FR 3038985 A1 20170120 FR 1556725 A 20150716 - 1 - Méthode de quantification des protéines [1] La présente invention concerne une méthode de quantification de protéines, notamment de protéines présentant une durée de vie courte. [2] La progression dans la phase G1 du cycle cellulaire est soit stimulée par des mitogènes ou facteurs de croissance soit bloquée par des cytokines antiprolifératives. Pour permettre l'entrée de la cellule dans le cycle cellulaire depuis la phase GO, un mitogène doit stimuler l'expression des cyclines de type D (D1, D2 et D3). Ces cyclines vont s'assembler, toujours sous stimulation mitogénique, avec des kinases dépendantes des cyclines D (CDK4 et CDK6), pour former un holoenzyme cataboliquement actif dès le milieu de la phase G1 avec un maximum atteint lors de la transition de G1 à S (12). Bien que l'activité du complexe n'influence le cycle que pendant le point critique de la phase G1, elle persiste tout au long du premier cycle et des cycles suivants si la stimulation mitogénique continue. Par contre, en l'absence de stimulation mitogénique, l'activité enzymatique chute rapidement à cause de la nature particulièrement labile des cyclines D et les cellules en phase G1 sortent rapidement du cycle. [3] La Cycline D1 est surexprimée dans beaucoup de cancers humains comme résultat d'amplifications de gènes ou de translocations ciblées sur le locus D1 (Ccndl) du chromosome 11q13 (16). Aussi, la quantification de son expression peut être 20 déterminante dans le cadre d'un pronostic ou un diagnostic. [4] Toutefois, la demie vie de la Cycline D1 est faible, environ 20 minutes, et sa détection quantitative n'est donc pas aisée. [5] La détection de la protéine Cycline D1 est donc généralement réalisée par des techniques immunologiques par marquage à l'aide d'un anticorps dirigé contre un 25 épitope de la protéine. Cependant, comme cela a été mentionné ci-dessus, la faible demie vie de la protéine rend sa détection, et encore plus sa quantification très difficile. En outre, comme il peut ne pas exister de colinéarité entre l'expression génique et la traduction protéique, il n'est pas avantageux de réaliser la mesure de l'expression de la Cycline D1 par biologie moléculaire de l'ADN ou de l'ARN. 30 [6] Il existe donc un besoin de fournir un mode de quantification de la protéine Cycline D1. [7] Des techniques d'amélioration de la détection de la Cycline D1 ont déjà été proposées. Par exemple Jain et al. (J Clin Pathol. 2002 Dec; 55(12): 940-945) ont mis au point un système de détection de la Cycline D1 par fluorescence dans les désordres 35 lymphoprolifératifs (DLP-B), en utilisant la technologie de la cytométrie de flux. Toutefois, une telle méthode est facilement applicable aux cellules hématopoïétiques, mais difficile à mettre en oeuvre sur des tumeurs solides, du fait de la nécessite de 3038985 - 2 - dilacérer la tumeur. [8] Aussi, le problème de la quantification de la Cycline D1 demeure. [9] L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients en fournissant une méthode de détection de la quantité de protéine Cycline D1 qui soit fiable et 5 reproductible. [10] Un autre but de l'invention est de fournir un kit permettant la mise en oeuvre de cette détection et qui soit facile d'utilisation. [11] Encore un autre but de l'invention vise à utiliser cette quantification pour le pronostic de pathologies. 10 [12] Aussi l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant : a. un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et b. au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un 15 épitope déterminé et différent de la protéine codée par le gène Condi, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection quantitative in vitro de la protéine codée par le gène Condi dans un échantillon (comprenant des protéines). [13] La présente invention est basée sur la constatation surprenante faite par les inventeurs qu'une détection de la protéine codée par le gène Condi, c'est-à-dire la protéine Cycline D1, peut être réalisé de manière quantitative à l'aide d'anticorps fluorescents capables de réaliser ou d'opérer un transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Rirster (ou FRET en anglais). [14] En effet, les inventeurs ont montré que si l'on utilise deux anticorps dirigés contre la Cycline D1 et qui sont susceptible de permettre le FRET, il est possible de 30 quantifier la quantité de protéine Cycline D1 de manière fiable, spécifique et reproductible. [15] Dans l'invention le gène Condi est représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, et correspond à la séquence humaine, et la protéine Cycline D1 correspondante est représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. 35 [16] L'invention concerne également une méthode de quantification, notamment in vitro, de la protéine Cycline D1 codée par le gène Condi, notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, dans un échantillon comprenant des protéines, ladite 3038985 - 3 - méthode comprenant les étapes suivantes : a. une étape de mise en contact dudit échantillon avec i. un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et ii. au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule 5 luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la 10 longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, et b. une étape de détection et de quantification de ladite protéine Cycline Dl. 15 [17] De manière avantageuse, l'invention concerne la méthode susmentionnée, comprenant, à la suite de l'étape a de mise en contact : - une étape d'exposition à une source lumineuse de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'excitation de la première molécule luminescente, et 20 - une étape de détection et de quantification de de ladite protéine codée par le gène Ccndl en mesurant la luminescence émise par la seconde molécule luminescente. [18] Comme indiqué ci-dessus, la méthode de l'invention utilise au moins un couple d'anticorps (c'est-à-dire au moins deux anticorps) dirigés contre la même protéine 25 Cycline D1, chacun des anticorps étant couplé à une molécule luminescente. La luminescence peut se définir comme une émission de lumière (photons) par une molécule luminescente (fluorophore, enzyme, etc.). Parmi les phénomènes de luminescence, on distingue la photoluminescence (fluorescence, phosphorescence) qui est consécutive à une excitation lumineuse, la chimioluminescence dont l'émission de lumière est consécutive à une réaction chimique et la bioluminescence qui est déclenché par une réaction enzymatique. [19] Lorsque deux molécules luminescentes (appelées respectivement le donneur et l'accepteur d'énergie) sont à proximité, il peut se produire un transfert d'énergie (RET) du donneur vers l'accepteur. Ce phénomène se traduit par l'extinction totale de la luminescence (fluorescence, bioluminescence, chimioluminescence) du donneur et par l'apparition d'une émission de fluorescence de l'accepteur. Ce transfert d'énergie s'effectue sans émission de lumière. 3038985 - 4 - [20] Pour cette raison, et afin de réaliser un transfert d'énergie entre la première molécule luminescente et la seconde molécule luminescente, le premier anticorps est appelé un anticorps donneur car il porte une première molécule luminescente qui, après excitation, transmettra son énergie à la seconde molécule luminescente portée 5 par l'anticorps que l'on appellera anticorps accepteur. [21] Il est avantageux dans le cadre de la méthode de l'invention que lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissent chacun spécifiquement un épitope différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl, afin qu'ils puissent concomitamment interagir avec ladite protéine. En effet, pour obtenir du FRET (ou un 10 transfert d'énergie) il est nécessaire que les molécules luminescentes soient proches spatialement. [22] Aussi, de manière avantageuse, les anticorps donneur et accepteur sont capables d'interagir avec des épitopes différents, qui sont localisés sur la même protéine de sorte que les molécules luminescentes qu'ils portent soient spécialement 15 proches. [23] Dans l'invention, il est précisé que « lesdites première et deuxième molécules luminescentes sont telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente ». Cela signifie qu'en présence de deux molécules luminescentes 20 (notamment des fluorophores) donneuse - accepteuse d'énergie, le phénomène d'excitation du donneur suit le processus décrit précédemment mais sa désexcitation peut, sous certaines conditions, passer par un transfert d'énergie non radiatif sur l'accepteur (et non par l'émission directe d'un photon). L'énergie de désexcitation du fluorophore donneur est donc « absorbée » par le fluorophore accepteur qui passe 25 alors d'un état fondamental à un état excité. Le retour vers l'état fondamental de l'accepteur peut se faire par une émission d'un photon dont la longueur d'onde est plus grande que celle du photon qui aurait été émis par le fluorophore donneur en absence d'accepteur. [24] Avantageusement, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, 30 dans laquelle l'étape de détection et de quantification consiste en - une première sous-étape d'exposition de l'échantillon à une source lumineuse excitatrice de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'absorption de la molécule fluorescente couplée audit anticorps donneur pendant une durée déterminée, et 35 - une seconde étape de détection de la luminescence émise après l'extinction de la source lumineuse excitatrice. [25] Comme on le verra ci-après, il peut être avantageux que la durée de détection 3038985 - 5 - de la luminescence émise par la seconde molécule luminescente soit d'une durée plus importante que la durée d'exposition de la première molécule luminescente par la source lumineuse excitatrice. [26] Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne la méthode 5 susmentionnée, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1, ab3, SP4 et SC450. [27] Les anticorps avantageux de l'invention sont - l'anticorps anti Cycline D1 clone ab1, commercialisé par Thermofisher Scientific. Cet anticorps correspond à un anticorps monoclonal de souris de type IgG2a,, de souris 10 aussi appelé clone DCS-6, obtenu par immunisation de souris avec la protéine Cycline D1 humaine entière, - l'anticorps anti Cycline D1 clone ab3, commercialisé par Thermofisher Scientific. Il s'agit d'un anticorps polyclonal de lapin obtenu après immunisation avec la partie C-terminale de la protéine Cycline D1 humaine. 15 - l'anticorps anti Cycline D1 clone SP4, commercialisé par Life Technologies qui reconnait l'épitope C-terminal de la protéine Cycline D1 humaine, et dirigé contre le peptide correspondant aux positions 250 à 295 de la séquence SEQ ID NO: 2, le peptide correspondant au peptide suivant : QIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO: 3), 20 et - l'anticorps anti Cycline D1 clone 72-13G, commercialisé par Santa Cruz Biotechnology Inc sous la référence sc450. Cet anticorps est anticorps monoclonal de souris dirigé contre une protéine de fusion Cycline D1 murine. [28] Comme cela a été mentionné ci-dessus, la méthode selon l'invention utilise un 25 anticorps donneur et au moins un anticorps accepteur. Aussi, au vu des quatre anticorps avantageux susmentionnés, la méthode selon l'invention couvre les différentes 28 combinaisons suivantes : Donneur Accepteur Donneur Accepteur Donneur Accepteur ab1 ab3 ab3 ab1 SP4 ab1 SP4 SP4 ab3 SC450 SC450 SC450 ab3 +SP4 ab1 +SP4 ab1 +ab3 ab3 +SC450 ab1 ab1 +SC450 +SC450 SP4 +SC450 SP4 +SC450 ab3 +SC450 ab3 +SP4 +SC450 ab1 +SP4 +SC450 ab1 +ab3 +SC450 3038985 - 6 - Donneur Accepteur ab1 ab3 SP4 ab1 +ab3 sc450 ab1 +SP4 ab3+ SP4 ab1 +ab3 +SP4 [29] Une des combinaisons avantageuses selon l'invention est la combinaison SC450 donneur et abl+ab3 accepteur. 5 [30] Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle la première molécule luminescente est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium. [31] Dans le cadre du transfert d'énergie entre deux molécules luminescentes, ce qui 10 est important c'est de disposer de molécules dont le spectre d'excitation soit le moins chevauchant avec son spectre d'émission. En d'autres termes, il est important pour une même molécule luminescente que le spectre d'émission et le spectre d'excitation soit le moins chevauchant possible, de sorte que la longueur d'onde d'excitation ne puisse pas correspondre à la longueur d'onde d'excitation d'une seconde molécule 15 luminescente qui devrait être activée par transfert d'énergie Dans le cas de chevauchement, il y aura un manque de spécificité spectrale qui sera à l'origine de bruit de fond important ce qui diminuera largement la sensibilité de la quantification. [32] Le développement de molécules luminescentes avec des propriétés singulières a permis d'améliorer considérablement la sélectivité spectrale des couples de 20 fluorophores organiques. Les propriétés de ces fluorophores permettent d'effectuer des mesures de FRET dans des intervalles de temps longs (de plusieurs microsecondes à la milliseconde contre quelques nanosecondes pour des fluorophores classiques). C'est pourquoi on utilise le terme de temps résolu (Time - Resolved, TR) ou sélectivité temporelle pour les techniques de RET utilisant ces molécules. 25 [33] Les cryptates de terre rare sont des complexes formés d'un macrolide (cryptate) formant une cage piégeant un atome de lanthanide. [34] Un exemple de lanthanide est illustré par la formule I suivante : 3038985 - 7 - (I) où R1 et R2 sont des groupements réactifs qui permettent de greffer le cryptate sur des biomolécules, et notamment les anticorps. [35] Une propriété intéressant des cryptates réside dans leur capacité à collecter 5 l'énergie des photons d'une source lumineuse excitatrice et de la transférer sur le cation lanthanide. Ce phénomène est appelé l'effet antenne. [36] En outre, les cryptates de lanthanides sont particulièrement intéressant car leur longueur d'onde se trouve dans l'ultraviolet (280 à 360 nm), tandis que leur longueur d'onde d'émission se trouve dans le vert-rouge (450 à 800 nm). 10 [37] Encore un autre avantage des cryptates de lanthanides est leur capacité de fluorescence longue, c'est-à-dire qu'après excitation, ils continuent d'émettre pendant des durées variant de microsecondes à des millisecondes, alors que les fluorophores classiques émettent pendant quelques nanosecondes. [38] Avantageusement, l'invention concerne la méthode telle que définie ci-dessus, 15 dans laquelle la deuxième molécule luminescente est choisie parmi d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP. [39] Plus particulièrement, la seconde molécule luminescente est avantageusement d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, ou tout autre fluorophore émettant dans le rouge lorsque la première molécule luminescente est le cryptate d'europium. Du fait de son spectre 20 d'émission plus étendu, le cryptate de terbium peut être couplé avec une seconde molécule luminescente absorbant dans le rouge (d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647), mais également dans le vert (la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP). Ces listes ne sont pas limitatives, et l'homme du métier peut, avec ses connaissances générales, déterminer les différentes première et deuxième molécules luminescentes à combiner 25 pour obtenir un transfert d'énergie. [40] La molécule d2 est connue de l'état de la technique, et est notamment décrite dans le brevet US7091348 B2 [41] Avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans 3038985 - 8 - laquelle ladite luminescence émise est détectée après au moins 60 micro secondes (ps) après l'exposition de l'échantillon à la source lumineuse excitatrice. [42] Lors d'un transfert d'énergie entre un donneur possédant une durée de vie de fluorescence longue (cryptates de terres rares) et un accepteur fluorescent avec une 5 durée de vie courte (d2, fluorescéine, etc.), ce dernier émettra un signal de fluorescence présentant une durée de vie apparente similaire à celle du donneur. Ainsi, l'utilisation des cryptates de terres rares permet de mesurer l'émission de fluorescence de l'accepteur en temps résolu (intégration du signal après un délai de 50 ps pendant 400 ps). Cette propriété permet ainsi de distinguer la fluorescence de l'accepteur 10 engagé dans un FRET (durée de vie longue), des fluorescences parasites émises par les molécules présentes dans les milieux biologiques et dont la durée de vie de fluorescence est de l'ordre de la nanoseconde. [43] De manière avantageuse, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec 15 - l'anticorps donneur SC450, et - l'un au moins des anticorps accepteurs suivants : ab1, ab3 et SP4. [44] Comme mentionné ci-dessus, la combinaison avantageuse est SC450 (donneur) et ab1+ab3 (accepteur). [45] De manière avantageuse, les couples utilisés sont les suivants : 20 - SC450 couplé au cryptate d'europium, et le ou les anticorps accepteurs sont couplés au d2, au DY647, au Cy5, à l'Alexa647 ou à toute autre molécule luminescente absorbant dans le rouge, - SC450 couplé au cryptate de terbium, et le ou les anticorps accepteurs sont couplés au d2, au DY647, au Cy5, à l'Alexa647 ou à toute autre molécule 25 luminescente absorbant dans le rouge, mais aussi à la fluorescéine et aux protéines fluorescentes GFP, ou à toute autre luminescente absorbant dans le vert. [46] Les conditions expérimentales pour réaliser la méthode de l'invention, c'est-à-dire : la quantité d'anticorps utilisés, les marquages, l'exposition à la lumière excitatrice, 30 les temps de détection, etc... sont à la portée de l'homme du métier car il s'agit d'expériences de routines. L'exemple 1 ci-après donne, sans être limitatif, des informations pour mettre en oeuvre ladite méthode. [47] L'invention concerne en outre une composition comprenant : - un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et 35 - au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement 3038985 - 9 - un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente 5 correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, pour son utilisation dans le cadre du pronostic de résistance à une chimiothérapie d'une tumeur cancéreuse, ou dans le cadre du pronostic de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et l'infertilité humaine. 10 [48] Les inventeurs ont effectivement montré que la variation du niveau d'expression protéique de la Cycline D1 avait un effet sur la résistance aux chimiothérapies, lorsque la Cycline D1 est plus exprimée d'au moins 30% par rapport au niveau de Cycline D1 dans le même tissu non cancéreux. [49] Les inventeurs ont en outre montré que la variation du niveau d'expression 15 protéique de la Cycline D1 avait un effet sur de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et la fertilité humaine, lorsque la Cycline D1 est moins exprimée d'au moins 30% par rapport au niveau de Cycline D1 dans le même tissu sain. [50] Avantageusement, l'invention concerne la composition susmentionnée, dans 20 laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1, ab3, SP4 et SC450. [51] Avantageusement, l'invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle la molécule luminescente couplée à l'anticorps accepteur est choisie parmi d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, la fluorescéine et les 25 protéines fluorescentes GFP. [52] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la molécule luminescente couplée à l'anticorps donneur est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium. 30 [53] De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec - l'anticorps donneur SC450, et - l'un au moins des anticorps accepteur suivants : ab1, ab3 et SP4. [54] Les combinaisons et définition susmentionnées s'appliquent mutatis mutandis à 35 la méthode de pronostic. [55] L'invention sera mieux comprise à la lecture des figures annexées, et de l'exemple qui ne présentent aucun caractère limitatif. 3038985 -10- [56] Légende des Figures. [57] La figure 1 représente un graphique montrant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) de cellules MEF immortalisées par l'antigène T et exprimant la Cycline Dl étiquetée FLAG-HA. Les barres noires correspondent au marquage de la protéine 5 étiquetée, et les bases blanches correspondent au marquage de la protéine sauvage (non étiquetée)). A. : marquage avec l'anticorps donneur anti-FLAG et anticorps accepteur anti-HA, B. : anticorps donneur anti-FLAG seul, C. : marquage avec l'anticorps donneur anti-HA et anticorps accepteur anti-FLAG, et D. : anticorps donneur anti-HA seul. L'écart-type des mesures est représenté (3 expériences par échantillon). 10 [58] Les figures 2 A et B comparent le FRET et le western blot pour la quantification de la Cycline Dl. [59] La figure 2A est un graphique représentant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) obtenu à partir de dilutions en séries d'un échantillon comprenant de la Cycline D1 étiquetée. Les anticorps donneurs et accepteurs sont dirigés contre les 15 étiquettes. Dans l'expérience, la quantité de Cycline D1 étiquetée « perdue lors de la dilution » est remplacée par de la Cycline D1 non étiquetée. La quantité de Cycline D1 reste donc constante. La courbe de régression linéaire est indiquée (R2=0,9979). Les chiffres en abscisse représentent la quantité de Cycline D1 étiquetée en % dans l'échantillon. 20 [60] La figure 2B est un western blot correspondant aux mêmes dilutions que la figure 2A. Les protéines sont marquées avec un anticorps anti Cycline Dl. La flèche représente la Cycline D1 étiquetée, et les deux têtes de flèche représentent la Cycline D1 non étiquetée. [61] Les figures 3A et 3B correspondent à d'autres exemples de dilutions tels que 25 décrits aux figures 2. [62] La figure 3A est un graphique représentant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) obtenu à partir de dilutions en séries d'un échantillon comprenant de la Cycline D1 étiquetée. Les anticorps donneurs et accepteurs sont dirigés contre les étiquettes. Dans l'expérience, la quantité de Cycline D1 étiquetée « perdue lors de la 30 dilution » est remplacée par de la Cycline D1 non étiquetée. La quantité de Cycline D1 reste donc constante. La courbe de régression linéaire est indiquée (R2=0,9979). Les chiffres en abscisse représentent la quantité de Cycline D1 étiquetée en % dans l'échantillon. [63] La figure 3B est un western blot correspondant aux mêmes dilutions que la 35 figure 3A. Les protéines sont marquées avec un anticorps anti Cycline Dl. La flèche représente la Cycline D1 étiquetée, et les deux têtes de flèche représentent la Cycline D1 non étiquetée. 3038985 [64] La figure 4 représente un western blot obtenu à partir d'extraits comprenant soit de la Cycline D1 étiquetée en C-terminal soit de la Cycline D1 étiquetée en N-terminal, et traité soit avec un inhibiteur de l'initiation de la traduction (cyclohéximide ; 1.) soit avec un inhibiteur du protéasome (MG132 ; 2.). Al représente un marquage avec un 5 anticorps anti étiquette C-terminale, A2 représente un marquage avec un anticorps anti étiquette N-terminale, et B représente un marquage anti actine utilisé pour normaliser les dépôts. [65] Les figures 5A et 5B montrent la mesure quantitative de la Cycline D1 après traitement au cyclohéximide. 10 [66] La figure 5A représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en N-terminal avant traitement (0) et toutes les 15 min pendant 45 min après traitement à la cyclohéximide. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur. [67] La figure 5B représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de 15 cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en C-terminal avant traitement (0) et toutes les 15 min pendant 45 min après traitement à la cyclohéximide. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur. [68] Les figures 6A et 6B montrent la mesure quantitative de la Cycline D1 après traitement au MG132. 20 [69] La figure 6A représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en N-terminal avant traitement (0) et toutes les heures pendant 3 heures après traitement au MG132. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur. [70] La figure 6B représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de 25 cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en C-terminal avant traitement (0) et toutes les heures pendant 3 heures après traitement au MG132. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur. [71] Les figures 7A et 7B montrent la quantification de la Cycline D1 après interférence à ARN. 30 [72] La figure 7A est un western blot réalisé à partir d'extraits de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en C-terminale, non traitées (A : siRNA non relevant), ou traités avec différents siRNA contre la Cycline D1 : B : siRNA décrit dans Bienvenu Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8, C : SiRNA Life et D : siRNA Qiagen. 1. représente le marquage avec un anticorps anti Cycline D1 à faible temps d'exposition, et 1.+ le même 35 marquage à un temps d'exposition plus important. 2. Représente le marquage à l'actine, comme contrôle de charge. [73] La figure 7B représente un graph montrant le signal HTRF (unités arbitraires) 3038985 - 12 - obtenu pour les mêmes cellules que celles décrites dans la figure 7A. [74] Les figures 8A et 8B montrent l'application de la quantification à des protéines Cycline D1 et Cycline D1 hyperstable. [75] La figure 8 A est un western blot montrant la détection de protéines cyclilnes 5 D1 : A : Cycline D1 étiquetée FLAG-HA et Cycline D1 T286A ; B : Cycline D1 T286A étiquetée FLAG-HA et Cycline D1 ; C : Cycline D1 étiquetée T286A FLAG-HA ; D : Cycline D1 étiquetée FLAG-HA ; E : cellules sans Cycline D1 (Ccndl-/-). Les extraits sont exposés à un anticorps anti Cycline D1 (1.) ou avec un anticorps anti actine (2.) en contrôle. 10 [76] La figure 8B représente le signal HTRF obtenu avec les mêmes extraits que dans la figure 8A. [77] La figure 9 est un graphique montrant le signal TR-FRET (unités arbitraires) obtenu avec d'autres protéines étiquetées : A : mCherry FLAG-HA et B : CDK4 V5 - MYC. En A l'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur, et en B l'anticorps anti V5 15 est utilisé comme donneur. [78] La figure 10 représente un graphique montrant le signal TR-FRET (unités arbitraires) montrant l'interaction entre la Cycline D1 et CDK4. A : Cycline D1 FLAG-HA et MYC-CDK4-V5, et B : Cycline D1 non étiquetée et MYC-CDK4-V5. En A et B l'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur, B correspond au contrôle négatif, car 20 les anticorps donneurs n'ont pas de cible (Cycline D1 sans TAG Flag). [79] Les figures 11A et 11B montrent que le signal HTRF peut être augmenté en utilisant plusieurs accepteurs. [80] La figure 11 A représente un graphique montrant le signal HTRF obtenus à partir de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en N-terminal pour les différentes 25 combinaisons « donneur » « accepteur » suivantes : A: Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; B : donneur anti-FLAG + accepteur ab1 ; C : Donneur anti-FLAG + accepteur ab3 ; D : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; E : donneur antiFLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; F : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; G : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 et ab3 ; H : donneur anti-HA + 30 accepteurs anti-FLAG ; I : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; J : donneur anti-HA + accepteurs ab3 ; K : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; L : donneur antiHA + accepteurs anti-FLAG et ab3 ; M : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, et N : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 et ab3. [81] La figure 11 B représente un graphique montrant le signal HTRF obtenu à partir 35 de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en C-terminal pour les différentes combinaisons « donneur » « accepteur » suivantes : A: Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; B : donneur anti-FLAG + accepteur ab1 ; C : Donneur anti-FLAG + 3038985 -13- accepteur ab3 ; D : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; E : donneur antiFLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; F : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; G : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 et ab3 ; H : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG ; I : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; J : donneur anti-HA + 5 accepteurs ab3 ; K : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; L : donneur antiHA + accepteurs anti-FLAG et ab3 ; M : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, et N : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 et ab3. [82] Les figures 12A et 12B comparent la détection par HTRF des cyclines D1 étiquetées en N-terminal ou en C-terminal. 10 [83] La figure 12A est un western blot mesurant le niveau d'expression de A : Cycline D1 étiquetée en N-terminal ou B : étiquetée en C-terminal. Les protéines sont issues de MEF Ccndl-/- transfectées avec les constructions correspondantes. Les protéines sont détectées avec un anticorps anti-HA (1.). EN contrôle de charge, les protéines sont détectées avec un anticorps anti-actine (2.). 15 [84] La figure 12B représente le signal HTRF obtenu avec les mêmes extraits que dans la figure 12A. [85] Les figures 13A à 13C représentent les signaux HTRF obtenus sur des lignées ou des organes de souris exprimant la Cycline D1 étiquetée. [86] La figure 13A représente la mesure par HTRF de la quantité de Cycline D1 dans 20 des lignées MEF Ccndl+/+ transformées avec RasV12 et un dominant négatif de p53, selon des dilutions successives de 100% à 10% de Cycline D1, et selon les combinaisons d'anticorps suivantes : A : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG ; B : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; C : donneur anti-HA + accepteurs ab3 ; D : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; E : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et 25 ab3 ; F : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, G : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et abi et ab3 ; H : Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; I : donneur antiFLAG + accepteur ab1 ; J : Donneur anti-FLAG + accepteur ab3 ; K : donneur antiFLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; L : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; M : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; N : donneur anti-FLAG + 30 accepteurs anti-HA et ab1 et ab3. [87] La figure 13B représente la mesure par HTRF de la quantité de Cycline D1 dans A : des cellules en culture, B : les poumons, C : les reins, D : le foie, E : les yeux, F : le coeur, G : les ovaires, H : les testicules, I : la rate, J : le pancréas, K : le cerveau. K représente une régression théorique de la détection en fonction de la dilution. Les 35 organes sont marqués avec la combinaison : donneur anti-FLAG et accepteur anti-HA et ab1 et ab3. [88] La figure 13 C correspond à la comparaison des mesures HTRF obtenues 3038985 - 14 - (barres noires) et théorique (barres blanches) sur des lignées cellules MEF transformées. La régression est de R2 : 0.9956. [89] La figure 14 est un western blot montrant l'expression de la Cycline D1 sauvage dans des organes de souris (A : foie, B : reins, C : poumons, D : coeur, E : yeux, F : 5 ovaires, G : rate, H : pancréas et I : cerveau). Les protéines sont marquées avec un anticorps anti-Cycline D1 (1.) et la charge protéique est évaluée avec un anticorps anti actine (2.) et un anticorps anti tubuline (3.). [90] La figure 15 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) de la Cycline D1 dans des extraits de cellules MEF Ccndl +/+ transformées 10 avec les combinaisons d'anticorps suivants : A : donneur ab1 + accepteur ab3, B : donneur Ab1 + accepteur SC450, C : donneur ab1 + accepteur ab 3 et SC450, D : donneur ab3 + accepter ab1, E : donneur ab3 + accepteur SC450, F : donneur ab3 + accepteur ab1 et SC450, G : donneur SC450 + accepteur ab1, H : donneur SC450 + accepteur ab3 et I : donneur SC450 et accepteur ab1 et ab3. 15 [91] La figure 16 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) de la Cycline D1 dans des cellules MEF transformées, après dilutions indiquées en abscisses. Les anticorps utilisés sont : donneur SC450 + accepteur ab1 et ab3. Les barres noires correspondent aux valeurs mesurées, les barres blanches aux valeurs prédites. La régression est : R2= 0.9943. 20 [92] La figure 17 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) obtenus à partir de testicules de souris CcndlNtag/Ntag 14 heures après une injection intrapéritonéale de sel (A) ou de solution saline d'acide méthoxyacétique à 150 mg/kg. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois expériences indépendantes. 25 [93] Les figures 18A à 18H correspondent à des immunofluorescence de la Cycline D1 dans les testicules. [94] La figure 18A correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de TRA98 et de l'étiquette HA, dans des testicules de souris CcndlCtag/Ctag 30 [95] La figure 18B correspond à la superposition des fluorescence obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de TRA98 et de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Ccndl+/+. [96] La figure 18C correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans des testicules de souris Ccndl Ctag/Ctag 35 [97] La figure 18D correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans des testicules de souris Ccndl+/+. [98] La figure 18E correspond au marquage de TRA98 dans des testicules de souris 3038985 -15- Ccndlctag/ctag [99] La figure 18F correspond au marquage de TRA98 dans des testicules de souris Condi+ +. [100] La figure 18G correspond au marquage de l'étiquette HA, dans des testicules de 5 souris Ccnd/ctag/ctag. [101] La figure 18H correspond au marquage de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Condi+ +. [102] La figure 19 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) obtenus à partir de la substantia nigra (B) et du striatum (A) de souris 10 CondiNtag/Ntag 24 heures après une injection intrapéritonéale de sel (barres noires) ou de solution saline de méthamphétamine (barres blanches) à 5 mg/kg. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois expériences indépendantes. [103] Les figures 20A à 20H correspondent à des immunofluorescence de la Cycline D1 dans Substantia nigra pars compacta de souris adultes. 15 [104] La figure 20A correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de la tyrosine hydroxylase et de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris CondiCtag/Ctag [105] La figure 20B correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de la tyrosine hydroxylase et de l'étiquette HA, dans la 20 substantia nigra de souris Condi+ +. [106] La figure 20C correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans la substantia nigra de souris Condi Ctag/Ctag [107] La figure 20D correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans la substantia nigra de souris Condl+/+. 25 [108] La figure 20E correspond au marquage de la tyrosine hydroxylase dans la substantia nigra de souris CondiCtag/Ctag [109] La figure 20F correspond au marquage de la tyrosine hydroxylase dans la substantia nigra de souris Condi+ +. [110] La figure 20G correspond au marquage de l'étiquette HA, dans la substantia 30 nigra de souris CondiCtag/Ctag [111] La figure 20H correspond au marquage de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris Condl+/+. [112] La figure 21 est un graphique montrant la quantité de Cycline D1 (unités arbitraires) chez des patientes atteintes de cancer du sein, significativement plus élevé 35 (p REVENDICATIONS1. Utilisation d'une composition comprenant - un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et - au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine CCND1, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection quantitative in vitro de la protéine codée par le gène Ccndl dans un échantillon (comprenant des protéines). 2. Méthode de quantification in vitro de la protéine Cycline D1, notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, dans un échantillon comprenant des protéines, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - une étape de mise en contact dudit échantillon avec o un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et o au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine CCN D1, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, et - une étape de détection et de quantification de ladite protéine Cycline Dl. 3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle l'étape de détection et de quantification consiste en - une première sous étape d'exposition de l'échantillon à une source 3038985 - 26 - 5 4. 105. 6. 15 7. 20 8. 25 30 35 lumineuse excitatrice de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'absorption de la molécule fluorescente couplée audit anticorps donneur pendant une durée déterminée, et - une seconde étape de détection de la luminescence émise après l'extinction de la source lumineuse excitatrice. Méthode selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1, ab3, SP4 et SC450. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans laquelle la première molécule luminescente est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans laquelle la deuxième molécule luminescente est d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec - l'anticorps donneur SC450, et - l'un au moins des anticorps accepteurs suivants : ab1, ab3 et SP4. Composition comprenant : - un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et - au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente, lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine Cycline D1, lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, pour son utilisation dans le cadre du pronostic de résistance à une chimiothérapie d'une tumeur cancéreuse, ou dans le cadre du pronostic de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et la fertilité humaine. 3038985 -27- 9. Composition selon la revendication 8, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1, ab3, SP4 et SC450. 10. Composition selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec - l'anticorps donneur SC450, et - l'un au moins des anticorps accepteur suivants : ab1, ab3 et SP4. 5 10