FR 3051253 A1 20171117 FR 1654148 A 20160510 1 Méthode de calibration universelle pour le dosage d'inhibiteurs d'enzymes de la coagulation du sang La présente invention concerne une méthode de calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur de la coagulation sanguine. L'invention concerne également une méthode de dosage d'au moins un inhibiteur, réversible ou irréversible, d'une enzyme de la coagulation sanguine dans un échantillon biologique. Cette méthode permet notamment la comparaison d'inhibiteurs entre eux. La coagulation sanguine est un phénomène physiologique complexe qui fait intervenir plusieurs facteurs, dont notamment : - le facteur tissulaire, activateur physiologique de la génération de thrombine, et - le fibrinogène, transformé en fibrine sous l'activation de la thrombine. La fibrine conduit, par son accumulation, à la formation d'un caillot, qui arrête l'hémorragie. La formation de ce caillot est régulée par un judicieux équilibre entre activations et inhibitions, où interviennent notamment de nombreuses enzymes et leurs inhibiteurs. Une rupture de cet équilibre entre activations et inhibitions peut induire deux familles de pathologies : les maladies thrombotiques d'un côté, et les maladies hémorragiques de l' autre. Dans le but de diagnostiquer l'une ou l'autre de ces maladies, ou de mesurer l'activité de thérapies mises en place pour traiter celles-ci, il peut être intéressant de doser l'une de ces enzymes ou l'un de ces inhibiteurs. Classiquement le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation du sang s'effectue en mettant en compétition pour l'enzyme l'inhibiteur présent dans l'échantillon sanguin, avec un substrat spécifique. Un tel dosage s'accomplit en utilisant un kit dédié et spécifique de l'inhibiteur, comprenant : - une méthodologie optimisée et généralement propre au dosage de l'inhibiteur, ce qui implique notamment une dilution de l'échantillon, des concentrations spécifiques en réactifs et des points de mesure précis ; 3051253 2 - un calibrant, typiquement des plasmas contenant des niveaux croissants en concentration en inhibiteur ; - un modèle mathématique de régression de la courbe de calibration, qui peut être linéaire, polynomiale ou logarithmique ; et 5 - des contrôles qualités contenant généralement un niveau bas et un niveau haut de concentration en inhibiteur. En outre, l'utilisateur doit détenir un kit de dosage par inhibiteur. Pour chaque inhibiteur, il est nécessaire de calibrer le système de mesure. 10 11 existe donc un besoin pour une méthode qui s'affranchit de l'ensemble de ces contraintes. Notamment, il existe un besoin pour une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, qui soit facile à mettre en oeuvre, et qui ne soit pas spécifique de l'inhibiteur concerné, i.e. qui soit universelle. 15 Tout d'abord, la présente invention propose une méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine. L'universalité de la calibration proposée par la méthode selon l'invention est fondamentale : elle permet de comparer directement plusieurs inhibiteurs entre eux. En 20 outre, la méthode est simple à mettre en oeuvre et économiquement intéressante. La présente invention propose également une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, qui met en oeuvre une calibration universelle, et qui permet ainsi le dosage de multiples inhibiteurs d'une même enzyme. Aussi, la méthode 25 de dosage selon l'invention permet de doser tous les inhibiteurs d'une même enzyme de la coagulation. Enfin, la méthode selon l'invention permet de comparer directement plusieurs inhibiteurs entre eux. La présente invention concerne donc tout d'abord une méthode pour obtenir une 30 calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine (ci-après « méthode de calibration »), ladite méthode comprenant au moins une étape b) comprenant les sous-étapes suivantes: 3051253 3 - b 1A) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration 5 ou d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis 10 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, - conversion de la concentration ou l'activité d'enzyme utilisée pour chaque mélange de l'étape b 1A), en activité anti-enzyme, de préférence par la simple soustraction correspondant à : 15 Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un mélange donné à l'étape blA), en %), puis - b1B) construction de la courbe indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue pour chaque mélange de 20 l'étape blA), ladite courbe correspondant à la courbe de calibration universelle. La présente invention concerne également une méthode de dosage d'au moins un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine dans un échantillon biologique (ci-après « méthode de dosage »), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 25 a) au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, ladite mesure étant obtenue par : - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément 30 ou séquentiellement au mélange, - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire; et 3051253 4 b) conversion de la mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage. De préférence, ladite méthode de dosage comprend les sous-étapes blA), de conversion et b1B) décrites ci-dessus. 5 Par « séquentiellement », dans la présente demande, on entend que le mélange de l'étape blA) pour la méthode de calibration, ou de l'étape a) pour la méthode de dosage, est effectué en mélangeant : soit d'abord l'échantillon biologique avec la solution d'enzyme, puis ajout de la solution 10 de substrat marqué, soit d'abord l'échantillon biologique avec la solution de substrat marqué, puis ajout de la solution d'enzyme. De préférence, la méthode de calibration ou de dosage selon l'invention comprend une 15 étape c) de conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur. En effet, la méthode de calibration ou de dosage selon l'invention permet le dosage d'un inhibiteur : 20 - soit sous la forme d'une activité, exprimée en pourcentage : cela correspond à une unité universelle, qui permet de comparer l'action de différents inhibiteurs entre eux vis-à-vis d'une enzyme donnée ; - soit sous la forme d'une quantité ou concentration, par exemple en ng/ml : cela correspond à une unité quantitative stricte. 25 Une telle méthode de calibration ou de dosage selon l'invention peut trouver une application dans l'antidotage. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'une méthode selon l'invention pour quantifier le besoin en composé antiinhibiteur. 30 Par enzyme de la coagulation sanguine, on entend toute enzyme impliquée dans la coagulation du sang, par exemple les facteurs de coagulation, la kallikréine ou la 3051253 5 plasmine. Cette enzyme est de préférence une enzyme de mammifère, plus préférentiellement une enzyme bovine ou humaine. L'enzyme peut être d'origine recombinante ou plasmatique ; elle peut être purifiée ou non. De préférence, l'enzyme de la coagulation sanguine est choisie parmi les facteurs IIa, Xa et la plasmine. 5 L'inhibiteur dosé par la méthode selon l'invention peut être réversible ou irréversible. Par inhibiteur réversible d'une enzyme de la coagulation sanguine, on entend un inhibiteur qui s'associe à l'enzyme par des liaisons non covalentes comme des liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes ou des liaisons ioniques. L'inhibiteur réversible selon l'invention est de préférence choisi parmi la bivalirudine, l'argatroban, 10 le dabigatran, le rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le darexaban, l'otamixaban, le melagatran, le ximelagatran et l'antiplasmine. Par inhibiteur irréversible d'une enzyme de la coagulation sanguine, on entend un inhibiteur qui s'associe à l'enzyme par au moins une liaison covalente. L'inhibiteur forme alors un complexe stable avec l'enzyme, ce qui l'inactive de façon permanente. 