FR 3058141 A1 20180504 FR 1660647 A 20161103 1 NOUVEAUX CONJUGUES COMPRENANT DES NANOCRISTAUX SEMI- CONDUCTEURS ET LEUR METHODE DE PREPARATION La présente invention concerne de nouveaux conjugués comprenant des 5 nanocristaux semi-conducteurs, leur méthode de préparation, et leurs utilisations. Les nanocristaux semi-conducteurs, notamment les points quantiques semi-conducteurs, font partie d'une famille de nanomatériaux. Comparés à des fluorophores classiques, tels que des fluorophores organiques ou des protéines 10 fluorescentes, les points quantiques présentent plusieurs avantages techniques, tels que la photostabilité, la haute luminosité, la possibilité de moduler la couleur selon la taille des points quantiques, un spectre d'émission étroit et un spectre d'absorption large (Biju et al., Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 3031-3056). Grâce à ces propriétés, les points quantiques semi-conducteurs attirent de plus 15 en plus l'attention pour leurs potentiels dans les applications biotechnologiques et médicales. A ce jour, les points quantiques sont souvent utilisés comme un matériau luminescent ou fluorescent pour être intégré dans un biosenseur pour l'imagerie ou le diagnostic in vitro ou in vivo. De plus, les propriétés photophysiques et nanométriques des points 20 quantiques les rendent idéal pour une application dans la technique de transfert d'énergie par résonance de type Fôrster (Fôrster resonance energy transfer ou FRET) qui consiste en une transmission d'énergie entre deux fluorophores (un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie) à une distance très proche l'un de l'autre. Cette dernière influence directement l'efficacité de FRET et doit être 25 inférieure à 20 nm. Les points quantiques peuvent être utilisés soit comme donneur d'énergie, soit comme accepteur d'énergie selon les combinaisons avec différents fluorophores. Dans ces applications, les points quantiques sont souvent utilisés sous forme de conjugués, dans lesquels un point quantique est combiné avec une 30 molécule biologique, telle qu'un anticorps, qui est reconnue spécifiquement par une cible biologique, telle qu'un antigène, afin de diriger ledit conjugué vers un site particulier selon la nécessité. Ce type de conjugué peut être notamment utilisé dans un immunodosage basé sur la technique FRET, qui est une technique utilisant le 35 phénomène de transfert d'énergie produite lorsqu'un donneur d'énergie et un 3058141 2 accepteur d'énergie sont rapprochés à l'aide de la reconnaissance entre une molécule biologique et sa cible, par exemple celle entre un anticorps et un antigène ou entre un ligand et son récepteur. Cette technique peut être utilisée pour indiquer la présence de ladite cible ou pour déterminer une reconnaissance entre une molécule biologique et sa cible potentielle. Cependant, la taille d'un tel système d'immunodosage est souvent considérable, puisqu'il doit comprendre une molécule biologique, sa cible, un donneur d'énergie et un point quantique en tant qu'accepteur d'énergie. Du fait de la distance éloignée entre le donneur et l'accepteur, l'efficacité de la transmission d'énergie dans un tel système est sensiblement limitée. La distance entre ladite molécule biologique et le point quantique affecte en partie la distance de FRET. Cependant, à ce jour, l'utilisation d'un agent de couplage est toujours nécessaire pour la conjugaison d'un anticorps au point quantique. Le brevet européen EP1 115 888 décrit un conjugué comprenant un point quantique semi-conducteur et une biomolécule, dans lequel ladite biomolécule est liée au point quantique via un acide carboxylique thiol, tel que l'acide mercaptoacétique, en tant qu'agent de couplage. La bio-molécule, par exemple un anticorps, est liée au groupe carboxylique dudit agent de couplage, alors que le point quantique est fixé au groupe thiol dudit agent de couplage. Les autres agents de couplage connus dans l'art sont, par exemple, les NHS-esters, les composés comportant un groupe maléimide, les composés comportant un groupe haloacétyle, ou les composés possédant une fonction hydrazide. On peut utiliser le N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) comme agent de couplage en combinaison avec le 1-éthy1-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) pour conjuguer des protéines et des points quantiques portant les groupements carboxyles; la conjugaison entre un point quantique portant les groupements amines et une protéine portant au moins un groupement sulfhydryle peut être mise en oeuvre en utilisant sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfoSMCC) comme agent de couplage. Par ailleurs, la conjugaison entre les points quantiques et les protéines peut aussi être obtenue par une reconnaissance biologique, par exemple celle entre la streptavidine et la biotine. 