FR 3048285 A1 20170901 FR 1651578 A 20160225 1 PROCEDE DE NEBULISATION DE PROTEINES POUR LA GENERATION DE REACTIONS IMMUNOCHIMIQUES, DISPOSITIF, UTILISATION. DOMAINE Le domaine de l'invention concerne les procédés pour réaliser des réactions immunochimiques sur des coupes histologiques et cytologiques. Plus particulièrement, le domaine de l'invention se rapporte aux réactions immunochimiques visant à localiser spécifiquement une protéine dans son espace cellulaire grâce à la reconnaissance d'un antigène par un anticorps. Le domaine de l'invention concerne, en outre, les dispositifs de dépôt d'un réactif comportant des anticorps sur un échantillon compotant des sites antigéniques. Enfin, l'invention se rapporte à une utilisation d'un dispositif de projection par nébulisation pour déposer des anticorps sur un échantillon comportant des sites antigéniques. ETAT DE L'ART Actuellement, les procédés d'immunochimie permettant de localiser spécifiquement une protéine dans son espace cellulaire grâce à la reconnaissance d'un antigène par un anticorps spécifique présentent quelques limitations. En effet, l'utilisation d'un anticorps, quel que soit sa nature, présente un coût excessif, limitant son utilisation. Parmi les anticorps utilisés pour révéler un antigène, deux types d'anticorps peuvent être utilisés. Un premier anticorps est un anticorps polyclonal. Ce dernier permet de reconnaitre différents épitopes pour un même antigène. Un second anticorps est un anticorps monoclonal. Ce dernier permet de reconnaitre un épitope spécifique pour un même antigène. Ce dernier est donc plus spécifique par essence. L'immunohistochimie permet de localiser les antigènes dans une coupe histologique de tissu en paraffine. L'épaisseur de la coupe peut être choisie selon le cas envisagé. Alternativement, sur cytologie, les cellules peuvent être déposées sur des lames par un procédé tel que le frottis, la cytocentrifugation ou un procédé mettant en oeuvre un dispositif en couche mince. Une solution consiste à déposer, par exemple, au moyen d'une 3048285 2 pipette un volume dilué d'une solution comprenant des anticorps. L'examen de l'échantillon, ayant ainsi réagi par l'action de réaction entre les anticorps et les antigènes, permet d'établir des diagnostiques. Actuellement, quel que soit la technique d'immunochimie ou s d'immunohistochimie, manuelle ou automatisée, les anticorps sont déposés par pipettes ou par seringues. En tenant compte de l'évolution et la volonté d'automatisation de ces techniques, la diminution de la quantité d'anticorps utilisés est un critère important du fait de leur coût. 10 Par ailleurs, les techniques employées aujourd'hui trouvent des limitations dans l'examen automatique des images générées de l'échantillon après la dépose d'anticorps. En effet, la dépose d'anticorps peut ne pas atteindre certaines zones de l'échantillon et la répartition des anticorps peut ne pas être homogène sur l'échantillon. En effet, la solution diluée peut être 15 non homogène et peut avec le temps révéler des disparités de concentration des anticorps. Un dernier problème est que lorsqu'un échantillon n'a pas réagi entièrement sur sa zone d'exposition, les réactions peuvent être identifiées comme des effets liés à la contamination de l'échantillon et non à des 20 réactions positives entre les antigènes et les anticorps. Il est alors difficile de caractériser les zones de réactions positives liées aux réactions des anticorps et des antigènes d'une simple contamination. RESUME DE L'INVENTION 25 L'invention permet de résoudre les inconvénients précités. Un objet de l'invention concerne un procédé de réalisation d'une réaction immunohistochimique comprenant : ^ Un agencement d'une préparation d'un échantillon pour le 30 traitement d'une réaction comprenant des antigènes sur un support de sorte à être en vis-à-vis d'une tête de nébulisation ; ^ Une projection par nébulisation d'une pluralité de gouttelettes correspondant à un volume prédéfini d'un réactif comprenant des anticorps, ladite projection interceptant une région du support 3048285 3 comprenant l'échantillon, ladite projection étant générée par un mode de vibration de l'élément piézoélectrique. Un avantage de l'invention est de générer une projection 5 homogène sur une zone dans laquelle les anticorps seront répartis uniformément. Cette répartition favorise la rencontre des anticorps qui sont compris dans les gouttelettes projetées avec les antigènes présents dans l'échantillon. 10 Selon un mode de réalisation, le procédé de réalisation d'une réaction immunochimique comprend : ^ Une analyse du marquage des réactions anticorps-antigène à partir d'un dispositif d'imagerie pour quantifier une proportion de réactions positives. 15 Selon un mode de réalisation, un mode vibratoire d'une membrane perforée excitée par l'élément piézoélectrique est configuré pour générer une projection desdites gouttelettes à travers les ouvertures de ladite membrane de sorte que l'énergie cinétique desdites gouttelettes soit 20 comprise dans une gamme de valeurs prédéterminées de sorte à : ^ préserver l'intégrité des anticorps expulsés, ^ favoriser par une action mécanique les rencontres anticorps-antigènes ^ limiter les dommages causés sur les antigènes lors de l'impact des 25 gouttelettes sur les sites antigéniques de l'échantillon. L'énergie cinétique peut être déduite : ^ des gammes de fonctionnement de la fréquence de vibration de l'élément piézoélectrique ; 30 ^ de la gamme de débits d'éjection du réactif en sortie de la buse 6 et , ^ de la gamme de valeurs de la taille des gouttelettes ou alternativement de la gamme de valeurs des dimensions des ouvertures de la membrane. 