FR 3065642 A1 20181102 FR 1758071 A 20170831 1 DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION La prÃ©sente invention concerne l'utilisation de 20-hydroxyecdysone (20E) naturelle purifiÃ©e ou des dÃ©rivÃ©s de synthÃ¨se pour le traitement de myopathies et notamment des dystrophies musculaires d'origines gÃ©nÃ©tiques. ÃTAT DE LA TECHNIQUE Les myopathies sont des maladies qui touchent directement le muscle. Il en existe diffÃ©rentes formes selon les manifestations et les mÃ©canismes de l'atteinte musculaire. Deux catÃ©gories existent : les myopathies gÃ©nÃ©tiques et les myopathies acquises. Les myopathies gÃ©nÃ©tiques se subdivisent en : - dystrophies musculaires progressives (dystrophies musculaires de Duchenne et de Becker, dystrophies musculaires des ceintures et dystrophie facioscapulo humÃ©rale), ou dystrophies congÃ©nitales, - myopathies mÃ©taboliques telles que les glycogÃ©noses et les lipidoses ainsi que les myopathies mitochondriales, - dystrophies myotoniques telles que la myopathie de Steinert (DM1), - myopathies congÃ©nitales de type central core, Ã bÃ¢tonnets, Ã multi mini core ou myopathie centronuclÃ©aire et myotubulaire, Les myopathies acquises regroupent : - les myopathies toxiques, - les myopathies inflammatoires, - les myopathies endocriniennes. Les myopathies se manifestent par une faiblesse musculaire Ã©volutive ou stable. Elles se caractÃ©risent en gÃ©nÃ©ral par une perte de masse musculaire (atrophie). Lors de l'Ã©volution de la maladie, le tissu musculaire est progressivement remplacÃ© par du tissu fibreux (fibrose). II existe plus de trente formes de dystrophies musculaires qui diffÃ¨rent notamment par la nature des muscles touchÃ©s. Elles apparaissent de maniÃ¨re plus ou moins prÃ©coce et touchent les muscles squelettiques de diffÃ©rentes parties du corps. Dans certains cas une atteinte progressive des muscles respiratoires et cardiaque rÃ©duit l'espÃ©rance de vie des patients. 3065642 2 Plusieurs dizaines de gÃ¨nes diffÃ©rents sont impliquÃ©s dans les dystrophies musculaires. Le plus souvent, ce sont des gÃ¨nes responsables de la synthÃ¨se de protÃ©ines situÃ©es dans la membrane des cellules musculaires ou liÃ©es Ã celle-ci et indispensables au maintien de l'architecture et Ã la fonction musculaire. A titre 5 d'exemple : - la dystrophine est impliquÃ©e dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et la dystrophie musculaire de Becker (BMD), - la calpaÃ¯ne, la dysferline les sarcoglycanes sont impliquÃ©s dans les dystrophies musculaires des ceintures, 10 - la mÃ©rosine, l'alpha-dystroglycane ou la sÃ©lÃ©noprotÃ©ine N sont impliquÃ©es dans le cas des dystrophies musculaires congÃ©nitales (DMC). La DMD est la plus frÃ©quente des dystrophies musculaires. Elle touche 1 garÃ§on sur 3500 et rÃ©sulte de mutations affectant le gÃ¨ne de la dystrophine, localisÃ© 15 sur le chromosome X. Une forme moins sÃ©vÃ¨re, la BMD, implique Ã©galement le gÃ¨ne de la dystrophine et touche 1 garÃ§on sur 18000. La DMD est une affection gÃ©nÃ©tique grave qui touche toute la musculature. Dans cette maladie, la fragilitÃ© des fibres musculaires aboutit Ã leur destruction entraÃ®nant une nÃ©crose du tissu musculaire. Lorsque les mÃ©canismes de rÃ©gÃ©nÃ©ration sont dÃ©passÃ©s, la dÃ©gÃ©nÃ©rescence 20 l'emporte entraÃ®nant une perte de force musculaire et une intolÃ©rance Ã l'effort (Barnabei et al. 2011). Les fibres musculaires sont alors remplacÃ©es par du tissu conjonctif (fibrose). Une faiblesse musculaire gagne progressivement les membres infÃ©rieurs des enfants Ã¢gÃ©s de plus de 3 ans. La maladie se dÃ©veloppe par la suite dans les muscles du dos, les membres supÃ©rieurs et enfin les muscles respiratoires. 