FR 3046907 A1 20170728 FR 1600099 A 20160121 "AGENT ANTIFONGIQUE, PROCEDE ET COMPOSITION " [0001] L'invention concerne un nouvel agent antifongique et son utilisation à l'encontre de tout type de phytopathogènes. [0002] L'invention concerne également le procédé de fabrication d'une substance antifongique comportant au moins cet agent, ainsi qu'une composition fongicide destinée à être utilisée en phytoprotection. [0003] La présente invention concerne le domaine technique des antifongiques destinés à être utilisés pour protéger les cultures. [0004] On connait des fongicides issus de molécules de synthèse tels que le mancozèbe ou le tébuconazole, actifs à l'encontre de la tavelure du pommier et du mildiou de la vigne. [0005] Il existe également des produits fongicides d'origine naturelle, par exemple d'origine minérale. Il s'agit notamment de dérivés de cuivre (hydroxyde de cuivre, sulfate de cuivre), de dérivés de soufre (soufre micronisé) et de bicarbonate de potassium. Mais ces produits présentent une toxicité non négligeable et présentent également une forte rémanence dans l'environnement. C'est notamment le cas du cuivre qui n'est pas dégradé. [0006] Tous ces produits, de synthèse ou d'origine naturelle, peuvent engendrer par ailleurs des phénomènes de résistance des nuisibles. [0007] Avec la prise de conscience de l'impact environnemental et sanitaire des pesticides et l'apparition de phénomènes de résistance face à ces produits, les 30 exigences réglementaires européennes pour l'utilisation des pesticides sont de plus en plus drastiques. Certains produits de synthèse ou fongicides d'origine minérale sont ou devront être dans un futur proche, retirés du marché. 3046907 2 [0008] Pour répondre à ces contraintes réglementaires il est donc nécessaire de développer de nouveaux types de produits de protection des cultures tels que des bio-pesticides, des produits d'origines naturelles à base de microorganismes et de molécules naturelles, d'origines végétale, animale ou microbienne, moins 5 rémanents et ayant à priori un impact réduit sur l'environnement. Ces besoins existent notamment pour les compositions antifongiques utilisables en protection des cultures. [0009] En outre, pour certaines maladies, par exemple certaines monilioses, 10 les produits de synthèse existants ne sont pas suffisamment efficaces et il n'existe pas de produit d'origine naturelle homologué. [0010] L'invention vise ainsi un fongicide d'origine naturelle présentant une efficacité suffisante sur les cultures pour pouvoir soit se substituer aux fongicides 15 actuellement utilisés, soit présenter une efficacité suffisante à l'encontre des maladies actuellement dépourvues de traitement efficace. [0011] À cet effet, l'invention porte essentiellement sur l'utilisation du composé 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou de l'un de ses dérivés comme agent antifongique. 20 [0012] L'utilisation de l'invention peut également comporter les caractéristiques optionnelles suivantes considérées isolément ou selon toutes les combinaisons possibles : on utilise, en plus du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou de l'un de ses dérivés un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30E14206 25 comme agent antifongique, le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206 présente un spectre de masse en ESI+ selon la figure 5, un spectre de masse en ESI- selon la figure 6, un spectre de ms2 en ESI+ selon la figure 7 et un spectre de ms2 en ESI- selon la figure 8, 3046907 3 - le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H4206 sont purs ou en mélange, et sont synthétisés ou extraits de plantes, 5 - le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H4206 sont extraits de plantes de la famille des Astéracées, par exemple du genre Dittrichia. 10 [0013] L'invention porte également sur l'utilisation d'un extrait d'une plante du genre Dittrichia comme agent antifongique. [0014] Avantageusement, la plante du genre Dittrichia est Dittrichia viscosa. 15 [0015] Plus avantageusement, l'extrait de la plante du genre Dittrichia est utilisé comme agent antifongique en traitement pré ou post-récolte sur zones agricoles, par exemple en traitement préventif, antigerminatif ou curatif sur semences, en viticulture, arboriculture ou maraichage, ou en traitement sur zone non agricole. 20 [0016] En outre, l'extrait de la plante du genre Dittrichia peut être utilisé comme agent antifongique à l'encontre de tout organisme phytopathogène tel que Basidiomycètes, Oomycètes, Ascomycètes et Deutéromycètes. 