FR 3046421 A1 20170707 FR 1651797 A 20160303 1 PROCÉDÉ DE FABRICATION DE SUBSTITUTS CUTANÉS PAR DÉPÔT ADDITIF DOMAINE TECHNIQUE L'invention concerne le domaine de la biotechnologie, et plus particulièrement celui des substituts cutanés. Elle concerne notamment la fabrication de substituts cutanés destinés à l'exécution d'essais de principes actifs pharmaceutiques ou cosmétiques. ETAT DE LA TECHNIQUE En Europe les produits chimiques à visée cosmétique ne doivent plus être testés sur des animaux de laboratoire ; on cherche donc constamment à améliorer les substituts cutanés, à leur donner des caractéristiques plus proches de celles d'un derme naturel, à diminuer leur coût de production et d'utilisation. Parmi les différentes méthodes expérimentales pour fabriquer des matériaux et matrices biotechnologiques ce sont les méthodes de dépôt additif qui ont reçu beaucoup d'attention ces dernières années. Initialement conçues pour la réalisation de modèles de pièces industrielles en matière plastique (prototypage rapide, voir FR 2 567 668), les méthodes de fabrication additives, dont certaines sont connues sous les termes « stéréolithographie » ou « impression 3D », sont depuis une dizaine d'années explorées dans de nombreux domaines d'application. Elles comprennent en règle générale le dépôt d'une phase poudreuse, pâteuse ou liquide (appelée « encre ») sous une forme tridimensionnelle contrôlée sur un substrat initial, suivie de la solidification de cette phase déposée, de manière à obtenir un objet de forme tridimensionnelle contrôlée. Ledit dépôt se fait le plus souvent en plusieurs passes, conduisant chacune au dépôt d'une phase poudreuse, pâteuse ou liquide de forme tridimensionnelle contrôlée ; ces dépôts sont typiquement solidifiés passe par passe (strate par strate). Ladite phase poudreuse, pâteuse ou liquide peut être homogène (par exemple une poudre homogène ou un fil de polymère thermoplastique en fusion) ou peut comprendre une dispersion de particules solides dans une phase liquide. Sa viscosité peut être un paramètre critique, car la préforme obtenue après son dépôt ne doit pas s'affaisser en attente de sa solidification (cette attente pouvant être d'une fraction de seconde). Sa solidification peut être réalisée par des techniques très différentes selon la composition de l'encre ; elle peut aussi avoir lieu spontanément, notamment dans le cas d'un polymère en extrudé à l'état fondu qui se solidifie, ou dans le cas de pâtes thixotropiques, ou encore dans le cas d'un polymère dont la composition comporte des molécules qui réagissent entre elles (comme cela est décrit dans US 6,942,830). A titre d'exemple, on peut fabriquer des pièces en matière plastique en déposant une encre polymérisable par la lumière (ou par la chaleur générée par l'absorption) d'un 3046421 2 faisceau laser, et on peut fabriquer des pièces métalliques en déposant des pâtes chargées de particules métalliques ou des poudres qui sont consolidées (le plus souvent par fusion intermédiaire) sous l'effet d'un faisceau laser (technique connue sous le sigle SLS, « Selective Laser Sintering ») ; on peut également déposer directement des métaux 5 en fusion. Ainsi on peut fabriquer des pièces industrielles de forme complexe. Une multiplicité de techniques (et de sigles s'y référant) existent sur le marché, telles que le dépôt fil tendu (FDMTM, « Fused Deposition Modeling »), le modelage à jets multiples, le FTI (Film Transfer Imaging). Le sigle SFF (Solid Freeform Fabrication ») est utilisé pour désigner un ensemble de techniques capables de fabriquer des structures 10 tridimensionnelles directement à partir de fichiers de CAS (Computer-Aided Design) par des techniques additives. L'état de la technique décrit la mise en oeuvre des techniques de fabrication additives dans le domaine de la biotechnologie ; on a ainsi imprimé des structures tridimensionnelles à base de matériaux dits biologiques. Plus précisément, il s'agit dans 15 ce cas d'encres à base de matériaux biocompatibles susceptibles d'être solidifiés. Ces matériaux peuvent servir comme support (« scaffold » en anglais) pour des cellules vivantes qui y sont introduites après la solidification du support. On peut également introduire dans les cellules vivantes directement dans l'encre, qui est alors une suspension comportant des cellules vivantes ; ces encres sont parfois appelées « bio- 20 encres ». Cette solidification peut se faire par voie photochimique. A titre d'exemple, le document US 2014/0052285 décrit l'utilisation de plusieurs types d'hydrogels photopolymérisables, à savoir PED-DA (= diacrylate de polyethylène glycol), PEG-DA-PEA (poly-ester amide), GMA-chitosane et alginate, pour réaliser des supports susceptibles d'être colonisés par 25 des cellules vivantes. US 2013/0304233 décrit la fabrication de structures de support résorbables à base de PPF (fumarate de polypropylène). US 7 780 897 et US 8 197 743 décrivent d'autres modes de mise en oeuvre de la stéréolithographie utilisant des hydrogels de polyéthylène glycol solidifiés par une réaction photochimique. La solidification par voie photochimique nécessite cependant des photocatalyseurs, 30 photoinitiateurs et/ou colorants, en quantités significatives (par exemple : 2% de photoinitiateur) ; ces additifs peuvent poser un problème toxicologique. En ce qui concerne le photocatalyseur, même si ce dernier n'est pas toxique en tant que tel, la production de radicaux libre favorise toujours la mortalité cellulaire, et risque de perturber le produit obtenu. Pour cette raison on cherche une alternative à la photopolymérisation pour des applications biotechnologique. 