FR 3065883 A1 20181109 FR 1770467 A 20170506 1 La prÃ©sente invention concerne les domaines techniques de la cristallisation et de la cristallographie des protÃ©ines, aussi appelÃ© MX pour "macromolecular crystallography". Plus prÃ©cisÃ©ment, l'invention concerne de nouveaux complexes ligand / ion mÃ©tallique qui peuvent Ãªtre utilisÃ©s en tant qu'agent d'aide Ã la cristallisation des protÃ©ines et/ou comme agent phasant pour la dÃ©termination de leur structure cristalline. L'invention a Ã©galement pour objet leur utilisation dans ces domaines et les procÃ©dÃ©s de cristallisation et de dÃ©termination de donnÃ©es structurales qui les mettent en oeuvre. Les protÃ©ines sont des Â« nanomachines Â» Ã l'origine de tous les processus biologiques complexes (rÃ©actions enzymatique, transport de mÃ©tabolite, production d'Ã©nergie, transmission de signaux). La fonction spÃ©cifique de chaque protÃ©ine est directement liÃ©e Ã sa structure tridimensionnelle. Ainsi, la biologie structurale s'intÃ©resse Ã dÃ©terminer les structures de macromolÃ©cules biologiques et l'organisation de leur assemblage spatial afin de comprendre leur fonctionnement. Elle a des applications importantes dans le domaine de la biochimie et de l'enzymologie, pour la comprÃ©hension des mÃ©canismes catalytiques et la reconnaissance spÃ©cifique de substrats. Elle prÃ©sente donc une valeur formidable pour le dÃ©veloppement des biotechnologies : (a) En santÃ© et en agriculture : connaissant la structure 3D d'une protÃ©ine, on peut par exemple modÃ©liser sur-mesure des principes actifs capables d'interagir spÃ©cifiquement avec cette derniÃ¨re (enzyme, rÃ©cepteur) afin de modifier son fonctionnement. De nombreux mÃ©dicaments ont Ã©tÃ© conÃ§us grÃ¢ce Ã de telles recherches. (b) En gÃ©nie gÃ©nÃ©tique des protÃ©ines : l'observation des changements de structure obtenus suite Ã des mutations gÃ©nÃ©tiques permet pas Ã pas d'optimiser les structures protÃ©iques pour amÃ©liorer les procÃ©dÃ©s biologiques industriels exploitant ces outils tels que, par exemple, les rÃ©actions enzymatiques. 3065883 2 La cristallographie est la principale technique utilisÃ©e par la biologie structurale. Avec cette mÃ©thode, la dÃ©termination de la structure des protÃ©ines est basÃ©e sur l'Ã©tude de la diffraction des rayons X par leurs cristaux. Par consÃ©quent, l'obtention de cristaux de protÃ©ines est le prÃ©requis obligatoire pour ce type d'Ã©tudes. 5 Dans ce domaine, plusieurs difficultÃ©s successives doivent Ãªtre surmontÃ©es. La premiÃ¨re difficultÃ© relÃ¨ve du domaine de la biologie et concerne la prÃ©paration et la purification de protÃ©ines d'intÃ©rÃªt. La seconde difficultÃ© concerne l'Ã©tape de cristallisation. Des dÃ©veloppements mÃ©thodologiques et instrumentaux ont Ã©tÃ© mis en place afin de les lever. 10 En particulier, on peut citer : L'automatisation de la cristallisation permettant un criblage de plusieurs centaines de conditions physico-chimiques, telle que la plateforme HTX Ã Grenoble, Les sources de rayonnement synchrotron permettant d'utiliser des 15 Ã©chantillons de petites tailles (5 Ã 10 microns) tel que l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Et plus rÃ©cemment, la mise en service des sources laser Ã Ã©lectrons libres (XFEL, projet europÃ©en Ã Hambourg) qui permet d'utiliser des cristaux de taille encore plus faible (infÃ©rieure au micron). 20 Pourtant ces dÃ©veloppements ne suffisent pas puisqu'une analyse des statistiques des consortium de gÃ©nomique structurale montre que ces deux verrous restent prÃ©dominants et seules 10 Â°A) des protÃ©ines purifiÃ©es verront finalement leur structure dÃ©terminÃ©e par MX. Cela illustre le potentiel sous-jacent de la MX, qui est dÃ©jÃ une mÃ©thode de choix, en particulier si le verrou majeur, la production de 25 cristaux de protÃ©ines, est levÃ©. Un cristal d'une protÃ©ine, et plus gÃ©nÃ©ralement d'une macromolÃ©cule biologique, est constituÃ© d'un empilement rÃ©gulier et pÃ©riodique des molÃ©cules qui le composent. L'empilement est maintenu par des contacts au sein du cristal (liaisons 3065883 3 hydrogÃ¨ne, ponts salins, contacts hydrophobes). Les processus de cristallisation des macromolÃ©cules biologiques sont encore loin d'Ãªtre compris. Les approches actuelles sont basÃ©es sur une approche empirique, de type essais/erreurs afin de dÃ©terminer les conditions favorables essentielles Ã une cristallisation efficace : tempÃ©rature, pH, 5 concentration en protÃ©ines, agents prÃ©cipitant, etc.... Une des notions importantes Ã considÃ©rer dans la cristallogenÃ¨se, le processus de formation d'un cristal, est la notion de solubilitÃ©. En solution, une macromolÃ©cule est entourÃ©e d'une couche de solvatation qui prÃ©sente un effet rÃ©pulsif et isolant et permet d'Ã©viter l'auto-agrÃ©gation et la prÃ©cipitation. La cristallisation va contre cet effet, puisqu'il s'agit de 10 s'Ã©loigner des conditions de solubilitÃ© de la macromolÃ©cule biologique par l'ajout d'un agent prÃ©cipitant, Ã©galement nommÃ© agent cristallisant. Au stade de la nuclÃ©ation, des molÃ©cules de protÃ©ines commencent Ã former des agrÃ©gats. Ces agrÃ©gats peuvent se re-dissoudre, mais, une fois qu'ils atteignent une certaine taille, ils forment des noyaux stables. Une fois que des noyaux stables ont Ã©tÃ© obtenus, une 15 croissance spontanÃ©e des cristaux peut se produire. Le principe gÃ©nÃ©ral de la cristallisation repose sur le diagramme prÃ©sentÃ© en Figure 1 qui correspond au schÃ©ma rÃ©alisÃ© par Mirjam Leunissen et figurant sur http://people.ds.cam.ac.uk/m1527/publications/assets/ leunissen- literatureresearch.pdf. Les deux Ã©tapes principales qui surviennent dans le processus 20 de cristallisation sont : la nuclÃ©ation et la croissance cristalline. Ã Supersaturato Concentration en protÃ©ine ,Zone de mmtÃ©etion Courbe de solubilitÃ© Zone mÃ©tastable Concentration en prÃ©cipitant FIGURE 1: Diagramme de phase illustrant le processus de cristallisation (Extrait de http://people.ds.cam.ac. uk/m1527/publications/assets/leunissenliteratureresearch.pdf) 25 3065883 4 Le but lors d'une cristallisation est de jouer sur les concentrations en macromolÃ©cule biologique et en agent cristallisant pour parvenir Ã atteindre la zone de nuclÃ©ation reprÃ©sentÃ©e sur le diagramme de la Figure 1. Lorsque cette zone est atteinte, il peut se former des nucleii (points de nuclÃ©ation). Ces nucleii sont des 5 agrÃ©gats plus ou moins organisÃ©s d'une centaine de macromolÃ©cules. La formation de ces dÃ©parts Â« cristallins Â» fait diminuer la concentration en macromolÃ©cule soluble. C'est le commencement de la croissance cristalline. D'autres macromolÃ©cules viennent s'agencer sur ce nucleii et forment des micro-cristaux qui vont grandir avec le temps. 