FR 3034419 A1 20161007 FR 1552850 A 20150402 1 PROCEDE DE PURIFICATION D'UNE PROTEINE RECOMBINANTE THERAPEUTIQUE A PARTIR D'UN LAIT TRANSGENIQUE Domaine de l'invention L'invention concerne la purification de protéines thérapeutiques produites de manière recombinante dans un fluide biologique issu d'un animal transgénique. Arrière-plan technologique Les biomédicaments, en particulier les protéines thérapeutiques, sont une source majeure d'innovation et représentent aujourd'hui près de la moitié des nouvelles molécules enregistrées dans le monde. En mai 2013, près de 170 biomédicaments étaient commercialisés en France, parmi lesquels les anticorps monoclonaux recombinants constituent une classe thérapeutique importante, en particulier pour le traitement du cancer et de certaines maladies auto-immunes ou encore pour la prévention du rejet de greffe (Leem, Biomédicaments en France et états des lieux, 2013). La grande majorité des protéines thérapeutiques sont produites de manière recombinante. 11 existe de nombreux systèmes d'expression tels que les organismes unicellulaires (bactéries ou levures), les cellules d'insecte (système baculovirus/cellule d'insecte) ou encore les plantes transgéniques. Néanmoins, ces systèmes d'expression présentent de nombreuses limitations, en particulier en lien avec un repliement protéique imparfait, l'impossibilité de produire des protéines complexes tels que les immunoglobulines ou encore une glycosylation incomplète ou différente de celle retrouvée chez l'homme. Les systèmes d'expression les plus utilisés dans l'industrie pharmaceutique sont, à l'heure actuelle, les cellules de mammifère. A titre d'exemple, le principe actif de MabThera®, un 25 anticorps chimérique anti-CD20 pour le traitement du lymphome non-hodgkinien, est produit de manière recombinante dans la lignée cellulaire CHO (Chinese Ovary Hamster). Les cellules mammifères permettent la production de protéines recombinantes avec des motifs de glycosylation très proches de celles des protéines endogènes humaines mais offrent généralement des rendements de production faibles. 30 La nécessité industrielle de produire des protéines thérapeutiques avec un haut rendement à conduit l'industrie pharmaceutique à considérer l'utilisation d'animaux transgéniques mammifères, tels que les vaches, les lapines ou les chèvres, en tant que systèmes d'expression. Dans cette approche, l'expression de la protéine recombinante est dirigée au niveau des cellules épithéliales mammaires. La protéine recombinante est ainsi sécrétée dans 3034419 2 le lait et peut être récupérée à partir de ce fluide par des procédés d'extraction et de purification. A titre d'exemple, l'Atryn®, une antithrombine recombinante humaine, approuvée par la FDA et l'EMEA pour le traitement préventif des thrombo-embolies veineuses chez des patients présentant un déficit congénital en antithrombine est produite 5 dans le lait de chèvres transgéniques (Houdebine, Comparative Immunology Microbiology & Infectious Disease, 2009, 32, 107-121). Plusieurs demandes et brevets décrivent la préparation de protéines thérapeutiques dans le lait transgénique. Notamment, le brevet EP 0 741 515 et la demande W02004/050847 décrivent la production d'anticorps recombinants. A titre d'exemple supplémentaire, on peut également 10 citer les travaux de Wei et al. concernant l'expression de l'anticorps chimérique chHab 18 dans le lait de souris transgéniques (Transgenic Res. 2011, 20, 321-330). Bien que les animaux transgéniques permettent d'obtenir des niveaux d'expression satisfaisants, l'extraction et la purification de la protéine recombinante à partir du lait demeure une des étapes limitantes de ces systèmes d'expression. 15 En effet, le lait est un fluide biologique complexe contenant environ 87% en poids d'eau et 13% en poids de matière sèche. Il comprend des lipides, essentiellement des triglycérides, présents sous forme d'émulsion, des protéines, dont la caséine, des sucres, en particulier le lactose, et des constituants secondaires tels que des vitamines et des oligoéléments. On distingue généralement trois phases dans le lait : 20 - le lactosérum comprenant les glucides, les oligoéléments, les séroprotéines et les vitamines hydrosolubles, dans lequel sont dispersées : - une phase lipidique ou crème composée essentiellement de lipides sous forme d'émulsion de globules gras d'environ 2 à 6 !lm de diamètre, et - une phase micellaire colloïdale résultant de l'association de protéines de caséine et de sels de phosphate de calcium. La protéine recombinante peut, selon sa nature, être présente dans le lactosérum, être associée aux globules gras et/ou être piégée dans les micelles de caséine, ce qui complique d'autant plus son extraction. Il a été proposé des méthodes d'extraction d'anticorps recombinants à partir du lait transgénique. Par exemple, la demande WO 97/42835 décrit un procédé d'extraction d'anticorps monoclonaux à partir de lait de chèvre comprenant une étape d'ultrafiltration tangentielle du lait brut, en présence d'EDTA, suivie d'une étape de chromatographie du perméat sur un support d'affinité en protéine G. 3034419 3 La demande WO 2004/050847 mentionne, quant à elle, qu'il serait possible d'extraire les anticorps recombinants présents dans un lait transgénique en mettant en oeuvre des étapes d'écrémage, de centrifugation, de sédimentation et/ou de fractionnement. Néanmoins, la demande WO 2004/050847 ne fournit aucun exemple précis de mise en oeuvre d'un procédé 5 de purification. De même, la demande WO 2007/106078 décrit un procédé d'extraction d'une protéine recombinante présente dans un lait transgénique comprenant une étape de filtration en profondeur, mais ne propose aucune application concrète à la purification d' anticorps recombinants. 11 existe donc, à l'heure actuelle, un besoin pour de nouvelles méthodes de purification de 10 protéines thérapeutiques recombinantes à partir d'un lait transgénique ou de solution protéique dérivant d'un lait transgénique. Résumé de l'invention L'invention a pour objet un procédé de purification d'une protéine recombinante à partir d'un 15 lait transgénique ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique, comprenant une étape de clarification à l'aide d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium), de préférence le poly(diallyldiméthylammonium chlorure) (pDADMAC). Dans certains modes de réalisation, la protéine recombinante est choisie parmi les hormones, les cytokines, les protéines impliquées dans la réponse immunitaire, les anticorps, et les facteurs et les 20 inhibiteurs de la coagulation. De préférence, la protéine recombinante est un anticorps. Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, l'étape de clarification comprend : l'ajout du sel de poly(diallyldiméthylammonium) audit lait transgénique ou à ladite solution de manière à former une phase liquide comprenant la protéine recombinante, et 25 un floculat, et la séparation du floculat et de la phase liquide, de manière à récupérer la phase liquide comprenant la protéine recombinante. La teneur finale du sel de poly(diallyldiméthylammonium) dans le lait ou la solution peut être comprise dans une gamme allant de 0,01 g/L à 20,0 g/L. Ledit lait ou ladite solution peut être 30 incubé(e) à une température de 20°C à 60°C, après l'addition du sel de poly(diallyldiméthylammonium). La séparation de la phase liquide et du floculat peut être réalisée par un procédé choisi parmi un pressage mécanique et un égouttage. 3034419 4 Dans certains modes de réalisation, l'étape de clarification est réalisée sur un lait transgénique brut ayant subi éventuellement un ou plusieurs traitements choisis parmi une congélation, une décongélation, et une pasteurisation. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre au moins une étape de purification 5 supplémentaire de préférence choisie dans le groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie 10 multimodale, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci. Dans un mode de réalisation, le procédé de purification comprend au moins une étape de chromatographie multimodale. A titre d'exemple, le procédé peut comprendre deux étapes de chromatographie multimodale Dans un autre mode de réalisation, le procédé de purification selon l'invention comprend une 15 étape d'élimination et/ou d'inactivation des pathogènes résiduels. Le procédé selon l'invention peut comprendre une, plusieurs, ou toutes les caractéristiques suivantes : la solution de lait est un lait transgénique brut, et/ou la protéine recombinante est un anticorps humain, humanisé ou chimérique, et/ou 20 le sel de pDADMA est un pDADMAC ayant un poids moyen moléculaire compris entre 100 000 et 500 000 g.mo1-1, et/ou dans l'étape de précipitation, la concentration finale du sel de pDADMA est de 2,0 g/L à 5,0 g/L, et/ou le procédé comprend au moins une étape de chromatographie multimodale réalisée en aval 25 de l'étape de clarification, et/ou le procédé comprend au moins une étape de purification choisie parmi une microfiltration, une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de 30 cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, et une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et/ou le procédé comprend une étape de pasteurisation réalisée en amont de l'étape de clarification, et/ou 3034419 5 l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA est la seule étape de clarification du procédé, et/ou le procédé ne comprend pas d'étape d'écrémage réalisée en amont de l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA. 5 Le procédé de purification selon l'invention peut, par exemple, comprendre la combinaison d'étapes suivantes: a. la pasteurisation du lait transgénique ou de ladite solution, b. une étape de clarification du lait transgénique pasteurisé ou de ladite solution pasteurisée 10 par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, c. la mise en oeuvre d'une étape de chromatographie multimodale sur la solution clarifiée obtenue à l'étape c., éventuellement après ajustement du pH ou de la conductivité de ladite solution, d. en option, la mise en oeuvre d'une ou plusieurs étapes de purification supplémentaire sur 15 la solution de protéine recombinante issue de l'étape d., de préférence choisies dans le groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, 20 une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci, et e. au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels, de préférence par nanofiltration stérilisante. 