FR 3054564 A1 20180202 FR 1657324 A 20160728 1 Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH La présente invention concerne un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH, une composition comprenant au moins un tel substrat, un marqueur diagnostique comprenant un tel substrat, ainsi que leurs utilisations et méthodes associées. Les aldéhydes déshydrogénases (ALDHs) sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'oxydation (déshydrogénation) des aldéhydes. A ce jour, dix-neuf gènes codant pour les ALDHs ont été identifiés dans le génome humain. Ces gènes participent à une grande variété de processus biologiques, y compris la détoxification des aldéhydes générés par voie exogène et endogène. Les ALDHs se retrouvent dans toutes les régions subcellulaires y compris dans le cytosol, dans les mitochondries, dans le réticulum endoplasmique et le noyau, plusieurs d'entre elles se retrouvant dans plus d'un compartiment. La plupart des ALDHs ont une large distribution tissulaire et affichent une spécificité de substrat distinct. Généralement considérées comme des enzymes de détoxification, il a été montré que les ALDHs ont une action de protection contre la cytotoxicité induite par les aldéhydes. Les ALDHs auraient par ailleurs un rôle central dans les fonctions et les processus physiologiques, tels que l'embryogenèse et le développement. En particulier, l'isoenzyme ALDH1 jouerait un rôle central dans l'embryogenèse et le développement par la médiation de la signalisation de l'acide rétinoïque. Elle serait également impliquée dans la détoxification du méthional alors que l'ALDH3 serait impliquée dans celle du 4-hydroxynonal, ces deux composés étant des aldéhydes apoptogéniques endogènes. Les ALDH1 et ALDH3 seraient également liées aux mécanismes de défense cellulaire contre les rayonnements UV induisant des dommages dans le tissu oculaire. L'isoenzyme ALDH2 est quant à elle une isoenzyme mitochondriale principalement liée à la détoxification de l'acétaldéhyde dans la deuxième étape du métabolisme de l'alcool. Il y a plus de 20 ans, les ALDHs ont été étudiées pour leur utilisation potentielle en tant que marqueur universel des cellules souches normales et cancéreuses, étant donné que certaines isoenzymes des ALDHs auraient été identifiées comme des éléments clés de ces cellules. Par exemple, il a été montré que l'ALDH1 était élevée dans les cellules souches hématopoïétiques et pouvait être utilisée pour les isoler. Une méthode commune utilisée pour identifier et isoler les cellules souches grâce à leur haute activité ALDH est l'utilisation du test ALDEFLUORTM (Stemcell Technologies 3054564 2 Inc.). Ce test ALDEFLUORTM utilise un substrat fluorescent pouvant être métabolisé par de nombreuses isoenzymes de l'ALDH. Dans ce test, le substrat de l'ALDH : BODIPY-aminacétaldéhyde (BAAA) est convertit en BODIPY-aminoacétate en présence d'ALDH, et celui-ci s'accumule dans les 5 cellules et accroît leur fluorescence par l'émission d'une couleur verte. Cependant, l'ALDEFLUORTM ne permet pas de différencier les différentes isoenzymes de l'ALDH. Malgré des recherches actives, le rôle des différentes isoenzymes de l'ALDH dans différents domaines tels que les cellules souches ou la cancérologie restent énigmatiques. 10 Comprendre le métabolisme des différentes isoenzymes dans le contrôle du phénotype cellulaire et pendant le développement, l'homéostasie tissulaire ou la réparation, ainsi que dans la cancérogenèse pourrait pourtant ouvrir des perspectives importantes en biologie tissulaire. Il existe donc un besoin d'identifier de nouveaux substrats qui seraient spécifiques 15 des différentes isoenzymes de l'ALDH. C'est dans ce contexte que les inventeurs de la présente invention ont découvert un outil permettant d'identifier les différentes isoenzymes de l'ALDH, en développant de nouveaux substrats spécifiques de celles-ci. La présente invention a donc pour objet un substrat spécifique d'une isoenzyme 20 de l'ALDH comprenant un composé : (a) de formule (I): R-COO-A (I); ou (b) de formule (II) : 25 30 dans lequel : R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; et - A-OH est un traceur fluorescent. 0 3054564 3 La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon invention pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire. La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon l'invention pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches 5 cancéreuses. La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon l'invention pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches. La présente invention concerne également une composition comprenant au moins 10 un substrat spécifique selon l'invention. La présente invention concerne également un marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'invention. La présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon l'invention pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme 15 de l'ALDH. En particulier, le marqueur est utilisé pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses. La présente invention concerne également une méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, 20 ladite méthode comprenant: (a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat spécifique selon l'invention, (b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire; et (c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la 25 fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec au moins un substrat spécifique selon l'invention. La présente invention concerne également un kit pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention. 