FR 3074682 A1 20190614 FR 1761808 A 20171207 COMPOSITIONS SOUS FORME D'UNE SOLUTION AQUEUSE INJECTABLE COMPRENANT DE L'AMYLINE, UN AGONISTE AU RECEPTEUR DE L'AMYLINE OU UN ANALOGUE D'AMYLINE ET UN CO-POLYAMINOACIDE [0001] L'invention concerne les thérapies par injection d'amyline, d'agoniste au récepteur de l'amyline ou d'analogue d'amyline pour traiter le diabète. [0002] L'invention concerne une composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins de l'amyline, un agoniste au récepteur de l'amyline ou un analogue d'amyline et un copolyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes selon l'invention et des compositions comprenant en outre une insuline (à l'exclusion des insulines basales dont le point isoélectrique pI est compris entre 5,8 et 8,5). L'invention concerne également des formulations pharmaceutiques comprenant les compositions selon l'invention. Enfin, l'invention se rapporte également à une utilisation des co-polyaminoacides porteurs de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes selon l'invention pour stabiliser des compositions d'amyline, d'agoniste au récepteur de l'amyline ou d'analogue d'amyline ainsi que des compositions d'amyline, d'agoniste au récepteur de l'amyline ou d'analogue d'amyline comprenant en outre une insuline. [0003] Le diabète de type 1 est une maladie autoinnmune conduisant à la destruction des cellules béta du pancréas. Ces cellules sont connues pour produire l'insuline dont le rôle principal est de réguler l'utilisation du glucose dans les tissus périphériques (Gerich 1993 Control of glycaemia). Par conséquent, les patients atteints de diabète de type 1 souffrent d'hyperglycémie chronique et doivent s'administrer de l'insuline exogène afin de limiter cette hyperglycémie. L'insulinothérapie a permis de changer drastiquennent l'espérance de vie de ces patients. Cependant, le contrôle de la glycémie assuré par l'insuline exogène n'est pas optimal, en particulier après la prise d'un repas. Ceci est lié au fait que ces patients produisent du glucagon après la prise d'un repas, ce qui conduit au déstockage d'une partie du glucose stocké dans le foie, ce qui n'est pas le cas chez la personne saine. Cette production de glucose médiée par le glucagon aggrave le problème de régulation de la glycémie de ces patients. [0004] Il a été démontré que l'amyline, une autre hormone produite par les cellules béta du pancréas et donc également déficiente chez les patients diabétiques de type 1, joue un rôle clé dans la régulation de la glycémie post-prandiale. L'amyline, 2 aussi connu sous le nom de « islet annyloid polypeptide » ou IAPP, est un peptide de 37 annino acides qui est co-stocké et co-sécrété avec l'insuline (Schmitz 2004 Amylin Agonists). Ce peptide est décrit pour bloquer la production du glucagon par les cellules alpha du pancréas. Ainsi, l'insuline et l'amyline ont des rôles complémentaires 5 et synergétiques, puisque l'insuline permet de réduire la concentration de glucose dans le sang alors que l'amyline permet de réduire l'entrée de glucose endogène dans le sang en inhibant la production (sécrétion) du glucagon endogène. [0005] Cette problématique de régulation de la glycémie post-prandiale est assez similaire pour les patients atteints de diabète de type 2 traités par l'insuline dans la 10 mesure où leur maladie a conduit à une perte très significative de leur masse de cellules béta et par conséquent, de leur capacité de production d'insuline et d'amyline. [0006] L'amyline humaine a des propriétés qui ne sont pas compatibles avec les exigences pharmaceutiques en termes de solubilité et de stabilité (Goldsbury CS, Cooper GJ, Goldie KN, Muller SA, Saafi EL, Gruijters WT, Misur MP, Engel A, Aebi U, 15 Kistler 3 : Polymorphic fibrillar assembly of human amylin. J Struct Biol 119:17-27, 1997). L'amyline est connue pour former des fibres amyloides qui conduisent à la formation de plaques qui sont insolubles dans l'eau. Bien qu'étant l'hormone naturelle, il a été nécessaire de développer un analogue afin de résoudre ces problèmes de solubilité. 20 [0007] Les propriétés physico-chimiques de l'amyline rendent ainsi son utilisation impossible : l'amyline n'est stable qu'une quinzaine de minutes à pH acide, et moins d'une minute à pH neutre. [0008] La société Amylin a développé un analogue de l'amyline, le pramlintide, pour pallier le manque de stabilité de l'amyline humaine. Ce produit commercialisé 25 sous le nom de Symlin a été approuvé en 2005 par la FDA pour le traitement des diabétiques de type 1 et de type 2. Il doit être administré par voie sous cutanée trois fois par jour, dans l'heure précédant le repas afin d'améliorer le contrôle de la glycémie post-prandiale. Ce peptide est formulé à pH acide et est décrit pour fibriller lorsque le pH de la solution est supérieur à 5,5. Des variantes d'analogues sont 30 décrites dans le brevet US 5,686,411. [0009] Cet analogue n'est ainsi pas satisfaisant sur le plan de la stabilité lorsqu'une formulation à pH neutre est envisagée. [00010] A ce jour, il n'existe aucun moyen permettant de stabiliser l'amyline humaine afin d'en faire un produit pharmaceutique. Or, il serait avantageux pour les 35 patients d'avoir accès à la forme humaine de cette hormone physiologique. Il serait également avantageux de pouvoir formuler un analogue ou un agoniste de récepteur d'amyline à pH neutre. 3 [00011] De plus, il y aurait un intérêt à pouvoir mélanger en solution aqueuse l'amyline, un analogue de l'amyline, ou un agoniste de récepteur à l'amyline, avec une insuline prandiale puisque ces deux produits sont à administrer avant le repas. Cela permettrait d'ailleurs de mimer la physiologie puisque ces deux hormones sont co- 5 sécrétées par les cellules béta en réponse à un repas afin d'améliorer le contrôle de la glycémie post-prandiale. [00012] Or, compte tenu du fait que les solutions d'insulines prandiales ont un pH proche de la neutralité pour des raisons de stabilité chimique, il n'est pas possible d'obtenir une solution aqueuse répondant aux exigences pharmaceutiques en termes 10 de solubilité et de stabilité. [00013] Pour cette raison, la demande de brevet U52016/001002 de la société ROCHE décrit une pompe contenant deux réservoirs séparés afin de rendre possible la co-administration de ces deux hormones avec un seul dispositif médical. Cependant, ce