FR 3045383 A1 20170623 FR 1562750 A 20151218 1 Procédé de lyophilisation d'un échantillon de microbiote fécal La présente invention se rapporte à un procédé de lyophilisation d'un échantillon de microbiote fécal. L'invention se rapporte également à l'utilisation du lyophilisat obtenu dans la transplantation de microbiote fécal, de préférence pour traiter les dysbioses intestinales, notamment les infections à Clostridium difficile. Le microbiote intestinal humain est l'ensemble des micro-organismes (bactéries, levures et champignons) qui se trouvent dans le système gastro-intestinal humain (estomac, intestin et côlon). La diversité microbienne est estimée à l'heure actuelle à environ 103 espèces bactériennes composant le microbiote intestinal dominant d'un individu adulte, avec une abondance de 1014 bactéries, représentant un métagénome bactérien dominant de 200 000 à 800 000 gènes chez chaque individu, soit 10 à 50 fois le nombre de gènes du génome humain. Stérile in utero, l'intestin se colonise dès les premiers jours de vie jusqu'à évoluer vers un microbiote individuel unique. Chaque personne possède des bactéries relativement proches en termes d'espèces, mais la composition exacte de son microbiote (espèces, proportions) est pour une large part (plus de % des espèces) spécifique de l'hôte. Ainsi, le microbiote intestinal humain est un écosystème très diversifié, complexe et spécifique de chaque individu. Il est essentiel pour la santé d'un individu de maintenir un microbiote stable qui est à la fois capable de revenir à son état initial après un changement et résistant à l'invasion. Le maintien d'une grande diversité du microbiote favorise sa stabilité. Cependant, certaines pathologies ou traitements déséquilibrent le microbiote : les antibiotiques par exemple, ainsi que les maladies à composante inflammatoire, telle que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), peuvent limiter la diversité du microbiote dans l'intestin. Les traitements antibiotiques (ou antibiothérapie), notamment, résultent en une altération du microbiote et une perte de ses fonctions de barrière, ce qui peut favoriser la prolifération d'organismes pathogènes comme Clostridium difficile. 3045383 2 Les infections à Clostridium difficile sont responsables de diarrhées nosocomiales ; cette bactérie peut présenter des résistances à l'antibiothérapie classique (à spectre large, tels que vancomycine ou métronidazole). Afin de rétablir le microbiote intestinal, et lutter contre les infections de type Clostridium difficile, et ainsi rétablir l'homéostasie (i.e. la 5 symbiose), la transplantation de microbiote fécal est envisagée et testée. Elle consiste en l'introduction des selles d'un sujet donneur sain dans le tube digestif d'un patient receveur, afin de rééquilibrer le microbiote intestinal altérée de l'hôte. Cette transplantation de microbiote fécal est en général allogénique (c'est-à-dire d'un individu donneur sain vers un patient). Les résultats obtenus sur les infections de type 10 Clostridium difficile sont encourageants, et certains patients ont été traités avec succès (Tauxe et al, Lab Medicine, Winter 2015, volume 46, Number 1 ou van Nood E, Speelman P, Nieuwdorp M, Keller J. 2014 Fecal microbiota transplantation: facts and controversies. Curr Opin Gastroenterol 30(1):34-9). 15 Cependant, la méthode de transplantation actuelle est empirique et ne prend aucune précaution particulière pour préserver au mieux la viabilité des bactéries anaérobies, composants majoritaires du microbiote intestinal. En outre, l'efficacité de la transplantation de microbiote fécal est variable, et peut nécessiter plus d'une cure. 20 Il existe donc un besoin de disposer d'échantillons de microbiote fécal sécurisés, efficaces et faciles à obtenir, notamment à l'échelle industrielle. En outre, il existe un besoin pour des échantillons de microbiote fécal dans lesquels la viabilité des bactéries est conservée, et ayant une longue durée de conservation. 25 La présente invention permet de répondre à ces besoins. La présente invention se rapporte donc à un procédé de préparation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur, comprenant les étapes suivantes : A) le mélange d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un diluant 30 choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et 3045383 3 B) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. De préférence, l'échantillon de microbiote fécal utilisé à l'étape A) est préalablement 5 purifié. De préférence, la présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur, comprenant les étapes suivantes : Al) optionnellement, la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- 10 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin comprenant éventuellement de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) 15 isophthalamide, en anaérobiose, A3) optionnellement, le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération en anaérobiose, ou l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A2) ou A3), 20 A5) la récupération de l'anneau bactérien ou du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien ou du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et 25 B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. Dans un tel procédé, l'étape Al), ainsi que de facto l'étape A3), sont facultatives. Un tel procédé est en effet facile à mettre en oeuvre, et son efficacité peut être estimée 30 en comparant la population microbienne obtenue après le procédé, comparée au prélèvement initial. 