FR 3054320 A1 20180126 FR 1656919 A 20160720 Dispositif et procédé pour la caractérisation d'échantillons par imagerie de spectroscopie PWR ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION Domaine de l'invention La présente invention concerne un procédé de mesure par spectroscopie par résonance plasmonique aux ondes guidées (PWR - « Plasmon waveguide resonance ») en mode imagerie. Elle concerne encore un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé de mesure, notamment pour la mesure de propriétés d'échantillons anisotropes et pour suivre l'organisation latérale de ces échantillons. Arrière-plan technologique La résonance plasmonique de surface est un phénomène physique principalement connu pour son utilisation dans la mesure de l'indice de réfraction d'un échantillon placé à proximité immédiate d'un film mince métallique, dans lequel les plasmons de surface sont excités par un rayonnement polarisé incident, c'est-à-dire lorsque l'énergie de l'onde incidente est entièrement dissipée dans ces plasmons de surface. Une des caractéristiques de cette méthode de mesure spectroscopique est qu'elle est visible dans l'intensité du rayonnement réfléchi. En variant l'angle d'incidence du rayonnement pour une longueur d'onde donnée, on peut mesurer une variation angulaire de la réflexion et le minimum de réflexion est obtenu pour un angle d'incidence, dénommé angle de résonance. Lorsque le film mince métallique est recouvert d'une couche diélectrique telle qu'une couche de silice, et que cette dernière présente une épaisseur dont la valeur est proche de celle de la longueur d'onde du rayonnement incident, la couche diélectrique joue le rôle d'un guide d'ondes de la lumière et génère des modes 3054320 2 guidées couplées à des plasmons de surface. Cela permet de créer des résonances excitables à la fois par des ondes électromagnétiques s-polarisées et par des ondes électromagnétiques p-polarisées. Ainsi, on observe une résonance pour chacune de ces deux polarisations à 5 des angles d'incidence du rayonnement différents. La spectroscopie par résonance plasmonique couplée aux ondes guidées (PWR) présente des résonances plus étroites que la spectroscopie par résonance plasmonique de surface (SPR), ce qui confère, avantageusement, une meilleure résolution spectrale. i.o L'avantage le plus significatif de la spectroscopie PWR par rapport à la spectroscopie SPR est lié à la possibilité d'obtenir des résonances avec la lumière pet s-polarisée et par conséquent, de distinguer des changements de masse et d'anisotropie des systèmes anisotropes orientées. Pour assurer la détection et la mesure de l'intensité du rayonnement réfléchi, 15 une photodiode unique de grande surface est typiquement mise en oeuvre. La mesure obtenue correspond donc à une réponse moyenne de l'ensemble de la surface d'une zone de mesure de l'échantillon dépendant du diamètre d'illumination de la source lumineuse. La réponse actuellement obtenue en spectroscopie PWR est une réponse 20 moyenne. Il n'est ainsi pas possible à partir d'une telle mesure de déterminer si l'échantillon tel qu'une membrane lipidique, est repartie de façon homogène sur un capteur optique au niveau latéral à la surface du guide d'onde diélectrique. De même, la détermination de zones d'intérêt permettant la détermination des propriétés de matériels biologiques tels que les cellules, bactéries, fragments membranaires 25 cellulaires, des peptides ou des protéines, ou de matériaux organiques n'est pas possible puisque nous enregistrons une réponse moyenne de toute la surface illuminée. Il existe donc un besoin pressant pour un dispositif imageant l'échantillon déposé sur un capteur optique, cette imagerie étant obtenue à partir des mesures de spectroscopie PWR et dont la conception originale remédie aux inconvénients de l'art antérieur rappelés ci-dessus. Cette technique de mesure spectroscopique sera dénommée ci-après, PWRi, pour imagerie par résonance plasmonique aux ondes guidées. Objet de l'invention La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure par spectroscopie imagerie PWR (PWRi), simples dans leur conception et dans leur mode opératoire, fiables et offrant une résolution spatiale proche de la limite de diffraction optique assurant une connaissance locale des propriétés d'un échantillon. 3054320 3 Un autre objet de la présente invention est un tel dispositif de mesure dont les éléments optiques sont configurés pour minimiser les aberrations optiques. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION A cet effet, l'invention concerne un procédé pour la mesure d'un échantillon. 