FR 3058159 A1 20180504 FR 1660495 A 20161028 1 VARIANTS DE POLYPEPTIDE Fc PRESENTANT UNE DEMI-VIE AUGMENTEE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc avec une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent. L'invention concerne également un procédé d'augmentation de la demi-vie d'un fragment Fc. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les anticorps monoclonaux sont utilisés aujourd'hui en tant qu'agents thérapeutiques pour traiter une variété de pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies inflammatoires chroniques, le rejet de greffe, les maladies infectieuses et les maladies cardio-vasculaires. Ils constituent donc un enjeu thérapeutique majeur. Nombre d'entre eux est déjà commercialisé, et une proportion toujours croissante est en cours de développement ou d'essais cliniques. Cependant, il existe un besoin important pour optimiser les propriétés structurales et fonctionnelles des anticorps, afin d'en maîtriser les effets secondaires. Une des questions critiques dans l'utilisation d'anticorps monoclonaux en thérapie est leur persistance dans la circulation sanguine. La clairance de l'anticorps affecte directement l'efficacité du traitement, et par conséquent, la fréquence et la quantité de l'administration du médicament, qui peut entraîner des effets indésirables chez le patient. Il existe cependant toujours un besoin de trouver des anticorps, ou des fragments d'anticorps, ayant une demi-vie améliorée permettant ainsi de maintenir leur efficacité et leurs propriétés biologiques intéressantes, avec un dosage moins élevé. DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention fournit des moyens pour obtenir un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc ayant une demi-vie améliorée. Le terme « demi- vie » se réfère à la demi-vie biologique d'un polypeptide d'intérêt dans la circulation 3058159 2 d'un patient donné, notamment humain ou murin, tel qu'une souris, et est représentée par le temps nécessaire pour que la moitié de la quantité du polypeptide d'intérêt présente dans la circulation du patient soit éliminée de la circulation et/ou d'autres tissus du patient. La demi-vie est calculée notamment tel que décrit en exemple 2. 5 En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert qu'un fragment Fc muté sur des positions spécifiques présente une demi-vie sensiblement augmentée par rapport au fragment Fc non muté. Cela permet ainsi d'augmenter les propriétés thérapeutiques du fragment Fc. De plus, les inventeurs ont découvert que certaines 10 combinaisons de mutations particulières avaient un effet synergique sur l'augmentation de la demi-vie, renforçant encore les propriétés avantageuses de fragments Fc selon l'invention. LEGENDE DES FIGURES 15 Figure 1 : La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgG1 humaine native se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'IgG2 humaine (SEQ ID NO: 7), IgG3 humaine (SEQ ID NO: 8) et IgG4 humaine (SEQ ID NO: 9). Les séquences d'IgG1 se réfèrent à l'allotype G1m1,17 20 (SEQ ID NO: 6) et à l'allotype G1m3 (SEQ ID NO: 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" d'IgG1 commence à la cystéine 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique. Figure 2 : Demi-vie d'anticorps anti-CD20 produits en cellules YB2/0: La concentration 25 des immunoglobulines dans le sérum de souris transgéniques a été évaluée au fil du temps. Définitions Tel qu'ils sont utilisés ici, les termes «protéine» et «polypeptide» sont utilisés de 30 manière interchangeable et se réfèrent à une séquence d'au moins deux acides aminés liés de façon covalente, incluant les protéines, polypeptides, oligopeptides et peptides. Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent notamment les anticorps ou immunoglobulines, notamment entiers, monoclonaux, multi-spécifiques, bi-spécifiques, 3058159 3 dual-spécifiques, synthétiques, chimériques, humanisés, humains, les protéines de fusion avec des immunoglobulines, les anticorps conjugués, et leurs fragments. Les termes « protéine » et « polypeptide » incluent également les polypeptides Fc définis par un polypeptide comprenant tout ou partie d'une région Fc, notamment les 5 fragments Fc isolés, Fc conjugués, Fc multimériques et les protéines de fusion avec un fragment Fc. Par « fragment Fc » ou « région Fc », on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région 10 constante d'immunoglobuline (i.e. CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines, en tout ou partie. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut 15 comprendre la chaîne J. De préférence, on utilise dans la présente invention un fragment Fc d'une IgG1, qui se compose d'une partie de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgG1 20 humaine (i.e. acides aminés 226 à 447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat). Dans ce cas, la partie de la charnière flexible N-terminale est la charnière inférieure, qui se réfère aux positions 226 à 230, le domaine CH2 fait référence aux positions 231 à 340 et le domaine CH3 se réfère aux positions 341-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Le fragment Fc utilisé selon l'invention peut comprendre en 25 outre la totalité, ou une partie, de la charnière flexible N-terminale (la totalité correspondant aux positions 216 à 230 selon l'index EU), qui inclut la partie supérieure de la région charnière flexible N-terminale, en amont de la position 226. Dans ce cas, de préférence, on utilise un fragment Fc d'une IgG1 humaine comprenant une partie de la région située entre les positions 216 à 226 (selon l'indice EU). Dans ce cas, le 30 fragment Fc d'une IgG1 humaine utilisé correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, le fragment Fc natif utilisé correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans 35 Kabat. 3058159 4 De préférence, le fragment Fc natif utilisé est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent a pour séquence SEQ ID NO : 1. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal. 5 Les séquences représentées en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec la totalité de leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10. 10 De préférence, le fragment Fc compris dans le polypeptide parent a une séquence constituée par les acides aminés aux positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 11-232 de la séquence SEQ ID NO : 6. La définition de « fragment Fe » inclut un fragment scFc pour « single chain Fc ». Par « fragment scFc », on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion 15 génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. De préférence, le fragment Fc utilisé dans le cadre de l'invention est choisi parmi le fragment Fc d'une IgG1 ou IgG2. De préférence encore, le fragment Fc utilisé est le fragment Fc d'une IgG, préférentiellement une IgG1, plus préférentiellement de séquence SEQ ID NO :1. 20 Dans la présente demande, la numérotation des résidus du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 25 Par « mutation d'acide aminé », on entend ici un changement dans la séquence d'acides aminés d'un polypeptide. Une mutation est choisie notamment parmi une substitution, une insertion et une délétion. Par «substitution», on entend le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent, par le même nombre d'autres acides aminés. De 30 préférence, la substitution est ponctuelle, i.e. elle ne concerne qu'un seul acide aminé. Par exemple, la substitution N434S (appelée aussi 434S) se réfère à un variant d'un polypeptide parent, dans lequel l'asparagine en position 434 du fragment Fc selon l'index EU ou équivalent dans Kabat est remplacé par la sérine. Par « insertion », on entend l'addition d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une 35 séquence de polypeptide parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une 3058159 5 insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par « délétion », on entend l'élimination d'au moins un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294de1 désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294 ; une telle délétion est aussi appelée De1294 ou de1294. 5 Par «polypeptide parent», on entend un polypeptide de référence qui est ensuite modifié pour générer un variant. Ledit polypeptide parent peut être un polypeptide d'origine naturelle, un variant d'un polypeptide d'origine naturelle, une version modifiée d'un polypeptide naturel ou un polypeptide synthétique. 10 Par «variant», on entend une séquence polypeptidique qui est différente de la séquence du polypeptide parent par au moins une modification d'acide aminé. De préférence, la séquence du variant est au moins 80% identique avec la séquence du polypeptide parent, et plus préférentiellement au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 15 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% identique. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement et sur toute la longueur de la séquence du variant, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux 20 séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le calcul d'identité s'effectue ici sur toute la longueur de la séquence du variant, et exclut un calcul sur une longueur partielle. Par « meilleur alignement» ou « alignement optimal», on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides 25 aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et 30 Waterman (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 35 575 Science Dr., Madison, WI). 3058159 6 Par « sialylation », on entend le mécanisme de glycosylation correspondant à un ajout, par liaison covalente, d'au moins un acide sialique (i.e. acide Nacétylneuraminique et ses dérivés, comme l'acide N-glycosylneuraminique, l'acide N- 5 acétylglycoylneuraminique) dans la chaîne glycosylée de la protéine. Par « récepteur de la région Fc » ou « FcR » on entend notamment le C1q et les Récepteurs Fcy (FcyR). Les « Récepteurs Fcy » ou « FcyR » se réfèrent aux récepteurs des Immunoglobulines de type IgG, appelés CD64 (FcyRl), CD32 (FcyRll), 10 et CD16 (FcyRIII), en particulier aux cinq récepteurs exprimés FcyRla, FcyRlla, FcyRllb, FcyRllla et FcyRlllb. Tous sont des récepteurs activateurs des cellules effectrices porteuses de tels récepteurs Fc, hormis le FcyRllb humain qui est un récepteur inhibiteur de l'activation des cellules immunitaires (Muta T et al., Nature, 1994, 368 :70-73). 