3045383 4 La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un lyophilisat de microbiote fécal susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, comme outil de recherche en génomique fonctionnelle, en métaprotéomique ou en immunologie. Par exemple, le lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention 5 peut être utilisé pour générer des culots bactériens qui, immobilisés dans des matrices d'agarose (ou autres gels), permettent l'extraction de fragments d'ADN de très grande taille, utilisés pour du clonage et des études fonctionnelles. Il peut être utilisé également pour préparer des extraits de protéines cytosoliques ou de protéines d'enveloppes de communautés bactériennes en vue d'analyses métaprotéomiques. Enfin, il peut être 10 utilisé pour étudier la reconnaissance des bactéries intactes par le système immunitaire de l'hôte. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon 15 l'invention, dans la transplantation de microbiote fécal autologue ou allogénique. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, pour traiter les dysbioses intestinales, dues à des infections et notamment 20 les infections à Clostridium difficile, les dysbioses induites par des traitements médicamenteux, par des traitements physiques (radiations notamment), par des interventions chirurgicales (intestinales notamment), par des coloscopies ou par des apports nutritionnels. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le 25 procédé selon l'invention, pour traiter une pathologie choisie parmi les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), les troubles fonctionnels intestinaux, l'obésité, les maladies métaboliques (diabète de type 2, syndrome métabolique notamment) et les maladies auto-immunes (diabète de type 1, notamment), les allergies, les maladies hépatiques (stéatose, cirrhose notamment), certaines maladies 30 neurologiques (autisme notamment) et certains cancers (cancer colorectal notamment). Par dysbiose intestinale, on entend tout déséquilibre soutenu du microbiote intestinal. Par déséquilibre soutenu du microbiote intestinal, on entend toute perte de micro- 3045383 5 organismes bénéfiques, et/ou toute perte de diversité de micro-organismes, et/ou toute expansion ou développement de micro-organismes agressifs parmi les commensaux (pathobiontes), et/ou toute prolifération de micro-organismes pathogènes (C. difficile notamment). Toute altération soutenue du microbiote intestinal humain peut en effet 5 engendrer ou accompagner de façon chronique un état pathologique. Notamment, la réduction de la diversité au sein du microbiote est caractéristique des maladies associées à une dysbiose (obésité, maladie de Crohn, diabète ou allergie notamment) (Sansonetti, Collège de France, 22 janvier 2014). De préférence, la pathologie à traiter est une dysbiose intestinale. 10 Par maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), on entend notamment la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique. Par troubles fonctionnels intestinaux, on entend notamment le syndrome du côlon irritable, la colite spasmodique. 15 Le procédé de préparation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur selon l'invention comprend ainsi les étapes suivantes : A) le mélange d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et 20 B) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. L'étape A) du procédé selon l'invention comprend le mélange d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un diluant choisi parmi les cryoprotectants tels 25 que les polyols, les di- à pentasaccharides; les agents de charge tels que les maltodextrines ; et leurs mélanges. De préférence, l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur est un échantillon de selles dudit donneur. En effet, l'échantillon de selles contient du microbiote fécal du 30 sujet donneur. De préférence, selon l'invention le sujet donneur est un sujet humain sain. Par sujet « sain », on entend un sujet non atteint d'un déséquilibre du microbiote 3045383 6 intestinal ou d'une pathologie diagnostiquée/reconnue par le corps médical. De préférence, l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur est préalablement purifié. Alternativement, de préférence, selon l'invention le sujet donneur est un sujet humain malade. 5 De préférence, l'échantillon de selles présente une masse d'au moins 20g. L'échantillon de microbiote fécal est toujours obtenu et mélangé en anaérobiose (i.e. sous une atmosphère dépourvue d'oxygène). En anaérobiose, la viabilité des bactéries constitutives du microbiote fécal et présentes dans l'échantillon est ainsi préservée. De préférence, préalablement à son utilisation, l'échantillon de microbiote fécal est 10 filtré en anaérobiose. L'étape préalable de filtration peut comprendre, en anaérobiose, la filtration en utilisant un sac Seward muni de filtre. De préférence, l'échantillon de microbiote fécal est prélevé en anaérobiose, en utilisant un dispositif de collecte étanche à l'air. De préférence, ce dispositif se présente sous une forme du type comprenant : 15 - un conteneur comprenant un corps qui comporte un espace intérieur adapté pour recevoir l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur, et un col qui délimite une ouverture d'accès à l'espace intérieur du corps, et - un couvercle adapté pour être monté de manière amovible et étanche sur le col du conteneur de manière à obturer l'ouverture d'accès du col et à fermer l'espace 20 intérieur du corps, dans lequel le corps du conteneur est constitué d'une poche souple, et dans lequel au moins l'un parmi le conteneur et le couvercle est pourvu d'un organe d'évacuation adapté pour évacuer au moins une partie des gaz contenus dans l'espace intérieur du corps du conteneur. 