FR 3061908 A1 20180720 FR 1750296 A 20170113 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 1 PROCEDE DE TRAITEMENT DE LA BIOMASSE La présente invention concerne un nouveau procédé de traitement de la biomasse, destiné notamment à permettre la valorisation de la biomasse lignocellulosique, ce procédé comprenant un traitement de la biomasse par de l'eau subcritique en présence d'un liquide ionique. Etat de la technique antérieure La biomasse lignocellulosique représente un fort potentiel pour développer la bioconversion de déchets végétaux jusqu'alors peu valorisés, en bio-produits à haute valeur ajoutée (Tamaru et LOpez-Contreras, 2013). En outre, les combustibles et les produits chimiques organiques issus de la biomasse lignocellulosique peuvent contribuer à réduire les émissions de gaz à effet de serre, améliorer la sécurité énergétique et améliorer le problème de gestion des déchets végétaux solides (Tamaru et LOpez-Contreras, 2013). Les plantes oléagineuses sont cultivées pour extraire la fraction de graisse de leurs graines ou de fruits pour l'alimentation, l'énergie ou l'utilisation industrielle. Ces cultures se caractérisent actuellement par la faible valeur des co-produits contenant la lignocellulose comme, entre autres, la paille, les feuilles, les tiges, les coques, les tourteaux. Ces co-produits issus de ces cultures représenteraient une source importante de biomasse lignocellulosique. Il en est de même pour d'autres déchets issus du monde végétal, tels que la sciure de bois, la bagasse de canne à sucre etc... Un fractionnement efficace de la biomasse lignocellulosique permettrait le remplacement de certains hydrocarbures fossiles par des hydrates de carbone biosourcés, et donc de réduire la dépendance de l'industrie chimique au pétrole. Une importante limitation à la transformation et la valorisation de la biomasse lignocellulosique réside dans sa résistance à la conversion enzymatique en composés de type sucres. La nature résistante de la biomasse, due notamment à sa structure complexe et à la résistance à l'hydrolyse des polymères qui composent la lignocellulose, est un obstacle majeur à un fractionnement efficace à faible coût de la biomasse lignocellulosique. Le traitement de la biomasse directement par hydrolyse enzymatique n'est pas efficace, et différents prétraitements qui fracturent la structure lignocellulosique sont nécessaires pour rendre la biomasse accessible à l'hydrolyse par des enzymes. De façon similaire, le traitement chimique de la biomasse requiert des conditions drastiques qui conduisent à un faible rendement en sucres et produisent des dérivés tel que par exemple le furfural, inhibiteur des enzymes de fermentation. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 2 Actuellement, l'étape de prétraitement de la biomasse lignocellulosique constitue un verrou technologique pour sa transformation en produits valorisables. Plusieurs variantes de prétraitements ont été étudiées. Les principaux procédés chimiques de prétraitement sont les suivants : 5 - Le pré-traitement par de l'acide dilué (100 ° C à 200 ° C, de 0,3 à 2% d'acide sulfurique aqueux, pendant une durée allant jusqu'à 20 minutes), - Le prétraitement en conditions alcalines (solution aqueuse de NaOH de concentration de 8 à 12%, à 80-120 ° C, pendant 30 à 60 minutes), et - Le procédé Organosolv qui consiste en l'extraction de lignine et 10 d'hémicellulose avec des solvants organiques (éthanol, acétone), à 150-200 ° C dans des conditions acides. Certains prétraitements classiques sont efficaces, mais ils présentent un impact environnemental élevé, qui est incompatible avec un développement durable. Par conséquent, la recherche de prétraitements respectueux de l'environnement a fait 15 l'objet de nombreux développements. Ces prétraitements produisent notamment des sucres simples et des polymères sensibles à l'hydrolyse, mais ils forment aussi d'autres produits de réaction qui sont susceptibles d'inhiber la réaction d'hydrolyse. Dans un tel cas, les rendements de l'hydrolyse enzymatique de la biomasse présentent des valeurs faibles et la viabilité 20 économique de l'ensemble du procédé de valorisation est faible. Le fractionnement de la biomasse par les liquides ioniques hydrophiles (IL) ou par de l'eau subcritique (SCW), sont deux prétraitements écologiques ayant fait l'objet de nombreux travaux et révélés comme des procédés prometteurs. Les liquides ioniques, tels que les imidazolium à chaine carbonée de longueur 25 inférieure ou égale à 4 C, sont des sels à faible point de fusion (en dessous de 100 ° C), et comparativement à d'autres solvants, ils sont plus respectueux de l'environnement pour ceux à cations imidazolium substitués par des chaines acylées de longueur inférieure ou égale à 4 carbones (Garcia-Lorenzo, A. et al., Green Chem. 2008, /0, 508-516 ; Egorova, K.S. et al., ChemSuschem 2014, 7, 336-360). Leur 30 utilisation dans le fractionnement de la biomasse lignocellulosique a présenté un gain d'attention considérable ces dernières années, car ils présentent plusieurs avantages, notamment une stabilité thermique élevée, une corrosion minimale (Hasib-ur-Rahman, M. et al., Ind. Eng. Chem. Res. 51, 8711-8718) et une faible volatilité qui s'avère avantageuse pour le recyclage. Ces propriétés les distinguent des solvants organiques 35 classiques (instables et toxiques) qui doivent être mis en oeuvre dans des conditions sévères. Les premiers résultats ont confirmé que l'utilisation des liquides ioniques est ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 3 une méthode efficace, plus avantageuse par rapport aux procédés de prétraitement classiques. Jusqu'à présent, l'acétate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, désigné [C2mim] [CH3COOT, semble être le liquide ionique le plus approprié pour le prétraitement de 5 la biomasse lignocellulosique : on a constaté qu'il induisait la dissolution des polymères de la biomasse (la lignine et la cellulose) (Auxenfans et al, 2012 ; Husson et al., 2011 ; Sant'Ana da Silva et al, 2011) et permettait son hydrolyse ultérieure par des enzymes. Le traitement de la biomasse lignocellulosique par les liquides ioniques seuls se 10 caractérise par une faible dégradation de l'hémicellulose solubilisée dans la fraction liquide, et par une perte de masse, qui dépend de la durée et de la température, et est au maximum de l'ordre de 30%. Les résidus de pré-traitement de la biomasse lignocellulosique par les liquides ioniques présentent une sensibilité moyenne à l'hydrolyse enzymatique, cette sensibilité étant variable en fonction du liquide ionique 15 employé et des conditions de prétraitement (température, durée, charge en biomasse). Enfin, un tel traitement fait appel à des quantités importantes de liquides ioniques, ce qui n'est pas totalement satisfaisant d'un point de vue économique. L'eau est la molécule la plus abondante sur Terre et elle présente de nombreux avantages : elle est non toxique, sans danger pour la santé, non inflammable. Lors de 20 l'utilisation de l'eau comme solvant d'extraction, sa constante diélectrique, qui peut être modifiée par la température, est le facteur le plus important. Elle diminue de 80 à la température ambiante, à 27 à 250 ° C, valeur sensiblement égale à celle de l'éthanol à température ambiante. L'eau subcritique est définie comme une eau portée à des températures 25 comprises entre 100 et 374 ° C (température critique de l'eau autour de 374 ° C) sous une pression élevée qui maintiennent l'eau à l'état liquide (la pression critique de l'eau est approximativement égale à 221 bars). L'eau est alors dans un état particulier qui lui confère des propriétés, notamment de densité, diffusivité et viscosité, intermédiaires entre celles qu'elle présente à l'état liquide et à l'état gazeux. 