FR 3070494 A1 20190301 FR 1757817 A 20170823 Méthode de diagnostic d'une peau présentant des signes de vieillissement La présente invention concerne des méthodes de diagnostic d'une peau présentant des signes de vieillissement. Au cours du vieillissement la peau subit dans son ensemble de nombreux dommages, reflets d'altérations fonctionnelles, structurales et de dégradations de l'ensemble de ses compartiments (épiderme, jonction dermo-épidermique, derme, jonction dermo-hypodermique et hypoderme), concomitantes d'une chute de la qualité de la vascularisation. Au niveau cellulaire, de nombreuses fonctions métaboliques sont touchées. L'épiderme s'affine avec le vieillissement, les kératinocytes perdent leur capacité de renouvellement et de réparation, la synthèse d'acide hyaluronique, de protéoglycannes s'effondre avec l'âge, la qualité et la cohésion de la jonction dermoépidermique baissent rendant le tissu cutané plus fin et plus fragile, l'épaisseur de l'épiderme est plus fine, la jonction dermo-épiderme perd ses invaginations caractéristiques majeures d'une peau jeune. Il en est de même au niveau dermique où les fibroblastes synthétisent moins les protéines ou molécules matricielles fondamentales dans son organisation (collagènes, protéoglycanes notamment). L'hypoderme est également affecté. L'ensemble de ces événements fragilise l'ensemble de la peau qui devient moins ferme, moins élastique, fragile et peine à retenir un niveau d'hydratation correct (perturbation de la fonction barrière). La peau peut aussi perdre de son éclat, présenter des altérations de son microrelief entrainant l'apparition d'une texture papyracée, une apparition de rides et ridules, présenter une augmentation de l'hétérogénéité du diamètre des pores, autant de signes perçus comme de « mauvaise forme » ou de fatigue et modifiant la perception de l'âge apparent. Qui plus est, l'altération de l'ensemble des propriétés de la peau peut être accentuée par différents facteurs secondaires, tels que la conséquence de différents désordres physiologiques, d'agressions environnementales, telles que la pollution ou les radiations comme les rayons ultraviolets, de facteurs extrinsèques, comme le tabac, de variations de l'organisation, de la densité de l'hypoderme, consécutivement à une modification de la masse corporelle, une grossesse, un état d'obésité, la cellulite, ou bien encore de désorganisation des constituants de la matrice extracellulaire résultant par exemple de vergetures, de cicatrices. De ce qui précède, on comprend l'importance de trouver des biomarqueurs permettant de détecter les signes de vieillissement de la peau et en particulier lorsque ceux-ci ne sont pas encore visibles, afin de pouvoir réduire et/ou ralentir la progression de ces signes de vieillissement de la peau. Plus particulièrement, le vieillissement de la peau 2 pouvant se matérialiser par un ou plusieurs des différents signes mentionnés ci-dessus, il existe un besoin important de biomarqueurs spécifiques de l'un ou plusieurs de ces signes, afin de les cibler de manière adaptée chez un sujet donné. La présente invention a pour objet de satisfaire à ce besoin. 5 La demanderesse a découvert de manière surprenante que l'expression du gène codant l'enzyme de dégradation de l'insuline (IDE), au niveau de la peau, est corrélée à la présence de signes de vieillissement de la peau, plus particulièrement à l'élastose, à l'apparition des rides de la patte d'oie et à l'apparition des rides sous les yeux. 10 L'enzyme de dégradation de l'insuline (abrégée IDE) est une métalloprotéase à zinc de 113 kDa qui est présente dans les bactéries, les champignons, les plantes et les animaux. Elle est également décrite sous d'autres noms tel que : insulysine, insulinase, insulinine glucagon protéase, protéase insuline-spécifique, FLJ35968, insuline protéase. L'IDE est une enzyme sécrétée qui est souvent située dans le cytosol ou associée à la 15 membrane plasmique des cellules. Elle est exprimée dans de nombreux tissus et les plus hauts niveaux d'IDE se trouvent dans le cerveau, les reins, le foie et les testicules. Ainsi, selon un premier de ses aspects, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic, préférentiellement in vitro, d'une peau présentant des signes de vieillissement, 20 chez un sujet, ladite méthode comprenant l'étape suivante : a) mesurer le niveau d'expression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau dudit sujet. Eventuellement cette méthode de diagnostic selon l'invention comprend en outre l'étape suivante : 25 b) sur la base du niveau d'expression du gène codant l'IDE mesuré à l'étape a), déterminer si la peau dudit sujet présente des signes de vieillissement. La présente invention concerne également une méthode de traitement cosmétique d'une peau présentant des signes de vieillissement chez un sujet, ladite méthode 30 comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau dudit sujet; b) déduire de l'étape a) si la peau dudit sujet présente des signes de vieillissement ; 3 C) si la peau est identifiée comme présentant des signes de