FR 3068363 A1 20190104 FR 1756277 A 20170703 UTILISATION DE SOUCHES DE SARCOCYSTIDAE DANS LA PREVENTION DE MALADIES INFECTIEUSES DE LA VOLAILLE La présente invention concerne l'utilisation de souches atténuées de parasites pour la prévention et le traitement de pathologies chez la volaille et notamment chez le jeune oiseau des espèces granivores telles que la poule domestique, la dinde et la pintade. Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles. Toxoplasma gondii (T gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l'environnement sous forme d' oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s'infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s'enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires. Les souches de T gondii sont classées en fonction de leur degré de virulence in vivo : les souches de type I (i.e. la souche RH) sont hautement virulentes alors que les souches de type II (i.e. les souches ME49, 76K ou Pru) et III (i.e. les souches CEP ou M7741) sont moins virulentes et établissent généralement des infections chroniques. Par ailleurs, de nombreuses souches atypiques non rattachables aux trois premiers types sont identifiées notamment en Afrique et en Amérique du Sud (Howe & Sibley, 1995, 1 Infect. Dis., 172(6) : 1561-6; Rajendran et al., 2012, Infect. Genet Evol, 12(2) : 359-68). Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMIC1 et TgMIC3 (Cérède et al., 2005, 1 Exp. Med., 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo tgmic/- 3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, 1 Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49). Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez 2 l'hôte final (i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d'oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire (i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc...) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmic1-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose. Toxoplasma gondii et Neospora caninum ont en commun un processus spécifique d'invasion des cellules hôtes en plusieurs étapes conduisant à la formation d'une vacuole parasitophore dans laquelle le parasite se multiplie et se développe. Les propriétés immunostimulantes de T gondii sont connues depuis de nombreuses années et récemment, de nouvelles études ont confirmé l'intérêt d'utiliser T gondii comme immunostimulant et ont apporté des éléments de réponse sur les mécanismes impliqués. Chez la souris, une infection par T gondii ou une stimulation avec un extrait parasitaire procure une résistance à une infection par Listeria monocytogenes (Neal et Knoll, 2014, PLoS,Pathog., 10(6) : e1004203) par le virus de la grippe H5N1 (O'Brien et al., 2011, J. Virol., 85(17) : 8680-8), ou à une malaria cérébrale due à Plasmodium berghei (Settles et al., 2014, Infect. Immun., 82(3) : 1343-53). Dans le cas de Plasmodium berghei, l'effet observé dépend de l'IL-12 et la protection serait potentiellement liée à la production précoce d'IFN-y (Settles et al., 2014). Dans le cas du virus de la grippe, l'effet observé dépend de l'IFN- y produit par les cellules NK activées par l'extrait parasitaire. Enfin, pour Lysteria monocytogenes, l'administration de la profiline de T gondii avant ou après infection par Lysteria monocytogenes reproduit l'effet protecteur. Cette protection, dépendante du TLR11, de l'IFNy, mais indépendante de l'IL-12 implique les monocytes inflammatoires recrutés sur le site d'infection fortement induit par la profiline (Neal et al., 2014). Une souche de T gondii, non réplicative (cps) a également été utilisée dans des traitements contre des tumeurs (Baird et al., 2013, Cancer Res., 73(13) : 3842-51 ; Baird et al., 2013, 1 Immunol., 190(1) :469-78; Sanders et al., 2015, Oncoimmunology, 5(4) : el104447). Le parasite vivant en activant le système immunitaire inné, rompt l'immunosuppression ce qui 3 conduit à une réactivation de l'immunité adaptative spécifique de la tumeur, cependant quelques différences existent dans les cellules et les mécanismes impliqués. Une dizaine d'effecteurs jouent un rôle dans la régulation de la réponse de la cellule hôte suite à une infection par T gondii. La protéine ROP16 compte parmi les modulateurs de la réponse immunitaire de l'hôte les mieux étudiés (Saeij et al., 2007, Nature, 445(7126) : 324-7. Cette protéine de rhoptries est une protéine kinase qui interagit avec la cascade de signalisation JAK/STAT en phosphorylant STAT3 via la Tyr 705 et STAT6 via la Tyr 641 et conférant ainsi au parasite un rôle de suppresseur de l'inflammation et de contrôle de l'infection par la cellule hôte. Dans les parasites type I, II et III, ROP16 est capable de phosphoryler STAT3 et STAT6 mais c'est seulement sous sa forme de type I et III qu'elle maintient de manière constitutive et durable, la phospohorylation des STATs 3 et 6 (Saeij et al., 2007, Yamamoto et al., 2009, I Exp. Med., 206(12) : 2747-60). L'effet immunosuppresseur de ROP16 a notamment été démontré sur une lignée de macrophages murins raw264.7 infectée avec différentes souches de Toxoplasma gondii (type I, II, III, II ROP16 KI, II ROP16KI-NLS déficient). Une diminution de la sécrétion d'IL-12p40 au bout de 24 heures est observée lorsque les raw264.7 sont infectées avec les souches exprimant R0P161. (Saeij et al., 2007). Par ailleurs, in vivo, chez la souris inoculée par voie intra-péritonéale avec une souche de type I ROP16IKO, une augmentation de la réplication du parasite dans le foie, la rate, les poumons et le cerveau comparé à une souche de type I WT est observée (Butcher et al., 2011, PLoS Pathogen, 7(9). : e1002236) La protéine de granule GRA15 est également une protéine capable de modifier la réponse de l'hôte. La forme GRA15 de type II (GRA1511) présente une protéine de 635 acides aminés contrairement à la souche de type I qui présente une protéine tronquée de 312 acides aminés due à une mutation de la séquence codante qui a engendré un codon stop prématuré (Rosowski et al., 2011,1 Exp. Med., 208(1) :195-212). Seule GRA1511 permet l'activation de la voie de signalisation de NF-K3 indépendamment des voies MyD88 et Trif (Rosowski et al., 2011) et permet une activation classique des macrophages en M1 qui expriment des cytokines pro-inflammatoires comme IL-12/23p40, l'IL-6 et d'autres costimulateurs, CD40 et CD8 ; permettant alors l'établissement d'une réponse de type Thl protectrice de l'hôte infecté (Jensen et al., 2011, Cell Host Microbe, 9(6) :462-83). 4 En synergie avec GRA1511, R0P16I activerait également STAT5 pour moduler l'expression des gènes de la cellule hôte : Jensen et son équipe (2013) par le biais de l'utilisation d'une variété de parasites transgéniques et KO, ont démontré que GRA1511 et ROP161 permettent de limiter la réplication du parasite dans les intestins d'une souris infectée oralement et améliorent la résistance à l'infection des macrophages stimulés par le TNFa et l'IFN-y. Ces mécanismes semblent être indépendants de STAT3 et STAT6, mais dépendants de STAT5.R0P16 induit une phosphorylation durable de STAT5 ainsi que sa translocation nucléaire (Jensen et al., 2013 ,Infect. Immun., 81(6) : 2156-67). De manière surprenante, les inventeurs ont trouvé que la suppression de la fonction des deux protéines MIC3 et MIC1, dans une souche de Sarcocystidae, conduit à une souche mutante qui possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux oiseaux et notamment aux volailles une protection vaccinale vis-à-vis des effets de maladies infectieuses. La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant formulée pour une administration in ovo ou chez un poussin âgé de 0 à 72 heures. Le terme « volaille » désigne les poules, dindes, pintades, canards, oies, cailles, pigeons, faisans, perdrix, les autruches, les nandous, les émeus et les kiwis élevés ou détenus en captivité en vue de leur reproduction, de la production de viande ou d'oeufs de consommation ou de la fourniture de gibier de repeuplement. Selon la présente invention, la souche mutante de Sarcocystidae peut être administrée in ovo, c'est-à-dire soit dans le liquide amiotique, soit dans l'embryon, après la ponte de l'oeuf. Le développement d'un oeuf fécondé commence, par division cellulaire, dès qu'il traverse l'oviducte de la volaille qui va le pondre. Lorsque la volaille pond l'oeuf, l'embryon se refroidit et le développement est suspendu. Le développement de l'embryon commence quand la température de l'oeuf dépasse 26,6 °C. Selon la présente invention, la souche mutante de Sarcocystidae peut également être administrée chez un poussin. Le terme « poussin » selon la présente invention désigne toute volaille âgée de 0 à 72 heures et non encore nourries. Toutefois les canards de Barbarie (Cairina moschata) ou leurs croisements peuvent être nourris. L'utilisation des souches mutantes de Sarcocystidae selon la présente invention par ces modes d'administration, va permettre de prévenir les maladies infectieuses chez la volaille au cours de son développement et tout au long de sa vie. Au sens de l'invention, on entend par « maladie infectieuse », une maladie provoquée par un agent infectieux choisi parmi : un virus, un parasite ou une bactérie. La présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine virale. La maladie d'origine virale est une maladie causée par un virus qui peut être : - un myxovirus, en particulier le virus Influenza, ou - un coronavirus, en particulier le virus de la bronchite infectieuse aviaire, ou - un reovirus, en particulier du virus de l'arthrite virale du poulet, ou - un picornavirus, en particulier le virus de l'hépatite du caneton, - un herpesvirus, en particulier le virus de la maladie de Mareck, - un adénovirus, en particulier le virus de l'entérite hémorragique de la dinde. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine virale, le virus pouvant appartenir aux groupes suivant : 6 - Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ADN susceptible d'infecter un poussin, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus de la maladie Marek chez la poule domestique, - Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d'affecter un poussin, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza aviaires. - Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, - Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l'hépatite du canard de Pekin (DHB V). Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine virale chez la volaille, ladite maladie d'origine virale étant la grippe aviaire. La présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine bactérienne. La maladie d'origine bactérienne est une maladie causée par une bactérie des genres: - Escherichia spp., en particulier l'espèce Escherichia colt 7 - Clostridium spp. en particulier l'espèce Clostridium perfringens - Mycoplasma spp., en particulier l'espèce Mycoplasma gallisepticum, - Salmonella spp., en particulier l'espèce Salmonella pullorum, responsable de la salmonellose aviaire. - Pasteurella spp., en particulier l'espèce Pasteurella multocida - Ornithobacterium spp., en particulier l'espèce Ornithobacterium rhinotracheale Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine bactérienne (ou causée par une toxine provenant d'une bactérie), ladite bactérie pouvant appartenir aux groupes suivant : - Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits' en particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus ; - Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria ; - Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus ; - Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Legionella, Ornithobacterium ou Salmonella ; - Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia ; - Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ; 8 - Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d'envahir une cellule de poussin, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Micobacterium. Salmonella Enteritidis est responsable de toxi-infections alimentaires et de gastro-entérites. L'Homme s'infecte par l'intermédiaire de viandes de volailles ou d'oeufs contaminés. La poule domestique est l'un des plus importants vecteurs de salmonelles. Elle s'infecte par voie orale. La bactérie colonise ensuite le tube digestif et peut s'implanter durablement dans les ovaires au cours d'une phase transitoire de dissémination systémique. Le portage long terme dans le tube digestif, notamment dans les coeca, est responsable de la contamination des viandes lors de l'abattage et de la contamination de la coquille d'oeuf lors du passage par le cloaque. Le portage des salmonelles dans les ovaires peut être responsable du transfert vertical des salmonelles à l'intérieur de l'oeuf. Ce mode de contamination est moins fréquent mais potentiellement plus dangereux car il est difficilement détectable et il n'y a pas de mesure corrective possible. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine bactérienne chez la volaille, ladite maladie d'origine bactérienne étant la salmonellose aviaire. La présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine parasitaire. La maladie d'origine parasitaire est une maladie causée par un parasite qui peut être : - Eimeria spp., en particulier l'espèce Eimeria acervulina responsable de la coccidiose - Echinuria spp., en particulier l'espèce Echinuria uncinata responsable de la spirurose 9 - Trichostrongylus spp. en particulier l'espèce Trichostrongylus tenuis - Ascaris spp., en particulier l'espèce Ascaridia galli - Cestoda spp. en particulier l'espèce Choanotaenia infundibulum - Leishmania spp., en particulier l'espèce Leishmania infantum. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine parasitaire, ledit parasite pouvant appartenir aux groupes suivant : - Protozoaires susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des protozoaires appartenant à l'embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou blastocystis ; - Némathelminthes susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ; - Plathelminthes susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ; - Arthropodes susceptibles d'être responsable d'une affection ou de la vectorisation d'un agent infectieux vis-à-vis un poussin, en particulier des arthropodes appartenant à l'ordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens. Les parasites du genre Eimeria sont responsables de coccidioses aviaires et de pertes économiques importantes dans les élevages avicoles. Ils ont un tropisme intestinal, allant du duodénum aux caeca et induisent des diarrhées plus ou moins sévères. Par exemple, Eimeria tenella est faiblement prévalent et fortement virulent. Ce parasite affecte les caeca et induit une entérite nécrotique hémorragique chez le poulet, responsable de taux de morbidité et de mortalité très important. A l'inverse, Eimeria acervulina envahit le duodénum et provoque une entérite modérée. Il est responsable d'une mortalité inférieure à 10% et d'une morbidité modérée qui se traduit par une perte de poids dans les élevages de poulet de chair industriels entre 1 et 3 semaines post-éclosion. Cette perte de poids peut être responsable d'un déclassement des carcasses et de pertes économiques importantes. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine parasitaire chez la volaille, ladite maladie d'origine parasitaire étant la coccidiose. La famille des Sarcocystidae, dans les Apicomplexes, comprend notamment les genres Toxoplasma spp. et Neospora spp., qui renferment notamment respectivement les espèces Toxoplasma gondii et Neospora caninum. Dans une mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche de Toxoplasma spp., en particulier de Toxoplasma gondii. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche de Neospora spp., en particulier de Neospora caninum. Dans les souches utilisées dans la présente invention, la fonction des protéines MIC1 et MIC3 a été supprimée. Les protéines sont les effecteurs de l'activité cellulaire. La suppression de la fonction d'une protéine peut résulter de son absence de biosynthèse ou de sa non 11 fonctionnalité. L'origine de ce dysfonctionnement peut être liée à des perturbations survenant lors de la transcription du gène codant la protéine, lors de sa traduction ou encore survenir lors de processus de maturation de la protéine (modifications post-traductionelles). La délétion du gène explique également qu'aucune protéine ne puisse être synthétisée. Les protéines MIC1 et MIC3 sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes. Elles sont respectivement codées par les gènes mic/ et mic3. Dans la présente invention, on entend par « la fonction de la protéine MIC1 est supprimée », soit l'absence de l'expression de la protéine MIC1, soit l'expression d'une protéine MIC1 non fonctionnelle, par exemple l'expression d'une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC1 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1. On entend par « la fonction de la protéine MIC3 est supprimée », soit l'absence de l'expression de MIC3, soit l'expression d'une protéine MIC3 non fonctionnelle, par exemple une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC3 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC3. L'absence de l'expression de la protéine MIC1 et de la protéine MIC3 peut résulter de la délétion de la totalité des gènes mic/ et mic3 codant respectivement pour les protéines MIC1 et MIC3, ou de sa région codante, ou d'une mutation, d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la région codante des gènes mic/ et mic3 entrainant l'absence d'expression des protéines ou des protéines avec peu d'identité de séquence en acides aminés avec les protéines MIC1 et MIC3, ou d'un dysfonctionnement de la région promotrice ou de la région régulatrice en cis ou en trans des gènes mic/ et mic3, ou d'un dysfonctionnement d'un ou plusieurs facteurs de transcription susceptibles de se lier à ladite région promotrice, ou d'un dysfonctionnement de la traduction de l'ARN messager, ou de quelques modifications épigénétiques bien connues de l'homme de l'art. Ainsi, la fonction d'une protéine peut être supprimée par l'inhibition de l'expression des gènes. On entend par « inhibition de l'expression des gènes mic/ et mic3 », tous les mécanismes qui perturbent la transcription des gènes mic/ et mic3 en un ARN messager ou tous les mécanismes qui perturbent la traduction des ARN messager en protéines MIC1 et 12 MIC3, ces deux étapes étant nécessaires à la synthèse d'une protéine MIC1 et MIC3 fonctionnelle. Une protéine MIC1 non fonctionnelle ou une protéine MIC3 non fonctionnelle est une protéine qui ne possède pas la capacité de reconnaître les cellules hôtes ou qui ne permet pas l'adhésion du parasite audites cellules hôtes. Une protéine non fonctionnelle peut résulter d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs acides aminés ou du décalage du cadre de lecture. Dans ce cas de figure, la modification de l'acide nucléique de la région codante ne bloque pas le mécanisme d'expression de la protéine qui peut éventuellement conserver une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1 ou celle de la protéine MIC3, mais change le cadre de lecture de l'ARNm correspondant lors de la traduction de la protéine. La non fonctionnalité de la protéine MIC3 et de la protéine MIC1, peut également être la conséquence de modifications post-traductionnelles inopérantes ou insuffisantes (i.e. glycosylation, isoprénylation, phosphorylation, sulfatation, amidation, acétylation, alkylation, etc) et qui lui permettaient d'assurer sa fonction. La fonction des protéines MIC3 et MIC1, peut également être supprimée de manière indirecte, notamment en altérant ou en supprimant l'expression d'une ou plusieurs autres protéines (notamment d'autres adhésines) qui se lient aux protéines MIC3 et MIC1, pour former un complexe fonctionnel. La déstructuration d'un tel complexe entraine une perte de fonction des protéines MIC3 et MIC1. La fonction d'une protéine peut être supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène codant pour ladite protéine, ou - la délétion totale du gène codant pour ladite protéine, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène codant pour ladite protéine, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène codant pour ladite protéine. Par « mutation d'un ou plusieurs nucléotides », on entend la substitution, permutation ou le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique 13 par un ou