FR 3061849 A1 20180720 FR 1750361 A 20170117 1 Procédé et dispositif de mesure de la fluorescence émise à la surface d'un tissu biologique [1] L'invention concerne le domaine de l'imagerie médicale. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé et un dispositif de mesure de la fluorescence dans un tissu biologique. [2] Un système d'imagerie médicale basée sur la fluorescence d'un marqueur est décrit par exemple dans le document FR2989876A2. Les systèmes de ce type peuvent être encore améliorés afin, notamment, de pouvoir progresser dans : [003] - l'évaluation des perfusions dans des tissus biologiques et le repérage des zones en danger d'ischémie ; [4] - la détection de nodules cancéreux ciblés par un marqueur moléculaire fluorescent et la réalisation de leur exérèse ; et [5] - la détection et la localisation par un repérage anatomique des parathyroïdes enfouies près de tissus thyroïdiens. [6] De tels progrès nécessitent de détecter un marqueur fluorescent en très faible concentration dans des tissus biologiques. 11 faut donc un capteur de fluorescence de taille suffisante. Mais, par ailleurs, il faut pouvoir localiser le marqueur, sa distribution et sa concentration dans le champ correspondant à la zone de tissus biologique observé. 11 est donc nécessaire d'acquérir simultanément une image de cette zone en fluorescence et une image dans le visible, en couleur ou en noir et blanc, de cette zone. En outre, on souhaite avoir la possibilité de manipuler aisément une sonde unique permettant d'acquérir simultanément ces deux images. [7] A cette fin, il est proposé, selon l'invention, un procédé de mesure de la fluorescence sur une zone en surface d'un tissu biologique, dans lequel on fournit une sonde comportant un premier et un deuxième systèmes optiques. Le premier système optique comprend un premier capteur (qui sera aussi désigné dans ce document par « capteur de fluorescence ») pour détecter une lumière de fluorescence émise à la surface du tissu biologique. Le deuxième système optique comprend un deuxième capteur (qui sera aussi désigné dans ce document par « capteur optique ») pour détecter une lumière dans le visible. Les premier et deuxième capteurs sont fixes l'un par rapport à l'autre. Selon ce procédé, on détermine une distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le 3061849 2 repère de la sonde. La distance ainsi déterminée est utilisée pour faire la mise au point (à l'aide de moyens motorisés adaptés pour déplacer des éléments optiques tels que des lentilles) du premier système optique, sur ce point de la zone en surface du tissu biologique. En effet, pour faire la mise au point du premier système optique sur 5 un point de la zone en surface du tissu biologique, il faut connaitre la distance entre ce point et le premier capteur. Mais, ce premier capteur ayant une position fixe et déterminée dans la sonde, il suffit, pour faire la mise au point du premier système optique, de connaitre n'importe quelle distance entre ce point de la zone en surface du tissu biologique et un point dont la position est précisément connue dans le repère 10 de la sonde. Dans ce document, nous utiliserons donc l'expression « distance entre un point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le repère de la sonde » ou « distance d'observation », pour désigner une distance entre le tissu biologique observé et un point de la sonde dont la position est connue, le point de la sonde considéré pouvant alors être choisi en fonction des commodités de calculs, 15 d'étalonnage, etc. [8] Ainsi, grâce à l'invention, on peut obtenir une image précise et nette de la fluorescence sur le premier capteur, même si la fluorescence émise sur la zone en surface du tissu biologique à observer est très faible, et éventuellement insuffisante pour réaliser une mise au point du premier système optique, par autofocus en analyse 20 d'images par exemple. [9] Grâce à l'invention, on peut également obtenir une mesure quantitative de la fluorescence, stable et indépendante de la distance et de l'orientation de la sonde par rapport au tissu biologique. En effet, la connaissance de la distance entre la zone émettrice de la fluorescence et la sonde, permet de déterminer, à partir de la quantité 25 de lumière détectée par le capteur de fluorescence, et celle émise par la source de lumière liée au capteur, celle émise au niveau du tissu biologique. Ainsi, un praticien dispose des éléments pour bien interpréter les images et prendre des décisions pertinentes en temps réel. [10] En outre, le fait de disposer de moyens pour faire la mise au point des 30 systèmes optiques sur une grande plage de distances permet de déplacer la sonde et de ne pas être contraint de placer la sonde à une distance fixe de la zone à observer. Ceci rend la manipulation et l'utilisation de la sonde plus aisées. 