5 Selon l'invention, on réalise les étapes suivantes : - envoyer un faisceau lumineux vers une surface d'incidence d'un capteur optique, ledit faisceau lumineux formant un angle d'incidence avec ladite surface d'incidence, ledit faisceau lumineux comportant des ondes électromagnétiques p-polarisées et des ondes électromagnétiques s-polarisées, 10 - ledit capteur optique comprenant un prisme comportant une surface de réflexion, un premier film conducteur ou semi-conducteur et un deuxième film diélectrique pour générer deux modes guidés, un premier desdits modes guidés étant généré pour des ondes électromagnétiques p-polarisées et pour un premier angle d'incidence Qi dudit faisceau lumineux sur ladite surface d'incidence et un 15 second desdits modes guidés étant généré pour les ondes électromagnétiques s-polarisés et pour un second angle d'incidence 02 dudit faisceau lumineux sur ladite surface d'incidence, ledit capteur optique présentant une surface pour recevoir ledit échantillon à mesurer, - varier ledit angle d'incidence dudit faisceau lumineux par rapport à la 20 surface d'incidence dudit capteur optique pour générer lesdits modes guidés, et - pour chaque angle d'incidence ûi, avec i = 1 ou 2, former l'image de ladite surface de réflexion sur un capteur d'image pour fournir des images bidimensionnelles de ladite surface de réflexion afin d'obtenir des informations optiques sur l'échantillon à mesurer. 25 On entend donc par « capteur optique » ci-après, l'ensemble comprenant un prisme comportant une surface de réflexion, un premier film conducteur ou semi-conducteur et un deuxième film diélectrique pour générer les deux modes guidés. Ce prisme comporte une surface d'entrée et une surface d'émission par laquelle sort le faisceau lumineux réfléchi par la surface de réflexion de ce prisme, qui 30 déterminent avantageusement la surface d'entrée et la surface d'émission, encore appelée de sortie, du capteur optique. On entend par « informations optiques » de l'échantillon à caractériser, notamment l'épaisseur et les indices de réfraction (n + i k) de cet échantillon. Une procédure d'ajustement ("fit") des spectres d'intensité mesurés, avec des spectres théoriques 35 (équations de Fresnel) permet d'extraire ces paramètres. Grâce au procédé ci-dessus décrit, on peut déterminer l'hétérogénéité spatiale de l'indice de réfraction des matériaux déposés sur le capteur optique. 3054320 4 L'échantillon à analyser peut être constitué de matériels biologiques à caractériser, tels que des cellules entières ou fragments membranaires, des bactéries, des biomolécules telles que des lipides ou protéines. Ces matériaux peuvent être physiquement (physisorbés) ou chimiquement (chimisorbés) liées, sur ledit capteur 5 optique. Les propriétés optiques (indice de réfraction (n), coefficient d'extinction (k) et épaisseur) de ces échantillons peuvent être mesurées par spectroscopie PWRi, ainsi que les changements au cours du temps induits par des variations de température, de pH ou suite à l'ajout d'autres matériaux afin de caractériser leurs interactions avec le ou les matériaux déjà déposés sur la surface du capteur optique. 10 Le deuxième film diélectrique est avantageusement réalisé en silice (SiO2) mais peut être alternativement réalisé dans un matériau choisi parmi le fluorure de magnésium (MgF2), le fluorure de lanthane (LaF3), la cryolite (Na3AIF6), le dioxyde de zirconium (ZrO2), l'oxyde d'aluminium (A1203) et le dioxyde de titane (TiO2). De préférence, son épaisseur est proche de la longueur d'onde du faisceau lumineux 15 émis par ladite source de lumière. De préférence, son épaisseur est avantageusement comprise entre 0,5 et 1,5 fois la valeur de la longueur d'onde du faisceau lumineux émis par ladite source de lumière. A titre purement illustratif, ce deuxième film diélectrique présente une épaisseur comprise entre 200 et 1200 nm, pour travailler avec des longueurs d'onde dans le domaine du visible, typiquement 20 entre 400 et 800 nm. Par exemple, la combinaison d'un premier film en argent de 50 nm et d'un film de recouvrement de silice de 460 nm est avantageuse pour les longueurs d'onde comprises entre 490 et 700 nm. Alternativement, ce capteur optique peut être adapté au domaine de l'infrarouge moyen (2000-4000 cm-1) en utilisant un matériau tel que le Séléniure de Zinc (ZnSe) 25 pour le guide d'onde et le prisme. La profondeur de la mesure étant plus grande, ce capteur optique permet alors de caractériser des objets plus épais tels que des cellules, qui ont des propriétés d'absorption particulières à ces longueurs d'onde. De manière plus générale, le faisceau lumineux est émis dans le domaine visible ou infrarouge, le capteur optique et le capteur d'image étant adaptés pour fournir des 30 images bidimensionnelles de la surface de réflexion du prisme pour le faisceau lumineux correspondant. Dans différents modes de réalisation particuliers de ce procédé de mesure, chacun ayant ses avantages particuliers et susceptibles de nombreuses combinaisons techniques possibles: 35 - ledit capteur d'image comportant une matrice bidimensionnelle de pixels pour transformer les données acquises par ledit capteur d'image en signaux électriques, on détermine pour chaque angle d'incidence dudit faisceau lumineux sur ladite surface d'incidence du capteur optique et pour chaque pixel, la valeur d'intensité du 3054320 5 faisceau lumineux réfléchi