FR 3062213 A1 20180727 FR 1750468 A 20170120 1 L'endométriose est causée par du tissu semblable au tissu endométrial qui se développe hors de l'utérus et provoque des lésions, des adhérences et des kystes dans les organes colonisés. Caractérisée par d'intenses douleurs, elle touche 10% des femmes en âge de procréer soit 180 millions de femmes dans le monde (Abbott, 2013; ASRM, 2012; Bulletti et al., 2010; Nucci and Oliva, 2009). L'endométriose peut être ovarienne, péritonéale, intestinale, rectale, et parfois même, dans certaines formes rares, ombilicales, pulmonaires ou cutanées. Pour les femmes concernées, les principaux symptômes sont des crampes menstruelles, des douleurs chroniques invalidantes, des mictions douloureuses et des menstruations très irrégulières et excessives. La maladie a un fort retentissement sur la vie sociale et professionnelle de ces femmes (ESHRE, 2007). L'infertilité est également une des conséquences majeures de l'endométriose : on estime que jusqu'à 40% des femmes atteintes d'endométriose sont infertiles ; inversement près de 40% des cas d'infertilité seraient dus à des endométrioses. Malgré une incidence et une prévalence très élevées, l'endométriose est diagnostiquée avec un retard moyen de neuf années, durant lesquelles la maladie a eu le temps de causer des dommages notables au niveau des différents organes affectés. Le coût sociétal annuel de l'endométriose a été estimé uniquement pour les Etats-Unis à 49,6 milliards de dollars (Simoens et al, 2012). Ce coût est comparable à celui d'autres maladies chroniques telles que le diabète de type II ou la maladie de Crohn. En France, le coût annuel par patiente a été extrapolé à 10.000 euros en 2012 à partir du coût estimé en Italie par Simoens (Journal Officiel du Sénat, Avril 2013). Les traitements actuels de l'endométriose Selon l'American Society for Reproductive Medicine (ASRM), l'endométriose doit être considérée comme une maladie chronique nécessitant un suivi médical tout au long de la vie des patientes atteintes afin de privilégier les traitements médicaux et éviter les interventions chirurgicales répétées. L'ASRM estime ainsi que 40 à 80% des femmes souffrant d'endométriose souffrent de douleurs chroniques récurrentes dans les deux ans 3062213 2 après la chirurgie et qu'un suivi sur le long terme de la douleur associée à l'endométriose est généralement nécessaire. (ASRM, 2012). Bien qu'aucun médicament spécifique n'existe actuellement pour 5 l'endométriose, plusieurs approches sont utilisées pour traiter les symptômes associés à cette pathologie. Les options de traitement comprennent la chirurgie, les traitements hormonaux, ou une combinaison des deux. La chirurgie conservatrice est une option fréquemment utilisée pour les femmes souhaitant une grossesse. En effet l'endométriose est l'un des principaux facteurs 10 d'infertilité. En raison du taux élevé de récidives post-chirurgicales de l'endométriose, la prise en charge combine la plupart du temps les versants chirurgicaux et médicaux pour améliorer les résultats (RCOG, 2006). Un traitement médical est généralement prescrit dans les cas où la douleur 15 associée à l'endométriose affecte significativement la qualité de vie de la patiente. Les traitements de l'endométriose les plus couramment utilisés sont les suivants : - Progestatifs et les Contraceptifs Oraux Combinés (COC) - Agonistes de la LH-RH. Ce traitement ne peut pas être prescrit au-delà 20 d'une durée d'un an. - Les anti-inflammatoires non stéroïdiens - Le Danazol - Coelioscopie opératoire (traitement le plus utilisé) - Hystérectomie avec ovariectomie et exérèse de toutes les lésions en 25 place pour prévenir tout risque de récidive (souvent l'opération "de dernier recours"). Il n'existe à ce jour aucun traitement curatif de l'endométriose. 