FR 3035107 A1 20161021 FR 1553319 A 20150415 1 Procédé de préparation d'hydrogel à partir d'acide hyaluronique modifié et de collagène de type I Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la biologie cellulaire, et plus particulièrement, les domaines de la chimie des polysaccharides et des milieux pour culture cellulaire. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de préparation d'hydrogel à partir d'acide hyaluronique modifié. Elle concerne également l'utilisation de ces hydrogels comme environnement de cultures cellulaires tridimensionnels. Etat de la technique La majorité des études de culture cellulaire sont effectuées sur des supports bidimensionnels (2D) tels que des plaques de micro-puits et des boîtes de Pétri ; ces dispositifs sont simples et faciles à utiliser, et ils confèrent une viabilité cellulaire élevée aux cellules conservées dans ces supports. Ces systèmes de culture cellulaire 2D ont permis d'améliorer la compréhension de la biologie cellulaire, mais ils ne permettent pas de reproduire les environnements complexes des cultures de cellules in vivo, qui sont connus pour moduler la morphologie des cellules, le taux de croissance des cellules, la géométrie de contact, les propriétés de transport des cellules, ainsi que de nombreuses autres fonctions cellulaires. Les matrices de culture cellulaires tridimensionnelles (3D), appelées par l'homme du métier aussi « scaffolds » (mot anglais signifiant « échafaudages »), ont été mises en place pour surmonter les limites de la culture cellulaire 2D. Ces matrices tridimensionnelles sont des substrats poreux permettant la croissance des cellules, l'organisation, la différenciation cellulaire sur et/ou au sein de leur structure. Il a été démontré que, par rapport aux cultures sur supports bidimensionnels, les milieux de culture 3D miment plus ou moins convenablement l'environnement in vivo des cellules. Les matrices 3D présentent une diversité architecturale et une diversité de matériels beaucoup plus importantes que celles des substrats 2D. On connaît de nombreux procédés de fabrication de matrices 3D permettant de moduler la porosité, la perméabilité, les caractéristiques mécaniques et la morphologie de surface des matrices, afin de mimer, au mieux, dans un système in vitro les divers environnements in vivo. De nombreuses études ont été menées sur l'utilisation de substances naturelles présentes au sein de la matrice extracellulaire (MEC) en tant que support des matrices de culture cellulaires tridimensionnelles 3D. 3035107 2 En effet, la matrice extracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement des cellules qui entrent en contact avec elle, notamment en modulant le développement cellulaire, la migration, la prolifération, la différenciation, l'adhésion et l'architecture spatiale des cellules et des tissus. La matrice extracellulaire représente 5 l'ensemble des macromolécules extracellulaires des tissus biologiques. Ces macromolécules extracellulaires sont synthétisées et sécrétées par les cellules telles que les ostéoblastes, les chondrocytes ou encore les fibroblastes qui entrent en contact avec la matrice. Ces macromolécules sont ensuite assemblées en une structure tridimensionnelle sous forme d'un maillage 3D dans les espaces extracellulaires de la 10 plupart des tissus. Les macromolécules, présentes dans la matrice extracellulaire, sont principalement des glycoprotéines, des protéines telles que le collagène, et des glycosaminoglycanes (polysaccharides) telles que l'acide hyaluronique. L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane composé d'un disaccharide de répétition de l'acide glucuronique et de N-acetylglycosamine. L'acide hyaluronique est l'un des 15 polysaccharides biocompatibles et biodégradables les plus répandus dans le corps animal et humain. L'acide hyaluronique, via ses interactions avec les récepteurs membranaires des cellules, participe à un certain nombre d'interactions cellulaires de surface, et contribue ainsi de manière significative à la prolifération, à la migration et à la différenciation cellulaires. De plus, l'acide hyaluronique possède la faculté de former des 20 hydrogels. Modifier chimiquement l'acide hyaluronique permet de synthétiser des hydrogels possédant des propriétés nouvelles et particulières, comme le soulignent la publication « Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications » par C.E. Schanté et al., parue dans la revue 25 Carbohydrate Polymers, vol. 85, p. 469-489 (2011), la thèse de doctorat de Zied Souguir (« Fonctionnalisation de polysaccharides et étude de leurs propriétés 'pH dépendantes' »), Université de Rouen, 2006, et la thèse de doctorat de Kristoffer Bergman « Hyaluronan Derivatives and Injectable Gels for Tissue Engineering », Upsala 2008. Le collagène peut aussi être employé dans la fabrication de matrices 3D. Le collagène est 30 une protéine fibreuse insoluble présente dans la matrice extracellulaire des organismes. Le collagène contient des acides aminés liés de façon covalente et présente une structure ordonnée en fibrilles qui confère aux tissus une excellente résistance mécanique à la traction. Il existe 28 types de collagènes différents comme le souligne la publication « Collagen structure and stability » de M.D Shoulders et R.T. Raines, parue dans l'Annual Review of Biochemistry, vol 78, p929-958 (2009). Le collagène de type I entre dans la constitution de la plupart des tissus conjonctifs tels que le derme, les os, les tendons, les 3035107 3 ligaments et la cornée. Les collagènes de type I et VI sont les deux principaux collagènes présents au sein de la matrice extracellulaire adipeuse. Le collagène de type IV se retrouve dans les membranes basales de nombreux tissus, membranes constituées d'une fine couche de matrice extracellulaire séparant les cellules épithéliales des cellules sous- 5 jacentes. De nombreux brevets traitent de la réalisation de matériaux à base d'acide hyaluronique et de collagène utilisables comme matrices cellulaires. A titre d'exemple, CN 103 849 594 décrit un procédé de culture in-vitro en trois dimensions pour un organe palatin, la matrice employée pouvant être composée d'acide hyaluronique et de collagène. 