30 L'eau subcritique a été largement utilisée pour l'hydrolyse des composés organiques, et récemment elle a été mise en oeuvre dans le prétraitement de la biomasse. L'eau subcritique a été utilisée pour convertir des hydrates de carbone en composants utiles par hydrolyse et fractionnement de la lignocellulose (Ahmed et al, 2013 ; Kruse et Gawlik, 2003 ; Sasaki et al., 1998). Dans la littérature concernant le 35 prétraitement de la biomasse par de l'eau subcritique, on trouve deux conditions opérationnelles principales appliquées : soit un traitement à haute pression pendant une très courte durée (250-350 ° C, entre 1-300 sec) (Cheng et al, 2009 ; Kumar et al., ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 4 2010) ; ou une pression modérée pendant une période plus longue (100-180 ° C, entre 10-90 min) (Ahmed et al, 2013 ; King et al., 2012; Tsigie et al, 2013a, 2013b, 2012). Toutefois, le traitement par l'eau subcritique se caractérise par une perte de masse plus élevée que le prétraitement par les liquides ioniques. Les résidus de pré- 5 traitement de la biomasse lignocellulosique par l'eau subcritique présentent une très faible sensibilité à l'hydrolyse enzymatique, ce qui constitue un inconvénient majeur à l'emploi de cette méthode de prétraitement dans la valorisation de la biomasse. Le document W02012/174459 a décrit le pré-traitement de la biomasse lignocellulosique par un liquide ionique sous pression, ce qui permet d'améliorer la 10 cinétique de la réaction et d'augmenter le rendement en glucose lors d'une hydrolyse ultérieure. Ce traitement peut être réalisé en présence d'un co-solvant tel que de l'eau. Toutefois, il n'est nullement enseigné dans ce document de mettre en oeuvre un procédé de traitement utilisant une eau en état subcritique. Il n'est pas non plus enseigné l'action synergique d'un traitement par une eau subcritique et par un liquide 15 ionique. Par ailleurs, la teneur en liquide ionique mis en oeuvre dans ce procédé est élevée donc couteuse. Le document W02014/138100 décrit des procédés pour (a) dissoudre la biomasse dans des liquides ioniques, (b) déconstruire la cellulose, l'hémicellulose et / ou la lignine en dérivés, (c) séparer les dérivés de la biomasse du liquide ionique, et (d) 20 convertir des dérivés de la biomasse en carburants ou en produits chimiques utiles. Ces procédés font appel à l'utilisation de liquides ioniques et éventuellement de cosolvants tels que l'eau. Le traitement peut être réalisé sous pression, toutefois, il n'est nullement enseigné dans ce document de mettre en oeuvre un procédé de traitement utilisant une eau en état subcritique. Il n'est pas non plus enseigné l'action synergique 25 d'un traitement par une eau subcritique et par un liquide ionique. Dans un tel procédé, si l'eau n'est pas à l'état subcritique, il y a un gros risque de précipitation de la cellulose et donc une efficacité limitée en termes de fractionnement et de désorganisation de la matrice lignocellulosique et de la cellulose elle-même, ce qui gêne la dégradation enzymatique. 30 De façon surprenante, les inventeurs ont constaté qu'un traitement de la biomasse lignocellulosique par de l'eau subcritique en présence d'au moins un liquide ionique, permet de surmonter les inconvénients des procédés de l'art antérieur. Résumé de l'invention 35 Un premier objet de l'invention consiste en un procédé de traitement d'une biomasse, ce procédé comprenant au moins (a) la mise en contact de la biomasse avec une eau à l'état subcritique en présence d'au moins un liquide ionique hydrophile. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 5 Selon un mode de réalisation préféré, la quantité de biomasse est de 1 à 30 % en masse par rapport au volume total de liquide. 5 Selon un mode de réalisation encore préféré, la quantité de biomasse est de 1 à 15 % en masse par rapport au volume total de liquide, encore plus préférentiellement de 2 à 10%. Selon un mode de réalisation préféré, la quantité de liquide ionique hydrophile 10 est de 1 à 10 % en volume par rapport au volume total d'eau. Selon un mode de réalisation encore préféré, la quantité de liquide ionique hydrophile est de 2 à 7 % en volume par rapport au volume total d'eau, encore plus préférentiellement de 3 à 5%. 15 Selon un mode de réalisation préféré, la biomasse est une biomasse lignocellulosique. Selon un mode de réalisation encore préféré, la biomasse est choisie parmi les 20 biomasses d'origine oléagineuse, comme les coques de tournesol, la paille de colza Selon un mode de réalisation préféré, le liquide ionique hydrophile est choisi parmi ceux dont le cation est un imidazolium éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyles. 25 Selon un mode de réalisation encore préféré le liquide ionique hydrophile est choisi parmi ceux dont le cation est un imidazolium substitué par un ou plusieurs groupements alkyles en C 1 -C4. 30 Selon un mode de réalisation très avantageux, le liquide ionique hydrophile est choisi parmi les sels organiques de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, encore plus préférentiellement parmi l'acétate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium et le méthylphosphonate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium. 35 De préférence, le liquide ionique hydrophile est l'acétate de 1-éthy1-3- méthylimidazolium. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 6 Selon un mode de réalisation préféré, à l'étape (a) le milieu réactionnel est soumis à une température allant de 160 à 240°C. Selon un mode de réalisation encore préféré, à l'étape (a) le milieu réactionnel 5 est soumis à une température allant de 160 à 240°C pendant une durée allant de 15 minutes à six heures, de préférence de 30 minutes à quatre heures, encore plus préférentiellement de 30 minutes à deux heures. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a) est précédée d'un traitement 10 mécanique permettant d'obtenir une biomasse sous forme de particules de taille contrôlée, notamment un broyage de la biomasse. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a) est suivie d'une étape (b) de filtration et de lavage permettant d'obtenir : d'une part une fraction solide de biomasse 15 pré-traitée, d'autre part une fraction liquide comprenant l'eau et le liquide ionique ainsi que de la lignine. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (b) est suivie d'une étape (c) de traitement enzymatique de la biomasse pré-traitée solide. 20 Selon un mode de réalisation encore préféré, l'étape (c) comprend un traitement par des cellulases, par exemple un traitement par des cellulases issues de Trichoderma reesei. 25 Selon un mode de réalisation encore préféré, l'étape (c) est suivie d'au moins une étape de fermentation. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre à l'issue de l'étape (b) une étape (d) d'élimination des solvants, avantageusement une étape (d) 30 d'élimination de l'eau de la fraction liquide. Selon un mode de réalisation encore préféré, l'étape (d) est suivie d'une étape (e) de dialyse et de traitement enzymatique permettant de récupérer : d'une part une fraction de lignine et d'autre part un mélange comprenant l'eau et le liquide ionique. 35 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 7 Selon un mode de réalisation encore préféré, l'étape (e) comprend un traitement par des cellulases, comme par exemple un traitement par des cellulases issues de Trichoderma reesei. 