FR 3040175 A1 20170224 FR 1501745 A 20150819 1 Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'ADN Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la toxicologie et plus particulièrement le domaine des méthodes génotoxicologiques de laboratoire. L'invention concerne plus particulièrement une nouvelle méthode prédictive de la toxicité cellulaire après exposition à des agents chimiques cassants directement ou indirectement l'ADN (notamment certains métaux, les pesticides et certains principes actifs pour chimiothérapie) et qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques. Etat de la technique Des données de littérature de plus en plus nombreuses montrent que les cassures double-brin (CDB) sont les dommages de l'ADN les mieux corrélés à la létalité cellulaire et à la toxicité - si elles ne sont pas réparées - et à l'instabilité génomique et au risque de cancer - si elles sont mal réparées (Jeggo et Lobrich, « DNA double-strand breaks: their cellular and clinicat impact ? », Oncogene 26(56) p.7717-7719 (2007) ; Joubert et al., « Radiation biology: major advances and perspectives for radiotherapy », Cancer Radiotherapy 15(5) p.348-354 (2011). A l'origine établie pour les CDB radio-induites, une telle conclusion semble être valable pour tous les agents cassants de l'ADN. Dès lors, une évaluation du risque toxique et cancérogène basée sur la quantification des CDB et des fonctionnalités de leur voie de réparation apparaît comme prometteuse. Pourtant, la détermination des CDB et les modèles de réparation et signalisation qui les régissent sont encore loin de faire l'unanimité parmi les radiobiologistes et les génotoxicologistes. A l'inverse, certains travaux ont montré une corrélation quantitative entre le nombre de CDB non réparées et la radiosensibilité cellulaire des cellules humaines en utilisant la technique de l'immunofluorescence, et ont proposé un modèle moléculaire en opposition avec les paradigmes actuels (Joubert et al., « DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response : at least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ? », Int.J.Radiation Biology 84(2), p.1-19 (2008); Joubert, et al. (article précité de 2011)). Plus récemment, ce même groupe de chercheurs a montré des réponses spécifiques de certains tissus humains à des métaux (notamment Pb, Cd, Al) (Viau et al., « Cadmium inhibits non-homologous end-joining and over- activates the MRE11-dependent repair pathway », Mutation Research 654 p.13-21 (2008) ; Gastaldo et al., « Lead contamination resuits in late and slowly repairable DNA double-strand breaks and impacts upon the ATM-dependent signaling pathways », Toxicology Letters 173, p.201-214 (2007) ; Gastaldo et al., « Induction and repair rate of 3040175 2 DNA damage: A unified mode! for describing effects of external and internai irradiation and contamination with heavy metals », J Theoretical Biology 251 p.68-81 (2008)). Toxicité et cancer peuvent être les conséquences de différents agents externes tels que 5 les agents physiques (rayons X, particules, UV, chaleur), les agents chimiques (agents alkylants, certains principes actifs utilisés en chimiothérapie, certains métaux), les agents biologiques (comme certains virus ou bactéries). Parmi ces facteurs de stress génotoxique les radiations' ionisantes sont l'agent externe pour lequel les effets biologiques sont les mieux documentés. Toutefois, comme pour tous les autres facteurs 10 de stress, l'histoire de l'estimation du risque toxique et cancérogène a montré que des modèles moléculaires et cellulaires de la réponse au stress doivent être validés et des paramètres clairement identifiés. Il apparaît également clair que le facteur individuel constitue un facteur majeur à prendre en compte mais pose à nouveau la pertinence des modèles considérés (Dorr and Hendry « Consequential late effects in normal tissues » 15 Radiother Oncol. 61(3):223-31 (2001) ; Granzotto A et al, "Individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability: its impact on low-dose phenomena" Health Phys. 100(3):282 (2011)). Ainsi, un diagnostic fiable du risque lié à tout stress génotoxique nécessite donc de solides pré-données obtenues sur un nombre suffisant d'individus, de modèles cellulaires, avec des paramètres justifiés. 20 La littérature actuelle montre un nombre croissant d'études concernant les effets génotoxiques de certains métaux et métalloïdes (comme Al, Cd, U, As, Se et Sb) et de leurs formes nanoparticulaires associées (Polya et Charlet, « lncreasing arsenic risk ? », Nature Geoscience 2, p.383-384 (2009); Akhter et al., « Cancer targeted metallic 25 nanoparticle : targeting overview, recent advancement and toxicity concern », Curr. Pharm. Des. 17(18),p.1834-1850 (2011); Almeida et al., « ln vivo biodistribution of nanoparticles », Nanomedicine (Lond) 6(5), p.815-835 (2011); Pereira et al., "Genotoxicity of uranium contamination in embryonic zebrafish cells", Aquatic Toxicology 109, p.11-16 (2012) ; Pereira et al., "Comparative genotoxicity of aluminium and cadmium in embryonic 30 zebrafish cells", Mutation Research 750, p.19-26 (2013)), notamment concernant l'exposition par l'eau et générée par l'industrie des semi-conducteurs, ainsi que des pesticides (Garaj-Vrhovac et Zeljezic, « Evaluation of DNA damage in workers occupationally exposed to pesticides using single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Pesticide