brevet ne résout pas le problème du mélange de ces deux hormones en solution qui 15 permettrait de les administrer avec les pompes conventionnelles déjà sur le marché qui ne contiennent qu'un réservoir. [00014] La demande de brevet W02013067022 de la société XERIS apporte une solution au problème de stabilité de l'amyline et de sa compatibilité avec l'insuline en employant un solvant organique à la place de l'eau. L'absence d'eau semble résoudre 20 les problèmes de stabilité mais l'utilisation d'un solvant organique pose des problèmes de sécurité d'utilisation chronique pour les patients diabétiques et également des problèmes de compatibilité avec les dispositifs médicaux usuels, au niveau des tubulures, des joints et des plastifiants employés. [00015] La demande de brevet W02007104786 de la société NOVO NORDISK 25 décrit une méthode permettant de stabiliser une solution de pramlintide, qui est un analogue de l'amyline, et d'insuline par l'ajout d'un phospholipide, dérivé de glycérophosphoglycérol, en particulier le dimyristoyl glycérophosphoglycérol (DMPG). Or, cette solution requiert l'emploi de quantités importantes de DMPG qui peuvent poser un problème de tolérance locale. 30 [00016] A la connaissance de la demanderesse, il n'existe pas de moyen satisfaisant qui permette de combiner en solution aqueuse une insuline prandiale et l'amyline humaine, un agoniste de récepteur d'amyline ou un analogue de l'amyline afin de pouvoir être administrée avec des dispositifs conventionnels. 35 [00017] Le pH de formulation acide et la fibrillation rapide sont des freins pour obtenir une formulation pharmaceutique à pH neutre à base d'annyline et de pramlintide, mais aussi un frein pour combiner l'amyline ou le pramlintide à d'autres ingrédients pharmaceutiques actifs, en particulier des peptides ou des protéines. 4 [00018] La demanderesse a remarqué que, de manière surprenante, les co- polyarninoacides selon l'invention stabilisent des compositions d'amyline, d'agoniste au récepteur de l'amyline ou d'analogue d'amyline à un pH compris entre 6 et 8. En effet, 5 des compositions comprenant de l'amyline, un agoniste au récepteur de l'amyline ou un analogue d'amyline en combinaison avec un co-polyaminoacide selon l'invention présentent une stabilité accrue dans le temps, ce qui est d'un grand intérêt pour le développement pharmaceutique. 10 [00019] La demanderesse a également constaté que les co-polyaminoacides selon l'invention permettent en outre d'obtenir une composition comprenant de l'insuline prandiale et de l'amyline, agoniste au récepteur de l'amyline ou analogue d'amyline, ladite composition étant limpide et ayant une stabilité à la fibrillation améliorée. 15 [00020] Une méthode classique pour mesurer les stabilités des protéines ou peptides consiste à mesurer la formation de fibrilles à l'aide de Thioflavine T, encore appelée ThT. Cette méthode permet de mesurer dans des conditions de température et d'agitation qui permettent une accélération du phénomène, le temps de latence avant la formation de fibrilles par mesure de l'augmentation de la fluorescence. Les 20 compositions selon l'invention ont un temps de latence avant la formation de fibrilles nettement supérieur à celui de l'amyline, d'un agoniste au récepteur de l'amyline ou d'un analogue d'amyline au pH d'intérêt. [00021] Les compositions selon l'invention présentent une stabilité physique, et 25 éventuellement chimique, satisfaisante au pH désiré. [00022] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins : 30 a) de l'amyline , un agoniste au récepteur de l'amyline ou un analogue d'amyline ; b) un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy, ledit co-polyaminoacide étant constitué d'unités glutamiques ou aspartiques et lesdits radicaux hydrophobes -Hy choisi parmi les radicaux de formule X telle que définie ci-dessous : *--(GpRHGpG GpA (GpL GpH)h GpC I II a' Formule X r a 35 dans laquelle 5 GpR est choisi parmi les radicaux de formules VII, VII' ou VII" : 0 H H I I *-N-R-N-* Formule VII ou * RN* 0 0 *-11-R-11-* Formule VII"; 5 Formule VII' ou GpG et GpH identiques ou différents sont choisis parmi les radicaux de formules XI ou XI': 0 *- NH-G-- NH- Formule XI' * II H G N * Formule XI 10 - GpA est choisi parmi les radicaux de formule VIII *- NH- Formule VIII Dans laquelle A' est choisi parmi les radicaux de formule VIII',VIII" ou VIII" A CO A1-N A2 Af-N- A2 -N A3 15 Formule VIII' Formule VIII" Formule VIII' -GpL est choisi parmi les radicaux de formule XII HN-* II* A/ HN-* Formule XII, 20 GpC est un radical de formule IX : Formule IX; 6 - les * indiquent les sites de rattachement des différents groupes liés par des fonctions amides ; - a est un entier égal à 0 ou à 1 et a' = 1 si a = 0 et a' = 1, 2 ou 3 si a = 1 ; - a' est un entier égal à 1, à 2 ou à 3 5 b est un entier égal à Cou à 1 - - c est un entier égal à 0 ou à 1, et si c est égal à 0 alors d est égal à 1 ou à 2; - d est un entier égal à 0, à 1 ou à 2 ; - e est un entier égal à 0 ou à 1 - g est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6; 10 - h est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6, et au moins un des g, h ou I est différent de 0; - I est un entier égal à 0 ou 1 et l' = 1 si I = 0 et l' = 2 si I = 1 ; - r est un entier égal à Cou à 1, et - s' est un entier égal à 0 ou 1 ; 15 - A, Ai, Az et A3 identiques ou différents sont des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes de carbone; - B est un radical alkyle linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant un noyau aromatique, comprenant de 1 à 9 atomes de carbone ; - Cx est un radical alkyl monovalent linéaire ou ramifié, dans lequel x indique le 20 nombre d'atomes de carbone et : ^ Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 1 -GpC, alors 9 faisant référence à l'injection ( ) (faisant référence à selon USP 35 et précisé dans selon USP 35 et dans 20 , et USP 38 (à partir du ler aout 2014), selon USP 38). Dans la pharmacopée européenne, les solutions injectables doivent remplir les critères donnés dans les sections 2.9.19 et 2.9.20. 25 [00087] Dans un mode de réalisation, la composition est caractérisée en ce que le co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est choisi parmi les co-polyaminoacides de formule XXX suivante : 0 Hy formule XXX 22 D représente, indépendamment, soit un groupe -CH2- (unité aspartique) soit un groupe -CH2-CH2- (unité glutamique), Hy est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes de formules X, Ri est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes de formules X dans lesquelles r=0 ou r=1 et GpR est un radical de Formule VII', ou un radical choisi dans le groupe constitué par un H, un groupe acyle linéaire en C2 à C10, un groupe acyle ramifié en C3 à C10, un benzyle, une unité « acide aminé » terminale et un pyroglutamate, R2 est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes de formules X ou un radical -NR'R", R' et R" identiques ou différents étant choisis dans le groupe constitué par H, les alkyles linéaires ou ramifiés ou cycliques en C2 à C10, le benzyle et lesdits R' et R" alkyles pouvant former ensemble un ou des cycles carbonés saturés, insaturés et/ou aromatiques et/ou pouvant comporter des hétéroatomes, choisis dans le groupe constitué par 0, N et S, X représente un H ou une entité cationique choisie dans le groupe comprenant les cations métalliques ; - n + m représente le degré de polymérisation DP du co-polyaminoacide, c'est-à-dire le nombre moyen d'unités monomériques par chaîne de copolyaminoacide et 5 5 n + m Molécule 13 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 12 et la N-Boc éthylènediamine. [000350] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 et appliqué à la molécule 12 (15,5 g, 33,05 mmol) et à la BocEDA (5,83 g, 36,36 5 mmol), un solide blanc de la molécule 13 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 19,8 g (83 °h) 10 LC/MS (ESI+) : 611,4 (calculé ([M+H]+) : 611,4). Molécule A3 15 [000351] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule A2 et appliqué à la molécule 13 (16,8 g, 27,50 mmol), un solide blanc de la molécule A3 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 13,5 g (90 0/0) 20 RMN 11-1 (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,52 (22H) ; 1,70-2,37 (10H) ; 2,80-2,90 (2H) ; 3,22-3,62 (4H) ; 3,57 (3H) ; 4,15-4,28 (1,75H) ; 4,41-4,44 (0,25H) ; 7,81- 8,13 (4,5H) ; 8,24-8,29 (0,25H) ; 8,33-8,39 (0,25H). LC/MS (ESI+) : 511,3 (calculé ([M+H]) : 511,4). 25 Exemple A4: Molécule A4 Molécule 14 : Produit obtenu par la réaction entre le chlorure de lauroyle et la Lproline [000352] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 11 et appliqué à au chlorure de lauroyle (27,42 g, 685,67 mmol) et à la L-proline 30 (60,0 g, 247,27 mmol), un solide blanc de la molécule 14 est obtenu. Rendement : 78,35 g (96 °/0) RMN 11-1 (CDCI3, ppm) : 0,87 (3H) ; 1,26 (16H) ; 1,70 (2H) ; 1,90-2,10 (3H) ; 2,35 (2H) ; 2,49 (1H) ; 3,48 (1H) ; 3,56 (1H) ; 4,60 (1H). LC/MS (ESI+) : 298,1 (calculé ([M+H]) : 298,2). RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,07-1,55 (22H) ; 1,37 (9H) ; 1,69-2,19 (7H) ; 2,22-2,36 (3H) ; 2,91-3,17 (4H) ; 3,28-3,60 (5H) ; 4,11-4,18 (0,7H) ; 4,20-4,28 (1H) ; 4,38-4,42 (0,3H) ; 6,74 (1H) ; 7,64 (0,7H) ; 7,87 (0,7H) ; 7,98 (0,3H) ; 8,22 (0,3H). 35 51 Molécule 15 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 14 et le L-glutamate de méthyle. [000353] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 8 et appliqué à la molécule 14 (34,64 g, 116,46 mmol) et au L-glutamate de méthyle 5 (19,14 g, 118,79 mmol), un solide blanc de la molécule 15 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 37,28 g (73 0/0) RMN 1H (CDCI3, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,42 (16H) ; 1,54-1,06 (2H) ; 1,80-2,47 (10H) ; 3,42-3,80 (2H) ; 3,65 (2,55H) ; 3,67 (0,45H) ; 4,37-4,40 (0,15H) ; 4,51-4,58 10 (0,85H) ; 4,58-4,67 (1H) ; 7,26 (0,15H) ; 7,65 (0,85H) ; 8,06 (1H). LC/MS (ESI+) : 441,1 (calculé ([M+H]) : 441,3). Molécule 16 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 15 et la N-Boc éthylènediamine. 15 [000354] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 et appliqué à la molécule 15 (37,30 g, 84,66 mmol) et à la BocEDA (14,92 g, 93,13 mmol), un solide blanc de la molécule 16 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 43,10 g (87 °/0) 20 RMN 11-1 (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,53 (18H) ; 1,37 (9H) ; 1,70-2,36 (10H) ; 2,91-3,60 (9H) ; 4,11-4,18 (0,7H) ; 4,21-4,28 (1H) ; 4,38-4,42 (0,3H) ; 6,38 (0,1H) ; 6,74 (0,9H) ; 7,65 (0,7H) ; 7,87 (0,7H) ; 7,99 (0,3H) ; 8,22 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 583,4 (calculé ([M+H]) : 583,4). 25 Molécule A4 [000355] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule A2 et appliqué à la molécule 16 (43,10 g, 73,96 mmol), un solide blanc de la molécule A4 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. 30 Rendement : 31,90 g (83 %) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,05-1,37 (16H) ; 1,39-1,52 (2H) ; 1,70-2,37 (10H) ; 2,29-2,91 (2H) ; 3,20-3,62 (7H) ; 4,16-4,29 (1,7H) ; 4,42-4,46 (0,3H) ; 7,86-8,18 (4,6H) ; 8,32 (0,3H) ; 8,40 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 483,2 (calculé ([M+H]) : 483,3). 35 52 Exemple AS : molécule AS Molécule 17 : Produit obtenu par la réaction entre la 1-amino-4,7,10-trioxa-13- tridécane amine et le tert-butyl phénylcarbonate. [000356] À une solution de 1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridécane amine (112,29 g, 5 509,71 mmol) dans l'éthanol (510 mL) à 80 °C est ajouté au goutte à goutte du tert- butyl phénylcarbonate (49,50 g, 254,86 mmol). Le milieu réactionnel est agité à 80 °C pendant 3 h 30 puis concentré sous pression réduite. Le résidu est solubilisé dans de l'eau (250 mL), le pH est ajusté à 2,3 avec une solution de HCI 37 % et le mélange est extrait au nnéthyl tert-butyléther (MTBE, 2 x 150 mL). La phase aqueuse est basifiée à 10 pH 12,6 par addition d'une solution de NaOH 2 N et extraite au DCM (3 x 250 mL). La phase organique est lavée avec une solution aqueuse de NaOH 1 N (1 x 100 mL), une solution aqueuse saturée en NaCI (100 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Une huile jaune de molécule 17 est obtenue. Rendement : 54,4 g (67 0/0) 15 RMN 1F1 (CDCI3, ppm) : 1,40-1,58 (11H) ; 1,73-1,81 (4H) ; 2,80-2,84 (2H) ; 3,20- 3,70 (14H) ; 5,11 (1H). LC/MS (ESI+) : 321,2 (calculé ([M+H]+) : 321,2). Molécule 18 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 12 et la molécule 17. 