FR 3048001 A1 20170825 FR 1651348 A 20160218 1 La présente invention concerne une méthode de dosage des D-dimères spécifiques de la maladie thromboembolique veineuse dans un échantillon sanguin, comprenant le dosage habituel des D-dimères de l'échantillon d'une part, ainsi que la mesure dynamique de la formation de fibrine de cet échantillon d'autre part. La méthode est destinée notamment au diagnostic in vitro de l'embolie pulmonaire et de la thrombose veineuse profonde dans un échantillon sanguin. La maladie thromboembolique veineuse (MTEV) est un problème majeur de santé publique. Elle regroupe la notion de thrombose veineuse profonde (TVP) et son risque vital immédiat, l'embolie pulmonaire (EP). Les principes de base de la pathogénèse de la MTEV ont été décrits par Virchow qui a défini l'origine de la thrombose dans l'association de trois facteurs favorisant la thrombose, qui sont la stase veineuse; le dysfonctionnement ou l'altération de l'endothélium; et l'hypercoagulabilité due à l'activation des facteurs de la coagulation, à l'hyperviscosité, à une déficience en antithrombine, à une thrombophilie, à un syndrome néphrotique, à un changement après de sévères traumatismes physiques ou brûlures, un cancer disséminé, une grossesse tardive, l'ethnie, l'âge, le tabac ou l'obésité (Lopez, Thromb Res. 2009). L'embolie pulmonaire (EP) est une maladie redoutée par tous les urgentistes parce que son diagnostic est difficile, peut-être un des plus difficiles, tant elle se manifeste avec des symptômes très différents, voire est totalement silencieuse. L'embolie pulmonaire est une affection si fréquente que toute anomalie respiratoire survenant de façon brutale doit faire évoquer ce diagnostic. Elle provoque une douleur thoracique aiguë et angoissante. Elle doit être différenciée de l'infarctus du myocarde par l'électrocardiogramme, le dosage des enzymes cardiaques (transaminases, troponine...) et la scintigraphie pulmonaire. Elle doit être différenciée de la péricardite aiguë et de la dissection aortique, qui contre-indiquent l'utilisation d'anticoagulants. Plusieurs types d'EP existent : - l'embolie pulmonaire avec coeur pulmonaire aigu peut être mortelle et apparaît surtout chez un patient alité dans les suites d'une intervention chirurgicale. L'aggravation est possible au cours des premières heures imposant le recours à un 3048001 2 acte chirurgical ou embolectomie ou au traitement thrombolytique. L'évolution fatale reste très fréquente, - les embolies pulmonaires foudroyantes entraînent une mort subite ou une mort en quelques minutes par collapsus, 5 - les embolies pulmonaires frustes sont très fréquentes, avec des symptômes souvent trompeurs. Le diagnostic est souvent porté quelques jours plus tard, et - les embolies pulmonaires chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque et respiratoire sont fréquentes et leur gravité impose un traitement anticoagulant préventif. 10 Les signes cliniques de la thrombose veineuse profonde (TVP) sont souvent frustes voire inexistants, ou similaires à ceux d'une thrombose veineuse superficielle, beaucoup moins grave car sans évolution vers l'EP. Il est nécessaire de différencier la TVP : - d'un hématome profond car le traitement anticoagulant va favoriser le saignement ; 15 - d'une maladie infectieuse sous-cutanée de la jambe ; - d'une maladie post-phlébitique, et - de la rupture d'un kyste poplité qui donne un tableau clinique assez similaire. Il existe trois types de complications, dont : l'EP, qui, dans près de la moitié des cas, est totalement asymptomatique ; l'extension du thrombus dans le système veineux ; et la 20 maladie post-phlébitique, complication fréquente, chez près d'un tiers des patients. Des scores permettent d'évaluer la probabilité clinique d'une EP en présence d'une dyspnée ou d'une douleur thoracique. Ils sont utilisés dans l'arbre de décision diagnostic pour optimiser la prise en charge des patients, en particulier pour décider de l'approche 25 thérapeutique. L'algorithme diagnostic actuel repose sur une démarche qui comporte : - une première étape d'évaluation de la probabilité clinique : score de Wells dans la TVP (Wells, J Thromb Haemost 2007), score de Wells ou score de Genève et leurs versions simplifiées dans l'EP (Ceriani, J Thromb Haemost 2010, Klok, Arch Intern Med 2008, Le Gal, Ann Intern Med 2006), regroupant plusieurs facteurs de risque, 30 des symptômes et des signes cliniques, - suivie dans la majorité des cas par un dosage de D-dimères, examen très sensible mais peu spécifique, qui, quand il est positif, impose la réalisation d'un angioscanner 3048001 3 thoracique spiralé avec injection de produit de contraste iodé ou d'une scintigraphie pulmonaire dans l'EP, d'un doppler dans la TVP. Une faible probabilité clinique, combinée à un taux de D-dimères inférieur au seuil de 0.50 1..tg/mL, permet d'exclure la présence d'une EP ou d'une TVP avec une excellente valeur prédictive 5 négative. Ainsi, l'utilisation du dosage des D-dimères comme test d'exclusion entraîne la nécessité d'avoir recours aux tests d'imagerie coûteux, pour visualiser le thrombus et faire le diagnostic de gravité avec le nombre et le type d'artères pulmonaires atteintes en 10 cas d'EP. En outre, de tels examens prolongent le séjour des malades aux urgences, sont sources d'irradiation et à l'origine d'un coût non négligeable. L'angioscanner peut être à l'origine de réactions allergiques au produit de contraste iodé, d'insuffisance rénale et d' oedème pulmonaire. 