30 Du fait de leur profil favorable en termes de sécurité, de tolérance et de coût, les COC sont systématiquement considérés comme l'option de traitement de première ligne, 3062213 3 à la fois comme une alternative à la chirurgie et à titre d'adjuvant postopératoire. Ces médicaments bloquent l'ovulation et inhibent la croissance des endométriomes. Les COC sont généralement bien tolérés et présentent peu d'effets secondaires. Les progestatifs prennent plusieurs formes, y compris les dispositifs intra-utérins (DIU), les injections, et la 5 pilule. Les médicaments anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS) sont généralement utilisés en conjonction avec les traitements de première ligne pour soulager la douleur. Le Danazol est un dérivé de l'éthistérone, et a été le premier médicament approuvé aux États-Unis pour traiter l'endométriose. Bien qu'il soit efficace pour réduire la taille des implants endométriosiques, ses effets secondaires trop importants (virilisation) font qu'il n'est 10 quasiment plus utilisé. Aujourd'hui les agonistes de la GnRH sont considérés comme le traitement médical de première ligne pour la douleur associée à l'endométriose modérée à grave. Cependant leurs effets secondaires et notamment la perte de densité osseuse significative qu'ils engendrent ont entrainé la limitation de ce traitement dans le temps à un maximum 15 de 12 mois. Le problème des traitements hormonaux est que leur utilisation, par définition, empêche la conception. En effet, nombre de patientes découvrent qu'elles souffrent d'endométriose à l'occasion d'un bilan pour infertilité. Or, la plupart des traitements 20 proposés actuellement sont des hormonothérapies ciblant la voie de production de l'cestrogène, et donc souvent des contraceptifs. En raison des limites intrinsèques des traitements disponibles, il y a donc un besoin très important de médicaments innovants avec de nouveaux mécanismes d'action indépendants de l'hormonothérapie pour traiter les patientes souffrant d'endométriose. 25 L'endométriose diminue et disparaît généralement après la ménopause, mais doit tout de même être surveillée surtout quand des traitements hormonaux substitutifs sont mis en place à la ménopause. Le récepteur CD71 Le CD71 est un récepteur de la transferrine présent à la surface de toutes les 30 cellules humaines. La transferrine est une protéine permettant le transport dans l'organisme d'un élément essentiel à la vie, le fer. La transferrine se fixe sur son récepteur le CD71 et permet ainsi la pénétration du fer dans la cellule. 3062213 4 Plus une cellule se multiplie, comme par exemple la cellule cancéreuse ou la cellule endométriosique, plus son besoin en fer augmente. Plusieurs études démontrent que les cellules tumorales, à haute capacité proliférative, expriment fortement le récepteur CD71, permettant ainsi une captation du fer adaptée aux besoins de la cellule. Le CD71 5 régulateur clé de l'activité cellulaire, et plus particulièrement de la prolifération des cellules, apparait donc comme une cible pertinente pour bloquer les proliférations tumorales et éradiquer les cellules cancéreuses. 10 Le récepteur CD71 une cible nouvelle dans le traitement de l'endométriose Le CD71 régule l'activation et la prolifération cellulaire en permettant l'entrée du fer dans la cellule. Les études précliniques conduites par Inatherys ont démontré que les cellules tumorales, à haute capacité proliférative, expriment fortement le récepteur CD71 et que le blocage de son activité biologique par l'anticorps anti-CD71 en induisant une carence 15 en fer de la cellule, inhibe la prolifération des cellules tumorales et provoque la mort cellulaire par apoptose. Inatherys a par ailleurs démontré la spécificité du ciblage de l'anticorps anti-CD71 qui se fixe préférentiellement sur les cellules à forte densité en récepteurs à la transferrine. 20 Il a été démontré récemment dans plusieurs publications internationales, que le métabolisme du Fer est impliqué dans la pathogénèse de l'endométriose, et que le Fer est présent à forte concentration dans la cavité péritonéale des patientes (Defrère et al., 2008 - Molecular Human Reproduction Vol.14, No.7 pp. 377-385, 2008; Lousse et al., 2009 - Fertility and Sterility Vol. 91, No. 5, May 2009; Sanchez et al., 2014 - Human Reproduction, 25 Vol.29, No.3 pp. 577-583, 2014). Ainsi, démontrer que de façon similaire aux cellules cancéreuses, les cellules endométriosiques surexpriment le récepteur CD71 à leur surface pour répondre à leur besoin accru en fer puis mettre en évidence l'activité antiproliférative de l'anticorps antiCD71 sur ces cellules constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel dans 30 l'endométriose. 