FR 3045664 A1 20170623 FR 1562707 A 20151217 1 Membrane pour tissu reconstruit comprenant des pores de plusieurs diamètres La présente invention concerne des membranes et dispositifs de culture cellulaire adaptés pour la préparation de tissu biologique reconstruit. L'ingénierie tissulaire pour des applications en recherche, en particulier dans des tests de sécurité ou d'efficacité, est basée sur la reconstruction de tissus humains ou animaux contenant un ou plusieurs type(s) cellulaire(s). Ces tissus sont reconstruits le plus souvent dans des inserts ou dispositifs de culture cellulaire après ensemencement et culture dans un milieu et des conditions définies (composition du milieu adaptée, conditions de température et de pH contrôlées). Aujourd'hui ces systèmes de reconstruction de tissus en 3D utilisent des membranes servant de support pour le dépôt des cellules. Du fait de limitations inhérentes à leur technique de fabrication, en particulier pour les membranes en polycarbonates et autres polymères chimiques, toutes les membranes du marché ne sont proposées qu'avec un seul diamètre de pores. Ainsi la plupart des membranes utilisées pour les systèmes de reconstruction de tissus en 3D utilisent des membranes possédant des pores d'un seul diamètre défini pour permettre la diffusion du milieu nutritif du compartiment inférieur vers le compartiment supérieur. Il existe par ailleurs des membranes possédant des pores d'un seul diamètre défini pour permettre la migration de cellules d'un compartiment à l'autre dans des tests de migration cellulaire. Néanmoins, cette taille unique de pores n'est pas compatible avec la reconstruction d'un modèle tissulaire, tel qu'un modèle d'épiderme humain reconstruit. Or, Il existe de très nombreuses applications de modèles de tissus humains ou animaux reconstruits dans laquelle la circulation de cellules entre le compartiment inférieur et supérieur du dispositif de culture ou le passage d'extensions cytoplasmiques entre les différents compartiments pourraient s'avérer très utile. Ainsi les modèles d'épiderme humain reconstruit (RHE) utilisés dans l'étude des mécanismes inflammatoires ne sont pas représentatifs de la majorité des dermatoses inflammatoires (dermatite atopique, psoriasis, lupus...) car ils sont limités par l'absence de cellules lymphocytaires. Il subsiste donc un besoin de modèles mieux adaptés à l'étude de l'inflammation chronique, en particulier un modèle autorisant la colonisation d'un épithélium reconstruit par des cellules impliquées dans la réponse inflammatoire de l'organisme. 3045664 2 De même, dans certains épithéliums humains ou animaux reconstruits, intégrant plusieurs types cellulaires dont des cellules immunocompétentes, comme des cellules de Langerhans, il serait intéressant de pouvoir reproduire l'activation de ces cellules et leur migration à l'extérieur de l'épiderme comme cela se produit in vivo dans les mécanismes 5 de sensibilisation. Enfin, les épithéliums humains ou animaux contiennent rarement le corps cellulaire de cellules nerveuses mais sont souvent innervés par des terminaisons nerveuses. Il serait donc intéressant de disposer de modèles de reconstruction d'un épithélium en 3D innervé par des dendrites dont les corps cellulaires sont localisés dans un compartiment 10 séparé. Il existe donc un besoin important de dispositifs de culture cellulaire permettant la préparation d'un modèle tissulaire reconstruit dans lequel la circulation de cellules ou le passage d'extensions cytoplasmiques entre les différents compartiments est possible. La présente invention répond à ce besoin. 15 Les présents inventeurs ont en effet montré de façon surprenante qu'il était possible de fabriquer des membranes comprenant deux types de porosité: une porosité de petite taille mais de densité élevée, permettant le support et la nutrition des cellules en culture de manière à obtenir un modèle tissulaire reconstruit, et 20 une porosité de grande taille mais de faible densité, permettant la circulation de certains types cellulaires et le passage d'extensions cytoplasmiques d'un compartiment à un autre. Les inventeurs ont montré que de telles membranes étaient parfaitement adaptées à l'obtention de modèles tissulaires reconstruits dans lesquels la circulation de cellules ou 25 le passage d'extensions cytoplasmiques entre les différents compartiments est possible. La présente invention a donc pour objet une membrane monocouche pour culture cellulaire comprenant au moins deux types de pores : (i) des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 à une densité 30 de 1 x105 à lx 105 pores par cm2 de membrane, et (ii) des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane, les deux types de pores traversant l'épaisseur de la membrane de part en part. Les pores (i) ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 lm permettent 35 typiquement la diffusion du milieu nutritif de part et d'autre de la membrane. 