plusieurs nucléotides non présents dans la séquence sauvage. Par séquence sauvage, on désigne la séquence nucléotidique trouvée à l'état naturel dans la souche sauvage du parasite. La séquence sauvage est par définition dépourvue de toute intervention humaine par le biais du génie génétique. Par « délétion d'un ou plusieurs nucléotides », on entend la suppression d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique. Par « insertion d'un ou plusieurs nucléotides », on entend l'addition, l'ajout ou l'intégration d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique. La mutation, la délétion ou l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides peut avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs exons du gène correspondant et modifier par conséquent la région codante dudit gène, ou bien avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs introns et modifier le site d'épissage d'un intron concerné. Cette modification du site d'épissage change par conséquent le cadre de lecture de l'ARNm et aboutit à la traduction d'une nouvelle protéine dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence de la protéine dite sauvage. On entend par « délétion totale du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5' et 3', dites 5' et 3'UTR, le terme « gène » désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5' et 3' UTR. On entend par « délétion totale de la région promotrice », la suppression de la séquence promotrice totale c'est-à-dire la suppression de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5' UTR transcrite non traduite qui sert de boitier de régulation de l'expression d'un gène. La délétion partielle de la région promotrice ou la délétion partielle de la séquence codante correspond à une délétion partielle du gène. Par délétion partielle de la séquence codante on entend la suppression d'une partie des exons de la séquence codante, suffisante pour altérer la fonction de la protéine exprimée, ou la suppression d'une partie des introns entrainant une altération de l'épissage. On entend par « délétion partielle de la région promotrice », la suppression d'une partie de la séquence promotrice c'est-à-dire d'une partie de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5' UTR transcrite non traduite qui sert de boitier de régulation de l'expression d'un gène. Par « déstabilisation de l'ARN messager », on entend une diminution de sa durée de demi-vie, c'est-à-dire de la période de temps pendant laquelle un ARN messager est 14 disponible pour permettre sa traduction en une protéine. La stabilisation des ARN messagers est assurée par des éléments cis (les séquences 5' et 3' UTR bordant les séquences codantes d'un gène) et des éléments trans, notamment des protéines capables de se lier aux éléments cis. La durée de demi-vie d'un ARN messager peut varier en réponse à divers stimuli tels que des facteurs environnementaux, des facteurs de croissance ou des hormones. Une modification, réalisée in vitro par génie génétique, des séquences nucléotidiques des éléments cis est susceptible de modifier la durée de demi-vie de l'ARN messager. Par « inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène », on entend le blocage de la traduction de l'ARN messager en la protéine lui correspondant. Dans ce cas de figure, l'ARN messager d'un gène est présent dans la cellule, alors que la protéine lui correspondant est absente. L'inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène peut résulter du dysfonctionnement d'un élément de la machinerie traductionnelle, notamment des ribosomes, des ARNs ribosomiques (ARNr) ou des ARNs de transfert (ARNt), ou des aminoacyl-ARNt synthétases. La présente invention porte également sur une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ou - la délétion totale du gène mic3, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic3 ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic3 et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic/ codant pour la protéine MIC1 ou - la délétion totale du gène mic/, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic/, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic/ ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic/. Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche comprenant une délétion totale des gènes mic/ et mic3. Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I est également supprimée et/ou ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. L'expression « moyens nécessaire à l'expression » d'une protéine (le terme protéine étant utilisé pour toute molécule d'acides aminés, telle que protéine, protéine de fusion, fragment de protéine, peptide, polyprotéine, polypeptide,...) s'entend de tout moyen qui permet d'obtenir la protéine, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acides nucléiques codant ledit peptide (d'intérêt). Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire inclus dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec le peptide d'intérêt à exprimer. La présente invention porte également sur une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, et dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161, est supprimée par : 16 - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène rop161 codant pour la protéine ROP16I ou - la délétion totale du gène rop161, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène rop161, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène rop161 ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène ropla La présente invention porte également sur une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, et dans laquelle ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161, est également supprimée et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161, est également supprimée et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus dudit gène rop161. 17 Lorsqu'un gène hétérologue à la souche initiale est introduit dans le génome de ladite souche par recombinaison, cette recombinaison peut être aléatoire ou ciblée de manière à contrôler l'endroit du génome où sera inséré ledit gène. Le terme « locus » défini un emplacement physique précis et invariable sur un chromosome . Au sens de la présente demande, un locus défini un endroit du chromosome où se situe un gène. Ainsi, un gène hétérologue peut être inséré de manière aléatoire et ainsi à un locus différent d'un gène connu, ou il peut être inséré de manière ciblée au locus d'un gène connu, qui pourra voir été préalablement délété. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161, est également supprimée et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rop161. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à 18 l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus du gène rop161 codant pour la protéine ROP161. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161 est supprimée par une délétion totale dudit gène ropla La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161 est supprimée par une délétion totale dudit gène rop161 et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161 est supprimée par une délétion totale dudit gène rop161 et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant 19 pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus dudit gène rop161. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161 est supprimée par une délétion totale dudit gène rop161 et ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rople La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies d'origine infectieuse chez la volaille ladite souche mutante étant une souche mutante de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1, la fonction de la protéine MIC 3 sont supprimées, et dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I est également supprimée et/ou ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1, la fonction de la protéine MIC 3 et la fonction de la protéine ROP16I sont supprimées. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1, la fonction de la protéine MIC 3 sont supprimées, et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus dudit gène rop161 codant pour la protéine ROP161. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1, la fonction de la protéine MIC 3 et la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop161 sont supprimées et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus dudit gène rop161. La présente invention concerne également une souche mutante dans laquelle ladite souche de Sarcocystidae est une souche de Toxoplasma spp., en particulier une souche de Toxoplasma gondii. La présente invention concerne également une souche mutante dans laquelle ladite souche de Sarcocystidae est une souche de Neospora spp., en particulier une souche de Neospora caninum. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ou - la délétion totale du gène mic3, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou 21 - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic3, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic3 la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic/ codant pour la protéine MIC1, ou - la délétion totale du gène mic/, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic/, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic/, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic/, et dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène rop161 codant pour la protéine ROP16I, ou - la délétion totale du gène rop161, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène rop161, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène rop161, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène rop161 et/ou ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/ et la fonction de la protéine ROP16I est supprimée par une délétion totale du gène ropla 22 La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par délétion totale du gène mic3 la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par délétion totale du gène mic/ et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par délétion totale du gène mic3 la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par délétion totale du gène mic/ la fonction de la protéine ROP16I est supprimée par délétion totale du gène rop161 et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaire à l'expression de ladite protéine, à un locus différent du locus dudit gène rop161 codant pour la protéine ROP16I. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins l'une des souches mutantes de Sarcocystidae telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également une composition comprenant au moins l'une des souches mutantes de Sarcocystidae telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme médicament. 23 DESCRIPTIONS DES FIGURES Figure 1-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KO-CATGFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmic3. Figure 1-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC1-KO-CATGFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène Figure 1-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAG1- Cre recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. Figure 2-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmic1-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du 24 gène mic/. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. Figure 2-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic/-3 KO et la souche finale Toxo tgmic1-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 3. Figure 2-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic1-3 KO 2G et confirme que les gènes mic/ et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP. Figure 2-D : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgmic3, tgmicl, cat-e dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic3 KO et/ou Toxo tgmic3 KO 2G et/ou Toxo tgmic1-3 KO et/ou Toxo tgmic1-3 KO 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 3 A et B : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic/-3 KO et la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1 (figure 3A), MIC3 (figure 3B) ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP. Figure 4: cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgROP16-KO-CATtdTomato. Ce plasmide de 9 443 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-tdTomato placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgrop16. Figure 5-A cette figure illustre l'étape pour obtenir la souche Toxo tgmic1-3 KO 2G ropl6KO. Cette étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-tdTomato au locus du gène rop16. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic1-3 KO 2G ropl6KO. Figure 5-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche Toxo tgmic1-3 KO 2G et la souche Toxo tgmic3 KO 2G et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G / ROP 16 KO en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 6. Figure 5-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des deux gènes tgrop16 et cat-tdtomato dans la souche sauvage et/ou la souche mutante de Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 6 : cette figure représente le plasmide pT230-2G GRA1511. Ce plasmide de 8108 paires de bases comprend le gène de sélection Ble placé sous le contrôle du promoteur de l'atubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression d'une protéine permettant la résistance à la phléomycine. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gral5HAII. Figure 7-A : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO 2G, Toxo tgmic1-3 KO 2G GRA1511 KI et la souche sauvage ME49, en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 9. Figure 7-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des gènes gral5 et gral5II dans les souches Toxo tgmicl3 KO 2G, Toxo tgmic1-3 KO 2G GRA1511 KI et la souche sauvage ME49 (type II) de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 8 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO 2G et Toxo tgmic1-3 KO 2G GRA1511 KI. 26 Figure 9 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO 2G, Toxo tgmic1-3 KO 2G ropl6K0 GRA1511 KI et la souche sauvage ME49, en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 9. Figure 10 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmicl3 KO 2G, Toxo tgmic1-3 KO 2G ropl6K0 et Toxo tgmic1-3 KO 2G ropl6K0 GRA1511 KI. Figure 11: cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRop 16K0- Gral5IIKI-CAT-GFP 1ox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites 1ox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gra15HAII. Puis de part et d'autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgrop16. Figure 12-A: cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP et le gène gra1511HA au locus du gène rop16. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche mutante Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI-2G. Figure 12- B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO 2G, Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI 2G Figure 12-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgrop16, gra1511, cat-e dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. 27 Figure 12-D : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI 2G et confirme que les gènes rop16 et cat-gfp ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gral5HAII. Figure 13 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO GRA15II KI-2G. Figure 14-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmic3. Figure 14-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC1-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmicl. Figure 15-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmic1-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic/. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. 28 Figure 15-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ncmic3, ncmic 1 , cat-e dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmic1-3 KO et/ou Neo ncmic1-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 15-C: cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmic1-3 KO et la souche Neo ncmic1-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 16. Figure 15-D : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmic1-3 KO 2G et confirme que les gènes mic/ et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN. Figure 16-A : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmic1-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3. Figure 16-B : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l'absence de la protéine CATGFP suite à l'action de la Cre Recombinase. Figure 17 : cette figure illustre la croissance des poussins entre J4 et J27 après immunisation (A-B) par voie in ovo à dose de 103, 104 ou 105 tachyzoïtes par animal inoculé soit dans le liquide amniotique (A) soit dans l'embryon (B). (C) Immunostimulation effectuée par voie sous-cutanée à 1 jour d'âge à la dose de 104, 105 ou 106 tachyzoïtes par animal. (D-F) Analyse statistique correspondante. ANOVA deux voies avec test post-hoc de Dunnett. Les animaux ayant été sacrifiés en série, le nombre d'animaux restant par groupe est indiqué au-dessus des courbes. Moyenne +/- SEM. Figure 18 : cette figure illustre le titre en anticorps dirigés contre Toxo-KO+ 2G après immunisation (A-B) par voie in ovo à dose de 103, 104 ou 105 tachyzoïtes par animal inoculé soit dans le liquide amniotique (A) soit dans l'embryon (B). (C) Immunostimulation effectuée 29 par voie sous-cutanée à 1 jour d'âge à la dose de 104, 105 ou 106 tachyzoïtes par animal. (D-F) Analyse statistique correspondante. ANOVA deux voies avec test post-hoc de Bonferroni. N=5 par groupe. Moyenne +/- SEM. Figure 19 : cette figure illustre le Poids et le gain quotidien moyen des animaux. A-B Poids des animaux infectés à J14 ou non infectés au moment de l'abattage. C-D Poids des animaux sacrifiés à J35, infectés à J7 à gauche ou infectés à J14 à droite. E-F Gain quotidien moyen des animaux sacrifiés à J35, infectés à J7 à gauche ou infectés à J14 à droite. ANOVA deux voies avec test Tukey post-hoc. Les analyses statistiques complètes sont disponibles en Annexe page 16. n=9-12 par groupe. Figure 20 : cette figure illustre le score de lésion macroscopique intestinal mesuré sept jours après infection par Eimeria acervulina. Résultats obtenus pour les groupes infectés à 7 jours ou à 14 jours de vie. Un test de fréquence (x2) a été utilisé pour comparer les groupes. Il n'y a pas de différence significative entre les animaux immunostimulés et les animaux contrôles. N=15-18/groupe. Figure 21A: cette figure illustre l'Expression des IgY dirigés contre Toxoplasma gondii mesurée dans le sérum des poulets sacrifiés à J21 (infectés à J14) et à J35 (infectés à J7 et J14). Aucun titre en anticorps n'a pu être déterminé chez les animaux infectés à J7 et sacrifiés à J14 (données non représentées). ANOVA deux voies avec test post-hoc de Tukey. n=9- 18/groupe. Figure 21B : cette figure illustre l'Expression des IgY dirigés contre Toxoplasma gondii mesurée dans le sérum des poulets sacrifiés à J35. Les animaux ont été immunostimulés avec 103 ou 105 tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI. Du DMEM (Dulbecco' s modified eagle' s medium) a été utilisé comme contrôle. Les animaux ensuite été infectés ou non par 2.105 oocystes d'Eimeria acervulina à J7 ou à J14 post immunostimulation. ANOVA deux voies avec test post-hoc de Tukey. n=9- 12/groupe. Figure 22 : cette figure illustre la Prise de poids des poulets immunostimulés avec des tachyzoïtes frais (A-B) ou lyophilisés (C-D). (A-B) Immunostimulation effectuée à J1 à la dose de 105 tachyzoïtes (sc), le DMEM (Dulbecco's modified eagle' s medium) seul a été utilisé comme contrôle. (C-D) Immunostimulation effectuée à J1 à la dose de 107 tachyzoïtes (sc), la solution F4 a été utilisée comme contrôle. Animaux infectés 7 jours post- Immunostimulation (A et C) ou 14 jours post-immunostimulation (B et D) par 2.27.104 bactéries de souche Salmonella Enteritidis par voie orale. Les animaux ont été sacrifiés en série, le nombre d'animaux restant par groupe est représenté sous les courbes. Moyenne +1SEM. Les écarts sont plus petits que les caractères représentant les points de courbe et ne sont donc pas toujours visible. ANOVA deux voies avec test Tukey post-hoc. Ns p value > 0,05 ; ** p value 0,05; ** p value 0,05 ; ** p value 0,05 ; * p Dans cette souche, le gène rop16 a été délété et remplacé par la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène rop16 délété contenant la cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 93. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G par PCR Pour valider la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11- C et sont détaillées dans le Tableau 12 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d' agarose (Figure 12-C). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 13 ci-dessous. Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G. Amorce F Séquence Tgrop16 (mixl) Rgl AGD rop 16CD S F SEQ ID NO: 83 GTTTGAGGAAGCGCAAAAAG Rg2 AGD rop 16CD S R SEQ lD NO: 84 TGCTGTGATTTCGCAAGTTC Validation KO en amont (mix2) Rg3 Rop 16K0 valid SEQ ID NO: 85 ACCCCCTGACCCCTTGTCTG 5F1 Rg4 Amont ropl6R SEQ ID NO: 86 TCGTCGTGGTATTCACTCCA Validation KO en aval (mix3) Rg5 Gral5 qPCR 2F SEQ lD NO: 87 CACGTACACAACCCATCTCG Rg6 Aval ropl6R SEQ ID NO: 88 AAAACGAATGCGAAGGAAGA Cicatrice ropl6K0 gral5 loxP (mix4) Rg7 cicrop16 loxF SEQ ID NO: 89 CAGTACCAGCCACGTTAGCA Rg8 cicrop16 loxGraR SEQ ID NO: 90 CAAGCAATCTGTGGCAAAAA Gral5I/II (mix5) Gral5I/II F SEQ ID NO: 109 GTGCAAAGCCAACTTCCACT Gral5I/II F SEQ ID NO: 110 GGACCTGGATCAGAGATCGT 56 Tableau 13 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G Toxo tgmic1-3 KO - 2G Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI - 2G Tgrop16 (mixl) 1682 - - Validation KO 5'Tgrop16 (mix2) - 2759 - Validation KO 3' Tgrop16 (mix3) - 2870 2870 Cicatrice ropl6K0 gral5loxP - 2550 321 (mix4) Gral5I/II (mix5) 560 560 et 308 560 et 308 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO: 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgrop16 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène de sélection CATGFP et gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases 57 pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO: 6 à la place du gène Tgrop16. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice 1ox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G (321 paires de bases) a été séquence et les séquençages ont confirmés que : - le gène Tgrop16 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 12-D). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tggral5 dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la présence du gène gral5HAII dans ces souches. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. 58 L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l'expression de la protéine GRA1511-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L'anticorps secondaire est l'anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-11012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%. Pour la souche sauvage Toxo tgmic1-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n'est observé au pôle apical du parasite révélant ainsi l'absence de la protéine GRA1511-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI, une fluorescence rouge est observé démontrant la protéine GRA1511-HA. La souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI exprime une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 alors qu'après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI 1ox2272 n'est plus fluorescente (Figure 13). Exemple 6 : Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G (notée Neo KO 2G) L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides - Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l'expression 59 du gène dans le parasite. En aval du gène cat-gfp SEQ ID :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction ClaI et XbaI (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO :10 digéré par ClaI et XbaI (7715 pb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 14 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KOCAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO :97. Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KOCAT-GFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO : 7 TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC ClaI LoxN catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT XbaI loxN ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG GTTCGA - Plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO: 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO :12 identiques de même orientation. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO :13 et CN11 SEQ ID NO :14 permettant l'ajout des sites loxP SEQ ID NO :12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindIII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindIII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F KpnI et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO:115) permettent l'amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118. La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R NotI (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO:117) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118 (BamHI -NotI). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO: 96 et une séquence 3'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO : 95. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 15 ci-dessous. 61 Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP Construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP CN10 SEQ ID NO: 13 HindIII loxP GCGGCCAAGCTTA TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA A GTTA TGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg SEQ ID NO: 14 CN11 cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGAACTA GTGGATC CA TAA SpeI , BamHI, loxP CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCCCTCGGGGG GGCAAGAATT 3 HR NCmicl F SEQ ID NO: 114 KpnI KpnI CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC 3 HR NCmicl R SEQ ID NO: 115 Hi ndIII HindIII CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC 5 HR NCmicl F SEQ ID NO: 116 BamHI BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC 5 HR NCmicl R SEQ ID NO: 117 Nod CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG No tI - Plasmide pTSAG1- Cre Recombinase Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage P1 (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial).qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. 62 L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmic/- 3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes : 1. Délétion par recombinaison homologue du gène Ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxN SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :1. 20 1.1g de plasmide purifié puis linéarisé par KpnI sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d' électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 !IL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 1.1F, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. 63 L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 3. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO :12. Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO :11 linéarisé par KpnI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102. 64 4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo Ncmic1-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par PCR Pour valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 15-B et sont détaillées dans le Tableau 16 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 15-C). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 17 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 15-C, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3K0 CATGFP et ncmic3K0 loxN (2G) ou ncmicl, ncmic1K0 CATGFP et ncmic1K0 loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches. Amorce Séquence Ncmic3 (mixl) c Nc mic3 F SEQ lD NO :22 TITCCCTTCTAAACACAGTCG d Nc mic3 R SEQ lD NO :23 CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT Validation KO i Integ NCmic3 F SEQ ID NO :24 GAAAGTGTCAGTGGTAGAGACTGC 5 'Ncmic3(mix2) j ORF CATGFP R SEQ lD NO :25 CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 GCATCGACTTCAAGGAGGAC 3'Ncmic3 (mix3) 1 Integ NCmic3 R SEQ ID NO :27 TOITTACAGGTGATCCAGAAAAGG Cicatrice Ncmic3(mix4) g AF3 SEQ lD NO :32 GTCATCGACCGCCGGAACTAGTAGT h AF4 SEQ ID NO :33 GCAGAGGTTCTGCGTATCTAACACGG Ncmicl (mix5) a Nc micl F SEQ lD NO :20 ACCCGGAGAATTATCGCCTA b Nc micl R SEQ lD NO :21 ITCTCCAGGCACTCACCT Validation KO m Integ NCmicl F SEQ lD NO :28 CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC 5 'Ncmicl(mix6) j ORF CATGFP R SEQ lD NO :25 CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 GCATCGACTTCAAGGAGGAC 3 'Ncmicl(mix7) n Integ NCmic 1 R SEQ lD NO :29 CTTGTCCGTCACATCGTTTG Cicatrice Ncmicl(mix8) e ncmicicrelox F B SEQ lD NO :30 GGCGACATACTGCATTGGAT f ncmicicrelox R B SEQ lD NO :31 GATCGGAGTCTGTCCCTCAA Tableau 17 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum NC-1 Neo mic3 KO Neo ncmic3 KO loxN Neo ncmicl- 3 KO loxP Neo ncmic1-3 KO 2G Ncmic3 (mixl) 850 - - - - Validation KO - 2960 - - - 5'Ncmic3(mix2) Validation KO 3'Ncmic3 (mix3) - 3668 - - - Cicatrice Ncmic3 (mix4) 2163 2575 276 276 276 Ncmicl (mix5) 701 701 701 - - Validation KO 5'Ncmic 1 - - - 3359 - (mix6) Validation KO 3'Ncmic 1 - - - 3421 - (mix7) Cicatrice Ncmic 1 (mix8) 3161 3161 3161 2560 261 66 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO :22 et d SEQ ID NO :23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmic1-3 KO et Neo Ncmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO :24 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et 1 SEQ ID NO :27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo Ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e dans cette souche à la place du gène Ncmic3. Cette bande n'est pas détectée dans les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmic1-3 KO et Neo Ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 3 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces amorces g SEQ ID NO :32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo Ncmic3 KO - 2G Neo Ncmic1-3 KO et Neo Ncmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO :20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Ncmic 1 SEQ ID NO :106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo Ncmic1-3 KO et Neo Ncmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. 