FR 3068696 A1 20190111 FR 1756385 A 20170706 L'invention concerne le domaine technique des complexes de lanthanide. En particulier, l'invention concerne des complexes de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, et complexant un ion lanthanide, des agents chélatants correspondants, ainsi qu'un procédé de détection d'une biomolécule à l'aide dudit complexe de lanthanide. Certains complexes de lanthanide luminescents présentent des propriétés spectroscopiques remarquables (bandes d'émission fines caractéristiques d'un métal donné et à longue durée de vie), et sont, de ce fait, des composés à très fort potentiel pour des applications en imagerie biologique (S.V. Eliseeva, J.-C. G. Bfinzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189). Ces composés luminescents peuvent être utilisés seuls pour des applications en imagerie par microscopie de fluorescence mono- ou biphotonique, ou bien en conjonction avec un fluorophore approprié pour réaliser des expériences de FRET (Rirster/Fluorescence Resonant Energy Transfer). Dans ce dernier cas, les complexes de lanthanide sont généralement sous la forme d'un complexe conjugué à une biomolécule. Ces deux techniques peuvent éventuellement être résolues en temps 15 grâce à la durée de vie longue des lanthanides, ce qui constitue un avantage important pour améliorer la détection, en s'affranchissant de signaux de fluorescence parasites à durée de vie courte (C. P. Montgomery B. S. Murray, E. J. New, R. Pal, D. Parker, Acc. Chem. Res. 2009, 42, 925 ; E. G. Moore, A. P. S. Samuel, K. N. Raymond, Ace. Chem. Res. 2009, 42, 542). De tels composés de lanthanide luminescents ont déjà été décrits dans la littérature, et 20 certains sont même commercialisés par Cisbio Bioassays, PerkinElmer ou Invitrogen. Ces dernières années, des complexes de lanthanide fonctionnalisés ont été développés, afin d'optimiser leurs propriétés spectroscopiques, de déplacer leur absorption vers le visible, optimiser leur absorption biphotonique, et améliorer leur solubilité en milieu aqueux. En particulier, le document WO 2005/058877 décrit des complexes de lanthanide basés sur 25 des cycles 1,4,7-triazacyclononane (TACN) dont trois atomes d'azote sont substitués par des chromophores constitués d'un dérivé de pyridine éventuellement substitué par un groupe réactif, afin de faciliter la conjugaison avec des biomolécules. L'objectif est de fournir des complexes fortement fluorescents, stables et facilement greffables à une biomolécule. Ce document décrit notamment un complexe de terbium de type TACN dont les trois atomes d'azote sont substitués 3{) par un groupe 2-carboxylate-4-(2,4,6-triméthoxyphényle)-pyridine (composé 22), mais n'indique pas la brillance mesurée pour ce composé. Par ailleurs, certains des inventeurs ont précédemment décrit des complexes de terbium basés sur des cycles 1,4,7-triazacyclononane (TACN) dont trois atomes d'azote sont substitués par des clu-omophores constitués d'un dérivé de pyridine (V. Placide, A. T. Bui, A. Grichine, A. Duperray, D. Pitrat, C. Andraud, O. Maury, Dalton Trans. 2015, 44, 4918). Ce document décrit 2 en particulier un complexe de terbium de type TACN dont les trois atomes d'azote sont substitués par un groupe 2-carboxylate-4-(4-méthoxyphényle)-pyridine, qui a une absorption intense, mais un rendement quantique et une brillance faibles. Il subsiste donc un besoin de complexes de lanthanide présentant une bonne brillance, et en 5 particulier lorsqu'ils sont excités dans la gamme spectrale d'intérêt de 330 nm à 350 nm, et plus particulièrement aux alentours de 337 nm (longueur d'onde correspondant aux sources laser souvent utilisées dans les dosages biologiques). La structure des complexes selon l'invention rend possible des variations chimiques pen-nettant d'obtenir avantageusement une bonne solubilité et une bonne stabilité en milieu biologique, et permettant un greffage aisé sur une 10 biomolécule. La brillance est définie comme le produit