3045664 3 De préférence, les pores (i) ont un diamètre moyen compris entre 0,2 et 0,9 i..tm, de préférence entre 0,3 et 0,8 i..tm, de préférence entre 0,4 et 0,7 i..tm, entre 0,4 et 0,6 lm ou entre 0,4 et 0,5 i..tm. De manière préférée entre toutes, les pores (i) ont un diamètre moyen de 0,4 iim. 5 De préférence, les pores (i) sont présents dans la membrane selon l'invention à une densité comprise entre 2x 106 et 9,5x 107 pores par cm2 de membrane, de préférence entre 3x106 et 9 x107, entre 4x106 et 8,5x107, entre 5x106 et 8x107, entre 6x106 et 7,5x 107, entre 7x 106 et 7x 107, entre 8x 106 et 6,5x 107, entre 9x 106 et 6x107, entre 1x 106 et 5,5x 107, entre 2x 106 et 5x 107, entre 3x 106 et 4x 107, entre 4x 106 et 3x 107, entre 5x 106 10 et 2x107 ou entre 6x106 et 1 x107 pores par cm2 de membrane. De manière préférée entre toutes, les pores (i) sont présents dans la membrane selon l'invention à une densité comprise entre 1x106 et 8,5x107 pores par cm2 de membrane. Les pores (ii) ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 lm permettent typiquement la migration de cellules, en particulier de cellules immunitaires, ou le passage 15 de prolongements cellulaires, en particulier de prolongements nerveux, à travers la membrane. De préférence, les pores (ii) ont un diamètre moyen compris entre 2,5 et 11 i..tm, de préférence entre 3 et 10µm, entre 3,5 et 9 lm, entre 4 et 8 lm, entre 4,5 et 7 lm ou entre 5 et 6 lm. De manière préférée entre toutes, les pores (ii) ont diamètre moyen de 5 lm. 20 Le diamètre moyen préféré des pores (ii) pourra être choisi par l'homme du métier en fonction du type de cellules dont la migration à travers la membrane est recherchée. Ainsi, lorsque les cellules dont la migration est recherchée sont des astrocytes, le diamètre moyen des pores (ii) sera de préférence de 12 lm. Lorsque les cellules dont la migration est recherchée sont des leucocytes, des neutrophiles et/ou des cellules 25 neuronales, le diamètre moyen des pores (ii) sera de préférence de 3 lm. Lorsque les cellules dont la migration est recherchée sont des lymphocytes, des macrophages, des monocytes et/ou des cellules dendritiques, le diamètre moyen des pores (ii) sera de préférence de 5 lm. Lorsque les cellules dont la migration est recherchée sont des cellules endothéliales, des cellules épithéliales et/ou des fibroblastes, le diamètre moyen 30 des pores (ii) sera de préférence de 8 i..tm. De préférence, les pores (ii) sont présents dans la membrane selon l'invention à une densité comprise entre lx 102 et 4,5x 103 pores par cm2 de membrane, de préférence entre 1,25x102 et 4x103, entre 1,5x102 et 3x103, entre 1,75x102 et 2x103, entre 2x102 et 1,5x 103, entre 2,25 x102 et lx 103, entre 2,5x 102 et 9,5x 102, entre 2,75x 102 et 9x 102, entre 35 3x102 et 8,5x102, entre 3,25x102 et 8x102, entre 3,5x102 et 7,5x102, entre 3,75x102 et 7x 102, entre 4x 102 et 6,5x 102, entre 4,25x 102 et 6x 102, entre 4,5x 102 et 5,75x102, entre 3045664 4 4,75x102 et 5,5x 102 ou entre 5x102 et 5,25x102 pores par cm2 de membrane. De manière préférée entre toutes, les pores (ii) sont présents dans la membrane selon l'invention à une densité de 2,5x 102, 5x 102 ou lx 103 pores par cm2 de membrane. Dans un mode de réalisation particulier, les pores (ii) sont répartis de manière 5 homogène sur toute la surface de la membrane. Dans un autre mode de réalisation particulier, les pores (ii) sont répartis de manière hétérogène sur la surface de la membrane. De préférence, les deux types de (i) et (ii) sont orientés dans le même sens. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la membrane selon 10 l'invention est une membrane monocouche pour culture cellulaire comprenant au moins deux types de pores : (i) des pores ayant un diamètre moyen de 0,4 i..tm, à une densité de 1 x106 à 8,5x 107 pores par cm2 de membrane, et (ii) des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 i..tm, de préférence 15 de 5 i..tm, à une densité de 2,5x 102 à 1 x 103 pores par cm2 de membrane, de préférence une densité de 2,5x 102, 5x 102 ou lx 103 par cm2 de membrane, les deux types de pores traversant l'épaisseur de la membrane de part en part et étant orientés dans le même sens. Les pores (i) et (ii) de la membrane selon l'invention traversent l'épaisseur de la 20 membrane. Ils créent donc des voies de passage entre des éléments situés d'un côté de la membrane et des éléments situés de l'autre côté de la membrane. Les pores (i) et (ii) de la membrane selon l'invention sont par ailleurs de préférence orientés dans le même sens. Par conséquent, les pores (i) et (ii) de la membrane selon l'invention forment de préférence des voies de passage essentiellement parallèles les 25 unes par rapport aux autres. Ainsi, de préférence, les pores (i) et (ii) de la membrane selon l'invention ne sont pas interconnectés. La membrane selon l'invention est une membrane monocouche. Autrement dit, la membrane selon l'invention est constituée d'une seule couche ou feuille de matière. De préférence, la membrane selon l'invention a une épaisseur comprise entre 2 30 i..tm et 200 pm. De manière davantage préférée, la membrane selon l'invention a une épaisseur comprise entre 5µm et 100 pm, de préférence entre 5 et 50 pm, de préférence entre 8 et 25 pm, de manière encore préférée entre 10µm et 20 pm, de manière préférée entre toutes entre 11 i..tm et 15 i..tm. La membrane selon l'invention est de préférence une membrane biocompatible. 