FR 3041260 A1 20170324 FR 1558899 A 20150921 UTILISATION D'UN TRIPEPTIDE CYCLIQUE PO .:"R. S11MULER L'AC' .VILUL Mfl'OCHONDRIALE DE. CELLULES, nreseme invention concerne le domaine de 1 assistance médicale à la procrL.Llion (.A\-IP ) et plus uénéralement toutes les applications médicales. vétérinaires ou autres dans lesquelles une stimulation de l'activte mitochondriale des cellules est souhaitée, en particulier lors de protocoles comportant une étane e culture cellulaire ou de maintien de cellules ex vivo. Plus de 1 5o des couples ont recours ù l'Assistance Médicale à la. 10 Procréation nu cours de leur vie génilale. Lorsque que le sperme est altéré, il est fréquent de recourir aux techniques de microiniection pour obtenir des fé.condhtions. Cette technique est trés invasive pour yocyte. Par ailleurs. lors de fécondations in vitro (11V) avec sperme normal. on retrouve réi,tufjèrenient. 3 û d'échecs de fé.condation inexpliqués. Dans unie demande de brevet antérieure (.\\..0 2005/051799 A21, l'équipe 15 des inventeurs u décrit untripeptidt- cyclique (Phe. Ac Glu. Ac Glu) de formule (SFQ ID No : I) avec une liaison de cyclisation entre les deux cvstéines terminales (11E:c). ainsi que son action augmentant les capacités fécondantes des gamètes Hmains. Il existe des équivalents de la molécule dans les différentes espèces animales avant les mêmes propriétés et ,alctnent décrits dans ce document. 20 Poursuivant leurs recherches, les inventeurs ont mis en é^.idence que la molécule ET-Tc a un impact sur les spermatozoïdes (exemple 1 ci-dessous). En particulier, elle améliore les paramètres du mouvement spermatique tels qu'analysés par CASA (C.:on/pu/or S.). Ainsi. par exemple, la vitesse linéaire et ramplitude du débattement 25 latéral de la tète sont respectivement ati'mentes de 7 et S (1.1(.1)(0.05 et P Dans ce qui précède_ le peptide cyclique comprenant; le lripeiMice reproduisant un site de liaison de la *I-eitiline béta à rintéLtrillc de l'ov(eyte" correspond nu peptide' décrit dans la demande de bre \tel: \VO 2005/051799 A2 mentionnée ci-dessus. Comme mentionné dans cette demande antérieure. notarnH1ent dans la Table 1, le trineIiue -varie selon les espèces. 11 peut être cyclisé par tout moyen connu de l'homme du métier. en particulier par l'intermédiaire de deux résidus cvstéines situés de part et d-autre du tripeptide. De manière Uenér toutes les déclinaisons décrites dans la demande WO 2005./051799 A2 sont considérées comme répondant à la définition du "peptide cyclique comprenant le tripeptide rormani un site de liaison de la fertiline béta rmté,rIni: de l''ovt:tevte" au sens de lu présente invention. Pour faciliter :a lecture du présent texte. Ce peptide cyclique. ainsi que le médicament le contenant à titrc de principe actif. seront désiuné ici par la formule "I'FFc' L'honni-1e du métier comprendra parfaitement celte notation eot.nTe également les formes utilisables chez dautres espèces que l'homme.. telles que. par exemple. le tripeptide cyclique oLli devrait être utilisé chez les bovins. Action en Insémination Intra Utérine En améliorant les paramètres du mouvement spermatique, elle e eiialement susceptible d'améliorer les latI'x: de grossesses en Insémination Intra Utérine (tli ) Selon un premier aspect particulier del'invention.; le FEEe est utilisé pour auumemer la vitesse (le pronression (tes spermatozoïdes dans un protocole de procréation médicalement. assistée (PNIA). Toujours dans ;e cadre d une AMP, le FFT.c peut etre utilisé pour augmenter le taux de spermatoYoïdes hyperactivés. Aussi« l'utilisation du 1:1-Te est particulièrement intéresszmte dans un protocole d'insemination intra utérine tant chez l'homme que chez mammifères non humains. I.ors de la mise en oeuvre de cet aspect de l'invention. les spermatozoïdes sont de préférence incubes pendant une minute à 3 heures en présence de 10 à 100 aM de peptide avant 1 insémination intra utérine. Action sur l'ovocyte La molécule est également efficace sur les ovocytes. La maturation in viiro des ovocytes humains bloqués en vésicule tierminale passe de 33.5% à 42,5% ers présence de FFT.c (exemple Chez les patientes fitiée.s de D / ans et plus. ce taux passe de 23.20% à 49.6%. cc qui montre que la molécule est particulièremen t. efficace dans cette tranche e. Les ovocytes des femmes de 37 à 40 an:-; sont aneuploïdes dans 50% des cas du fait d'une chute de leur activité mitoehondriale. La molécule est donc susceptible d'améliorer la ploïdie 3041260 de ovocytes et par là même celle des embryons dont le potentiel dc développement et la capacité implantatoire dépend également de 1 activiLe mitochondriale des ovocytes. LauL>mentation significative des taux de grossesse chez les lemmes de moins de 37 ans. dans le cadre de rétude Fertilinc décrite ci-dessous, inontre que cet effet bénéfiqueu lieu sur tout ovocyte et notamment lors de sa fécondation et du développement embryonnaire précoce. -i_tryo.létricntation des milieux de culture de fécondation in viiro avec la molécule perme: done daméliorer la maturation ovocytaire (notamment polir les femmes de 37 ans et plus) et le taux de fécondation en FIV classique, ainsi qu'en T'IV avec ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïde). La supplémentation des milieux de culture lors de la fécondation h vitro. avec ou sans micromanipulL.ttion, avec la molécule FER: permet donc d'améliorer le taux dc irrossesse et cl-entants nés. Action dans les protocole de .41a.turation In Vitro (MI L9 15 La molécule FI Ne est aussi susceptible d'être efficace dans les protocoles de maturation in vitro des ovocytes pour la préservation de la fertilité (M l\'). Dans un protocole de fécondation in vi, la maturation de l'ovocyte en i.énéral achevée lors du recueil des ovocytes. Toutefois. il arrive que des ovocytes soient encore immatures. En outre, certaines femmes présentent des anomalies de la tbnction 20 o' ...arienne qui rendent les stimulations difficiles. 1 es ponctions (mi tlors volontairement lien un stade immature pour une maturation in I e peptide pourrait efficacement aider à cette maturation ( Inaturation in vitro i)our la préservation de la fertilité). Lovoe totalement immature présente un grand appelé vésicule germinale (VG). L'ovocyte mature se caractérise par la présence du 1 g1olonle polaire (G1)) 25 dans 1-espace périvitellin (entre la surface de rovoe\ te et ln zone pellucide). Seuls les ovocytes matures sont fécondables. Les inventeurs ont mis en évidence que le FFF.c permet d.améliorer la maturation des ovocytes in vitro. Ceci s'expliquL-: par Faret du tripeptidc sur l'activité mitochondriale. En effet. Factivité mitochondriale diminue avec Fage et la maturation de 30 rknoevte comporte. plusieurs étapes très consommatrices d'énergie - Rupture de la Vésicules Germinale - Formation des Chromosomes - Formation de la plaque. Métaphasique - Formation du Fuseau 35 - Synilièse des protéines dc Checl.;.-Point - "felopbase - hPLilSiOti du GR 3041260 4 Or ces troubles de la maturation ovoeytaire qui apparaissent avec 1 ibe sont corrigés par la microinjection de mitochondries provenant de cellules ;eunes (ovocytes (le donneuses jeunes ou cellules souches ovogoniales). Cela renforce la probabilité selon laquelle le Fl.:11ic ont L.' eetivement le défaut cellulaire lié à une insuffisance mitochondriale. 5 Selon un aune c.le ses aspects, la présente invention porte donc sur titlisation du F17.17c pour améliorer la maturation in riicu «un ovocyte. Selon une mise en oeuvre particulière de cet aspect de l'invention. les ovocytes 'Proviennent de femmes iigées dc 36, 37, 38. 39, 40 ans ou davatuaue. L'amélioration de la qualité de la méiose est probablement à l'origine de le baisse du taux de fausses couches observée éLuilernent chez des 10 rimes plus jeunes. si bien que cet aspect de [invention est également intéressant pour améliorer la maturation in vitro des ovocytes de fermnes de moins de 37 ans. Dans ia mise en oeuue de cet aspect de l'invention, [ovocyte est incubé pendant une durée comprise entre 1 heure et 24 heures en présence de 10 à 100 uM de peptide. 15 Action sur l'activation de l'ovocyte econdé s inventeurs ont L....alentent mis en cvicence une augmeniation de la decondensation de :a tète dc.-; ..-Terinatozoïdes. Cela traduit une amélioration de [activation de [ovocyte lors de la .1:,..condatioil. Celle ç i est d'ailleurs liée à I activité mitoehondrialc de l'ovocy te. 20 Action sur 1(1 blastg rmation Les inventeurs ont également in ;s 011 évidence (chez la souris) que le 1=iIc permet une arne:loration dc la blastoformation. Ceci peut également être auriblie ïl l'Crrel du tripeptide sur l'activité mi',oehondriale. En effet_ il est connu qu'i7. n'y a pas de réplication 25 mitochondriat pendant rembryogénèse nrennplaniatoire. Pendant la première semaine de développement. le zygote (ou oeuf') se di'ise par mitoses successives en commençant par 2, puis 4 cellules. en passant par le stade de morula jusqu'à atteindre le stade dc hlastocyste. en utilisant uniquement les mitochondries initialemen!. présentes dans rovoeyte. Un déficit mit(1chondrlal (en nombre ou en rendement) peut done étre à l'oriuine 30 d'une instabilité chromosomique des blastomères lors de la mei(me et des mitoses, et conduire à un arrêt de [évolution du zygote. de l'embryon, voire de la grossesse. Ceci est une cause fréquente de fausse couche spontanée après fécondation naturelle ou après transfert des embryons lors d'une FR'. La présente invention porte donc égaiement sur l'utilisation du l'Hic pour 35 anréliorer la ploïche des blastomères pendant la première semaine de développement du zygote. Dans la mise en oeuvre de cet aspect de ivention. 1 emU.on est incubé pendant- une durée comprise entre 24 heures et 6 jours en présence de 10 à 100 p Nil de peptide. 3041260 Les utilisations décrites ci-dessus swit pariiLu.,crement utiles dans un protocole de fécondation in vitro (l' IV Chez l'humain. elles t3crmettent notamment à des femmes de 37 38. ans et davantage d'avoir des enfants par ,..\.\11) avec leurs propres ovocytes sans recourir aux injections de ntitochondries décrites dans la littérature (effet majeur le plus document,. usqu'à p1'esenrl. Diminution des risques de. (lusses couches prscrite invention porte é.Ézalement sur l'utilisation du FEFc peur diminuer les risques de fausse couche. comme cela est illustre dans la partie expérimentale ci-10 Diminution des risques dt trisomie La présente invention porte _!'e.alernent sur 1-utilisation du 1.'F} e pour diminuer les risques de trisomie lors d'une t IV. notamment chez des femmes d'au moins 35, 15 36, 37. 38. 39 ou 40 ans. Action en reproduction naturelle nien que les effets du 11:1:,c sur rovoc\.-te et le zygote aient été démontrés par le inventeurs dans un contexte de. l'IV. il est évident que ces eFeis pourraient ètrl 20 obtenus également lors des fécondations naturelles. par exemple par administration. au moment de l'ovulation_ de l'He par voie N.agiruile. le tripeptide étant couplé à des mar :-.ms ;1711.4._:- vectoriser \ te. Action lors (le la cryoprésc'!ycftion des gamètes et des embryons 25 ll a ée.alemem été montré que le taux de survie des ovocytes cryonréscrves dépend entre autre de leur activité mitochondriale. il est probable q en soit de inèine pour les embryons. Le peptide est donc susceptible d'améliorer les taux de survie et ou la qualité est gz.unetes et embn..-ons crvoprés.ei vés lors de leur décongélation. 30 Action sur d'autres types cellulaires Le tripeptide cyclique: a été fttbrigué pour se lier i. l'intégrine u6[3] sur l'ovocyte. I1 est capable de se lier à la membranc cytoplasmique de différents autres types cellulaires car cette .rine est très ubiquitairc. Cette molécule est donc vraisemblablement capable d'augmenter l'activité énergétique de nombreux types cellulaires. File est done potentiellement susceptible d'utilisations multiples en dehors de la 11V. 1.e mode d"action de la molécule se faisant probablement par I ntCrnidiaire de l'intégrftie a6P1 le FEFe est susceptible d'avoir des effets sur beaucoup d'autres types 3041260 6 cellulaires. Cette molécu.:!,e pourrait être utilisée pour améliorer le rendement de tonte culture cati:air Comme mentionné plus haut. le agit possiblemen: par 1 intermé.diaire del u.6 ou d'un autrc récepteur. piicsCla sur de nombreuA uipes cellulaires. Il peut 5 donc. être utilisé pour améliorer l'acti-\ ité mitochondriale de toute cellule porteuse de cette intCerinc ou de cet autre récepteur. line application immédiate de cette Propriété est l'amélioration du rendement de toute culture eï Llulaire. La présente invention porte donc également sur un procédé d'amélioration de l'activité mitoelondriale Ill cc mies in vitro, comportant une étape de mise en présence des cellules en question a\.ec le Ce procédé 10 peut avantageusement. être mis en oeuvre sur des cellules primaires cultivées ex vivo dans optique d'êre un patient dans le cadre d'une thérapie ceflulaire. A titre d'exemples non uni tau l de cultures cellulaires susceptibles de bénéficier de ce procédé. on petit citer les cultures de pent en vue du affes de peau. les cultures de lymphocytes en vue immunothérapies cellulaires, etc. 15 Action dans le monde animal ries mammifères La molécule présente une spécificité i1 espèce. Ses isoformes sont déclinables pour une utilisation chez, tous les animaux domestiques y compris les animaux de ferme dont certaines espèces se reproduisent difficilement (chevaux de course. vache Elolstein 20 (lion sur les pathologies mitochondriales et contre le vieillissement Tes propriétés du Ill lie comme molécule stimulai': l'activité. mitochondriale peuvent egalernent Cnre utilisées in vivo dans tout ..\ pe de pathologie liée à un défaut d'activité iniochondriale. cc titre. on peut citer. de façon générale. les patholouics du vieillissement. 25 L.t1 relation entre une dysfonction des mitochondries et les maladies nc.lirodeuénérati'es, par exemple. 19 été établie par plusieurs équipes. Aussi. le Halac pourrait être utilisé comme médicament pour traiter les maladies neurodégénératives telles due la maladie d-Maheimer ou tel maladie de Parkinson. Il a également été montré une relation entre la longueur des télomères des chromoomes et l'activité mitochonciriale de la cellule. Or le raccourcissement 30 des télomères est lié aux processus de vieillissement. il et donc possible qu'en sain-lu :am l'activité mitochondriale on soit à meme de retarder les effets du vieillissement. Les maladies mitc.)chondriales présentent un tableau varié mais associent nt.quemment des manifestations oculaires a type de rétinites pigmentaires ou d'ophtahnopleg' Pou:. ces dernières. une administration topique du Fric dans l'oeil, par exemple dans un collyre. pourrait améliorer les symptômes liés à l'insuffisance mit4cltondria1e. Un ature objet de l'invention est Clone un collyre comprenant un peptide cyclique comprenant le tripeptide formant un site de liaison de lu fertiline bétel fi. f'hné`griHi: de 1-ovocyte. T..n tel coll).re peut comprendre. outre e un autre agent tel qu'un agent 3041260 7 épaississant. un agent antiseptique. un antibiotique ou tout autre composé utilisable pour cc genre de produit. Les milieux décrits dans la demande WO 2005:051799 A2 sont bien entendu exclus de la définition du tenue H\-e' au sens de la présente inventIon. 5 Action en cosmétique La présente invention porte également sur Luiiisation du LEI k. dans une composition cosmétique ou thérapeutique destinée à une application topique. A titre d'exemples, on petit citer i'utiijstion du [ne pour stimuler les fibroblastes pour la production de collage ou pour stimuler les- follicules pileux pour favoriser la croissance des 10 cheveux, par exemp.le pour prévenir ou ralentir l'alopéc'.e. La présente invention porte done également sur une composition cosmétique ou dermatologique comprenant du FF.Fc it titre de principe actif Par "composition cosmétique ou dermatologique", on entend ici une composition qui. outre le 1:1-L.c. comprend des ingrédients usuellement utilisés dans le domaine dc la cosrnétologic. Selon l'invention. la composition cosmétique ou dermatologique 15 peut se présenter sous toute forme connue de nomme du métier. Il peut s'agir. par exemple, d'une émulsion huile-dans-l'eau. eau-dans-rhuile. eau dans silicone, dune émulsion multiple, d'une microémulsion, d'une nano-émulsion. dune émulsion solide. d'un gel aqueux ou hydroalcoolique, d'une crème. d'un lait, d'une lotion, dune pommade. d'une huile. d'un baume, d'un onguent. d'un masque. d'une poudre. d'un support imbibe. mir exemple un patch 20 transdermique, d'une lotion aqueuse OU hydroalcoolique et ou une cire. d'an produit de maquillage, par exemple un fond de. teinL d'un shampooii tg. d'un après-shampooing. dun masque. d'une sérum pour implication topique. d'une lotion capillaire. Les milieux décrits dans la demande WO 2005./051799 Aé sont bien entendu exclus de hi définition des compositions cosmétiques ou dermatologiques au sens de la présente invention. 25 Selon l'invention. la composition cosmétique ou dermatologique peut être. per exemple une composition pour le soin du visage, du corps, des cheveux, par exemple des compositions pour le visaoe etlou le corps et;ou les cheveux. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois limiter son 30 étendue. Légendes des igures Figure 1 : Variation du potentiel de membrane nd tochondrial en présence du IlL[c a roite) 35 versus peptide témoin "seramble' a gauche). Noter l'augmentation du potentiel de membrane chez les spermatozoïdes exposés. Figure 2 Comptage après excitation aux L V des spermatozoïdes humains fusionnes avec des ovocr tes humains dépeliucidés. incubés en l'absence (A) ou eu présence de FEEc à 3041260 100uM (13). Noter l'augmentation du nombre de spermatozoïdes fusionnés et la &condensation plus rapide de leur tête. gure 3 Proportion d'oy;.)cytes matures à 51 de Maturation In Vitro C.\TI-V). Représenilti011 schématique des proportions d'ovocytes humains en iriétaphase NUI) à partir du se.de VG après MIV dans le milieu témoin ou supplémenté en FEFe Ô. 1 00p.M.*p---0.02. " p-0,003. J1-2.411 de MIV. Figure 4 Proportion d'o^,-oevtes itrétiques àJi de Maturation ln Vitro (MIV). Représentation schématique des proportions d'ovocytes humains atrétiques. Résultats observés à .11 à partir du stade VG après maturation in vitro (M1V) dans le milieu érnoin OLI 10 seripléinCnté en Flic à 100wVi. FI -24h de MIV. Figure 5 -Nlarquage du fuseau méiotique obtenu sur un ovocyte humain en Mft après MIV dans le milieu standard (24h). Marquage du fuseau par un anticorps anti-u-tubuline et des chromosomes au DAPI. image obtenue an microscope confocal. A; ovocyte entier, B, agrandissement de la plaque métaphasique. 15 Figure 6 Comparaison du taux de fécondation Ô. .11 entre les souris jeunes et âgées en présence ou en l'absence de fe.rtiline, oui correspond au peptide QDF.c. .1eunes : souris B6CBAFi de 7 semaine ées souris R6(.1-3ATT1 de 7 mois Figure 7 : Comparaison des pourcentages moyens d'embryons clivé 12 et à .1,1 ci ire les souris jeunes et âgées. en présence ou en l'absence du peptide Q1..)1..;e. 20 Jeunes : souris 116C13/11.:1 de 7 semaines (n-108 ovocrtes 56 ternons. 