35 3048285 4 Par exemple, une gamme d'énergie cinétique des gouttelettes permettant d'obtenir un effet particulièrement intéressant, c'est-à-dire ne provoquant pas de cassure des sites antigéniques et favorisant les réactions favorables entre anticorps et antigènes, est obtenue pour les valeurs 5 suivantes : ^ Débit de réactif projeté compris entre 15m1/min et 22 ml/min ; ^ Fréquence de l'élément piézoélectrique comprise entre 80kHz et 120Khz ; ^ Taille de gouttelettes comprise entre 12 pm et 28 pm. 10 Cette configuration présente des résultats optimums tant en termes de réactions favorables que de la conservation des sites antigéniques. Toutefois, un effet positif peut être obtenu en dehors de ces gammes. 15 Selon un mode de réalisation, le débit d'éjection des gouttelettes peut être configuré entre 4m1/min et 30m1/min. Ce débit permet d'assurer qu'un volume donné d'anticorps soit projeté sur une surface donnée en un certain laps de temps. 20 Une gamme de débit particulièrement avantageusement se situe entre 15m1/min et 22 ml/min. Ce dernier débit permet une nébulisation efficace du réactif dans un laps de temps assez court tout en permettant d'obtenir une énergie cinétique des gouttelettes favorisant les réactions. 25 L'énergie cinétique des gouttelettes est maitrisée pour assurer un grand nombre de formations de couples anticorps-antigène tout en limitant les effets cassures lors de la projection. Selon un mode de réalisation, le cône d'émission du nuage de 30 gouttelettes définit une région d'impact sur le support dans laquelle les gouttelettes sont réparties de manière homogène sur l'échantillon, la vitesse d'éjection, la fréquence de vibration de l'élément piézoélectrique et la distance entre la sortie d'éjection de la tête piézoélectrique et le support étant configurées pour définir une surface d'impact comprise entre 200 mm2 et 35 4000 mm2. 3048285 5 Selon un mode de réalisation, un guide permettant de canaliser la projection des gouttelettes sur la région d'impact. La région d'impact est idéalement comprise sur la lame de verre. Un objectif de l'utilisation d'un tel guide est d'éviter la perte de réactif sur des zones situées hors de la lame et 5 d'éviter également toute pollution de l'environnement proche de la tête de nébulisation. Afin, de réaliser un guide qui canalise les gouttelettes sur la région d'impact, il est préférentiellement conçu de sorte à offrir : une première base circulaire de son extrémité supérieure, 10 l'extrémité supérieure étant destinée à coopérer avec la sortie de la tête de nébulisation et ; une seconde base rectangulaire de son extrémité inférieure, l'extrémité inférieure étant destinée à déboucher en vis-à-vis de la lame de verre ou un autre support rectangulaire 15 comportant l'échantillon à traiter. Selon un mode de réalisation, le guide comprend un moyen de fixation pour assurer qu'il soit rendu solidaire de la tête de nébulisation. Selon un mode de réalisation, le guide comprend un traitement de surface sur sa surface intérieure pour réduire le volume de réactif adhérent à 20 la surface. Ce traitement permet d'optimiser le volume de réactif atteignant la région d'impact. En outre, il évite toute contamination d'un essai à un autre utilisant le même guide. Le traitement de surface peut être par exemple un traitement chimique au Téflon. Un traitement anti-gouttes permettant de limiter l'adhérence de la surface permet d'obtenir un gain sur le taux de 25 dilution du réactif du fait que les pertes sont limitées. Selon un mode de réalisation, le guide a une hauteur de 2 à 8 mm. Il est adapté selon le choix de la distance entre la sortie de la tête de nébulisation et la lame de verre. Cette dernière distance étant comprise préférentiellement entre 2 et 12 mm, la hauteur de guide peut, par exemple, 30 correspondre à la moitié ou au deux tiers de cette distance. Un autre avantage est de provoquer une réaction sur une zone d'une dimension minimale afin de faciliter le traitement d'images subséquent à l'application du réactif pour établir un diagnostic. En outre, 35 l'homogénéisation de la dépose du réactif par nébulisation permet d'obtenir 3048285 6 un taux de répétabilité important du procédé et des rencontres entre anticorps et antigène. En outre, cette homogénéisation de la surface de réaction sur l'échantillon permet un traitement automatique de l'image obtenue par un logiciel de s traitement d'images. Enfin, lors du diagnostic, que ce soit en dénombrement quantitatif des zones dans lesquelles une réaction entre un anticorps et antigène a réagi favorablement ou que ce soit en proportion de surface, l'augmentation de la surface grâce à la nébulisation du réactif permet d'obtenir une to conclusion de l'analyse de l'échantillon traité de manière plus fiable. Selon un mode de réalisation, les anticorps sont dilués en volume entre une proportion de 1/50 et 1/100 dans la solution définissant le réactif. 15 Selon un mode de réalisation, les anticorps sont dilués en volume entre 1/10 et 1/15000 dans la solution du réactif. Le taux de dilution peut être, par exemple, choisi selon l'anticorps à projeter ou encore selon la surface de l'échantillon à atteindre, c'est à dire le volume de l'échantillon. Selon un mode de réalisation, la gamme de valeurs du taux de 20 dilution en volume des anticorps est comprise entre un cent-cinquantième et un cinquantième dans la solution définissant le réactif. Selon un mode de réalisation, la fréquence de vibration de l'élément piézoélectrique est comprise entre 70kHz et 120KHz de manière à favoriser la création de gouttelettes dont diamètre est inférieur à 100 um, 25 voire 80 um. Selon un mode de réalisation présentant un effet favorisant les réactions entre les anticorps et les sites antigéniques, les gouttelettes ont une taille comprise entre 12 um et 28 um. Les dimensions indiquées correspondent au diamètre d'une gouttelette. De telles dimensions de 30 gouttelettes permettent d'assurer de ne pas dégrader les sites antigéniques, de répartir un volume de réactif sur la surface de l'échantillon tout en évitant un phénomène de zonage. Le phénomène de zonage entraine des disparités sur l'échantillon entre des zones sans réaction et des zones ave réactions. 3048285 7 Selon un mode de réalisation, un récipient comprenant le réactif est agencé de sorte à établir un contact avec la tête de nébulisation qui comprend l'élément piézoélectrique. 