25 Il n'existe actuellement aucun traitement curatif Ã la DMD et la BMD, mais les traitements palliatifs, orthopÃ©diques et respiratoires, amÃ©liorent la qualitÃ© de vie et le pronostic vital. La prise en charge des patients repose actuellement sur l'optimisation de leurs capacitÃ©s musculaires ainsi que sur la prÃ©vention et le traitement des complications cardiaques et respiratoires. L'utilisation de corticoÃ¯des permet de 30 prolonger la pÃ©riode de marche de deux ans en moyenne. Toutefois, certains enfants ne rÃ©pondent pas Ã ce traitement qui de plus est responsable d'effets indÃ©sirables, notamment une fragilisation osseuse importante. Une protection cardiaque partielle est obtenue grÃ¢ce Ã une l'association d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion et de bÃªta-bloquants. 3065642 3 De nouveaux traitements sont au stade du dÃ©veloppement clinique. Le saut d'exon consiste Ã forcer la cellule Ã produire une version de la dystrophine plus courte que la protÃ©ine normale mais cependant fonctionnelle. Une autre approche du mÃªme type consiste Ã passer outre une mutation qui interrompt prÃ©maturÃ©ment la 5 synthÃ¨se de la dystrophine. Toutefois, ce type de thÃ©rapie ne s'adresse qu'Ã un petit nombre de patients, et ce en fonction de la nature exacte des mutations Ã l'origine de leur maladie. Enfin, la thÃ©rapie gÃ©nique, qui offre la possibilitÃ© de synthÃ©tiser des versions courtes de dystrophine (mini-dystrophines ou micro-dystrophines) chez les patients, se trouve confrontÃ©e un problÃ¨me majeur de rÃ©ponse immunitaire contre 10 ces protÃ©ines considÃ©rÃ©es comme Ã©trangÃ¨res par l'organisme. Outre une diminution irrÃ©versible de la force musculaire appendiculaire et l'apparition d'une intolÃ©rance Ã l'effort, une des complications majeures de la maladie est l'installation d'une fibrose qui touche notamment le coeur conduisant Ã une 15 insuffisance cardiaque (accompagnÃ©e d'une hypertrophie dilatÃ©e). Ces atteintes engagent le pronostic vital des patients. L'installation de la fibrose est par consÃ©quent une Ã©volution irrÃ©versible qu'il convient de contrecarrer afin de conserver la fonction musculaire. Dans ce sens, les approches thÃ©rapeutiques doivent concentrer leurs efforts sur : 20 - le maintien de la tolÃ©rance Ã l'effort - le maintien de la force musculaire - et sur la prÃ©vention de l'apparition de la fibrose. Les phytoecdysones reprÃ©sentent une importante famille de stÃ©rols 25 polyhydroxylÃ©s. Ces molÃ©cules sont produites pas diverses espÃ¨ces de plantes (fougÃ¨res, gymnospermes, angiospermes) et participent Ã la dÃ©fense de ces plantes contre les ravageurs. Le brevet FR 3 021 318 divulgue que les phytoecdysones, et plus particuliÃ¨rement la 20-hydroxyecdysone (20E), ont fait l'objet de nombreuses Ã©tudes 30 pharmacologiques. Ces Ã©tudes ont mis en avant les propriÃ©tÃ©s antidiabÃ©tiques et anabolisantes de cette molÃ©cule. Ses effets stimulants sur les synthÃ¨ses protÃ©iques dans les muscles sont observÃ©s chez le rat in vivo (Syrov et al., 2000; TÃ´th et al., 2008; Lawrence et al., 2012) et sur des myotubes murins C2C12 in vitro (GorelickFeldman et al., 2008). Il s'agit d'un effet au niveau de la traduction, qui implique la 3065642 4 phosphorylation de la protÃ©ine ribosomale p70S6K, Ã l'issue d'une cascade oÃ¹ intervient la protÃ©ine kinase Akt/PkB, une voie Ã©galement utilisÃ©e par l'IGF-1 pour stimuler la protÃ©osynthÃ¨se. Certains des effets dÃ©crits ci-dessus dans des modÃ¨les animaux ont Ã©tÃ© 5 retrouvÃ©s dans des Ã©tudes cliniques, encore peu nombreuses. Ainsi, la 20- hydroxyecdysone augmente la masse musculaire chez de jeunes sportifs (Simakin et al., 1988). Enfin le brevet franÃ§ais FR3021318 dÃ©crit l'utilisation de 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, pour le traitement et la prÃ©vention de la sarcopÃ©nie et de l'obÃ©sitÃ© 10 sarcopÃ©nique (Lafont et al. 2017). OBJET DE L'INVENTION Les inventeurs ont dÃ©couvert que la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s amÃ©liorent de maniÃ¨re significative les performances physiques in toto ainsi que la 15 force musculaire in situ de mammifÃ¨res atteints par une myopathie. Les performances physiques in toto et la force musculaire in situ sont dÃ©terminÃ©es respectivement par