25 [0017] L'invention porte aussi sur une substance biofongicide qui est essentiellement caractérisée en ce qu'elle comporte du 12-carboxyeudesma3,11(13)-diène ou l'un de ses dérivés. [0018] Avantageusement, la substance biofongicide de l'invention comprend 30 en outre un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H4206. [0019] Plus avantageusement, la substance biofongicide de l'invention est issue d'un extrait de la plante du genre Dittrichia, par exemple Dittrichia viscosa qui comprend au moins du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène ou l'un de ses dérivés. 3046907 4 [0020] L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'une telle substance qui est caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape d'extraction d'une plante avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, 5 les éthers, les solvants chlorés, les alcanes hydrocarbonés et tout mélange de deux ou plus des solvants cités ou par extraction sous fluide supercritique combinée ou non avec un co-solvant. [0021] Avantageusement, la plante est du genre Dittrichia, par exemple 10 Dittrichia viscosa. [0022] L'invention porte en outre sur une composition biofongicide qui est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la substance fongicide telle que précédemment décrite et se présente sous forme de granulés dispersibles, de 15 liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables. [0023] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description qui en est donnée ci-dessous, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux figures annexées parmi lesquelles : 20 - la figure 1 représente le spectre de masse ESI+ du composé majoritaire d'une première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène, - la figure 2 représente le spectre de masse ESI- du composé majoritaire de la 25 première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène, - la figure 3 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI+ de la figure 1 du composé majoritaire de la première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 1230 carboxyeudesma-3,11(13)-diène, 3046907 5 - la figure 4 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESIde la figure 2 du composé majoritaire de la première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12- carboxyeudesma-3,11(13)-diène, 5 - la figure 5 représente le spectre de masse ESI+ du composé majoritaire d'une seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire d'un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206, 10 - la figure 6 représente le spectre de masse ESI- du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30114206, - la figure 7 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse 15 ESI+ de la figure 5 du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30114206, - la figure 8 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESIde la figure 6 du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un 20 extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206, - la figure 9 présente l'efficacité d'un extrait brut de Dittrichia viscosa et d'une première et seconde fraction particulièrement active de cet extrait pour des concentrations de 25 et 50 ppm sur l'inhibition de la croissance mycélienne, 25 - la figure 10 présente la répartition de l'incidence de la moniliose pour des nectarines témoins et traitées avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12- carboxyeudesma-3,11(13)-diène et en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206, 3046907 6 - la figure 11 présente l'incidence et la sévérité moyenne observées sur le mildiou de la vigne (Plasmopara viticola) sans traitement, traité avec du cuivre, et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206, 5 - la figure 12 présente l'incidence et la sévérité moyenne observées sur l'oïdium de la vigne (Erysiphe necator) sans traitement, traité avec du cuivre, et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206, - la figure 13 présente l'incidence moyenne observée sur la tavelure du pommier 10 sans traitement et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12- carboxyeudesnm-3,11(13)-diène et en composé terpénique de masse 498 et de - formule brute C301-14206. [0024] La substance biofongicide de l'invention comprend au moins un acide sesquiterpénique de type 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène, autrement 15 dénommé acide eudesma-3,11(13)-diène-12-oïque ou l'un de ses dérivés. On citera comme dérivés à titre d'exemple, les dérivés déshydrogénés, les dérivés méthylés, acétylés et les isomères. 