FR 3053700 A1 20180112 FR 1656416 A 20160705 1 KIT DE DETECTION D'UN BIOMARQUEUR PROTEIQUE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET AMPLIFICATION DU SIGNAL Domaine de l'invention La présente invention se rapporte au domaine des kits de diagnostic in vitro pour la détection de biomarqueurs de pathologies dans un échantillon biologique. Plus spécifiquement, la présente invention est du domaine des techniques de détection de protéines, y compris en faible concentration, de la quantification de protéines dans un échantillon biologique et d'amplification du signal détecté. Contexte de l'invention D'une façon générale, plus une pathologie est détectée précocement chez un patient, plus les probabilités de guérison augmentent puisque la prise en charge sera meilleure et plus efficace. Des pathologies comme le cancer ou encore les maladies auto-immunes nécessitent un diagnostic rapide afin d'envisager un traitement de fond. En général, un examen physique permet au praticien de suspecter un cancer qui peut ensuite être confirmé par imagerie puis diagnostiqué par biopsie suite à l'étude de gènes, de protéines et autres facteurs spécifiques. Plus globalement, depuis quelques années, les diagnostics précoces se sont développés afin de prendre en charge les patients le plus tôt possible et ainsi augmenter les chances de guérison. L'établissement d'un diagnostic repose notamment sur des techniques de biologie moléculaire reposant soit sur l'interaction anticorps/antigène telles que la méthode ELISA (Enzyme-linked lm munosorbent Assay), le western blot ou l'immunohistochimie, soit sur l'étude génétique par des techniques de PCR (Polymérase Chain Reaction), la PCR quantitative, les techniques de séquençage ou la cytogénétique (caryotype, hybridation in situ). 3053700 2 Parmi ces méthodes utilisées actuellement, le caryotypage, les techniques d'hybridation in situ, la PCR, le séquençage permettent dans certains cas de reconnaitre la pathologie dans le cas d'anomalie chromosomique caractéristique, mais ne mettent cependant pas en évidence les anomalies génétiques additionnelles 5 et les modifications post-traductionnelles des protéines. La PCR et le séquençage bien que très sensibles de par l'amplification du signal sont limités à l'analyse des gènes. Ceci limite leur utilisation en diagnostic car en effet, il n'y a pas de corrélation absolue entre les niveaux d'expression d'ARNm et l'expression de la protéine correspondante (Gygi et al., 1999). De plus, il est impossible de déduire la situation 10 fonctionnelle d'une protéine pure à partir de son niveau d'expression. Par conséquent, des technologies qui faciliteront l'analyse directe des protéines sont nécessaires. Etat de la technique Il existe de l'état de la technique des méthodes d'analyse des protéines : 15 Parmi ces méthodes, les dosages immunologiques sont encore la plateforme préférée pour la plupart des études sur les protéines, en particulier les diagnostics cliniques et le développement de médicaments, où la spécificité est critique. La spécificité du Western blot peut être très élevée. Cependant, les Western blots sont limités à la détection de la protéine dénaturée, car toutes les protéines dans 20 l'échantillon sont dénaturées avant l'étape d'électrophorèse consistant à séparer les protéines selon leur poids moléculaire. De plus, l'étape de transfert des protéines sur membrane est techniquement complexe, nécessitant de nombreuses étapes et un volume relativement important d'échantillon, et ne sont donc pas facilement automatisées. Cette étape de transfert est relativement longue et coûteuse. Le 25 Western Blot est une bonne technique qualitative mais est très limitée d'un point de vue quantitatif. Seule une comparaison par rapport à un contrôle interne peut être réalisée mais celle-ci est purement indicative d'une tendance. Des tests ELISA sont techniquement moins difficiles que des transferts de Western blot, et peuvent être adaptés à un débit plus élevé avec les systèmes de traitement 3053 700 3 de plaques et de détection automatisée, mais comme le Western blot, ils offrent seulement des résultats d'une seule protéine par essai. Contrairement au Western blot, un ELISA peut être utilisé pour détecter les protéines naturelles intactes. Les tests ELISA peuvent être quantitatifs lorsqu'ils sont exécutés avec une courbe 5 standard d'une protéine connue, et les anticorps bien caractérisés. Cependant, ces tests ne sont pas très précis et nécessitent également de nombreuses étapes et un volume relativement important d'échantillon. La limite de détection d'une protéine dans un échantillon biologique par ELISA est de l'ordre du pg/ml à plusieurs ng/ml. Les puces à protéines offrent des avantages de débit plus élevé, l'analyse multiplex, 10 une faible consommation de réactifs, de sensibilité et une exigence en quantité d'échantillon inférieure par rapport aux tests ELISA ou Western Blot. Cependant, l'utilisation des puces à protéine n'est généralement pas réalisable en routine par un praticien hospitalier. Les tests en puce à protéines sont plus adaptés et utilisés pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments où il est nécessaire de 15 regarder plusieurs protéines (>100), ou un «protéome» dans un échantillon. Pour le diagnostic clinique, seulement quelques protéines avec des contrôles sont suffisantes. Cette approche est limitée par l'absence de réactifs de capture très spécifiques. En outre, le dosage actuel n'est pas suffisamment sensible pour mesurer les protéines de faible abondance. Tant que seul un nombre limité de 20 protéine doit être analysé, les puces à protéines auront des difficultés à devenir une alternative compétitive face aux méthodes classiques. (O. Poetz et al. / Mechanisms of Ageing and Development 126 (2005) 161170). Quant aux méthodes de spectrométrie de masse telles que la technologie SELDI, elles conviennent pour la détection rapide de différences dans la teneur totale en 25 protéines d'échantillons différents. Cependant, elles présentent des limitations en ce qui concerne les protéines de haut poids moléculaire ou des protéines de membrane. De plus, la sensibilité des expériences de SELDI est beaucoup plus faible par rapport aux dosages immunologiques en sandwich (Bandera et al, 2003 ; Uchida et al, 2002 ; Zhang et al, 2002). Récemment, l'hypothèse d'exploiter les systèmes d'auto-induction des bactéries à des fins de détection de protéines a été émise par Norris V et al (Norris V et al, The 3053700 4 mimic chain reaction, J Mol Microbiol Biotechnol, 2012). Ces systèmes d'auto-induction sont aujourd'hui utilisés pour produire des protéines recombinantes en quantité mais pas pour du diagnostic. Il est donc nécessaire de proposer de nouvelles solutions pour détecter de façon 5 fiable, rapide, sure, hautement spécifique et efficace une protéine, même en très faible quantité, dans un échantillon biologique et amplifier le signal détecté. Solution apportée par l'invention La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur : - par un procédé de détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique 10 par le biais de la mise en contact de l'échantillon biologique avec une bactérie lactique modifiée exprimant un système de détection, optionnellement un système d'amplification du signal dudit biomarqueur, ledit biomarqueur étant une protéine pouvant être en très faible concentration, - par un plasmide pour intégrer au moins un gène d'intérêt dans une bactérie 15 pour l'expression du système de détection et d'amplification dudit biomarqueur, - et par une bactérie lactique modifiée exprimant le système de détection, et optionnellement le système d'amplification du signal dudit biomarqueur. Ainsi selon un premier aspect, l'invention porte sur un procédé de détection d'un 20 biomarqueur dans un échantillon biologique comprenant les étapes de : - mise en contact de l'échantillon biologique avec une bactérie lactique modifiée, ladite bactérie lactique ayant au moins un récepteur histidine-kinase et au moins une séquence codant pour un gène rapporteur, ledit récepteur histidine-kinase étant chimérique et ledit récepteur comportant en outre une portion de liaison d'un 25 biomarqueur sur ledit récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et la partie cytoplasmique dudit récepteur active une cascade de signalisation spécifique dudit récepteur activant l'expression du gène rapporteur - maintien en culture de ladite bactérie en présence de l'échantillon biologique - mesure de l'expression du gène rapporteur. 