FR 3051196 A1 20171117 FR 1654332 A 20160513 La présente invention concerne un système rétroviral de transfert d'ARN non viraux dans des cellules cibles et plus particulièrement une particule rétrovirale capable de délivrer de multiples ARN. L'invention concerne également des compositions comportant ces particules rétrovirales, des kits de production de celles-ci, les procédés de fabrication afférents ainsi que les utilisations des particules et des compositions. Introduire des ARN multiples dans une cellule cible est un enjeu majeur en recherche et développement comme en thérapie génique. L'utilisation de vecteurs dérivés de virus est devenue une méthode cruciale de transfert de gènes. Les vecteurs viraux se répartissent aujourd'hui en deux catégories principales: - les vecteurs intégratifs, qui s'intègrent dans le génome receveur, et - les vecteurs non-intégratifs, qui forment habituellement un élément génétique extra-chromosomique. Les vecteurs intégratifs tels que les vecteurs gamma-rétroviraux (RV) et vecteurs lentiviraux (LV) sont intégrés de façon stable. Les vecteurs non-intégratifs, tels que les vecteurs adénoviraux (ADV) et les vecteurs adénoassociés (AAV) sont rapidement éliminés des cellules qui se divisent rapidement. Certains facteurs influençant le choix d'un vecteur particulier, comprennent sa capacité d'encapsidation, sa gamme de cellules cibles ou hôtes, son profil d'expression génique, son efficacité de transduction et sa capacité à induire une réponse immunitaire, ce qui est particulièrement problématique si des transductions répétées sont nécessaires. Certaines applications nécessitent l'utilisation de vecteurs non-25 intégratifs comme en thérapie génique ou dans de nombreuses applications in vitro, ex vivo et in vivo. A titre d'exemples, on peut citer : - l'induction de la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules pluripotentes, ainsi que l'induction de la différentiation de cellules souches ou pluripotentes en cellules spécialisées, 30 - l'expression d'antigènes ou de protéines (toxiques ou non) simultanément dans une cellule cible, 3051196 2 - l'expression de systèmes d'ingénierie du génome comme par exemple la protéine CRE, les systèmes TALEN, Zn Finger Nuclease ou CRISPR, ou de toute autre système nécessitant une expression de protéine ou d'ARN. 5 Un moyen d'introduire des ARN dans une cellule cible met en oeuvre des vecteurs viraux basé sur des virus appartenant à la famille des Retroviridae (également désignée sous l'appellation famille des Rétrovirus ou virus à ARN). En effet, durant son cycle de réplication, un virus de la famille des Retroviridae possède la capacité de convertir son génome, constitué 10 d'ARN, en ADN double brin qui sera intégré dans le génome de la cellule cible. Des exemples particuliers de cette famille de Rétrovirus sont les gamma-rétrovirus et les lentivirus. Le cycle réplicatif d'un rétrovirus comporte une première phase de reconnaissance de la cellule cible (ou hôte) via la fixation à un récepteur 15 membranaire. Cette phase de reconnaissance aboutit, après fusion membranaire, à l'entrée du rétrovirus dans la cellule hôte. L'ARN rétroviral est alors copié en ADN double brin par la transcriptase inverse, codée par le rétrovirus, puis intégré au génome de la cellule hôte. Ce génome viral est alors transcrit par la cellule hôte comme tous les autres gènes de la cellule. Ce 20 génome code l'ensemble des protéines et des séquences permettant la fabrication d'autres virus. Plus particulièrement, trois gènes sont communs à l'ensemble des rétrovirus : gag, pol et env. Gag est un gène codant pour une polyprotéine, les protéines issues de cette polyprotéine par clivage, étant des protéines de structure impliquées dans l'assemblage des virus lors de la réplication. Ces protéines de structure sont plus spécifiquement la protéine de matrice (MA), la protéine de capside (CA) et la protéine de nucléocapside (NC). Pol est un gène codant pour les enzymes intégrase, transcriptase inverse et protéase. Env est un gène codant pour des glycoprotéines d'enveloppe. 3051196 3 Ces trois gènes permettent donc de copier l'ARN rétroviral en ADN double brin, d'intégrer cet ADN au génome de la cellule hôte puis de générer la structure des rétrovirus néo-synthétisés : protéines d'enveloppe, de capside et de nucléocapside. Toutefois, afin que les rétrovirus néo-synthétisés soient 5 complets, il est nécessaire d'encapsider dans chacune de ces structures deux copies de l'ARN rétroviral. Cette encapsidation de deux copies de l'ARN rétroviral dans la structure s'effectue par la reconnaissance par la protéine de nucléocapside, d'une séquence d'encapsidation appelée Psi (pour « Packaging Signal ») portée par la copie de l'ARN rétroviral. 10 Lorsqu'un vecteur viral dérivé d'un rétrovirus est utilisé à des fins de thérapie génique, au moins une partie des régions codantes de gag, pol et/ou env est dissociée entre le système d'encapsidation et le système d'expression de la séquence d'intérêt. Les séquences codantes gag et pol, par exemple, sont portées par le plasmide d'encapsidation apportant en trans les protéines 15 nécessaires à la production de vecteurs viraux. La séquence d'encapsidation comme la séquence d'intérêt sont portée par des systèmes indépendants, afin de rendre le rétrovirus non réplicatif. Toutefois, dans certains cas, l'intégration de la séquence d'ARN d'intérêt dans le génome de la cellule hôte de façon aléatoire peut interrompre 20 une phase ouverte de lecture et bloquer l'expression de gènes importants. De plus, pour certaines applications, telles que la reprogrammation de cellules ou la différentiation de cellules souches, il est recommandé que l'expression transitoire d'une séquence d'intérêt soit réalisée de manière transitoire. La demande W02007/072056 décrit un système de vectorisation viral 25 comprenant env, gag, optionnellement gag/pol ainsi qu'une séquence d'ARN contenant un signal d'encapsidation hétérologue qui est reconnu par un domaine de liaison à ARN correspondant associé à gag ou à gag/pol. Ce système est décrit dans la demande comme étant non intégratif et permettant une expression transitoire. 30 Toutefois, l'efficacité de tels systèmes reste limitée. En particulier, pour qu'une cellule cible exprime un ARN d'intérêt véhiculé par ces systèmes, il est 3051196 4 généralement nécessaire d'introduire dans la cellule plusieurs copies de cet ARN d'intérêt et par conséquent, d'utiliser de fortes multiplicités d'infection (« multiplicity of infection » ou MOI). La MOI correspond au ratio du nombre de systèmes de vectorisation introduit sur le nombre de cellules à infecter. Une 5 forte MOI permet en effet d'introduire dans les cellules plusieurs copies de l'ARN d'intérêt en permettant qu'une même cellule subisse plusieurs infections. Or, si elle permet d'améliorer le niveau d'expression de l'ARN d'intérêt véhiculé, l'utilisation de fortes MOI, du fait des multiples infections subies par la cellule, engendre également une certaine toxicité. 10 Comme mentionné précédemment, ce type de système présente également un intérêt pour l'ingénierie du génome, et notamment pour des applications en thérapie génique. A l'heure actuelle, l'introduction de systèmes d'ingénierie du génome dans des cellules cibles, reste complexe et constitue un enjeu majeur pour la 15 mise en oeuvre avec succès des systèmes d'ingénierie du génome mentionnés ci-avant. En effet, pour qu'un système d'ingénierie du génome puisse fonctionner, il convient d'introduire a minima dans la cellule cible une enzyme capable de cliver l'ADN ou nucléase. Les applications en thérapie génique requièrent, en 20 outre, une spécificité de la coupure à l'ADN afin de cibler précisément un gène donné, sans générer de coupure non souhaitée. Aussi, pour l'utilisation des systèmes TALEN, ZnFinger et CRISPR, il est généralement nécessaire d'introduire un élément de reconnaissance à l'ADN. Par conséquent, de tels systèmes nécessitent l'introduction dans les cellules transduites d'au moins 25 une nucléase, et préférentiellement de deux éléments constitutifs du système d'ingénierie concerné. En outre, ces système d'ingénierie du génome doivent tenir compte de paramètres tels que la durée et l'intensité de l'expression du matériel génétique introduit dans la cellule cible, pour permettre une efficacité 30 satisfaisante du système sans induire de toxicité. Les méthodes existantes à l'heure actuelle de délivrance de ces systèmes 3051196 5 d'ingénierie du génome sont principalement : - la transfection d'ADN, - l'électroporation d'ARN, et - l'utilisation de vecteurs viraux. 5 Toutefois, chacune de ces méthodes présentent de sérieux inconvénients. En effet, la transfection d'ADN est un procédé qui a une très faible efficacité sur des cellules primaires ou sensibles, du fait d'une toxicité élevée liée au transfert d'ADN, à la présence de séquences bactériennes dans les 10 plasmides et/ou de l'intégration aléatoire des plasmides dans le génome des cellules transfectées. L'électroporation d'ARN messager quant à elle est une méthode utilisée préférentiellement ex vivo, dans des cellules primaires ou sensibles, qui ne permet pas non plus d'obtenir de bons résultats en termes d'efficacité à cause 15 d'une toxicité élevée résultant de la déstabilisation des membranes des cellules cibles. L'utilisation de vecteurs viraux semble être la méthode la plus prometteuse pour augmenter l'efficacité de la délivrance, tout en minimisant la cytotoxicité. Toutefois, les vecteurs lentiviraux sont des outils efficaces, mais ils 20 s'intègrent dans le génome des cellules cibles pour une expression stable du transgène qui peut conduire à des réactions incontrôlées. En outre, les vecteurs lentiviraux déficients pour l'intégration (IDLV) peuvent être utilisés afin de limiter la durée d'expression de la nucléase, néanmoins ils ne garantissent pas l'absence totale d'intégration dans le génome des cellules cibles. 