3062213 5 Utilisation d'un anticorps anti-CD71 : un mécanisme d'action novateur pour cibler CD71 et un traitement prometteur de l'endométriose Un tel anticorps cible essentiellement les cellules à forte capacité proliférative : il rentre en compétition avec la transferrine au niveau de sa fixation sur le CD71. Dans des 5 conditions physiologiques, les cellules quiescentes présentent un nombre restreint de molécules de CD71 à leur surface privilégiant la fixation de la transferrine. A l'opposé, les cellules cancéreuses ou les cellules endométriosiques qui se multiplient vite ont un besoin en fer accru et donc une forte densité de récepteurs CD71 à leur surface. Dans ce cas, l'anticorps anti-CD71 se fixe de manière bivalente sur le CD71 et empêche la fixation de la 10 transferrine sur son récepteur. L'anticorps anti-CD71 - réduit le nombre de CD71 à la surface cellulaire. Il induit une internalisation du récepteur vers les compartiments lysosomiaux où il est dégradé. Cette diminution très rapide implique jusqu'à 90% des récepteurs présents à la surface cellulaire, 15 - prive les cellules tumorales de fer. Les cellules tumorales ou endométriosiques ciblées par l'anticorps anti-0071 ont donc une réduction très importante d'apport en fer. Cette privation en fer semble être le mécanisme majeur impliqué dans la mort des cellules cancéreuses. - agit de façon autonome. Contrairement à la majorité des anticorps monoclonaux commercialisés, l'anticorps anti-CD71 présente un effet intrinsèque et indépendant de la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) ou du complément (CDC) et donc de l'état immunitaire du patient. Le récepteur CD71 une cible nouvelle dans le diagnostic de l'endométriose En parallèle de cette innovation thérapeutique, le développement d'un test diagnostic ciblant le récepteur CD71 permet d'identifier les patientes pouvant répondre à ce nouveau traitement. L'évaluation de la densité des récepteurs CD71 au niveau des lésions 30 d'endométriose constitue un test de diagnostic compagnon permettant de valider au cas par cas l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 comme traitement contre l'endométriose. Ce test peut prendre la forme d'un kit d'Immunohistochimie (IHC) comprenant l'anticorps anti-CD71 comme anticorps spécifique pour détecter l'expression du récepteur à 20 25 3062213 6 la transferrine. L'immunohistochimie étant une technique utilisée en routine dans les laboratoires d'analyses médicales ou les laboratoires hospitaliers, permettant de réaliser des analyses semi-quantitatives directement sur les tissus afin de renseigner sur la présence et la localisation des récepteurs ciblés, il s'agit d'une technique de choix pour développer un kit 5 de diagnostic in vitro robuste, fiable, peu coûteux et rapide à mettre en oeuvre. A la manière de l'Herceptest, dans le cancer du sein qui permet de stratifier les patientes en fonction de la surexpression de Her2neu pour déterminer lesquelles bénéficieront d'un traitement avec l'Herceptin, un test de diagnostic évaluant la surexpression du CD71 apporte un véritable changement de paradigme dans le traitement 10 des patientes atteintes d'endométriose. En effet, jusqu'alors le choix d'un traitement n'était pas ciblé. Définir le traitement de façon rationnelle en prédisant son efficacité constitue une amélioration significative de la prise en charge des patientes. De plus, outre la sélection des patientes éligibles à ce traitement, ce test compagnon 15 permettra à plus court terme: - D'améliorer le taux de réponse à anticorps anti-CD71 dans l'endométriose lors du développement clinique grâce au ciblage des patientes répondeuses - D'améliorer le ratio bénéfice/risque - De réduire la taille des cohortes nécessaires grâce à la stratification des patientes qui 20 permet de ne cibler que les patientes potentiellement répondeuses sans perdre de puissance statistique - De diminuer la durée de la phase de développement de l'anticorps anti-CD71 grâce à des cohortes plus petites en phase II et III ainsi que les coûts associés Ainsi la présente invention a pour objet : 25 - L'utilisation du récepteur CD71 comme cible dans la détection et/ou le traitement de l'endométriose. - Un test de diagnostic ciblant le récepteur CD71 dans un échantillon biologique pour la détection et/ou le suivi d'un traitement de l'endométriose. 