FR 3052337 A1 20171215 FR 1655263 A 20160608 1 L'invention concerne le domaine des antifongiques et anti-bactéricides des semences. Après la seconde guerre mondiale et afin de faire face à l'accroissement mondial de la population, l'avènement de la « révolution verte » a été mis en place en faisant appel aux programmes modernes de sélection variétale, à l'irrigation, aux engrais et aux pesticides de synthèse afin de contrôler la fertilité des sols et les organismes pathogènes. Ces différents éléments ont ainsi permis de quasiment tripler la production alimentaire mondiale en l'espace d'une quarantaine d'années. Aujourd'hui, le défi de l'agriculture est de nourrir 9 milliards d'individus à l'horizon 2050 et de continuer à accroître la production par unité de surface tout en tenant compte des ressources de plus en plus limitées et des contraintes croissantes. Par exemple, les pertes potentielles, dues aux stress biotiques et en l'absence de méthodes de protection des cultures, s'élèveraient à plus de la moitié de la production des céréales. Les produits phytosanitaires conventionnels font donc partie intégrante de la protection des cultures dans le monde afin de limiter les pertes. Cependant, ces produits chimiques ont un fort impact négatif sur la santé humaine et l'environnement incitant à utiliser d'autre moyen de lutte contre les maladies infectieuses tels que le bio-contrôle (ensemble des méthodes de protection des végétaux par l'utilisation de mécanisme naturel). L'objet de ce brevet vise à exploiter les algues unicellulaires, issues du phytoplancton, comme source de nouvelles molécules naturelles capables d'agir en tant que « pesticide biologique » en affectant directement la survie des phytopathogènes infectant des cultures d'importances agronomiques majeures, tels que le blé et la vigne. Les fusarioses En Europe, plusieurs maladies sur blé (Triticum aestivum) sont responsables de pertes de rendement ou encore d'une dégradation de la qualité sanitaire des grains. Une des plus importantes est la septoriose (Septoria spp.). La fusariose est associée à un complexe d'espèces regroupant deux genres de champignons phytopathogènes, Fusarium et Microdochium (1). Ces deux genres englobent environ 19 espèces capables d'induire la fusariose de l'épi de blé. Les espèces les plus fréquentes en Europe sont F. graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. poae, M. nivale et M. majus. Le genre Fusarium appartient à la division des Ascomycètes et à la famille des Nectriacées. Le genre Microdochium appartient à la famille des Tuberculariacées et regroupe deux espèces, M. nivale et M. malus , provoquant les mêmes symptômes sur épi et sur feuilles que les Fusaria. Plusieurs espèces de fusarium, dont Fusarium graminearum est le plus représenté, peuvent se retrouver ensemble à l'échelle de la région, de la parcelle ou sur un même épi formant ainsi le complexe fusarien. La sévérité, l'incidence et la prévalence de chaque espèce varient selon la localisation géographique, les 3052337 2 variations climatiques ainsi que les pratiques culturales. La présence sur un même épi de plusieurs de ces espèces est susceptible de modifier leur équilibre et leur dynamique de production de toxines. La fusariose du blé peut dévaster une culture quelques semaines avant la récolte. Elle peut être associée à la fois à de fortes pertes de rendement (avortement et faible poids des grains), une 5 réduction de leur qualité germinative ou encore une diminution de leur qualité par la présence de toxines dans les grains. En effet, les champignons du genre Fusarium, mais pas du genre Michrodochium, sont capables de produire des métabolites secondaires toxiques, les mycotoxines, dont la présence augmente l'incidence de la maladie sur les productions agricoles et constitue un problème majeur économique et de santé publique. Les principaux moyens de lutte contre la 10 fusariose regroupent les pratiques culturales, la résistance variétale et la lutte chimique. A l'heure actuelle, peu de variétés de blé sont résistantes à la fusariose. Cependant, il existe des variétés tolérantes possédant des niveaux de résistance partiels limitant les pertes de rendement et l'accumulation des toxines dans les récoltes. Une fois la culture installée, le recours à la lutte chimique est possible mais d'une efficacité limitée. La diversité des agents pathogènes ainsi que leur 15 sensibilité différente aux matières actives complexifient cette lutte. Par exemple, les champignons du genre Fusarium sont sensibles aux triazoles alors que les champignons du genre Microdochium sont sensibles aux strobilurines. Les septorioses La septoriose est une maladie du blé responsable d'importantes pertes de rendement et qui 20 provoque le plus de pertes économiques dans le monde, notamment dans les régions tempérées humides. Deux principales formes de septorioses peuvent être distinguées : La septoriose des épis (Phaeosphaeria nodorum) et la septoriose foliaire (Mycosphaerella graminicola). En France, la septoriose des épis est surtout présente dans les zones continentales alors que celle des feuilles l'est principalement dans le nord-ouest et sur les bordures maritimes où le champignon trouve des 25 conditions climatiques favorables à son développement. Les symptômes provoqués par M. graminicola apparaissent successivement sous forme de chloroses, taches de couleur vert clair, avant d'évoluer en taches brunâtres appelées nécroses. Ces nécroses finissent par se fondre les unes dans les autres (coalescence). Ensuite, apparaissent sur ces nécroses les pycnides, fructifications noires à peine visibles à l'oeil nu. La nuisibilité de la septoriose en termes de pertes de 30 photosynthèse, croissance ou rendement a été étudiée par plusieurs équipes de recherche. Une nuisibilité qualitative exprimant l'impact de la maladie sur la teneur en protéines des grains récoltés peut ainsi être établie. 3052337 3 M. graminicola est un champignon hémibiotrophe établissant une première phase biotrophe où l'infection se déroule sur des tissus vivants puis survient la phase nécrotrophe pendant laquelle le champignon exprime des toxines produisant la mort des tissus colonisés. En fonction des conditions environnementales, la reproduction de M. graminicola est de nature sexuée (production 5 d'ascospores) ou asexuée (production de pycnidiospores). Les ascospores, disséminées par le vent sur de longues distances participent notamment à la survie du champignon en l'absence de plante hôte et est considéré comme la source principale d'inoculum primaire pour initier la maladie. Les pycnidiospores, quant à eux, sont en majorité produites durant la phase épidémique de la maladie au cours de plusieurs cycles infectieux successifs. Ces spores sont dispersées sur de courtes distances 10 par l'action de l'éclaboussement des gouttes de pluie. La baisse des rendements potentiels est d'autant plus importante que les dernières feuilles sous l'épi impliquées dans le remplissage des grains sont sévèrement touchées par la maladie. Les pertes de rendement imputable à la septoriose ont été évaluées à 1-2 tha-1 en moyenne, avec des cas allant jusqu'à 3-3,5 tha-1, ce qui représente une diminution de 40 % des rendements. 15 Les méthodes de lutte pour contrôler M. graminicola sont basées sur l'utilisation de fongicide et de cultivars résistants. Cependant, ces dernières années ont vu une perte important de l'efficacité des fongicides due à une forte sélection des agents pathogènes avec, par exemple, une résistance à la famille des strobilurines ainsi qu'une perte récente de l'efficacité des triazoles en champ. Les maladies de la vigne 20 De nos jours , la vigne est cultivée dans le monde entier jouant un rôle central dans l'économie de nombreux pays. Elle est consommée en raisin de table et en jus, mais son exploitation principale repose sur l'industrie du vin. L'Union Européenne est le plus grand producteur de vin au monde et le plus grand exportateur mondial de produits viti - vinicoles. Le secteur rapporte ainsi à l'économie de l'Union Européenne environ 15 milliards d'euros par an 25 (www. ceev.be). En 2010, le vignoble français couvrait près de 865 000 ha, soit près de 3% des terres arables et permet à la France d'être le premier producteur mondial de vin avec 51,1 millions d'hectolitres. La vigne doit faire face à de nombreuses attaques d'agents pathogènes dont les maladies cryptogamiques. Celles-ci sont appelées « maladie du bois » lorsqu'elles touchent les parties lignifiées de la plante, c'est le cas notamment de l'esca, du black dead arm ou de l'eutypiose. 30 Les champignons qui infectent les baies et les parties herbacées de la vigne (feuilles, tiges...) induisent les maladies «cryptogamiques du feuillage» dont font partie la pourriture grise, le black rot, le mildiou et l'oïdium. L'esca 3052337 4 Si le mildiou, l'oïdium et la pourriture grise représentent les trois principales maladies cryptogamiques affectant les vignobles à travers le monde, les maladies du bois causées par des agents fongiques deviennent des facteurs limitant de la production de raisins. Les viticulteurs sont actuellement confrontés à deux problèmes majeurs concernant ces maladies du bois: l'absence de 5 méthodes de lutte et une méconnaissance profonde des différents facteurs biotiques et abiotiques. Les espèces de champignon les plus répandues à travers le monde pour la maladie de l'esca sont les ascomycètes Diplodia seriata, Diplodia mutila, Neofusicoccum parvum et Neofusicoccum luteum. En France, les espèces les plus isolées sont Diplodia seriata et Botryosphaeria dothidea. De nombreux autres champignons dont certains pathogènes sont fréquemment isolés des nécroses du 10 bois de plantes atteintes d'esca. C'est le cas d'Eutypa Iota, agent responsable de l'Eutypiose. Cette maladie se présente sous deux formes : la forme lente et la forme apoplectique. Les symptômes foliaires sont caractéristiques de la forme lente même s'ils peuvent être présents chez la forme apoplectique. La forme lente se caractérise par des colorations foliaires spécifiques : tâches internervaires jaunâtres sur cépages blancs et bordées de rouges sur cépages noirs, les nervures 15 restant vertes. Ces tâches évoluent progressivement vers un brunissement et un dessèchement. Les symptômes foliaires de la forme lente peuvent être visibles une année sur un cep et disparaître l'année suivante. La forme apoplectique est caractérisée par un dessèchement rapide des organes aériens, rameaux, feuilles et grappes d'une partie ou de la totalité du cep de vigne. Ce symptôme se manifeste généralement lorsque les étés sont chauds, entrainant la mort des ceps en quelques jours 20 seulement sans symptômes annonciateurs. La variété des sources d'inoculum et le développement très lent et non visible des champignons dans le bois de vigne rendent très compliquée la mise en oeuvre des méthodes de lutte. De plus, l'évolution de la réglementation des produits phytosanitaires à l'échelle européenne a conduit à l'interdiction de produits chimiques à base d'arsénite de sodium à cause des effets cancérogènes sur l'homme et de la forte toxicité de ces produits sur 25 l'environnement. De nombreuses recherches sont menées à travers le monde pour tester de nouvelles molécules utilisables en pépinière ou au vignoble. La pourriture grise La pourriture grise est une maladie cryptogamique causée par un champignon ascomycète appelé Botrytis cinerea. Il appartient à la classe des Leotiomycetes, à l'ordre des Helotiales et la 30 famille des Sclerotiniaceae. B. cinerea est un champignon nécrotrophe capable de coloniser les tissus végétaux sains, déjà infectés, ainsi que les tissus morts (saprophytisme). Sur feuille, les symptômes apparaissent sous forme de tâches brunes avec un feutrage grisâtre sur la face inférieure (fructifications du champignon) qui ont tendance à s'accroître et à envahir tout le limbe. Les grappes 3052337 5 peuvent être touchées avant la floraison et se dessécher. Elles sont surtout sensibles au stade de la véraison où il y a développement d'une coloration brune des baies des cépages blancs et l'apparition d'un épais feutrage gris. Les conidies sont