FR 3043558 A1 20170519 FR 1561107 A 20151118 1 Composition immunogène sous forme d'émulsion comprenant deux phases dispersées, l'une comprenant un antigène et l'autre comprenant un agent immunostimulant La présente invention concerne une composition immunogène sous forme d'émulsion comprenant une phase aqueuse continue, une première phase lipidique dispersée sous forme de gouttelettes et comprenant un antigène lié de façon covalente auxdites gouttelettes, et une deuxième phase dispersée comprenant un agent immunostimulant, son procédé de préparation et ses utilisations, notamment pour la production d'anticorps, en tant que médicament ou vaccin, ou dans une méthode d'immunisation. Afin d'améliorer leur immunogénicité, les antigènes doivent souvent être coadministrés avec des agents immunostimulants. La demande WO 201 4/1 31 809 décrit une composition immunogène comprenant une phase aqueuse continue et une phase dispersée sous forme de gouttelettes et comprenant : un lipide amphiphile, un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acide gras, un co-tensioactif comprenant au moins une chaine composée de motifs d'oxyde d'alkylène, un tensioactif porteur d'un antigène, et éventuellement un agent immunostimulant, et ses applications pour traiter ou prévenir une infection, un cancer, une maladie inflammatoire ou une allergie, pour induire une réponse immune contre l'antigène ou pour produire des anticorps. Il est de plus en plus reconnu que les cellules dendritiques jouent un rôle central, dans l'initiation des réponses immunitaires et dans les communications intercellulaires avec les lymphocytes. L'activation des cellules dendritiques est particulièrement efficace via les « Toll-like récepteurs » (TLR) dont elles sont porteuses. De fait, la littérature rapporte l'utilisation de ligand de ces TLR comme agent immunostimulant. En particulier, des nanoparticules polymériques, par exemple à base de poly(acide lactique-coglycolique (PLGA) ou à base d'un copolymère à blocs acide polylactique-cohydroxyméthylglycolique (pLHMGA), ont été utilisées pour vectoriser des antigènes, et ont été co-administrées avec un ligand de TLR à titre d'agent immunostimmulant. Les particules de PLGA se dégradent rapidement en milieu biologique. 3043558 2 Ainsi, la littérature rapporte que la réponse immunitaire induite (en termes d'anticorps spécifiques produits et de cellules T cytotoxiques activées) est considérablement améliorée lors de la co-administration d'un antigène vectorisé sur une nanoparticule polymérique et d'un ligand de TLR (libre, non vectorisé sur la 5 nanoparticule). La vectorisation de l'agent immunostimulant peut être bénéfique lorsque sont co-administrées deux types de particules polymériques distinctes : d'une part des particules vectorisant l'antigène, et d'autre part des particules vectorisant le ligand de TLR (Kasturi et Al, Nature, 470, 543-547, 2011). Les particules de PLGA utilisées avaient un diamètre de l'ordre de 300 nm. Les particules de PLGA ont généralement tendance à se 10 dégrader rapidement en milieu biologique. Bien que des particules polymériques et lipidiques soient toutes deux décrites dans la littérature comme utilisables comme vecteur d'antigène, leurs comportements en milieux biologiques sont souvent différents, notamment car leurs tailles sont différentes (les particules de PLGA sont généralement plus grosses) et car les mécanismes impliqués pour leur interaction avec les cellules de 15 l'immunité et pour le relargage de l'antigène sont différents. Par conséquent, il existe un besoin de fournir des compositions immunogènes alternatives à celles existantes, et présentant au moins l'un des avantages suivants : pouvoir être facilement utilisées pour la production d'anticorps, en tant que 20 médicament ou vaccin, ou dans une méthode d'immunisation, amplifier la réponse immunitaire, notamment par rapport à la co-administration d'un antigène vectorisé et d'un agent immunostimulant libre, être stables au stockage, notamment en évitant la fuite de l'antigène hors des vecteurs, 25 pouvoir être préparées facilement, notamment en utilisant des méthodes industrielles et sans qu'il soit nécessaire d'adapter le procédé de préparation et les composants de l'émulsion pour chaque antigène. posséder une petite taille (diamètre hydrodynamique 10 mPa.s à 25°C. Par ailleurs, lorsque l'on procède à la mesure rhéologique des modules de G' (module de conservation en cisaillement) et G" (module de perte en cisaillement), on considère que la nanoémulsion est sous forme d'un liquide visqueux lorsque G" >G'. Lorsque G' devient proche de G", la nanoémulsion est à l'état de solide viscoélastique. 25 Lorsque G" REVENDICATIONS1. Composition immunogène comprenant une phase aqueuse continue et au moins deux phases dispersées 1 et 2 sous forme de gouttelettes, où : la phase dispersée 1 comprend : un lipide amphiphile 1, un lipide solubilisant 1 comprenant au moins un glycéride d'acide gras, un co-tensioactif 1 comprenant au moins une chaine composée de motifs d'oxyde d'alkylène, un tensioactif 1 porteur d'un antigène de formule (I) suivante : (1_1-X1H1-Y1)v-G-Z1-Ag (I), dans laquelle : L1 représente un groupe lipophile, X1, Yl, Z1 et G représentent indépendamment un groupe de liaison, H1 représente un groupe hydrophile comprenant une chaîne polyalcoxylée, v est un nombre entier de 1 à 8, et Ag représente un antigène, dans laquelle le rapport molaire du tensioactif 1 porteur d'un antigène de formule (I) sur la somme du co-tensioactif 1 et du tensioactif 1 porteur d'un antigène de formule (I) est de 0,01 `)/0 à 5`)/0, et la phase dispersée 2 comprend : un lipide amphiphile 2, un lipide solubilisant 2 comprenant au moins un glycéride d'acide gras, un co-tensioactif 2 comprenant au moins une chaine composée de motifs d'oxyde d'alkylène, un agent immunostimulant 2, sous réserve que la phase dispersée 2 soit exempte de tensioactif porteur d'un antigène de formule (I). 2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle, dans la formule (I) : - L1 est choisi parmi : - un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 7 à 23 atomes de carbone, 3043558 83 un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 8 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et un poly(oxyde de propylène), et/ou 5 X1 , Y1 et Z1 sont indépendamment choisis parmi : une liaison simple, un groupe Z choisi parmi -0-, -NH-, -0(00)-, -(C0)0-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -0- (C0)-0-, -NH-(C0)-0-, -O-(CO)-NH- et -NH-(CO)-NH, un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 8 atomes de carbone 10 comprenant éventuellement un cycle (par exemple un radical ), et un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci-dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, et/ou H1 est choisi parmi un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 15 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et/ou G comprend au moins un groupe G' ayant l'une des formules suivantes : 3043558 84 /0 'ç -0 H- - N - H (XI) , 0 0 N-N H (XIII) 0 )\,.........7S- -A102 (XIV) (XV), 0 0 -S S- il \ / 0 (XVI) , H -N \ -0- C' (XX), 1\1, -N' 1\1 \-/ (XVIII) ,R102 N-(XXI) N- H -0 O ^ I /P-0- 0, (XXII) ip l' 0- (xxiii) , A100 -0- -N- -\\ (XXIV) , (XXV) , H N-0- (XXVI) (XXVII) où A102 représente CH ou N, R102 représente H ou une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, A101 représente -0-, -NH-(CO)- ou -O-(CO), Rloo représente H ou un méthyle, A100 représente -O- ou -NH- et R101 représente H, Me ou -OMe. 3. Composition immunogène selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle, dans la formule (I), le radical L1-X1-H1- consiste en l'un des groupes de formules suivantes : 3043558 dans lesquelles : - R1, R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 7 à 23 atomes de carbone, 5 A2, A3 et A4 représentent O ou NH, - m, n, o et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et - a représente un nombre entier de 20 à 120, M représente H ou un cation. 10 4. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le tensioactif 1 de formule (I) a la formule (I') suivante : O R4 0 (CI II) , a 0 0 04p (C IV) 85 Odrn (CI) RA 2y 2 O R3 A3 II H A 4 H A 0 n 2 0 Ag (r) 3043558 86 dans laquelle : R2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 7 à 23 atomes de carbone, de préférence 17, A2 représente O ou NH, de préférence NH, et 5 - n représente un nombre entier de 3 à 500, de préférence de 20 à 200, notamment 100, - Ag représente un antigène. 5. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 10 dans laquelle : le lipide amphiphile 1 et/ou le lipide amphiphile 2 est(sont) un phospholipide, et/ou le lipide solubilisant 1 et/ou le lipide solubilisant 2 est(sont) constitué(s) d'un mélange de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides 15 gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18, et/ou le co-tensioactif 1 et/ou le co-tensioactif 2 est(sont) choisi(s) parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine, les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène, et la chaîne 20 polyalcoxylée du co-tensioactif 1 et/ou du co-tensioactif 2 comprend de 10 à 200 motifs oxyde d'éthylène/oxyde de propylène. 6. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'agent immunostimulant 2 est un ligand de « Toll-like-récepteurs » (TLR), 25 notamment choisi parmi le monophosphoryl lipid A, l'oligodéoxynucléotide CpG, l'imiquimod et le resiquimod. 7. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle : 30 la phase dispersée 1 comprend un ligand biologique de ciblage 1 greffé ou non sur le co-tensioactif 1 et/ou la phase dispersée 2 comprend un ligand biologique de ciblage 2 greffé ou non sur le co-tensioactif 2, et/ou la phase dispersée 1 comprend un agent d'intérêt 1 choisi parmi un agent optique tel que un colorant, un chromophore, un fluorophore ou un agent physique, tel qu'un isotope radioactif et/ou la phase dispersée 2 comprend un agent d'intérêt 2 choisi 3043558 87 parmi un agent optique tel que un colorant, un chromophore, un fluorophore ou un agent physique, tel qu'un isotope radioactif ou un photo-sensibilisateur. 8. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 5 dans laquelle la phase dispersée 2 comprend : l'oligodéoxynucléotide CpG à titre d'agent immunostimulant 2, un co-tensioactif 2 comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène, un tensioactif 2 cationique, notamment choisi parmi choisi parmi le N[1-(2,3- 10 dioléyloxy) propyl]-N,N,N-triméthylammonium, le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium- propane, le N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethy1-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium), le 1[2-(oleoyloxy)ethy1]-2-oley1-3-(2-hydroxyethypimidazolinium, et le dioctadecylamidoglycylspermine, et éventuellement un lipide fusogène 2, tel que le dioléylphosphatidyléthanolamine. 15 9. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la phase dispersée 2 comprend : de 0,1 à 10% en poids du monophosphoryl lipid A à titre d'agent immunostimulant 2 par rapport au poids de la phase dispersée 2, et 20 de 0,1 à 40% en poids du co-tensioactif 2 par rapport au poids de la phase dispersée 2. 10. Procédé de préparation de la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant le mélange d'une émulsion 1 25 comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée 1 telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 7, et d'une émulsion 2 comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée 2 telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 5 à 9. 30 11. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour son utilisation en tant que médicament ou vaccin. 12. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour induire une réponse immune contre ledit antigène. 35 3043558 88 13. Composition immunogène pour son utilisation selon la revendication 12, pour traiter ou prévenir une infection, un cancer, une maladie inflammatoire, une allergie, une maladie liée à l'âge comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge, ou une maladie neuro-dégénérative. 5 14. Composition immunogène pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle ladite infection est une infection virale, bactérienne, parasitaire ou une maladie à prion. 10 15. Méthode de production d'anticorps polyclonaux, comprenant les étapes consistant en : (a) l'immunisation d'un animal avec une composition immunogène telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9, de manière à induire une réponse immune humorale contre ledit antigène, et 15 (b) la récolte des anticorps polyclonaux induits dirigés contre ledit antigène. 16. Méthode de production d'anticorps monoclonaux, comprenant les étapes consistant en : (i) l'immunisation d'un animal avec une composition immunogène telle que 20 définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9, (ii) récupération et isolement des lymphocytes B de l'animal immunisé à l'étape (i), (iii) production d'un hybridome et culture dudit l'hybridome afin de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène présent dans ladite 25 composition immunogène, (iv) récolte et purification des anticorps monoclonaux produits à l'étape (iii).