5 Selon un mode de réalisation encore préféré, l'étape (e) comprend un traitement par des xylanases, comme par exemple un traitement par des xylanases issues de Trichoderma viride. Selon un mode de réalisation préféré, le liquide ionique obtenu à l'issue de 10 l'étape (d) et éventuellement de l'étape (e) est réutilisé dans l'étape (a) d'un nouveau cycle de traitement d'une biomasse. Dans le procédé de l'invention de prétraitement de la biomasse lignocellulosique, le liquide ionique agit comme catalyseur ou comme composant 15 synergique dans le prétraitement par l'eau subcritique. On a constaté à l'issue de ce procédé une amélioration très significative du rendement de récupération de masse solide, comparativement à chacun des procédés de l'art antérieur pris isolément (traitement aux liquides ioniques et traitement par l'eau subcritique). On a également constaté que le procédé de l'invention permettait d'accéder à une biomasse pré-traitée 20 qui présente une sensibilité accrue à l'hydrolyse enzymatique, comparativement à chacun des procédés de l'art antérieur, en particulier comparativement au traitement par l'eau subcritique seul. Ainsi, ce procédé de pré-traitement donne accès à une fraction qui peut être convertie de façon efficace en sucres fermentiscibles par un traitement ultérieur de bioconversion enzymatique. Le procédé de l'invention permet 25 une dégradation sélective de l'hémicellulose comparativement aux procédés de traitement aux liquides ioniques, sans dégradation significative de la fraction cellulosique. Cette dégradation de l'hémicellulose conduit à la formation de sucres en C5 dans la fraction liquide récupérée. On obtient aussi par le procédé de l'invention des fractions de biomasse pré-traitée ayant une teneur en lignine plus faible 30 comparativement au procédé de pré-traitement par de l'eau subcritique seul. En effet, la lignine est partiellement extraite dans la fraction liquide obtenue à l'issue des étapes a) et b). Le procédé de l'invention permet ainsi d'accéder à des compositions de matière différentes de celles obtenues par les procédés de l'art antérieur et dont la valorisation peut être facilitée par la faible teneur en hémicellulose. Par ailleurs, ce 35 procédé permet la récupération de la lignine comme co-produit et sa valorisation de façon indépendante des autres fractions de matière obtenues. Ce procédé permet aussi de récupérer des sucres simples, notamment des sucres en C5, issus de la dégradation ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 8 de l'hémicellulose. Le procédé de l'invention conduit à une fraction contenant de la cellulose dont l'indice de cristallinité est supérieur à celui de la biomasse de départ, ce qui permet sa valorisation dans l'industrie des polymères pour la production de composites. Le procédé peut être mis en oeuvre avec des concentrations relativement 5 élevées de biomasse (jusqu'à 10% en masse de biomasse par volume de solvant). La reproductibilité de ce procédé est satisfaisante. Les liquides ioniques utilisés dans ce procédé sont mis en oeuvre en quantité beaucoup plus faible que dans les procédés de pré-traitement par des liquides ioniques seuls, ce qui représente un gain à la fois en termes d'économie et d'impact environnemental. Ces liquides ioniques peuvent être 10 recyclés et on a constaté un maintien des performances du procédé après plusieurs cycles de réutilisation des liquides ioniques. Description détaillée - La biomasse 15 Les biomasses qui peuvent être utilisées dans le procédé de la présente invention comprennent, de façon non limitative, une biomasse de cellulose, une biomasse d'hémicellulose, une biomasse lignocellulosique et leurs mélanges. Dans un mode de réalisation préféré, la biomasse est une biomasse lignocellulosique. La biomasse lignocellulosique peut être définie comme la matière végétale 20 ligneuse. Elle se trouve, de façon non limitative, dans le bois et les résidus verts, la paille, la bagasse de canne à sucre, le fourrage, certains déchets de cultures tels que les tiges, les feuilles, les coques, les enveloppes et les épis des plantes ou des feuilles, des branches. La biomasse lignocellulose peut aussi se trouver, de façon non limitative, dans la matière herbacée, les résidus agricoles, les résidus forestiers, les déchets de 25 papier, et les résidus de fabriques de pâtes à papier. La biomasse lignocellulosique se caractérise généralement par la présence de cellulose, d'hémicellulose et de lignine, en teneurs variables suivant l'origine de la biomasse. La biomasse lignocellulosique peut également contenir des protéines, des cendres, des lipides ainsi que d'autres composés organiques. Tous ces exemples de biomasses peuvent être mis en oeuvre dans le 30 procédé de l'invention. De préférence, le procédé de l'invention s'applique à des biomasses lignocellulosiques dans lesquelles l'ensemble composé de la cellulose, l'hémicellulose et la lignine représente au moins 50% en masse par rapport à la totalité de la masse de la biomasse. 35 Il est bien entendu que la biomasse lignocellulosique peut être sous la forme d'un matériau de paroi cellulaire végétale contenant de la lignine, la cellulose et l'hémicellulose dans une matrice mixte. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 9 Parmi les biomasses lignocellulosiques connues utilisables préférentiellement dans le procédé de l'invention, on peut citer : les coques de tournesol, la paille de céréales, comme la paille de blé, la paille de colza, la paille de miscanthus, la paille de riz, les copeaux de bois, tels que le chêne, le pin, l'épicéa, le peuplier ou le bouleau, la paille 5 de blé, les tiges de maïs, les fibres de maïs, l'écorce de riz, le son de blé, la bagasse, le papier, les déchets de traitement de la pâte à papier ou des mélanges de ces matériaux. De préférence, le procédé de l'invention s'applique à des biomasses lignocellulosiques choisies parmi les biomasses d'origine oléagineuse, comme par exemple : les coques de tournesol, la paille de colza, dont les cultures couvrent d'importantes surfaces 10 cultivables, notamment en France. En effet, les cultures d'oléagineux se caractérisent par la proportion importante de déchets non valorisables par les procédés de l'art antérieur. C'est le cas en particulier pour les coques de tournesol qui sont considérées comme un déchet. C'est aussi le cas pour la paille de colza qui peut toutefois, dans un premier temps, être 15 laissée aux champs comme fertilisant. De préférence, avant sa mise en oeuvre dans le procédé de l'invention, la biomasse est soumise à une étape de traitement mécanique permettant de lui donner la forme de particules de taille sensiblement homogène. Un tel pré-traitement mécanique permet de faciliter le pré-traitement de la biomasse de l'étape (a) et d'obtenir un 20 produit de composition sensiblement homogène. Le pré-traitement mécanique permet aussi une reproductibilité améliorée de l'étape (a). Un tel pré-traitement mécanique est avantageusement mis en oeuvre de façon connue, par broyage, ou par hachage, de la biomasse en particules. 25 - Le prétraitement de la biomasse : Selon l'invention, le procédé de traitement de la biomasse comprend au moins une étape (a) de pré-traitement comprenant la mise en contact de la biomasse avec une eau à l'état subcritique en présence d'au moins un liquide ionique hydrophile. Le traitement par une eau en état subcritique est connu de l'homme du métier. 30 Les composants du milieu réactionnel (biomasse, liquide ionique et eau) sont introduits dans le réacteur. Afin de parvenir à des conditions subcritiques, la pression est augmentée par incrément de température et réduite par la purge de la vapeur provenant du réacteur. Il est impossible de définir une pression fixe pour la mise en oeuvre de cette étape, mais ce paramètre est contrôlé, de façon connue de l'homme du 35 métier, afin de rester dans des conditions subcritiques. De façon avantageuse, l'étape (a) a été mise en oeuvre à une température allant de 160°C à 240 °C. En dessous de 160°C on a constaté des résultats moins ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 10 intéressants, en particulier une moindre sensibilité à l'hydrolyse enzymatique en aval. Au delà de 240°C les liquides ioniques hydrophiles présentent une moindre stabilité. La biomasse est mise en contact avec le liquide ionique pendant une durée suffisante pour augmenter l'accessibilité et l'hydrolyse des constituants hydrates de 5 carbone présents dans la biomasse. La mise en contact peut comprendre l'agitation ou le mélange du milieu réactionnel. En règle générale, la biomasse est mise en contact avec une eau à l'état subcritique en présence d'au moins un liquide ionique hydrophile pendant une période de temps allant d'environ 15 minutes à environ 6 heures. Préférentiellement, la biomasse est mise en contact avec une eau à l'état subcritique en 10 présence d'au moins un liquide ionique hydrophile pendant une période de temps allant d'environ 0,5 à environ 4 heures. De façon encore préférée, la biomasse est mise en contact avec une eau à l'état subcritique en présence d'au moins un liquide ionique hydrophile pendant environ 0,5 à 2 heures. Le procédé de l'invention permet en effet d'obtenir une biomasse pré-traitée, 15 sensible à l'hydrolyse, avec des rendements élevés de récupération, en un temps assez court, ce qui confère à ce procédé un avantage économique certain. Le pré-traitement est mis en oeuvre en présence de liquide ionique dans le réacteur. Les liquides ioniques sont des sels qui sont liquides plutôt que cristallins à des températures ambiantes. De nombreux liquides ioniques peuvent être utilisés dans 20 le procédé de prétraitement de la présente invention. De préférence, le liquide ionique est choisi pour sa compatibilité avec le traitement (b) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose. En effet, des résidus en faible quantité de certains liquides ioniques dans la biomasse prétraitée peuvent nuire à l'efficacité du traitement enzymatique de l'étape (b). On choisit de préférence un 25 liquide ionique compatible avec un traitement ultérieur par une cellulase thermostable. Les liquides ioniques mis en oeuvre sont de préférence hydrophiles, ce qui signifie qu'ils sont miscibles en toutes proportions avec l'eau. De préférence le liquide ionique hydrophile est choisi parmi ceux dont le cation est un imidazolium éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyles. 30 De tels liquides ioniques sont bien connus de l'homme du métier, on peut citer notamment, de façon non limitative : les alkanoates de 1-alky1-3-alkylimidazolium, les alkylphosphonates de 1-alky1-3-alkylimidazolium, les alkylsulfates de 1-alky1-3- alkylimidazolium, les méthylsulfonates de 1-alky1-3-alkylimidazolium, les hydrogénosulfates de 1-alky1-3-alkylimidazolium, les thiocyanates de 1-alky1-3- 35 alkylimidazolium, et les halogénures de 1-alky1-3-alkylimidazolium, dans lesquels le terme "alkyle" désigne un groupe alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et un «alkanoate» est un alkanoate comprenant de 1 à 10 atomes de carbone. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 11 Préférentiellement, le terme "alkyle" désigne un groupe alkyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, comme par exemple un groupe méthyle, un groupe éthyle, un groupe propyle ou un groupe butyle. Préférentiellement, l'alkanoate est un acétate. Préférentiellement, 5 l'alkylphosphonate est le méthylphosphonate. Comme exemple de liquides ioniques utilisables dans le procédé de l'invention, on cite notamment : l'acétate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, le méthylphosphonate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-éthy1-3-methylimidazolium, l'hydrogénosulfate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, le méthyl sulfate de 1-éthy1-3- 10 méthylimidazolium, le méthanesulfonate de 1-éthy1-3-methylimidazolium, l'éthylsulfate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, le tétrachloroaluminate de 1-éthy1-3- méthylimidazolium, le thiocyanate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, l'acétate de 1- buty1-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-buty1-3-méthylimidazolium, le formate de 1-buty1-3-méthylimidazolium, le formate de 1-ally1-3-méthylimidazolium le chlorure de 15 1-ally1-3-methylimidazolium, le bromure de 1-ally1-2,3-dimethylimidazolium; l'hydrogénosulfate 1-buty1-3-méthylimidazolium, le méthanesulfonate de 1-buty1-3- méthylimidazolium, le méthyl sulfate de 1-buty1-3-méthylimidazolium, le tétrachloroaluminate del-buty1-3- méthylimidazolium, le thiocyanate de 1-buty1-3- méthylimidazolium), l'éthylsulfate de 1-éthy1-2,3-diméthylimidazolium, le 20 méthylsulfate de tris (2-hydroxyéthyl) méthylammonium, le chlorure de 1- méthylimidazolium, le chlorure de 1-éthylimidazolium l'hydrogénosulfate de 1méthylimidazolium, le méthyl sulfate de 1,2,4-triméthylpyrazolium, le méthyl sulfate de tributylméthylammonium, le méthylphosphonate de 1-éthy1-3-methylimidazolium, le diméthylphosphonate de 1-éthy1-3-methylimidazolium, le diéthylphosphate de 1-éthyl- 25 3-methylimidazolium, le diméthylphosphate de 1-éthy1-3-methylimidazolium, l'acétate de choline, le salicylate de choline, et leurs mélanges. Les liquides ioniques préférés pour la mise en oeuvre de l'invention sont : 30 - l'acétate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium (EmimAc) 0 H3C NNeN.,C H3 H3c-c, 0- 35 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 12 - le méthylphosphonate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium (EmimPh) H 0 5 H3C \/ Ne H3C-0/ 0 Avantageusement, on utilise un liquide ionique ou un mélange de liquides ioniques présentant une pureté supérieure ou égale à 95 % en masse par rapport à la masse totale de liquide ionique, encore plus préférentiellement une pureté supérieure 10 ou égale à 98%. Dans l'étape (a), avantageusement, la quantité de biomasse est de 1 à 30 % en masse par rapport au volume total de liquide. Selon un mode de réalisation encore préféré, la quantité de biomasse est de 1 à 15 % en masse par rapport au volume total de liquide, encore plus préférentiellement de 2 à 10%. Une quantité élevée de 15 biomasse dans le réacteur permet une meilleure viabilité économique du procédé. Dans l'étape (a), avantageusement, la quantité de liquide ionique hydrophile est de 1 à 10 % en volume par rapport au volume total d'eau. Selon un mode de réalisation encore préféré, la quantité de liquide ionique hydrophile est de 2 à 7 % en volume par rapport au volume total d'eau, encore plus préférentiellement de 3 à 5%. 20 Le procédé de l'invention a permis d'obtenir un effet synergique entre le liquide ionique et l'eau subcritique, même en présence de très petites quantités de liquide ionique, ce qui représente un avantage à la fois économique et écologique. Le pré-traitement de l'étape (a) peut être mis en oeuvre en présence d'un cosolvant polaire et miscible avec les liquides ioniques, tel que par exemple de l'éthanol, 25 du méthanol, de l'acétone ou un mélange de ces solvants. Préférentiellement le pré- traitement de l'étape (a) est mis en oeuvre dans un milieu composé de liquide ionique et d'eau. Le milieu obtenu à l'issue de l'étape (a) comporte une partie solide, essentiellement composée de biomasse précipitée, et une partie liquide. 30 Avantageusement, l'étape (a) est suivie d'une étape (b) de filtration et de lavage permettant d'obtenir : d'une part une fraction solide de biomasse pré-traitée, d'autre part une fraction liquide comprenant l'eau et le liquide ionique ainsi qu'une partie de la lignine et des sucres issus majoritairement de l'hémicellulose initialement présente dans la biomasse. Ces sucres sont essentiellement des sucres simples, notamment des 35 sucres en C5, tels que par exemple : du xylose, du mannose, de l'arabinose mais aussi des sucres en C6 issus de l'hémicellulose, tels que par exemple : de l'arabinose, du galactose, du glucose. Le glucose peut également provenir d'une faible dégradation ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 13 partielle de la cellulose comme en témoigne la présence de cellobiose. La fraction solide de biomasse pré-traitée est obtenue à l'issue de l'étape (b) avec un rendement massique élevé par rapport à la masse totale de la biomasse engagée dans l'étape (a). Elle peut être stockée en l'état ou engagée dans un procédé de traitement enzymatique 5 visant à réduire les chaines hydrocarbonées en sucres de petite taille. La biomasse pré- traitée se caractérise, comparativement à la biomasse engagée dans l'étape (a), par une teneur très significativement réduite en hémicellulose. Celle-ci a été transformée au cours de l'étape (a) en résidus de type hydrates de carbone de plus petite taille. 10 - Traitements enzymatiques Avantageusement, l'étape (b) est suivie d'une étape (c) de traitement enzymatique de la biomasse pré-traitée solide, de façon à réduire les chaines hydrocarbonées en sucres de petite taille. Ce traitement enzymatique est réalisé de façon connue de l'homme du métier au moyen d'un traitement par une cellulase, une 15 protéase, une pectate, une xylanase, une lyase, une estérase d'acide férulique et une mannanase ou une combinaison de tels enzymes. Avantageusement, le traitement enzymatique comprend au moins le traitement par des cellulases, comme par exemple un traitement par des cellulases issues de Trichoderma reesei ou d'Aspergillus figer. 