3046421 3 Des hydrogels ont également été utilisés comme milieu pâteux solidifiable ; US 7 051 654 en décrit une vaste liste. US 2014/003932 décrit des hydrogels photoréticulables à base de méthyacrylate. US 2014/0012407 décrit plus spécifiquement des hydrogels thermoréversibles. EP 2 670 669 Al décrit un procédé dans lequel on dépose une 5 suspension de cellules vivantes comprenant un premier précurseur d'hydrogel capable de se solidifier lors que la température baisse en-dessous d'une température critique de gélification, et un second précurseur d'hydrogel réticulable, on solidifie la suspension déposée en la refroidissant, et on ajoute un agent réticulant. Le second précurseur peut être un alginate, l'acide hyaluronique, un dérivé de cellulose, du chitosane, de la 10 xanthane, de la fibrine, un gel de pectine, de l'alcool polyvinyle. D'une manière générale, les hydrogels solidifiés pour support de culture cellulaire sont connus de l'homme du métier sous le terme « lattice ». D'autres systèmes solidifiables sont décrits dans US 2013/0164339 et US 2014/00998709. On connaît également des encres à base d'alginate qui sont solidifiées avec une solution 15 pour fabriquer des supports pour culture cellulaire ; de tels systèmes et procédés sont décrits dans US 8 639 484, US 8 691 974 et US 8 691 274. US 2013/0017564 décrit le dépôt de hydroxyapatite pour faire des structures tridimensionnelles sur lesquelles peuvent se fixer des cellules ostéoblastiques. L'impression 3D a aussi été utilisée en biotechnologie pour appliquer une encre 20 comportant des cellules vivantes sur un support favorisant le développement de cultures cellulaires. US 2009/0208466 et WO 2014/039427 décrivent l'impression 3D avec des encres à base de collagène (pouvant comporter de l'alginate) comportant de cellules humaines. US 2011/0250688 décrit le dépôt de cellules musculaires lisses suspendues dans un hydrogel par impression 3D sur un substrat biologique ou synthétique. 25 US 2012/0089238 décrit le dépôt sur un substrat poreux (scaffold) de quatre types de cellules différentes par impression 3D, chacune déposée en suspension à partir d'une tête d'impression dédiée, pour créer une structure tridimensionnelle complexe mimant un tissu. WO 2013/040087 décrit la fabrication de structures biocompatibles de type « lattice » fabriquées par impression 3D sur lesquels on fixe des cellules vivantes 30 caractéristiques d'une certaine gamme de tissus : cellules musculaires lisses, fibroblastes dermiques, cellules endothéliales, cellules étoilées (en anglais : hepatic stellate cells), hépathocytes, monocytes, macrophages. La publication « Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication » par W. Lee et al., parue dans la revue Biomaterials 30 (2009), p. 1587-1595, décrit le dépôt par 35 impression 3D de cellules sur une lattice d'hydrogel à base de collagène de type I, 3046421 4 déposée de la même manière. Cette publication décrit notamment la fabrication de structures multi-couches de collagène dans lesquelles certaines couches incorporent des fibroblastes ou des kératinocytes ; après incubation des cellules elles peuvent servir comme modèle de peau. 5 La publication « On-Demand Three-Dimensional Freeform Fabrication of Multi-Layered Hydrigel Scaffoif With Fluidic Channels" par W. Lee et al., parue en 2010 dans la revue Bitechnology and Bioengineering, vol. 105 (6), p. 1178 - 1186, décrit un procédé de dépôt d'un biomatériau à partir de couches alternées d'un hydrogel à base de collagène et d'une solution de gélatine ; l'hydrogel est réticulé avec du bicarbonate de soude, alors que la 10 solution de gélatine se solidifie par refroidissement lors du dépôt. Les cellules à cultiver sont contenues dans l'hydrogel de collagène. Lors de l'incubation la solution de gélatine devient liquide et est enlevée par rinçage ; ainsi on crée une structure comprenant des couches denses d'hydrogel de collagène qui alternent avec des couches peu denses laissées par le départ de la gélatine. Si ce biomatériau permet la culture de cellules, il ne 15 s'agit cependant pas d'un substitut cutané. La publication "Design and Fabrication of Human Skin by Three-Dimensional Bioprinting" par V. Lee et al., parue dans la revue Tissue Engineering Part C, 20(6) (2014), p. 473484, montre que les systèmes multicouches obtenues par assemblage manuel et par impressions 3D évoluent de manière totalement différente dans des conditions de culture 20 cellulaire : les systèmes créés par impression 3D se développent bien et gardent leur forme, alors que les systèmes assemblés manuellement se rétrécissent comme une peau de chagrin. A l'heure actuelle la grande majorité des réalisations d'impression 3D en biotechnologie conduit à des produits pouvant servir comme modèles pour des études scientifiques ; une 25 grande variété de cellules et organes peut être mimée de cette manière. Ces systèmes modèle peuvent permettent de caractériser des principes actifs pharmaceutiques sur des cultures cellulaires élevées et maintenues dans des conditions proches des conditions intracorporelles. La publication "Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor mode/ in vitro" par Y. Zhao et al., parue dans la revue Biofabrication 6 (1914), 30 doi:10.1088/1758-5082/6/3/035001, en fournit un exemple. A l'opposé, et toujours dans le domaine de la peau humaine, les enjeux thérapeutiques sont énormes car de nombreux besoin insatisfaits existent. Ainsi, le document US 2014/0012225 décrit un dispositif qui permet de déposer sur des zones étendues de la surface du corps humain des hydrogels solidifiables comportant des cellules 3046421 5 épidermiques en guise de peau artificielle ; ce dispositif a été imaginé pour traiter des grands brûlés. La présente invention se concentre sur le domaine des substituts d'épithélia, et notamment sur les substituts d'épithélia destinés à l'exécution d'essais de principes actifs 5 pharmaceutiques ou cosmétiques. Les inventeurs ont constatés que les procédés traditionnels permettant de fabriquer des substituts cutanés prennent beaucoup de temps, sous deux points de vue : tout d'abord ils prennent beaucoup de temps de manipulation (exprimé en heures-homme), car la fabrication des substituts cutanés est un procédé complexe ; puis, le substitut cutané ne peut pas être utilisé tel quel mais doit d'abord 10 vieillir pendant plusieurs mois (typiquement environ six mois) avant de pouvoir être mis en condition de culture. La