FR 3040999 A1 20170317 FR 1558465 A 20150911 1 La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de génotypage de polymorphismes de nucléotide simple (SNP). ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Un polymorphisme de nucléotide simple ou SNP (single-nucleotide polymorphism) est une variation d'une seule paire de bases du génome entre individus de la même espèce ou entre chromosomes de la même paire. Les SNP représentent 90% de l'ensemble des variations génétiques humains. Ils se rencontrent environ toutes les 1000 bases dans le génome humain et à ce jour plus de 1,8 millions de SNP sont répertoriés et disponibles dans des banques de données spécialisées. L'exploitation de ces banques a permis de révéler que ces SNP pouvaient non seulement être utilisés à des fins de médecine légale afin de distinguer des individus mais également pour diagnostiquer ou déterminer des prédispositions pour certaines pathologies, prédire la gravité de l'atteinte ou la réponse du patient à un traitement ou encore déterminer le groupe sanguin d'un individu. Il existe de nombreuses méthodes permettant de détecter des SNP notamment les techniques de puces à ADN, d'hybridation allèle spécifique (ou ASO « Allele Specific Oligonucleotide Hybridization »), de séquençage d'ADN, d'analyse SSCP (Single-strand conformation polymorphism), de spectrométrie de masse, d'extension d'amorce, d'analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction, ou de ligation d'oligonucléotide allèle spécifique. Cependant, la majorité de ces techniques est coûteuse, complexe à mettre en place et ne permet pas la réalisation d'analyses ponctuelles avec des procédés d'utilisation simples. Ces dernières années ont donc vu le développement de nouvelles techniques simplifiées où les SNP sont détectés à l'aide de simples tests sur bandelette (ou « Lateral- flow assays ») permettant une lecture visuelle du résultat (Litos et al., 2009 ; Sapountzi et al., 2015). Ces nouvelles techniques sont basées essentiellement sur une amplification PCR de l'ADN cible à l'aide d'amorces spécifiques de l'allèle recherché. Cela signifie que la réaction d'amplification n'a lieu que si la région 3' de l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence cible. Chaque amorce spécifique d'un allèle comprend donc une séquence qui est adjacente au site du SNP avec un nucléotide en 3' 3040999 2 complémentaire du variant allélique, un bras espaceur ainsi qu'une étiquette en 5' lui permettant de s'hybrider avec les sondes immobilisées sur la bandelette. Litos et al. proposent une technique dans laquelle plusieurs SNP peuvent être génotypés simultanément sur la même bandelette. Pour cela, chaque amorce spécifique d'un allèle 5 comprend une étiquette différente en 5' qui s'hybridera spécifiquement à l'une des sondes immobilisées sur la bandelette. Cependant, malgré les avancées réalisées, ces techniques restent complexes à mettre en oeuvre, notamment en raison de l'utilisation de deux techniques d'amplification successives (PCR puis réaction par extension d'amorces) et/ou de la production des microsphères conjuguées avec les séquences spécifiques pour 10 chaque allèle à détecter et du dépôt de ces microsphères sur des membranes de nitrocellulose. RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont à présent démontré qu'il était possible de discriminer les différents variants alléliques d'un même SNP à partir d'un seul produit d'amplification à 15 l'aide d'un dispositif de test à flux latéral. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro de génotypage d'un ou plusieurs polymorphismes de nucléotide simple (SNP) dans un échantillon acide nucléique, ledit procédé comprenant : a) l'amplification d'une ou plusieurs régions de l'acide nucléique contenant le ou 20 les SNP à génotyper, les produits d'amplification comprenant un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, et b) l'analyse des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) à l'aide d'un dispositif de test à flux latéral comprenant une zone réactionnelle comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant 25 une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP à génotyper, l'obtention d'un signal au niveau du site d'immobilisation d'une sonde indiquant que l'acide nucléique comprend le variant allélique spécifique de la sonde. L'amplification est de préférence réalisée par PCR asymétrique, et de manière tout particulièrement préférée par LATE-PCR. 3040999 3 L'amplification simultanée de plusieurs régions de l'acide nucléique peut être réalisée par PCR multiplexe. Les produits d'amplification peuvent être marqués en 5', de préférence par l'utilisation d'amorces marquées en 5' durant l'amplification. 5 Les produits d'amplification peuvent être marqués par un composé coloré, luminescent, fluorescent, phosphorescent ou radioactif, par une enzyme ou le premier membre d'un couple ligand/anti-ligand, de préférence par une biotine. De préférence, le dispositif de test à flux latéral utilisé lors du procédé selon l'invention comprend 10 une matrice poreuse comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et (iii) la zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits 15 d'amplification, et (iv) optionnellement, une zone de contrôle de migration des réactifs en aval de la zone réactionnelle, et/ou (v) optionnellement, une zone de marquage comprenant un substrat ou partenaire de liaison spécifique du marqueur des produits d'amplification capable de générer 20 directement ou indirectement un signal détectable, disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration et en amont de la zone d'application des produits d'amplification, et/ou (vi) optionnellement, un tampon absorbant disposé en aval de la zone réactionnelle ou de la zone de contrôle lorsque celle-ci est présente, 25 les différentes zones de la matrice poreuse étant en communication de fluide avec la ou les zones adjacentes et le tampon absorbant étant en communication de fluide avec la matrice poreuse. Les produits d'amplification peuvent être analysés directement à l'aide du dispositif de test à flux latéral sans étape de purification ni dénaturation préalable. 3040999 4 L'analyse des produits d'amplification comprend typiquement (i) le dépôt des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) sur le dispositif de test à flux latéral ii) l'application d'un tampon de migration sur ledit dispositif, 5 iii) l'incubation du dispositif jusqu'à la détection dans la zone réactionnelle des signaux générés directement ou indirectement par le marqueur des produits d'amplification et/ou la détection d'un signal dans la zone de contrôle de migration lorsque celle-ci est présente, et iv) la lecture et l'interprétation des résultats. 10 La matrice du dispositif de test à flux latéral peut être en nitrocellulose, polyester, fibres de verre, fibres de cellulose, polyether sulfone (PES) et/ou ester de cellulose. De préférence, la matrice est une membrane de nitrocellulose. Le tampon de migration comprend de préférence un système tampon permettant de conserver un pH neutre, un ou plusieurs tensio-actifs et/ou un ou plusieurs agents 15 dénaturants qui déstabilisent les liaisons hydrogènes ainsi que les interactions non spécifiques. Selon un second aspect, la présente invention concerne également un kit comprenant un dispositif de test à flux latéral tel que défini ci-dessus, et au moins un couple d'amorces permettant d'amplifier une région génomique contenant un SNP. 20 Optionnellement, le kit peut également comprendre un tampon de migration, des réactifs pour l'amplification, de préférence des dNTP, une polymérase et/ou un tampon, et/ou une notice expliquant l'utilisation dudit kit. Selon un mode préféré, le kit comprend un ou plusieurs couples d'amorces permettant d'amplifier une ou plusieurs régions génomiques contenant un ou plusieurs 25 SNP associés à des systèmes d'antigènes érythrocytaires, de préférence les systèmes DUFFY, MNS et/ou KIDD. En particulier, le kit peut comprendre une ou plusieurs amorces sélectionnées dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1 à 8, et plus particulièrement un ou plusieurs des couples d'amorces (1) SEQ ID NO : 1 et 2, (2) SEQ ID NO : 3 et 4, (3) SEQ ID NO : 5 et 6, et (4) SEQ ID NO : 7 et 8. 