FR 3061720 A1 20180713 FR 1750146 A 20170106 1 DOMAINE DE L'INVENTION Le domaine de l'invention concerne un procédé de détection et de quantification d'ADN libre de toutes cellules (autrement nommé de façon générale 'ADN circulant') et leur utilisation notamment à des fins de diagnostic, pronostic ou suivi de l'état physiologique d'un sujet donné. ETAT DE L'ART On sait depuis de nombreuses années que le plasma sanguin contient de petites quantités d'ADN libre circulant, de l'ordre d'une dizaine de nanogrammes par millilitre, cette concentration pouvant s'élever significativement, jusqu'à 0,5 microgramme par millilitre, chez les patients atteints de cancer. Plusieurs études ont montré que l'on pouvait, à partir de cet ADN circulant, détecter des modifications génétiques spécifiques des processus cancéreux comme des mutations et des altérations des microsatellites (cancers pulmonaires, colorectaux, de la tête et du cou). La prévalence de ces altérations génétiques de l'ADN circulant varie cependant selon les maladies et les gènes étudiés (Pierre Hainaut, m/s n°3, vol.16, mars 2000). Si, actuellement les concentrations en ADN circulants ne sont pas ou peu utilisées comme outil diagnostique ou pronostique, c'est par manque d'une standardisation des méthodes d'extraction et de dosage qui permettrait d'établir ces seuils standardisés. Des "bonnes pratiques" pré-analytiques spécifiques aux ADN circulants ont été publiées. Ils recommandent notamment de travailler avec du plasma collecté dans des tubes (EDTA, Streck, Roche), de centrifuger le tube de sang au plus tard 6 h après le prélèvement (jusqu'à 24h selon les centres d'analyse), de conserver le plasma entre - 20°C (conservation 1 mois), de conserver les ADN circulants extraits à - 20 °C (en tube vissé) et d'éviter les cycles de décongélation-recongélation répétés. Cependant, les considérations pré-analytiques qui influencent le résultat analytique doivent prendre en considération d'autres facteurs tels que le volume de plasma à extraire, directement corrélé à la quantité d'ADN extrait, le rendement de la technique d'extraction pour un volume donné de liquide, la reproductibilité de l'extraction, la concentration finale de l'ADN et la standardisation inter-essais du rendement/concentration de l'éluat obtenu. 3061720 2 En raison de la relative facilité d'accès et la nature de l'échantillon, l'utilisation de l'ADN libre de toute cellule (autrement nommé ADN circulant) est depuis maintenant quelques années pressentie pour le suivi de la progression ou de la réponse des patients aux traitements anticancéreux (Aung KL et al., Hugo J 2010) ou autres. Le terme de «biopsie liquide» a 5 émergé pour décrire la surveillance de l'évolution génétique de la tumeur à partir du sang (Fatouros IG et al.,ClinBiochem 2010). Les concentrations en ADN circulants reflètent en effet des processus pathologiques mais également physiologiques (Fatouros IG, et al. ClinBiochem 2010). L'ADN extracellulaire circulant peut-être détecté chez les témoins sains (Fatouros IG, et al. ClinBiochem 2010) et 10 atteints d'affections malignes (Oxnard GR et al., Clin Cancer Res 2014 ; Lipson EJ et al., J Immunother Cancer 2014 ; Reinert T et al., Gut 2016 ; ) ou non malignes (Steinman CR. J Clin Invest 1984 ; Galeazzi M, et al. AutoimmunRev 2003). En outre, les traumatismes (Laktionov PP, et al., Nucleosides Nucleotides NucleicAcids 2004), procédures thérapeutiques (Davis GL, Jr., Davis JS., ArthritisRheum 1973) et la gestation (Lo YM et al, 15 1997) peuvent aussi entraîner la libération d'ADN libre dans la circulation. De nombreux facteurs peuvent donc influencer le niveau de l'ADN circulant dans le plasma. Le suivi de la réponse aux traitements par prise de sang régulière présente de réels avantages. Ainsi, si la quantité d'ADN circulant par ml de liquide peut être considérée comme un 20 biomarqueur d'une réponse clinique, la standardisation de la quantité d'ADN circulant extrait d'une extraction à l'autre est primordiale. En plus de la standardisation de la quantité d'ADN extrait, conserver le profil de taille des échantillons d'ADN circulant revêt une importance qui peut s'avérer capitale pour la validation biologique des résultats. En effet, la taille des fragments d'ADN circulants, chez les témoins 25 sains provient essentiellement des cellules apoptotiques. Les longueurs des fragments d'ADN circulant sont généralement de 185 à 200 bp (Giacona MB et al., Pancreas 1998). Cet ADN circulant uniformément tronqué est produit par clivage enzymatique au cours de l'apoptose (Wyllie AH, Nature 1980). En ce qui concerne la taille de l'ADN circulant provenant des cellules malignes, elle varie beaucoup, car outre l'apoptose, la nécrose, l'autophagie sont 30 responsables de la mort des cellules cancéreuses (Jin Z and EI-Deiry WS, Cancer BiolTher 2005). La taille des fragments d'ADN circulant est donc différente entre les individus sains et pathologiques. 3061720 3 Il est important que les techniques d'extraction d'ADN circulant conservent le profil en taille des ADN circulants, en particulier les fragments de petites tailles qui peuvent être éliminées si la proportion du mélange des composants chimiques de l'étape de fixation sur la colonne 5 de silice, varie. La composition du liquide peut également modifier cette proportion. Il est donc primordial de pouvoir vérifier et normaliser l'efficacité de l'extraction des fragments de petite taille, en particulier autour de 100 paires de bases. D'autres paramètres sont également à prendre en compte, notamment le rendement 10 d'extraction d'ADN (quantité totale), le volume d'élution et la concentration de ces ADN circulants. En effet, la quantité d'ADN circulant est directement proportionnelle à la quantité de plasma extrait, Il est donc important d'extraire un maximum de plasma. Le volume total à extraire incluant plasma, protéases et solutions de fixation dépasse en moyenne les 10 ml 15 (pour 4 ml de plasma) et doit être élue sur des colonnes de silice ne dépassant pas 1 à 2 cm de hauteur et 1 cm de diamètre. Il faut noter que plus le diamètre de la colonne est petit, plus le volume d'élution sera réduit et donc l'extrait d'ADN circulant concentré. Par ailleurs, le nombre d'analyse à réaliser sur ce type d'échantillon peut être très important ; il est ainsi primordial d'obtenir des volumes d'élutions qui permettront de réaliser 20 de nombreuses analyses avec des concentrations d'ADN circulant suffisante. Les deux sont antinomiques. Enfin, l'obtention d'une solution concentrée est primordiale car la sensibilité analytique est directement dépendante de la quantité d'ADN circulant analysée. Le volume de liquide à extraire, la concentration et le volume d'élution sont interdépendants. 25 A la connaissance de la Demanderesse, il n'existe pas actuellement de kits et dispositifs d'extraction, d'amplification et de quantification d'ADN, en particulier d'ADN libre de toutes cellules, répondant à ces différentes problématiques. 30 Les inventeurs ont justement mis au point un procédé de détection et de quantification d'ADN libres de toutes cellules ou non, en particulier d'ADN libres de toutes cellules (ADN circulants), comprenant une étape d'extraction dans laquelle sont ajoutés des calibrants autrement nommés standards (fragments d'ADN exogène) permettant de standardiser les 3061720 4 variations d'ADN circulant chez les patients, et de vérifier éventuellement par ailleurs la reproductibilité d'extraction des ADN circulants de petite taille. Par 'calibrants' ou 'standards' selon l'invention, on entend des contrôles internes du procédé 5 de détection et quantification de l'ADN circulant extrait, lesdits calibrants ou standards étant constitués par des fragments d'ADN exogène définis ci-après. Par 'fragment d'ADN exogène', on entend un fragment d'ADN d'une autre espèce que celle l'ADN circulant ; on choisira préférentiellement un fragment d'ADN exogène non humain pour 10 l'extraction d'ADN circulant génomique humain. Par 'ADN circulant', on entend l'ADN libre de toutes cellules. On parlera indifféremment d'ADN libre de toutes cellules ou d'ADN circulant dans le reste de la description. Selon un mode particulier, il s'agira d'ADN circulant humain. 