FR 3041974 A1 20170407 FR 1502060 A 20151002 1 EQUIVALENT DE DERME COMPRENANT DES CELLULES DE TYPE SKP, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES UTILISATIONS L'invention concerne le domaine de la dermo-cosmétique et se rapporte à un modèle in vitro d'équivalent de derme, son procédé de préparation et ses utilisations pour réaliser des études scientifiques ou pour évaluer l'effet de produits pour application topique ou administration systémique, dans le domaine cosmétique. L'invention concerne plus particulièrement un équivalent de derme in vitro en 3 dimensions (3D) comprenant des fibroblastes dermiques et des cellules de type SKP, inclus dans une matrice de fibres, tels que le collagène et les fibres élastiques, son procédé de préparation et ses utilisations pour étudier les interactions des cellules dans cette matrice, son utilisation pour l'étude in vitro de la biologie de la peau et son utilisation pour évaluer l'efficacité de principes actifs cosmétiques. L'invention concerne également un équivalent de peau multicouche comprenant un équivalent de derme surmonté d'au moins une couche de cellules épidermiques. Depuis de nombreuses années, on a cherché à développer des modèles de derme ou de peau entière reconstruits in vitro reproduisant les caractéristiques du tissu in vivo, afin d'effectuer des études sur le rôle du derme et le fonctionnement de la peau. Ainsi, plusieurs modèles in vitro en 3D mimant le derme humain ont été mis au point, dans le but de servir de support au développement ultérieur d'épidermes différenciés. Les équivalents de derme sont généralement composés d'un substrat naturel ou synthétique pouvant être acellulaire ou destiné à 3041974 2 être colonisé par des fibroblastes. Un des modèles les plus couramment décrit se compose d'une matrice de collagène comprenant des fibroblastes d'origine humaine (Bell et al., 1979 ; brevet US 5,639,654). A partir de ce modèle, des 5 modifications de la structure du collagène par glycation ou par dégradation enzymatique ont été décrites afin de créer des peaux artificiellement vieillies (brevet US 6,890,754). D'autres réalisations ont consisté à introduire dans la matrice de collagène des fibres élastiques (collagène III, chitosan, 10 chondroitines, élastines) ou d'autres types de fibroblastes dermiques d'origines réticulaires et papillaires, pour mimer plus étroitement la structure du derme humain (brevet US 6,497,875). On connait par ailleurs, des brevets US 6,497,875 et 15 KR818636, des équivalents de dermes composés de collagène, de fibroblastes et de cellules souches mésenchymateuses (MSC), ces dernières étant utilisées pour leur capacité à favoriser la cicatrisation. Les cellules MSC sont des cellules souches multipotentes présentes dans de nombreux organes et, entre 20 autre, dans le derme foetal ou le derme d'individus de moins de 20 ans (Meirelles et al. 2006). Néanmoins les cellules MSC sont difficiles à isoler et présentent une forte hétérogénéité quant à leur capacité proliférative et leurs voies de différentiation. Les cellules MSC issues de moelle osseuse ou 25 de tissus adipeux, dans des conditions de culture particulières, peuvent se différencier en colonies de fibroblastes (CFU-F) ; Les cellules sont alors individualisées, adhèrent à leur support et poussent en monocouche comme a pu le montrer Friedenstein (1970) chez les rongeurs. 30 Les cellules SKPs (Skin Derived Precursors) sont des cellules souches multipotentes distinctes des MSC. Elles ont été 3041974 3 décrites pour la première fois par (Toma et al. 2001) dans le derme de jeunes souris puis dans le derme humain. Elles résident principalement dans le derme et ont la capacité de se différencier en fibroblastes, adipocytes, mélanocytes, cellules 5 musculaires lisses, ostéocytes, chondrocytes, cellules neuronales et gliales aussi bien qu'en cellules hématopoïétiques. Les SKPs ont ensuite été identifiées dans les follicules pileux où elles jouent un rôle dans la morphogenèse du follicule, dans la cicatrisation ou encore se différencier 10 en cellules neuronales pour innerver le follicule en développement (Fernandes et al. 2004, Toma et al. 2005). Ces cellules peuvent induire la neo-formation de follicules pileux après réintroduction conjointe de cellules SKP et de kératinocytes dans la peau de mammifère, tel que décrit dans le 15 brevet US 8,617,882. Les cellules SKPs portent des marqueurs antigéniques spécifiques et, à la différence des cellules souches de type MSC, ont la particularité de se multiplier en suspension, sous forme d'amas multicellulaires sphériques (dénommés sphères) 20 pouvant mesurer de quelques dizaines à quelques centaines de micromètres, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu de culture approprié (Toma et al. 2001). Les cellules SKPs expriment certains marqueurs spécifiques, tels que la Nestine, la Fibronectine et la Vimentine, des 25 protéines des filaments intermédiaires, le Versican : un proteoglycanne de la matrice extracellulaire, l'OCT4, le SOX2 ou encore Nanog (Li et al. 2010). Dans leurs travaux, Li et ses collègues décrivent des conditions particulières de culture des cellules SKPs qui induisent leur différenciation en 30 mélanocytes, puis leur migration dans le compartiment épidermique. 