3061849 3 [011] Grâce à l'invention, il est également possible de privilégier la détection du signal de fluorescence en optimisant les dimensions du capteur de fluorescence (que l'on souhaite les plus grandes possibles tout en conservant une sonde manipulable). L'image recueillie dans le visible est essentiellement nécessaire pour donner une 5 information sur le contexte, sur la topologie de la zone observée, etc. Alors que l'image en fluorescence donne les informations essentielles. Un capteur optique de relativement petite dimension peut être suffisant pour recueillir la lumière dans le visible, ce qui permet de conserver une sonde ayant des dimensions suffisamment petites pour pouvoir être aisément manipulée. 10 [012] De plus, il devient possible, grâce à l'invention, de faire évoluer la caméra infra-rouge (système optique comprenant le capteur de fluorescence), en remplaçant cette caméra ou ce capteur de fluorescence au fur et à mesure que des capteurs de ce type plus performants deviennent disponibles sur le marché, et ceci sans remettre en cause l'architecture de la sonde. En effet, les capteurs de fluorescence évoluent très 15 rapidement et on veut pouvoir tirer le meilleur parti des nouvelles technologies. [13] Le procédé selon l'invention comporte en outre l'une ou l'autre des caractéristiques suivantes considérées isolément ou en combinaison d'une ou plusieurs autres : [14] - on module ou on corrige, à l'affichage, un signal de fluorescence détecté 20 par le premier capteur en fonction de la distance déterminée entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le repère de la sonde ; [15] - on projette, sur la zone de la surface du tissu biologique, une marque lumineuse détectable par le deuxième capteur, la position de l'image de cette marque sur le deuxième capteur étant utilisée pour déterminer la distance entre au moins un 25 point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le repère de la sonde (en outre, la marque lumineuse apparaissant dans l'image obtenue à partir du deuxième capteur, elle peut être également utilisée pour localiser et repérer la fluorescence détectée par le premier capteur, sur cette image de la zone de tissu biologique réalisée dans le visible) ; 30 [016] - la marque lumineuse est placée sur l'axe optique du premier système optique (ainsi l'intersection entre la marque lumineuse et cet axe optique est fixe sur le premier capteur quelle que soit la distance) ; et 3061849 4 [17] - on fournit une source lumineuse d'excitation dont on contrôle l'intensité en fonction de la distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique et le point fixe dans le repère de la sonde ; notamment, on peut arrêter l'émission de cette source lumineuse d'excitation si la distance entre la source 5 d'excitation et le tissu biologique est insuffisante pour garantir qu'il n'y a pas un risque d'échauffement trop important pour le tissu biologique. [18] Selon un autre aspect, l'invention est un dispositif de mesure de la fluorescence sur une zone à la surface d'un tissu biologique, ce dispositif comprenant une sonde comportant un premier système optique avec un premier capteur pour 10 détecter une lumière de fluorescence émise à la surface du tissu biologique et un deuxième système optique avec un deuxième capteur pour détecter une lumière dans le visible, les premier et deuxième capteurs étant fixes l'un par rapport à l'autre. Ce dispositif comporte des moyens pour déterminer la distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le repère de la sonde, et 15 des moyens de mise au point du premier système optique sur ce point de la zone en surface du tissu biologique, ces moyens de mise au point utilisant la distance déterminée entre au moins ce point de la zone en surface du tissu biologique et le point fixe dans le repère de la sonde. [19] Le dispositif selon invention comporte en outre l'une ou l'autre des 20 caractéristiques suivantes considérées isolément ou en combinaison d'une ou plusieurs autres : [20] - les capteurs ont des surfaces de détection différentes ; [21] - le premier capteur a une surface de détection