FR 3061410 A1 20180706 FR 1663540 A 20161230 1 COMPOSITION BIOSTIMULANTE DE LA CROISSANCE DES PLANTES OBTENUE A PARTIR DE SURNAGEANT DE CULTURE DE SOUCHES BACILLUS La présente invention a trait au domaine des biostimulants utilisés en agriculture pour favoriser la croissance des plantes. En particulier, la présente invention concerne une composition biostimulante et un procédé d'obtention d'une telle composition ainsi qu'une méthode favorisant le gain de matière végétale par application de cette composition. Les semences enrobées d'une composition biostimulante font également partie de l'invention. ETAT DE L,. TECH I: E L'augmentation de la demande alimentaire du fait de l'accroissement continuel de la population mondiale constitue un réel défi pour l'avenir. Les biostimulants peuvent contribuer efficacement à relever ce défi et sont de plus en plus utilisés dans la production agricole mondiale. La rapidité avec laquelle les racines d'une plante atteignent les éléments nutritifs constitue un paramètre déterminant dans le succès du développement et de la croissance initiaux de la plante, c'est-à-dire généralement au cours des premières semaines. Les biostimulants permettent d'améliorer la croissance des plantes en leur apportant des éléments nutritifs à base de produits naturels ou en aidant les plantes à accéder à leur nutriments. Les biostimulants favorisent la croissance et le développement des plantes durant tout le cycle de vie de la culture, de la germination des graines à la maturité des plantes. Ils permettent d'améliorer l'efficacité du métabolisme des plantes conduisant à une augmentation de la récolte et une meilleure qualité. Ils augmentent la tolérance des plantes aux stress abiotiques et la capacité de s'en remettre. Ils facilitent l'assimilation, le passage et l'utilisation des nutriments. Ils améliorent la qualité de la production agricole, y compris la teneur en sucre, la couleur et la taille du fruit. De plus, ils régulent et améliorent la teneur en eau des plantes. Ils accroissent enfin certaines propriétés physico-chimiques du sol et favorisent le développement des micro-organismes du terrain. L'utilisation de microorganismes ou de cocktails de micro-organismes pour la biostimulation des plantes est bien connue. Ces méthodes reposent sur l'application de compositions contenant un microorganisme purifié ou un mélange de microorganismes. De telles compositions contiennent notamment des souches de Bacillus. 3061410 2 Les compositions biostimulantes de la croissance des plantes décrites dans la littérature contiennent des souches de Bacillus purifiées, seules ou en association avec d'autres composants. A titre d'exemple, la demande W02016/109332 décrit des compositions 5 contenant une culture biologiquement pure de la souche D747 de Bacillus sp. (déposée sous le nom de FERM BP-8234). La demande W02016/108976 décrit des compositions contenant une culture biologiquement pure de la souche de Bacillus pumilus rti279 (déposée après de l'ATCC sous le numéro PTA-121164) qui peuvent être appliquées seules ou en association avec des agents chimiques ou d'autres agents microbiens, ou les 10 deux, pour favoriser la croissance des plantes et pour leur conférer une protection et/ou pour lutter contre les maladies végétales. De telles compositions présentent néanmoins des inconvénients. Pour que la composition soit active, il est souhaitable que le microorganisme soit vivant et capable de se multiplier sur la plante ; or ces conditions sont difficilement contrôlables. De plus, dans 15 un contexte agricole dans lequel les solutions écologiques sont favorisées, l'utilisation de souches de microorganismes génétiquement modifiées pose problème. La présente invention apporte une solution à ces problèmes. 20 En effet, les inventeurs ont montré de façon surprenante que le surnageant de culture de souches de Bacillus peut être avantageusement utilisé pour stimuler la croissance des plantes. Une préparation à base de surnageant de culture de Bacillus et ne contenant pas la et les souche(s) de Bacillus productrice(s) de ce surnageant présente le double avantage d'être active elle-même sans nécessiter une production in situ de molécules 25 biostimulantes et d'être dépourvue d'OGM. Si l'application de surnageant de culture de souches de Bacillus pour traiter les plantes a déjà été proposée, aucun des documents de l'art antérieur ne décrit l'utilisation d'une telle préparation pour la stimulation de la croissance. En effet, on peut citer le brevet US 30 6,103,228 qui décrit une méthode pour protéger ou traiter les plantes et les fruits infectés par les insectes consistant à appliquer du surnageant obtenu par mise en culture de la souche de Bacillus subtilis AQ713. De même, le brevet CN103589674 concerne l'utilisation d'une préparation de surnageant de fermentation de la souche Bacillus subtilis Pc3 (déposée sous le numéro NO: M2013470 auprès de la CCTCC) pour la 35 prévention et le contrôle d'une infection fongique chez une plante. Ainsi, la présente invention propose une approche innovante en vue de la biostimulation de la croissance des plantes. 3061410 3 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne une composition biostimulante de la croissance 5 des plantes caractérisée en ce que cette composition comprend le surnageant ou un extrait de surnageant d'une culture de Bacillus sp. à l'exclusion des cellules productrices. En effet, les inventeurs ont montré qu'une préparation d'un surnageant d'une souche de Bacillus sp. constituait une composition active en tant qu'agent stimulant pour favoriser 10 la croissance des plantes. Tel qu'utilisé ici, le terme « surnageant » correspond au surnageant ou à un extrait de surnageant d'une culture de Bacillus sp. Telle que définie ici, une « composition biostimulante » correspond à une préparation ou composition apte à améliorer la croissance des plantes. Afin de vérifier si une préparation 15 de surnageant de culture présente des propriétés biostimulantes, ledit surnageant doit être appliqué sur les parties supérieures de la plante et/ou au niveau des racines par arrosage et/ou trempage. L'effet biostimulant est évalué sur la croissance de la plante. Les critères d'évaluation de la croissance applicables sont multiples ; certains critères sont décrits dans la partie expérimentale. Il s'agit par exemple d'évaluer le gain en terme 20 de biomasse ou de hauteur des plantes attribuables à l'application de la composition biostimulante. Les souches de Bacillus qui peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention sont des souches naturelles ou des souches génétiquement modifiées. 25 Dans un mode de réalisation particulier, les souches de Bacillus sp. sont choisies parmi Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides et Bacillus firmus. 30 Avantageusement, les souches de Bacillus sont choisies parmi les souches de Bacillus subtilis et de Bacillus amyloliquefaciens. Dans un mode de réalisation préféré, les souches B. subtilis sont choisies parmi les souches ATCC 6633, ATCC 21332, 168, ATCC 9943 et NCIB 3610 et leurs dérivés ; les souches de B. amyloliquefaciens sont choisies parmi les souches FZB42 et LMG S-29032 (aussi appelée GA1) et leurs dérivés. 35 Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition biostimulante est obtenue par concentration du surnageant. Ainsi, la composition concentrée peut correspondre à une concentration d'au moins un facteur 2 par rapport au surnageant récolté, de manière 3061410 4 préférée d'au moins un facteur 20, et de manière encore plus préférée d'au moins un facteur 50. En effet, les souches de Bacillus sp. sont connues pour leur capacité à produire des 5 lipopeptides. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, une composition obtenue par concentration du surnageant peut également être définie par sa teneur en lipopeptides. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, une préparation de lipopeptides selon l'invention peut contenir des lipopeptides à une concentration d'au moins 0,001 %, 0,01%, 0,05% ou 0,1 10 %, de préférence entre 1% et 7 %, notamment de 3% ou 5%, et de manière encore plus préférée d'au moins 10%, voire d'au moins 20%, sachant qu'une solution à 1% correspond à concentration de 10g/L. Parmi les lipopeptides présentant des propriétés biostimulantes de la croissance des plantes, les lipopeptides de la famille des iturines, des surfactines, des fengycines, des 15 kurstakines et des locillomycines sont particulièrement intéressants dans le cadre de la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, la composition biostimulante est définie par sa teneur en molécules appartenant à la famille des iturines et/ou en molécules appartenant 20 à la famille des surfactines et/ou molécules appartenant à la famille des fengycines et/ou des molécules appartenant à la famille des kurstakines et/ou des molécules appartenant à la famille des locillomycines (voir Tableau de la Figure 1). Par « molécules de la famille des iturines », on entend l'iturine A, la mojavensine, la 25 mycosubtiline, et les bacillomycines A, B, C, D, F et L. Par « molécules de la famille des surfactines », on entend les surfactines A, B, C, la lichenysine et la pumilacidine. Par « molécules de la famille des fengycines », on entend les fengycines A et B, les plipastatines A et B et l'agrastatine. 30 Ainsi, une composition biostimulante selon l'invention peut par exemple contenir entre 1 et 15% de lipopeptides, dans les proportions suivantes : molécules appartenant à la famille des iturines 10-90%, molécules appartenant à la famille des surfactines 10-90%, molécules appartenant à la famille des fengycines 0-50%. 35 Une composition selon l'invention peut également contenir des métabolites primaires produits par ladite souche, comme par exemple l'acétoine, le 2-3 butanediol, des précurseurs de l'auxine et/ou des enzymes solubilisant le phosphate. 3061410 5 Afin de faciliter la pénétration de la préparation dans la plante, la préparation selon l'invention peut également contenir des adjuvants. De manière avantageuse, l'adjuvant facilite la pénétration de la composition biostimulante dans la plante. Le choix de l'adjuvant est guidé par l'effet recherché. A titre d'exemple, les mouillants augmentent 5 la surface de contact entre la feuille et la gouttelette en étalant la matière active et assurent la rétention du produit sur la cuticule. Les huiles quant à elles favorisent la pénétration des matières actives en « cassant » la barrière des couches de cires épicuticulaires de la plante ; cela devient un inconvénient quand on sait que l'huile va agir de la même façon sur les cuticules des plantes cultivées au point de risquer de 10 fragiliser ses défenses naturelles contre les champignons pathogènes. D'autres adjuvants comme les pénétrants sont des mouillants imprégnant les cuticules cireuses en respectant leur intégrité. Les sels peuvent également être utilisés comme adjuvants notamment pour absorber l'humidité de l'air et lutter ainsi contre la dessiccation. Enfin, les adhésifs fixent la matière active sur les feuilles et limitent le lessivage et la 15 volatilisation. Les adjuvants sont donc à adapter aux modes d'action des matières actives (racinaires, contact, systémique ou pénétrant), aux types de formulations des produits et aux types de plantes ciblées (feuilles glabres ou velues, épaisseur des cuticules, stades des plantes, positions des stomates ...). De manière avantageuse, les adjuvants sont choisis parmi les surfactants polymériques 20 chargés ou non, les alkylpolyglucosides et alkylpolyglucosides ester, les dérivés naphtalene-sulfonates, les dérivés cellulosiques, les polysaccharides naturels, les émulsions à base de silicone... La composition biostimulante selon l'invention peut, dans un autre mode de réalisation, 25 contenir également des cellules, à condition que ces cellules ne correspondent pas à la souche ou aux souches particulière(s) ayant produit le surnageant. Les cellules ajoutées à la préparation peuvent présenter des propriétés particulières permettant de renforcer l'effet biostimulant de la préparation de surnageant ou des propriétés additionnelles, notamment antifongiques. Ainsi, de telles cellules peuvent être choisies parmi une 30 souche de Bacillus sp. distincte de celle ayant été utilisée pour produire le surnageant, en particulier parmi les souches Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus firmus. De telles cellules peuvent aussi ne pas être des souches de type Bacillus mais de type Paenibacillus sp., 35 Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas syringae), Streptomyces sp. (Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lydicus). De telles cellules peuvent être aussi des levures, des champignons ou des mycorhizes de type Trichoderma sp. ou Pythium sp.... 3061410 6 Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé d'obtention d'une préparation biostimulante de la croissance des plantes comprenant les étapes de (i) mise en culture 5 d'au moins une souche de Bacillus sp., (ii) incubation dans un milieu de culture approprié pour la sécrétion de molécules dans le surnageant et (iii) récolte du surnageant. Dans ce procédé, le surnageant ou un extrait dudit surnageant peut être utilisé directement comme biostimulant. Le temps d'incubation ainsi que le milieu de culture sont choisis en fonction des souches 10 à cultiver ; l'homme du métier saura adapter ces paramètres. Dans un mode de réalisation particulier, la ou les souche(s) de Bacillus mise(s) en oeuvre dans ce procédé est/sont de préférence choisie(s) parmi Bacillus sp. Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus 15 pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus et Bacillus firmus. Avantageusement, les souches de Bacillus sont choisies parmi les souches de Bacillus subtilis et de Bacillus amyloliquefaciens. Dans un mode de réalisation préféré, les souches B. subtilis sont choisies parmi les souches ATCC 6633, ATCC 21332, 168, ATCC 9943 et NCIB 3610 et leurs dérivés ; les souches de B. amyloliquefaciens sont 20 choisies parmi les souches FZB42 et LMG S-29032 et leurs dérivés. En outre, ce procédé peut contenir une étape de concentration du surnageant. La concentration de la préparation peut être obtenue en utilisant l'une des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, la préparation peut être concentrée 25 soit par ultrafiltration sur membrane, soit par évaporation, soit par précipitation physico- chimique, soit par extraction. Ce procédé de concentration permet d'obtenir une composition biostimulante contenant une teneur minimale en lipopeptides de 0,001%, 0,005%, 0,01% ou 0,05%, de manière 30 préférée de 0,1%, en particulier entre 1% et 7 %, et de manière encore plus préférée d'au moins 10%, voire d'au moins 20%. La composition biostimulante ainsi obtenue peut être déshydratée sous forme d'une poudre pour faciliter sa conservation, son stockage et son transport. Ainsi une 35 composition biostimulante telle que définie précédemment peut être obtenue par dissolution d'une poudre de surnageant pour obtenir la concentration souhaitée en molécules d'intérêt, en particulier en lipopeptides. 3061410 7 Un troisième objet de l'invention concerne une méthode de biostimulation pour favoriser la croissance des plantes consistant à appliquer une préparation de surnageant telle que définie précédemment. 5 Dans un mode de réalisation particulier, la préparation biostimulante peut être appliquée par traitement foliaire afin d'obtenir un gain significatif de matière foliaire et/ou racinaire et/ou fruitière et/ou légumière et/ou céréalière. Ce traitement peut être appliqué par exemple par pulvérisation de la préparation biostimulante. 10 Dans un autre mode de réalisation particulier, la préparation biostimulante peut être appliquée par traitement racinaire afin d'obtenir un gain significatif de matière foliaire et/ou racinaire et/ou fruitière et/ou légumière et/ou céréalière. Ce traitement peut être appliqué par exemple par arrosage à l'aide de la préparation biostimulante. 15 Dans un autre de mode de réalisation, la préparation biostimulante peut être appliquée par traitement des semences afin d'obtenir un gain significatif de matière foliaire et/ou racinaire et/ou fruitière et/ou légumière et/ou céréalière. Ce traitement peut être appliqué par exemple par enrobage à l'aide de la préparation biostimulante. 20 Un autre objet de l'invention concerne des bulbes ornementaux traités à l'aide d'une préparation biostimulante telle que définie dans la présente invention afin d'obtenir un gain significatif de matière foliaire. Un autre objet de l'invention concerne une semence enrobée à l'aide d'une préparation 25 biostimulante telle que définie dans la présente invention. L'enrobage d'une semence végétale est destiné en particulier à améliorer la croissance initiale de la plante. 30 DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Tableau descriptif des masses moléculaires des principaux lipopeptides produits par Bacillus sp. 35 Figure 2 : Mesure de la hauteur des plants de tomates après application de compositions concentrées dérivées de surnageant de culture de Bacillus sp. Les hauteurs des plants ont été mesurés après application de compositions contenant :(modalité 1) composition issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens 3061410 8 contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L ; (modalité 2) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L ; (modalité 3) 5 composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 700 mg/L et en surfactine A de 300 mg/L. L'analyse révèle un effet significatif du traitement sur la hauteur de la plante (P=0,0029). Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par les lettres a et b. 10 Figure 3 : Mesure du poids de la biomasse fraîche des parties aériennes des plants de tomates après application de compositions concentrées dérivées de surnageant de culture de Bacillus sp. Les poids de la biomasse fraîche des parties aériennes des plants de tomates ont été mesurés après application de compositions contenant :(modalité 1) composition issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens 15 contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L ; (modalité 2) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L ; (modalité 3) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales 20 pour le traitement en mycosubtiline de 700 mg/L et en surfactine A de 300 mg/L. L'analyse révèle un effet significatif du traitement sur la hauteur de la plante (P=0,0029). Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par les lettres a, b et c. Figure 4 : Mesure de l'augmentation de la matière humide et des racines de 25 plants de blé après application de compositions concentrées dérivées de surnageant de culture de Bacillus sp. Les poids de la biomasse fraîche des parties aériennes et racinaires des plants de blé ont été mesurés après application uniquement en racinaire (R) ou en racinaire et foliaire (R+F) de compositions contenant :(modalité 1) composition issue de surnageant de 30 Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L ; (modalité 2) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L ; (modalité 4) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis 35 contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 350 mg/L et en surfactine A de 150 mg/L. Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par les lettres A et B pour l'effet biostimulant sur les parties aériennes des plants de blé et par les lettres a et b pour l'effet biostimulant sur les parties racinaires des plants de blé. 3061410 9 Figure 5 : Mesure de l'augmentation de la teneur en chlorophylle des plants de blé après application de compositions concentrées dérivées de surnageant de culture de Bacillus sp. La teneur en chlorophylle des parties aériennes des plants de 5 blé a été mesurées après application uniquement en racinaire (R) ou en racinaire et foliaire (R+F) de compositions contenant :(modalité 1) composition issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L ; (modalité 4) composition issue de surnageant de Bacillus subtilis contenant des 10 concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 350 mg/L et en surfactine A de 150 mg/L. Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par les lettres a, b et c. 15 EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'une composition biostimulante 1.a Préparation d'un surnageant de culture 20 Le surnageant de culture est obtenu à partir d'un procédé de fermentation aérobie d'une souche Bacillus dérivée de la souche Bacillus subtilis ATCC 6633 ou de la souche Bacillus amyloliquefaciens LMG S-29032. La culture est réalisée dans un milieu contenant une source de carbone (glucose, saccharose,...), une source d'azote (sulfate ammoniaque, 25 peptone...) et des oligoéléments sous agitation à 30°C. Le pH est maintenu à une valeur de 7. La culture est récoltée après 48 à 72h. Elle est ensuite centrifugée ou filtrée pour éliminer les cellules. Le surnageant de culture est prêt à être concentré. Le pourcentage de lipopeptides à ce stade est de l'ordre de 0,05 à 0,5% (poids/volume). 30 1.13 Préparation d'une préparation biostimulante concentrée - Par filtration tangentielle Le surnageant de culture obtenu via, par exemple, la préparation présentée en 1.a est concentré via ultrafiltration tangentielle en utilisant une membrane dont le seuil de 35 coupure peut être de 1KDa à 100 KDa. Pour exemple, 1000L de surnageant de culture obtenu comme décrit précédemment sont concentrés par passage sur la membrane pour obtenir un retentât d'un volume de 10 à 100L. 3061410 10 - Par précipitation à pH acide Un second exemple de préparation d'une préparation biostimulante concentrée consiste en une diminution du pH dans le but de précipiter les lipopeptides. Une addition d'acide sulfurique concentré est réalisée sur le surnageant obtenu, par exemple, via la 5 préparation présentée en 1.a. Après l'obtention d'un pH final aux alentours de 1, la solution est laissée sous agitation de 2 à 12h. Une centrifugation permet de récupérer un culot de matière contenant les lipopeptides. Ce culot est ensuite dissous par addition d'eau et de soude afin d'obtenir une valeur de pH comprise entre 7 et 8,5. Pour exemple, lorsque le culot est obtenu à partir de 1000L de surnageant de culture, ce culot peut être 10 repris dans un volume de 10 à 100L total. Le pourcentage de lipopeptides à l'issue de l'un de ces deux exemples de préparation est de l'ordre de 1 à 15% (poids/volume). Exemple 2 : Effet biostimulant de la composition obtenue à partir du surnageant 15 de culture de Bacillus sur la croissance des plantes 2.a Analyse des composés présents dans le surnageant La capacité du surnageant de culture à être utilisé en tant que composition 20 biostimulante, peut être vérifiée à l'aide de méthodes analytiques. La présence de lipopeptides, de métabolites primaires ou d'enzymes issus de la culture de Bacillus dans la composition peut en effet être mesurée par différentes méthodes connues de l'homme du métier, notamment par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (ou LC-MS), par chromatographie en phase liquide à haute 25 performance (HPLC) ou par méthodes colorimétriques. 2.b Méthode d'évaluation de l'effet biostimulant sur les plantes L'effet biostimulant de la composition peut être évalué directement sur la plante en 30 analysant des paramètres de croissance. A cet effet, le surnageant de culture ou la composition qui en dérive peuvent être appliqués sur les parties supérieures de la plante, au niveau des racines par arrosage, ou par trempage des semences. Ces modes d'application peuvent également être combinées entre elles. L'effet biostimulant est évalué après une phase de croissance. 35 L'effet biostimulant est obtenu si au moins un des critères suivants est satisfait : - Augmentation des tailles de la plante (en hauteur ou en épaisseur) - Augmentation des biomasses fraiches et/ou sèches des fruits de la plante 3061410 11 - Augmentation des biomasses fraiches et/ou sèches des parties aériennes de la plante - Augmentation des biomasses fraiches et/ou sèches des racines de la plante - Augmentation du nombre de noeuds, du nombre d'épi pour des cultures 5 céréalières - Augmentation de la longueur du système racinaire de la plante - Augmentation du rendement céréalier, légumier et/ou fruitier - Augmentation de la teneur en chlorophylle 10 2.c Effet d'un surnageant concentré sur l'augmentation de la hauteur de plants de tomates. Matériel et Méthodes L'essai est réalisé en serre de culture pour assurer des conditions semi-contrôlées de 15 température et d'ensoleillement : - Température : 25°C le jour / 20°C la nuit - Photopériode : 14h de jour / 10h de nuit La serre est régulée pour une luminosité minimale de 175 W/m2. En dessous de cette luminosité, l'éclairage s'allume et compense la valeur de luminosité. L'ombrage, lui, se 20 déploie au-delà d'une luminosité de 500 W/m2 et se replie sous 450 W/m2. Chaque modalité est évaluée sur 5 plants de tomate préalablement repiqués au stade 2 feuilles dans un sol agricole sableux. Une fertilisation initiale est effectuée deux jours avant repiquage par une solution d'Hakaphos rouge 8-12-24 apporté à raison de 0,2 g 25 par plant de tomate. Le mode d'usage testé dans cet essai d'efficacité biostimulante correspond à un apport du produit au pied des plants à la transplantation de la tomate et après 3 semaines de culture en pulvérisation foliaire en considérant un volume pulvérisé de 200L/ha. 30 Les compositions testées sont les suivantes : - Surnageant de culture de Bacillus amyloliquefaciens concentré d'un facteur 20 et dilué d'un facteur 40 pour obtenir une concentration de 50g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici iturine A) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) et de la famille des fengycines (ici fengycine A et B) (modalité 1), 35 - Surnageant de culture de Bacillus subtilis concentré d'un facteur 20 et dilué d'un facteur 40 pour obtenir une concentration de 50g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici mycosubtiline) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) (modalité 2), 3061410 12 - Surnageant de culture de Bacillus subtilis concentré d'un facteur 20 et dilué d'un facteur 10 pour obtenir une concentration 200g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici mycosubtiline) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) (modalité 3), - Témoin traité avec le même volume d'eau distillée (modalité Control) 5 La hauteur des plants et la biomasse fraiche des parties aériennes sont alors mesurées après 6 semaines de culture. Les données sont traitées par une analyse de la variance (ANOVA, méthode LSD au niveau de confiance de 95% soit un seuil de risque de 5%) afin de mettre en évidence les effets significatifs. Le test est réalisé au moyen du logiciel 10 STATGRAPHICS Centurion XV version 15.2.06. Résultats Le protocole expérimental permet de comparer l'effet biostimulant de différentes compositions dérivées d'un surnageant de culture d'une souche Bacillus sur la hauteur 15 atteinte par les plants de tomates. Les résultats sont présentés à la Figure 1. L'analyse statistique révèle un effet significatif du traitement sur ce paramètre (P=0,0029). Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par les lettres a et b, l'ensemble des modalités présentent un effet biostimulant significatif par rapport au témoin. Les résultats présentés à la Figure 2 montrent que les compositions issus de surnageant 20 de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L (modalité 2) et des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 700 mg/L et en surfactine A de 300 mg/L (modalité 3) permettent d'augmenter de manière significative la taille des plants de tomates sur une période de 6 semaines en comparaison avec la modalité non 25 traitée (modalité Control). L'effet biostimulant de la modalité 1 issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L est bien supérieur au témoin non traité mais appartient aux 2 groupes statistiques dont celui du témoin. 30 2.d Effet d'un surnageant concentré sur l'augmentation de la biomasse fraîche des parties aériennes des plants de tomates. Matériel et Méthodes 35 Le protocole expérimental est identique à celui décrit au paragraphe 2.c ci-dessus. Résultats Le protocole expérimental permet de comparer l'effet biostimulant de différentes compositions dérivées d'un surnageant de culture d'une souche Bacillus sur le poids de la 3061410 13 biomasse fraîche des parties aériennes des plants de tomates. Les résultats sont présentés dans la Figure 3. L'analyse statistique révèle un effet significatif du traitement sur ce paramètre (P=0,0029). Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par des lettres a, b et c. 5 Les résultats présentés à la Figure 2 montrent que les compositions issues de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L (modalité 2) et des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 700 mg/L et en surfactine A de 300 mg/L (modalité 3) permettent une augmentation significative des biomasses 10 fraiches des parties aériennes par rapport à celles de la modalité non traitée (modalité Control). L'effet biostimulant de la modalité 1 issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L est bien supérieur au témoin non traité mais appartient à 2 groupes statistiques dont celui du 15 témoin. 2.e Effet d'un surnageant concentré sur l'augmentation de la production de matière humide de plants de blé et de la matière humide des racines de plants de blé 20 Matériel et méthodes Les semences de blé de la variété Tybalt ont été semées sur un substrat inerte. Les racines se développent en milieu liquide. Lorsque les plantes de blé étaient au stade 1-2 feuilles, les plantes ont été plantées dans des pots avec un sol argileux sableux. Les pots 25 ont été maintenus dans une chambre de culture avec 16 heures de lumière et une température de 19° C. Pour chaque culture et chaque traitement, 20 plantes ont été cultivées. Dix plantes ont été traitées par application de racines (noté R dans les figures 4 et 5); 10 plantes n'ont pas été traitées. Puis, dans le groupe de 10 plantes traitées par application de racines, 5 30 plantes ont été traitées ensuite par application foliaire (noté R+F dans les figures 4 et 5); 5 plantes n'ont pas été traitées (noté R dans les figures 4 et 5). Les racines des plants de blé ont été traitées par immersion dans les différentes solutions de produit et immédiatement après le traitement plantées dans les pots avec du terreau fruitier sableux. Les applications foliaires ont été appliquées 4 semaines après la 35 plantation avec un volume de pulvérisation de 200 1/ha. La mesure finale est réalisée après 9 semaines de croissance. Les données obtenues ont été analysées statistiquement avec SAS 7. La normalité a été testée avec Kolmogorov-Smirnov et l'égalité des variances a été testée par le test de 3061410 14 Levene. Les variables homoscedastiques normalement distribuées ont été soumises à un Anova bidirectionnel à sens unique avec Tukey comme test post hoc. Les compositions testées sont les suivantes : 5 - Surnageant de culture de Bacillus amyloliquefaciens concentré d'un facteur 20 et dilué d'un facteur 40 pour obtenir une concentration de 50g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici iturine A) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) et de la famille des fengycines (ici fengycine A et B) (modalitél), - Surnageant de culture de Bacillus subtilis concentré d'un facteur 20 et dilué d'un 10 facteur 40 pour obtenir une concentration de 50g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici mycosubtiline) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) (modalité 2), - Surnageant de culture de Bacillus subtilis concentré d'un facteur 20 et dilué d'un facteur 20 pour obtenir une concentration 100g/ha en lipopeptides de la famille des Iturines (ici mycosubtiline) et de la famille des surfactines (ici surfactine A) (modalité 4), 15 - Témoin est traité avec le même volume d'eau distillée (modalité Control) Résultats Le protocole expérimental permet de comparer l'effet biostimulant de différentes compositions dérivées d'un surnageant de culture d'une souche Bacillus sur le poids de la 20 biomasse fraîche des parties aériennes (MF plante) et de la biomasse fraiche des racines (MF racine) des plants de blé. Les résultats sont présentés dans la Figure 4. Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par des lettres A et B pour les parties aériennes et a et b pour les racines. 25 - Effet sur la biomasse fraiche des parties aériennes des plants de blé Les résultats présentés à la Figure 4 montrent que les compositions issues de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L (modalité 2) appliqué en racinaire et en foliaire (R+F) et des concentrations finales pour le traitement en 30 mycosubtiline de 350 mg/L et en surfactine A de 150 mg/L (modalité 4) appliqué en racinaire (R) permettent une augmentation significative des biomasses fraiches des parties aériennes par rapport à celles de la modalité non traitée (modalité Control). Les résultats présentés à la Figure 4 montrent que la composition issue d'un surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en 35 iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L (modalité 1) appliqué uniquement en racinaire (R) ou en racinaire et en foliaire (R+F) est bien supérieur au témoin non traité mais appartient à 2 groupes statistique dont celui du témoin. Un résultat similaire est observé pour la modalité 4 appliquée en racinaire et foliaire (R+F). 3061410 15 - Effet sur la biomasse fraiche des parties racinaires des plants de blé Les résultats présentés à la Figure 4 montrent que les compositions issues de surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en 5 mycosubtiline de 175 mg/L et en surfactine A de 75 mg/L (modalité 2) appliqué en racinaire et en foliaire (R+F) et des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 350 mg/L et en surfactine A de 150 mg/L (modalité 4) appliqué en racinaire (R) permettent une augmentation significative des biomasses fraiches des parties racinaires par rapport à celles de la modalité non traitée (modalité Control). 10 Les résultats présentés à la Figure 4 montrent que la composition issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L (modalité 1) appliqué au niveau racinaire et en foliaire (R+F) est bien supérieur au témoin non traité mais appartient à 2 groupes statistique dont celui du témoin. Un 15 résultat similaire est observé pour la modalité 2 appliquée en racinaire (R) et pour la modalité 4 appliquée en racinaire et foliaire (R+F). 2.f Effet d'un surnageant concentré sur l'augmentation de la teneur en chlorophylle des plants de blé 20 Matériel et méthodes Le protocole expérimental est identique à celui décrit au paragraphe 2.e ci-dessus. 25 Résultats Le protocole expérimental permet de comparer l'effet biostimulant de différentes compositions dérivées d'un surnageant de culture d'une souche Bacillus sur la teneur en chlorophylle des parties aériennes des plants de blé. Les résultats sont présentés dans la Figure 5. Les groupes statistiques sont indiqués sur le graphique par des lettres a, b et c. 30 Les résultats présentés à la Figure 5 montrent que la composition issue d'un surnageant de Bacillus subtilis contenant des concentrations finales pour le traitement en mycosubtiline de 350 mg/L et en surfactine A de 150 mg/L (modalité 4) appliqué en racinaire et foliaire (R+F) permet une augmentation significative de la teneur en 35 chlorophylle des parties aériennes par rapport à celles de la modalité non traitée (modalité Control). Ces résultats montrent également que la composition issue de surnageant de Bacillus amyloliquefaciens contenant des concentrations finales pour le traitement en iturine A de 3061410 16 90 mg/L, en fengycine A et B de 100 mg/L et en surfactine A de 60 mg/L (modalité 1) appliqué en racinaire (R) ou en racinaire et en foliaire (R+F) permet une augmentation significative de la teneur en chlorophylle des parties aériennes par rapport à celles de la modalité non traitée (modalité Control). 5 REVENDICATIONS1. Composition biostimulante de la croissance des plantes caractérisée en ce que cette composition comprend le surnageant ou un extrait de surnageant d'une culture d'au moins une souche de Bacillus sp. à l'exclusion des cellules productrices. 2. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon la revendication 1 dans laquelle ladite ou au moins l'une desdites souches de Bacillus sp. est/sont choisie(s) parmi les souches de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus et Bacillus firmus. 3. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon la revendication 2 dans laquelle ladite ou au moins l'une desdites de Bacillus sp. est une souche de Bacillus subtilis, de préférence choisie parmi les souches ATCC 6633, ATCC 21332, 168, ATCC 9943 et NCIB 3610 ou une souche de Bacillus amyloliquefaciens, de préférence choisie parmi les souches FZB42 et LMG S-29032. 4. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation concentrée obtenue à partir d'un surnageant de culture d'au moins une souche de Bacillus et qu'elle contient une concentration en lipopeptides d'au moins 0,01 g/L, les lipopeptides étant choisis parmi les molécules appartenant à la famille des iturines et/ou molécules appartenant à la famille des surfactines et/ou molécules appartenant à la famille des fengycines et/ou des molécules appartenant à la famille des kurstakines et/ou des molécules appartenant à la famille des locillomycines. 5. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle contient entre 1 et 15% de lipopeptides selon les proportions suivantes : molécules appartenant à la famille des iturines 10-90% et/ou molécules appartenant à la famille des surfactines 1090% et/ou molécules appartenant à la famille des fengycines 0-50%. 3061410 18 6. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle contient en outre des adjuvants. 7. Composition biostimulante de la croissance des plantes selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle contient en outre des cellules autres que les cellules productrices du surnageant. 8. Procédé d'obtention d'une composition biostimulante de la croissance des plantes comprenant les étapes de : mise en culture d'une souche de Bacillus sp, et récolte du surnageant. 9. Procédé d'obtention d'une composition biostimulante de la croissance des plantes selon la revendication 8, comprenant en outre une étape de concentration et/ de séchage dudit surnageant récolté. 10. Procédé d'obtention d'une composition biostimulante de la croissance des plantes selon l'une des revendications 8 ou 9, dans lequel ladite ou au moins l'une desdites souches de Bacillus sp est choisie parmi les souches de Bacillus subtilis Bacillus, amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Paenibacillus polymixa, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus coagulans, Bacillus mycoides, Bacillus sphaericus et Bacillus firmus, de préférence parmi les souches de Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens. 11. Méthode de biostimulation pour favoriser la croissance des plantes consistant à appliquer une composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 7 par traitement foliaire et/ou traitement racinaire et/ou traitement des semences et/ou des bulbes ornementaux. 12. Utilisation d'une composition biostimulante telle que définie à l'une des revendications 1 à 7 pour enrober une semence.