3045664 5 Par "membrane biocompatible", on entend ici une membrane qui est faite dans une matière qui n'a pas d'effet délétère sur les cellules, en particulier sur la viabilité, l'adhésion, l'étalement, la mobilité, la croissance et/ou la division des cellules. La membrane peut être une membrane semi-perméable de polycarbonate, de 5 polyéthylène, de polypropylène, de polyéthylène térephtalate (PET) ou de polyester. De préférence, la membrane selon l'invention est une membrane de polycarbonate. La membrane selon l'invention peut en outre être recouverte d'un revêtement pour promouvoir l'adhésion de cellules. Le revêtement peut comprendre des biomolécules ou dérivés de biomolécules, 10 tels qu'un polymère comme la polyornithine ou la polylysine, des peptides ou protéines, ou des composants de matrice extracellulaire, tels que la gélatine, la fibronectine, la laminine, le collagène, un glycosaminoglycane, un peptidoglycane, etc. Ce revêtement recouvre de préférence la totalité de la surface de la membrane en contact avec des cellules. 15 Le revêtement peut être sous forme semi-solide ou de gel, et peut comprendre des composants additionnels, tels que des facteurs de croissance. Le revêtement peut être un mélange simple ou complexe de biomolécules et peut simuler ou être la réplique d'une matrice extracellulaire (ECM) naturelle. En particulier, le revêtement peut être la matrice MatrigelTM commercialisée par BD Biosciences. 20 Les inventeurs ont par ailleurs montré que la membrane selon l'invention peut être obtenue de manière surprenante par perforation, en particulier au laser, d'une membrane pour culture cellulaire présentant uniquement une porosité de petite taille mais de densité élevée, de manière à produire des pores ayant un diamètre plus élevé mais à une faible 25 densité. La présente invention concerne donc également un procédé de fabrication d'une membrane telle que définie ci-dessus, comprenant l'étape consistant à perforer une membrane monocouche pour culture cellulaire, comprenant des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 i..tm, à une densité de 1 x 105 à 1x 105 pores par cm2 de 30 membrane, de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 i..tm, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. De préférence, le procédé de fabrication selon l'invention cmprend les étapes suivantes : a) fournir une membrane monocouche pour culture cellulaire comprenant des 35 pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 i..tm, à une densité de 1 x105 à 1x105 pores par cm2 de membrane, et 3045664 6 b) perforer ladite membrane de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. De préférence, les pores déjà présents dans la membrane qui est soumise à 5 l'étape de perforation, en particulier les pores de la membrane fournie à l'étape a), ont un diamètre moyen compris entre 0,2 et 0,9 de préférence entre 0,3 et 0,8 de préférence entre 0,4 et 0,7 entre 0,4 et 0,6 lm ou entre 0,4 et 0,5 lm. De manière préférée entre toutes, les pores déjà présents dans la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier les pores de la membrane fournie à l'étape a), ont un 10 diamètre moyen de 0,4 De préférence, les pores déjà présents dans la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier les pores de la membrane fournie à l'étape a), sont présents dans la membrane à une densité comprise entre 2x105 et 9,5x107 pores par cm2 de membrane, de préférence entre 3x 105 et 9x 107, entre 4x 105 et 8,5x 107, entre 5x 105 et 15 8x 107, entre 6x 105 et 7,5x 107, entre 7x 105 et 7x107, entre 8x 105 et 6,5x107, entre 9x 105 et 6x 107, entre 1x 106 et 5,5x 107, entre 2x 106 et 5x 107, entre 3x 106 et 4x 107, entre 4 x106 et 3x107, entre 5x 106 et 2x 107 ou entre 6x106 et 1 x 107 pores par cm2 de membrane. De manière préférée entre toutes, les pores déjà présents dans la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier les pores de la membrane fournie à l'étape a), sont 20 présents dans la membrane à une densité comprise entre 1x106 et 8,5x107 pores par cm2 de membrane. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), est une membrane monocouche pour culture cellulaire comprenant des pores ayant un diamètre 25 moyen de 0,4 à une densité de 1x 106 à 8,5x 107 pores par cm2 de membrane. De préférence, les pores déjà présents dans la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier les pores de la membrane fournie à l'étape a), traversent l'épaisseur de la membrane de part en part. La membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane 30 fournie à l'étape a), est une membrane monocouche. Autrement dit, la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), est constituée d'une seule couche ou feuille de matière. De préférence, la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), a une épaisseur comprise entre 2µm et 200 pm. De 35 manière davantage préférée, la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), a une épaisseur comprise entre 5µm et 100 3045664 7 de préférence entre 5 et 50 de préférence entre 8 et 25 de manière encore préférée entre 10 lm et 20 de manière préférée entre toutes entre 11 lm et 15 La membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), est de préférence une membrane biocompatible, comme définie ci- 5 dessus. La membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), peut être une membrane semi-perméable de polycarbonate, de polyéthylène, de polypropylène, de polyéthylène térephtalate (PET) ou de polyester. De préférence, la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la 10 membrane fournie à l'étape a), est une membrane de polycarbonate. La membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), peut en outre être recouverte d'un revêtement pour promouvoir l'adhésion de cellules, comme défini ci-dessus. De préférence, la membrane est perforée par perforation au laser. 