10025] Le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène est identifié chez certaines 20 Lauracées du genre Nectandra sp. et chez un certain nombre de genres de la famille des Asteracées. Il a en effet été isolé d'extraits organiques de plantes des genres Cheirolophus sp., Cratystylis sp., Ophryosporus sp., Artemisia sp. ou encore Dittrichia sp. Des publications plus récentes font état de l'activité phytotoxique, antileishmanienne, anthelminthique et ichthyotoxique du 12- 25 carboxyeudesma-3,11(13)-diène, isolé d'extraits de Dittrichia viscosa ou D. graveolens. [0026] L'activité antibactérienne de l'huile essentielle de Dittrichia viscosa a en outre été observée, sans que cette activité ne soit attribuée à la présence de 30 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène. Par ailleurs, ces essais ont été menés essentiellement sur des souches fongiques et bactériennes humaines ou du sol. 3046907 7 Une publication précise l'activité antimicrobienne du 12-carboxyeudesma-3,11(13)- diène isolé de Dittrichia viscosa (Shtacher et al., 1970). Cependant, l'activité revendiquée concerne essentiellement les dermatophytes. 5 [0027] Ainsi, l'activité antifongique du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène vis- à-vis des phytopathogènes n'a, à la connaissance des inventeurs, jamais été caractérisée ni publiée. [0028] La substance de l'invention comporte en outre avantageusement un 10 second composé actif qui est un composé terpénique de formule C30H4206 et de masse 498 qui n'a jusqu'à présent, à la connaissance des inventeurs, jamais été identifié ni associé à une quelconque activité antimicrobienne ou antifongique dans des extraits de végétaux. 15 [0029] La présente invention concerne donc l'utilisation de ces deux molécules, le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et un composé terpénique de formule C30H4206 qui peuvent être purs ou en mélanges, comme agent antifongique, c'est-à-dire actif à l'encontre des champignons pathogènes, utilisable en protection des cultures. À titre d'exemple, un extrait de la plante du genre 20 Dittrichia pourra être utilisé à cette fin. [0030] La substance de l'invention peut être synthétisée ou issu d'extraits végétaux bruts ou purifiés. Ces extraits peuvent être des extraits cellulaires ou extracellulaires de toutes plantes entières ou de parties de plantes telles que les 25 racines, les tiges, les feuilles, les fruits, les fleurs ou tout mélange d'au moins deux de ces parties, pouvant être préparés selon toute méthode d'extraction des végétaux connues de l'homme du métier. Les parties des plantes extraites peuvent se présenter sous forme fraiche ou sèche, entière ou broyée. Les extraits utilisés peuvent notamment être obtenus par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, 30 les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés ou n'importe quel mélange de deux ou plusieurs de ces solvants. À titre d'exemple concernant les méthodes d'extraction, on peut citer les méthodes d'extraction usuelles utilisant des solvants à chaud ou à froid telles que la macération, la lixiviation, la cryoextraction, la digestion, la décoction, l'extraction par fluide 3046907 8 supercritique combiné ou non avec un co-solvant, ainsi que les extractions utilisant un rayonnement ondulatoire tels que les micro-ondes ou les ultrasons. [0031] Dans le cas d'une extraction par solvant, on pourra par exemple 5 procéder comme suit : les parties de la plante sélectionnée sont récoltées puis broyées sous forme fraiche ou sèche. Elles sont laissées à macérer, de préférence sous agitation ou ultrasons pendant 15 minutes à 1 mois. De façon avantageuse, on utilisera un rapport massique partie broyat sur solvant compris entre 1/1 et 1/10. À cette étape d'extraction peuvent s'ajouter des étapes de purification, 10 fractionnement, filtration, concentration et/ou séchage. [0032] Le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et le composé terpénique de - formule C301-14206 peuvent aussi être obtenus par synthèse. À titre d'exemple, l'une 15 des voies de synthèse envisageable pour le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène pourrait être celle décrite par Chen et al (Enantioselective total synthesis of eudesma-3,11(13)-dieu-12-oic acid, Chen, Yonggang; Zhou, Gang; Liu, Lijun; Xiong, Zhaoming; Li, Yulin, From Synthesis (2001), (9), 1305-1307), impliquant une synthèse chimique en 10 étapes à partir de (+)- dihydrocarvone. 