25 L'invention a également pour objet une méthode de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante, ladite méthode comprenant : la fourniture d'une protéine recombinante par la mise en oeuvre d'un procédé de purification selon l'invention, tel que défini ci-avant, et le mélange de la protéine recombinante avec un ou plusieurs excipients acceptables sur le 30 plan pharmaceutique. Un objet supplémentaire selon l'invention est l'utilisation d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium), de préférence le pDADMAC, en tant qu'agent de clarification pour la purification d'une protéine thérapeutique à partir d'un lait transgénique, ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique. 3034419 6 Figures Les Figures 1A, 1B et 1C montrent les résultats des expériences de clarification d'un lait transgénique décrites dans l'Exemple 1. Le terme « Floculent » désigne le pDADMAC. 5 La Figure lA montre la clarté du surnageant pour chaque agent clarifiant testé. La clarté correspond à 1/turbidité, la turbidité de chaque surnageant ayant été déterminée par absorbance à 400 nm. Plus la valeur de la clarté est élevée, plus l'agent clarifiant est efficace. La Figure 1B montre la teneur en anticorps recombinant (mg) dans le surnageant obtenu pour chaque agent clarifiant. La teneur en anticorps a été déterminée par néphélémetrie. 10 La Figure 1C montre la pureté protéique en anticorps (par rapport aux protéines totales) dans chaque surnageant ; la pureté protéique en anticorps a été déterminée à partir des gels SDS PAGE selon la technique de Laemmli. La Figure 2 montre le gel d'électrophorèse obtenu en SDS PAGE (coloration au bleu de Coomasie) pour les surnageants issus des différentes conditions de clarification testées et 15 résumées dans le tableau de l'Exemple 2. Pour chaque composé, le gel de gauche correspond à la concentration « basse » testée et le gel de droite correspond à la concentration haute testée. La Figure 3 montre un diagramme décrivant les étapes d'un procédé de purification selon l'invention. La mise en oeuvre de ce procédé est exemplifiée à l'Exemple 4. 20 Description détaillée A la connaissance des Inventeurs, le poly(diallyldiméthylammonium chlorure) (pDADMAC) est un agent de floculation principalement utilisé dans l'industrie chimique, en particulier dans le domaine du traitement de l'eau et de l'industrie papetière. 25 Les Inventeurs ont montré, de manière surprenante, que le poly(diallyldiméthylammonium chlorure) (pDADMAC) peut être utilisé comme agent de clarification pour la purification d'une protéine thérapeutique recombinante à partir d'un lait transgénique. En effet, le pDADMAC permet de précipiter une proportion importante des micelles de caséines et des globules gras présents dans le lait tout en maintenant la protéine recombinante en solution. 30 En particulier, les Inventeurs ont montré que l'ajout de pDADMAC dans un lait transgénique comprenant un anticorps recombinant induit la formation d'un système multiphasique comprenant : - un surnageant se présentant sous la forme d'une solution de faible turbidité, quasiment limpide, riche en anticorps recombinants, et 3034419 7 une phase présentant une turbidité élevée comprenant la majeure partie des micelles de caséine et des globules gras du lait de départ, sous la forme d'un floculat (également appelé floc ou dépôt laitier). Le surnageant riche en anticorps recombinants peut être récupéré par une étape classique de 5 séparation liquide/solide par exemple par une étape de pressage mécanique, d'égouttage ou de filtration. Ainsi, par une seule et unique étape de clarification, les Inventeurs ont obtenu une solution pré-purifiée d'anticorps recombinant, débarrassée de la quasi-totalité des globules gras et des caséines présents dans le lait de départ et présentant une turbidité inférieure à 0,1, avec un Mode général de réalisation du procédé de purification selon l'invention Ainsi, un premier objet selon l'invention est l'utilisation d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium) en tant qu'agent de clarification pour la purification d'une 15 protéine recombinante à partir d'un lait transgénique, ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de purification d'une protéine recombinante à partir d'un lait transgénique ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique, comprenant une étape de clarification à l'aide d'un sel de 20 poly(diallyldiméthylammonium). Au sens de l'invention, on entend par « clarification» le fait de diminuer la turbidité d'une solution. En d'autres termes, une étape de clarification permet de diminuer la quantité de particules en suspension dans une solution. Dans le cas d'une solution de lait, l'étape de clarification permet d'éliminer, au moins partiellement, les colloïdes de caséine et/ou les 25 globules gras en suspension. Au sens de l'invention, on entend par «protéine recombinante » une protéine dont l'expression chez l'animal transgénique résulte de l'introduction d'un gène hétérologue dans son génome. Les méthodes permettant de produire des animaux transgéniques exprimant une protéine recombinante dans leur lait sont bien connues de l'homme du métier. A titre 30 d'exemple, l'homme du métier peut se référer au brevet EP 0 741 515, à la demande WO 2004/050847 ou encore à l'article de synthèse de Houdebine, 2009, supra. Le gène hétérologue codant pour la protéine recombinante est de préférence sous le contrôle d'un promoteur dirigeant son expression au niveau des cellules épithéliales mammaires. Par exemple, il peut s'agir d'un promoteur 10 rendement de l'ordre de 80% en anticorps recombinant. 3034419 8 caséine, un promoteur de la lactalbumine, un promoteur de WAP (whey acidic protein), ou encore un promoteur de la béta-lactoglobuline, cette liste n'étant pas exhaustive. L'animal transgénique peut être choisi parmi une chèvre, une vache, une lapine, une truie, une souris, une brebis ou une chamelle. De préférence, l'animal transgénique est une chèvre, une truie ou 5 une lapine. La protéine recombinante peut être de tout type. De préférence, il s'agit d'une protéine recombinante destinée à une utilisation en médecine humaine ou vétérinaire. Il peut s'agir d'une protéine humaine ou d'un variant d'une protéine humaine. A titre d'exemple de «protéines recombinantes » d'intérêt que l'on souhaite exprimer chez 10 un animal transgénique, on peut citer les hormones, les cytokines, les protéines impliquées dans la réponse immunitaire, par exemple le facteur H, les anticorps thérapeutiques, des fragments d'anticorps tel que le fragment Fc ou les fragments Fab ou F(ab')2 ou des fragments monodomaines (dAb, nanobodies), ainsi que les facteurs et les inhibiteurs de la coagulation. Les cytokines comprennent, entre autres, les interférons, les interleukines, 15 chimiokines appelées aussi chémokines, le facteur de nécrose tumorale, les facteurs de croissance. Les hormones comprennent, entre autres l'insuline, l'érythropoiétine, les hormones stéroïdiennes, l'hormone de croissance. Les facteurs de la coagulation comprennent le facteur VII, (FVII), le facteur VIII (FVIII), le facteur X (FX), le facteur IX (Facteur IX), le facteur XI (FXI), le facteur XII (FXII), le facteur XIII (FXIII), le facteur II (prothrombine), 20 l'antithrombine III (AT III), le cofacteur II de l'héparine (Hal), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur V (FV), le facteur de von Willebrand (vWF), l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI). Selon un mode particulier, la protéine recombinante peut être un variant d'une protéine sauvage c'est-à-dire une protéine présentant une ou plusieurs mutations par rapport à la protéine sauvage. Dans un autre mode 25 de réalisation, la protéine recombinant peut être une protéine chimérique ou de fusion, par exemple comprenant des domaines protéiques provenant de protéines sauvages différentes. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine recombinante que l'on souhaite purifier est un anticorps recombinant. Le terme « anticorps » doit être compris comme englobant tout polypeptide comprenant un 30 domaine de liaison dérivant d'une partie variable d'une immunoglobuline, ledit domaine de liaison étant capable de reconnaître spécifiquement un épitope et comprenant un ou plusieurs domaines CDR (Complementary Determining Regions). De préférence, l'anticorps recombinant selon l'invention comprend au moins une partie variable couplée à une région Fc. Par "Fc" ou "région Fc", on entend un polypeptide comprenant la région constante d'une 3034419 9 immunoglobuline (à l'exception du premier domaine constant CH1). Pour les IgG, la partie Fc comprend les domaines CH2 et CH3 et éventuellement la partie basse de la région charnière (« hinge region »). L'anticorps recombinant selon l'invention peut être un anticorps chimérique, un anticorps humanisé, un anticorps humain ou encore une protéine de fusion 5 comprenant au moins une région variable d'une immunoglobuline fusionnée à un polypeptide d'intérêt, par exemple un polypeptide présentant une activité thérapeutique, un polypeptide permettant un ciblage cellulaire ou tissulaire, ou encore un polypeptide facilitant la purification ultérieure de l'anticorps. De préférence, l'anticorps recombinant est un anticorps humain, chimérique ou humanisé d'isotype G (IgG), par exemple une IgGl, IgG2, IgG3 ou 10 IgG4, d'une IgA, d'isotype M (IgM), d'isotype D (IgD) ou d'isotype E (IgE), comprenant, en option, une ou plusieurs mutations dans sa partie Fc. L'anticorps recombinant peut être un anticorps bloquant ou neutralisant. L'anticorps recombinant selon l'invention peut être dirigé contre n'importe quelle cible thérapeutique d'intérêt. Il peut s'agir d'un anticorps dirigé contre un récepteur membranaire, une cytokine, une interleukine, une hormone, une toxine, 15 une enzyme, un co-facteur d'enzyme, une protéine virale ou bactérienne, un facteur de croissance, un pathogène, une protéine plasmatique, une protéine cellulaire, une protéine du noyau cellulaire, de l'ADN ou de l'ARN. A titre d'exemple illustratif et non-limitatif, il peut s'agir d'un anticorps anti-RhD, anti-CD20, anti-TNFa, anti-CD137, anti-HBs, anti-toxine tétanique, ou encore anti-CMV. 20 A titre d'exemple de références décrivant la production d'anticorps recombinants dans un lait transgénique, on peut citer l'article de Pollock et al. Journal of Immunological Methods. , 1999, 231: 147-157) ou encore la demande internationale WO 2014125374 au nom de la Demanderesse qui décrit la production d'un anticorps anti-TNFa chez un animal transgénique. Un anticorps particulièrement préféré est un anticorps anti-TNFa tel 25 que adalimumab. Au sens de l'invention, on entend par « lait transgénique » un lait obtenu à partir d'un animal transgénique, c'est-à-dire à partir d'un animal qui a été génétiquement modifié de manière à ce qu'il produise une protéine recombinante d'intérêt dans son lait. Au sens de l'invention, un « lait transgénique » englobe un lait transgénique ayant subi éventuellement une 30 congélation/décongélation et/ou une étape de stérilisation ou de pasteurisation. On entend par « solution protéique dérivée, ou obtenue à partir, dudit lait ou du lait transgénique », également appelée ci-après « solution obtenue à partir dudit lait » une solution qui comprend la protéine recombinante que l'on souhaite purifier et qui a été obtenue 3034419 10 à partir d'un lait transgénique par la mise en oeuvre d'une ou plusieurs étapes de traitement ou de purification, telles que des étapes de fractionnement, d'inactivation virale et/ou de supplémentation. Les solutions protéiques dérivées dudit lait comprennent, sans y être limitées, un lait dans lequel un ou plusieurs constituants endogènes ont été au moins 5 partiellement éliminés, par exemple un lait écrémé, un lait partiellement clarifié, mais aussi un lait ayant subi une inactivation virale ou une stérilisation, un lait dilué, par exemple par ajout d'une solution tampon, un lait concentré, un lait supplémenté avec un agent conservateur, un agent antioxydant ou tout autre agent, par exemple une enzyme, un agent d'inactivation virale, ou encore un lait dont les constantes de pH et/ou de conductivité ont été modifiées, par 10 exemple, par ajout d'un acide, d'une base et/ou d'un électrolyte. La solution obtenue à partir d'un lait transgénique comprend un ou plusieurs contaminants, notamment des protéines endogènes du lait et/ou des lipides du lait. A titre d'exemple, ladite solution ou ledit lait peut comprendre au moins 5 g/1, voire au moins 10 g/1, de protéines endogènes notamment des caséines contaminantes. Dans certains modes de réalisation, le 15 rapport massique «protéine recombinante/protéines totales » dans la solution de lait est inférieur à 0,6, de préférence inférieur à 0,5, voire inférieur à 0,4 et même inférieur à 0,3. La quantité massique de «protéines totales » peut être déterminée par les techniques de dosage des protéines totales telles que la technique du Biuret, du BCA (dosage protéique par l'acide BiCinchoninique), du Bradford, du Bleu de Coomassie, de la détermination de l'azote 20 organique selon Kjeldahl, de l'absorption en UV ou en IR, de préférence par la méthode BCA. La quantité massique de la « protéine recombinante » peut être déterminée par des techniques spécifiques immunologiques telles que ELISA, EIA, RIA, Nephélémétrie ou spécifiques biologique et/ou biochimique comme un dosage enzymatique, un dosage cellulaire, un dosage de binding spécifique par résonnance plasmonique de surface 25 (exemple sur BiaCore). De préférence, la quantité massique de protéine recombinante est déterminée par un test ELISA. Les «protéines totales » comprennent la protéine recombinante à purifier ainsi que les protéines contaminantes, en particulier les caséines et les protéines du lactosérum. De préférence, la solution obtenue à partir du lait transgénique se présente sous la forme 30 d'une solution colloïdale. A des fins de concision, l'expression « solution de lait » désigne à la fois « le lait transgénique » et « la solution protéique obtenue à partir du lait transgénique ». On entend par « lait écrémé » un lait dont les lipides, en particulier sous forme de globules gras, ont été au moins partiellement éliminés, par exemple par ultrafiltration, filtration en 3034419 11 profondeur, ou centrifugation. Au sens de l'invention, on entend par «partiellement éliminé une entité présente dans une solution», le fait de réduire la quantité de cette entité d'au moins 5%, de préférence d'au moins 10%, par exemple d'au moins par 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ou encore d'au moins 70% par rapport à la quantité initiale de cette entité dans la solution 5 Au sens de la présente invention, on entend par « sel de poly(diallyldiméthylammonium) » (ci- après sel de pDADMA) un polymère de diallyldiméthylammonium, c'est-à-dire comprenant le motif suivant : - - n - - dans lequel n représente le nombre d'unités de monomère et X- est un contre-anion. De 10 préférence, n est supérieur ou égal à 100, de préférence inférieur ou égal à 5000. Les polymères de pDADMA se présentent généralement comme une population de polymères. De préférence, le sel de pDADMA présente un degré moyen de polymérisation, c'est-à-dire un nombre moyen d'unités de monomères par chaîne polymérique, allant de 500 à 4000, de 15 préférence de 1000 à 3000. X- est de préférence choisi parmi les anions acceptables sur le plan pharmaceutique. X- peut être par exemple choisi parmi les anions suivants : un halogénure en particulier un chlorure ou un bromure, un sulfate, un bisulfate, un acétate, un maléate, un bisulfate, un phosphate, un carbonate ou leurs combinaisons. 20 De préférence, X- est un halogénure, en particulier or. Un sel de poly(diallyldiméthylammonium) particulièrement préféré au sens de l'invention est le poly(chlorure de diallyldiméthyl ammonium), dénommé ci-après pDADMAC. Un pDADMAC adapté présente typiquement un poids moléculaire moyen allant de 70 000 g.mo1-1 à 700 000 g.mo1-1 de préférence allant de 100 000 à 500 000 g.mo1-1, par exemple de 25 200 000 à 350 000 g.mo1-1. L'étape de clarification est réalisée dans des conditions permettant de floculer voire de précipiter, au moins partiellement, un ou plusieurs constituants du lait tout en maintenant à 3034419 12 l'état soluble, au moins une partie de l'anticorps initialement présent dans la solution de départ. On entend par «floculer » le fait d'induire l'agglomération des particules en suspension dans la solution de lait, telles que les globules gras et les micelles de caséines, de manière à générer 5 des particules de plus grosses tailles appelés floculat ou focs. On entend par « constituant du lait » tout constituant endogène du lait, tels que la caséine, les protéines du lactosérum telles que la P-lactoglobuline, l'a-lactalbumine, l'albumine ou la lactoferrine, les lipides du lait, en particulier les triglycérides. De préférence, l'étape de clarification permet d'éliminer, au moins partiellement, les micelles de caséine et les lipides 10 sous forme de globules gras présents initialement dans ledit lait ou ladite solution. Typiquement, le sel de pDADMA peut être ajouté à la solution de lait, soit sous forme pure, soit sous la forme d'une solution. L'ajout peut être éventuellement effectué sous agitation, à une température comprise entre 2°C et 40°C. L'ajout du sel de pDADMA peut être fractionné ou étalé dans le temps, par exemple sur une durée de quelques minutes à une heure. 15 Après l'ajout du sel de pDADMA, la solution de lait peut être incubée à une température comprise entre 2°C et 60°C, le temps nécessaire à l'obtention du floculat, typiquement pendant quelques minutes à quelques heures, par exemple de 10 minutes à 24 heures. De manière avantageuse, la température d'ajout et d'incubation est comprise dans une gamme allant de 20°C à 50°C, de préférence de 30°C à 50°C. Une température particulière préférée 20 est comprise dans la gamme allant de 35°C à 50°C. Une température d'ajout et d'incubation adaptée est par exemple 37°C± 1°C. La quantité de sel de pDADMA à ajouter dans l'étape de clarification dépend de la composition de la solution de lait. Généralement, une concentration finale en sel de pDADMA comprise dans une gamme allant de 0,01 g/L à 20,0 g/L est suffisante pour obtenir 25 une clarification satisfaisante. De préférence, la concentration du sel de pDADMA est comprise dans une gamme allant de 0,5 g/L à 15,0 g/L, par exemple de 1,0 g/L à 10,0 g/L. Une concentration finale du sel de pDADMA adaptée peut être comprise dans une gamme allant de 1,0 g/L à 5,0 g/L, par exemple dans une gamme allant de 2 g/L à 5 g/L, voire dans une gamme allant de 3,0 g/L à 4,0 g/L, en particulier pour le pDADMAC. 30 Les Inventeurs ont montré que le pH initial de la solution de lait (c'est-à-dire du lait transgénique ou de la solution obtenue à partir du lait) n'a pas d'impact significatif sur la capacité du sel de pDADMA à précipiter les micelles de caséines et les globules gras. Le pDADMA est généralement capable de floculer les micelles de caséine et les globules gras du lait sur une gamme de pH allant de 5,0 à 11,0; en particulier de pH 6,0 à 10,0. Le pH initial 3034419 13 de la solution peut donc être choisi en fonction des propriétés de solubilité de la protéine recombinante que l'on souhaite purifier. A titre d'exemple, un pH initial allant de 6,0 à 10,0, typiquement de 6,5 à 9,5 est adapté pour purifier une immunoglobuline recombinante à partir d'un lait transgénique. 5 Dans un mode de réalisation préféré, le sel de pDADMA est ajouté sous la forme d'une solution aqueuse présentant typiquement une concentration en sel de pDADMA de 50 g/L à 450 g/L, par exemple de 100 g/L à 400 g/L. De telles solutions, en particulier les solutions aqueuses de pDADMAC, sont disponibles dans le commerce. Comme expliqué ci-avant, l'ajout du sel de pDADMA entraîne la floculation des micelles de 10 caséine et des lipides du lait, la protéine recombinante restant majoritairement sous forme soluble, dans la phase aqueuse. Le mélange ainsi obtenu peut être directement utilisé dans une étape ultérieure de purification. Néanmoins, afin d'améliorer le rendement global du procédé de purification, il est préférable d'éliminer le floculat formé consécutivement à l'ajout du sel de pDADMA avant la mise en oeuvre des étapes ultérieures de purification. 15 Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'étape de clarification comprend en outre une étape de séparation visant à éliminer le floculat formé. En d'autres termes, l'étape de clarification peut comprendre : - l'ajout d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium) à la solution de lait de manière à former unfloculat, et 20 - l'élimination du floculat ainsi formé, de manière à récupérer la solution comprenant la protéine recombinante. L'étape d'élimination du floculat peut être précédée d'une étape d'incubation de la solution de lait. La séparation du floculat et de la phase aqueuse comprenant la protéine recombinante peut être réalisée par toute méthode de séparation connue de l'homme du métier. A titre 25 d'exemple, on peut utiliser une technique classique de séparation liquide/solide de l'industrie agroalimentaire telle que l'égouttage ou le pressage mécanique. Le cas échéant, l'étape de séparation peut être réalisée par centrifugation et/ou filtration, par exemple par microfiltration tangentielle ou la filtration en profondeur. Au sens de l'invention, on entend par «filtration en profondeur », un procédé de filtration 30 dans lequel le lit de filtration dans sa totalité est utilisé pour piéger les particules en suspension dans le fluide. Le fluide traverse ainsi le lit de filtration dans sa totalité, les particules étant piégées à la surface du lit de filtration ainsi que dans les vides et/ou les pores du lit de filtration. La filtration en profondeur peut être réalisée sur des matrices à base de fibres de cellulose, de cellulose régénérée, de polypropylène, ou de leurs combinaisons. Ces 3034419 14 matrices de filtration peuvent comprendre des composés minéraux tels que de la perlite, les diatomites et la silice pyrogénée. Les Inventeurs ont montré que, dans certains cas, la mise en oeuvre d'une étape de séparation sophistiquée, telle que la filtration en profondeur, n'était pas nécessaire pour éliminer de 5 manière optimale le floculat. L'utilisation d'une technique de séparation simple telle qu'un égouttage, un pressage ou un pompage sous vide à travers une membrane, un fritté ou une toile, par exemple une toile tissée telle qu'une toile en nylon ne nuit pas à la clarté et à la pureté de la solution de protéine recombinante récoltée. Ainsi, dans certains modes de réalisation, l'étape d'élimination du floculat est réalisée : 10 - par pressage mécanique : Le pressage mécanique peut être réalisé, par exemple, à l'aide d'une enveloppe en toile telle qu'une toile de nylon. La toile de nylon peut être positionnée dans un support résistant à la pression, par exemple en inox, et permettant le récolte du liquide clarifié, ou - par égouttage : l'égouttage peut être également réalisé à l'aide d'une toile de préférence 15 nylon positionnée dans un support, par exemple composite, permettant au liquide clarifié de passer librement à travers le dit support par simple gravité. L'étape de clarification selon l'invention se caractérise généralement par un rendement en protéine recombinante d'au moins 60%, de préférence d'au moins 70%. 20 Typiquement, la mise en oeuvre de l'étape de clarification permet de diminuer d'au-moins un facteur 10, de préférence un facteur 100, voire un facteur 1000, la turbidité de la solution. De préférence, comme cela est illustré dans les exemples, la turbidité est déterminée par spectrophotométrie à la longueur d'onde d' absorbance de 400 nm. La turbidité peut également être mesurée par diffraction de lumière par exemple dans un turbidimètre, appareil 25 permettant de normaliser la turbidité en NTU (normal turbidity unit). L'étape de clarification permet généralement de diminuer la turbidité de la solution à une valeur mesurée en absorbance à 400 nm inférieure à 0,8, de préférence inférieure à 0,5, de manière encore plus préférée inférieure à 0,4, par exemple inférieure à 0,3 ou inférieure à 0,2. L'étape de clarification peut également permettre de diminuer la quantité de caséine d'au 30 moins 20%, de préférence d'au moins 30%, par exemple d'au moins par 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore d'au moins 90% par rapport à la quantité initiale de caséine présente dans la solution, avant la mise en oeuvre de l'étape de clarification. Dans le cadre de la présente invention, les teneurs en protéines, par exemple en protéine recombinante ou en caséine, peuvent être déterminées par néphélémétrie et ELISA. 3034419 15 De manière alternative ou additionnelle, l'étape de clarification peut permettre de diminuer la quantité de lipides en particulier de triglycérides d'au moins 20%, de préférence d'au moins 30%, par exemple d'au moins par 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, encore d'au moins 90% par rapport à la quantité initiale de lipides présente dans la solution, avant la mise en oeuvre de 5 l'étape de clarification. La quantité de lipides peut être par exemple mesurée par dosage colorimétrique. Le procédé de purification d'une protéine recombinante selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes supplémentaires pouvant être réalisées en amont ou en aval de l'étape 10 de clarification par ajout du sel de pDADMA. A titre d'exemple, le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes choisies dans le groupe constitué par : une étape de congélation/décongélation ou de décongélation (par exemple si la solution de lait est fournie sous forme congelée), 15 - une étape d'élimination ou d'inactivation d'un agent pathogène, par exemple une étape de stérilisation, une pasteurisation, et/ou une inactivation virale une étape d'écrémage, une étape d'ajustement d'un ou plusieurs paramètres de la solution de lait tels que le pH, la conductivité, l'osmolarité, ou encore la concentration protéique totale, 20 Cette ou ces étapes étant réalisées de préférence en amont de l'étape de clarification. On entend par « étape d'écrémage » une étape visant à éliminer, au moins partiellement, les lipides sous forme de suspension éventuellement présente dans la solution de départ. Cette étape d'écrémage peut être réalisée par centrifugation. Le cas échéant, l'étape d'écrémage peut être réalisée par décantation lipidique, c'est-à-dire en laissant reposer suffisamment le 25 lait afin d'obtenir deux phases. La densité relative de la crème (lipides du lait) est plus faible que l'eau, la couche lipidique monte en surface ce qui permet de récolter un lait écrémé dans la phase basse. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention ne comprend pas d'étape d'écrémage, de décantation et/ou de clarification réalisée en amont de l'étape de clarification 30 par ajout de pDADMA. En d'autres termes, l'étape de clarification selon l'invention est réalisée sur un lait transgénique qui n'a pas été écrémé, décanté ou clarifié. Ainsi, l'étape de clarification par ajout d'un sel de pDADMA peut être réalisée sur un lait brut transgénique ayant subi, éventuellement, un ou plusieurs traitements, de préférence physiques, tels qu'une congélation/décongélation ou une stérilisation, par exemple une pasteurisation. Il 3034419 16 peut s'agir également d'un lait transgénique ayant subi une inactivation virale, par exemple par ajout d'un agent adapté tel qu'un détergent, un lait supplémenté avec un agent conservateur, un agent antioxydant ou tout autre agent diluant, ou encore un lait dont les constantes de pH et/ou de conductivité ont été modifiées, par exemple, par ajout d'un acide, 5 d'une base et/ou d'un électrolyte. Dans un mode particulier de réalisation, l'étape de clarification par ajout de pDADMAC est la seule étape de clarification du procédé. A titre d'exemple, le procédé selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes: 10 i. en option, une étape de stérilisation du lait transgénique ou de la solution obtenue à partir dudit lait, ii. en option, une étape d'ajustement d'un paramètre de la solution de lait, en particulier de son pH, et iii. une étape de clarification par ajout d'un sel de pDADMA telle que décrite ci-avant, 15 ledit procédé ne comprenant pas, de préférence, d'étape de clarification, de décantation et/ou d'écrémage en amont de l'étape (iii). Dans un mode de réalisation supplémentaire ou alternatif, le procédé de purification selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes visant à augmenter la pureté de 20 l'anticorps recombinant. Ces étapes sont, de préférence, réalisées en aval de l'étape de clarification. Ces étapes peuvent permettre d'éliminer les traces résiduelles de lipides ou de caséines. En alternative ou de manière additionnelle, ces étapes peuvent permettre d'éliminer un ou plusieurs autres contaminants présents dans la solution de lait, comme certaines protéines du lactosérum (13-lactoglobuline, a-lactalbumine...). 25 Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes de chromatographie et/ou de filtration visant à éliminer, ou à diminuer, un ou plusieurs contaminants. 11 peut s'agir d'une microfiltration, d'une ultrafiltration, d'une ultrafiltration tangentielle, d'une microfiltration, d'une diafiltration, d'une chromatographie en phase inverse, d'une chromatographie par interaction hydrophobe, d'une chromatographie sur 30 hydroxyapatite, d'une chromatographie sur résine échangeuse de cations, d'une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, d'une chromatographie d'affinité, d'une chromatographie multimodale, d'une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci. 3034419 17 De préférence, la ou les étapes supplémentaires de purification est/sont choisie(s) dans le groupe constitué par une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie multimodale, et leurs versions hautement tolérantes aux sels. 5 Une technique particulièrement préférée est la chromatographie multimodale. On entend par « chromatographie multimodale » (également appelée chromatographie « mixed mode ») un procédé de chromatographie qui utilise plusieurs types d'interactions entre la phase stationnaire (ou résine) et les composés à séparer. A titre d'exemple, la chromatographie multimodale peut être basée sur la mise en oeuvre d'interactions 10 hydrophobes et électrostatiques, la phase stationnaire présentant alors des propriétés d'échangeuse d'ions et des propriétés propres aux résines d'interactions hydrophobes. D'autres types d'interaction peuvent intervenir, par exemple par liaison hydrogène ou via des fonctions thiols. Les résines adaptées à la chromatographie multimodale sont bien connues de l'homme du 15 métier. Typiquement, il s'agit de résines comprenant à leur surface un ligand capable d'établir plusieurs types d'interactions, tel que la 4-mercapto-éthyl-pyridine et la benzyle-méthyléthanolamine. A titre d'exemple, pour la purification d'un anticorps recombinant, on peut utiliser une résine commerciale telle que les résines MEP Hypercel, HEA Hypercel ou PPA Hypercel commercialisées par Millipore ou encore les résines Capto-MMC ou Capto-Adhere 20 commercialisées par GE Healthcare. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de chromatographie multimodale. Cette étape de chromatographie multimodale peut être réalisée dans des conditions permettant de capturer sélectivement la protéine recombinante à la surface de la phase stationnaire, les contaminants (autres protéines et/ou 25 lipides) présents dans la solution n'étant pas, ou peu, retenues sur la phase stationnaire, dans les conditions de charge utilisées. La protéine recombinante peut être ensuite décrochée, et donc récupérée de la phase stationnaire en modifiant les propriétés de la solution d'élution, par exemple en modifiant le pH. Le cas échéant, cette étape de chromatographie multimodale peut être réalisée dans des conditions dites « négatives » dans lesquelles la protéine 30 recombinante n'est pas retenue lors de la charge, alors que les contaminants le sont. La protéine recombinante est donc récupérable directement dans l'effluant de charge. Dans le contexte de la purification d'un anticorps recombinant, il est préférable que le pH de la solution clarifiée soit compris entre 5 et 10, typiquement à un pH d'environ 6 - 9 pour la mise en oeuvre de la chromatographie multimodale, en particulier pour des résines présentant 3034419 18 comme ligand la 4-mercapto-éthyl-pyridine et la benzyle-méthyl-éthanol amine. Comme cela est illustré dans les exemples, les anticorps recombinants présents dans la solution clarifiée s'adsorbent fortement sur la résine à base de 4-mercapto-éthyl-pyridine et peuvent être ensuite élués par diminution du pH de la solution d'élution à une valeur inférieure à 5, par exemple à 5 pH 4. La résine à base de benzyle-méthyl-éthanol amine permet, quant à elle, la mise en oeuvre d'une chromatographie multimodale « négative », les anticorps recombinants présents dans la solution clarifiée n'étant pas retenus sur la résine pour un pH d'environ 7, contrairement aux contaminants protéiques qui sont fortement adsorbés. Dans un autre mode de réalisation additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention peut 10 comprendre une ou plusieurs étapes additionnelles visant à améliorer la qualité sanitaire de la composition de protéine recombinante finale, c'est-à-dire visant à éliminer et/ou inactiver les éventuels agents pathogènes présents dans la solution de lait. Ces agents pathogènes englobent les bactéries, les virus ainsi que des agents pathogènes non conventionnels tels que les prions ou les endotoxines. L'étape d'inactivation et/ou d'élimination des éventuels agents 15 pathogènes peut être mise en oeuvre selon l'une quelconque des techniques connues par l'homme du métier. Cette étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes peut être choisie dans le groupe constitué par une irradiation UV, une irradiation gamma, un traitement thermique, par exemple une pasteurisation, un traitement par un agent chimique, par exemple par un solvant et/ou un agent détergent, une nanofiltration stérilisante, et leurs 20 combinaisons. La nanofiltration stérilisante se réfère généralement à une filtration à travers un filtre présentant une taille de pores inférieure à 80 nm, de préférence comprise entre 15 et 50 nm. La nanofiltration peut être réalisée sur un filtre unique ou sur plusieurs filtres en série de porosité décroissante. 25 Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification d'une protéine recombinante selon l'invention comprend une ou plusieurs (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14) des caractéristiques suivantes : la solution de lait est un lait transgénique, la protéine recombinante est un anticorps recombinant, 30 le sel de pDADMA présente un degré moyen de polymérisation allant de 500 à 4000, le sel de pDADMA est le pDADMAC, ledit pDADMAC ayant de préférence un poids moléculaire moyen allant de 70 000 g.mo1-1 à 700 000 g.mo1-1, par exemple de 100 000 à 500 000 g.mo1-1, 3034419 19 l'étape de clarification comprend l'incubation de la solution de lait, après ajout du sel de pDADMA, dans l'étape de clarification, l'ajout du sel de pDADMA et/ou l'incubation de la solution est/sont réalisé(s) à une température de 30°C à 60°C, 5 dans l'étape de précipitation, la concentration finale de sel de pDADMA est de 1,0 g/L à 10,0 g/L, de préférence de 1,0 g/L à 5,0 g/L, de manière plus préférée de 2,0 g/L à 5,0 g/L, dans l'étape de clarification, le floculat formé est éliminé par un procédé choisi parmi un pressage mécanique et un égouttage, de préférence à l'aide d'une toile tissée de nylon, le procédé comprend au moins une étape de chromatographie, de préférence au moins une 10 étape de chromatographie multimodale, réalisée en aval de l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA, le procédé comprend au moins une étape de purification choisie parmi une microfiltration, une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, 15 une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, et une chromatographie d'affinité, un chromatographie d'exclusion stérique. le procédé comprend une étape d'élimination d'un agent pathogène réalisée en aval de l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA, 20 le procédé comprend optionnellement une étape de pasteurisation réalisée en amont de l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA, l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA est la seule étape de clarification du procédé, le procédé ne comprend pas d'étape d'écrémage réalisée en amont de l'étape de 25 clarification par ajout du sel de pDADMA. Il va s'en dire que le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes additionnelles, à celles précédemment citées. Le procédé peut comprendre une étape de récupération de la protéine recombinante purifiée, ou d'un concentré de protéine 30 recombinante purifiée. Le procédé peut également comprendre des étapes visant à modifier ou ajuster la concentration protéique, la conductivité ou encore le pH de la solution avant la mise en oeuvre d'une étape de purification telle qu'une chromatographie. A titre d'exemple, le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes d'ajout d'un acide, d'une base ou d'un 3034419 20 tampon, ou encore une dialyse, une osmose inverse, une étape de concentration, ou une étape de dilution. Le procédé selon l'invention peut comprendre aussi une ou plusieurs étapes de conditionnement de la protéine recombinante ou du concentré de protéine recombinante 5 obtenue à l'issue des étapes de purification, en particulier une étape de formulation de la protéine recombinante avec un ou plusieurs excipients, de préférence un ou plusieurs agents stabilisants. A titre d'exemples supplémentaires, en particulier dans le contexte de la purification d'un anticorps recombinant à partir d'un lait transgénique, le procédé selon l'invention peut 10 comprendre une étape visant à éliminer les immunoglobulines endogènes qui ont été sécrétées dans le lait, c'est-à-dire les immunoglobulines autres que l'anticorps recombinant éventuellement présentes dans le lait. L'élimination des immunoglobulines endogènes peut être réalisée par chromatographie d'affinité, par exemple en utilisant une résine d'affinité capable de retenir sélectivement l'anticorps recombinant, l'anticorps recombinant étant 15 ensuite récupéré par élution, ou une résine d'affinité capable de retenir sélectivement les immunoglobulines endogènes. A titre d'exemple, la matrice d'affinité peut comprendre un ligand capable de lier sélectivement des immunoglobulines endogènes, ce ligand pouvant être un anticorps, un fragment d'anticorps. 20 - Exemples de procédé de purification selon l'invention Selon un aspect supplémentaire, l'invention a pour objet un procédé de purification d'une protéine recombinante, de préférence un anticorps recombinant, présente dans un lait transgénique ou dans une solution protéique obtenue à partir dudit lait, ledit procédé comprenant l'une quelconque des combinaisons d'étapes suivantes : 25 Combinaison 1 a. une étape de clarification de la solution de lait par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, b. au moins une étape de purification choisie dans le groupe constitué par une 30 chromatographie multimodale, une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine 3034419 21 échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci, et c. au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels. 5 Combinaison 2 a. une étape de clarification de la solution de lait par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, b. au moins une étape de chromatographie multimodale, c. éventuellement, une ou plusieurs étapes de purification supplémentaires choisies dans le 10 groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et les 15 combinaisons de celles-ci, et d. au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels. Combinaison 3 a. la pasteurisation du lait transgénique ou de ladite solution, 20 b. une étape de clarification du lait transgénique pasteurisé ou de ladite solution pasteurisée par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, c. la mise en oeuvre d'une étape de chromatographie multimodale sur la solution clarifiée obtenue à l'étape b, éventuellement après ajustement du pH ou de la salinité de ladite solution, 25 d. en option, la mise en oeuvre d'une ou plusieurs étapes de purification supplémentaire sur la solution de protéine recombinante issue de l'étape c., de préférence choisies dans le groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie 30 sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci, et e. au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels, de préférence par nanofiltration stérilisante. 3034419 22 Combinaison 4 a. la fourniture d'un lait transgénique, ladite protéine recombinante étant un anticorps recombinant, 5 b. la pasteurisation du lait transgénique, de préférence à une température de 45°C à 65°C, c. une étape de clarification du lait transgénique pasteurisé par ajout de pDADMAC, ladite étape comprenant de préférence : une étape d'ajout de pDADMAC au lait transgénique de manière à attendre une concentration finale en pDADMAC de 1,0 g/L à 5,0 g/L, de préférence de 2,0 g/L 10 à 5,0 g/L, une étape d'incubation dudit lait transgénique après ajout du pDADMAC, de préférence à une température comprise entre 30°C et 60°C, et - une étape de séparation du floculat formé et de la phase liquide, de préférence par pressage ou égouttage, par exemple à travers une toile tissée de nylon, 15 d. une étape de chromatographie multimodale réalisée sur la solution clarifiée obtenue à l'étape c., ladite chromatographie multimodale étant mise en oeuvre, de préférence sur une résine ayant comme ligand la 4-mercapto-éthyl-pyridine ou la benzyle-méthyléthanolamine et pour un pH de charge de 6 à 9, e. facultativement, au moins une étape de chromatographie choisie parmi, une 20 chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'exclusion stérique, f. une étape d'ultrafiltration, de préférence sur membrane en polyéthersufone g. une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels, de 25 préférence par nanofiltration stérilisante, et h. la récupération de la protéine recombinante purifiée, ou d'un concentré de protéine purifiée. Combinaison 5 30 a. une étape de clarification de la solution de lait par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, b. une étape de chromatographie multimodale qui est mise en oeuvre dans des conditions pour lesquelles la protéine recombinante n'est pas absorbée sur la matrice au pH de charge et est récupérée dans l'effluent, 3034419 23 c. une seconde étape de chromatographie multimodale qui est mise en oeuvre dans des conditions pour lesquelles la protéine recombinante est absorbée sur la résine au pH de charge et est ensuite éluée par modification du pH de la solution d'élution, l'étape b. pouvant être réalisée en amont ou en aval de l'étape c. 5 Combinaison 6 a. la fourniture d'un lait transgénique ou d'une solution protéique obtenue à partir dudit lait, où la protéine recombinante est un anticorps recombinant, b. une étape de clarification de la solution de lait par ajout d'un sel de pDADMA, de 10 préférence le pDADMAC, c. une première étape de chromatographie multimodale mise en oeuvre sur une résine ayant comme ligand la benzyle-méthyl-éthanolamine, à un pH compris entre 6 à 9, dans laquelle l'anticorps recombinant non-absorbé est récolté dans l'effluent, d. une seconde étape de chromatographie multimodale réalisée sur une résine ayant comme 15 ligand la 4-mercapto-éthyl-pyridine, avec un pH de charge compris entre 6 à 9, dans laquelle l'anticorps recombinant est absorbé sur la résine et est ensuite élué par acidification de l'éluant à pH inférieur 5, de préférence à pH 4. Combinaison 7 20 a. la fourniture d'un lait transgénique ou d'une solution protéique obtenue à partir dudit lait, où la protéine recombinante est un anticorps recombinant, b. une étape de clarification de la solution de lait par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, c. une première étape de chromatographie multimodale réalisée sur une résine ayant comme 25 ligand la 4-mercapto-éthyl-pyridine, avec un pH de charge compris entre 6 à 9, dans laquelle l'anticorps recombinant est absorbé sur la résine et est ensuite élué par acidification de l'éluant à pH inférieur 5, de préférence à pH 4, d. une seconde étape de chromatographie multimodale mise en oeuvre sur une résine ayant comme ligand la benzyle-méthyl-éthanolamine, à un pH compris entre 6 à 9, dans laquelle 30 l'anticorps recombinant non-absorbé est récolté dans l'effluent. 11 va de soi que le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes supplémentaires à celles listées dans chaque combinaison. 3034419 24 - Objets supplémentaires selon l'invention Selon un aspect supplémentaire, l'invention a également pour objet une protéine recombinante ou un concentré de protéine recombinante susceptible d'être obtenu par le procédé de purification tel que décrit ci-avant. Ladite protéine recombinante ou ledit 5 concentré sont, de préférence, adaptés à une utilisation en thérapie humaine ou vétérinaire. Un objet supplémentaire selon l'invention est une composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante purifiée selon le procédé ci-dessus décrit en combinaison avec un ou plusieurs excipients. Ladite composition pharmaceutique peut être sous forme liquide ou solide, par exemple lyophilisée. 10 L'invention a également pour objet une méthode de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante, comprenant : i. La fourniture d'une protéine recombinante purifiée par le procédé selon l'invention, et ii. Le mélange de la protéine recombinante avec un ou plusieurs excipients acceptables sur le plan pharmaceutique. 15 Dans certains modes de réalisation, la méthode de préparation d'une composition pharmaceutique comprend : i. La mise en oeuvre du procédé de purification selon l'invention, de manière à obtenir une protéine recombinante purifiée, et ii. Le mélange de la protéine recombinante purifiée avec un ou plusieurs excipients 20 acceptables sur le plan pharmaceutique. L'homme du métier saura choisir le ou les excipients à associer à la protéine recombinante en fonction de la forme galénique et de la voie d'administration souhaitée. A cette fin, l'homme du métier pourra se référer aux ouvrages de référence suivants : Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis, 25 2000), Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition, 2005) et, Handbook of Pharmaceuticals Excipients, American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press; 6th revised edition, 2009). Le ou les excipients présents dans les compositions selon l'invention peuvent être choisis parmi les diluants, les agents cryoprotecteurs et/ou lyoprotecteurs, les agents stabilisants, les 30 agents antioxydants, les agents régulateurs de pH, les agents tampons, les agents tensio-actifs, les agents détergents etc. A titre d'exemple d'excipients, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose, maltose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol), les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine, méthionine), les polysorbates (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), les polyoxamers, le polyéthylène glycol, le monothioglycérol, la glutathione, 3034419 25 l'acide citrique, l'acide ascorbique, le métabisulfite de sodium, et sulfite de sodium, les sels de carbonate, phosphate, citrate, acétate, borate, etc. La composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence destinée à une administration parentérale, par exemple par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique 5 ou intramusculaire. Une voie d'administration particulièrement préférée est la voie intraveineuse. La composition pharmaceutique et l'adjuvant pharmaceutique selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme, par exemple sous la forme d'une poudre, d'une suspension, d'une solution, d'une émulsion, ou d'un lyophilisat, de préférence destinée à être administrée par 10 injection au patient. Les exemples ci-après ont pour but d'illustrer plus pleinement l'invention sans pour autant en limiter la portée. Exemples 15 Exemple 1 : Evaluation de plusieurs agents chimiques pour la clarification d'un lait transgénique - Lait transgénique 11 s'agit d'un lait transgénique issu de chèvres transgéniques. La protéine recombinante thérapeutique sécrétée dans le lait est un anticorps anti-TNF-a. 20 Le lait a été collecté et congelé, pour stockage en vue de la purification. - Evaluation du pDADMAC et essais comparatifs Le pDADMAC a été évalué en tant qu'agent floculant. La solution stock de pDADMAC est 25 une solution commerciale fournie par Merck-Millipore. Le pDADMAC présente un poids Quantification Caractérisation du lait Dosage BCA Protéines totales 23,4 g/1 Elisa 2,9 g/1 Immunoglobulines Elisa Protéines de lait de chèvre (GMP) 26,6 g/1 Enzymatique Lactose 26,0 g/1 46 - 65% caséines 18 - 21% Ig 9- 11% P-Lactoglobuline 3 - 5% a Lactalbumine 1% Lactotransferrine HDMse / SDS Page Composition & quantification protéique Température de transition vitreuse (T'g) Calorimétrie -25 / -50 °C 3034419 26 moléculaire moyen de 100 000 à 500 000 g.mo1-1. A titre comparatif, des agents supposés clarifiants décrits dans la littérature pour la purification des protéines ont été testés dans les conditions indiqués ci-après. Agents clarifiants Produit commercial pH final du Concentration lait finale dans le lait Autres agents Citrate de sodium 7,5 200 mM poudre clarifiants (comparatifs) Chlorure de 5,5 200 mM poudre Calcium EDTA sodique 4,5 100 mM poudre EDTA acide 3,5 100 mM poudre Invention pDADMAC 6,5 0,1 % (w/v) soit environ 1 g/L. Solution aqueuse à 10 % (wt/v) 5 - Mode opératoire Chaque agent clarifiant a été testé de la manière suivante : Le lait transgénique (5 g) a été décongelé et amené à la température d'incubation souhaitée (4°C, 25°C ou 37°C). Le pH du lait a été ajusté à pH 9,5. Pour chaque agent testé, une quantité adaptée de la solution aqueuse stock a été rajoutée pour obtenir la concentration 10 souhaitée (voir tableau ci-dessous). Après ajout de l'agent clarifiant, le lait a été incubé pendant 20h, à la température d'incubation souhaitée. A la fin de l'incubation, on a prélevé les échantillons de surnageant pour analyses. La turbidité du surnageant a été déterminée par absorbance à 400 nm. La clarté du surnageant correspond à l'inverse de la turbidité (rapport = 1/turbidité). 15 La teneur en anticorps recombinant (mg/1) a été déterminée par néphélémétrie (anti-1g totales. La pureté protéique en anticorps recombinant a été déterminée par la mesure relative de la densité relative des bandes d'immunoglobulines après migration électrophorétique en SDS PAGE selon la technique de Laemmli 20 - Résultats La température d'incubation à 37°C a montré les meilleurs résultats, quel que soit l'agent clarifiant considéré. L'ajout de pDADMAC a entrainé une séparation de phases très nette : on a observé la formation d'un floculat blanc, qui sédimente, et d'un surnageant limpide. Un résultat 3034419 27 analogue a été observé pour l'EDTA acide. En revanche, les agents tels que le CaC12, le citrate de sodium ou l'EDTA disodique n'ont pas permis d'obtenir une phase limpide. . Les analyses du surnageant, pour chaque agent testé, sont illustrés aux Figures 1A-1C pour la température d'incubation de 37°C. Ces analyses confirment que le pDADMAC est l'agent le 5 plus efficace en termes de clarification (Figure 1A) et de pureté finale en anticorps recombinant (Figure 1C). Comme illustré à la Figure 1B, le pDADMAC permet également de récupérer, dans le surnageant, une proportion importante des anticorps recombinants initialement présents dans le lait transgénique. 10 Exemple 2: Optimisation de l'étape de clarification Les conditions suivantes ont été testées : Solutions Concentrations finales testées pH initial du lait pour de référence l'étape de clarification CaC12 200 mM 5,5 500 mM 215 mM Citrate 7,7 500 mM 100 mM EDTA sodique 4,7 300 mM 100 mM 3,5 EDTA acide 300 mM 4,5 pDADMAC 0,1% (w/v) (environ lg/L) 6,5 (invention) 0,3% (w/v) (environ 3 g/L) Le mode opératoire est similaire à celui utilisé dans l'exemple 1. Chaque agent clarifiant a été testé de la manière suivante : 15 Le lait transgénique (100g) a été décongelé et ajusté à la température d'incubation à savoir 37°C. Le lait décongelé a subi une étape de pasteurisation à 60°C, pendant 6 heures afin de neutraliser les éventuelles bactéries présentes dans le lait et éviter un développement bactérien pendant l'incubation avec l'agent clarifiant. Le pH du lait a été ajusté à la valeur souhaitée. Pour le pDADMAC, le pH initial du lait correspondait au pH souhaité, il n'a pas été procédé 20 d'ajustement de pH. Pour chaque agent testé, une quantité adaptée de la solution aqueuse stock correspondante a été ajoutée au lait transgénique pasteurisé. Après ajout de l'agent clarifiant et homogénéisation, le lait a été incubé pendant 20h sans agitation, à 37°C. A la fin de l'incubation, on a prélevé les échantillons de surnageant pour analyses. 3034419 28 La turbidité du surnageant, la teneur en anticorps recombinant, la pureté protéique en anticorps recombinant ont été déterminés comme décrit dans l'exemple 1. - Résultats 5 Le pDADMAC s'est révélé être, une fois encore, l'agent de clarification le plus efficace, même en l'absence de tout ajustement du pH initial de la solution. En effet, le pDADMAC à une concentration finale de 0,1% (w/v) a permis d'obtenir un surnageant présentant une pureté en anticorps recombinant et une clarté très élevées. L'utilisation d'une concentration plus élevée en pDADMAC, à savoir 0,3% (w/v) soit 3 g/L, a donné des résultats également 10 satisfaisants en terme de pureté et de teneur en anticorps dans le surnageant. La Figure 2 montre le gel d'électrophorèse obtenu en SDS PAGE (coloration au bleu de Coomasie) pour les surnageants obtenus pour les différentes conditions testées. Pour les surnageants obtenus avec le pDADMAC, les gels d'électrophorèse présentent une révélation des caséines quasiment inexistante ce qui atteste de l'élimination des caséines dans le floculat. 15 Les bandes protéiques correspondant aux immunoglobulines sont en revanche bien visibles. Un tel profil n'est pas observable pour les gels de surnageants obtenus avec CaC12, le citrate de sodium ou l'EDTA sodique, pour lesquels la révélation des caséines reste élevée. A noter toutefois que l'EDTA sous forme acide a permis une bonne élimination des caséines. Néanmoins, la quantité d'immunoglobuline récupérée dans le surnageant est plus faible que 20 celle obtenue avec le pDADMAC. Exemple 3 : Evaluation des méthodes de collecte du surnageant L'ajout de pDADMAC permet de précipiter efficacement les micelles de caséine et les globules gras tout en générant un surnageant quasiment limpide, enrichi en anticorps 25 recombinant. Le surnageant présente une clarté telle qu'il n'est pas nécessaire de le soumettre à une étape complexe de filtration en profondeur. Plusieurs techniques de séparation liquide/solide ont été testées. Les Inventeurs ont montré que le « liquide de pressage» c'est-à-dire la phase liquide obtenue par pressage du floculat présentait un profile en SDS PAGE équivalent à celui du surnageant clair, en particulier en terme de pureté protéique en 30 immunoglobuline. Un tel résultat a conduit les Inventeurs à tester 2 techniques simples de séparation solide/liquide, à savoir : - Le pressage mécanique à l'aide d'une toile nylon et d'un support poreux avec récolte par dépression par une pompe à vide 3034419 29 - L'égouttage à travers une toile nylon présentant une porosité de 25p.m, par simple gravité. Les filtrats ainsi obtenus présentent une teneur en protéines totales de 13,3 g/1, avec la composition suivante déterminée par SDS PAGE: 45% immunoglobulines, 0% caséines et 5 55% autres protéines du lait. Le rendement total de l'étape de clarification (ajout de pDADMAC suivi de l'élimination du floculat par égouttage ou pressage) en immunoglobulines est compris entre 75% et 90%, suivant l'expérience réalisée. Comme cela est montré dans l'exemple 4, les filtrats issus de l'étape de clarification 10 présentent une concentration en anticorps recombinants, une conductivité (inférieur à 20 mS/cm) et un pH d'environ 6,5 permettant la mise en oeuvre directe d'une étape de chromatographie multimodale, sans ajustement préalable de leur composition. Exemple 4 : Exemple de mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention 15 La Figure 3 montre un exemple de procédé selon l'invention. - Mode opératoire Le lait transgénique brut décongelé (100 g) a été soumis à une étape de pasteurisation par chauffage à 60°C pendant 10 heures. Le lait a été ensuite ramené à une température de 37°C. Une solution aqueuse de pDADMAC à 10% (w/v) a été rajoutée au lait pasteurisé de manière 20 à atteindre une teneur finale de 0,3% (w/v). Le lait transgénique a été ensuite incubé pendant 20 heures, à 37°C. Aucun ajustement du pH du lait transgénique n'a été effectué avant l'ajout du pDADMAC. Le surnageant riche en anticorps recombinant a été séparé du floculat formé consécutivement à l'ajout de pDADMAC par gravité. Le surnageant ainsi récolté a été soumis ensuite à une étape de chromatographie multimodale, sans ajustement préalable de son pH, de 25 sa conductivité ou de sa concentration en protéines. Deux types de chromatographie multimodale ont été testés, à savoir une chromatographie multimodale par adsorption des 1g sur résine MEP Hypercel et une chromatographie multimodale par adsorption des proteines non-1g sur résine Capto Adhere. La solution d'anticorps recombinant issue de l'étape de chromatographie multimodale a été purifiée x fois. La solution d'anticorps peut être ensuite 30 concentrée par ultrafiltration sur une membrane en polyethersulfone. - Chromatographie multimodale sur résine MEP Hypercel (ligand : 4-mercapto-éthylpyridine) Conditions opératoires testées : 3034419 30 - Adsorption : à pH 6,5 - Lavages : à une conductivité inférieure à 5 mS/cm - Elution : à pH 4,0 A pH 6,5, l'anticorps recombinant est fortement absorbé sur la résine, alors que les 5 contaminants ne sont pas retenus. L'anticorps recombinant est récupéré par élution grâce à la solution d'acide citrique à pH 4,0. - Chromatographie multimodale sur résine Capto Adhere (ligand : benzyle-méthyléthanolamine) 10 Conditions opératoires testées : Adsorption : à pH 7,0 A pH 7,0 l'anticorps recombinant est faiblement retenu sur la résine, alors que les contaminants le sont. L'anticorps recombinant est récupéré dans la fraction d'éluant de charge non-retenu. La chromatographie multimodale fonctionne donc en négatif pour l'anticorps recombinant. 15 - Résultats Les résultats obtenus par la combinaison d'une étape de clarification au pDADMAC suivie d'une chromatographie multimodale sont satisfaisants. Les deux techniques de chromatographies multimodales testées offrent de bons rendements en anticorps recombinant 20 (aux environs de 70-80%). La résine MEP Hypercel permet une adsorption excellente des anticorps recombinants (100% dans cet exemple de charge), conduisant à un rendement final de l'ordre de 70%. Selon la charge appliquée, une protéine contaminante, la caséine, peut être détectée en faible quantité en SDS-PAGE dans la solution d'anticorps purifiée par chromatographie multimodale sur 25 résine MEP Hypercel. La résine Capto-Adhere permet la mise en oeuvre d'une chromatographie négative, les contaminants du lait étant fortement retenus sur la résine lors de la charge alors que l'anticorps recombinant est directement élué à pH 7. Selon la charge appliquée, des quantités résiduelles de deux protéines contaminantes peuvent être détectées en SDS-PAGE dans la 30 solution d'anticorps purifiée par chromatographie multimodale sur résine Capto-Adhere. La combinaison d'une étape de clarification au pDADMAC suivie d'une chromatographie multimodale sur résine avec comme ligand la benzyle-méthyl-éthanolamine permet d'éliminer complètement les caséines et la P-lactoglobuline, ainsi que les globules gras du lait tout en ayant un rendement global, sur les 2 étapes, en anticorps recombinant de l'ordre de 60%. REVENDICATIONS1. Procédé de purification d'une protéine recombinante à partir d'un lait transgénique ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique, comprenant une étape de 5 clarification à l'aide d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium), de préférence le poly(diallyldiméthylammonium chlorure) (pDADMAC). 2. Procédé selon la revendication 1 dans laquelle la protéine recombinante est choisie parmi les hormones, les cytokines, les protéines impliquées dans la réponse immunitaire, les 10 anticorps, et les facteurs et les inhibiteurs de la coagulation, la protéine recombinante étant de préférence un anticorps. 3. Procédé de purification selon la revendication 1 ou 2, ladite étape de clarification comprenant : 15 l'ajout du sel de poly(diallyldiméthylammonium) audit lait transgénique ou à ladite solution de manière à former une phase liquide comprenant la protéine recombinante, et un floculat, et la séparation du floculat et de la phase liquide, de manière à récupérer la phase liquide comprenant la protéine recombinante. 20 4. Procédé de purification selon la revendication 3, la teneur finale du sel de poly(diallyldiméthylammonium) dans le lait ou la solution est comprise dans une gamme allant de 0,01 g/L à 20,0 g/L. 25 5. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, ledit lait ou ladite solution est incubée à une température de 20°C à 60°C, après l'addition du sel de poly(diallyldiméthylammonium). 6. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications 3-5, dans lequel la 30 séparation de la phase liquide et du floculat est réalisée par un procédé choisi parmi un pressage mécanique ou un égouttage. 3034419 32 7. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'étape de clarification est réalisée sur un lait transgénique brut ayant subi éventuellement un ou plusieurs traitements choisis parmi une congélation, une décongélation, et une pasteurisation. 8. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comprenant au moins une étape de purification supplémentaire, de préférence choisie dans le groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie multimodale, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci. 9. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit 15 procédé comprenant au moins une étape de chromatographie multimodale. 10. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape d'élimination et/ou d'inactivation des pathogènes résiduels. 20 11. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une, plusieurs, ou toutes les caractéristiques suivantes : la solution de lait est un lait transgénique brut, et/ou la protéine recombinante est un anticorps humain, humanisé ou chimérique, et/ou le sel de pDADMA est un pDADMAC ayant un poids moyen moléculaire compris entre 25 100 000 et 500 000 g.mo1-1, et/ou dans l'étape de précipitation, la concentration finale du sel de pDADMA est de 2,0 g/L à 5,0 g/L, et/ou le procédé comprend au moins une étape de chromatographie multimodale réalisée en aval de l'étape de clarification, et/ou 30 le procédé comprend au moins une étape de purification choisie parmi une microfiltration, une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de 3034419 33 cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, et une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et/ou le procédé comprend une étape de pasteurisation réalisée en amont de l'étape de clarification, et/ou 5 l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA est la seule étape de clarification du procédé, et/ou le procédé ne comprend pas d'étape d'écrémage réalisée en amont de l'étape de clarification par ajout du sel de pDADMA. 10 12. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant la combinaison d'étapes suivantes: a. la pasteurisation du lait transgénique ou de ladite solution, b. une étape de clarification du lait transgénique pasteurisé ou de ladite solution pasteurisée par ajout d'un sel de pDADMA, de préférence le pDADMAC, c. la mise en oeuvre d'une étape de chromatographie multimodale sur la solution clarifiée obtenue à l'étape c., éventuellement après ajustement du pH ou de la conductivité de ladite solution, d. en option, la mise en oeuvre d'une ou plusieurs étapes de purification supplémentaire sur la solution de protéine recombinante issue de l'étape d., de préférence choisie(s) dans le groupe constitué par une ultrafiltration, une ultrafiltration tangentielle, une microfiltration, une diafiltration, une chromatographie en phase inverse, une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie sur hydroxyapatite, une chromatographie sur résine échangeuse de cations, une chromatographie sur résine échangeuse d'anions, une chromatographie d'affinité, une chromatographie d'exclusion stérique et les combinaisons de celles-ci, et e. au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination des agents pathogènes résiduels, de préférence par nanofiltration stérilisante. 13. Méthode de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant une protéine 30 recombinante, ladite méthode comprenant : la fourniture d'une protéine recombinante par la mise en oeuvre d'un procédé de purification tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 12, et le mélange de la protéine recombinante avec un ou plusieurs excipients acceptables sur le plan pharmaceutique. 3034419 34 14. Utilisation d'un sel de poly(diallyldiméthylammonium), de préférence le pDADMAC, en tant qu'agent de clarification pour la purification d'une protéine thérapeutique à partir d'un lait transgénique, ou d'une solution protéique obtenue à partir d'un lait transgénique.