FR 3043556 A1 20170519 FR 1561056 A 20151117 UTILISATION DE COMPOSES OLIGOSACCHARIDIQUES POUR ACTIVER L'ANGIOGENESE La présente invention a pour objet un oligosaccharide polysulfaté synthétique ayant 1 à 4 unités oses, ses sels, ou ses complexes, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour la cicatrisation des plaies, en particulier pour activer l'angiogénèse lors de la cicatrisation des plaies. La cicatrisation d'une plaie est un phénomène biologique naturel, les tissus mammifères étant capables de réparer des lésions localisées par des processus de réparation et de régénération qui leur sont propres. La rapidité et la qualité de la cicatrisation d'une plaie dépendent de l'état général de l'organisme atteint, de l'étiologie de la plaie, de l'état et de la localisation de la plaie, et de la survenue ou non d'une infection, ainsi que des facteurs génétiques prédisposant ou non à des troubles de la cicatrisation. La cicatrisation naturelle d'une plaie se déroule principalement selon trois phases successives, chacune de ces phases étant caractérisée par des activités cellulaires spécifiques qui font progresser le processus de réparation selon des séquences chronologiques précises : la phase inflammatoire, la phase de granulation (ou phase proliférative), et la phase de maturation. La première phase, la phase inflammatoire, débute dès la rupture des vaisseaux sanguins qui déclenche la formation d'un caillot (coagulation du sang) principalement composé de fibrine et de fibronectine, et qui va constituer une matrice provisoire. Cette matrice comble en partie la lésion et va permettre la migration au sein de la zone lésée des cellules inflammatoires recrutées pour assurer la détersion de la plaie. Les plaquettes présentes vont également libérer des facteurs (par exemple cytokine, facteurs de croissance) permettant le recrutement des cellules de la cicatrisation comme les cellules inflammatoires (les polynucléaires neutrophiles et les macrophages), les fibroblastes et les cellules endothéliales. La seconde phase correspond au développement du tissu de granulation. On observe d'abord une colonisation de la blessure par prolifération des fibroblastes. Puis, la migration des cellules endothéliales à partir des vaisseaux sains va permettre la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation), ou angiogénèse, du tissu lésé. Cette étape d'angiogenèse est fondamentale pour amorcer la cicatrisation. Dans le tissu de granulation, les fibroblastes sont activés et vont se différencier en myofibroblastes présentant des propriétés 3043556 2 contractiles importantes, générées par les microfilaments d'actine, permettant la contraction de la plaie. La troisième phase du processus de réparation, la maturation, s'accompagne d'un remodelage du tissu de granulation. Une partie de la matrice extracellulaire est digérée par des 5 protéases (essentiellement des métallo-protéases matricielles (MMP) et des élastases), et on observe une réorganisation progressive de la matrice extracellulaire. Progressivement, le collagène de type III, majoritaire dans le tissu de granulation, est remplacé par le collagène de type I, principal composant matriciel du derme. A la fin de la phase de maturation, les fibroblastes, myofibroblastes et cellules vasculaires voient leur prolifération et/ou leur activité 10 réduites. Puis les cellules excédentaires meurent par apoptose. Parallèlement au remodelage de la matrice extracellulaire et à l'apoptose des cellules excédentaires, l'état inflammatoire diminue progressivement. Cette phase est la plus longue : au bout d'un an environ, la cicatrice se remodèle, elle n'est plus rouge, ni rigide, ne provoque plus de douleur et elle s'aplanie. Néanmoins, certains types de plaies ne cicatrisent pas correctement, les 3 étapes clés 15 du processus se déroulant de manière anormale et ce, malgré la mise en place des meilleures conditions physico-chimiques et biologiques possibles. En effet la rapidité et la qualité de la cicatrisation d'une plaie dépendent de facteurs intrinsèques et extrinsèques. Ce processus de réparation peut donc être anormalement prolongé selon : - l'étiologie de la plaie ; 20 - son état et sa localisation ; - la survenue d'une infection causée par la présence de certains agent infectieux comme Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa ; - l'existence d'une pathologie préexistante (comme le diabète, une déficience immunitaire, une insuffisance veineuse, etc...) ; 25 - l'environnement extérieur ; ou - des facteurs génétiques prédisposant ou non à des troubles de la cicatrisation. Parmi ces plaies, on retrouve les plaies chroniques telles que les ulcères veineux, les escarres ou les plaies caractéristiques des sujets diabétiques. Les plaies chroniques se définissent par une absence de cicatrisation après un délai de 6 semaines à compter de 30 l'apparition de la plaie et ce quel que soit le traitement appliqué. Pour traiter ce type de plaies, il peut être crucial d'accélérer le processus de cicatrisation. 3043556 3 La présente invention s'intéresse plus particulièrement à l'activation de l'angiogénèse, en particulier lors de la cicatrisation des plaies, pour permettre notamment une accélération de la cicatrisation. L'invention a pour objet, selon un premier aspect, un oligosaccharide polysulfaté 5 synthétique ayant 1 à 4 unités oses, ses sels, ou ses complexes, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse, en particulier pour activer l'angiogénèse lors de la cicatrisation des plaies. L'invention a également pour objet, selon un deuxième aspect, une composition pharmaceutique comprenant un oligosaccharide polysulfaté synthétique ayant 1 à 4 unités 10 oses, ses sels, ou ses complexes, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse, en particulier pour activer l'angiogénèse lors de la cicatrisation des plaies. Par l'expression « activer l'angiogénèse », on entend toute stimulation positive de la revascularisation par l'intermédiaire de toute action visant favoriser la circulation et le flux 15 sanguin, et plus particulièrement au travers de l'augmentation de la génération ou de la longueur des capillaires ou vaisseaux sanguins, mais aussi au travers de toute modification de la structure desdits capillaires ou vaisseaux sanguins sur une quelconque partie du corps humain ou animal et de préférence lors de la cicatrisation des plaies. 20 Description des figures La figure 1 illustre l'effet du traitement par du PBS, du VEGF-A ou du KSOS (sel de potassium de sucrose octasulfate) sur des membranes chorioallantoiques (CAM) d'embryons de poulets. Les figures 2A, 2B et 2C illustrent respectivement les paramètres de longueur totale des 25 tubes, de nombre de segments et de nombre de points de branchements des vaisseaux sanguins, et plus particulièrement leur niveau d'induction par rapport à un témoin négatif (PBS), observés sur les membranes chorioallantoiques (CAM) d'embryons de poulet traitées par du VEGF-A ou du KSOS à différentes concentrations. 30 3043556 4 Oligosaccharides polysulfatés synthétiques ayant 1 à 4 unités oses Les oligosaccharides utilisés dans le cadre de la présente invention sont des oligomères synthétiques formés de 1 à 4 unités d'oses, de préférence de 1 à 3 unités d'oses, et plus préférentiellement de 1 ou 2 unités d'oses, généralement liées entre elles par liaison 5 glycosidique alpha ou bêta. En d'autres termes, il s'agit de mono, di, tri ou tétrasaccharides, et de préférence de mono ou disaccharides. Il n'y a pas de limitation particulière concernant la nature des unités oses de ces polysaccharides. De préférence, il s'agira de pentoses ou d'hexoses. A titre d'exemple de monosaccharide, on peut citer le glucose, le galactose ou le mannose. A titre d'exemple de 10 disaccharide, on peut citer le maltose, le lactose, le sucrose ou le tréhalose. A titre d'exemple de trisaccharide, on peut citer le mélézitose. A titre d'exemple de tétrasaccharide, on peut citer le stachyose. De préférence, l'oligosaccharide est un disaccharide, et de préférence encore le sucrose. On entend par "oligosaccharide polysulfaté" au sens de la présente demande un 15 oligosaccharide dont au moins deux, et de préférence tous les groupes hydroxyles de chaque ose ont été substitués par un groupe sulfate. De préférence, l'oligosaccharide polysulfaté utilisé dans le cadre de la présente demande est le sucrose octasulfate. Les oligosaccharides polysulfatés utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent 20 se présenter sous forme de sels ou complexes. A titre d'exemple de sels, on peut citer les sels de métal alcalin tels que les sels de sodium, de calcium ou de potassium; les sels d'argent ; ou encore les sels d'acide aminé. A titre d'exemple de complexes, on peut citer les complexes d'hydroxyaluminium. Dans le cadre de la présente invention, des composés particulièrement préférés sont les 25 suivants : - le sel de potassium du sucrose octasulfate ; - le sel d'argent du sucrose octasulfate ; et - le complexe hydroxyaluminium du sucrose octasulfate, appelé communément sucralfate. 3043556 5 En particulier, dans le cadre de la présente invention, les oligosaccharides polysulfatés utilisés sont de préférence les sels de potassium plutôt que les sels d'aluminium du sucrose octasulfate. Les oligosaccharides polysulfatés utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent 5 se présenter sous forme de poudre micronisée ou sous forme solubilisée. Un exemple d'oligosaccharide polysulfaté utilisé dans le cadre de la présente invention est le sel de potassium du sucrose octasulfate (connu sous l'abréviation KSOS), commercialisé dans le produit Urgotul® Start par les Laboratoires URGO. L'oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention est mis en oeuvre à une 10 concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, de préférence supérieure ou égale à 100 mg/mL. Selon un mode préféré de réalisation, l'oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention est mis en oeuvre à une concentration comprise entre 100 mg/mL et 1000 mg/mL. Composition 15 L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant l'oligosaccharide polysulfaté synthétique précédemment décrit, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse, en particulier pour activer l'angiogénèse des plaies. 20 Substance active additionnelle D'une façon générale, les composés oligosaccharides selon l'invention pourront être utilisés seuls ou en mélange de deux ou plus d'entre eux, ou encore en combinaison avec une (ou plusieurs) autre(s) substance(s) active(s). De manière générale, les actifs sont choisis parmi les anti-bactériens, les antiseptiques, 25 les anti-douleurs, les anti-inflammatoires, les actifs favorisant la cicatrisation, les agents dépigmentants, les antiprurigineux, les filtres UV, les agents apaisants, les agents hydratants, les agents anti-oxydants, et leurs mélanges. De manière générale, les actifs sont choisis parmi : - les anti-bactériens tels que le Polymyxine B, les pénicillines (Amoxycilline), l'acide 30 clavulanique, les tétracyclines, la Minocycline, la chlorotétracycline, les aminoglycosides, 3043556 6 l'Amikacine, la Gentamicine, la Néomycine, l'argent et ses sels (Sulfadiazine argentique), les probiotiques, des sels d'argent ; - les antiseptiques tels que le mercurothiolate de sodium, l'éosine, la chlorhexidine, le borate de phénylmercure, l'eau oxygénée, la liqueur de Dakin, le triclosan, le biguanide, 5 l'hexamidine, le thymol, le Lugol, la Povidone iodée, le Merbromine, le Chlorure de Benzalkonium et de Benzethonium, l'éthanol, l'isopropanol ; - les anti-douleurs tels que le Paracétamol, la Codéine, le Dextropropoxyphène, le Tramadol, la Morphine et ses dérivés, les Corticoïdes et dérivés ; - les anti-inflammatoires tels que les Glucocorticoïdes, les anti-inflammatoires non 10 stéroïdiens, l'Aspirine, l'Ibuprofène, le Kétoprofène, le Flurbiprofène, le Diclofénac, l'Acéclofénac, le Kétorolac, le Méloxicam, le Piroxicam, le Ténoxicam, le Naproxène, l'Indométacine, le Naproxcinod, le Nimésulide, le Célécoxib, l'Etoricoxib, le Parécoxib, le Rofécoxib, le Valdécoxib, la Phénylbutazone, l'acide niflumique, l'acide méfénamique ; - les actifs favorisant la cicatrisation tels que le Rétinol, la Vitamine A, la Vitamine E, la 15 N-acétyl-hydroxyproline, les extraits de Centella Asiatica, la papaïne, les silicones, les huiles essentielles de thym, de niaouli, de romarin et de sauge, l'acide hyaluronique, l'Allantoïne, - Hema'tîte (gattefossé), Vitamine C, TEGO Pep 4-17( evonik), Toniskin (silab), Collageneer (Expanscience), Timecode (Seppic), Gatuline skin repair (gattefossé), Panthenol, PhytoCellTec Alp Rose (Mibelle Biochemistry), Erasyal(libragen), Serilesine (Lipotec), 20 Heterosides de Talapetraka (beyer), Stoechiol(codif), macarose (Sensient), Dermaveil (Ichimaru Pharcos), Phycosaccaride AI (Codif); - les agents dépigmentants tels que l'acide kojique (Kojic Acid SL® - Quimasso (Sino Lion)), l'Arbutine (Olevatin® - Quimasso (Sino Lion)), le mélange de palmitoylpropyl de sodium et d'extrait de nénuphar blanc (Sepicalm® - Seppic), l'undécylénoyl phénylalanine 25 (Sepiwhite® - Seppic), - les antiprurigineux : hydrocotisone, enoxolone, diphenyhydramine, antihistaminique à application locale anti H1 - les actifs hydratants tels que xpermoist (lipotec), Acide hyaluronique, Urée, acides gras, Glycérine, Cires, Exossine( unipex) 30 - les filtres UV tels que Parsol MCX, Parsol 1789 3043556 7 - les agents apaisants tels que de la camomille, du bisabolol, du xanthalène, de l'acide glycyrrhébénique, tanactine (CPN), Calmiskin (Silab), - les agents anti-oxydants, tels que la vitamine E. Selon un mode préféré de réalisation, les composés oligosaccharides selon l'invention 5 peuvent être utilisés en combinaison avec un agent anti-oxydant. Galénique Les oligosaccharides polysulfatés synthétiques utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent administrés par voie topique, et notamment mis en oeuvre au sein d'une 10 formulation galénique, comme par exemple un gel, une solution, une émulsion, une crème, des granules ou des capsules de taille variable allant du nano ou micromètre au millimètre, qui permettra leur application directement au niveau de la plaie. Alternativement, les composés utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être mis en oeuvre au sein d'une solution pour injection sous-cutanée. 15 S'ils sont employés en mélange de deux ou plusieurs d'entre eux ou encore en combinaison avec une ou plusieurs autres substances actives, ces composés pourront être incorporés dans la même formulation galénique ou dans des formulations galéniques distinctes. Bien entendu, la quantité d' oligosaccharides polysulfatés synthétiques selon l'invention 20 utilisée dans la formulation galénique est adaptée en fonction de la cinétique recherchée ainsi que des contraintes spécifiques liées à sa nature, solubilité, résistance à la chaleur, etc. Pansement De manière préférentielle, les composés oligosaccharides polysulfatés synthétiques 25 utilisés dans le cadre de la présente invention, ou une formulation galénique les contenant, seront intégrés à un pansement. Les composés oligosaccharides polysulfatés synthétiques, et notamment le sel de potassium de sucrose octasulfate ou une formulation galénique le contenant pourra être incorporé dans un élément quelconque de la structure d'un pansement sous réserve que ce 30 composé puisse entrer directement ou indirectement en contact avec la surface de la plaie. 3043556 8 De préférence et afin de favoriser une action rapide, ce composé (ou une formulation galénique le contenant) sera incorporé dans la couche du pansement qui vient en contact avec la plaie ou déposé sur la surface du pansement qui vient en contact avec la plaie. Avantageusement, le sel de potassium du sucrose octasulfate (ou une formulation 5 galénique le contenant) pourra ainsi être déposé, de façon continue ou discontinue, sur la surface destinée à venir au contact de la plaie : - soit sous forme liquide, par exemple par vaporisation d'une solution ou suspension le contenant ; - soit sous forme solide, par exemple par tamisage d'une poudre le contenant. 10 La couche ou surface venant en contact avec la plaie pourra être constituée par exemple d'un matériau absorbant telle qu'une mousse absorbante hydrophile en polyuréthane ; un matériau textile telle qu'une compresse, comme par exemple un non tissé, un film, un voile de fibres ; un matériau adhésif absorbant ou non ; une structure interface adhérente ou non. De façon générale, on pourra jouer sur la galénique ou la structure du pansement pour 15 obtenir un profil de relargage du sel de potassium de sucrose octasulfate spécifique, rapide ou retardé, selon les besoins. Bien entendu, la quantité de sel de potassium de sucrose octasulfate utilisée dans la formulation galénique ou dans le pansement sera adaptée en fonction de la cinétique recherchée ainsi que des contraintes spécifiques liées à sa nature, solubilité, résistance à la 20 chaleur, etc. Par pansement, on entend désigner, au sens de la présente demande, tous types de pansements utilisés pour le traitement des plaies. Typiquement, un pansement comprend au moins une couche ou matrice, adhésive ou non. 25 Les composés oligosaccharides polysulfatés synthétiques selon l'invention, ou une formulation galénique les contenant, peuvent être incorporés dans un élément quelconque de la structure d'un pansement, par exemple dans la matrice. De préférence, et afin de favoriser une action rapide, ce composé (ou une formulation galénique le contenant) peut être incorporé dans la couche du pansement qui vient en contact 30 avec la plaie ou déposé sur la surface de la couche du pansement qui vient en contact avec la plaie. 3043556 9 De telles techniques de dépôt sont bien connues de l'homme de l'art et certaines sont par exemple décrites dans la demande de brevet WO 2006/007814. Selon une variante de l'invention, le composé oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention peut être incorporé dans un pansement absorbant à base de fibres gélifiantes, 5 comme par exemple le produit AQUACEL® commercialisé par la société CONVATEC. Très souvent, lors de la pose de ces pansements, le personnel soignant maintient ces derniers en place à l'aide d'une bande ou recouvre ces derniers d'un élément secondaire tel qu'un second pansement absorbant ou une bande de contention. Il est donc utile que le pansement reste fixé sur la plaie afin que le personnel soignant conserve les mains libres pour 10 positionner ces éléments secondaires. D'une façon générale, tout type d'adhésif couramment employé dans les pansements pourra être utilisé à cet effet. Afin de ne pas altérer les tissus sains ou les berges de la plaie, notamment lors du retrait du pansement, on préfèrera un adhésif ayant la propriété d'adhérer à la peau sans adhérer à la plaie. 15 A titre d'exemple d'un tel adhésif, on peut ainsi citer les adhésifs à base d'élastomères de silicone ou de polyuréthane, tels que les gels de silicone ou de polyuréthane, et les adhésifs hydrocolloïdes. De tels adhésifs hydrocolloïdes sont notamment constitués d'une matrice élastomérique à base d'un ou plusieurs élastomères choisis parmi les polymères séquences poly(styrène- 20 oléfine- styrène) en association avec un ou plusieurs composés choisis parmi les plastifiants, tels que les huiles minérales, des résines tackifiantes et, si nécessaire, des antioxydants, dans laquelle est incorporée une quantité, de préférence faible, d'hydrocolloïdes (de 3 à 20% en poids) comme par exemple la carboxyméthylcellulose de sodium ou des polymères superabsorbants comme les produits commercialisés sous la dénomination LUQUASORB® 25 par la société BASF. Selon un mode préféré de réalisation, les composés oligosaccharides polysulfatés synthétiques utilisés dans le cadre de la présente invention, ou une formulation galénique les contenant, seront intégrés à un pansement comprenant un adhésif hydrocolloïde, ledit oligosaccharide polysulfaté étant incorporé dans ledit adhésif de préférence en une quantité 30 comprise entre 1 et 15 % en poids, de préférence encore entre 5 et 10 % en poids, par rapport au poids de l'adhésif. 3043556 10 La formulation de tels adhésifs hydrocolloïdes est bien connue de l'homme de l'art et décrite par exemple dans les demandes de brevet FR 2 783 412, FR 2 392 076 et FR 2 495 473. L'utilisation d'un filet d'adhésif sur le non tissé permet d'une façon particulièrement 5 avantageuse de diminuer ou d'éviter le risque que de petites fibrilles du matériau textile viennent au contact de la plaie et s'accrochent aux tissus, en provoquant ainsi une sensation douloureuse au retrait, voire un obstacle au processus de cicatrisation de la plaie. Selon une variante de réalisation préférée de la présente invention, le composé oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention est incorporé dans un tel adhésif à 10 une concentration compatible avec sa solubilité et sa résistance à la chaleur. Sur la base de ces critères, le composé oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention est utilisé de préférence en une quantité comprise entre 1 et 15% en poids, et de préférence encore entre 5 et 10% en poids, par rapport au poids total de l'adhésif. Si l'on souhaite augmenter l'absorption de ce pansement non tissé, on pourra associer ce 15 dernier avec une couche absorbante additionnelle, et de préférence une couche absorbante qui ne gélifie pas, comme en particulier une compresse telle que celle utilisée dans le produit URGOTULe Duo ou URGOTULe Trio, une mousse hydrophile absorbante, de préférence une mousse polyuréthane hydrophile présentant une capacité d'absorption supérieure à celle du non tissé telle que celle utilisée dans le produit CELLOSORB®. 20 Selon un mode préféré de réalisation, le composé oligosaccharide polysulfaté synthétique selon l'invention est incorporé dans un pansement non tissé, associé avec une couche absorbante additionnelle, et de préférence une couche absorbante qui ne gélifie pas, comme en particulier une compresse. Selon un autre mode préféré de réalisation, le composé oligosaccharide polysulfaté 25 synthétique selon l'invention est incorporé dans un pansement non tissé, associé avec une couche absorbante additionnelle, et de préférence une couche absorbante qui ne gélifie pas, comme en particulier une mousse hydrophile absorbante, de préférence une mousse polyuréthane hydrophile présentant une capacité d'absorption supérieure à celle du non tissé. Le non tissé et la mousse peuvent être associés par des techniques bien connues de 30 l'homme de l'art, par exemple par calandrage à chaud à l'aide d'une poudre thermofusible à base de polymères TPU/polycaprolactone. 3043556 11 Cette technique est couramment employée pour le liage entre eux de non tissés destinés au marché médical. Enfin, cette mousse ou le non tissé (lorsque celui-ci est utilisé seul) peuvent être recouverts d'un support pour protéger la plaie de l'extérieur. 5 Ce support peut être de taille supérieure à celle des autres couches et rendu adhésif de façon continue ou discontinue sur sa face venant en contact avec la plaie afin d'optimiser le maintien du pansement lors de son usage, en particulier si la plaie se situe sur des zones corporelles non planes. Ce support et son adhésif sont de préférence imperméables aux fluides mais très 10 perméables à la vapeur d'eau afin de permettre une gestion optimale des exsudats absorbés par le pansement et éviter les problèmes de macération. De tels supports sont bien connus de l'homme du métier et sont constitués par exemple de films respirants et imperméables tels que des films de polyuréthane, des complexes mousse/film ou non tissé/film. 15 Additifs Outre les agents actifs, les composés oligosaccharides selon l'invention pourront être utilisés en combinaison avec un (ou plusieurs) additifs couramment utilisés dans la préparation des pansements. Ces additifs peuvent notamment être choisis parmi les parfums, les conservateurs, les vitamines, la glycérine, l'acide citrique, etc. 20 L'activité des oligosaccharides polysulfatés synthétiques selon l'invention a été mise en évidence dans les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE : Mise en évidence de l'effet du sel de potassium du sucrose octasulfate KSOS) sur l'angiogenèse 25 Pour mettre en évidence de l'effet du sel de potassium du sucrose octasulfate (KSOS) sur l'angiogenèse, le modèle CAM ou modèle de membrane chorioallantoique de poulet (Chorioallantoic membrane) a été utilisé. Il s'agit d'une membrane vascularisée trouvée dans les oeufs d'oiseau ou de reptile. Chez les mammifères cette structure forme le placenta. Le modèle pour l'étude sera un modèle de CAM ex OVO (sans coquille) de poulet. 30 Les conditions expérimentales sont les suivantes : 3043556 12 1. Matériel biologique Des oeufs fécondés de poulets ont été utilisés. Pour l'étude, le VEGF-A a été utilisé comme contrôle positif 5 Le sel de potassium du sucrose octasulfate (KSOS) se présente sous la forme d'une solution à différentes concentrations, tamponnée avec du PBS. Une solution tampon de PBS a été utilisée comme témoin négatif 2. Procédure expérimentale 10 À réception, les oeufs sont stockés à 13 °C pour stopper leur développement jusqu'au moment de l'étude. Les oeufs sont ensuite mis en incubation dans un éclosoir à 37°C pour permettre le développement de l'embryon. A 3 jours, les oeufs sont cassés dans une coupelle de pesée afin de se débarrasser de la coquille, rendant ainsi l'embryon et toutes les structures accessibles pour le traitement futur. 15 Les embryons ex ovo sont ensuite replacés dans l'éclosoir où ils poursuivront leur développement in vitro. Les embryons seront traités avec le véhicule (PBS seul), le VEGF ou différentes concentrations de KSOS. La zone de traitement est délimitée par un anneau en silicone de 1 cm de diamètre et 0,2 20 mm d'épaisseur. Le volume de traitement est de 25 pL. Les embryons traités sont remis dans l'éclosoir pendant 48h. Après 48h d'incubation, du lait écrémé à 10% est injecté entre la CAM et le vitellus pour séparer les 2 vascularisations et augmenter le contraste pour une prise de photo optimale. La zone de traitement est prise en photo avec un NIKON AZ 1 00, logiciel de capture NIS- 25 élément, avec un grossissement 0,5x4. 3043556 13 Les traitements réalisés sont résumés dans le tableau suivant : Groupe Traitement Durée de traitement 1 PBS 48h 2 VEGF 0,5µg (20tg/mL) 48h 3 KSOS 3mg/mL 48h 4 KSOS 10mg/mL 48h 5 KSOS 30mg/mL 48h 6 KSOS 50mg/mL 48h 7 KSOS 100mg/mL 48h 3. Résultats : photo et traitement d'images La figure 1 illustre les observations des embryons en fonction du traitement : les photos 5 sont prises au niveau de la zone de traitement. Le VEGF induit une néovascularisation anarchique de la CAM, comme attendu. Le KSOS montre un léger changement vasculaire dès 30mg/mL, par rapport au témoin négatif (PBS seul) avec une accentuation de cet effet aux doses supérieures montrée sur les photos par les flèches. Des petits vaisseaux sont retrouvés accompagnés d'une réaction qui 10 s'apparenterait à une réaction hyperémique (Vasodilation, augmentation de l'afflux sanguin). A 100 mg/mL, on observe un réseau vasculaire bien développé, avec apparition de zones ou spots hémorragiques (flèche du haut). A la dose de 100 mg/mL, les résultats sont donc considérés comme probants, car démontrant une activation de l'angiogenèse équivalente à celle observée avec du VEGF-A utilisé comme témoin positif 15 Sur la base de ces photos, plusieurs paramètres ont été déterminés par le logiciel d'analyse d'images: a) la longueur totale des tubes (somme des longueurs de chaque vaisseau de l'image), b) le nombre de segments (nombre total de vaisseaux connectés à un point de branchement), 3043556 14 c) le nombre de points de branchements (nombre total de jonctions connectées à un segment). b et c sont représentatifs de la formation de nouveaux vaisseaux caractéristiques d'une angiogénèse. 5 La figure 2 illustre ces différents paramètres pour chaque groupe testé. Comme attendu, le VEGF induit une augmentation significative des 3 paramètres mesurés. Le KSOS induit également une augmentation significative des 3 paramètres mesurés à partir de 100 mg/mL. A des doses inférieures, c'est-à-dire à 30 et 50 mg/mL, un réseau 10 vasculaire peu développé est néanmoins visible, mais l'activation de l'angiogenèse n'est pas considérée comme significative par rapport à l'activation observée pour le traitement par le VEGF-A ou à 100 mg/mL de KSOS. On peut donc raisonnablement considérer que l'activation de l'angiogenèse est significative dès 70 mg/mL. 15 Le KSOS induit indéniablement augmentation de la vascularisation de la CAM au niveau de la zone de traitement. Le développement d'un réseau de vaisseaux sanguins de plus en plus prononcé en fonction de la dose inoculée est clairement quantifiable avec l'analyse d'image. L'activation de l'angiogenèse démontrée pour le KSOS permet d'accélérer la cicatrisation des plaies. 20 REVENDICATIONS1. Oligosaccharide polysulfaté synthétique ayant 1 à 4 unités oses, ses sels, ou ses complexes, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse. 2. Oligosaccharide selon la revendication 1, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse lors de la cicatrisation des plaies. 3. Oligosaccharide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que sa concentration est supérieure ou égale à 100 mg/mL. 4. Oligosaccharide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa concentration est comprise entre 100 et 1000 mg/mL. 5. Oligosaccharide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend 1 à 3 unités oses, 1 ou 2 unités oses choisies de préférence parmi les pentoses et les hexoses, ainsi que les sels et complexes de ces composés. 6. Oligosaccharide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - le sel de potassium du sucrose octasulfate ; - le sel d'argent du sucrose octasulfate ; et - le complexe hydroxyaluminium du sucrose octasulfate. 7. Oligosaccharide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est administré par voie topique, par exemple sous la forme d'une composition telle qu'un gel, une solution, une émulsion, une crème, des granules ou des capsules permettant une application directement au niveau de la plaie. 8. Oligosaccharide selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour accélérer l'angiogénèse lors de la cicatrisation. 9. Composition pharmaceutique comprenant un oligosaccharide polysulfaté synthétique ayant 1 à 4 unités oses, ses sels, ou ses complexes, à une concentration supérieure ou égale à 70 mg/mL, pour son utilisation pour activer l'angiogénèse, en particulier pour activer l'angiogénèse lors de la cicatrisation des plaies.30