15 L'inhibiteur irréversible selon l'invention est de préférence choisi parmi l'antithrombine, les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides comme le fondaparinux, le danaparoïde sodique, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine et la désirudine. 20 La méthode de dosage selon l'invention utilise un simple échantillon biologique du patient. Cet échantillon biologique est utilisé de préférence sous forme diluée dans la méthode, notamment dilué dans un tampon. De préférence, le tampon est le tampon Owren Koller. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes ou de plasma 25 contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes (PPP). Dans ce cas, il est notamment obtenu par centrifugation du tube citraté comprenant l'échantillon de sang de patient pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C. Si l'échantillon doit être 30 conservé, le protocole suivant peut être utilisé : - décanter rapidement le plasma, en laissant environ 0.5cm de plasma au-dessus de la couche cellulaire des globules blancs et plaquettes ; 3051253 6 - récupérer le plasma dans un tube à hémolyse ou un tube plastique; - centrifuger ce tube à nouveau pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C ; - aliquoter en fractions de 0,5 à 1 mL sans prendre le fond du tube (débris cellulaires) ; 5 puis - congeler rapidement à -70°C, mieux à -80°C. L'échantillon biologique non dilué est utilisé dans la présente invention en faible volume. De préférence, l'échantillon biologique a un volume compris entre 2 pt et 500 10 pt, de préférence compris entre 3 pt et 400 pt, de préférence compris entre 3 pt et 100 pt, de préférence compris entre 5 pt et 50 µL. Principede base de la méthode de calibration ou de dosage selon l'invention Le dosage enzymatique d'un inhibiteur réversible d'une enzyme de la coagulation du 15 sang met en compétition deux réactions biochimiques : - une réaction d'inhibition réversible E où : E désigne l'enzyme ciblée par l'inhibiteur présent dans l'échantillon ; I représente l'inhibiteur enzymatique réversible dont la quantité souhaite être mesurée ; 20 E - I est le complexe inactif enzyme- inhibiteur ; ki+ représente la constante d'association entre l'enzyme et l'inhibiteur ; ki- désigne la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur, - une réaction enzymatique 25 E E P où : E désigne l'enzyme ciblée par l'inhibiteur présent dans l'échantillon ; S représente un substrat spécifique de l'enzyme, qui est marqué par un marqueur de tout type, notamment chromogène, fluorescent ou électrochimique ; 3051253 7 E - S désigne le complexe instable enzyme- substrat ; P représente le produit issu de la catalyse du substrat par l'enzyme : dans la présente invention, la catalyse aboutit à la libération du marqueur ; kcat est la constante catalytique de l'enzyme ; 5 KM est la constante de Michaelis de la réaction. Au cours de la mesure, l'enzyme, inhibée dans une plus ou moins grande proportion par l'inhibiteur, clive le substrat en produit. Au bout d'un certain temps, les deux réactions biochimiques en compétition vont 10 atteindre un équilibre local ou état stationnaire : l'enzyme et l'inhibiteur sont en équilibre biochimique, i.e. les concentrations en enzyme, en inhibiteur et en complexe enzyme- inhibiteur sont constantes ; l'enzyme étant initialement en excès, il persiste à cet instant une activité résiduelle enzymatique qui va être quantifiée afin d'en déduire la concentration en inhibiteur. En effet, l'activité résiduelle de l'enzyme et la 15 concentration initiale en inhibiteur sont inversement proportionnelles : plus la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est élevée, plus l'enzyme va être inhibée au cours de la mesure et moins elle va être active au travers du substrat (notamment à l'état stationnaire) ; à l'inverse, plus la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est faible, moins l'enzyme sera inhibée et plus elle sera active sur son 20 substrat (notamment à l'état stationnaire). La relation entre ces deux grandeurs (activité résiduelle de l'enzyme à l'état stationnaire et concentration en inhibiteur) est ainsi bijective et il existe donc pour chaque concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon une unique équivalente activité 25 résiduelle enzymatique : une calibration contenant des niveaux croissants en inhibiteur peut donc être mimée par une calibration contenant des niveaux décroissants en enzyme; l'enzyme devient alors le calibrant unique et commun à tous les inhibiteurs que l'utilisateur souhaite doser. 30 Le principe de la méthode de calibration ou de dosage selon l'invention consiste à mesurer, pour des échantillons calibrants contenant des niveaux croissants de concentration en enzyme, l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire (étape 3051253 8 a)), puis à reporter sur un graphe les différents couples (activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire, [enzyme]). L'équation de la régression de ces différents couples va ensuite permettre de convertir l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire en équivalent de concentration en enzyme. Plutôt que de rendre le résultat 5 en équivalent de concentration en enzyme, le résultat est ici rendu en équivalent d'activité anti-enzyme (exprimée en pourcentage, étape b)). En effet, le but du dosage est de mesurer l'action d'inhibiteurs sur une enzyme : l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est une unité qui illustre bien et quantifie judicieusement l'action inhibitrice des différents inhibiteurs sur l'enzyme. Son équation (« équation 1 ») est de 10 la forme où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent 15 dans l'échantillon est nulle (i.e. l'activité résiduelle enzymatique maximale). Cette équation 1 peut également être remplacée par toute modélisation adéquate. Parmi les modélisations possibles, on peut notamment utiliser un polynôme. Les résultats sont exprimés en pourcentage : l'unité est ainsi commune à l'ensemble des 20 inhibiteurs de l'enzyme, et permet de comparer entre elles leur action inhibitrice. La méthode de calibration ou de dosage selon l'invention permet aussi de rendre le résultat en concentration en inhibiteur (étape c)). En effet, l'activité anti-enzyme peut être convertie en concentration en inhibiteur par le 25 biais d'un abaque dont l'équation (« équation 2 ») est donnée par où : 3051253 9 - Mo est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon ; - i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur qu'il est aisément possible de mesurer (cf exemples). De même, cette équation 2 peut être remplacée par toute modélisation adéquate. Parmi 5 les modélisations possibles, on peut notamment utiliser un polynôme. Les différentes étapes de la méthode de calibration selon l'invention sont détaillées ci-dessous : 10 La méthode de calibration comprend au moins une étape b) comprenant les sous-étapes suivantes: - b 1A) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant 15 obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et 20 obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, - conversion de la concentration ou l'activité d'enzyme utilisée pour chaque mélange de 25 l'étape b 1A), en activité anti-enzyme, de préférence par la simple soustraction correspondant à : Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un mélange donné à l'étape blA), en %), puis 30 - b1B) construction de la courbe indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue pour chaque mélange de l'étape blA), ladite courbe correspondant à la courbe de calibration universelle. 