FR 3068711 A1 20190111 FR 1770659 A 20170621 RESUME La présente invention a pour objet un extrait de fenugrec utilisé seul ou incorporé au sein d'un complément alimentaire, d'un produit cosmétique, d'une composition pharmaceutique ou d'un milieu de culture industriel pour stimuler la croissance des microorganismes bénéfiques pour le bienêtre et la santé humaine et animale. L'invention est plus particulièrement illustrée en relation avec les Lactobacilles et Bifidobactéries, bien qu'elle puisse s'appliquer à toutes les bactéries ayant une physiologie similaire à celle des bactéries précitées, ainsi qu'à des levures du genre Saccharomyces. ETAT DE LA TECHNIQUE De nombreuses bactéries ont un effet bénéfique sur la santé humaine et animale. Des substances alimentaires généralement composées d'oligosaccharides et polysaccharides essentiellement non amidonnés et non digestibles ou d'alcools de sucres non dégradés et non absorbés dans la partie supérieure du tube digestif, stimulent spécifiquement, principalement dans l'intestin et le vagin, un ou un nombre limité de bactéries vivantes et bénéfiques pour l'homme (essentiellement des lactobacilles et des bifidobactéries), ainsi que des levures. Ces substances sont généralement regroupées sous la terminologie de prébiotiques. La flore commensale contribue à la prévention des infections, des processus oxydatifs, ou encore améliore certaines fonctions telles que l'absorption digestive de minéraux reconnus pour leurs effets bénéfiques sur la santé, tels que le fer, le calcium, le zinc ou encore le magnésium. Il est ainsi important de favoriser la croissance et le métabolisme des microorganismes commensaux bénéfiques, au détriment des microorganismes pathogènes ou néfastes, afin d'entrainer un rééquilibrage de la composition de la flore (intestinale, vaginale, buccale, nasale, auriculaire) en faveur des microorganismes bénéfiques. Le fenugrec, dont le nom binominal est Trigonella foenum-graecum, appartient à la famille des légumineuses. Originaire d'Afrique du Nord et du bassin méditerranéen, cette plante annuelle est cultivée depuis longtemps en Asie, notamment en Inde et en Chine. Le fenugrec trouve de nombreuses applications chez l'homme ou l'animal. Il peut en particulier être utilisé traditionnellement comme tonique pour stimuler l'appétit et améliorer la digestion, comme orexigénique ou encore pour soulager l'irritation des voies respiratoires. Plus récemment, les recherches et études cliniques ont montré que le fenugrec pouvait contribuer à la régulation du taux de glucose sanguin en cas de diabète. 2 - , Des travaux chez la daurade royale (Sparus aurata L.) suggèrent que le fenugrec seul ou associé à des probiotiques stimulerait la réponse immunitaire (Bahl et al. 2017, Guardiola F.A. et al. 2017). Le brevet W0/2009/138684 décrit également des propriétés antiparasitaires contre les parasites flagellés humains et animaux. Il a également été prêté à des extraits de fenugrec des propriétés antibactériennes (Pangal M. et al. (2011) Ann. Cin. Microbial Antimicrob., Aman S. et al (2014) Food Sci. Technol. Int.) et antifongiques (Haoula R. et al. (2008) J. Environ. Sci.). Des essais chez le porc suggèrent que le fenugrec pourrait être un substrat source de carbone pour les bactéries du genre Lactobacillus et Clostridium de classe I (Zentek J. et al. (2013) Br. J. Nutr. 109: 859-866), du fait de la présence de galactomannanes, augmentant ainsi leur nombre dans le tube digestif de l'animal (Lin B. et al. (2011) Food Hydrocoll. 25 : 180-188). DESCRIPTION DE L'INVENTION De manière tout à fait surprenante, et contrairement à ce que l'Homme de l'Art pouvait envisager sur la base des données scientifiques connues, le Demandeur a constaté et démontré que le fenugrec n'était pas une source de carbone pour les bactéries, mais présentait des propriétés stimulatrices de croissance de bactéries commensales bénéfiques du système digestif humain et animal et de la sphère génitale. Cette stimulation de croissance (augmentation de la quantité de microorganismes, de la vitesse de croissance et de la viabilité) dépend de la quantité d'extrait (effet dose). Cette stimulation est spécifique des bactéries des genres Lactobacillus, Bifidobacterium