FR 3044875 A1 20170616 FR 1562192 A 20151211 1 APPÂT RODONTICIDE COMPRENANT DU BRODIFACOUM ET PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES L'invention concerne un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. 5 L'invention concerne également un procédé de séparation des stéréo-isomères de configuration du brodifacoum. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre le développement de populations de rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 0 147 052 que le stéréo-isomère « trans » du brodifacoum est métabolisé plus rapidement que le stéréo-isomère « cis » dans 10 les tissus d'espèces non-cible et non-rongeurs et que l'utilisation de ce stéréo- isomère « trans » du brodifacoum permet de diminuer les risques d'empoisonnement de ces espèces non-cible. En particulier EP 0 147 052 décrit un appât rodonticide comprenant du brodifacoum sous forme de stéréo-isomère « trans » dans une proportion de 50 ppm. 15 Un tel appât est susceptible d'être consommé par des animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation 20 peut induire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou chez ces humains un empoisonnement qui peut être létal. En outre, une fraction du brodifacoum de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux, en particulier des rapaces- prédateurs ou 25 charognards de rongeurs nuisibles et notamment de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entrainer à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux-appartenant à des espèces protégées. 30 L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en proposant un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et un procédé de 3044875 2 lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent cependant de limiter les risques d'empoisonnement d'espèces non cibles, par exemple des animaux domestiques ou des animaux de compagnie, ou encore des humains, susceptibles de consommer accidentellement de tels appâts rodonticides. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en proposant un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent cependant de limiter les risques d'empoisonnement par consommation secondaire d'animaux domestiques (animaux de compagnie ou d'élevage) ou sauvages -par exemple des renards ou des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles ayant consommé de l'appât rodonticide ou charognards de cadavres de rongeurs cibles nuisibles empoisonnés. L'invention vise aussi à proposer un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en oeuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un appât rodonticide 20 comprenant du brodifacoum et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cible. L'invention vise aussi à proposer à proposer un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et un procédé de lutte contre des 25 rongeurs cibles nuisibles qui sont susceptibles d'être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles devenus résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention vise donc aussi à proposer une alternative à des appâts rodonticides connus. 30 Pour ce faire, l'invention concerne un appât rodonticide comprenant du brodifacoum et au moins un excipient comestible pour des 3044875 3 rongeurs cibles nuisibles, caractérisé en ce que l'appât rodonticide comprend une quantité d'un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E3, du brodifacoum telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de brodifacoum dans l'appât rodonticide est inférieur à 10%, ledit énantiomère E3 présentant, par 5 analyse chromatographique d'une composition de brodifacoum comprenant quatre stéréo-isomères de configuration du brodifacoum, un temps de rétention t3 de valeur telle que t1 382,1 et m/z 541,1 -> 161 correspondant aux signaux du brodifacoum. Les valeurs des temps de rétention de chacun des énantiomères du brodifacoum sont, dans les conditions décrites, de : - t1 = 15,4 min pour l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,4 ; 25 - t2 = 17,2 min pour l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D2,3 ; - t3 = 19,9 min pour l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D2,3, et ; - t4 = 26,3 min pour l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D1,4. Les valeurs des temps de rétention t1, t2, t3 et t4 sont susceptibles de varier selon des variations des conditions chromatographiques et 30 notamment avec la température de la colonne de chromatographie. Cependant, dans ces conditions chromatographiques, l'ordre d'élution des stéréo-isomères de 3044875 22 configuration du brodifacoum reste inchangé. À titre indicatif, pour une variation de température de quelques degrés Celsius, la valeur du temps de rétention (t1) dudit énantiomère E1 peut varier entre 15,0 min et 15,7 min, la valeur du temps de rétention (t2) de l'énantiomère E2 du diastéréoisomère D2,3 peut varier entre 5 16,9 min et 17,5 min, la valeur du temps de rétention (t3) de l'énantiomère E3 du diastéréoisomère D2,3 peut varier entre 18,8 min et 20,0 min et la valeur du temps de rétention (t4) dudit énantiomère E4 peut varier entre 26,0 min et 27,5 min. Extraction du brodifacoum des foies de rats gavés avec du 10 brodifacoum Homogénéisation de l'échantillon de foie On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL On ajoute 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un 15 homogénéisateur/disperseur UltraTurrax® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On 20 soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C de façon à former un extrait sec. Élimination des lipides Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution 25 d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé des lipides est séché sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex. 3044875 23 Extraction du brodifacoum sur phase solide (« SPE, Solid Phase Extraction ») On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH2Ct2), puis 1 mL de méthanol (CH3OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une 5 cartouche Oasis HLB lcc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (1mL Me0H/H20 Milli-Q) et contenant le brodifacoum en tête de la cartouche préalablement conditionnée et à raison de 1 goutte toutes les 3 à 4 sec. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 10 1 mL de solution de lavage formée de méthanol (CH3OH) et d'eau ultra-pure (H2O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la colonne par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d' élution formée de dichlorométhane (CH2C12) et de méthanol (CH3OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de 15 cartouche un éluat comprenant le brodifacoum. On évapore le solvant de l'éluat sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans avec 0,5 mL d' acétonitrile (NC-CH3) et on filtre la solution d' acétonitrile contenant le brodifacoum sur filtre de porosité 0,2 ium. Rémanence hépatique des stéréo-isomères (E1, E2, E3 et E4) 20 de configuration du brodifacoum chez le rat On administre par voie orale (« peros ») à des rats de laboratoire (rats Sprague Dawley, Charles River, Saint germain sur l'Arbresle, France) mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant entre 180 et 200 g, une solution comprenant du brodifacoum dans un mélange d'huile végétale et de 25 DMSO à 5 % de façon que la quantité de brodifacoum ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 2,3 mg par kilogramme de rat. Les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine K1 à raison de 1U par rat. À 1 jour (J+1), 2 jours (J+2), 5 jours (J+5), 7 jours (J+7) et 30 9 jours (J+9) après le gavage, on euthanasie 6 rats préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait du foie et on 3044875 24 dose les quantités de chacun des énantiomères du brodifacoum présents dans le foie des rats gavés. Les résultats obtenus sur les rats (mâles et femelles) sont donnés au tableau 1 ci-après dans lequel les valeurs de la concentration de chacun des énantiomères du brodifacoum dans le foie sont la moyenne des 5 valeurs mesurées sur 6 rats et exprimées en nanogramme (ng) par gramme de foie. Concentration J+1 J+2 J+5 J+7 J+9 hépatique, ng/g Énantiomère El 2956,5 2025,5 1487 892 442 Énantiomère E2 7425 4980 3400 1869,5 1054 Énantiomère E3 13563,5 8700 8911,5 7762,5 5862,5 Énantiomère E4 2484,5 1921 1533 1311 860 Tableau 1 La figure 2 représente l'évolution du pourcentage de la quantité massique de chaque énantiomère (E1 et E4) du diastéréoisomère D1,4 et 10 de chaque énantiomère (E2 et E3) du diastéréoisomère D2,3 par rapport à la quantité de brodifacoum retenue dans le foie des rats gavés et euthanasiés à J+1, J+2, J+5, J+7 et J+9. Le pourcentage dudit énantiomère El est représenté par des colonnes à hachures obliques, le pourcentage dudit énantiomère E4 est représenté par des colonnes blanches, le pourcentage dudit énantiomère E2 est représenté par 15 des colonnes à hachures horizontales et le pourcentage dudit énantiomère E3 est représenté par des colonnes noires. Les proportions respectives de chacun des énantiomères (E1 et E4) du diastéréoisomère D1,4 et des énantiomères (E2 et E3) du diastéréoisomère D2,3 dans le brodifacoum de la composition de gavage sont représentées en colonne « X » figure 2 et sont de 15% pour l'énantiomère El et 20 de 15% pour l'énantiomère E4 et de 35% pour l'énantiomère E2 du diastéréoisomère D2,3 et de 35% pour l'énantiomère E3 du diastéréoisomère D2,3. Ledit énantiomère E3 est l'énantiomère du brodifacoum qui est le plus rémanent dans le foie des rats et le plus toxique pour l'environnement. 3044875 25 Rémanence hépatique de l'énantiomères E4 du diastéréoisomère D14 du brodifacoum chez le rat mâle et le rat femelle On procède comme précédemment en analysant séparément la rémanence de l'énantiomère E4 du brodifacoum dans le foie des 5 rats mâles et dans le foie des rats femelles. Les résultats obtenus dans le groupe de 3 rats mâles et dans le groupe de 3 rats femelles sont donnés au tableau 2 ci-après dans lequel les valeurs de la concentration de l'énantiomère E4 du brodifacoum dans le foie des rats mâles et des rats femelles sont la moyenne des valeurs de concentration 10 mesurées sur 3 rats et exprimées en nanogramme (ng) par gramme de foie. Ces résultats sont aussi représentés en figure 3 dans laquelle l'évolution de la concentration de l'énantiomère E4 du brodifacoum dans le foie des rats mâles est représentée par des colonnes à hachures obliques et l'évolution de la concentration de l'énantiomère E4 du brodifacoum dans le foie des rats femelles 15 est représentée par des colonnes noires. Concentration hépatique J+1 J+2 J+5 J+7 J+9 dudit énantiomère E4, ng/g Mâles 321 79 131 3 0 Femelles 4648 3763 2935 2619 1720 Tableau 2 La concentration dudit énantiomère E4 selon l'invention est plus faible, voire nulle, chez les mâles alors qu'elle reste élevée chez les femelles au moins jusqu'à J+9. Un appât rodonticide comprenant majoritairement dudit 20 énantiomère E4 permet de viser spécifiquement des rongeurs cibles nuisibles femelles, de limiter le nombre de portées de rongeurs cibles nuisibles et de limiter la quantité résiduelle dudit énantiomère E4 selon l'invention dans le foie des rongeurs cibles nuisibles mâles susceptibles d'être consommé par des prédateurs ou charognards de ces rongeurs cibles nuisibles. 25 Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, un appât rodonticide et un 3044875 26 procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât rodonticide que dans les modes de mise en oeuvre du procédé. 5 REVENDICATIONS1/ - Appât rodonticide comprenant du brodifacoum et au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles, caractérisé en ce que l'appât rodonticide comprend une quantité d'un stéréo-isomère de 5 configuration, dit énantiomère E3, du brodifacoum telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de brodifacoum dans l'appât rodonticide est inférieur à 10%, ledit énantiomère E3 présentant, par analyse chromatographique d'une composition de brodifacoum comprenant quatre stéréo-isomères de configuration du brodifacoum, un temps de rétention t3 de valeur telle que t1