FR 3045606 A1 20170623 FR 1562880 A 20151218 La présente invention concerne " naines techniques de la cristallisation et de cristallographie. Plus précisémer vention concerne de nouveaux complexes dë ianthanide qui peuvent être utilisés en tant qu'agents phasants pour la détermination de structure cri! nacromolécules biologiques, mais également en tant qu'aide pour bon. L'invention a également pour objet leur utilisation dans ces domaines et les procédés de cristallisation et de détermination de données structurales qui les mettent en oeuvre. Le succès retentissant de la détermination complète du génome humain en 2000 a ouvert la voie à un domaine de recherche plus vaste encore : la génomique structurale qui consiste à déterminer la structure des protéines pour comprendre les relations entre leur structure et leurs fonctions. De par le nombre et la variété de protéines existantes, il s'agit d'un chantier énorme dont la portée en termes de retombées scientifiques et médicales est inestimée. Aujourd'hui, les deux outils pour cette résolution structurale sont la cristallographie et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Il s'agit de deux techniques complémentaires qui présentent des avantages et des limites : (i) la RMN permet l'analyse en solution de protéines, mais requiert un enrichissement isotopique; (ii) la cristallographie permet une détermination plus rapide de structures mais reste tributaire de la préparatio cristaux de bonne qualité. Actuellement, l'effort de recherche est focalisé si développement de très grands instrii-ents au détriment de la recherche de nouvelles méthodologies. Dans ce domaine, plusieurs difficultés successives doivent être surmontées. La première difficulté relève du domaine de la biologie et concerne la préparation et la purification de protéines d'intérêt et seulement 18% des protéines clonées franchissent cette étape. La seconde l-fficulté concerne l'étape de cristallisation puisque là encore, seulement 20% des protéines purifiées peuvent être cristallisées et seulement la moitié de cee cristaux permettront la détermination de la structure par diffraction des rayons X. Au bilan, seulement 1,8% des protéines clonées sont structuralement caractérisées et ceci, au prix d'investissements en termes de temps et de moyens humains et financiers considérables. Un cristal d'une protéine, ou plus généralement d'une macromolécule biologique, est constitué d'un empilement régulier et périodique des molécules qui le 3045606 2 composent. L'empilement est maintenu par des contactsu <> du cristal (liaisorr hydrogène, ponts salin, contacts hydrophobes). L'obtention d'un cristal d'une macromolécule biologique est une étape clef dans la détermination de sa structure par cristallographie aux rayons X. 5 Il convient de souligner que les processus de cristallisation des macromolécules biologiques sont encore loin d'être compris et que les approches actuelles sont basées sur une approche empirique, de type essais/erreurs. Une des notions importantes à considérer dans la cristallogenèse est la notion de solubilité. En solution, une macromolécule est entourée d'une couche de 10 solvatation qui présente un effet répulsif et isolant et permet d'éviter l'auto- agrégation et la précipitation. La cristallisation va contre cet effet, puisqu'il s'agit de s'éloigner des conditions de solubilité de la macromolécule biologique par l'ajout d'un agent précipitant, également nommé agent cristallisant. Dans le cadre de la présente description, « agent précipitant » et « agent cristallisant » sont utilisés 15 indifféremment. On entend par agent cristallisant/précipitant, une molécule ou un mélange de molécules aidant à la formation d'un cristal de macromolécules biologiques, dans certaines conditions, Le principe général de la cristallisation repose sur le diagramme présenté cri Figure 1 qui correspond au schéma réalisé par Mirjam Leunissen et figurant sur 20 http://people.ds.cam.ac.uk/m1527/publications/assets/leunissen-literature- research.pdf. Les deux étapes principales qui surviennent dans le processus de cristallisation sont la nucléation et la croissant.: talline. L'agent cristallisant induit une modification de la solubilité et donc de la 25 sur le diagramme en fonction du temps. Il existe différentes méthodes cristallisation mettant en oeuvre un agent cristallisant. Le but lors d'une cristallisation est de jouer sur les concentrations en macromolécule biologique et en agent cristallisant pour parvenir à atteindre la zone de nucléation représentée sur le diagramme de la Figure 1. Lorsque cette zone est atteinte, il peut se former des nucleii (points de nucléation). Ces nucleii sont des agrégats plus ou moins organisés d'une centaine de macromolécules. La formation de ces départs « cristallins » fait diminuer la concentration en macromolécule 3045606 soluble. C'est le commencement de la croissafr .a-stalline. D'autres macromolécules viennent s'agencer sur ce nucteii et forment des micro-cristaux qui vont grandir avec le temps. Il existe trois grandes classes majeures d'agents cristallisants : 5 - les sels, - les solvants organiques (éthanol, dioxane, MPD pour méthylpentanediol etc...) - les polymères (PEG (Poly-Ethylène Glycol) de poids moléculaires allant 20000 g/mol, Jeffamine T etc...) Ces agents ont pour effet : 10 - d'entrer en compétition avec la macromolécule biologique pour l'eau, ou plus généralement le solvant dans lequel la macromolécule est initialement en solution, et ainsi diminuer la solubilité de la macromolécule, induisant sa cristallisation, d'écranter des charges à la surface de la macromolécule permettant le rapprochement de plusieurs macromolécules, 15 - de modifier la constante diélectrique du solvant et par conséquent les forces entre macromolécules - de favoriser des phénomènes de type volume exclu (exclusion hydrophobe). Pour obtenir la cristallisation d'une protéine, ou plus généralement d'une macromolécule biologique, une approche automatisée permettant un criblage de 20 différentes conditions de cristallisations commercialement disponibles (kits de la société Hampton Research, par exemple). Les expériences de cristallisation sont préparées par des robots et la phase de cristallisation est suivie régulièrement par des robots microscopes qui scrutent l'apparition des cristaux. Cette approche à haut débit a fait passer au second plan la recherche de méthodologies alternatives 25 permettant de favoriser la cristallisation, consistant à trouver des agents qui favorisent la cristallisation sans dénaturer la protéine. Quelques travaux existent sur ce sujet dans la littérature, comme l'utilisation de composés naturels : solides minéraux (Falini G., Fermani S., Conforti G., Ripamonti A. (2002) ; Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58, 1649-1652, McPherson, A. Si Shlichta, P. (1988), Science, 239, 30 385-387), substrat d'origine biologique comme les cheveux, les crins de chevaux, les moustaches de rat ou les algues séchées (D'Arcy A., Mac Sweeney A. & Haber, (2003), Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1343-1346), mais également des 3045606 4 produits de (Bijelic A., Molitor C., Mauracher S., G. Al-Oweini, R., Kortz j. Rompel, A. (2014), ChemBioChem. 16, 233-241, Pechkova, E. & Nicolini, C. (2(1-'7 1 Cell. Biochem. 