FR 3040789 A1 20170310 FR 1558224 A 20150904 1 Procédé de détermination de l'existence d'un risque de récidive d'un cancer basé sur la détection d'EGFR La présente invention est relative à un procédé de détermination de l'existence d'un risque de récidive, en particulier d'un risque de récidive métastatique, chez des patients souffrant d'un cancer colorectal de stade II ou III. Etat de la technique Le cancer colorectal (CRC) représente 10% à 15 % de tous les cancers et est la principale cause de décès par cancer dans le monde occidental. 40 % à 50 % des patients qui subissent une chirurgie potentiellement curative sans autre forme de traitement rechutent et meurent d'une maladie métastatique. L'indicateur de pronostic le plus important pour la survie dans le cancer du côlon est le stade de la tumeur, qui est déterminé par la profondeur de pénétration à travers la paroi intestinale et le nombre de ganglions lymphatiques envahis (système TNM). Chez les patients dits de stade II, il y a pénétration tumorale à travers la paroi de l'intestin mais pas d'envahissement des ganglions lymphatiques régionaux ou de métastases. Bien que la survie globale dans ce sous-groupe de patients soit d'environ 70% -80% 5 ans après la chirurgie, il a été reconnu qu'il existe un sous-groupe de patients de stade II présentant un pronostic clinique similaire à celui des patients ayant un cancer colorectal de stade III. Actuellement, ces patients à haut risque sont identifiés par la présence de tumeurs qui non seulement pénètrent la paroi intestinale, mais montrent également des signes d'infiltration péri-nerveuses, d'embolie vasculaire, d'adhésion ou d'invasion des structures environnantes, de perforation, d'obstruction ou d'aneuploïdie. Des données récentes utilisant des marqueurs moléculaires tels que la perte d'hétérozygotie (LOH) du chromosome 18q ou la présence de tumeurs sans instabilité de microsatellites, ont permis d'identifier un sous-groupe de patients de stade II de très mauvais pronostic vital et pour lequel un traitement par chimiothérapie pourrait être bénéfique. Au cours des 15 dernières années, le développement de la chimiothérapie adjuvante administrée après ablation chirurgicale des tumeurs chez les patients avec une maladie de stade III a permis de réduire le risque de réapparition d'un cancer lié à la présence de 3040789 2 cellules tumorales non détectables après chirurgie. Plusieurs milliers de patients atteints de CRC ont été inclus dans les essais cliniques pour évaluer le bénéfice potentiel de diverses combinaisons d'agents chimio thérapeutiques. Depuis la conférence consensus des National Institutes of Health (NIH, USA) en 1990, 5 l'administration de 5-fluorouracil (FU) en traitement adjuvant pour tous les patients CRC de stade III est devenue un standard de soins et a abouti à 30%-40% de diminution des taux de rechute et de mortalité par rapport à un traitement par chirurgie seule. À l'époque, le panel n'a pas recommandé de traitement adjuvant pour les patients de stade Il en dehors du domaine des essais cliniques, dans la mesure où les données cliniques 10 disponibles à l'époque ne permettaient pas de justifier une telle recommandation. L'un des problèmes des études cliniques impliquant des patients de stade II réside dans la difficulté à travailler avec des cohortes suffisamment importantes en raison du pronostic favorable global de ce sous-groupe de patients. Dans les études portant sur les chimiothérapies adjuvantes, la plupart des essais cliniques ont ainsi inclus des patients à 15 la fois de stades II et III, et la plupart de ces essais comprenaient un nombre trop faible de patients de stade II pour détecter tout bénéfice thérapeutique de traitement adjuvant des patients de stade II. Ainsi et à ce jour, la chimiothérapie adjuvante est seulement recommandée pour les patients ayant un cancer colorectal de stade III et la majorité des patients de stade II sont uniquement traités par chirurgie, et cela en dépit de la 20 connaissance du fait qu'un sous-groupe de mauvais pronostic pourrait probablement bénéficier d'une chimiothérapie adjuvante. Il existe un besoin pour des biomarqueurs fiables permettant d'identifier les patients de stade II ou III à risque de récidive métastatique, et pour lesquels une chimiothérapie adjuvante serait indiquée. 25 Description des figures La Figure 1 représente les caractéristiques de la cohorte de patients. La Figure 2 représente le protocole de dosage d'EGFR par FRET sur coupes FFPE. La Figure 3 représente la probabilité de survie sans récidive métastatique (« relapse-free 30 survival ») en fonction du temps pour les patients de la cohorte présentant un taux 3040789 3 d'expression d'EGFR faible (« low-EGFR expression ») ou élevé (« high EGFR expression ») sur coupes FFPE. La Figure 4 représente la corrélation entre le taux de survie sans récidive à 5 ans et le stade du cancer, la quantité d'EGFR évaluée par FRET ou par immunohistochimie. 5 La Figure 5 représente la corrélation entre le taux de survie sans récidive à 5 ans, la quantité d'EGFR évaluée par FRET ou par immunohistochimie avec différents anticorps. La Figure 6 représente le protocole de dosage d'EGFR par FRET sur cryosections. La Figure 7 représente la probabilité de survie sans récidive métastatique en fonction du temps pour les patients de la cohorte présentant un taux d'expression d'EGFR faible ou 10 élevé (mesure sur cryosections). Description de l'invention Les inventeurs ont découvert que la détermination quantitative de l'expression de la protéine EGFR par une approche TR-FRET dans un échantillon de tissu d'un patient atteint 15 d'un cancer colorectal de stade II ou III était un facteur indépendant de pronostic du risque de récidive. Par « récidive », on entend : soit le développement d'un nouveau cancer dans un organe qui a déjà été atteint au préalable par une première tumeur maligne, soit la réapparition du premier cancer (rechute) après une période de rémission 20 complète, qu'elle soit locale (au même endroit que le cancer de départ), régionale (métastases dans les ganglions lymphatiques qui drainent l'organe atteint par le cancer de départ) ou à distance, dans un autre organe, soit une récidive métastatique, à savoir le développement d'une colonie secondaire de cellules cancéreuses qui s'installent et se développent à distance du 25 cancer initial. Au sein d'une cohorte de patients de stade II ou III, les inventeurs ont ainsi déterminé que les taux élevés de protéine EGFR étaient corrélés de manière significative avec un mauvais pronostic, avec un risque de récidive. Les patients ainsi identifiés comme présentant un risque de récidive peuvent faire l'objet 30 d'un suivi médical plus approfondi et surtout un traitement par chimiothérapie peut leur être proposé. Cela est particulièrement avantageux pour les patients de stade II pour 3040789 4 lesquels un traitement par chimiothérapie n'est pas systématiquement mis en place, et pour lesquels l'invention peut potentiellement apporter un bénéfice très significatif. De manière plus précise, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade 5 Il ou III, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient, (ii) comparaison du niveau d'expression obtenu a l'étape (i) avec une valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un 10 risque de récidive, ladite détermination étant effectuée par la mesure de la fluorescence émise en temps résolu par un couple de partenaires de FRET mis en contact avec ladite coupe d'échantillon de tissu, le premier membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un premier ligand capable de se lier à un premier domaine de la protéine 15 EGFR, le second membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un second ligand capable de se lier à un second domaine de la protéine EGFR, lesdits premier et second domaines de la protéine EGFR étant différents, ledit couple de partenaires de FRET étant constitué d'un composé fluorescent donneur et d'un composé fluorescent accepteur. 20 On entend ici par « domaine » une partie de la séquence protéique constituant l'EGFR cette partie interagissant avec un ligand capable de la reconnaitre. Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux pour les patients de stade II. Par « couple de partenaires de FRET» on entend un couple constitué d'un composé fluorescent donneur d'énergie (ci-après « composé fluorescent donneur ») et d'un 25 composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé fluorescent donneur, ces composés émettent un signal de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Forster Resonance Energy Transfer ») qui correspond à la mesure de la fluorescence émise par le couple de partenaires de FRET. 30 L'échantillon de tissu tumoral est un échantillon de tissu prélevé sur un patient (tissu dit « natif »), comme par exemple un échantillon prélevé dans le cadre d'une biopsie, y 3040789 5 compris par une biopsie d'aspiration à l'aiguille fine, ou encore une pièce d'exérèse. Avant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le prélèvement est préparé sous forme de coupes, en particulier sous forme de coupes FFPE (acronyme de l'expression anglaise « formalin fixed paraffin embedded », c'est-à-dire enrobées dans de la paraffine 5 et fixées par formaldéhyde), ou encore de cryosections. Les techniques de préparation de tissu sous forme de coupes FFPE sont connues de l'homme du métier : elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec du formaldéhyde, son inclusion dans de la paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence 10 avec une épaisseur d'environ 1 à 50 um). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur rinçage à l'éthanol puis à l'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de même que la régénération des épitopes par la technique HIER (acronyme de l'expression anglaise « heat induced eptitope recovery », décrite notamment dans le brevet US 8 067 241). De manière alternative, le procédé 15 selon l'invention peut également être mis en oeuvre sur des cryosections, de préférence de 1 à 50 um d'épaisseur, également préparées selon les techniques classiques. Le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape d'homogénéisation ou de lyse de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire. Cette étape peut être mise en oeuvre postérieurement à la mise en contact du couple de partenaires 20 de FRET avec la coupe d'échantillon (conjugués au donneur et à l'accepteur), et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET, ou bien préalablement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. 25 L'homogénéisation de l'échantillon de tissu peut être effectuée par un traitement mécanique connu de l'homme du métier, qui peut être choisi parmi : l'application d'ultrasons (sonication), des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. Un 30 exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer a l'échantillon des ultrasons (sonication) à une fréquence > 16 000 Hz (de préférence 20 000Hz), à une 3040789 6 puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 15 secondes, et de préférence pendant 4 à 15 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le traitement pour limiter leur échauffement. Lorsque l'échantillon biologique est préparé sous forme d'homogénat, il peut être dilué 5 selon un facteur de dilution qui dépend de plusieurs facteurs et en particulier de l'affinité des ligands fluorescents avec la protéine EGFR. Ces dilutions relèvent de mise au point de routine pour l'homme du métier spécialiste de la détection de protéines dans des milieux biologiques. L'échantillon est dilué de préférence après son homogénéisation sous forme de lysat cellulaire et avant sa distribution dans un ou plusieurs contenants. 10 Du fait de la variabilité de la quantité de matériel biologique d'une coupe d'échantillon à l'autre, il est recommandé de normaliser le signal obtenu par une référence interne à l'échantillon. Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de normalisation du signal de FRET par une valeur représentative de la quantité de matériel biologique présent dans la coupe d'échantillon. Dans une première variante de cette mise 15 en oeuvre, le procédé selon l'invention comprend une étape d'incubation de la coupe d'échantillon de tissu avec un agent de marquage émettant un signal proportionnel à la quantité de matériel biologique présent dans l'échantillon, cette étape étant préalable à toute éventuelle étape de lavage, ainsi qu'une étape de normalisation du signal de FRET par le signal correspondant à cet agent de marquage. De préférence, l'agent de marquage 20 est un agent de marquage fluorescent de l'ADN (tel qu'un agent intercalant comme le compose Hoechst 33342, ou encore un colorant de l'ADN comme le SYBR Green), et le signal de FRET correspondant à la protéine EGFR est normalisé par le signal correspondant à la fluorescence de cet agent de marquage. Cette approche est décrite par exemple dans la demande de brevet WO 2013/124544 au nom de Cisbio Bioassays. 25 La normalisation peut également être effectuée en utilisant d'autres types d'agents de marquage, en particulier des composés fluorescents, tels que le chlorure de dansyle ou le NBD (nitrobenzoxadiazole) : ces composés, disponibles dans le commerce, se lient aux fonctions amines, notamment des protéines. Y.Uratani et al. décrivent un protocole de marquage de cellules avec le chlorure de dansyle (Journal of Bacteriology 1982 p. 523- 30 528). Une fois les cellules marquées, l'invention peut être mise en oeuvre avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant. 3040789 7 Dans une seconde variante de cette mise en oeuvre comprenant la normalisation du signal de FRET correspondant à la protéine EGFR, la référence interne est une caractéristique mesurée sur une coupe de tissu adjacente à la coupe d'échantillon sur laquelle le FRET est mesuré, telle que le nombre de noyaux, le nombre de cellules, la 5 surface des noyaux, avantageusement la référence interne est constituée par la surface des noyaux de cellules présentes dans l'échantillon. Dans cette variante, l'étape de normalisation comprend ainsi : - la mise en oeuvre de moyens informatiques pour l'acquisition de l'image d'une deuxième coupe de l'échantillon de tissu, cette deuxième coupe étant adjacente à 10 la coupe d'échantillon de tissu destinée à être mise en contact avec le couple de partenaires de FRET, et - l'analyse de cette image pour déterminer une valeur représentative d'un paramètre choisi parmi : le nombre de noyaux de cellules présents dans ladite deuxième coupe; le nombre de cellules présentes dans ladite deuxième coupe ; la 15 surface des noyaux des cellules présentes dans ladite deuxième coupe. De préférence, l'analyse de ladite image est effectuée par un logiciel mesurant la surface des noyaux des cellules présents dans ladite deuxième coupe (tel que le logiciel Histolab de la société Microvision Instruments), la valeur obtenue étant utilisé pour normaliser le signal de FRET. 20 Dans une troisième variante de cette mise en oeuvre comprenant la normalisation du signal de FRET correspondant à la protéine EGFR, la référence interne est une deuxième protéine, différente de l'EGFR, dont la quantité est mesurée par TR-FRET. Cette deuxième protéine peut être notamment une protéine de ménage ou encore une protéine caractéristique d'un état physiopathologique donné. Cette approche est décrite dans la 25 demande de brevet FR15 51191 déposée le 13 février 2015 au nom de Cisbio Bioassays. Protocoles préférés Dans un premier protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre sur une cryosection dudit échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : 30 a) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, 3040789 8 b) Incubation, c) Lavage, d) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, e) Transfert en microplaques, 5 f) Lecture du FRET. Dans un second protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre sur une coupe dudit échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, 10 b) Régénération des épitopes, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lavage, 15 f) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, g) Transfert en microplaques, h) Lecture du FRET. Dans un troisième protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre sur une cryosection dudit échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : 20 a) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, b) Transfert en microplaque, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, 25 e) Lecture du FRET. Dans un quatrième protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre sur une coupe dudit échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, 30 b) Régénération des épitopes, c) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 3040789 9 d) Transfert en microplaque, e) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, f) Incubation, 5 g) Lecture du FRET. Valeur de référence La valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive peut varier en fonction des caractéristiques techniques du dosage, 10 notamment les caractéristiques spectroscopiques du couple de partenaires de FRET, et l'affinité des premiers et seconds ligands spécifiques de la protéine EGFR. Néanmoins, pour un dosage donné, c'est-à-dire une fois le couple de partenaires de FRET et les ligands capables de se lier à l'EGFR choisis, cette valeur de référence peut être établie une seule fois comme étant par exemple la valeur médiane observée dans une population de 15 patients souffrant d'un cancer colorectal de stade II ou III. L'homme du métier du domaine de l'analyse statistique est à même de déterminer une autre valeur de référence, à partir des mesures observées dans cette population, pour une discrimination optimale des patients présentant un risque de récidive. 20 Les ligands spécifiques de la protéine EGFR Dans une mise en oeuvre préférée, le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR, et dans une mise en oeuvre particulière, ils se lient à des domaines localisés dans la partie intracellulaire de cette protéine. Le terme « anticorps » doit ici être pris au sens large et comprend toute protéine de la famille des 25 immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à la protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fab, Fab', des anticorps simple chaîne ou simple domaine, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines. L'homme du métier est à même de fabriquer des anticorps spécifiques de la protéine 30 EGFR en utilisant les techniques classiques. Des anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du métier veillera à sélectionner des anticorps 3040789 10 reconnaissant des épitopes différents sur la protéine EGFR, cela pour permettre la fixation simultanée de l'anticorps marqué par le donneur et de celui marqué par l'accepteur. Dans une mise en oeuvre préférée, lesdits premier et second ligands sont des anticorps 5 capables d'inhiber la liaison des anticorps de lapin D38B1 et C74B9 à la protéine EGFR de plus de 75 % (« D38B1 » et « C74B9 » désignent les références de deux clones d'anticorps monoclonaux de lapin). Ces deux anticorps sont préférés. Les ligands spécifiques peuvent également être des aptamères ou autres bioprobes. Dans le cas ou la coupe d'échantillon est sous forme de cryosection, les ligands naturels de la 10 protéine EGFR, tel que les amphirégulines ou l'EGF, peuvent être utilisés. Marquage des ligands par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie Les ligands peuvent être marqués par les fluorophores de manière directe (covalente) ou indirecte. De manière préférée, au moins un des partenaires de FRET est lié de manière 15 covalente au premier ou au second ligand, et de manière encore plus préférée, les deux partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second ligand. Le marquage direct d'un ligand par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de 20 groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand ou l'anticorps. Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur 25 est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : 30 3040789 11 Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison acrylamide thiol thioéther halogénure d'acyle amine/aniline carboxamide aldéhyde amine/aniline imine aldéhyde ou cétone hydrazine hydrazone aldéhyde ou cétone hydroxylamine oxime alkylsulfonate thiol thioéther anhydride amine/aniline carboxamide halogénure d'aryle thiol thiophénol halogénure d'aryle amine arylamine aziridine thiol thioéther carbodiimide acide carboxylique N-acylurée ou anhydride ester activé* amine/aniline carboxamide haloacétamide thiol thioéther halotriazine amine/aniline aminotriazine imido ester amine/aniline amidine isocyanate amine/aniline Urée isothiocyanate amine/aniline thiourée maléimide thiol thioéther sulfonate ester amine/aniline alkylamine halogénure de sulfonyle amine/aniline sulfonamide * : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est : - un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-0C4H4NO2), sulfo-succinimidyloxy (-0C4H3NO2-S03H) ; 5 - un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ; - un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou 3040789 12 différents et sont choisis parmi les groupes alkyle en C1-C6, perfluoroalkyle en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ; - le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle. 5 Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre 10 moyen de molécules de marqueur greffés au ligand. Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les 15 groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont 20 notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, L.J. Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., Londres, p. 66-72. Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel 25 qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour son récepteur ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour le récepteur. 30 Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu d'incubation un anticorps dit « secondaire », 3040789 13 lui-même lié de manière covalente à un composé fluorescent, cet anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand ou bien un haptène présent sur ce ligand (tel qu'un groupe dinitrophényle, dogoxigénine, la fluorescéine, les étiquettes FLAG, c-myc, 6-HIS). Lorsque le ligand est un anticorps, l'anticorps secondaire peut être un anticorps anti- 5 espèce. Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un fluorophore. Le marquage de ligand par la biotine relève des connaissances générales de l'homme du métier, et la société Cisbio Bioassays 10 commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec le fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf 610SADLA). Couples de partenaires de FRET Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé 15 fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de 20 l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du 25 donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur. La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. 30 Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer. 3040789 14 Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme 0,5-6 ms), en particulier les chélates ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène 5 d'auto-fluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptates d'europium 10 (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés. De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays. Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : 15 - Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la 20 société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : 3040789 15 H 0 N- /- - NH2 NH2 TrisBiPy-Eu Py-BiPy-Eu HOOC H O. N_ Y^ - NH2 N NH2 H N N N EU3+N-, m EU3+N-, N N=\ '1\1 N- \ 1± HOOC / HOOC 'COOH HOOC COOH HOOC TrisBiPy-tetraacide-Eu Py-BiPy-tetraacide-Eu - Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, 5 US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer. 10 - Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles \ -I\I / 'COOH COOH 3040789 16 aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 10131024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/010580. 5 - Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables. - Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : 10 et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89). - Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays. - Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être 15 couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) : , e. N N>\ NH HN0 HN H2N-(CH2)4 Tb3+ -0 00 HN NH HN \,...'Içie N / N.s..> NH NCS - Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine). 3040789 17 - Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821. 5 10 15 - Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75: 149-169) : NCS , N, N ----Tb3+-N S0 pl - 0 -0 -----(3, o=c-0 , HO OH Tb-W14016 De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les 20 cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés. 3040789 18 Le composé fluorescent accepteur doit posséder un spectre d'absorption qui recouvre le spectre d'émission du donneur (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959) et peut être choisi dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles 5 que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du borondipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. 10 Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole. Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement 15 comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce. Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la 20 société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros. Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluoréscéine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs. 25 Mesure du signal de TR-FRET La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (us) et pendant une durée de 10 à 2000 us. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 us (temps résolu). 30 Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie. 3040789 19 EXEMPLES Exemple 1 : analyse sur coupes FFPE Cohorte de patients L'étude a été conduite avec des échantillons de tissus provenant de 63 patients souffrant 5 d'un cancer colorectal de stade II ou III. Les données de suivi (notamment rechute métastatique) ont été collectées pour l'ensemble de la cohorte et les caractérisations moléculaires en termes de statut mutationnel KRAS, BRAF et d'instabilité des microsatellites (MSI) ont été réalisées (voir figure 1). Méthodologies d'analyse sur coupes en paraffine 10 L'analyse de l'expression d'EGFR par TR-FRET en homogène sur coupes en paraffine a été réalisée avec les anticorps monoclonaux de lapin D38B1 et C74B9 (commercialisés par la société Cell Signaling Technology), conjugués avec les composés fluorescent accepteur d2 et donneur cryptate Tris-Bipyridine (Eu3+) (commercialisés par la société Cisbio Bioassays) après régénération des épitopes, selon le protocole suivant (protocole schématisé figure 15 2) : - Coupe de l'échantillon FFPE au microtome pour évaluation de la densité en cellules tumorales et analyse de la surface des noyaux : une première coupe de 4um d'épaisseur a été effectuée au microtome ; cette coupe a été collectée sur une lame porte-objet puis la lame a été traitée afin d'effectuer une coloration HES (voir ci- 20 dessous). Cette lame est destinée à l'observation microscopique permettant 1) l'acquisition d'une image (scan) utilisée pour mesurer la surface des noyaux (logiciel Histolab de la société Microvision Instruments) et 2) la sélection de la zone tumorale à macro-disséquer si besoin afin d'enrichir l'échantillon en cellules tumorales et dans laquelle le pourcentage de cellules tumorales est évalué. Les coupes qui succèdent 25 immédiatement cette première coupe sont destinées à être collectées dans des tubes Eppendorf pour les analyses de FRET proprement dites. - Coloration HES (Hématoxyline Eosine Safran) : après réhydratation dans des bains successifs de xylène et d'alcool à concentration décroissante, les coupes ont été successivement colorées par l'hématoxyline, puis par l'éosine et enfin par le safran. 30 Les lames ont ensuite été rapidement déshydratées (bains d'alcools à concentration croissante puis bains de xylène) avant d'être recouvertes d'une lamelle permettant 3040789 20 leur conservation et leur visualisation. L'hématoxyline colore en bleu-violet le noyau et les substances basophiles; l'éosine colore en rouge-rosé le cytoplasme et le safran colore les fibres conjonctives en jaune-orangé. - Sélection de la zone d'intérêt et analyse de la surface des noyaux : la zone tumorale 5 localisée sur la lame colorée par HES a été identifiée au microscope et cerclée avec un marqueur directement sur la lamelle. Les échantillons colorés par HES ont ensuite été scannés par un scanner haute résolution (par exemple Scanner Hamamatsu). La zone d'intérêt, cerclée, a ensuite été analysée avec un logiciel (Histolab®, société Microvision Instruments) permettant de discriminer les noyaux par seuillage 10 colorimétrique. La surface des noyaux dans la zone d'intérêt est donnée en um2. - Réalisation des coupes pour les analyses FRET proprement dites et distribution en tubes Eppendorf : des coupes de 5um d'épaisseur ont été effectuées au microtome et soumises à une macro dissection visant à éliminer, si besoin, les tissus visiblement non-tumoraux repérés sur les lames soumises à la coloration HES. Les échantillons 15 résultants ont été collectés dans un tube Eppendorf (2 à 3 coupes selon la surface de la section de tissus tumoral de façon à obtenir au total en moyenne environ 300 mm2). - Déparaffinage : les coupes ont été soumises à un traitement par un substitut de xylène (1,2 ml, 5 min sous agitation sur agitateur à plateau), les tubes ont été 20 centrifugés (2 min, 10 000g) et le surnageant a été éliminé par pipetage. Le culot obtenu a été soumis au traitement par le substitut de xylène une seconde fois (1,2 ml, 5 min) et après centrifugation (2 min, 10 000g) le surnageant a été éliminé par pipetage. Le culot a ensuite été traité par l'éthanol pur (1,2 ml, 3 min), centrifugé (2 min, 10 000g) et le surnageant éliminé par pipetage. Puis le processus a été répété 25 une fois avec de l'éthanol pur puis avec de l'éthanol à 95%. Le culot a ensuite été mis à réhydrater dans du tampon de régénération (DAKO 10mM tris-EDTA pH9) pendant 30 min puis centrifugé (2 min, 10 000g) et le surnageant éliminé par pipetage. Régénération des épitopes : le culot a ensuite été remis en suspension dans 500111 de tampon de régénération (DAKO 10mM tris-EDTA pH9) puis porté à 97°C pendant 40 30 min sous agitation (Thermomix). Les tubes ont ensuite été laissés à température 3040789 21 ambiante pour refroidissement pendant 15-20 min puis centrifugés (3 min, 10 000 12000g) et le surnageant éliminé par pipetage. - Ajout de tampon de lyse : du tampon de lyse 1X (Cisbio Bioassays réf 64KL4FDF) a été ajouté (2500) et ensuite les tubes ont été mis à refroidir dans de la glace. 5 - Lyse par sonication : les tubes refroidis dans la glace ont été soumis à une sonication (2 x 5s à 20% d'intensité avec un sonicateur Branson 450 équipé d'une Sonotrode de 3,2 mm). - Stockage des lysats : les lysats ont été congelés puis stockés à -80°C jusqu'à leur utilisation. 10 - Transfert du lysat en microplaques : les lysats ont été distribués en doublets à raison de 16111 par puits, dans des puits de plaque de microtitration (Plaques 384w F-bottom, SV ,Hibase, White, GREINER réf #784075). - Ajout des deux ligands (anticorps) conjugués avec les donneur et accepteur : chacun des deux anticorps marqués préalablement dilués dans un tampon (HEPES 200 mM 15 pH7, 0,5M KF, 0,1% ASB) ont été ajoutés sous un volume de 20 de façon à obtenir une concentration finale de 0,5 nM en anticorps-TPB(Eu) et de 5nM en anticorps-d2. Des puits « négatifs » ont été constitués par 16111 de tampon de lyse lx (Cisbio Bioassays réf 64KL4FDF) auxquels ont été ajoutés 20 de solution de chacun des anticorps. 20 - Incubation: La plaque de microtitration a ensuite été incubée à température ambiante pendant environ 16h. Mesure du FRET : La lecture de la fluorescence a été effectuée en mode TRF sur un lecteur Pherastar (BMG) en utilisant les paramètres suivants : Module optique: HTRF 25 Excitation: 337 Emission A: 665 nm Emission B: 620 nm Hauteur focale: 12 mm Source de lumière: lampe Flash 30 Les valeurs d'intensité de fluorescence désignées E665 et E620 ont été respectivement mesurées pour chaque puits d'échantillon ainsi que pour les puits « négatifs ». Pour 3040789 22 chaque puits d'échantillon le ratio des intensités a été calculé: ratio (échantillon) = (E665/E620) x 10000. De même pour les puits « négatifs » : ratio (négatif) = (E665/E620) x 10000. La variation de fluorescence (DF) entre les valeurs de ratio obtenues pour chaque échantillon et le ratio moyen obtenu pour les puits « négatifs » a ensuite été calculé : 5 DF = 100 x [ratio(échantillon) - ratio(négatif)] / ratio(négatif). Les valeurs de DF obtenues sont proportionnelles à la concentration d'EGFR présente dans chaque puits. Cette valeur de DF est ensuite normalisée par la surface des noyaux (Sn) obtenue par l'analyse d'image effectuée sur la lame colorée HES. Le DF normalisé (DFN) a été obtenu selon la formule suivante : DFN= (DFx108) x Sn ; où Sn est exprimée en 10 11m2. Résultats Sur cette cohorte rétrospective de tumeurs coliques de stade 11/111 (n= 58), les tumeurs présentant des niveaux d'expression de l'EGFR élevés (>médiane) mesurés par TR-FRET étaient associées à un mauvais pronostic (figure 3). En particulier dans cette série, le seul 15 paramètre corrélé de manière significative (p=0,031) avec le risque de récidive métastatique était l'expression de l'EGFR mesurée par TR-FRET (figure 4). Cette étude a montré que la quantification de l'EGFR par TR-FRET est un donc facteur pronostique pour les cancers colorectaux de stade 11/111 qui permettrait de prédire les patients à risque de récidive. 20 Exemple 2 : analyse sur cryosections Les échantillons des 63 patients de l'exemple 1 étant initialement conservés sous forme de tumeurs congelées, ils ont également été analysés avec les mêmes réactifs après préparation de cryosections de 50 um d'épaisseur (protocole schématisé figure 6). La 25 même technique de normalisation par analyse de la surface des noyaux que celle présentés dans l'exemple 1 a été utilisée. Les cryosections ont été incubées une nuit dans 180 ul de tampon TR-FRET (1X PBS / 10% ASB + cocktail inhibiteur de protéase, Roche, réf. 1836153) contenant 50 nM de chacun des deux conjugués fluorescents (dans ce cas un conjugué anticorps-Lumi4(Tb) est utilisé 30 comme donneur). Après lavage et centrifugation, les échantillons ont été remis en 3040789 23 suspension dans le tampon TR-FRET, soumis à une sonication et transférés dans une microplaque et mesure du signal de TR-FRET. Les résultats sont similaires à ceux obtenus dans l'exemple précédent, et sont présentés dans la figure 7. 5 Exemple 3 : analyse par immunohistochimie Les échantillons de tissus ont également été analysés par immunohistochimie (IHC) selon le protocole suivant. Des coupes de 3um d'épaisseur, consécutives à celles réalisées pour l'analyse par FRET, 10 ont été effectuées sur un microtome, étalées sur des lames de verre et séchées pendant une nuit à 56°C dans une étuve ventilée. Trois anticorps monoclonaux [clone 31G7 (monoclonal de souris, InVitroGen, épitope localisé dans le domaine extra-cellulaire), D38B1 et C74B9 (monoclonaux de lapin, Cell Signalling Technology, épitopes localisés dans le domaine cytoplasmique)] ont été utilisés 15 en parallèle avec des protocoles de réhydratation et de démarquage antigénique différents (cf. tableau 1). La liaison antigène/anticorps a été objectivée par l'utilisation d'un kit de révélation EnVision Flex (DAKO) et de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comme substrat de la peroxydase de raifort. Les lames ont ensuite été contre-colorées avec l'hématoxyline avant d'être déshydratées et recouvertes d'une lamelle. 20 L'observation microscopique a permis d'évaluer l'expression de l'EGFR. Pour chaque cas, le pourcentage de cellules positives ainsi que l'intensité du signal (0 : absent, 1 : faible, 2 : marqué, 3: modéré) a été reporté et un score global, obtenu en multipliant le pourcentage de cellules positives par l'intensité, a été calculé, représentant l'expression globale de l'EGFR par la tumeur. 25 Les résultats présentés dans la figure 5 montrent que l'analyse de l'expression d'EGFR par IHC n'est pas un facteur de pronostic (p non significatif), et cela quel que soit l'anticorps testé (31G7, D38B1 ou C74B9). 3040789 24 Tableau 1: anticorps anti-EGRF utilisés en IHC Anticorps Clone Lapin/souris Type Fournisseur Epitope Référence Démasquage Concentra- Temps d'incubation tion de l'Ac EGFR 31G7 mAc souris IVD Invitrogen Domaine extracellulaire 28-005 Protéine K 5 minutes 0,3 µg/ml 20 min EGFR D38B1 mAc lapin RUO Cell Signaling Domaine cytoplasmique #4267 Citrate 0,34 µg/ml 20 min EGFR C74B9 mAc lapin RUO Cell Signaling Domaine cytoplasmique #2646 EDTA 0,36 µg/ml 20 min REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade II ou III, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient, (ii) comparaison du niveau d'expression obtenu a l'étape (i) avec une valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive, ladite quantification étant effectuée par la mesure de la fluorescence émise en temps résolu par un couple de partenaires de FRET mis en contact avec ladite coupe d'échantillon de tissu, le premier membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un premier ligand capable de se lier à un premier domaine de la protéine EGFR, le second membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un second ligand capable de se lier à un second domaine de la protéine EGFR, lesdits premier et second domaines de la protéine EGFR étant différents, ledit couple de partenaires de FRET étant constitué d'un composé fluorescent donneur et d'un composé fluorescent accepteur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR, et en ce que les dits premier et second domaines de la protéine EGFR sont localisés dans la partie intracellulaire de cette protéine. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un au moins des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second ligand. 3040789 26 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second ligand. 5 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'elle comprend une étape d'homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire. 10 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre postérieurement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. 15 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre préalablement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. 20 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la coupe d'échantillon de tissu est sous forme de cryosection ou bien d'une coupe enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde (coupe FFPE). 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau 25 d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une cryosection de la coupe d'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, b) Incubation, 30 c) Lavage, d) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 3040789 27 e) Transfert en microplaques, f) Lecture du signal de FRET. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau 5 d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une coupe de l'échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, 10 c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lavage, f) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 15 g) Transfert en microplaques, h) Lecture du signal de FRET. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une coupe de l'échantillon de 20 tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 25 d) Transfert en microplaque, e) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, f) Incubation, g) Lecture du signal de FRET. 30 3040789 28 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une cryosection de l'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, 5 b) Transfert en microplaque, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lecture du signal de FRET. 10 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de normalisation du signal de FRET par une valeur représentative de la quantité de matériel biologique présent dans la coupe d'échantillon de tissu. 15 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation de la coupe d'échantillon de tissu avec un agent de marquage émettant un signal proportionnel à la quantité de matériel biologique présent dans l'échantillon, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à cet agent de 20 marquage. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent de l'ADN, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à la fluorescence de cet agent de marquage. 25 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de normalisation comprend : - la mise en oeuvre de moyens informatiques pour l'acquisition de l'image d'une deuxième coupe de l'échantillon de tissu, cette deuxième coupe étant adjacente à 30 la coupe d'échantillon de tissu destinée à être mise en contact avec le couple de partenaires de FRET, et 3040789 29 - l'analyse de cette image pour déterminer une valeur représentative d'un paramètre choisi parmi : le nombre de noyaux de cellules présents dans ladite deuxième coupe; le nombre de cellules présentes dans ladite deuxième coupe ; la surface des noyaux des cellules présentes dans ladite deuxième coupe. 5 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'analyse de ladite image est effectuée par un logiciel mesurant la surface des noyaux des cellules présents dans ladite deuxième coupe, la valeur obtenue étant utilisé pour normaliser le signal de FRET. 10 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate de terre rare. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate d'europium ou de terbium. 15 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, les fluorophores connus sous la 20 dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa » et le nitrobenzoxadiazole. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands sont des anticorps capable d'inhiber la liaison des 25 anticorps de lapin D38B1 et C74B9 à la protéine EGFR de plus de 75 %. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands capables de se lier à la protéine EGFR sont les anticorps de lapin D38B1 et C74B9. 30 3040789 30 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le risque de récidive est un risque de récidive métastatique.