FR 3074679 A1 20190614 FR 1762007 A 20171212 DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des maladies du métabolisme lipido-glucidique, et concerne plus particulièrement une composition pouvant 5 être utilisée dans la prévention ou le traitement de la stéatose hépatique non-alcoolique. ART ANTERIEUR La stéatose hépatique non alcoolique est une maladie liée à une accumulation 10 importante de lipides dans le foie, elle est notamment définie par une accumulation supérieure à 5% de lipides neutres dans les hépatocytes. Cette pathologie représente un problème majeur de santé publique car elle touche actuellement 20 à 30% de la population des pays occidentaux et peut évoluer en stéatohépatite (NASH), voire dériver en cirrhose non alcoolique ou encore 15 en hépato-carcinome. L'ensemble de ces pathologies sont regroupées sous le terme de NAFLD (Non Alcoholic Fatty Liver Disease). Malheureusement, aucun traitement n'existe à l'heure actuelle pour soigner ces pathologies et le seul moyen de les détecter est de réaliser une biopsie du foie. C'est pourquoi la recherche se tourne actuellement vers des moyens préventifs du 20 développement de la stéatose hépatique. Lors de leurs recherches, les inventeurs ont découvert qu'une composition à base de phycocyanine, et plus particulièrement issue d'une extraction spécifique à partir de micro-algues ou de cyanobactéries telle que la spiruline, 25 présentait des propriétés intéressantes vis-à-vis de ces maladies du métabolisme lipido-glucidique, et notamment pouvait être utilisée dans le traitement ou la prévention de la stéatose hépatique non-alcoolique. En effet, toutes les études de l'art antérieur ont été réalisées en mettant en 30 oeuvre soit un extrait obtenu à partir de spiruline séchée, soit un extrait obtenu à partir de spiruline fraîche mais le produit extrait a subi une étape ultérieure de séchage (par exemple pour une conservation à sec). 2 BUTS ET RESUME DE L'INVENTION A cet effet la présente invention concerne une composition comprenant un extrait liquide aqueux de phycobiliprotéines, renfermant de la phycocyanine, obtenu à partir de cyanobactéries ou de micro-algues et n'ayant subi aucune étape de séchage, utilisée pour la prévention ou le traitement de maladies du métabolisme lipido-glucidique chez l'homme ou les mammifères. Le procédé de préparation de cet extrait, réalisé en milieu aqueux uniquement 10 (sans solvant organique) est décrit en détail dans la demande de brevet (non encore publiée) FR 1752452. N'ayant subi aucune étape de séchage lors de sa préparation, cet extrait renferme notamment une phycocyanine non dénaturée ni dégradée. De manière avantageuse, la composition selon l'invention peut être utilisée pour la protection du foie contre l'accumulation de lipides dans les hépatocytes, et plus particulièrement pour la prévention ou le traitement de la stéatose hépatique non-alcoolique ou la stéato-hépatite. De préférence, l'extrait aqueux est obtenu à partir de Spiruline Platensis. De préférence, la composition selon l'invention renferme uniquement ledit extrait aqueux, comprenant une teneur en phycocyanine d'au moins 0,5 g/L, de 25 préférence comprise entre 0,8 et 10 g/L, de préférence encore entre 1 g/L et 5 g/L. Avantageusement, elle se présente sous forme liquide et est formulée pour une administration par voie orale. Son avantage principal est de pouvoir être 30 ajoutée par exemple dans l'eau de boisson, sous forme d'un complément alimentaire. 15 20 Les résultats obtenus à ce jour indiquent que des doses d'administration 3 préventives de la stéatose hépatique non-alcoolique au moyen de la composition selon la présente invention seraient avantageusement comprises entre 0,1 et 10 mg/kg de poids corporel/jour de phycocyanine, de préférence entre 0,5 et 5 mg/kg/jour de phycocyanine, c'est-à-dire à des doses en 5 phycocyanine non dénaturée ni dégradée nettement inférieures aux doses mises en oeuvre dans l'art antérieur avec une spiruline séchée ou des extraits secs. Ceci permet d'envisager des applications plus intéressantes, notamment sur un plan économique. A des doses plus fortes, la composition pourrait être utilisée pour le traitement de la stéatose non-alcoolique. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante 15 d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 est un schéma du protocole mis en oeuvre sur des hamsters selon l'exemple 1, incluant une composition selon l'invention 20 La figure 2 présente les paramètres mesurés lors de l'étude selon le protocole de la figure 1 : A: Glycémie à jeun B : Contenu en cholestérol hépatique (mg/g de foie) C : Contenu en cholestérol aortique (mg/g d'aorte) 25 Les figures 3 à 18 se rapportent à l'exemple 2 selon l'invention : La figure 3 présente la consommation alimentaire des souris à 15 semaines de traitement : 30 A: Prise hydrique (ml/souris/jour) B : Prise alimentaire (g/souris/jour) 4 La figure 4 est un diagramme présentant la consommation de phycocyanine à 15 semaines de traitement en mg/souris/jour La figure 5 montre des suivis de poids corporels : 5 A: en fonction de la durée du traitement en jours le suivi de la prise de poids en grammes B : la prise de poids corporel terminal (en g) à 15 semaines de traitement La figure 6 présente la glycémie à jeun (mg/dl) : 10 A: à 4 semaines B: à 8 semaines La figure 7 présente des tests de tolérance au glucose à 2g/Kg, c'est-à-dire une glycémie en %: A: à 4 semaines B: à 8 semaines La figure 8 présente d'autres mesures métaboliques à 4 et 8 semaines de traitement (test de tolérance au glucose GTT, et glycémie en mg/dl) : A: Groupe contrôle B : WD C : WDS1 B : WDS2 La figure 9 présente des concentrations en triglycérides plasmatiques (mg/dl): A: à 4 semaines B: à 8 semaines La figure 10 montre d'autres paramètres biochimiques, à savoir le cholestérol 30 plasmatique (mg/dl): A: à 4 semaines B: à 8 semaines 5 La figure 11 est une autre présentation de l'évolution des paramètres biochimiques comparés à 4 et 8 semaines A: les triglycérides plasmatiques 5 B: le cholestérol plasmatique La figure 12 présente la répartition du cholestérol plasmatique (mg/dl) dans les lipoprotéines : A: à 4 semaines 10 B: à 8 semaines La figure 13 détaille l'évolution du cholestérol plasmatique dans les lipoprotéines pour chacun des groupes : A: Groupe contrôle 15 B : WD C : WDS1 D : WDS2 La figure 14 présente des analyses hépatiques : 20 A: le poids du foie en grammes à 4 semaines B : le ratio poids du foie/poids corporel de l'animal à 4 semaines La figure 15 montre les mêmes paramètres que la figure 14 à 8 semaines : A: le poids du foie en grammes 25 B: le ratio poids du foie/poids corporel de l'animal La figure 16 se concentre sur la fibrose : A: Aire pondérée de la fibrose à 4 semaines B : Aire pondérée de la fibrose à 8 semaines La figure 17 présente des mesures de la stéatose : A: Aire pondérée de la stéatose à 4 semaines 6 B : Aire pondérée de la stéatose à 8 semaines La figure 18 montre les mesures du stress oxydant : A: la production hépatique d'02° à 8 semaines 5 B: la production hépatique de NO à 8 semaines Les figures 19 à 23 concernent l'exemple 3 après 25 semaines de régime La figure 19 montre l'évolution de la consommation alimentaire : 10 A: prise hydrique B : prise alimentaire La figure 20 présente différentes mesures relatives au poids : A: l'évolution du poids en fonction du temps de traitement 15 B: une comparaison du poids final des souris La figure 21 présente une mesure de paramètres biochimiques à 25 semaines : A: les triglycérides plasmatiques B : le cholestérol plasmatique 20 La figure 22 présente des mesures faites sur le foie : A: les photos à la même échelle des foies obtenus après 25 semaines B: le poids du foie C: le ratio poids du foie/poids corporel 25 La figure 23 présente l'expression de différents gènes de la lipogenèse : A: expression de SCD1 B: expression de FASN C: expression de LXRa 30 D: expression de SREBP1 B: expression de ChREBP 7 EXEMPLES Exemple 1: L'effet de l'administration de phycocyanine a été étudié sur des hamsters, 5 notamment sur leur métabolisme lipidique. La phycocyanine a été introduite dans leur alimentation, plus particulièrement dans leur eau de boisson, sous la forme de l'extrait liquide de Spiruline dénommé Spirulysat®, commercialisé par la Société Algosource. Le Spirulysat® est un extrait liquide, dont le procédé d'extraction (demande de brevet FR1752452 non encore publiée) obtenu à 10 partir de cyanobactéries nommées Arthrospira platensis, plus communément appelées Spiruline, et qui sont très riches en molécules antioxydantes comme la phycocyanine (PC-C). 