d) de chez Bio- 10 rad (France) ou Bolium (France) comme support de leur milieu de culture. Si les tubes sont achetés stériles, les inventeurs peuvent couler leur milieu directement dans ces tubes. En revanche, si les tubes ne sont pas stériles, les inventeurs devront les autoclaver à vide à une chaleur de 134°C pendant 18 minutes dans des emballages poreux. 15 Exemple 1 Pour fabriquer une gélose bi-phasique, les inventeurs ont réalisé les étapes suivantes: 1) 2 mL d'un premier milieu de culture liquide 1-1 sont versés au fond 2a de tubes en verre stériles 2. Ce milieu de culture liquide est mis à congeler à - 20 80°C durant 10 min, l'axe >O(' du tube étant incliné de 60°par rapport la verticale Yr avec la surface libre du milieu de culture horizontale, de façon à obtenir une solidification sous forme inclinée du milieu de culture liquide (figure 1). 2) 10 mL d'un deuxième milieu de culture gélosé 1-2, comprenant les mêmes composants que le premier milieu mais étant supplémenté en agar, sous 25 forme solide a été autoclavé à 121°C pendant 15 minutes, puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant une première couche 1-1 du premier milieu de culture congelé, le tube étant incliné également de 60°par rapport la verticale Yle comme à l'étape 1). Les tubes ne sont pas refermés avec un bouchon 2c immédiatement après le coulage de la gélose. En effet, on attend que la gélose du 10 deuxième milieu ait pris en masse et que la condensation, due à la chaleur dégagée par le deuxième milieu de culture lors de son coulage, ait disparu. On obtient ainsi une deuxième couche 1-2 gélose bi-phasique dont la surface supérieure libre la de la deuxième couche 1-2 du dit deuxième milieu de culture solide est de a2 = 300 par 5 rapport à l'axe >OC du tube, comme montré figure 1. En effet, la congélation à -80°C du premier milieu de culture liquide permet d'obtenir une congélation assez importante du liquide pour que celui-ci ne se liquéfie pas immédiatement lors du coulage de la gélose chaude du deuxième milieu de culture. D'autre part, ces volumes de premier et deuxième milieu et cet angle 10 d'inclinaison permet en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond 2a du tube jusqu'à proximité du bord supérieur 2b du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 mL et de 14,5 cm de hauteur et 1.6 cm de diamètre. L'obtention de la gélose bi-phasique permet d'avoir une hydratation 15 permanente du milieu de culture et ainsi une croissance optimale des bactéries ensemencées sur ce milieu de culture. Pour la congélation du premier milieu de culture liquide, au lieu de le congeler pendant 10 minutes à une température de moins 80°C, on peut le solidifier dans de l'azote liquide à -196°C. Ce processus prend moins de temps puisque la congélation 20 a lieu en environ 1 minute. Pour cela, le tube en verre stérile est introduit en position inclinée dans l'azote liquide, et est ressorti environ 1 min plus tard. La deuxième étape, qui consiste à couler le deuxième milieu de culture solide sur cette première base reste la même que celle explicitée précédemment. Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants 25 suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Les bactéries lentes, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et 30 un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche. 11 En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu. a) Milieu Columbia 5 - Caséine hydrolysate (Tryptone) 10 g (1 0/0) - Extrait de levure 5 g (0,5 °/0) - Proteose peptone 5 g (0,5 °/0) - Tryptic Digest of Beef Heart 3 g (0,3 °/0) - L-cystéine 0,1 g (0,01%) 10 - Glucose 2,5 g (0,25 °/0) - NaCI 5 g (0,5 °/0) - Sulfate de magnesium (Mg504) 0,1 g (0,01 °/0) - Sulfate de fer (Fe504) 0,02 g (0,002 °/0) - Carbonate de sodium (Na2CO3) 0,6 g (0,06 °/0) 15 - Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane 0,83 g (0,083 °/0) - Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane HCI 2,86 g (0,286 °/0) - (Agar 15 g (1,5 °/0)) b) Milieu Schaedler: - Peptone trypticase-soja 20 - Peptone - Extrait de levure - Chlorhydrate de cystéine - Hémine - Glucose 25 - Tampon TRIS - (Agar 10,0 g (1%) 5,0 g (0,5 °/0) 5,0 g (0,5 °/0) 0,4 g (0,04 °/0) 0,01 g (0,001 °/0) 5,0 g (0,5 °/0) 0,75 g (0,075 °/0) 13,5 g (1,35 °/0)) Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries lentes suivantes est repiquée sur le dit milieu et la gélose est mise à incuber à 37°C : Mycobacterium 30 genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tuberculosis (2-3 semaines), Bartonella quintana (21 jours environs), Bartonella henselae (21 jours environs), Methanobrewbacter smithll(9-15 