30 - Un test de diagnostic permettant d'évaluer la surexpression du récepteur CD71. 3062213 7 - Un kit de diagnostic ou de suivi thérapeutique comprenant un anticorps spécifique du récepteur CD71. Dans une mise en oeuvre particulière, le kit de diagnostic comprenant en outre des anticorps 5 ciblant le marqueur KI67 et/ou la protéine BcI2. Dans une autre mise en oeuvre particulière de l'invention, le kit de diagnostic ou de suivi thérapeutique est un kit d'immunohistochimie. 10 - L'utilisation du kit selon l'invention pour détection et/ou le suivi de traitement de l'endométriose. - L'anticorps anti-CD71 pour son utilisation dans la détection et/ou le traitement de l'endométriose. 15 - Une méthode de détection du degré/gravité de l'endométriose par mesure de la concentration/densité/expression du récepteur CD71. 20 Exemple 1: Preuve de concept de l'utilisation de l'anticorps anti-CD71 comme possible traitement de l'endométriose 1) Validation de la présence des récepteurs de la transferrine sur lésions endométriosiques rétrospectives inclues en paraffine 25 Cette étape a été conduite sur des échantillons d'endométriose inclus en paraffine (n=44) grâce à la technique d'immunohistochimie (IHC), technique qu'Endodiag utilise en routine. Chaque série de bloc d'échantillon était représentative d'un stade de la pathologie. En parallèle à la validation de la présence de CD71 au niveau des lésions 30 d'endométriose, des IHC ciblant le marqueur de prolifération KI67 et l'oncogène BcI2 ont été réalisées. En effet l'anticorps anti-CD71 cible de préférence les cellules avec un fort taux de prolifération et induit leur apoptose par privation en fer. Les cellules ciblées par l'anticorps 3062213 8 anti-CD71, en plus d'exprimer CD71, sont positives pour le facteur de prolifération KI67 et le marqueur anti apoptotique BcI2. La figure 1 montre : - a) IHC anti CD71 / récepteur à la transferrine, 5 - b) IHC anti KI67 (marqueur de prolifération), - c) IHC anti BcI2 (marqueur anti apoptotique). Les IHC ont été réalisées sur 44 biopsies de lésions endométriosiques. Les résultats ont permis de démontrer que l'intensité du marquage CD71 est corrélée à celle du KI67. Ainsi plus le marquage KI67 est élevé (glande et/ou stroma) plus le marquage CD71 est important 10 (tissu N°1). A l'inverse pour les lésions présentant un faible marquage KI67, le marquage CD71 est également peu intense (tissu N°3). Il existe également une corrélation entre les marquages de KI67 et CD71 et celui de BcI2. Plus le marquage KI67 ou CD71 est élevé et plus le marquage de bcI2 est important. Cela confirme le statut prolifératif des cellules endométriosiques (prolifération élevée et apoptose 15 inhibée). Les lésions endométriosiques les plus prolifératives (associées à un KI67 élevé) surexpriment également le récepteur CD71. Il existe une corrélation entre l'expression de ces deux marqueurs. Ce premier résultat permet de faire l'hypothèse que, comme les 20 cellules cancéreuses, ces lésions prolifératives seraient sensibles à l'action ciblée de l'anticorps anti-CD71. Ces tests ont permis de valider l'intérêt de tester l'anticorps anti-CD71 dans le traitement de l'endométriose. 25 Exemple 2: Démonstration de la corrélation entre la densité de CD71 à la surface des cellules endométriosiques et l'efficacité thérapeutique de l'anticorps anti-CD71 : a) La première partie commence lors des tests in vitro réalisés sur des cultures primaires de cellules issues de lesions endométriosiques. Il s'agit de 30 tester l'effet de l'anticorps anti-CD71 sur ces cultures (test de proliferation, apoptose et invasivité, dose dependants) et vérifier l'effet anti proliferatif de l'anticorps anti- 3062213 9 CD71. Des immunocytochimies avec l'anticorps anti CD71 sont réalisées en parallèle pour quantifier les recepteurs CD71 à la surface des cellules. Des experiences en cytométrie de flux sont également réalisées pour quantifier les récepteurs CD71 à la surface des cellules. Ces données sont analysées en parallèle de l'effet constaté sur 5 les cellules in vitro et une corrélation entre densité de CD71 et efficacité de l'anticorps anti-CD71 est recherchée. b) Dans un deuxième temps, cette corrélation est démontrée lors des tests in vivo sur un modèle murin de xénogreffe de cellules endométriosiques. Les différents tests réalisés sur ce modèle permettent de mettre en évidence 10 l'efficacité de l'anticorps anti-CD71 sur les cellules endométriosiques. Ces résultats sont ensuite corrélés à la densité de récepteurs CD71 au niveau des lésions endométriosiques chez la souris xénogreffée et qui sont analysées par IHC à la fin de l'expérience. 15 Exemple 3 : Tests in vivo Une fois la technique in vivo validée, des cellules endométriosiques issues de 30 lésions fraiches dissociées sont injectées et une série de tests est effectuée utilisant ce modèle avec l'utilisation de multiples doses de l'anticorps anti-CD71, allant de 1, 5, 10, 20 et 20 40 mg/kg en une seule injection péritonéale, comme nous avons précédemment validé pour les hémopathies malignes. Puis plusieurs modes d'administration sont testés, intrapéritonéale (I.P) et intraveineuse (I.V) ainsi que plusieurs doses de ce traitement : 1 fois par semaine à 3 fois par semaine. Cette étude nous permet de valider l'utilisation de l'anticorps anti-CD71 in vivo pour le traitement de l'endométriose et de déterminer une 25 dose théorique à utiliser dans les premiers tests de toxicologie chez le singe. Afin de pouvoir quantifier au plus juste l'inhibition de la prolifération cellulaire suite au traitement par l'anticorps anti-CD71, Une sonde Xenolight RediJect 2-DG-750 qui permet de visualiser le métabolisme du glucose au sein de la tumeur (synonyme de prolifération) est injectée pour suivre la prolifération cellulaire in vivo . La fluorescence est mesurée par l'intermédiaire du 30 détecteur in vivo imagine FX pro de Kodak et les images sont analysées par le logiciel Carestream MI (Figure 2). Les études expérimentales sur animaux font l'objet de saisine du comité d'éthique et sont validées par les instances réglementaires universitaires Paris V. 3062213 10 La Figure 2 montre un exemple de suivi du développement sous cutanée de xénogreffes chez la souris NSG par imagerie microscopique. Les différences de prolifération cellulaire sont comptabilisées par soustraction des fluorescences entre les animaux traités et 5 témoins Exemple 4: Descriptif du kit Le kit est un kit d'immunohistochimie (IHC) basé sur l'utilisation de l'anticorps anti-CD71, garantissant ainsi une sensibilité et une sélectivité. L'anticorps anti-CD71 destiné 10 à l'usage diagnostique diffère de l'anticorps anti-CD71 à usage thérapeutique uniquement par la méthode de production qui ne se fera pas dans le cadre strict des BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication). Les clones produisant l'anti-CD71 seront néanmoins identiques. Le kit anti-CD71 d'IHC permet de réaliser entre 30 et 50 tests ce qui est généralement proposé pour les kits d'IHC déjà commercialisés. 15 I I comprend l'ensemble des réactifs nécessaires à la réalisation du test ainsi que les lames contrôles positif et négatif et un protocole complet avec les éléments nécessaires à l'analyse du résultat. Exemple 5 : optimisation du test 20 Il s'agit de définir les conditions optimales et les conditions limites d'utilisation du kit. Cette phase nécessite l'utilisation d'une vingtaine de prélèvements frais de lésions d'endométriose. Cette étape couvre respectivement : - les étapes pré analytiques qui représentent toutes les étapes du processus 25 précédant l'analyse des tissus soit, du prélèvement des tissus, transport, fixation, inclusion, épaisseur de coupe, type de lame etc. jusqu'à la réalisation de la coupe du bloc inclus en paraffine. - Les étapes de l'analyse à proprement parler soient toutes les étapes du protocole d'IHC, la coloration et le montage des lames 30 - Les étapes post analytiques qui comprennent l'interprétation et les rendus de résultats. 3062213 11 Lors des phases pré analytiques permettent de définir les critères et variables suivants : - Méthode de prélèvement des tissus - Fixation (temps, méthode) - Décalcification (temps, méthode) 5 Ces étapes sont critiques car les conditions de prélèvement des lésions peuvent varier de manière significative d'un chirurgien à l'autre et entrainer une dégradation des échantillons. Par exemple, l'utilisation des pinces et ciseaux rend les échantillons non analysables dans 40% des cas. 10 Ces phases ont déjà été optimisées, grâce au développement d'un pistolet à biopsies d'endométriose et d'un kit de prélèvement contenant tous les éléments nécessaires à la fixation rapide des biopsies (cf. W02013/034573)). Les phases analytiques permettent de définir les critères et variables suivants : 15 - Epaisseur de coupe - Type de lame - méthode de déparaffinage - méthode de démasquage antigénique - système de visualisation 20 - réactifs - contrôles - anticorps - méthode de réalisation du test (automate, manuel) - méthode de coloration 25 - type de montage de lamelle De façon plus détaillée, il s'agit de valider l'ensemble des conditions de réalisation du test et les réactifs qui sont utilisés lors de celui ci afin d'obtenir un marquage satisfaisant, un tissu correctement coloré et monté et donc analysable de façon optimale. 30 Pour chaque paramètre à ajuster, les différentes méthodes couramment utilisées sont testées et la plus appropriée est choisie. 3062213 12 Ainsi les données suivantes sont évaluées : - l'impact de l'épaisseur de la coupe sur les résultats, - l'impact du type de lame (lame simple, lame superfrost+®, lame FLEX®), - l'impact de la méthode de déparaffinage (temps, température, matériel, 5 couplée ou non au démasquage antigénique), - l'impact du système de visualisation ; kit basé sur la biotine / streptavidine ou sur un polymère, type de chromogène utilisé (DAB, AEC), type d'enzyme (HRP ou AP) etc. - l'impact des réactifs (tampon de lavage avec ou sans détergent, blocage des peroxydase endogène, etc), 10 - contrôles adaptés (contrôles positif et négatif internes et/ou externe), - La concentration et le temps de marquage optimal d'anticorps nécessaire à l'obtention d'une détection et d'une coloration de qualité et le diluent le plus approprié - la stabilité de l'anticorps de 0 à 6 mois - la stabilité des autres réactifs choisis 15 - la méthode utilisée, manuelle ou à l'aide d'un automate d'IHC - le temps et méthode de contre coloration (hématoxyline de Mayer, Harris) - le type de montage de lamelle (permanent, aqueux, selon le chromogène choisi) 20 REVENDICATIONS1. Anticorps anti-CD71 pour son utilisation pour le traitement de l'endométriose. 2. Test de diagnostic pour la détection et/ou le suivi d'un traitement de l'endométriose dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact d'un anticorps anti-CD71 avec ledit échantillon. 3. Kit de diagnostic ou de suivi thérapeutique comprenant un anticorps anti-CD71. 4. Kit de diagnostic ou de suivi thérapeutique selon la revendication 3 comprenant en outre des anticorps ciblant le marqueur KI67 et/ou la protéine BcI2. 5. Kit de diagnostic ou de suivi thérapeutique selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un kit d'immunohistochimie 6. Utilisation du kit selon l'une des revendications 3 à 5 pour détection et/ou le suivi de traitement de l'endométriose. 7. Anticorps anti-CD71 pour son utilisation dans la détection et/ou le traitement de l'endométriose. 8. Méthode de détection in vitro du degré/gravité de l'endométriose par mesure comparative de la concentration/densité/expression de CD71 entre un sujet sain et un sujet atteint d'endométriose par immunohistochimie mettant en oeuvre un anticorps anti-CD71.