au moins deux fois plus grande que celle du deuxième capteur ; 25 [022] - la surface de détection du premier capteur a une dimension supérieure à 1 pouce et la surface de détection du deuxième capteur a une dimension inférieure à 1/2 pouce ; [023] - les premier et deuxième systèmes optiques ont des axes optiques respectifs situés dans un même plan ; 30 [024] - il comporte au moins une source lumineuse de marquage émettant dans le visible et adaptée pour projeter, sur la zone de la surface du tissu biologique, une marque lumineuse détectable par le deuxième capteur et pas par le premier ; par 3061849 5 exemple, la source lumineuse de marquage n'excite pas la fluorescence détectée par le premier capteur ; [025] - la source lumineuse de marquage est fixe par rapport aux premier et deuxième capteurs ; 5 [026] - il comporte deux sources lumineuses, chacune étant constituée d'un émetteur laser et étant adaptée pour émettre un faisceau lumineux essentiellement plan, à une longueur d'onde détectable par le deuxième capteur et pas par le premier capteur, l'un des faisceaux passant par les premier et deuxième axes optiques et étant essentiellement perpendiculaire à l'autre, l'intersection des deux faisceaux projetée 10 sur la zone en surface du tissu biologique formant une croix centrée sur l'axe optique du premier système optique ; [27] - l'axe optique du premier système optique passe par la marque lumineuse [28] - la distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu 15 biologique et un point fixe dans le repère de la sonde, utilisée par les moyens de mise au point du premier système optique, est déterminée en prenant en compte le déplacement de la marque optique sur l'image recueillie par le deuxième capteur, en fonction du déplacement de la sonde par rapport à la zone en surface du tissu biologique ; 20 [029] - il comporte au moins une source lumineuse d'excitation fixe par rapport aux premier et deuxième capteurs ; et [030] - les moyens pour déterminer la distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique et un point fixe dans le repère de la sonde sont distincts d'un procédé d'analyse d'images. 25 [031] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit ainsi que sur les dessins annexés. Sur ces dessins : [032] - La figure 1 est un schéma représentant un exemple de mode de réalisation d'une sonde d'un dispositif conforme à l'invention ; 30 [033] - La figure 2 est un autre schéma, selon un plan passant par les axes optiques des systèmes optiques de la sonde illustrée par la figure 1; 3061849 6 [34] - la figure 3 représente schématiquement un exemple de mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention intégrant une sonde telle que celle illustrée sur les figures 1 et 2 ; [35] - La figure 4 représente schématiquement différentes étapes d'un procédé 5 conforme à l'invention ; [36] - les figures 5 et 6 montrent des images de fluorescence obtenues à partir de la sonde du dispositif illustré par les figures 1 et 2 ; et [37] - la figure 7 est un diagramme illustrant la variation, en fonction de la distance d'observation, du rapport de l'intensité de fluorescence calculé à partir des 10 mesures effectuées avec un dispositif tel que celui illustré par la figure 3, ainsi que la variation, en fonction de la distance d'observation, d'un rapport du carré de distances d'observation. [38] Sur les figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. 15 [039] Selon un exemple de mode de réalisation du dispositif selon l'invention, illustré par les figures 1 à 3, celui-ci comporte une sonde 1, comportant elle-même un boîtier 2 dans lequel sont logés une source lumineuse 3 apte à émettre un rayonnement d'excitation, une source d'éclairage 4, deux sources de marquage 5, 6, ainsi qu'un premier 7 et un deuxième 8 systèmes optiques (voir figures 1 et 2). Le 20 dispositif selon l'invention comporte également des moyens d'affichage 50 et de calculs 60. Les moyens d'affichages 50 permettent d'afficher simultanément des images dans le visible I et de fluorescence I', d'une zone d'un tissu biologique à observer 9. [040] La source lumineuse d'excitation 3 est fixe dans le repère de la sonde. Elle 25 est destinée à exciter au moins un marqueur fluorescent situé dans la zone de tissu biologique à observer 9 éclairée par la source d'éclairage 4. Par exemple, la longueur d'onde du rayonnement de la source d'excitation 3 est essentiellement ou à peu près comprise entre 630 et 820 nanomètres. Le marqueur fluorescent est par exemple du vert d'indocyanine, ou ICG (acronyme anglais signifiant IndoCyanine Green). La 30 bande spectrale d'excitation de ce marqueur est essentiellement ou à peu près comprise entre 750 et 820 nanomètres et sa bande spectrale de fluorescence est essentiellement ou à peu près comprise entre 800 et 870 nanomètres. 