FR 3045071 A1 20170616 FR 1563362 A 20151228 1 Méthode prédictive rapide pour caractériser la radiosensibilité d'un patient envers une irradiation avec un rayonnement ionisant Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique, qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques. Etat de la technique Environ 1 à 15% des patients traités par radiothérapie pour un cancer montrent une réaction tissulaire (tel qu'une dermite ou une rectite) qui peut mettre en jeu le bon déroulement du traitement dans la mesure où elle peut conduire le médecin à décider l'arrêt du traitement radiothérapeutique avant la fin du protocole prévu. Par ailleurs, cette réaction tissulaire est un indicateur d'une sensibilité particulièrement élevée du patient au rayonnement ionisant. Ainsi, le traitement radiothérapeutique, même interrompu au moment de l'apparition des premiers signes tissulaires visibles, peut augmenter la morbidité voire la mortalité post-traitement des patients, non seulement parce que le cancer qu'il était censé traiter n'a pas pu être éradiqué complètement dû à l'arrêt prématuré du traitement, mais encore à cause de l'endommagement collatéral des tissus sains induit par le rayonnement lui-même. On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de 3045071 2 dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe 5 à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise en 1981. Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu 10 cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, la radiosensibilité semble découler d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose maximale cumulée qu'un patient donné 15 peut recevoir sans risque. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie. On sait que deux protéines de la famille des kinases, appelées couramment ATM et ATR, 20 sont impliquées dans la détection, la réparation et la signalisation des CDB ; leur action nécessite au moins la présence d'une protéine connue sous la désignation BRCA1 et d'une cascade de phosphorylations ordonnée des différents substrats d'ATM (voir l'article de N. Foray et al., «A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein », paru dans The EMBO Journal vol. 22(11), p. 2860-2871 25 (2003)). L'essai a été entrepris d'utiliser l'enzyme ATM dans un modèle explicatif de la radiosensibilité cellulaire (voir Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiat. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), et cela a permis d'identifier trois types de radiosensibilité : les cellules 30 radiorésistantes (radiosensibilité dite de Groupe I), les cellules modérément radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe II), et les cellules extrêmement radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe III). Cependant, aucun modèle prédictif n'a été proposé sur cette base. De plus Selon notre modèle, le cytoplasme agirait comme un « réservoir » pour des dimères transphosphorylables de la protéine ATM. La protéine se monomérise sous l'action du stress oxydant et c'est sous cette forme monomérique qu'elle serait transportée dans le noyau. 3045071 3 La quasi-totalité des cellules du groupe Il ont un nucleo-shuttling d'ATM absent ou retardé après irradiation. De nombreux documents décrivent les conditions dans lesquelles l'ATM peut contribuer à la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN (Gately et al 5 « Characterization of ATM Expression, Localization, and Associated DNA-dependent Protein Kinase Activity » Molecular biology of the cell 1998 ; Khalil et al « ATM in focus: A damage sensor and cancer target » biodiscovery, 2012 ; Bhatti et al « ATM protein kinase: the linchpin of cellular defenses to stress » cellular and molecular life science, 2011. Khoronenkova et Dianov, « ATM prevents DSB formation by coordinating SSB 10 repair and cell cycle progression » PNAS 2014. Ces derniers documents décrivent donc des voies de réparation mais n'offrent aucune corrélation pour établir un lien avec la clinique. La demande WO 2015 / 121 596 Al décrit une méthode prédictive permettant de caractériser la radiosensibilité et la réaction tissulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant thérapeutique. Plus 15 particulièrement cette méthode inclut l'irradiation d'un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci nucléaires radioinduits sur du tissu conjonctif de type fibroblastique par l'utilisation d'au moins deux marqueurs de détection parmi pH2AX, pATM et MRE11. C'est la seule méthode de l'état de la technique qui permet de quantifier la radiosensibilité individuelle, d'évaluer le risque de réactions tissulaires post- 20 radiothérapie, et qui puisse être employé pour tout patient et tout type de rayonnement ionisant susceptible d'induire des CDB, et qui soit prédictif. Toutefois, l'analyse des focis dans des cellules de type lymphocyte est assez difficile du fait de leur petit noyau et rend cette méthode complexe et chronophage. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive rapide et simple 25 de la radiosensibilité individuelle permettant d'effectuer un criblage des patients et de les orienter si le test est positif vers une méthode plus complète de la radiosensibilité tissulaire et clinique. Objets de l'invention 30 Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE11-dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et 35 notamment à la suite d'un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB. 3045071 4 De plus, les inventeurs ont constaté que la quantité de pATM présente dans le cytoplasme et le noyau d'une cellule est fonction du type cellulaire étudié. Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène, il faut tenir compte, d'une part, de l'état spontané de l'ADN, et, d'autre part, de son état radioinduit. 