15 Le procédé de détection et quantification d'ADN circulant mettant en oeuvre une étape d'extraction dans laquelle sont ajoutés des calibrants ou standards selon l'invention, présente les avantages suivants en fonction des modes de réalisations décrits ci-après : - Un recouvrement supérieur des ADNs fragmentés pour les applications sensibles ; 20 - Le contrôle du rendement d'extraction par standardisation (contrôle interne exogène ICE grâce au premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases) ; - Le contrôle de l'efficacité de l'extraction pour les tailles proches de 100 paires de bases (LED grâce au second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases); - Une optimisation des rendements à l'élution des ADN circulants (en présence 25 d'albumine ou gélatine); et/ou - Une concentration de l'élution des ADN circulants (ultrafiltration). Elle est aussi avantageuse, notamment pour les modes de réalisation préférés de l'invention, de par sa praticité et le gain de temps grâce des accessoires surmontant les colonnes 30 d'extraction (permettant de charger la totalité du mélange échantillons/solution d'extraction en une fois, ce qui limite les contaminations croisées), son contrôle de qualité interne (milieu de 3061720 5 culture lyophilisé comme échantillon témoin), sa reproductibilité (albumine, gélatine ou substituts à l'étape d'élution), et la concentration des ADN circulants (ultrafiltration). RESUME DE L'INVENTION 5 Un premier objet de l'invention est un procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant au moins : (i) une étape d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un 10 échantillon de fluide biologique dans lequel on a ajouté au moins a) une quantité efficace d'un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases, (ICE), et b) éventuellement une quantité efficace d'un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du 15 premier fragment d'ADN exogène; (ii) une étape d'amplification et quantification de l'ADN libre de toutes cellules et des fragments d'ADN exogènes ICE et/ou LED extraits à l'étape (i), et (iii) une étape de standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait et éventuellement de son profil en taille comprenant : 20 le calcul d'un premier ratio du nombre de copies d'ADN libre de toutes cellules sur le nombre de copies de fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), et éventuellement le calcul d'un second ratio du nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de 25 bases (ICE) sur le nombre de copies du second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de base (LED). Par 'quantité efficace' de fragment d'ADN exogène, on entend un nombre de copies d'ADN exogène par ml d'échantillon de fluide biologique permettant la mise en oeuvre de l'étape de 30 standardisation de la quantité d'ADN circulant extrait et éventuellement de son profil de taille. Selon un mode particulier, le nombre de copies d'ADN exogène par ml d'échantillon de fluide biologique est d'au moins 2 fg (2000 copies) par ml d'échantillon, en particulier va de 2 fg (2000 copies) copies à 2ng (2x109 copies)par ml d'échantillon. 3061720 6 En particulier, on utilisera 20000 copies par ml d'échantillon de plasma. L'étape (i) d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique comprendra généralement successivement une étape de protéolyse dudit 5 échantillon biologique, une étape d'isolation de l'ADN libre circulant, et une étape d'élution, précipitation et éventuellement concentration de l'ADN libre circulant. L'étape (ii) d'amplification et quantification de l'ADN libre de toutes cellules extrait à l'étape précédente sera de préférence réalisée par une méthode de digital PCR, Q-PCR et/ou NGS. 10 L'étape (iii) de standardisation, caractéristique du procédé de l'invention, permet de mesurer de façon simple et fiable la quantité d'ADN libre circulant extrait et ses variations au cours du temps (nouvelles extractions et quantifications à partir d'un échantillon de fluide biologique du même sujet à des temps définis tO, t1, t2...), et éventuellement son profil en taille pour vérifier 15 la reproductibilité de l'extraction d'ADN circulant à la zone de taille spécifique, en particulier de l'ADN circulant de taille autour de 100 paires de bases. Un autre objet de l'invention porte sur un procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt selon 20 l'invention, pour son utilisation dans une méthode d'analyse d'un échantillon biologique d'un sujet d'intérêt susceptible de libérer des ADNs libres de toutes cellules, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer. L'invention porte encore sur un procédé in vitro de diagnostic, pronostic, théranostic, ou de 25 suivi de l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un sujet d'intérêt susceptible de libérer de l'ADN circulant, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer comprenant au moins les étapes suivantes : (i) à un temps tO, détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt 30 selon le procédé de l'invention tel que sus-décrit; (ii) à un temps t1, reproduction de l'étape (i), et 3061720 7 (iii) comparaison du ratio nombre de copies d'ADN circulant sur nombre de copies de fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases obtenu au temps t1 par rapport au même ratio obtenu au temps tO. Les étapes (ii) et (iii) pouvant être reproduites autant de fois que nécessaire (par exemple à 5 t2, t3, t4...) pour suivre l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un sujet d'intérêt, et par voie de conséquence l'effet d'un traitement médical (chirurgie, médicaments, radiothérapies,...) sur ledit sujet. Ces mesures pourront être faites facilement à partir d'un échantillon de sang collecté sur ledit sujet (prise de sang). 10 La durée de temps écoulé entre deux temps de mesure (t0 et t1, t1 et t2...) pourra généralement représenter une ou quelques heures, jours, semaines, mois ou années, en fonction de l'état physiologique du sujet d'intérêt et de l'objectif recherché par la quantification de l'ADN circulant à partir d'un échantillon de fluide biologique dudit sujet. 15 L'homme du métier saura ainsi adapter cette durée de temps écoulé entre deux temps de mesure en fonction de l'état physiologique du sujet d'intérêt et des éventuels traitements médicaux suivis afin de définir les t1, t2 et temps suivants par rapport à un tO donné. Un autre objet de l'invention est un kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un 20 échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant : (i) Au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), et éventuellement un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène ; 25 (ii) Des tampons et enzymes, en particulier un tampon de protéolyse, une enzyme de protéolyse, un tampon de fixation, un tampon de lavage, et un tampon d'élution de l'ADN libre de toutes cellules, (iii) Des dispositifs permettant l'isolation de l'ADN libre de toutes 30 cellules, en particulier des colonnes d'extractions à membrane de silice et avantageusement des colonnes d'extractions surmontées d'accessoires de charge, de préférence des entonnoirs, 3061720 8 (iv) Des plaques multi-puits, en particulier des plaques 24-puits DeepWell de 25 mL (y) Des tubes à vis, de préférence de 1,5 ml, et (vi) Une notice d'utilisation. 5 Selon un mode particulier, les accessoires de charge utilisés à l'étape (iii) sont des accessoires surmontant les colonnes d'extraction et présentant au moins un diamètre supérieur au diamètre de ladite colonne, permettant de charger en une fois la totalité du mélange échantillon/solution d'extraction. En particulier, de tels accessoires permettent de 10 charger dans la colonne des volumes allant de 1m1 à 36m1, préférentiellement de 1m1 à 14m1. Ces accessoires peuvent avoir différentes formes. Selon un mode particulier et préféré, on utilisera comme accessoires permettant de charger la totalité du mélange échantillon/solution d'extraction, des entonnoirs. Par 'solution d'extraction' on entend la solution comprenant les tampons et les enzymes 15 nécessaires à l'étape d'extraction de l'ADN circulant. Selon un mode particulier, le kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention est utilisé en association avec un kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules, fournis ensemble ou séparément. 20 Le kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules comprendra généralement au moins : (i) des amorces sens et antisens spécifiques respectivement de l'ADN libre de toutes cellules du sujet d'intérêt et du ou des fragments d'ADN exogènes tels que définis dans l'invention, pour l'étape d'amplification, 25 (ii) des sondes marquées respectivement pour l'ADN libre de toutes cellules du sujet d'intérêt et pour le ou les fragments d'ADN exogènes tels que définis dans l'invention, pour l'étape de détection et quantification, (iii) des tampons de réaction, (iv) des plaques multi-puits et 30 (y) une notice d'utilisation. L'invention porte encore sur l'utilisation d'au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), éventuellement en combinaison avec un second fragment 3061720 9 d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène, pour leur utilisation dans la standardisation d'une méthode d'extraction et de quantification d'ADN libre de toutes cellules ou non, de préférence d'ADN libre de toutes cellules. 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION PROCEDE DE DETECTION ET/OU QUANTIFICATION D'ADN CIRCULANT L'invention concerne donc un procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de 10 toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant au moins : (i) une étape d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique dans lequel on a ajouté au moins a) une quantité efficace d'un premier fragment d'ADN exogène de 50- 15 2000 paires de bases (ICE), et b) éventuellement une quantité efficace d'un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène; (ii) une étape d'amplification et quantification de l'ADN libre de toutes cellules et 20 des fragments d'ADN exogènes ICE et LED extraits à l'étape (i), et (iii) une étape de standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait et éventuellement de son profil en taille comprenant : - le calcul d'un premier ratio du nombre de copies d'ADN libre de toutes cellules sur le nombre de copies du fragment d'ADN exogène de 50- 25 2000 paires de bases (ICE), et - éventuellement le calcul d'un second ratio du nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène 50-2000 paires de bases (ICE) sur le nombre de copies du second fragment d'ADN exogène 50-150 paires de base (LED). 30 Selon un mode particulier, le fluide biologique est choisi dans le groupe constitué par le sang total, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, l'effluent de la moelle osseuse, la lymphe, le liquide céphalorachidien, le liquide lacrymal, la sueur, le lait, l'humeur aqueuse, le liquide 3061720 10 synovial, le liquide pleural, liquide péritonéal, liquide amniotique, la bile, liquide séminales, expectorations. De préférence, le fluide biologique est le plasma. 5 Les échantillons de plasmas sont généralement préparés à partir de sang complet. Afin de limiter la libération d'ADN cellulaire (cellules circulantes) provoquant la dilution de l'ADN libre de toutes cellules, on utilisera de préférence des protocoles incluant deux centrifugations. Selon un mode préféré, le sang total est collecté, par exemple sur tube des tubes Cell-Free 10 DNA BCT® (Streck), les tubes Roche (Ariosa) et tampon EDTA selon les recommandations des fournisseurs. On réalisera avantageusement : - une ler centrifugation (1200-1600g) à température ambiante (20°C +/- 5°C) réalisée dans une période de 6h maximum après le prélèvement ; le plasma (surnageant) est 15 récupéré sans prélever la galette de cellules en séparation entre le plasma et les hématies ; - une 2ème centrifugation (3000-16000g) à température ambiante (20°C +/- 5°C) ; le plasma est aspiré sans prélever le culot formé. 20 Quels que soient les tubes précités, le plasma peut être conservé à -20°C pour une durée inférieure ou égale à 1 mois ou -80°C pour des durées supérieures à 1 mois. Les principales étapes du procédé selon l'invention sont détaillées ci-après. 25 Extraction d'ADN circulant En particulier, l'étape d'extraction (i) comprendra les étapes suivantes : (il) Protéolyse dudit échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt après ajout dans ledit échantillon d'au moins une quantité efficace d'un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) et éventuellement 30 une quantité efficace d'un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) , 3061720 11 (i2) Isolation de l'ADN libre de toutes cellules, notamment par affinité sur un support de membrane, de préférence un support de membrane de silice dans une colonne d'extraction, (i3) Elution de l'ADN libre de toutes cellules isolé à l'étape (i2) dans une phase 5 aqueuse, (i4) Précipitation de l'ADN libre de toutes cellules, (i5) Avantageusement concentration de l'ADN libre de toutes cellules, (i6) Eventuellement conservation et/ou stockage dudit ADN libre de toutes cellules. 10 Chacune des étapes de la méthode d'extraction est précisée dans la description qui suit. (il) Protéolyse dudit échantillon biologique 15 Le ou les standards (fragments d'ADN exogènes précités), caractérisant le procédé d'extraction, d'amplification et de quantification d'ADN circulant de l'invention, sont ajoutés à l'échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt avant l'étape de protéolyse. On ajoute au moins le premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) et éventuellement le second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) tels 20 que définis selon l'invention. Selon un mode particulier, on utilisera leur mélange. Le premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de base sert au contrôle interne exogène (ICE). L'homme du métier définira la taille du premier fragment d'ADN exogène à utiliser en fonction 25 du sujet d'intérêt dont on souhaite quantifier l'ADN circulant et en fonction de la technique analytique (quantification) disponible. Selon un mode particulier, ce premier fragment d'ADN exogène peut avoir une taille allant de 50 à 200 paires de bases. Selon un autre mode particulier, le premier fragment d'ADN exogène (ICE) est un fragment 30 de préférence de 200 à 1000 paires de base, de préférence encore de 250 à 350 paires de bases. Selon un mode particulier de l'invention, le premier fragment d'ADN exogène est un fragment d'ADN non humain de 300 paires de bases. 3061720 12 Ce standard inter-essais (ICE) permet de standardiser la quantité d'ADN circulant extrait et ses variations inter-essais (et notamment dans le temps pour un même sujet d'intérêt) en calculant le ratio du nombre de copies d'ADN circulant sur le nombre de copies de premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE). Ces valeurs sont obtenues 5 après extraction, amplification et quantification desdits fragments d'ADN exogène, en parallèle de l'amplification et de la quantification de l'ADN circulant, comme décrit ci-après dans la description. La valeur du ratio est exprimée en Unité arbitraire (Grewis). Cette approche permet ainsi de s'affranchir de tout calcul ramenant à des volumes d'éluat et/ou de plasma. 10 Ce premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de base peut être utilisé seul ou en combinaison avec le second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de base, distinct du premier fragment. 15 Le second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de base, distinct du premier fragment, sert au contrôle des fragments de petite taille (LED). Selon un mode particulier, le second fragment d'ADN exogène est un fragment d'ADN exogène de 80-120 paires de bases. Selon un mode particulier de l'invention, le second fragment d'ADN exogène est un fragment 20 d'ADN non humain de 110 paires de bases. Ce second fragment d'ADN exogène (LED) permet de vérifier la reproductibilité d'extraction des ADN circulants à la zone de taille spécifique, autrement dit standardiser le profil en taille de l'ADN circulant extrait, et parer à l'influence de la composition chimique/biologique du plasma sur l'efficacité de l'extraction des fragments de petites tailles. On calcule le ratio du 25 nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) sur le nombre de copies du second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED). L'étape de protéolyse ou hydrolyse des protéines sous l'action d'enzymes est généralement 30 réalisée en présence d'un tampon et d'enzymes. Selon un mode particulier, on utilisera une enzyme (protéinase K) et un tampon de lyse (LYS). L'homme du métier déterminera les quantités d'enzyme et de tampon de lyse à utiliser 3061720 13 en fonction du volume d'échantillon à traiter. Selon un mode particulier, le mélange, une fois agité sous vortex, est mis à incuber à une température d'activation de l'enzyme, en particulier une température de 56°C +/- 5°C pendant 30 minutes à 1 heure sous agitation. 5 Selon un mode particulier, le tampon de lyse contient des sels chaotropes (Hydrochloride de guanidinium) ; ces sels apportent le chao dans les macromolécules et permettent d'écarter les molécules d'eau de la silice et des ADNs une fois les molécules chargées. Il peut se créer un pont favorable à la fixation des ADNs et des standards sur la silice 10 Selon un mode préféré, le procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention, met en outre en oeuvre dans l'étape d'extraction (i) au moins un échantillon témoin constitué de préférence par un lyophilisat de milieu de culture de lignée cellulaire mutée ou non, à réhydrater pour mimer l'échantillon de fluide biologique. Par lignée cellulaire mutée, on entend notamment une lignée cellulaire dont le génome 15 présente des modifications telles que des SNV pour Single Nucleotide Variant, délétions, insertions, CNV pour Copy Number Variation,...) Ce contrôle de qualité du rendement d'extraction permet de vérifier la reproductibilité inter-essais de l'extraction en calculant les 2 mêmes ratios sur cet échantillon témoin, soit respectivement le ratio du nombre de copies d'ADN circulant sur nombre de copies du 20 premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases et le ratio du nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) sur le nombre de copies du seconde fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED), qui ne doivent pas varier d'une série d'extraction à l'autre. 25 L'échantillon témoin selon l'invention subit les mêmes réactions que l'échantillon de fluide biologique du sujet d'intérêt dont on souhaite extraire l'ADN circulant, en particulier l'ajout des standards (fragments d'ADN exogène ICE et LED, extraction, amplification, quantification et contrôle). 30 (i2) Isolation de l'ADN circulant L'isolation de l'ADN circulant peut notamment être réalisée selon l'une des méthodes suivantes : 3061720 14 a. Par affinité de l'ADN circulant pour un support (membrane de silice, billes magnétiques,...), de préférence un support de membrane de silice, ou b. Par méthode d'extraction entre 2 phases liquides non miscibles (Phenol/chloroformes, Trizol, méthodes Piotr Chomczynski et Nicoletta Secchi) 5 c. Par gradient de densité (ex : chlorure de césium...). Selon un mode particulier, on utilisera la méthode d'affinité sur un support de membrane, de préférence un support de membrane de silice dans une colonne d'extraction. De préférence, on utilise des colonnes MIDI selon les recommandations du fournisseur, en 10 présence de tampons d'activation et de fixation. Selon un mode particulier, l'étape d'isolation et de fixation de l'ADN circulant sur le support de membrane de silice consiste à : - appliquer le tampon d'activation des membranes de silice dans chaque colonne MIDI, 15 incuber puis appliquer le vide (-0,4 bar); - ajouter un tampon de fixation par ml de plasma dans chaque échantillon lysé ; - mélanger le contenu du tube par un minimum de 5 aspirations/refoulements ; - mettre en place les entonnoirs sur chaque colonne ; - appliquer le mélange échantillon lysé dans les colonnes MIDI ; 20 - appliquer le vide à -0.4 bar pendant 5 minutes en s'assurant que tout le lysat est bien passé à travers la colonne. Les tampons d'activation et de fixation sont les tampons utilisés dans les protocoles d'extraction usuels. 25 Selon un mode particulier, on utilisera un tampon de fixation Hydrochloride de guanidinium- éthanol. Selon un mode préféré du procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention, la colonne d'extraction à l'étape (i2) d'isolation de l'ADN libre de 30 toutes cellules est surmontée d'un accessoire de charge, de préférence un entonnoir permettant de charger la totalité du mélange échantillon/solution d'extraction soit un volume allant de préférence de 1ml à 14m1. 3061720 15 Cette configuration permet de manipuler en un seul pipetage la totalité (manuel) ou la moitié (automatisé) du mélange plasma- tampon de protéolyse- solution de fixation. L'étape d'isolation et de fixation d'ADN circulant est suivie d'une étape de lavage de la 5 membrane selon les recommandations classiques du fournisseur (plusieurs cycles de lavage, application du vide à -0,4 bar pendant 5 minutes). (i3) Elution de l'ADN circulant Selon un mode particulier, avant de procéder à l'élution de l'ADN circulant, on applique le 10 vide, par exemple au minimum -0.6 bar pendant 10 minutes, pour sécher complètement la membrane de toute trace d'éthanol. On ajoute ensuite un tampon d'élution selon les recommandations du fournisseur. Selon un mode préféré du procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes 15 cellules selon l'invention, l'étape (i3) d'élution d'ADN libre de toutes cellules isolé à l'étape (i2) est réalisée en présence d'un tampon d'élution supplémenté en albumine, gélatine, ou substituts. Ceci permet avantageusement d'augmenter le rendement d'extraction et de stabiliser la reproductibilité du volume élue. 20 Selon un premier mode, l'étape d'élution est réalisée en présence d'un tampon d'élution supplémenté en albumine, telle que la BSA (Bovine Albumine Serum), de préférence à 0,5 mg/ml d'éluat. Selon un autre mode préféré, l'étape d'élution est réalisée en présence d'un tampon d'élution supplémenté en gélatine, telle que celle commercialisée par SIGMA sous la 25 dénomination commerciale Prionex®, de préférence utilisé à 1%. (i4) Précipitation et (i5) concentration de l'ADN circulant Selon un mode préféré du procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention, l'étape (i5) de concentration de l'ADN pur libre de toutes cellules est 30 réalisée sur une plaque de concentration par ultrafiltration. Cette étape de concentration pourra être réalisée par exclusion de la phase aqueuse, et avantageusement sans ajout de sels chaotropes pour la fixation et le lavage alcoolique de l'ADN circulant. 3061720 16 Le volume à concentrer peut aller de 20-300p1, le volume à récupérer peut aller de 25-300p1. (i6) Conservation et/ou stockage de l'ADN circulant Les ADN circulants obtenus doivent être conservés à 5°C ± 3°C si la dPCR (Digital PCR) ou 5 ddPCR (Droplet Digital PCR) ou Q-PCR (Quantitative PCR) est réalisée en suivant, sinon les ADN circulants doivent être stockés à -80 °C pour une conservation plus longue. Selon un mode particulier préféré de l'invention, l'étape d'extraction d'ADN libre de toutes cellules est réalisée selon les étapes suivantes : 10 (il) Protéolyse du plasma, et en parallèle de l'échantillon témoin (CQI), dans lesquels on a ajouté le ou les standards (fragments d'ADN exogène ICE et LED), avec de la Protéinase K et des tampons de lyse contenant des sels chaotropes Hydrochloride de guanidinium ; (i2) isolation d'ADN libre de toutes cellules sur une membrane de silice, en présence d'un tampon de fixation Hydrochloride de guanidinium-éthanol, ajouté en grand volume afin de 15 fixer les DNA à la silice, le % d'éthanol influant sur la taille des fragments retenus. Le volume est ajouté sur la colonne de silice équipée d'un entonnoir amovible en 1 étape en manuel et 2 étapes en automatique. 3 étapes de lavage sont nécessaires à l'élimination des inhibiteurs et des sels. Ensuite un séchage de 10minutes permet d'éliminer l'éthanol présent sur la membrane de silice ; 20 (i3) élution de l'ADN libre par une première étape dans laquelle l'ADN libre est désorbé grâce à un tampon sans EDTA faiblement tamponné a pH 8,5. Avantageusement, l'étape d'extraction selon l'invention ne prévoit pas d'addition d'ARN entrainant qui pourrait interférer avec certaines applications ultérieures comme l'amplification avec la méthode NGS. L'élution est de préférence réalisée en tampon supplémenté en albumine ou gélatine qui optimise le 25 volume et le rendement d'ADN extrait. (i4) et (i5) l'éluat peut être concentré par ultrafiltration si nécessaire, pour des applications en aval. Des procédés avec étape d'extraction pour des tubes collecte de sang Cell-Free DNA BCT® 30 de Streck ont également été développés. Les réactifs stabilisants des tubes BCT nécessitent une protéolyse prolongée afin d'isoler efficacement les ADN circulants. 3061720 17 Amplification et quantification de l'ADN circulant Cette étape d'amplification et de quantification de l'ADN libre de toutes cellules et des fragments d'ADN exogènes (standards ICE et LED) extraits à l'étape précédente, peut être réalisée par les méthodes bien connues de l'homme du métier. 5 Selon des modes préférés elle pourra être réalisée par une méthode de digital PCR, de QPCR (PCR quantitative en temps réel) et/ou Nouvelles Générations de Séquenceurs à ADN (NGS), selon les préconisations des fournisseurs. 10 On utilisera préférentiellement la digital PCR (dPCR) pour sa capacité à multiplexer les amplifications, sa sensibilité, sa quantification absolue, sa haute résolution pour les variations de quantité obtenue grâce à la loi de Poisson. On utilisera la Q-PCR en substitut dans le cas où la dPCR n'est pas disponible. 15 Enfin on utilisera plutôt le NGS en utilisant sa capacité de profondeur de lecture pour quantifier les ADN exogènes (ICE et LED) et l'ADN génomique. Selon un mode particulier, les ADN seront quantifiés de manière absolue à l'aide d'un système dPCR comprenant : 20 Un système d'amplification de l'ADN circulant extrait comprenant des amorces sens et antisens d'amplification d'une région du génome humain et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection de l'ADN circulant amplifié ; Un système d'amplification du premier fragment d'ADN exogène (ICE) extrait 25 comprenant des amorces sens et antisens d'amplification dudit premier fragment et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection dudit premier fragment d'ADN exogène amplifié (ICE) ; Eventuellement un système d'amplification du second fragment d'ADN exogène (LED) extrait comprenant des amorces sens et antisens d'amplification dudit 30 second fragment et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection dudit second fragment d'ADN exogène amplifié (LED). 3061720 18 Les valeurs absolues quantifiées pour chaque ADN (ADN circulant, fragments d'ADN exogène ICE et LED), respectivement extrait à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt ou d'un échantillon témoin, permettront de calculer les ratios selon l'étape de standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait et éventuellement de 5 son profil en taille décrite ci-après. Standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait L'étape de standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait et 10 éventuellement de son profil en taille, caractéristique du procédé de détection et de quantification d'ADN circulant selon l'invention comprend, pour les ADNs extraits de l'échantillon de fluide biologique et avantageusement en parallèle, pour les ADNs extraits de l'échantillon témoin : - le calcul d'un premier ratio du nombre de copies d'ADN libre de toutes 15 cellules sur le nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50- 2000 paires de bases (ICE), et éventuellement le calcul d'un second ratio du nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène 50-2000 paires de bases (ICE) sur le nombre de copies du second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de base (LED), 20 On calcule ainsi après chaque extraction, amplification et quantification d'ADN, pour l'échantillon de fluide biologique (ex : plasma) et pour l'échantillon témoin, le Grewis (premier ratio) et l'on vérifie éventuellement l'efficacité de l'extraction des fragments de petites taille autour 80-120bases (second ratio). 25 La valeur du premier ratio (Grewis) sert de référence qui peut être comparée entre chaque extraction est ainsi définir les variations de quantité d'ADN circulant chez un sujet donné au cours du temps. Si la valeur du premier ratio (Grewis) augmente entre deux extractions, cela signifie que la 30 quantité d'ADN circulant chez le sujet a augmenté entre la première et la deuxième extraction. Si la valeur du premier ratio (Grewis) diminue entre deux extractions, cela signifie que la quantité d'ADN circulant chez le sujet a diminué entre la première et la deuxième extraction. 3061720 19 La valeur du second ratio ne doit en revanche pas varier d'une extraction à l'autre. Les valeurs chiffrées n'ont pas d'importance ; on choisira par exemple une valeur du second ratio égale à 1, soit des proportions du premier fragment d'ADN exogène (ICE) et du second 5 fragment d'ADN exogène (LED) identiques. Si ce second ratio augmente, cela signifie que les ADN de petites tailles n'ont pas été extraits correctement, et que les résultats obtenus sur la quantification de l'ADN circulant sont biaisés. 10 UTILISATIONS Un autre objet de l'invention porte sur un procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt selon l'invention, pour son utilisation dans une méthode d'analyse d'un échantillon biologique d'un 15 sujet d'intérêt susceptible de libérer des ADNs libres de toutes cellules, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer. Ce procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention pourra notamment être utilisé dans des méthodes d'analyse in vitro d'échantillons 20 de fluide biologique (ex : plasma sanguin) de sujet d'intérêt pour des applications de diagnostic, pronostic, théranostic, ou de suivi de l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un individu. Selon un mode particulier préféré, ce procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention sera utilisé pour le suivi de l'évolution d'un état 25 physiologique spécifique d'un individu sous traitement, par exemple un traitement chirurgical, ou un traitement médicamenteux (ex : drogues), ou un traitement par radiothérapie ou tout autre procédé provoquant la mort cellulaire induisant la variation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules. 30 A titre d'exemple, on pourra mesurer, pour un sujet d'intérêt susceptible de libérer de l'ADN circulant, par exemple un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer, et à partir d'un échantillon de fluide biologique (plasma), à un temps tO de sa vie, la valeur du premier ratio (Grewis). 3061720 20 Cette valeur à tO peut avoir une valeur biologique de diagnostic d'une pathologie, pronostic d'un événement médical (métastase, reprise de la maladie, décès,...) et/ou de réponse à un traitement médical (chirurgie, médicaments, radiothérapies,...). On pourra suivre ainsi, en mesurant ce ratio (Grewis) à différents temps t1, t2, t3... au cours 5 de la vie dudit sujet d'intérêt, les variations de ce ratio, indiquant une augmentation ou une diminution de la quantité d'ADN circulant chez ledit sujet. L'invention concerne donc également un procédé in vitro de diagnostic, pronostic, théranostic, ou de suivi de l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un sujet d'intérêt 10 susceptible de libérer de l'ADN circulant, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer comprenant les étapes suivantes : (i) à un temps tO, détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt selon le procédé de l'invention tel que sus-décrit; 15 (ii) à un temps t1, reproduction de l'étape (i), et (iii) comparaison du ratio nombre de copies d'ADN circulant sur nombre de copies de fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases obtenu au temps t1 par rapport au même ratio obtenu au temps tO. 20 Les étapes (ii) et (iii) pouvant être reproduites autant de fois que nécessaire (par exemple à t2, t3, t4...) pour suivre l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un sujet d'intérêt, et par voie de conséquence l'effet d'un traitement médical (chirurgie, médicaments, radiothérapies,...) sur ledit sujet. 