3061849 7 [41] Le premier système optique 7 comporte divers composants optiques (lentilles de focalisation, filtres, etc.) organisés selon un premier axe optique A et un capteur d'image de fluorescence 10 (dit aussi « capteur de fluorescence » dans ce document), comprenant lui-même un photo-détecteur matriciel. Ce photo-détecteur 5 est sensible dans l'infrarouge. La surface de ce photo-détecteur est la plus grande possible. Par exemple, sa dimension en diagonale est supérieure à un pouce. D'une manière générale, plus la surface du photo-détecteur est grande, plus le photo-détecteur peut capter de photons, et donc meilleure sera la sensibilité du capteur de fluorescence 10. Par contre, les dimensions du photo-détecteur doivent être limitées 10 pour conserver une sonde 1 aisée à manipuler (par exemple, une sonde 1 ayant un diamètre de face avant inférieur ou égal à 80mm est un bon compromis). [42] Le deuxième système optique 8 comporte également divers composants optiques (lentilles de focalisation, etc.) organisés selon un deuxième axe optique B et un capteur d'images 11 dans le spectre visible, comprenant lui-même un photo- 15 détecteur matriciel. Ce capteur 11 (dit aussi « capteur optique » dans ce document) est par exemple le type CCD (acronyme anglais de « Charge Coupled Device », soit « dispositif à transfert de charges ») ou capteur de type CMOS (acronyme anglais de « Complementary Metal-Oxide Semiconductor », soit « semi-conducteur à oxyde de métal complémentaire »). Ce photo-détecteur est choisi pour avoir une surface la plus 20 petite possible, tout en conservant une bonne qualité d'image avec la lumière visible disponible. Par exemple, sa dimension en diagonale est inférieure à un tiers de pouce et est préférentiellement inférieure à un demi-pouce. [43] Afin de simplifier les calculs des distances mentionnés ci-dessous, il est préférable que les premier A et deuxième B axes optiques se croisent. Ils se trouvent 25 alors dans un même plan P de l'espace. [44] Avantageusement, le capteur optique 11 permet de réaliser une image en couleur de la zone de tissu biologique à observer 9 (mais il est également possible d'utiliser un capteur optique 11 permettant de réaliser une image, dans le spectre de la lumière visible, en noir et blanc, ou en niveaux de gris, de la zone 9). 30 [045] Alternativement, on pourrait avoir deux capteurs 10, 11 ayant un même axe optique (avec un renvoi d'angle ou avec un seul capteur et un filtre de Bayer modifié, ainsi qu'un télémètre placé sur la sonde 1 et basé sur un calcul du temps de 3061849 8 vol ou une triangulation). Mais dans ce cas, on augmente ainsi le tirage optique, or on souhaite travailler avec une ouverture optique la plus large possible. [46] Les deux sources de marquage 5, 6 sont par exemple des sources laser qui émettent par exemple avec une longueur d'onde dans le vert, essentiellement entre 5 520 et 532 nanomètres. Ainsi, la longueur d'onde de ces sources de marquage 5, 6 est visible par le capteur optique 11, mais pas par le capteur de fluorescence 10. [47] Les deux sources de marquage 5, 6 éclairent chacune un plan P ou P' de l'espace (en fait, il s'agit plutôt d'un secteur situé dans un plan P ou P', mais par la suite on utilisera le terme « plan » par souci de simplification). Le plan P projeté par 10 l'une 6 des sources de marquage 5, 6 correspond au plan P de l'espace dans lequel se trouvent les premier A et deuxième B axes optiques. Le plan P' projeté par l'autre source de marquage 5 correspond alors un plan perpendiculaire au plan de l'espace dans lequel se trouvent les premier A et deuxième B axes optiques, et il comporte également le premier axe optique A. L'intersection des deux plans P, P' projetés par 15 les deux sources de marquage correspond donc au premier axe optique A. L'intersection de ces deux plans P, P' se projette en un point 0, sur la zone de tissu biologique à observer 9. Ce point 0 est fixe pour le capteur de fluorescence 10, quelles que soient l'orientation et la position de la sonde 1 par rapport à cette zone 9. Par contre, le point 0 peut être mobile pour le capteur optique 11 si la sonde est 20 