FR 3059429 A1 20180601 FR 1661745 A 20161130 1 Procédé permettant d'imputer une réponse non négative obtenue dans un test de mutation réverse sur bactéries, réalisé à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro Domaine technique La présente invention concerne le domaine des tests de mutation réverse sur bactéries encore dénommé « tests d'Ames » réalisés pour démontrer l'innocuité, d'un point de vue mutagène, de préparations pharmaceutiques, cosmétiques ou nutritionnelles, en particulier à base de plantes. Plus précisément, la présente invention a notamment pour objet un procédé permettant d'imputer une réponse non négative obtenue dans un test de mutation réverse sur bactéries, uniquement à au moins un aglycone flavonique (quercétine, kaempférol, etc.) - également dénommé « aglycone de flavonol », « flavonol aglycone » ou encore « flavonol libre » - présent dans lesdites préparations. Etat de la technique Dans le domaine de la santé, et plus particulièrement de la santé humaine, les tests de génotoxicité in vitro sont fréquemment employés afin de déterminer le potentiel mutagène et/ou pro-mutagène d'un composé chimique, d'une composition (mélange) ou autre forme de préparation. Un des tests de génotoxicité in vitro, utilisé en première intention est un test de mutation reverse sur bactéries, encore dénommé « test d'Ames ». Ce dernier est fréquemment employé afin de déterminer le potentiel mutagène d'un composé chimique. Les cancers étant souvent liés à des dommages causés dans l'ADN, ce test rapide et peu onéreux est utilisé afin d'estimer le potentiel mutagène d'une substance. Le protocole fut décrit dans une série de publications au début des années 1970 par Bruce Ames et son équipe de l'Université de Californie, Berkeley. Ce test, largement décrit dans l'art antérieur, est de nos jours un des tests in vitro de référence - voire le test in vitro de référence - afin d'évaluer le potentiel mutagène d'une substance ou d'un produit. En résumé, le principe de ce test repose sur différentes souches bactériennes, typiquement de Salmonella typhimurium, portant des mutations dans les gènes nécessaires à la synthèse de l'histidine. Ainsi, celles-ci sont 3059429 2 donc auxotrophes pour l'histidine et requièrent par conséquent un apport d'histidine pour se développer. Le test permet donc d'évaluer la facilité que possède une substance à induire une 5 réversion de la souche auxotrophe. Dans le cas d'une substance mutagène, on observe ainsi l'apparition de souches prototrophes, ne nécessitant plus d'histidine pour croître mais capables de croître en un milieu minimum. Une des particularités de ce test est qu'il est réalisable en l'absence d'activation 10 métabolique, afin de tenter d'identifier le ou les composés directement mutagènes (ou « mutagènes directs ») ou en présence d'activation métabolique, afin de tenter d'identifier les composés pro-mutagènes, à savoir capables d'induire, une fois métabolisés, la formation de composés mutagènes. Le système le plus communément utilisé est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur, préparée à partir de foies 15 de rongeurs traités avec des inducteurs enzymatiques comme Aroclor 1254 (Ames et al., 1975 [15]; Maron et al., 1983 [16]) ou une combinaison de phénobarbitone et Gnaphthoflavone (Tamura et al., 1980 [17]; Matsushima et al., 1976 [18]; Elliott et al., 1992 [19]). 20 Tel qu'indiqué précédemment, différentes souches de Salmonella typhimurium (mais également d'Escherichia coi') peuvent être utilisées pour ce test. Différents types de dommages à l'ADN peuvent ainsi être observés en fonction des souches. A titre illustratif, la souche TA98 est plus sensible aux mutations qui affectent le cadre de lecture. La souche TA100, quant à elle, est une souche plus sensible aux mutations de 25 substitutions. Ce test d'Ames présente un intérêt particulier dans l'évaluation du pouvoir mutagène de substances végétales, de drogues végétales (« herbal substances », en langue anglaise) et des préparations à base de plantes (« herbal preparations », en langue 30 anglaise), lesquelles se retrouvent bien évidemment dans les médicaments à base de plantes (« herbal medicinal products », en langue anglaise) à usage humain ou vétérinaire (en particulier dans les études de résidus, lorsque les animaux sont destinés à l'alimentation humaine) mais également dans certains produits cosmétiques et compléments alimentaires à base de plantes En effet, ce test d'Ames est décrit comme 3059429 3 permettant de détecter la majorité des substances à base de plantes mutagènes et/ou pro-mutagènes. Si l'on s'intéresse en particulier aux médicaments à base de plantes à usage humain, 5 ces derniers sont régis, dans les Etats membres de l'Union européenne, par un cadre réglementaire strict (Directive 2001/83/CE en vigueur). Dans ce cadre réglementaire strict, la ligne directrice du Comité des Médicaments à base de plantes (EMEA/HMPC/ 107079/2007) [1] de l'EMA (« European Medicine Agency », en langue anglaise) recommande l'évaluation du potentiel génotoxique des substances / préparations à base 10 de plantes basée sur une approche pragmatique de type "arbre décisionnel". Ladite ligne directrice est notamment consultable sur le site internet de l'EMA. Plus précisément, l'arbre décisionnel susvisé est représenté, de manière schématique, en figure 1 de ladite ligne directrice. Tel que représenté sur cette figure 1, le test d'Ames 15 correspond à la première étape (au moins cinq souches de bactéries doivent être employées et l'exposition des bactéries à la substance d'essai doit être effectuée en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène). Cette première étape est une étape critique, dans la mesure où, en fonction du résultat obtenu au test d'Ames (positif, négatif ou équivoque), des démarches additionnelles (par 20 exemple des tests de génotoxicité supplémentaires) visant à évaluer plus avant le potentiel génotoxique de la substance / préparation à base de plantes doivent être effectuées. Plus précisément, lorsqu'un résultat non négatif, à savoir positif ou équivoque (à savoir 25 ininterprétable ou, à tout le moins, difficilement interprétable) est obtenu en mettant en oeuvre le test d'Ames (indiquant un effet mutagène ou pro-mutagène in vitro ou, à tout le moins, une suspicion d'un tel effet), l'étape la de l'arbre décisionnel de la ligne directrice EMEA/HMPC/ 107079/2007 [1] recommande d'évaluer l'implication d'un ou plusieurs constituants ayant un profil de sécurité établi (à savoir dont le potentiel/profil 30 génotoxique in vivo est connu) dans la non négativité observée en test d'Ames. Cette approche, dite « de dédouanement », vise à imputer la responsabilité de la non négativité au test d'Ames exclusivement à un ou plusieurs constituants, connus pour être des mutagènes in vitro mais pour lesquels l'innocuité génotoxique in vivo est établie (constituants spécifiques ayant un profil de sécurité établi, tels que. la quercétine). Dans 3059429 4 ce cas, l'on parle alors de « dédouanement », dans la mesure où l'on dédouane les autres constituants (pour lesquels l'innocuité in vivo n'est pas ou peu établie) de la préparation à base de plantes testée de toute responsabilité dans l'effet mutagène obtenu - ou suspecté - in vitro. 5 A titre de constituants spécifiques ayant un profil de sécurité établi, potentiellement présents dans des préparations à base de plantes (à usage pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnel), peuvent être mentionnés, les aglycones flavoniques (flavonols libres) communément retrouvés dans l'alimentation, tels que la quercétine et 10 le kaempférol (et éventuellement la myricétine), lesquels sont connus pour leur génotoxicité in vitro, contrairement aux hétérosides de flavonol (tel qu'indiqué dans la demande internationale de brevet publiée sous la référence WO 2010/139809), mais pour leur innocuité in vivo Harwood et al., 2007 [9]. 15 II convient d'ailleurs de noter, à cet égard, que la susdite ligne directrice de l'EMA (EMEA/HMPC/ 107079/2007) [1] cite l'exemple de la quercétine afin d'illustrer les substances présentes dans les préparations à base de plantes et ayant un profil de sécurité établi (cf. points 3 et 4.1 de ladite ligne directrice). 20 L'évaluation de l'imputabilité d'un ou plusieurs constituants spécifiques ayant un profil de sécurité établi dans le résultat non négatif au test d'Ames peut être effectuée, de manière conventionnelle, en réalisant un (ou des) essai(s) bactérien(s) de mutation reverse complémentaire(s) dans le(s)quel(s) la solution d'essai (préparation à base de plantes, par exemple extrait végétal, dissous dans le solvant adéquat) et un mélange de 25 flavonol(s) libre(s) à doses équivalentes (solution de référence) sont testés en parallèle au cours d'un même essai afin d'en déduire, par comparaison des réponses mutagènes des solutions d'essai et de référence, l'imputabilité des flavonols libres dans la non négativité observée en test d'Ames. Toutefois, cette méthodologie conventionnelle, basée sur la comparaison de la réponse mutagène des solutions d'essai et de 30 référence, testées à doses équivalentes au cours d'un même essai, ne permet pas d'arriver à une conclusion univoque, notamment en présence d'activation métabolique exogène. 3059429 5 En effet, la Demanderesse a découvert que cette solution technique présentait en particulier un biais en présence d'activation métabolique exogène (par exemple induite en test d'Ames par l'utilisation d'un mélange S9 : « S9 mix », en langue anglaise). Malgré l'imputabilité des seuls flavonols libres dans la non-négativité obtenue en test 5 d'Ames, ce biais se traduit, en présence d'activation métabolique, par une amplitude de réponse plus importante de la solution d'essai par rapport à une solution de référence comprenant un mélange de flavonol(s) libre(s) à doses équivalentes, laissant penser que, dans la solution d'essai, se trouve, en sus du/des flavonol(s) libre(s), un ou plusieurs constituants mutagènes. 10 Si la preuve de l'imputabilité des seuls flavonols libres dans la non négativité observée en test d'Ames ne peut être apportée, la nécessité de se conformer à l'arbre décisionnel de la ligne directrice EMEA/HMPC/ 107079/2007 [1] recommande de passer aux étapes supérieures de cet arbre décisionnel, à savoir réaliser au moins un test in vitro 15 additionnel (par exemple un essai de mutation génique sur cellules de mammifère) et, si nécessaire, un test de micronoyaux in vivo chez le rongeur, conformément aux étapes 2 et 3 de l'arbre décisionnel décrit dans les recommandations en vigueur. La réalisation de ce ou ces tests additionnels représente notamment un investissement humain et financier significatif et pose, de surcroît, des problèmes éthiques liés à l'expérimentation 20 animale lorsque le passage à l'étape 3 de l'arbre décisionnel (EMEA/HMPC/ 107079/2007) est requis. Les travaux de la Demanderesse ont mis au jour le besoin de démontrer que la présence des seuls flavonols libres dans une préparation à base de plantes entrant 25 dans la composition d'un médicament, d'un complément alimentaire ou d'un produit cosmétique à base de plantes permettait d'expliquer pleinement sa nonnégativité/positivité en test d'Ames. Une évaluation du risque basée sur la comparaison entre l'exposition à ces flavonols libres apportés par l'alimentation et celle liée à la prise du susdit médicament, complément alimentaire ou produit cosmétique à base de 30 plantes, comprenant ladite préparation à base de plantes, devient suffisante pour évaluer le potentiel génotoxique du médicament ou complément alimentaire à base de plantes et permet, ainsi, d'apporter la preuve de son innocuité chez l'homme d'un point de vue génotoxique sans nécessité de recourir aux étapes 2 et 3 de l'arbre décisionnel mentionné supra. Le fait de ne pas être contraint de réaliser les tests additionnels 3059429 6 prévus par ces étapes 2 et 3 représente, en plus du gain financier et humain, un bénéfice d'un point de vue éthique en limitant le recours à l'expérimentation animale dans le cas où le passage à l'étape 3 de l'arbre décisionnel (EMEA/HMPC/ 107079/2007) [1] aurait été requis. 5 De surcroît, ce ou ces tests additionnels sont susceptibles de présenter ou d'engendrer des complexités ou difficultés techniques, en particulier lorsque les préparations à base de plantes se présentent sous forme de plante pulvérisée (poudre de plante). En effet, dans le cas de préparations à base de plante pour lesquelles la totalité de la drogue 10 végétale correspond à la substance active telles que les poudres de plantes, il est nécessaire de sélectionner différents solvants prenant en considération l'ensemble du profil phytochimique de la poudre de plante [à savoir l'ensemble du spectre des constituants phytochimiques, incluant les constituants polaires et non polaires (EMEA/HMPC/67644/2009)] [10], ce qui représente, de toute évidence, un 15 investissement significatif supplémentaire, aussi bien en termes de temps, d'argent et de personnel requis. En outre, en ce qui concerne les préparations à base de plantes se présentant sous forme de plante pulvérisée (poudre de plante), un inconvénient additionnel réside dans 20 le fait que les solvants qu'il est nécessaire de sélectionner afin de couvrir le spectre entier des constituants phytochimiques de la préparation à base de plantes (cf. EMEA/HMPC/67644/2009) [10] ne sont pas toujours compatibles avec les tests de génotoxicité recommandés en étape 2 et 3 de l'arbre décisionnel. En effet, il peut exister une toxicité des solvants ne permettant pas toujours d'atteindre la dose maximale 25 d'exposition recommandée par les lignes directrices de l'OCDE ou d'utiliser la voie d'exposition garantissant l'atteinte du tissu cible (dans le cas du test de micronoyaux in vivo, nécessité d'utiliser la voie d'administration permettant d'assurer l'exposition systémique maximale et garantir ainsi l'exposition de la moelle osseuse à la substance testée). 30 Afin d'éviter l'obtention de résultats positifs lors de la réalisation de tests de génotoxicité in vitro réalisés sur des extraits de pollen, la susdite demande internationale de brevet WO 2010/139809 recommande - purement et simplement - l'élimination des hétérosides de flavonol (également dénommés « flavonols glycosides »), susceptibles d'être 3059429 7 responsables, selon WO 2010/139809, de la production d'aglycones flavoniques (flavonols libres) dans les extraits de pollen, en mettant en oeuvre un procédé d'ultrafiltration. Cette solution, qui s'avère toutefois radicale, vise à résoudre un problème technique très différent de celui qui sous-tend la présente invention. En effet, 5 la demande internationale de brevet WO 2010/139809 a pour but de s'affranchir, sans distinction, de tous les flavonols glycosides potentiellement présents dans les extraits de pollen et susceptibles d'être responsables de la production de flavonols libres dont certains ont été décrits et sont connus pour être mutagènes in vitro, afin d'obtenir des extraits de pollen ne présentant aucune activité mutagène in vitro. A contrario, un des 10 objectifs de la Demanderesse consiste à évaluer l'imputabilité de certains flavonols libres connus pour être mutagènes in vitro mais non génotoxiques in vivo, et donc sans danger pour une utilisation chez l'homme, de les identifier, et d'apporter la preuve de l'unique contribution de ces flavonols libres, tels que la quercétine et le kaempférol, dans la non négativité observée en test d'Ames avec l'extrait végétal considéré, sans 15 toutefois les éliminer ou éliminer les flavonols glycosides, susceptibles d'induire la formation de flavonols libres, de la préparation à base de plantes puisque pouvant participer à son activité thérapeutique, cosmétique ou nutritionnelle. En éliminant les aglycones flavoniques des préparations à base de plantes, l'on se prive de facto des effets bénéfiques susceptibles d'être associés in vivo avec ces aglycones flavoniques. 20 En effet, les aglycones flavoniques ont été décrits dans la littérature comme possédant notamment des propriétés anti-oxydantes, de chélation, anti-carcinogènes, cardioprotectrices et bactériostatiques (cross et al. 1996 [2] ; Middleton et al. [3], 2000 ; PDRNS 2001 [4]). Chez les végétaux, ces composés sont impliqués dans la production d'énergie et, de par leur fort pouvoir antioxydant, jouent probablement un rôle protecteur 25 contre les rayons ultraviolets. Par conséquent, une solution technique aussi radicale que celle divulguée dans WO 2010/139809 ne permet en aucune manière de répondre à l'objectif susvisé. Schimmer et al. [5] ont bien tenté de démontrer la corrélation entre l'activité mutagène in 30 vitro (en test d'Ames) d'extraits de plante et leur teneur en quercétine. Schimmer et al. [5] ont essayé d'isoler la quercétine des autres constituants de l'extrait végétal par fractionnement de la solution d'essai (l'extrait végétal qui sera mis en oeuvre dans le test d'Ames) en utilisant une colonne Sephadex LH-20. Toutefois, en raison de la présence de constituants autres que la quercétine dans ladite fraction, les auteurs ne parviennent 3059429 8 pas à démontrer, de manière univoque, l'implication de la seule quercétine dans l'activité mutagène in vitro observée (en test d'Ames). La méthodologie objet de cette publication s'avère donc insatisfaisante. 5 Au regard des problématiques susvisées, il existe un réel besoin de mettre au point une méthodologie de mise en oeuvre aisée, précise et fiable, reproductible et peu onéreuse, applicable à une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle à base de plantes (à usage humain ou animal, de préférence à usage humain) n'ayant pas subi de traitement visant à éliminer les flavonoïdes (hétérosides de flavonol et/ou aglycones 10 flavoniques) présents en son sein, afin d'évaluer l'imputabilité des résultats non négatifs (à savoir positifs ou équivoques) obtenus en effectuant un test de mutation reverse sur bactéries (encore dénommé test d'Ames), à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle à base de plantes, à usage humain ou vétérinaire (de préférence à usage humain), exclusivement à la présence d'un ou plusieurs constituants 15 présentant un profil de sécurité établi (à savoir non génotoxique in vivo ; Etape 1 a de la ligne directrice EMEA/HMPC/107079/2007 [1], mentionnée précédemment), tels que la quercétine et/ou un ou des autre(s) flavonol(s) libre(s) communément retrouvés dans l'alimentation comme le kaempférol ; ce profil de sécurité garantissant, par définition, l'innocuité in vivo du composé concerné. La méthodologie mise en oeuvre doit permettre 20 d'écarter, sans équivoque, la responsabilité de constituant(s) autre(s) que celui/ceux ayant un profil de sécurité établi dans la réponse non négative au test de mutation reverse sur bactéries, réalisé sur les susdites préparations pharmaceutiques, cosmétiques ou nutritionnelles à base de plantes. En outre, afin de se conformer à la ligne directrice EM EA/HM PC/107079/2007 [1], il est particulièrement avantageux qu'une 25 telle méthodologie puisse être mise en oeuvre à la fois en absence et en présence d'activation métabolique. Exposé de l'invention 30 En réponse au besoin identifié précédemment, la Demanderesse a mis au point un procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai adaptée pour subir un test de mutation reverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, ladite solution d'essai étant préparée à partir d'une préparation 3059429 9 pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, susceptible de contenir au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro,. Selon un premier aspect de l'invention, ledit procédé comprend les étapes suivantes : 5 a) à partir de ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, préparer une solution d'essai, adaptée pour subir un test de mutation réverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, en solubilisant tout ou partie de ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou 10 nutritionnelle dans un solvant approprié, b) fractionner ladite solution d'essai de manière à obtenir deux fractions complémentaires, adaptées pour subir un test de mutation réverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, à savoir : une fraction A comprenant, ou consistant essentiellement en, ledit au 15 moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et une fraction C dépourvue dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et c) prélever un volume prédéfini de ladite fraction A et dégrader, de manière sélective, ledit au moins un constituant identifié comme étant mutagène in vitro au 20 sein de ce volume prédéfini, de manière à obtenir une fraction B, dans laquelle ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a été sélectivement dégradé. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape de fractionnement b) est 25 effectuée par extraction sur au moins une phase solide, ladite au moins une phase solide étant sélectionnée pour adsorber spécifiquement ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro. De manière avantageuse, et selon ce mode de réalisation préféré, l'étape de 30 fractionnement b) comprend les étapes suivantes : b.1) charger ladite solution d'essai à fractionner sur ladite au moins une phase solide en éluant les composés sans affinité de manière à obtenir ladite fraction C, et 3059429 10 b.2) éluer spécifiquement ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro resté adsorbé sur ladite au moins une phase solide après l'étape b.1) de manière à obtenir ladite fraction A. 5 De préférence, ledit procédé comprend, entre les étapes b.1) et b.2), l'étape suivante : b.1') éluer les composés autres que ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro sur ladite au moins une phase solide de manière à compléter ladite fraction C. 10 Préférablement, ledit procédé comprend, après l'étape de fractionnement b), l'étape suivante : d) effectuer au moins un lavage de ladite au moins une phase solide, de manière à obtenir une fraction D comprenant les composés éventuellement encore adsorbés sur ladite au moins une phase solide après l'étape de fractionnement b). De préférence, et toujours selon le mode de réalisation préféré susvisé, ledit procédé 15 comprend, après l'étape de fractionnement b) et avant l'étape de prélèvement c), l'étape suivante : b') à partir de la fraction A, effectuer au moins un deuxième fractionnement, de préférence par extraction sur au moins une phase solide sélectionnée pour adsorber ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro avec une sélectivité 20 différente de celle de ladite au moins une phase solide mentionnée précédemment, de manière à : obtenir une fraction A dépourvue de composés autres que ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et compléter la fraction C avec les composés autres que ledit au moins un 25 constituant identifié comme mutagène in vitro obtenus à l'issue dudit au moins un deuxième fractionnement. De préférence, l'étape b') est effectuée à partir d'une fraction regroupant le contenu des fractions A et D. 30 3059429 11 Avantageusement, la dégradation sélective dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est obtenue, à l'étape c), en plaçant le volume prédéfini de la fraction A dans les conditions expérimentales suivantes : pH compris entre environ 7,0 et environ 7,4 et température comprise entre environ 35°C et environ 40°C, 5 durant un laps de temps compris entre environ 1 heure et environ 3 heures. Selon un deuxième aspect de l'invention, l'invention concerne un procédé tel que décrit précédemment comprenant, avant l'étape b), l'étape suivante : a') traiter ladite solution d'essai avec un système d'activation métabolique 10 exogène tel qu'un mélange S9 puis appliquer les étapes b) et c), et éventuellement au moins une des étapes b', b.1), b.1'), b.2), de préférence au moins les étapes b.1), b.1'), et b.2), à la solution d'essai ainsi traitée afin d'obtenir les fractions suivantes : - Fraction A', comprenant, ou consistant essentiellement en, ledit au moins un 15 constituant identifié comme mutagène in vitro - Fraction C', dépourvue dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et - Fraction B', dans laquelle ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a été sélectivement dégradé. 20 De manière avantageuse, selon ce deuxième aspect de l'invention, l'on applique, après l'étape de fractionnement b), l'étape d) à la solution d'essai ainsi traitée afin d'obtenir la fraction D', comprenant les composés éventuellement encore adsorbés sur ladite au moins une phase solide après l'étape de fractionnement b). 25 L'invention a également pour objet un procédé permettant d'imputer une réponse non négative, de préférence une réponse positive, obtenue lors d'un premier test de mutation reverse sur bactéries réalisé en absence d'activation métabolique exogène, à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain 30 ou animal, à au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro susceptible d'être présent au sein de ladite préparation, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - mettre en oeuvre le procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai selon le premier aspect de l'invention mentionné supra, 3059429 12 à partir desdites fractions A, C et B, réaliser un deuxième test de mutation réverse sur bactéries dans les mêmes conditions expérimentales que celles dans lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé, 5 comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit premier test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit deuxième test 10 de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C et B. Avantageusement, ce procédé comprend les étapes suivantes : réaliser ledit deuxième test de mutation réverse sur bactéries également sur ladite fraction D, comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse 15 sur bactéries, et imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit premier test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit deuxième test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, 20 pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C, B et D. Un autre objet de l'invention concerne un procédé permettant d'imputer une réponse non négative, de préférence une réponse positive, obtenue lors d'un premier test de mutation réverse sur bactéries réalisé au moins en présence 25 d'activation métabolique exogène, au moyen d'un système d'activation métabolique exogène tel qu'un mélange S9, à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, à au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro susceptible d'être présent au sein de ladite préparation, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 30 1) mettre en oeuvre le procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai selon le premier aspect de l'invention mentionné supra, 3059429 13 2) traiter ladite fraction C au moyen dudit système d'activation métabolique exogène dans des conditions expérimentales appropriées pour permettre, le cas échéant, la production dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro à partir d'au moins un pro-mutagène contenu dans ladite 5 fraction C, 3) mettre en oeuvre au moins un moyen d'analyse adapté pour détecter ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et 4) dans l'éventualité où ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est détecté dans la fraction C ainsi traitée, 10 4.1) mettre en oeuvre le procédé selon le deuxième aspect de l'invention de manière à obtenir lesdites fractions A', C' et B', et de préférence D', puis réaliser un deuxième test de mutation réverse sur bactéries à partir des fractions A', C' et B', et de préférence D', dans les mêmes conditions expérimentales que celles dans 15 lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé en absence d'activation métabolique exogène, 4.2) comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et 4.3) imputer la réponse non négative, de préférence positive, 20 obtenue audit un test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A' et négatif pour lesdites fractions C', B' et, de préférence, D', ou 25 5) dans l'éventualité où ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro n'est pas détecté dans la fraction C ainsi traitée, 5.1) mettre en oeuvre le procédé selon le premier aspect mentionné supra de manière à obtenir lesdites fractions A, C et B, et de préférence D, puis réaliser un deuxième test de mutation réverse 30 sur bactéries à partir desdites fractions A, C et B, et de préférence D, dans les mêmes conditions expérimentales que celles dans lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé, 3059429 14 5.2) comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et 5.3) imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit un test de mutation réverse sur bactéries audit au 5 moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C, B et, de préférence, D. 10 De préférence, et ce quel que soit l'aspect/le mode de réalisation de l'invention considéré, la préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle mentionnée dans la présente demande de brevet est une préparation à base de plantes, de préférence à base de plantes comprenant, ou suspectée de comprendre, des flavonols, avantageusement comprenant, ou suspectée de comprendre, des 15 aglycones flavoniques. De préférence, ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a un profil de sécurité établi, garantissant son innocuité in vivo. 20 Préférablement, ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est au moins un aglycone flavonique, avantageusement la quercétine et/ou le kaempférol; de manière particulièrement préférée ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est la quercétine. Tel qu'indiqué précédemment, la dégradation sélective dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro 25 (et en particulier dudit au moins un aglycone flavonique) est obtenue, à l'étape c), en plaçant le volume prédéfini de la fraction A dans les conditions expérimentales suivantes : pH compris entre environ 7,0 et environ 7,4 et température comprise entre environ 35°C et environ 40°C, durant un laps de temps compris entre environ 1 heure et environ 3 heures. Cette dégradation sélective, effectuée dans les conditions 30 expérimentales susvisées, s'avère particulièrement efficace pour ce qui concerne la quercétine et/ou le kaempférol (et en particulier la quercétine). Avantageusement, ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle est sous forme pulvérulente. 3059429 15 Le procédé selon la présente invention permet de démontrer, avec une grande fiabilité et reproductibilité, l'imputabilité de la non négativité (et de préférence de la positivité) au test d'Ames uniquement audit au moins un flavonol. En d'autres termes, 5 ceci démontre clairement qu'aucun autre constituant (constituant phytochimique) de la préparation à base de plantes testé (par exemple de l'extrait végétal testé) n'est impliqué dans le fait que la réponse au test d'Ames n'est pas négative/est positive. Tel qu'indiqué précédemment, le procédé selon l'invention est particulièrement 10 adapté aux préparations pharmaceutiques, cosmétiques ou nutritionnelles à base de plantes. Toutefois, ce procédé peut également être mis en oeuvre, avec succès, à partir de toute préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, à partir du moment où celle-ci est susceptible de contenir au moins un constituant connu/identifié comme mutagène in vitro, et que ledit au moins 15 un constituant connu/identifié comme mutagène in vitro peut être sélectivement dégradé à l'étape c) du procédé selon l'invention. L'homme du métier saura, sans difficultés excessives, adapter les différentes étapes, et en particulier les étapes en lien avec le fractionnement, en fonction de la nature : - de la préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle testée, et 20 - dudit au moins un constituant connu/identifié comme mutagène in vitro. Définitions Flavonoïdes. Les flavonoïdes (ou bioflavonoïdes) sont des métabolites secondaires des 25 plantes partageant tous une même structure de base formée par deux cycles aromatiques reliés par une chaîne à trois carbones, ladite chaîne à trois carbones étant généralement cyclique et plus précisément « fermée » en un hétérocycle oxygéné hexaou pentagonal. Les flavonoïdes sont responsables de la couleur variée des fleurs et des fruits et représentent une source importante d'antioxydants dans l'alimentation humaine. 30 Ils forment une sous-classe des polyphénols. A ce jour, plus de six mille flavonoïdes ont été décrits chez les plantes. 3059429 16 Flavonols. Les flavonols représentent une classe de flavonoïdes particuliers qui ont en commun un squelette 3-hydroxyflavone (3-hydroxy-2-phenylchromen-4-one), représenté par la formule (I) infra : 5 (I) La diversité des flavonols est principalement liée à la présence de différents groupements OH et/ou OCH3 sur le squelette 3-hydroxyflavone. 10 Les flavonols peuvent se présenter sous forme « libre » (également dénommée « forme aglycone » ; on parle alors indifféremment de « flavonols libres », d'« aglycones flavoniques », d' « aglycones de flavonol » ou encore de « flavonols aglycones ») ou encore sous forme glycoside (à savoir liés à un sucre, tel que le robinose ou le rutinose ; 15 on parle alors indifféremment « d'hétérosides de flavonol » ou de « flavonols glycosides »). A titre illustratif, les principaux aglycones flavoniques (flavonols libres) sont présentés dans le Tableau 1 infra et les principaux hétérosides de flavonols sont présentés dans le 20 Tableau 2 infra, les deux tableaux faisant référence à la formule générale (I) présentée ci-dessus. 3059429 17 Nom Nom IUPAC 5 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6 3- 3-hydroxy-2- phenylchromen-4- one H H H H H H H H H Hydroxyflavone Azaléatine 2-(3,4- dihydroxyphenyl)- 3,7-dihydroxy-5- methoxychromen4-one OC H3 H OH H H H OH OH H Fisétine 3,3',4',7- tetrahydroxy-2- phenylchromen-4- one H H OH H H H OH OH H Galangine 3,5,7-trihydroxy-2- phenylchromen-4- one OH H OH H H H H H H Gossypétine 2-(3,4- dihydroxyphenyI)- 3,5,7,8- tetrahydroxychrom en-4-one OH H OH OH H OH OH H H Isorhamnétine 3,5,7-trihydroxy-2- (4-hydroxy-3- methoxyphenyl)chr omen-4-one OH H OH H H OC H3 OH H H Kaempféride 3,5,7-trihydroxy-2- (4- methoxyphenyl)chr omen-4-one OH H OH H H H OC H3 H H Kaempférol 3,4',5,7- tetrahydroxy-2- phenylchromen-4- one OH H OH H H H OH H H Morine 2-(2,4- dihydroxyphenyl)- 3,5,7- trihydroxychromen4-one OH H OH H O H H OH H H Myricétine 3,3',4',5',5,7- hexahydroxy-2- phenylchromen-4- one OH H OH H H OH OH OH H Natsudaidaine 2-(3,4- dimethoxyphenyl)- 3-hydroxy-5,6,7,8- tetramethoxychrom en-4-one OC H3 O OC H3 OC H3 H H OC H3 OC H3 H C H3 Pachypodol 5-hydroxy-2-(4- hydroxy-3- methoxyphenyI)- 3,7- dimethoxychromen OH H OC H3 H H OC H3 OH H H 3059429 18 -4-one Quercétine 3,3',4',5,7- pentahydroxy-2- phenylchromen-4- one OH H OH H H OH OH H H Rhamnazine 3,5-dihydroxy-2-(4- hydroxy-3- methoxyphenyI)-7- methoxychromen4-one OH H OC H3 H H OC H3 OH H H Rhamnétine 2-(3,4- dihydroxyphenyl)- 3,5-dihydroxy-7- methoxychromen4-one OH H OC H3 H H OH OH H H Tableau 1 : Principaux aglycones flavoniques Nom Nom de I'aglycone flavonique correspondan t 3 5 6 7 8 2 , 3' 4' 5 6 1 1 Astragalin Kaempférol Glc Azalein Azaléatiné Rha Hyperoside Quercétine Gal Isoquercéti Quercétine Glc ne Kaempféritr Kaempférol Rha Rha ine Myricitrine Myricétine Rha Quercitrine Quercétine Rha Robinine Kaempférol Robi nose Rha Rutine Quercétine Ruti nose Spiraéoside Quercétine Xanthorha Rhamnétine trisa ccha ride mnine Amurensin e Kaempférol Glc Ter t-am yl Icariine Kaempféride Rha Glc Ter tam yl Troxérutine Quercétine Ruti nose hydroxy ethyl hydroxy ethyl hydroxy ethyl Tableau 2 : principaux hétérosides de flavonol 3059429 19 Quercétine. La quercétine, telle que mentionnée dans les Tableaux 1 et 2 supra, également dénommée quercétol [3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, CAS n° 117-39-5], est un aglycone flavonique (flavonol libre) largement retrouvé dans l'alimentation. La 5 quercétine est représentée par la formule (Il) infra. 10 La quercétine est constituée de cycles benzéniques (cycles A et B ; cf. formule (Il)) reliés par un hétérocycle oxygéné de type y-pyrone (Cycle C ; cf. formule (Il)) (Kühnau, 1976 [6] ; Morand et al. 1998) [7]. Dans les plantes, la quercétine est le plus communément retrouvée sous forme 15 d'hétéroside/ glycoside (présence d'un groupement sucre, le plus souvent en position 3 du cycle insaturé C) formant des 0-8-glycosides tels que la quercitrine ou la rutine (Merck, 2001 [8]). La quercétine peut être obtenue à partir de plantes par l'extraction de ses formes glycosylées suivie d'une hydrolyse permettant le relargage de la forme aglycone puis par une étape de purification. 20 Test de génotoxicité in vitro . Par « test de génotoxicité in vitro », l'on entend, au sens de la présente invention, tout test permettant de mettre en évidence, au sein d'une substance ou d'une préparation (avantageusement à base de plantes), une activité génotoxique et/ou une activité pro-génotoxique). Tel qu'indiqué précédemment, ledit test 25 de génotoxicité in vitro est en première intention un test de mutation reverse sur 3059429 20 bactéries (encore dénommé test d'Ames), avantageusement en absence et en présence d'un système d'activation métabolique exogène. Test de mutation réverse sur bactéries. Le test/essai de mutation réverse sur 5 bactéries - également dénommé « test d'Ames » - est pratiqué sur des souches de Salmonella typhimurium et/ou d'Escherichia coli auxotrophes pour un acide aminé, afin de détecter des mutations ponctuelles provenant de substitutions ou de décalages du cadre de lecture. Le principe de cet essai de mutation réverse sur bactéries repose sur la détection de mutations qui inversent des mutations présentes dans les souches 10 d'essai et rétablissent les possibilités fonctionnelles des bactéries pour synthétiser un acide aminé essentiel. Selon la ligne directrice 471 de l'OCDE, les suspensions des cellules bactériennes sont exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un système d'activation 15 métabolique exogène. Au moins cinq concentrations différentes analysables de la substance d'essai devraient être employées. La concentration d'essai maximum recommandée pour les substances non-cytotoxiques solubles est de 5 mg/boîte ou de 5 pL/boîte. Il existe deux méthodes : la méthode par étalement et la méthode de pré-incubation. Pour les deux techniques, après deux ou trois jours d'incubation à 37°C, les 20 colonies révertantes sont comptées et comparées au nombre de colonies révertantes spontanées des boîtes de contrôle. Afin de se conformer à la ligne directrice 471 de l'OCDE, au moins cinq souches de bactéries (de préférence Salmonella typhimurium TA1535, TA1537, TA98, TA100 et 25 TA102) ainsi qu'une activation métabolique exogène sont employées aux fins de la présente invention. Activation métabolique exogène (ou, plus simplement « activation métabolique). Les bactéries doivent être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un 30 système d'activation métabolique exogène approprié. Le système le plus communément utilisé est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur, préparée à partir de foies de rongeurs traités avec des inducteurs enzymatiques comme Aroclor 1254 (Ames et al. [15], 1975 ; Maron et al., 1983 [16]) ou une combinaison de phénobarbitone et G naphthoflavone (Tamura et al., 1980 [17] ; Matsushima et al., 1976 [18]; Elliott et al., 1992 [19]). La fraction post-mitochondriale est généralement utilisée à une concentration 3059429 21 comprise entre 5 et 30 % v/v dans le mélange S9 (« S9 mix », en langue anglaise). Comme cela est bien connu de l'homme du métier, le choix et la composition du système d'activation métabolique exogène peut varier suivant la classe chimique de la substance qui est soumise à l'essai. Dans certains cas, il peut y avoir un avantage à utiliser plusieurs concentrations de 5 la fraction post-mitochondriale. S'agissant de composés azoïques et diazoïques, un système d'activation métabolique différent peut s'avérer plus approprié (ligne directrice 471 de l'OCDE). - Fraction post-mitochondriale S9 0.1mL - MgCl2, 0.4M 0.02 mL - KCI, 1.65M 0.02 mL - Tampon phosphate 0.2M pH 7.4 0.5 mL - NADP, 0.1M 0.04 mL - Glucose-6-phosphate, 1M 0.005 mL - H2O 0.315 mL Avantageusement, le mélange S9 est préparé extemporanément avant chaque essai et est préservé dans un endroit réfrigéré avant utilisation. 25 Profil de sécurité établi. Comme cela est connu de l'homme du métier, l'expression « profil de sécurité établi » - ou « profil de sécurité bien établi » - désigne le potentiel génotoxique d'un composé qui est connu et établi (reconnu) par la Communauté scientifique. 30 Drogues végétales. Les drogues végétales sont essentiellement des plantes, parties de plantes ou algues, champignons, lichens, entiers, fragmentés ou brisés, utilisés en l'état, soit le plus souvent sous forme desséchée, soit à l'état frais. Certains exsudats n'ayant pas subi de traitements spécifiques sont également considérés comme des drogues végétales. Mélange S9 (« S9-mix » en langue anglaise). Le mélange S9, bien connu de l'homme 10 du métier, a été abondamment décrit dans la littérature. Dans les essais de mutation reverse présentés en exemple, le système d'activation métabolique correspond à un mélange S9 (« 59-mix » en langue anglaise) préparé à partir de la fraction post-mitochondriale de foie de rats traités par Aroclor 1254. La composition de ce mélange S9 par mL est la suivante : 15 20 35 3059429 22 Préparations à base de drogues végétales (plus simplement dénommée « préparations à base de plantes » ; la législation communautaire européenne privilégiant cette dénomination). Les préparations à base de drogues végétales sont des produits homogènes obtenus en soumettant les drogues végétales à des traitements 5 tels que l'extraction, la distillation, l'expression, le fractionnement, la purification, la concentration ou la fermentation. Ce sont, par exemple, des extraits, des huiles essentielles, des jus d'expression, des exsudats ayant subi un traitement, ou des drogues végétales ayant subi une opération de réduction de taille pour des applications spécifiques (par exemple, divisées pour des tisanes ou pulvérisées pour une 10 encapsulation). Les drogues végétales pulvérisées pour encapsulation présentent un intérêt particulier pour la Demanderesse. 