10 WO 2013/023793 A3 décrit une matrice comprenant un polysaccharide modifié tel que de l'acide hyaluronique et pouvant contenir du collagène. La matrice obtenue peut notamment être utilisée comme « échafaudage » pour la régénération de cellules vivantes. Des matériaux poreux élaborés à partir d'acide hyaluronique et de collagène de type I ont 15 d'ailleurs été développés, comme le présente la publication «Studies of nove/ hyaluronic acid-collagen sponge materials composed of two different species of type I collagen » par Y.K. Lin et D.0 Liu, parue dans le journal of biomaterials applications, vol. 21, p265-281 (2007). Cette publication précise d'ailleurs que de nombreuses études ont été réalisées sur ce type de matériaux poreux à base de collagène combiné à de l'acide hyaluronique 20 utilisables comme matériau de reconstruction de la peau ou encore comme matrice cellulaire favorisant la réplication cellulaire pour la reconstruction de tissu. Certaines macromolécules de la matrice extracellulaire possèdent des sites actifs peptidiques responsables de la fixation des cellules. Le tripeptide RGD (Arg-Gly-Asp) est une séquence d'acides aminés favorisant l'adhésion cellulaire. La séquence tripeptidique 25 RGD est d'ailleurs connue pour ses propriétés d'adhésion cellulaire, notamment de la fibronectine, de la laminine, de l'entactine, du collagène I, du collagène IV et de la ténascine. D'après la fiche technique du tetrapeptide RGDS fournie par la société Cayman Chemical, le motif RGD seul ne permet pas l'adhésion des cellules à la matrice. En revanche, le tétrapeptide RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser) permet l'adhésion de plusieurs 30 types cellulaires sur la matrice via notamment les interactions avec les intégrines aV[31 ou encore aV[33. D'autres motifs favorisant l'adhésion spécifique de cellules peuvent être employés, tels que le motif galactose favorisant l'adhésion de cellules hépatocytes dans des matrices 3D, comme le précise la publication « Galactose-functionnalized PolyHIPE scaffolds for use in routine three dimensional culture of mammalian hepatocytes » de 35 Hayward et al, parue dans la revue Biomacromolecules, vol. 14 p4271-4277 (2013). 3035107 4 WO 2000 04 941 Al (Pharmacal Biotechnologies) décrit un système de reconstruction osseux, comprenant une matrice pouvant être composé d'hydroxyapatite, une molécule biologiquement active telle qu'une protéine ou un peptide facilitant l'adhésion cellulaire et du collagène. 5 Bien qu'il existe de nombreuses matrices 3D, les biologistes auront toujours besoin de matrices 3D possédant des propriétés améliorées, notamment d'hydrogels capables de mimer l'environnement biologique de cellules spécifiques et ainsi de présenter une plus grande affinité à leurs regards. Un autre objectif de l'invention est de réaliser par un procédé suffisamment général des matrices 3D adaptables à l'accueil et à la croissance 10 de cellules très différentes. Un autre objectif de l'invention est de réaliser par un procédé simple et rapide une matrice 3D spécifique qui soit à la fois biocompatible et biodégradable. Un autre objectif de l'invention est de proposer des matrices 3D spécifiques mimant l'environnement biologique de cellules au regard des principaux constituants (i.e. 15 collagène, acide hyaluronique) de la matrice extracellulaire dont sont issues les cellules d'intérêt. Un autre objectif de l'invention est de réaliser une matrice 3D spécifique facilement caractérisable. Un autre objectif de l'invention est de proposer des matrices 3D spécifiques d'une part, de 20 cellules adipocytes et d'autre part de cellules hépatocytes permettant une culture cellulaire 3D satisfaisante. Objets de l'invention La présente invention concerne un procédé de préparation d'un hydrogel à partir d'acide hyaluronique réticulé pouvant être utilisé dans de nombreuses applications impliquant la 25 culture cellulaire 3D. L'hydrogel obtenu peut notamment être employé comme matrice d'une culture cellulaire 3D. En particulier, un procédé selon l'invention permet l'obtention d'un hydrogel d'acide hyaluronique réticulé ayant des propriétés améliorées / optimisées au regard d'un hydrogel d'acide hyaluronique qui n'aurait pas été soumis à un tel traitement. En effet, un hydrogel selon la présente invention est constitué de composants 30 de la matrice extracellulaire, tels que le collagène et l'acide hyaluronique, permettant de mieux imiter l'environnement in vivo de certaines cellules. Ainsi, un hydrogel selon l'invention présente une plus grande affinité cellulaire, en particulier pour les cellules hépatocytaires et adipocytaires, de sorte qu'il tend à faciliter l'ingénierie tissulaire. 