FR 3047011 A1 20170728 FR 1650540 A 20160122 1 SOUCHE BACTERIENNE GENETIQUEMENT MODIFIEE PRODUISANT DE LA KURSTAKINE DANS LE MILIEU DE CULTURE La présente invention a pour objet une souche bactérienne génétiquement modifiée, en particulier une souche de Bacillus thuringiensis, ainsi que l'utilisation d'une telle souche pour produire de la kurstakine. L'invention a également pour objet un procédé de production de kurstakine ne milieu liquide et l'utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique et biosurfactant. Bacillus thuringiensis est une bactérie ubiquitaire que l'on le retrouve dans pratiquement tous les sols, les milieux aquatiques, l'air et le feuillage des végétaux. Aussi appelé bacille de Thuringe, cette bactérie a été découverte au tout début du XXe siècle et utilisée comme agent de lutte microbiologique ou insecticide depuis les années 50. Elle est utilisée en agriculture, en culture maraîchère, en protection des forêts, mais aussi en lutte antivectorielle pour le contrôle d'insectes porteurs de maladies comme le paludisme. La particularité de Bacillus thuringiensis tient à sa capacité à synthétiser des cristaux protéiques toxiques pour certains insectes. Ces cristaux sont majoritairement composés de protéines toxiques appelées delta-endotoxines ou toxines Cry. Une fois ingérés par les insectes (généralement lors des stades larvaires), les cristaux rencontrent, dans l'intestin moyen des insectes, un milieu capable d'assurer la dissolution de leurs constituants, grâce au pH alcalin ou acide, et à la présence de protéases, et la libération des protéines toxiques. Ces protéines interagissent avec la paroi intestinale de l'insecte et détruisent les cellules qui la composent en formant des pores dans la paroi digestive. Aujourd'hui, Bacillus thuringiensis, ou Bt, est l'insecticide le plus utilisé au monde en agriculture biologique : il représente à lui seul près de 95% des bioinsecticides. La kurstakine est un lipopeptide produit en faible quantité par certaines souches du groupe Bacillus cereus, notamment plusieurs souches de l'espèce Bacillus thuringiensis, chez laquelle cette molécule a été isolée pour la première fois en 2000 (Hathout et al.). La kurstakine est produite de façon non-ribosomique par une Non Ribosomal Peptide Synthase (NRPS), complexe multi-enzymatique fonctionnant de façon modulaire. Les enzymes de ce complexe sont exprimées à partir d'un opéron (appelé opéron krs) comprenant les gènes krsE, krsA, krsB, krsC et krsD (de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' de l'opéron). La kurstakine se présente sous différents isoformes. La kurtakine présente une activité anti-fongique contre la souche Stachybotris charaturn, initialement décrite par Hathout et al. (2000). Les inventeurs ont maintenant mis en évidence 3047011 2 l'effet anti-fongique de fa kurstakine contre deux autre souches phytopathogènes : Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea. li serait de plus intéressant d'utiliser la kurstakine en tant que biosurfactant. ll n'existe actuellement aucun procédé permettant une production à grande échelle de 5 kurstakine, notamment en milieu liquide. En effet, deux verrous technologiques limitent actuellement la possibilité de produire et extraire ce lipopeptide à l'échelle industrielle : le faible niveau d'expression des gènes de l'opéron kurstakine et la faible production de lipopeptides qui en découle. En vue d'une utilisation de ce lipopeptide dans le domaine phytosanitaire, les inventeurs ont 10 modifié génétiquement des souches de Bacillus thuringiensis de sorte à augmenter leur capacité de production de kurstakine. En utilisant ces souches améliorées, ils ont mis au point un procédé de production et de purification de kurstakine en milieu liquide. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 15 La présente invention a pour premier objet une souche bactérienne génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine &y, Les souches bactériennes qui peuvent être modifiées conformément à la présente invention sont toutes les souches bactériennes qui expriment la kurstakïne, de façon naturelle ou non. Une souche bactérienne pouvant être génétiquement modifiée selon l'invention est donc tout 20 d'abord une souche portant l'opéron krs nécessaire à la synthèse de la kurstakine. D'une façon générale, toutes les souches appartenant au groupe Bacillus cereus sont susceptibles d'exprimer la kurstakine. Parmi les souches utilisables à cette fin, on peut citer les souches de Bacillus thurengiensis (Bt) ou de Bacillus cereus qui expriment naturellement l'opéron krs, et en particulier les souches Bt HD-1, Bt HD-73, Bt 407, Bt serovar chiniensis, BT 1S5056, Bt HD789, Bt 25 YBT 1518, etc... Une souche bactérienne pouvant être modifiée selon l'invention peut aussi être une souche n'exprimant pas naturellement la kurstakine mais qui a été préalablement modifiée génétiquement par apport des gènes de l'opéron krs, de sorte à ce qu'elle exprime la kurstakine. Une telle souche peut par exemple être une souche de Bacillus 3047011 3 Une souche bactérienne selon l'invention se définit donc comme une souche exprimant la kurstakine et n'exprimant pas de toxine Cry. Par « souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry », on entend une souche bactérienne qui n'est pas capable de produire de toxine Cry du fait qu'au moins un des gènes responsables de 5 l'expression de ces protéines, est inactivé ou absent (par mutation, délétion ou insertion au niveau du gène lui-même ou de son promoteur). Les gènes cry responsables de la production des toxines Cry étant naturellement portés par des plasmides, il est possible d'éliminer ces plasmides pour supprimer la production de toxine. Une telle perte de plasmide a été réalisée et a permis l'obtention des souches Bt 407 Cry-, Bt 1-1D73 Cry, et Bt 407 Cry Aspo0A décrites par Yang et al., 10 (2012), Lereclus et al., (1989) et Lereclus et al., (1995). Une souche n'exprimant pas de toxine peut également être une souche qui a conservé le plasmide porteur des gènes cry mais dans laquelle ce plasmide ne permet pas l'expression de toxines Cry. Il est entendu qu'une souche n'exprimant pas de toxine Cry peut être toute souche bactérienne chez laquelle l'opéron krs est absent, en particulier absent naturellement. 15 Dans un mode de réalisation particulier, une souche bactérienne selon l'invention est une souche exprimant la kurstakine, n'exprimant pas de toxine et dans laquelle une séquence stabilisatrice de l'ARNm a été introduite en amont du gène krsE de l'opéron krs. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, cette séquence stabilisatrice de l'ARNm correspond à STAB-SD de séquence SEQ ID NO. 1. 20 Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche selon l'invention correspond à une souche Bt génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine Cry et comprenant un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs. De plus, afin d'augmenter le niveau d'expression de la kurstakine, le promoteur endogène de l'opéron krs peut être remplacé par le promoteur cry3A « Pcry3a » et une séquence terminatrice 25 « termcrylAc » peut être introduite en aval du gène krsD. La séquence de Pcry3A correspond à la SEQ ID NO. 2 et la séquence terminatrice termcrylAc correspond à la séquence SEQ ID NO. 3. Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu'il est à la portée de l'homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes. 30 Dans un autre mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry et incapable de sporuler. 3047011 4 Afin de supprimer l'activité de sporulation d'une souche Bt, il est possible d'inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l'expression des facteurs sigma de sporulation SigE, SigH et Sie, et en particulier de supprimer l'expression de la protéine SpoOA, par exemple en délétant le gène spoOA. 5 Dans un mode particulier de mise en oeuvre, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry suite à la perte du plasmide porteur des gènes responsable de la production de ladite toxine et dans laquelle le gène spoOA est inactivé. Un exemple d'une telle souche est la souche Bt 407 Cry- Aspo0A. Dans un autre mode de réalisation, une souche selon l'invention est une souche Bt surexprimant 10 la protéine KrsE. Les inventeurs ont en effet démontré que la surexpression de KrsE permet une excrétion du lipopeptide dans le milieu de culture. Ce résultat est très intéressant du fait qu'il permet une production en milieu liquide, élément nécessaire au développement d'un procédé de production à grande échelle. 15 Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention n'exprime pas de toxine Cry et surexprime KrsE. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, une souche selon l'invention comprend en outre une délétion du gène spoOA, un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs, le remplacement du promoteur endogène de l'opéron krs par le promoteur cry3A « Pcry3a » et l'introduction d'une séquence terminatrice « termcrylAc » en aval 20 du gène krsû. Une souche ainsi modifiée peut, en outre surexprimer les protéines Sfp et KrsD. La surexpression des protéines KrsE, Sfp et KrsD peut être obtenue par introduction de la séquence codante de ces protéines dans la bactérie, par exemple en introduisant un plasmide porteur d'une cassette d'expression pour ces protéines. Ce plasmide peut permettre l'insertion de 25 ladite cassette dans le génome de la bactérie ou persister à l'état épisomal. La présente invention a pour second objet l'utilisation d'une souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production de kurstakine, notamment une souche de Bacillus thuringiensis, ladite souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry. La séquence protéique de la kurstakine ainsi produite correspond à la séquence suivante : 30 Thr-Gly-Ala-Ser-His-Gin-Gin (SEO ID NO. 4 ) 3047011 5 Les inventeurs ont montré que les souches Bt 407 Cry et Bt HD-73 Cry- (n'exprimant pas de toxine Cry) présentent une propriété intéressante puisque leur capacité de production de kurstakine est augmentée d'un facteur 3 à un facteur 5 selon les souches, par rapport aux souches correspondantes exprimant naturellement les toxines Cry (Cf Exemple 1.4). Toutefois, pour pouvoir utiliser ces souches pour la production de kurstakine à grande échelle, il était nécessaire d'améliorer encore leur capacité de production. La présente invention se décline en différents modes de réalisation correspondant à l'utilisation des différentes souches décrites précédemment en tant qu'objets de l'invention. 10 Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche a été modifiée par l'introduction du promoteur Pcry3A et du stabilisateur d'ARNm STAB-SD en amont de l'opéron krs de la souche Bt HD-73 Cry-, et l'introduction de la séquence termcrylAc en aval du gène krsD. Dans ce contexte, le stabilisateur STAB-SD permet une augmentation d'environ 20% de la production de kurstakine. Cet effet est même amplifié lorsque que le gène spo0A est délété chez cette souche (Cf Exemple 15 1.6). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, on privilégie l'utilisation des souches Bt Cry comportant un stabilisateur d'ARNm et, de manière préférée, les souches Bt Cry comportant un stabilisateur d'ARNm et une délétion du gène spoOA. Les inventeurs ont également montré pour la première fois que l'introduction de la séquence 20 termcrylAc permet à elle seule une augmentation de la production (Cf Exemple 1.8). Ainsi, dans un mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, la séquence termcrylAc peut être utilisée pour augmenter l'expression d'un gène et de la protéine associée, en particulier en stabilisant l'ARNm correspondant. Dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche exprimant la 25 kurstakine, n'exprimant pas de toxine Cry et comportant une séquence termcrylAc située en aval du gène krsD. Cette combinaison avantageuse s'ajoute aux autres modifications génétiques précédemment décrites. Les inventeurs ont également montré que la surexpression de la protéine KrsE présente un intérêt pour la production de kurstakine en milieu liquide. Ils ont ainsi participé à élucider le rôle de cette 30 protéine en mettant en évidence l'effet de KrsE sur la libération de la kurstakine dans le 3047011 6 surnageant de culture. A l'aide d'un système d'expression inductible, ils ont mis en évidence une augmentation de la production de kurstakine proche d'un facteur 20 lorsque KrsE est surexprimée (Cf Exemple 1.7). Dans le cadre de la présente invention, la surexpression de protéine KrsE peut également être 5 contrôlée par un promoteur constitutif tel que le promoteur du gène aphA3 (Trieu-Cuot P, Courvalin P., 1983, Gene 23:331-341; Dubois, T., et al., 2012. PLaS Pathog. 8: e1002629), par un promoteur préférentiellement activé pendant la phase stationnaire comme le promoteur du gène nprR (Perchat, S., Dubois, T. et al., 2011.. Mol. Microbiol. 82: 619-633) ou encore un promoteur inductible comme le promoteur Pxy, inductible par le xylose (Slamti, L. and Lereclus, D., 2002. 10 EMBO J. 21: 4550-4559). En particulier, il est préconisé pour obtenir une souche exprimant fortement la kurstakine en interne et capable de l'excréter dans le surnageant de culture d'introduire une séquence termCrylAc en plus de la surxpression de KrsE. Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une 15 souche bactérienne, de préférence une souche Bt, n'exprimant pas de toxine, comportant un stabilisateur d'ARNm et surexprimant le gène krsE. Une telle souche est par exemple Bt Cry- krs STAB-SD pl-IT1618T-P'AkrsE. Cette souche peut en outre comporter une séquence termcrylAc comme dans la souche Bt 1-073 Cry- Aspo0A [krs::Pcry3A-STAB-SD ; krsD::TermcrylAC] (p1-1T1618T-pxylf)krsE). 20 Afin d'améliorer encore le transport de la kurstakine vers le surnageant de culture, deux autres éléments pouvant être impliqués dans la maturation de la kurstakine peuvent être surexprimés concomitamment à la surexpression du gène krsE : il s'agit des gènes sfp et krsD qui codent respectivement pour une phosphopantéthéinyltransférase et une thioestérase. La séquence de protéine Sfp correspond à la SEQ ID NO. 5. 25 La séquence de la protéine KrsD correspond à la SEQ ID NO. 6. Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une souche Bt n'exprimant pas de toxine, comprenant un stabilisateur de l'ARNm de l'opéron krs et la surexpression du gène krsE et comportant en outre une inactivation du gène spo0A. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la souche Bt comprend également un promoteur Pcry3A à 30 la place du promoteur endogène de l'opéron krs et une séquence terminatrice termcrylAc en aval de l'opéron krs, et surexprime les gènes sfp et krsD. 3047011 7 En vue de l'industrialisation du procédé, et selon un mode de réalisation préféré de l'invention, une souche d'intérêt est une souche HD1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry et comprenant fa construction génétique capable d'induire la plus forte l'expression de kurstakine dans le milieu de culture. 5 Un troisième objet de l'invention consiste en un procédé de production de kurstakine consistant à cultiver une souche bactérienne génétiquement modifiée conformément à l'invention, en milieu liquide et à récupérer la kurstakine produite dans le surnageant. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la souche bactérienne selon l'invention est cultivée dans un milieu de culture liquide et la kurstakine est récoltée dans le milieu de culture. Ce 10 milieu liquide peut être optimisé afin d'augmenter encore la concentration de la protéine dans le surnageant, notamment en diminuant sa dégradation au cours du temps. Il peut s'agit en particulier du milieu AK tel que décrit par Hathout et al. (2000). Le temps de culture est adapté en fonction de la cinétique de production propre à chaque souche, ce qui est à la portée de l'homme du métier. 15 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de production de kurstakine en milieu liquide consiste à cultiver une souche bactérienne surexprimant KrsE. En effet, les inventeurs ont démontré que la surexpression de KrsE est déterminante pour promouvoir une excrétion efficace de KrsE dans le milieu de culture. Ainsi parmi les souches génétiquement modifiées selon l'invention, on choisira de préférence une 20 souche exprimant KrsE pour une production de kurstakine en milieu liquide. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de production de kurstakine comprend en outre une étape d'extraction en continu par microfiltration. Dans un mode de réalisation préféré, cette étape d'extraction est suivie du transfert de la kurstakine ainsi obtenue dans un milieu dont le pH est inférieur à 4, de préférence inférieur ou égal à 2. Un tel procédé permet de préserver 25 l'activité de la kurstakine au cours du temps. Il est par exemple possible de conserver l'activité du lipopeptide pendant plusieurs jours à 37°C dans un milieu à pH 2, alors que l'activité est perdue si le lipopeptide était conservé dans un milieu dont le pH supérieur ou égal à 4. Ce procédé en milieu liquide a l'avantage de ne pas nécessiter d'extraction du lipopeptide à partir des cellules bactériennes. Le lipopeptide est simplement récolté dans le surnageant de culture, 30 puis purifié par deux étapes d'ultrafiltration membranaire, la première sans solvant et la deuxième en présence d'un solvant (par exemple éthanol, méthanol...). 3047011 8 L'utilisation d'un procédé de production en milieu liquide permet une montée en échelle afin d'augmenter les quantités de molécules produites en vue de l'industrialisation du procédé. Ce procédé constitue le premier procédé de production de kurstakine à visée commerciale. Un quatrième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstakine en tant 5 qu'agent anti-fongique à l'encontre des souches Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea. En effet, les inventeurs ont testé l'effet anti-fongique de la kurstakine sur différentes souches de champignons. Ils ont ainsi confirmé les propriétés antifongiques de ce lipopeptide sur Stochybotris charatum et démontré son effet sur deux autres souches phytopathogènes : Goiactomyces geotrichum et Botrytis cinereo. 10 Un cinquième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstakine en que biosurfactant pour améliorer la dispersion de souches de Bacillus thuringiensis utilisées comme biopesticide. Les bactéries Bt exprimant la toxine Cry (Cry+) constituent le biopesticide de loin le plus utilisé au monde en agriculture. Afin de faciliter la dispersion et augmenter la persistance de ces souches 15 dans la rhizosphère ou la phyllosphère, il est proposé d'utilisation la kurstakine, notamment la kurstakine recombinante telle que produite selon l'invention, en tant que biosurfactant. Les modes de réalisation décrits dans cette demande et les exemples qui suivent ne sont donnés qu'a titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES 20 Figure 1 : Carte des constructions utilisées pour la préparation des souches surproductrices de kurstakine. 1A : insertion de P,,y3A et de STAB-SD en amont de krsA, et de termcrylAc en aval de krsD. 1B : carte du plasmide pli-1-16181-pxynkrsE. 