FR 3038325 A1 20170106 FR 1556169 A 20150630 1 La présente invention se rapporte à une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, et d) des cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques. La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques, comprenant les étapes suivantes : i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, 15 puis ii) congélation du mélange obtenu à l'étape i). La cryoconservation est un processus dans lequel des échantillons biologiques sont stockés à basse température. La cryoconservation de matériel biologique est 20 généralement effectuée par la congélation dudit matériel, dans un support approprié, tel qu'un tube ou une ampoule en verre ou en matière plastique (généralement appelé "paillette" ou tube de congélation dans le domaine de la cryoconservation), ledit support étant adapté pour le stockage à long terme et à basse température. 25 La cryoconservation pose cependant un certain nombre de problèmes et de contraintes techniques. Notamment, des lésions cellulaires peuvent se produire lors de la décongélation, entraînant l'apoptose ou l'éclatement des cellules. En outre, la survie des cellules cryoconservées peut dépendre des conditions et des techniques employées lors de la congélation. Le contrôle de la vitesse de refroidissement est 30 important : un refroidissement à faible vitesse permet une cristallisation ordonnée de l'eau congelable à l'extérieur des cellules - les cellules se déshydratent, se rétrécissent et l'eau sort de la cellule. Dans le cas contraire, la formation de glace 3038325 2 intracellulaire entraîne la destruction des structures membranaires qui est létale pour la cellule. Pour la plupart des cellules de mammifères, comme cela est le cas pour les produits et médicaments de thérapie cellulaire, que les cellules soient ou non génétiquement 5 modifiées, il est en outre indispensable d'utiliser des cryoprotectants pour préserver l'intégrité et la fonctionnalité cellulaires. Actuellement, la fabrication à une échelle industrielle (européenne ou mondiale notamment) de produits de thérapie cellulaire pose de nouvelles problématiques, 10 telles que la stabilité du produit fini administré et la variabilité liée à la matière biologique de départ. Dans la plupart des cas, le produit fini est conditionné : frais dans un milieu liquide (type albumine ou solution saline) avec une conservation limitée à quelques heures ou jours, ou bien congelé dans une formulation simple à base de DMSO, peu stable et peu efficace à long terme. La quantité non négligeable de cellules mortes, de débris aux effets potentiellement immunogènes et la toxicité pour le patient des excipients couramment utilisés sont autant de limites. La plupart du temps, un lavage des cellules pour retirer ces éléments toxiques (biologiques ou non) est indiqué : ces solutions ne sont pas compatibles avec une distribution industrielle. De plus, elles offrent peu de flexibilité d'administration et de stockage, au contraire des autres classes de médicaments « classiques ». 11 existe donc un besoin pour le développement d'un produit et/ou médicament de thérapie cellulaire qui soit stable à long terme (i.e. pendant plusieurs mois), qui soit facile à utiliser, directement injectable et non toxique. La présente invention permet de répondre à ce besoin. En effet, la composition selon l'invention permet d'obtenir des produits de thérapie cellulaire comprenant des cellules à visée thérapeutique, prêts à l'emploi (i.e. prêts à être injectés sans lavage, 3038325 3 ce qui évite toutes manipulations supplémentaires provoquant une baisse de viabilité et une perte de cellules), stables à long terme, faciles à utiliser et non toxiques. La présente invention se rapporte donc à une composition comprenant, dans un 5 milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, et d) des cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la 10 tumeur, lesdits lymphocytes infiltrant la tumeur étant obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence (appelée également la « sortie » ou la 15 « culture primaire ») desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 20 Ces lymphocytes infiltrant la tumeur (appelés également « TILs » pour « Tumor Infiltrating Lymphocytes ») sont obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant : 25 - l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase. Cette émergence est également appelée « culture primaire » ou « sortie » ; c'est l'étape au cours de laquelle les lymphocytes infiltrant la tumeur, initialement contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, passent dans le milieu de culture et 30 sont cultivés in vitro, puis - la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin 3038325 4 - l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. De tels TILs sont appelés « lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques » ou « lymphocytes spécifiques infiltrant la tumeur » dans la présente demande. 