FR 3042043 A1 20170407 FR 1570017 A 20150804 1 PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE OPTIQUE INTRODUCTION La présente invention concerne un procédé et un dispositif de mesure optique. Elle trouve des applications dans tous les domaines de l'imagerie, en particulier mais non limitée au domaine de la Microscopie, incluant mais non limité aux domaines de la Biologie, de la Médecine, de la Pharmacie, des Semiconducteurs, de l'Etude des matériaux, de la Métrologie, du contrôle, de la mesure et de l'observation et à l'ensemble des processus d'acquisition de l'information à partir d'observations optiques, dans le domaine macroscopique ou microscopique. De nombreuses définitions, utilisées pour l'ensemble de cette invention, sont regroupées dans un chapitre ultérieur : « Définitions et compléments techniques ». Microscopie Un Microscope optique est un instrument utilisé en général pour voir, analyser ou mesurer les objets trop petits pour être visualisés à l'oeil nu. On se réfère à la Figure. 1, qui représente une illustration du paradigme de la Microscopie, 100. La Microscopie optique consiste en l'illumination, par une source lumineuse, non représentée, à l'aide d'un Microscope, 10, d'un échantillon biologique ou non-biologique,11, et la mesure en fonction du temps, à l'aide d'une observation visuelle ou d'un module de détection, 12, de la lumière émise, réémise, diffusée ou réfléchie ou transmise par l'échantillon. En Biologie, l'échantillon consiste en une - ou une pluralité - d'entités objets biologiques différentes, 13 et 14, positionnées à différentes positions. Des exemples de tels objets, sont, entre autres, une cellule, un virus, une protéine ou un fragment d'ADN. En vision industrielle artificielle l'échantillon peut être, par exemple, un élément semi-conducteur La Microscopie est segmentée en différentes modalités ayant des caractéristiques et des finalités différentes. De nombreuses descriptions des différentes modalités, de leurs caractéristiques et de leurs avantages existent extensivement dans la littérature et se trouvent par exemple sur les sites web des sociétés Zeiss, Leica, Nikon, ou Olympus. On peut segmenter les applications de Microscopie de différentes manières : l'une d'entre elles est de distinguer les modalités de Microscopie dévolues à la visualisation de sources ponctuelles minuscules de celles dévolues à la mesure d'objets continus. Le cas des sources ponctuelles minuscules est a priori beaucoup plus simple. L'objet consiste en un petit nombre de points lumineux ; ceux-ci peuvent être décrits par un petit nombre de paramètres - les descripteurs définis par la suite - simplifiant de beaucoup le problème physique et la complexité algorithmique. Le cas d'un objet continu, décrit par une distribution spatiale - ou spatio-temporelle, si on prend en compte la dynamique continue, est différent et est décrit aussi dans cette demande de brevet. 3042043 2 Microscopie de fluorescence La microscopie de fluorescence est une des modalités de la microscopie; elle a remplacé, dans de nombreuses applications, les autres techniques de microscopie. Un microscope à fluorescence est un microscope optique utilisé pour étudier les propriétés d'objets, ou de substances organiques ou inorganiques en utilisant les phénomènes de fluorescence au lieu de, ou en plus d'autres modalités telle que la réflexion et l'absorption. On se réfère de nouveau à la Figure. 1, décrivant, cette fois, un microscope de fluorescence utilisé soit en Biologie soit en Vision artificielle pour caractériser, par exemple, des matériaux; en microscopie de fluorescence on fixe des sources ponctuelles minuscules, 15 à 18, par exemple des fluorophores basées sur le phénomène physique de la fluorescence à un photon, à des positions spécifiques et prédéterminées des objets, 13 et 14; on observe la lumière émise par les sources ponctuelles en lieu et place d'observer la lumière émise par les objets, 13 et 14, eux-mêmes. L'échantillon est éclairé par une lumière de longueur d'onde, ou de longueurs d'onde spécifiques, qui est absorbée par les sources ponctuelles, induisant ainsi l'émission de lumière à des longueurs d'onde différentes et plus élevées. Lors de la collecte de la lumière émise, en fluorescence, la lumière d'illumination est séparée de la fluorescence émise, qui est plus faible, par l'utilisation d'un filtre spectral d'émission. La microscopie de fluorescence étudie la lumière émise par de petites sources ponctuelles, les fluorophores. Toutefois, lorsque la densité des fluorophores est élevée, les fluorophores ne sont plus analysés individuellement mais traités comme un objet continu. Il est important de noter, dès ce stade, que le même système permet l'observation d'objets continus, et n'est pas limité à l'observation de sources ponctuelles. Les fluorophores sont devenus un outil important de la visualisation d'objets biologiques. L'activité et l'information biologique comprenant des détails au-dessus de la limite de résolution de 200 - 250 nm sont systématiquement visualisés et mesurées en utilisant la microscopie de fluorescence. Cette limite de résolution est dérivée du critère de Rayleigh, qui, dans le meilleur des cas, atteint 200 - 250 nm dans des systèmes conçus spécialement. Pendant longtemps, jusqu'à l'émergence des techniques de superrésolution décrites ci-dessous, il était reconnu que les techniques optiques, y compris la microscopie de fluorescence, sont incapables de visualiser des détails plus petits que le critère de Rayleigh, de l'ordre de 200 - 250 nm. Les principales implémentations de la microscopie de fluorescence, décrites en détails dans la littérature, sont le microscope confocal, souvent utilisé dans une configuration à balayage ou à disque rotatif et le microscope d'imagerie à grand champ. 3042043 3 Microscopie confocale On se réfère maintenant à la figure 2, qui est une représentation simplifiée d'un microscope confocal à fluorescence de l'art antérieur 200. Un microscope confocal de fluorescence, Fig. 2, est un instrument optique. Ses principaux composants matériels sont représentés dans la figure. 2. Ils comprennent: - Une source de lumière, 20, - un cadre optomécanique non représenté, - un cube de filtres, 21, - un objectif de microscope 22, et, - un ensemble détecteur, 23, - une unité de traitement, non représentée. La source de lumière, 20, qui peut être une lampe à arc ou un laser, crée de l'énergie lumineuse nécessaire pour la fluorescence. Le cadre optomécanique, non représenté, est le support de tous les éléments optiques et comprend des optiques auxiliaires et les capacités d'alignement. Il comprend également, des éléments optiques, non représentés, capables de façonner le faisceau, pour permettre sa focalisation d'un point de taille minimale, au moyen de l'objectif du microscope. Il peut comprendre également, dans un microscope confocal de fluorescence à balayage, un mécanisme de balayage, spatial ou angulaire, non représenté pour modifier la position de la source ponctuelle par rapport à l'objet à mesurer. Le cube de filtres, 21, canalise les différents signaux optiques et évite la contamination du signal de fluorescence par la lumière d'excitation. Le cube de filtres se décompose en: filtre d'excitation, 210, miroir dichroïque, 211, et filtre d'émission, 212. L'objectif de microscope, 22, focalise la lumière créée par la source dans le plan focal de l'objectif, 24, en une distribution lumineuse de taille réduite, la distribution lumineuse considérée comme optimale consistant en un disque d'Airy. L'objectif de microscope, 22, permet également de recueillir en retour la lumière fluorescente émise par les fluorophores. Pour un microscope confocal de fluorescence à balayage le système peut être déscanné, c'est-à-dire que la lumière en retour peut passer par le mécanisme de balayage pour compenser la translation due au balayage. Une lentille de détecteur, 25, crée, au plan image du détecteur 26, une image magnifiée du plan focal de l'objectif, 24. Un trou confocal, 27, est théoriquement placé dans le plan image du détecteur, 26. Dans la plupart des systèmes pratiques, le trou confocal, 27, est placé dans un plan d'imagerie intermédiaire non représenté et réimagé sur le plan image du détecteur, 26. 3042043 4 L'assemblage du détecteur, 23, détecte l'intensité fluorescente globale dans le volume éclairé, et la transforme en signal numérique. Pour un microscope confocal à balayage, l'assemblage du détecteur est constitué d'un détecteur d'un seul élément, comme un PMT ou SPAD. Pour un microscope confocal à disque rotatif, l'assemblage du détecteur est constitué d'une matrice d'éléments de détection, telle qu'un CCD, un EMCCD, un CMOS ou une matrice de SPAD. L'ensemble des composants montés à partir de la source lumineuse jusqu'au filtre dichroïque est la voie d'éclairage, 201. L'ensemble des composants montés à partir du filtre dichroïque jusqu'à l'assemblage du détecteur est la voie de détection, 202. Le processus optique élémentaire d'un microscope confocal standard peut être segmenté en six parties: - Projection de la lumière sur le volume d'analyse - Emission de lumière fluorescente par les fluorophores - Imagerie des fluorophores sur le plan focal - Limitation dans le plan focal de la lumière analysée par le trou confocal - Intégration de la lumière analysée par un détecteur photoélectrique - Visualisation de l'intensité mesurée sous forme d'une valeur de pixel dans une image Des microscopes à fluorescence sont disponibles auprès de plusieurs fabricants, comme par exemple, Nikon, Zeiss, Leica ou Olympus. Les microscopes à fluorescence peuvent être soit des microscopes standards adaptés à la fluorescence soit des microscopes spécifiques optimisés pour la fluorescence. Les microscopes modernes sont des instruments polyvalents capables de fonctionner dans de nombreuses modalités différentes, y compris, mais sans s'y limiter, les modalités de fluorescence, en utilisant la même plate-forme optomécanique et la plupart des composants. La plupart des microscopes à fluorescence sont développés en tant que plate-forme ouverte, capable d'effectuer plusieurs fonctionnalités additionnelles avec des modifications minimes. D'autres microscopes à fluorescence sont des instruments dédiés, personnalisés à une tâche spécifique, comme le diagnostic médical ou pharmaceutique. Cependant, d'autres activités biologiques fondamentales se produisent également à des échelles de taille inférieure à 200 nm dans des échantillons biologiques. A ce niveau de résolution spatiale, des phénomènes importants peuvent être observés : les processus biologiques à l'échelle intracellulaire, le transfert d'information cellulaire, le repliement et le dépliement des protéines ou les modifications de l'ADN et l'ARN. Ainsi, par exemple, la mesure de ces informations intracellulaires ouvrira de nouvelles voies à la compréhension de l'activité biologique, et conduira à des progrès dans la connaissance et le suivi de la recherche et du diagnostic médical. Toutefois, les différentes méthodes de microscopie existantes et les microscopes existants, n'incorporant pas la superrésolution, permettent l'observation microscopique sous la limite de la diffraction optique. Ceci réduit leur champ d'utilisation à un ensemble d'applications limité. 3042043 Superrésolution De nouvelles méthodes optiques, les méthodes de superrésolution, sont capables d'obtenir des images à une résolution supérieure à la limite de diffraction. Ces méthodes sont développées par plusieurs entreprises, laboratoires et chercheurs et certains des instruments utilisant ces méthodes, les microscopes de superrésolution, sont disponibles commercialement. Une synthèse des techniques de superrésolution a été publiée par l'Académie des Sciences de Suède, à l'occasion de la remise des Prix Nobel de Chimie 2014 [38]. Plusieurs analyses comparatives des méthodes de superrésolution ont été publiées récemment dans la littérature, comme les articles de Schermelleh et al. [1]. Une bibliographie mise à jour sur la superrésolution se trouve sur le site web de la société Zeiss, et sur le site web de la société Nikon. Les nouvelles techniques de superrésolution permettent d'obtenir des informations au-delà de la limite de résolution. Le principal problème de l'ensemble des techniques existantes de superrésolution est la limite de l'enveloppe des performances, exprimée en termes de résolution, latérale et longitudinale, de vitesse, d'intensité lumineuse nécessaire et de phototoxicité dans l'objet biologique, et donc d'aptitude à mesurer des objets biologiques différents. Ce point a d'ailleurs été souligné par Eric Betzig, lors de sa présentation magistrale à la cérémonie de réception du prix Nobel de Chimie 2014. De plus, la plupart des méthodes et instruments existants de superrésolution peuvent fournir soit une bonne résolution latérale, soit une bonne résolution longitudinale, mais rarement les deux. De plus, tous ces instruments sont complexes et nécessitent une haute technicité de l'opérateur. De plus, ces instruments ne peuvent observer généralement qu'une faible partie des spécimens biologiques, en raison de fortes limitations opérationnelles, telles que pour certains d'entre eux une faible profondeur de champ ou de très fortes intensités nocives pour les cellules. Un autre problème avec les méthodes et instruments existants de superrésolution, est que la plupart d'entre eux sont en mesure de récupérer, dans le volume illuminé, les attributs d'un fluorophore unique, mais ne parviennent pas à reconnaître simultanément la présence de plusieurs fluorophores et de mesurer leurs attributs. Un problème supplémentaire avec certaines méthodes et instruments existants de superrésolution est que ces méthodes et instruments existants sont présentés aux utilisateurs et perçus par eux comme un outil général, apte à remplacer les microscopes standard ou confocal. Cependant, les méthodes et instruments existants de superrésolution manquent de simplicité, de robustesse, de facilité d'utilisation et sont onéreux par rapport aux microscopes standards, ce qui freine leur utilisation comme outils de recherche générale ou comme outils de diagnostic. Un autre problème avec certaines méthodes et instruments existants de superrésolution est que la plupart de ces méthodes et instruments sont construits comme des instruments autonomes 3042043 6 conçus pour remplacer les microscopes standards. Une telle approche nécessite le remplacement des instruments existants ainsi que le renouvellement de tous les systèmes périphériques et toutes les connaissances et savoir-faire, liés aux plateformes de microscopie et développées depuis de nombreuses années. Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus sur un paradigme d'acquisition d'image, pour lequel l'entité de base de l'information est une - ou plusieurs images, ou une - ou plusieurs - régions ROI - Region Of Interest bi ou tridimensionnelles. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront, par leur inhérente flexibilité, le développement de stratégies nouvelles d'acquisition. Ces procédures d'acquisition, dynamiques et sélectives, seront définies par une gestion optimisée de la séquence d'acquisition et de traitement interactif et différé. Elles permettront une optimisation plus évoluée de l'information utile, définie par des critères basés sur la forme, la géométrie et la dynamique d'un ou plusieurs objets fluorescents, séparément ou l'un par rapport à l'autre. Un autre problème avec la plupart des méthodes et instruments existants de microscopie de fluorescence et de superrésolution est que ces méthodes et instruments sont conçus pour étudier des échantillons sur des lamelles de microscopes. Cependant, le microscope confocal est aujourd'hui utilisé dans de nombreux domaines médicaux comme instrument de diagnostics in-vivo pour des examens internes et externes au corps humain par le biais de fibres optiques utilisées pour illuminer et pour visualiser la fluorescence émise par les tissus à diagnostiquer. La superrésolution ne permet pas actuellement de pratiquer de tels diagnostics in-vivo. Les méthodes algorithmiques, systémiques et de superrésolution décrites ultérieurement dans le contexte de l'invention permettront le développement de nouvelles méthodes de diagnostics in-vivo qui réduiront les besoins de pratiquer des biopsies et raccourciront le temps d'attente du patient. Il y a donc toujours un besoin urgent de fournir des méthodes et instruments de superrésolution et des méthodes algorithmiques capable de mesurer avec une grande précision un objet ou une scène biologique. 3042043 7 RESUME DE L'INVENTION Un premier aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l' échantillon; un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori. Une loi a posteriori peut combiner, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection. Dans un mode de réalisation le module d'algorithme est configuré pour estimer la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; et estimer la moyenne a posteriori, représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques Selon un mode de réalisation l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC) Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant 3042043 8 un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, intégré ou non dans le dispositif, un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet; un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité pour traiter les données et reconstruire l'échantillon, la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov Selon un mode de réalisation pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle est utilisée, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage. Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse-fréquence et une composante plus parcimonieuse. Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation. Selon un mode de réalisation un masque de taille variable est utilisé dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement Un autre aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon 3042043 9 comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le balayage optique de l'échantillon, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l' échantillon; l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'application d'un algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori. Une loi a posteriori peut combiner, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection. Dans un mode de réalisation l'algorithme comporte l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; et l'estimation de la moyenne a posteriori, représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques Selon un mode de réalisation l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit 3042043 une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le balayage optique de l'échantillon, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet; l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'application d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité, la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov Selon un mode de réalisation pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle est utilisée, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage. Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse-fréquence et une composante plus parcimonieuse. Selon un mode de réalisation l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation. Selon un mode de réalisation un masque de taille variable est utilisé dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement 3042043 11 BREVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention va maintenant être décrite en relation avec certains modes de réalisation en référence aux figures illustratives suivantes de sorte qu'elle puisse être mieux comprise. Avec une référence spécifique aux figures, il est souligné que les indications figurantes sont présentées à titre d'exemple, et à des fins d'illustration de la discussion des modes de réalisation de l'invention et ne sont présentés que dans le but de fournir ce qui puisse être considéré comme la description la plus utile et facile à comprendre des principes et des aspects conceptuels de l'invention. À cet égard, aucune tentative n'est faite pour montrer des détails de structure de l'invention plus en détail que ce qui est nécessaire pour une compréhension fondamentale de l'invention, la description prise avec les dessins faisant apparaître à l'homme de l'art comment les différentes formes de l'invention peuvent être réalisées dans la pratique. Dans les dessins: Fig. 1 est une représentation simplifiée d'un microscope à fluorescence confocal de l'art antérieur, utilisé aussi comme support de l'invention; Fig. 2 est une représentation picturale simplifiée d'un système de superrésolution en microscopie de fluorescence, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 3 est une illustration schématique simplifiée d'un module de diffraction conique, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 4a à 4f sont des représentations picturales simplifiées des paradigmes de mesure et de confinement volumique selon des modes de réalisation de l'invention et de la microscopie confocale; Fig. 5 est une représentation picturale simplifiée d'un mode de réalisation particulier de la plateforme de microscopie SRCDP ; Fig. 6a est une illustration schématique simplifiée d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 6b est une illustration schématique simplifiée d'une autre réalisation d'un module latéral de superrésolution, conformément à un mode de réalisation de la présente invention; Fig. 7a à 7c présente des tables de distributions lumineuses d'un module de diffraction conique en fonction de la polarisation des polariseurs d'entrée et de sortie pour plusieurs valeurs du paramètre de diffraction conique, po. Ces distributions lumineuses ont été calculées par simulation des équations développées par Berry, [2] ; la Figure 7d complète ces tables de distribution en présentant la variation des distributions dites demi-lunes décalées en fonction de la position axiale (axe z). Fig.8 est une illustration schématique simplifiée d'un des modes de réalisation du dark tracking ; 3042043 12 Fig. 9 est une illustration schématique simplifiée d'une méthode d'algorithme de superrésolution de données de fluorophores, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. Fig. 10 est une illustration schématique simplifiée du calcul des descripteurs ; Fig. 11 est une illustration schématique simplifiée du module de contrôle de la plateforme SRCDP. Dans toutes les figures, des chiffres de référence similaires identifient des pièces similaires. 3042043 13 DEFINITIONS ET COMPLEMENTS TECHNIQUES Nous utiliserons le terme biologique pour décrire toute entité de la Science du vivant, quelle que soit sa provenance, humaine, animale ou végétale et la finalité de son observation, recherche, diagnostique ou thérapeutique. Ce terme inclut les utilisations médicales de la technique décrite. La Microscopie est utilisée dans le domaine de la Biologie, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des entités (objets) biologiques et leur dynamique. Nous utiliserons, par extension, le terme de Vision artificielle pour décrire l'ensemble des applications de mesure, métrologie ou observation d'objets ou éléments produits ou construits ou réalisés par un être humain ou une machine, par exemple, pour observer, étudier et mesurer des Semiconducteurs ou pour caractériser les matériaux. Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour: phase et polarisation, polarimétrie, vecteurs et matrices de Jones, paramètres de Stokes et techniques de mesure des paramètres de Jones et de Stokes. Les définitions usuelles sont utilisées pour: limite de diffraction optique, critère de Rayleigh, disque d'Airy et ses rayon et diamètre. Nous utilisons dans le contexte de l'invention les termes de superrésolution, superrésolu, d'imagerie de superrésolution et de microscopie de superrésolution pour décrire l'acquisition de données optiques, en imagerie, en microscopie ou en Vision artificielle, à une résolution supérieure à la limite de diffraction optique. Les définitions usuelles sont utilisées pour la fluorescence et pour les fluorophores. Nous utiliserons alternativement les termes longitudinal et axial pour décrire la dépendance de la lumière le long de l'axe de propagation, auquel nous nous référons comme l'axe z ou axe longitudinal. Nous utiliserons le terme latéral pour décrire la dépendance de la lumière dans les axes orthogonaux à l'axe optique du système, auquel nous nous référons comme les axes x et y. Les définitions usuelles sont utilisées dans la description pour le mode TEM00 d'une fibre et les termes anglais, « Photonic Crystal Fiber » - PCF -, « few modes fiber » - FMF , vortex Fiber et « dual core Photonic Crystal Fiber » pour des fibres spécifiques. Nous nous référerons à un dispositif permettant de coupler plusieurs lasers à différentes longueurs d'onde ou à une même longueur d'onde, avec la même polarisation ou avec différentes polarisations, dans une ou plusieurs fibres optiques, en utilisant le terme de banc laser. La définition des superoscillations est celle de Yakir Aaronov et de Sir Michael Berry. Une superoscillation est un phénomène dans lequel un signal qui est globalement limité en bande peut contenir des segments locaux qui oscillent plus rapidement que ses composantes de Fourier les plus rapides. [261 Le centre ou centroïde d'une distribution de lumière est le centre de gravité de l'intensité. Le diamètre d'une distribution de lumière est le diamètre du premier zéro d'intensité, pour des ondes régulières et singulières, sans prendre en compte le zéro central de l'onde singulière. 3042043 14 Deux distributions de lumière sont co-localisées si leurs centres coïncident ou sont séparés par une valeur spatiale faible par rapport à la dimension de la distribution de lumière. Dans cette demande de brevet, nous utiliserons la longueur d'onde d'émission, comme métrique de base du système. Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optiques suivants : lentille dont la définition est élargie, pour inclure l'ensemble des moyens optiques qui transmettent, réfractent ou réfléchissent la lumière, optique auxiliaire - sous-module optique visant à interfacer et à ajuster soit les paramètres géométriques soit les paramètres de phase et/ou de polarisation entre deux autres sous-modules ou modules optiques -, polariseur, analyseur, lame de retard, séparateur de faisceau « beamsplitter » en anglais, polarisant et non-polarisant, combineur de faisceau « beam combiner » en anglais, polarisant et non-polarisant. Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour les polariseurs azimutal et radial. Nous étendrons, implicitement ou explicitement, certains développements décrits ultérieurement pour les polariseurs azimutal et radial, à l'ensemble des éléments polarisants variables dans l'espace. Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles, [3] et [38], sont utilisées pour les différentes techniques de superrésolution; ces techniques peuvent être regroupées en familles: - REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions(RESOLFT), regroupant les techniques : Stimulated Emission Depletion microscopy (STED), Ground State Depletion (GSD), Saturated Structured Illumination Microscopy (SSIM) et SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy), Localisation Microscopy, (microscopie de localisation, en anglais) regroupant les techniques Photo-Activated Localization Microscopy (PALM), FPALM (3D Localization in Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), dSTORM (direct STORM), SPDM (Spectral Precision Distance Microscopy), « stochastic blinking », Ground State Depletion (GSD), et techniques similaires (quel que soit l'acronyme utilisé) - Structured Image Microscopy (SIM) - FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), - TIRF (Total Internai Reflection Fluorescence Microscopy). Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour différentes techniques de Microscopie, de résolution standard ou de superrésolution, fluorescentes ou non, telles que les termes anglais « Computational Microscopy », « Correlative Microscopy », « Crossplatform-microscopy », FCS - « Fluorescence Correlation Spectroscopy », FCCS - « Fluorescence 3042043 Cross-Correlation Spectroscopy », ou PCH - Photon Counting Histogram, RICS « Raster Imaging Correlation Spectroscopy » ou FRAP - « Fluorescence Recovery After Photobleaching analysis ». Dans cette demande de brevet, les définitions usuelles sont utilisées pour la transformée de Hough, pour les algorithmes MAP - « Maximum A Posteriori estimation », LSE « Least Squares Estimation », ICE « Iterated Conditional Expectation ». Nous nous référons à l'algorithme E-LSE, « emitter-Least Square Error » un algorithme nouveau décrit dans cette demande de brevet. Nous nous référons à un polariseur partiel pour décrire un élément ou un module dont l'absorption est différente pour les deux polarisations linéaires - dichroïsme linéaire - ou pour les deux polarisations circulaires - dichroïsme circulaire. Nous nous référons à des éléments dynamiques de polarisation ou de phase, pour décrire les moyens optiques dont les propriétés de polarisation ou de phase varient en fonction du temps de façon contrôlée, de façon discrète ou continue. Ces éléments dynamiques de polarisation ou de phase comprennent, mais ne sont pas limités à: lames d'onde tournante sur leur axe, valves de lumière basées sur des technologies à cristaux liquides, dispositifs électro-optiques, connus aussi comme cellules de Pockels, cellules de Kerr, par exemple en utilisant des composants de matériau PLZT, dispositifs électro-optiques résonnants, dispositifs magnéto-optiques, connus également en tant que cellules de Faraday, dispositifs acousto- ou élasto- optiques ou toute combinaison de ces moyens. Nous nous référons à des éléments dispersifs de polarisation ou de phase pour décrire des éléments dont l'état de polarisation dépend de la longueur d'onde. Le plus simple des sous-modules dispersifs de polarisation est la lame d'onde multimode ou épaisse, Nous nous referons a l' « algorithme du centroïde » pour décrire la procédure usuelle de mesure du centroïde et éventuellement de la largeur (FWHM - acronyme en anglais pour « Full Width Half Maximum ») d'une distribution lumineuse. Dans ce document, les définitions usuelles sont utilisées pour les composants optoélectroniques suivants : détecteur photoélectrique, CCD, EMCCD, CMOS, SPAD Single Photon Avalanche Diode et matrice de SPAD. Nous utiliserons les termes: o image optique, pour la distribution spatiale d'intensité lumineuse, o image électronique, pour décrire la distribution spatiale de charges pour un CCD, de courant pour un CMOS ou d'évènements pour un SPAD, créées par l'image optique, à un instant donné, dans un plan de détection, o image numérique, pour décrire une matrice de nombres créée par la numérisation de l'image électronique. 3042043 16 Pour simplifier la lecture et la compréhension du texte nous utiliserons aussi le terme d'image pour la sortie d'un détecteur à pixel unique tel qu'un PMT ou SPAD, en la considérant comme une image consistant en un unique pixel. Lorsqu'aucune ambiguïté n'existe, ou que la distinction entre les trois types d'images n'est pas nécessaire, nous utiliserons le terme simplifié générique d'image. Pour les images, nous utilisons la terminologie utilisée pour les détecteurs matriciels, tels que les CCD, les EMCCD et les CMOS. Pour les SPAD et les matrices de SPAD, le résultat d'une mesure est une liste ordonnée dans le temps, d'impacts de photons détaillant, pour chaque photon, le temps d'impact et la position de l'impact. Pour simplifier la présentation de ce document, nous inclurons ce cas dans notre définition des images. Les images détaillées dans ce document, dans de nombreux cas, peuvent être qualifiées de microimages, des images de taille sensiblement égale à un petit nombre de diamètres du disque d'Airy, typiquement inférieur à 5 diamètres, et/ou à faible nombre de pixels, typiquement 4*4 à 32*32. Dans une image numérique Aj, les indices m et n représentent les indices des pixels ; l'origine des pixels sera choisie comme la projection du centre du volume d'analyse défini dans un paragraphe ultérieur. Polarimétrie et vecteurs de Stokes La polarimétrie se réfère à la mesure de l'état de polarisation de la lumière incidente. L'état de polarisation de la lumière incidente peut être décrit par les paramètres de Stokes, un ensemble de valeurs, introduit par George Gabriel Stokes en 1852, et utilisé en Optique. Copropagation de deux faisceaux optiques De nombreux systèmes et dispositifs optiques utilisent deux faisceaux - ou plus - ayant des propriétés différentes. Les faisceaux peuvent interagir entre eux ou non, être projetés séquentiellement ou simultanément. Dans la majorité de ces systèmes et dispositifs, les deux chemins optiques sont séparés physiquement l'un de l'autre. Cette séparation physique créée, au niveau de l'ingénierie du système un ensemble de contraintes, qui bien que résolvables, alourdissent de façon importante la complexité du système et son coût. Nous nous référons à des systèmes à chemin commun « common path » en anglais, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, à des variations mineures près. Dans cette invention, nous référencerons, par extension, des systèmes à quasi chemin commun, pour référencer un ensemble de dispositifs dans lesquels les deux faisceaux différenciés se propagent suivant le même chemin physique, mais se séparent et se recombinent dans un module optique, le chemin optique dans l'élément optique étant négligeable par rapport au chemin optique total. Cette définition permet d'introduire le cas d'un module optique, contenant un séparateur de polarisation suivi à une distance très faible par un élément combinant les deux 3042043 17 polarisations, ou tout élément similaire. L'introduction d'un tel module ne modifie pas de façon significative la fonctionnalité et les avantages d'un système à chemin commun. Dans la suite de cette invention, pour simplifier la lecture, lorsque nous nous référerons à un système à chemin commun, nous inclurons le cas d'un système à quasi chemin commun. Champ électrique en coordonnées polaires et modes angulaires E(p, 0) = A(p, 0) x exp[i cp(p, 0)]u(p, 0) (EQ. 1) Il est usuel en Optique de décomposer les composantes du champ, soit son amplitude, sa phase et sa polarisation, en modes orthogonaux, cartésiens ou polaires. De nombreuses décompositions en modes orthogonaux polaires, tels que les modes Gaussiens, Hermite-Gaussiens, HGG et « Elégant » et Laguerre-Gaussiens sont connus de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons principalement dans ce document, la décomposition de l'amplitude du champ Ondes singulières Ce thème de recherche en Optique, initié par l'article majeur de J.F Nye et M. Berry, en 1974, [4], est maintenant connu comme l'« optique singulière ». Des exemples d'ondes régulières et singulières sont présentés dans la suite. Nous utilisons le terme anglais beam shaping pour décrire la transformation d'une onde de forme et de topologie donnée en une onde d'une autre forme ou topologie, et en particulier la transformation d'une onde régulière en singulière et vice versa. Topologie et distributions lumineuses compactes Une distribution lumineuse, ponctuelle, sera réputée compacte si elle remplit une des conditions de compacité définies ci-dessous, par deux conditions alternatives et non exclusives : - soit, plus de 75% de l'énergie est contenue dans un cercle de rayon inférieur à 1.75 fois le rayon d'Airy, - soit un domaine lumineux, contenant plus de 65% de l'énergie est délimité par une ligne d'intensité nulle comprise dans un cercle de rayon inférieur à deux fois le rayon d'Airy, Nous distinguons différentes familles de distributions lumineuses ponctuelles, de topologies différentes : Les distributions régulières, dans leur définition usuelle en Optique, Les distributions ou ondes singulières, dénommées aussi vortices optiques, de charge topologique (ordre azimutal) t, dans lesquelles la phase varie de 0 à 27( t, autour de la direction de propagation, t étant un entier. Les distributions d'amplitude à variation azimutale d'ordre f, dénommées aussi distribution de Laguerre-Gauss, 3042043 18 Les distributions de polarisation et optionnellement de phase à variation azimutale d'ordre (dénommées aussi modes de Laguerre-Gauss polarisés radialement. Deux distributions lumineuses compactes, seront réputées de familles topologiques différentes si elles remplissent au moins une, et n'importe laquelle, des conditions suivantes : L'une est régulière et l'autre est singulière, L'une est ponctuelle et l'autre est annulaire, Les ordres azimutaux f de l'amplitude des deux distributions lumineuses différent, Les ordres azimutaux E de la polarisation ou de la phase des deux distributions lumineuses différent. Alternativement, deux distributions lumineuses projetées sur un volume donné seront réputées de topologies différentes si dans une partie conséquente de la surface illuminée conjointement, les gradients sont de direction inversées. Nanoémetteurs lumineux Un nanoémetteur lumineux est un petit émetteur secondaire, attaché à un objet; il est de taille sensiblement inférieure à une fraction de longueur d'onde, typiquement mais non limité à une taille inférieure à un cinquième de la longueur d'onde ; un nanoémetteur lumineux absorbe l'énergie incidente et réémet de la lumière à la même longueur d'onde que la lumière incidente ou à des longueurs d'onde différentes ; la lumière émise par le nanoémetteur peut être cohérente, partiellement cohérente ou incohérente avec la lumière absorbée. Les principaux exemples de nanoémetteurs lumineux sont les fluorophores et les nanoparticules, mais ils incluent aussi un grand nombre d'autres éléments. La définition, dans le contexte de l'invention, des nanoémetteurs lumineux est, déterminée par les deux conditions suivantes: création d'un émetteur lumineux secondaire ponctuel, et positionnement prédéterminé de cet émetteur relativement à une entité artificielle, biologique ou organique. Les mécanismes physiques qui peuvent créer un nanoémetteur sont nombreux ; ils incluent mais ne sont pas limités à l'absorption, la diffusion ou la réflexion, la fluorescence, «émission-déplétion», [51, par exemple en utilisant les techniques RESOLFT, les phénomènes de photo activation et de photo déplétion, la fluorescence à deux ou plusieurs photons, la diffusion élastique ou non, la diffusion Raman, ou à d'autres mécanismes physiques connues de l'Homme de l'Art. Nous utiliserons le terme émission de lumière pour décrire l'émission d'ondes électromagnétiques par le nanoémetteur lumineux, que la lumière soit cohérente, incohérente ou partiellement cohérente. 3042043 19 Nous étendrons notre définition des nanoémetteurs, en y incluant les particules diffusantes, absorbantes et réfléchissantes, attachées à une entité biologique ou organique ; l'action d'une particule diffusante, réfléchissante ou absorbante sur le champ électromagnétique peut en effet être décrite comme la création avec une phase inverse, suivant le principe de Babinet, pour une particule absorbante d'un champ secondaire auxiliaire, émergeant de la particule, superposé au champ électromagnétique incident. Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un nanoémetteur pour dénoter l'ensemble d'information décrivant un nanoémetteur en tant que source ponctuelle, à un instant déterminé. Etant donné que le nanoémetteur est considéré comme une source ponctuelle, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit ; sa position dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par le fluorophore, en fonction de la lumière incidente. Nous nous référerons dans cette demande de brevet aux descripteurs d'un objet structuré. Par exemple, pour une ligne uniforme, l'ensemble de l'information le représentant contient un nombre limité de paramètres, soit : son orientation dans l'espace, son intensité, les caractéristiques spectrales, d'intensité, de cohérence, de phase et de polarisation de la lumière émise par l'objet, en fonction de la lumière incidente. Pour une distribution continue, l'objet est représenté, comme habituel en traitement d'image, par une matrice d'intensités. Toutefois, dans la majorité des cas, et dans la description de l'invention, nous nous référons, sous la désignation de descripteurs, à un sous-ensemble des descripteurs d'un nanoémetteur ou d'un objet géométrique simple, comprenant sa position géométrique, son intensité, et le type du fluorophore, lorsque plusieurs populations de nanoémetteurs lumineux, différenciées par exemple par leur spectre d'émission, sont présentes dans un même échantillon. Cette simplification utilisée dans la description n'altère pas le domaine de l'invention qui inclura dans son champ d'application l'intégralité des descripteurs des nanoémetteurs lumineux. Pour simplifier la compréhension du contexte de l'invention, la suite de la description référence seulement le cas le plus simple, celui dans lequel le nanoémetteur est un fluorophore et l'interaction physique est la fluorescence à un photon. Pourtant, cette description doit être comprise comme une illustration simplifiée d'une description générale des méthodes et concepts applicables à l'ensemble des nanoémetteurs lumineux cités préalablement ou connus de l'Homme de l'Art, quel que soit le phénomène physique sous-jacent. Il est marquant que le nanoémetteur échantillonne le champ ou l'intensité incidente à une position tridimensionnelle précise, sans influence de l'ensemble de la distribution spatiale de l'intensité incidente. Nous référencerons cette propriété remarquable dans cette demande de brevet comme la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux. 3042043 Toutefois, le mode de réalisation de l'invention décrit permet aussi de mesurer des objets structurés et des distributions continues ne possédant pas la capacité d'échantillonnage du nanoémetteur lumineux. On se réfère de nouveau à la Figure. 1 ; qui représente un ensemble de nanoémetteurs ou d'objets structurés, positionnés sur un objet biologique donné, 15 et 16 d'une part et 17 et 18 d'autre part. Alternativement, la lumière émise peut consister en une distribution continue, non représentée sur la Figure 1, ou en toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues. L'ensemble de nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distribution continues est référencé comme un ensemble «d'objets biologiques lumineux»; ils représentent une carte de l'objet biologique, dans le sens défini par Alfred Korzybski en sémantique générale. Il est toutefois de pratique courante pour simplifier la description, de référencer l'objet biologique lumineux comme l'objet biologique lui-même, lorsqu'aucune ambiguïté ne peut apparaître. L'objet biologique lumineux contient de nombreuses informations pertinentes liées à l'objet biologique, principalement l'information spatiotemporelle, la position de l'objet et son orientation en fonction du temps, et l'information morphologique, par exemple dans le cas de la division d'une cellule en deux. Le système de mesure selon au moins un mode de réalisation de l'invention permettra de calculer la carte mesurée, et effectuer une évaluation des descripteurs de toute combinaison de nanoémetteurs, d'objets structurés ou une évaluation de la distribution spatiale de distributions continues. Cette carte mesurée diffère de la carte originale, en raison du bruit, des conditions de mesure, des limites du système ou de l'incertitude de mesure. Cette information de la carte mesurée peut être élaborée ultérieurement en différents niveaux d'abstraction. Ce premier niveau d'abstraction, qui décrit les résultats directs de la mesure, ne contient, à priori, aucune information biologique mais les résultats d'une mesure physique décrite par des nanoémetteurs, par des objets structurés ou par des distributions continues, qui pourrait d'ailleurs représenter n'importe quelle entité marquée. Le second niveau, le niveau d'abstraction géométrique structure les nanoémetteurs, d'objets structurés ou de distributions continues sous forme d'objets géométriques. Il consiste en une description d'objets lumineux et de leurs caractéristiques dynamiques, telles que leur position ou orientation, ou leur morphologie. A ce niveau, l'information est encore une information physique et géométrique décrivant un ensemble d'objets. L'information géométrique utilise la carte mesurée et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation entre les points lumineux et des objets. Le niveau d'abstraction biologique permet une certaine appréhension de la réalité biologique grâce à une relation constitutive entre les objets mesurés et des entités biologiques correspondantes. Il contient un ensemble d'informations sur l'objet biologique, principalement la position et sa dynamique, sa forme et sa morphologie. L'information biologique utilise la carte 3042043 21 mesurée et l'information géométrique, et une information auxiliaire, potentiellement extérieure au système, sur la relation des points lumineux et des objets aux entités biologiques. Un certain nombre de conclusions sur la fonctionnalité biologique de l'échantillon peuvent être obtenues à ce niveau. Le niveau d'abstraction fonctionnel permet une appréhension de la réalité biologique. Il consiste en une information fonctionnelle, décorrélée des informations géométriques, et répondant à des interrogations en termes et jargon biologique, tel que : « le virus a-t-il pénétré la cellule ? ». Un niveau additionnel d'information peut être défini incluant le processus de contrôle et d'instrumentation ; en effet, un processus de contrôle et d'instrumentation plus évolué peut être défini, permettant de remonter à une information biologique plus structurée, à travers une automatisation du processus d'acquisition de données. Un exemple de tels processus est décrit par Steven Finkbeiner, sous la dénomination de « Robotic Microscopy systems ». Cette description des niveaux d'abstraction, définis dans cette demande, a été rédigée, par simplicité, pour la Biologie. Elle est applicable, mutatis mutandis, à tous les domaines de la Vision, biologique et médicale, artificielle et industrielle. Diffraction conique La diffraction ou réfraction conique, est un phénomène optique prédit par Hamilton, [61, en 1832, et confirmé expérimentalement deux mois après par Lloyd, [71. La diffraction conique décrit la propagation d'un faisceau de lumière dans la direction de l'axe optique d'un cristal biaxe. En effet, dans un cristal biaxe, l'axe optique est positionné dans le plan créé par les axes cristallographiques x et z; l'angle par rapport à l'axe z est 00, dépendant des trois indices de -2 - -2 réfraction suivant la loi, tan 00 = ni n2 -2 -2 - n2 - n3 Hamilton a prédit que la lumière émerge sous la forme d'un cône creux de rayons. La réfraction conique est une étape importante de l'histoire des sciences et a joué un rôle dans la démonstration de la théorie des ondes électromagnétiques. Un regain d'intérêt pour la diffraction conique eu lieu dans les dernières années du XXe siècle; elle a abouti à une théorie complète par Berry et al.[21, validée expérimentalement en 2009, [81. Nous suivons ici la théorie, la terminologie et les définitions de Berry, y compris le changement de dénomination de l'effet physique, à partir de ce point, utilisant le terme plus rigoureux de diffraction conique. Toutefois, il est important de noter, que le terme « diffraction conique » est aussi utilisé pour deux autres techniques n'ayant aucune relation avec la technique que nous décrivons : - la diffraction en incidence oblique est aussi appelée diffraction conique - Le terme anglais, « conical diffraction mounting » référence un montage de réseau de diffraction dans lequel le réseau est monté sur une surface courbe. 3042043 22 La diffraction conique a suscité un intérêt considérable au niveau théorique et expérimental, mais, « aucune application pratique ne semble avoir été trouvée », [91. Historiquement, la diffraction conique a été observée dans les cristaux biaxes. Nous nous référons à un cristal conique pour décrire un cristal biaxe inorganique ou organique, présentant le phénomène de diffraction conique. Quelques exemples non limitatifs de cristaux biaxes comprennent, l'Aragonite, KTP, KTA, KBiW, LBO, KNbO3, MDT, YCOB, BIBO, DAST, POM, NPP, LAP, LiInS2 et LiInSe2. D'autres effets existent, créant soit une diffraction conique intrinsèquement plus faible soit en créant une diffraction conique plus faible le long d'un trajet optique plus court. Toutefois, ces effets peuvent être utilisés dans le cadre des dispositifs décrits. Ces effets comprennent les polymères, les cristaux liquides et les effets de biréfringence induite par voie externe. Les polymères comprennent mais ne sont pas limités à des feuilles de polymère étirées et à la polymérisation en cascade, [101; les cristaux liquides comprennent mais ne sont pas limités à la phase nématique biaxe thermotrope, [111; les effets externes de biréfringence induite comprennent, mais ne sont pas limités à l'application d'un champ électrique créant un effet électro-optique, sur un cristal cubique non-centrosymétrique, et le modulateur photo-élastique. La phase dans le vortex créé par diffraction conique est une phase géométrique et est donc intrinsèquement achromatique. Les effets chromatiques additionnels sont la dispersion de l'axe optique et la dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde. La dispersion chromatique de l'axe optique crée un angle de l'axe optique du cristal, dépendant de la longueur d'onde, par rapport à l'axe optique du système. Elle est due, dans la majorité des cas, à la dispersion des indices de réfraction. Les indices de réfraction dépendent de la longueur d'onde, suivant les équations de Sellmeier. L'angle de l'axe optique varie donc en fonction de la longueur d'onde, il crée un angle d'inclinaison chromatique de l'axe optique dans le plan créé par les axes x et z cristallographiques. Il dépend fortement du type de cristal. Dans un cristal de MDT, le cristal le moins dispersif dans le visible, la direction de l'axe optique varie de moins de 0,1 degrés entre 540 nm et 700 nm. Dans un cristal de KTP, le cristal plus achromatique dans l'IR de télécommunication, l'angle varie de 0,05 degrés, entre 1,350 nm et 2,100 nm, et moins de 0,02 degrés sur la fenêtre de télécommunication - 1450 nm à 1650 nm. D'autre part, l'angle 00 peut varier fortement en fonction de la longueur d'onde dans certains cristaux organiques comme le DAST. La compensation de la dispersion chromatique de l'axe optique peut être effectuée en utilisant l'optique géométrique. La dispersion chromatique de la direction de l'axe optique peut être compensée en utilisant la dispersion naturelle de verre ou d'autres matériaux optiques, ou en utilisant des réseaux ou de prismes. La procédure d'achromatisation ne diffère pas, dans ce cas, de 3042043 23 la procédure standard de correction de toute aberration chromatique en optique géométrique. Cette procédure peut être conçue et optimisée en utilisant l'un des logiciels optiques commerciaux disponibles en définissant des fonctions cibles adéquates. Un concept différent d'achromatisation, est basé sur l'utilisation de deux matériaux différents, ayant des effets de diffraction coniques inverses, à haute et basse dispersions chromatiques. La dépendance des différents paramètres présents dans les équations de la diffraction conique en fonction de la longueur d'onde, modifie les paramètres d'efficacité des effets de diffraction conique. Pour des cristaux coniques linéaires, définis ultérieurement, la fonction de transfert fondamentale est identique à l'unité et ainsi trivialement indépendante de la longueur d'onde. Par contre, la fonction de transfert du vortex dépend de la longueur d'onde et peut être représentée par un facteur chromatique égal à i (2k). Pour des cristaux coniques sinusoïdaux, définis ultérieurement, le comportement est différent de celui de cristaux linéaires coniques: l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et l'onde vortex est presque indépendante de celle-ci. En effet, les simulations montrent que la forme de l'onde vortex n'est que légèrement modifiée par une variation du paramètre, 00 de 0,5 à 0,75. Par contre, la forme de l'onde fondamentale dépend de la longueur d'onde et cet effet doit être pris en compte dans la conception de systèmes utilisant les deux ondes, fondamentale et vortex. On se réfère maintenant à la figure 3, qui est une illustration schématique simplifiée d'une configuration d'un module de diffraction conique, 300, conformément à un mode de réalisation de la présente invention. La lumière incidente, 30, est supposée être collimatée, même si d'autres conditions peuvent être adaptées en utilisant des moyens optiques simples. Le montage lui-même comprend une première lentille, 31, un cristal conique, 32 et une lentille optionnelle 33. Les deux premières lentilles, 31 et 33, sont configurées de préférence sous forme d'un télescope Kepler 1:1. L'ouverture numérique de la première lentille, 31, dans l'espace image, représentée ci-dessous par Uo, détermine les paramètres de l'effet conique à travers le rayon conique, défini ci-dessous. Un plan d'imagerie conique, 35, est placé au plan focal de la première lentille 31; un polariseur, ou un polariseur partiel, 29, décrit ci-dessus, peut également être ajouté. Toutefois, dans certains systèmes optiques ou la lumière incidente est déjà polarisée, cet élément n'est pas nécessaire. Une lentille de focalisation, 36, détermine la taille finale de la tache lumineuse. Elle peut être un objectif de microscope externe, ou peut être fusionnée avec la seconde lentille 33, telle qu'implémentée dans un autre mode de réalisation de cette invention. La répartition de la lumière projetée sur l'échantillon est, en première approximation, en négligeant les effets vectoriels, une image réduite de la distribution de la lumière dans le plan image. L'influence des effets vectoriels sera discutée ci-dessous. Le rapport d'échelle ou le grossissement est déterminé par l'objectif de microscope. 3042043 24 Soit la variable spatiale, R, au plan d'imagerie conique, et le vecteur d'onde, U, représentées en coordonnées cylindriques par R, OR et U, Ou. Soit X, la longueur d'onde de la lumière. Le comportement du champ électrique émergeant du cristal conique 32 est entièrement caractérisé par un seul paramètre, le rayon conique, RO; le rayon conique dépend du matériau et l'épaisseur du cristal. Nous introduisons des paramètres normalisés permettant à la description ci-dessous de la répartition de la lumière, d'être valide à la fois au plan d'imagerie conique et au foyer de l'objectif du microscope, dans les limites de la théorie scalaire de diffraction. Un exemple d'introduction des paramètres normalisés est décrit dans la référence [2] La position radiale normalisée, p, le vecteur d'onde normalisée, u, représentés en coordonnées cylindriques par p, OR et u, Ou, et le rayon normalisé conique, po, sont donnés par: U p = 2 7 Uo, u = -uo ; po = 2 U0 (EQ. 2) 110 étant l'ouverture numérique du système. Différents régimes existent pour l'ensemble des effets de diffraction optique volumique à faible interaction. Les effets de diffraction volumique à faible interaction ont les propriétés suivantes : - une modification de la lumière incidente est créée par une perturbation des équations de Maxwell, - l'échelle de l'interaction très supérieure à la longueur d'onde, typiquement plus de 10 i_tm. Le fait que ces régimes différents créent des effets optiques totalement différents, a été étudié principalement pour les interactions acousto-optiques, mais est présent dans l'ensemble des effets optiques, incluant, la diffraction conique. Nous utiliserons une terminologie adaptée des travaux de Raman sur l'acousto-optique et différencierons les cas suivants : po« 1, régime de Raman Nath linéaire, référencé antérieurement, [37], « cristal conique mince linéaire », dans lequel une approximation surfacique simple de l'effet peut être utilisée, po 0.5, régime de Raman Nath sinusoïdal, référencé antérieurement, [37], « cristal conique mince sinusoïdal», dans lequel une approximation surfacique de l'effet peut être utilisée, po 1, régime intermédiaire, référencé antérieurement, [37], « cristal conique moyen», dans lequel des effets complexes, couplant les effets des régimes Raman Nath et le régime de Hamilton-Lloyd décrit ultérieurement, po> 3, régime que nous appellerons régime de Hamilton-Lloyd référencé antérieurement, [37], sous la dénomination de « cristal épais», similaire au régime de Bragg en acousto-optique, dans lequel les effets décrits par Hamilton et Lloyd sont présents. Seuls, les cristaux du régime de Hamilton-Lloyd, ou cristaux coniques épais, po>3, peuvent être décrits par la théorie de Hamilton, 3042043 et ont la particularité, de propager les rayons à l'intérieur du cristal sous forme d'un « cône obscur », ou « conefringent », diffractant sous forme de cône, terme utilisé par certains auteurs. Hamilton avait d'ailleurs, dès 1832, [61, déjà noté cette condition sur l'amplitude de l'effet des cristaux biaxes, nécessaire la validité de sa description de la réfraction conique, en montrant la nécessité, de «sufficient biaxal energy» "29 New consequences of Fresnel's principles. It follows from those principles, that crystals of sufficient biaxal energv ought to exhibit two kinds of conical réfraction, an external and an internai: a cusp-ray giving an external cone of rays, and a normal of circular contact being connected with an internai cone. » L'onde émergeante du cristal conique mince, E(p, OR), exprimée en coordonnées normalisées pour une onde polarisée circulairement, est constituée par la superposition de deux ondes, référencées ici comme l'onde fondamentale, EF (p), une onde régulière, et l'onde vortex , Ev (p,OR), une onde singulière; ces deux ondes sont cohérentes l'une avec l'autre, co-localisées, polarisées circulairement et de chiralité inverse : E(p, OR) = EF(p) + Ev(p,OR) = EF(P) (2-i) + Fv(p)exp(-i0R) (3 (EQ. 3) Dans cette équation, EF (p) est l'amplitude fondamentale scalaire, Fv (p) est l'amplitude scalaire de vortex réduite; elles sont donnés par: EF(p) = 2n- f du u cos(po, u)Jo(pu); Fv(p) = 2n- f du u sin(pQu)h(pu).(EQ. 4) Pour un cristal conique mince linéaire, l'onde fondamentale peut être approximée par une tache d'Airy et l'onde de vortex peut être approximée par un vortex linéaire, représenté par: Fv(P) = 2n-po f du u2 (EQ. 5) En supposant que l'action du polariseur partiel, 29, est la mise à l'échelle de l'onde vortex par a, les paramètres de Stokes peuvent être déduits des équations précédentes, f3 étant l'angle de la polarisation linéaire: So = (EF(0))2 + (a2Fv(P))2 = 2cOEF(P)Fv(P) sin OR; S2 = 212EF(P)Fv(P) cos OR ; (EQ. 6) 53 = (EF(P))2 (122Fv(P))2 = OR; Comme décrit précédemment, l'onde émergeante du cristal conique, pour une onde polarisée circulairement, est constituée par la superposition de deux ondes, l'onde fondamentale, une onde régulière, et l'onde vortex, une onde singulière Tous les faisceaux incidents à polarisation homogène peuvent se décomposer sur la base orthogonale composée des polarisations circulaire droite et circulaire gauche. Le faisceau incident est donc la superposition cohérente de deux faisceaux, l'un polarisé en polarisation circulaire droite et le second en polarisation circulaire gauche. Le faisceau 3042043 26 émergent est la superposition cohérente de quatre faisceaux ; deux ondes fondamentales, la première créée par le faisceau polarisé en polarisation circulaire droite et la seconde par le faisceau polarisé en polarisation circulaire gauche et deux ondes vortex créée par les faisceaux polarisés en polarisation circulaire droite et gauche. Toutefois, si les deux ondes fondamentales ont la même distribution spatiale et peuvent interférer en gardant leur topologie, les deux vortex sont de chiralités opposées et créent des distributions complexes. Différentes combinaisons de ces ondes peuvent être réalisées en choisissant les polarisations en entrée et sortie, ce qui permet d'obtenir des PSF de différentes formes. Objet parcimonieux Nous utiliserons les termes d'un objet parcimonieux « sparse object » en anglais, pour décrire soit un ensemble d'émetteurs parcimonieux, ou clairsemés, des émetteurs lumineux ponctuels, soit un ensemble d'objets parcimonieux, la parcimonie étant définie dans les références [41-43] et n'étant pas limité à des objets ponctuels mais incluant, par exemple, des filaments. Pour des émetteurs parcimonieux, la limite choisie, est un nombre inférieur à douze, positionné dans un volume dont la taille, dans chacune des dimensions, est inférieure à 3 longueurs d'ondes, à la longueur d'onde d'émission ou de réflexion des émetteurs. Le volume de taille inférieure à 3 longueurs d'ondes, qui contient l'objet parcimonieux, sera référencé comme un volume d'analyse de taille réduite. Nous utiliserons le terme d'objet continu pour décrire un ensemble d'émetteurs lumineux ponctuels ou continus, ne remplissant pas les conditions décrites précédemment dans la définition de l'objet parcimonieux. La transition entre ces deux régimes n'est pas franche et de nombreux cas expérimentaux seront des cas intermédiaires entre ces deux types d'objet. On se réfère maintenant aux figures 4a à 4c qui sont une représentation simplifiée du concept de confinement volumique du microscope confocal. La fonctionnalité du confinement volumique est de limiter, dans les trois dimensions spatiales, la région observée de l'échantillon à un volume de taille la plus petite possible, le volume d'analyse. La fonctionnalité du confinement volumique limite le volume d'analyse par la combinaison de deux effets : le confinement de la lumière projetée sur une petite surface, idéalement de la taille de la tâche d'Airy, 50, et l'élimination de la lumière défocalisée par le trou confocal, 28 de la Figure 2. La superposition de ces deux effets crée un petit volume, le volume d'analyse, 60. Ce volume détermine la taille de la région élémentaire détectée par le système. Considérons un objet parcimonieux ou continu, 51, consistant en un ensemble de nanoémetteurs, 53 à 59. Les nanoémetteurs 53 à 55 positionnés dans le volume d'analyse 60, et seulement eux, sont à la fois excités par la source lumineuse et les photons émis par eux arrivent au module du détecteur. Les nanoémetteurs ne se trouvant pas dans le cône d'éclairage, 56 et 57, ne sont pas illuminés par la lumière incidente. La lumière émise par les nanoémetteurs 58 et 59 ne 3042043 27 se trouvant au plan conjugué du trou confocal, 28 de la Figure 2, est bloquée, presque intégralement, par le trou confocal, 28 de la Figure 2. Deux repères cartésiens différents sont définis dans le système, Figure 4c: Le référentiel « i » : Les axes référencés « i » représentent un repère cartésien centré sur le centre du volume d'analyse, 61. Le référentiel « a » : Les axes référencés « a » représentent un repère cartésien centré, pour chaque nanoémetteur lumineux, sur le nanoémetteur lumineux considéré comme un point discret, 62, Lorsque, en utilisant un mode de réalisation de l'invention qui sera décrite ultérieurement, on projette un vortex sur l'échantillon sous analyse, le centre du vortex sera en général défini comme le centre du volume d'analyse. Au moins un mode de réalisation de l'invention utilise la diffraction conique pour réaliser les modules optiques fondamentaux de la technique. Toutefois, des implémentations alternatives, remplaçant les modules basés sur la diffraction conique, par des modules basés sur d'autres concepts optiques, sont en mesure de fournir les mêmes fonctionnalités. Elles font partie intrinsèquement du champ de cette invention. Les concepts optiques alternatifs comprennent mais ne sont pas limités aux cristaux uniaxes, aux réseaux à pas inférieur à la longueur d'onde, « subwavelength gratings », aux modes de laser structurés, aux composants holographiques et à d'autres techniques connues de l'Homme de l'Art, Les concepts, techniques et dispositifs optiques et optoélectroniques, qui peuvent être utilisés dans des modes de réalisation de l'invention sont décrits dans par exemple le livre écrit par D. Goldstein, «Polarized light», [121, le « Handbook of Confocal Microscopy », [131, le « Handbook of Optics », [141. Sémaphore optique Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l'invention le terme de sémaphore optique pour décrire un élément optique, passif ou actif, capable de canaliser la lumière incidente vers différents canaux ou détecteurs en fonction d'une propriété de la lumière. Le cas le plus simple est une lame dichroïque qui sépare la lumière en deux canaux en fonction de la longueur d'onde. Nous utilisons dans ce mode de réalisation de l'invention le terme, en anglais, de « Position dependent Optical Semaphore » - acronyme PDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position du point émetteur. Le PDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(x,y,z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position de l'émetteur (x,y,z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le PDOS sera sans perte « lossless » en anglais, dans un volume d'analyse, si la somme des fonction de transfert, Ti(x,y,z) est égale à l'unité dans le volume d'analyse. 3042043 28 Le trou confocal, décrit par Minsky, [151, pourrait être considéré dans ce mode de réalisation de l'invention comme un PDOS dégénéré d'ordre 1. Dans la majorité des cas la dépendance du PDOS est une fonction complexe des positions latérales et longitudinale. Toutefois, nous utilisons dans des modes de réalisation de l'invention le terme, en anglais, de « Longitudinal Position dependent Optical Semaphore » - acronyme LPDOS - ou sémaphore optique dépendant de la position longitudinale - pour décrire un sémaphore optique qui canalise la lumière en fonction de la position longitudinale du point émetteur. Le LPDOS sera déterminé par une série de fonctions de transfert, Ti(z) dépendant, pour chaque canal ou détecteur i, de la position longitudinale de l'émetteur (z), dans un volume de référence. L'ordre du PDOS sera le nombre de canaux ou détecteurs. Le LPDOS sera souvent couplé à un stop, limitant le champ latéral du système. Transmission par des fibres optiques Une utilisation principale des fibres optiques est la transmission exclusive du mode TEM00. Toutefois, certaines configurations de fibres optiques, telles que les FMF ou les vortex Fibers, principalement mais non exclusivement basées sur des fibres dites « Photonic Crystal Fiber » (en anglais) - acronyme PCF - et les fibres dites « vortex fiber » permettent la transmission simultanée ou non, de modes plus complexes, y compris des modes de vortex, ayant une vorticité égale ou inférieure à 2. Il serait donc possible de déporter les distributions optiques créées par la diffraction conique à l'aide de fibres optiques, permettant une simplification majeure du système optique. La possibilité de déporter les distributions optiques créées par la réfraction conique à l'aide de fibres optiques permet l'application des modes de réalisation de l'invention à de nombreuses applications supplémentaires, par exemple mais non limité à l'observation gastrique ou gastroentérologique, et à l'observation du colon et des voies urinaires. De plus, certaines fibres les « dual-core photonic crystal fibers », en anglais, [161, permettent une interaction entre deux modes, l'un d'entre eux pouvant être un vortex, et fournissent un mécanisme physique supplémentaire pour créer des fonctions de transfert diversifiées. Mesures à plusieurs longueurs d'onde Dans des modes de réalisation de l'invention l'objet peut être éclairé en lumière monochromatique et en utilisant par exemple un laser classique ou une lampe monochromatique. De plus, dans certaines configurations, un laser à spectre large - dit laser blanc » peut être utilisé. Cette configuration est simple, car un des paramètres principaux du système est fixe et bien déterminé. Toutefois, dans d'autres modes de réalisation de l'invention l'objet peut aussi être éclairé à plusieurs longueurs d'onde, soit de façon discrète, en utilisant par exemple plusieurs lasers, soit de façon continue, en utilisant par exemple une lampe ou un laser ayant un spectre plus large. 3042043 29 De nombreux systèmes de superrésolution existant mesurent simultanément ou séquentiellement à plusieurs longueurs d'ondes. En effet, il est possible de marquer des éléments similaires ou différents avec des fluorophores ayant des réponses spectrales différentes, permettant de les reconnaître et de les séparer. Il est important de présenter deux cas différents : - L'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes différentes, excités par la même longueur d'onde - L'utilisation de marqueurs fluorescents émettant à deux longueurs d'ondes différentes ou similaires, excités par deux longueurs d'ondes différentes Il faut noter que dans le cas de l'utilisation de marqueurs fluorescents, émettant à deux longueurs d'ondes différentes, excités par la même longueur d'onde, le problème du recalage entre les mesures d'une longueur d'onde par rapport à la seconde, sont intrinsèquement inexistants car l'information de position de superrésolution est dérivée de la projection de la lumière, qui est parfaitement identique pour les différentes longueurs d'onde. Ceci permet une calibration relative de la position de fluorophores à deux longueurs d'onde différentes, avec une précision limitée seulement par le système expérimental de calibration, éliminant le problème majeur du recalage entre deux images de longueur d'onde différentes. La possibilité d'achromatiser les systèmes optiques basés sur la diffraction conique en font un outil de choix pour l'implémentation de systèmes optiques, a chemin commun, dans de nombreuses applications, et plus particulièrement pour des modes de réalisation de l'invention décrits. L'achromatisation est aussi possible pour les systèmes optiques basés sur les cristaux uniaxes, et pour presque toutes les implémentations alternatives de cette invention, avec, pour chacun d'entre eux, une complexité pratique plus ou moins grande. D'autres systèmes de fluorescence existants utilisent une lumière ayant un contenu spectral plus large, pour réduire des artefacts, et principalement les effets de speckle. Corollairement, les propriétés spectrales des protéines fluorescentes permettent de mesurer le potentiel des interactions moléculaires intracellulaires en utilisant la technique de transfert d'énergie de Fiirster - Fiirster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET). Dans certaines implémentations des systèmes PSIT, la lumière d'un ou des faisceaux laser incidents est séparée à l'aide d'un séparateur de lumière en deux faisceaux, le faisceau principal qui accomplira la fonctionnalité du système PSIT, et un faisceau supplémentaire de faible intensité utilisé pour mesurer la position du faisceau laser à l'aide d'une caméra ou d'un détecteur de position. Ce dispositif permet de mesurer en temps réel la position du laser indépendamment de toute erreur de wobble ou autre erreur mécanique avec une très haute précision. Information a priori et information complémentaire 3042043 Des modes de réalisation de l'invention décrite permettent l'intégration et la fusion d'information supplémentaire externe à la plateforme décrite, optique ou contextuelle, pour obtenir une amélioration de la précision de l'information recueillie de l'échantillon pour l'un quelconque des niveaux d'abstraction cités : la carte, le niveau d'abstraction géométrique, le niveau d'abstraction biologique et le niveau d'abstraction fonctionnel. Plus généralement, la diversité spectrale, l'information obtenue à plusieurs longueurs d'onde, la diversité de polarisation, et l'information obtenue en projetant différents états de polarisation, étend l'étendue de l'information disponible. Le fait que l'absence d'énergie, par exemple dans le cas du zéro du vortex, est une information pertinente, ouvre des possibilités supplémentaires à l'acquisition d'information sans « coût » en nombre de photons. Cette situation a une grande importance pour la détection de phénomènes de fluorescence faible, comme par exemple l'autofluorescence. Une des modalités décrites pour certains modes de réalisation de l'invention sera référencée sous le nom du dark tracking. Nous introduisons le concept d'information intégrale optique, l'information qui pourrait être récupérée à partir de mesures optiques ou par ondes électromagnétiques, sur une cible, par un observateur, à partir d'un point de vue donné. Cette information contient de très nombreux paramètres de l'objet, liés à sa position, les matériaux qui la composent, sa température, ou son orientation. L'information intégrale optique ne contient pas, par contre, d'informations sur des régions de l'objet n'ayant pas de chemin optique vers l'observateur, par exemple un élément positionné dans une boite opaque, ou une information physique qui n'a pas de transcription optique. Mesures superrésolues et limite de diffraction Il a longtemps été considéré que l'optique limitait intrinsèquement la résolution de tout système optique, à travers la limite de diffraction. L'apparition de techniques de superrésolution dans différents domaines et sous différentes dénominations - a montré qu'il est possible de dépasser cette limite de diffraction, par différents moyens. Des modes de réalisation décrits dans cette invention, tels que la détection de la présence de deux points de même intensité, par projection d'un vortex au centre de gravité de la distribution lumineuse créée par l'onde fondamentale, ne sont pas limités en résolution a priori et pourrait idéalement -avec un nombre de photons infini - obtenir n'importe quelle résolution, comme nous le décrirons ultérieurement pour un cas spécifique. 3042043 31 Utilisation des interactions non-linéaires dans la superrésolution et famille de techniques RESOLFT et STED L'utilisation des interactions non linéaires dans un milieu matériel, entre deux faisceaux de lumière, a été proposée en 1994 par Hell, [5] et [17], comme base d'un système de super résolution. De nombreuses techniques différentes ont découlées des travaux de Hell créant plusieurs familles de techniques, telle que le RESOLFT et la « localization microscopy». Plusieurs revues de ces techniques ont été publiées ([1] ou [38]). Ces interactions non linéaires incluent mais ne sont pas limitées aux phénomènes d'interaction à deux photons, aux effets d'émission-déplétion, de clignotement (blinking en anglais) et de photoactivation sur lesquels sont basées la famille de technologie RESOLFT et la famille de technologies de « localization microscopy». La famille de technologies RESOLFT est bien connue et est décrite dans plusieurs références, telles que l'article initial de Hell [5] et du brevet initial [17], ou par Schermelleh et al. [1], ou dans des publications récentes, Vicidomini et al. [18], ou de Willig et al. [19]. Dans la technique STED décrite dans l'article initial de Hell [5], deux faisceaux sont projetés, séquentiellement sur l'objet: un faisceau d'excitation standard, modélisé dans la majorité des cas par une distribution de lumière décrite par une fonction d'Airy, et un faisceau de déplétion - ayant une forme de doughnut ou vortex ; l'effet de la déplétion est d'empêcher la fluorescence des fluorophores se trouvant dans la surface de la distribution de lumière de déplétion, tout en ne modifiant pas l'émission des fluorophores positionnés au centre de la distribution de lumière en dehors de la distribution de lumière de déplétion; ceci permet de créer une distribution de lumière d'émission équivalente plus petite que la distribution de lumière d'excitation initiale. Cette technique a permis de réaliser des distributions de lumière d'émission équivalentes de très petite taille, tout en nécessitant toutefois des énergies de déplétion lumineuses très importantes. Plusieurs variantes du STED ont été développées : le « CW STED », [20], le « gated STED », [21], et le « modulated STED » [22]. Dans le CW STED le laser pulsé utilisé dans la première version du STED est remplacé par un laser continu - plus simple. Dans le « gated STED » les photons émis sont discriminés en fonction de leur temps d'émission pour écarter les photons émis depuis des fluorophores n'ayant pas reçu suffisamment de temps le faisceau de déplétion ; le « modulated STED » utilise un faisceau d'excitation modulé en intensité, en combinaison avec une détection synchrone dépendant de la fréquence de modulation. Ceci permet de discriminer le signal de fluorescence créé par le faisceau d'excitation de la fluorescence résiduelle provoquée par le faisceau de déplétion. Une autre variante, proposée par Gould et al. [45], utilise un SLM pour créer, soit séparément soit conjointement, les distributions de déplétion latérale et/ou axiale. Le doughnut - ou vortex - était créé, dans la première version du STED, à l'aide d'une lame de phase variant spatialement, « phase plate» en anglais. Cette implémentation nécessite l'utilisation 3042043 32 de deux chemins optiques séparés pour les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion. Ce montage optique est complexe, fortement dépendant de toute dérive mécanique, et crée des alignements optiques complexes. Le système mis au point nécessite une forte technicité et le cout du système est important. De plus, cette implémentation est chromatique, car la lame de phase adaptée à une longueur d'onde ne le sera plus à une autre longueur d'onde. Le système optique n'étant pas achromatique, l'utilisation d'un STED à deux longueurs d'onde de déplétion nécessite un système optique encore plus complexe. Pour simplifier la mise en oeuvre du STED, plusieurs auteurs ont proposé des solutions permettant de réaliser un STED dans lequel les deux faisceaux, le faisceau d'excitation et le faisceau de déplétion, se propageraient suivant le même chemin optique : Wildanger et al. ont proposé un Microscope STED à chemin optique commun, insensible à la dérive mécanique, basé sur les propriétés de dispersion des différents matériaux optiques, [23], Cette technologie est commercialisée sous le nom EASYDOnut par la société Abberior Instruments. [28]. Bokhor et al. [24], propose l'utilisation d'une séparation annulaire chromatique des faisceaux préalignés ; toutefois cette solution bloque une partie de la lumière de déplétion, Hoeffman [25], propose l'utilisation d'un module contenant les éléments optiques préalignés créant le vortex, dans le chemin optique du laser de déplétion, pour simplifier l' alignement, Menon et al ; [26], propose des lentilles diffractives permettant de créer des zéros d' amplitude sans singularités de phase, Reuss et al. [27] introduit un dispositif de formation de faisceau placé directement en face de la lentille d'objectif. Ce dispositif se base sur l'utilisation de cristaux biréfringents, montés sous forme d'une lame d'onde segmentée, consistant en quatre segments. Par un choix du paramètre d'épaisseur de la lame, il est possible de réaliser un élément consistant en une lame de phase pour la déplétion et une lame neutre pour l'excitation. Gould et al. [45], utilise un SLM pour créer, soit séparément, les distributions de déplétion latérale et/ou axiale. Cette solution permet de faire varier les paramètres dynamiquement pour s' adapter à différentes longueur d'onde. D' autres travaux intègrent les distributions latérales et axiales sur un seul SLM. Toutefois, les solutions proposées décrites antérieurement sont toutes fortement chromatiques et sont conçues pour une seule longueur d'onde d'excitation et de déplétion. Cependant, les applications biologiques nécessitent dans de nombreux cas un système à deux ou plus, longueurs d'onde d'excitation. En effet, il est de pratique courante de marquer des objets biologiques différents avec des marqueurs fluorescents différenciés par leur longueur d'onde d'excitation ou d'émission. Les systèmes de fluorescence les plus évolués peuvent utiliser quatre à six marqueurs différenciés. La présence d'une seule voie de super résolution limite fortement l'utilisation des 3042043 33 systèmes. Des systèmes STED à deux longueurs d'onde sont d'ailleurs disponibles commercialement. Il est clair que pour un microscope STED achromatique ou 3D STED à plusieurs longueurs d'onde, l'utilisation du même chemin optique pour deux faisceaux de déplétion à deux longueurs d'onde différentes simplifiera la super résolution sur des fluorophores différents. Dans l'Art Antérieur, pour l'ensemble des solutions proposées pour le STED, les faisceaux laser initiaux, sont sous forme d'une distribution régulière et dans la majorité des cas d'une distribution gaussienne. Ces faisceaux laser initiaux seront ultérieurement transformés en faisceau d'excitation, une onde régulière, et en faisceau de déplétion, une onde singulière, par un système optique adéquat, décrit par les différents inventeurs. Co-localiser ces faisceaux en amont lorsqu'ils sont encore sous forme de distribution gaussienne est relativement simple. Co-localiser ces faisceaux en aval lorsqu'ils ont été transformés en onde régulière et singulière est beaucoup plus complexe. Co-localiser ces faisceaux en amont peut être réalisé de façon commerciale par des systèmes de banc laser en utilisant des techniques basées sur les fibres optiques. Il est donc relativement aisé, comme il est d'ailleurs fait dans l'ensemble des microscopes confocal, de créer un ensemble de sorties laser à différentes longueurs d'ondes d'une même fibre optique et donc co-localisées de façon très précise. La solution proposée dans des modes de réalisation de la présente invention permet de se baser sur cette co-localisation en amont, simplifiant de beaucoup le système et permettant la réalisation d'un STED à plusieurs longueurs d'onde, de façon intrinsèque. Pour ceci, il est préférable d'utiliser un système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ». Il est préférable de réaliser un beam shaping différent pour les différents faisceaux, soit une onde régulière pour le faisceau d'excitation et une onde singulière pour le faisceau de déplétion, et ceci à n'importe quelle longueur d'onde dans le spectre visible ou infrarouge. La capacité de réaliser un beam shaping achromatique, permettant d'obtenir pour une polarisation une onde régulière et pour une autre polarisation, une onde singulière, sur l'ensemble de la lumière visible ou infrarouge, diffèrent pour les différentes polarisations, est nouvelle. Le module PSIT permet la réalisation d'un tel système optique qui combine les propriétés de chemin optique commun, d'achromaticité et de « beam shaping ». A notre connaissance, il n'existe pas en effet un système à chemin commun, achromatique et permettant un beam shaping différent pour les différents faisceaux, dans la littérature. Un tel système améliore certainement la simplicité de conception et d'utilisation du STED. 3D STED De nombreux systèmes ont été proposés pour étendre le concept du STED à la troisième dimension. La solution retenue pour l'ensemble des STED-3D est le « depletion ring » proposé par l'équipe de Stefan Hell, référence 36. Le « depletion ring » permet de créer une « sphère noire », une distribution dans laquelle l'intensité est nulle au centre du champ à focalisation, et 3042043 34 augmente relativement rapidement avec la défocalisation. Une implémentation de la « sphère noire » a été décrite, par Zhang, [291, créant un spot noir entouré en trois dimensions par une sphère lumineuse et par un des auteurs de ce brevet dans la référence 37. Acronymes Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, SRCD, « Super Resolution using Conical Diffraction » pour nommer la plateforme, les modules et systèmes spécifiques à l'implémentation de cette invention. Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, PSIT, méthode de projection d'une séquence d'intensités lumineuses différant topologiquement, soit en anglais : « Projected Sequence(s) of Intensifies with various Topologies » ; la méthode PSIT peut aussi être utilisée pour projeter des séquences d'intensités lumineuses différant topologiquement, à deux ou plusieurs longueurs d'onde, séquentiellement ou simultanément. Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, PDOS, sémaphore optique à dépendance spatiale, soit en anglais : «Position Dependent Optical Semaphore». La plateforme SRCDP, « Super Resolution using Conical Diffraction Platform», est une plateforme de Microscopie utilisant des modules optiques basés sur la diffraction conique. Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, LatSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PSIT à l'implémentation de cette invention. Nous utiliserons dans cette demande de brevet l'acronyme, LongSRCS pour nommer le module optique implémentant la méthode PDOS. La plateforme SRCDP, décrite en détails par la suite, consiste principalement en deux modules matériels, deux modules optiques nouveaux et complémentaires, les modules optiques LatSRCS et LongSRCS, montés sur un microscope, et un module algorithmique, SRCDA, « Super Resolution using Conical Diffraction Algorithm», permettant de reconstruire l'information superrésolue de l'échantillon. De plus la plateforme SRCDP, inclut un module de détection amélioré, un module de contrôle du système, et un support informatique et logiciel. De plus, certains modes de réalisation de l'invention concernent un nombre important de variantes d'implémentations des méthodes PSIT et PDOS, de la plateforme SRCD, des modules optiques LatSRCS et LongSRCS et de l'algorithmique, SRCDA. 3042043 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION DISTRIBUTIONS LUMINEUSES Distributions lumineuses créées par la diffraction conique Se référant à la Figure 7a, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.388, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée et/ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un polariseur radial ou azimutal. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation - d'entrée et de sortie - sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires. Se référant à la Figure 7b, cette figure représente les distributions lumineuses, créées à travers un cristal conique de paramètre conique normalisé po de 0.818, calculées par une approximation scalaire, pour différents états de polarisation d'entrée et de sortie, incluant en entrée ou en sortie soit un polariseur circulaire ou linéaire soit un polariseur radial ou azimutal. Ces distributions lumineuses ont été calculées dans un plan intermédiaire d'imagerie et non au foyer de l'objectif pour séparer la réfraction conique des effets vectoriels. Les états de polarisation d'entrée et de sortie sont caractérisés par leur angle pour les polarisations linéaires et par leurs chiralités pour les polarisations circulaires. Nous présentons dans ces figures un grand nombre de fonctions de transfert différentes, incluant les cas incluant en entrée ou en sortie des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux. Il faut compléter cette description en y incluant en plus des polariseurs circulaires, linéaires, azimutaux ou radiaux décrits dans les figures, les cas de polariseurs elliptiques, dichroïques ou partiellement dichroïques, et polariseurs variant spatialement. De plus, comme illustré dans les figures 7a et 7b, ces fonctions de transfert varient fortement en fonction du paramètre conique normalisé po. De plus, l'introduction de deux cristaux coniques, ou d'un cristal conique et d'un cristal uniaxe ou biaxe (dans lequel la lumière se propage dans une direction de propagation différente de celle de la diffraction conique) en cascade permet un nombre encore plus grand de fonctions de transfert comme illustré pour deux cristaux coniques dans la figure 7c. En résumé nous référencerons, dans cette demande de brevet, sous le terme de fonction de transfert de diffraction conique, l'ensemble des fonctions de transfert pouvant être obtenues à l'aide d'un faible ( REVENDICATIONS1. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l' échantillon; un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori, 2. Un dispositif selon la revendication 1 dans lequel une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection 3. Un dispositif selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le module d'algorithme est configuré pour estimer la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; estimer la moyenne a posteriori, et représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques 4 (E-LSE - MCMC) Le dispositif optique de mesure selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC) (MAP non régularisé) Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au 3042043 73 moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le dispositif comportant un module de projection achromatique, contenant un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, un module de balayage pour balayer optiquement l'échantillon, un module de détection pour détecter la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet; un module d'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, un module d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité, la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques 6 Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon suivant la revendication 5, dans lequel l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle 7 Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, dans lequel l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov 8 Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, utilisant, pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage. 9 Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des 5 à 8, dans lequel l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse-fréquence et une composante plus parcimonieuse. Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications5 à 9, dans lequel l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques 3042043 74 numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation. 11 Un dispositif optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, utilisant un masque de taille variable dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement 12. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le balayage optique de l'échantillon, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l' échantillon; l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'application d'un algorithme dans lequel la formulation de la reconstruction de l'échantillon et de ses propriétés spatiales et/ou temporelles et/ou spectrales est considérée comme un problème inverse bayésien et conduit à la définition d'une distribution a posteriori, 13. Un procédé selon la revendication 12 dans lequel une loi a posteriori combinant, grâce à la loi de Bayes, la formulation probabiliste d'un modèle de bruit, ainsi que d'éventuels aprioris sur une distribution de lumière crée dans l'échantillon par projection. 14. Un procédé selon la revendication 12 ou 13 dans lequel l'algorithme comporte l'estimation de la distribution de lumière dans l'échantillon par l'utilisation de nuées d'émetteurs ponctuels qui permet de favoriser les solutions parcimonieuses; et l'estimation de la moyenne a posteriori, 3042043 75 représenter les résultats, basés sur la moyenne a posteriori, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques 15. Un procédé optique de mesure selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, dans lequel l'estimation de la moyenne a posteriori est réalisée au moyen d'un algorithme de type Monte-Carlo Markov Chain (MCMC) 16. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon, l'échantillon comportant au moins une source réémettrice, excitée par la lumière et réémettant de la lumière suivant une loi déterminée en fonction de la lumière projetée sur l'échantillon, le procédé comportant la projection achromatique, par un laser, dont la longueur d'onde est accordée sur la longueur d'onde d'excitation de ladite au moins une source réémettrice, pour créer soit une distribution lumineuse compacte soit une séquence des distributions lumineuses compactes de topologie différentes, le balayage optique de l'échantillon, la détection de la lumière réémise par ledit au moins une source réémettrice de l'échantillon pour la ou pour chacune des distributions lumineuses compactes de topologie différentes et pour chacun des points de balayage de l'objet; l'acquisition d'image pour acquérir pour chaque point de balayage, soit une image soit une séquence d'images, pour la séquence d'images, chaque image correspondant à une des distributions lumineuses compactes de topologies différentes, l'application d'algorithme MAP non régularisé avec contrainte de positivité, la représentation des résultats, basés sur les résultats de l'algorithme MAP, soit sous forme d'une image soit sous forme de données numériques ou graphiques 17. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon la revendication 16, dans lequel l'algorithme MAP contient de plus une contrainte de limitation de bande-fréquentielle 18. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 16 et 17, dans lequel l'algorithme MAP utilise un schéma numérique accéléré de type Nesterov 19. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, utilisant, pour une séquence d'images, la redondance dans l'information fréquentielle, due au caractéristiques fréquentielles différentes des différentes distributions projetées sur l'échantillon, pour compenser et réduire fortement l'impact de points manquants ou d'irrégularités de balayage. 20. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des 16 à 19, dans lequel 3042043 76 l'algorithme MAP est adapté afin de résoudre un problème inverse portant sur une somme d'un petit nombre de termes, comme une composante basse-fréquence et une composante plus parcimonieuse. 21. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, dans lequel l'algorithme MAP est adapté afin d'imposer une contrainte de redondance non-locale de la solution, par exemple en calculant des poids sur les images ou sur les différents masques numériques et l'arbre de similitudes non-locales étant appliqué à la solution comme une régularisation. 22. Un procédé optique de mesure pour déterminer la distribution spatiale ou la localisation de sources réémettrices sur un échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 à 21, utilisant un masque de taille variable dans le plan du détecteur pour obtenir des images ayant soit des caractéristiques axiales différentes, soit des capacités de rejection de lumière parasite différentes ou optimisées, globalement ou localement 23. Un programme d'ordinateur configuré pour mettre en oeuvre un procédé selon l'ine quelconques des revendications 12 à 22.