FR 3044016 A1 20170526 FR 1661255 A 20161121 DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne des vecteurs d'acide nucléique comprenant des gènes nécessaires à la production rétrovirale et leurs utilisations. L'invention concerne également des procédés de production de lignées cellulaires d'emballage/de production de rétrovirus comprenant les vecteurs d'acide nucléique tels que décrits dans le présent fascicule. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION En thérapie génique, du matériel génétique est administré à des cellules endogènes chez un sujet ayant besoin d'un traitement. Le matériel génétique peut 15 introduire de nouveaux gènes chez le sujet ou bien introduire des copies supplémentaires de gènes préexistants, ou bien introduire différents allèles ou variantes des gènes qui sont présents chez le sujet. Des systèmes de vecteurs viraux sont proposés comme procédé 20 d'administration efficace de gènes pour une utilisation en thérapie génique (Verma et Somia (1997) Nature 389 : 239- 242). En particulier, ces vecteurs viraux sont à base de membres de la famille des rétrovirus du fait de leur 25 capacité à intégrer leur héritage génétique dans le génome de l'hôte. Les vecteurs rétroviraux sont conçus pour garder les protéines essentielles nécessaires à l'emballage et la distribution du génome rétroviral, mais toute protéine accessoire non essentielle, y compris celle responsable de 30 leur profil pathogène, est éliminée. Les exemples de vecteurs rétroviraux comprennent les vecteurs lentiviraux, comme ceux à base du virus de l'immunodéficience humaine de 3044016 2 type 1 (VIH-1), qui sont largement utilisés car ils sont capables de s'intégrer dans des cellules non prolifératives. Actuellement, la majorité des vecteurs viraux sont 5 produits par co-transfection transitoire de gènes viraux dans une lignée cellulaire hôte. Les gènes viraux sont introduits en utilisant des plasmides bactériens qui existent dans la cellule hôte seulement pendant un laps de temps limité car les gènes viraux restent sur les plasmides 10 et ne sont pas intégrés dans le génome. En tant que tel, le matériel génétique transfecté transitoirement n'est pas transmis aux générations suivantes au cours de la division cellulaire. Il existe de nombreux inconvénients associés à la 15 transfection transitoire, comme la variabilité d'un lot un autre, le coût élevé des réactifs de transfection et la difficulté de maintenir le contrôle qualité (voir Segura et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7) : 987-1011). Le procédé de transfection lui-même nécessite également 20 beaucoup d'opérations et son passage à l'échelle supérieure constitue un défi. Il s'avère également difficile d'éliminer les impuretés plasmidiques qui sont charriées au cours de la préparation du vecteur (voir Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81(2) : 539-47). 25 Afin de régler les problèmes liés à la transfection transitoire, il existe une aspiration à développer des lignées cellulaires d'emballage rétroviral et productrices de rétrovirus afin de simplifier la production de vecteurs rétroviraux. 30 Des lignées cellulaires d'emballage ont été générées par transfection d'une lignée cellulaire capable d'emballer des vecteurs rétroviraux avec des plasmides, où les 3044016 3 plasmides individuels portent des gènes d'emballage rétroviral et des marqueurs de sélection eucaryotes uniques. Les gènes d'emballage sont intégrés dans le génome des lignées cellulaires d'emballage et sont décrits comme 5 étant transfectés de manière stable. Ces 20 dernières années, diverses tentatives ont été faites pour produire des lignées cellulaires stables d'emballage et de production pour les vecteurs rétroviraux. Plusieurs problèmes ont été rapportés concernant les 10 lignées cellulaires de production et d'emballage produites par le biais de l'intégration de composants de vecteur rétroviral dans le génome de cellules hôtes. En premier lieu, l'introduction séquentielle des composants du vecteur rétroviral peut s'avérer laborieuse et peu flexible. On rencontre également des problèmes avec l'instabilité génétique et/ou transcriptionnelle des composants de vecteur rétroviral quand ils sont intégrés dans le génome des cellules hôtes car le site d'intégration est impossible à prédire (Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7 : 818-834.). Une chute significative de la productivité du vecteur viral a aussi été rapportée au cours de l'adaptation en suspension et du passage à l'échelle supérieure des lignées cellulaires productrices (Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12 : 981-997 ; Guy et al. (2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2) : 125-39). Un objet de la présente invention vise par conséquent à proposer un procédé de production de lignées cellulaires stables pour la production et l'emballage de rétrovirus qui permet de surmonter un ou plusieurs des inconvénients associés aux procédés existants. RESUME DE L'INVENTION 3044016 4 Les présents inventeurs ont développé un nouveau mode de production de lignées cellulaires d'emballage et de production qui implique l'utilisation de vecteurs d'acide nucléique comprenant une origine de réplication non 5 mammifère et ont la capacité de contenir au moins 25 kilobases (kb) d'ADN, comme les chromosomes artificielles bactériens, comprenant les gènes rétroviraux essentiels pour la production d'un vecteur rétroviral. Cela permet l'expression des gènes rétroviraux nécessaires à la 10 production de particules de vecteur rétroviral défectif en réplication pour régler les problèmes liés aux procédés de transfection transitoire. L'utilisation d'un vecteur d'acide nucléique comprenant une origine de réplication non mammifère et 15 possédant la capacité de contenir au moins 25 kb d'ADN (c'est-à-dire un gros ADN hybride) présente plusieurs avantages. En premier lieu, les vecteurs peuvent être d'abord manipulés dans des cellules non mammifères (par exemple cellules microbiennes, comme les cellules 20 bactériennes) à l'inverse des cellules mammifères hôtes, ce qui les rend plus faciles à utiliser (par exemple des chromosomes artificiels bactériens peuvent être d'abord manipulés dans E. coli). Une fois que le vecteur d'acide nucléique a été préparé, il peut être introduit dans une 25 cellule hôte et toute cellule mammifère qui a le vecteur d'acide nucléique intégré dans ses chromosomes endogènes peut être sélectionnée afin d'isoler une lignée cellulaire stable. L'introduction d'acides nucléiques rétroviraux dans la 30 cellule hôte mammifère s'effectue également en une étape, ce qui permet de réduire la pression de la sélection et l'intervalle temporel de silençage. Cela permet un criblage 3044016 5 plus rapide des cellules d'emballage potentielles et réduit le coût des matières puisqu'un unique vecteur seulement est utilisé à l'inverse des précédents procédés qui utilisent de multiples vecteurs plasmidiques. En particulier, 5 l'utilisation du système actuel réduit le coût de fabrication en faisant des économies en matière de coûts des plasmides, de réactifs de transfection nécessaires (par exemple polyéthylène-imine [PEI]), en réduisant la quantité de traitement à la benzonase requise (il y a une quantité 10 réduite d'ADN dans la récolte lentivirale, par conséquent, moins de benzonase est nécessaire pour éliminer l'excédent au cours du traitement en aval), et en matière de coûts d'essai (il n'est plus nécessaire d'effectuer des essais pour le plasmide résiduel dans le produit lentiviral) 15 De plus, les gènes rétroviraux essentiels à la production rétrovirale (avec ou sans le vecteur de transfert) sont présents à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique de sorte que, si le vecteur est introduit dans les cellules hôtes mammifères, la totalité des gènes 20 rétroviraux incorporés dans le vecteur d'acide nucléique s'intégreront dans un locus à l'intérieur du génome endogène de la cellule hôte mammifère. Cela permet de régler des problèmes tels que le silençage génique qui peut se produire quand les gènes rétroviraux sont intégrés 25 aléatoirement et au niveau de locus différents à l'intérieur du génome de la cellule hôte. L'utilisation des vecteurs d'acide nucléique de l'invention apporte par conséquent des avantages en termes de génération de lignées cellulaires de production et 30 d'emballage de rétrovirus. 3044016 6 Par conséquent, selon un premier aspect de l'invention, on propose une cellule productrice rétrovirale comprenant des séquences d'acide nucléique codant pour : les protéines gag et pol, 5 une protéine env ou un substitut fonctionnel de celle- ci ; et l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral, dans laquelle lesdites séquences d'acide nucléique sont toutes situées au niveau d'un unique locus à 10 l'intérieur du génome de la cellule productrice rétrovirale. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES FIGURE 1 : Guide étape par étape pour la construction 15 de BACpack-WTGP-277delU5 et de BACpack-SYNGP-277delU5. FIGURE 2 : Sélection d'un lot polyclonal stable. Des cellules adhérentes HEK293T ont été transfectées avec BACpackWTGagPol-Transfer en utilisant du phosphate de calcium. Des lots stables ont été produits au bout de 2 20 semaines de sélection avec Zéocin. Pour voir quels transfectants stables étaient capables de générer des virus, les lots poly stables ont été induits avec de la doxycycline pendant 48 heures. Le surnageant viral a été récolté 48 heures après l'induction, filtré à travers un 25 filtre de 0,22 pm et titré par transduction des cellules HEK293T. Des cellules transduites GFP positives ont été utilisées pour calculer les unités de transduction/ml (TU/ml). 30 FIGURE 3 : Génération de clones de transfection stables en suspension. Des cellules HEK293 6E ont été transfectées avec BACpackWTGagPol-Transfer en utilisant le 3044016 7 réactif 293fectine. Des lots stables ont été produits au bout de 2 semaines de sélection avec Zéocin. Les lots stables ont été clonés en limitant la dilution dans des plaques à 96 puits afin d'obtenir des clones monocellulaires, qui ont été 5 ensuite étendus. La GFP a détecté par microscopie de fluorescence les meilleurs clones 1, 14, 15 et 16 obtenus avec le milieu adhérent (DMEM + FBS), puis une adaptation en suspension (milieu FreeStyle) a été effectuée. 10 FIGURE 4 : Induction de lentivirus dans les clones en suspension. Pour voir si les transfectants HEK6E stables étaient capables de générer des virus, 20 ml de clones stables en suspension ont été induits avec de la doxycycline (2 gg/ml) pendant 48 heures. Le surnageant viral a été 15 récolté 48 heures après l'induction, filtré à travers un filtre de 0,45 gm et titré par transduction des cellules HEK293T. Des cellules transduites GFP positives ont été utilisées pour calculer les unités de transduction/m1 (TU/mi). 20 FIGURE 5 : Titres du vecteur des clones produits d'après l'exemple 4. Les résultats montrent que les titres de vecteur à partir des clones 1 et 16 ont augmenté modestement entre le passage 5 et le passage 21. 25 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION DEFINITIONS Sauf stipulation contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans le présent fascicule ont la 30 même signification que celle communément admise par l'homme du métier dont fait partie la présente invention. 3044016 8 Le terme « comprenant » englobe « y compris » ou « constitué », par exemple une composition « comprenant » X peut se composer exclusivement de X ou peut inclure quelque chose de plus, par exemple X Y. 5 Le terme « constitué essentiellement de » limite l'étendue de la caractéristique aux matières ou étapes spécifiées et à celles qui n'affectent pas matériellement les caractéristiques basiques de la caractéristique revendiquée. Le terme « constitué de » exclut la présence de tout 10 composant additionnel. Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x ± 10 1, 5 %, 2 % ou 1 %. Le terme « vecteur » ou « vecteur d'acide nucléique » désigne un véhicule qui est capable de porter 15 artificiellement un matériel génétique étranger (à savoir exogène) dans une autre cellule, où il peut être répliqué et/ou exprimé. Les exemples de vecteurs comprennent les vecteurs d'acide nucléique non chromosomes artificiels bactériens 20 artificiels de levure (YAC), les dérivés de Pl (PAC), les cosmides ou Les autres exemples de vecteurs mammifère, comme les (BAC), les chromosomes chromosomes artificiels les fosmides. comprennent les vecteurs viraux comme les vecteurs rétroviraux et lentiviraux, qui sont d'un intérêt particulier dans la présente demande. Les 25 vecteurs lentiviraux, comme ceux à base du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), sont largement utilisés puisqu'ils sont capables de s'intégrer dans des cellules non prolifératives. Les 3044016 9 vecteurs viraux peuvent être rendus défectifs en réplication en cassant leur génome viral en parties séparées, par exemple en le plaçant sur des plasmides séparés. Par exemple, ce que l'on appelle la première 5 génération de vecteurs lentiviraux, développée par le Salk Institute for Biological Studies, a été construite sous la forme d'un système d'expression à trois plasmides constitué d'une cassette d'expression d'emballage, de la cassette d'expression d'enveloppe et de la cassette d'expression du 10 vecteur. Le « plasmide d'emballage » contient la totalité des séquences gag-pol, les séquences régulatrices (tat et rev) et accessoires (vif, vpr, vpu, nef). Le « plasmide d'enveloppe » contient la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVg) en substitution de la protéine 15 d'enveloppe du VIH-1 native, sous le contrôle d'un promoteur du cytomégalovirus (CMV). Le troisième plasmide (le « plasmide de transfert ») porte les répétitions terminales longues (LTR), la séquence d'encapsulation la séquence élément de réponse Rev (RRE) et le promoteur 20 CMV afin d'exprimer le transgène à l'intérieur de la cellule hôte. La deuxième génération de vecteurs lentiviraux a été caractérisée par la délétion des séquences de virulence vpr, vif, vpu et nef. Le vecteur d'emballage a été réduit 25 aux gènes gag, pol, tat et rev, accroissant par conséquent la sûreté du système. Pour améliorer le système lentiviral, les vecteurs de troisième génération ont été conçus en éliminant le gène tat de l'hybride d'emballage et en inactivant les LTR de la 30 cassette du vecteur, ce qui a donc réduit les problèmes relatifs aux effets de la mutagenèse insertionnelle. 3044016 10 Les différentes générations de lentivirus sont décrites dans les références suivantes : Première génération : Naldini et al. (1996) Science 272(5259) : 263-7 ; Deuxième génération : Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15(9) : 5 871-5 ; Troisième génération : Dull et al. (1998) Jr. Virol. 72(11) : 8463-7. Un récapitulatif du développement des vecteurs lentiviraux se trouve dans Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443(3) : 603-18 et Picanço-Castro et al. (2008) Exp. Cpin. Therap. Patents 18(5) :525-539. 10 Le terme « origine de réplication non mammifère » désigne une séquence d'acide nucléique où la réplication est initiée et qui est dérivée d'une source non mammifère. Cela permet aux vecteurs d'acide nucléique de l'invention de se répliquer de manière stable et de se ségréger aux côtés des 15 chromosomes endogènes dans une cellule hôte appropriée (par exemple une cellule microbienne, comme une cellule bactérienne ou de levure) de manière à être transmissibles à la descendance de la cellule hôte, sauf si la cellule hôte est une cellule hôte mammifère. Dans les cellules hôtes 20 mammifères, les vecteurs d'acide nucléique ayant des origines de réplication non mammifères seront soit intégrés dans les chromosomes endogènes de la cellule hôte mammifère, soit perdus lors de la réplication de la cellule hôte mammifère. Par exemple, les vecteurs d'acide nucléique ayant des 25 origines de réplication non mammifères comme les chromosomes artificiels bactériens (BAC), le chromosome artificiel dérivé de P1 (PAC), les cosmides ou fosmides, sont capables de se répliquer de manière stable et de se ségréger aux côtés des chromosomes endogènes dans des cellules bactériennes (comme 30 E. cou), mais s'ils sont 3044016 11 introduits dans des cellules hôtes mammifères, le BAC, PAC, cosmide ou fosmide sera soit intégré, soit perdu lors de la réplication de la cellule hôte mammifère. Les chromosomes artificiels de levure (YAC) sont capables de se répliquer 5 de manière stable et de se ségréger aux côtés des chromosomes endogènes dans des cellules de levure, mais s'ils sont introduits dans des cellules hôtes mammifères, les YAC seront soit intégrés, soit perdus lors de la réplication de la cellule hôte mammifère. Par conséquent, 10 dans ce contexte, les vecteurs d'acide nucléique de l'invention font office de réservoirs d'ADN (c'est-à-dire pour les gènes essentiels à la production rétrovirale) qui peuvent être facilement transférés dans des cellules de mammifères afin de générer des lignées cellulaires stables 15 pour la production rétrovirale. Les exemples d'origines de réplication non mammifères comprennent les origines de réplications bactériennes, comme oriC, oriV ou oriS ; ou les origines de réplication de la levure connues sous le nom de séquences de réplication autonome (éléments ARS). 20 Les vecteurs d'acide nucléique de la présente invention comprennent une origine de réplication non mammifère et sont capables de contenir au moins 25 kilobases (kb) d'ADN. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique possède la capacité de contenir 25 au moins 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 ou 350 kb d'ADN. Il est bien entendu que les références à la « capacité de contenir » ont leur sens 30 usuel et impliquent que la limite supérieure pour la taille de l'insert pour le vecteur d'acide nucléique n'est pas 3044016 12 inférieure à la taille revendiquée (c'est-à-dire n'est pas inférieure à 25 kb d'ADN). Le but de la présente invention est d'inclure les gènes essentiels à l'emballage rétroviral dans un unique 5 hybride (c'est-à-dire le vecteur d'acide nucléique). Par conséquent, les vecteurs d'acide nucléique de l'invention doivent être capable de contenir de gros inserts d'ADN. Pour éviter tout doute, il est bien entendu que les références à des « vecteurs d'acide nucléique » ou 10 « chromosomes artificiels » ne se rapportent pas à des plasmides bactériens naturels (par exemple comme les plasmides actuellement utilisés dans les procédés de transfection transitoire) car ils ne sont pas capables de contenir au moins 25 kb d'ADN. L'insert de taille maximale 15 qu'un plasmide peut contenir est environ 15 kb. Ces vecteurs d'acide nucléique ne désignent également pas des bactériophages, lesquels ne contiennent en général que des inserts maximaux de 5 à 11 kb. Par conséquent, dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique de l'invention 20 n'est pas un plasmide, ni un bactériophage, ni un épisome. Le terme « chromosomes endogènes » désigne des chromosomes génomiques se trouvant dans la cellule hôte avant la génération ou l'introduction d'un vecteur d'acide nucléique exogène, comme un chromosome artificiel 25 bactérien. Les termes « transfection », « transformation » et « transduction », tels qu'utilisés dans le présent fascicule, peuvent être utilisés pour décrire l'insertion du vecteur non mammifère ou viral dans une cellule cible. 30 L'insertion d'un vecteur est usuellement appelée transformation pour les cellules bactériennes et transfection pour les cellules eucaryotes, bien que 3044016 13 l'insertion d'un vecteur viral puisse aussi être nommée transduction. L'homme du métier connaîtra les différents procédés de transfection non virale communément utilisés, qui comprennent mais sans y être limités l'utilisation de 5 procédés physiques (par exemple électroporation, compression cellulaire, sonoporation, transfection optique, fusion de protoplaste, impaléfection, magnétofection, pistolet à gène ou bombardement de particules), de réactifs chimiques (par exemple phosphate de calcium, composés 10 organiques fortement ramifiés ou polymères cationiques) ou lipides cationiques (par exemple lipofection). Plusieurs procédés de transfection nécessitent le contact de solutions d'ADN de plasmide avec les cellules qui sont ensuite cultivées et sélectionnées au niveau d'une 15 expression d'un gène marqueur. Le terme « promoteur » désigne une séquence qui impulse l'expression génique. Afin d'impulser un taux d'expression élevé, il peut être bénéfique d'utiliser un promoteur fortement efficace, comme un promoteur non 20 rétroviral fortement efficace. Les exemples de promoteurs appropriés peuvent comprendre un promoteur tel que le promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV) humain, le promoteur SFFV (spleen focus-forming virus), le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV) ou le promoteur 25 du facteur 1-alpha d'élongation humain (pEF). Un opéron Tet (Activation transcriptionnelle contrôlée par la tétracycline) peut être utilisé dans un procédé d'expression de gènes inductibles, la transcription étant mise en marche ou arrêtée de manière réversible en présence 30 de l'antibiotique tétracycline ou de l'un de ses dérivés (par exemple doxycycline). Par nature, le promoteur Ptet exprime TetR, le répresseur, et TetA, la protéine qui pompe 3044016 14 l'antiobiotique tétracycline hors de la cellule. Dans la présente invention, l'opéron Tet peut être présent ou absent, par exemple, dans un mode de réalisation, l'opéron Tet peut être présent dans le promoteur. 5 Le terme « marqueur sélectionnable » désigne un gène qui aidera la sélection des cellules exprimant activement un gène inséré (par exemple un transgène). Les exemples de marqueurs de sélection appropriés comprennent les enzymes codant pour la résistance à un antibiotique (c'est-à-dire 10 un gène de résistance à un antibiotique), par exemple kanamycine, néomycine, puromycine, hygromycine, blasticidine ou zéocine. Un autre exemple de marqueurs de sélection appropriés sont les protéines fluorescentes, par exemple la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine 15 fluorescente rouge (RFP) ou la protéine fluorescente bleue (BFP). Le terme « signal polyA » désigne une séquence signal de polyadénylation, par exemple en place 3' d'un transgène, qui permet à des facteurs hôtes d'ajouter une queue 20 polyadénosine (polyA) à la fin de l'ARNm naissant lors de la transcription. La queue polyA est un étirement allant jusqu'à 300 ribonucléotides d'adénosine qui protège l'ARNm de la dégradation enzymatique et facilite également la traduction. Par conséquent, les vecteurs d'acide nucléique 25 de la présente invention peuvent inclure une séquence signal polyA comme les signaux polyA de la bêta globine humaine ou de la bêta globine du lapin, les signaux polyA précoces ou tardifs du virus simien 40 (SV40), le signal polyA de l'insuline humaine, ou le signal polyA de 30 l'hormone de croissance bovine. Dans un mode de réalisation, la séquence signal polyA est le signal polyA de bêta globine humaine. 3044016 15 Le terme « séquence d'intron » désigne une séquence de nucléotide qui est retirée du produit génique final par épissage de l'ARN. L'utilisation d'un intron en aval de la région de l'activateur/du promoteur et en amont de l'insert 5 d'ADNc s'est révélée accroître le taux d'expression du gène. La hausse de l'expression dépend en particulier de l'insert d'ADNc. Par conséquent, le vecteur d'acide nucléique de la présente invention peut comprendre des introns comme l'intron de la bêta globine humaine, l'intron 10 II de la bêta globine du lapin, ou un intron de bêta globine humaine-immunoglobine chimérique. Dans un mode de réalisation, l'intron est un intron de la bêta globine humaine et/ou un intron II de la bêta globine du lapin. Le terme « lignée cellulaire d'emballage » désigne une 15 lignée cellulaire comportant la protéine gag et pol et des gènes de la glycoprotéine d'enveloppe insérés de manière stable. En variante, le terme « lignée cellulaire productrice » désigne une lignée cellulaire d'emballage comportant un vecteur de transfert inséré de manière stable 20 contenant un transgène d'intérêt. L'homme du métier comprendra que les vecteurs d'acide nucléique décrits dans le présent fascicule peuvent être utilisés pour générer des lignées cellulaires d'emballage (à savoir quand au moins les gènes gag, pol et env sont présents sur le vecteur 25 d'acide nucléique et incorporés dans une cellule hôte) ou des lignées cellulaires productrices (à savoir quand le vecteur d'acide nucléique comprend en outre les composants du vecteur de transfert à incorporer dans une cellule hôte en compagnie des gènes gag, pol et env). 30 Le terme « transfectées de manière stable » désigne des lignées cellulaires qui sont capables de transmettre à leur descendance (c'est-à-dire les cellules filles) les 3044016 16 gènes rétroviraux introduits, soit du fait que l'ADN transfecté a été incorporé dans les chromosomes endogènes soit par héritage stable des chromosomes exogènes. 5 VECTEURS D'ACIDE NUCLEIQUE Selon un aspect de l'invention, on propose un vecteur d'acide nucléique comprenant une origine de réplication non mammifère et ayant la capacité de contenir au moins 25 kilobases (kb) d'ADN, caractérisé en ce que ledit vecteur 10 d'acide nucléique comprend des séquences d'acide nucléique rétroviral codant pour : les protéines gag et pol, et une protéine env ou un substitut fonctionnel de celle- ci. 15 En particulier, chacune des séquences d'acide nucléique rétroviral peut être disposée sous la forme d'hybrides d'expression individuels à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique. Les procédés actuels pour la génération de vecteurs 20 rétroviraux impliquent la transfection transitoire des gènes rétroviraux dans une cellule hôte. Cependant, plusieurs inconvénients sont liés à ce procédé car il est coûteux, nécessite beaucoup d'opérations et il est difficile de le faire passer à l'échelle supérieure. Une 25 solution consisterait à manipuler une lignée cellulaire d'emballage qui incorpore de manière stable les gènes d'emballage rétroviraux afin d'éviter les problèmes liés à la transfection transitoire et de réduire l'émission de vecteurs rétroviraux variables. 30 Les présents inventeurs ont découvert que les vecteurs d'acide nucléique décrits dans le présent document pouvaient être utilisés pour produire une lignée cellulaire 3044016 17 d'emballage rétroviral qui éliminent les difficultés antérieures liées aux procédés de production des vecteurs rétroviraux. Par exemple, des procédés connus de production de lignées cellulaires d'emballage rétroviral impliquent de 5 multiples cycles de sélection après l'introduction de chaque gène rétroviral. Cette opération peut prendre jusqu'à six mois et nécessite également beaucoup de main d'oeuvre. En incluant la totalité des gènes rétroviraux dans le vecteur d'acide nucléique, les gènes rétroviraux peuvent 10 être ensuite insérés dans les chromosomes endogènes d'une cellule hôte de mammifère en une seule étape. Par conséquent, l'utilisation d'un vecteur d'acide nucléique, telle que proposée dans le présent document, permettra de réduire la pression de sélection, de réduire l'intervalle 15 temporel de silençage et permettra un criblage plus rapide des cellules d'emballage potentielles. De plus, les gènes rétroviraux inclus sur le vecteur d'acide nucléique seront tous intégrés dans les chromosomes endogènes de la cellule hôte mammifère au niveau d'un unique locus, ce qui réduira 20 le risque que les gènes rétroviraux individuels deviennent silencieux et permettra de garantir que tous les gènes rétroviraux seront exprimés de manière régulière. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend, en plus, des séquences d'acide 25 nucléique qui codent pour l'ARN génomique d'une particule de vecteur rétroviral. Il est bien entendu que l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral est usuellement inclus sur le « vecteur de transfert » utilisé dans les procédés de transfection transitoire. Le plasmide 30 du vecteur de transfert contient un promoteur (comme CMV), la LTR 3' (qui peut être ou ne pas être une LTR 3' à auto-inactivation (c'est-à-dire SIN)), la LTR 5' (qui peut 3044016 18 contenir ou ne pas contenir la région U5), la séquence d'encapsidation (Ili) et potentiellement, le transgène lié à un promoteur. Dans un mode de réalisation, des copies multiples de 5 l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral (c'est-à-dire le vecteur de transfert) sont incluses dans le vecteur d'acide nucléique. On s'attend à ce que de multiples copies du vecteur de transfert produisent un titre de vecteur viral plus élevé. Par exemple, le vecteur 10 d'acide nucléique peut comprendre deux copies ou plus, comme trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix copies ou plus de l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral (c'est-à-dire du vecteur de transfert). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 15 nucléique contient un site ou une pluralité de sites de recombinaison. Cela permet aux séquences cibles d'être intégrées dans les chromosomes endogènes de la cellule hôte mammifère d'une manière spécifique au site en présence d'une enzyme recombinase. L'enzyme recombinase catalyse la 20 réaction de recombinaison entre deux sites de recombinaison. Plusieurs types des systèmes de recombinaison spécifique à un site sont connus dans l'art et tout système de recombinaison approprié peut être utilisé dans la 25 présente invention. Par exemple, dans un mode de réalisation, le ou les sites de recombinaison sont choisis ou dérivés du système int/att du phage lambda, du système Cre/lox du bactériophage Pl, du système FLP/FRT de la levure, du système recombinase Gin/gix du phage Mu, du 30 système recombinase Cin, du système recombinase Pin de E. cou et du système R/RS du plasmide pSR1, ou de toute combinaison de ceux-ci. Dans un autre mode de réalisation, 3044016 19 le site de recombinaison est un site att (par exemple provenant du phage lambda), où le site att permet une intégration orientée en présence d'une intégrase lambda. Il est bien entendu que la référence à l'intégrase lambda 5 comprend les références aux intégrases mutantes qui sont toujours compatibles avec le système int/att, par exemple les intégrases lambda modifiées, décrites dans le document WO 2002/097059. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 10 nucléique est choisi parmi : un chromosome artificiel bactérien (BAC), un chromosome artificiel de levure (YAC), un chromosome artificiel dérivé de P1 (PAC), un fosmide ou un cosmide. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique est un chromosome artificiel bactérien 15 (BAC). Chromosomes artificiels bactériens Le terme « chromosome artificiel bactérien » ou « BAC » désigne un ADN hybride dérivé de plasmides 20 bactériens qui est capable de contenir un gros insert d'ADN exogène. Ils peuvent en général contenir un insert d'ADN maximal d'environ 350 kb. Les BAC ont été développés à partir du plasmide de la fertilité fonctionnelle bactérienne bien caractérisé (plasmide F) qui contient des 25 gènes de répartition qui favorisent la distribution régulière des plasmides après la division cellulaire bactérienne. Cela permet aux BAC d'être répliqués de manière stable et de subir une ségrégation aux côtés des génomes bactériens endogènes (comme E. coli). Le BAC 30 contient usuellement au moins une copie d'une origine de réplication (comme le gène oriS ou oriV), le gène repE (pour la réplication du plasmide et la régulation du nombre 3044016 20 de copies) et des gènes de répartition (comme sopA, sopB, parA, parB et/ou parC), ce qui garantit le maintien stable du BAC dans les cellules bactériennes. Les BAC sont naturellement circulaires et super-enroulés, ce qui les 5 rend plus faciles à récupérer que les chromosomes artificiels linéaires comme les YAC. Ils peuvent être aussi introduits dans des cellules hôtes bactériennes relativement facilement, en utilisant des procédés simples tels que l'électroporation. 10 Dans un mode de réalisation, le chromosome artificiel bactérien comprend un gène oriS. Dans un mode de réalisation, le chromosome artificiel bactérien comprend un gène repE. Dans un mode de réalisation, le chromosome artificiel bactérien comprend des gènes de répartition. 15 Dans un autre mode de réalisation, les gènes de répartition sont choisis parmi sopA, sopB, parA, parB et/ou parC. Dans encore un autre mode de réalisation, le chromosome artificiel bactérien comprend un gène sopA et sopB. Le BAC pour une utilisation dans la présente invention 20 peut être obtenu auprès de sources commerciales, par exemple le BAC pSMART de LUCIGENTM (voir n° d'entrée du Génome EU101022.1 pour la séquence squelette complète). Ce BAC contient le système « copie-plus » du L-arabinose qui contient également l'origine de réplication de copie du 25 milieu oriV, qui est active seulement en présence de la protéine de réplication TrfA. Le gène pour TrfA peut être incorporé dans le génome des cellules hôtes bactériennes sous le contrôle du promoteur inductible du L-arabinose araC-PBAD (voir Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9) : 1434- 30 1444). L'addition du L-arabinose induit l'expression de TrfA, qui active oriV, ce qui provoque une réplication du plasmide pouvant aller jusqu'à 50 copies par cellule. 3044016 21 Chromosomes artificiels de la levure Le terme « chromosome artificiel de la levure » ou « YAC » désigne des chromosomes dans lesquels l'ADN de la 5 levure est incorporé dans des plasmides bactériens. Ils contiennent une séquence de réplication autonome (ARS) (c'est-à-dire une origine de réplication), un centromère et des télomères. Au contraire des BAC, le YAC est linéaire et contient donc des télomères de levure à chaque extrémité du 10 chromosome afin de protéger ses extrémités de la dégradation puisqu'il se transmet à la descendance de la cellule hôte. Les YAC peuvent contenir une gamme de tailles d'insert ADN, à peu près de 100 à 2000 kb. 15 Chromosomes artificiels dérivés de P1 Le terme « chromosome artificiel dérivé de P1 » ou « PAC » désigne des ADN hybrides dérivés de l'ADN du bactériophage P1 et du plasmide F bactérien. Ils peuvent contenir usuellement un insert d'ADN maximal d'environ 100 20 à 300 kb et sont utilisés comme vecteurs de clonage dans E. coll. Les PAC présentent des avantages similaires aux BAC, comme celui de se purifier facilement et de pouvoir s'introduire dans des cellules hôtes bactériennes. 25 Cosmides et fosmides Le terme « cosmide » désigne des ADN hybrides dérivés de plasmides bactériens qui contiennent, en plus, des sites cos dérivés du bactériophage lambda. Les cosmides contiennent en général une origine de réplication 30 bactérienne (comme oriV), un marqueur de sélection, un site de clonage et au moins un site cos. Les cosmides peuvent usuellement accepter un insert d'ADN maximal de 40 à 45 kb. 3044016 22 Les cosmides se sont avérés être plus efficaces dans l'infection des cellules de E. coli que les plasmides bactériens standards. Le terme « fosmides » désigne des vecteurs d'acide nucléique non mammifère qui sont 5 similaires aux cosmides sauf qu'ils sont à base du plasmide F bactérien. En particulier, ils utilisent l'origine de réplication du plasmide F et des mécanismes de répartition qui permettent le clonage de gros fragments d'ADN. Les fosmides peuvent usuellement accepter un insert d'ADN 10 maximal de 40 kb. RETROVIRUS Les rétrovirus sont une famille de virus qui contiennent un ARN génomique simple brin pseudo-diploïde. 15 Ils codent pour une transcriptase inverse qui produit de l'ADN à partir de l'ARN génomique, qui peut être ensuite inséré dans l'ADN de la cellule hôte. L'invention décrite dans le présent document peut être utilisée pour produire des particules de vecteur rétroviral défectif en 20 réplication. La particule de vecteur rétroviral de la présente invention peut être choisie parmi ou dérivée de tout rétrovirus approprié. Dans un mode de réalisation, la particule de vecteur rétroviral est dérivée ou choisie parmi un lentivirus, un 25 alpha-rétrovirus, un gamma-rétrovirus ou un rétrovirus mousseux, comme un lentivirus ou un gamma-rétrovirus, en particulier un lentivirus. Dans un autre mode de réalisation, la particule de vecteur rétroviral est un lentivirus choisi dans le groupe constitué du VIH-1, VIH-2, 30 VIS, VIF, VAIE et Visna. Les lentivirus sont capables d'infecter des cellules qui ne se divisent pas (c'est-à-dire quiescentes), ce qui en fait des vecteurs rétroviraux 3044016 23 intéressants pour la thérapie génique. Dans encore un autre mode de réalisation, la particule de vecteur rétroviral est le VIH-1 ou est dérivée du VIH-1. La structure génomique de certains rétrovirus peut se trouver dans l'art. Par 5 exemple, des détails sur le VIH-1 peuvent se trouver auprès de la GenBank NCBI (n° d'entrée du Génome n° AF033819). Le VIH-1 est l'un des rétrovirus les mieux compris et est par conséquent souvent utilisé comme vecteur rétroviral. 10 Gènes rétroviraux Les séquences d'acide nucléique communes à tous les rétrovirus peuvent être expliquées plus en détail comme suit : Répétitions terminales longues (LTR) : la structure 15 basique d'un génome de rétrovirus comprend une LTR 5' et une LTR 3' entre ou à l'intérieur desquelles sont situés les gènes nécessaires à la production rétrovirale. Les LTR sont nécessaires pour l'intégration et la transcription rétrovirales. Elles peuvent aussi faire office de séquences 20 promoteurs pour réguler l'expression des gènes rétroviraux (ce qui veut dire que ce sont des gènes à action cis). Les LTR sont composées de trois sous-régions nommées U3, R, U5 : U3 est dérivée de la séquence unique à l'extrémité 3' de l'ARN, R est dérivée d'une séquence répétée aux deux 25 extrémités de l'ARN ; et U5 est dérivée de la séquence unique à l'extrémité 5' de l'ARN. Par conséquent, dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus une LTR 5' et 3'. Dans un autre mode de réalisation, la région U5 de la LTR 5' peut être délétée et 30 remplacée par une queue polyA non VIH-1 (voir Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3) : 242-51). 3044016 24 Afin de régler les problèmes de sécurité concernant la génération de virus compétents en réplication, un vecteur à auto-inactivation (SIN) a été développé par délétion d'une section dans la région U3 de la LTR 3', qui comprend la 5 boîte TATA et des sites de liaison pour les facteurs de transcription Spi et NF-KB (voir Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72(10) :8150-7). La délétion est transférée à la LTR 5' après transcription inverse et intégration dans des cellules infectées, ce qui aboutit à l'inactivation 10 transcriptionnelle de la LTR. Ceci est connu comme étant un système de vecteur à base de lentivirus à auto-inactivation qui peut être inclus dans la présente invention. W : L'encapsidation des ARN rétroviraux se produit en vertu d'une séquence * (psi) située au niveau de 15 l'extrémité 5' du génome rétroviral. Il est aussi bien connu dans l'art que les séquences en aval de la séquence psi et s'étendant dans la région codant gag sont impliquées dans la production efficace de vecteurs rétroviraux (voir Cui et al. (1999) J. Virol. 73(7) : 6171-6176). Dans un 20 mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus une séquence i (psi). Site de liaison à l'amorce (PBS) : Le génome rétroviral contient un PBS qui est présent après la région U5 de la LTR 5'. Ce site se lie à l'amorce d'ARNt 25 nécessaire pour l'initiation de la transcription inverse. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus une séquence PBS. PPT : Les génomes rétroviraux contiennent de courts étirements de purines, appelés tractus de polypurine (PPT) 30 près de l'extrémité 3' du génome rétroviral. Ces PPT font office d'amorces d'ARN pour la synthèse de l'ADN à plus de brins au cours de la transcription inverse. Les rétrovirus 3044016 25 complexes (tels que le VIH-1) contiennent un deuxième PPT localisé plus au centre (c'est-à-dire un tractus polypurine central (cPPT)) qui fournit un deuxième site pour l'initiation de la synthèse de l'ADN. Les vecteurs 5 rétroviraux codant pour un cPPT se sont avérés avoir une transduction et une expression du transgène améliorées (voir Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12(9) :1103-8). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus une séquence PPT en 3' et/ou une séquence 10 cPPT. La structure génomique des régions non codantes décrites ci-dessus est bien connue de l'homme du métier. Par exemple, des détails sur la structure génomique des régions non codantes dans le VIH-1 peuvent se trouver dans 15 la base de données GenBank NCBI, au n° d'entrée du Génome AF033819, ou pour HXB2 du VIH-1 (une souche de référence du VIH-1 communément utilisée) au n° d'entrée du Génome K03455. Dans un mode de réalisation, les régions non codantes sont dérivées des séquences disponibles sous le n° 20 d'entrée du Génome K03455, par exemple à partir des paires de bases 454-1126 (pour R-U5-PBS-Gag), 7622-8479 (pour RRE) ou 7769-8146 (pour RRE), 4781-4898 (pour cPPT), 9015-9120 & 9521-9719 (pour dNEF-PPT-sinU3-R-U5). Gag/pol : L'expression des gènes gag et pol est basée 25 sur un décalage de traduction du cadre de lecture entre gag et gagpol. Les deux sont des polyprotéines qui sont clivées au cours de la maturation. Les protéines structurelles majeures de matrice, capside et nucléocapside du vecteur rétroviral, sont codées par gag. Le gène pol code pour les 30 enzymes rétrovirales : i) transcriptase inverse, essentielle pour la transcription inverse de l'ARN génomique rétroviral en un ADN double brin, ii) intégrase, 3044016 26 qui permet l'intégration de l'ADN génomique rétroviral dans un chromosome de la cellule hôte, et iii) protéase qui clive la polyprotéine synthétisée afin de produire les protéines matures et fonctionnelles du rétrovirus. Dans un 5 mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique rétroviral codant les protéines gag et pal est dérivée de la séquence HXB2 du VIN-1, qui est disponible au n° d'entrée du Génome K03455, par exemple à partir des paires de bases 790-5105. Env : Le gène env 4 enveloppe ») code pour la surface 10 et les composants transmembranaires de l'enveloppe rétrovirale (par exemple glycoprotéines gp120 et gp41 du VIN-1) et est impliqué dans la fusion membranaire de la cellule rétrovirale. Afin d'élargir le tropisme des tissus du vecteur rétroviral, les vecteurs rétroviraux décrits ici peuvent être 15 pseudotypés avec une protéine d'enveloppe provenant d'un autre virus. Le pseudotypage désigne le procédé par lequel la gamme des cellules hôtes des vecteurs rétroviraux, y compris des vecteurs lentiviraux, peut être étendue ou modifiée en changeant les glycoprotéines (GP) sur les particules de 20 vecteur rétroviral (par exemple en utilisant les GP obtenues ou dérivées d'autres virus à enveloppe ou en utilisant des GP synthétiques/artificielles). La glycoprotéine la plus communément utilisée pour le pseudotypage des vecteurs rétroviraux est la GP du virus de la stomatite vésiculaire 25 (VSVg), du fait de son large tropisme et de la haute stabilité de ses particules de vecteur. Cependant, il est bien compris par l'homme du métier que d'autres glycoprotéines peuvent être utilisées pour le pseudotypage (voir Cronin et a/. (2005) Curr. Gene Ther. 5(4) :387-398). 30 Le choix du 3044016 27 virus utilisé pour le pseudotypage peut aussi dépendre du type de cellule et/ou d'organe à cibler car certains pseudotypes se sont révélés avoir des préférences pour un type de tissus. 5 Dans un mode de réalisation, la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci est obtenue ou dérivée d'un virus choisi parmi un vésiculovirus (par exemple virus de la stomatite vésiculaire), un lyssavirus (par exemple virus de la rage, virus Mokola), un arénavirus (par exemple 10 virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV)), un alphavirus (par exemple virus de la Ross River (RRV), virus Sindbis, virus de la forêt de Semliki (SFV), virus de l'encéphalite équine vénézuélienne), un filovirus (par exemple le virus Ebola de Reston, le virus Ebola du Zaïre, 15 le virus de Lassa), un alpharétrovirus (par exemple le virus de la leucose aviaire (ALV)), un bétarétrovirus (par exemple le rétrovirus du mouton de Jaagsiekte (JSRV)), un gammarétrovirus (par exemple le virus de la leucémie murine de Moloney (MLV), le virus de la leucémie du singe Gibbon 20 (GALV), le rétrovirus endogène félin (RD114)), un deltarétrovirus (par exemple un virus T-lymphotrophe humain 1 (HTLV-1)), un spumavirus (par exemple virus mousseux humain), un lentivirus (par exemple virus de Maedi-visna (MVV)), un coronavirus (par exemple SARS-coV), un 25 respirovirus (par exemple virus de Sendai, virus syncytial respiratoire (RSV)), un hépacivirus (par exemple le virus de l'hépatite C (VHC)), un virus de la grippe (par exemple virus de la grippe A) et un nucléopolyhédrovirus (par exemple, le nucléopolyhédrovirus multiple Autographa 30 californica (AcMNPV)). Dans un autre mode de réalisation, la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci est obtenue ou dérivée du virus de la stomatite vésiculaire. 3044016 28 Dans ce mode de réalisation, la protéine de glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVg) peut être utilisée, laquelle permet aux particules rétrovirales d'infecter une gamme de cellules hôtes plus large et 5 d'éliminer les chances de recombinaison afin de produire des protéines d'enveloppe de type sauvage. Dans un autre mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique codant la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci est dérivée de la séquence disponible au n° d'entrée du Génome 10 n° J02428.1, par exemple à partir des paires de bases 3071 à 4720. Les gènes structurels décrits dans le présent document sont communs à tous les rétrovirus. D'autres gènes auxiliaires peuvent être trouvés dans différents types de 15 rétrovirus. Par exemple, les lentivirus, comme le VIH-1, contiennent six autres gènes auxiliaires connus sous le nom de rev, vif, vpu, vpr, nef et tat. D'autres rétrovirus peuvent avoir des gènes auxiliaires qui sont analogues aux gènes décrits dans le présent document, mais ils peuvent ne 20 pas être toujours indiqués sous le même nom que dans la littérature. Des références telles que Tomonaga et Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8) : 1611-1621 décrivent divers gènes auxiliaires de rétrovirus. Rev : Le gène auxiliaire rev (« régulateur de 25 virion ») code pour une protéine accessoire qui se lie à l'élément de réponse Rev (RRE) et facilite l'exportation des transcrits rétroviraux. Le produit protéique du gène permet aux fragments d'ARNm rétroviral contenant l'élément de réponse Rev (RRE) d'être exportés depuis le noyau dans 30 le cytoplasme. La séquence RRE est prédite former une structure pliée complexe. Ce rôle particulier de rev reflète un couplage serré des étapes d'épissage et 3044016 29 d'exportation nucléaire. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend une séquence RRE. Dans un autre mode de réalisation, la séquence RRE est dérivée de la séquence HXB2 du VIH-1 qui est disponible au n° 5 d'entrée du Génome n° K03455, par exemple à partir des paires de bases 7622 à 8479 ou 7769 à 8146, en particulier des paires de bases 7622 à 8479. Rev se lie à RRE et facilite l'exportation des transcrits viraux mono-épissés (env, vif, vpr et viol]) ou 10 non épissés (gag, pol et ARN génomique), provoquant ainsi des évènements en aval comme la traduction et l'emballage des gènes (voir Suhasini et Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7(1) : 91-100). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus le gène auxiliaire rev 15 ou un gène analogue à celui-ci (c'est-à-dire provenant d'autres rétrovirus ou un système analogue fonctionnellement). L'inclusion du gène rev garantit l'exportation efficace des transcrits d'ARN du génome de vecteur rétroviral depuis le noyau jusque dans le 20 cytoplasme, en particulier si un élément RRE est aussi inclus dans le transcrit à transporter. Dans un autre mode de réalisation, le gène rev comprend une identité de séquence d'au moins 60 %, comme d'au moins 70 %, avec les paires de bases 970 à 1320 du n° d'entrée du Génome M11840 25 (c'est-à-dire l'ADNc du clone 12 du VIH-1, le locus HIVPCV12). Dans un mode de réalisation alternatif, le gène rev comprend une identité de séquence d'au moins 60 %, comme d'au moins 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % avec les paires de bases 5970 à 6040 et 8379 à 8653 du n° d'entrée du 30 Génome K03455.1 (c'est-à-dire du virus de l'immunodéficience humaine de type 1, HXB2). 3044016 30 On pense que les gènes auxiliaires jouent un rôle dans la réplication rétrovirale et la pathogenèse, par conséquent, plusieurs systèmes de production de vecteurs viraux actuels ne comprennent pas certains de ces gènes. 5 L'exception est rev qui est usuellement présent ou un système analogue au système rev/RRE est potentiellement utilisé. Par conséquent, dans un mode de réalisation, les séquences d'acide nucléique codant pour un ou plusieurs gènes auxiliaires vpr, vif, vpu, tat et nef, ou gènes 10 auxiliaires analogues sont interrompues de sorte que lesdits gènes auxiliaires soient retirés de l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral ou soient incapables de coder des protéines auxiliaires fonctionnelles. Dans un autre mode de réalisation, au moins deux gènes auxiliaires 15 ou plus, trois ou plus, quatre ou plus, ou la totalité des gènes auxiliaires vpr, vif, vpu, tat et nef, ou gènes auxiliaires analogues sont interrompus de sorte que lesdits gènes auxiliaires soient retirés de l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral ou soient incapables de 20 coder des protéines auxiliaires fonctionnelles. Le retrait du gène auxiliaire fonctionnel peut ne pas nécessiter le retrait du gène entier, le retrait d'une partie du gène ou l'interruption du gène sera suffisant. Il est bien entendu que les séquences d'acide 25 nucléique codant la particule de vecteur rétroviral défectif en réplication peuvent être les mêmes que les gènes de type sauvage du rétrovirus sur lequel est basée la particule de vecteur rétroviral, ou en être dérivées, ce qui veut dire que les séquences peuvent être des versions 30 de séquences génétiquement modifiées ou modifiées par un autre biais, présentes dans le virus de type sauvage. Par conséquent, les gènes rétroviraux incorporés dans les 3044016 31 vecteurs d'acide nucléique ou génomes de la cellule hôte peuvent aussi se désigner des versions des gènes de type sauvage optimisées au niveau du codon. 5 COMPOSANTS ADDITIONNELS Les vecteurs d'acide nucléique de l'invention peuvent comprendre d'autres composants additionnels. Ces caractéristiques additionnelles peuvent être utilisées pour aider par exemple à stabiliser les transcrits pour la 10 traduction, augmenter le taux d'expression des gènes et mettre en marche/arrêter la transcription des gènes. Les particules de vecteur rétroviral produites par l'invention peuvent être utilisées dans des procédés de thérapie génique. Par conséquent, dans un mode de 15 réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend un ou plusieurs transgènes. Ce transgène peut être un gène thérapeutiquement actif qui code pour un produit génique qui peut être utilisé pour traiter ou améliorer une maladie cible. Le transgène peut coder par exemple un ARN antisens, 20 un ribozyme, une protéine (par exemple une protéine suppresseur de tumeur), une toxine, un antigène (qui peut être utilisé pour induire des anticorps ou des lymphocytes T assistants ou des lymphocytes T cytotoxiques) ou un anticorps (comme un anticorps monocaténaire). Dans un mode 25 de réalisation le transgène code pour la bêta globine. On s'attend à ce que de multiples copies du vecteur de transfert contenant le transgène permettent une hausse du titre du vecteur rétroviral, donc, dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend de 30 multiples copies du transgène, comme deux copies du transgène ou plus, en particulier trois ou plus. Dans certains cas, plus d'un produit génique est nécessaire pour 3044016 32 traiter une maladie, par conséquent, dans un autre mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend, en plus, deux transgènes différents ou plus, comme trois ou plus, ou quatre ou plus. 5 Les références présentes à un « transgène » désignent l'ADN hétérologue ou étranger qui n'est pas présent ou pas suffisamment exprimé dans la cellule hôte d'un mammifère dans laquelle il est introduit. Cela peut inclure, par exemple, le cas où un gène cible n'est pas exprimé 10 correctement dans la cellule hôte mammifère, par conséquent une version corrigée du gène cible est introduite comme transgène. Par conséquent, le transgène peut être un gène d'intérêt thérapeutique potentiel. Le transgène peut avoir été obtenu à partir d'un autre type cellulaire, ou d'une 15 autre espèce, ou préparé par synthèse. En variante, le transgène peut avoir été obtenu à partir d'une cellule hôte, mais lié de manière fonctionnelle à des régions régulatrices qui sont différentes de celles présentes dans le gène natif. En variante, le transgène peut avoir un 20 allèle différent ou un variant différent d'un gène présent dans la cellule hôte. Le but de la thérapie génique est de modifier le matériel génétique des cellules vivantes à des fins thérapeutiques, et cela implique l'insertion d'un gène 25 fonctionnel dans une cellule afin d'obtenir un effet thérapeutique. Le vecteur rétroviral produit en utilisant les vecteurs d'acides nucléiques et les cellules hôtes décrits dans le présent document peut être utilisé pour transfecter des cellules cibles et induire l'expression du 30 gène d'intérêt thérapeutique potentiel. Le vecteur rétroviral peut par conséquent être utilisé pour le traitement d'un sujet mammifère, comme un sujet humain, 3044016 33 atteint d'une maladie comprenant, mais sans y être limitée, les pathologies héréditaires, le cancer, et certaines infections virales. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 5 nucléique comprend en plus un élément de régulation de la transcription. Par exemple, l'un quelconque des éléments décrits dans le présent document peut être lié de manière fonctionnelle à un promoteur de manière à pouvoir contrôler l'expression. Les promoteurs désignés ici peuvent inclure 10 des promoteurs connus, en tout ou en partie, qui peuvent être constitutivement actifs ou inductibles, par exemple en présence d'une protéine régulatrice. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un promoteur de haute efficacité comme un promoteur CMV. Ce 15 promoteur présente l'avantage de favoriser un haut niveau d'expression des éléments codés sur le vecteur d'acide nucléique non mammifère. Dans un autre mode de réalisation, le promoteur CMV comprend une séquence dérivée de la souche du cytomégalovirus humain AD169. Cette séquence est 20 disponible sous le n° d'entrée du Génome X17403, par exemple à partir des paires de bases 173731 à 174404. Dans un mode de réalisation, le promoteur (comme le promoteur CMV) comprend en plus au moins un opéron Tet. Le système d'opéron Tet peut être utilisé pour contrôler 25 l'expression des séquences rétrovirales contenues à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique. En bref, la protéine répresseur Tet bloque l'expression par la liaison au site de l'opéron Tet, il n'y a pas d'expression génique. Lors de l'addition de la tétracycline ou de la doxycycline, 30 le répresseur Tet est séquestré, permettant ainsi l'activité du promoteur, l'expression génique est alors mise en marche. Les systèmes d'opéron Tet sont largement 3044016 34 disponibles, comme l'opéron Tet utilisé dans le vecteur d'expression mammifère pcDNATm4/TO disponible chez Invitrogen. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 5 nucléique comprend en plus une protéine répresseur de l'opéron de la résistance à la tétracycline (« répresseur Tet » ou « TetR »). Dans un autre mode de réalisation, le répresseur Tet est optimisé au niveau du codon. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 10 nucléique comprend en plus un isolant, comme un isolant chromatine. Le terme « isolant » désigne une séquence génétique qui bloque l'interaction entre les promoteurs et les activateurs. Dans un autre mode de réalisation, l'isolant (comme un isolant chromatine) est présent entre 15 chacune des séquences d'acide nucléique rétroviral. Cela aide à prévenir l'interférence du promoteur (c'est-à-dire quand le promoteur d'une unité de transcription influence l'expression d'une unité de transcription adjacente) entre les séquences d'acide nucléique rétroviral adjacentes. On 20 comprendra que si les isolants sont présents dans le vecteur d'acide nucléique entre chacune des séquences d'acide nucléique rétroviral, alors ceux-ci peuvent être disposés sous la forme d'hybrides d'expression individuels à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique. Par exemple, 25 chaque séquence codant pour les séquences d'acide nucléique rétroviral possède son propre promoteur et/ou un intron et/ou un signal polyA. Dans un mode de réalisation l'isolant chromatine a une identité de séquence d'au moins 90 %, par exemple d'au moins 95 %, avec la séquence de 30 l'isolant HS4 du poulet (Gallus gallus) (par exemple voir n° d'entrée du Génome U78775.2, paires de bases 1 to 1205). 3044016 Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un marqueur sélectionnable. Cela permet aux cellules qui ont été incorporées dans les séquences d'acide nucléique codant pour une particule de 5 vecteur rétroviral défectif en réplication d'être sélectionnées. Dans un autre mode de réalisation, le marqueur sélectionnable est un gène de résistance à un antibiotique, comme un gène résistance à la zéocine, kanamycine ou puromycine, en particulier un gène de 10 résistance à la zéocine (ZeoR). Dans encore un autre mode de réalisation, le gène de la résistance à la zéocine est dérivé du gène Streptoalloteichus hindustans ble, voir par exemple le n° d'entrée du Génome X52869.1 à partir des paires de bases 3 à 377. 15 Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un signal polyA. L'utilisation d'un signal polyA présente l'avantage de protéger l'ARNm de la dégradation enzymatique et de faciliter la traduction. Dans un mode de réalisation, le signal polyA est obtenu ou 20 dérivé du SV40, de l'hormone de croissance bovine et/ou de la bêta globine humaine. Dans un mode de réalisation, le signal polyA est dérivé du signal polyA précoce du SV40 (par exemple voir n° d'entrée du Génome EF579804.1, paires de bases 2668 à 2538 à partir du brin moins). Dans un mode 25 de réalisation, le signal polyA est dérivé du signal polyA de la bêta globine humaine (par exemple voir n° d'entrée du Génome GU324922.1, paires de bases 3394 à 4162). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus une séquence d'intron. 30 L'utilisation d'un intron en aval de la région de l'activateur/du promoteur et en amont de l'insert d'ADNc (c'est-à-dire du transgène) est connue pour accroître le 3044016 36 taux d'expression de l'insert. Dans un autre mode de réalisation, la séquence d'intron est une séquence d'intron de la bêta globine humaine ou d'intron II de la bêta globine du lapin. Dans un mode de réalisation, l'intron de 5 la bêta globine humaine est dérivé de la séquence disponible sous le n° d'entrée du Génome KM504957.1 (par exemple à partir des paires de bases 476 à 1393). Dans un mode de réalisation, l'intron II de la bêta globine du lapin est dérivé de la séquence disponible sous le n° 10 d'entrée du Génome V00882.1 (par exemple à partir des paires de bases 718 à 1290). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un élément régulateur de post-transcription du virus de l'hépatite de la marmotte (WPRE). 15 La présence du WPRE s'est révélée renforcer l'expression et, en tant que telle, est susceptible d'être bénéfique dans l'obtention de hauts niveaux d'expression. Dans un autre mode de réalisation, le WPRE est dérivé de la séquence disponible au n° d'entrée du Génome J04514.1 (par 20 exemple à partir des paires de bases 1093 à 1684). Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un site d'entrée dans le ribosome interne (IRES). Un IRES est un élément d'ARN structuré qui se trouve usuellement dans la région non 25 traduite 5' en amont de la coiffe 5' (qui est nécessaire pour l'assemblage du complexe d'initiation). L'IRES est reconnu par des facteurs d'initiation de la traduction et permet la traduction indépendante de la coiffe. Dans un autre mode de réalisation, l'IRES est dérivé du génome du 30 virus de l'encéphalomyocardite (EMCV) (par exemple voir le n° d'entrée du Génome KF836387.1, paires de bases 151 724). 3044016 37 Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend en plus un site de clonage multiple (MCS). Un MCS est un segment court d'ADN à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique qui contient de multiples sites 5 de restriction (par exemple 10, 15 ou 20 sites). Ces sites sont usuellement présents seulement une fois à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique pour garantir que l'endonucléase ne clive qu'au niveau d'un site. Cela permet aux gènes rétroviraux d'être facilement insérés en 10 utilisant les endonucléases appropriées (c'est-à-dire des enzymes de restriction). L'homme du métier comprendra que les hybrides peuvent être disposés dans un ordre quelconque à l'intérieur du vecteur d'acide nucléique. Dans un exemple de mode de 15 réalisation, le vecteur d'acide nucléique comprend l'insert suivant : une séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour les protéines gag et pol, une séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci (comme VSVg), une 20 séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour le gène auxiliaire rev (comme une séquence rev à codon optimisé) ou une gène analogue à celui-ci ou un système fonctionnellement analogue, une protéine répresseur de l'opéron de résistance à la tétracycline (TetR), un site 25 d'entrée dans le ribosome interne, et un marqueur sélectionnable (comme un marqueur de sélection de la résistance à la zéocine) (c'est-à-dire une séquence BAC conservant GagPol-Env-Rev-RépresseurTet-IRES-marqueur de résistance à l'antibiotique (« Squelette BAC ») ; comme : 30 GagPol-(type sauvage)VSVg-(à codon optimisé)Rev- RépresseurTet-IRES-Résistance à la zéocine-pSMARTBAC). Dans un autre mode de réalisation, un isolant (comme un isolant 3044016 38 chromatine) est présent entre chacune séquences gagpol, env et rev. Dans un autre mode de réalisation, un promoteur est présent entre chacune des séquences gagpol, env et rev. Dans encore un autre mode de réalisation, au moins une 5 copie de la séquence du vecteur de transfert (c'est-à-dire comprenant les séquences d'acide nucléique qui codent pour l'ARN génomique d'une particule de vecteur rétroviral) est présente avant la séquence gagpol. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide 10 nucléique comprend l'insert suivant : un isolant (comme un isolant chromatine), un promoteur (comme un promoteur CMV, comprenant éventuellement une séquence d'opéron Tet), un intron (comme un intron de bêta globuline humaine), une séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour les 15 protéines gag et pol, un acide nucléique rétroviral codant RRE, un signal polyA (comme un signal polyA de bêta globuline humaine), un isolant (comme un isolant chromatine), un promoteur (comme un promoteur CMV, comprenant éventuellement une séquence d'opéron Tet), un 20 intron (comme un intron de bêta globuline humaine), une séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci (comme VSVg), un signal polyA (comme un signal polyA de bêta globuline humaine), un isolant (comme un isolant 25 chromatine), un promoteur (comme un promoteur CMV, comprenant éventuellement une séquence d'opéron Tet), une séquence d'acide nucléique rétroviral codant pour le gène auxiliaire rev ou un gène analogue à celui-ci ou un système fonctionnellement analogue, un signal polyA (comme un 30 signal polyA de bêta globuline humaine), un isolant (comme un isolant chromatine), un promoteur (comme un promoteur CMV), un intron (comme un intron de bêta globuline de 3044016 39 lapin), une protéine répresseur de l'opéron de la résistance à la tétracycline (TetR), un site d'entrée dans le ribosome interne, un marqueur sélectionnable (comme un marqueur de sélection de la résistance à la zéocine), un 5 signal polyA et un site de clonage multiple. Les séquences d'acide nucléique peuvent être introduites dans le vecteur d'acide nucléique séquentiellement. Cela permet une sélection après chaque intégration afin de garantir que la totalité des séquences 10 d'acide nucléique nécessaires sont intégrées avec succès dans le vecteur d'acide nucléique. En variante, au moins deux séquences d'acide nucléique ou plus sont introduites dans le vecteur d'acide nucléique simultanément. On comprendra que les gènes additionnels décrits dans 15 le présent document peuvent être introduits dans le vecteur d'acide nucléique par des techniques de clonage moléculaire standards connues dans l'art, par exemple en utilisant les endonucléases de restriction et les techniques de ligation. En outre, le vecteur d'acide nucléique, en particulier les 20 BAC, PAC, fosmides et/ou cosmides, peut être introduit dans des cellules hôtes bactériennes (comme les cellules de E. coli, en particulier la souche DH1OB de E. coli) par des techniques standards, comme l'électroporation. 25 UTILISATIONS Selon un autre aspect de l'invention, on propose le vecteur d'acide nucléique tel que défini dans le présent fascicule pour une utilisation dans la production de lignées cellulaires d'emballage ou de production 30 rétroviraux. Les vecteurs d'acide nucléique décrits dans le présent document peuvent être utilisés pour créer une lignée 3044016 cellulaire d'emballage rétroviral qui simplifierait grandement la production de vecteurs rétroviraux. Il est bien entendu que si un transgène est inclus sur le vecteur d'acide nucléique, celui-ci serait alors utilisé pour créer 5 une lignée cellulaire productrice. Comme cela est indiqué dans le présent document, il serait utile de développer une lignée cellulaire stable d'emballage rétrovirale (ou productrice de rétrovirus) afin de surmonter les difficultés liées à la transfection 10 transitoire. Les vecteurs d'acide nucléique décrits dans le présent fascicule peuvent être utilisés pour préparer lesdites lignées cellulaires d'emballage car ils sont capable de contenir de gros inserts d'ADN contenant les gènes essentiels requis pour l'emballage rétroviral, qui 15 peuvent être ensuite intégrés dans le génome endogène des cellules hôtes mammifères en une étape. CELLULES HÔTES Selon un autre aspect de l'invention, on propose une 20 cellule d'emballage rétroviral comprenant des séquences d'acide nucléique codant pour : les protéines gag et pol, et une protéine env ou un substitut fonctionnel de celle- ci ; 25 dans laquelle lesdites séquences d'acide nucléique sont toutes situées au niveau d'un unique locus l'intérieur du génome de la cellule d'emballage rétroviral. L'avantage qu'apporte l'inclusion de la totalité des gènes rétroviraux sur un gros vecteur d'acide nucléique est 30 qu'ils peuvent être préparés dans des cellules microbiennes (comme des cellules bactériennes ou de levure) d'abord, lesquelles sont bien plus faciles à utiliser et à 3044016 41 manipuler, avant de les introduire dans des cellules mammifères dans une unique étape. Cela permet de relâcher la pression de sélection et de réduire l'intervalle temporel de silençage une fois que les gènes rétroviraux 5 ont été intégrés dans une cellule hôte mammifère. Le trait caractéristique de ce procédé est que la totalité des gènes rétroviraux nécessaires pour créer une lignée cellulaire d'emballage est présente dans un unique locus dans le génome endogène, plutôt que d'être distribués aléatoirement 10 tout au long du génome endogène. Cela apporte l'avantage de produire une cellule d'emballage rétroviral qui exprime la totalité des gènes rétroviraux au même taux car ils sont situés sur le même locus, par rapport aux procédés antérieurs où les gènes rétroviraux sont intégrés 15 aléatoirement tout au long du génome endogène, ce qui peut susciter des taux d'expression irréguliers. Dans un mode de réalisation, la cellule d'emballage rétroviral comprend en outre des séquences d'acide nucléique qui codent pour l'ARN génomique de la particule 20 de vecteur rétroviral. Celui-ci peut aussi être situé sur le même locus que les séquences d'acide nucléique codant pour les protéines gag et pol et la protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci. Par conséquent, selon un autre aspect de l'invention, 25 on propose une cellule productrice rétrovirale comprenant des séquences d'acide nucléique codant pour : les protéines gag et pol, une protéine env ou un substitut fonctionnel de celle-ci ; et 30 l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral, dans laquelle lesdites séquences d'acide nucléique sont toutes situées au niveau d'un unique locus 3044016 42 l'intérieur du génome de la cellule productrice rétrovirale. Dans un mode de réalisation, la cellule d'emballage rétroviral est une cellule mammifère. Dans un autre mode de 5 réalisation, la cellule mammifère est choisie parmi une cellule HEK 293, une cellule CHO, une cellule de Jurkat, une cellule KS62, une cellule PerC6, une cellule HeLa, ou un dérivé ou un équivalent fonctionnel de celles-ci. Dans encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte 10 mammifère est une cellule HEK 293 ou dérivée d'une cellule HEK 293. Ces lignées cellulaires pourraient être des lignées cellulaires adhérentes (c'est-à-dire qu'elles croissent en une monocouche fixée à une surface) ou des lignées cellulaires adaptées/non adhérentes en suspension 15 (c'est-à-dire qu'elles croissent en suspension dans un milieu de culture). Dans encore un autre mode de réalisation, la cellule HEK 293 est une cellule HEK 293T. Le terme « cellule HEK 293 » désigne la lignée cellulaire 293 du rein embryonnaire humain qui est communément 20 utilisée en biotechnologie. En particulier, les cellules HEK 293T sont communément utilisées pour la production de divers vecteurs rétroviraux. D'autres exemples de lignées cellulaires appropriées disponibles dans le commerce comprennent les lignées cellulaires T REXTM (Life 25 Technologies). On comprendra que tous les modes de réalisation décrits ci-dessus pour le vecteur d'acide nucléique pourront aussi être appliqués aux cellules de production/d'emballage rétroviral de l'invention. 30 PROCEDES 3044016 43 Selon un autre aspect de l'invention, on propose un procédé de production d'une lignée cellulaire stable d'emballage rétroviral, comprenant : (a) l'introduction du vecteur d'acide nucléique tel 5 que défini dans le présent document dans une culture de cellules hôtes mammifères ; et (b) la sélection, à l'intérieur de la culture, d'une cellule hôte mammifère qui possède les séquences d'acide nucléique codées sur le vecteur intégré dans un chromosome 10 endogène de la cellule hôte mammifère. Dans un mode de réalisation, la cellule hôte mammifère est choisie parmi une cellule HEK 293, une cellule HEK 6E, une cellule CHO, une cellule de Jurkat, une cellule KS62, une cellule PerC6, une cellule HeLa, ou un dérivé ou un 15 équivalent fonctionnel de celles-ci. Dans un autre mode de réalisation, la cellule hôte mammifère est une cellule HEK 293 ou dérivée d'une cellule HEK 293. Ces lignées cellulaires pourraient être des lignées cellulaires adhérentes (c'est-à-dire qu'elles croissent en une 20 monocouche fixée à une surface) ou des lignées cellulaires adaptées/non adhérentes en suspension (c'est-à-dire qu'elles croissent en suspension dans un milieu de culture). Dans encore un autre mode de réalisation, la cellule HEK 293 est une cellule HEK 293T ou une cellule HEK 25 6E. D'autres exemples de lignées cellulaires appropriées disponibles dans le commerce comprennent les lignées cellulaires T REXTM (Life Technologies). L'homme du métier saura que l'introduction du vecteur d'acide nucléique dans la cellule hôte peut être réalisée 30 en utilisant des procédés appropriés connus dans l'art, par exemple, la transfection induite par des lipides, la micro-injection, la fusion cellulaire (comme micro-cellulaire), 3044016 44 l'électroporation, ou le bombardement de microprojectiles. Dans un mode de réalisation, le vecteur d'acide nucléique est introduit dans la cellule hôte par électroporation. On comprendra que le choix du procédé à utiliser pour 5 l'introduction du vecteur d'acide nucléique puisse dépendre du type de cellule hôte mammifère utilisé. Une fois à l'intérieur de la cellule hôte mammifère, le vecteur d'acide nucléique intégrera aléatoirement le génome endogène de la cellule hôte mammifère. Par 10 conséquent, le procédé comprend en outre la sélection de la cellule hôte mammifère qu'ont intégré les acides nucléiques codés sur le vecteur d'acide nucléique (par exemple en utilisant un marqueur de sélection de la résistance à un antibiotique, comme un marqueur de résistance à la 15 zéocine). L'homme du métier connaîtra les procédés permettant de favoriser l'intégration du vecteur d'acide nucléique, par exemple la linéarisation du vecteur d'acide nucléique s'il est naturellement circulaire (par exemple BAC, PAC, 20 cosmides ou fosmides). Le vecteur d'acide nucléique peut comprendre en outre des zones d'homologie partagée avec les chromosomes endogènes de la cellule hôte mammifère afin de diriger l'intégration dans un site sélectionné l'intérieur du génome endogène. De plus, si des sites de 25 recombinaison sont présents sur le vecteur d'acide nucléique, alors ceux-ci peuvent être utilisés pour une recombinaison ciblée. Par exemple, le vecteur d'acide nucléique peut contenir un site loxP qui permet une intégration ciblée une fois combiné à la recombinase Cre 30 (c'est-à-dire en utilisant le système Cre/lox dérivé du bactériophage P1). En variante (ou en plus), le site de recombinaison est un site att (par exemple provenant du 3044016 phage lambda), où le site att permet l'intégration orientée en présence d'une intégrase lambda. Cela permettrait aux gènes rétroviraux d'être ciblés sur un locus à l'intérieur du génome endogène, ce qui permet une expression élevée 5 et/ou stable. D'autres procédés d'intégration ciblée sont bien connus dans l'art. Par exemple, des procédés permettant l'induction du clivage ciblé de l'ARN génomique peuvent être utilisés pour favoriser la recombinaison ciblée sur un 10 locus chromosomique choisi. Ces procédés impliquent fréquemment l'utilisation de systèmes de clivage manipulés afin d'induire une cassure double brin (DSB) ou une brèche dans le génome endogène afin d'induire la réparation de la cassure par des processus naturels comme la jonction 15 d'extrémités non homologues (NHEJ) ou la réparation en utilisant une matrice de réparation (c'est-à-dire réparation orientée par homologie ou HDR). Le clivage peut se produire par l'utilisation de nucléases spécifiques, comme les nucléases du doigt de zinc 20 manipulées (ZFN), les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), en utilisant le système CRISPR/Cas9 avec un ARNcr/ARN tracr manipulé ('ARN simple guide') afin de guider le clivage spécifique et/ou en utilisant des nucléases basées sur le système Argonaute 25 (par exemple provenant de T. thermophilus, connu sous le nom de 'TtAgo', voir Swarts et al. (2014) Nature 507(7491) : 258-261). Le clivage ciblé en utilisant un de ces systèmes de nucléases peut être exploité pour insérer un acide nucléique dans un endroit cible spécifique en 30 utilisant des processus induits soit par HDR soit par NHEJ. Par conséquent, dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre l'intégration des séquences d'acide 3044016 46 nucléique codées sur le vecteur d'acide nucléique dans le génome (c'est-à-dire un chromosome endogène) de la cellule hôte mammifère en utilisant au moins une nucléase, où la au moins une nucléase clive le génome de la cellule hôte 5 mammifère de telle sorte que les séquences d'acide nucléique soient intégrées dans le génome de la cellule. Dans un autre mode de réalisation, la au moins une nucléase est choisie dans le groupe constitué par une nucléase doigt de zinc (ZFN), une nucléase TALE (TALEN), un système de 10 nucléase CRISPR/Cas et des combinaisons de ceux-ci. Selon un autre aspect de l'invention, on propose une cellule d'emballage rétroviral obtenue par le procédé tel que défini dans le présent fascicule. La lignée cellulaire obtenue en utilisant les procédés 15 tels que définis dans le présent fascicule peut être utilisée pour produire un titre élevé de vecteur rétroviral. Les références présentes ici au terme « titre élevé » désigne une quantité efficace d'un vecteur rétroviral ou 20 d'une particule qui est capable de transduire une cellule cible, comme une cellule d'un patient. Dans un mode de réalisation, un titre élevé est un titre excédant 106 TU/ml sans concentration (TU = unités de transduction). Selon un autre aspect de l'invention, on propose un 25 procédé de production d'une particule de vecteur rétroviral défectif en réplication, comprenant : (a) l'introduction du vecteur d'acide nucléique tel que défini dans le présent document dans une culture de cellules hôtes mammifères ; 30 (b) la sélection, à l'intérieur de la culture, d'une cellule hôte mammifère qui possède les séquences d'acide 3044016 47 nucléique codées sur le vecteur intégré dans un chromosome endogène de la cellule hôte mammifère ; et (c) la poursuite de la culture de la cellule hôte mammifère dans des conditions permettant de produire la 5 particule de vecteur rétroviral défectif en réplication. Comme cela a été décrit dans ce qui précède, dans un mode de réalisation, la cellule hôte mammifère est choisie parmi une cellule HEK 293, une cellule CHO, une cellule de Jurkat, une cellule KS62, une cellule PerC6, une cellule 10 HeLa, ou un dérivé ou un équivalent fonctionnel de celles- ci. Dans un autre mode de réalisation, la cellule hôte mammifère est une cellule HEK 293 ou dérivée d'une cellule HEK 293. Ces lignées cellulaires pourraient être des lignées cellulaires adhérentes (c'est-à-dire qu'elles 15 croissent en une monocouche fixée à une surface) ou des lignées cellulaires adaptées/non adhérentes en suspension (c'est-à-dire qu'elles croissent en suspension dans un milieu de culture). Dans encore un autre mode de réalisation, la cellule HEK 293 est une cellule HEK 293T. 20 D'autres exemples de lignées cellulaires appropriées disponibles dans le commerce comprennent les lignées cellulaires T REXTM (Life Technologies). L'homme du métier comprendra que les conditions utilisées dans le procédé décrit dans le présent document 25 soient dépendantes de la cellule hôte utilisée. Les conditions typiques, par exemple le milieu de culture ou la température à utiliser, sont bien connues dans l'art. Dans un mode de réalisation, la culture est réalisée en incubant la cellule hôte de mammifère dans des conditions 30 humidifiées. Dans un autre mode de réalisation, les conditions humidifiées comprennent l'incubation des cellules transfectées à 37°C à 5 % de CO2. Dans un mode de 3044016 48 réalisation, la culture est réalisée en utilisant un milieu de culture choisi parmi : le milieu d'Eagle modifié par Dubelcco (DMEM) contenant 10 % (vol/vol) de sérum foetal de bovin (FBS), un milieu UltraCULTURETm sans sérum (Lonza, n° 5 cat. 12-725F) ou le milieu d'expression FreeStyleTM (Thermo fisher, n° cat. 12338-018). Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en plus l'isolation de la particule de vecteur rétroviral défectif en réplication. Par exemple, dans un mode de 10 réalisation, l'isolation est réalisée en utilisant un filtre. Dans un autre mode de réalisation, le filtre est une membrane de faible liaison aux protéines (par exemple une membrane de faible liaison aux protéines de 0,22 pm ou une membrane de faible liaison aux protéines de 0,45 pm), 15 comme les membranes artificielles de fluorure de polyvinylidène (PVDF) ou de polyéthersulfone (PES). Une fois à l'intérieur de la cellule hôte mammifère, les acides nucléiques rétroviraux présents sur le vecteur d'acide nucléique s'intégreront dans un unique locus 20 aléatoire à l'intérieur du génome endogène. Les étapes d'intégration peuvent être favorisées comme décrit dans ce qui précède, par exemple en utilisant la linéarisation et/ou des zones d'homologie partagée. Des sites de recombinaison peuvent être utilisés pour la recombinaison 25 ciblée. Si les gènes cibles sont intégrés dans les chromosomes endogènes avec un marqueur sélectif, comme un gène de résistance à un antibiotique, alors le procédé peut comprendre en plus la sélection des cellules hôtes 30 mammifères qu'ont intégrées avec succès les acides nucléiques rétroviraux. 3044016 49 Une fois isolées, les particules de vecteur rétroviral peuvent être concentrées pour des applications in vivo. Les procédés de concentration comprennent par exemple l'ultracentrifugation, la précipitation ou la 5 chromatographie d'échange anionique. L'ultracentrifugation est utile comme procédé rapide pour la concentration du vecteur rétroviral à petite échelle. En variante, la chromatographie d'échange anionique (utilisant par exemple des cartouches de membrane d'échange anionique Mustang Q) 10 ou la précipitation (par exemple utilisant PEG 6000) sont particulièrement utiles pour la transformation de gros volumes de surnageants de vecteurs lentiviraux. Selon un autre aspect de l'invention, on propose une particule de vecteur rétroviral défectif en réplication 15 obtenue par le procédé tel que défini dans le présent fascicule. L'invention va à présent être décrite plus en détails à l'aide des exemples non limitatifs suivants. 20 EXEMPLES EXEMPLE 1 : Guide de construction d'hybrides La Figure 1 montre un guide étape par étape pour la construction de BACpack-WTGP-277delU5 et BACpack-SYNGP- 25 277delU5. Grâce aux extrémités compatibles d'un produit de digestion de XbaI et NheI, les gènes d'emballage lentiviraux ont été progressivement chargés dans le vecteur pSmart BAC. Au moment de l'addition de GagPol, 2 hybrides ont été fabriqués, lesquels contiennent soit GagPol de type 30 sauvage (WTGP) soit GagPol à codon optimisé, SYNGP. La nomenclature de BACpack-WTGP et de BACpack-SYNGP leur a été respectivement donnée. La cassette de transfert a été 3044016 ensuite chargée sur ces deux hybrides, générant ainsi BACpackWTGP-277delU5 et BACpackSYNGP-277delU5. EXEMPLE 2 : Sélection d'un lot polyclonal stable. 5 Des lots transfectants stables polyclonaux ont été générés par transfection de la lignée cellulaire adhérente, HEK293T, avec BACpackSYNGP-277delU5 et BACpackWTGP277delU5. Des évènements d'intégration réussie ont été ensuite sélectionnés avec Zéocin. 10 Pour évaluer la capacité de ces lots polyclonaux à générer un vecteur lentiviral, les cellules ont été induites avec de la doxycycline (I) ou laissées non induites (UI) et comparées aux cellules HEK293T non transfectées. 15 Les résultats montrent le titre en unités de transduction (TU)/ml du surnageant de vecteur lentiviral récolté à partir de chaque condition de transfection. On peut voir à partir des résultats de titration sur la Figure 2 que les lots polyclonaux stables, produits soit avec 20 BACpackSYNGP-277delU5 soit avec BACpackWTGP-277delU5, sont capables de produire le vecteur lentiviral à des concentrations situées dans la région de 107 TU/ml, ce qui est comparable au système de tansfection transitoire actuel. 25 Ces résultats confirment que le vecteur BAC unique contenant la totalité des gènes d'emballage nécessaires à la production lentivirale peut produire des lignées cellulaires capables de produire le vecteur lentiviral à un titre approprié. 30 EXEMPLE 3 : Génération de clones de transfection stables en suspension 3044016 51 Le but primaire de la génération de lignées cellulaires productrices de vecteur lentiviral en utilisant la technologie BAC est d'appliquer rapidement les nouvelles avancées sur la plateforme. Ces avancées sont susceptibles 5 d'inclure une modification des lignées cellulaires spécialistes. Par exemple, augmenter le rendement en produisant des produits biologiques dans des cellules en suspension est une norme de l'industrie puisqu'elles croissent à des densités plus élevées que les cellules 10 adhérentes. Cependant, le système de production de vecteurs lentiviraux actuel repose sur des taux de transfection élevés, qui sont plus difficiles à obtenir dans des cellules en suspension que dans des cellules HEK293T adhérentes. Comme l'efficacité de la transfection est moins 15 importante lors de la génération d'une lignée cellulaire stable du fait de la sélection des intégrants réussis, l'hybride BAC est une solution idéale permettant de générer des lignées cellulaires en suspension produisant un vecteur lentiviral. 20 Comme démontré précédemment, l'hybride BAC est capable de générer des lignées cellulaires productrices de vecteur lentiviral à partir de cellules HEK293T adhérentes. Afin de prouver la flexibilité des hybrides BAC, des lignées cellulaires transfectantes stables ont été générées 25 partir de la lignée cellulaire en suspension HEK293 6E. Les cellules HEK293 6E ont été transfectées avec l'hybride BAC BACpackWTGP-277delU5 puis sélectionnées avec Zéocine. Cette opération a été suivie d'un clonage pour générer des lignées cellulaires clonales. Les résultats sur la Figure 3 30 montrent le signal GFP généré par les lignées cellulaires stables. Cela indique à la fois la présence de la 3044016 52 résistance à la Zéocin et une cassette d'expression GFP fonctionnelle dans le segment du vecteur de transfert. Ce résultat suggère que l'hybride BAC est capable de générer des clones stables à partir de lignées cellulaires 5 multiples. EXEMPLE 4 : Induction de lentivirus dans les clones en suspension. Afin de confirmer la capacité des clones stables en suspension à produire le vecteur lentiviral, les clones 1, 10 14, 15 et 16 ont été induits avec 2 pg/ml de doxycycline et le titre viral du surnageant a été mesuré par transduction des cellules HEK293T. Les résultats sur la Figure 4 montrent le titre en unités de transduction (TU)/ml du surnageant de vecteur 15 lentiviral récolté à partir de chaque clone. Les résultats montrent clairement que les lignées cellulaires générées par transfection stable de la lignée cellulaire en suspension HEK293 6E avec BACpackWTGP-277delU5 sont capables de produire le vecteur lentiviral à des rendements 20 comparables à ceux du système de transfection transitoire actuel. EXEMPLE 5 : Titres du vecteur des clones Les clones 1 et 16 tels que décrits sur la Figure 4 25 ont été passés en culture et induits et titrés à des moments ultérieurs afin de déterminer si la production de vecteur a été stable à partir de ces clones fortement producteurs. Comme le montrent les Figures 5A et 5B, les titres de vecteur à partir de ces clones ont véritablement 30 augmenté modestement entre le passage 5 et le passage 21, peut-être à cause d'une hausse de la concentration en butyrate de sodium introduite dans le procédé d'induction. 3044016 53 On comprendra que les modes de réalisation décrits ici peuvent être appliqués à tous les aspects de l'invention. REVENDICATIONS1. Cellule productrice rétrovirale comprenant des séquences d'acide nucléique codant pour les protéines gag et pol ; une protéine env; et l'ARN génomique de la particule de vecteur rétroviral, dans laquelle lesdites séquences d'acide nucléique sont toutes situées au niveau d'un unique locus à l'intérieur du 10 génome de la cellule productrice rétrovirale. 2. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 1, qui comprend en outre le gène auxiliaire re.v. 15 3. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle les séquences d'acide nucléique rétroviral sont dérivées d'un rétrovirus choisi parmi les lentivirus, les alpha-rétrovirus, 20 les gamma-rétrovirus ou les rétrovirus mousseux. 4. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 3, dans laquelle les séquences d'acide nucléique rétroviral sont dérivées d'un lentivirus choisi 25 dans le groupe constitué du VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VAIE et Visna. 5. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 4, dans laquelle les séquences d'acide 30 nucléique rétroviral sont dérivées du VIN-1. 6. Cellule productrice rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la 3044016 55 ?ine env est dérivée du virus de la stomatite vesLeulaire. 7. Cellule productrice rétrovirale selon l'une 5 quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend en outre un élément régulateur de transcription. 8. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 7, dans laquelle l'élément régulateur de 10 transcription est un promoteur CMV. 9. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 8, dans laquelle le promoteur CMV comprend en outre au moins un opéron Tet. 10. Cellule productrice rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, qui comprend en outre une protéine répresseur de l'opéron de la résistance à la tétracycline (TetR). 11. Cellule productrice rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui comprend en outre un isolant. 25 12. Cellule productrice rétrovirale selon la revendication 11, dans laquelle un isolant est présent entre chacune des séquences d'acide nucléique rétro-viral. 13. Cellule productrice rétrovirale selon l'une 30 quelconque des revendications 1 à 12, qui comprend en outre un marqueur sélectionnable. 15 20 3044016 56 14. Cellule productrice rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, qui comprend en outre un ou plusieurs transgènes. 5 15. Cellule Productrice rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans laquelle la cellule est une cellule mammifère.