85, 243-251, Sugahara, M. Asada, Y. Morikawa, Y. Kageyama, Y. & Kunishima, N. (2008), Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 686-695, Matar- 5 Merheb, R. Rhimi, M. Leydier, A. Huché, F. Galiàn, C. Desuzinges-Mandon, E. Ficheux, D. Flot, D. Aghajari, N. Kahn, R. et al. (2011), PLoS ONE. 6, e18036). Dans tous ces cas, la croissance cristalline se produit au contact « impuretés ». Les travaux les plus aboutis dans ce domaine sont ceux de l'écr Naomi E. Chayen qui propose l'utilisation de matériaux mésoporeux, capable 10 d'induire la nucléation dans les pores après une étape de concentration/agrégation au sein de ces mêmes pores (WO 02/088435). Le même groupe décrit également l'utilisation de MIP « molecular imprinted polymers » basés sur le même principe. Il s'agit de polymères préalablement imprimé par la protéine à cristalliser et qui en contiennent donc la trace. Ajoutés ensuite à la goutte de cristallisation, une 15 interaction de forme peut se produire favorisant la nucléation (Saridakis, PNAS, 2001, 108,11081). Tous ces agents d'aide à la cristallisation sont des solides formant une phase hétérogène dans le milieu de cristallisation, chacun d'eux devant donc être ajouté manuellement dans la goutte de cristallisation, ce qui est inconciliable avec l'utilisation des plateformes de criblage robotisées, à l'exception des MIR Par ailleurs, de par la taille gigantesque des macromolécules biologiques, comme les protéines, la détermination de leur structure par diffraction des rayons X implique de résoudre le problème des phases en cristallographie. Cela implique de posséder un cristal natif (protéine pure) et/ou un cristal dérivé contenant un atome lourd facilement repérable et permettant de lever le problème des phases, on parle 25" d'agent de phasage. La méthode la plus classique, basée sur la diffraction anomale à plusieurs longueurs d'onde (MAD) est fondée sur le remplacement du soufre des acides aminées méthionines de la protéine par un atome de sélénium. Utilisée depuis les années 90, cette méthode a révolutionné la cristallographie macromoléculaire, mais elle implique la synthèse, la purification, la cristallisation et la résolution de la 30 structure de protéines séléniées analogues. C'est une méthode très coûteuse en temps. D'autres agents phasants exogènes peuvent être utilisés et sont d'ailleurs commercialisés. On peut citer le brome, les métaux lourds (Pt, Au, Hg). Dans ce 3045606 contexte, R. Kahn a montré au début des années 2000 que les lanthanides, qui présentent des effets anomaux parmi les r:Js intenses, peuvent être inclus sous forme de complexes dans des cristaux :éines, ce qui permet de résoudre rapidement la structure de la macromolen le lanthanide est fixé (E. Girard, M. 5 Stelter, P. L. Anelli, J. Vicat, R. Kahn, Acta. Cristallogr. D, 2003, D59, 118; E. Girard, P.L. Anelli, J. Vicat, R. Kahn, Acta. Cristallogr. D, 2003, D59, 1877). A ce jour, cinq complexes de lanthanide sont commercialisés, en tant qu'agent phasant par société NatX-ray. 3- 003A DOTA HPDO3A DTPA.BMA Ln = (et Gd poour HPDO3A) 10 Il existe dans la littérature quelques agents phasants luminescents, comme des dérivés fonctionnels du DPA3 (FR 2 991 322 et ACIE 2008) ou des complexes de lanthanide directement greffés à la structure des protéines (X. C. Su, H. B. Liang, K. V. Loscha and G. Otting, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 10352-10353). Parmi tous ces dérivés, les complexes tri-anioniques [(DPA)3Ln]3 semblaient très prometteurs car des interactions spécifiques avec des acides aminés cationiques et en particulier, avec l'arginine ont été mises en évidence par certains des inventeurs de la présente demande de brevet (E. Dumont, G. Pompidor, A. D'Aléa, J. Vicat, L. Toupet, R. Kahn, E. Girard, 0. Maury, N. Giraud, PhysChemulemPhys 20 2013, 15, 18235-18242), et confirmées par des mesures de RMN (X. C. Su, H. B. Liang, K. V. Loscha, G. Otting, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 10352-10353). Malheureusement, ce composé s'est avéré instable dans un grand nombre de formulation composant les kits de cristallisation commerciaux : (i) la présence de métaux de transition (Zn(II), Cu(II), Fe(II)) induit la déstructuration du complexe, 25 (ii) la présence de sels alcalino-terreux divalents (Ba(II), Ca(II), Mg(II)) provoque l'auto-cristallisation immédiate du c,79plexe donnant lieu à une détectioJ x- 3045606 6 positifs (cristaux de complexes et non de cristaux dérivés de protéines) (Thèse de doctorat de R. Talon soutenue à Grenoble le 6 Juin 2012). D'autres solutions ont proposé d'introduire des lanthanides dans les cristaux de protéines, pour obtenir un effet phasant. Nagem et al. (Nagem, R. A., Dauter, Z. & 5 Polikarpov I, Acta Crystallogr. D, 2001, D57, 996-1002) ont proposé d'utiliser les sels de lanthanide et la méthode du trempage rapide (Dauter Z., Dauter, M. Rajashankar, K. R. Acta Crystallogr. D, 2000, D56, 232-237). Cette méth développée initialement pour les sels d'halogénure (NaCI, NaI, NaBr) consisttremper, pendant un temps inférieur à la minute, les cristaux dans une solution 10 saline très concentrée (> 1 mol L'). Dans le cas du sel de lanthanide, cette méthode a conduit à une dégradation rapide des cristaux. Purdy et al. (Purdy M. D., Ge P., Chen J., Selvin P. R., & Wiener, M. C. Acta Crystallogr. D, 2002, D58, 1111-1117) ont proposé d'utiliser une liaison covalente reliant des complexes de lanthanide (où le ligand assure une coordination complète du lanthanide) à la protéine. La liaison 15 est constituée par un pont disulfure formé entre des cystéines libres de la protéine et une fonction réactive thiol portée par le complexe. Enfin, Silvaggi et al. (Silvaggi, N. R., Martin, L. J., Schwalbe, H., Imperiali, B., Allen, K. N. J., Am. Chem. Soc., 2007 129, 7114-7120) ont proposé l'utilisation d'un « tag » fixant un ou deux lanthanides (LBT pour Lanthanide-Binding Tag). Le LBT est fondé sur une séquence peptidique 20 dérivée des boucles à calcium qui peut être introduite dans les protéines par les techniques de biologie moléculaire classiques (Allen, K. N. Imperiali B., Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14, 247-254). Il existe donc un besoin de disposer d nouveaux agents phasants qui ne nécessitent pas de modifier la structure des macromolécules biologiques, dont on 25 souhaite déterminer la structure. De manière additionnelle, l'invention se propose de fournir des agents phasants qui soient suffisamment stables dans la plupart des conditions de cristallisation des macromolécules biologiques et qui permettent également d'élargir les possibilités d'obtention de cristaux permettant d'obtenir des informations structurales sur la macromolécule biologique d'intérêt. 30 3045606 7 Dans ce contexte, rH: ,pn concerne des complexes caLioniques formés d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I) : Y R1- N (I) dans laquelle : - X et Y, identiques ou différents, représentent, chacun indépendamment, -CH2-(C1-12)-, -CH2-(CH2)n-A-CH2CH2- ou -CH2-CR3R'4-CH2-, X se lisant sur la formule générale (I) de la gauche vers la droite et Y se lisant sur la formule générale (I) de la droite vers la gauche, avec ; o n qui est égal à 1, 2 ou 3 ; la o A qui représente -NR2-, -0(0-12)20- ou -d-, avec R2 qui est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R5, R5 représentant un groupe phényle, pyridinyle ou picolinyle ; R3 qui représente un groupe méthyle ; et R'4 qui représente -NHR4 avec R4 qui représente C -CH2R6 Re 15 représentant un groupe phényle ou pyridinylee ; - Ri. représente avec : R7 qui représente -000, -CONH2, -CONHR9, - , ou un groupe choisi Y R9 N parmi : 70 avec R9 qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle ; et 3045606 R.8 qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode, groupe -0H ou -NH2 ; étant entendu qu'au moins un des enchaînements X et Y est différent de -CH2-(CH2)'-, et leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates ; à l'exception des complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln3 et d'un ligand répondant à l'une des formules (I.1) à (I.5) suivantes, et de leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates ooc -00C coo- (I.2) - 0 OC 00- (I.3) 3045606 00C cOo- (1.4) C COO- (I.5) Les ligands de formule (I) comprennent au moins 7 coordination pour 5 un ion lanthanide Ln"-, voire plus, en fonction des structures de X et Y. Ces sites de coordination se trouvent sur les deux atomes d'azote représentés sur la formule (I), sur les deux pyridines des groupements R1, sur les deux groupes R7, au moins un site de coordination se trouvant sur X et/ou Y. Les complexes selon l'invention, ainsi que les complexes de lanthanide formés 10 avec les ligands de formules (I.1) à (1.5), sont cationiques et présentent une charge positive supérieure ou égale à 1. Ils comportent un ligand macrocyclique incorporant plusieurs groupements aromatiques formant une sphère de coordination ouverte pour l'ion lanthanide. Ces groupes aromatiques, lorsque l'ion Ln3+ est Eu3+ ou Tb3+, agissent également comme antennes pour sensibiliser la luminescence du lanthanide 15 dans le visible. 3045606 10 Par ailleurs, les complexes selon l'invention, présentent l'avantage d'être solubles dans l'eau et stables dans la plupart des milieux de cristallisation commerciaux. Dans le cadre de l'invention, il a été démontré que s complexes présentaient un intérêt, non seulement en tant qu'agent phasant, 0e l'obtention 5 de données structurales, mais également en tant qu'aide à la cristallisation. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisatior l'une macromolécule biologique. De telles applications n'avaient jamais été de tes ou envisagées pour les complexes de lanthanide formés avec les ligands ue formules (I.1) à (I.5) déjà décrits dans la 10 littérature (M. Mato-Iglesias et al., Inorg. Chem. 2008, 47, 7840-7851 ; Z. Palinkas et iorg. Chem. 2009, 48, 8878-8889 ; A. Roca-Sabio et al., Dalton Trans, 2011, 40, 384-392 et M. Regueiro-Figueroa et al., Inorg. Chem. 2015, 54, 4940-4952 pour les complexes des ligands (I.1) à (I.3) et A. Rodrigues-Rodrigues et al., Inorg. Ch 2012, 51, 2509-2521, pour les complexes des ligands (I.4) et (I.5)). En eff 15 complexes ont été préparés pour des études fondamentales de chimie coordination des lanthanides (étude de la stabilité des complexes formés avec différents lanthanides) et dans le cas du Gd, seules des applications en tant qu'agent de contraste IRM ont été envisagées. De manière avantageuse, les complexes selon l'invention, ainsi que leurs sels 20 avec un anion, leurs solvats et hydrates, sont formés avec un ligand répondant à l'une des formules suivantes : D) (16) H3C (IC) F) 3045606 11 -Ivec Ri, R2, n et R4 qui sont tels que définis pour la formule (I). A titre d'exemple de sels, des complexes selon l'invention ou des complexes formés avec l'un des ligands (I.1) à (I.5) qui trouvent application dans le cadre de l'invention, on peut citer les sels d'un complexe cationique avec un anion (ou 5 plusieurs anions, en fonction de la charge du complexe) choisi parmi : Cr, Br, NO3, triflate, PF6-, SbF6-, B(Ph)4-, BF4-, les sulfates, sulfonates, carbonates, phosphates, phosphonates et carboxylates. Les sulfates et sulfonates pourront correspondre à S042-, HS03- ou R'503-, les carbonates à C032-, HCO2 ou RiCO2-, les phosphates et phosphonates à R'0P032- et R'P032 et les carboxylates à R`CO2-, avec 10 R' qui peut être, notamment, un groupe alkyle ou aryle, notamment un groupe alkyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe phényle. Sous la forme de sels, les complexes, selon l'invention, pourront également se trouver sous la forme d'hydrate ou solvats, c'est-à-dire avec au moins une molécule d'eau ou de solvant dans la sphère de coordination du lanthanide. 15 De manière préférée, les complexes selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates, sont formés avec un ligand répondant à la formule (IA) : (LA) dans laquelle n=1 et R2=H, et Ri est tel que défini pour les composés de formule 20 (I). De manière avantageuse, dans les ligands de formule (I), (TA) (IF), R1 représente : avec : 3045606 2 R7 qui représente -000 ou -PR no avec R9 qui représente un groupe N_- N N N/ méthyle ou éthyle ; ou bien R7 qui représente un groupe: R8 qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode. Dans le cadre de l'invention, lorsqu'un substituant représente un groupe 5 picolinyle, il représente : De manière préférée, les complexes selon l'invention sont choisis parmi les complexes de formule : N 10 ainsi que leurs sels avec un anion, en particulier, leur sel chlorhydrate, leurs solvats et hydrates. De manière avantageuse, les complexes selon l'invention ou les complexes formés avec l'un des ligands (Li) à (1.5) qui trouvent application dans le cadre de 15 l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion, en particulier leur sel chlorhydrate, 3045606 13 leurs solvats et ri, sont formés avec un ion lanthanide Ln3 , Ln étant Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb ou Lu, avec Eu, Tb, Yb et Lu qui sont préférés. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe selon invention, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de 5 formules (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent -istallisant lors d^ la cristallisation d'une macromolécule biologique Tous les complexes de lanthanide selon l'invention, ou formés avec un ligand de formule (I.1) à (1.5), présentent un intérêt pour leur effet nucléant ou cristallisant. Cependant, seuls les complexes de terbium ou d'europium présenteront des propriétés de luminescence dans le visible. Aussi, si dans le complexe, Ln =Eu ou Tb, le complexe pourra également être utilisé en tant qu'agent luminescent pour la 15 détection de cristaux. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe selon l'invention, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à l'obtention de données 90 structurales d'une macromolécule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent phasant lors de la détermination structurale par diffraction des rayons X. Là encore, si dans le complexe, Ln =Eu ou Tb, le complexe pourra également être utilisé en tant qu'aide au positionnement du cristal dans un faisceau de rayons X. 25 En particulier, dans le cadre de l'invention, par « macromolécule biologique », on entend en particulier les peptides (enchainement de moins de 100 acides ar protéines (enchainement d'au moins 100 acides aminés) et les acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN. De telles macromolécules biologiques présenteront notamment une masse moléculaire moyenne supérieure à 1 kDa. 30 L'invention a également pour objet les cristaux dérivés d'une macromolécule biologique comprenant un complexe selon l'invention ou un complexe cationique 3045606 14 formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate. L'invention a également pour objet un procédé de cristallisation d'une macromolécule biologique, de préférence choisie parmi les peptides, les protéines et 5 les acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN, comprenant les étapes suivantes disposer d'une solution comprenant ladite macromolécule biologique et un complexe selon l'invention, ou un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que précédemment 0 définie, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate, obtenir des cristaux de la macromolécule à partir de ladite solution. La solution utilisée pourra comprendre, en outre, un agent précipitant, autre que le complexe, notamment choisi parmi ceux utilisés dans les kits de cristallisation commerciaux, ef ')articulier parmi ceux présents dans les tableaux présentés en 15 Annexes 2A ou 28, comme par exemple, les sels tels que les sels d'ammonium, les sulfates (notamment le sulfate d'ammonium), acétates, phosphates, citrates (notamment le citrate de sodium), formiates, tartrates tels que le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, les chlorures, iodures et fluorures, par exemple NaCl ; les polymères tels que les polyéthylèneglycols et la 3effamine T ; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol, le glycérol, l'isopropanol, 2- méthy1-2,4-pentanecliol. De manière avantageuse, dans la solution, le complexe est présent à une concentration de 1 à 100 mM, préférentiellement à une concentration de 1 à 25 et de manière encore plus préférée à une concentration de 10 mM 10%. 25 En particulier, l'obtention de cristaux est réalisée par cristallisation par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides. Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être intégré à un criblage ou à une optimisation de conditions de cristallisation d'une macromolécule 30 biologique. Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être mis en oeuvre de manière automatisée. 3045606 15 L'invention a également pour objet un procédé d'analyse ou de détermina de la structure d'une macromolécule biologique comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'un cristal dérivé de la macromolécule biologique tel que défini dans le cadre de l'invention, b) analyser la structure cristalline de la macromolécule biologique à partir dudit cristal dérivé. Le cristal dérivé pourra être obtenu selon un procédé de cristallisation tel que décrit dans le cadre de l'invention ou encore par trempage d'un cristal de la macromolécule biologique dans une solution d'un complexe selon l'invention ou d'un 10 complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I.1) à (L5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates. Le cristal dérivé peut également être obtenu par trempage cristal dérivé de la macromolécule biologique obtenu selon un procédé ue cristallisation tel que décrit dans le cadre de l'invention, dans une solution d'un 15 complexe selon l'invention ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I.1) à (I.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates. En particulier, l'analyse de la structure cristalline de la macromolécule biologique à partir dudit cristal dérivé correspond à la détermination de la structure de la macromolécule biologique et est réalisée par diffraction des Rayons X (RX). Il est également possible qu'elle corresponde à l'obtention de données structurales par une méthode haute résolution, telle que la diffraction des Rayons X (RX) ou par une méthode à basse résolution par les méthodes SAXS (Small-Angle X-ray Scattering) ou MASC (Multiwavelength-Anomalous Solvent Contrast). 25 La description détaillée ci-après permet de mieux comprendre l'invention. Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF) sont des complexes cationiques, et en particulier mono-cationiques. Ils sont donc capables de conduire à la formation de 30 cristaux dérivés d'une macromolécule biologique. De tels cristaux dérivés peuvent être obtenus par trempage ou par co-cristallisation, comme détaillé plus loin. L'effet flomal dû à la présence des lanthanides dans les cristaux dérivés obtenus, conduit à 3045606 16 un effet phasant et facilite la détermination de la structure de la macromolécule biologique concernée, notamment par diffraction des rayons X. LtS complexes selon l'invention peuvent donc être utilisés en tant qu'aide à la détermination ou à l'analyse de la structure cristalline d'une macromolécule biologique. Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates peuvent également être utilisés en tant qu'aide à la cristallisation de macromolécules biologiques. En effet, en fonction de leur structure, et en fonction des conditions de 10 cristallisation mises en oeuvre, les complexes selon l'invention présentent au moins l'une des propriétés suivantes : effet nucléant : la présence dudit complexe de lanthanide lors de la cristallisation provoque la croissance de cristaux dans des conditions (tampon et/ou additifs et/ou température et/ou concentration et/ou durée...) qui ne permettent pas la formation 15 de cristaux en l'absence du complexe selon l'invention. effet cristallisant : la présence dudit complexe de lanthanide lors de tests d'une série de conditions de cristallisation (nombre de cristaux et/ou taille des cristaux et/ou amélioration de la diffraction des cristaux obtenus...) permet d'améliorer la cristallisation obtenue, par rapport à une série de conditions différant par l'absence de complexe. En l'absence de complexe, des cristaux apparaissent mais sont de moins bonne qualité. En particulier, les complexes de lanthanide formés avec les ligands de formule (I) formés d'un ion lanthanide Ln n ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) 25 à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates, soit permettent d'augmenter le nombre de conditions dans lesquelles l'obtention de cristaux d'une macromolécule biologique est possible, soit de travailler dans des conditions plus faibles en macromolécule biologique et/ou en autre agent précipitant classiquement utilisé, soit d'améliorer la qualité ou le nombre de cristaux favorisant ainsi l'obtention de 30 données structurales ultérieures, soit d'obtenir plusieurs de ces avantages. Les complexes d'Europium et de Terbium présentent également l'avantage d'être luminescents sous irradiation UV. Ainsi, leur utilisation permet une mise en 3045606 17 évidence aisée des cristaux dérivés lors des essais de cristallisation. Cette propriété peut être utilisée comme méthode de détection rapide pour les plateformes de cristallisation équipées d'imageur automatique sous irradiation UV. De plus, cette propriété peut être utilisée comme une aide au centrage dans un faisceau de rayons X lors d'une caractérisation par diffraction notamment. Les complexes selon l'invention pourront être préparés selon des techniques adaptées par l'homme du métier, techniques décrites dans les exemples ou dans la demande WO 2014/162105. La synthèse des complexes selon l'invention est généralement réalisée dans l'eau. Les complexes ainsi formés seront donc plutôt 10 sous la forme d'hydrate, mais le complexe peut ensuite être mis dans un solvant autre, du type alcool ou DMSO et donner lieu à un solvat ou encore être déshydraté. Sous forme hydratée, un complexe selon l'invention comportera, notamment jusqu'à 3 molécules d'eau par complexe. En moyenne, le nombre de molécules d'eau par complexe, pourra, par contre, être différent d'un nombre entier, et être par exemple 15 égal à 0,5. Pour les applications envisagées dans le cadre de l'invention, les complexes de lanthanide selon l'invention pourront être utilisés sous forme hydratée, ou déshydratée, solvatée ou non, sous la forme de poudre ou en solution. La qualité et la pureté d'un agent cristallisant sont essentielles au bon déroulement de la cristallisation d'une macromolécule, lorsque ces derniers sont utilisés en tant qu'agent de cristallisation. Aussi, au final, les complexes de lanthanide selon l'invention seront soumis à une étape de purification adaptée, notamment par chromatographie d'exclusion stérique. Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés 25 avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates, pourront être utilisés en tant qu'agent cristallisant dans toute technique adaptée à la cristallisation de macromolécules biologiques. Pour une description détaillée de telles techniques, on pourra se référer aux ouvrages de référence suivants : « Protein Crystallization, Second Edition (IUL 30 Biotechnology Series) » édité par Therese Bergfors ou « Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach » édité par Arnaud Ducruix et Richard Giegé. 3045606 18 En particulier, les complexes cationiques it d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates pourront être utilisés en tant qu'agent cristallisant dans un procédé de cristallisation de macromolécules biologiaues par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de crisi 3abon en phase cubique de lipides. Ces différentes techniques vont ci. - une être décrites succinctement, l'agent cristallisant s'entendant d'un complexe de lanthanide ou mélange d'agents cristallisants contenant au moins un complexe de lanthanide avec un ligand de 10 formule (I), sous forme de sels, solvats ou hydrates La cristallisation par diffusion de vapeur est la plus utilisée actuellement. C'est la méthode généralement mise en oeuvre au niveau des plateformes de cristallisation automatisée. Il existe trois approches différentes schématisées sur la Figure 2 tes techniques de la goutte assise (« Sitting drop » en anglais), de la goutte suspendue 15 (« Hanging drop » en anglais) et de la goutte en sandwich (« Sandwich drop » en anglais). Ces trois techniques sont représentées schématiquement sur la Figure 2. Dans ces trois approches, une solution de l'agent cristallisant est placée dans un puits (solution en gris clair). La solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt est mélangée avec l'agent cristallisant et déposée sous forme de goutte (soit suspendue, soit assise ou encore en sandwich). Le puits de cristallisation est fermé hermétiquement par une lamelle de verre ou un film plastique. Au démarrage de la cristallisation, la concentration en agent cristallisant dans la goutte est deux fois plus faible que dans le puits. Le système étant clos, il se met en place une cinétique de diffusion du solvant de la goutte (généralement de l'eau) vers le puits. Le volume 25 de la goutte va donc diminuer (perte de solvant ie. d'eau) et les concentrations en macromolécule biologique et en agent cristallisant vont ainsi augmenter permettant, dans les cas favorables, d'atteindre la phase de nucléation. Dans cette méthode, la concentration en agent cristallisant est extrêmement importante. En effet, un excès d'agent cristallisant pourrait entraîner une cinétique de diffusion du solvant trop 30 rapide et donc entraîner la précipitation de la macromolécule biologique. A l'inverse, une concentration trop faible ne permettra pas d'atteindre la zone de nucléation. La ,centration adaptée en agent cristallisant sera donc déterminée, par des tests de 3045606 19 routine, par l'homme du métier. A partir de la nucléation, la croissance cristalline va ensuite faire diminuer la concentration en macromolécule soluble jusqu'à atteindre un état stationnaire. - La dialyse est une autre méthode de cristallisation qui reste cependant moins utilisée que la diffusion de vapeur. Cette technique est représentée schématiquement sur la Figure 3. Le principe général consiste à faire croitre, de manière lente, la concentration en agent cristallisant. Pour cela, une solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt est placée dans un contenant de dialyse, par exemple du type capillaire ou 10 bouton de dialyse fermé par une membrane semi-perméable laissant passer les molécules d'agent cristallisant (mais pas la macromolécule). Ce contenant est alors placé dans une solution d'agent cristallisant. Un équilibre entre la solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt (qui ne contient pas d'agent cristallisant) et ia solution extérieure contenant l'agent cristallisant va se mettre en place. Ainsi, la 15 concentration en agent cristallisant dans le contenant de dialyse va augmenter et modifier la solubilité de la macromolécule. Cette technique présente l'avantage d'être plus précise que la diffusion de vapeur en ce qui concerne le maintien du pH et des volumes. Cependant, la manipulation des cristaux reste beaucoup plus délicate. - La cristallisation en batch est la dernière technique utilisée pour cristalliser les 20 macromolécules biologiques. Cette technique, tout comme la dialyse, nécessite un volume important de solution. Le principe de cette technique, représenté schématiquement sur la Figure 4, est simple : la macromolécule très concentrée est mélangée à l'agent cristallisant. La solution sursaturée en macromolécule va, avec le temps, induire la formation de 25 nucléii qui va induire la diminution de la concentration de la macromolécule en solution, vers la formation de cristaux. Les techniques de cristallisation par diffusion de vapeur, de cristallisation par dialyse ou de cristallisation en batch fonctionnent sur tous les types de protéines qu'elles soient solubles dans l'eau ou qu'elles soient membranaires, alors solubles en 30 détergent, ainsi que sur les autres macromolécules biologiques (ADN, ARN, complexes protéiques, complexes protéine-ADN ou ARN.. 3045606 20 Pour la cristallisation des protéines membranaires, il est également possible d'utiliser un complexe de lanthanide, en tant qu'agent cristallisant dans une technique de cristallisation en :bique de lipides. La cristallisation en phase cubique de lipides des protéines branaires est décrite dans les publications 5 suivantes : Landau et al. Lipidic cubic phase: A novel concept for the crystallization of membrane proteins, PNAS Vol. 93 no. 25 14532- 14535 (1996), Caffrey et al. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc 4 (5) 706-31 (2009), Cherezov V., Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin Struct Biol Vol 21 559-566 (2011). 10 Les complexes de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates sont compatibles avec toutes les méthodes de cristallisation qui viennent d'être détaillées. En particulier, une solution contenant une concentration de 1 à 100 mM, 15 préférentiellement 1 à 25 mM d'un complexe de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, et de manière encore plus préférée de 10 mM ± 10% sera utilisée. Dans les cristallisations, en particulier, en phase vapeur ou en batch, une solution de la macromolécule biologique à cristalliser et d'un complexe de lanthanide formé d'un ion lanthanide Ln3-" et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat 25 ou d'un hydrate (qui sera, par souci de simplification, dans le reste de la description, nommé complexe de lanthanide), sera préparée, avec de préférence une concentration de 1 à 100 mM, préférentiellement 1 à 25 mM, et de manière encore plus préférée de 10 mM ± 10%, en complexe de lanthanide. Le complexe de lanthanide formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (I), 30 correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, peut être directement solubilisé par la 3045606 21 solution contenant la macromolécule biologique pour atteindre une concentration finale en complexe de 1 à 100 mM, de préférence de 1 à 25 mM, et préférentiellement de 10 mM 1 10°/D qui correspond à la concentration à laquelle l'effet nucléant est prépondérant. Le complexe de lanthanide peut aussi être introduit 5 à partir d'une solution à une concentration préférentielle de 10 à 30 mM, lors de la fabrication d'une goutte de cristallise+ sont alors ajoutés successivement un volume de la solution de macromolécul - n volume identique de la solution de complexe de lanthanide et un volume identique de solution de puits utilisé pour la cristallisation. Dans ces techniques de c complexe de lanthani, la macromolécule biologique à cristalliser seront solution généralement. c. :e l'eau ou dans une solution aqueuse tamponnée (voir exemples dans la description des kits de cristallisation figurant dans les Annexes 2A et 2B), par exemple, dans une solution tampon acétate, cacodylate, citrate, Bis tris propane, TRIS, HEPES, 15 phosphate. Les solutions contenant une macromolécule biologique sont généralement tamponnées. Si une solution du complexe de lanthanide est formée, elle ne sera pas forcément tamponnée. La solution contenant le complexe, la solution contenant la macromolécule biologique et/ou la solution contenant la macromolécule biologique et le complexe, en fonction de la technique de cristallisation utilisée 20 présenteront, de préférence, un pH dans la gamme allant de 3 à 9. Des additifs tels que des additifs déjà connus pour jouer le rôle d'agent précipitant/cristallisant ou des additifs permettant de favoriser au départ la dissolution de la macromolécule biologique à cristalliser pourront être ajoutés. A titre d'exemples, on peut citer ceux présents dans les tableaux présentés en Annexe 2A 25 ou 2B, comme par exemple, les sels tels que les sels d'ammonium, les sulfates (notamment le sulfate d'ammonium), acétates, phosphates, citrates (notamment le citrate de sodium), formiates, tartrates tels que le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, les chlorures, iodures et fluorures, par exemple NaCi ; les polymères tels que les polyéthylèneglycols et la 30 ..leffamine T ; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol, le glycérol, l'isopropanol, 2- méthy1-2,4-pentanediol. En particulier, il est possible d'utiliser le complexe de lanthanide dans toute solution de cristal ation déjà commercialisée. 3045606 22 La concentration en macromolécule dans la solution sera en théorie proche de sa limite de solubilité dans ladite solution, mais pourra être plus diluée, en fonction de la solution utilisée. Les complexes de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln3 et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat C J'un hydrate, pourront également être utilisés pour obtenir des cristaux dérivés de macromolécules biologiques, c'est-à-dire des cristaux contenant ledit complexe de lanthanide. En particulier, ledit complexe de 10 lanthanide sera fixé sur une position spécifique de la macromolécule biologique à étudier permettant la détermination de la structure de ladite macromolécule biologique étudiée. La détermination des phases peut être faite avec des cristaux dérivés obtenus dans une solution contenant de 1 à 100 mM de complexe, préférentiellement de ` 15 100 mM, et de manière encore plus préférée de 100 mM ± 10% au dit complex, lanthanide. Cependant, pour améliorer la qualité du phasage, un trempage dans une solution d'un complexe de lanthanide, en particulier, avec une concentration élevée en complexe, peut également être réalisé. Cela permet d'augmenter le taux d'occupation des sites occupés par le complexe. La co-cristallisation consiste donc à ajouter le complexe de lanthanide pendant le processus de cristallisation. Ainsi, lors de la cristallisation, le complexe de lanthanide peut s'insérer dans des sites cristallins spécifiques conduisant à l'obtention de cristaux dérivés. Par ailleurs, pour obtenir un cristal dérivé ou augmenter l'occupation par un 25 complexe de lanthanide de sites dans le cristal dérivé, un trempage d'un cristal d'une macromolécule biologique dans une solution de complexe de lanthanide peut être effectué. II est possible de réaliser un trempage rapide ou un trempage long. Le trempage rapide consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière brève (notamment de 45 secondes à 30 2 minutes) dans une solution du complexe de lanthanide. De manière avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration en 3045606 23 complexe de lanthanide, typiquement une concentration de 50 à 500 préférence de 100 mM ± 10%. En particulier, un trempage rapide lors d'une phase cc congélation d'un ou plusieurs cristaux peut être réalisé. Un trempage rapide lors d'une phase de congélation se déroule typiquement en trois étapes des cristaux sont prélevés de leur goutte d'origine et trempés dans une goutte de trempage, correspondant à une solution équivalente à la solution d'origine utilisée pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux) à laquelle est ajoutée une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10% de complexe de lanthanide, ainsi qu'un cryoprotectant tel 0 qu'utilisé par l'homme de l'art. Après une durée de 45 secondes à 2 mins' cristal est trempé dans une solution de cryoprotection sans complexe de lanthanide, afin d'en éliminer l'excès. Enfin, le cristal est plongé dans l'azote liquide et stocké à basse température, par exemple à 100K. Cette méthode de trempage est très efficace et permet d'augmenter les taux d'occupation et d'améliorer la qualité du phasage. A titre d'exemple, dans le cas de la protéine PhP1 un trempage de 45 secondes dans une solution à 100 mM de complexe 10 a augmenté le taux d'occupation du complexe par 3. Un trempage court permet d'éviter que le cristal ne se dégrade et de préserver les qualités de diffraction de ce dernier. Le trempage long consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière prolongée (notamment de 10 minutes à 24 heures) dans une solution du complexe de lanthanide. De manière avantageuse, solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration complexe de lanthanide, typiquement une concentration de 50 à 500 mM, préférence de 100 mM ± 10%. A l'exception de la durée, le trempage long peut se dérouler selon le même protocole que celui décrit pour le tr, ,,ge rapide, notamment lors d'une phase de congélation. Cependant, la goutte dr- ,,mpage est placée en équilibre avec un puits contenant de la solution d'origine utilise,: pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux), 30 afin d'éviter une déshydratation de la goutte. Quel que soit le type de trempage, il est possible de tremper aussi bien des cristaux obtenus par co-cristallisation, en présence d'un complexe de lanthanide, que 3045606 24 des cristaux obtenus en l'absence d'un tel complexe (nommés cristaux natifs dans le cadre de la présente demande de brevet). Le trempage n'entraîne aucune destruction ou modification de la macromolécule biologique. Les complexes de lanthanide permettent de former des cristaux dérivés d'une 5 macromolécule biologique permettant l'obtention de données structurales pour ladite macromolécule biologique. En particulier, l'obtention de données si raies sera obtenue à partir d'un cristal dérivé d'une macromolécule biologique intégrant un complexe de lanthanide qui joue le rôle d'agent phasant. Ces données structurales pourront être obtenues par une méthode haute résolution, telle que la diffraction des 10 Rayons X (RX) ou par une méthode basse résolution, telles que les méthodes SAXS et MASC. Les complexes de lanthanide pourront être u' rés en tant qu'agent phasant en diffraction des RX (cristallisation et analyse de structure) ou en diffusion des RX, ou encore en tant qu'agent de contraste en SAXS ou MASC, en microscopie électronique. 15 L'utilisation des complexes de lanthanide formés d'un ion anide Ln e d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon iinvention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, en tant qu'agent phasant notamment, présente l'avantage de ne pas nécessiter une modification de la macromolécule biologique par génie génétique, comme dans le cas de l'obtention de protéines séléniés. Aucune liaison covalente n'intervient entre le complexe de lanthanide et la macromolécule biologique d'intérêt. Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais ne présentent aucun caractère limitatif. 25 La Figure 1 représente un diagramme de phase illustrant le processus de cristallisation (Extrait de http://people.ds.cam.ac.uk/m1527/publications/assets/leunissen-literature- research.pdf) La Figure 2 représente trois approches différentes : les techniques de la 30 goutte assise (« Sitting drop » en anglais), de la goutte suspendue (« Hanging drop » en anglais) et de la goutte en sandwich (« Sandwich drop » en anglais). 3045606 25 La Figure 3 r la technique de dialyse : autre méthode ue cristallisation qui reste cep moins utilisée que la diffusion de vapeur. La Figure 4 représente schématiquement une technique de cristallisation en batch utilisée pour cristalliser les macromolécules biologiques. 5 La Figure 5 repr:, diagrammes de phase de la protéine lysozyme en absence (à droite) e de complexe 10 ou 17 déterminés à différents temps de cristallisation co.rcHtions, ayant donné des cristaux, sont illustrées par des points noirs, les points beca étant des gouttes claires. La Figure 6 représente des diagrammes de phase du lysozyme de blanc d'oeuf 10 de poule en absence et en présence de 10mM de complexe 11 déterminés après 4 jours de cristallisation. Les conditions donnant des cristaux sont illustrées par des points noirs, les points blancs sont des gouttes claires et les triangles des précipités. La Figure 7 représente des diagrammes de phase de la protéine PB6 en absence et en présence de 10mM de complexe 10 déterminés après un jour de 15 cristallisation. Les conditions donnant des cristaux sont illustrées par des points noirs, les points blancs sont des gouttes claires et les triangles des précipités. La Figure 8 représente des cristaux de pb6 (condition pb6-1) en présence de 10 mM de complexe 10 à droite (13% PEG - 10 mg/ml) et sans complexe 10 à gauche (15 % PEG - 20 mg/ml). 20 La Figure 9 représente la mise en évidence de la luminescence induite dans les cristaux par les complexes de lanthanide. La Figur,,:, 10 représente un spectre de fluorescence X mesuré sur une solution de 10 mivi complexe 10 (à gauche) et traitement par le logiciel CHOOCH (à droite). Les longueurs d'onde pour les enregistrements permettant d'exploiter de 25 manière optimale la diffusion anomale du lanthanide (ici le terbium) sont indiquées par une flèche. La Figure 11 représente des exemples de cartes de densité électronique expérimentale. La Figure 12 reprér.,t des images obtenues au robc cristallisation 30 HTXlab. 3045606 26 Exemples de réalisation Partie I Synthèse et caractérisation des complexes Les abréviations ci-après sont utilisées : Me = méthyle 5 Moz = méthoxybenzyloxycarbonyle Bac = tert-butoxycarbonyle Ms = mésyle Et = éthyle TA = température ambiante 10 Ac = acétyle DCM = dichiorométhane TACN = triazacyclononane DMF = diméthylformamide TFA = acide trifluoroacétique 15 ACN = acétonitrile CCM = chromatographie sur couche mince Produits de départ et caractérisa Tous les produits de départ, solvants L' s de lanthanide ont été achetés chez Sigma-Aldrich®, Acros Organics® et TCI® avec des puretés supérieures à 98% pour les composés organiques et supérieures à 99,99% pour les sels de lanthanide. Ces produits ont été utilisés directement sans purification supplémentaire. Les chromatographies ont été effectuées, d'une part, sur alumine neutre activité III obtenue par hydratation d'alumine Acros Organics® d'activité I (60Â), et d'autre part, sur gel de silice Acros Organics® (60Â). Les complexes formés ont tous 25 été purifiés par colonne d'exclusion stérique LH2O de chez Sephadex®. Les spectres RMN (11-1, 13C) ont été enregistrés sur deux appareils Bruker® Avance opérant respectivement à 500.10 MHz et 125.75 MHz pour 1H et 13C pour l'un, et à 300 MHz pour 1H pour le second. Les déplacements chimiques sont reportés en partie par million (ppm) relativement au signal du tetraméthylsilane 30 13C), les pics résiduels des solvants étant utilisés comme référence interne. Les mesures de masses exactes ont été effectuées au Centre Commun de spectrométrie de Masse (Villeurbanne, France). 3045606 27 A) Préparation d'une première série de ligands/complexes à base de triazacyciononane (TACN) b a OH OH 2 3 / d NH N. M02 e NH H N N brioz 3HCI 4 6 g Boc NH N _ 6 7 Ln r. Tb 10 Eu 11 1 a) HCI (cat.) dans Me0H b) NaBH4 dans DCM/Me0H c) MsCI, Et3N dans DCM d) Mozon, Et3N dans ACN e) Boc-0-succinimide dans DCM f) H2, Pd/C dans Me0H g) Na2CO3 dans Me0H/H20 h) TFA dans DCM i) Na2CO3 dans ACN j) Na2CO3 dans H20 puis LnCI3,6(H20) avec Ln=Tb ou Eu 10 Le composé 6 a été préparé selon la procédure précédemment décrite dans la demande de brevet W02013/011236A1. 3045606 28 Al Préparation du compw: OMe OMe A une suspension de 20 g d'acide dipicolinique (0,12 mol, léq.) dans 120 mL de méthanol, on ajoute 1 mL d'acide sulfurique concentré. Le mélange est porté à reflux 5 pendant 24h. Après refroidissement, le produit cristallisé est filtré et rincé au méthanol froid pour donner, après séchage, 18 g de poudre cristalline blanche du composé 1 (R = 78%). 'H-NMR (300 MHz, CDCI3) (ppm) 8.26 (d, 3 = 8 z, 2H), 7.99 (t, J = 8 Hz, 1H), 3.98 (s, 6H). 10 A2) Préparation du composé 2 fi ( OH ')Me 18 g de composé 1 (92 mmol, éq.) sont dissouts dans 450 ml de méthanol et refroidis à 0°C. 3,8 g de NaBH4 (101,2 mmol, 1,1 éq.) sont alors ajoutés. Le mélange est ensuite agité 30 min à 0°C et 30 min supplémentaires en laissant la température 5 remontée lentement jusqu'à TA. La réaction est stoppée par ajout de 50 mL de HO (1M dans H20), puis, la phase organique est extraite avec 100 mL de dichiorométhane. Après, lavage de la phase organique avec de la saumure (jusqu'à pH = 7), séchage avec Na2SO4 et évaporation, le produit obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant: DCM/AcOEt 9/1 v/v jusqu'à AcOEt pur). On 20 obtient 6 g d'un solide blanc du composé 2 (R = 4O%). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) à (ppm) = 8.01 8 Hz, 1 ) 7.84 (t, = 8 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 8 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 3 Hz, 21-i), 3.98 (s, 3H), 3.69 (bs, 1H). o 3045606 29 A3) Préparation du composé 3 A une solution de 1,2 g de l'alcool 2 dans 50 mL de dichlorométhane à 0°C, on ajoute 3mL de Et3N (22 mmol, 3,2 éq.) puis, rapidement, 0,79 mL de chlorure de 5 mésyle (10,2 mmol, 1,Séq.). On laisse ensuite le mélange revenir à température ambiante avant de le chauffer pendant 1h à 50°C. On ajoute ensuite 40 mL d'eau et on extrait le mélange au dichlorométhane (3x20 mL). Le résidu huileux obtenu, après séchage et évaporation des phases organiques, est finalement purifié sur gel de silice (éluant : CH2Cl2) pour obtenir une huile incolore du composé 3 qui cristallise au 10 congélateur. NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8.12 d, J = 7.7 Hz, H , 7.93(tJ = 7.8 Hz, H, H10), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1I-1), 5.44 (s, 2H, 1-17), 4.01 (s, 3H, OMe), 3.15 (s, 3H, OMs). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) 5 165.33 (C13), 154.59 (s), 147.92 (s), 138.45 (C10), 125.41 (s), 125.13 (s), 71.11 (C7), 53.23 (OMe), 38.24 (0Ms). 15 A4) Préparation du composé 6 Boc. 1 \ N HN 2HC1 Le composé 6 est préparé par la méthode précédemment décrite. (a) W02013011236A1 b) 1.S. J. Butler, B. K. McMahon, R. Pal, D. Parker and J. W. Walton, Chem. Eur. J., 2013, 19, 9511-9517.) 20 3045606 30 A5) Préparation du composé 7 i 0 6 C:)'-'r\j N 4 REVENDICATIONS1 - Complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln3÷ et d'un ligand de formule (I) : X -N Y dans laquelle : - X et Y, identiques ou différents, représentent, chacun indépendamment, -CH2-(CH2)'-, -C1-12-(CH2)n-A-CH2CH2- ou -CH2-CR31114-C -, X se lisant sur la formule générale (I) de la gauche vers la droite et Y se lisant sur la formule générale (I) de la droite vers la gauche, avec : o n qui est égal à 1, 2 ou 3 ; A qui représente -NR2-, -0(CH2)20- ou -0-, avec R2 qui est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R5, R5 représentant un groupe phényle, pyridinyle ou picolinyle ; R3 qui représente un groupe méthyle ; et o R'4 qui représente -NHR4, R4 représentant -H, -CH3, -CH2R6 ; R6 représentant un groupe phényle ou pyridinyle R1 représente : R7 avec : R7 qui représente -000, -CONH2, -CONHR9, - R 00, ou un groupe choisi (I) Rg N parmi : 3045606 93 avec R9 qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle ; et o R8 qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH2 ; 5 étant entendu qu'au moins un des enchainements X et Y est différent de -CH2-(0-12)n-, et leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates ; à l'exception des complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln3 et d'un ligand répondant à l'une des formule I.1) à (I.5) suivantes, et de leurs sels avec un 1 0 anion, leurs solvats et hydrates 00C "00C C 3045606 94 00C 00C -°0C C00- (1.5). 2 - Complexes selon la revendication 1 formés avec un ligand répondant à l'une des formules suivantes : 3045606 95 R4 H3C R1 (IB) (IC) N (IF) avec R1, R2, n et R4 qui sont tels que définis à la revendication 1, ainsi que leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates. 3 - Complexes selon la revendication 1 ou 2 sous la forme d'un sel avec un 5 anion choisi parmi : Cl-, Br, F, NO3-, triflate, PF6-, SbF6-, B(Ph)4-, BF4-, les sulfates, carbonates, phosphates et carboxy ates. 4 - Complexes selon l'une des revendications 1 à 3 formés avec un ligand répondant à la formule (IA) : (LA) 10 dans laquelle n=1 et R2=H, et R1 est tel que défini à la revendication 1, ainsi que leurs sels avec un anice, solvats et hydrates. 5 - Complexes selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R1 eprésente avec : 3045606 96 - R7 qui représente -000 ou -PR900 avec R9 qui représente un groupe méthyle ou éthyle ; ou bien R7 qui représente un groupe: - R8 qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode; ainsi que leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates. 5 6- Complexes selon la revendication 1. choisis parmi les complexes de + 10 ainsi que leurs sels avec un anion, en particulier leur sel chlorhydrate, leurs solvats et hyd rates. 7- Complexes selon l'une des revendications 1 à 6, avec un ion lanthanide n3+, Ln étant Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb ou Lu, avec Eu, Tb, Yb et Lu qui sont préférés. 15 8- Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que définie à la revendication 1, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à la cristallisation l'une macromolécule biologique. 3045606 97 9 - Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que le complexf est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de cristallisation d'une macromolécule biologique. 10 - Utilisation selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que, 5 dans le complexe, Ln =Eu ou Tb et le complexe est également utilisé en tant qu'agent luminescent pour la détection de cristaux. 11 - Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que définie à la revendication 1, ou d'un de 10 leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à l'obtention de données structurales d'une macromolécule biologique. 12 - Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que le complexe est utilisé en tant qu'agent phasant lors de la détermination structurale par diffraction des rayons X. 15 13 - Utilisation selon la revendication 11 ou 12 caractérisée el que, dans le complexe, Ln =Eu ou Tb et le complexe est également utilisé en qu'aide au positionnement du cristal dans un faisceau de rayons X. 14 - Utilisation selon l'une des revendications 8 à 13 caractérisée en ce que la macromolécule biologique est choisie parmi les peptides, les protéines et les acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN. 15 - Cristal dérivé d'une macromolécule biologique comprenant un complexe selon l'une des revendications 1 à 7 ou un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (I.1) à (1.5) telle que définie à la revendication 1, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate. 16 - Cristal dérivé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la macromolécule biologique est choisie parmi les peptides, les protéines et les acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN. 17 - Procédé de cristallisation d'une macromolécule biologique, préférence choisie parmi les peptides, les protéines et les acides nuc notamment les ADN ou ARN, comprenant les étapes suivantes - disposer d'une. solution comprenant ladite macromolécule biologique c.. u . complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un complexe 3045606 98 cationique formé d'un ion lanthanide Ln3+ et d'un ligand de formule I.1) à (1.5) telle que définie à la revendication 1, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate, - obtenir des cristaux de la macromolécule biologique à partir de ladite solution. 5 18 - Procédé de cristallisation selon la revendication 17 caractérisé ce que la solution comprend, en outre, un agent précipitant choisi parmi les sels que les sels d'ammonium, les sulfates, acétates, phosphates, citrates, formiates, tartrates tels que le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, les chlorures, iodures et fluorures, par exemple NaCI ; les 10 polymères tels que les polyéthylèneglycols et la Jeffamine T; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol, le glycérol, l'isopropanol, 2-méthyl-2,4-pentanediol. 19 - Procédé de cristallisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que dans la solution, le complexe est présent à une concentration de 1 à 100 mM, préférentiellement à une concentration de 1 à 25 mM, et de manière 15 encore plus préférée à une concentration de 10 mM ± 10%. 20 - Procédé de cristallisation selon la revendication 17, 18 ou 19, caractérisé en ce que l'obtention de cristaux est réalisée par cristallisation par diffusion de vapeur, par dialyse, er batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides. 20 21 - Procédé d'analyse ou de détermination de la structure d'une macromolécule biologique comprenant les étapes suivantes a) disposer d'un cristal dérivé de la macromolécule biologique tel que défini à la revendication 15 ou 16, b) analyser la structure cristalline de la macromolécule biologique à partir 25 dudit cristal dérivé. 22 - Procédé d'analyse ou de détermination selon la revendicatiu 21 caractérisé en ce que le cristal dérivé est obtenu selon un procédé de cristallisuion selon l'une quelconque des revendications 17 à 20. 23 - Procédé d'analyse ou de détermination selon la revendication 21 30 ou 22 caractérisé en ce que le cristal dérivé est obtenu par trempage d'un cristal de .3 macromolécule biologique dans une solution d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln 3045606 99 et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que définie à la revendicà , ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates. 24 - Procédé d'analyse ou de détermination selon la revendication 21 ou 22 caractérisé en ce que le cristal dérivé est obtenu par trempage d'un cristal 5 dérivé de la macromolécule biologiq- r",htenu selon un procédé de cristallisation selon l'une quelconque des revendicail 1.7 à 20, dans une solution d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 7 ou J'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que définie à la revendication 1, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates. 25 - Procédé d'analyse ou de détermination selon l'une quelconque des revendications 21 à 24 caractérisé en ce que l'analyse de la structure cristalline de l'étape b) correspond à la détermination de la structure de la macromolécule biologique réalisée par diffraction des Rayons X (RX) ou à l'obtention de données structurales par la méthode SAXS ou MASC. 15