20 [0033] L'activité antifongique recherchée peut être de nature fongistatique ou fongicide. La préparation peut être appliquée en traitement antigerminatif, préventif ou curatif sur tout type de champignons pathogènes des plantes comprenant notamment ceux de la famille des Ascomycètes, des Basidiomycètes, des 25 Deuteromycètes et Oomycètes. A titre d'exemple concernant les cibles potentielles de telles préparations, on peut citer sans aucun caractère limitatif, les agents de rouilles (Albugo sp., Puccinia sp., Melapsora sp., Melampsorella sp., Gymnosporangium sp., Cronartium sp...), de septoriose (Septoria sp., Mycosphaerella sp...), fusariose (Fusarium sp., Gibberella sp...), phoma (Phoma 30 sp.) de pourriture grise (Botrytis cinerea), de monilioses (Monilinia sp.), des mildious (Plasmopara sp. , Phytophtora sp., Bremia sp., Peronospora sp.) des oïdiums (Podosphaera sp., Erysiphe sp., Blumeria sp), chancres (Neonectria sp., 3046907 9 Cryphonectria sp.), galles (Synchytrium sp.) et tavelures (Venturia sp., Fusicladium sp.). [0034] Les extraits comportant du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et le 5 composé terpénique de formule C301-14206, ou les molécules seules, purifiées ou synthétisées pourront être intégrés dans une préparation finale qui peut se présenter sous forme de liquides plus ou moins concentrés, de granulés dispersibles, d'émulsion ou tout autre type de préparation connue par l'homme du métier. A ces préparations pourront être ajoutés différents adjuvants ou formulants 10 permettant par exemple une meilleure pénétration et stabilisation de l'extrait. [0035] On citera à titre d'exemple comme adjuvants la paraffine et ses dérivés, les polymères d'hydrocarbures, les huiles végétales telles que l'huile de - colza, les huiles minérales, les résines, les dérivés de triglycérides, les oligomères 15 terpéniques, le diméthyl polysiloxane, les alcools terpéniques, l'alcool - polyvinylique, les polymères d'amines gras, ou tout autre adjuvant ou formulant homologué pour leurs utilisations dans des bouillies fongicides. [0036] Selon un mode de réalisation non limitatif, ces deux molécules sont 20 issues d'un extrait végétal de Dittrichia viscosa également dénommé Inule visqueuse. Ces deux molécules pourront également être issues d'un extrait végétal d'une autre espèce de plante du genre Dittrichia. Dans l'exemple qui suit, ces deux molécules actives ont été identifiées dans l'extrait de Dittrichia viscosa au moyen d'un fractionnement bio-guidé. 25 Préparation de l'extrait brut de Dittrichia viscosa et identification des métabolites marqueurs d'activité [0037] Les parties aériennes de Dittrichia viscosa ont été récoltées en juin 30 2012 dans différentes zones en friche et jachère de Perpignan, en France, dans les Pyrénées orientales. [0038] L'extraction par macération assistée aux ultrasons de 100 g de plante sèche de Dittrichia viscosa dans 3 x 1L d'éthanol a permis d'obtenir 13 g de résidu 3046907 10 sec. L'extrait brut de Dittrichia viscosa obtenu se présente sous la forme d'une cire verte visqueuse à température ambiante. [0039] Les analyses HPLC sont réalisées sur un appareillage Agilent 5 Technologies équipé d'un détecteur à barrette de diode et connecté à un spectromètre de masse MAT LCQ connecté à une trappe d'ions. Une colonne kinetex greffée en C18 est utilisée. 10 pl d'échantillon sont injectés dans la colonne avec une détection UV entre 200 et 600 nm, en ciblant particulièrement les longueurs d'onde 210, 254 et 280 nm. Le solvant d'élution est un gradient de 10 méthanol dans l'eau contenant 0,1% d'acide formique. [0040] Les familles de composés majoritaires retrouvées dans l'extrait brut sont des flavonoides aglycones et des terpènes, notamment des sesquiterpènes. Il - est procédé à une identification des composés majoritaires. 15 [0041] L'extrait brut est fractionné sur des systèmes de flash chromatographie et chromatographie semi-préparative en phase inverse en utilisant comme phase stationnaire de la silice greffée en C18. Le macérât alcoolique des parties aériennes de Dittrichia viscosa est fractionné sur flash chromatographie en phase 20 inverse avec un solvant d'élution constitué d'un gradient de méthanol dans l'eau. Ce partage permet de récupérer deux fractions. [0042] En référence à la figure 9, la première fraction 1 et la seconde fraction 2 sont testées in vitro sur des souches de Monilinia taxa pour deux concentrations 25 respectivement de 25 et 50 ppm et comparées à l'extrait brut 3. On constate que l'inhibition de la croissance mycélienne la plus forte est obtenue avec la seconde fraction 2. Des tests similaires sont également menés in vivo sur Plasmopara viticole et Venturia inaequalis et les résultats montrent également une activité plus importante de la seconde fraction 2. 