3053700 5 L'on comprend que la bactérie lactique modifiée résulte de la modification du contenu en acides nucléiques de la bactérie lactique par ajout d'un fragment d'ADN, par exemple au moins un plasmide. L'on comprend par « chimérique » que le récepteur comporte une portion 5 représentative du récepteur histidine-kinase pouvant naturellement être retrouvée chez l'organisme dont il est issu, et une portion de liaison à un biomarqueur que le récepteur originel ne possède pas. Le biomarqueur ne peut normalement pas se lier au récepteur histidine-kinase originel. Dans un mode préféré de réalisation, le récepteur chimérique est codée par une séquence comportant une séquence codant 10 pour tout ou partie du récepteur histidine-kinase originel et une portion de liaison spécifique d'un biomarqueur. Le récepteur histidine-kinase originel peut être d'origine bactérienne et la portion de liaison du biomarqueur d'origine mammifère, par exemple humaine. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comporte en outre une 15 étape préalable de mesure de l'expression du gène rapporteur en fonction de quantités croissantes et connues de biomarqueur. Cette étape permet d'établir une gamme étalon à partir de concentration connue en biomarqueur pour la détermination de la concentration inconnue en biomarqueur dans l'échantillon biologique à tester. 20 Le biomarqueur est une protéine présente ou non dans l'échantillon biologique selon l'état de l'organisme dont provient l'échantillon. Par exemple, pour le diagnostic d'une pathologie chez l'Homme, la présence de la protéine peut révéler que le patient est atteint d'une pathologie précise. Le procédé selon l'invention permet de détecter une protéine, même en faible concentration, c'est-à-dire inférieure à 1 ng/mL, de 25 préférence inférieure à 1 pg/mL, encore plus préférentiellement inférieure à 0,1 pg/mL, dans l'échantillon biologique et d'amplifier le signal de détection. Le biomarqueur peut de façon non limitative être une protéine impliquée dans une pathologie humaine telle qu'un cancer ou une maladie auto-immune, par exemple la PSA pour le cancer de la prostate chez l'Homme, l'IL6, l'IL1 beta, l'ILI 0, l'IL12, l'IL15, 30 l'IL17, l'IL38 ou le TNFa pour les maladies inflammatoires et auto-immunes chez l'Homme. Tous types de protéines peuvent être détectés par l'invention. Le tableau 1 3053 700 6 cite un certain nombre de protéines, sans être limitatif, pouvant être détectées selon l'invention ainsi que la classe de pathologie dans laquelle elles sont impliquées. De même, des protéines de la matrice extracellulaire telle que le collagène pourraient être détectées par la présente invention. Protéine Type de pathologie HER2 Cancer mucin 1 (MUC1) Cancer EGP 40 (EpCAM) : marqueur de Cellule Tumorale Circulante (CTC) Carcinome mammaglobine : marqueur de CTC Cancer Du Sein TP53 muté Cancer TTF-1 : marqueur de CTC Cancer Du Poumon EML4-ALK fusion protein Cancer Kras muté (G12C) Cancer EGFR muté (L858R) Cancer EGFR muté (T790M) Cancer tumor-associated antigen L6 Cancer cytokeratine 8, 18, et/ou 19: marqueur de CTC Cancer guanylyl cyclase C (GCC) : marqueur de CTC Cancer Colorectal (p210BCR-ABL) Leucémie myéloïde chronique p185BCR-ABL) Leucémie myéloïde chronique p190BCR-ABL Leucémie aiguë PSCA Cancer De La Prostate PSMA : marqueur de CTC Cancer De La Prostate HE4 (WFDC2) Cancer uMAGE-A Cancer De La Peau IgA-EMA Maladie Coeliaque IgA-tTG/IgG-tTG Maladie Coeliaque anti-peptides cycliques citrullinés (PCC) Polyarthrite Rhumatoïde anticorps anti-kératine(AKA) Polyarthrite Rhumatoïde IgG (MYC)/IgM (MYC) Mycoplasmose due à la bactérie M. pneumoniae 5 Tableau 1. Protéines pouvant être détectées, non limitativement, selon le système selon l'invention 3053700 7 Des applications vétérinaires de la présente invention sont réalisables. Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention comporte en outre une étape d'amplification de la détection du biomarqueur par activation de la transcription dans la bactérie lactique modifiée d'au moins une 5 séquence codant pour une molécule amplificatrice. Ainsi le procédé selon l'invention comprend les étapes de : - mise en contact de l'échantillon biologique avec une bactérie lactique modifiée, ladite bactérie lactique ayant au moins un récepteur histidine-kinase et au moins une séquence codant pour un gène rapporteur, au moins une séquence 10 codant pour une molécule amplificatrice, ledit récepteur histidine-kinase étant chimérique et ledit récepteur comportant en outre une portion de liaison d'un biomarqueur sur ledit récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et la partie cytoplasmique dudit récepteur active une cascade de signalisation spécifique dudit récepteur activant l'expression du gène rapporteur 15 - maintien en culture de ladite bactérie en présence de l'échantillon biologique - mesure de l'expression du gène rapporteur. Selon un second aspect, l'invention porte sur un plasmide pour transfert dans une bactérie comportant : - Au moins une séquence codant pour un récepteur histidine-kinase, 20 - Au moins une séquence codant pour un gène rapporteur, caractérisé en ce que ladite séquence codant pour un récepteur histidine-kinase code pour un récepteur histidine-kinase chimérique comportant une portion de liaison d'un biomarqueur sur ledit récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et la partie cytoplasmique dudit récepteur active une 25 cascade de signalisation spécifique dudit récepteur activant l'expression du gène rapporteur. Dans une variante de réalisation, le récepteur est un récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant au moins une des régions variables d'un 30 anticorps monoclonal ayant une forte affinité pour le biomarqueur 3053700 8 Dans une autre variante de réalisation, le récepteur est un récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant un domaine extracellulaire de reconnaissance du ligand d'un récepteur dont le ligand est le biomarqueur. 