de l'absorption à la longueur d'onde d'intérêt et du rendement quantique d'émission, et correspond à la quantité de lumière effectivement disponible pour l'expérience d'imagerie et/ou de FRET. Une brillance optimale permet d'optimiser le rapport signal/bruit, et donc d'augmenter la sensibilité de la détection et/ou de 15 réduire la quantité de chromophore utilisé. Les Demandeurs proposent de nouveaux complexes de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, complexant un ion lanthanide Ln3+ choisi parmi le terbium et le dysprosium, l'agent chélatant comprenant au moins un groupe de structure (B) suivante : R1 (B) dans laquelle : -R1 représente un hydrogène, un groupe -R6, ou un groupe électrodonneur -El, -R2 représente un hydrogène, un groupe -R7, ou un groupe électrodonneur -E2, -R3 représente un hydrogène, un groupe -R8, ou un groupe électrodonneur -E3, -R4 et -R5, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un hydrogène ou un groupe -R9 ou -0R9, -M, -E2 et -E3 sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes -0R10, -SR10, -NH(CO)R10, -NH(C 0)NR1OR' 10, -NH(CS)NR1OR' 10 et -NH(CS)NHR10, 3 -R6, -R7, -R8, -R9, -R10 et R'10 identiques ou différents, représentent indépendamment les uns des autres un groupe (C1-C6) alkyle, éventuellement substitué par un groupe -X1 ou un groupe -Y, -X1 est un groupe réactif, 5 -Y est un groupe hydrosolubilisant, étant entendu que : o au moins l'un des substituants -R2 et -R3 n'est pas un hydrogène, o un seul des groupes -R1, -R2 et -R3 représente un groupe électrodonneur, o ledit agent chélatant comprend au plus un groupe réactif. 10 Les complexes de l'invention sont luminescents. La luminescence correspond à une émission de lumière consécutive à un apport d'énergie, en particulier un apport de lumière. Cet apport en énergie fait passer des atomes ou molécules dans un état « excité » se situant à une énergie supérieure à celle qu'ils possèdent dans leur état normal dit « fondamental ». C'est lors du retour à leur état fondamental qu'ils peuvent émettre de la lumière. De manière générale, les 15 complexes de lanthanide sont sensibilisés par effet d'antenne et la nature de l'antenne organique contrôle l'absorption de la lumière et permet d'optimiser la luminescence du lanthanide (S. V. Eliseeva, J.-C. Bünzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189). Les complexes selon l'invention ont l'avantage d'avoir une brillance élevée, notamment due à un rendement quantique très élevé, en particulier en milieu hydrophile et notamment en 20 milieu aqueux. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que l'amélioration du rendement quantique, et l'optimisation de la brillance, des complexes de l'invention est due à la combinaison des effets électroniques et stériques des antennes (i.e. des groupes (B)). La présence d'un seul groupe électrodonneur permet d'améliorer significativement le rendement quantique. Ainsi, de manière surprenante, notamment par rapport au document 25 WO-2005/058877, les inventeurs ont observé une chute drastique du rendement quantique lorsque plusieurs groupes électrodonneurs sont présents, comparé à un même complexe ne comportant qu'un seul groupe électrodonneur. De plus, il apparait que l'introduction de groupements en position R2 et/ou R3 petniet vraisemblablement d'éviter la rotation interne de l'antenne autour de la liaison pyridine-phényle qui contribue à augmenter les désexcitations non radiatives et conduit à une diminution du rendement quantique. Ainsi, l'encombrement stérique des groupes -R2 et/ou -R3, qui ne sont pas tous les deux des hydrogènes dans les complexes de l'invention, bloquerait cette rotation et serait donc important pour la brillance finale du complexe. Par ailleurs, les complexes selon l'invention peuvent être pourvus d'un groupe réactif, pour être éventuellement conjugués par une liaison covalente à une molécule d'intérêt, telle qu'une 4 biomolécule. Les complexes selon l'invention peuvent également être pourvus d'un ou plusieurs groupes hydrosolubilisants, ce qui permet alors d'améliorer leur solubilité en milieu hydrophile, et en particulier en milieu aqueux. Dans le cadre de l'invention, on entend par « alkyle » une chaîne hydrocarbonée saturée, 5 qui peut être linéaire ou ramifiée. A titre d'exemples de groupes alkyles comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso-butyle, tert-butyle, sec-butyle, n-pentyle, iso-pentyle, tert-pentyle, neo-pentyle, sec-pentyle, et n-hexyle. De manière préférée dans le cadre de l'invention, le lanthanide Ln est le terbium. Les 10 complexes de terbium sont en effet très lumineux. Avantageusement, les complexes de lanthanide selon l'invention comprennent un groupe réactif, noté -X, -X1 ou -X2, permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule. D'après la définition même de l'agent chélatant formant le complexe, un seul groupe réactif peut être présent. 15 Par « groupe réactif », on entend un groupe comprenant une fonction qui permet un greffage covalent sur une fonction susceptible de réagir et présente sur une biomolécule (amine, alcool, thiol, acide carboxylique, insaturation...). Les différentes fonctions permettant une telle bio-conjugaison sont bien connues de l'homme de l'art et sont décrites, par exemple, dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, 1996, 137-166. 20 Par « biomolécule », on entend les molécules d'intérêt biologique qu'il peut être avantageux de marquer grâce à un complexe luminescent. A titre d'exemple de biomolécules, on peut citer les protéines, les peptides, les anticorps, les antigènes, les brins d'ADN, la biotine et la streptavidine. Les protéines sont les biomolécules qui seront le plus souvent liées aux complexes de l'invention. 25 Dans le cadre de l'invention, le groupe réactif peut être choisi parmi -COOH, un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldhéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester 30 d'hydroxysuccinimidyle, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule : 5 0 H2}NCS H v w 0 eN) (CH2)NH2 H v w 0 eN) H2}S H H v w 0 N ) (C H2) N - Ar H v wH 0 eNt-(C H2}NCO J"L 0 eN)H2}S-S-Ar H v w 0 0 -eN) (CH2}N H v 0 0 CI )LN-(C H2)- N N H wH N-4 CI 0 S03- O-N H v w 0 0 0 -CH =C H I-Y v w 0 N3 w ^ v 0 NCS NCO 0 N)(oH H v -)LN) (C1-12)-4, H w 0 0 dans lesquels w est un entier appartenant à la gamme allant de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène ; les groupes réactifs choisis parmi -COOH, 5 -NH2, les esters de succinimidyle, les haloacétamides, les azides, les hydrazines, les isocyanates et les maléimides étant préférés. De préférence, les complexes selon l'invention comprennent au moins un et au maximum 15 groupes hydrosolubilisants, notés -Y, et avantageusement au moins 2, et de préférence de 2 à 9 groupes hydrosolubilisants, en particulier de 2 à 5, et de préférence 2 ou 3. 10 Par « groupe hydrosolubilisant », on entend un groupe qui comprend une fonction qui permet d'améliorer la solubilité en milieu hydrophile. Dans le cadre de l'invention, le ou les groupes hydrosolubilisants -Y peuvent être choisis parmi les groupes -SO3-, -000-, sulfobétaine et -0-[(CH2)2-0]11-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3. Selon un mode de réalisation préféré, le ou les groupes 15 hydrosolubilisants sont choisis palud les groupes -0-[(CH2)9-0],n-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3. Par « sulfobétaïne », on entend un groupement bétaine comportant une fonction -S03- en tant que fonction porteuse de la charge négative. Un groupe bétaïne est défini comme un groupement zwittérionique dans lequel l'atome portant la charge positive ne porte pas d'atome 20 d'hydrogène et n'est pas adjacent à l'atome porteur de la charge négative. Dans le cadre de l'invention, on entend par sulfobétaïne, par exemple, les groupements zwittérioniques associant un cation ammonium, ou iminium aromatique, généralement pyridinium, imidazollium, et un groupement anionique de type sulfonate. Le cation et l'anion sont espacés par au moins un 6 ehainon CH,, et de préférence par une chaine alkyle bivalente (également nommé alkylène) comprenant de 1 à 4, voire de 1 à 6, atomes de carbone. A titre d'exemple de groupe sulfobétaïne, on peut citer les groupes de foimule : --- 12. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24h. Un suivi LC-MS permet d'observer la déprotection complète des esters méthyliques. Le produit est utilisé pour la complexation sans purification supplémentaire. HRMS (EST) calculée 5 pour C54H58N909 976.4352. Exp 976.4306 [M+H] ; tR= 6.24 min (méthode HPLC-MM-ACN, It0/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). OPeg Composé 7d OPeg 7d 6d (38.7 mg, 0.028 mmol) est dissout dans le tetrahydrofurane (3 mL) et NaOH 1M (3 mL) est ajouté jusqu'à pH 14. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante 10 pendant 6h30. Le suivi par spectrométrie de masse montre la disparition du produit de départ. Le mélange est utilisé pour l'étape de complexation sans purification supplémentaire. HRMS (ES!) calculée pour C75H98N6018 667.3463. Exp 667.3461 [M+2F1]2+ ; tR= 9.57 min (méthode HPLC-ESI-ACN, H20/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). OMe Me0 o Complexe la.! OMe Ia.1 13 Le ligand 6a (70 mg, 0.075 mmol) est dissout dans THF (10 mL) puis NaOH 1M (5 L) est ajouté et la solution est agitée à température ambiante pendant 1h30. Le pH est ensuite ajusté 42 à pH 4 avec HC1 1M (5 L) et le mélange est concentré sous vide. Le milieu est dilué avec Me0H puis le pH est ajusté à pH 8-9 à l'aide d'une solution de Na2CO3sat. Enfin, TbC13.6H20 (84 mg, 0.224 rnmol) est ajouté et le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 72h. Le milieu est concentré sous pression réduite puis le complexe est précipité avec 5 ajout d'Hl() (2 x) et centrifugé pour obtenir un solide blanc correspondant au complexe de terbium(III) (79 mg, quant.). HR1VIS (ES!) calculée pour C511-153N609Tb 526.1558. Exp 526.1557 [M+2H]. Cale pour C511-152N609Tb 1051.3044. Exp 1051.3011 [M+H]t OPeg OPeg Complexe la.2 Ia.2 Le ligand 6b (50 mg, 0.038 mmol) est solubilisé dans Me01-1 (5 mL) puis NaOH 1M 10 (2 L) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant lh. Puis le pH est ajusté à pH 3-4 avec HC1 1M, puis à pH -7 avec Na2CO3sat. TbC13.6H20 (21 mg, 0.056 mmol) est ajouté et la solution est laissée à température ambiante pendant une nuit. Après concentration sous pression réduite, le mélange est purifié par extractions/lavages avec DCM/H20, et la phase organique évaporée pour donner le produit sous forme d'un solide jaune 15 pâle (55 mg, quant.). HRIVIS (EST) calculée pour C69H87N6Na.2018Tb 746.2557. Exp 746.2565 [M+2Na]2 ; tR= 9.65 min (méthode HPLC-MM, H90/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). N- OPeg 43 HN NH Complexe Ia.3 la.3 Le pH de la solution de 7c est ajusté à pH 6 par ajout d'une solution de HC1 1M puis TbC13.6H20 est ajouté à température ambiante. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 48h puis le THF est évaporé sous pression réduite. Le précipité formé est centrifugé 5 dans H/0 (3x) afin d'éliminer l'excès de sels présents puis le solide blanc est séché sous vide (43 mg, 83%). HRMS (EST) calculée pour C54H55N909Tb 1132.3371. Exp 1132.3323 [M+Hr, C54H54N909TbNa 1154.3190, Exp 1154.3133 [M+Naf ; tR= 6.67 min (méthode HPLC-MMACN, H20/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). HN 1/2(- cl N OPeg Complexe Ia.4 °Peg Ia.4 10 Le pH de la solution 7d est ajusté à pH 6 avec HC1 1M puis TbC13.6H20 (12 mg, 0.031 rnmol) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 6 jours. Le THF est ensuite évaporé et une extraction CH2C12/H20 est effectuée. Les phases organiques sont rassemblées et évaporées pour obtenir le complexe de terbium(III) pur (38 mg, 90%). HRIVIS (ES!) calculée pour C72H95N6018Tb 745.2973. Exp 745.2966 [M+2F1]2+, 44 C721194N 60 i8TbNa 756.2882. Exp 756.2882 [M+H+Na]2+ - tR= 9.64 min (méthode