25 L'autre alternative est l'utilisation de systèmes adénoviraux d'AAV pour des applications in vivo, mais ce type d'outil implique l'utilisation d'une nucléase de taille réduite à cause d'une capacité d'encapsidation des systèmes adénoviraux limitée à une taille inférieure à 4,8kb, incompatibles avec les systèmes CRISPR ou TALEN (Chen, 2015). 30 Il existe donc toujours un besoin pour des systèmes de vectorisation viraux plus efficaces et moins toxiques. 3051196 6 Le travail des inventeurs a permis de réaliser un système de vectorisation capable de délivrer plusieurs ARN d'intérêt dans une même cellule en une seule infection. La présente invention se rapporte donc à une particule rétrovirale 5 comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la 10 protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins desdites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase. La particule rétrovirale selon l'invention permet d'introduire au moins deux ARN non viraux, préférentiellement 3, dans une cellule par une seule 15 infection. L'introduction de telles particules dans les cellules peut être effectuée par un procédé in vivo, in vitro ou ex vivo. Par « protéine issue de la polyprotéine Gag », on entend toute protéine résultant du clivage de la polyprotéine Gag. Plus particulièrement, il s'agit d'une protéine de nucléocapside, d'une protéine de matrice (par exemple, dans 20 des particules rétrovirales dérivées du virus murins de type MoMuLV) ou de la protéine p12, spécifique aux gammaretrovirus. Par « protéine d'enveloppe », on entend toute protéine d'enveloppe, y compris une protéine d'enveloppe de pseudotypage. A titre d'exemple, on peut citer la protéine d'enveloppe Ampho, la protéine d'enveloppe écotrope, la 25 protéine d'enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de l'Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome murin d'Harvey (HaMuSV), la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la protéine d'enveloppe du 30 virus de la rougeole (aussi MV pour measles virus), la protéine d'enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon (GaIV), la protéine du virus endogène félin 3051196 7 (RD114) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG). Plus particulièrement, la protéine d'enveloppe est la protéine d'enveloppe Ampho, la protéine d'enveloppe écotrope, la protéine d'enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de 5 l'Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome murin d'Harvey (HaMuSV), la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la protéine d'enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour measles virus), la protéine d'enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon 10 (GaIV) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). La protéine d'enveloppe peut ainsi être modifiée pour cibler certains types cellulaires ou certaines applications (utilisation de récepteurs de surface comme protéine d'enveloppe). Il est également possible de modifier la protéine d'enveloppe avec un 15 anticorps, un glycolipide et/ou un ligand particulier afin de cibler un récepteur et/ou un type cellulaire particulier. Préférentiellement, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G. Par « intégrase », on entend la protéine enzymatique codée par le gène pol, qui permet l'intégration de l'ADN rétroviral dans l'ADN de la cellule infectée 20 par le rétrovirus lors de la réplication dudit rétrovirus. Par « séquence d'encapsidation », on désigne un motif (séquence et structure tridimensionnelle) ARN reconnu spécifiquement par un domaine de liaison. Préférentiellement, la séquence d'encapsidation est un motif tige-boucle. Plus préférentiellement encore, la séquence d'encapsidation de la 25 particule rétrovirale est le motif tige-boucle de l'ARN du bactériophage MS2 ou du phage PP7 tel que par exemple, celui résultant de la séquence ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) ou (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°2) respectivement. Le motif tige-boucle et plus particulièrement le motif tige-boucle de l'ARN du 30 bactériophage MS2 ou celui de l'ARN du phage PP7, peut être utilisé seul ou répété plusieurs fois, de préférence de 2 à 25 fois, plus préférentiellement de 2 3 0 5 1 1 9 6 8 à 18 fois, par exemple de 6 à 18 fois. Par « domaine de liaison », on désigne tout ou partie d'une protéine se liant spécifiquement à la séquence d'encapsidation liée à la séquence d'ARN d'intérêt. Plus particulièrement, il s'agit d'une protéine mutante ou non, définie 5 par une structure tridimensionnelle, se liant spécifiquement à la séquence d'encapsidation. Préférentiellement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage Qr3, la protéine nun du prophage HK022, la protéine U1A ou encore la protéine hPum. 10 Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7. Plus préférentiellement encore, lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7, la séquence de celle-ci est déficiente pour l'auto- assemblage, grâce à une délétion des acides aminés 67 à 75 (PCPAFG) 15 (Chao et al. 2008). Préférentiellement, la séquence de la protéine Coat du phage PP7 est codon-optimisée pour les cellules humaines, c'est-à-dire que les bases de l'ADN sont choisies pour coder pour des acides aminés préférentiellement présents dans l'espèce humaine. Par « chaque séquence », on entend que les séquences 20 d'encapsidation peuvent être identiques ou différentes, selon que ces séquences d'encapsidation sont reconnues par un domaine de liaison identique ou différent. En effet, la particule rétrovirale selon l'invention peut comporter un ou plusieurs domaines de liaison. Lorsque plusieurs domaines de liaison sont introduits, ceux-ci peuvent l'être dans la polyprotéine Gag et/ou 25 dans l'intégrase. Le domaine de liaison permet non seulement la reconnaissance de la séquence d'encapsidation mais également l'encapsidation des ARN portant la séquence d'encapsidation dans la particule (ou dans le cas présent, d'un ARN non viral lié à une séquence d'encapsidation). 30 Par « encapsidation », on entend l'empaquetage d'un ARN dans la capside virale d'une particule virale. On notera que dans la présente invention, 3051196 9 l'encapsidation des ARN non viraux s'effectue par la reconnaissance d'un signal d'encapsidation non viral, en particulier autre que Psi. Par « séquence d'intérêt », on vise une séquence codant pour une fonction présentant un intérêt pour l'utilisateur. Plus particulièrement, la 5 séquence d'intérêt portée par chacun des deux ARN non viraux encapsidés peut être identique ou différente. A l'aide des particules selon l'invention, il est possible de transférer dans des cellules cibles des ARN non viraux identiques ou différents. Les ARN encapsidés étant non viraux, ces ARN ne présentent pas les 10 sites de reconnaissance des protéines codées par le gène pol. En effet, ces ARN non viraux n'entrent pas dans les étapes précoces du cycle réplicatif des rétrovirus, à savoir : - La copie de l'ARN viral simple brin en ADN double brin par la transcriptase inverse ; 15 - La maturation de l'ADN viral double brin par reconnaissance des extrémités LTR par l'intégrase et maturation du complexe de pré-intégration cytoplasmique en complexe de pré-intégration nucléaire. Ces protéines virales (transcriptase inverse, intégrase), codées par le gène pol sont donc optionnelles dans la particule et le gène pol peut donc être 20 soit présent, soit délété partiellement ou totalement. Préférentiellement, le gène pol est soit présent, soit délété partiellement. On notera que les particules rétrovirales selon l'invention comportent un matériel génétique à la fois viral et non viral : - le gène gag, qui peut être viral ou chimérique. Plus particulièrement, 25 le gène gag est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans celui-ci. - Optionnellement, le gène pol, qui peut être viral ou chimérique. Le gène pol codant pour plusieurs enzymes, les séquences afférentes à ces enzymes peuvent être délétées totalement ou partiellement, 30 présentes et non fonctionnelles, ou présentes et fonctionnelles. Plus particulièrement, le gène pol est chimérique lorsque le ou les 3051196 10 domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans l'intégrase. - Au moins deux ARN non viraux, chaque ARN non viral étant porteur d'une séquence d'intérêt et d'une séquence d'encapsidation. Plus particulièrement, ces ARN non viraux sont dépourvus de toute 5 séquence virale. Plus spécifiquement, les particules rétrovirales selon l'invention permettent d'introduire dans des cellules cibles des ARN capables d'induire - Le transfert d'une ou plusieurs séquences d'intérêt codantes endogènes ou exogènes de la cellule cible, 10 - Le transfert d'un ou plusieurs ARN non codants comme des ARN capables d'induire un effet sur l'expression génétique, par exemple par le biais de shRNA, miRNA, sgRNA, LncRNA ou circRNA. - Le transfert d'ARN cellulaires, de type ARN messagers ou autres (miRNA...), des réplicons sous génomique de virus à ARN (VHC, etc...) 15 ou de génomes complets de virus à ARN, - l'expression simultanée de séquences codantes ou non codantes endogènes, exogènes de la cellule cible, - participer à la modification du génome de la cellule cible par des systèmes d'ingénierie du génome, par exemple le système CRISPR. 20 Par « nucléase », on entend une enzyme ayant la capacité de cliver un ou deux brins d'ADN, une nucléase ayant la capacité d'initier le clivage d'une liaison phosphodiester des acides nucléiques de deux nucléotides. Avantageusement, la nucléase est une endonucléase, c'est-à-dire qu'elle coupe le brin d'ADN à l'intérieur de celui-ci. 25 La nucléase peut par ailleurs générer des extrémités cohésives ou des extrémités non cohésives. Elle génère avantageusement des extrémités cohésives. La nucléase peut être sous sa forme native (WT), sous une forme mutée, sous une forme optimisée, sous une forme tronquée ou une forme 30 invalidée. Il est en effet possible de muter la nucléase native pour invalider ses capacités de clivage de la liaison phosphodiester des acides nucléiques. 