10 Dans le cadre de la prÃ©sente description, Â« agent prÃ©cipitant Â» et Â« agent cristallisant Â» sont utilisÃ©s indiffÃ©remment. On entend par agent cristallisant/prÃ©cipitant, une molÃ©cule ou un mÃ©lange de molÃ©cules aidant Ã la formation d'un cristal de macromolÃ©cules biologiques, dans certaines conditions. 15 L'agent cristallisant induit une modification de la solubilitÃ© et donc de la position sur le diagramme en fonction du temps. Il existe trois grandes classes majeures d'agents cristallisants : - Les sels (NaCI, tartrate de sodium ou de potassium etc...) - Les solvants organiques (Ã©thanol, dioxane, MPD pour mÃ©thylpentanediol etc...) 20 - Les polymÃ¨res (PEG (Poly-EthylÃ¨ne Glycol) de poids molÃ©culaires allant jusqu'Ã 20000 g/mol, Jeffamine T etc...) Ces agents ont pour effet - d'entrer en compÃ©tition avec la macromolÃ©cule biologique pour l'eau, ou plus gÃ©nÃ©ralement le solvant dans lequel la macromolÃ©cule 25 est initialement en solution, et ainsi diminuer la solubilitÃ© de la macromolÃ©cule, induisant sa cristallisation, - d'Ã©cranter des charges Ã la surface de la macromolÃ©cule permettant le rapprochement de plusieurs macromolÃ©cules, - de modifier la constante diÃ©lectrique du solvant et par consÃ©quent les forces entre macromolÃ©cules, et/ou - de favoriser des phÃ©nomÃ¨nes de type volume exclu (exclusion hydrophobe). Les expÃ©riences de cristallisation sont prÃ©parÃ©es par des robots permettant un criblage de diffÃ©rentes conditions de cristallisations commercialement disponibles 306 5 883 5 (kits de la sociÃ©tÃ© Molecular Dimensions, par exemple) en parallÃ¨le et la phase de cristallisation est suivie rÃ©guliÃ¨rement par des robots microscopes. Cette approche Ã haut dÃ©bit a fait passer au second plan la recherche de 5 mÃ©thodologies alternatives permettant de favoriser la cristallisation et consistant Ã trouver des agents qui favorisent la cristallisation sans dÃ©naturer la protÃ©ine. Une de ces mÃ©thodes consiste Ã essayer de contrÃ´ler l'Ã©tape de nuclÃ©ation. Quelques travaux existent sur ce sujet dans la littÃ©rature, comme par exemple ceux portant sur l'ensemencement et l'ajout de nuclÃ©ants. La mÃ©thode dite d'ensemencement insÃ¨re 10 des graines de cristaux dans des essais de cristallisation mais nÃ©cessite des cristallites de la protÃ©ine souhaitÃ©e qui ne sont pas toujours disponibles. D'autres matÃ©riaux hÃ©tÃ©rogÃ¨nes ont Ã©galement Ã©tÃ© proposÃ©s tels que : - des solides minÃ©raux (Falini, G., Fermani, S., Conforti, G., Ripamonti, A. (2002). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58, 1649-1652. McPherson, A. 8t 15 Shlichta, P. (1988). Science. 239, 385-387.). L'Ã©quipe de Naomi E. Chayen propose Ã©galement l'utilisation de matÃ©riaux mÃ©soporeux capable d'induire la nuclÃ©ation dans les pores aprÃ¨s une Ã©tape de concentration/agrÃ©gation au sein de ces mÃªmes pores (WO 02/088435) - ou des composÃ©s organiques : 20 o D'origine biologique : comme les cheveux, les crins de chevaux, les moustaches de rat ou les algues sÃ©chÃ©es (D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., & Haber, A. (2003). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1343-1346). o Mais Ã©galement synthÃ©tiques (Bijelic, A., Molitor, C., Mauracher, S. G., Al-Oweini, R., Kortz, U., & Rompel, A. (2014). ChemBioChem. 16, 233-241; 25 Pechkova, E. & Nicolini, C. (2002). J. Cell. Biochem. 85, 243-251; Sugahara, M., Asada, Y., Morikawa, Y., Kageyama, Y., & Kunishima, N. (2008). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 686-695; Matar-Merheb, R., Rhimi, M., Leydier, A., HuchÃ©, F., GaliÃ n, C., Desuzinges-Mandon, E., Ficheux, D., Flot, D., Aghajari, N., Kahn, R., et al. (2011). PLoS ONE. 6, e18036.). L'utilisation 30 de MIP Â« molecular imprinted polymers Â» a Ã©galement Ã©tÃ© dÃ©crite. Il s'agit de polymÃ¨res prÃ©alablement Â« imprimÃ©s Â» par la protÃ©ine Ã cristalliser et qui en contiennent donc la trace. AjoutÃ©s ensuite Ã la goutte de cristallisation, une 3065883 6 interaction de forme peut se produire favorisant la nuclÃ©ation (Saridakis, PNAS, 2001, 108,11081). Ã l'exception des MIP, qui permettent d'augmenter le taux de cristallisation de 5 l'ordre de 10 Ã 15 Â°/(:), tous ces agents d'aide Ã la cristallisation sont des solides formant une phase hÃ©tÃ©rogÃ¨ne dans le milieu de cristallisation, chacun d'eux devant donc Ãªtre ajoutÃ© manuellement dans la goutte de cristallisation, ce qui est inconciliable avec l'utilisation des plateformes de criblage robotisÃ©es. 10 TrÃ¨s rÃ©cemment, des nouveaux complexes cationiques formÃ©s d'un ion lanthanide Ln3+ conduisant Ã l'obtention de conditions de cristallisation uniques et reproductibles ont Ã©tÃ© brevetÃ©s (PCT/FR2016/053539), dont certains des inventeurs de la prÃ©sente demande de brevet sont Ã l'origine. Ils permettent d'augmenter le taux de cristallisation de l'ordre de 40 Â°A) (une quinzaine de protÃ©ines ont Ã©tÃ© 15 Ã©valuÃ©es jusqu'Ã prÃ©sent). MalgrÃ© des succÃ¨s importants obtenus par ces nouveaux complexes de lanthanide Ln3+, ces derniers ne sont pas universels et il existe donc toujours un besoin urgent de disposer de nouveaux outils simples, stables et complÃ©mentaires afin d'Ã©largir les possibilitÃ©s d'obtention de cristaux des macromolÃ©cules biologiques 20 dont on souhaite dÃ©terminer la structure. Comme cela a Ã©tÃ© vu prÃ©cÃ©demment, les relations des protÃ©ines avec l'eau sont extrÃªmement complexes. La solubilitÃ© des protÃ©ines va dÃ©pendre d'un grand nombre de facteurs extrinsÃ¨ques et intrinsÃ¨ques (tempÃ©rature, pH, tampon, ions, agents de prÃ©cipitation...). La recherche des conditions physico-chimiques favorables Ã la 25 cristallisation des protÃ©ines est par consÃ©quence largement empirique et se fait par vÃ©rification expÃ©rimentale des variables qui affectent gÃ©nÃ©ralement la solubilitÃ©. Compte tenu que ces derniÃ¨res sont multiples et variables d'une macromolÃ©cule Ã l'autre, il est aujourd'hui impossible de prÃ©voir Ã l'avance les conditions de cristallisation (pH, tampon, ions...), des macromolÃ©cules biologiques ou de 30 prÃ©dÃ©terminer quelles conditions seront appropriÃ©es pour former des cristaux. 3065883 7 RÃ©ciproquement, toute modification apportÃ©e sur un des composÃ©s prÃ©sents va affecter de faÃ§on non prÃ©dictible la solubilitÃ© des protÃ©ines dans une solution aqueuse contenant des sels, celle-ci dÃ©pendant de deux effets antagonistes liÃ©s d'une part aux interactions Ã©lectrostatiques ("salting in" ou effet dissolvant), et 5 d'autre part aux interactions hydrophobes (salting outou effet relargant). De faÃ§on surprenante, les inventeurs ont dÃ©couvert que des nouveaux complexes ligand / ion mÃ©tallique formÃ©s d'un ion mÃ©tallique choisi parmi les mÃ©taux de transitions ou de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, et ayant 10 un degrÃ© d'oxydation de +2, +3, +4 ou +5, seuls ou en mÃ©lange, permettent l'obtention de conditions de cristallisation uniques et reproductibles. Ces nouveaux complexes ligand / ion mÃ©tallique sont parfaitement stables et solubles dans les kits commerciaux de cristallisation et sont donc compatibles avec les systÃ¨mes de cristallisation robotisÃ©s des grandes plateformes existantes. 