5 Un avantage est de favoriser un mélange homogène du réactif qui comprend les anticorps. Le mélange est ainsi assuré par les vibrations de l'élément piézoélectrique, cela évite, en outre, une sédimentation des anticorps dans le récipient. Selon un mode de réalisation, une étape de préparation de 10 l'échantillon pour le traitement d'une réaction comprend le paraffinage d'un premier échantillon comprenant des antigènes et une découpe d'une fine tranche du premier échantillon pour fournir un échantillon pour le traitement d'une réaction. Selon un mode de réalisation, le procédé de réalisation d'une 15 réaction immunochimique comprend une étape de démasquage des sites antigéniques soit par un traitement enzymatique, soit par un traitement par élévation de température. Selon un mode de réalisation une étape de contre-coloration ou de coloration subséquente à la projection des anticorps est réalisée sur 20 l'échantillon pour révéler les zones d'intérêts des réactions anticorps-antigènes. Un autre objet de l'invention concerne un dispositif de projection d'un réactif comprenant des anticorps, lesdits anticorps étant dilués dans une 25 proportion prédéfinie dans le réactif, ledit dispositif comprenant une tête de nébulisation comportant un élément piézoélectrique excitant une portion du réactif pour générer une pluralité de gouttelettes d'un volume de réactif dans un cône d'éjection, ledit dispositif de projection comprenant, en outre, un emplacement apte à recevoir un support sur lequel un échantillon d'une 30 préparation peut être disposé. Selon un mode de réalisation, le dispositif de projection comprend une membrane perforée dont au moins un mode propre est configuré pour être excité par l'élément piézoélectrique, ladite membrane perforée réalisant l'éjection des gouttelettes à travers ses ouvertures afin de générer un nuage 35 de gouttelettes vers le support. 3048285 8 Selon un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de projection comprend un récipient dans lequel le réactif est stocké, ledit dispositif de projection comprenant des moyens de prélèvement d'un volume prédéfini de réactif acheminant ledit volume au sein de la tête de nébulisation 5 pour sa projection, le dispositif de projection réalisant un contact entre le récipient et la tête de nébulisation pour propager les ondes émises par l'élément piézoélectrique de manière à homogénéiser la concentration du réactif stocké dans le récipient. Selon un mode de réalisation, le dispositif de projection d'un 10 réactif comprenant des anticorps, lesdits anticorps étant dilués dans une proportion prédéfinie dans le réactif, ledit dispositif de projection comprenant une tête de nébulisation comportant un élément piézoélectrique excitant une portion du réactif pour générer une pluralité de gouttelettes du réactif dans un cône d'éjection, ledit dispositif de projection comprenant, en outre, un 15 emplacement apte à recevoir un support sur lequel un échantillon d'une préparation peut être disposé, ledit dispositif de projection étant agencé pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention Un autre objet de l'invention concerne une utilisation d'un dispositif de projection comprenant une tête de nébulisation et un élément 20 piézoélectrique pour générer un mode propre d'une membrane perforée afin de projeter un réactif comprenant des anticorps dilué selon une proportion diluée prédéfinie. 25 BREVE DESCRIPTION DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description détaillée qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : ^ figure 1A : un schéma d'une tête de nébulisation projetant des 30 anticorps selon le procédé de l'invention sur une préparation cytologique ou histologique comportant des antigènes ; ^ figure 1 B : un exemple de guide permettant de canaliser une projection de gouttelettes de l'invention ; ^ figure 2 : un schéma des principaux éléments du dispositif de 35 projection de l'invention ; 3048285 9 ^ figure 3 : un schéma présentant les principales étapes visant à exploiter par imagerie les échantillons ayant réagi avec un réactif déposé par nébulisation ; ^ figure 4A : une image d'un échantillon ayant réagi obtenu avec une 5 méthode de l'art antérieur : ^ figure 4B : une image d'un échantillon ayant réagi obtenu avec la méthode de l'invention. DESCRIPTION 10 L'invention a pour objectif de détecter la présence d'une protéine : dans son espace cellulaire en cytologie ; dans son espace cellulaire ou intercellulaire en histologie. Cette détection est effectuée grâce à la reconnaissance d'un antigène par un anticorps. L'anticorps est choisi de manière à réagir avec 15 l'antigène à détecter, l'anticorps est donc spécifique de l'antigène. La nébulisation de l'invention fonctionne avec tous les anticorps. Lorsque la reconnaissance a lieu, on parle dans la suite de la description d'une réaction positive. On en conclue la présence d'un antigène spécifique dans l'échantillon analysé. Lorsque la reconnaissance n'a pas 20 lieu, on parle dans la suite de la description d'une réaction négative. On conclue alors à l'absence d'un antigène spécifique dans l'échantillon analysé. Or il est possible, selon le mode opératoire, que l'échantillon analysé soit analysé négativement alors qu'il devrait être positif. Par ailleurs, pour s'assurer que la réaction a lieu, il convient d'utiliser un réactif dosé 25 utilisant le moins d'anticorps possible pour diminuer les coûts de production des réactifs. Les anticorps primaires sont choisis en fonction de l'antigène recherché qui sont contenus dans un prélèvement de tissus. Un des objectifs 30 de l'invention est de fournir un dispositif et un procédé permettant de faciliter la lecture des réactions positives et/ou négatives d'un échantillon traité un réactif comportant des anticorps tout en limitant la quantité d'anticorps utilisée. 3048285 -10- Par ailleurs, des anticorps secondaires peuvent être utilisés conjointement aux anticorps primaires selon le procédé de l'invention ou le dispositif de l'invention. 5 Préparation d'un échantillon Selon un mode de réalisation, en histologie, les prélèvements de tissus comportant des antigènes peuvent être par exemple fixés avec du formol consécutivement à leur extraction. Lorsque l'antigène recherché est identifié, une préparation 10 comprenant des d'anticorps adaptés est préparée à partir, par exemple, d'une étape de paraffinage et une étape de découpe d'une fine lamelle de tissus qui sera apposée sur un support 20. D'autres modes de réalisation existent et peuvent être mis en oeuvre pour réaliser l'invention afin d'obtenir une fine lamelle constituant 15 l'échantillon. Alternativement à l'étape de paraffinage qui vise à remplacer l'eau dans un prélèvement pour présenter un échantillon solide, une étape de polymérisation de l'échantillon peut être exécutée. La fine lamelle découpée est par exemple de l'ordre de 3 microns 20 d'épaisseur. Elle peut découpée à partir d'un microtome. En cytologie, la préparation de l'échantillon peut être déposée sous forme liquide sur la lame de verre. 25 Préparation du réactif Le réactif est préparé en mélangeant une proportion d'anticorps dans une solution diluée d'eau. La solution obtenue pour une dilution donnée d'anticorps est également notée « aliquote ». Elle peut être préparée avant d'appliquer le procédé de l'invention ou encore décongelée préalablement si 30 cette dernière est conservée sous cette forme. Un récipient 10 permet de stocker un volume de réactif dans le dispositif 1 de l'invention. Un avantage est de pouvoir disposer d'un certain volume permettant de réaliser différents tests. A chaque test, un volume prédéfini est prélevé pour être appliqué à un échantillon 25 disposé sur un 35 support 20. 304 82 85 -11- Selon un mode de réalisation, le récipient 10 est conçu amovible pour définir une cartouche consommable qui peut être inséré dans le dispositif de l'invention. Selon un autre mode de réalisation, le récipient 10 est fixe dans le 5 dispositif 1 de l'invention. Il peut alors être alimenté en réactif, par exemple, par une ouverture supérieure par laquelle le réactif est inséré. Principe favorisant les réactions La figure 1A représente le principe d'éjection d'un volume to prédéterminé de réactif 15 sur un support 20 comprenant un échantillon 25 de préparation comportant des antigènes, encore appelés site antigénique pour définir leur localisation. Le dispositif de l'invention 1 comprend une tête de nébulisation 2, appelée également nébuliseur. Selon un mode de réalisation, la tête de 15 nébulisation 2 comprend un élément piézoélectrique 3, tel qu'un émetteur piézoélectrique, générant des ondes excitantes un ensemble comprenant un volume de réactif 15 et une membrane perforée 4 sur laquelle le volume de réactif est déposé. Le volume de réactif est expulsé à travers les ouvertures de la membrane perforée 4 sous forme d'un nuage de gouttelettes 5. Le 20 volume prédéfini est expulsé vers une surface d'impact rencontrant un support 20 sur lequel un échantillon 25 d'une préparation comprenant des antigènes agencé. La distance 8 séparant la tête de nébulisation, la buse de sortie, et le support est représentée à la figure 1A. Cette distance 8 est configurée de 25 sorte à ce que le nuage de gouttelettes 5, qui forme sensiblement un cône d'éjection 7, intercepte une surface souhaitée du support 20. Selon un mode de réalisation, la surface d'impact est définie de manière à ce que les gouttelettes 5 soient uniformément réparties sur la surface de l'échantillon 25. Dans ce cas de figure, la surface d'interception du cône d'éjection 7 peut 30 être légèrement supérieure à la surface de l'échantillon 25 sur le support 20 afin de garantir une homogénéité de la répartition des gouttelettes même au niveau de la bordure de l'échantillon. Le cône d'éjection 7 est notamment défini par les dimensions de la sortie 6 de la tête de nébulisation 2, les dimensions de la membrane perforée 35 4 et du dimensionnement des ouvertures de la membrane, de la taille des 3048285 -12- gouttelettes 5, de la fréquence de l'élément piézoélectrique, de la vitesse d'éjection et du volume de réactif 15 éjecté. En conséquence, le dispositif de projection 1 de l'invention peut être configuré de sorte à obtenir un ratio donné entre la distance 8 et la 5 surface d'interception avec le support 20. Selon un mode de réalisation, la vitesse d'éjection des gouttelettes en sortie 6 de la tête de nébulisation 2 est configurée pour favoriser les réactions entre les anticorps et les antigènes. Les réactions sont favorisées lorsque les gouttelettes arrivent avec une certaine vitesse d'impact sur 10 l'échantillon. Un des principes de l'invention réside en ce que l'énergie cinétique des gouttelettes favorise les liaisons entre les anticorps et les antigènes et donc la réaction attendue lorsque la réaction doit être positive. Ce résultat est particulièrement surprenant dans la mesure où l'énergie cinétique des gouttelettes ou leur vitesse paraissaient potentiellement être 15 une source de destruction des anticorps lors de leur éjection et potentiellement des antigènes lors de l'impact des gouttelettes sur les sites antigéniques. Un préjugé semblait être de considérer qu'aucune réaction entre antigènes et anticorps ne puisse être favorisée par nébulisation. Il a été très surprenant de constater, à l'issue de tests, que certaines réactions entre 20 antigènes et anticorps étaient favorisées par la vitesse d'impact des gouttelettes sur l'échantillon comportant des antigènes. Il a été constaté qu'à faible vitesse, grâce à la nébulisation, l'impact des gouttelettes permet d'ouvrir les sites antigéniques et de favoriser les réactions. Enfin une seconde surprise est que l'utilisation d'une tête de 25 nébulisation parait totalement contre-indiquée pour projeter sous forme de gouttelettes un réactif comportant des anticorps. Car de prime abord, il apparait que l'éjection d'un tel réactif provoquerait, par l'effet de nébulisation dans lequel il y a une élévation d'une part de la température et d'autre part de la pression, des cassures ou des dégradations des anticorps. Or ce 30 préjugé parait infondé lorsque la fréquence de l'élément piézoélectrique est configurée dans une certaine gamme de fréquences favorisant un effet de nébulisation tout en limitant l'élévation de température. Enfin, l'utilisation d'une membrane perforée semble limiter l'effet de cisaillement et donc les dégradations des anticorps lors de leur éjection sous forme de gouttelettes. 35 3048285 -13- Une difficulté qui a été surmontée par l'invention est la maitrise de l'énergie cinétique des gouttelettes qui doit rester faible pour éviter de détériorer les sites antigéniques de l'échantillon. Ainsi, le principe de nébulisation permet par principe de limiter cette énergie et de limiter l'impact 5 des gouttelettes sur les sites antigéniques. Les impacts résultant de l'interception des gouttelettes avec les sites antigéniques sont suffisant pour provoquer une action mécanique visant à ouvrir les sites antigéniques tout en préservant leur intégrité. La nébulisation comporte donc un double effet bénéfique lors de la 10 projection d'anticorps : une homogénéisation permettant une répartition sur l'ensemble de l'échantillon avec une même statistique potentielle de réactions avec les sites antigéniques et une action permettant de faciliter l'ouverture desdits sites antigéniques. Une conséquence heureuse de la favorisation des rencontres 15 anticorps-antigènes liée à la nébulisation est de permettre de diluer les anticorps dans un réactif avec des taux de dilution très faibles, beaucoup plus faibles que ce qui est pratiqué dans l'état de l'art. Une quantité donné d'anticorps projetée par dépôt d'une goute par l'aide d'une pipette sur un échantillon favorise autant de réactions anticorps-antigène qu'une même 20 quantité divisée par deux d'anticorps dans un réactif lorsqu'elle est nébulisée. Cela a pour conséquence une diminution du gaspillage d'anticorps et un coût réduit de chaque test. Un test réalisé avec une nébulisation d'un anticorps primaire de type Cytokératine AE1-AE3 dilué au 100ème a donné le même marquage 25 qu'une technique classique avec le même anticorps dilué au 50ème. Support De manière avantageuse, l'échantillon est disposé sur un support 20 tel que, par exemple, une lame de verre ou une lame en matériau 30 polymère. Selon un mode de réalisation, le support 20 comprend un rebord permettant de retenir l'échantillon 25 si ce dernier était incliné pendant sa manipulation. Un tel rebord n'est pas représenté sur la figure 1A. En outre, selon un mode de réalisation le support 20 comprend une languette 21 latérale permettant d'étiqueter le support 20 ou d'inscrire par exemple une 35 identification. 3048285 -14- Création d'un nuage de gouttelettes La figure 2 représente une vue détaillée d'un mode de réalisation d'une tête de nébulisation 2 et des principaux éléments du dispositif 1 de 5 l'invention. Dans ce mode de réalisation, la tête de nébulisation 2 comprend une entrée 110 par laquelle un volume prédéfini de réactif 15 est acheminé dans un réceptacle 9. Le volume prédéfini est prélevé d'un récipient 10 au moyen d'un dispositif de prélèvement 11 pour être acheminé au sein de la 10 tête de nébulisation 2. Une membrane perforée 4 est agencée au niveau de la sortie 6 de la tête de nébulisation 2 de manière à favoriser l'expulsion de microgouttelettes lors de l'activation d'un élément piézoélectrique 3 qui est configuré pour résonner à une fréquence prédéfinie. La sortie 6 de la tête de nébulisation est également appelée « buse » de nébulisation. La membrane 15 perforée 4 est en contact avec le réceptacle 9 et peut en constituer une partie du fond pour faciliter l'expulsion des gouttelettes 5 à partir du volume prédéterminé retenu en son sein. L'activation de l'élément piézoélectrique 3 permet de mettre en vibration la membrane 4, telle qu'une membrane micro perforée. 20 La membrane micro perforée 4 est conçue pour que les modes propres de vibrations de cette dernière soient compatibles de la fréquence employée par l'élément piézoélectrique 3. Notamment, sont prises en compte dans cette conception : les dimensions de la membrane 4, son épaisseur, le matériau la constituant ainsi que la distribution des ouvertures et de leur 25 géométrie. Il existe sur le marché des membranes dont les modes propres sont compatibles d'éléments piézoélectriques actuellement. On sait que ces éléments, membranes perforées et élément piézoélectrique, ne sont pas utilisés pour nébuliser des réactifs comportant des anticorps mais ils peuvent 30 constituer une solution pour qu'un homme du métier puisse configurer une solution qui fonctionne. Selon certaines configurations, une pluralité de membranes dont les dimensions sont adaptées à la fréquence de l'élément piézoélectrique 3 peuvent être utilisées selon la quantité souhaitée de réactif à déposer sur un 35 échantillon. 3048285 -15- Selon un mode de réalisation, les dimensions des ouvertures de la membrane perforée 4 et la fréquence de résonnance de l'élément piézoélectrique 3 sont adaptées pour limiter le cisaillement en sortie de la s buse afin de peu dénaturer les principes actifs, c'est-à-dire les anticorps du réactif 15. Cette adaptation peut être calibrée en fonction de la contrainte de cisaillement mesurée en sortie de buse. Pour cela, le taux de cisaillement Y, la viscosité dynamique n et la tension superficielle a, également appelée tension inter-faciale dans le cas d'un changement de milieu sont adaptées en 10 conséquence en fonction des paramètres rendus ajustables. L'équation de la contrainte de cisaillement en sortie de la buse 6 peut s'écrire ainsi : r = a / h.Y, où r est la contrainte de cisaillement. On comprend alors qu'il est envisageable de réduire la contrainte 15 de cisaillement par une configuration particulière de la viscosité propre du réactif et de la tension superficielle. La contrainte de cisaillement étant maitrisée sur les gouttelettes, le procédé de l'invention permet de préserver l'intégrité des anticorps lors de leur expulsion par le nébuliseur. 20 Guide Un guide 26 permettant de canaliser la projection des gouttelettes sur la surface de la lame ou d'un support comportant l'échantillon est représenté à la figure 1 B. Il comprend dans sa partie supérieure une base circulaire 27 pour 25 coopérer avec la base circulaire de la sortie 6 de la tête de nébulisation 2, c'est-à-dire la zone correspondant sensiblement à l'emplacement de la membrane perforée 4 de la figure 1A. Selon un mode de réalisation, le guide 26 comprend une partie inférieure comportant une base rectangulaire 28 ou sensiblement 30 parallélépipédique permettant de concentrer les gouttelettes éjectées sur la lame 20 et plus particulièrement sur la zone comportant l'échantillon 25. Ainsi, le guide 26 permet d'éviter de projeter des gouttelettes en dehors de la zone de la lame et permet de ce fait d'optimiser le volume de réactif à déposer puisque les pertes sont réduites. 3048285 -16 La figure 1A est représentée sans le guide 26, dans le cas où il est positionné entre la buse 6 et la lame 20, il est fixé à la sortie 6 de la tête de nébulisation de sorte à être rendu solidaire de cette dernière. Dans ce dernier cas, le guide 26 occupe une place dans l'intervalle 8 entre la lame et s la buse 6. Elément piézoélectrique Selon un mode de réalisation, l'élément piézoélectrique 3 peut être, par exemple, une céramique piézoélectrique dont la fréquence de 10 résonnance est choisie entre 80kHz et 120Khz. Une fourchette de fréquences particulièrement efficace tant sur l'aspect bénéfique de la nébulisation préservant les anticorps et favorisant les réactions antigènes-anticorps et ayant un bénéfice sur la limitation de la réduction de la viscosité du réactif lié à l'augmentation de la température est 15 de 86Khz à 100Khz. Selon un test conduit avec une fréquence de 100Khz avec un anticorps primaire Cytokératine AE1-AE3 de type IGG dilué au 100ème a permis de vérifier qu'aucune dégradation des anticorps n'a eu lieu lors de la vibration de la membrane micro perforée. 20 Selon un mode de réalisation, une alimentation par une électrode permet d'alimenter la tête piézoélectrique 3 pour engager un mode vibratoire. Une alimentation 8 est représentée à la figure 2. L'alimentation 8 peut être agencée au sein du dispositif de projection 1 de l'invention ou être agencée 25 extérieurement à ce dispositif de projection. Mélange dans le récipient et le réceptacle, effet de l'élément piézoélectrique Selon un mode de réalisation, un récipient 10 comprenant le 30 réactif 15 est agencé de sorte à établir un contact avec la tête de nébulisation 2 qui comprend l'émetteur 3. Selon un premier mode de réalisation, le contact peut être réalisé par un agencement co-localisé de l'élément piézoélectrique 3 avec le récipient 10. Selon un second mode de réalisation, un élément 12 réalise une jonction entre le récipient 10 et 3048285 -17- l'élément piézoélectrique de manière à faire se propager les ondes émises par l'élément piézoélectrique sur le bâti mécanique du récipient 10. Un avantage de ces dispositions est de favoriser un mélange homogène des anticorps dans le réactif stocké dans le récipient 10. Ce 5 mélange permet d'éviter un effet de sédimentation des anticorps dans le réactif. En effet, les ondes piézoélectriques se propageant mécaniquement au travers du dispositif permettent de créer un effet de vortex notamment par une élévation de la température dans le récipient 10. Ce dernier permet d'éviter la sédimentation des anticorps dans le récipient 10. 10 En outre, il permet d'assurer que le prélèvement d'un volume prédéfini de réactif 15 dans le récipient 10 est dilué selon un niveau de dilution attendu. Selon un mode de réalisation, la vibration générée par l'élément piézoélectrique 3 permet également de favoriser le mélange dans le 15 réceptacle 9 et favorise la diffusion d'un nuage de gouttelettes 5 homogène en concentration de réactif 15. Dans un mode de réalisation, un unique récipient-réceptacle 9 est utilisé. Dans ce cas de figure, le réactif 15 est stocké dans le réceptacle 9. Le 20 volume prédéterminé de réactif 15 émis par nébulisation est alors configuré par une durée d'activation de l'élément piézoélectrique 3. Pour un débit donné de réactif 15 éjecté de la buse 6 et une durée d'application donnée de l'élément piézoélectrique, le volume d'anticorps peut être facilement configuré ou mesurée pour un test donné. 25 Dans tous les modes de réalisation, le volume projeté de réactif peut être déterminé par une durée d'excitation de l'élément piézoélectrique. Lorsque l'élément piézoélectrique ne vibre pas, alors le récipient 9 comprend soit plus de réactif, soit un volume de réactif n'ayant pas été éjecté. Les dimensions des ouvertures de la membrane perforée peuvent être conçues 30 de sorte que le réactif ne puisse être projeté sans qu'il y ait une excitation de l'élément piézoélectrique. Dans ce dernier mode de réalisation, la vibration de l'élément piézoélectrique 3 permet d'une part d'expulser le réactif 15 sous forme de 35 gouttelettes 5 et de mélanger le réactif dans le réceptacle 9. 3048285 -18- L'invention permet de tirer profit des vibrations de l'élément piézoélectrique 3 pour améliorer la piézoviscosité du réactif 15 lors de son stockage, dans un récipient 10 et/ou un réceptacle 9, et sa projection sous forme de gouttelettes. Lorsque le récipient 10 est uniquement lié à l'élément 5 piézoélectrique 3 au moyen d'un élément de jonction 12, cela permet d'éviter une élévation de la température du réactif au sein du récipient 12 du fait de la distance les séparant. On note que les vibrations permettent de générer un effet de mise en suspension et d'homogénéisation des anticorps dans le réactif. Cet effet 10 reste valide pour des taux de dilutions des anticorps en volume dans le réactif allant d'un cinquantième, 1/50, à un trois centième, 1/300. Extraction du réactif Lorsque le récipient 10 et le réceptacle 9 sont disposés dans deux 15 enceintes différentes comme cela est représenté à la figure 2, un dispositif de prélèvement 11 d'un volume prédéterminé de réactif 15 permet d'acheminer ce volume dans le réceptacle 9 pour le nébuliser. A cet effet, une vanne ou électrovanne 112 peut être pilotée de sorte à prélever un volume prédéfini de réactif 15. Selon le test conduit, le volume prédéfini peut 20 être paramétré, par exemple, en prenant en considération la quantité de l'échantillon, la dilution du réactif, la configuration du nébuliseur. A cette fin, le récipient 10 est pourvu d'une sortie d'extraction 111 et le réceptacle 9 comprend une entrée 110 pour que le volume de réactif 15 soit acheminé au niveau de la tête de nébulisation 2. 25 Selon un autre mode de réalisation, une pipette comportant le réactif alimente une entrée de la tête de nébulisation 2. Ce mode n'est pas représenté sur les figures mais il constitue une alternative. Dans ce cas, la portion du liquide introduite dans la pipette peut être contrôlée par un marquage. La pipette peut être configurée pour qu'une commande 30 numérique active ou non la dépose d'un volume de réactif 15, par exemple, dans un réceptacle 9 tel que représenté à la figure 2. Analyse d'images Une étape d'analyse de l'échantillon 25 après réaction est 35 réalisée, par exemple, soit à partir d'un microscope 40, soit à partir d'un 3048285 -19- scanner de lame comme cela est représenté à la figure 3. Un avantage de l'utilisation d'un scanner de lame est de permettre une analyse d'imagerie de l'échantillon photographié. Dans ce dernier cas, l'image 30 peut être une image numérique qui peut être alors analysée numériquement par des 5 moyens de calculs de traitement d'image. Une analyse d'image peut être réalisée par un contrôle humain dans un premier temps. Mais un avantage de l'invention est de permettre un contrôle automatique de l'échantillon 25 pour détecter les tissus ayant réagi 10 positivement. Enfin un taux de réactions positives peut être mesuré sur l'ensemble de l'échantillon 25 de sorte à valider que les sites antigéniques ont réagi positivement. Une amélioration des pratiques antérieures est de permettre de fournir un échantillon 25 dont les réactions entre anticorps et antigènes, si 15 elles ont lieues, sont réparties de manière homogène sur la coupe de l'échantillon 25. Selon l'art antérieur, lorsque l'échantillon 25 présentait qu'une portion ayant réagi positivement, par exemple parce que les réactifs n'ont pas été déposés de manière homogène, un contrôle « humain » pouvait permettre de repérer les tissus présentant des réactions positives. 20 En revanche, la non-homogénéité des réactions présentait un frein à la mise en place d'une analyse automatique faite par ordinateur. En effet, la non-homogénéité des réactions peut : ^ soit conduire à un échec du contrôle par ordinateur car de mauvais points de l'image sont analysés, 25 ^ soit imposer la mise en oeuvre d'algorithmes compliqués et lourds à configurer pour traiter l'image et la segmenter pour obtenir une portion valide. En effet, lorsqu'un échantillon 25 comporte des réactions non-homogènes sur la surface de ce dernier, il convient de conclure que l'un des 30 cas suivants s'est produit : ^ une contamination d'un échantillon 25 dans la chaine de traitement de l'échantillon visant remettre en cause la validité du test ; ^ des réactions positives entre antigènes et anticorps avec une 35 mauvaise distribution du réactif sur l'échantillon liée à la 3048285 - 20 - procédure de dépôt du réactif qui ne favorise pas l'homogénéité du dépôt. Un problème peut provenir du fait qu'il est impossible de conclure à l'une ou à l'autre de ces conclusions lors de l'analyse de certaines images. 5 Il serait alors préférable de quantifier les réactions positives lorsque l'échantillon 25 comporte des zones ayant réagi et d'autres zones n'ayant pas réagi afin de valider l'une des deux conclusions. Cette validation permet de déduire si les réactions sont dues à 10 une contamination liée au mode opératoire ou si elles sont liées à une non- homogénéité de la distribution du réactif 15. La figure 4A représente une image obtenue à partir d'un procédé de l'art antérieur dans laquelle deux zones sont différenciées Z1 et Z2 et 15 délimitées par une frontière 35. Le procédé utilisé n'a pas permis d'obtenir un effet homogène quant aux réactions antigènes-anticorps. Une zone Z1 ne présente aucune réaction positive conformément à la distribution des sites antigéniques 32 n'ayant pas réagi aux anticorps de couleur blanche. 20 Une zone Z2 présente des réactions positives entre antigènes et anticorps correspondants aux sites antigéniques hachurés 31. Néanmoins, on remarque un site antigénique 32 dans la sous-région Z2' n'ayant pas réagi avec un anticorps. 25 La figure 4B représente le même test appliqué à un échantillon identique correspondant à une autre coupe d'un bloc paraffiné d'une préparation d'antigènes. Le procédé selon l'invention est appliqué avec une même quantité d'anticorps qui est nébulisée au lieu d'être déposée. On remarque sur cette image que les réactions positives les deux 30 régions Z1 et Z2 sont plus homogènes que sur l'image de la figure 4A. Le procédé de l'invention permet d'obtenir une meilleure homogénéité des réactions anticorps-antigènes sur l'échantillon 25. Enfin, le site antigénique 31 dans la région Z2' de la figure 4B a réagi positivement contrairement au site antigénique identique 32 dans la 35 région Z2' de la figure 4A. On observe que certains sites antigéniques ont 3048285 - 21 - réagi grâce au procédé de l'invention et non avec une technique antérieure. Cette réaction positive montre que l'impact de certaines gouttelettes sur l'échantillon a permis d'obtenir une ouverture du site antigénique favorisant la réaction entre les anticorps et les antigènes. s Le procédé et le dispositif de l'invention présentent donc un double avantage du fait de la combinaison de la nébulisation d'un réactif comportant des anticorps. REVENDICATIONS1. Procédé de réalisation d'une réaction immunohistochimique caractérisé en ce qu'il comprend : ^ Un agencement d'une préparation d'un échantillon (25) pour le traitement d'une réaction comprenant des antigènes sur un support (20) de sorte à être en vis-à-vis d'une tête de nébulisation (2) ; 10 ^ Une projection par nébulisation d'une pluralité de gouttelettes (5) correspondant à un volume prédéfini d'un réactif (15) comprenant des anticorps dans une région du support comprenant l'échantillon (25), ladite projection étant générée par un mode de vibration de l'élément piézoélectrique (3). 15 2. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : ^ Une analyse du marquage (31) des réactions anticorps-antigène à partir d'un dispositif d'imagerie pour quantifier une proportion de 20 réactions positives. 3. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un mode vibratoire d'une membrane perforée (4) excitée par l'élément piézoélectrique (3) est 25 configuré pour générer une projection desdites gouttelettes à travers les ouvertures de la membrane de sorte que l'énergie cinétique desdites gouttelettes soit comprise dans une gamme de valeurs prédéterminées de sorte à : ^ préserver l'intégrité des anticorps expulsés, 30 ^ favoriser par une action mécanique les rencontres anticorps- antigènes ^ limiter les dommages causés sur les antigènes lors de l'impact des gouttelettes sur les sites antigéniques de l'échantillon (25). 3048285 23 4. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le débit d'éjection des gouttelettes est compris entre 4m1/minute et 30 ml/minute. 5. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cône d'émission (7) du nuage de gouttelettes (5) définit une région d'impact sur le support dans laquelle les gouttelettes sont réparties de manière homogène sur l'échantillon (25), la vitesse d'éjection, la fréquence de vibration de l'élément piézoélectrique (3) et la distance (8) entre la sortie d'éjection (7) de la tête de nébulisation (2) et le support (20) étant configurées pour définir une surface d'impact comprise entre 200 mm2 et 4000 mm2. 6. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont dilués en volume dans une gamme de valeur entre un taux de 1/15000 et un dixième, soit 1/10, dans la solution définissant le réactif. 7. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fréquence de vibration de l'élément piézoélectrique (3) est comprise entre 70kHz et 120KHz de manière à favoriser la création de gouttelettes (5) dont le diamètre est inférieur à 100 pm. 8. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un récipient (10) comprenant le réactif (15) est agencé de sorte à établir un contact avec la tête de nébulisation (2) qui comprend l'élément piézoélectrique. 9. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une étape de préparation de l'échantillon pour le traitement d'une réaction comprend le paraffinage d'un premier échantillon comprenant des antigènes et une découpe 3048285 24 d'une fine tranche du premier échantillon pour fournir un échantillon (25) pour le traitement d'une réaction. 10. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la 5 revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de démasquage des sites antigéniques soit par un traitement enzymatique, soit par un traitement par élévation de température. 11. Procédé de réalisation d'une réaction immunochimique selon la 10 revendication 1, caractérisé en ce qu'une étape de contre-coloration ou de coloration subséquente à la projection des anticorps est réalisée sur l'échantillon pour révéler les zones d'intérêts des réactions anticorps-antigènes. 15 12. Dispositif de projection (1) d'un réactif (15) comprenant des anticorps, lesdits anticorps étant dilués dans une proportion prédéfinie dans le réactif (15), ledit dispositif (1) comprenant une tête de nébulisation (2) comportant un élément piézoélectrique (3) excitant une portion du réactif (15) pour générer une pluralité de gouttelettes (5) d'un volume 20 de réactif (15) dans un cône d'éjection (7), ledit dispositif de projection (1) comprenant, en outre, un emplacement apte à recevoir un support (20) sur lequel un échantillon (25) d'une préparation peut être disposé. 13. Dispositif de projection (1) selon la revendication 12, caractérisé en ce 25 qu'il comprend une membrane perforée (4) dont au moins un mode propre est configuré pour être excité par l'élément piézoélectrique (3), ladite membrane perforée (4) réalisant l'éjection des gouttelettes à travers ses ouvertures afin de générer un nuage de gouttelettes vers le support (20). 30 14. Dispositif de projection (1) selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient (10) dans lequel le réactif (15) est stocké, ledit dispositif de projection (1) comprenant des moyens de prélèvement (11) d'un volume prédéfini de réactif (15) acheminant ledit volume au sein de la tête de nébulisation (2) pour sa projection, 3048285 25 le dispositif de projection (1) réalisant un contact entre le récipient (10) et la tête de nébulisation (2) pour propager les ondes émises par l'élément piézoélectrique (3) de manière à homogénéiser la concentration du réactif (15) stocké dans le récipient (10). 5 15 Dispositif de projection (1) selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend un guide d'éjection canalisant les gouttelettes générées dans une région d'impact, ledit guide comprenant une base circulaire formant une extrémité supérieure ayant une fixation pour io rendre le guide solidaire de la tête de nébulisation (2) et une seconde extrémité inférieure formant une base rectangulaire destinée à déboucher sur une lame rectangulaire dont les dimensions correspondent au prolongement des dimensions de la base rectangulaire. 15 16.Utilisation d'un dispositif de projection (1) comprenant une tête de nébulisation (2) et un élément piézoélectrique (3) pour générer un mode propre d'une membrane perforée (4) afin de projeter un réactif comprenant des anticorps dilués selon une proportion prédéfinie. 20