ainsi que de la levure Saccharomyces cerevisiae. Le nom commercial attribué à l'extrait de fenugrec présentant ces propriétés est FenulineTM lorsque la flore digestive est ciblée, ou SetuflorTM lorsque la flore vaginale est ciblée, ou lorsque le produit est utilisé en production industrielle. Selon l'invention, la plante entière ou toutes les parties de la plante peuvent être utilisées. Dans un premier mode de réalisation, l'extrait est obtenu à partir de la graine, comme décrit dans le brevet W0/2009/138684. Les graines sont avantageusement des graines détégumentées, qui sont micronisées (taille de l'ordre de 50 gm) ou atomisées (taille inférieure à 50 pin). Dans un second mode de réalisation, l'extrait est obtenu à partir de graines de fenugrec par solubilisation dans un solvant aqueux ou alcoolique. En pratique, les graines détégumentées ou les germes sont mis à macérer sous agitation dans de l'eau stérile ou de l'éthanol à température ambiante et la solution est ensuite centrifugée pour ne récupérer que le surnageant. , Bien entendu, l'extrait ou la poudre de fenugrec peut être utilisé tel quel ou plus avantageusement 65 formulé au sein d'une composition, notamment pharmaceutique plus complexe en présence d'excipients. Il peut également être incorporé au sein d'un complément alimentaire, d'un produit cosmétique, d'hygiène, ou encore d'un milieu de culture destiné à la production de probiotiques. Les ingrédients pouvant être utilisés dans la formulation, en particulier sous forme de complément alimentaire animal ou humain, sont à titre d'exemple le blé, le mais, le soja, l'huile de soja, l'huile de 70 palme, ou encore des sels minéraux, acides aminés, vitamines et autres sources de carbone, et plus généralement tout composé pouvant entrer dans la composition d'aliments. La plupart du temps, la composition est administrée oralement. Dans le cas de la recherche d'une activité sur la sphère vaginale, l'extrait est administré par voie vaginale à l'aide de capsules, gélules, seringues, tampons ou tout autre mode d'administration adapté. 75 Pour une utilisation à des fins de production industrielle de bactéries bénéfiques, l'extrait de fenugrec SetuflorTM est ajouté avantageusement au milieu de culture. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples qui suivent à l'appui des figures annexées. 80 EXEMPLES DE REALISATION Augmentation du nombre de microorganismes bénéfiques Afin de tester si l'extrait de fenugrec SetuflorTM augmentait la quantité de microorganismes bénéfiques en culture, des cultures de bactéries (Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. gasseri) ont été effectuées en présence ou non d'extrait aqueux d'extrait de fenugrec SetuflorTM à 2 mg/mL. Après 24 heures (L. 85 adidophilus, L. casei, L. gasseri), ou 48 heures (L. gasseri), la population bactérienne a été évaluée quantitativement en absence (Figure 1, Témoin 24H) ou présence (Figure 1, Essai 24H) d'extrait de fenugrec SetuflorTM. Il est clairement apparu que les populations microbiennes étaient significativement augmentées dans des proportions allant de 10% (L. casei 24 h; L. gasseri 48 h) à 50% (L. acidophilus 24h). L'extrait de fenugrec SetuflorTM augmente donc la quantité de bactéries 90 cultivées après 24 heures de culture. Augmentation de la vitesse de croissance des microorganismes bénéfiques Afin de tester si l'extrait de fenugrec SetuflorTM augmentait la vitesse de croissance de microorganismes bénéfiques, une culture de Lactobacillus casei a été réalisée en présence ou non d'extrait aqueux de fenugec SetuflorTM à 1 et 2 mg/mL. La croissance bactérienne a été suivie au cours 95 du temps par mesure de l'absorption à 595nm (Figure 2). Il est clairement apparu qu'en présence d'extrait de fenugrec SetuflorTM à 1 et 2 mg/mL. En comparant les demi-phases de croissance des bactéries cultivées, la croissance était avancée de 4 heures par rapport à la culture de bactéries effectuée en absence d'extrait de fenugrec SetuflorTM. L'extrait de fenugrec SetuflorTM augmente donc la vitesse de croissance des bactéries. 