20 Après l'hydrolyse enzymatique, les sucres présents dans la biomasse hydrolysée peuvent être fermentés à l'aide d'un ou plusieurs organismes de fermentation, comme par exemple des levures, capable de fermenter certains sucres comme le glucose, le xylose, le mannose et le galactose. Les conditions de fermentation dépendent du produit de fermentation souhaité et sont bien connus de l'homme du métier. La 25 fermentation peut être mise en oeuvre de façon à produire de l'éthanol qui est utilisable comme biocarburant. - Récupération de la lignine et recyclage : Avantageusement, la fraction liquide récupérée à l'issue de l'étape (b), qui 30 comprend le liquide ionique, l'eau, une partie de la lignine engagée dans l'étape (a) et des sucres majoritairement issus de l'hémicellulose, est traitée de façon à éliminer les solvants, au cours d'une étape (d). Au cours de l'étape (d), la majeure partie de l'eau et du liquide ionique sont séparés de façon à récupérer une fraction essentiellement composée de lignine et des sucres majoritairement issus de l'hémicellulose. 35 Avantageusement, l'eau, et éventuellement les co-solvants, est d'abord évaporée, puis le liquide ionique ainsi récupéré peut être réutilisé directement tel quel dans un nouveau cycle de traitement, ou alors soumis à l'étape e). ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 14 La fraction de biomasse contenant la lignine récupérée à l'étape (d) est à ce stade solubilisée dans le liquide ionique. Avantageusement, la fraction de biomasse contenant la lignine, récupérée à l'étape (d), est soumise à une étape (e) de dialyse et de traitement enzymatique permettant de récupérer : d'une part une fraction de lignine 5 et d'autre part un mélange d'eau et de liquide ionique et des sucres majoritairement issus de l'hémicellulose, c'est-à-dire principalement des sucres simples en C5. Ce mélange d'eau et de liquide ionique peut encore être traité thermiquement pour obtenir l'évaporation de l'eau et récupérer une seconde fraction de liquide ionique qui peut être réutilisé directement dans un nouveau cycle de traitement. 10 Avantageusement, le traitement enzymatique de l'étape (e) comprend un traitement par des cellulases, comme par exemple un traitement par des cellulases issues de Trichoderma reesei ou d' Aspergillus figer. Avantageusement, le traitement enzymatique de l'étape (e) comprend un traitement par des xylanases, comme par exemple un traitement par des xylanases 15 issues de Trichoderma viride . De préférence l'étape (e) comprend un traitement par au moins deux enzymes appartenant à deux familles distinctes, telles qu'une cellulase et une xylanase. Figures : 20 Figure 1 : La figure 1 illustre schématiquement les étapes du procédé de l'invention décrit ci-dessus et illustré dans la partie expérimentale. Figure 2 : spectres FTIR de la biomasse de coques de graines de tournesol avant et après les prétraitements. La transmittance (%) est représentée en ordonnée et le nombre d'ondes en abscisse (cm-1). La courbe supérieure correspond aux coques de 25 graines de tournesol n'ayant pas subi de prétraitement. Les courbes inférieures correspondent à la biomasse de coques de graines de tournesol après prétraitement. Figure 3 : spectres FTIR de la biomasse de paille de colza avant et après les prétraitements. La transmittance (%) est représentée en ordonnée et le nombre d'ondes en abscisse (cm-1). La courbe supérieure correspond à la paille de colza n'ayant pas 30 subi de prétraitement. Les courbes inférieures correspondent à la biomasse de paille de colza après prétraitement. Figure 4 : représentation graphique du rendement en glucose (%) après hydrolyse enzymatique de la biomasse de coques de graines de tournesol avant et après les prétraitements. La colonne de gauche correspond à la biomasse de coques de 35 graines de tournesol n'ayant pas subi de prétraitement. Figure 5 : représentation graphique du rendement en glucose (%) après hydrolyse enzymatique de la biomasse de paille de colza avant et après les ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 15 prétraitements. La colonne de gauche correspond à la biomasse de paille de colza n'ayant pas subi de prétraitement. Figures 6A et 6B : représentation graphique de la concentration de la lignine dans les fractions de liquides ionique après prétraitement et séparation de la masse 5 solide. La concentration figure en ordonnée en g/litre. En abscisse les indices RO, R1, Rn désignent le cycle de traitement : RO = premier traitement, R1= premier recyclage, Rn = n-ième recyclage du liquide ionique. Les résultats correspondant aux coques de graines de tournesol sont représentés par des points : (.), les résultats correspondant à la paille de colza sont représentés par 10 des carrés : (M) Partie expérimentale : L'étude a été réalisée à partir de sous-produits et déchets oléagineux : paille de colza et coquilles de tournesol. L'objectif du procédé est de briser la structure 15 complexe et bien organisée de la matrice lignocellulosique et d'étudier le fractionnement, la composition et la modification de la structure (déterminée par hydrolyse enzymatique) observée après prétraitement. Afin de réduire le coût du prétraitement, le procédé a été complété par une étude de recyclage. 20 1. Matériel et Méthodes : 1.1 Matériel On a utilisé comme matières premières de la paille de colza et des coques de graines de tournesol. Les deux biomasses proviennent de l'industrie de l'huile végétale. La taille des particules de biomasse a été réduite à l'aide d'un broyeur FORPLEX 25 POITTEMILL FNG1 équipée d'un rotor à marteaux avec une grille de 500 microns. Les poudres obtenues ont été stockées à 5°C jusqu'à utilisation. Les liquides ioniques utilisés pour le prétraitement sont : - l'acétate de 1-éthyle-3-méthylimidazolium ([EmimAc]) avec une pureté supérieure à 98 % commercialisé par la société Solvonic SA, Verniole, 30 France ; - le méthylphosphonate de 1-éthyle-3-méthylimidazolium ([EmimPh]) avec une pureté supérieure à 98 % commercialisé par la société Solvonic SA, Verniole, France. Les hydrolyses enzymatiques ont été réalisées en utilisant de l'acétate de sodium 35 anhydre (99%) commercialisé par la société Sigma-Aldrich Steinheim, Allemagne, l'acide acétique (99%) commercialisé par la société Carl Roth, Lauterbourg, France et 1CG70114 FR Dépôt Texte 3061908 16 les cellulases de Trichoderma reesei (EC 3.2.1.4), commercialisées par la société Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne), avec une activité de 5 U / mg. Les réactifs utilisés pour la quantification des fibres par la technique Van Soest sont : des solutions d'ADF pour « Acid Detergent Fiber » ou « fibre au détergent 5 acide » en français, commercialisées par la société VWR International Haasrode, Belgique ; de décahydronaphtalène commercialisé par la société VWR international, Briare France ; d'acide sulfurique (95%) commercialisé par la société Fisher scientifique, Loughborough, Royaume-Uni ; d''acétone (99%) commercialisé par la société Fisher Scientifique, Loughborough, Royaume-Uni et enfin de sulfite de 10 sodium (98%) fourni par Aldrich Sternheim, Allemagne. 1.2 Caractérisation physicochimique La caractérisation physico-chimique a été réalisée sur les échantillons avant et/ou après le traitement de l'invention. Les protéines ont été quantifiées par une 15 technique de micro-Kjeldahl (basé sur l'analyse quantitative de l'azote), en appliquant un facteur de conversion N (gN) X 6,25 (gprotéines.gN-1) (AOAC International, 1990). La teneur en eau a été mesurée par la perte de masse après le séchage des échantillons dans un four à 105 ° C. Le contenu en cendres a été obtenu par l'incinération de l'échantillon dans un four à moufles avec une programmation de 20 températures à 550 ° C. Les matières extractibles à l'eau et à l'éthanol ont été déterminées en utilisant la technique décrite par NREL (NREL, 2012) : l'échantillon est porté à ébullition dans l'eau pendant 8 heures, puis au reflux de l'éthanol pendant 12 heures en utilisant un appareil de Soxhlet. La quantification des fibres a été réalisée en utilisant la technique de Van Soest (Goering et Soest, 1970), ce qui nécessite 25 environ un gramme pour déterminer la quantité de cellulose, d'hémicellulose et de lignine. Le prétraitement avec des liquides ioniques est une étape limitante en raison du coût élevé des liquides ioniques (de qualité de laboratoire), aussi cette méthode présente les meilleurs résultats pour un petit échantillon. Les lipides extractibles ont été évalués selon la méthode d'extraction Soxhlet, en utilisant un mélange 1:1 (v:v) 30 d'éther diéthylique-éther de pétrole comme solvant. La masse de l'échantillon de biomasse était de 5g. Le mélange solvant-huile a été distillé en utilisant un évaporateur rotatif sous vide (R BüchiRotavapor-200 avec un bain thermostatique B490 de Büchi, Rugins, France) pendant 5 heures à 40 ° C et à 40 tours/minute, la teneur en lipides a été calculée par la différence de masse dans la fiole. 