5 Par ailleurs, après irradiation, il faut tenir compte de la localisation cellulaire de la protéine ATM qui va être directement corrélée à une radiosensibilité. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle. 10 Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur : 1) la détection de l'activité kinase de la protéine ATM cytoplasmique et nucléaire 2) un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines notamment des cellules sanguines; 3) des tests fonctionnels quelle que soit la modalité thérapeutique. Un premier objet de l'invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un 15 échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient, dans lequel procédé: a. on isole des cellules nucléées cibles constituant l'échantillon cellulaire ; b. on irradie ledit échantillon cellulaire avant ou après l'étape a) avec une 20 dose absorbée D d'un rayonnement ionisant, c. on récupère les fractions cytoplasmiques et nucléaires de l'échantillon cellulaire ; d. on détermine sur les fractions cytoplasmiques et/ou nucléaires dudit échantillon cellulaire irradié, soit : 25 dl. la quantité de substrat phosphorylé par la protéine ATM activée à au moins un temps d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, de préférence à au moins un temps d'observation t2 après irradiation avec une dose absorbée D, d2 . l'activité kinase par la quantification du pATM phosphorylée 30 à au moins un temps d'observation t sélectionné parmi t = t1, t2, e. on détermine au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : le grade de sévérité de la réaction tissulaire post- 35 radiothérapie du patient selon la classification CTCAE, en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); 3045071 5 - la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); et où - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de 5 cassures double-brin (CDB) reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50 % des CDB sont réparées dans des fibroblastes témoins issus de patients radiorésistants et le temps au bout duquel 30 % des CDB sont réparées dans des lymphocytes ou 10 lymphoblastes témoins issus de patients radiorésistants; - t3 est une valeur fixe qui représente z fois t2, où z est compris entre 1,1 et 8, et de préférence compris entre 1,2 et 6. Les valeurs de z définies ci-dessus sont valables pour tout type de cellules. 15 Un second objet de l'invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient, dans lequel procédé: a. on isole des cellules nucléées cibles constituant l'échantillon cellulaire ; 20 b. on irradie ledit échantillon cellulaire avant ou après l'étape a) avec une dose absorbée D d'un rayonnement ionisant, c. on récupère les fractions cytoplasmiques et nucléaires de l'échantillon cellulaire ; d2. on détermine sur les fractions cytoplasmiques et/ou nucléaires dudit 25 échantillon cellulaire irradié, l'activité kinase par la quantification du pATM phosphorylée à au moins un temps d'observation t, e. on détermine au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par le grade de sévérité de la réaction tissulaire post-radiothérapie du 30 patient selon la classification CTCAE, en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); 3045071 6 - la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); et où - t est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB 5 reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants. Avantageusement, selon le second objet de l'invention, l'échantillon cellulaire est issu d'une biopsie. Encore plus préférentiellement, selon le second objet de l'invention, les dites-cellules nucléées cibles sont des fibroblastes. 10 Dans un premier mode de réalisation, à l'étape dl la quantité du substrat phosphorylé (PP) par la protéine ATM activée est déterminée par spectrométrie de masse. Avantageusement,: i. on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant, si à un instant d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, et 15 préférentiellement à t2, la relation qP1=',7' qPayto est valable, ii. on considère que l'échantillon est radiosensible, si à un instant d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, et préférentiellement à t2, la relation qPRyto > qP1=',' est valable. où 20 - qPRyto correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction cytoplasmique de l'échantillon cellulaire, - qPPnuc correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction nucléaire de l'échantillon cellulaire, - PP se réfère au peptide phosphorylé par la protéine ATM ou au substrat 25 phosphorylé par la protéine ATM, - NPP se réfère au peptide non phosphorylé par la protéine ATM ou au substrat non phosphorylé par la protéine ATM, - nuc se réfère à la partie nucléaire, - cyto se réfère à la partie cytoplasmique, 30 - et q représente un nombre ou une quantité. 3045071 7 Dans un deuxième mode de réalisation avantageux, la quantité de la protéine pATM activée est détectée dans le cytoplasme et le noyau cellulaire par un test ELISA. Ces deux modes de réalisation sont adaptés à tout type d'échantillon cellulaire, mais de manière avantageuse, l'échantillon cellulaire est choisi parmi : un échantillon sanguin 5 comprenant des lymphocytes, ou des lymphoblastes et un échantillon issu d'une biopsie. Avantageusement, les dites-cellules nucléées cibles sont choisies parmi : des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes. Dans un autre mode de réalisation avantageux, la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des 10 lymphoblastes et des lymphocytes issus de cellules sanguines de la manière suivante : - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM max nuc 0,3 ng par million de cellules, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM max nuc