FR 3048780 A1 20170915 FR 1652087 A 20160311 1 Procédé de diagnostic in vitro d'atteintes hépatiques Domaine de l'invention L'invention appartient au domaine de l'hépatologie (médecine du foie) et concerne l'utilisation de biomarqueurs permettant de diagnostiquer des troubles hépatiques. Plus précisément, cette invention concerne des méthodes de diagnostic in vitro et/ou de suivi et/ou de pronostic in vitro des atteintes hépatiques telles que les insuffisances hépatiques aiguës et fulminantes ou la stéatohépatite par la détection et/ou le dosage de certains biomarqueurs. État de la technique Les atteintes hépatiques regroupent une multitude de maladies affectant le foie de manière chronique (comme la cirrhose) ou aigüe (on parle alors d'insuffisance hépatique aigüe). Leurs causes sont variées et incluent l'alcoolisme, les virus des hépatites A, B, C et E, des anomalies génétiques (maladie de Wilson) ou immunitaires (hépatites auto-immunes), des intoxications médicamenteuses ou une surcharge graisseuse associée à l'obésité. Les insuffisances hépatiques aigües (« Acute Liver lnjury», abrégé ici ALI) ou fulminantes (« Acute Liver Failure », abrégé ici ALF) se déclarent de manière soudaine chez des patients sans maladie hépatique préexistante. Leurs causes sont variées : médicaments (dont le paracétamol), virus, maladie automimmune. Les insuffisances hépatiques aigües se caractérisent par la mort des cellules hépatiques (hépatocytes) sur un mode nécrotique et/ou apoptotique et conduisent à une diminution de la masse fonctionnelle du foie. Ces atteintes hépatiques sont associées à des troubles de la coagulation sanguine et la modification des paramètres d'exploration clinico-biologique du foie (augmentation des transaminases et de la CK18 sérique). Dans leur forme la plus sévère (hépatite fulminante ou ALF), une encéphalopathie est également présente. Les atteintes hépatiques aigües peuvent conduire à la mort du patient sans prise en charge médicale adaptée. Les maladies du foie gras non induites par l'alcool (connues sous le sigle NAFLD qui est l'abréviation de « Non-Alcoholic Fatty Liver Disease ») sont des maladies hépatiques très fréquentes. Elles englobent un large éventail de maladies telles que la stéatose isolée (connue sous le sigle NAFL - « Non-Alcoholic Fat Liver »), la stéatohépatite non alcoolique (NASH - « Non-Alcoholic SteatoHepatitis ») et la cirrhose. Elles sont associées à une accumulation anormale de graisse dans le foie. Elles sont liées à l'augmentation de la prévalence du diabète et de l'obésité. La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est une maladie potentiellement grave pouvant évoluer en cirrhose et entrainer une insuffisance hépatique chronique ou aigüe et/ou un carcinome hépatocellulaire. Les atteintes hépatiques peuvent être diagnostiquées par la détection ou le dosage dans le sang de certaines molécules spécifiques (biomarqueurs). La cytolyse (nécrose des 3048780 2 hépatocytes) est évaluée par la détection de protéines, contenues dans les cellules hépatiques, et qui sont déversées dans les voies sanguines suite à la nécrose des cellules hépatiques (biomarqueurs mécanistiques) : tel est le cas des transaminases qui reflètent une lyse des cellules du foie. Les transaminases ne sont cependant pas 5 spécifiques du foie et leurs concentrations sanguines peuvent augmenter lors d'atteinte d'autres organes (coeur, muscle). Il peut également s'agir de molécules synthétisées par le foie, dont la fonction est impactée par la diminution de leur synthèse (biomarqueurs fonctionnels): c'est le cas du taux de prothrombine qui explore les facteurs de coagulation I, Il, V, VII et X synthétisés par le foie. Cependant, du fait de la demi-vie sanguine de 10 quelques heures des facteurs de coagulation, les troubles de la coagulation ne sont pas immédiats. En ce qui concerne la stéatose hépatique non alcoolique et alcoolique, le diagnostic de certitude est habituellement réalisé sur une biopsie du foie du patient; ainsi on peut évaluer les lésions tissulaires hépatiques et déterminer la sévérité de la maladie. Une 15 biopsie est un examen invasif, associé à des risques hémorragiques, et nécessite une prise en charge hospitalière; c'est donc un examen coûteux. Il serait préférable de pouvoir détecter les troubles hépatiques et suivre leur évolution par des méthodes non invasives, de préférence à partir d'un liquide biologique, par exemple provenant d'une simple prise de sang. 20 Ces dernières années, un certain nombre de méthodes non invasives d'évaluation de lésions hépatiques ont été proposées, notamment pour détecter la stéatohépatite alcoolique et non alcoolique. A titre d'exemple, US 2006 / 0 172 286 décrit un procédé non invasif permettant le diagnostic de la stéatohépatite non alcoolique ou alcoolique chez un