FR 3037602 A1 20161223 FR 1555557 A 20150617 1 1VIATERIAUX FIBREUX INTEGRANT DES PROTEINES AMYLOIDES ET LEUR PROCEDE DE FABRICATION La présente invention s'inscrit dans le domaine de la production de textiles intelligents. Elle concerne un procédé de fabrication de matériaux composites fibreux à base de polymères et de protéines amyloïdes, avantageusement fonctionnalisées, ainsi que les matériaux ainsi obtenus. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les textiles intelligents sont aujourd'hui en plein développement. On connait par exemple des textiles munis de microprocesseurs et capables de détecter ou mesurer de nombreux paramètres comme la température, l'humidité, les mouvements, les champs électrostatiques et électromagnétiques ou encore certains produits chimiques, et de modifier leur structure en fonction de ces paramètres. Diverses méthodes sont connues pour obtenir de tels tissus. Il est par exemple possible d'ajouter à un support textile existant des structures de petite taille possédant des propriétés intéressantes, telles que par exemple des nanoparticules formées de micelles ou des microprocesseurs équipés de systèmes de communication. Ces textiles ont l'avantage de posséder de bonnes propriétés rhéologiques, principalement apportées par le support polymérique. On a aussi tenté de mettre à profit les fonctions naturellement présentes dans les molécules biologiques pour obtenir des textiles intelligents en utilisant des molécules biologiques d'intérêt en tant que biopolymères. A titre d'illustration, on peut citer notamment l'utilisation du chitosane en tant que biopolymère pour la régénération des tissus et l'ostéogenèse, ainsi que la vectorisation de molécules biologiquement actives. Ces textiles ont l'avantage de posséder des fonctionnalités résultant des molécules biologiques d'intérêt. Leurs propriétés rhéologiques ne sont toutefois pas toujours optimales et gagneraient à être améliorées. Il existe un besoin évident de développer de nouveaux textiles présentant des fonctionnalités biologiques d'intérêt, de conception et de réalisation aisées. 3037602 2 DESCRIPTION DE L'INVENTION Dans le cadre de l'invention, le Demandeur a mis au point un procédé permettant de 5 produire des matériaux comprenant des fibres amyloïdes, avantageusement d'origine bactérienne, dont la fonction est préservée. Ceci offre de grandes perspectives puisque les fibres amyloïdes en tant que telles possèdent des propriétés d'intérêt : Il a pu être mis en évidence que la capacité connue des 10 fibres amyloïdes de types curli d'Escherichia colt à chélater le nickel est préservée dans un matériau issu du procédé selon l'invention. De manière plus large, ces fibres amyloïdes peuvent être utilisées comme « squelette » pour insérer ou greffer d'autres fonctionnalités d'intérêt (capture d'autres métaux ou polluants, diagnostic sur molécules excrétées, libération de molécules thérapeutiques ou protectrices, ...). 15 Le procédé de l'invention repose sur un procédé de filage en voie solvant, en particulier la technique bien connue d' électrofilage, aussi appelée électrofilature ou encore « electrospinning ». Cette technique est désormais bien établie dans le domaine de la préparation de fibres artificielles. Elle a été décrite plus en détail par Bhardwaj et al. et 20 par Subbiah et al. Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un matériau composite fibreux comprenant au moins un polymère et au moins une protéine amyloïde, selon lequel un mélange comprenant ledit polymère et 25 ladite protéine est soumis à une technique de filage en milieu solvant, avantageusement la technique d' électrofilage. Par « matériau composite fibreux », on entend au sens de l'invention un matériau comprenant des fibres ou filaments. Ainsi et de manière connue, l'électrofilage permet de 30 fabriquer des fibres polymériques dont le diamètre varie entre quelques nanomètres et quelques microns et qui possèdent une haute surface spécifique. Grâce au procédé utilisé et malgré la présence de protéines amyloïdes, le matériau de l'invention comprend des fibres d'un faible diamètre, typiquement des fibres de diamètre compris entre 50 nm et 50 i.tm, avantageusement compris entre 500 nm et 5 iam, encore plus avantageusement 35 compris entre 500 nm et 21.1.m. 3037602 3 De manière caractéristique selon l'invention, le matériau est obtenu à l'aide d'une technique de filage (ou tissage) en milieu solvant, également appelée filage par voie humide. Selon ces technologies, le composé d'intérêt à mettre sous forme de fibres (ou filaments) est formulé en milieu liquide, à savoir dissout dans un solvant adapté de sorte à 5 former une solution. Ces techniques comprennent notamment la polymérisation interfaciale, l'électrofilage, la précipitation induite par antisolvant et la filature électrostatique. De manière avantageuse, la technique mise en oeuvre est la technique d' électrofilage. 