FR 3049348 A1 20170929 FR 1652501 A 20160323 1 Procédé de caractérisation d'une particule dans un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est lié à la caractérisation de particules présentes dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par reconstruction holographique. ART ANTERIEUR L'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image, également appelée hologramme, est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons biologiques, en l'occurrence des cellules, par imagerie sans lentille. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, son champ d'observation est nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. On comprend alors que les perspectives d'application liées à cette technologie sont importantes. La demande de brevet W02015011096 décrit un procédé permettant d'estimer l'état d'une cellule à partir d'un hologramme. Cette demande permet par exemple de discriminer des cellules vivantes de cellules mortes. D'une façon générale, l'hologramme acquis par le capteur d'image peut être traité par un 30 algorithme de reconstruction holographique, de manière à estimer des propriétés optiques de l'échantillon, par exemple un facteur de transmission ou une phase. De tels algorithmes sont 3049348 2 bien connus dans le domaine de la reconstruction holographique. Pour cela, la distance entre l'échantillon et le capteur d'image étant connue, on applique un algorithme de propagation, prenant en compte cette distance, ainsi que la longueur d'onde de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. On peut alors reconstituer une image d'une propriété optique de 5 l'échantillon. L'image reconstruite peut, en particulier, être une image complexe de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, comportant des informations sur les propriétés optiques d'absorption ou de variation de phase de l'échantillon. Un exemple d'algorithme de reconstruction holographique est décrit dans la publication Ryle et al, « Digital in-line holography of biological specimens », Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006). 10 Mais les algorithmes de reconstruction holographiques peuvent induire un bruit de reconstruction dans l'image reconstruite, désigné par le terme de « twin image ». Cela est essentiellement dû au fait que l'image formée sur le capteur d'image ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse atteignant ce capteur. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique partielle, basée 15 uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé. La demande US2012/0218379 décrit par exemple un procédé permettant de reconstruire une 20 image complexe d'un échantillon, ladite image complexe comportant des informations d'amplitude et de phase. Une telle image permet d'obtenir certaines informations permettant, l'identification d'une cellule. La demande US2012/0148141 applique le procédé décrit dans la demande US2012/0218379 pour reconstruire une image complexe de spermatozoïdes et de caractériser leur motilité, leur orientation, ou certains paramètres géométriques, par exemple 25 la taille de leur flagelle. La demande W02014/012031 décrit également l'application d'un procédé de reconstruction d'une image complexe de cellules, en l'occurrence des spermatozoïdes. Ce document décrit également l'acquisition d'hologrammes successifs, chaque hologramme faisant l'objet d'une reconstruction holographique afin d'obtenir un suivi tridimensionnel de la trajectoire de spermatozoïdes. Les inventeurs ont estimé que le recours à une image complexe, obtenue par reconstruction holographique à partir d'un hologramme, ne permettait pas une caractérisation suffisante d'un échantillon, en particulier lorsque l'échantillon comporte des particules dispersées dans un 3049348 3 milieu. L'invention permet de résoudre ce problème et permet une caractérisation précise de particules, pouvant être mise en oeuvre sur la base d'un seul hologramme EXPOSE DE L'INVENTION Un objet de l'invention est un procédé de caractérisation d'une particule contenue dans un 5 échantillon, comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un 10 plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) 15 application d'un opérateur de propagation à l'image acquise lors de l'étape b), de façon à calculer une image complexe, dite image de référence, représentative de l'échantillon, dans un plan de reconstruction ; d) sélection d'une position radiale de ladite particule dans un plan parallèle au plan de détection ; e) 20 à partir de l'image complexe calculée lors de l'étape c), détermination d'au moins une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, à une pluralité de distances du plan de détection ou du plan de reconstruction ; f) formation d'un profil, représentant l'évolution de la grandeur caractéristique déterminée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par la position radiale sélectionnée lors de l'étape d); 25 g) caractérisation de la particule en fonction du profil formé lors de l'étape f). De préférence, l'étape e) comprend : l'application d'un opérateur de propagation à l'image complexe de référence, de façon à calculer des images complexes dites secondaires selon une pluralité de distances du plan de reconstruction ou du plan de détection ; 30 la détermination de grandeurs caractéristiques de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le capteur d'image, c'est-à-dire l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, à chacune desdites distances, à partir des images complexes secondaires. 