5 Dans encore une autre variante de réalisation, le récepteur est un récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant le ligand du biomarqueur, ledit biomarqueur étant, dans ce cas, un récepteur spécifique dudit ligand. Dans un mode de réalisation, le plasmide selon l'invention comporte en outre au 10 moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice, l'expression de ladite molécule amplificatrice étant activée par la cascade de signalisation activée par la fixation du biomarqueur sur le récepteur chimérique. Dans ce mode de réalisation, le plasmide pour transfert dans une bactérie comporte : - Au moins une séquence codant pour un récepteur histidine-kinase, 15 - Au moins une séquence codant pour un gène rapporteur, - Au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice, caractérisé en ce que ladite séquence codant pour un récepteur histidine-kinase code pour un récepteur histidine-kinase chimérique comportant une portion de liaison d'un biomarqueur sur ledit récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand 20 naturel et/ou le biomarqueur, et la partie cytoplasmique dudit récepteur active une cascade de signalisation spécifique dudit récepteur activant l'expression du gène rapporteur. Avantageusement, la séquence codant pour une molécule amplificatrice est une séquence codant pour le ligand naturel du récepteur NisK et/ou une séquence 25 codant pour un peptide mimétique du biomarqueur synthétisés par la bactérie lactique modifiée en présence du biomarqueur. Le système NICE (Nisin Controlled gene expression system) est le système d'expression de la nisine dans les bactéries lactiques. Ce système présente la caractéristique de s'autoréguler. La nisine active le récepteur membranaire histidine 30 kinase NisK. Une fois activé, le récepteur NisK phosphoryle la protéine de régulation intracellulaire NisR, cette dernière activant le promoteur PnisA et/ou PnisF et par 3053700 9 conséquent, les gènes sous le contrôle de ce promoteur. Ce système a largement été exploité notamment dans l'industrie agroalimentaire pour produire de grandes quantités d'une protéine d'intérêt. L'on comprend que dans un mode de réalisation, le plasmide selon l'invention 5 comprend la séquence codant la protéine de régulation intracellulaire NisR, pour le récepteur chimérique, la séquence codant pour le gène rapporteur sous contrôleur d'un promoteur PnisA et/ou PnisF et la séquence codant pour une molécule amplificatrice sous le contrôle d'un promoteur PnisA et/ou PnisF. La séquence codant pour la zone de liaison spécifique au biomarqueur est insérée 10 au niveau du BAES (sensory histidine kinase in two-component regulatory system) en amont la séquence de l'histidine kinase A (zone de dimérisation / phosphoaccepteur) selon le schéma de la figure 1. Avantageusement, le biomarqueur est une protéine. Avantageusement, le plasmide est codé par la séquence SEQ ID 1 et par un insert 15 d'une séquence choisie parmi les SEQ ID 2 à 9. L'on comprend que le plasmide est constitué d'un plasmide de base pGNSK de séquence SEQ ID 1 dans lequel peuvent être insérées l'une au moins des séquences SEQ ID 2 à 9 codant pour au moins le récepteur chimérique selon l'invention sur lequel le biomarqueur d'intérêt peut se lier et optionnellement au 20 moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice et au moins une séquence codant pour un gène rapporteur. Le plasmide selon l'invention est destiné à être inséré dans une bactérie, de préférence une bactérie lactique, plus préférentiellement une bactérie de type Lactococcus lactis, pour que la bactérie exprime le récepteur chimérique, ainsi que le 25 gène rapporteur et dans un mode de réalisation que la bactérie exprime en outre la molécule amplificatrice sous contrôle du promoteur sensible à la cascade de signalisation du récepteur chimérique. Le plasmide selon l'invention est destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique. 3053700 10 Selon un autre aspect, l'invention porte sur une bactérie lactique modifiée pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comportant : - Au moins un récepteur histidine-kinase - Au moins une séquence codant pour un gène rapporteur 5 caractérisé en ce que ledit récepteur histidine-kinase est chimérique et ledit récepteur comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur sur le récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et en ce que la partie cytoplasmique dudit récepteur active une cascade de signalisation activant l'expression du gène rapporteur. 10 Dans un premier mode de réalisation, le récepteur histidine-kinase chimérique est un récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant au moins une des régions variables d'un anticorps monoclonal ayant une forte affinité pour le biomarqueur. 15 Dans un second mode de réalisation, le récepteur histidine-kinase chimérique est le récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant une le domaine extracellulaire de reconnaissance du ligand d'un récepteur dont le ligand est le biomarqueur. 20 Dans encore une autre variante de réalisation, le récepteur histidine-kinase chimérique est un récepteur NisK dont au moins une portion du domaine membranaire comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant le ligand du biomarqueur, ledit biomarqueur étant, dans ce cas, un récepteur spécifique dudit ligand. 25 Avantageusement, le gène rapporteur est placé devant un promoteur activable par NisR. L'on comprend que le gène rapporteur est choisi parmi la GFP, GusA, luciférase, lacZ, CobA ou tout autre gène rapporteur connu de l'Homme du métier et que ce 3053700 11 dernier est placé devant un promoteur activable par NisR, NisR étant activé par le récepteur NisK-c après fixation du biomarqueur sur le NisK-c. Le gène rapporteur selon l'invention est préférentiellement sous le contrôle d'un promoteur PnisA ou PnisF. Lorsque le récepteur chimérique selon l'invention est 5 activé par le biomarqueur, NisR est phosphorylé et NisR phosphorylé va activer la transcription du gène rapporteur sous le contrôle de PnisA ou PnisF. Préférentiellement, le gène rapporteur est choisi parmi les gènes rapporteurs luminescents. Les gènes rapporteurs luminescents pour la mise en oeuvre de la présente invention sont la luciférase. 10 Dans un mode de réalisation, la bactérie lactique modifiée comporte en outre au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice, l'expression de ladite molécule amplificatrice étant activée par la fixation du biomarqueur sur le récepteur chimérique. La séquence codant pour une molécule amplificatrice selon l'invention est préférentiellement sous le contrôle d'un promoteur PnisA ou PnisF. Dans ce 15 mode de réalisation, la bactérie lactique modifiée pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comporte : - Au moins un récepteur histidine-kinase - Au moins une séquence codant pour un gène rapporteur - Au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice 20 caractérisé en ce que ledit récepteur histidine-kinase est chimérique et ledit récepteur comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur sur le récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et en ce que la partie cytoplasmique dudit récepteur active une cascade de signalisation activant l'expression du gène rapporteur. 25 Avantageusement, la molécule amplificatrice est le ligand natif du récepteur histidine- kinase et/ou le biomarqueur et/ou une séquence du biomarqueur reconnaissable par le récepteur histidine-kinase. Le récepteur histidine-kinase pouvant reconnaître un séquence du biomarqueur, le biomarqueur et/ou le ligand natif est le récepteur Nisk et/ou le récepteur chimérique NisK-c. 3053700 12 Avantageusement, la bactérie lactique modifiée est une bactérie Gram+ choisie parmi les genres Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Bifidobacterium, de préférence Lactococcus. De façon encore plus préférée, la bactérie lactique est une 5 Lactococcus lactis. Les bactéries lactiques dont Lactococcus lactis sont des bactéries non invasives et non pathogène utilisée largement dans la fabrication de produits laitiers, notamment le fromage. Lactococcus lactis est une bactérie bien caractérisée, au même titre que Escherichia cou ou Bacillus subtilis. 