FR 3044516 A1 20170609 FR 1561886 A 20151204 1 Modèle animal de tumeur et son procédé de préparation La présente invention concerne l'obtention d'un modèle de tumeur, par exemple hépatique, sur animaux de taille moyenne (compatibles avec des études chirurgicales, notamment lapin et porc), pouvant être immunocompétents et non-syngéniques. Ce modèle permettra notamment de tester de nouveaux raisonnements diagnostiques, médicaux et/ou chirurgicaux dans le cadre de la prise en charge des cancers. L'invention concerne aussi la production de lignées cellulaires transformées issues d'un organe de ces animaux susceptibles, après greffage, de former des tumeurs in vivo chez un animal de la même espèce. Les tumeurs hépatiques (primitives et métastatiques) constituent un problème majeur de santé publique. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer primitif du foie le plus fréquent. Il s'agit du sixième cancer en termes d'incidence dans le Monde et du 2ème en termes de mortalité par cancer. Son incidence croît en raison de l'endémie virale C. Son mauvais pronostic est dû à un diagnostic souvent tardif à un stade où la tumeur est inopérable en raison d'une dissémination intra-ou extra -hépatique. Le cancer colorectal est très fréquent dans les pays occidentaux, le plus souvent en rapport avec une atteinte tumorale métastatique hépatique. Le foie est le premier site de récidive chez plus de 40% des malades. Le traitement des métastases hépatiques repose principalement sur l'exérèse chirurgicale mais celle-ci n'est praticable d'emblée que pour 15% des patients. Elle permet d'espérer une survie à 5 ans de 25 à 45%.Pour les patients porteurs de métastases non opérables, la chimiothérapie et les traitements par destruction focalisée (Radiofréquence, Micro-ondes, Cryothérapie, etc.) permettent d'augmenter la survie. Actuellement les modèles animaux utilisés dans la recherche sur l'hépatocarcinome sont pour la majorité des modèles transgéniques de souris ainsi que des modèles de xénogreffes (huh7, HepG2, SK-Hep, etc.) en sous cutané ou orthotopiques. Dans les modèles non rongeurs, on peut citer le modèle VX2 qui est largement utilisé et reconnu comme modèle de tumeur hépatique. Il s'agit d'un carcinome épidermoïde d'origine cutanée qui est peu caractérisé et standardisé. Pour le cancer du pancréas, les modèles animaux existant à ce jour sont essentiellement des modèles de souris PDX (Patient Derived Xenograft) ou encore des souris transgéniques qui miment fidèlement la pathologie humaine et à ce titre sont très utiles pour la compréhension des mécanismes de la maladie. Cependant, comme pour le cancer hépatique, la taille de ces modèles limite considérablement le développement de nouveaux traitements (chirurgie, dispositif médicaux, thérapies multimodales) et l'évaluation 3044516 2 de nouveaux outils diagnostics (imagerie notamment). De plus les modèles PDX sont des modèles sous cutanés et ne permettent pas une standardisation des études. Dans le cancer colorectal, la majorité des modèles animaux disponibles sont des modèles rongeurs soit induits soit obtenus suite à une mutation génétique (souris Apc et rats 5 Pirc). Les modèles induits sont soit avec un régime alimentaire particulier (western diet mice models), soit après une induction chimique (DMH ou AOM, PhiP, MNNG et MNU) chez les rats et les souris. Une autre catégorie de modèles rongeurs est la catégorie de souris transgéniques pour laquelle on retrouve plus de 13 modèles bien identifiés. A la marge de ces modèles rongeurs, on trouve également les modèles du chien ou du mouton mais qui 10 sont très limités car ils présentent un faible taux d'incidence ( 0,15 mm2) sont comptées. Les colonies macroscopiques formées dans le milieu semi-solide sont isolées, trypsinées et réensemencées pour remise en culture, puis à nouveau ensemencées sur un milieu agar pour former de nouvelles colonies. Les cellules donnant des colonies en agar 10 mou sont dites "transformées". On peut également, ou en plus, vérifier la caractère transformé et tumorigène par un test in vivo. On peut le faire sur animal immunodéprimé: lapin ou porc (voir exemples), ou plus simplement sur souris. On peut travailler en deux passages sur un modèle de souris immunodéficientes sévères (absence de lympocytes B et T et de NK). Les cellules sont 15 injectées en sous-cutané chez la souris, par exemple souris « Shorn » SHrN, qui est issue d'un croisement de souris NOD.SCID et « hairless ». Les souris sont suivies toutes les semaines pour suivre la formation de la tumeur. Les tumeurs sont mesurées et photographiées à partir de leur apparition. Avant l'atteinte du point limite de la taille de tumeur, les animaux sont euthanasiés et les tumeurs prélevées. Des fragments tumoraux 20 sont découpés et réimplantés sur une autre série de souris. On peut aussi travailler sur un modèle de souris Nude Athymic qui est moins immunodéficiente que la souris SHrN et qui présente uniquement une déficience en lymphocyte T. La procédure est identique à celle réalisée sur souris SHrN. 25 En outre, les cellules tumorales peuvent intégrer un ou des « gènes rapporteurs » qui, soit par fluorescence, soit par sécrétion d'une molécule spécifique dosable dans le sang périphérique, permet un suivi non invasif de la croissance tumorale. Dans un mode de réalisation, les cellules sont des hépatocytes, notamment des hépatocytes primaires. Ce sont des hépatocytes de lapin si l'animal est un lapin, et de porc si 30 l'animal est le porc. La tumeur est alors localisée dans le foie de l'animal objet de l'invention. Il peut y avoir plusieurs tumeurs ou nodules tumoraux, par exemple de 2 à 5. Dans ces cellules, l'expression des transgènes peut être confirmée comme décrit ci- dessus. Par ailleurs, l'expression de gènes hépatocytaires peut aussi être contrôlée ou mesurée par toute méthode connue. A titre d'exemple, on peut mesurer l'expression des 35 gènes albumine et/ou alpha-foetoprotéine. Cette mesure peut être réalisée par une RT-PCR Quantitative en temps réel (iQRT-PCR), notamment avec un Light Cycler 480 (Roche) en utilisant un kit QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen). Les niveaux d'expression des gènes 3044516 6 peuvent être déterminés en utilisant la méthode Cycle Treshold (Ct) avec le gène 18S comme gène de ménage. Dans un mode de réalisation, les cellules hépatocytaires transformées ont un niveau d'expression du gène albumine inférieur ou égal à 100, notamment à 50, calculé par le 5 nombre de copies d'ARNm du gène albumine rapporté au nombre de copies d'ARN ribosomal 18S. Dans un mode de réalisation, les cellules hépatocytaires transformées ont un niveau d'expression du gène alpha-foetoprotéine inférieur ou égal à 1, notamment à 0,5, calculé par le nombre de copies d'ARNm du gène alpha-foetoprotéine rapporté au nombre de copies 10 d'ARN ribosomal 18S. Dans un mode de réalisation, les cellules hépatocytaires cumulent les deux caractéristiques d'expression concernant les gènes albumine et alpha-foetoprotéine. On peut également contrôler la génération d'une tumeur ad hoc dans l'animal modèle, par des techniques d'imagerie, par exemple par échographie pour déterminer 15 notamment le nombre et la taille des tumeurs présentes dans l'organe, ou par l'imagerie IRM (notamment IRM avec séquences T1 et T2 et injection intraveineuse (IV) de gadolinium), permettant de caractériser le type de tumeur générée. Des exemples de mise en oeuvre sont présents plus loin. Dans un autre mode de réalisation, les cellules sont des cellules épithéliales du 20 colon. Ce sont des cellules de lapin si l'animal est un lapin, et de porc si l'animal est le porc. La tumeur est localisée sur ou dans la paroi interne du colon de l'animal objet de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, les cellules sont des cellules pancréatiques acineuses exocrines. Ce sont des cellules de porc si l'animal est le porc. La tumeur est localisée dans le pancréas (intra-pancréatique) de l'animal objet de l'invention. 25 Un autre objet de l'invention est une méthode de préparation d'une lignée immortalisée et transformée de cellules d'un organe de mammifère non humain, notamment lapin ou porc. Le procédé comprend notamment les étapes suivantes : Prélèvement de cellules déterminées à partir d'un organe cible chez un 30 mammifère sain, ou disposer de cellules déterminées qui ont été préalablement prélevées à partir d'un organe cible chez un mammifère sain ; Mise en culture des cellules Transduction des cellules par des vecteurs lentiviraux, codant pour un ou plusieurs oncogènes, comme décrit supra ; les oncogènes peuvent notamment 35 comprendre T et t de SV40 et H-RasV12 Récolte des cellules immortalisées et transformées. 3044516 7 Le procédé peut aussi comprendre un contrôle de l'expression des transgènes et/ou de marqueurs, notamment de gènes, des cellules de l'organe, comme décrit par ailleurs ici. Le procédé peut aussi comprendre le contrôle de l'immortalisation des cellules et/ou du caractère transformé et tumorigène, comme décrit par ailleurs ici. 5 Dans un mode de réalisation, le procédé comprend le prélèvement d'hépatocytes. Le prélèvement comprend la découpe d'un fragment ou tranche du parenchyme hépatique. Le prélèvement subit une dissociation des cellules, notamment par perfusion par la collagénase, puis une récupération des cellules, notamment par centrifugation, par exemple en Ficoll, ce qui permet d'isoler les cellules hépatocytaires. Ces cellules peuvent être ensuite cultivées 10 pendant plusieurs jours sans sérum de veau foetal afin d'éliminer les cellules non hépatocytaires, notamment les fibroblastes et les cellules endothéliales contaminants. On récolte à la fin une culture substantiellement pure d'hépatocytes Les lentivirus, par exemple provenant du VIH-1 (notamment pLentiV6 d'Invitrogen) (dans les lesquels ont été introduits les différents oncogènes retenus (SV4OLT+ST, H-Rasv12, 15 etc.) peuvent être produits dans des cellules appropriées, telles que les cellules 293FT (Invitrogen) comme déjà décrit. Les cellules, par exemple les hépatocytes primaires sont transduits par chaque type de lentivirus, puis sélectionnées par exemple par antibiotique grâce à un gène de résistance incorporé dans le transgène, comme précédemment décrit. Les clones immortalisés et transformés in vitro peuvent être sélectionnés par 1 ou 20 plusieurs, par exemple 2, passages en agar mou, entrecoupés de phase d'expansion en culture cellulaire. La tumorigénicité in vivo des clones est confirmée sur souris, lapin ou porc immunodéprimé, notamment par injection sous-cutanée et/ou implantées de manière orthotopique dans l'organe cible, ce qui est le test de référence. 25 Les clones retenus comme immortels, transformés et tumorigènes forment les lignées cellulaires, qui sont aussi un objet de l'invention. L'invention a aussi pour objet un procédé de production d'un animal modèle selon l'invention. 30 Selon une première modalité, ce procédé peut comporter l'introduction, notamment l'injection, l'implantation ou la greffe, orthotopique dans l'organe de l'animal de cellules issues d'un organe d'un animal de la même espèce, cellules qui sont immortelles et transformées, cet organe pouvant être par exemple le foie, le colon ou le pancréas. Les cellules ont été immortalisées et transformées par introduction in vitro d'un ou plusieurs 35 oncogènes, comme décrit par ailleurs ici. Le procédé peut comprendre la préparation de cellules immortelles et transformées, selon la méthode décrite ici, ou l'utilisation de cellules 3044516 8 immortalisées et transformées, contenant un ou plusieurs oncogènes. L'animal injecté, implanté ou greffé peut être sous traitement immunosuppresseur ou non. Des tumeurs peuvent être produites chez la souris ou directement chez l'animal cible par injection des cellules, soit en sous-cutané, soit dans l'organe cible. Les tumeurs formées 5 peuvent être prélevées, ou des biopsies peuvent être prélevées, éventuellement congelées pour conservation. Ou l'animal peut être utilisé tel quel comme modèle. Selon une deuxième modalité, ce procédé peut comporter l'implantation ou la greffe orthotopique dans l'organe de l'animal d'une tumeur ou d'un fragment de tumeur prélevé sur un animal de le même espèce qui a développé cette tumeur suite à l'injection, l'implantation 10 ou la greffe orthotopique des cellules issues d'un organe d'un animal de la même espèce, cellules qui sont immortelles et transformées, cet organe pouvant être par exemple le foie, le colon ou le pancréas. Cet animal donneur a pu notamment être traité par le procédé qui vient d'être décrit comme première modalité. L'animal implanté ou greffé peut être sous traitement immunosuppresseur ou non. 15 Des fragments de tumeur peuvent être implantés dans l'organe cible chez l'animal, lapin ou porc notamment. Suivant une modalité, l'animal est prêt comme modèle dès lors que la ou les tumeurs ont atteint un volume, poids ou dimensions déterminé. Suivant une autre modalité, le modèle intègre la croissance tumorale et le modèle est prêt dès l'injection ou implantation réalisée, 20 ou peu après. La présente invention a aussi pour objet un tel animal mammifère non humain, de préférence choisi parmi lapin et porc, porteur d'une tumeur résultant de l'introduction orthotopique de cellules immortalisées, transformées et tumorigènes issues d'un organe d'un 25 animal de la même espèce, lesdites cellules intégrant un ou plusieurs oncogènes, pour utilisation pour tester et développer de nouveaux raisonnements diagnostiques, médicaux et/ou chirurgicaux pour le traitement et la destruction de tumeurs solides (primitives ou métastatiques), notamment hépatiques, pancréatiques et colorectales: Cet animal peut notamment être utilisé pour : 30 - servir de modèle en chirurgie du cancer, notamment pour l'entraînement du chirurgien ou la mise au point d'un protocole de résection ou exérèse tumorale ; - servir de modèle de chimiothérapie ; - servir de modèle pour la destruction focalisée de la tumeur, par exemple par radiofréquence, micro-ondes et/ou cryothérapie, etc. ; 35 - servir de modèle pour la radiothérapie externe à haute dose (conformationnelle ou stéréotaxique) ; - servir de modèle à la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale ; 3044516 9 - servir de modèle à la chimioembolisation ou à la radioembolisation intra-artérielle hépatique ; - servir de modèle pour le développement de techniques ou de méthodes d'imagerie, par exemple utilisation de produits de contraste, de caméra proche infra-rouge, etc. ; 5 - servir de modèle d'étude de l'interaction de la tumeur avec son microenvironnement, les relations entre développement tumoral et immunités, etc. La présente invention a aussi pour objet les méthodes mettant en oeuvre ces modèles, pour réaliser les actes de développement et de recherche ci-dessus. Les animaux modèles sont sacrifiés après utilisation, conformément aux bonnes 10 pratiques. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs. Exemple 1 : préparation et obtention d'hépatocytes immortalisés et transformés. 15 METHODOLOGIE Culture cellulaire et transduction lentivirale Des hépatocytes primaires de porc (PPH) et de lapin (PRH) ont été isolés à partir de foies fraîchement réséqués chirurgicalement chez un porc et un lapin sain. Le parenchyme hépatique a subi la méthode en deux étapes de perfusion par la collagénase (0,05%, Sigma- 20 Aldrich C5138). La coupe hépatique est d'abord perfusée avec du tampon Hépes (étape de rinçage et décoloration), puis avec du tampon Hépes + CaC12 + collagénase (étape de digestion enzymatique), ce qui conduit à la libération d'hépatocytes primaires du foie, récupérés par filtration, puis lavés, avant d'être ensemencées à confluence dans des puits au fond desquels est fixé du collagène [Gripon 1993, Virology, 192 : 534-540]. Les cellules 25 ont été maintenues pendant 3 jours dans du milieu de William dépourvu de FCS (Fetal CaIf Serum) supplémenté avec 100 U/ml de pénicilline G, 100 pg/ml de streptomycine, 5 pg/ml d'insuline, et 5.10-5M hémisuccinate d'hydrocortisone, puis cultivées dans du milieu complet de William avec 10% de FCS et 1,8% de DMSO. Les lentivirus codant pour H-Rasv12 humain et SV40sT±LT ont été produits dans des 30 cellules 293FT (Invitrogen). Les PRH et les PPH ont été transduits par chaque lentivirus avec une multiplicité d'infection égal à un (MOI-1) dans un milieu contenant 6 pg/ml de polybrène. Les cellules ont été sélectionnées (gènes de résistance à la généticine et blasticidine) avec 300µg/m1 de généticine (pour le lentivirus SV40sT±LT) et/ou 3pg/mL de blasticidine (pour le lentivirus H-Ras12v). Des particules lentivirales contenant le vecteur vide 35 (EV) ont été utilisées comme contrôles. Contrôle de l'expression des transgènes 3044516 10 Pour vérifier l'expression des transgènes SV40 et H-Ras, la liste des anticorps utilisés est la suivante : SV4OLT±sT(sc58665 SantaCruz); RAS (SC520, SantaCruz); [3-actine (A1978, Sigma). Anticorps secondaires : chèvre anti-lapin conjugué à HRP et anti-souris de chèvre (BioRad). Tous les produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma, sauf indication 5 contraire. Les protéines ont été extraites à l'aide de tampon RIPA [50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate de sodium, 0.1% SDS, 1mM Na3VO4, protease cocktail inhibitor (Roche)] et la concentration en protéine a été déterminée en utilisant le dosage BCA (Pierce). Les extraits de cellules ont été traités par SDS-PAGE, marqués avec un anticorps primaire spécifique et révélés avec le système de 10 chimioluminescence amplifiée (Amersham). Les blots ont été normalisés pour une charge égale en protéines avec coloration [3-actine . Des Western blot ont montré l'expression des transgènes SV40 et H-Ras dans les clones de PPH ou PRH transformés in vitro, c'est-à-dire ayant donné des colonies en agar mou. Expression de gènes hépatocytaires 15 L'ARN cellulaire total a été extrait en utilisant le kit d'extraction Extract-all (Eurobio) selon les instructions du fabricant. Environ 1µg d'ARN total a été digéré par de la DNAse I (Roche), puis a subi une transcription reverse avec des amorces aléatoires et la transcriptase reverse MMLV-RT (Life technologies). Une PCR Quantitative en temps réel (qPCR) a été effectuée avec un Light Cycler 480 (Roche) en utilisant un kit QuantiFast 20 SYBR Green PCR (Qiagen). Les niveaux d'expression des gènes ont été déterminés en utilisant la méthode Ct avec le gène 18S comme gène de ménage (Tableau 1). Chaque expérience a été réalisée trois fois en triplicata. Valeur Valept a! bitraire-6443 R H I 9 , / 7459 'Win 'ut vI12 0,28 sv40 rat, Isv40 ras b 0,12 t,v40 ras 6C: ALBUMINE PR H ;met. pin ràs Ga sv40 ras 6b P P H sv40 rais sv40 ras 2 b p v40 las Pph sv40 ras 2a. 70o sv40 SV40 0.03 Table 1. Niveau d'expression de gènes hépatocytaires (albumine et alpha- 25 foetoprotéine), mesuré par RT-PCR quantitative en temps réel. La valeur arbitraire représente le nombre de copies d'ARNm du gène d'intérêt rapporté au nombre de copie du gène de ménage choisi, c'est-à-dire ARN ribosomal 18S dans cette expérience. VH2 représente la tumeur PRH SV40 Ras ayant poussé chez le lapin. Les clones testés sont, 3044516 11 pour les hépatocytes de porc, PPH2A, PPH2B et PPH2C, et, pour le lapin, PRH6A, PRH6B et PRH6C, intégrant H-RasV12 humain et SV40sT±LT. Test de transformation in vitro: croissance en agar mou et isolement des colonies 5 5.103 PRH-SV40/H-Ras ou PPH-SV40/H-Ras cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 6 cm avec un milieu de culture contenant 0,35% d'agar (Noble), sur un milieu de culture contenant 0,7% d'agar. Le milieu liquide était renouvelé tous les 5 jours et les cultures ont été maintenues pendant 4 semaines et les colonies macroscopiques (> 0,15 mm de diamètre) ont été comptées. Pour l'isolement des colonies en agar mou, les colonies 10 macroscopiques formées dans le milieu semi-solide ont été isolées, trypsinées et réensemencées pour remise en culture. PPH- ou PRH-SV40/H-Ras donnent des colonies en agar mou, traduisant leur transformation in vitro. Test de tumorigénicité in vivo Des clones issus de PRH- ou PPH-SV40/HRas ayant donné 2 fois des colonies en 15 agar mou après sous-culture entre chaque test en agar mou, ont été amplifiés en culture in vitro afin de réaliser les tests de tumorigénicité in vivo. Exemple 2: passage in vivo démontrant la tumorigénicité des lignées cellulaires issues de la transformation des hépatocytes de porc et de lapin. 20 A partir des 2 lignées cellulaires transformées obtenues (1 lignée porc et une lignée lapin), plusieurs clones ont pu être identifiés par passages successifs en Agar mou. Les 6 clones donnant les plus grosses colonies en agar mou ont été sélectionnés (3 lignées pour le porc et 3 lignées pour le lapin) pour les étapes in vivo. Exemple 2.1 Souris 25 La première étape a été réalisée chez la souris immunodéficiente afin de s'assurer de la tumorigénicité in vivo des clones sélectionnés et s'est décomposée en 2 phases successives. La première phase a été réalisée sur un modèle de souris immunodéficientes sévères (absence de lympocytes B et T et de NK). 30 Les 6 lignées retenues ont été injectées en sous cutanée chez la souris « Shorn » SHrN, qui est issue d'un croisement de souris NOD.SCID et hairless. Les souris ont été suivies toutes les semaines pour suivre la formation de la tumeur. Les tumeurs ont été mesurées et photographiées à partir de leur apparition. Avant l'atteinte du point limite de la taille de tumeur, les animaux ont été euthanasiés et les tumeurs ont été prélevées. Des 35 fragments tumoraux ont été découpés et réimplantés sur une autre série de souris. Cette étape a nécessité l'utilisation de 12 souris SHrN (2 passages). 3044516 12 La deuxième phase a été réalisée sur le modèle de souris Nude Athymic qui est moins immunodéficiente que la souris SHrN et qui présente uniquement une déficience en lymphocyte T. Les 6 lignées cellulaires ont été injectées de la même façon jusqu'à obtention de tumeur. La procédure ensuite a été identique à celle réalisée sur souris SHrN. Cette 5 étape a nécessité l'utilisation de 18 souris Nude Athymic. Exemple 2.2 Lapin La deuxième étape a été réalisée sur le modèle de lapin immunodéprimé. Les 3 lignées cellulaires issues de la transformation d'hépatocytes de lapin ont été injectées en sous cutanée chez les lapins. 10 Les lapins ont été suivis toutes les semaines pour suivre la formation de tumeurs. Les tumeurs ont été ensuite mesurées et photographiées régulièrement. Avant atteinte de la taille limite des tumeurs, les lapins ont été euthanasiés et les tumeurs prélevées. Des fragments tumoraux ont été découpés et réimplantés sur une autre série de lapins immunodéprimés à la fois en sous cutanée et de manière orthotopique dans le foie. Les 15 lapins ont été suivis et une échographie hebdomadaire a été réalisée pour suivre la croissance tumorale dans le foie. A J14 et J28 un scanner ainsi qu'une IRM ont été programmés afin de suivre la progression tumorale. Avant atteinte des points limites, les animaux ont été euthanasiés avec prélèvement des tumeurs. 3 passages ont été ainsi effectués sur des séries de lapins avec des analyses histologiques et moléculaires. Cette 20 étape a nécessité l'utilisation de 6 lapins. Exemple 2.3 Porc La troisième étape est réalisée sur le modèle de porc immunodéprimé. Les 3 lignées cellulaires issues de la transformation d'hépatocytes de porc ont permis d'obtenir des tumeurs chez la souris. Des fragments de ces tumeurs sont implantés en sous 25 cutané au niveau de l'aine ainsi qu'en intrahépatique chez des porcs immunodéprimés. Les animaux sont suivis chaque semaine, une échographie est réalisée. A J14 et J28 un scanner ainsi qu'une IRM sont programmés afin de suivre la progression tumorale. Les animaux sont euthanasiés avant atteinte d'un point limite, les tumeurs obtenues sont prélevées, puis découpées en fragments pour une réimplantation sur une nouvelle série d'animaux. Trois 30 passages sont ainsi effectués avec des analyses histologiques et moléculaires. Cette étape nécessite l'utilisation de 6 porcs. 1. Préparation des fragments Les tumeurs sont prélevées de façon stérile sur les animaux après euthanasie. Des fragments de 20mg (+/-1mg) sont ensuite découpés et pesés stérilement puis placés dans 35 du sérum physiologique à 4°C. Ces fragments sont utilisés pour greffer de nouveaux animaux dans les 30 minutes 2. Souris 3044516 13 - Animaux Il s'agit de souris de souche SHrN ou Athymic Nude femelles de 7 semaines. Elles sont hébergées en l'animalerie conventionnelle en cages par 6 dans des locaux adaptés et climatisés (plage de température 18-22°C). L'hygrorrétrie est régulée entre 45 et 55%. Un 5 cycle d'éclairage 12h/12h est mis en place. Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation d'une durée de 7 jours avant toute intervention. - Anesthésie L'induction de l'anesthésie se fait en boite à induction avec de ('Isoflurane 3%. L'entretien de l'anesthésie se fait au masque (Isoflurane à 2%) 10 - Inoculation des tumeurs en SC (sous-cutané) ^ A partir de cellules Les cellules sont préparées afin d'obtenir des suspensions cellulaires de 5 millions de cellules dans 0,2 ml de PBS. Ces suspensions cellulaires sont injectées sur animal vigile en sous-cutanée au niveau des flancs (deux injections par souris) à l'aide de seringue de 1 ml 15 avec une aiguille 25G. Deux clones différents sont injectés par souris. ^ A partir de fragments Une incision au bistouri de quelques millimètres est réalisée au niveau des flancs, puis une petite loge est créée en sous-cutané à l'aide d'une pince. Le fragment tumoral est ensuite déposé dans la loge qui est refermée par un point en U cutané (Monocryl 5/0). 2 20 clones différents par souris sont implantés au niveau des flancs (1 de chaque côté). - Points limites et euthanasie Les points limites standard retenus sont : diamètre de tumeur supérieur à 17mm, ulcération et/ou nécrose de la tumeur, décubitus permanent, convulsions, anorexie supérieure à 48h. En fin de protocole ou en cas d'atteinte d'un point limite, l'euthanasie sera 25 réalisée par dislocation cervicale sur animal après passage en boite à induction (Isoflurane 30/0). 3. Lapin - Animaux Il s'agit de lapins de race New-Zealand White de 18 semaines (3kg). Ils sont 30 hébergés en cages individuelles dans des locaux adaptés et climatisés (plage de température 18-22°C). L'hygrométrie est régulée ente 45 et 55%. Un cycle d'éclairage 12h/12h est mis en place. Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation d'une durée de 7 jours avant toute intervention. - Immunosuppression 35 Le traitement immunosuppresseur consiste en une injection sous-cutanée quotidienne de Cyclosporine 15mg/kg, au niveau de la nuque du lapin après tonte préalable de la zone. Une prise de sang hebdomadaire est réalisée à la veine marginale de l'oreille 3044516 14 pour dosage du taux de cyclosporine résiduel (avant l'injection quotidienne du traitement) afin de s'assurer de la bonne réponse au traitement. Un taux résiduel supérieur à 200pg/L signe un niveau d'immunosuppression adéquat. Le traitement est mis en place au moins 4 jours avant la greffe. 5 - Anesthésie et analgésie La prémédication intramusculaire des animaux est effectuée un quart d'heure avant le début de l'intervention avec un mélange Kétamine (1mL d'Imalgène 1000 ND) / Xylazine (0.6m1 de Rompun ND). Un cathéter 22G (9.5/10) est mis en place à la veine de l'oreille. L'induction est réalisée par injection IV d'un quart de dose du mélange utilisé pour la 10 prémédication. L'entretien de l'anesthésie est assuré par une injection IV à la demande du même mélange anesthésique (environ un quart de dose par demi-heure). L'analgésie peropératoire est assurée par la valence analgésique de la Kétamine utilisée pour l'anesthésie. L'analgésie post opératoire est assurée par injections SC de 15 mg de Ketoprofène tous les jours. 15 - Inoculation des tumeurs o En SC ^ A partir de cellules Sur animal prémédiqué, la zone des lombes est rasée à la tondeuse, puis des suspensions cellulaires (issues de 3 clones différents) de 10 millions de cellules dans 0,2 ml 20 de sérum (NaCI 0,9%) contenues dans des seringues de 1mL sont injectées en triangle dans la zone des lombes en SC à l'aide d'une aiguille 23G. ^ A de fragments Tout d'abord, tonte et désinfection (Bétadine) du site opératoire. Une incision au bistouri de quelques millimètres est réalisée au niveau des lombes, puis une petite loge est 25 créée en sous-cutané à l'aide d'une pince. Le fragment tumoral est ensuite déposé dans la loge qui est refermée par un point en U cutané (Monocryl 3/0). 3 clones différents sont implantés en triangle dans la zone des lombes pour chaque lapin. o En intra-hépatique Tout d'abord, une tonte et une désinfection (Bétadine) du site opératoire sont 30 réalisées. Une laparotomie médiane sous-xiphoïdienne d'environ 3 cm est réalisée pour l'implantation des fragments tumoraux. Le lobe du foie concerné par la greffe est ensuite extériorisé à l'aide de compresses. Les fragments sont implantés par effraction de la capsule hépatique sur la face viscérale. Trois fragments (1 issu de chaque clone) sont greffés par lapin, respectivement dans les lobes gauche, paramédian gauche et paramédian droit. Une 35 suture en 2 plans (Monocryl 3/0) est réalisée pour refermer la plaie. A la fin de l'intervention, un nettoyage de la plaie opératoire est réalisée avec de l'Aluspray et un pansement collé est mis en place. 3044516 15 Lors de la phase de réveil les animaux sont gardés et surveillés en salle de réveil et placés sous lampe IR jusqu'au retour de l'état vigile. Les animaux sont ensuite hébergés en cages individuelles. Un examen clinique des animaux est réalisé chaque jour pour évaluer l'état de récupération des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite défini (état de santé de 5 l'animal d'expérience qui n'est plus compatible avec la poursuite du protocole), le vétérinaire et le responsable de l'expérimentation sont prévenus pour décider de l'euthanasie de l'animal. La même procédure peut être reproduite avec des suspensions cellulaires (10 millions de cellules dans 0.2m1 de sérum NaCI 0.9%). 10 - Points limites et euthanasie Les points limites standard retenus sont : ulcération et/ou nécrose des tumeurs SC, décubitus permanent, convulsions, anorexie supérieure à 48h, signes de douleur ne rétrocédant pas à la procédure d'analgésie. En fin de protocole ou en cas d'atteinte d'un point limite, l'euthanasie sera réalisée par 15 injection IV de 4m1 de Doléthal ND sur animal prémédiqué selon le même protocole que décrit pour la chirurgie. 4. Porc - Animaux Il s'agit de porcs de race Landrace de 4 semaines (10kg). Ils sont hébergés en box 20 collectif dans des locaux adaptés et climatisés (plage de température 18-22°C). L'hygrométrie est régulée entre 45 et 55%. Un cycle d'éclairage 12h/12h est mis en place. Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation d'une durée de 7 jours avant toute intervention. - Immunosuppression 25 Le traitement immunosuppresseur consiste en une prise orale de Cyclosporine 15mg/kg 2 fois par jour (matin et soir). La quantité de produit est ensuite adaptée au cours du temps en fonction de la croissance des animaux et des résultats des dosages. Une prise de sang hebdomadaire est réalisée à la veine marginale de l'oreille pour dosage du taux de cyclosporine résiduel (avant l'injection quotidienne du traitement) afin de s'assurer de la 30 bonne réponse au traitement. Un taux résiduel supérieur à 200pg/L signe un niveau d'immunosuppression adéquat. Le traitement est mis en place au moins 4 jours avant la greffe. - Anesthésie et analgésie Les animaux sont mis à jeun (nourriture et eau) 24 heures avant l'intervention. La 35 prémédication intramusculaire des animaux est effectuée un quart d'heure avant l'anesthésie avec un mélange Kétamine (15mg/kg - 1 ml d'Imalgène 1000 ND)/Azapérone (2.2 mg/kg - 1 ml de Stresnil ND). Un cathéter 20G (11/10) sera mis en place à la veine de l'oreille. 3044516 16 L'induction et l'entretien de l'anesthésie est assuré par une injection IV à la demande d'un mélange anesthésique suivant : mélange de 2,5m1 de Rompun 2% avec 2,5m1 d'Imalgène 1000 Injecté dans un flacon de poudre de Zoletil 100. Induction : 0.15mI/10kg du mélange en IV. Entretien : la moitié de la dose d'induction en IV toutes les 30 minutes environ. Une 5 antibioprophylaxie per opératoire sera réalisée par une injection IV de 400 à 800 mg de Clamoxyl. L'analgésie peropératoire est assurée par la valence analgésique de la Kétamine utilisée pour l'anesthésie. L'analgésie post-opératoire est assurée par injections SC de 15 mg de Ketoprofène tous les jours. L'antibioprophylaxie post opératoire sera assurée par des injections IM de 1 ml de Clamoxyl LA tous les 2 jours. 10 - Inoculation des tumeurs à partir de fragments ^ En sous cutané On débute par une désinfection (Bétadine) du site opératoire. Sur animal anesthésié, une incision au bistouri de quelques millimètres est réalisée au niveau de l'aine, puis une petite loge est créée en sous-cutané à l'aide d'une pince. Le fragment tumoral est ensuite 15 déposé dans la loge qui est refermée par un point en U cutané (Monocryl 3/0). 3 clones différents sont implantés pour chaque porc. ^ En intra-hépatique On débute par une désinfection (Bétadine) du site opératoire. Sur animal anesthésié, une laparotomie médiane sous-xiphoïdienne d'environ 3 cm est réalisée pour l'implantation 20 des fragments tumoraux. Le lobe du foie concerné par la greffe est ensuite extériorisé à l'aide de compresses. Les fragments sont implantés par effraction de la capsule hépatique sur la face viscérale. Trois fragments (1 issu de chaque clone) sont greffés par porc, respectivement dans les lobes gauche, paramédian gauche et paramédian droit. Une suture en 2 plans (Monocryl 3/0) est réalisée pour refermer la plaie. 25 Pendant 3 jours post opératoires, les animaux sont hébergés en box individuel, isolés de leurs congénères afin d'éviter la détérioration du pansement et les morsures de la plaie opératoire. Ils sont ensuite à nouveau hébergés en loge avec leurs congénères. Un examen clinique des animaux sera réalisé deux fois par jour pour évaluer l'état de récupération, de santé et de confort des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite défini (état de santé de 30 l'animal d'expérience qui n'est plus compatible avec la poursuite du protocole), le vétérinaire et le responsable de l'expérimentation sont prévenus pour décider de l'euthanasie de l'animal. - Points limites et euthanasie Les points limites standard retenus sont : ulcération et/ou nécrose des tumeurs SC, 35 des décubitus permanent, convulsions, fièvre persistante, anorexie supérieure à 48h, signes de douleur ne rétrocédant pas à la procédure d'analgésie. En fin de protocole ou en cas 3044516 17 d'atteinte d'un point limite, l'euthanasie sera réalisée par injection IV de 20m1 de Doléthal ND sur animal prémédiqué selon le même protocole que décrit pour la chirurgie. 5. Résultats 5.1. Tumeurs sous-cutanées chez la souris Nude Athymic à J30 (in situ et après 5 exérèse Il a été obtenu des tumeurs chez la souris Nude Athymic, d'un diamètre d'environ 12 mm 30 jours après l'injection sous cutanée de cellules pour les 6 clones testés. 5.2. Immunosuppression Le taux résiduel de cyclosporine dans le sang chez les lapins est maintenu au-dessus de 10 2004/L sur plus de 50 jours, ce qui démontre l'efficacité du traitement immunosuppresseur mis en place. Des résultats similaires sont obtenus pour le traitement immunosuppresseur chez le porc. 5.3. Imagerie des tumeurs dans le foie de lapin 15 L'imagerie par échographie de tumeurs présentes dans le foie des lapins 28 jours après implantation de fragments tumoraux, a montré un signal hypodense. Les 3 tumeurs repérées ont un diamètre mesuré de 8 à 9 mm. L'imagerie IRM (séquences T1 et T2) avec injection IV de gadolinium, permet de décrire des zones lésionnelles. Comme chez l'homme, ces lésions de CHC sont caractérisées sans 20 injection comme hypoT1 et hyperT2, avec restriction de la diffusion. Ces lésions prennent le contraste au temps artériel (15-30 secondes après l'injection), puis elles s'homogénéisent plus tardivement et présentent un lavage tardif à la phase portale (1 min 30s post-injection) ou sur les séquences plus tardives (3 min post-injection). Cette sémiologie radiologique est caractéristique de CHC (carcinome hépatocellulaire). L'imagerie scanner met en évidence la 25 présence de lésions nodulaires dans le parenchyme hépatique. Les tailles mesurées en imagerie sont corrélées avec l'examen macroscopique réalisé lors de l'autopsie des animaux. 5.4. Images macroscopiques de tumeurs dans le foie de lapin L'observation du foie prélevé des lapins a permis de voir la pousse tumorale en 30 intrahépatique après implantation sous capsulaire de fragments tumoraux. Ce résultat valide l'obtention d'un modèle tumoral orthotopique dans le foie des lapins. 5.5. Histologie 5.5.1. En sous-cutané L'analyse histologique après coloration HES d'une tumeur sous cutanée 28 jours après 35 implantation d'un fragment tumoral chez le lapin (grossissement X100) a permis d'observer des nodules tumoraux situés dans le chorion. Les cellules tumorales sont de grande taille, 3044516 18 peu cohésives, avec des atypies sévères et de nombreuses mitoses, souvent anormales. De nombreuses multinucléations sont présentes, et peu différenciées. 5.5.2. Dans le foie Le parenchyme hépatique est multifocalement sévèrement remanié par un processus 5 tumoral infiltrant, non encapsulé, densément cellulaire, composé de plages et d'îlots de cellules épithéliales tumorales reposant sur un fin stroma fibrovasculaire. Une prolifération mésenchymateuse lâche multifocale minime est associée. Les cellules tumorales sont rondes à polygonales, de grande taille, à cytoplasme abondant éosinophile finement granuleux à vacuolisé. Leur noyau est rond à ovale, volumineux et vésiculeux, à nucléole 10 central discret. Des irrégularités et indentations nucléaires sont fréquemment notées. L'anisocytose et l'anisocaryose sont marquées et de nombreuses atypies sont observées, caractérisées par des macronucléations ou des plurinucléations. Les mitoses sont nombreuses (50/champs x40) et fréquemment atypiques. De larges zones de nécrose tumorale sont observées et quelques minéralisations sont dispersées dans ces zones. Le 15 stroma est multifocalement oedémateux et infiltré de quelques lymphocytes, macrophages et hétérophiles. Ces lésions sont caractéristiques d'un hépatocarcinome solide de haut grade, indifférencié. 5.6. Fragments congelés 20 Par ailleurs des essais supplémentaires ont pu confirmer la possibilité d'obtenir des tumeurs orthotopiques à partir de fragments tumoraux congelés comparables à celles obtenues avec des fragments frais (2 lapins sur 2 pour les 3 clones). Cela valide la possibilité d'induire le modèle tumoral en partant d'un pool de fragments congelés sans être obligé de repasser par une phase de culture cellulaire ou un maintien des tumeurs in vivo 25 par greffes successives sur le long terme. 7. Pousse tumorale sur des animaux non immunodéprimés Des tests préliminaires ont pu montrer la faisabilité d'induire des tumeurs orthotopiques à partir de fragments frais sur des lapins immunocompétents (1 lapins sur 2 pour 2 clones sur 3). Ces résultats établissent la preuve du concept d'un modèle tumoral sur animaux 30 immunocompétents. Des essais par greffes successives et sélection des lignées les plus vivaces in vivo vont être réalisés. REVENDICATIONS1. Animal mammifère non humain choisi parmi lapin et porc, porteur d'une tumeur résultant de l'introduction orthotopique de cellules immortalisées, transformées et tumorigènes issues d'un organe d'un animal de la même espèce, lesdites cellules intégrant 5 un ou plusieurs oncoatnes. 2. Animal selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules comprennent les oncogènes T et t de SV40 et1-1-Rasv12: 3. Animal selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les cellules sont des hépatocytes et la tumeur est située dans le foie. 10 4. Animal selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules tumorales hépatocytaires transformées ont un niveau d'expression du gène albumine inférieur ou égal à 100, notamment à 50, calculé par le nombre de copies d'ARNm du gène albumine rapporté au nombre de copies d'ARN ribosomal 18S. 5. Animal selon la revendication 3 ou 4,'caractérisé en ce que les cellules tumorales 15 hépatocytaires transformées ont un niveau d'expression du gène alpha-foetoprotéine inférieur ou égal à 1, notamment à 0,5, calculé par le nombre de copies d'ARNm du gène alpha-foetoprotéine rapporté au nombre de copies d'ARN ribosomal 18S. 6. Animal selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules du pancréas. 20 7. Animal selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules du colon. 8. Animal mammifère non humain choisi parmi lapin et porc, porteur d'une tumeur résultant de l'introduction orthotopique de cellules immortalisées, transformées et tumorigènes issues d'un organe d'un animal de la même espèce, lesdites cellules intégrant 25 un ou plusieurs oncogènes, pour utilisation pour: - servir de modèle en chirurgie du cancer, notamment pour l'entraînement du chirurgien ou la mise au point d'un protocole de résection ou exérèse tumorale ; - servir de modèle à en chimiothérapie ; - servir de modèle pour la destruction focalisée de la tumeur, par exemple par 30 radiofréquence, micro-ondes et/ou cryothérapie ; - servir de modèle pour la radiothérapie externe à haute dose (conformationnelle ou stéréotaxique) ; - servir de modèle à la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale ; - servir de modèle à la chimioçmbolisation ou à la radioembolisation intra-artérielle 35 hépatique ; 3044516 20 - servir de modèle pour le développement de techniques ou de méthodes d'imagerie, par exemple utilisation de produits de contraste, de caméra proche infra-rouge; ou - servir de modèle d'étude de l'interaction de la tumeur avec son microenvironnement, les relations entre développement tumoral et immunité.5