vieillissement à l'étape b), traiter ladite peau avec une composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement de la peau. 5 Par « signes de vieillissement de la peau », on entend ici toutes les modifications de la peau intervenant avec l'âge et qui ne sont parfois pas visibles aux stades précoces, et en particulier l'élastose, l'apparition des rides de la patte d'oie et l'apparition des rides sous les yeux. L'IDE est une protéine ayant deux isof ormes dont les séquences en acides aminés 10 sont connues et notamment correspondent aux séquences ayant pour code d'accession NOBI : NP 004960.2 (version du 13 avril 2016) et NP 001159418.1 (version du 13 avril 2016). La séquence de l'ARNm codant l'IDE est également connue de l'homme du métier et notamment accessible avec le code d'accession NOBI : M21188.1 (version du 23 juin 2010). 15 Par « niveau d'expression du gène codant l'IDE » on entend le niveau d'expression en ARN messager (ARNm) du gène codant l'IDE et/ou le niveau d'expression de la protéine IDE. Préférentiellement, le niveau d'expression de la protéine IDE est mesuré à l'aide d'un ligand spécifique de la protéine IDE, comme par exemple un anticorps, de 20 préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFv ou un nanocorps, spécifique de cette protéine. Le niveau d'expression peut alors être mesuré par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, comme par exemple par un test ELISA. En particulier, la mesure du niveau d'expression de la protéine IDE peut être effectuée à l'aide d'un système miniaturisé tel qu'une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande 25 internationale W02011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la protéine IDE. La puce peut ensuite être analysée au moyen d'un lecteur adapté pour déterminer si des protéines IDE se sont liées audit ligand et conclure quant à la présence et la quantité d'IDE dans l'échantillon de peau. Préférentiellement, le niveau d'expression en ARNm du gène codant l'IDE est 30 mesuré à l'aide d'une séquence nucléotidique complémentaire de l'ARNm du gène codant l'IDE et s'hybridant spécifiquement à l'ARNm du gène codant l'IDE ou, un fragment de celle-ci s'hybridant spécifiquement à l'ARNm du gène codant l'IDE, cette séquence ou ce fragment comprenant 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou à l'aide d'un couple d'amorces ou d'une sonde de 10 à 60 nucléotides, préférentiellement 35 15 à 30 nucléotides comprenant ladite séquence ou ledit fragment. Le niveau 4 d'expression peut alors être mesuré par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, par exemple par une PCR quantitative. Dans le cadre de l'invention, les termes «hybrider» ou «hybridation», comme bien connu de l'homme du métier, se réfèrent à la liaison d'une molécule d'acide nucléique à 5 une séquence nucléotidique particulière dans des conditions appropriées, notamment dans des conditions stringentes. Le terme «conditions stringentes», tel qu'utilisé ici correspond à des conditions qui sont appropriées pour produire des paires de liaison entre les acides nucléiques ayant un niveau déterminé de complémentarité, tout en étant impropre à la formation de paires 10 entre les acides nucléiques de liaison ayant une complémentarité inférieure audit niveau déterminé. Les conditions stringentes sont dépendantes des conditions d'hybridation et de lavage. Ces conditions peuvent être modifiées selon les méthodes connues de l'homme de l'art. Généralement, des conditions de haute stringence sont une température d'hybridation environ 5°C inférieure à la températue de fusion (Tm), de préférence 15 proche de la Tm des brins parfaitement appariés par bases. Les procédures d'hybridation sont bien connues dans la technique. Les conditions de haute stringence impliquent généralement l'hybridation à une température d'environ 50°C à environ 68°C dans unesolution 5x SSC/5x solution de Denhardt /1,0% SDS, et un lavage dans une solution 0,2x SSC/0,1°A SDS à une 20 température comprise entre environ 60°C et environ 68°C. Selon un mode de réalisation préféré, l'échantillon de peau du sujet utilisée dans les méthodes de diagnostic et de traitement cosmétique selon l'invention, est un échantillon prélevé, de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet. 25 Préférentiellement l'échantillon de peau est issu du stratum corneum. Le stratum corneum est la couche la plus éloignée de l'épiderme, et comprend la surface de la peau. Elle est composée principalement de cellules mortes. Selon un mode de réalisation, les méthodes selon l'invention comprennent une 30 étape de prélèvement de l'échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non invasive, et en particulier ne nécessite pas d'anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape de prélèvement de l'échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu'un disque D-squame®. 5 Par « sujet » on comprend un être humain, de préférence âgé de 20 à 90 ans, préférentiellement de 30 à 80 ans, de 36 à 75 ans et encore plus préférentiellement de 60 à 80 ans. De préférence, le sujet est une femme. 