FR 3067360 A1 20181214 FR 1755310 A 20170613 MILIEU ET PROCEDE DE CULTURE ET ISOLEMENT SELECTIF DE LA BACTERIE ENTEROCOCCUS HIRAE La présente invention concerne un nouveau milieu et procédé de culture et d'isolement sélectif de la bactérie commensale Enterococcus hirae au sein d'un échantillon biologique, notamment de selles. Les bactéries du genre Enterococcus sont des cocci à Gram positif, retrouvés sous forme de diplocoques. Ce sont des germes commensaux du tube digestif, le plus souvent responsables d'endocardites et d'infections urinaires [1]. Le genre Enterococcus est rangé dans le domaine des Bacteria, le phylum des Firmicutes, la classe des Bacilli, l'ordre des Lactobacillales, la famille des Enterococcaceae et enfin la branche des Clostridium. A l'heure actuelle, il existe 58 espèces d'entérocoques différentes [1]. Les entérocoques les plus souvent retrouvés dans les échantillons cliniques sont Enterococcus faecalis qui représentent qui représentent 75 à 85 °A) des souches cliniques d'entérocoques et Enterococcus faeckim. faecalis qui représentent 10 à 20 °A) des souches cliniques d'entérocoques, les autres espèces des souches cliniques du genre Enterococcus représentant environ 5 °A) à savoir Enterococcus hirae, E. casseliflavus, E gallinarum et E. raffinosus [14]. Enterococcus hirae est un pathogène zoonotique, retrouvé chez les zo mammifères et les oiseaux, qui a rarement été isolé à partir d'une infection chez l'homme [2]. Actuellement, différents milieux de culture solides sont utilisés pour sélectionner les bactéries du genre Enterococcus, tel que le milieu BEA (Bile Esculine Azide) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) [3], qui permet l'isolement 25 sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et les bactéries du genre Enterococcus. Il existe également les milieux mEI Agar (Difco, BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis), Chromocult® enterococci (Merck, Darmstadt, Allemagne), et m-Enterococcus agar (Sigma-Aldrich), qui permettent d'isoler les entérocoques [4]. 2 L'objectif de la présente invention est de sélectionner spécifiquement E hirae, parmi les autres bactéries du genre Enterococcus. En effet, cette bactérie E. hirae joue un rôle important dans l'immunité, notamment dans le traitement du cancer du sein [5]. Il a été démontré que la présence d'E. hirae chez les femmes atteintes d'un 5 cancer du sein favorisait la réponse au traitement par chimiothérapie. E. hirae est un « oncomicrobiotique », elle favorise l'effet thérapeutique anti-cancéreux du cyclophosphamide (CTX). En effet, elle active l'immunité anti-tumorale via l'induction de cellules Th17 et en augmentant le ratio des cellules cytotoxiques sur les cellules T régulatrices [5]. 10 Le but de la présente invention est de sélectionner E hirae à partir de prélèvements biologiques, en particulier de selles de patients, afin de mettre en évidence la présence ou non de cette bactérie dans le microbiote de ces patients et ainsi prédire leur possible réponse au traitement thérapeutique par cyclophosphamide [5]. 15 La présente invention a consisté tout d'abord à sélectionner spécifiquement les bactéries du genre Enterococcus et plus particulièrement E. faecalis, E faecium et E. hirae sur un milieu de culture puis différencier E. hirae des autres entérocoques par une technique de coloration. On comprend que le milieu de culture pour Enterococcus selon l'invention est constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture sélective des entérocoques, comprenant notamment différents inhibiteurs des bactéries Gram négatif et de la plupart des bactéries Gram positif, autres que les entérocoques. Un milieu couramment utilisé pour la mise en évidence des entérocoques est le milieu bile-esculine qui comprend : - 10 °A) de bile de boeuf (les entérocoques tolèrent jusqu'à 40 °A) de bile contrairement à de nombreux autres germes) ; - de l'azoture de sodium (un antiseptique élimine toutes les bactéries. Gram négatifs) ; - de l'esculine et du citrate de fer ammoniacal (un composé qui permet le virage vers le noir du milieu de culture lorsque l'esculine est hydrolysée). 3 Les entérocoques se développent en hydrolysant l'esculine de sorte que les entérocoques poussent en faisant virer le milieu au noir : le noircissement du milieu traduisant l'hydrolyse par le citrate de fer ammoniacal de l'esculine en esculétine qui se lie avec le fer. 5 Un milieu de culture solide spécifique des entérocoques, dénommé milieu m- Enterococcus agar [3] comprend de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L: - Extrait pancréatique de gélatine: 10 g (1%) - Extrait de levure : 30 g (3%) lo - Chlorure de sodium : 15 g (1,5%) - Esculine : 1 g (0,1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) 15 - Agar : 15 g (1,5%) L'azoture de sodium présente une action inhibitrice sur les bactéries Gram négatif et sur tous les streptocoques sauf ceux du groupe D. Le cycloheximide présente une son action antifongique. L'acide nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones, utilisé pour 20 son action sur les bactéries Gram négatif. Le chlorure de sodium permet d'inhiber les bactéries gram positifs autres qu'Enterococcus, en particulier le sous-genre Streptococcus D peut être inhibé par la salinité d'un milieu de culture. Ainsi Les Enterococcus peuvent être cultivées sélectivement sur un milieu hypersalé. 25 L'extrait pancréatique de gélatine et l'extrait de levure apportent les nutriments nécessaires. La présente invention fournit un milieu de culture solide spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des 4 entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend : - comme seul sucre du mannitol, et 5 - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol. On évite en particulier la mise en oeuvre d'esculine dans le milieu de base car 10 celle-ci colore en noir tous les entérocoques comme indiqué ci-dessus. Selon la présente invention on tire parti du fait que E. hirae ne consomme pas de mannitol alors que le mannitol est consommé en provoquant une baisse du pH ou acidification dudit milieu de culture spécifique, par toutes les principales autres bactéries Enterococcus susceptibles d'être présentes dans des échantillons cliniques 15 de patients humains, notamment de selles, à savoir E faecalis, E. faeckim, E. casselfflavus, E gallinarum et E. raffinosus [14]. Plus particulièrement, le pH dudit milieu de culture spécifique selon l'invention est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol. Cet indicateur coloré vire à un pH de 5,2-6,8, un pH dans cette fourchette de 20 5,2-6,8 correspondant à l'acidification d'un milieu de culture de PH 7,3 +/- 0,2; ensemencé par au moins une colonie isolée de bactérie Enterococcus autre que Enterococcus hirae. Plus particulièrement encore, le milieu de culture spécifique selon l'invention comprend au moins 10 g/L de mannitol. 25 Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10g/L. Cette concentration relativement élevée en mannitol par rapport aux autres nutriments permet de favoriser la consommation prioritaire dudit sucre par les Enterococcus autres que E. 30 hirae d'une part offre suffisamment de nutriment pour la croissance de E hirae. 5 Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention 5 comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50mg/L. De façon connue, lesdits nutriments sont des sources d'énergie et source de carbone, azote ou phopsphore. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention 10 comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux métalliques, notamment de métaux tels que Cu, Zn, Co, Ni, Bi, Ti, et des composés azotés. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés : 15 - un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone. La peptone permet d'apporter des acides aminés et des peptides comme source d'énergie et de carbone autre que sucres. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention 20 comprend : - un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de 25 préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques : 6 - du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L, et - de l'azoture de sodium, et - de l'acide nalidixique. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention 5 comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L: - Protéose-peptone : 10 g (1%) - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) Io - Mannitol 10 g (1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) 15 - Agar : 15 g (1,5%) La présente invention fournit également un procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que 20 Enterococcus hirae, à une température de 37°C durant un temps suffisant pour faire apparaitre une coloration de bactéries Enterococcus autres qu'Enterococcus hirae par ledit colorant dans undit milieu de culture spécifique selon l'invention. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention permet de sélectionner une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé 25 comprenant d'autres bactéries choisies parmi E faecalis, E. faecium, E. casselfflavus, E gallinarum et E. raffinosus. Plus particulièrement encore, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes dans lesquelles: 7 a) on effectue une série de plusieurs dilutions du prélèvement de départ, de préférence d'au moins 10-5 à partir d'un échantillon de selle, notamment prélevé à l'aide d'une oése, à raison de 0,10 à 0,50 g/mL de tampon PBS, et b) un échantillon de chacune des dilutions est ensemencé sur le dit milieu de 5 culture spécifique solide selon l'invention, de préférence d'un échantillon de 100 microlitres de selle diluée sur le dit milieu de culture spécifique solide, et c) au bout de 72 heures d'incubation à 37°C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et io d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. L'identification d'Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a été décrite [15]. 15 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lumière de la description détaillée de l'invention et des exemples illustratifs ci-après. Du fait que les entérocoques sont résistants aux fortes concentrations salines [1], afin d'éliminer une partie des bactéries Gram positif autres qu'entérocoques et 20 les bactéries Gram négatif, résistantes aux inhibiteurs cités précédemment, il a été testé différentes concentrations de sel (chlorure de sodium) pour trouver la plus adéquate à ajouter à la formulation de la présente invention. Quatre concentrations ont été expérimentées (60 g/L, 65 g/L, 70 g/L et 75 g/L). Les résultats ont montrés que les 3 souches d'entérocoques - E. hirae, E faechen et E faecalis- testées sur 25 ces milieux ont eu une croissance pour chacune des concentrations testées. Cependant, après lecture des géloses à 24 heures, il a été observé que plus les concentrations en sel étaient augmentées, plus les colonies des bactéries E. hirae obtenues étaient de petite taille. 8 Pour permettre une meilleure visibilité des colonies, la concentration en chlorure de sodium retenue pour un milieu sélectif selon la présente invention est d'au moins 20g/L mais pas plus de 60 g/L. Les entérocoques les plus représentés dans les prélèvements biologiques, en 5 particulier les selles, sont E. faecalis et E. faecium [2, 6, 7]. Les autres espèces d'entérocoques étant sous-dominantes, aucun inhibiteur des autres entérocoques n'a été ajouté à la formulation de la présente invention. Cependant, certains entérocoques - Enterococcus casselfflavus, ente rococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus- sont présents en quantité comparable à Enterococcus hirae [8] dans les io selles. La présente invention permet toutefois de les différencier d'Enterococcus hirae, comme démontré ci-après. Le principal objectif de la présente invention est d'isoler E. hirae parmi E. faecium et E. faecalis. Ces deux dernières espèces bactériennes étant résistantes à un grand nombre d'inhibiteurs auxquels E hirae résiste, il n'a pas été possible de les 15 éliminer des prélèvements. Les inventeurs ont alors cherché à les différencier en fonction de leur profil métabolique. Pour cela, les inventeurs ont recherché des sucres consommés soit exclusivement par E hirae, soit exclusivement par E. faecium et E. faecalis. Après étude des données de la littérature, trois sucres ont été retenus : le mélibiose, le raffinose et le mannitol. En effet, le mélibiose est 20 consommépar E. hirae et de façon variable par E faecium. On entend par variable le fait que la consommation de ce sucre par E faecium est souche-dépendante. Quant au raffinose et au mannitol, ils sont exclusivement consommés par E faecalis et E. faecium et non pas par E hirae (cf tableau 1) [9, 10, 11]. Pour mettre en évidence la consommation du sucre par les bactéries, les 25 inventeurs ont ajouté au milieu de la présente invention un indicateur coloré dont la couleur va varier en fonction du pH du milieu. En effet, lors de la consommation du sucre par la bactérie, il y a une acidification du milieu, ce qui entraîne un virage de l'indicateur coloré. Pour déterminer l'indicateur coloré le plus approprié, les inventeurs en ont testé plusieurs dont les trois suivants : le rouge phénol, le vert de 30 bromocrésol et le pourpre de bromocrésol. En se basant sur les concentrations dans des milieux contenant déjà un de ces indicateurs colorés, les inventeurs ont choisi, 9 dans un premier temps, de tester une concentration de 25 mg/L [12] pour chacun des indicateurs choisis. 1) Tests des différents indicateurs colorés Le rouge phénol est de couleur rouge ; il vire vers le jaune lorsque le pH est 5 dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 6.6 et 8. Le milieu ayant un pH compris entre 7.3±0.2, l'indicateur a commencé a viré vers le jaune dès l'autoclavage, ne permettant pas son utilisation dans un milieu selon la présente invention. Le vert de bromocrésol a une couleur bleue ; il vire vers le jaune lorsque le pH 10 est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 3.8 et 5.4. Cet indicateur coloré nécessite une acidification du milieu trop importante pour pouvoir visualiser un véritable changement de couleur. Les inventeurs ont ainsi observé un virage davantage vers le vert que vers le jaune. Le contraste entre les colonies de E faecalis et E faechen et le milieu de culture n'a donc pas été assez important pour 15 les différencier. Le pourpre de bromocrésol est de couleur violet ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 5.2 et 6.8. L'avantage de cet indicateur coloré est qu'il ne nécessite pas un fort abaissement du pH pour laisser apparaitre des colonies jaunes avec un halo jaune dessous. De plus, 20 cette zone de virage est idéale puisque le pH de la présente invention est de 7.3±0.2. Les inventeurs ont donc choisi ce dernier indicateur coloré pour la formulation de la présente invention. Voulant améliorer davantage le contraste, les inventeurs ont augmenté la concentration du pourpre de bromocrésol jusqu'à 50 mg/L. 25 2) Détermination du sucre Une fois l'indicateur coloré choisi, les inventeurs ont pu déterminer quel sucre était le plus adapté à la présente invention. Le mélibiose a donné des résultats variables, du fait de la consommation variable de ce sucre par E faechen. Ce sucre ne peut donc pas être utilisé pour isoler 10 les E hirae. Concernant le raffinose, le test n'a pas été concluant car aucun changement de couleur des colonies de E faecalis et E. faeckim n'a pu être observé. Enfin, le dernier sucre testé a été le mannitol. Pour ce sucre, les inventeurs 5 ont constaté qu'il y avait bien un changement de couleur du milieu et des colonies pour E faecalis et E. faecium, mais pas pour celles d'E hirae qui sont restées incolores. Les inventeurs ont donc choisi le mannitol comme sucre pour la formulation de la dite invention, à une concentration de 10 g/L, concentration fréquemment retrouvée dans les milieux de culture [12]. 10 Mélibiose Raffinose Mannitol Enterococcus hirae Enterococcus faecalis Enterococcus faeckim + - + - - V _ + + Tableau 1 : Consommation des sucres par les 3 entérocoques étudiés De plus, il a été montré dans la littérature que certaines souches d'entérocoques - Enterococcus casselfflavus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présentes en quantité comparable à E hirae. Etant 15 donné que les bactéries appartenant au genre Enterococcus sont dans l'ensemble sensibles et résistantes aux mêmes inhibiteurs, les inventeurs ont recherché la consommation des sucres pour ces différents entérocoques. Il s'est avéré qu'ils consommaient tous le mannitol (cf tableau 2). Il est donc possible de distinguer E hirae parmi ces entérocoques. 20 Mannitol Enterococcus hirae Enterococcus casselfflavus Enterococcus gallinarum - + + Enterococcus raffinosus Tableau 2 : Consommation du mannitol par les espèces d'entérocoques présents en quantité comparable à E. hirae dans les selles. Ledit milieu de culture comprend également une source de vitamines, de sels essentiels et de composés azotés par la présence d'extrait de viande de boeuf [13] à 5 la concentration de 1 g/L et la protéose-peptone ajoutée à 10 g/L à ladite invention qui permet d'apporter des acides aminés et des peptides (source d'énergie et de carbone). Aucun autre élément nutritif n'a été apporté à la présente invention car l'objectif est que E. faecalis et E. faecium se servent en priorité du sucre, le mannitol, comme source de nutrition pour permettre leur croissance. Ces sources ne peuvent 10 cependant pas être supprimées puisque E. hirae, n'utilisant pas le sucre sélectionné comme source d'énergie, a besoin de nutriments pour croitre. Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. 15 Un milieu de culture permettant la sélection des Enterococcus hirae selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L d'eau. Exemple A: - Protéose-peptone : 10 g (1%) 20 - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azide de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) 25 - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) - Agar : 15 g (1,5%) Tous les composés de ce milieu sont référencés chez Sigma-Aldrich. 11 + Plus particulièrement, on cultive un échantillon contenant une bactérie 12 Enterococcus hirae à une température de 37 °C durant 72 heures dans ledit milieu de culture de sélection d'Enterococcus hirae. Plus particulièrement encore, on réalise les étapes suivantes : - on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant 5 contenir Enterococcus hirae. Dans un premier temps, on effectue une série de six dilutions au dixième à partir d'une solution mère du prélèvement de départ. Cent microlitres de chacune des dilutions sont ensemencés sur une gélose, correspondant à la présente invention, et - au bout de 72 heures d'incubation à 37°C, on identifie que la bactérie 10 détectée non colorée est une bactérie de l'espèce Enterococcus hirae par une technique de spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF[15]. Un milieu de culture d'Enterococcus hirae selon l'invention permet de sélectionner E hirae au bout de 72 heures. Aux exemples 1 à 3 ci-après, on fournit des résultats de l'ensemencement 15 d'une série de six dilutions de divers échantillons contenant trois entérocoques - E hirae, E faecalis et E faecium - sur un milieu de culture solide selon la présente invention, au bout de 72 heures d'incubation à 37 °C. Mode opératoire : Dans les 3 exemples, on réalise une série de six dilutions de 10-1 à 10-6 d'un 20 échantillon de départ comme suit : - à l'exemple 1, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae, d'une souche d'Enterococcus faecalis et d'une souche d'Enterococcus faecium, ont été mélangées dans un millilitre de PBS (Phosphate Buffered Saline), - à l'exemple 2, une selle est artificiellement enrichie en E hirae, une 25 colonie d'une souche d'Enterococcus hirae a été mélangée dans un millilitre de PBS avec l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle, à savoir environ 0,15 g, et - à l'exemple 3, l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g que l'on sait riche en E hirae a été 30 mélangé dans un millilitre de PBS. 13 Pour réaliser ces dilution, les inventeurs ont préparé six tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS et, à partir du tube mère, contenant les colonies et le cas échéant les échantillons de selles, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres 5 de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir six dilutions de 10-1 à 10-6. Puis, on réalise l'ensemencement de 100 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple A ci-dessus, de la série des six dilutions et on observe le résultat après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 °C pendant 72 heures. Io Pour les 3 exemples, on observe l'apparition de colonies jaunes pour E faeckim et E faecalis et de colonies transparentes pour E hirae. Les colonies isolées sont les plus visibles sur les dilutions 10-5 et 10-6. Les autres dilutions sont trop concentrées en bactéries pour que l'on puisse observer des colonies isolées et ainsi bien distinguer Enterococcus hirae des autres entérocoques pour l'analyse de la 15 richesse en Enterococcus hirae de la selle testée. 14 REFERENCES 1. Aguilar-Galvez A, Dubois-Dauphin R, Destain J, Campos D, Thonart P. 5 Les entérocoques : avantages et inconvénients en biotechnologie (synthèse bibliographique). Biotechnologie. Agronomie. Société. Environnement. 2012 16(1), 67-76 2. Bourafa N, Loucif L, Boutefnouchet N and Rolain J-M. Enterococcus hirae, an unusual pathogen in humans causing urinary tract infection in a patient lo with benign prostatic hyperplasia: first case report in Algeria. New Microbe and New Infect. 2015; 8: 7-9 3. Rodier J, Legube B, Merlet N, Brunet R. L'analyse de l'eau - 10e éd.: Eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer. In : Dunod, editor. 2016 p 611 4. Maheux A, Bouchard S, Bérubé E and Bergeron M. Rapid molecular 15 identification of fecal origin-colonies growing on Enterococcus spp.-specific culture methods. Journal of water and health. 2017; doi: 10.2166/wh.2016.199 5. Daillère R et al. Enterococcus hirae and Barnesiella intestinihominis Facilitate Cyclophosphamide-Induced Therapeutic Immunomodulatory 20 Effects. Immunity. 2016 ; 45 : 931-943 6. Savini V, Bonfini T, Marrollo R, Argentieri AV, Riccioni S, Astolfi D, Fazii P, D'Antonio D, Gherardi G. Enterococcus hirae: a zoonotic microorganism in human umbilical cord blood. World Journal of Microbiology and Biotechnology. April 2014; 30(4):1423-6 25 7. Zhanel G, Hoban D and Karlowsky J. Nitrofurantoin Is Active against Vancomycin-Resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. January 2001; 45(1): 324-326. 8. Pinto B, Pierotti R, Canale G, Reali D. Characterization of 'faecal streptococci' as indicators of faecal pollution and distribution in the 30 environment. Letters in Applied Microbiology. October 1999; 29(4):258-63 15 9. Berger S. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria: 2017 edition. In : GIDEON Informatics Inc, editor. 2017 p 761-782 10. Devriese L, Van De Kerckhove A, Kilpper-Bâlz R, Schleifer K. Characterization and Identification of Enterococcus Species Isolated 5 from the Intestines of Animais. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. July 1987; 37: 257-259 11. Schleifer K, Kilpper-Bâlz R. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faechen to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faechen comb. nov. 10 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. January 1984; 34: 31-34 12. Les milieux de culture en microbiologie [Internet]. Disponible sur : http ://www2.ac-Iyon .fr/enseigne/biotech/microbio/mi lieux. html 13. Extrait de viande de boeuf [Internet]. Disponible sur : 15 http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU606_FR.pdf 14. Leclercq R. Faut-il identifier les entérocoques, et comment ? La Lettre de l'Infectiologue - Tome )(N/I - n° 7 - septembre 2001 15. Seng P, Abat C, Rolain JM, Colson P, Lagier J-C, Gouriet F, Pierre Edouard Fournier, Michel Drancourt, Bernard La Scola and Didier Raoult. 20 Identification of rare pathogenic bacteria in a clinical microbiology laboratory: Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. J Clin Microbiol. 2013; 51(7):2182 REVENDICATIONS1. Milieu de culture solide spécifique pour la culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend : - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol. 2. Milieu de culture spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce que le 15 pH dudit milieu de culture spécifique est de 7,3 +/- 0,2 et 'Indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol. 3. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 g/L de mannitol. 4. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé 20 en ce qu'il comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins 10 g/L 5. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L. 25 6. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50 mg/L. 17 7. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux métalliques et des composés azotés. 8. Milieu de culture spécifique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés : - un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone. 9. Milieu de culture spécifique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il 10 comprend : - un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L. 10. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et 15 agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. 11. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques : 20 - du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20 g/L, et - de l'azoture de sodium, et - de l'acide nalidixique. 12. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend les composants suivants, de préférence dans les 25 quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L: -Protéose-peptone 10 g (1%) -Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%) -Chlorure de sodium : 60 g (6%) -Mannitol 10 g (1%) 18 5 -Azoture de sodium : -Cycloheximide : -Acide nalidixique -Pourpre de bromocrésol : -Agar : 0,15 g (0,015%) 0,05 g (0,005%) 0,25 g (0,025%) 0,05 g (0,005%) g (1,5%) 13. Procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37°C durant un 10 temps suffisant pour faire apparaitre une coloration de bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae par ledit colorant dans undit milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 12. 14. Procédé de culture selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'on sélectionne une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé comprenant 15 d'autres bactéries choisies parmi E faecalls, E. faecium, E. casselifla vus, E. gallinarum et E. raffinosus. 15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes : a) on effectue une série de plusieurs dilutions du prélèvement de départ, de 20 préférence d'au moins 10-5 à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à 0,50 g/mL de tampon PBS, et b) un échantillon de chacune des dilutions est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide, de préférence d'un échantillon de 100 microlitres de selle diluée sur le dit milieu de culture spécifique solide, et 25 c) au bout de 72 heures d'incubation à 37°C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identificatiaq par 30 spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.