10 Ainsi et de manière plus précise, le procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes : - préparer un mélange liquide comprenant le polymère et la protéine amyloïde ; - soumettre le mélange liquide, avantageusement éjecté à l'aide d'une aiguille, à une 15 tension ; - collecter les fibres obtenues, formant le matériau composite fibreux. Cette technique, connue dans l'état de l'art, permet la production de fibres à partir de composés divers. Typiquement, elle consiste à faire passer un mélange de ces composés 20 dans un montage appelé banc d'électrofilage, lequel comporte une seringue contenant le mélange à électrofiler, une pompe permettant de contrôler le débit injecté par la seringue, une source électrique reliée à l'aiguille de la seringue et à un collecteur. La solution est poussée à travers l'aiguille, soit par la gravité, soit par l'action d'une force 25 extérieure. Une fois expulsé à l'extérieur de l'aiguille, trois forces agissent sur le liquide : la gravité, les forces électriques et la tension de surface. Ces forces entrent en compétition et se compensent les unes avec les autres pour former un cône de Taylor, et selon l'équilibre des forces, un jet ou des gouttes peuvent être produits. 30 L'application d'un voltage approprié génère des charges à la surface de la goutte de polymère sortant de la pointe de l'aiguille. Ces charges conduisent à la rupture de la tension de surface et la formation d'un filament de matériau. Le filament se solidifie très rapidement et se dépose sur le collecteur pour 35 former un film, ou une autre structure selon le collecteur utilisé. À la fin de l'injection, ce film (ou toute autre structure obtenue) est récolté et séché sous vide. Le matériau obtenu comprend donc des fibres, qui résultent de la solidification du filament, et dont l'organisation, soit en réseau, soit sous la forme d'un fil, dépend du collecteur utilisé. 3037602 4 Les collecteurs les plus simples correspondent à une plaque ou un disque de métal connecté à un fil de masse. Pour contrôler l'alignement des fibres, on peut utiliser un cylindre ou un disque rotatif. D'autres solutions consistent à utiliser des disques chargés pour orienter le jet vers le collecteur. 5 Ainsi, selon le collecteur utilisé, on peut organiser le filament en un film au moyen d'un collecteur plan, ou en un fil continu au moyen d'un rouleau collecteur, ce fil pouvant ultérieurement être utilisé pour la préparation de textiles tissés. 10 Il est possible de faire varier certains des paramètres du banc d' électrofilage pour adapter notamment le diamètre des filaments obtenus, et par conséquent celui des fibres présentes dans le matériau final. Ainsi, il est connu que les paramètres tels que le voltage appliqué et la distance seringue- 15 collecteur sont susceptibles d'avoir un impact sur les caractéristiques du produit obtenu. Les inventeurs ont notamment déterminé, dans le cadre du procédé de l'invention, les conditions les plus efficaces pour obtenir un matériau comprenant des fibres présentant un diamètre adapté. 20 Dans le cadre de l'invention, le voltage appliqué est avantageusement compris entre 10 et kV, de préférence compris entre 15 et 35 kV, de manière particulièrement préférée égal à 30 kV. De manière adaptée, dans le cadre du présent procédé, la distance seringue-collecteur 25 appropriée est typiquement d'au moins 5 centimètres, de préférence allant de 10 à 30 centimètres, de manière particulièrement préférée allant de 10 à 15 centimètres, voire égale à 10 cm. Le procédé selon l'invention met en oeuvre un mélange comprenant le polymère et la 30 protéine amyloïde d'intérêt. De préférence, ce mélange est une solution. Avantageusement, le mélange comprend un solvant approprié au polymère choisi et compatible avec la protéine en présence. Selon un mode de réalisation particulier, il s'agit d'un système solvant comprenant au moins deux solvants. 35 Le choix d'un solvant approprié au polymère à électrofiler, c'est-à-dire assurant sa solubilisation, fait partie des connaissances de l'homme de l'art. Pour obtenir des fibres, il est classiquement conseillé d'utiliser des solvants avec une pression de vapeur saturante élevée, tels que les alcools. Les systèmes utilisant l'eau comme solvant fonctionnent 3037602 5 également. L'homme de l'art pourra le cas échéant se référer à Luo et al. (Polymer, 51(7):1654-1662, 2010). Dans le cas particulier du procédé de l'invention, le solvant ou système solvant présent 5 doit également être compatible avec la protéine amyloïde, en particulier doit assurer le maintien de sa structure et de sa fonction. On citera, à titre d'exemple de solvant, l'eau, le chloroforme, le N, N-diméthylformamide (DMF), ou leurs mélanges, en particulier les systèmes binaires tels que les mélanges d'eau et d'éthanol ou les mélanges de chloroforme et de DMF. 10 Selon un mode de réalisation particulier, le mélange à électrofiler comprend du chloroforme et du DMF. En d'autres termes, le système solvant utilisé est un système binaire constitué de chloroforme et de DMF. De manière encore plus avantageuse, les proportions en termes de volumes (ou rapport volumique) entre ces deux solvants est de 15 80:20. Au sens de l'invention, le polymère mis en oeuvre peut être tout type de polymère classiquement utilisé dans le domaine des fibres textiles. 20 De préférence, le polymère est un polymère biodégradable. Un tel polymère peut être choisi parmi : - les polyhydroxyalcanoates (PHA), tels que par exemple le polyhydroxybutyrate (PHB) ou le poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) ; - les polymères dérivés de l'acide lactique, tels que par exemple l'acide 25 polylactique (PLA) ou la polycaprolactone (PCL) ; - les polyesteramides (PEA) ; - les copolymères tels que le poly(butylene succinate) (PBS), le poly[(butylene succinate)-co-adipate] (PB SA), le poly(butylène adipate-co-téréphtalate) (PBAT), de préférence le poly(butylène adipate-co-téréphtalate) (PBAT). 