FR 3045053 A1 20170616 FR 1562068 A 20151209 1 Agents complexants hydrosolubles à base de triazapyridinophane et complexes de lanthanide fluorescents correspondants La présente invention a pour objet de nouveaux agents complexant hydrosolubles basés sur des macrocycles de type triazapyridinophane, des complexes de lanthanides fluorescents obtenus à partir de ces agents complexants, et l'utilisation de ces complexes de lanthanides fluorescents pour marquer des molécules et les détecter par des techniques de fluorescence en temps résolu. Etat de la technique Les complexes d'europium et de terbium sont désormais acceptés par l'ensemble de la communauté scientifique pour être des sondes fluorescentes de choix (Inorg. Chem., 2014, 53, 1854-1866, Chem. Rev. 2010, 110, 2729-2755). En effet grâce à leurs propriétés photo-physiques très spécifiques, ces molécules ont été largement utilisées dans l'industrie et étudiés par les laboratoires universitaires dans le domaine des sciences de la vie. Ces composés fluorescents sont particulièrement appropriés pour être utilisés en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fôrster Resonnance Energy Transfer »), dont l'application pour étudier les interactions entre biomolécules est exploitée de manière commerciale par plusieurs sociétés, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La durée de vie d'émission relativement longue des complexes de lanthanides permet également d'effectuer des mesures de fluorescence en temps résolu, c'est-à-dire avec un délai après excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interférences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette dernière caractéristique est d'autant plus utile que le milieu de mesure se rapproche d'un milieu biologique, qui comprend de nombreuses protéines dont la fluorescence pourrait interférer avec celle des composés étudiés. De nombreux complexes de lanthanides ont été divulgués et certains sont exploités de manière commerciale : on peut citer en particulier les cryptates macropolycycliques de lanthanides (EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 , WO 2001/96877, W02008/063721), les complexes de lanthanides comportant un motif dérivé de la coumarine lié à un motif diéthylènetriamine penta- acide (US 5,622,821), et ceux comprenant des dérivés de pyridine (US 4,920,195, US 4,761,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, US 5,202,423, US 5,324,825). Le brevet US 5,385,893 décrit des dérivés de triazapyridinophanes substitués par des groupes acides (carboxyliques ou phosphoniques), et des complexes de ces composés avec un atome de gadolinium, de manganèse ou de fer. Les complexes décrits ne sont pas fluorescents et peuvent être utilisés comme agents de contraste. Les triazapyridinophanes selon US 5,385,893 sont très peu adaptés à la préparation de complexes fluorescents du fait de la taille de la cage macrocyclique qui permet les échanges de molécules d'eaux assez facilement. La synthèse de ce macrocycle triazapyridinophane a été réalisée avec un rendement de 2%. L'obtention de ce composé n'est pas directe et passe obligatoirement par l'utilisation d'un intermédiaire dont les trois 3045053 2 atomes d'azote appartenant au macrocycle sont protégés par des groupements tosyles. Ces derniers sont éliminés en fin de synthèse dans des conditions drastiques. Un peu plus tard l'amélioration de la synthèse a été rapportée par Lee et al. (J. Org. Chem. 1996, 5 61, 8304-8306) qui obtiennent de meilleurs rendements. Le composé macrocyclique est obtenu selon une synthèse convergente comportant 8 étapes dont la dernière consiste à déprotéger les groupements tosyles, là encore en milieu fortement acide. En 2008 Nolan et al. ont tenté de reproduire le procédé de synthèse décrit par Lee mais ont 10 échoué, ce qui les a conduit à développer une nouvelle stratégie de synthèse convergente (Tetrahedron Lett. 2008, 49, 1993-1996). L'étape finale de déprotection des tosyles est réalisée encore une fois en milieu très acide. Récemment les travaux de Castro et al. sur les systèmes macrocycliques de type 15 triazapyridinophane (Inorg. Chem., 2015, 54, 1671-1683 et Inorg. Chem., 2013, 52, 6062-6072 ont permis de caractériser les complexes de lanthanides correspondants par diffraction des rayons X. Cependant la méthode de synthèse utilisée est la même que celle décrite précédemment par Lee et al. 20 Les macrocycles triazapyridinophanes de l'art antérieur ne sont pas adaptés à une utilisation pour des dosages biologique en FRET : - Les macrocycles triazapyridinophanes complexés avec un atome d'europium ou de terbium décrits précédemment présentent des longueurs d'onde d'absorption optimales à 267 nm ce qui est rédhibitoire pour une utilisation comme composés fluorescents donneurs 25 pour des mesures de FRET. En effet, d'une part les sources laser utilisées dans les dosages biologiques pour exciter les fluorophores donneurs émettent à différentes longueur d'ondes : 337 nm (laser à azote), 355 nm (laser Nd : YAG), 349 nm (Nd : YLF) et d'autre part les lampes flash qui permettent l'excitation entre 310 et 350 nm : les composés de l'art antérieur, absorbant de manière optimale à 267 nm, ne peuvent pas être excités 30 par ces dispositifs. - Les macrocycles triazapyridinophanes de l'art antérieur sont relativement hydrophobes, ce qui est un problème pour leur utilisation dans des dosages biologiques en milieu aqueux, et peut entraîner un important signal non-spécifique dans les mesures de FRET. De plus les complexes peu solubles dans les milieux aqueux ne sont tout simplement pas 35 utilisables. - Les méthodes de synthèse de ces macrocycles comprennent plusieurs étapes dont la dernière nécessite des conditions expérimentales très drastiques pour la libération des fonctions amines secondaires protégées par des groupements tosyles, à savoir plusieurs heures de réaction dans de l'acide sulfurique concentré à 120°C. Ceci est un véritable 3045053 3 obstacle pour la synthèse de molécules plus élaborées utilisables comme fluorophore dans des dosages biologiques de type FRET, puisque ces conditions ne sont pas compatibles avec l'ajout de fonctions sensibles à ces conditions. - Il est par ailleurs important de noter que les méthodes de synthèse de 5 triazapyridinophanes décrites dans la littérature ne permettent d'accéder qu'à des composés de symétrie C3 et donc ne permettent pas de différencier les substituants portés par les trois noyaux pyridines pour obtenir des composes adaptés à une utilisation comme fluorophore dans des dosages biologique en FRET. 10 Finalement, les macrocycles triazapyridinophanes de l'art antérieur ne sont non seulement pas adaptés à une utilisation comme fluorophore dans des dosages biologiques de type FRET, du fait de leur propriétés spectroscopique et de leur hydrophobie, mais en plus les méthodes décrites pour leur synthèses rendent impossible toute adaptation de ces molécules à cette application (molécules de symétrie C3, conditions trop drastiques de déprotection des amines). 15 Il existe donc un besoin pour des macrocycles triazapyridinophanes et des complexes de lanthanides correspondants utilisables dans des dosages biologiques de type FRET. La présente invention vise à pallier aux inconvénients des composés de l'art antérieur, et à fournir 20 des complexes de lanthanides fluorescents présentant une meilleure brillance que les composés de l'art antérieur lorsqu'ils sont excités entre 310 et 350 nm, si possible une bonne solubilité en milieu aqueux, un spectre d'émission adapté à leur utilisation dans des expériences de FRET, ainsi qu'une bonne praticité pour le marquage de biomolécules. 25 Description de l'invention Les inventeurs ont dépassé le préjugé technique selon lequel les triazapyridinophanes sont très peu adaptés à la préparation de complexes fluorescents du fait de la taille de la cage macrocyclique qui permet les échanges de molécules d'eaux assez facilement. Les problèmes mentionnés précédemment ont été résolus grâce à l'élaboration d'un protocole de synthèse 30 permettant la préparation d'agents complexants constitués d'un macrocycle triazapyridinophane, dont les pyridines sont substituées par des groupements paraméthoxyphénylacétylènes ou paraméthoxyphényles, ces groupements portant eux-mêmes des groupes susceptibles d'augmenter l'hydrosolubilité des macrocycles, et éventuellement un groupement permettant la conjugaison des macrocycles avec d'autres molécules, notamment des molécules biologiques que 35 l'on souhaite marquer avec un composé fluorescent. L'invention a donc pour objet des agents complexants basés sur un macrocycle triazapyridinophane, des complexes de lanthanides fluorescents constitués d'un atome de lanthanide complexé par un agent complexant selon l'invention, et des molécules organiques 40 d'intérêts marquées par un complexe selon l'invention. 3045053 4 Agents complexants Les agents complexants selon l'invention sont les composés de formule (I) : Al R1"--/N R1 A2 N)A3 (I) 5 dans laquelle : les groupes R1 sont identiques et sont choisis parmi : -CO2H, -PO(OH)R, R étant choisi parmi les groupes: phényle, phényle substitué par un groupe -SO3H, de préférence en position ortho ou para, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; 10 les groupes Al, A2 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : un groupe de formule ; un groupe de formule (II) ou (II') ; le groupe A3 est choisi parmi : un groupe de formule -O-L3-G, un groupe de formule (II), (II'), (III) ou (III') ; O-L2-E O-L3-G 15 H3C0 H3CO (III) L1, L2 et L3 sont identiques ou différents et représentent un groupe de liaison divalent ; E est un groupe augmentant l'hydrosolubilité de l'agent complexant, choisi parmi : -S03H, -PO(OH)2, -CO2H, -N+Alk1Alk2Alk3, un résidu carbohydrate; une sulfobétaïne ; un groupe PEG ; 20 G est un groupe réactif ; Alki, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1-C6)alkyle. Par carbohydrate, on entend : un résidu glucose sous forme cyclique ou linéaire, ou bien un groupe de formule -(CHOH)k-CH2OH, k étant un nombre entier allant de 3 à 12, de préférence, 25 égal à 4. Par sulfobétaïne on entend un groupe choisi parmi : 3045053 5 8 S03- ' e N \ci S03- avec R2 qui représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, et de préférence un méthyle ou éthyle, et q qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, et de préférence qui est égal à 1 ou 2, la sulfobétaïne de formule -(CH3)2N-(CH2)3-S03- étant préférée. 5 En fonction du pH, les groupes -SO3H, -CO2H et -PO(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc dans la suite du texte également les groupes -S03, -0O2 et -PO(OH)0-, et vice-versa. 10 Par groupe PEG on entend un groupe polyéthylène glycol de formule -CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3, y étant un nombre entier allant de 1 à 5. Les groupes (II), (II'), (III) et (III') contribuent à la formation d'antennes qui contribuent aux propriétés spectroscopiques des fluorophores. Les groupes -L1-E, (II) et (II') portent des 15 groupements E augmentant l'hydrosolubilité de l'agent complexant, et les groupes -O-L3-G, (III) et (III') portent un groupe réactif G permettant de conjuguer les complexes fluorescents selon l'invention avec une molécule d'intérêt que l'on souhaite marquer. Selon l'invention, les antennes comportent des groupes paraméthoxyphényles (II'), (III') ou 20 paraméthoxyphénylacétylènes (II), (III), ces derniers étant préférés. Par ailleurs les composés selon l'invention peuvent comporter 1, 2 ou 3 antennes, et les agents complexants selon l'invention peuvent ainsi être subdivisés selon les sous-familles préférées suivantes, à base d'antennes paraméthoxyphénylacétylènes : - Agents complexants à 3 antennes, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, 25 correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II) et A3 est un groupe de formule (III). - Agents complexants à 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al est un groupe de formule (II), A2 est un groupe -1_1-E et A3 est un groupe de formule (III). 30 - Agents complexants à 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. - Agents complexants à 1 antenne, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont 35 des groupes de formule -L1-E et A3 est un groupe de formule (III). 3045053 6 On distingue les mêmes sous-familles à base d'antennes paraméthoxyphényles en remplaçant les groupes de formule (II) et (III) par les groupes de formule (II') et (III'), respectivement, à savoir : - Agents complexants à 3 antennes, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont 5 des groupes de formule (II') et A3 est un groupe de formule (III'). - Agents complexants à 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al est un groupe de formule (II'), A2 est un groupe -1_1-E et A3 est un groupe de formule (III'). - Agents complexants à 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, 10 correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II'), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. - Agents complexants à 1 antenne, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe réactif, correspondants aux composés de formule (I) dans lesquels Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L1-E et A3 est un groupe de formule (III'). 15 Pour chacune de ces sous-familles, les groupes R1 qui participent à la complexation du lanthanide peuvent être soit un carboxylate -CO2H soit un phosphinate -PO(OH)R tel que défini ci-dessus (et de préférence dans ce dernier cas un méthylphosphinate). 20 Pour chacune de ces sous-familles, les composés dont les groupes E sont soit des groupes -SO3H, soit un résidu glucose, ou soit une sulfobétaïne de formule ci-dessous sont préférés. R2 q SO3- R2 Le groupe réactif G porté par un bras d'espacement L3, permet de coupler les composés selon 25 l'invention avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine. Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, AcademicPress, Second Edition 2008, p. 169-211. 30 Typiquement, le groupe réactif est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel 35 entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. 3045053 7 De préférence, le groupement réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la 5 monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule : 0 0 e,i4cH2,_Ncs e 'CH2)-NCO NH NH / v o )1,.... :4,4 CH2)-NI-12 NH /v 0 CH2)-SH ; NH w 0 I (CH2)-NHAr NH/ 0 NH 1)L ',i4CE12)-1\13 o e ,CH2)-S-S-Ar NH /v O o ekINn ...),,cH2,N v 0 )LNH:y(CH2 \ /v eNH/ 'ECH 0 V NCS NCO HCH2 w - Iv 0 eNE_I,y(CH20,N /v wi 0 o CI H N=( CH2)-N-(\ ,N 'LNH'-'( w N-f( \ /,/ 10 CI 0 NEM CH20, N 'w 1 v 0 0 S03- dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 15 De manière préférée, le groupe réactif G est un acide carboxylique, une amine, de préférence une amine aliphatique (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un 3045053 8 haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -CO2Me, -CO2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile 5 Une molécule organique, un peptide ou une protéine susceptible d'être marquée par un composé selon l'invention comprendra donc un groupe fonctionnel avec lequel réagira le groupe réactif du complexe de lanthanide ou de l'agent complexant. Par exemple, la molécule organique, la protéine ou le peptide comporte un des groupes suivants : amine, amide, thiol, alcool, aldéhyde, cétone, hydrazine, hydroxylamine, amine secondaire, halogénure, époxyde, ester (carboxylate d'alkyle), 10 acide carboxylique, des groupes comportant des doubles liaisons ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Les groupes amines ou thiols présents naturellement sur les protéines sont souvent utilisés pour procéder au marquage de ces molécules. Le groupe réactif et les groupes solubilisants E sont liés à l'agent complexant via un bras 15 d'espacement (L1, L2, L3) constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent, choisi parmi un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; un groupe cycloalkylène en C5-08 ou un groupe arylène en C6-014, 20 lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-08, aryle en C6-014, sulfonate ou oxo. - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : 3045053 9 - (cH2),- ; (c1-12)n-0-(cH2),70-(c1-12)p- , 0 0 tr, -(CH2)n (CH2),,70- (CH2)p H N ^,-1-12)q O 0 H 0 - (CH2)n N (CH2)m (CH2)n (CI-12)rr ; " O 11 -N - (CH2)n N (CH2m) - (cH2)- ; 0 0 - (CH2)n N (CH2)m s N (CH2)p- ; 0 -(CH2)n (C1-12)rr ; -(CH2)n (CH2)n- - (CH2)p- ; H H 0I I - (CH2)n-N- (CH2)n-N- (CH2)n- - 0 (CH2)n- i i i i -(CH2)n 0 N (CH2),. , N (CH2)n- , dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. De manière préférée, le groupe -L3G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un 5 acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -CO2Me, -CO2tBu), une amine, de préférence une amine aliphatique (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, et d'un bras d'espacement L3 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. De manière encore plus préférée, le groupe -L3G est une amine portée par une chaîne 10 alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. 3045053 10 En ce qui concerne L1, le groupe divalent suivant est préféré : O C NH-(CH2 où n est un nombre entier de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 5 En ce qui concerne L2, le groupe divalent suivant est préféré : 0 NH CH où n et m sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 En ce qui concerne L3, le groupe divalent suivant est préféré : 10 (CH2)n- où n est un nombre entier de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 Les sous-familles dans lesquelles, à la fois, 15 L1 est le groupe divalent de formule : 0 et L2 est le groupe divalent de formule C NH-(CH2) L3 est le groupe divalent de formule sont également préférées. , et 0 -(-H2C NH CH - (CH2)n- 20 Complexes L'invention concerne également les complexes de lanthanides fluorescents constitués d'un atome de lanthanide complexé par un agent complexant tel que décrit ci-dessus. De préférence, le lanthanide est Tb3+, Eu3+ ou Sm3+ et de manière encore plus préférée Eu3+. 25 Ces complexes sont préparés en mettant en contact les agents complexants selon l'invention et un sel de lanthanide. Ainsi la réaction entre un équivalent d'agent complexant et 1 à 5 équivalents de sel de lanthanide (europium, terbium ou samarium sous forme par exemple de chlorures) dans un 3045053 11 milieu aqueux à pH 6 conduit après 24 h de réaction à température ambiante au complexe correspondant. Comme indiqué précédemment, les complexes fluorescents obtenus présentent d'excellentes 5 propriétés photo-physiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. De plus la répartition des bandes de leurs spectres d'émission est centrée autour de 620 nm conférant ainsi aux complexes des propriétés exceptionnelles et très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que 10 la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). De manière avantageuse, l'invention concerne les complexes suivants : 0R3 02C 1\1 R3 (V) 15 3045053 12 0R3 dans lesquelles : Ln3+ est choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Sm3+ ; 5 R3 est choisi parmi les groupes suivants : OH ; HO H H OHM H . NH ; Coniuclués Les agents complexants et complexes selon l'invention comportant un groupe réactif sont 10 particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation de complexes pour le marquage de molécules biologiques (protéines, anticorps, enzymes, hormones etc...). 15 L'invention concerne également les molécules marquées par un complexe selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un complexe selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un complexe selon l'invention et une molécule choisie parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une 20 chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme (en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisées sous les dénominations SNAP-tag® et CLIP-tag®), un chloroalcane (substrat de l'enzyme commercialisée sous la dénomination Halo-tag), le coenzyme A (substrat de l'enzyme commercialisée sous le nom ACP-tag ou MCP-tag). Les conjugués de OH 3045053 13 l'invention sont obtenus par mise en contact d'un complexe de lanthanide selon l'invention, comprenant un groupe réactif G, avec une molécule d'intérêt. Synthèses 5 La préparation des agents complexants et des complexes de lanthanides selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après, et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale. Synthèse systèmes tri-antennes 10 La synthèse des complexes comportant 3 antennes, 2 groupes solubilisants et 1 groupe réactif est décrite dans les schémas 1-4 et s'appuie sur une synthèse convergente. Les composés comportant d'autres groupes solubilisants / groupe réactifs peuvent être préparés de manière similaire à partir de l'intermédiaire 24. 3045053 14 OH BrCO2Me TMS OCO2Me CO2Me K2CO3, Me2CO 50°C, 12 h_ OCO2Me K2CO3 Pd(dppf)Cl2, Cul DCM,MeOH THF, Et3N, 65°C, 12 h 0°C-T amb, 1 h a- 97% 65% Il 83% TMS 2 3 4 OH i) SOCl2, DMF reflux, 24 h Cl i) Nal, MeCN Ultrasons, 20 min ii)AcCI NaBH4, Me0H T amb, 12 h ii) Me0H reflux, 24 h Ultrasons, 3 h 75% Me02C CO2Me 90% Me02C CO2Me 70% OH OH 5 6 7 8 H2N CO2tBu I TsC, I, Ag20 I KI DCM K2CO3, MeCN -20°C-T amb, 16 h /L 60°C, 20 h (N 44% r-re. 90% OH OH OH OTs 8 9 Schéma 1 L'introduction de la fonction ester permettant ultérieurement la fixation d'une fonction solubilisante de type sulfonate, sulfo-bétaïne ou dérivés de sucres est réalisée par une réaction d'alkylation sur 5 le 4-iodo-phénol. Une réaction de couplage de type Sonogashira entre le dérivé 2 et le triméthylsilyl acétylène permet d'obtenir le composé 3. Le groupe protecteur (triméthylsilyl) est supprimé en utilisant un mélange de solvants méthanol-dichlorométhane en présence de carbonate de potassium. Ces conditions permettent d'épargner la fonction ester méthylique qui est relativement sensible à l'hydrolyse. Le diol 8 est obtenu à partir de l'acide chélidamique en 3 étapes comme 10 décrit dans la littérature (Tetrahedron-2005-61-1755. Tetrahedron-2008-64-399. European Journal of Organic Chemistry 2002-21-3680). La réaction de monotosylation est réalisée en présence de sels d'argent. Ces conditions ont été développées sur l'analogue non-halogéné. (Tetrahedron 2004-49-11117; 2004 et Angewandte Chemie, International Edition, 2014-53-5872). La réaction de OCO2Me 4 Pd(dppf)Cl2, Cul THF, Et3N, p-ondes, 30 min 71% OH OH Me02C0 OCO2Me I CO2tBu 11 TsCI, Ag20 KI, DCM -5°C -T amb, 16 h 88% OH OH 0 3045053 15 condensation permet d'obtenir le motif di-pyridinyle 10 sur lequel est réalisée une double réaction de Sonogashira conduisant au squelette du premier synthon clé. Les fonctions diols sont activées par l'introduction des groupements tosyles dans des conditions assez similaires à celles de la monotosylation. 5 Boc2O, Et3N, DCM 0°C - T amb, 24 h HBr H2NBr 13 BocHNBr 14 94% BocHN BocHN BocHNBr OH 14 Cs2CO3, Nal, MeCN, 60°C, 24 h 85% SiMe3 Pd(PPh3)Cl2, Cul Et3N, THF, p-ondes, 30 min 99% BocHN K2CO3, Me0H 0 0°C - T amb, 24 h 98% OH OH 8 15 TMS 16 NsCI, DCM, Et3N, 0°C - T amb, 12 h H2N/\CO2tBu > Ns,N/\CO2tBu H 94°A 19 18 17 Ns = NO2 0=S=0 Ns,N/\CO2tBu H19 K2CO3, MeCN Reflux 72 h re tBuO2C N,CO2tBu Ns Ns/ 21 0 ''NHBoc O 17 Pd(dppf)C12, Cul Et3N, THF, 60°C, 20 h 57% tBuO2C TsCI, NaOH, H2O, THF 0°C - T amb, 20 h 84% NHBoc 89% OTs OTs 20 CO2tBu HSOH 22, X= Ns DBU, MeCN, 55% T amb, 45 min 23, X= H Schéma 2 La synthèse du deuxième synthon clé 23 est décrite dans le schéma 2. Ce synthon portera une fonction amine masquée (groupement protecteur Boc) permettant par exemple une réaction de 10 bioconjugaison avec un anticorps ou une biomolécule. Le composé 17 a été préparé selon les procédures décrites dans la littérature (WO 2014/111661). Le diol 8 est activé sous forme de ditosylate puis condensé avec le composé 19 conduisant au composé 21 avec un bon rendement. La réaction de Sonogashira suivie de la déprotection du groupement nosyle permet l'obtention du synthon 23. 15 3045053 16 NHBoc 0-rj Schéma 3 L'étape la plus délicate est représentée dans le schéma 3. Il s'agit de l'étape de macrocyclisation qui après optimisation a conduit au ligand 24 avec un rendement très convenable. Cet 5 intermédiaire constitue une plateforme pour réaliser des séries de complexes de lanthanides (europium, terbium et samarium) portant différents groupes solubilisants comme décrit dans le schéma 4. CO2Me 0) Na2CO3, Nal MeCN reflux, 40 h 24 23 tBuO2CNH OTs 74% HNCO2tBu + OTs 3045053 17 JO2Me 0 OJ CO2H LiOH (1 M), MeCN T amb, 1 h HATU, DIPEA DMSO, NH2-R T amb, 5 min Cla, Ln= Eu, R= C2a, Ln= Tb, R= eS03 C3a, Ln= Sm, R= 0 NHBoc Me02C Cl b, Ln= Eu, R= C2b, Ln= Tb, R= Ln= Sm, R= Clc, Ln= Eu, R= C2c, Ln= Tb, R= C3c, Ln= Sm, R= Cld, Ln= Eu, R= C2d, Ln= Tb, R= C3d, Ln= Sm, R= HO2C i) TFA, DCM T amb, 1 h ii) LnCI3 N H2 0 NHBoc tBuO2C 26a, R= 26b, R= HO 0 OH OH 26c, R= / 26d, R= N OH Schéma 4 5 En utilisant une stratégie analogue les complexes de pyridinophane mono et di-antennes peuvent être préparés. Les schémas de synthèse sont décrits ci-après Synthèse systèmes mono antenne La synthèse de ces systèmes est décrite dans les schémas 5-7. 10 3045053 18 CO2Me ^N 27 (NH4)S208, H2SO4 cat. Me0H / H2O reflux, 20 h ... 28% CO2Me OH OH 28 PPh3, CCI4 CHCI3, T amb, 20 h 28% OH 29 H2N/\CO2tBu 18 Na2CO3, CH3CN reflux, 16 h CI 66% y 0 Ag2 CO2Me CO2Me TsCI, CO2Me CO2Me KI, DCM -« -5°C-T amb, 16 h r--N---, -N N-..---1 N N OTs OTs OH OH 31 CO2tBu Schéma 5 L'isonicotinate de méthyle traité dans des conditions oxydantes conduit au diol 28 avec un rendement de 28% ; Bien que ce rendement soit médiocre, cette réaction permet d'introduire 5 simultanément deux groupements hydroxy-méthylene en position 2 et 6 du noyau pyridinyle et ceci en une seule étape. La mono-chloration du diol permet d'obtenir le composé 29 qui réagit ensuite avec le composé 18 conduisant au squelette di-pyridinyle 30. Les fonctions alcools sont activées sous forme de tosylate puis l'étape de macrocyclisation est effectuée comme décrit précédemment sur les systèmes tri-antennes et conduit à l'intermédiaire clé 32. 10 CO2Me NaBH4 CaCl2, Et0H 36 37 Boc tBuO2C.....'-N- OTs OH Ns , N Ns 62% EtO0C COOEt 93% EtO0C N Ns /\ OTs 38 N CO2tBu 28% H TsCI, NaOH ONH 19 130C H20, THF Boc K2CO3, MeCN 0°C - T amb - 20 h Reflux 72 h CO tBu OH 2 39 40 41 Hs/OH DBU, MeCN T amb, 45 min 0."'NNH Boc tBuO2C,''NH HN',..,,,C02tBu 42 Schéma 8 En ce qui concerne les systèmes di-antennes, la synthèse commence par une réaction 5 d'estérification sur l'acide chélidamique 36 qui est disponible commercialement (procédure décrite dans Inorganic Chemistry, 2000-39-4678-4687). Le bras servant de lien entre le complexe et la biomolécule est introduit à ce niveau de la synthèse en alkylant le groupement hydroxyle dans des conditions classiques utilisées par l'homme du métier (procédure décrite dans Organic Biomolecular Chemistry, 2012-10-9183). Le diol 39 est obtenu par une double réaction de 10 réduction en utilisant la combinaison NaBH4-CaCl2 dans l'éthanol, qui est ensuite activé sous forme ditosylée (procédure décrite dans Organic Biomolecular Chemistry, 2012-10-9183). Le synthon 42 est préparé comme précédemment (système tri-antennes) en condensant 19 avec 40 (préparé selon la procédure décrite dans Organic Biomolecular Chemistry, 2012-10-9183) puis en déprotégeant les groupements protecteurs nosyles. Les deux composés 12 et 42 sont utilisés pour 15 la préparation de l'intermédiaire clé 43 constituant la base des systèmes di-antennes. 3045053 NHBoc Schéma 9 42 43 21 12 Na2CO3, Nal MeCN reflux, 40 h tBuO2CNH HN---.'CO2tBu NJ Me02C CO2Me 0) Me02C LiOH (1 M), MeCN T amb, 1 h NHBoc HO2C NHBoc 44 OJ CO2H CO2me 43 i) TFA, DCM T amb, 1 h ii) LnCI3 NH2 O HATU, DIPEA DMSO, NH2-R T amb, 5 min 26a, R= NHBoc SO3- 26b, R= ise,./".-\ HO 0 26c, R= OH OH OH 26d, R= 0 C6a, Ln= Eu, R=1 C7a, Ln= Sm, R=I I''",-"*.-'s03- C7b,Ln= Sm, R=} `....."----...NIS03- C6b, Ln= Eu, R= i \ HO C6c, Ln= Eu, R= 1 C7c, Ln= Sm, R= C6d, Ln= Eu, R=1 à /, C7d, Ln=Sm, R= OH Schéma 10 3045053 22 Les fonctions esters sont hydrolysées et les fonctions hydrosolubilisantes sont introduites comme précédemment mais cette fois sur les antennes directement. La suite de la synthèse est identique à ce qui a été décrit pour les tri et mono-antennes. 5 Ces sondes fluorescentes peuvent être activées soit sous forme de maléimide permettant la bioconjugaison sur des protéines, soit sur des messagers secondaires de type cAMP. Les schémas 11 et 12 décrivent deux exemples de ces molécules. Schéma 11 15 Cl a-maléimide 10 0 NH 0 H ,----..,,,,O,'...^.0.-.,'N..r.,".'.. 0 H CO2H 0 ° ''P CAMP-Glu-CO2H 0 \ 0 OH so3- NH2 0 OcP 0 HO 0y0 HN 0 NH O NH NH2 N eN DIPEA, TSTU :Ee 0 ''N'',/', -'N --^ / AI 1 e03 503 HN--0 HNIr 0 Cla 1 0 NH2 HN Cla-CAMP Schéma 12 3045053 23 Partie Expérimentale Informations générales Abréviations utilisées Boc : tert-Butyloxycarbonyle 5 Boc-OSu: N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide cAMP : adénosylmonophosphate cyclique CCM : chromatographie en couche mince m-CPBA : acide métachloroperbenzoïque DCC: dicyclohexylurée 10 DCM : dichlorométhane 6: déplacement chimique DIPEA: diisopropyléthylamine DMF : diméthylformamide EtOH : éthanol 15 ESI : ionisation par électronébulisation h : heure HATU :1-[Bis(diméthylamino)méthylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxyde hexafluorophosphate HPLC : chromatographie liquide à haute performance 20 HRMS : spectroscopie de masse à haute résolution HTRF: Fluorescence Homogène en Temps Résolu Hz : Hertz MeCN : acétonitrile Me0H : méthanol 25 min : minute Mops : acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique Ms : mésyle NBS: N-bromosuccinimide NHS : N-hydroxysuccinimide 30 NIS : N-iodosuccinimide Ns : nosyle PEG : polyéthylène glycol Ph: phényle ppm : partie par million 35 PtF: point de fusion RMN : résonance magnétique nucléaire SM : spectrométrie de masse SMPH : hexanoate 6-((béta-maléimidopropionamido) de succinimidyle) TA : température ambiante 40 TEA / Et3N: triéthylamine 3045053 24 TFA :acide trifluoroacétique THF : tétrahydrofurane TMS = triméthylsilyle TsCI : chlorure de tosyle 5 TSTU: tétrafluoroborate de 0-(N-Succinimidy1)-1,1,3,3-tétraméthyluronium Chromatographie Les chromatographies sur couches minces ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254 sur feuille d'aluminium ou sur des plaques d'oxyde d'aluminium neutre Merck 60 F254 10 (type E) sur feuille d'aluminium. Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils : HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3.5 lm, 4.6 x 100 mm. 15 HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes VarianProStar, colonne préparative Waters XBridgeprép. C18, 5 lm: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées sur gel de silice Merck 60 (0.0400.063 mm). Les chromatographies sur colonne d'alumine ont été réalisées sur oxyde d'aluminium 20 Sigma-Aldrich, neutre, activé, Brochmann I. Gradient A : Colonne Waters Xbridge 018, 300 Â, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 0,1 % acide formique - B/ acétonitrile 0,1 % acide formique, t = 0 min, 5 % B - t = 15 min 100 % B - 1 mL.min-1. 25 Gradient B : Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm, A / eau 0,1 % acide formique B / acétonitrile t = 0 min, 50 % B - t = 17 min, 100 % B - 20 mL.min-1. Gradient C : Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 50 x 150 mm, A / eau 0,1 % acide formique B / acétonitrile t = 30 0 min, 15 % B - t = 2 min, 15 c/0 B - t = 20 min, 100 c/0 B - 100 mL.min-1. Gradient D Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm, A / eau 0,1 % acide formique B / acétonitrile t = 0 min, 15 % B - t = 2 min 15 % B - t = 20 min 100 % B - 20 mL.min-1. Gradient E 35 Colonne Waters Xbridge C18, 300 Â, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm, N H2O 5 mM acétate d'ammonium pH 6,5 - B/ acétonitrile - t = 0 min 2 % B - t = 15 min 40 % B. 1 mL.min-1. Gradient F Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 50 x 150 mm, A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - t = 17 min 40 % B - 100 mL.min-1. 40 3045053 25 Gradient G Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm, A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - B - t = 17 min 40 % B - 20 mL.min-1. Gradient H 5 Colonne Waters XBridge C18, 300 Â, 5 lm, 10 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - t = 19 min 40 % B - 5 mL.min-1 Spectroscopie a. Résonance magnétique nucléaire 10 Les spectres RMN (1H, 13C et 31 P) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d'une sonde de mesure BBFO, multi noyaux de diamètre de 5 mm, de gradient Z et de lock2H. Les déplacements chimiques (ô) sont exprimés en partie par million (ppm). Les abréviations suivantes sont utilisées : s : singulet, se : singulet élargi, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : 15 doublet dédoublé, td : triplet dédoublé, qd : quadruplet dédoublé, ddd : doublet de doublet dédoublé. b. Spectrométrie de masse Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Waters ZQ 2000 simple quadipôle à source multimode ESI/APCI équipé de colonne Waters XBridge C18, 3.511m, 4.6 x 100 20 mm. c. Spectrométrie de masse haute résolution Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse QStar Elite (AppliedBiosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (API) assistée pneumatiquement. L'échantillon a été ionisé en mode electrospray positif dans les conditions 25 suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d'orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de nébulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute résolution (MS) a été obtenu avec un analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a été effectuée en triplicat avec un double étalonnage interne. 30 Divers Appareil à point de fusion : les points de fusion ont été réalisés en utilisant un appareil BUCHI melting point B-540. Composé 1 : disponible commercialement. 35 Composé 2 : Le composé 2 a été préparé selon la procédure décrite dans WO 2004/094386. Composé 3 : Le composé 3 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : J. Med. Chem 2013-56-4990. 3045053 26 Composé 4 A une solution du composé 3 (20 g, 38,1 mmol) dans du DCM anhydre (20 mL) ont été ajoutés successivement à 0°C du Me0H anhydre (30 mL) et du carbonate de potassium anhydre (15,8 g, 114 mmol). La suspension a été agitée à 0°C pendant 15 min puis à TA pendant 1 h puis a été 5 filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu a été dilué avec du DCM (100 mL) et ensuite a été ajouté de l'eau (80 mL). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du DCM (2 x 60 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de sodium, filtrées et concentrées sous pression réduite pour conduire au composé 4 (12 g, 83%) comme un solide légèrement marron qui a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification 10 supplémentaire. RMN 1 H (CDCI3, 400 MHz) Ô 7.45 (d, J = 8Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (s, 1H); RMN 130 (CDCI3, 100 MHz) b 168.9, 158.0, 133.6, 115.4, 114.6, 83.3, 76.3, 65.1, 52.3. LRMS (ESI+) : calculée pour C11111103 [m+H]+, m/z 191.07, trouvée 191.70. Composé 5 : disponible commercialement. Composé 6 : Le composé 6 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Tetrahedron- 15 2005-61-1755. Composé 7 : Le composé 7 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : Tetrahedron2008-64-399. Composé 8 : Le composé 8 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article : European Journal of Organic Chemistry 2002-21-3680. 20 Composé 9 A une suspension du composé 8 (3 g, 11.3 mmol) dans du DCM anhydre (50 mL) refroidie à -20 °C ont été ajoutés de l'oxyde d'argent (3,93 g, 17,0 mmol), de l'iodure de potassium (0,37 g, 2,2 mmol) puis par petites portions du TsCI (2,37 g, 12,5 mmol). Le mélange a été agité à TA pendant 16 h puis filtré sur Celite. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et l'huile résiduelle a été 25 purifiée par chromatographie sur colonne de silice en utilisant du DCM comme éluant pour conduire à un solide blanc correspondant au composé 9 (2,1 g, 44%). Pt de fusion : 97-98°C. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) b 7.84 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.64 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.4Hz, 2H), 5.10 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 3.20 (bs, 1H), 2.48 (s, 3H); RMN 13 C (CDCI3, 100 MHz) b 160.0, 153.4, 145.4, 132.6, 130.0, 129.4, 129.3, 128.0, 106.9, 70.5, 63.4, 21.7. HRMS (ESI+) : calculée pour 30 C14H15N041S [M+H]+, m/z 419.9766, trouvée 419.9759. Composé 10 A une suspension d'hydrochlorure de glycinate de tert-butyle (0,76 g, 4,5 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (76 mL) a été ajouté du carbonate de potassium anhydre (1,88 g, 13,6 mmol) et ce mélange a été chauffé à 55°C pendant 30 min puis refroidi à TA. A cette suspension a été 35 ajouté le composé 9 (4,0 g, 9 mmol) puis le mélange a été chauffé à 60°C pendant 20 h. Lorsque le mélange est revenu à TA, le mélange a été filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant acétate d'éthyle - méthanol 97/3 jusqu'à 90/10 par incrément de 1% pour conduire au composé 10 (2,5 g, 90%) sous forme de mousse. RMN1H (CDCI3, 400 MHz) b 7.79 (s, 2H), 7.53 40 (s, 2H), 4.70 (s, 4H), 3.96 (s, 4H), 3.86 (bs, 2H), 3.40 (s, 2H), 1.53 (s, 9H); RMN 130 (CDCI3, 100 3045053 27 MHz) b 170.1, 159.6, 158.8, 131.0, 128.3, 106.8, 81.6, 63.6, 59.2, 56.7, 38.2. HRMS (ESI+) : calculée pour C201-126N304I[M+H]+, m/z 626.0013, trouvée 626.0015. Composé 11 Une solution de composé 10 (1,64 g, 2,62 mmol) et de composé 4 (1,5 g, 7,87 mmol) dans un 5 mélange THF (7,5 mL) et TEA (7,5 mL) a été dégazée par un courant d'argon pendant 15 min. Puis à ce mélange ont été ajoutés du 1,1'-bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (0,64 g, 0,78 mmol) et de l'iodure de cuivre (0,3 g, 1,57 mmol). Ce mélange a été irradié sous microondes (100 W) pendant 30 min puis refroidi à TA et enfin filtré sur un lit de Celite. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de 10 silice en utilisant un gradient de solvant dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol de 1/0/0, 5/5/0, 0/1/0 jusqu'à 0/9/1 par incrément de 5% pour conduire au composé 11 souhaité (1,39 g, 71%). RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) Ô 7.51 (s, 2H), 7.48 (d, J = 8.7Hz, 4H), 7.19 (s, 2H), 6.87 (d, J = 8.7Hz, 4H), 4.75 (s, 4H), 4.68 (s, 4H), 4.16 (bs, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.84 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 1.53 (s, 9H); RMN13C (CDCI3, 100 MHz) b 170.4, 168.9, 158.5, 158.3, 158.0, 133.6, 132.6, 123.7, 120.5, 115.3, 15 114.7, 93.6, 86.2, 81.4, 65.1, 63.9, 59.5, 56.4, 52.3, 28.2. HRMS (ESI+) : calculée pour C42H44N3010 [M+H]+, m/z 750.3027, trouvée 750.3022. Composé 12 A une solution de diol 11 (250 mg, 0,33 mmol) dans du DCM (8 mL) ont été ajoutés de l'iodure de potassium (22 mg, 0,14 mmol) et de l'oxyde d'argent (231 mg, 1 mmol). A ce mélange refroidi à - 20 5°C a été ajouté en une fois du TsCI (190 mg, 1 mmol). Le mélange a été ensuite agité à TA pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, le solvant a été éliminé sous pression et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant DCM-MeOH de 99/1 jusqu'à 98/2 par incrément de 0,2 % pour conduire à une huile beige (300 mg, 88%). RMN 1H (CDCI3; 300 MHz) b 1.46 (s, 9H); 2.4 (s, 6H), 25 3.32 (s, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.87 (s, 4H), 4.65 (s, 4H), 5.07 (s, 4H), 6.83 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 7.28 (s, 2H), 7.29 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 7.44 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 7.52 (s, 2H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 4H). RMN 130 (CDCI3 ; 75 MHz) b 170.0, 168.8, 159.0, 158.3, 153.1, 145.0, 133.5, 133.0, 132.6, 129.8, 128.0, 124.2, 121.6, 115.1, 114.7, 94.1, 85.9, 81.2, 71.3, 65.0, 59.5, 56.0, 52.3, 28.1, 21.5. HRMS (ESI+) : calculée pour C56H56N3014S2 [M+H]+, m/z 1058.3204, trouvée 1058.3241. 30 Composé 13 : disponible commercialement. Composé 14: disponible commercialement. Composé 15: Le composé 15 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article Org. Lett. 2006-8-4251. Composé 16 : Le composé 16 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article Org. Lett. 35 2006-8-4251. Composé 17 : Le composé 17 a été préparé selon la procédure décrite dans la demande WO 2014/111661. Composé 18 : disponible commercialement. Composé 19 : Le composé 19 a été préparé selon la procédure décrite dans l'article Org. Lett. 40 2007-9-1635. 3045053 28 Composé 20 A une solution de composé 8 (3,0 g, 11,3 mmol) dans du THF (10 mL) a été ajoutée une solution aqueuse de soude (1,36 g, 34 mmol dissous dans 10 mL d'eau) à TA. A ce mélange refroidi à 0°C a été additionné une solution de TsCI (6,47 g, 34 mmol) dans du THF (10 mL) et a été agité 5 pendant 20 h à TA. A cette suspension ont été ajoutés du DCM (100 mL) et une solution saturée de saumure (50 mL). Après décantation, la phase aqueuse a été extraite par du DCM (2 x 100 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de sodium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice avec un gradient d'éluant cyclohexane/dichlorométhane de 50/50 jusqu'à 0/100 pour conduire au 10 composé 20 (5,41 g, 84%) comme un solide blanc. Pt de fusion : 143.5-144.5°C. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) b 7.81 (d, J= 8.2Hz, 4H), 7.64 (s, 2H), 7.36 (d, J= 8.2Hz, 4H), 5.01 (s, 4H), 2.47 (s, 6H); 130 NMR (CDCI3, 100 MHz) b 154.1, 145.3, 132.6, 130.3, 130.0, 128.0, 106.9, 70.38, 21.72. HRMS (ESI+) : calculée pour C21 H21 N061S2 [M+H]+, m/z 573.9855, trouvée 573.9854. Composé 21 15 A une solution de composé 19 (1,83 g, 5,75 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (36 mL) a été additionné du carbonate de sodium (2,77 g, 26,2 mmol) puis la suspension a été agitée à 80°C pendant 1 h. A cette suspension refroidie à TA a été ajoutée le composé 20 (1,5 g, 2,62 mmol) et le mélange a été agité à 80°C pendant 72 h. Après cette période, le mélange réactionnel a été refroidi à TA, filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu été purifié par 20 chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant acétate d'éthyle/méthanol de 98/2 jusqu'à 95/5 par incrément de 0,5% pour conduire au composé 21 (2,0 g, 89%) comme une huile jaunâtre. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) b 8.08 (dd, J = 7.6Hz, 1.6Hz, 2H), 7.75-7.66 (m, 6H), 7.60 (s, 2H), 4.63 (s, 4H), 4.15 (s, 4H), 1.39 (s, 18H); RMN 130 (CDCI3, 100 MHz) b 167.3, 156.3, 147.7, 133.7, 133.5, 131.7, 130.8, 130.4, 124.2, 107.3, 82.6, 52.8, 49.2, 28.0. HRMS 25 (ESI+) : calculée pour 031 H37N5012 IS2 [M+H]+, m/z 862.0925, trouvée 862.0927. Composé 22 A une solution de composé 17 (2,58 g, 9,4 mmol) et de composé 21 (8,2 g, 8,54 mmol) dans un mélange de TEA (42 mL) et de THF (42 mL) a été dégazée sous un courant d'argon pendant 15 min. Puis à ce mélange ont été ajouté du 1,1'- 30 bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (1,39 g, 1,70 mmol) et de l'iodure de cuivre (0,49 g, 1,57 mmol) et a été chauffé à 60°C sous agitation pendant 20 h. Ce mélange a été refroidi à TA et filtré sur un lit de Celite. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant cyclohexane/dichlorométhane/acétate d'éthyle de 5/2/3 jusqu'à 2/5/3 pour conduire au composé 22 35 (4,9 g, 57%) comme une mousse jaune. RMN 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) b 8.10 (dd, J = 7.6Hz, 1.7Hz, 2H), 7.75-7-65 (m, 6H), 7.49 (d, J = 8.7Hz, 2H), 7.32 (s, 2H), 6.92 (d, J = 8.7Hz, 2H), 4.76 (bs, 1H), 4.68 (s, 4H), 4.17 (s, 4H), 4.08 (t, J = 6.0Hz, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.38 (s, 18H); 130 NMR (CDCI3, 100 MHz) b 167.4, 159.7, 156.0, 155.8, 147.9, 133.8, 133.6, 133.6, 131.8, 130.8, 124.2, 122.7, 114.7, 113.8, 95.3, 85.5, 82.4, 79.3, 65.9, 53.0, 49.2, 37.8, 29.5, 28.4, 40 27.9. HRMS (ESI+) : calculée pour C47H57N6015S2 [M+H]+, m/z 1009.3323 trouvée 1009.3322. 3045053 29 Composé 23 A une solution de composé 22 (0,1 g, 0,099 mmol) dans de l'acétonitrile (4,3 mL), ont été additionnés sous agitation du 2-mercaptoéthanol (76 gL, 1,09 mmol) et du 1, 8 diazabicyclo [5-4-0] unde-7-ène (67 gL, 0,445 mol). La réaction a été agitée pendant 45 min à TA. L'avancement de la 5 réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant comme éluant un mélange acétate d'éthyle/méthanol (98/02 puis 96/04) pour conduire au composé 23 (35 mg, 55%) comme une huile beige. RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) b 1.46 (s, 9H), 1.49 (s, 18H), 2.01 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.40 (s, 4H), 3.94 (s, 4H), 4.06 (m, 2H), 6.89 (d, J = 8.8Hz, 10 2H); 7.32 (s, 2H); 7.48 (d, J = 8.8Hz, 2H). RMN 130 (CDCI3, 75 MHz) Ô , 171.3, 159.4,159.0, 156.0, 133.4, 132.6, 122.0, 114.6, 114.3, 93.7, 86.1, 81.2, 79.2, 65.8, 54.3, 51.1, 37.8, 29.5, 28.3, 28.1, HRMS (ESI+) : calculée pour C35E1511\1407 [M+H]+, m/z 639.3758, trouvée 639.3784. Composé 24 A une solution de dérivé ditosylé 12 (312 mg, 0,295 mmol) et de dérivé 23 (188 mg, 0,295 mmol) 15 dans de l'acétonitrile anhydre (140 mL) ont été additionnés du carbonate de sodium (312 mg, 2,95 mmol) et de l'iodure de sodium (4.4 mg, 0,0295 mmol). La suspension a été agitée à reflux pendant 40 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à TA, filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine en utilisant 20 comme éluant un mélange DCM/Me0H (98/02 puis 97/03) pour conduire au composé 24 (297 mg, 74%) comme une huile beige. RMN 1H NMR (CDCI3, 300 MHz) b 1.47(s, 9H), 1.52 (s, 27H), 2.02 (m, 2H), 3.37 (m, 2H), 3.43 (s, 4H), 3.45 (s, 2H), 3.84 (s, 6H), 3.90 (m, 12H), 4.02 (m, 2H), 4.62 (s, 4H), 6.69 (m, 6H), 7.22 (m, 4H), 7.25 (s, 2H), 7.35 (m, 6H). RMN 130 (CDCI3, 75 MHz) b 170.6, 25 1352.6495, trouvée 1352.6521. Composé 25 A une solution de composé 24 (21,1 mg, 15,6 'mol) dans de l'acétonitrile (2,11 mL) a été ajouté 30 une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium 1 M (156 gL, 156 'mol). La solution a été agitée à TA pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient B) et a conduit au composé 25 (9,4 mg, 45%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C75H86N7015 [M+H]+, m/z 1324.6182, trouvée 1324.6185. HPLC (gradient A) Tr = 35 13.95 min. Composé 26a A une solution du composé 25 (34 mg, 25,7 'mol) dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1275 g) ont été ajouté de la taurine (12,85 mg, 102,7 'mol), de la diisopropyléthylamine (26,4 gL, 19,9 mg, 154 'mol) et enfin du HATU (39 mg, 102,7 'mol). La solution a été agitée à TA pendant 40 min. 40 L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction 168.9, 159.1, 158.49, 158.45, 158.4, 157.8, 156.0, 133.43, 133.41, 132.0, 131.7, 123.0, 122.97, 122.8, 115.8, 114.6, 114.4, 114.3, 92.9, 92.4, 86.6, 86.4, 81.1, 79.2, 65.7, 65.0, 60.3, 60.2, 60.1, 59.0, 58.7, 52.3, 37.7, 29.4, 28.4, 28.2. HRMS (ESI+) : calculée pour C77H90N7015 [M+H]+, m/z 3045053 30 était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient C) et a conduit au composé 26a (30 mg, 76%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C79H97N9019S2 [M+2H]2+, m/z 769.8171, trouvée 769.8166. HPLC (gradient A) Tr= 11.33 min. Composé 26b 5 Le 3-((2-aminoéthyl)diméthylammonio)propane-1-sulfonate a été préparé selon la procédure décrite dans WO 2011/146595 et dans Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 1883-1895. A une solution du composé 25 (15 mg, 11,3 'mol) dans du diméthylsulfoxyde anhydre (562 g) ont été ajouté du 3-((2-aminoéthyl)diméthylammonio)propane-1-sulfonate (15 mg, 71,58 'mol), de la DIPEA (11,6 gL, 8,8 mg, 67,9 'mol) et enfin du HATU (17,2 mg, 45,3 'mol). La solution a été 10 agitée à TA pendant 10 min. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient D) et a conduit au composé 26b (11.6 mg, 60%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C89H119N11019S2 [M+2H]2+, m/z 854.9062, trouvée 854.9054. HPLC (gradient A) Tr= 11.14 min. 15 Composé 26c A une solution du composé 25 (15 mg, 11,3 'mol) dans du diméthylsulfoxyde anhydre (562 g) ont été ajouté de la glucosamine (9,77 mg, 45,3 'mol), de la DIPEA (11,6 gL, 8,8 mg, 67,9 'mol) et enfin du HATU (17,2 mg, 45,3 'mol). La solution a été agitée à TA pendant 10 min. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. La 20 solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient D) et a conduit au composé 26c (16,3 mg, 87%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C87H108N9023 [M+H]+, m/z 1646.7558, trouvée 1646.7558. HPLC (gradient A) Tr= 11.62 min. Complexes Cie - C2a Au composé 26a (30 mg, 19,5 'mol) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (500 gL). La solution a 25 été agitée à TA pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été divisé en deux parties. Une partie a été utilisée pour la préparation du complexe d'europium Cie et l'autre partie pour la préparation du complexe de terbium C2a. Cie 30 Au résidu (22,2 mg, 18 'mol) ont été ajouté de l'eau (6 mL), de l'acétonitrile (2 mL) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir une solution pH 7. A cette solution ont été ajouté du chlorure d'europium (26,4 mg, 72 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution 35 a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient F) et a conduit au complexe Cie (9,7 mg, 38%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C62H63N9O17S2Eu [M]3+, m/z 473.4322, trouvée 473.4319. HPLC (gradient E). C2a Au résidu obtenu lors de la première étape (1,9 mg, 1,5 'mol) ont été ajoutés de l'eau (375 gL), du 40 chlorure de terbium (2,24 mg, 6 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin 3045053 31 d'obtenir une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient G) et a conduit au complexe C2a (107 4, 5%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C62H63N9017S2Tb 5 [M+311]3+, m/z 476.1012, trouvée 476.1005. HPLC (gradient E). Complexes Cl b - C2b Au composé 26b (11,6 mg, 7 'mol) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (250 gL). La solution a été agitée à TA pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le 10 résidu a été divisé en deux parties. Une partie a été utilisée pour la préparation du complexe d'europium Clb et l'autre partie pour la préparation du complexe de terbium C2b. Cl b Au résidu obtenu précédemment (7,9 mg, 5,5 'mol) ont été ajoutés de l'eau (3,15 mL), du chlorure d'europium (8,1 mg, 22 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir 15 une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient F) et a conduit au complexe Clb (3.58 mg, 41%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C72H831\111017S2Eu [M+H]3+, m/z 530.1540, trouvée 530.1580. HPLC (gradient E) Tr = 8.56 et 8.81 min (mélange 20 d'isomères 58%-42%). C2b Au résidu obtenu lors de la première étape (2,2 mg, 1,5 'mol) ont été ajoutés de l'eau (857 gL), du chlorure de terbium (2,24 mg, 6 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la 25 réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient G) et a conduit au complexe C2b (231 4, 10%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C72H851\111017S2Tb [M+3H]3+, m/z 532.8273, trouvée 532.8268. HPLC (gradient E) Tr = 8.71 et 8.94 min (mélange d'isomères 35%-65%). 30 Complexes Cl c - C2c Au composé 26c (16,3 mg, 11,8 'mol) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (250 gL). La solution a été agitée à TA pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient A). Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu ont été ajoutés de l'eau (4 mL) et une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 3 M pour 35 obtenir une solution pH 7. Cette solution a été divisée en deux parties. Une partie a été utilisée pour la préparation du complexe d'europium Clc et l'autre partie pour la préparation du complexe de terbium C2c. Cl c A la solution obtenue précédemment (16,3 mg, 11,8 gmol, 3,5 mL), ont été ajoutés du chlorure 40 d'europium (15,1 mg, 41,2 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir 3045053 32 une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient F) et a conduit au complexe Clc (3,25 mg, 18%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C701-172N9021Eu [M+]2+, 5 m/z 763.7027, trouvée 763.7093. HPLC (gradient E) Tr= 8.68 min. C2c A la solution obtenue précédemment (2,1 mg, 1,5 gmol, 508 gL), ont été ajoutés de l'eau (508 gL), du chlorure de terbium (2,24 mg, 6 'mol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d'obtenir une solution pH 6. La solution a été agitée à TA pendant une nuit. L'avancement de la 10 réaction a été suivi par LC-MS (gradient E). Après cette période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient G) et a conduit au complexe C2c (184 4, 8%) identifié comme le composé souhaité. HRMS (ESI+) : calculée pour C70H74N9O21Tb [M+2H]2+, m/z 767.7126, trouvée 767.7141. HPLC (gradient E) Tr = 8.30 et 8.78 min (mélange d'isomères 25%-75%). 15 Cl a-maléimide Au complexe de pyridinophane C1a (0,56 mg, 400 nmol) ont été ajouté une solution d'hexanoate 6-((éta-maléimidopropionamido) de succinimidyle) (0,23 mg, 600 nmol) dans du DMF anhydre (50 ptL) et de la DIFFA (0,2 gL, 155 lig, 1,2 gmol). Le mélange a été agité à TA pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E) Tr = 10.64 min. Après cette 20 période, la réaction était totale. La solution a été directement purifiée par HPLC préparative (gradient H) et a conduit au complexe Cla-maleimide (353 4, 210 nmol, 52%) identifié comme le composé souhaité. LRMS (ESI+) : calculée pour C75H771\111021S2Eu [M+H]+, m/z 1684.3933, trouvée 1684.65. HPLC (gradient E) Tr= 10.64 min. Cl a-CAMP 25 Au CAMP-Glu-acide (0,25 mg, 400 nmol) ont été ajoutés du TSTU (0,13 mg, 440 nmol) en solution dans du DMF anhydre (50 g) et de la DIPEA (0,1 gL, 77,5 4, 600 nmol). Le mélange a été agité à TA pendant 1 h. Puis à cette solution a été ajouté le complexe Cla (0,28 mg, 200 nmol) en solution dans du tampon phosphate 50 mM pH 7 (350 gL). L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS (gradient E) Tr = 9,1 min. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été 30 directement purifiée par HPLC préparative (gradient H) et a conduit au complexe Cla-CAMP (303 4, 150 nmol, 75%) identifié comme le composé souhaité. LRMS (ESI+) : calculée pour C84H92N16O28PS2Eu [M+2H]2+, m/z 1010.2329, trouvée 1010.89. HPLC (gradient E) Tr= 9.1 min. Composé 27 : disponible commercialement. Composé 28 : Le composé 28 a été préparé selon la procédure décrite dans EP-A-533131. 35 Composé 29 A une suspension du composé 28 (2,6 g, 13,4 mmol) dans du chloroforme (265 mL) a été ajouté de la triphénylphosphine (4,2 g, 16,1 mmol). Le mélange a été agité à TA jusqu'à totale dissolution (30 min). A cette solution a été ajouté du tétrachlorure de carbone (37 mL) et le mélange a été agité pendant 20 h à TA. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la 40 réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par 3045053 33 chromatographie sur colonne de silice en utilisant une éluant cyclohexane - acétate d'éthyle 3/7 pour conduire au composé souhaité (0,8 g, 28%) RMN 1H (CDC13, 300 MHz) b 7.96 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.74 (s, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.45 (s11H). Composé 30 : A une suspension de composé 29 (0,8 g, 3,7 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre 5 (15 mL) ont été additionnés du carbonate de sodium (1,25 g, 11,8 mmol) et l'amine 18 (250 III_ 1,85 mmol). Le mélange hétérogène a été chauffé à reflux pendant 20 h puis refroidi à TA. A ce mélange ont été additionnés une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (20 mL), de l'eau (15 mL) puis du DCM (50 mL). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du DCM (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de 10 sodium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant DCM - Me0H 97/3 jusqu'à 90/10 par incrément de 1% pour conduire au composé 30 (0,6 g, 66%). RMN 1H RMN (CDC13, 300 MHz) 7.97 (s, 2H), 7.67 (s, 2H), 4.82 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.12 (s, 4H), 4.02 (s, 2H), 3.98 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 1.53 (s, 9H). 15 Composé 31 A une solution de composé diol 30 (50 mg, 102 'mol) dans du DCM (2 mL) ont été additionné de l'iodure de potassium (7 mg, 42,5 'mol) et de l'oxyde d'argent (71 mg, 306 'mol). A ce mélange refroidi à -20°C sous atmosphère inerte a été additionné du TsCI (39 mg, 204 'mol). La solution a été réchauffée à TA puis agitée sous atmosphère inerte pendant 20 h. Après cette période, le 20 mélange réactionnel a été purifié directement par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un mélange d'éluant dichlorométhane - acétate d'éthyle 90/10 pour conduire au dérivé ditosylé 31 sous forme d'une huile incolore (57 mg, 71%). RMN 1H (CDC13) : b 1,46 (s, 9H) ; 2,42 (s, 6H) ; 3,33 (s, 2H) ; 3,94 (s, 6H) ; 3,96 (s, 4H) ; 5,13 (s, 4H) ; 7,31-7,33 (d, 4H,J = 8,1 Hz); 7,75 (s,2H); 7,807,83 (d, 4H,J = 8,4 Hz); 7,96 (s, 2H). RMN 130 (0D013): ô = 21,7; 28,2; 52,8; 59,4; 56,1; 71,3; 81,4; 25 119,3; 122,1; 128,1; 129,9; 132,7; 138,9; 145,2; 154,4; 160,4; 165,3; 170,1. MS (ES+): m/z= 798,5 [M+Hl (100%). REVENDICATIONS1. Agent complexant de formule (I) Al R1 A2 A3 (I) dans laquelle : les groupes R1 sont identiques et sont choisis parmi : -COOH, -PO(OH)R, R étant choisi parmi les groupes: phényle, phényle substitué par un groupe -SO3H, de préférence en position ortho ou para, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; les groupes Al, A2 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : un groupe de formule ; un groupe de formule (II) ou (II') ; le groupe A3 est choisi parmi : un groupe de formule -O-L3-G, un groupe de formule (II), (II'), (III) ou (III') ; O-L2-E O-L3-G H3C0 H3CO (III) L1, L2 et L3 sont identiques ou différents et représentent un groupe de liaison divalent ; E est un groupe augmentant l'hydrosolubilité de l'agent complexant, choisi parmi : -SO3H, -PO(OH)2, -CO2H, -N+Alk1Alk2A1k3, un résidu carbohydrate; une sulfobétaïne ; un groupe PEG ; G est un groupe réactif ; Alki, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1-C6)alkyle. 2. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques et sont un groupe de formule (II) et A3 est un groupe de formule (III). 3045053 35 3. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al est un groupe de formule (II), A2 est un groupe -1_1-E et A3 est un groupe de formule (III). 4. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques 5 et sont des groupes de formule (II), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. 5. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L1-E et A3 est un groupe de formule (III). 10 6. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II') et A3 est un groupe de formule (III'). 7. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al est un groupe de formule (II'), A2 est un groupe -L-E et A3 est un groupe de formule (III'). 15 8. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II'), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. 9. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que Al et A2 sont identiques 20 et sont des groupes de formule -L1-E et A3 est un groupe de formule (III'). 10. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce le groupe réactif G est choisi parmi : un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide 25 carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule : 3045053 36 0 _(CH2)- NCS NH/ w 0 ,CH2)-NH2 NH 0 ,i4CH2)-NCO NH/ O `...'4CF12)-N3 NH /v 0 1\in v 0 ',i4CH2)-S-S-Ar NH/ w 0 O O ,(LNEMCH2),TvNHAr /v -1\1 v 0 NCS O NCO -LNHyCH eNH /v 0 NIICH2 0 CH2 LNI-1\)4 /v CI 0 H N=( N,_,,cH2,_N_,, ,N w Iv N-( CI O N CH2 I-1 w v 0 'LNH)4CE12hr 0 Ci' 0 S03- dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 5 11. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les bras d'espacement L1, L2 et L3, lorsqu'ils sont présents, sont choisis parmi : un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; 10 un groupe cycloalkylène en C5-08 ou un groupe arylène en C6-014, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-08, aryle en 06- 15 014, sulfonate ou oxo ; - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : 3045053 37 - (cH2),- (c1-12)n-0-(cH2),,0-(c1-12) , 0 0 - (CH2)n-0-(CH2)n70-(CH2)p H N 11 (C1-12)q H H - (CH2),-N (CI-126 (CH2)n N (C1--12)rr " O 11 (CF-1 -N - (CH2)n N 2)m - (cH2)p- ; 0 O II H S - (CH2)n N (CH2)m (CF-12)p- ; 0 -(cH2)n (c1-12), ; -(CH2)n (CH2)n- - (CH2)p- ; H H 011 - (CH2)n-N- (C1-12)n-N- (C1-12) - (CE12)n- 0 11 11 -(CH2)n N (C1-12) O , N (C1-12)n- ; dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 5 12. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe -L3-G, lorsqu'il est présent, est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une amine, de préférence une amine aliphatique, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, et d'un bras d'espacement L3 constitué d'un groupe alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. 10 3045053 38 13. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que L1, lorsqu'il est présent, est un groupe divalent de formule : O C NH CH2 5 où n est un nombre entier de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 14. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que L2, lorsqu'il est présent, est un groupe divalent de formule : 0 NH-ECH2)71 où n et m sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 15. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que L3, lorsqu'il est présent, est un groupe divalent de formule : -(CH2) n où n est un nombre entier de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 16. Complexe de lanthanide fluorescent comprenant un agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes et un lanthanide choisi parmi : Eu3+, Sm3+, Tb3+. 17. Complexe de lanthanide fluorescent de formule (IV), (V) ou (VI) suivante : R3 10 15 20 3045053 39 0R3 -02C N CO2- R3 (V) 0R3 o- 5 dans lesquelles : Ln3+ est choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Sm3+ ; R3 est choisi parmi les groupes suivants : OH ; HO H H OH H . 3- 'S 03- NH ,N Nt- `?-1,! SO . - 'Ill_ ; 10 18. Conjugué fluorescent d'une molécule d'intérêt obtenu par la mise en contact d'un complexe de lanthanide selon les revendication 16 ou 17, ledit complexe comprenant un groupe réactif G, avec une molécule d'intérêt. OH