15 Dans le cadre de la prÃ©sente description, les mÃ©taux de transition sont dÃ©finis selon la dÃ©finition de l'IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry - https://doi.org/10.1351/goldbook.T06456 ) conduit Ã ranger les Ã©lÃ©ments des groupes 3 Ã 11 du tableau pÃ©riodique y compris la plupart des lanthanides et des actinides (aussi appelÃ©es Â«mÃ©taux de transition internesÂ»), tandis que les Ã©lÃ©ments 20 du groupe 12 (zinc 3oZn, cadmium 48Cd, mercure 80Hg...) en sont exclus. De mÃªme, en chimie, un mÃ©tal pauvre aussi appelÃ© mÃ©tal de post-transition ou mÃ©tal post-transitionnel, est un Ã©lÃ©ment chimique mÃ©tallique situÃ©, dans le tableau pÃ©riodique, entre les mÃ©taux de transition Ã leur gauche et les mÃ©talloÃ¯des Ã leur droite. Il est employÃ© ici Ã dÃ©faut d'une terminologie validÃ©e par l'IUPAC pour dÃ©signer 25 collectivement les Ã©lÃ©ments de cette nature. De maniÃ¨re additionnelle, l'invention se propose de fournir Ã©galement des nouveaux agents phasants qui soient suffisamment stables dans la plupart des conditions de cristallisation des macromolÃ©cules biologiques permettant d'obtenir des informations structurales sur la protÃ©ine macromolÃ©cule biologique d'intÃ©rÃªt. 3065883 8 Dans ce contexte, l'invention concerne des complexes ligand / ion mÃ©tallique neutres ou cationiques formÃ©s : - d'un ion mÃ©tallique choisi parmi les mÃ©taux de transitions ou de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, seuls ou en mÃ©lange, qui peut Ãªtre 5 - soit divalents 2+, choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : Cu, Ru, Os et Pb - soit trivalent 3+, choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : Al, Sc, Fe, Co, Ga, Y, Rh, In, Ir et Bi - soit tÃ©travalent 4+, choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : Hf et Ce, - soit pentavalent 5+, choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : Nb, (Ta) et W, - et d'un ligand, aussi appelÃ© complexant, de formule (I) : 3C (ID) (IB) (IF) (IC) 10 dans laquelle : - n est Ã©gal Ã 1, 2 ou 3 ; - R2 est un atome d'hydrogÃ¨ne ou un groupe mÃ©thyle ou -CH2R5, R5 reprÃ©sentant un groupe phÃ©nyle, pyridinyle ou picolinyle ; 15 - R4 reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne ou un groupe mÃ©thyle ou -CH2R6, R6 reprÃ©sentant un groupe phÃ©nyle ou pyridinyle; . Ri et Ri', identiques ou diffÃ©rents, reprÃ©sentent : 5 3065883 9 avec : 0 R7 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH2 ; o R8 qui reprÃ©sente -000-, -CONH2, -CONHR9, -PR900-, ou un groupe choisi parmi : R9 / N N - Avec R9 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, un groupe mÃ©thyle, Ã©thyle ou phÃ©nyle ; et 10 et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. Les ligands de formule (I) comprennent au moins 7 sites de coordination, voire plus, en fonction des structures de X et Y. Ces sites de coordination se trouvent sur les deux atomes d'azote reprÃ©sentÃ©s sur la formule (I), sur les deux pyridines des groupements R1, sur les deux groupes R7, au moins un site de coordination se 15 trouvant sur X et/ou Y. Les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention prÃ©sentent une charge supÃ©rieure ou Ã©gale Ã O. Ils comportent un ligand macrocyclique incorporant plusieurs groupements aromatiques formant une sphÃ¨re de coordination ouverte pour l'ion mÃ©tallique. 3065883 10 Par ailleurs, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention prÃ©sentent l'avantage d'Ãªtre solubles dans l'eau et stables dans la plupart des milieux de cristallisation commerciaux. Dans le cadre de l'invention, il a Ã©tÃ© dÃ©montrÃ© que ces complexes ligand / ion mÃ©tallique prÃ©sentaient un intÃ©rÃªt, non seulement en tant 5 qu'aide Ã la cristallisation mais Ã©galement pour certains en tant qu'agent phasant, lors de l'obtention de donnÃ©es structurales. En particulier, ledit complexe est utilisÃ© en tant qu'agent nuclÃ©ant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. De telles applications n'avaient jamais Ã©tÃ© dÃ©crites ou envisagÃ©es auparavant. 10 De maniÃ¨re avantageuse, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, sont formÃ©s d'un ion mÃ©tallique choisi parmi : 0s2Â±, Pb2Â±, Al3+, Sc3+, Y3+, Rh3+, In3+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+, Nbs+ et Tas+. A titre d'exemple de sels des complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention 15 qui trouvent application dans le cadre de l'invention, on peut citer les sels d'un complexe cationique avec un anion (ou plusieurs anions, en fonction de la charge du complexe) choisi parmi : F-, Cl-, Br, I-, OH-, NO3-, triflate, PF6-, SbF6-, B(Ph)4, BF4-, les sulfates, sulfonates, carbonates, phosphates, phosphonates et carboxylates. Les sulfates et sulfonates pourront correspondre Ã S042-, HS03- ou R'S03-, les carbonates 20 Ã C032-, HCO2- ou R'CO2-, les phosphates et phosphonates Ã R'OP032- et R'P032- et les carboxylates Ã R'CO2-, avec R' qui peut Ãªtre, notamment, un groupe alkyle ou aryle, notamment un groupe alkyle comprenant de 1 Ã 4 atomes de carbone ou un groupe phÃ©nyle. Les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention pourront Ã©galement se 25 trouver sous la forme d'hydrate ou solvats, c'est-Ã -dire avec au moins une molÃ©cule d'eau ou de solvant dans la sphÃ¨re de coordination du mÃ©tal. De maniÃ¨re prÃ©fÃ©rÃ©e, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention, et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, sont formÃ©s avec un ligand rÃ©pondant Ã la formule (IA) : 3065883 11 dans laquelle n=1 et R2=H, et Ri/Ri', identiques ou diffÃ©rents, sont tels que dÃ©finis pour les composÃ©s de formule (IA) Ã (IF). De maniÃ¨re avantageuse, dans les ligands de formule (IA) Ã (IF), Ri/Ri' 5 reprÃ©sentent : avec : - R7 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, de fluor, chlore, brome ou iode, et - R8 qui reprÃ©sente -000-, -CONH2, -CON R9 OU -PR900-, ou un groupe choisi 10 parmi : 0 Avec R9 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, un groupe mÃ©thyle, Ã©thyle ou phÃ©nyle, 3065883 12 et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. Dans le cadre de l'invention, lorsqu'un substituant reprÃ©sente un groupe picolinyle, il reprÃ©sente : 5 L'invention a Ã©galement pour objet l'utilisation d'un complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, en tant qu'aide Ã la cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisÃ© en tant qu'agent 10 nuclÃ©ant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. Tous les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention prÃ©sentent un intÃ©rÃªt pour leur effet nuclÃ©ant ou cristallisant. Ledit complexe est utilisÃ© en tant qu'agent phasant lors de la dÃ©termination structurale par diffraction des rayons X si 15 dans le complexe, l'ion mÃ©tallique est choisi parmi : 0s2Â±, Ir3+, Bi3+, Hf 4Â±, Ce4+ et Tas+. En particulier, dans le cadre de l'invention, par Â« macromolÃ©cule biologique Â», on entend en particulier les peptides (enchainement de moins de 100 acides aminÃ©s), les protÃ©ines (enchainement d'au moins 100 acides aminÃ©s) seuls ou en 20 association avec des ligands ou des acides nuclÃ©iques, notamment les ADN ou ARN. De telles macromolÃ©cules biologiques prÃ©senteront notamment une masse molÃ©culaire moyenne supÃ©rieure Ã 1 kDa. 3065883 13 L'invention a Ã©galement pour objet les cristaux dÃ©rivÃ©s d'une macromolÃ©cule biologique comprenant un complexe selon l'invention telle que prÃ©cÃ©demment dÃ©finie, ou leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. 5 L'invention a Ã©galement pour objet un procÃ©dÃ© de cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique, de prÃ©fÃ©rence choisie parmi les peptides et les protÃ©ines comprenant les Ã©tapes suivantes : - disposer d'une solution comprenant une macromolÃ©cule et un complexe selon l'invention, 10 - obtenir des cristaux de la macromolÃ©cule Ã partir de ladite solution. Dans ces procÃ©dÃ©s de cristallisation, le complexe selon l'invention et la macromolÃ©cule biologique Ã cristalliser seront mis en solution gÃ©nÃ©ralement dans de l'eau ou dans une solution aqueuse tamponnÃ©e, par exemple dans une solution tampon acÃ©tate, cacodylate, citrate, Bis tris propane, TRIS, HEPES... Si une solution 15 du complexe ligand / ion mÃ©tallique est formÃ©e, elle ne sera pas forcÃ©ment tamponnÃ©e. La solution contenant le complexe, la solution contenant la macromolÃ©cule biologique et/ou la solution contenant la macromolÃ©cule biologique et le complexe, en fonction de la technique de cristallisation utilisÃ©e prÃ©senteront, de prÃ©fÃ©rence, un pH dans la gamme allant de 3 Ã 9. 20 La solution utilisÃ©e pourra comprendre, en outre, un agent prÃ©cipitant, autre que le complexe, choisi parmi ceux dÃ©crits dans les kits de cristallisation commerciaux, comme par exemple, les sels tels que NaCI, le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, le citrate de sodium, le sulfate d'ammonium ; les polymÃ¨res tels que polyÃ©thylÃ¨neglycol (PEGs) et la Jeffamine T; 25 l'Ã©thanol, le dioxane, le mÃ©thylpentanediol... Celui-ci sera gÃ©nÃ©ralement ajoutÃ© Ã la solution comprenant une macromolÃ©cule et un complexe selon l'invention. La concentration en macromolÃ©cule dans la solution sera en thÃ©orie proche de sa limite de solubilitÃ© dans ladite solution, mais pourra Ãªtre plus diluÃ©e, en fonction de la solution utilisÃ©e. De maniÃ¨re avantageuse, dans la solution, le complexe est prÃ©sent 30 Ã une concentration de 1 Ã 100 mM et prÃ©fÃ©rentiellement Ã une concentration de 5 Ã 3065883 14 20 mM. L'obtention de cristaux est rÃ©alisÃ©e par cristallisation par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procÃ©dÃ© de cristallisation en phase cubique de lipides. Le procÃ©dÃ© de cristallisation selon l'invention pourra Ãªtre intÃ©grÃ© Ã un criblage ou 5 Ã une optimisation de conditions de cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. Le procÃ©dÃ© de cristallisation selon l'invention pourra Ãªtre mis en oeuvre de maniÃ¨re automatisÃ©e. En fonction de leur structure, et en fonction des conditions de cristallisation mises en oeuvre, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention prÃ©sentent au 10 moins l'une des propriÃ©tÃ©s suivantes : - effet nuclÃ©ant : la prÃ©sence dudit complexe ligand / ion mÃ©tallique lors de la cristallisation provoque la croissance de cristaux dans des conditions (tampon et/ou additifs et/ou tempÃ©rature et/ou concentration et/ou durÃ©e...) qui ne permettent pas la formation de cristaux en l'absence du complexe selon l'invention. 15 - effet cristallisant : la prÃ©sence dudit complexe ligand / ion mÃ©tallique lors de tests d'une sÃ©rie de conditions de cristallisation (nombre de cristaux et/ou taille des cristaux et/ou amÃ©lioration de la diffraction des cristaux obtenus...) permet d'amÃ©liorer la cristallisation obtenue, par rapport Ã une sÃ©rie de conditions diffÃ©rant par l'absence de complexe. En l'absence de complexe, des cristaux apparaissent mais 20 sont de moins bonne qualitÃ©. En particulier, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention permettent soit d'augmenter le nombre de conditions dans lesquelles l'obtention de cristaux d'une macromolÃ©cule biologique est possible, soit de travailler dans des conditions plus faibles en macromolÃ©cule biologique et/ou en autre agent prÃ©cipitant 25 classiquement utilisÃ©, soit d'amÃ©liorer la qualitÃ© ou le nombre de cristaux favorisant ainsi l'obtention de donnÃ©es structurales ultÃ©rieures, soit d'obtenir plusieurs de ces avantages. La qualitÃ© et la puretÃ© d'un agent cristallisant sont essentielles au bon dÃ©roulement de la cristallisation d'une macromolÃ©cule, lorsque ces derniers sont 3065883 15 utilisÃ©s en tant qu'agent de cristallisation. Aussi, au final, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention seront soumis Ã une Ã©tape de purification adaptÃ©e, notamment Ã une chromatographie par exclusion stÃ©rique. Les complexes formÃ©s selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque 5 le complexe ligand / ion mÃ©tallique est cationique, solvats et hydrates, pourront Ãªtre utilisÃ©s en tant qu'agent cristallisant dans toute technique adaptÃ©e Ã la cristallisation de macromolÃ©cules biologiques comme par exemple par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procÃ©dÃ© de cristallisation en phase cubique de lipides. 10 Pour une description dÃ©taillÃ©e de telles techniques, on pourra se rÃ©fÃ©rer aux ouvrages de rÃ©fÃ©rence suivants : Â« Protein Crystallization, Second Edition (IUL Biotechnology Series) Â» Ã©ditÃ© par Therese Bergfors ou Â« Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach Â» Ã©ditÃ© par Arnaud Ducruix et Richard GiegÃ©. 15 L'invention a Ã©galement pour objet un procÃ©dÃ© de dÃ©termination de la structure d'une macromolÃ©cule biologique comprenant les Ã©tapes suivantes : a. disposer d'un cristal dÃ©rivÃ© de la macromolÃ©cule biologique tel que dÃ©fini dans le cadre de l'invention, b. analyser la structure cristalline de la macromolÃ©cule biologique Ã partir dudit 20 cristal dÃ©rivÃ©. Le cristal dÃ©rivÃ© pourra Ãªtre obtenu selon un procÃ©dÃ© de cristallisation tel que dÃ©crit dans le cadre de l'invention ou encore par trempage d'un cristal de la macromolÃ©cule biologique dans une solution d'un complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention formÃ© d'un ion mÃ©tallique choisi parmi les mÃ©taux de transitions ou 25 de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe ligand / ion mÃ©tallique est cationique, solvats et hydrates. En particulier, la dÃ©termination de la structure de la macromolÃ©cule biologique est rÃ©alisÃ©e par diffraction des Rayons X (RX) et l'obtention d'information 3065883 16 structurale Ã basse rÃ©solution par les mÃ©thodes SAXS (Small-Angle X-ray Scattering) ou MASC (Multiwavelength-Anomalous Solvent Contrast). De tels cristaux dÃ©rivÃ©s peuvent Ãªtre obtenus par trempage ou par cocristallisation, comme dÃ©taillÃ© plus loin. Les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon 5 l'invention peuvent donc Ãªtre utilisÃ©s en tant qu'aide Ã la dÃ©termination de la structure cristalline d'une macromolÃ©cule biologique. La dÃ©termination des phases peut Ãªtre faÃ®tes avec des cristaux dÃ©rivÃ©s obtenus dans une solution contenant de 10 Ã 500 mM de complexe, prÃ©fÃ©rentiellement de 50 Ã 200 mM et de maniÃ¨re encore plus prÃ©fÃ©rÃ©e de 100mM + 10% en dit complexe 10 ligand / ion mÃ©tallique. Cependant pour amÃ©liorer la qualitÃ© du phasage, un trempage dans une solution d'un complexe ligand / ion mÃ©tallique, en particulier avec une concentration Ã©levÃ©e en complexe, peut Ã©galement Ãªtre rÃ©alisÃ©. Cela permet d'augmenter le taux d'occupation des sites occupÃ©s par le complexe. La co-cristallisation consiste donc Ã ajouter le complexe ligand / ion mÃ©tallique 15 formÃ© d'un ion mÃ©tallique ayant un degrÃ© d'oxydation de +2, +3, +4 ou +5 et choisi parmi les mÃ©taux de transitions ou de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, selon l'invention pendant le processus de cristallisation. Ainsi, lors de la cristallisation, le complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention peut s'insÃ©rer dans des sites cristallins spÃ©cifiques conduisant Ã l'obtention de cristaux 20 dÃ©rivÃ©s. Par ailleurs, pour obtenir un cristal dÃ©rivÃ© ou augmenter l'occupation de sites dans le cristal dÃ©rivÃ©, un trempage d'un cristal d'une macromolÃ©cule biologique dans une solution de complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention peut Ãªtre effectuÃ©. Il est possible de rÃ©aliser un trempage rapide ou un trempage long. 25 Le trempage rapide consiste Ã prÃ©lever un cristal d'une macromolÃ©cule biologique d'intÃ©rÃªt et Ã le tremper de maniÃ¨re brÃ¨ve (notamment de 45 secondes Ã 5 minutes) dans une solution du complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention. De maniÃ¨re avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempÃ© prÃ©sente une 306 5 883 17 forte concentration en complexe ligand / ion mÃ©tallique, typiquement une concentration de 50 Ã 500 mM, de prÃ©fÃ©rence de 100 mM + 10%. En particulier, un trempage rapide lors d'une phase de congÃ©lation d'un ou plusieurs cristaux peut Ãªtre rÃ©alisÃ©. Un trempage rapide lors d'une phase de 5 congÃ©lation se dÃ©roule typiquement en trois Ã©tapes : des cristaux sont prÃ©levÃ©s de leur goutte d'origine et trempÃ©s dans une goutte de trempage, correspondant Ã une solution Ã©quivalente Ã la solution d'origine utilisÃ©e pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux) Ã laquelle est ajoutÃ©e une concentration de 50 Ã 500 mM, de prÃ©fÃ©rence de 100 mM + 10% de complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention, ainsi qu'un 10 cryoprotectant tel qu'utilisÃ© par l'homme de l'art. AprÃ¨s une durÃ©e de 45 secondes Ã 2 minutes, le cristal est trempÃ© dans une solution de cryoprotection sans complexe ligand / ion mÃ©tallique afin d'en Ã©liminer l'excÃ¨s. Enfin, le cristal est plongÃ© dans l'azote liquide et stockÃ© Ã basse tempÃ©rature, par exemple Ã 100K. Cette mÃ©thode de trempage est trÃ¨s efficace et permet d'augmenter les taux 15 d'occupation et d'amÃ©liorer la qualitÃ© du phasage. Un trempage court permet d'Ã©viter que le cristal ne se dÃ©grade et de prÃ©server les qualitÃ©s de diffraction de ce dernier. Le trempage long consiste Ã prÃ©lever un cristal d'une macromolÃ©cule biologique d'intÃ©rÃªt et Ã le tremper de maniÃ¨re prolongÃ©e (notamment de 5 minutes Ã 24 heures) dans une solution du complexe ligand / ion mÃ©tallique formÃ© selon 20 l'invention. De maniÃ¨re avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempÃ© prÃ©sente une forte concentration en complexe ligand / ion mÃ©tallique, typiquement une concentration de 50 Ã 500 mM, de prÃ©fÃ©rence de 100 mM + 10%. A l'exception de la durÃ©e, le trempage long peut se dÃ©rouler selon le mÃªme protocole que celui dÃ©crit pour le trempage rapide, notamment lors d'une phase de 25 congÃ©lation. Cependant, la goutte de trempage est placÃ©e en Ã©quilibre avec un puits contenant de la solution d'origine utilisÃ©e pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux), afin d'Ã©viter une dÃ©shydratation de la goutte. Quel que soit le type de trempage, il est possible de tremper aussi bien des cristaux obtenus par co-cristallisation en prÃ©sence d'un complexe ligand / ion 3065 883 18 mÃ©tallique formÃ© selon l'invention que des cristaux obtenus en l'absence d'un tel complexe (nommÃ©s cristaux natifs dans le cadre de la prÃ©sente demande de brevet). Le trempage n'entraine aucune destruction ou modification de la macromolÃ©cule biologique. 5 Les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention permettent de former des cristaux dÃ©rivÃ©s d'une macromolÃ©cule biologique permettant l'obtention de donnÃ©es structurales pour ladite macromolÃ©cule biologique. En particulier, l'obtention de donnÃ©es structurales sera obtenue Ã partir d'un cristal dÃ©rivÃ© d'une macromolÃ©cule biologique intÃ©grant un complexe ligand / ion mÃ©tallique formÃ© d'un 10 d'un ion mÃ©tallique choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : 0s2+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+ et Ta5+, qui joue le rÃ´le d'agent phasant. Ces donnÃ©es structurales pourront Ãªtre obtenues par une mÃ©thode haute rÃ©solution, telle que la diffraction des Rayons X (RX) ou par une mÃ©thode basse rÃ©solution, telles que les mÃ©thodes SAXS et MASC. Les complexes ligand / ion mÃ©tallique formÃ©s d'un d'un ion mÃ©tallique choisi de 15 prÃ©fÃ©rence parmi : 0s2+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+ et Ta5+, pourront Ãªtre utilisÃ©s en tant qu'agent phasant en diffraction des RX (cristallisation et analyse de structure) ou en diffusion des RX, ou encore en tant qu'agent de contraste en SAXS ou MASC, en microscopie Ã©lectronique. L'utilisation des complexes ligand / ion mÃ©tallique formÃ©s d'un ion mÃ©tallique 20 choisi de prÃ©fÃ©rence parmi : 0s2+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+ et Ta5+, et d'un ligand de formule (I), sous forme d'un sel avec un anion, Ã©ventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, en tant qu'agent phasant notamment, prÃ©sente l'avantage de ne pas nÃ©cessiter une modification de la macromolÃ©cule biologique par gÃ©nie gÃ©nÃ©tique, comme dans le cas de l'obtention de protÃ©ines sÃ©lÃ©niÃ©s. Aucune liaison 25 covalente n'intervient entre le complexe cationique et la macromolÃ©cule biologique d'intÃ©rÃªt. Les complexes selon l'invention pourront Ãªtre prÃ©parÃ©s selon des techniques adaptÃ©es par l'homme du mÃ©tier des techniques dÃ©crites dans les exemples ou dans la demande W02014/162105. La synthÃ¨se des complexes selon l'invention est 30 gÃ©nÃ©ralement rÃ©alisÃ©e dans l'eau. Les complexes, ainsi formÃ©s seront donc plutÃ´t 3065883 19 sous la forme d'hydrate, mais le complexe peut ensuite Ãªtre mis dans un solvant autre, du type alcool ou DMSO et donner lieu Ã un solvat ou encore Ãªtre dÃ©shydratÃ©. Sous forme hydratÃ©e, un complexe selon l'invention comportera, notamment jusqu'Ã 3 molÃ©cules d'eau par complexe. En moyenne, le nombre de molÃ©cules d'eau par 5 complexe, pourra, par contre, Ãªtre diffÃ©rent d'un nombre entier, et Ãªtre par exemple Ã©gal Ã 0,5. Pour les applications envisagÃ©es dans le cadre de l'invention, les complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention pourront Ãªtre utilisÃ©s sous forme hydratÃ©e, ou dÃ©shydratÃ©e, solvatÃ©e ou non, sous la forme de poudre ou en solution. Exemples de rÃ©alisation 10 Partie I : SynthÃ¨se et caractÃ©risation des complexes Les abrÃ©viations ci-aprÃ¨s sont utilisÃ©es : BiNo3 = nitrate de bismuth Me = mÃ©thyle Moz = mÃ©thoxybenzyloxycarbonyle 15 Boc = tert-butoxycarbonyle Ms = mÃ©syle Et = Ã©thyle TA = tempÃ©rature ambiante Ac = acÃ©tyle 20 DCM = dichloromÃ©thane TACN = triazacyclononane DMF = dimÃ©thylformamide TFA = acide trifluoroacÃ©tique ACN = acÃ©tonitrile 25 CCM = chromatographie sur couche mince Produits de dÃ©part et caractÃ©risation Tous les produits de dÃ©part, solvants et sels de mÃ©taux ont Ã©tÃ© achetÃ©s chez Sigma-AldrichÂ®, Acros OrganicsÂ® et TCIÂ® avec des puretÃ©s supÃ©rieures Ã 98% pour les composÃ©s organiques et supÃ©rieures Ã 99,99% pour les sels de nitrate de 30 bismuth. Ces produits ont Ã©tÃ© utilisÃ©s directement sans purification supplÃ©mentaire. Les chromatographies ont Ã©tÃ© effectuÃ©es d'une part, sur alumine neutre activitÃ© III obtenue par hydratation d'alumine Acros OrganicsÂ® d'activitÃ© I (60Ã), et d'autre 3065883 20 part, sur gel de silice Acros OrganicsÂ® (60Ã). Les complexes formÃ©s ont tous Ã©tÃ© purifiÃ©s par colonne d'exclusion stÃ©rique LH20 de chez SephadexÂ®. Les spectres RMN (1-H, 13C) ont Ã©tÃ© enregistrÃ©s sur deux appareils BrukerÂ® Avance opÃ©rant respectivement Ã 500.10 MHz et 125.75 MHz pour 1+1 et 13C pour 5 l'un, et Ã 300 MHz pour 1-H pour le second. Les dÃ©placements chimiques sont reportÃ©s en partie par million (ppm) relativement au signal du tetramÃ©thylsilane (1+1, 13C), les pics rÃ©siduels des solvants Ã©tant utilisÃ©s comme rÃ©fÃ©rence interne. Les mesures de masses exactes ont Ã©tÃ© effectuÃ©es au Centre Commun de spectromÃ©trie de Masse (Villeurbanne, France). 10 A) PrÃ©paration de ligands/complexes Ã base de triazacyclononane (TACN) z '...HH1'. H 3HCI G a) HCI (cat.) dans Me0H b) NaBH4 dans DCM/Me0H c) MsCI, Et3N dans DCM d) Mozon, Et3N dans ACN e) Boc-O-succinimide dans DCM f) H2, Pd/C dans Me0H g) Na2CO3 dans Me0H/H20 h) TFA dans DCM i) Na2CO3 dans ACN j) Na2CO3 dans H20 15 puis BiNO3. 306 5 883 21 Le composÃ© 6 a Ã©tÃ© prÃ©parÃ© selon la procÃ©dure prÃ©cÃ©demment dÃ©crite dans la demande de brevet W02013/011236A1. Al) PrÃ©paration du composÃ© 1 A une suspension de 20 g d'acide dipicolinique (0,12 mol, lÃ©q.) dans 120 mL de 5 mÃ©thanol, on ajoute 1 mL d'acide sulfurique concentrÃ©. Le mÃ©lange est portÃ© Ã reflux pendant 24h. AprÃ¨s refroidissement, le produit cristallisÃ© est filtrÃ© et rincÃ© au mÃ©thanol froid pour donner, aprÃ¨s sÃ©chage, 18 g de poudre cristalline blanche du composÃ© 1 (R = 78%). 11-1-NMR (300 MHz, CDCI3) Ã´ (ppm) = 8.26 (d, 3 = 8 Hz, 2H), 7.99 (t, 3 = 8 Hz, 1H), 10 3.98 (s, 6H). A2) PrÃ©paration du composÃ© 2 18 g de composÃ© 1 (92 mmol, 1 Ã©q.) sont dissouts dans 450 ml de mÃ©thanol et refroidis Ã 0Â°C. 3,8 g de NaBH4 (101,2 mmol, 1,1 Ã©q.) sont alors ajoutÃ©s. Le mÃ©lange est ensuite agitÃ© 30 min Ã 0Â°C et 30 min supplÃ©mentaires en laissant la tempÃ©rature 15 remontÃ©e lentement jusqu'Ã TA. La rÃ©action est stoppÃ©e par ajout de 50 mL de HCI (1M dans H20), puis la phase organique est extraite avec 100 mL de dichloromÃ©thane. AprÃ¨s, lavage de la phase organique avec de la saumure (jusqu'Ã pH = 7), sÃ©chage avec Na2SO4 et Ã©vaporation, le produit obtenu est purifiÃ© par chromatographie sur gel de silice (Ã©luant : DCM/AcOEt 9/1 v/v jusqu'Ã AcOEt pur). 20 On obtient 6 g d'un solide blanc du composÃ© 2 (R = 40%). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) Ã´ (ppm) = 8.01 (d, 3 = 8 Hz, 1H), 7.84 (t, 3 = 8 Hz, 1H), 7.53 (d, 3 = 8 Hz, 1H), 4.85 (d, 3 = 3 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.69 (bs, 1H). A3) PrÃ©paration du composÃ© 3 A une solution de 1,2 g de l'alcool 2 dans 50 mL de dichloromÃ©thane Ã 0Â°C, on 25 ajoute 3mL de Et3N (22 mmol, 3,2 Ã©q.) puis, rapidement, 0,79 mL de chlorure de mÃ©syle (10,2 mmol, 1,5Ã©q.). On laisse ensuite le mÃ©lange revenir Ã tempÃ©rature ambiante avant de le chauffer pendant lh Ã 50Â°C. On ajoute ensuite 40 mL d'eau et 306 5 883 22 on extrait le mÃ©lange au dichloromÃ©thane (3x20 mL). Le rÃ©sidu huileux obtenu, aprÃ¨s sÃ©chage et Ã©vaporation des phases organiques, est finalement purifiÃ© sur gel de silice (Ã©luant : CH2Cl2) pour obtenir une huile incolore du composÃ© 3 qui cristallise au congÃ©lateur. 5 1-H NMR (500 MHz, CDCI3) Ã´ 8.12 (d, 3 = 7.7 Hz, 1H), 7.93 (t, 3 = 7.8 Hz, 1H, H10), 7.70 (d, 3 = 7.8 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H, H7), 4.01 (s, 3H, OMe), 3.15 (s, 3H, 0Ms). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) Ã´ 165.33 (C13), 154.59 (s), 147.92 (s), 138.45 (C10), 125.41 (s), 125.13 (s), 71.11 (C7), 53.23 (0Me), 38.24 (0Ms). A4) PrÃ©paration du composÃ© 6 10 Le composÃ© 6 est prÃ©parÃ© par la mÃ©thode prÃ©cÃ©demment dÃ©crite. (a) W02013011236A1 ; b) 1.S. J. Butler, B. K. McMahon, R. Pal, D. Parker and J. W. Walton, Chem. Eur. 3., 2013, 19, 9511-9517.) A5) PrÃ©paration du composÃ© 7 360 mg de composÃ© 6 (1,19 mmol) et 760 mg de carbonate de sodium (7,15 mmol, 15 6 Ã©q.) sont sÃ©chÃ©s sous pression rÃ©duite dans un schlenk avant d'ajouter 100 mL d'acÃ©tonitrile. Sous argon, 710 mg de composÃ© 3 (2,74 mmol, 2,3 Ã©q.) sont ajoutÃ©s Ã la suspension avant chauffage 12h Ã 70Â°C. AprÃ¨s retour Ã la tempÃ©rature ambiante, le mÃ©lange est filtrÃ© sur frittÃ© (porositÃ© 4) et concentrÃ© sous pression rÃ©duite. Le produit est purifiÃ© par chromatographie sur alumine (activitÃ© III, Ã©luant DCM puis 20 DCM/Me0H 96/4 v/v) pour finalement obtenir une huile jaune du composÃ© 7 (532 mg, Rendement : 80%). 1+1 NMR (500 MHz, CDCI3) Ã´ 7.99 (dd, 3 = 6 Hz, 2H, H11), 7.86 - 7.65 (m, 4H, H9), 3.98 (s, 10H, H7+0Me), 3.39 (d, 3 = 30 Hz, 4H, H4H5), 3.11 (s, 2H, H3H6), 2.95 (s, 2H, H3'H6'), 2.66 (d, 3 = 31 Hz, 4H, H1H2), 1.44 (s, 9H, boc). 25 13C NMR (126 MHz, CDCI3) Ã´ 166.01, 166.09 (C13), 161.43, 161.60 (C8), 155.88(C0(boc)) 147.45(C12), 137.42 (d,C10), (s), 126.19,126.46 (C9), 123.70 306 5 883 23 (C11), 79.48 (C(boc)), 63.70 (d, C7), 57.21 (C1C2), 55.37 (s), 55.11 (s), 54.67 (s), 53.04 (0Me), 50.54, 49.95 (C4C5), 28.72 (CH3(boc)). A6) PrÃ©paration du composÃ© 8 Dans 100 mL de dichloromÃ©thane, 5 mL d'acide trifluoroacÃ©tique sont ajoutÃ©s sur 5 une solution de 427 mg du composÃ© 7. AprÃ¨s 5h d'agitation Ã la tempÃ©rature ambiante, le mÃ©lange est Ã©vaporÃ© en Ã©liminant le TFA par entrainement avec plusieurs ajouts de toluÃ¨ne. Le rÃ©sidu obtenu est purifiÃ© par chromatographie sur alumine (activitÃ© III, Ã©luant DCM/Me0H (gradient 1% jusqu'Ã 7%)). Le solide visqueux jaunÃ¢tre obtenu du composÃ© 8 est conservÃ© sous argon au congÃ©lateur 10 (masse : 315 mg, rendement : 90%). 1+1 NMR (500 MHz, CDCI3) Ã´ 7.96 (dd, 3 = 7.7, 0.5 Hz, 2H, H11), 7.71 (t, 3 = 8 Hz, 2H, H10), 7.42 (dd, 3 = 7.9, 0.5 Hz, 2H), 3.98 (d, 10H, H7+0Me), 3.40 (t, 3 = 5 Hz, 4H, H4H5), 3.03 (t, 3 = 5 Hz, 4H, H3H6), 2.71 (s, 4H, H1H2). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) Ã´ 165.37 (C13), 159.43 (C8), 147.59 (C12), 137.87 (C10), 15 126.10 (C9), 124.02 (C11), 60.95 (C7), 54.60 (C1C2), 53.31 (0Me), 51.66 (C3C6), 46.52 (C4C5). NB: la synthÃ¨se de ce composÃ© a Ã©tÃ© prÃ©cÃ©demment dÃ©crite dans la rÃ©fÃ©rence suivante : A. Nonat, C. Gateau, P. H. Fries, M. Mazzanti, Chem. Eur. 3., 2006, 12, 7133. 20 A7) PrÃ©paration du composÃ© 9 Le ligand 9 est gÃ©nÃ©rÃ© in situ par saponification du diester 8 en prÃ©sence de carbonate de sodium Na2CO3 (2 Ã©q.) dans un mÃ©lange Me0H/H20 (1/1, v/v) agitÃ© 3h Ã 50Â°C. 1-H NMR (500 MHz, D20) Ã´ 7.77 (d, 3 = 7.1 Hz, 2H, H9), 7.69 (t, 3 = 7.7 Hz, 2H, 25 H10), 7.29 (d, 3 = 7.2 Hz, 2H, H11), 3.86 (s, 4H, H7), 3.08 (t, 3 = 5.9 Hz, 4H, H4H5), 2.91 (t, 3 = 5.9 Hz, 4H, H3H6), 2.65 (s, 4H, H1H2). 3065883 24 13C NMR (126 MHz, D20) Ã´ 173.22 (C13), 158.44 (C8), 153.01 (C12), 138.23 (C10), 125.17 (C11), 122.40 (C9), 60.27 (C7), 50.53 (C1,C2), 47.12 (C3,C6), 44.10 (C4,C5). A8) PrÃ©paration du complexe 10 AprÃ¨s rÃ©action pendant 3h Ã 50Â°C de 100 mg de diester 8 (0,22 mmol) avec 120 mg 5 de Na2CO3 (1,13 mmol, 5,0 Ã©q.) et neutralisation par HCI (1M), la disparition de l'ester est vÃ©rifiÃ©e par RMN. 213 mg de nitrate de bismuth pentahydrate (0,44 mmol, 1,0 Ã©q.) sont ajoutÃ©s. Le mÃ©lange est ensuite agitÃ© pendant une nuit. Le produit final est ensuite sÃ©parÃ© des sels rÃ©siduels par chromatographie d'exclusion stÃ©rique sur SÃ©phadex LH20 (Ã©luant : eau) pour obtenir 60 mg de produit pur (R= 40%). 10 1-H NMR (300 MHz, D20) Ã´ 8.08 (dd, 3 = 7.7 Hz, 2H), 7.94 (s, 2H), 7.70 (s, 2H), 3.5- 4 .2 (m, 8H), 3.30 (d, 3 = 8.1 Hz, 4H), 3.14 - 1.75 (m, 4H). Partie II : Etudes cristallographiques A) ProtÃ©ine modÃ¨le Ã©tudiÃ©e La protÃ©ine commerciale sÃ©lectionnÃ©e est le lysozyme de blanc d'ceuf de 15 poule (HEWL). C'est une protÃ©ine modÃ¨le en matiÃ¨re de cristallogenÃ¨se. Elle est achetÃ©e sous forme lyophilisÃ©e. Elle est Ã©tÃ© solubilisÃ©e dans de l'eau milliQ juste avant les expÃ©riences de cristallogenÃ¨se Ã la concentration souhaitÃ©e. Elle est prÃ©sentÃ©e dans le Tableau 1 ci-aprÃ¨s. ProtÃ©ines Nombre d'acides aminÃ©s RÃ©fÃ©rence produit Fournisseur HEWL 129 10 837 059 001 Roche 20 Tableau 1 : ProtÃ©ine commerciale utilisÃ©e et fournisseur associÃ© Les conditions de cristallisation native (c'est-Ã -dire sans ajout de complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention) de cette protÃ©ine sont connues et dÃ©crites 3065883 25 dans le Tableau 2 ci-aprÃ¨s. Ces conditions ont Ã©tÃ© reprises pour caractÃ©riser l'effet des complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention, sur la cristallogenÃ¨se de cette protÃ©ine commerciale. ProtÃ©ine Tampon Agent prÃ©cipitant / cristallisant HEWL 100 mM acÃ©tate de0,5 sodium pH 4,6 Ã 2 M NaCI (chlorure de sodium) 5 Tableau 2: Conditions de cristallisation usuelles de la protÃ©ine HEWL B) Cristallisations rÃ©alisÃ©es manuellement en laboratoire Afin de mettre en Ã©vidence ce phÃ©nomÃ¨ne de nuclÃ©ation induit par les 10 complexes selon l'invention, des diagrammes de cristallisation ont Ã©tÃ© rÃ©alisÃ©s en dÃ©terminant les gammes de concentration en agents prÃ©cipitant et en protÃ©ine qui permettent l'obtention de cristaux. La protÃ©ine HEWL (Tableau 1) a Ã©tÃ© cristallisÃ©e manuellement selon les conditions de cristallisation usuelles connues (Tableau 2). Les conditions de 15 cristallisation dÃ©crites dans le Tableau 2 ont donc Ã©tÃ© reproduites en prÃ©sence de complexe 10 Ã une concentration de 10 mM. Pour rÃ©aliser ces gammes de cristallisation manuelles, les gouttes de cristallisation ont Ã©tÃ© prÃ©parÃ©es selon le schÃ©ma suivant : 1,5p1 de solution de protÃ©ine + 1,5p1 de solution de complexe Ã une concentration de 10 mM + 1,5p1 de solution d'agent prÃ©cipitant (NaCI). Afin de 20 mettre en avant un potentiel effet des complexes ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention sur la cristallisation, la gamme en agent prÃ©cipitant a Ã©tÃ© ajustÃ©e de maniÃ¨re Ã se trouver en limite de la zone de cristallisation, puis, Ã©ventuellement Ã©tendue au-delÃ lorsqu'un effet Ã©tait observÃ©. Chaque condition de cristallisation a Ã©tÃ© rÃ©alisÃ©e en triplicata. Des diagrammes 25 de cristallisation ont Ã©tÃ© dÃ©terminÃ©s aprÃ¨s 10 jours de de croissance cristalline. Ils sont reprÃ©sentÃ©s sur la Figure 2. 3065883 26 O 0 0 O 0 0 O 0 0 0 200 350 500 650 800 9 Concentration en NaCI (mM) E Concentration en NaCI (mM) FIGURE 2: Diagrammes de phase du lysozyme de blanc d'ceuf de poule HEWL en absence (Ã gauche) et en prÃ©sence de 10mM de complexe 10 dÃ©terminÃ©s aprÃ¨s 10 jours de cristallisation : les conditions ayant donnÃ© des cristaux sont illustrÃ©es par 5 des points noirs, les points blancs Ã©tant des gouttes claires. Comme on peut le constater, l'effet nuclÃ©ant du complexe 10 est trÃ¨s important. En particulier, des cristaux sont apparus pour 5mg/m1 de lysozyme et pour une concentration en prÃ©cipitant de 650 mM. Par comparaison, l'absence de complexe ligand / ion mÃ©tallique selon l'invention permet seulement la formation de 10 cristaux Ã cette mÃªme concentration pour des concentrations de 15 mg/m1 de protÃ©ine. Ainsi, un effet nuclÃ©ant marquÃ© a Ã©tÃ© observÃ©. L'effet nuclÃ©ant doit ici Ãªtre entendu par la croissance de cristaux en prÃ©sence du complexe 10 Ã des concentrations en prÃ©cipitant faible, concentrations qui ne permettent pas la 15 formation de cristaux natifs. Les cristaux obtenus en prÃ©sence du complexe de bismuth selon l'invention apparaissent, de plus, trÃ¨s prometteurs pour une Ã©tude cristallographique. A ce jour, aucun complexe Ã base de mÃ©taux de transitions ou de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, n'avait montrÃ© ni mÃªme suggÃ©rÃ© 20 un tel effet nuclÃ©ant compte tenu de l'ultra sensibilitÃ© des protÃ©ines au moindre changement apportÃ© dans leur environnement lors de la cristallogenÃ¨se. 306 5 883 27 A titre de comparaison : - Le tris-dipicolinate de lanthanide a produit une nouvelle forme cristalline du lysozyme seulement lorsqu'il a Ã©tÃ© utilisÃ© Ã des concentrations supÃ©rieures Ã 50 mM. 5 - Les MIPs proposÃ©es par Naomi E. Chayen (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L., Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N. E. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081-11086 and W02010139972) conduisent Ã des dÃ©calages de la zone de cristallisation de seulement une Ã deux unitÃ©s de concentration en agents prÃ©cipitant. Les effets 10 nuclÃ©ants associÃ©s ne sont obtenus que pour des concentrations conventionnelles de lysozyme de l'ordre de 30 mg/m1 (Khurshid et al. Automating the application of smart materials for protein crystallization. (2014) Acta cryst D). Selon Saridakis et al. (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L., Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N. E. 15 (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081-11086.), la gamme de cristallisation du lysozyme en prÃ©sence de leurs agents nuclÃ©ants dÃ©bute Ã partir de 480 mM de NaCI et ce, pour une concentration en protÃ©ine de 20 mg/mL. Aucun cristal de lysozyme n'a Ã©tÃ© observÃ© en dessous de 460 mM NaCI. Concernant la protÃ©ine thaumatine (30 mg/mi) aucun cristal n'est observÃ© 20 en dessous de 0,2 M tartrate. En prÃ©sence de leurs agents nuclÃ©ants, ils obtiennent des cristaux pour 0,3 et 0,4 M tartrate (idem complexe 10) et des cristaux natifs pour 0,5 M tartrate. - Les complexes de type POM ne prÃ©sentent d'effet nuclÃ©ant qu'avec des concentrations Ã©levÃ©es de lysozyme (de l'ordre de 100 mg/mi), ce qui pose des 25 problÃ¨mes de solubilitÃ© pour la plupart des protÃ©ines. (A. Bijelic et al Hen Egg- White Lysozyme Crystallisation: Protein Stacking and Structure Stability Enhanced by a Tellurium(VI)-Centred Polyoxotungstate ChemBioChem 2015, 16, 233 - 241). De plus, la stabilitÃ© du complexe 10 (ligand / bismuth) a Ã©tÃ© Ã©valuÃ©e Ã 3 30 concentrations diffÃ©rentes (10, 50 et 100 mM). Le complexe 10, mÃªme Ã une 3065883 28 concentration de 100 mM, prÃ©sente une stabilitÃ© accrue. En effet, aucun cristal du complexe n'a Ã©tÃ© observÃ© et seule la prÃ©sence de prÃ©cipitÃ©s a Ã©tÃ© dÃ©tectÃ©e. Cette derniÃ¨re n'est toutefois pas synonyme d'incompatibilitÃ© avec l'apparition de cristaux de protÃ©ine. 5 29 REVENDICATIONS1. Complexes prÃ©sentent une charge supÃ©rieure ou Ã©gale Ã 0 formÃ©s d'un ion mÃ©tallique choisi parmi les mÃ©taux de transitions ou de post transition, Ã l'exception des ions lanthanides Ln3+, et ayant un degrÃ© d'oxydation de +2, +3, +4 ou +5 et d'un ligand rÃ©pondant Ã l'une des formules suivantes : \ N nfti ' N R2 (IA) Ri\ r-hl n H LH \ n (ID) N H Rs ' H C (IC) dans laquelle : - n est Ã©gal Ã 1, 2 ou 3 ; - R2 est un atome d'hydrogÃ¨ne ou un groupe mÃ©thyle ou -CH2R5, R5 reprÃ©sentant un groupe phÃ©nyle, pyridinyle ou picolinyle ; - R4 reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne ou un groupe mÃ©thyle ou -CH2R6, R6 reprÃ©sentant un groupe phÃ©nyle ou pyridinyle; - Ri et Ri', identiques ou diffÃ©rents, reprÃ©sentent : 30 3065883 avec : 0 R7 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH2 ; 0 Re3 qui reprÃ©sente -000-, -CONH2, -CONHR9, -PR900-, ou un groupe 5 choisi parmi : NiR9 ru....-N 1 N . . ./ -NI/ . W - Avec R9 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, un groupe mÃ©thyle, Ã©thyle ou phÃ©nyle ; et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. 10 2. Complexes cationiques selon la revendication 1 sous la forme d'un sel avec un anion choisi parmi : F-, Cl-, F-, Br, I-, OH-, NO3-, triflate, PF6-, SbF6-, B(Ph)4, BF4-, les sulfates, carbonates, phosphates et carboxylates. 3. Complexes selon l'une des revendications 1 Ã 3 formÃ©s avec un ligand rÃ©pondant Ã la formule (IA) : RI\ N/ W Ris N- R2 (IA) dans laquelle n est Ã©gal Ã 1, R2 est un atome d'hydrogÃ¨ne et Ri et Ri', identiques ou diffÃ©rents, sont tels que dÃ©finis Ã la revendication 1, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. 31 3065 883 4. Complexes selon l'une des revendications 1 Ã 4 caractÃ©risÃ© en ce que Ri. et Ri', identiques ou diffÃ©rents, reprÃ©sentent : R8 avec : 5 - R7 qui reprÃ©sente -000-, ou -PR900- avec Rg qui reprÃ©sente un groupe mÃ©thyle ou Ã©thyle ou bien R7 qui reprÃ©sente un groupe : AM - R8 qui reprÃ©sente un atome d'hydrogÃ¨ne, de fluor, chlore, brome ou iode, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats 16 et hydrates. 5. Complexes selon la revendication 1 choisi parmi les complexes rÃ©pondant Ã l'une des formules suivantes : avec p 0, p Ã©tant la charge du complexe et M Ã©tant l'ion mÃ©tallique, ainsi 32 3065883 que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. 6. Complexes selon la revendication 1, 2 ou 5 formÃ©s d'un ion mÃ©tallique choisi parmi : Cu2+, Ru2+, 0s2+, Pb2+, Al3+, Sc3+, Fe3+, Co3+, Ga3+, Y3+, Rh3+, 5 Ir3+, Bi3+, Hf4+, Ce4+, Nb5+, Ta5+ ou W5+. 7. Complexes selon la revendication 1, 2 ou 5 formÃ©s de prÃ©fÃ©rence d'un ion mÃ©tallique choisi parmi : 0s2+, Pb2+, Al3+, Sc3+, Y3+, Rh3+, In3+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+, Nb5+ et Ta5+. 8. Utilisation d'un complexe tel que dÃ©fini Ã l'une quelconque des revendications 10 1 Ã 6, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats ou hydrates, seuls ou en mÃ©lange, en tant qu'aide Ã la cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. 9. Utilisation selon la revendication 7 caractÃ©risÃ©e en ce que le complexe est utilisÃ© en tant qu'agent nuclÃ©ant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la 15 cristallisation d'une macromolÃ©cule biologique. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9 caractÃ©risÃ©e en ce que, dans le complexe, l'ion mÃ©tallique = OS2+, Ir3+, Bi3+, Hf 4+, Ce4+ et Ta5+ et le complexe est Ã©galement utilisÃ© en tant qu'aide Ã l'obtention de donnÃ©es structurales d'une macromolÃ©cule biologique. 20 11.Utilisation selon la revendication 10 caractÃ©risÃ©e en ce que le complexe est utilisÃ© en tant qu'agent phasant lors de la dÃ©termination structurale par diffraction des rayons X. 12.Utilisation selon l'une des revendications 1 Ã 11 caractÃ©risÃ© en ce que la macromolÃ©cule biologique comprend au moins un peptide. 13.Cristal dÃ©rivÃ© d'une macromolÃ©cule biologique comprenant un complexe selon l'une des revendications 1 Ã 7 ou un de ses sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvat ou hydrate.