30 Selon un mode de réalisation particulier, le polymère est un polyester aromatique, avantageusement le poly(butylène adipate-co-téréphtalate) (PBAT). Par « protéine amyloïde » on entend au sens de l'invention des protéines, 35 avantageusement d'origine bactérienne, arrangées au moins en partie sous forme de feuillets (3. De manière connue, ces protéines sont capables de former des fibres dites amyloïdes. 3037602 6 Les fibres amyloïdes, en particulier celles synthétisées par les bactéries, sont bien connues et caractérisées en biologie. Elles sont facilement observables en microscopie optique en lumière polarisée, du fait de leur biréfringence lorsqu'elles sont marquées au rouge congo. Une définition basée sur leur structure physico-chimique a été proposée par 5 Fândrich (Cellular and Molecular Life Sciences, 64(16):2066-2078). Celui-ci les décrit comme des fibres d'agrégats de protéines, ces protéines étant arrangées au moins en partie sous forme de feuillets (3. Selon un mode de réalisation particulier, les fibres amyloïdes sont des fibres de type curli, 10 en particulier des fibres comprenant le peptide CsgA codé par le gène csgA d'Escherichia colt CsgA est couramment considéré comme un peptide sous sa forme monomérique, sa forme polymérique étant impliquée dans la formation des curli. Au sens de l'invention, on entend par « protéine CsgA » aussi bien la forme monomérique, polymérique que les curli. 15 Dans le cadre de l'invention, la protéine amyloïde est avantageusement la protéine CsgA d'Escherichia coli, telle que par exemple la protéine codée par le gène dont la séquence est connue de l'homme de l'art (par exemple publiée sous le numéro d'accession EG11489 dans la base de donnée EcoGene, abritée sur le site internet : 20 http://www.ecogene.org), ou un de ses homologues, issus par exemple de Salmonella enterica (tel que la protéine CsgA dont la séquence est publiée sous le numéro d'accession B5QY21 SALEP dans la base de donnée UniProt, abritée sur le site internet : http ://www.uniprot.org). 25 Alternativement, il peut s'agir d'une protéine : - de type TasA de Bacillus subtilis (telle que par exemple la protéine décrite dans Romero et al., PNAS, 107(5) : 2230-2234, 2010 et dont la séquence est publiée sous le numéro d'accession Q5ND72 BACIU dans la base de donnée UniProt, abritée sur le site internet : http ://www.uniprot. org), ou 30 - de type Fap, en particulier FapC, de Pseudomonas (telle que par exemple la protéine dont la séquence est publiée sous le numéro d'accession C4IN70 9PSED dans la base de donnée UniProt, abritée sur le site internet : http://www.uniprot.org). Dans le cadre de l'invention, la protéine amyloïde correspond avantageusement à la 35 protéine CsgA ou un dérivé de celle-ci. Au sens de l'invention, un « dérivé » comprend une protéine issue d'un autre organisme, ou un homologue, présentant avantageusement au moins 50% (voire 60%, 70%, 80% ou même 90%) d'identité de séquence avec CsgA. 3037602 7 De manière préférée, un dérivé est un dérivé fonctionnel, c'est-à-dire présentant au moins une fonction conservée de CsgA, en particulier la capacité à se structurer en feuillets (3. Les protéines amyloïdes mises en oeuvre dans le procédé de l'invention peuvent être 5 utilisées pour leurs fonctions biologiques propres, qui reposent sur les domaines protéiques qui les constituent. Selon un premier aspect, les protéines natives, notamment produites et purifiées à partir des microorganismes susmentionnés, peuvent être utilisées. A noter que ces 10 microorganismes peuvent être génétiquement modifiés pour augmenter la production de la protéine, par exemple par introduction d'un plasmide de surexpression ou par mutation d'un régulateur de l'expression du gène (par exemple OmpR d'Escherichia coh). Alternativement, il peut s'agir de protéines dites synthétiques, obtenues par génie génétique notamment par mutagénèse, présentant des propriétés améliorées. 15 Selon un autre mode de réalisation, lesdites protéines peuvent être modifiées pour greffer ou insérer des propriétés d'intérêt, les protéines servant alors essentiellement de « squelette », notamment au vu de leur organisation en feuillets (3 non affectée par la technique de filage mise en oeuvre. Le greffage des fonctions d'intérêt peut intervenir 20 avant ou après la mise sous forme de fibres. L'insertion d'activités d'intérêt peut faire appel à des techniques de génie génétique, par exemple par l'insertion d'une séquence codant la fonction recherchée dans la séquence codante de la protéine amyloïde, avantageusement à un endroit n'affectant pas le repliement de ladite protéine, voire n'affectant pas ses propriétés biologiques intrinsèques. A titre d'exemple, l'homme du 25 métier pourra greffer sur les protéines amyloïdes de l'invention des protéines ou peptides, tels que des anticorps, des antigènes, des ligands, des récepteurs, des protéines connues pour leur fonction en tant que biomarqueurs, ou des fragments de ceux-ci. Dans la suite de la demande, ces différentes possibilités sont appelées « dérivés » et 30 « dérivés fonctionnalisés » de la protéine amyloïde, respectivement. Selon l'invention, les protéines amyloïdes peuvent donc présenter naturellement une propriété d'intérêt, telle que la capacité à chélater certains métaux, et les modifications génétiques apportées ont pour but d'améliorer cette capacité. Alternativement, les 35 protéines amyloïdes ne présentent pas naturellement cette propriété, en particulier la capacité à capter ce métal, et les modifications génétiques apportées ont pour but de leur conférer cette propriété. 