par ladite surface de réflexion dudit prisme et reçu par ledit pixel afin d'enregistrer un spectre d'intensité pour chaque pixel de ladite matrice. Les résonances observées pour les ondes électromagnétiques p-polarisées et s-polarisées sont ainsi mesurées lors d'un même enregistrement de spectre d'intensité 5 pour chaque pixel. L'image bidimensionnelle de la surface de réflexion du prisme sur la surface active du capteur d'image est ainsi découpée en pixels, ce nombre de pixels correspondant à la taille de la surface active du capteur optique, chaque pixel correspondant à une zone de la surface de réflexion. De manière avantageuse, on obtient ainsi une 10 résolution spatiale sur les propriétés optiques de l'échantillon à caractériser, laquelle peut permettre de déterminer une hétérogénéité spatiale des propriétés optiques de l'échantillon. On détermine à partir de ces spectres PWRi, l'indice de réfraction en chaque zone de mesure de la surface de réflexion. En effet, il peut être montré que les spectres 15 PWRi sont entièrement déterminés par les paramètres du capteur optique et de l'échantillon incluant les indices de réfraction dans les deux directions de polarisation (np et ne), les coefficients d'extinction optique dans ces deux directions (kp et ks) et l'épaisseur (t) des différentes couches. Les spectres PWRi peuvent donc être simulés pour obtenir les valeurs de ces paramètres, ce qui permet d'obtenir des 20 mesures de certaines propriétés de l'échantillon ainsi que les modifications induites dans ces propriétés par les interactions entre l'échantillon et son environnement. - on mesure une série de spectres d'intensité pour chaque pixel en fonction du temps t pour obtenir des mesures cinétiques et/ou de la longueur d'onde À du faisceau lumineux émis par ladite source de lumière. 25 La mesure de chaque spectre d'intensité en fonction du temps pour chaque pixel permet l'acquisition d'une série temporelle d'images. On peut également mesurer une série de spectres d'intensité pour chaque pixel en fonction d'un autre paramètre tel que la température, le pH, la concentration d'un autre matériau, ... 30 - ce capteur optique est configuré de sorte que lesdits modes guidés sont obtenus pour des angles d'incidences du faisceau lumineux sur la surface d'incidence dudit capteur optique, égaux à, ou sensiblement égaux à, 90°. De manière avantageuse, une telle configuration du prisme permet d'envoyer ledit faisceau lumineux émis par ladite source lumineuse sous un angle d'incidence de 35 90°, ou proche de 90°, par rapport à ladite surface d'incidence de manière à limiter les aberrations optiques en entrée et en sortie de ce capteur optique. Le prisme étant symétrique, on obtient une réciprocité en entrée et en sortie de celui-ci. 3054320 6 - les informations optiques déterminées sont l'épaisseur et les indices de réfraction (n + i k) dudit échantillon à mesurer ainsi que son anisotropie. De manière avantageuse, les deux résonances observées (composante TM de la lumière incidente, ou ondes électromagnétiques p-polarisées et composante TE de 5 la lumière incidente, ou ondes électromagnétiques s-polarisées) présentent des profondeurs de détection différentes. De même, la valeur de l'angle de réflexion totale évalue l'indice de réfraction du milieu sondé sans être sensible au matériel de faible épaisseur ( REVENDICATIONS1. Procédé pour la mesure d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes : - envoyer un faisceau lumineux vers une surface (12) d'incidence d'un capteur optique, ledit faisceau lumineux formant un angle d'incidence avec ladite surface d'incidence, ledit faisceau lumineux comportant des ondes électromagnétiques p-polarisées et des ondes électromagnétiques s-polarisées, - ledit capteur optique comprenant un prisme (13) comportant une surface de réflexion, un premier film (15) conducteur ou semi-conducteur et un deuxième film (16) diélectrique pour générer deux modes guidés, un premier desdits modes guidés étant généré pour des ondes électromagnétiques p-polarisées et pour un premier angle d'incidence Qi dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence et un second desdits modes guidés étant généré pour les ondes électromagnétiques s-polarisés et pour un second angle d'incidence 02 dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence, ledit capteur optique présentant une surface pour recevoir ledit échantillon à mesurer, - varier ledit angle d'incidence dudit faisceau lumineux par rapport à la surface (12) d'incidence dudit capteur optique pour générer lesdits modes guidés, et - pour chaque angle d'incidence ûi, former l'image de ladite surface de réflexion sur un capteur d'image pour fournir des images bidimensionnelles de ladite surface de réflexion afin d'obtenir des informations optiques sur l'échantillon à mesurer. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit capteur d'image comportant une matrice bidimensionnelle de pixels pour transformer les données acquises par ledit capteur d'image en signaux électriques, on détermine pour chaque angle d'incidence dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence et pour chaque pixel, la valeur d'intensité du faisceau lumineux réfléchi par ladite surface de réflexion dudit prisme (13) et reçu par ledit pixel afin d'enregistrer un spectre d'intensité pour chaque pixel de ladite matrice. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on mesure une série de spectres d'intensité pour chaque pixel en fonction du temps t pour obtenir des mesures cinétiques et/ou de la longueur d'onde À du faisceau lumineux émis par ladite source (11) de lumière. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit capteur optique est configuré de sorte que lesdits modes guidés sont 3054320 13 obtenus pour des angles d'incidences du faisceau lumineux sur la surface (12) d'incidence dudit capteur optique, égaux à ou sensiblement égaux à 90°. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les informations optiques déterminées sont l'épaisseur et les indices de 5 réfraction (n + i k) dudit échantillon à mesurer ainsi que son anisotropie. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on agence ledit capteur d'image et un moyen pour former l'image de ladite surface de réflexion sur ledit capteur d'image, de manière à présenter une profondeur de champ maximal dans une configuration dite de Scheimpflug. 10 7. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de mesure selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend - une source (11) de lumière émettant un faisceau lumineux comportant des ondes électromagnétiques p-polarisées et des ondes électromagnétiques s-polarisées, 15 - un capteur optique comprenant une surface d'incidence, un prisme (13) comportant une surface de réflexion, un premier film (15) conducteur ou semiconducteur et un deuxième film (16) diélectrique pour générer deux modes guidés, un premier desdits modes guidés étant généré pour des ondes électromagnétiques p-polarisées et pour un premier angle d'incidence ûi dudit faisceau lumineux sur 20 ladite surface (12) d'incidence et un second desdits modes guidés étant généré pour les ondes électromagnétiques s-polarisés et pour un second angle d'incidence 02 dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence, ledit capteur optique présentant une surface pour recevoir ledit échantillon à mesurer, - un moyen pour varier l'angle d'incidence dudit faisceau lumineux par 25 rapport à ladite surface (12) d'incidence du capteur optique, - un ensemble (14) imageur comportant un capteur d'image et un moyen pour former l'image de ladite surface de réflexion sur ledit capteur d'image, pour acquérir des images bidimensionnelles de ladite surface de réflexion afin d'obtenir des informations optiques sur l'échantillon à mesurer. 30 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit moyen pour former l'image comprend un objectif de microscope et au moins une lentille, pour collecter au moins une partie du faisceau lumineux réfléchi par ladite surface de réflexion dudit prisme (13) et l'envoyer vers ledit capteur d'image. 9. Dispositif selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que ledit capteur 35 d'image et ledit moyen pour former l'image sont agencés pour présenter une profondeur de champ maximal dans une configuration dite de Scheimpflug. 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que ledit moyen pour varier l'angle d'incidence dudit faisceau lumineux par 3054320 14 rapport à la surface (12) d'incidence du capteur optique comporte une table rotative sur laquelle est monté ledit capteur optique, ladite source (11) de lumière étant fixe ou une table rotative sur laquelle est montée ladite source (11) de lumière, ledit capteur optique étant fixe. 5 11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que ladite source (11) de lumière est choisie dans le groupe comprenant une source laser supercontinuum, une source laser monochromatique non cohérente ou encore une diode électroluminescente. 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé 10 en ce que ledit capteur optique est configuré pour fournir lesdits modes guidés pour des angles d'incidence Qi et 02 dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence, avec 02= 01 +1- 10°, et encore mieux 02= 01 +1- 5°, le montage optique dudit dispositif dans la position initiale de référence de la source (11) de lumière et de la surface (12) d'incidence dudit capteur optique, étant tel que ledit faisceau de 15 lumière tombe sur ladite surface (12) d'incidence sous un angle 03 avec 03 = 01 + (02 - °1)/2. 13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que ledit angle 03 est égal ou sensiblement égal à 90°. 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé 20 en ce que ledit prisme (13) est configuré de manière à supprimer les déformations dans les images bidimensionnelles fournies par l'ensemble (14) imageur quel que soit l'angle d'incidence 0; dudit faisceau lumineux sur ladite surface (12) d'incidence.