15 Par «FcRn» ou «récepteur Fc néonatal» tel qu'utilisé ici, on entend une protéine qui se lie à la région Fc des IgG et est codée au moins en partie par un gène FcRn. Le FcRn peut être de n'importe quel organisme, y compris, mais sans s'y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes. Comme cela est connu dans la 20 technique, la protéine FcRn fonctionnelle comprend deux polypeptides, souvent désignés sous le nom de chaîne lourde et de chaîne légère. La chaîne légère est la bêta-2-microglobuline et la chaîne lourde est codée par le gène FcRn. Sauf indication contraire ici, FcRn ou protéine FcRn se réfère au complexe de la chaîne a avec la bêta-2-microglobuline. Chez l'homme, le gène codant pour le FcRn est appelé FCGRT. 25 Variants de fragment Fc La présente invention a pour objet un variant d'un polypeptide parent comprenant un 30 fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent, et comprenant : - au moins une mutation du fragment Fc augmentant la liaison du Fc au FcRn; et - au moins une mutation du fragment Fc augmentant la sialylation du Fc. 35 La présente invention concerne également un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par 3058159 7 rapport audit polypeptide parent, et comprenant au moins trois mutations par rapport au fragment Fc du polypeptide parent, comprenant : une mutation A) d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 5 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305 dudit fragment Fc; et une mutation B) choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S; et au moins une mutation C) choisie dans le groupe constitué de 226G, 228L, 10 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, étant entendu que : la mutation C ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que la mutation B, et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU 15 ou équivalent dans Kabat. Préférentiellement, ladite mutation A) est de1294 ou 264E. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une 20 combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 25 étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Ainsi de préférence, ledit variant comprend : i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en 30 position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 35 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294de1/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, 3058159 8 264E/396L/434S, 294de1/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend en outre au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294de1, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 15 Ainsi de préférence, ledit variant comprend : i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 20 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264 E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264 E/396 L/434S, 294de1/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, 25 et au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294de1, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 30 434S et 439R, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie dans le groupe constitué de 35 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 5 10 3058159 9 315D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294de1/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 5 2301/241L/264E/265G/378V/4211, 264 E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 2301/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230 L/241L/243 L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241 L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 10 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 2311/241L/264E/3781/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 2301/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 15 230T/303A/322R/389T/404L/434S, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Ainsi de préférence, un variant selon l'invention comprend : 20 i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 25 315D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428 L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294de1/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 2301/241L/264E/265G/378V/4211, 264 E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 30 264E/378T/396L, 2301/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 35 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 3058159 10 230T/264E/378V/434S, 2311/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 2301/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S, 5 étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 10 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 294de1/307P/434Y et 315D/330V/361D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprend au moins une combinaison de mutations ii) choisie parmi 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y et 15 315D/330V/361D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, la demi-vie dudit variant est augmentée d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 5, 20 de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30 par rapport audit polypeptide parent. 25 De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc choisi parmi les fragments Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs variants naturels. De préférence, selon une première alternative, le polypeptide parent consiste en un fragment Fc, et de préférence un fragment Fc entier. 30 De préférence, selon une seconde alternative, le polypeptide parent consiste en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un fragment Fc. Dans ce cas, avantageusement, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, un polypeptide de fusion Fc ou un conjugué Fc. 3058159 11 De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, le fragment Fc du polypeptide parent consiste en la séquence SEQ ID NO : 1. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de la partie supérieure de la région charnière en N- 5 terminal. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le 10 fragment Fc du polypeptide parent est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10. Ces séquences sont résumées comme suit: SEQ ID NO : Protéine 1 Fragment Fc d'IgG1 humaine G1m1,17 (résidus 226-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat) sans partie supérieure de région charnière N-terminale. 2 Fragment Fc d'IgG2 humaine sans partie supérieure de région charnière N-terminale. 3 Fragment Fc d'IgG3 humaine sans partie supérieure de région charnière N-terminale. 4 Fragment Fc d'IgG4 humaine sans partie supérieure de région charnière N-terminale. 5 Fragment Fc d'IgG1 humaine G1m3 sans partie supérieure de région charnière N-terminale. 6 Fragment Fc d'IgG1 humaine G1m1,17 (résidus 226-447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat) avec région charnière N-terminale. 7 Fragment Fc d'IgG2 humaine avec région charnière N-terminale. 8 Fragment Fc d'IgG3 humaine avec région charnière N-terminale. 9 Fragment Fc d'IgG4 humaine avec région charnière N-terminale. 3058159 12 10 Fragment Fc d'IgG1 humaine G1m3 avec région charnière N-terminale. Alternativement, le polypeptide parent consiste en une immunoglobuline, un anticorps ou encore en une séquence d'acides aminés fusionnée en N- ou C-terminal à un anticorps ou une immunoglobuline. De manière préférée, ledit polypeptide parent est 5 une immunoglobuline ou un anticorps. Procédé d'augmentation de la demi-vie d'un fragment Fc La présente invention a également pour objet un procédé d'augmentation de la demi- 10 vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc, comprenant les étapes suivantes: insertion d'au moins une mutation du fragment Fc augmentant la liaison du Fc au FcRn; et insertion d'au moins une mutation du fragment Fc augmentant la sialylation du Fc. 15 La présente invention a également pour objet un procédé d'augmentation de la demi-vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc, comprenant les étapes suivantes: i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides 20 ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G, 25 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S; étant entendu que : les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide, la mutation C ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que la mutation B, 30 et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; 3058159 13 De préférence, ladite étape i) est une étape de délétion de l'acide aminé en position 294 ou une étape d'insertion d'une mutation 264E, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 5 De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 378T/396L, 378V/416K, 10 378V/434S, 396L/434S, 307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 15 Dans un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend en outre une étape iii) d'insertion d'au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 20 434Y, 434S et 439R, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 25 De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 294de1/307P/434Y et 315D/330V/361D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 30 De préférence, ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie parmi 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y et 315D/330V/361D/378V/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294de1, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 35 Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées sont applicables ici. 3058159 14 Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps, de préférence une IgG, et le variant selon l'invention est alors choisi parmi les variants d'IgG. Plus préférentiellement, le variant selon 5 l'invention est choisi parmi les variants d'IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 humaines. De manière préférée, le procédé d'augmentation de la demi vie d'un fragment Fc selon l'invention permet une augmentation de la demi vie d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 5, de 10 préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30, par rapport à la demi-vie dudit polypeptide comprenant un fragment Fc avant les étapes de mutation dudit procédé. 15 Plus préférentiellement, l'étape de mutation du procédé est obtenue comme suit : a) on fournit une séquence nucléique codant pour le polypeptide parent comprenant le fragment Fc ; b) on modifie la séquence nucléique fournie en a) pour obtenir une séquence nucléique 20 codant pour le variant ; et c) on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte, et on récupère le variant. Une telle étape de mutation est donc effectuée en utilisant une séquence nucléique 25 (polynucléotide ou séquence nucléotidique) codant pour ledit polypeptide parent (étape a)). La séquence nucléique codant pour le polypeptide parent peut être synthétisée par voie chimique (Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 1 5;32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide 30 parent peut être également amplifiée par PCR en utilisant des amorces adaptées. La séquence nucléotidique codant pour le polypeptide parent peut également être clonée dans un vecteur d'expression. L'ADN codant pour un tel polypeptide parent est inséré dans un plasmide d'expression et inséré dans une lignée cellulaire ad hoc pour sa production (par exemple la lignée HEK-293 FreeStyle, la lignée YB2/O, ou la lignée 35 CHO), la protéine ainsi produite étant ensuite purifiée par chromatographie. 3058159 15 Ces techniques sont décrites en détails dans les manuels de référence : Molecular cloning : a laboratory manual, 31eme édition-Sambrook and Russel eds. (2001) et Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007). 5 La séquence nucléique fournie en a) (polynucléotide), qui code pour le polypeptide parent, est ensuite modifiée pour obtenir une séquence nucléique codant pour le variant. C'est l'étape b). Cette étape est l'étape de mutation à proprement parler. Elle peut être effectuée par toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par mutagénèse dirigée ou par 10 mutagénèse aléatoire. De préférence, la mutagénèse aléatoire telle que décrite dans la demande W002/038756 est utilisée : il s'agit de la technique Mutagen. Cette technique utilise une ADN mutase humaine, notamment choisie parmi les ADN polymérases [3, n et I. Une étape de sélection des mutants ayant conservé la liaison au FcRn est nécessaire pour retenir les mutants d'intérêt. 15 Alternativement, les substitutions d'acides aminés sont de préférence réalisées par mutagénèse dirigée, par la technique de PCR d'assemblage utilisant des oligonucléotides dégénérés (voir, par exemple, Zoller et Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488). 20 Enfin, dans l'étape c), on exprime la séquence nucléique obtenue en b) dans une cellule hôte, et on récupère le variant ainsi obtenu. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des 25 cellules d'insectes ou des cellules de plantes. Les cellules hôtes préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lec13, PER.C6TM (Crucell), les cellules HEK notamment HEK293(ATCC # CRL1573), T1080, EB66, K562, NSO, SP2/0, les cellules 30 HeLa, BHK ou COS. De préférence encore, on utilise la lignée de rat YB2/0. Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire le polypeptide dans le lait. Dans ce cas, l'expression d'une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention est contrôlée par un 35 promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, 3058159 16 ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et la séquence d'ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L'animal peut ainsi être choisi parmi le mouton, la chèvre, la 5 lapine, la brebis ou la vache. Le polynucléotide codant pour le variant obtenu à l'étape b) peut également comprendre des codons optimisés, notamment pour son expression dans certaines cellules (étape c)). Par exemple, lesdites cellules comprennent les cellules YB2/0, les 10 cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK, les cellules BHK, les cellules PER.C6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, 293 (ATCC # CRL1573), des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le 15 fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de codons joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de codons a également un impact sur le 20 pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel de traduction (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934). L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et 25 plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence. De préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules HEK, telles que des cellules HEK293, les cellules CHO, ou les 30 cellules YB2/0. Plus préférentiellement, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules YB2/0. Alternativement, de préférence, le polynucléotide comprend des codons optimisés pour son expression dans les cellules d'animaux transgéniques, de préférence la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache. 35 3058159 17 Procédé de production d'un variant Dans un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport au polypeptide parent, comprenant les étapes 5 suivantes: i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; 10 ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S et insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S; étant entendu que : 15 les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide parent, la mutation C ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que la mutation B, et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 20 Toutes les caractéristiques techniques précédemment énoncées sont applicables ici. Composition pharmaceutique Le variant obtenu selon l'invention peut être combiné avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération 25 prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intra- 30 oculaire, intra-cérébrale, transdermique, pulmonaire, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions 35 ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les 3058159 18 aérosols, les implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale. 5 De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions 10 lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables. Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y 15 compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, 20 comme les bactéries et les champignons. Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un 25 conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges 30 appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera 35 préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de 3058159 19 sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. 5 Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les 10 autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les 15 formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment 20 de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaCI isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée 25 sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la 30 maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle. 35 3058159 20 EXEMPLES Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de 5 l'invention. Exemple 1 : Production des variants selon l'invention La mise au point des variants de l'invention « optimisés FcRn » peut se faire selon les 10 méthodes décrites dans l'art antérieur, en particulier la demande de brevet européen EP 0 233 500, qui décrit l'obtention de tels mutants selon la technique dite Technique MutaGen TM. Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes : 15 A/ Construction d'une banque de Fc Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1) dérivé de la chaine lourde d'une IgG1 humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles 20 standards bien connus de l'homme du métier. B/ Mutagenèse Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but 25 d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol 6, n et t) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires. C/ Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants 30 présentant une demi-vie améliorée Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément aux protocoles connus de mesure de demi-vie. 35 D/ Production des variants sous forme d'Ig entière 3058159 21 Plusieurs combinaisons de mutations ont été sélectionnées pour servir de base à la production de mutants selon l'invention. Les combinaisons suivantes ont été sélectionnées : - T5A-74De1294 : E294de1/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y 5 - T5A-74H: V264E/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y mais aussi : - C6A-74De1294 : 2591/de1294/315D/434Y 1- Production des variants IgG dans les cellules HEK 10 La séquence de fragment Fc SEQ ID NO : 1 a été clonée dans un vecteur d'expression eucaryote générique dérivé de pCEP4 (Invitrogen) et contenant la chaîne lourde d'un anticorps chimérique anti-CD20 selon des protocoles de PCR standard. La chaîne légère de cet anticorps a été insérée dans un vecteur dérivé de pCEP4 semblable. Toutes les mutations d'intérêt dans le fragment Fc ont été insérées dans le vecteur 15 d'expression contenant la chaine lourde anti-CD20 par PCR de chevauchement. Par exemple, le variant De1294 a été obtenu en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la délétion en position 294 sur la chaine lourde contenue dans le vecteur d'expression. 20 Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gels d'agarose 1% (w/ v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression de la chaine lourde anti-CD20. 25 Les cellules HEK 293 ont été cotransfectées avec les vecteurs d'expression de la chaine légère et de la chaine lourde de l'IgG anti-CD20 en des quantités équimolaires selon des protocoles standard (Invitrogen). Les cellules ont été cultivées de manière à produire les anticorps de manière transitoire. Les anticorps produits ont pu être isolés 30 et purifiés selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation. 2- Production des variants IgG dans les cellules YB2/0 Les variants Fc ont été préparés dans un format IgG entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-CD20. Pour cela, la chaine lourde et 35 légère des IgG ont été clonées dans un vecteur bicistronique HKCD20 optimisé pour la 3058159 22 production dans YB2/0. La production a été réalisée dans des pools stables de cellules YB2/0. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation. 5 Les polypeptides suivants ont été développés (Anti-CD20 IgG variants) : Nom Mutations Anti-CD20 C6A-66 E294del/T307P/N434Y Anti-CD20 De1294 De1294 Anti-CD2UT5A-74 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y Anti-CD20 T5A-74De1294 E294del/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y Anti-CD20 T5A-74H V264E/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y Anti-CD20 WT / Le variant T5A-74H diffère du variant parent T5A-74 par la mutation V264E. Le mutant 10 T5A-74De1294 diffère du variant parent T5A-74 par la délétion de l'acide aminé en position 294. Nom Mutations Anti-CD20 C6A-74 2591/315D/434Y Anti-CD20 De1294 De1294 Anti-CD20 C6A-74De1294 294de1/2591/315D/434Y Anti-CD20 WT / Le mutant C6A-74De1294 diffère du variant parent C6A-74 par la délétion de l'acide 15 aminé en position 294. Exemple 2 : Analyse de la demi-vie des le selon l'invention Des expériences de pharmacocinétique ont ainsi été effectuées chez la souris hFcRn 20 qui sont homozygotes KO pour un allèle du FcRn murin et hétérozygote pour un transgène de FcRn humain (mFcRn-/- hFcRnTg). Pour ces études pharmacocinétiques, chaque animal a reçu une seule injection intrGveineuS8d'IgG à5 mg / kg au niveau du sinus rétro-orbital, dans un protocole 25 similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of 3058159 23 genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006). Généralement la demi-vie est calculée à partir des concentrations plasmatiques 5 mesurées durant la phase d'élimination. Le temps de demi-vie peut être ainsi obtenu : - par résolution d'équation: T1/2 = (Ln2 x Vd) / CL, avec Vd = volume de distribution = Dose / concentration plasmatique initiale 10 CL = Clairance = Dose / AUC (aire sous la courbe) - par analyse graphique en déterminant sur l'axe des ordonnées (concentration en pg/m1) l'intervalle de temps écoulé entre la concentration Cl et la concentration C2. Il est impératif de tracer cette courbe en échelle semi-logarithmique afin de s'assurer de 15 l'alignement des points expérimentaux dans cette dernière phase dite d'élimination. La durée d'exploration de cette pente doit être suffisamment longue pour permettre une estimation précise de la demi-vie. Une fois la pente de la phase d'élimination mesurée (ke ou constante d'élimination), la demi-vie peut être calculée comme suit : 20 T1/2= Ln2 / ke = 0.693 / ke Par ailleurs, le MRT ou le temps moyen de résidence peut être estimé. Il traduit la durée de présence du polypeptide Fc dans l'organisme. Le MRT peut être obtenu comme suit : 25 MRT = AUC / AUMC, avec AUC = moment d'ordre 0 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps AUMC = moment d'ordre 1 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps. 30 Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrées par ELISA. Résultats : 35 3058159 24 Variants T5A-74 : Dans cet essai, les deux IgG T5A-74 et De1294 ont montré une augmentation de la demi-vie (Figure 2). De façon avantageuse, la combinaison des mutations T5A-74 et Del 294 d'une part, et T5A-74 et V264E, a permis d'observer un effet 5 synergique sur l'augmentation de la demi-vie des IgG T5A-74De1294 et T5A-74H. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous : mAb ID T1/2 Cmax AUCK Vd CI MRT - (h) (pg/mL) (h*pg/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h) anti-CD20 WT (YB2/0) 34.2 72.2 1478 167 3.38 17.7 anti-CD20 DEL294 (YB2/0) 54.4 75.3 1471 267 3.40 15.0 anti-CD20 C6A66 (YB2/0) 74.2 79.0 4261 126 1.17 83.1 anti-CD20 T5A74 (YB2/0) 64.1 76.9 3118 148 1.60 64.7 anti-CD20 T5A74H (YB2/0) 178 85.7 10234 126 0.489 228 anti-CD20 T5A74DEL294 (YB2/0) 154 81.9 7755 143 0.645 191 10 Les paramètres analysés sont définis ci-dessous : T1/2 : demi-vie Cmax: concentration maximale obtenu à un temps donné, correspondant au temps de concentration plasmatique maximale (Tmax) 15 AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de TO à l'infini Vd : Volume de distribution Cl : Clairance MRT: temps moyen de résidence 20 Variants C6A-74 : L'IgG C6A-74De1294 montre également une augmentation de la demi-vie. De façon avantageuse, la combinaison des mutations C6A-74 et Del 294 a permis d'observer une augmentation de la demi-vie. 25 Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous : mAb_ID T1/2 Cmax AUCinf Vd CL MRT (h) (pg/mL) (h*ug/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h) anti-CD20 WT (YB2/0) 34.6 76.8 1688 62.4 3.05 20.4 anti-CD20 DEL294 (YB2/0) anti-CD20 C6A-74 (YB2/0) anti-CD20 C6A-74DEL294 (YB2/0) 74.8 76.5 1785 58.0 2.82 20.6 82.8 79.6 3432 119.8 1.52 81.1 116 74.1 5710 128 0.897 145 3058159 25 Les paramètres analysés sont définis ci-dessous : T1/2 : demi-vie Cmax: concentration maximale obtenu à un temps donné, correspondant au temps 5 de concentration plasmatique maximale (Tmax) AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de TO à l'infini Vd : Volume de distribution CI : Clairance MRT: temps moyen de résidence 10 REVENDICATIONS1. Variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une demi-vie améliorée par rapport audit polypeptide parent, et comprenant : au moins une mutation du fragment Fc augmentant la liaison dudit Fc au FcRn; et au moins une mutation du fragment Fc augmentant la sialylation dudit Fc. 2. Variant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois mutations dudit fragment Fc comprenant : une mutation A) d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en une mutation B) choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 434Y et 434S; et au moins une mutation C) choisie dans le groupe constitué de 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, étant entendu que : la mutation C ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que la mutation B, la numération des positions des acides aminés du fragment Fc étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 3. Variant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294de1/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et 3058159 27 étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 4. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il 5 comprend i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 10 315D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294de1/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 2301/241L/264E/265G/378V/4211, 264 E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 15 264E/378T/396L, 2301/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230 L/241L/243 L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241 L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 20 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 2311/241L/264E/3781/397M/434S, 230L/264E/378V/434S, 2301/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 2301/303A/322R/3891/404L/434S, 25 étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 5. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend i) une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés 30 en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; et ii) au moins une combinaison de mutations choisie parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 294de1/307P/434Y et 315D/330V/361D/378V/434Y, étant 3058159 28 entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 6. Variant selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ladite mutation A 5 est de1294 ou 264E, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 7. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le 10 polypeptide parent consiste en un fragment Fc. 8. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit polypeptide parent est une immunoglobuline ou un anticorps. 15 9. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le fragment Fc du polypeptide parent est un fragment Fc d'une IgG, de préférence un fragment Fc d'une IgG1 correspondant de préférence à la séquence SEQ ID NO: 1. 10. Variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la 20 demi-vie dudit variant est augmentée d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30 par rapport audit 25 polypeptide parent. 11. Procédé d'augmentation de la demi-vie d'un polypeptide comprenant un fragment Fc, comprenant les étapes suivantes: 30 i) insertion d'une mutation A d'au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés en position 240, 241, 242, 243, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 ou 305; ii) insertion d'une mutation B choisie dans le groupe constitué de 378V, 378T, 35 434Y et 434S et 3058159 29 insertion d'au moins une mutation C choisie dans le groupe constitué 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S; 5 étant entendu que : les mutations sont effectuées sur le fragment Fc du polypeptide, la mutation C ne peut avoir lieu sur le même acide aminé que la mutation B, et la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 10 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite étape i) est une étape de délétion de l'acide aminé en position 294 ou une étape d'insertion de la mutation 264E. 15 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 L/264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 3781/396L, 378V/416K, 378V/434S, 396L/434S, 307P/434Y, 20 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que 25 ladite étape ii) consiste en l'insertion d'une combinaison de mutations choisie dans le groupe constitué de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 294de1/307P/434Y, étant entendu que la numération des positions des acides aminés du fragment Fc est 30 celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que la demi-vie dudit polypeptide comprenant un fragment Fc est augmentée d'un facteur au moins égal à 2, de préférence supérieur à 3, de préférence supérieur à 4, de 35 préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de 3058159 30 préférence supérieur à 9, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, et de préférence supérieur à 30, par rapport à la demi-vie dudit polypeptide comprenant un fragment Fc avant les étapes de mutation dudit procédé. 5