3035107 5 Un premier objet de l'invention concerne un procédé de fabrication d'un hydrogel lyophilisé comprenant au moins les étapes suivantes, dans lequel : (a) on fait réagir une fonction amine du groupement peptidique ARG-GLY-ASP-SER (appelé « RGDS ») sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir 5 un premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié, et (b) on fait réagir ledit premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié avec une solution aqueuse et/ou alcoolique d'un agent réticulant, de préférence de l'acide adipique dihydrazide (ADH), en présence d'au moins un collagène, et de préférence d'au moins un collagène de type I, pour obtenir un hydrogel 10 réticulé, (c) on lyophilise l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b); et (d) on stérilise l'hydrogel lyophilisé obtenu à l'étape (c). Dans une variante de ce procédé : 15 (a) on fait réagir une fonction amine du groupement peptidique ARG-GLY-ASP-SER (RGDS) sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir un premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié, et (a') on fait réagir une fonction amine du galactosamine (H2NGal) sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir un second acide hyaluronique au 20 moins partiellement modifié, (b) on fait réagir ledit premier et/ou ledit second acide hyaluronique au moins partiellement modifié avec une solution aqueuse et/ou alcoolique d'un agent réticulant, de préférence de l'acide adipique dihydrazide (ADH) en présence d'au moins un collagène, et de préférence d'au moins un collagène de type I, pour 25 obtenir un hydrogel réticulé, (c) on lyophilise l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b); et (d) on stérilise l'hydrogel lyophilisé obtenu à l'étape (c). Selon l'invention, l'étape (a), l'étape (a') et/ou l'étape (b) est (sont) effectuée(s) à un pH 30 compris entre 4,0 et 5,0 , et de préférence à un pH compris entre 4,5 et 4,9 , et encore plus préférentiellement à un pH de 4,75. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape (a), l'étape (a') et/ou l'étape (b) est effectuée en présence d'EDCI et de NHS. 35 Dans un autre mode de réalisation particulier, le solvant de la solution alcoolique d'un agent réticulant de l'étape (b) est choisie parmi l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le butanol. 3035107 6 Dans un mode de réalisation particulier, les collagènes employés à l'étape (b) sont de type I et IV. 5 Dans un autre mode de réalisation particulier, les collagènes employés à l'étape (b) sont de type I et VI. Selon l'invention, l'étape (d) de stérilisation de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) est effectuée par exposition de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) à des rayonnements ionisants, 10 et plus particulièrement par exposition de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) aux rayonnements gamma. Selon l'invention, entre l'étape (c) de lyophilisation de l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b) et l'étape (d) de stérilisation de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) sont effectués : 15 - une étape de compression physique de l'hydrogel lyophilisé, - et un traitement thermique de l'hydrogel. De préférence, le traitement thermique est effectué par chauffage dans une gamme de température comprise entre 45 °C et 110 °C. 20 L'invention a pour objet un produit susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci- dessus. L'invention a également pour objet un un hydrogel susceptible d'être obtenu à partir du produit décrit ci-dessus et d'un liquide aqueux, ledit liquide aqueux comprenant possiblement du sérum et/ou un milieu de culture de cellules. 25 L'invention concerne une utilisation d'un produit ou d'un hydrogel comme décrit ci-dessus dans un milieu pour la culture cellulaire 3D ou dans un milieu pour le transport de cellules, notamment la culture ou le transport de cellules de type adipocytes ou la culture ou le transport de cellules de type hépatocytes. 30 L'invention a également pour objet un acide hyaluronique modifié par de la galactosamine selon l'étape a'). 1. Terminologie 35 Par définition, un hydrogel est un réseau tridimensionnel polymérique dans lequel l'agent gonflant est l'eau (IUPAC PAC, 2007, 79, 1801). Placés dans un environnement aqueux, les hydrogels vont s'hydrater et absorber l'eau présente dans le fluide aqueux. La 3035107 7 quantité de fluide aqueux absorbé peut être modulée par le type de macromolécule utilisée. L'hydrogel peut comprendre des additifs tels que des principes actifs. Le terme « matrice » signifie ici un réseau 3D de macromolécules reliées entre elles par des liaisons covalentes et/ou des liaisons non covalentes. 5 Le terme « collagènes de type x », x étant compris entre 1 et 28 en chiffres romains, signifie des collagènes bien connus dans la littérature selon leurs natures chimiques et leurs structures. On se référera à la publication « Collagen structure and stability » parue dans l'Annual Review of Biochemistry, vol 78, p929-958 (2009) de M.D. Shoulders et al. L'acide hyaluronique est abrégé ici « HA ». De préférence, les acides hyaluroniques 10 utilisés ont un poids moléculaire élevé (> 1x106 Da). 2. Description des figures La figure 1 présente un spectre 1H-RMN de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS. La figure 2 présente un spectre 1H-RMN de l'acide hyaluronique greffé par de la galactosamine. 15 La figure 3 présente l'évolution, par microscopie optique inversée, de 40 000 cellules préadipocytes humaines ensemencées sur les hydrogels pour culture cellulaire 3D adipocytes après 1 jour (figure 3 A), 4 jours (figure 3 B), 10 jours (figure 3 C) et 28 jours (figure 3 D) de culture cellulaire. 3. Description détaillée 20 La présente invention porte sur un procédé de préparation d'un hydrogel à partir d'acide hyaluronique réticulé en présence de collagène pouvant être utilisé dans de nombreuses applications impliquant la culture cellulaire 3D. Le procédé général de réalisation des hydrogels selon l'invention est décrit ci-après. Deux variantes du mode de réalisation adaptées à deux types de cultures cellulaires 25 spécifiques sont ensuite présentées. Enfin, l'utilisation de ces différents hydrogels est décrite. 