jours). Exemple 2 La phase de congélation du premier milieu de culture liquide dans les tubes en 35 verre stérile, que ce soit par le procédé de congélation à -80°C ou par le procédé de 12 congélation à l'azote liquide, n'est pas facilement réalisable par un industriel, dans un but de commercialisation. Pour pallier cet inconvénient, les inventeurs ont testé la mise en oeuvre d'un premier milieu comprenant d'autres gélifiants que le deuxième milieu de culture, avec un pouvoir de rétention d'eau moindre que celui de l'agar afin 5 de permettre ainsi d'hydrater la gélose, tout en ayant une légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu. Dans ce but, les inventeurs ont testé comme autre gélifiant du premier 10 milieu : la gomme kappa-carraghénane. La composition des premiers gélifiants (gélifiant du premier milieu) est la suivante, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L: - Kappa-carraghénane : 4 g (0,4%) - PO K 1-1 .-2-. -4 . 0,83 g (0,083%) 15 - CaCl2 : 0,1 g (0,01%) - Amidon : 5 g (0,5%). K2HPO4, CaCl2 et l'amidon permettent une meilleure prise en masse de la gomme kappa-carraghénane. Ce mélange est autoclavé avant d'être coulé à une 20 température d'environ 56°C. Le coulage des premier et deuxième milieux à 56°C est avantageux car les milieux ne gélifient qu'à 40°C pour le kappa-carraghénane et respectivement 35°C pour l'agar on reste en deçà de la température de fusion du premier milieu contenant kappa-carraghénane qui est supérieure à 65°C, la température de fusion du 25 deuxième milieu contenant l'agar étant de 90°C . En terme quantitatif, on met 15 g/L d'agar dans un milieu solide dont alors que pour avoir une gélification comparable, il faut 8 g/L de gomme kappacarraghénane. Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud, en 13 pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après. Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar 5 comme gélifiant, a été autoclave puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au deuxième gélifiant qu'est l'agar. 10 Les autres conditions et paramètres de mise en oeuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1. Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue de la gélose du deuxième milieu de 15 culture solide par relargage d'eau par les premiers gélifiants du premier milieu de culture. Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont ainsi permis d'avoir une hydratation continue de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que 20 ceux décrits à l'exemple 1. Exemple 3 Les inventeurs ont testé la mise en oeuvre d'un premier milieu comprenant le même gélifiant que le deuxième milieu de culture, mais à une concentration moindre pour permettre ainsi d'hydrater la gélose du deuxième milieu, tout en ayant une 25 légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu. Dans ce but, les inventeurs ont testé des concentrations d'agar du premier milieu allant de 2.5 à 5 g/L d'agar. Ils ont obtenu une gélification mais beaucoup 14 moins dure que lorsqu'ils ont mis une concentration plus élevée d'agar du deuxième milieu de 15 g/L d'agar. Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud à 56°C, en pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une 5 première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après. Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar comme gélifiant, a été autoclavé puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du 10 mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au gélifiant qu'est l'agar. Les autres conditions et paramètres de mise en oeuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1. 15 Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue de la gélose du deuxième milieu de culture solide par relargage d'eau par les gélifiants du premier milieu de culture. Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont 20 ainsi permis d'avoir une hydratation continue de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que ceux décrits à l'exemple 1. Exemple 4 Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants 25 suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Lors de l'ajout d'antioxydants à la recette de base de ces milieux, permet la culture de certaines bactéries anaérobie strictes en aérobiose. Les bactéries anaérobies cultivées en aérobie, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se 15 déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche. En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux 5 biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu. a) Milieu Columbia - Caséine hydrolysate (Tryptone) 10 g (1 0/0) - Extrait de levure 5 g (0,5 °/0) 10 - Proteose peptone 5 g (0,5 °/0) - Tryptic Digest of Beef Hear 3 g (0,3 °/0) - L-cystéine 0,1 g (0,01%) - Glucose 2,5 g (0,25 °/0) - NaCI 5 g (0,5 %) 15 - Sulfate de magnesium (Mg504) 0,1 g (0,01%) - Sulfate de fer (Fe504) 0,02 g (0,002 °/0) - Carbonate de sodium (Na2CO3) 0,6 g (0,06 °/0) - Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane 0,83 g (0,083 °/0) - Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane HCI 2,86 g (0,286 %) 20 - (Agar 15 g (1,5 °/0)) b) Milieu Schaedler: - Peptone trypticase-soja 10,0 g (1 °/0) - Peptone 5,0 g (0,5 °/0) - Extrait de levure 5,0 g (0,5 %) 25 - Chlorhydrate de cystéine 0,4 g (0,04 °/0) - Hémine 0,01 g (0,001%) - Glucose 5,0 g (0,05%) - Tampon TRIS 0,75 g (0,075%) - (Agar 13,5 g (1,35 °/0)) 30 Antioxydants ajoutés à chacun de ces milieux : - Acide ascorbique 1 g (0,1 °/0) - Acide urique 0,4 g (0,04 °/0) - Glutathion 0,1 g (0,01%) - Na2S 0,5 g (0,05%) 16 Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries anaérobies cultivées en aérobie suivantes est repiquée sur le dit milieu gélosé et le tube est mis à incuber à 37°C sous atmosphère d'air : Clostndkim masstlioamazonfense, Ftnegoldia magna, Clostndkim irregulare, Clostndkim butricum ou encore Propiontbacterium acnes. 5 On observe la croissance de colonies bactériennes en surface de la gélose. 17 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Evaluation of a Novel Biphasic Culture Medium for Recovery of Mycobacteria: A Multi-Center Study. Zhenling Cui et al. Plos one. April 27, REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique (1) conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube de culture de bactéries (2), destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles : a.1) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (al) de son axe (XX') par rapport à la verticale, et a.2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche (1-1) du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse, telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube, et b.1) on coule dans ledit récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée (al) de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale pour former une deuxième couche (1-2) de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure (1a) de la dite deuxième couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, de préférence parallèlement à la surface supérieure de la première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'aux étapes a.1) et 30 b.1), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier 19 milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre (1a) de la deuxième couche s'étend depuis le fond (2a) du récipient jusqu'à proximité du bord supérieur (2b) du récipient. 5 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'aux étapes a.1) et b.1), le dit récipient est un tube (2), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe (Xe) du tube d'un angle a2 de 50 à 75° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure (1a) de la deuxième couche solide (1-2) après l'étape b.2) d'un angle al 10 de 15 à 40° par rapport à l'axe (XX') dudit tube. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit 15 premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. 20 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu contenant un (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. 25 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que et le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse. 20 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa-carraghénane, de préférence avec l'amidon, K2HP et CaCl2, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme 5 deuxième agent gélifiant. 10. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou io des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar. 11. Milieu de culture biphasique (1-1 - 1-2) contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube (2) de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé 15 en ce qu'il comprend : - une première couche (1-1) d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et 20 - une deuxième couche (1-2) d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée (al) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de 25 dite bactérie en conditions d'aérobiose. 12. Procédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture conditionné dans un dit récipient selon la revendication 11 dans lequel on ensemence la surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, en conditions d'aérobiose, avec une dite bactérie, puis 21 laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe ()OE') disposé verticalement.