FR 3061718 A1 20180713 FR 1750239 A 20170111 1 PROCÉDÉ ENZYMATIQUE D'ÉLIMINATION DU SULFITE DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé enzymatique d'élimination du sulfite. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé de transformation du sulfite présent dans une composition en thiosulfate comprenant l'introduction dans ladite composition de 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) et d'un substrat de ladite 3- m ercaptopyruvate sulfurtransférase. La présente invention trouve des applications notamment dans le domaine pharmaceutique, cosmétique, agroalimentaire, chimique et tout domaine impliquant l'utilisation de sulfite. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. État de la technique Le sulfite est un composé très utilisé dans l'industrie, car il est peu coûteux et possède un très large spectre d'actions et/ou d'effets. En particulier, le sulfite est utilisé pour ses propriétés antioxydantes, antiseptiques et/ou antioxydasiques. De par son utilisation dans différents domaine techniques, notamment dans le domaine agroalimentaire, l'effet des sulfites et sa tolérance par l'être humain sont de plus en plus étudiés. En particulier, il a été démontré qu'une consommation excessive de sulfite pouvait entrainer des effets néfastes sur la santé, induire une intolérance voir des effets toxiques. Une évaluation du sulfite en tant qu'additif alimentaire a été effectuée en 2008 par l'OMS qui a indiqué que l'exposition totale alimentaire aux sulfites diffère entre les pays en raison de différents modes d'utilisation de ceux-ci dans les aliments et de la consommation des dits aliments 3061718 2 auxquels les sulfites peuvent être ajoutés. Il a été montré qu'ils étaient présents notamment dans les boissons alcoolisées, notamment le vin, et non alcoolisées, mais aussi dans la charcuterie, notamment les saucisses, dans les fruits secs, dans les noix et les pommes de terre transformées. 5 Une dose journalière admissible a été déterminée et est de 0 à 0,7 mg/kg de masse corporelle (Organisation Mondiale de la Santé). La présence de sulfites dans les produits de la vie quotidienne tels que les aliments et les médicaments conduit à l'absorption de quantités journalières importantes susceptibles de provoquer des problèmes de santé 10 tel que maux de têtes, allergies et asthme pour les conséquences les moins graves allant jusqu'à des problèmes cardiovasculaires et une augmentation du risque de cancer, par exemple des tumeurs cérébrales et/ou hépatiques, pour les cas les plus graves (Shih et al., 1977, The New England Journal of Medicine [1]; Andersson et al., 2013, International Archives of Occupational 15 and Environmental Health [2]; Ozsoy et al., 2014, Toxicology and Industrial Health [3]). En outre, les sulfites ont été répertoriés comme faisant partie des dix allergènes prioritaires de l'alimentation (Agence de la santé, gouvernement canadien). La présence de sulfites dans les produits agroalimentaires peut 20 être désormais considérée comme un problème de santé publique car environ un million de français sont actuellement en surdose (étude réalisée par I'Insee et l'Anses en septembre 2012). Ainsi dans le cadre d'un programme national français (depuis 2009) financé par FranceAgriMer coordonné par l'IFV (Institut Français de la vigne et du Vin) et regroupant 25 plusieurs partenaires techniques tels que l'INRA (Institut National de la Recherche Agronomique), des recherches sont menées depuis de nombreuses années avec pour but de diminuer la quantité finale de sulfites, notamment dans le vin. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen de réduire la 30 quantité/la présence de sulfite palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier un procédé permettant de maîtriser 3061718 3 les teneurs en sulfite dans les compositions quel que soit le domaine, notamment alimentaire, pharmaceutique etc. Il existe dans l'état de la technique des procédés/dispositifs qui sont utilisés /étudiés/ en cours de test afin d'essayer réduire la teneur en 5 sulfite dans des compositions. Par exemple dans le domaine viticole, une voie explorée est de tester différents itinéraires/procédés de production visant à diminuer l'utilisation du sulfite dans les procédés de vinification, l'objectif à moyen terme étant de diminuer la concentration finale en sulfite entre 50 et 100 10 mg/L (développé par l'IFV). Une autre voie est d'essayer de substituer le sulfite par un ou plusieurs composé(s), par exemple l'acide ascorbique, le lysozyme ou les acides gras à courte chaîne comme l'acide sorbique. Toutefois, ces différents composés ne permettent pas de reproduire/d'obtenir l'ensemble des effets techniques des sulfites. Ainsi, ils 15 ne permettent pas une substitution efficace, en particulier une substitution à l'identique. En outre, ils peuvent provoquer ou provoquent une modification et altération des propriétés de la composition et notamment des caractères organoleptiques des compositions, notamment du vin (IFV et INRA). Une autre voie explorée est le retrait/l'élimination des sulfites des 2 0 compositions, notamment du produit fini après production. Par exemple une stratégie consiste à utiliser une méthode chromatographique permettant de fixer et donc d'éliminer le sulfite présent dans le vin à la fin du procédé (W02015051187 [4]). Cette technique permet