FR 3035221 A1 20161021 FR 1553413 A 20150416 1 Biocapteurs électrochimiques implantables La présente invention concerne le domaine de la chimie analytique, et en particulier celui de la détection des molécules biologiques, notamment celles présentes dans le cerveau de l'homme et de l'animal. Les biocapteurs implantables dans le système nerveux central sont des outils prometteurs pour permettre un suivi en temps réel du milieu interstitiel du cerveau. Le principe de la détection consiste à immobiliser, sur une microélectrode, une enzyme, par exemple de la classe des oxydases, sélective de la molécule à détecter (l'analyte). Lorsqu'elle est mise en présence de son substrat, l'enzyme le transforme en produisant un composé oxydable tel que le peroxyde d'hydrogène (H202), à partir de l'oxygène ambiant. Le peroxyde d'hydrogène est ensuite oxydé à la surface de l'électrode et le courant d'oxydation qui en résulte est détecté pour fournir une estimation quantitative de la concentration de la molécule d'intérêt au voisinage du biocapteur. Actuellement, il est possible de détecter de nombreuses molécules par cette méthode, notamment le glucose, le lactate, la D-sérine, le glutamate, la choline, l'ATP ou l'adénosine. Les biocapteurs implantables offrent une résolution temporelle et spatiale inégalée. Ils permettent notamment un contrôle du milieu interstitiel seconde par seconde. Les biocapteurs implantables les plus courants sont constitués d'un fil de platine recouvert d'un polymère écran permettant de limiter la pénétration de molécules interférentes, et d'une couche d'enzyme (Pernot et al., 2008). Une des principales limitations de ce type de biocapteur est cependant liée à leur caractère invasif. Leur diamètre, généralement compris entre 40 et 200 pm, est en effet plus grand que la distance moyenne entre les capillaires sanguins du cerveau estimée à 15 pm. La rupture de vaisseaux sanguins et le déclenchement de microhémorragies est donc inévitable au moment de l'implantation du biocapteur. Ce problème peut ainsi aboutir à des phénomènes d'inflammation locale, ou de rupture de la barrière hémato-encéphalique qui peuvent impacter la fiabilité des mesures effectuées in situ. Il existe donc un besoin de fabriquer des biocapteurs de faible diamètre, notamment d'un diamètre inférieur à 15 pm, afin de limiter les lésions dans le site d'implantation. Or, il n'existe pas de fil de platine suffisamment rigide pour atteindre de telles tailles. Une des solutions proposées pour surmonter cette limitation consiste à utiliser des fibres de carbone. Malheureusement, le carbone est un matériau peu propice à l'oxydation du peroxyde d'hydrogène. Certains laboratoires ont proposé d'immobiliser la couche d'enzyme sur une fibre de carbone avec un médiateur chimique qui permet d'améliorer l'oxydation du peroxyde d'hydrogène, comme le bleu de prusse, le violet de ruthénium, ou un hydrogel à base d'osmium 3035221 2 (Schuvailo et al., 2005). Cependant, ce procédé d'immobilisation est peu stable. L'enzyme n'est retenue que quelques dizaines de minutes au contact de l'électrode et le médiateur chimique s'échappe de la couche d'enzyme. La détection électrochimique n'est en général plus possible après quelques dizaines de minutes. 5 Une autre solution consiste à métalliser des fibres de carbone. Cette idée a été explorée par certains laboratoires, qui ont déposé une couche de ruthénium ou de rhodium sur la fibre de carbone, par électrodéposition à partir d'une solution standard (Sakslund et al., 1995 ; Wang et al., 1997). Cependant, les dépôts métalliques obtenus de cette manière sont peu stables et perdent leurs propriétés catalytiques rapidement. Ce procédé ne permet donc pas de réaliser 10 des mesures sur de grandes durées et ne permet pas non plus de stockage à long terme des électrodes, pour une utilisation ou une réutilisation ultérieure. Il limite donc considérablement les possibilités d'utilisations des biocapteurs, ainsi que leurs perspectives de commercialisation. Objets et résumé de l'invention 15 Afin de surmonter les inconvénients associés aux biocapteurs de l'art antérieur, les inventeurs de la présente invention proposent d'utiliser un procédé de métallisation par dépôt sous vide. Les inventeurs ont découvert que le dépôt sous vide permettait l'obtention d'une couche métallique mince, de haute pureté, ayant d'excellentes propriétés catalytiques, et une grande stabilité. La couche métallique ainsi déposée conserve en particulier une excellente sensibilité 20 pour la détection du peroxyde d'hydrogène pendant plusieurs mois. Ce procédé de dépôt permet de fabriquer des biocapteurs enzymatiques à détection électrochimique d'un diamètre total inférieur à 15 pm, ce qui réduit considérablement les biais méthodologiques liés à la nature invasive des biocapteurs implantables : lésions cellulaires, microhémorragies, lésions des capillaires cérébraux, inflammation autour du biocapteur. Les