phase de culture proprement dite prend au moins six à sept semaines. On note que la manipulation complexe lors de la fabrication implique un risque de contamination des cultures. Les techniques de fabrication de substituts cutanés à partir d'une bio-encre peuvent être 15 automatisées facilement, elles présentent une bonne reproductibilité et permettent ainsi d'obtenir un produit normalisé et sont plus rapides : le biomatériau est mélangé avec les cellules le jour de la production pour former la bio-encre, et la maturation du derme se fait en dix à quinze jours. Cependant, le résultat n'est pas très bon, car on n'obtient pas de derme artificiel 20 permettant la culture d'un épiderme stratifié à sa surface, qui puisse servir comme modèle réaliste d'une peau naturelle. En effet, la publication « Standardized 3D Bioprinting of Soft Tissue Models with Human Primary Cells » par M. Riemann et al., paru en 20 15 dans J. of Laboratory Automation, p. 1 - 14 (doi : 10.1177/2211068214567146) décrit la fabrication d'un substitut cutané par dépôt additif de couches successives (épaisseur 25 individuelle : 0,05 mm) d'une bio-encre photopolymérisable ; une couche de matrice est alternée avec une couche comprenant des fibroblastes. Chaque couche est immédiatement photopolymérisée. La bio-encre est à base de PEG. Le substitut cutané ainsi obtenu ne présente cependant pas la structure stratifiée d'un épiderme naturel, et il comprend de nombreux trous. 30 Le problème de fabriquer, en faisant intervenir des techniques additives, un substitut cutané qui présente une ressemblance structurelle et fonctionnelle suffisante avec la peau naturelle reste sans solution. Objet de l'invention 3046421 6 Selon l'invention le problème a été résolu par l'utilisation d'une composition de bio-encre nouvelle, comprenant un mélange de gélatine naturelle et d'alginate, qui est solidifiée par trois moyens différents : lors du dépôt de l'encre, la gélatine solidifie, ce qui permet de garder la forme du boudin d'encre déposé. Après dépôt on traite l'objet déposé par avec 5 une solution comportant des ions de calcium et de thrombine, afin de solidifier l'alginate par les ions de calcium et de coaguler le fibrinogène par l'effet de la thrombine. Ainsi, un premier objet de l'invention est un procédé de fabrication d'une bio-encre pour dépôt additif, dans lequel : (a) On approvisionne une première solution comprenant entre 5% et 40% 10 massiques de gélatine (de préférence entre 6% et 30% massiques) et entre 0 % et 5% massiques de NaCI ; (b) On approvisionne une seconde solution comprenant entre 1% et 12% massiques d'alginate (de préférence entre 1% et 8% massiques) et entre 0% et 5% de NaCI ; 15 (c) On approvisionne une troisième solution comprenant entre 1% et 15% massiques de fibrinogène (de préférence entre 3% et 15% massiques), et optionnellement des cellules vivantes (telles que des fibroblastes) en suspension ; (d) On crée un mélange comprenant : 20 environ 35% à 65% volumiques de la première solution ; environ 15% à 35% volumiques de la seconde solution ; environ 15% à 35% volumiques de la troisième solution ; ces proportions étant choisies de manière à s'additionner à 100%, et dans lequel procédé : 25 - l'ordre des étapes (a),(b) et (c) est indifférent, - la teneur en NaCI est choisie de manière à ce que dans ladite première solution et ladite seconde solution réunies elle est comprise entre 0,2% et 5% massiques, de préférence entre 0,2 et 3% massiques, et encore plus préférentiellement entre 0,4% et 2% massiques. 30 Lesdites cellules vivantes peuvent notamment être sélectionnées dans le groupe formé par : les adipocytes et préadipocytes, les cellules endothéliales, les cellules nerveuses, les cellules dendritiques dermiques, les cellules de Langerhans, les mélanocytes, les cellules de Merkel, les sébocytes, les macrophages, les mastocytes, les cellules épithéliales des follicules pileux. Un autre objet de la présente invention est la bio-encre 35 susceptible d'être obtenue à partir de ce procédé. Elle peut contenir des cellules vivantes, 3046421 7 et notamment des fibroblastes. La gélatine confère à cette bio-encre une viscosité qui présente un point de transition (point de gélification) à une température se situant typiquement entre 27°C et 32°C, et de préférence entre 28°C et 30°C : la bio-encre est fluide au-dessus de cette température et gélifie au-dessous de cette température. Cette 5 gélification a notamment lieu lorsque la bio-encre est portée à une température T1 supérieure à son point de gélification et déposée sur un substrat se trouvant à une température T2 inférieure à ce point de gélification : dans ce cas elle peut se solidifier immédiatement sans s'étaler complètement, éventuellement en gardant la forme du boudin d'extrusion. Ainsi, la bio-encre peut être utilisée dans des procédés de dépôt 10 additif. Encore un autre objet de l'invention est un procédé de fabrication d'un substitut de tissu corporel, dans lequel : (i) on approvisionne une bio-encre selon l'invention ; (ii) on approvisionne une solution aqueuse (dite « solution de 15 polymérisation ») comprenant entre 1% à 5% massiques d'ions de calcium et entre 5 U/mL et 40 U/mL (et de préférence entre 10 U/mL et 30 U/mL) de thrombine ; (iii) on porte ladite bio-encre à une température T1 supérieure à son point de gélification et on la dépose sur un substrat se trouvant à une température 20 T2 inférieure au point de gélification de ladite bio-encre, où elle gélifie pour former un objet de forme tridimensionnelle contrôlée dit « objet imprimé brut », (iv) on traite ledit objet imprimé brut avec ladite solution de polymérisation pour consolider ledit objet imprimé brut en un substitut de tissu corporel ; 25 (y) optionnellement, dans le cas où ladite bio-encre comporte des cellules vivantes, on incube ledit précurseur de substitut corporel dans un milieu de culture cellulaire. Cette incubation est avantageusement effectuée à une température comprise entre 36°C et 38°C, de préférence dans une atmosphère humide avec 5% de CO2. 