20 [000357] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 et appliqué à la molécule 12 (20,46 g, 43,66 mmol) et à la molécule 17 (16,79 g, 52,39 mmol), une cire blanche de la molécule 18 est obtenue après purification par chromatographie flash (éluant : DCM, méthanol), solubilisation du résidu dans le DCM (300 mL), lavages de la phase organique avec une solution aqueuse de NaHCO3 (2 x 25 150 mL), une solution aqueuse de HCI 10 % (2 x 150 mL), une solution aqueuse saturée en NaCI (2 x 150 mL), séchage sur Na2SO4 et concentration sous pression réduite. Rendement : 30,15 g (90 °/0) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,09-1,52 (31H) ; 1,55-1,67 (4H) ; 1,69-2,36 30 (10H) ; 2,91-2,98 (2H) ; 3,02-3,17 (2H) ; 3,28-3,61 (17H) ; 4,12-4,17 (0,7H) ; 4,20- 4,28 (1H) ; 4,39-4,42 (0,3H) ; 6,37 (0,1H) ; 6,71 (0,9H) ; 7,59 (0,7H) ; 7,85 (0,7H) ; 7,94 (0,3H) ; 8,21 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 771,4 (calculé ([M+H]) : 771,5). 35 Molécule AS [000358] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule A2 et appliqué à la molécule 18 (30,0 g, 38,91 mmol), un solide blanc de la molécule 53 A5 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après solubilisation du résidu dans l'eau (500 mL) et lyophilisation. Rendement : 25,2 g (91 9/0) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,06-1,37 (20H) ; 1,39-1,52 (2H) ; 1,58-1,66 5 (2H) ; 1,70-2,37 (12H) ; 2,78-2,85 (2H) ; 3,01-3,15 (2H) ; 3,31-3,62 (17H) ; 4,11- 4,17 (0,7H) ; 4,19-4,27 (1H) ; 4,41-4,44 (0,3H) ; 7,63-7,71 (0,7H) ; 7,90-8,24 (4H) ; 8,28-8,35 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 671,4 (calculé ([M+H]+) : 671,5). 10 Exemple A7 : molécule A7 Molécule 21 : Produit obtenu par couplage entre la molécule 11 et la L-lysine. [000359] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 8 appliqué à la molécule 11 (133,00 g, 408,61 mmol) et à la L-lysine (31,36 g, 214,52 mmol), un solide blanc de molécule 21 est obtenu après cristallisation 2 fois dans 15 l'acétone. Rendement : 106,50 g (68 °h) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (6H) ; 1,26 (40H) ; 1,35-1,50 (6H) ; 1,50-2,10 (10H) ; 2,10-2,25 (4H) ; 3,01 (2H) ; 3,31-3,55 (4H) ; 4,10-4,40 (3H) ; 7,68 (0,6H) ; 7,97 (1H) ; 8,27 (0,4H) ; 12,50 (1H). 20 LC/MS (ESI): 761,8 ; (calculé ([M+H]): 762,1). Molécule 22 : Produit obtenu par couplage entre la molécule 21 et la L-lysinate de méthyle. [000360] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 25 10 appliqué à la molécule 21 (43,00 g, 56,50 mmol) en solution dans le THF et au chlorhydrate de L-Iysinate de méthyle (20,12 g, 67,79 mmol), un solide transparent de molécule 22 est obtenu et utilisé sans purification complémentaire. Rendement : 55,80 g (98 0/0) 30 8,26 (0,4H). LC/MS (ESI) : 1003,8 (calculé ([M+H]+) : 1003,8). RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,86 (6H) ; 1,08-2,03 (64H) ; 1,37 (9H) ; 2,07-2,30 (4H) ; 2,84-3,09 (4H) ; 3,29-3,57 (4H) ; 3,58-3,65 (3H) ; 4,14-4,43 (4H) ; 6,40 (0,1H) ; 6,74 (0,9H) ; 7,69 (0,6H) ; 7,82 (0,6H) ; 7,95-8,06 (1H) ; 8,11-8,20 (0,4H) ; 35 54 Molécule 23 : Produit obtenu par saponification de la molécule 23. [000361] Une solution de molécule 22 (55,80 g, 55,61 mmol) dans un mélange THF/eau 1:1 (370 mL) à 0 °C est traitée par addition lente d'une solution de LiOH (2,00 g, 83,41 mmol) dans l'eau (185 mL). Après 16 h d'agitation à 0 °C, le milieu est 5 concentré sous pression réduite et le résidu est repris dans l'eau (500 mL). Du DCM (500 mL) est ajouté, le mélange hétérogène est refroidi à 10 °C et acidifié par ajout d'une solution aqueuse de HCI 10 °h jusqu'à pH 1. La phase aqueuse est extraite au DCM (2 x 300 mL), les phases organiques combinées sont lavées par une solution aqueuse saturée en NaCI (2 x 300 mL), séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées 10 sous pression réduite. Un solide blanc de molécule 23 est obtenu après cristallisation dans l'acétone. Rendement : 46,10 g (84 0/0) RMN 1H (pyridine-d6, ppm) : 0,85 (6H) ; 1,05-2,03 (67H) ; 2,07-2,61 (10H) ; 3,12- 3,93 (8H) ; 4,54-4,93 (2H) ; 4,98-5,16 (2H) ; 7,35-7,45 (1H) ; 8,34-8,63 (1H) ; 15 8,94-9,41 (2H). LC/MS (ESI) : 989,8 (calculé ([M+H]) : 989,8). Molécule A7 [000362] À une solution de la molécule 23 (12,00 g, 12,13 mmol) dans le 20 dichlorométhane (40 mL) à 0 °C est ajoutée une solution de HCI 4 N dans le dioxane (15,20 mL) puis le milieu est agité pendant 15 h à 0 °C et 5 h température ambiante. Le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite, le résidu est solubilisé dans un mélange de DCM (120 mL) et de NaOH 2 N (60 mL). Après séparation des phases, la phase organique est lavée par une solution de NaOH 2 N (60 mL), séchée 25 sur Na2SO4 et concentrée sous pression réduite. Rendement : 10,90 g (98 °/0) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,86 (6H) ; 1,05-2,27 (70H) ; 2,45-2,52 (2H) ; 2,90-3,58 (6H) ; 3,67-3,76 (1H) ; 4,02-4,10 (0,6H) ; 4,11-4,17 (0,4H) ; 4,20-4,26 (0,6H) ; 4,30-4,39 (1H) ; 4,42-4,46 (0,4H) ; 7,29-7,42 (1H) ; 7,71-7,80 (0,6H) ; 7,97-8,05 30 (0,6H) ; 8,10-8,24 (0,4H) ; 8,33-8,45 (0,4H). LC/MS (ESI) : 887,7 (calculé ([M-H]-) : 887,7) Partie B - Synthèse des co-polyaminoacides hydrophobes co- structure polyaminoacide B1 = 0,038, DP = 26 Ri = H ou pyroglutamate B2 3: o H = 0,15 , DP (m + n) = 40 Hy = Ala0 0 ''Ci3H27 ONa = H ou pyroglutamate 56 B3 Hy 1= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = 0 0 ONa Ri = H ou pyroglutamate B4 i= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = C111-123 Ri = H ou pyroglutamate 57 Co-polyaminoacide Bi: poly-L-glutamate de sodium modifié à une de ses extrémités par la molécule Al et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 2800 g/mol 5 [000363] Dans un ballon préalablement séché à l'étuve, du y-benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride (8,95 g, 34 mmol) est solubilisé dans du DMF anhydre (34 mL). Le mélange est refroidi à 4 °C, puis une solution de molécule Al (1,64 g, 1,55 mmol) dans le chloroforme (6,6 mL) est introduite rapidement. Le mélange est agité entre 4 °C et température ambiante pendant 68 h, puis chauffé à 65 °C pendant 2 h. La Hy i= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = NII. = H ou pyroglutamate C131-127 o NH 'NH = 0,038, DP = 26 Ri = H ou pyroglutamate B5 B7 58 moitié du solvant est distillé sous pression réduite puis le milieu réactionnel est refroidi à température ambiante et versé goutte à goutte dans du diisopropyléther (300 mL) sous agitation. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé avec du diisopropyléther (5 x 50 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C pour obtenir un 5 solide blanc. Le solide (7,9 g) est dilué dans du TFA (30 mL), et une solution d'acide bromhydrique (HBr) à 33 % dans de l'acide acétique (21 mL, 120 mnnol) est alors ajoutée au goutte à goutte à 0 °C. La solution est agitée pendant 2 h à température ambiante puis est coulée goutte à goutte sur un mélange 1:1 (v/v) de diisopropyléther/eau sous agitation (360 mL). Après 2 h d'agitation, le mélange 10 hétérogène est laissé au repos pendant une nuit. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé successivement avec de l'IPE (2 x 30 mL) puis avec de l'eau (2 x 30 mL). Le solide obtenu est solubilisé dans de l'eau (200 mL) en ajustant le pH à 7 par ajout d'une solution aqueuse de soude 1 N. De l'eau (65 mL) est ajoutée. Le mélange est filtré sur filtre 0,45 pm puis purifié par ultrafiltration contre une solution de NaCI 15 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perrnéat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de co-polyaminoacide est ensuite concentrée à environ 25 g/L théorique, le pH est ajusté à 7 et la solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm. Cette solution est diluée avec de l'eau et de l'acétone afin d'obtenir une solution à 12 g/L contenant 30 % massique d'acétone, puis elle est filtrée sur filtre de charbon actif (3M 20 R53SLP). L'acétone est distillée (40 °C, 100 mbar) et la solution est purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de copolyaminoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. 25 Extrait sec : 17,8 nngig DP (estimé d'après la RMN 1H) : 26 D'après la RMN 1H : i = 0,038 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B1 est de 4994 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 2800 g/mol 30 Co-polyaminoacide B2 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A2 dont les esters sont saponifiés et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 5200 g/mol Co-polyarninoacIck? 62-1 : acide poly-L-glutamique issu de la polymérisation du y- 35 benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride initiée par l'hexylamine [000364] Dans un réacteur à double enveloppe, du y-benzyl-L-glutamate N- carboxyanhydride (500 g, 1,90 mol) est solubilisé dans du DMF anhydre (1100 mL). Le mélange est alors agité jusqu'à complète dissolution, refroidi à 0 °C, puis de 59 l'hexylamine (6,27 mL, 47,5 mmol) est introduite rapidement. Le mélange est agité à 0 °C pendant 5 h, entre 0 °C et 20 °C pendant 7 h, puis à 20 °C pendant 7 h. Le milieu réactionnel est ensuite chauffé à 65 °C pendant 2 h, refroidi à 55 °C et du méthanol (3300 mL) est introduit en 1 h 30. Le mélange réactionnel est alors refroidi 5 à 0 °C et laissé sous agitation pendant 18 h. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé au diisopropyléther (2 x 800 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C pour donner un acide poly(gamma-benzyl-L-glutamique) (PBLG). A une solution de PBLG (180 g) dans du N,N-diméthylacétamide (DMAc, 450 mL) est ajouté du Pd/A1203 (36 g) sous atmosphère d'argon. Le mélange est placé sous 10 atmosphère d'hydrogène (10 bar) et agité à 60 °C pendant 24 h. Après refroidissement à température ambiante et filtration du catalyseur sur fritté P4 puis sur membrane Omnipore 0,2 pm PTFE hydrophile, une solution d'eau à pH 2 (2700 mL) est coulée goutte à goutte sur la solution de DMAc, sur une période de 45 min et sous agitation. Après 18 h sous agitation, le précipité blanc est récupéré par filtration, 15 lavé avec de l'eau (4 x 225 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C Co-polyaminoacide B2 [000365] Le co-polyanninoacide B2-1 (15,0 g) est solubilisé dans du DMF (230 mL) à 40 °C puis de la N-méthylnnorpholine (NMM, 11,57 g, 114,4 mmol) est ajoutée. En 20 parallèle, la molécule A2 sous forme de sel de chlorhydrate (10,17 g, 17,2 mmol) est mise en suspension dans du DMF (250 mL) et de la triéthylamine (2,39 mL, 17,2 mmol) est ajoutée, puis le mélange est légèrement chauffé sous agitation jusqu'à complète dissolution. À la solution de co-polyaminoacide, refroidie à 25 °C, sont successivement ajoutés la solution de molécule A2, de la N-oxyde de 2- 25 hydroxypyridine (HOPO, 3,81 g, 34,3 mmol) puis du N-(3-dimethylaminopropyI)-N'- ethylcarbodiimide (EDC, 6,58 g, 34,3 mmol). Le milieu réactionnel est agité à 25 °C pendant 2 h, filtré sur filtre tissé 0,2 mm et coulé au goutte-à-goutte sur 2,6 L d'eau contenant du NaCl à 15 % massique et du HCI (pH 2) sous agitation. A la fin de l'ajout, le pH est réajusté à 2 avec une solution de HCI 1 N, et la suspension est 30 laissée reposer une nuit. Le précipité est collecté par filtration, puis rincé par 2 x 100 mL d'eau. Le solide blanc obtenu est solubilisé dans 1,2 L d'eau par ajout lent d'une solution aqueuse de NaOH 1 N jusqu'à pH 7 sous agitation, puis la solution est filtrée sur filtre 0,45 pm. De l'éthanol (30 % massique) est ajouté puis la solution est filtrée sur filtre de charbon actif (3M R53SLP). Une solution de NaOH 10 N est lentement 35 ajoutée sous agitation jusqu'à pH 13 puis le mélange est laissé sous agitation pendant 2 h. Après neutralisation à pH 7 par ajout d'une solution de HCI 37 %, la solution limpide obtenue est purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau, jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de co-polyaminoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. Extrait sec : 22,6 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 5 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B2 est de 9301 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 5200 g/mol. Co-polyaminoacide B3 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule 10 A3 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 4900 g/mol [000366] Le co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g) est solubilisé dans du DMF (92 mL) à 40 °C puis de la N-méthylmorpholine (NMM, 9,25 g, 91,5 mmol) est ajoutée. En parallèle, une solution de la molécule A3 sous forme de sel de chlorhydrate (7,51 g, 15 13,7 mmol) et de N,N-diisopropylethylannine (DIPEA, 2,39 mL, 13,7 mmol) dans du DMF (27 mL) est préparée. À la solution de co-polyaminoacide refroidie à 25 °C, sont successivement ajoutés la solution de molécule A3 et de la N-oxyde de 2- hydroxypyridine (HOPO, 3,05 g, 27,4 