3 0 5 1 1 9 6 11 L'une au moins des séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase, c'est-à-dire que cette séquence d'ARN peut comprendre uniquement une séquence d'ARN codant pour une nucléase ou alternativement une séquence d'ARN codant pour une 5 nucléase et une ou plusieurs autre(s) séquence(s) d'ARN, ces autres séquences d'ARN pouvant par exemple coder pour au moins une protéine, identique ou différente, ou une séquence d'ARN non codante. Plus particulièrement, la nucléase est choisie parmi le groupe constitué par les nucléases associées au système CRISPR, la nucléase du système 10 TALEN, la nucléase du système Zn Finger et la nucléase Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo). Le système d'ingénierie du génome CRISPR/Cas9 est devenu un outil de génie génétique à fort potentiel. Il fait intervenir deux types de composants : - Les CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic 15 Repeats) caractérisées par des séries de répétitions directes courtes (de 21 à 37 paires de bases) et régulièrement espacées par des séquences appelées « spacer », généralement uniques, de 20 à 40 paires de bases ; - Une des nucléases associées au système CRISPR, préférentiellement la nucléase Cas9 (CRISPR associated protein 9), c'est-à-dire une enzyme 20 spécialisée pour couper l'ADN avec deux zones de coupe actives, une pour chaque brin de la double hélice. Par exemple, S. pyogenes utilise l'outil Cas9 pour détecter et défaire l'ADN étranger, tels que l'invasion de l'ADN de bactériophages ou d'un ADN plasmidique. Cas9 effectue cette détection par déroulement de l'ADN étranger et la vérification de complémentarité avec la 25 région longue d'espacement d'une vingtaine de paires de base de l'ARN guide. Si une séquence d'ADN est apparentée à l'ARN guide, Cas9 découpe l'ADN invasif. Ce système est utilisé pour modifier facilement et rapidement le génome des cellules animales et végétales. Grâce à la spécificité de la cible de Cas9 30 qui provient de l'ARN guide et de la complémentarité de l'ADN et non pas des modifications de la protéine elle-même (comme TALEN et les nucléases à doigt 3051196 12 de zinc), l'outil Cas9 peut cibler un nouvel ADN très facilement. Le système d'ingénierie du génome TALEN utilise une nucléase artificielle générée par la fusion d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé TALE, avec un domaine ayant la capacité de cliver l'ADN, appelée TALENs. La 5 relation simple entre la séquence en acides-aminés et la séquence d'ADN reconnue par le domaine de liaison à l'ADN permet de synthétiser des protéines personnalisées. Ces systèmes peuvent être conçus pour se fixer à quasiment n'importe quelle séquence spécifique d'ADN cible en combinant un domaine de reconnaissance de l'ADN cible TALE avec un domaine de clivage 10 de l'ADN. Les TAL effector (TALE) sont des protéines naturellement sécrétées par la bactérie Xanthomonas comprenant un domaine de liaison à l'ADN constitué de répétitions de 33 ou 34 acides-aminés identiques à l'exception des acides aminés 12 et 13 très variables qui confère la reconnaissance d'un nucléotide 15 spécifique. Cette relation simple entre la séquence en acides-aminés et la reconnaissance de l'ADN permet de créer des domaines de liaison à l'ADN spécifiques d'une séquence en sélectionnant un assemblage de segments répétés contenant les résidus variables appropriés. Ces domaines de liaison à l'ADN spécifiques d'une séquence peuvent être rapidement conçus pour se 20 fixer à quasiment n'importe quelle séquence d'ADN voulue. Le domaine de clivage de l'ADN non spécifique de l'endonucléase Fok1 peut être utilisé pour construire des nucléases hybrides qui ont prouvé leur efficacité dans des essais chez la levure, dans les cellules végétales et animales. Les premières études sur les TALEN ont été réalisées avec le 25 domaine original de Fok1, ou des variants de Fok1 présentant une plus grande spécificité ou efficacité du clivage de l'ADN. Les domaines Fok1 fonctionnent sous forme de dimère, ce qui nécessite deux constructions avec des domaines de liaison à l'ADN dirigés contre des sites du génome présentant des orientations tête-bêche et un espacement 30 correct. En combinant un domaine TALE avec un domaine de clivage de l'ADN 3051196 13 (qui va couper le brin d'ADN), on peut ainsi créer des enzymes de restriction spécifiques pour n'importe quelle séquence d'ADN. Le système Zn Finger utilise la nucléase à doigts de zinc, et est constitué d'une association de deux protéines, comportant chacune trois doigts 5 de zinc de reconnaissance de rADN spécifiquement choisis et d'un domaine catalytique de l'endonucléase Fok I. La nature des acides aminés qui composent un doigt de zinc va conduire à la reconnaissance d'une séquence spécifique d'ADN de trois nucléotides. Ainsi en utilisant deux protéines comportant chacune trois doigts 10 de zinc spécifiques, la reconnaissance s'effectue sur une séquence spécifique de dix-huit nucléotides et conférera une spécificité de reconnaissance sur le génome. L'endonucléase utilisée est le domaine endonucléasique de l'enzyme Fok I et agit sous forme dimérique. 15 Les domaines Fok1 fonctionnent sous forme de dimère, ce qui nécessite deux constructions avec des domaines de liaison à l'ADN dirigés contre des sites du génome présentant des orientations tête-bêche et un espacement correct. Avantageusement, deux protéines comportant chacune trois structures 20 en doigt de zinc reconnaissant des séquences éloignées de quelques nucléotides sont utilisées. La liaison des deux protéines en doigts de zinc sur leurs séquences respectives rapproche les deux endonucléases qui leur sont associées. Ce rapprochement permet la dimérisation des endonucléases et par la suite la coupure du double brin d'ADN. 25 Préférentiellement, la nucléase est choisie parmi le groupe constitué par la nucléase Cas9, la nucléase TALEN et la nucléase Zn Finger. Par « nucléases associées au système CRISPR », on peut citer à titre non limitatif la nucléase Cas9 dans sa version sauvage (Cas9 WT), mutée pour un de ses deux sites actifs (Cas9N) ou mutée pour ses deux sites actifs 30 (dCas9), ainsi que la nucléase Cpf1. La nucléase Cas9 (CRISPR associated protein 9), est une enzyme 3051196 14 spécialisée pour couper l'ADN avec deux zones de coupe actives, une pour chaque brin de la double hélice. Par exemple, S. pyogenes utilise coutil Cas9 pour détecter et défaire l'ADN étranger, tels que l'invasion de l'ADN de bactériophages ou d'un ADN plasmidique. 5 La nucléase TALEN (Transcription activator-like effector nucleases), est générée par la fusion d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé TALE, et d'un domaine enzymatique ayant la capacité de cliver l'ADN, tel que par exemple le domaine catalytique de Fok1, ou des variants de Fok1. Par « variant de Fok1 », on désigne tout domaine protéique permettant 10 de couper la séquence d'ADN 5'-GGATG(N)9-3'. La nucléase du système Zn Finger (également désignée nucléase du système à doigt de zinc) est une enzyme artificielle formée par la fusion d'un domaine de liaison à l'ADN, de type doigt de zinc, et d'un domaine catalytique de coupure à l'ADN, par exemple le domaine catalytique de Fok1, ou des 15 variants de Fok1. Selon un premier type de particule rétrovirale selon l'invention, la séquence d'intérêt d'au moins deux ARNs non viraux encapsidés peut comporter une partie codant pour une nucléase. Ces particules ont un intérêt particulier pour les systèmes d'ingénierie 20 du génome TALEN et ZnFinger dont les nucléases agissent sous forme dimérique. Aussi préférentiellement, la séquence d'intérêt comporte une partie codant pour la nucléase TALEN ou la nucléase à doigt de zinc, encore préférentiellement pour le domaine catalytique de Fok1, ou des variants de Fok1. 25 Selon un second type de particule rétrovirale, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt. Plus particulièrement, dans ce second type : - la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à 30 l'ADN en 3', et - la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant 3051196 15 pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN en 5'. La partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN de la séquence d'intérêt correspond avantageusement à un ARN codant pour une 5 protéine capable de reconnaitre une séquence spécifique de l'ADN. Avantageusement, dans une particule rétrovirale selon ce second type, les séquences d'intérêt comportent une partie codant pour le domaine catalytique de la nucléase Fokl, ou des variants de celui-ci. Ce domaine catalytique de la nucléase Fokl est avantageusement utilisé 10 pour la construction des nucléase recombinantes TALEN et de la nucléase à doigts de zinc, respectivement pour la mise en oeuvre des systèmes d'ingénierie du génome TALEN ou ZnFinger. A titre d'exemple, la particule rétrovirale selon l'invention peut comporter deux ARN non viraux encapsidés de séquences d'intérêt différentes : 15 - une première séquence d'intérêt comportant une partie codant pour la nucléase Fokl et une partie codant pour un TALE 3', et - une deuxième séquence d'intérêt comportant une partie codant pour la nucléase Fokl et une partie codant pour un TALE 5' - ou, la particule rétrovirale selon l'invention peut comporter deux ARN 20 non viraux encapsidés de séquences d'intérêt différentes : - une première séquence d'intérêt comportant une partie codant pour la nucléase Fokl et une partie codant pour trois doigts de zinc de reconnaissance d'une séquence d'ADN en 3', et - une deuxième séquence d'intérêt comportant une partie codant pour la 25 nucléase Fokl et une partie codant pour trois doigts de zinc de reconnaissance d'une séquence d'ADN en 5'. Selon un mode de réalisation spécifique, dans la particule rétrovirale selon l'invention, la séquence d'intérêt d'au moins un des ARN non viraux encapsidés code pour une nucléase. 