15 Extraits de drogues végétales. Les extraits de drogues végétales mentionnés supra sont des préparations liquides (préparations liquides obtenues par extraction), semisolides (extraits mous et oléorésines) ou solides (extraits secs) obtenues à partir de drogues végétales à l'aide de solvants appropriés. 20 Au sens de la présente invention, les préparations à base de plantes incluent également les teintures mères pour préparations homéopathiques. Les teintures mères pour préparations homéopathiques sont des préparations liquides, obtenues par l'action dissolvante d'un véhicule approprié sur des matières premières. Ces dernières sont généralement utilisées à l'état frais ou, parfois, sous forme desséchée. Elles peuvent 25 également être obtenues à partir de sucs végétaux avec ou sans addition d'un véhicule. Brève description des dessins L'invention, sa fonctionnalité, ses applications ainsi que ses avantages seront mieux 30 appréhendés à la lecture de la description détaillée présentée ci-après, faite en référence aux figures, dans lesquelles : 3059429 23 - les figures 1A et 1B présentent les résultats du test de mutation reverse sur bactéries obtenus avec l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge ainsi que sur une solution quercétine de référence, à doses équivalentes (étude El), - les figures 2 et 3 sont des représentations graphiques regroupant les données 5 cinétiques du contenu en quercétine de l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge et d'une solution quercétine de référence, d'une part en conditions de cinétique sans activation métabolique S9(-) (cf. figure 2) et d'autre part après activation métabolique S9(+) (cf. figure 3), - la figure 4 est une représentation graphique des données cinétiques des 10 contenus en quercétine et en hétérosides de flavonol d'un extrait hydro- alcoolique de Vigne Rouge (éthanol 50% V/V), après traitement au mélange S9, - les figures 5 et 6 sont des chromatogrammes obtenus à partir du susdit extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge avant et après 8 heures de traitement au mélange S9, la figure 6 étant un agrandissement de la partie caractéristique de la 15 figure 5, - les figures 7 et 8 sont des représentations graphiques de la cinétique du contenu en quercétine d'une solution d'extrait sec de feuille de lierre et d'une solution de référence de quercétine, d'une part en conditions de cinétique sans activation métabolique S9(-) (cf. figure 7) et d'autre part après activation métabolique S9(+) 20 (cf. figure 8), - la figure 9 représente les chromatogrammes de la Fraction A et de la Fraction B obtenus en CLHP (détection 370 nm), - la figure 10 représente les chromatogrammes de la Fraction A et de la Fraction B obtenus en utilisant une détection "Max Plot", chromatogrammes qui montrent la 25 dégradation complète de la quercétine dans la Fraction B, ainsi que la présence de tous les autres composés au sein de cette Fraction B, - la figure 11 représente les chromatogrammes de la Fraction A et de la Fraction B obtenus en GC (détection FID), chromatogrammes à partir desquels l'on observe des profils chromatographiques similaires entre lesdites Fractions A et B, 30 - la figure 12 représente les chromatogrammes de la solution DMSO d'extrait sec de lierre, de la Fraction C et de la Fraction A, obtenus en utilisant une détection « Max Plot », - la figure 13 représente les chromatogrammes de la solution DMSO d'extrait sec de lierre et de la Fraction D, obtenus en utilisant une détection « Max Plot » 3059429 24 (chromatogrammes permettant de conclure à l'absence de composés adsorbés sur la cartouche), - la figure 14 représente les chromatogrammes de la solution DMSO d'extrait sec de lierre et de la Fraction D obtenus en GC (détection FID) (chromatogrammes 5 permettant de conclure à l'absence de composés adsorbés sur la cartouche), - la figure 15 est une représentation graphique présentant la cinétique du contenu en quercétine de la Fraction C en présence d'activation métabolique, - la figure 16 présente les résultats du test de mutation réverse sur bactéries sur les différentes fractions A, B, C et D préparées à partir d'une solution DMSO 10 d'extrait sec de feuille de lierre (étude E3), - la figure 17 présente les résultats du test de mutation réverse sur bactéries sur les fractions A, et C préparées à partir d'une solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre, ainsi que sur une solution de référence, en l'absence d'activation métabolique (étude E4), 15 - la figure 18 présente les résultats du test de mutation réverse sur bactéries sur les fractions A, et C préparées à partir d'une solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre, ainsi que sur une solution de référence, en présence d'activation métabolique (étude E5), - les figures 19 et 20 sont des chromatogrammes obtenus en CLHP à partir du 20 susdit extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge et de sa fraction C, la figure 20 étant un agrandissement de la partie caractéristique de la figure 19, - la figure 21 est une représentation graphique présentant la cinétique du contenu en quercétine de la fraction C préparée à partir du susdit extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge en présence d'activation métabolique dans les conditions 25 expérimentales du test d'Ames, - la figure 22 représente les chromatogrammes de la Fraction C préparée à partir du susdit extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge avant traitement et après traitement par le mélange S9, - la figure 23 représente les chromatogrammes de l'extrait DMSO de feuille d'Olivier 30 avant et après traitement par le mélange S9, et - la figure 24 représente les chromatogrammes de l'extrait DMSO de feuille d'Olivier traité par le mélange S9 avant fractionnement et de sa fraction C. Description détaillée de l'invention 3059429 25 La description détaillée ci-après a pour but d'exposer l'invention de manière suffisamment claire et complète, notamment à l'aide d'exemples, mais ne doit en aucun cas être regardée comme limitant l'étendue de la protection aux modes de réalisation 5 particuliers et aux exemples présentés ci-après. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé innovant développé par la Demanderesse est applicable - et parfaitement adapté - aux substances/préparations à base de plantes comprenant des - ou susceptibles d'induire 10 la formation de - flavonols libres et permet de connaître leur imputabilité dans la non-négativité (typiquement la positivité) observée en test d'Ames. Ce procédé innovant est basé sur un procédé - également innovant - de préparation et de fractionnement de la solution d'essai, tel que mentionné supra. 15 L'objectif de la Demanderesse étant que la susdite fraction C (fraction exempte de flavonols libres) soit la plus représentative possible de la solution initiale fractionnée et donc de la drogue végétale/préparation à base de plantes étudiée en contenant la majorité des constituants de la préparation à base de plantes (par exemple de l'extrait végétal) à l'exception des flavonols libres. 20 La susdite fraction A, quant à elle, ne doit pas contenir d'autres constituants de la drogue végétale que les flavonols libres ou, sinon, seulement en faible quantité. En outre, de manière avantageuse, cette fraction A ne doit pas contenir de constituant(s) qui s'avère(nt) instable(s) lorsque le traitement permettant d'obtenir la fraction B est 25 réalisé. Toujours selon ce mode de réalisation particulièrement préféré, le fractionnement de la solution d'essai est réalisé en utilisant une méthodologie de séparation solide-liquide, couramment nommée SPE (pour « Solid Phase Extraction », en langue anglaise). Une 30 ou deux phases solides (cartouche(s) de fractionnement) est/sont sélectionnée(s) pour leurs propriétés permettant l'adsorption spécifique des flavonoïdes par rapport à d'autres constituants de la matrice végétale. Il s'agit de préférence d'une phase Strata-X fournie par Phenomenex (Strata-X 33pm Polymeric Reversed Phase) et/ou d'une phase Bond Elut C18 fournie par Agilent. 3059429 26 Lorsque la fraction A, obtenue après le premier fractionnement, contient en quantité non négligeable (typiquement plus de dix pour cent) les traceurs de l'extrait végétal ou contient au moins un constituant susceptible de se montrer instable lors du traitement 5 permettant d'obtenir la fraction B, un second fractionnement des constituants s'avère particulièrement avantageux. Ce second fractionnement est, de préférence, mis en oeuvre en utilisant une seconde phase solide (par exemple phase Bond Elut C18). Cette phase solide permet d'adsorber, avec une autre sélectivité, les flavonols libres par rapport aux autres constituants présents et ainsi permet d'isoler les flavonols libres et de 10 constituer la fraction C exempte de flavonols libres en regroupant les constituants écartés de la fraction A avec ceux obtenus lors du premier fractionnement. Le fractionnement de la solution d'essai en deux fractions complémentaires, à savoir la fraction A contenant les flavonols libres et la fraction C exempte de flavonols libres, se 15 décompose avantageusement en quatre ou huit grandes étapes : 1) charge de la solution d'essai à fractionner (environ 5 ml d'extrait végétal, dont l'éthanol est évaporé si le solvant est hydro-alcoolique, dilué au quart dans l'eau ou dans un tampon phosphate pH 5,3 permettant de stabiliser) sur la phase solide avec élution des composés sans affinité, constituant une partie de la fraction C exempte de 20 flavonols libres, 2) élution de composés autres que les flavonols libres adsorbés sur la phase solide permettant de compléter la fraction C exempte de flavonols libres par lavages successifs avec des mélanges composés de méthanol et d'eau dont le pourcentage de méthanol varie de 50 à 75 % (pourcentages à adapter aux constituants à éluer), 25 3) élution des composés restés adsorbés sur la phase solide avec du méthanol permettant l'obtention de la fraction A contenant les flavonols libres, 4) lavage de la phase solide avec 5 ml de solvant entrant dans la composition de la solution d'essai (DMSO ou solvant hydro-alcoolique) et avec environ 50 ml d'éthanol anhydre pour obtenir la fraction D de lavage, 30 5) Si un second fractionnement s'avère opportun/nécessaire (cf. supra), la fraction D de lavage (étape 4) est regroupée avec la fraction A contenant les flavonols libres (étape 3) afin de faire l'objet d'un second fractionnement. La solution obtenue après évaporation des solvants volatils (par exemple méthanol et éthanol) et dilution au quart ou ajustement du volume à environ 10 ml avec du tampon phosphate pH 5,3 est chargée 3059429 27 sur la phase solide choisie (Bond Elut). Les composés recueillis lors de cette charge constituent une partie de la fraction A contenant les flavonols libres, 6) élution de composés flavonols libres faiblement adsorbés sur la phase solide permettant de compléter la fraction A en flavonols libres par lavages successifs avec 5 des mélanges composés de méthanol et d'eau dont le pourcentage de méthanol varie de 50 à 60 % (pourcentages à adapter aux constituants à éluer), évaporation du solvant puis ajustement du volume à 5 ml avec le solvant entrant dans la composition de la solution d'essai (DMSO, solvant hydro-alcoolique ou autre) ; 7) élution des composés restés adsorbés sur la phase solide avec du méthanol 10 permettant de compléter la fraction C exempte de flavonols libres obtenue lors du premier fractionnement (étape 1 et 2), évaporation du solvant puis ajustement du volume à 5 ml avec le solvant entrant dans la composition de la solution d'essai (DMSO, solvant hydro-alcoolique ou autre) ; 8) lavage des deux cartouches superposées avec 5 ml de solvant entrant dans la 15 composition de la solution d'essai (DMSO ou solvant hydro-alcoolique) et 50 ml d'éthanol anhydre, évaporation du solvant puis ajustement du volume à 5 ml avec le solvant entrant dans la composition de la solution d'essai (DMSO, solvant hydroalcoolique ou autre) (fraction de lavage). L'analyse du contenu des fractions A et C et de leur complémentarité effectuée, de préférence, en CLHP (Chromatographie Liquide 20 Haute Performance) et/ou CG (Chromatographie Gazeuse), avantageusement en CLHP et CG, a montré l'intérêt de préparer une fraction supplémentaire, la fraction B, afin de pouvoir apporter la preuve indiscutable de l'imputabilité des flavonols libres dans la positivité observée en test d'Ames avec la solution d'essai. 25 Plus précisément, la fraction B correspond à la fraction contenant les flavonols libres c'est-à-dire la fraction A après dégradation sélective de ces derniers (car présence de composés additionnels dans la fraction A contenant les flavonols). De préférence, la dégradation est réalisée par dilution d'une partie de la fraction A dans du tampon phosphate pH 7,4 (de 1/2 à 1/20ème en fonction de la matrice) puis chauffage à 35-40°C 30 pendant 1 à 3h. La solution est ensuite reconstituée à l'équivalent de la fraction A par évaporation du solvant sous pression réduite avec ajout d'éthanol anhydre et pour finir reconstitution de la solution au volume initial dans le solvant entrant dans la composition de la solution d'essai (DMSO, solvant hydro-alcoolique ou autre). 3059429 28 La fraction de lavage D de la phase solide, quant à elle, a pour objectif de vérifier qu'aucun constituant de l'extrait végétal n'est resté adsorbé sur la/les phases solides (de préférence Strata X et /ou Bond Elut). 5 D'après les travaux de la Demanderesse, les flavonols glycosides éventuellement contenus dans la fraction C, pourraient s'avérer susceptibles, le cas échéant, de donner lieu à une nouvelle production d'aglycones flavoniques si cette fraction C devait être testée au cours d'un essai de mutation réverse en présence d'activation métabolique. Ceci entrainerait bien évidemment un biais de résultat. 10 Afin d'éviter ce biais de résultat, avant que chacune des 4 fractions mentionnées supra, à savoir les fractions A, B, C et D, ne soit testée au cours d'un essai de mutation réverse sur bactéries, il convient donc de s'assurer du comportement du contenu en flavonol(s) libre(s) (et, de manière avantageuse, en quercétine) de la fraction C après activation 15 métabolique exogène (par exemple par le biais d'un traitement avec le mélange S9). Le protocole correspondant est présenté ci-après. Afin d'évaluer si le fractionnement doit être réalisé sur la préparation à base de plantes (par exemple sur l'extrait végétal) préalablement traitée ou pas par le mélange S9, le 20 comportement du contenu en quercétine de la fraction C en présence d'activation métabolique est testé selon le protocole suivant qui consiste à mélanger 2mL de solution de NaCI à 5 g/L ; 0,1 mL de tampon phosphate pH 7,4 ; 0,5 mL de S9-Mix et 0,5 mL de la fraction C. La solution obtenue est ensuite filtrée sur membrane 0,45 pm (PVDF) puis placée à 37°C dans le passeur d'échantillon permettant les injections en 25 CLHP aux temps définis de l'étude de cinétique, toutes les 35 min jusqu'à 105 min pour la détermination de la teneur en quercétine. Deux options sont alors possibles : 1) Le traitement de la fraction C avec le mélange S9 ne conduit à aucune 30 nouvelle génération de quercétine (exemple du lierre - cf. figure 15) ; dans ce cas un nouveau fractionnement de la préparation à base de plantes (par exemple de l'extrait végétal) devra être conduit avec obtention des fractions A, B, C et D qui seront directement testées en test d'Ames et ce dans les mêmes conditions que celles où la préparation à base de plantes présentait 3059429 29 une positivité (mêmes souches bactériennes et même conditions, à savoir. en présence ou en absence d'activation métabolique selon les cas) ; ou 2) le traitement de la fraction C avec le mélange S9 conduit à une génération de quercétine (exemple de l'extrait hydro-alcoolique de vigne rouge - cf. figure 21 5 et section 3.2 infra) ; dans ce cas, un nouveau fractionnement devra être effectué mais sur la préparation à base de plantes (par exemple sur l'extrait végétal) qui aura été préalablement traitée par un mélange S9 afin que les flavonols glycosides de l'extrait végétal susceptibles de se retrouver dans la fraction C et potentiellement « générateurs » de quercétine soient 10 métabolisés, avant fractionnement, en flavonols aglycones. Dans ce dernier cas, le fractionnement se réalise donc sur la préparation à base de plantes (par exemple sur l'extrait végétal) traitée préalablement avec le mélange S9 et les fractions A, B, C et D obtenues seront testées au cours d'un essai de mutation réverse sur bactéries uniquement en absence d'activation 15 métabolique vis-à-vis des souches où une positivité de la préparation à base de plantes (par exemple sur l'extrait végétal) a été obtenue. Le traitement par activation métabolique avant fractionnement est réalisé en mettant en oeuvre les étapes suivantes : 1) dans un flacon muni d'un bouchon, mélange de 1 volume de la 20 solution d'essai avec 5 volumes de S9-Mix préalablement centrifugé (5 min, 10000 rpm) (par exemple respectivement 5 mL et 25 mL) 2) incubation de la solution dans le flacon fermé à 37°C pendant 60 minutes 25 3) reconstitution de la solution d'essai par ajout de 200 mL d'éthanol anhydre, repos pendant 3-4h à -20°C afin de précipiter les sels, centrifugation (5 min, 10000 rpm), évaporation du solvant sous vide puis ajustement au volume de solvant initial de la solution d'essai mise en oeuvre (dans l'exemple 5 mL). 30 L'étape de fractionnement décrite supra est alors mise en oeuvre sur la solution ainsi obtenue afin d'obtenir les 4 fractions A, B, C et D. Et pour les deux options présentées ci-dessus, si l'essai de mutation réverse sur bactéries à partir des fractions A, B, C et D révèle une positivité uniquement de la 3059429 30 fraction contenant les flavonols libres (à savoir la fraction A) et une négativité des trois autres fractions, à savoir les fractions B, C et D, il peut être alors conclu avec certitude que l'activité mutagène initialement obtenue en test d'Ames avec la préparation à base de plantes (par exemple avec l'extrait végétal) est exclusivement attribuable/imputable à 5 la présence des flavonols libres dans cette préparation à base de plantes (par exemple dans cet extrait végétal) et qu'aucun autre constituant phytochimique de ladite préparation à base de plantes (par exemple de l'extrait végétal) n'est impliqué dans la positivité observée. 10 Exemple 1 : Etudes cinétiques simulant le test d'Ames (avec et sans activation métabolique au S9) et étude de déglycosylation liée à l'action du mélange S9 1.1. Introduction Dans le cas d'un extrait liquide aqueux préparé à partir du contenu des gélules ARKOGELULES Vigne Rouge des laboratoires ARKOPHARMA, testé en mettant en 15 oeuvre le test d'Ames en absence d'activation métabolique, le profil mutagène de la quercétine (« solution de référence » ou « solution témoin »), évaluée dans les mêmes conditions expérimentales et à des doses équivalentes à celles retrouvées dans l'extrait liquide aqueux, était similaire à celui de l'extrait liquide aqueux (solution d'essai), avec cependant une amplitude de réponse légèrement plus élevée obtenue avec la solution 20 de référence de quercétine, indiquant que la présence de quercétine dans l'extrait liquide aqueux explique pleinement les effets mutagènes observés avec l'extrait liquide aqueux, dans la condition spécifique d'absence d'activation métabolique. Toutefois, en présence d'activation métabolique exogène, la présence de quercétine 25 dans l'extrait liquide aqueux contribue mais ne semble pas pleinement expliquer les effets mutagènes induits par cet extrait. En effet, une amplitude de réponse avec la solution de référence de quercétine nettement plus faible comparée à celle observée avec l'extrait aqueux a été obtenue en présence d'activation métabolique. 30 Une telle situation, comme rencontrée avec l'extrait liquide aqueux de feuille de Vigne Rouge, où uniquement en présence d'activation métabolique, la présence de ces flavonols libres identifiés dans l'extrait végétal considéré, ne semble pas totalement 3059429 31 suffisante pour expliquer la positivité obtenue, a été observée avec plusieurs autres préparations à base de plantes contenant des flavonoïdes (et en particulier des flavonols), à savoir en présence d'activation métabolique, obtention d'une amplitude de réponse de la solution de référence toujours beaucoup plus faible que celle obtenue 5 avec l'extrait considéré alors qu'en absence d'activation métabolique, obtention d'une amplitude de réponse de la solution de référence similaire ou très légèrement supérieure à celle observée avec l'extrait considéré, permettant d'expliquer pleinement la positivité observée, uniquement en absence d'activation métabolique. 10 Cette constance de comportement a donc soulevé la question de savoir si, en présence d'activation métabolique, la quercétine se comportait de manière identique dans l'extrait végétal considéré et dans la solution de référence, mis en oeuvre parallèlement dans l'essai bactérien. Des études cinétiques, simulant le mode opératoire du test d'Ames (à savoir réalisées dans les conditions de ce test) ont donc été réalisées afin d'évaluer le 15 comportement du contenu en quercétine de l'extrait considéré et de la solution de référence, testés en parallèle. En outre, une étude de déglycosylation a été réalisée dans le but de faire le lien entre présence d'hétérosides de flavonol, activation métabolique au S9 et augmentation de la 20 quercétine en analysant une solution d'essai à différents temps d'exposition au S9 par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP). 1.2. Matériel et Méthodes 25 1.2.a. Matériel La poudre de Vigne Rouge a été obtenue à partir du contenu des ARKOGELULES Vigne Rouge des laboratoires ARKOPHARMA (code 41050102, lot 1130013833). Les réactifs permettant d'obtenir le S9-Mix sont les suivants : nicotinamide adénine 30 dinucléotide phosphate (NADP dibasique) et Glucose 6-phosphate (G6P dibasique, 2H20) fournis par Carl Roth, chlorure de potassium (KCI) et chlorure de magnésium (MgC12,6H20) fournis par Sigma Aldrich Chimie et le S9 (Post mitochondrial supernatant) par MOLTOX (Trinova-Biochem GmbH). La solution de NaCI à 5,0 g/L est obtenue à partir de chlorure de sodium fourni par Sigma Aldrich Chimie. Le tampon phosphate à 3059429 32 pH 7,4 est réalisé à partir de dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4.H20) et d'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) fournis par Sigma Aldrich Chimie. Le tampon phosphate à pH 5,3 est réalisé à partir d'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4.12H20) fourni par Sigma Aldrich Chimie et de dihydrogénophosphate de 5 potassium (KH2PO4) fourni par Merck KGaA. La quercétine dihydrate (C151-11007,2H20, Mr= 338,27) est fournie par Extrasynthèse. L'eau de grade pour chromatographie est obtenue à partir d'une boucle d'eau de purification du réseau interne. L'acide trifluoroacétique et le méthanol, qualité pour gradient, sont fournis par Sigma Aldrich. L'éthanol anhydre est fourni par Cristalco (DEULEP). 10 1.2.b. Extrait liquide aqueux de Vigne Rouge L'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge est obtenu par extraction de 2,0 g de poudre avec 25,0 mL d'eau purifiée sous agitation magnétique à 400 ± 50 rpm en bain-marie à 15 60°C ± 2°C pendant 30 min ± 1 min. Après retour à température ambiante, la suspension est centrifugée à 6000 rpm pendant 5 min, le surnageant est prélevé et la poudre est à nouveau extraite dans les mêmes conditions. Les surnageants obtenus sont regroupés pour obtenir l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge. 20 1.2.c. Extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge L'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge est obtenu par extraction de 4,0 g de poudre avec 20,0 mL d'éthanol 50 % V/V sous agitation magnétique à 400 ± 50 rpm en bain-marie à 60°C ± 2°C pendant 30 min ± 1 min. Après retour à température ambiante, la 25 suspension est centrifugée à 6000 rpm pendant 5 min. 1.2.d. Solutions tampon Tampon phosphate pH 7,4. La solution tamponnée à pH 7,4 est obtenue en mélangeant 30 120 mL d'une solution de NaH2PO4H2O à 0,2M et 880 mL d'une solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Le pH est ajusté si nécessaire à 7,4 par ajout de l'une ou l'autre des solutions. Tampon phosphate pH 5,3. La solution tamponnée à pH 5,3 est obtenue en ajoutant progressivement une solution de Na2HPO4.12 H2O à 28,4 g/L à une solution de KH2PO4 à 9,06 g/L jusqu'à obtention du pH souhaité de 5,3. 35 3059429 33 1.2.e. Solutions témoin de quercétine Les solutions témoin de quercétine préparées dans le solvant approprié à l'utilisation, témoin d'analyse ou témoin de cinétique. 5 Solution mère de quercétine. Une solution à 0,5 mg/mL est préparée dans l'éthanol anhydre. Solution témoin en milieu aqueux (solution de référence) à 1pg/500pL. La solution mère de quercétine à 5 mg/mL est diluée avec du tampon phosphate pH 5,3. Solution étalon externe. La solution mère de quercétine à 0,5 mg/mL est d'abord diluée 10 au vingtième dans l'éthanol anhydre puis diluée à la concentration souhaitée avec le mélange composé de 85 volumes de tampon phosphate pH 5,3 et de 15 volumes de méthanol. 1.2.f. Réactif 59-Mix 15 Mélanger extemporanément 5 mL de tampon phosphate pH 7,4, 400 pL de NADP 0,1M, 50 pL de G6P 1M, 200 pL de la solution de chlorure de potassium 1,65 M et de chlorure de magnésium 0,4 M, 3,35 mL d'eau purifiée et 1,0 mL de S9. 20 1.2.g. Essai de mutation réverse sur bactéries sur extrait liquide aqueux de Vigne Rouge (étude El) Un essai de mutation reverse sur bactéries (test d'Ames) a été réalisé avec l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge décrit au point 1.2.b supra (permettant d'extraire les 25 constituants polaires de la feuille de vigne). Ce test d'Ames, réalisé par l'Institut Pasteur de Lille, respecte la ligne directrice 471 de l'OCDE ainsi que les Bonnes Pratiques de Laboratoire (selon arrêté du 14 mars 2000 relatif aux Bonnes Pratiques de Laboratoire Journal Officiel du 23 mars 2000). L'extrait liquide aqueux a été testé au cours de deux essais indépendants, sans et avec système d'activation métabolique (mélange S9 30 préparé à partir de la fraction post-mitochondriale de foie de rats traités par Aroclor 1254), vis-à-vis des souches de Salmonella typhimurium TA1535, TA1537, TA98, TA100 et TA102 et à la dose d'exposition maximale compatible avec le système d'essai c'est-à-dire 500 pL/boite. 4 dilutions plus faibles, choisies selon une progression semilogarithmique, ont également été testées. 35 3059429 34 1.2.h. Traitements en simulation du test d'AMES Le traitement sans activation métabolique S9(-) consiste à mélanger 2 mL de solution de NaCI à 5 g/L ; 0,6 mL de tampon phosphate pH 7,4 et 0,5 mL de solution d'extrait liquide 5 aqueux (cf. 1.2.b supra) ou de la solution de référence. La solution est filtrée sur membrane 0,45 pm en polydifluorure de vinylidène (« PVDF »). Le traitement avec activation métabolique S9(+) consiste à mélanger 2 mL de solution de NaCI à 5 g/I ; 0,1 mL de tampon phosphate pH 7,4 ; 0,5 ml de S9-Mix et 0,5 mL de solution d'extrait liquide aqueux (cf. 1.2.b supra) ou de la solution de référence. La 10 solution est filtrée sur membrane 0,45 pm (PVDF). 1.2.i. Solution initiale permettant de déterminer la teneur quercétine avant traitement 15 Une solution initiale permettant de déterminer la teneur avant traitement est préparée en mélangeant 2,6 ml du mélange composé de 85 volumes de tampon phosphate pH 5,3 et de 15 volumes de méthanol avec 0,5 ml de solution d'extrait liquide aqueux (cf. 1.2.b supra) ou de la solution de référence. La solution est filtrée sur membrane 0,45 pm (PVDF). Cette solution présente une bonne stabilité et permet une détermination fiable 20 de la teneur initiale en quercétine. La quantification est réalisée par rapport à un étalon externe de quercétine dihydratée La formule permettant de déterminer cette teneur initiale en quercétine est la suivante : x Se x C T(pg/mL) = Se ou T(pg/500pL) - StCt St x2t avec : Se : Surface du pic de substance ubiquitaire dans le chromatogramme obtenu avec la solution à analyser St : Surface du pic de substance ubiquitaire dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin Ct : Concentration du témoin de la substance ubiquitaire identifiée, en pg/mL, calculée comme suit : Ct (pg/mL) - Mt x Tix 1000 VDt Mt : masse du témoin de la substance ubiquitaire identifiée, en mg Ti : Pureté du témoin, en pour cent (ex :0,89) VDt : Volume de dilution de la solution témoin, en mL 3059429 35 1.2.j. Traitement par le S9 pour le test de déglycosylation 1 mL d'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge d'extrait préparé conformément aux indications données au point 1.2.c supra est mélangé avec 5 mL de S9-Mix. Le mélange 5 est placé à 37°C dans un flacon bien fermé. 1.2.k. Chromatographie liquide haute performance (« CLHP » ou «HPLC », en langue anglaise) - Détection dans l'ultraviolet avec barrette de diodes 10 L'analyse est réalisée en utilisant un système CLHP muni d'un détecteur UV à barrette de diodes, Agilent technologies HP1100, associé au logiciel de traitement de données Chromeleon. La solution obtenue pour le test de déglycosylation après traitement par le S9 est filtrée 15 sur membrane 0,45 pm (PVDF) avant injection de 20 pL aux temps suivants, juste après préparation puis après incubation à 37°C, toutes les heures pendant 8h et après 24h. 10 pL sont injectés pour la solution témoin de quercétine. Concernant les études cinétiques simulant les conditions expérimentales du test 20 d'AMES, 100pL de la solution traitée conservée dans le passeur d'échantillon HP1100 à 37°C sont injectés à 5 min (dès la préparation) puis toutes les 35 min jusqu'à 105 min. La solution avant activation métabolique au S9 est injectée à 25°C ainsi que la solution étalon externe de quercétine. Les injections sont réalisées sur une colonne Zorbax C18 150 x 3,0 mm de taille de particules 3,5 pm (Agilent technologies), à 30°C. Un gradient 25 est réalisés à partir d'une phase A composée de 85 % d'eau à 0,05% d'acide trifluoroacétique et de 15% de méthanol et d'une phase B composée de méthanol. Le gradient est le suivant : de 0 à 10 min, un gradient linéaire de 100% A à 65 % A, puis de 10 à 20 min de 65 % A à 25% A, suivi d'une phase de rinçage de 20 à 25 min avec 25% A et 75% B. Le débit est 0,6 mL/min. 30 1.3. Résultats 1.3.a. Résultats du test d'Ames sur l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge (étude El) 35 3059429 36 Les résultats obtenus sont présentés en figures 1A et 1 B. Comme l'on peut le constater d'après les résultats présentés sur la figure 1A, dans les conditions expérimentales utilisées (voir Matériel et Méthodes ci-dessus), aucune activité mutagène n'a été mise en évidence vis-à-vis des souches TA1535 et TA102 en absence et en présence 5 d'activation métabolique (le deuxième essai de mutagénicité ayant été réalisé selon la méthode de pré-incubation), ainsi que vis-à-vis de la souche TA1537 en absence d'activation métabolique. En revanche, l'extrait liquide aqueux a été considéré comme équivoque vis-à-vis de la 10 souche TA100 en absence d'activation métabolique (au cours des 2 essais indépendants, essais 1 et 2, facteurs d'induction obtenus inférieurs au seuil de significativité biologique (1.7 et 1.6 à la plus forte dose respectivement pour essai 1 et essai 2) mais augmentations du nombre moyen de révertants statistiquement significatives aux deux plus fortes doses ou à la plus forte dose respectivement pour 15 essai 1 et essai 2 et nombre moyens de révertants plus élevé que la limite supérieure des données historiques des contrôles négatifs. De plus, une activité mutagène a été observée vis-à-vis de la souche TA98 en absence d'activation métabolique ainsi que vis-à-vis des souches TA98, TA1537 et TA100 en présence d'activation métabolique (sans pré-incubation). 20 Concernant la souche TA98 en absence d'activation métabolique, le profil mutagène de la quercétine, évaluée dans les mêmes conditions expérimentales et à des doses équivalentes à celles retrouvées dans l'extrait liquide aqueux (cf. figure 1 B), est similaire à celui de l'extrait liquide aqueux (cf. figure 1A), indiquant que la présence de quercétine 25 dans l'extrait liquide aqueux explique pleinement les effets mutagènes observés avec l'extrait liquide aqueux, dans la condition spécifique d'absence d'activation métabolique. Toutefois, en présence d'activation métabolique, la présence de quercétine dans l'extrait liquide aqueux contribue mais ne semble pas pleinement expliquer les effets mutagènes 30 induits par cet extrait dans les souches TA1537, TA98 et TA100. En effet, une amplitude de réponse avec la solution de référence de quercétine (cf. figure 1B) nettement plus faible comparée à celle observée avec l'extrait aqueux (cf. figure 1A) a été obtenue en présence d'activation métabolique 3059429 37 Des analyses chromatographiques ont montré la présence de quercétine dans l'extrait liquide aqueux (1.35 pg/mL). 1.3.b. Etude de cinétique en simulation du test d'AMES 5 Les teneurs en quercétine sont déterminées pour chaque solution, extrait liquide aqueux Vigne Rouge (cf. Tableau 3 infra) et témoin quercétine (cf. Tableau 4 infra) après injection en CLHP aux temps définis de l'étude de cinétique. Une représentation graphique des données est réalisée en regroupant les données témoins et de la solution 10 d'extrait liquide aqueux Vigne Rouge d'une part en conditions de cinétique sans activation métabolique S9(-) (cf. figure 2) et d'autre part après activation métabolique S9(+) (cf. figure 3). Tps(min) Vigne Rouge extrait liquide aqueux-S9(-) Vigne Rouge extrait liquide aqueux-S9(+) pg/500p1 pg/500p1 Essai 1 Essai 2 Moyenne Essai 1 Essai 2 Moyenne 0 0,61 0,61 0,61 0,61 0,61 0,61 5 0,53 0,40 0,47 0,34 0,28 0,31 35 0,24 0,16 0,20 1,24 1,92 1,58 70 0,04 0,03 0,04 2,03 3,55 2,79 105 0,00 0,00 0,00 2,83 4,51 3,67 Tableau 3 Tps(min) Solution de référence de quercétine-59(-) Solution de référence de quercétine-59(+) pg/500p1 pg/500p1 Essai 1 Essai 2 Moyenne Ajustement Essai 1 Essai 2 Moyenne Ajustement pour graphe à pour graphe à teneur teneur 0,6 pg/100p1 0,6 pg/100p1 0 1,21 1,21 1,21 0,61 1,21 1,21 1,21 0,61 5 0,31 0,31 0,31 0,16 0,70 0,41 0,56 0,28 35 0,20 0,22 0,21 0,11 0,09 0,12 0,11 0,05 70 0,14 0,15 0,15 0,07 0,04 0,06 0,05 0,03 105 0,08 0,10 0,09 0,04 0,03 0,04 0,03 0,02 15 Tableau 4 3059429 38 1.3.c. Test de déglycosylation La teneur en quercétine et la somme du pic d'isoquercitroside + autre hétéroside de la 5 quercétine ont été relevées, les recouvrements par rapport à la teneur ou la réponse avant traitement ont été calculés (cf. Tableau 5 infra). Les données obtenues ont été exploitées pour représenter l'évolution de teneur des composés considérés sur un graphe (Figure 4). Une comparaison des chromatogrammes obtenus pour les solutions avant et après 8h de traitement est réalisée (cf. figures 5 et 6 ; ladite figure 6 étant un 10 agrandissement de la partie caractéristique de la figure 5). Solution Temps (h) Surface Concentration Recouvrement /TO Surface du pic Recouvrement pic Quercétine % d'isoquercitroside % quercétine (pg/ml) + autre hétéroside du quercétol Extrait 0 3,924 0,920 100 551,619 100 liquide Vigne Rouge dans l'éthanol 50% VN 1,16 1,262 0,296 32 494,939 90 2,30 4,341 1,018 111 482,734 88 3,50 6,116 1,434 156 467,668 85 4,70 14,282 3,350 364 455,511 83 5,80 14,701 3,448 375 436,869 79 7,00 16,995 3,986 433 425,734 77 8,16 17,212 4,037 439 409,502 74 24,00 30,792 7,222 785 258,406 47 Tableau 5 1.4. Discussion et conclusion 15 A partir des résultats obtenus dans l'essai de mutation réverse sur bactéries (test d'Ames), une positivité a été observée : en présence de l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge, dans la souche TA98 en absence d'activation métabolique et dans les souches TA98, TA1537 et TA100 avec activation métabolique (cf. figure 1A). 20 Dans la condition spécifique d'absence d'activation métabolique, la présence de 3059429 39 quercétine dans l'extrait liquide aqueux explique pleinement la positivité obtenue puisque le profil mutagène de la quercétine, testée parallèlement et à des doses équivalentes à celles présentes dans l'extrait liquide aqueux, est similaire à celui de l'extrait liquide aqueux (comme l'indique la comparaison des figures 1A et 1 B). 5 En revanche, en présence d'activation métabolique, la présence de quercétine dans l'extrait liquide aqueux contribue mais ne semble pas pleinement expliquer la positivité observée puisque la réponse mutagène de la quercétine, testée parallèlement et à des doses équivalentes à celles présentes dans cet extrait, présente une amplitude 10 considérablement plus faible que celle observée avec l'extrait liquide aqueux (comme l'indique la comparaison des figures 1A et 1 B). Une telle situation, comme rencontrée avec l'extrait liquide aqueux de feuille de Vigne Rouge, où uniquement en présence d'activation métabolique, la présence de ces 15 flavonols identifiés dans l'extrait végétal considéré, ne semble pas totalement suffisante pour expliquer la positivité obtenue, a été observée avec plusieurs autres préparations à base de plantes contenant des flavonoïdes (et en particulier des flavonols), à savoir en présence d'activation métabolique, obtention d'une amplitude de réponse de la solution de référence toujours beaucoup plus faible que celle obtenue avec l'extrait considéré, 20 alors qu'en absence d'activation métabolique, l'on obtient une amplitude de réponse de la solution de référence similaire ou très légèrement supérieure à celle observée avec l'extrait considéré, permettant d'expliquer pleinement la positivité observée, uniquement en absence d'activation métabolique. 25 Cette constance de comportement a donc soulevé la question de savoir si, en présence d'activation métabolique, la quercétine se comportait de manière identique dans l'extrait végétal considéré et dans la solution de référence, mis en oeuvre parallèlement dans l'essai bactérien. Des études cinétiques, simulant le mode opératoire du test d'Ames ont donc été réalisées afin d'évaluer le comportement du contenu en quercétine de l'extrait 30 considéré et de la solution de référence, testés en parallèle. Les résultats de ces cinétiques, réalisées à la fois sur l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge ainsi que sur une solution de référence de quercétine, et en simulant le mode opératoire du test d'Ames utilisant la méthode par étalement en absence et en présence 3059429 d'activation métabolique, ont montré : un comportement similaire entre les deux solutions comparées en absence d'activation métabolique, à savoir des diminutions du contenu en quercétine à la fois dans l'extrait végétal considéré et dans la solution de référence ; voir figure 2 5 en présence d'activation métabolique, un comportement totalement différent de la quercétine entre les deux solutions comparées, à savoir. une augmentation du contenu en quercétine dans l'extrait de plante considéré vs une diminution du contenu en quercétine dans la solution de référence, malgré une quantité initiale 10 identique (voir figure 3). Les teneurs en quercétine calculées au cours des cinétiques respectivement pour l'extrait liquide aqueux et pour la solution de référence sont présentées dans les Tableaux 3 et 4 supra. 15 Concernant l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge, une parfaite cohérence est obtenue entre les résultats des études cinétiques (cf. figures 2-4) et ceux du test d'Ames (cf. figures 1A et 1B), à savoir : 20 en absence d'activation métabolique, le profil de réponse similaire de l'extrait liquide aqueux de Vigne Rouge et de la solution de référence de quercétine est expliquée par une diminution similaire du contenu en quercétine des deux solutions comparées (cf. figure 2); en présence d'activation métabolique, l'amplitude de réponse considérablement 25 plus faible pour la solution de référence est expliquée par une très forte augmentation du contenu en quercétine dans l'extrait liquide aqueux végétal alors qu'une diminution du contenu en quercétine est observée dans la solution de référence malgré un même niveau initial de quercétine (cf. figure 3). 30 Une totale cohérence est donc établie entre les résultats des études cinétiques et ceux des essais bactériens, à savoir, en absence d'activation métabolique, obtention de cinétiques comparables entre solution d'essai et solution de référence aboutissant au « dédouanement » de la positivité de la solution d'essai par la seule présence de flavonols libres (majoritairement représentés par de la quercétine) dans la solution 3059429 41 d'essai (extrait végétal). En revanche, en présence d'activation métabolique, l'on obtient des cinétiques différentes entre solution d'essai et solution de référence aboutissant à une absence de « dédouanement » en test d'Ames qui serait donc expliquée par une différence de comportement cinétique des flavonols libres dans la solution d'essai et la 5 solution de référence et non pas par la présence d'un autre mutagène in vitro dans l'extrait végétal. L'hypothèse avancée par la Demanderesse afin d'expliquer la différence de comportement cinétique de la quercétine en présence d'activation métabolique entre 10 l'extrait végétal et la solution de référence, malgré un même niveau de quercétine initial (cf. figure 3), est que la matière végétale génère de la quercétine au cours du traitement par le système d'activation métabolique S9 en métabolisant (plus précisément en déglycosylant) les hétérosides de de la quercétine (hétérosides de quercétol) également présents dans l'extrait végétal. 15 Afin de vérifier cette hypothèse de travail, une étude de déglycosylation a donc été réalisée dans le but de faire le lien entre présence d'hétérosides de la quercétine, activation métabolique avec le mélange S9 (S9+) et augmentation de la quercétine en analysant une solution d'essai à différents temps d'exposition au mélange S9 par CLHP 20 (pour cette étude de déglycosylation l'extrait hydro-alcoolique tel que défini au 1.2.c supra, dans la section intitulée « Matériel et Méthodes », a été choisi comme exemple). Les données présentées dans le Tableau 5 obtenues lors du test de traitement par le mélange S9 pour évaluer l'impact du mélange S9 sur les hétérosides de flavonol 25 montrent une augmentation de la teneur en quercétine au cours de l'étude de cinétique, augmentation d'environ 400% après 8h, corrélée avec une diminution de la réponse des pics d'hétérosides de flavonol d'environ 30% (isoquercitroside et autre hétéroside de la quercétine, identification spectrale et données de la littérature). 30 La figure 4 représente la cinétique d'évolution des valeurs sur une durée de 24 heures et montre l'augmentation de la teneur en quercétine et la diminution de la teneur en hétérosides de flavonol après traitement au mélange S9. Les figures 5 et 6, qui comparent les données analytiques obtenues avant traitement et 3059429 42 après 8 heures d'action du mélange S9, montrent que les pics correspondant aux hétérosides de la quercétine et du kaempférol (identification spectrale et données de la littérature) de temps de rétention entre 12,6 min et 20,3 min sont plus petits après traitement qu'avant, le pic correspondant à la quercétine de temps de rétention 15,9 min 5 augmente significativement après 8h de traitement par le mélange S9. Ceci est particulièrement visible sur l'agrandissement montré en figure 6. Il y a aussi formation de kaempférol, mais en quantité non significative sur le chromatogramme. Ce résultat est validé par la connaissance d'une très bonne stabilité des hétérosides de flavonol dans l'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge (extrait liquide éthanol 50% V/V) à 37°C en 10 l'absence de mélange S9. L'action du système d'activation métabolique exogène (mélange S9) sur les hétérosides de flavonol a donc été prouvée. En outre, il a également été démontré que le mélange S9 induisait la formation de quercétine. 15 La preuve qu'en présence d'activation métabolique une production d'aglycones flavoniques (flavonols libres) à partir de certains hétérosides de flavonol a donc été apportée par cette étude. 20 La méthodologie qui consiste à évaluer l'implication des flavonols libres tels que quercétine et kaempférol dans la positivité observée en test d'Ames en réalisant un (ou des) essai(s) bactérien(s) de mutation reverse complémentaire(s) dans le(s)quel(s) la solution d'essai (extrait végétal ou préparation à base de plantes dissous dans le solvant adéquat) et un mélange de flavonol(s) libre(s) à doses équivalentes (solution de 25 référence) sont testés en parallèle au cours d'un même essai et d'en déduire par la comparaison des réponses mutagènes des solutions d'essai et de référence, l'imputabilité totale ou partielle des flavonols libres dans la positivité observée présente donc un biais en présence d'activation métabolique et ne peut être utilisée qu'en absence d'activation métabolique. 30 C'est pourquoi, confronté à cette problématique, et afin d'éviter ce biais, la Demanderesse a mis au point un procédé innovant basé sur le fractionnement de la solution d'essai (dans le cas présent l'extrait végétal qui sera mis en oeuvre dans le test d'Ames) , procédé qui présente l'avantage de pouvoir être utilisé à la fois en absence et en présence d'activation métabolique par rapport à la méthodologie conventionnelle et 3059429 43 qui permet d'évaluer avec fiabilité le potentiel mutagène et/ou pro-mutagène d'une préparation à base de plantes contenant des flavonoïdes (également dénommée(s) plantes à flavonoïdes»), et en particulier d'une préparation à base de plantes à flavonols. Ce procédé innovant est illustré par l'exemple 2 infra. 3059429 44 Exemple 2: Extrait sec de feuille de lierre : essai de mutation réverse sur bactéries, études cinétiques du contenu en quercétine, études analytiques et génotoxiques des différentes fractions préparées à partir d'extrait sec de feuille 5 de lierre pour évaluation de son potentiel génotoxique 2.1 Matériel et méthodes 2.1.a Essai de mutation réverse sur bactéries sur un extrait sec de feuille de 10 lierre (DER 4-8:1), solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m) (lot 1130019619) (Etude E2) Le potentiel génotoxique d'un extrait sec de feuille de lierre (DER 4-8:1), solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m) (lot 1130019619), a été évalué au moyen d'un test 15 d'Ames respectant la ligne directrice 471 de l'OCDE ainsi que les Bonnes Pratiques de Laboratoire (selon arrêté du 14 mars 2000 relatif aux bonnes Pratiques de Laboratoire Journal officiel du 23 mars 2000). L'extrait sec de feuille de lierre a été testé, après dissolution dans du diméthylsulfoxide (DMSO), vis-à-vis de 5 souches de Salmonella typhimurium, TA1535, TA 1537, TA98, TA100 et TA102, en absence et en présence 20 d'activation métabolique (mélange S9 préparé à partir de la fraction post-mitochondriale de foie de rats traités par Aroclor 1254), au cours de deux ou trois essais indépendants et jusqu'à la dose d'exposition maximale recommandée de 5000 pg/boîte. Quatre dilutions plus faibles ont également été testées 25 2.1.b Mode opératoire pour études cinétiques du contenu en quercétine par CLHP Substances testées Extrait sec de feuille de lierre (DER 4-8:1) solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m) : lot 30 1130019619 (fabricant : Finzelberg) Quercétine dihydratée : Extrasynthèse, réf. 1135S (lot 18) Solutions de référence Solution de quercétine dans le DMSO. Dissoudre 5,65 mg quercétine dihydratée (pureté 3059429 de 89 pourcent) dans 10,0 ml de DMSO. Diluer 1,0 ml de cette solution jusqu'à 50,0 ml avec du DMSO. Filtrer (0,45 pm). Solution de référence de quercétine dans le DMSO (Q). À 0,1 ml de la solution de quercétine et de DMSO ajouter 2,6 ml de méthanol. 5 Solution de référence de quercétine dans le DMSO (Q_S9()). À 2,0 ml d'une solution de chlorure de sodium 5,0 g/I, ajouter 0,1 ml d'une solution tampon de phosphate à un pH de 7,4 et 0,1 ml d'une solution de quercétine dans le DMSO. Filtrer (0,45 pm). Solution de référence de quercétine dans le DMSO (Q_59(+)). À 2,0 ml d'une solution de chlorure de sodium à 5,0 g/I, ajouter 0,1 ml d'une solution tampon de phosphate à un 10 pH de 7,4, 0,5 ml du mélange S9 (voir la préparation ci-dessous) et 0,1 ml de la solution de quercétine dans le DMSO. Filtrer (0,45 pm). Solutions test d'extrait sec de feuille de lierre Solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO. Dissoudre 1,0 g de l'extrait dans 15 20,0 ml de DMSO. Filtrer (1 pm). Solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre (IL). À 0,1 ml de la solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO ajouter 2,6 ml d'un mélange composé de 50 volumes d'eau et de 50 volumes de méthanol. Filtrer (0,45 pm). Solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre (IL S9()). À 2,0 ml d'une solution de 20 chlorure de sodium à 5,0 g/I, ajouter 0,1 ml d'une solution tampon de phosphate à un pH de 7,4 et 0,1 ml de la solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO. Filtrer (0,45 pm). Solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre (IL S9(+)). À 2,0 ml d'une solution de chlorure de sodium à 5,0 g/I, ajouter 0,1 ml d'une solution tampon de phosphate à un pH 25 de 7,4, 0,5 ml du mélange S9 (voir la préparation ci-dessous) et 0.1 ml de la solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO. Filtrer (0,45 pm). Mélange S9 Le mélange S9 est préparé selon la procédure utilisée par le sous-traitant IPL. Deux 30 fractions de S9 différentes sont utilisées, une produite par le sous-traitant IPL (lot 13H) et l'autre achetée auprès de Moltox (lot 3166). La composition du mélange S9 utilisé est présentée dans le Tableau 6 infra. 3059429 46 Volume de solution Tampon phosphate pH 7.4 5 ml Solution 0.1 M de NADP 0.4 ml Solution 1 M de Glucose-6- phosphate 0.05 ml Solution 1.65 M de chlorure de potassium + 0.4 M de chlorure de magnésium 0.2 ml eau pour injections 3.35 ml Fraction S9 1 ml Tableau 6 : composition du mélange S9 utilisé Conditions chromatographiques (cf. 1.2.k supra) Colonne : 5 - taille : 0,15 m x 3,0 mm - phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour chromatographie (3,5 pm) [Zorbax SB] - température : 30 °C Phase mobile : 10 - phase mobile A : eau, méthanol (85:15 V/V) avec 0,05 pour cent d'acide trifluoroacétique. - phase mobile B : méthanol gradient d'élution : Temps Phase mobile A Phase mobile B (min) (pourcent VN) (pourcent VN) 0-10 100 -> 65 0-35 10 - 20 65 -> 25 35 -> 75 20 - 25 25 75 25 - 25,5 25 -> 100 75 -> 0 25,5 - 35 100 0 Tableau 7 15 3059429 47 Débit : 0,6 ml/min Détection : 370 nm Volume d'injection : 100 pl. Température du passeur d'échantillon : initialement à 25 °C et ensuite à 37 °C. 5 Etudes cinétiques par CLHP de solutions de référence préparées à partir de quercétine dihydratée Les études cinétiques par CLHP incluent des analyses, effectuées à différents temps, des trois solutions de référence décrites ci-dessus. Les solutions testées sont : 10 - temps initial TO : solution de référence de quercétine dans le DMSO Q (Q-TO) - T5 min, T35 min, T70 min et T105 min : solution de référence de quercétine dans le DMSO Q_S9(-) en l'absence d'activation métabolique (Q_S9(-)-T5, Q_S9(-)-T35, Q_S9(-)-T70, Q_S9(-)-T105) et la solution de référence de 15 quercétine dans le DMSO Q_S9(+) en présence d'activation métabolique (Q_S9(+)-T5, Q_S9(+)-T35, Q_S9(+)-T70, Q_S9(+)-T105). Etudes cinétiques par CLHP des solutions test préparées à partir d'un extrait sec de feuille de lierre 20 Les études cinétiques par CLHP incluent des analyses, effectuées à différents temps, des trois solutions d'extrait sec de feuille de lierre décrites ci-dessus. Les solutions testées à différents temps sont : - temps initial TO : solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre IL (IL-TO) ; - T5 min, T35 min, T70 min et T105 min : solution d'essai d'extrait sec de 25 feuille de lierre IL _S9() en l'absence d'activation métabolique (IL_S9(-)-T5, I L_S9(-)-T35, I L_S9(-)-T70, I L_S9(-)-T105) et solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre IL _S9(+) en présence d'activation métabolique (IL_S9(+)-T5, IL S9(+)-T35, IL S9(+)-T70, I L_S9(+)-T105). 30 Etudes réalisées : Les études réalisées incluent : - une étude cinétique de la quercétine et d'extrait sec de feuille de lierre en l'absence d'activation métabolique ; - deux études cinétiques de la quercétine en présence d'activation 3059429 48 métabolique ; - quatre études cinétiques d'extrait sec de feuille de lierre en présence d'activation métabolique. 5 2.1.c Fractionnement de la solution d'essai c.-à-d. de la solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO (lot 1130019619) Le fractionnement a été effectué comme suit : - étape 1 : la solution d'extrait sec de feuille de lierre dans le DMSO a été diluée 10 avec de l'eau purifiée, 15 ml d'eau ont été ajoutés à 5 ml de solution de DMSO - étape 2 : la solution a été chargée sur une cartouche Strata-X conditionnée (2 g, Phenomenex), la solution éluée par gravité a été recueillie dans un ballon à fond plat de 500 ml (ballon 1) - étape 3 : les composés à l'exception de la quercétine ont été éluées par lavages 15 successifs avec 20 ml des mélanges méthanol/eau, avec des rapports exprimés en pourcentage de 50/50 ; 55/45 ; 60/40 ; 65/35 ; 70/30 et 75/25 V/V. Les solutions éluées ont été recueillies dans le ballon 1 (solution fractionnée C ; abrégée en fraction C ») - étape 4 : 20 ml de méthanol ont été ajoutés et la quercétine a été éluée, la solution 20 a été recueillie dans un ballon 2 (solution fractionnée A ; abrégée en « fraction A ») - étape 5 : un lavage de cartouche final a été réalisé avec 5 ml de DMSO suivi par 20 ml d'éthanol anhydre ; les solutions ont été recueillies dans un ballon 3 (solution fractionnée D ; abrégée en «fraction D »). - étape 6 : le solvant de chaque solution fractionnée a été évaporé afin d'obtenir le 25 volume de la solution de DMSO initiale, le volume pour la fraction A a été ajusté à 5 ml avec du DMSO. Les fractions suivantes ont été obtenues, la fraction C à partir du ballon 1, la fraction A à partir du ballon 2 et la fraction D à partir du ballon 3. Une étape supplémentaire a été ajoutée : à partir de la fraction A, une fraction B a été 30 réalisée par dégradation sélective de la quercétine d'une partie de la fraction A. Plus précisément, une moitié de la fraction A a été diluée dans un tampon phosphate à un pH 7,4 et placée à 37°C pendant une heure. Puis le volume de la fraction a été ajusté au volume initial (2,5 ml) par évaporation du solvant aqueux à l'aide d'éthanol anhydre. 3059429 49 2.1.d Etudes analytiques des différentes fractions d'extrait sec de feuille de lierre dissous dans le DMSO Les analyses ont été réalisées en utilisant deux appareils CLHP différents et deux 5 conditions de chromatographie différentes permettant une quantification sélective (méthode d'essai-CLHP 1) et d'obtenir un profil chromatographique avec détection « optimale » (CLHP 2). Qui plus est, un profil chromatographique en phase gazeuse a été réalisé. 10 La CLHP 1 a été réalisée telle que décrite au point 2.1.b supra, intitulé « Conditions de chromatographie ». Un détecteur à barrettes de diodes Agilent HP1100 a été utilisé, des chromatogrammes ont été enregistrés à 370 nm pour l'essai de la quercétine et à 205 nm pour l'hédéracoside C (un marqueur d'essai pour l'extrait sec de feuille de lierre). Les solutions ont été filtrées sur une membrane de 0,45 pm et 10 pL ont été injectés. 15 La CLHP 2 a été réalisée en utilisant un appareil UPLC Dionex (ThermoFisher) avec un détecteur à barrettes de diodes et le logiciel Chromeleon. Des chromatogrammes ont été enregistrés avec une acquisition « optimale » entre 200 et 400 nm et une suppression du bruit de fond (« blank subtraction », en langue anglaise). Les solutions 20 ont été filtrées au travers d'une membrane de 0,22 pm et 1,6 pL ont été injectés sur une colonne Zorbax C18 (50 mm x 2,1 mm, taille des particules 1,8 pm - Agilent Technologies). La phase mobile a été préparée à partir de deux solutions : Eluant 1 (un mélange de 97 volumes d'eau purifiée avec 0,05 % d'acide trifluoroacétique et 3 volumes d'acétonitrile) et Eluant 2 (acétonitrile avec 0,05 % d'acide trifluoroacétique). Le 25 profil a été obtenu en appliquant le gradient : 100 % de l'éluant 1 pendant 0,5 min, de 0,5 à 14 min un gradient linéaire de 100 % de l'éluant 1 jusqu'à 60 %, de 14 à 23 min un gradient linéaire de 60 % de l'éluant 1 jusqu'à 20 % de l'éluant 1, puis de 23,1 à 24,6 min 100 % de l'éluant 2. Le débit était de 0,95 ml/min à une température de colonne de 30 °C. 30 L'analyse CPG a été réalisée avec un appareil Agilent Technologies 6890 équipé d'un injecteur automatique d'échantillon et d'un détecteur FID. La température du détecteur a été fixée à 320 °C, le gaz vecteur était de l'azote avec un débit constant de 3,1 ml/min. Le logiciel était Empower 3 (Waters). La solution a été diluée cinq fois avec de l'éthanol 3059429 anhydre. Un injecteur split a été utilisé à 305 °C et 1 pL a été injecté avec un rapport de split de 1/5 sur une colonne Rtx-1 (30 m x 0,25 mm - 0,25 pm - Resteck) avec le gradient de température : 2,5 °C/min de 60 à 300 °C puis 300 °C jusqu'à 165 min. 5 2.1.e. Etude de la cinétique du contenu en quercétine de la fraction C en présence d'activation métabolique Afin d'évaluer si le fractionnement doit être réalisé sur l'extrait végétal (à savoir l'extrait sec de lierre dissous dans le DMSO), préalablement traité ou pas par le mélange S9, le comportement du contenu en quercétine de la fraction C en présence d'activation 10 métabolique est évalué en mettant en oeuvre le protocole suivant qui consiste à mélanger 2mL de solution de NaCI à 5 g/L ; 0,1 ml de tampon phosphate pH 7,4 ; 0,5 mL de S9-Mix et 0,5 mL de la fraction C. La solution obtenue est ensuite filtrée sur membrane 0,45 pm (PVDF). 15 La teneur en quercétine a été suivie par analyse CLHP comme décrit supra (2.1.b). 2.1.f Tests d'Ames sur les différentes fractions d'extrait sec de feuille de lierre dissous dans du DMSO 20 Les Fractions A, B, C et D ont été préparées par la Demanderesse en solutions DMSO. Ensuite, elles ont été testées dans un essai de mutation reverse sur bactéries, respectant la ligne directrice 471 de l'OCDE et réalisé par le Laboratoire de toxicologie génétique de l'Institut Pasteur de Lille (IPL, France). Les fractions A, B, C et D ont été testées au cours d'un essai unique, et seulement vis-à-vis de la souche TA98, en 25 absence et en présence d'activation métabolique exogène en, utilisant la méthode par étalement (sans pré-incubation) (correspondant à la souche et aux conditions expérimentales où la positivité de l'extrait sec de feuille de lierre a été notée). Elles ont été testées jusqu'à la dose-volume maximale de 100 pL/boîte correspondant à la dose d'exposition maximale recommandée par la ligne directrice 471 de l'OCDE, c.-à-d. 5 000 30 pg/boîte (étude E3). Afin de confirmer les résultats de l'étude E3, les fractions A, C et une solution de référence de quercétine, à des doses équivalentes à celles présentes dans la fraction A (c'est-à-dire la fraction contenant la quercétine obtenue à partir de la solution DMSO 3059429 51 d'extrait sec de feuille de lierre) ont aussi été testées en parallèle par le laboratoire de toxicologie génétique de l'Institut Pasteur de Lille (IPL, France), au cours de deux essais bactériens de mutation reverse indépendants (études E4 et E5) respectant la ligne 471 de l'OCDE. Plus précisément, les fractions A, C ainsi que la solution de référence de 5 quercétine ont été testées vis-à-vis de la souche TA98, en absence d'activation métabolique (étude E4), ainsi qu'en présence d'activation métabolique (étude E5), utilisant la méthode par étalement (sans pré-incubation). Elles ont été testées jusqu'à la dose-volume maximale de 100 pL/boîte correspondant à la dose maximale recommandée par la ligne directrice 471 de l'OCDE, c.-à-d. 5000 pg/boîte. 10 2.2 Résultats et discussion 2.2.a Résultats de l'essai de mutation réverse sur bactéries réalisé sur l'extrait sec de feuille de lierre et considérations relatives à l'évaluation du risque (étude E2) 15 Dans les conditions expérimentales de l'étude E2, aucune augmentation biologiquement significative du nombre moyen de révertants n'a été notée avec l'extrait sec de feuille de lierre (DER 4-8:1), solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m), dissous dans le DMSO, vis-à-vis des souches de Salmonella typhimurium TA1535, TA100 et 20 TA102 au cours des 2 essais indépendants à la fois en absence et en présence d'activation métabolique (le second essai avec le mélange S9 a été réalisé selon la méthode de pré-incubation). Les résultats des premier et deuxième essais sont respectivement présentés dans les Tableaux 8 et 9 infra. 25 30 3059429 52 ESSAI 1 TA 1535 TA 1537 TA 98 TA 100 TA102 DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES Rapport pg/boite d'induction pg/boite d'induction pg/boite d'induction pg/boite d'induction pg/boite d'induction (a) (a) (a) (a) (a) SUBSTANCE D'ESSAI 0 50 150 500 1500 5000 - 1,2 1,8 1,2 1,9 1,8 0 50 150 500 1500 5000 - 0,5 0,7 0,9 1,2 1,7 0 50 150 500 1500 5000 - 0,9 1,2 1,3 1,4 2,0 0 50 150 500 1500 5000 - 1,2 1,1 1,1 1,3 1,3 0 50 150 500 1500 5000 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 EN L'ABSENCE du mélange-S9 0 - 0 - 0 - 0 - 0 SUBSTANCE D'ESSAI 50 1,2 50 1,0 50 1,2 50 1,1 50 0,7 EN PRESENCE 150 1,1 150 1,7 150 1,2 150 1,0 150 0,9 du mélange-S9 500 1,0 500 0,9 500 1,6 500 1,1 500 0,8 SANS 1500 1,6 1500 2,0 1500 2,3 1500 1,2 1500 1,2 PRE-INCUBATION 5000 1,3 5000 3,3 5000 4,6 5000 1,6 5000 1,2 (a) Rapport d'induction = nombre moyen de révertants obtenus avec la substance d'essai / nombre moyen de révertants obtenus avec le témoin négatif Tableau 8 : Résumé des résultats d'essai du 1er essai de mutagénicité (étude E2) ESSAI 2 TA 1535 TA 1537 TA 98 TA 100 TA102 DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES Rapport DOSES pg/boite Rapport pg/boite d'induction pg/boite d'induction pg/boite d'induction pg/boite d'inductio d'induction (a) (a) (a) n (a) (a) SUBSTANCE 0 50 150 500 1500 - 1,1 1,5 0,9 1,1 0 50 150 500 1500 - 0,8 0,9 0,9 1,2 0 150 500 1500 3000 - 1,0 1,0 1,5 2,0 0 50 150 500 1500 - 1,1 1,0 1,2 1,1 0 50 150 500 1500 0,9 1,2 1,1 1,1 D'ESSAI 5000 1,3 5000 1,7 5000 2,3 5000 1,2 5000 0,9 EN L'ABSENCE du mélange- S9 SUBSTANCE 0 - 0 - 0 - 0 - 0 D'ESSAI 50 1,3 150 0,9 150 0,5 150 1,1 50 1,1 EN 150 1,2 500 0,9 500 0,7 500 1,1 150 1,2 PRESENCE 500 1,3 1500 0,8 1500 0,8 1500 1,3 500 1,1 du mélange- 1500 1,0 3000 1,5 3000 0,9 3000 1,4 1500 1,1 S9* 5000 1,5 5000 1,3 5000 1,3 5000 1,5 5000 1,1 (a) Rapport d'induction = nombre moyen de révertants obtenus avec la substance d'essai/ nombre moyen de révertants obtenus avec le témoin négatif "TA1535, TA100, TA102 : avec pré-incubation TA1537, TA98 : sans pré-incubation Tableau 9 : Résumé des résultats d'essai du 2ème essai de mutagénicité (étude E2) 5 10 3059429 53 Dans le premier essai de mutagénicité, une augmentation biologiquement significative du nombre moyen de révertants a été notée vis-à-vis de la souche TA1537 en présence d'activation métabolique (Tableau 8), à la plus forte dose testée de 5 000 pg/boîte avec un rapport d'induction de 3,3. Cette légère augmentation n'a pas été observée au cours 5 des essais 2 et 3 (voir respectivement Tableaux 9 et 10). L'extrait sec de feuille de lierre (DER 4-8:1), solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m) a donc été considéré comme non mutagène vis-à-vis de la souche TA1537 en présence d'activation métabolique. TA 1537 DOSES pg/boite révertants Rapport d'induction (a) /boite Témoin positif ou (b) 325.3 37.0 Contrôle positif SUBSTANCE D'ESSAI 0 8.8 - EN PRESENCE du 150 7.0 0.8 mélange S9 SANS PRE- INCUBATION 500 5.3 0.6 1500 11.7 1.3 3000 13.0 1.5 5000 17.3 2.0 (a) Rapport d'induction = nombre moyen de révertants obtenus avec la substance d'essai / nombre moyen de révertants 10 obtenus avec le témoin négatif Contôle positif ou témoin positif (pg/boite) : (b) 2-anthramine 2 Tableau 10 : Résultats du 3ème essai de mutagénicité sur la souche TA1537 en présence d'activation métabolique exogène (étude E2) 15 Dans les conditions expérimentales de l'étude E2, et à partir des résultats obtenus (voir Tableaux 8, 9 et 10) l'extrait sec de feuille de lierre (DER 4-8:1), solvant d'extraction éthanol 30 % (m/m) a été conclu non mutagène vis-à-vis des souches TA1535, TA1537, TA100 et TA102, à la fois en absence et en présence d'activation métabolique. 20 Concernant la souche TA98, des augmentations biologiquement et statistiquement significatives du nombre moyen de révertants ont été notées avec l'extrait sec de feuille de lierre à la plus forte dose ou aux 2 plus fortes doses testées (à savoir 3000 et de 5000 pg/boîte) à la fois en absence et en présence d'activation métabolique (sans pré- 3059429 54 incubation). Étant donné les résultats discordants obtenus lors des 2 premiers essais en présence d'activation métabolique, un 3ème essai de mutagénicité sur la souche TA98 a été mis en oeuvre (cf. Tableau 12 infra), dans lequel l'extrait sec de feuille de lierre a induit des augmentations biologiquement et statistiquement significatives du nombre de 5 révertants aux 3 plus fortes doses, allant de 1500 à 5000 pg/boîte avec des facteurs d'induction de 2,2 - 3,4 et 4,3, c.-à-d. au-dessus du seuil de significativité biologique fixé à 2,0 pour cette souche. Il est connu que l'extrait sec de feuille de lierre contient des aglycones flavoniques tels que la quercétine et le kaempférol qui sont connus pour être mutagènes in vitro (en particulier lorsque testés au cours d'un essai de mutation reverse sur bactéries, mais possédant un profil de sécurité établi, garantissant leur innocuité in vivo. Afin d'attribuer l'activité mutagène observée avec l'extrait sec de feuille de lierre à certains de ces constituants, il a été jugé opportun de déterminer si ces génotoxiques in vitro, que sont la quercétine et le kaempférol, pouvaient être impliqués dans l'effet mutagène observé, en les testant de manière individuelle ou en combinaison parallèlement à l'extrait sec de lierre (à savoir au cours d'un même essai) à des doses équivalentes à celles contenues dans les doses testées d'extrait sec de feuille de lierre. Dans ce but, une première étape d'identification et de quantification de ces deux aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre a été réalisée par une méthode chromatographique (CLHP, détection 370 nm) qui a démontré la présence de quercétine et de kaempférol dans l'extrait sec de feuille de lierre aux concentrations suivantes : quercétine : 180 pg/g et kaempférol : 23 pg/g. 10 Par conséquent, en parallèle de l'extrait sec de feuille de lierre dissous dans le DMSO, un mélange [quercétine + kaempférol], avec chacun de ces deux aglycones flavoniques à des doses équivalentes à celles présentes dans l'extrait sec de lierre dissous dans le DMSO, a été testé au cours du deuxième et troisième essai de mutagénicité de l'étude E2 vis-à-vis de la souche TA98 en absence et en présence d'activation métabolique 15 Au cours du deuxième essai vis-à-vis de la souche TA98 en absence d'activation métabolique, des augmentations biologiquement significatives du nombre de révertants ont été observées aux 2 plus fortes doses testées, avec des facteurs d'induction de 2 et de 2,3 aux doses de 3 000 et à 5 000 pg/boîte, respectivement (cf. Tableau 9 supra). 20 Des facteurs d'induction de 2,8 et de 3,9 (cf. Tableau 11 infra) ont été obtenus avec le 3059429 mélange [quercétine + kaempférol] aux 2 plus fortes doses testées (correspondant aux doses de quercétine et kaempférol contenues dans l'extrait sec de feuille de lierre respectivement aux concentrations de 3 000 et de 5 000 pg/boîte). En absence d'activation métabolique, les profils mutagènes de la solution d'essai d'extrait sec de 5 feuille de lierre et du mélange [quercétine + kaempférol] (solution de référence) sont donc similaires. Ceci a été confirmé dans un autre essai indépendant (essai 3; dont les résultats sont résumés dans le Tableau 12 infra). Par conséquent, l'activité mutagène (positivité) de l'extrait sec de feuille de lierre 10 observée vis-à-vis de la souche TA98 en absence d'activation métabolique peut être exclusivement attribuée/imputée à la présence de ces deux aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre que sont la quercétine et le kaempférol, et qui sont connus pour être mutagènes in vitro mais non génotoxiques in vivo. Cela permet de dédouaner les autres constituants de l'extrait sec de feuille de lierre de toute 15 responsabilité dans la génotoxicité in vitro obtenue vis-à-vis de la souche TA98 en absence d'activation métabolique. ESSAI 2 DOSES TA 98 pg/boite Rapport d'induction (a) 0 _ Q K Mélange [Quercétine 0,0273 0,0036 1,4 +Kaempférol] 0,091 0,012 1,4 0,273 0,036 1,7 EN L'ABSENCE du mélange-S9 0,546 0,072 2,8 0,91 0,12 3,9 Mélange [Quercétine + 0 - Kaempférol] Q K 0,0273 0,0036 1,1 EN PRESENCE du mélange-S9 0,091 0,012 1,0 0,273 0,036 0,9 SANS PRE-INCUBATION 0,546 0,072 1,3 0,91 0,12 2,1 (a) Rapport d'induction = nombre moyen de révertants obtenus avec le mélange [Quercétine + Kaempférol] / nombre moyen de révertants obtenus avec le témoin négatif Q : Quercétine - K : Kaempférol Tableau 11 : Résumé des résultats de l'essai 2 de mutagénicité (étude E2) avec le mélange [quercétine + kaempférol] sur la souche TA98 3059429 56 Au cours des 2ème et 3ème essais sur la souche TA98 avec activation métabolique, la réponse mutagène du mélange [quercétine + kaempférol] a induit une augmentation statistique et biologique importante du nombre de révertants mais seulement à la dose la plus élevée avec un ratio d'induction de 2,1 et de 3, respectivement. Dans le 3ème 5 essai, l'amplitude de réponse du mélange [quercétine + kaempférol] a été plus faible que celle de l'extrait sec de feuille de lierre (facteur d'induction de 3 vs 4,3 pour l'extrait sec de feuille de lierre à la plus forte dose). Dans ces conditions expérimentales, la présence de [quercétine + kaempférol] ne semble pas totalement expliquer l'activité mutagène observée avec l'extrait sec de feuille de lierre sur la souche TA98 en 10 présence d'activation métabolique exogène (induite par le mélange S9). L'activité mutagène (positivité) de l'extrait sec de feuille de lierre, observée sur la souche TA98 en présence d'activation métabolique, ne semble donc pas être exclusivement attribuable à la présence de ces flavonols aglycones dans l'extrait de lierre. Le « dédouanement » par la seule présence de quercétine et de kaempférol dans l'extrait sec de lierre semble, par 15 conséquent, insuffisant, ce qui signifie que l'on ne peut pas écarter définitivement l'hypothèse selon laquelle l'activité mutagène de l'extrait sec de feuille de lierre vis-à-vis de la souche TA98 en présence d'activation métabolique pourrait être due à des constituants autres que la quercétine et le kaempférol ; constituants dont on ignore le profil de sécurité. 3059429 57 Tableau 12 : Résumé des résultats de test du 3ème essai de mutagénicité sur la souche TA98 de FSRIPL 140210) Essai 3 TA 98 DOSES Rapport pg/boite d'induction (a) Extrait sec de 0 - feuille de 150 1,1 lierre 500 1,4 1500 1,3 EN 3000 1,7 L'ABSENCE 5000 2,0 du mélange- S9 Extrait sec de 0 - feuille de 150 1,2 lierre 500 1,1 1500 2,2 Mélange S9 3000 3,4 SANS PRE- INCUBATION 5000 4,3 (a) Rapport d'induction = nombre moyen de révertants obtenus avec la substance d'essai (extrait sec de feuille de lierre) /nombre moyen de révertants obtenus avec le témoin négatif Essai 3 DOSES en pg/boite TA 98 Rapport d'induction (a) 0 _ Q K Mélange 0,0273 0,0036 0,9 [Quercétine + 0,091 0,012 1,2 Kaempférol] 0,273 0,036 2,1 EN ABSENCE du mélange S9 0,546 0,072 3,0 0,91 0,12 4,3 Mélange [Quercétine + 0 _ Q K Kaempférol] 0,0273 0,0036 1,1 0,091 0,012 1,1 EN PRESENCE 0,273 0,036 1,2 du mélange S9 SANS PRE- 0,546 0,072 1,7 INCUBATION 0,91 0,12 3,0 (a) Rapport d induction = nombre moyen de révertants obtenus avec le mélange [Quercétine + Kaempférol] / nombre moyen de révertants obtenus avec le témoin négatif D'après les conclusions générales obtenues à partir de cet essai de mutation reverse 5 sur bactéries (étude E2), il peut être conclu que des réponses positives ont été observées en présence de la solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre : Sur la souche TA98 en absence d'activation métabolique : un effet mutagène faible a été noté (augmentations statistiquement et biologiquement significatives à la dose la plus forte ou aux deux doses les plus fortes testées 10 mais avec des nombres moyens de révertants compris dans l'intervalle des données historiques relatives aux contrôles négatifs) qui peut être pleinement attribué à la présence de [quercétine + kaempférol] dans l'extrait sec de feuille de lierre ; Sur la souche TA98 en présence d'activation métabolique : un effet mutagène 15 significatif a été observé (augmentations statistiquement et biologiquement 3059429 58 significatives au cours de deux essais sur 3 réalisés), qui ne semble pas être pleinement attribuable à la présence de [quercétine + kaempférol] dans l'extrait sec de feuille de lierre. Tel qu'indiqué précédemment, une telle situation, où un extrait de plante contient des aglycones flavoniques (par exemple quercétine seule ou quercétine + kaempférol) et présente une positivité en test d'Ames qui, en absence d'activation métabolique, peut être totalement attribuée à la présence de ces aglycones flavoniques dans l'extrait de plante (profil de réponse similaire en test d'Ames de la solution d'essai d'extrait de plante et la solution de référence de flavonol(s) aglycone(s), avec quelquefois selon l'extrait de plante considéré, une amplitude de réponse légèrement plus forte pour la solution de référence d'aglycones flavoniques), tandis que, en présence d'activation métabolique, semble ne pas être totalement attribuable à la présence d'aglycones flavoniques dans l'extrait de plante (amplitude de réponse beaucoup plus faible de la solution de référence d'aglycones flavoniques comparée à celle de la solution d'essai d'extrait de plante), a été observée plusieurs fois par la Demanderesse avec des préparations à base de plantes contenant des flavonoïdes (« plantes à flavonoïdes »), et en particulier contenant des flavonols. 5 2.2.b. Cinétique du contenu en quercétine simulant le test d'Ames (à savoir dans les conditions expérimentales de ce test) : La présence d'aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre permettant 10 d'expliquer les réponses positives obtenues uniquement en absence - et non en présence - d'activation métabolique a soulevé la question de savoir si, en présence d'activation métabolique, les flavonols aglycones (principalement représentés par la quercétine) se comportait de manière identique dans l'extrait végétal considéré et dans la solution de référence, mis en oeuvre parallèlement dans l'essai bactérien. 15 Comme pour l'exemple 1, et en vue de répondre à cette question, des études cinétiques ont été réalisées par la Demanderesse, avec la solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre et avec la solution de référence de quercétine (à des doses équivalentes de quercétine ; le véhicule étant le même, à savoir le DMSO). Ces études cinétiques ont 20 été réalisées dans l'intention de reproduire au mieux le mode opératoire du test d'Ames, 3059429 59 utilisant la méthode par étalement à la fois en absence et en présence d'activation métabolique Dans l'essai de mutagénicité en absence d'activation métabolique, utilisant la méthode 5 par étalement, la technique suivante a été utilisée : 0,1 ml d'une suspension bactérienne issue d'une culture agitée pendant toute une nuit à env. 37 °C et 0,1 ml de la solution d'essai sont ajoutés de manière successive dans un tube pré-rempli avec 2 ml d'agar mou maintenus dans un état de surfusion à env. 45 °C. Le contenu du tube est agité, puis réparti dans une boîte de pétri contenant 20 ml d'agar minimum. La boîte de pétri 10 est ensuite incubée à env. 37 °C pendant approximativement 44 h. En présence d'activation métabolique (méthode par étalement), la méthode est la même que celle utilisée en absence d'activation métabolique sauf qu'immédiatement avant l'étalement dans la boîte de Pétri, 0,5 ml du mélange S9 sont ajoutés dans l'agar 15 mou. Par conséquent, pour les études cinétiques, conformément au mode opératoire du test d'Ames décrit ci-dessus, les réactifs sont ajoutés à 2 ml d'une solution de NaCI (5 g/1) (en remplacement de l'agar ci-dessus) dans l'ordre suivant :Pour les essais en absence 20 d'activation métabolique : - 100 pI de tampon de phosphate de sodium à 0,2 M et à un pH de 7,4 à la place de la suspension bactérienne; - l'élément d'essai (100 pI de la solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre ou 100 pI de la solution de référence de quercétine). 25 - Pour les essais en présence d'activation métabolique : - 100 pI d'un tampon de phosphate de sodium à 0,2 M et à un pH de 7,4 à la place de la suspension bactérienne ; - l'élément d'essai (100 pI de la solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre ou 100 pI de la solution de référence de quercétine) ; 30 - 500 pI du mélange S9 à 10 %. (Pour plus de détails sur les solutions de remplacement utilisées dans les études cinétiques de la quercétine, voir le Tableau 13 ci-dessous). 3059429 Réactifs pour les études cinétiques de la quercétine Réactifs pour test d'Ames Essais sans activation métabolique (méthode d'incorporation directe standard) 2 ml de Top Agar : Pour 1 000 ml d'eau stérile agar Difco : 6 g NaCI : 5 g 0,1 ml d'une culture bactérienne fraîche Le milieu nutritionnel adapté à la culture de bactéries est à un pH de 7,4 (milieu nutritif N°2 Oxoid 2 ml d'une solution de NaCI (5 g/1) en remplacement de la solution de Top Agar 0,1 ml d'un tampon phosphate de sodium à 0,2 M à un pH de 7,4 à la place de la culture bactérienne fraîche 0,1 ml de solution d'extrait sec de feuille de lierre ou 0,1 ml de solution de référence de quercétine 0,1 ml de la solution d'extrait sec de feuille de lierre ou 0,1 ml de la solution de référence de quercétine 2 ml de Top Agar : Pour 1000 ml d'eau stérile : agar Difco : 6 g NaCI : 5 g 2 ml de la solution de NaCI (5 g/1) en remplacement de la solution de Top Agar Essais avec activation métabolique (méthode d'incorporation directe standard) 0,1 ml d'une culture bactérienne fraîche Le milieu nutritionnel adapté à la culture de bactéries est à un pH de 7,4 (milieu nutritif N°2 Oxoid) 0,1 ml d'une solution d'extrait sec de feuille de lierre ou 0,1 ml d'une solution de référence de quercétine 500 pl du mélange S9 à 10% Le mélange S9 contient par ml : - S9 : 0,1 ml - MgC12, 0,4 M : 0,02 ml - KCI, 1.65 M : 0,02 ml - Tampon phosphate, 0,2 M pH 7,4 : 0,5 ml - NADP, 0,1 M : 0,04 ml - Glucose-6-phosphate, 1 M : 0,005 ml - H20 : 0,315 ml 0,1 ml d'un tampon phosphate de sodium à 0,2 M à un pH de 7,4 à la place de la culture bactérienne fraîche 0,1 ml d'une solution d'extrait sec de feuille de lierre ou 0,1 ml d'une solution de référence de quercétine 500 pl du mélange S9 à 10% Le mélange S9 contient par ml : -S9 : 0,1 ml -MgC12, 0,4 M : 0,02 ml -KCI, 1,65 M : 0,02 ml -Tampon phosphate, 0,2 M pH 7,4 : 0,5 ml -NADP, 0,1 M : 0,04 ml -Glucose-6-phosphate, 1 M : 0,005 ml -H20 : 0,315 ml Tableau 13 : Réactifs utilisés pour le test d'Ames et dans les études cinétiques de la quercétine 3059429 61 Les solutions finales obtenues ont été maintenues à 37 °C (température d'incubation des boîtes de Pétri dans le test d'Ames) et testées toutes les 35 minutes pour évaluer la teneur en quercétine par CLHP sur une durée de 105 minutes afin de comparer le comportement de la quercétine dans la solution d'essai d'extrait sec de feuille de lierre 5 avec celui de la solution de référence, testée en parallèle. Malgré la présence de kaempférol dans l'extrait sec de feuille de lierre, les études cinétiques par CLHP réalisées par la Demanderesse n'ont pas pris en considération le kaempférol puisque sa quantité dans l'extrait sec de feuille de lierre est très faible 10 [teneur en kaempférol = 0,08 pg/100 pL c.-à-d. même quantités de quercétine et de kampférol dans la solution DMSO -)même quantité d'un marqueur d'extrait sec de feuille de lierre (hédéracoside C) dans la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre à 50 mg/ml et dans la Fraction C ->absence de quercétine et de kaempférol dans la Fraction C ->complémentarité des Fractions A et C par rapport à la composition chimique Comparaison sec de feuille de lierre et dans la Fraction A ->dégradation complète de la quercétine ; présence résiduelle d'une très faible quantité de kampférol ->présence de quercétine et de kaempférol dans la Fraction A de la solution DMSO, . sec de feuille des (0,4 pg/ml) dans la Fraction B ->dégradation complète de la quercétine dans la Fraction B ->présence dans la Fraction B de tous les autres composants trouvés dans la Fraction A extrait chromatogrammed'extrait s ->complémentarité ->complémentarité des Fractions A et C par rapport à la composition chimique de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre d de lierre complémentarité des Fractions A et C par rapport à la composition chimique de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre ->absence de composés adsorbés sur la cartouche -+profils chromatographiques similaires entre la Fraction A et la Fraction B ->absence de composés adsorbés sur la cartouche Tableau 14: Résultats d'analyses chromatographiques de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre et des Fractions A, B, C et D Les chromatogrammes obtenus à la longueur d'onde de 370 nm, démontrent que la 5 fraction A correspond à la fraction contenant les aglycones flavoniques, à savoir la quercétine et le kaempférol (cf. figure 9). Dans cette fraction A, les quantités de quercétine et de kaempférol étaient identiques à celles déterminées dans l'extrait sec de feuille de lierre, à concentrations équivalentes (pour la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre à 50 mg/ml : teneur en quercétine de 8,7 mg/ml, teneur en kaempférol 10 de 0,8 pg/ml - pour la Fraction A obtenue par traitement d'une solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre à 50 mg/ml : teneur en quercétine de 8.1pg/m1 et teneur en kaempférol de 0,8 pg/ml). En effet, comme pour l'extrait sec de feuille de lierre, la Fraction A contient principalement de la quercétine et une faible quantité de kaempférol (c.-à-d. environ 10 % de la teneur en quercétine). En contraste, la fraction C, fraction 15 dépourvue de quercétine, obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre est totalement dépourvue d'aglycones flavoniques puisqu'aucun pic au temps de rétention attendu pour la quercétine (Tr 15,97 min) et pour le kaempférol (Tr 17,71 min) n'a été observé. 3059429 67 L'analyse du profil CLHP obtenu en détection « Max Plot » a aussi démontré, dans la Fraction A, la présence de pics supplémentaires au cours des 15 dernières minutes du chromatogramme démontrant la présence d'autres constituants en plus de la quercétine 5 et du kaempférol dans cette fraction A. Du fait de la présence de ces constituants additionnels inconnus dans la Fraction A, la préparation d'une autre fraction (Fraction B) contenant uniquement ces constituants additionnels inconnus, c.-à-d. la Fraction A dépourvue de quercétine et de kaempférol, a 10 été nécessaire, dans le but de comparer la réponse dans le test d'Ames de la Fraction A et de la Fraction B et ainsi confirmer que la positivité en test d'Ames de l'extrait sec de feuille de lierre est exclusivement attribuée aux aglycones flavoniques. La Fraction B est obtenue à partir de la Fraction A par dégradation sélective de la quercétine. Pour ce faire, à 5 ml de la Fraction A, 5 ml d'un tampon phosphate à 0,2 M à un pH de 7,4 sont 15 ajoutés. Après une incubation de 1 h à 37 °C, l'eau est évaporée et le volume est ajusté jusqu'à 5 ml avec du DMSO, aboutissant à la Fraction B. Comme vérifié par comparaison des chromatogrammes obtenus par CLHP et par CPG entre les Fractions A et B, la Fraction B correspond à la Fraction A dans laquelle la 20 quercétine a été totalement dégradée. Ceci se traduit par : - l'absence de pic au temps de rétention escompté de la quercétine (Tr 15,97 min) dans le chromatogramme à la longueur d'onde de 370 nm pour la Fraction B (voir figure 9 ;limite de détection 0,4 pg/ml) ; - les chromatogrammes de la Fraction A et de la Fraction B obtenus en utilisant une 25 détection "Max Plot", se superposent totalement à l'exception d'un pic absent pour la fraction B correspondant à la quercétine (Tr 8,09 min) (voir figure 10) ; - des profils chromatographiques CPG similaires entre la Fraction A et la Fraction B (voir figure 11) ; la quercétine n'étant pas observée en condition CPG car n'étant pas un composé volatil. 30 Néanmoins, une infime teneur en kaempférol (0,4 pg/ml) était toujours présente dans la Fraction B (voir figure 9). De plus, la comparaison des chromatogrammes obtenus par CLHP (avec une détection 3059429 68 « Max Plot ») et par CPG pour la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre, la Fraction A et la Fraction C, a permis de démontrer que la Fraction A et la Fraction C étaient totalement complémentaires par rapport à la composition chimique de l'extrait sec de feuille de lierre. Ceci signifie que lorsque les chromatogrammes de la Fraction A 5 et de la Fraction C sont superposés, cela aboutit au chromatogramme de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre (c.-à-d. que la somme des pics obtenus à partir du chromatogramme de la Fraction A et celle obtenue à partir du chromatogramme de la Fraction C, aboutissent à l'ensemble des pics obtenus pour la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre en CLHP en détection à 370 nm ou en détection « Max Plot »et 10 en CPG. Le chromatogramme de la fraction C en détection « Max Plot » montre la présence du marqueur de qualité de l'extrait sec de feuille de lierre, l'hédéracoside C (Tr 10,36 min) en proportion comparable à celle obtenue dans le chromatogramme de la solution 15 DMSO d'extrait sec de lierre, celui-ci étant - logiquement - absent dans le chromatogramme de la fraction A (figure 12). Afin de vérifier si des composés résiduels sont toujours adsorbés sur la cartouche Strata X après élution des Fractions A et C, une fraction de lavage obtenue avec du DMSO a 20 été préparée, appelée Fraction D. L'analyse de la Fraction D par CLHP en détection "Max Plot" et par CPG a démontré une absence de composés chimiques adsorbés sur la cartouche utilisée pour préparer les Fractions A et C (cf. respectivement figures 13 et 14). L'analyse chromatographique de la fraction C indique donc que cette dernière contient des flavonols glycosides susceptibles de conduire à une nouvelle production d'aglycones flavoniques lorsque cette dernière est testée dans un essai bactérien de mutation reverse en présence d'activation métabolique exogène. Avant que chacune de ces 4 fractions A, B, C et D ne soit testée en test d'Ames, il convient donc de s'assurer du comportement du contenu en quercétine de la fraction C après traitement de cette dernière par le mélange S9 (selon les conditions du test d'Ames) afin d'évaluer si le fractionnement doit être réalisé: 25 30 3059429 69 - directement sur la solution DMSO d'extrait sec de lierre (cas où le traitement de la fraction C avec le mélange S9 ne conduirait à aucune nouvelle génération de quercétine), ou - sur cette même solution préalablement traitée par le mélange S9 selon les conditions 5 du test d'Ames (cas où la cinétique du contenu en quercétine de la fraction C conduirait à une nouvelle génération de quercétine) 2.2.e. Résultat de l'étude cinétique du contenu en quercétine de la fraction C après traitement par le mélange S9 selon les conditions expérimentales du test 10 d'Ames Les résultats de l'étude cinétique présentés en tableau 15 infra et en figure 15 montrent une absence de quercétine tout au long de l'étude de cinétique. Temps (min) Teneur en quercétine dans la Fraction C de la solution DMSO d'extrait sec de lierre (pg/100p1) 0 0,0 5 0,0 35 0,0 0,0 105 0,0 15 Tableau 15 : Cinétique du contenu en quercétine de la fraction C en présence d'activation métabolique Puisque aucune nouvelle génération de quercétine n'est attendue par le traitement de la fraction C avec le mélange S9 selon les conditions expérimentales du test d'Ames, un 20 nouveau fractionnement peut être réalisé afin de déterminer l'implication des flavonols libres dans la positivité obtenue avec l'extrait sec de feuille de lierre en test d'Ames, (le premier fractionnement ayant servi à étudier le comportement de la fraction C en présence d'activation métabolique), sans aucun traitement préalable de cette dernière selon le protocole opératoire décrit au point 2.1 c supra. Les fractions A, B, C et D 25 obtenues seront ensuite testées dans un essai de mutation reverse sur bactéries, uniquement sur la souche TA98, en absence et en présence d'activation métabolique (souche et conditions pour lesquelles une réponse positive de la solution DMSO d'extrait 3059429 70 sec de feuille de lierre a été obtenue). 2.2.f. Essai de mutation reverse bactérien sur les différentes fractions A, B, C et D préparées à partir d'une solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre 5 Dans les conditions expérimentales de l'étude E3, une activité mutagène a été observée uniquement pour la Fraction A, qui correspond à la fraction contenant les aglycones flavoniques c.-à-d. la quercétine et le kaempférol (la teneur en kaempférol correspondant à environ un dixième de la teneur en quercétine). Évaluées dans les 10 mêmes conditions expérimentales, les Fractions B, C et D ne présentent aucune activité mutagène (aucune augmentation statistiquement ou biologiquement significative du nombre moyen de révertants n'a été observée quelle que soit la condition ou la dose testée ; voir figure 16). 15 Ceci démontre que, lorsque la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre est dépourvue d'aglycones flavoniques (c.-à-d. de quercétine et de kaempférol [Fraction C]) ou quand la quercétine (principal flavonol libre de l'extrait sec de feuille de lierre) présente dans la Fraction A (c.-à-d. fraction contenant la quercétine obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre) est dégradée, donnant la Fraction B, 20 la réponse mutagène observée avec la fraction contenant la quercétine obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre (Fraction A) n'est plus observée. De plus, comme supposé, la Fraction D (fraction de lavage obtenue avec du DMSO après élution de la fraction contenant la quercétine et de celle dépourvue de quercétine, c.-à-d. après élution des fractions A et C) n'a présenté aucun effet mutagène, ce qui est en 25 accord avec les données chromatographiques obtenues (cf. figures 13 et 14), démontrant l'absence de composés absorbés sur la cartouche après avoir préparé les Fractions A et C. Ceci démontre que les effets mutagènes de l'extrait sec de feuille de lierre (Lot 30 1130019619), dissous dans le DMSO (étude E2) observé vis-à-vis de la souche TA98 sont exclusivement dus/imputables à la présence d'aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre (c.-à-d. quercétine et kaempférol, majoritairement représentés par la quercétine dans le cas de l'extrait sec de feuille de lierre). 3059429 71 La positivité en test d'Ames de la fraction contenant la quercétine obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre (Fraction A), de même que la négativité en test d'Ames de la fraction exempte de quercétine (Fraction C) obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre, vis-à-vis de la souche TA98, ont été 5 confirmées par deux essais bactériens de mutation reverse indépendants, à la fois en absence d'activation métabolique (étude E4) et en présence d'activation métabolique (étude E5). Un contrôle (témoin) a été ajouté lors de la réalisation des études E4 et E5, c.-à-d. qu'une solution de référence de quercétine à une concentration en quercétine équivalente à celle de la fraction contenant la quercétine obtenue à partir de la solution 10 DMSO d'extrait sec de feuille de lierre (fraction A) a été testée, parallèlement aux fractions A et C. A la fois en absence (E4) et en présence (E5) d'activation métabolique, une activité mutagène a été notée à la fois pour la fraction contenant la Quercétine obtenue à partir 15 de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre (Fraction A) et pour la solution de référence de quercétine avec un profil similaire de réponse. En revanche, aucune activité mutagène n'a été observée pour la fraction dépourvue de quercétine (Fraction C) obtenue à partir de la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre c.-à-d. quand la solution DMSO d'extrait sec de feuille de lierre est dépourvue d'aglycones flavoniques 20 (cf. figures 17 et 18). Les résultats des études E4 et E5 confirment ceux de l'étude E3, et permettent de démontrer définitivement et sans équivoque que : - les effets mutagènes de l'extrait sec de feuille de lierre (Lot 1130019619), dissous 25 dans le DMSO (étude E2) observés vis-à-vis de la souche TA98, en absence et en présence d'activation métabolique sont exclusivement attribués à la présence d'aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre, à savoir la quercétine et le kaempférol, principalement représentés par la quercétine dans l'extrait sec de feuille de lierre, et 30 - qu'aucun autre constituant présent dans l'extrait sec de feuille de lierre, n'est impliqué dans cette mutagénicité in vitro. Dans la mesure où : a) la positivité en test d'Ames de l'extrait sec de feuille de lierre (Lot 1130019619) 3059429 72 dissous dans le DMSO (E2) est uniquement attribuable à la présence d'aglycones flavoniques dans l'extrait sec de feuille de lierre, c.-à-d. à la présence de quercétine et de kaempférol, principalement représentés par la quercétine dans l'extrait sec de feuille de lierre, et 5 b) la quercétine et le kaempférol sont signalés/identifiés comme mutagènes in-vitro mais connus pour être dépourvus de mutagénicité/génotoxicité in vivo (Harwood et al., 2007) [9], à savoir possèdent un profil de sécurité établi ; une évaluation des risques basée sur la comparaison de l'exposition de ces flavonols aglycones, c.-à-d. quercétine et kaempférol, apportée par l'alimentation à celle liée à la 10 consommation de l'extrait sec de feuille de lierre devient suffisante pour évaluer le potentiel génotoxique de l'extrait sec de feuille de lierre et aucun test de génotoxicité supplémentaire n'est nécessaire, conformément aux recommandations de la ligne directrice EMEA/HMPC/107079/2007 [1] qui accepte le fait qu' « un risque dû à l'administration d'un produit médicinal à base de plante peut être accepté si sa 15 contribution par rapport à l'exposition apportée par l'alimentation est considéré comme faible». Néanmoins, toutes les préparations à base de plantes ne se comportent pas de façon identique à l'extrait sec de feuille de lierre et selon les préparations à base de plantes 20 considérées, certaines pourront donner lieu à une (ré)génération de quercétine à partir de la fraction C (fraction exempte de quercétine mais pouvant contenir des flavonols glycosides) lorsque cette dernière est traitée par un système d'activation métabolique exogène, tel qu'un mélange S9, selon les conditions expérimentales du test d'Ames. C'est par exemple ce qui peut être suspecté avec la Vigne Rouge compte tenu du profil 25 cinétique du contenu en quercétine obtenu pour l'extrait aqueux de Vigne Rouge (voir Figure 3) pour lequel est observée une augmentation du contenu en quercétine pendant les 105 minutes d'étude. Un extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge (éthanol 50% V/V) est pris ci-dessous à titre d'exemple pour illustrer ce cas. 30 Exemple 3 : Fractionnement d'un extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge et étude cinétique du contenu en quercétine de la fraction C après traitement par le mélange S9 selon les conditions expérimentales du test d'Ames 3.1 Matériel et méthodes 3059429 73 3.1.a. Matériel - Cf. 1.2.a supra. 5 3.1.b. Extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge Cf. 1.2.c supra 10 3.1.c. Solutions tampon Cf. 1.2.d supra 3.1.d. Réactif 59-Mix Cf. 1.2.f. 15 3.1.e. Traitements en simulation du test d'AMES Cf. 1.2.h supra 20 3.1.f Solution permettant de déterminer la teneur en quercétine avant traitement Cf. 1.2.i supra 3.1.g. Réalisation de la fraction C à partir de l'extrait hydro-alcoolique de vigne 25 rouge L'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge a fait l'objet d'un fractionnement afin d'obtenir une fraction C exempte de quercétine et d'évaluer le comportement de cette fraction en présence d'activation métabolique, en condition de simulation du test d'AMES. La Fraction C (fraction dépourvue de quercétine) a été obtenue à partir de 5 ml d'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge. L'éthanol a tout d'abord été évaporé, 5 ml de tampon phosphate pH 5,3 ont été ajoutés pour stabiliser et le volume porté à 20 ml avec de l'eau. La 3059429 74 fraction C a été obtenue par fractionnement de la solution sur phase solide (SPE), en utilisant une cartouche Strata-X ainsi que des mélanges eau/méthanol de différentes concentrations en tant que « solvant d'élution ». Les éluats obtenus ont été combinés et le solvant (méthanol et eau) évaporé. Les résidus secs ont été dissous dans 5 ml d'éthanol 50% V/V. La fraction contenant la quercétine (fraction A) a été écartée. 3.1.h. Chromatographie liquide haute performance (« CLHP » ou «HPLC », en langue anglaise) - Détection dans l'ultraviolet avec barrette de diodes Cf. 1.2.k supra. 5 3.2 Résultats et discussion Le fractionnement de la solution d'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge a permis d'obtenir une fraction C dépourvue de quercétine comme le montre la chromatogramme 10 d'analyse CLHP avec l'absence de pic au temps de rétention de la quercétine (16,1 min) tout en préservant la composition de la solution d'essai (cf. figures 19 et 20 ; ladite figure 20 étant un agrandissement de la partie caractéristique de la figure 19). L'étude cinétique du contenu en quercétine de cette fraction C en présence d'activation métabolique dans les conditions expérimentales du test d'Ames montre que de la quercétine est générée par le traitement avec le mélange S9 avec une augmentation progressive de la concentration en quercétine dans la solution étudiée (cf. tableau 16 infra et figure 21). Tps(min) Fraction C préparée à partir de l'extrait hydro-alcoolique de Vigne Rouge Essai 1 Essai 2 Moyenne 0 0 0 0 5 0 0,25 0,12 35 0,78 1,23 1,0 70 1,40 2,78 2,1 105 2,02 4,16 3,1 Tableau 16 De plus, la comparaison des chromatogrammes obtenus lors de l'analyse montre clairement l'apparition d'un pic de quercétine après 105 min de traitement par le mélange S9 (cf. figure 22). 3059429 Ainsi, pour les préparations à base de plante pour lesquelles on observe en test d'Ames une positivité en présence d'activation métabolique et qui après fractionnement aboutissent à une fraction C, laquelle, lorsqu'elle est traitée par un mélange S9 selon les conditions expérimentales du test d'Ames, conduit à une nouvelle génération de 5 quercétine, il convient de traiter, préalablement, ces préparations à base de plante par un mélange S9 dans les conditions expérimentales du Test d'Ames, avant d'effectuer le fractionnement permettant d'obtenir les fractions A, B, C et D qui seront alors testées au cours d'un essai de mutation reverse sur bactéries uniquement en absence d'activation métabolique et vis-à-vis des souches où une positivité en test d'Ames de ces 10 préparations à base de plantes a été obtenue. Exemple 4 : Fractionnement d'un extrait DMSO de feuille d'olivier, préalablement traité par le mélange S9 conformément aux conditions expérimentales du test d'Ames 15 4.1 Introduction Afin que le procédé objet de la présente invention soit applicable à l'ensemble des préparations à base de plantes à flavonoïdes, et considérant la capacité de certaines 20 préparations à base de plantes de générer de la quercétine à partir de la fraction C suite à son traitement par le mélange S9 dans les conditions expérimentales du test d'Ames (cf. exemple 3 supra), une méthodologie d'activation métabolique permettant de réaliser le traitement préalable de la préparation à base de plantes par le mélange S9 conformément aux conditions expérimentales du test d'Ames a été mise en place et 25 appliquée au cas concret de l'extrait DMSO de feuille d'Olivier, tel qu'exposé ci-après. 4.2 Matériel et méthodes 4.2.a. Matériel 30 Cf. 1.2.a. Le DMSO (C2H60S) est fourni par Sigma Aldrich Chimie. 4.2.b. Extrait DMSO de feuille d'Olivier L'extrait DMSO de feuille d'Olivier est obtenu par extraction de 4.0 g de poudre avec 3059429 76 20,0 mL de DMSO sous agitation magnétique à 400 ± 50 rpm en bain-marie à 60°C ± 2°C pendant 30 min ± 1 min. Après retour à température ambiante, la suspension est centrifugée à 6000 rpm pendant 5 min. 5 4.2.c. Chromatographie liquide haute performance (« CLHP » ou «HPLC », en langue anglaise) - Détection dans l'ultraviolet avec barrette de diodes Cf. 1.2.k. supra 10 4.2.d. Traitement préalable de la solution d'essai (Extrait OMS() de feuille d'Olivier) par le mélange S9 avant fractionnement Le traitement par le mélange S9 avant fractionnement est réalisé comme suit : 1) dans un flacon muni d'un bouchon, mélange de 1 volume de la solution d'essai (cf. 4.2.b) et de 5 volumes de S9-Mix (cf. 1.2.f) préalablement centrifugé (5 min, 10000 rpm) 15 (par exemple respectivement 5 mL et 25 mL) 2) incubation de la solution dans le flacon fermé à 37°C pendant 60 minutes 3) reconstitution de la solution d'essai par ajout de 200 mL d'éthanol anhydre, repos pendant 3-4h à -20°C afin de précipiter les sels, centrifugation (5 min, 10000 rpm), évaporation du solvant sous vide puis ajustement au volume de solvant initial de la 20 solution d'essai mise en oeuvre (dans l'exemple à 5mL de DMSO). 4.2.e. Fractionnement de la solution d'essai (extrait DMSO de feuille d'Olivier) obtenue après traitement par le mélange S9 25 La solution d'essai obtenue après traitement par le mélange S9 est diluée dans du tampon phosphate pH 5,3 par ajout de 5 ml de tampon et de 15 ml d'eau purifiée pour 5 ml de solution dans le DMSO puis le fractionnement est réalisé comme décrit en 2.1.c supra pour la solution d'extrait sec de lierre. 30 4.3 Résultats et discussion Le traitement de l'extrait DMSO de feuille d'Olivier par le mélange S9 conformément aux conditions expérimentales du test d'Ames indique une génération de quercétine. La comparaison des chromatogrammes obtenus pour la solution d'essai avant et après 3059429 77 traitement par le mélange S9 (cf. figure 23) montre une augmentation du pic de quercétine ainsi que l'apparition d'un pic analogue aux temps de rétention respectifs de 16 et 18 minutes. 5 Le fractionnement réalisé sur l'extrait DMSO de feuille d'Olivier préalablement traité par le mélange S9 permet d'obtenir une fraction C exempte de quercétine (cf. figure 24). Ainsi, lorsqu'il s'avère nécessaire, afin d' évaluer l'implication des flavonols aglycones dans la positivité d'une préparation à base de plantes (par exemple un extrait végétal) 10 observée en test d'Ames, que les fractions A, B, C et D soient testées en présence d'activation métabolique (correspondant uniquement au cas où la susdite préparation à base de plantes présenterait une positivité en présence d'activation métabolique vis-à-vis d'au moins une souche bactérienne), il convient d'étudier le comportement du contenu en quercétine de la fraction C traitée avec le mélange S9 dans les conditions 15 expérimentales du test d'Ames. L'alternative suivante est alors envisageable : 1) Le traitement de la fraction C avec le mélange S9 ne conduit à aucune nouvelle génération de flavonols aglycones, dans ce cas le fractionnement de la préparation à base de plantes permettant l'obtention des fractions A, B, C et D qui seront mis en oeuvre dans un essai de mutation reverse sur bactéries se fera 20 directement sur la préparation à base de plantes (par exemple sur l'extrait végétal) n'ayant subi aucun traitement préalable au moyen d'un système d'activation métabolique exogène (tel que le mélange S9) et les fractions A, B, C et D seront testées sur les mêmes souches et dans les mêmes conditions (en présence ou en absence d'activation métabolique selon les cas) que celles où la 25 préparation à base de plantes présentait une positivité ; 2) Le traitement de la fraction C avec le mélange S9 conduit à une nouvelle génération de flavonols aglycones, dans ce cas avant fractionnement permettant d'obtenir les fractions A, B, C et D dans l'objectif de les tester en test d'Ames, la préparation à base de plantes devra être préalablement traité par le mélange S9 30 afin que tous les flavonols glycosides de la préparation à base de plantes susceptibles de se retrouver dans la fraction C et potentiellement « générateurs » de quercétine soient métabolisés en flavonols aglycones avant fractionnement et obtention des fractions A, B, C et D qui seront alors testées au cours de l'essai de mutation reverse sur bactéries uniquement en absence d'activation 3059429 78 métabolique. Les exemples 1 à 4, détaillés ci-dessus illustrent différents cas de figures et démontrent clairement que le procédé objet de la présent invention permet d'imputer/attribuer 5 l'activité mutagène obtenue initialement en test d'Ames avec la préparation à base de plantes d'intérêt (par exemple avec l'extrait végétal d'intérêt) à la seule présence de flavonol(s) libre(s) présent(s) dans ladite préparation à base de plantes, lorsqu'une positivité de la Fraction A est observée au cours d'un essai de mutation réverse sur bactéries et que les fractions B, C et D donnent des résultats négatifs au cours de cet 10 essai. De manière particulièrement avantageuse, le procédé objet de la présente invention peut-être, dans une certaine mesure, qualifié d'« universel », puisqu'il est applicable à l'ensemble des préparations à base de plante contenant des flavonoïdes et, au-delà, à 15 toute préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, à partir du moment où celle-ci est susceptible de contenir au moins un constituant connu/identifié comme mutagène in vitro, et que ledit au moins un constituant connu/identifié comme mutagène in vitro peut être sélectivement dégradé, afin d'obtenir une fraction dans laquelle ledit au moins un constituant connu/identifié 20 comme mutagène in vitro a été sélectivement dégradé. Grâce au processus innovant développé, basé sur la division/le fractionnement de la solution d'essai, il peut être déterminé quelle est l'implication des flavonols aglycones dans la positivité observée en test d'Ames avec toute préparation à base de plantes 25 contenant des flavonoïdes. Le processus développé, représente un processus approprié et fiable pour évaluer l'imputabilité de/des aglycone(s) de flavonol dans la positivité observée avec le test d'Ames, à la différence de la méthodologie conventionnelle basée sur une comparaison des réponses mutagènes entre la solution d'essai et la solution de référence (mélange d'aglycone(s) de flavonol à des doses équivalentes), qui ne semble 30 pas être totalement appropriée pour évaluer de manière univoque la contribution de ces génotoxiques in vitro, notamment en présence d'activation métabolique. En effet, tel qu'indiqué précédemment, les études cinétiques internes reproduisant au mieux le mode opératoire du test d'Ames démontrent que la susdite méthodologie conventionnelle présente notamment un biais systématique en présence d'activation 3059429 79 métabolique, biais qui peut être mis en évidence par un comportement différent en présence d'activation métabolique du contenu en aglycone(s) flavononiques entre la solution d'essai (par exemple extrait végétal dans le solvant approprié) et la solution de référence de flavonols aglycones, ne permettant pas l'utilisation de la méthodologie 5 conventionnelle en présence d'activation métabolique. Ce biais, qui apparaît avec la plupart des préparations à base de plantes contenant des flavonoïdes (« plantes à flavonoïdes »), semble dû, selon toute vraisemblance, à l'environnement chimique complexe de la préparation à base de plantes en comparaison à la solution de référence. En effet, des études analytiques internes (cf. exemple 1) ont démontré qu'en 10 présence d'activation métabolique, une déglycosylation de certains hétérosides de flavonol des préparations à base de plantes se produisait, induisant la génération d'aglycone(s) flavononiques (cf. exemple 1 supra et figure 4). Par conséquent, le processus innovant développé présente l'avantage de pouvoir être 15 utilisé avec succès à la fois en absence et en présence d'activation métabolique contrairement à la méthode conventionnelle, qui peut valablement être utilisée en l'absence d'activation métabolique pour la plupart des préparations à base de plantes à flavonoïdes. 20 Grâce au procédé développé par la Demanderesse : - un biais, qui apparaît quand les préparations à base de plante contenant des flavonoïdes sont testées en test d'Ames en présence d'activation métabolique, peut être évité; - une évaluation du risque basée sur la comparaison entre l'exposition à un/des 25 aglycone(s) de flavonol apportés par l'alimentation et celle liée à la prise du médicament à base de plante, devient suffisante pour évaluer le potentiel génotoxique du médicament à base de plantes et permet d'apporter la preuve de son innocuité chez l'homme d'un point de vue génotoxique sans nécessiter de passer aux étapes supérieures de l'arbre décisionnel. Cela permet d'éviter des études de génotoxicité 30 supplémentaires et par conséquent, d'économiser notamment des frais supplémentaires et du temps opérateur. Ceci présente aussi un avantage d'un point de vue éthique en limitant l'utilisation d'expérimentations animales dans le cas où la procédure de l'étape 3 de l'approche progressive recommandée (EMEA/HPMC/107079/2007) [1] serait requise pour prouver l'innocuité 35 génotoxique de la préparation à base de plantes. 3059429 En conclusion, le procédé selon l'invention présente différents avantages et/ou applications industrielles : 5 - améliorer la précision de la méthodologie conventionnelle basée sur la comparaison de la réponse mutagène des solutions d'essai et de référence, testées à doses équivalentes, au cours d'un même test d'Ames en absence d'activation métabolique, - éviter un biais susceptible de se produire avec les plantes à flavonoïdes (plantes contenant - ou suspectées de contenir - au moins un flavonoïde), et en particulier avec 10 les plantes à flavonols, lorsque ces dernières sont testées en test d'Ames en présence d'activation métabolique, biais dû à la complexité phytochimique de la préparation à base de plantes. En d'autres termes, le procédé selon l'invention, basé sur le fractionnement de la 15 solution test, suivi d'un test d'Ames sur chaque fraction, permet donc de mieux vérifier l'imputabilité des seuls flavonols libres dans la positivité de la préparation à base de plantes et permet d'éviter le biais se produisant, en présence d'activation métabolique, avec la susdite méthodologie conventionnelle. 20 De plus, de par la spécificité de certaines spécialités à base de plantes pour lesquelles la totalité de la préparation à base de plantes correspond à la substance active (cas des poudres de plantes, des plantes pour tisane,...) et pour lesquelles il est nécessaire de sélectionner différents solvants prenant en considération l'ensemble du profil phytochimique de la poudre de plante (ensemble du spectre des constituants 25 phytochimiques, incluant les constituants polaires et non polaires (EMEA/HMPC/67644/2009)] [10]), cette méthodologie devient d'autant plus pertinente du fait que les solvants sélectionnés permettant de couvrir le spectre entier des constituants phytochimiques de la drogue végétale ne sont pas toujours compatibles avec les tests de génotoxicité recommandés en étapes 2 et 3 du susdit arbre 30 décisionnel (toxicité des solvants ne permettant pas d'atteindre la dose maximale d'exposition recommandée par les lignes directrices de l'OCDE ou d'utiliser la voie d'exposition permettant de garantir l'atteinte du tissu cible ; dans le cas du test de micronoyaux in vivo, nécessité d'utiliser la voie d'administration permettant d'assurer l'exposition systémique maximale et garantir ainsi l'exposition de la moelle osseuse à la 3059429 81 substance testée). De par le caractère ubiquitaire des flavonols et notamment des aglycones flavoniques (flavonols libres) - et en particulier de la quercétine (largement retrouvée dans le règne 5 végétal) - le procédé selon l'invention, basé sur le fractionnement de la solution d'essai est applicable ; - aux ingrédients cosmétiques à base de plantes pour lesquels un essai de mutation reverse sur bactéries conforme à la ligne directrice 471 de l'OCDE est recommandé pour évaluer leur potentiel mutagène (SCCS/1501/12 [11] et SCCS/1532/14 [12]) , et 10 - aux aliments et denrées alimentaires pour lesquels à la fois un test d'Ames (mise en évidence d'agents mutagènes) et un essai in vitro de micronoyaux sur cellules de mammifère (mise en évidence d'agents aneugènes et clastogènes) sont recommandés en première étape de l'évaluation du potentiel génotoxique d'un aliment ou d'une denrée alimentaire (EFSA Journal 2011 ; 9 (9) : 2379 [13]). 15 Le procédé selon l'invention permettra donc également aux fabricants ou aux responsables de la mise sur le marché de produits cosmétiques ou de compléments alimentaires de ne pas écarter de leur composition certaines substances à base de plantes, s'il peut être démontré, comme le prouve cette méthodologie, que la positivité 20 observée en test d'Ames est exclusivement attribuée à la présence d'un aglycone flavonique - typiquement à la présence de quercétine - considérée comme sans danger aux doses retrouvées dans l'alimentation (Harwood et al., 2007 [9] ; Gras notice for high-purity quercetin submitted to FDA, 2010 [14]). 3059429 82 Références bibliographiques [1] EMEA (European Medicines Agency), 2007. 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Procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai adaptée pour subir un test de mutation réverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, ladite solution d'essai étant préparée à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, susceptible de contenir au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir de ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, préparer une solution d'essai, adaptée pour subir un test de mutation réverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, en solubilisant tout ou partie de ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle dans un solvant approprié, b) fractionner ladite solution d'essai de manière à obtenir deux fractions complémentaires, adaptées pour subir un test de mutation réverse sur bactéries en présence et/ou en absence d'activation métabolique exogène, à savoir : une fraction A comprenant, ou consistant essentiellement en, ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et une fraction C dépourvue dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et c) prélever un volume prédéfini de ladite fraction A et dégrader, de manière sélective, ledit au moins un constituant identifié comme étant mutagène in vitro au sein de ce volume prédéfini, de manière à obtenir une fraction B, dans laquelle ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a été sélectivement dégradé. 2. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape de fractionnement b) est effectuée par extraction sur au moins une phase solide, ladite au moins une phase solide étant sélectionnée pour adsorber spécifiquement ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape de fractionnement b) comprend les étapes suivantes : 3059429 86 b.1) charger ladite solution d'essai à fractionner sur ladite au moins une phase solide en éluant les composés sans affinité de manière à obtenir ladite fraction C, et b.2) éluer spécifiquement ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro resté adsorbé sur ladite au moins une phase solide après l'étape b.1) de 5 manière à obtenir ladite fraction A. 4. Procédé selon la revendication 3, ledit procédé comprenant, entre les étapes b.1) et b.2), l'étape suivante : b.1') éluer les composés autres que ledit au moins un constituant identifié comme 10 mutagène in vitro sur ladite au moins une phase solide de manière à compléter ladite fraction C. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, ledit procédé comprenant, après l'étape de fractionnement b), l'étape suivante : d) effectuer au moins un lavage de ladite au moins une phase solide, de manière à obtenir une fraction D comprenant les composés éventuellement encore adsorbés sur ladite au moins une phase solide après l'étape de fractionnement b). 15 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, ledit procédé comprenant, après l'étape de fractionnement b) et avant l'étape de prélèvement c), l'étape suivante : b') à partir de la fraction A, effectuer au moins un deuxième fractionnement, de préférence par extraction sur au moins une phase solide sélectionnée pour adsorber 20 ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro avec une sélectivité différente de celle de ladite au moins une phase solide mentionnée dans la revendication 2, de manière à : obtenir une fraction A dépourvue de composés autres que ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et 25 compléter la fraction C avec les composés autres que ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro obtenus à l'issue dudit au moins un deuxième fractionnement. 7. Procédé selon la revendication précédente lorsqu'elle dépend de la revendication 5, 30 dans lequel l'étape b') est effectuée à partir d'une fraction regroupant le contenu des fractions A et D. 3059429 87 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la dégradation sélective dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est obtenue, à l'étape c), en plaçant le volume prédéfini de la fraction A dans les 5 conditions expérimentales suivantes : pH compris entre environ 7,0 et environ 7,4 et température comprise entre environ 35°C et environ 40°C, durant un laps de temps compris entre environ 1 heure et environ 3 heures. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant avant l'étape b), 10 l'étape suivante : a') traiter ladite solution d'essai avec un système d'activation métabolique exogène tel qu'un mélange S9 puis appliquer les étapes b) et c), et éventuellement au moins une des étapes b', b.1), b.1'), b.2), de préférence au moins les étapes b.1), b.1'), et b.2), à la solution d'essai ainsi traitée afin d'obtenir 15 les fractions suivantes : - Fraction A', comprenant, ou consistant essentiellement en, ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro - Fraction C', dépourvue dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et 20 - Fraction B', dans laquelle ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a été sélectivement dégradé. 10. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'on applique, après l'étape de fractionnement b), l'étape d) à la solution d'essai ainsi traitée afin d'obtenir 25 la fraction D', comprenant les composés éventuellement encore adsorbés sur ladite au moins une phase solide après l'étape de fractionnement b). 11. Procédé permettant d'imputer une réponse non négative, de préférence une réponse positive, obtenue lors d'un premier test de mutation reverse sur bactéries 30 réalisé en absence d'activation métabolique exogène, à partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, à au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro susceptible d'être présent au sein de ladite préparation, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 3059429 88 mettre en oeuvre le procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai selon l'une des revendications 1 à 8, à partir desdites fractions A, C et B, réaliser un deuxième test de mutation réverse sur bactéries dans les mêmes conditions expérimentales que 5 celles dans lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé, comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit 10 premier test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit deuxième test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C et B. 12. Procédé selon la revendication 11 lorsqu'elle dépend de la revendication 5, ledit 15 procédé comprenant les étapes suivantes : réaliser ledit deuxième test de mutation réverse sur bactéries également sur ladite fraction D, comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et 20 imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit premier test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit deuxième test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C, B et D. 25 13. Procédé permettant d'imputer une réponse non négative, de préférence une réponse positive, obtenue lors d'un premier test de mutation réverse sur bactéries réalisé au moins en présence d'activation métabolique exogène, au moyen d'un système d'activation métabolique exogène tel qu'un mélange S9, à 30 partir d'une préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, à usage humain ou animal, à au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro susceptible d'être présent au sein de ladite préparation, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 3059429 89 1) mettre en oeuvre le procédé de préparation et de fractionnement d'une solution d'essai selon l'une des revendications 1 à 8, 2) traiter ladite fraction C au moyen dudit système d'activation métabolique exogène dans des conditions expérimentales appropriées pour permettre, 5 le cas échéant, la production dudit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro à partir d'au moins un pro-mutagène contenu dans ladite fraction C, 3) mettre en oeuvre au moins un moyen d'analyse adapté pour détecter ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro, et 10 4) dans l'éventualité où ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est détecté dans la fraction C ainsi traitée, 4.1) mettre en oeuvre le procédé selon la revendication 9 ou 10 de manière à obtenir lesdites fractions A', C' et B', et de préférence D', puis réaliser un deuxième test de mutation réverse sur bactéries à 15 partir des fractions A', C' et B', et de préférence D' en absence d'activation métabolique exogène, dans les mêmes conditions expérimentales que celles dans lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé, 4.2) comparer les résultats des premier et deuxième tests de 20 mutation réverse sur bactéries, et 4.3) imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit un test de mutation réverse sur bactéries audit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de 25 préférence positif, pour ladite fraction A' et négatif pour lesdites fractions C', B' et, de préférence, D', ou 5) dans l'éventualité où ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro n'est pas détecté dans la fraction C ainsi traitée, 5.1) mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 30 8 de manière à obtenir lesdites fractions A, C et B, et de préférence D, puis réaliser un deuxième test de mutation réverse sur bactéries à partir desdites fractions A, C et B, et de préférence D, dans les mêmes conditions expérimentales que celles dans lesquelles le premier test de mutation réverse sur bactéries a été réalisé, 3059429 90 5.2) comparer les résultats des premier et deuxième tests de mutation réverse sur bactéries, et 5.3) imputer la réponse non négative, de préférence positive, obtenue audit un test de mutation réverse sur bactéries audit au 5 moins un constituant identifié comme mutagène in vitro lorsque ledit test de mutation réverse sur bactéries est non négatif, de préférence positif, pour ladite fraction A et négatif pour lesdites fractions C, B et, de préférence, D. 10 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle est une préparation à base de plantes, de préférence à base de plantes comprenant, ou suspectée de comprendre, des flavonols, avantageusement comprenant, ou suspectée de comprendre, des aglycones flavoniques. 15 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro a un profil de sécurité établi, garantissant son innocuité in vivo. 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est au moins un aglycone 20 flavonique, avantageusement la quercétine et/ou le kaempférol ; de manière particulièrement préférée ledit au moins un constituant identifié comme mutagène in vitro est la quercétine. 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite préparation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle est sous forme 25 pulvérulente.