3049348 4 Chaque grandeur caractéristique peut être déterminée en déterminant le module ou l'argument d'une image complexe secondaire calculée lors de l'étape e). Selon un mode de réalisation, la caractérisation est effectuée en comparant le profil formé lors de l'étape f) à des profils étalons déterminés au cours d'une phase d'apprentissage. Cette phase 5 d'apprentissage consiste à mettre en oeuvre les étapes a) à f) en utilisant un échantillon étalon à la place de l'échantillon à caractériser. Lors de l'étape d), la position radiale de chaque particule peut être sélectionnée à l'aide de l'image acquise lors de l'étape b) ou à l'aide de l'image complexe de référence calculée lors de l'étape c). 10 Selon un mode de réalisation, aucune optique de grossissement n'est interposée entre l'échantillon et le capteur d'image. De préférence, le plan de reconstruction, dans lequel l'image de référence est calculée, est un plan selon lequel s'étend l'échantillon, dit plan de l'échantillon. La source de lumière peut être une diode laser ou une diode électroluminescente. 15 Selon un mode de réalisation, lors de l'étape c), le calcul de l'image complexe de référence comporte les sous-étapes suivantes : i) définition d'une image initiale de l'échantillon dans le plan de détection, à partir de l'image acquise par le capteur d'image ; ii) détermination d'une image complexe de l'échantillon dans un plan de reconstruction 20 en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de l'échantillon définie lors de la sous-étape i) ou l'image de l'échantillon, dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente ; iii) calcul d'un indicateur de bruit à partir de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii), cet indicateur de bruit dépendant, de préférence selon une fonction croissante 25 ou décroissante, d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe ; iv) mise à jour de l'image de l'échantillon dans le plan de détection par un ajustement de valeurs de phase des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur calculé lors de la sous-étape iii) selon lesdites valeurs de phase ; v) réitération des sous-étapes ii) à iv) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de 30 façon à obtenir une image complexe de référence de l'échantillon dans le plan détection, ou dans le plan de reconstruction. Selon un mode de réalisation, la sous-étape iii), comporte : 3049348 5 pour différents pixels, le calcul d'une grandeur associée à chaque pixel, en fonction de la valeur de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii) audit pixel, ou d'une dérivée dimensionnelle de ladite image complexe audit pixel ; la combinaison des grandeurs calculées en différents pixels, de façon à obtenir 5 l'indicateur de bruit. L'indicateur de bruit peut être une norme d'ordre inférieur ou égal à 1 calculée à partir des grandeurs associées à chaque pixel. La grandeur associée à chaque pixel peut être calculée à partir du module d'une dérivée dimensionnelle, audit pixel, de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii). 10 Elle peut être obtenue à partir d'une dérivée dimensionnelle de l'image complexe, cette dérivée étant calculée en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. Elle peut également être obtenue à partir de la valeur de l'image complexe en plusieurs pixels de l'image, voire à chaque pixel de l'image. Selon un mode de réalisation, 15 lors de la sous-étape i), l'image initiale de l'échantillon est définie par une normalisation de l'image acquise par le capteur d'image, par une image représentative de l'onde lumineuse émise par la source de lumière ; lors de la sous-étape iii), la grandeur associée à chaque pixel est calculée en fonction de la valeur de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape ii), audit pixel, soustraite 20 d'un nombre strictement positif, par exemple le nombre 1. Le procédé peut comprendre l'une des caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison : lors de la sous-étape iii), l'indicateur est une somme, éventuellement pondérée, de la grandeur associée à chaque pixel de l'image complexe déterminée lors de la sous-étape 25 ii) ; lors de la sous-étape iv), l'ajustement de la valeur de la phase de chaque pixel est réalisé en constituant un vecteur, dit vecteur de phase, dont chaque terme correspond à la valeur de la phase d'un pixel de l'image de l'échantillon dans le plan de détection , ce vecteur étant mis à jour, au cours de chaque itération, de façon soit à minimiser, soit à 30 maximiser l'indicateur de bruit calculé lors de la sous-étape iii), en se basant sur un gradient de l'indicateur de bruit selon chaque terme dudit vecteur de phase. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape d), on sélectionne une pluralité de coordonnées radiales, représentant une même particule, et lors de l'étape f), on forme autant de profils que 3049348 6 de coordonnées sélectionnées. L'étape f) peut alors comprendre une combinaison de ces profils, par exemple une moyenne de ces profils. La particule peut être une cellule ou un microorganisme ou une microbille ou un exosome ou une gouttelette d'une émulsion. Il peut également s'agir d'un noyau cellulaire, d'un débris 5 cellulaire, d'un organite cellulaire. Par caractérisation, on entend notamment : - une détermination de la nature d'une particule, c'est-à-dire une classification de cette particule parmi une ou plusieurs classes prédéterminées ; - une détermination de l'état d'une particule, parmi un ou plusieurs états prédéterminés ; - une estimation de la taille d'une particule, ou de sa forme, ou de son volume ou tout 10 autre paramètre géométrique ; - une estimation d'une propriété optique d'une ou plusieurs particules, par exemple l'indice de réfraction ou une propriété de transmission optique ; - un dénombrement desdites particules en fonction de leur caractérisation. Un autre objet de l'invention est un dispositif permettant l'observation d'un échantillon, 15 comportant : une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon ; un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre ladite source de lumière et un capteur d'image ; 20 un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et à mettre en oeuvre le procédé décrit dans cette demande, et plus particulièrement les étapes c) à f) ou c) à g) précédemment évoquées. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et 25 représentés aux dessins listés ci-dessous. FIGURES La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 2A illustre les principales étapes d'un procédé permettant le calcul d'une image complexe d'un échantillon dans un plan de reconstruction. 30 Les figures 2B, 2C, 2D, 2E et 2F représentent respectivement : - un hologramme acquis par le capteur d'image ; 3049348 7 une image reconstruite dans un plan de reconstruction lors d'une première itération du procédé représenté sur la figure 2A ; une image représentant une grandeur associée à chaque pixel de l'image représentée sur la figure 2C ; 5 une représentation d'une image, dite image complexe de référence, reconstruite après plusieurs itérations du procédé représenté sur la figure 2A. un profil obtenu sur la base d'images complexes secondaires formées à partir de l'image complexe de référence. Les figures 3A et 3B schématisent un profil radial du module ou de la phase d'une image 10 complexe obtenue par reconstruction holographique, respectivement en présence et sans bruit de reconstruction. La figure 4 résume le fonctionnement d'un procédé mettant en oeuvre l'invention. La figure 5A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des cellules dispersées dans une solution aqueuse. Les figures 5B et 5C représentent respectivement 15 le module et la phase d'une image complexe, dite de référence, cette image complexe étant formée dans un plan de reconstruction. Les figures 5D et 5E sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par une première cellule. Les figures 5F et 5G sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase 20 de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par une deuxième cellule. La figure 5H est une image au microscope de l'échantillon observé. La figure 6A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des globules rouges dispersées dans une solution aqueuse. Les figures 6B et 6C représentent 25 respectivement le module et la phase d'une image complexe, dite de référence, cette image complexe étant formée dans un plan de reconstruction. Les figures 6D et 6E sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par un globule rouge. 30 La figure 7A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des globules rouges dispersées dans une solution aqueuse. Les figures 7B et 7C représentent respectivement le module et la phase d'une image complexe, dite de référence, cette image complexe étant formée dans un plan de reconstruction. Les figures 7D et 7E sont des profils 3049348 8 représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par un globule rouge. La figure 8A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon étant une émulsion 5 comportant des gouttelettes d'huiles dispersées dans une solution aqueuse. Les figures 8B et 8C représentent respectivement le module et la phase d'une image complexe, dite de référence, cette image complexe étant formée dans un plan de reconstruction. Les figures 8D et 8F sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par un 10 une gouttelette, ces profils étant obtenus directement à partir d'images complexes secondaires calculées par application d'un opérateur de propagation à l'hologramme de la figure 8A. Les figures 8E et 8G sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par une gouttelette, ces profils étant obtenus à partir d'images complexes 15 secondaires calculées par application d'un opérateur de propagation à l'image complexe de référence dont le module et la phase sont représentées sur les figures 8B et 8C. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est 20 apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale 4X, comportant une longueur d'onde X. Cette longueur d'onde peut être une longueur d'onde centrale de ladite bande spectrale. L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il peut notamment s'agir d'un 25 milieu 10a comportant des particules 10b. Les particules 10b peuvent être des particules sanguines, par exemple des globules rouges. Il peut également s'agir de cellules, de parasites, de microorganismes, par exemple des bactéries ou des levures, des microalgues, des microbilles, ou des gouttelettes insolubles dans le milieu liquide, par exemple des nanoparticules lipidiques. Il peut également s'agir de noyaux cellulaires, d'organites ou de débris cellulaires. De 30 préférence, les particules 10b ont un diamètre, ou sont inscrites dans un diamètre, inférieur à 1 mm, et de préférence inférieure à 100 um. Il s'agit de microparticules (diamètre inférieur à 1 mm) ou de nanoparticules (diamètre inférieur à 1 um). Le milieu 10a, dans lequel baignent les particules, peut être un milieu liquide, par exemple un liquide corporel, un milieu de culture ou 3049348 9 un liquide prélevé dans l'environnement ou dans un procédé industriel. Il peut également s'agir d'un milieu solide ou ayant la consistance d'un gel, par exemple un substrat de type gélose, propice à la croissance de colonies bactériennes. Il peut également s'agir d'un échantillon évaporé, fixé ou congelé. 5 L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une micro-cuvette, d'utilisation courante dans les dispositifs de type point of care, dans laquelle l'échantillon 20 pénètre, par exemple par capillarité. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation varie typiquement entre 10 um et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 um et 500 um, par exemple 150 um. 10 L'échantillon s'étend selon un plan P10, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation. Il est maintenu sur un support 10s. La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa 15 diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. La source de lumière 11 peut être une diode électroluminescente ou une diode laser. Elle peut être associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement 20 comprise entre 5 um et 1 mm, de préférence entre 50 um et 500 um. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 um. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon 10. 25 Le dispositif peut comporter un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11,, (1 REVENDICATIONS1. Procédé de caractérisation d'une particule (10b) contenue dans un échantillon (10), 5 comportant les étapes suivantes : a) illumination dudit échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (In) de l'échantillon (10), 10 formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (22) transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) application d'un opérateur de propagation (h) à l'image acquise (In) lors de l'étape b), 15 de façon à calculer une image complexe (Aret), dite image de référence, représentative de l'échantillon, dans un plan de reconstruction (Pz, Po) ; d) sélection d'une position radiale (x, y) de ladite particule dans un plan parallèle au plan de détection (P0) ; e) à partir de l'image complexe de référence (Aref) calculée lors de l'étape c), 20 détermination d'au moins une grandeur caractéristique (M, cp, k) de l'onde lumineuse (22) transmise par l'échantillon, à une pluralité de distances du plan de détection (P0) ou du plan de reconstruction (Pi); f) formation d'un profil (M (z), (p(z), k(z)), représentant l'évolution de la grandeur caractéristique déterminée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de 25 propagation (Z) et passant par la position radiale (x, y) sélectionnée lors de l'étape d); g) caractérisation de la particule en fonction du profil formé lors de l'étape f). 2. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'étape e) comprend : 3049348 31 l'application d'un opérateur de propagation (h) à l'image complexe de référence (Aret), de façon à calculer des images complexes dites secondaires (Aref,z) selon une pluralité de distances du plan de reconstruction (Pz) ou du plan de détection (P0); la détermination d'une grandeur caractéristique (M, cf), k) de l'onde lumineuse (22) transmise par l'échantillon (10) à chacune desdites distances, à partir des images complexe secondaire (Aref,z)- 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel chaque grandeur caractéristique (M, cf), k) est déterminée à partir du module ou de l'argument d'une image complexe secondaire (Aref,z)- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel I est effectuée en comparant le profil formé lors de l'étape f) à des profils étalons déterminés au cours d'une phase d'apprentissage. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lors de l'étape d), la position radiale de chaque particule (x, y) est sélectionnée à l'aide de l'image acquise (In) lors de l'étape b) ou à l'aide de l'image complexe de référence (11'f,z) calculée lors de l'étape c). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune optique de grossissement n'est disposée entre l'échantillon (10) et le capteur d'image (16). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - l'étape d) comporte une sélection d'une pluralité de coordonnées radiales représentatives d'une même particule ; - l'étape f) comporte une formation d'une pluralité de profils, dits profils élémentaires, à chaque coordonnée radiale sélectionnée, et la combinaison desdits profils de façon à former un profil représentatif de ladite particule. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape c), le calcul de l'image complexe de référence comporte les sous-étapes suivantes : i) définition d'une image initiale de l'échantillon (111,:cc°) dans le plan de détection, à partir de l'image (In) acquise par le capteur d'image ; ii) détermination d'une image complexe de l'échantillon (AZ) dans un plan de reconstruction (Pi) en appliquant un opérateur de propagation à l'image initiale de l'échantillon (Ar-) définie lors de la sous-étape i) ou à l'image de l'échantillon (4-1), dans le plan de détection, résultant de l'itération précédente (k - 1); 3049348 32 iii) calcul d'un indicateur de bruit (el') à partir de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii), cet indicateur de bruit dépendant d'un bruit de reconstruction affectant ladite image complexe (11,10 ; iv) mise à jour de l'image de l'échantillon (Ain dans le plan de détection(P0) par un 5 ajustement de valeurs de phase ((picax, y)) des pixels de ladite image, l'ajustement étant réalisé en fonction d'une variation de l'indicateur calculé lors de la sous-étape iii) selon lesdites valeurs de phase ; v) réitération des sous-étapes ii) à iv) jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, de façon à obtenir une image complexe de référence de l'échantillon (10) dans le plan 10 détection (P0), ou dans le plan de reconstruction (Pi). 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la sous-étape iii), comporte : pour différents pixels (x, y), le calcul d'une grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel, en fonction de la valeur de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii) audit pixel, ou d'une dérivée dimensionnelle de ladite image complexe audit pixel ; 15 la combinaison des grandeurs (Ek (x, y)) associées en différents pixels (x, y), de façon à obtenir l'indicateur de bruit (ek). 10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel l'indicateur de bruit (el') est une norme d'ordre inférieur ou égal à 1 calculée à partir des grandeurs ek (x, y) associées à chaque pixel. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, dans lequel lors de la sous-étape 20 iii), la grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel (x, y) est calculée à partir du module d'une dérivée dimensionnelle, audit pixel, de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii). 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10 dans lequel : lors de la sous-étape i), l'image initiale de l'échantillon (Ar-) est définie par une 25 normalisation de l'image (In) acquise par le capteur d'image (16) par une image (/12) représentative de l'onde lumineuse (12) émise par la source de lumière ; lors de la sous-étape iii), la grandeur (Ek (x, y)) associée à chaque pixel est calculée en fonction de la valeur de l'image complexe (11,10 déterminée lors de la sous-étape ii), audit pixel, soustraite d'un nombre strictement positif, notamment le nombre 1. 3049348 33 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de la sous-étape iv), l'ajustement de la valeur de la phase de chaque pixel est réalisé en constituant un vecteur, dit vecteur de phase (e), dont chaque terme correspond à la valeur de la phase ((ploc (x, y)) d'un pixel de l'image de l'échantillon dans le plan de détection (P0), ce vecteur étant 5 mis à jour, au cours de chaque itération, de façon soit à minimiser, soit à maximiser l'indicateur de bruit (Ek) calculé lors de la sous-étape iii), en se basant sur un gradient (Vek) de l'indicateur de bruit (Ek) selon chaque terme dudit vecteur de phase. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la particule est choisie parmi : une cellule, un microorganisme, une microbille, un exosome, une goutelette 10 d'une émulsion, un noyau cellulaire, un débris cellulaire. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la caractérisation est : - une classification de la particule parmi une pluralité de classes de particules prédéterminées ; 15 - ou une détermination d'un état de la particule, parmi une pluralité d'états prédéterminés ; - ou une estimation d'un paramètre géométrique de la particule ; - ou une estimation d'un paramètre optique de la particule. 16. Dispositif pour la caractérisation d'une particule contenue dans un échantillon, le dispositif 20 comportant : une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre ladite source de lumière (11) et un capteur d'image (16) ; 25 un processeur (20), configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et à mettre en oeuvre les étapes c) à f) du procédé objet de l'une quelconque des revendications 1 à 15.