30 Tel qu'indiqué précédemment, l'invention concerne un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant un composé : (a) de formule (I): R-000-A (I); ou (b) de formule (Il) : 3054564 dans lequel : R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le 5 rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diéthylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; et - A-OH est un traceur fluorescent. Par « substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH », on entend une molécule chimique qui va interagir spécifiquement avec une isoenzyme particulière de l'ALDH telle 10 que l'ALDH1 ou l'ALDH3 par exemple, pour produire une réaction chimique qui, dans le cadre de la présente invention, va permettre de libérer une molécule fluorescente permettant ainsi d'identifier de façon certaine ladite isoenzyme particulière de l'ALDH. Ainsi, dans le contexte de l'invention, le substrat spécifique sera clivé par une isoenzyme de l'ALDH qui permettra la libération du traceur fluorescent A-OH. 15 Le substrat spécifique selon l'invention résulte de l'estérification du traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant RCOOH ou R'COOH. Par exemple, dans le cas où R et/ou R' est un heptyle, l'ester correspondant est l'octanoate, lorsque R et/ou R' est un éthyle, l'ester correspondant est le propionate, lorsque R et/ou R' est un phényle, l'ester correspondant est le benzoate, lorsque R et/ou 20 R' est un 3-aminopropyle, l'ester correspondant est le 4-aminobutyrate, etc. Le tableau 1 ci-dessous donne la structure des substituants R et R' selon l'invention, liés au traceur fluorescent. Le tableau indique également la spécificité de chaque substrat vis-à-vis des isoenzymes de l'ALDH. Tableau 1 Agent acylant (R/R1 ALDH spécifique ALDH1 ._ ' 0 ALDH1 , 0 4 3054564 5 0 ALDH1 A 0 ALDH3 OSA r gOl 0 ALDH3 N OSA HO \ O ALDH3 0,A H2NcyA O ALDH9 Par « traceur fluorescent » on entend un composé chimique identifiable par fluorescence. En particulier, un traceur fluorescent selon l'invention est un fluorochrome ou un fluorophore c'est à dire une substance chimique capable d'émettre de la lumière 5 de fluorescence après excitation. Dans le cadre de la présente invention, le fluorophore sera libéré sous l'action d'une isoenzyme de l'ALDH. Les fluorophores sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple Manafi (2000) Int. J. Food Microbiol. 60:205-218). 10 Différents traceurs fluorescents selon l'invention figurent dans le tableau 2 ci- dessous. 3054564 6 Tableau 2 Traceur Structures et Formules Couleur d'émission 7-hydroxycoumarine HO gpi O O bleu Formule = C9H603 Fluorescéine HO le O - vert Formule= C20H1205 O le OH 2-méthyl-4-méthoxy- Tokyo Green HO gOl / el O / 0 el O vert Formule= C21H1604 Résorufine HO O O rouge Formule= C12H7NO3 N 5 En particulier, dans le cadre de la présente invention, A-OH est choisi parmi la 7- hydroxycoumarine, un fluorophore de la famille des tokyo green, en particulier le 2- méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, la résorufine et la fluorescéine. Ces traceurs sont tous connus de l'homme du métier et sont soit disponibles commercialement, soit peuvent être synthétisés par des méthodes bien connues de l'homme du métier. 3054564 7 En particulier, le 2-méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green est aussi nommé 6-Hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylpheny1)-3H-xanthen-3-one, 2-Me-4-OMe TokyoGreen ou 2-Me-4- OMe TG. Ainsi, on peut citer à titre de substrat spécifique selon la présente invention les 5 molécules suivantes : le rétinoate de résorufine, le propionate de résorufine, l'octanoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-aminobutyrate de résorufine, l'hexanoate de résorufine, le 4-diéthylaminobenzoate de résorufine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- 10 aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7- hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2- méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, l'octanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le benzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4-aminobutyrate de 2-méthy1-4- 15 méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, 4diéthylaminobenzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de fluorescéine, le di-octanoate de fluorescéine, le di-benzoate de fluorescéine, le di-4aminobutyrate de fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine, le di-4- 20 diéthylaminobenzoate de fluorescéine ou le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine. Comme indiqué précédemment « ALDH » est utilisé pour « aldéhydes déshydrogénases » et représente un groupe d'enzymes de type déshydrogénases qui existe sous des formes constitutives et inductibles. Chez l'être humain, 19 ALDHs ont été identifiées, dont autant de gènes. Ils sont 25 répartis en sous-groupes : l'ALDH1 regroupant ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 et ALDH1L2, l'ALDH2, I'ALDH3 regroupant ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1 et ALDH3B2, I'ALDH4, I'ALDHS, I'ALDH6, l'ALDH7, l'ALDH8, l'ALDH9, l'ALDH16, et l'ALDH18. En particulier, un substrat spécifique selon l'invention est un substrat spécifique de 30 l'ALDH1 ou de l'ALDH3. Selon un mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDH1, R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, l'hexanoate ou le propionate. En particulier, lorsque l'isoenzyme de I'ALDH est l'ALDH1, un substrat spécifique selon l'invention est choisi parmi le rétinoate de résorufine, l'hexanoate de résorufine, le 3054564 8 propionate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7- hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de 5 fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDH3, R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à obtenir l'octanoate, le 4-hydroxy-2-nonenoate, le 4-diéthylaminobenzoate ou le benzoate. En particulier, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDH3, un substrat spécifique 10 selon l'invention est choisi parmi l'octanoate de résorufine, le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-diéthylaminobenzoate de résorufine l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7-hydroxycoumarine, le 4-diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 2-méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthy1-4-méthoxy- 15 Tokyo Green, le benzoate de 2-méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthy1- 4-méthoxy-Tokyo Green , le di-octanoate de fluorescéine, le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine, le di-benzoate de fluorescéine le di-4-diéthylaminobenzoate de fluorescéine. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est I'ALDH9, R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à obtenir 20 le 4-aminobutyrate. En particulier, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est I'ALDH9, un substrat spécifique selon l'invention est choisi parmi le 4-aminobutyrate de résorufine, le 4-aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, le 4-aminobutyrate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-4- aminobutyrate de fluorescéine. 25 Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une composition comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention. La composition selon l'invention comprend ainsi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 ou plus de substrats spécifiques selon l'invention. Ladite composition permet ainsi de détecter et d'identifier directement plusieurs 30 isoenzymes de l'ALDH. Par exemple, la composition comprend un substrat spécifique de l'ADLH1 et un substrat spécifique de l'ALDH3 ou un substrat spécifique de l'ALDH1 et de l'ALDH9, ou de l'ALDH3 et de l'ALDH 9 ou de l'ALDH1, de l'ALDH3 et de l' ALDH9. Ainsi la composition selon l'invention peut par exemple comprendre un ou plusieurs des substrats spécifiques suivants : le rétinoate de résorufine, le propionate de 35 résorufine, l'octanoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-aminobutyrate de 3054564 9 résorufine, l'hexanoate de résorufine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le 4diéthylaminobenzoate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7hydroxycoumarine, le 4-aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7- 5 hydroxycoumarine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'octanoate de 2-méthy1-4- méthoxy-Tokyo Green, le benzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4- aminobutyrate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy- 10 Tokyo Green ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4- diéthylaminobenzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de fluorescéine, le di-octanoate de fluorescéine, le di-benzoate de fluorescéine, le di-4-aminobutyrate de fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine ou le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine, le di-4- 15 diéthylaminobenzoate de fluorescéine. En particulier, le substrat spécifique selon l'invention est caractérisé en ce que l'isoenzyme de I'ALDH est détecté dans une population cellulaire. Par « population cellulaire », on entend un ensemble de cellules de même origine ou d'origine différente et dont les caractéristiques (séquences génétiques, niveaux 20 d'expression, état de différentiation) sont identiques ou différentes. En particulier la population cellulaire comprend au moins 2 cellules, par exemple 10, 100, 1000 ou 1000000 cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation de la présente invention, le substrat spécifique est détecté in vitro ou ex vivo par l'utilisation de la technique de fluorescence en plaque, 25 de la technique de cytométrie en flux et/ou d'immunofluorescence. Les substrats spécifiques selon l'invention sont utiles pour identifier les différentes isoenzymes de I'ALDH. Ils permettent notamment d'identifier des cellules exprimant les différentes isoenzymes de I'ALDH (par exemple, certains types de cellules souches) et de les distinguer dans une population mixte de celles qui n'expriment pas d'isoenzyme de 30 I'ALDH ou pas la même isoenzyme de I'ALDH. Les substrats selon l'invention peuvent également permettre de distinguer des cellules qui expriment une isoenzyme de I'ALDH à un degré élevé des cellules qui l'expriment à un degré moindre. Ainsi la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour quantifier au moins une isoenzyme de I'ALDH dans une population 35 cellulaire. 3054564 10 Ainsi la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour isoler et/ou sélectionner une partie d'une population cellulaire surexprimant une isoenzyme de l'ALDH. Ainsi la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat 5 spécifique selon l'invention pour trier toute ou une partie d'une population cellulaire en fonction de son expression d'au moins une isoenzyme de l'ALDH. Par « au moins une » isoenzyme de l'ALDH, on entend 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18 ou 19 isoenzymes de l'ALDH. Les 19 isoenzymes ont été décrites précédemment. 10 « Au moins un » substrat spécifique selon l'invention a la même signification que précédemment décrit. La présente invention concerne également une méthode pour quantifier au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, comprenant l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention. 15 La quantification peut être réalisée en utilisant une technique de fluorescence par plaque. L'identification et/ou la quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH permet ainsi de distinguer et/ou d'identifier différents types cellulaires. Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour distinguer des cellules souches saines de cellules 20 souches cancéreuses. Elle concerne également une méthode pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses comprenant l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention. Ladite méthode et ladite utilisation permettent également d'isoler ces cellules, en 25 incluant par exemple une étape d'isolement des cellules présentant une fluorescence. Par « cellules souches cancéreuses », on entend par exemple des cellules souches de cancer de la vessie, du sein, du col de l'utérus, du côlon, de la tête et du cou, du foie, du poumon, du pancréas, de la prostate, de l'ovaire, de leucémie. En particulier, le substrat spécifique selon l'invention est utilisé pour distinguer les 30 cellules souches de cancers solides et/ou les tumeurs malignes hématologiques. Par « cancer solide », on entend par exemple le cancer du sein, du poumon ou de la prostate. Par « tumeurs malignes hématologiques », on entend par exemple la leucémie, les lymphomes ou le myélome. 3054564 11 En particulier, les cellules souches d'intérêt sont les cellules hématopoïétiques cancéreuses ou saines. L'identification et/ou la quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH permet également de caractériser différentes étapes d'une maladie ou de la différentiation des cellules. 