biocapteurs selon l'invention 25 peuvent être utilisés en expérimentation animale, notamment dans le domaine des neurosciences, et sont également compatibles avec une utilisation en clinique humaine pour fournir de nouveaux moyens de neuro-monitoring chez les patients cérébrolésés. Ils sont également utiles pour des méthodes de détection in vitro, par exemple sur des préparations de tissu isolé (tranches de cerveau...), dans lesquelles leur faible taille sera également 30 avantageuse pour limiter les lésions au tissu d'implantation. Ils sont également utilisables sur d'autres préparations biologiques, telles que les cultures cellulaires. De façon plus générale, ils sont utilisables comme outil de détection dans tout dispositif analytique existant, par exemple pour l'analyse de fluides biologiques. Selon un premier objet, la présente invention porte donc sur un procédé de fabrication d'un biocapteur électrochimique pour la détection d'un analyte, ledit procédé comprenant : 3035221 3 le dépôt, sur un filament support, d'une couche métallique apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable, ledit dépôt étant réalisé par un procédé de dépôt sous vide ; et le dépôt, sur le filament métallisé, d'une couche enzymatique apte à catalyser la dégradation dudit analyte en générant ledit composé oxydable. 5 Dans un mode de réalisation, le procédé de dépôt sous vide est un procédé de dépôt chimique en phase vapeur ou un procédé de dépôt physique en phase vapeur, en particulier le dépôt physique en phase vapeur sous faisceaux d'électrons (« Electron beam physical vapor deposition » (EBPVD)) ou le dépôt physique en phase vapeur par pulvérisation cathodique. La couche métallique peut comprendre au moins un métal noble, en particulier le platine, le 10 ruthénium, le rhodium, le palladium ou leur combinaison. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend, avant le dépôt de la couche métallique, le dépôt d'une sous-couche d'accroche sur le filament support. La couche d'accroche peut permettre d'augmenter l'adhérence de la couche métallique sur le filament. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la sous-couche d'accroche est à base de 15 titane ou de chrome. Dans un mode de réalisation, le dépôt de la sous-couche d'accroche est réalisé par un procédé de dépôt sous vide, par exemple l'un des procédés de dépôt sous vide décrits dans la présente demande. Dans un mode de réalisation, la couche enzymatique comprend une enzyme de la classe des 20 oxydases, en particulier la glucose oxydase, la lactate oxydase, la D-amino acide oxydase, la glutamate oxydase, la choline oxydase, la xanthine oxydase, la glycerol-3-phosphate oxydase, la cholestérol oxydase ou la glycine oxydase. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la couche enzymatique est immobilisée sur le filament métallisé, par exemple à l'aide d'un agent chimique de réticulation tel que le 25 glutaraldéhyde, ou le poly(éthylène glycol) diglycidyl ether (PEGDE). Dans un mode de réalisation, le filament support est une fibre de carbone. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend, après le dépôt de la couche métallique, le dépôt d'un matériau écran apte à limiter la pénétration de molécules interférentes au contact du filament métallisé, en particulier un polymère tel que la poly-m- 30 phénylènediamine, la poly-o-phénylènediamine, le polyphénol ou l'acétate de cellulose. Un autre objet de l'invention est un biocapteur électrochimique fabriqué ou susceptible d'être fabriqué selon le procédé tel que décrit dans la présente invention. 3035221 4 Un autre objet de la présente demande est un biocapteur électrochimique pour la détection d'un analyte, ledit biocapteur comprenant un filament support successivement revêtu : d'une couche métallique apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable ; et d'une couche enzymatique apte à catalyser la dégradation dudit analyte en générant 5 ledit composé oxydable. La couche métallique est de préférence déposée par un procédé de dépôt sous vide, ou susceptible d'avoir été déposée par un procédé de dépôt sous vide. Comme le montre la Figure 1, le dépôt sous vide permet d'aboutir à des couches métalliques lisses, d'une uniformité et d'une régularité inégalées, qui contrastent avec les dépôts irréguliers et beaucoup plus épais 10 obtenus par électrodéposition, qui se caractérisent par la présence de grain métalliques d'une épaisseur d'au moins 1 pm (voir également Sakslund et al., 1995, Wang et al., 1997). Les biocapteurs selon l'invention se distinguent donc nettement des biocapteurs utilisant une couche métallique déposée par électrodéposition, tels que décrits dans l'état de la technique. Dans un mode de réalisation, le biocapteur comprend une sous-couche d'accroche entre le 15 filament support et la couche métallique. La sous-couche d'accroche peut permettre d'augmenter l'adhérence de la couche métallique sur le filament. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la sous-couche d'accroche est à base de chrome, de titane, ou de nitrure de titane. Dans un autre mode de réalisation, le biocapteur comprend, entre la couche métallique et la 20 couche enzymatique, un matériau écran apte à limiter la pénétration de molécules interférentes au contact du filament métallisé, en particulier un polymère tel que la poly-m-phénylènediamine, la poly-o-phénylènediamine, le polyphénol ou l'acétate de cellulose. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diamètre du filament n'excède pas 25 pm, en particulier 20 pm, plus particulièrement 15 pm, et de façon encore plus particulière 10 25 pm. Dans un autre mode de réalisation, le diamètre du filament est de 1 pm à 25 pm, en particulier de 1 pm à 20 pm, plus particulièrement de 1 pm à 15 pm, et de façon encore plus particulière de 1 pm à 10 pm, ou de 3 pm à 10 pm. Dans un mode de réalisation, l'épaisseur de la sous-couche d'accroche n'excède pas 50 nm, en particulier 30 nm, et plus particulièrement 20 nm. Dans un autre mode de réalisation, 30 l'épaisseur de la sous-couche d'accroche est de 0,1 nm à 50 nm, en particulier de 0,1 nm à 30 nm, et plus particulièrement de 0,1 à 20 nm. Des couches d'une épaisseur de quelques atomes peuvent être obtenues par la technique d' « atomic layer deposition » . Dans un mode de réalisation, l'épaisseur de la couche métallique n'excède pas 200 nm, en particulier 150 nm, plus particulièrement 100 nm. Dans un autre mode de réalisation, 3035221 5 l'épaisseur de la couche métallique est de 10 nm à 200 pm, en particulier de 10 nm à 150 nm, plus particulièrement de 10 nm à 100 nm. Dans un autre mode de réalisation, l'épaisseur de la couche métallique n'excède pas 10%, en particulier 5%, du diamètre du filament. Dans un autre mode de réalisation, le dépôt de la couche métallique est un dépôt conforme. Le couche 5 métallique est notamment exempte ou sensiblement exempte d'aspérités et/ou irrégularités non présentes à la surface du filament, telles que des grains métalliques déposés à la surface du filament. Dans un mode de réalisation, l'épaisseur de la couche d'enzyme n'excède pas 10 pm, en particulier 5 pm, de façon plus particulière 3 pm. Dans un autre mode de réalisation, l'épaisseur 10 de la couche d'enzyme est de 1 pm à 10 pm, en particulier de 1 pm à 5 pm, de façon plus particulière de 1 pm à 3 pm. Dans un autre mode de réalisation, l'épaisseur de la couche enzymatique n'excède pas 100%, en particulier 75%, plus particulièrement 50% du diamètre du filament. Dans un mode de réalisation, l'épaisseur de la couche de matériau écran n'excède pas 100 nm, 15 en particulier 50 nm, de façon plus particulière 20 nm. Dans un autre mode de réalisation, l'épaisseur de la couche de matériau écran est de 1 nm à 100 nm, en particulier de 1 nm à 10 nm, de façon plus particulière de 1 nm à 20 nm ou de 5 nm à 20 nm. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le diamètre total du biocapteur n'excède pas 100 pm, en particulier 50 pm, de façon plus particulière 15 pm, 14 pm, 13 pm, 12 pm, 11 20 pm ou 10 pm. Dans un autre mode de réalisation, le diamètre total du biocapteur est de 5 pm à 15 pm, en particulier de 10 pm à 15 pm, plus particulièrement de 10 pm à 12 pm ou de 12 pm à 15 pm, et encore plus particulièrement de 10 pm à 11 pm, de 11 à 12 pm, de 12 à 13, pm, de 13 à 14 pm ou de 14 à 15 pm. Dans un mode de réalisation particulier, le biocapteur selon l'invention comprend : 25 un filament support, notamment d'un diamètre de 3 à 10 pm ; une couche d'accroche, notamment d'une épaisseur de 0,1 à 20 nm ; une couche de platine, notamment d'une épaisseur de 20 à 200 nm ; une couche de matériau écran, notamment d'une épaisseur de 5 à 20 nm ; une couche d'enzyme, notamment d'une épaisseur de 1 à 5 pm. 30 Dans un mode de réalisation du biocapteur, le filament support est relié à un moyen de connexion électrique, par exemple un fil métallique tel qu'un fil de cuivre. Le filament support est par exemple collé à la surface dudit fil. L'isolation de la partie non-sensible du filament et/ou du moyen de connexion électrique peut- être réalisée par insertion du filament dans un capillaire de verre, dont seule dépasse la partie 3035221 6 sensible du filament. La jonction entre le filament et le capillaire est alors scellée, par exemple par collage ou par fusion. Un autre objet de l'invention est un dispositif pour la détection électrochimique d'un analyte, ledit dispositif comprenant : 5 un biocapteur tel que décrit dans la présente demande ; un dispositif d'amplification de courant électrique ; et, de façon facultative au moins l'un parmi : un dispositif de conversion analogique/numérique ; un logiciel d'acquisition et/ou d'exploitation des données de détection ; 10 une électrode de référence, en particulier une électrode Ag/AgCI. Un autre objet de l'invention est l'utilisation, en tant qu'électrode de détection électrochimique, d'un filament support revêtu d'une couche métallique apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable. La couche métallique est de préférence déposée par un procédé de dépôt sous vide, ou susceptible d'avoir été déposée par un procédé de dépôt sous vide. Ladite électrode peut 15 être utilisée pour la détection du composé oxydable, en particulier le peroxyde d'hydrogène, ou d'un analyte susceptible de générer le composé oxydable, par exemple par le biais d'une réaction enzymatique. Dans ce cas, l'électrode peut être recouverte d'une couche d'enzyme pour former un biocapteur électrochimique, en particulier un biocapteur électrochimique selon l'invention. 