FR 3043780 A1 20170519 FR 1560945 A 20151116 1 La présente invention se rapporte à une nouvelle méthode pour évaluer ex vivo le processus de coagulation sanguine, et notamment pour diagnostiquer à partir d'un échantillon de sang issu d'un individu des anomalies de la coagulation, telles que des états d'hémophilie. La coagulation sanguine est un processus complexe permettant de combler une brèche au niveau de la paroi endothéliale des vaisseaux sanguins chez les mammifères. La coagulation, ou hémostase, débute presque instantanément après une lésion de la paroi des vaisseaux sanguins. Elle se décompose en trois étapes principales : 1) Formation d'un « clou » par agrégation des plaquettes, pour bloquer le saignement : c'est l'hémostase primaire. 2) Induction d'une cascade d'événements complexe, lors de laquelle des protéines plasmatiques appelées « facteurs de coagulation » réagissent pour former des fibres de fibrine, qui renforcent le clou plaquettaire : c'est l'hémostase secondaire. 3) Destruction du caillot primaire ou fibrinolyse. De nombreux troubles de la coagulation, qui mènent à des risques de saignements plus importants, ont été répertoriés. Ces troubles de la coagulation sont liés chacun à un déficit ou une anomalie de l'un des facteurs impliqués dans la cascade, et se manifestent cliniquement par des pathologies hémorragiques qualifiées de mineures, modérées ou sévères, selon la sévérité du déficit ou de l'anomalie. Les maladies provoquant un problème de coagulation sont appelées les coagulopathies ; parmi celles-ci on distingue les maladies liées à un trouble de l'hémostase primaire, et celles dont l'origine est un défaut des facteurs de coagulation, de façon constitutionnelle ou acquise. Les maladies de l'hémostase primaire incluent les thrombopénies, les thrombopathies, et la maladie de Willebrand. Une thrombopénie ou thrombocytopénie est une diminution significative du nombre de plaquettes sanguines en dessous du seuil de 150 000 plaquettes par millimètre cube. Les thrombopathies sont liées à des dysfonctions plaquettaires diverses. Elles sont le plus souvent acquises, dues à des prises médicamenteuses (aspirine, anti- 3043780 2 inflammatoires non stéroïdiens...). Les thrombopathies constitutionnelles, héréditaires, sont beaucoup plus rares. La maladie de Willebrand est la plus fréquente des pathologies constitutionnelles de l'hémostase primaire. Elle est due à un déficit quantitatif ou qualitatif 5 du facteur de von Willebrand (vWF), qui permet l'adhésion des plaquettes au sous- endothélium. Les pathologies hémorragiques liées à des facteurs de coagulation sont soit acquises, telles que l'insuffisance hépatocellulaire, les coagulations intravasculaires disséminées, l'hypovitaminose K, et la présence d'anticorps anti-facteur comme dans 10 l'hémophilie acquise ; soit constitutionnelles telles que les hémophilies, le déficit en facteurs de la coagulation XI, VII, XIII, II, X et l'hypofibrinogènémie ou afibrinogènémie. Les hémophilies sont liées à une anomalie constitutionnelle de la coagulation sanguine, en rapport avec un déficit en facteur VIII (Hémophilie A) ou en facteur IX 15 (hémophilie B). L'anomalie génétique responsable est située sur le gène du F8 ou du F9. Dans un tiers des cas, l'hémophilie est engendrée par une mutation de novo ; dans les autres cas la mutation est transmise de façon héréditaire. D'autres anomalies constitutionnelles plus rares concernent les déficits en Facteur XI, Facteur VII, Facteur XIII, Facteur X, Facteur II ou encore la faible quantité ou 20 l'absence de fibrinogène. Les anomalies peuvent êtres quantitatives, liées à une absence ou une diminution de concentration de facteur de coagulation, ou qualitatives, dans les cas où le facteur de coagulation est présent mais peu ou non fonctionnel. Les manifestations cliniques des anomalies constitutionnelles en facteur de coagulation sont principalement les hémorragies, qui peuvent atteindre chaque organe. 25 Elles sont proportionnelles à l'importance du déficit ou défaut du facteur de la coagulation. La maladie peut être sévère avec des manifestations hémorragiques spontanées dès la première année de vie chez un hémophile sévère, ou présenter un tableau clinique plus discret en cas de déficit modéré ou mineur. Les déficits congénitaux en fibrinogène, très rares, sont des troubles de la 30 coagulation dus à une réduction de la concentration et/ou de la fonction du fibrinogène circulant et caractérisés par des hémorragies de sévérité variable. 3043780 3 D'autres déficits héréditaires en facteur(s) de coagulation ont été décrits mais restent exceptionnels. Dans ces cas également, les manifestations hémorragiques sont variables et dépendent de la sévérité de l'anomalie. 5 ART ANTERIEUR A ce jour, plusieurs tests de dépistage des anomalies de la coagulation du sang sont connus et utilisés en routine par les cliniciens. Ces tests sont utilisés à des fins diverses, notamment pour le diagnostic des troubles listés ci-dessus, pour suivre l'effet d'un traitement coagulant ou anticoagulant sur 10 un individu, ou encore pour cribler des traitements coagulants ou anticoagulants potentiels. D'une manière générale, pour les praticiens hospitaliers, il est nécessaire de détecter les anomalies de la coagulation d'un individu avant de pratiquer une intervention chirurgicale sur ledit individu, afin d'exclure le risque hémorragique. En dehors de la numération plaquettaire, les tests de mesure du temps de Quick 15 (TQ, également connu sous la dénomination taux de prothrombine ou TP) et temps de céphaline + activeur (TCA, aussi appelé TCK si l'activateur utilisé est le kaolin) sont les deux examens les plus fréquemment prescrits pour le dépistage d'une coagulopathie. Le TQ permet de mesurer le temps de coagulation dans des conditions in vitro, après activation par une thromboplastine calcique (contenant du facteur tissulaire en forte 20 concentration -de l'ordre de 4 à 6 nM- et des phospholipides pro-coagulants). Le résultat du TQ est compris