FR 3040395 A1 20170303 FR 1558079 A 20150831 1 SOUCHES DE LEVURE CO-EXPRIMANT DES GLUCOAMYLASES EXOGENES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION ET LEUR UTILISATION POUR PRODUIRE DU BIOETHANOL Domaine technique de l'invention La présente invention concerne des souches de levure de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées de manière à ce qu'elles co-expriment des gènes codants pour des glucoamylases d'origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. De telles souches trouvent particulièrement un intérêt dans la production de biocarburant, notamment de bioéthanol. La présente invention concerne également un procédé d'obtention de ces levures ainsi que l'utilisation de ces levures pour produire du bioéthanol. Arrière-plan technologique L'utilisation de la biomasse pour la production de bioéthanol a suscité un intérêt considérable ces dernières années. L'éthanol produit à partir de résidus agricoles, de déchets industriels et de plantes à croissance rapide a notamment été proposé comme carburant alternatif prometteur. Actuellement, le bioéthanol dit de première génération est produit principalement à partir de sucre de canne et de grains riches en amidon au Brésil et aux Etats-Unis respectivement, en utilisant des souches de levure Saccharomyces cerevisiae, qui permettent de fermenter le glucose en éthanol avec un titre alcoolique, une productivité et un rendement élevé. Le processus permettant la conversion d'amidon en bioéthanol nécessite une préhydrolyse et une liquéfaction de l'amidon de la biomasse, la conversion de l'amidon liquéfié en sucres fermentescibles (par hydrolyse de l'amidon) et la fermentation de ces sucres en éthanol. Ces deux dernières étapes sont souvent réalisées de façon simultanée. L'hydrolyse de l'amidon nécessite l'action d'enzymes dites amylolytiques, mais, malheureusement, S. cerevisiae est dépourvue de ce type d'enzymes. Actuellement, la production d'éthanol à partir de la biomasse composée d'amidon requiert par conséquent l'addition d'enzymes exogènes en deux étapes : une première étape d'addition d'enzymes amylolytiques exogènes de manière à préhydrolyser et liquéfier l'amidon contenu dans la biomasse; et une deuxième étape où l'on utilise d'autres enzymes exogènes pour hydrolyser l'amidon liquéfié et une souche de levure de S. cerevisiae pour fermenter les sucres fermentescibles libérés. L'utilisation d'enzymes exogènes engendre une augmentation des coûts et des pertes de temps non négligeables, et il serait donc très avantageux d'obtenir des souches de levures qui soient à la fois capables d'hydrolyser l'amidon liquéfié tout en étant capable de fermenter de manière efficace les sucres issus de l'hydrolyse de l'amidon liquéfié. Invention 3040395 2 Dans ce cadre, les inventeurs de la présente invention ont développé une souche génétiquement modifiée de Saccharomyces cerevisiae, ladite souche co-exprimant plusieurs gènes de glucoamylases exogènes. En particulier les souches de Saccharomyces cerevisiae selon l'invention co-expriment à la fois un gène codant une glucoamylase d'origine fongique 5 ainsi qu'un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Les inventeurs ont démontré que ces souches étaient capables d'hydrolyser l'amidon liquéfié extrait de la biomasse tout en réussissant à fermenter efficacement les sucres issus de cette hydrolyse. En effet, l'utilisation d'une souche de levure selon la présente invention permet de remplacer tout ou partie de la quantité d'enzymes exogènes nécessaires lors de la conversion 10 de l'amidon liquéfié en bioéthanol. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle co-exprime : - un gène codant une glucoamylase d'origine fongique; et - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. 15 Les inventeurs ont également mis au point une méthode permettant d'obtenir des souches de Saccharomyces cerevisiae ayant la capacité à la fois d'hydrolyser l'amidon et de fermenter les sucres issus de cette hydrolyse. Ainsi, selon un second aspect, la présente invention concerne une méthode d'obtention d'une souche de levure, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 20 a) modification génétique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à la faire exprimer un gène codant une glucoamylase d'origine fongique et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus; b) mise en culture et fermentation de la souche obtenue à l'étape a) sur un milieu dextrine ; 25 c) sélection des souches présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à celle obtenue avec la souche déposée le 9 Juillet 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-4999 dans les mêmes conditions. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production de bioéthanol à partir d'une biomasse caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 30 a) préhydrolyse et liquéfaction de l'amidon de la biomasse ; b) mise en contact de l'amidon liquéfié obtenu à l'étape a) avec une levure de Saccharomyces cerevisiae modifiée selon l'invention; c) hydrolyse et fermentation de l'amidon liquéfié par ladite levure ; d) extraction de l' éthanol produit à l'étape c). 35 En outre, la présente invention concerne l'utilisation d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae modifiée selon l'invention pour la production de biocarburant. 3040395 3 Description détaillée de l'invention Afin d'obtenir une souche de levure qui puisse hydrolyser l'amidon et fermenter les sucres issus de l'hydrolyse de l'amidon, les inventeurs ont génétiquement modifié une souche de 5 Saccharomyces cerevisiae de manière à lui faire co-exprimer deux gènes codant pour des glucoamylases exogènes. Ainsi, un premier objet de la présente invention est une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle exprime : - un gène codant une glucoamylase d'origine fongique ; et 10 - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Particulièrement la présente invention a pour objet une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle exprime : - un gène codant une glucoamylase d'origine fongique ; et - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus 15 dans laquelle la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus a la séquence protéique SEQ ID NO : 4. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que l'utilisation spécifique d'un gène de glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus et d'un gène de glucoamylase d'origine fongique permettait d'obtenir des souches avec d'excellentes capacités d'hydrolyse. 20 Ces résultats sont particulièrement étonnants, car la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est connue pour avoir un rendement beaucoup moins efficace que celui obtenu avec les glucoamylases d'origine fongique, ce qui en fait une enzyme très peu utilisée par les enzymiers. Ce postulat est par exemple démontré dans la demande de brevet internationale publiée sous la référence W02011/153516, qui décrit le criblage enzymes dont 25 la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus (qui correspond à la protéine IDAAA35107.1). Dans ce document, la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus n'est pas retenue comme étant intéressante pour son activité enzymatique. L'expression « souche de levure » désigne une population relativement homogène de cellules de levure. Une souche de levure est obtenue à partir d'un clone, un clone étant une population 30 de cellules obtenue à partir d'une seule cellule de levure. Par « gène codant la glucoamylase» on entend ici une séquence d'acides aminés qui, lorsqu'elle est exprimée, va donner une protéine de glucoamylase fonctionnelle. Par « glucoamylase » on entend ici une enzyme capable d'hydrolyser les liaisons glycosidiques ct-1,4 de l'amidon brut ou soluble à partir de l'extrémité non réductrice de 35 l'amylose et de l'amylopectine. Les amylases sont également connues sous la dénomination 3040395 4 d'amyloglucosidases ou de y-amylases (MEDLINE reference : EC 3.2.1.3). En plus d'agir sur les liaisons a-1,4, l'enzyme glucoamylase peut hydrolyser lentement les liaisons a-1,6 des molécules d'amylopectine, à condition que la liaison voisine dans la séquence soit une liaison a-1,4. 5 Une glucoamylase d'origine fongique est choisie parmi des glucoamylases commerciales connues pour leur bonne activité enzymatique et, en particulier, la glucoamylase d'origine fongique est sélectionnée dans le groupe consistant en : une glucoamylase d'Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Rhizopus oryzae, une glucoamylase d'Aspergillus oryzae et une 10 glucoamylase Thermomyces lanuginosis Ces glucoamylases sont connues de l'homme du métier, et leurs séquences sont accessibles sous les références GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) suivantes : Trichoderma reesei ETS06561 Rhizopus oryzae BAA00033 15 Aspergillus oryzae BAA00841 Thermomyces lanuginosis ABQ23180 Selon un mode de réalisation particulier, la glucoamylase d'origine fongique est une glucoamylase d'Aspergillus niger ou de Saccharomycopsis fibuligera. 20 La glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera est codée par le gène GLU0111 qui présente la séquence nucléique correspondant à la SEQ ID NO : 17 et a pour séquence protéique la séquence correspondant à la SEQ ID NO : 18. La glucoamylase d'Aspergillus niger est codée par le gène GLAA qui présente la séquence nucléique correspondant à la SEQ ID NO : 1 et a pour séquence protéique la séquence correspondant à la SEQ ID NO : 2. 25 La glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par le gène STA1 qui présente la séquence nucléique correspondant à la SEQ ID NO : 3 et a pour séquence protéique la séquence correspondant à la SEQ ID NO : 4. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence 30 nucléique SEQ ID NO : 1 et la séquence nucléique SEQ ID NO : 3. Dans un mode de réalisation, la présente invention a pour objet une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle co-exprime : - un gène codant la glucoamylase d'Aspergillus niger; et - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. 3040395 5 Dans mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle co-exprime : - un gène codant la glucoamylase d'Aspergillus piger; et - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus 5 où la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus a la séquence protéique SEQ ID NO : 4 et la glucoamylase d'Aspergillus piger a la séquence protéique SEQ ID NO : 2. Les expressions « glucoamylase d'origine fongique» et « glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus » ne doivent pas être interprétées de manière stricte : elles 10 englobent les glucoamylases d'origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus qui sont codées par les séquences nucléiques telles que décrites ci-dessus, mais également les variants fonctionnels de ces glucoamylases. Typiquement, un variant fonctionnel d'une glucoamylase selon l'invention a une séquence protéique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80%, 90%, 95%, plus 15 particulièrement de 99% avec la séquence protéique de ladite glucoamylase. Par exemple, les variants fonctionnels des glucoamylases d'Aspergillus piger et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ont une séquence protéique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80%, 90%, 95%, plus particulièrement de 99% respectivement avec la séquence SEQ ID NO: 2 ou 4. 20 Le « pourcentage d'identité » est une comparaison entre des séquences d'acides aminés, et est déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale sur une fenêtre de comparaison. L'homme du métier sait comment calculer un pourcentage d'identité entre deux séquences et dispose de nombreux outils le lui permettant. L'une des deux séquences peut présenter des insertion, substitutions et des délétions d'acides aminés par rapport à l'autre 25 séquence. L'homme du métier saura comment sélectionner des variants fonctionnels des glucoamylases selon l'invention. Par "variant fonctionnel" on entend un variant qui conserve son activité de glucoamylase et ce avec des caractéristiques de cinétique d'hydrolyse de l'amidon similaires. Des méthodes permettant de mesurer et de comparer des cinétiques d'hydrolyse de l'amidon 30 sont décrites dans la partie expérimentale de la présente demande. Des variants fonctionnels peuvent être préparés par diverses méthodes conventionnelles, telles que par exemple la mutagénèse aléatoire ou la mutagénèse dirigée. L'homme du métier connait de multiples méthodes permettant d'introduire un gène dans une souche de levure, notamment via l'utilisation de vecteurs comprenant des cassettes 35 d'expression. On entend par « vecteur » toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acides nucléiques étrangers, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les vecteurs dérivés de virus. Les vecteurs permettent soit l'intégration des gènes 3040395 6 hétérologues directement dans le génome de la levure, soit leur expression dans un plasmide indépendant. L'introduction de vecteurs dans une cellule hôte est un procédé largement connu de l'homme du métier. Plusieurs méthodes sont notamment décrites dans « Current Protocols in Molecular 5 Biology », 13.7.1-13.7.10 ; ou encore dans Ellis T et al., Integrative Biology, 2011, 3(2), 109- 118. Selon l'invention, le gène codant une glucoamylase d'origine fongique et celui codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus peuvent être insérés au sein d'un seul et même vecteur, ou au sein de deux vecteurs séparés. 10 Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, le gène codant une glucoamylase d'origine fongique et celui codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés séparément chacun dans un vecteur. Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur est un plasmide. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le gène codant une glucoamylase 15 d'origine fongique et celui codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés au sein du génome de ladite levure. Le vecteur selon l'invention pourra également porter un marqueur de sélection. On entend par « marqueur de sélection » un gène dont l'expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de 20 résistance aux antibiotiques ou d'un gène permettant la croissance de la levure sur un milieu particulier. Les gènes selon l'invention peuvent être liés opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans levure. Dans un mode particulier de l'invention, l'expression des gènes codant pour les 25 glucoamylases d'origines fongiques et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est contrôlée par un promoteur dit « fort ». L'homme du métier connait la signification de promoteur fort. Un promoteur fort est par exemple le promoteur pADH1, le promoteur pTEF, ou le promoteur pTDH3. Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche de levure de 30 Saccharomyces cerevisiae telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l'expression du gène codant une glucoamylase d'origine fongique et celui codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est contrôlée par le promoteur pADH1. Les gènes codant pour les glucoamylases d'origines fongiques et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus peuvent être présents en plusieurs copies. 35 Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend m copies du gène codant une glucoamylase d'origine fongique et n copies du gène 3040395 7 codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, où m est un nombre entier compris entre 2 et 10 et n est un nombre entier compris entre 2 et 10. m et n sont donc indépendamment égaux à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Dans un mode de réalisation plus particulier, m est un nombre entier compris entre 2 et 8, et n 5 est un nombre entier compris entre 2 et 8. L'invention concerne particulièrement deux souches de levures de Saccharomyces cerevisiae telles que décrites ci-dessus, lesdites souches étant la souche déposée le 6 août 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-5005 ou la souche déposée le 9 Juillet 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-4997. 10 La souche de levure I-5005 comprend 4 copies du gène codant la glucoamylase d'Aspergillus niger et 3 copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. La souche de levure I-4997 comprend 4 copies du gène codant la glucoamylase d'Aspergillus niger et 4 copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. 15 diastaticus. Les inventeurs ont parallèlement mis au point une méthode permettant d'obtenir des souches de Saccharomyces cerevisiae qui sont capables d'hydrolyser l'amidon. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode d'obtention d'une souche de levure, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 20 a) modification génétique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à la faire co-exprimer un gène codant une glucoamylase d'origine fongique et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ; b) mise en culture et fermentation de la souche obtenue à l'étape a) sur un milieu dextrine ; 25 c) sélection des souches présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à celle obtenue avec la souche de référence déposée le 9 Juillet 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-4999 dans les mêmes conditions. La levure Saccharomyces cerevisiae de l'étape a) est une levure utilisée pour la production de 30 bioéthanol. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la levure Saccharomyces cerevisiae de l'étape a) est la levure Ethanol Red ®, ci-après nommée ER, déposée à la CNCM le 4 septembre 2008 sous le numéro I-4071. Par « milieu dextrine », on entend un milieu synthétique contenant des dextrines tel que connu 35 de l'homme du métier. Il s'agit par exemple d'un milieu synthétique contenant des dextrines 3040395 8 d'amidon (220 g/kg), de l'extrait de levure (5 g/kg), de l'urée (2 g/kg), du dihydrogénophosphate de potassium (1 g/kg) ainsi que des minéraux et des vitamines. La souche de référence I-4999 correspond à la souche de levure Ethanol Red ® génétiquement modifiée comprenant 4 copies du gène codant la glucoamylase de 5 Saccharomycopsis fibuhgera. La cinétique de fermentation peut être facilement mesurée par différentes techniques connues de l'homme du métier. Par exemple, la cinétique de fermentation peut-être mesurée via un suivi de fermentation par pesée au cours du temps. Les souches ainsi sélectionnées sont particulièrement intéressantes pour produire du 10 biocarburant, notamment du bioéthanol à partir de biomasse. Le terme « biomasse » désigne un ensemble de matières organiques qui peuvent être transformées en énergie. De nombreux types de biomasse, y compris le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées peuvent être utilisées pour la production de biocarburant, particulièrement de bioéthanol. Le bioéthanol est caractérisé de « bio » car il est produit à 15 partir de biomasse renouvelable. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production de bioéthanol à partir d'une biomasse caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préhydrolyse et liquéfaction de l'amidon de la biomasse ; b) mise en contact de l'amidon liquéfié obtenu à l'étape a) avec une levure selon 20 l'invention ; c) hydrolyse et fermentation de l'amidon liquéfié par ladite levure ; d) extraction de l' éthanol produit à l'étape c). Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de production de bioéthanol décrit ci-dessus comprend en outre une étape b') d'ajout d'enzymes glucoamylases exogènes après 25 l'étape b) et/ou au cours de l'étape c). L'éthanol ainsi produit peut avoir de multiples utilisations, notamment dans l'industrie automobile. L'invention concerne également l'utilisation d'une souche de levure telle que décrite ci-dessus pour la production de biocarburant, particulièrement de bioéthanol. 30 Brève description des figures La figure 1 illustre deux exemples de vecteur pANG et pSDG de surexpression et de clonage pour les glucoamylases. Ce vecteur est un vecteur de clonage intégratif utilisé pour l'expression de gènes chez la levure. pADH1 : promoteur d'ADH1 de S. cerevisiae ; tCYC1 : terminateur CYC1 de S. cerevisiae ; Kan-MX : marqueur de résistance à la généticine ; 3040395 9 AmpR : marqueur de résistance à l'ampicilline. BUD5 A et BUD5 B les régions recombinogéniques pour l'intégration au locus BUD5. La figure 2 décrit la stratégie de clonage pour l'insertion de 4 modules d'expression et un module de sélection au locus HO. 5 La figure 3 décrit la stratégie et les différentes étapes pour l'obtention des souches I-5005 (A) et I-4997 (B). La figure 4 illustre un exemple de résultat de criblage de 88 clones ER-GAND sur un milieu YEG/amidon. Après 48h d'incubation, l'hydrolyse de l'amidon apparait comme des halos clairs autour des colonies de levure sécrétant des glucoamylases fonctionnelles. Les levures 1 10 à 6 sur la 12ème colonne sont des souches témoins permettant une comparaison de la taille et de l'intensité des halos. La figure 5 illustre le criblage réalisé avec les clones ER-GAND série 8000 en fermentation sur milieu dextrine. Trois durées de fermentations (20h, 31h et 54h) sont présentées. Les flèches indiquent les 15 clones ER-GAND-série 8000 sélectionnés. 15 La figure 6 représente une fermentation sur milieu dextrine des 30 meilleurs clones ER- GAND criblés ainsi que de 4 souches témoins (ER, I-4998; I-4899 et I-4999). La fermentation est réalisée à 32°C et est suivie par perte de masse (g/kg) pendant 74h. La figure 7 représente une fermentation sur milieu industriel de maïs des 5 meilleurs clones ER-GAND série 7000 criblés ainsi que de 3 souches témoins (I-4998; I-4899 et I-4999). La 20 fermentation est réalisée à 32°C et est suivie par une perte de masse (g/kg) pendant 70h. EXEMPLES Exemple 1 : Intégration de 4 copies du gène codant la glucoamylase d'Aspergillus niger et de 3 ou 4 copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae 25 var. diastaticus dans une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae Les copies des gènes de la glucoamylase d' Aspergilus niger GLAA (SEQ ID NO : 1) et de la glucoamylase de S. cerevisiae var. diastaticus STA1 (SEQ ID NO : 3) ont été synthétisés au biais de codon pour Saccharomyces cerevisiae. Les séquences d'ADN utilisées ont été clonées dans un vecteur-type comprenant : 30 - les cibles d'intégration - les promoteurs/terminateurs choisis, par exemple pADH1/tCYC1 - les marqueurs de résistance qui pourront être éliminés par la suite. Dans le présent exemple le plasmide pANG (dénomination interne au demandeur) a été utilisé pour exprimer la glucoamylase GLAA d'Aspergillus niger (cf figure 1). De la même 3040395 10 manière, on réalise le plasmide pSDG (dénomination interne au demandeur) pour exprimer la glucoamylase de S. cerevisiae var. diastaticus Le principe du clonage de 4 copies de GLAA ou 3 ou 4 copies STA1 peut être détaillé de la façon suivante : 5 - un module d'expression comprenant le promoteur pADH1, l'ORF des glucoamylases et le terminateur tCYC1 a été amplifié avec 3 ou 4 couples d'oligonucléotides différents. Chaque module obtenu après amplification PCR a en commun ces 3 éléments 10 - Un module de sélection comprenant un promoteur/terminateur fort, un gène dont l'expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques ou d'un gène permettant la croissance de la levure sur un milieu particulier. Le module de résistance au marqueur antibiotique étant flanquée de sites LoxP, il sera possible de 15 l'éliminer a posteriori par action de la recombinase Cre. « ORF » a pour signification « Open Reading Frame » signifiant cadre ouvert de lecture. Les amorces utilisées pour l'intégration des 4 copies du gène GLAA et du module de sélection au locus HO sont les suivantes : 20 1f-Gibson AMG : TCTGATGGCTAACGGTGAAATTAAAGACATCGCAAACGTCACGGCTAACTTGAAGCTTCGTACGCTGCAGG (SEQ ID NO : 5) 25 A1-Gibson AMG : TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTG CGCATAGGCCACTAGTGGATCT (SEQ ID NO : 6) A2-Gibson AMG : CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 7) 30 81-Gibson AMG: TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGA CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 8) 82-Gibson AMG: 35 TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 9) Cl-Gibson AMG: TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAG CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 10) C2-Gibson AMG : CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 11) D1-Gibson AMG : TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCA CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 12) D2-Gibson AMG : 3040395 11 TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 13) 2r-Gibson AMG : ACATACTTGCAATTTATACAGTGATGACCGCTGAATTTGTATCTTCCATACAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ 5 ID NO : 14) Les amorces utilisées pour l'intégration de 3 ou 4 copies du gène STA1 et du module de sélection au locus GRE3 sont les suivantes : 10 MCI-pADH1-GRE3-f : TAAGGGATATAGAAGCAAATAGTTGTCAGTGCAATCCTTCAAGACGATTG GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 15) Al-Gibson AMG : 15 TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTG CGCATAGGCCACTAGTGGATCT (SEQ ID NO : 6) A2-Gibson AMG : CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 7) 20 81-Gibson AMG: TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGA CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 8) 82-Gibson AMG: TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 9) 25 Cl-Gibson AMG: TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAG CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 10) C2-Gibson AMG : 30 CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 11) D1-Gibson AMG : TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCA CAGCTTGCAAATTAAAGCCT (SEQ ID NO : 12) 35 D2-Gibson AMG : TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAA GCATAACCGCTAGAGTACTT (SEQ ID NO : 13) MCI-tCYC1-GRE3-r : CACATATACAGCATCGGAATGAGGGAAATTTGTTCATATCGTCGTTGAGT CAGCTTGCAAATTAAAGCCT 40 (SEQ ID NO : 16) Le tableau 1 mentionne les couples d'oligonucléotides utilisés dans les modules de sélection et d'expression. 3040395 12 Couples Couples d'amorces du module d'expression pour le clonage de 4 copies de GLAA et 4 copies de STA1 Couples d'amorces du module d'expression pour le clonage de 4 copies de GLAA et 3 copies de STA1 d'amorces du module de sélection Amorces If-Gibson A2-Gibson AMG + BI -Gibson A2-Gibson AMG + BI -Gibson pour le AMG + AI- AMG AMG clonage Gibson AMG B2-Gibson AMG + CI-Gibson B2-Gibson AMG + CI-Gibson du gène AMG AMG ANG C2-Gibson AMG + DI-Gibson C2-Gibson AMG + DI-Gibson AMG AMG D2-Gibson AMG + 2r-Gibson D2-Gibson AMG + 2r-Gibson AMG AMG Amorces MCI-pADHI- A2-Gibson AMG + BI -Gibson A2-Gibson AMG + BI -Gibson pour le GRE3-f + AMG AMG clonage A1-Gibson B2-Gibson AMG + CI-Gibson B2-Gibson AMG + CI-Gibson du gène AMG AMG AMG SDG C2-Gibson AMG + DI-Gibson AMG C2-Gibson AMG + MCI- tCYCJ-GRE3-r D2-Gibson AMG + MCI-tCYCI- GRE3-r Tableau 1: Couples d'amorces utilisés pour le clonage de 4 copies de GLAA et 3 ou 4 copies de STA1 « Gène ANG » signifie gène de la glucoamylase d'Aspergillus niger. 5 « Gène SDG » signifie gène de la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Chaque module amplifié possède des séquences recombinogéniques (Al, B1, Cl et Dl) de part et d'autre de son promoteur et de son terminateur. Ces séquences sont apportées par les queues flottantes des amorces PCR et permettront aux modules de s'aligner et recombiner spécifiquement par homologie entre ces séquences recombinogéniques (figure 2). 10 La stratégie employée consiste à intégrer simultanément plusieurs modules d'expression des gènes de glucoamylase dans une souche de S. cerevisiae en une seule étape à un locus donné, en se basant sur la capacité naturelle de la levure à réaliser la recombinaison homologue in vivo. En fonction des combinaisons de produits PCR préparés, trois ou quatre modules 15 d'expression de la glucoamylase et un module de sélection peuvent être transformés dans la souche S. cerevisiae. La sélection des clones ayant intégré correctement les cassettes d'expression est faite dans un premier temps sur la base de la présence du module de sélection dans la cassette d'intégration (MCI). 20 La présence de séquences homologues à un locus donné, par exemple le locus HO, aux extrémités 5' et 3' de la cassette d'expression multi-intégrative permet l'intégration 3040395 13 simultanée des modules d'expression et du module de sélection par recombinaison homologue à ce locus donné. L'utilisation de différents marqueurs de sélection et de leur recyclage ainsi que l'intégration à différents locus, permet l'intégration séquentielle et itérative de plusieurs cassettes multi- 5 intégratives. Par exemple, la figure 3 illustre les différentes étapes pour l'obtention des souches I-4997 et I5005 telles qu'expliquées ci-dessous : 1- intégration de 4 modules d'expression de la glucoamylase d'A. niger, ci-après GLAA, et du module de sélection G418 (gène de résistance à la généticine / marqueur 10 KanMX) au niveau du locus HO permettant alors d'obtenir la souche ER-ANG-G418 ; 2- élimination du module de sélection par l'action de la recombinase Cre permettant la sélection de la souche déposée le 15 octobre 2014 à la CNCM sous le numéro I-4899 3- intégration d'une deuxième cassette composée de 3 ou 4 modules d'expression de la 15 glucoamylase de S. cerevisiae var. diastaticus, ci-après STA1, au niveau du locus GRE3. Les souches exprimant conjointement les glucoamylases d'A. niger (GLAA) et de S. diastaticus (STA1) ont été nommées ER-GAND. Selon ce modèle de construction, il est ainsi possible de construire des levures ayant intégré 4 copies du gène de glucoamylase GLAA et 3 20 copies du gène de glucoamylase STA1 ou ayant intégré 4 copies du gène de glucoamylase GLAA et 4 copies du gène de glucoamylase STA1. Pour les levures ER-GAND deux séries de clones ont été générées. La série 7000 (ERGAND-7200 à ER-GAND-7376) correspond à l'intégration de 4 copies du gène de glucoamylase GLAA (d'A. niger) et 3 copies du gène de glucoamylase STA1 (de S. 25 cerevisiae var. diastaticus). Quant à la série 8000 (ER-GAND-8000 à ER-GAND-8159), 4 copies du gène de glucoamylase GLAA (d'A. niger) et 4 copies du gène de glucoamylase STA1 (de S. cerevisiae var. diastaticus) ont été clonées. Les souches de levure utilisées dans l'invention sont rappelées ci-dessous dans le tableau 2 ainsi que leurs caractéristiques. Nom souches CNCM Copies Copies Copies GA - GA de GA de ANG SDG SFG ER I-4071 0 0 0 ER-ANG-G418 nd 4 0 0 ER-GA-36 I-4899 4 0 0 ER-GAND-8159 I-4997 4 4 0 ER-GAND-7302 I-5005 4 3 0 ER-SFG-4c I-4999 0 0 4 ER-SDG-3c I-4998 0 3 0 3040395 14 Tableau 2 : Récapitulatif des noms/ numéros de souches et du nombre de copies de gènes de glucoamylase intégrés (nd : non déposé) Exemple 2 : Criblage des souches 5 Trois criblages phénotypiques ont été réalisés afin de sélectionner les quinze meilleurs clones les plus performants pour l'application visée. a) Criblage phénotypique à l'iode L'hydrolyse de l'amidon soluble par les transformants de levure est testée sur un milieu agar YEG/amidon (Glucose 1%, extrait de levure 0.5%, amidon soluble 1%). Les cellules de 10 levure sont déposées sur la gélose YEG/amidon et incubées pendant 2 jours à 30°C. Ensuite les boites sont colorées à la vapeur d'iode afin de visualiser les halos d'hydrolyse présents autour des colonies de levure. Ce criblage à la vapeur d'iode permet de sélectionner les clones sécrétant au moins une enzyme capable d'hydrolyser l'amidon. Ces clones positifs sont visualisables notamment par 15 des halos d'hydrolyse dont la taille est proportionnelle à l'activité enzymatique. La figure 4 illustre un exemple de criblage de 88 clones ER-GAND sur milieu YEG/amidon après coloration à l'iode. Le tableau 3 présente les résultats obtenus après coloration à l'iode. Souches ER- Nombre Croissance Aucun Phénotype d'hydrolyse GAND de sur YEG phénotype plus faible que le clones criblés d'hydrolyse témoin Série 7000 (3 176 173 (98%) 1 ( REVENDICATIONS1. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle co-exprime : - un gène codant une glucoamylase d'origine fongique ; et - un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. 2. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, caractérisée en ce que la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus a la séquence protéique SEQ ID NO : 4. 3. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la glucoamylase d'origine fongique est choisie dans le groupe consistant en : une glucoamylase d'Aspergillus piger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Thermomyces lanuginosis, une glucoamylase de Rhizopus oryzae ou une glucoamylase d'Aspergillus oryzae, 4. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 3, caractérisée en ce que la glucoamylase d'origine fongique est une glucoamylase d'Aspergillus piger ou une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera. 5. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 4, caractérisée en ce que la glucoamylase d'origine fongique est une glucoamylase d'Aspergillus piger et a la séquence protéique SEQ ID NO : 2. 6. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend m copies du gène codant une glucoamylase d'origine fongique et n copies du gène codant pour la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, dans lequel m est un nombre entier compris entre 2 et 10 et n est un nombre entier compris entre 2 et 10. 7. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le gène codant une glucoamylase d'origine fongique et celui codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés au sein du génome de ladite levure. 8. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, ladite souche étant 30 la souche déposée le 6 août 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I5005. 9. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, ladite souche étant la souche déposée le 9 Juillet 2015 en vertu du traité de Budapest à la CNCM sous le numéro I-4997. 35 10. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae caractérisée en ce qu'elle contient la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 et la séquence nucléique SEQ ID NO : 3. 3040395 19 11. Méthode d'obtention d'une souche de levure, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) modification génétique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à la faire co-exprimer un gène codant une glucoamylase d'origine fongique et un gène 5 codant la glucoamylase d' Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus; b) mise en culture et fermentation de la souche obtenue à l'étape a) sur un milieu dextrine ; c) sélection des souches présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la souche déposée le 9 Juillet 2015 en vertu du traité de Budapest à la 10 CNCM sous le numéro I-4999 dans les mêmes conditions. 12. Procédé de production de bioéthanol à partir d'une biomasse caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préhydrolyse et liquéfaction de l'amidon de la biomasse ; b) mise en contact de l'amidon liquéfié obtenu à l'étape a) avec une levure telle que 15 décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; c) hydrolyse et fermentation de l'amidon liquéfié par ladite levure ; d) extraction de l' éthanol produit à l'étape c). 13. Procédé selon la revendication 12, ledit procédé comprenant en outre une étape b') d'ajout d'enzymes glucoamylases exogènes après l'étape b) et/ou au cours de l'étape c). 20 14. Utilisation d'une souche de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la production de bioéthanol.