FR 3046612 A1 20170714 FR 1650128 A 20160107 1 La présente invention appartient au domaine technique des méthodes de contrôle de qualité de méthodes de détection de la présence de micro-organismes dans les selles. En particulier, l'invention concerne l'utilisation de particules synthétiques et/ou naturelles, pour le contrôle de la qualité interne de méthodes de concentration de micro-organismes dans les selles, des kits comprenant de telles particules, ainsi que des méthodes de contrôle de la qualité de méthodes de détection de la présence de micro-organismes dans les selles comprenant de telles particules. Les structures de santé comprennent notamment des hôpitaux, des cliniques, des cabinets médicaux, des Laboratoires de Biologie Médicale (LBM) d'analyses privés ou publics. Ces derniers, dans le cadre de leurs activités, effectuent régulièrement des analyses sur des prélèvements tels que le sang, les urines ou les selles. Les résultats de ces analyses fournissent des informations concernant un état physiologique, tel que la grossesse, ou pathologique, tel que un diabète, un cancer, une grippe. Pour réaliser ces analyses, les Laboratoires de Biologie Médicale (LBM en abrégé) utilisent des réactifs qui sont appelés des Dispositifs Médicaux de Diagnostic In Vitro ou DMDIV. En France, la législation relative à la biologie médicale impose depuis le 16 janvier 2010 la mise en place de l'accréditation de tous les Laboratoires de Biologie Médicale (code de la Santé Publique - article L 6221-1). Ces laboratoires devront être accrédités sur la totalité de leur activité au plus tard le 31 octobre 2020. En France l'organisme d'accréditation est le Cofrac (Comité français d'accréditation). Cette accréditation est basée sur des normes, telles que les normes NF EN ISO 15189 ou NF EN ISO 22870. Elle permet notamment la vérification de la qualité des analyses donc des résultats, l'habilitation et la qualification du personnel. Pour être accrédités, les Laboratoires de Biologie Médicale doivent satisfaire à de nombreuses exigences. La validation des techniques, qu'ils utilisent pour réaliser les analyses, en fait partie. Cette validation des techniques est obtenue par : - l'utilisation des contrôles qualités internes, dont l'abréviation utilisée couramment est CQI (contrôle permanent). Ces CQI sont des produits ou des réactifs proposés aux Laboratoires de Biologie Médicale (LBM), pour valider et/ou établir la fidélité de leurs techniques, - leur participation obligatoire à des contrôles inter-laboratoires ou EEQ (abréviation de « évaluations externes de la qualité »). Des produits ou des prélèvements sont proposés, par des sociétés ou des associations, aux LBM pour des enquêtes en aveugle, pour une évaluation de la qualité des résultats rendus, c'est à dire 3046612 2 l'exactitude et la justesse du laboratoire. L'utilisation de ces CQI et la mise en place des EEQ par les LBM sont obligatoires pour l'accréditation. Des dispositifs de CQI sont proposés dans tous les domaines de la biologie médicale. Cependant peu d'entre eux concernent la parasitologie. L'une des difficultés 5 majeures dans ce domaine est que le développement des produits CQI connus nécessite, dans certains cas, des prélèvements d'origine humaine (sang, selles) contenant des parasites, par exemple les plasmodium agents du paludisme ou les amibes, présents dans des pays en voie de développement. Pour le diagnostic des parasitoses intestinales, les LBM réalisent des techniques 10 permettant la recherche et l'identification des parasites dans les selles. Selon la nomenclature des actes de biologie réalisés dans les laboratoires de biologie médicale, la recherche des parasites dans les selles comprend : - un examen macroscopique, - un examen microscopique direct avant et/ou après coloration des selles, 15 - un examen microscopique après concentration parasites des selles. Les méthodes utilisées pour la concentration des parasites dans les selles sont classées selon leur principe en : - méthodes de concentration par sédimentation. Elles utilisent un liquide de densité inférieure à celle des parasites qui sont alors retrouvés dans le sédiment ou 20 dans le culot de centrifugation, - méthodes de concentration par flottation. Elles utilisent un liquide de densité supérieure à celle des parasites qui sont alors retrouvés à la surface du liquide, - méthodes de concentration diphasiques, ou physico-chimiques. Elles utilisent une solution aqueuse et un solvant non miscible tel que l'éther ou l'acétate d'éthyle. 25 Dans un tube à centrifuger, les selles sont mises en suspension dans une solution aqueuse. Après addition du solvant et agitation pour obtenir une émulsion, le tube est centrifugé pour casser cette émulsion et permettre la séparation des éléments présents dans les selles, selon leur balance hydrophile-lipophile. Avec ces méthodes, une grande partie des débris fécaux se localise dans la phase organique ou à l'interface, et 30 les parasites, kystes ou oeufs, généralement hydrophiles sont retrouvés dans le culot. Chacune de ces trois méthodes est bien décrite dans l'état de la technique et bien connue de l'homme du métier. Les CQI pour ces méthodes de concentration des parasites dans les selles, doivent être traités comme les prélèvements à analyser. Ils doivent donc contenir des 3046612 3 selles ou être incorporés dans des selles avant la réalisation de la technique de concentration à évaluer. Les CQI pour les méthodes de concentration des parasites dans les selles devraient en toute logique être composés de selles, fixées et/ou lyophilisées, contenant 5 des parasites, par exemple des oeufs d'helminthes et/ou des kystes de protozoaires, identifiés et en quantité connue. Le problème est l'obtention de selles humaines parasitées, en tant que matière première, en quantité suffisante pour la réalisation d'un tel CQI. En effet dans les pays industrialisés, les parasitoses intestinales sont rares, voire inexistantes pour certaines, et dans les pays en voie de développement la 10 récupération, la fixation et l'expédition des selles, en quantité suffisante pour la réalisation de plusieurs lots de CQI, ne sont pas faciles à mettre