la mesure de distance maximale parcourue et par la force maximale isomÃ©trique absolue du muscle tibial antÃ©rieur. Ces effets permettent d'amÃ©liorer la mobilitÃ© chez les mammifÃ¨res atteints de myopathie et notamment de 20 dystrophies musculaires. La prÃ©sente invention vise la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'une myopathie. Dans la suite de la description, on entend par 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, la 20-hydroxyecdysone, ses dÃ©rivÃ©s, des extraits de vÃ©gÃ©taux riches en 20- 25 hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, et des compositions comportant Ã titre d'agent actif la 20-hydroxyecdysone, ses dÃ©rivÃ©s et/ou des extraits de vÃ©gÃ©taux riches en 20hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s. Les dÃ©rivÃ©s de 20-hydroxyecdysone sont obtenus par hÃ©misynthÃ¨se. La 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s sont avantageusement purifiÃ©s au 30 grade pharmaceutique. Plus particuliÃ¨rement, l'invention concerne la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'affections rÃ©sultant d'une altÃ©ration de la fonction musculaire provoquÃ©e soit par une myopathie gÃ©nÃ©tique soit par une myopathie acquise. 3065642 5 La fonction musculaire est celle du muscle striÃ© squelettique ou du myocarde. Plus particuliÃ¨rement, l'altÃ©ration de la fonction musculaire est une hypertrophie du myocarde. 5 Encore plus particuliÃ¨rement l'invention concerne la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement de toute myopathie dans laquelle la fonction musculaire est au moins en partie altÃ©rÃ©e par l'installation progressive d'une fibrose. Tout particuliÃ¨rement, l'invention concerne la 20-hydroxyecdysone et ses 10 dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'une myopathie rÃ©sultant d'une altÃ©ration gÃ©nÃ©tique. Par altÃ©ration gÃ©nÃ©tique on entend une mutation, une insertion de nuclÃ©otide(s) ou une dÃ©lÃ©tion de nuclÃ©otide(s). L'invention concerne la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre 15 utilisÃ©s dans le traitement par exemple de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et/ou la dystrophie musculaire de Becker (BMD). Selon l'invention, la 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, sont destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement de toute myopathie rÃ©sultant d'une mutation du gÃ¨ne de la dystrophine. 20 Selon une caractÃ©ristique, la 20-hydroxyecdysone est un composÃ© de formule (I) : OH OH= (I) 25 De maniÃ¨re avantageuse, le composÃ© de formule (I) est purifiÃ© au grade pharmaceutique. 3065642 6 Tout particuliÃ¨rement, la 20-hydroxyecdysone est un extrait de plante ou d'une partie de plante, ladite plante Ã©tant choisie parmi les vÃ©gÃ©taux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone de formule (I) en poids sec dudit vÃ©gÃ©tal, ledit extrait comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone 5 de formule (I). On parle de purification au grade pharmaceutique. L'extrait est appelÃ© par la suite 610101. Il comporte de faÃ§on remarquable entre 0 et 0,05 %, en poids sec de l'extrait, d'impuretÃ©s, comme des composÃ©s mineurs, susceptibles d'affecter l'innocuitÃ©, la disponibilitÃ© ou l'efficacitÃ© d'une 10 application pharmaceutique dudit extrait. Selon une caractÃ©ristique de l'invention, les impuretÃ©s sont des composÃ©s Ã 19 ou 21 atomes de carbone, comme la RubrostÃ©rone, la DihydrorubrostÃ©rone ou la PoststÃ©rone. La plante Ã partir de laquelle est produit 610101 est avantageusement choisie 15 parmi Stemmacantha carthamoides (aussi appelÃ©e Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga. L'invention s'intÃ©resse tout spÃ©cialement Ã l'utilisation d'un extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone de formule (I). 