l'élimination des sulfites libres uniquement et pourrait conduire à l'élimination d'autres composants 25 essentiels. Une autre stratégie consiste à utiliser des enzymes ; par exemple la sulfite oxydase qui transforme le sulfite en sulfate (W02015051187 [4]). Toutefois, cette réaction est réversible, l'équilibre peut être déplacé et ce procédé est donc susceptible de produire du sulfite à partir de sulfate. En 30 outre, la stabilité de la sulfite oxydase est relative, en particulier l'enzyme n'est pas assez stable pour une utilisation à pH bas comme c'est le cas lorsque le sulfite est ajouté comme additif de conservation. Une autre 3061718 4 enzyme, la sulfite réductase qui possède une activité rapide d'élimination du sulfite, a été proposée. Toutefois, le produit obtenu est du sulfure d'hydrogène altérant grandement les propriétés de la composition, et notamment les propriétés organoleptiques (Hermann et al., 2015, Nature 5 [5]). D'autres procédés d'oxydation des sulfites, par exemple via l'ajout de composés et/ou d'enzymes dans la composition ont été également envisagés. Toutefois, ces procédés sont limités de par leur efficacité et/ou l'altération éventuelle des propriétés de la composition, notamment ses 10 propriétés organoleptiques. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen de réduire la quantité/la présence de sulfites, notamment présent dans des compositions, palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier un moyen d'éliminer/réduire la quantité de sulfites sans altérations 15 négatives des propriétés de la composition. Description de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre à ce 2 0 besoin en fournissant une 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) qui transforme très efficacement le sulfite en thiosulfate. Les inventeurs fournissent en particulier un procédé de traitement d'une composition comprenant l'introduction dans ladite composition de 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) et au moins un substrat de 2 5 ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase. Les inventeurs fournissent également un procédé de transformation du sulfite présent dans une composition en thiosulfate comprenant l'introduction dans ladite composition de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate 3 0 sulfurtransférase. En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la 3-m ercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) permet, 3061718 5 en présence d'un substrat, de catalyser une réaction transformant le sulfite en thiosulfate. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la transformation du sulfite en thiosulfate par la 3-mercaptopyruvate 5 sulfurtransférase d'Escherichia coli (3-MST) est irréversible. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la transformation du sulfite en thiosulfate par la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) est une réaction stoechiométrique irréversible permettant avantageusement de transformer une quantité déterminée de 10 sulfite et/ou la totalité des sulfites présents dans la composition. La figure 1 est un schéma de la réaction enzymatique catalysée par la 3mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) en présence de 3mercaptopyruvate (3-MP) et de sulfite. Dans la présente par « traitement d'une composition » on entend 15 l'introduction dans une composition de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase afin de transformer des sulfites présents en thiosulfates. Dans la présente par « introduction de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate 20 sulfurtransférase dans la composition » on entend tout moyen d'introduction adapté connu de l'homme du métier de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase dans la composition. L'introduction peut être réalisée par versement de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et de son substrat 25 dans la composition, par injection, par exemple avec un dispositif de type seringue dans la composition, par aspersion de la composition. L'homme du métier, de par ses connaissances générales saura adapter l'introduction de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase en fonction de la composition à traiter. 30 Dans la présente, la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase peut être introduite sous toute forme connue de l'homme du métier adaptée. Par exemple, elle peut être introduite sous la forme de poudre, par exemple 3061718 6 lyophilisée, encapsulée ou non ; en solution, par exemple dans du sérum physiologique ou une solution tamponnée. Dans la présente, le substrat de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase peut être introduit sous toute forme connue de l'homme du 5 métier adaptée. Par exemple, il peut être introduit sous la forme de poudre, par exemple lyophilisée, encapsulée ou non; en solution, par exemple dans du sérum physiologique ou une solution tamponnée. Dans la présente, la 3mercaptopyruvate sulfurtransférase peut être une protéine isolée et/ou une protéine recombinante. Il peut s'agir par exemple d'une 3-mercaptopyruvate 10 sulfurtransférase isolée à partir d'un animal, d'un insecte, d'une bactérie, d'un champignon, d'une plante, d'un microorganisme extremophile et/ou d'une Archée. Il peut s'agir d'une 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase comprenant dans