FR 3040180 A1 20170224 FR 1559963 A 20151020 1 Méthode prédictive de l'excès de dose dû aux produits de contraste iodés injectés pendant les examens de radiodiagnostic et d'évaluation de l'excès de dose biologique Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire et clinique dans le cadre du radiodiagnostic impliquant des produits de contraste iodés et qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques. Etat de la technique Le radiodiagnostic représente pour l'homme la plus grande cause d'exposition aux radiations ionisantes et donc constitue l'une des plus grand source de risques de cancer (selon un rapport "Biological Effects of Iow radiation doses", Vol. I, Annex G publié en 2000 par l'UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation)). Généralement consistant en une exposition à une dose faible de rayons X allant de 2 à 40 mSv pour les mammographies, les scanners ou l'angiographie et de l'ordre du liSv pour la radiologie, les examens de radiodiagnostic nécessitent parfois une augmentation du contraste afin de mieux visualiser l'organe à étudier (Perez, Devic et al. 2015). Depuis les années 20, l'iode (administré sous la forme de composés iodés) reste le meilleur compromis pour augmenter le contraste à faibles énergies de rayons X entre les éléments suffisamment lourds et les produits chimiques aisés à produire, non toxiques et faciles à éliminer (voir Bae, « Intraveneous contrasts medium administration and scan timing at CT : considerations and approaches », Radiology 256(1),p.32-61 (2010)). Les agents de contraste iodés actuellement disponibles peuvent être divisés en quatre classes : 1) les monomères ioniques (les plus anciens, développés dans les années 1950) ; 2) les monomères non-ioniques, 3) les dimères ioniques ; 4) les dimères non-ioniques (les plus récents). La structure de base de ces agents de contraste iodés est un cycle benzénique, sur lequel sont fixés trois atomes d'iode. Les agents de contraste sont injectés avant et pendant le traitement et s'accumulent principalement dans les tumeurs, plus vascularisées. L'iode diffuse facilement dans l'espace intercellulaire et on observe un gradient naturel important de concentration entre la zone pathologique et la zone saine. La concentration d'iode dans les tissus sains reste faible (voir l'article précité de Bae). Ce gradient de concentration se traduit par un gradient dans les sections efficaces d'absorption. Le fait d'irradier avec des rayons X de radiodiagnostic (120-140 3040180 2 kV) d'énergie moyenne de l'ordre de 65 keV, implique un renforcement du dépôt de dose par effet photoélectrique à proximité des atomes d'iode de l'agent de contraste. Dès les années 1970, Norman et coll. (« Cytogenetic effects of contrast media and 5 triiodobenzoic derivatives in human lymphocytes », Radiology 129(1), p.19-203 (1978)) observèrent des cassures et des aberrations chromosomiques dans des lymphocytes circulants de patients soumis à des scanners après injection de produits de contraste iodés. De telles observations se multiplièrent sans véritable explication mécanistique. 10 En 2005, Joubert et al. ont montré que l'irradiation par scanner émet un maximum d'énergie entrez 50 et 60 keV qui correspond au maximum d'absorption d'énergie de l'iode dans l'eau (« Irradiation in presence of iodinated contrast agent resuits in radiozensitization of endothelial cells : Consequences for coputed tomography therapy », Int J Radiation Oncology Biol Phys 62(5), p.1486-1496 (2005)). Cette publication montre 15 qu'une telle énergie provoque la radiolyse des produits de contraste iodés qui aboutit à la production d'ions I- qui se transforment en iodure de sodium ou de potassium. De telles molécules, au contraire des molécules de produits de contraste iodés, peuvent rentrer dans les cellules et se fixer à l'ADN. A ce stade, les cassures double-brin de l'ADN qui sont induites par l'irradiation auront une réparation limitée ou fautive du fait de la présence 20 de iodures dans l'ADN par inhibition des kinases DNA-PK et ATM qui régulent la réparation et la signalisation des dommages de l'ADN. On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, 25 au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction 30 notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de 35 dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). 3040180 3 En 2013, Bodgi et al. ont proposé une formule qui permet de modéliser la cinétique de reconnaissance et de réparation des CDB de l'ADN (Bodgi et al, «A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical definition of individual radiosensitivity », J Theor Biol. 21 p 333:135-45.2013) : 1 1 = /Dthérap (1 N H2Ax (t D) 1 + br't)(1 + bre?, (t - to)) 5 Avec : I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X Dthérap : la dose d'irradiation bref : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min-1 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min-1 10 to : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB. On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inherent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621- 15 629 (1981) ; « lntrincsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11, p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus 20 qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Ce qui est vrai pour la radiosensibilité l'est également 25 pour la prédisposition au cancer, et plus particulièrement au cancer radioinduit. Ainsi, tout excès de dose augmente à la fois le risque de réaction tissulaire de radiosensibilité et le risque de cancer radioinduit. Toutefois, aux faibles doses utilisées en radiodiagnostic, les réactions tissulaires (brûlures) radioinduites ne sont pas observées : seul l'excès de risque de cancer du au surdosage est à envisager. Il serait donc désirable de disposer 30 d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer le risque et l'excès de dose dû à la radiolyse du produit de contraste iodé provoquée par l'exposition radiodiagnostique. 