35 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 17 1.3. Prétraitement de la biomasse Pour cette étape, la biomasse a été prétraitée par trois méthodes : - le traitement de la biomasse par un liquide ionique, - l'extraction par l'eau en état subcritique, 5 - une combinaison de ces deux méthodes consistant en l'extraction par l'eau en état subcritique en présence d'une petite quantité de liquide ionique. 1.3.1. Prétraitement par le liquide ionique (IL) et recyclage du solvant : Le prétraitement par le liquide ionique a été fait suivant le protocole décrit par 10 Auxenfans et al, 2012 Husson et al., 2011 avec quelques modifications : deux cents milligrammes de biomasse ont été pesés, puis 10 mL de liquide ionique ont été ajoutés. La suspension a été incubée dans un bain d'huile à 110 ° C pendant 40 minutes sous agitation magnétique. Après cette période, la réaction a été stoppée avec 10 ml d'eau ultra-pure (déminéralisée ayant une résistivité de 13,3 MQ cm, obtenue à partir 15 d'une eau pure RF BarnstedEasy), et le réacteur a été placé dans un bain de glace sous agitation magnétique pendant 30 minutes, pour augmenter la polarité du milieu. Une fois ce temps écoulé, la fraction liquide a été filtrée (45 microns). Après filtration de la fraction liquide, le solide a été lavé avec 20 ml d'eau ultrapure. Enfin, les deux fractions ont été séchées : la fraction solide par lyophilisation (Christ Alpha 20 ScientificBioblock Fisher 1-2, Amueblados Osterode, Allemagne), et la fraction liquide par évaporation rotative (R BüchiRotavapor-200 avec un bain thermostatique B-490 Buchi, Rugins, France) Les deux fractions ont été stockées à 5 ° C jusqu'à utilisation. 25 1.3.2. Prétraitement classique par l'eau subcritique Le réacteur à haute pression utilisé dans cette étude a été acheté auprès de la société Autoclaves France. Le réacteur a une capacité de 560 ml. L'agitation et la température sont contrôlées par un système automatique. L'eau subcritique est préparée dans un deuxième réacteur et ensuite injectée dans le premier réacteur 30 contenant la biomasse. Pour le prétraitement, la charge solide de biomasse introduite dans le réacteur est de 2% (10 g pour 500 ml d'eau), en utilisant la capacité maximale de volume du réacteur (500 m1). Les conditions de température sont définies dans le système de commande (160, 200, 240 ou 280 ° C). Afin de parvenir à des conditions subcritiques, 35 la pression a été augmentée par incrément de température et réduite par la purge de la vapeur provenant du réacteur. Il est impossible de définir une pression fixe, mais ce paramètre a été contrôlé afin de rester dans des conditions subcritiques. Les ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 18 températures réelles et les pressions de fonctionnement ont été enregistrées. Une fois la durée de traitement passée (30min ou 2h), la dépressurisation est réalisée en déchargeant la vapeur du réacteur. Le réacteur a été laissé à refroidir à température ambiante. Ensuite, la biomasse prétraitée a été recueillie par filtration. La fraction 5 solide a été séchée à l'aide du lyophilisateur décrit ci-dessus, les échantillons ont été stockés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation. 1.3.3. Combinaison des liquides ioniques et de l'eau subcritique La combinaison des pré-traitements (liquide ionique et eau subcritique) a été 10 faite par lots, à l'aide de liquides ioniques introduits dans le réacteur. 2% de la biomasse (environ 10 g) a été immergée directement dans 20 mL de liquide ionique (environ 4% du volume du réacteur, v / v), puis on a suivi le même mode opératoire que pour un pré-traitement par lots classique (addition de 500 ml d'eau subcritique). Comme illustré sur la figure 1, la biomasse lignocellulosique et le liquide ionique sont 15 introduits dans un réacteur pressurisé d'eau subcritique. A l'issue du traitement (160°C/120 min ou 200°C/120 min) la biomasse solide est extraite, filtrée et lavée, elle est utilisable dans un procédé ultérieur de saccharification enzymatique et éventuellement de fermentation. La fraction liquide est récupérée, l'eau en est évaporée, le liquide ionique récupéré soumise à une dialyse et un traitement 20 enzymatique par les cellulases de T.reesei et les xylanases T.viride. Ce traitement permet de récupérer d'une part une fraction lignine et d'autre part un mélange d'eau et de liquide ionique et des sucres majoritairement issus de l'hémicellulose. L'eau est évaporée de cette fraction et le liquide ionique recyclé. 25 1.4. Hydrolyse enzymatique de la cellulose L'hydrolyse enzymatique est un bon indicateur de la conversion du polymère (principalement de la cellulose) en glucose (Auxenfans et al, 2012 ; Husson et al, 2011), reflétant l'accessibilité aux enzymes de la matrice lignocellulosique, et donc le degré de complexité et la structure organisationnelle. Le rendement de conversion de 30 la cellulose en glucose après l'hydrolyse enzymatique a été déterminée après chaque traitement préalable dans la fraction solide. L'hydrolyse de la biomasse catalysée par les cellulases (avant et après traitement préalable) a été effectuée dans des tubes Eppendorf d'un volume de 1,5 mL. Dans une réaction d'hydrolyse typique, 20 mg d'échantillon sont ajoutés à 0,9 ml d'une solution 35 tampon (acétate / acide sodium, l'acide acétique, 50 mM, pH 4,8) et on fait incuber dans un Thermomixer 5436 (Eppendorf Netheler-Hinz, Hambourg, Allemagne) pendant 30 minutes à 40 ° C sous agitation à 1400 tours/min. Pendant le temps ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 19 d'attente, une solution tampon de 60 unités de cellulase / ml a été préparée (10 ou 12 mg / mL en fonction de l'activité enzymatique de 5 unités ou 6 respectivement). Après pré-incubation, 0,1 ml de la solution d'enzyme a été ajoutée pour démarrer l'hydrolyse. Les concentrations finales de la biomasse et de l'enzyme dans le milieu réactionnel 5 étaient de 2% en masse par volume et 1 mg/mL, respectivement. Au bout de 48 heures, 400 microlitres de surnageant ont été décantés et mis à incuber dans un bain d'huile à 90 ° C pendant 20 min. Cette action contribue à dénaturer l'enzyme et arrêter l'hydrolyse enzymatique. Chaque hydrolyse enzymatique a été effectuée en triple. Ensuite, l'échantillon a été dilué avec de l'eau ultra-pure, puis filtré avec un filtre pour 10 seringue de 0,2 micron, avant l'analyse par chromatographie haute performance d'échange d'anions (HPAEC-PAD). L'analyse par HPAEC-PAD a été réalisée en utilisant un appareil Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA, USA) avec un passeur automatique d'échantillons A550, une pompe à gradient GP50 et un détecteur électrochimique ED50 mis en oeuvre dans la méthode ampérométrique pulsée pour la 15 détection des hydrates de carbone. La colonne était une CarboPac PA-20 analytique (150 mm X 3 mm 6 p.m) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) équipée d'une colonne de garde, fonctionnant à 25 ° C avec un gradient de la phase mobile (solvant A et B: 2 et NaOH 200 mM, respectivement, et le solvant C: NaOH 200 mM et de l'acétate de sodium 250 mM) à un débit de 1 mL / min. 20 Le calcul du rendement de glucose après l'hydrolyse enzymatique a été réalisée avec les formules suivantes : Yglucose (%) = glucose (g) x facteur de correction! Cellulose initiale (g) x 100 Facteur de correction = Masse Molaire Glu libre/ Masse Molaire GluPS = 162/180 = 0,9 25 1.5. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) L'appareil utilisé est un spectroscope à transformée de Fourier infrarouge (Shimadzu 8400S, ATROOS FTIR) équipé d'une cellule de réflexion ATR de diamant (réflexion totale atténuée) avec un détecteur DTGS (sulfate de triglycine deutérié). Les 30 spectres d'absorption ont été recueillis sur une plage spectrale de nombre d'onde entre 600 et 4000 cm-1 en utilisant une résolution de 4 cm-1 avec 200 scans. Une masse d'environ 3-5 mg de particules fines de biomasse lyophilisée a été appliquée à la surface du cristal, puis pressée sur la tête du cristal. Deux analyses ont été effectuées. Analyse de l'air ambiant et la correction de fond ont été faites avant chaque analyse. 35 Les scans ont été enregistrées en utilisant le logiciel spectroscopique (version 10. PerkinElmer, Allemagne). L'éthanol et l'acétone ont été utilisés pour nettoyer la pointe de diamant ATR entre deux analyses. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 20 1.6. Indice de Cristallinité (ICR) par résonance magnétique nucléaire (RMN) Les indices de cristallinité (ICR) ont été déterminés par la déconvolution des spectres RMN 13C à partir des zones cristallines (86-92 ppm) et amorphes (79-86 5 ppm) C4 du glucose (Auxenfans et al, 2012a ; Husson et al, 2011). Les ICR ont été donnés à ± 5%. La spectroscopie par polarisation croisée avec rotation à l'angle magique de résonance magnétique nucléaire (CP-MAS 13C) a été réalisée sur un spectromètre Bruker DRX-500 équipé d'une sonde de 4 mm fonctionnant à 125,7452 MHz (canal 13C) et 500,0800 MHz (canal 1H). 10 Cri ( A86__ 92 p h )2, ppm) X 100 La vitesse de rotation du rotor contenant l'échantillon est de 5 kHz. L'étalonnage des spectres de RMN 13C a été réalisé à l'aide d'éthyle-benzène comme référence. 1.7. Microscopie électronique à balayage (MEB) 15 Les micrographies de particules de biomasse avant et après prétraitement ont été obtenues en utilisant un microscope à balayage à haute résolution Quanta 200 FEG (FEI Company, États-Unis). Les échantillons ont été observés sans métallisation à faible vide (pression partielle d'eau dans le vide) en utilisant le mode d'électrons secondaires pour permettre le contraste de la topographie produite par les différences 20 dans la composition chimique des composants. Les conditions d'observation étaient les suivantes : tension d'accélération entre 10 et 20 kV, la distance de travail entre 5 et 9 mm, et une pression comprise entre 0,5 et 2 mbar. 2. Résultats et discussion 25 2.1. Composition de matières premières Le contenu en hémicellulose, cellulose, lignine, protéines, lipides et cendres a été déterminé pour les coques de graines de tournesol et de paille de colza (tableau 1). Une composition similaire d'hémicellulose et de cellulose a été observée dans les deux échantillons, alors que le contenu de la lignine est plus élevé dans les graines de 30 coques de tournesol (17%) que dans la paille de colza (9%). Une quantité plus élevée des composants non-lignocellulosiques (protéines, lipides, cendres) a été observée dans la paille de colza. L'effet de la lignine sur l'accessibilité des autres composants de la paroi cellulaire est considérée comme un effet en grande partie physique, avec des molécules de lignine réduisant la surface disponible pour la pénétration et l'activité 35 enzymatique. Par conséquent, ces résultats suggèrent une résistance plus forte des coques de graines de tournesol au traitement enzymatique que la paille de colza. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 21 Coques de graines de Paille de colza (g/100g) tournesols /100g) Hemicelluloses 23.0 ± 2.0 20.8± 1.2 Cellulose 42.5 ± 1.8 41.6 ± 2.6 Lignine 16.5 ± 0.5 9.0 ± 1.2 Extractibles (*) 12.7 12 Tableau 1 (*) extractibles à l'eau et à l'éthanol (protéines, lipides et cendres) 2.2. Prétraitements 5 Les prétraitements appliqués sur les deux biomasses étaient - Dissolution des polymères hydrophiles lignocellulosiques par un liquide ionique à base d'imidazolium ([Emim Ac] ou ([Emim Ph]) à 110 ° C pendant 40 min. - Extraction à l'eau dans des conditions subcritiques (HPSW) dans un réacteur à haute pression. Des températures modérées pendant les prétraitements à long terme ont 10 été étudiés (200°C pendant 120 min). Selon la littérature, ces conditions permettraient le fractionnement des composantes principales (cellulose, hémicelluloses et lignine), tout en tenant compte des performances du réacteur. - Ajout de liquide ionique à base d'imidazolium ([Emim Ac] ou [Emim Ph]) comme catalyseur en extraction à l'eau dans des conditions subcritiques. Un 15 prétraitement combinant de l'eau subcritique et le liquide ionique (4% en volume par rapport au volume d'eau) à 160 ou 200 ° C pendant 120 minutes a été mis en oeuvre. 2.2.1. Effet des pré-traitements sur la composition de la biomasse La perte de masse après les différents prétraitements des deux biomasses a été 20 déterminée et les résultats sont présentés dans le tableau 2. 25 30 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 22 Coques de graines de Paille de colza (g/100g) tournesols /100g) EmimAc 110°C/40min 14 28 EmimPh 110°C/40min 14.0 29 HPSW 200°C/120min 20 34 HPSW 18 42 240°C/30min HPSW- EmimAc 4% 17 14 160°C/120min HPSW- EmimAc 4% 19 14 200°C/120min HPSW- EmimPh 4% ND 240 ° C) pendant une courte période (30min) les hémicelluloses et la cellulose se dissolvent, ce qui permet la récupération d'une fraction riche en lignine. À l'opposé, une température plus 15 basse (200 ° C) pendant un temps plus long (120 min) induit la solubilité des hémicelluloses permettant la récupération de la fraction riche en cellulose. La combinaison des deux méthodes (BPSW - 4% EmimAc) permet d'observer un effet catalytique avec l'obtention d'une fraction riche en cellulose et une teneur très réduite en hémicelluloses. 20 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 24 2.2.2. Effet de l'EmimAc sur la structure des polymères étudiés par FTIR et RMN Les spectres FTIR de coques de graines de tournesol et de paille de colza sont présentés respectivement sur les figures 2 et 3. Les spectres montrent des bandes 5 centrées sur 3700 et 730 cm-1. Les pics dominants à 3346 cm-1 (allongement des liaisons OH) et 2892 cm-1 (allongement des liaisons CH) attribué à des groupes aliphatiques de trois polymères (cellulose, lignine et hémicellulose) ne sont pas représentés dans les spectres, car les principaux changements ont été observés entre 600 et 200 cm-1. Le pic à 1730 cm-1 dans la biomasse est attribuée à la vibration 10 d'étirement de C = 0 des groupes acétyle dans les hémicelluloses. Les pics caractéristiques de la lignine sont observés à 1591-1505 cm-1 (vibration d'étirement), 1256 cm-1 (déformation asymétrique de CH3) et 1251 cm-1 attribué à l'étirement des cycles aromatiques (vibration CO du noyau syringyle). Les bandes d'absorption à 1093 et 896 cm-1, correspondent respectivement à la vibration d'étirement de CO dans la 15 cellulose / hémicellulose et la vibration de déformation de CH dans la cellulose. Ce dernier pic (896 cm-1) est caractéristique des régions amorphes de la cellulose. Les spectres FTIR de coques de graines tournesol et de paille de colza brutes sont similaires, sauf pour le pic caractéristique de la lignine à 1505 cm-1 correspondant à la vibration d'étirement qui est bien définie sur les spectres de paille de colza. 