25 Alternativement, le dispositif de collecte étanche à l'air se présente sous une forme du type comprenant : - un conteneur comprenant un corps qui comporte un espace intérieur adapté pour recevoir l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur, et un col qui délimite une ouverture d'accès à l'espace intérieur du corps, et 30 - un couvercle adapté pour être monté de manière amovible et étanche sur le col du conteneur de manière à obturer l'ouverture d'accès du col et à fermer l'espace intérieur du corps, 3045383 7 dans lequel l'espace intérieur du corps du conteneur comprend éventuellement un dispositif chimique neutralisant l'oxygène. Le diluant peut être choisi parmi les composés suivants : 5 - les cryoprotectants tels que les di- à pentasaccharides, i.e. les disaccharides, les trisaccharides, les quadrisaccharides et les pentasaccharides; ou les polyols, tels que le glycérol, le mannitol, le sorbitol, le propylène glycol ou l'éthylène glycol, - les agents de charge, tels que les hydrolysats partiels d'amidon, notamment de blé ou de maïs, ou de fécule, comprenant une forte quantité de maltodextrines, 10 - et leurs mélanges. De préférence, le diluant est une solution aqueuse saline comprenant au moins un cryoprotectant et/ou un agent de charge. Ainsi, typiquement, la solution aqueuse saline comprend de l'eau et des sels physiologiquement acceptables. Typiquement, les sels 15 sont des sels de calcium, sodium, potassium ou magnésium, avec des ions chlorure, gluconate, acétate ou hydrogénocarbonate. La solution aqueuse saline peut également optionnellement comprendre au moins un antioxydant. L'antioxydant est notamment choisi parmi l'acide ascorbique et ses sels (ascorbate), les tocophérols (notamment l'a-tocophérol), la cystéine et ses formes 20 salifiées (chlorhydrate notamment) et leurs mélanges. De préférence, la solution aqueuse saline comprend : - au moins un sel choisi parmi le chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le chlorure de potassium, le sodium gluconate et le sodium acétate, et - optionnellement au moins un antioxydant, de préférence choisi parmi le L-ascorbate 25 de sodium, les tocophérols, le chlorhydrate de L-cystéine monohydraté et leurs mélanges. Typiquement, le sel est présent dans la solution aqueuse saline en concentration comprise entre 5 et 20g/L, de préférence entre 7 et 10 g/L. Typiquement, l'antioxydant est présent dans la solution aqueuse saline en quantité 30 comprise entre 0.3 et 1% en poids par rapport au volume total de solution, de préférence en quantité comprise entre 0.4 et 0.6% en poids par rapport au volume total de solution. 3045383 8 De préférence, lorsque l'antioxydant est un mélange de L-ascorbate de sodium et de chlorhydrate de L-cystéine monohydraté, le L-ascorbate de sodium est présent en quantité comprise entre 0.4 et 0.6% en poids par rapport au volume total de solution, et le chlorhydrate de L-cystéine monohydraté est présent en quantité comprise entre 0.01 5 et 0.1% en poids par rapport au volume total de solution. De préférence, la solution aqueuse saline comprend au moins un cryoprotectant. Un cryoprotectant est une substance utilisée pour protéger l'échantillon des dommages causés par la congélation, notamment dus à la formation de cristaux de glace. 10 De préférence, le cryoprotectant est choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides (i.e. les disaccharides, les trisaccharides, les quadrisaccharides et les pentasaccharides), et leurs mélanges. De préférence, le cryoprotectant est choisi parmi les polyols, les tri-et disaccharides et leurs mélanges. Plus préférentiellement, le cryoprotectant présent dans la solution aqueuse saline est un disaccharide ou un trisaccharide. 15 Parmi les polyols utilisables, on trouve notamment le glycérol, le mannitol, le sorbitol, mais également le propylène glycol ou l'éthylène glycol. Parmi les di- à pentasaccharides utilisables, on peut citer les dimères, trimères, quadrimères et pentamères d'unités identiques ou différentes, lesdites unités étant choisies parmi le glucose, le fructose, le galactose, le fucose et l'acide N- 20 acétylneuraminique. Parmi les disaccharides utilisables, on trouve notamment le tréhalose ou l'un de ses analogues, ou le saccharose. Ces cryoprotectants peuvent être utilisés seuls ou en mélange. Typiquement, la quantité totale de cryoprotectant présent dans la solution aqueuse 25 saline est comprise entre 3 et 30% en poids par rapport au volume total de solution, de préférence entre 4% et 20% en poids par rapport au volume total de solution. De préférence, le cryoprotectant est choisi parmi le glycérol, le mannitol, le sorbitol, le propylène glycol, l'éthylène glycol, le tréhalose et ses analogues, le saccharose, le galactose-lactose et leurs mélanges. Plus préférentiellement, le cryoprotectant est le 30 galactose-lactose ou le tréhalose. 3045383 9 De préférence, la solution aqueuse saline selon l'invention comprend au moins un agent de charge. L'agent de charge est de préférence choisi parmi les hydrolysats partiels d'amidon ou de fécule. Les hydrolysats partiels d'amidon, notamment de blé ou de maïs, ainsi que les 5 hydrolysats partiels de fécule, par exemple de pomme de terre, comprennent une forte quantité de maltodextrines. Les maltodextrines sont le résultat de l'hydrolyse partielle d'amidon ou de fécule, et sont constituées de différents sucres (glucose, maltose, maltotriose, oligo- et polysaccharides), dont les proportions varient en fonction du degré d'hydrolyse. 