5 Dans un mode de réalisation particulier, l'étape (b) est réalisée après comparaison du niveau d'expression du gène codant l'IDE obtenu avec une valeur de référence. Dans un mode de réalisation, la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d'expression du gène codant l'IDE dans une population déterminée, par exemple une population dans une tranche d'âge déterminée, et/ou ayant un type de peau défini 10 (caucasien, asiatique, etc.. ou peau à tendance grasse, peau sèche ou ayant un phototype particulier défini selon la classification de Fitzpatrick). De préférence la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d'expression du gène codant l'IDE dans une population caucasienne, et/ou dans une population ayant un phototype II ou III selon la classification de Fitzpatrick. 15 Dans un mode de réalisation particulier la valeur de référence est déterminée par la valeur moyenne du niveau d'expression du gène codant l'IDE chez des femmes âgées de 30 à 80 ans, de 36 à 75 ans et encore plus préférentiellement de 60 à 80 ans. Dans un mode de réalisation particulier la valeur de référence est comprise entre 9.0 et 13.0 ng/ml de protéine IDE et de préférence la valeur de référence est comprise entre 9.35 et 12.65 20 ng/ml de protéine IDE. Dans une autre forme de réalisation, la valeur de référence est la valeur seuil optimale déterminée par analyse ROC. Conformément à l'invention une valeur de référence peut être déterminée par une pluralité d'échantillons, de préférence plus de 50, 100, 200 ou 500 échantillons. Le terme «comparaison» fait référence au fait de déterminer si le niveau 25 d'expression du gène codant l'IDE est essentiellement identique à une valeur de référence ou diffère de celle-ci. De préférence, le niveau d'expression du gène codant l'IDE est considéré comme différent d'une valeur de référence si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n'est pas statistiquement significative, le niveau d'expression du gène codant l'IDE et la valeur de référence sont essentiellement 30 identiques. Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si la peau présente des signes de vieillissement. Typiquement, la peau est considérée comme présentant des signes de vieillissement lorsque le niveau d'expression du gène codant l'IDE est significativement inférieur à la valeur de référence et la peau n'est pas considérée comme 35 présentant des signes de vieillissement lorsque le niveau d'expression du gène codant l'IDE est essentiellement identique ou significativement supérieur à la valeur de référence. 6 Par « composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement de la peau» on comprend toute composition cosmétique connue de l'homme du métier permettant de réduire et/ou de ralentir la progression des signes de vieillissement de la peau tels l'élastose, l'apparition des rides 5 de la patte d'oie, et l'apparition des rides sous les yeux. L'invention porte également sur une méthode d'identification d'un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement d'une peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 10 a) mesurer le niveau d'expression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau exposé audit composé candidat; b) comparer ledit niveau d'expression au niveau d'expression dans un échantillon de ladite peau non exposé audit composé ; c) identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la réduction 15 et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement d'une peau lorsque une augmentation du niveau d'expression du gène codant l'IDE dans l'échantillon de peau qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport au niveau d'expression du gène codant l'IDE dans l'échantillon de peau qui n'a pas été exposée au composé candidat. 20 Selon un mode de réalisation préféré l'échantillon de peau utilisée dans la méthode d'identification de composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement de la peau selon l'invention est une culture de cellules de peau, une culture d'épiderme, une peau complète reconstruite, un expiant de 25 peau humaine, ou un échantillon de peau d'un sujet tel que défini précédemment. Préférentiellement les méthodes selon l'invention comprennent une étape de traitement de l'échantillon afin de préparer la mesure du niveau d'expression du gène codant l'IDE. Par exemple l'échantillon traité est un extrait protéique soluble. En particulier 30 si l'échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu'un disque D-squame® l'extrait protéique soluble peut être obtenu par un système d'extraction de protéines tel que celui décrit dans la demande internationale W02015/009085 qui permet de mettre en contact les échantillons D-squames avec un volume minimal de tampon d'extraction et ainsi d'obtenir un extrait protéique soluble. 35 La présente invention porte également sur un kit comprenant : 7 a) un moyen pour la mesure du niveau d'expression du gène codant l'IDE dans un échantillon de peau, et b) une notice d'instructions. 