52 Ql.)12,e) Anées souris B6E:13AH de 7 mois 01-128 ovocytes. 65 témoins: QDrc 0,02. Figure 8 : Comparaison des pourcentages moyens d'atrésie ,ATR a J 2 entre les souris jeunes et 2nécs. en présence Ou en l'absence du peptide QDF.e. 25 Jeunes souris 136CHAF I de 7 semaines n-, 8 ovocytes. 56 témoins. 52 Q c 1_-,5 souris B6C13.,\FI dc 7 mois (n-128 ovocytes. 65 té.11.1.0inS. 63 QDlict. 'Figure 9 Représentation sehénumque de la méthodoloine de l'étude réalisée dans 1- exemp e Figure 10 : Résultats préliminaires des critères de jugement principal et secondaire dans te cadre de l'étude clinique. Faux de grossesse par transfert d'embryon frais ou congelé Iproripe témoin. n-17 transterts/groupe ITEc, n-13 transferts). Pourcentage de « top embryon (groupe témoin, 11=75 embryons clivés/groupe FEEe. n---/ Taux de fécondation (groupe témoin, n-259 Miliiiroupe Fille. n-246 I : 'taux de grossesse obtenus dans le cadre de l'étude clinique. 35 3041260 NIitériels et Méthodes Tes exemples expérimentaux présents ci-des:sons ont cté obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants : Observation des paramètres du mouvement spermatique Les spermes étudiés om chacun été divisés en 2 aliquotes dont. [une a été incubée. avec le ILL et l'autre avec un peptide z scrambie » contenant les males acides aminés ruais dans un ordre aléatoire. Les inventeurs ont incubé pendant. 311 à 37°C. des spermatozoïdes de l'espèce 10 humaine en présence d(..- :On uM du peptide ITEc ou du peptide scramble puis ont observeles p:.amètres du mouvement spermatique selon une anal se automatis.ec (Conipme./ Assis/cd ( A SA). es paramètres spermatiques testés sont les suivants : la VAP lissée, lu la VCL et IsA1.1-1. Ils correspondent respectivement à la vitesse selon la raiectoire moyenne. la vitesse 15 en ligne droite (ra.o'. Line 1:uiociiv), la vitesse cur i lAine et le déplacement latéral de la tète. L'étude a montré une augmentation significative du pourcentage de spermatozoïdes hyperaetivés (selon les critères de Mortimer et a. Cela est de nature à expliquer l'augmentai ion destatu,;.- de fécondation obsené en présence du peptide. 20 Mesure du potentiel de membrane mitochondrial Les inventeurs ont, incubé pendant 3h à 37C. des spermatozoïdes de I espèce humaine en présence soit du peptide l'LLe soit du peptide "scramble" qui comprend les tnémes acides aminés dans un ordre aléatoire et constitue ainsi le groupe témoin. Après lavage, les spermatozoïdes sont marqués grâce à un colorant lipophile fluorescent. le DIUC6. 25 Le potentiel de membrane mitochondrial (gradient protonique au niveau de la membrane interne de lu mitoeltondrie) a ensuite été mesuré par cvtoinétrie en flux. 11 se trouve augmenté dans cs spermatozoïdes après exposition au FEE. Mesure de l'index de fécondation 30 Des ovocytes humains dépellueidés ont été incubés avec des spermatozoïdes humains en l'absence ou en présence de [1.1.e. à 100 t:v1. 1 s spermatozoïdes fusionnés ont été décomptés après excitation UV. Les spermatozoïdes ont été considérés fusionnés lorsque le noyau était marqué au TIOECI-IST 33342. De plus les têtes des spermatozoïdes ayant pénétré l'ovocyte en présence du peptide FIT sont non seulement plus nombreuses niais présentent également un 35 aspect flouté témoin de la décondensation de leur tête spermatique. Cette décondensation est une des premières étapes de [activation (.)vocytaire après la pénétration du spermatozoïde. Nous pouvons donc cri conclure que le FEL non seulement améliore la Isécondance du. spermatozoïde niais Qu'il active également I ovocyte fécondé. 3041260 10 (7olfecte des fflumpes humains en vue de la Maturation In Vitro Ont) Des ovocytes humains inmta.tures donnés à la recherche Ont été collectés au sein du laboratoire de Lecondation in Vitro (FIV) du Centre d'Assistance \lécii cale à la Procréation (A.M.P) de l'hôpital Cochin (Paris. France n Deux heures apres la ponction ovoeytaire. les ovocytes destinés à. étre microinjeetés ont été decoronises pu la hyaluronidase Limonest. France). Après observation au microscope inversé U loffman t. les ovocytes immatures au stade vésicule germinative (..VG) ont été retenus pour la suite des cxperiences. 0 illaturation hi 1,"itro (lin) des ovocytes humains immatures 1.es ovocytes humains immatures au stade VG ont été randomisés. soit dan le milieu de culture témoin (Global, JCD. La Mulmière. France) (n-203) soit dans le même milieLi supplémenté avce 100 uNI dc ld.il.LC (n-103). Les oyoc) tes humains immatures ont été classés en den. groupes : ceux appartenant aux femmes âgées de moins de 37 ans et ceux appartenant 15 à celles âgées de 37 ans et plus. Le jour (.1e la ponction folliculaire. les deux groupes ovocytes au stade VG ont été incubés dans des gouttes de 20u1 recouveries d'huile. ei maintenus a 37C. sous dc CO2 pour être observés au microscope inversé (Floffivan) a .1 i (24h d'incubation) et .12 (48n d'incubation). 1,es ovocytes étaient classés en inéu..tnhase 11 (1er globule polaire dates l'espace perivitellin), vésicule germinative (V(j). métaphase I (rupture de 20 la vésicule germinative sans expulsion du niobule polaire) ou atrétiques. Collecte des ovocytes mutins Cil vue de la Maturation In 1-7tro (Mn) Des femelles B6C1.3A.F1 -tuées entre -1 8 sen-laines) fournies par le laboratoire Charles River (L-Arbresie. I rance) ont été stimulées par injection de PMSG (Pregnunt S'L, ru m 25 Gonadorrophin) à 101:1 ( S KINI A-A 1.. ))R int. Saint-Quentin l'a! lay ier. France) sans déclenchement de l'ovulation. 1...es ovocytes immatures ont été recueillis dans los ovaires 48h aprés cette dernire injection. nuis dénudés de leurs cumulus grâce à la hyaluronidase et lavés à trois reprises dans du milieu de culture M2. Seuls les ovocytes classés en VG ont été retenus pour la suite des expériences. 30 (114D) des ovocytes de souris immatures Les ovocytes de souris ont été incubés de maniere randomisée entre le milieu standard d'une 'Nl et le milieu supplementé en Q1)1.....c 100 uN1 d'autre part. Les boîtes de culture. ont été préparé la veille et incubées à 37'(.: sous ..5/0 de CO,. Les ovocles ont été observés à JO (8h 35 post-sacri Lice) et. .1 I 2411). 3041260 11 inumuio uor?sCeI!ce Les ovocytes humains issus de \ln/ ont été fixés dans Je parafmnaldehvdc (PFA) 2% pendant 11] à température ambiante puis lavés dans le PLIS contenant 0.5% de BSA. La perméabilisation a été assurée par incubation des ovoc '.'s clans une .01.ution contenant 0.5% 5 de BSA. 0.1H1) de Triton X-100. 0.05% de Tween-20 Ci _ 0 de sérum normal de chèvre. Puis les ovocytes ont été lavés dans le PBS-BS2.1. 0.5% avant d. être incubés toute la nuit dans une dilution au 1:200 «anticorps anti-a tubuline humaine (SIGMA-ALDRICH) dans du PBS cornenani 0.5% de BSA. Les ovocytes ont ensuite été incubés 1h en présence de [anticorps secondaire de type IgG conjugué Fluor (LIFE TECHNOLOGIES. Alfortville. 10 1...:.ance). Après une étape de lavage, les ovocytes ont été incubés 10 min dans du DAPI (dilué au 11 ON) avant dètre montés sur lame et observés en microscopie confocale dans l'obscurité. Pour I-ana:yse du fuseau. les ovocytes avec des libres de microtubu:cs distincts et bien organisés associés à un alignement parfait des chromosomes au niveau de la plaque métaphasiquc sont identifiés comme normaux. 15 Stimulation et accouplements des souris Des femelles R6C.RAF1 "jeunes" âgées de 7 semaines et "âgées" de. 7 mois ont été accouplées avec des mâles CS7N après superovulation. cette dernière consistant à injecter la PMS0 à 1OUI (SIGMA-ALDRICH) suivi du déclenchement de ovulation par .ichninisn-ation 20 (Human Chorionic (ionadotrophin) à IO Li (SIGMA-ALDRICH), 46-48h après. Le lendemain de Faceouplement, les souris présentant un bouchon \'aginal ont été sacri liées. Les ovocytes ont été recueillis dans les oviductes 15-1611 après l'injection d'hCG et le taux de fécondation a été évalué par la présence du second globule polaire dans l'espace périvitellia. 25 incetbation des ovocytes fécondés de souris Les ovocytes de souris Uécondés après accouplement et recueillis 0111 été randomisés en 4 groupes (jeunes «exposées au peptide QD1 cyclique (Q.D.L.c.). jeunes contrôles. iées exposées au Q1-..)F.c. âgées contrôles) et disposés dans des gouttes de milieu de culture (1.KSC.).\1) de 24.1. pour les témoins et supplén-lentés avec I 001.iN4 de QDFc pour les exposés. 30 T...e.Nposition u duré dc .T1 à .14 après l'accouplement in vivo (.10). I.e ODEc est équivalent au FFFc humain. L'incubation des boites de culture est réalisée à 37CC sous 5% dc CO c cules sont recouvertes d'huile minérale. Les ovocytes ont été observés tous les jours à la loupe binoculaire pour i:mrecier les signes de développement embryonnaire, La cinétique de des normale correspond au 35 Minimum. à à un embryon clivé à 2 cellules et à J5 un embryon au stade: morula ou blastoevste. 3041260 12 Enfile prospective randomisée en FIV humaine Un essai clinic;ue a clébuté au sein du laboratoire de 1:1\.' du Centre d'AMP do Cochin. 08/09/201.1. sur 66 couples la inoyenne d'âge étant de 34.3+/- 42 ans pc.L11 fentIneS JIM -.nir leurs partenaires. il s d-une étude prOspCcIiA C. monocentriquc randomisée. (les Fécondation In Vitro (UV) réalisées en présence ou en l'absence de FEL.c. Les ovocytes, récupérés dans leurs cumulus. ont été répartis en deux groupes alternativement dans l'un puis dans :-autre en ibnction de leur ordre de récupération. Lorsque tous les ovocytes om été récupérés. uri technicien nayant pas participé au recueil des cumulus déterminait par r11(1o111sIon lequel des deux groupes était ins.éni en p sellée de FIEEc 10 lequel servait de témoin. Line partie des ovocytes est incubée dans t 7-nilieu de c.ulture standard (Global...ICD). Fautre partie clans ce mente milieu supplémenté en FFEc (JOLC\4. méthodologie de cette étude. schématisée& la fiare 9, est présentée ci-dessous. Des ovocytes humains provenant de femmes âgécs de 18 à 43 ans ont été récupérés par ponction des ovaires après stimu:Hon hormonale par les gynécologues. Ils ont été répartis de manière 15 randomisée en 2 groupes : les ov(..)cYtes incubés en présence «un milieu de culture standard supplémenlé en 1+17e a 100 u.V1 ou d'un milieu de culture standard (Global..1CD) puis placés dans un incubateur à sous une atmosphère de 5 o de CO. 1...es spermatozoïdes du e.onjoinr ont été récupérés au laboratoire et les plus mobiles, sélectionnées scion une préparation standard des centres d-AMP. La 1-1V consiste en la mise en présence des spermatozoïdes et , 20 (...; ovocytes dans le milieu d'insémination à raison d'une concentration de t0. spermatozoïdes sélectionnés ml dans des gouttes de 20 microlitres sous huile. 1:insémination a ieti dans un incubateur è 37°C. sous 5% de CO: pendant 18 heures. I Sh après l'insémination Op. in decoronisation des ovocytes est effectuée. Les ovocytes fécondés sont layés et transférés dans une autre goutte de milieu et mis en culture nour 24h supplémentaires. Lors du 25 transfert in utéro, ils sont invés trois l'ois, puis mis dans un milieu de transfert et placés dans la cavité utérine. 1,es embryons sont transférés selon leur qualité apparente sans se soucier du groupe «origine. L11, OU plusieurs embryons sont transférés en fonction de l'âge, de l'indication de la l'IV. du ranir de. la. tentative et de la qualité (les embryons obtenus, et avec l'accord des couples. 30 I.e critère d'évaluaion principal est le taux de grossesse clinique par transfcr d'embryon frais ou congelé ct le taux de 1uussc couche cri tenant compte des 3 groupes : transferts homogènes (témoins et traites) et mixtes (mélange des deux). Les critères secondaires sont : Les taux de fécondation, e rapport du nombre de zygotes ayant deux 35 prenucleas dans le cytoplasme. 18 heures après insémination rapporté au nombre d'ovocyte en métaphasc..12 dans la cohorte. pourcentage d'embryon de bonne qualité j. e.. des embryons dont la séquence dc e ivage correspond à la séquence idéale soit : 4 à 5 cellules à .12 et 8 à 9 cellules à 3041260 13 J3 et dont iragmentation des blastomères est de type A tlortié;Oue le volume occupé par les framne'nts est inférieur à 10% du volume embryonnaire) ou B (lorsque le volume occupé par les Crcii'n1ents compris entre 10% c dit volume tota, de embryon). .A.insi ces eml-ryons dit lop » correspondent au rapport du nombre ii embryons de chaque type rapporte au nombre d'embryons total pour chru groupe. Ce protocole a rccu l'avis favorable du Comité de Protection des Per;onnes (CPP) Ouest vr le 13/12/2012. L'étude a obtenue l'autorisation de l'Agence de la Biomédecine le 08/07/2013. FIV est effectuée dans le strict respect des Bonnes Praliques Cliniques. Chaque couple accepl.:mt de participer a l'étude a gné un consentement libre ci é`claire. 10 .4nlli'.3'e statistique Les variables quantitatives ont été étudiées par leurs effectifs. moyenne et éeart°tvpc. Les données ont été comparées entre le groupe exposé et non exposé à I aide d un test approprie (test de Stedcnt ou test cle Wileaxon) pour les variables quantitatives. Les comparaisons de 15 pourcentages ont été effectuées grâce à un test de Chi-2 (y2) ou un test exact de Fisher. Les di fférences entre les données comparées ont été considérées commc statistiquement significatives lorsque la valeur de p (seuil de Si1211iikal.:Vité) était in rérieure à 0,0 5, Exemple Amélioration des paramètres du mouvement des spermatozoïdes el du 20 pourcentage de spermatozoïdes hvperactivés citez l'Homme Des expériences préliminaires ont montré que dons (est de survie sur 18 heures de spermes incubés en présence du peptide FEL la survie est signi:icativenient améliorée dans le u?roupe traité par le t'Id a la concentration de 10001 comparé au témoin. 25 Exemple Analyse antomatlsée des para triètre lF uvuieincnt spermatique après incubation en présence de FEEe et d'un peptide seramble pour témoin. Les résultats présentés dans le tableau 1 ci-dessous montrent une augmentation de la VAP lissée (p--0.008). de la VSL CD=0.048), de la VC1. (p S LIN ° SLI 1.2,6 50.9 1-- 12.2 NS Hyperactivation 12,3 ,E 9.7 15,9 +.11.6 0,009 29% Tableau I : Anal se automatisée des paramètu.s du mouvement spermatique compar entre :e- groupes témoin et après incubation en presence de LLE. Exemple 11) : Mesure du potentiel de membrane mitoehandrial Le potentiel de membrane mitochondrial savère être augmenté de.. I c'.4; en présence Liu peptide FI./1.:c par rapport au peptide scramble » (n 0,05. 15 Exemple 3 : Organisation du fuseau méiotique des ovocytes humains watt/rés in vitro La fleure 5 montre l'oreanisation incomplète et aberrante de l'alignement des chromosomes sur la p &ie niétaphasique avec des chromosomes non alionés. :image est obtenue a partir d- an ovocyte minant en \1I1 après 24h de MIt/ en présence du milieu contrôle. 20 Exemple 4 : Amélioration du taux de lécondation et du développement embryonnaire précoce chez la souris A .1 1. le taux de fécondalion reste inchan,,e chez les souris jeunes. tandis quil nasse de 39`!:, 51% chez les sourisSmgées (p 0.05). [es taux de fécondation sont de 66.2% parmi !es témoins contre 67.6% dans le groupe exposé au FEEc (p---.-0.05). Le taux de fausse couche spontanée précoce atteint 37,5°./0 (318) dans le groupe tcnnxn cow.re 11.1%. (1/9) lorsque I embryon a été expose au 1.1.1e tp:-).05) ;. Figure Pour les femmes écs de moins de 37 ans :près exposition au FEEe. les taux de fécondation sont de 70.9% contre 68.3% dans le groupe témoin. Dans e cas où rovocyte a été exposé au les :aux de grossesse atteignent 57.1% contre 20,03- dans le groupe témoin (Tableau 3 ci-dessoust. Taux laux ce Taux fécondation grossesse :1m:3s:esse FFE Témoin 111, Atc femme Nombre Taux (année) 1 couple (n) fécondation Témoin (e. 7-43 Tublept: 3 : [aux ,:>37 ou .,/ ans) P REVENDICATIONS1. Peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l'intégrine de l'ovocyte, pour son utilisation comme 5 médicament pour améliorer l'activité mitochondriale. 2. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament augmente la vitesse de progression des spermatozoïdes et/ou leur fécondance dans un protocole de procréation médicalement assistée (PMA). 10 3. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament augmente le taux de spermatozoïdes hyperactivés dans un protocole de PMA. 4. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans un protocole d'insémination infra utérine (IIU). 15 5. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que les spermatozoïdes sont incubés pendant 1 minute à 3h en présence de 1 à 100 µM de peptide avant l'insémination infra utérine. 6. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la 20 revendication 1, caractérisée en ce que le médicament améliore la maturation in vitro des ovocytes. 7. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 6, pour améliorer la maturation in vitro d'ovocytes humains. 8. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la 25 revendication 6 ou la revendication 7, pour améliorer la fécondation et l'activation ovocytaire. 9. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que les ovocytes sont incubés pendant une durée comprise entre 1 minute et 24 heures en présence de 1 à 100 jaM de peptide. 10. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la 30 revendication selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament améliore la ploïdie des blastomères pendant la première semaine de développement du zygote. 11. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour améliorer la cryopréservation des gamètes et 35 des embryons. 12. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans un protocole de fécondation in vitro (FIV). 3041260 2 13. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le médicament augmente les chances de grossesse. 14. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que le médicament diminue les risques de fausse couche. 15. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le médicament diminue les risques de trisomie. 16. Procédé d'amélioration de l'activité mitochondriale de cellules in vitro, comportant une étape de mise en présence desdites cellules cultivées ex vivo avec le peptide cyclique tel que défini selon la revendication 1. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des lymphocytes. 18. Composition cosmétique ou thérapeutique comprenant le peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l'intégrine de l'ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer l'activité mitochondriale, ladite composition étant destinée 'à une application topique. 19. Composition selon la revendication 18, ladite composition étant destinée à une application topique dans 20. Composition cosmétique ou dermatologique comprenant un peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l'intégrine de l'ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer l'activité mitochondriale. 21. Collyre comprenant un peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l'intégrine de l'ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer l'activité mitochondriale.30