20 Un autre objet de l'invention est un procédé de détection électrochimique d'un analyte dans un milieu de mesure, comprenant: le placement d'un biocapteur selon l'invention, dans le milieu de mesure; l'application d'un potentiel de travail au biocapteur électrochimique; la détection d'un courant d'oxydation indicateur de la présence et/ou de la 25 concentration dudit analyte dans le milieu de mesure. Dans un mode de réalisation, le procédé de détection selon l'invention est un procédé in vivo, par exemple mis en oeuvre sur un animal de laboratoire, notamment un modèle murin tel que la souris ou le rat, ou mis en oeuvre sur l'homme, par exemple pour des applications cliniques, telles que le suivi opératoire ou le diagnostic. 30 Dans un autre mode de réalisation, le procédé de détection selon l'invention est un procédé in vitro. Le milieu de mesure est par exemple un tissu isolé ou une culture cellulaire. Le milieu de mesure peut également être un fluide biologique, par exemple le milieu interstitiel du cerveau, le sang, le plasma sanguin, le sérum sanguin ou l'urine, ou un dérivé d'un de ces fluides, notamment après traitement et/ou purification. 3035221 7 Dans un mode de réalisation particulier, l'analyte est le glucose, le lactate, le glutamate, la choline, l'acétylcholine, l'adénosine, l'ATP, le cholestérol, la glycine, ou un D-amino acide, en particulier la D-sérine. 5 Définitions Un biocapteur est un dispositif intégré capable de fournir des informations spécifiques quantitatives ou semi-quantitatives grâce à un élément de reconnaissance d'origine biologique (tel qu'une enzyme) associé à un élément de transduction (tel qu'une électrode). Un filament est un élément solide de forme fine et allongée, tel qu'un fil ou une fibre. Le 10 filament, dans la présente invention, sert de support de métallisation, et constitue, sous forme de filament métallisé, l'électrode de détection électrochimique proprement dite. Le filament peut être constitué de tout matériau susceptible d'être utilisé comme substrat pour le dépôt sous vide d'une couche métallique, notamment le carbone (par exemple sous forme de fibres de carbone) ou un polymère tel que le poly(p-phénylènetéréphtalamide). Il peut être conducteur ou non 15 conducteur. Le filament a de préférence une section transversale circulaire. Il peut être par exemple cylindrique, de forme effilée, ou conique. La partie sensible du filament, c'est-à-dire la partie utile pour la détection du composé oxydable, a de préférence une longueur qui n'excède pas 200 pm, plus particulièrement 150 pm, et de façon plus particulière 100 pm. La longueur de la partie sensible du filament peut notamment être de 10 pm à 200 pm. 20 Le terme de dépôt sous vide recouvre un ensemble de techniques de dépôt d'une couche mince (un film) sur un substrat solide, ayant en commun d'être réalisées à des pressions plus faibles que la pression atmosphérique, par exemple au moins inférieures à 10-1 torr. Le film est généralement déposé atome par atome ou molécule par molécule. Comme exemple de procédé de dépôt sous vide, on compte notamment le dépôt physique en phase vapeur, ou le 25 dépôt chimique en phase vapeur. Une oxydase est une enzyme catalysant une réaction d'oxydo-réduction impliquant une molécule de dioxygène (02) comme accepteur d'électron, en produisant généralement du peroxyde d'hydrogène (H202). Le terme composé oxydable définit tout composé capable d'être transformé dans une réaction 30 d'oxydation électrochimique. Un exemple préféré de composé oxydable, dans la présente invention est le peroxyde d'hydrogène, qui peut être produit par une enzyme de la classe des oxydases. Une molécule interférente est toute molécule susceptible d'interférer dans la détection de l'analyte. Plus particulièrement, une molécule interférente peut interférer directement dans la 3035221 8 détection du composé oxydable au contact du filament métallisé. Une molécule interférente est donc en particulier toute molécule susceptible d'être oxydée au contact du filament métallisé, à l'exception du composé oxydable lui-même, par exemple le peroxyde d'hydrogène (H202). Les molécules interférentes les plus courantes dans le milieu interstitiel du système nerveux central 5 sont