3051253 10 Ces étapes blA), de conversion et b1B) sont détaillées ci-dessous dans la description de la méthode de dosage. 5 En particulier, la construction de la courbe de l'étape b1B) est la construction d'une droite. En effet, de préférence, l'étape b1B) comprend la construction d'une droite de calibration répondant à l'équation suivante où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; 10 - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est nulle. Une modélisation alternative, par exemple un polynôme, est également utilisable. 15 La méthode de calibration selon l'invention peut comprendre une étape c) de conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur. De préférence, la conversion de l'étape c) se fait à l'aide d'un abaque obtenu en 20 effectuant une régression non linéaire de l'équation suivante, sur des échantillons dont les couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) sont connus : =ix où : - AntiEnzyme (%) est l'activité anti-enzyme ; - Mo est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon ; 25 - i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur. Une modélisation alternative, par exemple un polynôme, est également utilisable. 3051253 11 Préférentiellement, l'étape c) comprend les étapes suivantes: cl) construction d'un abaque de conversion spécifique de chaque inhibiteur, puis c2) conversion de l'activité anti-enzyme, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en 5 concentration en inhibiteur à l'aide de l'abaque obtenu en cl). Les différentes étapes de la méthode de dosage selon l'invention sont détaillées ci-dessous : 10 L'étape a) comprend au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, ladite mesure étant obtenue par : - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son 15 substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire. 20 Cette étape utilise donc un substrat marqué. Le substrat peut être ajouté simultanément à l'échantillon biologique et à la solution d'enzyme. Le substrat peut également être ajouté séquentiellement au mélange obtenu entre l'échantillon biologique et la solution d'enzyme. Le substrat est spécifique de l'enzyme étudiée. Le substrat est marqué par tout marqueur classique permettant d'observer un changement de propriétés physiques 25 de l'échantillon lorsque le marqueur est libéré. Le suivi du marquage au cours du temps revient ainsi à mesurer au cours du temps ce changement de propriétés physiques de l'échantillon. Le marquage est de préférence un marquage chromogène (plus préférentiellement le marqueur MAPA-Gly-Arg-pNA), fluorescent ou électrochimique. Par exemple, un marqueur chromogène induira un 30 changement de couleur de l'échantillon ; un marqueur fluorescent induira une apparition de fluorescence dans l'échantillon ; et un marqueur électrochimique induira un changement d'impédance de l'échantillon. 3051253 12 L'échantillon biologique est ainsi mélangé dans l'étape a), avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément 5 ou séquentiellement au mélange. De préférence, l'échantillon biologique est dilué dans un tampon, de préférence le tampon Owren Koller (TOK). L'échantillon biologique peut également être dilué dans du plasma. Typiquement, l'échantillon biologique est dilué pour représenter 12.5% en volume du volume final (i.e. 6.250 d'échantillon dans un volume final de 500), ou 10 bien 50% en volume du volume final (i.e. 250 d'échantillon dans un volume final de 500). Typiquement, la quantité de solution d'enzyme et la quantité de solution de substrat utilisées sont chacune égale à 1500 environ. Le mélange ainsi obtenu est de préférence incubé, notamment à une température 15 comprise entre 35°C et 40°C. Le marquage est suivi au cours du temps, notamment pendant une durée de 240 secondes, de préférence au moins entre 50 et 80 secondes. De préférence, lorsque le marquage est un marquage chromogène, plus préférentiellement le marqueur MAPA-Gly-Arg-pNA, le suivi se fait par mesure de la densité optique au cours du temps. 20 On obtient ainsi, pour chaque mesure de l'étape a), une courbe de suivi du marquage (notamment densité optique) en fonction du temps (notamment au moins entre 50 et 80 secondes). Pour chaque courbe, on calcule la pente obtenue à l'état stationnaire. Par état 25 stationnaire, on entend l'état observé lorsque l'enzyme et l'inhibiteur sont en équilibre biochimique. Typiquement cet état correspond à l'intervalle de temps allant de 50 à 80 secondes. A la fin de l'étape a), on obtient ainsi, pour chaque mesure effectuée avec une concentration d'enzyme connue, la pente à l'état stationnaire correspondante. 30 Cette pente à l'état stationnaire correspond à l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire. 3051253 13 De préférence, lorsque le suivi du marquage se fait par mesure de la densité optique (DO) au cours du temps, notamment à une longueur d'onde comprise entre 400 et 500nm, typiquement à 405nm, on obtient une pente à l'état stationnaire exprimée en DO/min. 5 L'étape b) de la méthode de dosage selon l'invention comprend ensuite la conversion d'au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage. Plus précisément, l'étape b) comprend typiquement : 10 bl) la construction d'une droite de calibration, puis b2) la conversion d'au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage, à l'aide de la droite obtenue en 1)1). 15 L'équation (« équation 1 ») régissant l'étape bl) est de la forme où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent 20 dans l'échantillon est nulle (i.e. l'activité résiduelle enzymatique maximale). Cette équation 1 peut également être remplacée par toute modélisation adéquate, notamment par utilisation d'un polynôme. La construction de la droite de calibration de l'étape bl) est typiquement obtenue par les 25 étapes suivantes : b 1A) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : 3051253 14 - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, 5 - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, et b1B) construction de la droite indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en blA). Les conditions opératoires décrites pour l'étape a) sont applicables à l'étape blA). 10 Typiquement, la quantité de solution d'enzyme et la quantité de solution de substrat utilisées dans l'étape b 1A) sont chacune égale à 1500 environ. La solution d'enzyme utilisée à l'étape b 1A) peut être une solution de facteur de coagulation, notamment humain ou bovin. Par exemple, il peut s'agir d'une solution de FXa bovin de concentration ou d'activité initiale connue. 15 Pour les dilutions sérielles, une solution tampon, ou du plasma selon les cas, peuvent être utilisés. La première mesure effectuée en b 1A) est réalisée avec la solution d'enzyme de la coagulation sanguine à sa concentration ou son activité initiale, et correspond à une concentration ou activité d'enzyme de 100%, et donc à une activité anti-enzyme de 0%. 