FR 3047079 A1 20170728 FR 1650667 A 20160127 1 PROCEDE DE DIAGNOSTIQUE DE LA CIVD DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique et à un kit de détection et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) dans un échantillon biologique. La présente invention se rapporte également à un procédé de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique. La présente invention trouve une application notamment dans le domaine médical et vétérinaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Le choc septique est un syndrome caractérisé par une réaction inflammatoire de l'hôte en réponse à un agent pathogène responsable d'une hypotension résistante à l'expansion volémique et nécessitant l'introduction de vasopresseurs (noradrénaline) et s'accompagnant de défaillances viscérales. La coagulation est activée de manière constante au cours du choc septique et participe à la défense de l'hôte. Toutefois, cette activation peut être « dérégulée » avec une thrombopénie une stimulation leucocytaire et endothéliale ainsi qu'une consommation des facteurs de la coagulation et de ses inhibiteurs, se traduisant par des microthromboses et responsable d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). L'association entre CIVD, gravité et défaillance multiviscérale est connue de longue date, rationnel de l'utilisation de traitements anticoagulants au 3047079 2 cours du choc septique en plus des traitements étiologiques et de défaillances d'organes. Toutefois, les études cliniques portant sur des traitements ayant un impact sur la coagulation - qui n'ont jamais ciblé spécifiquement les patients présentant une CIVD - se sont révélées 5 décevantes car ne permettant pas d'améliorer le pronostic des patients. À l'échelle de la France, 80000 cas de sepsis sont observés chaque année, défini comme une réponse inflammatoire systémique que l'organisme développe en réponse à l'invasion par un micro-organisme pathogène, et qui se traduit par une hypoperfusion des organes et une 10 dette en oxygène, pouvant évoluer vers un tableau de défaillance multiviscérale. L'hypotension artérielle y est persistante malgré un remplissage vasculaire adapté et nécessite le recours à des vasopresseurs (noradrénaline, adrénaline). Il s'agit donc d'une maladie grave et assez fréquente. 15 Cet état est lié à une activation cellulaire intense via l'induction de cytokines pro-inflammatoires et des modifications phénotypiques de l'endothélium vasculaire, qui prend alors un caractère pro-adhésif, pro-inflammatoire et pro-thrombotique Il a été montré dans l'état de la technique après invasion par un 20 agent pathogène, la réponse de l'hôte se fait par la mise en jeu des systèmes d'immunité innée et d'immunité adaptative. L'immunité innée constitue la première ligne de défense, en libérant un grand nombre de chimiokines et cytokines (Aziz et al., 2013). Les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont des cellules de 25 l'immunité innée. Ces cellules ont longtemps été considérées comme des cellules ayant pour seule fonction la phagocytose des pathogènes extra-cellulaires. Au cours des dernières années, l'évolution des connaissances sur la physiologie et la place des PNN a progressé dans un schéma plus complexe associant immunité innée, immunité adaptative, et hémostase 30 (Môcsai, 2013). Si les PNN ont un rôle majeur dans la défense antibactérienne par l'intermédiaire de la phagocytose, leur rôle ne s'y limite pas et il a été démontré depuis le début des années 2000 un rôle dans la 3047079 3 protection vis-à-vis des germes intracellulaires (virus, mycobactéries) mais aussi dans la régulation de la réponse immunitaire adaptative en particulier par l'interaction avec les lymphocytes B de la zone marginale au sein de la rate. Ainsi, les PNN sont capables de relarguer le contenu de leur noyau, 5 ADN et histones, formant un maillage de fragments d'ADN et d'histones qui supportent des enzymes comme la myéloperoxidase, (MPO) ou l'élastase. Ces structures, décrites pour la première fois en 2004, sont appelées NETs (Neutrophil Extracellular Traps) et sont capables de capturer des pathogènes dans leur réseau macromoléculaire (Brinkmann 10 et al., 2004). Deux mécanismes de NETose sont décrits : l'un aboutit au suicide cellulaire et dure quelques heures, l'autre, la NETose "vitale", plus rapide permet la survie du PNN sous forme anucléée capable de phagocytose, fonction qui ne dépend pas de la synthèse de nouvelles protéines donc de la présence d'un noyau. (Fuchs et al., 2007) 15 Les deux mécanismes s'accompagnent de modifications morphologiques des PNN décrites en microscopie électronique après induction de NETose in-vitro par du PMA ou phorbol-myristate-acetate (Brinkmann and Zychlinsky, 2012) : D'abord, la chromatine se décondense, le noyau perd ses lobulations, le cytoplasme se dégranule et 20 les NETs sont expulsés par la cellule. La voie de la NETose vitale semble impliquée au cours des infections par bactéries gram-positives. Les NETs sont relargués à partir des vésicules contenant la chromatine décondensée et les protéines anti-bactériennes. Les NETs exercent une fonction anti-microbienne en piégeant 25 bactéries et mycètes, mais pourraient également avoir un rôle dans la thrombinoformation. Ainsi, les NETs pourraient être un acteur majeur d'un nouveau concept appelé immunothrombose (Kessenbrock K, Krumbholz M, Schônermarck U, Back W, Gross WL, Werb Z, Grône HJ, Brinkmann V, Jenne DE. Nat. Med. 2009;15:623-625 ; Hashiba M, Huq A, Tomino A, 30 Hirakawa A, Hattori T, Miyabe H, Tsuda M, Takeyama N J Surg Res. 2015; 194(1):248-54) 304 70 79 4 A ce jour, la rapidité du processus de NETose, sa focalisation au site de l'infection et la dégradation de l'ADN nu par les nucléases circulantes sont des obstacles à la détection directe in vivo dans le sang circulant. Toutefois, il existe des marqueurs indirects de NETose, 5 notamment l'association de taux élevés de nucléosomes, d'histones citrullinées et de MPO circulants (Abrams et al., 2013)'(Kessenbrock et al., 2009). La NETose a pu être associée par l'intermédiaire de ces marqueurs à différentes pathologies notamment thrombotiques, infectieuses, cancéreuses ou auto-immunes (Kessenbrock et al., 2009)'(Demers et al., 10 2012). Les NETs jouent donc non seulement un rôle dans les mécanismes de défense de l'hôte, mais participent aussi à l'interaction entre inflammation et coagulation durant les processus infectieux.(Branzk and Papayannopoulos, 2013). 15 Deux scores biologiques combinant les paramètres sanguins accessibles dans l'état de l'art actuel ont été proposés pour le diagnostic de CIVD. Une des difficultés de l'élaboration de scores réside dans le fait qu'il n'existe pas à ce jour de « définition biologique » consensuelle de la CIVD. Le premier test de détection décrit en 2001 émane de l'International 20 Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH), le second de la Japanese Association for Acute Medicine (JAAM) en 2005 et revu en 2006. Le score de l'ISTH est basé sur la présence d'une thrombopénie sévère, d'une diminution du taux de prothrombine (allongement du temps de Quick), d'une consommation du fibrinogène et d'une élévation des D- 25 dimères, marqueurs de la fibrinolyse. Il permet de diagnostiquer les CIVD survenant au cours des pathologies néoplasiques, des traumatismes, de la pathologie obstétricale mais apparait déficient au cours du choc septique en raison de l'importance du syndrome inflammatoire avec une thrombocytose, une élévation du fibrinogène et la présence de D-dimères. 30 Il semble donc peu adapté à une détection de CIVD lors d'un choc septique. 3047079 5 Le score JAAM a été développé afin de développer la CIVD lors de choc septique, et ne retient pas le fibrinogène comme critère diagnostic tout en utilisant des valeurs seuil plus « cohérentes » dans le cadre d'un sepsispour les D-dimères et les plaquettes. Ces différences ont conduit à 5 des discussions au niveau du comité CIVD de l'ISTH pour redéfinir l'entité CIVD en séparant coagulopathies obstétricales, traumatiques, septiques ou oncologiques. Toutefois, les scores précités ne peuvent être calculés, mis en oeuvre qu'à partir d'échantillons particuliers et nécessitent un temps 10 important pour l'obtention des résultats générant ainsi un coût important dans la prise en charge. En outre, il n'existe pas actuellement de procédé permettant de détecter de manière sure et systématique une CIVD. Il n'existe pas non plus de procédé et/ou de moyen permettant de prédire la survenue, par 15 exemple à partir d'un échantillon biologique, d'une coagulation intravasculaire disséminée. Il n'existe pas dans l'état de la technique de procédé permettant de déterminer chez un individu présentant un choc septique si celui-ci va déclencher/présenter dans un futur proche une coagulation intravasculaire 20 disséminée. En revanche, il existe un procédé capable d'établir une prédiction d'un diagnostic négatif de CIVD chez un individu présentant un choc septique. Il s'agit d'un score combinant 3 paramètres : La concentration de microparticules circulantes membranaires exposant la phosphatidylsérine et l'antigène CD105, la numération plaquettaire et le 25 taux de prothrombine avec une spécificité de 71.2%, sensibilité de 71.0%, et une valeur prédictive négative de 93.1% (ajouter ici la référence du CCM lorsqu'elle sera publiée après la révision). Ce procédé, même efficace, n'est pas technologiquement d'une mise en oeuvre facile et rapide. 30 Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un moyen palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé rapide et efficace permettant de détecter la CIVD, 3047079 6 afin d'améliorer le pronostic vital des individus et de réduire ainsi les coûts de sa prise en charge. Description de l'invention 5 La présente invention a pour but de surmonter les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant une mesure de la fluorescence des neutrophiles circulants. 10 En particulier, les inventeurs de la présente invention montrent que le procédé de l'invention permet de déterminer la présence d'une CIVD chez un individu présentant un choc septique et/ou d'identifier un individu susceptible de développer une CIVD à partir d'un échantillon sanguin. 15 Dans la présente par « marqueur biologique » on entend au moins un marqueur biologique choisi dans le groupe comprenant la fluorescence des neutrophiles, la numération plaquettaire, la concentration en microparticules sanguines exposant la phosphatidylsérine et reconnues par un anticorps anti CD105 et le taux de prothrombine. 20 Selon l'invention par « neutrophiles activés», on entend tout neutrophile dont la décompaction de l'ADN permet le marquage par un fluorochrome. Selon l'invention est appelée « intensité de fluorescence » tout signal mesuré à la longueur d'onde de réémission du flluorophore après 25 excitation par exemple 630 nm. L'intensité de fluorescence est proportionnelle à l'état de décompaction de l'ADN. Le fluorochrome est appliqué à l'échantillon sanguin après une étape de lyse des globules rouges par un premier réactif qui agit également sur la membrane des leucocytes en la perméabilisant 30 permettant ainsi sa fixation. Le fluorochrome est un agent non perméant à base ou non de polyméthine qui se lie aux acides nucléiques et ne diffuse dans le cytoplasme qu'au travers de la membrane leucocytaire 3047079 7 perméabilisée et fixée. Les différentes populations leucocytaires peuvent être identifiées sur la base de leur granulométrie ou de leur taille. Dans la présente par « échantillon biologique » on entend tout échantillon obtenu à partir de mammifères, par exemple un mammifère 5 choisi dans le groupe comprenant l'ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, 10 Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea. Il peut s'agir par exemple d'un humain ou d'un animal. Il peut s'agir par exemple d'un animal d'élevage, d'un animal de compagnie, d'un animal en voie de disparition ou de tout autre animal. 15 Selon l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon de sang. Selon l'invention, l'échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique ou un risque de choc septique. Selon l'invention la mesure de la concentration du marqueur 20 biologique choisi peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de la fluorescence peut être réalisée par tout procédé adapté connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé en cytométrie en flux basée sur la reconnaissance 25 de sondes fluorescentes, Les sondes fluorescentes peuvent être par exemple des intercalants s'insérant entre les bases de l'ADN ou des sondes spécifiques d'histones citruillinées comme des anticorps, ou des sondes spécifiques d'une conformation des histones ou des nucléosomes induite par la décompaction de l'ADN ou par la NETose. 30 En particulier, la présente invention a pour objet un procédé de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) comprenant 304 70 79 8 une mesure à partir d'un premier échantillon biologique de la fluorescence des neutrophiles. Selon l'invention, le procédé de détection peut comprendre en outre une étape de comparaison de l'intensité de la fluorescence mesurée 5 avec une valeur de référence de fluorescence. Selon l'invention l'intensité de fluorescence de référence peut être l'intensité de fluorescence des neutrophiles mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. 10 Dans la présente par « sujet sain de référence », on entend un mammifère, par exemple un être humain ou un animal, n'ayant pas subi d'infection, de choc, d'hémorragie, de choc septique et/ou toute autre atteinte corporelle susceptible d'entrainer une Coagulation Intravasculaire Disséminée telle que définie ci-dessus. 15 Selon l'invention par « groupe de sujets de référence » on entend un groupe permettant de définir une valeur de référence fiable. Il peut s'agir par exemple d'un groupe comprenant au moins 2 sujets de référence tel que définis ci-dessus, par exemple au moins 10, au moins 40, au moins 60, au moins 100 sujets de référence. Il peut s'agir par exemple 20 d'un groupe comprenant de 30 à 500 sujets, de 40 à 200, de 45 à 110 sujets de référence. Selon l'invention, la valeur de référence fluorescence des neutrophiles peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC obtenu à partir d'analyse statique de valeurs obtenues à partir 25 d'un sujet de référence et/ou groupe de sujets de référence Selon l'invention la valeur de référence R Neut SFL peut être une fluorescence supérieure à 57 unités arbitraires. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la 30 détermination de la fluorescence des neutrophiles permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 91 % et une spécificité supérieure ou égale à 81 % 3047079 9 Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RCD105 de microparticules membranaires porteuses du le 5 cluster de différenciation 105 (CD105) et exposant la phosphatidylsérine. Selon l'invention, le second échantillon biologique est un échantillon biologique tel que défini ci-dessus. Selon l'invention, le second échantillon biologique peut être identique ou différent du premier échantillon biologique. 10 Selon l'invention, le premier et second échantillons biologiques peuvent être un seul et même échantillon. Selon l'invention, le premier et/ou le second échantillon biologique peut provenir d'un mammifère présentant un choc septique. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 15 la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration R0CD105 mesurée avec une valeur de référence RCD105. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être la valeur de la concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation CD105 mesurée chez un sujet ou la moyenne de la valeur 20 de la concentration mesurée chez un groupe de sujets sains de référence. Selon l'invention, la valeur de référence RCD105 peut être également une valeur obtenue par analyse d'une courbe ROC. Selon l'invention la valeur de référence RCD105 peut être une concentration de microparticules porteuses du cluster de différenciation 25 supérieure à 0,6 nM équivalent PhtdSer, Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la concentration RMCD105 permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 72 % et une spécificité supérieure ou 30 égale à 48 %. 3047079 10 Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure de la concentration plaquettaire ROPIt. Selon l'invention, la mesure de la concentration plaquettaire 5 dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison de la concentration ROPIt mesurée avec une valeur de référence RPIt. 10 Selon l'invention la valeur de référence RPIt peut être une concentration de plaquette égale à127 G/L ou une concentration inférieure à 127 G/L. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la 15 détermination de la concentration RPIt permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 64 % et une spécificité supérieure ou égale à 90 %. Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de 20 la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) peut comprendre en outre une étape de mesure du taux de prothrombine RoTP. Selon l'invention, la mesure du taux de prothrombine dans un échantillon peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. 25 Selon l'invention, le procédé de prédiction et/ou de détection de la CIVD peut comprendre en outre une étape de comparaison du taux de prothrombine ROPIt mesurée avec une valeur de référence RPIt. Selon l'invention la valeur de référence RTP peut être un taux de prothrombine inférieur à 58%, ou une concentration de microparticules 30 porteuses du cluster de différenciation inférieure à 58%, Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la 3047079 11 détermination de la concentration RoTp permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 82 % et une spécificité supérieure ou égale à 60%. Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont 5 également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la combinaison de la la fluorescence et du CD105, des plaquettes et du taux de prothrombine permet une détection avec une sensibilité supérieure ou égale à 76%et une spécificité supérieure ou égale à 86%. 10 Avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont également montré que le procédé de détection de la CIVD comprenant la détermination de la combinaison de la fluorescence, de la numération plaquettaire et du taux de prothrombine permet une détection avec une 15 sensibilité supérieure ou égale à 66% et une spécificité supérieure ou égale à 95%. Aussi, la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les 20 étapes suivantes : a. mesure de la Fluorescence des neutrophiles b. comparaison de la valeur mesurée Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. Affectation d'une valeur Vneutsfl égale 1 si Roneutsfl est supérieure 25 à la valeur RNeut SFL ou d'une valeur Vneutsfl égale 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur RNeut SFL d. Calcul du score S selon la formule suivante : S1 = 0.785889+1.040004*Fluo+0.851408*CD1051- 0.010391*P1q1-0.017264*TP1 30 Si = E+ Vneutsflx a+ VCD105 x Vplaquettes X 0+ VTp X 6 3047079 12 dans laquelle E est compris de -0,707 à 2,279, a est compris de 0,151 à 1,928, 13 est compris entre -1,108 à 1,549, Q est compris entre -0,015 à -0,004, 0 est compris entre -0,035 et 0,001. En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés 5 avec le devenir du mammifère dont il provient. En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S1 est inférieure à -0,47 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 76% et une spécificité supérieure ou égale à 85%. 10 e. Calcul du score S2 selon la formule suivante : S2 = 1.725766+1.059880*Fluo-0.010351*P1q1-0.022321*TP1 ou S2= 1 ,725766+1 ,059880* VNEUT SFL 0, 010351*Vpiq - (0, 022321*VTp), ou S2 = E + VneutsflX a + Vplaquettes X 0+ V-rp X e dans laquelle E est compris de 0,381 à 3,070, a est compris de 0,209 à 15 1,910, Q est compris entre -0,015 à -0,005, 0 est compris entre -0,059 et - 0,023. En d'autres termes les scores obtenus peuvent être corrélés avec le devenir du mammifère dont il provient. 20 En outre, les inventeurs ont montré que lorsque la valeur de S est inférieure à 0,16 le procédé permet avantageusement une prédiction avec une sensibilité supérieure ou égale à 66% et une spécificité supérieure ou égale à 95%. La présente invention a également pour objet un procédé de 25 détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R000105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 30 (CD105), b. comparaison de la valeur mesurée R000105 avec une valeur de référence RC0105 3047079 13 c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP 5 f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 10 h. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 15 inférieur à la valeur RTP j. calcul du score S3 selon la formule suivante : S3= 1,342 + (0,515 x [Vc01o5]) - (0,012 x [Vpic]) - (0,018 x [VTP]) La présente invention a également pour objet un procédé de 20 détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutsfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des 25 neutrophiles Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt 30 e. mesure du taux de prothrombine RoTP f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP 3047079 14 g. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutsfl égale à 1 si Roneutsfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutsfl égale à 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur Rneutsfl 5 h. affectation d'une valeur Vpic, égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpic, égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 10 inférieur à la valeur RTP j. calcul du score S2 selon la formule suivante : S2= 1,725766+1,059880* VNEUT SFL 0,010351*Vplq- (0,022321*VTp), La présente invention a également pour objet un procédé de 15 détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutsfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des 20 neutrophiles Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), 25 d. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt 30 g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP 304 70 79 15 i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutsfl égale à 1 si Roneutsfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutsfl égale à 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur Rneutsfl 5 j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est 10 inférieur à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP m. calcul du score S1 selon la formule suivante : 15 S1 = 0,785889 + (1,040004*VneutsflL) + (0,851408* Vcoio5) - (0,010391*Vplq) - (0, 017264*V-rp La présente invention a également pour objet un examen de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) selon l'invention comprenant des moyens de mesure de la Fluorescence des 20 neutrophiles. Selon l'invention par moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence des neutrophiles on entend tout moyen connu de l'homme du métier pour la mesure de la décompaction de l'ADN des neutrophiles. Il peut s'agir par exemple des molécules choisies dans le groupe 25 comprenant des intercalants de l'ADN, des sondes de décompaction ou de marqueurs d'une activité enzymatique associée à l'ADN lors de la Netose, insolubilisés ou non sur tout type de support combinés ou non. Il peut s'agir par exemple de iodure de propidium, anticorps, substrats fluorescents d'élastase leucocytaire. 30 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 3047079 16 Brève description des figures Figure 1. 5 A. Normal scattergram with cell distribution. Neutrophils are characterized by fluorescence (NEUT-SFL) and granulometry (NEUT-SSC). B. NEUTSFL in non DIC (blue) or DIC (red) patients. C. Representative scattergrams from healthy control and septic shock patients without and with DIC. Mean NEUT-SFL and NEUT-WY are slightly increased in the 10 absence of DIC and greatly increased in DIC. D. NEUT-SFL; Representative May-Grunwald-Giemsa staining of thin blood smears in healthy donors, septic patient and DIC patient. Normal neutrophil is characterized by a nucleus with 2 to 5 lobules and low granule cytoplasm content. Septic neutrophil exhibit a more segmented nucleus and contains 15 more granules. During DIC, neutrophil is characterized by a bilobular nucleus with abnormal distribution of granules. E. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of NEUT-SFL in septic shock-induced DIC. F CD66b-MPs/neutrophils count in non DIC (blue) or DIC (red) patients, data are shown in whisker boxes (horizontal line inside box median, upper and 20 lower box limits 25-75 percentiles and T-bars 10-90 percentiles respectively). Dashed lines correspond to reference values. Figure 2 Time-course of microparticles during septic shock Results are shown in white (no DIC) or grey (early DIC) whisker boxes (horizontal line inside box median, upper and lower box limits 25-75 25 percentiles and T-bars 10-90 percentiles respectively). Dashed lines correspond to reference values. Statistical analyses represent differences of repeated measurements between patients with early or without DIC (DIC vs. no DIC) and differences of time-dependent evolution during ICU stay (days 1,3 and 7 when available) using general linear mixed models with 30 Gamma distribution. A. (Total) PhtdSer+-MPs, B. Leucocyte-derived CD11a+-MPs to leucocyte count ratio, C. Endothelial cell-derived CD105+- MPs, D. Endothelial cell-derived CD31+-MPs. 3047079 17 Figure 3 Characterisation of patients who would develop DIC (DIC-D2) Results are shown in white (no DIC) or grey (DIC-D2) whisker boxes (horizontal line inside box median, upper and lower box limits 25-75 percentiles and T-bars 10-90 percentiles respectively) at day 1, then at 5 day 3. Dashed lines correspond to reference values. A. Platelet count, B. Antithrombin activity, C. Prothrombin Time, D. D-dimers, E. Endothelial cell-derived CD105+-MPs, F. Leucocyte-derived CD11a+-MPs to leucocyte count ratio. Figure 4 Prediction of DIC and flow chart of patients 10 A. ROC curves of CD105-MPs, prothrombin time, platelet count and predictive score, B. Flow chart of patients and treatment option. N+ referred to the number of patients with DIC-D2 and N- to the number of patients with no DIC. 15 Exemple Participants: 100 patients with septic shock. 35 had DIC according to JAAM 2006 score. Measurements and Main Results: Neutrophil chromatin decondensation 20 was assessed by measuring neutrophil fluorescence (NEUT-SFL) labeled by a fluorochrome-based polymethine reagent using a routine automated flow cytometer Sysm ex TM XN20 and neutrophil-derived CD66b microparticles (CD66b-MPs) by prothrombinase assay. Measurements in DIC and no DIC patients showed that a mean value of NEUT-SFL above 25 57.3 AU had a sensitivity of 90.91% and a specificity of 80.60% for DIC diagnosis. NEUT-SFL was correlated to the CD66b-MPs/neutrophil count, a surrogate of neutrophil activation associated with septic shock-induced DIC. Conclusion: NEUT-SFL, routinely available, prove an accurate biomarker 30 of neutrophil activation. 3047079 18 INTRODUCTION Septic shock is the most severe clinical form of the host response to infectious pathogens. It is characterized by a broad inflammatory response in close association with the activation of the blood coagulation cascade 5 eventually leading to disseminated intravascular coagulation (DIC) (1). In intensive care units, DIC remains difficult to assess at bedside. In spite of different scoring scales proposed by international academic societies (2, 3), no gold standard is yet available for DIC diagnosis. We have recently reported that circulating leucocyte-derived microparticles 10 (CD11a-MPs) are rapidly elevated in the time-course of DIC, and are reliable surrogates of leucocyte activation (4), in line with an eventual contribution of immune cells to the development of DIC (5). Increasing reports on the interactions between the contact activation pathway of blood coagulation and the response of innate immune cells prompted by 15 pathogens has led to the emerging concept of "immunothrombosis" (6). Among innate immune cells, neutrophils are now recognized as potent actors in immunothrombosis, mostly via the release of neutrophil extracellular traps (NETs). Despite the lack of integrated and concerted approaches through the use of scores, converging data indicate that the 20 assessment of neutrophil morphological changes could prove helpful in the diagnosis, prognosis, and monitoring of sepsis (7). Neutrophil fluorescence (NEUT-SFL) and granulation (NEUT-SSC) parameters are routinely available in hospital laboratories (8) and the NEUT-SFL was recently associated to sepsis (9). We therefore designed the present study to 25 assess neutrophil activation for the diagnosis of early septic shock-induced DIC. PATIENTS AND METHODS Patients 30 One hundred consecutive adult patients referred to our intensive care unit for septic shock were prospectively enrolled. Patients with end-stage chronic diseases or neutropenia were excluded. The Strasbourg University 3047079 19 Hospital Ethic Committee approved this study. Informed consent was obtained from the patient or relatives on admission time, and further confirmed by the patient. Blood collection and laboratory analysis 5 Sampling on EDTA (7.2 mg/4 mL) and citrate (0.129 M) anticoagulants was performed on admission. Thin blood smears were stained with MayGrünwald-Giemsa. Poor platelet citrated-plasma was obtained after a twostep centrifugation (15 min., 2,500 x g). Hemostasis was analyzed on STAe Evolution (Stago, Asnières, France) with standard commercial reagents 10 for PT, aPTT, fibrinogen and D-dimers. For validation purposes, we assessed ex-vivo neutrophil activation in samples from healthy volunteers stimulated by 4pM ionomycin stimulation (Calbiochem, Merk Biodévelopment, Martillac, France) (4). 15 Neutrophil analysis on SysmexTM XN20 Complete blood cell count (CBC) was measured on an automated SysmexTM XN20 analyzer (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) equipped with impedance and fluorescence flow cytometry devices and used according to the manufacturer's recommendation without intervention. The 20 optical system of the XN20 employs a stable red diode laser producing a light beam with a wavelength of 633 nm. Cell permeabilization was performed by treatment with specific lysis reagents allowing the polymethine fluorescent XN-20 basic dye to enter the cells, where it binds to nucleic acids in the cytoplasmic organelles and the nucleus. Three 25 different signais displayed in the white cell differential channel scattergrams were recorded: forward-scattered light (FSC, cell size), sidescattered light (SSC, internai cell structure and granularity) and sidefluorescence light (SFL, DNA/RNA content). These parameters are produced and supported by a rule based work area manager XN-20 30 software and values of neutrophil fluorescence (NEUT-SFL) and granulation (NEUT-SSC) were extracted from the research screen of the device (8). NEUT-SFL was recorded as a witness of activation with 304 70 79 20 fragmented DNA and nucleic acids enrichment (Figure 1A). NEUT-SFL signal is generated by the incorporation of the fluorescent dye that targets unpacked DNA within the permeabilized cell. Because the binding of the fluorescent probe is dependent on the number of binding sites that are 5 unmasked on the DNA strand, NEUF-SFL was recorded as a surrogate of DNA unpacking in the neutrophil. Microparticle analysis Neutrophil-derived CD66b-MPs were measured by prothrombinase assay after capture onto an anti-CD66b biotinylated antibody (Leinco, St Louis, 10 MO, USA). Results were expressed as nanomolar phosphatidylserine equivalents (nM PhtdSer eq.) by reference to a standard curve established with liposomes containing known amounts of phosphatidylserine. To circumvent a possible interference of plasma proteins, MPs were isolated and washed in TBS containing 3% w/v human serum albumin (LFB, Les 15 Ullis, France) by a double step centrifugation (60 min., 12,000 x g) before the capture step (4). DIC scoring DIC scores were calculated according to ISTH 2001 "overt", "non overt" and JAAM 2006 (3,4). Early DIC was confirmed if JAAM (taking into 20 account the inflammatory response in critically ill patients) score was 4 or higher. Statistical analysis Categorical variables were analyzed using Fisher's exact test and continuous variables with the use of Wilcoxon rank sum test. The normality 25 of the distribution was assessed by Shapiro-Wilk test. The "Holm" method was used to compute adjusted p-values for multiple comparisons. The ROC curve analysis (area under the ROC curve) was performed and the spearman rank correlation coefficient determined. p-value 0.60 nM eq. PhtdSer, OR 1.67, p REVENDICATIONS1. Procédé in-vitro de prédiction et/ou de détection de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un premier échantillon biologique comprenant une mesure de la fluorescence de neutrophiles. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison de la valeur mesurée avec une valeur de référence. 3. Procédé de de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant un échantillon de sang 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de mesure à partir d'un second échantillon biologique de la concentration RMCD105 de microparticules mem branaires porteuses du le cluster de différenciation 105 (CD105). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdits premier et second échantillons biologiques proviennent d'un patient présentant un choc septique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la valeur de référence fluorescence de neutroophiles est supérieure à 57 UA. 3047079 40 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans lequel la valeur de référence RCD105 est supérieure à 0,6 nM eq PS. 9. Procédé selon la revendication 9, dans lequel lesdits premier, 5 second et troisième échantillons biologiques sont un seul et même échantillon. 10. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon 10 biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), b. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur 15 de référence RCD105 c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP 20 f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP g. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 25 h. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est 30 inférieur à la valeur RTP j. calcul du score S3 selon la formule suivante : S3= 1,342 + (0,515 x [Vc01o5]) - (0,012 x [Vpiq]) - (0,018 x [VTP]) 3047079 41 11. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : 5 a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutsfl b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt 10 d. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt e. mesure du taux de prothrombine RoTP f. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP 15 g. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutsfl égale à 1 si Roneutsfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutsfl égale à 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur Rneutsfl h. affectation d'une valeur Vpic, égale à 1 si RoPlt est supérieur 20 à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpic, égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt i. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP 25 j. calcul du score S2 selon la formule suivante : S2= 1,725766+1,059880* VNEUT SFL 0,01 0351*Vpiq - (0,022321*VTp), 12. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon 30 biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutsfl 304 70 79 42 b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules 5 membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt 10 f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP 15 i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutsfl égale à 1 si Roneutsfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutsfl égale à 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur Rneutsfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est 20 supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt 25 I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP m. calcul du score S1 selon la formule suivante : S1 = 0,785889 + (1,040004*VneutsfIL) + (0,851408* Vco105) - 30 (0,010391*Vplq) - (0,017264*V-rp), 3047079 43 13. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la fluorescence des neutrophiles Roneutsfl 5 b. comparaison de la valeur mesurée de fluorescence des neutrophiles Roneutsfl avec une valeur de référence RNeut SFL c. mesure de la concentration R0CD105 de microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 10 (CD105), d. comparaison de la valeur mesurée R0CD105 avec une valeur de référence RCD105 e. mesure de la concentration plaquettaire RoPlt f. comparaison de la valeur mesurée RoPlt avec une valeur 15 de référence RPIt g. mesure du taux de prothrombine RoTP h. comparaison de la valeur mesurée RoTP avec une valeur de référence RTP i. affectation d'une valeur fluorescence des neutrophiles Vneutsfl 20 Végale à 1 si Roneutsfl est supérieure à la valeur Rneutsfl ou d'une valeur Vneutsfl égale à 0 si Roneutsfl est inférieure à la valeur Rneutsfl j. affectation d'une valeur VCD105 égale à 1 si R0CD105 est supérieur à la valeur RCD105 ou d'une valeur CD 105 égale 25 à 0 si R0CD105 est inférieur à la valeur RCD105 k. affectation d'une valeur Vpiq égale à 1 si RoPlt est supérieur à la valeur RPIt ou d'une valeur Vpiq égale à 0 si RoPlt est inférieur à la valeur RPIt I. affectation d'une valeur VTP égale à 1 si RoTP est supérieur 30 à la valeur RTP ou d'une valeur VTP égale à 0 si RoTP est inférieur à la valeur RTP m. calcul du score S1 ou S2 ou S3 selon la formule suivante : 3047079 44 S1 = 0,785889 + (1,040004*VneutsflL) + (0,851408* VCD1 05) (0,010391*Vplq) - (0,017264*VTp), S2= 1,725766+1,059880* VNEUT SFL - 0, 010351*Vpiq - (0, 022321*VTp), S3= 1,342 + (0,515 x [Vc01o5]) - (0,012 x [Vpiq]) - (0,018 x [VTp]) 5 14. Procédé de détection et/ou de suivi de l'évolution d'une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) à partir d'un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a. mesure de la concentration [CD105+-MPs] de 10 microparticules membranaire comprenant le cluster de différenciation 105 (CD105), b. mesure de la concentration plaquettaire [Plt] c. mesure du taux de prothrombine [PT] d. calcul du score S4 selon la formule suivante : 15 S4 = 1,342 + (0,515 x [CD105+-MPs]) - (0,012 x [Plt]) - (0,018 x [PT])