3058141 3 Du fait de l'utilisation d'un agent de couplage, la distance entre le point quantique et la molécule biologique est augmentée, ce qui constitue une barrière technique pour obtenir un biosenseur de haute sensibilité. Il y a par conséquent une nécessité de mettre à disposition de 5 nouveaux conjugués « point quantique - molécule biologique » ayant une distance réduite entre ces deux parties et de développer une nouvelle méthode de fabrication de ces conjugués. La présente invention a pour objet un conjugué entre un nanocristal 10 semi-conducteur et une molécule biologique. Ledit conjugué comprend ou consiste en : - un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, 15 cd2+, pt2+1 Fig2+1 Ai3 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+, et - une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle, ladite molécule biologique étant liée directement aux susdits ions métalliques situés à la surface dudit nanocristal par ledit groupement sulfhydryle. 20 On entend par « nanocristal semi-conducteur » des nanoparticules en matériaux semi-conducteurs ayant des propriétés électroniques et optiques uniques et un diamètre inférieur à 100 nm, notamment de 1 à 100 nm. Dans un mode de réalisation avantageux, ledit nanocristal semiconducteur est un point quantique. 25 Le terme « point quantique » se réfère aux nanocristaux semi- conducteurs ayant un diamètre inférieur à 10 nm. Lesdits nanocristaux ou points quantiques semi-conducteurs comportent un coeur constitué d'au moins un matériau semi-conducteur appartenant au groupe IV, II-VI, II-VI2, IV-VI, III-V, 113-VI2, I-III-VI2 ou un alliage de 30 ceux-ci. Lesdits nanocristaux ou points quantiques peuvent également appartenir à la famille des pérovskites ABX3. Un matériau semi-conducteur du groupe IV est un composé constitué d'un élément ou d'une combinaison de deux éléments du groupe IVa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple les nanoparticules de carbone, de 35 silicium ou de germanium. 3058141 4 Un matériau semi-conducteur du groupe II-VI est un composé contenant : - un élément choisi parmi les éléments du groupe IIb du tableau périodique ou un élément du groupe VIIIb en état 2+, et 5 - un élément choisi parmi les éléments du groupe VIa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du groupe II-VI, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, NiS, CoS, PdS, FeS. 10 Un matériau semi-conducteur du groupe II-VI2 est un composé contenant : - un élément choisi parmi les éléments du groupe VIIIb du tableau périodique en état 2+, et - au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe VIa du 15 tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du groupe II-VI2, FeS2, NiS2, CoS2, ou PdS2. Un matériau semi-conducteur du groupe IV-VI est un composé contenant au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe IVa du zo tableau périodique et au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe VIa du tableau périodique. A titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs de ce groupe, on peut citer PbSe, PbS, PbTe, SnS, SnSe, SnTe. Un matériau semi-conducteur du groupe III-V est un composé contenant : 25 - un élément choisi parmi les éléments du groupe Ma du tableau périodique, et - un élément choisi parmi les éléments du groupe Va du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du 30 groupe III-V, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb. Un matériau semi-conducteur du groupe I-VII est un composé contenant au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Ib du tableau périodique et au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe VIIa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple CuCI. 3058141 5 Un matériau semi-conducteur du groupe 113-VI2 est un composé contenant : - au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe IIb du tableau périodique ou les éléments du groupe VIIIb du tableau périodique en 5 état 2+, et - au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe VIa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple Zn3P2 et Cd3P2. Un matériau semi-conducteur du groupe I-III-VI2 est un composé contenant : 10 - un élément choisi parmi les éléments du groupe Ib du tableau périodique, - un élément choisi parmi les éléments du groupe IIIa du tableau périodique, ou un élément du groupe VIIIb du tableau périodique en état 3+, et - au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe VIa du 15 tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple AgInS2, CuInS2, CuFeS2, et CuInSe2. Un matériau semi-conducteur de la famille des pérovskites ABX3 est un composé contenant au moins un cation A choisi parmi un ion méthylammonium (MA), le cation formamidinium (FA) et le cation césium, au moins un élément B 20 choisi parmi les métaux divalents du tableau périodique et au moins un élément X choisi parmi les éléments du groupe VIIa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple MAPbI3, MASnI3 et CsPbBr3. Dans un mode de réalisation avantageux, le coeur dudit nanocristal ou 25 dudit point quantique est du CdSe, du CdTe, de l'InP de l'InZnP, du CuInS2, du AgInS2 ou du CsPbBr3. Le coeur d'un nanocristal ou point quantique de l'invention peut être enrobé par une coquille en matériau semi-conducteur différent de celui du coeur. 30 La coquille qui forme une couche à l'extérieur du coeur doit pouvoir inactiver le coeur et possède un écart énergique par rapport au coeur. Ladite coquille est liée au coeur par des liaisons covalentes. Un tel nanocristal est un nanocristal à structure « coeur/coquille ». Conformément à la présente invention, lorsque le coeur est constitué 35 par au moins un matériau semi-conducteur du groupe II-VI, II-VI2, IV-VI, III-V, 3058141 6 I-VII, 113-VI2, I-III-VI2, ABX3 ou un alliage entre eux, et comporte sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+, la présence d'une 5 coquille n'est pas nécessaire. En revanche, lorsque le coeur est constitué uniquement par un ou plusieurs matériaux semi-conducteurs du groupe IV, ledit point quantique comporte une coquille constituée par au moins un matériau semi-conducteur du groupe II-VI, IV-VI, II-VI2, 113-VI2, I-III-VI2, ABX3 ou un alliage 10 entre eux et ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, A13+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+. Dans un mode de réalisation particulier, le nanocristal ou point 15 quantique dans un conjugué de la présente invention est un nanocristal ou point quantique à structure « coeur/coquille ». Plus particulièrement, la coquille dudit nanocristal ou point quantique comporte les ions métallique choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, 20 Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+. Dans un mode de réalisation avantageux, la coquille dudit nanocristal ou dudit point quantique est constituée de ZnS, de Zn(Se,S), de CdS ou de (Cd,Zn)S. Dans un mode de réalisation plus avantageux, le nanocristal ou le point 25 quantique de l'invention est (CdSe)ZnS, dont le coeur est du CdSe et la coquille est du ZnS. Pour un nanocristal de l'invention ayant la structure « coeur/coquille », le diamètre du coeur est de préférence de 1 à 10 nm, notamment de 1,5 - 6 nm ; l'épaisseur de la coquille est de préférence de 0,5 à 10 nm, notamment 30 de 1 à 3 nm. Un nanocristal ou un point quantique de la présente invention peut être préparé par toutes méthodes connues dans l'art antérieur, telles que la méthode de préparation dans un solvant aqueux (Rajh et al., J.Phys Chem. 35 1993, Vol. 97, no.46, pp. 11999-12003), la méthode organométallique (Murray 3058141 7 et al., JACS, 1993, vol. 115, no. 19, pp. 8706-8715), la synthèse hydrothermale (Yang et al., Materials setters. 2008, Vol 62n no.17-18, pp. 2564-2566) ou la synthèse assistée par micro-onde (Correa-Duarte et al., Langmuir, 1998, vol. 14, no. 22, pp. 6430-6435). 5 Dans un mode de réalisation, un nanocristal ou un point quantique d'un conjugué de la présente invention est fonctionnalisé par un agent de fonctionnalisation comportant un groupement sulfhydryle. Ledit agent de fonctionnalisation permet d'augmenter la solubilité et la stabilité des points quantiques dans une solution aqueuse, notamment lorsque ledit nanocristal ou point quantique est préparé par une méthode utilisant un solvant organique. Ledit agent de fonctionnalisation peut être choisi parmi la cystéine, la pénicillamine, l'acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, l'acide 15 mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou un poly(éthylèneglycol) comportant un groupement sulfhydryle. La fonctionnalisation par un susdit agent peut être mise en oeuvre par toute méthode connue dans l'art, par exemple par la méthode décrite par Mohammad-Rezaei et al. (Luminescence 2013, 28: 503-509) ou par l'échange zo de ligand (Reinhart et Johansson, Chem. Mater., 2015, 27 (21), pp 7313-7320). Un susdit agent de fonctionnalisation est lié au point quantique par son groupement sulfhydryle. On entend par « une molécule biologique portant au moins un 25 groupement sulfhydryle » soit une molécule biologique contenant naturellement au moins un groupement sulfhydryle soit une molécule dans laquelle un groupement sulfhydryle est introduit artificiellement par une méthode biologique ou chimique dans une molécule biologique naturellement ne comportant pas de groupement sulfhydryle, ledit groupement sulfhydryle étant 30 lié directement à ladite molécule biologique par une liaison covalente, sans par intermédiaire d'un agent de couplage. Par exemple, une molécule biologique contenant naturellement au moins un groupement sulfhydryle peut être une protéine contenant au moins une cystéine. 3058141 8 Conformément à la présente invention, la molécule biologique contenue dans un conjugué de l'invention est un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, une glycoprotéine, un polypeptide, un peptide ou un acide nucléique. Ladite molécule biologique peut être un produit naturel d'origine 5 humaine, animale, végétale, bactérienne ou viral, obtenu par extrait, ou un produit synthétique comme par exemple un produit recombinant obtenu par bio-ingénierie ou un produit synthétisé par une méthode chimique. Dans un mode de réalisation particulier, ledit fragment d'anticorps est un fragment choisi parmi F(ab')2, Fab, Fv, scFv ou Fc. Dans un mode de réalisation avantageux, ladite molécule biologique est un anticorps, un fragment F(ab')2 ou un fragment Fab. On entend par « fragment F(ab')2 » un fragment d'anticorps bivalent constitué de deux chaînes légères entières et de deux fragments des chaînes lourdes contenant respectivement le domaine VH et le domaine CH1, lesdites 15 chaînes et lesdits fragments étant liés par des ponts disulfures. Un fragment F(ab')2 peut être obtenu par la digestion d'un anticorps par la pepsine. On entend par « fragment Fab » un fragment d'anticorps monovalent constitué d'une chaîne légère entière et d'un fragment de la chaîne lourde contenant le domaine VH et le domaine CH1, ladite chaîne légère et ledit 20 fragment étant liés par des ponts disulfures. Un fragment Fab peut être obtenu par la digestion d'un anticorps par la papaïne. On entend par « fragment Fv » un fragment d'anticorps monovalent formé par un domaine VL et un domaine VH, les domaines VL et VH étant liés par des ponts disulfures. 25 On entend par « scFv » un peptide contenant un domaine VL et un domaine VH d'un anticorps. On entend par « Fc » un fragment d'anticorps formé par deux chaînes peptidiques constituant les domaines CH2 et CH3, lesdites deux chaînes peptidiques étant liées par des ponts disulfures. Un fragment Fc peut être 30 obtenu par la digestion d'un anticorps par la papaïne. Un fragment d'anticorps contenant au moins un groupement sulfhydryle peut être obtenu en réagissant un susdit fragment d'anticorps avec un agent réducteur pour interrompre partiellement les ponts disulfures. 3058141 9 Contrairement aux conjugués décrits dans l'art antérieur, une molécule biologique dans un conjugué de la présente invention est liée directement à un ion métallique situé à la surface du point quantique par un groupement sulfhydryle porté par ladite molécule biologique, sans par l'intermédiaire d'un 5 agent de couplage. Grâce à cette caractéristique technique, le conjugué de la présente invention permet de réduire la distance entre la molécule biologique et le point quantique et d'améliorer la limite de détection de la cible de la molécule biologique. 10 Par exemple, l'utilisation d'un conjugué de la présente invention dans un immunodosage basé sur le FRET peut diminuer la limite de détection de l'antigène spécifique de la prostate (PSA) à 0,08 ng/mL par rapport à la limite de détection obtenue par les conjugués connus dans l'art utilisant un agent de couplage. Par exemple, la limite de détection d'un conjugué QD705-Fab utilisant 15 un agent de couplage de type sulfo-EMCS est de 2ng/mL (Bhuckory et al. Sensors, 2016, 16(2), 197). Un autre conjugué QD705-Mali-Fab utilisant MALdPEG3- acide lipoïque comme agent de couplage est de 0,8 ng/mL (Mattera et al. Nanoscale, 2016, vol.8, num.21, pp. 11275-11283). 20 Un conjugué de la présente invention peut être utilisé dans le domaine du diagnostic in vitro ou in vivo et dans le domaine du traitement thérapeutique. La présente invention concerne également un biosenseur comprenant un conjugué tel que décrit dans la présente invention. 25 Un conjugué ou un biosenseur tel que décrit dans la présente invention peut être utilisé dans l'imagerie fluorescente pour le diagnostic in vivo, par exemple pour le diagnostic du cancer, notamment le cancer de prostate. La présence de la cible de la molécule biologique du conjugué est indiquée par 30 l'émission directe ou indirecte d'une fluorescence par le point quantique activé par une source énergique. Dans un mode de réalisation, un biosenseur de l'invention consiste en un conjugué de la présente invention. 3058141 10 Un tel biosenseur peut être utilisé comme agent de contraste fluorescent dans le diagnostic in vivo. Dans un autre mode de réalisation particulière, un biosenseur selon 5 l'invention consiste en : - un conjugué tel que décrit dans la présente invention, dans lequel ladite molécule biologique est un premier anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un premier épitope spécifique d'un antigène, - un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un 10 deuxième épitope spécifique dudit antigène et marqué par un deuxième fluorophore. Dans ce système, ledit conjugué et ledit deuxième anticorps ou fragment d'anticorps marqué constituent un système de FRET dans lequel le point quantique et ledit deuxième fluorophore fonctionnent comme un donneur 15 d'énergie et un accepteur d'énergie. La présence d'une cible qui est reconnue simultanément par un anticorps ou un fragment d'anticorps du conjugué de l'invention et par un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps induit le rapprochement entre le donneur d'énergie et l'accepteur d'énergie et conduit finalement au transfert 20 d'énergie entre le donneur d'énergie et l'accepteur d'énergie. Dans un mode de réalisation particulier, ledit deuxième fluorophore est un lanthanide. De préférence, ledit fluorophore est un ion d'un lanthanide choisi parmi Tb3+, Eu3+, Sm3+, Dy3+, Er3+, Tm3+ ou Ho3+. Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit deuxième fluorophore 25 est l'ion Tb3+, plus particulièrement un complexe de terbium Lumi4®-Tb, qui a une longue durée de vie en état excité. La présente invention concerne également l'utilisation d'un conjugué de la présente invention ou un biosenseur tel que décrit ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par résonance de type Fôrste (Fôrster resonance 30 energy transfer). Un autre objet de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de préparation d'un conjugué tel que décrit dans la présente invention. Ce procédé permet de conjuguer directement une molécule biologique avec un 3058141 11 point quantique sans présence de groupement chimique comme liaison entre ladite molécule biologique et ledit point quantique. En effet, contre toute attente, une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle peut être liée directement à un ion métallique 5 choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, pd2+1 cd2+1 pt2+1 Fig2+1 Ai3 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ par une liaison métallique. Par conséquent, lorsque ces ions métalliques sont situés à la surface d'un nanocristal semi-conducteur, une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle peut être 10 fixée directement audit nanocristal sans besoin d'utiliser un agent de couplage. Ledit procédé comprend une étape consistant à mélanger ladite molécule biologique avec un nanocristal ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, co2+1 Ni2+1 cu2+1 zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, pd2+1 cd2+1 pt2+1 Fig2+1 Al3+1 15 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué. Le mélange peut être effectué dans une solution aqueuse à température ambiante. Une molécule biologique peut naturellement comporter au moins un groupement sulfhydryle, notamment lorsque ladite molécule comporte au 20 moins une cystéine. Ledit groupement sulfhydryle peut être également introduit artificiellement dans une molécule biologique par une méthode biologique ou chimique. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de 25 préparation d'un conjugué tel que décrit dans la présente invention dans lequel ladite molécule biologique est un anticorps ou un fragment d'anticorps, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (i) faire réagir un anticorps ou un fragment d'anticorps avec un agent réducteur pour obtenir un anticorps ou un fragment d'anticorps partiellement 30 réduit portant au moins un groupement sulfhydryle, (ii) mélanger ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps partiellement réduit avec un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, 3058141 12 pt2+1 Fig2+1 A.3+1 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué. L'utilisation d'un agent réducteur dans l'étape (i) dudit procédé permet d'interrompre partiellement les ponts disulfures situés entre les chaînes légères 5 et lourdes, d'une part, et entre deux chaînes lourdes, d'autre part. Conformément à la présente invention, un agent réducteur est choisi parmi le groupe comprenant le tris(2-carboxyéthyl)phosphine, le 2- mercaptoéthylamine, le 2-mercaptoéthanol et le dithiothreitol. 10 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit procédé comprend en outre avant l'étape (ii), une étape (ii') de fonctionnalisation d'un susdit nanocristal semi-conducteur par un agent de fonctionnalisation comportant un groupement sulfhydryle, choisi parmi le groupe comprenant la cystéine, la pénicillamine, l'acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, 15 l'acide mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou par un poly(éthylèneglycol) comportant un groupement sulfhydryle. La présente invention est illustrée plus en détail par les figures et les exemples ci-après. 20 Figure 1: cette figure illustre la liaison directe du fragment Fab, par son groupement sulfhydryle, sur la surface du point quantique contenant du ZnS, ledit point quantique étant fonctionnalisé par la pénicillamine. Figures 2A et 2B: La figure 2A illustre la courbe de calibration d'un 25 immunodosage basé sur le FRET. L'augmentation de la quantité d'antigène TPSA (total prostate specific antigen) dans une solution contenant Tb-anticorps et les conjugués de la présente invention conduit à l'augmentation du signal FRET. La figure 2B montre la limite de détection de ce système d'immunodosage basé sur le FRET. La limite de détection obtenue est de 0,08 30 ng/mL. Exemples Exemple 1 : Conjugaison directe de l'anticorps anti-TPSA avec les points quantiques CdSe/ZnS 3058141 13 Un anticorps dirigé contre TPSA (total prostate specific antigen) est utilisé dans l'exemple. Le fragment F(ab')2 et le fragment Fab sont préparés par « PierceTM Mouse IgG Fab and F(ab')2 preparation kit » conformément aux instructions du fournisseur. 5 Le ratio molaire initial entre les points quantiques et les anticorps est 1 :20. 200 mM du chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) est préparé en dissolvant 0,0057 g de (TCEP) dans 100 pL de l'eau déionisée. Les anticorps ou les fragments d'anticorps sont incubés avec le TCEP en 10 température ambiante pendant 30 min pour partiellement réduire les ponts disulfures. 3,75 pL du TCEP sont ajoutés dans 150 pL d'une solution d'anticorps pour obtenir une solution dont la concentration finale en TCEP est d'environ 5 mM. L'incubation est réalisée sous agitation à 30 tpm. Après la réaction, le TCEP en excès est purifié par la colonne de 15 purification ayant un seuil de coupure à 30kDa (Millipore®) et dans un tampon 1XPBS à pH7,5. La colonne est ensuite lavée deux fois par 4 mL du tampon 1XPBS à pH7,5 avec centrifugation à 4000g. Le volume final de l'anticorps ou du fragment d'anticorps collecté est de 150 pL. L'anticorps ou le fragment d'anticorps collecté après la purification est 20 mélangé avec 100 pL des points quantiques tels que décrits dans la présente d'invention. Le mélange est incubé pendant 4 heures à l'obscurité et à température ambiante sous agitation à 30 tpm. Après la conjugaison, les anticorps ou les fragments d'anticorps qui ne sont pas liés aux points quantiques sont lavés par 1mL du tampon 1XPBS à pH 25 7,5 dans une colonne de purification ayant le seuil de coupure à 100 kDa (Millipore®) et ensuite centrifugé à 1000 g. Le lavage est répété 4 fois. La solution collectée est centrifugée à 4000g pendant 5 minutes. Le surnageant obtenu après la centrifugation est conservé à 4°C. 30 Exemple 2 : Détection de TPSA Les conjugués QD-IgG, QD-F(ab')2, and QD-Fab sont produits selon l'exemple 1. L'immunodosage basé sur le FRET est mis en oeuvre dans une solution contenant ledit conjugué et un deuxième anticorps anti-PSA marqué par un 35 complexe de terbium. Après l'ajout du PSA dans ladite solution, l'apparition 3058141 14 d'un signal de transmission d'énergie du Tb aux points quantiques confirme la fonctionnalité du système d'immunodosage utilisant ledit conjugué (Figures 2A et 2B). La limite de détection de l'antigène PSA obtenue par ce système est de 0,08 ng/mL, alors que la limite de détection des conjugués utilisant des agents 5 de couplage est au moins 10 fois supérieur (Mattera et al. Nanoscale, 2016, vol.8, num.21, pp. 11275-11283). REVENDICATIONS1. Conjugué comprenant : - un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, cd2+1 pt2+1 Fig2+1 Al3+1 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+, et - une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle, ladite molécule biologique étant liée directement aux susdits ions métalliques situés à la surface dudit nanocristal par ledit groupement sulfhydryle. 2. Conjugué selon la revendication 1, dans lequel ledit nanocristal est un nanocristal à structure « coeur/coquille ». 15 3. Conjugué selon la revendication 2, dans lequel la coquille dudit nanocristal comporte un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, pd2+1 cd2+1 pt2+1 Fig2+1 Ai3 In3+, Ga3+, As3+, 20 As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+. 4. Conjugué selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la coquille dudit nanocristal est du ZnS, du Zn(Se,S), du CdS ou du (Cd,Zn)S. 25 5. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel le coeur dudit nanocristal est du CdSe, du CdTe, de l'InP ou de l'InZnP, du CuInS2, du AgInS2 ou du CsPbBr3. 6. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel 30 ledit nanocristal est fonctionnalisé par un agent de fonctionnalisation comportant un groupement sulfhydryle, choisi parmi le groupe comprenant la cystéine, la pénicillamine, l'acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, l'acide mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou par un poly(éthylèneglycol) 35 comportant un groupement sulfhydryle. 3058141 16 7. Conjugué selon une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite molécule biologique est un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, une glycoprotéine, un polypeptide, un peptide 5 ou un acide nucléique. 8. Conjugué selon la revendication 7, dans lequel ledit fragment d'anticorps est F(ab)2, Fab, Fv, scFv , Fc. 9. Conjugué selon une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ledit nanocristal semi-conducteur est un point quantique. 10.Procédé de préparation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant une étape consistant à mélanger ladite molécule biologique avec un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe 2+ Fe3+, co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+ Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, pd2+1 cd2+1 pt2+1 Fig2+1 A13 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite molécule biologique est un anticorps ou un fragment d'anticorps, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (i) Faire réagir un anticorps ou un fragment d'anticorps avec un agent réducteur pour obtenir un anticorps ou un fragment d'anticorps partiellement réduit portant au moins un groupement sulfhydryle, (ii) Mélanger ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps partiellement réduit avec un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, co2+, Ni2+, cu2+, zn2+1 pb2+1 sn2+1 sn4+1 Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, pd2+1 cd2+1 pt2+1 Fig2+1 A13+1 In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel un agent réducteur est choisi parmi le groupe comprenant le tris(2-carboxyéthyl)phosphine, le 2-mercaptoéthylamine, le 2-mercaptoéthanol et le dithiothreitol. 3058141 17 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre avant l'étape (ii), une étape (ii') de fonctionnalisation d'un susdit nanocristal semi-conducteur par un agent de fonctionnalisation 5 comportant un groupement sulfhydryle, choisi parmi le groupe comprenant la cystéine, la pénicillamine, l'acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, l'acide mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou par un poly(éthylèneglycol) comportant un groupement sulfhydryle. 10 14. Biosenseur comprenant un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 15. Biosenseur selon la revendication 14 consistant en : 15 - Un conjugué tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ladite molécule biologique est un premier anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un premier épitope spécifique d'un antigène, - Un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un 20 deuxième épitope spécifique dudit antigène et marqué par un deuxième fluorophore, notamment un lanthanide. 16. Utilisation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou un biosenseur selon la revendication 14 ou 15 pour la mise en 25 oeuvre de Fôrster resonance energy transfer.