20 Dans cet extrait, la 20-hydroxyecdysone est purifiÃ©e au grade pharmaceutique. Plus particuliÃ¨rement, l'extrait est administrÃ© Ã raison de 3 Ã 15 mg/kg*jour. Tout particuliÃ¨rement, l'extrait est administrÃ© Ã raison de 200 Ã 1000 mg/jour, en une ou plusieurs prises, chez un patient adulte, et une dose de 70 Ã 350 mg/jour, 25 en une ou plusieurs prises, chez l'enfant. En outre l'invention concerne une composition comportant Ã titre d'agent actif 610101. La composition contient de prÃ©fÃ©rence entre 200 et 1000 mg d'agent actif (BI0101). 30 Selon une autre caractÃ©ristique, un dÃ©rivÃ© de la 20-hydroxyecdysone est un composÃ© de formule gÃ©nÃ©rale (II) : 3065642 7 Q-R1 dans laquelle : V-U est une liaison simple carbone-carbone et Y est un groupement hydroxyle 5 ou un hydrogÃ¨ne, ou V-U est une liaison Ã©thylÃ©nique C=C ; X est un oxygÃ¨ne, Q est un groupement carbonyle ; R' est choisi parmi : un groupement (C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (CiC6)W(C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); un groupement 10 (C1-C6)A, A reprÃ©sentant un hÃ©tÃ©rocycle Ã©ventuellement substituÃ© par un groupement de type OH, OMe, (Ci-C6), N(C1-C6), CO2(Ci-C6) ; un groupement CH2Br ; W Ã©tant un hÃ©tÃ©roatome choisi parmi N, O et S, de prÃ©fÃ©rence O et encore plus prÃ©fÃ©rentiellement S. 15 Plus particuliÃ¨rement, dans la formule (II) : Y est un groupement hydroxyle ; R' est choisi parmi : un groupement (C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (C1- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); un groupement (Ci-C6)A, A reprÃ©sentant un hÃ©tÃ©rocycle Ã©ventuellement substituÃ© par un 20 groupement de type OH, OMe, (Ci-C6), N(Ci-C6), CO2(Ci-C6) ; W Ã©tant un hÃ©tÃ©roatome choisi parmi N, O et S, de prÃ©fÃ©rence O et de prÃ©fÃ©rence encore S. En particulier, les composÃ©s de formule (II) sont choisis parmi : - nÂ° 1 : (2S,3R,5R,1 OR,1 3R,1 4S,1 75)-2,3,14-trihydroxy-1 0,1 3-dimÃ©thy1-1 7- 25 (2-morpholinoacÃ©tyI)-2,3,4,5,9,1 1 ,1 2,1 5,1 6,1 7-dÃ©cahydro-1 H- cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one, 3065642 8 - nÂ° 2 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-1712-(3- hydroxypyrrolidin-1-yl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thyl-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°3 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(4-hydroxy-1- 5 pipÃ©ridyl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16, 17-dÃ©cahydro-1H- cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°4 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-171244-(2- hydroxyÃ©thyl)-1-pipÃ©ridyl]acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15, 16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; 10 - nÂ°5 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-1742-(3- dimÃ©thylaminopropyl(mÃ©thyl)amino)acÃ©ty1]-2,3,14-trihydroxy-10,13- dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-dÃ©cahydro-1Hcyclopenta[a] phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°6 : 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13- 15 dimÃ©thy1-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-dÃ©cahydro-1H- cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-17-yl]Ã©thyl]sulfanylacÃ©tate d'Ã©thyle; - nÂ°7 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-Ã©thylsulfanylacÃ©ty1)-2,3,14- trihydroxy-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16, 17-dÃ©cahydro-1Hcyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; 20 - nÂ°8 . (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-1742-(2- hydroxyÃ©thylsulfanyl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one. Tour particuliÃ¨rement, la phytoecdysone est un composÃ© de formule (III) : HO HO O 25 (III) Ce composÃ© est appelÃ© par la suite 610103. 