FR 3039649 A1 20170203 FR 1557275 A 20150729 PROCEDE DE DETECTION D'ESPECES OX I ANTES L'invention se rapporte à un procédé utile pour l'analyse d'espèces oxydantes et à un système de détection d'espèces oxydantes, adapté à mettre en oeuvre ce procédé. De - ,( procédés ont déjà été proposés visant à détecter la présence d'espèces oxydantes dans un échantillon. Les espèces oxydantes plus particulièrement ciblées sont notamment des messagers cellulaires impliquées dans diverses voies de signalisation. Leur régulation est primordiale dans les réactions immunitaires et dans des pathologies telles que certains cancers, maladies cardiovasculaires ou maladies neurodégénératives. 11 est donc particulièrement intéressant de disposer de méthodes efficaces de détermination de la présence, de quantification de cette présence et de l'évolution temporelle de la concentration d'espèces oxydantes dans un échantillon à tester, notamment dans un échantillon biologique. Il est à noter cependant que la détection d'espèces oxydantes présente de 15 nombreuses autres applications. La demande FR-A-2 980 847 présente ainsi, à titre d'exemple, une méthode de détection d'explosifs basée sur la détection d'espèces oxydantes. Certains des procédés connus proposent d'utiliser agent fluorescent organique (ou fluorophore) dont la luminescence est exaltée par la présence d'espèces oxydantes dans 20 l'échantillon. La DiChloroFluorescéine est un exemple d'un tel agent fluorescent organique, dont la fluorescence est exaltée en présence d'oxydant, pouvant être utilisé en milieu vivant. Cependant, il est connu qu'un tel agent fluorescent organique subit un fort photoblanchiment et est susceptible de s'oxyder spontanément en milieu ambiant, ce qui ne 25 permet pas de réaliser, en pratique, des mesures quantitatives de longue durée. En outre, l'augmentation de fluorescence fait suite à une réaction d'oxydation irréversible, ce ne permet pas de réaliser des mesures résolues en temps. Il est également connu de mettre en oeuvre une protéine fluorescente en tant qu'agent fluorescent, notamment dans un organisme génétiquement modifié. cpYFP, 30 HyPer (1,2 et 3) ou roGFP sont des exemples connus d'une telle protéine fluorescente. Cependant, ces agents peuvent être spécifiques à ce . nes espèces oxydantes seulement, présenter un temps de réponse long ou avoir une gamme de détection restreinte, avec par exemple une saturation à 500 nmol.L-1 pour la plus performante des protéines Hyper, Hyper3, incompatible avec certaines applications, notamment les applications biologiques. 3039649 2 ri' et al, ACS Chem. Biol 2013 ont cependant montré que ces protéines fluorescentes pouvaient être utilisées pour la détection d'espèces oxydantes dans des cellules vivantes, mais sans obtenir de mesure de la concentration absolue d'oxydants. Par ailleurs, il est connu de l' 'cle « Single europium-doped nanoparticles 5 measure temportal pattern of reactive oxygen species production inside cells », de Didier Casanova et al., Nature Nanotechnology, vol. 4, Septembre 2009, un procédé de détection quantitative d'espèces oxydantes dans lequel des nanoparticules d'Y0,6Eu0,4VO4 dopées à l'europium à l'état d'oxydation III sont utilisées comme agent photoluminescent. L'utilisation de ces particules requiert donc au préalable leur réduction pour les rendre 10 oxydables. Cette réduction y est réalisée in situ sous irradiation laser de manière à disposer d'élément europium au degré d'oxydation II et donc sous une forme oxydable par une ou plusieurs espèces oxydantes. Or, cette photo-réduction dédiée à générer l'espèce europium oxydable s'avère parfois délétère à l'égard des cellules conjointement présentes. Cette photo-réduction est de plus difficilement praticable sur des échantillons macroscopiques ou in vivo. En outre, pour déterminer l'évolution temporelle de la concentration en espèces oxydantes dans l'échantillon testé, le procédé décrit dans cet article nécessite de déterminer l'intensité lumineuse des nanop. 'cules et la dérivée par rapport au temps de ce signal. La détermination de cette dérivée nécessite plusieurs mesures successives de l'intensité lumineuse, ce qui limite la résolution temporelle d'un tel procédé à environ 30 s. Enfin, un tel procédé s'appuie sur la mesure d'une intensité absolue de luminescence et suppose donc l'observation des nanoparticules sous une forme individualisée, ce qui empêche toute détection dans un volume macroscopique. Le but de la présente invention est de proposer une méthode de détection d'espèces 25 oxydantes ne présen t pas les inconvénients des procédés connus de l'art antérieur. No ent, l'invention vise à proposer une méthode qui soit compatible avec une mesure volumique et/ou présente une meilleure résolution temporelle et qui selon une variante préférée ne requiert pas de générer in situ une espèce oxydable. À cette fin, l'invention propose à titre principal un procédé utile pour l'analyse 30 d'espèces oxydantes un éc tillon, en particulier dans échantillon biologique, comprenant les étapes consis t à : i) mettre en contact l'échantillon avec un premier agent photoluminescent, et un deuxième agent optiquement actif, au moins le premier agent 3039649 3 photoluminescent compo t des nanoparticules dopées aux terres rares et oxydables, avec - la luminescence du premier agent photoluminescent variant, à au moins une première longueur d'onde, avec la quantité d'espèces oxydantes, et 5 - le signal émis par le deuxième agent optiquement actif étant constant ou variant, à au moins une seconde longueur d'onde distincte de la première longueur d'onde, avec la quantité d'espèces oxydantes et dans un sens opposé à la luminescence du premier agent photoluminescent, ii) exciter le premier agent photoluminescent et le deuxième agent 10 optiquement actif dans l'échantillon ; iii) mesurer l'intensité lumineuse de l'échantillon à au moins ladite première longueur d'onde et au moins ladite seconde longueur d'onde, et apprécier la présence et/ou quantité d'espèce(s) oxydante(s) par - erprétation desdites intensités lumineuses mesurées, et le cas échéant 15 par référence à des valeurs étalon. Au sens de l'invention, l'expression « analyse d'espèces oxydantes » couvre l'aspect détection ou encore caractérisation qualitative de la présence ou non d'espèces oxydantes et également l'aspect dosage ou encore caractérisation quantitative des espèces oxydantes. 20 Au sens de l'invention, on entend par agent optiquement actif, agent adapté à émettre des photons suite à une excitation par des photons, éventuellement de longueurs d'ondes différentes. Ainsi, le procédé proposé repose sur la mesure simultanée de l'intensité d'émission d'un premier agent photoluminescent et d'un deuxième agent optiquement actif, l'intensité 25 d'émission d'au moins l'un des deux agents variant en fonction de la présence d'espèces oxydantes. I -e mesure simultanée est possible en choisissant des agents ayant des longueurs d'ondes d'émission distinctes. Les inventeurs ont démontré qu'en outre cette double mesure permet de réaliser des mesures en volume sur un échantillon macroscopique, ou microscopique, avec une meilleure résolution temporelle, comme cela 30 sera expliqué plus en détails par la suite. Plus précisément, la première longueur d'onde, correspond à une longueur d'onde d'émission représentative de la forme oxydée ou de la forme réduite du premier agent photoluminescent. 3039649 4 Pour sa part, la seconde longueur d'onde, correspond à une longueur d'onde d'émission spécifique du deuxième agent optiquement actif et le cas échéant représentative de sa forme réduite ou oxydée. Selon une variante préférée, la première longueur d'onde de luminescence est 5 représentative d'une forme oxydée du premier agent photoluminescent. En conséquence, la présence d'espèces oxydantes sera sanctionnée par la visualisation d'une intensité lumineuse accrue à cette longueur d'onde. Selon une première variante, le premier agent luminescent est mis en oeuvre en combinaison avec un agent optiquement actif dont l'intensité lumineuse ne varie pas avec 10 la concentration en espèces oxydantes. Dans cette alternative, l'intensité lumineuse spécifique à l'agent optiquement actif peut être directement utilisée à titre de valeur étalon pour sanctionner un accroissement ou non de l'intensité lumineuse spécifique au premier agent luminescent, un accroissement é . t révélateur de la présence d'au moins une espèce oxydante. 15 Ce mode de réalisation reposant sur l'association du premier agent luminescent avec un. second agent optiquement actif est particulièrement avantageux pour une analyse I volume macroscopique et notamment dans un environnement non surfacique, par exemple un volume liquide ou dans une épaisseur d'échz, Selon une seconde variante, le premier agent luminescent est mis en oeuvre en 20 combinaison avec agent optiquement actif dont l'intensité lumineuse de ladite seconde longueur d'onde attitrée varie également en fonction de la concentration d'espèces oxydantes mais avec une évolution opposée à celle manifestée par le premier agent luminescent. Les nanoparticules des deux types sont observées individuellement, par exemple après dépôt sur une surface ou internalisation dans une cellule. Ainsi dans la variante préférée du procédé selon l'invention où la première longueur d'onde de luminescence est représentative d'une forme oxydée du premier agent photoluminescent, la deuxième longueur d'onde spécifique à l'agent optiquement actif est représentative de la forme réduite de cet agent. Ainsi, la présence d'espèces oxydantes sera sanctionnée par la visualisation d'une diminution de l'intensité lumineuse de cette seconde longueur d'onde. Dans cette alternative, l'interprétation des mesures des deux intensités lumineuses est avantageusement réalisée en se reportant à des valeurs étalons préétablies. Plus précisément, la quantité d'espèces oxydantes i s l'échantillon peut être déterminée par lecture sur une nappe étalon de la valeur correspondant au couple d'intensités lumineuses mesurées à l'étape iii). Cette nappe étalon est une nappe préétablie 3039649 5 au moyen de mesures réalisées avec des échantillons à quantité connue en espèces oxydantes, de préférence dans des conditions identiques à celles de l'étude de l'échantillon, ces conditions identiques incluant notamment l'un au moins parmi le solvant, le pH et la température de test. 5 Ce mode de réalisation reposant sur l'association premier agent luminescent avec un second agent optiquement actif à intensité lumineuse variable est particulièrement avantageux dans la mesure où il permet d'accéder à partir d'une unique mesure du couple d'intensité lumineuse représentatif des premier et deuxième agents, et donc de manière rapide, limitée uniquement par la cadence d'acquisition du dispositif d'enregistrement, et 10 qui plus est fiable, à une valeur quantitative de la concentration en espèces oxydantes dans l'échantillon à analyser. Selon une variante de réalisation, le procédé sel( l'invention met en oeuvre à titre de premier agent photoluminescent des nanoparticules d'AxEul-x(VO4)y(PO4)(1-y), en particulier d'AxEul-xVO4, où A est l'un parmi Y, Gd et La, 0 REVENDICATIONS1. Procédé utile pour l'analyse d'espèces oxydantes dans un échantillon, en 'culier dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à: i) mettre en contact (12) l'échantillon avec un premier agent photolurninescent, et un deuxième agent optiquement actif, au moins le premier agent photoluminescent comportant des nanoparticules dopées aux terres rares et oxydables, avec b luminescence du premier agent photoluminescent variant, à au moins I 0 une première longueur d'onde, avec la quantité d'espèces oxydantes, et le signal émis par le deuxième agent optiquement actif étant cons t ou variant, à au moins une seconde longueur d'onde distincte de la première longueur d'onde, avec la quantité d'espèces oxydantes et dans un sens opposé à la luminescence du premier agent photoluminescent, 15 ii) exciter (16) le premier agent photoluminescent et le deuxième agent optiquement actif dans l'échantillon iii) mesurer (18) l'intensité lumineuse de l'échantillon à au moins ladite première longueur d'onde, et au moins ladite seconde longueur d'onde, et 20 iv) apprécier la présence et/ou la quantité d'espèce(s) oxydante(s) p interprétation (20) desdites intensités lumineuses mesurées, et le cas échéant par référence à des valeurs étalon. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel, à l'étape iv), une quantité d'espèces oxydantes dans l'échantillon est déterminée par lecture (20) sur une nappe étalon 25 (30) de la valeur correspondant au couple d'intensités lumineuses mesurées à l'étape iii). 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la nappe étalon est une nappe (30) préétablie au moyen de mesures réalisées avec des échantillc, ï à quantité connue en espèces oxydantes. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 30 l'étape est réalisée après un temps d'attente déterminé, non nul, après l'étape ii). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'intensité lumineuse de la luminescence premier agent photoluminescent est croissante avec la quantité d'espèces oxydantes. 3039649 24 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 5, dans lequel l'intensité lumineuse d'émission du deuxième agent optiquement actif est sensiblement constante avec la quantité d'espèces oxydantes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le 5 deuxième agent optiquement actif est photoluminescent et comporte, de préférence, des nanop. cules de LaPO4:Eu, LaPO4:Er, LaPO4:Nd, LaPO4:Tb, LaF3:TR, NaYF4:Yb, NaYF4:Er, CdSe/Zns, CdTe/ZnS, KTP et/ou BaTiO3. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'intensité I incusc d'émission du deuxième agent optiquement actif est décroissante avec la quantité d'espèces oxydantes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 8, dans lequel la première longueur d'onde est représentative de la forme oxydée du premier agent photoluminescent et la deuxième longueur d'onde est représentative de la forme réduite de l'agent optiquement actif et de préférence photoluminescent. 10, Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 8 ou 9, lequel le deuxième agent optiquement actif est photoluminescent et comporte, de préférence, des nanop 'cules de YAG:Ce, LaPO4:Ce. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lel le premier agent photoluminescent comporte des nanoparticules au moins partiellement réduites d'AxEui_x(VO4)y(PO4)(1_y), en p. 'culier d'A.,,Eui,VO4, où A est l'un parmi Y, Gd et La, 0