20 Dans le cas où 4 mesures sont effectuées, les 3 mesures restantes sont obtenues par dilution sérielle de cette même solution d'enzyme, pour obtenir, par exemple, une concentration ou activité d'enzyme de 25%, 50% et 75% (et ainsi une activité antienzyme respectivement égale à 75%, 50% et 25%). La concentration ou activité d'enzyme utilisée pour chaque mélange (donc chaque 25 mesure) de l'étape b 1A) est ainsi convertie, préalablement à l'étape b1B), en activité anti-enzyme, notamment par la simple soustraction correspondant à : Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un mélange donné à l'étape blA), en %). 30 A la fin de l'étape blA), on obtient ainsi au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures. Pour chacune de ces mesures, l'activité anti-enzyme, en %, est connue. 3051253 15 S'ensuit alors une étape b1B), de construction de la droite indiquant l'activité antienzyme (notamment en %) en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en b lA). 5 A la fin de l'étape b1B), et donc à la fin de l'étape b1), on obtient ainsi une droite de calibration, qui indique l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire. Cette droite de calibration est utilisée dans l'étape b), plus particulièrement à l'étape 10 b2), pour la conversion d'au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage, à l'aide de la droite obtenue enbl). En d'autres termes, dans l'étape b2), la mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a) avec un échantillon biologique, est convertie, grâce à la 15 droite de calibration obtenue en bl), en activité anti-enzyme, exprimée en pourcentage. A la fin de l'étape b) de la méthode de dosage de l'invention, chaque échantillon biologique se voit attribuer une activité anti-enzyme spécifique, en pourcentage. En effet, l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est une unité qui illustre et 20 quantifie judicieusement l'action inhibitrice de différents inhibiteurs sur une enzyme donnée. L'unité étant commune à l'ensemble des inhibiteurs d'une enzyme, elle permet ainsi de comparer entre elles leur action inhibitrice. La méthode de dosage selon l'invention peut également comprendre une étape c) de conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en 25 pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur. En effet, l'activité anti-enzyme peut être convertie en concentration en inhibiteur par le biais d'un abaque dont l'équation (« équation 2 ») est donnée par où : Mo est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon ; 3051253 16 - i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur. Cette équation 2 peut également être remplacée par toute modélisation adéquate, notamment par utilisation d'un polynôme. Notamment, cette étape c) se fait à l'aide d'un abaque. Cet abaque est spécifique de 5 chaque inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine. Il est obtenu en effectuant une régression non linéaire de l'équation 2 sur des échantillons dont les couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) sont connus. Par exemple, les échantillons utilisés pour construire l'abaque peuvent être des échantillons présentant des concentrations croissantes en inhibiteur, typiquement 10 comprises entre 0 et 600 ng/ml. Par exemple, les échantillons utilisés ont des concentrations égales à 0, 100, 200, 300, 400 et éventuellement 500 ng/ml. Alternativement, des échantillons présentant des concentrations comprises entre 0 et 200 ng/ml peuvent être utilisés. Typiquement, lesdites concentrations peuvent être égales à 0, 30, 65 et 100 ng/ml ; ou bien égales à 0, 50, 100 et 150 ng/ml. 15 Typiquement, l'étape c) comprend les étapes suivantes: cl) construction d'un abaque de conversion spécifique de chaque inhibiteur, puis c2) conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur à l'aide de l'abaque obtenu en cl). 20 Typiquement, l'abaque spécifique d'un inhibiteur est construit comme suit (étape cl) : c 1A) au moins 2 mesures de l'activité anti-enzyme, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'un échantillon biologique comprenant une concentration connue 25 dudit inhibiteur, avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité fixe connue et une solution de son substrat marqué, chaque mesure utilisant une concentration d'inhibiteur différente, et ladite solution d'enzyme étant de préférence ajoutée en dernier lieu, - suivi du marquage au cours du temps, 30 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, qui correspond à l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, puis 3051253 17 - conversion de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire en activité anti-enzyme, notamment grâce à la droite obtenue en b1), préférentiellement en b 1B), puis c1B) construction de l'abaque indiquant la concentration en inhibiteur en fonction de 5 l'activité anti-enzyme, avec les mesures obtenues en clA). Les conditions opératoires décrites pour l'étape a) sont applicables à l'étape clA). En particulier, pour chaque mesure de l'étape c 1A), l'échantillon biologique est préalablement mélangé à une solution d'inhibiteur de concentration connue. Puis le 10 mélange de l'échantillon obtenu avec la solution d'enzyme et la solution de substrat marqué, est effectué. De préférence, l'échantillon biologique comprenant l'inhibiteur est mélangé avec la solution de substrat marqué, puis la solution d'enzyme est ajoutée en dernier lieu. 15 A la fin de l'étape clA), on obtient une activité anti-enzyme pour chaque concentration d'inhibiteur spécifique utilisée. Chaque couple (activité anti-enzyme ; concentration en inhibiteur) est alors reporté sur un graphe, afin de construire l'abaque ; c'est l'étape c1B). A la fin de l'étape c1B), et donc à la fin de l'étape cl), on obtient ainsi l'abaque de 20 conversion spécifique de chaque inhibiteur, qui indique, pour l'inhibiteur concerné, la concentration en inhibiteur en fonction de l'activité anti-enzyme. Cet abaque est utilisé dans l'étape c2), pour la conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en 25 inhibiteur. En d'autres termes, dans l'étape c2), la mesure de l'activité anti-enzyme obtenue en b) avec un échantillon biologique, est convertie, grâce à l'abaque obtenu en cl), en concentration d'inhibiteur. 30 A la fin de l'étape c) de la méthode de dosage de l'invention, il est ainsi possible de déterminer la concentration d'inhibiteur présent dans chaque échantillon biologique. 3051253 18 En particulier, les étapes de la méthode de dosage ou de calibration selon l'invention sont réalisées sur un automate de diagnostic. Plus préférentiellement, toutes les étapes de la méthode de dosage ou de calibration selon l'invention sont mises en oeuvre sur un tel automate. Plus préférentiellement, la 5 méthode de dosage ou de calibration selon l'invention est mise en oeuvre sur l'automate STA-R® Evolution Expert Series du groupe Stago. Un tel automate permet de charger simultanément les échantillons, d'effectuer les mélanges et l'incubation, et de mesurer les densités optiques. Cela en fait une méthode de calibration ou de dosage rapide, fiable et reproductible. 10 La méthode de dosage selon l'invention peut trouver une application dans l'antidotage. En effet, lorsqu'un patient est par exemple traité par un anticoagulant (i.e. inhibiteur d'enzyme de la coagulation selon l'invention), il peut être nécessaire, notamment avant une intervention chirurgicale, de doser ledit anticoagulant dans un échantillon 15 biologique dudit patient. Si ce dosage est élevé, il y a alors risque d'hémorragie pour le patient. 