entre 11 et 13 secondes pour un échantillon de sang normal. Un allongement de cette durée est un indicateur de la présence d'une anomalie de la coagulation, notamment d'un déficit constitutionnel ou acquis en Facteur VII. Le TCA permet de mesurer le temps de coagulation dans des conditions in 25 vitro, la céphaline étant utilisée à la place des phospholipides pro-coagulants : chez l'adulte, la valeur de référence est comprise entre 30 et 40 secondes. Un allongement significatif du TCA est un indicateur de la présence d'une anomalie de la coagulation liée à une hémophilie ou à la prise d'un traitement anticoagulant. Le test de temps de thrombine (TT) permet de mesurer le temps de coagulation 30 d'un plasma sanguin suite à l'ajout de thrombine et de calcium. La valeur de référence est d'environ vingt secondes. Cet examen teste la transformation du fibrinogène en fibrine; il est utilisé en cas de syndrome hémorragique ou de traitement par l'héparine ou par 3043780 4 thrombolytique. Il est aujourd'hui de moins en moins utilisé, sauf pour le diagnostic des défauts en fibrinogène. Le test de génération de thrombine, une méthode semi-automatisée basée sur l'utilisation d'un substrat chromogène ou fluorogène, permet de mesurer la génération de 5 thrombine in vitro après activation avec du facteur tissulaire. Ce test, intéressant car proche des conditions physiologiques, a une mise en oeuvre délicate due à des conditions pré-analytiques spécifiques, un manque de standardisation, et est ainsi limité à des laboratoires expérimentés. Les inconvénients majeurs de ces tests sont d'une part leur manque de 10 sensibilité pour les pathologies modérées, et d'autre part leur absence de spécificité ; il est souvent nécessaire d'avoir recours à des tests complémentaires (dosages de facteurs, recherche d'anticoagulant circulant...) pour comprendre l'origine du trouble de la coagulation observé. Ainsi, un « bilan de coagulation » comprend souvent la réalisation de plusieurs 15 tests complémentaires du TQ et du TCA tel que le dosage du fibrinogène, complété en cas d'anomalie par des tests plus spécifiques. Ceci représente un coût élevé à la fois en termes de réactifs et de matériel, ainsi qu'en temps de travail. Par ailleurs, un inconvénient majeur des tests actuellement mis en oeuvre est qu'ils doivent être réalisées sur du plasma pauvre en plaquette, obtenu à partir d'un 20 échantillon de sang total après 15 minutes de centrifugation dudit échantillon. Ceci limite la réalisation de ces tests en cas d'urgence en raison du délai supplémentaire dû à cette étape de centrifugation ; et induit un coût supplémentaire lié au pré-traitement de l'échantillon sanguin. Parmi les tests pouvant être réalisés sur sang total, sans centrifugation, on citera 25 le test du temps de coagulation activé (ACT) ; ce test est peu utilisé car n'est adapté que pour une seule indication, la surveillance de l'héparinothérapie pré-opératoire de chirurgie cardiaque et la neutralisation de celle-ci par la protamine. On citera également la thromboélastographie en sang total (TEG) qui permet une exploration complète du processus de coagulation, de la formation initiale du caillot 30 jusqu'à sa rétraction et sa dissolution, grâce à un appareillage spécifique. La technique est basée sur le suivi du mouvement d'une goupille animée d'un mouvement de rotation permanent, la coagulation du sang interférant avec la rotation de la goupille. Le 3043780 5 thromboélastogramme rotatif (ROTEM®, Allemagne) permet de réaliser en parallèle plusieurs tests différents, par l'utilisation de réactifs spécifiques (Lang et al., 2005). L'inconvénient de cette technique est la nécessité d'employer de nombreux réactifs, et de devoir procéder à plusieurs tests en parallèle, pour obtenir une vision globale 5 des différentes caractéristiques de la coagulation. Par ailleurs, la sensibilité à certaines anomalies de la coagulation, notamment l'hémophilie, est médiocre. Actuellement il n'existe pas de test permettant d'identifier un individu atteint d'une coagulopathie, et notamment un individu atteint d'un trouble hémophile, sur la base d'un test unique. 10 Pour l'hémophilie A ou B, le diagnostic repose en effet, en plus de la symptomatologie clinique, sur la mise en évidence : - d'un allongement isolé du TCA, sans anticoagulant circulant, associé avec des résultats normaux aux tests TQ et au temps d'occlusion plaquettaire ; - d'un déficit isolé de facteur FVIII ou FIX. 15 De même, il n'existe pas de test permettant d'identifier un individu présentant un déficit en un autre facteur de la coagulation sur la base d'un test unique. D'une manière plus générale, il n'existe pas de test global, rapide, pouvant être réalisé sur du sang total sans nécessiter une première étape de centrifugation, et basé sur l'utilisation d'un seul réactif et sur la mesure d'une seule valeur, capable de prédire le 20 risque hémorragique et de dépister les anomalies constitutionnelles ou acquises de la coagulation. La mise à disponibilité d'un tel test de dépistage simple et rapide devrait permettre un gain de temps et un gain médico-économique dans l'exploration des anomalies de l'hémostase. 25 FIGURES Les figures 1-4 et 6-7 présentent des courbes représentant la mesure de la variation d'impédance au cours du temps, sur des échantillons de sang total, cette mesure étant réalisée par un Multiplate-analyzer®. L'axe des abscisses représente le temps, mesuré 30 à partir de l'ajout du facteur tissulaire, sur une période de 20 minutes. L'axe des ordonnées représente la variation de l'impédance, en unités arbitraires (AU pour Arbitrary Units). 