3065642 9 BRÃVE DESCRIPTION DES FIGURES D'autres avantages, buts et caractÃ©ristiques particuliÃ¨res de la prÃ©sente invention ressortiront de la description non limitative qui suit d'au moins un mode de rÃ©alisation particulier des dispositifs objets de la prÃ©sente invention, en regard des 5 dessins annexÃ©s, dans lesquels : La figure 1A est un diagramme reprÃ©sentatif de la tolÃ©rance Ã l'effort des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : saines (C57) et mdx (mutÃ©es sur le gÃ¨ne de la dystrophine) non traitÃ©es, La figure 1B est un diagramme reprÃ©sentatif de la tolÃ©rance Ã l'effort des 10 groupes de souris : mdx non traitÃ©es, mdx traitÃ©es par BI0101 et mdx traitÃ©es par BI0103 aprÃ¨s deux mois de traitement, La figure 2A est un diagramme reprÃ©sentatif de la force isomÃ©trique maximale absolue du muscle tibial antÃ©rieur des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : saines (C57) et mdx non traitÃ©es, 15 La figure 2B est un diagramme reprÃ©sentatif de la force isomÃ©trique maximale absolue du muscle tibial antÃ©rieur des groupes de souris : mdx non traitÃ©es, mdx traitÃ©es par BI0101 et mdx traitÃ©es par BI0103 aprÃ¨s deux mois de traitement, Les figures 3A et 3B sont des diagrammes reprÃ©sentatifs de l'expression 20 gÃ©nique (ARNm) des marqueurs de fibrose CTGF (facteur de croissance de tissu conjonctif) et Colt a1 (collagÃ¨ne 1) du coeur de diffÃ©rents groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : saines (C57), mdx non traitÃ©es, mdx traitÃ©es par BI0101 et mdx traitÃ©es par BI0103, aprÃ¨s deux mois de traitement, 25 Les figures 3C et 3D sont des diagrammes reprÃ©sentatifs de l'expression gÃ©nique (ARNm) des marqueurs d'hypertrophie myh7 (chaÃ®ne lourde bÃªta de la myosine) et BMP4 (protÃ©ine morphogÃ©nÃ©tique osseuse 4) du coeur de diffÃ©rents groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : saines (C57), mdx non traitÃ©es, mdx traitÃ©es par BI0101 et mdx traitÃ©es par BI0103, aprÃ¨s deux 30 mois de traitement, La figure 4A est une image reprÃ©sentative de coupe histologique de muscle tibial antÃ©rieur de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 saines (C57), colorÃ© Ã l'hÃ©matoxyline Ã©osine (HE), 3065642 10 La figure 4B est une image reprÃ©sentative de coupe histologique de muscle tibial antÃ©rieur de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 mdx non traitÃ©es (mdx), colorÃ© Ã l'hÃ©matoxyline Ã©osine (HE), La figure 4C est une image reprÃ©sentative de coupe histologique de muscle 5 tibial antÃ©rieur de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 mdx mdx traitÃ©es par BI0101 (mdx+BlO101), colorÃ© Ã l'hÃ©matoxyline Ã©osine (HE) La figure 4D est une image reprÃ©sentative de coupe histologique de muscle tibial antÃ©rieur de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 mdx traitÃ©es par BI0103 (mdx+BI0103), colorÃ© Ã l'hÃ©matoxyline Ã©osine (HE), 10 Les figures 5A et 5B sont des coupes histologiques reprÃ©sentatives de muscle tibial antÃ©rieur colorÃ©es au rouge sirius (RS) respectivement des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 saines (C57) et mdx non traitÃ©es (mdx), La figure 5C est un diagramme reprÃ©sentatif de la quantification des zones de fibrose des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 saines (C57) et 15 mdx non traitÃ©es (mdx), Les figures 5D et 5E sont des coupes histologiques reprÃ©sentatives de muscle tibial antÃ©rieur colorÃ©es au rouge sirius (RS) des groupes de souris mdx traitÃ©es par BI0101 (mdx BI0101) et mdx traitÃ©es par BI0103 (mdx BI0103), La figure 5F est un diagramme reprÃ©sentatif de la quantification des zones de 20 fibrose des groupes de souris mdx traitÃ©es par BI0101 (mdx BI0101) et mdx traitÃ©es par BI0103 (mdx BI0103), La figure 6A prÃ©sente l'expression protÃ©ique, dÃ©tectÃ©e par western blot, du marqueur de fibrose collagÃ¨ne 1 (Collai) du muscle gastrocnÃ©mien des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : saines (C57), mdx non 25 traitÃ©es (mdx), La figure 6B prÃ©sente l'expression protÃ©ique, dÃ©tectÃ©e par western blot, du mÃªme marqueur de fibrose du muscle gastrocnÃ©mien des groupes de souris de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 : mdx non traitÃ©es (mdx), mdx traitÃ©es par BI0101 et mdx traitÃ©es par BI0103, aprÃ¨s deux mois de traitement. 30 DESCRIPTION DÃTAILLÃE DE MODES DE RÃALISATION DE L'INVENTION La prÃ©sente description est donnÃ©e Ã titre non limitatif. 