FR 3050992 A1 20171110 FR 1654098 A 20160506 1 Mutants du facteur X La présente invention concerne des mutants du facteur X, et leur utilisation pour le traitement des troubles de la coagulation sanguine. Le facteur X est une protéine présente dans le sang. Cette protéine joue un rôle important dans la cascade de la coagulation. La coagulation du sang est un processus complexe qui permet d'éviter l'écoulement du sang par les vaisseaux endommagés. Aussitôt qu'un vaisseau est brisé, les éléments responsables de la coagulation interagissent entre eux pour former un bouchon, le clou plaquettaire, à l'endroit où le vaisseau est brisé. Les facteurs de la coagulation sont requis pour tenir le clou plaquettaire en place et stabiliser le caillot. La formation d'un caillot normal s'effectue en quatre étapes : Étape 1 Le vaisseau sanguin est endommagé. Étape 2 Le vaisseau sanguin se contracte de façon à restreindre l'apport de sang vers la zone lésée. Étape 3 Les plaquettes adhèrent à l'espace sous-endothélial exposé lors de la lésion du vaisseau ainsi qu'aux parois des vaisseaux sanguins stimulées. Les plaquettes s'étalent, c'est ce que l'on appelle « l'adhésion plaquettaire ». Ces plaquettes étalées libèrent des substances qui activent d'autres plaquettes avoisinantes de sorte qu'elles s'agglomèrent au siège de la lésion afin de former le clou plaquettaire. C'est ce que l'on appelle « l'agrégation plaquettaire ». Étape 4 La surface des plaquettes activées constitue ainsi une surface sur laquelle la coagulation du sang peut s'effectuer. Les protéines de la coagulation qui circulent dans le sang (dont le facteur X) sont activées à la surface des plaquettes et forment un caillot de fibrine. Ces protéines de la coagulation (c'est-à-dire, les facteurs I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII et 30 XIII, ainsi que le facteur de Von Willebrand) fonctionnent en une réaction en chaîne, i.e. la cascade de la coagulation. 3050992 2 Le facteur X sous forme activée (Xa) intervient plus particulièrement dans l'activation de la prothrombine (facteur II) en thrombine (facteur lia), notamment lorsqu'il est complexé avec le co-facteur V activé pour former le complexe prothrombinase. Ce facteur est un élément essentiel dans la cascade de la coagulation. 5 Lorsque ce facteur fait défaut, des saignements se manifestent, comme une épistaxis (saignements de nez), une hémarthrose (épanchement de sang dans une cavité articulaire) ou des saignements gastro-intestinaux. La déficience en facteur X est extrêmement rare. Sa transmission est autosomique récessive, et sa prévalence est de 1/1 10 000000. L'activation du FX intervient : - soit très précocement lors de l'étape d'initiation de la cascade de la coagulation par le complexe facteur VIIa/facteur tissulaire, dans une réaction peu efficace qui 15 conduit à la formation de trace de thrombine ; - soit lors de l'étape d'amplification de la cascade de la coagulation issue d'un rétrocontrôle positif effectué par les traces de thrombine conduisant à l'activation des facteurs VIII et IX. Ces deux derniers facteurs sont manquants chez les hémophiles A et B, causant ainsi un 20 trouble hémorragique qui peut être fatal sans traitement. L'absence de ces facteurs ne permet pas de générer des quantités suffisantes de facteur X activé, pour juguler l'hémorragie. Les 42 premiers acides aminés de la chaîne légère du facteur X (résidus 1-42 de SEQ ID 25 NO :5) représentent le domaine « Gla », domaine de liaison aux phospholipides. Le domaine « Gla » contient 11 résidus d'acide Glutamique (Glu) tous ou en partie modifiés de façon post-traductionnelle (gamma-carboxylés) pour donner des acides ycarboxyglutamique (Gla). Le facteur X est ainsi une protéine de la coagulation dont l'activité biologique dépend du degré de la gamma-carboxylation de son domaine « Gla ». L'ensemble des protéines « Gla » ou protéines à domaine Gla sont dépendantes de la vitamine K. La vitamine K est une vitamine liposoluble impliquée dans la gamma- 3050992 3 carboxylation des résidus protéiques de glutamates pour former des résidus de gammacarboxyglutamate. Les résidus de gamma-carboxyglutamate sont essentiels pour l'activité biologique de toutes les protéines possédant des domaines Gla, notamment via une haute affinité de liaison aux ions calcium. 5 La présence des résidus Glu gamma-carboxylés (également appelés résidus Gla) dans les protéines dépendantes de la vitamine K s'est ainsi avérée essentielle pour leur activité fonctionnelle. Ainsi, la présence de résidus Glu sur le facteur X et leur niveau de gamma-carboxylation est essentiel à l'activité fonctionnelle du facteur X activé. 10 Ainsi il existe un besoin pour un facteur X modifié pouvant être activé par la thrombine, et possédant un taux de gamma-carboxylation qui permettrait d'avoir une coagulation efficace en absence de facteur VIII et/ou de facteur IX, par l'utilisation directe des traces de thrombine générées lors de l'initiation de la coagulation. 15 Les inventeurs ont identifié des mutants spécifiques du facteur X (appelés également facteurs X variants), qui sont efficacement activés par la thrombine, permettant ainsi de restaurer la coagulation en absence de facteur VIII, de facteur IX. De préférence, les mutants spécifiques du facteur X identifiés par les inventeurs peuvent également restaurer la coagulation en absence de facteur X. En effet, comme démontré en 20 exemples, ces mutants du facteur X peuvent être activés par la thrombine, et permettent une coagulation efficace, et ce, même en absence de facteur VIII et/ou de facteur IX et/ou, de préférence, de facteur X endogène. Ces mutants du facteur X présentent avantageusement un fort taux de gamma-carboxylation. Par fort taux de gammacarboxylation, on entend un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 20%,de 25 préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %. La présente invention concerne une protéine qui est un variant du facteur X comprenant 30 une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale, optionnellement le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 3050992 4 De préférence, la protéine comprend à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 5 La présente invention concerne de préférence une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant au moins une mutation A, A', B, C ou C', dans laquelle : la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et 10 KATXATLSPR, la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, 15 KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1, 20 la mutation C' consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et 25 ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. De préférence, la présente invention concerne une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant au moins 30 une mutation consistant en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et 3050992 5 LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1 (i.e. au moins la mutation B ci-dessus), où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence 5 SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur X. Un autre objet de l'invention est un polynucléotide codant pour ladite protéine. Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit 10 polynucléotide. Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant ledit vecteur d'expression ou ledit polynucléotide. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ladite protéine comme médicament. En particulier, ladite protéine peut être utilisée pour le traitement des troubles de la 15 coagulation sanguine, notamment les troubles hémorragiques, tels que les hémophilies A, B et C (déficit en facteur XI), voire les déficits en facteur X voire encore des besoins en coagulation d'urgence pour se substituer au Facteur VIIa. Lorsqu'une réponse procoagulante puissante et rapide est requise, ladite protéine peut être utilisée en combinaison avec d'autres molécules hémostatiques, telles que le facteur VIIa et/ou le 20 fibrinogène, voire en association avec des composés procoagulants (transfusion de plaquettes, mélange procoagulant comme FEIBA, Kaskadil, Kanokad etc), qui pourront renforcer l'efficacité du traitement. Tel qu'il est utilisé ici, les termes «protéine» et «polypeptide» sont utilisés ici de 25 manière interchangeable et se réfèrent à une séquence d'acides aminés ayant plus de 100 acides aminés. De préférence, la protéine consiste en une séquence d'acides aminés ayant entre 100 et 1000 acides aminés, de préférence entre 120 et 600 acides aminés. La présente invention concerne donc une protéine qui est un variant du facteur X 30 comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale, optionnellement le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 3050992 6 De préférence, la protéine comprend à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 5 Un variant du facteur X selon l'invention présente avantageusement un fort taux de gamma-carboxylation. Par fort taux de gamma-carboxylation, on entend un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 20%,de préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %. 