qP1=',', on considère que l'échantillon est radiosensible où - qPRyto correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction cytoplasmique de l'échantillon cellulaire, 10 - qPP,' correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction nucléaire de l'échantillon cellulaire, - PP se réfère au peptide phosphorylé par la protéin e ATM, - nuc à la partie nucléaire, - cyto à la partie cytoplasmique, 15 - et q représente un nombre ou une quantité. La validation analytique d'une dizaine de lignées a été réalisée à chaque fois avec une corrélation établie avec la détermination du statut de radiosensibilité réalisée par 20 immunofluorescence avec les marqueurs H2AX et pATM selon la méthode décrite dans WO 2015 / 121 596 Al. Ces résultats sont rassemblés dans les tableaux 1 et 2. Tableau 1 : Résultats qualitatifs obtenus sur des lymphoblastes par spectrométrie de masse Lignée testée Activité ATM quantitatif mesurée par Radiosensibilité du patient spectrométrie de masse à t1 =5 min à t2 =10 min Témoin GM03798 ciPP ePnuc> cIP PcYt0 radiorésistant ,- - nuc REVENDICATIONS1. Procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient, dans lequel procédé: (a) on isole des cellules nucléées cibles constituant l'échantillon cellulaire ; (b) on irradie ledit échantillon cellulaire avant ou après l'étape (a) avec une dose absorbée D d'un rayonnement ionisant, (c) on récupère les fractions cytoplasmiques et nucléaires de l'échantillon cellulaire ; (d) on détermine sur les fractions cytoplasmiques et/ou nucléaires dudit échantillon cellulaire, soit : (dl) la quantité de substrat phosphorylé par la protéine ATM activée à au moins un temps d'observation t compris entre tl fois 1,2 et t3, de préférence à au moins un temps d'observation t2 après irradiation avec une dose absorbée D, (d2) l'activité kinase par la quantification de pATM phosphorylée à au moins un temps d'observation t sélectionné parmi t= t1, t2 ; (e) on détermine au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : le grade de sévérité de la réaction tissulaire post-radiothérapie du patient selon la classification CTCAE, en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM max nuc (t); et où - tl est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de cassures double-brin (CDB) reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50 % des CDB sont réparées dans des fibroblastes témoins issus de patients radiorésistants et le temps au bout duquel 30 % des CDB sont réparées dans des lymphocytes ou lymphoblastes témoins issus de patients radiorésistants; - t3 est une valeur fixe qui représente z fois t2, où z est compris entre 1,1 et 8, et de préférence compris entre 1,2 et 6. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel à l'étape (dl) la quantité de substrat phosphorylée par la protéine ATM activée est déterminée par spectrométrie de masse. 3045071 31 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel : (i) on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant, si à un instant d'observation t compris entre t1 fois 1,2 et t3, et 5 préférentiellement à t2, la relation qPP,' qPRyto est valable, (ii) on considère que l'échantillon est très radiosensible, si à un instant d'observation t compris entre t1 fois 1,2 et t3, et préférentiellement à t2, la relation qPRyto > qPPn' est valable. où 10 - qPRyto correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction cytoplasmique de l'échantillon cellulaire - qPPn' correspond à la quantité de peptides phosphorylés dans la fraction nucléaire de l'échantillon cellulaire. 15 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la quantité de la protéine pATM activée est détectée dans le cytoplasme et le noyau cellulaire par un test ELISA. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon 20 cellulaire est choisi parmi : un échantillon sanguin comprenant des lymphocytes ou des lymphoblastes et un échantillon issu d'une biopsie. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les dites-cellules nucléées cibles sont choisis parmi : des lymphoblastes, des lymphocytes et 25 des fibroblastes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et des lymphocytes issus de cellules 30 sanguines et dans lequel - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM max nuc 0,3 ng par million de cellules, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM max nuc 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel on détermine le grade de sévérité de la réaction tissulaire post-radiothérapie selon la classification CTCAE selon la formule : grade CTCAE = 5 - 1 In (B x pATMmax nuc 10C A-pATMmax nuc où 5 - pATM max nuc désigne la quantité nucléaire maximale en ng de pATM par million de cellules dans des fibroblastes, A est une constante entière ou décimale qui représente la quantité maximale de pATMmax nuc atteinte pour un échantillon radiorésistant, et qui appartient à l'intervalle [0,25 ,1] ng par million de cellule. - B est une constante d'ajustement entière ou décimale qui appartient à l'intervalle 10 [200 ,300] - C est une constante d'ajustement décimale qui appartient à l'intervalle [0,1, 0,3] et qui correspond à l'inverse d'un nombre de foci pATM. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel on 15 détermine le grade CTCAE du patient à partir de la teneur en pATMmax nuc (exprimée en ng par million de cellules dans des fibroblastes) selon au moins une des relations suivantes : Grades CTCAE pATMmax nuc 0-1 kO,25 2-3 k0,07 et 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la 25 radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie de patient et dans lequel - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM max nuc k 0,25 ng par million de cellules, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM max nuc