15 L'antigène D-dimère est un marqueur unique de la dégradation de la fibrine formée par l'action séquentielle de la thrombine, du facteur de coagulation FXIIIa et de la plasmine, comme le montre la figure 1. En effet, la thrombine clive le fibrinogène en monomères de fibrine, qui polymérisent et servent de substrat au FXIIIa et à la formation de plasmine. Puis, la thrombine reste associée à la fibrine et active le FXIII 20 lié aux polymères de fibrine pour produire le FXIIIa, qui catalyse la formation de liens covalents entre les domaines D de la fibrine polymérisée. Enfin, la plasmine dégrade la fibrine polymérisée pour libérer les produits de dégradation de la fibrine (PDFn) de différents poids moléculaires, incluant les produits terminaux contenant le complexe Ddimère-fragment E et expose l'antigène D-dimère, qui reste indétectable jusqu'à sa 25 libération par la plasmine. L'antigène D-dimère peut être présent soit sur les PDFn provenant de la fibrine avant son incorporation dans le caillot de fibrine, soit des complexes de haut poids moléculaire libérés après dégradation du caillot par la plasmine (Adam, Blood 2009). 30 Le D-dimère est un marqueur de la formation du caillot de fibrine et de la fibrinolyse. La fibrinolyse joue un rôle important sur la stabilité du caillot et le risque thrombotique si elle commence après la formation du caillot. Si elle est initiée en même temps, il y a 3048001 4 compétition entre la liaison thrombine-fibrine et la liaison plasmine-fibrine, donc entre formation et lyse de la fibrine. Les D-dimères proviennent de la dégradation des polymères de fibrine soluble, qui sont 5 des marqueurs d'activation de la coagulation intravasculaire (Mirshahi. PLoS ONE 2014). Dans les états d'hyper-coagulation et dans les états inflammatoires aigus, les D-dimères proviennent de la dégradation de la fibrine extravasculaire par les enzymes présentes localement au niveau des sites d'inflammation, comme le montre la figure 2. Cette notion est supportée par les taux souvent élevés de D-dimères chez les patients 10 atteints de cancer ou d'états inflammatoires aigus (Dirix. Br J Cancer 2002). Lorsque la fibrinolyse s'étend et se généralise (« hyper fibrinolyse »), la dégradation du fibrinogène par la plasmine générée en large excès devient alors possible. Il apparaît dans la circulation, à la fois, des produits de dégradation de la fibrine dont les D- 15 dimères et des produits de dégradation du fibrinogène (PDFg), comme le montre la figure 2. Ainsi, des taux élevés de D-dimères sont générés dans le cancer et dans les états d'activation importante de la coagulation, en association avec des taux importants de PDFg. 20 Les dosages de D-dimères utilisés actuellement ne sont pas identiques, car l'antigène D- dimère est présent sur les PDFn de différente taille et les anticorps monoclonaux reconnaissent différents épitopes (Dempfle. FACT study group. Thromb Haemost 2001). Les méthodes les plus fréquemment utilisées sont les méthodes immuno- 25 turbidimétriques automatisées, basées sur le changement de turbidité d'une suspension de microparticules de latex coatées par des anticorps monoclonaux anti-antigène D-dimère. En présence de D-dimères dans l'échantillon, les microparticules de latex agglutinent, induisant une augmentation de la turbidité du milieu, qui se traduit par une augmentation de l'absorbance en photométrie à 540 nm. Ces dosages en plasma 30 présentent une meilleure sensibilité que les tests d'agglutination en sang total (de Groot, Thromb. Haemost, 1999), permettant ainsi l'exclusion de la MTEV, mais ils sont très peu spécifiques, et ne peuvent être utilisés pour le diagnostic de la MTEV. 3048001 5 Cependant, aucune méthode de l'art antérieur n'a relié la mesure dynamique de la formation de fibrine d'un échantillon, aux D-dimères et aux produits de dégradation du fibrinogène (PDFg) générés par l'hyper-coagulation, l'inflammation et l'hyper- 5 fibrinolyse, pour déterminer les D-dimères résultant de la lyse de la fibrine intravasculaire. Ainsi, aucune méthode actuelle n'est capable de mesurer les D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse dans un échantillon sanguin. La mise à disposition d'une méthode de diagnostic in vitro, aussi sensible mais plus 10 spécifique que le dosage habituel des D-dimères, pourrait ainsi diminuer le recours aux examens d'imagerie chez les malades avec suspicion d'EP et de TVP, tels qu'un angioscanner thoracique spiralé avec injection de produit de contraste iodé ou une scintigraphie pulmonaire. Une telle méthode permettrait de limiter les coûts, d'assurer une prise en charge plus rapide des patients, en particulier les personnes âgées et les 15 patients atteints de cancer, à haut risque de thrombose, et permettre une décision rapide de traitement. Il existe donc un besoin de disposer d'une méthode de détermination des D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse dans un échantillon de patient, ladite méthode 20 étant capable de différencier les D-dimères dudit patient générés par l'hyper- coagulation, l'inflammation et l'hyper-fibrinolyse, de ceux résultant de la lyse de la fibrine intravasculaire et spécifiques de la thrombose, comme cela est montré en figure 2. Une telle méthode doit, en outre, être automatisée pour être réalisée en urgence au laboratoire ou réalisable au lit du patient. De plus, elle doit être fiable, reproductible, 25 simple et aider à la décision de traitement. De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant mis au point une méthode capable de distinguer les D-dimères provenant de l'activation de la coagulation, de l'inflammation et de l'excès de fibrinolyse, de ceux spécifiques de la thrombose, 30 provenant de la dégradation de la fibrine intravasculaire, et de les mesurer quantitativement. Cette méthode permet en outre leur détermination en situation d'urgence sur un automate de laboratoire, un dispositif de biologie délocalisée ou un 3048001 6 dispositif portable. Elle est fiable, simple et rapide à mettre en oeuvre, reproductible et sans ajustement en fonction de l'âge. La méthode selon l'invention est basée sur trois constats : l'hyper-coagulation et l'hyper 5 fibrinolyse sont absentes ou réduites dans la thrombose, contrairement aux états d'activation de la coagulation ; en revanche, l'état inflammatoire est prédominant. La présente invention concerne donc une méthode de dosage des D-dimères spécifiques de la maladie thromboembolique veineuse dans un échantillon de plasma