5 La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques, comprenant les étapes suivantes : i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec : a) d'abord de la sérum albumine humaine, puis 10 b) au moins un saccharide, et c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, puis ii) congélation du mélange obtenu à l'étape i). La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition 15 comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, 20 à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques. Dans la présente demande, les lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques exclus de la composition selon l'invention sont autologues ; ils correspondent aux lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans la(es) tumeur(s). 25 Ces lymphocytes infiltrant la tumeur exclus de la présente invention sont obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant : - l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement 30 de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase. Cette émergence est également appelée « culture primaire » ou « sortie » ; c'est l'étape au cours de laquelle les lymphocytes infiltrant la tumeur, initialement contenus dans le prélèvement de 3038325 5 nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, passent dans le milieu de culture et sont cultivés in vitro, puis - la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin 5 - l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. En particulier, l'étape d'émergence des TILs peut être réalisée par culture primaire du prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, notamment par culture primaire dans un milieu de culture sélectif sans sérum de type X-VIVO 15® (commercialisé par Cambrex Corp) supplémenté en interleukine-2 (IL-2). 10 Après émergence des TILs, ces derniers subissent une étape de stimulation, de préférence dans un récipient de culture clos compartimenté, notamment en présence au moins de cellules nourricières allogéniques irradiées non proliférantes. Par « récipient de culture clos », on entend un système permettant d'entretenir des cellules en culture dans un milieu adapté, sans que celles-ci ne soient directement au 15 contact avec l'environnement extérieur. Enfin, l'étape de stimulation des TILs est suivie d'une étape d'amplification. De préférence, tous les TILs sont exclus des cellules à visée thérapeutique de la présente demande. 20 La composition selon l'invention comprend donc, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, 25 c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, et d) des cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques. Par « milieu physiologiquement acceptable », on entend un milieu aqueux 30 comprenant des électrolytes. Les électrolytes sont par exemple des sels de sodium, de potassium, de magnésium et/ou de calcium avec des anions de type chlorure, carbonate, hydroxyde ou caprylate. De préférence, le milieu physiologiquement 3038325 6 acceptable est un milieu aqueux comprenant du chlorure de sodium et du caprylate de sodium. La composition selon l'invention comprend la sérum albumine humaine (composé 5 a)). Cette protéine est une protéine plasmatique de haut poids moléculaire (environ 65 kDa). C'est la protéine la plus abondante du plasma ; sa concentration moyenne normale est de 38 à 48 g/l. Elle permet de tamponner le pH et de maintenir l'osmolarité. Sa pureté est de préférence de 95%. On peut également utiliser un ou plusieurs fragments et/ou dérivés de la sérum albumine humaine, lesdits fragments 10 ou dérivés étant non immunogènes et ayant une propriété oncotique similaire à la sérum albumine humaine. De préférence, la sérum albumine humaine, ses fragments et/ou dérivés, est présente en quantité comprise entre 2 et 10% en poids par rapport au poids total de composition, de préférence entre 2.5 et 6% en poids, de préférence entre 3.5 et 4.5% 15 en poids. Dans la présente demande, sauf mention contraire, les quantités sont mentionnées en poids par rapport au poids total de composition. La composition selon l'invention comprend également au moins un saccharide 20 (composé b)). Le saccharide améliore la survie et la fonction des cellules en préservant l'équilibre osmotique. Une fraction pénètre les cellules et permet de stabiliser les structures membranaires. Le saccharide est de préférence choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides. Les monosaccharides sont de préférence choisis parmi le glucose, le galactose, le 25 fructose et le manno se. Le disaccharide a de préférence pour formule A-B, dans laquelle A et B sont chacun indépendamment choisis parmi le glucose, le fructose et le mannose. Le saccharide est de préférence un disaccharide. Le disaccharide est de préférence un dimère de glucose. Plus préférentiellement, le disaccharide est choisi parmi le tréhalose et le 30 saccharose. Plus préférentiellement, le disaccharide est le tréhalose. Les trisaccharides sont de préférence choisis parmi le raffinose (trimère de galactose, glucose et fructose), le maltotriose et l'isomaltotriose (trimères de glucose). 3038325 7 Le saccharide est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0.05M et 1M, de préférence entre 0.07M et 0.5M, de préférence entre 0.08M et 0.12M. 5 La composition selon l'invention comprend enfin au moins du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05 (composés c)). La composition selon l'invention comprend ainsi, comme composés c), au moins du coenzyme Q10 et au moins un alcanediol en C3-05. Alternativement, la composition selon l'invention comprend, comme composés c), de la L-cystéine et au moins un 10 alcanediol en C3-05. Le coenzyme Q10, également appelé ubiquinone, est un composé chimique comprenant un groupement quinone. Son nom chimique est le 2,3-diméthoxy-5- méthy1-6-décaprénylbenzoquinone. 11 est de préférence présent dans la composition selon l'invention en quantité comprise entre 0.005 et 1% en poids, de préférence 15 entre 0.007 et 0.5% en poids, de préférence entre 0.007 et 0.1% en poids. La L-cystéine est un acide aminé présentant un groupement thiol -SH. Elle est de préférence présente dans la composition en concentration comprise entre 0.05mM et 5mM. L'alcanediol en C3-05 est de préférence un alcane linéaire, ramifié ou cyclique 20 comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. De préférence, il est choisi parmi les alcanes linéaires comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. Plus préférentiellement, il est choisi parmi le propane-1,2- diol, le pentane-1,5-diol et le butane-2,3-diol. L'alcanediol en C3-05 est de préférence le propane-1,2-diol (également appelé propylène glycol). 25 L'alcanediol en C3-05 est de préférence présent dans la composition selon l'invention en quantité comprise entre 3 et 10% en volume, de préférence entre 3 et 7% en volume. De préférence, la composition selon l'invention comprend, dans un milieu 30 physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, 3038325 8 b) un saccharide, de préférence du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, et c) du coenzyme Q10 et du propane-1,2-diol, de préférence respectivement en quantité comprise entre 0.007 et 0.1% en poids, et en quantité comprise entre 3 et 5 10% en volume. La composition selon l'invention est particulièrement intéressante, et vise à cryoconserver au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique. En effet, les composés a) à c) utilisés dans la composition selon l'invention permettent de 10 cryoconserver les cellules à visée thérapeutique, de façon durable et efficace. Les cellules à visée thérapeutique (composés d)) sont de préférence choisies parmi : - les cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes T naturels ou génétiquement modifiés tels que les lymphocytes T 15 régulateurs et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR) ; - les myoblastes humains ; - les cellules souches hématopoïétiques ; - les cellules souches mésenchymateuses ; - les cellules cardiaques ; et 20 - toutes autres cellules naturelles ou génétiquement modifiées. Les cellules NK (ou lymphocytes NK) sont des cellules de l'immunité innée. Ce sont des lymphocytes non T (CD3-) non B (CD19-), caractérisés chez l'homme par les marqueurs CD56, CD16 et NK. Les monocytes sont des leucocytes qui évoluent en macrophages, cellules 25 dendritiques ou ostéoclastes. Les lymphocytes T régulateurs sont une sous-population de lymphocytes T CD4+, qui inhibent la prolifération d'autres lymphocytes T effecteurs. Enfin, les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), appelés également cellules CAR-T, correspondent à une technologie particulière d'ingénierie 30 cellulaire. Ce sont des lymphocytes T qui expriment un récepteur antigénique chimérique. Les cellules CAR-T sont capables de tuer les cellules cancéreuses, par 3038325 9 reconnaissance et liaison à l'antigène tumoral présent sur lesdites cellules cancéreuses. L'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir du patient à traiter (dans 5 ce cas le patient et le donneur sont la même personne), par biopsie ou prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue, une fois cryoconservée puis décongelée, sera administrée à ce même patient : c'est un produit autologue. Alternativement, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir d'une autre source (i.e. autre individu, ingénierie cellulaire), notamment par biopsie ou 10 prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue, une fois cryoconservée puis décongelée, sera administrée à un patient à traiter autre que le donneur : c'est un produit allogénique. La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au 15 moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur spécifiques, comprenant les étapes suivantes : i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et 20 c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, puis ii) congélation du mélange obtenu à l'étape i). Dans ce procédé, l'étape de mélange i) de l'échantillon de cellules à visée 25 thérapeutique avec les composés a) à c) décrits ci-dessus se fait typiquement par dilution. De préférence, les cellules sont reprises dans le composé a) sous forme liquide, de préférence pour 50% du volume, puis les composés b) et c), de préférence précédemment mélangés entre eux pour obtenir une solution de concentration 2x, sont ajoutés. Le mélange de l'étape i) peut se faire aux alentours de 4°C, ou à 30 température ambiante (i.e. 20°C). De préférence, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique est, quant à lui, préalablement cultivé in vitro, dans un milieu de culture approprié. Puis il subit une 3038325 10 centrifugation, le surnageant est retiré et le culot est suspendu dans les composés a), puis b) et c) décrits ci-dessus. L'étape de congélation (étape ii)) est de préférence effectuée sur une descente en 5 température de +4°C ou température ambiante jusqu'à une température comprise entre -100°C et -160°C. L'étape de congélation (étape ii)) est de préférence effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C. L'échantillon est ensuite stocké à une température inférieure à -130°C en général. 10 De préférence, la congélation ii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu dans l'étape i) dans un récipient immergé dans un mélange d'isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C. Ce système (« congélation en boîte Nalgène ») permet, grâce au refroidissement lent de l'alcool, une descente en température quasi-linéaire comprise entre -1°C et -2°C par minute. 15 Alternativement, de préférence, la congélation ii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé. De tels congélateurs sont notamment commercialisés par Air Liquide ou Cryobiosystem. De préférence, la congélation ii) se fait, notamment à l'aide d'un congélateur programmé, par les étapes suivantes : 20 placer le mélange obtenu à l'étape i) à une température de +4°C ; puis diminuer la température de 1°C par minute, de +4°C à -40°C ; puis diminuer la température de 10°C par minute, de -40°C à -150°C, pour atteindre une température finale de stockage d'environ -150°C. 25 Le produit ainsi obtenu, congelé, peut être conservé pendant quelques mois à -150°C environ. Ces températures sont celles appliquées à l'échantillon. 30 REVENDICATIONS1. Composition de cryoconservation comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, et d) des cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur, 10 lesdits lymphocytes infiltrant la tumeur étant obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la 15 tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le saccharide est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides. 20 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que le saccharide est un disaccharide choisi parmi le tréhalose et le saccharose. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la sérum albumine 25 humaine est présente en quantité comprise entre 2 et 10% en poids par rapport au poids total de composition, de préférence entre 2.5 et 6% en poids. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le disaccharide est présent en concentration comprise entre 0.05M et 1M, de préférence entre 0.07M et 0.5M. 30 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les cellules à visée thérapeutique sont choisies parmi les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes T naturels ou génétiquement modifiés tels que les lymphocytes T régulateurs et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), les myoblastes humains, les cellules souches 3038325 12 hématopoïétiques, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules cardiaques et toutes autres cellules naturelles ou génétiquement modifiées. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) de la sérum albumine humaine, de préférence en quantité comprise entre 2.5 et 6% en poids, b) du tréhalose, de préférence en concentration comprise entre 0.07M et 0.5M, c) du coenzyme Q10 et du propane-1,2-diol, de préférence respectivement en quantité comprise entre 0.007 et 0.1% en poids, et en quantité comprise entre 3 et 10% en volume, et d) des cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur, lesdits lymphocytes infiltrant la tumeur étant obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 8. Procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes : i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec: a) de la sérum albumine humaine, b) au moins un saccharide, et c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, puis ii) congélation du mélange obtenu à l'étape i), les cellules à visée thérapeutique étant à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur, lesdits lymphocytes infiltrant la tumeur étant obtenus par culture in vitro de lymphocytes infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la tumeur stimulés. 3038325 13 9. Procédé de cryoconservation selon la revendication 8, caractérisé en ce que la congélation ii) est effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C. 5 10. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que la congélation ii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu en i) dans un récipient immergé dans un mélange d'isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C. 10 11. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la congélation ii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé. 12. Utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) de la sérum albumine humaine, 15 b) au moins un saccharide, et c) du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine, et au moins un alcanediol en C3-05, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, à l'exception de lymphocytes infiltrant la tumeur, lesdits lymphocytes infiltrant la tumeur étant obtenus par culture in vitro de lymphocytes 20 infiltrant la tumeur à partir de prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase d'un patient atteint d'un mélanome de stade 3 ou 4, ladite culture comprenant l'émergence desdits lymphocytes infiltrant la tumeur contenus dans le prélèvement de nodules cutanés en transit, ganglion ou métastase, puis la stimulation des lymphocytes infiltrant la tumeur issus de l'étape d'émergence, puis enfin l'amplification des lymphocytes infiltrant la 25 tumeur stimulés.