30 [0043] Cette seconde fraction 2 la plus active est sous-fractionnée sur flash chromatographie avec un solvant d'élution constitué d'un gradient de méthanol dans l'eau. Ce partage permet de récupérer 8 sous fractions. Une première sous fraction plus active F2.1 est ensuite sous-fractionnée sur flash chromatographie en 6 sous-fractions. 3046907 11 [0044] En référence au Tableau 1 ci-dessous, parmi les six sous fractions obtenues, trois sous fractions F 2.1.3, F2.1.4 et F2.1.5 sont les plus actives sur Plasmopara viticola et Venturia inaequalis avec des CMI (Concentrations 5 Minimales Inhibitrices) en comparaison avec l'extrait brut. Les CMI obtenues pour ces trois extraits à l'encontre du mildiou de la vigne sont comprises entre 16 et 63 ppm alors que la CMI de l'extrait brut est dans ce cas de 250 ppm. En ce qui concerne la tavelure du pommier, les CMI des fractions F.2.1.3 et F 2.1.4. sont de 63 ppm pour une CMI de l'extrait brut de 158 ppm. 10 Fractions Plasmopara viticola Venturia inaequalis (mildiou de la vigne) (tavelure du pommier) F.2.1.3 63 63 F.2.1.4 63 63 F.2.1.5 16 500 Extrait 250 158 brut Tableau 1 : Concentrations Minimales Inhibitrices exprimées en dag/ml in vitro de trois sous fractions d'un extrait de Dittrichia viscosa 15 [0045] Ces résultats montrent deux choses. En premier lieu, les CMI obtenues pour l'extrait brut de Dittrichia viscosa sont suffisamment basses pour mettre en évidence l'efficacité fongicide de cet extrait. En outre, les trois fractions F 2.1.3, F 2.1.4 et F 2.1.5 présentent une activité particulièrement importante à l'encontre du mildiou de la vigne et de la tavelure du pommier. Il convient alors 20 d'identifier les substances actives présentes dans ces trois fractions. [0046] L'élucidation structurale des composés majoritaires des trois sous fractions actives F 2.1.3, F.2.1.4 et F.2.1.5 a été établie par l'interprétation des données de spectrométrie de masse et de RMN 1D et 2D et par spectrométrie de 25 masse à haute résolution pour la fraction F 2.1.5. L'appareillage de RMN utilisé est un Bruker BioSpin. Les spectres RMN 1H, 13C, DEPT 135, HMBC et HSQC ont été traités avec le logiciel Mestrenova. 3046907 12 [0047] Les figures 1 et 3 présentent respectivement les spectres de masse en ESI+ et le spectre de ms2 correspondant de la sous fraction active F.2.1.4. et les figures 2 et 4 présentent respectivement les spectres de masse en ESI- et le 5 spectre de ms2 correspondant de cette sous fraction active F.2.1.4. [0048] Il est identifié à partir des spectres de masse des figures 1 à 4 et des spectres de RMN la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène dans la sous fraction active F.2.1.4. 10 [0049] Les figures 5 et 7 présentent respectivement les spectres de masse en ESI+ et le spectre de ms2 correspondant de la sous fraction active F.2.1.5. et les figures 6 et 8 présentent respectivement les spectres de masse en ES1- et le spectre de ms2 correspondant de cette sous fraction active F.2.1.5. 15 [0050] Ces spectres de masse des figures 5 à 8 correspondent à un composé de formule brute C30H4206 et de masse 498 (m/z 497,2903 en ESI-) présent majoritairement dans la sous fraction active F.2.1.5 . 20 [0051] Enfin, le composé majoritaire de la sous fraction F 2.1.3. a été identifié comme étant un dérivé déshydrogéné du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène. [0052] Il a ainsi été identifié que le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et ses dérivés, ainsi que le composé de formule brute C30H4206 et de masse 498, sont 25 des composés actifs antifongiques d'un extrait brut de Dittrichia viscosa. C'est particulièrement le cas pour le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène qui présente une efficacité homogène à l'encontre du mildiou de la vigne et de la tavelure du pommier. 