3041974 4 Le nombre de cellules SKPs dans le derme et les follicules pileux est très faible, ce qui rend leur étude assez difficile, en particulier chez l'adulte car leur nombre diminue avec l'âge (Ruetze et al. 2013). 5 Dans une publication récente, Wenzel et ses collègues (2012) ont mis en évidence qu'une sous-population très minoritaire de cellules SKPs se maintenait dans des cultures de fibroblastes dermiques y compris après plus de 20 passages en culture et qu'il était possible d'isoler cette sous population de cellules 10 grâce à leur capacité à résister à un choc thermique froid, contrairement aux fibroblastes dermiques. Après un choc thermique de plusieurs heures à 4°C, environ 85% des fibroblastes dermiques meurent et environ 15% des cellules survivent. Les cellules survivantes, ayant conservées un 15 potentiel prolifératif de cellules souches, peuvent être subcultivées en suspension jusqu'à former des sphères multicellulaires pouvant atteindre 300 pm de diamètre après 3 semaines de culture. Par ce procédé, le nombre de sphères obtenu est très important, car les cellules ont été 20 préamplifiées par plusieurs passages en culture. Ainsi, le rendement d'obtention de sphères à partir d'un échantillon de peau adulte est considérablement augmenté par rapport à la technique d'isolement direct des cellules SKPs à partir de peau adulte. Wenzel et al. (2012) ont montré que les cellules 25 présentes dans les sphères possèdent les mêmes caractéristiques morphologiques que les cellules SKPs issues directement du derme, expriment les mêmes marqueurs, tels que la Nestine, la Fibronectine, la Vimentine et l'OCT4 et sont les progénitrices des cellules de type fibroblastes ou encore des cellules 30 musculaires lisses. 3041974 Néanmoins la similitude absolue entre les cellules SKPs directement issues du derme ou des follicules pileux et les cellules préamplifiées obtenues par la technique décrite par Wenzel n'ayant pas été établie, ces cellules sont dénommées 5 SKP-like dans la présente invention. Selon l'invention les cellules SKPs sont définies comme des cellules souches isolées du derme jeune ou adulte selon la technique décrite par Toma et al. en 2005, et ayant la capacité, lorsqu'elles sont cultivées en milieu de culture 10 composé de DMEM et de HAM F12 dans un ratio 3:1 (DMEM/HAM F12 3:1), enrichi en facteurs de croissance EGF et FGF2 et hormones (mélange B27®) de se multiplier en suspension sous forme de sphères multicellulaires. Selon l'invention, les cellules SKP-like sont définies comme 15 des cellules ayant un potentiel de cellules souches, obtenues à partir de culture de fibroblastes dermiques (jeunes ou adultes, de tous sexes, de toutes origines corporelles et de toutes ethnies) et isolées après un choc thermique froid, selon le protocole développé par Wenzel et al. (2012). 20 Selon l'invention, l'expression « cellules de type SKP » désigne indifféremment les cellules SKPs et les cellules SKPlike. Il s'agit de cellules souches adultes ou de cellules ayant conservé un potentiel prolifératif de cellules souches, c'est-à-dire ayant la capacité de se multiplier en suspension 25 sous forme de sphères multicellulaires, lorsqu'elles sont cultivées en milieu de culture DMEM/HAM F12, 3:1 enrichi en facteurs de croissance EGF et FGF2 et hormones (mélange 327(D). Considérant ce qui précède, un des problèmes que se propose de résoudre l'invention est de produire un équivalent de derme 30 in vitro, en 3 dimensions, facile à mettre en oeuvre, comprenant 3041974 6 des fibroblastes dermiques et des cellules de type SKP, utilisable en cosmétique pour évaluer l'efficacité de principes actifs ou étudier les interactions entre les cellules souches dermiques et les fibroblastes, ainsi qu'entre les cellules 5 souches dermiques et les cellules épidermiques, par exemple les kératinocytes et les mélanocytes. Ainsi un des buts de l'invention est de reconstruire un équivalent de derme in vitro en 3D, comprenant des fibroblastes dermiques et des cellules de type SKP provenant de donneurs de 10 tous âges, de tous sexes et de toutes ethnies. L'invention a pour premier objet un équivalent de derme in vitro en 3D comprenant des cellules de type SKP et des fibroblastes dermiques inclus dans une matrice de collagène, selon un ratio compris entre 1/100 (1 sphère de cellules de 15 type SKP pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère de cellules de type SKP pour 10000 fibroblastes). Préférentiellement, les équivalents de derme sont caractérisés en ce que le ratio de cellules de type SKP et de fibroblastes dermiques est de 1/100 (1 sphère de cellules de 20 type SKP pour 100 fibroblastes). Préférentiellement, les équivalents de derme sont maintenus en culture dans un milieu DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal 10 à 15 %. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les 25 fibroblastes dermiques et les cellules de type SKP sont d'origine humaine. Le rôle des cellules SKPs dans le derme est très important puisque ce sont, entre autre, les cellules progénitrices des 3041974 7 fibroblastes, toutefois leur très faible concentration les rend assez difficiles à isoler ou à étudier in situ dans le derme. De ce fait, les cellules SKP-like peuvent être utilisées avantageusement pour leur facilité d'obtention et leur grande 5 similitude avec les cellules SKPs. En suivant le protocole de Wenzel et al. (2012) il est possible d'obtenir des sphères de cellules SKP-like à partir de culture de fibroblastes dermiques humains normaux cultivés en monocouche. Les fibroblastes dermiques sont isolés à partir d'échantillons de derme selon 10 des techniques standards bien connues de l'homme du métier, par exemple par méthode enzymatique (trypsine/EDTA) ou par des méthodes organotypiques (isolement des fibroblastes par migration naturelle depuis le tissu dermique) puis cultivés en monocouche dans du milieu DMEM supplémenté en sérum de veau 15 foetal (SVF). Les fibroblastes dermiques ainsi obtenus sont mis en suspension à une concentration comprise entre 10000 et 10 000 000 cellules/ml dans du PBS et soumis à un choc thermique à 4°C pendant 24h. Les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture DMEM/HAM F12 3 :1 20 supplémenté en facteurs de croissance EGF et FGF2 et en un mélange d'hormones B27® et cultivées de façon à éviter l'adhésion des cellules. Dans ces conditions, les cellules SKPlike se développent en suspension sous forme de sphères multicellulaires. 25 A partir d'un seul donneur jeune ou adulte, il est ainsi possible d'obtenir plus de 15% de cellules SKP-like par rapport au nombre total de cellules amplifiées par culture en monocouche, alors que l'on ne peut obtenir que quelques pourcents de cellules SKPs après un isolement direct à partir 30 de peau. 3041974 8 La plus grande facilité d'obtention des cellules SKP-like par rapport aux cellules SKPs, permet de simplifier énormément la préparation d'équivalent de derme selon l'invention. Il est par exemple possible à partir d'un seul échantillon de peau, y 5 compris de peau adulte, de préparer un nombre suffisant de fibroblastes dermiques d'une part et de cellules SKP-like d'autre part pour réaliser un nombre important d'équivalent de derme selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, 10 l'équivalent de derme selon l'invention est réalisé à partir de fibroblastes dermiques et de cellules SKP-like d'origine autologues, c'est-à-dire issues du même donneur. Pour réaliser l'équivalent de derme selon l'invention, il est possible d'utiliser du collagène de type I d'origine bovine, 15 humaine, murine ou d'autres espèces. Préférentiellement, l'équivalent de derme selon l'invention est réalisé à l'aide d'une solution de collagène de type I d'origine bovine. Alternativement, pour réaliser l'équivalent de derme selon 20 l'invention il est possible d'utiliser, outre le collagène de type I, du collagène de type III et d'autres fibres élastiques préférentiellement de la même origine que le collagène I. L'invention a pour 2eme objet un procédé d'obtention d'un équivalent de derme, comprenant les étapes suivantes : 25 a) Une suspension de fibroblastes dermiques cultivés jusqu'au 20eme passage, à une concentration de 100000 à 500000 fibroblastes / ml dans du milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal est préparée extemporanément, 3041974 9 b) Des sphères de cellules de type SKP d'une taille au moins égale à 50 }gym sont préparées en suspension dans du milieu pour cellules SKP composé de milieu DMEM/HAM F12, 3 :1, supplémenté en facteurs de croissance EGF et FGF2 et en mélange d'hormones 5 E27®, c) Pour la préparation des équivalents de derme, une solution de collagène de concentration comprise entre 1 et 10mg/ml, est mélangée à du DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal, puis les fibroblastes dermiques humains normaux 10 (100000 à 500000 / ml) de l'étape a) et les sphères de cellules de type SKP obtenues à l'étape b), sont ajoutés, afin d'obtenir un ratio compris entre 1/100 (1 sphère pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère pour 10000 fibroblastes) et enfin un volume suffisant d'une solution de soude (NaOH) 1N est ajoutée 15 au mélange pour amener le pH à 7, d) La solution obtenue à l'étape c) est déposée dans des puits puis recouverte avec du milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10% sérum de veau foetal. De préférence, le milieu de culture des fibroblastes pour 20 réaliser l'étape a) est du DMEM lg/L supplémenté avec 10% de sérum de veau spécial. Pour l'étape a) les fibroblastes dermiques sont amplifiés en culture, dans du milieu de culture pour fibroblaste classique, jusqu'au 20eme passage, puis, lorsqu'ils arrivent à un stade 25 compris entre 80 % de sub-confluence et la confluence, sont détachés par un traitement à la trypsine, lavés et remis en suspension dans du milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal (SVF) à une concentration de 100000 à 500000 fibroblastes / ml. 3041974 10 Pour l'étape b) les cellules de type SKP sont cultivées en suspension pendant 1 à 3 semaines, jusqu'à la formation de sphères de taille minimum 50 pm, puis les sphères sont séparées de leur milieu de culture par centrifugation douce (1000 RPM), 5 resuspendues dans 1 ml de milieu pour cellules SKP composé de milieu DMEM/HAM F12, 3 :1, supplémenté en facteurs de croissance EGF et FGF2 et en mélange d'hormones B27® et comptées, De préférence, les cellules de type SKP de l'étape b) sont 10 des cellules SKP-like, obtenues à partir d'une culture de fibroblastes dermiques à sub-confluence (80%) ou à confluence, détachés par un traitement à la trypsine, lavés et remis en suspension, puis soumis à un choc thermique froid à 4°C afin d'isoler les cellules