1C : carte du plasmide pH1-315pxylQkre-sfpkrsD Figure 2 Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine par 25 différentes colonies de B. thuringiensis. 2A Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis HD-73 cultivée sur milieu LB gélose pendant 24 heures à 30°C. Une colonie a été reprise dans 20 LtL de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs m/z des adduits Na+ et le des différentes 30 formes observées. 2B : Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis 3047011 9 Bt407 cultivée sur milieu LB gélose pendant 24 heures à 30°C. Une colonie a été reprise dans 20ML de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs miz des adduits H+, Na{ et le des différentes formes observées. 5 Figure 3 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC, 3A : Chromatogramme HPLC de 20uL d'un extrait liquide enrichi en kurstakine produite par Bt HO-73 en milieu AK agar après 1 nuit à 37°C et 3 jours à température ambiante selon le protocole décrit par Hathout et al (2000). La kurstakine présente 4 pics à 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes d'analyse. La séparation est effectuée sur une colonne Kinetex C8, avec un gradient de 10 concentration en acétonitrile de 30 à 70% de 0 à 25 minutes. 3B : Comparaison du profil de chromatogramme HPLC obtenu lors de cette étude pour la production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HO-1 sur milieu AK agar(A) avec l'analyse réalisée lors de la découverte de la kurstakine B (Hathout et al., 2000). Figure 4: Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine. 15 Analyse des pics aux temps de rétention compris entre 9 et 14minutes lors de l'analyse HPLC de l'extrait de kurstakine produit par B. thuringiensis HO-73 sur milieu AK agar. Figure 5 : Taux de production de kurstakine. Analyse réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37°C et 3 jours à température ambiante par les souches de Bacillus thuringiensis HD-1, 1-ID-73 et Bt407. 20 Figure 6 : Croissance de la souche Bt HO-73. Expérience réalisée en milieu liquide LB et AK à 30°C, 160 rpm. Figure 7: Mesure de la concentration en kurstakine. Analyse du surnageant de culture de la souche Bt HD-73 cultivée en milieu LB et AK à 24 et 72H. Figure 8 : Courbe de croissance de la souche Bacillus thuringiensis HO-73. Expérience réalisée en 25 fermenteur de 3L en milieu LB. Figure g : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC. Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HO-73 après 8H de culture en fermenteur en milieu LB à 30°C. 3047011 10 Figure 10: Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine. Analyse du composé récolté après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de B. thuringiensis HD-73 après 8H de culture en milieu LB à 30°C. Figure 11: Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC. 5 Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HD-73 après 9H de culture en fermenteur en milieu LB à 30°C. Figure 12.: Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine. Analyse des composés récoltés après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de B. thuringiensis HD-73 après 9H de culture en milieu LB à 30°C. 10 Figure 13 : Cinétique de production de kurstakine. Analyse réalisée en milieu AK agar et LB gélosé (LBg) par la souche Bacillus thuringiensis HD-73. Figure 14: Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine. Analyse d'une colonie de la souche Bt407Aspo0A cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37°C. 15 Figure 15 : Spectre de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine chez des souches 8t407. 15A : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry+ cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37°C. 15B : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry- cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37°C. Figure 16: Effet de la perte du plasmide portant les gènes cry chez la souche Bt HD-73 sur la 20 production de kurstakine. Le dosage HPLC a été réalisé à partir d'extraits cellulaires de cellules cultivées sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37°C et 3 jours à température ambiante et purifiée sur SPE C8. Figure 17 : Taux de production de kurstakine après insertion d'un stabilisateur de l'ARNm en amont du locus krs. Expérience réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37°C et 3 jours à 25 température ambiante chez les souches Bt HD-73 Cry- et Bt HD-73 Cry-STAB-SD. Figure 18: Effet de la surexpression du gène krsE sur la courbe de croissance de la souche B. thuringiensis HD73. Expérience réalisée avec la souche Bt HD73 krs STAB-SD pl-fT1618T- pxylOkrsE en milieu LB liquide avec ou sans addition de xylose à 20 mM. 3047011 11 Figure 19 : Dosage de kurstakine dans les surnageants de culture de la souche Bt surexprimant la protéine KrsE. Dans cette expérience, B.thuringiensis H073 krs STAB-SD pHT1618T-pxylûkrsE est cultivée en milieu LB et LBxyl. La concentration du lipopeptide, évaluée par dosage HPLC, est exprimée en mg/L. 5 Figure 20 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine. 20A : Effet antifongique contre la souche Rhizoctonia soloni. 206: Effet antifongique contre la souche Fusarium oxysporum. Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrile à 30%. Figure 21 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine. 21A : Effet antifongique 10 contre la souche Galactomyces geotrichum après 3 jours (A) et 5 jours d'incubation (B); 218 : Effet antifongique contre la souche Botrytis cinerea après 5 jours (A) et 7 jours d'incubation (B). Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrile à 30%. MATERIELS ET METHODES 15 1. Souches microbiennes utilisées 1.1 Description des souches Les souches de Bacillus thuringiensis (Bt) utilisées lors de cette étude ont été fournies par l'équipe MICALIS de l'INRA de Jouy-en-Josas. Ce sont, d'une part des souches sauvages isolées de l'environnement, et, d'autre part, des souches modifiées génétiquement pour l'étude de l'effet de 20 différents facteurs sur la production de kurstakine par Bt. 3047011 12 Tableau 1 : Liste des souches de Baciflus thuringiensis utilisées dans le cadre de l'étude du mécanisme de production de la kurstakine Les souches sont mises en culture dans 5 mL de milieu de culture LB liquide à 37°C, agitées sur un 5 agitateur rotatif à 160 rom jusqu'à l'obtention d'une DO500nm de 1. La culture est alors répartie dans des cryotubes de 1 mL selon les proportions suivantes : 0,3 mL de glycérol pour 0,7 mL de culture. Les cryotubes ainsi obtenus sont directement mis au congélateur à -80°C pour le stockage de longue durée des souches bactériennes. Bacillus thuringiensis pxylakrsE-sfp-krsD) D73 Cry Aspo0A [krs::Pcry3A-STAB-SD ; krsD::TermcrylAC] (pHT315- Souche B. thuringiensis Bacillus thuringiensis 407 2 Bacillus thuringiensis 407 Cry Bacillus thuringiensis 407,84p 00A 4 Bacillus thuringiensis HD1 - Bacillus thuringiensis..HD73 6 Bacillus thuringiensis HD73 Cry- Bacillus huringiensis HI)73 Cry- ficrs::1)'peSTA13 I 8 Bacillus thuringiensisHD73 Cry- [krs::Pcry3A-STAB-SD] / pHT1618T-Pxy flkrsE Bacillus thuringiensis HD73 Cry" AkrsE [krs::13'v3A-STAB-SDI 10 Bacillus thuringiensis HD73 Cry- Aspo0A [krs::13,,1,3A-STAB-SD] 11 Bacillus tiluringiensisHD73 Cry; AsPo0A Ikrs:;Pcr3A-STAB-SD] / pHT16181` PxylnkrsE 12 Bacillus thuringiensis HD73 Cry-Aspo0A AkrsE [krs::P'f3A-STAB-SD] 13 Bacillus thuringiensis HD73 Cry-Aspo0A [krs::13, A-STAI3-SD; krsDuTerrncrylAC] Bacillus thuringiensis HD73 Cry AspoOA [krs::1),,y3A-STAB-SD ; krsD::TermcrylAC] fpliT1618TpxylOkrsE) acinus thuringiensis HD73 Cry- [krs-:-.Pcry3A-STAB-SD (pHT315-pxylakrsE-sfp-krsD) Bacillus thuringiensis HD73 Cry- Aspo0A [krs::P cry3A-STAB-SD (p1-11-315-pxylnkrsE-sfp-krsD) -5TAB-SD - krsD::TernricrylAC] (pHT31.5-pxylOkrsE- acinus thuringiensis HD73 Cr: [krs:'_P cr 14. 14 16 17 N° 3047011 13 2. Milieux de culture 2.1. Milieu LB Le milieu de culture Luria Bertani (LB) est un milieu complexe classiquement utilisé pour la mise en culture des souches bactériennes. Il est composé de tryptone, 10 gill.; extrait de levure, 5 g/L ; 5 NaCl, 10 g/L. Les composants sont solubilisés dans 800 mL d'eau déminéralisée, le pH est ensuite ajusté à 7,0 et le volume est complété à 1 L. Ce milieu peut être solidifié (milieu LGg) par l'addition de d'agar (15 g /1). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121°C pendant 15 minutes. 2.2. Milieu 863 Le milieu 863 est un milieu utilisé pour la mise en culture des souches de levures utilisées pour les 10 manipulations de biologie moléculaire. La composition du milieu 863 est la suivante : glucose, 10 g/L ; extrait de levure 10 g/L ; peptone de caséine, 10 g/L. Le milieu gélose 868 peut être préparé en ajoutant de l'agar (15 g/L). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121°C pendant 15 minutes. 2.3. Milieu AK agar #2 Le milieu AK agar #2 (Beckton, Dickinson, Etats-Unis) est un milieu acheté prêt à l'emploi utilisé 15 pour la sporulation des souches de Bacillus. La composition approximative indiquée par le fournisseur est la suivante : peptone de gélatine, 6 g/L ; peptone de caséine, 4 g/L ; extrait de levure, 3g/L; extrait de boeuf, 1,5 g/L ; glucose, 1 g/L ; agar, 15 g/L ; sulfate de manganèse II, 0,3 g/L. Le milieu est préparé en solubilisant 30,8 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée, et est stérilisé par autoclavage à 121°C pendant 15 minutes. 20 2.4. Milieu AK liquide Le milieu AK liquide est identique au milieu AK agar décrit ci-dessus à la différence qu'il ne contient pas d'agar. 2.5. Milieu PDA Le milieu PDA (Potato Dextrose Agar, Biokar Diagnostics) est le milieu utilisé pour la mise en 25 culture des souches de moisissures et pour les tests d'activité antifongique, La composition du milieu est la suivante : extrait de pommes de terre, 4 g/L ; glucose, 20 g/L ; agar, 15 g/L. Le milieu est préparé en solubilisant 39 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée et est stérilisé par autoclavage à 121°C pendant 15 minutes. 3047011 14 3. Construction des souches surproductrices de kurstakine Les différentes étapes pour la construction de souches surproductrices de kurstakine sont les suivantes : délétion du gène spo0A, insertion d'un promoteur fort Pcry3A (Agaisse H. and Lereclus D. 1994, J Bacteriol 176: 4734-4741) et d'un stabilisateur de l'ARNm STAB-SD (Agaisse H. and 5 Lereclus D. 1996, Molecular Microbiology 20: 633-643) en amont du locus krsEABC, insertion d'un terminateur fort (termcrylAc) stabilisant l'ARNm en aval de ce locus, transformation de la souche par un plasmide permettant la surexpression du gène krsE codant pour le transporteur de la kurstakine KrsE, et des gènes sfp et krsD, dont les produits permettent le recyclage du complexe enzymatique impliqué dans la synthèse du lipopeptide. Les souches 407, HD1 et HD73 sont des 10 souches naturelles. Les souches 407 Cry, HD73 Cri et 407 Cry Aspa0A ont été obtenues et publiées précédemment (Du C., Nickerson K.W. 1996, Appl Environ Microbiol 62: 3722-3726 ; Lereclus D. et al., 1989, FEMS Microbiol Lett 60: 211-217 ; Lereclus D. et al., 1995, Bio/Technology (N Y) 13: 69-71). 3.1 Délétion de spo0A 15 La délétion de spo0A dans la souche HD73 Cry est réalisée par insertion dans ce gène d'une cassette de résistance à la kanamycine, selon la méthode publiée précédemment (Yang H., et al. 2012, Appl Environ Microbiol 78: 6466-6474). La souche obtenue est nommée HD73 Cry-Aspo0A. 3.2. Insertion de Pey3A et de STAB-SD L'insertion de P cry3A et de STAR-SD (SEQ ID NO. 2) en amont de krsEABC (Figure 1) est réalisée par 20 échange allélique en utilisant une construction génétique portée par le vecteur suicide pMAD. Pcry3A et STAB-SD sont situés en contigulté sur une même séquence d'ADN, amplifiée par PCR à partir du plasmide pHT7830 (Agaisse H. and Lereclus D., 1994, Molecular Microbiology 13: 97107) en utilisant les amorces stabSD-fwd et stabSD-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xmal et EcoRI aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 577pb. Les régions situées en 25 amont et en aval du promoteur de krsE sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fwd, krs-up-rev) pour la région amont (960pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (084pb). Les sites de restriction (Ncol, Xmal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (EcoRI, BamHl) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, Pcry3A-stabSD et aval sont digérés et ligaturés au niveau de Xmal et EcoRl. 30 Cette construction est amplifiée par PCR et traitée par la T4 polynucléotide kinase (phosphorylation des extrémités 5' et 3' du fragment en blunt ends). Le fragment phosphorylé est inséré dans le plasmide pMAD au niveau du site Smal, après déphosphorylation par la 3047011 15 phosphatase alcaline des extrémités du plasmide ouvert, pour obtenir le plasmide pMAD-Pcry3ASTAB-SD. Ce plasmide est transféré dans les souches HD73 cry et HD73 cry- AspoOA par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30° et 370 pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus D. et al., 1992, 5 Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de Pcry3A-STAR-SD est vérifiée par séquençage. Les souches obtenues sont la HD73 krs P cry3A-STAB-SD et la HD73 AspoOA krs::Pcry3A -STA 13-S D. 3.3. Insertion de termcrylAc 10 L'insertion de termcrylAc en aval de krsD (Figure 1) est réalisée par échange allélique en utilisant une construction portée par le vecteur suicide pMAD. La séquence nucléotidique du terminateur 'termcrylAc' du gène crylAc (SEQ ID NO. 3) est amplifiée par PCR à partir de l'ADN du plasmide pHT73 (Liu G., et al. 2013, Genome Announc 1: e0008013), en utilisant les amorces termcry-fwd et termcry-rev (Tableau 1). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Pstl aux extrémités 5' et 3' 15 de cette séquence de 222pb. Les séquences du gène krsD d'une part, et de la région située en aval de ce gène d'autre part, sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fwd, krs-up-rev) pour la région amont (936pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (1035pb). Les sites de restriction (Bam1-11, Xbal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (Pstl, Ncol) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, 20 termcrylAc et aval sont digérés puis ligaturés au niveau de Xbal et Pstl. Cette construction est amplifiée par PCR, digérée par BamHI et Ncol et ligaturé au plasmide pMAD ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide pMAD-termcrylAc, est transféré dans la souche HD73 cry Aspa0A krsA::Pcry3A-stabSD par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30° et 37° pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus D. 25 et al., 1992, Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de termcrylAc est vérifiée par séquençage. La souche obtenue est la HD73 Cry AspoOA krsA::Pcry34-stabSD krsD:: termcrylAc. 3.4. Surexpression des gènes krsE, sfp et krsD 30 La surexpression des gènes krsE, sfp et krsD est obtenue par clonage de ces gènes derrière le promoteur inductible Pxyl, dans les plasmides à haut nombre de copies pHT1618 (Lereclus D. and Arantes 0. 1992, Mol Microbiol 6: 35-46) (figure 2) et pHT315pxyl (Slamti L. and Lereclus D., 2002, 3047011 16 EMBO J 21: 4550-4559) (figure 3). La séquence du gène krsE est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73, en utilisant les amorces krsE-fwd et krsE-rev (tableau 1). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Kim' aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1250pb. La séquence est ensuite digérée par ces enzymes puis ligaturée dans le plasmide 5 pHT1618T ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide pHT1618TpxyllUrsE est sélectionné chez E. cou pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquençage puis transféré par électroporation dans la souche HD73 Cry AspoOA. La souche obtenue est la HD73 Cry- spoOA pliT1618TpxylOkrsE. Pour la surexpression des gènes krsE, sfp et krsD, les clonages suivants ont été réalisés : La 10 séquence du gène krsE précédé de son promoteur est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73, en utilisant les amorces pkrsE-fwd et pkrsE-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites BamHl et Xbal aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1800pb. La séquence des gènes sfp et krsD, organisés en opéron, est amplifiée par PCR à l'aide des amorces sfpkrsD-fwd et sfpkrsD-rev. La séquence amplifiée, de taille 1500pb, possède les 15 sites de restriction Xbal et Hindlll à ses extrémités 5' et 3'. Les deux séquences amplifiées sont digérées par les enzymes BamHl, Xbal et Hindlll puis sont ligaturées dans le plasmide pHT315pxyl ouvert par BamHl et Hindlll. Le plasmide pHT315pxylfàkrsE-sfp-krsD est sélectionné chez E. cou pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquencage puis transféré par électroporation dans la souche HD73 Cry- AspoOA krsA::Pcry3A-STAB-SD krsD::termcrylAc, donnant la souche 20 HD73 Cry AspoOA krsA::Pcry3A-STAB-SD krsD::termcrylAc pliT315pxyllUrsE-sfp-krsD. Le plasmide pHT315oxynkrsE-sfp-krsD a aussi été transféré dans la souche HD73 Cry- krsA::Pcry3ASTAB-SD krsD::termcrylAc, donnant la souche HD73 Cry krsA::Pcry3A-STAB-SD krsD::termcry 1AcpHT315pxylQ krsE-sfp-krsD. 25 3047011 17 Tableau 2 : Liste des amorces utilisées pour les différentes constructions. En souligné : sites de restrictions introduits. nom séquence sites SEQ ID NO. stabSD-fwd TCCCCCCGGGTCGAAACGTAAGATGAAACCTT Xmal 7 stabSD-rev GGAATTCATAAATCCATTAGACGGTGC EcoRI 8 krs-up-fwd CATGCCATGGCAATGTAACGAATATGATATTAAGTGT Ncol 9 krs-up-rev TCCCCCCGGGAACTTCGTCAAAACTCAAACTACTCTT Xmal 10 krs-dn- fwd GGAATTCAAATTCTAGGTGAGATGTCAATAA EcoRI 11 krs-dn- rev CGGGATCCAACCATACCTCCACATACTACCCA BamHI 12 termcry-fwd GCTCTAGAAACTCAGGMAAATATCGTT Xbal 13 termcry-rev AACTGCAGAATAAAAAAAGAAAAAGCAGA Pst! 14 krsD-up fwd CGGGATCCCATTAAATTCATTCTCT BamHl 15 krsD-up-rev Xbal 16 GCTCTAGACTAAAAACTATTTGATAATC I 111 AGA krsD-dn-fwd AACTGCAGATACCATTTAGAGTCTTTATTAT Pst! 17 krsD-dn-rev CATGCCATGGAAGCTTTCCATTCTCAAGGTT Ncol 18 krsE-fwd GCTCTAGAATGAAAACTATTGATTCAAAAGGC Xbal 19 krsE-rev GGGGTACCTCAAAAATTA i I 1GCTCTTATTGG Kpni 20 pkrsE-fwd CGGGATCCTATCAAC1 I 1AGTTATTGGA BamHI 21 pkrsE-rev GCTCTAGATCAAAAATTATTTGCTCTTATTGG Xba I 22 sfpkrsD-fwd GCTCTAGAATGAAGCGTTTATTAAACTCAT Xbal 23 sfpkrs D-rev CCCAAGCTTTATAGGTAAAGCCAACTTAAA HindIII 24 4. Production de kurstakine 4.1. Production en milieu solide Les souches de B. thuringiensis ont été cultivées sur milieux solides (AK agar ou LBg) pour la production de kurstakines selon le protocole décrit par Hathout et al. Une pré-culture d'une nuit a 5 été réalisée dans du milieu LB liquide à 30°C, agitée à 160 rpm. Les boites de milieu gélosé sont alors ensemencées par inondation, et le surplus de pré-culture est éliminé. Les boites sont mises à incuber une nuit à 37°C et 3 jours à température ambiante sur paillasse. Le prélèvement de la culture sur boite est réalisé après 24, 48, 72 et 120 heures de culture pour le dosage des lipopeptides. 10 Le tapis bactérien s'étant développé sur les boites de milieu gélosé est récupéré au moyen d'un râteau, et repris dans une solution à 1 M KCl/0,5 M NaCI. La solution est homogénéisée au vortex, 3047011 18 puis centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Le culot est ensuite lavé 3 fois par un volume équivalent d'eau distillée. L'extraction est réalisée sur ces culots par ajout de solvant ACN/H20 90/10 (V/V), suivi d'une homogénéisation au vortex. La suspension est ensuite centrifugée à 3 000 g pendant 10 minutes, afin de séparer le surnageant, contenant les composants récupérés de la 5 surface des spores, et le culot cellulaire. Le surnageant est ensuite directement traité par extraction en phase solide (SPE) pour l'extraction des kurstakines. 4.2. Production en milieu liquide Pour les cultures bactériennes, une culture de réveil est réalisée dans 10 mL de milieu LB dans un tube à essai à partir d'un cryotube de la souche conservée à -80°C, 10 Les cultures liquides de Bt sont réalisées à partir des cryotubes préparés précédemment. Une pré- culture est réalisée dans 100 mL de milieu de culture liquide correspondant au milieu utilisé pour la culture, à savoir milieu LB ou AK. La croissance de la pré-culture est réalisée dans les mêmes conditions de température et d'agitation que la culture pour laquelle celle-ci a été préparée. Lorsque la pré-culture atteint une DO60onn, z 1, elle est utilisée pour ensemencer la culture pour 15 atteindre une D0600,, initiale égale à 0,2. 4.3. Purification La purification des kurstakines est effectuée par SPE sur colonnes C8 adaptées sur un extracteur sous vide Alltech Vacuum 12-port Manifold, au moyen d'une pompe Savant Gel Pump GP100. Les colonnes SPE C8 (Bond-Elut Jr C8 1000Mg) sont tout d'abord lavées et conditionnées par le 20 passage de 20 mL d'ACN /0,1% TFA, puis 20 mL dl-120/0,1% TFA. L'échantillon à analyser (5 mL d'extrait cellulaire ou de surnageant de culture) est alors déposé sur la colonne et entièrement passé à travers la colonne. Un premier lavage est effectué avec 10 mL d'H20/0,1%TFA afin d'éliminer les sels et impuretés hydrophiles contenus dans l'échantillon. Un deuxième lavage est effectué par le passage de 10 mL d'ACN/H20/TFA (30/70/0,1; v/v/v). Les lipopeptides sont élues 25 par le passage de 5 mL d'ACN/H20/TFA (90/10/0,1 ; v/v/v). Les 5 mi d'échantillon ainsi collectés sont séchés au moyen d'un concentrateur rotatif sous vide. Les culots sont repris dans 300 uL d'ACN/H20/TFA (30/70/0,1; v/v/v) afin d'être analysés en HPLC. La mise au point de la purification de kurstakine par HPLC a été réalisée afin de permettre la purification du lipopeptide à partir de volumes importants d'extraits cellulaires de Bacillus 30 thuringiensis ne pouvant être réalisé par colonnes SPE de faible volume. 3047011 19 La purification a été réalisée au moyen d'une colonne en verre de 15 cm de hauteur pour 2 cm de diamètre remplie au moyen de phase BONDESIL-C8, 40pm (Agitent Technologies). Les solvants sont pour la voie A de l'acétonitrile additionné de TFA à 0,1% (v/v) et pour la voie B de l'eau ultrapure contenant 0,1% de TFA (v/v). Un volume de 5 à 10 ml d'extrait de kurstakine concentré 5 est injecté dans la colonne. La séparation des kurstakines est réalisée au moyen d'un programme en 4 phases basé sur le programme utilisé en HPLC : 25 minutes à 100% d'eau pour l'élution des contaminants hydrophiles, 20 minutes à 30% d'acétonitrile pour l'élution d'une partie des contaminants présentant une affinité avec ce solvant, 20 minutes de passage de solvant à 70% d'acétonitrile pour l'élution des kurstakines, et enfin 20 minutes à 100% d'acétonitrile pour te 10 nettoyage de la colonne. La récolte de la kurstakine est réalisée au moyen d'un collecteur automatique pendant la phase d'élution à 70% d'acétonitrile. 4.4. Détection et quantification L'analyse est réalisée au moyen d'une cotonne Kinetex C8 (ref) sur un appareillage Waters (Online Degaser, 717 Autosampler, 6605 Controller, 626 Pump, 2996 PhotoDiodeArray, Waters 15 Corporation, Milford, MA, U.S.A.). La séparation des kurstakines est effectuée par un gradient linéaire d'acétonitrile additionné de 0,1% de TFA (solvant A) de 30 à 70% sur 25 minutes. La colonne HPLC subit ensuite un lavage pendant 5 minutes avec 100% de solvant A, puis 5 minutes de rééquilibrage à 30% du solvant A pour le passage de l'échantillon suivant. La détection des lipopeptides est effectuée par lecture de l'absorbance des liaisons amides à 214 nm. Le temps de 20 rétention des pics obtenus et leurs dérivées secondes sont analysés au moyen du logiciel EMPOWER 2 Software. La quantification de la kurstakine est réalisée par comparaison avec l'aire de pics obtenus pour un standard de surfactine à 1 g/L analysé dans les mêmes conditions. La standardisation des dosages de lipopeptides est réalisée en rapportant les quantités de lipopeptides mesurées à la masse sèche biologique à partir de laquelle la kurstakine a été extraite. 25 Dans le cadre des analyses de production en milieu solide, les cellules sont récupérées après l'extraction sur SPE par reprise dans 5 mL d'eau déminéralisée et la suspension obtenue est déposée dans une coupelle en aluminium préalablement pesée et mise à sécher dans une étuve à 95°C pendant 48 h pour l'élimination totale de l'eau de l'échantillon. Après évaporation, la coupelle est à nouveau pesée pour déterminer la masse sèche de l'échantillon. 30 4.5. Spectrométrie de masse La recherche des différents peptides synthétisés par B. thuringiensis est réalisée par spectrométrie de masse à partir de colonies bactériennes développées sur AK agar ou milieu LB 3047011 20 gélose pendant 24 et 48h. Une colonie est en mise en suspension dans 25 uL de matrice HCCA (Acide a-cyano-4-hydroxycinnarnique). La suspension est homogénéisée au vortex pendant 10 secondes, centrifugée rapidement (short spin) à 5000 rom pendant 5 secondes et le surnageant est déposé sur plaque pour analyse. L'acquisition des spectres de masse est réalisée au moyen 5 d'un instrument MALDI-TOF-TOF UltraFlex Il (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne), équipé avec un laser Smartbeam, en mode réflectron positif. Un millier de spectres MALDI-MS ont été acquis à chaque position dans un champ de 500 à 2000 Da en utilisant une fréquence de laser de 20 Hz. L'analyse des surnageants de culture et d'échantillons liquides est réalisée en mélangeant 10 pi d'échantillon avec 10 g de matrice HCCA. 10 Afin d'identifier les molécules recherchées, les pics correspondants aux adduits H+, Na+ et K+ de celles-ci sont recherchés. 5. Tests d'activité biologique 5.1. Souches de champignons Afin d'évaluer le potentiel antifongique de la kurstakine, 4 souches de moisissures 15 phytopathogènes ont été utilisées dans le cadre de tests d'activité. Ces souches ont été fournies par Monica Hôfte (Laboratoire de phytopathologie, Département de protection des cultures de l'Université de Gand, Belgique). Tableau 3 : Liste des souches de moisissures utilisées pour les tests d'activités antifongiques Moisissure Maladie Botrytis cinerea R1-6 FUSCIfiLlin oxysporum f. sp. Congutinans Galactomyces geotrichurn MUCL 28959 :egehicle:WPOUetittite:griSW.deeffiSin:: Agent de fa fusariose chez fes céréales Agént de la pourriture basale de la laitue Agent de la pourriture aigre des fruits 5.2. Test d'activité antifongique 20 L'activité antifongique des extraits de Bacillus thuringiensis enrichis en kurstakine est évaluée au moyen d'un test d'inhibition de croissance de différentes souches de moisissures et de levures sur boite en milieu solide. Les différentes moisissures à tester sont d'abord cultivées en déposant sur un milieu PDA gélose un carré de gélose colonisée par ces souches (une souche /boîte de Pétri). Après inoculation, les différentes boîtes sont mises à incuber à 25°C jusqu'à la 25 colonisation complète des boites. Un carré de gélose de chacune de ces souches sert à coloniser 3047011 21 les boîtes utilisées pour le test antifongique. Celui-ci est réalisé en boites de Pétri contenant précisément 20m1 de PDA. Des carrés de gélose colonisée sont découpés à partir des cultures précédentes et déposés à l'envers au centre des boites. L'incubation s'effectue à 25°C jusqu'à l'obtention d'un disque de culture d'1 cm de diamètre. Des disques imprégnés d'extraits purifiés 5 de kurstakines correspondant à 25, 50 et 100g de lipopeptides sont alors déposés à 1cm du bord de la boite. Un témoin négatif est réalisé en déposant un disque imprégné du solvant dans lequel ont été repris les extraits de kurstakine (AC111/1-120 30/70 (v/v)). Les boites sont incubées à 25°C jusqu'à l'envahissement total de la boite par la souche de moisissure testée. L'effet antifongique de fa kurstakine est observé par l'inhibition de la croissance de chaque souche autour des disques 10 imprégnés en lipopeptide. R ES U LTATS 1. Analyse de la production de kurstakine 1.1. Détection de la kurstakine produite par Bt HD-73 et Bt407 15 Afin de confirmer le potentiel de production de kurstakine par les souches Bt HD-73 et Bt407, une analyse en spectrométrie de masse des cellules est réalisée pour détecter le lipopeptide. En effet, la présence de gènes de synthétase ne signifie pas pour autant que la production du peptide ou lipopeptide associé sera effective. Ainsi, plusieurs souches de B. thuringiensis chez lesquelles les gènes de la kurstakine synthétase avaient été détectés ne présentent pas de production du 20 lipopeptide lors d'une analyse par spectrométrie de masse. (Abderrahmani et cil., 2011). La production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HD-73 a été analysée par spectrométrie de masse MALI:Il-TOP sur colonies cultivées sur milieu LB pendant 24 heures (Figure 2A). Les différents pics détectés correspondent aux adduits H+, Na+ et K. de la kurstakine portant un acide gras à 11, 12, 13 et 14 carbones, indiquant la production de ces 4 formes de lipopeptide par 25 la souche B. thuringiensis HD-73. L'intensité relative des groupes de pics semblent indiquer la production d'une forte majorité de kurstakine C13. De la même manière, une analyse des formes de kurstakines produites par la souche B. thuringiensis Bt407 est réalisée par spectrométrie de masse dans les mêmes conditions (Figure 30 2B). 3047011 22 La souche B. thuringiensis Bt407 présente un profil de pics proche de celui de la souche B. thuringiensis HD-73. Les adduits Na+ et le de la forme C13 sont majoritaires, et les pics des adduits des formes C12 et C14 ne sont que peu visibles. En revanche, seul l'adduit H+ de la forme C11 peut être détecté. L'intensité des pics observés étant moins forte que celle obtenue avec la 5 souche B. thuringiensis HD-73, le signal des pics correspondant aux autres adduits n'est sans doute pas suffisant pour se dégager du bruit de fond. Ces expériences montrent que les deux souches analysées produisent un mélange similaire des formes C11 à C14 de la kurstakine. 1.2. Analyse quantitative de la production de kurstakine par différentes souches de 10 B. thuringiensis Les gènes de la kurstakine synthétase et la production de kurstakine ayant été observés chez différentes souches, l'identification de la souche présentant le meilleur taux de production en lipopeptide est nécessaire pour la sélection d'une souche d'intérêt biotechnologique. Afin de déterminer ce potentiel, les taux de production de kurstakine de différentes souches sauvages de 15 B. thuringiensis et ont été évalués en réalisant le dosage HPLC d'extraits préparés à partir de cultures réalisées en milieu solide AK agar selon le protocole modifié d'Hathout et al. décrit dans la section Matériels et Méthodes. Les souches sont cultivées sur le milieu AK agar une nuit à 37°C et 3 jours à température ambiante. Après extraction et purification des lipopeptides sur colonne SPE C8, les échantillons sont analysés par HPLC permettant la séparation des différentes formes 20 de la kurstakine par une colonne greffée par de la phase C8 lors d'un gradient de solvant de 30 à 70% d'acétonitrile. La séparation des molécules est suivie par la mesure de l'absorbance à 214 nm. Un exemple de chromatogramme obtenu est présenté ci-dessous (Figure 3A). L'analyse HPLC permet d'identifier 4 pics aux temps de rétentions 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes. Les trois premiers pics présentent des intensités du même ordre de grandeur. Le pic à 25 13,12 minutes présente une intensité relativement plus importante. Cette analyse est comparée avec les données de la littérature. La première analyse d'extraits de spores de Bt par HPLC a été réalisée en 2000 par Hathout et al. Elle a démontré que dans les conditions utilisées, la kurstakine est détectée par HPLC sous la forme de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution (Figure 3B). 3047011 23 La comparaison des résultats obtenus avec le premier chromatogramme de séparation des différentes formes de kurstakine avec les résultats obtenus lors de cette étude permet d'observer la présence du même massif de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution. De plus, une confirmation de la nature des pics observés est réalisée en récoltant le produit de 5 l'élution à la sortie du système HPLC entre 9 et 14 minutes. Après concentration de l'extrait par évaporation du solvant, le produit séché est repris dans un volume de 20 pl de matrice HCCA pour une analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 4). L'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des pics récoltés lors de l'analyse HPLC permet d'identifier les différents adduits H+, Na{ et r les formes C11 à C14 de la kurstakine, confirmant 10 ainsi que les pics détectés par HPLC correspondent aux différentes formes du lipopeptide. L'utilisation de la technique HPLC permettant de détecter les différentes formes de kurstakines, le dosage de la production des lipopeptides par les souches B. thuringiensis HD-1, HD-73 et Bt407 a été réalisé selon le même protocole (Figure 5). Aucun standard de kurstakine n'étant disponible à ce jour, un standard de surfactine, possédant le même nombre de liaisons peptidiques que la 15 kurstakine, a été utilisé pour réaliser cette quantification. La souche B. thuringiensis HD-73 produit environ 6 pg de kurstakine par mg de matière sèche. A titre de comparaison la souche B. thuringiensis FID-1 produit entre 15 et 20 µg/mg de matière sèche. La souche B. thuringiensis Bt407 produit quant à elle 1µg/mg de matière sèche. A la vue de ces résultats la souche B. thuringiensis HD-1 présente le taux de production de 20 kurstakine le plus élevé parmi les souches testées, suivi de a thuringiensis HD-73 et B. thuringiensis Bt407. Néanmoins, lors du début des travaux réalisés dans le cadre de cette étude, seuls les génomes des souches B. thuringiensis HD-73 et Bt407 avaient été séquences et publiés. La souche HD-73 possédant le meilleur taux de production du lipopeptide entre ces deux souches, elle a été majoritairement utilisée pour l'étude des facteurs limitant potentiellement la 25 production de kurstakine. Plusieurs mutants réalisés à partir de fa souche B. thuringiensis 407 étant également disponibles au début de cette étude, ceux-ci ont été également utilisés pour l'analyse de l'impact de certains de ces facteurs. 3047011 24 1.3. Cinétique de production de la kurstakine Lors de la découverte de la kurstakine en 2000, ce lipopeptide avait été identifié à partir de spores de B. thuringiensis, obtenues après 4 jours de culture sur milieu de culture AK agar#2, milieu spécifiquement dédié à la production de spores bactériennes (Hathout et al., 2000). 5 L'influence du milieu de culture sur la production de kurstakine a donc été étudiée dans le cadre de production en milieu liquide et en milieu solide. Production en milieu liquide Dans le cadre de l'étude de la production en milieu liquide, la souche 8T HD-73 est cultivée en milieu LB et AK liquide pendant 72 heures à 30°C sous une agitation à 160 rpm. Le suivi de 10 croissance est réalisé par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 6), et la production de kurstakine est réalisée sur chaque échantillon selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes. La croissance de la souche Bt I-ID-73 est similaire dans les deux milieux de culture liquides testés. La souche est en phase exponentielle de croissance pendant environ 3 heures, puis est en phase 15 de ralentissement de 3 à 24 heures de culture, moment à laquelle elle entre en phase stationnaire. La cinétique de production en milieu liquide ne permet pas de quantifier de kurstakine par HPLC, aussi bien au niveau des culots cellulaires qu'au niveau des surnageants de cultures pendant les 8 premières heures de culture. En revanche, une quantification de kurstakine a pu être réalisée de 20 façon plus tardive dans les surnageants de culture après 24h et 48h de culture (Figure 7). Après 24 h de culture, la production de kurstakine en milieu AK atteint 5 mg/L dans le surnageant de culture. Après 72 h de culture, 3,7 mg/L sont mesurés. En milieu LB, 1 mg/L est mesuré après 24 h, mais la kurstakine n'est plus détectable après 72 h. La culture en milieu liquide AK permet donc la production d'une quantité de kurstakine 25 supérieure à celle d'une culture en milieu liquide LB. Quel que soit le milieu de culture utilisé, la production de kurstakine semble suivre le même comportement, avec une impossibilité de détecter la molécule dans le surnageant pendant les premières heures de culture, une production détectable de quelques milligrammes par litre après 24h de culture, puis une diminution de la quantité de lipopeptides mesurée dans le surnageant 30 après 72h. 3047011 25 Dans le cadre des travaux réalisés, une première étude de la production de kurstakine par B. thuringiensis en fermenteur a été menée. La souche B. thuringiensis HD-73 a été cultivée dans 3L milieu LB pendant 24H en batch. La croissance de la culture a été suivie par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 8). Toutes les heures, un prélèvement de 20mL a été effectué, et le 5 culot et le surnageant ont été analysés séparément après leur séparation par centrifugation. Bacillus thuringiensis présente en fermenteur une phase de croissance exponentielle de 3 heures, et une phase de ralentissement de 2h Le prélèvement réalisé 8h après le début de la culture permet d'identifier par HPLC un pic correspondant à la kurstakine, avec un temps de rétention de 13 minutes environ, et un profil 10 d'absorbante en UV similaire à celui observé fors des quantifications du lipopeptide réalisées précédemment (voir paragraphe 1.2.2) (Figure 9). Afin de confirmer la nature des peptides élues lors de cette chromatographie, une récolte du pic a été effectuée, et l'échantillon a été concentré par réduction du volume à lOuL final par séchage, puis additionné de 101.À.L de matrice HCCA pour analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 15 (Figure 10). L'analyse par spectrométrie de masse permet d'observer la présence d'adduits de kurstakine de forme C13. Après 1h de culture supplémentaire, le profil HPLC observé est légèrement différent. Deux pics sont observés en HPLC, à respectivement 12,6 et 13,6 minutes. Le profil de l'absorbance en UV est 20 différent de celui du pic observé après 8h de culture (Figure 11). Une collecte a été réalisée à l'issue de la séparation par HPLC de 12 à 14 minutes d'élution afin d'identifier les composés détectés. Le volume de l'échantillon prélevé est réduit à un volume de 10u1 final par séchage, et est mélangé à lOpiL de matrice HCCA pour l'analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 12). 25 Après analyse par spectrométrie de masse, la présence de pics de rapport m/z 924,71, 946,71 et 962,70 peuvent être observés. Ces pics correspondent aux adduits H+, Na+ et K+ de la kurstakine C13 sous sa forme linéaire, indiquant la linéarisation partielle de la quantité de lipopeptide produit par B. thuringiensis HD-73 entre 8 et 9h de culture. 3047011 26 - Production en milieu solide Pour l'étude de la cinétique de production de kurstakine en milieu solide, la souche I-ID-73 a été cultivée en milieu AK agar et LB gélosé pendant 5 jours. L'extraction, la purification et la quantification de kurstakine ont été réalisées selon le protocole décrit dans la partie Matériels et 5 Méthodes (Figure 13). En milieu de culture solide la production de kurstakine présente également de grande variation en fonction de l'âge de fa culture. Ainsi, après 9h de culture, la production de kurstakine atteint 5 µg/mg de matière sèche en milieu AK agar. Après 24h et 32h de culture, le niveau de production mesuré est de 2µg/mg de matière sèche environ. Enfin, le niveau de production à 96h et 120h est 10 d'environ 8 µg/mg de matière sèche. Le maximum de production observé est donc atteint après 4 à 5 jours de cultures, soit le temps recommandé par le protocole décrit par Hathout et al. En milieu LB, la production de kurstakine est d'environ 1 µg/mg de matière sèche après 9h de culture, et atteint un maximum après 24h de culture, avec 2 µg/mg de matière sèche. La quantité de kurstakine diminue ensuite jusqu'à 0,5 µg/mg de matière sèche après 96h, puis s'établit à 2 15 µg/mg de matière sèche après 120h. Néanmoins, les imprécisions de mesures liées aux faibles quantités de molécule détectée ne permettent pas d'établir de différence significative des mesures entre les différents temps de culture pour ce milieu. Ces résultats montrent que la quantité de kurstakine produite est supérieure lorsque les souches Baciflus thurungiensis sont cultivées dans un milieu optimisé AK par rapport à une culture en 20 milieu classique LB également en condition de culture en milieu solide. 1.4. Etude de la relation entre la sporulation de Bt et la production de kurstakine La production de kurstakine a été, depuis la découverte de cette molécule, associée au phénomène de sporulation de B. thuringiensis. Cela est notamment dû à l'état physiologique des cellules utilisées lors de la découverte du lipopeptide. Afin d'en savoir plus sur la relation entre la 25 production de kurstakine et la sporulation des cellules, la capacité de production du lipopeptide par la souche Bt 407 Aspo0A a été étudiée. Cette souche dont le gène spo0A, codant pour un activateur des gènes liés à la sporulation, a été interrompu est donc incapable de sporuler ou même de s'engager dans le processus de sporulation (Lereclus, et al., 1, 1995. Nature Bia/rechnolagy, 13: 67-71). Pour cela, une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a été 30 réalisée sur une colonie cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37°C (Figure 14). 3047011 27 L'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF permet d'identifier les adduits H+, Na; et K+ de la kurstakine C12 et C13. Les pics correspondants aux formes C11 et C14 ne sont pas détectés. Il est néanmoins difficile de déterminer s'il s'agit d'une réelle absence de production de ces deux formes, ou de l'effet de la limite de détection par l'appareil. 5 Les résultats démontrent que la souche Bt407,Aspo0A produit de la kurstakine malgré la délétion de l'activateur transcriptionnel principal de la sporulation chez B. thuringiensis. Cela indique que la sporulation des cellules de Bt n'est pas nécessaire à la production de kurstakine. 1.5. Effet de l'inactivation de la production de toxines de B. thuringiensis sur la production de kurstakine 10 La production de toxines protéiques sous forme de cristaux est l'une des particularités métaboliques les plus importantes de B. thuringiensis. Il a été décidé de tester si la suppression de cette activité de synthèse pouvait donc avoir un effet bénéfique sur la production de kurstakine. L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques par les souches de 13t a donc été étudié au moyen de deux souches 15 modifiées Bt 407 Cry- et Bt HD-73 Cry-. - Analyse qualitative Dans un premier temps, l'analyse des produits des différentes souches a été réalisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF à partir de colonies cultivées sur milieu LB gélose pendant 24 heures à 30°C (Figure 15A). 20 La souche Bt 407 sauvage présente les pics des adduits des kurstakines en C11, C12, C13 et C14. L'analyse a été réalisée dans les mêmes conditions pour la souche Bt407 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes cry a été supprimé (Figure 1513). Les kurstakines de forme C11 à C14 sont retrouvées sur les cellules de la souche Bt407 Cry-. Les souches Bt407 sauvage et Bt 407 Cry- produisent donc les mêmes formes de kurstakine, 25 indiquant que la suppression du plasmide portant les gènes responsables de la production de toxines n'entraîne pas de modification qualitative des formes de kursakine produites. Afin de confirmer ce résultat, les produits de la souche sauvage B. thuringiensis HD-73 sauvage et de la souche modifiée B. thuringiensis HD-73 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes de production de toxine a été supprimé ont été analysés dans les même conditions. 3047011 28 La perte du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques n'a pas d'effet majeur sur la variété de kurstakine produite par les souches de Bt, les mêmes formes de la molécule étant retrouvées dans la souche sauvage et la souche curée du plasmide. - Analyse quantitative 5 L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes de production de toxines sur la production de kurstakine par B. thuringiensis a également été analysé quantitativement par un dosage de la production du lipopeptide par HPLC. Ce dosage a été réalisé à partir d'extrait cellulaires réalisés selon le protocole décrit dans la partie Matériel et Méthodes après culture des souches sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37°C puis 3 jours à température ambiante (Figure 16). 10 La souche sauvage Bt HD-73 présente un niveau de production de kurstakine d'environ 6 µg/mg de matière sèche. Après la perte du plasmide, la souche produit environ 18 mg/mg de matière sèche. Pour la souche Bt 407, la perte du plasmide permet l'augmentation de la production de 1 à 5 pg/mg de matière sèche. L'élimination du plasmide a ainsi un effet positif sur la production de kurstakine d'un point de vue 15 quantitatif, avec une augmentation du taux de production de lipopeptide ramené à la matière sèche d'un facteur 3 à 5 en fonction de la souche. Dans la perspective de produire la kurstakine à l'échelle industrielle, la meilleure construction sera introduite dans une souche 1-1D1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry. 1.6. Effet de l'augmentation de la stabilité de l'ARNm de la kurstakine synthétase sur la 20 production de kurstakine La stabilité des ARN messagers issus des gènes de production est essentielle à la production de la synthétase responsable de la production de la kurstakine. Un problème de stabilité des ARNm entrainerait une synthèse très faible du complexe enzymatique produisant le lipopeptide. L'importance de la stabilité de l'ARNm des gènes krsEABC a donc été évaluée ici par le dosage de 25 la kurstakine par les souches Bt HD-73 Cry- STAB-SD et Bt HD-73 Cry- spo0A STAB-SD chez lesquelles la séquence STAB-SD a été intégrée en amont du gène krsE. Cette séquence de type Shine-Dalgarno présente en amont du gène de toxine cry3A a été identifiée chez B. thuringiensis comme agissant en tant que stabilisateur d'ARNm. La séquence STAB-SD minimale permettant de stabiliser l'ARNm situé en aval correspond à la SEQ ID NO. 1. Cette séquence peut être placée 30 entre n'importe quel promoteur et la séquence du gène d'intérêt. L'insertion de cette séquence en amont de krsE pouvait donc permettre donc d'augmenter la stabilité de l'ARNm de la 3047011 29 kurstakine synthétase. Les différentes souches modifiées ont été cultivées sur milieu AK agar et utilisées pour la préparation d'extraits cellulaires selon la méthode décrit dans la partie matériels et méthodes. Les résultats de production de ces souches et des souches mère correspondantes sont présentés dans la Figure 17. 5 La souche Bt HO-73 Cry- produit 18,2 u.g de kurstakine par mg de matière sèche. L'introduction du stabilisateur STAB-SD chez la souche entraîne une augmentation de la production à 21,7 ug/mg, soit une augmentation d'environ 20%. L'effet de l'introduction du stabilisateur d'ARNm en amont du locus krs chez B. thuringiensis entraine donc une augmentation de la production chez la souche HD73 Cry-. En revanche, cet 10 effet semble proportionnellement plus important chez la souche HD73 Lspo0A. 1.7. Rôle du gène krsE dans le transport de la kurstakine Le rôle du produit du gène krsE, dont l'analyse bioinformatique démontre une proximité avec la famille des protéines de transport de type Major Facilitator Superfamily (MFS-1), est à ce jour inconnu. Néanmoins, la prédiction de son activité suggère l'implication de la protéine KrsE dans le 15 transport de la kurstakine. Afin de déterminer le rôle joué par cette protéine dans la synthèse de la kurstakine, l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstakine a été étudié lors d'une culture en milieu liquide. Une souche HD73 krs STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE a été utilisée pour l'évaluation de l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production et le transport de kurstakine. Cette souche, chez laquelle le promoteur de la kurstakine synthétase est 20 inductible par l'addition de xylose, a été cultivée en milieu LB liquide, en absence ou en présence de xylose à 20 mM (LBxyl), permettant l'induction de la transcription du gène krsE. Les cultures liquides ont été réalisée dans 100 mL de milieu LB ou LBxyl en erlenmeyer de 500 mi, à 30°C pendant 24 heures. Un prélèvement de 5 mL a été effectué toutes les heures pendant les 8 premières heures de culture. Un prélèvement de 5 mL a également été effectué après 24, 28 et 32 25 heures de culture. Pour chaque prélèvement, le culot et le surnageant ont été séparés par centrifugation à 5000g pendant 5 minutes, et l'extraction, la purification et l'analyse de la production de kurstakine ont été réalisés comme décrit dans la partie matériel et méthodes. Les courbes de croissance de la souche HD73 krs STAB-SD pi-IT1618T-pxylOkrsE cultivée en milieu LB en absence ou en présence de xylose à 20mM sont présentés dans la Figure 18. 30 En milieu LB, la souche Bt HD73 krs STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE présente une phase exponentielle de croissance d'environ 3 heures. La souche entre ensuite en phase de 3047011 30 ralentissement, jusqu'au début de la phase stationnaire, à environ 10 heures de culture, atteignant une D©600,,, maximale de 6,0 après 32 heures de culture. En milieu LBxyl, la souche présente le même profil de croissance au niveau de la phase exponentielle. Néanmoins, là où la souche présente une simple phase de ralentissement en milieu LB, la croissance en présence de xylose voit la D060onn, de la culture chuter à partir de 6 heures de cultures, et ce jusqu'à 10 heures, passant de 2,9 à 1,8. A 24 heures de culture, la souche cultivée en présence de xylose présente une 00600nm plus faible qu'en milieu LB. La suivi de la concentration de kurstakine présente dans le surnageant de culture de la souche dans les différentes conditions est présentée dans la Figure 19. 10 En milieu LB, la concentration en kurstakine dans le surnageant de culture est relativement faible, voire impossible à évaluer par HPLC, étant inférieure au seuil de détection de l'appareil malgré l'étape de concentration réalisée sur colonne SPE. La concentration maximale mesurée est obtenue après 24 heures de cultures, avec 1,02 mg/L de kurstakine dans le surnageant de culture. En milieu LBxyl, les concentrations mesurées dès les premières heures de cultures sont de l'ordre 15 de 4,6 et 5,4 mg/L pour la première et la deuxième heure de culture respectivement. La concentration diminue ensuite progressivement jusqu'à la 7ème heure de culture, avec une concentration de 0,1 mg/L de lipopeptide. A 8 heures de culture, la concentration mesurée augmente à 1,3 mg/L. Après 24 heures de culture, la concentration mesurée dans le surnageant de culture de la souche cultivée en LBxyl est de 18,46 mg/L. 20 Ces résultats montrent une augmentation de la production de kurstatine dans le surnageant d'environ un facteur 18, à 24 heures de culture en milieu LB. Cette expérience montre l'effet positif de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstatine dans le surnageant en condition de culture en milieu liquide. 1.8. Effet de l'introduction d'une séquence terminatrice termcrylAc en aval du gène 25 krsD La séquence termcrylAc a été introduite dans différentes souches Bt selon l'invention afin d'étudier l'effet propre à cette séquence sur la production de kurstakine dans le milieu de culture. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. 3047011 31 Tableau 4 Production de kurstakine en milieu AK après 24h de culture Souches utilisées pg/I DO 600 nm a. HD73 Cry- ::STAB SD ::Term-crylAC 1008 5,45 b. HD73 Cry- AspoOA krs ::STAB SD krsD ::TermcrylAC 2369 4,65 c. HD73 Cry- Aspo0A krs ::STAB SD pHT 315-pxylnkrsE-sfp-krsD 546 3,67 d. HD73 Cry- AspoOA krs ::STAB SD pHT 1618 T-pxyl ÛKrsE 781 4,07 e. HD73 0 5,04 f. HD73 Cry- 0 4,87 Ces expériences permettent une comparaison relative de la production de kurstakine dans le milieu de culture. Elles mettent en évidence le fait que les souches qui produisent le plus de 5 kurstakine comportent la séquence termcrylAc (a. et b.). Ce résultat est surprenant du fait ces souches sont meilleures productrices que la souche qui surexprime KrsE (e.) alors même que les inventeurs ont montré par ailleurs que la surexpression de KrsE est déterminante pour une bonne excrétion du lipopeptide dans le surnageant. Ces données mettent donc en évidence que l'introduction de la séquence termcrylAc est une modification génétique particulièrement 10 intéressante pour augmenter la production protéique. 2. Tests d'activités biologiques de la kurstakine Comme décrit dans la partie synthèse bibliographique, les lipopeptides de Bacillus possèdent une variété importante d'activités industriellement valorisables (antibactérienne, antifongique, surfactant...). A ce jour, une seule activité antifongique a été démontrée chez la kurstakine, contre 15 la seule souche Stachybrotris chartarum. Le but de cette partie est d'évaluer les activités biologiques de la kurstakine, notamment en tant qu'antifongique et antibactérien. 2.1. Test d'activité antifongique Afin de déterminer le potentiel d'utilisation de la kurstakine en phytoprotection, des tests d'activité antifongique sont réalisés à partir d'extraits purifiés en kurstakine. Chaque souche de 20 moisissure sur laquelle l'effet de la kurstakine est testé est cultivée en milieu PDA à partir du centre de la boite de Pétri, et l'inoculum est entouré de disques contenant respectivement 25, 50 et 100pg de kurstakine. L'activité antifongique est évaluée par l'inhibition de la croissance des moisissures testées autour des disques contenant le lipopeptide. 3047011 32 La souche Rhizoctonia solanii a pu se développer sur toute la surface de milieu gélose PDA, en recouvrant également les disques imbibés d'extrait de lipopeptide (Figure 20A). La kurstakine n'a donc aucun effet antagoniste sur la croissance de la souche. Comme pour Rhizoctonia solanii, la souche Fusarium oxysporum a pu croître sur toute la surface 5 de la boite de Pétri et a recouvert les disques d'extrait de kurstakine (Figure 20B). Celle-ci n'a donc pas d'effet antagoniste contre F. oxysporum aux concentrations testées. La souche Galoctomyces geotrichurn n'a pas colonisé toute la surface de la boite de Pétri. Trois jours après le dépôt de la moisissure, sa croissance a atteint le disque témoin et a commencé à le recouvrir. En revanche, un halo d'inhibition de croissance est visible autour de tous les disques 10 contenant de la kurstakine. Après 5 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, mais n'a pas recouvert les disques contenant l'extrait de lipopeptide. De plus, une inhibition de croissance est visible du côté des disques opposés au centre (Figure 21A). La kurstakine possède donc un effet antifongique sur la souche Galoctomyces geotrichum. La kurstakine est aussi active contre la souche Botrytis cinerea. En effet, après 5 jours de culture, 15 un halo d'inhibition est visible autour des disques contenant de la kurstakine. Après 7 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, tandis qu'un halo d'inhibition de croissance d'un diamètre d'environ 1,5cm est visible autour des disques contenant du lipopeptide, et ce à toutes les concentrations testées (Figure 21B). 20 REVENDICATIONS1. Souche bactérienne génétiquement modifiée exprimant la kurstakine caractérisée en ce qu'elle n'exprime pas de toxine Cry et qu'elle comprend un stabilisateur d'ARMm STAB-SD introduit en amont du gène krsE. 2. Souche selon la revendication 1 dans laquelle le promoteur endogène de l'opéron kurstatine est remplacé par le promoteur du gène cry3A et une séquence terminatrice termcrylAc est introduite en aval du gène krsD. 3. Souche selon l'une des revendications 1 ou 2 dans laquelle le gène spo0A est inactivé. 4. Souche selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le gène krsE est surexprimé. 5. Souche selon la revendication 4 dans laquelle les gènes sfp et krsD sont surexprimés. 6. Souche selon l'une des revendications précédentes correspondant à une souche Bacillus th uringiensis. 7. Souche selon la revendication 6, choisie parmi Bt HD-1, Bt I-ID-73 et Bt 407. 8. Utilisation d'une souche telle que définie à l'une des revendications 1 à 7 pour la production de kurstakine. 9. Procédé de production de kurstakine caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche bactérienne génétiquement modifiée telle que définie à l'une des revendications 4 à 7 en milieu liquide et à récupérer la kurstakine dans le surnageant. 10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel ladite souche est cultivée dans un milieu AK. 11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10 comprenant en outre une étape d'extraction en continu par microfiltration. 12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel la kurstakine ainsi obtenue est conservée dans un milieu dont le pH est inférieur à 4, de préférence inférieur ou égal à 2. 13. Utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique à l'encontre des souches Golactomyces geotrichum et Botrytis cinerea. 14. Utilisation de la kurstakine en tant que biosurfactant pour améliorer la dispersion de souches de Bacillus thuringiensis utilisées comme biopesticide.