HPLC-ESI-ACN-365, H20/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). Complexe 8 (hors invention) o 18 Le ligand 6e (31 mg, 0.032 mmol) est dissout dans Me0H (5 mL) puis NaOH 1M (2 mL) 5 est ajouté et la solution est agitée à température ambiante pendant 2h. Le pH est ensuite ajusté à pH 3-4 avec HC1 1M (2 mL) puis à pH 7 à l'aide d'une solution de Na2CO3sat. TbC13.61-170 (18 mg, 0.047 mmol) est enfin ajouté et le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 14h. Le milieu est concentré sous pression réduite puis le complexe est précipité avec ajout d'H20 (2 x) et centrifugé. Puis le solide obtenu est de nouveau précipité dans Et20 et 10 centrifugé pour obtenir un nouveau précipité blanc correspondant au complexe de terbium(III) (30 mg, 85%). MS Cale pour C511-153N6012Tb 550.1488. Exp 550.1482 [M+21-1]2+; cale pour C511-152N6Na012Tb 561.1392. Exp 561.1405 [M+H+Na]2+; cale pour C5IH5IN6Na2012Tb 572.1301. Exp 572.1323 [M+2Na]2-. Exemple 2 : Complexe de Dysprosium 1a.5 et la.6 OPeg 15 Complexe Ia.5 OPeg Ia.5 Le ligand 6h (50 mg, 0.038 mmol) est solubilisé dans Me0H (5 L) puis NaOH 1M (2 mL) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant lh. Puis le pH est ajusté à pH 3-4 avec HC1 1M, puis à pH -7 avec Na2CO3sat- Dy(NO3)3.5H20 (20 mg, 0.056 nunol) est ajouté et la solution est laissée à température ambiante pendant une 5 nuit. Après concentration sous pression réduite, le mélange est purifié par extractions/lavages avec DCM/F170, et la phase organique évaporée pour donner le produit sous forme d'un solide jaune pâle (50 mg, 92%). HRMS (ES!) calculée pour C69H87DyN6Na1018 748.7577. Exp 748.7576 [M+2Nari . OPeg Complexe I a.6 OPegIa.6 10 6d (9 mg, 0.007 mmol) est dissout dans le tetrahydrofurane (2 mL) et NaOH 1M (2 L) est ajouté jusqu'à pH 14. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 241 Le pH de la solution est ensuite ajusté à pH 6 avec HC1 1M puis DyC13.6H20 (3.2 mg, 0.008 mmol) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours. Le THF est ensuite évaporé et une extraction CH2C12/1-120 est effectuée. Les 15 phases organiques sont rassemblées et évaporées pour obtenir le complexe de dysprosium(III) pur (8 mg, 77%). HRMS (ES!) calculée pour C72H93N6018DyNa2 769.7811. Exp 769.7818 [M+2Na]2+, C72H93N6018DyNa3 520.8505. Exp 520.8521 [M+3Na]3+ ; tR= 9.57 min (méthode HPLC-ESI-ACN.365,1120/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min). 20 B. EVALUATION DES COMPLEXES Exemple 3 : propriétés spectroscopiques Les propriétés des complexes !a.1-Ia.6 et 8 ont été évaluées dans le méthanol (Tableau 1) et dans l'eau (Tableau 2). Ces propriétés ont été comparées à celles du complexe 9, décrit dans le document, Dalton Trans. 2015, 44, 4918, et de structure suivante : 46 Me0 OMe HO Me0 9 Les mesures photophysiques des complexes montrent que les complexes de terbium Ia.1-Id.4 selon l'invention ont une absorption intense dans le méthanol (Tableau 1). De plus, ces complexes possèdent des rendements quantiques très importants, et bien 5 supérieurs à celui du complexe 9 hors invention, qui ne possède pas de substituant autre que des hydrogènes en alpha de la liaison pyridine-phényle (positions R2 et R3). La forte limitation, voire la suppression, de la rotation interne autour de la liaison pyridine-phényle permet ainsi d'améliorer significativement le rendement quantique. La brillance des complexes selon l'invention est alors supérieure à celle du complexe 9. 10 Différents groupes électrodonneurs ont été testés : méthoxy, PEG ou amide. De moins bons résultats ont été observés avec un groupe amide (complexe Ia.3), en raison d'un moins bon rendement quantique, mais demeurent tout de même satisfaisants en termes de brillance. En revanche, la présence d'un second groupe électrodonneur de type méthoxy sur le groupe phényle (complexe 8) provoque une chute du rendement quantique, comparé à un groupe 15 méthyle (complexe Ia.1). L'introduction d'un second groupement méthyle a un effet majeur sur le coefficient d'extinction molaire avec une baisse de plus de 50 %. Ainsi, en dépit d'un rendement quantique excellent, la.4 présente une brillance à 330 nm inférieure à celle de son homologue Ia.2. Les propriétés spectroscopiques des complexes Ia.2 et Ia.4 sont conservées dans l'eau 20 (Tableau 2). La brillance du complexe Ia.2 est très élevée, et comparable à celle du complexe TbLumi4, issus des travaux du groupe de K. Raymond (J. Xu et al. J. Ain. Chem. Soc. 2011, 133, 19900- 19910), qui figure parmi les meilleurs complexes actuellement sur le marché (01) = 59%, E de l'ordre de 25000 L.mo1-1. cm-1 et une brillance aux alentours des 15000 L.mo1-1. cm-1). 47 La figure 1 présente le spectre d'absorption et d'émission du complexe Ia.4 dans l'eau à température ambiante. Tableau 1-propriétés photophysiques des complexes Ia.1-Ia.6, 8 et 9 mesurées dans le méthanol complexe X max E (L.mo1-1. (1) (%) T B à X max B à 330 nm (nm) cm-1) (ms) (L.mo1-1. (L.morl. cm - cm-1) 1) la.! 306 21000 74 1.33 15500 n.d. Ia.2 305 34800 74 1.32 26000 10000 Ia.3 305 34800 35 0.79 12000 5600 Ia.4 274 19000 65 1.59 12000 3400 302 13000 8500 8 (hors 325 51000 13 0.22 6600 6500 invention) Ia.5 306 n.d. 2.8 0.021 n.d. n.d. Ia.6 301 n.d. 2.6 0.020 n.d. n.d. 9 (hors 308 33000 12 n.d. 3900 n.d. invention) Tableau 2 - propriétés photophysiques des complexes Ia.2 et Ia.4-1a.6 mesurées dans l'eau complexe X max E (L.mo1-1. cm-1) T B à X, max B à 330 nm m (I) (%) (ms) (L.mo1-1. (L.mo1-1. cm- (n) cm4) 1) Ia.2 302 30400 74 1.36 23000 8900 Ia.4 275 21000 66 1.46 14000 2500 300 11800 7800 Ia.5 302 n.d. 1.8 0.017 n.d. n.d. Ia.6 300 n.d. 2.5 0.028 n.d. n.d. Les complexes de Dysprosium Ia.5 et Ia.6 présentent également des propriétés photophysiques remarquables, dans le méthanol et dans l'eau. Ces complexes sont parmi les complexes les plus brillants rapportés dans la littérature. La figure 2 présente le spectre d'absorption et d'émission du complexe Ia.6 dans un mélange méthanol/éthanol à température ambiante. 10 Exemple 4 : imagerie cellulaire Le complexe Ia.2 a montré un intérêt important en imagerie par microscopie de fluorescence à un ou deux photons. La figure 3 représente des images de cellules fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.2 (concentration = 10-5 mol.L-1, excitation biphotonique, = 720 nm), qui montre bien son internalisation dans la cellule. Les spectres d'émission 1_5 confirment la présence de Ia.2 à l'intérieur de la cellule et non dans le tampon. La figure 4 représente des images de cellules T24 fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.5 (concentration = 10-5 mol.L-1, excitation biphotonique, Xex = 720 nm). De même que pour le complexe Ia.2, l'internalisation du complexe Ia.5 dans la cellule est confirmée par les spectres d'émission. REVENDICATIONS1. Complexe de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, complexant un ion lanthanide Ln3+, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi le terbium et le dysprosium et en ce que l'agent chélatant comprend au moins un groupe (B) de structure suivante : R1 (B) dans laquelle : -R1 représente un hydrogène, un groupe -R6, ou un groupe électrodonneur -El, -R2 représente un hydrogène, un groupe -R7, ou un groupe électrodonneur -E2, -R3 représente un hydrogène, un groupe -R8, ou un groupe électrodonneur -E3, -R4 et -R5, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un hydrogène ou un groupe -R9 ou -0R9, - -El, -E2 et -E3 sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes -0R10, -SR10, -NH(CO)R10, -NH(CO)NR1OR'10, -NH(CS)NR10 R'10 et -NI-1(CS)NHR10, -R6, -R7, -R8, -R9, -R10 et R'10 identiques ou différents, représentent indépendamment les uns des autres un groupe (C1-C6) alkyle, éventuellement substitué par un groupe -X1 ou un groupe -Y, - -X1 est un groupe réactif, -Y est un groupe hydrosolubilisant, étant entendu que : o au moins l'un des substituants -R2 et -R3 n'est pas un hydrogène, o un seul des groupes -RI, -R2 et -R3 représente un groupe électrodonneur, o ledit agent chélatant comprend au plus un groupe réactif. 2. Complexe de lanthanide selon la revendication 1 choisi parmi les complexes de lanthanide de formule (I) : 49 Chrom1 \ 3+ Ln N Chrom2 N Chrom3 (I) dans lesquels : Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy, - -A- représente -CH2- ou -CH(LA-X2)-, 5 -LA- est une liaison covalente, ou un groupe (C1-C20) alkylène, linéaire ou ramifié, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons, et éventuellement substitué par un à trois groupes -S03H, ou -LA- est un groupe (C5-C8) cycloalkylène ou un groupe (C6-C14) arylène, -X2 est un groupe réactif, 10 -Chroml, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques ou différents et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B1) : R1 R4 R5 R2 R3 ,0 ° (B1) -121, -R2, -R3, -R4, et -R5 sont tels que définis à la revendication 1, -Z- représente -C- ou -P(Rz)-, et 15 - -Rz représente un groupe phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, iso-butyle ou tert-butyle, et de préférence un groupe phényle ou méthyle, - étant entendu que si -A- est -CH(LA-X2)-, alors aucun des groupes -Chroml, -Chrom2 et -Chrom3 de formule (B1) ne comprend de groupe -Xl. 3. Complexe de lanthanide selon la revendication 2, caractérisé en ce que -A- représente 20 -CF12- et -Z- représente -C-. 4. Complexe de lanthanide selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que -Chroml, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques, avec de préférence : - -R1 représentant un groupe électrodonneur -El tel que défini à la revendication 1, notamment choisi panai les groupes -0R10 et -NH(CO)R10, -R10 étant tel que 25 défini à la revendication 1, de préférence -R1 représente -0Me ou -OPEG, 50 -R2 étant un groupe -R7 tel que défini à la revendication 1, de préférence -Me, et -R3 étant un groupe -R8 tel que défini à la revendication 1, et notamment -Me, ou, de préférence, un hydrogène. 5. Complexe de lanthanide selon la revendication 2 ou 3 dans lesquels : 5 -A- représente -CH2-, - -Chroml et -Chrom2 sont identiques et sont de structure (B2) : R11 R41 R5 1 R21 R3 1 avec -R11, -R21, -R31, -R41, -R51 et -Z1- tels que définis respectivement pour R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans l'une des revendications 1 à 3, étant entendu que 10 Chroml et -Chrom2 ne comprennent pas de groupe réactif, et - -Chrom3 est différent de -Chroml et de -Chrom2 et est de structure (B3) : - (B3) - avec -R12, -R22, -R32, -R42, -R52 et -Z2- tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans l'une des revendications 1 à 3, 15 étant entendu que -Chrom3 comprend un groupe réactif, et de préférence : -R11 est un groupe -0(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -Y, - -R12 est un groupe -0(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -Xi, - -R21 et -R22, identiques ou différents, représentent un groupe -R7 tel que défini à la 20 revendication 1, et sont de préférence identiques et représentent, préférentiellement, un groupe (Cl -C6) alkyle, et notamment -Me, et ° (B2) R 2 51 - -R31 -R32, -R41, -R42, -R51, et -R52 sont des hydrogènes. 6. Complexe de lanthanide selon la revendication 1 choisi parmi les complexes de lanthanides de formule (II) : R11-Chrom4 R12 -00C N Ln Chrom6 Chrom5 -00C C00- 5 dans lesquels : Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy, -R11 et -R12, identiques ou différents, sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi -Y, un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6) alkyle, -Chrom4-, -Chrom5-, et -Chrom6-, identiques ou différents, représentent 10 indépendamment l'un de l'autre un groupe de formule (B), tel que défini à la revendication 1. 7. Complexe de lanthanide selon la revendication 6, caractérisé en ce que -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques, avec de préférence : -R1 représentant un groupe électrodonneur -El tel que défini à la revendication 1, 15 notamment choisi parmi les groupes -0R10 et -NH(C0)R10, -R10 étant tel que défini à la revendication 1, de préférence -R1 représente -0Me ou -OPEG, -R2 étant un groupe -R7 tel que défini à la revendication 1, de préférence -Me, et -R3 étant un groupe -R8 tel que défini à la revendication 1, et représente notamment -Me, ou, de préférence, est un hydrogène. 20 8. Complexe de lanthanide selon la revendication 6, caractérisé en ce que : - soit : -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B10) : R1 3 R43 R53 R23 R33 (B10) 52 avec -R13, -R23, -R33, -R43, et -R53 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom5- et -Chrom6- ne comprennent pas de groupe réactif, - -Chrom4- est différent de -Chrom5- et de -Chrom6- et est de structure (B11) : R1 4 R44 R54 R24 R3 4 (B11) avec -R14, -R24, -R34, -R44 et -R54 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendications 6, étant entendu que -Chrom4- comprend un groupe réactif -Xl, - soit : - -Chrom4- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B12) : R15 R45 R55 R25 R35 (B12) avec -R15, -R25, -R35, -R45 et -R55 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom4- et -Chrom6ne comprennent pas de groupe réactif, et 15 -Chrom5- est différent de -Chrom4- et de -Chrom6- et est de structure (B13) : R1 6 R4 6, R56 R26 R36 (B13) 5 10 53 avec -R16, -R26, -R36, -R46 et -R56 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom5- comprend un groupe réactif-Xi. 9. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en 5 ce que -R4 et -R5 représentent des hydrogènes. 10. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend un seul groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule, ledit groupe réactif étant, de préférence, choisie parmi -COOH, un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldhéhyde, un halogénure d'alkyle, 10 un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl 15 dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule: 0 Cl N,( )-N-(C H2)- N- N H Cl N (c l-1 H y O 0 --(ÂN) (CHNCS --(-1L'N-1-(C H 2)-NCO O 0 ,e1"N (CH2)N H2 eN)(cH2N3 H y w Fi y w S03- 0 )1\1-(CH2}J---f H O N (OH NCO H y N) H2}S-5-Ar H y w Fi w 0 H2)N-Ar H y wH 0 -{1N--(C H H y O- N N) (C H2)-4 v w 0 0 -()L111)-(CH =CH W o /3( (c H 240- N Hi w 0 0 NCS dans lesquels w est un entier appartenant à la gamme allant de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 2. a hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène ; 54 les groupes réactifs choisis parmi -COOH, -NH2, les esters de succinimidyle, les haloacétamides, les azides, les hydrazines, les isocyanates et les maléimides étant préférées. 11. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en 5 ce que le groupe Y est choisi parmi -S03-, -000-, les groupes sulfobétaine et -0-[(Cf11)7-0]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3. 12. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que Ln est du terbium. 13. Agent chélatant de formule (III) : 10 Chrom1' (HI) NA CN-Chromi Chrom3' avec -ChromP, -Chrom2', et -Chrom3', identiques ou différents, et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B5) : Ri R4 R5 R2 R3 0R13 (B5) avec R1, R2, R3, R4 et R5 tels que définis à la revendication 1, et -R13 un groupe 15 protecteur des fonctions acide, tel qu'un alkyle, et notamment un méthyle, ou sous la forme d'un sel. 14. Agent chélatant de formule (IV) : Ra00C Ch ro m6 R13000/ Chrom4 R12 NCCOORa Chrom5 COOR13 55 avec -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- tels que définis à l'une quelconque des revendications 6 à 8, et -R13 un groupe protecteur des fonctions acide, tel qu'un alkyle, et notamment un méthyle, ou sous la forme d'un sel. 15 Procédé de détection d'une biomolécule comprenant la détection de la luminescence d'un 5 conjugué de ladite biomolécule avec un complexe luminescent selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant un groupe réactif, et obtenu par couplage de ladite biomolécule avec ledit complexe luminescent sur son groupe réactif.