l'acide ascorbique, la dopamine, le DOPA, la noradrénaline, la sérotonine, le 5-HIAA, l'acide urique, et l'acide homovanillique. Dans la présente invention, les termes couche métallique désignent la couche déposée à la surface d'un filament conducteur ou non conducteur. Ladite couche est à base d'un métal ou de plusieurs métaux capable(s) de catalyser l'oxydation d'un composé oxydable, par exemple le 10 peroxyde d'hydrogène (H202). La réaction d'oxydation génère un courant d'électrons dont la détection permet une mesure quantitative ou semi-quantitative de la concentration du composé oxydable au voisinage du filament métallisé. Une sous-couche d'accroche désigne toute couche de matériau déposée sous la couche métallique, et apte à stabiliser le dépôt et/ou améliorer l'adhérence de la couche métallique sur 15 le filament support. Un matériau écran est un matériau qui permet de limiter la pénétration de molécules interférentes au contact d'une électrode de détection électrochimique. La pénétration du composé oxydable est moins affectée, voire n'est pas affectée du tout par le matériau écran. En d'autres termes, le matériau écran permet d'augmenter la proportion de composé 20 oxydable/molécules interférentes au voisinage de l'électrode. Un matériau écran peut agir par discrimination stérique, c'est-à-dire en limitant la pénétration des molécules ayant une taille supérieure à un seuil de discrimination stérique. C'est notamment le cas des polymères écrans tels que la poly-m-phénylènediamine, la poly-o-phénylènediamine, le polyphénol ou l'acétate de cellulose. Le seuil de discrimination stérique peut être ajusté en variant le degré de 25 polymérisation. Par exemple, le matériau écran peut limiter la pénétration des molécules de taille comparable à l'acide ascorbique, la dopamine, le DOPA, la noradrénaline, la sérotonine, le 5-HIAA, l'acide urique, ou l'acide homovanillique, tout en laissant pénétrer le peroxyde d'hydrogène au voisinage du filament métallisé. Le matériau écran peut également consister en ou comprendre une enzyme de dégradation d'une ou plusieurs molécules interférentes. 30 Le terme immobilisation désigne tout procédé apte à stabiliser le dépôt de la couche enzymatique sur le biocapteur. L'immobilisation se fait par exemple par fixation covalente à l'aide d'un agent chimique de réticulation (cross-linking) tel que le glutaraldéhyde ou le poly(éthylène glycol) diglycidyl ether (PEGDE). Les termes détection électrochimique désignent tout procédé de détection qualitative ou 35 quantitative d'une molécule par le biais d'une réaction impliquant la production d'un courant 3035221 9 électrique. La détection peut se faire par ampérométrie, par exemple ampérométrie à potentiel constant, ampérométrie pulsée, chronoampérométrie, ou voltamétrie, par exemple voltamétrie cyclique, voltamétrie à impulsion, voltamétrie à impulsion différentielle. Conformément au sens usuel du terme dans les techniques de dépôt sous vide, les termes 5 dépôt conforme désignent le dépôt d'une couche qui épouse la forme des reliefs éventuels existant sur la surface sous-jacente. La couche déposée a donc une épaisseur sensiblement constante sur toute la surface du filament, par exemple, variant de moins de 20%, en particulier moins de 15%, 10% ou 5%. Sauf indications contraires, toute mesure de taille relative au biocapteur dans la présente 10 demande, telle que le diamètre ou la longueur, se rapporte à la partie sensible du biocapteur, c'est-à-dire la partie exposée au milieu de mesure, au contact de laquelle ont lieu les réactions d'oxydation servant à la détection du composé oxydable. Pour mieux illustrer la présente invention, on va en décrire ci-après, à titre indicatif et non 15 limitatif, plusieurs modes de réalisations particuliers avec référence aux dessins annexés. Brève description des dessins La Figure 1A est une image en microscopie électronique d'une fibre de carbone de 7 pm métallisée par dépôt physique en phase vapeur, par une couche de platine de 100 nm 20 d'épaisseur. La Figure 1B est une image en microscopie électronique d'une fibre de carbone de 7 pm métallisée par électrodéposition d'une couche de ruthénium. La Figure 2 représente un enregistrement d'une durée de 3h de la concentration extracellulaire de glucose dans le cortex d'un rat anesthésié, réalisé à l'aide d'un biocapteur selon l'invention. 25 A t=60min, l'administration d'insuline provoque la diminution du glucose extracellulaire. A t=112min, l'injection intraveineuse d'un bolus de glucose provoque un rebond rapide de la concentration extracellulaire de glucose. Exemples 30 Exemple 1 : Matériels et Méthodes Préparation des fibres de carbone métallisées 3035221 10 Des fibres de carbone de 7 pm ou 4,8 pm de diamètre (Goodfellow, Lille, France) sont découpées en segments d'environ 5 cm puis collées sur un support métallique à l'aide d'un adhésif en kapton (Radiospares, Beauvais, France) choisi pour sa tenue sans dégazage à haute température (jusqu'à 200°C). Le dépôt s'effectue dans une enceinte sous vide, dans un 5 évaporateur Edwards Auto306 équipé d'un canon à électrons à 5KV. Le support est introduit dans l'évaporateur, un faisceau d'électrons est émis par le filament chauffant sous vide (10-5 à 10-7 mbar). L'intensité du courant pendant le dépôt est maintenue autour de 200mA et la température du substrat à moins de 130°C. Le faisceau d'électrons est focalisé au niveau d'un creuset qui contient le matériau à évaporer. La vitesse de dépôt est ajustable par le courant qui 10 traverse le filament. L'épaisseur déposée ainsi que la vitesse de dépôt sont contrôlées avec une mini balance à quartz étalonnée au préalable. Les creusets peuvent être sélectionnés pendant le dépôt par un système automatisé ce qui permet d'enchaîner sous vide le dépôt de plusieurs matériaux de très haute pureté sans remettre l'enceinte à l'air. Le dépôt d'une couche d'accroche, de Ti ou du Cr (en particulier, de 1 à 20 nm) est suivi par le dépôt d'une couche 15 métallique de Pt ou Ru (en particulier de 10 à 200 nm). Les matériaux utilisés sont de très haute pureté (5N). Le support porte-fibre est mis en rotation pendant le dépôt pour obtenir une meilleure homogénéité. Le dépôt se fait sur toute la surface non protégée de la fibre en retournant le support. A titre de comparaison, des fibres de carbone sont métallisées par électrodéposition d'un 20 couche de ruthénium. Le dépôt de Ru par électrodéposition est effectué par trempage de l'électrode en fibre de carbone dans une solution de standard atomique de Ruthénium (1mg/mL, dans HCI 5%, Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) dont le pH a été ajusté à 2.5 sous un potentiel imposé à -500 mV vs. Ag/AgCI pendant 30 min. L'uniformité et la régularité de la couche de platine déposée par dépôt physique en phase 25 vapeur (Figure 1A) contraste avec le dépôt irrégulier obtenu par électrodéposition, qui génère des grains d'une épaisseur d'au moins 1 pm à la surface du filament (Figure 1 B). Le dépôt réalisé par dépôt physique en phase vapeur suit la structure striée de la fibre de carbone sous-jacente (Figure 1A) 30 Préparation des microélectrodes Les fibres de carbone métallisées sont ensuite collées individuellement sur un fil de bobinage en cuivre de 0.5 mm de diamètre (Becker, Almacen, Espagne) avec de la peinture d'argent conductrice (Radiospares, Beauvais, France). Elles sont ensuite insérées dans un capillaire en borosilicate étiré et coupé pour laisser passer la fibre métallisée par l'extrémité étirée. Les deux 35 extrémités du capillaire sont ensuite scellées par de la colle époxy (Loctite, Marne la Vallée, 3035221 11 France). La fibre de carbone métallisée est ensuite coupée pour ne laisser dépasser que 100 pm hors du capillaire, qui forment la partie sensible de l'électrode. Préparation des biocapteurs 5 Les microélectrodes sont ensuite fonctionnalisées par une première couche de poly-m- phénylènediamine obtenu par électropolymérisation à +700 mV (vs Ag/AgCI) dans une solution de m-phénylènediamine (Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France) 100 mM dans du tampon phosphate salin (PBS, 0.01 M, pH = 7.4). Des biocapteurs enzymatiques peuvent ensuite être préparés à partir d'enzymes de la classe des oxydases immobilisées sur la microélectrode. Le 10 diamètre total de la partie sensible des biocapteurs ainsi obtenus est inférieur à 15 pm, correspondant à l'épaisseur cumulée de la fibre de carbone centrale, de la couche d'accroche, de la couche métallique, de la couche de poly-m-phénylènediamine, et de la couche d'enzyme immobilisée. Par exemple, des biocapteurs de glucose sont obtenus en déposant sur la pointe de l'électrode 15 une solution visqueuse de glucose oxydase : 60 mg/mL glucose oxydase, 30 mg/mL albumine de sérum bovin (BSA), 1% glycérol et 30 mg/mL de poly(éthylène glycol) diglycidyl ether (PEGDE) dans du PBS 0.01M. L'électrode est ensuite placée à 57°C pendant 2h pour permettre l'immobilisation covalente de l'enzyme par le PEGDE. Les biocapteurs de lactate sont obtenus de la même manière avec de la lactate oxydase : 60 20 mg/mL lactate oxydase, 60 mg/mL de BSA, 1 `)/0 glycérol et 60 mg/mL PEGDE dans du PBS 0.01 M avec 2h de chauffage à 57 °C. Les biocapteurs de D-sérine sont obtenus à partir d'une solution de D-amino acide oxydase : 60 mg/mL de D-amino acide oxydase, 30 mg/mL de BSA, 1% glycerol, 10 mg/mL de PEGDE et chauffage pendant 1h45 à 56 °C. 25 Les biocapteurs de glutamate sont obtenus à partir d'une solution de glutamate oxydase : 100 mg/mL glutamate oxydase, 150 mg/mL BSA, 1% glycérol et 200 mg/mL de PEGDE dans du PBS 0.01 M avec chauffage à 45-47 °C pendant 1h30. De nombreux autres biocapteurs permettant de détecter la choline, l'acétylcholine, l'adénosine ou l'ATP peuvent aussi être obtenus de cette manière. 30 Méthode d'enregistrement et détection Tous les enregistrements in vitro sont réalisés dans une solution de PBS 0.01 M à pH 7.4. 3035221 12 L'électrode de référence est constituée d'un fil d'argent de 0.25 mm de diamètre chloruré dans une solution de KCI 2M. Le potentiel est imposé à +500 mV par rapport à la référence Ag/AgCI grâce à un amplificateur VA-10 (NPI Electronic GmbH, Tamm, Allemagne) et le courant mesuré est numérisé sur une carte d'acquisition NI USB-6221 (National Instruments, Nanterre, France) 5 et analysé sur un logiciel Igor pro 6.1 (Wavemetrics, Lake Oswego, Oregon). La calibration des biocapteurs se fait par ajouts dosés de solutions standard de concentration connue afin de déterminer la sensibilité des biocapteurs (en densité de courant d'oxydation exprimée en nA.mM-1.cm-2) ainsi que leur sélectivité. Dans la présente demande, sauf s'il en est spécifié autrement, la sensibilité des biocapteurs est exprimée par la médiane et l'intervalle interquartile. 10 Exemple 2 : Effet de l'épaisseur de la couche métallique sur la sensibilité à l'H202 Un dépôt de platine (couche de 20 ou 100 nm) a été réalisé sur une couche d'accroche de titane de 15 nm d'épaisseur. La sensibilité des microélectrodes obtenues avec ces deux épaisseurs de platine était respectivement de 26 (22-32) nA.mM-'.cm-2 (n=6) et de 145 (97-217) 15 nA.mM-1.cm-2 (n=69). La couche de platine de 100 nm permet d'obtenir une sensibilité supérieure à la couche de 20 nm. Exemple 3 : Effet du matériau utilisé pour la sous-couche d'accroche sur la sensibilité à l'H202 Les inventeurs ont testé une couche d'accroche de 15 nm de titane ou de chrome en gardant 20 une épaisseur de platine de 100 nm. La sensibilité de 145 (97-217) nA.mM-'.cm-2 (n=69) obtenue avec la couche de titane est passée à 325 (184 - 629) nA.mM-'.cm-2 lorsque le Cr était utilisé en sous-couche d'accroche. La couche d'accroche de Cr confère donc une sensibilité de détection supérieure à la couche d'accroche de Ti. 25 Exemple 4 : Effet des différentes couches de fonctionnalisation Les microélectrodes constituées d'un fil de carbone métallisé avec 100 nm de platine sont ensuite fonctionnalisées pour obtenir des biocapteurs de glucose. La première couche de polymère écran en poly-m-phénylènediamine induit une diminution de la sensibilité à l'H202 qui est passée de 166 (116-217, n=6) à 6 (5-21, n=5) nA.mM-'.cm-2. Cette sensibilité permet 30 d'obtenir des biocapteurs de glucose d'une sensibilité médiane de 9 (1-28, n=4) nA.mM-'.cm-2 de glucose. 3035221 13 Exemple 5 : Stabilité à 6 mois Deux lots de microélectrodes fabriquées à base d'une fibre de carbone platinée ont été testés à 6 mois d'intervalle. Le premier lot est constitué de fibres de carbone recouvertes d'une couche d'accroche en titane et d'une couche métallique de 100 nm de platine (n=17). Leur 5 sensibilité est passée de 130 (77-156) à 131 (96-166) nA.mM-1.cm-2. Le deuxième lot est constitué de fibres de carbone recouvertes d'une couche d'accroche en chrome et d'une couche métallique de platine de 100 nm (n=13). En revanche, dans ce lot, la sensibilité est passée de 413 (305-809) à 64 (32-91) nA.mM-'.cm-2. La bonne stabilité de la couche métallique, et le maintien de bonnes propriétés catalytiques au 10 bout de plusieurs mois, sont particulièrement surprenants pour un dépôt en phase vapeur sur une surface non plane, telle que celle des fibres de carbone. La stabilité de la couche métallique étant déterminante dans la stabilité globale du biocapteur enzymatique, et le maintien à long terme d'une sensibilité acceptable, ces résultats permettent de prédire une excellente stabilité globale du biocapteur enzymatique. En effet, la stabilité d'une 15 couche d'enzyme peut atteindre plusieurs mois. Par exemple, une couche de D-amino acide oxydase immobilisée par le glutaraldéhyde a pu être conservée 3 mois à -20 °C sans perte significative d'activité (Pernot et al, 2008). Exemple 6 : Détection in vivo des concentrations de glucose 20 Un biocapteur à glucose de diamètre inférieur à 15 pm est implanté in vivo dans le cortex de rats anesthésiés. Ce biocapteur permet de suivre la concentration extracellulaire de glucose pendant plus de 3 heures dans un protocole consistant à administrer 45 U/kg d'insuline pour faire baisser la concentration de glucose cérébrale, puis à délivrer une dose de 1 mL de glucose à 1 M pour induire une augmentation rapide du glucose intracérébral (Figure 2). 25 Il est bien entendu que les modes de réalisation qui ont été décrits ci-dessus ont été donnés à titre indicatif et non limitatif et que des modifications peuvent être apportées sans que l'on s'écarte pour autant du cadre de la présente invention. 30 Références bibliographiques Pernot, P., Mothet, J.-P., Schuvailo, O., Soldatkin, A., Pollegioni, L., Pilone, M., Adeline, M.-T., Cespuglio, R., Marinesco, S., 2008. Characterization of a yeast D-amino acid oxidase 3035221 14 microbiosensor for D-serine detection in the central nervous system. Anal. Chem. 80, 15891597. doi:10.1021/ac702230w Sakslund, H., Wang, J., 1995. Development and evaluation of glucose microsensors based on electrochemical codeposition of ruthenium and glucose oxidase onto carbon fiber 5 microelectrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry - J ELECTROANAL CHEM 397, 149- 155. doi:10.1016/0022-0728(95)04152-0 Schuvailo, 0.N., Dzyadevych, S.V., El'skaya, A.V., Gautier-Sauvigné, S., Csiiregi, E., Cespuglio, R., Soldatkin, A.P., 2005. Carbon fibre-based microbiosensors for in vivo measurements of acetylcholine and choline. Biosens Bioelectron 21, 87-94. 10 doi:10.1016/j.bios.2004.09.017 Wang, J., Rivas, G., Chicharro, M., 1997. Glucose microsensor based on electrochemical deposition of iridium and glucose oxidase onto carbon fiber electrodesl. Journal of Electroanalytical Chemistry 439, 55-61. doi:10.1016/S0022-0728(97)00371-9 15 REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un biocapteur électrochimique pour la détection d'un analyte, ledit procédé comprenant : le dépôt, sur un filament support, d'une couche métallique apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable, ledit dépôt étant réalisé par un procédé de dépôt sous vide ; et le dépôt, sur le filament métallisé, d'une couche enzymatique apte à catalyser la dégradation dudit analyte en générant ledit composé oxydable. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le procédé de dépôt sous vide est un procédé de dépôt chimique en phase vapeur ou un procédé de dépôt physique en phase vapeur. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la couche métallique comprend au moins un métal noble. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant, avant le dépôt de la couche métallique, le dépôt d'une sous-couche d'accroche sur le filament support. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la sous-couche d'accroche est à base de de chrome, de titane ou de nitrure de titane. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la couche enzymatique comprend une enzyme de la classe des oxydases. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le filament support est une fibre de carbone. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant, après le dépôt de la couche métallique, le dépôt d'un matériau écran apte à limiter la pénétration de molécules interférentes au contact du filament métallisé. 3035221 16 9. Biocapteur électrochimique pour la détection d'un analyte, ledit biocapteur comprenant un filament support successivement revêtu : - d'une couche métallique déposée par un procédé de dépôt sous vide, ladite couche métallique étant apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable ; et 5 - d'une couche enzymatique apte à catalyser la dégradation dudit analyte en générant ledit composé oxydable. 10. Biocapteur selon la revendication 9, comprenant une sous-couche d'accroche entre le filament support et la couche métallique. 10 11. Biocapteur selon l'une des revendications 9 ou 10, comprenant, entre la couche métallique et la couche enzymatique, un matériau écran apte à limiter la pénétration de molécules interférentes au contact du filament métallisé. 15 12. Biocapteur selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel : le diamètre du filament n'excède pas 10 pm ; - l'épaisseur de la couche métallique n'excède pas 200 nm; et/ou - l'épaisseur de la sous-couche d'accroche n'excède pas 20 nm. 20 13. Biocapteur selon l'une des revendications 9 à 12, dans lequel le diamètre total du biocapteur n'excède pas 15 pm. 14. Dispositif pour la détection électrochimique d'un analyte, ledit dispositif comprenant : - un biocapteur selon l'une des revendications 9 à 13 ; 25 - un dispositif d'amplification de courant électrique ; et, de façon facultative au moins l'un parmi : - un dispositif de conversion analogique/numérique ; - un logiciel d'acquisition et/ou d'exploitation des données de détection ; - une électrode de référence. 3035221 17 15. Utilisation, en tant qu'électrode de détection électrochimique, d'un filament support revêtu d'une couche métallique déposée par un procédé de dépôt sous vide, ladite couche métallique étant apte à catalyser l'oxydation d'un composé oxydable, et ladite couche métallique étant recouverte d'une couche d'enzyme apte à générer ledit composé oxydable, 5 par le biais d'une réaction enzymatique. 16. Procédé in vitro de détection électrochimique d'un analyte dans un milieu de mesure, comprenant: le placement d'un biocapteur selon l'une des revendications 9 à 13, dans le milieu 10 de mesure; l'application d'un potentiel de travail au biocapteur électrochimique; la détection d'un courant d'oxydation indicateur de la présence et/ou de la concentration dudit analyte dans le milieu de mesure. 15 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel l'analyte est le glucose, le lactate, le glutamate, la choline, l'acétylcholine, l'adénosine, l'ATP, le cholestérol, la glycine, ou un Damino acide.