3043780 6 Figure 1. Echantillon issu d'un individu ne présentant pas d'anomalie de la coagulation. Concentration de facteur tissulaire : 2 pM Aire sous la courbe : 4703 UA*minute Figure 2. Echantillon issu d'un individu hémophile sévère 5 Concentration de facteur tissulaire : 2 pM Aire sous la courbe : 301 UA*minute Figure 3. Echantillon issu d'un individu hémophile mineur Concentration de facteur tissulaire : 2 pM Aire sous la courbe : 2180 UA*minute 10 Figure 4. Echantillon issu d'un individu présentant un déficit en fibrinogène Concentration de facteur tissulaire : 2 pM Aire sous la courbe : 1173 UA*minute Figure 5. Schéma récapitulatif de la répartition des valeurs d'aire sous la courbe, en fonction des populations étudiées. Les valeurs d'aire sous la courbe sont indiquées en 15 ordonnées en AUC (AU*minute). Les populations représentées sont les suivantes : individus témoins, hémophiles A (HA) et B (HB) sévères, hémophiles A (HA) et B (HB) modérés, hémophiles A (HA) et B (HB) mineurs, individu avec une hypofibrinigénémie, individu présentant un déficit mineur en facteur XI. 20 Figure 6. Test avec une concentration de facteur tissulaire : 100 pM A) Echantillon issu d'un individu ne présentant pas d'anomalie de la coagulation. B) Echantillon issu d'un individu hémophile Figure 7. Test avec une concentration de facteur tissulaire : 1 pM A) Echantillon issu d'un individu ne présentant pas d'anomalie de la coagulation. 25 B) Echantillon issu d'un individu hémophile Figure 8. Courbe de la corrélation entre le taux d'activité de facteur VIII plasmatique (en abscisse) et l'aire sous la courbe mesurée chez les individus (en ordonnées) Le taux d'activité du facteur VIII plasmatique est inférieur à 1% pour les hémophiles A sévères, compris entre 1 et 5% pour les hémophiles A modérés, et compris 30 entre 5 et 40% pour les hémophiles A mineurs. Les valeurs au-dessus de 40% ont été déterminées sur des échantillons d'individus non hémophiles. 3043780 7 RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode pour diagnostiquer des anomalies de la coagulation sanguine, basée sur la mesure de l'impédance dans un échantillon de sang total, après ajout de facteur tissulaire en une concentration adéquate. 5 La présente méthode se base sur la détermination d'une valeur d'aire sous la courbe, la courbe représentant la variation d'impédance mesurée entre deux électrodes immergées dans une solution de sang total, dont la coagulation est déclenchée par ajout de facteur tissulaire en faible concentration, au cours du temps. La détermination de cette valeur permet de déterminer de façon rapide, précise 10 et spécifique si un individu présente une anomalie de la coagulation, et si celle-ci est sévère ou modérée. La présente invention présente les avantages suivants : - cette méthode de diagnostic s'effectue sur du sang total, elle est donc rapide puisqu'elle ne nécessite pas de centrifugation de l'échantillon de sang ; 15 - cette méthode permet de diagnostiquer, par un seul test, différentes anomalies de la coagulation sanguine, et notamment des anomalies de l'hémostase secondaire ; - cette méthode ne nécessite pas un appareillage supplémentaire à celui déjà existant ; elle peut notamment être réalisée sur des appareillages déjà utilisés en routine, tel que le Multiplate-analyzere ; 20 - cette méthode est réalisée sur des échantillons de faible volume, notamment inférieurs à 1 ml, réduisant ainsi le volume de prélèvement nécessaire, ce qui est particulièrement avantageux lorsque les individus sont des enfants. La mise en oeuvre de la présente méthode permet notamment de diagnostiquer, en un test unique, des troubles de l'hémostase secondaire, et notamment les hémophilies. 25 La présente invention est également relative à une méthode pour effectuer un suivi thérapeutique personnalisé d'individus atteints d'une anomalie de la coagulation, et notamment d'une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une anomalie de la coagulation sanguine chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit 30 individu avant le début dudit traitement, et ii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit individu après le début dudit traitement, 3043780 8 ledit traitement étant jugé comme efficace lorsque la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape ii) est supérieure à la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape i). 5 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Il est entendu que la présente méthode peut être mise en oeuvre sur tout type d'équipement ou d'appareil comprenant a minima une cuve, deux paires d'électrodes pouvant être immergées dans la cuve, et un appareil générant un signal électrique et capable de mesurer la variation d'impédance entre les électrodes. 10 Avantageusement, cet appareil permet également de générer automatiquement une courbe des valeurs d'impédance en fonction du temps. Selon un aspect préféré de l'invention, la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention est réalisée sur un Multiple Analyzer®. Multiplate Analyzer® 15 Il existe des appareils permettant, par la présence de deux paires d'électrodes dans la cuvette contenant l'échantillon de sang, de mesurer l'impédance entre les électrodes, celle-ci étant fonction de la viscosité de l'échantillon et donc de l'avancement du processus de coagulation. Un de ses appareils est en particulier le Multiplate-analyzer®, aussi appelé Multiplate®, commercialisé par ROCHE. 20 Le Multiplate® se compose de cuvettes à usage unique dans lesquelles sont introduites un échantillon sanguin et un réactif. La cuvette est introduite dans la machine, puis un courant électrique traverse la solution en contact avec les électrodes. L'impédance ainsi mesurée est liée à l'agrégation plaquettaire de l'échantillon de sang, et varie en fonction de celle-ci. 25 Cet équipement est décrit de manière détaillée notamment dans les demandes de brevet US 8,877,510 et EP 2 182 345. Jusqu'à présent, les analyses suivantes étaient réalisées avec le Multiplate® : 30 3043780 9 Tableau 1 Nom de Description complète du test Finalité code du test diagnostique du test ADP+PGE1 =ADPtest FIS Agrégation induite par l'ADP et spécifique des récepteurs P2Y12 qui sont la cible des thiénopyridines (inhibition des autres cibles de l'ADP par PGE1) Dépistage de résistances aux AAP (antiagrégants plaquettaires) ASPItest Agrégation dépendante