de patient, 10 ladite méthode comprenant le dosage habituel des D-dimères de l'échantillon d'une part, ainsi que la mesure dynamique de la formation de fibrine de ce même échantillon, d'autre part, ladite mesure dynamique comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon de plasma, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; 15 b) incubation, notamment à 37°C, du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la génération de thrombine et la formation d'un caillot ; c) mesure de la variation de densité optique (DDO) du caillot en formation de l'étape b), à une seule longueur d'onde comprise entre 350 et 800 nm, de 20 préférence à la longueur d'onde de 540 nm, pendant une durée de préférence inférieure à 10 minutes ; d) détermination du profil de formation du caillot analysé en c), i.e. détermination du temps de formation de la fibrine (TFF) mesuré par la tangente de la courbe, et de la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de 25 polymérisation de la fibrine ; e) calcul des D-dimères résultant de la dégradation de la fibrine intravasculaire, à partir du temps de formation de fibrine (TFF) mesuré en d) et de la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine déterminée en d), et exprimés en unités équivalentes au fibrinogène 30 initial (FEU) ; 3048001 7 f) détermination du taux de D-dimères obtenu en e) par rapport à un seuil, de préférence au seuil de 0.5 p.g/mL, ce qui permet notamment de déterminer la probabilité d'une thrombose veineuse ; g) déduction des produits de dégradation du fibrinogène (PDFg), générés par 5 l'hyper-fibrinolyse présente dans les états d'activation de la coagulation ; et h) détermination des D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse, à partir du taux de D-dimères obtenu en f), des PDFg obtenus en g), et du temps de formation de fibrine (TFF) obtenu en d), par rapport à un seuil. Cela permet notamment de confirmer ou infirmer la probabilité d'une embolie 10 pulmonaire (EP) ou d'une thrombose veineuse profonde (TVP) et/ou orienter vers un état d'hyper-coagulation dans l'échantillon du patient. La méthode selon l'invention permet de doser des D-dimères spécifiques de la maladie thromboembolique veineuse, résultant de la dégradation de la fibrine intravasculaire. 15 Elle comprend le dosage habituel des D-dimères de l'échantillon, ainsi que la mesure dynamique de la formation de fibrine de cet échantillon constituée par les étapes a) à h). Alternativement, selon l'invention, la mesure dynamique de la formation de fibrine peut également être réalisée dans un échantillon biologique de sang total, ladite méthode 20 comprenant les étapes suivantes: a) mélange de l'échantillon biologique de sang total avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium ; c) mesure de la variation temporelle des propriétés physiques du caillot de fibrine 25 en formation b), par thromboélastographie, rhéométrie ou par analyse d'images, pendant une durée de préférence inférieure à 10 minutes ; d) détermination du profil de formation du caillot analysé en c), i.e. détermination du temps de formation de la fibrine (TFF) mesuré par la tangente de la courbe, et de l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine ; 30 e) calcul des D-dimères résultant de la dégradation de la fibrine intravasculaire à partir du temps de formation de la fibrine (TFF) et de l'amplitude au temps 3048001 8 d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine déterminés en d), et exprimés en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU) ; f) détermination du taux de D-dimères obtenu en e), par rapport à un seuil, de préférence au seuil de 0.5 p.g/mL, pour déterminer la probabilité d'une 5 thrombose veineuse ; g) déduction des produits de dégradation du fibrinogène (PDFg), générés par l'hyper-fibrinolyse présente dans les états d'activation de la coagulation ; et h) détermination des D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse, à partir du taux de D-dimères obtenu en f), des PDFg obtenus en g) et du temps de 10 formation de la fibrine obtenu en d) par rapport à un seuil. Par « dosage habituel des D-dimères de l'échantillon », on entend un dosage effectué selon une méthode immuno-turbidimétrique, comme la méthode latex ou une méthode immuno-enzymatique, comme la méthode ELISA (« enzyme-linked immunosorbent 15 assay ») ou la méthode ELFA (« enzyme-linked fluorescent assay »). Les méthodes immuno-turbidimétriques sont basées sur le changement de turbidité d'une solution comprenant les D-dimères. Typiquement, une méthode immuno-turbidimétrique comprend (i) le mélange de l'échantillon de patient avec une suspension de microparticules de latex coatées par des anticorps monoclonaux anti-antigène D-dimère 20 (« méthode latex ») ; puis (ii) le suivi de la turbidité du mélange, notamment à une longueur d'onde donnée, typiquement à 540 nm. Une méthode immuno-enzymatique comprend la capture des D-dimères de l'échantillon par des anticorps monoclonaux anti-antigène D-dimère puis leur révélation par des anticorps secondaires marqués. 25 La méthode selon l'invention permet de déterminer les D-dimères spécifiques de la MTEV, en ajustant les D-dimères de l'échantillon en fonction des D-dimères générés par : - l'hyper-coagulation avec le temps de formation de la fibrine, après initiation de la génération de la thrombine et de fibrine ; 30 - l'inflammation avec la variation de densité optique ou l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine, et avec l'expression du résultat en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU) ; et 3048001 9 - l'hyper-fibrinolyse avec la déduction du fibrinogène dégradé par la plasmine en PDFg, et en orientant vers un état d'activation de la coagulation avec le raccourcissement du temps de formation de la fibrine, pour diagnostiquer une maladie thromboembolique 5 veineuse, comme cela est explicité en figures 3 et 4. Par « profil de formation du caillot de fibrine », on entend l'évolution des propriétés physiques du caillot, de préférence des propriétés optiques du caillot, au cours de la formation de fibrine jusqu'au plateau de polymérisation de la fibrine, en présence de 10 facteur tissulaire. Pour la méthode selon l'invention réalisée avec du plasma, il correspond notamment au temps de formation de la fibrine (TFF) mesuré par la tangente de la courbe, et à la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine. Pour la méthode selon l'invention réalisée avec du sang total, il correspond notamment 15 au temps de formation de la fibrine (TFF) mesuré par la tangente de la courbe, et à l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine mesurée de préférence par thromboélastographie, rhéométrie ou par analyse d'images. Cela est notamment illustré : 20 - en figure 5a, avec un plasma de patient normal et un plasma de patient avec une hyper-coagulation, - et en figure 5b, avec un sang total de patient normal et un sang total de patient avec une hyper fibrinogénémie. Le temps de formation de la fibrine au niveau de la tangente de la courbe ainsi que le 25 temps d'atteinte du début du plateau de fibrine sont raccourcis proportionnellement à l'hyper-coagulation, que ce soit avec le plasma hyper-coagulant pour la méthode selon l'invention, ou avec le sang total ayant un taux de fibrinogène élevé, pour la méthode alternative selon l'invention. 30 Le niveau du plateau de polymérisation de la fibrine, exprimé soit par la DDO au temps d'atteinte du plateau dans la méthode selon l'invention, soit par l'amplitude au temps d'atteinte du plateau dans la méthode alternative selon l'invention, augmente avec 3048001 10 l'inflammation, représentée soit par le taux de fibrinogène dans la figure 5 ; soit par le taux de Protéine C réactive (CRP) dans la figure 6a et le taux de fibrinogène dans la figure 6b, dans les échantillons de patients pour lesquels les deux protéines (CRP et fibrinogène) ont été dosées. 5 La DO au plateau est moins élevée pour le plasma de patient avec une hypercoagulation que pour le plasma de patient normal (3.5 g/L), car il contient moins de fibrinogène (3.0 g/L). L'amplitude au temps d'atteinte dans la méthode alternative selon l'invention est plus élevée pour le sang total ayant un taux de fibrinogène élevé (5g/L) que pour le sang 10 normal qui a un taux de fibrinogène normal (2.5 g/L). Le temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine est proportionnel au temps de formation de la fibrine, pour tous les patients avec suspicion de thrombose, comme montré en figure 7a pour les patients sans cancer actif, qu'ils aient ou non une 15 thrombose veineuse et en figure 7b pour les patients avec un cancer actif. Ce temps d'atteinte du plateau ne dépasse pas 8 minutes, quels que soient les patients, en absence de traitement anticoagulant. Une telle méthode permet de déterminer le taux de D-dimères spécifiques de la MTEV 20 pour le patient concerné, et ce, en un temps très court (i.e. moins de 10 minutes) comme décrit notamment dans l'exemple 1. En effet, les différents plasmas de patients avec et sans embolie pulmonaire, avec et sans thrombose veineuse profonde, et avec et sans état d'activation de la coagulation, sont discriminés en moins de 10 minutes, sur leur profil de formation du caillot de fibrine après initiation de la génération de thrombine. 25 La méthode selon l'invention utilise un simple échantillon biologique du patient. Cet échantillon biologique est utilisé non dilué dans la méthode. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma, ou bien un échantillon de sang total, notamment citraté. Un échantillon de sang total prélevé dans le tube citraté destiné 30 au dosage habituel des D-dimères peut être utilisé en situation d'urgence avec la méthode alternative. 3048001 11 De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes (PPP). Dans ce cas, il est notamment obtenu par centrifugation du tube citraté destiné au dosage habituel des D-dimères, comprenant l'échantillon de sang de patient, pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée 5 à une température comprise entre 18 et 22°C. Si l'échantillon de PPP doit être conservé, le protocole suivant peut être utilisé : - décanter rapidement le plasma, en laissant environ 0.5 cm de plasma au-dessus de la couche cellulaire des globules blancs et plaquettes ; 10 - récupérer le plasma dans un tube à hémolyse ou un tube plastique ; - centrifuger ce tube pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à une température comprise entre 18 et 22°C; - aliquoter en fractions de 0,5 à 1 ml sans prendre le fond du tube (qui contient les débris cellulaires) ; puis 15 - congeler rapidement à une température comprise entre -70°C et -90°C, de préférence à -80°C. L'échantillon biologique non dilué est utilisé dans la présente invention en faible volume. De préférence, l'échantillon biologique a un volume compris entre 1 pt et 300 20 pt, de préférence entre 50 pt et 200 pt, de préférence d'environ 200 pt pour un volume final de 300 pt, de préférence d'environ 100 pt pour un volume final de 150 pt. Un tel volume suffit en effet pour l'analyse sur instrument de routine, mais peut être réduit sur un dispositif de biologie délocalisée, à condition de respecter le rapport de volume d'échantillon sur le volume final (i.e. rapport d'environ 2 : 3). Il peut être réduit 25 davantage à un volume compris entre 5 pt et 20 pt, de préférence 10 pt, dans le cas d'un dispositif portable dont le réactif est lyophilisé et reconstitué par l'échantillon au moment de l'utilisation au lit du malade, pourvu que les mêmes concentrations finales réactionnelles soient obtenues. 