FR 3058732 A1 20180518 FR 1661157 A 20161117 1 Alpha-1,3-(3,6-ANHYDRO)-D-GALACTOSIDASES ET LEUR UTILISATION POUR HYDROLYSER DES POLYSACCHARIDES DESCRIPTION Domaine technique La présente invention concerne l'isolement, la purification et la caractérisation d'un nouveau polypeptide ayant une activité a-1,3-(3,6-anhydro)- D-galactosidase, et ses utilisations. Ce polypeptide est l'enzyme terminale de la dégradation des carraghénanes, l'une des principales familles de polysaccharides formant la paroi cellulaire des algues rouges. C'est une exo-enzyme qui agit après l'action des endo-carraghénases, qui elles hydrolysent la liaison 13-1 ,4 des carraghénanes selon un mode d'action endo-lytique. Cette nouvelle enzyme hydrolyse spécifiquement la liaison glycosidique a-1,3 entre le 3,6-anhydro-D-galactose localisé à l'extrémité non-réductrice d'oligo-carraghénanes et le D-galactose qui le précède. Ce catalyseur enzymatique est donc utile pour produire le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. De plus cette exo-enzyme libère également des oligosaccharides impairs de la série du carrabiose, alors que les endo-carraghénases connues libèrent des oligo-carraghénanes pairs de la série du neocarrabiose. La présente invention trouve par exemple des applications dans le domaine cosmétique, agroalimentaire, pharmaceutique ou des biocarburants. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (E]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les carraghénanes ont des propriétés rhéologiques uniques et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment dans l'industrie agro-alimentaire et cosmétique. Ainsi, environ 50 000 tonnes de carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à des fins agro-alimentaires. 3058732 2 Les carraghénanes et leurs dérivés présentent également un intérêt dans le domaine thérapeutique. Ainsi, l'énoxaparine (Lovenoe), lequel est commercialisé pour le traitement de troubles thromboemboliques, est un mélange de chaînes de polysaccharides sulfatés de longueurs variables et formées d'unités 5 disacchariques récurrentes. Par ailleurs, certains polysaccharides et oligosaccharides sulfatés, tels que les oligo-fucanes sulfatés produits à partir de polysaccharides algaux, sont utiles en tant qu'agents anti-microbiens et/ou antiviraux chez l'homme [1]. Les polysaccharides sulfatés venant des algues rouges ont montré des propriétés anticoagulantes, ont réduit le cholestérol plasmatique 10 chez les poulets, ont montré des propriétés anti-thrombiques chez les chiens et les humains, ont été utilisés pour le contrôle des ulcères, ont été utilisés pour le traitement de diarrhée et dysenterie [2]. De plus les polysaccharides extraits des algues rouges stimulent la biosynthèse de collagène et la formation de tissue connective, ils montrent des propriétés anti-tumeur et d'immunomodulation dans 15 les souris et ils ont des effets anti-viraux [2]. Les carraghénanes sont des polysaccharides anioniques complexes (galactanes sulfatés) trouvés dans les parois des algues rouges. Certaines espèces d'algues contiennent des carraghénanes donnés comme composé majoritaire, comme par exemple l'algue Tichocarpus crinitus, qui contient comme 20 constituant principal dans la paroi le beta-carraghénane (appelé anciennement et incorrectement « Danish agar »). L'unité disaccharidique de base formant le carraghénane est appelé le carrabiose et est constitué d'une unité D-galactose (voir Figure 1) lié en p-1,4 avec une unité 3,6-anhydro-D-galactose (voir Figure 1) [3]. Les unités disaccharides 25 sont ensuite connectées entre elles par des liaisons a-1,3. Les unités disaccharides peut être non sulfatés (beta-carrabiose) ou être sulfatés par exemple une fois sur le 04 d'unité D-galactose (kappa-carrabiose) ou deux fois, sur le 04 d'unité D-galactose et le 02 d'unité 3,6-anhydro-D-galactose (iotacarrabiose) ou deux fois, sur le 02 d'unité D-galactose et le 02 d'unité 3,6- 3 0 anhydro-D-galactose (theta-carrabiose). Le résidu 3,6-anhydro-D-galactose est unique aux algues rouges et est responsable des propriétés gélifiantes des carraghénanes de la famille Kappa (incluant les kappa- et iota-carraghénanes 3058732 3 commerciaux). Certains carraghénanes, comme le lambda carraghénane, possèdent un groupement ester sulfate en 06 à la place du pont 3,6-anhydro. Ce type de carraghénane est très visqueux mais ne peut pas gélifier. Les carraghénanes natifs ont en réalité des structures hybrides avec différents ratios 5 de différents motifs carrabioses (exemple : kappa/iota carraghénane, kappa/beta- carraghénanes). Les variantes de motifs de sulfations modulent le caractère gélifiant du polymère. Il est possible de désulfater le kappa, le iota ou le thetacarraghénane par des méthodes chimiques et/ou enzymatique (par exemple avec les sulfatases) pour générer le motif de base beta-carrabiose. 10 Plusieurs bactéries marines capables d'hydrolyser les carraghénanes ont été isolées [4-6]. A partir de ces microorganismes, plusieurs gènes de carraghénases agissant sur la liaison [3-1,4 de carraghénane [4, 7, 8] ont déjà été clonés et les protéines correspondantes surexprimées et purifiées. En revanche, il n'y a aucune enzyme spécifique pour l'hydrolyse de la liaison a-1,3 dans les 15 carraghénanes décrite à ce jour. En particulier, l'une des bactéries carraghénolytiques les plus étudiées a été isolée à partir de l'algue rouge Delesseria sanguinea [9-11]. Cette souche bactérienne a été déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Samm lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le numéro DSM 20 12170. L'identification taxonomique de cette souche montre qu'elle définit un nouveau genre dans la classe des Flavobactériia et sa caractérisation lui a valu le nom de Zobellia galactanivorans DsiJ [10]. Les carraghénases sont spécifiques d'un type de motif carrabiose et forment à ce jour trois familles de protéines n'ayant aucune homologie de séquence [7, 8, 12]. Les kappa-carraghénases hydrolysent 25 la liaison [3-1,4 des carraghénanes, majoritairement constitué de motifs kappa- carrabiose sulfatés sur le 04 de l'unité D-galactose. Les iota-carrageenases, produit par Z. galactanivorans et la marine bactérie Alteromonas fortis, hydrolysent la liaison [3-1,4 des iota-carraghénanes, entre le D-galactose sulfaté sur le 04 et le 3,6-anhydro-D-galactose sulfaté sur le 02 [7, 13]. Finalement, la lambda 30 carraghénase de Pseudoalteromonas carra geenovora hydrolyse la liaison [3-1,4 des lambda-carraghénanes, entre le D-galactose sulfaté sur le 02 et le second D-galactose disulfaté sur le 02 et 06 [8, 14]. L'hydrolyse de la liaison [31,4 dans les 3058732 4 kappa- et iota-carraghénanes par les kappa- et iota-carraghénases, respectivement, résultent dans la libération d'oligo-carraghénanes de degré de polymérisation (DP) pair de la série neocarrabiose, qui présentent à l'extrémité non-réductrice un résidu 3,6-anhydro-D-galactose (non sulfaté dans le cas du 5 kappa, et sulfaté sur le 02 pour le iota) et à l'extrémité réductrice un résidu D- galactose, sulfaté sur le 04 aussi bien pour le kappa- que pour le iotacarraghénane. Il existe donc un besoin en enzymes capables de catalyser l'hydrolyse de la liaison a-1,3 dans les carraghénanes. Ces enzymes seraient essentielles pour 10 plusieurs applications : (i) pour réaliser l'hydrolyse complète des carraghénanes et donc ouvrir la voie vers leur saccharification et la production éventuelle de bioéthanol à partir des algues rouges carraghénophytes ; (ii) pour produire du 3,6- anhydro-D-galactose pur. Comme tout monosaccharide, il pourrait avoir de multiples applications, notamment pour servir de nouveaux synthons en chimie ; 15 (iii) pour obtenir de nouveaux agents oligosaccharidiques utilisables dans l'industrie agro-alimentaire, cosmétique et/ou pharmaceutique. Il est important de noter que le gène pourrait être aussi directement utilisé à travers une approche de biologie synthétique, comme cela été réalisé pour la production de bioéthanol à partir d'algues brunes [15]. 20 Description de l'invention Les inventeurs ont de manière tout à fait inattendue isolé et caractérisé la première a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase décrite à ce jour. Cette glycoside hydrolase est produite par la bactérie marine Z. 25 galactanivorans et elle libère les 3,6-anhydro-D-galactoses non-sulfatés en coupant la liaison a-1,3 à l'extrémité non-réductrice des oligos-carraghénanes. Bien qu'appartenant à la famille des GH129 des glycoside hydrolases, elle ne possède que 15 % d'identité de séquence avec le seul autre membre de la famille caractérisé à ce jour, une alpha-N-acetylgalactosaminidase d'une bactérie 30 intestinale qui est spécifique des mucines des cellules intestinales humaines [16]. Le gène de cette protéine, Zobellia_3152, a été identifié dans le génome complet de Z. galactanivorans. La protéine recombinante correspondante (ci- 3058732 5 après dénommée Zobellia_3152) a été surexprimée chez Escherichia cou i et purifiée à l'homogénéité électrophorétique. Il a été démontré que Zobellia_3152 possède une activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase. Une enzyme possédant une telle activité enzymatique n'a jamais encore été décrite. Cette 5 enzyme a un mode d'action exo, attaquant les oligosaccharides par l'extrémité non-réductrice. Zobellia_3152 est également spécifique du 3,6-anhydro-Dgalactose non sulfaté, ce qui a été démontré par l'activité de l'enzyme sur les kappa/beta-oligocarraghénanes issu des algues rouges Tichocarpus crinitus [17] et de Furcellaria. 10 Il a également été démontré que Zobellia_3152 peut être utilisée pour hydrolyser des oligos-carraghénanes pour l'obtention d'oligosaccharides de structure et de taille définie. Plus particulièrement, Zobellia_3152 permet d'obtenir des oligosaccharides impairs sans le 3,6-anhydro-D-galactose à l'extrémité non-réductrice, ainsi que le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. 15 La présente invention a donc pour objet un polypeptide caractérisé en ce qu'il possède une activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase. Selon un mode de réalisation préférée, le polypeptide est sous forme isolée et purifiée. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le polypeptide isolé est un polypeptide recombinant. 20 Par « activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase », on entend ici la capacité à hydrolyser de manière exo- les liaisons a-1,3 des carraghénanes (ou des oligo-carraghénanes) pour libérer le monosaccharide 3,6-anhydro-Dgalactose. L'activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase peut par exemple être mesurée en réalisant une digestion de kappa/beta-oligocarraghénanes 25 (oligosaccharides pairs de la série neocarrabiose) comme décrit dans l'exemple 3. Plus particulièrement, une solution contenant 1 % (w/v) d'oligosaccharide peut être utilisée. Cet oligosaccharide a été produit à partir du polymère beta-carraghénane extrait de Tichocarpus crinitus préalablement hydrolysé par la kappacarraghénase de P. carrageenovora [18] puis purifié par chromatographie 30 d'exclusion de taille. 10 pl de la solution oligosaccharidique est incubé à 18°C avec 2 pg de Zobellia_3152 pendant une nuit. Cette incubation avec Zobellia_3152 3058732 6 résulte en la libération de 3,6-anhydro-D-galactose et des oligosaccharides impairs sans le 3,6-anhydro-D-galactose à l'extrémité non-réductrice. Par « kappa-carraghénane », on entend ici la molécule constituée d'un enchaînement d'unités disaccharidiques kappa-carrabiose constitué d'une 5 majorité d'unité D-galactose modifiée par une 0-sulfatation sur la position 04 lié en [3-1,4 avec une unité 3,6-anhydro-D-galactose. Les unités disaccharides sont ensuite connectées entre elles par des liaisons a-1,3. Par « beta-carraghénane », on entend ici le polysaccharide constitué d'un assemblage d'enchaînement d'unités disaccharidiques soit kappa-carrabiose, 10 constituée d'une unité D-galactose modifiée par une 0-sulfatation sur la position 04 liée en [3-1,4 avec une unité 3,6-anhydro-D-galactose ou soit beta-carrabiose, constituée d'une unité D-galactose liée en 13-1,4 avec une unité 3,6-anhydro-Dgalactose. Les unités disaccharides sont ensuite connectées entre elles par des liaisons a-1,3. 15 Par « kappa/beta-oligocarraghénane », on entend ici les oligosaccharides (DP2 jusqu'à DP100) constitué d'un assemblage d'enchaînement d'unités disaccharidiques soit kappa-carrabiose, constitué d'une unité D-galactose modifiée par une 0-sulfatation sur la position 04 liée en 13-1,4 avec une unité 3,6- anhydro-D-galactose ou soit beta-carrabiose, constitué d'une unité D-galactose 20 liée en [3-1,4 avec une unité 3,6-anhydro-D-galactose. Les unités disaccharides sont ensuite connectées entre-elles par des liaisons a-1,3. De préférence, le polypeptide selon la présente invention comprend ou consiste en une séquence choisie parmi : les résidus 32 à 693 de la séquence SEQ ID NO : 2 (lesquels 25 correspondent à la protéine Zobellia_3152 mature, sans son peptide signal); les résidus 1 à 693 de la séquence SEQ ID NO : 2 (lesquels correspondent à la protéine Zobellia_3152 complète, avec son peptide signal); 30 Les polypeptides selon l'invention incluent également des polypeptides dérivés de la protéine Zobellia_3152 de séquence SEQ ID NO: 2 étant entendu 3058732 7 que ces polypeptides dérivés conservent l'activité a-1,3-(3,6-anhydro)-Dgalactosidase. De tels polypeptides dérivés comprennent ou consistent en une séquence choisie parmi : a) une séquence ayant au moins 26 % d'identité, de préférence au 5 moins 30% d'identité, préférentiellement au moins 50% d'identité, tout préférentiellement au moins 80% d'identité, avec la séquence des résidus : - 32 à 693 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; - 1 à 693 de la séquence SEQ ID NO : 2 ; b) un fragment d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la 10 séquence SEQ ID NO :2. Le pourcentage d'identité est généralement déterminé en utilisant un logiciel d'analyse de séquences. Le programme « needle », qui fait appel à l'algorithme d'alignement global « Needleman-Wunsch » pour trouver l'alignement optimal (avec gaps) de deux séquences sur la totalité de leur longueur, peut par 15 exemple être utilisé. Ce programme est notamment disponible sur le site ebi.ac.uk. Les polypeptides dérivés peuvent différer de la séquence de référence (en l'occurrence la séquence SEQ ID NO : 2 ou l'un de ses fragments) par la présence de mutations de type délétion, insertion et/ou substitution d'acides aminés. Les substitutions peuvent être conservatives ou non conservatives. 20 Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, les polypeptides dérivés différent de la séquence de référence uniquement par la présence de substitutions conservatives. Les substitutions conservatives sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la 25 glutamine, la serine, la cystéine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique), d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane). 30 Les polypeptides dérivés peuvent également correspondre à des variants alléliques de la protéine Zobellia_3152 de séquence SEQ ID NO: 2, à des protéines homologues à Zobellia_3152 chez d'autres espèces que Zobellia 3058732 8 galactanivorans, ou à des fragments de tels variants alléliques ou protéines homologues, tous conservant l'activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase. De manière optionnelle, les polypeptides selon l'invention comprennent un peptide signal. Si un peptide signal est présent, il peut être le peptide signal natif 5 de la protéine (i.e. les résidus 1 à 32 de SEQ ID NO: 2 pour Zobellia_3152). Alternativement, le peptide signal peut être un peptide signal hétérologue à Zobellia_3152, par exemple un peptide signal convenant à l'expression de la protéine Zobellia_3152 mature dans une cellule hôte donnée. Les polypeptides selon l'invention peuvent être préparés par purification à 10 partir de leur organisme ou microorganisme d'origine, par synthèse chimique ou par génie génétique, et ce en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, les polypeptides selon l'invention sont obtenus par génie génétique. La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé ou 15 recombinant codant pour un polypeptide selon l'invention. De préférence, l'acide nucléique est sous forme isolée et purifiée. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'acide nucléique isolé est un acide nucléique synthétisé. Le terme « acide nucléique » se réfère aussi bien à des molécules d'ADN 20 qu'à des molécules d'ARN, et incluse notamment des molécules d'ADNc et des molécules d'ARNm. L'acide nucléique peut être sous forme double brin (par exemple dans le cas d'un acide nucléique compris dans un vecteur d'expression) ou sous forme simple brin (par exemple dans le cas de sondes ou d'amorces). Plus particulièrement, l'acide nucléique selon l'invention peut comprendre 25 ou consister en une séquence des nucléotides 1 à 2079 ou 94 à 2079 de la séquence SEQ ID NO: 1. L'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre ou consister en des séquences dérivées des séquences SEQ ID NO : 1. Les acides nucléiques dérivés incluent les acides nucléiques dont les séquences comprennent ou 30 consistent en une séquence choisie parmi : 3058732 9 a) une séquence ayant au moins 30 % d'identité, de préférence au moins 50% d'identité, préférentiellement au moins 65% d'identité, tout préférentiellement au moins 80% d'identité, avec la séquence des nucléotides : - 1 à 2082 ou 94 à 2082 de la séquence SEQ ID NO : 1. 5 b) un fragment d'au moins 1041 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 1 ; c) une séquence d'acide nucléique qui s'hybride à la séquence SEQ ID NO : 1 dans des conditions de forte stringence ; Le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques est 10 déterminé de la même manière que le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés. Les « conditions de forte de stringence » sont des conditions connues de l'homme du métier, et peuvent par exemple correspondre des conditions d'hybridations sur ADN lié à un filtre dans un tampon salin citrate de sodium (SSC) 15 5X, dodécyl sulfate de sodium (SDS) 2%, 100 microgrammes/mL d'ADN simple-brin, à 55-65°C pendant 8 heures, et lavage dans SSC 0,2X et SDS 0,2% à 6065°C pendant 30 minutes. Les séquences des acides nucléiques dérivés peuvent inclure des mutations telles que des substitutions, délétions et/ou insertions de nucléotides. 20 Les substitutions peuvent soit être silencieuses, soit conduire à des mutations au niveau de la protéine codée par l'acide nucléiques. De préférence, les substitutions, délétions et/ou insertions au niveau de la séquence nucléotidique ne conduisent pas à un changement de phase de lecture, ni à l'introduction d'un codon-stop. 25 De préférence, l'acide nucléique dérivé est un acide nucléique codant pour la protéine Zobellia_3152 mature ou complète de séquence SEQ ID NO: 2, ou pour des fragments de celles-ci conservant l'activité 3,6-anhydro-D-galactosidase, mais dont la séquence nucléotidique diffère de la séquence SEQ ID NO : 1 en raison de la dégénérescence du code génétique et/ou en raison d'une variation 30 allélique. Plus préférentiellement, l'acide nucléique dérivé est un acide nucléique codant pour des protéines homologues de Zobellia_3152 chez d'autres espèces 3058732 10 que Zobellia galactanivorans, ou des fragments de celles-ci conservant l'activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase. Un autre aspect de l'invention porte sur des sondes et des amorces nucléotidiques comprenant ou consistant en un fragment de SEQ ID NO: 1. De 5 telles sondes et amorces peuvent par exemple comprendre ou consister en 15 à 50 nucléotides consécutifs, préférentiellement 18 à 35 nucléotides consécutifs, de SEQ ID NO: 1. De telles sondes et amorces ne codent pas pour un polypeptide selon l'invention mais sont utiles pour le clonage, le séquençage et/ou la détection des acides nucléiques selon l'invention. Les sondes peuvent éventuellement être 10 marquées, par exemple grâce à un marqueur radioactif ou à un fluorophore. Par ailleurs, les sondes et amorces peuvent comprendre, outre un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, une séquence hétérologue telle que la séquence d'un site de restriction ou une séquence de liaison à un marqueur. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse 15 chimique ou par génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites, entre autres, dans Molecular Cloning - A Laboratory Manuel [19]. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent par exemple être obtenus par amplification des gènes de Zobellia galactanivorans à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit dans l'exemple 1. Le 20 fragment d'acides nucléiques ainsi amplifié peut ensuite être cloné dans un vecteur d'expression selon les techniques décrites Molecular Cloning - A Laboratory Manuel. (19) et/ou dans l'exemple 1. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention. 25 Ces vecteurs d'expression, qui peuvent par exemple être des plasmides, comportent, outre la séquence d'acide nucléique selon l'invention, les moyens nécessaires à son expression. Ces moyens peuvent par exemple inclure un promoteur et un terminateur de transcription. Le vecteur d'expression peut également comporter d'autres éléments tels qu'une origine de réplication, un site 30 de clonage multiple, un enhanceur, un peptide signal qui pourra être fusionné en phase avec le polypeptide de l'invention lors du clonage, et un ou plusieurs marqueurs de sélection. 3058732 11 La présente invention a également pour objet une cellule hôte transformée par un vecteur d'expression ou un acide nucléique selon l'invention. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Des cellules hôtes couramment utilisées pour l'expression de cellules 5 recombinantes incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia cou, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae, des cellules de champignons tels que Aspergillus figer, des cellules d'insecte, et des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées cellulaires CHO, HEK 293, PER-C6, etc. 10 La transformation des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier. En fonction de la cellule à transformer, l'homme du métier pourra aisément déterminer les moyens nécessaires à l'introduction et à l'expression l'acide nucléique selon l'invention chez la cellule hôte choisie. Ainsi, le vecteur d'expression et la méthode 15 d'introduction du vecteur d'expression au sein de la cellule hôte seront sélectionnés en fonction de la cellule hôte choisie. La cellule hôte transformée par un vecteur d'expression ou un acide nucléique selon l'invention exprime préférentiellement le polypeptide selon l'invention de manière stable. L'homme du métier peut aisément vérifier que la 20 cellule hôte exprime le polypeptide selon l'invention de manière stable, par exemple en utilisant la technique du Western Blot. Les cellules hôtes selon l'invention sont notamment utiles pour produire des polypeptides selon l'invention. L'invention concerne donc une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention comprenant l'étape de cultiver une 25 cellule hôte selon l'invention dans des conditions permettant l'expression du dit polypeptide selon l'invention. Cette méthode peut en outre comprendre une étape de purification dudit polypeptide selon l'invention. Les étapes de culture et de purification peuvent par exemple être réalisées comme décrit dans l'exemple 2. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide 30 selon l'invention pour produire un monosaccharide (le 3,6-anhydro-D-galactose) et/ou pour produire des oligo-carraghénanes impairs (= oligosaccharides impairs 3058732 12 de la série carrabiose) ; les oligo-carraghénanes impairs n'étant actuellement connu ni de l'art ni disponible dans le commerce. En effet les inventeurs ont mis en évidence pour la première fois que l'enzyme Zobellia_3152 peut être utilisée pour hydrolyser de façon exo-lytique les 5 liaisons a-1,3 des carraghénanes et oligo-carraghénanes présentant un motif disaccharide beta-carrabiose à l'extrémité non-réductrice. Ces motifs existent naturellement dans les carraghénanes extraits de certaines algues rouges comme Tichocarpus sp. [17] et Furcellaria sp (appelés beta-carraghénanes ou anciennement « Danish agar » ou « furcellaran »). Ces motifs beta-carrabiose 10 peuvent aussi être artificiellement introduits dans les carraghénanes de la famille Kappa (incluant les kappa- et les iota-carraghénanes, utilisés notamment dans l'industrie agroalimentaire) ou dans le theta carraghénane par désulfatation chimique ou enzymatique. Les inventeurs ont préparé et purifié des kappa/betaoligocarraghénanes en hydrolysant du beta-carraghénane de Tichocarpus crinitus 15 par la kappa-carraghénase de P. carrageenovora [18]. Ces oligosaccharides présentent donc un résidu 3,6-anhydro-D-galactose à l'extrémité non-réductrice et un motif disaccharidique kappa-carrabiose à l'extrémité réductrice. L'hydrolyse de ces kappa/beta-oligocarraghénanes (DP4, DP6, DP8 etc...) par Zobellia_3152 permet d'obtenir le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose et des kappa/beta- 20 oligocarraghénanes impairs (DP3, DP5, DP7 etc...) sans 3,6-anhydro-D-galactose à l'extrémité non-réductrice. Les polysaccharides utilisés dans le cadre de cette méthode sont des polysaccharides et oligosaccharides susceptibles de contenir des polysaccharides sulfatés, lesquels peuvent être ou non le composé majoritaire dudit 25 polysaccharide. Les polysaccharides et oligosaccharides utilisés dans le cadre de cette méthode comprennent ou consistent en des motifs beta-carrabioses. Alternativement, les polysaccharides et oligosaccharides utilisés dans le cadre de cette méthode peuvent comprendre ou consister en un polysaccharide ou oligosaccharide qui contient des motifs disaccharides différent du beta-carrabiose, 30 mais pour lesquels les motifs beta-carrabiose peuvent être introduit par désulfatation chimique ou enzymatique des motifs kappa-, iota- et thetacarragbioses. 3058732 13 De tels polysaccharides sont présents chez les algues rouges, et peuvent être obtenus en utilisant des protocoles d'extraction bien connus de l'homme du métier, tels que la technique décrite dans Morrice et al. (20). Ils peuvent éventuellement être séparés des autres composants éventuels par des méthodes 5 de chromatographie liquide. La présente invention a également pour objet une méthode d'hydrolyse d'oligosaccharides et/ou polysaccharides contenant des motifs disaccharidiques beta-carrabioses et/ou de production d'oligosaccharides impairs de la série carrabiose et/ou de monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose comprenant les 10 étapes suivantes : a) fournir un polypeptide selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention ; et b) mettre ledit polypeptide ou ladite cellule hôte exprimant ledit polypeptide en contact avec un oligosaccharide dans des conditions conduisant à 15 l'obtention d'oligosaccharide modifié, par exemple dans des conditions conduisant à une hydrolyse complète ou une hydrolyse partielle. Les conditions conduisant à l'obtention d'oligosaccharides hydrolysés peuvent aisément être déterminées par l'homme du métier. Par exemple, les conditions décrites dans l'exemple 3 peuvent être utilisées. Une kappa- 20 carraghénase peut en premier être utilisé pour digérée le carraghénane en oligosaccharides pairs (DP2, DP4, DP6, DP8, DP10 etc..) et les oligosaccharides peuvent, par exemple, être purifier par exclusion de taille. Le polypeptide Zobellia_3152 ou la cellule hôte peut par exemple être mis en contact avec les oligosaccharides à une température de 18°C. 2 !Ag de Zobellia_3152 peuvent par 25 exemple être ajoutés à 10 pl d'une solution contenant 1 % (w/v) d'oligosaccharide. Pour avoir une réaction aussi complète que possible, l'incubation peut par exemple duré 14 heures. Ainsi, en partant d'une solution de carraghénane, il sera possible d'obtenir le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose et des oligo-carraghénanes impairs (DP3, DP5, DP7, DP9 etc..) sans le résidu 3,6-anhydro-D-galactose à 30 l'extrémité non réductrice. La méthode selon l'invention peut éventuellement comprendre une étape (c) de purification desdits poly/oligosaccharides hydrolysés. Les techniques de 3058732 14 purification de poly/oligosaccharides hydrolysés sont bien connues de l'homme du métier. La purification peut par exemple être réalisée par chromatographie d'exclusion de taille, tel que décrit dans l'exemple 3. L'échantillon contenant les oligosaccharides peut par exemple être élue avec de l'ammonium carbonate 5 50mM à une vitesse de 1,5 m l/m in pendant 650 minutes. Dans un mode de réalisation préféré, les oligosaccharides hydrolysés obtenus par la méthode selon l'invention ont une masse moléculaire moyenne (Mw) inférieur ou égal à 5800 Da. Dans un autre mode de réalisation préférée, les oligosaccharides 10 hydrolysés obtenus par la méthode selon l'invention comprennent au moins 25% d'un ou plusieurs oligo-carraghénanes impairs (DP3, DP5, DP7 etc... ). Dans ces deux modes de réalisation préférés, on obtient également le monosaccharide 3,6- anhydro-D-galactose. Par exemple, le traitement d'un hexasaccharide kappa/beta- 15 oligocarraghénane avec Zobellia_3152 avec deux motifs kappa-carrabioses et un motif beta-carrabiose (produit par la digestion de beta-carraghénane par une kappa-carraghénase) résulterait en un monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose et un pentasaccharide sans 3,6-anhydro-D-galactose à l'extrémité non-réductrice. Par exemple, le traitement d'un octasaccharide kappa/beta- 20 oligocarraghénane (produit par la digestion de beta-carraghénane par une kappa- carraghénase) avec Zobellia_3152 contenant deux unités beta-carrabiose et deux unités kappa-carrabiose résulterait en un monosaccharide 3,6-anhydro-Dgalactose et un heptasaccharide sans le 3,6-anhydro-D-galactose sur la coté non-réductrice. 25 Les oligosaccharides impairs et le monosaccharide ainsi obtenus et purifiés peuvent ensuite être formulés en composition agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Les motifs beta-carrabiose peuvent être aussi générés par la désulfation des motifs kappa-, iota-, et/ou theta-carrabioses présent des les kappa, iota- et theta-carraghénanes (en utilisant des methodes chimiques ou 30 enzymatiques). La présente invention a également pour objet des oligosaccharides impairs de la série carrabiose susceptibles d'être obtenus par la méthode selon l'invention, 3058732 15 ainsi que des compositions agroalimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques contenant les produits d'hydrolyse décrits ci-dessus : oligosaccharides impairs de la série carrabiose et/ou monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. 5 Brève Description des figures - Figure 1 : Présentation schématique des unités disaccharidiques de répétition de carraghénanes. - Figure 2 : Activité enzymatique de Zobellia_3152 évaluée par électrophorèse de glucides assistée par fluorescence (Fluorescence- 10 assisted carbohydrate electrophoresis, FACE) [21]. Les substrats hexasaccharides sont produits à partir de beta-carraghénane de Tichocarpus crinitus. (qui contient à la fois des motifs kappa- et betacarrabioses) préalablement digéré par la kappa-carraghénase recombinante venant de Pseudoalteromonas carra geenovora. Ces 15 oligosaccharides sont purifiés par chromatographie d'exclusion de taille [17]. Kappa/beta-hexasaccharide (issu du beta-carraghénane extrait de Tichocarpus crinitus) incubé la nuit A) avec Zobellia_3152 et B) sans enzyme. Kappa/beta-hexasaccharide (d'origine du beta-carraghénane extrait de Furcellaria) incubé la nuit C) avec Zobellia_3152 et D) sans 20 enzyme. Les produits de réaction ont été séchées et marquées avec du 8- aminonaphthalene-I,3,6-trisulphonate (ANTS) et puis soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. - Figure 3: Analyse par spectrométrie de masse (MALDI-MS) des produits d'hydrolyse des kappa/beta-oligocarraghénanes obtenus avec l'enzyme 25 Zobellia_3152. Kappa/beta-hexasaccharide (issu du beta-carraghénane de Tichocarpus crinitus) incubé la nuit A) sans enzyme et B) avec Zobellia_3152. Kappa/beta-hexasaccharide (issu du beta-carraghénane de Furcellaria sp.) incubé la nuit C) sans enzyme et D) avec Zobellia_3152. 3058732 16 EXEMPLES Exemple 1: Clonage des gènes de Zobellia 3152 Le cadre de lecture ouvert codant pour l'enzyme Zobellia_3152 a été 5 identifié sur la base de la séquence complète du génome de Z. galactanivorans (EMBL Accession No. FP476056). Le gène cible a été amplifié en parallèle par PCR, partant du matériel ADN génomique de Z. galactanivorans, avec des amorces 5' et 3' comme indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous. 10 Tableau 1: Séquence des amorces pour le clonage du gène de Zobellia_3152 Nom SEQ ID Séquence NO: Amorce 5' Zobellia_ 3152fw 4 TTTTTTGTCGACAGC CCAGACC CTATTGTTTTG GAG Amorce 3' Zobel lia _ 3152rev 5 TTTTTTC T G CAG TTAATC CATATG TAAAC T CAC TTG G AA Le gène entier de Zobellia_3152 (correspondant à l'enzyme avec son signal peptide et le module catalytique) a été tronqué par génie génétique pour produire une protéine recombinante contenant uniquement la module catalytique (résidus 15 32-693), qui sera appelé par la suite Zobellia_3152 recombinante. Les produits d'amplification PCR ont ensuite été purifiés avec le kit Qiaquick PCR et élues avec 50 pl de H20. Les produits PCR purifiés ont à leur tour été digérés pendant trois heures à 37°C avec le mélange des enzymes de restriction Sall/Pstl. Après digestion, les produits ont été à nouveau purifiés avec le kit 20 Qiaquick PCR puis élues avec 25 pl de H20. Les produits de PCR ont été ligaturés dans le vecteur pF04 (dérivé du vecteur pET15b de Novagen, Cf Groisillier et al, 2010, Microbial Cell Factories), préalablement digéré par les enzymes de restrictions Xhol/Nsil et ensuite 3058732 17 déphosphorylé. Cette procédure de ligature a été effectuée avec la T4 ADN Ligase à 20°C pendant 4 heures suivi d'une incubation durant une nuit à 10 °C. Pour la procédure de transformation, des cellules d'Escherichia cou i (souche NEB5alpha) compétentes disponibles commercialement ont été utilisées. Pour 5 cela, les cellules ont été mises sur glace pour être décongelées, puis ont été incubées pendant 30 minutes sur glace avec le mélange résultant de la ligature. La transformation a été effectuée en appliquant un choc thermique pendant 45 sec à 42°C, puis les cellules ont été remises dans la glace 5 minutes. Les cellules ont été étalées sur des boites de Pétri LB-agar contenant de l'ampicilline (100 ug/m L) 10 et incubées à 37°C pendant la nuit. Les minipreps pour avoir l'ADN plasmidique des colonies d'E. cou/ ont été effectuées avec les kits Qiagen. Exemple 2: Production et purification de Zobellia 3152: Zobellia_3152 a été surexprimée dans des cellules d'E. cou/ (souche 15 BL21(DE3)). La surexpression a été effectuée à 20°C dans 1 L d'un milieu ZYP- 5052 avec 100 pg.m1-1 d'ampicilline (22). Les cellules ont été récoltées par centrifugation (1398 g, 30 min, 4°C) après 3 jours et demi de culture. Le culot a ensuite été suspendu dans le tampon suivant (50 mM Tris pH 8, 25 % sucrose, Lysozyme). Les cellules ainsi suspendues ont été lysées par du lysozyme pendant 20 30 minutes sur glace, puis mélangées avec un tampon avec 1% deoxycholate, 1% triton, 20 mM Tris pH 7.5, et 100 mM NaCI. Du MgC12 a été ajouté à 5 mM et 200 pg de DNase ont été ajoutés en mélangeant doucement à température ambiante pendant une demi-heure. Le lysat a été clarifié par centrifugation (23700 g, 45 min, 4°C), puis par une filtration en utilisant des filtres (Millipore) de 0.2 pm. 25 La solution ainsi filtrée a été chargée sur une colonne de 10 ml de résine IMAC HyperCell (Pall Corporation), laquelle a été chargée avec une solution NiSO4. La colonne avait préalablement été équilibrée avec du tampon A (20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCI, 5 mM imidazole). Après une étape de lavage avec le tampon A (dix volumes de colonne), la protéine a été éluée, à 1 ml.min-1, dans 60 ml en effectuant 30 un gradient linéaire entre le tampon A et un tampon A additionné de 100 % de tampon B (20 mM Tris pH 8, 200 mM NaCI et 500 mM Imidazole). Toutes les fractions contenant la protéine pure (comme analysé par SDS-PAGE) ont été 3058732 18 additionnées et concentrées par filtration/centrifugation (Amicon, taille limite 10 kDa) et dialyser dans 1xPBS (MWCO 3000 Da). La concentration finale était 10 mg/mi avec un volume final de 200 pl. Toutes les procédures de chromatographie ont été effectuées avec un système ÂKTA Purifier (GE-Healthcare) à température 5 ambiante. Exemple 3: Dégradation enzymatique des kappaibeta-hexasaccharides Les substrats hexasaccharides ont été produits à partir de beta- carraghénane extrait de Tichocarpus crinitus et de Furcellaria sp. et qui a été 10 préalablement digéré avec la kappa-carraghénase recombinante issue de Pseudoalteromonas carra geenovora [18]. Les oligocarraghénanes obtenus par cette hydrolyse ont été purifiés par chromatographie d'exclusion de taille et leur structure chimique a été établie par résonnance magnétique nucléaire (RMN) [17]. Une solution contenant 1 °A (w/v) de kappa/beta-hexasaccharide a été utilisée 15 pour l'hydrolyse enzymatique avec Zobellia_3152. Un total de 10 pl de la solution de glucides a été incubé avec 2 pg d'enzyme à 18°C pendant une nuit (environ 14 heures). Comme contrôle négatif un échantillon sans enzyme a été aussi réalisé. Les échantillons ont été analysés par la méthode d'électrophorèse de glucides assistée par fluorescence (Fluorescence-assisted carbohydrate 20 electrophoresis, FACE) (21). Les mélanges réactionnels ont été séchés en utilisant un système SpeedVac pendant 2 heures. Les oligosaccharides ont été marqués avec 2 pl 0.15M ANTS et 5 pL 1 M NaBH3CN, à 37 °C pendant une nuit. Les oligosaccharides marqués ont été resuspendus en 20% glycérol puis ont été soumis à électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 27%, puis visualisés sous 25 lumière UV. Les gels FACE ont montré que l'enzyme était active sur kappa/betaoligocarraghénane. Les tailles des bandes correspondant aux oligosaccharides pairs initiaux ont été diminuées après digestion avec Zobellia_3152 et une bande additionnelle de basse taille moléculaire a fait son apparition. 30 3058732 19 Exemple 4 : Analyse des produits d'hydrolyse par spectrométrie de masse Les échantillons sans et avec Zobellia_3152 (correspondant aux mélanges réactionnels décrits dans l'exemple 3) ont été comparés en utilisant leurs empreintes massiques obtenues en spectrométrie de masse MALDI-MS par la 5 plateforme Biopolymères, biologie structurale (BIBS) du centre INRA de Nantes. Les analyses montrent qu'après traitement avec Zobellia_3152 les oligosaccharides kappa/beta pair (DP6, DP8) sont diminués par une masse correspondant à un monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose (voir Figure 3). Les produits de cette réaction sont donc des oligosaccharides impairs (DP5, DP7) et 10 3,6-anhydro-D-galactose. Exemple 5: Résultats Le séquençage du génome complet de la bactérie Zobellia galactanivorans (déposée à la Collection DSMZ le 8 mai 1998 sous le numéro DSM 12170) a été 15 réalisé en collaboration avec Genoscope. La séquence du génome a été déposée à l'EMBL sous le numéro d'accession FP476056. L'analyse de ce génome a permis d'identifier un gène (zobellia_3152) qui code pour une protéine appartenant à la famille GH129 des glycosides hydrolases [23]. La protéine correspondante (Zobellia_3152) possède seulement 15% d'identité de séquence avec le seul autre 20 membre caractérisé de la famille qui est une alpha-N-acetylgalactosaminidase d'une bactérie intestinal qui dégrade les mucines des cellules épithéliales humaines [16]. Une fois le clonage du gène zobellia_3152 effectué, la protéine Zobellia_3152 a été surexprimée chez Escherichia cou/ comme exposé dans 25 l'exemple 2. La pré-protéine Zobellia_3152 est composée de 693 acides aminés et a une masse moléculaire théorique de 77839 Da. Après élimination de son peptide signal, la protéine mature a une masse moléculaire calculée de 74572 Da. L'activité de la protéine recombinante Zobellia_3152 sur plusieurs 30 galactanes d'algues rouges a ensuite été étudiée (exemple 3). Il a été constaté que cette protéine n'a pas activité détectable sur les carraghénanes sous leur forme polysaccharidique, ni les oligosaccharides kappa, iota, ou lambda- 3058732 20 carraghénanes lorsqu'ils possèdent encore leurs motifs de sulfatation initiaux (Figure 2A). En revanche, Zobellia_3152 présentent une forte activité sur les oligosaccharides provenant de beta-carraghénane pré-hydrolysés par une kappacarraghénase (Figure 2B). Ces oligosaccharides présentent une structure 5 naturelle hybride avec des motifs disaccharides kappa-carrabiose (monosulfaté) et beta-carrabiose (non-sulfaté). Cette structure peut être aussi obtenue par la désulfation (par méthodes chimiques ou enzymatiques) des carraghénanes de type kappa, iota ou theta. La caractérisation des réactions enzymatique par spectrométrie de masse 10 (exemple 4) a démontré que l'enzyme Zobellia_3152 hydrolysait spécifiquement les liaisons a-1,3 entre les unités 3,6-anhydro-D-galactose et les unités D-galactose non-sulfatés. L'analyse de spectrométrie de masse des hexasaccharide kappa/beta-carraghénanes a démontré que ce clivage avait lieu à partir de l'extrémité non-réductrice des oligosaccharides. Cette réaction résulte en la 15 libération du 3,6-anhydro-D-galactose et d'oligosaccharides impairs de la série carrabiose (DP5, DP7, etc). Comme ces oligosaccharides impairs s'accumulent, ce sont des produits terminaux et ils ne sont donc plus substrat de Zobellia_3152. Par conséquent, Zobellia_3152 ne peut pas cliver une liaison a-1,3 interne à ces oligosaccharides ; ce qui démontre le caractère exo-lytique de cette nouvelle 20 glycoside hydrolase. Ceci explique pourquoi l'activité de Zobellia_3152 est difficile à détecter sur les polysaccharides lorsque l'enzyme est seule. Par contre, comme montré sur le beta-carraghénane, l'action combinée d'une carraghénase (ici une kappa-carraghénase) et de Zobellia_3152 permet d'obtenir une plus grande saccharification des carraghénanes, résultant notamment en la libération du 25 monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. Enfin, comme montré dans l'exemple 4, l'hydrolyse des oligosaccharides par Zobellia_3152 permet d'obtenir des mélanges définis d'oligosaccharides impairs contenant des motifs kappa- et betacarrabiose. Par conséquent, la protéine Zobellia_3152 est la première a-1,3-(3,6- 3 0 anhydro)-D-galactosidase décrite à ce jour. 3058732 21 Liste de références 1 Ghosh, T., Chattopadhyay, K., Marschall, M., Karmakar, P., Mandai, P., and Ray, B. (2009) Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: from 5 structure-activity analysis to clinical evaluation. Glycobio119, 2-15 2. 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Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend une séquence ayant au moins 50% d'identité avec les résidus 1 à 693 de la séquence SEQ ID NO: 2 ou un fragment d'au moins 20 aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 2, et en ce qu'il possède une activité a-1,3-(3,6-anhydro)-D-galactosidase. 2. Polypeptide selon la revendication 1, ledit polypeptide étant un polypeptide recombinant. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, comprenant une séquence ayant au moins 50 % d'identité avec les résidus 32 à 693 de la séquence SEQ ID NO : 2. 4. Acide nucléique isolé codant pour un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 4. 6. Cellule hôte transformée par un vecteur d'expression selon la revendication 5. 7. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour hydrolyser des oligosaccharides et/ou polysaccharides contenant des motifs disaccharidiques beta-carrabioses. 8. Utilisation selon la revendication 7, où lesdits polysaccharides sont des carraghénanes. 9. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la production de bioéthanol à partir d'algues rouges. 3058732 25 10. Méthode d'hydrolyse d'oligosaccharides et/ou polysaccharides contenant des motifs disaccharidiques beta-carrabioses comprenant les étapes suivantes : a) fournir un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3 ; et b) mettre ledit polypeptide en contact avec lesdits polysaccharides et/ou oligosaccharide dans des conditions permettant leur hydrolyse. 10 11. Méthode selon la revendication 10, où lesdits polysaccharides sont des carraghénanes. 12. Méthode selon la revendication 10 ou 11, où ledit polypeptide est produit par une cellule hôte selon la revendication 6. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre une étape (c) de purification des produits d'hydrolyse obtenus de l'étape b) comprenant des oligosaccharides impairs de la série carrabiose et/ou le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. 14. Méthode selon la revendication 13, comprenant en outre une étape (d) de formulation desdits oligosaccharides impairs de la série carrabiose et/ou monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose obtenus de l'étape c) en composition agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. 15. Oligosaccharides impairs de la série carrabiose susceptibles d'être obtenus par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 14. 16. Composition agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique 30 contenant les oligosaccharides impairs de la série carrabiose selon la revendication 15 et/ou le monosaccharide 3,6-anhydro-D-galactose. 15 20 25