genotoxicity revealed by cornet assay », Mutation Research 469(2), p.279-285 35 (2000); Garaj-Vrhovac et al., « Efficacity of HUMN criteria for scoring the micronucleus assay in human lymphocytes exposed to a low concentration of p,p'-DDT », Braz J Med Biol Res 41(6), p.473-376 (2008); Guilherme et al., « Differential genotoxicity of Roundup ® formulation and its constituents in blood ceils of fish (Anguilla anguilla) : considerations 3040175 3 on chemical interactions and DNA damaging mechanisms », Ecotoxicology 21(5), p138190. (2012)). Or, ces deux types d'agents représentent clairement des enjeux sociétaux majeurs au vu du développement de l'industrie, de la pollution atmosphérique et du besoin d'augmentation des rendements agricoles. De fait, ils se trouvent également aux 5 centres des préoccupations de santé et dans le cadre environnemental et dans le cadre du travail. La communauté scientifique suspecte que la toxicité de certains composants nanoparticulaires oxydés pourrait engendrer génotoxicité et carcinogénèse : la recherche sur les effets biologiques spécifiques des nanoparticules s'inscrit donc naturellement dans la programmation de recherches sur les conséquences humaines et environnementales 10 d'une telle technologie. On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celle des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres 15 espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort 20 cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité (dans le cas d'une exposition aux radiations ionisantes). Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de 25 réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). On sait également que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » 30 a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inherent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621629 (1981) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell Unes is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11, p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les 35 effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu 3040175 cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. 5 Ce qui est vrai pour la radiosensibilité l'est également pour la prédisposition au cancer, et plus particulièrement au cancer radioinduit. Ainsi, tout excès de dose biologique augmente à la fois le risque toxique et le risque carcinogène. Il serait donc utile de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer le risque et l'excès de 10 dose biologique dû à l'exposition à des agents génotoxiques cassant l'ADN. Dans le cadre de leur publications (Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiat. Biol., vol. 84(2), p. 15 107-125 (2008)), une classification de la radiosensiblité humaine en 3 groupes a été proposée : Groupe I : radioresistance et faible risque de cancer, Groupe II radiosensibilité modérée et haut risque de cancer ; Groupe III, hyper-radiosensibilité et haut risque de cancer. Cette classification est basée sur des critères moléculaires ; elle permet de décrire tous les cas de radiosensibilité humaine. Une telle classification qui prend en 20 compte le facteur individuel n'existe pas pour le stress génotoxique engendré par des agents chimiques tels que les métaux et les pesticides. Un certain nombre de documents décrivent les conditions dans lesquelles H2AX est utilisée comme marqueur de la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN 25 notamment lors de l'utilisation d'agents cassants. La demande de brevet WO 2014/152873 décrit une méthode de quantification de la génotoxicité de principes actifs utilisés en chimiothérapie par la quantification de l'expression de l'histone H2AX. 30 La demande de brevet WO 2005/113821 décrit l'utilisation du marqueur y-H2AX comme moyen de détection de cassures double brin de l'ADN dans des méthodes pour identifier les produits du tabac les moins toxiques. Dans ces méthodes, la fumée de tabac est mise au contact des cellules pendant une durée prédéterminée (15 minutes, 20 minutes, 30 35 minutes, 40 minutes ou une heure). La présence ou absence de foci de y-H2AX est vérifiée par immunofluorescence. Cependant cette méthode concerne un cocktail de produits chimiques dont on n'identifie pas l'agent cassant de manière exact. 3040175 5 Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate qu'il n'existe pas de méthode de quantification de l'excès de dose biologique et du risque lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN. Pour ces agents, le problème de fournir une méthode prédictive de la génotoxicologie individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La 5 présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive du risque de toxicité lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN. Objets de l'invention Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que les 10 cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages les plus prédictifs de la génotoxicité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Dans le cadre de la présente invention les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit de recombinaison MRE11- 15 dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM et constitue le facteur individuel. Le marqueur pH2AX indique un site de CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE11 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE11-dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et 20 l'inhibition de la voie MRE11-dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress induisant des CDB et produisant une oxydation dans le cytoplasme. 25 Les inventeurs ont montré que ces modèles sont valables pour un grand nombre d'agents chimiques et biochimiques cassant l'ADN comme les métaux, les pesticides, les nanoparticules et certaines drogues chimiothérapiques. Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène génotoxique, il 30 faut tenir compte : - d'une part, de l'état spontané de l'ADN, - d'autre part, de son état stress-induit. Par ailleurs, après l'exposition à un stress génotoxique, il faut tenir compte de la 35 réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend de la nature du stress mais aussi potentiellement de la nature du tissu impacté. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une sensibilité exceptionnelle. 3040175 Enfin, afin de mieux appréhender les différences inter-individuelles, il faut construire un système basé sur une dose ou une concentration de référence pour mieux quantifier les phénomènes à partir d'une même base. 5 Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur : (i) La préparation d'un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules non transformées, prélevées sur un individu, par exemple de cellules 10 issues de biopsies de peau de l'individu concerné mais aussi de cellules témoins dites de référence considérées comme résistantes au stress cassant considéré (ex : cellules d'individu Groupe I) ; (ii) La détermination d'une concentration de référence après exposition de 15 l'échantillon cellulaire issu des cellules de référence (Groupe I) au stress donné. A noter que cette étape peut avoir été déjà effectuée et être contenue dans une base de données du laboratoire inventeur ; (iii) La définition d'un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines 20 quiescentes ; (iv) Des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB sur les cellules de l'individu considéré à la concentration de référence définie plus haut. 25 Un premier objet de l'invention est donc un procédé pour prédire la sensibilité d'un individu envers un stress cassant l'ADN à partir d'un échantillon cellulaire issu de cellules (de préférence de cellules de peau) prélevé sur l'individu et de la définition d'une concentration de référence à laquelle les expériences sont réalisées. 30 dans lequel procédé : (Etape dite de définition des références) 35 (i) si la concentration de référence n'a pas été déjà déterminée pour l'agent chimique ou biochimique à étudier, on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (groupe I de sensibilité) ; on applique plusieurs concentrations à l'intérieur d'une large 3040175 7 gamme de concentration dudit agent cassant (ladite gamme de concentration allant par exemple du pM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h) sur cet échantillon cellulaire ; on procède à une immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI qui permet 5 également sur le même échantillon cellulaire l'analyse de micronoyaux pour toutes les concentrations appliquées. (ii) Soit le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé 10 NpH2AX(t, C)), soit le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)), soit l'écart-type a correspondant à l'erreur commises sur ces mesures respectives qui doivent être effectuées sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou 3 expériences indépendantes de 50 noyaux 15 (écart-type de la moyenne). (iii) La concentration de référence dite Cref est la concentration qui donne : NpH2AX(24h, Cref) ÷ 2a = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2 a = 0,5% ; 20 (Etape dite d'estimation du risque) (iv) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules prélevées sur l'individu considéré. On applique à cet échantillon cellulaire la concentration de référence Cref définie plus haut pendant une 25 durée prédéterminée (de préférence 24 h). On procède ensuite à une détermination de l'immunofluorescence ipH2AX avec contre-coloration au DAPI. (v) On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2AX(24, Cref) et NMN(t, 24h). 30 (vi) Si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) É 2 ou bien NMN(24h, Cref) 0,5% , alors le risque génotoxique est considéré comme faible et dit « de Groupe I » (vii) Si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) >8 ou bien NMN(24h, Cref) > 10%, alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de 35 Groupe III » 3040175 8 (viii) Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe Il ». Un autre objet de l'invention est un procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes : (a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite 10 combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ; (b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ; (c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans 15 sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ; (e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e). 20 Ledit agent chimique peut être, à titre d'exemple, un anion métallique ou non métallique, un cation non-métallique, un anion organique, un cation organique, un composé zwitterionique, un composé inorganique neutre ou non, un composé organique neutre ou non, un organo-métallique, un composé insoluble ; ledit agent chimique peut être présent 25 par exemple sous forme dissout dans un milieu liquide (aqueux ou non-aqueux), sous forme de particules, sous forme de nanoparticules, fixé sur un membrane cellulaire, sous forme gazeuse. Ledit agent biochimique peut être, à titre d'exemple, un peptide (recombinant ou non), un anticorps, un antigène, un virus (désactivé ou non), un fragment de virus, un fragment 30 cellulaire. Avantageusement le procédé selon l'invention comprend en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite 3040175 9 combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail. Selon l'invention, la détection des cassures double brin à l'étape (e) se fait avantageusement en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, 5 l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ pulsé. Dans un mode de réalisation on détecte à l'étape (e) au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1, Phospho-DNAPK, MDC1. De manière avantageuse on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré on 10 procède à une contre-coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN). Dans un mode de réalisation on détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de micronoyaux (MN), et on détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2AX(24, Cref) et 15 NMN(t, 24h) ; si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) s 2, ou bien si NMN(24h, Cref) s 0.5%, alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I » ; si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) >8, ou bien NMN(24h, Cref) > 10%, alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de Groupe III » ; pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ». 20 A l'étape (e) du procédé selon l'invention la concentration de travail est avantageusement une concentration de référence Cref préalablement déterminée. Cette détermination se fait avantageusement par un procédé dans lequel : (i) on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en 25 plusieurs fractions ; (ii) on applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du pM au mM) pendant une durée 30 prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ; (iii) on détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ; (iv) On détermine : 3040175 10 o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NpH2AX(t, C)), (cette détermination se faisant de préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au 5 DAPI), o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)), o l'écart-type o sur ces mesures respectives, sachant que ces mesure 10 sont être effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne), o la concentration de référence dite Cref en tant que la concentration qui donne : NpH2AX(24h, Cref) + 2a = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 20 = 15 0,5%. Dans un mode de réalisation du procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissue prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques : 20 (i) on isole et/ou amplifie des cellules issues dudit tissue prélevé, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) lesdits temps d'observation t 25 étant le temps t=0 min (appelé tO, état non exposé à ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) et au moins un temps d'observation t4 après la mise en contact dudit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa 30 concentration de travail pendant une durée prédéterminée (cette mise en contact étant appelée ici « exposition génotoxique »); (iii) on détermine le groupe de sensibilité de l'échantillon à l'exposition génotoxique, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t) ; 3040175 11 t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; Dans un mode de réalisation on détermine en plus sur ledit échantillon cellulaire le 5 nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé NMN(t)), les temps t étant au moins tO (non irradié) et t4 après exposition avec une dose absorbée D. Dans cadre de la présente invention, le critère de Groupe peut être défini selon des critères cliniques : Groupe I = absence de signes cliniques ; Groupe Il = présence de 10 signes cliniques ; Groupe III = effet létal. Description détaillée Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain. 15 1. Préparation de l'essai Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que lesdits opérateurs puissent prendre les mesures appropriées 20 de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire. Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon de tissu servant à la préparation de l'échantillon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom 25 « punch dermatologique ». L'échantillon de tissu est placé dans du milieu DMEM+20% (sérum de veau fétal stérile). L'échantillon de tissu est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante. Dès réception, l'échantillon de tissu (typiquement la biopsie) est établi sous la forme d'une 30 lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'Elkind et al. « The radiobiology of cultured mammalien cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est suffisant (typiquement après 1 à 3 3040175 12 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. On prépare un échantillon cellulaire : Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles sont contaminées avec des métaux ou des pesticides ou tout autre agent chimique ou biochimique cassants 5 pour l'ADN à différentes concentrations. Une autre partie n'est pas contaminée; elle représente l'état spontané. Pendant la contamination, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules contaminées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état 10 après un temps d'incubation avec l'agent chimique ou biochimique cassant l'ADN. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX. Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (Bodgi et al, «A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical definition of individuel 15 radiosensitivity », J Theor Biol. 21 p 333:135-45.2013) : les cellules sont fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgC12, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-Oct-C6I-14- 20 (OCH2CH2)x0H avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1, fourni par exemple par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture sont lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par exemple par Sigma Aldrich) et a été 25 suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX sont utilisés à une concentration de 1 :800. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1:100, fournis par exemple par Sigma Aldrich) sont effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du VectashieldîM contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. 30 La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase G1 (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles). L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à 35 immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en Go/G, pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de 3040175 13 préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles. Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (exposition) indépendantes sont 5 effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée. 2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques 2.1 Généralités et marqueurs utilisés 10 L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour un des deux marqueurs pH2AX sur des cellules non-contaminées (état spontané) et contaminées. La méthode est basée sur l'étude du marquage par ce marqueur pour une durée de contamination donnée : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à 15 compter de l'arrêt de la contamination, et on étudie leur immunofluorescence. Les moyennes obtenues pour chaque point et chaque dose avec chaque marqueur sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). 20 pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés. 25 La contre-coloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire pour quantifier les micronoyaux, qui sont des marqueurs cellulaires complémentaires aux données sur les foci. 30 2.2 Paramètres biologiques et cliniques On définit et détermine comme indiqué : 35 - Noi2Ax(t), les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX aux temps d'observations tO (non contaminé) et t4 sachant que la 3040175 14 détermination du paramètre NpH(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention, - NMN(t) le nombre de micronoyaux observés spontanément (à t = tO, i.e. 5 contamination) ou à t = t4 après contamination pour 100 cellules (en %). Le procédé selon l'invention montre que la sensibilité tissulaire à un métal donné varie en fonction du tissu d'intérêt. Par exemple des astrocytes contaminés avec 100 pM d'aluminium présentent moins de cassures (cellules HA, 2 foci de H2AX) comparés à des 10 cellules endothéliales pour la même concentration (cellules HMEC, 3,7 foci de H2AX) (cf tableau 1). De plus, pour certains métaux, les inventeurs ont montré qu'il existait une correspondance entre l'échelle unique de toxicité proposée et certains signes cliniques décrits par exemple dans le cas du plomb (saturnisme) ou dans le cas du cadmium (maladie d'Itai-ltai) (cf tableau 3). 15 Le procédé selon l'invention permet de montrer également que des cellules contaminées avec du cuivre présentaient pour la plus forte concentration testée (1 mM) un nombre de cassures de l'ADN visualisées par des foci de H2AX allant de 2 à 21 foci selon le type cellulaire testé (cf. tableaux 1 et 2). 20 On note que le procédé selon l'invention est tellement sensible qu'il permet de caractériser l'impact sur un tissu d'agents chimiques cassant l'ADN dans des concentrations très faibles, qui sont de l'ordre de grandeur des valeurs limites réglementaires pour certains agents chimiques dans l'eau potable ; ces valeurs limites 25 sont par exemple de l'ordre de 2 mM (2 mg/L) pour le cuivre, 200 pM pour l'aluminium, 5 pM pour le cadmium, 10 pM pour le Pb. 2.3 Evaluation prédictive Elle vise la prédiction de paramètres cliniques à partir des données biologiques 30 mesurées. Un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; celui-ci concerne le critère suivant : (i) La classification du patient dans un Groupe I, Il ou III (critère appelé GROUPE) : 35 La définition des groupes de sensibilité (GROUPE) aide le médecin à déterminer à partir des scores selon l'invention et du tableau clinique du 3040175 15 patient des analogies avec des syndromes génétiques connus. Ces groupes ont été définis initialement dans la publication de Joubert et al. (Int. J. Radiat. Biol. 84(2), p. 107-125 (2008), citée ci-dessus. Selon la présente invention, on considère que : 5 Si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) 8 ou bien NMN(24h, Cref) > 10% , alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de Groupe III » Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe II ». Exemples Les tableaux qui suivent résument les résultats de nombreuses expériences qui ont été exécutées tel que décrit dans la partie « Description détaillée » ci-dessus. 10 15 3040175 16 Tableau 1 : Métaux Lignée Agent cassant Marqueur Concentration [pM 3 10 30 100 300 1000 Ha AICI3 y-H2AX 0,34 0,88 1,37 2,18 2,96 6,04 Micronoyaux 10 15 16,7 46,7 56,7 70 Cu y-H2AX 0,3 0,62 2,55 0 0 Micronoyaux 4 5 13 20 50 Hah AICI3 y-H2AX 0,07 0,68 0,83 1,22 1,77 2,28 Micronoyaux 2 2 4 6 20 30 Cu y-H2AX 1,01 1,87 2,62 5,45 6,61 Micronoyaux 6 10,7 20,7 46,7 73,3 Hasp AICI3 y-H2AX 0,84 0,46 0,74 2,15 1,7 1,62 Micronoyaux 2 4 4 7,3 8,7 13 Cu y-H2AX 0,29 0,64 1,13 1,78 2,36 Micronoyaux 4 7 9 10 16 AICI3 y-H2AX 3,2 3,2 5,7 3,7 4,5 9,9 Micronoyaux 1,75 3,75 5 4,33 7,33 11,5 CuCl2 y-H2AX 1,6 1,9 1,6 1,5 5,3 21,4 Micronoyaux 4 6,7 5,3 6,7 7,3 4 CuSO4 y-H2AX 1,9 2,3 3,4 6,4 20,1 30,2 Micronoyaux 3 5 4,7 5,3 9,3 4 Pb(NO3)2 y-H2AX 4 7,5 15 21 Micronoyaux 0 7 12 20 10 CdCl2 y-H2AX 2,5 3,7 8,3 Micronoyaux 3,5 9 12,25 Cd- acétate y-H2AX 5 5,5 7 Micronoyaux 5 10 10 Cd- acetate- citrate y-H2AX 1 4,75 7 Micronoyaux 3040175 17 Tableau 2 : Pesticides Concentration [PMI Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 3 10 30 100 150 300 04PSL Glyphosate micronoyaux 1 6 4 10 12 14 yH2AX 0 1,7 1,9 4,8 6,5 8,7 Concentration [pMj 5 10 Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,3 1 01PAU Permethrine micronoyaux 2 2 2 4 6 yH2AX 0 0,1 0,2 1,3 1,8 Concentration [pM] 10 3 Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,3 1 08HNG Thiobendazole micronoyaux 0 2 4 10 10 yH2AX 0 1,8 2 4,3 6 Concentration [pMl Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,3 3 10 30 50 100 1BR3 PCP micronoyaux 1 2 4 10 10 20 yH2AX 0 1,2 1,5 1,9 4,3 Concentration [pM] Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,01 0,1 0,3 1 10 20 30 1BR3 Atrazine micronoyaux 1 5 6 13,5 15 40 yH2AX 1 1,3 1,8 3,1 3,5 3040175 18 Tableau 3: Exemples numériques de correspondance entre l'échelle unique de toxicité selon l'invention et les signes cliniques correspondants Espèce chimique Concentration de référence Prévision à partir de l'algorithme Effets cliniques observés Cref Plomb 8 Cadmium 10 pM Risque « Groupe II » prévu entre 10 et 100 pM Concernent les expositions qu'ont subi certains habitants de la préfecture de Toyama (Japon) suite à une intoxication générale au cadmium (Maladie Itai-Itai) [sel utilisé : CdC12] NpH2Ax(24h) 8 Chrome 3 nM Risque « Groupe II » prévu entre 3 et 30 nM Intoxiqués de Hinkley (USA, affaire Erin Brockovich) avec 1,19 g/I dans les eaux de puits correspondant à 4,6 mM. La concentration dans l'eau du robinet a été estimée à 23 Nm. [sel utilisé : Na2Cra4] NpH2Ax(24h) 8 Où le critère GROUPE est défini comme suivant : GROUPE I = absence de signes cliniques GROUPE II = présence de signes cliniques GROUPE III = effet létal REVENDICATIONS1. Procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes : (a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ; (b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ; (c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ; (e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e). 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte les cassures double brin en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ pulsé. 4. Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1, PhosphoDNAPK, MDC1. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel on procède à une contre- coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel : 3040175 20 - A l'étape (e) la concentration de travail est une concentration de référence Cref préalablement déterminée, On détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de 5 micronoyaux (MN) On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2AX(24, Cref) et NMN(t, 24h), o et si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) 5 2, ou bien si NMN(24h, Cref) 5 0.5%, 10 alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I», o si pour l'échantillon cellulaire NpH2AX(24h, Cref) >8, ou bien NMN(24h, Cref) > 10% , alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de 15 Groupe III », o pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ». 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite concentration de travail est une concentration de référence Cref déterminée par un procédé 20 dans lequel : (y) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en plusieurs fractions ; (vi) On applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou 25 biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du pM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ; 30 (vii) On détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ; (viii) On détermine : o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NpH2AX(t, C)), (cette détermination se faisant de 3040175 21 préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI), o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)), o l'écart-type o sur ces mesures respectives, sachant que ces mesure sont être effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne), o la concentration de référence dite Cref en tant que la concentration qui donne : NpH2AX(24h, Cref) + 20 = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2a = 0,5%.