30 Ce procédé peut être réalisé par dépôt simple ou par dépôt additif, le dépôt additif permettant la création d'objets imprimés bruts ayant une certaine extension bidimensionnelle contrôlée, voire même d'objets ayant une forme tridimensionnelle contrôlée. De manière avantageuse T1 est compris entre 28°C et 37°C (de préférence entre 28°C et 35 33°C) et T2 est compris entre 0°C et 20°C (et de préférence entre 4°C et 18°C). 3046421 8 C'est le traitement de l'objet imprimé brut avec la solution de polymérisation qui le consolide définitivement : si la coagulation de l'alginate par le calcium peut être au moins partiellement réversible par le départ éventuel du calcium, la coagulation du fibrinogène par la thrombine est irréversible. Dans le procédé selon l'invention cette consolidation est 5 homogène dans l'épaisseur de l'objet. Le traitement dudit objet imprimé brute avec ladite solution de polymérisation peut être effectué par trempage, de préférence à une température T3 supérieure à T1 et de préférence comprise entre 35°C et 38°C. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit précurseur de tissu corporel 10 est un précurseur de substitut cutané. Dans ce cas, ladite bio-encre comprend des cellules vivantes en suspension qui sont des fibroblastes. Ladite incubation est effectuée à une température comprise entre 36°C et 38°C, en atmosphère humide et sous 5% CO2. Elle comprend avantageusement une première phase d'incubation comprise entre un et quarante jours, et une deuxième phase d'incubation entre cinq et quarante jours, sachant 15 qu'entre la première et la deuxième phase on dépose sur la surface dudit substitut cutané une suspension aqueuse de kératinocytes. Ledit précurseur de substitut cutané peut avoir une forme plate ou autre. Dans un mode de réalisation ledit objet imprimé brut comprend une surface supérieure sensiblement plate et présente une répartition homogène de fibroblastes, qui est comprise entre 0,5 et 20 10 x 105 (et de préférence entre 1 et 5 x 105) fibroblastes par cm2 de surface supérieure plate. Toujours dans le but de préparer un substitut cutané, la quantité de kératinocytes déposées est avantageusement comprise entre 0,5 et 10 x 105 (et de préférence entre 1 et 5 x 105) kératinocytes par cm2 de surface supérieure plate. 25 Encore un autre objet de l'invention est un substitut de tissu corporel, et en particulier d'un substitut cutané, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Le procédé selon l'invention permet la fabrication de substituts cutanés comprenant une couche de derme comprenant des fibroblastes, une couche d'épiderme, et une couche cornée comprenant des kératinocytes et des mélanocytes. Cette structure est bien 30 stratifiée. Le substitut cutané selon l'invention peut être utilisé pour étudier l'effet de principes actifs cosmétiques ou dermatologiques, ou encore pour des études toxicologiques. Description des figures 3046421 9 Les figures 1 à 3 illustrent certains aspects de l'invention. La figure 1 montre de manière schématique le procédé selon l'invention. La figure 2 montre une la micrographie optique d'une coupe transversale à travers un substitut cutané selon l'invention. La barre noire en bas à droite représente la longueur de 5 50 pm. La figure 3 montre une micrographie optique d'une coupe transversale à travers un substitut cutané selon l'invention, avec marquage immunohistochimique de la vimentine. La barre blanche en bas à droite représente la longueur de 50 pm. 10 Description détaillée La présente invention permet de créer des substituts de dermes équivalents par le biais de l'impression 3D. Ce nouveau procédé de fabrication permet un gain de temps et une facilité de fabrication des substituts de dermes extrêmement avantageuse, simple et reproductible. Les temps de fabrication et de maturation sont très réduits. 15 La bio-encre est composée d'un mélange de biomatériaux susceptibles de former un hydrogel et de cellules. Elle peut être préparée juste avant son emploi à partir de solutions aqueuses stables. Une fois que les solutions ont été préparées avec les bonnes concentrations, il suffit de les mélanger délicatement avec une suspension de cellules (typiquement des fibroblastes) dans une seringue. Ensuite, la seringue est montée sur la 20 bio-imprimante. Avantageusement on prévoit un pousse-seringue afin d'avoir un contrôle de débit ; à titre d'exemple le pousse-seringue peut être contrôlé par une vis sans fin et un moteur qui exerce une pression constante sur le liquide ou gel à extruder. Ainsi on imprime un objet en hydrogel ; cet objet est typiquement un objet plat. Une fois l'hydrogel imprimé, il est nécessaire de l'immerger dans une solution de polymérisation 25 biocompatible, ce qui va permettre aux biomatériaux de former un réseau solide et de maintenir la forme tridimensionnelle souhaitée. Ensuite, dans une étape appelée aussi « étape de maturation » on laisse les cellules se développer. Au cours de ce développement cellulaire en réseau tridimensionnel les cellules imprimées (fibroblastes) contenues dans l'hydrogel polymérisé sécrètent leur matrice extracellulaire. L'hydrogel va 30 alors progressivement se résorber pour laisser place à l'émergence d'un tissu néosynthétisé où des fonctions spécifiques vont apparaitre, ce qui est un avantage certain par rapport à une approche de type « scaffold » où les biomatériaux sont quelquefois nonrésorbables. L'ensemencement de la surface avec des kératinocytes suivi d'une 3046421 10 incubation appropriée permet d'obtenir un substitut cutané stratifie comportant le derme, la jonction dermo-épidermique, l'épiderme et la couche cornée. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la bio-encre doit être préparée selon des proportions et un ordre prédéfini et précis. 