30 Avantageusement, dans ce mode de réalisation spécifique, la nucléase est Cas9. 3051196 16 Plus particulièrement, dans la particule rétrovirale selon ce mode de réalisation spécifique, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt et la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé correspond à au moins un élément de reconnaissance d'un 5 guide d'ARN. Un guide d'ARN correspond à une séquence d'ARN allant de 3 à 40 bases. Il comporte généralement deux éléments de reconnaissance : - un ARN non codant, capable de s'hybrider par complémentarité de bases à une séquence spécifique de l'ADN et 10 - un ARN non codant dit « transactivateur » (« scaffold »), qui permet de fixer la nucléase sur l'ADN. La séquence d'ARN permet de cibler spécifiquement un site spécifique de coupure de l'ADN. La séquence d'intérêt peut comprendre une ou plusieurs partie(s) 15 correspondant à un ou plusieurs guide(s) d'ARN, identique(s) ou différent(s). Avantageusement, la séquence d'intérêt du second ARN non viral encapsidé correspond à un guide d'ARN. Le guide d'ARN inclue à la fois la partie de reconnaissance à l'ADN et la partie permettant la fixation d'une nucléase. 20 Préférentiellement, le guide d'ARN est un sgRNA. Préférentiellement, la particule comporte deux ARN de séquences d'intérêt différentes : - une première séquence d'intérêt codant pour la nucléase Cas9, et - une deuxième séquence d'intérêt correspondant à un guide d'ARN. 25 Avantageusement, la particule rétrovirale selon ce mode de réalisation spécifique comporte en outre au moins un troisième ARN non viral encapsidé ayant une séquence d'intérêt correspondant à un second élément de reconnaissance d'un guide d'ARN ou à un guide d'ARN supplémentaire. Avantageusement, la particule comporte trois ARN de séquences 30 d'intérêt différentes : - une première séquence d'intérêt codant pour la nucléase Cas9, 3051196 17 - une deuxième séquence d'intérêt correspondant à un guide d'ARN, et - une troisième séquence d'intérêt correspondant à un guide d'ARN identique ou différent de la deuxième séquence d'intérêt. Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention comporte une 5 protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou 10 dans l'intégrase. Par « protéine de nucléocapside », on entend la protéine de structure NC codée par le gène gag. Lorsque le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, alors cette protéine est une protéine chimérique, issue d'un gène gag chimérique. 15 Lorsque le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, alors l'intégrase est une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique. Par « protéine chimérique », on désigne une protéine recombinante comprenant plusieurs séquences protéiques différentes fusionnées. Selon un premier mode de réalisation, dans la particule rétrovirale selon 20 l'invention, le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside et les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN. Ce premier mode de réalisation permet une expression précoce et transitoire des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le 25 génome des cellules cibles. En effet, lors de la mise en contact d'une particule selon ce premier mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule rétrovirale et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la particule dans la cellule cible. Les ARN sont alors libérés dans le 30 cytoplasme et la machinerie cellulaire permet de traduire directement ces ARN en protéine(s), c'est-à-dire sans étapes supplémentaires comme la 3051196 18 transcription inverse, la translocation dans le noyau ou l'intégration dans le génome de la cellule cible. Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d'encapsidation. Dans ce cas, les au moins deux ARN non 5 viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt, c'est-à- dire que les séquences d'ARN d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes. Par « différentes », on vise des séquences d'intérêt non identiques ou présentant une différence ne résultant pas d'une mutation spontanée ou non intentionnellement choisie par le manipulateur. 10 Alternativement, les au moins deux ARN non viraux présentent deux séquences d'encapsidation différentes. Ces au moins deux séquences d'encapsidation sont alors reconnues par au moins deux domaines de liaison différents, au moins un de ces domaines étant introduit dans la protéine de nucléocapside. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés 15 peuvent comporter des séquences d'intérêt identiques ou différentes. Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux. Selon un mode de réalisation particulier du premier mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside 20 de la particule rétrovirale selon l'invention. A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du bactériophage MS2 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la 25 protéine « Coat » du bactériophage MS2. Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside. 30 Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même 3051196 19 séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d'encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation 5 est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside. D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside. Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans la protéine de 10 nucléocapside, il est également possible d'introduire un domaine de liaison dans l'intégrase. L'intégrase est alors une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique. Préférentiellement, lorsque le domaine de liaison est introduit dans 15 l'intégrase, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C- terminal afin d'insérer la séquence du domaine de liaison. Plus préférentiellement encore, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine « Coat » du bactériophage MS2 ou du phage PP7. 20 Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans la protéine de nucléocapside et dans l'intégrase respectivement. Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : 25 - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé portant une séquence 30 d'encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans l'intégrase. 3 0 5 1 1 9 6 20 D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l'intégrase. Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une particule lentivirale. 5 Préférentiellement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) 10 de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. Avantageusement : - La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la 15 protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. - La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement, de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. De préférence, la 20 séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1). Ou, préférentiellement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence 25 tige-boucle de PP7, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7. 30 Avantageusement : - La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la 3051196 21 protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. - La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement 5 encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2). Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la 10 protéine Coat du bactériophage MS2, ou le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7. Selon un second mode de réalisation, l'invention concerne une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, 15 préférentiellement une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans l'intégrase et, optionnellement par un 20 domaine de liaison introduit dans une protéine issue de la polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside. Ce second mode de réalisation permet une expression transitoire des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des cellules cibles. 25 Préférentiellement, dans ce second mode de réalisation, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence du domaine de liaison. Avantageusement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus particulièrement, le domaine de liaison est la protéine Coat du 30 bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage Q6, la protéine nun du prophage HK022, la protéine U1A ou encore la protéine hPum. 3051196 22 De préférence, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine « Coat » du bactériophage MS2 ou du phage PP7. Les au moins deux ARN non viraux peuvent présenter ou non la même 5 séquence d'encapsidation. De même, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent présenter ou non la même séquence d'ARN d'intérêt. Préférentiellement, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt c'est-à-dire que les séquences 10 d'ARN d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes. Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d'encapsidation, celle-ci étant reconnue par le domaine de liaison introduit dans l'intégrase. 15 Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux. Selon un mode de réalisation particulier du second mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans l'intégrase de la particule rétrovirale selon l'invention. 20 A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du bactériophage MS2 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2. 25 Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d'encapsidations différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans l'intégrase. Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : 30 - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison, ces 3051196 23 deux ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d'encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation 5 est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans l'intégrase. D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l'intégrase. Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans l'intégrase, il est 10 également possible d'introduire un domaine de liaison dans la protéine de nucléocapside. La protéine de nucléocapside est alors une protéine chimérique, issue d'un gène gag chimérique. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent 15 porter des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans l'intégrase et dans la protéine de nucléocapside respectivement. Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même 20 séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison introduit dans l'intégrase, ces ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé porte une séquence d'encapsidation différente, correspondant à un second domaine de 25 liaison introduit dans la protéine de nucléocapside. D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside. Avantageusement, dans le cas où la particule selon l'invention comporte une protéine de nucléocapside, le domaine de liaison peut être introduit dans 30 la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase. 3051196 24 Alternativement, dans la particule rétrovirale selon l'invention, le domaine de liaison peut être introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase. Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une 5 particule lentivirale. Lorsque la particule rétrovirale est une particule lentivirale, il est possible d'exprimer transitoirement des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des cellules cibles, en particulier des cellules quiescentes. 10 En effet, en dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-même, l'intégrase (IN) participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import nucléaire du complexe de préintégration (PIC). Plus particulièrement, chez les lentivirus, l'intégrase contient des 15 séquences de localisation nucléaire (NLS) permettant sa localisation dans le noyau grâce au PIC. Par conséquent, lorsque l'encapsidation des ARN non viraux est effectuée par un domaine de liaison porté par une intégrase d'un lentivirus, les ARN non viraux encapsidés seront transportées dans le noyau de la cellule cible. En effet, lors de la mise en contact d'une particule lentivirale 20 selon ce second mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la capside dans la cellule cible. Les ARN sont alors pris en charge par l'intégrase qui, via les PIC, va permettre l'import des ARN dans le noyau. Cette prise en charge est particulièrement intéressante pour certaines 25 applications, telles que l'expression dans des cellules quiescentes. Dans le cas de particules rétrovirales, autres que les lentivirus, l'intégrase ne contient pas ces NLS et se trouve donc localisée dans le cytoplasme. Il est toutefois possible de rajouter dans ce type d'intégrase, les séquences NLS afin d'induire une localisation nucléaire de l'intégrase, et donc des ARN pris en charge par 30 cette intégrase. Cette prise en charge est également particulièrement utile pour un 3051196 25 système CRISPR, qui fait appel à des guides ARN qui viennent s'hybrider spécifiquement au génome de la cellule cible. Une fois hybridés, ces guides ARN guident une endonucléase (Cas9), qui va permettre la modification d'un locus spécifique du génome de la cellule cible. 5 Plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la 10 séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. Ou, plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence 15 tige-boucle de PP7, - l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7. Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans la 20 nucléocapside peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7. En effet, l'intégrase (IN) est composée de 3 domaines fonctionnels 25 distincts, chacun indispensable pour assurer une réaction d'intégration complète. Le domaine N-terminal contient un motif de type doigt de zinc qui stabilise la structure repliée de l'IN et augmente l'activité catalytique de l'enzyme. Le domaine central de l'IN contient le motif d'acides aminés DDE auquel est attribué l'activité catalytique de l'enzyme. Ce domaine central est 30 aussi impliqué dans la reconnaissance de la séquence nucléotidique conservée à chaque extrémité de l'ADN rétroviral. Le domaine C-terminal est le 3051196 26 moins conservé parmi la famille des rétrovirus. H possède l'activité de liaison à l'ADN et est indispensable pour les réactions de maturation des extrémités 3' de transfert de brin. En dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-même, IN participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus 5 comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import nucléaire du complexe de préintégration. Comme décrit par Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), l'insertion d'une séquence exogène en C-terminal de l'IN ne perturbe pas les étapes de production et de transduction de cellules cibles alors qu'une même insertion en 10 N-terminal ne permet pas la détection d'un événement de transduction. La particule rétrovirale a donc été modifiée pour contenir la protéine « Coat » du bacteriophage MS2 en fusion avec la protéine de l'intégrase (voir Figure I) ou la protéine « Coat » du phage PP7 (voir Figure XXXVII). Le plasmide d'encapsidation p814, porteur du gène pol codant pour la protéine 15 de l'intégrase, est modifié afin d'insérer la séquence codant la protéine Coat en C-terminal de l'intégrase par PCR d'assemblage. Le plasmide p8.74 est linéarisé par PCR puis la séquence Coat, préalablement amplifiée par PCR, est clonée au niveau C-terminal de l'intégrase, soit directement bout-à-bout soit avec l'ajout un linker. 20 Avantageusement : - La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. - La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2 et/ou de PP7, selon le domaine de 25 liaison introduit, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions, plus préférentiellement de 2 à 18 répétitions, tel que de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore pour la séquence tige-boucle de MS2, de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. 30 - Préférentiellement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) lorsque le domaine 3 0 5 1 1 9 6 27 de liaison est la protéine Coat de MS2 et/ou la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2) lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de PP7. Plusieurs exemples de particule lentivirale selon l'invention sont décrits 5 ci-après et pour certaines de manière plus détaillée dans les exemples qui suivent : - une particule MS2RLP ou MS2 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la 10 protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, 15 - une particule MS2 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée 20 par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du 25 bactériophage MS2, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat 30 du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule PP7 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée 3051196 28 par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée 5 par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7RLP ou PP7 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige 10 boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans 15 l'intégrase, - une particule PP7 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase, 20 - une particule PP7 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase. Préférentiellement, la particule lentivirale formée par encapsidation 25 d'ARNs porte un motif tige boucle du bactériophage MS2 ou du phage PP7, répété de 2 à 25 fois, préférentiellement encore 2, 6 ou 12 fois. Plus préférentiellement encore, la particule selon l'invention est choisie parmi MS2 (NC)-RLP 12X, PP7 (NC)-RLP 6X, PP7 (NC)-RLP 2X, MS2 (IN)- RLP 12X, PP7 (IN)-RLP 6X et PP7 (IN)-RLP 2X. 30 L'invention concerne également des compositions comportant des particules selon l'invention. 3 0 5 1 1 9 6 29 Plus particulièrement, les compositions selon l'invention sont des compositions concentrées. Avantageusement, les compositions sont également purifiées. Ces compositions peuvent être concentrées et purifiées selon le procédé décrit dans la demande W02013/014537. 5 Typiquement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Plus particulièrement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. 10 Par « surnageant brut », on vise le surnageant de culture(s) cellulaire(s), comportant des particules rétrovirales selon l'invention, après clarification. Une telle étape de clarification est plus particulièrement décrite ci-après dans les procédés de fabrication des particules selon l'invention. Lorsque la récupération du surnageant est effectué en plusieurs fois, le surnageant brut 15 correspond alors à l'ensemble des surnageants collectés, réunis (ou « poolés ») puis clarifié. Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. 20 L'invention se rapporte aussi à des kits de production de particules selon l'invention et aux procédés de fabrication de ces kits. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit de production de particules selon l'invention, comportant : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence 25 d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence 30 d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. 3051196 30 Un tel kit peut également comporter une notice d'utilisation des plasmides contenus dans le kit. Plus spécifiquement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, ce kit comporte : 5 (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un 10 second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison 15 permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes. 20 Préférentiellement, le kit produisant des particules selon le premier mode de réalisation comporte : (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont, en aval ou au sein de chacune de ces séquences est insérée une séquence 25 d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences 30 d'encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de 3051196 31 nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. Avantageusement, le kit produit des particules lentivirales. 5 Préférentiellement : - Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par exemple 12 10 répétitions. Avantageusement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1). - Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt 15 de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. - Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. 20 Ou, préférentiellement : - Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. 25 Avantageusement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2). - Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt 30 de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7. 3051196 32 - Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. Optionnellement, le kit comporte un second plasmide d'encapsidation 5 codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation. Le second domaine de liaison peut être identique ou différent du domaine de liaison de la protéine de nucléocapside chimérique. A titre d'exemple de domaines de liaison différents : 10 - le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de MS2 et le domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat de PP7, ou - le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de PP7 et le domaine de liaison introduit dans 15 l'intégrase peut être la protéine Coat de MS2. Plusieurs domaines de liaison peuvent être introduits dans chacune des protéines chimériques. Alternativement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce kit comporte : 20 (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de 25 reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. Des procédés de fabrication des kits selon l'invention sont également proposés. Typiquement, un procédé de fabrication d'un kit selon l'invention comporte : 30 (i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au 3051196 33 sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, 5 chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. Plus spécifiquement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à 10 produire des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte : (i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence d'intérêt est insérée une 15 séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une 20 protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce 25 que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes. Préférentiellement, ce procédé comporte : (i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont, en aval ou 30 au sein de chacune de ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement d'un premier et d'un second 3051196 34 plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences 5 d'encapsidation étant identiques, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une 10 protéine d'enveloppe. Alternativement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte : (i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au 15 sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, 20 (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. L'invention se rapporte également à des procédés de fabrication des particules selon l'invention. Un tel procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec : 25 (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un 30 domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, 3051196 (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules. Les cellules mises en oeuvre dans les procédés de fabrication de 5 particules selon l'invention sont des cellules productrices, c'est-à-dire des cellules, qui une fois transfectées avec les plasmides portant le matériel génétique nécessaire à la formation des particules rétrovirales, permettent la formation desdites particules. A titre d'exemple de cellules productrices, on peut citer HEK293T. 10 Par « étape de co-transfection », on entend une étape de transfection lors de laquelle la transfection est effectuée par mise en contact des cellules productrices avec l'ensemble des plasmides du procédé de fabrication des particules. Plus spécifiquement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire 15 des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont, en 20 aval ou au sein de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, 25 (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les 30 particules. Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce 3051196 36 que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes. Préférentiellement, ce procédé de fabrication de particules comporte une étape de co-transfection de cellules avec : 5 (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont, en aval ou au sein de chacune de ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt 10 en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de 15 nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules. 20 Alternativement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette 25 séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, 30 et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules. 3 0 5 1 1 9 6 37 Préférentiellement, tous les procédés de fabrication de particules selon l'invention sont réalisés conformément aux procédés décrits dans la demande W02013/014537. Plus particulièrement, ces procédés de fabrication de particules sont 5 réalisés sur des cellules productrices cultivées en milieu sans sérum et aucune induction au sodium butyrate n'est effectuée. Avantageusement, le surnageant est collecté en plusieurs fois, par exemple entre 3 et 6 fois, à des intervalles de temps spécifiques, tels qu'à des intervalles de temps de l'ordre de la demi vie des particules rétrovirales. 10 Typiquement, la récupération du surnageant est effectuée en 4 à 5 fois, à des intervalles de temps de l'ordre de 6 à 18h, préférentiellement de 8 à 16h, tels que 8h, 12h et/ou 16h. Préférentiellement, cette collecte est effectuée après changement du milieu de culture des cellules, ce changement étant effectué préférentiellement à 24h post-transfection. 15 Les procédés de fabrication de particules selon l'invention comportent également une étape dans laquelle le surnageant est clarifié. Préférentiellement, la clarification du surnageant est effectuée par centrifugation. Plus préférentiellement encore, ces procédés de fabrication de 20 particules selon l'invention comportent en outre une étape dans laquelle le surnageant est concentré et/ou purifié. De préférence, la concentration et purification est effectuée par ultrafiltration frontale sur des unités de centrifugation. Avantageusement, le surnageant subit une ou plusieurs étapes 25 supplémentaires de purification. Ces étapes de purification sont effectuées de préférence par ultrafiltration tangentielle et/ou diafiltration. Plus préférentiellement encore, le surnageant subit une étape d'ultrafiltration tangentielle suivie d'une étape de diafiltration. L'ultrafiltration tangentielle est avantageusement effectuée sur des 30 cartouches de fibres creuses en polysulfone. Optionnellement, la composition peut ensuite subir une étape de 3 0 5 1 1 9 6 38 chromatographie par échange d'ions, en particulier une chromatographie par échange d'anions. L'éluât issu de cette étape de chromatographie est ensuite récupéré puis concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation. Une composition résultant d'un tel procédé 5 comporte moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. L'invention concerne également des compositions susceptibles d'être obtenues par l'un quelconque des procédés de fabrication de particules selon l'invention. 10 Typiquement, ces compositions comportent moins de 30 `)/0 de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Plus particulièrement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. 15 Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'une particule selon l'invention, ou d'une composition selon l'invention pour transduire des cellules. 20 L'utilisation des particules et des compositions selon l'invention est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules primaires et des lignées immortalisées, afin de les modifier de façon transitoire. Les cellules peuvent être des cellules de mammifères ou d'autres eucaryotes. En particulier, la transduction de ces cellules peut être effectuée in vivo, in vitro ou 25 ex vivo. L'utilisation des particules selon l'invention pour transduire des cellules permet d'introduire une mutation dans le génome grâce à leur capacité à induire des cassures du double brin d'ADN, auxquelles les cellules répondent par des mécanismes de réparation de l'ADN. Par exemple, la réparation peut 30 être effectuée par insertion d'extrémités non-homologues permettant de reconnecter deux extrémités d'ADN résultant d'une cassure double brin, d'ARN 3 0 5 1 1 9 6 39 introduits à cet effet ou disponible dans la cellule. Ces systèmes d'ingénierie du génome peuvent également être utilisés pour réaliser des KO de gène, c'est-à-dire une invalidation de l'expression d'un gène, voire induire une mort cellulaire selon les gènes ciblés. 5 Les particules selon l'invention introduites dans les cellules, elles peuvent alors être utilisées pour modifier le génome in vivo, in vitro ou ex vivo. L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent donnés à titre illustratif, avec référence aux figures, qui représentent respectivement : - La figure I est un schéma illustrant le plasmide d'expression pCDNA- 10 EF1-Cas9-MS2 12X comportant une séquence d'ADN codante pour l'ARN de la nucléase Cas9 ; - La figure Ila illustre la stratégie de modification du plasmide d'encapsidation p8.74 porteur des gènes codant les protéines de structure et de fonction (Gag, Pol) pour la construction d'un 15 p8.74AZF-MS2-Coat ; - La figure Ilb est un schéma de construction d'un plasmide d'encapsidation p8.74tZF-MS2-Coat ayant le second doigt de zinc substitué par la protéine « Coat » du bactériophage MS2, obtenu par la stratégie présentée en Figure lia ; 20 - La figure III est un schéma de construction d'un plasmide d'enveloppe pENV ; - La figure IV est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV-EF1-Cas9-WPRE comportant un ADN codant pour la séquence d'ARN de la nucléase Cas9 ; 25 - La figure Va est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV-EF1-GFP-WPRE comportant un ADN codant pour l'ARN de la GFP ; - La figure Vb est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV-H1-GuideU3-U6-GuideDl-WPRE comportant un 30 ADN codant pour deux ARN non codant ciblant la séquence de la GFP (sgRNA = ARN guide = Guide U3 et Guide D1) ; 3 0 5 1 1 9 6 - La figure Vc est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV-H1/U6-Guide-WPRE comportant un ADN codant pour un ARN non codant ciblant la séquence de la GFP (sgRNA = ARN guide = Guide) ; 5 - La figure VI est un schéma de construction d'un plasmide d'encapsidation p8.74 porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) ; - La figure VII est un schéma illustrant le plasmide d'expression pCDNA-H1-GuideDl-MS2 2X porteur d'une séquence d'ADN codant 10 pour un ARN guide non codant ciblant la séquence de la GFP (sgRNA = ARN guide), dans lequel 2 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (SEQ ID N°1) ont été insérées au sein de la cassette d'expression en aval de l'ARN guide ; - La figure VIII est un schéma illustrant le plasmide d'expression 15 pCDNA-H1-GuideDl Chimerique-MS2 2X porteur d'une séquence d'ADN codant pour un ARN guide non codant ciblant la séquence de la GFP (sgRNA = ARN guide), d'une cassette d'expression prometteur-séquence d'intérêt-poly A, dans lequel 2 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (SEQ ID N°1) sont incluses dans la 20 partie « scaffold » du guide chimérique ; - La figure IX illustre l'efficacité d'une particule MS2-(NC) RLP 12X selon l'invention à délivrer l'ARN codant pour la nucléase Cas9 lors de la transduction de cellules HCT119-GFP ; - La figure X illustre l'impact de la position des motifs répétés MS2 25 pour l'encapsidation d'ARN guides dans de particules MS2-(NC) RLP 12X selon l'invention, après transduction des cellules HCT119-GFP Cas9 ; - La figure XI illustre l'efficacité de production de particules MS2RLP délivrant de l'ARN guide selon qu'elles sont produites par l'utilisation 30 d'une quantité simple ou double du plasmide d'expression portant l'ARN guide pour la transduction des cellules HCT116-GFP-Cas9 ; 3051196 41 - La figure XII illustre l'efficacité d'une particule MS2-(NC) RLP 12X selon l'invention à délivrer le système CRISPR/Cas9 (ARN guide + ARN codant pour la Cas 9), dans des cellules FICT116-GFP ; - La figure Xllla est un schéma illustrant le plasmide d'expression 5 pcDNA.EF1.PPRV.TALEN 5'.WPRE MS2(12X) comportant une séquence d'ADN codant pour l'ARN de la nucléase TALEN constituée de la nucléase Fokl fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN, TALE, reconnaissant le brin 5' de l'ADN ; - La figure Xlllb est un schéma illustrant le plasmide d'expression 10 pcDNA.EF1.PPRV.TALEN 3'.WPRE MS2(12X) comportant une séquence d'ADN codant pour l'ARN de la nucléase TALEN constituée de la nucléase Fokl fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN, TALE, reconnaissant le brin 3' de l'ADN ; - La figure XlVa est un schéma illustrant le plasmide d'expression 15 pILV.EF1.TALEN 5' comportant une séquence d'ADN codant pour l'ARN de la nucléase TALEN constituée de la nucléase Fokl fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN, TALE, reconnaissant le brin 5' de l'ADN ; - La figure XlVb est un schéma illustrant le plasmide d'expression 20 pILV.EF1.TALEN 3' comportant une séquence d'ADN codant pour l'ARN de la nucléase TALEN constituée de la nucléase Fokl fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN, TALE, reconnaissant le brin 3' de l'ADN; - La figure XVa est un schéma illustrant le plasmide d'expression, 25 pcDNA.EF1.PPRV.ZFP 5'.WPRE.MS2 (12X), porteur d'un domaine de reconnaissance à l'ADN de type doigt de zinc chimérique à la nucléase Fokl pour la reconnaissance du brin d'ADN 5' ; - La figure XVb est un schéma illustrant le plasmide d'expression pcDNA.EF1.PPRV.ZFP 3'.WPRE.MS2 (12X), porteur d'un domaine 30 de reconnaissance à l'ADN de type doigt de zinc chimérique à la nucléase Fokl pour la reconnaissance du brin d'ADN 3' ; 3 0 5 1 1 9 6 42 - La figure XVIa est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV.EF1.ZFP 5' porteur d'un domaine de reconnaissance à l'ADN de type doigt de zinc chimérique à la nucléase Fokl pour la reconnaissance du brin d'ADN 5' ; 5 - La figure XVIb est un schéma de construction d'un plasmide d'expression pILV.EF1.ZFP 3' porteur d'un domaine de reconnaissance à l'ADN de type doigt de zinc chimérique à la nucléase Fokl pour la reconnaissance du brin d'ADN 3' ; - La figure XVII présente le schéma du plasmide d'expression portant 10 comme séquence d'ARN d'intérêt la Luciférase utilisé pour la production de particules lentivirales PP7RLP, comprenant le motif tige-boucle PP7 répété 12 fois, selon l'invention ; - La figure XVIII présente un schéma de la modification du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 afin d'insérer un domaine de liaison 15 dans la séquence de l'Intégrase ; et - La figure XIX présente un schéma du plasmide d'encapsidation utilisé pour la production de particules lentivirales PP7 (IN)-RLP selon l'invention, obtenu par la modification du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 présenté Figure VI. 20 EXEMPLE 1 : Comparaison du transfert de l'ARN codant pour la Cas9 après transduction d'un clone particulier de cellules HCT116 par des ILV ou des particules MS2RLP selon l'invention 25 L Matériels & Méthodes 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2-(NC)-RLP 12X - Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide 30 d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA (Figure I) avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice 3 0 5 1 1 9 6 43 d'ARN. Afin de véhiculer les ARN dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval de la séquence de l'enzyme Cas9. Le promoteur utilisé est celui d'EF1 (Figure I) 5 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt du plasmide est un ADN codant pour l'ARN de la protéine Cas9 (Figure I), dans sa forme sauvage (WT) ou dans sa forme mutée (N). - Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second 10 domaine en doigt de Zn, la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules MS2RLP est modifié selon la stratégie illustrée par la Figure lia : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par PCR d'assemblage, un plasmide 15 dépourvu du second doigt de zinc de la protéine de nucléocapside p8.74AZF. Le second doigt de zinc est substitué par la protéine « Coat » du bactériophage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide p8.74LZFMS2-Coat. On obtient ainsi la construction illustrée en Figure ilb. La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction 20 comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT) ou l'intégrase (IN) sans altérer la fonction des MS2RLP. - Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSVG codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III). 25 1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV 1.2.1. Plasmide pour la production d'une particule lentivirale intégrative (ILV) pour Cas 9 - Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide 30 d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt. Ce plasmide peut contenir d'autres éléments comme la séquence 3 0 5 1 1 9 6 44 native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Le promoteur utilisé est celui de l'EF1, 5 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt du plasmide est un ADN codant pour l'ARN de la protéine Cas9 (Figure IV), dans sa forme sauvage (WT) ou dans sa forme mutée (N). - Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) 10 est utilisé pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (Figure VI). -Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique au plasmide d'enveloppe utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP (Figure III). 15 1.2.2. Plasmides pour la préparation du clone HCT116-GFP Clone D2 - Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt. Ce plasmide peut contenir d'autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory 20 Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Le promoteur utilisé est celui de l'EF1, mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt est la protéine fluorescente GFP (Figure Va). 25 - Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (Figure VI). -Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique au plasmide d'enveloppe utilisé pour la production de particules lentivirales 30 MS2RLP (Figure III). 3 0 5 1 1 9 6 1.2.3. Plasmides pour la préparation du clone HTC116-GFP Clone D2-H1- GuideU3-U6-GuideD1 - Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence 5 d'intérêt. Ce plasmide peut contenir d'autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Les promoteurs utilisés sont H1 et U6, 10 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. Les séquences d'intérêt sont deux ARN non codants ciblant la séquence de la GFP (sgRNA = ARN guide) (Figure Vb). - Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) 15 est utilisé pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (Figure VI). -Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique au plasmide d'enveloppe utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP (Figure III). 20 2. Productions des lots Après la transfection des plasmides sur des cellules, les surnageants sont récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon l'un des procédés mentionnés ci-après décrits dans la demande WO 2013/014537. 25 2.1 Production des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales Les productions sont réalisées en CeIISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning) avec des cellules HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1% pénicilline/streptomycine et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37°C en 30 atmosphère humide à 5% CO2. Pour chaque lot (MS2-(NC)-RLP 12X et ILV), le mélange de transfection est composé des trois plasmides suivants : 3051196 46 - Un des plasmides d'expression décrit ci-avant, selon que l'on forme une particule (MS2-(NC)-RLP 12X) ou un vecteur (ILV), - p8.74AZF Coat (MS2-(NC)-RLP 12X) ou p8.74 (ILV) - pENV portant l'enveloppe VSV-G. 5 Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV 24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non 10 supplémenté. Les cellules sont incubées à 37°C / 5% CO2. Après changement du milieu, le surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection). Chaque récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être microfiltrée sur filtre de 0,45pm (Stericup®, Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour composer le surnageant brut. 15 2.2 Concentration et purification des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales Les vecteurs et particules sont concentrés et purifiés selon l'une des deux procédés ci-après : 20 - Le procédé P1 vise à réaliser une ultrafiltration frontale du surnageant sur des unités centrales de centrifugation. - Le procédé P2 vise à réaliser une ultrafiltration tangentielle puis une diafiltration du surnageant. Le surnageant brut est concentré et purifié par ultrafiltration tangentielle via l'utilisation de cartouches de fibres creuses en 25 polysulfone. Le surnageant est traité par diafiltration pour 20 diavolumes en mode continu contre du tampon DMEM ou TSSM. Après la diafiltration, le rétentat est récupéré puis concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation. 30 3. Titration 3.1 Titration des particules fonctionnelles par qPCR. 305 1 1 9 6 47 Les cellules HCT116 (ATCC, CCL-247) sont ensemencées en plaque 96 puits dans 100pL de DMEM supplémenté de 10% SVF, 100 pg/mL Streptomycine, 100 U/mL Pénicilline et 2mM L-Gln (L-Glutamine) puis incubées 24h à 37°C / 5% CO2. Six dilutions sériées sont réalisées pour chaque vecteur 5 ainsi que pour un étalon interne. Les cellules sont transduites par ces dilutions sériées en présence de Polybrene® 8pg/mL (Sigma) puis incubées trois jours à 37°C / 5% CO2. Pour chaque série d'échantillons, un puits de cellules non transduites est rajouté en contrôle. Les cellules sont ensuite trypsinées et le titre (Unité de Transduction/mL) est déterminé par qPCR après extraction de 10 l'ADN génomique en utilisant le Nucleospin tissue gDNA extraction kit (Macherey-Nagel). Le titre obtenu (TU/mL) par qPCR est normalisé par l'étalon interne dont le titre a été précédemment déterminé par FACS. 3.2 Quantification des particules physiques par test ELISA p24. 15 La protéine de capside p24 est détectée directement sur le surnageant viral en utilisant et en suivant les recommandations du kit HIV-1 p24 ELISA kit (Perkin Elmer). La protéine p24 capturée est complexée avec un anticorps polyclonal biotinylé, puis détectée par une stréptavidine conjuguée à la péroxydase de raifort (HRP). Le complexe résultant est détecté par 20 spectrophotométrie après incubation avec le substrat ortho-phénylènediamineHCI (OPD) produisant une coloration jaune qui est directement proportionnelle à la quantité de protéine p24 capturée. L'absorbance de chaque puits est quantifiée au lecteur de plaque Synergy H1 Hybrid (Biotek) et calibrée contre l'absorbance d'une gamme étalon de protéine p24. Le titre viral exprimé en 25 particules physiques par mL est calculé à partir de la concentration de protéine p24 obtenue sachant que 1pg de protéine p24 correspond à 104 particules physiques. 4. Transduction 30 Cet exemple vise à montrer qu'il est possible de transférer l'ARN codant pour la nucléase Cas9 via des particules MS2RLP non intégratives, et qu'à 3051196 48 l'issue de ce transfert d'ARN, pour générer des cassures d'ADN double brins permettant l'invalidation d'un gène cible. 4.1 Cellules HCT116-GFP Clone D2 5 Les cellules HCT116-GFP Clone D2 sont obtenues par transduction de cellules HCT116 (ATCC, CCL 247) à M0120 en présence de 8pg de Polybrene® avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) exprimant la GFP. La lignée monoclonale HCT116-GFP Clone D2 ne contenant qu'une seule copie d'ADN codant pour la GFP a été obtenue par dilution limite de la lignée 10 polyclonale HCT116-GFP (préparé à partir du plasmide d'expression de la Figure Va) et criblage des clones par quantification du nombre de copies intégrées de la séquence GFP par PCR quantitative. 4.2 Cellules HCT116-GFP CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideDl 15 Les cellules HCT116-GFP Clone D2 sont ensemencées en plaque 24 puits à 25000 cellules/cm2 et incubées 24h à 37°C / 5% COR. Dans un premier temps les cellules sont transduites par les vecteurs ILV-H1-GuideU3-U6- GuideD1 (préparé à partir du plasmide d'expression de la Figure Vb) en présence de 8pg/mL Polybrene®. Le surnageant de transduction est éliminé 4 20 heures après et remplacé par du milieu de culture supplémenté frais. Une semaine après la transduction avec l'ILV, les cellules HCT116-GFP CloneD2- H1-GuideU3-U6-GuideD2 sont transduites par les vecteurs ILV-EF1-Cas9 (préparé à partir du plasmide d'expression de la Figure IV) ou les particules MS2RLP-Cas9 en présence de 8pg/mL Polybrene®. Le surnageant de 25 transduction est éliminé 4 heures après et remplacé par du milieu de culture supplémenté frais. Un inhibiteur des mécanismes de défense cellulaire, le BX795 (Invivogen), est utilisé à une concentration de 6 pM dans le cas des particules MS2RLP.A J14 post-transduction, les cellules sont récupérées et le pourcentage de cellules exprimant la GFP ainsi que l'intensité de fluorescence 30 sont quantifiés par cytométrie (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec). 3 0 5 1 1 9 6 49 Il. Résultats L'objectif de cette expérience est de comparer l'efficacité de transfert d'ARN codant pour la Cas9 par transduction de cellules HCT116-GFPCloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideDl avec des vecteurs ILV ou des particules 5 MS2RLP. Dans un premier temps, les résultats présentés sur la figure IX montrent que les cellules HCT116 non transduites (NT) ne sont pas fluorescentes ( REVENDICATIONS1. Particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins desdites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase. 2. Particule selon la revendication 1, dans laquelle la nucléase est choisie parmi le groupe constitué par les nucléases associées au système CRISPR, la nucléase du système TALEN, la nucléase du système Zn Finger et la nucléase Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo). 3. Particule rétrovirale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence d'intérêt d'au moins deux ARNs non viraux encapsidés comporte une partie codant pour une nucléase. Particule rétrovirale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt. Particule rétrovirale selon la revendication 4, dans laquelle : la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN en 3', et - la séquence d'intérêt d'au moins un ARN comporte une partie codant pour une nucléase et une partie codant pour un système de reconnaissance à l'ADN en 5'. Particule rétrovirale selon la revendication 5, dans laquelle les séquences d'intérêt comportent une partie codant pour le domaine catalytique de la nucléase Fokl, ou des variants de celui-ci. 3051196 67 7. Particule rétrovirale selon la revendication 1, 2 ou 4, dans laquelle la séquence d'intérêt d'au moins un des ARN non viraux encapsidés code pour une nucléase. 8. Particule selon la revendication 7, dans laquelle la nucléase est Cas9. 9. Particule rétrovirale selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'intérêt et la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé correspondant à au moins un élément de reconnaissance d'un guide d'ARN. 10. Particule rétrovirale selon la revendication 9, qui comporte en outre au moins un troisième ARN non viral encapsidé ayant une séquence d'intérêt correspondant à un second élément de reconnaissance d'un guide d'ARN ou à un guide d'ARN supplémentaire. 11. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase. 12. Particule rétrovirale selon la revendication 11, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase. 13. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase. 14. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, laquelle est une particule lentivirale. 15. Composition comportant des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 3051196 68 16. Kit de production de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comportant : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette 5 séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, 10 (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. 17. Procédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence 15 d'intérêt, pour laquelle en amont, en aval ou au sein de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence 20 d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules. 18. Composition de particules susceptible d'être obtenue par le 25 procédé de fabrication des particules selon la revendication 17. 19. Utilisation d'une particule selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou d'une composition selon la revendication 15 ou 18, pour transduire in vitro des cellules. 20. Utilisation selon la revendication 19, pour générer chez les 30 cellules transduites une cassure du double brin d'ADN, une mutation ponctuelle, une délétion de séquence dont invalidation de gène, une insertion de séquence ou remplacement de gène.