FR 3049616 A1 20171006 FR 1652933 A 20160404 1 INRIA 186.FRD BIORÉACTEUR SÉLECTIF POUR MICROALGUES La présente invention se rapporte à un bioréacteur pour sélectionner des souches de microalgues. L'invention se rapporte également à un procédé de sélection de souches de microalgues. Il existe des micro-organismes photosynthétiques procaryotes et eucaryotes, regroupés communément sous le terme de microalgues. Les micro-organismes photosynthétiques procaryotes sont représentés par les cyanobactéries (parfois appelées « algues bleu-vert »). Les micro-organismes photosynthétiques eucaryotes sont représentés par une multitude de classes parmi lesquelles on peut citer les chlorophycées, les diatomées, les chrysophycées, les coccolithophycées, les euglénophycées et les rhodopycées. D'une manière générale, la taille d'une cellule de microalgue est comprise entre 1 um et 100 um. On estime aujourd'hui qu'il existe plus d'un million d'espèces de microalgues dont quelques dizaines de milliers d'espèces sont référencées. Les microalgues sont ubiquistes et on les trouve aussi bien dans les eaux douces et que dans les eaux saumâtres et marines. La production de microalgues est un secteur qui prend de plus en plus d'ampleur. En effet, les microalgues synthétisent de nombreux produits de natures différentes parmi lesquels on peut citer les protéines, les antioxydants, les pigments, les acides gras polyinsaturés à longues chaînes DHA (acide docosahexaénoïque) et EPA (acide eicosapentaénoïque). Ainsi, les microalgues trouvent une application dans plusieurs domaines technologiques et notamment dans l'industrie cosmétique, l'industrie pharmaceutique, l'aquaculture, l'industrie des alicaments ou des compléments alimentaires. De plus, les microalgues sont utilisées dans la production de bioénergie. Les microalgues ont une capacité à capter l'énergie lumineuse pour fixer et métaboliser le carbone inorganique à partir du dioxyde de carbone (CO2) dans des molécules énergétiques. Le couplage des microalgues avec le CO2 et le fait que les microalgues sont souvent riches en sucres ou en huiles ont pour conséquence que les microalgues présentent un grand intérêt dans la production de biocarburants. Ce couplage est aussi à l'origine de capacités épuratoires que présentent les microalgues. 3049616 2 Les microalgues sont des espèces photosynthétiques. Les cellules de microalgues ont besoin de la lumière pour proliférer. Les microalgues peuvent être cultivées en utilisant de la lumière naturelle (lumière solaire) ou de la lumière artificielle. Il existe des systèmes de culture ouverts de type bassin de culture (aussi appelé bassin « raceway») et des systèmes de culture fermés 5 comme les bioréacteurs d'alimentation par batch, les bioréacteurs d'alimentation par fed- batch ou les bioréacteurs d'alimentation continu. D'une manière générale, tous les systèmes de culture présentent une cuve destinée à recevoir un milieu de culture qui comprend des nutriments. Les microalgues sont dispersées dans ce milieu de culture et reçoivent de la lumière. Les bioréacteurs d'alimentation en continu ont 10 l'avantage de présenter une entrée et une sortie de milieu de culture associées à un contrôleur. Le contrôleur permet de piloter la cuve en continue à une concentration choisie de microalgues dans le milieu de culture durant un temps de travail. Dans les systèmes de cultures ouverts ou fermés, la lumière est majoritairement absorbée par les cellules proches de la source lumineuse. Lorsque la densité de microalgues est élevée, une 15 grande partie de la lumière ne parvient pas à pénétrer en profondeur de la cuve. En conséquence, les microalgues en profondeur des cuves se retrouvent dans l'obscurité et ne peuvent pas proliférer correctement. Les systèmes de cultures présentent un problème de surexposition lumineuse des cellules proches de la source lumineuse et un problème de sous-exposition des cellules situées en 20 profondeur du milieu de culture. Ce gradient de lumière au sein des systèmes de culture limite la production de microalgues. L'état de la technique propose une approche qui consiste à modifier génétiquement les microalgues. Il s'agit de réduire la taille ou le nombre des antennes collectrices (molécules de chlorophylle) et/ou de modifier les ratios entre les différents pigments (notamment 25 chlorophylle a, chlorophylle b, chlorophylle c, caroténoïdes et autres pigments) des microalgues pour les rendre plus transparentes. Le document WO 2014/089533 divulgue des microalgues mutantes présentant des antennes collectrices réduites. Dans cette approche, chaque cellule de microalgue capte une quantité moindre de lumière ce qui permet à la lumière de pénétrer en profondeur des cuves. Les cellules localisées dans les 3049616 3 zones les plus éloignées de la source lumineuse sont donc moins ombragées. Toutefois, cette approche requiert des méthodes complexes et coûteuses de génie génétique ou de mutation-sélection telles que la mutagenèse chimique ou le traitement par ultra violet ou irradiation gamma. Par ailleurs, les systèmes de cultures ne comprennent qu'un seul type de mutant : il 5 s'agit de monocultures de microalgues. Les monocultures sont moins robustes, notamment face à des conditions d'exploitation industrielle. L'état de la technique propose également une approche qui consiste à sélectionner des souches de microalgues riches en composants utilisés dans la production de biocarburants. Le document WO 2013/012329 divulgue un procédé de sélection de microalgues présentant 10 une capacité de stockage accrue en composants utiles pour la production de biocarburants. Dans cette approche, une culture de différentes souches de microalgues est soumise à un stress nutritionnel. Seules les souches capables de stocker une forte concentration en nutriments survivent à ce stress. Les souches sont récoltées et cultivées dans les systèmes de cultures décrits plus hauts. Les problèmes liés au gradient de lumière persistent. 15 La présente invention vient améliorer la situation. À cet effet, l'invention vient introduire un bioréacteur comportant une source de lumière, un capteur de lumière en regard de ladite source de lumière et une cuve disposée entre la source de lumière et le capteur de lumière destiné à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, un contrôleur relié au capteur de 20 lumière pour piloter la cuve à une concentration de culture cellulaire choisie dans le milieu de culture durant un temps de travail, ladite source de lumière étant capable d'émettre une lumière incidente d'une intensité lumineuse d'entrée en direction de la cuve, et le capteur de lumière étant capable de mesurer une intensité lumineuse en sortie et de transmettre des données relatives à cette intensité au contrôleur pour le pilotage de la cuve, et une commande 25 de la source de lumière agencée pour régler, durant un temps inférieur ou égal audit temps de travail, l'intensité lumineuse d'entrée à une valeur de consigne permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques. La valeur de consigne peut être supérieure ou égale à 500 umol quanta rn-2 s-1. Elle est de préférence supérieure ou égale à 800 umol quanta rn-2 s-1. La concentration de culture 30 cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture peut être comprise entre 0,001 g/I à 10 g/L. 3049616 4 Selon un mode de réalisation, la concentration de culture cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture est comprise entre 0,001 g/I à 0,1 g/L, de préférence entre 0,05 g/I à 0,1 g/L. La commande peut être agencée pour régler ladite lumière à une intensité lumineuse d'entrée (L') à une valeur de repos inférieure à la valeur de consigne, et pour commuter entre la valeur 5 de repos et la valeur de consigne durant le temps de travail. La commande peut être agencée pour fixer un premier temps d'irradiation pour lequel la lumière est réglée à l'intensité lumineuse d'entrée (L') à la valeur de repos et un deuxième temps d'irradiation pour lequel la lumière est réglée à la valeur de consigne, le premier temps d'irradiation étant supérieur au deuxième temps d'irradiation, et pour appliquer une succession des premiers et deuxième 10 temps d'irradiations. Les premiers et deuxième temps d'irradiations peuvent être fixés de sorte que la valeur moyenne de l'intensité lumineuse d'entrée (L') durant le temps de travail calculée à partir de la valeur de repos et la valeur de consigne soit inférieure ou égale à un tiers de ladite valeur de consigne. Dans un mode de réalisation, le premier temps d'irradiation est au moins trois fois supérieur au deuxième temps d'irradiation. La commande peut être 15 agencée pour fixer une pluralité de premiers et deuxièmes temps d'irradiation durant lesquels la lumière est réglée à une intensité lumineuse d'entrée (L') à la valeur de repos lors de chaque premier temps d'irradiation et la lumière est réglée à une intensité lumineuse d'entrée (L') à la valeur consigne lors de chaque deuxième temps d'irradiation. La commande peut etre agencée pour fixer la valeur de consigne à chaque deuxième temps d'irradiation. 20 Dans un autre mode de réalisation la concentration de culture cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture est comprise entre 0,1 g/I à 10 g/L, de préférence entre 1 g/I à 10 g/L. Dans ce mode, la commande peut être agencée pour maintenir l'intensité lumineuse d'entrée (/,') à la valeur de consigne de sorte que l'intensité lumineuse en sortie (Tout) soit sensiblement constante durant un temps inférieur ou égale au temps de travail. 25 L'invention vise également un procédé de sélection de micro-organismes photosynthétiques, comprenant les étapes suivantes : 1. Mettre à disposition un bioréacteur comportant une source de lumière, et une cuve disposée en regard de la source de lumière destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, ladite 30 source de lumière étant capable d'émettre une lumière d'une intensité lumineuse d'entrée /,' en direction de la cuve, 3049616 5 2. Emplir la cuve d'un milieu de culture ; 3. Inoculer le milieu de culture avec une culture cellulaire constituée de microorganismes photosynthétiques ; 4. Piloter la cuve durant un temps de travail à une concentration de culture cellulaire x, 5 choisie dans le milieu de culture ; 5. Régler l'intensité lumineuse d'entrée L!], à une valeur de consigne permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques ; 6. Maintenir l'intensité lumineuse d'entrée L!], à la valeur de consigne durant un temps 10 inférieur ou égal audit temps de travail de manière à provoquer une dégradation cellulaire d'au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques et ainsi sélectionner les micro-organismes photosynthétiques présentant une résistance accrue à la photoinhibition ; et 7. Récolter les micro-organismes photosynthétiques présentant une résistance accrue à 15 la photoinhibition dudit milieu de culture. La récolte à l'étape 7. peut être réalisée lorsque le milieu de culture comporte une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques constituée à plus de 75%, préférentiellement à plus de 90%, encore plus préférentiellement sensiblement à 100% de 20 micro-organismes présentant une résistance accrue à la photoinhibition. Dans un mode de réalisation, le procédé met en oeuvre une répétition successive des étapes 5. et 6. jusqu'à l'obtention d'une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques constituée de micro-organismes présentant une résistance accrue à la photoinhibition. 25 L'étape 6. du procédé de l'invention peut comprendre les sous-étapes suivantes: 6a. Régler la lumière à une intensité lumineuse d'entrée (La) à une valeur de repos inférieure à la valeur de consigne durant un temps inférieur audit temps de travail ; 6b. Maintenir l'intensité lumineuse d'entrée (L') à la valeur de repos durant un temps 30 inférieur audit temps de travail ; et 6c. Commuter successivement entre la valeur de repos et la valeur de consigne durant le temps de travail. 3049616 6 Le procédé de l'invention peut en outre comprendre les étapes suivantes : 8. Inoculer un milieu de culture avec les micro-organismes photosynthétiques récoltés à l'étape 7. dans un bioréacteur ; et 5 9. Piloter le bioréacteur de l'étape 8. pour une production de biomasse constituée desdits micro-organismes photosynthétiques. Le bioréacteur mis en oeuvre dans le procédé peut en outre comprendre un capteur de lumière disposé à l'opposé de la source de lumière par rapport à la cuve, le capteur de lumière étant 10 capable de mesurer une intensité lumineuse de sortie (bout). Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend en outre l'étape 4a. de mesurer l'intensité lumineuse en sortie (bout). Dans ce mode de réalisation l'intensité lumineuse d'entrée (Ln) à l'étape 5. est réglée en fonction de l'intensité lumineuse en sortie (bout) mesurée à l'étape 4a. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description 15 détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels : la figure 1 montre un schéma de production de microalgues dans un système de culture ; la figure 2 montre un schéma de principe du bioréacteur de l'invention durant un temps de travail ; 20 la figure 3 montre un schéma de principe du bioréacteur de la figure 2 en fin du temps de travail ; la figure 4 montre un diagramme sur lequel figure l'opacité d'une souche sauvage de microalgue et l'opacité d'une souche sélectionnée par le bioréacteur de l'invention ; et la figure 5 montre la production de biomasse de la souche sauvage et la souche 25 sélectionnée de la figure 4. Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. 30 Pour une bonne production de microalgues (ou biomasse de microalgues) il convient de les cultiver dans un milieu de culture riche en nutriments (azote, phosphore, souffre, oligo- 3049616 7 éléments, vitamines) et d'apporter suffisamment de lumière. La présence des nutriments est nécessaire pour permettre aux microalgues de convertir l'énergie lumineuse en métabolisant le CO2. Cette conversion a pour conséquence la production d'oxygène et l'augmentation en biomasse par la prolifération des microalgues (multiplication par division cellulaire). 