30 3046 90 7 13 Caractérisation de l'activité antifongique d'extraits de Dittrichia viscosa comportant du 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénique de formule C301-I4206 5 [0053] Un extrait brut de Dittrichia viscosa est préparé par extraction par macération assistée aux ultrasons de cette plante sèche dans de l'éthanol tel que précédemment décrit. [0054] Les tests antifongiques in vitro sont réalisés par contact de l'extrait brut 10 sur les souches suivantes : - Penicillium expansum - Botrytis cinerea, Botrytis &Ill - Monilinia laxa, Monilinia fructigena 15 [0055] Les tests sont effectués dans des microplaques 12 puits, avec 3 répétitions par modalité. Un disque mycélien de 6 mm de diamètre issu d'une culture sur milieu malt agar âgée de 10 jours a été déposé sur 2 ml de milieu gélosé contenant 1% d'extrait éthanolique. Après incubation 1 à 3 jours à 23°C la lecture de la taille du halo mycélien permet de déterminer le taux d'inhibition de la 20 croissance par rapport au contrôle. [0056] Le Tableau 2 ci-dessous présente les concentrations inhibitrices médiane (CI50) obtenues sur les différentes souches lors des essais in vitro de l'extrait brut de Dittrichia viscosa sur la croissance mycélienne. L'extrait est actif 25 sur toutes les souches testées, et plus particulièrement sur les souches de Botrytis sp. et Monilinia sp. 30 3 04 6 90 7 14 cinerea Botrytis Botrytis Penicillium Monilini Monilinia &Hi expansum a laxa fructigena Temps d'incubation 24h 24h 48h 72h 72h Extrait 400 > CI50 400 > CI50 2000 > C150 25 ppm 25 ppm > de Dittrichia viscosa > 100 > 100 > 1500 > C I5o C150 ppm ppm ppm . .. Tableau 2 : Concentration inhibitrice me iane de I extra sur différentes souches lors d'essais in vitro sur la croissance mycélienne [0057] Des essais ont été menés in vivo sur des mini-plants de vigne 5 (Plasmopara viticola) et de pommier (Venturia inaequalis) selon des protocoles standardisés. Toutes les expérimentations ont été menées avec six répétitions par traitement en utilisant une répartition aléatoire des traitements dans chaque bloc. Les plants ont été traités avec l'extrait brut de Dittrichia viscosa sur l'ensemble des feuilles à l'aide d'un compresseur d'air équipé d'une cabine de pulvérisation 10 assistée par air automatique (environ 20 ml par plante ; 120 kPa à la buse). Les plantes ont ensuite été mises à sécher à température ambiante avant d'être inoculées par les suspensions de spores. [0058] L'inoculum a été préparé à partir de spores de P. viticola et V. 15 inaequalis récupérées sur plantes préalablement infectées. La suspension, préparée immédiatement avant l'inoculation des plantes, a été pulvérisée sur la surface de chaque feuille. Les plants inoculés ont ensuite été maintenus pendant 24 heures dans l'obscurité à 20-21 ° C et en présence d'un taux d'humidité relative de 80-99 %, puis 6 jours à 18-25 ° C en présence d'un taux d'humidité relative de 20 60-80 % et d'une photopériode 16 heures jour/8 heures nuit. Les plantes ont ensuite été incubées pendant une nuit à l'obscurité à 20 ° C et en présence d'un taux d'humidité relative de 80-99 % afin de promouvoir la sporulation. L'incidence de la maladie (nombre, exprimé en pourcentage, de feuilles présentant des symptômes de tache d'huile et/ou de sporulation visible) et la sévérité de la 25 maladie (pourcentage de la surface des feuilles couvert par des spores) ont été évalués. Toutes les évaluations de la maladie ont été faites en se basant sur l'échelle standard OEPP (OEPP , 2004). 3046907 15 [0059] Le Tableau 3 ci-dessous regroupe les efficacités de l'extrait brut de Dittrichia viscosa sur les deux souches testées. L'extrait présente une très bonne activité in vivo sur les deux cibles testées, avec une inhibition comparable à celle du contrôle positif pour des doses de 1000 et 2500 ppm. 5 Efficacité (%) Contrôle cuivre Extrait brut de Dittrichia viscosa (Kocide Opti ®) Concentration PP 300m' 500 ppm 1000 ppm 2500 ppm PPm 30 * Plasmopara viticola 98% 99% 83% 91% non testé Venturia inaequalis 83% 87% non testé 57% 95% Tableau 3 : Efficacité in vivo de l'extrait brut de Dittrichia viscosa sur Plasmopara viticola et Venturia inaequalis 10 [0060] Des essais ont été également été menés en champs sur moniliose de nectarine de variété Nectacrisp (Monilinia fructigena). Toutes les expérimentations ont été menées avec six répétitions par traitement en utilisant une répartition aléatoire des traitements. L'extrait brut de Dittrichia viscosa à 2500 ppm a été 15 appliquée 5 fois durant la saison d'essais, de début Juillet à début Août 2014. L'adjuvant utilisé est un adjuvant commercialisé sous l'appellation Helioterpen® film comportant 910 g/I d'oligomères terpéniques. Cet adjuvant a été introduit dans l'extrait brut de Dittrichia viscosa à hauteur d'une concentration volumique de 0,2%. 20 En référence à la figure 10, le traitement des nectarines avec l'extrait brut de Dittrichia viscosa 4 a permis de diminuer l'incidence de la moniliose au champ de plus de 60% par rapport à un témoin non traité. 25 [0061] Des tests d'activité antifongique avec l'extrait brut de Dittrichia viscosa ont été réalisés en plein champs sur deux maladies cryptogamiques de la vigne : oïdium (Erysiphe necator) et mildiou (Plasmopara viticola). 