100 Effet dose Afin de tester si l'augmentation de la vitesse de croissance et de la quantité de bactéries cultivées en présence d'extrait de fenugrec SetuflorTM dépendait de la dose d'extrait de fenugrec SetuflorTM, plusieurs expériences ont été réalisées. Dans une première série, des extraits alcooliques d'extrait de fenugrec SetuflorTM ont été ajoutés à une 105 culture de Lactobacillus acidophilus, en absence ou présence de lmg et 2 mg d'extrait de fenugrec SetuflorTM. Le suivi de la croissance bactérienne au cours du temps a permis de mettre en évidence une augmentation quantitative de la biomasse bactérienne, comme observé avec les extraits aqueux (Figure 3a). L'augmentation moyenne a été de 30% en présence d' 1 mg/mL d'extrait de fenugrec SetuflorTM, et de 40% en présence de 2 mg/mL d'extrait de fenugrec SetuflorTM. 110 Afin de confirmer et affiner ce résultat, la même expérience a été réalisée avec des doses croissantes d'extrait de fenugrec SetuflorTM en solution aqueuse: 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL. L'augmentation quantitative a été respectivement de 40%, 70%, 85%, 105% et 115% par rapport au contrôle sans extrait de fenugrec SetuflorTM (Figure 3b). De plus, la prolifération bactérienne a été plus rapide, comme précédemment observé. 115 L'effet stimulateur de croissance de l' extrait de fenugrec SetuflorTM sur les bactéries bénéfiques est donc dose-dépendant. Spécificité de genre et d'espèce Afin de savoir si l'extrait de fenugrec SetuflorTM avait un effet général sur la croissance de l'ensemble des microorganismes ou seulement sur les microorganismes bénéfiques pour l'homme et l'animal, 120 l'extrait de fenugrec SetuflorTM a été testé sur d'autres bactéries gram positif et gram négatif ainsi que sur des levures bénéfiques ou non pour la santé animale et humaine. La Figure 4 reprend la liste des souches testées, ainsi que l'effet sur la croissance (quantité de biomasse) ou la vitesse de croissance de concentrations d'extrait de fenugrec SetuflorTM variant de 0,1 g/L à 4 g/L, et provenant de graines totales ou détégumentées. 125 Ces expériences ont permis de confirmer que l'extrait de fenugrec SetuflorTM avait un effet positif sur la croissance des bactéries lactiques testées du genre Bifidobacterium et du genre Lactobacillus. , Il n'a pas été mis en évidence d'augmentation qualitative (vitesse de croissance) ou quantitative (augmentation de la biomasse mesurée par absorbance) chez aucune de ces espèces Bacillus cereus, Bac illus subtilis, Clostridiul perfringens, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecium, 130 Enterococcus hirae, Escherichia cou, Listeria monocytogenes, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Shigella boydii, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Yersinia enterolytica. Salmonella enterica serovar typhimurium et Clostridium sporogenes sont légèrement stimulés mais de manière très modérée et uniquement aux concentrations les plus fortes de 4 g/L, respectivement d'extrait issu de graines détégumentées et de graines totales. 135 Concernant les levures, l'extrait de fenugrec SetuflorTM stimule très significativement la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae, mais pas la levure pathogène Candida albicans. L'extrait de fenugrec SetuflorTM stimule donc spécifiquement la croissance des bactéries et levures bénéfiques pour l'homme et l'animal. Essais de source de carbone 140 Dans des essais chez le porcelet, il avait été suggéré que des graines de fenugrec ajoutées à l'alimentation quotidienne pouvaient être une source de carbone pour des bactéries du genre Lactobacillus et des Clostridium de groupe I, grâce aux galactomannanes contenus dans les graines. Des essais ont donc été conduits en présence de plusieurs sources de carbone avérées (glucose, inuline, fructooligosaccharides), en présence ou absence de , l'extrait de fenugrec SetuflorTM. L'extrait de 145 fenugrec SetuflorTM a également été testé comme source unique de carbone. De manière surprenante, contrairement à ce qui était décrit précédemment chez le porcelet, l'extrait de fenugrec SetuflorTM testé seul n'est pas une source de carbone. Incorporé dans un milieu minimal sans source de carbone, l'extrait de fenugrec SetuflorTM ne permet quasiment pas la croissance des bactéries (Figure 5a, SET), contrairement au glucose seul (Figure 5a, GLU). Associé comme source de carbone 150 par contre, l'extrait de fenugrec SetuflorTM stimule grandement la vitesse de croissance et la biomasse des bactéries, et ce de manière stable (Figure 5a, GLU+SET). Des résultats similaires sont obtenus en remplaçant le glucose comme source de carbone par des fructo-oligosaccharides (Figure 5b) ou de l'inuline (Figure 5c). Contrairement à ce qui pouvait être attendu, l'extrait de fenugrec SetuflorTM n'est pas une source de 155 carbone, mais agit comme un « stimulant » de la croissance de bactéries, tant d'un point de vue quantitatif qu'en termes de vitesse de croissance. LEGENDES , La figure 1 est une représentation graphique de l'effet de l'extrait de l'invention sur la croissance de 160 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, et Lactobacillus gasseri. La figure 2 est une représentation graphique comparant l'effet de concentrations croissantes de l'extrait de l'invention sur la vitesse de croissance une culture de Lactobacillus casei au cours du temps. La figure 3a est une représentation graphique de l'effet de l'extrait de l'invention solubilisé dans 165 l'éthanol sur des cultures de Lactobacillus acidophilus au cours du temps. La figure 3b est une représentation graphique de l'effet de quantités croissantes de l'extrait de l'invention solubilisé dans l'eau sur des cultures de Lactobacillus acidophilus au cours du temps. La figure 4 synthétise de manière schématique l'effet de concentrations variables d'extraits issus de graines totales ou détégumentées sur diverses souches bactériennes et fongiques, bénéfiques ou 170 pathogènes. La figure 5 représente la croissance de Lactobacillus acidophilus en absence ou présence de différentes sources de carbone. GLU-Glucose, FOS=Fructo-oligo-saccharides, INU--Inuline, SET-SetuflorTm, ES = contrôle eau. Figure 5a: Glucose additionné ou non de SetuflorTM. Figure 5n: Fructooligosaccharides additionnés ou non de SetuflorTM. Figure 5e: Inuline additionnée ou non de 175 SetuflorTM. CITATIONS Bahi A et al. (2017) Effects of dietary administration of fenugreek seeds, alone or in combination with probiotics, on growth performance parameters, humoral immune respeonse and gene expression of 180 gilthead seabream (Sparus aurata L), Fish Shellfish Immunol., 60 :50-58 Guardiola FA et al. (2017) Effects of dietary supplementation with fenugreek seeds, atone or in combination with probiotics, on gilthead seabream (Sparus aurata L) skin mucosal immunity, Fish Shellfish Immunol., 65: 169-178 W0/2009/138684 Fenugreek extract for treating human nd animal diseases involving flagellate 185 parasites Pangal M et al. (2011) In vitro antimicrobial activity of ten medicinal plants against clinical isolates of oral cancer cases, Ann. Clin. Microb. Antimicrob., 20 :10-21 s Aman S et al. (2014) Antimicrobial polyphenols from small tropical fruits, tea and spice oilseeds, Food Sci. TechnoL Int., 20(4) : 241-251 190 Haouala R et al. (2008) Aqueous and organic extracts of Trigonella foenum-graecum L. inhibit the mycelia growth of fungi, J. Environ. Sci., 20(12) : 1453-1457 Zentek J et al. (2013) Fenugreek seed affects intestinal microbiota and immunological variables in piglets aller weaning, Br. J. Nutr., 109 (5) : 859-866 Lin B et al. (2011) Galactomann-guided preemptive vs. empirical antifungals in the persistently febrile 195 neutropenic patient : a prospective randomized study, Food Hydrocoll. 25: 180-188 MATERIEL ET METHODE Préparation de l'extrait L'extrait de fenugrec est obtenu comme décrit dans le brevet W0/2009/13 8684 par broyage à partir de 200 graines détégumentées micronisées (grains de la taille égale à 50 lim) et est dénommé par la suite indifféremment SetuflorTM ou FenulineTM. 1 g de cette poudre est repris dans 5 mL d'eau stérile (concentration de 200 mg/mL), ou bien lorsque cela est précisé, dans de l'éthanol à 50% (concentration de 200 mg/mL). La solution est laissée une nuit sous agitation à température ambiante puis centrifugée 10 min à 205 16100g à 4°C. Le surnageant est récupéré et centrifugé à nouveau 10 min à 16100g à 4°C. Le surnageant est ensuite stocké en aliquots de 1 mL à -80°C. Culture des bactéries Les bactéries utilisées pour évaluer l'effet de l'extrait de fenugrec SetuflorTM sont Bifidobacterium 210 breve CIP 64.69, Bifidobacterium lactis CIP 105.265, Bifidobacterium longum subsp. longum CIP 64.62, Bacteroides thetaiotamicron CIP 104.207, Lactobacillus acidophilus CIP 103598, Lactobacillus delbruecki CIP 101.027, Lactobacillus paracasei CIP 103.704, Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis CIP 52.62, Campylobacter jejuni ATCC 29428, Clostridium sporogenes CIP 100.651, Clostridium perfringens ATCC 13124, Enterococcus faecium C1P 102.379, Enterococcus 215 hirae ATCC 8043, Escherichia cou i CIP 53.126, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Propionibacterium acnes ATCC 6919, Salmonella enterica ser. typhimurium CIP 103.799, Staphylococcus aureus CIP 4.83, Shigella boydii CIP 52.48, Vibrio alginolyticus CIP 103.336, Vibrio . ,cholerae CIP 106.973, Yersinia enterolytica ATCC 23715, Saccharomyces cerevisiae UMIP 1181.79, Candida albicans UMIP 48.72. 220 Les bactéries sont cultivées en milieu MRS à 37°C. La composition du milieu MRS est la suivante : Gélose Bouillon Peptone 10 g 10 g Extrait de viande 10 g 8 g Extrait de levure 5 g 4 g Glucose 20 g 20 g Acétate de sodium trihydraté 5 g 5 g Citrate d'ammonium 2 g 2 g Tween 80 1 g 1 g Hydrogénophosphate de potassium 2 g 2 g Sulfate de magnésium heptahydraté 0,1 g 0,2 g Sulfate de manganèse tétrahydraté 0,05 g 0,05 g Agar 15 g Eau qsp (quantité suffisante pour) 1 1 pH = 6,2 Culture en absence ou présence de différentes sources de carbone Le milieu minimum contenant tous les ingredientes essentiels pour les tests de sources de carbone est constitué comme suit : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L Dipotassium phosphate monobasique 2 g/L Sulfate de magnesium 0,2 g/L Tween 80 1 g/L Cystéine 0,5 g/L Acétate de sodium 5 g/L Eau qsp (quantité suffisante pour) 900 mL 225 Pour ces tests, les concentrations des défférentes sources de carbone ajoutées sont : glucose (GLU) : 5 g/L; fructo-oligosaccharides (FOS) : 5 g/L; inuline (INU) : 1 g/L; SetuflorTM (SET) : 2 g/L. Dénombrement des microorganismes Les bactéries (105 ufc/mL = unités formant des colonies par millilitre) sont mises en présence de quantités croissantes d'extrait de fenugrec SetuflorTM dans un bouillon MRS en anaérobie. Après 24 230 ou 48 heures de culture à 37°C, la suspension bactérienne est diluée en milieu MRS à une dilution connue, puis la dilution est étalée sur gélose MRS. Après 48 heures, les colonies sont comptées ; lorsque ce nombre est compris entre 30 et 300, le nombre de colonies est multiplié par le facteur de dilution afin d'avoir la charge bactérienne initiale (en ufc/mL). Les données sont traitées à l'aide d'ExcelTM (MicrosoftTM). 235 Cinétiques de croissance bactérienne Les bactéries (105 ufc/mL = unités formant des colonies par millilitre) sont mises en présence de quantités croissantes de SetuflorTM dans un bouillon MRS en anaérobie. La croissance à 37°C des bactéries est mesurée par absorbance de la densité optique à 595 nm pendant 48 heures, à l'aide d'un automate de mesure FluostarTM ( BMG Labtech) qui effectue les mesures toutes les heures. Les 240 données sont traitées à l'aide cl'ExcelTM (MicrosoftTM). REVENDICATIONS1/ Utilisation d'un extrait de fenugrec pour stimuler spécifiquement la croissance de microorganismes commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les microorganismes commensaux et probiotiques sont des bactéries lactiques des genres Lactobacillus et Bifidobacterium, ainsi que des levures du genre Saccharomyces. 3/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l'extrait stimule la vitesse de croissance des microorganismes commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait stimule l'obtention de la quantité de biomasse des microorganismes commensaux et probiotiques bénéfiques pour l'Homme et pour l'animal. 5/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir de graines broyées. 6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un milieu de culture industriel. 7/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un complément alimentaire. 10 8/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un produit d'hygiène ou de cosmétique. 11 - , 9/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est incorporé au sein d'un médicament.