11 est alors nécessaire d'administrer un composé anti-inhibiteur, afin de contrecarrer les inconvénients dudit inhibiteur. Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'une méthode de dosage selon l'invention pour quantifier le besoin en composé anti-inhibiteur. 20 Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention. 25 Les légendes des figures sont les suivantes : Figure 1 : Calibrations universelles. Les graphiques donnent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux. 30 A. Méthodologie gamme large : la régression linéaire de ces points expérimentaux donne la droite d'équation y = -0, 999x + 1, 053 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 994. 3051253 19 B. Méthodologie gamme fine : la régression linéaire de ces points expérimentaux donne la droite d'équation y = -1, 081x + 1, 034 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 996. 5 Figure 2: Abaques de conversion. Ces abaques permettent la conversion de l'activité anti-Xa (%) mesurée en concentration en ng/ml pour chacun des trois AODs. A. Méthodologie gamme large : les régressions non linéaires de l'équation 2 sur plusieurs points expérimentaux donnent respectivement pour le rivaroxaban (0) i = 0, 10 73 et e = 16, 43, pour l'apixaban (A) i = 1, 35 et e = 14, 66 et pour l'edoxaban (1) i = 1, 14 et e = 15, 66. B. Méthodologie gamme fine : les régressions non linéaires de l'équation 2 sur plusieurs points expérimentaux donnent respectivement pour le rivaroxaban (0) i = 1, 42 et e = 15, 36, pour l'apixaban (A) i = 2, 91 et e = 13, 23, et pour l'edoxaban (:) i = 1, 98 et e = 15 14, 96. Figure 3 : Rivaroxaban. A. Méthodologie gamme large : les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 20 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle 20 aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 98x+6, 91 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 998. B. Méthodologie gamme fine : les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 8 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 96x + 1, 63 avec un coefficient 25 de détermination R2 = 0, 995. Figure 4 : Apixaban. A. Méthodologie gamme large : les comparaisons des résultats des dosages des taux en apixaban mesurés sur 24 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle 30 aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 97x + 10, 41 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 999. 3051253 20 B. Méthodologie gamme fine : les comparaisons des résultats des dosages des taux en apixaban mesurés sur 10 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 97x + 2, 79 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 999. 5 Figure 5: Edoxaban. A. Méthodologie gamme large : les comparaisons des résultats des dosages des taux en edoxaban mesurés sur 24 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 99x + 0, 83 avec un coefficient 10 de détermination R2 = 0, 996. B. Méthodologie gamme fine : les comparaisons des résultats des dosages des taux en edoxaban mesurés sur 10 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 1, 00x - 0, 24 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 997. 15 Figure 6 : Amélioration de la régression de la calibration universelle. Les graphiques donnent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux en méthodologie gamme fine. A. Régression linéaire : la régression de ces points expérimentaux donne la droite 20 d'équation y = -1, 081x +1, 034 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 9963. B. Régression avec un polynôme d'ordre deux : la régression de ces points expérimentaux donne le polynôme d'équation y = -0, 281x2 - 0, 789x + 0, 978 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 9998. 25 Figure 7: Dilution en plasma : calibrations universelles. Les graphiques donnent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux en méthodologies gamme large (0) et gamme fine (-). A. Dilution en tampon: les régressions linéaires donnent respectivement en 30 méthodologie gamme large (0) la droite d'équation y = -0, 999x +1, 053 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 994 et en méthodologie gamme fine (A) la droite d'équation y = -1, 081x + 1, 034 avec un coefficient de d'etermination R2 = 0, 996. 3051253 21 B. Dilution en plasma : les régressions linéaires donnent respectivement en méthodologie gamme large (0) la droite d'équation y = -1, 173x + 1, 022 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 998 et en méthodologie gamme fine ( - ) la droite d'équation y = -1, 198x + 1, 020 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 998. 5 Figure 8 : Dilution en plasma : rivaroxaban. A. Méthodologie gamme large : les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 20 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle avec une dilution en plasma aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 10 96x+11, 03 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 999. B. Méthodologie gamme fine : les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 8 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle avec une dilution en plasma aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0, 95x + 1, 15 avec un coefficient de détermination R2 = 0, 995. 15 Exemples : Mise en oeuvre de la méthode selon l'invention Les antagonistes de la vitamine K (AVK) sont historiquement la première et unique 20 classe d'anticoagulants s'administrant par voie orale. La grande variabilité dans la réponse des patients à ce type de traitements à laquelle s'ajoutent de nombreuses interactions alimentaires et médicamenteuses imposent une surveillance régulière in vitro du traitement, impliquant pour le patient de nombreux prélèvements sanguins. Ce constat a conduit l'industrie pharmaceutique à développer une nouvelle famille 25 d'anticoagulants, appelés anticoagulants oraux directs (AODs), qui théoriquement ne requièrent pas de suivi régulier et n'ont que peu d'interactions alimentaires et médicamenteuses. Cette famille d'anticoagulants se décline en deux classes : - les anti-Xa, inhibiteurs directs du facteur Xa ; - les anti-IIa, inhibiteurs directs de la thrombine. 30 Cet exemple se focalise sur la famille des anti-Xa dont les principales molécules sont : - le rivaroxaban ou Xarelto commercialisé par Bayer/Janssen Pharmaceutical ; 3051253 22 - l'apixaban ou Eliquis commercialisé par Bristol-Myers Squibb/Pfizer; - l'edoxaban ou Lixiana/Savaysa commercialisé par Daiichi Sankyo. Matériels et méthodes 5 1. Matériels Les échantillons de plasma (Etablissement Français du Sang, La Plaine Saint-Denis, France) sont issus de patients sains, n'étant pas sous traitements pro ou anticoagulants. Différents pools de plasma datés du 01/2011, du 03/2012, du 04/2014, du 11/2014 et du 10 02/2015 sont utilisés pour les expériences. Avant la réalisation des pools de poches de plasma, des tests sont réalisés afin de vérifier que les valeurs des taux de prothrombine (TP), des temps de céphaline avec activateur (TCA) ainsi que les concentrations en facteurs de coagulation sont conformes. Les poches de plasma sont par la suite décongelées pendant 50 min à 37°C et laissées à température ambiante pendant 30 min 15 pour leur stabilisation. Un pool est réalisé et le plasma est mis sous agitation à 153 tours/min pendant 35 min avant répartition. Les fractions sont conservées à environ 70°C. Avant leur utilisation elles sont décongelées à 37°C pendant 5 min. Les surcharges en anticoagulants sont réalisées à partir de solutions d' apixaban (Eliquis, Bristol Myers Squibb, New York, Etats Unis) concentrées à 400 1..tg/mL, de tosylate 20 d'edoxaban (Lixiana, Daiichi-Sankyo, Tokyo, Japon) à 500 1..tg/mL et de rivaroxaban (Xarelto, Bayer, Leverkusen, Allemagne) à 3931..tg/mL. Les réactifs du kit commercial STA - Liquid Anti-Xa (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) F. Xa (facteur Xa d'origine bovine) et substrat (MAPA-Gly-Arg-pNA) sont utilisés. Ces réactifs commerciaux ainsi que le pool de plasma humain normal Pool 25 Norm (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France), le tampon Owren Koller (TOK) (pH 7,35 STA - Owren-Koller, Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) et la solution de désorption (DU) STA - Desorb U (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) sont régénérés à température ambiante pendant 30 min, comme recommandé par le fournisseur. 30 Du diméthylsulfoxyde (DMSO) (Carlo Erba, Val de Rueil, France) dilué à 5 % dans de l'eau déminéralisée est utilisé pour les expériences. 3051253 23 Toutes les mesures sont effectuées sur l'automate STA-R (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) AUT00460 (Numéro Hasting). La version de logiciel de l'automate est la v3.04.05. 5 2. Méthodes Dosages enzymatiques anti-Xa Le suivi des cinétiques s'obtient par colorimétrie à 405nm en détectant la libération de paranitroanilide (pNA). La densité optique (DO) est mesurée toutes les deux secondes. 10 Deux méthodologies ont été optimisées pour le dosage des trois anticoagulants oraux directs anti-Xa. La méthodologie gamme large permet le dosage des anticoagulants sur l'intégralité de la plage souhaitée ; toutefois la mesure de faibles concentrations de ces anticoagulants nécessitant une grande précision, une méthodologie gamme fine a été développée. En gamme large, 6,25 !IL de plasma sont dilués avec du TOK dans un 15 volume final de 50 p.L. La microcuvette est mise en incubation pendant 240 s à 37°C en présence de 150 !IL de substrat. La réaction est déclenchée par l'ajout de 150 !IL de F. Xa préalablement incubé à 37°C. En gamme fine, 25 !IL d'échantillon sont dilués avec 25 !IL de TOK. Les conditions expérimentales d'ajout de substrat et d'enzyme sont les mêmes que pour la 20 méthodologie gamme large. La détermination des pentes est faite entre 50 et 80 secondes. Calibration universelle La calibration est réalisée à partir d'une gamme en F. Xa composée de 10 points allant 25 de 10 à 100 % de F. Xa, correspondant à une activité anti-Xa allant de 90 à 0 %. La gamme est créée à partir des réactifs du kit STA- Liquid Anti-Xa. Le F. Xa (2 ml, 1,8 ml... 0,2 ml) est dilué dans du TOK (0 ml, 0,2 ml... 1,8 ml) pour un volume final de 2 ml. Le pool de plasmas daté du 04/2014 est utilisé pour cette expérience. Du DMSO 5 % est dilué au 1/20ème dans le plasma. Les résultats (mesures des DO/mn 30 entre 50 et 80 secondes) sont déterminés en deux réplicats. Les pentes des cinétiques mesurées pour les 10 points de calibration permettent le tracé du graphe activité anti-Xa(%) en fonction de la DO/mn. L'équation de la courbe 3051253 24 obtenue est utilisée pour convertir les DO/mn des échantillons testés en activité anti-Xa en pourcent. Elle est donnée par une régression polynomiale d'ordre un ou d'ordre deux. 5 Construction des abaques de conversion Les paramètres de l'abaque, propres à chaque AOD, sont déterminés pour les deux méthodologies par une régression non linéaire de l'équation 2 sur quelques points expérimentaux. En gamme large, les échantillons surchargés à 0, 100, 200, 300 et 400 ng/ml sont utilisés pour construire l'abaque associé au rivaroxaban. Les échantillons 10 surchargés à 0, 100, 200, 300, 400 et 500 ng/ml sont utilisés pour construire les abaques associés à l'apixaban et à l'edoxaban. En gamme fine, les échantillons surchargés à 0, 30, 65 et 100 ng/ml sont utilisés pour construire l'abaque associé au rivaroxaban. Les échantillons surchargés à 0, 50, 100 et 150 ng/ml sont utilisées pour construire les abaques associés à l'apixaban et à l'edoxaban. Pour chaque échantillon est mesurée la 15 DO/mn entre 50 et 80 secondes. Surcharges de plasma Le pool de plasma daté du 04/2014 est utilisé pour réaliser les surcharges. Les dilutions des solutions mères en AODs se font dans du DMSO 5 %. Une solution intermédiaire à 20 10 µg/ml permet de réaliser les gammes de dilution pour les différentes surcharges. La dilution des AOD dans le plasma est au 1/20ème. Les concentrations des surcharges sont de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 65, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 ng/ml pour le rivaroxaban et de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ng/ml pour 25 l'apixaban et l'edoxaban. Le volume final des surcharges est de 1 ml. Les solutions contenant de l'edoxaban sont conservés à l'abri de la lumière. Les résultats (mesures des DO/mn entre 50 et 80 secondes) sont déterminés pour chaque surcharge en trois réplicats. 30 3051253 25 Configuration des tests pour la calibration universelle Une configuration de test est créée par dilution en F. Xa pour les méthodologies gamme large et gamme fine. Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa". 5 Configuration des tests pour la construction des abaques Comme précédemment, les différentes mesures sont obtenues suivant les méthodologies gamme large et gamme fine décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa". 10 Configuration des tests pour les surcharges de plasma Les mesures sur les plasmas surchargés en AODs se font suivant les méthodologies gamme large et gamme fine décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa". Détermination de la limite de blanc 15 La limite de blanc (LoB) est réalisée suivant une procédure standard. Les cinq différents plasmas utilisés sont ceux datés du 01/2011, du 03/2012, du 04/2014, du 11/2014 et du 02/2015. Quatre réplicats sont réalisés chaque jour, pendant trois jours sur le même automate. Les tests sont lancés pour les méthodologies gamme large et gamme fine. 20 Détermination de la limite de détection La détermination de la limite de détection (LoD) a été réalisée suivant une procédure standard. Des plasmas bas en analytes sont préparés. Les surcharges se font au 1/20ème. Le plasma daté du 04/2014 est utilisé. Lorsque la régression de la calibration universelle est un polynôme d'ordre un, les concentrations en analytes en gamme large sont de 10 25 ng/ml en rivaroxaban et en apixaban et de 15 ng/ml pour l'edoxaban. En gamme fine, les concentrations des surcharges sont de 5 ng/ml pour les trois anticoagulants. Cinq surcharges sont réalisées pour un volume final de 900 p.L. Lorsque la régression de la calibration universelle est un polynôme d'ordre deux, les concentrations en analytes en gamme large et en gamme fine sont de 2 ng/ml pour les trois AODs. Le volume final 30 des surcharges est de 1000p.L. 3051253 26 Chaque surcharge est fractionnée en trois tubes. Les échantillons sont congelés à -70°C jusqu'à leur utilisation. Les analyses se font sur trois jours sur le même automate avec quatre réplicats d'analyse par jour et par surcharge. 5 Dosages enzymatiques anti-Xa avec dilution en plasma Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites dans les sections précédentes mis à part la dilution qui ne se fait plus en tampon mais en plasma. Le diluant utilisé est le Pool Norm. La calibration universelle s'obtient toutefois en diluant le F. Xa dans du TOK dans les mêmes conditions que celles décrites dans la section 10 "Calibration universelle". 3 Résultats 1 Calibrations universelles 15 La figure 1 illustre les calibrations universelles, obtenues respectivement en méthodologies gamme large et gamme fine, qui expriment les résultats en activité antiXa (%) en fonction des DO/mn mesurées. Les régressions linéaires des différents points expérimentaux donnent les équations y = -0, 999x + 1, 053 (R2 = 0, 994) et y = -1, 081x + 1, 034 (R = 0, 996). 20 L'équation théorique de ces calibrations est donnée par la droite d'équation 1 comme décrit dans la description ; les résultats obtenus ici sont en parfait accord avec cette expression : régression linéaire avec un coefficient de détermination très proche de 1 et ordonnée à l'origine proche de 1. Notons que les équations de ces deux droites sont différentes : ceci s'explique par le fait que la dilution de l'échantillon est différente entre 25 les deux méthodologies (1/8 pour la méthodologie gamme large, 1/2 pour la méthodologie gamme fine), un effet matrice est observé. 2 Abaques de conversion La figure 2 illustre les abaques qui permettent de convertir l'activité anti-Xa (%) 30 mesurée en concentration en ng/ml pour chacun des trois AODs. Ces abaques sont construits en effectuant une régression non linéaire de l'équation 2 sur des échantillons dont les couples (activité anti-Xa, [anticoagulant]) sont connus. En méthodologie 3051253 27 gamme large, ces régressions non linéaires ont respectivement des coefficients de détermination R2 de 0,997 pour le rivaroxaban, de 0,995 pour l'apixaban et de 0,993 pour l'edoxaban. En méthodologie gamme fine, ces régressions non linéaires ont respectivement des coefficients de détermination R2 de 0,993 pour le rivaroxaban, de 5 0,997 pour l'apixaban et de 0,992 pour l'edoxaban. L'ensemble des valeurs de ces coefficients de détermination souligne la pertinence du modèle mathématique développé. En outre, à concentrations égales, le rivaroxaban possède l'activité anti-Xa in vitro la plus élevée contrairement à l'edoxaban qui en a la plus faible : ceci confirme que le ng/ml n'est pas une unité universelle pour le dosage des AODs anti-Xa. 10 3 Dosages de plasmas surchargés en AODs Dans cette section, les résultats des dosages des taux de plasmas surchargés en AODs (rivaroxaban, apixaban et edoxaban) sont obtenus en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention en comparaison aux taux théoriques. Les résultats sont 15 jugés satisfaisants lorsque la pente de la régression linéaire est comprise entre 0,9 et 1,1 et que le coefficient de détermination R2 est supérieur ou égal à 0,95. Rivaroxaban La figure 3 donne les résultats des comparaisons des dosages des taux en rivaroxaban 20 mesurés en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques sur 20 surcharges selon la méthodologie gamme large et sur 8 surcharges selon la méthodologie gamme fine. Ces comparaisons donnent respectivement une pente de 0,98 et de 0,96 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,998 et de 0,995 validant ainsi les résultats. 25 Apixaban La figure 4 donne les résultats des comparaisons des dosages des taux en apixaban mesurés en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques sur 24 surcharges selon la méthodologie gamme large et sur 10 surcharges selon la 30 méthodologie gamme fine. Ces comparaisons donnent respectivement une pente de 0,97 et de 0,97 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,999 et de 0,999 validant ainsi les résultats. 3051253 28 Edoxaban La figure 5 donne les résultats des comparaisons des dosages des taux en edoxaban mesurés en utilisant le principe de calibration universelle aux taux théoriques sur 24 5 surcharges selon la méthodologie gamme large et sur 10 surcharges selon la méthodologie gamme fine. Ces comparaisons donnent respectivement une pente de 0,99 et de 1,00 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,996 et de 0,997 validant ainsi les résultats. 10 4 Limites de blanc et limites de détection Dans cette section, nous donnons les limites de blanc (LoB) ainsi que les limites de détection (LoD) mesurées en utilisant le principe de calibration universelle en méthodologie gamme large et gamme fine. De plus, une méthode d'amélioration de ces valeurs en méthodologie gamme fine est proposée. Pour rappel, le seuil décisionnel pour 15 autoriser une intervention chirurgicale chez un patient prenant un traitement AOD est un taux inférieur ou égal à 30 ng/ml (a minima pour le rivaroxaban [Pernod et al., 2013, Annales françaises d'anesthésie et de réanimation, 32(10):691-700]). 'Alétll[dolunie gammu large de blanc ut limitus de détection. 20 Méthodologie gamme large Le tableau 1 liste les limites de blanc et les limites de détection obtenues en méthodologie gamme large en utilisant le principe de calibration universelle. Les valeurs des LoD observées sont respectivement de 21,5 ng/ml pour le rivaroxaban, de 25 21,8 ng/ml pour l'apixaban et de 28,8 ng/ml pour l'edoxaban : ces résultats indiquent que la méthodologie gamme large ne permet pas de mesurer les faibles taux en AODs anti-Xa avec la précision requise dans le contexte d'une intervention chirurgicale urgente. 3051253 29 "1: NIéthodulugie gal/ mite ffillitCb 1 al1C et HW/ tu., du détection. Méthodologie gamme fine 5 Le tableau 2 liste les limites de blanc et les limites de détection obtenues en méthodologie gamme fine en utilisant le principe de calibration universelle. Les valeurs des LoD observées sont respectivement de 6,9 ng/ml pour le rivaroxaban, de 6,9 ng/ml pour l'apixaban et de 8,7 ng/ml pour l'edoxaban : ces résultats démontrent que la méthodologie gamme fine est suffisamment performante pour mesurer avec 10 précision de très faibles taux en AODs anti-Xa. -1":,.1)1.: 3: Op( ieit un méthodologie le blanc et lill2it es du détection. Optimisation en méthodologie gamme fine 15 11 a été démontré et validé expérimentalement que la calibration universelle est une droite donnée par l'équation 1. Toutefois, de manière empirique, une régression de la calibration universelle par un polynôme d'ordre deux approxime mieux les points expérimentaux qu'une régression linéaire : cette observation est illustrée sur la figure 6. La régression de la calibration universelle par un polynôme d'ordre deux permet 20 d'améliorer les LoB et LoD en méthodologie gamme fine (cf. le tableau 3) mais n'impacte pas sur la qualité des comparaisons des taux mesurés aux taux théoriques (résultats non montrés). 25 3051253 30 5 Dilution en plasma La différence de la valeur de la dilution de l'échantillon entre les méthodologies gamme large (dilution = 1/8) et gamme fine (dilution = 1/2) induit un effet matrice. Il est proposé une méthode pour s'en affranchir : pour cela, l'échantillon n'est plus dilué en 5 tampon (TOK) mais est dilué en plasma (Pool Norm), les facteurs de dilution restant inchangés. La figure 7 compare l'allure des calibrations universelles lorsque l'échantillon est dilué en tampon à l'allure des calibrations universelles lorsque l'échantillon est dilué en plasma. Les régressions linéaires des points expérimentaux respectivement en méthodologie gamme large et en méthodologie gamme fine donnent 10 les droites d'équation y = -0,999x+1,053 et y = -1,081x+1,034 lorsque l'échantillon est dilué en tampon, et donnent les droites d'équation y = -1,173x + 1,022 et y = -1,198x + 1,020 lorsque l'échantillon est dilué en plasma. Ces résultats indiquent que lorsque l'échantillon est dilué en plasma les équations des deux droites des calibrations universelles se superposent : dans cette configuration, il n'est plus nécessaire d'effectuer 15 deux calibrations mais simplement une seule, commune aux deux méthodologies. Soulignons par ailleurs que la comparaison des taux théoriques en rivaroxaban aux taux mesurés sur des plasmas surchargés en utilisant le principe de calibration universelle avec dilution de l'échantillon en plasma donne une pente de 0,96 et un coefficient de détermination de 0,999 en méthodologie gamme large, ainsi qu'une pente de 0,95 et un 20 coefficient de détermination de 0,995 en méthodologie gamme fine, cf. figure 8 : ces résultats démontrent qu'il est possible de mesurer in vitro les taux en AODs d'échantillons dilués en plasma. REVENDICATIONS1. Méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, ladite méthode comprenant au moins une étape b) comprenant les sous-étapes suivantes : - blA) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat 10 marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, 15 - conversion de la concentration ou l'activité d'enzyme utilisée pour chaque mélange de l'étape blA), en activité anti-enzyme, de préférence par la simple soustraction correspondant à: Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un 20 mélange donné à l'étape blA), en %), puis - b1B) construction de la courbe indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue pour chaque mélange de l'étape blA), ladite courbe correspondant à la courbe de calibration universelle. 25 2. Méthode de dosage d'au moins un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, ladite mesure étant obtenue par 30 - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, - suivi du marquage au cours du temps, puis 3051253 32 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire; et b) conversion de la mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage. 5 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape c) de conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur est réversible ou irréversible. 5. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que la mesure de l'étape a) est obtenue par : - mélange de l'échantillon biologique avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou d'activité connue, et une solution de son substrat chromogène, ladite solution de substrat chromogène pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, - suivi de la densité optique au cours du temps, de préférence entre 50s et 80s, puis - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, de préférence entre 50s et 80s. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 3 à 5, caractérisée en ce que l'étape b1B) comprend la construction d'une droite de calibration répondant à l'équation suivante où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est nulle. 7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'étape b) comprend : bl) la construction d'une droite de calibration répondant à l'équation suivante 3051253 33 où : - v correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire ; - 1/vo est la pente de la droite, et vo correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon 5 est nulle, puis b2) la conversion d'au moins une mesure de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en a), en activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage, à l'aide de la droite obtenue en 111). 10 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'étape bl) comprend les étapes suivantes : blA) au moins 2 mesures de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou 15 d'activité initiale connue, et une solution de son substrat marqué, ladite solution de substrat marqué pouvant être ajoutée simultanément ou séquentiellement au mélange, chaque mélange étant réalisé avec une concentration ou activité d'enzyme différente et obtenue par dilution sérielle de la concentration ou activité initiale, - suivi du marquage au cours du temps, puis 20 - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, et b1B) construction de la droite indiquant l'activité anti-enzyme en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue en blA). 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que la concentration ou l'activité 25 d'enzyme utilisée pour chaque mélange de l'étape blA) est convertie, préalablement à l'étape b1B), en activité anti-enzyme par la simple soustraction correspondant à : Activité anti-enzyme (%) = 100 - (concentration ou activité d'enzyme utilisée pour un mélange donné à l'étape blA), en %). 30 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma 3051253 34 pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule, de préférence de plasma pauvre en plaquettes. 11. Méthode selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que la conversion de 5 l'étape c) se fait à l'aide d'un abaque obtenu en effectuant une régression non linéaire de l'équation suivante, sur des échantillons dont les couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) sont connus : où : - AntiEnzyme (%) est l'activité anti-enzyme ; 10 - Mo est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon ; - i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur. 12. Méthode selon l'une des revendications 3 à 11, caractérisée en ce que l'étape c) comprend les étapes suivantes: 15 cl) construction d'un abaque de conversion spécifique de chaque inhibiteur, puis c2) conversion de l'activité anti-enzyme de la coagulation sanguine, exprimée en pourcentage et obtenue en b), en concentration en inhibiteur à l'aide de l'abaque obtenu en cl). 13. Méthode selon la revendication 12 et selon la revendication 7, 8 ou 9, caractérisée en ce 20 que l'étape cl) comprend les étapes suivantes: clA) au moins 2 mesures de l'activité anti-enzyme, de préférence au moins 4, de préférence au moins 10 mesures, chaque mesure étant obtenue par : - mélange d'un échantillon biologique comprenant une concentration connue dudit inhibiteur, avec une solution d'enzyme de la coagulation sanguine de concentration ou 25 d'activité fixe connue et une solution de son substrat marqué, chaque mesure utilisant une concentration d'inhibiteur différente, et ladite solution d'enzyme étant de préférence ajoutée en dernier lieu, - suivi du marquage au cours du temps, - calcul de la pente obtenue à l'état stationnaire, qui correspond à l'activité 30 enzymatique résiduelle à l'état stationnaire, puis 3051253 - conversion de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire en activité antienzyme, grâce à la droite obtenue en bl), puis c1B) construction de l'abaque indiquant la concentration en inhibiteur en fonction de l'activité anti-enzyme, avec les mesures obtenues en clA). 14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que l'enzyme de la coagulation sanguine est choisie parmi les facteurs de coagulation, la kallikréine et la plasmine, de préférence choisie parmi les facteurs IIa, Xa et la plasmine. 10 15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine est choisi parmi l'antithrombine, les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides comme le fondaparinux, le danaparoïde sodique, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine, la désirudine, la bivalirudine, l'argatroban, le dabigatran, le 15 rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le darexaban, l'otamixaban, le melagatran, le ximelagatran et l'antiplasmine. 16. Utilisation d'une méthode selon l'une des revendications 2 à 15, pour quantifier le besoin en composé anti-inhibiteur. 20