15 Par "perforation au laser", "perforation laser", ou "perforer au laser" on entend ici l'action de percer un objet au moyen d'un laser. Les techniques de perforation au laser sont bien connues de l'homme du métier et par exemple décrites dans Mielke et al. (2013) JLMN-Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:115-123. Un laser de type femtoseconde qui produit des impulsions ultra-courtes dont la 20 durée est de l'ordre de quelques femtosecondes à quelques centaines de femtosecondes peut être utilisé. De préférence, la perforation au laser mise en oeuvre dans le procédé de fabrication selon l'invention est une microperforation au laser, de manière davantage préférée une microperforation au laser femtoseconde. 25 Typiquement, la perforation au laser est mise en oeuvre à l'aide d'un laser femtoseconde, de préférence avec une seule impulsion de faisceau de Bessel, de préférence de l'ordre d'une centaine de nanojoules par trou. Les pores formés à l'étape de perforation dans le procédé de fabrication selon l'invention permettent la migration de cellules ou le passage de prolongements cellulaires 30 à travers la membrane. De préférence, les pores formés à l'étape de perforation ont un diamètre moyen compris entre 2,5 et 11 pm, de préférence entre 3 et 10 pm, entre 3,5 et 9µm, entre 4 et 8µm, entre 4,5 et 7µm ou entre 5 et 6µm. De manière préférée entre toutes, les pores formés à l'étape de perforation ont un diamètre moyen de 5 3045664 8 Le diamètre moyen des pores formés à l'étape de perforation pourra être choisi par l'homme du métier en fonction du type de cellules dont la migration à travers la membrane est recherchée, comme indiqué ci-dessus. De préférence, les pores formés à l'étape de perforation sont perforés dans la 5 membrane en particulier fournie à l'étape a) à une densité comprise entre 1x102 et 4,5x 103 pores par cm2 de membrane, de préférence entre 1,25x 102 et 4x 103, entre 1,5x 102 et 3 x 103, entre 1,75x 102 et 2 x 103, entre 2 x 102 et 1,5 x 103, entre 2,25x102 et 1x 103, entre 2,5x 102 et 9,5x 102, entre 2,75x102 et 9x 102, entre 3x 102 et 8,5x 102, entre 3,25 x 102 et 8x102, entre 3,5x102 et 7,5x102, entre 3,75x102 et 7x102, entre 4 x 102 et 10 6,5x102, entre 4,25x102 et 6x102, entre 4,5x102 et 5,75x102, entre 4,75x102 et 5,5x102 ou entre 5x 102 et 5,25x 102 pores par cm2 de membrane. De manière préférée entre toutes, les pores formés à l'étape b) sont perforés dans la membrane fournie à l'étape a) à une densité de 2,5x 102, 5x 102 ou lx 103 pores par cm2 de membrane. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'étape de perforation 15 consiste à perforer au laser la membrane en particulier fournie à l'étape a) de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 3 et 8 iim, de préférence de 5 iim, à une densité de 2,5 x 102 à 1 x103 pores par cm2 de membrane, de préférence une densité de 2,5x 102, 5x 102 ou lx 103 par cm2 de membrane. De préférence, les pores formés à l'étape de perforation traversent l'épaisseur de 20 la membrane de part en part. De préférence, les pores formés à l'étape de perforation sont orientés dans le même sens que les pores initialement présents dans la membrane. La membrane selon l'invention est particulièrement utile pour la culture cellulaire 25 lorsqu'elle fait partie d'un dispositif de culture cellulaire. La présente invention a donc également pour objet un dispositif de culture cellulaire comprenant au moins un compartiment dont au moins une des parois comprend ou est constituée par la membrane selon l'invention. Les termes "dispositif de culture cellulaire" et "insert" sont ici utilisés 30 indifféremment. Par "insert", on entend ici un support qui comprend une ou plusieurs dépressions ou puits qui peut être placé dans un récipient, typiquement dans une plaque de culture multi-puits. De préférence, le dispositif de culture cellulaire selon l'invention comprend deux 35 compartiments, la paroi comprenant ou étant constituée par la membrane selon l'invention séparant les deux compartiments. 3045664 9 La base de l'insert est de préférence constituée par la membrane selon l'invention qui sépare donc le compartiment formé par le puits de l'insert et un deuxième compartiment de l'insert ou le compartiment formé par le récipient dans lequel l'insert est placé. 5 L'insert peut être de toute forme et de toute taille. L'insert peut en particulier avoir un diamètre compris entre 3 et 80 mm, entre 4 et 75 mm, entre 4,26 et 70 mm, entre 4,5 et 65 mm, entre 5 et 60 mm, entre 5,5 et 55 mm, entre 6 et 50 mm, entre 6,5 et 45 mm, entre 7 et 40 mm, entre 7,5 et 35 mm, entre 8 et 30 mm, entre 8,5 et 25 mm, entre 9 et 24 mm, entre 9,5 et 23 mm, entre 10 et 22 mm, entre 11 et 21 mm, entre 12 et 20 mm, entre 10 13 et 19 mm, entre 14 et 18 mm, entre 15 et 17 mm ou entre 15 et 16 mm. L'insert peut être agencé de manière à être disposé dans un puits de plaque de culture cellulaire sans être en contact avec le fond dudit puits. L'insert peut comporter des ergots, des crochets ou tout autre moyen permettant son maintien à une distance appropriée du fonds d'un puits de plaque de culture 15 cellulaire. La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un dispositif de culture cellulaire selon l'invention, comprenant l'étape consistant à perforer la membrane monocouche d'un dispositif pour culture cellulaire qui comprend au moins un 20 compartiment dont au moins une des parois comprend ou est constituée par cette membrane monocouche qui comprend des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 iim, à une densité de 1x105 à 1x105 pores par cm2 de membrane, de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 iim, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. 25 De préférence, le procédé de fabrication d'un dispositif de culture cellulaire selon l'invention, comprend les étapes suivantes : A) fournir un dispositif pour culture cellulaire qui comprend au moins un compartiment dont au moins une des parois comprend ou est constituée par une membrane monocouche comprenant des pores ayant un diamètre 30 moyen compris entre 0,1 et 1 iim, à une densité de 1x105 à 1x105 pores par cm2 de membrane, et B) perforer ladite membrane de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 iim, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. 35 La membrane du dispositif pour culture cellulaire qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier du dispositif fourni à l'étape A), est telle que définie ci-dessus 3045664 10 pour la membrane qui est soumise à l'étape de perforation, en particulier la membrane fournie à l'étape a), du procédé de fabrication de membrane selon l'invention. De préférence, le dispositif de culture cellulaire dont la membrane est soumise à l'étape de perforation, en particulier le dispositif fourni à l'étape A), comprend deux 5 compartiments, la paroi comprenant ou étant constituée par ladite membrane séparant les deux compartiments. Le dispositif pour culture cellulaire dont la membrane est soumise à l'étape de perforation, en particulier le dispositif fourni à l'étape A), peut typiquement être un insert disponible commercialement tel qu'un insert pour culture cellulaire de 0,5 cm2 ou 4 cm2 de 10 surface de culture commercialisé par Nunc, ou un insert pour culture cellulaire de 0,38 cm2 ou 1,2 cm2 de surface de culture commercialisé par Corning. De préférence, la membrane est perforée par perforation au laser. L'étape de perforation peut être mise en oeuvre dans les mêmes conditions que celles définies pour l'étape de perforation du procédé de fabrication de membrane selon 15 l'invention, et pour produire des pores ayant les mêmes caractéristiques. Les inventeurs ont montré que la membrane et le dispositif de culture cellulaire selon l'invention étaient particulièrement utiles pour la culture cellulaire, et en particulier pour produire des tissus biologiques reconstruits vers lesquels ou à partir desquels des 20 cellules peuvent circuler. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation in vitro de la membrane selon l'invention ou du dispositif de culture cellulaire selon l'invention pour la culture cellulaire. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la membrane selon 25 l'invention ou du dispositif de culture cellulaire selon l'invention pour la préparation d'un tissu biologique reconstruit. Par "tissu biologique", on entend ici tout ensemble de cellules semblables et de même origine, regroupées en amas, réseau ou faisceau. Le tissu biologique peut en particulier être un tissu épithélial, conjonctif, musculaire ou nerveux. Le tissu biologique 30 est de préférence un tissu épithélial. Il peut s'agir d'un tissu de n'importe quel organe humain, tel qu'un tissu d'épiderme, un tissu de derme, un tissu cardiaque, un tissu hépatique, un tissu renal, etc. La présente invention concerne ainsi également un tissu biologique reconstruit comprenant, sur la membrane selon l'invention, au moins un groupe de cellules (i) 35 comprenant au moins un premier type cellulaire. 3045664 11 De préférence, ladite membrane permet le passage de certaines cellules et/ou des prolongements cytoplasmiques de certaines cellules dudit tissu biologique, en particulier à travers les pores de diamètre compris entre 2 et 12 i..tm. De préférence, ledit au moins premier type cellulaire compris dans le groupe de 5 cellules (i) est constitué de cellules d'épithélium. Par "cellule d'épithélium", on entend ici toute cellule faisant partie d'un épithélium. Les cellules d'épithélium du tissu biologique reconstruit selon l'invention peuvent ainsi être des cellules d'épiderme, d'épithélium vaginal, oral, pulmonaire, intestinal ou cornéal ainsi que toutes cellules résidentes de ces tissus épithéliaux. Ainsi, le groupe de 10 cellules (i) du tissu biologique reconstruit selon l'invention peut constituer un équivalent d'épiderme, d'épithélium vaginal, oral , pulmonaire, intestinal ou cornéal. Les cellules d'épithélium utilisées dans le cadre de l'invention sont de préférence des cellules épithéliales. On utilisera préférentiellement des kératinocytes. Le groupe de cellules (i) peut en outre comprendre d'autres types cellulaires que le 15 premier type cellulaire, tels que des cellules immunitaires. Dans un mode de réalisation particulier, ledit groupe de cellules (i) comprend en outre des cellules immunitaires. Par "cellule immunitaire", on entend ici toute cellule impliquée dans les réactions immunitaires d'un organisme. Les cellules immunitaires incluent en particulier les 20 lymphocytes tels que les lymphocytes ganglionnaires, les leucocytes, les macrophages, les monocytes, les cellules dendritiques et les cellules de Langerhans. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le tissu biologique reconstruit selon l'invention comprend: un groupe de cellules (i) comprenant au moins un premier type cellulaire, tel 25 que défini ci-dessus, et un groupe de cellules (ii) comprenant au moins un deuxième type cellulaire, les groupes de cellules (i) et (ii) étant séparés par la membrane selon l'invention. De préférence, ledit au moins deuxième type cellulaire compris dans le groupe de cellules (ii) est constitué de cellules nerveuses. 30 Par "cellule nerveuse", on entend ici toute cellule impliquée dans le système nerveux, y compris les cellules gliales. Les cellules nerveuses incluent en particulier les neurones, parmi lesquels les motoneurones, les neurones sensitifs et les neurones d'association, les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules de Schwann. De préférence, la cellule nerveuse incluse dans le tissu reconstruit selon l'invention est une 35 cellule nerveuse à extension cytoplasmique. 3045664 12 Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, ladite membrane permet le passage de d'extensions cytoplasmiques du groupe de cellules (ii) dudit tissu biologique vers le groupe de cellules (i), en particulier à travers les pores de 2 à 12 lm de diamètre. Dans un autre mode de réalisation préféré, ladite membrane permet le passage 5 d'extensions cytoplasmiques de cellules nerveuses du groupe de cellules (ii) dudit tissu biologique vers le groupe de cellules (i), en particulier à travers les pores de 2 à 12 lm de diamètre. Dans un mode de réalisation particulier, le tissu biologique reconstruit selon l'invention est un modèle de peau reconstruite. 10 Ainsi, dans ce mode de réalisation particulier, le groupe de cellules (i) du tissu biologique reconstruit constituent de préférence un équivalent d'épiderme. Dans cet équivalent d'épiderme (i), ledit au moins premier type cellulaire est constitué de cellules d'épithélium, de préférence des cellules d'épiderme, en particulier des cellules choisies dans le groupe constitué des kératinocytes, des mélanocytes et des 15 mélanges de ceux-ci. De préférence, l'équivalent d'épiderme (i) comprend des cellules immunitaires, telles que définies ci-dessus, en particulier des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. De préférence, ces cellules de Langerhans sont localisées dans la partie 20 suprabasale de l'équivalent d'épiderme (i). La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tissu biologique reconstruit comprenant au moins un type cellulaire, dans un dispositif de culture cellulaire selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : 25 a) ensemencer un premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans un compartiment du dispositif de culture, de manière à permettre son adhésion à la membrane du dispositif de culture, et b) maintenir les cellules en culture pendant un délai et dans des conditions appropriées pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu. 30 Dans un mode de réalisation particulier, le procédé est pour préparer un tissu biologique reconstruit comprenant au moins deux types cellulaires, et comprend les étapes suivantes: al) ensemencer un premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans un compartiment du dispositif de culture, 35 a2) après un délai nécessaire pour permettre l'adhésion de cellules à la membrane du dispositif de culture, ensemencer le deuxième type cellulaire, et 3045664 13 b) maintenir les cellules en culture pendant un délai et dans des conditions appropriées pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu. De préférence, le premier type cellulaire du tissu à reconstituer est une cellule d'épithélium telle que définie-ci-dessus. 5 Dans un mode de réalisation particulier, l'étape a) ou al) d'ensemencement du premier type cellulaire du tissu à reconstituer peut inclure l'ensemencement de plusieurs types cellulaires, qui constitueront un premier ensemble du tissu biologique reconstruit. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'étape a) ou al) d'ensemencement du premier type cellulaire du tissu à reconstituer inclut l'ensemencement simultané ou 10 consécutif de plusieurs types de cellules d'épithélium, de préférence l'ensemencement simultané ou consécutif de kératinocytes et de mélanocytes. L'étape a) ou al) d'ensemencement du premier type cellulaire du tissu à reconstituer peut en outre inclure l'ensemencement simultané ou consécutif de cellules immunitaires telles que définies ci-dessus, en particulier de cellules de Langerhans ou de précurseurs de cellules de 15 Langerhans. De préférence, le deuxième type cellulaire du tissu à reconstituer est une cellule nerveuse telle que définie ci-dessus ou une cellule immunitaire telle que définie ci-dessus. Les cellules ensemencées sont maintenues en culture à l'étape b) pendant un délai et dans des conditions appropriées pour permettre l'organisation cellulaire 20 caractéristique du tissu, par exemple dans une atmosphère d'air contenant 2 à 10% de CO2 à 37°C. L'ensemble des cellules du tissu biologique reconstruit selon l'invention peut être mis en culture dans un milieu adapté au maintien et/ou à la croissance et/ou à la prolifération de chacun des types cellulaires du tissu. 