3037602 8 A titre d'exemple, il est connu que les fibres curli, comprenant la protéine CsgA, possèdent une capacité à chélater le nickel. Dans le procédé selon l'invention, il est donc possible d'utiliser la protéine CsgA en tant que telle, pour laquelle la présente demande démontre qu'elle conserve cette capacité après intégration dans le matériau fibreux. 5 Alternativement, il est possible d'utiliser une protéine modifiée génétiquement, avantageusement par insertion de résidus histidine, conférant une capacité améliorée à chélater le nickel. Par « capacité à chélater le nickel », en référence à une protéine (ou des fibres la 10 comprenant), on entend au sens de l'invention la capacité de ladite protéine (ou desdites fibres) à former un complexe, le chélate, entre la protéine (ou les fibres) et le nickel. En pratique, cette capacité est facilement mesurée en mesurant la quantité de nickel effectivement retenue par la protéine (ou les fibres la comprenant) lorsque celle-ci est immergée dans une solution aqueuse de nickel, comme détaillé dans la partie 15 expérimentale. Il est entendu que la capacité d'une protéine génétiquement modifiée à chélater le nickel (ou d'un matériau la comprenant) est considérée comme améliorée si elle est supérieure à celle de la protéine non modifiée (ou d'un matériau la comprenant), aussi appelée 20 sauvage. Dans le cadre de la présente demande, il a été établi que le mélange de polymère et de protéine amyloïde permet d'obtenir des matériaux composites fibreux dont les propriétés rhéologiques sont particulièrement intéressantes. Il a été notamment montré qu'en faisant 25 varier la concentration de polymère, il est possible d'obtenir des filaments possédant une élongation à la rupture très élevée. Ces filaments sont donc très élastiques, ce qui rend leur utilisation dans la préparation de produits textiles particulièrement avantageuse. Selon un mode de réalisation particulier, le polymère est présent dans le mélange à hauteur de 5% à 30% en poids par rapport au poids du mélange, avantageusement de 15% 30 à 25% en poids, encore plus avantageusement 20%. La quantité de protéine amyloïde introduite dans le mélange dépend de la quantité souhaitée dans le produit final et peut atteindre plusieurs milligrammes. Selon un mode de réalisation particulier, la majorité de la protéine introduite dans le mélange est retrouvée 35 dans le produit final. 3037602 9 Selon un autre aspect, l'invention concerne un matériau composite fibreux susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus. En pratique, celui-ci comprend des fibres constituées de polymère et de protéine amyloïde, ou ses dérivés éventuellement 5 fonctionnalisés comme définis précédemment. Selon un mode de réalisation particulier, un tel matériau comprend des fibres à base de PBAT et de la protéine CsgA ou ses dérivés, éventuellement fonctionnalisés. 10 Avantageusement, le matériau composite fibreux comprend des protéines amyloïdes représentant de 104 à 10-5 g par gramme de matériau, de préférence de 2.104 à 4.104 g par gramme de matériau, de manière particulièrement préférée allant de 3.104 à 3,5.104 g par gramme de matériau. 15 Comme déjà dit et de manière avantageuse, le matériau selon l'invention comprend des fibres d'un diamètre compris entre 50 nm et 50 lm, de préférence entre 500 nm et 5 i.tm, de manière particulièrement préférée entre 500 nm et 2 i.tm. En outre, le matériau selon l'invention possède des propriétés qui le rendent 20 particulièrement adapté à la fabrication de textiles. Un autre objet de l'invention est donc l'utilisation du matériau composite fibreux selon l'invention pour la fabrication de textiles. 25 Au sens de l'invention, le terme « textile » doit être compris dans son sens communément accepté, à savoir tout matériau constitué de fibres arrangées entre elles par tissage (textile tissé) ou bien de manière aléatoire (textile non tissé), et propre ou destiné à faire des étoffes. 30 En effet et comme déjà dit, le matériau composite fibreux produit sous la forme d'un filament peut être organisé de différentes façons, selon les particularités du collecteur utilisé. Ces considérations sont classiques dans le domaine de la fabrication de textiles, et ne nécessitent pas d'être détaillés pour l'homme de l'art. Il est donc simple, à partir du matériau composite de préparer des textiles « tissés » ou « non tissés ». 35 Selon un mode de réalisation particulier, le matériau selon l'invention se présente sous la forme d'un non-tissé, à savoir une nappe, une membrane ou un film. 3037602 10 En relation avec la protéine CsgA et comme démontré dans la présente demande, il est ainsi possible d'obtenir un matériau présentant une capacité améliorée à chélater le nickel. Ainsi et selon un aspect particulier, la présente invention vise l'utilisation d'un matériau selon l'invention pour la fabrication d'un textile présentant des capacités de chélation du 5 nickel améliorées. La présente invention va être illustrée plus avant en rapport avec un procédé selon l'invention, mettant en oeuvre du PolyButylène-Adipate-co-Téréphtalate (PBAT) et des fibres amyloïdes de type curli, purifiées à partir d'Escherichia Coli. En d'autres termes, 10 les exemples illustrent l'élaboration d'un matériau composite fibreux comprenant du PBAT et la protéine CsgA. Toutefois, ces exemples ne sont en aucun cas limitatifs et leur enseignement peut être étendu à d'autres polymères ainsi qu'à d'autres protéines amyloïdes. 