30 Etapes de la méthode ^ Etape a) 3048001 12 L'étape a) comprend le mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides. L'échantillon biologique non dilué est de préférence utilisé tel quel. Il est mélangé à une solution de facteur tissulaire (FT), de préférence humain, et de phospholipides (PL), de préférence semi-purifiés ou purifiés. Le facteur 5 tissulaire et les phospholipides sont de préférence lyophilisés pour être reconstitués par l'échantillon biologique non dilué, notamment dans le cas d'un dispositif de biologie délocalisée ou d'un dispositif portable. Le mélange de l'étape a) peut comprendre une concentration finale de phospholipides 10 de 2 à 5 p.M dans le mélange, de préférence une concentration d'environ 4 p.M. De préférence, le FT est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.5 et 20 pM, de préférence entre 1 et 5 pM, de préférence 2 pM. Le mélange de l'étape a) peut comprendre également des ions calcium. Les ions calcium 15 peuvent être présents à une concentration finale de 15 à 20 mM, de préférence de 17 mM. De préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend : al) l'introduction de FT dans une solution de PL et éventuellement d'ions calcium, puis 20 a2) le mélange de la solution obtenue en al) avec l'échantillon biologique non dilué. Alternativement, de préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend : al) l'introduction de PL à une solution de FT, et optionnellement l'ajout d'ions calcium, puis a2) la lyophilisation de la solution obtenue en al) pour être reconstituée avec 25 l'échantillon biologique non dilué. A la fin de l'étape a), un mélange d'au moins le FT avec l'échantillon biologique de plasma non dilué ou un mélange d'au moins le FT avec l'échantillon biologique de sang total non dilué est obtenu pour la détermination du profil de formation de fibrine 30 jusqu'au plateau de polymérisation. ^ Etape b) 3048001 13 S'ensuit une étape b) d'incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la génération de thrombine et la formation d'un caillot de fibrine. Préférentiellement, l'étape b) initie la génération de thrombine et la formation d'un caillot de fibrine. 5 L'étape b) comprend ainsi l'incubation du mélange obtenu à l'étape a). Cette incubation peut typiquement se faire pendant un temps compris entre 20 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 60 secondes et 300 secondes, de préférence de 300 secondes sur l'instrument de routine, à une température comprise entre 30°C et 40°C, de préférence d'environ 37°C. 10 Ce temps d'incubation peut être raccourci à moins de 60 secondes, de préférence moins de 30 secondes avec des volumes réduits, en particulier avec l'utilisation d'un instrument de biologie délocalisée, de préférence avec l'utilisation d'un dispositif portable. Puis des ions calcium sont ajoutés au mélange incubé. Ces ions calcium peuvent être ajoutés sous forme de solution de CaC12, à une concentration d'environ 0.1 M. Par 15 l'ajout de calcium, en présence de FT, la génération de thrombine et la formation d'un caillot de fibrine sont initiées. ^ Etape c) La formation du caillot de fibrine est ensuite suivie de façon dynamique, c'est-à-dire 20 toutes les 2 secondes ou moins, lors de l'étape c), par mesure de la densité optique à au moins une longueur d'onde comprise entre 350 nm et 800 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 10 minutes. De préférence, la mesure de densité optique se fait à la longueur d'onde de 540 nm, qui est celle utilisée pour le dosage habituel des D-dimères. De préférence, la durée de mesure de l'étape c) est comprise entre 1 minute et 10 25 minutes, de préférence 10 minutes. Pendant cette durée, la formation du caillot de fibrine est donc analysée, notamment par les variations de la densité optique par rapport à la densité optique au temps de base compris entre 10 et 20 secondes. Alternativement, la formation du caillot de fibrine est suivie par la variation temporelle des propriétés physiques du caillot, jusqu'à atteindre l'amplitude au temps d'atteinte du 30 plateau, soit pendant une durée inférieure à 10 minutes, de préférence inférieure à 5 minutes. 3048001 14 ^ Etape d) Le profil de formation du caillot analysé en c) est déterminé par les paramètres de formation du caillot de fibrine, qui sont exprimés par : - le temps de formation de la fibrine (TFF), qui correspond à la tangente de la courbe, et 5 par - la variation de densité optique (DDO) au niveau du plateau de polymérisation. La DDO est ainsi mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine. Alternativement, le profil de formation du caillot analysé en c) est déterminé par : 10 - le temps de formation de la fibrine (TFF), qui correspond à la tangente de la courbe, et par - le niveau du plateau, qui correspond à l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine. Cela est notamment exemplifié à la figure 5. 15 ^ Etape e) Les inventeurs ont observé qu'il y a un allongement systématique du temps de formation de la fibrine (TFF) dans tous les échantillons de patients avec EP et/ou TVP, comparativement aux échantillons de patients sans thrombose, comme montré en 20 exemple 1. La fonction linéaire de l'exemple 2 est mise à profit pour ajuster les D- dimères en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation. Le taux des D-dimères ajustés est déterminé à partir du taux des D-dimères de l'échantillon par la formule suivante : Temps de formation de la fibrine TFF Y = X x Temps Témoin 25 Où : Y est le taux des D-dimères ajustés, X est le taux des D-dimères de l'échantillon, Le temps de formation de la fibrine TFF de l'échantillon est représenté par la tangente de la courbe, 3048001 15 Le temps Témoin est le temps moyen de formation du caillot de fibrine d'échantillons de sujets sains normaux, ne présentant pas de suspicion de thrombose, notamment comme le montre l'exemple 3. Ainsi, l'étape e) comprend une étape de calcul des D-dimères, à partir du temps de formation de la fibrine (TFF) mesuré en d) pour soustraire 5 les D-dimères résultant de l'activation de la coagulation. Les D-dimères qui résultent de la dégradation de la fibrine intravasculaire sont également calculés à partir de la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine déterminée en d), et exprimés en unités 10 équivalentes au fibrinogène initial (FEU). Ils sont notamment