sa séquence peptidique les trois séquences suivantes : RXaWWM (SEQ ID N°13) 15 CGSGVTAXb (SEQ ID N°14) GHIXcG (SEQ ID N°15) dans lesquelles Xa est A, V ou L, Xb est A ou C, et Xc est P ou E. Les inventeurs ont en effet démontré que les 3-mercaptopyruvate 20 sulfurtransférases comprennent ces séquences en commun dans leur séquence respective et sont capables de catalyser la réaction de transfert de soufre d'un substrat donneur tel que le 3-mercaptopyruvate (3-MP) vers le sulfite en passant par un intermédiaire persulfure transitoire de l'enzyme (Figure 1). La réaction conduit à la formation de pyruvate et de thiosulfate : 25 produits inodores, incolores et non toxiques. Dans la présente, la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase peut être une enzyme recombinante comprenant une ou plusieurs mutation(s) dans sa séquence peptidique. Il peut s'agir par exemple d'une 3mercaptopyruvate sulfurtransférase comprenant le remplacement d'au 30 moins un acide aminé acide par un acide aminé hydrophobe. La 3- mercaptopyruvate sulfurtransferase peut être une enzyme recombinante comprenant le remplacement d'un acide aminé acide, par exemple l'acide 3061718 7 aspartique ou l'acide glutamique, par un acide aminé comprenant une chaine latérale hydrophobe, par exemple l'alanine, valine, isoleucine, méthionine, phénylalanine, tyrosine, méthionine et/ou tryptophane. Il peut s'agir par exemple d'une 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase 5 d'Escherichia coli comprenant une substitution en position 17 de sa séquence peptidique de l'acide aspartique par une alanine. Il peut s'agir par exemple de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase de séquence SEQ ID NO 2, 5, 6 ou 7 du listage de séquences annexé et/ou d'une protéine dont la séquence comprend les peptides de séquences SEQ ID NO 13, 14 et 15. 10 Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la substitution de l'acide aspartique en position 17 de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia coli par une alanine permet avantageusement d'augmenter le rendement de production de l'enzyme. Par exemple dans le cas d'une production dans des cellules d'Escherichia 15 coui, le rendement de production/purification de ce mutant D17A est supérieur d'un facteur 10 à celui de la forme sauvage de l'enzyme. Dans la présente invention la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase peut être obtenue à partir d'une séquence nucléotidique codant la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase utilisée dans la présente 2 0 invention, par exemple les protéines dont la séquence comprend les peptides de séquences SEQ ID NO 13, 14 et 15, le peptide de séquence choisi dans le groupe comprenant les protéines de séquence SEQ ID NO 2, 5, 6 ou 7. Il peut s'agir par exemple d'un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence choisie dans le groupe comprenant la séquence 25 SEQ ID N°1, 8, 9, 10, 11 et 12. Dans la présente invention, la ou les séquences nucléotidiques codant la 3-m ercaptopyruvate sulfurtransférase peu(ven)t être contenue(s) indépendamment dans un vecteur d'expression adapté pour leur expression. 30 Dans la présente, un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant une des 3-mercaptopyruvate sulfurtransférases utilisées dans la présente invention, par exemple une séquence 3061718 8 nucléotidique choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID NO 1, 8, 9, 10, 11 et 12. Le vecteur peut être un des vecteurs connus de l'homme du métier pour produire des protéines recombinantes. Il est choisi en général notamment en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Le vecteur peut être par 5 exemple choisi parmi les vecteurs listés dans le catalogue http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm [6] ou http://www.qiagen.com/overview/qiagenes.aspx?gaw=PROTQIAgenes080 7&gkw=mammalian+expression [7], ou encore http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM%20Expressio 10 n%20Vectors [8]. Il peut s'agir par exemple du vecteur d'expression décrit dans le document WO 83/004261 [9]. Les acides nucléiques de la présente invention ou les vecteurs de la présente invention sont utilisables notamment pour la production de 3- mercaptopyruvate sulfurtransferase. Aussi, la présente se rapporte 15 également à une cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une des 3-mercaptopyruvate sulfurtransferases ou un vecteur codant pour une des 3-mercaptopyruvate sulfurtransferases. La cellule hôte ou hôte cellulaire peut être tout hôte approprié pour la production des 3-mercaptopyruvate sulfurtransférases de la 2 0 présente à partir des vecteurs précités comprenant une séquence nucléotidique codant une 3-m ercaptopyruvate sulfurtransferase selon l'invention. On entend par « cellule hôte » au sens de la présente invention une cellule procaryote ou eucaryote. Des cellules hôtes couramment 25 utilisées pour l'expression de protéines recombinantes incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia coli ou Bacillus sp., des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae, des cellules de champignons tels que Aspergillus piger, des cellules d'insectes, et des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées 30 cellulaires HEK 293, PER-C6, CHO, etc... La transformation des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier, par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou 3061718 9 des méthodes chimiques. En fonction de la cellule à transformer, l'homme du métier pourra aisément déterminer les moyens nécessaires à la transformation de la cellule hôte choisie. Ainsi le vecteur d'expression et la méthode d'introduction du vecteur d'expression au sein de la cellule hôte 5 seront sélectionnés en fonction de la cellule hôte choisie. La cellule hôte transformée par un vecteur d'expression va produire une protéine correspondante par exemple sous forme recombinante. L'homme du métier peut aisément vérifier que la cellule hôte produit la protéine, par exemple recombinante, par exemple en utilisant la technique du Western blot. 10 Aussi, la présente se rapporte également à un procédé de production de 3-m ercaptopyruvate sulfurtransférase par transformation d'une cellule hôte par utilisation d'un vecteur tel que défini ci-dessus et incubation de ladite cellule transformée. Dans ce procédé, la cellule hôte peut être toute cellule connue de 15 l'homme du métier adaptée. Il peut s'agir par exemple des cellules hôtes telles que définies ci-dessus. Selon l'invention, la transformation peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. La transformation des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du 20 métier, par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. En fonction de la cellule à transformer, l'homme du métier pourra aisément déterminer les moyens nécessaires à la transformation de la cellule hôte choisie. Selon l'invention, l'incubation peut être réalisée par tout procédé 25 connu de l'homme du métier. L'incubation/la culture des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier. En fonction de la cellule, l'homme du métier pourra aisément déterminer les moyens nécessaires, milieu de culture, conditions de temps et de température requis pour l'incubation/la culture de la cellule hôte choisie. 30 Selon l'invention, le procédé de fabrication peut comprendre une étape, après transformation et culture/incubation de la cellule transformée, de purification de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase. 3061718 10 La purification de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase produite peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation 5 différentielle, par exemple au sulfate d'ammonium, une ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d'ions, une séparation par interactions hydrophobes, ou une chromatographie d'affinité, par exemple de type IMAC. Dans la présente, la quantité de 3-mercaptopyruvate 10 sulfurtransférase introduite dans la composition peut être comprise entre 100 et 500nM, par exemple de 250 à 500nM. Bien entendu l'homme du métier de par ses connaissances générales saura adapter la quantité de 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase à introduire dans la composition. Dans la présente, le procédé selon l'invention peut comprendre 15 après l'introduction de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase une étape d'incubation dans la composition. Dans la présente, l'incubation peut être réalisée pendant un temps de 1 à 60 min, par exemple de 1 à 5 min. Dans la présente, l'incubation peut être réalisée à une 20 température de 3 à 35°C, par exemple de 4 à 30°C. Dans la présente, la composition peut être toute composition connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une composition chimique, une composition agroalimentaire, une composition pharmaceutique, une composition cosmétique et/ou une composition 2 5 vétérinaire. Dans la présente la composition peut être sous toute forme liquide connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une solution aqueuse, une solution alcoolique, une solution hydro alcoolique. Dans la présente la composition agroalimentaire peut être toute 30 composition agroalimentaire, par exemple liquide connue de l'homme du métier susceptible de comprendre des sulfites. Il peut s'agir par exemple de composition alcoolique, par exemple du vin blanc, vin rouge, vin rosé, 3061718 11 champagne, bière et/ou cidre, d'aliments par exemples les cornichons, la sauce tomate, le ketchup, la moutarde, la confiture, les fruits en conserve, les jus de fruits, les salades de fruits, les sirops de fruits, les légumes en conserve, le vinaigre, les vinaigrettes et les soupes. 5 Dans la présente la composition pharmaceutique peut être toute composition pharmaceutique connue de l'homme du métier susceptible de comprendre des sulfites. Il peut s'agir par exemple d'une composition pour administration intraveineuse, une composition orale, un produit à application cutanée, et/ou toute administration connue de l'homme du métier sous 10 forme de composition/formulation liquide et/ou de compositions sèches hydratables, par exemple une poudre à réhydrater. Dans la présente la composition vétérinaire peut être toute composition vétérinaire connue de l'homme du métier susceptible de comprendre des sulfites. Il peut s'agir par exemple de toute composition 15 vétérinaire, par exemple liquide, connue de l'homme du métier et/ou de compositions sèches hydratables, par exemple une poudre à réhydrater. Dans la présente la composition cosmétique peut être toute composition cosmétique connue de l'homme du métier susceptible de comprendre des sulfites. Il peut s'agir par exemple des gels douche, des 20 auto-bronzants. Dans la présente, par substrat de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase on entend tout substrat connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple du 3-mercaptopyruvate ou de tout composé soufré conduisant à la formation d'un intermédiaire persulfure sur la 3- 25 mercaptopyruvate sulfurtransférase. Dans la présente, la quantité maximale de substrat, par exemple de 3-mercaptopyruvate, introduit dans la composition peut correspondre à la quantité de sulfite présente dans la composition. Dans la présente, le rapport stoechiométrique dudit substrat et du sulfite présent dans ladite 30 composition peut être au maximum de 1 :1. Par exemple, pour 1L d'une composition contenant 1,25 mmoles de sulfite, la quantité maximale de 3mercaptopyruvate introduite dans la composition est de 1,25 mmoles. Bien 3061718 12 entendu l'homme du métier de par ses connaissances générales saura adapter la quantité de 3-mercaptopyruvate à introduire dans la composition. Dans la présente, le procédé selon l'invention peut comprendre préalablement à l'introduction dans une composition de 3-mercaptopyruvate 5 sulfurtransférases et/ou de substrats de celles-ci une étape préalable de mesure de la concentration et/ou quantité de sulfites présents dans la composition. Dans la présente la mesure de la concentration et/ou quantité de sulfites présents dans la composition peut être réalisée par tout procédé 10 adapté connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé et/ou dispositif disponible dans le commerce, par exemple le kit SO commercialisé par la société Megazyme International, Irlande (Beutler, H. 0. (1988). Sulphite In Methods of Enzymatic Analysis [10]) ou les bandelettes Quantofix Sulfit (marque déposée) commercialisées par la 15 société Macherey-Nagel. La quantité de sulfite peut également être déterminée préalablement à l'application dudit procédé par des méthodes classiques, par exemple utilisées actuellement dans l'industrie vinicole par exemple la méthode de Franz Paul qui est la méthode de référence en oenologie (Bondet Chantal et Raymond Sylvestre, Pratiquer les contrôles en 20 oenologie [11]), et/ou par l'utilisation de kits chimiques, par exemple commercialisés par la société Megazyme International, Irlande. L'homme du métier, de par ses connaissances générales saura adapter le procédé de mesure de la concentration/quantité de sulfites en fonction de la composition. 25 Dans la présente, le pourcentage du rapport molaire de 3- mercaptopyruvate introduit dans la composition par rapport aux sulfites présents dans la composition peut être compris de 0,01 à 100 %, par exemple de 25 à 100 %. Les inventeurs ont démontré que la réaction de transformation de 30 sulfite en thiosulfate présente une stoechiométrie de 1:1 avec la quantité de 3-mercaptopyruvate. Les inventeurs ont également démontré qu'il est 3061718 13 possible de transformer une quantité déterminée de sulfite présent dans la composition. En d'autres termes, le procédé de l'invention permet en outre de contrôler précisément la quantité de sulfites transformés en thiosulfate et 5 également la quantité résiduelle éventuelle présente dans la composition après la mise en oeuvre du procédé. En outre, le procédé de l'invention permet, lorsque le substrat est le 3-mercaptopyruvate, la production de pyruvate dans la composition. La formation de pyruvate notamment dans des compositions agroalimentaire, 10 pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire est sans effet concernant la couleur, l'odeur et/ou une éventuelle toxicité. En d'autres termes le pyruvate et le thiosulfate issus du procédé sont inodores, incolores et non toxiques (rapport sur le thiosulfate de la FDA 223-75-2004, 1975 [12]). De plus, les produits issus du procédé ne modifient pas 15 négativement les caractéristiques essentielles de la composition, par exemple son aspect, ses propriétés gustatives, ses propriétés olfactives. Le procédé selon l'invention permet également avantageusement d'obtenir des compositions dont les propriétés organoleptiques sont inchangées. En d'autres termes, le procédé selon l'invention ne modifie pas 20 les propriétés organoleptiques de la composition à laquelle il est appliqué. De plus, le procédé selon l'invention permet la production de thiosulfate qui avantageusement est utile dans le traitement contre la calciphylaxis (Arrestier et al., 2016, Medicine [13]). En outre, le thiosulfate, de par son effet antioxydant est utile pour la stabilisation de composition 25 alcoolique, par exemple tel qu'utilisé aux Etats-Unis. Ainsi, l'invention permet avantageusement d'améliorer la stabilité des compositions sur lesquelles elle est utilisée. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures 3 0 annexées, donnés à titre illustratif. 3061718 14 Brève description des figures La figure 1 est un schéma représentant le mécanisme catalytique de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase dans lequel le 3- 5 mercaptopyruvate est utilisé comme substrat donneur de soufre et le sulfite comme accepteur conduisant à la formation de pyruvate et de th iosu lfate. La figure 2 est une photographie d'un gel de protéine SDS-PAGE 12,5% montrant les différentes étapes de purification de la 3-mercaptopyruvate 10 sulfurtransférase d'Escherichia coli. La colonne MW correspond aux marqueurs de poids moléculaire, la colonne SSO correspond à la fraction soluble obtenue après la lyse des cellules bactériennes, la colonne C65% correspond à la fraction insoluble obtenue après précipitation en présence de 65% de sulfate d'ammonium, la colonne Ph-Seph 15 correspond à la fraction obtenue après chromatographie d'interaction hydrophobe Phenyl-Sépharose (GE Healthcare (marque déposée)) et la colonne Q-Seph correspond à la fraction obtenue après chromatographie échangeuse d'anion Q-Sépharose (GE Healthcare (marque déposée)). 20 La figure 3 est un schéma simplifié représentant le principe du kit SO comprenant l'utilisation de deux enzymes chacune catalysant une étape réactionnelle. La première étape fait intervenir la sulfite oxydase (réaction 1) et la deuxième la NADH peroxydase (réaction 2). La figure 4 représente le suivi de l'absorbance à 340nm en fonction du 25 temps d'un échantillon de vin blanc non traité (courbe noire vin blanc seul) et d'un échantillon de vin blanc après traitement avec 2 pM de 3mercaptopyruvate sulfurtransférase et une quantité stoechiométrique (1 :1) de 3-mercaptopyruvate par rapport aux sulfites (courbe supérieure vin blanc+3-MST+3-MP). 30 La figure 5 représente le suivi de l'absorbance à 340nm en fonction du temps d'un échantillon de vin blanc après traitement avec une quantité stoechiométrique (1 :1) de 3-mercaptopyruvate par rapport aux sulfites 3061718 15 (courbe noire vin blanc seul), d'un échantillon de vin blanc après traitement avec 2 pM de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (vin blanc+3-MST) et d'un échantillon de vin blanc après traitement avec 2 pM de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et une quantité 5 stoechiométrique (1 :1) de 3-mercaptopyruvate par rapport aux sulfites (courbe supérieure vin blanc+3-MST+3-MP). La figure 6 représente le suivi de l'absorbance à 340nm en fonction du temps d'un échantillon de vin blanc non traité (courbe noire vin blanc seul), d'échantillons de vins blancs après traitement avec 2 pM de 3- 10 mercaptopyruvate sulfurtransférase et un rapport 3- mercaptopyruvate/sulfite égal à 1/4 (courbe 1/4 de 3-MP), à 1/ (courbe 1/2 de 3-MP) et à 3/4 (courbe 3/4 de 3-MP). La figure 7 est un graphique représentant le pourcentage de sulfite résiduel après traitement par ledit procédé (ordonné) en fonction du 15 temps (abscisse). La figure 8 représente le suivi de l'absorbance à 340nm en fonction du temps d'un échantillon de vin rouge non traité (courbe noire vin rouge seul) et d'un échantillon de vin rouge après traitement avec 0,5 pM de 3mercaptopyruvate sulfurtransférase et une quantité stoechiométrique 20 (1 :1) de 3-mercaptopyruvate par rapport aux sulfites (courbe supérieure vin rouge+3-MST+3-MP). La figure 9 représente le suivi de 1"absorbance à 340nm en fonction du temps d'un anesthésique local (Septanest (marque déposée)) après traitement avec 0,5 pM de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et du 3- 25 mercaptopyruvate avec un rapport 3-mercaptopyruvate/sulfite égal à 0 (courbe 0 3-MP / sulfite), à 1/2 (courbe 1/2 de 3-MP/sulfite) et à 1 (courbe Septanest+3MST+3MP). La figure 10 représente un alignement de séquences protéiques et de structures secondaires de trois 3-mercaptopyruvate sulfurtransférases 30 (3-MST): 3-MST d'Escherichia cou/ (code PDB 1URH), 3-MST humaine (code PDB 4JGT) et 3-MST de Leishmania major (code PDB 10KG) 3061718 16 mettant en évidence les acides aminés conservés et la position de l'acide aminé (Aspartate 17) qui a été muté en alanine. La figure 11 représente un schéma du vecteur pET20b 3-MST utilisé pour la production de la forme sauvage et du mutant D17A de la 3- 5 mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia coll. La construction pET20b 3-MST est un vecteur recombinant obtenu à partir du pET20b commercial Invitrogen (marque déposée). La figure 12 correspond à la séquence de la partie codante du gène 3mst d'Escherichia coll. Le codon muté permettant l'obtention du mutant D17A 10 de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia cou/ est souligné et surligné en gris. La figure 13 est la séquence protéique de la forme sauvage de la 3- m ercaptopyruvate su lfurtransférase d'Escherichia coll. L'acide aspartique souligné et surligné en gris correspond à l'acide aminé muté 15 en alanine dans le mutant D17A de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia coll. La figure 14 contient la séquence des amorces nucléotidiques sens (a) et anti-sens (b) utilisées lors de la mutagenèse dirigée effectuée sur le vecteur d'expression pET20b 3-MST. 20 EXEMPLES Exemple 1 : Production et purification de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase D17A d'Escherichia coli 25 Le plasmide codant la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase D17A d'Escherichia coli a été obtenu par mutagenèse dirigée du plasmide codant la forme sauvage de l'enzyme (Figures 11, 12, 13 et 14). Le mutant D17A de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia coli a été produit par transformation de bactéries Escherichia 30 coli BL21(DE3) avec un vecteur d'expression pET20b-3MST. La transformation de 50 pL de cellules compétentes BL21(DE3) par 100 ng de pET20b-3MST a été réalisée par incubation du mélange dans la glace 3061718 17 pendant 30 min suivie d'un choc thermique (30 secondes à 42°C). Le mélange a ensuite été utilisé pour inoculer une préculture de 50 mL de milieu LB supplémenté en ampicilline (200 mg/L). Après incubation d'une nuit à 37°C sous agitation, 4 L de milieu LB supplémenté en ampicilline (200 mg/L) 5 ont été ensemencés au 1 /1 Cerne et placées à 37°C sous agitation. Lorsque la densité optique à 600nm a atteint 0,6, l'expression a été induite par l'ajout de 1 mM d'IPTG (Isopropy1-1-thio-p-D-galactopyranoside). Les cellules ont été ensuite placées pendant 3 heures à 37°C sous agitation puis récoltées par centrifugation à 3000 g. Les culots cellulaires ont été repris dans 20 mL 10 de tampon TE (Tris HCI 50mM, EDTA 2mM, pH 8), 10mM de DTT, 20 U/mL de benzonase et 4mM de MgSO4. La lyse cellulaire a été réalisée par sonication à 4°C sous une puissance de 40W par période de deux fois 2 minutes pendant 50 % du temps. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à 17 000 g pendant 45 minutes. 15 L'enzyme a été purifiée grâce à un protocole comprenant les 3 étapes suivantes : Précipitation au sulfate d'ammonium : La fraction soluble obtenue après sonication a été amenée à 65% de saturation en sulfate d'ammonium (SA) sous légère agitation à 4°C. A cette 20 concentration, la protéine a précipité et après centrifugation à 17 000 g pendant 45 minutes le culot a été alors repris dans 20 mL de tampon TE (Tris HCI 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8). Chromatographie d'interaction hydrophobe Phenyl-Sepharose (GE Healthcare (marque déposée)) : Du sulfate d'ammonium a été 25 ajouté progressivement à la solution protéique jusqu'à une concentration de 1 M. Cette solution a été alors filtrée (0,2 pm) avant injection sur une colonne d'interaction hydrophobe Phényl Sépharose préalablement équilibrée avec du tampon TE, 1M SA. L'élution est réalisée par gradient décroissant en sulfate 30 d'ammonium (de 1 à 0 M). Les fractions collectées ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE 12,5% et celles contenant la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase ont été 3061718 18 rassemblées puis dialysées pendant une nuit contre du tampon TE (Tris HCI 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8). Chromatographie échangeuse d'anions Q-Sépharose (GE Healthcare (marque déposée)): Après dialyse, la solution protéique 5 a été filtrée à 0,2 pm puis injectée sur une colonne de chromatographie échangeuse d'anions Q-Sépharose préalablement équilibrée avec du tampon TE (GE Healthcare (marque déposée)). L'élution a été réalisée en appliquant un gradient croissant de KCI (0 à 1 M). Les fractions contenant la 3- 10 mercaptopyruvate sulfurtransférase ont été identifiées par électrophorèse SDS-PAGE 12,5% puis rassemblées et concentrées par ultrafiltration sur cellule Am icon en utilisant une membrane YM 10 (seuil de 10 kDa). La solution protéique ainsi purifiée a été amenée à une saturation de 70 % en sulfate 15 d'ammonium afin de précipiter la protéine et la conserver à -20°C en présence de 5 mM de DTT. La figure 2 est une photographie d'un gel de protéine SDS-PAGE 12,5% après migration des échantillons obtenus après chacune des étapes de purification de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia 20 coll. Cette figure illustre clairement les différentes étapes de purifications démontrant l'obtention de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase purifiée à homogénéité. Exemple 2 : Elimination du sulfite présent dans du vin blanc 25 La 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase utilisée était le mutant D17A de la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase d'Escherichia coli purifiée obtenue dans l'exemple 1 ci-dessus. L'étude a été réalisée avec un vin blanc sec (Colombard Sauvignon, Côte de Gascogne, 44330 La chapelle Heulin, France). La 30 concentration en sulfite dans ce vin a été mesurée à 160 mg/L avant traitement par l'utilisation du kit sulfite oxydase (kit SO) (Megazyme International, Irlande) (courbe en noir, figure 4). La quantité en sulfite est 3061718 19 donnée par la différence de Densité Optique à 340 nm (AD0340nm) mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (SAFAS UVmc2). La densité optique a été mesurée à 340 nm car elle permet de suivre la quantité de NADH oxydé en NAD+ (réaction 2, figure 3) qui est 5 corrélée à la quantité de sulfite transformée en sulfate (réaction 1, figure 3). En d'autres termes, la diminution de la densité optique correspond à l'oxydation des sulfites par la sulfite oxydase démontrant ainsi la présence de sulfite. Le kit SO permet de doser la quantité des sulfites totaux du vin 10 c'est-à-dire les sulfites libres et les sulfites combinés aux molécules organiques. Ledit procédé présente l'avantage d'éliminer les sulfites totaux, or les formes combinées une fois dans l'estomac à pH de 1,5 à 5 sont libérées et constituent une source non négligeable de sulfite dans l'organisme qu'il est nécessaire de supprimer. Si la méthode permet 15 d'éliminer les sulfites totaux, c'est que l'élimination des formes sulfite libres conduit à un déplacement de l'équilibre chimique vers la décombinaison des sulfites fixés et donc in fine à l'élimination totale des sulfites (Grignard et al., 1950, Traité de chimie organique [14]). Afin de déterminer si la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase 20 permet effectivement de transformer le sulfite en thiosulfate, 25 mL de vin blanc ont été mélangés avec 2 pM de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase et du 3-mercaptopyruvate en stoechiométrie 1:1 par rapport au sulfite. L'ensemble a été incubé 5 min à température 25°C et la densité optique à 340 nm mesurée. La figure 4 présente les résultats obtenus. 25 La densité optique a été mesurée et il n'y a plus de diminution de l'absorbance attestant d'une élimination totale du sulfite présent dans le vin démontrant la transformation du sulfite en thiosulfate (courbe Vin blanc+3- MST+3MP, figure 4). Différents témoins montrent que l'élimination du sulfite est bien liée à l'activité enzymatique de l'enzyme puisque la même 30 expérience réalisée en absence du substrat 3-mercaptopyruvate ou en absence d'enzyme n'entraîne pas de baisse de la quantité de sulfite dans le 3061718 20 vin. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 5 (respectivement courbes Vin blanc+3-MST et Vin blanc + 3MP). L'élimination des sulfites libres dans le vin blanc a également été mise en évidence par l'utilisation de bandelettes (Quantofix (marque 5 déposée)) Sulfit, Macherey-Nagel) (résultats non divulgués). Par contre la quantité de sulfite après le procédé n'a pas pu être déterminée par les méthodes classiques utilisées actuellement dans l'industrie vinicole telles que : a. La méthode de Franz Paul car elle nécessite une acidification forte et 10 agressive par ajout d'acide sulfurique et chauffage ce qui conduit dans ces conditions à la dismutation du thiosulfate en sulfite, b. L'utilisation de kits chimiques car ils contiennent des réactifs spécifiques des groupements thiols or le thiosulfate et l'enzyme possèdent des groupements thiolates constituant une source de 15 réactions « parasites » biaisant la mesure. Le dosage de sulfite après la mise en oeuvre d'un exemple de procédé conforme à la présente invention a été fait par l'utilisation du kit SO (Megazyme International, Irlande) qui constitue une méthode de dosage spécifique quantitative et par l'utilisation de bandelettes (Quantofix (marque 20 déposée)) Sulfit, Macherey-Nagel) permettant de valider cette méthode en tant que test qualitatif. Tel que mentionné ci-dessus, le kit SO permet de doser la quantité des sulfites totaux du vin c'est-à-dire les sulfites libres et les sulfites combinés aux molécules organiques. Ce dosage a été réalisé selon le 25 protocole préconisé dans une cuve en verre en mélangeant 1,3 mL d'eau distillée, 250 pL de tampon, 100 pL d'échantillon étudié, 100 pL de NADH, 10 pL de NADH peroxydase. Après stabilisation de l'absorbance, 10 pL de sulfite oxydase ont été ajoutés et la variation d'absorbance à 340 nm a été mesurée. 30 Afin de déterminer la concentration optimale de 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase à utiliser, des essais ont été réalisés en présence de 3-mercaptopyruvate en quantité stoechiométrique par rapport 3061718 21 aux sulfites et de concentrations variables de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase. La densité optique à 340 nm a été mesurée instantanément suite au mélangé réactionnel. La concentration de sulfite dans l'échantillon de vin blanc était de 5 160 mg/L. Une mesure de la concentration résiduelle de sulfite après mise en oeuvre du procédé a été effectuée à l'aide du kit SO. Les résultats obtenus en présence de différentes concentrations de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous et sur la figure 5. 10 Tableau 1 : Quantité de sulfite résiduelle en fonction de la concentration de 3-m ercaptopyruvate sulfurtransférase Concentration d'enzyme 100 250 350 450 500 (3-MST) en nM Concentration de 160 96 50 25 REVENDICATIONS1. Procédé de traitement d'une composition comprenant l'introduction dans ladite composition de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase. 2. Procédé de transformation du sulfite présent dans une composition en thiosulfate comprenant l'introduction dans ladite composition de 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase (3-MST) et d'un substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel ladite 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase est recombinante. 15 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel ladite 3- mercaptopyruvate sulfurtransférase comprenant dans sa séquence peptidique les trois séquences suivantes : RXaWWM (SEQ ID N°13) 20 CGSGVTAXb (SEQ ID N°14) GHIXcG (SEQ ID N°15) dans lesquelles Xa est A, V ou L, Xb est A ou C, et Xc est P ou E. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans 25 lequel ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase est d'Escherichia coll. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase est une protéine de séquence peptidique choisi dans le groupe comprenant la séquence SEQ 30 ID N°2, 5, 6 et 7. 3061718 27 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel la composition est une composition agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique, vétérinaire. 5 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans lequel ledit substrat de ladite 3-mercaptopyruvate sulfurtransférase est choisi dans le groupe comprenant le 3-mercaptopyruvate. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes dans lequel le rapport stoechiométrique dudit substrat et du sulfite présent dans ladite composition est au maximum de 1 :1.