5 Dans une première étape on approvisionne des poudres d'alginate et de gélatine, on les stérilise et solubilise pour obtenir deux solutions stock : la première est une solution aqueuse de gélatine, obtenue par dissolution de poudre de gélatine (de préférence à une concentration comprise entre 5% m/v et 40% m/v) dans une solution de NaCI (de préférence à une concentration comprise entre 0,2% m/v et 5% m/v, plus 10 préférentiellement entre 0,4% m/v et 3% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v), la deuxième est une solution aqueuse d'alginate, obtenue par dissolution de poudre d'alginate (de préférence de qualité dite « Very Low Viscosity ») à une concentration comprise entre 1% m/v et 10% m/v (de préférence entre 2% m/v et 7% m/v) dans une solution de NaCI (de préférence à une concentration comprise entre 0,2% 15 m/v et 5% m/v, plus préférentiellement entre 0,4% m/v et 3% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v). Ces deux solutions sont stables et peuvent être stockées. Avantageusement on utilise la même solution de NaCI pour préparer ces deux solutions. Les gammes de concentration suivantes sont particulièrement avantageuses : 20 - - 25 - 30 - Solution de gélatine entre 6% m/v et 30% m/v, solution d'alginate entre 1% m/v et 8% m/v ; solution de NaCI entre 0,2% m/v et 3% m/v (de préférence entre 0,4% m/v et 2% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v). Solution de gélatine entre 10% m/v et 30% m/v, solution d'alginate entre 2% m/v et 6% m/v ; solution de NaCI entre 0,2% m/v et 3% m/v (de préférence entre 0,4% m/v et 2% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v). Solution de gélatine entre 15% m/v et 26% m/v, solution d'alginate entre 2% m/v et 6% m/v (et de préférence entre 3% m/v et 5% m/v) ; solution de NaCI entre 0,2% m/v et 3% m/v (de préférence entre 0,4% m/v et 2% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v). Solution de gélatine entre 17% m/v et 24% m/v, solution d'alginate entre 2% m/v et 6% m/v (et de préférence entre 3% m/v et 5% m/v) ; solution de NaCI entre 0,4% m/v et 2% m/v (préférentiellement entre 0,5% m/v et 1,4% m/v, et encore plus préférentiellement entre 0,6% m/v et 1,3% m/v). 3046421 11 La poudre d'alginate est un produit commercialement disponible, et on préfère la qualité dite « Low Viscosity », et encore plus préférentiellement la qualité dit « Very Low Viscosity ». Par ailleurs, on prépare une troisième solution qui est une solution aqueuse de 5 fibrinogène, de préférence à une concentration comprise entre 1% m/v et 15% m/v (plus préférentiellement entre 3% m/v et 12% m/v, et encore plus préférentiellement entre 5%m/v et 10% m/v) dans laquelle on a introduit une concentration cellulaire appropriée (typiquement entre 0,5 et de 5 millions cellules/mL (de préférence entre 1 et 3,5 millions par mL). Pour un essai de dépôt de précurseur de substitut cutané on peut par exemple 10 préparer 2 mL de cette solution. Lesdites cellules sont notamment des fibroblastes. Dans une troisième étape on prépare la bio-encre à partir de ces trois solutions de manière à obtenir un mélange qui contient environ 35% à 65% (de préférence environ 45% à 55%, et encore plus préférentiellement environ 50%) de la première solution (gélatine), environ 15% à 35% (de préférence environ 20% à 30%, et encore plus 15 préférentiellement environ 25%) de la deuxième solution (alginate) et environ 15% à 35% (de préférence environ 20% à 30%, et encore plus préférentiellement environ 25%) de la troisième solution pour un total de 100%, ces pourcentages étant exprimés en pourcent volumiques. Dans une quatrième étape on prépare une quatrième solution aqueuse, qui est la solution 20 de polymérisation. Elle comprend du calcium en solution à raison d'environ 1 à 5% m/v et de préférence environ 3% m/v, à laquelle on ajoute de la thrombine à une concentration finale d'environ 20 U/mL. Cette solution de polymérisation doit être approvisionnée en quantité suffisante pour permettre d'immerger l'objet obtenu par impression 3D afin d'obtenir un gel polymérisé de manière homogène. Cette quatrième étape peut être 25 réalisée avant ou au cours des trois étapes précédentes, mais la durée de stockage de cette quatrième solution est limitée ; les inventeurs ont observé que lorsque l'on prépare la quatrième solution juste avant son emploi, on obtient une solidification et polymérisation plus homogène de la bio-encre. Dans une cinquième étape on procède à l'impression, c'est-à-dire au dépôt de l'encre sur 30 un support. A cette fin l'encre est portée à une température T1 suffisante pour faire fondre la gélatine. Cette température T1 dépend de la composition exacte de l'encre et doit être déterminée par des essais simples : pour le domaine le domaine de composition le plus préférentiel indiqué ci-dessus une température T1 de l'ordre de 28°C à 29° peut convenir. Cette impression peut être réalisée par tout moyen approprié, par exemple à l'aide d'une 35 seringue monté sur un chariot, sur lequel la seringue se déplace le long d'un axe, et le 3046421 12 chariot se déplace dans un sens orthogonal audit axe. Le substrat est posé sur une table ou plateforme. Un déplacement selon l'axe de la hauteur peut être prévu soit pour le chariot porteur de la seringue soit pour la table ou plateforme porteuse du substrat. Le substrat est avantageusement refroidi afin que la gélatine se solidifie immédiatement ; 5 Cette température T2 du substrat dépend de la composition et température T1 de l'encre et de la vitesse de son dépôt ; elle peut être déterminée par des essais simples. Dans un autre mode de réalisation l'ensemble d'impression se trouve dans une chambre froide, c'est-à-dire à la température T2, optionnellement la seringue peut être chauffée à la température Ti. Ce mode de réalisation est avantageux pour permettre la fabrication de 10 structures plus épaisses ou de forme plus complexe, pour lesquelles la conduction thermique à travers la couche d'encre qui vient d'être déposée ne permet pas à la couche d'encre en cours de dépôt un refroidissement suffisamment rapide. Dans une sixième étape on consolide l'objet imprimé brut en le traitant avec la solution de polymérisation (quatrième solution), de préférence par immersion totale ; ainsi on obtient 15 un objet dit « objet solidifié ». Le temps de