des cyclooxygénases, pouvant être inhibées par l'aspirine ou autres AINS TRAPtest Stimulation de l'agrégation via les récepteurs de la thrombine. Sensible aux inhibiteurs de GpIIbIIIa COLLtest Stimulation de l'agrégation par le collagène Dépistage d'anomalies de l'hémostase primaire ADPtest Stimulation de l'agrégation par l'ADP RISTOhigh Agrégation dépendante du facteur de Willebrand et du récepteur plaquettaire GpIbIX RISTOlow Agrégation dépendante du facteur de Willebrand et du récepteur plaquettaire GpIbIX : détection d'une hyperagrégabilité avec de faibles concentrations en ristocétine Comme indiqué au tableau 1, les indications reconnues de l'analyseur Multiplate® concernent des tests permettant de mesurer l'agrégation plaquettaire c'est-à- 5 dire d'évaluer l'hémostase primaire. L'équipement est en particulier utilisé pour les tests de résistance aux antiagrégants plaquettaires (AAP), pour le dépistage de la maladie de Willebrand, et pour le dépistage des thrombopathies constitutionnelles (Glanzmann, Jean Bernard Soulier, anomalies de sécrétion). La présente invention est relative à une nouvelle utilisation de cet équipement 10 pour effectuer un test global de dépistage des troubles de l'hémostase, notamment dans le but de diagnostiquer des troubles de l'hémostase secondaire. Ainsi, la présente invention est relative à une nouvelle utilisation d'un appareil adapté pour mesurer la variation d'impédance dans un échantillon de sang total, pour diagnostiquer des troubles de l'hémostase secondaire. 15 Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode pour diagnostiquer des anomalies de la coagulation sanguine, comprenant les étapes successives suivantes : 3043780 10 a) placer un échantillon de sang total dans une cuve contenant deux paires d'électrodes connectées à un appareil générant un courant électrique ; b) incuber cet échantillon pendant 60 à 180 secondes en présence de calcium ; 5 c) ajouter à cet échantillon du facteur tissulaire en une concentration adéquate pour déclencher la coagulation sanguine ; d) mesurer la variation d'impédance entre les électrodes en fonction du temps, pendant une période comprise entre 10 et 30 minutes à partir de l'étape (c) et générer une courbe des valeurs d'impédance en fonction 10 du temps; e) comparer la valeur de l'aire sous la courbe générée à l'étape (d) avec une valeur d'aire sous la courbe de référence. Conditions optimales de mise en oeuvre La présente invention est basée sur l'utilisation d'un appareil générant un 15 courant électrique, permettant de mesurer la variation d'impédance entre des électrodes immergées dans un échantillon de sang total ex vivo. L'impédance électrique mesure l'opposition d'un circuit électrique au passage d'un courant alternatif sinusoïdal. La variation d'impédance est aussi appelée principe de Coulter, du nom de son inventeur. Elle correspond à la résistance électrique de 20 l'échantillon sanguin, celle-ci variant au cours du processus de coagulation. Au sens de la présente invention, les termes 'cupule', 'cuvette' et 'cuve' sont utilisés indifféremment pour désigner le récipient dans lequel est introduit l'échantillon de sang total, et dans lequel la mesure de la variation d'impédance est effectuée. Il est entendu que, dans la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, 25 l'échantillon de sang testé est maintenu à une température d'environ 37°C afin que la coagulation puisse s'effectuer dans des conditions au plus près des conditions physiologiques. La présence d'un agitateur dans la cuve est optionnelle, mais est préférable pour la mise en oeuvre de l'invention. 30 Par ailleurs, et comme cela est bien connu de l'homme du métier, la présence de calcium dans l'échantillon sanguin est nécessaire pour la mise en oeuvre de la méthode. 3043780 11 Le calcium joue un rôle indispensable dans la cascade de la coagulation et notamment dans la formation du clou plaquettaire. En effet, dans les plaquettes, le calcium active la protéine kinase C, qui active à son tour la phospholipase A2, qui modifie l'intégrine glycoprotéique IIb/IIIa, augmentant son affinité pour le fibrinogène. Les 5 plaquettes ainsi activées changent de forme: de sphériques, elles deviennent stellaires, et le fibrinogène entrecroisant les glycoprotéines IIb/IIIa promeut l'aggrégation des plaquettes. Le calcium permet également la liaison des facteurs de coagulation aux surfaces phospholipidiques exprimées à la surface des plaquettes activées lors du processus de coagulation. 10 Selon un aspect préféré de l'invention, une solution saline comprenant du calcium est ajoutée à l'échantillon à l'étape (b), de préférence en effectuant une dilution volume / volume. Cette solution sera choisie parmi les solutions salines contenant du calcium bien connues de l'homme du métier, telles qu'une solution de NaCl/CaC12 ou une solution 15 de PB S supplémenté en calcium. A l'étape (b) du procédé, l'échantillon est incubé pendant 60 à 180 secondes, de préférence de 90 à 150 secondes, et plus préférentiellement pendant 120 secondes. Cette « pré-incubation » permet un mélange homogène de l'ensemble des acteurs de la coagulation, et une stabilisation de la température (37°C) de l'échantillon de sang déposé 20 dans la cupule. Facteur tissulaire Lors de la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, la réaction de coagulation est déclenchée par l'ajout de facteur tissulaire à faible concentration. Le facteur tissulaire ajouté au sang total, en présence de calcium, déclenche la génération des 25 premières traces de thrombine. La thrombine générée active les plaquettes contenues dans le sang ; celles-ci vont s'agréger au niveau des électrodes, ce qui entraine une modification du signal électrique entre les électrodes. La coagulation qui suit l'agrégation plaquettaire permet de générer un réseau de fibrine qui va également modifier le signal entre les deux électrodes. La mesure d'impédance en fonction du temps est représentée par une courbe 30 réactionnelle. La méthode selon l'invention comprend l'addition, à l'étape (c), du facteur tissulaire en une concentration adéquate pour déclencher la coagulation sanguine. 