en oeuvre. Une alternative pourrait être l'utilisation de parasites d'animaux. Pour ceux qui seraient naturellement infestés, la récupération des déjections en fonction de l'espèce animale n'est pas toujours facile. En outre, reste le problème de la quantité pour la fabrication 15 de lots ayant les mêmes caractéristiques. Pour les animaux qui seraient expérimentalement infestés, une demande d'expérimentation animale est obligatoire. L'entretien pour certains parasites d'un cycle et le risque de contamination limitent cette possibilité. Face à ces difficultés, et notamment la difficulté d'obtention de matière 20 première en quantité suffisante, les inventeurs ont cherché à développer des produits de CQI efficaces et faciles à mettre en oeuvre pour le contrôle de la qualité des méthodes de concentration des parasites dans les selles. La présente invention concerne ainsi l'utilisation de particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes supérieures ou égales à 1 [lm, pour le contrôle de la 25 qualité interne de méthodes de concentration de micro-organismes dans les selles. Au sens de la présente invention, on entend par « particules », des particules minérales ou organiques, pouvant être d'origines synthétiques ou naturelles, de tailles moyennes supérieures ou égales à 1 [lm, préférentiellement entre 2 et 200 [lm. L'invention propose ainsi, pour l'évaluation des méthodes de concentration de 30 micro-organismes, tels que des parasites, dans les selles, d'utiliser des particules synthétiques ou biologiques à la place des parasites. Ces particules qui miment des éléments parasitaires par leur taille et leur balance hydrophile-lipophile, présentent l'avantage d'être plus faciles à obtenir en grande quantité que les parasites. Lorsque ces particules seront mélangées à une suspension de selles utilisée dans l'une des 3046612 4 méthodes de concentration à évaluer, elles seront retrouvées soit dans le culot soit à la surface du liquide obtenu à la fin de la méthode, en fonction de la méthode de concentration utilisée et/ou de la nature de la particule. De manière plus précise, une quantité prédéterminée de particules est mélangée 5 avec des selles qui sont ensuite traitées avec la technique de concentration à évaluer. La comparaison du nombre de particules présentes dans la suspension de selles, au départ de la méthode, avec le nombre de particules retrouvé après concentration permet de déduire le coefficient de concentration de la technique de concentration utilisée par le laboratoire et de conclure sur l'efficacité de cette technique. 10 Avantageusement, les particules sont colorées. Ces particules, qui sont colorées naturellement ou artificiellement, sont facilement observées et identifiées au moyen d'un microscope. Les colorants utilisés sont du type connu et peuvent être de couleurs variées telles que le bleu, le rouge, le fuchsia. Le choix du colorant utilisé dépendra de la méthode de concentration car les réactifs ou solutions de telles méthodes peuvent 15 être eux mêmes colorés. Il conviendra alors de choisir une coloration des particules qui se distingue. Avantageusement encore, les particules synthétiques sont des particules hydrophiles et/ou des particules hydrophobes. Les particules hydrophiles peuvent être des polymères, notamment des polymères d'agarose. Les particules hydrophobes sont 20 par exemple des particules de polystyrène. En fonction de la méthode de concentration à évaluer, le choix de la nature hydrophile ou hydrophobe, ou l'utilisation conjointe des particules hydrophiles et hydrophobes, sera déterminée. A titre d'exemple, les particules de polystyrène, hydrophobe, peuvent être utilisées pour les méthodes de concentration par flottation et 25 à l'issue desquelles elles sont retrouvées à la surface du liquide. Ces particules ne seront pas utilisées dans des méthodes diphasiques car elles sont solubles dans l'éther. Par contre, les particules d'agarose, hydrophiles, peuvent être utilisées pour les méthodes de concentration diphasique à l'issue desquelles elles sont retrouvées dans le culot car elles sont insolubles dans l'éther. 30 Selon un mode de réalisation de l'invention, les particules naturelles sont des spores de champignons macroscopiques ou microscopiques, des levures, ou des grains de pollen. A titre de spores de champignons microscopiques, on pourra utiliser des levures Saccharomyces cerivisae. A titre de spores de champignons macroscopiques, 3046612 5 on pourra utiliser Agaricus bisporus. A titre de grains de pollen, on pourra utiliser un pollen de pâquerette. Il est également tout à fait envisageable d'utiliser, dans une même méthode de contrôle de qualité, des particules synthétiques hydrophobes et/ou hydrophiles et des 5 particules naturelles de différentes origines. A titre d'exemple, des levures ou des particules d'agarose ou le mélange des deux peuvent être utilisés pour : - les méthodes de sédimentation : si la technique utilise un filtre, la taille des particules devra être adaptée à la porosité du filtre. Avec ces méthodes les particules 10 seront retrouvées dans le sédiment, - les méthodes de concentration diphasiques utilisant une solution aqueuse et un solvant non miscible tel que l'éther ou l'acétate d'éthyle dans le cadre de la méthode de Bailenger ou de MIF concentration. Avec ces méthodes les particules seront retrouvées dans le culot. 15 Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'utilisation comprend à titre de particules, à la fois des particules d'agarose et des particules de levures, préférentiellement colorées. Selon une caractéristique de l'invention, les particules se trouvent en suspension dans un liquide ou intégrées à un support, le support étant une granule, un comprimé, 20 une gélule ou toute autre forme de support solide utilisé en pharmacie. Selon un mode de réalisation, l'utilisation selon l'invention comprend, de plus, l'utilisation de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, et/ou de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution 25 hydrophobe. Préférentiellement selon ce mode de réalisation, les composés colorants sont en solution ou imprégnés sur une granule. Cette utilisation de composés colorants, conjointement à l'utilisation de particules décrite précédemment, est adaptée pour le contrôle des techniques de 30 concentration diphasiques qui utilisent deux types de solutions, l'une hydrophile et l'autre hydrophobe. Elle permet de vérifier le pH du tampon utilisé ainsi que l'obtention d'une séparation de phases hydrophiles/hydrophobes. On utilise alors un colorant comprenant des composés solubles en milieu aqueux et un autre colorant comprenant des composés solubles dans un solvant tel que l'éther. L'ajout de l'un ou 3046612 6 des composés colorants, par exemple sous forme de gouttes ou de granules, est réalisé dans la suspension de selles à analyser avant l'ajout du solvant. Après agitation et centrifugation, la phase aqueuse et la phase organique présentent une couleur différente en relation avec celle des composés colorants. Les composés colorants 5 solubles en milieu aqueux seront retrouvés dans la phase hydrophile (aqueuse) qui présentera une couleur et les composés colorants solubles dans le solvant seront retrouvés dans la phase hydrophobe (éther) qui présentera une autre couleur. A titre d'exemple, un composé colorant hydrophobe peut être de l'iode, de couleur brun rougeâtre, du noir Soudan, du rouge de méthyle. Un composé colorant 10 hydrophile peut être le chlorure de cuivre (II), de couleur bleue, ou le vert de malachite ou le chlorure de fer. A ce titre, l'association Iode et de chlorure de cuivre (II), l'association de noir Soudan et vert de malachite ou l'association chlorure de fer et rouge de méthyle sont préférées. L'invention concerne encore un produit de contrôle de la qualité interne de 15 méthodes de concentration de micro-organismes, tels que des parasites, dans les selles, du type composé d'au moins un élément, et qui se caractérise en ce qu'il comprend au moins un élément contenant des particules telles que décrites précédemment. Selon un mode de réalisation, le produit comprend deux autres éléments, l'un comprenant des composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi 20 synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, l'autre comprenant des composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophobe. Les composés colorants sont tels que décrits précédemment et, à ce titre, se présentent sous la forme de solutions ou sont imprégnés sur une granule. 25 Avantageusement, dans le produit selon l'invention, chaque élément se trouve sous la forme d'un contenant tel qu'un tube, un flacon, une boîte ou une plaque. Un tel produit se présente ainsi préférentiellement sous la forme d'un kit comprenant un ensemble d'éléments, dont un élément au moins comprend des particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à 11.tm, les particules se 30 trouvant en suspension dans un liquide ou intégrées à un support. A titre d'exemple, un kit selon l'invention pourra comprendre un élément contenant des particules d'agarose et un autre élément contenant des particules de levures, telles que des spores de saccharomyces cerevisae. Lorsque le kit sera destiné à un contrôle de la qualité d'une méthode de concentration diphasique, il contiendra 3046612 7 en outre un élément contenant un colorant hydrophile, et un élément contenant un colorant hydrophobe. Les éléments seront par exemple sous forme de flacon. L'invention concerne encore une méthode de contrôle de la qualité interne de méthode de concentration de micro-organismes dans les selles, tels que des parasites, 5 ladite méthode incluant l'obtention de selles, la mise en suspension d'une quantité prédéterminée desdites selles, l'ajout, dans cette suspension, d'une quantité prédéterminée de particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à l[tm, puis la concentration desdits micro-organismes. Les particules sont ajoutées dans la suspension de selles selon une concentration 10 connue et prédéterminée. Préférentiellement, la concentration desdits micro-organismes est réalisée par une technique de sédimentation, une technique de flottation, ou une technique de concentration diphasique. Selon un mode de réalisation, la concentration desdits micro-organismes est 15 réalisée par la technique de concentration diphasique et comprend, de plus, l'ajout dans la suspension de selles, de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, et/ou de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophobe. 20 Ainsi que mentionné précédemment, les techniques de concentration des micro- organismes dans les selles sont principalement des méthodes de concentration par sédimentation, par flottation ou des méthodes de concentration diphasiques. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier. De manière illustrative, il est indiqué dans ce qui suit un exemple de chaque méthode pour la concentration de 25 micro-organismes tels que des parasites. Méthodes de sédimentation : Parmi ces méthodes, on peut se référer à celle de Faust et Ingalls en eau glycérinée et à celle de Van Someren et Grégoire en colonne haute. 30 A titre d'exemple, une telle méthode peut comprendre les étapes suivantes : - Réaliser un prélèvement de selles, - Homogénéiser le prélèvement, - Prélever quelques grammes de matières fécales recueillies avec une spatule, 3046612 8 - Déposer l'échantillon dans un récipient (verre à pied, tube) contenant 10 à 20 fois son volume d'une solution telle que l'eau glycérinée, - Mélanger pour obtenir une suspension, - Laisser sédimenter (30 à 60 minutes) ou centrifuger lentement, 5 - Décanter, - Reprendre le sédiment avec la même solution et recommencer deux fois le même protocole, - Reprendre le dernier sédiment (ou culot) avec 2 à 3 fois son volume de la solution, 10 - Mélanger par agitation pour obtenir une suspension, - Observer au microscope une partie de la suspension. Des particules, selon l'invention, synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à l[im, par exemple des particules de pollen, ou des particules d'agarose (taille variant de 25 à 100 [im), ou un mélange de particules 15 d'agarose et des spores de levures (taille d'environ 5 [im), sont ajoutées à l'étape au cours de laquelle les selles sont mélangées avec la solution. Elles sont retrouvées dans le sédiment. Méthodes de flottation : 20 Parmi ces méthodes on peut se référer à celle de Willis ou celle de Faust. A titre d'exemple, une telle méthode peut comprendre les étapes suivantes : - Réaliser un prélèvement de selles, - Homogénéiser le prélèvement, - Prélever quelques grammes de matières fécales recueillies avec une spatule, 25 - Déposer l'échantillon dans un flacon en plastique, - Ajouter 20 ml d'une solution de flottation (solution de chlorure de sodium saturée de densité de 1,2 dans la méthode de Willis ou solution de sulfate de zinc de densité de 1,18 dans la méthode de Faust), - Délayer soigneusement le mélange de façon à obtenir une solution homogène, 30 - Filtrer le mélange, - Remplir complètement un tube à centrifugation (ou à défaut un tube à essai) avec le liquide filtré jusqu'à formation d'un ménisque convexe, - Attendre 15 à 20 minutes la remontée des oeufs des parasites par ascension (ou centrifuger le mélange 4 min à 3000 tours/min), 3046612 9 - Appliquer une lamelle à la surface du liquide, - Retirer la lamelle à la face inférieure de laquelle se sont accumulés les oeufs, - Poser la face inférieure de cette lamelle sur une lame porte-objet, - Observer au microscope. 5 Des particules selon l'invention, synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à 11..tm, par exemple des particules de pollen ou des particules de polystyrène sont ajoutées à l'étape au cours de laquelle les selles sont délayées dans la solution de flottation. Elles sont retrouvées à la surface du liquide. 10 Méthodes diphasiques : Parmi ces méthodes, on peut se référer à celle de Bailenger, celle de Blagg Schloer, celle de Faust et Ingalls ou celle de Teleman Rivas. Le Tableau 1 résume les réactifs utilisés pour chaque méthode. 15 Tableau 1 Technique Bailenger Blagg Faust Ingalls Teleman Rivas Schloegel Solution Tampon acéto- MIF* Sulfate de Acide acétique aqueuse acétate pH 5 zinc 5% Solvant Ether Ether Ether Ether Autre solvant Acétate Acétate Acétate Acétate d'éthyle d'éthyle d'éthyle d'éthyle *MIF : Merthiolate Iode Formol A titre d'exemple, une telle méthode peut comprendre les étapes suivantes : - Réaliser un prélèvement de selles, 20 - Homogénéiser le prélèvement, - Peser quelques grammes de matières fécales recueillies avec une spatule, - Déposer l'échantillon dans un flacon en plastique, - Délayer les selles dans 10 fois leur volume de solution aqueuse (tampon), - Laisser sédimenter pendant 10 min puis tamiser en recueillant le filtrat dans un 25 tube à centrifuger, - Ajouter un demi volume égal de solvant, 3046612 10 - Emulsionner en agitant le tube, - Centrifuger pendant 5 minutes à 1500 tours/min, - Remettre le culot en suspension, prélever et examiner au microscope optique. Des particules selon l'invention, synthétiques et/ou naturelles, de tailles 5 moyennes, supérieures ou égales à l[tm, par exemple des particules de levures et des particules d'agarose sont ajoutées avant l'ajout de solvant, par exemple à l'étape au cours de laquelle les selles sont délayées dans la solution aqueuse. Elles sont retrouvées dans le culot. De plus, des composés colorants hydrophiles et hydrophobes, par exemple de 10 l'iode (lipophile) et du chlorure de fer (hydrophile) ou du noir Soudan (lipophile) et du vert de malachite (hydrophile) sont ajoutés au cours de la même étape. Les caractéristiques de l'invention, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture des modes de réalisations et exemples suivants qui se veulent illustratifs et non restrictifs. 15 Exemple 1 : Etudes de la stabilité des traceurs particulaires : particules colorées d'agarose et levures colorées I - Protocole d'étude : 20 A - Composition du kit : Le kit se compose d'un flacon contenant des particules colorées d'agarose et d'un flacon contenant des levures colorées. B - Etudes de la stabilité en temps réel ou par vieillissement accéléré : 25 Les flacons de particules colorées d'agarose et de levures colorées ont été conservés dans l'emballage du kit. Les études de stabilité ont été effectuées avec : - les lots des particules colorées d'agarose : lot 12022014, lot 11042014 et 15052014 30 - les lots de levures colorées lot 151214, lot 100215 et 260215. Des flacons des 2 types de particules ont été placés à +4 ± 2°C, à la température du laboratoire (22± 4°C) et à +37± 2°C. Les particules ont été testées après 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 et 18 mois de conservation. 3046612 11 Les tests ont été réalisés selon le protocole qui sera celui de la notice d'utilisation du réactif. L'étude de la stabilité a été réalisée en utilisant la technique de Bailenger. Huit grammes de selles pâteuses ont été homogénéisés avec 16 mL de tampon 5 acéto-acétate (pH 5) pour obtenir une suspension à 33%. Après 5 minutes de sédimentation pour éliminer les gros débris, le surnageant (18 à 20 mL) a été décanté, agité pour homogénéiser et reparti dans 3 tubes de 10 mL sous un volume de 5 mL. Cinquante !IL de particules ont été ensuite déposés dans chaque tube. Après addition de trois mL d'éther ou d'acétate d'éthyle les tubes ont été agités vigoureusement 10 (vortex 30 à 45 secondes) pour obtenir une émulsion. Une centrifugation de 5 minutes à 400 g a été ensuite effectuée, pour « casser » l'émulsion. Après décantation des phases supérieures, le culot a été repris avec du NaC1 à 0,15 M pour avoir une suspension à 33%. Vingt !IL de la suspension avant concentration et 20 !IL de la suspension après concentration ont été déposés sur une lame et recouverts d'une 15 lamelle 20x20. La lecture microscopique de la totalité des préparations entre lame et lamelle et la numération des levures colorées ont ensuite été réalisées. Les résultats ont été exprimés en coefficient de concentration qui a été calculé en comparant les résultats obtenus avant et après concentration. Les résultats ont été considérés comme conformes lorsque le coefficient de 20 concentration était supérieur à 15. C - Etudes après stress ou chocs thermiques : Elles ont été réalisées selon les indications résumées ci-dessous - Les flacons sont placés à +4+/- 2°C, - Les flacons sont ramenés à 22+/- 2°C, 25 - Les flacons sont placés à +37°C, 2h - Les flacons sont ramenés à 22+/- 2°C, 30 min, - Les flacons sont placés à +4+/- 2°C, 2 h, - Les flacons sont ramenés à 22+/- 2°C, 30 min, D - Etudes de stabilité durant le transport : 30 Pour cette étude, des colis de kits contenant des flacons de particules colorées d' agarose ou de levures colorées, ont été acheminés entre deux adresses (Avrillé Paris) dans des conditions similaires à celles que rencontreront les produits lors de leur commercialisation et distribution. A leur arrivée à Paris, les colis ont été stockés à 3046612 12 la température ambiante pendant 7 jours et réexpédiés à Avrillé. A leur retour, les kits ont été placés à +4± 2°C pendant 4 jours puis testés. Les résultats ont été considérés comme conformes lorsque le coefficient de concentration était supérieur à 15. 5 II - Résultats A - Résultats de l'étude de la stabilité en temps réel ou par vieillissement accéléré : 10 Les résultats obtenus avec les 3 lots de particules colorées d'agarose et ceux obtenus avec les levures colorées ont montré une bonne conservation quelle que soit la température de conservation. En effet, pour tous les tests, le coefficient de concentration était supérieur à 15. Les résultats obtenus nous permettent de fixer à 18 mois le temps de conservation du réactif conservé à +4± 2°C. 15 B - Résultats des études après stress ou chocs thermiques : Les résultats obtenus montrent une très bonne stabilité des particules colorées d'agarose et des levures colorées aux chocs thermiques. 20 C - Résultats des études de stabilité lors du transport Les résultats obtenus montrent une très bonne stabilité des particules colorées d'agarose et des levures colorées après transport. III - Conclusion 25 Les chocs thermiques provoqués ou ceux pouvant être obtenus lors du transport sont sans effet sur la stabilité des particules colorées d'agarose et des levures colorées. Exemple 2 : Etudes de la répétabilité et de la reproductibilité des traceurs particulaires : particules colorées d'agarose et levures colorées 30 A - Composition du kit Les études de la répétabilité et de la reproductibilité sont réalisées sur un kit identique à celui de l'exemple 1. 3046612 13 B - Etudes de la répétabilité Lots utilisés et réalisation des tests : Ces études de répétabilité ont été effectuées avec les mêmes lots que ceux de 5 l'exemple 1. Elles ont été réalisées en utilisant la technique de Bailenger, avec en tant que solvant : l'éther ou l'acétate d'éthyle. Quarante grammes des selles pâteuses ont été homogénéisés avec 200 mL de tampon acéto-acétate (pH 5). Après 5 minutes de sédimentation pour éliminer les gros débris, le surnageant a été décanté, agité pour homogénéiser et reparti dans 30 tubes 10 de 10 mL sous un volume de 5 mL. Cinquante 1.1L de particules colorées d'agarose et 50 1.1L de levures colorées ont été ensuite déposés dans chaque tube. Après agitation, 100 1.1L de chaque suspension de selles ont été prélevés pour un examen microscopique et un dénombrement des particules avant concentration. Après addition de trois mL d'éther ou d'acétate d'éthyle, les tubes ont été agités vigoureusement 15 (vortex 45 à 60 secondes) pour obtenir une émulsion. Une centrifugation de 5 minutes à 400 g a été ensuite effectuée, pour « casser » l'émulsion. Après décantation des phases supérieures, le culot a été repris en suspension avec 100 1.1L de NaC1 à 0,15 M. Vingt 1.1L ont été prélevés, déposés sur une lame et recouverts d'une lamelle 20x20. La lecture microscopique de la totalité de la préparation et la numération des particules 20 colorées d'agarose et des levures colorées a ensuite été réalisée. Résultats : Les résultats ont été exprimés en nombre de particules colorées d'agarose et de levures colorées dans 20 1.1L et les coefficients de concentration ont été calculés. 25 Les résultats obtenus avec comme solvant l'éther figurent dans les Tableaux 2a et 2b. Ils montrent une bonne répétabilité des CQI utilisant des particules colorées d'agarose et des levures colorées, avec la méthode de Bailenger (après concentration). Le coefficient de variation est de 5 % pour les particules colorées d'agarose et de 3 % pour les levures colorées. Des résultats similaires ont été obtenus avec comme solvant 30 l'acétate d' éthyle. Tableau 2a : étude de la répétabilité des CQI (particules colorées d'agarose) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant. 3046612 14 Test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Nombre 5 6 8 6 8 7 5 7 4 6 6 8 6 5 7 avant concentration Nombre 197 175 165 177 198 178 193 185 180 174 187 193 188 190 181 après concentration M E CV CC Test 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Nombre 6 6 7 8 8 5 5 8 7 7 8 8 6 6 8 6,8 1,19 17% avant concentration Nombre 184 174 182 185 188 184 189 176 187 18' 183 175 190 179 180 182,7 9,4 5% 31 après concentration M : moyenne ; E : écart-type. 3046612 15 Tableau 2 b : étude de la répétabilité des CQI (levures colorées) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant Test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Nombre avant 22 16 21 24 19 19 16 17 24 16 24 18 18 21 24 concentration Nombre après 310 325 297 310 325 295 297 315 301 314 317 313 310 299 313 concentration Test 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M E CV CC Nombre avant 21 16 22 19 22 24 17 19 21 16 24 24 16 24 21 20 3 15% concentration Nombre après 310 325 297 310 325 295 297 315 301 314 317 313 310 299 313 309 9,5 3% concentration 3046612 16 C - Etudes de la reproductibilité intra-lot Lots utilisés et réalisation des tests : Ces études de reproductibilité intra-lot ont été réalisées avec le lot 12022014 des particules colorées d'agarose et le lot 151214 de levures colorées. 5 Elles ont été réalisées en utilisant la technique de Bailenger et comme solvant : l'éther et l'acétate d'éthyle. Vingt quatre grammes des selles pâteuses ont été homogénéisés avec 120 mL de tampon acéto-acétate (pH 5). Après 5 minutes de sédimentation pour éliminer les gros débris, le surnageant a été décanté, agité pour homogénéiser et reparti dans 20 tubes 10 (de 10 mL) sous un volume de 5 mL. Les tubes ont été placés au congélateur à -20°C jusqu'à leur utilisation. A J1, J3, J5, J8, J10, J12, J15, J17, J19 et J22 deux tubes ont été décongelés et 50 !IL de particules colorées d'agarose et 50 !IL de levures colorées ont été ensuite déposés dans chaque tube. Après addition de trois mL d'éther ou d'acétate d'éthyle les tubes ont été agités vigoureusement (vortex 30 à 45 secondes) 15 pour obtenir une émulsion. Une centrifugation de 5 minutes à 200 g a été ensuite effectuée, pour « casser » l'émulsion. Après décantation des phases supérieures, le culot a été repris en suspension avec 100 !IL de NaC1 à 0,15 M. Vingt !IL ont été prélevés, déposés sur une lame et recouverts d'une lamelle 20x20. La lecture microscopique de la totalité de la préparation et la numération des particules colorées 20 d'agarose et des levures colorées ont ensuite été réalisées. Résultats : Les résultats ont été exprimés en nombre de particules colorées d'agarose et de levures colorées dans 20 1.1.L et les coefficients de concentration ont été calculés. Les résultats obtenus avec comme solvant l'éther, figurent dans les Tableaux 3a 25 et 3b. Ils montrent une bonne reproductibilité intra-lot des CQI utilisant des particules colorées d'agarose et des particules de levures colorées, avec la méthode de Bailenger (après concentration). Le coefficient de variation est de 15% pour les particules colorées d'agarose et de 4,6% pour les levures colorées. Des résultats similaires ont été obtenus avec comme solvant l'acétate d'éthyle. 3046612 17 Test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M E CV CC Nombre avant 8 5 6 6 7 8 9 7 8 7 7 1,1 15% concentration Nombre après concentration 188 176 177 190 180 169 179 178 272 175 188 28,4 15% 26,8 M : moyenne ; E : écart-type 5 Tableau 3a : étude de la reproductibilité intra-lot des CQI (particules colorées d'agarose) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant. Test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M E CV CC Nombre avant 18 16 19 16 18 17 17 18 17 19 17,5 1 5% concentration Nombre après concentration 320 298 312 310 327 333 342 328 298 301 316,9 14,7 4,6% M : moyenne ; E : écart-type Tableau 3b : étude de la reproductibilité intra-lot des CQI (levures colorées) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant 10 3046612 18 D - Etudes de la reproductibilité inter-lots Lots utilisés et réalisation des tests : Ces études de reproductibilité inter-lots ont été effectuées avec : 5 - les lots des particules colorées d'agarose : lot 12022014, lot 11042014 et 15052014, - les lots de levures colorées lot 151214, lot 100215 et 260215. Elles ont été réalisées en utilisant la technique de Bailenger et comme solvant : l'éther et l'acétate d'éthyle. 10 Huit grammes des selles pâteuses ont été homogénéisés avec 40 mL de tampon acéto-acétate (pH 5). Après 5 minutes de sédimentation pour éliminer les gros débris, le surnageant a été décanté, agité pour homogénéiser et reparti dans 6 tubes de 10 mL sous un volume de 5 mL. Cinquante !IL de particules colorées d'agarose de chaque lot ou 50 !IL de levures colorées de chaque lot ont été ensuite déposés dans chaque 15 tube. Après agitation, 100 !IL de chaque suspension de selles ont été prélevés pour un examen microscopique et un dénombrement des particules avant concentration. Après addition de trois mL d'éther ou d'acétate d'éthyle, les tubes ont été agités vigoureusement (vortex 45 à 60 secondes) pour obtenir une émulsion. Une centrifugation de 5 minutes à 400 g a été ensuite effectuée, pour « casser » l'émulsion. 20 Après décantation des phases supérieures, le culot a été repris en suspension avec 100 !IL de NaC1 à 0,15 M. Vingt !IL ont été prélevés, déposés sur une lame et recouverts d'une lamelle 20x20. La lecture microscopique de la totalité de la préparation et la numération des particules colorées d'agarose et des levures colorées ont ensuite été réalisées. 25 Résultats : Les résultats ont été exprimés en nombre de particules colorées d'agarose et de levures colorées dans 20 !IL et les coefficients de concentration ont été calculés. Les résultats obtenus avec comme solvant l'éther, figurent dans les tableaux 4a et 4b. Ils montrent une bonne reproductibilité inter-lots des CQI (particules colorées 30 d'agarose et levures colorées) avec la méthode de Bailenger (après concentration) avec un coefficient de variation de 6,5% pour les particules colorées d'agarose et de 2,7% pour les levures colorées. Des résultats similaires ont été obtenus avec comme solvant l'acétate d'éthyle. 3046612 19 Lot particules colorées d'agarose 12022014 11042014 15052014 Moyenne Ecart- type CV CC Nombre avant concentration 10 7 9 8,6 1,24 14,4% Nombre après concentration 187 172 202 187 12,24 6,5% 21,7 Tableau 4a : étude de la reproductibilité inter-lots des CQI (particules colorées d'agarose) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant Lot levures colorées 12022014 11042014 15052014 M E CV CC Nombre avant concentration 20 16 19 18,3 1,69 9,2% Nombre après concentration 303 312 324 313 8,6 2,7% 17 5 Tableau 4b : étude de la reproductibilité inter-lots des CQI traceur-ParColor (levures colorées) avec la méthode de Bailenger et l'éther comme solvant D - Etudes de la sensibilité (coefficient de concentration) 10 Les différents tests réalisés pour les études de répétabilité et de reproductibilité ont montré que le coefficient de concentration de la technique de Bailenger utilisant l'éther comme solvant était en moyenne respectivement de 8,8% et de 3,4% pour les particules colorées d'agarose et pour les levures colorées. 15 Exemple 3: Etudes des performances des particules selon l'invention comme COI pour les techniques de concentration diphasiques des parasites dans les selles Objectif : 20 Démontrer que pour des selles contenant une quantité connue de parasites et de particules telles que définies dans la présente invention (dites « traceur »), pour une technique de concentration de parasites donnée, en fonction des manipulations, le coefficient de concentration du traceur et celui du parasite, évoluaient parallèlement (dans le même sens). Le point critique d'une technique diphasique étant la qualité de 25 l'émulsion, la variation de la durée de l'agitation permettait de montrer l'intérêt des traceurs selon l'invention pour maîtriser cette phase. 3046612 20 Protocole : Ont été utilisées : - des selles expérimentalement contaminées avec des kystes d'Entamoeba coli ou des kystes de Giardia intestinalis ou des oeufs d'Ascaris lumbricoides, 5 - des levures colorées et des particules colorées d'agarose comme « traceurs », - la technique de Bailenger (méthode de concentration diphasique) et celle du MIF avec comme solvant l'éther. Matériel 10 - Selles d'un sujet sain ne contenant aucun parasite (Selles négatives), - Suspension de levures bleues en NaCL à 0,9% (lot ScB 7) à 25000 levures /mL, - Suspension de particules bleues d'agarose en NaCL à 0,9% (lot BR 0.5) à 25000 particules /mL, - Suspension de selles contenant des kystes d'Entamoeba coli en NaCL à 0,9% 15 (25000 kystes /mL), - Suspension de selles contenant des kystes de Giardia intestinalis en NaCL à 0,9% % (25000 kystes /mL), - Suspension de selles contenant des oeufs d'Ascaris lumbricoides en NaCL à 0,9% (25000 oeufs /mL), 20 - Tampon de Bailenger, --- Solution de MIF, - Ether, - Spatule en bois. 25 Méthodes A 5 g de selles négatives placés dans un flacon, ont été ajoutés 50 [IL des 2 suspensions de chaque type de particules (levures ou particules d'agarose), et 50 [IL des 3 suspensions de selles contenant les parasites (Entamoeba coli). Vingt cinq mL de tampon de Bailenger ou de 25 mL de solution de MIF ont été ensuite ajoutés. 30 Après agitation et homogénéisation avec une spatule et un repos de 2 minutes, 20 mL de la suspension ont été décantés dans un flacon, homogénéiser et distribuer dans 3 tubes à centrifuger à raison de 5 mL par tube. La suspension restante, qui est à 16,6%, a été utilisée pour un examen direct avant concentration. Trois mL d'éther ont été ajoutés dans les 3 tubes. Un tube n'a pas été agité, un autre a été agité pendant 10 secondes et le troisième a été agité pendant 60 secondes. Les 3 tubes ont été centrifugés à 300 g pendant 5 minutes. Après décantation des 3 phases (phase éthérée, interphase et phase aqueuse) le culot a été repris avec une quantité de solution de NaCL à 0,9% pour avoir une suspension à 16,6%. La suspension non concentrée et 3046612 21 celle obtenue après concentration ont été placées sous un volume de 30 pL entre lame et lamelle et la totalité de la préparation a été observée au microscope. A partir des moyennes du nombre de parasites ou de particules colorées ou de levures colorées obtenues pour 3 lectures, les coefficients de concentration (CC) ont été calculés en 5 faisant le rapport : nombre après concentration/nombre avant concentration. Résultats Les résultats obtenus avec la technique de Bailenger (tableau 5) et ceux obtenus avec la technique du MIF (tableau 6) ont montré que : 10 - les coefficients de concentration variaient en fonction du temps d'agitation pour obtenir l'émulsion. Des coefficients plus élevés ont été observés après une agitation de 60 secondes, temps nécessaire pour obtenir une bonne émulsion, - les coefficients de concentration des traceurs (particules de levures colorées et particules colorées d'agarose) et ceux des parasites (kystes d'Entamoeba coli, kystes 15 de Giardia intestinalis et oeufs d'Ascaris lumbricoides) évoluaient dans le même sens. Examen après concentration Nombre de parasites dans 30 !IL Examen direct Sans agitat ion CC Agitation 10 CC Agitation CC secondes 60 secondes Kystes 1,3 2 1,9 11 8,4 33 25,3 Entamoeba ,5 cou Kystes 1 4 4 8 8 28 28 Giardia intestinalis Oeufs 0,8 3 3,75 6 7,5 21 26,25 Ascaris lumbricoides Levures 0,7 1 1,4 5 7,1 33 47 colorées 3046612 22 Particules 1,2 1,6 1,3 10 8,3 32 26,6 colorées d' agarose Tableau 5 : Coefficients de concentration (CC) obtenus avec la technique de Bailenger pour la concentration des parasites (kystes d'Entamoeba coli, kystes de Giardia intestinalis et oeufs d'Ascaris lumbricoides) et des traceurs (levures colorées 5 et particules colorées d' agarose). Examen après concentration Nombre de Examen direct Sans CC Agitation 10 CC Agitation CC parasites dans agitation secondes 60 30 !IL secondes Kystes 1 2 2 8 8 27 7 Entamoeba coli Kystes 0,7 1,4 2 4,5 6,4 21 0 Giardia intestinalis Oeufs 1,2 3,6 3 6 5 24 0 Ascaris lumbricoides Levures colorées 1 1 1 4 4 31 1 Particules 1,3 1,6 1,2 7 5,3 37 8,4 colorées d' agarose Tableau 6 : Coefficients de concentration (CC) obtenus avec la technique du 10 MIF pour la concentration des parasites (kystes d'Entamoeba coli, kystes de Giardia intestinalis et oeufs d'Ascaris lumbricoides) et des traceurs (levures colorées et particules colorées d' agarose) 3046612 23 Conclusion Le résultat obtenu confirme que la qualité de l'agitation, donc de l'émulsion, est un facteur important pour la réalisation des techniques de concentration diphasiques. Les résultats obtenus démontrent que les particules de levures colorées et 5 particules colorées d'agarose sont des bons CQI pour vérifier et valider les techniques de concentration des parasites dans les selles. Exemple de compositions de kits : 10 Kit 1 : Elément 1 : flacon de particules d'agarose (taille moyenne de 25 à 100 [tm) colorées en bleu, rouge ou fuchsia et en suspension dans l'eau physiologique. Elément 2 : flacon de particules de levures saccharomyces cerevisae (taille moyenne de 5 [tm) fixées (levures tuées avec un composant qui conserve intactes les 15 structures du microorganisme et permet leur observation au microscope), colorées en bleu et en suspension dans l'eau physiologique. Eventuellement : notice d'utilisation. Ce kit convient au contrôle de la qualité d'une méthode de concentration diphasique. 20 Kit 2 : Elément 1 : flacon de particules d'agarose (taille moyenne de 25 à 100 [tm) colorées en bleu, rouge ou fuchsia et en suspension dans l'eau physiologique. Elément 2 : flacon de particules de levures saccharomyces cerevisae (taille 25 moyenne de 5 [tm) fixées, colorées en bleu et en suspension dans l'eau physiologique. Elément 3 : flacon de solution d'iode. Elément 4 : flacon de solution de chlorure de fer. Eventuellement : Notice d'utilisation. Ce kit convient au contrôle de la qualité d'une méthode de concentration 30 diphasique. Kit 3 : Elément 1 : flacon de grains de pollen colorés en bleu (taille moyenne de 30 [tm) et en suspension dans l'eau physiologique. 3046612 24 Eventuellement : Notice d'utilisation. Ce kit convient au contrôle de la qualité d'une méthode de concentration par flottation ou sédimentation. 5 Kit 4 : Elément 1 : flacon de particules de polystyrène (taille moyenne de 30 !am) colorées en rouge et en suspension dans l'eau physiologique. Eventuellement : notice d'utilisation. Ce kit convient au contrôle de la qualité d'une méthode de concentration par 10 flottation ou sédimentation. Références bibliographiques : - Copro-parasitologie pratique 15 Intérêt et méthodologie Notions sur les parasites du tube digestif Rousset JJ. Editions ESTEM - 1993 - Coprologie parasitaire et fonctionnelle 20 Bailenger J. Editions E. Drouillard - 1965 - Atlas pratique de parasitologie humaine Bailenger J. Editions E. Drouillard - 1975 25 - Guide de parasitologie pratique Leger N., Nottenghem MJ. Et Pesson B Editions SEDES - 1977 REVENDICATIONS1) Produit de contrôle de la qualité interne de méthodes de concentration de micro-organismes dans les selles, du type composé d'au moins un élément, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément contenant des particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à 1 ktm, les particules se trouvant en suspension dans un liquide ou intégrées à un support. 2) Produit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdites particules sont colorées. 3) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules synthétiques sont des particules hydrophiles, telles que des polymères, notamment des polymères d'agarose, et/ou des particules hydrophobes, telles que des particules de polystyrène. 4) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules naturelles sont des spores de champignons macroscopiques ou microscopiques, des levures, ou des grains de pollen. 5) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ou les supports sont des granules, comprimés, gélules ou toute autre forme de support solide utilisée en pharmacie. 6) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend deux autres éléments, l'un comprenant des composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, l'autre comprenant des composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophobe. 7) Produit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdits composés colorants sont en solution ou imprégnés sur des granules. 8) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de particules, des particules d'agarose et des particules de levures, préférentiellement colorées. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque élément se trouve sous la forme d'un contenant tel qu'un tube, un flacon, une boîte ou une plaque. 10) Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit se présente sous la forme d'un kit comprenant un ou plusieurs 3046612 26 éléments, dont un élément au moins comprend des particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à les particules se trouvant en suspension dans un liquide ou intégrées à un support. 11) Méthode de contrôle de la qualité interne de méthodes de concentration 5 de micro-organismes dans les selles, ladite méthode de contrôle de la qualité interne incluant l'obtention de selles supposées contaminées par des microorganismes, la mise en suspension d'une quantité prédéterminée desdites selles, l'ajout, dans cette suspension, d'une quantité prédéterminée de particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à 1 lm, puis la concentration desdits 10 parasites. 12) Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la concentration desdits parasites est réalisée par la technique de sédimentation, de flottation, ou de concentration diphasique. 13) Méthode selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que la 15 concentration desdits parasites est réalisée par la technique de concentration diphasique et comprend, de plus, l'ajout dans la suspension de selles, de composés colorant d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, et/ou de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophobe. 20 14) Utilisation de particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles moyennes, supérieures ou égales à 1 gm, pour le contrôle de la qualité interne de méthodes de concentration de micro-organismes dans les selles. 15) Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle consiste en l'utilisation conjointe de particules synthétiques et/ou naturelles, de tailles 25 moyennes, supérieures ou égales à lgm et d'une matrice constituée de selles. 16) Utilisation selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que lesdites particules sont colorées. 17) Utilisation selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que les particules synthétiques sont des particules hydrophiles, telles que des 30 polymères, notamment des polymères d'agarose, et/ou des particules hydrophobes, telles que des particules de polystyrène. 18) Utilisation selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que les particules naturelles sont des spores de champignons macroscopiques ou microscopiques, des levures, ou des grains de pollen. 3046612 27 19) Utilisation selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que les particules se trouvent en suspension dans un liquide ou intégrées à un support, le support étant une granule, un comprimé, une gélule ou toute autre forme de support solide utilisée en pharmacie. 5 20) Utilisation selon l'une des revendications 14 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend, de plus, l'utilisation 'de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophile, et/ou de composés colorants d'origine naturelle, synthétique ou semi synthétique, aptes à colorer une solution hydrophobe. 10 21) Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que lesdits composés colorants sont en solution ou imprégnés sur des granules. 22) Utilisation selon l'une des revendications 14 à 21, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de particules, à la fois des particules d'agarose et des particules de levures, préférentiellement colorées.