10 Le calcul dudit taux de gamma-carboxylation peut être réalisé par toute technique classique permettant de détecter puis quantifier les résidus Gla, telle que la technique ELISA utilisant un anticorps anti-Gla pour la capture des facteurs X gamma-carboxylés. Par exemple, la mesure de densité optique obtenue pour un facteur X variant selon 15 l'invention peut être rapportée à la mesure de densité optique obtenue pour une même quantité de facteur X plasmatique, considérée comme la mesure de référence du taux de gamma-carboxylation à 100%. De préférence, un variant de facteur X selon l'invention comprend au moins 2 résidus 20 Glu gamma-carboxylés (i.e. résidus Gla) parmi 11 Glu, au moins 3 résidus gamma- carboxylés parmi 11 Glu, au moins 4 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 5 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 6 résidus gammacarboxylés parmi 11 Glu, au moins 7 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 8 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 9 résidus gamma- 25 carboxylés parmi 11 Glu, au moins 10 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, ou 11 résidus gamma-carboxylés. Préférentiellement, un variant de facteur X selon l'invention comprend au moins 10 des 11 résidus gamma-carboxylables susmentionnés, présents sur le domaine Gla de la chaine légère du facteur X, gamma-carboxylés. Ainsi, de préférence, un variant de facteur X selon l'invention comprend 10 résidus Glu gamma- 30 carboxylés (10 résidus Gla). Plus préférentiellement, un variant de facteur X selon l'invention comprend 11 résidus Glu gamma-carboxylés (11 résidus Gla). 3050992 7 Selon un aspect particulier, l'invention concerne une composition de variants du facteur X selon l'invention, présentant avantageusement un fort taux de gamma-carboxylation au sein de la composition. Par fort taux de gamma-carboxylation au sein de la composition, on entend un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 20%, de 5 préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation au sein d'une composition de facteur X plasmatique, considérée à 100 %. Dans ce cas, une composition de variants du facteur X selon l'invention peut comprendre une population de facteur X gamma-carboxylés homogène pour le nombre 10 de résidus Gla. De préférence, une composition de variants du facteur X selon l'invention comprend une population de facteurs X gamma-carboxylés chacun comprenant 10 résidus Gla. De préférence, une composition de variants du facteur X selon l'invention comprend une population de facteurs X gamma-carboxylés chacun comprenant 11 résidus Gla. Alternativement, une composition de variants du facteur X 15 selon l'invention peut comprendre une population hétérogène de facteur X gamma- carboxylés, comprenant au moins deux populations de facteur X gamma-carboxylés ne comprenant pas le même nombre de résidus gamma-carboxylés Gla. Par exemple, une composition de variants du facteur X selon l'invention peut comprendre 50 % de variants comprenant 10 résidus Gla et 50 % de variants comprenant 11 résidus Gla. 20 La présente invention concerne de préférence une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant au moins une mutation A, A', B, C ou C', dans laquelle : la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ 25 ID NO :1 par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, 30 la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, 3050992 8 la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C' consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, 5 FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence 10 SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. De préférence, la présente invention concerne une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant au moins une mutation consistant en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, 15 KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur 20 X. Une telle protéine selon l'invention est un facteur X muté, qui est efficace dans le traitement de troubles de la coagulation. 25 Le facteur X, appelé également facteur de Stuart-Power, est codé par le gène F10 et se réfère à la sérine protéase EC3.4.21.6. Le facteur X est composé d'une chaîne lourde, de 306 acides aminés, et d'une chaîne légère, de 139 acides aminés. Le facteur X est une protéine de 488 acides aminés, constitué d'un peptide signal, d'un propeptide, et des chaînes légère et lourde. 30 Le facteur X humain peut être trouvé dans UniProtKB sous le numéro d'accession P00742. Sa structure primaire est illustrée en figure 1. 3050992 9 La protéine est traduite sous forme de prépropeptide. Après clivage du peptide signal, le propeptide est finalement coupé, résultant en une chaîne légère et une chaîne lourde (respectivement de 142 et 306 acides aminés) (zymogène). Suite au déclenchement de la coagulation, la chaîne lourde est finalement activée par clivage du peptide d'activation, 5 pour ne contenir que 254 acides aminés aminés (les 52 premiers acides aminés sont clivés lors du traitement): c'est la chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6). Le prépropeptide de facteur X humain correspond à SEQ ID NO: 4. La chaîne lourde du facteur X humain non activé correspond à SEQ ID NO: 1, et la chaîne légère correspond à SEQ ID NO: 5. Le peptide d'activation de la chaîne lourde correspond à SEQ ID 10 NO :3, et comprend 52 acides aminés. Le peptide signal correspond à SEQ ID NO :7, et comprend 31 acides aminés. Le propeptide naturel du facteur X correspond à SEQ ID NO : 8, et comprend 9 acides aminés. SEQ ID NO: 2 est identique aux acides aminés 1 à 182 de SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 1 est identique aux acides aminés 183 à 488 de SEQ ID NO: 4. 15 La chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6) correspond à la SEQ ID NO :1, dans laquelle le peptide d'activation représenté par la SEQ ID NO :3 a été clivé. Dans le cadre de l'invention, par « propeptide naturel du facteur X », on entend de préférence un variant du propeptide naturel du facteur X humain représenté par la séquence SEQ ID NO :9 qui comprend 9 acides aminés. 20 La protéine selon l'invention est un mutant (ou variant) de facteur X. La mutation préférée selon l'invention consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ 25 ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée. De préférence, la mutation selon l'invention consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1. La séquence SEQ ID NO :1 comprenant au moins une mutation selon l'invention est également appelée « séquence mutée de SEQ ID NO :1 ». 30 Dit en d'autres termes, de préférence, la séquence SEQ ID NO :1 comprenant au moins une mutation selon l'invention (« mutation B ») consiste en la séquence SEQ ID NO :3, fusionnée à son extrémité C-terminale à une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, 3050992 10 KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, elle-même fusionnée à son extrémité C-terminale à la séquence SEQ ID NO :6. Lorsque la mutation consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR, la séquence 5 mutée de SEQ ID NO :1 correspond à SEQ ID NO :11. La séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant une mutation A, A', B, C ou C', peut comprendre en outre au moins une mutation d'au moins un acide aminé n'altérant pas l'activité fonctionnelle de la protéine selon l'invention. De préférence, la séquence 10 mutée de SEQ ID NO :1 comprenant une mutation A, A', B, C ou C' et comprenant en outre au moins une mutation additionnelle d'au moins un acide aminé n'altérant pas l'activité fonctionnelle, présente au moins 80% d'identité, au moins 81% au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au 15 moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant uniquement une mutation A, A', B, C ou C'. La protéine selon l'invention comprend de préférence, entre le peptide signal de 20 séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO :1, une séquence intermédiaire. De préférence, la séquence intermédiaire est fusionnée à son extrémité N-terminale, au peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et à son extrémité C-terminale, à la séquence mutée de 25 SEQ ID NO :1. De préférence, la séquence intermédiaire est la séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5. La protéine selon l'invention comprend ainsi de préférence, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du 30 propeptide naturel du facteur X, puis - la séquence SEQ ID NO :5, puis - ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1. 3050992 11 Plus particulièrement, la protéine selon l'invention comprend, dans le sens N- à C-terminal, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis la séquence SEQ ID NO :5, puis la séquence mutée de SEQ ID NO :1. 5 La protéine selon l'invention comprend de préférence, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis 10 - la séquence SEQ ID NO :5, puis - la séquence SEQ ID NO :11. Ainsi, la protéine selon l'invention comprend de préférence, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, fusionné à la séquence SEQ ID NO :17. 15 Le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est différent du propeptide naturel du facteur X. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est celui d'une protéine vitamine K dépendante. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est choisi parmi le propeptide de la protéine S, 20 le propeptide de la protéine Z, le propeptide du FIX, le propeptide de l'une des protéines GAS6, BGP, MGP, et PRGP1, PRGP2, TMG3 et TMG4, le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, incluant leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées. Par « version modifiée », on entend que le propeptide utilisé est tronqué, et comprend éventuellement l'insertion d'un ou plusieurs 25 acides aminés, par exemple à son extrémité N-terminale. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est celui d'un facteur de coagulation différent du facteur X. Ainsi, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est préférentiellement le propeptide naturel d'un facteur de coagulation différent du facteur X. De préférence, le propeptide est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le 30 propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l'invention correspond à l'isoforme A du propeptide du facteur VII (ou « FVIIv 1 ») et a pour 3050992 12 séquence SEQ ID NO :14. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l'invention correspond à l'isoforme B du propeptide du facteur VII (ou « FVIIv2 ») et a pour séquence SEQ ID NO :15. 5 Plus préférentiellement, le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 et SEQ ID NO :16. Plus préférentiellement, le propeptide est SEQ ID NO :14. De préférence, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide 10 différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21. Plus préférentiellement, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est SEQ ID NO :19. 15 De préférence, la protéine selon l'invention comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24 et SEQ ID NO :25. Plus préférentiellement, la protéine selon l'invention comprend, de préférence consiste en, la séquence SEQ ID NO :23. La protéine selon l'invention peut également être fusionnée en C-terminal à au moins un 20 fragment d'immunoglobuline de type sauvage, optionnellement muté. On entend, par fragment d'immunoglobuline de type sauvage, un fragment choisi parmi les fragments Fc de type sauvage et les fragments scFc de type sauvage, optionnellement mutés. Par "fragment Fc", on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. 25 CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, la région Fc d'une IgG1 30 se compose de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'indice EU ou équivalent dans Kabat. 3050992 13 Par « fragment scFc » (« single chain Fc »), on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le linker peut notamment être -(GGGGS)n-, où n est un entier de 1 à 3. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. Le fragment scFc a de 5 préférence la séquence SEQ ID NO :42 (ce qui correspond à SEQ ID NO :36 fusionnée en C-terminal à -GGGGS- fusionnée en C-terminal à SEQ ID NO :37) éventuellement suivie d'une lysine. La fusion de la protéine selon l'invention à au moins un fragment d'immunoglobuline de type sauvage (notamment un fragment Fc ou scFc) en C-terminal, permet d'améliorer la stabilité et la rétention de la protéine dans l'organisme, 10 et ainsi sa biodisponibilité ; elle permet également d'améliorer sa demi-vie dans l'organisme. En outre, elle peut permettre de simplifier la purification de la molécule obtenue par le ciblage ou par l'utilisation du fragment Fc lors d'une des étapes de la purification. De préférence, le fragment Fc de type sauvage est choisi parmi la séquence SEQ ID NO :36 et la séquence SEQ ID NO :37 éventuellement suivie d'une lysine en 15 C-terminal (226 ou 227 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO :36; 231 ou 232 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO: 37). Le fragment Fc correspondant à la séquence SEQ ID NO :36 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d'une IgG de type sauvage et la région charnière partielle en N-terminal (DKTHTCPPCP, SEQ ID NO :38). Le fragment correspondant à la séquence SEQ ID 20 NO :37 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d'une IgG de type sauvage et la région charnière entière en N-terminal (séquence EPKSSDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :39, variante de la séquence naturelle présente sur une IgG de type sauvage, de séquence EPKSCDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :81). De préférence, la protéine selon l'invention fusionnée à un fragment Fc de type sauvage en C-terminal a pour séquence 25 SEQ ID NO :40 éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :41 éventuellement suivie d'un codon codant pour une lysine en C-terminal. De préférence, la protéine selon l'invention fusionnée à un fragment scFc de type sauvage en C-terminal a pour séquence SEQ ID NO :43 éventuellement suivie d'une 30 lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :44 éventuellement suivie d'un codon codant pour une lysine en C-terminal. 3050992 14 Le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage utilisé selon l'invention peut être muté selon la technologie « knobs-into-holes ». Cette technologie est décrite dans la demande W096/27011 de Genentech : elle consiste en l'obtention d'hétérodimères, qui comprennent et s'apparient de préférence au niveau d'un domaine 5 constant CH3 d'anticorps. Ces hétérodimères, de préférence 2 fragments Fc ou un scFc, comprennent différentes mutations ponctuelles, qui induisent une interface « protubérance-dans-cavité » (en anglais « knobs-into-holes »). Une première mutation sur le premier monomère induit une protubérance, et une seconde mutation sur le second monomère induit une cavité, de sorte que l'hétérodimère s'apparie de façon 10 préférentielle. De préférence, le premier monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation T366Y, et le second monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation Y407T. 15 Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit: SEQ ID NO: Protéine 1 Chaîne lourde de facteur X humain (306 acides aminés), comprenant le peptide d'activation 2 Peptide signal, propeptide, et chaîne légère de facteur X humain (182 acides aminés) 3 Peptide d'activation de la chaîne lourde (52 acides aminés) 4 Prépropeptide de facteur X humain (488 acides aminés) 5 Chaîne légère de facteur X humain (142 acides aminés) 6 Chaîne lourde du Facteur X humain activé (FXa) (254 acides aminés) 7 Peptide signal du facteur X humain (31 acides aminés) 8 Propeptide du facteur X humain (9 acides aminés) 9 Variant du propeptide du facteur X humain (9 acides aminés) 10 FX-WT (488 acides aminés) 3050992 15 11 Mutant de SEQ ID NO :1 comprenant l'insertion de DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53 (mutation selon l'invention) 12 Aptamère anti-Gla 13 Propeptide de la thrombine (19 acides aminés) 14 Propeptide du facteur VII version 1 (« FVIIvl ») (40 acides aminés) 15 Propeptide du facteur VII version 2 (« FVIIv2 ») (18 acides aminés) 16 Propeptide de la protéine C (24 acides aminés) 17 FX-IIa (458 acides aminés) 18 Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la thrombine 19 Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIvl 20 Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIv2 21 Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la protéine C 22 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :18 fusionnée à SEQ ID NO :17) 23 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :19 fusionnée à SEQ ID NO :17) 24 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :20 fusionnée à SEQ ID NO :17) 25 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :21 fusionnée à SEQ ID NO :17) 26 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :7 27 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :13 28 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :14 29 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :15 30 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :16 31 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :17 3050992 16 32 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :22 33 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :23 34 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :24 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :25 36 Fragment Fc sauvage, éventuellement suivi d'une lysine 37 SEQ ID NO :36 comprenant la région charnière entière en N-terminal, éventuellement suivie d'une lysine 38 Région charnière partielle en N-terminal 39 Région charnière entière en N-terminal Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment Fc sauvage SEQ ID NO :36, éventuellement suivie d'une lysine 41 Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :40, éventuellement suivi d'un codon codant pour une lysine 42 Fragment scFc sauvage, éventuellement suivie d'une lysine 43 Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment scFc sauvage SEQ ID NO :42, éventuellement suivie d'une lysine 44 Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :43 éventuellement suivi d'un codon codant pour une lysine VKORC1 humaine sauvage 46 Acide nucléique codant pour la sous-unité SEQ ID NO :45 47 Peptide signal de la prothrombine 48 Peptide signal du facteur VII 49 Peptide signal de la protéine C à 80 Amorces des exemples 81 Région charnière entière native en N-terminal 3050992 17 Un autre objet de l'invention est un acide nucléique (polynucléotide) codant pour ladite protéine. De préférence, l'acide nucléique est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32 à 35. 5 Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit polynucléotide codant pour ladite protéine, ou une cassette d'expression comprenant ledit polynucléotide. Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation selon l'invention peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à la séquence d'acide nucléique. Les éléments de 10 contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de la séquence d'acide nucléique. Des exemples d'éléments de contrôle d'expression incluent notamment des systèmes lac, le promoteur du phage lambda, les promoteurs de levure ou les promoteurs viraux. D'autres éléments opérationnels peuvent être incorporés, comme une séquence de tête, des codons de terminaison, des signaux de 15 polyadénylation et des séquences nécessaires pour la transcription et la traduction ultérieure de la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. Il sera compris par l'homme de l'art que la combinaison correcte des éléments de contrôle d'expression dépend du système hôte choisi. Il sera également entendu que le vecteur d'expression doit contenir les éléments supplémentaires nécessaires pour le transfert et la réplication 20 ultérieure du vecteur d'expression contenant la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. De tels vecteurs sont facilement construits en utilisant des méthodes conventionnelles ou disponibles dans le commerce. 25 De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un vecteur polycistronique comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, et optionnellement un polynucléotide codant pour la furine, et/ou un polynucléotide codant pour un fragment Fc dans le cadre 30 de la production de variants selon l'invention fusionnés à un fragment Fc. La co- expression de la furine permet d'optimiser le clivage naturel à l'intérieur de la cellule au niveau des sites naturels de clivage présents sur le facteur X (RRKR). De préférence, le 3050992 18 vecteur d'expression utilisé est un bicistronique comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage. 5 La sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage est la sous-unité catalytique du complexe ; c'est une protéine de 163 acides aminés. La séquence de cette sous-unité humaine sauvage peut être trouvée dans UniProt sous le numéro d'accession Q9BQB6 (SEQ ID NO :45). L'acide nucléique codant pour cette protéine a pour séquence SEQ ID NO :46. Cette protéine est présente 10 dans le réticulum endoplasmique des cellules. Le polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR peut également être un polynucléotide codant pour une VKOR mutée. De préférence, alternativement, les vecteurs d'expression utilisés sont autant de vecteurs que de polynucléotides à exprimer, l'un comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, un autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme 15 VKOR citée ci-dessus, optionnellement un autre encore comprenant un polynucléotide codant pour la furine, et/ou un autre encore comprenant un polynucléotide codant pour un fragment Fc ou scFc dans le cadre de la production de variants selon l'invention fusionnés à un fragment Fc ou scFc. 20 Un autre objet de l'invention est une cellule recombinante comprenant un vecteur d'expression tel que décrit ci-dessus, ou un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Selon l'invention, des exemples de cellules hôtes qui peuvent être utilisées sont des cellules eucaryotes, comme les cellules animales, végétales, d'insectes et de levure ; et des cellules procaryotes, comme E. coli. Les moyens par lesquels le vecteur portant le 25 gène peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAE-dextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression permettant une expression dans les cellules eucaryotes sont utilisés. Des exemples de tels vecteurs 30 comprennent les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, adénovirus, virus de l'herpès, virus de la vaccine, virus de la variole, le poliovirus, lentivirus, les vecteurs d'expression bactériens ou des plasmides tels que pcDNA5. Les lignées cellulaires eucaryotes 3050992 19 préférées comprennent les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK notamment HEK293 (ATCC # CRL1573), les cellules BHK, les cellules PerC6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. De préférence, les cellules utilisées sont des cellules HEK. 5 Un autre objet de l'invention est un procédé de production d'une protéine selon l'invention, ladite protéine comprenant une chaîne légère (de préférence SEQ ID NO :5), comprenant : a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, dans une 10 cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence en présence de vitamine K; 15 b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant, 20 -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d' aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X. 25 Toutes conditions de culture bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour la culture de la cellule hôte à l'étape b). Par exemple, tout mode de production peut être choisi, la culture pouvant être ainsi réalisée en mode de production type batch, fedbatch, perfusion continue ou XD process, sans être limitatif. 30 La concentration du surnageant optionnellement réalisée à l'étape d) peut être réalisée par toute technique bien connue, telle que par passage sur des cassettes de 3050992 20 concentration, par filtration tangentielle, ou par utilisation de colonnes de chromatographies permettant de concentrer le produit. Un autre objet de l'invention est un procédé de production d'une protéine selon 5 l'invention, ladite protéine comprenant une chaîne légère (de préférence SEQ ID NO :5), comprenant : a) l'expression de deux vecteurs d'expression, l'un comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR citée ci-dessus, dans une cellule- 10 hôte, de préférence une cellule HEK, de préférence en présence de vitamine K; b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, 15 -la concentration du surnageant, -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d' aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X. 20 Les deux procédés cités ci-dessus permettent avantageusement l'obtention de mutants de facteur X selon l'invention présentant un taux de gamma-carboxylation identique à celui du facteur X plasmatique, avoisinant les 100%. Les aptamères utilisés dans les procédés décrits ci-dessus sont notamment ceux décrits 25 dans la demande de brevet W02011/012831. En particulier, l'aptamère utilisé a la séquence suivante : 5' CCACGACCTCGCACATGACTTGAAGTAAAACGCGAATTAC 3' (SEQ ID NO: 12). De façon avantageuse, cet aptamère se lie spécifiquement aux formes biologiquement 30 actives de facteur X. Ainsi, les procédés de production d'une protéine selon l'invention, comprenant une étape de purification utilisant une colonne d' aptamères décrits ci-dessus, permettent l'obtention de formes biologiquement actives de facteur X. 3050992 21 La protéine selon l'invention peut être produite dans le lait d'animaux transgéniques. Dans ce cas, selon un premier aspect, l'expression du polynucléotide codant pour la protéine selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou 5 un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et le polynucléotide contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre le gène et le promoteur. L'animal transgénique utilisé est capable non seulement de produire la protéine désirée, 10 mais également de transmettre cette capacité à sa descendance. La sécrétion de la protéine dans le lait facilite la purification et évite l'utilisation de produits sanguins. L'animal peut ainsi être choisi parmi la souris, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache. La protéine selon l'invention peut être utilisée en tant que médicament. Par conséquent, 15 la protéine selon l'invention peut être introduite dans une composition pharmaceutique. En particulier, la protéine selon l'invention peut être utilisée pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment des troubles hémorragiques. La composition pharmaceutique de l'invention peut être combinée avec des excipients 20 pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique de la présente invention peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intraoculaire, intracérébrale, transdermique, locale ou rectale. Le principe 25 actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les 30 implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale. 3050992 22 De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. 11 peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou 5 de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables. Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris 10 l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et 15 les champignons. Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes. 20 Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action 25 de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions 30 d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients 3050992 23 énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles 5 pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, 10 mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, 15 sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaC1 isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité. 20 La composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée dans un mélange thérapeutique comprenant environ 0.0001 à 1.0 milligrammes, soit environ 0.001 à 0.1 milligrammes, soit environ de 0.1 à 1.0 milligrammes, voire environ 10 milligrammes par dose ou plus. Des doses multiples peuvent également être administrées. Le niveau 25 de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique 30 utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle. 3050992 24 La protéine selon l'invention peut également être utilisée comme produit d'une thérapie génique ou cellulaire. A cet effet, la présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, ledit 5 polynucléotide étant tel que décrit ci-dessus. Ce vecteur d'expression peut être utilisé comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique. Ce vecteur d'expression peut également être utilisé comme médicament de thérapie cellulaire : dans ce cas, il est destiné à être injecté ex vivo à un échantillon de cellules de patient, avant leur réinjection. 10 Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention. 15 Légende des figures Figure 1 : Structure primaire du facteur X humain Figure 2 : Vecteur bicistronique OptiHEK-VKOR-FXIIa 20 Figure 3 : Vecteur final FVIIv1-psFX-IIaf2 Figure 4: Evaluation du niveau de gamma-carboxylation des différents FX variants 25 Figure 5 : Evaluation des FX après purification 2 tg de produit/piste ont été déposés. A, SDS-PAGE des FX plasmatiques (piste 2), FX-IIa-F2 de CHO immunopurifié (piste 4) et FX-IIa-F2 de CHO aptamopurifié (piste 3). 30 B, SDS-PAGE des FX plasmatiques (piste 2) et FX-IIa-F2 de HEK aptamopurifié (piste 3). En piste 1 : marqueurs de poids moléculaires ou MW (les valeurs en kDa sont 3050992 25 indiquées sur la gauche de la figure). NR : produits non réduits; DTT-R : produits réduits au DTT. Figure 6 : Activation des FX variants par la fraction RVV-X 5 FX activé (FXa) plasmatique (0), FX plasmatique (a), FVIIv1-psFX-IIa-F2 issu de HEK aptamopurifié (0), FX-IIa-F2-VKOR issu de HEK aptamopurifié (o), FVIIv 1- psFX-IIa-F2 issu de HEK aptamopurifié (A). Figure 7: Activation des FX variants par le complexe FVIIa/Facteur tissulaire (FT) 10 FXa plasmatique (0), FX plasmatique (a), FX-IIa-F2-VKOR aptamopurifié issu de HEK (o), FVIIv1-psFX-IIa-F2 aptamopurifié issu de HEK (A). Figure 8: Génération de thrombine par les FX modifiés en plasma déficient en FVIII 15 La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (0); signal obtenu en plasma déficient en FVIII (0) ; en présence de 0,1 U/m1 de FVIII recombinant (o); en présence de 1 U/m1 de FVIII recombinant (a); en présence de 10 tg/ml (A) ou 20 tg/ml (-) de 20 FVIIv1-psFX-IIa-F2 aptamopurifié issu de HEK. Exemple 1: Génération des vecteurs d'expressions contenant les propeptides modifiés 25 Construction d'un vecteur d'expression bicistronique exprimant un FX modifié et la VKOR humaine Un vecteur d'expression non commercial (OptiCHO) a été utilisé pour insérer, par ligation In Fusion au niveau des sites de restriction NheI-SwaI un polynucléotide codant pour le FX modifié. Brièvement, le vecteur d'expression OptiCHO a été digéré par les 30 enzymes de restriction NheI-SwaI puis purifié sur gel à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey Nagel). 3050992 26 Le polynucléotide FX modifié a été obtenu par PCR d'assemblage en utilisant comme matrice un vecteur contenant un polynucleotide codant pour le FX sauvage. Les amorces utilisées sont -5'FXWT : ACCAGCTGCTAGCAAGCTTGCCG (SEQ ID NO :50) et 5 -3'FX-2b : GTCAGGCCCTCGGCCAGGAAGTCCCTAGTCAGATTGTTATCGCCTCTTTCAG GC (SEQ ID NO :51) pour la première PCR, et -5'FX- lb AGGGCCTGACCCCTAGGATCGTGGGAGGACAGGAGTGCAAGGA (SEQ ID NO :52) et 10 -3'FX-SwaI GAAACTATTTAAATGGATCCTCACTTGCCGTCAATCAGC (SEQ ID NO :53) pour la seconde PCR. Le fragment d'intérêt obtenu par PCR a ensuite été cloné par ligation In Fusion dans le vecteur OptiCHO digéré au préalable au niveau des sites de restriction NheI et SwaI. 15 La séquence polynucleotidique codant pour la VKOR humaine obtenue par synthèse de gène avec optimisation de codon pour Homo sapiens. a été extraite d'un vecteur parental (OptiHEK-v3-VKOR) avec l'ensemble de l'unité promotrice (enhancer CMV, promoteur RSV, polynucleotide, signal de terminaison BGH poly A) par digestion AscI - SpeI. Elle a été introduite dans le vecteur construit précédemment par ligation sur les 20 mêmes sites de restriction AscI - SpeI. La VKOR humaine contenait en position C-terminale un tag hexahistidine. Le vecteur final obtenu contenant 2 unités de transcription (vecteur bicistronique codant pour le FX-modifié d'une part et la VKOR humaine d'autre part) a été nommé OptiHEK-VKOR-FXIIa (Figure 2). 25 Construction des vecteurs d'expression bicistronique exprimant la VKOR humaine et un FX modifié contenant un peptide signal et/ou un propeptide différent de celui du FX wt Préparation du vecteur d'expression final pour la ligation 30 Le vecteur bicistronique optiHEK-VKOR-FXIIa qui contient l'unité de transcription (UT) codant pour le FX-modifié d'une part et pour la VKOR humaine d'autre part a été digéré par les enzymes de restriction SpeI-SwaI permettant d'obtenir 2 fragments de 3050992 27 6904 et 3510 pb respectivement. Le fragment de 6904pb (vecteur digéré) a été purifié sur gel à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey Nagel). Préparation d'une UT promotrice permettant l'expression du FX modifié 5 A partir d'un vecteur contenant un polynucleotide codant pour le FX modifié, l'unité promotrice du FX a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces : 3UTFX : GGTGGCGGCAAGCTTGCTAGC (SEQ ID NO :54) et 5UTFX : CCTTGGGCAATAAATACTAGTGGCGTTAC (SEQ ID NO :55). L'amplicon obtenu avec la polymérase Kappa Hifi a ensuite été digéré par les enzymes 10 de restriction NheI et SpeI pour obtenir un fragment final de 1983pb. Le fragment a été purifié sur gel d' agarose et extrait à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey Nagel). Préparation des inserts peptide signal et propeptide pour l'expression des FX variants 15 Le peptide signal (PS) et le propeptide du FX-WT ont été remplacés par ceux de la prothrombine ou du FVII Isoforme A ou du FVII Isoforme B ou de la protéine C. Pour cela la même stratégie a été appliquée à chaque fois (dans le cas de la protéine C, 3 amorces ont été utilisées pour réaliser la PCR d'assemblage): - le peptide signal et le propeptide d'intérêt ont été obtenus par PCR à partir d'un 20 vecteur contenant les séquences nucléotidiques correspondantes en utilisant respectivement les amorces suivantes : - prothrombine : amorces 5PSth : AAGCTTGCCGCCACCATGGCTCACGTCCGAGGGCTG (SEQ ID NO :56) et 25 3PSth : CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGCTCTCCGCACCCGCTGCAGC(SEQ ID NO :57) - FVII isoforme A: 30 amorces 5PSFVII : AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO :58) et 3050992 28 3PSFVII : CAGGAAAGAGTTGGCCCTTCTCCTTCTATGCAGCACTCCATG(SEQ ID NO :59) 5 - FVII isoforme B : amorces 5PSFVII : AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO :60) et 3FVIIv2 : GTCACGAACACAGCAGCCAGACATCCCTGCAGTC(SEQ ID NO :61) 10 - Protéine C : amorces Proteinel :AAGCTTGCCGCCACCATGTGGCAGCTGACCAGCCTGCTGCTGTTC GTGGCCACATG (SEQ ID NO :62), Proteine2 :GAGCTGCTGAACACGCTATCCAGAGGGGCGGGTGTGCCAGAGAT 15 GCCCCATGTGGCCACG (SEQ ID NO :63), Proteine3 :TTCAGCAGCTCTGAGCGGGCCCACCAGGTGCTGCGGATCAGAAAG AGAGCCAACTCTTTC (SEQ ID NO :64) - La séquence du FX modifié sans le peptide signal et sans le propeptide FX-WT a 20 été obtenu par PCR avec les amorces 5FX : GCCAACTCTTTCCTGGAGGAAATGAAG (SEQ ID NO :65) et 3FXIIa : AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :66) (amplicon de 1142pb). - Une PCR d'assemblage a été réalisée entre ces 2 produits de PCR 25 - Une ligation par recombinaison (ligation In Fusion) a été réalisée entre ce produit de PCR d'assemblage, l'UT promotrice et le vecteur final digéré, précédemment préparés. L'efficacité de clonage a été vérifiée par PCR sur colonies avec les amorces 5'EF la : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :67) et 2BGHpA et séquençage avec l'amorce 5'EFla : 30 GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :68) et 5FXseq : GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO :69). 3050992 29 Les vecteurs bicistroniques suivants ont ainsi été obtenus : - proth-FX-IIaf2 : PS+ propeptide prothrombine- FX modifié + VKOR humaine WT - FVIIv1-FX-IIaf2 : PS+ propeptide FVII isoforme A- FX modifié + 5 VKOR humaine WT - FVIIv2-FX-IIaf2 : PS+ propeptide FVII isoforme B- FX modifié + VKOR humaine WT - protc-FX-IIaf2 : PS+ propeptide protéine C- FX modifié + VKOR humaine WT 10 Remplacement du PS par le PS du FX-WT. A partir des 4 vecteurs finaux obtenus, la stratégie suivante a été mise en oeuvre afin de remplacer uniquement le peptide signal par celui du FX-WT: 1) A partir d'un vecteur contenant la séquence nucléotidique du FX modifié, nous 15 avons obtenu par PCR la séquence correspondant au PS du FX-WT avec les amorces PS1fxWT et PS2fxWT. 2) Sur chacun des 4 vecteurs finaux nous avons obtenu par PCR la séquence correspondant à celle du FX modifié sans peptide signal en utilisant les amorces suivantes : 20 - proth-FX-IIaf2 : amorces 3FXIIA : AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :70) ET PSWT-PRTH : GACGGGAGCAGGCCCAGCATGTCTTCCTGGCACCACAG (SEQ ID NO :71) 25 - FVIIv1-FX-IIaf2 : amorces 3FXIIA : AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :72) ET PSWT-FVII Vi : CGGGAGCAGGCCGCTGGCGGCGTCGCTAAGGC (SEQ ID NO :73) - FVIIv2-FX-IIaf2 : amorces 3FXIIA : 30 AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :74) ET PSWT-FVII v2: 3050992 30 CGGGAGCAGGCCGCTGTGTTCGTGACCCAGGAAGAG (SEQ ID NO :75) - protc-FX-IIaf2 : amorces 3FXIIA : AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :76) 5 ET PSWT-PROT : CGGGAGCAGGCCACACCCGCCCCTCTGGATAGCG (SEQ ID NO :77) Une PCR d'assemblage a ensuite été réalisée entre l'amplicon obtenu à l'étape 1 (PS du FX WT) et chacun de ceux obtenu à l'étape 2 (FX modifié sans peptide signal). 10 Une ligation par recombinaison (ligation In Fusion) a été réalisée entre ces produits de PCR d'assemblage, l'UT promotrice et le vecteur final digéré, précédemment préparés. L'efficacité de clonage a été vérifiée par PCR sur colonies avec les amorces : 3) 5'EFla : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :78) et 15 4) 2BGHpA et séquençage avec les amorces 5'EF1A : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :79) et 5FXsEQ : GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO :80). Nous avons ainsi obtenu les vecteurs bicistroniques finaux suivants : - proth-psFX-IIaf2 : PS FXwt + propeptide prothrombine- FX modifié 20 + VKOR humaine WT - FVIIv1-psFX-IIaf2 : PS FXwt + propeptide FVII isoforme A- FX modifié + VKOR humaine WT (figure 3) - FVIIv2-psFX-IIaf2 : PS FXwt + propeptide FVII isoforme B- FX modifié + VKOR humaine WT 25 - protc-psFX-IIaf2 : PS FXwt + propeptide protéine C- FX modifié + VKOR humaine WT. Les différentes séquences utilisées dans les exemples sont représentées dans le tableau 1 suivant: Nom de Peptide Propeptide séquence FX-IIa la signal séquenc e FX-IIa MGRPLHL VLLSASLA NNILARVRR ANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEARE VFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQN (SEQ ID NO :9) 3050992 31 AGGVAKASG(SLT RDMP POP FI R \il:VT(1)1-111AI IGV1_, HRRRR (Sa) ID NO :14) QIIVFLAPOQARS I.I,ORN/RR (SEQ ID NO :13) GLLLLGES LFIRREQA (SEQ ID NO :7) NIAI IVRGL PGCLAI, AAI CSI, \11 Ils (S1-1() ID NO :47) NI Q\L R ()(C l\ (SEQ ID NO :48) QGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTR KLC SLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGY TLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSV AQATS S SGEAPDSITWKPYDAADLDPTENP FDLLDFNQTQPERGDNNLTRDFLAEGLTPR IVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGG TILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNT EQEEGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDI AVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAEST LMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLE VPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQ EDACQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWG EGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTR GLPKAKSHAPEVITSSPLK (SEQ ID NO :17) ProtltFX-11a FV11v1- FX-Ila FVIIv 2- FX-11a M VS ()A L. R AVI- VOLE:Ali() \I LIMRRR ProlCFX-11a LLCLUGL (S1-1() II) NE) :15) QGCLA FRAPI,DSVF 55517 RAHOVLRIRKR (SLO ID NO :16) (SLO ID NO :48) M \VOL FSL 1.1 TVATW (jISE') (SFIO ID NO :49) MGRPLHL VLLSASLA GLLLLGES LFIRREQA (SEQ ID NO :7) Proth-psFX-IIa* (SEQ ID NO:22) psFX- IIa*(SE Q ID NO:23) FVIIv2- psFXIIa* (SEQ ID NO:24) ProtC-psFX- (SEQ ID NO:25) QHVFLAPQQARS LLQRVRR (SEQ ID NO :13) AG G VAKASGGET RDMPWKPGPHR VF VTQEEAHG VL HRRRR (SEQ ID NO :14) AVFVTQEEAHGV LHRRRR (SEQ ID NO :15) TPAPLDSVFSSSE RAHQVLRIRKR (SEQ ID NO :16) ANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEARE VFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQN QGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTR KLC SLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGY TLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSV AQATS SSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENP FDLLDFNQTQPERGDNNLTRDFLAEGLTPR IVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGG TILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNT EQEEGGEAVHEVEVVIKHNRF TKETYDFDI AVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAEST LMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLE VPYVDRNSCKLS SSFIITQNMFCAGYDTKQ EDACQGDSGGPHVTRFKDTYF VTGIVSWG EGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTR GLPKAKSHAPEVITS SPLK (SEQ NO :17) *mutant selon l'invention Tableau 1 : Séquences de Facteurs X variants 3050992 32 Exemple 2: Production des FX contenant des propeptides modifiés dans la lignée de production HEK 293 Freestyle 1. Réactifs 5 Milieu de culture FreestyleTM F17 L-glutamine Milieu de transfection des cellules HEK: Opti-MEM Vitamine K1 10 2. Protocole Le facteur X de type sauvage et les FX modifiés ont été produits dans des cellules eucaryotes HEK-293-Freestyle (HEK 293F) en expression transitoire. Les HEK 293F ont été cultivées en milieu F17, supplémenté de 8 mM de L-glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% CO2) à 37°C. La veille du 15 jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 7.105 cellules/ml. Le jour de la transfection, l'ADN (30 1..1g) et 60 pl d'agent de transfection (AT) ont été pré-incubés séparément en milieu Opti-MEM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L'ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/ml dans un volume de 30 ml. 20 Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs ont été ajoutés à différents ratios pour obtenir une quantité totale d'ADN de 20-30 tg. Immédiatement après la transfection, la vitamine K1 (5 idg/m1) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l'aide d'un plasmide contrôle exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein). Les productions ont été réalisées en mode « batch » 25 durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, supplémenté par 2 mM PMSF et 10 mM benzamidine, filtré en 0.221..tm, concentré 10X puis congelé. 30 Exemple 3: Production des FX contenant des propeptides modifiés dans la lignée de production CHO-S 3050992 33 1. Réactifs Milieu de culture proCH04 L-glutamine Milieu de transfection des cellules CHO-S : Opti-Pro SFM 5 Vitamine K1 2. Protocole Le facteur X de type sauvage et les FX modifiés ont été produits dans des cellules eucaryotes CHO-S (Invitrogen) en expression transitoire. 10 Les CHO-S ont été cultivées en milieu proCH04, supplémenté de 4 mM de Lglutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% CO2) à 37°C. La veille du jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 6.105 cellules/ml. Le jour de la transfection, l'ADN (37.5 1..1g) et 37.5 pl d'agent de transfection (AT) ont 15 été pré-incubés séparément en milieu Opti-Pro SFM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L'ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/ml dans un volume de 30 ml. Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs ont été ajoutés à différents ratios pour 20 obtenir une quantité totale d'ADN de 20-45 1..tg. Immédiatement après la transfection, la vitamine K1 (5 idg/m1) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l'aide d'un plasmide contrôle exprimant la GFP. Les productions ont été réalisées en mode « batch » durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules 25 ont été éliminées et le surnageant a été récolté, supplémenté par 2 mM PMSF et 10 mM benzamidine, filtré en 0.221..tm, concentré 10X puis congelé. Exemple 4: Quantification de la gamma-carboxylation des facteurs X produits 30 1- Protocole expérimental : Mesure de la concentration en facteur X La concentration en facteur X a été mesurée par l'intermédiaire de l'ELISA commercial Zymutest Factor X (HYPHEN BioMed réf RK033A) en suivant les recommandations 3050992 34 du fabricant. Les concentrations ont été mesurées en triplicat en utilisant des valeurs d'antigène situées dans la zone linéaire de détection de l'essai. Pour s'assurer que les mutations introduites ne perturbent pas la mesure de la concentration, les FX ont été déposés en quantité identique et révélés par immunoblotting avec un anticorps 5 polyclonal différent de celui utilisé en ELISA (Polyclonal antibody anti-human FX (CRYOPEP cat n'PAHFX-S) ou par coloration après SDS-PAGE (données non montrées). Les concentrations des FX variants présents dans les surnageants des cellules HEK transfectées ont été mesurées afin de déposer la même quantité de FX sur l'ELISA anti- 10 Gla. 2- Protocole expérimental : Mesure du taux de Gamma-carboxylation Le taux de gamma-carboxylation a été mesuré grâce à un ELISA établi au laboratoire qui utilise l'anticorps de révélation du kit ELISA assay Zymutest Factor X (Hyphen) et 15 l'anticorps anti-Gla (American Diagnostica,) comme anticorps de capture. L'anticorps anti-Gla (200 pl à 5 idg/m1) a été incubé sur la nuit à température ambiante (TA). Après incubation, la plaque a été saturée avec du PBS + 1% BSA (250 Opuit) pendant 2 h à TA. Après lavage, 200 pl d'échantillon à 0.2 1..tg/ml ou de standards (consistant en un mélange à différents ratios de FX plasmatique et de facteur X produit 20 dans HEK (non gamma-carboxylés)) ont été déposés 2 h à TA. Après lavages, l'anticorps anti-FX couplé à la peroxydase (200 pl du kit ZYMUTEST) a été dilué dans le tampon fourni et incubé lh à TA. Après lavages, la révélation a été faite en ajoutant 200 pl de TMB pendant 8 minutes. La révélation a été stoppée par 50 1..IL d'acide sulfurique à 0.45 M) et la densité optique a été lue à 450 nm. 25 3-Résultats Les cellules HEK produisent naturellement le FX ectopique non gamma-carboxylé (non montré). Pour augmenter avantageusement le taux de gamma-carboxylation, le FX a été co-transfecté en présence de VKOR. Cette co-transfection peut se faire soit en traitant 30 les cellules avec deux vecteurs (Opti-HEK-FX-IIa-F2) soit en utilisant un vecteur bicistronique portant les deux ADNc (Opti-HEK-VKOR-IIa). Dans les deux cas, le taux de gamma-carboxylation était identique à 11,55 % et 10,20 % à celui du FX 3050992 35 plasmatique respectivement (tableau 2). La substitution intégrale du peptide signal du FX et du propeptide par ceux du FVII (v1 et v2), de la prothrombine ou de la protéine C n'a pas augmenté significativement le taux de gamma-carboxylation (6,7 à 24,5 %). La combinaison avec le FVIIvl (FVIIv 1 -FX-IIa-F2) est toutefois la plus efficace des 4 à 5 24,5%. Des constructions chimériques ont ensuite été construites en conservant le peptide signal du FX et en insérant les propeptides utilisés précédemment. Les nouvelles constructions ainsi générées s'avèrent de façon surprenante avantageuses en terme de gamma-carboxylation, surtout celle avec le propeptide FVIIvl (FVIIvl- psFX-IIa-F2) 10 pour laquelle un taux de 52 % a été observé. Ainsi cette dernière construction permet d' accroitre de 4,7 fois le taux de gammacarboxylation. L'ensemble des mesures individuelles a été présenté en figure 4 qui montre la supériorité de l'utilisation de la combinaison FX et du propeptide FVIIvl. 36 % GLA Taux de production Rdmt % (Pen» Opti-CHO-FX-IIa- F2 11,55 [16,97 - 6,4984] 0,647 [0,45 - 0,82] 83,790 [96,95 - 62,85] Opti-HEK-VKOR- Ha 10,2 [19,19 - 4,2627] 0,375 [0,18 - 0,71] 71,677 [46,7 - 86,899]5 Proth-FX-IIa-F2 12,21 [9,81 - 17,64] 0,243 [0,17 - 0,3] 83,653 [45,09 - 144,65] FVIIv1-FX-IIa-F2 6,66 [3,2707 - 15,54] 0,151 [0,09 - 0,21] 74,549 [45,54 - 97,48] FVIIv2-FX-IIa-F2 24,47 [9,4374 - 55,58] 0,269 [0,15 - 0,45] 77,163 [45,83 - 90,61] IO ProtC-FX-IIa-F2 14,71 [0,54 - 40,2] 0,219 [0,17 - 0,29] 87,586 [66,90 - 273] Proth-psFX-Ha-F2 44,8 [17,53 - 75,035] 0,388 [0,23 - 0,5] 75,752 [60,62 - 113,24] FVIIv1-psFX-Ha-F2 52,03 [14,79 - 80,2091 0,513 [0,35 - 0,74] 83,133 [76,22 - 87,17] 15 FVIIv2-psFX-Ha-F2 23,95 [9,213 - 54,43] 0,519 [0,22 - 0,71] 79,476 [67,54 - 113,43] ProtC-psFX-Ha-F2 13,83 [9,05 - 18,98] 0,413 [0,37 - 0,46] 78,863 [57,72 - 150,54] Tableau 2: Evaluation de la gamma-carboxvlation des différents mutants 3050992 37 Exemple 5: Purification des FX contenant des propeptides modifiés sur une colonne d'aptamères capable de fixer le domaine Gla du facteur X 5 1. Protocole Le surnageant de culture concentré issu de HEK ou CHO a été décongelé à 37°C. Il a ensuite été dilué au 1/2 en tampon d'équilibration (Tris HC1 50 mM , CaC12 10 mM, pH 7.5) puis purifié sur une colonne d' aptamère anti-Gla qui a été préalablement équilibrée dans le même tampon. La colonne a été lavée par 12 volumes de colonne en tampon 10 d'équilibration. Le FX a ensuite été élué par un tampon Tris HC1 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. La colonne a été replacée en tampon d'équilibration (25 volumes de colonne) avant stockage à 4°C. Le FX a été traité par 2 mM de PMSF, concentré, et stocké à -80°C. 15 2. Résultats Les FX-FIIa-F2 produits à partir de CHO ou HEK ont été purifiés sur un aptamère reconnaissant le domaine gamma-carboxylé. Le produit de CHO a été purifié suivant un protocole classique d'immunopurification ou par aptamopurification. Les produits purifiés ont été contrôlés par SDS-PAGE 4-10 % (Figure 5A). Les deux produits 20 recombinants ont montré un profil similaire suite à la séparation en acrylamide avec ou sans réduction au DTT (Figure 5A, piste 4 et 3). Non réduit, les produits sont apparus sous forme d'une bande unique à environ 60-65 kDa. Leur migration a été un peu plus lente que celle du FX plasmatique (Figure 5A, piste 2) car les produits ont 10 acides aminés supplémentaires. La réduction des produits sépare complètement la chaine 25 lourde (48 kDa) de la chaine légère (17 kDa). Les FX recombinants ont montré un profil similaire quel que soit leur mode de purification. La chaine légère des trois facteurs X purifiés a migré de la même manière, comme attendu. Le produit de HEK aptamopurifié a été comparé au FX plasmatique (Figure 5B). Le produit était pur à homogénéité et est apparu sous la forme d'une seule bande migrant à 30 un poids moléculaire légèrement supérieur à celui du FX plasmatique comme vu précédemment (Figure 5B, piste 3). La réduction du produit montre que la différence de migration est portée par la chaine lourde. 3050992 38 Ces données montrent que l'aptamopurification, par exemple du FX-IIa-F2, permet d'obtenir un produit pur à homogénéité après une seule étape de purification. Exemple 6: Mesure de l'activation des facteurs X variants produits dans HEK par 5 la fraction de venin RVV-X 1. Protocole expérimental L'activation des FX variants produits par les cellules HEK a été mesurée suite à l'incubation des facteurs X aptamopurifiés en présence de la fraction anti-facteur X du 10 venin de la vipère de Russell (RVV-X). Le facteur X activé de contrôle, la fraction X du venin (RVV-X) et le substrat pNAPEP 1025 étaient disponibles dans le commerce (e.g. Haematologic Technologies). L'activation a été étudiée à 37°C dans le tampon suivant : 25 mM HEPES, pH 7.4, 0.175 M NaC1, 5 mM CaC12, 5 mg/ml BSA. Pour des concentrations de 0 à 100 nM de 15 FX, une concentration de 200 mU/m1 de RVV-X a été utilisée. Après 5 min d'incubation, la réaction a été arrêtée dans le tampon 50 mM Tris, pH 8.8, 0.475 M NaC1, 9 mM EDTA. La quantité de FXa générée a été suivie en mesurant la vitesse d'hydrolyse du substrat pNAPEP 1025 (250p.M) à 405 nm. 20 2. Résultats Les variants de facteur X purifiés ont été incubés avec le RVV-X. La génération de FXa a été mesurée suite à ce traitement à partir de différentes concentrations en FX. La présence de FXa a été quantifiée par la vitesse d'apparition du produit du pNAPEP 1025 en solution (en mUDO/min). Cette génération est le reflet de la reconnaissance et 25 du clivage des FX par le RVV-X ainsi que de la capacité du FXa généré à reconnaitre le substrat du FX. La moyenne des vitesses d'apparition a été faite pour les différentes concentrations initiales de FX et cette valeur a été ramenée en pourcentage de la valeur du FX-WT. Les contrôles du FX déjà activé et du FX traité par le RVV-X donnaient tous deux un 30 signal positif et du même ordre de grandeur (Figure 6). Le contrôle FXa a été considéré comme le 100 %. Les deux constructions de facteur X variant ont été activées à environ 60 % du FXa (54 % pour Opti-HEK-VKOR-IIa et 63 % pour FVIIv 1-FX-IIa-F2). Ce 3050992 39 résultat n'était pas surprenant car l'activation par le RVV-X n'est pas sensible au taux de gamma-carboxylation. Ce résultat a montré en revanche avantageusement que la modification du propeptide n'entraine pas de perte de l'activité chromogénique du FXa. 5 Exemple 7: Mesure de l'activation des facteurs X variants produits dans HEK par le complexe facteur VIIa/Facteur Tissulaire (FT) 1. Protocole expérimental 10 L'activation des FX variant produits par les cellules HEK a été mesurée suite à l'incubation du produit aptamopurifié en présence de 50 pM de FVIIa et de facteur tissulaire. En plaque à fond plat, le complexe FVIIa (100 pl à 100 pM) - FT a été ajouté aux différentes dilutions de FX (100 pl). Au bout de 10 min, le mélange (20 pl) a été prélevé et déposé dans 180 pl de tampon STOP (Tris 50 mM, EDTA 9 mM, NaC1 475 15 mM, pH 8,8). Le substrat PNAPEP dilué au 1/2 en eau PPI (50 pl) a été ajouté et une lecture immédiate en mode cinétique toutes les 25 secondes a été faite pendant 10 min à 405 nm. 2. Résultats 20 Les contrôles représentés par le FX plasmatique déjà activé et le FX plasmatique traité par le FVIIa/TF ont donné tous deux un signal positif et du même ordre de grandeur (Figure 7). Le contrôle FXa plasmatique a été considéré comme le 100 %. Les deux constructions de facteur X variant ont été activées à 27 % du FXa pour Opti-HEKVKOR-IIa et à 36 % pour FVIIv 1-FX-IIa-F2. Cette activité est sensible au taux de 25 gamma-carboxylation. La modification du propeptide a permis au FVIIv 1-FX-IIa-F2 d'avoir une activité de 142 % de celle de la molécule contenant le propeptide de type sauvage. Ces résultats indiquent que l'augmentation du taux de gamma-carboxylation permet d'augmenter l'activité procoagulante du FXa variant par rapport à la molécule contrôle. 30 3050992 40 Exemple 8: Mesure en temps de génération de thrombine (TGT) de la capacité procoagulante des facteurs X variants: Activation de la voie extrinsèque de la coagulation (FT 1pM/PL 4uM) en plasma déficient en FVIII 5 1. Protocole expérimental 1.1. Réactifs Thrombin calibrator, PPP reagent low, CK-Prest, Fluca Kit (Fluo-buffer + Fluosubstrat) et le PNP étaient disponibles dans le commerce, par exemple chez Stago. Le plasma déficient en FVIII (e.g. Siemens Healthcare) et le Facteur VIII recombinant 10 humain de contrôle provient de chez Baxter (Recombinate). 1.2. Protocole Le test de génération de thrombine consiste à activer la coagulation ex vivo à l'aide d'un mélange de facteur tissulaire et de phospholipides (activation de la voie extrinsèque de 15 la coagulation) et à mesurer ensuite la concentration de thrombine générée au cours du temps. Les tests de génération de thrombine ont été réalisés sur 80 pl d'un pool de plasma contenant du produit purifié ou les contrôles, en présence de 20 pl de réactif PPP contenant au final 1 pM de Facteur Tissulaire (FT) et 4 1..1M de phospholipides (PL). 20 Différents plasmas peuvent être utilisés : plasma normal, déficient en facteur X, déficient en facteur VIII ou déficient en facteur IX. La réaction a été démarrée par l'ajout de 20 1..1L de Fluca-kit (substrat + CaC12) qui constitue le début de la mesure de l'apparition de thrombine. L'apparition de fluorescence a été mesurée sur un fluorimètre de type Fluoroskan Ascent 25 (ThermoLabsystems) à une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et à une longueur d'onde d'émission de 460 nm. Les thrombinogrammes (courbes représentant l'intensité de fluorescence en fonction du temps) ont ensuite été analysés grâce au logiciel ThrombinoscopeTm qui transforme la valeur de fluorescence en nM de thrombine par calcul comparatif. 30 3050992 41 2. Résultats Les plasmas Unicalibrator, ainsi que les plasmas déficients en FVIII reconstitués par 0, 0.1 ou 1 U/ml de FVIII recombinant ont été utilisés comme témoins. Le FVIIv1-FX-IIaF2 aptamopurifié a été utilisé à 10 et 20 tg/ml. 5 Comme attendu suite à l'activation de la coagulation par le facteur tissulaire, le plasma déficient en FVIII a donné le signal le plus faible, correspondant au bruit de fond de l'expérience (Figure 8). Le plasma Unicalibrator a fourni un signal plus faible que le plasma déficient en FVIII reconstitué par les concentrations de FVIII (0.1 ou 1 U/ml). Le FX variant possédant un propeptide modifié a la capacité de corriger un plasma 10 déficient en FVIII aussi efficacement que le FVIII. Une réponse en fonction de la dose a été observée avec un temps de latence qui se raccourcit lorsque la dose augmente et une amplitude qui augmente. L'amplitude du signal n'a toutefois pas atteint complètement la reconstitution par 1 U/ml de FVIII mais elle était bien supérieure à celle d'un plasma normal. En conséquence l'augmentation de la gamma-carboxylation obtenue pour un 15 facteur X variant selon l'invention, avantageusement couplée à une aptamopurification, a permis d'obtenir un facteur X variant parfaitement actif et qui se substitue efficacement au FVIII. REVENDICATIONS1. Protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale, optionnellement le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 10 3. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend au moins une mutation A, A', B, C ou C', dans laquelle : la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, 15 la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, 20 la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C' consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID 25 NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO :1, où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. 30 4. Protéine selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend la mutation B. 5. Protéine selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le propeptide est un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur X. 3050992 43 6. Protéine selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le propeptide est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées. 7. Protéine selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15 et SEQ ID NO :16. 8. Protéine selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le peptide signal de 10 séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21. 9. Protéine selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend, 15 entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO :1, une séquence intermédiaire. 10. Protéine selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence intermédiaire est la 20 séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5. 11. Protéine selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du 25 propeptide naturel du facteur X, puis - la séquence SEQ ID NO :5, puis - ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1. 12. Protéine selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend, de 30 l'extrémité N-terminale à C-terminale : - le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis - la séquence SEQ ID NO :5, puis - la séquence SEQ ID NO :11. 3050992 44 13. Protéine selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :25. 14. Protéine selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle est fusionnée au niveau de l'extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté. 15. Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37, éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal. 16. Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fragment scFc de type 15 sauvage a la séquence SEQ ID NO :42. 17. Protéine selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'elle a la séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43. 20 18. Protéine selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation T366Y ou Y407T. 19. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour la protéine selon l'une des 25 revendications 1 à 18. 20. Acide nucléique selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35. 30 21. Cassette d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 19 ou 20. 22. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend l'acide nucléique selon la revendication 19 ou 20. 3050992 45 23. Vecteur d'expression selon la revendication 22, pour son utilisation comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique. 24. Cellule recombinante comprenant l'acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, ou le vecteur selon la revendication 22. 25. Protéine selon l'une des revendications 1 à 18 pour son utilisation en tant que médicament. 10 26. Protéine selon l'une des revendications 1 à 18 pour son utilisation pour traiter les troubles hémorragiques. 27. Procédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 10 à 18, comprenant : a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence en présence de vitamine K; b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant, -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X. 28. Procédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 10 à 18, 30 comprenant : a) l'expression de deux vecteurs d'expression, l'un comprenant un acide nucléique selon la revendication 19 ou 20, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, dans une cellule-hôte, de préférence une cellule HEK, de préférence en présence de vitamine K; 3050992 46 b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ; d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi : -la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, 5 -la concentration du surnageant, -la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X.