67 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO :28 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et n SEQ ID NO :29 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo Ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Ncmicl. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 1 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO :30 et f SEQ ID NO :31 (cicatrice Ncmicl) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Ncmicl dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmicl. Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquences et les séquençages ont confirmés que : - le gène ncmic3 SEQ ID NO :105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 15-D). - le gène ncmicl SEQ ID NO :106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 15-D). Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les 68 cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti-MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-11012). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC3 (Figure 16-A). L'anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMIC1 SEQ ID NO: 119. Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmic1-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 16-B). Exemple 7: Immunostimulation ex vivo de macrophages aviaires primaires ou sous lignées de macrophage de type HD11 L'objectif de cette expérimentation est de définir quel est le potentiel d'activation de cellules immunitaires de poulet par chacune de ces souches sous la forme vivante, inactivée ou d'extrait total. Matériel et méthodes Cellules primaires de poulet Les splénocytes sont isolés à partir de rate de poulet de statut SPF (exempt d'agents pathogènes spécifiques) fournies directement par la plateforme d'expérimentation animale de l'INRA (PFIE, Nouzilly, France). Brièvement, les rates sont broyées sur un tamis cellulaire de 69 porosité de 100 i.tm (CellStrainer, Becton Dickinson, France). Les cellules immunitaires sont isolées par gradient de densité en respectant les consignes du fabriquant (Histopaque 1119, Sigma). Elles sont ensuite lavées à trois reprises dans du milieu de culture, comptées en cytométrie en flux et diluées à 2 .106 cellules vivantes par millilitre dans du milieu de culture. Les cellules primaires de poulet sont cultivées en milieu RPMI additionné de 12% de sérum de poule (Référence commerciale 16110082, Life Technology), de 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Les macrophages primaires de poulet sont isolés à partir de 10 mL de sang de poulet. Après dilution au tiers, le sang dilué est déposé sur un gradient de densité de 1119 (Histopaque 1119, Sigma) et centrifugé à 1200g pendant 30 minutes sans frein. L'anneau de cellules mononuclées est récupéré, lavé à trois reprises dans du milieu de culture. Les cellules immunitaires sont quantifiées en cytométrie en flux et la concentration cellulaire sera ajusté à 5.106 cellules vivantes par millilitre. Elles sont réparties à raison de 200 !IL par puits dans une plaque 96 puits à fond plat (Flacon, Corning) et maintenues trois heures à 37°C. Les cellules non adhérentes sont lavées à trois reprises dans du PBS (tampon phosphate salin, 70011036, ThermoFisher Scientific). Chaque puits est complété par 200 !IL de milieu de culture frais. Après 48 heures supplémentaires d'incubation à 37°C, les cellules non adhérentes et notamment les débris plaquettaires sont éliminés par deux lavages en PBS. La pureté est mesurée en cytométrie en flux en comptant le nombre de cellules portant l'antigène membranaire KUL1 (ab25441, Abcam), les macrophages obtenus dans cette expérience sont à un niveau de pureté supérieure ou égale à 92%. La lignée de macrophage de poulet HD11 est cultivée dans du milieu DMEM (11885-084, Thermofisher scientific) auquel est ajouté 5% de sérum de veau foetal décomplémenté et 5% de sérum de poule 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Production de parasites dérivés de Toxoplasma gondii et de Neospora caninum Les souches Toxo-KO+ , Toxo tgmic 1-3 KO 2G, Toxo K0+2G, Neo ncmic 1-3 KO 2G, Toxoplasma gondii RH et Neospora caninum NC1 sont entretenues par passages successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivées dans du milieu DMEM auquel est ajouté 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Les tachyzoïtes extra-cellulaires obtenus après trois jours de culture sont utilisés dans cette étude. Ils sont concentrés et lavés par centrifugation à 900 g pendant 5 minutes à température ambiante. Après remise en suspension dans une solution de DMEM, les tachyzoïtes sont comptés en cytométrie en flux et leur viabilité est évaluée par la proportion du nombre de tachyzoïtes n'incorporant pas l'Iodure de Propidium (P4864-10mL, Sigma-Aldrich) par rapport au nombre de tachyzoïtes total. La viabilité des tachyzoïtes utilisés dans cette expérience est supérieure à 85% lors de l'utilisation de tachyzoïtes frais. Production des parasites inactivés Pour produire les parasites inactivés pour chacune des souches, 109 tachyzoïtes sont produits et centrifugés à 900 g pendant 5 minutes. Ils sont remis en suspension dans une solution de PBS complémentée avec 4% de formaldéhyde (Référence commerciale 252549, Sigma) et sont laissés 30 minutes à 4°C. Après quatre lavages avec du PBS, les parasites inactivés sont recomptés en cellule de Malassez et ajustés à 109 parasites par millilitre. Production des extraits totaux Pour produire les extraits totaux pour chacune des lignées, 109 parasites sont produits et centrifugés à 900 g pendant 5 minutes. Ils sont remis en suspension dans de l'eau distillée dépourvue d'endotoxine (Référence commerciale 10977035, Gibco). La lyse cellulaire est effectuée par deux périodes de sonication de 10 minutes à 60W dans la glace. Les débris non solubles sont filtrés sur une membrane PVDF (polyflurorure de vinylidène) de 45 i.tm faible absorbance et stérile (SLHVO33RS, Merck-Millipore). La quantité de protéines totales extraites est quantifiée selon la méthode BCA (dosage par l'acide bicinchronique) en respectant les consignes du fabriquant (Référence commerciale Sigma B-9643 et C-2284). Les différents extraits produits à partir des différentes souches sont standardisés à 1 mg/mL et conservés à -80°C. Stimulation cellulaire Pour chacune des souches et des types cellulaires étudiés, les cellules sont stimulées 4h et 24h par les extraits totaux de chacune des souches produites, par les tachyzoïtes inactivés pour chacune des souches et par des tachyzoïtes frais aux doses indiquées. 71 Extraction des ARN messagers et transcription inverse Après 4 ou 24 heures de stimulation, les cellules sont lysées avec le tampon de lyse cellulaire RLT+ (Qiagen), contenant une forte concentration en guanidine isothiocycanate, et les ARN messagers sont extraits en respectant strictement la procédure du Kit RNeasy micro kit plus (74034, Qiagen). Les ARNm sont quantifiés par spectrophotométrie (NanodropTM) et dilués en eau distillée RNAse/DNAse free à une concentration de 200 ng/pt. Les ADN complémentaires sont produits en respectant les consignes du kit iScriptTM Reverse Transcription Supermix (1708841, Bio-Rad) et à partir de 2 tg d'ARN messager. Mesure de l'expression cytokinaire L'expression de l'IL-8, l'IL-113, l'IL-6, LITAF, l'IFN-y, l'IFN-a, l'IL-12 et la GAPDH est mesurée en RT-qPCR en respectant la méthode préconisée par le fabriquant (SsoAdvancedTM Universal SYBRe Green Supermix , 1725270, Bio-Rad). Les conditions de PCR, les primers (amorces) sont décrits dans le tableau 18 ci-dessous. L'expression de chacune des cytokines est rapportée à l'expression de la GAPDH en utilisant la méthode des courbes standard. Tableau 18 : Description des amorces et conditions de PCR Gène Primer sens Primer anti-sens Hybridation GAPDH SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 60°C GAGATGGTGAAAGTCGGAGTC 155 TTTCC CGTTCTCAGCCTTGAC IL12B SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 157 60°C TACTTTCCTTTGCTGCCCTTCT TGGTGTCTCATCGTTCCACT IFN- gamma SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 60°C CTGAAGAACTGGACAGAGAGAAA 159GTTTGATGTGCGGCTTTGACT LITAF SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 161 60°C CTGTGTATGTGCAGCAACCC AACAACCAGCTATGCACCCCA IFN- alpha SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 58°C CCTTGCTCCTTAACGACA 163 CGCTGAGGATACTAGAAGAGGT IL- lbeta SEQ ID NO: SEQ ID NO: 60°C 164 CTTC CTC CAGCCAGAAAGT 165 CAGCGTTGTAGC CCTTGAT IL-6 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 167 53°C CAACCTCAACCTGCCCAA GGAGAGCTTCCTCAGGCATT IL-8 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 58°C 168 CTGAGGTGC CAGTGCATTAG 169AGCACACCTCTCTTCCATCC IL-12a SEQ ID NO: SEQ ID NO: 171 60°C 170AAGACCTGAAAACCTACAAGGC GGCTTGCATCATGTCATCAA 72 Analyse statistique Les analyses statistiques ont été calculées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 7. Une ANOVA deux voies suivie d'un test post-hoc de Tukey ou de Bonferroni a été utilisée pour effectuer les comparaisons multiples en prenant en compte l'appariement des données, la durée de stimulation et le type de stimulation. Résultats Expression de cytokines pro-inflammatoires L'expression de l'IL-8, l'IL-6, l'IL-113 et l'IFN-a reflète une réponse inflammatoire active, telle que classiquement observée lors d'une infection bactérienne, virale ou parasitaire. L'expression de ces cytokines est forte dans les cellules primaires après une stimulation de type PMA/Ionomycine utilisée ici comme contrôle positif dans les macrophages. La lignée HD11 bien que réceptive aux stimuli pro-inflammatoires n'exprime pas ces cytokines à un haut niveau. L'expression de chacune de ces cytokines est respectivement plus forte après stimulation par les souches vivantes de Toxo-KO+ et Toxo-KO+ 2G, telles qu'obtenues respectivement aux exemples 4 et 5, en regard des stimulations effectuées avec les souches, Toxo tgmic1-3 KO 2G, Toxoplasma gondii RH, Neospora caninum NC1 et Neo ncmic1-3 KO 2G. ces différences d'expression de cytokines pro-inflammatoire entre les groupes sont plus faibles lorsque les souches sont testées sous la forme d'extraits totaux ou de parasites inactivés. Expression de cytokines pro-cytotoxiques Les parasites du genre Apicomplexa, comme Toxoplasma spp. et Neospora spp., sont des parasites intracellulaires