patient, comprenant la mesure des 3 marqueurs biochimiques ApoAl, ALT et AST 25 dans un échantillon de sérum ou de plasma. WO 2010 / 058 295 décrit un procédé permettant de quantifier les lésions du foie d'un patient par l'intermédiaire du dosage d'un ou plusieurs biomarqueur (dont ALT). WO 2015 / 071 669 décrit une méthode de diagnostic, de pronostic ou de surveillance d'une tumeur du foie chez un individu par l'intermédiaire de la détection ou la quantification d'un ou plusieurs marqueurs présents 30 notamment dans le sang ; la liste des marqueurs est extrêmement vaste et comprend notamment les protéines ADH IA, ADHI B, GSTA1, FABP1, ARGI , GPT1 (correspondant à l'ALTI), BHMT et ADH4. En tout état de cause, la quantification absolue, c'est-à-dire la détermination de la concentration de protéines ou peptides présents dans un échantillon liquide, notamment 35 un échantillon sanguin peut être un procédé assez complexe. On constate que diagnostiquer des atteintes hépatiques à un stade précoce et prédire l'évolution de ces atteintes est devenu un enjeu de santé majeur, en particulier pour la stéatohépatite non alcoolique dont la prévalence augmente avec l'obésité. La présente invention cherche à proposer un procédé de de diagnostic in vitro d'atteintes 40 hépatiques, plus particulièrement un nouveau test de diagnostic non invasif de troubles hépatiques plus précis que les procédés de de diagnostic de l'art antérieur. 3048780 3 Objets de l'invention La présente invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de suivi et/ou de pronostic et/ou théranostique in vitro de troubles hépatiques à partir d'un échantillon biologique issu 5 d'un individu, dans lequel procédé on détermine la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) et/ou la présence et/ou la concentration de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 1). L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) et/ou d'au moins la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A 10 (SEQ ID N° 1) pour le diagnostic, le suivi, le pronostic et/ou la théranostique in vitro de troubles hépatiques à partir d'un échantillon biologique issu d'un individu; utilisation dans laquelle on détermine la présence et/ou la concentration dudit marqueur. Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation ci-dessus, on détermine la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire, 15 préférentiellement d'au moins deux marqueurs supplémentaires, et encore plus préférentiellement d'au moins trois marqueurs supplémentaires, lesdits marqueurs étant sélectionnés dans le groupe constitué par : ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), FABP1 (SEQ ID N° 11), GSTA1 (SEQ ID N° 12) et ALTI (SEQ ID N° 13). 20 Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation ci-dessus, on détermine au moins la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire sélectionné parmi ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4) et BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7). Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation ci-dessus, on détermine au 25 moins la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) ou de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 1), d'une part, et des marqueurs ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4) et BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), d'autre part. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé ou de l'utilisation ci-dessus, le 30 marqueur BHMT est le variant de séquence BHMT1 (SEQ ID N° 5) et/ou la combinaison des variants de séquence BHMT1 (SEQ ID N° 5) et BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7). Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation décrit ci-dessus, on détermine en outre la présence et/ou la concentration du marqueur CK18. 35 Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation décrit ci-dessus, on utilise pour ladite détermination de la présence et/ou de la concentration desdits marqueurs des peptides signatures présents dans lesdits marqueurs. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé ou de l'utilisation décrit ci-dessus, lesdits peptides signatures sont générés à partir desdits marqueurs par un procédé de 40 digestion, de préférence enzymatique. 3048780 4 Dans un mode de réalisation du procédé ou de l'utilisation décrit ci-dessus, la présence et/ou la concentration : a. de la combinaison des marqueurs ADH1A (SEQ ID N° 1) et ADH1B (SEQ ID N° 2), si elle est selectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un peptide 5 signature choisi parmi INEGFDLLHSGK (SEQ ID N° 16) et FSLDALITHVLPFEK (SEQ ID N° 15), b. du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature AAVLWEVK (SEQ ID N° 17), c. du marqueur ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), s'il est sélectionné, est 10 déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi FNLDALVTHTLPFDK (SEQ ID N° 20), IDDDANLER (SEQ ID N° 18) ou IIGIDINSEK (SEQ ID N° 19), d. du marqueur ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi 15 DVDPGEHYILK (SEQ ID N° 25), TIGIIGAPFSK (SEQ ID N° 24) ou EGLYITEEIYK (SEQ ID N° 26), e. du marqueur BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), AIAEELAPER (SEQ ID N° 23) ou EAYNLGVR (SEQ ID N° 20 22), f. du marqueur BHMT1 (SEQ ID N° 5), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), g. de la combinaison des marqueurs BHMT1 (SEQ ID N°5) et BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), si elle est sélectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un 25 peptide signature choisi parmi AIAEELAPER (SEQ ID N° 23) ou EAYNLGVR (SEQ ID N° 22), h. du marqueur FABP1 (SEQ ID N° 11), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi AIGLPEELIQK (SEQ ID N° 27), FTITAGSK (SEQ ID N° 28) ou TVVQLEGDNK (SEQ ID N° 29), 30 i. du marqueur GSTA1 (SEQ ID N° 12), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature LHYFNAR (SEQ ID N°30), j. du marqueur ALTI (SEQ ID N° 13), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi ALELEQELR (SEQ ID N° 34), LLVAGEGHTR (SEQ ID N° 35) ou KPFTEVIR (SEQ ID N° 36), sachant que ALTI (SEQ 35 ID N° 13), s'il est sélectionné, est plus particulièrement déterminée par la présence du peptide signature ALELEQELR (SEQ ID N° 34) ou LLVAGEGHTR (SEQ ID N° 35). Dans un mode de réalisation avantageux du procédé d'utilisation décrit ci-dessus, le procédé d'utilisation, dans lequel on dose au moins un desdits marqueurs (dit « marqueur 3048780 5 sélectionné »), dont au moins un marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) et/ou la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 1), par l'intermédiaire d'au moins un peptide signature caractéristique dudit marqueur, comprend les étapes suivantes : 5 a) l'approvisionnement d'un échantillon biologique prélevé sur un individu à un temps to, b) l'ajout d'une quantité connue d'une protéine isotopiquement marquée (appelée « standard ») homologue du marqueur sélectionné dans l'échantillon biologique obtenu à l'étape a), 10 c) le traitement de l'échantillon biologique pour extraire au moins une partie des protéines abondantes ou au moins une partie des glycoprotéines, d) le traitement de l'échantillon après extraction d'au moins une partie des protéines abondantes ou des glycoprotéines pour générer des peptides protéolytiques, de préférence par digestion, étant entendu que parmi les peptides protéolytiques obtenus se 15 trouvent les peptides signatures des marqueurs sélectionnés, e) le dosage quantitatif par spectrométrie de masse d'au moins un peptide signature généré à partir du marqueur sélectionné, f) la détermination d'un rapport de l'abondance du peptide signature isotopiquement marqué, issu du standard, ajouté à l'étape b), sur l'abondance du peptide signature non 20 marqué issu de l'échantillon biologique, g) le calcul à partir du rapport obtenu à l'étape f) et de la quantité connue de ladite protéine isotopiquement marquée ajoutée à l'étape b), de la concentration dudit marqueur sélectionné dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape c) du procédé ou de l'utilisation décrite 25 ci-dessus, est effectuée par déplétion et préférentiellement par glycodéplétion. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape c) du procédé ou de l'utilisation décrite ci-dessus, est suivie d'une étape d'électrophorèse de l'échantillon biologique. Dans un mode de réalisation avantageux, le procédé est effectué à un temps to et à un temps t1 supérieur à to, et comprend après l'étape g), la comparaison de la concentration 30 du marqueur sélectionné dans l'échantillon entre t1 et to. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape d) du procédé décrit ci-dessus est effectuée par digestion enzymatique, de préférence par l'emploi de trypsine ou d'un mélange d'EndolysC et de trypsine. Dans un mode de réalisation avantageux, le trouble hépatique est une insuffisance 35 hépatique aiguë ou une stéatohépatite. Un autre objet de l'invention concerne une utilisation du procédé pour évaluer la toxicité de molécules (candidats médicaments, médicament, xénobiotique) préalablement administrées à l'individu dont est issu ledit échantillon biologique. 3048780 6 Description des figures Les figures 1 à 8 illustrent certains aspects de l'invention. La figure 1 décrit le principe de la glycodépletion de protéines plasmatiques pour le dosage de biomarqueurs non glycosylés (comme les protéines de lyse hépatocytaire). 5 Le protéome plasmatique est composé (en poids) de 50% des protéines glycosylées et de 50% de protéines non glycosylées. Les protéines glycosylées peuvent être capturées sur des billes magnétiques fonctionnalisées par de l'hydrazide via la formation de liaisons covalentes. Les protéines non glycosylées sont ensuite éluées avec de l'urée permettant de casser les interactions protéines / protéines. 10 La figure 2 présente les courbes d'étalonnage obtenue pour ADH1B, ARG1, BHMT1 et GSTA1 dans le plasma après immunodéplétion. Ces courbes d'étalonnage permettent d'évaluer les performances analytiques de la méthode de dosage. La figure 3 présente les courbes d'étalonnage obtenue pour ADH4, BHMT1, FABP1 et ALTI dans le plasma après glycodepletion. 15 La figure 4 décrit l'analyse des biomarqueurs dans des échantillons biologiques issus de patients ayant une insuffisance hépatique induite par du paracétamol. Les concentrations des biomarqueurs cibles ont été déterminées en utilisant les standards PSAQTM après préfractionnement de sérum par LC-SRM. Le taux de prothrombine est mentionné comme un indicateur de troubles de la coagulation et d'une insuffisance hépatique ALI ou ALF. 20 La figure 5 décrit l'analyse des biomarqueurs dans des échantillons biologiques issus de patients ayant une atteinte hépatique ALI ou ALF induite par une cause autre que le paracétamol. Les concentrations des biomarqueurs cibles ont été déterminées en utilisant les standards PSAQTM (WO 2008 / 145 763 Al) après préfractionnement de sérum et analyse LC-SRM. Le taux de prothrombine est mentionné comme un indicateur 25 de troubles de la coagulation et d'une insuffisance hépatique ALI/ALF. La figure 6 décrit la méthode de standardisation, préparation et analyse des échantillons. Le panel A correspond à la procédure de standardisation et de préparation. Les panels B et C correspondent aux signaux des différents peptides signatures obtenus par analyse LC-SRM. 30 La figure 7 montre les concentrations plasmatiques de BHMT1 (cf. figure 7a) et les concentrations plasmatiques des variants A et B de l'ADH1 (cf. Figure 7b) chez des patients atteints de stéatohépatites non alcooliques (NASH) en comparaison de donneurs sains appariés par âge et sexe (n = 11 individus dans chaque groupe). Les concentrations plasmatiques sont mentionnées en ordonnée en pg/mL. Un test statistique de Mann- 35 Whitney a été appliqué avec p 95% de pureté) et quantifiée par analyse d'acides aminés comme décrit dans la publication de Louwagie et al. « Introducing AAAMS, a rapid and sensitive method for amino acid analysis using isotope dilution and high- 30 resolution mass spectrometty » parue dans Journal of Proteome Research vol.11, p39293936 (2012). Pour ce faire, les protéines PSAQTM ont été hydrolysées en voie acide en présence d'une quantité connue d'une protéine de référence l'albumine de sérum bovin fournie par l'Institut National des Standards et de la Technologie (Etats-Unis). Les acides aminés issus des protéines PSAQTM ont été quantifiés par spectrométrie de masse haute 35 résolution par comparaison des signaux émis par les acides aminés marqués issus de la protéine PSAQTM et leurs analogues non marqués issus de l'albumine de sérum bovin. L'incorporation des acides aminés isotopiquement marqués, tel que déterminée par LCMS et LC-SRM (chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en mode de suivi de réaction sélectionnée), était supérieure à 99%. 40 3048780 23 2. Préparation d'un échantillon biologique Treize patients porteurs d'une insuffisance hépatique aiguë (ALI) ont été recrutés au département d'hépatologie de l'Hôpital Paul Brousse (Villejuif, France). L'insuffisance hépatique aiguë de ces patients a été décelée par une activité élevée de transaminase 5 reflétant la lyse active des cellules du foie présente dans le sang de ces patients, des troubles de la coagulation avec un INR (International Normalized Ratio) > 1.5 et par l'absence chez ces patients de maladie hépatique préexistante. Parmi ces patients, quatre ont présenté une encéphalopathie hépatique (grade >=1) en moins de 26 semaines après l'apparition des symptômes et ont été classés comme 10 patients ALF (cf. tableau 5). Des échantillons de sérum de ces patients ont été fournis par le Centre de Ressources Biologiques de la Faculté Paris-Sud de Médecine, France (numéro d'agrément: 2011/39938). L'Etablissement Français du Sang (Etablissement Français du Sang, La Tronche, France) a fourni sept échantillons de sérum anonymes provenant de donneurs sains. Ces échantillons de sérum ont ensuite été recueillis dans 15 des tubes non traités (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) et ont été centrifugés à 1000 g pendant 15 min pour obtenir le sérum. Des échantillons de sérum ont été aliquotes et immédiatement congelés à -80 °C avant toute utilisation ultérieure. Pour chaque patient, plusieurs échantillons de sérum ont été prélevés à plusieurs jours d'échantillonnage pendant l'hospitalisation. Des analyses ont été faites sur chaque patient 20 de manière à s'assurer que ces patients ne souffraient pas d'une hépatite virale A, B et/ou C. Tous les patients ont été criblés pour l'hépatite virale A, B et C (HAV, HBV, HCV) et ont été trouvés négatifs pour tous ces virus. Les paramètres biologiques de l'atteinte hépatique (INR, le temps de prothrombine (PT), les niveaux de transaminases, de bilirubine, de plaquettes et de créatinine) ont été déterminés en utilisant des méthodes 25 standard. Les niveaux de la protéine CK18 soluble et de la protéine caspase - cytokératine-18 clivée (CK18Asp396) présentes dans le sérum ont été mesurés à l'aide des kits ELISA M65 et M30Apoptosense (Peviva, Suède). Les courbes d'étalonnage ont été établies en utilisant le plasma humain acheté auprès de Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). 24 3048780 Numéro du Collecte des Aetiologie Sexe Age activit Pl* INR** ALI or Résultat CK18 CK18 Asp396 patient échantillons à x j (années é ALT (%) ALF*** (U/L) après ) (U/L) (U/L) l'hospitalisation 1 0 Paracétamol F 20 1489 9 16 ALI Vivant 13800 3333 10 402 59 1.42 1048 944 2 0 Paracétamol F 29 634 19 4.8 ALF Vivant N/A N/A 2 4565 17 5.45 N/A N/A 3 8118 18 4.73 N/A N/A 3 0 Paracétamol F 24 6410 21 3.82 ALI Vivant 22243 5691 3 2295 66 1.31 1150 404 4 0 Paracétamol F 18 2653 31 2.6 ALI Vivant 19806 7212 2 1900 57 1.45 1618 479 5 0 Paracétamol M 25 173 41 1.99 ALI Vivant N/A N/A 2 2571 26 3.21 N/A N/A 6 683 75 1.2 N/A N/A 6 0 Paracétamol F 23 770 39 2.06 ALI Vivant 5138 1379 1 7165 18 4.8 23088 8938 5 1831 89 1.07 956 529 7 0 Médicament + alcool M 24 7300 13 7.47 ALI Vivant 12138 5350 7 481 100 0.89 631 338 8 0 Paracétamol F 16 15480 20 4.17 ALI Vivant 21363 533 4 NA 68 1.3 600 254 9 0 Paracétamol + alcool M 57 2710 16 5.53 ALF Mort 23025 15288 (sepsis) 2 NA 42 1.97 9956 1117 7 NA 51 1.65 2000 421 10 0 maladie auto-immune F 58 2224 17 5.76 ALF Vivant 15638 9933 2 1861 11 10.69 15013 7275 5 NA 66 1.3 1275 450 11 0 maladie auto-immune M 56 2170 31 2.52 ALI Vivant 23056 15117 2 1119 16 5.59 6400 2417 12 NA 85 1.11 2256 617 12 0 Virus Herpès simplex F 22 1383 14 6.52 ALF Vivant 11669 4863 5 153 40 2.07 11388 4029 15 133 56 1.1 1088 229 13 0 Médicament F 32 892 28 2.8 ALI Vivant 14781 7458 2 984 54 1.58 3463 938 3 589 80 1.15 1856 375 Tableau 5 : Caractéristiques cliniques et biologiques des patients atteints d'ALI (Insuffisance hépatique aiguë) ou d'ALF 3048780 25 3. Procédé de diagnostic in vitro de troubles hépatiques par la présence et la quantification d'un marqueur d'intérêt La protéine-étalon PSAQTM est injectée directement dans l'échantillon biologique (sérum) avant tout prétraitement. Cette approche permet de déterminer, dans des fluides biologiques tels que le plasma, le sérum, le liquide spinal ou l'urine, les concentrations de certaines protéines cibles tels que des biomarqueurs de pathologies dont ils constituent des analogues marqués. Plusieurs modes de prétraitement tels que la déplétion des protéines abondantes (par immunoaffinité ou affinité avec un réactif chimique) et la glycodéplétion de l'échantillon biologique ont été envisagés de manière à conserver, au cours du procédé, l'intégrité des protéines PSAQTM. Ainsi, les protéines ARG1, ADH1B, BHMT1 et GSTA ont été sujettes à la déplétion des protéines abondantes selon la technologie MARS d'Agilent Technologies et les protéines ADH4, FABP1, ALTI et BHMT1 à la glycodéplétion. a. Déplétion des protéines abondantes Avant tout prétraitement, des quantités définies de protéine PSAQTM (voir tableau 2) ont été ajoutées à 14 pl de sérum ou de plasma précédemment prélevés sur un individu, qu'il soit porteur d'une insuffisance hépatique aiguë ou donneur sain de manière à pouvoir quantifier la présence des protéine dans le sérum de l'individu. La solution sérum protéines PSAQTM a ensuite été laissée incubée pendant 1 heure à 4 °C sous agitation douce. L'échantillon comprenant du sérum (ou du plasma) et les protéines PSAQTM, ont été déposés sur une colonne d'affinité permettant d'extraire les six protéines les plus abondantes (Albumine, IgG, Transferrine, IgA, haptoglobine et antitrypsine) dans le sérum (technologie MARS, cartouche spin d'Agilent Technologies, Les Ulis, France) selon les instructions du fabricant. Cette méthode permet d'extraire près de 85 à 90% de l'ensemble des protéines présentes dans le sérum. Suite au passage du sérum (ou plasma) sur la colonne d'affinité MARS, les échantillons de sérum ainsi exempts d'albumine, d'IgG, de transferrine, d'IgA, d'haptoglobine et de antitrypsine se sont retrouvés concentrés jusqu'à un volume de 50 pl sur un dispositif d'ultrafiltration possédant une limite d'exclusion de 3000 Da (Merck Millipore, Molsheim, France). Une solution d'urée 4 M et de NH4HCO3 à 50 mM a été déposée sur l'échantillon dans le dispositif d'ultrafiltration de manière à échanger le tampon. Les concentrés de protéines faiblement abondantes résultants ont ensuite été soumis à une étape de digestion enzymatique. b. Glycodéplétion Avant tout prétraitement, des quantités définies de protéine PSAQTM (voir tableau 2) ont été ajoutées à 18 pl de sérum ou de plasma précédemment prélevés sur un individu, qu'il soit porteur d'une insuffisance hépatique aiguë ou donneur sain de manière à pouvoir quantifier la présence de cette protéine dans le sérum du patient. La solution sérum protéine PSAQTM a ensuite été laissée incuber pendant 1 heure à 4 °C sous agitation douce. 3048780 26 L'échantillon de sérum ou de plasma précédemment prélevé sur un patient, qu'il soit porteur d'une insuffisance hépatique aiguë ou donneur sain, et additionné de standards PSAQ, a été mélangé avec 11 pl d'une solution de meta-periodate de sodium à 0.1 M afin d'oxyder les glycoprotéines et de transformer les groupements cis-diol des sucres en aldéhydes. L'échantillon comportant des glycoprotéines porteuses de groupements aldéhydes et des protéines non glycosilées a été introduit sur une colonne d'affinité du kit d'immobilisation GlycoLink de Life technologies selon les instructions du fabricant. La colonne d'affinité employée comprend une résine UltraLink fonctionnalisée par de l'hydrazide. La résine ainsi fonctionnalisée va permettre d'extraire les glycoprotéines présentes dans le sérum par la réalisation de liaisons stables entre l'hydrazide de la résine et les aldéhydes des glycoprotéines précédemment modifiées. Les protéines non glycosylées ont ensuite été éluées par centrifugation en présence de 400 pl d'urée à une concentration de 8M. L'échantillon a été concentré jusqu'à 50 pL sur un dispositif d'ultrafiltration possédant une limite d'exclusion de 3000 Da puis a été soumis à la digestion. Courbes d'étalonnage Afin de pouvoir quantifier la présence d'une protéine cible dans un échantillon de sérum humain, des courbes d'étalonnage ont été réalisées après les étapes de prétraitement de l'échantillon biologique (Figures 2 et 3). Pour chaque courbe, 5 points de calibration ont été réalisés par ajout d'une quantité croissante de protéine non marquée et d'une quantité constante de protéine étalon PSAQTM aux échantillons de plasma. La quantité de protéines non marquées ajoutée a été ajustée de manière à couvrir tous les concentrations sériques/plasmatiques les plus extrêmes dans la pathologie étudiée. Des blancs contenant uniquement les biomarqueurs endogènes ont aussi été réalisés. Tous les points de calibration ont été effectués au moins 3 fois par souci de reproductibilité. Pour les 2 plus faibles points de calibrations, 4 réplicas ont été réalisés. Ces courbes d'étalonnage ont permis d'évaluer les performances analytiques du dosage (linéarité de la réponse, précision, exactitude, sensibilité). Comme le montrent les Figures 2 et 3, le dosage des protéines cibles est très performant et il peut être appliqué à l'analyse d'échantillons cliniques. Protéolyse Une solution de digestion a été préparée en utilisant un mélange d'EndolysC et de trypsine (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) à un rapport protéine / enzyme de 1 / 30 en masse dans une solution d'urée 4 M et de NH4HCO3 à 50 mM à 37 °C. Après 3 heures d'incubation, les échantillons ont été dilués quatre fois et incubées une nuit à 37 °C. La digestion a été stoppée par addition d'acide formique (0,1% en concentration finale). Les échantillons ont été purifiés sur colonne SpinColumns macro C18 (Harvard Apparatus, Les Ulis, France) et séchés par centrifugation sous vide. Les culots ont été resolubilisés dans 15 pL d'une solution contenant 2% en volume d'acétonitrile, d'acide formique à 0,1% en volume. 6 pl de cette solution ont été injectés sur le système de chromatographie liquide couplé au spectromètre de masse en mode SRM (LC-SRM). 3048780 27 Analyse LC-SRM Les analyses LC-SRM ont été réalisées sur un spectromètre de masse de type 6500 QTrap (AB Sciex, Les Ulis, France) équipé d'une source TurboV et contrôlé par le logiciel Analyst (version 1.6.1, AB Sciex) dans une gamme allant de 400 à 1000 m/z. L'instrument a été couplé à un système de chromatographie Ultima 3000 LC (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France). La chromatographie des échantillons a été effectuée en utilisant un système combinant 2 solvants, le solvant A (2% d'acétonitrile et acide formique à 0,1%) et le solvant B (80% acétonitrile, acide formique% 0,1%). Les peptides protéolytiques ont été concentrées sur une précolonne 1 x 15 mm C18 PepMap (Thermo Scientific) puis ont été séparées sur une colonne Kinetex XB-C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 pm, 100 Â; Phenomenex, Le Pecq, France) en mode gradient. Ainsi l'élution graduée a été réalisée de manière à modifier la concentration de la solution initiale de B à 3% à 35% en 30 minutes, puis de 35% à 90% en 10 minutes, et ce à un débit de 50 pl/min. L'analyse des données LC-SRM et 1"identification des pics de chaque peptide a ensuite été réalisée en utilisant le logiciel Skyline. En plus de l'évaluation du signal du peptide (signal composite issu de plusieurs transitions), toutes les transitions ont été inspectées individuellement et exclues si elles étaient jugés inaptes pour la quantification (faible rapport signal sur bruit, interférences évidentes). Les ratios des surfaces des pics relatifs aux peptides marqués et non marqués ont été calculés pour chaque transition SRM. Ces ratios ont ensuite été utilisés pour déterminer le ratio moyen correspondant, et finalement le rapport moyen de l'abondance de la protéine cible a été calculé à partir des rapports obtenus pour les différents peptides signatures. La concentration des biomarqueurs a ensuite été calculée à partir du ratio moyen en protéines. La limite inférieure de détection (LID) a été déterminée selon la méthode de la courbe d'étalonnage et la limite inférieure de quantification (LIQ) a été définie comme étant égale à 3 fois la LID. Pour chaque patient, la concentration des biomarqueurs cibles a été déterminée à différents instants t. Les Figures 4 et 5 montent le suivi longitudinal des concentrations sériques des différents biomarqueurs chez des patients atteint d'ALI ou ALF et dont l'étiologie est soit le paracétamol (figure 4) soit une autre cause (figure 5). (cf. figures 4 et 5). Ce suivi est analysé en parallèle avec les paramètres clinico-biologiques standards (taux de transaminases, paramètres de coagulation). Chez les patients avec une ALI/ALF induite par le paracétamol (figure 4), les concentrations sériques des biomarqueurs augmentent avec le développement de l'atteinte hépatique, en particulier les biomarqueurs ADH1B, ADH1B et ADH1A, BHMT1, BHMT1 et BHMT2, et ADH4 qui atteignent des concentrations circulantes très élevées. Les concentrations baissent alors que l'état clinique et les paramètres clinico-biologiques classiques s'améliorent. Pour les patients atteints d'ALI/ALF d'étiologies variées, ces modifications sont également observables mais les niveaux sériques détectés sont globalement moins élevés. La figure 7 concerne des patients atteints de NASH. Chez ces patients le dosage des biomarqueurs cibles en phase aigüe de la maladie montre des concentrations sériques de BHMT1, ADH1A et ADH1B significativement plus élevées que chez des donneurs sains. Cette observation montre que les biomarqueurs cibles présentent un intérêt dans le diagnostic des NASH. REVENDICATIONS1. Procédé de diagnostic et/ou de suivi et/ou de pronostic et/ou théranostique in vitro de troubles hépatiques à partir d'un échantillon biologique issu d'un individu, dans lequel procédé on détermine la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) et/ou la présence et/ou la concentration de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 1). 2. Procédé in vitro selon la revendication 1 dans lequel procédé on détermine la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire, préférentiellement d'au moins deux marqueurs supplémentaires, et encore plus préférentiellement d'au moins trois marqueurs supplémentaires, lesdits marqueurs étant sélectionnés dans le groupe constitué par : ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), FABP1 (SEQ ID N° 11), GSTA1 (SEQ ID N° 12) et ALTI (SEQ ID N° 13). 3. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel on détermine au moins la présence et/ou la concentration d'au moins un marqueur supplémentaire sélectionné parmi ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4) et BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7). 4. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel on détermine au moins la présence et/ou la concentration du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) ou de la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 1), d'une part, et des marqueurs ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4) et BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7).), d'autre part. 5. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le marqueur BHMT est le variant de séquence BHMT1 (SEQ ID N° 5) et/ou la combinaison des variants de séquence BHMT1 (SEQ ID N° 5) et BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7). 6. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on détermine en outre la présence et/ou la concentration du marqueur CK18. 7. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on utilise pour ladite détermination de la présence et/ou de la concentration desdits marqueurs des peptides signatures présents dans lesdits marqueurs. 8. Procédé in vitro selon la revendication 7, dans lequel lesdits peptides signatures sont générés à partir desdits marqueurs par un procédé de digestion, de préférence enzymatique. 9. Procédé in vitro selon la revendication 7 ou 8, dans lequel la présence et/ou la concentration: 3048780 29 a. de la combinaison des marqueurs ADH1A (SEQ ID N° 1) et ADH1B (SEQ ID N° 2), si elle est selectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi INEGFDLLHSGK (SEQ ID N° 16) et FSLDALITHVLPFEK (SEQ ID N° 15) b. du marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature peptide signature AAVLWEVK (SEQ ID N° 17), c. du marqueur ADH4 (SEQ ID N° 3 & SEQ ID N° 4), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi FNLDALVTHTLPFDK (SEQ ID N° 20), IDDDANLER (SEQ ID N° 18) ou IIGIDINSEK (SEQ ID N° 19), d. du marqueur ARG1 (SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 & SEQ ID N° 10), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi DVDPGEHYILK (SEQ ID N° 25), TIGIIGAPFSK (SEQ ID N° 24) ou EGLYITEEIYK (SEQ ID N° 26), e. du marqueur BHMT (SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), AIAEELAPER (SEQ ID N° 23) ou EAYNLGVR (SEQ ID N° 22), f. du marqueur BHMT1 (SEQ ID N° 5), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature EATTEQQLK (SEQ ID N° 21), g. de la combianison des marqueurs BHMT1 (SEQ ID N°5) et BHMT2 (SEQ ID N° 6 & SEQ ID N° 7), si elle est sélectionnée, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi AIAEELAPER (SEQ ID N° 23) ou EAYNLGVR (SEQ ID N° 22), h. du marqueur FABP1 (SEQ ID N° 11), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi AIGLPEELIQK (SEQ ID N° 27), FTITAGSK (SEQ ID N° 28) ou TWQLEGDNK (SEQ ID N° 29), i. du marqueur GSTA1 (SEQ ID N° 12), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence du peptide signature LHYFNAR (SEQ ID N° 30), j. du marqueur ALTI (SEQ ID N° 13), s'il est sélectionné, est déterminée par la présence d'au moins un peptide signature choisi parmi ALELEQELR (SEQ ID N° 34), LLVAGEGHTR (SEQ ID N° 35) ou KPFTEVIR (SEQ ID N° 36), sachant que ALTI (SEQ ID N° 13), s'il est sélectionné, est plus particulièrement déterminée par la présence du peptide signature ALELEQELR (SEQ ID N° 34) ou LLVAGEGHTR (SEQ ID N° 35). 10. Procédé in vitro dans lequel on dose au moins un desdits marqueurs (dit « marqueur sélectionné »), dont au moins un marqueur ADH1B (SEQ ID N° 2) et/ou la combinaison des marqueurs ADH1B (SEQ ID N° 2) et ADH1A (SEQ ID N° 3048780 30 1), par l'intermédiaire d'au moins un peptide signature caractéristique dudit marqueur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes suivantes : a) l'approvisionnement d'un échantillon biologique prélevé sur un individu à un temps to, b) l'ajout d'une quantité connue d'une protéine isotopiquement marquée homologue du marqueur sélectionné dans l'échantillon biologique obtenu à l'étape a), c) le traitement de l'échantillon biologique pour extraire au moins une partie des protéines abondantes ou au moins une partie des glycoprotéines, d) le traitement de l'échantillon après extraction d'au moins une partie des protéines abondantes ou des glycoprotéines pour générer des peptides protéolytiques, de préférence par digestion, étant entendu que parmi les peptides protéolytiques obtenus se trouvent les peptides signatures des marqueurs sélectionnés, e) le dosage quantitatif par spectrométrie de masse d'au moins un peptide signature généré à partir du marqueur sélectionné, f) la détermination d'un rapport de l'abondance du peptide signature isotopiquement marqué, ajouté à l'étape b), sur l'abondance du peptide signature non marqué issu de l'échantillon biologique, g) le calcul à partir du rapport obtenu à l'étape f) et de la quantité connue de ladite protéine isotopiquement marquée ajoutée à l'étape b), de la concentration dudit marqueur sélectionné dans l'échantillon. 11. Procédé in vitro selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape c) est effectuée par déplétion et préférentiellement par glycodéplétion. 12. Procédé in vitro selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le procédé est effectué à un temps to et à un temps t1 supérieur à to, et comprend après l'étape g), la comparaison de la concentration du marqueur sélectionné dans l'échantillon entre t1 et to. 13. Procédé in vitro selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'étape d) est effectuée par digestion enzymatique, de préférence par l'emploi de trypsine ou d'un mélange d'EndolysC et de trypsine. 14. Procédé in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le trouble hépatique est une insuffisance hépatique aiguë ou une stéatohépatite. 15. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 pour évaluer la toxicité de molécules (candidats médicaments, médicament, xénobiotique) préalablement administrées à l'individu dont est issu ledit échantillon biologique.