15 FIGURES Figure 1 : Les matériaux fibreux comprenant uniquement du PBAT (A) ou comprenant du PBAT et des fibres curli (B) sont observés en microscopie électronique à balayage (MEB) à faible grossissement (xl ; à gauche) ou à fort grossissement (x3000 ; au centre). La 20 distribution du diamètre des fibres a été établie par analyse d'image (à droite). EXEMPLES 25 MATERIEL ET METHODES A/ Matériaux 1/ PBAT 30 Le PBAT (Polybutylène-adipate-co-téréphtalate) utilisé correspond au polymère commercialisé sous le nom Ecoflex® (BASF). Il s'agit d'un hétéropolymère du butylène téréphtalate et du butylène adipate, possédant les caractéristiques résumées dans le tableau ci-dessous (mesurées selon les méthodes normalisées indiquées et sur un fil de 50 35 i.tm d'épaisseur) : 3037602 11 Propriété Méthode PBAT Ecoflex® Densité [g/cm3] ISO 1183 1,25-1,27 MIT (190 °C, 2,16 kg) [g/10min] ISO 1133 2,7-4,9 Température de fusion DSC 110-120 [°c] Dureté Shore D ISO 868 32 Module d'élasticité [MPa] ISO 527 35-44 Contrainte à la rupture [MPa] ISO 527 36-45 Allongement à la rupture (%) ISO 527 560-710 2/ Fibres curli : Les fibres curli ont été obtenues par purification de cultures d'une souche d'Escherichia 5 colt MG1655 ompR234. a) Culture des bactéries Escherichia colt Dans un premier temps, des boîtes de milieu gélose de faible osmolarité contenant du 10 rouge congo, appelé milieu CFA (Collinson et al., J Bacteriol.;175(1):12-18,1993), sont ensemencées avec des cultures de la souche d'Escherichia colt susmentionnée. Le rouge congo sert de marqueur permettant d'évaluer la présence de fibres curli. Dans un deuxième temps, les colonies issues de ces premières cultures sont multipliées en 15 milieu liquide. La culture s'effectue classiquement pendant au moins trois jours en milieu minimum M63 additionné d'une source de carbone et du mannitol à 0,2 g/L. Si nécessaire, des antibiotiques appropriés pour le maintien de plasmides et du rouge congo peuvent être ajoutés. La culture est faite sous agitation, dans des bains à eau à agitation va-et-vient, à 30 °C et à 80 rpm. 20 b) Purification de fibres curli Le protocole suivant est mis en oeuvre : 3037602 12 - Les culots bactériens sont récupérés par centrifugation des milieux de culture à 5000 g, pendant 10 minutes et à 20 °C. Les culots récoltés sont resuspendus et réunis dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4. - Les culots sont mixés quatre fois 1 minute à environ 19 000 tr/min avec 1 5 minute d'intervalle entre les mixages à l'aide du blender ULTRA-TURRAX®. - La solution obtenue est diluée dans du tampon Tris, puis mixée trois fois 1 minute à 16 000 tr/min. Elle est ensuite centrifugée à 5000 g, pendant 8 minutes à 20 °C. Ces étapes sont répétées trois fois. Par la suite, les surnageants sont réunis et une solution 10 de NaC1 est ajoutée jusqu'à avoir une concentration finale de 150 mM. La solution est incubée à 4°C pendant 3 heures puis centrifugée à 13 000 g pendant 30 minutes et à 4 °C. Le culot final est resuspendu dans du tampon Tris (aussi appelée Tris-HC1). Les fibres curli purifiées peuvent être conservées dans cette solution. 15 c) Obtention par électrofilage d'un matériau fibreux comprenant du PBAT, dépourvu de fibres curli (pour comparaison) Une solution de PBAT comprenant 20% en poids de PBAT par rapport au poids total de 20 la solution est préparée. Le PBAT est dissous dans une solution de chloroforme-N, N- diméthylformamide (DMI) dans les proportions volumiques 80:20, pendant 24 h et sous agitation continue. Les fibres de PBAT sont préparées par électrofilage (électrofilature ou 25 « electrospinning ») de cette solution, à l'aide du dispositif NANON-01A de MECO, avec une vitesse d'alimentation de 5 mL/min, à une température de 23 °C et une humidité de 55 %. Le voltage utilisé est de 30 kV et la distance entre la seringue et le collecteur est fixée à 10 cm. 30 d) Obtention par électrofilage d'un matériau composite fibreux selon l'invention comprenant des fibres curli Le PBAT est dissous dans une solution de chloroforme pendant 24 h, sous agitation continue. 35 Les fibres curli sont séparées du milieu Tris par lyophilisation (48 h), puis dispersées dans du N, N-diméthylformamide (DMI) pendant 24 h. 3037602 13 Les deux solutions sont mélangées pour obtenir la solution finale à électrofiler comprenant 20% en poids de PBAT par rapport au poids total de la solution à électrofiler et la quantité souhaitée de protéines curli (de l'ordre du milligramme). Par ailleurs, une telle solution contient un mélange chloroforme-N, N-diméthylformamide (DMF) dans les 5 proportions volumiques 80:20. Le matériau de l'invention comprenant les protéines curli est préparé par électrofilage dans des conditions similaires à celles exposées ci-dessus, à savoir en mettant en oeuvre le dispositif d'électrospinning NANON-01A de MECC, avec une vitesse d'alimentation de 10 5 mL/min à une température de 23 °C et une humidité de 55 %. Le voltage utilisé est de 30 kV et la distance entre la seringue et le collecteur est fixée à 10 cm. B/ Dosage des groupements amine dans le matériau composite obtenu 15 Un dosage des groupements amines est réalisé afin d'identifier la présence de fibres curli dans le matériau composite fibreux de l'invention. Principe du dosage : Une façon de déterminer la quantité d'amines consiste à utiliser la réaction colorimétrique 20 entre les groupes fonctionnels amine et carboxylique des acides aminés avec la ninhydrine. Dans cette réaction, la ninhydrine agit comme agent oxydant, formant une nihydrine réduite. Un acide aminé oxydé peut ensuite réagir avec la ninhydrine réduite pour former un complexe violet détecté par spectrométrie UV à la longueur d'onde de 570 nm. 25 Préparation de la solution de ninhydrine : Une solution A de 25 mL est préparée, contenant 1 mL d'acide acétique concentré, 10 mL de soude NaOH (1 M) et 0,04 g de sulfate d'étain (II). Elle est ensuite complétée à 25 mL par du tétrahydrofurane (THF). 