5 Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches. Elle concerne également une méthode pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches comprenant 10 l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention. Par « différentes étapes de la différenciation des cellules souches », on entend les étapes qui sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les étapes suivantes : cellules indifférenciées, cellules peu différenciées, cellules modérément différenciées et cellules bien différenciées. 15 Par « différentes étapes d'un cancer », on entend les étapes qui sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les étapes suivantes : tumeur ou cancer indifférencié, tumeur ou cancer peu différencié, tumeur ou cancer modérément différencié, tumeur ou cancer bien différencié. Les substrats spécifiques selon l'invention, en permettant l'identification et/ou la 20 quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH, sont utiles en tant que marqueur diagnostique. La présente invention concerne donc également un marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'invention. Par « marqueur diagnostique », on entend le sens couramment attribué à ces 25 termes par un homme du métier c'est-à-dire un élément caractéristique permettant de confirmer ou d'infirmer un diagnostic. Selon un mode de réalisation de la présente invention, le marqueur diagnostique selon l'invention est un substrat spécifique selon l'invention. Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon 30 l'invention pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH. Elle concerne également une méthode pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant l'utilisation d'un marqueur selon l'invention. 3054564 12 Une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH est une maladie impliquant que ladite isoenzyme va être surexprimée ou sous exprimée chez le sujet malade par rapport à l'expression dite normale, c'est-à-dire l'expression observée chez un sujet saint. 5 Par « surexprimée » ou « surexpression », on entend un taux d'expression chez le sujet malade supérieur à celui du sujet sain. Par « sous exprimée » ou « sous expression », on entend un taux d'expression chez le sujet malade inférieur à celui du sujet sain. Une telle maladie peut être choisie parmi les cancers, les troubles de la motilité du 10 sperme, les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites. Par « cancer », on entend par exemple la leucémie, le cancer du sein ou le cancer du poumon. Par « troubles de la motilité du sperme », on entend les troubles influant sur la vitesse à laquelle le sperme peut se déplacer et passer à travers le col de l'utérus, l'utérus 15 et les trompes de Fallope de la femme. La présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon l'invention pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses. 20 Elle concerne également une méthode pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses comprenant l'utilisation d'un marqueur selon l'invention. Par « sujet », on entend dans le cadre la présente invention, un animal à sang 25 chaud tel qu'un mammifère, animal ou humain, en particulier un être humain. Le sujet peut être un sujet sain ou un sujet qui est atteint de, ou qui a le potentiel d'être atteint d'une ou plusieurs maladies et/ou affections décrites dans le cadre de la présente invention. Par « thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH », on entend une 30 thérapie dont la cible directe ou indirecte serait une isoenzyme de l'ALDH tel que par exemple l'ALDH1, ALDH3, l'ALDH9 ou plusieurs isoenzymes de l'ALDH. Par « thérapie dirigée contre les cellules souches cancéreuses », on entend une thérapie dont la cible serait les cellules souches cancéreuses dont une des caractéristiques est le niveau élevé d'ALDH. 3054564 13 Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, ladite méthode comprenant: (a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat 5 spécifique selon l'invention, (b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire; et (c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec ledit au moins substrat spécifique. 10 Par « mise en contact », on entend en particulier l'incubation avec au moins un substrat spécifique selon l'invention pendant un temps défini allant de quelques minutes, par exemple 30 minutes à plusieurs heures, par exemple 4 heures ou plus, avec la population cellulaire. Une « population cellulaire » est telle que définie précédemment. « Au moins une 15 isoenzyme de l'ALDH » et « au moins un substrat spécifique selon l'invention » sont tels que définis précédemment. La mesure de la fluorescence peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple l'utilisation du fluorimètre, du cytomètre en flux ou par microscopie à fluorescence. 20 Par « une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec le substrat spécifique », on entend une florescence de la population cellulaire étudiée supérieure à la fluorescence de cette même population cellulaire avant que celle-ci ait été mise en contact avec le substrat spécifique selon l'invention. 25 Si au moins deux substrats spécifiques d'au moins deux isoenzymes de l'ALDH différentes sont mis en contact avec la population cellulaire, ladite méthode peut également comprendre une étape additionnelle d) comprenant la distinction entre les cellules exprimant les au moins deux isoenzymes de l'ALDH. Cette distinction peut par exemple être réalisée en observant des couleurs de 30 fluorescence différentes en fonction de l'isoenzyme détectée. A titre d'exemple, si la méthode comprend la mise en contact de la population cellulaire avec du rétinoate de résorufine et de l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, les cellules présentant une fluorescence accrue de couleur rouge seront identifiées comme exprimant l'ALDH1 alors que les cellules présentant une fluorescence accrue de couleur 35 bleue seront identifiées comme exprimant l'ALDH3. 3054564 14 Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également un kit pour les différentes utilisations mentionnées dans le cadre de la présente invention, en particulier pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH, plus particulièrement dans une population cellulaire, comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention. 