FR 3028962 A1 20160527 FR 1461528 A 20141126 - 1 - «Dispositif pour objectif de microscope, et procédé d'utilisation d'un tel dispositif» Domaine technique La présente invention concerne un dispositif pour objectif de microscope, et un procédé d'utilisation d'un tel dispositif. Un tel dispositif permet à un utilisateur d'acquérir à partir d'un échantillon ou de transmettre à un échantillon un signal optique notamment avec moins d'artefact de détermination de position du plan focal de l'objectif dans l'échantillon et/ou une meilleure résolution et/ou une minimisation de perte de signal. Le domaine de l'invention est plus particulièrement, mais de manière non limitative, celui de la microscopie Raman, notamment pour la mesure d'épaisseur d'un échantillon et/ou de la profondeur d'un plan de focalisation. Etat de la technique antérieure On connaît l'article de Tomba et al. intitulé « Avoiding Coupling FluidSample Interaction in Confocal Raman Depth Profiling with Immersion 20 Objectives » et paru en 2008 dans le volume 62, n°7, de la revue Applied Spectroscopy. Cet article décrit un dispositif ayant pour objectif et pour résultat : - d'éliminer toute interface d'air ou de gaz (de faible indice de réfraction, autour de 1) entre un objectif de microscope et un échantillon 25 (d'indice de réfraction environ égal à 1,5), et - de n'intercaler entre l'objectif et l'échantillon exclusivement des milieux ayant un indice de réfraction très proche de celui de l'échantillon (typiquement une huile de couplage d'indice 1,50 et un film en polyéthylène (PE) d'indice 1,51 pour un échantillon en polypropylène (PP) d'indice 1,49), 30 ceci afin de profiter au maximum de la bonne ouverture numérique de l'objectif de microscope et d'éviter des problèmes de résolution, de détermination de profondeur du plan de focalisation de l'objectif, et de réduction de l'intensité Raman avec l'augmentation de la profondeur de focalisation de l'objectif. 3028962 -2- Le but de la présente invention est de proposer un dispositif permettant de s'affranchir de ces mêmes problèmes tout en permettant une meilleure adaptabilité du dispositif en fonction de différentes natures possibles de l'échantillon. 5 Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé d'utilisation d'un tel dispositif. Exposé de l'invention Cet objectif est atteint avec un dispositif pour objectif de microscope, 10 comprenant : - une lame, - un réservoir agencé pour contenir du liquide et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement, dont : 15 o une extrémité ouverte, prévue pour l'insertion d'une extrémité distale d'un objectif de microscope, et o une extrémité fermée par la lame, - un dispositif d'espacement, situé du côté opposé de la lame par rapport au réservoir, et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement est placé contre une surface plane d'un échantillon, créer un espace intermédiaire entre la lame et l'échantillon. Le dispositif selon l'invention peut être dénué de moyens pour créer une dépression dans l'espace intermédiaire. La lame est de préférence rigide, c'est-à-dire avec un module d'Young supérieur à 3 GPa (de préférence supérieur à 6 GPa, de manière préférentielle à 70 GPa), de préférence compris entre 3 GPa et 200 GPa (de préférence entre 6 GPa et 200 GPa, de préférence entre 70 GPa et 200 GPa). Le dispositif d'espacement : - peut comprendre des moyens pour régler une hauteur, le long de la direction d'alignement, de ce dispositif d'espacement, et/ou - peut être un premier dispositif d'espacement et être interchangeable, et le dispositif selon l'invention peut en outre 3028962 - 3 - être accompagné d'au moins un autre dispositif d'espacement de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement. La lame a de préférence une épaisseur supérieure ou égale à 100 micromètres, de préférence à 130 micromètres. 5 La lame peut avoir une épaisseur inférieure ou égale à 500 micromètres. Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé d'utilisation d'un dispositif selon l'invention, caractérisé en ce que : 10 - on remplit le réservoir avec du liquide à immersion et on insère une extrémité distale d'un objectif de microscope dans le réservoir par l'extrémité ouverte du réservoir, de sorte que l'extrémité distale de l'objectif et la lame soient reliées par le liquide, 15 - on place le dispositif d'espacement contre une surface d'un échantillon ou autour de l'échantillon de manière à créer un espace intermédiaire entre la lame et l'échantillon, - on transporte un signal optique à travers l'objectif, ce transport de signal optique comprenant une acquisition du signal en 20 provenance de l'échantillon via l'objectif ou un acheminement du signal optique jusqu'à l'échantillon via l'objectif. De préférence, le procédé selon l'invention ne comprend aucune dépressurisation dans l'espace intermédiaire entre la création de l'espace intermédiaire et le transport du signal. 25 De préférence, le procédé selon l'invention ne comprend aucune déformation de la lame entre la création de l'espace intermédiaire et le transport du signal. Le procédé selon l'invention peut comprendre un réglage d'une hauteur, le long de la direction d'alignement, du dispositif d'espacement. 30 L'écart de l'indice de réfraction du liquide, par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif au moment du transport du signal, est de préférence inférieur à vingt pour cent. 3028962 -4- L'écart de l'indice de réfraction de la lame, par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif au moment du transport du signal, est de préférence inférieur à vingt pour cent. 5 L'indice de réfraction du liquide est de préférence compris entre 1,3 et 1,7. La distance entre la lame et l'échantillon est : - de préférence supérieure ou égale à 10 micromètres, et/ou - de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre. 10 le procédé selon l'invention peut comprendre une mesure d'une épaisseur de l'échantillon à partir de l'acquisition du signal. Description des figures et modes de réalisation D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la 15 lecture de la description détaillée de mises en oeuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants : - la figure 1 illustre un objectif 80 et un échantillon 11 selon l'art antérieur, - la figure 2 illustre une utilisation du montage la figure 1, 20 - la figure 3 illustre des données Raman acquises selon l'utilisation de l'objectif 80 des figures 1 et 2, - la figure 4 est une vue de coupe de profil d'un premier mode de réalisation de dispositif 1 selon l'invention en cours d'utilisation sur un échantillon 11, 25 - la figure 5 est une vue de coupe de profil d'une première variante de dispositif selon l'invention de la figure 4, - la figure 6 est une vue de coupe de profil d'une deuxième variante de dispositif selon l'invention de la figure 4 (cette deuxième variante étant combinable avec la première variante de la figure 5), 30 - la figure 7 illustre un mouvement de l'objectif 8 de dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6, - les figures 8 et 9 illustrent des données Raman obtenues avec le dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une mesure d'épaisseur de l'échantillon 11, 3028962 - 5 - - la figure 10 illustre des données Raman obtenues avec le dispositif 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une détermination de la résolution à la surface supérieure de l'échantillon 11, et - la figure 11 illustre des données Raman obtenues avec le dispositif 5 1 selon l'invention des figures 4 à 6 pour une détermination de résolution en profondeur, et - la figure 12 est un tableau qui donne différentes valeurs d'un facteur de correction F entre le déplacement réel d' du plan de focalisation de l'objectif 8 et le déplacement nominal d du plan de focalisation de 10 l'objectif 8. Ces modes de réalisation étant nullement limitatifs, on pourra notamment considérer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites ou illustrées par la suite isolées des 15 autres caractéristiques décrites ou illustrées (même si cette sélection est isolée au sein d'une phrase comprenant ces autres caractéristiques), si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de 20 préférence fonctionnelle sans détails structurels, et/ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou à différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. 