30 Une solution B de 25 mL est préparée : 1 g de ninydrine est dissout dans 25 mL d'éthylène glycol. Chaque solution est laissée 1 h sous agitation continue puis les deux solutions sont mélangées et la solution résultante est laissée à agiter pendant 2 h. 35 Dosage des groupements amine : Le dosage s'effectue en mesurant l'absorbance de la solution à température ambiante par spectrométrie UV-Vis à 570 nm, longueur d'onde caractéristique du produit de réaction 3037602 14 entre la ninhydrine et les groupements NH2 : dicetohidrindilideno dicetohidrindamina (Ruhemann Purple). L'absorbance des solutions de ninhydrine-glycine permet d'établir une courbe étalon. Les membranes PBAT-curli sont ajoutées à 5 mL de solution de ninhydrine et maintenues 5 sous agitation à 100 °C pendant 20 minutes jusqu'à complète dissolution. L'absorbance UV des échantillons reflétant la quantité de groupements amine, et donc la quantité de protéines, est déterminée par comparaison avec la courbe étalon. C/ Mesure de la capacité à chélater le nickel 10 Le matériau est testé, sous la forme d'un échantillon de 1 cm2, immergé pendant 1 heure à 20 °C dans une solution aqueuse de nickel de concentration 100 !AM. Après récupération, l'échantillon est attaqué chimiquement avec de l'acide nitrique 15 (HNO3 69% w/v) à 105 °C pendant 2 heures. Le volume est ajusté à 50 mL avec de l'acide nitrique (HNO3 2% w/v) et de l'indium (étalon interne), avant dosage au spectromètre de masse (ICP-MS 7500cx Agilent, USA). D/ Etude de la morphologie 20 Les études de morphologie des matériaux ont été conduites à l'aide d'un microscope électronique en transmission (MET) Philips CM120 (Centre de Technologique des Microstructures de Lyon nit) et un microscope électronique à balayage Philips XL 20 (MEB étudiant INSA Lyon). Pour le MET, les échantillons extraits des cultures 25 bactériennes ont été lavés avec 1 mM d'EDTA et sédimentés à 4°C. Le surnageant a été éliminé et 5 pL de cellules sédimentées ont été déposées sur des grilles de carbone (mesh 200). Après fixation au tetroxide d'osmium les cellules ont été colorées avec de l'acide phosphotungstique concentré à 1 %. Pour le MEB, les échantillons ont été déposés sur un substrat de carbone avant d'être métallisés pendant 30 s à 30 [I.A. Les échantillons 30 métallisés ont été observée en mode SE sous une tension de 20,0 kV avec un spot de 5.0. Les images obtenues ont ensuite été traitées numériquement grâce au logiciel ImageJ : la taille des fibres de chaque échantillon a été mesurée aléatoirement sur au moins 800 fibres puis une étude de dispersion a été menée avec Matlab. 35 E/ Etudes thermiques et physico-chimiques Trois appareillages différents ont été utilisés pour caractériser les matériaux obtenus : 3037602 15 L'analyse thermogravimétrique (ATG) a été réalisée avec une ATG Q500 (TA instruments) permettant d'étudier la dégradation des échantillons grâce à une rampe de température de 10 °C/min, de la température ambiante jusqu'à 600 °C, sous atmosphère azote. 5 La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) a été réalisée à l'aide d'une DSC Q10 (TA instruments) permettant de déterminer les températures de transition vitreuse (Tg), les températures de fusion et de cristallisation (Tf et Tc) et les enthalpies de réaction (AH) et d'en déduire la cristallinité des échantillons. Pour cela, l'échantillon est soumis à deux cycles identiques de variation de température : l'échantillon est équilibré à -70 °C pendant 10 1 minute puis une rampe de 20 °C/min jusqu'à 180 °C où un isotherme est appliqué pendant 1 minute, puis l'échantillon est refroidi jusqu'à -70 °C avec une rampe de 20 °C/min. Les échantillons ont été analysés sous atmosphère azote avec un flux de 50 mL/min. Des études de diffraction aux rayons X (DRX) ont également été menées grâce à un 15 diffractomètre Bruker D8 Advance X-ray au Centre de Diffractométrie Henri Longchambon, Lyon. La diffraction caractéristique de CuK (k=0,15406 nm) a été réalisée grâce à un monochromateur à quartz et en utilisant une intensité de 45 mA avec un voltage de 33 kV avec la géométrie de Bragg-Brentano. La gamme d'angles scannée est 1-10 ° 20. 20 F/ Comportement mécanique et rhéologique Le comportement mécanique et rhéologique a été étudié par des essais de traction (MTS 2/M) avec des paramètres fixés à 5mm/min et 100 Hz, dans des conditions de température 25 et d'humidité de 22±1 °C et 50±5 %. L'analyse dynamique mécanique a été réalisée grâce à l'appareil Rheometrics Solic Analyzer, RSA II. Elle a été menée entre -100 et 100 °C avec une rampe de 3 °C/min et à une déformation constante de 0,2. La fréquence de sollicitation est de 1 Hz. Cette analyse permet de déterminer avec précision la température de transition vitreuse Tg qui correspond à la température pour laquelle tan Ô, rapport de 30 l'énergie dissipée (E") et de l'énergie élastique (E'), est maximale. RESULTATS 35 I/ Analyse morphologique : Les fibres obtenues ont été observées en microscopie électronique à balayage (MEB), ce qui a permis de mesurer le diamètre moyen des fibres. 