3040999 5 La présente invention concerne en outre l'utilisation du kit selon l'invention pour génotyper un ou plusieurs SNP, de préférence un ou plusieurs SNP associés à des systèmes d'antigènes érythrocytaires, selon le procédé de l'invention. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS 5 Figure 1 : Résultats de génotypage obtenus après la migration de cibles biotinylées amplifiées par le protocole de PCR-LATE monoplexe et multiplexe, à partir d'échantillons d'ADN génomique présentant différents génotypes, sur une membrane de nitrocellulose. Résultats obtenus après l'amplification d'échantillons à partir de différents protocoles de PCR-LATE : (i) monoplexe pour les systèmes de groupe sanguin (A) FY 10 (échantillons #1 à #6), (B) JK (échantillons #7 à #12), et (ii) multiplexe (C) (échantillons #13, #14 et #15) et (D) (échantillons #16 et #17). Les signes - et + signifie, respectivement, l'absence et la présence de l'allèle. Figure 2 : Liste des phénotypes obtenus pour le système FY par technique sérologique (technique de référence) et des phénotypes prédits à partir des génotypes 15 obtenus par les deux méthodes de génotypage : (i) puce à ADN (technique de référence pour le génotypage) et (ii) par migration sur une membrane de nitrocellulose selon la méthode de la présente invention, pour les échantillons #1 à #6 de la Figure 1A. Figure 3 : Liste des phénotypes obtenus pour le système JK par technique sérologique (technique de référence) et des phénotypes prédits à partir des génotypes 20 obtenus par les deux méthodes de génotypage : (i) puce à ADN (technique de référence pour le génotypage) et (ii) par migration sur une membrane de nitrocellulose selon la méthode de la présente invention, pour les échantillons #7 à #12 de la Figure 1B. Figure 4 : Liste des phénotypes obtenus pour les systèmes JK, FY et MNS par technique sérologique (technique de référence) et des phénotypes prédits à partir des 25 génotypes obtenus par les deux méthodes de génotypage : (i) puce à ADN (technique de référence pour le génotypage) et (ii) par migration sur une membrane de nitrocellulose selon la méthode de la présente invention, pour les échantillons #13 à #17 des Figures 1C et 1D. Figure 5 : Résultats de génotypage obtenus après la migration à 30°C de cibles 30 biotinylées amplifiées par le protocole de PCR-LATE en duplexe pour les systèmes JK 3040999 6 et FY, à partir d'échantillons d'ADN génomique présentant différents génotypes, sur une membrane de nitrocellulose (échantillons #19, #20 et #21). Figure 6 : Liste des phénotypes obtenus pour les systèmes JK et FY par technique sérologique (technique de référence) et des phénotypes prédits à partir des génotypes 5 obtenus par les deux méthodes de génotypage : (i) puce à ADN (technique de référence pour le génotypage) et (ii) par migration sur une membrane de nitrocellulose selon la méthode de la présente invention, pour les échantillons #19 à #21 de la Figure 5. Figure 7 : Contrôle sur gel d' agarose 2% des produits amplifiés par PCR-LATE monoplexe pour les systèmes JK et FY. 10 Figure 8 : Liste des phénotypes obtenus pour les systèmes JK, FY et MNS par technique sérologique (technique de référence) et des phénotypes prédits à partir des génotypes obtenus par les deux méthodes de génotypage : (i) puce à ADN (technique de référence pour le génotypage) et (ii) par migration sur une membrane de nitrocellulose selon la méthode de la présente invention, pour les échantillons #22 à #25. 15 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le groupage sanguin est d'une importance capitale pour évaluer la compatibilité entre le sang d'un donneur et d'un receveur lors d'une transfusion et limiter les risques d'accident transfusionnel ou d' alloimmunisation. A ce jour, plus de 300 antigènes érythrocytaires regroupés en 35 systèmes de groupes sanguins ont été identifiés. Selon les 20 pratiques actuelles, le typage des poches de sang en routine ne concerne qu'un petit nombre d'antigènes érythrocytaires tels que les antigènes des systèmes ABO, RH et Kell (KEL). Cependant, d'autres antigènes, notamment ceux des systèmes DUFFY (FY), MNS (MNS) ou KIDD (JK), s'avèrent avoir une importance clinique du fait de la fréquence des accidents transfusionnels causés par les anticorps correspondants. 25 Bien qu'efficace pour les antigènes des systèmes ABO, RH et Kell, le typage étendu des unités sanguines au moyen des techniques sérologiques classiques présente plusieurs inconvénients. Il s'agit en effet d'un test monoparamétrique de coût élevé dont un des facteurs limitants est la difficulté à obtenir des anticorps monoclonaux performants pour les différents systèmes. De plus, dans certaines situations cliniques comme pour des 3040999 7 patients immunisés ou transfusés chroniques, les techniques d'agglutination classiques ne peuvent pas être utilisées, complexifiant ainsi la prise en charge transfusionnelle. Grâce à une meilleure connaissance des bases moléculaires des antigènes sanguins, il est à présent possible de déterminer le groupe sanguin d'un individu ou d'une 5 poche de sang en identifiant des SNP dans l'ADN génomique. A titre d'exemples, le système KIDD comprend le couple d'antigènes JK1 et JK2 résultant du SNP 838G>A qui génère les allèles co-dominants JK* 1 et JK*2 codant respectivement pour des résidus acide aspartique et asparagine en position 280 de la glycoprotéine Kidd. Les inventeurs ont ici développé une technique simple, rapide et peu coûteuse 10 permettant de déterminer le phénotype érythrocytaire d'un individu ou d'un échantillon de sang en procédant au génotypage des SNP associés à différents systèmes de groupes sanguins. Cette technique peut être aisément transposée au génotypage de tout site polymorphe. 15 Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour détecter les variants alléliques d'un ou plusieurs sites polymorphes dans un acide nucléique, et plus particulièrement de génotyper un ou plusieurs polymorphismes de nucléotide simple (SNP). Un SNP est une variation à une seule position de l'ADN génomique entre 20 individus d'une même espèce (espèce procaryote, eucaryote ou virale). Les SNP peuvent se retrouver au sein des exons, des introns ou encore dans les régions intergéniques. Les SNP qui se trouvent dans les régions codantes peuvent modifier ou non la séquence en acides aminés de la protéine codée. Ceux contenus dans les régions non codantes peuvent avoir des effets par exemple sur l'épissage ou les facteurs de transcription. Bien que 25 pouvant avoir théoriquement quatre allèles (A, T, C et G), la majorité des SNP n'en ont que deux. Un SNP peut être identifié par la position du nucléotide concerné par le polymorphisme (par exemple « 125G>A » signifie que le nucléotide en position 125 d'une séquence génomique donnée peut être G ou A), par la position du résidu d'acide aminé concerné (par exemple « Gly42Asp » signifie que l'acide aminé en position 42 30 d'une séquence protéine donnée peut être une glycine ou un acide aspartique), ou par son 3040999 8 identifiant dans une banque de données référençant les différents SNP telle que par exemple la banque « NCBI SNP database » (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). Tel qu'utilisé ici, le terme « génotyper un SNP » signifie déterminer les variants alléliques d'un SNP qui sont présents dans l'acide nucléique contenu dans un échantillon. 5 Cela permet par exemple de déterminer si un individu est homozygote (possède deux allèles identiques) ou hétérozygote (possède deux allèles différentes) pour un SNP donné. L'acide nucléique contenu dans l'échantillon à génotyper peut être de l'ADN, de l'ARN, un acide nucléique simple brin, double brin, ou un mélange de ceux-ci. L'acide nucléique est de préférence un ADN, et de manière plus particulièrement préférée un 10 ADN double brin. L'acide nucléique peut être de toute origine, notamment d'origine humaine, animale, bactérienne, virale ou fongique. De préférence l'acide nucléique est d'origine humaine ou animale. Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon est de l'ADN ou de l'ARN génomique, de préférence de l'ADN génomique. 