FR 3049346 A1 20170929 FR 1652478 A 20160323 1 BILLES SOLUBLES POUR LA PRÉPARATION DE SOLUTIONS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la préparation de solutions, notamment pour la mise en oeuvre de méthodes d'analyse, en particulier par spectrométrie, notamment pour la réalisation de solutions standard utiles par exemple à la calibration d'appareils de spectrométrie ou pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostique. Elle permet la mise en oeuvre d'un procédé aisé de préparation de telles solutions standard. ETAT DE LA TECHNIQUE L'utilisation d'appareils de spectrométrie nécessite une calibration de ces derniers, tant pour s'assurer de son bon fonctionnement, de la qualité des résultats, que pour mettre en oeuvre des méthodes de spectrométrie quantitative. On connaît par exemple des méthodes d'analyse quantitatives de protéines par spectrométrie de masse au moyen de gammes de produits marqués nécessitant la réalisation de solutions standard (EP 1 456 227, WO 2010/035504, WO 2014/066284). La réalisation de telles solutions standard est souvent chronophage et nécessite une attention toute particulière pour s'assurer une bonne reproductibilité des résultats dans le temps et une bonne stabilité. La présente invention permet de résoudre ce problème technique. EXPOSE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit 25 pour son analyse par spectrométrie, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés le ou les dits produits à analyser. Elle concerne aussi un ensemble de billes solubles supportant au moins un produit à analyser greffé à leur surface, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité 30 prédéterminée de produit greffé à leur surface sensiblement égale, en particulier un ensemble dont les billes sont conditionnées dans un même emballage permettant une libération contrôlée du nombre de billes, et par ce moyen un contrôle de la quantité de produit à analyser. L'invention concerne également une gamme de produits à analyser caractérisée en 35 ce qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon l'invention, chaque ensemble ayant une quantité prédéterminée de produit greffé différente des autres ensembles. 3049346 2 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles est greffé le ou lesdits produit. 5 Par bille, que l'on peut également appeler grain, on entend selon l'invention tout support solide particulaire de forme patatoïde susceptible de s'écouler au travers d'un tamis. Toutefois, l'objectif étant de réaliser des solutions standard, l'homme du métier choisira de préférence des billes de forme homogène, notamment ovoïdes, de préférence essentiellement rondes. 10 Les billes sont avantageusement calibrées avec un diamètre homogène, de préférence de 1 à 4 mm. La mesure du diamètre des billes est bien connue de l'homme du métier. S'agissant de préférence de billes produites industriellement, le diamètre moyen d'un ensemble de bille produites dans un même lot est généralement homogène, avec une marge d'erreur de moins de 5%, de préférence de moins de 3%. Le diamètre des billes 15 peut contrôlé par l'utilisation de tamis tolérant une marge d'erreur de 5%, voire de 3%, de la taille attendue. L'homme du métier connaît bien les constituants des billes et saura les choisir en fonction du solvant employé dans les solutions de spectrométrie, de la méthode de spectrométrie et du produit à analyser. En effet, les constituants des billes ne doivent pas 20 interférer avec les produits greffés après dissolution, avec les appareils de spectrométrie et les résultats obtenus. Par « greffé », on entend selon l'invention toute interaction entre le support et le produit qui permet de lier le produit à son support lors de son stockage (produit sec) et facilite la libération du produit après dissolution du support. Cette liaison peut être une liaison physico-chimique forte ou faible, en particulier une adsorption du produit à la surface du support. Il est important que la liaison produit/support soit rompue de sorte que le produit soit substantiellement intégralement libéré dans la solution. L'homme du métier saura déterminer cette libération intégrale en comparant la concentration attendue en produit dans la solution à la concentration mesurée. Le solvant des solutions est généralement de l'eau ou une solution hydroacloolique, de préférence de l'eau. La bille est avantageusement constituée de un ou plusieurs composés hydrosolubles choisis parmi les sucres, les polyosides, les acides hydroxycarboxyliques, et leurs mélanges, en particulier choisis parmi le saccharose, le lactose, les alginates, l'acide 35 lactique et leurs mélanges. 3049346 3 On citera en particulier les billes employées comme support pour des préparations homéopathiques, bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans WO 98/07411. De manière avantageuse, la quantité de produit greffé sur chaque bille est 5 prédéterminée de sorte que chaque bille d'un ensemble de billes comprend substantiellement la même quantité de produit, permettant ainsi à l'homme du métier de connaître la quantité de produit dans la solution par simple multiplication du nombre de billes dissoutes dans la solution. La quantité de produit va de 1 picogramme à 100 microgrammes par bille. 10 Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour préparer des solutions de produits à analyser, plus particulièrement par spectroscopie. Bien entendu, le procédé selon l'invention est adapté pour la préparation aisée de solutions de produits de concentrations prédéterminées, quelque soit la finalité de ces solutions. 15 Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit pour son analyse par spectrométrie, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés le ou les dits produits à analyser L'homme du métier connaît les différents produits susceptibles d'être employés pour 20 préparer des solutions de concentrations prdéterminées, en particulier pour des analyses par spectrométrie, notamment comme produits de calibration. On citera notamment les peptides, protéines ou petites molécules. Les molécules greffées peuvent être marquées isotopiquement, deutérées ou contenir des modifications comme les phosphorylations, les oxydations, les carbamidométhylation ou tout autre modification post traductionnelle 25 connues dans le cas des peptides ou des protéines. Les molécules greffées peuvent être synthétisées chimiquement puis adsorbé sur le support polymérique purifiées ou non. Les molécules peuvent également être purifiées directement à partir d'échantillon biologique avant d'être greffées sur les supports polymériques ou être ajouté greffée lors de la production par couche successive des supports polymériques. 30 La bille selon l'invention peut comprendre plusieurs produits greffés, chacun dans des proportions prédéterminées, indépendantes les unes des autres. Une même bielle peut avoir greffé à sa surface 2, 3, 5, 10, 20 voir 30 produits différents ou plus. Une bille greffée avec plus de 70 produits différents a été préparée selon la présente invention. Parmi les produits susceptibles d'êtres greffés, seuls ou combinés, on peut citer des 35 peptides ou des petites molécules organiques, notamment des produits ayant une activité thérapeutique, comme des antibiotiques, en particulier les produits ci-après 3049346 4 Sequence Sequence Sequence Sequence Sequence peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom molecule molecule molecule molecule molecule EGVLYVGSK Bitertanol TFDPYYAVALVK Isoprocarb VQIINK EGVVAAAEK Boscalid FTDPVNI I SVYK Isoproturon VQIVY [ Pho] KP VDLSK EGVVHGVTTVAE Bromucanozole LGDPLGADVAQV Ivermectin AVFVDLEPTVID K TGALR EVR EQVTNVGGAVV Bupirimate GIDPEAVLADLR Kresoxim- VGINYQPPTVVPG GDLAK TGVTAVAQK methyl QGVAEAAGK Buprofezin YDPLVVFSHGLGA Linuron VAPEEHPVLLTEA PLNPK FR TVEGAGNIAAA Butafenacil QDPNEILIFWSK Lufenuron GYSFTTTAER TGFVK AEEAGIGDTPN Butocarboxim QE DPVTNVGGAVV TGVTAVAQK Mandipropamid DVNAAIAAIK QEDQAAGHVT [ Pho] QAR AEEAGIGDTPN QEDQAAGHVTQ Butoxycarboxi IDPGSSDGSSSR Mefenacet EIIDPVLDR AR m AEEAGIGDTPS Carbaryl EGDPVVAAAEK Mepanipyrim DSYVGDEAQSK LEDEAAGHVT [ Pho ] QAR AEEAGIGDTPS LEDEAAGHVTQ Carbendazim EADPNYIGSDK Mepronil AVFPSIVGRPR AR C [CAM] GSLGN Carbetamide SQDPTVLQNTGGR Mesotrione GIAPLQLGK IHHKPGGGQVE VK DRTGNDEK Carbofuran SGDPGVCLNCR Metaflumizone LHTFGDENEDDSE LAR ES [ Pho] PLQT Carboxin ATDPFNPAQDK Metalaxyl SGGVCLNCR PTEDGSEEPGS ET SDAK ES [Pho] PPQP Carfentrazoneethyl ANDPIGATLNR Metconazole SPIAPCIK PADDGAEEPGS ET SDAK ESPLQTPTEDG Chlorantranilipr LYYDPSQDNDR Methabenzthiaz uron SSLVIQWR SEEPGSETSDA ole K ESPPQPPADDG Chlorfluazuron SDPIAPCIK Methamidopho gentamicine AEEPGSETSDA s K GAAPPGQK Chlorotoluron SLADPAVVTGK Methiocarb FDPVHAALVWGPE K GAASPAQK Chloroxuron TLDPFSR Methomyl SYDPYWIGIR HLSNVSSTGSI Clethodim LHDPTFGDENEDD SELAR Methoprotryne Flusilazole DMVDSPQLATL ADEVSASLAK HVLGGGSVQIV Clofentezine ASDPYLDCIK Methoxyfenozid Flutolanil YKPVDLSK e HVPGGGSVQIV Clothianidin IGDPSLDNITHVP GGGNK Metobromuron Flutriafol YKPVDLSK IATPRGAAPPG Cyazofamid ADPAATVVDVDEVR Metribuzin Forchlorfenuron QK IAT PRGAAS PA Cycluron VDPSVYPLDR Mevinphos Formetanate QK HCL 3049346 5 IGS [ Pho] LDN CyMOXarlil EGDPYYGYTGAFR Mexacarbate Fuberidazole ITHVPGGGNK IGS [ Pho] TEN _ DSDPAYGFFK Monocrotophos Furalaxyl LK uyproconazole IGSLDNITHVP Cyprodinil VEDPSWILR Monolinuron Furathiocarb GGGNK IGSTENLK Cyromazine SSDPLVIQWR Moxidectin Halofenozide LDLSNVQS [ Ph Desmedipham CI PDFVNAAFGK Myclobutanil Hexaconazole o] K LDLSNVQSK Diclobutrazol Tacrolimus Neburon Hexaflumuron LQTAPVPMPDL Dicrotophos Sirolimus Nitenpyram Hexythiazox K QEFDTMEDHAG Diethofencarb Everolimus Novaluron Hydramethylnon DYTLLQDQEGD MDHGLK QEFEVM[Oxi] Difenoconazole TCTTPAQGNSMFP Nuarimol Imidacloprid EDHAGTYGLGD SCCCTKPTDGNCT R CI PI PSSWAFAK QEFEVMEDHAG Diflubenzuron TCTTPAQGNSMFP SCCCTKPTD Omethoate Indoxacarb TYGLGDR S [ Pho] PVVSG Dimethoate GNCTCIPIPSSWA FAK Oxadixyl Ipconazole DTS [Pho] PR S [ Pho] PVVSG Dimethomorph KTCTTPAQGNSMF PSCCCT Oxamyl Iprovalicarb DTSPR S [Pho]TPT [P Dimoxystrobin PK TDGNCTCIPIP SSWAFA Paclobutrazol Isocarbophos ho] AEDVTAPL VDEGAPGK S[Pho]TPT [P Diniconazole TCTTPAQGNSMFP SCCCTK Penconazole GIAPLQLGK ho] AEDVTAPL VDER S [ Pho] TPTAE Dinotefuran PTDGNCTCIPIPS SWAFAK Pencycuron IAKPNVSASTQAS DVTAPLVDEGA R PGK S [ Pho] TPTAE Dioxacarb LGPLV*EQGR Phenmedipham TLDFHDSNVK DVTAPLVDER SGYSSPGS [ Ph Diuron LGATQSNEITIPV TFESR Picoxystrobin VLPEDGPR o] PGT [Pho] P GSR SGYSSPGS [ Ph Doramectin NGVPQEESLEDSD VDADFK Piperonyl YLGADYIK o] PGTPGSR butoxide SGYSSPGSPGT Emamectin- LGASVPGSQTVVV Pirimicarb 3- [Pho] PGSR benzoate K Hydroxycarbofur an SGYSSPGSPGT _ NGISQVLEK Prochloraz Abamectin PGSR Epoxiconazole SPVVSGDTS [ P Eprinomectin NGFSIQVR Promecarb Acephate ho] PR SPVVSGDTS PR Etaconazole DGVTLQK Prometon Acetamiprid STPT [ Pho ] AE Ethiofencarb SGIPDNAFQSFGR Propamocarb Acibenzolar-S- DVTAPLVDEGA methyl PGK STPT [ Pho ] AE Ethiprole LGLIFDTSNLQSG VPSR Propargite Alanycarb DVTAPLVDER STPTAEDVTAP Ethirimol LGPQTLSR Propham Aldicarb LVDEGAPGK STPTAEDVTAP Ethofumesate EGQLTPLIK Propiconazole Aldicarb sulfone LVDER T [Pho] PPGS [ Etoxazole EGFDDLPLAEQR Propoxur Aldicarb sulfoxide Pho] GEPPK 3049346 6 T [ Pho] PPGSG EPPK Famoxadone TGQSSLVPALTDF Prothioconazol Ametryn VR e 3049346 7 T[Pho] PPSS [ Fenamidone GGFPEFVNELHNN GQK Pymetrozine Aminocarb Pho] GEPPK T[Pho] PPSSG Fenarimol EGAQLPVIENK Pyracarbolid Amitraz EPPK T[Pho] PS [Ph Fenazaquin AGI PNNQVLGK Pyraclostrobin Azoxystrobin o] LPTPPTR TDHGAEIVY [P Fenbuconazole ALVQIVGK Pyridaben Tebufenpyrad ho] K TDHGAEIVYK Fenhexamid GHSGLQPGR Pyrimethanil Tebuthiuron TPPGS [Pho] G Fenobucarb AS T P GAAAQ I QEV Pyriproxyfen Teflubenzuron EPPK GK TPPGSGEPPK Fenoxycarb VVNPTQGK Quinoxyfen Temephos TPPSS [Pho] G _ I PLENLQI IGR Rotenone Terbumeton EPPK renpropimorph TPPSSGEPPK Fenpyroximate NLAVQAQGK Secbumeton Terbutryn TPS [Pho] LPT Fenuron VLDALQAIGK Siduron Tetraconazole PPTR TPSLPTPPTR Fipronil VTEPISAESGEQVEGR Simetryn Thiabendazole VAVVRT [ P h o ] Flonicamid I S PNTSQQNFVTQ Spinetoram Thiacloprid PPK GR VAVVRT P PK Fluazinam FQAFANGSLLI PDFGGK Spinosad Thiamethoxam VQIVYKPVDLS Flubendimide EPISVSSEQVLGK Spirodiclofen Thidiazuron K HLSNVSS [Pho ] TGSIDMVDSP QLATLADEVSA SLAK Fludioxonil AVFQANQENLPIL Spiromesifen Thiobencarb GK HVPGGGSVQIV Flufenacet VQPVSEILQLGK Spirotetramat Thiofanox Y [Pho] KPVDL SK HVSGGGSVQIV Flufenoxuron ALDVIQAGGK Spiroxamine Thiophanate- YKPVDLSK methyl SGYSS [Pho] P Fluometuron IIHESGAQILGR Sulfentrazone Triadimefon GSPGTPGSR T [Pho] PSLPT Fluoxastrobin EQLS SVS S FER Tebuconazole Triadimenol PPTR TPSLPT [Pho] Fluquinconazol GDVAFVK Tebufenozide Trichlorfon PPTR e La préparation de telles billes et les méthodes pour leur imprégnation par des réactifs sont bien connues de l'homme du métier, en particulier en adaptant les méthodes usuelles de préparations de billes pour médicaments homéopathiques (FR 2 574 659, WO 5 98/07411). Les billes sont déposées dans un contenant en verre de taille proportionnelle au diamètre des billes. Avantageusement, le volume du contenant doit être 5 fois supérieur au volume totale représenté par les billes, soit, par exemple, 50 billes de 3mm dans un contenant de 4 cm de diamètre. 10 La solution mère des molécules à greffer est composée à plus de 70% de solvant organique comme le méthanol ou l'acétonitrile. Les billes sont mises en contact avec la 3049346 8 solution mère avec une proportion de 1g de bille pour 100 pl de solution mère pouvant contenir de l'acide afin de favoriser l'adsorption des molécules sur les billes de polymères. Le procédé de greffage est réalisé de préférence sous agitation permanente afin de garantir une adsorption homogène des molécules sur l'ensemble des billes d'un lot de 5 production. Le procédé de fabrication peut être décomposé en deux étapes, une première étape consistant en l'imprégnation des billes de polymères par une solution contenant la ou les molécules à analyser, puis une seconde étape de séchage des billes de polymères. L'imprégnation est réalisée de préférence sous agitation dans un contenant en verre, en particulier à une pression allant de 300mbar à 800mbar, de préférence environ 600 mbar 10 et à une température allant de 20°C à 60°C, de préférence environ 40°C, pour une duré comprise entre 10 et 40 minutes, de préférence environ 20 minutes. Le séchage des billes après imprégnation est réalisé de préférence sous une atmosphère contrôlée à une pression allant de 300mbar à 800mbar, de préférence environ 600 mbar, à une température allant de 20°C à 60°C, de préférence environ 40 °C, 15 avantageusement par un flux de gaz, pouvant être de l'air comprimé, de l'azote ou tout autre gaz inerte, par exemple entrant par l'intermédiaire d'un tube dont l'extrémité est à l'entrée du flacon en verre contenant les billes, pour une duré comprise avantageusement entre 10 et 40 minutes, de préférence environ 10 minutes. Ce cycle d'imprégnation et séchage peut être répété plusieurs fois, avantageusement 20 à au moins trois reprise pour garantir une homogénéité du greffage des molécules sur les billes de polymère. Lorsqu'il y a plusieurs produits greffés, on pourra les greffer soit ensembles, à partir d'un solution mère qui les comprend tous, ou encore les greffer en plusieurs groupes successifs, chacun comprenant un ou plusieurs produits. 25 L'invention concerne aussi un ensemble de billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites précédemment et dans les exemples, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité prédéterminée de produit adsorbé à leur surface sensiblement égale. De manière avantageuse, cet ensemble de billes est conditionné dans un emballage 30 qui permet une libération contrôlée du nombre de billes. De tels emballages sont bien connus de l'homme du métier, notamment utilisés pour la libération de billes de compositions homéopathiques, de produits alimentaires tel que les tablettes d'aspartame ou des bonbons. L'invention concerne aussi une gamme de produits à analyser caractérisée en ce 35 qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon l'invention, chaque ensemble ayant une quantité prédéterminée de produits greffés différente des autres ensembles. 3049346 9 La différence de quantités de produits greffés entre les différents ensembles dépendra de l'usage de ces ensembles. On pourra choisir des quantités prédéterminées de chaque ensemble séparées par exemple par un facteur 2, ou un facteur 10, ou encore selon une règle logarithmique. 5 Une telle gamme de produits peut être employée pour la réalisation de gammes d'étalonnage externe utilisées pour la quantification de composés ou la mesure de composé dans des échantillons ayant des niveaux de concentration différents du composé à analyser. Les billes greffées peuvent avoir différents usages, elles peuvent être utilisées pour 10 la quantification absolue de composés. Les billes greffées peuvent également être utilisée pour libérer un standard permettant la quantification relative d'échantillon entre eux, les billes seront donc utilisées pour normaliser les résultats issus de l'analyse des échantillons. Elles peuvent également être utilisée pour libérer des composés utilisé pour le 15 contrôle qualité d'instrument de mesure comme les spectromètres. Les billes greffées peuvent être utilisées pour libérer des composés utiles à la détection de mécanisme biologique comme des réactions immunitaires, des compétitions entre un anticorps et un antigène ou évaluer la toxicité des composés sur des modèles biologiques, notamment pour des analyses dans le domaine du diagnostique. 20 De manière avantageuse, les billes pourront être mis dés les premières étapes de la préparation d'échantillon, à une étape intermédiaire de la préparation d'échantillon ou encore à la fin de la préparation d'échantillon avant analyse de l'échantillon final. EXEMPLES 25 Exemple 1 - Préparations de billes greffées avec des peptides Une solution mère de peptide est réalisée par la reprise de 200pg de peptide GDVAFVK marqué aux isotope lourd 13C et 15N sur la lysine (K) par 1m1 d'une solution de méthanol 0,5% d'acide formique. 100p1 de cette solution mère sont prélevé et mis dans 900p1 de méthanol pour obtenir une solution à 20pg/ml. 50 billes de saccharose d'un 30 diamètre de 3mm sont déposées dans un ballon en verre d'un volume de 25m1. 100p1 de la solution à 20pg/m1 sont déposé dans le ballon contenant les billes de saccharose. Le ballon en verre contenant les billes et la solution peptidique est mis en rotation et sous vide pour atteindre une pression de 600mbar pendant 20 minutes. A l'issue de cette période d'imprégnation, de l'air comprimée est injectée dans le ballon à un débit de 12L/min pendant 10 minutes sous un vide constant de 600mbar. A l'issu de ce premier cycle d'imprégnation/séchage, il est répété deux fois pour obtenir trois cycle complet. 3049346 10 Une bille greffée avec le peptide GDVAFVK est reprise dans 500p1 d'une solution 95% H2O, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes. Un volume de 40p1 de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes : 5 Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France) Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm Solvant A : H2O + 0,1% acide formique Solvant B : ACN + 0,1% acide formique 10 Gradient de chromatographie liquide suivant : min Flow (ul/min) Soient A Solvent B 0 300 95 5 1 300 95 5 8 300 50 50 8.1 300 5 95 12 300 5 95 12.1 300 95 5 15 300 95 5 L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm. 15 L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement injecté dans la source d'ionisation du spectromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants : Type de balayage: MRM Polarité: Positive Source d'ionisation: Turbo V (Sciex) Précurseur: 372,2 Ion fragment: 472,3 Ion fragment: 401,3 Ion fragment: 571,4 Réglage Q1: Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Tension de cône: 5500 V Température de source: 500,00 °C Gaz de nébulisation: 50,00 psi Gaz chauffant: 40,00 psi Gaz rideau: 50,00 psi 3049346 11 Ce protocole peut également s 'appliquer à d'autres type de molécules comme des pesticides, des antibiotiques ou tout autre petite molécule. Exemple 2 - Préparation de billes greffées avec 7 peptides(figure 1) 5 Les 7 peptides suivant ont été greffés aux billes de saccharose GIAPLQLG[K(13C6; 15N2)] EQLSSVSSFE[R(13C6; 15N4)] TLDFHDSNV[K(13C6; 15N2)] VLPEDGP[R(13C6; 15N4)] GDVAFV[K(13C6; 15N2)] YLGADYI[K(13C6; 15N2)] IAKPNVSASTQAS[R((13C6);15N4)] Un aliquot de 200pg du premier peptide est dissous dans 1 ml de méthanol. La solution est ajoutée au 200pg du second peptide puis cette dernière est ajoutée au 200pg du troisième peptide et ainsi de suite jusqu'au septième et dernier peptide afin d'obtenir un 10 mélange de 7 peptides avec chacun une concentration de 200pg/ml. 1,8 ml de méthanol est ajouté à la solution mère à 200pg/ml pour obtenir une solution à 70pg/ml. 100p1 de cette solution sont ajouté à 250p1 de méthanol pour obtenir une solution à 20pg/m1 pour chacun des peptides. Le protocole de greffage décrit dans l'exemple 1 est réalisé pour obtenir des billes 15 greffées avec les 7 peptides. Une bille greffée avec les 7 peptides est reprise dans 500p1 d'une solution 95% H2O, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes. Un volume de 40p1 de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes : 20 Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France) Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm Solvant A : H2O + 0,1% acide formique Solvant B : ACN + 0,1% acide formique 25 Gradient de chromatographie liquide suivant : min Flow (ul/min) Solvant A Solvant B 0 300 95 5 1 300 95 5 8 300 50 50 8.1 300 5 95 12 300 5 95 12.1 300 95 5 15 300 95 5 3049346 12 L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm. Le résultat est représenté sur la figure 1, 5 Exemple 3 - Gamme de Gentamycine (figure 2) Pour réaliser la solution qui sera déposée sur les billes, la gentamicine 10mg/m1 sera diluée 5000 fois. 100p1 de la solution mère sont mis dans 900p1 d'H20. 100p1 de la solution générée sont mis dans 900p1 d'H20. 500p1 de la solution générée sont mis dans 500p1 d'H20 pour obtenir une solution à 100pg/ml. 40p1 de la solution à 100pg/m1 sont mis 10 dans 960p1 de méthanol. Le greffage de la gentamicine sur les billes de saccharose de 3mm s'effectue comme décrit dans l'exemple 1. Une gamme de concentration est réalisée par la reprise d'une bille dans : - 1m1 d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v) - 750p1 d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v) 15 - 500p1 d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v) Un volume de 20p1 de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes : Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France) Colonne Xbridge Hilic amide 2,1mm*100, 3,5pm colonne de WATERS 20 Solvant A : H2O + 0,1% acide formique Solvant B : ACN + 0,1% acide formique Gradient de chromatographie liquide suivant : min Flow (ul/min) Solvant A Solvant B 0 300 45 55 1 300 45 55 4 300 50 15 4.1 300 95 5 7 300 95 95 7.1 300 35 65 11 300 35 65 L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement 25 injecté dans la source d'ionisation du spec- tromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants : Type de balayage: MRM Polarité: Positive Source d'ionisation: Turbo V (Sciex) Précurseur: 478,4 3049346 13 Ion fragment: Ion fragment: Réglage Q1: Réglage Q3: Tension de cône: Température de source: Gaz de nébulisation: Gaz chauffant: Gaz rideau: 322,4 160,0 Filtrage avec résolution unitaire Filtrage avec résolution unitaire 5500 V 500,00 °C 50,00 psi 40,00 psi 50,00 psi Les résultats sont représentés sur la figure 2. Exemple 4 Gammes réalisées à deux semaines d'intervalles avec des billes 5 produites à partir de solutions mères de concentration différentes (figures 3A et 3B) Une solution mère de peptide est réalisée par la reprise de 200pg de peptide GDVAFVK marqué aux isotope lourd 13C et 15N sur la lysine (K) par 1m1 d'une solution de méthanol 0,5% d'acide formique. 350p1 de la solution mère sont dilué dans 350p1 de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 100pg/ml. 350p1 de la 10 solution mère à 100pg/m1 sont dilué dans 350p1 de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 50pg/ml. 350p1 de la solution mère à 50pg/m1 sont dilué dans 350p1 de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 25pg/ml. 350p1 de la solution mère à 25pg/m1 sont dilué dans 350p1 de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 12,5pg/ml. 350p1 de la solution mère à 12,5pg/m1 15 sont dilué dans 350p1 de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 6,25pg/ml. Chacune des solutions mères est utilisé pour le greffage sur des billes de saccharose selon le protocole cité en exemple 1. Chacune des billes greffées avec des quantités de peptide GDVAFVK allant de 20 1,2pg à 12,5ng est reprise dans 500p1 d'une solution 95% H2O, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes. Un volume de 40p1 de chaque échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes : Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France) 25 Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm Solvant A : H2O + 0,1% acide formique Solvant B : ACN + 0,1% acide formique Gradient de chromatographie liquide suivant 3049346 14 min Flow (ul/min) Solvant A Solvant B 0 300 95 5 1 300 95 5 8 300 50 50 8.1 300 5 95 12 300 5 95 12.1 300 95 5 15 300 95 5 L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm. 5 Les résultats représentés sur les figures 3A et 3B confirment la reproductibilité de la méthode selon l'invention. Exemple 5 - Quantification de l'apolipoprotéine E dans du plasma par le peptide LGPLVEQGR marqué en 13C et 15N sur la valine (V). 10 Les billes de polymère sont préparées à partir d'une solution mère du peptide LGPLVEQGR à 1 pg/ml selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Digestion enzymatique du plasma selon le protocole suivant : 1 mL of plasma dilué dans 4mL d'urée à 8M 550 pL of DTT à 150mM 15 1700 pL IAA à 150mM 30 mL de bicarbonate d'ammonium à 50 mM pH8 1 mL de trypsine à 2mg/mL dans 50mM de bicarbonate d'ammonium à pH8. 1 mL H20+0.5%FA sont ajouté à 10 ul de plasma hydrolysé Une bille de polymère greffé avec 6 ng de peptide LGPLVEQGR est ajoutée 20 Dessalage et concentration des échantillons par extraction sur phase solide selon le protocole suivant : Equilibrage des colonnes HLB Oasis Waters avec Iml de méthanol puis 1 ml H20/acide formique 0,1% Dépôt de l'échantillon qui s'écoule par gravité 25 Lavage avec 1m1 H20/acide formique 0,1% Elution avec 1m1 de méthanol 80% dans un mélange H20/acide formique 0,1% Evaporation à sec et reprise dans 200p1 d'une solution 95% H2O, 5% ACN et 0,5% acide formique. Un volume de 20p1 de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions 30 suivantes : - Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France) 3049346 15 Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm Solvant A : H2O + 0,1% acide formique Solvant B : ACN + 0,1% acide formique 5 Gradient de chromatographie liquide suivant min Flow (ul/min) Solvant A Solvant B 0 300 95 5 1 300 95 5 8 300 50 50 8.1 300 5 95 10 300 5 95 10.1 300 95 5 12 300 95 5 L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement injecté dans la source d'ionisation du spec- tromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants : Type de balayage: MRM Polarité: Positive Source d'ionisation: Turbo V (Sciex) Réglage Ql: Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Tension de cône: 5500 V Température de source: 500,00 °C Gaz de nébulisation: 50,00 psi Gaz chauffant: 40,00 psi Gaz rideau: 50,00 psi 10 Les valeurs des masses et les paramètres du chemin optique sont les suivants : ID Q1/Q3 time DP EP CE CXP APOEHUMAN LGPLVEQGR + 484.8 / 855.5 100 ms 66.5 10 26.3 13 - 2y5 light AP6EHUMAN LGPLVEQGR + 484.8 / 798.4 100 ms 66.5 10 26.3 13 - 2y6 _light APOEHUMAN LGPLVEQGR + 484.8 / 701.4 100 ms 66.5 10 26.3 13 - 2y7 _light APOEHUMAN LGPLVEQGR + 484.8 / 588.3 100 ms 66.5 10 26.3 13 - 2y7+2_light APOEHUMAN LGPLVEQGR + 484.8 / 399.7 100 ms 66.5 10 26.3 13 - 2y8 _light APOEHUMAN LGPLVEQGRheavy_+2y5_heavy 487.8 / 861.5 100 ms 66.5 10 26.3 13 APOEHUMAN LGPLVEQGRheavy_+2y6_heavy 487.8 / 804.5 100 ms 66.5 10 26.3 13 APOEHUMAN LGPLVEQGRheavy_+2y7_heavy 487.8 / 707.4 100 ms 66.5 10 26.3 13 3049346 16 REFERENCES EP 1 456 227, WO 2010/035504 WO 2014/066284 5 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la 5 solution à la surface desquelles sont greffés le ou lesdits produits. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les billes sont calibrées avec un diamètre homogène. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le diamètre des billes va de 1 à 4 mm. 10 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant contient de l'eau et la bille constituée de un ou plusieurs composés hydrosolubles choisis parmi les sucres, les polyosides, les acides hydroxycarboxyliques, et leurs mélanges. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le composé 15 hydrosoluble est choisi parmi le saccharose, le lactose, les alginates et l'acide lactique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la quantité de produit greffé sur chaque bille est prédéterminée, de 1 picogramme à 100 microgrammes par bille. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le 20 produit est choisi parmi les peptides, les protéines ou petites molécules, éventuellement marquées isotopiquement, deutérées ou pouvant contenir des modifications comme les phosphorylations, les oxydations ou les carbamidométhylation. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la solution préparée est appropriée pour son utilisation dans une méthode d'analyse par 25 spectrométrie. 9. Ensemble de billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité prédéterminée de produit greffé à leur surface sensiblement égale. 30 10. Ensemble de billes selon la revendication 9, caractérisé en ce que les billes sont conditionnées dans un même emballage permettant une libération contrôlée du nombre de billes. 11. Gamme de produits à analyser caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon la revendication 9 ou 10, chaque ensemble ayant 35 'une quantité prédéterminée de produit adsorbé différente des autres ensembles. 12. Gamme selon la revendication 11, caractérisée en ce que les quantités prédéterminées de chaque ensemble sont séparées d'un facteur prédéterminé. 3049346 18 13. Procédé de préparation billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une première étape d'imprégnation des billes de polymères par une solution contenant la ou les produits à analyser pour permettre le greffage desdits produits à la surface des billes, puis une étape de séchage des billes greffées obtenues. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'imprégnation et/ou le séchage sont réalisés sous atmosphère contrôlée. 15. Procédé selon 'lune des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que le cycle d'imprégnation et de séchage est répété plusieurs fois. 10