25 L'invention porte encore sur l'utilisation d'au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases, de préférence de 200 à 1000 paires de base, de préférence encore de 250 à 350 paires de bases (ICE), éventuellement en combinaison avec un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment 30 d'ADN exogène, pour leur utilisation dans la standardisation d'une méthode d'extraction et de quantification d'ADN libre de toutes cellules ou non, de préférence d'ADN libre de toutes cellules. 3061720 21 KITS D'EXTRACTION, D'AMPLIFICATION-QUANTIFICATION DES ADNs CIRCULANTS Un autre objet de l'invention est un kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant : 5 (i) Au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases, de préférence de 200 à 1000 paires de base, (ICE), et éventuellement un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène ; (ii) Des tampons et enzymes, en particulier un tampon de protéolyse, une enzyme 10 de protéolyse, un tampon de fixation, un tampon de lavage, et un tampon d'élution de l'ADN libre de toutes cellules, (iii) Des dispositifs permettant l'isolation de l'ADN libre de toutes cellules, en particulier des colonnes d'extractions à membrane de silice et avantageusement des colonnes d'extractions surmontées d'accessoires de charge, de préférence des 15 entonnoirs, (iv) Des plaques multi-puits, en particulier des plaques 24-puits DeepWell de 25 mL (y) Des tubes à vis, de préférence de 1,5m1, et (vi) Une notice d'utilisation. 20 Selon un mode particulier, le kit d'extraction d'ADN circulant selon l'invention comprend : (i) Au moins un premier fragment d'ADN exogène non humain de 300 paires de base et éventuellement un second fragment d'ADN exogène non humain de 110 paires de bases, tous deux étant des séquences d'ADN codant pour le précurseur d'une protéase à serine 25 pro-agrégante de Cerastes cerastes (ii) Des tampons et enzymes: un tampon de protéolyse avantageusement supplémenté en albumine sérique bovine (BSA) et/ou Gélatine de porc purifiée (Prionex®), une enzyme de lyse, de préférence la protéinase K, un tampon de fixation, un tampon de lavage, un tampon d'élution, 30 (i) Des colonnes d'extractions à membrane de silice, des plaques 24-puits DeepWell de 25 mL, des entonnoirs, des tubes à vise de 1,5 mL et (iii) Une notice d'utilisation. 3061720 22 Selon un mode particulier, un kit selon l'invention pourra être caractérisé par les paramètres définis dans le tableau 1 suivant : 5 Tableau 1 Technologie Technologie de membrane de silice Format Colonnes Midi avec entonnoir amovible Echantillon 1 à 10m1 de plasma, en particulier 1 à 5m1 de plasma Tubes de prélèvement sanguin EDTA, Cell-Free DNA BCT® (Streck) , Roche Taille de fragments k 50 bp Rendement De 1 a 1000 ng Volume d'élution avant concentration 100-200 pl Volume d'élution après concentration 50 pl Temps de préparation 2h15 minutes/ 24préparations Selon un mode particulier, il s'agira d'un kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir de plasma sanguin. Ce kit permet la purification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un volume allant jusqu'à 10 10 ml de plasma, en particulier 5m1 de plasma. Le kit contient des colonnes Midi, de préférence avec des accessoires de charge desdites colonnes, de préférence des entonnoirs permettant de charger en une seule fois la totalité du mélange échantillon/solution d'extraction et permet le traitement de 1 à 24 échantillons en parallèle. 15 La fixation, le lavage, le séchage et l'élution des ADN libres de toutes cellules sont faits avec un dispositif de chambre à vide, et des support de colonnes (Starter S et Midi ) 3061720 23 L'extraction se fait avantageusement sans ADN ou ARN entrainant (formation d'un complexe avec l'ADN afin de facilité son isolement). En effet, ces ADN ou ARN entrainant induisent la surestimation des concentrations d'ADN libres de toutes cellules lorsque l'on utilise des techniques de quantification d'ADN total, double ou simple brin. 5 Selon un mode particulier, le kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention est utilisé en association avec un kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules, fournis ensemble ou séparément. 10 Selon un premier mode de réalisation, le kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules selon l'invention et le kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules sont conditionnés ensemble. Selon un premier mode de réalisation, le kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules selon 15 l'invention et le kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules sont conditionnés séparément. Le kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules comprendra généralement au moins : 20 des amorces sens et antisens spécifiques respectivement de l'ADN libre de toutes cellules du sujet d'intérêt et du ou des fragments d'ADN exogènes tels que définis dans l'invention, pour l'étape d'amplification, (ii) des sondes marquées respectivement pour l'ADN libre de toutes 25 cellules du sujet d'intérêt et pour le ou les fragments d'ADN exogènes tels que définis dans l'invention pour l'étape de détection et quantification, (iii) des tampons de réaction, (iv) des plaques multi-puits et 30 (y) une notice d'utilisation. La présente invention sera détaillée dans les exemples illustratifs et non limitatifs suivants. 3061720 24 EXEMPLES Les échantillons de plasmas sont préparés selon le protocole suivant : - On prépare les plasmas à partir de sang total collecté sur tube BCT (streck) ou 5 Cell-Free DNA collection tube (Roche) ou EDTA. Pour les tubes EDTA, le plasma doit être préparé dans les 4 heures qui suivent la prise de sang ; - On centrifuge les tubes à 1600 x g pendant 10 minutes à température ambiante ; - On collecte le surnageant (correspondant au plasma) puis on transfère dans 10 un tube conique de 15 ml ; - On centrifuge le plasma récupéré à 4500 g pendant 10 minutes à température ambiante ; - On transfère le plasma dans un tube conique et mesure le volume ; - On ajuster le volume de plasma au millilitre supérieur si nécessaire avec du 15 tampon phosphate puis on le transfère dans un tube de 50 ml ou on le place dans une DeepWell de 25 ml. Exemple 1 : Extraction standardisée d'ADN circulant à partir d'un échantillon de plasma 20 1.1 Protéolyse des plasmas La protéolyse des échantillons de plasma tels que préparés ci-dessus est réalisée selon le protocole suivant : - En plus des échantillons de plasma, un échantillon témoin CQI (lyophilisat de milieu de 25 culture de lignée cellulaire de poumon humain référencée NCI-H1975, CRL-5908) autrement nommé contrôle de qualité d'extraction selon l'invention est utilisé pour contrôler la qualité d'extraction ; - A chaque échantillon de plasma et échantillon témoin, on ajoute 30 pl de protéinase K liquide par ml d'échantillon ; 30 - On ajoute ensuite dans chaque échantillon par ml (plasma et échantillon témoin) 20000 copies du premier fragment d'ADN exogène de 300 paires de bases (ICE) représenté par la SEQ ID N°1 décrite ci-dessous et 20000 copies du second fragment d'ADN exogène 3061720 25 de 110 paires de bases (LED) représenté par la SEQ ID N°2 décrite ci-dessous, tous deux étant des séquences d'ADN codant pour le précurseur d'une protéase à serine pro-agrégante de Cerastes cerastes ; - On mélange au vortex brièvement puis on incube 5 minutes à température ambiante ; 5 - On ajoute ensuite dans chaque échantillon 400 pl de tampon de lyse (LYS) par ml de plasma ou de témoin; - On