5 Classiquement on utilise une source de lumière capable d'émettre une lumière à une longueur d'onde qui est fortement absorbée par les microalgues, afin d'obtenir un taux de croissance élevé. Les publications Light requirements in microalgal photobioreactors: an overview of biophotonic aspects - Carvalho et al., Appl Microbiology and Biotechnology, 2011, vol. 89, no. 5: 1275-1288 10 et Light emitting diodes (LEDs) applied to microalgal production - Schulze et al., Trends in Biotechnology, 2014, vol. 32, no. 8: 422-430 décrivent l'utilisation de la lumière dans les systèmes de culture des microalgues pour obtenir une bonne croissance cellulaire. Dans un bioréacteur, les microalgues peuvent recevoir un excès de photons qui peut entraîner une baisse de l'efficacité photosynthétique. Ceci correspond à une dissipation de l'énergie 15 appelée dissipation non-photochimique (en anglais : non-photochemical quenching). Le phénomène de la dissipation non-photochimique est notamment décrit dans la publication Non-Photochemical Quenching. A Response to Excess Light Energy -Müller et al., Plant Physiol, 2001, vol. 125, no. 4: 1558-1566. De plus, l'excès d'absorption de photons peut provoquer une dégradation de l'appareil photosynthétique qui diminue, voire inhibe, la prolifération des 20 microalgues. Ce phénomène est appelé photoinhibition. La figure 1 montre un schéma de production de biomasse de microalgues dans un bioréacteur d'alimentation continue. Le bioréacteur comprend une cuve 100 apte à recevoir un milieu de culture comportant des microalgues. Les microalgues sont dispersées dans le milieu de culture ou sous forme de 25 biofilm. Les microalgues sont constituées de cellules C de micro-organismes photosynthétiques. Le bioréacteur comprend une entrée 102 et une sortie 104 respectivement associées à un dispositif de régulation de débit. Ainsi, l'entrée 102 et la sortie 104 sont respectivement associées à une première vanne (ou pompe) 106 et une deuxième vanne (ou pompe) 108 pour ouvrir et fermer l'entrée 102 et la sortie 104. L'entrée 102 et la première 30 vanne 106 permettent de contrôler l'apport du milieu de culture frais dans la cuve 100. La sortie 104 et la deuxième vanne 108 permettent de contrôler l'évacuation du milieu de culture 3049616 8 et, le cas échéant, de certaines au moins des cellules C. L'entrée et la sortie permettent de piloter en continu le bioréacteur pour une production P de biomasse de microalgues. D'une manière générale, le contrôle de la production de biomasse dans un système de culture à alimentation en continu s'appuie sur la maîtrise de la croissance cellulaire de la culture de 5 microalgues. La concentration x [g/L] de microalgues dans le milieu de culture évolue en fonction du taux de croissance spécifique y (x) [h-1] et du taux de dilution D [h-1] du milieu de culture. Le taux de dilution D est défini par le débit d'entrée (L/h) divisé par le volume (L) du milieu de culture. La concentration x [g/L] de microalgues dans le milieu de culture évolue au cours du temps. 10 Pour une souche de microalgues donnée cette évolution peut être exprimée par la formule F1 suivante : jc = ,ux -Dx [F1] En conséquence, pour la production de biomasse dans la cuve 100 du bioréacteur (à volume constant): 15 Si y (x) > D: les cellules se multiplient (par division cellulaire) plus vite qu'elles ne sont évacuées, leur nombre et donc leur concentration (biomasse) va augmenter. Si y (x) REVENDICATIONS1. Bioréacteur caractérisé en ce qu'il comporte une source de lumière (200), un capteur de lumière (300) en regard de ladite source de lumière et une cuve (100) disposée entre la source de lumière (200) et le capteur de lumière (300) destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, un contrôleur (400) relié au capteur de lumière (300) pour piloter la cuve (100) à une concentration de culture cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture durant un temps de travail, ladite source de lumière (200) étant capable d'émettre une lumière incidente (L) d'une intensité lumineuse d'entrée (Ln) en direction de la cuve (100), et le capteur de lumière (300) étant capable de mesurer une intensité lumineuse en sortie (bout) et de transmettre des données relatives à cette intensité (bout) au contrôleur pour le pilotage de la cuve, et une commande (500) de la source de lumière (200) agencée pour régler, durant un temps inférieur ou égal audit temps de travail, l'intensité lumineuse d'entrée (L') à une valeur de consigne permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques. 2. Bioréacteur selon la revendication 1, dans lequel la valeur de consigne est supérieure ou égale à 500 umol quanta rn-2 s 1, de préférence supérieure ou égale à 800 umol quanta rn-2 s-1. 3. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la concentration de culture cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture est comprise entre 0,001 g/I à 0,1 g/L, de préférence entre 0,05 g/I à 0,1 g/L. 4. Bioréacteur selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la commande est en outre agencée pour régler ladite lumière à une intensité lumineuse d'entrée (L') à une valeur de repos inférieure à la valeur de consigne, et pour commuter entre la valeur de repos et la valeur de consigne durant le temps de travail. 5. Bioréacteur la revendication 4, dans lequel la commande est en outre agencée pour fixer un premier temps d'irradiation pour lequel la lumière est réglée à l'intensité lumineuse d'entrée (La) à la valeur de repos et un deuxième temps d'irradiation pour lequel la lumière est réglée à la valeur de consigne, le premier temps d'irradiation étant supérieur au deuxième temps d'irradiation, et pour appliquer une succession des premiers et deuxième temps d'irradiations. 6. Bioréacteur selon la revendication 5, dans lequel les premiers et deuxième temps d'irradiations sont fixés de sorte que la valeur moyenne de l'intensité lumineuse d'entrée (La) 3049616 26 durant le temps de travail calculée à partir de la valeur de repos et la valeur de consigne soit inférieure ou égale à un tiers de ladite valeur de consigne. 7. Bioréacteur selon l'une des revendications 5 et 6, dans lequel le premier temps d'irradiation est au moins trois fois supérieur au deuxième temps d'irradiation. 5 8. Bioréacteur selon l'une des revendications 5 à 7, dans lequel la commande est en outre agencée pour fixer une pluralité de premiers et deuxièmes temps d'irradiation durant lesquels la lumière est réglée à une intensité lumineuse d'entrée (Ln) à la valeur de repos lors de chaque premier temps d'irradiation et la lumière est réglée à une intensité lumineuse d'entrée (Ln) à la valeur consigne lors de chaque deuxième temps d'irradiation. 10 9. Bioréacteur selon la revendication 8, dans lequel la commande est en outre agencée pour fixer la valeur de consigne à chaque deuxième temps d'irradiation. 10. Bioréacteur selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel la concentration de culture cellulaire choisie (x,) dans le milieu de culture est comprise entre 0,1 g/I à 10 g/L, de préférence entre 1 g/I à 10 g/L. 15 11. Bioréacteur selon la revendication 10, dans lequel la commande est agencée pour maintenir l'intensité lumineuse d'entrée (Ln) à la valeur de consigne de sorte que l'intensité lumineuse en sortie (bout) soit sensiblement constante durant un temps inférieur ou égale au temps de travail. 12. Procédé de sélection de micro-organismes photosynthétiques, comprenant les étapes 20 suivantes : 1. Mettre à disposition un bioréacteur comportant une source de lumière, et une cuve disposée en regard de la source de lumière destinée à recevoir un milieu de culture comprenant une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques, ladite source de lumière étant capable d'émettre une lumière d'une intensité lumineuse 25 d'entrée /,' en direction de la cuve, 2. Emplir la cuve d'un milieu de culture ; 3. Inoculer le milieu de culture avec une culture cellulaire constituée de microorganismes photosynthétiques ; 4. Piloter la cuve durant un temps de travail à une concentration de culture cellulaire x, 30 choisie dans le milieu de culture ; 3049616 27 5. Régler l'intensité lumineuse d'entrée L', à une valeur de consigne permettant d'induire un stress cellulaire chez certains au moins desdits micro-organismes photosynthétiques ; 6. Maintenir l'intensité lumineuse d'entrée L', à la valeur de consigne durant un temps 5 inférieur ou égal audit temps de travail de manière à provoquer une dégradation cellulaire d'au moins une partie desdits micro-organismes photosynthétiques et ainsi sélectionner les micro-organismes photosynthétiques présentant une résistance accrue à la photoinhibition ; et 7. Récolter les micro-organismes photosynthétiques présentant une résistance accrue à 10 la photoinhibition dudit milieu de culture. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la récolte à l'étape 7. est réalisée lorsque le milieu de culture comporte une culture cellulaire de micro-organismes photosynthétiques constituée à plus de 75%, préférentiellement à plus de 90%, encore plus préférentiellement 15 sensiblement à 100% de micro-organismes présentant une résistance accrue à la photoinhibition. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, comprenant en outre les étapes suivantes : 20 8. Inoculer un milieu de culture avec les micro-organismes photosynthétiques récoltés à l'étape 7. dans un bioréacteur ; et 9. Piloter le bioréacteur de l'étape 8. pour une production de biomasse constituée desdits micro-organismes photosynthétiques. 25 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel le bioréacteur comprend en outre un capteur de lumière à l'opposé de ladite source de lumière par rapport à la cuve, le capteur de lumière étant capable de mesurer une intensité lumineuse de sortie (bout) ; le procédé comprenant en outre l'étape 4a. de mesurer l'intensité lumineuse en sortie (bout), et dans lequel l'intensité lumineuse d'entrée (La) à l'étape 5. est réglée en fonction de l'intensité 30 lumineuse en sortie (bout) mesurée à l'étape 4a.