déterminés par le ratio R suivant : D-dimères ajustés Y R= Niveau de l'inflammation Où: Les D-dimères ajustés en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation Y sont calculés à partir du temps de formation de la fibrine comme décrit ci-dessus ; 15 Le niveau de l'inflammation est déterminé par la DDO du plateau de fibrine, selon la méthode de l'invention, ou l'amplitude du plateau de fibrine, selon la méthode alternative de l'invention, et est exprimé en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU) à partir de l'équation logarithmique qui relie la DDO et le taux de fibrinogène, notamment comme le montrent les figures 9a et 9b et l'exemple 4, et à partir des 20 équations qui relient l'amplitude et le taux de fibrinogène, notamment comme le montrent la figure 9c et l'exemple 4, respectivement. Les D-dimères sont ainsi exprimés en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU). ^ Etape f) 25 Le taux des D-dimères obtenu en e) est déterminé par rapport à un seuil, pour déterminer la probabilité d'une thrombose veineuse, notamment d'une embolie pulmonaire (EP) ou d'une thrombose veineuse profonde (TVP), dans l'échantillon du patient. De préférence, le seuil est de 0.501..tg/mL. En effet, de préférence, la quantité de D-dimères générés par la plasmine étant environ 50% de l'unité FEU avec les anticorps 3048001 16 8D2 et 2.1.16 utilisés, le seuil de positivité de la mesure est ainsi de 0.50 p.g/mL. De préférence, ce seuil est le même que celui du dosage habituel des D-dimères. Notamment, parmi les patients avec un taux de D-dimères obtenu en e) déterminé par le ratio R et exprimés en unités FEU, plus de 90% des patients sans thrombose ont un taux 5 négatif et tous les patients avec thrombose ont un taux positif variant de 0.5 p.g/mL à 10.5 p.g/mL, comme le montre le tableau 4. Parmi les patients sans thrombose, trouvés faussement positifs ( 71..tg/mL), les PDFg générés avec la fibrine intravasculaire sont systématiquement plus faibles dans les échantillons provenant de patients avec thrombose que dans ceux de patients sans thrombose ; ceci 20 quel que soit le réactif des D-dimères utilisé. Ceci permet de discriminer les patients avec thrombose de ceux sans thrombose, sur la base d'une différence entre les PDFg avant et après ajustement des D-dimères positive, au seuil de 1 1..tg/mL, comme montré dans le tableau 5 ci-dessous. A l'inverse, une différence négative ou 11..tg/mL Avec et Ddi Nég 127 0.09 Nég Nég / Négatifs sans Sans 69 0.26 Nég Nég / Négatifs 4 0.51 Nég Nég / 4 Faux + cancer thrombose 9 1.13 11.2 10.9 +0.3 Négatifs Avec 6 0.91 15.3 9.2 +6.1 6 Faux + suspicion (+2.6 thrombose à+20.3) Avec 2 0.55 Nég Nég / Positifs thrombose 19 1.77 18.8 14.5 +4.3 Positifs (0.58- (8.3- (7.1- (+1.2 à 10.5) 83.3) 68.7) +14.6) Avec 10 0.26 Nég Nég / Négatifs cancer Sans 2 1.97 16.1 15.8 +0.3 Négatifs Avec thrombose 1 0.51 Nég Nég / 1 Faux+ suspicion 3 0.97 18.8 9.5 +9.2 3 Faux+ de Avec 6 1.44 16.2 12.4 +3.8 Positifs thrombose thrombose (0.58- (9.5- (7.1- (+1.3 à Positifs 3.65) 31.7) 26.2) +6.7) Tableau 5. Discrimination des plasmas de patients avec ou sans thrombose, et avec ou sans cancer, en fonction de l'hyper fibrinolyse ava déduction des PDFg, par la méthode optique sur STAR® (Stago). 5 Ainsi, 95% des patients évitent l'imagerie sur la base d'un taux négatif de D-dimères ajustés en fonction des D-dimères générés à la fois par l'hyper-coagulation (H), l'inflammation (I) et l'hyper fibrinolyse (F). Parmi les faux positifs, 3 sont en limite de seuil, 4 sont des cancers et 3 ont une cause 10 d'activation de la coagulation et peuvent éviter l'imagerie sur la base d'un 3048001 34 raccourcissement important du temps de formation de fibrine, sans générer de faux négatifs, comme montré en exemple 7. 5 Exemple 7 - Ajustement des D-dimères par la méthode de l'invention comparativement au ratio [Ddi/Fibrinogène par la méthode de Clauss] la) Protocole A : méthode sur STAR® Evolution 10 L'ajustement des D-dimères en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation (H), de l'inflammation (I) et de l'hyper fibrinolyse (F) selon la méthode de l'invention (étape h)) est plus performant que le ratio [D-dimères /Fibrinogène], comme le montrent la figure 12 et le tableau 6 ci-dessous. Les patients avec thrombose sont discriminés de ceux sans thrombose sur la base d'un taux élevé de D-dimères ajustés, qui sont 15 multipliés par un facteur 5.3, comme le montre le tableau 6 ci-dessous. Ainsi, 92% des patients avec un taux de D-dimères faussement positif, soit 97% des patients sans thrombose sont rendus négatifs avec l'ajustement des D-dimères selon l'étape h), comme le montre la figure 12. Parmi les 7 faux +, 4 sont des cancers et 3 sont en limite de seuil. 20 Les faux négatifs avec le ratio [D-dimères/Fibrinogène] sont détectés par la méthode de l'invention, ce qui permet de ne pas passer à côté d'une thrombose. Il y a moins de faux positifs par la méthode de l'invention qu'avec le ratio [Ddimères/Fibrinogène], ce qui permet de diminuer le nombre de patients diagnostiqués 25 par l'imagerie. Plasmas Diagnostic Nom -bre Ddi ajustés Résul- tat Ratio Résul de Ddi et/ou [Ddi / (H+I+F)] [Ddi/Fib] Clauss tat patients imagerie Moy Gamme Moy Gamme Avec et Ddi négatifs 127 0.09 0.04-0.21 Nég 0.09 0.04-0.16 Nég sans cancer Avec Ddi positifs 88 0.31 0.11-1.56 7 0.40 0.09-3.60 17 Sans Faux+ Faux+ thrombose 3048001 suspicion Ddi positifs 21 1.65 0.52-10.5 0 1.35 0.38-7.71 2 d'EP et/ou Avec Faux- Faux- TVP thrombose Variation +/- thrombose x 5.3 x 3.4 Avec Sans 16 0.45 0.12-1.56 4 0.75 0.09-3.60 7 cancer thrombose Faux+ Faux+ Avec suspicion de thrombose Avec 6 1.44 0.58-3.65 0 1.18 0.38-3.0 1 thrombose Faux- Faux- Variation +/- thrombose x 3.2 x 1.6 Tableau 6. Ajustement des D-dimères par la méthode optique de l'invention, comparativement à l'ajustement par le ratio [D-dimères/Fibrinogène par la méthode de Clauss], dans les plasmas de patients avec ou sans thrombose, et avec ou sans cancer (H: hyper-Coagulation, I.. inflammation, F : hyper Fibrinolyse, Ddi : D-dimères, Fib : fibrinogène) 5 Exemple 8 - Influence du taux de D-dimères ajustés selon la méthode de l'invention, sur la probabilité d'EP et/ou de TVP : 10 la) Protocole A : méthode sur STAR® Evolution Le seuil des D-dimères ajustés selon la méthode de l'invention n'a avantageusement pas été ajusté en fonction de l'âge. En effet, les taux des D-dimères, l'activation de la coagulation, et l'inflammation augmentent progressivement en fonction de l'âge après 15 50 ans. De ce fait, le ratio n'est pas ajusté en fonction de l'âge. Plus les taux de D-dimères ajustés selon la méthode de l'invention sont élevés, plus le dénominateur de la formule avec le temps de formation de fibrine et du ratio avec la DDO est élevé, plus la probabilité d'EP ou de TVP est élevée. 20 3048001 36 Les D-dimères ajustés sont d'autant plus importants que l'EP est étendue et que la TVP est proximale plutôt que distale ou superficielle, comme montré dans le tableau 7 ci-dessous : Nombre Ddi Ddi ajustés Delta TFF Probabilité Plasmas de patients avec EP et/ou TVP [Ddi / PDFg 0.5 p.g/mL 0.52-12.13 Ratio [D-dimères 30 0.67 1.14 2.1% 6.7% /Fibrinogène] 0.12-4.92 Ratio négatif 25 0.28 0.13 2.4% 7.3% 0.12-0.53 Ratio positif 5 2.61 1.85 0.2% 1.8% 0.60-4.92 D-dimères spécifiques de 30 0.71 1.00 2.3% 6.8% la thrombose (pg/mL) 0.14-4.28 Ddi spécifiques négatifs 21 0.30 0.11 3.6% 7.7% 0.14-0.50 Ddi spécifiques positifs 9 1.66 1.44 -0.6% 1.8% 3048001 41 0.51-4.28 Tableau 10. Répétabilité des doublons de mesure de la formation de fibrine, des D-dimères et D-dimères ajustés selon la méthode de l'invention, ainsi que du ratio [D-dimères/Fibrinogène] dans les échantillons de patients avec et sans thrombose à l'imagerie. 5 Exemple 11 - Ajustement des D-dimères selon la méthode de l'invention avec un autre réactif de dosage des D-dimères : la) Protocole A : méthode sur STAR® Evolution 10 Les D-dimères sont ajustés en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation (H) par la formule de l'exemple 2, de l'inflammation (I) par la fonction logarithmique de l'exemple 4 et le ratio R de l'exemple 5, et de l'hyper fibrinolyse (F) par les équations linéaires de l'exemple 6, avec la méthode de dosage des D-dimères 15 Instrumentation Laboratory (IL). L'ajustement des D-dimères en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation permet de soustraire les D-dimères générés par l'hyper-coagulation dans les états d'activation de la coagulation, mais ne permet pas de discriminer les patients avec et 20 sans thrombose, comme le montre le tableau 11. Plasmas de Diagnostic Nombre Taux de D-dimères Taux de D-dimères patients D-dimères initiaux (pg/mL) ajustés/hyper-coag et/ou imagerie (pg/mL) Moy Gamme Moy Gamme Avec Ddi négatifs 120 0.43 0.11-3.32 0.46 0.09-3.35 suspicion de thrombose Ddi positifs 79 1.75 0.20-7.34 2.12 0.21-16.7 sans thrombose Ddi positifs 15 8.42 1.39-25.4 10.9 1.82-34.7 avec thrombose 3048001 42 Tableau 11 Ajustement des D-dimères avec la méthode de dosage des D-dimères IL en fonction des D-dimères générés par l'hyper-coagulation dans des plasmas de patients avec suspicion de thrombose. 5 L'ajustement des D-dimères en fonction des D-dimères générés par l'inflammation permet de discriminer les patients avec et sans thrombose, comme le montrent la figure 13 et le tableau 12. Ainsi, 90% des patients environ peuvent éviter l'imagerie avec l'un ou l'autre des 2 réactifs Stago et IL, sur un taux de D-dimères ajustés négatif. Plasmas de Diagnostic Nombre Taux de D-dimères Taux de D-dimères Résul patients Ddi et/ou ajustés (pg/mL) ajustés (pg/mL) tat imagerie /hyper-coag H /inflammation I Faux + Faux - Moy Gamme Moy Gamme Plasmas de patients avec suspicion de thrombose Ddi négatifs 120 0.46 0.09-3.35 0.12 0.02-1.04 2 Fx + Ddi positifs 79 2.12 0.21-16.7 0.45 0.06-2.47 22 Fx+ sans thrombose Ddi positifs 15 10.9 1.82-34.7 2.45 0.49-8.84 1 lim avec thrombose 10 Tableau 12. Ajustement des D-dimères avec la méthode de dosage des D-dimères IL en fonction des D-dimères générés par l'inflammation dans des plasmas de patients avec suspicion de thrombose. L'ajustement des D-dimères en fonction des D-dimères générés par l'hyper fibrinolyse 15 (F), en plus de l'hyper-coagulation (H) et de l'inflammation (I), permet de discriminer davantage de patients, comme le montrent la figure 13 et les tableaux 13 et 14 ci-dessous. Ainsi, plus de 95% des patients peuvent éviter l'imagerie, sur un taux négatif de D-dimères ajustés selon la méthode de l'invention. Parmi les 9 faux +, 3 sont des cancers avec métastases, 3 sont en limite de seuil ( 80 ans). 3048001 43 Plasmas de Diagnostic Nombre Ddi PDFg PDFg PDFg Résultat patients Ddi positif et ajustés Ddi Ddi Seuil >1.0 imagerie ajustés Avec Ddi négatifs 120 0.12 / / / Nég suspicion thrombose Sans 79 0.45 5.67 5.52 / 11 Fx+ thrombose Avec 15 2.45 23.4 17.7 +5.66 Positifs thrombose 1 limite Tableau 13. Discrimination des plasmas de patients avec ou sans thrombose, par la méthode de l'invention, avec la méthode de dosage des D-dimères IL, en fonction des D-dimères générés par l'hyper fibrinolyse avec la déduction des PDFg. 5 Cet ajustement selon la méthode de l'invention est plus performant que le ratio [D- dimères /Fibrinogène], comme le montrent la figure 13 et le tableau 14 ci-dessous. Les faux négatifs avec le ratio [D-dimères/Fibrinogène] sont détectés par la méthode de l'invention, ce qui permet de ne pas passer à côté d'une thrombose. 11 y a moins de faux positifs par la méthode de l'invention qu'avec le ratio [D10 dimères/Fibrinogène], ce qui permet de diminuer le nombre de patients diagnostiqués à l'imagerie. Plasmas Diagnostic Nombre Ddi ajustés Résul Ratio [Ddi / Fil)] Résul de Ddi et/ou [Ddi / (C+I+F)] tat (Clauss) tat patients imagerie Faux + Faux - Moy Gamme Moy Gamme Avec Ddi négatifs 120 0.12 0.02-0.41 0 Fx + 0.12 0.01-1.01 2 Fx + suspicion d'EP et/ou TVP Ddi positifs 79 0.37 0.06-2.23 9 Fx+ 0.41 0.05-2.26 l7Fx+ Sans thrombose Ddi positifs 15 2.45 0.49-8.84 1 lim 2.01 0.37-6.52 3 Fx - Avec thrombose Tableau 14. Comparaison de l'ajustement des D-dimères par la méthode optique de l'invention avec le réactif de dosage des D-dimères IL et par le ratio [D-dimères/Fibrinogène], dans les 3048001 44 plasmas de patients avec ou sans thrombose (H : hyper-Coagulation, I : inflammation, F : hyper Fibrinolyse, Ddi : D-dimères, Fib : fibrinogène). 5 REVENDICATIONS1. Méthode de dosage des D-dimères spécifiques de la maladie thromboembolique veineuse dans un échantillon de plasma de patient, ladite méthode comprenant le dosage habituel des D-dimères de l'échantillon effectué selon une méthode immunoturbidimétrique ou immuno-enzymatique d'une part, ainsi que, d'autre part, la mesure dynamique de la formation de fibrine de ce même échantillon, ladite mesure dynamique comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon de plasma, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la génération de thrombine et la formation d'un caillot ; c) mesure de la variation de densité optique (DDO) du caillot en formation de l'étape b), à une seule longueur d'onde comprise entre 350 et 800 nm, de préférence à la longueur d'onde de 540 nm, pendant une durée de préférence inférieure à 10 minutes ; d) déteimination du profil de formation du caillot analysé en c), i.e. détermination du temps de formation de la fibrine mesuré par la tangente de la courbe, et de la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine ; e) calcul des D-dimères résultant de la dégradation de la fibrine intravasculaire à partir du temps de formation de la fibrine mesuré en d) et de la DDO de l'échantillon mesurée au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine déterminée en d), et exprimés en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU); f) détermination du taux de D-dimères obtenu en e), par rapport à un seuil, de préférence au seuil de 0.5 pg/mL, ce qui permet notamment de déterminer la probabilité d'une thrombose veineuse ; g) déduction des produits de dégradation du fibrinogène (PDFg), générés par l'hyperfibrinolyse présente dans les états d'activation de la coagulation ; et h) détermination des D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse, à partir du taux de D-dimères obtenu en f), des PDFg obtenus en g), et du temps de formation de la fibrine obtenu en d) par rapport à un seuil. 2. Méthode de dosage des D-dimères spécifiques de la maladie thromboembolique veineuse dans un échantillon de sang total de patient, ladite méthode comprenant le dosage habituel des D-dimères de l'échantillon effectué selon une méthode immuno- 3048001 46 turbidimétrique ou immuno-enzymatique d'une part, ainsi que la mesure dynamique de la formation de fibrine de ce même échantillon, d'autre part, ladite mesure dynamique comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique de sang total avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium ; c) mesure de la variation temporelle des propriétés physiques du caillot de fibrine en formation b), de préférence par thromboélastographie, rhéométrie ou par analyse d'images, pendant une durée de préférence inférieure à 10 minutes; d) détermination du profil de formation du caillot analysé en c), i.e. détermination du temps de formation de la fibrine mesuré par la tangente de la courbe, et de l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine ; e) calcul des D-dimères résultant de la dégradation de la fibrine intravasculaire à partir du temps de formation de la fibrine et de l'amplitude au temps d'atteinte du plateau de polymérisation de la fibrine déterminés en d), et exprimés en unités équivalentes au fibrinogène initial (FEU) ; f) détermination du taux de D-dimères obtenu en e) par rapport à un seuil, de préférence au seuil de 0.5 i_tg/mL, pour déterminer la probabilité d'une thrombose veineuse ; g) déduction des produits de dégradation du fibrinogène (PDFg), générés par l'hyperfibrinolyse présente dans les états d'activation de la coagulation ; et h) détermination des D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse, à partir du taux de D-dimères obtenu en f), des PDFg obtenus en g) et du temps de formation de la fibrine obtenu en d) par rapport à un seuil. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le facteur tissulaire de l'étape a) est présent en une concentration comprise entre 0.5 et 5 pM, de préférence 2 pM. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le mélange de l'étape a) comprend des ions calcium. 5. Méthode selon l'une des revendications 1, 3 ou 4, caractérisée en ce que l'échantillon de plasma est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes. 3048001 47 6. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que l'échantillon de sang total est un échantillon de sang total citraté. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'échantillon a un volume compris entre 1 'IL et 300 iaL, de préférence compris entre 50 µL et 200e. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'étape b) comprend l'incubation du mélange obtenu à l'étape a) pendant un temps compris entre 20 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 60 secondes et 300 secondes, à une température comprise entre 30°C et 40°C. 9. Méthode selon l'une des revendications 1, 3 à 5, 7 ou 8, caractérisée en ce que la mesure de la densité optique de l'étape c) se fait à la même longueur d'onde que celle utilisée pour le dosage habituel des D-dimères, effectué selon une méthode immunoturbidimétrique ou immuno-enzymatique. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'au moins les étapes c) et d) sont réalisées sur un automate de diagnostic ou sur un analyseur de biologie délocalisée, de préférence sur un analyseur de coagulation. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que des taux élevés de D-dimères spécifiques de la thrombose veineuse, mesurés en h) sont représentatifs de l'étendue de l'embolie pulmonaire ou de la localisation de la thrombose veineuse profonde.