FR 3055704 A1 20180309 FR 1658163 A 20160902 1 PROCEDE DE DETECTION D'ESPECES FLUORESCENTES REVERSIBLEMENT PHOTOCOMMUTABLES A HAUTE FREQUENCE L'invention porte sur un procédé de détection d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables à haute fréquence. Un tel procédé présente de nombreuses applications, notamment en chimie, en biologie et dans le domaine des mesures et du criblage environnementaux. On entend par « espèce » une espèce chimique telle qu'une molécule ou un complexe, ou un objet physique tel qu'une nanoparticule. On entend par « espèce réversiblement photocommutable » (« photoswitchable » ou « photoconvertible » dans la littérature en anglais) une espèce présentant au moins deux états distincts, ayant des propriétés de fluorescence différentes, et pouvant passer d'un état à l'autre de manière réversible par effet de la lumière. Des exemples d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables sont la protéine « Dronpa » et le complexe « Spinach - DFHBI » (« Spinach » étant un aptamère d'ARN et DFHBI une sonde fluorogène). Ces espèces peuvent, en particulier, être utilisées comme sondes ou marqueurs. D'autres exemples d'espèces fluorescentes réversiblement commutables peuvent être des dérivés azoïques ou bien des échafaudages protéiques. L'imagerie, et plus particulièrement la microscopie par fluorescence est devenue un outil indispensable en biologie, mais également dans d'autres disciplines telles que la science des matériaux. Ses applications, cependant, sont limitées par la capacité d'observer un signal d'intérêt dans un fond de fluorescence ou de bruit. Ce problème est particulièrement aigu dans les applications d'imagerie in vivo, animale ou végétale, dans lesquelles les marqueurs fluorescents à détecter sont dispersés dans un milieu complexe auto- fluorescent et/ou diffusant ; le signal utile se retrouve alors noyé dans un bruit de fond intense. Une autre limite des techniques de détection et d'imagerie par fluorescence réside dans la largeur de la bande spectrale des fluorophores 3055704 2 généralement employés par rapport à la largeur de la bande spectrale visible : il est difficile de détecter sélectivement plus de quatre marqueurs fluorescents dans un même échantillon, car leurs spectres d'émission tendent à se superposer. 5 Pour surmonter ces limites, la demande de brevet WO 2015075209 Al divulgue une méthode utilisant des sondes fluorescentes réversiblement photocommutables, dans laquelle on illumine un échantillon, contenant une espèce de fluorophore photocommutable avec une lumière modulée 10 périodiquement. La composante de l'intensité émise par les fluorophores à la même pulsation est alors détectée, en quadrature de phase par rapport à l'onde d'excitation. Cette méthode permet de détecter sélectivement certains fluorophores réversiblement photocommutables en minimisant, dans certaines conditions calculées analytiquement en fonction des caractéristiques du 15 fluorophore, le bruit apporté dans les méthodes traditionnelles par l'auto-fluorescence et/ou la diffusion du milieu de l'échantillon. Un des problèmes de cette méthode réside dans la fréquence d'acquisition d'images successives. Les différentes espèces fluorescentes réversiblement photocommutables utilisées dans l'état de l'art passent d'un état activé à leur état initial non activé de 20 manière thermo-induite : le temps caractéristique de cette transition est par exemple de 5 à 10 secondes et correspond au temps d'acquisition d'une image en utilisant cette méthode. Cette échelle de temps est trop grande pour réaliser un grand nombre de mesures pertinentes en biologie. 25 Une autre technique de l'art antérieur est divulguée dans l'article de Yen- Cheng Chen et al. (Chen, Y. C., Jablonski, A. E., Issaeva, I., Bourassa, D., Hsiang, J. C., Fahrni, C. J., & Dickson, R. M., 2015, Optically Modulated Photoswitchable Fluorescent Proteins Yield Improved Biological Imaging Sensitivity, Journal of the American Chemical Society, 137(40), 12764-12767) 30 qui propose une méthode de détection de fluorophore mettant en oeuvre une excitation hétérodyne d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable par deux sources d'illumination laser monochromes de longueurs d'onde d'excitation différentes. Cette technique propose un choix empirique des paramètres de mesure de la fluorescence d'une d'espèce, ce qui 3055704 3 ne permet pas de transposer facilement ce type de mesure à d'autres espèces. De plus, le rapport signal sur bruit lors de la mesure d'une d'espèce fluorescente réversiblement photocommutable n'est pas optimal. Enfin, la méthode divulguée n'indique pas à l'homme du métier comment observer deux d'espèces 5 fluorescentes réversiblement photocommutables en même temps. L'invention vise à remédier aux inconvénients précités de l'art antérieur, et plus particulièrement à : 10 - imager un échantillon en discriminant plusieurs fluorophores différents ; - permettre d'imager des fluorophores selon une technique permettant d'éliminer le bruit de diffusion/d'auto-fluorescence à haute fréquence ; - d'une manière générale, imager sélectivement et quantitativement une ou plusieurs sondes fluorescentes dans un mélange. 15 Un objet de l'invention permettant d'atteindre ce but, partiellement ou totalement, est un procédé de détection d'au moins une espèce fluorescente réversiblement photocommutable , comportant les étapes suivantes : (a) éclairer un échantillon contenant ladite ou au moins une dite espèce 20 fluorescente réversiblement photocommutable avec une première lumière d'éclairage, de longueur d'onde À1, et modulée périodiquement à une pulsation w et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde À2 différente de modulée périodiquement à ladite pulsation co ; (b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit 25 échantillon ainsi éclairé ; et (c) extraire l'amplitude de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même périodicité que ladite première lumière d'éclairage modulée périodiquement et en quadrature de phase par rapport à elle ; 30 - ladite seconde lumière d'éclairage étant modulée en antiphase par rapport à ladite première lumière d'éclairage et - l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage, et leur pulsation w étant 3055704 4 choisies de manière à s'approcher d'un maximum de ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. Par exemple, l'amplitude peut prendre une valeur égale à au moins 75%, de préférence 80%, de manière encore préférée 90% du maximum. 5 Selon un mode de réalisation particulier d'un tel procédé, au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut présenter un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits états étant fluorescent, ladite ou chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit 10 deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retourner audit premier état par une seconde réaction photo-induite, et ladite première lumière d'éclairage peut présenter une intensité moyenne /1° et être modulée à une pulsation w et ladite seconde lumière d'éclairage présenter une intensité moyenne /2 avec: 15 612,1 ± 621,1) 2 2 ± 0-21,2)1":1 et 2 où 612,1/1° et 621,111° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite 20 première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage ; et où 612,2/2 et 621,2/2 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage. Par ailleurs, l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, 25 l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage, et leur pulsation w peuvent également être choisies de manière à assurer un contraste minimum entre ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence et l'amplitude d'une composante d'intensité de fluorescence, présentant la même périodicité, issue d'une espèce interférente. 30 Un autre objet de l'invention est un procédé de détection d'au moins deux espèces fluorescentes réversiblement photocommutables présentant des propriétés dynamiques différentes, comportant les étapes suivantes : 3055704 5 (a) éclairer un échantillon contenant chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde À, et modulée périodiquement selon une première fonction sommant au moins deux premières composantes d'éclairage modulées par des 5 pulsations coi, chaque dite pulsation coi de chaque dite première composante d'éclairage étant associée à une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable, et étant différente de la ou des autres dites pulsations coi ; et éclairer avec une seconde lumière d'éclairage, de longueur d'onde À2 différente de À1, et modulée périodiquement selon une seconde fonction sommant au 10 moins deux secondes composantes d'éclairage modulées par desdites pulsations coi, chaque dite pulsation coi de chaque dite seconde composante d'éclairage étant égale à une dite pulsation coi d'une dite première composante d'éclairage ; (b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit 15 échantillon ainsi éclairé ; (c) extraire chaque amplitude (algébrique) de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même pulsation coi que chaque dite composante d'éclairage, et en quadrature de phase par rapport à chaque dite première composante d'éclairage ; 20 - pour chaque dite pulsation coi, chaque dite seconde composante d'éclairage modulée par ladite pulsation coi étant en antiphase par rapport à chaque dite première composante d'éclairage modulée par ladite pulsation w; ; - et l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage, et lesdites pulsations étant 25 choisies de manière à s'approcher d'un maximum de chaque dite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel procédé : - Chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut présenter un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits 30 états étant fluorescent, chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retourner audit premier état par une seconde réaction photo-induite, et ladite première lumière 3055704 6 d'éclairage peut présenter une intensité moyenne /1° et être modulée périodiquement selon une dite première fonction, et ladite seconde lumière d'éclairage peut présenter une intensité moyenne /2 avec pour chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable : 5 (0-12,1 + - (u12,2 + u21,2) où 612,1112 et 621,1112 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage de ladite espèce ; et où 612,2C et 621,2C sont, 10 respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage de ladite espèce. - Pour chaque dite pulsation o correspondant à une dite espèce 15 fluorescente réversiblement photocommutable on peut avoir : = *12,1 + 0-21,1)C. où 612,1/1) et 621,1112 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage de ladite espèce. Avantageusement, le rapport entre au moins deux dites pulsations 0 peut être strictement supérieur à 10. 20 - Lors de ladite étape a), ledit échantillon peut être éclairé par au moins une lumière d'éclairage sensiblement monochromatique. - Lesdites étapes b) et c) peuvent être mises en oeuvre par détection synchrone dudit rayonnement de fluorescence. - Le procédé peut comporter également l'étape suivante : 25 d) déterminer la concentration de ladite ou d'au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors d'une dite étape c). - Ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut être choisie parmi : une protéine fluorescente 30 photochrome ; et un complexe d'une biomolécule avec une sonde fluorogène. - L'échantillon peut comporter de la matière biologique. 3055704 7 Encore un autre objet de l'invention est un procédé d'imagerie à fluorescence (et notamment de microscopie à fluorescence) mettant en oeuvre un tel procédé de détection. Dans ce cas, ledit échantillon peut comprendre un organisme vivant, et au moins un élément choisi parmi la présence et la 5 concentration d'une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut être mesuré à partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors de ladite étape c) sans effectuer de prélèvement sur ledit organisme vivant. - Une dite lumière d'éclairage peut comprendre une partie de la 10 lumière du jour et ladite partie de la lumière du jour peut participer à l'intensité lumineuse reçue par ladite espèce fluorescente réversiblement photocommutable en restant inférieure ou égale aux intensités moyennes desdites lumières d'éclairage. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages, détails et 15 caractéristiques de celle-ci apparaîtront au cours de la description explicative qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre un procédé de détection d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P selon l'invention ; 20 - la figure 2 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P dans le cas d'une réalisation appartenant à l'art antérieur ; 25 - la figure 3 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable dans une réalisation de l'invention ; - la figure 4 illustre une réalisation de l'invention permettant d'imager 30 plusieurs espèces fluorescentes réversiblement photocommutables lors de la même détection d'image ; 3055704 8 la figure 5 illustre une simulation numérique correspondant à la quantification d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable en présence de composés interférents X ; 5 la figure 6 est un graphique illustrant des propriétés photochimiques d'un ensemble d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables ; la figure 7 est un ensemble de photographies illustrant une comparaison expérimentale entre des réalisations de l'art antérieur et une réalisation de 10 l'invention ; la figure 8 illustre une détection de l'image en fluorescence d'une cellule selon une réalisation de l'invention ; 15 - la figure 9 illustre un système mettant en oeuvre un procédé selon un mode de réalisation de l'invention. La figure 1 illustre un procédé de détection d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P selon l'invention. Le procédé comprend 20 l'éclairage d'un échantillon E par une première lumière d'éclairage FEX1, de longueur d'onde Â1 et une seconde lumière d'éclairage FEX2, de longueur d'onde 2L2, différente de Chacune des lumières d'éclairage FEX1, FEX2 est de préférence sensiblement monochromatique, c'est-à-dire que son spectre présente un seul maximum d'intensité, et/ou une largeur spectrale inférieure ou 25 égale à 50 nm. L'espèce fluorescente réversiblement photocommutable P présente deux états différents échangeables sous l'action de la lumière. Il peut s'agir d'une espèce fluorescente photochrome, ou de tout autre système dont le 30 comportement dynamique peut se réduire à un échange entre deux états sous l'action de la lumière ; ces états peuvent correspondre à des configurations stéréochimiques différentes d'une molécule, à un état lié/non lié d'un complexe, etc. Sur la figure 1, le premier état - thermodynamiquement plus stable - est indiqué par 1 et représenté par un carré plein ; le second état - thermodynamiquement moins 3055704 9 stable - est indiqué par 2 et représenté par un carré creux. Ces deux états possèdent des brillances différentes. Dans un souci de simplicité, et à titre d'exemple non limitatif, on peut considérer que seul l'état 1 est fluorescent de manière significative. 5 L'échantillon E, et plus précisément l'espèce P qu'il contient, éclairé par une première lumière d'éclairage FEX1 et par une seconde lumière d'éclairage FEX2, émet un rayonnement de fluorescence FLU dont l'intensité est, elle-aussi, modulée et peut être décomposée en : 10 - une composante en phase avec la première lumière d'éclairage FEX1, indiquée sur la figure par 'Fin; et - une composante en quadrature avec le faisceau d'excitation, indiquée sur la figure par IF°ut. La demande de brevet WO 2015075209 Al divulgue l'intérêt et le fondement d'une observation de la composante le ut lors de 15 l'observation d'espèces P. Le comportement dynamique d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P peut être décrit de la manière suivante. Sous l'illumination d'une espèce P par une lumière d'intensité 1(t) comprenant deux composantes 20 11(t) et /2(0, correspondant respectivement à une première lumière d'éclairage FEX1, de longueur d'onde Â1 et à une seconde lumière d'éclairage FEX2, de longueur d'onde )L2, le comportement dynamique de l'espèce P peut être décrit par l'échange à deux états suivant : X12 (t) 25 2 (1) dans lequel l'état 1, thermodynamiquement plus stable, est converti par une réaction photochimique en un état thermodynamiquement moins stable 2 avec une constante /. ), et peut retourner vers l'état initial 1 plus cinétique t' 30 stable par un processus photochimique et/ou thermique avec une constante cinétique k21(t) = o-21,1/1(t) + o-21,2/2(t) + dans lesquels 0-12,1/1(t), 3055704 10 0-12 212(t), 0-21,1/1(t), 21,212 (t) représentent les contributions photochimiques et k2 la contribution thermique aux constantes de vitesse, 0-12.1 étant la section efficace de photoconversion de l'état 1 vers l'état 2 éclairée par la lumière FEX1, U12.2 étant la section efficace de photoconversion de l'état 1 vers l'état 2 éclairé par 5 la lumière FEX2, 021,1 étant la section efficace de photoconversion de l'état 2 vers l'état 1 éclairée par la lumière FEX1 et 0-212 étant la section efficace de photoconversion de l'état 2 vers l'état 1 éclairée par la lumière FEX2. L'ensemble de ces constantes définissent le comportement de l'espèce P. 10 Par hypothèse, le système est éclairé de manière uniforme ou peut être considéré comme homogène à tout temps. L'évolution des concentrations 1 (concentration en état 1 de l'espèce P) et 2 (concentration en état 2 de l'espèce P) peut alors être décrite par le système d'équations suivant : dl 15 d (2) et d2 1 km (t) 2 (3) En considérant que l'échantillon E est éclairé soudainement par deux sources d'éclairage constant, respectivement de longueur d'onde Â1 et À2, 20 l'éclairage est caractérisé par l'intensité / -1-'(2) = la et les constantes cinétiques peuvent être écrites sous la forme : ki2(t) = 142 1 + ki°2,2 k21(t) = 121 = z11 + 42 + où 25 U12,11-V, k2)1,1 0-21,1e, 42 (721,2/(1. U12,2-TI)2 3055704 11 En considérant que l'état initial ne contient que l'espèce 1, les concentrations de 1 et 2 évoluent selon : 5 où 2 2° = - ' ('X'.) (10) 712 correspond au temps de relaxation d'un fluorophore réversiblement photocommutable et 1° et 2° aux concentrations 1 et 2 à l'état photostationnaire 10 atteint au temps Tj)2 . On a également : où : 1° - Pl(), (12) KV2 kj[)2 (13) 15 et la concentration totale en espèce P vaut Ptot = 1 + 2. Il est possible d'analyser la réponse en émission fluorescente, ou rayonnement de fluorescence FLU d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P quand elle est soumise à deux lumières d'éclairage 20 modulées périodiquement FEX1, FEX2, correspondant à des réalisations de l'invention. De manière générale, on peut considérer qu'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P est soumise à un éclairage comprenant 25 deux composantes : un éclairage périodique 11(t) à la longueur d'onde Â1 et un éclairage 12(t) à la longueur d'onde Â2, qui peut être constant dans une réalisation différente de l'invention, ou modulé périodiquement dans l'ensemble des réalisations de l'invention. On peut écrire, dans le cas le plus général : I(t) = Ii(t)+ t) (35) 1 3055704 12 et ah3 (t)] (36) avec j = 1 ou 2. Dans l'équation (36), a correspond à l'amplitude de la modulation lumineuse et h1(t) correspond à des fonctions périodiques. Les 5 équations (4) et (5) deviennent ici : cxh 1 (t)] et 112 (t) = k21 (t) = 02.1 [1 + 1( 1 [1 ahi( }] En introduisant une fonction f(t), on peut développer l'expression des 10 concentrations de la manière suivante : 2 = 2° ce f (t) (39) et 1 = - (t). (40) Le système d'équations différentielles gouvernant les évolutions temporelles des 15 concentrations 1 et 2 peut être résolu avec les équations (2) et (3) pour obtenir : = f (x) [al_ (x)] hi (x) [az - ( )] h2(x) (41) t (42) A Pl 2 "1 2 1 7-1" (43) (44) 'so A o (45) a2 P12'12,2112 b2 et (012,2 I 021,2)-ry1l2 (46) Pij2 = k0_210 X012° (47) df (x) dx où : 20 25 et où : 3055704 13 0 21,1 k kO '012,1 '12,2 k k(212 k V2,2 +'°22 + l e k1 12,1 '12,2 21.1 21.2 désignent respectivement la vitesse de la réaction correspondant à l'équation (1) 5 à l'état stationnaire (avec 1° et 2° donnés dans l'équation (12)) et les différences des contributions relatives des moyennes des éclairages modulés (respectivement /1° et /12 ) aux constantes cinétiques menant respectivement de l'état 1 vers l'état 2 ou de l'état 2 vers l'état 1. 10 Après le temps de relaxation T1132, un régime permanent est établi, dans lequel f(x) est une fonction périodique continue. De manière plus générale, f(x) peut être une fonction périodique. Dans les différentes réalisations de l'invention, la modulation d'un éclairage FEX1, FEX2 peut être réalisée par une pulsation fondamentale co ou deux pulsations fondamentales (col et col) ou au moins deux 15 pulsations fondamentales, chacune des différentes pulsations fondamentales étant appelées dans ce cas par un terme générique Dans un premier cas, la série de Fourier correspondant à f (x) peut être écrite sous la forme : f (c 9 x) = a° [ ncos cos (_t,D \ -i sin ( pvW) 1' sin rivx) 20 n=1 (50) où : w (22 (51) et où an'"" et désignent les amplitudes des n-ièmes composantes de la 25 série de Fourier. Dans le second cas, la série de Fourier correspondant à f(x) peut être écrite sous la forme : AO 12,1 A° 12.2 k)1,2 (48) (49) 3055704 (52) 01 (52) 02 4-'271)2 et où a°, an,m,cos et bn'm'sin correspondent aux amplitudes du 0-ième et des {n,m}- ièmes composantes de la série de Fourier. a° et/ou an,m,cos et/ou bn'm'sin peuvent être extraits de l'équation (41) en identifiant les composantes du même ordre. L'ensemble d'équations obtenues peut être transformé de manière à expliciter les modulations de concentration pour toutes les pulsations. On peut alors écrire : 25 +00 main sin (n0 x) .2"s cos (n0 x) (55) 2 15 2n'si" sin (n0x) n= 2n'"s cos (n0 x) (56) = 1 - où ou bien : 20 0 = 2° ± cia°, 0 - 1° - aa°, n sin (57) (58) (59) (60) , ILICOS Ti-COS = . 2n'sin 2n,cos fl .Sin 14 = où : 5 10 (53) (54) in 17102 2 = + a n,rn,co£Ï cos rit().) (61) 3055704 15 211,111C0e3 cos [(101 + m02) x nOi mt92) 5 où : 11.111.,3111 20 a° .4i Il (62) Il .111, C 10 - a0, (63) 11.111. Ci 1 11 (64) _1 (65) 11.111. C (66) 10 On peut également exprimer l'intensité fluorescente. On définit, dans l'équation (67), l'observable O] correspondant à l'observation à la longueur d'onde Ài avec j = 1 ou 2 : O(t) = 2 Mt) + Q2,2(t) (67) 15 soit, en extrayant l'émission en fluorescence /f(t) dans l'équation (68) : /F(t) = 0 (t)/ (t) 02(t)12(t). (68) On a, avec la dépendance temporelle donnée par les équations (55) et (56) : DO O(t) = CI) oni ,sin sin (n0 x) + .5.);1'"s cos (n0 x) (69) 20 avec : sin =( (Q2,j - Qii (s)bn'sin (70) (71) (72) ,COS (Q 2 ,j 'j) 25 et I n'in sin (n0 x) 'c's cos (n0 x)] )2= (73) 3055704 16 Alors que les expressions des amplitudes des termes 01(t) sont génériques, les expressions des amplitudes des termes IF(t) varient avec les dépendances temporelles de l'éclairage. On a, avec les dépendances temporelles de 1(t) et de 2(t) données par les équations (61) et (62) : 5 n III (74) 10 avec : 1. (75) (76) (77) Q (Q2, (Q2, j) cean,m,cos on,m,sin non, cos lJJ et 15 el MO (78) dans lesquelles, de la même manière, les expressions des amplitudes des termes 01(t) sont génériques, les expressions des amplitudes des termes IF(t) varient avec les dépendances temporelles de l'éclairage. Les inventeurs ont, dans un premier temps, considérés des cas dans lesquels les modulations des deux amplitudes d'éclairage sont faibles, et notées E à la place de a par la suite. Ce cas permet de linéariser les équations et de dériver des expressions analytiques. Dans des réalisations appartenant à l'art antérieur, on réalise des modulations sinusoïdales de l'un des deux éclairages, par exemple l'éclairage FEX1 à la longueur d'onde Â1 oscillant autour d'une intensité moyenne /1° à la 20 25 3055704 17 pulsation co et avec une faible amplitude En? (E « 1) sur lequel on superpose un éclairage d'intensité constante 12 à une longueur d'onde À2. On a alors : /(t) 11 [ E sin + Iz (79) hi(t) (80) 5 h (t) (81) En développant au premier ordre l'expression de la perturbation lumineuse, l'équation (41) devient : (If (*r) O. + a (0.i.) cid; (82) Après le temps de relaxation -cl°2 donné dans l'équation (11), on peut dériver : (83) 1 o (84) (85) 10 15 CIO 21, COS -11, COS - (/' (86) 20 et : (Q i, + Q2,12°) + Q1. 21° + Q2.22°) (87) (88) (89) ( 2 _ C: 25 En utilisant deux longueurs d'ondes différentes, les échanges entre les états 1 et 2 sont essentiellement gouvernés par les contributions 3055704 18 photochimiques en choisissant les intensités moyennes (11),12) de manière à ce que : 0-211-TV I _ 21,24) >> 121 La figure 2 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la 5 réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P dans le cas d'une réalisation appartenant à l'art antérieur. Le diagramme de la figure 2 illustre la valeur de l'amplitude normalisée des oscillations en quadrature de coi / phase pour une concentration 1 (1 inerin - tot ), en fonction des paramètres de contrôle CM) et co/11). Ce cas correspond à un éclairage FEX1 à 10 la longueur d'onde À., oscillant autour d'une intensité moyenne /1) à la pulsation co et avec une faible amplitude E/1" (E « 1) auquel on superpose un éclairage constant d'intensité 112 à une longueur d'onde À2. L'espèce fluorescente réversiblement photocommutable P considérée est « Dronpa-2 », dont les inventeurs ont mesuré les paramètres cinétiques, correspondant à a12,1 = 15 n2.1°1-15 /21,1= m2.moIrl, u12,2= m2.mU 1-1 u21,2= 413 m2.mo1-1 et ce1 = -2 -1 - 100 k°,, 1,4.10 s et avec 0-12.1-T-0 1. 1 ',cos présente un maximum singulier quand les deux Dans ce cas, inorm i conditions de résonance suivantes sont remplies : 20 (a12,1 } 0-21,1) 1-1 = (0-12.2 + 0-2 2) /(2) et (90) w = 2(0"12,1 021,1) (91) Cette optimisation résulte d'une optimisation indépendante des termes ai et 0/-1 + 02] de l'équation (86). al correspond à la variation 020 du régime 25 stationnaire 2° après un saut d'amplitude Lil = EiV. Il est maximisé quand les constantes cinétiques des réactions photochimiques induites par les deux éclairages sont égales. Le second terme optimisé, 8/]1 + 02], est maximisé en ajustant la pulsation co au temps de relaxation ti°2 de manière à avoir t9 = 1. Quand >>1171%, l'échange est lent par rapport aux variations de l'éclairage et le couple 30 {1,2} n'a pas assez de temps pour répondre, de manière à faire disparaître les 196 3055704 19 ,f..t cos. A l'opposé, quand w Ptot (224) titration Quand le signal e est utilisé pour titrer des espèces P, le résultat de la titration surestime la concentration totale Ptot en raison des contributions des espèces 25 interférentes. En revanche, la réponse du premier ordre en quadrature de phase rn à l'éclairage peut s'exprimer : -1.cos '_1 cx 11'cos Lcosf 1,cos -1 os = ( lp /Ptot)F titration X (225) où 3055704 27 (226) iipp 1, CO titration = Ptot (1,1»OS /xtot) pLcos /Ptot) tot et permet de déterminer Ptot quand le triplet de paramètres (11°,112,w) est ajusté dans les conditions de résonance pour une espèce P. En effet, le terme lpl'c°s est 5 maximum alors que les termes l'x'c°s sont négligeables. Le signal issu de l'espèce P est prédominant par rapport à celui des autres espèces interférentes, et le résultat de titration Pt licr°astion est approximativement égal à Ptot. Le panneau A de la figure 5 illustre une simulation numérique des 10 amplitudes normalisées 1171(p) (illustrées par des disques gris) et des amplitudes normalisées de 1xl,cov1pl,cos (illustrées par des carrés noirs) pour quatre mélanges équimolaires incluant l'espèce cible caractérisée par le quintuplet (o 12,1, 0 21,1, 0 12,2, 0- 21,2,kA et seize autres espèces interférentes. Dans chaque échantillon marqué n, ces espèces interférentes correspondent aux seize 15 quintuplets (o 12,1,X, o 21,1,X, o 12,2,X, 0- 21,2,X,k21), dont les quatre paramètres photochimiques diffèrent par n ordres de grandeur de (0 12,1, 6 21,1, 6 12,2, 6 21,2). La figure 6 illustre des propriétés photochimiques d'un ensemble d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables. Pour chacune des 20 espèces considérées, les conditions de résonance selon les équations (90) et (91) ont été mesurées et sont illustrées par des courbes iso-valeur absolue de l'amplitude normalisée de la réponse en quadrature de phase en fluorescence du premier ordre. La courbe (a) correspond à l'espèce « Dronpa », la courbe (b) correspond à l'espèce « Dronpa-2 », la courbe (c) correspond à l'espèce 25 « Dronpa-3 », la courbe (d) correspond à l'espèce « RS-FastLime », la courbe (e) correspond à l'espèce « Padron », la courbe (f) correspond à l'espèce « Kohinoor », la courbe (g) correspond à l'espèce « rsEFGP » et la courbe (h) correspond à l'espèce « rsEFGP2 ». 30 Dans l'une des réalisations de l'invention, on éclaire l'échantillon E avec deux lumières d'éclairage de longueurs d'onde différentes, et on module 3055704 28 périodiquement chacune des lumières d'éclairage, pour imager plusieurs espèces réversiblement photocommutables sélectivement, comme illustré dans la figure 4, le triplet /1°_,C, coi étant choisi pour chacune des espèces de manière à maximiser la composante IF°ut du rayonnement de fluorescence. 5 Dans une réalisation particulière de l'invention, on se place dans les conditions de résonances imposées par les deux intensités moyennes des lumières d'éclairage, c'est-à-dire selon la relation + 1.1 / 2,2 + u21, Graphiquement, cette solution consiste à 10 imager deux espèces réversiblement photocommutables dont les conditions de résonance peuvent être illustrées par des points sensiblement proches de la même droite verticale sur la figure 6. Une variante de l'invention consiste à se placer dans ces conditions et 15 de choisir deux fréquences col et w2 (dans le cas d'une détection de deux espèces P' et P") vérifiant les conditions de résonances de chacune des espèces. Autrement dit, chaque pulsation w vérifie la condition ck) - 2 (a12,1 0-21,1) Cette réalisation permet de maximiser l'amplitude de chaque réponse du premier ordre en quadrature de phase en fluorescence IF°ut. 20 Une autre variante de l'invention consiste à se placer dans les conditions vérifiant la relation (a12,1 + (72. i) + u21,2) de choisir deux pulsations de modulation des lumières d'éclairage, chacune associée à une espèce réversiblement photocommutable, dont le rapport est, par exemple, strictement 25 supérieur à 10, préférentiellement à 100. En effet, quand la relation (90) est vérifiée, le rapport des pulsations de résonance propre à deux espèces P' et P" peut être faible, par exemple inférieur à 10. Dans ce cas, en se plaçant dans des conditions vérifiant la relation (91), on maximise l'amplitude IF°ut correspondant à chaque espèce, mais la contribution des interférences d'une amplitude associée 30 à une espèce sur l'autre empêche d'obtenir un contraste optimal d'une espèce vis-à-vis de l'autre. On peut, dans cette variante, utiliser la relation (106) pour choisir des pulsations de modulation des lumières d'éclairage FEX1, FEX2 de 3055704 29 manière à imposer un rapport entre les pulsations supérieur à une valeur prédéfinie, par exemple 10, pour augmenter le contraste. D'une manière plus générale, il est possible de s'écarter du maximum 5 d'amplitude du signal de fluorescence afin d'augmenter le contraste par rapport à une ou plusieurs espèces interférentes. On peut par exemple maximiser l'amplitude de la fluorescence sous contrainte d'assurer un contraste minimum, maximiser le contraste sous réserve d'assurer une amplitude minimale (exprimée généralement en pourcentage du maximum d'amplitude), voire 10 déterminer une région de l'espace de paramètres (c.o/li, 11/12) assurant à la fois une amplitude suffisamment importante et un contraste suffisamment élevé. De même, dans le cas où l'on vise la détection d'une seule espèce fluorescente, il peut être avantageux de s'écarter des conditions de résonance pour améliorer le contraste avec la fluorescence d'espèces interférentes, aux prix d'une 15 diminution de l'amplitude du signal. Le plus souvent, néanmoins, on choisira des conditions d'illumination assurant une amplitude du signal égale à au moins 75%, de préférence 80% et de manière encore préférée 90% du maximum atteignable. 20 La figure 7 est un ensemble de photographies illustrant une comparaison expérimentale entre des réalisations de l'art antérieur et une réalisation de l'invention. Le panneau A de la figure 7 est une photographie illustrant des noyaux 25 cellulaires, marqués par une espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode de l'art antérieur, en imageant le signal 1F°ut avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde À, = 480 nm modulée périodiquement, et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde )L2 = 405 nm, d'intensité constante. 30 Le panneau B de la figure 7 est une photographie illustrant les mêmes noyaux cellulaires, marqués par la même espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode de l'art antérieur, en imageant le signal 1F°ut avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde À, = 480 nm d'intensité 3055704 30 constante, et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde À2 = 405 nm modulée périodiquement. Le panneau C de la figure 7 est une photographie illustrant les mêmes 5 noyaux cellulaires, marqués par la même espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode réalisation de l'invention, en imageant le signal 'Fout avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde À, = 480 nm modulée périodiquement, et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde À2 = 405 nm modulée à la même période et en antiphase. 10 Dans le panneau A de la figure 7, les intensités sont multipliées par deux. Dans le panneau B de la figure 7, les intensités sont multipliées par -2. Les pics d'intensité sont sensiblement égaux dans l'ensemble des panneaux de la figure, illustrant l'augmentation du signal, décrite en figure 3, lors d'une 15 réalisation mettant en oeuvre deux éclairages, modulés périodiquement en antiphase comparativement à un éclairage modulé périodiquement, ou à un éclairage modulé périodiquement et un second éclairage à éclairage constant. L'amplitude IF°ut mesurée, dans des réalisations de l'art antérieur et/ou dans des réalisations de l'invention est algébrique : on peut discriminer des IF°ut mesurés 20 par leurs valeurs absolues et/ou par leurs signes. La figure 8 illustre une détection de l'image en fluorescence d'une cellule selon une réalisation de l'invention. Dans cet exemple, le noyau de la cellule est marqué par une espèce P, en l'occurrence « Dronpa-2 ». Les mitochondries de 25 la cellule sont marquées par une autre espèce P' « Padron ». L'espèce P' « Padron » est caractérisée par un état 1 sombre et un état 2 fluorescent. Dans cet exemple, deux pulsations de modulation sont fixées. On impose un rapport de 100 entre les deux pulsations de modulation. Une première pulsation, nioow(D - 2) est associée à l'espèce P' « Dronpa-2 » ; cette pulsation 30 est supérieure à la pulsation de résonance de « Dronpa-2 ». Une seconde pulsation, co(Padron), est associées à l'espèce P"« Padron » ; cette pulsation est inférieure à la pulsation de résonance de « Padron ». Les légendes « Padron » et « D-2 » à gauche des images indiquent respectivement une démodulation du signal de fluorescence aux pulsations associée à « Padron » et 3055704 31 à « Dronpa-2 ». Les légendes « P » et « N » à droite des images indiquent respectivement que l'amplitude représentée de IF°ut est de signe positif (P) ou négatif (N). 5 La colonne de gauche de la figure 8 illustre des images obtenues selon une réalisation de l'invention, en éclairant avec deux lumières d'éclairage de longueurs d'onde différentes modulées en antiphase, à la pulsation nioow(D - 2). On observe de manière significative le noyau de la cellule, correspondant à une amplitude positive de IF°ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à 10 D-2. La colonne du milieu de la figure 8 illustre des images obtenues selon une réalisation de l'invention, en éclairant avec deux lumières d'éclairage FEX1, FEX2 de longueurs d'onde différentes modulées en antiphase, à la pulsation 15 co(Padron). On observe de manière significative les mitochondries de la cellule, correspondant à une amplitude négative de IF°ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à Padron. La colonne de droite de la figure 8 illustre des images obtenues selon 20 une réalisation de l'invention, en éclairant deux lumières d'éclairage FEX1, FEX2 de longueurs d'onde différentes, et modulées par des composantes aux pulsations nioow(D - 2) et co(Padron), chaque composante de la seconde lumière d'éclairage FEX2 étant en antiphase de la composante correspondante de la première lumière d'éclairage FEX1. On observe de manière significative à 25 la fois le noyau de la cellule, correspondant à une amplitude positive de IF°ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à D-2 et les mitochondries de la cellule, correspondant à une amplitude négative de IF°ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à Padron. 30 La figure 9 illustre un système mettant en oeuvre un procédé selon un mode de réalisation de l'invention. Ce système, illustré à titre d'exemple non limitatif, comprend deux sources de lumière SLM1 et SLM2 constituées chacune d'une diode électroluminescente. La source de lumière SLM1 est alimentée par une source d'alimentation AM1 et la source de lumière SLM2 est alimentée par une source 3055704 32 d'alimentation AM2. La modulation de chacune des sources lumineuses SLM1 et SLM2 est obtenue par modulation de la puissance électrique d'alimentation respective au moyen d'un générateur de fonctions GF présentant deux sorties indépendantes. L'émission des diodes électroluminescentes étant à bande large, les 5 faisceaux FEX1 et FEX2, émis par SLM1 et SLM2 respectivement, sont collimatés par des lentilles, puis filtrés par deux filtres optiques avant d'être dirigés sur un échantillon, constitué par un dispositif microfluidique DMF ; dans un souci de simplicité, les filtres optiques ne sont pas représentés sur la figure. L'échantillon éclairé est observé, par sa face arrière, par un objectif OBJ qui collecte le 10 rayonnement en fluorescence et le focalise en un faisceau FLU. Ce dernier est filtré (filtre F2) et dirigé, par un miroir M et une lentille LF, sur le capteur d'une caméra CAM. Un ordinateur comprend un processeur PR pilotant la caméra CAM de manière à détecter en quadrature de phase telle que décrit précédemment. Avantageusement, la fréquence d'acquisition de la caméra est commensurable de la 15 fréquence de modulation des sources FEX1, FEX2. Pour réaliser une détection et/ou un titrage simples, sans imagerie, la caméra CAM peut être remplacée par un capteur ponctuel de lumière. 20 REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'au moins une espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P), comportant les étapes suivantes : (a) éclairer un échantillon contenant ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable avec une première lumière d'éclairage (FEX1), de longueur d'onde 2.1, et modulée périodiquement à une pulsation w et avec une seconde lumière d'éclairage (FEX2) de longueur d'onde Â.2 différente de zig, modulée périodiquement à ladite pulsation co ; (b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; et (c) extraire l'amplitude (IFout) de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence (FLU) présentant la même périodicité que ladite première lumière d'éclairage (FEX1) modulée périodiquement et en quadrature 20 de phase par rapport à elle ; - ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2) étant modulée en antiphase par rapport à ladite première lumière d'éclairage (FEX1) et 25 - l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage (FEX1), l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2), et leur pulsation w étant choisies de manière à s'approcher d'un maximum de ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence (FLU). 30 2. Procédé selon la revendication précédente dans lequel au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) présente un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits états étant fluorescent, ladite ou chaque dite espèce fluorescente réversiblement 35 photocommutable (P) étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit 3055704 34 deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retourner audit premier état par une seconde réaction photo-induite, et dans lequel ladite première lumière d'éclairage présente une intensité moyenne /1" et est modulée à une pulsation co et ladite seconde lumière d'éclairage présente une intensité 5 moyenne e avec: (0.12,1 + O21,1) 110 = (0-12,2 + (721,2) g et w = 2(0'12,1 +0.21,1)Il 10 où 512,14° et 0-21,111 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage (FEX1) ; où et - - - - 12,21 et 021,212 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2). 15 3. Procédé selon l'une des revendications précédente dans lequel l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage (FEX1), l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2), et leur pulsation (1) sont également choisies de manière à assurer un contraste minimum entre ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence (FLU) et l'amplitude d'une composante d'intensité de fluorescence, présentant la même périodicité, issue d'une espèce interférente. 4. Procédé de détection d'au moins deux espèces fluorescentes 25 réversiblement photocommutables (P) présentant des propriétés dynamiques différentes, comportant les étapes suivantes : (a) éclairer un échantillon contenant chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) avec une première lumière d'éclairage 30 (FEX1) de longueur d'onde .t1 et modulée périodiquement selon une première fonction sommant au moins deux premières composantes d'éclairage modulées par des pulsations coi, chaque dite pulsation coi de chaque dite première composante d'éclairage étant associée à une dite espèce fluorescente 3055704 35 réversiblement photocommutable (P), et étant différente de la ou des autres dites pulsations co ; et éclairer avec une seconde lumière d'éclairage (FEX2), de longueur d'onde À2 différente de 2.1, et modulée périodiquement selon une seconde fonction sommant au moins deux secondes composantes d'éclairage modulées par desdites pulsations coi, chaque dite pulsation col de chaque dite seconde composante d'éclairage étant égale à une dite pulsation coi d'une dite première composante d'éclairage ; 10 (b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; (c) extraire chaque amplitude ((Fout) de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même pulsation coi que chaque dite 15 composante d'éclairage, et en quadrature de phase par rapport à chaque dite première composante d'éclairage ; - pour chaque dite pulsation coi, chaque dite seconde composante d'éclairage modulée par ladite pulsation coi étant en antiphase par rapport à 20 chaque dite première composante d'éclairage modulée par ladite pulsation 0)1 ; - et l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage (FEX1), l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2), et lesdites pulsations étant choisies de manière à s'approcher d'un maximum de chaque 25 dite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. 5. Procédé selon la revendication précédente dans lequel chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) présente un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits états étant fluorescent, 30 chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retourner audit premier état par une 3055704 36 seconde réaction photo-induite, et dans lequel ladite première lumière d'éclairage (FEX1) présente une intensité moyenne I° et est modulée périodiquement selon une dite première fonction, et ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2) présente une intensité moyenne /2 avec pour chaque dite 5 espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) : 0-12,1 + 0-21,1) = (u12,2 ± 21,2) où 612,1/1° et 621,111° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage (FEX1) de ladite espèce ; et où 612,212 et 621,212 sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2) de ladite espèce. 6. Procédé selon la revendication précédente dans lequel, pour chaque dite 15 pulsation coi correspondant à une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) : = 2(0-12,1 + 0-21,1W où 612,1/1° et 621,111° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière 20 d'éclairage (FEX1) de ladite espèce. 7. Procédé selon la revendication 5 dans lequel le rapport entre au moins deux dites pulsations coi est strictement supérieur à 10. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel, lors de ladite étape a), ledit échantillon est éclairé par au moins une lumière d'éclairage sensiblement monochromatique. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel lesdites étapes b) et c) sont mises en oeuvre par détection synchrone dudit rayonnement de fluorescence. 305 5 704 37 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes comportant également l'étape suivante : d) déterminer la concentration de ladite ou d'au moins une dite espèce 5 fluorescente réversiblement photocommutable (P) à partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors d'une dite étape c). 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable est 10 choisie parmi : - une protéine fluorescente photochrome ; et - un complexe d'une biomolécule avec une sonde fluorogène. 15 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes dont l'échantillon comporte de la matière biologique. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel une dite lumière d'éclairage (FEX) comprend une partie de la lumière du jour et dans 20 lequel ladite partie de la lumière du jour participe à l'intensité lumineuse reçue par ladite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) en restant inférieure ou égale aux intensités moyennes desdites lumières d'éclairage (FEX1,FEX2). 25 14. Procédé d'imagerie à fluorescence mettant en oeuvre un procédé de détection selon l'une des revendications précédentes. 15. Procédé selon la revendication précédente dans lequel ledit échantillon peut comprendre un organisme vivant, et dans lequel au moins un élément 30 choisi parmi la présence et la concentration d'une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable (P) est mesuré à partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors de ladite étape c) sans effectuer de prélèvement sur ledit organisme vivant.