FR 3074810 A1 20190614 FR 1762058 A 20171213 - 1 - Puce échantillon micro fluidique, système d'analyse utilisant une telle puce et procédé PCR pour la détection de séquences ADN L'invention concerne, selon un premier aspect, une puce micro fluidique de thermalisation à cycles de température variable constituée d'un bloc de matériau dans lequel se trouve une cavité pouvant contenir au moins un fluide, cette cavité comportant au moins un orifice d'entrée et au moins un orifice de sortie, l'orifice d'entrée de fluide étant reliée à au moins deux canaux d'injection de fluide. Elle concerne également selon ce premier aspect, un système utilisant une telle puce de thermalisation pour le changement rapide de température d'échange thermique avec un échantillon contenant de l'ADN ainsi qu'un procédé PCR pour la détection de séquences ADN dans un échantillon. L'invention concerne également, selon un deuxième aspect, une puce échantillon micro fluidique pour le test d'échantillons biologiques, notamment pour une analyse de type PCR et/ou de fluorescence, ayant la forme d'un bloc creux comportant au moins une chambre délimitée par une paroi supérieure, une paroi inférieure et au moins une paroi latérale, dans laquelle peut être introduit un échantillon à tester. - 2 - Elle concerne également, selon ce deuxième aspect, un système d'analyse d'un échantillon de type PCR contenu dans une chambre ménagée dans une puce échantillon, ainsi qu'un procédé PCR pour la détection 5 de séquences ADN utilisant la puce et le système permettant une mesure fluorescence de l'échantillon. Selon le premier aspect, un état de la technique détaillé concernant les différents procédés et dispositifs permettant la détection de séquences d'ADN dans un io échantillon liquide en utilisant une réaction nécessitant des cycles de température répétés (que l'on appellera ci-après « cyclage » thermique d'échantillons ADN pour la réalisation d'une réaction de type « PCR » (« Polymerase chain reaction» en anglais) ou plus 15 simplement « cyclage thermique ») est décrit par exemple dans la demande de brevet W02009/105499. Parmi ces procédés de cyclage thermique, certains utilisent avantageusement un liquide caloporteur que l'on fait circuler à proximité de l'échantillon pour 20 contrôler sa température. L'utilisation d'un liquide caloporteur permet d'obtenir une température de thermalisation de l'échantillon très homogène, car la convection limite l'apparition de gradients de température dans le liquide, contrairement aux 25 solutions basées sur un chauffage local ou pompage local de chaleur avec un élément thermoélectrique, qui peuvent créer localement des gradients de températures. L'utilisation d'un liquide caloporteur permet également un transfert de chaleur vers l'échantillon très efficace car il ne dépend que de la 5 proximité thermique de l'échantillon avec le liquide caloporteur et du coefficient de convection du liquide caloporteur qui peut être très important lorsque ce liquide est transporté dans des canalisations de faibles dimensions (canaux micro fluidiques). Par ailleurs, 10 l'utilisation d'un liquide caloporteur permet d'obtenir rapidement un contrôle précis et homogène de la température d'un échantillon ayant un volume important (supérieur au microlitre) car quelle que soit sa taille, la température de l'échantillon tend 15 rapidement vers la température du liquide caloporteur lorsqu'il est à proximité, contrairement aux systèmes basés sur l'injection d'une énergie thermique comme le chauffage par effet joule pour lesquels il est difficile de contrôler de manière homogène la température sur la 20 seule base du contrôle de la puissance injectée. US-A-5508197 décrit la thermalisation de puits aux parois très fines contenant des échantillons de PCR en faisant circuler successivement autour de ces puits des liquides caloporteurs préalablement « thermalisés » 25 (c'est à dire amenés à une température précise et homogène) à différentes températures, à l'aide d'une - 4 - série de vanne qui redirigent les liquides provenant de réservoirs thermalisés vers plusieurs échantillons. Ce système, qui permet un changement de la température de l'échantillon en environ 8 secondes, est limité en 5 vitesse par le transfert de la chaleur à travers les puits et le volume de 15 pl de l'échantillon, dont la géométrie et la taille ne permettent pas un transfert plus rapide. Dans ce système, le volume de liquide utilisé pour thermaliser les échantillons est important io (-150 mL), si bien que les débits de liquide sont importants (-10 L/min), les volumes de liquides dans les réservoirs doivent être importants (-25 L) pour assurer une bonne stabilité de la température. Ces contraintes de volume rendent le système encombrant 15 et très consommateur d'énergie. De plus un tel système est difficilement transportable compte tenu de sa taille. EP-A-2415855 décrit une réaction de PCR en faisant circuler successivement deux liquides caloporteurs à 20 températures différentes pour thermaliser un échantillon dans un puit réalisé dans une feuille d'aluminium fine permettant d'obtenir avec une forme aplatie des puits, des changements de température très rapides (jusqu'à 0.3 s). Les volumes de liquide 25 utilisés dans ce système restent importants, de l'ordre de plusieurs dizaines de millilitres et le débit également - 5 - (plus de 60 mL/min) ce qui en fait encore un système encombrant et consommateur d'énergie. WO 2011/138748 décrit une puce micro fluidique et un système de régulation de la température d'un 5 échantillon comportent une pluralité de canaux micro fluidiques disposés au fond d'une cavité de forme généralement parallélépipédique et comportant une paroi inférieure de faible conductivité thermique pour éviter les pertes thermiques lors de son utilisation et 10 une paroi supérieure de forte conductivité thermique sur laquelle est déposée un échantillon à analyser , permettant un bon échange thermique entre le liquide caloporteur circulant dans les canaux et l'échantillon. Le liquide caloporteur est injecté à travers un orifice 15 d'entrée dans les canaux micro fluidiques et récupéré à travers un orifice de sortie à l'autre extrémité des canaux micro fluidiques. La température du liquide caloporteur est régulée en amont de l'orifice d'entrée à l'extérieur et à distance de la puce. Un exemple d'un 20 procédé de fabrication d'une puce de ce type est décrit sur le site internet de la société ELVESYS à l'adresse www.elveflow.com dans l'article intitulé « la micro fluidique et les puces micro fluidiques : Revue ». Ce type de puce a été utilisé par les auteurs Houssin et 25 al. d 'un article publié en 2016 par « The royal society of chemistry 2016 » sous le titre « Ultrafast sensitive and large volume on-chip real time PCR for the molecular diagnosis of bacterial and viral infections », dans lequel ils décrivent la mise en oeuvre d'un procédé de « cyclage » thermique pour réaliser une réaction de 5 PCR qui n'est pas entièrement satisfaisant : le changement de température de l'échantillon est réalisé en faisant circuler alternativement dans la puce micro fluidique, qui contient une zone d'échange de chaleur avec l'échantillon, deux liquides caloporteurs 10 thermalisés auparavant à l'aide de deux modules thermoélectriques (dispositifs à effet Peltier). Par échange thermique entre la puce et l'échantillon, on réalise cette alternance de température de l'échantillon liquide, permettant ainsi d'amplifier une séquence 15 d'ADN présente dans l'échantillon. Si ce système permet de réaliser des thermalisations rapides (de l'ordre de 2s. également) avec un débit de liquide faible (de l'ordre de 10 mL/min ou 160 pL/s), les performances de ce système restent limitées par le 20 volume et la thermalisation des canalisations alimentant la puce. En effet, lorsque le liquide ne circule pas dans la puce, la température des canalisations (le diamètre d'une canalisation micro fluidique varie du micron à plusieurs centaines de 25 microns) qui ont un faible volume, donc une faible inertie thermique, tend en quelques secondes vers la - 7 - température ambiante. Lorsque le liquide circule à nouveau, il faut tout d'abord évacuer tout le liquide à température proche de l'ambiante qui se trouve dans la canalisation (ce qui d'après les expériences conduites 5 par les inventeurs prend environ 0.5 seconde), puis « thermaliser » la canalisation, c'est à dire l'amener à une température stable, ce qui d'après les expérimentations conduites par les inventeurs, prend de quelques secondes à quelques dizaines de secondes. io Avant d'atteindre cette stabilité, la température du liquide injecté dans la puce est perturbée par le transfert de chaleur vers la canalisation. Ainsi, il faut environ deux secondes pour réaliser 95% du changement de température souhaité mais une dérive 15 de la température pouvant atteindre plusieurs degrés est observée sur un temps plus long en fonction des conditions, typiquement de l'ordre de la dizaine de secondes. Cette dérive de température n'étant pas reproductible puisqu'elle dépend de la température de 20 la canalisation avant le changement imposé de température, il n'est donc pas possible avec ce système d'obtenir un contrôle rapide et précis de la température d'un échantillon avec de petits débits permettant la miniaturisation du système et le rendant ainsi aisément 25 transportable. Il est connu de US2006/188979 un système pour faire réagir simultanément une pluralité de réactifs avec l'échantillon, dans une pluralité de canaux parallèles à la même température, le nombre de canaux étant égal 5 au nombre de réactifs prévus pour être utilisés dans ce système. Les différentes solutions de changement de température rapide proposées dans l'art antérieur utilisant des liquides caloporteurs ne permettent donc 10 pas à ce jour, un contrôle rapide de la température d'un échantillon (c'est à dire en moins de cinq secondes environ), précis, homogène, reproductible et peu consommateur d'énergie et utilisant un appareillage peu encombrant. 15 Pourtant, les besoins actuels de tests rapides d'orientation du diagnostic nécessitent de pouvoir réaliser des réactions telles que la PCR en quelques minutes dans un dispositif léger et peu consommateur d'énergie, qui puisse fonctionner éventuellement sur le 20 site (« on-site ») c'est à dire ayant d'une part une petite taille et pouvant éventuellement d'autre part être alimenté par une batterie. Sachant qu'une analyse de type PCR nécessite entre 30 et 40 cycles de température dont la durée minimale 25 pour chaque cycle est de l'ordre de 8 s, chaque seconde gagnée sur la durée du changement de température de l'échantillon est un gain significatif sur la durée totale de ce type de test. Par ailleurs, la complexification des kits de détection moléculaires basés sur la PCR, notamment pour la 5 détection multiplexe, impose le contrôle précis des températures aux différentes phases du cycle pour fonctionner correctement. La puce micro fluidique de thermalisation, le système et le procédé selon le premier aspect de l'invention 10 permettent de résoudre le problème ainsi posé. La puce micro fluidique de thermalisation selon l'invention est constituée d'un bloc de matériau dans lequel sont disposées successivement : - une zone d'injection de fluide comportant au moins 15 un canal micro fluidique d'injection de fluide, - une cavité de forme parallélépipédique ayant une face supérieure comprenant une zone d'échange thermique munie d'une zone de thermalisation de surface S au niveau de la face supérieure de la cavité, la zone de 20 thermalisation comprenant au moins un canal micro- fluidique de circulation de fluide, cette cavité étant munie d'au moins un orifice d'entrée de fluide issu de la zone d'injection de fluide et d'au moins un orifice de sortie de fluide, entre lesquels s'étend la zone 25 d'échange thermique caractérisée en ce qu'elle comporte de préférence un seul orifice d'entrée de - 10 - fluide, de préférence un seul orifice de sortie de fluide, et en outre au moins un canal micro fluidique de contournement de la cavité, relié par une première extrémité à l'un au moins des canaux micro fluidiques 5 d'injection de fluide, l'embranchement du canal de contournement sur le canal d'injection de fluide étant situé à une distance L de l'orifice d'entrée de fluide de la cavité, la distance L entre chaque embranchement et l'orifice d'entrée de fluide étant telle que : 10 L 95°C). - 34 - De préférence, la paroi supérieure de la puce est constituée d'une matière plastique transparente choisie parmi les polycarbonates et leurs dérivés et/ou les polymères ou copolymères oléfiniques cycliques 5 (communément désignés par les acronymes COC et COP) et leurs dérivés. Selon une configuration préférée, la puce comporte de une à quatre chambres de forme parallélépipédique reliées chacune à de préférence deux ouvertures au 10 moins. Selon le deuxième aspect, l'invention concerne également un système d'analyse d'un échantillon de type PCR contenu dans une chambre ménagée dans une puce échantillon telle que décrite dans la présente 15 demande, comportant notamment : - des moyens de thermalisation permettant d'augmenter ou de diminuer par cyclage thermique la température de la puce et de ses échantillons, en contact thermique avec la face inférieure de la puce 20 échantillon, qui est caractérisé en ce qu'il comporte en outre : -des moyens pour fermer les ouvertures des chambres utilisées dans la puce échantillon permettant de maintenir une pression intérieure relative d'au moins 25 5000 Pascal (50 mbar), de préférence d'au moins 50000 Pa (500 mbar), dans lesdites chambres, - 35 - l'augmentation de température de l'échantillon engendrant une dilatation des chambres, améliorant ainsi le contact thermique entre la face inférieure et les moyens de thermalisation, 5 - des moyens de maintien d'une pression extérieure relative supérieure à 50 mbar sur l'ensemble de la face supérieure de la puce échantillon de manière à assurer un contact thermique sensiblement uniforme entre la face inférieure de la puce et les moyens de 10 thermalisation, la partie transparente de la paroi supérieure de la puce pouvant être traversée par des rayons lumineux étant située au-dessus d'au moins une des chambres contenant un des échantillons. Le système selon ce deuxième aspect de l'invention 15 comporte de préférence des moyens de mesure optique, permettant de préférence une observation optique des échantillons avec une résolution spatiale. Selon une première variante, le système comporte une pièce conductrice de la chaleur, de préférence une 20 pièce métallique d'épaisseur inférieure ou égale à 1 mm disposée entre la face inférieure de la puce échantillon et les moyens de thermalisation, de préférence un film métallique d'aluminium. Selon une autre variante, le système comporte des 25 moyens de thermalisation rapide capables d'engendrer - 36 - un changement de température de l'échantillon supérieur ou égal à 5°C/s. De préférence, le système comporte des moyens de maintien d'une pression extérieure relative supérieure 5 à 1 bar sur une partie au moins, de préférence l'ensemble de la face supérieure de la puce échantillon Selon un mode préférentiel, le système comporte des moyens de mise sous pression extérieure constitués d'une plaque de matériau transparent, de préférence 10 du verre, associée à un cadre disposé à la périphérie de la plaque et des moyens élastiques tels que des ressorts appliquant une pression sur ledit cadre. Selon une variante, le système comporte des moyens de mise sous pression extérieure constitués d'un 15 logement aux dimensions extérieures identiques à celles de la puce permettant l'introduction de celle-ci dans le logement à température ambiante, logement dont les parois exercent une pression sur les parois supérieure et inférieure de la puce lors d'une élévation 20 de température d'un échantillon emprisonné dans une chambre au moins de ladite puce, du fait de la dilatation des chambres. Selon une autre variante, le système comporte des moyens d'injection d'un échantillon dans l'une au moins 25 des chambres lorsque cette puce est déjà positionnée dans le système. - 37 - Selon encore une autre variante, le système comporte également des moyens pour sceller les ouvertures de la puce après le remplissage d'une au moins des chambres. 5 L'invention concerne également un appareil, un système et un procédé mettant en oeuvre le premier et le second aspect de l'invention, c'est-à-dire comportant à la fois un système de cyclage thermique avec une puce de thermalisation selon le premier aspect de 10 l'invention, combiné à une puce échantillon de dimensions adaptées à celles du logement complémentaire dans lequel s'insère la puce échantillon qui comporte notamment une paroi supérieure transparente selon le deuxième aspect de l'invention, 15 ainsi que de préférence un système optique de mesure de fluorescence de l'échantillon, le cyclage thermique réalisé alternativement à des températures différentes permettant de multiplier l'ADN contenu dans l'échantillon de la puce échantillon maintenue sous 20 pression tout au long du cyclage thermique. Dans toute la description, les termes suivants auront en outre la signification suivante : -Thermalisation d'un échantillon (ou thermaliser en 25 général) signifie en modifier la température de manière - 38 - à ce que la température de l'échantillon atteigne une température voulue. -Vitesse de changement de température d'un échantillon d'une température Ti à une température T2 5 différente de Ti, signifie le temps nécessaire pour que l'échantillon passe de la température Ti à une température effective T2eff tel que (T2- T2eff)/(T2-T1) REVENDICATIONS1 - Puce échantillon micro fluidique (289) pour le test d'échantillons biologiques, notamment pour une analyse de type PCR et/ou de fluorescence, ayant la forme d'un bloc creux comportant au moins une chambre (45) délimitée par une paroi supérieure (44), une paroi inférieure (42) et au moins une io paroi latérale (43), dans laquelle peut être introduit un échantillon à tester, caractérisée en ce que le bloc est pourvu d'au moins une première face et une deuxième face parallèles entre elles, la première face (ou face inférieure) étant disposée sur la paroi 15 inférieure (42) constituée d'un matériau à forte conductivité thermique, de préférence supérieure à 15 w.m-1.K-1, la seconde face (ou face supérieure) étant disposée sur la paroi supérieure (44) constituée d'un matériau à faible conductivité 20 thermique et en outre perméable au moins au niveau de l'une des chambres, aux rayonnements de longueur d'onde comprise entre 300 nm et 900 nm, de préférence perméable aux rayonnements dans le spectre visible entre 400 et 700 nm, ce bloc 25 possédant au moins deux ouvertures (47) permettant l'introduction de l'échantillon dans l'une - 79 - au moins des chambres et l'évacuation de l'atmosphère présente dans la chambre lors de l'introduction de l'échantillon. 2 - Puce selon la revendication 1, caractérisée en ce 5 que au moins une ouverture (47) est disposée sur la seconde face et traverse la paroi supérieure (44) pour atteindre l'une des chambres (45) au moins. 3 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que au moins une ouverture (47) est disposée sur au moins une paroi latérale (43) et traverse celle-ci pour atteindre l'une des chambres au moins. 4 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le bloc a une forme extérieure d'un parallélépipède ou d'un cylindre dont les faces des parois supérieure (44) et inférieure (42) sont parallèles entre elles. 