possédant encore un potentiel cellules 15 souches SKP. De manière encore plus préférentielle, lorsque les fibroblastes de l'étape a) arrivent à sub-confluence (80%) ou confluence, une partie de ces fibroblastes est soumise à un choc thermique froid à 4°C selon l'étape b) et l'autre partie 20 des cellules est remise en culture dans du milieu de culture pour fibroblastes pour être cultivée en monocouche. L'étape c) de préparation des équivalents de derme est dans ce cas là réalisée avec des fibroblastes dermiques et des cellules SKPlike provenant du même donneur de départ, c'est-à-dire 25 autologues. Pour l'étape c) de préparation des équivalents de derme, une solution de collagène de concentration comprise entre 1 et l0mg/ml, selon la consistance du derme souhaitée, est mélangée à du DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal 30 (SVF), puis les fibroblastes dermiques humains normaux (100000 3041974 11 à 500000 / ml) de l'étape a) et les cellules de type SKP obtenues à l'étape b), sous forme de sphères multicellulaires, sont ajoutées, afin d'obtenir un ratio compris entre 1/100 (1 sphère pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère pour 10000 5 fibroblastes) et enfin un volume suffisant d'une solution de soude (NaOH) 1N est ajouté au mélange pour amener le pH à 7 ; L'étape c) est réalisée sur de la glace, afin d'éviter que le collagène ne gélifie trop rapidement. La gélification de l'équivalent de derme se produit après 30 10 à 60 minutes à 37°C, 5% de CO2 dans un incubateur, puis on observe une contraction de l'équivalent derme qui commence 1h à 24h après la gélification. Pour l'étape d), la solution obtenue à l'étape c) est déposée dans des puits (par exemple des plaques 6, 12 ou 24 puits, 15 selon la taille de l'équivalent de derme souhaité) puis recouverte avec du milieu de culture DMEM 1g/L supplémenté avec 5 à 10% sérum de veau foetal. Pour réaliser l'invention, la solution de collagène utilisée à l'étape d) du procédé peut comprendre du collagène de type I 20 d'origine bovine, humaine, murine ou de tout autre espèce. Préférentiellement, le collagène utilisé est du collagène de type I d'origine bovine. Alternativement, la solution de collagène utilisée pour réaliser l'étape d) du procédé peut comprendre, outre le 25 collagène de type I, du collagène de type III et d'autres fibres élastiques préférentiellement de la même origine que le collagène I A l'inverse d'autres techniques de l'art antérieur utilisant des cellules souches multipotentes (MSC), le procédé de la 3041974 12 présente invention permet d'obtenir, en quantité suffisante, une population homogène de cellules souches SKP-like. Un des avantages de l'invention est ainsi d'obtenir aisément des cellules présentant les mêmes caractéristiques que les cellules 5 SKPs. L'invention a pour 3eme objet, l'utilisation d'équivalents de derme selon l'invention pour réaliser des études scientifiques, par exemple sur les interactions entre les populations de cellules de type SKP et de fibroblastes dermiques dans une 10 matrice extracellulaire composée de collagène de type I et/ou III d'origine bovine, humaine, murine ou d'autres espèces et comprenant éventuellement d'autres fibres élastiques préférentiellement issues de la même origine animale que le collagène de type I. 15 En effet, L'inclusion des cellules en 3 Dimensions (3D) permet d'étudier ces populations de cellules dans un environnement matriciel proche du derme in vivo. Il est ainsi possible de réaliser des études dans le domaine du vieillissement de la peau. 20 L'invention a pour 4' objet, l'utilisation d'équivalents de derme selon l'invention pour évaluer l'efficacité de principes actifs cosmétiques, et en particulier sur les cellules de type SKP. Il est ainsi possible d'étudier l'impact de principes actifs cosmétiques sur les cellules de type SKP. 25 L'invention a pour 5eme objet, l'utilisation d'équivalents de derme selon l'invention pour réaliser des études en 3 dimensions des cellules de type SKP en fonction du type de donneurs (âge, ethnies, phototype particulier, origine de la biopsie, sexe). 3041974 13 En effet, quand les équivalents de derme sont réalisés à l'aide de cellules SKP-like, un grand nombre d'équivalents de derme peuvent être produit à partir d'un seul échantillon de peau, ce qui permet de réaliser une étude approfondie, par 5 exemple, de l'influence de ratios fibroblastes/SKP-like. Un autre problème que se propose de résoudre l'invention est de produire un équivalent in vitro de peau multicouche, comprenant un équivalent de derme contenant des fibroblastes dermiques et des cellules de type SKP et un épiderme composé de 10 plusieurs types cellulaires. En particulier, les inventeurs ont développé un procédé pour obtenir un équivalent de derme in vitro comprenant des fibroblastes dermiques et des cellules SKPs ou SKP-like provenant de peaux jeunes ou adultes, inclus dans une matrice de collagène. 15 L'invention a ainsi pour eme objet un équivalent de derme comprenant en outre un équivalent d'épiderme constitué d'au moins une couche supérieure de cellules épidermiques, l'équivalent de derme, surmonté de l'équivalent d'épiderme constituant ainsi un équivalent de peau multicouche. 20 L'équivalent de peau multicouche selon l'invention permet d'étudier l'interaction entre les cellules SKP-like et les cellules épidermiques telles que les kératinocytes, en reproduisant in vitro une peau humaine. Ce modèle de peau est constitué d'un équivalent de derme selon l'invention et d'un 25 équivalent d'épiderme constitué d'une couche supérieure de cellules épidermiques, comme par exemple des kératinocytes. Cette couche supérieure distincte de cellules épidermiques peut être une monocouche ou un épiderme pluristratifié. 3041974 14 De préférence, l'équivalent d'épiderme est différencié et stratifié, et comprend au moins deux couches de morphologie différente : une couche basale et une couche superficielle. Avantageusement, les kératinocytes reproduisent les 5 caractéristiques d'un épiderme in vivo, à savoir un épithélium multicouche stratifié constitué d'une couche basale au contact de l'équivalent de derme et de plusieurs strates supérieures typiques ; une couche épineuse, une couche granuleuse (stratum granulosum) et une couche cornée (stratum corneum). Les 10 kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés a partir de prélèvements de peau humaine normale. 15 Les kératinocytes sont ensemencés à la surface de l'équivalent de derme, selon des méthodes bien connues de l'homme de métier (Ackermann et al. 2010 ; Supp et al. 2005). Par exemple, l'équivalent de derme est disposé à l'interface air-liquide dans une boite de culture, puis les kératinocytes 20 sont ensemencés dessus. L'ensemble équivalent de derme et équivalent d'épiderme est cultivé à l'interface air-liquide pendant au moins 10 jours, afin de permettre une stratification et une différentiation des kératinocytes. Alternativement, les kératinocytes peuvent provenir du même donneur que les 25 fibroblastes dermiques et les cellules SKP-like. Alternativement l'équivalent d'épiderme reconstitué sur l'équivalent de derme peut contenir d'autres types de cellules épidermiques, ensemencées en même temps que les kératinocytes ou séquentiellement. Avantageusement on utilise des 30 mélanocytes. 3041974 15 Ainsi, l'invention a encore pour objet l'utilisation d'un équivalent de peau multicouche pour étudier l'influence de la composition cellulaire du derme sur la pigmentation de l'épiderme. 5 D'autres utilisations peuvent être envisagées, comme par exemple l'utilisation d'un équivalent de peau multicouche selon l'invention pour évaluer l'efficacité de principes actifs cosmétiques. LISTE DES FIGURES 10 Figure 1 : Mesure de la contraction de l'équivalent de derme entre JO et J4 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES : Bell et al. 1979: Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of 15 different proliferative potential in vitro. Proc Nati Acad Sci USA 76: 1274-1278. Toma et al., 2001. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nature Cell Biology. Vol 3: 778-784 . 20 Fernandes et al. 2004. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nature Cell Biology. 6:11. Supp et al. 2005. Engineered skin substitutes: practices and potentials. Clinics in Dermatology 23, 403-412. Toma et al., 2005. Isolation and characterization of mulipotent 25 Skin-derived Precursors from human skin. Stem cells. 23:727737. Meirelles et al. 2006. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119(Pt 11):2204-13. 3041974 16 Hunt et al., 2009. Multipotent skin-derived precursors: from biology,to clinical translation. Curr Opin biotechnol. 20:522530. Li et al., 2010. Human dermal stem cells differentiate into 5 functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123(Pt 6):853-60. Ackermann et al. 2010. The Phenion full-thickness skin model for percutaneous absorption testing. Skin Pharmacol Physiol. 23(2):105-12. Wenzel et al., 2012 Naïve adult stem cells from patients with 10 Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Biology open. 1:516-526. Ruetze et al. 2013. A novel niche for skin derived precursors in non-follicular skin. Journal of Dermatological Science 69 (2013) 132-139. 15 Exemple 1 : Obtention de cellules SKPs issues de peau adulte Selon le protocole d'extraction décrit par Toma et al. (2001) l'épiderme est séparé du derme par traitement enzymatique, puis le derme est soumis à de multiples dissociations enzymomécaniques (trypsination suivi de plusieurs aller-retour à la 20 pipette répétés), qui permettent d'isoler les cellules SKPs. Après quelques jours de culture dans du milieu DMEM 4.5g de glucose (Lonza BE12-604F) / HAMs F12 (Lonza BE12-615) 75 : 25 supplémenté en fibroblast growth factor (FGF2, 4Ong/mL final, Sigma, E4127), de l'epithelial growth factor (EGF, 2Ong/mL 25 final, Sigma, E4127) et un mélange d'hormones B27® à 1% (Gibco, 17504-044). A partir de 7 jours, nous observons la formation de sphères de différentes tailles (allant de quelques cellules à plusieurs dizaines de cellules) au fond du flacon de culture. Par 30 observation au microscope grossissement 40, nous constatons que 3041974 17 ces sphères sont formées de plusieurs dizaines de cellules. Leur taille varie de quelques dizaines de microns pour les plus petites jusqu'à plusieurs centaines de microns pour les plus grosses après 15 jours de culture. A partir de ce moment les 5 sphères peuvent être utilisées telles quelles dans les dermes équivalents ou être dissociées de façon enzymatique avec de la collagènase pour reformer des sphères. Exemple 2 : Obtention de cellules SKP-like A partir d'un donneur adulte, 5 fragments de dermes de 5 à 10 10 mm de long sont déposés dans le fond d'une boite de pétri de diamètre 100 mm pendant quelques minutes puis du milieu DMEM lg/L (Lonza BE12-707F) supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (Biowest, 51810) est ajouté. Après quelques jours de culture, les fibroblastes dermiques commencent à coloniser la 15 boite de culture. Les fibroblastes sont alors récupérés après décollement enzymatique à l'aide de trypsine / EDTA et ensemencé dans un flacon de culture pour être amplifiés. Les fibroblastes dermiques sont cultivés dans le milieu DMEM lg/L supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF) jusqu'à 20 l'obtention d'une confluence de 80% à 37°C et 5% CO2 en flasque T75. Les cellules sont cultivées et maintenues en culture jusqu'au passage 20 au maximum. Les fibroblastes sont rincés avec du PBS (5 mL) puis traités avec de la trypsine / EDTA (Sigma, T3924) préchauffée à 37°C (3 ml). Les cellules sont 25 ensuite incubées pendant 3 min à 37°C et 5% CO2. Les cellules sont récupérées avec 5 ml de milieu fibroblastes afin d'être numérées. Les cellules sont ensuite centrifugées à 1200 RPM pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé et les cellules sont rincées avec 5 ml de PBS puis la suspension est 30 homogénéisée et centrifugée de nouveau à 1200 RPM pendant 5 3041974 18 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est repris avec soit 1 ml de PBS froid pour une extraction de moins de 6 millions de fibroblastes ou au prorata pour des concentrations supérieures. La suspension est homogénéisée, 5 déposée dans un tube de 1.5 ml stérile ou dans un tube conique de 15 ml et placée à 4°C pendant 24 h sous agitation. Le PBS est éliminé et le culot cellulaire est repris dans 1 ml de milieu de prolifération SKPs composé de DMEM 4,5g/L glucose (Lonza, BE12-688F), HAM F12(Lonza, BE12-615F) avec un ratio 3 : 10 1 supplémenté avec EGF (20ng/mL final, Sigma, E4127), human bFGF (40 ng/ml final, Sigma, E4127) et du supplément B27(1) à 1% (Gibco, 17504-044) et la suspension est déposée dans 1T25 contenant 4 ml de milieu de prolifération SKPs pour des concentrations initiales de fibroblastes inférieures à 6 15 millions de cellules ou 1 T75 contenant 14 ml de milieu de prolifération SKPs pour des concentrations de cellules supérieures à 6 millions. Les cellules sont placées à 37°C et 5% CO2 en position verticale afin d'éviter l'adhésion des cellules. 20 Quotidiennement, un examen microscopique est nécessaire pour observer l'évolution de la culture. Après un jour, on observe des cellules rondes en suspension (cellules mortes ou SKPs en devenir) car plus de 85% de la suspension sont des cellules mortes dues au choc thermique. Après 4 à 5 jours de culture, 25 les cellules SKP-like se présentent sous forme de sphères de tailles différentes composées de quelques cellules à plusieurs dizaines de cellules selon les sphères. Leur taille varie de 50 pm à plus de 300 pM pour les plus grosses. Les fibroblastes dermiques ont adhéré au fond du flacon de culture et forment un 30 tapis cellulaire qui sera éliminé. Les sphères sont cultivées pendant 1 semaine. 3041974 19 Exemple 3 : Obtention d'équivalents de derme comprenant des fibroblastes et des cellules SKP-like autologues dans une matrice de collagène I Des fibroblastes dermiques sont maintenus en culture pendant 5 plusieurs semaines dans un flacon de culture de grande taille (225cm2) dans du milieu DMEM 1g/1 préchauffé à 37°C supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. A 80% de confluence, un flacon de culture est divisé en 2 afin d'avoir un flacon de culture pour la culture de fibroblastes et un deuxième servant pour 10 l'isolement et la culture des SKP-like, cultivé selon l'exemple 2. Après 10 jours de culture des fibroblastes, cultivés avec du milieu DMEM supplémenté de 10% SVF, et des SKP-like cultivées dans du milieu DMEM/HAM F12 3 :1 supplémenté de facteurs de croissance (EGF, KGF et mélange B27®), les cellules sont 15 dénombrées (après trypsination pour les fibroblastes) et maintenues dans leur milieu respectif. Dans un tube conique de 15m1, déposer 1,5m1 de solution de collagène bovin de type I liquide à 5mg/m1 (Corning réf. 354231), ajouter 500p1 de SVF (Biowest réf. S1810), 300pL de 20 solution de sphères de cellules SKP-like à 20000 sphères de cellules/ml, 1,2m1 de fibroblastes à 500000 cellules /ml soit un ratio 1/100 (1 sphère pour 100 fibroblastes). Mélanger en laissant la solution sur la glace et finir en ajoutant 30pL de NaOH 1N afin de remonter le pH pour initier la gélification. 25 Déposer 3,5 ml de cette solution dans 1 puits d'une plaque 6 puits. Placer la plaque dans une enceinte climatique à 37°C, 5% CO2. Laisser gélifier au minimum 30 minutes puis recouvrir la matrice de milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Changer le milieu par aspiration tous les 30 2/3 jours de culture. 3041974 20 Exemple 4 : Etude de l'expression du procollagène I, du collagène I et du collagène III par les cellules de l'équivalent de derme Le but de ce test est d'évaluer l'effet de l'incorporation de 5 cellules SKPs sur la synthèse du procollagène I et des collagènes I et III par les cellules de l'équivalent de derme. Les collagènes I et III, ainsi que le procollagène I, précurseur du collagène I, participent au maintien et à la fermeté de la peau via un important dynamisme du derme. 10 Des équivalents de derme avec ou sans incorporation de cellules SKPs (avec un ratio de 1 sphère de cellules SKP /10000 fibroblastes) sont maintenus en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM lg/L, SVF et antibiotiques) dans des puits de plaques 6 puits. Les équivalents de derme sont 15 cultivés pendant 5 jours puis sont fixées dans le formaldéhyde et inclus dans la paraffine. Des coupes de 4 }gym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Les marquages du procollagène I et des collagènes I et III sont effectués après démasquage des sites spécifiques par une incubation au four micro-onde puis par un 20 traitement enzymatique (pepsine pour le procollagène I et trypsine pour les collagène I et III). Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps monoclonal de rat spécifique du procollagène I (Millipore Upstate, Réf. MAB1912), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I 25 (Rockland, Réf. 600-401-103-0.5) et d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène III (Rockland, Réf. 600-401105-0.5), puis d'un anticorps secondaire anti-rat couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A11006) et d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, 30 Réf. A21206). Les équivalents de derme sont alors examinés au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). 3041974 21 Une quantification de la fluorescence, à l'aide du logiciel Volocity® image analysis software (PerkinElmer, Inc.) a été réalisée à partir des photographies obtenues. Résultats et conclusions : 5 Les immunomarquages par fluorescence mettent en évidence une augmentation de l'expression du procollagène I, du collagène I et du collagène III. L'inclusion de cellules SKPs dans l'équivalent de derme permet une expression globale plus importante de collagène humain de type I (+48%), de type III 10 (+23.4%) et de procollagène I (+18%). résultats démontrent une Ces fibroblastes augmentation sécrétion de interaction entre les et les cellules SKP-like se traduisant par une de l'activité fibroblastique sous la forme de fibres élastiques et principalement de collagène. 15 Exemple 5 : Mesure de la contraction de l'équivalent de derme Afin de vérifier l'activité fibroblastique à l'intérieur des équivalents de derme, une mesure de la contraction en fonction du temps a été réalisée. A l'aide d'un trépied fixé sur l'appareil photographique, une photo de l'équivalent de derme 20 est prise et analysée à l'aide d'un logiciel de mesure ImageJ 1.47V (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA). Le diamètre l'équivalent de derme est mesuré à l'aide du logiciel ImageJ, une échelle arbitraire est définie et le diamètre des différentes conditions est normalisé par cette échelle. Une 25 mesure du diamètre de l'équivalent de derme est ainsi obtenue. La contraction des équivalents de derme est un processus lié à l'activité contractile des fibroblastes qui se lient aux fibres de collagène, les orientent dans une même direction et densifient la matrice extracellulaire en expulsant l'eau. La 30 contraction de l'équivalent de derme au cours du temps se 3041974 22 traduit par une diminution plus ou moins importante du diamètre l'équivalent de derme selon les conditions étudiées. Résultats et conclusions : On constate qu'en présence de cellules SKP-like, la 5 contraction des équivalents de derme est supérieure de 10% par rapport aux contrôles ne contenant pas de cellules SKP-like, comme illustré par la figure 1. Les cellules SKP-like incluses dans les équivalents de derme interagissent avec les fibroblastes dermiques. Ces interactions 10 se traduisent par une expression plus importante du collagène endogène et en conséquence une contraction plus forte des équivalents de derme au cours du temps. Exemple 6 : Reconstruction d'un équivalent de peau multicouche Afin d'étudier les mécanismes d'interactions entre les 15 cellules épidermiques telles que les kératinocytes et les mélanocytes d'une part et les cellules dermiques, telles que cellules de type SKP et fibroblastes, d'autre part un équivalent de peau multicouche a été développé. Ce modèle de peau reconstruite en 3 dimensions permet 20 d'étudier le comportement des kératinocytes dans le processus de différentiation lorsqu'ils sont mis en contact avec un équivalent de derme contenant des cellules type SKP et des fibroblastes. Les cultures des fibroblastes et des cellules SKP sont 25 réalisées selon l'exemple 2, la reconstruction de l'équivalent de derme se fait selon l'exemple 3. 3041974 23 Après 5 jours de culture, un derme d'épaisseur comprise entre 0,05 cm et 0,5 cm est obtenu. Le derme est déposé à l'interface air-liquide sur du milieu KSFM (Invitrogen) pendant 24h. Des keratinocytes sont ensuite ensemencés à la surface de l'équivalent de derme et cultivés sur du milieu KSFM enrichi en calcium (1.8mM), supplémenté avec de l'EGF, du KGF et de la vitamine C afin de créer un équivalent d'épiderme. Résultats et conclusions : Après 10 jours de culture à l'interface air-liquide, un 10 épiderme différencié est obtenu. L'observation microscopique après coloration histologique à l'hématoxyline-éosine de l'équivalent de peau, montre que l'équivalent d'épiderme présente les mêmes caractéristiques qu'un épiderme in vivo. En particulier, qu'il se compose de 5 à 15 6 couches de kératinocytes. En partant de la jonction avec l'équivalent de derme, on distingue une couche basale, une couche épineuse, une couche granuleuse, un stratum granulosum et une ou deux couches de cornée (stratum corneum). L'adhésion de la couche basale sur le équivalent de derme a été mise en 20 évidence par la détection immuno-histochimique de protéines spécifiques de la jonction dermo-épiderme, c'est-à-dire le collagène IV, le collagène 17, la laminine 5 et 10. Toutes ces protéines sont présentes à la jonction entre le derme et la couche basale de l'épiderme, témoignant ainsi d'une cohésion 25 entre les 2 structures composant l'équivalent de peau multicouche, à savoir l'équivalent de derme et l'équivalent d'épiderme. Le marquage est uniforme tout le long de la jonction de l'équivalent derme-épiderme. Des fibroblastes sont observés dans le derme après coloration 30 hématoxyline-éosine des coupes de l'équivalent derme-épiderme. 5 3041974 24 La méthode de reconstruction permet ainsi de reproduire une peau équivalente composée d'un derme, contenant des fibroblastes et des cellules type SKPs, et d'un épiderme différencié possédant les caractéristiques d'un épiderme in 5 vivo. L'équivalent de peau multicouche ainsi reconstruit possède les caractéristiques d'un tissu in vivo. En effet, les protéines majeures de la jonction dermo-épidermique d'une peau in vivo sont exprimées au sein de ce modèle. REVENDICATIONS1. Equivalent de derme in vitro comprenant des cellules de type SKP et des fibroblastes dermiques inclus dans une matrice de collagène, selon un ratio compris entre 1/100 (1 sphère de cellules de type SKP pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère de cellules de type SKP pour 10000 fibroblastes). 2. Equivalent de derme selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ratio de cellules de type SKP et de fibroblastes dermiques est de 1/100 (1 sphère de cellules de type SKP pour 100 fibroblastes). 3. Equivalent de derme selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que les fibroblastes dermiques et les cellules de type SKP sont d'origine humaine. 4. Equivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel, lorsque les cellules de type SKP sont des cellules SKP-like, les fibroblastes dermiques et les cellules SKP-like sont d'origine autologues. 5. Equivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la matrice de collagène est du collagène de type I d'origine bovine. 6. Equivalent de derme selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend, outre le collagène de type I, du collagène de type III et/ou d'autres fibres élastiques. 7. Procédé d'obtention d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes suivantes : 3041974 26 a) Une suspension de fibroblastes dermiques cultivés jusqu'au 20'' passage, à une concentration de 100000 à 500000 fibroblastes / ml dans du milieu de culture DMEM lg/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal est 5 préparée extemporanément, b) Des sphères de cellules de type SKP d'une taille au moins égale à 50 }gym sont préparées en suspension dans du milieu de culture DMEM/HAM F12, 3 :1, supplémenté en facteurs de croissance EGF et FGF2 et en mélange 10 d'hormones B27®, c) Pour la préparation des équivalents de derme, une solution de collagène de concentration comprise entre 1 et 10mg/ml, est mélangée à du DMEM 1g/L supplémenté avec 5 à 10 % de sérum de veau foetal, puis les fibroblastes 15 dermiques humains normaux (100000 à 500000 / ml) de l'étape a) et les sphères de cellules de type SKP obtenues à l'étape b), sont ajoutés, afin d'obtenir un ratio compris entre 1/100 (1 sphère pour 100 fibroblastes) et 1/10000 (1 sphère pour 10000 20 fibroblastes) et enfin un volume suffisant d'une solution de soude (NaOH) 1N est ajoutée au mélange pour amener le pH à 7, d) La solution obtenue à l'étape c) est déposée dans des puits puis recouverte avec du milieu de culture DMEM lg/L 25 supplémenté avec 5 à 10% sérum de veau foetal. 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel les cellules de type SKP de l'étape b) sont des cellules SKP-like. 30 9. Procédé selon la revendication 7 dans lequel les fibroblastes dermiques de l'étape a) et les cellules SKPlike sont des cellules autologues. 3041974 27 10. Utilisation d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, pour réaliser des études scientifiques. 5 11. Utilisation d'un équivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, pour évaluer l'efficacité de principes actifs cosmétiques. 12. l'utilisation d'équivalents de derme selon l'une des 10 revendications 1 à 6 pour réaliser des études en 3 dimensions des cellules de type SKP en fonction du type de donneurs. 13. Equivalent de derme selon l'une des revendications 1 à 6, 15 comprenant en outre un équivalent d'épiderme constitué d'au moins une couche supérieure de cellules épidermiques, l'équivalent de derme surmonté de l'équivalent d'épiderme constituant ainsi un équivalent de peau multicouche. 20 14. Equivalent de derme selon la revendication 13, dans lequel l'équivalent d'épiderme comprend des kératinocytes et des mélanocytes. 15. Utilisation d'un équivalent de derme selon la 25 revendication 14, pour étudier l'influence de la composition cellulaire du derme sur la pigmentation de l'épiderme.