FR 3043779 A1 20170519 FR 1560917 A 20151113 1 SYSTEME DE DETECTION ELECTROCHIMIQUE DE MOLECULES D'INTERET La présente invention se rapporte à un système de détection électrochimique de molécules d'intérêt ainsi qu'à une méthode mettant en oeuvre ledit système. La mesure d'une molécule biologique, notamment d'un ADN ou d'une protéine pathogène, dans un échantillon est très utile et nécessaire dans différents domaines d'analyse tels que le diagnostic, l'environnement, ou l'alimentaire. Cette détection se fait actuellement par le biais de systèmes d'analyse nécessitant un environnement technique et des outils lourds, telle que la PCR. Afin d'être utilisée dans le domaine d'analyse cliniques, le système de détection doit être sensible et permettre de quantifier dans un échantillon à analyser la présence des pathogènes même à de très faibles concentrations, par exemple de l'ordre de femtomolaire (10-15 mol/I), avec une très faible probabilité de faux-positifs. Les dispositifs électrochimiques s'adaptent à cette problématique. Il est connu de l'art antérieur que les biosenseurs indiquent la présence d'une molécule d'intérêt, notamment un ADN, à l'aide d'une sonde ADN complémentaire à l'ADN d'intérêt et d'une sonde redox donnant un signal électrochimique. Parmi les dispositifs de détection électrochimique de l'art antérieur, on distingue deux types de biosenseurs : les biosenseurs « signal-off » et les biosenseurs « signal-on ». Les biosenseurs « signal-off » produisent une diminution de signal électrochimique après l'hybridation de la sonde ADN avec l'ADN d'intérêt. En effet, la formation d'un ADN double brin contraint la sonde redox à s'éloigner de la surface de l'électrode réduisant ainsi le transfert d'électrons entre la sonde redox et l'électrode. Par exemple, Farjami et al. (Anal. Chem., 2011,83 (5), pp 1594-1602) décrivent la détection d'ADN par une méthode électrochimique impliquant un biosenseur, lequel comporte: 3043779 2 - une sonde ADN en épingle à cheveux immobilisée par son extrémité 3' sur une électrode en or, et - une sonde redox liée à l'extrémité 5' de ladite sonde ADN se trouvant à proximité de ladite électrode grâce à la structure en épingle à cheveux de la 5 sonde ADN. L'inconvénient de ce type de biosenseur est l'incertitude quant à l'origine de la diminution de signal qui peut être due à la dégradation ou au vieillissement de la sonde redox. 10 Les biosenseurs « signal-on » induisent une augmentation du signal électrochimique dès lors que la sonde ADN s'est hybridée avec l'ADN d'intérêt. Ces biosenseurs nécessitent : - une structuration préalable particulière de la sonde ADN pour permettre d'éloigner la sonde redox de la surface d'électrode ou de la masquer, 15 et - une adaptation structurelle de la sonde ADN pour chaque ADN d'intérêt. Lorsque le biosenseur entre en contact avec un ADN cible, l'interaction entre la sonde ADN et le biosenseur libère la sonde redox qui peut alors se 20 rapprocher de l'électrode et créer un signal électrochimique. La sonde ADN mise en oeuvre dans ce type de biosenseur peut être sous forme d'une structure double brin, voire triple brin, et éventuellement configurée sous forme d'épingle à cheveux. Xiao et al. (J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 11896-11897) décrivent un 25 biosenseur électrochimique d'ADN comportant une sonde ADN simple brin marquée par une sonde redox. Ladite sonde ADN forme une structure en triple brin permettant d'éloigner la sonde redox de la surface de l'électrode. Lors de l'hybridation avec la sonde ADN, la sonde redox entre en contact avec la surface conductrice ayant pour conséquence une augmentation de courant. Le 30 biosenseur électrochimique possède un seuil de sensibilité limité à 5nM. Le principal inconvénient des biosenseurs de type « signal-on » connus est la structuration nécessaire et complexe de la sonde ADN qui exige une optimisation pour chaque ADN d'intérêt à détecter. Par ailleurs, ces 3043779 3 biosenseurs électrochimiques d'ADN possèdent un seuil de sensibilité de détection non satisfaisant. Ainsi, il existe toujours un besoin, notamment dans les domaines 5 d'analyses cliniques et alimentaires, de développer un biosenseur électrochimique permettant la détection de molécules d'intérêt à de très faibles concentrations sans structuration préalable ou optimisation de la sonde ADN. La présente invention a pour objet de mettre à disposition un système 10 de détection électrochimique de type biosenseur « signal-on » dont la sensibilité est très élevée et dont l'adaptation de la sonde ADN n'est pas nécessaire. Le système de détection électrochimique de molécule(s) d'intérêt selon 15 la présente invention comprend : un matériau conducteur, au moins un nanomatériau portant des fonctions positives, lié de manière covalente audit matériau conducteur, au moins une molécule redox, et 20 au moins une sonde oligonucléotidique simple brin ciblant une molécule d'intérêt, ladite molécule redox étant liée de manière covalente à la fois audit nanomatériau et à la sonde oligonucléotidique, le nombre de fonctions positives dudit nanomatériau étant assez élevé afin de bloquer le transfert 25 d'électrons de la molécule redox vers le matériau conducteur, et notamment le nombre de fonctions positives dudit nanomatériau étant supérieur au nombre de sondes oligonucléotidiques. La présente invention repose sur le fait surprenant que l'interaction 30 entre les charges négatives des groupements phosphates de la sonde oligonucléotidique et les charges positives du nanomatériau permet une organisation tridimensionnelle telle qu'elle bloque le transfert d'électrons de la molécule redox vers le matériau conducteur. 3043779 4 En l'absence de la molécule d'intérêt à détecter, les groupements phosphates chargés négativement interagissent avec les fonctions positives présentes à la surface du nanomatériau. Ces interactions de type ionique impliquent un repliement de la sonde oligonucléotidique sur le nanomatériau 5 ayant pour effet d'empêcher le transfert d'électrons de la molécule redox vers la surface du nanomatériau. Dès lors que la molécule d'intérêt à détecter est présente dans l'échantillon analysé, la réaction entre la molécule d'intérêt et la sonde oligonucléotidique change la conformation de la sonde oligonucléotidique, par 10 exemple un ADN double brin se formant entre un ADN d'intérêt à détecter et la sonde oligonucléotidique, et interrompt l'interaction entre cette dernière et le nanomatériau, ce qui permet de démasquer la molécule redox et permettre le transfert d'électrons de la molécule redox vers la surface du nanomatériau. Ce transfert d'électrons engendre un courant faradique qui peut être 15 détecté par une méthode d'électroanalyse. Dans le cadre de l'invention, l'intensité de ce courant est proportionnelle au nombre de molécules d'intérêt interagissant avec la sonde oligonucléotidique. Par conséquent, la mesure du courant électrique permet d'indiquer la 20 concentration de molécule d'intérêt dans l'échantillon analysé. L'un des avantages du système de la présente invention est sa sensibilité élevée pour une molécule d'intérêt. Le système de la présente invention est capable de quantifier les molécules d'intérêt à de très faibles concentrations, notamment de l'ordre du femtomolaire (10-15 mol/L). 25 Un autre avantage du système de la présente invention est que la sonde oligonucléotidique simple brin ne nécessite ni structuration préalable particulière ni optimisation vis-à-vis des différentes molécules d'intérêt, du fait des interactions entre les charges négatives des groupements phosphates de la sonde oligonucléotidique et les charges positives du nanomatériau 30 permettant une configuration tridimensionnelle telle que le transfert d'électrons est empêché. De plus, contrairement aux systèmes de détection électrochimiques connus, le système de détection selon l'invention limite considérablement 3043779 5 l'apparition de faux-positifs, grâce à la forte spécificité de la sonde oligonucléotidique et au fort blocage de transfert d'électrons. Selon l'invention, on entend par « sonde oligonucléotidique » un oligonucléotide simple brin de 10 à 25 nucléotides, spécifique d'une molécule 5 d'intérêt, dont la fonctionnalisation à l'extrémité 5' ou 3' permet la liaison covalente entre ladite sonde et la molécule redox. A titre d'exemple, ledit oligonucléotide peut être fonctionnalisé par une amine. L'amine peut être séparée de l'extrémité de l'oligonucléotide par un lieur hydrocarboné contenant 1 à 10 atomes de carbone. 10 Ledit oligonucléotide simple brin peut être un ARN ou un ADN, éventuellement formant un aptamère. Par « molécule d'intérêt » susceptible d'être détectée par le système de 15 détection électrochimique de l'invention, on peut citer un ADN, un ARN, une protéine, une toxine ou une molécule chimique. Un ADN d'intérêt peut être un ADN génomique naturel isolé, un ADN viral, un ADNc synthétisé, ou un produit de PCR. Un ARN d'intérêt peut être un ARNg, un ARNm, un pré-ARNm, un siARN, 20 un microARN, un ARNi, un ARNt, un ARNr, un ARNsn, ou un ARN satellite. Lorsque la molécule d'intérêt est un ADN ou un ARN, la sonde oligonucléotidique ciblant ladite molécule est un ADN ou un ARN ayant une séquence complémentaire. La présence de ladite molécule d'intérêt dans un échantillon conduit à la formation d'une structure double brin qui est placée 25 perpendiculaire à la surface du nanomatériau. Lorsque la molécule d'intérêt est une protéine ou une toxine, la sonde oligonucléotidique ciblant ladite molécule forme un aptamère sur lequel peut se fixer ladite molécule d'intérêt comme ligand. La séquence d'une telle sonde oligonucléotidique peut être déterminée selon les connaissances de l'homme 30 du métier ou sélectionnée selon une méthode conventionnelle, telle que la technique SELEX (évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel). Conformément à la présente invention, on entend par « molécule redox » une molécule active pour une réaction d'oxydoréduction et capable de 3043779 6 produire un signal électrochimique mesurable par une méthode d'électroanalyse liée au transfert d'électrons entre ladite molécule redox et le matériau conducteur. Ce signal électrochimique permet d'indiquer la présence d'une molécule d'intérêt complémentaire à la sonde oligonucléotidique. 5 La molécule redox utilisée dans le système de détection électrochimique de l'invention peut être toute molécule redox connue de l'homme du métier, et plus particulièrement choisie dans le groupe comprenant le ferrocène, la quinone, le bleu de méthylène, les métalloporphyrines et le viologène. 10 Ladite molécule redox peut être fonctionnalisée selon une méthode conventionnelle afin de la lier de manière covalente à la fois au nanomatériau et à la sonde oligonucléotidique. Avantageusement, la fonctionnalisation préalable se fait par « chimie-click ». 15 Dans le cadre de la présente invention, les termes « molécule redox » et « sonde redox » peuvent être remplacés l'un par l'autre. On entend par « nombre de fonctions positives dudit nanomatériau étant assez élevé » que le nombre de fonctions positives est suffisamment important pour permettre un repliement efficace des sondes zo oligonucléotidiques sur lesdites fonctions positives. On entend par « le nombre de fonctions positives dudit nanomatériau étant supérieur au nombre de sondes oligonucléotidiques » que le nombre de fonctions positives portées par ledit nanomatériau est supérieur au nombre de sondes oligonucléotidiques liées de manière covalente au nanomatériau par 25 l'intermédiaire d'une molécule redox, ce qui assure un blocage efficace du transfert d'électrons entre les charges négatives des groupements phosphates de la sonde oligonucléotidique et les charges positives du nanomatériau porteur de fonctions positives. Le nombre de fonctions positives portées par un nanomatériau et le 30 nombre de sondes oligonucléotidiques peuvent respectivement être déterminé selon les méthodes connues dans l'art antérieur. Conformément à la présente invention, le nanomatériau portant des fonctions positives dudit système de détection électrochimique est choisi parmi le groupe comprenant : 3043779 7 - un dendrimère, préférentiellement un dendrimère de type de poly(amidoamine) notamment de deuxième, quatrième ou sixième génération (respectivement G2, G4 ou G6), - des particules métalliques comme des nanoparticules d'or, 5 - des nanoparticules magnétiques, telles que l'oxyde de fer, - des nanomatériaux hybrides à base de chitosan, et - des polymères conducteurs éventuellement modifiés par des fonctions positives, tels que le polypyrrole, la polyaniline, ou le polyparaphénylène. 10 Dans un mode de réalisation avantageux, le nanomatériau utilisé selon le système de détection électrochimique de l'invention est un dendrimère de type poly(amidoamine) (PAMAM), dont la structure est globulaire et dont le diamètre ainsi que le nombre de groupes amines primaires présent à la surface 15 dudit dendrimère augmentent en fonction du nombre de générations, aussi : - les PAMAM G2 ont un diamètre d'environ 2,9 nm et possèdent 16 groupes amines primaires, - les PAMAM G4 ont un diamètre d'environ 4,5 nm et possèdent 64 groupes amines primaires, et 20 - les PAMAM G6 ont un diamètre d'environ 6,7 nm et possèdent 256 groupes amines primaires. L'utilisation des PAMAM portant une haute densité de groupes amines permet non seulement de faciliter la fonctionnalisation par différentes substances, telles que différentes molécules redox, mais aussi d'augmenter le 25 seuil de la sensibilité dudit système de détection. Dans un mode de réalisation plus avantageux, le nanomatériau utilisé dans un système de détection électrochimique de l'invention est les PAMAM G4. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le nanomatériau utilisé 30 dans un système de détection de l'invention est des nanoparticules d'or fonctionnalisées. Les nanoparticules d'or ont un grand rapport surface sur volume permettant d'obtenir des matériaux structurés en trois dimensions utiles dans la construction de senseurs électrochimiques. 3043779 8 A titre d'exemple, les nanoparticules d'or peuvent être fonctionnalisées par la cystamine pour devenir un nanomatériau portant des fonctions positives. La cystamine comporte deux atomes de soufre pouvant s'attacher à la surface des nanoparticules d'or et laisser les groupements amines libres. 5 Ces derniers peuvent être fonctionnalisés ultérieurement. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le nanomatériau utilisé dans un système de détection de l'invention est des nanoparticules d'or éventuellement fonctionnalisées associées aux PAMAM G4. Les nanoparticules d'or améliorent la conductivité et augmentent davantage le signal électrochimique. L'association des nanoparticules d'or avec des PAMAM permet d'élargir la gamme dynamique du système de détection de l'invention. Le nanomatériau est lié au matériau conducteur par liaison covalente. L'homme du métier saura choisir une méthode adaptée à la nature du nanomatériau pour le déposer sur le matériau conducteur. 15 Par exemple, les PAMAM peuvent être déposés à la surface d'une électrode en carbone par électrodéposition. L'oxydation des groupements amines des PAMAM créée un radical cationique -NI-1.± qui interagit avec le groupement C=C en surface de carbone, mettant en oeuvre ainsi un greffage covalent. 20 Les nanoparticules d'or fonctionnalisées par la cystamine peuvent être déposées, par l'intermédiaire des groupements amines, à la surface d'une électrode en carbone, en utilisant préalablement N-(3-diméthylaminopropyI)- N'-éthylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) pour fonctionnaliser ladite électrode. 25 Dans le système de détection électrochimique de l'invention, ledit matériau conducteur joue le rôle d'une électrode et fournit une surface régulière pour l'attache des nanomatériaux. Ledit matériau peut être formé de carbone, en particulier de nanotubes de carbone, de carbone vitreux, de 30 graphite, de graphène ou d'un métal. Dans un mode de réalisation particulier, ledit matériau conducteur est une micro- ou une nano-électrode qui peut être dispersée dans une solution. 3043779 9 Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le matériau conducteur est absent dudit système de détection lorsque ledit nanomatériau porteur de fonctions positives est conducteur. Par exemple, des nanoparticules d'or, nanoparticules métalliques 5 (platine, argent, ...), d'oxyde métalliques, de quantum dot, de graphite ou de graphène peuvent être à la fois le nanomatériau porteur de fonctions positives et le matériau conducteur. Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un système de détection électrochimique comprenant : 10 - au moins deux types de molécules redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts, et - au moins deux types de sondes oligonucléotidiques en simple brin chacun ciblant une molécule d'intérêt différente, le même type de sondes oligonucléotidiques étant lié au même type de 15 molécules redox. L'utilisation d'au moins deux types de molécules redox chacun associé à un type de sonde oligonucléotidique dans ledit système de détection électrochimique permet de détecter simultanément au moins deux molécules d'intérêt différentes dans un échantillon. La présence de chaque molécule zo d'intérêt est indiquée respectivement par un signal électrochimique distinct. Ledit système est particulièrement utile pour détecter les SNP (polymorphisme nucléotidique) dans un échantillon. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un système de détection électrochimique comprenant : 25 - deux types de molécules redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts, et - deux types de sondes oligonucléotidiques en simple brin, chacun ciblant une molécule d'intérêt différente, le même type de sondes oligonucléotidiques étant lié au même type de 30 molécules redox. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un système de détection électrochimique comprenant : - trois types de molécules redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts, et 3043779 10 - trois types de sondes oligonucléotidiques en simple brin, chacun ciblant une molécule d'intérêt différente, le même type de sondes oligonucléotidiques étant lié au même type de molécules redox. 5 Un système de détection électrochimique selon l'invention peut être utilisé dans : - la détection des pathogènes, tels que les bactéries, les virus, les parasites, ou des biomarqueurs, tels que les biomarqueurs 10 oncologiques, les biomarqueurs de la maladie d'Alzheimer, les biomarqueurs de la maladie de Parkinson..., dans un échantillon biologique, ce qui permet le diagnostic in vitro ou in vivo de maladies, - l'identification de la résistance d'au moins un pathogène à un 15 médicament, - la détection de pathogène ou d'une toxine dans un échantillon agroalimentaire, pharmaceutique ou un effluent, par exemple les toxines bactériennes du genre Salmonelle, Staphylocoque, Aeromona, Escherichia coli, Listéria, Clostridium, ..., et 20 - le suivi de la présence ou l'absence d'au moins un médicament dans des fluides biologiques, notamment dans le cadre de traitements chroniques et/ou lourds comme la chimiothérapie ou la prise d'anticoagulant. Pour ce faire, le système de détection électrochimique selon l'invention 25 s'utilise selon les étapes suivantes : i. mise en contact dudit système de détection électrochimique et de l'échantillon, et ii. détection d'au moins un pathogène, d'au moins une toxine ou d'au moins un médicament d'intérêt. 30 A titre d'exemple, ledit système de détection électrochimique selon l'invention peut être utilisé dans la détection de l'Ochratoxine A. Ledit système de détection électrochimique peut être aussi utilisé dans la détection ou dans la discrimination de sites SN P. 3043779 11 Selon un mode de réalisation particulier, ledit système de détection électrochimique de l'invention comporte une sonde oligonucléotidique de séquence SEQ ID NO : 4. Ledit système peut être utilisé pour détecter Mycobacterium tuberculosis résistant à la rifampicine en discriminant le site 5 SNP (TCG/TTG) au sein du génome de Mycobacterium tuberculosis. L'invention a également pour objet de proposer une méthode de détection électrochimique de molécules d'intérêt au sein d'un échantillon. Ladite méthode comprend les étapes suivantes : 10 (i) la mise en contact d'un système de détection selon l'invention avec un échantillon susceptible de contenir une molécule d'intérêt, et (ii) la mesure électrochimique du signal redox spécifique de ladite molécule d'intérêt. 15 On entend par « mesure électrochimique », la mesure d'une variation du potentiel d'oxydoréduction de la molécule redox ou la mesure d'une variation de type ampérométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné ou la mesure d'une variation d'impédance à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées selon des méthodes bien 20 connues de l'homme du métier. Lorsqu'une molécule d'intérêt est présente dans un échantillon, son interaction avec la sonde oligonucléotidique permet d'interrompre l'interaction entre ladite sonde oligonucléotidique et le nanomatériau portant des fonctions positives, afin de démasquer la molécule redox, créant ainsi un courant 25 faradique. La mesure électrochimique permet de détecter ce courant, représenté par un signal redox. Ce signal est par conséquent spécifique de ladite molécule d'intérêt. La mesure électrochimique pour la mise en oeuvre de l'invention peut 30 être une mesure potentiométrique, une mesure d'impédancemétrie, une mesure coulométrique ou une mesure ampérométrique. Dans un mode de réalisation avantageux, la mesure électrochimique est mise en oeuvre par une mesure ampérométrique. 3043779 12 La mesure du courant électrique peut être réalisée au moyen des techniques ampérométriques connues, préférentiellement par une voltampérométrie à balayage de potentiel pouvant être linéaire, cyclique, à impulsion, ou encore du type à saut de potentiel, tel que la 5 chronoampérométrie. Selon l'invention, l'échantillon doit être à un pH pour lequel, au sein dudit système de détection, la sonde oligonucléotidique est chargée négativement et le nanomatériau est porteur de charges positives. En particulier, l'échantillon doit être à un pH compris entre 6 et 7. 10 Conformément à l'invention, ledit échantillon peut être un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel. 15 Selon l'invention, la méthode de détection électrochimique peut comprendre, en plus des étapes (i) et (ii) et après l'étape (ii), le dosage quantitatif de ladite molécule d'intérêt. La quantification de la ou des molécule(s) d'intérêt se fait à l'aide d'une courbe de calibration établie au préalable selon l'une des méthodes connue de l'homme du métier. 20 Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une méthode électrochimique de détection multiple d'au moins deux types de molécules d'intérêt. Ladite méthode comprend les étapes suivantes : 25 (i) la mise en contact d'un système de détection comprenant au moins deux types de molécules redox et au moins deux types de sondes oligonucléotidiques, tels que décrits ci-dessus, avec un échantillon susceptible de contenir lesdites molécules d'intérêt ; (ii) la mesure des signaux redox spécifiques auxdites molécules 30 d'intérêt. Ladite méthode permet de détecter simultanément au moins deux types de molécules d'intérêt. 3043779 13 La présente invention porte également sur un support modifié pour la préparation du système de détection. Ledit support comprend : - un matériau conducteur, 5 un nanomatériau portant des fonctions positives, et - au moins une molécule redox, ledit nanomatériau étant situé entre ledit matériau conducteur et ladite molécule redox et étant lié de manière covalente à ces deux derniers. Ledit support permet de fournir une plateforme prête à être 10 fonctionnalisée par des sondes oligonucléotidiques selon les besoins de l'utilisateur. Ledit support peut se lier, par l'intermédiaire de molécule redox fonctionnalisée, à un oligonucléotide dont l'extrémité 5' est également modifiée. 15 Ledit support peut être préparé selon la méthode suivante: - recouvrir un matériau conducteur par un nanomatériau portant des fonctions positives, en formant des liaisons covalentes entre ledit matériau conducteur et ledit nanomatériau ; - fonctionnaliser ledit nanomatériau portant des fonctions positives 20 par au moins une molécule redox également fonctionnalisée. L'invention prévoit également la méthode de préparation dudit système de détection électrochimique qui comprend : (i) la mise en contact dudit support modifié tel que décrit ci- 25 dessus avec au moins un oligonucléotide fonctionnalisé ciblant une molécule d'intérêt ; (ii) la formation des liaisons covalentes entre le susdit support modifié et ledit oligonucléotide fonctionnalisé. La méthode de préparation dudit système de détection électrochimique 30 nécessite la fonctionnalisation préalable de la sonde oligonucléotidique à l'extrémité 3' ou 5' et la fonctionnalisation préalable de la molécule redox à son extrémité libre. Lorsqu'elles sont mises en contact, ledit oligonucléotide fonctionnalisé et la molécule redox forment des liaisons covalentes au niveau des extrémités fonctionnalisées. 3043779 14 On entend par « oligonucléotide fonctionnalisé » un oligonucléotide dont l'extrémité 5' ou 3' est modifiée par une fonction active, telle qu'une amine, un acide, un azide, un alcyne, un thiol, ... et susceptible de mettre en oeuvre une réaction chimique rapide de type « chimie-click » avec un composé 5 comportant une autre fonction active compatible. Avantageusement, la présente invention propose également un kit de détection ultrasensible de molécules d'intérêt pouvant servir dans le diagnostic précoce ou ambulant. Ledit kit comprend: (i) un support modifié tel que décrit ci-dessus, et (ii) au moins un oligonucléotide ciblant une molécule d'intérêt. Ledit kit permet aux utilisateurs de préparer eux-mêmes à leur convenance un système de détection électrochimique selon l'invention et 15 d'éviter le vieillissement ou la dégradation de la sonde oligonucléotidique qui puisse donner de faux négatifs. Afin de se lier à la molécule redox contenue dans ledit support modifié, ledit oligonucléotide est modifié à son extrémité 5' par ajout d'un groupement amine. 20 Selon un mode de réalisation de l'invention, le kit de préparation dudit système de détection électrochimique selon l'invention peut comprendre : - au moins deux types de molécules redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts, et - au moins deux types de sondes oligonucléotidiques simple brin, 25 chaque type de sondes oligonucléotidiques étant lié à une molécule redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts les uns des autres. Les figures 1 à 7 et les exemples ci-après illustrent la présente invention. 30 La figure 1 représente le système de détection selon l'invention en absence et en présence d'une molécule d'intérêt, en particulier un ADN. La figure 2 représente le système de détection selon l'invention en absence et en présence d'une molécule d'intérêt, en particulier un aptamère. 3043779 15 Les figures 3a et 3b présentent la spécificité du système de détection selon l'invention lorsque le nanomatériau utilisé est le PAMAM G4. La figure 3c présente la gamme de concentrations détectables dudit système. Les figures 4a et 4b présentent la spécificité du système de détection 5 selon l'invention lorsque le nanomatériau utilisé est des nanoparticules d'or modifiées. La figure 4c présente la gamme de concentrations détectables dudit système. Les figures 5a et 5b présentent la spécificité du système de détection selon l'invention lorsque le nanomatériau utilisé est PAMAM G4 associé à des 10 nanoparticules d'or modifiées. La figure 5c présente la gamme de concentrations détectables dudit système. La figure 6 présente la spécificité du système de détection selon l'invention lorsque la sonde oligonucléotidique est un ADN synthétique, et en particulier dans la détection du virus de l'hépatite C. 15 Les figures 7a et 7b présentent la spécificité du système de détection selon l'invention lorsque la sonde oligonucléotidique est un aptamère spécifique de l'Ochratoxine A. En particulier, la figure 7b présente la sélectivité dudit système de détection pour l'Ochrotoxine A vs l'Ochratoxine B. 20 EXEMPLES Matériels et méthodes - Produits Le ferrocène Fc(NHP)2 est synthétisé selon des méthodes connues de 25 l'homme du métier. La solution saline de tampon phosphate (PBS) pH = 7,4 contient 10mM de Na2HPO4, 1,8mM de KH2PO4, 2,7mM de KCI et 137mM de NaCI. Le PBS est préparé avec de l'eau bidistillée et filtré au travers de membranes de 0,22pm puis stocké à 4°C jusqu'à son utilisation. 30 Les dendrimères PAMAM G4 sont purifiés par des membranes de filtration de 0,22pM avant utilisation. Les nanoparticules d'or (AuNPs) proviennent de chez Sigma-Aldrich dans une solution de 0,1mM de PBS et ont un diamètre de 5nm. 3043779 16 La sonde oligonucléotidique utilisée pour étudier la gamme dynamique du système de l'invention, désignée ci-après par « sonde ADNss », comporte un oligonucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 (5'GAT-ACT-TCT-ATC-ACC3'), qui est modifié à l'extrémité 5' par le groupement NH2C6-. 5 Ladite sonde cible un oligonucléotide d'intérêt synthétique de séquence SEQ ID NO : 2 (5'GGT- GAT-AGA-AGT-ATC3'), désigné ci-après ADN d'intérêt synthétique. Un oligonucléotide de séquence SEQ ID NO : 3 (5'CAT-TCC-CTCTTA-GG3') non complémentaire avec la susdite sonde oligonucléotide est utilisé en tant que contrôle. 10 Dans le cadre d'expérience de détection de Mycobacterium tuberculosis résistant, un produit PCR de 411 bases est obtenu à partir du gène rpoB de Mycobacterium tuberculosis. cPCR est le produit PCR obtenu de 5 souches de Mycobacterium tuberculosis comportant la mutation TCG/TTG dans le gène rpoB qui est 15 responsable de la résistance à la rifampicine. Ces 5 souches sont 2-09, 7-09, 8-09, 10-09 et 11-09. ncPCR est le produit PCR obtenu à partir du gène rpoB non-muté des souches sauvages de Mycobacterium tuberculosis. La sonde oligonucléotidique ciblant cPCR, désignée ci-après par « sonde 20 PCR », comporte un oligonucléotide de séquence SEQ ID NO : 4 (5'CCG-ACTGTT-GGC-GCT-GGG3'), dont l'extrémité 5' est modifiée par le groupement NH2C6- pour la mise en oeuvre de la liaison covalente avec le ferrocène. Dans le cadre des expériences de détection des virus de l'hépatite C, la 25 sonde oligonucléotidique ciblant le virus comporte un oligonucléotide de séquence SEQ ID NO : 5 (5'TCA ACT TCG GGA ATC TCA ATG TTA G3'), dont l'extrémité 5' est modifiée par le groupement NH2C6- pour la mise en oeuvre de la liaison covalente avec le ferrocène. Dans le cadre d'expérience de détection de l'Ochratoxine (OTA), la 30 sonde ciblant la toxine est une sonde de type aptamère de séquence SEQ ID NO : 6 (5'GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA3'), dont l'extrémité 5' est modifiée par le groupement NH2C6- pour la mise en oeuvre de la liaison covalente avec le ferrocène. 3043779 17 - Techniques de mesure Voltampérométrie cyclique (CV) Les analyses sont faites dans 0,1M de KCI avec le couple [Fe(CN)6]4- 5mM /[Fe(CN)6]3- 5mM dans une gamme de potentiels de -0,2 et 0,5V avec un 5 taux de balayage de 50mV.s-1. Spectrométrie d'impédance (EIS) Les analyses sont faites dans 0,1M de KCI avec le couple [Fe(CN)6]4- 5mM /[Fe(CN)6]3- 5mM. Toutes les impédances sont obtenues à 0,2V vs. Ag/AgCI à un potentiel DC de 10mV avec une gamme de fréquences de 100KHz à 0,1Hz. Voltammétrie à vague carré (SWV) Les analyses sont faites dans du PBS pH = 7,4 contenant 10mM de 15 Na2HPO4, 1,8mM de KH2PO4, 2,7mM de KCI et 137mM de NaCI filtré par des membranes de 0,22pm et stocké à 4°C jusqu'à utilisation. SWV sont effectués dans une gamme de potentiels de -0,3 à 0,4 avec un temps de conditionnement de 180s, de fréquence 25Hz et d'amplitude de modulation de 20mV. 20 Voltampérométrie à impulsion différentielle (DPV) Les analyses sont effectuées dans du PBS pH = 7,4 contenant 10mM de Na2HPO4, 1,8mM de KH2PO4, 2,7mM de KCI et 137mM de NaCI filtré par des membranes de 0,22pm et stocké à 4°C jusqu'à utilisation. Les analyses DPV 25 sont effectuées dans une gamme de potentiels de -0,3 à 0,4V à un taux de balayage de 50mV.s-1 avec une hauteur d'impulsion de 45mV et 0,05s de largeur d'impulsion. Exemple 1 : Système de détection comportant PAMAM G4 30 - Modification de la surface de l'électrode en carbone vitreux avec les dendrimères PAMAM G4 Les liaisons covalentes des dendrimères PAMAM G4 sur l'électrode de carbone vitreux sont faites dans de l'eau contenant 0,5M de LiCIO4 par 3043779 18 méthode de CV en balayant le potentiel de 0,0 à 1,1V vs. Ag/AgCI en tant qu'électrode de référence pendant un cycle avec une vitesse de balayage de 50mV.s-1. Pendant la réaction, l'électrode de travail et la contre-électrode sont séparées dans des cellules de faible volume (Basi) contenant 200p1 d'une 5 solution de PAMAM G4 de 50pM. Après la fixation des molécules à la surface et un lavage délicat des électrodes à l'eau bidistillée, les analyses de CV et d'EIS sont réalisées. - Association de la molécule redox ferrocène et l'oligonucléotide 10 modifié de séquence SEQ ID NO : 1 Le ferrocène modifié par deux groupes phtalymidyl Fc(NHP)2 est associé aux dendrimères dont la surface est modifiée. La réaction se fait par immersion de l'électrode dans une solution d'imM de ferrocène dans de l'acétonitrile pendant 1h à température ambiante. Les résidus non liés sont lavés à 15 l'acétonitrile et à l'eau bidistillée. Puis l'électrode est immergée dans une solution de 10pM de sondes ADNss-C6NH2 de SEQ ID NO : 1 modifiées préparées dans du PBS pendant 1h à température ambiante. L'électrode est ensuite rincée dans l'eau distillée et du PBS, et afin de saturer les esters phtalymidyle de ferrocène, elle est immergée dans une solution de 1mM 20 d'éthanolamine en solution de PBS pendant 30min à température ambiante. Le système de détection est ensuite lavé à l'eau distillée et du PBS puis stocké dans du PBS à 4°C jusqu'à utilisation. Après chaque étape de construction du système de détection à ADN, les modifications de surface sont contrôlées par méthode SWV. 25 - Hybridation avec l'oligonucléotide complémentaire de SEQ ID NO : 2 L'hybridation des 15 bases complémentaires à la sonde d'ADNss de SEQ ID NO : 1 associée à la surface est effectuée par immersion de l'électrode dans 30 la solution de l'ADN synthétique (SEQ ID NO : 2) pendant 1h à 40°C. Les différentes concentrations utilisées pour l'hybridation sont 100fM, 1pM, 10pM, 100pM, 1nM, 10nM et 100nM. Après chaque incubation, l'électrode est lavée délicatement avec de l'eau distillée et du PBS puis l'électrode est analysée par méthode SWV. Le test de contrôle est effectué par immersion de l'électrode 3043779 19 dans 1pM d'oligonucléotide non-complémentaire (SEQ ID NO : 3) dans du PBS et incubation dans les mêmes conditions que pour l'ADN d'intérêt synthétique (SEQ ID NO : 2) (1h à 40°C). Les mêmes conditions sont appliquées pour détecter les échantillons issus de PCR qui sont préalablement 5 traités à 90°C pendant 5min pour déshybridation des ADN double-brins obtenus à l'issu de la PCR. Résultats a) Détection de l'ADN d'intérêt synthétique de séquence SEQ ID NO : 2 10 La détection de l'ADN d'intérêt synthétique de séquence SEQ ID NO : 2 est effectuée par méthode SWV. Le système de détection est incubé successivement dans une solution contenant des concentrations d'ADN variables entre 100fM et 1nM et une analyse par SWV est effectuée pour chaque concentration. La figure 3c montre l'augmentation du courant 15 correspondant au ferrocène à 0,11V avec chaque concentration d'ADN d'intérêt. Cette variation de courant est proportionnelle à la concentration d'ADN d'intérêt synthétique. Le premier signal positif pendant la détection d'ADN d'intérêt est obtenu après incubation du système de détection dans une solution d'ADN d'intérêt 20 de 1pM et entraine une variation de courant de 10%. Et, la saturation du système de détection est observée à 100pM avec une variation de courant de 97% ce qui correspond aux changements du signal redox du ferrocène. L'augmentation du courant lors de la détection de l'ADN d'intérêt s'explique par le dévoilement de la molécule redox par l'hybridation de l'ADN 25 d'intérêt complémentaire synthétique (SEQ ID NO : 2) à la sonde oligonucléotidique SEQ ID NO : 1 et par l'utilisation de PAMAM G4. Ce changement d'orientation du complexe sonde ADNss/ADN d'intérêt complémentaire synthétique ou issu d'échantillons PCR induit l'augmentation du transfert d'électrons entre le ferrocène et le PAMAM G4 (figures 3a et 3c). 30 b) Détection de l'ADN d'intérêt issu de la PCR Le système de détection comportant PAMAM G4 et la sonde oligonucléotidique de séquence SEQ ID NO : 4 est préparé selon les méthodes 3043779 20 décrites ci-dessus pour détecter l'ADN d'intérêt composé de 411 bases issu de PCR (cPCR). Après l'incubation, la variation de courant correspondant au ferrocène est calculée. La valeur de la variation obtenue par 5 expériences 5 indépendantes est de 86%. Lorsque l'échantillon ne contient le produit ncPCR dont la séquence diffère de celle de cPCR par un acide nucléotidique, la variation de courant n'est plus que de 7% (figure 3a et figure 3b). Ces résultats montrent que ledit système peut détecter efficacement et spécifiquement un ADN d'intérêt comme celui de Mycobacterium tuberculosis et différencier les 10 souches résistantes à la rifampicine. Il peut être utilisé dans le domaine clinique. Exemple 2 : Système de détection comportant des nanoparticules d'or 15 - Modification des nanoparticules d'or et leur association à la surface 2g (0,008mol) de dichlorhydrate de cystamine sont dissous dans 20m1 de NaOH 5M (0,1M) et extrait avec 10m1 de CH2C12. La phase organique est rincée avec 10m1 d'eau distillée, séchée sur du MgSO4 et concentrée sous vide. De la cystamine dissoute dans de l'eau bidistillée est ajoutée à la solution de 20 1m1 de nanoparticules d'or (D0=0,4) pour une concentration finale de 50pM. La solution est incubée à 4°C jusqu'à utilisation. La concentration en cystamine ainsi que le temps d'incubation ont été optimisé pour permettre d'obtenir des puits de nanoparticules d'or modifiées non agrégées afin d'être analysés par spectrométrie ultraviolet-visible et diffusion dynamique de la lumière. 25 Après cette réaction, l'échantillon de nanoparticules d'or modifiées avec la cystamine (AuNPs-NH2) est centrifugé pendant 20min à 14 000 tours/min pour éliminer les résidus cystamine. Le culot est ensuite rincé deux fois avec 1m1 d'eau bidistillée et centrifugé jusqu'à ce que l'excès de cystamine soit éliminé. Au final, l'échantillon d'AuNPs-NH2 est dissous dans 300p1 d'eau. 30 100p1 d'AuNPs-NH2 sont mélangés avec une solution de 100p1 de N-(3- diméthylam i nopropy1)- N '-éthylcarbodi im ide hydrochloride/N- Hydroxysuccinimide (10mM/10mM dissous dans l'eau) afin d'associer les AuNPs-N H2 à l'électrode de carbone vitreux. Puis, l'électrode modifiée avec des groupes carboxyliques -COOH est immergée dans ce mélange et est incubée 3043779 21 pendant 2h à température ambiante. Différents temps d'incubation ont été testés et 2h est la durée optimale pour une bonne performance du système de détection. L'électrode est rincée délicatement avec de l'eau bidistillée puis est analysée par mesures EIS. 5 La modification d'AuNPs par la cystamine est optimisée et contrôlée par spectrométrie ultraviolet-visible. Les AuNPs de 5nm de diamètre absorbent les ultraviolets visibles à 520nm, tandis que la valeur d'absorption des AuNPs modifiés est augmentée et confirme ainsi l'efficacité de la réaction. 10 - Electrodéposition de 13-alanine et d'éthanolamine La liaison covalente de la 13-alanine sur l'électrode de carbone vitreux est effectuée dans de l'eau contenant 0,5M de LiCIO4 par balayage des potentiels de 0,2 à 1,1V vs. Ag/AgCI comme électrode de référence pendant 10 cycles jusqu'à saturation avec taux de balayage de 50mV.s-1. Pendant la 15 réaction l'électrode de travail et la contre-électrode sont séparées dans des cellules de faible volume (Basi) contenant 200pl d'une solution de 10mM de 13 alanine. Puis l'électrode est rincée délicatement à l'eau bidistillée. La saturation de la surface par l'éthanolamine est effectuée dans les mêmes conditions, par balayage des potentiels de 0,2 à 1,1V vs. Ag/AgCI pendant 3 cycles. La 20 concentration d'éthanolamine utilisée pour cette réaction est d'imM préparé dans de l'eau contenant 0,5M de LiCIO4. Après la fixation des molécules à la surface et le rinçage délicat de l'électrode à l'eau bidistillée, les mesures EIS sont effectuées. 25 - Construction du système de détection Le ferrocène modifié par deux groupes phtalymidyl Fc(NHP)2 est associé à la surface AuNP5-NH2 modifiée. La réaction est effectuée par immersion de l'électrode dans une solution d'imM de ferrocène dans l'acétonitrile pendant 1h à température ambiante. Les résidus non liés sont évacués par rinçage à 30 l'acétonitrile et à l'eau bidistillée. Puis, l'électrode est immergée dans une solution de 10pM d'ADN SEQ ID NO : 1 modifiée préparée dans du PBS pendant 1h à température ambiante. Après le rinçage de l'électrode à l'eau distillée et au PBS, l'électrode est immergée dans une solution d'imM d'éthanolamine dans du PBS pendant 30min à température ambiante afin de 3043779 22 saturer les esters phtalymidyle de ferrocène. Le système de détection est ensuite lavé avec de l'eau distillée et du PBS puis stocké dans du PBS à 4°C jusqu'à utilisation. Après chaque étape de construction du senseur à ADN, les modifications de surface sont contrôlées par la méthode EIS. 5 - Hybridation avec l'ADN d'intérêt complémentaire synthétique L'hybridation de l'ADN d'intérêt synthétique complémentaire à la sonde ADNss associée à la surface est effectuée par immersion de l'électrode dans la solution de l'ADN d'intérêt synthétique de SEQ ID NO : 2 pendant 1h à 40°C. 10 Les différentes concentrations utilisées pour l'hybridation sont 100fM, 1pM, 10pM, 100pM, 1nM, 10nM et 100nM. Après chaque incubation, l'électrode est lavée délicatement avec de l'eau distillée et du PBS puis l'électrode est analysée par la méthode DPV. Les produits de PCR contiennent 411 bases et sont détectés par un 15 système de détection comportant la sonde PCR de séquence SEQ ID NO : 4 dans une solution selon le même procédé décrit ci-dessus. Le test de contrôle est effectué par immersion de l'électrode dans 1pM de cible non-complémentaire dans du PBS et incubé dans les mêmes conditions que pour les ADN d'intérêt complémentaires synthétique (1h à 20 40°C). Les mêmes conditions sont appliquées pour détecter les échantillons issus de PCR. Résultats a) Détection de l'ADN d'intérêt synthétique de séquence SEQ ID NO : 2 25 La détection de l'ADN d'intérêt est effectuée par la méthode SWV. Le système de détection est incubé successivement dans une solution contenant des concentrations d'ADN variables entre 100fM et 1nM et une analyse par SWV est effectuée pour chaque concentration. La figure 4c montre l'augmentation du courant correspondant au ferrocène à 0,11V avec chaque 30 concentration d'ADN d'intérêt complémentaire. Cette variation de courant est proportionnelle à la concentration d'ADN d'intérêt synthétique (SEQ ID NO : 2). Le premier signal positif pendant la détection d'ADN d'intérêt synthétique est obtenu après incubation du système de détection dans une 3043779 23 solution contenant 100fM d'ADN d'intérêt synthétique et entraine une variation de courant de 10%. Et, la saturation du système de détection est observée à 100pM avec une variation de courant de 97% ce qui correspond aux changements du 5 ferrocène. Néanmoins, des analyses à des concentrations de 100pM à 1nM sont réalisables avec le système de détection utilisé (Figure 4c). b) Le même système de détection que celui mentionné dans l'exemple 2a) est construit avec des sondes oligonucléotidiques de séquence SEQ ID NO : 4 pour 10 détecter un échantillon comprenant le produit de PCR correspondant au gène rpoB muté (cPCR) de Mycobacterium tuberculosis. Ledit système de détection est capable de donner un signal électrique spécifique lorsque le produit cPCR est présent dans l'échantillon (Figures 4a et 4b). Ledit système permet de détecter de façon spécifique les souches de 15 Mycobacterium tuberculosis résistantes à la rifampicine. Exemple 3 : Système de détection comportant des nanoparticules d'or et PAMAM G4 (G4-AuNPs) - Modification de la surface de l'électrode en carbone vitreux avec les 20 dendrimères PAMAM G4 Les liaisons covalentes des dendrimères PAMAM G4 sur l'électrode de carbone vitreux sont faites dans de l'eau contenant 0,5M de LiCIO4 par méthode de CV en balayant le potentiel de 0,0 à 1,1V vs. Ag/AgCI en tant qu'électrode de référence pendant un cycle avec un taux balayage de 50mV.s- 25 1. Pendant la réaction, l'électrode de travail et la contre-électrode sont séparées dans des cellules de faible volume (Basi) contenant 200p1 d'une solution de PAMAM G4 de 50pM. Après la fixation des molécules à la surface et un lavage délicat des électrodes à l'eau bidistillée, les analyses de CV et d'EIS sont réalisées. 30 - Modification de la surface de l'électrode en carbone vitreux avec les dendrimères PAMAM G4 et les AuNPs La première étape dans la construction du système de détection est l'électrodéposition des dendrimères PAMAM G4 à la surface de l'électrode en 3043779 24 carbone vitreux. L'électrodéposition est faite par la technique de CV en balayant le potentiel de 0,0 à 1,1V vs. Ag/AgCI en tant qu'électrode de référence pendant un cycle avec une vitesse de balayage de 50mV.s-1. Pendant la réaction d'oxydation, les groupes amines des dendrimères forment un 5 radical cationique -N1-1.± qui interagit avec les groupes aromatiques C=C de la surface carbonée. - Modification des nanoparticules d'or et leur association à la surface 2g (0,013mol) de dichlorhydrate de cystamine est dissous dans 20 ml 10 de NaOH 5M (0.1M) et extrait avec 10m1 de CH2C12. La couche organique est rincée avec 10m1 d'eau distillée, séchée sur du MgSO4 et concentrée sous vide. De la cystamine dissoute dans de l'eau bidistillée est ajoutée à la solution de 1m1 de nanoparticules d'or (D0=0,4) pour une concentration finale de 50pM. La solution est incubée à 4°C jusqu'à utilisation. 15 Après cette réaction, l'échantillon de nanoparticules d'or modifiées avec la cystamine (AuNPs-NH2) est centrifugé pendant 20min à 14000 tours/min pour éliminer les résidus cystamine. Le culot est ensuite rincé deux fois avec 1m1 d'eau bidistillée et centrifugé jusqu'à ce que l'excès de cystamine soit éliminé. Au final, l'échantillon d'AuNPs-NH2 est dissous dans 300p1 d'eau. 20 - Association des AuNPs et des dendrimères PAMAM G4 Afin d'associer les AuNPs-NH2 à l'électrode de carbone vitreux modifiée par les dendrimères PAMAM G4, le glutaraldéhyde est utilisé comme lien. L'électrode modifiée par les dendrimères PAMAM G4 est immergée dans une 25 solution de 0,5% de glutaraldéhyde pendant 20min puis est rincée délicatement. Ensuite, l'électrode est incubée dans 100p1 d'AuNPs-NH2 pendant 2h à température ambiante. Différents temps d'incubation ont été testés et 2h est la durée optimale pour une bonne performance du système de détection. L'électrode est rincée délicatement avec de l'eau bidistillée et est 30 ensuite analysée par mesures CV et EIS. - Association de la molécule redox ferrocène et la sonde ADNss 3043779 25 Le ferrocène modifié par deux groupes phtalymidyl Fc(NHP)2 est associé aux AuNPs-NH2 dont la surface est modifiée. La réaction se fait par immersion de l'électrode dans une solution d'imM de ferrocène dans de l'acétonitrile pendant 1h à température ambiante. Les résidus non liés sont lavés à 5 l'acétonitrile et à l'eau bidistillée. Puis l'électrode est immergée dans une solution de 10pM de sondes ADNss-C6NH2 préparées dans du PBS pendant 1h à température ambiante. L'électrode est ensuite rincée dans l'eau distillée et du PBS, et immergée pendant 30min à température ambiante dans une solution de 1mM d'éthanolamine en solution de PBS afin de saturer les esters 10 phtalymidyle de ferrocène. Le système de détection est ensuite lavé avec de l'eau distillée et du PBS puis stocké dans du PBS à 4°C jusqu'à utilisation. Après chaque étape de construction du système de détection à ADN, les modifications de surface sont contrôlées par la méthode SWV. 15 - Hybridation avec l'ADN d'intérêt synthétique de séquence SEQ ID NO :2 L'hybridation de l'ADN d'intérêt synthétique (SEQ ID NO : 2) à la sonde d'ADNss SEQ ID NO : 1 associée à la surface est effectuée par immersion de l'électrode dans la solution de l'ADN d'intérêt synthétique pendant 1h à 40°C. 20 Les différentes concentrations utilisées pour l'hybridation sont 100fM, 1pM, 10pM, 100pM, 1nM, 10nM et 100nM. Après chaque incubation, l'électrode est lavée délicatement avec de l'eau distillée et du PBS puis l'électrode est analysée par la méthode SWV. Le test de contrôle est effectué par immersion de l'électrode dans 1pM d'ADN d'intérêt non-complémentaire de séquence SEQ 25 ID NO : 3 dans du PBS et incubé dans les mêmes conditions que pour les ADN d'intérêt (1h à 40°C). Les mêmes conditions sont appliquées pour détecter les échantillons issus de PCR. Résultats 30 a) Détection de l'ADN d'intérêt synthétique La détection de l'ADN d'intérêt SEQ ID NO : 2 est effectuée par la méthode SWV. Le système de détection est incubé successivement dans une solution contenant des concentrations d'ADN variables entre 100fM et 1nM et une analyse par SWV est effectuée pour chaque concentration. La figure 5c 3043779 26 montre l'augmentation du courant correspondant au ferrocène à 0,11V avec chaque concentration d'ADN d'intérêt synthétique SEQ ID NO : 2. Cette variation de courant est proportionnelle à la concentration de l'ADN d'intérêt synthétique. 5 Le premier signal positif pendant la détection d'ADN d'intérêt SEQ ID NO : 2 est obtenu après incubation du système de détection dans une solution d'ADN d'intérêt SEQ ID NO : 2 de 1pM et entraine une variation de courant de 10%. Et, la saturation du système de détection est observée à 100pM avec 10 une variation de courant de 97% ce qui correspond aux changements du ferrocène. Néanmoins, des analyses à des concentrations de 100pM à 1nM sont faisables avec le système de détection utilisé (figure 5c). b) Le même système de détection que celui mentionné dans l'exemple 2 est 15 construit avec des sondes oligonucléotidiques de séquence SEQ ID NO : 4 pour détecter un échantillon comprenant le produit de PCR correspondant au gène rpoB muté (cPCR) de Mycobacterium tuberculosis. Ledit système de détection est capable de donner un signal électrique spécifique lorsque le produit cPCR est présent dans l'échantillon (Figures 5a et 20 5b). c) Le même système de détection que celui mentionné dans l'exemple 3a) est construit avec des sondes oligonucléotidiques de séquence SEQ ID NO : 5 pour détecter un échantillon d'ADN synthétique du virus de l'hépatite C. 25 Ledit système de détection est capable de donner un signal électrique en présence de l'ADN synthétique (Figure 6). Ledit système permet donc de détecter le virus de l'hépatite C. Le tableau I ci-dessous résume les gammes de détection obtenues selon les 30 différents exemples cités ci-dessus : 3043779 27 Système de Gamme dynamique Gamme linéaire Limite détection quantitative PAMAM 1pM - 100pM 1pM - 10pM 1pM AuNPs 100fM - 1nM 1pM - 1nM 100fM PAMAM-AuNPs 100fM - 10nM 100fM - 10nM 100fM Tableau I Exemple 4 : Détection de l'ochratoxine A (OTA) Le même système de détection que celui mentionné dans l'exemple 1 est 5 construit avec une sonde aptamère de séquence SEQ ID NO : 6 pour détecter la présence ou l'absence de l'OTA dans un échantillon alimentaire comme le lait ou le vin dont la matrice est complexe. Ledit système de détection est capable de donner un signal électrique en présence de l'OTA (Figures 7a et 7b). Ledit système permet donc la détection 10 de la toxine OTA. La présence d'une autre toxine non spécifique de l'aptamère tel que l'OTB qui n'est pas détectée (Figure 7b). REVENDICATIONS1. Système de détection électrochimique de molécules d'intérêt, caractérisé en ce que ledit système comprend : - un matériau conducteur, - au moins un nanomatériau portant des fonctions positives, lié covalemment audit matériau conducteur, - au moins une molécule redox, et - au moins une sonde oligonucléotidique simple brin ciblant une molécule d'intérêt, ladite molécule redox étant liée covalemment à la fois audit nanomatériau et à la sonde oligonucléotidique, le nombre de fonctions positives dudit nanomatériau étant supérieur au nombre de sondes oligonucléotidiques. 2. Système de détection électrochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit nanomatériau portant des fonctions positives est choisi parmi le groupe comprenant : - un dendrimère, préférentiellement un dendrimère de type de poly(amidoamine) notamment de deuxième, quatrième ou sixième génération, - des particules métalliques comme des nanoparticules d'or, - des nanoparticules magnétiques, telles que l'oxyde de fer, - des nanomatériaux hybrides à base de chitosan, et - des polymères conducteurs éventuellement modifiés par des fonctions positives. 3. Système de détection électrochimique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit matériau conducteur est formé de carbone, en particulier des nanotubes de carbone, de carbone vitreux, de graphite, de graphène ou d'un métal. 4. Système de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit matériau conducteur 3043779 29 est absent dudit système lorsque ledit nanomatériau porteur de fonctions positives est conducteur. 5. Système de détection électrochimique selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite molécule redox est choisie dans le groupe comprenant le ferrocène, la quinone, le bleu de méthylène, les métalloporphyrines, le viologène. 6. Système de détection électrochimique selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques ciblent au moins une molécule d'intérêt choisie indépendamment parmi un ADN, un ARN, une protéine ou une toxine. 7. Système de détection électrochimique selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit système comprend : - au moins deux types de molécules redox dont les potentiels d'oxydoréduction sont distincts, et - au moins deux types de sondes oligonucléotidiques en simple brin chacun ciblant une molécule d'intérêt différente, 20 le même type de sondes oligonucléotidiques étant lié au même type de molécules redox. 8. Support modifié pour la préparation du système de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant : 25 un matériau conducteur, un nanomatériau portant des fonctions positives, et au moins une molécule redox, ledit nanomatériau étant situé entre ledit matériau conducteur et ladite molécule redox et étant lié covalemment à ces deux derniers. 30 9. Kit de préparation d'un système de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant: (i) un support modifié tel que défini selon la revendication 8, et (ii) au moins un oligonucléotide ciblant une molécule d'intérêt. 3043779 30 10. Méthode de préparation d'un système de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant : (i) la mise en contact d'un support modifié tel que défini selon la 5 revendication 8 avec au moins un oligonucléotide fonctionnalisé ciblant une molécule d'intérêt ; (ii) la formation des liaisons covalentes entre le susdit support modifié et ledit oligonucléotide fonctionnalisé. io 11. Méthode électrochimique de détection d'au moins un type de molécule d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : (i) la mise en contact d'un système de détection tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 avec un 15 échantillon susceptible de contenir ladite molécule d'intérêt ; (ii) la mesure électrochimique du signal redox spécifique à ladite molécule d'intérêt. 12. Méthode électrochimique de détection selon la revendication 11, 20 caractérisée en ce qu'elle comprend, en plus des étapes (i) et (ii) et après l'étape (ii), le dosage quantitatif de ladite molécule d'intérêt en se rapportant à une courbe de calibration. 13. Méthode électrochimique de détection multiple d'au moins deux types 25 de molécules d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : (i) la mise en contact d'un système de détection tel que défini selon la revendication 7 avec un échantillon susceptible de contenir lesdites molécules d'intérêt ; 30 (ii) la mesure des signaux redox spécifiques auxdites molécules d'intérêt. 14. Utilisation d'un système de détection électrochimique tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'un kit de 3043779 31 préparation dudit système selon la revendication 9 pour diagnostiquer in vitro ou in vivo une maladie, pour identifier la résistance à un médicament et pour suivre la présence d'un médicament dans les fluides biologiques. 5 15. Utilisation d'un système de détection électrochimique tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'un kit de préparation dudit système selon la revendication 9 pour détecter la présence d'un pathogène ou une toxine dans un échantillon 10 agroalimentaire, pharmaceutique ou un effluent.