contact entre l'objet imprimé brut et la solution de polymérisation est de préférence d'au moins quinze minutes. Lors de cette étape la température T3 de la solution de polymérisation se trouve de préférence au-dessus de la température de fusion de la gélatine. Cela permet à la gélatine de passer en phase aqueuse, et ainsi la plus grande partie de la gélatine est enlevée de l'objet solidifie. On 20 obtient ainsi un objet appelé « précurseur de substitut cutané ». La température T3 peut être d'environ 37°C. Les étapes 5 et 6 sont illustrées de manière schématique sur la figure 1. Dans une sixième étape on incube le précurseur de substitut cutané pour obtenir un substitut cutané. Cette incubation se fait en trois phases. Pendant une première phase 25 d'incubation on immerge ledit précurseur de substitut cutané dans un milieu de culture de fibroblastes appropriée, de préférence à une température d'environ 37°C. La durée de cette incubation peut être comprise entre trois et vingt jours (jusqu'à 40 jours avec les kératinocytes) ; une durée comprise entre huit et quinze jours est préféré ; une durée de douze jours est optimale pour les fibroblastes. 30 A l'issue de cette première phase d'incubation on applique sur la surface du précurseur de substitut cutané une suspension aqueuse de kératinocytes. Une concentration comprise entre 1 et 5 x 105 cellules par cm2 convient. Puis, pendant une deuxième phase d'incubation on immerge le précurseur de substitut cutané dans une solution de culture appropriée, par exemple le milieu de Green ; il faut 3046421 13 apporter des nutriments régulièrement (chaque jour de préférence). Cette deuxième phase d'incubation dure entre cinq et dix jours, de préférence environ sept jours. La température est de 37°C. Et enfin, pendant une troisième phase d'incubation on maintient les précurseurs de 5 substitut cutané à la surface du milieu de culture de différenciation et les incube pendant une durée comprise entre 15 et 30 jours, de préférence entre 18 et 25 jours, typiquement 21 jours. La température est de 37°C. Ainsi on obtient un substitut cutané. Ledit milieu de différenciation comprend typiquement du DMEM ainsi que des additifs spécifiques ; dans un mode de réalisation avantageux ces additifs sont : hydrocortisone (0,4 pg/mL), insuline 10 (5 pg/mL), albumine bovine (8 mg/mL). Le procédé de bio-impression selon l'invention permet d'obtenir des objets de tailles centimétriques voir décimétriques. L'imprimante ressemble à une imprimante 3D FDM classique (Fused Deposition Modelling) mais le pousse-seringue remplace alors les extrudeurs plastiques. 15 La bio-encre selon l'invention répond à trois objectifs : - Le maintien de l'hydrogel avec une rhéologie adéquate pendant le processus d'impression (d'extrusion), - La formation d'un objet polymérisé de manière homogène, qui va conserver sa forme obtenue en 3D, 20 - Permettre le développement d'un réseau cellulaire en 3D. Ces trois fonctions ont été validées grâce à l'utilisation des biomatériaux suivants. La gélatine, un polymère à base de collagène ayant une température de transition de phase à 29°C, a été utilisée en tant que composant rhéologique, ce qui donne à la bio-encre sa tenue une fois imprimée sur un substrat refroidi et qui pourra ensuite être éliminé dans les 25 étapes ultérieures du procédé. L'alginate, un polymère à base d'hydrate de carbone avec la capacité de former un hydrogel en présence de calcium, utilisé comme un élément de structure, permet de donner une stabilité mécanique à la bio-encre imprimée une fois la gélatine solubilisée. Le fibrinogène, une glycoprotéine ayant la capacité de former un hydrogel sous l'action de la thrombine, utilisé à la fois comme un élément de construction 30 et de maturation grâce à ses composants d'adhérence cellulaire (motifs RGD). L'invention a de nombreuses applications. Le procédé de fabrication d'un substitut de tissu corporel selon l'invention permet de fabriquer des substituts de tissus corporels de différentes natures. En effet, on peut incorporer dans la bio-encre selon l'invention tous 3046421 14 types de cellules vivantes. A titre d'exemple, on peut incorporer dans la bio-encre tous les autres types cellulaires de la peau (notamment : adipocytes et préadipocytes, cellules endothéliales, cellules nerveuses, cellules dendritiques dermiques, cellules de Langerhans, mélanocytes, cellules de Merkel, sébocytes, macrophage; mastocytes, 5 cellules épithéliales des follicules pileux). Le procédé permet notamment de fabriquer des substituts pour tous les épithélia du corps (cornée, muqueuse orale, oesophage etc) ainsi que des substituts de cartilage. Ainsi, le substitut de tissu corporel selon l'invention peut être utilisé non seulement comme substitut cutané pour des essais de produits cosmétiques, pharmaceutiques et 10 chimiques, mais également pour des applications cliniques, par exemple en chirurgie réparatrice et reconstructrice. A titre d'exemple, le substitut cutané selon l'invention peut servir comme peau pour les brulés. Le procédé de fabrication d'un substitut de tissu corporel par dépôt additif selon l'invention permet également de fabriquer des objets de taille complexe, et ainsi on peut fabriquer des substituts d'oreille ou de nez par exemple. 15 Exemples Exemple 1 : Culture et récolte de cellules Cet exemple illustre un procédé d'amplification et de récolte de cellules (fibroblastes et kératinocytes) qui peuvent ensuite être utilisées dans la fabrication du substitut cutané 20 selon l'invention. On a isolé des kératinocytes et fibroblastes dermiques à partir d'un preputium humain. Les kératinocytes ont été cultivées sur des fibroblastes humains irradiés selon une technique bien connue de l'homme du métier, en utilisant le milieu de culture connue sous le nom « Green's medium » contenant du DMEM et Ham's F12 (dans un rapport de 3 :1), 25 auquel on a ajouté de l'adénine (24,3 pg/mL), le facteur de croissance épidermique humain (10 ng/mL), de l'hydrocortisone (0,4 pg/mL), de l'insuline (Humulin ®, 5 pg/mL), 2 x 10-9 M tri-iodo-L-thyronine (5 pg/mL), 10-19 M isoproterenol, de la pénicilline (100 U/mL), de la streptomycine (100 pg/mL) et 10% de sérum de veau foetal. On a utilisé les kératinocytes récoltés lors des passages 2, 3 et 4. 