5 Le kit peut être également un kit pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH, ladite maladie étant choisie par exemple parmi : les cancers, les troubles de la motilité du sperme les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites; pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules 10 souches cancéreuses ; pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses, par exemple pour distinguer les cellules souches de cancers solides et/ou de tumeurs malignes hématologiques ; ou pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches. Les kits selon l'invention peuvent par exemple comprendre en outre des 15 instructions pour l'utilisation dudit kit pour déterminer la quantité d'une isoenzyme de l'ALDH, en particulier dans une population cellulaire, pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH, pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses, pour distinguer des cellules 20 souches saines de cellules souches cancéreuses, ou pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches. Les différents composés inclus dans un kit selon l'invention peuvent être fournis sous forme d'un solide (par exemple lyophilisée) ou sous forme liquide. Les kits de la présente invention peuvent éventuellement comprendre des 25 récipients différents (par exemple, une ampoule, un tube à essai, un flacon ou une bouteille) pour chaque composé. Chaque composé sera généralement aliquote dans son conteneur ou fourni sous une forme concentrée. D'autres récipients appropriés pour la réalisation de certaines étapes des méthodes décrites dans le cadre de la présente invention peuvent également être fournis. 30 La présente invention sera illustrée plus en détails par les figures et exemples suivants. Figures Figure 1 : Tracé de Michaelis-Menten pour déterminer le Km et la Vmax du propionate de 35 résorufine sur les ALDH1A1, ALDH2 etALDH3A1. 3054564 15 Figure 2 : Dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après un traitement à l'ARN interférant ALDH1A1. Figure 3 : Dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après traitement aux inhibiteurs d'ALDH 1 et 3. 5 Figure 4 : Activité ALDH1 détecté par cytométrie en flux via le propionate de résorufine. Exemples 1. Préparation des substrats spécifiques selon l'invention 10 Conditions opératoires Les réactifs et solvants commerciaux (Fisher, Sigma, Fluorochem etc ...) ont été utilisés sans purification excepté le dichlorométhane distillé sous atmosphère inerte sur CaH2. Les réactions ont été suivies par chromatographie sur couche mince sur des feuilles d'aluminium recouvertes de gel de silice Macherey-Nagel ALUGRAM SIL G/UV254 15 (épaisseur 0,2 mm), l'observation des plaques ayant été réalisée sous lampe ultraviolet à 254 et 312 nm. Les chromatographies sur colonne ont été réalisées sur gel de silice Macherey-Nagel 60M (40-63 pm) sous pression d'air. Les points de fusion ont été mesurés avec un appareil Tottoli Büchi SMP-20 et n'ont pas 20 été corrigés. Les spectres RMN 1H ont été enregistrés avec des appareils Brucker ALS300 ou DRX300 à 300 MHz. Les spectres RMN 130 ont été obtenus sur des appareils Brucker DRX300 à 75 MHz. Les déplacements chimiques Ô sont exprimés en partie par million (ppm), le pic résiduel du solvant ayant été pris comme référence interne. Les constantes de couplage J 25 sont exprimées en Hz. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode positif sur un spectromètre de masse à temps de vol hybride (MicroTOFQ-II, Bruker Daltonics, Bremen) avec une source electrospray (ESI). Le flux de gaz de pulvérisation était à 0,4 bar et la tension capillaire à 3500v. Les 30 solutions ont été perfusées à 10 pl/min dans un mélange de solvants (méthanol/ dichlorométhane/eau 45/40/15) avec de l'acide formique à 1%. La plage de masse de l'analyse était 50-1000m-z et l'étalonnage a été effectué avec du formate de sodium. Exemples de structure des substrats spécifiques selon l'invention 35 Tableau 3 3054564 16 N 0 Propionate de résorufine JO . * 0 jt 0 aN & 0 Hexanoate de résorufine 0 N 0 Octanoate de résorufine a & 0 N 0 Benzoate de résorufine °iggi 0 0 N o 4-diéthylaminobenzoate de résorufine °* a 0 0 Et ,N n'Ir I Et el N Rétinoate de résorufine \ 0 01 i 00 ---.....-----.....r oel ,- o001 o Hexanoate de 2-méthyl4-méthoxy-Tokyo Green lel OMe \V\V\Vr00 0 Octanoate de 2-méthy1-4- méthoxy-Tokyo Green 0 el el el OMe 0ifillh 0 Octanoate de 4- 0 W 0 hydroxycoumarine o Di-hexanoate de . o fluorescéine ° lel i3. ,, 0 lei 0 0 Di-octanoate de . 0 fluorescéine 0 ..---"\---"\--11 el * 0 0 0 3054564 17 Di-rétinoate fluorescéine de Esters de résorufine Propionate et benzoate de résorufine Les composés ont été préparés à partir de la résorufine (sel de sodium) (Sigma) à 5 l'aide du chlorure d'acide (2 équivalents) correspondant dans le dichlorométhane (0.05M) en présence de DIPEA (diisopropyléthylamine, 2 équivalents). Pour le proprionate, à une suspension de sel de sodium de résorufine (235.2 mg, 1.0 mmol) dans 20 mL de DCM anhydre ont été ajoutés la DIPEA (2 équivalents) à température ambiante puis le chlorure de propionyle (2 équivalents) goutte à goutte à 10 0°C. Après 5 minutes à 0°C le milieu réactionnel aété porté à température ambiante et agité la nuit. 30 mL d'eau ont ensuite été ajoutés et une extraction par 3x30mL de DCM a été réalisée. Les phases organiques réunies ont été lavées par 30 mL d'une solution saturée de NaH003 puis 30 mL d'une solution saturée de NaCI. Après séchage sur Na2SO4, filtration et évaporation du solvant, le résidu a été repris par EtOH. Une 15 sonication a été réalisée et le solide obtenu a été filtré sur fritté et lavé par EtOH (2 fois). Après séchage sous vide 218 mg (81%) d'un solide orange ont été obtenus. Mp 176-177°C (EtOH) (Guilbault et al Analytical Chem 1965, 37, 120-123:177°C); 1HRMN (300 MHz, DMSO) b 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.0 20 Hz, 1H), 2.66 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.5 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z 270.1 [M+H]+Poids : 269.2 g.mo1-1 Formule :C15HliN04 O 0 Pour le benzoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Le 25 chlorure de benzoyle a été utilisé (échelle:1.0 mmol). Le solide isolé (166 mg) a été purifié par chromatographie sur gel de silice (Me0H/DCM : 1/99) pour donner 156 mg (49%) de benzoate pur. 3054564 18 Mp >210°C (Guilbault et al Analytical Chem 1965, 37, 120-123: 203°C); 'HRMN (300 MHz, DMSO) Ô 8.21 - 8.14 (m, 2H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.84 - 7.75 (m, 1H), 7.62 (ddd, J = 11.7, 10.5, 8.1 Hz, 4H), 7.44 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 9.8, 2.1 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 2.1 Hz, 1H) ; ESI-MS m/z 318.1 [M+H]+. 