3046907 16 [0062] Les essais ont été menés sur vigne de cépage Chasselas avec la substance de l'invention (à 2,5g/L). Toutes les expérimentations ont été menées avec 4 réplicas de 6 individus par cultivar en utilisant un dispositif randomisé selon les directives de l'Organisation Européenne et méditerranéenne pour la Protection 5 des Plantes (OEPP) . 16 traitements ont été réalisés entre le début du mois de mai et la fin du mois d'Août. [0063] Les figures 11 et 12 présentent l'incidence Al ,A2 et la sévérité moyenne B1,B2 sur mildiou (figure 11) et oïdium (figure 12) pour un témoin non 10 traité 6,7, la référence cuivre 8,9 et l'extrait brut de Dittrichia viscosa 10,11. [0064] Le traitement des vignes avec l'extrait de Dittrichia viscosa a eu un effet notable sur mildiou et oïdium de la vigne. Il a en effet permis de réduire la _ sévérité du mildiou de la vigne d'environ 60% (sévérité de 18% contre 50% pour le 15 témoin non traité) et a eu un effet comparable à celui de l'hydroxyde de cuivre sur l'incidence de l'oïdium de la vigne, avec une efficacité de plus de 90%. [0065] Enfin, la figure 13 présentent l'incidence moyenne observée sur la tavelure du pommier traitée avec l'extrait brut de Dittrichia viscosa 12 en 20 comparaison avec un témoin non traité 13. On constate également une réduction substantielle de l'incidence lorsque le traitement est effectué avec la substance de REVENDICATIONS1. Utilisation du composé 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou de l'un de ses dérivés comme agent antifongique. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre l'utilisation d'un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30F14206 comme agent antifongique. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206 présente un spectre de - masse en ESI+ selon la figure 5, un spectre de masse en ESI- selon la figure 6, un spectre de ms2 en ESI+ selon la figure 7 et un spectre de ms2 en ESI- selon la figure 8. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que le 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206 sont purs ou en 20 mélange, et sont synthétisés ou extraits de plantes. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le 12- carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C301-14206 sont extraits de plantes de 25 la famille des Astéracées, par exemple du genre Dittrichia. 6. Utilisation d'un extrait d'une plante du genre Dittrichia comme agent antifongique. 30 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la plante du genre Dittrichia est Dittrichia viscosa. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée en ce que l'extrait de la plante du genre Dittrichia est utilisé comme agent antifongique 3046 90 7 18 en traitement pré ou post-récolte sur zones agricoles, par exemple en traitement préventif, antigerminatif ou curatif sur semences, en viticulture, arboriculture ou maraichage, ou en traitement sur zones non agricoles. 5 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'extrait de la plante du genre Dittrichia est utilisé comme agent antifongique à l'encontre de tout organisme phytopathogène, tels que Basidiomycètes, Oomycètes, Ascomycètes et Deutéromycètes. 10 10. Substance biofongicide, caractérisée en ce qu'elle comporte du 12- carboxyeudesma-3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés. 11. Substance biofongicide selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé terpénique de masse 498 et de formule brute 15 C30H42O6- 12. Substance biofongicide selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un extrait de la plante du genre Dittrichia, par exemple Dittrichia viscosa qui comprend au moins du 12-carboxyeudesma- 3,11(13)-diène et/ou l'un de ses dérivés. 13. Procédé de préparation d'une substance biofongicide selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape d'extraction d'une plante avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les solvants chlorés, les alcanes hydrocarbonés et tout mélange de deux ou plus des solvants cités ou par extraction sous fluide supercritique combinée ou non avec un co-solvant. 14. Procédé de préparation selon la revendication 13, caractérisé en ce que la plante est du genre Dittrichia, par exemple Dittrichia viscosa. 15. Composition biofongicide, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins la substance selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 et se présente sous 3046907 19 forme de granulés dispersibles, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables.