FR 3056403 A1 20180330 FR 1601418 A 20160928 RESUME La présente invention a pour objet l'activité bactéricide d'un mélange de dérivés terpéniques ci-après dénommé TTOD, un dérivé de l'huile essentielle d'arbre à thé dépourvu de la majorité de ses monoterpènes. L'activité du TTOD peut être utilisée en tant qu'agent antibactérien dans le traitement préventif ou curatif d'infections ou de contaminations. ETAT DE LA TECHNIQUE Depuis leur découverte au début du vingtième siècle, de nombreuses molécules utilisées comme antibiotiques ont permis de traiter différentes infections, jusqu'alors incurables. La résistance aux antibiotiques est l'un des enjeux majeurs de la santé publique du vingt et unième siècle, qui engendre une augmentation des coûts hospitaliers et de la mortalité (1). Elle s'accompagne d'un sévère manque de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces. Ces nouvelles molécules, sont le plus souvent de synthèse, similaires aux molécules existantes, et de ce fait engendrent malheureusement l'apparition de résistances, plus rapidement qu'il y a de nouvelles molécules crées. Sans nouveaux traitements, les infections aux bactéries résistantes et multi résistantes aux antibiotiques engendreront 10 millions de morts par ans d'ici 2050 (1, 2). L'utilisation de cocktails de molécules actives, agissant en complémentarité, sur plusieurs cibles et en tuant rapidement les bactéries, sont aujourd'hui la meilleure stratégie contre les infections devenues incurables, et contre l'apparition de résistance aux antibiotiques. Et c'est en s'inspirant de la nature que les cocktails les plus efficaces peuvent être créés. Le Tea Tree ou « arbre à thé » (Melaleuca alternifolia) était autrefois utilisé par les aborigènes d'Australie pour soigner de nombreux maux. La plante était traditionnellement utilisée en inhalation pour traiter les rhumes, la toux et était dispersée sur les plaies pour favoriser la guérison (3, 4). Puis en 1992 son huile essentielle a pour la première fois été décrite pour ses incroyable propriétés désinfectantes (5). 2/15 3056403 Au cours des siècles qui ont suivi sa découverte, l'huile essentielle d'arbre à thé a prouvé son efficacité en tant qu'agent antimicrobien à spectre large, mais aussi pour ses autres propriétés telles qu'anti-inflammatoire, antioxydant, ou encore immuno-modulateur (6). Plusieurs brevets décrivent l'inhibition de croissance de bactéries par l'huile essentielle d'arbre à thé, par des techniques de Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) ou de diffusion de disque. Ainsi, à titre d'exemple : Le brevet W02014203263 décrit une combinaison d'huiles essentielles, testée en CMI en microdilution sur Actinomyces viscosus, inhibant la croissance bactérienne pour des applications en hygiène buccodentaire. Le brevet CA2665983 décrit une huile essentielle de plante à l'activité antimicrobienne augmentée par l'ajout d'huile essentielle d'origan, et de cannelle ainsi que de polyionique organique ou inorganique pour des applications en médecine vétérinaire. Le brevet US2006/0068044 décrit un extrait d'huile essentielle d'arbre à thé inhibant la croissance de microorganismes par la technique de zones de diffusion comprenant des bactéries Gram négatif et positif, ainsi que des moisissures. Son activité sur des virus est aussi décrite. Dans ce même brevet, un autre extrait d'huile essentielle d'arbre à thé présente des propriétés d'inhibition de croissance par la technique de CMI sur Staphylococcus aureus ATCC 33591, et un SARM. Il est bien connu de l'homme de l'art que l'huile essentielle d'arbre à thé dans sa forme originelle, peut contenir jusqu'à 40% de molécules toxiques et irritantes, comme les monoterpènes et les produits issus de leur dégradations ce qui limite ses applications. Il est alors essentiel de séparer ces molécules nocives des composés bénéfiques présents dans l'huile essentielle d'arbre à thé. L'inventeur a développé un processus d'extraction permettant de retirer la très grande majorité des monoterpènes toxiques et irritants contenus dans l'huile essentielle d'arbre à thé, sans en affecter ses propriétés biologiques. Le brevet US 2013/0158127 décrit l'activité inhibitrice d'une fraction d'huile essentielle d'arbre à thé. Il est caractérisé comme bactériostatique, d'après la technique de CMI en micro-dilution, sur un 3/15 3056403 ensemble de microorganismes bactéries Gram négatif et positif ainsi que des levures et moisissures. L'invention est aussi décrite comme ayant une activité antivirale testée in vivo sur des macaques infectés par la dengue. Par comparaison, la toxicité sur cellules FIFF-1 de l'huile essentielle d'arbre à thé est plus élevée que celle de la fraction décrite. L'ensemble de ces brevets utilisent des techniques telles que la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) ou la diffusion par disque qui ne permettent de mettre en évidence que des inhibitions de croissance, aussi appelées propriétés bactériostatiques, et non des propriétés bactéricides (létales). DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention est basée sur l'activité bactéricide du TTOD, dérivé de l'huile essentielle d'arbre à thé, sur des bactéries au métabolisme actif (division) et ralenti (persistance). L'objet de la présente invention est l'activité bactéricide rapide du TTOD associée à l'incapacité des bactéries à y développer une résistance acquise ce qui présente à titre d'exemple, mais de manière non exhaustive, un intérêt pour les industries pharmaceutiques, vétérinaires, de l'hygiène et de la cosmétique. L'huile essentielle d'arbre à thé contient environ 40% de monoterpènes, bien connus de l'homme de l'art pour leurs propriétés antimicrobiennes largement décrites. Elle contient également des sesquiterpènes et alcools terpéniques. Il a été démontré que les sesquiterpènes et les alcools terpéniques possèdent également des propriétés antiniicrobiennes. Mais les travaux visant à le démontrer se focalisaient sur l'inhibition de croissance en utilisant des techniques de recherche de concentration minimale inhibitrice de croissance (CMI) ou d'inhibition de croissance par diffusion de disque, et non la démonstration d'un réel pouvoir bactéricide. Ainsi, l'homme de l'art ne peut que conclure que sur la base des données disponibles, la propriété antimicrobienne/antibactérienne de l'huile essentielle d'arbre à thé est en partie due aux monoterpènes qu'elle contient. 4/15 3056403 Le TTOD est obtenu par un processus de distillation contrôlé à partir d'huile essentielle d'arbre à thé. Il est quasiment dépourvu de monoterpènes ( 80% masse/masse). Ainsi donc, sur la base des arguments précédemment exposés, l'homme de l'art s'attend à ce que le TTOD ait un pouvoir bactéricide inférieur à celui de l'huile essentielle d'arbre à thé, puisque déplété de l'essentiel des monoterpènes. De manière surprenante, l'inventeur a constaté un maintien de l'activité antibactérienne du TTOD, alors que ce dernier est dépourvu de la très grande majorité des monoterpènes connus pour être de très bons antimicrobiens. De plus, le TTOD s'est montré au moins aussi bactéricide que l'arbre à thé contre les bactéries pathogènes. La concentration de certaines molécules actives ciblées dans le TTOD, qui sont le terpinène-4-ol et l'a-terpinéol, associée à la déplétion des molécules réputées actives, mais aussi toxiques, irritantes, ou allergènes, n'affecte pas les activités biologiques du TTOD. Le TTOD, biocide à spectre large, peut être utilisé par exemple, mais de manière non exhaustive, dans des formulations pour développer des désinfectants ou antiseptiques pour l'Homme ou l'animal Le TTOD peut également être incorporé dans des pansements, tissus, et autres dérivés, pour désinfecter les plaies, écorchures ou autres blessures externes. Le TTOD, peut être aussi utilisé dans des formulations pour l'hygiène de l'Homme ou l'animal en tant que savon, crème, ou lotion aux propriétés multiples, comme par exemple, mais de manière non exhaustive : antipelliculaire, assainissement de la peau, anti-acné, répulsif. 11 peut aussi être utilisé en formulation pour l'hygiène intime en prévention ou traitement d'un déséquilibre de la flore impliquant ou menant à des infections de la sphère uro-vaginale. Le TTOD, efficace contre la plaque dentaire, peut être incorporé dans des produits d'hygiènes buccale, tel que des chewing-gums, bain de bouches, dentifrices, fils dentaire. 5/15 3056403 EXEMPLES DE REALISATION L'invention et son intérêt sont bien illustrés dans les exemples ci-dessous, qui n'ont toutefois aucune portée limitative. Les exemples ci-après présentent des tests effectués en milieu Mueller Hinton répétés deux à trois fois de manière indépendante. Exemple 1 : Composition du TTOD Le tableau 1 représente la composition de l'huile essentielle d'arbre à thé et du TTOD. Les données en pourcentage indiquent les quantités maximales et minimales obtenues sur 3 productions indépendantes de TTOD, les données de l'huile essentielle d'arbre à thé correspondent aux directives de la norme ISO/FDIS 4730 :2004 (n=3). Le TTOD est ainsi composé de terpènes à une concentration en masse/masse inférieure à 0,2% pour l'a-pinène, 0,2% pour le sabinène, 0,5% pour l'a-terpinène, 0,2% pour le limonène, 0,6% pour le pcymène, 0,5% pour le 1-8-cinéol, 3% pour le y-terpinène, 1% pour le terpinolène. Le TTOD présente également une concentration en masse/masse supérieure à 68% pour le terpinèn-4- ol, à 4% pour l'a-terpinéol. La composition du TTOD en molécules indésirables (monoterpènes) est bien inférieure à celle de l'huile essentielle d'arbre à thé. En effet, ils composent seulement 4% du TTOD en masse/masse, tandis que les molécules bénéfiques sont présentes à plus de 71% et 5% pour le terpinène-4-ol et l'aterpinéol respectivement en masse/masse. Tableau 1 HE d'arbre à thé TTOD Famille de terpènes Molécule (%) min / max (%) min / max Monoterpenes a-Pinene 2.5 Trace Sabinene 0.2 Trace a-Terpinene 9 / 11 0.3 / 0.4 6/15 3056403 Limonene 1 / 2 0.03 / 0.07 p-Cymene Trace / 2 0.2 / 0.4 1,8-Cineol (Eucalyptol) Trace / 2 Trace / 0.3 y-Terpinene 20 / 23 1.7 / 2.8 Terpinolene 4 0.5/0.8 Alcools Terpinen-4-ol 42 / 46 71 / 75 Monoterpeniques a-Terpineol 4/ 5 5/ 9 Sesquiterpenes Aromadendrene Trace / 2 1.9 / 3.3 Leden (Viridiflorene) Trace / 0.8 0.9 / 2.8 6-Cadinene Trace / 0.7 0.6 / 2.2 Alcools Globulol Trace / 0.4 0.4 / 0.9 Sesquiterpeniques Viridiflarol Trace / 0.2 0.2 / 0.4 Exemple 2 : Activité bactéricide du TTOD Le tableau 2 représente les résultats de Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et Bactéricide (CMB) du TTOD sur les souches bactériennes Staphylococcus aureus, Staphyloccus aureus résistant à la méthicilline (SARM), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Les concentrations testées en dilutions sérielles vont de 0,0049% à 2,5% de TTOD. Un contrôle d'activité est effectué en parallèle avec un antibiotique de référence : l'ampicilline (0,020-10 itg/ml), ou l'amoxicilline ou la gentamicine (0,049-25 tg/ml) (n=3). Tableau 2 CMI CMB TTOD Antibiotique TTOD Antibiotique Ordre Genre Espèce (%) (i1g/m1) (%) (µg/ml) Bacillales Staphylococcus S. aureus 1,25 0,078 1,25 - 2,5 5 - 10 7/15 3056403 SARM 1,25 1,25 2,5 1,25 Pseudomonales Pseudomonas P. aeruginosa 1,25 0,39 1,25 - 2,5 0,2 - 1,56 Enterobacteriales Escherichia E. coli 1,25 6,25 0,62 - 1,25 6,25 - / Le graphique 1 (a-h) représente les cinétiques de croissance par dénombrement de Staphylococcus aureus, SARM, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa en présence de concentrations croissantes en TTOD allant de 1,25% à 5%. Les tests ont été effectués en parallèle d'un antibiotique de référence et du solvant de TTOD, le diméthylsulfoxyde (DMSO) (n=2). L'activité bactéricide du TTOD est définie dans un premier temps par une valeur de la CMB identique à celle de la CMI. La cinétique des souches en présence du TTOD montre une activité bactéricide sur les bactéries Gram Positif en seulement 1h à 5%. La cinétique des souches en présence du TTOD montre une activité bactéricide sur les bactéries Gram Négatif en seulement lh à 1,25%. Le TTOD est au moins aussi efficace sur les bactéries sensibles que sur les bactéries résistantes et multi résistantes aux antibiotiques, avec des concentrations efficaces égales ou inférieures sur les bactéries résistantes et multi résistantes par rapport aux bactéries sensibles. Exemple 3 : Absence d'apparition de résistance au traitement par le TTOD Le tableau 3 présente les résultats des CMIs des bactéries exposées et non exposées au TTOD et aux antibiotiques de référence pendant 30 passages. E. coli est testé sur l'amoxicilline ; P. aeruginosa sur la gentamicine ; S. aureus sur l'ampicilline. Le breakpoint définit la concentration à atteindre pour considérer la souche comme résistante à l'antibiotique (EUCAST Clinical Breakpoint Table y. 3.1, valid from 2013- 02-11) (n=2). Le TTOD montre les mêmes valeurs de CMI après 30 passages de bactéries en présence de concentrations sub-inhibitrices de TTOD. Les résultats témoignent de l'incapacité des bactéries à développer des systèmes de résistances au TTOD. Pour les souches et antibiotiques utilisés en contrôles, P. aeruginosa développe 8/15 3056403 une résistance à la gentamicine, S. aureus développe une résistance à l'ampicilline, et E. coli se rapproche du seuil de résistance à l'amoxicilline Tableau 3 CMI TTOD (%) CMI Antibiotique (µg/ml) Souche Non exposée Non exposée Non exposée Exposée Breakpoint E. coli 0,25-0,25 0,25-0,25 2 7 8 P. aeruginosa 0,5-0,25 0,25-0,25 0,25 >5 4 S. aureus 1-0,5 1-0,5 0,078 >0,16 0,12 Exemple 4 : Activité du TTOD sur les bactéries en croissance et en persistance Le tableau 4 présente les résultats de CMB obtenus en présence de TTOD et de son antibiotique de référence l'amoxicilline sur E. coli, en phase de croissance en comparaison à E. coli en phase de persistance. Les bactéries en persistance, sont aussi sensibles à l'activité bactéricide du TTOD que lorsqu'elles sont en croissance. La même CMB, à une dilution sérielle d'ordre 2 près, a été mesurée. En revanche, E. coli en phase de persistance est est plus résistant à l'amoxicilline avec aucune CMB mesurée, même à la concentration maximale testée de 50 .tg/ml, alors qu'elle est de 12,5 lig/mi en phase de croissance. Le TTOD est efficace contre E. coli en phase de croissance et de persistance avec la même intensité. Tableau 4 CMB Phase TTOD (%) amoxicilline (µg/ml) Croissance 0,63 12,5 Persistance 1,25 Exemple 5 : Gel topique Exemple de composition d'un gel topique 9/15 3056403 Glycérine 12 g Cyclopentasiloxane/Cyclotetrasiloxane/Dimethiconol 2 g Octydodecanol 2 g Carbomère 974P 0,5 g Gomme Xanthane 0,3 g Hydroxyde de sodium 0,25 g TTOD 1 g Eau Qsp 100 g Exemple 6 : Produit cosmétique Exemple de composition d'une crème cosmétique anti-acnéenne : Cire d'abeille 11 g Ethoxydiglycol 4 g Octydodecyl myristate 10 g Isostéaryl Isostéarate 9 g Hydroxyde de sodium 0,4g TTOD 0,5 g Eau, conservateur, parfum Qsp 100 g Exemple 7 : Produit cosmétique Exemple de solution hydroalcoolique antiseptique : Alcool 68 °A Eau 30,3-28,8 % TTOD 1-2 % Gélifiant 0,5 % Huile essentielle de thym 0,1-0,5% Huile essentielle de ravintsara 0,1-0,2% Exemple 8 : Crème exfoliante Exemple de crème exfoliante antiseptique : 10/15 3056403 Eau florale 48,5-58 % Huile de graines de sésame 15 % Eau 15-5 % Glycérine 5 % Base autoémulsifiante 5 ')/0 Exfoliant minéral 8 % Kaolin 2 % TTOD 1-1,5 % Agent gélifiant 0,3 ')/0 Conservateurs 0,2 % Exemple 8 : Baume nourrissant Exemple de baume nourrissant nettoyant : Hydrolat de camomille 39 g Hydrolat de lavande vraie 18 g Eau 14,9 g Glycérine 10 g Huile végétale de macadamia 5 % Montanov 68 4 % Beurre de cupuacu 2% Huile végétale de césame 2 % Huile végétale de calophyllum 1 'Yo Huile essentielle de millepertuis 1 Isocide bas 0,5 'Yo Huile essentielle de lavande vraie 0,5 % Huile essentielle de palmarosa 0,35 % Xanthane 0,2 % Copherol 1300 0,2 % Sorbate de potassium 0,2% Acide citrique 0,2 4)/0 TTOD 0,1 % 11/15 3056403 LEGENDES Tableau 1 : Profil chromatographique de l'huile essentielle (HE) d'arbre à thé et de TTOD. Tableau 2: CMI et CMB du TTOD et des antibiotiques. L'ampicilline est l'antibiotique de référence de Staphylococcus aureus, et du SARM, la gentamicine est l'antibiotique de référence de Pseudomonas aeruginosa, et l'amoxicilline est l'antibiotique de référence de Escherichia coll. I : Pas de CMI ni de CMB aux concentrations testés. Graphique 1: Courbes de time-Kill de E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, et du SARM. a, c, e, g) En présence d'antibiotiques (ATB) ; b, d, f, h) En présence de TTOD. Les expériences ont été menées en triplicata indépendants. Losanges = Contrôle croissance, carré = CMI, triangles = 2xCMI, et ronds = 4xCMI. La moyenne des courbes de DMSO (trois concentrations) représente le contrôle du TTOD, tandis que les antibiotiques ont été remplacés par de l'eau pour leurs contrôles. Tableau 3 : Résultats des CMIs des bactéries exposées et non exposées aux antibiotiques de référence. E. coli testé avec l'amoxicilline ; P. aeruginosa avec la gentamicine ; S. aureus avec l'ampicilline. Le breakpoint définit la concentration à atteindre pour considérer la souche comme résistante à l'antibiotique (EUCAST Clinical Breakpoint Table y. 3.1, valid from 2013-02-11). Tableau 4 : Résultats des CBM sur E. coli en phase de croissance ou de persistance en présence de TTD et d'amoxicilline. / : Pas de CMB aux concentrations testées. MATERIEL ET METHODE L'efficacité du TTOD est testée sur quatre souches bactériennes : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM). Matériel. L'ampicilline, l'amoxicilline, et la gentamicine (Sigma-Aldrich) sont préparés dans de l'eau stérile. Pour augmenter la solubilité du TTOD, du Dimethyl sulfoxide (DMSO) est utilisé (10% TTOD dans DMSO 10%). Staphylococcus aureus CIP 4.83, SARM CIP 107422, Pseudomonas aeruginosa 12/15 3056403 CIP 82.118, et Escherichia coli CIP 53.126, sont cultivés en bouillon/gélose milieu Mueller Hinton (B/GMH). Concentration minimale inhibitrice et bactéricide (CMI/B). Les CMI sont menées en microdilutions selon les directives du CLSI 2009 (7), pendant 18h à 37°C. La concentration maximale testée en TTOD et DMSO est de 2,5%, de 10 µg/ml pour l'ampicilline, et de 25 µg/m1 pour l'amoxicilline et la gentamicine. 500 des puits sans croissance visible sont étalés sur géloses nutritive de tripticase soja (GTS) et incubés minimum 24h pour comptage. La CMB est définie par une réduction de 4 Logi° de l'inoculum soit 99,99% de diminution. Un contrôle positif sans produit et un contrôle négatif sans bactérie sont réalisés pour chaque test, ainsi qu'un contrôle solvant avec le DMSO pour chaque concentration utilisée dans les préparations de TTOD. Chaque test est effectué trois fois indépendamment. Pour étudier les persisteurs, le même protocole est utilisé sauf que les bactéries sont inoculées dans du PBS. L'absence de nutriment incite les bactéries à ralentir leur métabolisme et à se stabiliser en phase stationnaire. Pour insister sur ce fait, la suspension en PBS est préparée et incubée 3h avant le lancement du test. Le dénombrement de la suspension s'effectue après les 3h d'incubation pré-test (=inoculum), et après les 24h post-test (CMB). La lecture se fait uniquement par CMB en étalant tous les puits et en dénombrement le témoin positif pour valider qu'il soit proche à 1 ou 2 Logi° près de l'inoculum utilisé pour le test. Cinétique de croissance par dénombrement. L'étude de la cinétique de croissance par dénombrement est adaptée d'un protocole publié (8). Trois concentrations en antibiotique, DMSO et TTOD sont testées pour chaque bactérie, correspondant à la CMI, 2xCMI et 4xCMI (sauf pour le DMSO dont les concentrations sont identiques aux concentrations de TTOD testées). Les concentrations en antibiotiques testées sur le SARNIsont les mêmes que celles testées sur S. aureus. La suspension bactérienne utilisée pour l'inoculum est préparée à 5.105-106 UFC/mL dans du BMH. Le test est mené en microplaque 96 puits à fond rond. Chaque test est effectué sur trois puits qui sont ensuite regroupés et dénombrés sur géloses TS à chaque mesure. De cette manière, les conditions d'expérimentation sont similaires à celle des CMI et CMB ce qui permet une comparaison pertinente 13/15 3056403 des résultats. Concernant l'interprétation des résultats, le dénombrement est exprimé en log10 en fonction du temps de contact. Chaque test est effectué trois fois indépendamment. Développement de résistance acquise. Cette technique permet de déterminer la capacité des microorganismes à s'adapter à un antimicrobien (diminution de sa sensibilité). Elle est adaptée de deux méthodes publiées (9, 10). La technique reprend le même schéma de plaque que les tests de CMI, dans des microplaques 96 puits à fond rond. Les concentrations testées sont préparées en fonction de la CMI préalablement obtenue, variant de 0.5% entre deux puits consécutifs. Trente passages au minimum sont effectués. Un passage correspond classiquement à un jour ou deux (sauf croissance lente du microorganisme). Lors de chaque passage, le puit à la concentration en principe actif le plus élevé ayant une croissance est inoculé sur une nouvelle gamme de concentration. La gamme de concentrations peut être redéfinie à chaque passage en fonction d'une apparition d'adaptation. La plaque est ensuite placée dans un contenant clos saturé en humidité, et incubée à la température optimale de croissance jusqu'au prochaine passage. Une fois les 30 passages effectués, la souche exposée est testée en CMI standard en présence du principe actif et de l'antibiotique de référence, en parallèle de la même souche non exposée. Tous les cinq passages, une coloration de Gram (plus test oxydase si besoin) est effectuée en parallèle d'un isolat sur gélose riche afin de valider la pureté de la suspension et observer une éventuelle modification morphologique (ex : activation du système SOS). 14/15 3056403 290 REFERENCES (1) Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. U.S. Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention. (2) Estimating the economic costs of antimicrobial resistance, 2014, RAND (3) Shemesh, A., and W. L. Mayo. 1991. Australian tea tree oil: a natural antiseptic and fungicidal 295 agent. Aust. J. Pharm. 72:802-803. (4) Low T. 1990. Bush medicine. Harper Collins Publishers, North Ryde, NSW, Australia. (5) Penfold, A. R., and R. Grant. 1925. The germicidal values of some Australian essential oils and their pure constituents, together with those for some essential oil isolates, and synthetics. Part III. J. R. Soc. New South Wales 59:346-349 300 (6) Carson CF, Hammer KA, Riley TV. 2006. Melaleuca alternifolia (Tea Tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clin Microbiol Rev. 2006 Jan;19(1):50-62. (7) Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, CLSI, 2008 (8) Ojo SKS, Ejims-Enukwe O, Esumeh FI. In-vitro antibacterial Time-Kill assay of Phyllanthus Amarus and Diodia Scandens crude extracts a Staphylococci isolated from wound and burns patients. 305 International J pharmaceutical science invention, Volume 2 issue 8 august 2013 p09-13. (9) Hammer KA, Carson CF, Riley TV. 2012. Effects of Melaleuca alternifolia (tea tree) essential oil and the major monoterpene component terpinen-4-ol on the development of single- and multistep antibiotic resistance and antimicrobial susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Feb;56(2):909-15. doi: 10.1128/AAC.05741-11. Epub 2011 Nov 14. 310 (10) Cooper RA, Jenkins L, Henriques AF, Duggan RS, Burton NF. 2010. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010 Oct;29(10):1237-41. doi: 10.1007/s10096-010-0992-1. Epub 2010 Jun 13. REVENDICATIONS1. Composition comprenant un produit naturel obtenu par un processus de distillation contrôlée à partird'huile essentielle d'arbre à thé ou Melaleuca alterntfolia en tant qu'agent bactériostatique, bactéricide ou biocide. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit naturel issu de l'huile essentielle d'arbre à thé présente une concentration en masse/masse inférieure à 0,2% pour l'a-pinène, 0,2% pour le sabinène, 0,5% pour l'a-terpinène, 0,2% pour le limonène, 0,6% pour le p-cymène, 0,5% pour le 1-8-cinéol, 3% pour le y-terpinène, 1% pour le terpinolène. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit naturel issu de l'huile essentielle d'arbre à thé présente une concentration en masse/masse supérieure à 68% pour le terpinèn-4-ol, à 4% pour l'a-terpinéol. 4. Composition selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle présente une activité bactéricide soit une diminution de l'inoculum d'au moins 4log soit 99,99% sur des bactéries pathogènes en moins d'une heure, à une concentration supérieure à 1,25% sur les bactéries Gram négatif, et à 5% sur les Gram positif. 5. Composition selon les revendications 1 à 3 est caractérisée en ce qu'elle est bactéricide sur les souches bactériennes sensibles ou résistantes à un ou plusieurs antibiotiques avec la même efficacité. 6. Composition selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisée en ce que les bactéries ne développent pas de résistance acquise. 7. Composition selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisée en ce qu'elle est au moins aussi bactéricide sur les bactéries en persistance que sur les bactéries en croissance. 8. Utilisation de la composition selon les revendications 1 à 3, pour la fabrication de formulations pour développer des désinfectants ou antiseptiques pour l'Homme ou l'animal. 9. Utilisation de la composition selon la revendication 8 pour son incorporation dans des pansements et autre dérivés. 10. Utilisation de la composition selon les revendications 1 à 3, pour la fabrication de formulations pour l'hygiène de l'Homme ou l'animal. 6 3056403 11. Utilisation de la composition selon la revendication 10 pour son incorporation dans des savons de corps, visage, main, de l'hygiène intime, ou dans du shampoing. 12. Utilisation de la composition selon la revendication 10 pour son incorporation dans des crèmes pour le corps, les mains, le visage, les pieds. 13. Utilisation de la composition selon la revendication 10 pour son incorporation dans des produits d'hygiènes buccale, tel que des chewing-gums, bain de bouches, dentifrices, fils dentaire.