15 L'échantillon peut être un échantillon biologique tel que par exemple du sang, du plasma, du sérum, de la salive, de l'urine, des échantillons de fluide séminal ou des échantillons de tissus ou organes obtenus à partir d'un sujet (animal ou humain, de préférence humain). Selon un mode de réalisation particulier, l'échantillon est un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum obtenu à partir d'un sujet animal ou 20 humain, de préférence humain. L'échantillon peut optionnellement être soumis à un traitement chimique, enzymatique, thermique et/ou mécanique avant utilisation. L'échantillon peut être utilisé immédiatement après le prélèvement, après conservation à 4°C ou -20°C. L'échantillon peut également être obtenu par purification partielle ou totale de 25 l'ADN ou ARN génomique à partir d'un échantillon biologique au moyen de toute technique bien connue de l'homme du métier. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour le génotypage d'un seul SNP ou de plusieurs. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé est utilisé pour génotyper simultanément plusieurs SNP, de préférence de 2 à 20, 15 ou 10 SNP, et de manière plus 30 particulièrement préférée de 2 à 5 SNP. 3040999 9 Les SNP à génotyper peuvent être tout SNP d'intérêt. Les SNP peuvent être notamment des SNP humains, animaux, de plantes, bactériens, fongiques ou viraux. De préférence, les SNP à génotyper sont des SNP humains ou animaux. Les SNP peuvent être, par exemple, des SNP associés à une pathologie, une prédisposition à une pathologie, 5 une réponse thérapeutique, des SNP d'intérêt pour l'identification d'individus, notamment en médecine légale, ou encore des SNP permettant le typage d'antigènes érythrocytaires. Selon un mode de réalisation préféré, les SNP à génotyper sont associés à un ou plusieurs systèmes de groupe sanguin. A titre d'exemples, ces SNP incluent, sans y être 10 limités, le SNP rs1058396 (NCBI SNP database) responsable du polymorphisme JK*1/JK*2, le SNP rs12075 (NCBI SNP database) responsable du polymorphisme FY*1/FY*2, le SNP rs2814778 (NCBI SNP database) responsable du polymorphisme FY*wt/FY*Fy, et le SNP 143T>C dans le gène codant la glycophorine B (GYPB) (GeneID : 2994) responsable du polymorphisme MNS*3/MNS*4. 15 Le procédé selon l'invention comprend une étape d'amplification génique de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon suivie de l'analyse des produits d'amplification à l'aide d'un dispositif de test à flux latéral. Ainsi, le procédé selon l'invention comprend a) l'amplification d'une ou plusieurs régions de l'acide nucléique contenant le ou 20 les SNP à génotyper, les produits d'amplification comprenant un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, et b) l'analyse des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) à l'aide d'un dispositif de test à flux latéral comprenant une zone réactionnelle comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant 25 une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP à génotyper, l'obtention d'un signal au niveau du site d'immobilisation d'une sonde indiquant que l'acide nucléique comprend le variant allélique spécifique de la sonde. Contrairement aux méthodes décrites dans l'art antérieur, l'étape a) 30 d'amplification génique du procédé selon l'invention n'est pas réalisée à l'aide d'amorces 3040999 10 spécifiques de l'allèle à détecter. Les amorces sont choisies de manière à encadrer le ou les sites polymorphes à génotyper. De manière préférée, aucune des amorces ne chevauche de site polymorphe à analyser. Un seul produit d'amplification est donc suffisant pour génotyper le ou les SNP contenus dans la région amplifiée et pour détecter 5 les différents variants alléliques d'un même SNP. La technique utilisée lors de cette étape d'amplification dépend de la nature de l'acide nucléique à analyser et contenu dans l'échantillon. L'amplification génique peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier notamment par PCR, RTPCR, amplification par cercle roulant (RCA), amplification par la Q(3-réplicase, réaction 10 en chaîne par ligation (LCR), « nucleic acid sequence based amplification » (NASBA), amplification par déplacement de brin, amplification isotherme induite par boucle, amplification ramifiée par cercle roulant (HRCA) ou amplification médiée par la transcription (TMA). Selon un mode particulier de réalisation, l'acide nucléique contenu dans 15 l'échantillon est un ADN, de préférence un ADN génomique, et l'amplification est réalisée par PCR asymétrique. La technique de PCR asymétrique permet d'amplifier préférentiellement un des brins d'ADN dans une matrice d'ADN double-brin. La PCR est réalisée selon un protocole standard mais avec l'une des amorces en large excès par rapport à l'autre. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, 20 jusqu'à épuisement de l'amorce limitante. Seul de l'ADN simple brin est produit durant les derniers cycles. La PCR asymétrique peut être notamment une LATE-PCR (« LinearAfter-The-Exponential-PCR », cf WO 03/054233) ou une « improved LATE-PCR » (ou imLATE-PCR, Song et al., 2013). De préférence, la PCR asymétrique est une LATE-PCR. La LATE-PCR est une 25 technique utilisant une amorce limitante avec une température de fusion (Tm) supérieure d'au moins 5°C à celle de l'amorce en excès. Cela permet de maintenir une efficacité réactionnelle satisfaisante lorsque la concentration en amorce limitante diminue (Pierce and Wangh, 2007). Selon un mode de réalisation particulier, l'amplification est réalisée par LATE-PCR dans laquelle la ou les amorces limitantes ont une température de fusion 30 (Tm) supérieure de 6 à 8°C, de préférence supérieure de 6,7 à 7,7°C, à celle de la ou des amorces en excès. 3040999 11 Lorsque plusieurs régions de l'acide nucléique doivent être amplifiées, l'amplification est de préférence réalisée au moyen d'une PCR multiplexe permettant d'amplifier simultanément, et dans le même contenant réactionnel, plusieurs régions distinctes au moyen de différents couples d'amorces. Les techniques de PCR multiplexe 5 sont bien connues de l'homme du métier et illustrées par exemple dans l'article de Paris et al., 2014. Les amorces peuvent être aisément dessinées par l'homme du métier selon la région de l'acide nucléique à amplifier et la technique utilisée. Comme mentionné ci-dessus, les amorces encadrent les sites polymorphes à analyser sans les chevaucher. Les 10 amorces définissent la taille des produits d'amplification. De préférence, ces derniers ont une longueur de 25 à 500 nucléotides, de préférence 50 à 250, 200, 180, 150 ou 100 nucléotides. Dans le procédé selon l'invention, les produits d'amplification (ou amplicons) 15 comprennent un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Le marquage des amplicons peut être réalisé durant l'amplification, notamment au moyen d'amorces marquées ou de nucléotides marqués, ou lors d'une étape postérieure à l'amplification. Selon un mode de réalisation, les amplicons sont marqués durant la réaction 20 d'amplification. Les amplicons peuvent être marqués en 5', en 3' ou au niveau d'un ou plusieurs sites internes. De nombreuses techniques enzymatiques ou chimiques sont connues de l'homme du métier et disponibles commercialement pour générer des amplicons marqués. Selon un mode de réalisation particulier, les produits d'amplification comprennent 25 un marquage en 5'. Ce marquage est de préférence obtenu durant l'amplification en utilisant des amorces marquées en 5'. Lorsque l'amplification est réalisée par LATEPCR, l'amorce marquée est l'amorce en excès. Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme de « signal détectable » se réfère à un signal qui peut être perçu directement par l'oeil humain ou par le biais d'un système 30 de détection. La nature de ce signal varie selon la nature du marqueur utilisé. Le signal 3040999 12 peut être notamment un signal coloré, luminescent, fluorescent, phosphorescent ou radioactif ou magnétique. Les amplicons peuvent être marqués par des marqueurs capables de générer directement un signal détectable tels que, par exemple, des composés fluorescents tels 5 que la rhodamine, fluorescéine, carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA), tétraméthylrhodamine (TMR), sulforhodamine 101, Texas Red, Rhodamine Red, les Alexa, les DyLight et les phycocyanines, ou des éléments radioactifs tels que le 32P. Alternativement, les amplicons peuvent être marqués par des marqueurs capables de générer indirectement un signal détectable. Tel qu'utilisé ici, le terme « indirectement » 10 signifie que le marqueur ne peut générer de signal détectable qu'après interaction avec un autre composé tel qu'un substrat ou un partenaire de liaison. Les marqueurs capables de générer indirectement un signal détectable peuvent être par exemple le premier membre d'un couple ligand/anti-ligand ou une enzyme produisant un signal détectable en présence d'un substrat. Des exemples de couples ligand/anti-ligand considérés dans le procédé 15 selon l'invention incluent, sans y être limités, les couples biotine/streptavidine, antigène/anticorps notamment biotine/anticorps anti-biotine ou digoxygénine/anticorps anti-digoxygénine, molécule/récepteur ou sucre/lectine. Les enzymes utilisables en tant que marqueurs peuvent être par exemple la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline ou la (3-galactosidase. 20 Selon un mode de réalisation plus particulier, les produits d'amplification sont marqués, de préférence en 5', par une biotine. De préférence, ce marquage est obtenu lors de l'amplification en utilisant une amorce marquée en 5'. Après amplification, les amplicons ainsi obtenus sont analysés au moyen d'un 25 dispositif de test à flux latéral permettant de discriminer les variants alléliques du ou des SNP à génotyper. Les tests à flux latéral ont été abondamment décrits dans la littérature et sont couramment utilisés aux fins d'analyses cliniques, pharmaceutiques, alimentaires ou chimiques. Ils peuvent être employés pour détecter la présence de nombreux types 30 d' analytes tels que des anticorps, des antigènes, des protéines, des molécules chimiques, ou plus récemment des acides nucléiques (e.g. Ang et al., 2012). 3040999 13 Les procédés décrits dans l'art antérieur dans lesquels les SNP sont détectés à l'aide de tests sur bandelette sont basés sur des techniques de PCR à l'aide d'amorces spécifiques de l'allèle recherché. Cela signifie que la réaction d'amplification n'a lieu que si la région 3' de l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence cible. Chaque 5 amorce spécifique d'un allèle comprend donc une étiquette en 5' lui permettant de s'hybrider avec les sondes immobilisées sur la bandelette. La longueur de l'étiquette est généralement de l'ordre de 24 nucléotides (Litos et al., 2009 ; Sapountzi et al., 2015), ce qui permet aisément de distinguer les différents amplicons. Le dispositif de test à flux latéral utilisé dans le procédé selon l'invention a la 10 particularité de comprendre une zone réactionnelle comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP à génotyper. Cela signifie que deux sondes spécifiques de deux allèles du même SNP, ne diffèrent que d'un nucléotide, celui du site polymorphe (sans compter les possibles nucléotides additionnels aux extrémités 15 3' ou 5' des séquences spécifiques des amorces). Le terme de « flux latéral » se réfère à un flux liquide dans lequel tous les composés dissous ou dispersés sont transportés par capillarité, de préférence à des vitesses équivalentes et un débit régulier, latéralement à travers une matrice. Ce terme s'oppose à celui de « rétention préférentielle » dans lequel un ou plusieurs composés à 20 analyser ou détecter, sont retenus ou ralentis via des interactions préférentielles avec la matrice. Le terme de « flux latéral » est utilisé ici à des fins descriptives et non limitantes. Le dispositif peut en effet adopter n'importe quelle configuration qui permettrait de mettre en oeuvre les principes de la présente invention. Le dispositif peut ainsi avoir une configuration linéaire (« test strip »), radiale, en T, en L, en croix, ect. 25 Typiquement, un dispositif de test à flux latéral tel qu'utilisé dans le procédé selon l'invention comprend une matrice poreuse comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et 3040999 14 (iii) une zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits d'amplification (et comprenant une ou plusieurs sondes immobilisées en des sites distincts, chaque sonde étant spécifique d'un variant allélique d'un SNP à génotyper). Les premières sondes de la zone réactionnelle sont disposées de préférence de 1 à 5 10 cm, et de manière plus particulièrement préférée de 2 à 5 cm de la zone d'application des produits d'amplification. Optionnellement, la matrice peut également comprendre une zone de contrôle de migration des réactifs en aval de la zone réactionnelle. Cette zone de contrôle de migration indique à l'utilisateur qu'au moins une partie de l'échantillon est bien passée au travers de 10 la matrice. Le réactif immobilisé dans cette zone doit permettre de générer un signal lorsqu'il entre en contact avec le tampon de migration, éventuellement additionné d'un marqueur, substrat ou partenaire de liaison capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. La matrice peut également comprendre une zone de marquage comprenant un 15 substrat ou partenaire de liaison spécifique du marqueur des produits d'amplification, ledit substrat ou partenaire de liaison étant capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. La zone de marquage est de préférence disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration et en amont de la zone d'application des produits d'amplification. 20 Chacune des différentes zones de la matrice poreuse est en communication de fluide avec la ou les zones adjacentes. Optionnellement, la matrice peut être en communication de fluide avec un tampon absorbant disposé en aval de la zone réactionnelle ou de la zone de contrôle lorsque celle-ci est présente. 25 Selon un mode de réalisation particulier, le dispositif de test à flux latéral tel qu'utilisé dans le procédé selon l'invention comprend une matrice poreuse comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et 3040999 15 (iii) une zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits d'amplification, (iv) une zone de contrôle de migration en aval de la zone réactionnelle, et (v) un tampon absorbant disposé en aval de la zone de contrôle. 5 Dans le cadre du test à flux latéral, les produits d'amplification sont déposés sur une matrice poreuse au travers de laquelle ils vont migrer par capillarité jusqu'à la zone réactionnelle. Tel qu'utilisé ici, le terme « matrice poreuse» fait donc référence à tout type de 10 matériau poreux capable d'assurer le flux et le transfert d'un fluide, de préférence par la force de capillarité. En particulier, ce terme se réfère à toute membrane adaptée aux tests à flux latéral. A titre d'exemples non limitatifs, la matrice poreuse peut être de la nitrocellulose, du polyester, des fibres de verre, des fibres de cellulose, du polyether sulfone (PES), un ester de cellulose, etc. Les différentes zones de la matrice peuvent être 15 constituées d'un même matériel ou de matériaux différents. A titre d'exemple, la zone d'application des produits d'amplification, la zone réactionnelle et la zone de contrôle de migration peuvent être en nitrocellulose, la zone de marquage en fibres de verre et le tampon absorbant et/ou la zone d'application du tampon de migration en fibres de cellulose. 20 Selon un mode de réalisation particulier, la matrice poreuse est une membrane de nitrocellulose. Des exemples de membranes de nitrocellulose incluent, sans y être limité, les membranes MilliporeTM HF240, MilliporeTM HF180, MilliporeTM HF135, MilliporeTM HF120, MilliporeTM HF090, MilliporeTM HF075, SartoriusTM CN140 et SartoriusTM CN150, FF120 HP membranes (GE), FF170HP membranes (GE), FF8OHP membranes 25 (GE), AE membranes (GE), Immunopore membranes (GE). Selon un mode de réalisation préféré, la matrice poreuse est une membrane de nitrocellulose présentant une vitesse capillaire de 50 à 250 sec / 4 cm, de préférence de 70 à 180 sec / 4 cm, et de manière tout particulièrement préférée de 80 à 140 sec / 4 cm. 3040999 16 La taille de la matrice peut être aisément choisie par l'homme du métier. Selon certains modes de réalisation préférés, celle-ci est une bande de 5 à 20 cm, de préférence de 7 à 15 ou 10 cm, de long et de 0,3 à 1 cm, de préférence de 0,5 à 0,8 cm, de large. La matrice poreuse peut être optionnellement fixée à un support solide tel qu'une 5 plaque ou une cassette, généralement en matière plastique. Selon un mode de réalisation, les produits d'amplification sont soumis à une dénaturation thermique, typiquement quelques minutes à environ 90-95°C, avant d'être déposés sur le dispositif de test à flux latéral afin d'augmenter la quantité d'acide 10 nucléique simple brin. Selon un autre mode de réalisation, les produits d'amplification sont analysés directement à l'aide du dispositif de test à flux latéral sans étape de purification ni dénaturation préalable. Les produits de la réaction d'amplification sont donc déposés directement sur la zone d'application des produits d'amplification. Ce mode de réalisation 15 est d'autant plus pertinent lorsque l'amplification est réalisée par PCR asymétrique, et plus particulièrement par LATE-PCR. La zone réactionnelle du test comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées qui agissent comme agents de capture en s'hybridant spécifiquement avec 20 les produits d'amplification. Chaque sonde est immobilisée en un site distinct et est spécifique d'un variant allélique d'un SNP à génotyper. Les sondes immobilisées comprennent une séquence nucléotidique strictement complémentaire de la séquence de l'allèle du site polymorphe recherché. Ces sondes ont de préférence une longueur de 8 à 25 nucléotides, et de manière plus particulièrement 25 préférée de 10 à 20 nucléotides (sans compter d'éventuels espaceurs et poly(dT)) complémentaires de la séquence cible). Selon un mode de réalisation, 5 à 25 pmoles, de préférence 10 à 20 pmoles, de chaque sonde sont déposés en des sites distincts dans la zone réactionnelle. 3040999 17 Le nucléotide associé au site polymorphe, (i.e. le nucléotide qui varie selon l'allèle à détecter) est de préférence positionné au milieu, ou sensiblement au milieu, de la séquence nucléotidique spécifique de la cible. Outre la séquence spécifique de l'allèle à détecter, les sondes peuvent également 5 comprendre un ou plusieurs groupements espaceurs à l'extrémité 3' ou 5', de préférence en position 5'. Ces groupement peuvent être notamment des espaceurs poly(dT) ou des espaceurs en C3 à C12 liés à un ou plusieurs groupes de greffage, de préférence en C6 ou C7. Les groupes de greffage peuvent être notamment des groupes aminos, aldéhydes, carboxyles, etc., de préférence des groupes aminos. Selon un mode de réalisation 10 particulier, les sondes comprennent un espaceur poly(dT) en 5', de préférence un espaceur poly(dT) comprenant de 5 à 20 dT, et de manière tout particulièrement préférée 15dT. Selon autre mode de réalisation, les sondes comprennent un espaceur en C3 à C12 en 5', de préférence, un espaceur en C6 ou C7 lié à un groupe de greffage, de préférence un groupe amino, en extrémité 5' de la sonde. Selon un mode de réalisation préféré, les 15 sondes comprennent à la fois un espaceur en C3 à C12, de préférence un espaceur en C6 ou C7, et un espaceur poly(dT), de préférence comprenant de 5 à 20 dT, et de manière tout particulièrement préférée 15dT. Les différentes sondes immobilisées au niveau de la zone réactionnelle sont dessinées de manière à avoir des températures de fusion (Tm) proches. De préférence, les 20 Tm des différentes sondes immobilisées sur la matrice varient de moins de 8°C, et de manière plus particulièrement préférée de moins de 6, 5, 4, 3 ou 2 °C. Les sondes peuvent être immobilisées sur la matrice poreuse selon des techniques bien connues de l'homme du métier. En particulier, les sondes peuvent être immobilisées sur la matrice par liaison covalente, adsorption ou toute autre méthode appropriée. De 25 préférence, les sondes sont immobilisées par adsorption. Le déroulement du test à flux latéral dépend de la nature du marqueur utilisé pour marquer les produits d'amplification, i.e. un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. 30 Si les produits d'amplification sont marqués par un marqueur capable de générer indirectement un signal détectable, cela signifie que le marqueur ne peut générer de signal 3040999 18 détectable qu'après interaction avec un autre composé tel qu'un substrat ou un partenaire de liaison. Dans ce cas, deux modes de réalisation sont envisageables : (i) le tampon de migration comprend le substrat ou partenaire de liaison capable 5 d'interagir avec le marqueur afin de générer directement ou indirectement un signal détectable, ou (ii) le dispositif de test à flux latéral comprend une zone de marquage comprenant un substrat ou partenaire de liaison spécifique du marqueur des produits d'amplification, ledit substrat ou partenaire de liaison étant capable de générer directement ou 10 indirectement un signal détectable. La zone de marquage est de préférence disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration et en amont de la zone d'application des produits d'amplification. Selon un mode de réalisation particulier, le marqueur des produits d'amplification est le premier membre d'un couple ligand/anti-ligand. Dans ce cas, le tampon de 15 migration ou la zone de marquage comprend le second membre de ce couple, éventuellement conjugué à un marqueur détectable. Des exemples de marqueurs détectables incluent, sans y être limités, des métaux colloïdaux comme l'or ou l'argent, des métaux non-colloïdaux comme des particules de sélénium, téllurium ou soufre, de latex, des colorants visibles, fluorescents, luminescents ou chimioluminescents, des 20 particules magnétiques, des éléments radioactifs ou des enzymes. Selon un mode de réalisation préféré, le marqueur des produits d'amplification est la biotine et le tampon de migration ou la zone de marquage comprend un anticorps antibiotine couplé à un marqueur détectable, de préférence couplé à une particule d'or. Dans ce mode de réalisation, la zone de contrôle de migration peut comprendre une molécule 25 biotinylée, par exemple de l'albumine de sérum bovin biotinylée, déposée sur la matrice qui sera révélée par l'anticorps anti-biotine couplé à un marqueur détectable. Si les produits d'amplification sont marqués par un marqueur capable de générer directement un signal détectable, cela signifie qu'aucun substrat ou partenaire de liaison 30 n'est requis pour générer un signal détectable. L'application du tampon de migration suffit à faire migrer les produits d'amplification vers la zone réactionnelle et à générer un 3040999 19 signal provenant de l'hybridation des produits d'amplification avec les sondes immobilisées. Après dépôt des produits d'amplification sur le dispositif, le tampon de migration est appliqué sur le dispositif par immersion de la zone d'application ou dépôt direct du 5 tampon sur la zone d'application. Selon le mode de réalisation, le tampon de migration comprend ou pas un substrat ou partenaire de liaison du marqueur des produits d'amplification. Le tampon de migration permet de préférence de stabiliser les structures simple brin durant la migration, d'obtenir une migration homogène au travers du mouillage de la 10 membrane, d'apporter une bonne mobilité des particules lors de la migration afin d'éviter les phénomènes d'agrégation et apporter un niveau de stringence suffisant pour permettre une hybridation sonde/cible spécifique. Le tampon de migration comprend, de préférence, un système tampon permettant de conserver un pH neutre tel que du SSC, un ou plusieurs tensio-actifs tels que le SDS 15 ou le Tween® 20, et/ou un ou plusieurs agents dénaturants tels que l'urée ou le formamide qui déstabilisent les liaisons hydrogènes. Selon un mode de réalisation, le tampon de migration comprend du SSC, du SDS, de préférence 0,2 à 1%, du Tween® 20, de préférence de 5 à 20%, et du formamide, de préférence de 2 à 10%. Selon un mode de réalisation particulier, la formulation du tampon de migration est la suivante : 1X SSC, 20 0,5% SDS, 10% Tween® 20 et 5% formamide. Le dispositif de test est ensuite incubé jusqu'à la détection dans la zone réactionnelle des signaux générés directement ou indirectement par le marqueur des produits d'amplification et/ou la détection d'un signal dans la zone de contrôle de migration lorsque celle-ci est présente. 25 La température d'incubation durant cette étape dépend essentiellement des Tm des sondes immobilisées. De préférence, la température d'incubation est choisie de manière à ce qu'aucune sonde ne présente de Tm qui diffère de la température d'incubation de plus de 8°C, de préférence de plus de 7 ou 6°C, et de manière plus particulièrement préférée de plus de 5°C. 3040999 20 La lecture des résultats se fait par détection des signaux générés aux niveaux de sondes immobilisées. Selon la nature des signaux, la détection se fait par simple lecture visuelle ou au moyen d'un système de détection. Les résultats sont ensuite interprétés, la détection d'un signal au niveau du site 5 d'immobilisation d'une sonde indiquant que l'acide nucléique contenu dans l'échantillon comprend le variant allélique complémentaire de la sonde. Lorsque le dispositif comprend une zone de contrôle de migration, les résultats sont considérés comme valables lorsqu'un signal est également détecté dans cette zone. 10 Selon un second aspect, la présente invention concerne également un dispositif de test à flux latéral tel que décrit ci-dessus, et comprenant une matrice poreuse, de préférence une membrane de nitrocellulose, optionnellement fixée à un support solide, ladite matrice comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, 15 (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et (iii) une zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits d'amplification et comprenant une ou plusieurs sondes immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP 20 d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier, la zone réactionnelle comprend au moins deux sondes spécifiques de deux variants différents d'un même SNP, ou au moins deux sondes spécifiques de deux SNP différents. Optionnellement, la matrice peut également comprendre une zone de contrôle de 25 migration des réactifs en aval de la zone de réactionnelle et/ou une zone de marquage en aval de la zone d'application du tampon et en amont de la zone d'application des produits d'amplification. Chacune des différentes zones de la matrice poreuse est en communication de fluide avec la ou les zones adjacentes. 3040999 21 Optionnellement, la matrice peut être en communication de fluide avec un tampon absorbant disposé en aval de la zone réactionnelle ou de la zone de contrôle lorsque celle-ci est présente. Selon un mode de réalisation particulier, la ou les sondes immobilisées sont 5 spécifique d'un ou plusieurs systèmes d'antigènes érythrocytaires, de préférence d'un ou plusieurs systèmes sélectionnés parmi les systèmes DUFFY, MNS et KIDD. En particulier, la ou les sondes peuvent être sélectionnées dans le groupe constitué des sondes présentant les séquences des SEQ ID NO : 9 à 20. 10 Dans un autre aspect, la présente invention concerne également un kit comprenant un dispositif de test à flux latéral selon l'invention, et au moins un couple d'amorces permettant d'amplifier une région génomique contenant un ou plusieurs SNP. De préférence, le kit comprend un ou plusieurs couples d'amorces permettant d'amplifier une ou plusieurs régions génomiques contenant un ou plusieurs SNP associés 15 à des systèmes d'antigènes érythrocytaires tels que DUFFY, MNS et KIDD. Selon un mode de réalisation particulier, le kit comprend une ou plusieurs amorces sélectionnées dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1 à 8. De préférence, le kit comprend un ou plusieurs des couples d'amorces (1) SEQ ID NO : 1 et 2, (2) SEQ ID NO : 3 et 4, (3) SEQ ID NO : 5 et 6, et (4) SEQ ID NO : 7 et 8. 20 Le kit peut également comprendre un tampon de migration, des réactifs pour l'amplification, notamment des réactifs nécessaires à une amplification des cibles par LATE-PCR tels que des dNTP, une polymérase ou un tampon, et/ou une notice. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un dispositif 25 de test à flux latéral selon l'invention ou d'un kit selon l'invention pour génotyper un ou plusieurs SNP selon le procédé de l'invention. La présente invention concerne également l'utilisation d'un dispositif de test à flux latéral selon l'invention ou d'un kit selon l'invention pour procéder au typage des antigènes érythrocytaires d'un individu à partir d'un échantillon, de préférence un 3040999 22 échantillon de sang, plasma ou sérum. Le typage peut en particulier concerner un ou plusieurs des systèmes DUFFY, MNS et KIDD. Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence 5 dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES Exemple 1 10 Matériels et méthodes Le chlorure de sodium, le citrate de sodium, le méthanol, le sucrose, le dodecyl sulfate de sodium (SDS), le Tween® 20, le formamide, l'albumine de sérum bovin biotinylée ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Les particules d'or conjuguées avec un anticorps anti-biotine (40 nm, 9 x 1010 particules/mL) ont été achetées chez BBI Solutions 15 (Angleterre). Les oligonucléotides, les amorces et les sondes ont été synthétisés par Eurogentec (Belgique). Echantillons de sang total, technique de phénotypage et génotypage Les échantillons de sang total ont été prélevés, sur anticoagulant (EDTA), par l'Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes et ont été phenotypés étendus par 20 technique sérologique standard au sein du laboratoire de Qualification Biologique du Don (Metz-Tessy, France). Les échantillons ont été génotypés étendus par l'utilisation d'une technique de génotypage érythrocytaire décrite précédemment (Paris et al., 2014). Conception des amorces de la PCR-LATE Les amorces ont été conçues pour être utilisées à des concentrations non 25 stoechiométriques et en se basant sur un ajustement de la valeur des Tm en fonction de leur concentration d'utilisation, pour répondre à la contrainte (Tm amorce limitante - Tm 3040999 23 amorce en excès) ) > 5°C, permettant la génération de produits monocaténaires avec un taux d'efficacité important (Pierce et al., 2005 ; Sanchez et al., 2004). Les amorces ont été marquées en position 5' par un groupement biotine pour permettre la détection des cibles hybridées via l'apparition de plots colorés sur la membrane de nitrocellulose, par 5 l'utilisation de nanoparticules d'or fonctionnalisées par un anticorps anti-biotine. Les séquences des amorces sont décrites dans le Tableau 1. Tableau 1 : Séquences des amorces utilisées pour l'amplification des systèmes de groupe sanguin par PCR-LATE. Système Allèle Type de Séquences Conc. (pM) Tm (°C) l'amorce JK JK*01/ Amorce en excès 5'-Biotine-CAGTCTTTCAGCCCCATTTGAG-3' 1 56.1 JK*02 (SEQ ID NO : 1) Amorce 5'-GGTGAGCGCCATGAACATTCCTCCC-3' 0.1 63.8 limitante (SEQ ID NO : 2) MNS GYPB*03 Amorce en excès 5'- Biotine-ACCTGGTACAGTGAAACGATG-3' 1 54.7 (MNS*03)/ (SEQ ID NO : 3) GYPB*04 (MNS*04) Amorce 5'-AGG AAA CCC GCA GAA CAG TTT GAT TCC- 0.1 60.2 limitante 3' (SEQ ID NO : 4) FY FY*01/FY*02 Amorce en excès 5'- Biotine-ATGATTCCTTCCCAGATGGAGAC-3' 1 56.3 (SEQ ID NO : 5) Amorce 5'-TGCAGAGTCATCCAGCAGGTTACAGGAGT-3' (SEQ ID NO : 6) 0.1 64 limitante FY*02M.02 Amorce en excès 5'-Biotine-CCCTCATTAGTCCTTGGCTCTT-3' 1 56.4 (FY*Fy) (SEQ ID NO : 7) Amorce 5'-CTCACCCTGTGCAGACAGTTCCCC-3' 0.1 63.5 limitante (SEQ ID NO : 8) 3040999 24 Conditions d'amplifications par PCR-LATE L'extraction d'ADN génomique a été réalisée à partir de 400 !IL de sang total sur un système MagNA Pure Compact (Roche Diagnostics, Suisse), en utilisant le kit d'isolation I MagNA Pure Compact Isolation (Roche Diagnostics, Suisse). Après 5 extraction, l'ADN a été élue dans 100 µL d'une solution tampon et quantifié sur un spectrophotomètre NanoVue (GE Healthcare, USA). Conditions d'amplification par PCR-LATE monoplexe. Le master mix contenait 1 !IL d'ADN génomique, du tampon 1X (Eurogentec, 10 Belgique), du MgC12 (1.5 mM), des dNTPs (0.2 mM), de la polymérase Hotgoldstar® Diamond Taq DNA (5 unités par !IL), et les amorces spécifiques. La PCR monoplexe a été réalisée sur un thermocycleur TProfessional (Biometra, Allemagne) en débutant par une étape d'activation de l'enzyme à 95°C durant 3 minutes, suivie par 35 cycles à 95°C durant 30 secondes, 55.5°C durant 30 secondes, et 72°C 15 durant 30 secondes. Les produits d'amplification ont été contrôlés par illumination U.V d'un gel d'agarose à 2 % chargé avec du GelRedTm (Biotum, USA). Conditions d'amplification par PCR-LATE multiplexe. Les ADNs génomiques ont été utilisés pour amplifier simultanément, et dans un seul microtube PCR, des 20 fragments génomiques de 86 à 133 bp. Des conditions de PCR asymétrique non-conventionnelle, PCR-LATE, ont été appliquées pour l'amplification des allèles JK*01/JK*02,FY*wt/FY*02M.02 (FY*Fy) et GYPB*03 (MNS*03)/ GYPB*04 (MNS*04) (Tableau 1). Le master mix contenait 2.5 µL d'ADN génomique, du tampon 1X KAPA2G, du MgC12 (1.5 mM), de l'albumine de sérum bovin ou BSA (0.5 mg/mL), des 25 dNTPs (0.2 mM), de la polymérase KAPA2G Fast HotStart DNA (5 units per !IL), et les amorces spécifiques. La PCR multiplexe a été effectuée sur un instrument Lightcycler® 2.0 (Roche Diagnostics, Germany), présentant des vitesses de rampes en température élevées. Une première étape d'activation de l'enzyme à 95°C durant 30 secondes a été suivie par 45 30 cycles à 95°C durant 5 secondes, 55°C durant 10 secondes, et 72°C durant 10 secondes. 3040999 25 Les produits d'amplification ont été contrôlés par illumination U.V du gel d' agarose à 2 % chargé avec du GelRedTm (Biotum, USA). Préparation des membranes de nitrocellulose Les membranes de nitrocellulose HF135 (Millipore, USA) ont été achetées auprès 5 de Millipore (USA). Les sondes ont été spécialement conçues pour détecter les allèles des trois systèmes de groupe sanguin (Tableau 2). Les sondes ont été conçues avec un espaceur poly(dT) dTis en position 5', entre le lien amino et la séquence spécifique afin d'accroître l'efficacité de l'hybridation. Les bandelettes ont été assemblées avec une membrane de nitrocellulose (80 mm x 5 mm) et un pad d'absorption. La membrane et le 10 pad d'absorption ont été coupés à l'aide d'une guillotine. Une solution de BSA biotinylée à une concentration de 5 mg.mL-1, a été immobilisée sur la partie supérieure de la bandelette pour former une zone témoin (CT) lors de la réalisation du test. Les sondes ont été déposées manuellement sur la membrane à l'aide d'une 15 solution de sondes à une concentration de 501.1.M.L-1 dans du tampon de dépôt (6X SSC, 0.1 % SDS, 2 % méthanol, 2 % sucrose). Après dépôt, les membranes ont été séchées à 80°C durant 45 minutes. Tableau 2. Séquences des sondes utilisées lors du génotypage érythrocytaire 20 multiplexé. Les polymorphismes (SNPs) pour chaque sonde sont indiqués par le nucléotide en gras et souligné. Système Allèle Séquences Tm (°C) JK JK*01 5'- C6 NH2-(dT)15AGTAGATGTCCTCAAATGG-3' 48.7 (SEQ ID NO: 9) JK*02 5'- C6 NH2-(dT)15AAGTAGATGTTCTCAAATGGG-3' 50 (SEQ ID NO: 10) FY FY*01 5'- C6 NH2-(dT)15AGGTTGGCACCATAGTCTC-3' 54.2 (SEQ ID NO: 11) 3040999 26 5'- C6 NH2-(dT)15AGGTTGGCATCATAGTCTC-3' FY*02 51.5 (SEQ ID NO: 12) 5'- C6 NH2-(dT)15GCTTCCAAGATAAGAGCCA-3' FY*wt 52 (SEQ ID NO: 13) 5'- C6 NI-12-(dT)15GCTTCCAAGGTAAGAGCCA-3' FY*02M.02 (FY*Fy) 54.7 (SEQ ID NO: 14) 5'- C6 NH2-(dT)15AGGAGAAATGGGACAACTTG-3' GYPB*03 (MNS*03) 52.4 (SEQ ID NO: 15) M NS 5'- C6 NH2-(dT)i5ATAGGAGAAACGGGACAACTT-3' GYPB*04 (MNS*04) 53.5 (SEQ ID NO: 16) Détection visuelle du génotype érythrocytaire sur membrane Sans étape de purification, ni de dénaturation, les produits de PCR ont été directement appliqués sur la partie basse de la membrane (entre 1 et 1,5cm au-dessus du bas de la membrane) qui a ensuite été immergée dans un puits d'une microplaque 96 puits 5 contenant 10 !IL d'une solution de nanoparticules d'or conjuguées diluée deux fois dans le tampon de migration (1X SSC, 0.5 % SDS, 10 % Tween® 20, 5 % formamide). Après migration des nanoparticules, la membrane a été immergée dans un premier tube conique de 50 mL (Greiner Bio-one, Allemagne), contenant 100 !IL de tampon de migration et incubé à 53°C. Après 5 minutes de migration, la membrane a été immergée dans une 10 nouvelle solution de nanoparticules d'or diluée deux fois dans le tampon de migration. Après migration des nanoparticules, la membrane a été à nouveau immergée dans un tube conique de 50 mL (Greiner Bio-one, Allemagne) et incubée à 53°C. La détection visuelle du génotypage érythrocytaire a été complète en 30 minutes. Résultats 15 Les inventeurs ont développé un test de génotypage érythrocytaire par migration de cibles amplifiées sur une membrane de nitrocellulose, dans un format monoplexe. Les cibles d'intérêt pour les deux systèmes de groupe sanguin JK (JK*1/JK*2) et FY (FY*1/FY*2) ont été amplifiées par PCR-LATE monoplexe. Un contrôle des produits 3040999 27 d'amplification sur gel d'agarose à 2 % ont montré la présence de bandes aux tailles attendues (JK*11JK*2 : 100 pb, FY* 1/FY*2 : 86 pb) (Figure 7). Six échantillons de profils différents (Fig. 2 et 3), pour lesquels le phénotype et le génotype avaient été au préalable déterminés par des techniques de références (phénotype 5 déterminé par sérologie, génotype par l'utilisation de puces à ADN (Paris et al, 2014)) ont été amplifiés par le protocole de PCR-LATE. Les produits de PCR ont été appliqués sur une membrane de nitrocellulose (HF135, Millipore) sur laquelle étaient déposées les sondes spécifiques des allèles d'intérêt. L'apparition de zone colorée, après leur migration par flux latéral, a montré la 10 possibilité de détecter visuellement la présence et/ou l'absence des allèles amplifiés, de déterminer un génotype érythrocytaire en concordance avec les résultats obtenus par les techniques de référence et de discriminer les différents génotypes pour les systèmes JK et FY (Fig. lA et 1B). L'apparition d'une coloration sur la zone témoin de la bandelette (B SA biotinylée) a permis de valider le bon fonctionnement des particules de révélation 15 ainsi que leur bonne migration à travers la membrane lors de la réalisation du test. Les inventeurs ont également développé un test de génotypage érythrocytaire par migration de cibles amplifiées sur une membrane de nitrocellulose, dans un format multiplexe intégrant de nouveaux systèmes d'intérêt (MNS : MNS*3/MNS*4, FY : FY*wt/FY*Fy). 20 De nouvelles sondes spécifiques de chaque allèle ont été conçues puis déposées sur la membrane pour la réalisation du test de génotypage. Cinq échantillons d'ADN génomique de profils différents (Fig. 4) ont été amplifiés par PCR-LATE multiplexe. Leur migration sur un système à flux latéral a conduit à l'apparition de zones colorées (Fig. 1C et 1D) et a permis la détermination du génotype pour chaque échantillon. Les 25 résultats obtenus ont été concordants entre les phénotypes prédits à partir du génotype et les techniques de références, et prouvent la possibilité de déterminer simultanément un génotype érythrocytaire pour les six antigènes d'intérêt (Fig. 1D) dans un format multiplexe et de prédire le phénotype étendu. 3040999 28 Exemple 2 Matériels et méthodes De nouvelles sondes ont été conçues pour permettre la détermination d'un génotype érythrocytaire à des températures de migration inférieures à celle présentées 5 dans l'exemple 1. Les séquences sont présentées dans le tableau 3. Les bandelettes ont été assemblées avec une membrane de nitrocellulose HF090 (80 mm x 5 mm) et un pad d'absorption. La membrane et le pad d'absorption ont été coupés à l'aide d'une guillotine. Une solution de BSA biotinylée à une concentration de 5 mg.mL-1, a été immobilisée sur la partie supérieure de la bandelette pour former une zone témoin (CT) 10 lors de la réalisation du test. Les sondes ont été déposées manuellement sur la membrane à l'aide d'une solution de sondes à une concentration de 501.1M.L-1 dans du tampon de dépôt (6X SSC, 0.1 % SDS, 2 % méthanol, 2 % sucrose). Après dépôt, les membranes ont été séchées à 80°C durant 40-45 minutes. 15 Tableau 3. Séquences des sondes utilisées lors du génotypage érythrocytaire multiplexé des systèmes JK et FY. Les polymorphismes (SNPs) pour chaque sonde sont indiqués par le nucléotide en gras et souligné. Système Allèle Séquence Tm (°C) JK JK*01 5'- C6 NH2-(dT)15AGATGTCCTCAA-3' 34.3 (SEQ ID NO: 17) JK*02 5'- C6 NH2-(dT)15TAGATGTTCTCAAT-3' 33.8 (SEQ ID NO: 18) FY FY*01 5'- C6 NH2-(dT)15TGGCACCATAG-3' 35.7 (SEQ ID NO: 19) FY*02 5'- C6 NH2-(dT)15TGGCATCATAGT-3' 35.0 (SEQ ID NO: 20) 3040999 29 Les produits de PCR ont été directement appliqués sur la partie basse de la membrane qui a ensuite été immergée dans un puits d'une microplaque 96 puits contenant 10 !IL d'une solution de nanoparticules d'or conjuguées diluée deux fois dans le tampon de migration (1X SSC, 0.5 % SDS, 10 % Tween® 20, 5 % formamide). Après migration 5 des nanoparticules, la membrane a été immergée dans un tube conique de 50 mL (Greiner Bio-one, Allemagne), contenant 100 1.1.L de tampon de migration et incubée à 30°C. La détection visuelle du génotypage érythrocytaire a été complète en moins de 30 minutes. Résultats Le procédé de génotypage érythrocytaire sur un système de flux latéral décrit dans 10 l'exemple 1, a été adapté afin de permettre la réalisation de ce test à une température de 30 °C. Les cibles d'intérêt pour les deux systèmes de groupe sanguin JK (JK*1/JK*2) et FY (FY* 1/FY*2) ont été amplifiées par PCR-LATE duplexe. Par comparaison au procédé décrit dans l'exemple 1, la taille des sondes a été réduite et la membrane de nitrocellulose 15 a été remplacée par une membrane ayant une vitesse de capillarité plus importante (membrane de nitrocellulose HF090). Trois échantillons d'ADN génomiques de profils différents ont été amplifiés par PCR-LATE duplexe et ont été appliqués sur la membrane de nitrocellulose sur laquelle avaient été déposées les sondes spécifiques des allèles concernés. L'apparition de plots 20 colorés au niveau de la zone réactionnelle de la membrane (Fig. 5) a permis la détermination simultanée du génotype pour les systèmes JK et FY et de prédire les phénotypes. Les résultats obtenus ont été concordants avec ceux déterminés par les autres techniques de référence. 25 Exemple 3 Les inventeurs ont également démontré que le procédé de génotypage érythrocytaire selon l'invention pouvait être mis en oeuvre directement à partir d'un échantillon de sang total. 3040999 30 Pour cela, les cibles d'intérêt pour les quatre systèmes de groupe sanguin JK (JK*1/JK*2), FY (FY*1/FY*2), MNS (MNS*3/MNS*4) et FY (FY*wt/FY*Fy) ont été amplifiées par PCR-LATE multiplexe selon le protocole détaillé dans l'exemple 1, en utilisant 2.5pt de sang total à la place de l'ADN génomique. 5 Quatre échantillons de profils différents pour lesquels le phénotype et le génotype avaient été au préalable déterminés par des techniques de références (phénotype déterminé par sérologie, génotype par l'utilisation de puces à ADN (Paris et al, 2014)) ont été amplifiés par le protocole de PCR-LATE. Les produits de PCR ont été appliqués sur une membrane de nitrocellulose (HF135, Millipore) sur laquelle étaient déposées les 10 sondes spécifiques des allèles d'intérêt (cf exemple 1). L'apparition de zone colorée, après leur migration par flux latéral, a permis de déterminer un génotype érythrocytaire en concordance avec les résultats obtenus par les techniques de référence (Figure 8). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 15 Ang et al. Biosensors ans Bioelectronics 38 (2012) 151-156 Paris, S., et al., J Mol Diagn, 2014. 16(3): p. 335-42 Pierce, K.E., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005. 102(24): p. 8609-8614. Pierce KE and Wangh LJ (2007). Methods Mol Med. Methods in Molecular 20 Medicine 132: 65-85 Sanchez, J.A., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(7): p. 1933-1938. Song et al., Analyst, 2013, 138, 4991 REVENDICATIONS1. Procédé in vitro de génotypage d'un ou plusieurs polymorphismes de nucléotide simple (SNP) dans un échantillon acide nucléique, ledit procédé comprenant : a) l'amplification d'une ou plusieurs régions de l'acide nucléique contenant le ou les SNP à génotyper, les produits d'amplification comprenant un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, et b) l'analyse des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) à l'aide d'un dispositif de test à flux latéral comprenant une zone réactionnelle comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques immobilisées en des sites distincts, chaque sonde ayant 10 une séquence complémentaire d'un variant allélique d'un SNP à génotyper, l'obtention d'un signal au niveau du site d'immobilisation d'une sonde indiquant que l'acide nucléique comprend le variant allélique spécifique de la sonde. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'amplification est réalisée par 15 PCR asymétrique, de préférence par LATE-PCR. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'amplification simultanée de plusieurs régions de l'acide nucléique est réalisée par PCR multiplexe. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits d'amplification sont marqués en 5', de préférence par l'utilisation d'amorces marquées en 5' durant l'amplification. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les 25 produits d'amplification sont marqués par un composé coloré, luminescent, fluorescent, phosphorescent ou radioactif, par une enzyme ou le premier membre d'un couple ligand/anti-ligand, de préférence par une biotine. 3040999 32 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif de test à flux latéral comprend une matrice poreuse comprenant (i) une zone d'application d'un tampon de migration, 5 (ii) une zone d'application des produits d'amplification disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration, et (iii) la zone réactionnelle disposée en aval de la zone d'application des produits d'amplification, et (iv) optionnellement, une zone de contrôle de migration des réactifs en aval de la zone réactionnelle, et/ou (v) optionnellement, une zone de marquage comprenant un substrat ou partenaire de liaison spécifique du marqueur des produits d'amplification capable de générer directement ou indirectement un signal détectable, disposée en aval de la zone d'application du tampon de migration et en amont de la zone d'application des produits d'amplification, et/ou (vi) optionnellement, un tampon absorbant disposé en aval de la zone réactionnelle ou de la zone de contrôle lorsque celle-ci est présente, les différentes zones de la matrice poreuse étant en communication de fluide avec la ou les zones adjacentes et le tampon absorbant étant en communication de fluide avec la matrice poreuse. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits d'amplification sont analysés directement à l'aide du dispositif de test à flux latéral sans étape de purification ni dénaturation préalable. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'analyse comprend (i) le dépôt des produits d'amplification obtenus à l'étape (a) sur le dispositif de test à flux latéral 3040999 33 ii) l'application d'un tampon de migration sur ledit dispositif, iii) l'incubation du dispositif jusqu'à la détection dans la zone réactionnelle des signaux générés directement ou indirectement par le marqueur des produits d'amplification et/ou la détection d'un signal dans la zone de contrôle de migration 5 lorsque celle-ci est présente, et iv) la lecture et l'interprétation des résultats. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la matrice est en nitrocellulose, polyester, fibres de verre, fibres de cellulose, polyether 10 sulfone (PES) et/ou ester de cellulose. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la matrice est une membrane de nitrocellulose. 15 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le tampon de migration comprend un système tampon permettant de conserver un pH neutre, un ou plusieurs tensio-actifs et/ou un ou plusieurs agents dénaturants qui déstabilisent les liaisons hydrogènes. 20 12. Kit comprenant un dispositif de test à flux latéral tel que défini dans la revendication 6, et au moins un couple d'amorces permettant d'amplifier une région génomique contenant un ou plusieurs SNP, et optionnellement un tampon de migration, des réactifs pour l'amplification, de préférence des dNTP, une polymérase et/ou un tampon, et/ou une notice expliquant l'utilisation dudit kit. 25 13. Kit selon la revendication 12, comprenant un ou plusieurs couples d'amorces permettant d'amplifier une ou plusieurs régions génomiques contenant un ou plusieurs SNP associés à des systèmes d'antigènes érythrocytaires, de préférence les systèmes DUFFY, MNS et/ou KIDD. 3040999 34 14. Kit selon la revendication 12 ou 13, comprenant une ou plusieurs amorces sélectionnées dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1 à 8. 5 15. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour génotyper un ou plusieurs SNP selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1à 11.