3065642 11 1. ProcÃ©dÃ© de purification de 810101 810101 est prÃ©parÃ© Ã partir d'une prÃ©paration de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90%, selon les Ã©tapes suivantes : a) Dissolution Ã chaud de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90% 5 dans du mÃ©thanol, filtration et concentration partielle, b) Ajout de 3 volumes d'acÃ©tone, c) Refroidissement Ã une tempÃ©rature comprise entre 0 et 5Â°C, sous agitation, d) Filtration du prÃ©cipitÃ© obtenu, 10 e) RinÃ§ages successifs avec de l'acÃ©tone et de l'eau, et f) SÃ©chage. Cette purification met en jeu un processus de recristallisation appropriÃ© Ã cette molÃ©cule et apte Ã Ãªtre rÃ©alisÃ© Ã l'Ã©chelle industrielle. La filtration de l'Ã©tape a) est rÃ©alisÃ©e grÃ¢ce Ã un filtre Ã particules de 0,2 um. 15 La concentration partielle de l'Ã©tape a) est avantageusement effectuÃ©e par distillation sous vide, Ã une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C, en prÃ©sence de Me0H. L'Ã©tape f) de sÃ©chage est effectuÃ©e sous vide Ã une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C. 20 2. ProcÃ©dÃ© de synthÃ¨se de 810103 B10103 est obtenu par hemi-synthÃ¨se Ã partir de Ã partir de 20- hydroxyecdysone puis purification au grade pharmaceutique selon le procÃ©dÃ© de prÃ©paration suivant : r P PCC Br2IMeOH 20Â°C/20h Pyridine 20Â°C/4h PoststÃ©rone EtS H K ,C043114F 20'Cr2Oh B10103 3065642 12 SchÃ©ma de synthÃ¨se de BI0103 en 3 Ã©tapes : 1) coupure oxydante de la chaÃ®ne latÃ©rale de la 20-hydroxyecdysone entre les carbones C20 et C22 pour obtenir la poststÃ©rone (protocole connu de l'homme du 5 mÃ©tier), 2) introduction d'un atome de brome en position C21, 3) rÃ©action du dÃ©rivÃ© bromÃ© avec de l'Ã©thane-thiol. 3. ActivitÃ© biologique de BI0101 et 810103 10 Si les effets anabolisants de la 20E prÃ©sente dans des prÃ©parations commerciales ont dÃ©jÃ Ã©tÃ© dÃ©montrÃ©s chez des animaux jeunes, on ne connait pas l'effet de la 20E dans un contexte de mammifÃ¨re atteint de myopathie dans laquelle l'installation progressive d'une fibrose contribue Ã l'altÃ©ration de la fonction musculaire. Le modÃ¨le animal de la myopathie de Duchenne employant des souris 15 mdx, de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10, qui prÃ©sentent une mutation sur le gÃ¨ne de la dystrophine, a Ã©tÃ© mis en oeuvre (Bulfield et al. 1984 ; Sicinski et al. 1989). Des souris mÃ¢les de fond gÃ©nÃ©tique C57BL10 (souris sauvages dÃ©nommÃ©es Â« C57 Â» dans les figures) et C57BL10 mdx (modÃ¨le murin de la dystrophie musculaire de Duchenne, dÃ©nommÃ©es Â« mdx Â» dans les figures) de douze 20 semaines, produites chez Charles Rivers, ont Ã©tÃ© utilisÃ©es. Deux groupes des souris mdx ont Ã©tÃ© exposÃ©s par voie orale de maniÃ¨re chronique soit Ã BI0101 (nombre de souris n=9) soit Ã BI0103 (nombre de souris n=9) Ã la dose de 50 mg/kg*jour. Un groupe de souris C57 (nombre de souris n=5) et un groupe des souris mdx (nombre de souris n=15) ont reÃ§u le vÃ©hicule, soit aucun traitement. Les animaux de tous les 25 groupes ont Ã©tÃ© testÃ©s pour leur capacitÃ© fonctionnelle (test de tolÃ©rance Ã l'effort) aprÃ¨s deux mois de traitement. Le test de tolÃ©rance Ã l'effort consiste Ã mesurer la distance maximale parcourue (activitÃ© in toto ; Figures 1A et 1B). En outre, des mesures de la force maximale isomÃ©trique absolue du muscle tibial antÃ©rieur (activitÃ© in situ ; Figures 2A et 2B) ont Ã©tÃ© effectuÃ©es aprÃ¨s deux mois de traitement. 30 Le traitement par voie orale sur deux mois consiste au gavage pendant cinq jours par semaine et dans l'eau de boisson deux jours par semaine. Test de tolÃ©rance Ã l'effort (Ã©tude fonctionnelle in toto : figures 1A et 1 B) 3065642 13 Le test de tolÃ©rance Ã l'effort est un exercice forcÃ© sur tapis roulant motorisÃ©. C'est une mÃ©thode non invasive pour Ã©valuer la fonction du muscle squelettique in toto. C'est la mÃ©thode de rÃ©fÃ©rence dans le domaine (Ferry et al. 1992, 1993 ; HadjSaid et al. 2012). 5 La durÃ©e d'acclimatation des animaux est au moins de 48h avant la sÃ©ance durant laquelle est mesurÃ©e la distance maximale de course. Durant le test, la souris est placÃ©e dans un couloir de course sur un tapis roulant motorisÃ© qui permet de faire un exercice contrÃ´lÃ© par l'expÃ©rimentateur dans son intensitÃ© et sa durÃ©e. Le tapis roulant se termine par une grille horizontale qui administre un choc Ã©lectrique 10 (0,4 mA) si l'animal est en contact plus d'une seconde avec la grille. La sÃ©ance de course dÃ©bute par une pÃ©riode d'Ã©chauffement de 2 minutes pendant laquelle la vitesse est amenÃ©e de 0 Ã 20 cm/s. Par la suite, la vitesse de course est augmentÃ©e de 5 cm/s toutes les 10 minutes jusqu'Ã la limite des capacitÃ©s maximales de la souris. Lorsqu'elle subit 5 chocs en moins de 10 secondes, le test 15 s'arrÃªte. La distance parcourue est notÃ©e. De maniÃ¨re attendue, il est constatÃ© que les animaux qui prÃ©sentent une mutation sur le gÃ¨ne de la dystrophine (mdx) courent significativement moins (75,4%, p Combined application of prÃ©paration Ecdysten. Science Bulletin N Â°2, 29-31. Song Y, Yao S, Liu Y, Long L, Yang H, Li Q, Liang J, Li X, Lu Y, Zhu H, Zhang N. 2017. Expression levels of TGF-f31 and CTGF are associated with the severity of Duchenne muscular dystrophy. Exp Ther Med 13(4): 1209-1214. 3065642 20 Syrov VN. 2000. Comparative experimental investigations of the anabolic activity of ecdysteroids and steranabols. Pharm Chem Journal 34(4):193-197. TÃ´th N, Szabd A, Kacsala P, HÃ©ger J, ZÃ dor E. 2008. 20-Hydroxyecdysone increases fiber size in a muscle-specific fashion in rat. Phytomedicine 15: 691-698. 5 Wang X, McLennan SV, Allen TJ, Twigg SM. 2010. Regulation of pro-inflammatory and pro-fibrotic factors by CCN2/CTGF in H9c2 cardiomyocytes. J Cell Comm. Signal 4: 15-23 Yin Z., Ren J., Guo W. (2014), Sarcomeric protein isoform transitions in cardiac muscle: A journey to heart failure. Biochim Biophys Acta. 1852(1):47-52 10 REVENDICATIONS1. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'une myopathie. 2. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'affections rÃ©sultant d'une altÃ©ration de la fonction musculaire provoquÃ©e soit par une myopathie gÃ©nÃ©tique soit par une myopathie acquise. 3. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s selon la revendication prÃ©cÃ©dente dans laquelle la fonction musculaire est celle du muscle striÃ© squelettique ou du myocarde. 4. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s selon la revendication prÃ©cÃ©dente dans laquelle l'altÃ©ration de la fonction musculaire est une hypertrophie du myocarde. 5. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications 2 Ã 4, caractÃ©risÃ© en ce que la fonction musculaire est au moins en partie altÃ©rÃ©e par l'installation progressive d'une fibrose. 6. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement d'une myopathie rÃ©sultant d'une altÃ©ration gÃ©nÃ©tique. 7. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement 25 d'une myopathie rÃ©sultant d'une mutation du gÃ¨ne de la dystrophine. 8. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s, destinÃ©s Ã Ãªtre utilisÃ©s dans le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et/ou la dystrophie musculaire de Becker (BMD). 20 30 3065642 22 9. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications prÃ©cÃ©dentes, caractÃ©risÃ©s en ce que la 20- hydroxyecdysone est un composÃ© de formule (I) : OH OH= O 5 (I) 10. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon la revendication prÃ©cÃ©dente, caractÃ©risÃ© en ce que la 20-hydroxyecdysone est un extrait de plante ou d'une partie de plante, ladite plante Ã©tant choisie parmi 10 les vÃ©gÃ©taux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone de formule (I), en poids sec dudit vÃ©gÃ©tal, ledit extrait comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone de formule (I). 11. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon la revendication 15 prÃ©cÃ©dente, caractÃ©risÃ© en ce que l'extrait comporte entre 0 et 0,05 % en poids sec de l'extrait d'impuretÃ©s susceptibles d'affecter l'innocuitÃ©, la disponibilitÃ© ou l'efficacitÃ© d'une application pharmaceutique dudit extrait. 12. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications 5 Ã 6, caractÃ©risÃ© en ce que la plante est choisie parmi Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga. 13. 20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications 5 Ã 7, caractÃ©risÃ© en ce que la 20-hydroxyecdysone est un extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone de formule (I). 3065642 23 14.20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 3, caractÃ©risÃ© en ce qu'un dÃ©rivÃ© est un composÃ© de formule gÃ©nÃ©rale (II) : Q-R1 5 dans laquelle : V-U est une liaison simple carbone-carbone et Y est un groupement hydroxyle ou un hydrogÃ¨ne, ou V-U est une liaison Ã©thylÃ©nique C=C ; 10 X est un oxygÃ¨ne, Q est un groupement carbonyle ; R1 est choisi parmi : un groupement (C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (CiC6)W(C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); un groupement (C1-C6)A, A reprÃ©sentant un hÃ©tÃ©rocycle Ã©ventuellement 15 substituÃ© par un groupement de type OH, OMe, (Ci-C6), N(C1-C6), CO2(C1- C6) ; un groupement CH2Br ; W Ã©tant un hÃ©tÃ©roatome choisi parmi N, O et S. 15.20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon la revendication 20 prÃ©cÃ©dente, caractÃ©risÃ© en ce que dans la formule (II) : Y est un groupement hydroxyle ; R1 est choisi parmi : un groupement (C1-C6)W(C1-C6) ; un groupement (C1- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); un groupement (C1-C6)A, A reprÃ©sentant un hÃ©tÃ©rocycle Ã©ventuellement 25 substituÃ© par un groupement de type OH, OMe, (C1-C6), N(C1-C6), CO2(C1- C6). W Ã©tant un hÃ©tÃ©roatome choisi parmi N, O et S. 3065642 24 16.20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications10 Ã 11, caractÃ©risÃ© en ce qu'ils sont choisis parmi : - nÂ°1 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13-dimÃ©thy1-17-(2- morpholinoacÃ©tyI)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-dÃ©cahydro-1H- 5 cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°2 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-1712-(3- hydroxypyrrolidin-1-yl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thyl-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°3 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(4-hydroxy-1- 10 pipÃ©ridyl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16, 17-dÃ©cahydro-1H- cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°4 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-171244-(2- hydroxyÃ©thyl)-1-pipÃ©ridyl]acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15, 16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; 15 - nÂ°5 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-1742-(3- dimÃ©thylaminopropyl(mÃ©thyl)amino)acÃ©ty1]-2,3,14-trihydroxy-10, 13-dimÃ©thy1- 2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°6 : 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13- dimÃ©thy1-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-dÃ©cahydro-1H- 20 cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-17-yl]Ã©thyl]sulfanylacÃ©tate d'Ã©thyle; - nÂ°7 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-Ã©thylsulfanylacÃ©ty1)-2,3,14- trihydroxy-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16, 17-dÃ©cahydro-1Hcyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one; - nÂ°8 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(2- 25 hydroxyÃ©thylsulfanyl)acÃ©ty1]-10,13-dimÃ©thy1-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- dÃ©cahydro-1H-cyclopenta[a]phÃ©nanthrÃ¨n-6-one. 17.20-hydroxyecdysone et ses dÃ©rivÃ©s pour Ãªtre utilisÃ©s selon l'une quelconque des revendications 10 Ã 12, caractÃ©risÃ© en ce que le dÃ©rivÃ© est de formule (III) : 3065642 25 HO HO