3037602 16 Les résultats sont présentés à la figure 1. Il ressort que l'introduction des fibres curli dans la solution de PBAT n'empêche pas la 5 formation d'un matériau comprenant des fibres de diamètres réguliers, c'est à dire ne comprennent pas de « beads » (structures ayant l'apparence de perle en microscopie électronique). En outre, le diamètre moyen des fibres dans le matériau constitué uniquement de PBAT 10 (sans fibres curli) est de 1,3 !am, tandis que le diamètre moyen des fibres dans le matériau selon l'invention (comprenant des fibres curli) est de 0,6 !am. Cette diminution du diamètre est avantageuse car un diamètre plus petit permet de maximiser la surface libre où les fibres curli sont disponibles. 15 II/ Propriétés des matériaux obtenus : a. Calorimétrie différentielle à balayage (DSC). Lors du premier cycle, l'histoire thermique n'a pas encore été détruite et permet d'observer les différentes phases cristallines présentes dans les produits obtenus à l'issu 20 du procédé, et donc de les comparer. Selon les échantillons, deux ou trois pics de fusion peuvent être observés. Ces pics correspondent aux trois phases cristallines qu'il est possible de voir dans du PBAT et qui correspondent aux phases cristallines du PBT: a', a et (3 (par analogie). Dans le cas du PBT, les phases a et (3 sont deux phases cristallines distinctes du PBT alors que la phase 25 a' est une forme cristalline mal organisée qui réalise la transition entre la phase cristalline a et la phase amorphe. Par analogie, on considère donc que la phase a' obtenue pour les produits issus du procédé (avec ou sans fibres curli) représente une forme mal organisée due à la technique d' électrofilage en tant que telle. En effet, il est bien connu qu'il s'agit d'une technique 30 très rapide qui ne laisse pas le temps au polymère de cristalliser. Lors du second cycle de température, l'histoire thermique du polymère a été détruite. Une seule phase cristalline est observée pour tous les échantillons, qui correspond à la phase (3 du PBT (par analogie). La modification de la répartition des phases, par rapport au premier cycle de température, est due à une meilleure organisation des chaînes polymères 35 qui ont cette fois eu le temps de cristalliser pour former une phase (3. La phase a' a donc disparue. 3037602 17 Il a été observé (données non montrées) que les fibres de PBAT seul et les fibres de l'invention comprenant des fibres curli possèdent des propriétés physico-chimiques comparables. Les températures de fusion de la phase p sont très proches avec (119 °C) et sans (117 °C) 5 fibres curli. Les secondes températures de fusion (correspondant a priori à la phase ct) divergent d'environ 20 °C (58 °C et 75 °C). b. Diffractométrie aux rayons X Les spectres obtenus à partir d'échantillons de matériaux sans et avec fibres curli 10 (données non montrées) sont très proches. La présence des fibres curli à l'intérieur de la fibre ne modifie que très peu la cristallinité de la membrane de matériau fibreux finale : 15 % pour PBAT seul et 16,2 % pour PBAT- fibres curli c. Analyse thermogravimétrique Il a été observé (données non montrées) que la présence de fibres curli semble donner une 15 courbe moins nette que pour le matériau sans fibres curli. Les variations observées sont toutefois relativement faibles, laissant penser que la présence de fibres curli ne modifie que très peu les propriétés thermique du matériau. d. Analyse mécanique et rhéologique Les essais mécaniques réalisés sur les échantillons de matériau PBAT-fibres curli 20 (données non montrées) révèlent de moins bonnes propriétés mécaniques que dans les matériaux fibreux comprenant du PBAT mais pas de fibres curli, en ce qui concerne le module d'élasticité. Celui-ci est fortement diminué, passant de 3,18 MPa à 1,09 MPa. Cependant, la contrainte à la rupture reste, quant à elle, sensiblement identique (2,47 et 2,33 MPa). 25 L'élongation à la rupture diminue, mais reste bonne, passant de 650 % à 510 %. En outre, il n'y a pas de modification de la température de transition vitreuse en présence de fibres curli dans le matériau (données non montrées). III/ Analyse fonctionnelle : 30 a. Dosage des groupements amine La spectroscopie UV a permis de déterminer l'absorbance d'une solution de ninhydrine contenant 600 mg du matériau de l'invention comprenant des fibres curli, obtenu sous la 35 forme d'une membrane (ou film). Grâce à une courbe étalon, la concentration a pu être déterminée : 2,22.10-3 mg/mL, soit 7,4 pg/100mg de matériau. 3037602 18 La concentration obtenue a pu être convertie en une quantité de fibres curli, selon les calculs suivants : [aminesinh = [filycine]rz/MglycinexNA=1,78.1016 amines/mL avec : 5 [amines],ib= nombre de groupements amine par unité de volume [glycine]m = masse de glycine par unité de volume Mglycine = 75,0666 glmol (masse molaire de la glycine) NA = 6,022.1023 mol-1 le nombre d'Avogadro 10 Le nombre d'amines portées par une fibre curli a été déterminé de la manière suivante : La longueur des fibres curli étant variable, la quantité d'amines portée par un monomère CsgA a été utilisée par approximation. A partir de la séquence d'acides aminés, le nombre d'amines libres de la chaîne capables de réagir avec la ninhydrine a été compté. Ces amines correspondent à celles portées par des acides aminés bifonctionnels qui ont deux 15 amines : une liée à l'acide aminé voisin, l'autre libre. Un nombre de 43 amines libres a été déterminé, soit en divisant le nombre d'amines par mL par ce chiffre, un nombre de 4,14.1014 CsgA/mL. Sachant qu'un monomère CsgA a une masse molaire de 15 kDa et en convertissant en unités standards, une concentration de 10,3 lag CsgA/mL a été déterminée. Par hypothèse, 20 cette concentration est également la concentration en fibres curli. Pour 600 mg de membrane solubilisés dans 20 mL, une concentration de 34,33 lag de fibres curli/100 mg de membrane est donc obtenue. La masse surfacique approximative de la membrane a été mesurée par la pesée successive 25 de trois morceaux de membrane de 25 cm2, donnant une valeur de 6,42 mg/cm2. La concentration surfacique en fibres curli, en admettant que celles-ci soient uniformément dispersées, est donc de 2,20 [tg/cm2. Deux calculs ont permis d'estimer la quantité totale de fibres curli dans la membrane : La surface totale de la membrane a été estimée à 630 cm2, soit en utilisant la 30 concentration surfacique, une masse totale de fibres curli de 1,4 mg. La masse totale de la membrane a été estimée à 3400 mg, ce qui donne en utilisant la concentration massique une masse totale de fibres curli de 1,12 mg. La quantité de fibres curli insérées dans la membrane de matériau de l'invention a été estimée à 0,9 mg. Ces calculs semblent cohérents et la présence de fibres curli dans la 35 membrane est vérifiée. b. Capacité à chélater le nickel 3037602 19 Les deux types de matériau obtenus (matériau fibreux de PBAT seul et matériau fibreux selon l'invention comprenant en plus des fibres curli) ont été testés pour leur capacité à chélater le nickel. 5 Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Concentration en nickel Ni retenu ([tg/cm2) dans la solution ([tM) PBAT seul 100 0,695 PBAT/curli 100 0,879 Il ressort que les matériaux de l'invention possèdent une fonction de chélation du nickel améliorée (augmentation de 26%) due à la présence de fibres curli. 10 CONCLUSIONS : Ces expériences montrent que le procédé mis en oeuvre permet l'insertion d'une quantité 15 significative de curli dont la fonctionnalité en termes de fixation du nickel est au moins partiellement conservée. Par ailleurs, les caractéristiques et propriétés du matériau fibreux ainsi obtenu sont tout à fait compatibles avec les applications visées. 3037602 20 REFERENCES Bhardwaj, N.; Kundu, S. C., Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. 5 Biotechnology Advances 2010, 28 (3), 325-347 Subbiah, T.; Bhat, G. S.; Tock, R. W.; Parameswaran, S.; Ramkumar, S. S., Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science 2005, 96 (2), 557569. Luo et al., A novel method of selecting solvents for polymer electrospinning, Polymer, 10 2010, 51(7):1654-1662. Romero et al., Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms PNAS, 2010, 107(5) : 2230-2234. Collinson et al., Thin, aggregative fimbriae mediate binding of Salmonella enteritidis to fibronectin, J Bacteriol.; 1993, 175(1): 12-18,1993 . 15 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un matériau composite fibreux comprenant au moins un 5 polymère et au moins une protéine amyloïde, selon lequel un mélange comprenant ledit polymère et ladite protéine est soumis à une technique de filage en milieu solvant, avantageusement la technique d' électrofilage. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange comprend du 10 chloroforme et du N, N-diméthylformamide (DMI), avantageusement dans un rapport volumique 80:20. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit polymère est un polyester aromatique, avantageusement le poly(butylène adipate-co-téréphtalate) (PBAT). 15 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polymère est présent dans le mélange à hauteur de 5% à 30% en poids par rapport au poids du mélange, avantageusement de 15% à 25%, encore plus avantageusement à 20%. 20 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine amyloïde est d'origine bactérienne, avantageusement la protéine CsgA formant les curli chez Escherichia coh, ou un dérivé, avantageusement fonctionnalisé de celle-ci. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la technique 25 d' électrofilage est réalisée dans les conditions suivantes : - le voltage appliqué est compris entre 10 et 40 kV, avantageusement compris entre 15 et 35 kV, de préférence égal à 30 kV ; et/ou - la distance entre l'aiguille et le collecteur de fibres est comprise entre 5 et 15 cm, avantageusement égale à 10 cm. 30 7. Matériau susceptible d'être obtenu à l'aide du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant des fibres constituées de polymère et de protéine amyloïde, éventuellement fonctionnalisée. 35 8. Matériau selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend du PBAT et la protéine CsgA ou ses dérivés, éventuellement fonctionnalisés. 3037602 22 9. Matériau selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend des fibres présentant un diamètre compris entre 50 nm et 50 i.tm, de préférence entre 500 nm et 5 iam, de manière particulièrement préférée entre 500 nm et 21.1.m. 10. Matériau selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un non-tissé, de préférence une nappe, une membrane ou un film. 11. Utilisation d'un matériau selon l'une des revendications 7 à 10, pour la fabrication de textiles présentant une capacité améliorée à chélater le nickel. 15 20 25 30 35