1,1 g de Spirulysat®/kg de poids corporel/jour (soit 10 mg de phycocyanine/kg 15 de poids corporel/jour) a été administré à quatre groupe de hamsters : - un groupe contrôle (C) nourri en régime normal, - un groupe contrôle (CSp) nourri avec 10 mg de phycocyanine/kg de poids corporel/jour, - un groupe nourri en régime hyper-lipidique (HF), et 20 - un groupe nourri en régime hyper-lipidique complété par 80 mg de phycocyanine/kg de poids corporel/jour (HFSp). Ces hamsters avaient préalablement été nourris avec un régime riche en lipides pendant 2 semaines pour induire des perturbations métaboliques. A la 25 fin de cette période, les hamsters ont continué à recevoir le même régime pendant deux semaines en parallèle de l'administration du Spirulysat® dans l'eau de boisson. Le protocole mis en oeuvre est schématisé sur la figure 1. Les résultats marquants de cette étude se définissent essentiellement en 3 30 points. Premièrement, a été notée une diminution significative de la glycémie à jeun dans le groupe HFSp comparé au groupe HF (-17%) et ce, sans modification de poids des hamsters (respectivement 145,9 ± 5,45 vs 142,1 ± 8 4,48 g) (Figure 2A). Deuxièmement, il a aussi été remarqué une baisse importante du cholestérol hépatique dans le groupe HFSp par rapport au groupe HF (respectivement 7,65 ± 0,43 vs 9,61 ± 0,41 mg de cholestérol/g de foie) (Figure 2B). Une tendance à une moindre accumulation hépatique des 5 acides gras libres (14,94 ± 0,71 vs 12,77 ± 0,69 pmol/g de foie respectivement pour les HF et les HFSp, p=0,06) et des triacylglycérols (4,95 ± 0,39 vs 4,01 ± 0,44 mg/g de foie respectivement pour les HF et les HFSp, p=0,09) est aussi visible. Enfin, les hamsters buvant une eau supplémentée au Spirulysat® accumulent moins de cholestérol au niveau de l'aorte, lorsqu'ils sont 10 challenges avec un régime riche en lipides (2,58 ± 0,31 vs 1,65 ± 0,17 mg de cholestérol/g d'aorte respectivement pour les groupes HF et HFSp) (Figure 2C). Exemple 2: 15 Suite aux résultats obtenus sur les hamsters de l'exemple 1, une étude plus complète a été réalisée sur des souris C57BI/6. Les souris C57BI/6 sont des modèles d'étude sur les maladies hépatiques, car elles sont sensibles au régime hyper-lipidique et développent les facteurs de risques des NAFLD. 20 Ce protocole comportait quatre groupes d'animaux : - un groupe contrôle (Ctrl) nourri avec un régime normal, - un groupe (WD) nourri avec un régime hyper-lipidique (23 % de lipides et 2 % de cholestérol) et contenant du fructose dans l'eau de boisson, - un groupe (WDS1) nourri avec un régime hyper-lipidique et contenant du 25 fructose et du Spirulysat® à 30 mg de Phycocyanine /kg de poids corporel/jour dans l'eau de boisson, et -un groupe (WDS2) nourri avec un régime hyper-lipidique et contenant du fructose et du Spirulysat® à une dose 5 fois plus forte, c'est-à-dire à 150 mg de Phycocyanine /kg de poids corporel/jour dans l'eau de boisson. 30 Les NAFLD regroupent plusieurs maladies qui correspondent aux différents stades de l'atteinte hépatique. L'étude est ainsi une étude cinétique de 9 l'installation de ces différents stades. A cet effet, 10 souris de chacun des groupes du protocole ci-dessus ont été sacrifiées après 4, 8, 16, 25 et 35 semaines. Le régime utilisé et la durée 5 d'exposition à ce régime ont été choisis selon la publication de Charlton, dans American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology, 2011, 301(5) : G825-34, montrant une similitude dans le développement physiopathologique des NAFLD entre la souris et l'homme. 10 2.1. Consommation alimentaire et poids corporel Les résultats montrent que les souris WD consomment significativement moins de croquettes hyper-lipidiques que les souris sous le régime de référence (groupe Ctrl) (12%, voir Figure 3B). En effet, le régime hyper-lipidique dit « occidental » apporte 42% de calories de plus que le régime contrôle pour un 15 même poids de croquettes. De plus, cela est associé à une augmentation de la consommation de l'eau de boisson contenant du fructose (3,45 ± 0,04 vs 3,28 ± 0,03 ml/souris/jour respectivement) (Figure 3A), d'où un apport calorique journalier plus important d'environ 30% chez le groupe WD comparé au groupe Ctrl. Cependant on note que la présence de Spirulysat® dans l'alimentation 20 des souris ne modifie pas leur consommation hydrique, mais diminue leur prise alimentaire. La figure 4 montre que la consommation en phycocyanine est environ 5 fois plus élevée chez les souris du groupe WDS2 que chez les souris du groupe 25 WDS1. Le suivi du poids des animaux révèle que le régime hyper-lipidique exerce bien son rôle puisque les souris sous WD ont toutes un poids corporel significativement plus élevé que les souris Ctrl (figure 5 A et B). Après 15 30 semaines de régime le poids corporel est moindre chez les souris ayant absorbé du Spirulysat®. 10 2.2 Mesures métaboliques Les mesures de glycémie montrent que la prise de Spirulysat® ne diminue pas la glycémie à jeun (Figure 6 A et B et Figure 8) mais diminue l'excursion glycém igue (Figures 7 A et B) respectivement dès 4 et 8 semaines de régime. 2.3 Paramètres biochimiques On ne note pas d'effet notable de l'alimentation renfermant du Spirulysat® sur les triglycérides plasmatiques (Figure 9 A et B et Figure 11A), mais par contre une augmentation du cholestérol plasmatique (Figure 10 A et B et Figure 11B). L'étude de la répartition de ce cholestérol plasmatique montre que la concentration de cholestérol dans les HDL (dénommé « bon cholestérol ») est nettement augmentée chez les souris dont l'alimentation renferme du Spirulysat® (voir l'ensemble des Figures 12 et 13). 2.4 Analyses hépatiques La stéatose et la fibrose hépatique ont été quantifiées respectivement après coloration trichromique par ajout de Safran et coloration au picrosirius rouge à 0,1 %. 20 La comparaison des figures 14 et 15 montre que les groupes WDS1 et WDS2 ont un foie dont le poids a augmenté à 8 semaines. Cependant à 8 semaines de régime, l'aire pondérée de la fibrose est nettement réduite chez le groupe de souris WDS2 (400 mg de phycocyanine) ; Les valeurs de stéatose ne sont 25 pas significatives à 8 semaines (Figure 17). La mesure du SO (stress oxydant) hépatique (02°- et NO) a été réalisée par résonance paramagnétique électronique. 30 Le stress oxydant, induit par le régime hyper-lipidique avec fructose (groupe WD), est fortement réduit chez les souris nourries avec de la phycocyanine WDS1 et WDS2, et ramené aux valeurs équivalentes à celles du groupe 5 10 15 11 contrôle (CtrI), comme le montrent les valeurs de la figure 18, diagrammes A (production hépatique d'02°) et B (production hépatique de NO). Exemple 3: 5 L'expérimentation conforme à l'exemple 2 a été poursuivie pendant 25 semaines sur trois groupes de souris C57BI /6 âgées de 7 semaines : - un groupe contrôle (Ctrl) nourri avec un régime normal, - un groupe (WD) nourri avec un régime hyper-lipidique (23% de lipides et 2% 10 de cholestérol) et contenant 42 g/I de fructose dans l'eau de boisson, et - un groupe (WD-Spi) nourri avec un régime hyper-lipidique (23%) et contenant 42 g/I de fructose et du Spirulysat® à 150 mg de PC-C/kg de poids corporel/jour dans l'eau de boisson. 15 Les résultats obtenus confirment notamment que l'extrait liquide de spiruline, à 25 semaines de régime : -diminue la prise alimentaire (Figure 19B) -diminue le poids corporel et le gain en masse graisseuse (Figure 20) -diminue les triglycérides plasmatiques et le cholestérol total (Figure 21) 20 -réduit l'augmentation du poids du foie par rapport à celui du groupe WD (Figure 22) - et enfin module l'expression des gènes impliqués dans les mécanismes de défense antioxydante et de lipogenèse (figure REVENDICATIONS1. Composition comprenant un extrait liquide aqueux de phycobiliprotéines, renfermant de la phycocyanine, obtenu à partir de cyanobactéries ou de micro-algues et n'ayant subi aucune étape de séchage, utilisée pour la prévention ou le traitement de maladies du métabolisme lipido-glucidique chez l'homme ou les mammifères. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est utilisée pour la protection du foie contre l'accumulation de lipides dans les hépatocytes. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce 15 qu'elle est utilisée pour la prévention ou le traitement de la stéatose hépatique non-alcoolique ou la stéato-hépatite. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'extrait aqueux est obtenu à partir de Spiruline 20 Platensis. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle renferme uniquement ledit extrait aqueux, comprenant une teneur en phycocyanine d'au moins 0,5 g/L, de préférence 25 comprise entre 0,8 g/L et 10 g/L, de préférence encore entre 1 g/L et 5 g/L. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme liquide et est formulée pour une administration par voie orale. 30