30 Les fibroblastes ont été cultivés dans un milieu approprié comportant du DMEM, 20% de sérum de veau nouveau-né et des antibiotiques, à 37°C dans une atmosphère comportant 5% CO2. On a utilisés les fibroblastes récoltés lors des passages 5, 6, 7 et 8. 3046421 15 Exemple 2 : Dépôt par technique additive (procédé selon l'invention) On a préparé une première solution aqueuse de gélatine en dissolvant une poudre de gélatine à 20% m/v dans une solution de NaCI à 0,9% m/v. On a préparé une deuxième solution aqueuse d'alginate en dissolvant de la poudre d'alginate (Very Low Viscosity) à 5 4% m/v dans une solution de NaCI à 0,9% m/v. On a préparé une troisième solution aqueuse de fibrinogène à 8% m/v dans laquelle on a introduit des fibroblastes en suspension (obtenus selon l'exemple 1) en une concentration cellulaire de 2 millions cellules/mL. Ensuite on a mélangé ces trois solutions de manière à obtenir un mélange (dit « bio- 10 encre ») qui contient 50 vol-% de la première solution (gélatine), 25 vol-% de la deuxième solution (alginate) et 25 vol-% de la troisième solution (fibroblastes reprises dans le fibrinogène. On a préparé une solution aqueuse de polymérisation comprenant calcium 3% m/v et de thrombine à une concentration finale de 20 U/mL. 15 Ladite bio-encre présente une transition visqueuse à 29°C. Elle a été chauffée à une température d'environ 30°C et utilisée à cette température pour le dépôt additif selon une technique de dépôt de type connue, à travers une seringue équipé d'un pousse-seringue pur pouvoir contrôler le débit. Le substrat se trouvait à une température d'environ 4°C, et de ce fait l'encré déposée s'est solidifiée immédiatement. A partir d'un boudin d'un 20 diamètre de 300 pm on a déposé plusieurs couches d'une épaisseur totale d'environ 10 mm sur une surface de l'ordre de quelques centimètres carrés. On a ainsi obtenu des objets plats qui comprenaient une répartition homogène de fibroblastes, à raison de 2,5 x 105 fibroblastes par cm2. Ensuite chaque objet imprimé brut ainsi déposé a été trempé dans la solution de 25 polymérisation pour réticuler l'alginate et coaguler le fibrinogène maintenue à une température de 37°C pour polymériser l'alginate et coaguler le fibrinogène. L'objet plat ainsi obtenu est appelé ici « précurseur de substitut cutané ». Exemple 3 : Maturation du précurseur de substitut cutané (procédé selon l'invention) On a incubé les précurseurs de substitut cutané pendant 12 jours dans un milieu de 30 culture de fibroblastes comprenant 1 mM d'acide ascorbique 2-phosphate ; ils ont été alimentés chaque jour. Après douze jours on a appliqué sur la surface des précurseurs de substitut cutané des kératinocytes en une concentration de 2,5 x 105 cellules par cm2. 3046421 16 Les précurseurs de substitut cutané ont été incubés pendant une première période d'incubation de sept jours en immersion dans le milieu de Green comme décrit ci-dessus, avec une concentration de 1mM d'acide ascorbique 2-phosphate et des antibiotiques ; ils ont été alimentés chaque jour. 5 Ensuite les précurseurs de substitut cutané ont été incubés pendant une deuxième période d'incubation de 21 jours, maintenus à la surface du liquide, dans un milieu de différenciation contenant du DMEM avec de l'hydrocortisone (0,4 pg/mL), de l'insuline (5 pg/mL), de l'acide ascorbique 2-phosphate et des antibiotiques ; le milieu de différentiation comportait de l'albumine de serum bovin à raison de 8 mg/mL. 10 On a ainsi obtenu des substituts cutanés. Ils peuvent être utilisés pour effectuer des essais de produits cosmétiques ou chimiques. La figure 2 montre une coupe transversale à travers un tel substitut cutané. On aperçoit l'épiderme comportant à sa périphérie une véritable couche cornée, et comportant des kératinocytes. La jonction dermo-épidermique est nette. Le derme comprend des 15 fibroblastes (sur la figure 2 on voit uniquement les noyaux, entourés par une ligne noire). Dans le derme on aperçoit des pores ; ceux-ci se replissent progressivement de matrice extracellulaire sécrétée par les fibroblastes. La figure 3 montre les filaments intermédiaires du cytosquelette des fibroblastes dans le substitut de derme (marquage immunohistochimique de la vimentine). On note la forme 20 tridimensionnelle du cytosquelette, qui ressemble à celle dans un derme naturel sain. Exemple 4 : Cet exemple rassemble des tentatives de fabrication de substituts de derme selon des procédés selon l'état de la technique ou des procédés nouveaux, qui ne donnent pas satisfaction. 25 Exemple 4a : Encre photopolymérisable à base de PEG diacrylate On a préparé un précurseur de substitut cutané avec une bio-encre à base de PEG-DA (polyéthylène glycol diacrylate) photopolymérisable en utilisant un procédé similaire à celui décrit en relation avec la présente invention. Le photoinitiateur était le Irgacure TM 819 (Bis(2,4,6-triméthylbenzoyl)-phénylphosphine oxide, société CIBA). Après incubation 30 on a constaté un taux de mortalité cellulaire de 100% après 2 jours. Sans vouloir être liés par cette théorie, les inventeurs pensent que ce n'est pas le photoinitiateur en tant que tel qui est cytotoxique mais les radicaux libres dont il promeut la génération. 