5 Par « moyen pour la mesure du niveau d'expression du gène codant l'IDE» on entend un ligand spécifique de la protéine IDE, comme par exemple un anticorps, de préférence monoclonal, un fragment Fab, un scFy ou un nanocorps, spécifique de cette protéine ou encore une puce microfluidique, comme celle décrite dans la demande internationale W02011/126249, cette puce contenant des ligands spécifiques de la 10 protéine IDE. On entend alternativement une séquence nucléotidique complémentaire de l'ARNm du gène codant l'IDE et s'hybridant spécifiquement à l'ARNm du gène codant l'IDE ou, un fragment de celle-ci s'hybridant spécifiquement à l'ARNm du gène codant l'IDE, cette séquence ou ce fragment comprenant 5 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 à 20 nucléotides, ou un couple d'amorces ou une sonde de 10 à 60 nucléotides, 15 préférentiellement 15 à 30 nucléotides comprenant ladite séquence ou ledit fragment. Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend en outre une gamme étalon du niveau d'expression du gène codant l'IDE. 20 Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention, comprend en outre un moyen de prélever l'échantillon de peau tel qu'un disque D-squame®. La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un kit selon l'invention pour identifier un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression 25 des signes de vieillissement d'une peau. La présente invention sera illustrée par l'exemple suivant. Exemple : 30 Les rides de la patte d'oie, les rides sous les yeux et l'élastose ont été évalués sur les yeux et l'ensemble du visage de 376 femmes âgées de 36 à 75 ans. Le niveau d'expression du gène codant l'IDE a également été évalué sur les joues de ces femmes, grâce à un prélèvement D-squame dont l'extrait protéique solubilisé a été analysé par un 35 test de type ELISA réalisé sur une puce. 8 Après avoir discrétiser les signes de vieillissement, l'analyse statistique des résultats obtenus montre une corrélation entre la présence de ces signes de vieillissement et le niveau d'expression d'IDE. 5 Tableau 1 : signes de P Seuil ASC* Sensibilité Spécificité vieillissement values (ng/ml) clinique Rides de la REVENDICATIONS1.- Méthode de diagnostic d'une peau présentant des signes de vieillissement, chez un sujet, ladite méthode comprenant l'étape suivante : a) mesurer le niveau crexpression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau dudit sujet. 2.- Méthode de traitement cosmétique d'une peau présentant des signes de vieillissement chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau dudit sujet; b) déduire de l'étape a) si la peau dudit sujet présente des signes de vieillissement; c) si la peau est identifiée comme présentant des signes de vieillissement à l'étape b), traiter ladite peau avec une composition cosmétique permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement de la peau. 3.- Méthode d'identification d'un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement d'une peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mesurer le niveau d'expression du gène codant l'IDE, dans un échantillon de peau exposé audit composé candidat; b) comparer ledit niveau d'expression mesuré à l'étape a) au niveau d'expression du gène codant l'IDE dans un échantillon de peau non exposé audit composé ; c) identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement d'une peau lorsque une augmentation du niveau d'expression du gène codant l'IDE dans l'échantillon de peau qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport au niveau d'expression du gène codant l'IDE dans l'échantillon de peau qui n'a pas été exposée au composé candidat. 4.- Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit échantillon de peau est une culture de cellules de peau, une culture d'épiderme, une peau complète reconstruite, _un expiant de peau humaine, ou un échantillon de peau d'un sujet. 10 5.- Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'échantillon de peau est prélevé en utilisant un disque D-squame®. 6.- Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le niveau 5 d'expression du gène codant l'IDE est déterminé par le niveau d'expression en ARNm dudit gène ou par mesure du niveau d'expression de la protéine codée par ledit gène. 7.- Méthode selon la revendication 6, dans laquelle le niveau d'expression de la protéine codée par le gène codant l'IDE est mesuré à l'aide d'un ligand spécifique de la 10 protéine IDE. 8.- Kit comprenant : a) un moyen pour la mesure, dans un échantillon de peau, du niveau d'expression du gène codant l'IDE, et 15 b) une notice d'instructions. 9.- Kit selon la revendication 8, dans lequel le moyen pour la mesure, dans un échantillon de peau, du niveau d"expression du gène codant l'IDE est un ligand spécifique d'IDE ou une séquence nucléotidique complémentaire de cet ARNm ou un 20 fragment de celle-ci, un couple d'amorces ou une sonde spécifique de l'ARNm de l'IDE. 10.- Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 8 à 9 pour l'identification d'un composé permettant la réduction et/ou le ralentissement de la progression des signes de vieillissement d'une peau. 25 30