3.1. Hydrogel pour culture cellulaire 3D Afin d'améliorer l'adhésion des cellules au sein de la matrice, des motifs RGDS ont été greffés à l'acide hyaluronique servant de base à la matrice développée. Le motif RGDS 30 permet l'adhésion de plusieurs types de cellules. 3035107 8 3.1.1. Modification du HA par greffage du (ARG-GLY-ASP-SER) RGDS Dans un procédé selon l'invention, la fonctionnalisation du HA par du RGDS peut être réalisée par différents modes de synthèse, et en particulier par voie enzymatique ou par greffage du motif sur un bras espaceur, ultérieurement greffé sur de l'acide hyaluronique. 5 Dans un mode de réalisation la fonctionnalisation du HA par du RGDS est réalisée via une réaction de couplage covalente entre une fonction acide de l'acide hyaluronique et une fonction amine du motif RGDS en présence du couple EDCl/NHS (schéma I). Cette réaction de couplage est connue en tant que telle (voir Rowley (1999) « Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials », Genes (2004) « Effect of substrate 10 mechanics on chondrocyte adhesion to modified alginate surfaces » et Hersel (2003) « RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond »). -COOH H2NRGDS -CONHRGDS COOH COOH EDCl/NHS pH= 4,7 COOH -COOH 15 (I) La réaction de couplage entre une fonction acide de l'acide hyaluronique et une fonction amine du motif RGDS est effectuée à température ambiante, via l'ajout stoechiométrique 20 des composés EDCI et NHS dans le milieu réactionnel. Avantageusement on ajoute au milieu réactionnel, une mole d'EDCl/NHS pour une mole de RGDS. En cas d'excès d'EDCl/NHS par rapport au RGDS, des réactions secondaires de réticulation non souhaitées peuvent être observées. L'EDCI (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide aussi connu sous le sigle EDC 25 ayant pour numéro CAS : 1892-57-5) est un réactif de couplage servant d'activateur du groupement carboxylique et favorise la réaction du groupement carboxylique de l'HA avec le N-hydroxysuccinimide. Le N-hydroxysuccinimide (NHS ayant pour numéro CAS : 6066-82-6) est un composé organique couramment utilisé en chimie organique comme activateur d'acides 30 carboxyliques et conduisant à l'obtention d'esters activés (ester de succinate). 3035107 9 Cette réaction de couplage entre une fonction acide de l'acide hyaluronique et une fonction amine du motif RGDS en présence du couple EDCl/NHS est une réaction simple effectuée dans un milieu aqueux permettant de conserver l'intégrité de l'acide hyaluronique. L'absence d'utilisation de solvant coûteux (tel que le DMF ou le 5 dichlorométhane) lors de la réaction de couplage permet de réaliser des économies. De plus, ces solvants étant toxiques, ils doivent être éliminés au moyen d'étapes fastidieuses, afin d'éviter la contamination du produit fini par des substances toxiques pour les cellules cultivées. En effet, l'acide hyaluronique modifié doit être exempt de composés toxiques risquant d'entraver son utilisation finale, notamment comme matrice de culture cellulaire 10 3D. La réaction est préférentiellement réalisée à un pH compris entre 4 et 5, de préférence à un pH compris entre 4,5 et 4,9 , et encore plus préférentiellement à un pH de 4,75 , de manière à ce que les groupements carboxyliques de l'acide hyaluronique soient sous forme protonée, favorisant ainsi la réaction de couplage entre une fonction acide de 15 l'acide hyaluronique et une fonction amine du composé que l'on souhaite greffer. Le taux de greffage peut être déterminé par 1H-RMN. Selon l'invention, le taux de greffage des fonctions acides de l'acide hyaluronique est compris entre 0,5 et 20 % molaire, de préférence 1%. Au-delà d'un taux de greffage de 20% molaire, l'adjonction du motif RGDS induit un encombrement stérique tel, que la réticulation ultérieure de l'acide 20 hyaluronique modifié ne se fait plus de la même manière. Pour un taux de greffage inférieur à 0,5% molaire, l'hydrogel obtenu via la réticulation de l'acide hyaluronique modifié par du RGDS présente un comportement similaire à l'hydrogel obtenu par la simple réticulation de l'acide hyaluronique natif. 3.1.2. Réticulation des HA modifiés en présence de collagènes I par une solution 25 aqueuse et/ou alcoolique d'un agent de réticulation Dans un échafaudage, les molécules d'acide hyaluronique sont réticulées par des liaisons chimiques covalentes appropriées, i.e. via des ponts de type aldéhyde, des ponts disulfures. De nombreuses méthodes de réticulation d'acide hyaluronique pour la préparation d'hydrogels sont connues de l'homme du métier, et notamment décrites dans 30 la publication de Prestwich et al, J. Control.Release, 1998, 53: 93-103. La réticulation des acides hyaluroniques modifiés par du RGDS est effectuée via l'emploi d'une solution aqueuse et/ou alcoolique d'un agent de réticulation tel que l'ADH, et ce, en présence de collagènes de type I (cf. schéma II). La présence d'acide hyaluronique et de collagène de type I au sein de l'hydrogel permet de mimer la matrice extracellulaire et 35 ainsi favoriser la culture cellulaire. 3035107 10 o H,N,N,111.1( N H NH2 ADH ° RGDSNHCO ( 1x106 Da). 30 Le schéma réactionnel du greffage du tetrapeptide RGDS sur l'acide hyaluronique est présenté ci-après (Schéma I). 3035107 22 -COOH H2NRGDS -CONHRGDS COOH COOH EDCl/NHS pH= 4,7 COOH (I) -COOH 5 400 mg d'acide hyaluronique et 17 mg de tetrapeptide RGDS ont été ajoutés et dissous dans 0,1 litre d'eau. 5 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 6 mg d'ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide 10 (EDCI ou 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide ; fourni par TOI Europe) ont été ajoutées sans purification préalable à température ambiante dans la solution aqueuse d'acide hyaluronique contenant le tetrapeptide RGDS précédemment préparée. Les ratios NHS/ acide hyaluronique et d'EDCl/acide hyaluronique ont été ajustés afin d'obtenir des acides hyaluroniques greffés par du RGDS optimisés pour l'adhésion de cellules et pour 15 la culture cellulaire. Le pH, de la solution contenant le tetrapeptide RGDS et l'acide hyaluronique, a été fixé à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. Le mélange a ensuite été agité pendant 12 heures à température ambiante afin d'obtenir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS. La purification du HA greffé par du (ARG-GLY-ASP-SER) RGDS a été effectuée par 20 filtration tangentielle. L'acide hyaluronique greffé par du RGDS a ensuite été placé dans un récipient en plastique, congelé puis lyophilisé dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Le taux de greffage de motif RGDS a été déterminé par 1H-RMN (cf. figure 1) et est de 25 l'ordre de 1%. 4.1.2. Réticulation des HA modifiés en présence de collagènes I et VI par l'ADH Les hydrogels d'acides hyaluroniques modifiés ont été préparés comme le montre le schéma réactionnel suivant (11), à partir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, du collagène de type 1, du collagène de type VI, de l'acide adipique 30 dihydrazide (ADH, fourni par TOI Europe) utilisé comme agent de réticulation et à partir 3035107 23 d'EDCI (i.e. l-éthyl-3 [3- (diméthylamino) propyl] carbodiimide, fourni par TOI Europe)) utilisé comme réactif. o COOH HOOC NH NH2 ADH ° HOOC - H2N-Collagene o -NH NI-LN H_ 5 HOOC CONH -collagene RGDSNHCO RGDSNHCO COOH -COOH COOH EDCl/NHS pH=4,75 (Il) 400 mg d'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, 0,787 mg de 10 collagène de type I, 0,25 mg de collagène de type VI et 1,810 g l'acide adipique dihydrazide (ADH) ont été dissous dans 0,1 litre d'eau milliQ, et le pH de la solution a été ajusté à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. La concentration du HA dans le gel est égale à 4 mg/ml. Le réactif EDCI (220 mg) a été dissout dans 2 ml d'eau milliQ sans purification préalable, 15 puis a été ajouté au mélange réactionnel contenant de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, du collagène de type I, du collagène de type VI et de l'acide adipique dihydrazide. Le mélange réactionnel a ensuite été laissé gélifier pendant 12 heures à température ambiante. La gélification est effectuée la première heure sous agitation douce puis le gel 20 est laissé sans agitation, pendant 11 heures, à température ambiante, afin que le gel puisse se stabiliser. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés obtenus ont ensuite été purifiés par dialyse, i.e. équilibrés dans une solution de NaCI à 0,1 M pendant 2 jours, puis équilibrés dans un mélange eau / éthanol (3/1 en volume) pendant 2 jours, puis équilibrés dans l'eau milliQ 25 pendant 2 jours afin d'éliminer les composés n'ayant pas réagi, tels que l'ADH. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés ont ensuite coulés dans des plaques de culture cellulaire congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Les hydrogels d'acide hyaluronique lyophilisés en forme cylindrique ont ensuite été 30 stockés à -20 ° C. 3035107 24 Les hydrogels cylindriques ont ensuite compressés puis ont été chauffés à 100 ° C pendant 1 heure en utilisant un bain d'huile. Les hydrogels ont ensuite été réhydratés (0,5 mg d'hydrogels lyophilisés introduits dans 100 mg d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique à 2 g/L), transférés dans une plaque 5 de culture cellulaire, congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Les hydrogels ont été ensuite exposés, à une dose de rayonnement gamma de 20 000 Gray afin de les stériliser. Les hydrogels, se présentant sous la forme d'une poudre sèche, sont ensuite stockés à - 10 20°C sous conditions stériles, avant toute réhydratation et utilisation. La présence des collagènes de type I et de type VI dans les hydrogels, i.e. dans la matrice, a été déterminée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (I RTF). 4.1.3. Caractérisation et propriétés physicochimiques des hydrogels Les hydrogels ainsi obtenus ont ensuite été caractérisés. 15 Les mesures rhéologiques sont réalisées sur un rhéomètre HR2. Les tests consistent en un balayage en déformation (2 à 500 Pa) à fréquence constante (2Hz). Il permet de déterminer la zone linéaire de viscoélasticité et de connaître la déformation critique (yc) nécessaire pour briser le réseau d'hydrogel. La détermination des propriétés physicochimiques et l'effet de l'incorporation des 20 collagènes types I et VI dans la matrice a été obtenue par des mesures de taux de gonflement (Q) et des mesures rhéologiques de module élastique (G'), présentés dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 Hydrogel Taux de gonflement (Q) [g/g] Module élastique G' [KPa] Acide hyaluronique seul 75 1x106 Da). Le schéma réactionnel du greffage du tetrapeptide RGDS sur l'acide hyaluronique est présenté ci-après (Schéma I). 5 10 -COOH H2NRGDS -CONHRGDS COOH COOH EDCl/NHS pH= 4,7 COOH (I) -COOH 15 400 mg d'acide hyaluronique et 17 mg de tetrapeptide RGDS ont été ajoutés et dissous dans 0,1 litre d'eau. 5 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 6 mg d'ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI ou 1-éthyl-3-(3-diméthyIaminopropyI)carbodiimide) ont été ajoutées à température 20 ambiante, sans purification préalable, dans la solution aqueuse d'acide hyaluronique contenant le tetrapeptide RGDS précédemment préparée. Les ratios NHS/acide hyaluronique et d'EDCl/acide hyaluronique ont été ajustés afin d'obtenir des acides hyaluroniques greffés par du RGDS optimisés pour l'adhésion de cellules et pour la culture cellulaire. 25 Le pH, de la solution contenant le tetrapeptide RGDS et l'acide hyaluronique, a été fixé à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. Le mélange a ensuite été agité pendant 12 heures à température ambiante afin d'obtenir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS. La purification du HA greffé par du (ARG-GLY-ASP-SER) RGDS a été effectuée par filtration tangentielle. 3035107 26 L'acide hyaluronique greffé par du RGDS a ensuite été placé dans un récipient en plastique, congelé puis lyophilisé dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Le taux de greffage de motif RGDS a été déterminé par 1H-RMN (cf. figure 1) et est de 5 l'ordre de 0,5%. 4.2.2. Modification du HA par greffage d'un motif galactosamine (H2NGal) Dans certains modes de réalisation préférés, les acides hyaluroniques utilisés ont un poids moléculaire élevé (> 1x106 Da). Le schéma réactionnel du greffage du motif H2NGal sur l'acide hyaluronique est présenté 10 ci-après dans le schéma III. COOH H2NGal CONHGal COOH COOH COOH COOH Ye- EDCl/NHS pH= 4,7 15 Une solution aqueuse de galactosamine H2NGal (9 mM dans de l'eau) à température ambiante a été ajoutée progressivement dans une solution aqueuse d'acide hyaluronique (9 mM dans de l'eau) contenant du N-hydroxysuccinimide (NHS) et de 20 l'ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI ou 1-éthy1-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide) à une concentration de 1.8 mM de NHS et 10 mM de EDCI dans de l'eau). Les ratios NHS/ acide hyaluronique et d'EDCl/acide hyaluronique ont été ajustés afin d'obtenir des acides hyaluroniques greffés par de la galactosamine optimisés pour l'adhérence de cellules et pour la culture cellulaire. 25 Le pH, de la solution contenant le motif galactosamine et l'acide hyaluronique, a été fixé à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. Le mélange a ensuite été agité pendant 12 heures à température ambiante afin d'obtenir de l'acide hyaluronique greffé par de la galactosamine. La purification du HA greffé par de la galactosamine a été effectuée par filtration 30 tangentielle. 3035107 27 L'acide hyaluronique greffé par de la galactosamine a ensuite été placé dans un récipient en plastique, congelé puis lyophilisé dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant environ 7 jours. Le taux de greffage a été déterminé par 1H-RMN (cf. figure 2) et est de l'ordre de 12%. 5 4.2.3. Réticulation des HA modifiés en présence de collagènes I et VI par l'ADH Les hydrogels d'acides hyaluroniques modifiés ont été préparés comme le montre le schéma réactionnel suivant (IV), à partir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, de l'acide hyaluronique greffé par de la galactosamine obtenu à l'étape précédente, du collagène de type I, du collagène de type VI, de l'acide adipique 10 dihydrazide (ADH, fourni par TOI Europe) utilisé comme agent de réticulation et à partir d'EDCI (i.e. l-éthyl-3 [3- (diméthylamino) propyl] carbodiimide (EDCI, fourni par TOI Europe)) utilisé comme réactif. o CONHGaI HOOC - H2N,N,111.1( NH NH2 ADH ° CONHGaI HOOC 15 -COOH HOOC COOH RGDSNHCO H2N-Collagene EDCl/NHS pH=4,75 (IV) ( - ji......._....'1NH NH H 'NEI- 0 CONH -collagene RGDSNHCO 200 mg d'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, 200 mg d'acide 20 hyaluronique greffé par de la galactosamine, obtenu à l'étape précédente, 0,8 g de collagène de type I, 0,2 g de collagène de type IV et 1,810 g d'acide adipique dihydrazide (ADH) ont été dissous dans 0,1 litre d'eau milliQ, et le pH de la solution a été ajusté à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. La concentration du HA dans le gel est égale à 4 mg/ml. 25 Le réactif EDCI (220 mg) a été dissout dans de 2 ml d'eau milliQ, puis a été ajouté au mélange réactionnel contenant de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, du collagène de type I, du collagène de type IV et de l'acide adipique dihydrazide. Le mélange réactionnel est ensuite laissé gélifier pendant 12 heures à température 30 ambiante. La gélification est effectuée la première heure sous agitation douce puis le gel 3035107 28 est laissé sans agitation, pendant 11 heures, à température ambiante, afin que le gel puisse se stabiliser. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés obtenus ont ensuite été purifiés par dialyse, i.e. équilibrés dans une solution de NaCI à 0,1 M pendant 2 jours, puis équilibrés dans un 5 mélange eau / éthanol (3/1 en volume) pendant 2 jours, puis équilibrés dans l'eau milliQ pendant 2 jours ou par diafiltration tangentielle afin d'éliminer les composés n'ayant pas réagi, tels que l'ADH. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés ont ensuite été coulés dans des plaques de culture cellulaire congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - 10 performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Les hydrogels d'acide hyaluronique lyophilisés en forme cylindrique ont ensuite été stockés à -20 ° C. Les hydrogels cylindriques ont ensuite été compressés puis ont été chauffés à 100 ° C pendant 1 heure en utilisant un bain d'huile. 15 Les hydrogels ont ensuite été réhydratés. 0,5 mg d'hydrogels lyophilisés comprimés ont été introduits dans 100 mg d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique à 2 g/L, puis ont été transférés dans une plaque de culture cellulaire, congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. 20 Les hydrogels lyophilisés ont été ensuite exposés aux rayonnements gamma, et ce, à une dose de rayonnement de 20 000 Gray afin de les stériliser. Les hydrogels, se présentant sous la forme d'une poudre sèche, sont ensuite stockés à 20°C sous conditions stériles, avant toute réhydratation et utilisation. La présence des collagènes de type I et de type IV dans les hydrogels, i.e. dans la 25 matrice, a été déterminée par infrarouge à transformation de fourrier (I RTF). 4.2.4. Caractérisation et propriétés physicochimiques des hydrogels Les hydrogels ainsi obtenus ont ensuite été caractérisés. La détermination des propriétés physicochimiques et l'effet de l'incorporation des collagènes types I et IV dans la matrice a été obtenue par des mesures de taux de gonflement (Q) et des mesures rhéologiques 30 de module élastique (G'), présentés dans le tableau 2 ci-après. 3035107 29 Tableau 2 hydrogel Taux de gonflement (Q) [g/g] Module élastique G' [KPa] Acide hyaluronique seul 75 1x106 Da). Le schéma réactionnel du greffage du tetrapeptide RGDS sur l'acide hyaluronique est présenté ci-après (Schéma I). 15 -COOH H2NRGDS -CONHRGDS COOH COOH COOH -COOH EDCl/NHS pH= 4,7 20 (I) 400 mg d'acide hyaluronique et 17 mg de tetrapeptide RGDS sont ajoutés et dissous dans 0,1 litre d'eau. 3035107 30 5 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 6 mg d'ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI ou 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide) ont été ajoutées à température ambiante dans la solution aqueuse d'acide hyaluronique contenant le tetrapeptide RGDS précédemment préparée. Les ratios NHS/ acide hyaluronique et d'EDCl/acide 5 hyaluronique ont été ajustés afin d'obtenir des acides hyaluroniques greffés par du RGDS optimisés pour l'adhérence de cellules et pour la culture cellulaire. Le pH, de la solution contenant le tetrapeptide RGDS et l'acide hyaluronique, a été fixé à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. Le mélange a ensuite été agité pendant 12 heures à température ambiante afin d'obtenir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS. 10 La purification du HA greffé par du (ARG-GLY-ASP-SER) RGDS a été effectuée par filtration tangentielle. L'acide hyaluronique greffé par du RGDS a ensuite été placé dans un récipient en plastique, congelé puis lyophilisé dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 7 jours. 15 Le taux de greffage de motif RGDS a été déterminé par 1H-RMN (cf. figure 1) et est de l'ordre de 1%. 4.3.2. Réticulation des HA modifiés en présence de collagènes I par l'ADH Les hydrogels d'acides hyaluroniques modifiés ont été préparés comme le montre le schéma réactionnel suivant (II), à partir de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, 20 obtenu à l'étape 1, du collagène de type I, de l'acide adipique dihydrazide (ADH, fourni par TOI Europe) utilisé comme agent de réticulation et à partir d'EDCI (i.e. l-éthyl-3 [3- (diméthylamino) propyl] carbodiimide, fourni par TOI Europe) utilisé comme réactif. 0 25 COOH HOOC - H2N,jwyNH -COOH COOH HOOC NH2 COOH HOOC ADH ° H2N -Collagene - Il NH NH 0 EDCl/NHS CONH -collagene pH=4,75 RGDSNHCO RGDSNHCO 400 mg d'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, 0,8 mg de 30 collagène de type I et 1,810 g d'acide adipique dihydrazide (ADH) ont été dissous dans 0,1 litre d'eau milliQ, et le pH de la solution a été ajusté à 4,75 par l'ajout d'HCI 0,1 M. 3035107 31 La concentration du HA dans le gel est égale à 4 mg/ml. Le EDCI (220 mg) a été dissou dans 2 ml d'eau milliQ, puis a été ajouté au mélange réactionnel contenant de l'acide hyaluronique greffé par du RGDS, obtenu à l'étape 1, du collagène de type I et de l'acide adipique dihydrazide . 5 Le mélange réactionnel est ensuite laissé gélifier pendant 12 heures à température ambiante. La gélification est effectuée la première heure sous agitation douce puis le gel est laissé sans agitation, pendant 11 heures, à température ambiante, afin que le gel puisse se stabiliser. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés obtenus ont ensuite été purifiés par dialyse, 10 i.e. équilibrés dans une solution de NaCI à 0,1 N pendant 2 jours, puis équilibrés dans un mélange eau / éthanol (3/1 en volume) pendant 2 jours, puis équilibrés dans l'eau milliQ pendant 2 jours ou par diafiltration tangentielle afin d'éliminer les composés n'ayant pas réagi, tels que l'ADH. Les hydrogels d'acide hyaluronique réticulés ont ensuite été coulés dans des plaques de 15 culture cellulaire congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 performances: 2 kg de glace par 24 heures, T = -55 ° C) durant 24 heures. Les hydrogels d'acide hyaluronique lyophilisés en forme cylindrique ont ensuite été stockés à -20 ° C. Les hydrogels cylindriques ont ensuite été compressés puis ont été chauffés à 100 ° C 20 pendant 1 heure en utilisant un bain d'huile. Les hydrogels ainsi comprimés ont ensuite été réhydratés. 0,5 mg d'hydrogels lyophilisés comprimés ont été introduits dans 100 mg d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique à 2 g/L, puis ont été transférés dans une plaque de culture cellulaire, congelés puis lyophilisés dans un lyophilisateur (Alpha 1-2 - performances: 2 kg de glace par 24 heures, 25 T = -55 ° C) durant 24 heures. Les hydrogels ont été ensuite exposés aux rayonnements gamma, et ce, à une dose de rayonnement de 20 000 Gray afin de les stériliser. Les hydrogels, se présentant sous la forme lyophilisée, sont ensuite stockés à -20°C sous conditions stériles, avant toute réhydratation et utilisation.La présence de collagène 30 de type I dans les hydrogels, i.e. dans la matrice, a été déterminée par infrarouge à transformation de fourrier (I RTF). 