mélange au vortex brièvement et on incube à 56°C pendant 30 minutes sous agitation ou 1 h pour les tubes Streck. SEQ ID N°1 : 10 CCTAATGACACTTATCCCAAAGTCCCTCATTGTGCTAACATTAACATACTTGAGCATTCGC TGTGTGAAAGAGCTTACAATGATCTTTCGGCGAGTAGCAGAACATTGTGTGCAGGTATC GAAAAAGGAGGCATAGATACATGTAAGGGTGACTCTGGGGGACCCCTCATCTGTAATGG ACAAATCCAGGGCATTGTATCTTGGGGAGATGAAGTTTGTGGTAAACCTAATAAGCCTG GCGTCTATACCAAGGTCTTTGATTATACTGACTGGATCCGGAACATTATTGCAGGAAATA 15 CA SEQ ID N° 2 : GCTGAACAAACCAGTTAACAACAGTACACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAGTC CTCCCAGTGTGGGCTCAGATTGCCGTATTATGGGATGGGGCACAATCACAT 20 1.2 Isolation de l'ADN circulant sur les colonnes : L'isolation et la fixation de l'ADN circulant sur les colonnes est réalisée selon le protocole suivant : - Pendant l'incubation de la lyse, on applique 1 ml de tampon d'activation des 25 membranes de silice (ACTIVB) dans chaque colonne MIDI, on incube 1 minute puis on applique le vide à -0.4 bar pendant 1 minute ; - On ajoute 2 ml de tampon de fixation (BB) par ml de plasma dans chaque échantillon lysé ; - On mélange le contenu du tube par un minimum de 5 aspirations/refoulements ; 30 - On met en place les entonnoirs sur chaque colonne ; - On applique le mélange échantillon lysé dans les colonnes MIDI ; - Enfin, on applique le vide à -0.4 bar pendant 5 minutes en s'assurant que tout le lysat est bien passé à travers la colonne. 3061720 26 1.3 Lavage de la membrane : L'étape de lavage de la membrane est réalisée selon le protocole suivant : - On ajouter 4 ml de tampon de lavage de lavage Wash 1 dans chaque colonne, on incube 5 1 minute ; - On applique le vide à -0.4 bar pendant 5 minutes ; - On ajoute 2 ml de tampon de lavage Wash 2 dans chaque colonne, on incube 1 minute ; - On applique le vide à -0.4 bar pendant 2 min ; - On ajoute 2 ml de tampon Wash 2 dans chaque colonne, on incube 1 minute ; 10 - Enfin on applique le vide à -0.4 bar pendant 2 minutes. 1.4 Elution de l'ADN circulant Avant de procéder à l'élution de l'ADN circulant, on appliquer le vide, au minimum -0.6 bar pendant 10 minutes pour sécher complètement la membrane de toute trace d'éthanol. 15 L'élution de l'ADN circulant est ensuite réalisée selon le protocole suivant : - On ajoute ensuite 150 pl de tampon d'élution supplémenté extemporanément en Prionex à 1% (ELU) et préalablement chauffé à 70°C dans chaque colonne ; - On incube 5 minutes à température ambiante ; 20 - On appliquer le vide à -0.5 bar pendant 30 secondes ; - Enfin on applique à nouveau le vide à -0.5 bar pendant 10 sec 1.5 Concentration des échantillons d'ADN circulant pour une analyse unique La concentration de l'ADN circulant est réalisée selon le protocole suivant : 25 - On charge la totalité des éluats dans la plaque d'ultrafiltration ; - On applique le vide à -0.5 bar 10 minutes (passage complet du volume) ; - On ajoute 50 pl de tampon d'élution dans chaque puits contenant les échantillons ; - On agite pendant 5 minutes à température ambiante ; - Enfin on transfère les échantillons dans un nouveau tube préalablement labélisé. 3061720 27 1.6 Stockage et/ou conservation des ADN circulants extraits Les ADN circulants obtenus doivent être conservés à 5°C ± 3°C si la ddPCR ou Q-PCR est réalisée en suivant, sinon les ADN circulants doivent être stockés à -80 °C pour une conservation plus longue. 5 Exemple 2 : Détection et quantification d'ADN circulant avec contrôle interne (ICE) La détection de l'ADN circulant extrait à l'exemple 1 et sa quantification est réalisée par droplet digital PCR (ddPCR) selon le protocole suivant, pour un volume réactionnel de 20 pl/échantillon : 10 - on met 10 pL de ddPCR Supermix pour sondes (no dUTP) (BioRad) - on ajoute 0,1 pL d'une amorce sens dirigée contre le premier fragment d'ADN exogène pour le contrôle interne exogène ICE (TGG-ACA-AGG-ACA-TCA-TGC-TGA-T correspondant à la SEQ ID N°3) à 100 pM ; - on ajoute 0,1 pL d'une amorce antisens dirigée contre le premier fragment d'ADN exogène 15 pour le contrôle interne exogène ICE (GAC-TGG-AAG-GCA-AGC-TGA-GA correspondant à la SEQ ID N°4) à 100 pM ; - on ajoute 0,06 pL de Sonde marquée HEX et BHQ1 dirigé contre le control interne exogène ICE (AAC-CAG-TTA-ACA-ACA-GTA-CAC-ACA-TCG-CGC correspondant à la SEQ ID N°5) à 100 pM ; 20 - on ajoute 0,1 pL d'une amorce sens dirigée contre le gène RPP-30 humain (GAT-TTG- GAC-CTG-CGA-GCG correspondant à la SEQ ID N°6) à 100 pM ; - on ajoute 0,1 pL d'une amorce antisens dirigée contre le gène RPP-30 humain (GAG-CGGCTG-TCT-CCA-CAA-GT correspondant à la SEQ ID N°7) à 100 pM ; - on ajoute 0,06 pL de Sonde marquée FAM et MGB dirigé contre le gène RPP-30 humain 25 (CTG-ACC-TGA-AGG-CTC-T correspondant à la SEQ ID N°8) à 100 pM ; - on ajoute 1,48 pl de H2O de qualité Biologie Moléculaire ; - on ajoute 8 pL de l'ADN extrait (ADN circulant extrait et fragment d'ADN exogène); - on homogénéise le mélange et on le charge dans un puit de DG8 cartridges (Biorad) - on ajoute 70 pL d'huile pour la génération de gouttelettes dans la DG8 cartridges (Biorad) 30 - on met en place le joint DG8 gasket (Biorad) et on génère les gouttelettes en utilisant le Droplet Generator de Biorad ; - on transfère l'échantillon dans une plaque 96-puits, on la scelle et on réalise une PCR temps-fini selon le programme ci-dessous : 3061720 28 Etape 1 : 95°C 10 min Etape 2: 94°C 30 sec Etape 3 : 60°C 1 min Répéter étapes 2 et 3 40 fois 5 Etape 4 : 98°C 10 minutes Etape 5 : 12°C 1 sec A la fin de la PCR, on transfère la plaque 96-puits dans le lecteur de gouttelette Biorad et on effectue la lecture des gouttelettes. 10 On réalise la même étape d'amplification et quantification pour les ADNs extraits de l'échantillon de plasma et pour les ADNs extraits de l'échantillon témoin. Les résultats obtenus pour le gène RPP30 représentent le nombre de copies d'ADN circulant extrait. Les résultats obtenus pour le fragment d'ADN exogène extrait (ICE) représentent le 15 nombre de copies de ICE extrait. Le calcul du Grewis s'effectue en divisant la valeur obtenue pour RPP30 par la valeur obtenue pour ICE. Cette valeur sert de valeur de référence que l'on peut comparer entre chaque extraction pour un même sujet et ainsi déterminer la variation de la quantité d'ADN libre dudit sujet au cours du temps. 20 On obtient un ratio (Grewis) représentatif de la quantité d'ADN circulant dans l'échantillon du sujet d'intérêt. Exemple 3 : Détection et quantification d'ADN circulant avec contrôle du profil de taille 25 (LED) La détection de l'ADN circulant extrait à l'exemple 1 et sa quantification est réalisée par droplet digital PCR (ddPCR) selon le protocole suivant, pour un volume réactionnel de 20 pl/échantillon : - on met 10 pL de ddPCR Supermix pour sondes (no dUTP) (BioRad) 30 - on ajoute 0,1 pL d'une amorce sens dirigée contre le premier fragment d'ADN exogène pour le contrôle interne exogène ICE (TGG-ACA-AGG-ACA-TCA-TGC-TGA-T correspondant à la SEQ ID N°3) à 100 pM ; 3061720 29 - on ajoute 0,1 pL d'une amorce antisens dirigée contre le premier fragment d'ADN exogène pour le contrôle interne exogène ICE (GAC-TGG-AAG-GCA-AGC-TGA-GA correspondant à la SEQ ID N°4) à 100 pM ; - on ajoute 0,06 pL de Sonde marquée HEX et BHQ1 dirigé contre le control interne exogène 5 ICE (AAC-CAG-TTA-ACA-ACA-GTA-CAC-ACA-TCG-CGC correspondant à la SEQ ID N°5) à 100 pM ; - on ajoute 0,1 pL d'une amorce sens dirigée contre le second fragment d'ADN exogène pour contrôle d'extraction des fragments de petite taille LED (ATG-ACA-CTT-ATC-CCA-AAGTCC-CTC correspondant à la SEQ ID N°9) à 100 pM ; 10 - on ajoute 0,1 pL d'une amorce antisens dirigée contre le second fragment d'ADN exogène pour contrôle d'extraction des fragments de petite taille LED (CAA-TGT-TCT-GCT-ACTCGC-CGA correspondant à la SEQ ID N°10) à 100 pM ; - on ajoute 0,06 pL de Sonde marquée FAM et MGB dirigé contre le control interne exogène LED (CAT-ACT-TGA-GCA-TTC-GCT-GT correspondant à la SEQ ID N°11) à 100 pM ; 15 - on ajoute 1,48 pl de H2O de qualité Biologie Moléculaire ; - on ajoute 8 pL de l'ADN extrait (ADN circulant extrait et second fragment d'ADN exogène); - on homogénéise le mélange et on le charge dans un puit de DG8 cartridges (Biorad) - on ajoute 70 pL d'huile pour la génération de gouttelettes dans la DG8 cartridges (Biorad) - on met en place le joint DG8 gasket (Biorad) et on génère les gouttelettes en utilisant le 20 Droplet Generator de Biorad ; - on transfère l'échantillon dans une plaque 96-puits, on la scelle et on réalise une PCR temps-fini selon le programme ci-dessous : Etape 1 : 95°C 10 min Etape 2: 94°C 30 sec 25 Etape 3 : 60°C 1 min Répéter étapes 2 et 3 40 fois Etape 4 : 98°C 10 minutes Etape 5 : 12°C 1 sec A la fin de la PCR, on transfère la plaque 96-puits dans le lecteur de gouttelette Biorad et on 30 effectue la lecture des gouttelettes. On réalise les mêmes étapes d'extraction, d'amplification et quantification pour les ADNs extraits de l'échantillon de plasma et pour les ADNs extraits de l'échantillon témoin. 3061720 30 Les résultats obtenus pour le fragment d'ADN exogène extrait (ICE) représentent le nombre de copies de ICE extrait. Les résultats obtenus pour le second fragment d'ADN exogène extrait (LED) représentent le nombre de copies de LED extrait. 5 Le calcul du contrôle d'extraction des fragments de petites tailles s'effectue en divisant la valeur obtenue pour ICE par la valeur obtenue pour LED. On obtient des ratios ICE/LED proches de 1, qui doivent rester stables d'une extraction à l'autre. Si ce ratio augmente, cela signifie que les ADN de petites tailles n'ont pas été extraits correctement, et que les résultats obtenus sur la quantification de l'ADN circulant sont 10 biaisés. On peut également réaliser une amplification et quantification en utilisant simultanément les 3 cibles (ADN circulant, ICE et LED) telles que décrites respectivement dans les exemples 2 et 3 ci-dessus. REVENDICATIONS1. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant au moins : (i) une étape d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique dans lequel on a ajouté au moins a) une quantité efficace d'un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), et b) éventuellement une quantité efficace d'un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène ; (ii) une étape d'amplification et quantification de l'ADN libre de toutes cellules et desdits fragments d'ADN exogènes ICE et LED extraits à l'étape (i), et (iii) une étape de standardisation de la quantité d'ADN libre de toutes cellules extrait et éventuellement de son profil en taille comprenant : le calcul d'un premier ratio du nombre de copies d'ADN libre de toutes cellules sur le nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), et éventuellement le calcul d'un second ratio du nombre de copies du premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) sur le nombre de copies du second fragment d'ADN exogène 50-150 paires de base (LED). 2. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluide biologique est choisi dans le groupe constitué par le sang total, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, l'effluent de la moelle osseuse, la lymphe, le liquide céphalorachidien, le liquide lacrymal, la sueur, le lait, l'humeur aqueuse, le liquide synovial, le liquide pleural, liquide péritonéal, liquide amniotique, la bile, liquide séminales, expectorations, de préférence le plasma. 3061720 32 3. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape d'extraction (i) comprend les étapes suivantes : (il) Protéolyse dudit échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt dans 5 lequel on a ajouté au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE) et éventuellement un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène, (i2) Isolation de l'ADN libre de toutes cellules, notamment par affinité sur un 10 support de membrane, de préférence un support de membrane de silice dans une colonne d'extraction, (i3) Elution de l'ADN libre de toutes cellules isolé à l'étape (i2) dans une phase aqueuse, (i4) Précipitation de l'ADN libre de toutes cellules, 15 (i5) Avantageusement concentration de l'ADN libre de toutes cellules, (i6) Eventuellement conservation et/ou stockage dudit ADN libre de toutes cellules. 4. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir 20 d'un échantillon de fluide biologique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la colonne d'extraction à l'étape (i2) d'isolation de l'ADN libre de toutes cellules est surmontée d'un accessoire de charge, de préférence un entonnoir. 5. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir 25 d'un échantillon de fluide biologique selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que l'étape (i3) d'élution d'ADN libre de toutes cellules isolé à l'étape (i2) est réalisée en présence d'un tampon d'élution supplémenté en albumine ou gélatine. 6. Procédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir 30 d'un échantillon de fluide biologique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'étape (i5) de concentration de l'ADN libre de toutes cellules est réalisée sur une plaque de concentration par-ultrafiltration. 3061720 33 7. Utilisation duprocédé de détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans une méthode d'analyse d'un échantillon biologique d'un sujet d'intérêt susceptible de libérer des ADNs libres de toutes 5 cellules, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer. 8. Procédé in vitro de diagnostic, pronostic, théranostic, ou de suivi de l'évolution d'un état physiologique spécifique d'un sujet d'intérêt susceptible de libérer de l'ADN circulant, en particulier un sujet atteint ou susceptible de développer un cancer 10 comprenant les étapes suivantes : (i) à un temps tO, détection et/ou de quantification d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide biologique d'un sujet d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; (ii) à un temps t1, reproduction de l'étape (i), et 15 (iii) comparaison du ratio du nombre de copies d'ADN circulant sur nombre de copies de fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases obtenu au temps t1 par rapport au même ratio obtenu au temps tO. 9. Kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules à partir d'un échantillon de fluide 20 biologique d'un sujet d'intérêt, comprenant : (i) Au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), et éventuellement un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN exogène; 25 (ii) Des tampons et enzymes, en particulier un tampon de protéolyse, une enzyme de protéolyse, un tampon de fixation, un tampon de lavage, et un tampon d'élution de l'ADN libre de toutes cellules, (iii) Des dispositifs permettant l'isolation de l'ADN libre de toutes cellules, en particulier des colonnes d'extractions à membrane de silice 30 et avantageusement des colonnes d'extractions surmontées d'accessoires de charge, de préférence des entonnoirs, (iv) Des plaques multi-puits, en particulier des plaques 24-puits DeepWell de 25 mL (v) Des tubes à vis, de préférence de 1,5m1, et 3061720 34 (vi) Une notice d'utilisation. 10. Utilisation du kit d'extraction d'ADN libre de toutes cellules selon la revendication 9, en association avec un kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes 5 cellules, fournis ensemble ou séparément, ledit kit d'amplification et de quantification d'ADN libre de toutes cellules comprenant au moins : (i) des amorces sens et antisens spécifiques respectivement de l'ADN libre de toutes cellules du sujet d'intérêt et du ou des fragments d'ADN exogènes tels que définis dans la revendication 1, 10 (ii) des sondes marquées respectivement pour l'ADN libre de toutes cellules du sujet d'intérêt et pour le ou les fragments d'ADN exogènes tels que définis dans la revendication 1, (iii) des tampons de réaction (iv) des plaques multi-puits et 15 (y) une notice d'utilisation. 11. Utilisation d'au moins un premier fragment d'ADN exogène de 50-2000 paires de bases (ICE), éventuellement en combinaison avec un second fragment d'ADN exogène de 50-150 paires de bases (LED) distinct du premier fragment d'ADN 20 exogène, dans la standardisation d'une méthode d'extraction et de quantification d'ADN libre de toutes cellules.