déplacée. La projection sur la zone de biologique à observer 9 du deuxième axe optique B correspond à un point fixe M pour le capteur optique 11 et sa position sur l'image I réalisée à l'aide du capteur optique 1 lest donc connue par construction. La position du point 0 vue par le capteur optique 11, par rapport à la position du point M vue par le capteur optique 11, correspond à une distance e. Cette distance e, variable 25 en fonction de la distance entre le point 0 et un point fixe dans le repère de la sonde, permet de déterminer la distance entre le capteur optique 11 et la surface sur laquelle se projette ce point mobile O. Les capteurs optique 11 et de fluorescence 10 étant fixes l'un par rapport à l'autre, la détermination, par les moyens de calcul 60, de cette distance e permet également de connaître la distance entre le capteur de fluorescence 30 10 et le point 0 sur la surface de la zone de tissu biologique à observer 9. [48] La connaissance de la distance entre le capteur de fluorescence 10 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 permet : 3061849 9 [49] - de calculer la quantité de lumière d'excitation reçue par le tissu biologique à observer 9, [50] - de régler la focalisation du premier système optique 7 sur la surface de la zone de tissu biologique à observer 9, et 5 [051] - de sécuriser l'utilisation de la sonde 1, en coupant l'émission de la source d'excitation 3, si l'opérateur travaille à une distance trop courte de la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 et qu'il y un risque d'échauffement trop important de ce tissu. [52] En outre, sur l'image I formée à partir du capteur optique 11, apparaît la 10 position du point 0 correspondant à la projection du premier axe optique A sur la zone de tissu biologique à observer 9. L'indication de la position du point 0 permet de pointer sur cette image I le point central de l'image I' formée à partir du capteur de fluorescence 10 (voir figure 3). Ceci est particulièrement avantageux, dans une configuration dans laquelle les deux capteurs sont placés l'un à côté de l'autre dans le 15 boîtier 2 et captent chacun une image I ou I' correspondant à des champs différents, observés sous des angles différents. Les images I, I' réalisées chacune respectivement par les capteurs optiques 11 et de fluorescence 10 sont affichées l'une à côté de l'autre, mais un praticien peut aisément repérer à l'aide du point 0 (intersection des plans Pet P' projetés sur la surface et visible par le capteur 11) sur l'image I formée 20 à partir du capteur optique 11, la position et l'orientation de la surface fluorescente 12 qu'il peut observer sur l'image I' formée à partir du capteur de fluorescence 10. [53] Un exemple de mode mise en oeuvre du dispositif décrit ci-dessus est présenté en relation avec la figure 4. Ce mode de mise en oeuvre comporte par exemple les principales étapes suivantes : 25 - on éclaire la zone de tissu biologique à observer 9, avec la source lumineuse d'excitation 3, la source d'éclairage 4 et les deux sources de marquage 5, 6 (Etape 100) ; - la position 0, dans le champ détecté par le capteur optique, de la croix formée par l'intersection des deux plans P, P' projetés par les sources de 30 marquage 5, 6 est déterminée en temps réel à l'aide d'un algorithme de traitement d'image (Etape 200); - cette position de la croix est utilisée pour, en temps réel : 3061849 10 o calculer la distance entre un point fixe dans le repère de la sonde 1 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 (Etape 300), o vérifier que cette distance est suffisante pour garantir que la source 5 lumineuse d'excitation 3 ne crée pas un échauffement présentant un risque pour le tissu biologique à observer 9, et o effectuer la mise au point du premier système optique 7 sur la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 (Etape 400) ; on calcule l'intensité du signal de fluorescence en fonction de la distance 10 calculée précédemment, entre un point fixe dans le repère de la sonde 1 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 (Etape 500). [54] La détermination, dans l'image I captée par le capteur optique 11, de la position de la croix (c'est-à-dire du point 0) est réalisée, par exemple, par seuillage adaptatif des composantes colorimétriques. Le calcul de la distance entre le point 15 fixe dans le repère de la sonde 1 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 est réalisé selon une méthode de télémétrie classique ou à l'aide d'un étalonnage préalable de la sonde 1 donnant la distance entre un point fixe dans le repère de la sonde (ce point étant situé sur le hublot de la sonde 1 par exemple) et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9, en fonction du déplacement de la croix dans 20 l'image I captée par le capteur optique 11. [55] Alternativement, la distance entre le capteur de fluorescence 10 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 peut être déterminée par d'autres méthodes qui ne reposent pas sur un procédé d'analyse d'image. Par exemple, on peut utiliser la méthode du temps de vol exposée dans le document FR3036195A1. 25 [056] Le principe de la détermination de l'intensité du signal de fluorescence en fonction de la distance entre le capteur de fluorescence 10 et la surface de la zone de tissu biologique à observer 9 est le suivant. Le signal de fluorescence reçu par le capteur de fluorescence 10 dépend directement de l'irradiance d'excitation reçue par le tissu biologique à observer 9 (il dépend aussi du temps d'exposition que l'on 30 considère constant dans un premier temps). Or, pour une puissance d'excitation constante, lorsque la source lumineuse d'excitation 3 est sur la sonde 1, cette irradiance varie avec la distance entre le tissu biologique à observer 9 et cette source 3061849 11 lumineuse d'excitation 3. Donc, en connaissant en temps réel cette distance il est possible de normaliser la valeur de l'intensité de la fluorescence mesurée par rapport à cette distance. [57] En effet, l'irradiance reçue sur une zone de tissu biologique à observer 9 5 varie de manière inversement proportionnelle au carré de la distance qui la sépare de la source lumineuse d'excitation 3. Or, l'intensité du signal de fluorescence émis par cette zone est proportionnelle à la quantité de lumière d'excitation atteignant cette zone par unité de temps. Donc, l'intensité du signal de fluorescence détecté varie aussi de manière inversement proportionnelle au carré de la distance d qui sépare la 10 zone émettrice de la fluorescence 12 de la source lumineuse d'excitation 3: Fluorescence signal (cl) = A. où A est un coefficient qui prend en compte la puissance d'excitation de la source lumineuse d'excitation 3, le pouvoir d'absorption et d'émission du tissu biologique à observer, la sensibilité du capteur de fluorescence 10 dans la gamme de 15 longueur d'onde de l'émission fluorescente et la concentration de marqueur fluorescent (fluorophore) en superficie du tissu biologique à observer. [58] On notera, que dans la sonde 1, la source lumineuse d'excitation 3 et le capteur de fluorescence 10 sont fixes les uns par rapport aux autres. Donc, le rapport des intensités des signaux de fluorescence mesurés respectivement à deux distances 20 di et d2, ne dépend que de ces distances : Fluorescence signal (d1) d2 2 = - Fluorescence signal (d2) d12 [59] Pour que le praticien puisse observer une image pour laquelle l'intensité 25 du signal de fluorescence ne dépend pas de la distance à laquelle il place la sonde 1 par rapport à la zone de tissu biologique 9 qu'il souhaite observer, on corrige, en temps réel, l'image I' de fluorescence affichée, en fonction de cette distance, en suivant la démarche présentée ci-dessous : a) une image est réalisée avec le signal de fluorescence détecté, grâce au capteur de 30 fluorescence 10, et l'intensité du signal de fluorescence est déterminée pour chaque pixel de cette image ; 3061849 12 b) la valeur de la distance entre la source d'excitation 3 et la zone de tissu biologique à observer 9 est mesurée à l'aide du capteur optique 11, comme indiqué ci-dessus, c) on corrige l'intensité déterminée à l'étape a), pour chaque pixel, en utilisant une 5 distance cire f arbitraire de X cm, et d) on affiche une image pour laquelle l'intensité de la fluorescence correspondant à chaque pixel a été corrigée à l'étape c). Pour le calcul, on fait l'hypothèse que l'image I' est obtenue à partir d'une surface plane. Expérimentalement, l'erreur introduite par cette hypothèse est négligeable. 10 [060] Par exemple, les images Ta, lb et Ic de la figure 5 n'ont pas été corrigées. La figure Ta représente une image d'une scène comportant des émetteurs 13 d'un signal de fluorescence (cette image, qui est choisie pour sa simplicité d'obtention de la scène correspondante, ne correspond pas à une zone de tissu biologique, mais le procédé expliqué ici est en tout point analogue à ce qu'il serait pour exploiter une 15 image de tissu biologique). Cette image Ta est réalisée à partir du signal de fluorescence détecté par le capteur de fluorescence 10, en plaçant la sonde 1 à une distance de 115mm des émetteurs 13 du signal de florescence. [061] L'image lb représente la même scène, en plaçant la sonde 1 à une distance de 190mm des émetteurs 13 du signal de florescence. 