obligatoires. La réponse cytotoxique est directement en lien avec la production d'IFN-y et d'IL-12 c'est pourquoi le niveau d'expression de ces deux cytokines a également été quantifié pour comparer la capacité d'activation du système immunitaire de chacune des souches dérivées de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum L'expression de l'IFN-y et de l'IL-12 est très augmentée par une stimulation avec de la PMA/Ionomycine qui est utilisée ici comme contrôle positif Le niveau d'expression d'IL-12 73 et d'IFN-y par les splénocytes est également élevé. En revanche, les macrophages primaires et HD11 produisent peu d'IFN-y et sont plus enclins à produire de l'IL-12. Ces deux cytokines sont exprimées dans une forte mesure en réponse à une stimulation par des parasites vivants des souches Toxo-KO+ et Toxo-KO+ 2G, telles qu'obtenues respectivement aux exemples 4 et 5. Dans une moindre mesure, l'expression de ces deux cytokines est augmentée par rapport à la condition contrôle après une stimulation par les autres souches dérivées de Toxoplasma gondii et Neospora caninum, y compris les souches sauvages. Comme pour l'expression des cytokines pro-inflammatoires, la différence d'expression de l'IFN-y et de l'IL-12 est diminuée lorsque la stimulation est effectuée avec des parasites inactivés et dans une plus forte mesure avec les extraits totaux de parasites. Néanmoins, l'expression est sensiblement plus forte en réponse à une stimulation par les souches ToxoKO+ et Toxo-KO+ 2G par rapport à une stimulation par les autres souches. Conclusion L'effet de chacune des souches sur l'activation de la réponse immunitaire est évaluée in vitro et sous la forme de tachyzoïtes vivants, de tachyzoïtes inactivés ou d'extraits totaux de parasites. Les résultats mettent en évidence une augmentation significative de l'expression des cytokines pro-inflammatoires et des cytokines favorisant la réponse cytotoxique après une stimulation par les souches Toxo-KO+ et Toxo-KO+ 2G. Cependant, chacune des souches est exploitable pour moduler l'activité du système immunitaire, soit fortement avec les souches Toxo-KO+ et Toxo-KO+ 2G, soit plus modérément avec les autres souches. Exemple 8 : Innocuité de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI (notée Toxo KO +2G) inoculée par voie sous-cutanée au poussin d'un jour L'objectif de l'expérimentation est de valider l'innocuité de la souche Toxo KO +2G, telle qu'obtenue à l'exemple 5, chez la volaille nouveau-né et de vérifier que la souche Toxo KO +2G induit une réponse immunitaire. Matériel et méthode Production de parasites Toxo KO +2G La souche mutante de Toxoplasma gondii Toxo KO +2G, obtenue à l'exemple 5, est entretenue par passages successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivées dans du milieu DMEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Animaux Cent poussins de 1 jour ont été inclus dans l'étude. Les poussins ont été divisés en 4 lots distincts: o Lot A: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.103 tachyzoïtes de la souche Toxo KO +2G à un jour d'âge, o Lot B : composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.104 tachyzoïtes de la souche Toxo KO +2G à un jour d'âge, o Lot C: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.105 tachyzoïtes de la souche Toxo KO +2G à un jour d'âge, o Lot D : composé de 25 poussins contrôle inoculés avec du PBS à un jour d'âge. L'ensemble des injections ont été réalisés par voie sous-cutanée à la base du cou dans un volume de 1001.1E. L'ensemble des animaux est sacrifié 28 jours après le début de l'expérimentation. Résultats Aucun signe clinique n'a été observé au cours de l'expérimentation et le gain de poids des poussins immunostimulés est globalement similaire au gain de poids des poussins contrôles, quel que soit la dose d'immunostimulant. 74 Exemple 9 : Innocuité de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI (notée Toxo KO + 2G) inoculée par voie sous-cutanée au poussin d'un jour ou par voie in ovo dans le liquide amniotique ou dans l'embryon L'objectif de l'expérimentation est de valider l'innocuité de la souche Toxo KO +2G chez le poulet de chair, telle qu'obtenue à l'exemple 5, chez la volaille nouveau-né et de vérifier que la souche Toxo KO +2G induit une réponse immunitaire après inoculation par voie in-ovo ou sous-cutanée. Matériel et méthodes Production de parasites Toxo KO + 2G La souche mutante de Toxoplasma gondii Toxo KO + 2G, telle qu'obtenue à l'exemple 5, est entretenue par passage successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivées dans du milieu DMEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Animaux Trois-cents poussins ont été inclus dans l'étude. Les poussins ont été divisés en 12 lots distincts : o Lot A: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.103 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie in ovo trois jours avant éclosion (liquide amnioti que), o Lot B : composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.104 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie in ovo trois jours avant éclosion (liquide amnioti que), o Lot C: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.105 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie in ovo trois jours avant éclosion (liquide amnioti que), o Lot D: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.103 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie in ovo deux jours avant éclosion (embryon), o Lot E: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.104 tachyzoïtes de la souche 76 Toxo KO + 2G par voie in ovo deux jours avant éclosion (embryon), o Lot F: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.105 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie in ovo deux jours avant éclosion (embryon), o Lot G: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.104 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie sous-cutanée une journée après éclosion, o Lot H: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.105 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie sous-cutanée une journée après éclosion o Lot I: composé de 25 poussins immunostimulés avec 1.106 tachyzoïtes de la souche Toxo KO + 2G par voie sous-cutanée une journée après éclosion. o Lot J: composé de 25 poussins contrôle inoculés avec 50 uL de DMEM par voie in ovo trois jours avant éclosion (liquide amniotique)' o Lot K: composé de 25 poussins contrôle inoculés avec 50 uL de DMEM par voie in ovo deux jours avant éclosion (embryon), o Lot L: composé de 25 poussins contrôle inoculés avec 200 uL de DMEM par voie sous-cutanée une journée après éclosion. Chaque semaine, 5 animaux par groupe sont sacrifiés pour étudier la cinétique d'apparition des anticorps. Résultats Effet clinique et mortalité Quel que soit la dose et la voie d'inoculation testée, aucune mortalité ou effet clinique spécifique n'a été observé en comparaison avec les groupes contrôles respectifs. Après autopsie, aucune évidence de lésion aiguë ou chronique n'a été observée sur les animaux sacrifiés entre 2 et 27 jours post-immunostimulation, soit pendant toute la durée de l'expérimentation. Ces résultats suggèrent l'absence d'un effet toxique majeur de ToxoKO+ 2G lorsqu'utilisé à des doses comprises entre 103 et 105 tachyzoïtes par animal injectés in ovo ou entre 104 et 106 tachyzoïtes par animal injectés par voie sous-cutanée. Croissance des animaux La croissance des animaux contrôles, ayant reçu seulement du DMEM (groupe J, K, L) par voie in ovo ou sous-cutanée est conforme aux attentes et similaire entre les trois groupes testés ce qui suggère une bonne homogénéité des conditions d'élevage entre les différentes unités de 77 confinement. La moyenne du poids des animaux au moment de l'abattage dans les groupes immunostimulés est significativement inférieure aux moyennes observées dans les groupes contrôles respectifs (figures 17 A-C). Cette diminution du poids est observée de manière intermittente entre J11 et J27 quel que soit la dose employée. De plus, pour une même voie d'inoculation, les différences de moyennes de poids au cours de l'expérimentation sont faibles ce qui suggère que la dose aurait un impact mineur sur la perte de poids induite par Toxo-KO+ 2G. De la même manière, la voie d'inoculation n'influence pas ou peu ce profil différentiel de croissance. Pris dans leurs ensembles, ces résultats suggèrent que Toxo-KO+ 2G induit une diminution faible mais significative du poids des animaux quel que soit la voie d'inoculation et la dose testée. Influence sur la réponse immunitaire L'effet de Toxo-KO+ 2G sur l'activation de la réponse immunitaire a été évalué par la quantification de la réponse humorale dirigée contre Toxo-KO+ 2G (figures 18 A-C). La présence d'anticorps anti-Toxo-KO+ 2G reflète une activation nécessairement aboutie du système immunitaire. La production d'anticorps spécifique ne peut apparaitre qu'après une activation de cellules du système immunitaire innée, comme certaines cellules présentatrices d'antigène, des lymphocytes T CD4 helper et une activation puis une maturation des lymphocytes B. Ces derniers pour produire des anticorps de type IgY (IgG chez le poulet) ont nécessairement commuté de classe et ont donc ainsi été pleinement activés. Les anticorps de sous classe IgY dirigés contre Toxo-KO+ 2G sont exprimés dès 20 jours post-éclosion quel que soit les groupes immunostimulés considérés. A J28, on observe un effet dose dépendant clair et significatif, démontrant qu'une dose faible active moins fortement le système immunitaire qu'une dose forte (figures 18 A-C). Le titre maximal en anticorps a été observé dans le groupe immunostimulé par voie sous-cutanée à dose de 106 tachyzoïtes par animal. Néanmoins, à dose égale, les titres en anticorps dans les groupes immunisés par voie sous-cutanée sont globalement plus faibles que ceux observés dans les groupes immunisés par voie in ovo (figures 18 A-C). L'immunisation par voie in ovo dans le liquide amniotique montre une meilleure efficacité sur l'activation de la réponse immunitaire, 78 notamment à dose de 105 tachyzoïtes par animal (figures 18 A-C). Ces résultats montrent que l'inoculation de Toxo-KO+ 2G induit une activation dose dépendante