25 De nombreux milieux de culture susceptibles de convenir à la mise en oeuvre de l'invention peuvent être obtenus commercialement. A titre d'exemples non exhaustifs de milieux de culture convenant à l'invention, on peut mentionner le Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), le MCDB 153 ou autres dérivés, le Minimal Essential Medium (MEM), le M199, le RPMI 1640 ou l'Iscove's Modified Dulbecco's Medium (EDMEM), le 30 Ham's F-12, le Ham's F-10, le NCTC 109 et le NCTC 135. Ces milieux peuvent être complémentés par tout additif classiquement utilisé en culture cellulaire tel que, par exemple, des précurseurs de phospholipides, des acides aminés non-essentiels, des acides nucléiques, des vitamines, des antibiotiques, des cofacteurs enzymatiques, des sels minéraux, de l'insuline, de la transferrine, de la 35 triiodothyronine, de l'éthanolamine, de l'o-phosphoryl-éthanolamine ou des facteurs de croissance. 3045664 14 Les concentrations des différents additifs usuellement utilisés pour complémenter les milieux de culture cellulaire peuvent être déterminés et adaptés par l'homme de l'art, notamment selon le type de cellules à cultiver. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser des mélanges de différents milieux 5 notamment des milieux précités, tels que par exemple un mélange DMEM/Ham's F-12. De manière générale, un tissu biologique reconstruit selon l'invention peut être maintenu dans des conditions de culture, de maintien, de survie et/ou de croissance et/ou de prolifération cellulaire pendant une durée d'environ 5 à 24 jours, dans des conditions de culture standard. 10 Comme indiqué ci-dessus, l'utilisation d'une membrane adaptée pour l'obtention de modèles tissulaires reconstruits et permettant la circulation de cellules est particulièrement appropriée pour mettre en oeuvre des tests de criblage ou d'identification de composés susceptibles de moduler une réponse inflammatoire ou immunitaire d'un 15 tissu humain comme par exemple d'un épithélium. L'utilisation d'une membrane adaptée pour l'obtention de modèles tissulaires reconstruits et permettant le passage d'extensions cytoplasmiques est également particulièrement appropriée pour mettre en oeuvre des tests de criblage ou d'identification de composés susceptibles de moduler une réponse sensorielle d'un tissu humain en 20 interagissant avec des terminaisons nerveuses présentes dans le tissu. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un tissu biologique reconstruit selon l'invention pour cribler ou identifier des agents susceptibles de moduler une réponse inflammatoire d'un tissu biologique, en particulier d'un épithélium, impliquant l'activation et la migration de cellules immunitaires ou pour cribler des agents susceptibles 25 de moduler une réponse sensorielle d'un tissu biologique en interagissant avec des terminaisons nerveuses présentes dans le tissu. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro de criblage d'agents susceptibles de moduler une réponse inflammatoire d'un tissu biologique, en particulier d'un épithélium, impliquant l'activation et la migration de cellules immunitaires 30 comprenant les étapes suivantes : a) mettre l'agent à cribler en présence d'un tissu biologique reconstruit selon l'invention présentant une réponse inflammatoire impliquant l'activation et la migration de cellules immunitaires dans ce tissu biologique reconstruit, b) déterminer un changement éventuel dans l'activation et la migration de cellules 35 immunitaires dans le tissu biologique reconstruit, et 3045664 15 c) si un changement est déterminé à l'étape b), en déduire que l'agent à cribler est un agent susceptible de moduler la réponse inflammatoire d'un tissu, en particulier d'un épithélium impliquant, l'activation et la migration de cellules immunitaires. 5 De préférence, dans ces modes de réalisation, la membrane du tissu biologique reconstruit permet le passage, en particulier à travers les pores de diamètre compris entre 2 et 12 lm, de cellules immunitaires, telles que définies ci-dessus, du tissu biologique reconstruit vers un autre compartiment, et inversement. De préférence, le tissu biologique reconstruit présentant une réponse 10 inflammatoire impliquant l'activation et la migration de cellules immunitaires est un modèle de peau reconstruite, telle que définie ci-dessus, modèle d'inflammation, en particulier un modèle de peau reconstruite telle que définie ci-dessus colonisée par des cellules impliquées dans la réponse inflammatoire, en particulier des cellules immunitaires telles que les lymphocytes, les leucocytes, les macrophages, les monocytes, les cellules 15 dendritiques et les cellules de Langerhans. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro de criblage d'agents susceptibles de moduler une réponse sensorielle d'un tissu biologique, en particulier d'un épithélium, en interagissant avec des terminaisons nerveuses présentes dans le tissu, comprenant les étapes suivantes : 20 a) mettre l'agent à cribler en présence d'un tissu biologique reconstruit selon l'invention comprenant un groupe de cellules (i) comprenant au moins un premier type cellulaire, et un groupe de cellules (ii) comprenant des cellules nerveuses, les groupes de cellules (i) et (ii) étant séparés par la membrane selon l'invention qui permet le passage d'extensions cytoplasmiques de 25 cellules nerveuses du groupe de cellules (ii) vers le groupe de cellules (i), b) déterminer un changement éventuel dans l'activité des cellules nerveuses dans le tissu biologique reconstruit, par mesure de l'activité électrique dans les cellules nerveuses et/ou de la libération de substance P par les cellules nerveuses, et 30 c) si un changement est déterminé à l'étape b), en déduire que l'agent à cribler est un agent susceptible de moduler la réponse sensorielle d'un tissu, en particulier d'un épithélium, en interagissant avec des terminaisons nerveuses présentes dans le tissu. 35 L'agent à cribler est de préférence mis en présence du tissu biologique reconstruit dans des conditions propices à une interaction avec ledit tissu, en particulier par contact 3045664 16 avec au moins un des types cellulaires en culture et/ou au moins un milieu de culture desdites cellules, notamment dans un insert et/ou un puits. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- 5 dessous. Brève description des figures 10 Figure 1: Photographie au microscope optique de la membrane de polycarbonate d'un insert Nunc avec une forte densité de pores de 0,4 lm dans laquelle a été ajoutée une faible densité de pores de 5 Figure 2 : Photographie d'une coupe histologique d'épidermes reconstruits sur une 15 membrane classique ne présentant qu'une porosité de 0,4 lm ou sur des membranes dans lesquelles des pores de 5 lm ont été ajoutés. Exemples 20 Exemple 1 : Fabrication des membranes et inserts selon l'invention Les inventeurs ont montré qu'il était possible à partir d'inserts industriels du marché utilisés pour la culture cellulaire et la reconstruction tissulaire de fabriquer un 25 système présentant deux diamètres de pores différents ou plus. Des inserts Nunc (Cat N° 140700) possédant une membrane en polycarbonate de 0,5 cm2 et de 11 lm d'épaisseur, dotée de pores de 0,4 lm d'une densité REVENDICATIONS1. Membrane monocouche pour culture cellulaire comprenant au moins deux types de pores : (i) des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 um, à une densité de 1 x105 à 1 x 105 pores par cm2 de membrane, et (ii) des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 um, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane, les deux types de pores traversant l'épaisseur de la membrane de part en part. 2. Membrane monocouche selon la revendication 1, dans laquelle les deux types de pores sont orientés dans le même sens. 3. Membrane monocouche selon la revendication 1 ou 2, ladite membrane étant une membrane de polycarbonate. 4. Procédé de fabrication d'une membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant l'étape consistant à perforer une membrane monocouche pour culture cellulaire, comprenant des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 um, à une densité de 1x 105 à 1 x 105 pores par cm2 de membrane, de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 um, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. 5. Procédé de fabrication selon la revendication 4, dans lequel la membrane est perforée par perforation au laser. 6. Dispositif de culture cellulaire comprenant au moins un compartiment dont au moins une des parois comprend ou est constituée par une membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 7. Dispositif selon la revendication 6, ledit dispositif comprenant deux compartiments et ladite paroi comprenant ou étant constituée par ladite membrane séparant les deux compartiments. 8. Procédé de fabrication d'un dispositif de culture cellulaire selon la revendication 6 ou 7, comprenant l'étape consistant à perforer la membrane monocouche d'un dispositif pour culture cellulaire qui comprend au moins un compartiment dont au moins une des parois 3045664 19 comprend ou est constituée par cette membrane monocouche qui comprend des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 i..tm, à une densité de 1 x105 à 1 x105 pores par cm2 de membrane, de manière à produire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 2 et 12 i..tm, à une densité de 0,5x102 à 5x103 pores par cm2 de membrane. 5 9. Utilisation in vitro de la membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou du dispositif selon la revendication 6 ou 7 pour la culture cellulaire. 10. Utilisation de la membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou du 10 dispositif selon la revendication 6 ou 7 pour la préparation d'un tissu biologique reconstruit. 11. Tissu biologique reconstruit comprenant, sur une membrane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, au moins un groupe de cellules (i) comprenant au moins un 15 premier type cellulaire. 12. Procédé de préparation d'un tissu biologique reconstruit comprenant au moins un type cellulaire, dans un dispositif de culture cellulaire selon la revendication 6 ou 7, comprenant les étapes suivantes : 20 a) ensemencer un premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans un compartiment du dispositif de culture, de manière à permettre son adhésion à la membrane du dispositif de culture, et b) maintenir les cellules en culture pendant un délai et dans des conditions appropriées pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu. 25 13. Utilisation d'un tissu biologique reconstruit selon la revendication 11 pour cribler des agents susceptibles de moduler une réponse inflammatoire d'un tissu impliquant l'activation et la migration de cellules immunitaires ou pour cribler des agents susceptibles de moduler une réponse sensorielle d'un tissu en interagissant avec des terminaisons 30 nerveuses présentes dans le tissu. 35