mmol). Le mélange est refroidi à 0 °C puis du EDC (5,26 g, 27,4 mmol) est ajouté. Après 5 min à 0 °C, le milieu réactionnel est 20 agité à 25 °C pendant 2 h, filtré sur filtre tissé 0,2 mm et coulé au goutte-à-goutte sur 950 mL d'eau contenant du NaCI à 15 % massique et du HCI (pH 2) sous agitation. A la fin de l'ajout, le pH est réajusté à 2 avec une solution de HCI 1 N, et la suspension est laissée reposer une nuit. Le précipité est collecté par filtration, puis rincé par 3 x 100 rra_ d'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans 1 L d'eau par ajout lent d'une 25 solution aqueuse de NaOH 1 N jusqu'à pH 7 sous agitation. Une fois la solubilisation complète, le pH est ajusté à pH 12 pendant 2 h puis à pH 13 pendant 1 h par ajout d'une solution de NaOH 10 N. Après neutralisation à pH 7 par ajout d'une solution de HCI 37 0/0, cette solution est diluée avec de l'eau et de l'acétone afin d'obtenir une solution à 12 g/L contenant 30 % massique d'acétone, puis elle est filtrée sur filtre de 30 charbon actif (3M R53SLP). La solution obtenue est filtrée sur 0,45 pm et purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de copolyaminoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. 35 Extrait sec : 20,6 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B3 est de 8977 g/mol. 61 HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 4900 g/mol. Co-polyaminoacide B4 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A4 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre 5 (Mn) de 4700 g/mol [000367] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B3 appliqué au sel de chlorhydrate de la molécule A4 (7,12 g, 13,7 mmol) et au co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g), un poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A4 dont l'ester est saponifié est obtenu. 10 Extrait sec : 19,4 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B4 est de 8809 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 4700 g/mol. 15 Co-polyaminoacide B5 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A5 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 5400 g/mol [000368] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- 20 polyaminoacide B3 appliqué au sel de chlorhydrate de la molécule A5 (9,71 g, 13,7 mmol) et au co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g), un poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A5 dont l'ester est saponifié est obtenu. Extrait sec : 20,8 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 25 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B5 est de 9939 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 5400 g/mol. 30 Co-polyaminoacide B7 : poly-L-glutamate de sodium modifié à l'une de ses extrémités par la molécule A7 et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 2500 g/mol [000369] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B1 appliqué à la molécule A7 (2,50 g, 2,74 mmol) et à du y-benzyl-L- 35 glutamate N-carboxyanhydride (15,89 g, 60,4 mmol), un poly-L-glutamate de sodium modifié à l'une de ses extrémités par la molécule A7 est obtenu. Extrait sec : 20,3 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 26 62 D'après la RMN H : i = 0,038 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B7 est de 3893 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 2500 g/mol Partie C : Compositions [000370] Le glucagon utilisé est du glucagon humain issu d'un processus de synthèse peptidique. Il provient de la société Bachem (référence 4074733). Exemple Cl : Solution de Glucagon à 2 mg/mi.. [000371] Dans un tube Falcon de 50 mL est introduit 94,7 mg de glucagon DS en poudre suivi de 45 mL d'une solution d'acide chlorhydrique à 0,003 N contenant 2 mg/mL de L-méthionine. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions 15 répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 2 mg/mL est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). Exemple C2 : Solution de Glucauon à 4 rng/ml [000372] Du glucagon (160 mg) en poudre est introduit dans un tube falcon de 45 20 ml puis 40 mL de la solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,006 N contenant 2 mg/mL de L-méthionine est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 4 mg/mi est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). 25 Exemple CAO : Préparatio d'une solution de ulucauen à 1 mg/mL et contenant différents co-polvarninoacides de l'invention, un tampon phosphate (2 mM) et de la olvcérine à DI-1 7,2 [000373] Dans un flacon contenant des solutions concentrées d'excipients 30 (phosphate, glycérol (pour obtenir 300 nnOsmole/kg dans la formulation finale)) et potentiellement des additifs (m-crésol, citrate), est ajoutée une solution de copolyaminoacide. La composition est brièvement agitée jusqu'à dissolution du copolyaminoacide, puis la solution est filtrée sur membrane (0,22 pm). [000374] Le mélange équivolumique de cette solution avec la solution de glucagon 35 fraichement préparée, telle que décrite à l'exemple Cl, conduit aux compositions finales CA1 à CA20 contenant 1 mg/mL de glucagon. Le pH de la solution est ajusté à 5 10 63 pH 7,2 ± 0,1 par ajout de Na0H/HCI 1 N puis filtrée sur membrane (0,22prn). Le détail des compositions est récapitulé dans le tableau ci-dessous. Une inspection visuelle est effectuée pour déterminer si l'on obtient ou non une solution limpide (Par comparaison, la solution de glucagon à pH neutre n'est pas soluble au-delà de 0,2 mg/n1L). L'inspection visuelle des échantillons est effectuée afin de détecter les particules visibles, ou une turbidité. Cette inspection est réalisée selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne (EP 2.9.20) : les échantillons sont soumis à un éclairage d'au moins 2000 Lux et sont observés face à un fond blanc et un fond noir. Quand des particules sont visibles dans la moitié des échantillons la composition est estimée non limpide. Composition BC Concentration - Additifs Glycérol (mM) Aspect de co- Ratio molaire BC/Glu visuel polyaminoacides de la (711WmL) solution CA1 B3 3,43 1,33 290 limpide CA2 4,02 1,56 290 limpide CA3 3,61 1,4 10 mM 250 limpide citrate CA4 4,13 1,6 10 mM 250 limpide citrate CAS B2 6,95 2,6 10 mM 250 limpide citrate CA6 7,75 2,9 10 mM 250 limpide citrate CA7 7,75 2,9 294 limpide CA8 8,55 3,2 294 limpide CA9 9,62 3,6 294 limpide CA10 Bi 4,3 3 27 mM 259 limpide m- crésol_ CA11 7,2 5 27 mM 253 limpide m- crésol 64 Composition BC Concentration Ratio Additifs Glycerin Aspect visuel de la solution de co- BC/ Glu polyaminoacides (mg/mL) CA12 B3 2,58 1 290 limpide CA13 3,09 1,2 290 limpide CA14 2,58 1 10 mM 260 limpide citrate CA15 3,09 1,2 10 mM 260 limpide citrate CA16 B2 2,67 1 10 mM 260 limpide citrate CA17 3,20 1,2 10 mM 260 limpide citrate CA18 2,14 0,8 300 limpide CA19 2,67 1 300 limpide CA20 3,20 1,2 300 limpide Tableau 1 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 1 mg/mL à pH 7,2 à différentes concentrations en co-polyaminoacide contenant 2 mM de tampon phosphate et 1 mg/mL de L-méthionine. 5 Exemple CB0 : Préparation d'une solution de co-polyaminoacide et de glucacion à 2 mg/ml à DI-1 7,2 [000375] De manière analogue à l'exemple CAO, des compositions de glucagon à 2 mg/mL contenant différents co-polyaminoacides, du glycérol (pour obtenir 300 10 mOsmole/kg dans la formulation finale), un tampon phosphate (2 mM) et des additifs sont préparées. Elles sont présentées dans le tableau 2 suivant : Composition BC Concentration Ratio co- Additif Glycérole (mM) Aspect de co- polyaminoacide/Glucagon visuel polyaminoacides de la (mg/mL) solution CB1 B3 6,9 1,33 290 limpide CB2 10,3 2 10 mM 250 limpide citrate CB3 B2 16 3 10 mM 250 limpide citrate CB4 16 3 294 limpide Tableau 2 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 2 mg/mL à pH 7,2 à différentes concentrations en co-polyaminoacide contenant 2 mM de tampon 15 phosphate et 1 mg/mL de L-méthionine. Stabilité physique des compositions [000376] Les compositions précédemment préparées ont été transférées dans des cartouches (easy-to-fill de OMPI de 3 ml - Ref P4084100.3250) à raison de 1 mL par cartouche et placées en conditions statiques à 37 °C. 5 [000377] L'inspection visuelle des échantillons placés en conditions statiques à 37 °C est effectuée à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 semaines à 37 °C afin de détecter l'apparition de particules visibles, de fibrilles ou d'une turbidité. Cette inspection est réalisée selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne (EP 2.9.20) : les échantillons sont 10 soumis à un éclairage d'au moins 2000 Lux et sont observés face à un fond blanc et un fond noir pour respecter les recommandations de la pharmacopée Européenne. Quand des particules sont visibles dans la moitié des échantillons la composition est estimée non stable. Stable signifie donc qu'au jour de l'inspection au moins la moitié des échantillons étaient dépourvus de particules, de fibrilles ou d'une turbidité. 15 [000378] Les résultats des inspections visuelles sont reportés dans le tableau suivant. [000379] L'étude des stabilités physiques des compositions décrites dans le tableau 20 ci-dessous a été menée sur des volumes de 1 mL de composition dans des cartouches de contenance de 3 mL (OMPI - ref : P4084100.3250). Par comparaison, la solution de glucauon à pH acide à 1 menL n'est stable que 2 jours à 37 °C. Concentration de co-Stabilité Composition BC Additifs polyaminoacides (semaines) (rngimL) >2 >2 >2 >2 10 mM citrate 10 mM citrate 10 mM citrate 10 mM citrate B2 7,75 >2 8,55 >2 9,62 >2 CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 CA7 CA8 CA9 83 4,02 3,61 4,13 6,95 7,75 >2 [000380] La composition CA11 a été transféré dans un vial de 3 mL (Adelphi - ref 25 :VCDIN2RDLS1) à raison de 1 mL par vial et placées en conditions statiques à 37 °C. 66 Les résultats des inspections visuelles sont reportés dans le tableau suivant. Concentration de co- BC polyaminoacides (mg/mL) CA11 Bi 7,2 27 mM m-crésol >2 Composition Additifs Stabilité 37 °C (semaines) [000381] Les solutions selon l'invention présentent une stabilité physique à 37 °C en conditions statiques en cartouche supérieure à deux semaines à 37 °C. L'addition 5 de co-polyaminoacide permet de solubiliser et de stabiliser le glucagon à pH neutre alors que le glucagon en solution a pH acide n'est stable que quelques jours à 37°C (2 jours). Résultats des observations visuelles au mélange et des mesures de 10 fibrillation par ThT [000382] Les compositions précédemment préparées ont été aliquoté dans une plaque 96 puits en triplicat (3*150pL) et placées en conditions statiques à 37 °C. 15 Principe [000383] La mauvaise stabilité d'un peptide peut conduire à la formation de fibrilles amyloïdes, définies comme des structures macromoléculaires ordonnées. Celles-ci peuvent éventuellement résulter à la formation de gel au sein de l'échantillon. L'essai de suivi de la fluorescence de la thioflavine T (ThT) est utilisé pour analyser la 20 stabilité physique des solutions. La Thioflavine est une petite molécule sonde ayant une signature de fluorescence caractéristique lorsqu'elle se lie à des fibrilles de type amyloïdes (Naiki et al. (1989) Anal. BioChem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284). [000384] Cette méthode permet de suivre la formation de fibrilles pour de faibles 25 concentrations de ThT au sein de solutions non diluées. Ce suivi est réalisé dans des conditions de stabilité accélérées : sous agitation et à 37°C. Conditions expériment'.1,,,. [000385] Les échantillons ont été préparés juste avant le début de la mesure. La 30 préparation de chaque composition est décrite dans l'exemple associé. La Thioflavine T a été ajoutée dans la composition à partir d'une solution mère concentrée de manière à induire une dilution négligeable de la composition. La concentration de Thioflavine T dans la composition est de 40 pM. 67 [000386] Un volume de 150 pL de la composition a été introduit au sein d'un puit d'une plaque 96 puits puis 2,7 pL de solution concentrée de ThT a été introduite. Chaque composition a été analysée en trois essais (triplicat) au sein d'une même plaque. La plaque a été scellée par du film transparent afin d'éviter l'évaporation de la 5 composition. [000387] Cette plaque a ensuite été placée dans l'enceinte d'un lecteur de plaques (Xenius XC, SAFAS). La température est réglée à 37°C, et une agitation latérale de 960 rpm avec 1 mm d'amplitude est imposée. [000388] Une lecture de l'intensité de fluorescence dans chaque puit est réalisée 10 avec une longueur d'onde d'excitation de 442 nm, et une longueur d'onde d'émission de 482 nnn au cours du temps. [000389] Le processus de fibrillation se manifeste par une forte augmentation de la fluorescence après un délai appelé temps de latence. [000390] Le lag time est déterminé graphiquement, en prennant le temps où la 15 tangente à la phase linéaire de croissance coupe l'axe des abscisses. [000391] La valeur de temps de latence reportée correspond à la moyenne des mesures de temps de latence faites sur trois puits. [000392] Un exemple de détermination graphique est représenté à la figure 1. Sur cette figure est représentée de façon graphique la détermination du temps de 20 latence ou « lag time » (LT) par suivi de la fluorescence de la Thioflavine T, sur une courbe ayant en ordonnées la valeur de la fluorescence (en u.a. unités arbitraires) et en abscisses le temps en minutes. [000393] Les résultats de temps de latence obtenus sont présentés dans le tableau 25 ci-dessous. Par comparaison, le glucagon seul est insoluble en solution à pH physiologique et la solution de glucagon à pH acide à 1 mg/mL montre un temps de fibrillation de 0,5 h environ. 68 [000394] Les compositions contenant des co-polyaminoacides permet d'augmenter le temps de latence par rapport à la solution de glucagon seul à pH acide qui n'est 5 stable que quelques minutes dans ces conditions de mesures. 10 Additifs Temps de fibrillation (h) Concentration de co- polyaminoacides (mg/mL) Composition BC >9 >10 >10 CA12 CA13 CA14 B3 CA15 CA16 CA17 B2 CA18 CA19 CA20 >60 >90 10 mM citrate 10 mM citrate 10 mM citrate 10 mM citrate 2,14 2,67 3,20 2,58 3,09 2,58 >60 >60 3,09 2,67 3,20 >10 >20 REVENDICATIONS1. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins : a) de l'amyline, un agoniste au récepteur de l'amyline ou un analogue d'amyline ; b) un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy, ledit co-polyaminoacide étant constitué d'unités glutamiques ou aspartiques et lesdits radicaux hydrophobes Hy choisi parmi les radicaux de formule X telle que définie ci-dessous : *--(GpR)r (GpG) (GpA) a {PpL) GpC I g h a Formule X dans laquelle GoR est choisi parmi les radicaux de formules VII, VII' ou VII": 0 H H Il * Formule VII' ou *-N-R-N-* Formule VII ou * R o ---1-1-R-1-1-* Formule VII"; - GpG et GpH identiques ou différents sont choisis parmi les radicaux de formules XI ou XI': * *- NH-G- NH -* G N * Formule XI Formule XI' GpA est choisi parmi les radicaux de formule VIII * N H - A' - [N H Hl Formule VIII 25 Dans laquelle A' est choisi parmi les radicaux de formule VIII',VIII" ou VIII" Al-N A2 A1- - A2 - N A3 Formule VIII' Formule VIII" Formule VIII" 5 -GpL est choisi parmi les radicaux de formule XII HN-* II A HN-* Formule XII, - GpC est un radical de formule IX: Formule IX; 10 - les * indiquent les sites de rattachement des différents groupes liés par des fonctions amides - a est un entier égal à 0 ou à 1 et a' = 1 si a = 0 et a' = 1, 2 ou 3 si a = 1 ; - a' est un entier égal à 1, à 2 ou à 3 15 - b est un entier égal à 0 ou à 1 ; - c est un entier égal à 0 ou à 1, et si c est égal à 0 alors d est égal à 1 ou à 2; - d est un entier égal à 0, à 1 ou à 2 ; - e est un entier égal à 0 ou à 1 ; - g est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6; 20 - h est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6, et au moins un des g, h ou I est différent de 0; - I est un entier égal à 0 ou 1 et l' = 1 si I = 0 et l' = 2 si I = 1 ; - r est un entier égal à 0 ou à 1, et s' est un entier égal à 0 ou 1 ; - A, Ai, Az et A3 identiques ou différents sont des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes de carbone; - B est un radical alkyle linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant un noyau aromatique, comprenant de 1 à 9 atomes de carbone ; Cx est un radical alkyl monovalent linéaire ou ramifié, dans lequel x indique le nombre d'atomes de carbone et : Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 1 -GpC, alors 9 x 2 -GpC, alors 9 5 x 15, 5 Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 3 -GpC, alors 7 5 x 13, - Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 4 -GpC, alors 7 x 11, Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte au moins 5 -GpC alors, 6 x 11, G est un radical alkyle ramifié de 1 à 8 atomes de carbone ledit radical alkyle 10 portant une ou plusieurs fonction(s) acide carboxylique libre. - H est un radical alkyle ramifié de 1 à 8 atomes de carbone ledit radical alkyle portant une ou plusieurs fonction(s) acide carboxylique libre., - R est un radical choisi dans le groupe constitué par un radical alkyle divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un radical alkyle 15 divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone portant une ou plusieurs fonctions -CONH2 ou un radical éther ou polyéther non substitué comprenant de 4 à 14 atomes de carbone et de 1 à 5 atomes d'oxygène : Le ou les radicaux hydrophobes -Hy de formule X étant liés au PLG: o via une liaison covalente entre un carbonyle du radical hydrophobe -Hy et 20 un atome d'azote porté par le PLG formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction amine portée par le PLG et une fonction acide portée par le précurseur -Hy' du radical hydrophobe -Hy, et o via une liaison covalente entre un atome d'azote du radical hydrophobe -Hy et un carbonyle porté par le PLG formant ainsi une fonction amide 25 issue de la réaction d'une fonction amine du précurseur -Hy' du radical hydrophobe -Hy et une fonction acide portée par le PLG, le ratio M entre le nombre de radicaux hydrophobes et le nombre d'unités glutamiques ou aspartiques étant compris entre 0 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédente, caractérisée en ce que l'amyline, agoniste au récepteur de l'amyline ou analogue 10 d'amyline est l'amyline. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'amyline, agoniste au récepteur de l'amyline ou analogue d'amyline est le pramlintide. 15 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une insuline prandiale. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédente, 20 caractérisée en ce que ratio molaire co-polyaminoacide/insuline est supérieur ou égal à 1. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition présente une stabilité mesurée par ThT supérieure à celle 25 d'une composition de référence comprenant de l'amyline , un agoniste au récepteur de l'amyline ou un analogue d'amyline mais ne comprenant pas de co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy.