FR 3045043 A1 20170616 FR 1562167 A 20151211 1 STÉRÉO-ISOMÈRE DE CONFIGURATION DU FLOCOUMAFÈNE, COMPOSITION ET APPÂT RODONTICIDE LE COMPRENANT, PROCÉDÉ DE LUTTE CONTRE DES RONGEURS CIBLES NUISIBLES L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration du flocoumafène, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un tel stéréo-isomère de configuration du flocoumafène. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre des populations de rongeurs cibles nuisibles. Il est connu d'utiliser des poisons sous forme d'appâts rodonticides contre des rongeurs cibles nuisibles. On connait de W02005/072524 un appât rodonticide comprenant une proportion de flocoumafène de 50 ppm dans l'appât et une proportion de fipronil de 40 ppm. Un tel appât est susceptible d'être consommé par des animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation peut induire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou chez ces humains un empoisonnement qui peut être létal. En outre, une fraction du flocoumafène de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs ou charognards de rongeurs nuisibles et notamment de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât 25 rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entraîner à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration du flocoumafène, une composition 30 et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps 3045043 2 efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles -notamment des animaux domestiques ou d'élevage, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide. 5 L'invention vise aussi à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration du flocoumafène, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont en même temps efficaces pour contrôler les populations de rongeurs cibles nuisibles et qui 10 permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement secondaire d'animaux -par exemple de renards ou d'oiseaux- sauvages prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou d'animaux sauvages charognards de cadavres de rongeurs cibles nuisibles empoisonnés. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de 15 configuration du flocoumafène, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en oeuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-. 20 L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration du flocoumafène, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui respectent l'environnement, la santé humaine et les animaux non cibles -notamment les oiseaux, et en particulier les rapaces-. L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration du flocoumafène, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention vise donc aussi à proposer une alternative à des 3045043 3 substances et appâts rodonticides connus. Pour ce faire, l'invention concerne un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E2, du flocoumafène, ledit énantiomère E2 présentant, par analyse chromatographique d'une composition de flocoumafène 5 comprenant quatre stéréo-isomères de configuration du flocoumafène effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t2 de valeur telle que t1 382,1 et m/z 541,1 -> 161 correspondants au signal du flocoumafène. Les valeurs des temps de rétention de chacun des 5 énantiomères du flocoumafène sont, dans les conditions décrites, de : - t1 = 4,5 min pour l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,4 ; - t2 = 6,2 min pour ledit énantiomère E2 selon l'invention ; - t3 = 6,8 min pour ledit énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D2,3, et ; - t4 = 9,3 min pour l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D1,4. 10 Les valeurs des temps de rétention t1, t2, t3 et t4 sont susceptibles de varier, notamment avec la température de la colonne de chromatographie. Cependant, dans ces conditions chromatographiques, l'ordre d'élution des énantiomères du flocoumafène reste inchangé. À titre indicatif, la valeur du temps de rétention (t1) de l'énantiomère El dudit diastéréoisomère D1,4 15 peut varier entre 4,4 min et 4,6 min. La valeur du temps de rétention (t2) de l'énantiomère E2 dudit diastéréoisomère D2,3 peut varier entre 5,9 min et 6,4 min. La valeur du temps de rétention (t3) de l'énantiomère E3 dudit diastéréoisomère D2,3 peut varier entre 6,4 min et 6,9 min. La valeur du temps de rétention (t4) dudit énantiomère E4 selon l'invention peut varier entre 8,9 min et 9,4 min. 20 Extraction du flocoumafène de foies de rats gavés avec du flocoumafène Homogénéisation de l'échantillon de foie On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL On ajoute 25 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur/disperseur Ultra-Turrax® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation 30 par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On 3045043 27 soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C de façon à former un extrait sec. Élimination des lipides Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL 5 d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé des lipides est séché sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous 10 vortex. Extraction du flocoumafène sur phase solide (« SPE, Solid Phase Extraction ») On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH2Ct2), puis 1 mL de méthanol (CH3OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une 15 cartouche Oasis HLB 1cc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (1mL Me0H/H20 Milli-Q) et contenant le flocoumafène en tête de la cartouche préalablement conditionnée. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de 20 méthanol (CH3OH) et d'eau ultra-pure (H2O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH2C 12) et de méthanol (CH3OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant le 25 flocoumafène. On évapore le solvant de l'éluat sous un flux d'azote (N2) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans 0,5 mL d'acétonitrile (NC-CH3) et on filtre la solution d'acétonitrile contenant le flocoumafène sur filtre de porosité 0,2 ium. 3045043 28 Rémanence hépatique des stéréo-isomères de configuration du flocoumafène chez le rat On administre par voie orale (« peros ») à des rats de laboratoire (rats Sprague Dawley, Charles River, Saint germain sur l'Arbresle, 5 France) mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant entre 180 et 200 g, une solution comprenant du flocoumafène dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 % de façon que la quantité de flocoumafène ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 2,3 mg par kilogramme de rat. Les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine 10 K1 à raison de 1U par rat de façon à maintenir les rats en vie tout au long de l'expérience. Le rapport de la somme des quantités dudit énantiomère E2 et dudit énantiomère E3 (diastéréoisomère D2,3) sur la quantité de flocoumafène dans la solution de gavage est de 59% et le rapport de la somme des quantités dudit énantiomère El et dudit énantiomère E4 (diastéréoisomère D1,4) sur la quantité de 15 flocoumafène dans la solution de gavage est de 41%. À 1 jour (J+1), 3 jours (J+3) et 7 jours (J+7) après le gavage, on euthanasie 3 rats mâles et 3 rats femelles préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait du foie et on dose les quantités de chacun des stéréo-isomères de configuration du 20 flocoumafène présents dans le foie des rats mâles et femelles gavés. Les résultats obtenus sur les rats mâles sont donnés au tableau 1 ci-après et les résultats obtenus sur les rats femelles sont donnés au tableau 2 ci-après dans lesquels les valeurs de la concentration de chacun des stéréo-isomères de configuration du flocoumafène dans le foie sont la moyenne des valeurs mesurées sur 3 rats et 25 exprimées en nanogramme (ng) par gramme de foie. Concentration hépatique, ng/g J+1 J+3 J+7 Énantiomère El 196 47 0 Énantiomère E2 3904 1962 319 Énantiomère E3 3301 1862 647 Énantiomère E4 8143 9906 2623 Tableau 1 (rats mâles) 3045043 29 Concentration hépatique, ng/g J+1 J+3 J+7 Énantiomère Ei 4585 2692 1196 Énantiomère E2 5396 2522 469 Énantiomère E3 5478 2734 1228 Énantiomère E4 10342 7765 5054 Tableau 2 (rats femelles) La figure 2 représente l'évolution du pourcentage de la quantité massique de chaque énantiomère (E1 et E4) du diastéréoisomère D1,4 et de chaque énantiomère (E2 et E3) du diastéréoisomère D2,3 par rapport à la 5 quantité de flocoumafène retenue dans le foie des rats (mâles et femelles) gavés et euthanasiés à J+1, J+3 et J+7. Le pourcentage dudit énantiomère E1 est représenté par des colonnes à hachures obliques, le pourcentage dudit énantiomère E4 est représenté par des colonnes à hachures horizontales, le pourcentage dudit énantiomère E2 est représenté par des colonnes noires et le 10 pourcentage dudit énantiomère E3 est représenté par des colonnes blanches. Les proportions respectives de chacun des énantiomères (E1 et E4) du diastéréoisomère D1,4 et des énantiomères (E2 et E3) du diastéréoisomère D2,3 dans le flocoumafène de la composition de gavage sont représentées en colonne « X » figure 2 et sont de 20,5% pour l'énantiomère El, de 20,5% pour 15 l'énantiomères E4, de 29,5% pour l'énantiomère E2 du diastéréoisomère D2,3 et de 29,5% pour l'énantiomère E3 du diastéréoisomère D2,3. La rémanence dudit énantiomère E2 dans le foie des rats mâles et femelles est inférieure à la rémanence de l'énantiomère E4 dudit diastéréoisomère D1,4 et inférieure à la rémanence du flocoumafène dans le foie 20 des rats. Ledit énantiomère E2 du flocoumafène est donc susceptible de pouvoir être utilisé à titre de substance rodonticide présentant une toxicité réduite pour l' environnement. Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât 25 rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets 3045043 30 à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât rodonticide que dans les modes de mise en oeuvre du procédé. REVENDICATIONS1/ - Stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E2, du flocoumafène, ledit énantiomère E2 présentant, par analyse chromatographique d'une composition de flocoumafène comprenant quatre stéréo-isomères de configuration du flocoumafène effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention t2 de valeur telle que t1