FR 3059870 A1 20180615 FR 1662255 A 20161209 1 PLANTES DE LIN A HAUTE TENEUR EN OMEGA-3 La présente invention concerne un procédé d'augmentation de la teneur en acide gras C18:3, ou acide alpha-linolénique, d'une graine de lin, ainsi que les plantes qui en résultent, et ce via l'augmentation de l'expression de la 415 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine au sein de la plante. La culture du lin est l'une des plus anciennes cultures utilitaires, les premières traces de son utilisation datant de 8000 av. JC en Turquie. Sa dénomination Linum usitatissimum, traduit du latin « lin le plus utile », fait référence à ses multiples débouchés. Actuellement, le lin est utilisé dans les domaines de l'industrie textile (fibre), alimentaire (graine et huile) et chimique (huile). Les particularités de la graine de lin résident dans sa teneur en huile (de 35 à 45%) et le profil en acides gras de son huile à dominance d'acide alpha-linolénique (C18:3, 48 à 65%). La triple insaturation de cet acide gras confère à l'huile une grande réactivité vis-à-vis de l'oxygène et donc une forte siccativité. Cette aptitude de l'huile à polymériser et à sécher rapidement lorsqu'elle est déposée en couche mince est intéressante pour des applications oléochimiques. Cependant dans le cadre d'une utilisation alimentaire, cette réactivité chimique induit une dégradation organoleptique rapide de l'huile. Les graines de lin sont utilisées en alimentation humaine et animale, (respectivement 5% et 18% dans l'Union Européenne). Mais dans ces domaines, la France présente un profil différent de ses homologues européens. En effet les récentes évolutions liées aux demandes des éleveurs, des organisations de santé et surtout des consommateurs, ont conduit à un changement drastique de son utilisation. Ainsi, en France 75 à 95% des graines de lin produites et utilisées sur le territoire le sont en alimentation animale. Cette tendance s'explique donc par une demande croissante en aliments riches en Oméga-3 (oeufs, viande, lait). A ce niveau, la filière Bleu-Blanc-Coeur s'est donnée pour mission de promouvoir et de contrôler la qualité des produits alimentaires issus des filières (notamment du lin oléagineux) pour assurer aux consommateurs une haute qualité dans le domaine animal, environnemental et de la santé humaine. Pour les Oméga-3 chez le lin, c'est-à-dire l'acide alpha-linolénique (ALA), dans cette filière alimentaire Bleu-BlancCoeur, la limite basse acceptée est à 48% de C18:3 dans l'huile du lot récolté. En 3059870 2 dessous de cette limite basse le prix de référence subit une décote de 30 euros/tonne. A contrario, à partir d'une teneur en C18:3 de 56%, une prime de 3 euros/tonne est appliquée par rapport au prix de référence. Dès 60% elle est de 15 euros/tonne en plus du prix de référence. Cette prime peut atteindre 30 euros/tonne 5 par rapport au prix de référence pour une teneur supérieure à 62% en C18:3. On comprend aisément l'intérêt de disposer de lin haut producteur de C18:3. En 2013, la France produisait plus de 16 000 tonnes de graines de lin oléagineux sur 8 510 hectares, ce qui ne suffisait qu'à couvrir la moitié de ses besoins. La production de graines de lin oléagineux est un marché de niche mais qui tend à 10 un fort développement dans les années à venir. Actuellement les contrats entre producteurs, collecteurs et industriels, ont fixé un prix minimal pour l'agriculteur de 350E/t (Oméga-3 70%). Après fixation par autopollinisations successives, la lignée M48 fut croisée avec trois autres 10 lignées : L1, L2 et L3 (voir Figure 1). L1, L2, L3 : lignées de lin oléagineux standard de la sélection Laboulet Semences. M48 : lignée mutée à haute teneur sur fond génétique M1. Dans la descendance de ces croisements, une fixation et sélection ont été effectuées durant les 10 générations suivantes, afin de créer des variétés à haute 15 teneur en C18:3 et performantes au niveau agronomique. HT1, HT2, HT3 : lignées fixées issues des croisements avec la lignée à haute teneur. La plante Linum usitatissimum VL8.29.3 déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016 correspond à la HT3. 20 Dosage des acides gras en CPG La teneur des différents acides gras est importante pour les débouchés alimentaires des huiles. De ce fait la teneur en C18:3 des graines de lin est primordiale pour leur 25 valeur commerciale. Un bulk provenant d'une même plante est broyé, puis l'huile est extraite du broyat grâce à de l'isooctane et transestérifié avec une solution méthanolique d'hydroxyde 3059870 43 de potassium. Les esters méthyliques d'acides gras sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Le teneur en acide linolénique est déterminée par chromatographie gazeuse des esters méthyliques d'acides gras selon la norme de Organisation Internationale de 5 Normalisation, Animal and vegetable fats and oils 1505508:1990E. Séquençage Les extractions d'ADN génomique ont été réalisées selon le protocole du kit DNeasy 10 Plant Mini Kit (Qiagen). Le génome complet des lignées HT1, HT2, VL8.29.3 et L1 ont été séquencés avec un séquenceur très haut débit Hiseq2500 (Illumina). Positionnement de la délétion 15 - Les génomes complets de HT1, HT2, HT3 (VL8.29.3) et L1 ont été séquencés et alignées. - HT1, HT2, HT3 (VL8.29.3) sont les seuls à posséder une délétion (en comparaison à L1 et aux bases de données accessibles sur le lin) en amont d'une désaturase delta-15 expliquant la surexpression de celle-ci. 20 - Une publication sur des mutants de lin possédants des teneurs en C18:3 très faibles montre que des délétions dans la même zone ont conduit à une extinction génique de Lus10038321.g (Vrinten et al. 2005). - Zone promotrice 5' du gène Lus10038321.g omega-3 fatty acid desaturase; delta-15 desaturase (Linum usitatissimum clone LuBAC395P20, 25 complete sequence). 3059870 44 Résultats de rendement et de teneur en graine en C18:3 Variétés Rdt (en grain net Quinal/ha) Rdt C18:3 Germination (%) (%Temoin) (% de la MG) Eurodor (Variété Commerciale de lin jaune. Linea Lin 2000) 85.7 100 56.2 95 Lin ALA HT1 21.9 91.1 70,9 93 Lutea (variété commerciale) 18.5 76.9 62,8 89 Omegalin (variété commerciale. Terres de Lin) 23.4 97.3 66.3 .92 Festival (Variété commerciale. Laboulet Semences 24.7 102.7 60.9 96 5 Les variétés Omegalin et Festival sont les deux variétés temoins et le « 100% » de de rendement de référence auquel est comparé le rendement des autres plantes testées est la moyenne de ces deux (ie [102.7+97.31/2). On constate que la plante HT1 à haute teneur en C18:3 permet de maintenir un rendement en grains (en % par rapport à la moyenne des rendements des témoins) 3059870 dans une gamme tout à fait compatible avec une utilisation agricole et en particulier en comparaison avec les variétés Eurodor, Omégalin, Festival et Lutéa cultivées en France dans les conditions agronomiques et environnementales identiques, à savoir selon la norme VATE GEVES comme expliqué dans la description. 5 Dépôt de matière biologique : Linum usitatissimum VL8.29.3 a été déposée sous le Numéro NCIMB 42681 le 24 octobre 2016. 10 SEQ ID 1 (correspondant à la plante mutée VL8.29.3). AGAGCAAAAAAGTTGGGTGGTGTAGGCTAGTTTGTCTGAAATCAGTGTACATTTT GCATTTCCATTTACTCTTCTCCATCCACTTGGCATCCTGCATTACTTCTTCTTCGT TAGTTCTCACCAACCTACATACTCTTCGGTTATAAATACTGTGAGGCTGAAACCA 15 AAGGCCACTCAGTCTATTCATTATTATTCAAAAATATATATTGGGTTTGTTTGGTGC AGATTACAGTGACTTCAAAACTGTGGCTCTGCACGACCAAACTATGAGCCCTCC AAACTCAATGAGTCCCGCCACCAACGGCAGCACCAATGGTGTGGCTATCAATG GGGCGAAGAAGCTACTCGATTTCGACCCGAGTGCTGCTCCCCCTTTCAAGATT GCAGACATCCGTGCTGCAATCCCGCCGCATTGTTGGGTGAAGAACCCCTGGAG 20 GTCACTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTGGTCATCCTCAGCTTCGCCGTTG CGGCGACAAAGCTGGACAGCTGGACTGTCTGGCCTCTCTACTGGATTGCTCAA GGAACCATGTTCTGGGCAGTCTTTGTTCTTGGACATGATTGGTAATTTCACATGA TCTTTCTGGTAATGTGGGTTTTCTTTTCTTATTGAAAAAGATTAAAACTTTTTATCT GGGCTGTTGCATGCAGTGGCCATGGGAGCTTCTCAGACAGTTGGTTGTTGAAC 25 AACGTGATGGGACATATACTCCATTCCTCAATCCTCGTACCTTACCATGGATGGT ATTGTAACTATTGTTCGATATTCGATTATGATTACTGTTCTTTCAGATGAAGAATCT GTACCCTAATTGTTTTTTGTTACCAGGAGAATTAGCCACAAGACCCATCACCAGA ATCACGGCAATGTGGAGAAAGATGAATCCTGGGTTCCAGTAAGTTGACATGCAG TTTGCTCTAAAATGCAGAGTCCTCTGTTTTTTGTGTGTTCTTGTGCTTTAATGAC 30 GATGATAATGAAATTGAAATTTGTAATAGCTGCCGGAGAAGGTGTACAAGAGCTT GGATACCGGCACCAAGTTCATGAGGTTCACCATCCCTCTCCCAATGTTTGCGTA 3059870 46 TCCTATCTACTTGGTAAGTAAACAGACTGACTCCAAAGTAGGAACTAATGACAAT TTTGGACCCGACCTGGTTTGGTTGACTCGGGTCGATATGTTTCGGGTGGGTAAT TACCCGATCTGGCGATGGGTGTGCGGCGGACATTGTCTTGCTCGTGGTCCACC CCGCTCCCAACCCGCCCCATTCTTGACGAAAAAGATTTCGGAATATGTATCAAC 5 AGAAAAATCTAGTTTTTATGTTACTAGTTTTCTGTATTTCCATGTTTTTTCCTCAAT TCTAGCCGGAATTTGAATTCAAACTGAAATCGGGTAATTCCGTCCATAACAAAAC GGAATTGGGCAGCCGTAATTAGTTGAAACTAGACCTCAATTTTGGCGGAATTGG ACCCGGCCATTTTTTACGTTTGCAAAACGGAAAACGTTTTTCTTTTGTAAAGCGC AAAATGAAAAACGTATCTAGTGGAATTATTGGACCCATCTAGAATGGGTCCAATT 10 CCACCCCAATTTCGGCTCCAATTCATGCCCGGAAAACACTACTGTCATGCATTTT AATCTTGTATGGTTTTACCCCAATGGATGCAGCGATGGATCCGGACGATTTTTAA AATATTATCGGGTTAAATTTAAAAATATCTTAAAACTATAAGAAAAAAATAACCAATT TTAAAGAATAAAAGAACTGGACACATATGACGGGTGTCGTGGATGGATGTACTTG TCCCGCTCTATTAAAGGCTGATAATATACAGGTCAACGGTGAATGAAGGTTAGAT 15 GCGCTATTGGATTTGAATCCGATATGAAATGATAATTTTGGACACGATCTGTTTTG GGTGGGTAATATTTGATCTAGGGATGGCTCGTGCTCCAAACCGCACCAAAACCG CCTAATTCTCGACCAAAAAGATTTTATGAATACATATCAACAGAAAAATCTAGTTTT CATGTTACTAGTTTTATGTACAACAATATTAGGTGTCGTTTTCCCAGCCTTTTTCTT CAATTCCGGCCGGAATTCGCATTCAAACCGGAATTGGATGGAATCGGTATACCT 20 CGTCACGGATGCATTGTCAATTCCTAGTTAGTTTCATGGTTTTGAAACCAATCAAT CTATTCTATATGGTTTTGATTAACAGTGGAGGAGAAGTCCGGGGAAGAAAGGGT CGCATTTCAACCCATACAGTGACCTGTTCGCACCGAACGAGAGGACATCGGTCA TGATTTCGACATTGTGCTGGACAGCCATGGCCTTACTCCTCTGCTACTCATCGTT CATCTACGGCTTCCTTCCGGTCTTCAAAATCTACGGCGTCCCTTATCTAATATTC 25 GTGGCGTGGCTCGACATGGTGACCTACCTTCACCACCACGGGTACGAGCAGAA GCTGCCGTGGTACAGAGGCAAAGAGTGGAGCTACCTACGTGGAGGGCTGACG ACCGTCGATCGAGATTACGGGGTCATCAACAACATCCACCATGACATTGGCACC CATGTTATTCACCATCTCTTCCCTCAAATGCCACACTATCACCTAGTCGAAGCGG TAAGGAGGTCTTGATTATTAACTTAATGTTTTTGTTGTTATAATTTGAGTCCGATTC 30 TGGAGTCAGGGGATTTCCTTCTTGGATCCGATCCAGGATCAAGCTGGTCCCTTG AATTTCTATATGATCTTATATTAATTAAGGATAATGTGGTCATATGTTTTTAAATATTT TTGTTTACCATCATTTCCGATCACCGGAAAATGTCCTGAGCAGTTTTCCGGTCAC TTTAACCTCCATTGACAAATTTTTTCACCCACATGATCACCCTAGCCGGGTTTAC GTTTATTGAAAATTTTTATTTTTTTGAATTTTTTTTCGATGACCAACTGTACAACTTT 3059870 47 GTATTGAAAGTTGTATGGATCATACAAATGTGTATGTACAAAAGTATATTCTAAGTA CTATACTAAGCATTACTTAGTATTACGTTTCTACAAACCTATAGAGAAATGCATACA ATTTTGTATAGAACTTAGTATACACGTAGCTGTGAAATGTCAATTTCCCTCCGTAT TTTCAGAGACAAGACATGATTTTTAGACTGGCAGATTTTTTTTATCGGATAGATTT 5 CTCCAACTTCAGATTCGGACTGGATTATTAACTATATTATTCATCAACTCTGACGT TTGATGTTGCATGTGACAGACTCAGGCAGCGAAGCACGTGCTGGGGAAGTACT ACAGAGAACCGAAGAAATCAGGGCCTTTCCCATTCCACTTGTTTGGGTACTTGG TGAGGAGCCTGGGCGAGGATCACTACGTTAGCGATACAGGCGACGTCGTTTTC TATCAATCTGACCCACATATTCCCAAGTTCCCTACCAGTGCCACCACCAAGTCCA 10 AATCTAGCTGATGATATTGGCTCTGATCTGATGTATGCTGCAGGCTGTTTTATTTT GTCCTTTGTTCGTTTCTTTCTGCCAGAAACAAATTCTCTGTTTCTATGTTTCTCTG TCTCTCCCACCCCAGCTTTCTTTCTGAGTATATCGTATAAAGTTTCAAGTGATTGT AAGAGCAGGAAAGAAAAGAAGAAGAAGAATAATAA. 15 SEQ ID 2 (correspondant à la plante standard 1_1) : AGAGCAAAAAAAAAGGGGTTGGGTGGTGTAGGCTAGTTTGTCTGAAATCAGTG TACATTTTGCATTTCCATTTACTCTTCTCCATCCACTTGGCATCCTGCATTACTTC TTCTTCGTTAGTTCTCACCAACCTACATACTCTTCGGTTATAAATACTGTGAGGCT GAAACCAAAGGCCACTCAGTCTATTCATTATTATTCAAAAATATATATTGGGTTTGT 20 TTGGTGCAGATTACAGTGACTTCAAAACTGTGGCTCTGCACGACCAAACTATGA GCCCTCCAAACTCAATGAGTCCCGCCACCAACGGCAGCACCAATGGTGTGGCT ATCAATGGGGCGAAGAAGCTACTCGATTTCGACCCGAGTGCTGCTCCCCCTTT CAAGATTGCAGACATCCGTGCTGCAATCCCGCCGCATTGTTGGGTGAAGAACC CCTGGAGGTCACTCAGCTACGTCCTGAGAGACCTCCTGGTCATCCTCAGCTTC 25 GCCGTTGCGGCGACAAAGCTGGACAGCTGGACTGTCTGGCCTCTCTACTGGAT TGCTCAAGGAACCATGTTCTGGGCAGTCTTTGTTCTTGGACATGATTGGTAATTT CACATGATCTTTCTGGTAATGTGGGTTTTCTTTTCTTATTGAAAAAGATTAAAACT TTTTATCTGGGCTGTTGCATGCAGTGGCCATGGGAGCTTCTCAGACAGTTGGTT GTTGAACAACGTGATGGGACATATACTCCATTCCTCAATCCTCGTACCTTACCAT 30 GGATGGTATTGTAACTATTGTTCGATATTCGATTATGATTACTGTTCTTTCAGATGA AGAATCTGTACCCTAATTGTTTTTTGTTACCAGGAGAATTAGCCACAAGACCCAT CACCAGAATCACGGCAATGTGGAGAAAGATGAATCCTGGGTTCCAGTAAGTTGA CATGCAGTTTGCTCTAAAATGCAGAGTCCTCTGTTTTTTGTGTGTTCTTGTGCTT REVENDICATIONS1. Méthode pour accroître la quantité d'acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, ladite méthode comprenant la surexpression de la A15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante, caractérisée en ce qu'elle comprend la transformation d'une cellule végétale de Linum usitatissimum avec au moins un acide nucléique qui code pour la A15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine et est sous le contrôle d'un promoteur assurant la surexpression de la d15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine de ladite plante et la culture de la plante à maturité. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le au moins un acide nucléique comprend un acide nucléique selon SEQ ID N°1. Méthode de sélection de plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce qu'elle comprend la recherche d'un allèle du gène de la A15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine possédant une mutation résultant en un accroissement de la quantité d'acide alpha-linolénique (C18:3) chez une plante de Linum usitatissimum, Plante de Linum usitatissimum, caractérisée en ce que la teneur, en % en poids, en acide alpha-linolénique (C18:3) de l'huile des graines de la plante est supérieure à 66.7%, que le taux de germination est supérieur à 90% et que le rendement est compris entre 85 et 110% de la valeur de variétés de référence témoins suite à évaluation dans des conditions similaires en France, caractérisée en ce qu'elle comprend une modification du gène de la d15 désaturase responsable de la conversion du C18:2 en C18:3 dans la graine, que la modification du gène de la A15 désaturase est une mutation au niveau de la région promotrice dudit gène et que ladite mutation résulte d'un traitement volontaire de mutagénèse par l'action d'agents mutagènes chimiques ou physiques. Plante selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gène comprend la SEQ ID N°1. Utilisation d'une plante selon l'une des revendications 4 ou 5, ou d'une partie d'une telle plante, pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation humaine ou animale.