20 Les principaux impacts du prétraitement HPSW-EmimAc sur les coques de graines de tournesol (figure 2) et sur la paille de colza (figure 3) sont : - la disparition de la bande caractéristique de l'hémicellulose (selon la composition chimique) ; - un effet sur la fraction lignine de délignification partielle ou des changements 25 structurels ; - un impact sur la fraction de cellulose de diminution de l'intensité des bandes liées à des régions amorphes. En ce qui concerne les pics caractéristiques de la cellulose, considérés dans les deux biomasses, les pics des régions cristallines (1093 cm-1) ont présenté une intensité 30 plus élevée après traitement préalable HPSW + liquide ionique et suggèrent une fraction enrichie en cellulose, confirmée par les résultats des compositions (tableau 3). En outre, les pics des régions amorphes (893 cm-1) présentent une nette augmentation dans les échantillons après prétraitement au liquide ionique dans les deux biomasses, ainsi qu'après prétraitement à l'eau subcritique à 200 ° C / 120 min dans les coques de 35 graines de tournesol et à 240 ° C / 30 min dans la paille de colza. Dans le cas des échantillons prétraités par HPSW- EmimAc 4%, les pics de la région cristalline présentent une augmentation d'intensité importante, alors que les pics des régions ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 25 amorphes sont absents dans les deux biomasses (coques de graines de tournesol et paille de colza). Pour compléter, l'Indice de Cristallinité (ICR%) a été déterminée par RMN et est rapporté dans le tableau 4 pour les deux biomasses. Considérant que le 5 prétraitement au liquide ionique a entrainé la diminution de l'ICR% dans les deux échantillons, les prétraitements HPSW et HPSW-EmimAc 4% ont augmenté considérablement cet indice. Enfin, le pré-traitement des deux échantillons avec du liquide ionique n'entraine pas de modifications sur les pics caractéristiques (730cm-1) des hémicelluloses. Les 10 prétraitements HPSW et HPSW-EmimAc 4% conduisent à la disparition des pics caractéristiques des hémicelluloses, qui peut être expliquée par une dissolution totale des hémicelluloses, cette hypothèse a été confirmée par analyse de la composition (tableau 3). Les résultats des analyses de composition confirment la dissolution de la lignine 15 dans le liquide ionique, en effet la concentration de lignine de la fraction solide diminue dans les coques de graines de tournesol de 17-14 g / 100 g, ainsi que dans la paille de colza 9-5 g / 100g. Le même effet est observé pour la cellulose dont la concentration diminue dans les coques de graines de tournesol de 42-31 g / 100g et dans la paille de colza 42-33 g / 100g. 20 2.2.3. Rendement en glucose après hydrolyse enzymatique L'effet des prétraitements sur le rendement en glucose (après hydrolyse enzymatique) est représenté sur les figures 4 et 5 respectivement pour les coques de graines de tournesol et la paille de colza. 25 On constate que la combinaison des prétraitements comparativement au prétraitements individuels par l'eau subcritique (HPSW) conduit à une amélioration de la digestibilité enzymatique de la fraction de cellulose et à l'obtention de performances de saccharification similaires à celles du traitement par un liquide ionique seul. 30 2.2.4. Indice de cristallinité Les résultats des analyses sont rapportés dans le tableau 5 ci-dessous : 35 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 26 Prétraitements Coques de graines de Paille de colza tournesols Aucun 13.2 22.6 EmimAc 110°C/40min 10.0 14.0 HPSW 200°C/120min 43.1 47.7 HPSW- EmimAc 4% 45.6 42.0 200°C/120min Tableau 5 Les valeurs des indices de cristallinité rapportées dans le tableau 5 sont données à ±5%. On constate une augmentation de la cristallinité induite par un traitement à l'eau 5 subcritique qui est conservé en présence de liquide ionique. 2.3. Influence de la charge de biomasse : Sauf indication contraire, les essais ont été réalisés avec une charge de 2% en masse de biomasse par rapport au volume de liquide. 10 Des essais à des concentrations de 5 et 10 % ont également été réalisés afin d'évaluer la faisabilité du traitement à une plus forte concentration. Le pré-traitement réalisé était HPSW-EmimAc 4% 200°C/120min. Le rendement de récupération de la biomasse et la composition des fibres insolubles (en pourcentages en masse d'hémicelluloses, de cellulose et de lignine par 15 rapport à la masse totale de la biomasse récupérée) avant et après le prétraitement des coques de graines de tournesol et de la paille de colza sont résumées dans le tableau 6. Charge (%m/v) Masse récupérée Hemicellulose Cellulose Lignine (%) Coques de graines de tournesol 2 81 ± 3 0 27 ± 1.8 14 ± 2.6 5 85 ± 2 1 ± 0.3 33 ± 2.1 19 ± 1.79 Paille de colza 2 86 ± 2 2 ± 0.7 31 ± 0.9 8 ± 0.7 5 75 ± 4 2 ± 1.2 27 ± 1.1 8 ± 1.3 10 80 ± 2 2 ± 0.6 32 ± 1.5 9 ± 1.1 Tableau 6 20 ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 27 2.4. Recyclage du liquide ionique : On a constaté un maintient des performances du procédé sur la dégradation enzymatique en glucose obtenue après plusieurs recyclages du liquide ionique mis en oeuvre conformément au schéma représenté sur la figure 1 et dans les mêmes 5 conditions opératoires que rapporté au § 1.3.3 ci-dessus (jusqu'à 7 cycles). 2.5. Récupération de la lignine dans la fraction liquide ionique : On constate sur les figures 6A et 6B une délignification plus faible avec le prétraitement HPSW-EmimAc 4% 200°C/120 min (figure 6B) comparativement au 10 traitement avec le liquide ionique seul (EmimAc 110°C/40 min) (figure 6A). L'analyse statistique du recyclage a été réalisée par une analyse de la variance et la différence entre les pré-traitements a été évaluée par la méthode HSD de Tukey. Références bibliographiques 15 Ahmed, IN., Sutanto, S., Huynh, L.H., Ismadji, S., Ju, Y.-H., 2013. 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Procédé de traitement d'une biomasse, ce procédé comprenant au moins (a) la mise en contact de la biomasse avec une eau à l'état subcritique en présence d'au moins un liquide ionique hydrophile. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la quantité de biomasse est de 1 à 30 %, de préférence de 1 à 15 %, encore plus préférentiellement de 2 à 10% en masse par rapport au volume total de liquide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel la quantité de liquide ionique hydrophile est de 1 à 10 %, de préférence de 2 à 7 %, encore plus préférentiellement de 3 à 5% en volume par rapport au volume total d'eau. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la biomasse est une biomasse lignocellulosique, de préférence choisie parmi les biomasses d'origine oléagineuse, comme les coques de tournesol, la paille de colza. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le liquide ionique hydrophile est choisi parmi ceux dont le cation est un imidazolium, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyles, de préférence des alkyles en C1-C4. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le liquide ionique hydrophile est choisi parmi les sels organiques de 1-éthy1-3-méthylimidazolium, encore plus préférentiellement parmi l'acétate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium et le méthylphosphonate de 1-éthy1-3-méthylimidazolium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel à l'étape (a) le milieu réactionnel est soumis à une température allant de 160 à 240°C. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel à l'étape (a) le milieu réactionnel est soumis à une température allant de 160 à 240°C pendant une durée allant de 15 minutes à six heures, de préférence de 30 minutes à quatre heures, encore plus préférentiellement de 30 minutes à deux heures. ICG70114 FR Dépôt Texte 3061908 30 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (a) est précédée d'un traitement mécanique permettant d'obtenir une biomasse sous forme de particules de taille contrôlée, notamment un broyage de la biomasse. 5 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (a) est suivie d'une étape (b) de filtration et de lavage permettant d'obtenir : d'une part une fraction solide de biomasse pré-traitée, d'autre part une fraction liquide comprenant l'eau et le liquide ionique ainsi que de la lignine. 10 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'étape (b) est suivie d'une étape (c) de traitement enzymatique de la biomasse pré-traitée solide, notamment un traitement par des cellulases, comme par exemple les cellulases issues de Trichoderma reesei. 15 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'étape (c) est suivie d'au moins une étape de fermentation. 13. Procédé selon la revendication 10, qui comprend en outre à l'issue de l'étape (b) une étape (d) d'élimination des solvants, avantageusement une étape (d) 20 d'élimination de l'eau de la fraction liquide. 14. Procédé selon la revendication 13 dans lequel l'étape (d) est suivie d'une étape (e) de dialyse et de traitement enzymatique permettant de récupérer : d'une part une fraction de lignine et d'autre part un mélange comprenant l'eau et le liquide 25 ionique. 15. Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14 dans lequel le liquide ionique obtenu à l'issue de l'étape (d) et éventuellement de l'étape (e) est réutilisé dans l'étape (a) d'un nouveau cycle de traitement d'une biomasse. 30