de la réponse immunitaire quel que soit la voie d'inoculation testée. Conclusion L'effet d'une inoculation par voie in ovo ou sous-cutanée de Toxo-KO+ 2G a été évalué chez le poulet. De manière dose dépendante, un effet activateur de la réponse immunitaire de Toxo-KO+ 2G a été mis en évidence quel que soit les voies d'inoculation testées. Aux différentes doses et voies d'inoculation testées, une faible diminution de la croissance a été observée après immunostimulation. Cette diminution du poids ne s'accompagne pas d'une toxicité aiguë ou chronique visible macroscopiquement sur l'animal vivant ou après autopsie. Pris ensemble, ces résultats montrent que l'inoculation de Toxo-KO+ 2G active la réponse immunitaire et que la dose maximale admissible en l'absence de manifestation clinique apparente est de 106 tachyzoïtes par animal. Exemple 10 : Efficacité de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI (notée Toxo KO + 2G) dans la prévention de la coccidiose aviaire Matériel et méthode Production de parasites Toxo KO+ 2G La souche mutante de Toxo KO+ 2G telle qu'obtenue à l'exemple 5est entretenue par passage successifs sur une lignée de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivées dans du milieu DMEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal 10%, 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Les tachyzoïtes ont été concentrés et lavés par centrifugation à 900G pendant 5 minutes à température ambiante. Après remise en suspension dans une solution de DMEM, ils ont été comptés en cellule de Malassez et dilués soit à 1.104, soit à 1.106 tachyzoïtes par millilitre. Leur viabilité a été évalué en cytométrie en flux (MACS Quant 10, Miltenyi) et a été calculée comme étant la fréquence du nombre de tachyzoïtes n'incorporant pas l'iodure de propidium (référence commerciale P4864-10ML, Sigma- 79 Aldrich) par rapport au nombre de tachyzoïtes total. La viabilité des tachyzoïtes est supérieure à 82%. Production d'Eimeria acervulina La souche d'Eimeria acervulina utilisée dans cette étude provient d'un élevage Français. Les parasites ont été amplifiés par des passages successifs sur des poulets SPF (Exempt d'agents pathogènes spécifiques) Les oocystes d'E. acervulina ont été purifiés à partir de fèces provenant de poulets infectés 5 jours auparavant. Comme décrit dans de précédents travaux (Cloning and expression of cDNA encoding an Eimeria acervulina 70 kDa sporozoite protein which is related to the 70 kDa heat-shock protein family_Laurent F. et al., Mol Biochem Parasitol. 1994 Aug;66(2):349-52) (Effects of whole wheat feeding on the development of coccidian infection in broiler chickens. Gabriel I, et al., Poult Sci. 2003 Nov;82(11):1668-76), la purification fait intervenir un processus de flottaison dans une solution de sulfate de magnésium, des lavages dans l'eau et une décontamination à l'eau de javel. Après purification les oocystes sont conservés dans une solution de PBS stérile à 4°C. Les animaux ont été inoculés per os avec 2.105 oocystes sporulés préalablement dilués dans 0.5mL d'eau de boisson stérile. Animaux 263 poussins de race ROSS PM3 de 1 jour ont été acheté au couvoir Boyé-accouvage (La Boissière-en-Gâtine, France). Les animaux ont été hébergés dans une salle de confinement de classe II Les animaux ont ensuite été répartis dans différents groupes présentés dans le tableau 19 ci-dessous. Au jour 1 de l'expérimentation, les poussins ont été immunostimulés par 103 (Dose 1) ou 105 (Dose 2) tachyzoïtes de Toxo KO+ 2Gfrais administrés par voie sous-cutanée. Les animaux contrôles ont reçu un volume équivalent de DMEM. A 7 ou 14 jours post éclosion, les animaux ont été infectés par 2.105 oocystes d'Eimeria acervulina per os. Une solution d'eau de boisson stérile a été administrée aux groupes contrôles. Tableau 19 : Répartition des animaux et description des groupes Nom du groupe A B C D E F G H I Immunostimulation -- Dose Dose -- Dose Dose -- Dose Dose 2 1 2 1 2 1 Infection -- -- -- Infection E. acervulina Infection E. acervulina J7 J14 Nombre d'animaux 22 22 22 25 25 25 25 25 25 n= Sacrifice J14 6 6 6 15 15 15 Sacrifice J21 6 6 6 15 15 15 Sacrifice J35 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Le poids de chaque individu a été mesuré trois fois par semaine. Une semaine après chaque temps d'infection, J7 ou J14, 15 à 18 animaux par groupe ont été sacrifiés et un score macroscopique de lésion des anses duodénales a été attribué. Résultats Prise de poids Une diminution de la prise de poids des animaux non-immunostimulés de 24.20% et 36.33% a été observés après infection par Eimeria acervulina à J7 ou à J14 respectivement (*, p 0.05, figure 19) et sur la vitesse de croissance des animaux (p>0.05, figure 19 E). Pour les animaux infectés à J14 à la dose 103 tachyzoïtes par animal, une augmentation non significative du poids, atteignant 13.5% à J35, a été observée (ns, p > 0.05, figure 19 D) par rapport au groupe contrôle (DMEM). Les animaux immunostimulés à la dose de 105 ont présenté une forte augmentation significative du poids à partir de J28 (*, p REVENDICATIONS1. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation dans la prévention de maladies infectieuses chez la volaille ; ladite fonction de la protéine MIC3 étant supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ou - la délétion totale du gène mic3, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic3, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic3 ; et ladite fonction de la protéine MIC1 étant supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic/ codant pour la protéine MIC1, ou la délétion totale du gène mic/, ou la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic/, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic/, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic/. 2. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon la revendication 1, ladite souche mutante de Sarcocystidae étant formulée pour une administration in ovo ou chez un poussin de volaille âgé de 0 à 72h. 3. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, 95 ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine virale ou une maladie d'origine bactérienne ou une maladie d'origine parasitaire. 4. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, ladite maladie infectieuse étant une maladie d'origine virale, en particulier la grippe aviaire, ou une maladie d'origine bactérienne, en particulier la salmonellose, ou une maladie d'origine parasitaire, en particulier la coccidiose. 5. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, ladite souche mutante étant une souche de Toxoplasma spp., en particulier de Toxoplasma gondii. 6. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, ladite souche mutante étant une souche de Neospora spp., en particulier de Neospora caninum. 7. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop 1 6I est supprimée et/ou ladite souche comprend au moins un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, ladite fonction de la protéine ROP16I étant supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène rop 1 61 codant pour la protéine ROP16I, ou - la délétion totale du gène rop161, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène rop 1 6I, ou 96 - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène ropl6I,ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène rop161 8 Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, ladite souche mutante étant une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/. 9. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon la revendication 7, ladite souche mutante étant choisie parmi : - une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mia, ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA1 5II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, - une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP1 6I codée par le gène rop 1 61 est supprimée par une délétion totale dudit gène rop 1 61, - une souche mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/, la fonction de la protéine ROP1 61 codée par le gène ropl6I est supprimée par une délétion totale dudit gène rop16I et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA1 511 ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine. 10. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 sont supprimées, pour son utilisation selon l'une des 97 revendications 1 à 4 et 6, ladite souche mutante étant une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/. 11. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma gondii, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1, la fonction de la protéine MIC 3 sont supprimées, et la fonction de la protéine ROP16I codée par le gène rop16I est supprimée et/ou ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ou la délétion totale du gène mic3, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic3, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic3 ; et la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic/ codant pour la protéine MIC1, ou - la délétion totale du gène mia, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic/, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic/, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic/ ; et dans laquelle la fonction de la protéine ROP16I est supprimée par : 98 - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ropl 61 codant pour la protéine ROP1 6I, ou - la délétion totale du gène ropl6I, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène ropl6I, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène ropl6I, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène rople notamment ladite souche étant une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par délétion totale du gène mic3, la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par délétion totale du gène mic/, et la fonction de la protéine ROP1 6I est supprimée par délétion totale du gène ropl6I et ladite souche comprend un acide nucléique codant pour la protéine GRA1 511, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine. 12. Composition comprenant au moins l'une des souches mutantes de Sarcocystidae selon la revendication 11, pour son utilisation comme médicament.