3040180 4 Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de l'excès de dose et de risque lié à l'utilisation de produits de contraste iodés en examen radiodiagnostique. Le problème de fournir une méthode prédictive de la radiosensibilité individuelle reste donc sans 5 solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité tissulaire et clinique à la suite d'un examen radiodiagnostique impliquant des produits de contraste iodés. Objets de l'invention 10 Les inventeurs ont constaté, et c'est le premier point de départ de la présente invention, que les raies d'émission du spectre des rayons X produit par un tube standard des appareils de radiodiagnostic, qui correspondent aux raies K du tungstène (raie Ka à 59,3 keV, raie Ki3 à 67,23 keV) composant l'anode des tubes, et qui se superposent au spectre 15 polychromatique continu (s'étalant, selon la tension d'accélération, d'environ 20 keV jusqu'à typiquement environ 80, 100 ou 120 keV), sont très proches du maximum d'absorption de l'énergie des atomes d'iode dans l'eau (rapport maximal entre les coefficients relatifs d'absorption d'énergie massiques d'iode et de l'eau) se situant entre 40 et 60 keV, sachant que le seuil d'absorption K des atomes d'iode se situe à environ 20 33,2 keV : à cette énergie l'effet photoélectrique est prédominant. Ces constatations sont rassemblées dans le tableau 1 ci-dessous. On doit donc s'attendre à ce qu'avec une anode en tungstène l'effet radiolytique du rayonnement X sur un agent de contraste iodé est maximal. Les inventeurs ont constaté que la radiolyse d'un agent de contraste iodé au cours d'un examen radiodiagnostique 25 conduit à la libération d'iode, ce iode libre ayant un effet cassant l'ADN qui s'ajoute à l'effet cassant l'ADN de la dose de rayonnement X de l'examen radiodiagnostique qui provoque ladite radiolyse. Cet effet supplémentaire cassant l'ADN lié à la radiolyse de l'agent de contraste iodé est appelé ici « l'excès de dose biologique » ou « surplus de dose biologique ». 30 Les doses à ne pas dépasser pour le grand public, soumis à des examens radiographiques et radioscopiques, sont identiques à ceux des travailleurs exposés : l'exposition est limitée à 50 mSv chez l'enfant et 100 mSv chez l'adulte. Or, on suspecte que le cumul des doses lié à la répétition de tels examens serait susceptible d'induire un véritable excès de cancers, même si des données épidémiologiques précises ne 35 semblent pas exister. La mesure d'un éventuel excès de dose lié à l'iode est donc d'intérêt car elle permettrait de mieux connaitre, pour chaque individu et pour des conditions d'irradiation données, la dose et les seuils cumulatifs à ne pas dépasser. 3040180 5 Les inventeurs ont par ailleurs constaté, et c'est le deuxième point de départ de la présente invention, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages radioinduits les plus prédictifs de la radiosensibilité quand ils sont non-réparés d'une part, 5 et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit recombinaison MRE11dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM. Le marqueur pH2AX indique un site CDB reconnu par le mode de réparation par 10 suture. Le marqueur MRE11 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE11-dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE11-dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la 15 protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB. Enfin, les inventeurs ont montré que ce sont les produits de radiolyse spécifiques du produit de contraste iodé qui sont responsables de l'excès de CDB non réparés après une 20 examen radiodiagnostique : c'est notamment le cas des iodures de sodium. Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène dus aux produits de radiolyse spécifiques du produit de contraste iodé, il faut tenir compte : - d'une part, de l'état spontané de l'ADN, 25 - d'autre part, de son état radioinduit, - enfin de son état radioinduit après l'action des produits de radiolyse des produits de contraste iodés notamment de l'iodure de sodium. Par ailleurs, après irradiation, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la 30 cinétique dépend du mécanisme de réparation et donc du type d'endommagement radioinduit. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle. L'effet des produits de radiolyse des produits de contraste iodés s'ajoute aux effets radioinduits. 35 Selon l'invention le problème est résolu par une méthode dans laquelle (1) on procède à une amplification de cellules non transformées issues d'un échantillon cellulaire, notamment de cellules issues de biopsies de peau ; 3040180 6 (2) on établit un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes; (3) on procède à des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB ; (4) on applique soit des produits de radiolyse des produits de contraste iodés, soit un 5 iodure d'un élément alcalin (de préférence iodure de sodium). Cette méthode forme un premier objet de la présente invention. Les deux modes de réalisation de l'étape (4) sont équivalents mais ne sont pas utilisés 10 dans le même but prédictif. L'utilisation des produits de radiolyse des produits de contraste iodés est adaptée au matériel dont dispose le radiothérapeute, c'est-à-dire un irradiateur gamma à hautes énergies pour la radiothérapie. Le radiothérapeute est amené à réaliser des imageries par 15 scanners pour mieux situer la tumeur avant, pendant et après la radiothérapie. On utilise une dose Dscan de rayonnement X équivalente à une session d'imagerie médicale sur scanner. Cette dose Dscan est avantageusement comprise entre 5 mGy et 50 mGy, et de préférence entre 10 mGy et 40 mGy suivant les organes à imager. 20 Le mode de réalisation dit « du radiothérapeute » de la méthode selon l'invention consiste à mesurer le nombre de CDB non réparées après une dose Dthérap équivalente à une session de radiothérapie, en présence d'iodure de sodium, produit final de radiolyse des produits de contraste iodés. La dose Dthérap est typiquement comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et plus préférentiellement entre 1,7 Gy et 2,3 Gy. 25 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on standardise les paramètres Dscan et Dthérap selon le mode de réalisation dit du radiologue (Dscan) ou du radiothérapeute (Dthérap) (et de préférence les deux à la fois) à une valeur fixe afin de générer des données comparables pour différents tissus et patients ; ces valeurs standardisées sont : D 30 Gy et/ou Dscan = 20 mGy. Dthérap = 2 L'utilisation d'un iodure d'un élément alcalin est adaptée au matériel dont dispose le radiologue, c'est-à-dire un scanner X de faibles énergies. 35 Le mode de réalisation dit « du radiologue » de la méthode selon l'invention consiste à mesurer le nombre de CDB non réparées après 20 mGy (dose équivalente à une séance d'imagerie par scanner) en présence ou en absence de produit de contraste iodé. 3040180 7 Pour l'imagerie par scanner aux rayons X on utilise en règle générale des tubes générant des rayons X avec une anode en tungstène. Un autre objet de l'invention est un procédé d'évaluation de l'effet supplémentaire cassant 5 l'ADN d'un agent de contraste iodé injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un tissu prélevé sur ledit individu, dans lequel procédé : (a) On approvisionne des cellules d'un tissu à évaluer qui a été prélevé (de préférence par biopsie) sur un individu ; 10 (b) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (c) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec un milieu à tester, ledit milieu à tester comprenant ledit agent de contraste iodé et/ou des ions d'iodure ; (d) On soumet ledit échantillon cellulaire en contact avec ledit milieu à tester à une dose absorbée Dtherap ou Dscan déterminée de rayonnement ionisant, sachant que : 15 - Dscan représente la dose de rayons X utilisée pour un examen d'imagerie médicale, - Dtherap représente la dose de rayonnement ionisant administrée lors d'une séance de radiothérapie qui suit un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X ; (e) On détermine sur l'échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre de cassures 20 double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. Lesdits rayons X sont typiquement générés avec une anode en tungstène. Dans un mode de réalisation de ce procédé : (a) On soumet ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) en contact avec un milieu 25 à tester (qui comprend avantageusement des ions d'iodure, mais pas d'agent de contraste iodé) à une dose déterminée de rayons gamma Dthérap (Dthérap étant comprise de préférence entre 0,5 Gy et 4 Gy, plus préférentiellement entre 1 Gy et 3 Gy, encore plus préférentiellement entre 1,7 Gy et 2,3 Gy, et typiquement de 2 Gy) ; et puis ([3) On détecte sur l'échantillon cellulaire le nombre de cassures double brin de l'ADN, 30 et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. Dans un mode de réalisation de ce procédé : on détermine sur ledit échantillon cellulaire n'ayant pas encore été mis en contact avec le milieu à tester le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant 3040180 8 appelé respectivement NpH2Ax(t) et NpATm(t)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps t= t4 (où t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est 5 encore plus préférentiellement d'environ 24 heures) ; et puis - on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dscan) (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2AX(t, Dscan)) et NpATM(t, Dscan)), ledit temps d'observation étant t = 10 t4. Avantageusement, on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (a) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dthérap (Gy) (ces nombres moyens étant appelé 15 respectivement NpH2Ax(t, D 11 et N rt Dthérap)), ledit temps d'observation étant t = t4. Dthérap)) - - -pATM,-, -thérap, On peut effectuer les déterminations à l'étape (a) et/ou à l'étape ([3) également à des temps d'observations t1 et/ou t2 et/ou t3, sachant que - t4 est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et encore 20 plus préférentiellement d'environ 24 heures ; - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 25 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, 30 mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préferentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de 35 patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. 3040180 9 Par exemple, t1 est compris entre 8 minutes et 12 minutes, t2 est compris entre 50 minutes et 70 minutes, t3 est compris entre 3,5 heures et 4,5 heures, et t4 est compris entre 22 heures et 26 heures, ou encore t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures ; de préférence, Dtherap est 2 Gy. 5 Dans un mode de réalisation, à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode. Dans ce cas : _S. M I ,..pH2AX(t21., Dthérap) N'IDA-m(t2, Dthérap) et NipATm(t1, Dthérap) > 30, alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ; 10 - si (NlpH2Ax(t4, Dthérap) > 8 ou NIMN(t4, Dthérap) > 24), alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; - pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II ». 15 Dans un autre mode de réalisation, à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend un agent de contraste iodé. Dans ce cas : - si N lpH2(t4, Dscan) NpH2AM4, Dscan)) 8 , alors on considère que l'échantillon 20 cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; - Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II ». Dans un autre mode de réalisation (appelé ici « méthode du radiothérapeute ») du 25 procédé selon l'invention on détermine l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'ions iodure, ledit procédé étant caractérisé en ce que : (i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 .tM d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé, (ii) on détermine la dose supplémentaire uniquement sur la base du nombre de foci H2AX 30 au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante : NIpH2AX (t4, Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap Dsup X Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap où : NipH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode, 3040180 10 N pH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode. Par ailleurs l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'ions iodure (dans la « méthode du radiothérapeute ») peut être déterminé aussi de la manière suivante : 5 (i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 .tM d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé, (ii) on détermine la dose supplémentaire sur la base du nombre de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4, et de préférence selon la méthode suivante : 10 - dans une première étape, on détermine les nombres de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans produit de contraste iodés, - dans une deuxième étape on calcule les paramètres brec, brep et to dans la formule 1 1 NH2AX(t, Dthérap) = I Dthérap (1 1 + br't)(1 + brep (t to)) 15 où : I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X, bref: inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues [min-1], 20 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées [min-1], to : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB ; - dans une troisième étape on détermine les nombres de foci H2AX obtenus aux obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 25 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec le produit de contraste iodé, - dans une quatrième étape on calcule la dose équivalente D1 de l'irradiation avec le produit de contraste iodé en utilisant les paramètres brec, brep et to déterminés à la deuxième étape, en utilisant la formule : 1 1 N H2AX(t, Di) = 1D1(1 1 + brect) (1 + brep (t - to)) 3040180 11 - dans une cinquième étape on détermine le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup selon la formule : Dsup=Di-Dtherap 5 Dans un autre mode de réalisation (dans la méthode « du radiologue ») on peut utiliser le nombre de foci H2AX uniquement au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante : NipH2AX (t4, Dscan) - NpH2AX (t4, Dscan D stip - X Dscan NpH2AX (t4, Dscan) où : 10 N ipH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé, NpH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé. 15 Dans le cadre de la présente invention on utilise typiquement entre 5 et 25 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et de préférence entre 10 et 20 mg, mais ces valeurs ne sont pas limitatives. Nous donnons ici des précisions sur les deux principaux modes d'utilisation du procédé 20 selon l'invention. 1) Le mode de réalisation dit « du radiothérapeute » Un premier mode de réalisation de l'invention est un procédé pour prédire la 25 radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant associé à la présence de produits de contraste contenant des atomes d'iode, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé : 30 (i) on isole et / ou amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules isolées et /ou amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; 3040180 12 (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et à une dose de radiation D (ce nombre moyen étant appelé NpH2Ax(t, D)) et NpATm(t, D)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps d'observation t4 (et de préférence 5 en plus les temps t1, t2 et t3) après irradiation, (iii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM à tous les temps d'observation t et à une dose de radiation D en présence (pendant l'irradiation) d'ions de iode, 10 - de préférence à raison de 2 à 20 pM de iodure (de préférence à raison de 5 à 15 pM, et encore plus préférentiellement d'environ 10 JIM), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiothérapeute »), sachant que le iodure peut être ajouté sous la forme d'un iodure d'un élément alcalin, de préférence Nal ; 15 lesdits nombres moyens de foci nucléaires étant appelé respectivement NIpH2Ax(t,D), NIpATm(t, D), où - t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures 20 ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des 25 CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et 10 est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; 30 - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est 35 encore plus préférentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 3040180 13 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. Pour l'utilisation de la méthode avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise 5 avantageusement une solution contenant 10 .tM d'iodure de sodium, et si : (i) NIpH2Ax(t4, Dthérap) N'IDA-m(t2, Dthérap ) et NIpATM(t1 Dthérap ) > 30, alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ; si 10 (ii) (NlpH2Ax(t4, Dthérap) > 8 ou NIMN(t4, Dthérap ) > 24), alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; et (iii) pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de Groupe II ». 15 Dans ce mode de réalisation, la détermination mathématique du « surplus de dose » associé à une irradiation avec une dose D en présence d'iode peut se faire selon deux méthodes, selon le nombre d'informations disponibles : si l'on ne dispose que du temps t4 alors la méthode 1 sera appliquée, si l'on dispose de tous les temps (t1,t2,t3,t4) c'est la méthode 2 qui sera appliquée. 20 Avantageusement on utilise une solution d'iodure d'un métal alcalin, de préférence une solution contenant 10 JIM d'iodure de sodium. 25 Méthode 1 : en utilisant uniquement le nombre de foci H2AX au temps t4 On utilise la formule suivante : NIpH2AX (t4, Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap D'p -X Dthérap (t4, Dthérap ) Méthode 2 : en utilisant le nombre de foci H2AX dans une condition sans irradiation (0 30 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 La deuxième méthode pour déduire le surplus de dose causé par la présence de produits de contraste iodés se fera en 2 étapes : 35 3040180 14 Etape 1 : Les nombres de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. JTB 2013) et grâce à 5 cet ajustement, les paramètres brec, brepetto seront déterminés : 1 1 NH2AX(t, Dthérap) = I Dthérap (1 1+ brect)(1+ brep(t - to)) Avec : I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X Dthérap : la dose d'irradiation bref: inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min-1 10 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min-1 to : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB. Etape 2 : Les nombres de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec les produits de 15 contraste iodé seront ajustés par la formule de Bodgi ((Bodgi et al. "A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical definition of individual radiosensitivity." J Theor Biol. 21;333:p135-45 (2013)) en fixant les paramètres brec, brepetto déterminés à l'étape 1 : 1 1 N H2AX(t, Di) = 1D1(1 1+ brect)(1 brep(t - to)) Cette formule permet de déterminer le paramètre D1, qui est la dose équivalente de 20 l'irradiation avec le produit de contraste iodé. Le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup sera donc donné par la formule : Dsup=D1-Dtherap 2) Le mode de réalisation dit « du radiologue » 25 Un deuxième mode de réalisation de l'invention est un procédé pour prédire la radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant 3040180 15 associé à la présence de produits de contraste contenant des atomes d'iode, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé : 5 (i) on isole et / ou amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules isolées et /ou amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à une dose de radiation D 10 (ce nombre moyen étant appelé NpH2Ax(t, D)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps d'observation t4 après irradiation, (iii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX à tous les temps d'observation t et à une dose de 15 radiation D en présence (pendant l'irradiation) d'ions de iode ; de préférence à raison de 5 à 25 mg d'iode par ml de produits de contraste (et de préférence à raison de 10 à 20 mg, et encore plus préférentiellement d'environ 15 mg), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiologue »), ces produits de contraste étant par exemple : Loméron, Xenetix ou Ultravist). 20 Pour l'utilisation de la méthode avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et si : 25 (a) NIpH2Ax(t4, Dscan) NpH2Ax(t4, Dscan) 8 , alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; (c) Pour toutes les autres conditions on considère que le est modéré : l'échantillon est dit 30 « de Groupe II ». Dans ce mode de réalisation de l'invention on détermine la détermination mathématique du « surplus de dose » associé à une irradiation avec une dose D en présence d'iode peut se faire selon la méthode suivante : 35 On utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé. 3040180 16 On détermine l'équivalent de dose supplémentaire en utilisant uniquement le nombre de foci H2AX au temps t4 à partir de la formule suivante : NIpH2AX (t4, Dscan) - NpH2AX (t4, Dscan D stip - X D scan NpH2AX (t4, Dscan) 5 Description détaillée Les termes « endommagement radioinduit », « radioinduit », « radiosensibilité, « radiorésistance », « radiotoxicité », « radiothérapie » se réfèrent tous à un rayonnement ionisant, notamment à un rayonnement de type particules, tel que constitué par des particules de type alpha (a) ou béta ([3), ou encore à un rayonnement électromagnétique à 10 haute énergie, notamment de type gamma (y) ou X. Le terme « transit cyto-nucléaire d'ATM » décrit la translocation qu'effectue la protéine ATM en passant du cytoplasme au noyau, notamment après irradiation. On appelle « effet iode » l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons 15 X, sur un échantillon cellulaire issu d'un tissu prélevé sur ledit individu. Les inventeurs se sont rendus compte que les raies d'émission du spectre des rayons X produit par un tube de rayons X avec une anode en tungstène, de type habituellement utilisé dans les dispositifs d'imagerie tridimensionnelle (scanner tomographiques aux rayons X), et qui se superposent au spectre continu (dont la distribution spectrale dépend 20 de la tension d'accélération, qui est typiquement comprise entre 80 et 120 kV), sont proches du maximum d'absorption de l'énergie des atomes d'iode dans l'eau. Ces données sont rassemblées dans le tableau 1. 3040180 17 Tableau 1 Propriétés relatives aux rayons X générés avec une anode de tungstène de l'eau et de l'atome d'iode Energie Intensité Coefficient d'absorption massique de l'atome d'iode Coefficient en iode / (P, in) / Absorption relative Produit "Emission relative x absorption relative » [keV] relative Pen/P d'absorption -, d'émission massique de (Li /01 d'un tube d'un l'eau pen/p ,en- ,-,eau scanner à 120 kV (typique) 33 0.10 11.90 0.1557 76.429 0.49 0.049 (bord I K) 0.18 9.62 0.06947 138.47 0.89 0.1602 50 0.21 6.57 0.04223 155.576 1 0.21 59.3 1 4.58 0.0328 139.634 0.91 0.91 (bord W Ka) 60 0.21 4.52 0.0319 141.692 0.90 0.1911 67.23 0.50 3.77 0.0285 132.28 0.85 0.425 (bord W K[3) 80 0.17 2.33 0.02597 89.71 0.57 0.0969 5 1. Préparation de l'essai Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prelévées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de 10 sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire. Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon cellulaire est 3040180 18 placé dans du milieu DM EM+20% sérum de veau foetal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante. Dans un mode de réalisation avantageux lesdites cellules témoins issues de patients 5 radiorésistants ont été sélectionnées en tant que cellules montrant un taux de survie clonogénique in vitro supérieur à 55% après une irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy. Dans un autre mode de réalisation lesdites cellules témoins issues de patients radiorésistants ont été sélectionnées en tant que cellules prélevées sur des patients 10 n'ayant pas montré de réactions tissulaires significatives pendant ou à la suite d'un scanner ou d'un traitement radiothérapeutique. Le procédé selon l'invention utilise au moins un échantillon de tissu sain, de préférence des fibroblastes. Ces derniers sont de préférence prélevés sur le tissu conjonctif du patient. Ce prélèvement peut être effectué par biopsie. Ainsi, dans un mode de réalisation 15 avantageux lesdites cellules prélevées sont des cellules fibroblastiques issues d'une biopsie de peau d'un patient (prélevées typiquement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique »). L'échantillon de tissu est cultivé dans un milieu de culture approprié. L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé. Dans un 20 mode de réalisation, dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établi sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'Elkin M. et al. « The radiobiology of cultured mammalien cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est 25 suffisant (1 - 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Petri. Les cellules sont mises en présence d'ions iode de préférence à raison de 5 à 25 mg d'iode par ml de produits de contraste (et de préférence à raison de 10 à 20 mg, et encore plus préférentiellement d'environ 15 mg), ce mode de réalisation étant 30 appelé le mode de réalisation « du radiologue »), ces produits de contraste étant par exemple : Loméron, Xenetix ou Ultravist), ou de préférence à raison de 2 à 20 pM de iodure (de préférence à raison de 5 à 15 pM, et encore plus préférentiellement d'environ 10 pM), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiothérapeute »), sachant que le iodure peut être ajouté sous la forme d'un iodure d'un 35 élément alcalin, de préférence Nal. 3040180 19 Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradié ; elle représente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy). 5 Ledit rayonnement ionisant est défini par sa dose absorbée (paramètre appelé Dthérap et DScan exprimés en Gray). Dans le cadre de la présente invention la dose absorbée Dscan est comprise entre 0,01 Gy et 1 Gy, de préférence comprise entre 0,01 Gy et 0,05 Gy, et est encore plus préférentiellement de 0,02 Gy. Dans le cadre de la présente invention la 10 dose absorbée Dthérap est comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence comprise entre 1,7 Gy et 2,3 Gy, et est encore plus préférentiellement de 2 Gy. Ces zones correspondent typiquement à une séance individuelle de scanner ou de traitement radiothérapeutique pour lesquels le nombre de séances dépendent de la localisation, du type et du stade d'avancement de la tumeur. 15 Après l'irradiation et pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état radio- 20 induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). Dans la méthode dite du radiothérapeute on acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1, t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX et pATM. Dans la méthode dite du radiologue on acquiert un point à t4 pour le marqueur pH2AX. 25 Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al.), peut être utilisée : les cellules ont été fixés dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM 30 MgC12, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-OctC6H4-(OCH2CH2)x0H avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1, fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additioné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu 35 sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, 3040180 20 les autres anticorps au 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC antisouri ou TRITC anti-lapin (1:100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du VectashieldTM contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. 5 La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase G1 (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles). L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à 10 immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en Go/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles. 15 Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée. 2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques 20 2.1 Généralités et marqueurs utilisés L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour au moins deux marqueurs pH2AX, pATM sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps 25 de temps déterminé à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 4 points se situant avantageusement à t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), et avant irradiation (état spontané). 30 Mais la demanderesse s'est rendue compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du 3040180 21 diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode. C'est cette méthode simplifiée qui constitue la base de la méthode prédictive selon l'invention. Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées 5 avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). (i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures 10 double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés. (ii) pATM désigne les formes phosphorylées en sérine 1981 de la protéine kinase ATM. 15 Selon les constatations de la demanderese, ATM passe du cytoplasme au noyau après irradiation en conditions normales (statut radiorésistant). Les formes pATM se concentrent principalement dans le cytoplasme puis marquent des sites de CDB. Le marqueur pATM se distingue par une localisation qui peut être cytoplasmique homogène (pas de foci cytoplasmique) sans foci nucléaire, uniquement nucléaire sous forme uniquement de foci 20 nucléaires (pas de localisation nucléaire homogène), soit cytoplasmique et foci nucléaire. La contrecoloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire (cette répartition étant modifiée pATM sous l'influence de la radiation ionisante) 25 2.2 Paramètres biologiques On définit et détermine comme indiqué : - NpH2Ax(t), NpATm(t) les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les 30 marqueurs pH2AX, pATM, obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps d'observations t1, t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy ou 20 mGy), sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention, alors que celle des autres paramètres NpATm(t) est facultative mais avantageuse ; 35 2.3 Evaluation prédictive 3040180 22 Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Deux niveaux de diagnostic sont proposés : A) un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; celui-ci concerne les deux critères suivants : 5 2.3.1 La classification du patient dans un groupe I, Il ou III (critère appelé GROUPE) : Pour l'utilisation de la méthode dite du radiothérapeute avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise avantageusement une solution contenant 10 lal\A d'iodure de sodium, et si : 10 (a) NIpH2Ax(t4, D -pyrm'--, -thérap , -- -IpATM,- - , -thérap , > 30, alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ; (b) (NlpH2Ax(t4, Dthérap) > 8 ou NIMN(t4, Dthérap) > 24), alors on considère que 15 l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; (c) pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de groupe II ». 20 Pour l'utilisation de la méthode dite du radiologue avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et si : - NIpH2Ax(t4, Dscan) NpH2AX(t4, Dscan) 8 , alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; - Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de Groupe II ». 2.3.2 La détermination de la dose supplémentaire 30 Pour l'utilisation de la méthode dite du radiothérapeute avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise avantageusement une solution contenant 10 lal\A d'iodure de sodium. Deux méthodes sont proposées selon le nombre d'informations disponibles : 3040180 23 Méthode 1 : en utilisant uniquement le nombre de foci H2AX au temps t4 On utilise la formule suivante : NIpH2AX (t4, Dthérap ) NpH2AX (t4, Dthérap ) D'p = X Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap ) 5 Méthode 2 : en utilisant le nombre de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 La deuxième méthode pour déduire le surplus de dose causé par la présence de produits 10 de contraste iodés se fera en 2 étapes : Etape 1 : Les nombres de foci H2AX obtenus obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. JTB 2013) et grâce à 15 cet ajustement, les paramètres brec, brepetto seront déterminés. 1 1 NH2AX (t, Dthérap) = I Dthérap(1 1 + brect)(1 brep(t to)) Avec : I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X Dthérap : la dose d'irradiation pour la méthode du radiothérapeute en Gy bref: inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min-1 20 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min-1 to : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB. Etape 2 : Les nombres de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec les produits de 25 contraste iodé seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. JTB 2013) en fixant les paramètres brec, brepetto déterminés à l'étape 1 : 1 1 N H2AX(t, Di) = 1D1(1 1 + brect)(1 + brep (t to)) 3040180 24 Cette formule permettra de déterminer le paramètre D1, qui est la dose équivalente de l'irradiation avec le produit de contraste iodé. Le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup sera donc donné par la formule : Dsup=Di-Dtherap 5 Pour l'utilisation de la méthode dite du radiologue avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé en utilisant uniquement le nombre de foci H2AX au temps t4. 10 On obtient l'équivalent de dose supplémentaire en utilisant uniquement le nombre de foci H2AX au temps t4 à partir de la formule suivante : NipH2AX (t4, Dscan) - NpH2AX (t4, Dscan D stip - X D scan NpH2AX (t4, Dscan) 15 B) Dans le cadre de la présente invention on propose également un diagnostic plus qualitatif, influencé par le diagnostic quantitatif mais qui tient compte d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien. 20 REVENDICATIONS1. Procédé d'évaluation de l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un tissu prélevé sur ledit individu, dans lequel procédé : (a) On approvisionne des cellules d'un tissu à évaluer qui a été prélevé (de préférence par biopsie) sur un individu ; (b) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (c) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec un milieu à tester, ledit milieu à tester comprenant ledit agent de contraste iodé et/ou des ions d'iodure ; (d) On soumet ledit échantillon cellulaire en contact avec ledit milieu à tester à une dose absorbée Dtherap ou Dscan déterminée de rayonnement ionisant, sachant que : Dscan représente la dose de rayons X utilisée pour un examen d'imagerie médicale, Dtherap représente la dose de rayonnement ionisant administrée lors d'une séance de radiothérapie qui suit un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X ; (e) On détermine sur l'échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdits rayons X sont générés avec une anode en tungstène. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel (a) On soumet ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) en contact avec un milieu à tester (qui comprend avantageusement des ions d'iodure, mais pas d'agent de contraste iodé) à une dose déterminée de rayons gamma Dthérap (Dthérap étant comprise de préférence entre 0,5 Gy et 4 Gy, plus préférentiellement entre 1 Gy et 3 Gy, encore plus préférentiellement entre 1,7 Gy et 2,3 Gy, et typiquement de 2 Gy) ; et puis ([3) On détecte sur l'échantillon cellulaire le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. 3040180 26 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel : - On détermine sur ledit échantillon cellulaire n'ayant pas encore été mis en contact avec le milieu à tester le nombre moyen de foci nucléaires obtenus 5 avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) et NpATO)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps t= t4, où t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 10 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; et puis - On détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dscan) (ces nombres moyens étant 15 appelés respectivement N pH2AX(t, Dscan)) et NpATM(t, Dscan)), ledit temps d'observation étant t = t4. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans lequel on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (a) le nombre moyen de foci 20 nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dthérap (Gy) (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t, Dthérap)) et NpATO, Dthérap)), ledit temps d'observation étant t = t4. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel on effectue les 25 déterminations à l'étape (a) et/ou à l'étape (3) également à des temps d'observations t1 et/ou t2 et/ou t3, sachant que - t4 est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; 30 - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, 3040180 27 mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préferentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de 5 CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. 10 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel t1 est compris entre 8 minutes et 12 minutes, t2 est compris entre 50 minutes et 70 minutes, t3 est compris entre 3,5 heures et 4,5 heures, et t4 est compris entre 22 heures et 26 heures. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures, et dans laquelle, de 15 préférence, Dtherap est 2 Gy. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel à l'étape (h) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel : _si N MI ipH2A)(t21., Dthérap) N'IDA-m(t2, Dthérap) et NIpATK(t1, 20 Dthérap) > 30, alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ; - si (NlpH2Ax(t4, Dthérap) > 8 ou NIMN(t4, Dthérap) > 24), alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » 25 - pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II ». 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape (h) ledit milieu à tester comprend un agent de contraste iodé. 30 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel - si NIpH2AX(t4, Dscan) NpH2A)*4, Dscan)) 8 , alors on considère que l'échantillon 35 cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; 3040180 28 - Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe I I ». 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel on détermine 5 l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé, ledit procédé étant caractérisé en ce que : (i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 .tM d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste, (ii) on détermine la dose supplémentaire uniquement sur la base du nombre de foci H2AX 10 au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante : NIpH2AX (t4, Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap D sup = X Dthérap NpH2AX (t4, Dthérap où : N ipH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode, NpH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode. 15 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel on détermine l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé, ledit procédé étant caractérisé en ce que : (i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 20 .tM d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé, (ii) on détermine la dose supplémentaire sur la base du nombre de foci H2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4, et de préférence selon la méthode suivante : - dans une première étape, on détermine les nombres de foci H2AX obtenus 25 dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans produit de contraste iodés, - dans une deuxième étape on calcule les paramètres brec, brep et to dans la formule 1 1 NH2AX(t,Dthérap) - I Dthérap (1 1 + br't)(1 + brep(t to)) où : 30 I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X, 3040180 29 bref: inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues [min-1], brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées [min-1], 5 to : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB ; - dans une troisième étape on détermine les nombres de foci H2AX obtenus aux obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec le produit de contraste iodé, 10 - dans une quatrième étape on calcule la dose équivalente D1 de l'irradiation avec le produit de contraste iodé en utilisant les paramètres brec, brep et to déterminés à la deuxième étape, en utilisant la formule : 1 1 N H2AX(t, Di) = 1D1(1 1 + brect)(1 + b'p(t - to)) - dans une cinquième étape on détermine le surplus de dose dû au produit de 15 contraste iodé Dsup selon la formule : Dsup=D1-Dtherap 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel on utilise entre 5 et 25 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et de préférence entre 10 et 20 mg. 20 16. Procédé selon la revendication 15 dépendante de la revendication 15, dans lequel on utilise le nombre de foci H2AX uniquement au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante : NipH2AX (t4, Dscan) - NpH2AX (t4, Dscan D sup = X Dscan NpH2AX (t4, Dscan) 25 où : N ipH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé, NpH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.