20 [062] L'image Tc représente également la même scène, en plaçant la sonde 1 à une distance de 262mm des émetteurs 13 du signal de florescence. [63] On constate donc que plus on éloigne la sonde 1 de la scène comportant les émetteurs 13 du signal de florescence, moins le signal de fluorescence apparaît intense (en effet en éloignant la sonde, on éloigne également la source d'excitation 3 25 et, comme indiqué ci-dessus, l'intensité du signal de fluorescence détecté varie de manière inversement proportionnelle au carré de la distance d qui sépare la zone émettrice de la fluorescence de la source d'excitation 3). [64] Le tableau ci-dessous reprend des valeurs de l'intensité de la fluorescence quantifiée en niveaux de gris, en fonction de la distance entre la sonde 1 et les 30 émetteurs 13 du signal de florescence: 3061849 13 Distance (mm) Niveau de gris 115 45651 132 35738 163 24177 190 18325 235 12208 262 9894 295 7881 [065] Ces mesures des valeurs de l'intensité de la fluorescence sont toujours effectuées sur la même région d'intérêt. Par exemple, pour les images des figures 5 et 6, la région d'intérêt correspond au rectangle central. 5 [066] Par contre, si on veut afficher une image dont l'intensité de la fluorescence vue par un opérateur est indépendante de la distance entre la sonde 1 et la zone de tissu biologique à observer 9, ou distance d'observation, di, on calcule le rapport de l'intensité du signal de fluorescence pour différentes distances d'observation di sur l'intensité du signal de fluorescence pour une distance de référence d'f arbitrairement 10 choisie, par exemple égale à 163mm : Fluorescence signal (di) dre f 2 Fluorescence signal (dref) [067] (croix) et (ronds) où d'f vaut 163mm. [068] L'erreur L'erreur Fluorescence signal (dl) Fluorescence signal (dre f) dre fz d12 est aussi calculée. Fluorescence signal (d1) Fluorescence signal (dre f) 20 [069] Des résultats obtenus pour plusieurs distances d'observation di sont reportés dans le tableau ci-dessous : Distances di Niveau i. F /Fref dref2/di2 erreur sur (mm) de gris l'interpolation 115 45651 1,89 2,01 6,4% 132 35738 1,48 1,52 3,2% 163 24177 1,00 1,00 0,0% 190 18325 0,76 0,74 2,9% 235 12208 0,50 0,48 4,7% 262 9894 0,41 0,39 5,4% 295 7881 0,33 0,31 6,3% 15 3061849 14 [070] Les valeurs du tableau ci-dessus représentent respectivement le rapport des intensités de fluorescence et le rapport du carré des distances d'observation di, en fonction de la distance d'observation di. En reportant ces valeurs sur le graphe de la 2 5 ,.ref figure 7, on constate que la courbe en -di2 suit la même tendance que la courbe en Fluorescence signal (di) En outre, l'erreur entre ces deux rapports est suffisamment Fluorescence signal (dref). faible, pour que l'on puisse calculer, avec un taux d'erreur acceptable ( REVENDICATIONS1. Procédé de mesure de la fluorescence sur une zone en surface d'un tissu biologique (9), dans lequel on fournit une sonde (1) comportant un premier système optique (7) comprenant un premier capteur (10) pour détecter une lumière de fluorescence émise à la surface du tissu biologique et un deuxième système optique (8) comprenant un deuxième capteur (11) pour détecter une lumière dans le visible, les premier (10) et deuxième (11) capteurs étant fixes l'un par rapport à l'autre, caractérisé par le fait qu'on détermine une distance entre au moins un point (0) de la zone en surface du tissu biologique (9) et un point fixe dans le repère de la sonde (1), la distance ainsi déterminée étant utilisée pour faire la mise au point du premier système optique (7) sur le point (0) de la zone en surface du tissu biologique (9). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on module un signal de fluorescence détecté par le premier capteur (10) en fonction de la distance déterminée entre au moins le point de la zone en surface du tissu biologique et le point fixe dans le repère de la sonde (1). 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel on projette, sur la zone de la surface du tissu biologique (9), une marque lumineuse détectable par le deuxième capteur (11), la position de l'image de cette marque sur le deuxième capteur (11) étant utilisée pour déterminer la distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique (9) et le point fixe dans le repère de la sonde (1). 4. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la marque lumineuse est placée sur l'axe optique (A) du premier système optique (7). 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel on fournit une source lumineuse d'excitation (3) dont on contrôle l'intensité en fonction de la 3061849 17 distance entre au moins un point de la zone en surface du tissu biologique (9) et le point fixe dans le repère de la sonde (1). 6. Dispositif de mesure de la fluorescence sur une zone à la surface d'un tissu 5 biologique (9), ce dispositif comprenant une sonde (1) comportant un premier système optique (7) avec un premier capteur (10) pour détecter une lumière de fluorescence émise à la surface du tissu biologique (9) et un deuxième système optique (8) avec un deuxième capteur (11) pour détecter une lumière dans le visible, les premier (10) et deuxième (11) capteurs étant fixes l'un par rapport à 10 l'autre, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens pour déterminer la distance entre au moins un point (0) de la zone en surface du tissu biologique (9) et un point fixe dans le repère de la sonde (1), et des moyens de mise au point du premier système optique (7) sur ce point (0) de la zone en surface du tissu biologique (9), 15 utilisant la distance déterminée entre au moins un point (0) de la zone en surface du tissu biologique et le point fixe dans le repère de la sonde (1). 7. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel les capteurs (10, 11) ont des surfaces de détection différentes. 20 8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel la surface de détection du premier capteur (10) est au moins deux fois plus grande que celle du deuxième capteur (11). 25 9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le premier capteur (10) a une dimension supérieure à 1 pouce et le deuxième capteur (11) a une dimension inférieure à 1/2 pouce. 10. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel les premier (7) et 30 deuxième (8) systèmes optiques ont des axes optiques (A, B) respectifs situés dans un même plan (P). 3061849 18 11. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 10, comportant au moins une source lumineuse de marquage (5 ou 6) émettant dans le visible et adaptée pour projeter, sur la zone de la surface du tissu biologique (9), une marque lumineuse détectable par le deuxième capteur (11) et pas par le premier (10). 5 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel la source lumineuse de marquage (5 ou 6) est fixe par rapport aux premier (10) et deuxième (11) capteurs. 13. Dispositif selon la revendications 11 ou 12, comportant deux sources lumineuses 10 de marquage (5, 6), chacune étant constituée d'un émetteur laser et étant adaptée pour émettre un faisceau lumineux essentiellement plan, à une longueur d'onde détectable par le deuxième capteur (11) et pas par le premier capteur (10), l'un des faisceaux passant par les premier (A) et deuxième (B) axes optiques et étant essentiellement perpendiculaire à l'autre, l'intersection des deux faisceaux 15 projetée sur la zone en surface du tissu biologique (9) formant une croix centrée sur l'axe optique (A) du premier système optique (7). 14. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 13, dans lequel l'axe optique (A) du premier système optique (7) passe par la marque lumineuse. 20 15. Dispositif selon la revendication 14, dans lequel la distance entre au moins un point (M) de la zone en surface du tissu biologique (9) et le point fixe dans le repère de la sonde, utilisée par les moyens de mise au point du premier système optique (7), est déterminée en prenant en compte le déplacement (e) de la marque 25 optique (M) sur l'image recueillie par le deuxième capteur (11), en fonction de déplacement de la sonde (1) par rapport à la zone en surface du tissu biologique (9). 16. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 15, comportant au moins une source 30 lumineuse d'excitation (3) fixe par rapport aux premier (10) et deuxième (11) capteurs. 3061849 19 17. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 16, dans lequel les moyens pour déterminer la distance entre au moins un point (0) de la zone en surface du tissu biologique (9) et un point fixe dans le repère de la sonde (1) sont distincts d'un procédé d'analyse d'images. 5