10 De préférence, l'agent de charge présent dans la solution aqueuse saline est un mélange de maltodextrines, dans lequel la quantité de maltodextrines est comprise entre 4 et 20% en poids par rapport au volume total de solution. De préférence, l'étape A) est réalisée en mélangeant l'échantillon de microbiote fécal 15 avec le diluant, dans un rapport poids de microbiote, de préférence purifié (g) / volume de diluant (mL) compris entre 1 : 1 et 1 : 10. Puis le mélange obtenu en A) est congelé à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis soumis à lyophilisation : c'est l'étape 20 B). Elle est réalisée de préférence en conditions suivantes : B1) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, de préférence à une température d'environ 80°C, B2) le chargement du mélange congelé obtenu en B1) dans un lyophilisateur pré- 25 refroidi à une température comprise entre -50°C et -30°C, à pression atmosphérique, puis B3) au moins une étape de dessiccation primaire du mélange chargé en B2) comprenant l'abaissement de la pression jusqu'à une valeur comprise entre 80 et 200 !Aar (préférentiellement entre 100 et 150 !Aar) puis l'augmentation de la température des 30 étagères jusqu'à une valeur comprise entre -20°C et +25°C (préférentiellement -10°C) en appliquant une vitesse de chauffage comprise entre 0,2 et 0,5 °C/min. Les valeurs de pression et de température des étagères sont choisies de façon à ce que la température 3045383 10 du produit soit maintenue en dessous de la température d'effondrement tout au long de la sublimation. Les paramètres sont maintenus constants jusqu'à l'élimination complète de la glace du mélange, puis B4) la dessiccation secondaire du mélange obtenu en B3) comprenant l'abaissement de 5 la pression à une valeur inférieure ou égale à 801..tbar, de préférence la valeur minimale possible pour l'équipement, et l'élévation de la température des étagères à une valeur comprise entre +25°C et +35°C, préférentiellement 25°C à une vitesse de chauffage comprise entre 0,1 et 0,3 °C/min, et l'y maintenir entre 8 et 15 heures. 10 De préférence, la congélation de l'étape B1) est effectuée à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C. De préférence, la température de congélation est comprise entre -70°C et -100°C ; plus préférentiellement elle est d'environ -80°C ou d'environ -100°C. Afin d'être congelé, le mélange obtenu en A) peut être préalablement aliquoté, pour assurer des spécimens de volume constant. 15 L'échantillon congelé est ainsi chargé dans un lyophilisateur pré-refroidi à une température comprise entre -50°C et -30°C, à pression atmosphérique ; c'est l'étape B2). Puis, la dessiccation primaire du mélange chargé en B2) intervient ; c'est l'étape B3). 20 Elle comprend au moins une étape de dessiccation primaire du mélange chargé en B2) comprenant l'abaissement de la pression jusqu'à une valeur comprise entre 80 et 200 1..tbar (préférentiellement entre 100 et 150 1..tbar) puis l'augmentation de la température des étagères jusqu'à une valeur comprise entre -20°C et +25°C (préférentiellement 10°C) en appliquant une vitesse de chauffage comprise entre 0,2 et 0,5 °C/min. Les 25 valeurs de pression et de température étagères sont choisies de façon à ce que la température du produit soit maintenue en dessous de la température d'effondrement tout au long de la sublimation. Les paramètres sont maintenus constants jusqu'à l'élimination complète de la glace du mélange. Enfin, B4) la dessiccation secondaire du mélange obtenu en B3) est effectuée. Elle 30 comprend l'abaissement de la pression à une valeur inférieure ou égale à 80 1..tbar, de préférence la valeur minimale possible pour l'équipement, et l'élévation de la température des étagères à une valeur comprise entre +25°C et +35°C, 3045383 11 préférentiellement 25°C à une vitesse de chauffage comprise entre 0,1 et 0,3 °C/min, et l'y maintenir entre 8 et 15 heures. On obtient ainsi in fine un lyophilisat selon l'invention. 5 De préférence, le procédé selon l'invention comprend, en étape A), des étapes préalables de traitement de l'échantillon de microbiote fécal, avant de le mélanger au diluant. Ainsi, de préférence, l'étape A) comprend les sous-étapes suivantes : 10 Al) optionnellement, la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin comprenant éventuellement de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 315 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, en anaérobiose, A3) optionnellement, le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération en anaérobiose, ou 20 l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A2) ou A3), A5) la récupération de l'anneau bactérien ou du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, et A6) le mélange de l'anneau bactérien ou du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs 25 mélanges. Dans un tel procédé, l'étape Al), ainsi que de facto l'étape A3), sont facultatives. De préférence, le tampon salin utilisé dans les différentes sous-étapes décrites ci-dessus est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, de préférence à 30 une concentration comprise entre 7 et 15g/l. De préférence, l'HEPES est présent en concentration comprise entre 8 et 50 mM, de préférence entre 9 et 42 mM. 3045383 12 Première alternative De préférence, selon une première alternative, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : Al) la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 35 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin additionné d'une solution aqueuse comprenant de l'iodixanol ou du 5(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) 10 isophthalamide, ledit tampon salin étant de préférence une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, en anaérobiose, A3) le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A3), pendant une durée comprise entre 40 et 50 minutes, à une température comprise entre 2°C et 6°C, à une accélération 15 comprise entre 13000 et 16000 x g, A5) la récupération de l'anneau bactérien formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et 20 B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. L'étape Al) comprend ainsi la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) 25 isophthalamide formé par congélation-décongélation. Par gradient continu d'iodixanol, on entend un gradient continu d'iodixanol de densité allant de 1.03 à 1.24, de préférence allant de 1.06 à 1.24. Par gradient continu de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, on entend un gradient continu de 5- (N-2, 330 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide de densité allant de 1,03 à 1,22. De préférence, cette étape Al) est réalisée selon les étapes suivantes : 3045383 13 A1.a) congélation d'une solution d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide à une température comprise entre -70°C et -100°C pendant au moins 12 heures. De préférence, ladite solution est dégazée. Par solution d'iodixanol ou de 5- (N- 5 2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide dégazée, on entend une solution d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide dans laquelle la concentration en air dissous est réduite, par exemple sous vide. Cela permet de créer une micro-anaérobiose favorable à la survie des 10 bactéries au cours du procédé de purification ; puis A1.b) décongélation de la solution obtenue en A1.a) à température ambiante pendant 2 à 4 heures, afin d'obtenir un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide. 15 De préférence, la solution d'iodixanol utilisée à l'étape Al) est une solution présentant une concentration comprise entre 15 et 25%, préférentiellement aux alentours de 20%, en poids d'iodixanol par volume de solution (p/v). Plus préférentiellement, la solution d'iodixanol utilisée est obtenue en diluant 3 fois une solution aqueuse commerciale d'iodixanol à 60%, commercialisée sous le nom OptiPrep (solution aqueuse stérile à 20 60% p/v d'iodixanol), dans un tampon salin, préférentiellement un tampon comprenant de l'HEPES 15mM et du NaC1 9 g/L ayant un pH de 7.0. De préférence, la solution de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide est une solution comprenant 20% en poids de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 25 dihydroxypropyl) isophthalamide par volume de solution (p/v). Plus préférentiellement, le 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide utilisé est commercialisé par Progen Biotechnik sous le nom Nycodenz. De préférence, dans l'étape A1.a), la congélation de la solution d'iodixanol ou de 5- (N- 30 2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide peut être effectuée pendant plusieurs jours, voire 1 mois. 3045383 14 Une fois le gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide obtenu à l'étape Al), les étapes ultérieures A2), A4) et A5) sont réalisées en anaérobiose. 5 L'étape A2) comprend le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin additionné d'une solution aqueuse comprenant de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, en anaérobiose. De préférence, ledit tampon salin est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium. De préférence, 10 l'HEPES est présent en concentration comprise entre 30 et 50 mM dans le tampon salin. De préférence, le chlorure de sodium est présent à une concentration comprise entre 7 et 15g/1 dans le tampon salin. De préférence, la solution aqueuse d'iodixanol est à une concentration comprise entre 50% et 70%, de préférence à environ 60% (p/v). De préférence, le ratio tampon salin : solution aqueuse d'iodixanol est d'environ 1 : 3. 15 De préférence, la solution aqueuse de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri- iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide est à une concentration de 60% (p/v). De préférence, le ratio tampon salin : solution aqueuse de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide est d'environ 1 : 3. 20 Ainsi, selon l'étape A2), le tampon salin est préalablement mélangé avec une solution aqueuse d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'- bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide ; on obtient ainsi un tampon salin comprenant de l'iodixanol ou de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodoN, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide. Puis le mélange résultant est mélangé 25 avec l'échantillon de microbiote fécal. De préférence, le mélange de l'échantillon de microbiote fécal avec un tampon salin comprenant de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodoN, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide s'effectue dans un ratio de 3 à 4 grammes d'échantillon pour 22 à 30m1 de tampon salin comprenant de l'iodixanol ou du 30 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide. 3045383 15 De préférence, lorsque l'échantillon de microbiote fécal est filtré entre les étapes A2) et A3), il subit une étape de filtration du mélange obtenu en A2) en anaérobiose, notamment en utilisant un sac Seward muni de filtre. 5 Ensuite, le mélange obtenu en A2), éventuellement filtré, est déposé sous le gradient obtenu en Al) : c'est l'étape A3). L'étape A3) peut être effectuée en aérobiose ou en anaérobiose. De préférence, le mélange obtenu en A2) est présent dans une seringue munie d'une aiguille, et le gradient d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6- 10 tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide est présent dans un récipient de type tube. Dans ce cas, le mélange obtenu en A2) est déposé en plongeant l'aiguille de la seringue au fond du tube contenant le gradient d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, et en vidant le contenu de la seringue. 15 Puis, la préparation obtenue en A3) est centrifugée sous vide dans une ultracentrifugeuse à faible accélération: c'est l'étape A4). Cette ultracentrifugation est effectuée pendant une durée comprise entre 40 et 50 minutes, à une température comprise entre 2°C et 6°C, à une vitesse comprise entre 13000 et 16000 x g. De 20 préférence, l'ultracentrifugation est effectuée pendant une durée comprise entre 40 et 50 minutes, à une température d'environ 4°C, à une vitesse d'environ 14500-14600 x g. A l'issue de cette étape, un anneau bactérien s'est formé au sein du gradient. Cet anneau est récupéré en anaérobiose dans l'étape A5). 11 contient le microbiote d'intérêt. 25 Seconde alternative De préférence, selon une seconde alternative, le procédé de préparation comprend les étapes suivantes : A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec 30 un tampon salin, en anaérobiose, A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération du mélange obtenu en A2), en anaérobiose, 3045383 16 A5) la récupération du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, A6) le mélange du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de 5 préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. Cette seconde alternative comprend une étape de centrifugation séquentielle à faible accélération. Par faible accélération, on entend une accélération comprise entre 200 et 500 x g. Ainsi, les différentes particules présentes dans l'échantillon de microbiote fécal (débris puis cellules bactériennes) vont sédimenter. 10 L'étape A2) comprend le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin, en anaérobiose. De préférence, ledit tampon salin est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium. De préférence, l'HEPES est présent en concentration comprise entre 5 et 15 mM. De préférence, le 15 chlorure de sodium est présent à une concentration comprise entre 7 et 15g/l. De préférence, le mélange de l'échantillon de microbiote fécal avec un tampon salin s'effectue dans un ratio pondéral échantillon : tampon de 1 :20 à 1 : 25. De préférence, lorsque l'échantillon de microbiote fécal est filtré entre les étapes A2) et 20 A4), il subit une étape de filtration du mélange obtenu en A2) en anaérobiose, notamment en utilisant un sac Seward muni de filtre. Ensuite, le mélange obtenu en A2), éventuellement filtré, est soumis à une centrifugation séquentielle à faible accélération, en anaérobiose : c'est l'étape A4). 25 La centrifugation séquentielle à faible accélération de l'étape A4) est de préférence réalisée à une accélération comprise entre 200 et 500 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C. Plus préférentiellement, la centrifugation séquentielle à faible accélération est réalisée à une accélération d'environ 300 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une 30 température comprise entre 20 et 25°C. 3045383 17 A l'issue de cette étape, le surnageant est récupéré en anaérobiose (étape A5)). Il contient le microbiote d'intérêt. De préférence, la centrifugation séquentielle à faible accélération de l'étape d) et l'étape de récupération du surnageant subséquente e) sont réalisées plusieurs fois, de préférence 5 au moins 2 fois, chaque étape d) étant réalisée à une accélération comprise entre 200 et 500 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes et à une température comprise entre 20 et 30°C. Ainsi, de préférence, dans l'étape A5) : A5.1) le surnageant formé à l'issue de l'étape A4) est récupéré, 10 A5.2) le culot obtenu en A4) est mélangé avec un tampon salin (le même que celui de l'étape A2)), puis soumis à centrifugation séquentielle à faible accélération comme décrit à l'étape A4), et le surnageant ainsi obtenu est mélangé avec le surnageant de la fraction A5.1). Cette opération de lavage du culot peut être répétée à volonté jusqu'à épuisement du culot en bactéries. Dans la pratique et par mesure d'économie de temps 15 et de volumes d'extraction, un seul lavage du culot est typiquement pratiqué. Quel que soit le procédé selon l'invention (première ou seconde alternative), ce dernier peut comprendre les étapes suivantes, en anaérobiose, en tant qu'étape A6) : a) centrifugation de l'anneau bactérien remis en suspension dans un tampon salin ou du 20 surnageant obtenu en A5), à une accélération comprise entre 3000 et 4000 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, b) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape a), et remise en suspension dans un tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 200 et 500 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 25 30°C, c) récupération du surnageant obtenu à l'issue de l'étape b), et remise en suspension dans un tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 3000 et 4000 x g pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, 30 d) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape c), et e) le mélange du culot récupéré en d) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges. 3045383 18 Ces étapes a) à e) peuvent ainsi être des sous-étapes de l'étape A6). Les étapes a) à d) visent à laver le microbiote obtenu en A5). De préférence, la température des étapes a) à d) est comprise entre 20 et 25°C. 5 De préférence, dans ces étapes a) à d), le tampon salin est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, de préférence à une concentration comprise entre 7 et 15g/l. De préférence, l'HEPES est présent en concentration comprise entre 8 et 15 mM. 10 Le culot obtenu à l'étape d) contient le microbiote d'intérêt. Il peut ainsi être mélangé au diluant, comme décrit dans l'étape e). A l'issue de l'étape A5) ou d) (peu importe les procédés selon la première ou seconde alternative), la fraction récupérée est mélangée avec un diluant choisi parmi les 15 cryoprotectants tels que les polyols, les di- à pentasaccharides; les agents de charge tels que les maltodextrines ; et leurs mélanges. Puis, l'étape B) de congélation et lyophilisation se déroule, comme décrit ci-avant. 20 La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, comme outil de recherche, notamment comme décrit ci-avant, en génomique fonctionnelle, en métaprotéomique ou en immunologie. 25 La présente invention se rapporte également à un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation dans la transplantation de microbiote fécal autologue ou allogénique. En effet, le lyophilisat de microbiote fécal purifié selon le procédé de l'invention peut être administré au patient receveur. 30 Le patient receveur peut être différent du sujet donneur, et la transplantation est alors allogénique. 3045383 19 Le patient receveur peut aussi être identique au sujet donneur, et la transplantation est alors autologue ; ce type de transplantation peut avoir lieu lorsque le sujet, alors sain, donne un échantillon avant l'altération de son microbiote. Le lyophilisat est alors conservé, puis transplanté à ce même sujet (patient receveur) si celui-ci présente 5 notamment une infection à Clostridium difficile. La transplantation de microbiote fécal autologue présente l'avantage d'éviter la transmission d'agent pathogène provenant d'un autre donneur. La présente invention se rapporte également à un lyophilisat de microbiote fécal d'un 10 sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation pour traiter les infections à Clostridium difficile. La présente invention se rapporte également à un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation pour accompagner le traitement ou pour traiter une pathologie choisie parmi les maladies inflammatoires 15 chroniques de l'intestin (MICI), les troubles fonctionnels intestinaux, l'obésité, les maladies métaboliques et les maladies auto-immunes, les allergies, les maladies neurologiques et les cancers. La présente invention se rapporte également à un lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation pour limiter les effets secondaires d'un traitement choisi parmi les 20 antibiothérapies, les chimiothérapies, les radiothérapies et les chirurgies notamment de l' appareil digestif. Le lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention présente une bonne viabilité des bactéries présentes, comme démontré en exemple 4. 25 Typiquement, la viabilité des bactéries du microbiote fécal est mesurée grâce au marquage LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit commercialisé par ThermoFisher Scientific. Ce kit permet en effet de distinguer les bactéries vivantes et mortes sur la base de l'intégrité de leurs membranes, par l'intermédiaire de deux fluorophores, le SYTO9® et l'iodure de propidium (PI). Le premier pénètre dans toutes 30 les cellules, intègres ou non, se fixe à l'ADN et émet à 540nm (vert) après excitation à 470nm (laser bleu). Le PI cible également l'ADN, mais pénètre uniquement dans les cellules dont les membranes sont endommagées ; il émet à 635nm (rouge) après 3045383 20 excitation à 470nm. Un tel kit peut être associé à la cytométrie en flux ou la microscopie en épifluorescence. De préférence, le marquage des bactéries avec le mélange des deux fluorophores SYTO9®/PI, est réalisé en anaérobiose. 5 L'invention va maintenant être exemplifiée à l'aide des exemples qui suivent, qui ne sont pas limitatifs. 10 Exemple 1: Purification d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur par gradient continu d'iodixanol (OptiPrep) selon l'invention Principe : Séparation de la fraction bactérienne totale, par flottaison au sein d'un gradient continu 15 d' OptiPrep auto-formé par congélation-décongélation. La dilution fécale alourdie en OptiPrep est déposée sous un gradient continu d' OptiPrep, préformé par congélation-décongélation. Au cours de la centrifugation, les bactéries remontent au sein du gradient jusqu'à leur densité de flottaison (1.110-1.190), alors que les débris alimentaires et endogènes plongent au fond du gradient. Tout le procédé est en anérobiose. 20 Matériels & Méthodes: Tampons Hepes-NaC1 NaC1 Hepes QSP MilliQ Pour diluant pour suspensions fécales Hepes 40mM-NaC19g/L 0,9 g 953,2 mg QSP REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur, comprenant les étapes suivantes : A) le mélange d'un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape A) comprend les étapes suivantes : Al) optionnellement, la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 315 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin comprenant éventuellement de l'iodixanol ou du 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) 20 isophthalamide, en anaérobiose, A3) optionnellement, le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération en anaérobiose, ou l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A2) ou A3), 25 A5) la récupération de l'anneau bactérien ou du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), en anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien ou du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges. 30 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, comme étape A6), les étapes suivantes en anaérobiose : 3045383 29 a) centrifugation de l'anneau bactérien remis en suspension dans un tampon salin ou du surnageant obtenu en A5), à une accélération comprise entre 3000 et 4000xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, b) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape a), et remise en suspension dans un 5 tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 200 et 500xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, c) récupération du surnageant obtenu à l'issue de l'étape b), et remise en suspension dans un tampon salin, puis centrifugation à une accélération comprise entre 3000 et 10 4000xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise entre 20 et 30°C, d) récupération du culot obtenu à l'issue de l'étape c), et e) le mélange du culot récupéré en d) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lyophilisation de l'étape B) est réalisée en conditions suivantes : B1) la congélation du mélange obtenu en A) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, B2) le chargement du mélange congelé obtenu en B1) dans un lyophilisateur pré- refroidi à une température comprise entre -50°C et -30°C, à pression atmosphérique, puis B3) au moins une étape de dessiccation primaire du mélange chargé en B2) comprenant l'abaissement de la pression jusqu'à une valeur comprise entre 80 et 200 1..tbar, puis l'augmentation de la température des étagères jusqu'à une valeur comprise entre -20°C et +25°C, en appliquant une vitesse de chauffage comprise entre 0,2 et 0,5 °C/min, puis B4) la dessiccation secondaire du mélange obtenu en B3) comprenant l'abaissement de la pression à une valeur inférieure ou égale à 80 1..tbar, et l'élévation de la température des étagères à une valeur comprise entre +25°C et +35°C, à une vitesse de chauffage comprise entre 0,1 et 0,3 °C/min, et l'y maintenir entre 8 et 15 heures. 3045383 30 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le tampon salin est une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, de préférence à une concentration comprise entre 7 et 15g/l. 5 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: Al) la préparation d'un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide formé par congélation-décongélation, 10 A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin additionné d'une solution aqueuse comprenant de l'iodixanol ou du 5(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide, ledit tampon salin étant de préférence une solution aqueuse d'HEPES comprenant du chlorure de sodium, en anaérobiose, 15 A3) le dépôt du mélange obtenu en A2) sous le gradient obtenu en Al), A4) l'ultracentrifugation du mélange obtenu en A3), pendant une durée comprise entre 40 et 50 minutes, à une température comprise entre 2°C et 6°C, à une vitesse comprise entre 13000 et 16000 x g, A5) la récupération de l'anneau bactérien formé à l'issue de l'étape A4), en 20 anaérobiose, A6) le mélange de l'anneau bactérien récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. 25 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la préparation d'un gradient continu d'iodixanol formé par congélation-décongélation de l'étape Al) est réalisée selon les étapes suivantes : A 1 . a) congélation d'une solution d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- 30 dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide à une température comprise entre -70°C et -100°C pendant au moins 12 heures ; puis 3045383 31 A1.b) décongélation de la solution obtenue en A1.a) à température ambiante pendant 2 à 4 heures, afin d'obtenir un gradient continu d'iodixanol ou de 5- (N-2, 3- dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide. 5 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en anaérobiose: A2) le mélange d'au moins un échantillon de microbiote fécal d'un sujet donneur avec un tampon salin, 10 A4) la centrifugation séquentielle à faible accélération du mélange obtenu en A2), A5) la récupération du surnageant formé à l'issue de l'étape A4), A6) le mélange du surnageant récupéré en A5) avec un diluant choisi parmi les polyols, les di- à pentasaccharides, les maltodextrines et leurs mélanges, et B) la congélation du mélange obtenu en A6) à une température inférieure à -50°C, de 15 préférence comprise entre -70°C et -100°C, puis sa lyophilisation. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la centrifugation séquentielle à faible accélération de l'étape A4) est réalisée à une accélération comprise entre 200 et 500xg pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, à une température comprise 20 entre 20 et 30°C. 10. Lyophilisat de microbiote fécal d'un sujet donneur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, pour son utilisation dans la transplantation de microbiote fécal autologue ou allogénique, ou pour traiter les dysbioses intestinales. 25 11. Utilisation d'un lyophilisat susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comme outil de recherche, de préférence en génomique fonctionnelle, en métaprotéomique ou en immunologie.