3043780 12 Au sens de la présente invention, l'expression « une concentration adéquate pour déclencher la coagulation sanguine » désigne une concentration finale de facteur tissulaire ajouté dans la cuve permettant de déclencher le processus de coagulation. L'exemple 3 présenté ci-après montre les résultats obtenus avec l'ajout de deux 5 concentrations différentes: 100 pM et 1 pM de facteur tissulaire (figures 6A, 6B, et 7A, 7B respectivement). Ces deux concentrations sont adéquates pour déclencher la coagulation sanguine dans l'échantillon de sang testé. Il a néanmoins été observé que lorsque le facteur tissulaire est ajouté en une concentration finale de 1 pM, les résultats obtenus avec un échantillon issu d'un individu 10 sain, et un échantillon d'un individu hémophile, sont plus nettement distinguables qu'avec des concentrations plus fortes (figures 7A et 7B). Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le facteur tissulaire est ajouté à une concentration finale dans l'échantillon comprise entre 0.5 et 5 pM. Le facteur tissulaire pourra en particulier être utilisé à une concentration de 0.5 15 pM, 0.8 pM, 1 pM, 1.5 pM, 2 pM, 2.5 pM, 3 pM, 3.5 pM, 4 pM, 4.5 pM, ou 5 pM. Selon un aspect préféré le facteur tissulaire est ajouté en une concentration finale dans l'échantillon de 1 pM ou 2 pM. Dans d'autres tests de coagulation, tel que le test TQ, le facteur tissulaire est utilisé à des concentrations d'environ 4 nM, soit une concentration largement supérieure à 20 celle utilisée dans la méthode selon la présente invention. Dans la mise en oeuvre de la présente invention, le facteur tissulaire est ajouté en une concentration relativement plus faible que celle utilisée dans d'autres tests, mais néanmoins adéquate pour déclencher la coagulation sanguine. Temps de mesure 25 La méthode est mise en oeuvre en mesurant la variation d'impédance de l'échantillon de sang en présence de facteur tissulaire, à partir de l'ajout de ce facteur tissulaire, pendant une période comprise entre 10 et 30 minutes, de préférence entre 15 et 25 minutes. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, la mesure de la variation 30 d'impédance est réalisée pendant une période d'environ 20 minutes. 3043780 13 En particulier, les inventeurs ont observé qu'au-delà de 30 minutes les résultats n'étaient plus exploitables, car l'échantillon de sang coagule même en absence de facteur tissulaire. Echantillon de sang 5 Les échantillons de sang humain sont obtenus selon les techniques habituelles, par des expérimentateurs qualifiés. De tels prélèvements sont en particulier réalisés au sein de laboratoires d'analyses médicales, dans des hôpitaux ou cliniques, ou en ambulatoire, notamment dans des unités mobiles de santé. On entend par « sang total » le sang qui n'a pas été centrifugé et qui contient 10 donc toutes les cellules, notamment les globules rouges, présents dans le sang. Le sang prélevé est introduit dans des tubes comprenant des composés anticoagulants réversibles, permettant de maintenir la dilution du sang hors de l'organisme, tels que du citrate ou du CTI (Corn Trypsin Inhibitor). Selon un aspect particulier de l'invention, l'échantillon de sang est dit 15 « citraté » c'est-à-dire qu'il comprend du citrate à titre d' anti-coagulant réversible. Selon une mise en oeuvre préférée de la méthode selon l'invention, l'échantillon de sang total est citraté. Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, le volume de l'échantillon de sang total est inférieur à 1 ml, de préférence inférieur à 500 pl. L'échantillon testé peut en 20 particulier être d'un volume d'environ 300 pl. Courbe de référence Il est entendu que la détermination d'une courbe de référence indiquant la réponse normale attendue d'un échantillon de sang à l'ajout de facteur tissulaire, reflétant un processus de coagulation normal, est essentielle à la mise en oeuvre de la méthode selon 25 l'invention. Cette courbe de référence peut être aisément déterminée par l'homme du métier à l'aide de ses connaissances générales. En effet, une telle courbe est réalisée à partir d'échantillons de sang issus d'individus ne présentant pas de troubles de la coagulation sanguine, ou au contraire présentant un trouble spécifique et connu de la 30 coagulation sanguine . Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la courbe de référence est une courbe moyenne obtenue en réalisant les étapes (a) à (d) de la méthode sur des 3043780 14 échantillons de sang issus d'individus ne présentant pas d'anomalie de la coagulation, et en calculant la moyenne arithmétique de chacune des valeurs obtenues à l'étape (d). Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, la courbe de référence est la courbe obtenue en réalisant les étapes (a) à (d) de la méthode sur un échantillon de sang 5 issu d'un seul individu ne présentant pas d'anomalie de la coagulation. En particulier, chaque mesure peut être réalisée en duplicat dans une même cuve réactionnelle, et la moyenne arithmétique de chaque mesure est le chiffre considéré pour dessiner la courbe de référence. Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, la courbe de référence est la 10 courbe obtenue en réalisant les étapes (a) à (d) de la méthode sur un échantillon de sang issu d'un seul individu affecté d'une anomalie de la coagulation déterminée, telle qu'une anomalie « mineure », « modérée » ou « sévère ». Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, la courbe de référence est la courbe obtenue en réalisant les étapes (a) à (d) de la méthode sur des échantillons de sang 15 issus d'individus affectés d'une anomalie de la coagulation déterminée, telle qu'une anomalie « mineure », « modérée » ou « sévère », et en calculant la moyenne arithmétique de chacune des valeurs obtenues à l'étape (d). A partir de ces courbes de référence, la valeur de l'aire sous la courbe de référence est aisément déterminable, en calculant la surface délimitée par la courbe et par 20 l'axe des abscisses. La valeur numérique de cette « aire sous la courbe » est comparée avec l'aire mesurée sous la courbe de référence, aussi appelée « valeur de référence ». Une valeur moyenne de référence peut être définie, cette valeur « seuil » séparant sans ambiguïté les valeurs obtenues à partir d'échantillons de sang d'individus témoins, sans anomalie de la coagulation, et ceux d'individus présentant une 25 coagulopathie. Cette valeur de référence « seuil », aussi dite de « cut-off », est déterminée à partir (i) de valeurs d'aires sous la courbe déterminées chez des individus sans coagulopathie et (ii) de valeurs d'aires sous la courbe déterminées chez des individus présentant une coagulopathie. 30 Cette valeur d'aire sous la courbe étant basée sur des unités arbitraires, elle pourra être définie de manière chiffrée, sans difficultés, par l'Homme du métier lors de la mise en oeuvre de l'invention. 3043780 15 L'étape (e) de la méthode consiste à comparer la valeur de l'aire sous la courbe générée à l'étape précédente avec la valeur de l'aire sous la courbe de référence. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la variation d'impédance est mesurée une fois par minute pour générer la courbe. 5 Avantageusement, la variation d'impédance est mesurée une fois toutes les secondes, une fois toutes les deux secondes, une fois toutes les 5 secondes, une fois toutes les dix secondes, une fois toutes les 15 secondes, une fois toutes les 20 secondes, une fois toutes les 30 secondes ou une fois par minute. La variation d'impédance étant mesurée à l'aide de valeurs arbitraires, chaque 10 expérimentateur déterminera une courbe de référence et une valeur de référence dépendantes du type d'appareillage utilisé pour réaliser la méthode selon l'invention. D'une manière générale, il peut être défini la relation suivante : si la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon est inférieure ou égale à la valeur de l'aire sous la courbe de référence, la variation calculée étant d'au moins deux écart-types, il peut être 15 conclu que le individu dont est issu l'échantillon présente probablement une coagulopathie. Chaque individu étant unique, il est entendu que les valeurs observées d'aires sous la courbe pourront varier légèrement de la valeur de référence, d'une variation inférieure ou égale à un écart-type, sans que cela soit lié à une anomalie de la coagulation. Au sens de l'invention, un écart-type est défini comme étant égal à la racine 20 carré de la variance, elle-même calculée selon la formule mathématique suivante : Variance = moyenne(vie) - moy2, avec vi représentant chaque valeur d'aire sous la courbe, pour chaque échantillon, et moy représentant la moyenne arithmétique des valeurs d'aire sous la courbe. Les valeurs d'aires sous la courbe obtenues à partir d'échantillons issus de 25 différentes populations de individus ont été reportées en figure 5 : il apparait clairement que les déficits sévères présentent des valeurs d'aire sous la courbe bien inférieures à celles observées pour les déficits mineurs, et largement inférieures aux valeurs observées pour la population témoin, ne souffrant pas d'anomalies de la coagulation. Troubles de l'hémostase et suivi de traitements coagulants 30 La méthode selon l'invention permet de diagnostiquer des anomalies de la coagulation sanguine. 3043780 16 Avantageusement, la méthode selon l'invention permet également de déterminer la sévérité de l'anomalie de la coagulation sanguine, et de distinguer des cas sévères et des cas mineurs. La classification des hémophilies selon leur gravité est indiquée dans le tableau 5 2 ci-dessous : Tableau 2 Classification Activité coagulante Manifestations hémorragiques HEMOPHILIE Sévère 5-40% Hémorragies lors de traumatismes importants ou d'interventions chirurgicales Ainsi, l'invention se rapporte également à une méthode pour déterminer la sévérité d'une anomalie de la coagulation chez un individu, comprenant les étapes 10 suivantes : a) placer un échantillon de sang total dans une cuve contenant deux paires d'électrodes connectées à un appareil générant un courant électrique ; b) incuber cet échantillon pendant 60 à 180 secondes en présence de calcium ; 15 c) ajouter à cet échantillon du facteur tissulaire en une concentration adéquate pour déclencher la coagulation sanguine ; d) mesurer la variation d'impédance entre les électrodes en fonction du temps, pendant une période comprise entre 10 et 30 minutes à partir de l'étape (c) et générer une courbe des valeurs d'impédance en fonction 20 du temps; 3043780 17 e) comparer la valeur de l'aire sous la courbe générée à l'étape (d) avec des valeurs de référence déterminées chez des individus présentant une coagulopathie mineure, modérée, ou sévère. Les valeurs de référence sont des valeurs d'aire sous la courbe déterminées 5 chez des individus atteints d'une anomalie de la coagulation sévère, mineure ou modérée. Il est ainsi possible de déterminer la sévérité de l'anomalie de la coagulation observée chez l'individu testé. De manière avantageuse, les anomalies de la coagulation diagnostiquées sont des troubles de l'hémostase secondaire, pour lesquels il n'existait pas, à ce jour, de test 10 unique. Le diagnostic ne pouvait être posé qu'après de multiples tests et dosages avant de conclure à la présence d'une telle anomalie. Par troubles de l'hémostase secondaire, on désigne des troubles liés à des déficits ou défauts de facteurs de coagulation ; ces troubles peuvent être constitutionnels ou acquis. 15 Ainsi, les troubles de l'hémostase secondaire pouvant être diagnostiqués par la méthode selon l'invention sont en particulier choisis parmi : - les coagulopathies constitutionnelles : Hémophilie A ou B, déficit en d'autres facteurs de la coagulation tel que déficit en facteur XI, VII, XIII, X, V, II et fibrinogène et 20 - les coagulopathies acquises, dues à la prise médicamenteuse d'inhibiteurs de la coagulation, notamment dans le cadre d'un traitement anticoagulant. La méthode selon l'invention permet par ailleurs d'assurer le suivi de traitements thérapeutiques, notamment de traitements coagulants ou anticoagulants, administrés à des individus présentant une anomalie de la coagulation. De tels traitements 25 sont désignés ci-après comme étant des « traitement d'une anomalie de la coagulation sanguine ». De tels traitements coagulants sont administrés, souvent de façon prolongée, chez les individus présentant une anomalie de la coagulation. En particulier, la présente invention se rapporte à une méthode pour déterminer 30 l'efficacité d'un traitement d'une anomalie de la coagulation sanguine chez un individu, comprenant les étapes suivantes : 3043780 18 i) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit individu avant le début dudit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode décrite précédemment, et ii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit 5 individu après le début dudit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode décrite précédemment, ledit traitement étant jugé comme efficace lorsque la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape ii) est supérieure à la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape i). 10 Selon un aspect particulier de l'invention, ladite méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'un état hémophile d'un individu, comprend les étapes suivantes : i) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit individu à un instant T1 après le début dudit traitement, en effectuant les étapes 15 (a) (b) (c) et (d) de la méthode décrite précédemment, et ii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit individu à un instant T2, postérieur au premier instant T1, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode décrite précédemment, ledit traitement étant jugé comme efficace lorsque la valeur de l'aire sous la courbe 20 déterminée à l'étape ii) est supérieure à la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape i). Enfin, la présente invention concerne également une méthode pour cribler des molécules thérapeutiques susceptibles d'agir sur le processus de coagulation, comprenant les étapes suivantes : 25 i) obtenir deux échantillons de sang d'un même individu traité avec une molécule thérapeutique candidate, l'un avant le début du traitement, et l'autre pendant ou après le traitement; ii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe de l'échantillon de sang obtenu avant le début dudit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la 30 méthode décrite précédemment, et 3043780 19 iii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe de l'échantillon de sang obtenu pendant ou après ledit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode décrite précédemment, iv) comparer les valeurs obtenues aux étapes (ii) et (iii) pour déterminer l'effet 5 du traitement avec ladite molécule thérapeutique, EXEMPLES Exemple 1. Protocole expérimental 300 microlitres d'une solution de NaC1/CaC12 (Roche Diagnostic) sont placés 10 dans la cupule, avant l'ajout de 300 microlitres de sang prélevé sur tube citraté 0.107 M ou 0.109 M. La cupule est munie d'un barreau aimanté pour l'agitation et de deux paires d'électrodes en argent connecté à l'automate Multiplate® (Roche diagnostic). Après 120 secondes d'incubation, la coagulation est déclenchée par ajout d'une solution de facteur tissulaire, diluée dans du tampon Hepes; la concentration finale dans 15 l'échantillon est de 2 pM (figures 1 à 4), de 100 pM (figure 6A, 6B) ou de 1 pM (figure 7A, 7B). La mesure de la variation d'impédance entre les électrodes (exprimée en unités arbitraires - UA) est réalisée sur une période de 20 minutes. Une courbe est ainsi générée, en fonction du temps, et la courbe ainsi tracée définit une aire sous la courbe, mesurée en 20 UA*minutes. Exemple 2. Résultats obtenus avec l'ajout de facteur tissulaire à une concentration de 2 pM Les figures 1 à 4 montrent, respectivement, que : 25 - la courbe obtenue avec un échantillon de sang issu d'un individu ne présentant pas de troubles de la coagulation ; l'aire sous la courbe est de 4703 UA*minutes (Fig 1.) - la courbe obtenue avec un échantillon de sang issu d'un individu diagnostiqué comme étant un hémophile sévère ; l'aire sous la courbe est de 301 UA*minutes. (Fig 2.) 30 - la courbe obtenue avec un échantillon de sang issu d'un individu diagnostiqué comme présentant une hémophilie mineure ; l'aire sous la courbe est de 2180 UA*minutes. (Fig 3.) 3043780 20 - la courbe obtenue avec un échantillon de sang issu d'un individu diagnostiqué comme présentant un déficit en fibrinogène ; l'aire sous la courbe est de 1173 UA*minutes. (Fig 4.) Il peut ainsi être déduit de ces courbes que lorsque l'aire sous la courbe est 5 inférieure à une valeur seuil dite « de référence », une anomalie de la coagulation est présente. La figure 5 représente la répartition des valeurs d'aires sous la courbe, en fonction des caractéristiques des individus testés. Dans le cas présent, une valeur seul de 4000 unités arbitraires*minutes (AUC) 10 a pu être déterminée, qui sépare : - les valeurs autour de 6000 AUC caractéristiques des individus témoins, ne présentant pas d'anomalies de la coagulation ; et - les valeurs inférieures ou égales à 4000 AUC, caractéristiques des individus présentant une anomalie de la coagulation, même mineure ; parmi ces individus, ceux 15 présentant une anomalie sévère présentent des valeurs sous la courbe inférieures à 2000 AUC. Exemple 3. Ajustement de la concentration nécessaire de facteur tissulaire pour déclencher la coagulation 20 Des expériences ont été réalisées, selon le même protocole que celui décrit en exemple 1, pour déterminer une gamme de concentration optimale de facteur tissulaire adéquate pour déclencher la coagulation sanguine in vitro, dans le cadre du test décrit dans la présente demande. Deux concentrations ont été testées : 100 pM et 1 pM, sur deux types 25 d'échantillons sanguins : l'un provenant d'un individu sain ne présentant pas d'anomalie de la coagulation (A), l'autre provenant d'un sujet hémophile modéré. Lorsque la coagulation est déclenchée avec une concentration de 100 pM de facteur tissulaire, les valeurs d'aires sous la courbe sont élevées, et distinguables entre les deux individus : 30 - 17 191 UA*minute pour l'individu sain ne présentant pas de trouble de la coagulation ; - 11 638 UA*minute pour l'individu hémophile. (figures 6A, 6B) 3043780 21 Lorsque la coagulation est déclenchée avec une concentration de 1 pM de facteur tissulaire, les valeurs d'aires sous la courbe sont moins élevées, et sont plus nettement distinguables entre les deux individus : - 4 838 UA*minute pour l'individu sain ne présentant pas de trouble de la 5 coagulation; - 524 UA*minute pour l'individu hémophile. (figures 7A, 7B) Avec cette concentration en facteur tissulaire, la différence de valeur entre les deux sujets est bien nette, l'individu hémophile présentant une valeur d'aire sous la courbe inférieure à 15% de la valeur de l'aire sous la courbe de l'individu sain, cette courbe étant 10 ici la courbe de référence. Exemple 4. Une corrélation directe existe entre le taux de facteur VIII et la valeur d'aire sous la courbe La figure 8 montre une courbe linéaire de la corrélation observée entre le taux 15 d'activité du facteur VIII plasmatique (en abscisse) et l'aire sous la courbe mesurée chez les individus (en ordonnées). Le taux d'activité du facteur VIII a été mesuré par une technique chronométrique sur un automate de coagulation, dont le principe repose sur la mesure d'un temps de coagulation (TCA) d'un mélange constitué de plasma du patient et de plasma 20 déficient en facteur VIII. Il est bien connu que le taux d'activité du facteur VIII plasmatique est inférieur à 1% pour les hémophiles A sévères, compris entre 1 et 5% pour les hémophiles A modérés, et compris entre 5 et 40% pour les hémophiles A mineurs. (White GC II et al., 2001). Les valeurs au-dessus de 40% ont été déterminées sur des échantillons d'individus 25 non hémophiles. Comme démontré précédemment, la valeur de l'aire sous la courbe est dépendante de la sévérité de l'anomalie de la coagulation. En rapportant le taux d'activité du facteur VIII avec la valeur d'aire sous la courbe, on a pu constater qu'il existe une relation directe entre le taux d'activité du facteur 30 de coagulation VIII et la valeur d'aire sous la courbe mesurée par la méthode selon l'invention. 3043780 22 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES US 8,877,510 EP 2 182 345 5 Lang T, Bauters A, Braun SL, et al. Multi-centre investigation on reference ranges for ROTEill thromboelastometry. Blood Coagul Fibrinolysis 2005 ; 16 : 301-10. White GC II, Rosendaal F, Aledort LM, Lusher JM, Rothschild C, Ingerslev J. Definitions in hemophilia. Recommendation of the scientific subcommittee on factor VIII and factor IX of the scientific and standardization committee of the International Society on Thrombosis 10 and Haemostasis. Thromb Haemost. 2001 Mar;85(3):560 REVENDICATIONS1. Méthode pour diagnostiquer des anomalies de la coagulation sanguine, comprenant les étapes successives suivantes : a) placer un échantillon de sang total dans une cuve contenant deux paires d'électrodes connectées à un appareil générant un courant électrique ; b) incuber cet échantillon pendant 60 à 180 secondes en présence de calcium ; c) ajouter à cet échantillon du facteur tissulaire en une concentration adéquate pour déclencher la coagulation sanguine ; d) mesurer la variation d'impédance entre les électrodes en fonction du temps, pendant une période comprise entre 10 et 30 minutes à partir de l'étape (c) et générer une courbe des valeurs d'impédance en fonction du temps; e) comparer la valeur de l'aire sous la courbe générée à l'étape (d) avec une valeur d'aire sous la courbe de référence. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure de la variation d'impédance est réalisée pendant une période d'environ 20 minutes. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l'échantillon de sang total est citraté. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le facteur tissulaire est ajouté à une concentration finale dans l'échantillon comprise entre 0.5 et 5 pM. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le volume de l'échantillon de sang total est inférieur à 1 ml, de préférence inférieur à 500 pl. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) une solution saline comprenant du calcium est ajoutée à l'échantillon, de préférence en effectuant une dilution volume / volume. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la courbe de référence est une courbe moyenne obtenue en réalisant les étapes (a) à (d) sur des échantillons de sang issus d'individus ne présentant pas d'anomalie de la coagulation. 3043780 24 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la variation d'impédance est mesurée une fois par minute pour générer la courbe. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les anomalies de la coagulation diagnostiquées sont des troubles de l'hémostase secondaire, en 5 particulier choisis parmi les coagulopathies constitutionnelles et les coagulopathies acquises. 10. Méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une anomalie de la coagulation sanguine chez un individu, comprenant les étapes suivantes : i) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit 10 individu avant le début dudit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode selon l'une des revendications 1 à 9, et ii) déterminer la valeur de l'aire sous la courbe d'un échantillon de sang dudit individu après le début dudit traitement, en effectuant les étapes (a) (b) (c) et (d) de la méthode selon l'une des revendications 1 à 9, 15 ledit traitement étant jugé comme efficace lorsque la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape ii) est supérieure à la valeur de l'aire sous la courbe déterminée à l'étape i). 20