10 Dans une autre variante, la bactérie modifiée est une bactérie Gram+ telle que Bacillus sp. Ainsi l'on comprend que la bactérie lactique modifiée selon l'invention comporte au moins un plasmide selon l'invention tel que décrit précédemment. La bactérie peut comprendre une des combinaisons suivantes : 15 - Au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du gène rapporteur - Au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour 20 l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du gène rapporteur, au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression de la molécule amplificatrice - Au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour 25 l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, la bactérie comportant déjà un gène rapporteur contrôlé par la voie de signalisation activée par le récepteur chimérique - Au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, la bactérie 30 comportant déjà un gène rapporteur contrôlé par la voie de signalisation 3053700 13 activée par le récepteur chimérique ainsi qu'une molécule amplificatrice dont la synthèse est activée par la détection du biomarqueur - Au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, au moins une copie 5 d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression de la molécule amplificatrice, la bactérie comportant déjà un gène rapporteur contrôlé par la voie de signalisation activée par le récepteur chimérique - au moins une copie d'un plasmide comportant le matériel génétique pour l'expression du récepteur chimérique selon l'invention, pour l'expression du 10 gène rapporteur, pour l'expression de la molécule amplificatrice. L'on comprend que dans un mode de réalisation, la bactérie lactique exprime le système de détection et d'amplification du biomarqueur par intégration d'au moins une copie d'un plasmide comprenant la séquence codant pour la protéine de régulation intracellulaire NisR, le récepteur chimérique, la séquence codant pour le 15 gène rapporteur sous contrôleur d'un promoteur PnisA et/ou PnisF et la séquence codant pour une molécule amplificatrice sous le contrôle d'un promoteur PnisA et/ou PnisF. Selon une variante de réalisation, la bactérie lactique exprime le système de détection et d'amplification du biomarqueur par intégration d'au moins une copie d'un 20 plasmide contenant une séquence codant pour le gène rapporteur et d'au moins une copie d'un plasmide contenant une séquence codant pour le récepteur chimérique et une séquence codant pour la molécule amplificatrice. Le plasmide codant pour le gène rapporteur peut être co-transfecté avec le plasmide codant pour le récepteur chimérique et la molécule amplificatrice ou être présent constitutivement dans la 25 souche bactérienne utilisée ou dans le même plasmide que le gène codant pour le récepteur chimérique et la molécule amplificatrice. Dans cette variante de réalisation, le gène rapporteur est sous contrôle d'un promoteur sensible à la cascade de signalisation du récepteur chimérique, soit sous le contrôle d'un promoteur PnisA et/ou PnisF. 30 La bactérie lactique modifiée permet la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. 3053700 14 Selon un troisième aspect, la présente invention porte sur des kits de détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique. Selon une première variante, le kit pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comporte 5 - au moins une bactérie lactique modifiée conformément à l'invention - le milieu de culture de ladite bactérie - un standard. Les bactéries présentes dans le kit peuvent être sous forme de culot, en suspension dans un milieu de culture, prise dans un gel de culture, congelées ou lyophilisées. 10 Préférentiellement les bactéries sont lyophilisées et à remettre en culture après réhydratation. L'on comprend que le standard est un le biomarqueur ou la molécule amplificatrice. Selon une deuxième variante, le kit pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comporte : 15 - au moins un plasmide selon l'invention - un standard. L'on comprend que les kits de l'invention peuvent comporter des réactifs de transfection, des bactéries lactiques, du milieu de culture des bactéries lactiques, des plaques de culture de type 96 puits, des systèmes micro fluidique. 20 La présente invention présente les avantages de diminuer le nombre d'étapes à réaliser par l'expérimentateur, de réduire de façon conséquente le temps d'obtention des résultats, et d'avoir une limite de détection plus importante, notamment grâce à son système d'amplification du signal par réaction en chaîne. De plus, la présente invention est transposable à la détection de tout type de protéines, y compris 25 lorsqu'elles sont présentes en de très faibles quantités dans un échantillon biologique. De part l'amplification du signal, une quantité même infime de protéine peut être détectable par amplification du signal. La technologie de la présente invention présente également l'avantage d'être abordable et potentiellement plus 3053700 15 rentable que les techniques de l'état de l'art. De par la possibilité d'avoir des récepteurs à la place d'un anticorps, ce système offre la possibilité d'analyser des protéines pour lesquelles des anticorps n'existent pas actuellement. La présente invention peut être utilisée en monoplex, pour détecter une seule 5 protéine, ou en multiplex, pour détecter plusieurs protéines de façon simultanée. Les applications de la présente invention peuvent être : - des applications diagnostiques à destination de l'Homme ou de l'animal, dont le diagnostic précoce, - l'orientation thérapeutique et la stratification de pathologies pour une 10 meilleure orientation thérapeutique - le suivi de pathologies par quantification du biomarqueur à différents temps par l'objet de l'invention - l'évaluation de la réponse d'un patient à une solution thérapeutique. Les pathologies concernées par la présente invention peuvent notamment être des 15 pathologies oncologiques, inflammatoire ou auto-immunes. Description La présente invention sera mieux comprise à la lumière d'exemples non limitatifs de réalisation. Brève description des figures : 20 La figure 1 a représente un schéma de conception de NisK-c par modification génétique du réception NisK natif. La figure 1 b représente un schéma du plasmide pGNSK. La figure le représente un exemple de schéma d'insertion du récepteur NisK-c dans le plasmide pGNSK. 3053700 16 La figure 1d représente un exemple de schéma d'insertion de la molécule amplificatrice puis du Nisk-c dans le plasmide pGNSK. Dans les figures 1c et figure 1d : le nombre de paires de base correspond à celui du système spécifique à la PSA selon l'invention. 5 La figure 2 représente la vérification de l'authenticité du plasmide par digestion enzymatique BamHI chez les colonies transformées par au moins un plasmide selon l'invention. La figure 3 représente la mesure de fluorescence en absence et en présence de PSA chez des bactéries intégrant le plasmide selon l'invention spécifique de la 10 détection de la PSA. La figure 4 représente la mesure de fluorescence en absence et avec des doses croissantes d'IL6 chez des bactéries intégrant le plasmide selon l'invention spécifique de la détection de l'IL6. La figure 5 représente un test de détermination de la limite de détection de l'IL6 par 15 mesure de fluorescence de bactéries intégrant le plasmide selon l'invention spécifique de la détection de l'IL6 en absence et en présence de doses croissantes d'IL6. Définitions : BAES : Signal de transduction histidine kinase du récepteur NisK 20 Biomarqueur : Le biomarqueur est une protéine présente ou non dans l'échantillon biologique selon l'état de l'organisme dont provient l'échantillon. Le biomarqueur est une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou pathologique. Ery : résistance à l'Erythromycine 3053700 17 HATPase_c : histidine ATPases du système NICE. Le domaine intracellulaire (HATPase_c ) du NisK ou Nisk-c phosphoryle la protéine de régulation intracellulaire NisR qui active alors le promoteur PnisA et/ou le promoteur PnisF. HisKA : histidine kinase A (dimérisation / phosphoaccepteur) du récepteur NisK 5 IL6 : Interleukine 6: cytokine impliquée dans la phase aiguë de l'inflammation et régule l'inflammation aiguë et chronique. NisK : Nisin biosynthesis sensor protein : récepteur histidine-kinase membranaire de la nisine. Le domaine intracellulaire (HATPase_c) du NisK phosphoryle la protéine de régulation intracellulaire NisR qui active alors le promoteur PnisA et/ou le promoteur 10 PnisF. NisK-c : récepteur histidine-kinase chimérique selon l'invention NisR : protéine de régulation intracellulaire du système, phosphorylée par NisK ou NisK-c. NisR une fois phosphorylée active le promoteur PnisA et le promoteur PnisF. pGNSK : plasmide de base selon l'invention dans lequel un insert contenant au 15 minimum un récepteur NisK-c selon l'invention peut être inséré PnisA et PnisF : promoteurs activés par NisR phosphorylé par NisK ou Nisk-c et déclenchant la synthèse des gènes en aval PSA : prostate-spécifique antigen : l'antigène prostatique spécifique est une protéine fabriquée exclusivement par la prostate servant à liquéfier le sperme. Cette protéine 20 est fortement exprimée dans le cas d'hypertrophie bénigne ou de cancer de la prostate chez l'Homme. repD: gène de réplication D, repE : gène de réplication E, repF: gène de réplication F, repG : gène de réplication G Récepteur chimérique : récepteur selon l'invention étant un récepteur histidine-25 kinase ne reconnaissant pas naturellement le biomarqueur et comportant un domaine de reconnaissance du biomarqueur. Le récepteur chimérique est apte en 3053700 18 outre à activer une voie de signalisation déclenchant la synthèse du gène rapporteur et optionnellement d'une molécule amplificatrice. TNFa : facteur de nécrose tumorale : cytokine impliquée dans l'inflammation systémique et dans la phase aiguë de l'inflammation. Une dérégulation de cette 5 cytokine est observée dans de nombreuses maladies auto-immunes. Méthode pour l'obtention des gènes synthétiques codant pour les récepteurs chimériques NisK-c : Différents récepteurs chimériques NisK-c selon l'invention ont été construits (GeneArt Gene Synthesis , Thermofisher). Ces récepteurs sont codés par des 10 gènes synthétiques. Ils comportent : - le domaine cytoplasmique des récepteurs NisK natifs responsable de l'initiation de la transduction du signal qui conduit à l'activation du NisR - un domaine de reconnaissance du biomarqueur d'intérêt pouvant correspondre : 15 o soit aux régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère d'un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement le biomarqueur d'intérêt o soit la partie extracellulaire d'un récepteur transmembranaire reconnaissant de manière spécifique le biomarqueur 20 o soit le domaine de liaison du biomarqueur sur des molécules de signalisation de type cytokines ou hormones o soit le ligand d'un récepteur membranaire (lorsque le récepteur membranaire est le biomarqueur). - le promoteur PnisF 25 - les sites de restriction Ndel, Ncol Le site Ncol à l'extrémité de PnisF permet ultérieurement la fusion transcriptionnelle avec un gène qui peut être un gène rapporteur . Ces exemples non limitatifs de gènes synthétiques sont récapitulés dans le tableau 1 et sont codés par les séquences SEQ ID 2 à 7. 3053700 19 Nom du gène synthétique Biomarqueur à détecter Description N° de séquences Nap7 PSA Nisk-anti-protéine 7 (NisK-c modèle 7) spécifique à la PSA, PnisF avec sites de restriction Ndel, Ncol SEQ ID 2 NapT7 TNFa Nisk-anti-protéine 7 (NisK-c modèle 7) spécifique du TNFa, PnisF avec site SEQ ID 3 de restriction Ndel, Ncol Nap6 PSA Nisk-anti-protéine 6 (NisK-c modèle 6) spécifique à la PSA, PnisF avec site de restriction Ndel, Ncol SEQ ID 4 NapT6 TNFa Nisk-anti-protéine 6 (NisK-c modèle 6) spécifique du TNFa, PnisF avec site de restriction Ndel, Ncol SEQ ID 5 OPnapIR IL6 Nisk-anti-protéine 7 (NisK-c modèle 7) spécifique de l'IL6, PnisF avec site de restriction Ndel, Ncol SEQ ID 6 OPnapl7 IL6 Nisk-anti-protéine 7 (NisK-c modèle 7) spécifique à l'IL6, PnisF, PnisA , avec SEQ ID 7 site de restriction Ndel, Ncol, Fsel, plus la séquence codant pour l'IL6 avec la séquence signal d'Usp45 Tableau 1. Exemples de gènes synthétiques codant pour un récepteur chimérique NisK-c Les gènes synthétiques Nap7, NapT7, Nap6, NapT6 du tableau 1 combinent le domaine cytoplasmique du NisK natif avec les régions variables de la chaîne lourde 5 et de la chaîne légère d'un anticorps monoclonal spécifique du biomarqueur. Le gène synthétique OPnapIR combine le domaine cytoplasmique du NisK natif avec la partie extracellulaire d'un récepteur transmembranaire reconnaissant de manière spécifique le biomarqueur. Le gène synthétique OPnapl7 comporte en outre un amplificateur constitué par une 10 séquence codant pour l'IL6 additionnée d'une séquence pour un signal de sécrétion extracellulaire Usp45 (voir paragraphe « gènes synthétiques codant pour les amplificateurs du signal » ci-dessous). 3053700 20 Les gènes synthétiques codant pour les amplificateurs du signal : Dans ces exemples de réalisation de l'invention, le système comprend un amplificateur du signal induit par la fixation du biomarqueur sur le NisK-c capable de reconnaître spécifiquement le biomarqueur. Cet amplificateur est codé par un gène 5 synthétique comportant une séquence codant pour un signal de sécrétion extracellulaire, Usp45 dans le cas de la bactérie Lactococcus lactis. Le tableau 2 liste non limitativement les gènes synthétiques des amplificateurs. Nom du gène Description N° de synthétique séquence Amnap7 Séquence codant pour la PSA avec la séquence signal Usp45 SEQ ID 8 Am napT7 Séquence codant pour le TNFa avec la séquence signal Usp45 SEQ ID 9 OPnapl7 Nisk-anti-protéine 7 spécifique à l'IL6, PnisF, SEQ ID 7 séquence codant pour l'IL6 avec la séquence signal d'Usp45 Tableau 2. Exemples de gènes synthétiques codant pour des amplificateurs Le gène OPnapl7 combine une séquence codant pour un NisK-c spécifique de l'IL6 10 et une codant pour un amplificateur constitué de l'IL6 et de Usp45. La séquence pour ce gène synthétique est identifiée dans les tableaux 1 et 2 par le même numéro de séquence, SEQ ID 7, puisqu'il s'agit de la même séquence. Génération du plasmide comportant le gène codant pour le récepteur chimérique NisK-c et un amplificateur 15 Un plasmide pGNSK a été construit par insertion d'un fragment synthétique comprenant un gène de résistance à l'erytromicine (Em), une origine de réplication pAMb1 (rep E, rep G, rep F, rep D), un gène codant pour NisR, un promoteur PnisF, les sites de restriction Ndel et Fsel) dans le vecteur pBluescript II SK via le site de clonage Smal (Genecust ®, Luxembourg). Ce plasmide est capable de se répliquer 20 dans des bactéries gram+ et gram-. Ce plasmide pGNSK est le plasmide de base de l'invention dans lequel un insert contenant au minimum une séquence codant pour 305 3 700 21 un récepteur NisK-c selon l'invention peut être inséré. Le plasmide pGNSK a le numéro de séquence SEQ ID1. Les gènes synthétiques OPnapI7, OPnapIR, Amnap7 et AmnapT7 sont clonés dans le site Ndel- Bglll du plasmide PGNSK par ligation (GeneAre Gene Synthesis, 5 Thermofisher). Les gènes synthétiques (NAP7 NAP6, NAPT7, NAPT6) sont clonés via le site Ndel-Fsel du plasmide PGNSK ou pGNAmnaP ou pGNAmnaPT par la methode seamless clonning en utilisant le kit d'assemblage geneare Seamless plus Cloning and Assembly Kit conformément aux recommandations du commerçant (Thermofisher). Le gène rapporteur fluorescent cobA est cloné via le site Ncol-Fsel 10 du plasmide PGNAPI. Le tableau 3 récapitule les plasmides utilisés ou obtenus selon l'invention. Nom du plasmide Description pNZ8008 (Mobitec ; Mierau et Cm, origine de réplication (pSH71), PnisA, Kleerebezem, 2005) GusA pGNSK (SEQ ID 1) pBlueScript II, origine de réplication pAMb1 NisR, PnisF pGN6 pGNSK (SEQ ID 1) + Nap6 spécifique de la PSA (SEQ ID 4) pGNT6 pGNSK (SEQ ID 1) + NAPT6 spécifique à la TNFa (SEQ ID 5) pGNO6 pGN6 + gène cobA pGNAmnaP pGNSK (SEQ ID 1) + Amnap7 (SEQ ID 8) pGNAmnaPT pGNSK (SEQ ID 1) + AmnapT7 (SEQ ID 9) pGNAPT6 pGNAmnaPT + NAPT6 (SEQ ID 5) pGNAPT7 pGNAmnaPT + NAPT7 (SEQ ID 3) pGNAP6 pGNAmnaPT + NAP6 (SEQ ID 4) pGNAP7 pGNAmnaPT + NAP7 (SEQ ID 2) PGNAPI pGNSK (SEQ ID 1) + OPNapI (SEQ ID 7) PGNAP1cobA pGNSK (SEQ ID 1)+ OPNapI (SEQ ID 7) + cobA PGNAPIR pGNSK (SEQ ID 1) + OPNapIR (SEQ ID 6) Tableau 3. Plasmides utilisés et obtenus selon l'invention 3053 700 22 Propagation et vérification des plasmides Les plasmides résultants (Tableau 3) sont propagés dans E.coli (conformément aux recommandations du fabriquant (geneart® Seamless plus Cloning and Assembly Kit , Thermofisher)) : 3 pl du mélange de la réaction d'assemblage (ligation) est ajouté à 5 un flacon de bactéries E. coli chimiquement compétentes (One Shot DH1OB TM T1R SA Thermofisher). En parallèle, 3 pl de l'ADN de contrôle pGNSK est ajouté dans un flacon séparé de bactéries E. cou/ chimiquement compétentes (One ShotTM DH1OB T1R SA, Thermofisher). Le mélange de transformation est incubé sur de la glace pendant 30 minutes puis, transféré dans un bain marie à 37°C pendant exactement 10 10minutes, puis de nouveau sur la glace pendant 2 minutes. 250 pL de milieu S.O.C. est ajouté à température ambiante au mélange de transformation puis agité horizontalement (200 rpm) à 37°C pendant 1 heure. Après incubation, 5-150 pL de chaque transformation sont répartis sur une plaque sélective préchauffée (LB avec 100 pg/ml d'ampicilline). Les plaques sont incubées pendant une nuit à 37°C. Le 15 lendemain, des colonies individuelles sont prélevées. Leur ADN plasmidique est isolé purifié. Analyse des transformants Les colonies sont choisies et cultivées la nuit dans un milieu LB contenant l'antibiotique (100 pg/ml d'ampicilline). L'ADN plasmidique est isolé en utilisant 20 PureLink® HiPure plasmide Kits Miniprep (Thermofisher) et leur concentration déterminée par spectroscopie UV. Les plasmides sont par la suite analysés par analyse de restriction et les résultats sont visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose (E-Gel ® EX agarose gel 1`)/0 , InvitrogenTM) Les produits de synthèse ont été vérifiés par séquençage (Thermofisher) 25 conformément à sa charte de contrôle qualité ((GeneArt® Gene Synthesis, Thermofisher). La congruence de séquence dans les sites d'insertion a été de 100%. Intégration du plasmide dans la bactérie Les plasmides de clone positif sont électroporés dans une souche de bactérie lactique, Lactococcus lactis MG1363. Cette souche a la particularité de ne pas 3053 700 23 produire de nisine. Elle ne contient pas les gènes de régulation NisR et NisK. Cette souche MG1363 est rendues électrocompétantes dans le milieu SGM17-G (milieu M17 plus 0,5M saccarose, 2.5% glycine et 0.5% glucose) conformément aux recommandations du fournisseur (Mobitec). Les cellules électrocompétentes sont 5 décongelées sur la glace. 50 pl de cellules électrocompétentes sont transférés dans une cuvette d'électroporation pré-réfrigérée puis 1 pl du plasmide (>100ng) est ajouté aux cellules électrocompétentes. Une fois que l'ADN est ajouté aux cellules, l'électroporation est effectuée immédiatement grâce au Bio-Rad micropulser (2000V, 25 Pf, 200 0- Pulse (lecture normale est 4,5-5 ms)). 10 Immédiatement après l'électroporation, 1 ml de G/L-M17 (milieu de culture M17 (Merck, Millipore) plus glucose 0.5%) + 20 mM MgCl2 + 2 mM CaCl2 sont ajoutés dans la cuvette à la température ambiante. Puis la cuvette est maintenue pendant 5 min sur la glace puis incubée 1-2 h à 30°C. 100 pl et 900 pl des cellules électroporées sont étalées à 30°C sur du M17 + agarose (1.5%) contenant 0,5% 15 (poids / volume) de glucose et 0,5 M de saccharose (M17GS) avec les antibiotiques de sélection (5 pg/ml d'Erythromycine pour le plasmide avec le Nisk-c complété avec 10 ug/ml Chloramphénicol si un deuxième plasmide avec le gène rapporteur gusA pNZ8008 est présent). - vérification de l'efficacité de transformation des clones positifs dans Llactis 20 6 colonies ont été choisies et cultivées pendant une nuit dans 5 ml du milieu M17G (10 pg/ml d'Erythromycine pour le plasmide avec le Nisk-c complété avec 10 pg/ml Chloramphénicol si un deuxième plasmide avec le gène rapporteur gusA pNZ8008 est présent). Le lendemain, 5 ml de la culture fullgrown sont dilués dans 25 ml de milieu M17G, et incubé 3 heures à 30°C. Le tube est ensuite centrifugé 10 min à 25 6000 g. Le culot est repris dans 10 ml de la solution de suspension R3 (PureLink® HiPure plasmideKits Midiprep, Thermofisher) plus 40 mg/ml de lysozyme dans le tube de réaction. La resuspension est incubée 30 minutes à 37°C. L'ADN plasmidique est alors isolé (PureLink® HiPure plasmideKits Miniprep (Thermofisher)). 3053700 24 Les plasmides isolés sont analysés après restriction par digestion enzymatique BamHI conformément aux indications du kit (AnzaTM Restriction Enzyme Cloning System, InvitrogenTM) et révélation sur gel d'agarose. La première colonie corespond au marqueur de taille (E-Gel® 1 Kb Plus DNA Ladder, InvitrogenTM ) et chaque 5 colonne correspond à une colonie isolée. Le plasmide vide (pGNSK) a servi de témoin. La figure 2 montre que 67% des colonies après transformation avec le plasmide pGNAP6 ont donné des clones positifs, 75% des colonies après transformation avec le plasmide pGNAP7 ont donné des clones positifs. 100% des colonies après 10 transformation avec le plasmide pGNT6 et pGNO6 ont donné des clones positifs. Les souches indicatrices (clones positifs) sont ensuite cultivées pendant une nuit dans M17G (milieu M17 plus glucose 0.5%) complété avec l'antibiotique de sélection (10 pg/ml d'Erythromycine pour le plasmide avec le Nisk-c complété avec 10 pg/ml Chloramphénicol si deuxième plasmide présent (pNZ8008)). Ensuite 1 ml de glycérol 15 (60%) est ajouté à 3 ml de culture et les cellules sont stockées à -80 °C pour le stockage à long terme. Validation de l'induction spécifique du gène rapporteur par stimulation des bactéries avec le biomarqueur Cette étape a pour objectif de : 20 a) démontrer que le gène rapporteur est induit par le biomarqueur d'intérêt. Pour cela, les bactéries sont mises en contact avec le biomarqueur d'intérêt et l'induction de l'expression du gène rapporteur sous contrôle du promoteur PnisA ou PnisF qui sont normalement naturellement induit en présence de nisine est suivie. 25 b) Démontre qu'il n'y a pas d'induction lorsque le biomarqueur d'intérêt est absente du milieu de culture afin de montrer la spécificité du système. c) Démontrer que cette détection permet de quantifier le biomarqueur La protéine d'intérêt (PSA humaine (merkmillipore) ou IL6 recombinante humaine ou TNFa recombinante humaine (Thermofisher) selon la souche bactérienne) est 305 3 700 25 préparée dans 0,1% de Tween 80 dissous dans de l'eau distillée acidifiée à pH 2,5 avec HCI afin d'empêcher l'adsorption de la protéine sur les surfaces du tube de polypropylène de sorte que la concentration de la protéine d'intérêt dans le milieu de culture varie de 1 à 1000 pg /ml . 5 Validation de la capacité d'un NisK-c à reconnaître son ligand et activer NisR et en conséquence les promoteurs inductibles par ce dernier o Gène rapporteur sous le contrôle du promoteur PnisA : analyse fonctionnelle par détection de l'activité -glucuronidase Les plasmides ont été introduits dans Lactococcus lactis MG1363 par électroporation 10 comme décrite précédemment hébergeant le plasmide pNZ8008 (NIZO, Mobitec), un dérivé pNZ273 qui contient une fusion de transcription du gène rapporteur GusA codant pour la [3-glucuronidase au promoteur PnisA. Les bactéries transformées résultantes sont désignées par U-NGN . Les souches indicatrices ont étés étalées sur des plaques de milieux gélose GM17-X-Gluc (M17 [Merck, Allemagne] 15 supplémenté avec 1% de glucose et 0,5 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide (X -Gluc; ThermoFisher) plus chloramphenicol (5 pg/ml) et érythromycine (3pg /ml) en présence ou non de 1 ng/ml de la protéine d'intérêt. Les cellules sont cultivées à 30°C pendant une nuit. Les transformants qui ont montré une résistance au chloramphenicol (5 mg / ml) et à l'érythromycine (3 mg / ml) ont 20 été facilement obtenus. Les bactéries contenant le plasmide avec récepteur NisK-c chimérique selon l'invention ont donné naissance à des colonies blanches sur des plaques de GM17- X-Gluc (M17 [Merck, Allemagne] supplémenté avec 1% de glucose et 0,5 mM de 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronide (X -Gluc; ThermoFisher) lorsque la protéine 25 d'intérêt n'a pas été ajoutée aux plaques ou lors que le plasmide pGNSK ne contenait pas le gène modifié (exemple de PSA). En revanche, des colonies bleues ont été obtenues lorsque ces transformants ont été étalés sur des plaques de GM17- X Gluc dans laquelle la protéine d'intérêt était incluse (par exemple la PSA ou l'IL6). Donc, l'activité [3-glucuronidase (gène rapporteur) est restée en deçà des limites de 30 détection dans des conditions de non-induction (aucune colonie bleue formée en 3053 700 26 absence de biomarqueur spécifique) et porté à des niveaux élevés (formation de colonies bleues) par addition de la protéine d'intérêt dans le milieu de culture selon le type de récepteur Nisk-C présent dans le plasmide. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 4. Test GusA : formation de colonies bleues MG1363 hébergeant les plasmides d'intérêts en présence ou non de biomarqueur spécifique Interleukine 6 (IL6) PGNAPI + PGNAPIR + PGNSK + Pnz8008 pNZ8008 pNZ8008 ng/ml % % % 0 ng/ml 0 0 0 1 ng/ml 100 100 0 5 Tableau 4. Expression du gène rapporteur GusA chez des bactéries comportant au moins un plasmide pour la détection d'IL6 selon l'invention o Gène rapporteur associé au PnisF pour la détection de la PSA Figure 3 Les cellules utilisées dans ce test sont des bactéries L. lactis MG1363 intégrant le plasmide PGNO6 comprenant le gène NAP6 spécifique à la PSA et le gène 10 rapporteur cobA fusionné à PnisF (bactérie indicatrice U-GNO6). Les cellules alors stockées à -80°C sont diluées au 1:25 dans un milieu M17 supplémenté avec du glucose (0,5%), et complété avec de l'érythromycine (10 pg/ml). Les cellules sont cultivées à 30°C sans aération jusqu'à une absorbance optique de 0,16 à 600 nm. Les suspensions bactériennes sont ensuite réparties en portions de 50 pl dans une 15 plaque de microtitrage 96 puits. Ensuite, 150 pl de PSA (1 ng/ml) préparée dans 0,1% de Tween 80 (pH 2,5) ou 150 pl de 0,1% de Tween 80 (pH 2,5) sans PSA (0 ng) en tant que contrôle sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées pendant 3h à 30°C puis la fluorescence est lue. La fluorescence est exprimée en %EMI tel que déterminé avec un lecteur de plaque (Lecteur de microplaques 20 multimode thermocontrôlé Flx-Xenius XM (SAFAS)). L'expérience a été réalisée avec quatre colonies bactériennes différentes avec une répétition de trois puits parallèles pour chaque colonie. 3053700 27 Les résultats obtenus sont montrés en figure 3. Les cellules indicatrices sans la protéine d'intérêt, autrement dit les contrôles (0 ng/ml de PSA), présentaient une fluorescence de 20%EMI. En présence de 1 ng/ml de PSA dans le milieu de culture, la fluorescence augmentait significativement à 31,40%EMI (l'écart type est le résultat 5 de trois expériences réalisées en parallèle). L'expérience a permis de montrer que la présence de PSA dans le milieu induisait la production du gène rapporteur cobA placé sous le contrôle du promoteur PnisF par le système avec le récepteur Nisk-c spécifique de la PSA. Les transformants hébergeant les plasmides selon l'invention comprenant les 10 récepteurs chimériques selon l'invention expriment des gènes sous le contrôle de promoteur nisine-inductibles tels que PnisA, PnisF dans Lactococcus lactis MG1363. Ces résultats démontrent que le système selon l'invention est bien fonctionnel. - Relations dose-réponse dans Llactis MG1363 hébergeant le plasmide 15 pGNAPIcobA (U-GNIC) : figure 4 Des cellules sont mises en culture le soir et maintenues en culture sur la nuit. Ces cellules en pleine croissance (absorbance optique d'environ 0,7 à 600nm) sont diluées au 1:25 dans du milieu de culture M17 supplémenté avec du glucose (0,5%), 10-3M d'acide aminolévulinique et complété avec de l'érythromycine (10 pg/ml). Les 20 cellules sont cultivées à 30°C sans aération pendant 1h30 à 2h jusqu'à une absorbance optique à 600 nm mesurée avec un spectrophotomètre comprise entre 0,2 et 0.3. Les suspensions bactériennes sont ensuite réparties en portions de 50 pl dans une plaque de microtitrage 96 puits. Différentes solutions d'IL6 à des concentrations 25 croissantes (0, 15, 30, 60 et 125 pg/ml) sont préparées dans 0,1% de Tween 80 (pH 2.5). 150 pl de ces solutions sont répartis dans des puits dédiés. Puis la plaque 96 puits est scellée et placée dans le lecteur de microplaques multimode thermocontrôlé Flx-Xenius XM (SAFAS) à 30°C. La mesure de la fluorescence ainsi que de la croissance bactérienne est effectuée toutes les heures pendant 7 heures (début de 3053 700 28 la phase stationnaire) La longueur d'onde d'excitation est de 357 nm et la longueur d'onde d'émission est de 605 nm. La fluorescence est exprimée en %EMI. Les résultats sont présentés en figure 4A (n=3). Le bruit de fond correspond au puits contenant des cellules avec une solution à 0 5 ng/mL d'IL6. Les valeurs de fluorescence du bruit de fond ont été retranchées des valeurs mesurées de fluorescence pour les autres concentrations en IL6 pour obtenir des valeurs relatives de fluorescence (RUF) (valeur mesurée divisée par la valeur du bruit de fond). La concentration la plus faible en IL6 pour laquelle un signal a été détecté a reçu une valeur de RUF de 1 à laquelle ont été rapportées les autres 10 mesures de détection à des concentrations plus élevées. Une fluorescence reflétant une dose-réponse en utilisant la bactérie indicatrice UGNIC a été obtenue dès la première heure (coefficient de corrélation linéaire R2=94) après l'induction avec différentes concentrations d'IL6 (figure 4A). Il a été démontré que des concentrations de 15 à 125 pg/ml ont pu être détectées de manière fiable et 15 ceci de façon quantitative et stable même 7h après l'induction (Fig. 4B).Les niveaux de fluorescence optimaux en fonction du temps d'induction ont été déterminés (figure 4C). L'activité du promoteur PnisF a été mesurée à plusieurs points de temps après l'addition d'une solution d'IL6 à 125 pg/ml. Il a été observé que l'activité du promoteur augmente rapidement de façon exponentielle après l'induction par la solution d'IL6, 20 le niveau maximum étant atteint 4h à 7h après l'induction (Fig. 4C). Le système selon l'invention permet donc, en plus de la détection, la quantification de biomarqueurs grâce aux standards des concentrations et ceci dans des délais courts. _ Test de la limite de détection du système Nisck-c : exemple de Llactis 25 MG1363 hébergeant le plasmide pGNAPIcobA (U-GNIC) Le test biologique de IL6 utilisé dans cette étude comprenait les étapes suivantes : Pour ce test, des concentrations d'IL6 allant de 0 à 1000 pg / ml d'IL6 (concentration finale du mélange de dosage) sont ajoutés (Fig. 5) à un échantillon de cellules UGNIC décongelées et diluées 1:100 dans M17G (plus 10-3M d'acide 305 3 700 29 aminolévulinique), suivit d'une nuit d'incubation à 30°C, le lendemain 150 pl du surnageant sont éliminés, suivit d'une congélation à -20°C (30min) puis décongélation et mesure de la fluorescence. La fluorescence est exprimée en %EMI tel que déterminé avec un lecteur de plaque (Lecteur de microplaques multimode 5 thermocontrôlé Flx-Xenius XM (SAFAS)). Tous les dosages d'IL6 ont été répétés deux fois; chaque répétition contenait trois puits parallèles pour chaque concentration d'IL6. A partir des expériences répétées et la reproduction des puits, les concentrations les plus faibles en IL6 (limites de détection minimales) ont été déterminées en tant que valeurs relatives des unités de fluorescence (RU) qui ont 10 été supérieure à la fluorescence des conditions sans ajout du biomarqueur. En règle générale, le signal de fluorescence reste en deçà des limites de détection dans des conditions de non induction et est augmenté à des niveaux élevés, par addition de quantités faibles (>1pg) d'IL6 dans le milieu de culture (figure 5), tout en présentant une relation dose-linéaire. Les cultures ayant été laissées toute la nuit, le 15 signal atteint une saturation et compte tenu de l'amplification du signal par le système, les faibles concentrations d'induction finissent par donner un signal quasi équivalent à celui obtenu par les concentrations plus importantes. Car l'amplification du signal est dose-dépendant jusqu'à la saturation du signal, le système pourra donc permettre en principe la détection même de molécules uniques. 20 Cette nouvelle analyse a permis de détecter significativement de plus faibles quantités d'IL6. L'avantage majeur de cette sensibilité est que les échantillons peuvent être dilués largement avant l'essai, permettant ainsi d'utiliser de très faible quantité d'échantillon. Ces résultats démontrent que le système inductible par les biomarqueurs peut être 25 mis en oeuvre dans les bactéries lactiques telles que Lactococcus lactis et que la stimulation avec le biomarqueur induit de façon spécifique le gène rapporteur, et ce de façon dose-dépendant dans le cas d'un système sans molécule amplificatrice ou permet de détecter une protéine même en très faible quantité avec un système doté d'une molécule amplificatrice. 30 REVENDICATIONS1 - Plasmide pour transfert dans une bactérie comportant : une séquence codant pour un récepteur chimérique NisK, une séquence codant pour la protéine de régulation intracellulaire NisR et une séquence codant pour un gène rapporteur sous contrôleur d'un promoteur PnisA et/ou PnisF, dans lequel ledit récepteur comporte une portion de liaison d'un biomarqueur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et en ce que la 10 partie cytoplasmique dudit récepteur correspond au domaine cytoplasmique d'un récepteur NisK. 2 - Plasmide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une portion du domaine membranaire dudit récepteur chimérique NisK comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant au moins une des 15 régions variables d'un anticorps monoclonal ayant une forte affinité pour le biomarqueur 3 - Plasmide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une portion du domaine membranaire dudit récepteur chimérique NisK comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant un domaine 20 extracellulaire de reconnaissance du ligand d'un récepteur dont le ligand est le biomarqueur. 4 - Plasmide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice, l'expression de ladite molécule amplificatrice étant activée par la cascade de 25 signalisation activée par la fixation du biomarqueur sur ledit récepteur chimérique. 5 - Plasmide selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence codant pour une molécule amplificatrice est une séquence codant pour le ligand naturel du récepteur NisK et/ou une séquence codant pour un peptide mimétique du 3053700 31 biomarqueur synthétisés par la bactérie lactique modifiée en présence du biomarqueur. 6 - Plasmide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence SEQ ID 1 et par un insert d'une séquence choisie parmi les 5 SEQ ID 2 à 9. 7 - Bactérie lactique modifiée pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle exprime un système de détection et d'amplification dudit biomarqueur par intégration d'un ou plusieurs plasmides comprenant une séquence codant pour un récepteur chimérique NisK, une séquence codant pour la protéine de régulation intracellulaire NisR et une séquence codant pour un gène rapporteur sous contrôleur d'un promoteur PnisA et/ou PnisF, et en ce que ledit récepteur comporte une portion de liaison d'un biomarqueur sur le récepteur, ledit récepteur étant activé par son ligand naturel et/ou le biomarqueur, et en ce que la partie cytoplasmique dudit récepteur correspond au domaine 15 cytoplasmique d'un récepteur NisK. 8 - Bactérie lactique modifiée selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'au moins une portion du domaine membranaire dudit récepteur chimérique NisK comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant au moins une des régions variables d'un anticorps monoclonal ayant une forte 20 affinité pour le biomarqueur. 9 - Bactérie lactique modifiée selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'au moins une portion du domaine membranaire dudit récepteur chimérique NisK comporte en outre une portion de liaison d'un biomarqueur, ladite portion de liaison étant le domaine extracellulaire de reconnaissance du ligand d'un récepteur dont le 25 ligand est le biomarqueur. 10 - Bactérie lactique modifiée selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que ledit gène rapporteur est placé devant un promoteur activable par NisR. 3053 700 32 11 - Bactérie lactique modifiée selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice, l'expression de ladite molécule amplificatrice étant activée par la fixation du biomarqueur sur ledit récepteur chimérique. 5 12 - Bactérie lactique modifiée selon la revendication 11 caractérisée en ce que ladite molécule amplificatrice est le ligand natif du récepteur histidine-kinase et/ou le biomarqueur et/ou une séquence du biomarqueur reconnaissable par ledit récepteur chimérique. - 13 - Bactérie lactique modifiée comprenant le plasmide selon les revendications 1 à 10 6. 14 - Procédé de détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comprenant les étapes de : - mise en contact de l'échantillon biologique avec une bactérie lactique telle que définie à l'une des revendications 7 à 13, - maintien en culture de ladite bactérie en présence de l'échantillon biologique, et - mesure de l'expression du gène rapporteur. 15 - Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape préalable de mesure de l'expression du gène rapporteur en fonction de 20 quantités croissantes et connues de biomarqueur. 16 - Procédé selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en qu'il comprend en outre une étape d'amplification de la détection du biomarqueur par activation de la transcription dans la bactérie lactique modifiée d'au moins une séquence codant pour une molécule amplificatrice. 25 17 - Kit pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comportant : - au moins une bactérie lactique modifiée selon les revendications 7 à 13, - le milieu de culture de ladite bactérie, et 3053700 33 - un standard (molécule amplificatrice ou biomarqueur). 18 - Kit pour la détection d'un biomarqueur dans un échantillon biologique comportant : - au moins un plasmide selon les revendications 1 à 6, et 5 - un standard.