5 Poids : 317.3 g.mo1-1 Formule :C19H11N04 Hexanoate et octanoate de résorufine 10 Les composés ont été préparés et isolés de la même manière que pour les deux esters précédents à l'aide des chlorures d'acide correspondants. Les rendements respectifs obtenus sont de 65% et 81%. Pour l'hexanoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Du chlorure d'hexanoyle (échelle: 1.0 mmol) a été utilisé. Le composé obtenu a été isolé par 15 précipitation dans l'EtOH, suivi de 2 lavages à l'EtOH, rendement 65%. Mp 130-132°C ;1HRMN (300 MHz, DMSO) Ô 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1H), 6.30 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 2.63 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 1.75 - 1.57 (m, 2H), 1.43 - 1.25 (m, 4H), 0.90 (t, J= 7.0 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z312.1 [M+H]+. 20 Poids : 311.3 g.mo1-1 Formule :C18H17N04 0 Pour l'octanoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Du 25 chlorure d'octanoyle (échelle : 1.0 mmol) a été utilisé. Le composé obtenu a été isolé par précipitation dans l'EtOH, suivi de 2 lavages à l'EtOH, rendement 81%. Mp 127-129°C ; 'HRMN (300 MHz, DMSO) ô 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1H), 6.30 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.72 - 1.57 (m, 2H), 1.44 - 1.19 30 (m, 8H), 0.87 (t, J= 6.8 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z 340.2 [M+H]+. 3054564 19 Poids : 339.4 g.mo1-1 Formule :C20H21 NO4 5 4-diéthylamino benzoate de résorufine Le sel de sodium de résorufine (235.2 mg, 1.0 mmol), l'acide 4- diéthylaminobenzoïque (1.1 équivalent), l'EDCI (1.1 équivalent) et le 4-DMAP (0.1 équivalent) ont été placés sous argon. 25 ml de DCM ont été ajoutés et le milieu réactionnel a été agité la nuit à température ambiante. Le solvant a été évaporé et le 10 résidu purifié par chromatographie sur gel de silice (Me0H/DCM=1/99 à 2.5/87.5) pour donner 207 mg (53%) de produit présentant une très légère impureté (UV visible) qu'une deuxième colonne (Me0H/DCM=1/99) permet d'éliminer. Mp 206-208°C ; 1HRMN (300 MHz, DMSO) b 7.92 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.59 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 15 3.46 (q, J= 7.0 Hz, 4H), 1.14 (t, J= 7.0 Hz, 6H) ; ESI-MS m/z 389.1 [M+H]+. Poids : 388.4 g.mo1-1 Formule :C23H2oN204 20 (All)trans rétinoate de résorufine Le composé a été préparé de la même manière que l'ester précédent à l'aide de l'acide rétinoïque commercial (rdt. 40%). Le brut (solide rouge orangé) obtenu a été lavé au Me0H et purifié par chromatographie sur gel de silice (Me0H/DCM : 1/99). Un lavage supplémentaire à l'EtOH puis au Me0H a donné 100 mg (40%) de produit pur. Mp 150- 25 160 (décomposition) ; 'HRMN(300 MHz, CDC13) b 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.25 - 7.10 (m, 3H), 6.89 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1H), 6.46 - 6.31 (m, 3H), 6.26 6.14 (m, 2H), 6.00 (s, 1H), 2.45 (d, J= 0.9 Hz, 3H), 2.10-2.00 (m, 5H), 1.75 (d, J= 0.6 Hz, 3H), 1.70 - 1.58 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 1.06 (s, 6H) ; ESI-MS m/z 496.2 [M+H+]. Poids : 495.6 g.mo1-1 30 Formule :C32H33N04 3054564 20 Esters de tokyo-green Le 2-Me-4-Me0 tokyo-green (CAS n° 643755-84-4 : 6-hydroxy-9-(4-methoxy-2- 5 methylphenyI)-3H-Xanthen-3-one) a été synthétisé en deux étapes : une bis-silylation de la 3,6- dihydroxyxanth-9-one commerciale réalisée selon le mode opératoire décrit dans l'article « J. Biol. ChemVol. 264, No. 14. Issue of May 15, PP. 8171-8178, 1989" a conduit à la 3,6-bis(tbutyldiméthylsilyloxy)xanthone. Une deuxième étape réalisée selon le mode opératoire décrit dans l'article « Chem. Eur. J. 2014, 20, 447 - 455 » consistant en un 10 traitement à l'aide du magnésien issu du 2-Bromo-3-meéhoxytoluene suivi d'une hydrolyse acide a donné le 2-Me-4-Me0 tokyo green. MgBr HO OH 0 HO OMe -3. OMe Hexanoate et octanoate de 2-Me-4-Me0 tokyo-green Les composés ont été préparés de manière classique à l'aide des chlorures 15 d'acides correspondants. Pour l'hexanoate, à partir de 0.15 mmol de 2-Me-4-Me0 -TG, une purification par chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM : de 1/99 à 10/90), a été réalisée, rendement : 40% (résine non cristallisée). 'HRMN (300 MHz, Me0D) et 7.45 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.16 20 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.11 (dd, J = 8.8, 2.1 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 9.7, 1.9 Hz, 1 H), 6.44 (d, J = 1.9 Hz, 1 H), 3.89 (s, 3H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.81 - 1.67 (m, 2H), 1.47 - 1.33 (m, 4H), 1.00 - 0.89 (m, 3H). 13CRMN(101 MHz, CDCI3) et 186.23, 171.64, 160.63, 158.85, 154.54, 153.29, 25 148.87, 138.07, 131.00, 130.88, 130.58, 129.38, 124.29, 120.84, 118.85, 118.56, 116.24, 111.80, 110.38, 106.18, 77.16, 55.51, 34.47, 31.32, 24.60, 22.42, 20.19, 14.05. ESI-MS: [M+H]+ : 431.1 Poids :430.5 g.mo1-1 3054564 Formule :C27112605 21 g OMe Pour l'octanoate, à partir de 0.19 mmol de TG, une purification par 5 chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM : de 1/99 à 10/90), a été réalisée, rendement : 20% (résine non cristallisée) 1H RMN (300 MHz, Me0D) et 7.46 (s, 1H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.17 (d, 1 = 8.9 Hz, 2H), 7.12 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.00 (cid, 1 = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 9.7, 1.5 Hz, 1 H), 6.45 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.64 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 10 2.05 (s, 3H), 1.81 - 1.67 (m, 2H), 1.49 - 1.26 (m, 9H), 0.96 - 0.87 (m,3H). 13CRMN(101 MHz, CDCI3) et 186.20, 171.66, 160.61, 158.78, 154.49, 130.92, 130.59, 129.34, 124.33, 120.89, 118.86, 106.23, 77.16, 55.51, 34.51, 31.76, 29.14, 29.02, 24.92, 22.73, 20.19, 14.21. ESI-MS : [M+H]+ : 459.2 15 Poids :485 g.mo1-1 Formule :C29H3005 ° 0 OMe Diesters de fluorescéine La préparation identique est à celle décrite précédemment en utilisant 3.0 eq. des 20 chlorures d'acides correspondants et 3eq. de base. L'hexanoate et l'octanoate ont déjà été décrits [litt. Ge, Feng-Yan; Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326]. Di-hexanoate de fluorescéine : [7364-90-1] Echelle 0.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ Et0Ac : 90/10). Solide blanc, rdt : 98%. Mp 103-105°C (lavages pentane) (litt. 25 100°C, Ge, Feng-Yan;Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326) ; 1H NMR (300 MHz, DMSO) b 8.09 - 8.03 (m, 1H), 7.83 (td, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1 H), 7.44 - 7.38 (m, 1 H), 7.28 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 3054564 22 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.71 - 1.58 (m, 4H), 1.40 - 1.25 (m, 8H), 0.95 - 0.81 (m, 6H) ; ESI-MS : [M+H]+ : 529.2 Poids :528.9 g.mo1-1 5 Formule :C32H3207 c) o oJ /\/\) Di-octanoate de fluorescéine [19722-86-2] Echelle 0.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice 10 (PE/ EtOAc : 90/10 à 80/20). Solide blanc, rdt : 92%. Mp 50-52°C 0 (litt. 49°C, Ge, Feng- Yan; Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326). 1H NMR (300 MHz, DMSO) b 8.09 - 8.04 (m, 1H), 7.83 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.3, 1.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 2.59 (t, J= 7.4 Hz, 4H), 1.70 - 1.57 (m, 4H), 15 1.41 - 1.20 (m, 16H), 0.92 - 0.81 (m, 6H) ; ESI-MS : [M+H]+ : 585.3. Poids : 584.7 g.mo1-1 Formule :C36H4007 0 (-.)./\/\./\ 20 Di-rétinoate de fluorescéine Le composé a été préparé à partir de 2.1 équivalents d'acide rétinoique, 2.1 équivalents D'EDCI, 0.1 équivalent de 4-DMAP. Echelle : 0.5 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ Et0Ac : 80/20). Solide jaune, rdt 45%. Mp 145150 °C (dec) ; 25 1H NMR (300 MHz, DMSO) b 8.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.89 - 7.73 (m, 2H), 7.42 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 15.0, 11.5 Hz, 2H), 6.98 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 6.39 - 6.15 (m, 6H), 6.11 (s, 2H), 2.38 (s, 6H), 2.07 - 1.95 (m, 10H), 1.70 (s, 6H), 1.63 - 1.51 (m, 4H), 1.50 1.40 (m, 4H), 1.03 (s, 12H). 30 ESI-MS : [M+H]+ : 897.3 3054564 23 Poids : 879.1 g.mo1-1 Formule :C60H6407 5 Esters de 7-hydroxycoumarine Ces esters ont été préparés de la même manière que précédemment à partir de la 7-hydroxycoumarine et du chlorure d'acide en présence de DIPEA. Octanoate de 7-hydroxycoumarine : Echelle 2 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ Et0Ac : 10 70/30) rdt : 92%. Mp 58-59°C ; 1H NMR (300 MHz, DMSO) Ô 8.08 (d, J= 9.3 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 2.61 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65 (s, 2H), 1.42 - 1.21 (m, 8H), 0.93 - 0.81 (m, 3H) ; ESI-MS : [M+H]+ : 289.1 15 Poids : 288.3 g.mo1-1 Formule :Cl7H2004 2. Activité des substrats spécifiques selon l'invention 20 Matériel et méthodes Lignées Cellulaires Des cellules de cancers de poumons NCI-H522 et A549 ainsi que des lignées de leucémies ont été utilisées. Les cellules ont été obtenues de chez American Type Culture Collection (ATCC), the European Collection of Cell Cultures (ECACC) et Deutsche 25 Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultruren (DSMZ). Détermination du Km et de la Vmax du -ro-lonate de résorufine avec les différentes isoenzymes ALDH1A1, ALDH2 et ALDH3A1 purifiées. Dans 50pL de tampon phosphate 0.1 M pH6,00 ; 0.2 M KCI ; 2mM NADP+ ; 2 mM EDTA, une gamme de propionate de résorufine a été faite : 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80 et 70 30 ptM et 0 pM. 50 !IL de solution d'enzyme recombinante à 2,5 mU/puits ALDH1A1 (R&D 3054564 24 Sytems, 5869-DH), ALDH2 (abcam, ab87415) et ALDH3A1 (R&D Sytems, 6705-DH)a été ajoutée. L'incubation a été réalisée 30 minutes à +37°C puis la lecture en fluorescence a été faite (Em : 590 nm, Ex : 530 nm). Les données ont ensuite été converti en résorufine relarguée (nM.min-1.4-1) puis le Km et le Vmax ont été calculés via l'équation de 5 Michaelis-Menten en utilisant GraphPad Prism 5.0. Traitement des cellules par des inhibiteurs spécifique de IADLH1 et 3 Dans une plaque 96 puits, les cellules HL-60 ont été ensemencées à une concentration de 50 000 cellules/puits dans un milieu RPMI-1640 sans rouge phénol supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) complété 10 avec du dimethyl ampalthiolester (DIMATE) un inhibiteur spécifique ALDH1 et 3, morpholino ampal thiolester (MATE) un inhibiteur spécifique de l'ALDH3, à des concentrations respectivement de 8 1..1M. Après incubation de 6 heures, les substrats des différentes ALDHs respectivement le propionate de résorufine pour l'ALDH1 et le 4- diethylaminobenzoate de résorufine pour l'ALDH 3 ont été ajoutés à une concentration 15 finale de 10 1..1M puis incubés durant une heure à +37°C. La plaque a ensuite été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent Appliskan (ex= 560 nm, Em=600). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative produites par un nombre égale de cellules. Traitement des cellules avec des ARN interférant ALDH1A1 20 Dans une boîte de Petri 60mm, les cellules NCI-H522 ont été ensemencées à une concentration de 250 000 cellules/plaques, correspondant à une confluence de 40-50%, dans un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) sur la nuit à+37°C Le lendemain, le milieu a été remplacé par le même milieu sans SVF. La solution de transfection a ensuite été 25 préparée en diluant 100nM dans 5001..1L de milieu de culture sans SVF, à laquelle on a ajouté 5001..1L de milieu de culture sans SVF complété avec 3 !IL de lipofectamine 2000 (Invitrogen). La solution a ensuite été incubée 30 minutes à température ambiante, puis ajoutée gouttes à gouttes dans la solution cellulaire. Le mélange a été incubé à +37°C dans un incubateur à CO2 5% pendant 8 heures. Après l'incubation, le milieu a été 30 changé par du milieu supplémenté en SVF puis les cellules ont été laissées en culture pendant 48 heures. L'inhibition de la protéine a été validée par Western Blot. L'activité spécifique de l'ALDH1A1 a ensuite été dosée par fluorescence. Dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine Les cellules ont été ensemencées à une concentration de 1X104 cellules/puits dans une 35 plaque 96 puits dans 1001..1L dans un milieu RPMI-1640 sans rouge phénol supplémenté 3054564 25 en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) complété avec du propionate de résorufine 10 1..1M. Les cellules ont ensuite été incubées 1 heure puis la plaque a été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent Appliskan (ex= 560 nm, Em=600). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative 5 produites par un nombre égale de cellules. Double localisation du propionate de résorufine et de IALDH1A1 par microscopie fluorescente Dans une plaque 24 puits avec des verres de microscopie préalablement lavées à l'éthanol puis placées dans les puits, les cellules NCI-H522 ont été ajoutées à une 10 concentration cellulaire de 50 000 cellules/puits puis incubé dans un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Foetal sur la nuit à+37°C avec une atmosphère 5% 002. Le bndemain, le milieu de culture a été changé avec soit du DIMATE (51.1M) ou bien le véhicule de traitement puis incubé 6 heures. Les cellules ont été incubées 30 minutes avec du milieu de culture supplémenté 15 avec 101..1M de propionate de résorufine, ont ensuite été lavées avec du PBS à froid puis fixées au paraformaldehyde 15 minutes à 37°C. Les cellules ont été perméabilisées et saturées avec une solution PBS ; 3% Albumine de Bovin ; 0.3% de Triton pendant 1 heure. L'incubation a été réalisée avec l'anticorps anti-ALDH1A1 (R&D System, MAB5869) 1 heure à +37°C, puis avec un anticorps arti-souris couplé à la fluorescéine 20 pendant 1 heure à température ambiante à l'obscurité, avec lavages au PBS entre les deux étapes. 3 lavages au PBS ont été effectués puis les verres de microscopie ont été montés avec un support d'antidécoloration complété avec du DAPI. Les cellules ont ensuite été observées au microscope. Identification des cellules ALDH1 positive par cytomérie en flux 25 Dans une boîte de Petri 60mm, 500 000 cellules ont été incubées avec un un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Foetal sur la nuit à+37°C avec une atmosphère 5)/0 002. Pour le contrôle négatif, les cellules ont été reprises dans du milieu supplémenté avec 151..1M du dimethyl ampalthiolester (DIMATE) un inhibiteur spécifique des ALDH1 et 3, puis incubées 5 30 heures à 37°C, 5% CO2. Après trypsination, les celbles ont été reprises dans du milieu RPMI supplémenté et centrifugé à 800g 5 minutes. Le culot cellulaire a ensuite été repris dans du milieu supplémenté frais contenant 10 1..1M de propionate de résorufine, puis est incubé pendant 1 heure dans un tube de polycarbonate à 37°C, 5% CO2. Après incubation, les cellules ont ensuite été centrifugées puis lavées dans du PBSx1 froid et 3054564 26 enfin repris dans 200mL de PBSx1 froid. La solution a ensuite été analysée via cytométrie en flux (Ex 590nm / Em 560 nm ou laser rouge). Résultats 5 Les résultats sont présentés dans les figures 1 à 5. En particulier, la figure 1 représente les données obtenues pour déterminer le Km et la Vmax du propionate de résorifine. Les résultats figurent également dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 4 ALDH1 ALDH2 ALDH3 Vmax 12132 6693 8141 Km 115.5 116.0 445.1 Km/Vmax 105.04 57.69 18.29 Augmentation 1 0.54 0.17 10 Les résultats du dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après un traitement à l'ARN interférant ALDH1A1 sont illustrés par le figure 2 qui montre qu'une inhibition complète de l'ALDH1A1 est observé à 100nM de siRNA qui induit une diminution significative (P REVENDICATIONS1. Substrat spécifique d'une isoenzyme de I'ALDH comprenant un composé : (a) de formule (I): R-COO-A (I) résultant de l'estérification d'un traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant RCOOH, dans lequel R est choisi de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; ou (b) de formule (II) 0 R)L0 0 (Il) dans lequel R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate. 2. Substrat spécifique selon la revendication I caractérisé en ce que A-OH est choisi parmi la 7-hydroxycoumarine, un fluorophore de la famille des tokyo green, en particulier le 2-méthy1-4-méthoxy-Tokyo Green, la résorufine et la fluorescéine. 3. Substrat spécifique selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ALDH est I'ALDHI et en ce que R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, l'hexanoate ou le propianoate. 4. Substrat spécifique selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que l'isoenzyme de I'ALDH est I'ALDH3 et en ce que R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former l'octanoate, le 4-hydroxy-2-nonenoate, le 4- diethylaminobenzoate ou le benzoate. 5. Substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ADLH est détectér-elens une population cellulaire. 3054564 6. Composition comprenant au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour quantifier au moins une isoenzyme de I'ALDH dans une population cellulaire. 9. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour trier toute ou une partie d'une population cellulaire en fonction de son expression d'au moins une isoenzyme de I'ALDH. 10. Utilisation d'un marqueur selon la revendication 7 pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de I'ALDH. 11. Utilisation selon la revendication 10, dans laquelle ladite maladie est choisie parmi : les cancers, les troubles de la motilité du sperme, les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites. 12. Utilisation d'un marqueur selon la revendication 7 pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses. 13. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses. 14. Utilisation selon la revendication 13 pour distinguer les cellules souches de cancers solides et/ou de tumeurs malignes hématologiques. 15. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches. 16. Méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, ladite méthode comprenant: 3054564 (a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, (b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire; et (c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec au ledit moins un substrat spécifique. 17. Kit pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH comprenant au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.