3035107 32 4.4. Utilisation des hydrogels comme milieu de culture cellulaire Les hydrogels ont été ensuite réhydratés pendant 24 heures dans le milieu de culture cellulaire RPMI 1640 (Eurobio) puis les hydrogels ont ensuite été lavés avec du PBS (D système, France R & D), afin de faciliter la migration et la colonisation des cellules dans 5 les hydrogels. Les hydrogels ont ensuite été ensemencés avec des cellules d'intérêt, des cellules adipocytes. Les hydrogels ont été ensemencés avec 50 pl d'une solution de cellules d'intérêt, de cellules adipocytes. Ont été ajoutés, 1 heure après l'ensemencement de l'hydrogel, 150 pl de milieu de culture cellulaire exempt de cellules afin de favoriser la croissance cellulaire. 10 Ensuite, toutes les 48 heures, le milieu de culture a été extrait et remplacé par un milieu de culture propre afin de favoriser la croissance cellulaire. La matrice cellulaire 3D a ensuite été caractérisée une vingtaine de jours après la mise en culture cellulaire, i.e. l'ensemencement de l'hydrogel de manière à ce que la croissance cellulaire des cellules d'intérêt soit suffisante. La figure 3 montre la croissance cellulaire, observée par 15 microscopie optique inversée, de 40 000 cellules préadipocytes humaines ensemencées sur les hydrogels pour culture cellulaire 3D adipocytes après 1 jour (figure 3 A), 4 jours (figure 3 B), 10 jours (figure 3 C) et 28 jours (figure 3 D) de culture cellulaire. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un hydrogel lyophilisé comprenant au moins les étapes suivantes, dans lequel : (a) on fait réagir une fonction amine du groupement peptidique ARG-GLY-ASP-SER (appelé « RGDS ») sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir un premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié, et (b) on fait réagir ledit premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié avec une solution aqueuse et/ou alcoolique d'un agent réticulant, de préférence de l'acide adipique dihydrazide (ADH), en présence d'au moins un collagène, et de préférence d'au moins un collagène de type I, pour obtenir un hydrogel réticulé, (c) on lyophilise l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b); et (d) on stérilise l'hydrogel lyophilisé obtenu à l'étape (c). 2. Procédé de fabrication d'un hydrogel lyophilisé selon la revendication 1, dans lequel: (a) on fait réagir une fonction amine du groupement peptidique ARG-GLY-ASP-SER (RGDS) sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir un premier acide hyaluronique au moins partiellement modifié, et (a') on fait réagir une fonction amine du galactosamine (H2NGal) sur une fonction acide de l'acide hyaluronique, pour obtenir un second acide hyaluronique au moins partiellement modifié, (b) on fait réagir ledit premier et/ou ledit second acide hyaluronique au moins partiellement modifié avec une solution aqueuse et/ou alcoolique d'un agent réticulant, de préférence de ['acide adipique dihydrazide (ADH) en présence d'au moins un collagène, et de préférence d'au moins un collagène de type I, pour obtenir un hydrogel réticulé, (c) on lyophilise l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b); et (d) on stérilise l'hydrogel lyophilisé obtenu à l'étape (c). 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape (a), l'étape (a') et/ou l'étape (b) est effectuée à un pH compris entre 4,0 et 5,0, et de préférence à un pH compris entre 4,5 et 4,9 , et encore plus préférentiellement à un pH de 4,75. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (a), l'étape (a') et/ou l'étape (b) est effectuée en présence d'EDCI et de NHS. 3035107 34 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le solvant de la solution alcoolique d'un agent réticulant de l'étape (b) est choisi parmi l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le butanol. 5 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les collagènes employés à l'étape (b) sont de type I et IV. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les collagènes employés à l'étape (b) sont de type I et VI. 10 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'étape (d) de stérilisation de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) est effectuée par exposition de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) à des rayonnements ionisants, et plus particulièrement par exposition de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) aux rayonnements gamma. 15 9. Procédé selon les revendications précédentes dans lequel entre l'étape (c) de lyophilisation de l'hydrogel réticulé obtenu à l'étape (b) et l'étape (d) de stérilisation de l'hydrogel obtenu à l'étape (c) sont effectués : une étape de compression physique de l'hydrogel lyophilisé, 20 et un traitement thermique de l'hydrogel, ce traitement thermique étant effectué, de préférence, par chauffage dans une gamme de température comprise entre 45°C et 110°C. 10. Produit susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 9. 11. Hydrogel susceptible d'être obtenu à partir du produit selon la revendication 10 et à partir d'un liquide aqueux, ledit liquide aqueux comprenant possiblement du sérum et/ou un milieu de culture de cellules. 30 12. Utilisation d'un produit selon la revendication 10 ou d'un hydrogel selon la revendication 11, dans un milieu pour la culture cellulaire 3D ou dans un milieu pour le transport de cellules. 35 13. Utilisation selon la revendication 12 pour la culture ou le transport de cellules de type adipocytes ou de cellules de type hépatocytes.