3046421 17 Exemple 4b : Encre selon l'invention mais sans fibrinogène On a préparé un précurseur de substitut cutané selon l'invention, sauf que la bio-encre ne comportait pas de fibrinogène. Dans ce cas, malgré une bonne tenue du gel, les cellules ne se développaient pas de manière satisfaisante au cours de l'incubation du fait de 5 l'absence de motif d'adhésion cellulaire au sein du gel Exemple 4c : Encre trop fluide On a utilisé le procédé selon l'invention, en utilisant différents types d'alginates qui se distinguaient notamment par leur viscosité : « Low Viscosity » et « High Viscosity » au lieu de « Very Low Viscosity ». On a constaté qu'avec l'encre « High Viscosity » on n'obtient 10 pas une extrusion satisfaisante. Avec l'encre « Low Viscosity » on peut régler le procédé pour obtenir des objets imprimés bruts, mais ce mode de réalisation est propice à l'instabilité de l'extrusion, et n'est pas préféré. Exemple 4d : Autres causes d'échecs Des échecs (formation d'un précurseur de substitut cutané de mauvaise morphologie 15 et/ou qualité) ont été observés dans les cas suivants : - Temps de contact trop court entre la bio-encré après son application et la solution de polymérisation (inférieur à environ quinze minutes) ; - Défaut d'immersion totale du dépôt de bio-encre pendant sa polymérisation ; - Vieillissement de la solution de polymérisation. 20 Exemple 5 : Fabrication d'une peau totale avec les 3 couches de la peau : hypoderme, derme et épiderme (procédé selon l'invention). Avec le même procédé il est possible d'imprimer les trois couches de la peau avec trois seringues différentes comportant la bioencre et des cellules différentes : - une première seringue contient des pré-adipocytes et/ou des adipocytes matures dilués 25 dans la bioencre. Cet hypoderme est imprimé en plusieurs couches. Il est imprimé en premier pour former la couche la plus profonde de la peau. - la deuxième seringue contient les fibroblastes dans la bioencre comme décrit dans le procédé. Cette partie de derme est imprimée en plusieurs couches à la surface de l'hypoderme préalablement imprimé 30 -la troisième seringue contient des kératinocytes dilués dans une bioencre un peu différente. Cet épiderme est imprimé en une seule ou plusieurs couches à la surface de la 3046421 18 couche du derme.On peut ajouter à tout moment à la suspension de kératinocytes, des mélanocytes en proportion 1/10 à 1/2, pour obtenir des peaux pigmentées. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'une bio-encre pour dépôt additif, dans lequel : (a) On approvisionne une première solution comprenant entre 5% et 40% massiques de gélatine (de préférence entre 6% et 30% massiques) et entre 0 % et 5% massiques de NaCI ; (b) (On approvisionne une seconde solution comprenant entre 1% et 12% massiques d'alginate (de préférence entre 1% et 8% massiques) et entre 0% et 5% de NaCI ; (c) On approvisionne une troisième solution comprenant entre 1% et 15% massiques de fibrinogène (de préférence entre 3% et 15% massiques), et optionnellement des cellules vivantes en suspension ; (d) On crée un mélange comprenant : environ 35% à 65% volumiques de la première solution ; environ 15% à 35% volumiques de la seconde solution ; environ 15% à 35% volumiques de la troisième solution ; ces proportions étant choisies de manière à s'additionner à 100%, et dans lequel procédé : - l'ordre des étapes (a),(b) et (c) est indifférent, - la teneur en NaCI est choisie de manière à ce que dans ladite première solution et ladite seconde solution réunies elle est comprise entre 0,2% et 5% massiques, de préférence entre 0,2 et 3% massiques, et encore plus préférentiellement entre 0,4% et 2% massiques. 2. Bio-encre susceptible d'être obtenue à partir du procédé selon la revendication 1. 3. Procédé de fabrication d'un substitut de tissu corporel, dans lequel : (i) on approvisionne une bio-encre selon la revendication 2 ; (ii) on approvisionne une solution aqueuse (dite « solution de polymérisation ») comprenant entre 1% à 5% massiques d'ions de calcium et entre 5 U/mL et 40 U/mL (et de préférence entre 10 U/mL et 30 U/mL) de thrombine ; (iii) on porte ladite bio-encre à une température T1 supérieure à son point de gélification et on la dépose sur un substrat se trouvant à une température T2 inférieure au point de gélification de ladite bio-encre, où elle gélifie pour former un objet de forme tridimensionnelle contrôlée dit « objet imprimé brut » ; 3046421 20 (iv) on traite ledit objet imprimé brut avec ladite solution de polymérisation pour consolider ledit objet imprimé brut en un substitut de tissu corporel ; (v) optionnellement, dans le cas où ladite bio-encre comporte des cellules vivantes, on incube ledit précurseur de substitut corporel dans un milieu de 5 culture cellulaire. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel T1 est compris entre 27°C et 32°C et T2 est comprise entre 4°C et 20°C. 10 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel le traitement dudit objet imprimé brute avec ladite solution de polymérisation est effectué par trempage, à une température T3 supérieure à T1 et de préférence comprise entre 35°C et 38°C. 15 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel o ledit précurseur de tissu corporel est un précurseur de substitut cutané, et o ladite bio-encre comprend des cellules vivantes en suspension qui sont des fibroblastes ; o ladite incubation est effectuée à une température comprise entre 36°C et 20 38°C et comprend une première phase d'incubation comprise entre huit et quarante jours, et une deuxième phase d'incubation entre cinq et dix jours, sachant qu'entre la première et la deuxième phase on dépose sur la surface dudit substitut cutané une suspension aqueuse de kératinocytes. 25 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit objet imprimé brut comprend une surface supérieure sensiblement plate et présente une répartition homogène de fibroblastes, qui est comprise entre 0,5 et 10 x 105 (et de préférence entre 1 et 5 x 105) fibroblastes par cm2 de surface supérieure plate. 30 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la quantité de kératinocytes déposées est comprise entre 0,5 et 10 x 105 (et de préférence entre 1 et 5 x 105) kératinocytes par cm2 de surface supérieure plate. 9. Substitut de tissu corporel susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une 35 quelconque des revendications 3 à 8. 3046421 21 10. Substitut de tissu corporel selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un substitut cutané comprenant : o une couche de derme comprenant des fibroblastes, o une couche d'épiderme, et 5 o une couche cornée comprenant des kératinocytes.