disséminées par le vent et pénètrent dans les organes herbacés de façon directe ou par le biais de blessures. C'est pourquoi l'éclatement des baies dû au 5 mildiou favorise les infections par B. cinerea. Cette maladie entraîne non seulement des pertes de rendement pouvant aller jusqu'à 40% (Viniflhor, données 2006) mais elle altère également les qualités organoleptiques des vins. Néanmoins, Botrytis cinerea est également responsable de la « pourriture noble » nécessaire à l'obtention de certains vins liquoreux. Le mildiou 10 Les deux maladies qui touchent le plus sévèrement les vignobles à l'heure actuelle sont le mildiou et l'oïdium. L'agent responsable du mildiou, l'oomycète Plasmospora viticola appartenant à l'ordre péronosporale, est un parasite obligatoire ; pour le maintenir en vie et le multiplier, il est obligatoire de le propager sur des feuilles de vigne en survie. P. viticola s'attaque à tous les tissus herbacés de la vigne ainsi qu'aux grappes. Il provoque des défoliations, le brunissement et 15 l'assèchement des baies et des tiges. En l'absence de traitement et dans des conditions climatiques favorables, le mildiou de la vigne peut dévaster jusqu'à 75% de la récolte de la saison. Le cycle de vie de P. viticola comprend une phase sexuée et une phase asexuée. La phase asexuée conduit à la production de spores nécessaires aux infections secondaires et à la dispersion de l'agent pathogène sur une courte distance, tandis que la phase sexuée produit des oospores 20 quiescentes et résistantes au froid permettant le passage de l'hiver et les infections primaires. La première preuve macroscopique de la présence de mildiou dans un vignoble est l'apparition de tâches jaune pâle et irrégulières (tâches d'huile) grossissant sur la face supérieure ou adaxiale, des feuilles. A mesure que la colonisation interne du mycélium avance, le développement de coussins blancs cotonneux sur la face inférieure en correspondance avec les tâches d'huile devient plus 25 important. Dans les infections avancées ces symptômes sont accompagnés de tissus morts bruns. La lutte contre le mildiou s'organise principalement par des mesures préventives par des pulvérisations de fongicides. S'il est possible de stopper une attaque, les dégâts, une fois occasionnés sur les inflorescences et les grappes, sont irrémédiables. L'oïdium 30 L'oïdium de la vigne (Erysiphe necator) est un ascomycète biotrophe obligatoire appartenant à l'ordre des Erysiphales. Le champignon colonise la surface de tous les organes verts de la vigne, notamment la face supérieure des feuilles, et se propage sur les baies. Une phase sexuée qui est caractérisée par la production de cléistothèces contenant des ascospores peut alterner avec une 3052337 6 phase asexuée conduisant à la formation de conidiophores portant des conidies. Durant la phase hivernale de repos de la vigne, le champignon survit sous forme d'hyphes dans les bourgeons dormants ou de cléistothèces à la surface de la plante. Les spores contenues dans les cléistothèces seront libérées au printemps pour germer à la surface des bourgeons et des jeunes feuilles. Un 5 hyphe primaire se développe ensuite sur la surface de la feuille, puis un réseau mycélien de plus en plus complexe et ramifié tapisse la surface foliaire. Par la suite, des conidiophores se différencient à partir du mycélium constituant le début de l'étape de sporulation et coloniseront d'autres tissus verts de la plante donnant lieu aux infections secondaires. La présence du mycélium et des conidiophores portant les conidies à la surface des tissus 10 infectés de l'hôte donne une apparence poudreuse de couleur blanche grisâtre. Le feutrage blanc se développe sur les boutons floraux qui se dessèchent. Seules les jeunes baies ayant un taux de sucre REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait cellulaire d'une ou plusieurs micro-algues du genre Amphidinium pour son activité fongicide et/ou bactéricide sur les champignons, les oomycètes et/ou bactéries pathogènes des plantes et semences de culture. 2. Utilisation selon la revendication 1 d'un extrait cellulaire d'une ou plusieurs micro-algues du genre Amphidinium pour son activité fongicide sur les champignons et/ou les oomycètes pathogènes des plantes et semences de culture par inhibition de la germination des spores. 3. Utilisation selon la revendication 1 d'un extrait cellulaire d'une ou plusieurs micro-algues du genre Amphidinium pour son activité fongicide sur les champignons et/ou les oomycètes pathogènes des plantes et semences de culture par inhibition de la croissance du champignon et/ou des oomycètes. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle la ou l'une des micro-algues du genre Amphidinium est Amphidinium carterae. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle lesdits 20 champignons pathogènes des plantes et semences de culture sont des champignons pathogènes des plantes et semences de culture des genres Fusarium, Colletotrichum, Mycosphaerella, Phytophthora et Alternaria, de préférence les couples champignons vs. plantes de culture Triticum sativum/Mycosphaerella graminicola - Triticum sativum/Fusarium graminearum - Solanum tuberosum/Phytophtora infestons - Vinis vitifera/Plasmospora viticola - Vinis vitifera/Erysiphe 25 necator- Lycopersicon esculentum/Phytophtora infestons. 6. Utilisation selon la revendication 5 dans laquelle lesdits champignons pathogènes des plantes et semences de culture des genres Fusarium, Colletotrichum, Mycosphaerella, Phytophthora et Alternaria sont choisis dans le groupe constitué de Fusarium oxysporum, Fusarium solani, 30 Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium poae, Fusarium proliferatum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium tricinctum, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum coffeanum, Colletotrichum gloeosporioides, Mycosphaerella graminicola, Phytophthora infestons, Alternaria solani et Alternaria brassisicola. 15 3052337 48 7. Procédé de préparation d'un extrait cellulaire d'une ou plusieurs micro-algue(s) du genre Amphidinium caractérisé par les étapes suivantes : Lyophilisation ou congélation d'un culot cellulaire d'une ou plusieurs micro-algue(s) du genre 5 Amphidinium Resuspendre ledit lyophilisat ou ladite biomasse congelée dans un solvant aqueux ou organique à une température supérieure à 60°C dans un rapport en poids de 1:100 à 1:50 Ramener rapidement la température proche de la température ambiante. Eventuellement lyophilisation de l'extrait obtenu 10 8. Extrait cellulaire ou lyophilisat de cellules d'Amphidinium susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 7. 9. Procédé de préparation d'un lyophilisat de cellules d'une ou plusieurs micro-algue(s) du genre Amphidinium caractérisé par les étapes suivantes : Culture cellulaire dans des conditions de température, photopériode et salinité adaptées à la souche concernée jusqu'à une concentration cellulaire comprise entre 5.104 cellules/ml et 5.106 cellules/ml, Lyophilisation. 10.Lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 9. 11. Procédé de lutte contre les champignons, les oomycètes et/ou les bactéries pathogènes des plantes et semences de culture comprenant l'application sur les plantes de culture et/ou l'enrobage desdites semences d'un extrait cellulaire d'une ou plusieurs micro-algues du genre Amphidinium ou d'un extrait selon la revendication 8. 12. Procédé de lutte contre les champignons, les oomycètes et/ou les bactéries pathogènes des plantes et semences de culture comprenant les étapes suivantes : Resuspendre un lyophilisat de cellules d'une ou plusieurs micro-algue(s) du genre Amphidinium ou un lyophilisat selon la revendication 8 ou 10 dans de l'eau ou dans un solvant organique ou inorganique à une température supérieure à 60°C dans un rapport en poids de 1 :100 à 1 :50, 3052337 49 Mélanger avec de l'eau ou dans un solvant organique ou inorganique dans une proportion de 1 :2 à 1 :50 pour ramener rapidement la température proche de la température ambiante, Appliquer ce mélange sur les plantes de culture et/ou enrober lesdites semences de ce mélange. 5