5 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les ouvertures (47) sont scellées après introduction de l'échantillon dans une chambre (45) au moins, les différentes parois de la puce étant assemblées de manière à résister sans endommagement à une pression interne et/ou externe supérieure ou égale à 50000 Pa (500 mbar), de préférence supérieure ou égale à 100000 Pa (1 bar). - 80 - 6 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que sa paroi inférieure (42) est réalisée en un matériau d'une part de conductivité thermique supérieure ou égale à 15 w.m-1.K-1, de 5 préférence supérieure ou égale à 100 w.m-1.K-let d'autre part de préférence qui n'est pas un inhibiteur de réaction de type PCR tel que notamment l'aluminium pur et/ou ses alliages ou dérivés éventuellement anodisés. 10 7 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la conductivité thermique de sa paroi supérieure (44) est inférieure ou égale à 1 w.m-1.K-1, ayant une effusivité de préférence inférieure ou égale à 1000 J.m-2.K-1.s-0,5 et 15 supportant de préférence une température supérieure ou égale à 95°C sans se déformer, c'est-à-dire une température de fléchissement sous charge (norme ISO 75), et de transition vitreuse du matériaux supérieure ou égale à 95°C. 20 8 - Puce selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que sa paroi supérieure (44) est constituée d'une matière plastique transparente choisie parmi le polycarbonate et ses dérivés et/ou les polymères ou copolymères oléfiniques cycliques 25 et leurs dérivés. - 81 - 9 - Puce selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte de une à quatre chambres de forme parallélépipédique reliées chacune à deux ouvertures au moins. 5 10 - Système d'analyse d'un échantillon de type PCR contenu dans une chambre ménagée dans une puce échantillon selon l'une des revendications précédentes comportant notamment : - des moyens de thermalisation (1) permettant 10 d'augmenter ou de diminuer par cyclage thermique la température de la puce (289) et de ses échantillons, en contact thermique avec la face inférieure de la puce échantillon, caractérisé en ce qu'il comporte en outre 15 -des moyens pour fermer les ouvertures (47) des chambres (45) utilisées dans la puce échantillon permettant de maintenir une pression intérieure relative d'au moins 5000 Pa (50 mbar), de préférence d'au moins 50000 Pa (500 mbar), dans 20 lesdites chambres, l'augmentation de température de l'échantillon engendrant une dilatation des chambres, améliorant ainsi le contact thermique entre la face inférieure et les moyens de thermalisation (1), 25 - des moyens de maintien (294, 295, 296) d'une pression extérieure relative supérieure à 50 mbar sur - 82 - l'ensemble de la face supérieure de la puce échantillon (289) de manière à assurer un contact thermique sensiblement uniforme entre la face inférieure de la puce et les moyens de thermalisation 5 (1), la partie transparente de la paroi supérieure (44) de la puce (289) pouvant être traversée par des rayons lumineux étant située au-dessus d'au moins une des chambres contenant un des échantillons. 11- Système selon l'une des revendications 10 précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte également des moyens de mesure optique (210), permettant de préférence une observation optique des échantillons avec une résolution spatiale. 12- Système selon la revendication 11, caractérisé 15 en ce que les moyens de mesure optique comportent une camera (300). 13- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de thermalisation rapide (1) capables 20 d'engendrer un changement de température de l'échantillon supérieur ou égal à 5°C/s. 14- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de maintien (213) d'une pression extérieure 25 relative supérieure à 100000 Pa (1 bar) sur une - 83 - partie au moins, de préférence l'ensemble de la face supérieure de la puce échantillon 15- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de 5 mise sous pression extérieure sont constitués d'une plaque de matériau transparent (293), de préférence du verre, associée à un cadre (294) disposé à la périphérie de la plaque (293) et des moyens élastiques (295, 296) tels que des ressorts 10 appliquant une pression sur ledit cadre. 16- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens de mise sous pression extérieure sont constitués d'un logement aux dimensions extérieures de la puce 15 permettant l'introduction de celle-ci dans le logement à température ambiante, logement dont les parois exercent une pression sur les parois supérieure et inférieure de la puce lors d'une élévation de température d'un échantillon 20 emprisonné dans une chambre au moins de ladite puce. 17 - Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens d'injection d'un échantillon dans l'une au 25 moins des chambres lorsque cette puce est déjà positionnée dans le système. - 84 - 18- Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte également des moyens pour sceller les ouvertures de la puce après le remplissage d'une au moins des 5 chambres. 19 - Utilisation d'un système selon l'une des revendications précédentes, pour la réalisation d'une PCR notamment une PCR digitale dPCR et/ou PCR digitale en gouttes ddPCR. 10 15 20 25