25 La figure 1 représente l'état de l'art. Les figures 1 et 2 illustrent un objectif 80 et un échantillon 11 (d'indice de réfraction ns) séparés par de l'air d'indice na. L'échantillon 11 est une couche de polymère de TOPAS 8007® avec une épaisseur de 165 dam mesurée avec un micromètre MITUTOYO (modèle 30 15610110). L'objectif 80 est un objectif d'ouverture numérique égale à 0,9 et de référence MPLFLN100X d'Olympus. En référence à la figure 2, lorsque l'on déplace l'objectif de microscope 80 le long de l'axe Z au-dessus de l'échantillon 11 entre deux 3028962 - 6 - positions 80a et 80b distants d'une distance d, le plan focal de l'objectif 80 se déplace dans l'échantillon 11 d'une distance d'. d est différent de d'. En outre, il n'y a pas de proportionnalité entre d et d'. Autrement dit, 5 d' n'est pas une fonction affine de d, et il n'est pas simple de déterminer d' en fonction de d. Un tel montage selon l'état de l'art antérieur, au fur et à mesure que le plan de focalisation de l'objectif 80 s'enfonce dans l'échantillon, pose des problèmes de plus en plus importants de résolution, de détermination de la 10 profondeur du plan de focalisation de l'objectif 80, et de réduction de l'intensité Raman. Par exemple, la figure 3 illustre le profil Raman confocal collecté avec cet objectif 80 sur l'échantillon 11 en déplaçant l'objectif 80 le long de l'axe Z. L'axe des abscisses du graphique de la figure 3 est la position nominale A 15 en dam de l'objectif 80 le long de l'axe Z. Sur la base de ce profil, on arrive à une mesure erronée d'épaisseur de l'échantillon 11 égale à 89pm. On va maintenant décrire, en référence aux figures 4 à 12, un premier mode de réalisation de dispositif ou embout ou capuchon 1 selon 20 l'invention et un procédé selon l'invention d'utilisation de ce dispositif ou embout ou capuchon 1. Le dispositif 1 selon l'invention va à l'encontre de l'enseignement technique de l'article de Tomba et al. intitulé « Avoiding Coupling FluidSample Interaction in Confocal Raman Depth Profiling with Immersion 25 Objectives », et vainc les préjugés techniques de cet article selon lesquels il faut absolument éliminer tout air entre l'objectif de microscope et l'échantillon et il ne faut intercaler entre l'objectif et l'échantillon rien que des milieux ayant un indice de réfraction très proche de celui de l'échantillon (typiquement une huile de couplage d'indice 1,50 et un film PE 30 d'indice 1,51 pour un échantillon en PP d'indice 1,49). En référence aux figures 4 à 6, le dispositif 1 selon l'invention pour objectif de microscope, comprend une lame 2. La lame 2 est plane. La lame 2 est une lame à double faces parallèles. Ainsi, on limite les effets optiques de cette lame. 3028962 - 7 - Le dispositif 1 comprend un réservoir 3 agencé pour contenir du liquide 4, c'est-à-dire pour retenir le liquide 4 sans que le liquide 4 ne se répande à l'extérieur du réservoir 3. Le réservoir 3 est muni de deux extrémités opposées alignées le long 5 d'une direction d'alignement 5, dont : o une extrémité ouverte 6, prévue pour l'insertion d'une extrémité distale 7 d'un objectif 8 de microscope, et o une extrémité fermée 9 par la lame 2. Le dispositif 1 comprend un dispositif d'espacement 10, situé du côté 10 de la lame 2 opposé par rapport au réservoir 3, et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement 10 est placé contre une surface plane d'un échantillon 11, créer un espace intermédiaire 12 entre la lame 2 et l'échantillon 11. Le dispositif 1 est dénué de moyens pour créer une dépression dans 15 l'espace intermédiaire 12. Par dépression, on entend de préférence toute pression à l'intérieur de l'espace 12 inférieure à 0,8 atmosphère. Le dispositif 1 est dénué de moyens agencés pour aspirer un gaz en provenance de l'espace intermédiaire 12 ou au moins dénué de moyens agencés pour aspirer un gaz en provenance de l'espace intermédiaire 12 20 sans le remplacer par un autre gaz. Le dispositif 1 est dénué de moyens pour déformer la lame 2. La dispositif d'espacement 10 a une hauteur supérieure ou égale à 10 micromètres, de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre. Selon la variante envisagée, le dispositif d'espacement 10 peut être 25 muni : - de trous pour faire communiquer l'espace intermédiaire 12 avec l'atmosphère gazeuse environnante autour du dispositif 1, ou - peut être fermé pour isoler l'espace intermédiaire 12 par rapport à l'atmosphère gazeuse environnante autour du dispositif 1 ; dans 30 ce cas, le dispositif 1 peut comprendre des moyens pour remplacer le contenu de l'espace intermédiaire 12 (par exemple remplacer un contenu initial d'air par un gaz neutre ou tout autre gaz ou mélange de gaz avec lequel on souhaite mettre en contact l'échantillon 11). 3028962 - 8 - La lame 2 est rigide. Ainsi, on assure le maintien du volume de l'espace intermédiaire 12. La lame 2 a un module d'Young supérieur à E=3 GPa (de préférence supérieur à 6 GPa, de manière préférentielle à 70 GPa), de préférence 5 compris entre 3 GPa et 200 GPa (de préférence entre 6 GPa et 200 GPa, de préférence entre 70 GPa et 200 GPa). Par exemple, le module d'Young du verre classique Schott® pour lamelles de microscopes (utilisable pour la lame 2) est de 72,9 GPa. La lame a une épaisseur 16 supérieure ou égale à e=100 pm ou 130 10 pm (de préférence inférieure ou égale à 500 micromètres). La lame 2 a un Coefficient de contrainte optique supérieur ou égal à C=3,4.10-12 m2/N La lame 2 a un coefficient de poisson supérieur ou égal à p=0,208 La lame 2 a un Module de cisaillement supérieur ou égal à G=30,1 15 kN/mm2 La lame 2 a une dureté Knoop HK100 supérieur ou égal à 590. La lame 2 est en verre ou en polymère. Dans une première variante de ce mode de réalisation illustré sur la 20 figure 5, le dispositif d'espacement 10 est interchangeable. Ainsi, sur la figure 4, le dispositif d'espacement 10 est un premier dispositif d'espacement 101 interchangeable. Le dispositif 1 est accompagné (par exemple sous la forme d'un « kit », typiquement sous sa forme commercialisée) d'au moins un autre dispositif d'espacement 102 (de 25 préférence de plusieurs autres dispositifs d'espacement) de hauteur (définie, comme toutes les autres hauteurs de cette description, parallèlement à la direction d'alignement 5 ou à l'axe optique de l'objectif 8 qui est parallèle à cette direction 5) différente de celle du premier dispositif d'espacement 101. Le dispositif d'espacement 101 interchangeable de la 30 figure 4 peut ainsi être remplacé par le dispositif d'espacement 102 (plus haut) tel que représenté sur la figure 5, et inversement. Ceci permet une meilleure adaptabilité à l'échantillon 11 en fonction : - des hauteurs des reliefs 18 de l'échantillon 11, ou 3028962 - 9 - - de la hauteur de l'échantillon (par exemple dans une variante où sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon posé sur ce support). 5 - de la distance focale de l'objectif 8 de microscope Chaque dispositif d'espacement 10 parmi les différents dispositifs d'espacement interchangeables 101, 102, etc. peut par exemple être un anneau ou une rondelle en polymère et/ou métal anodisé et/ou verre. Chaque dispositif d'espacement 10 parmi les différents dispositifs 10 d'espacement interchangeables 101, 102, etc. est agencé pour être de préférence maintenu par une force mécanique (coincé, clipsé, ou serré) ou magnétique (aimantation) sur le réservoir 3 ou, de manière moins préférée, simplement posé ou mis en contact du réservoir 3. 15 Dans une deuxième variante de ce mode de réalisation illustré sur la figure 6, le dispositif d'espacement 10 comprend des moyens 13 pour régler (sans interchanger ce dispositif 10) une hauteur 14, le long de la direction d'alignement 5, de ce dispositif d'espacement 10. Ces moyens de réglage 13 sont agencés pour permettre différentes (de préférence au moins 5) 20 valeurs non nulles et stables dans le temps de la hauteur 14 du dispositif d'espacement 10. Ceci permet une meilleure adaptabilité à l'échantillon 11 en fonction : - des hauteurs des reliefs 18 de l'échantillon 11, ou - de la hauteur de l'échantillon (par exemple dans une variante où 25 sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon posé sur ce support). - de la distance focale de l'objectif 8 de microscope. Le dispositif d'espacement 10 peut par exemple être une paire 30 d'anneaux ou de rondelles 21, 22 munis de moyens pour écarter ces deux anneaux ou rondelles 21, 22 l'un par rapport à l'autre. Ces moyens de réglage 13 ou d'écartement peuvent par exemple comprendre : 3028962 -10- - une vis micrométrique 19 qui tourne dans un pas de vis à travers l'anneau ou rondelle supérieur(e) 21 et dont la pointe vient en butée de l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22, et - au moins une (de préférence plusieurs) tige de guidage 20 libre de 5 coulisser à travers l'anneau ou rondelle supérieur(e) 21 et qui est fixée à l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22. En tournant la vis 19, on écarte ou rapproche les anneaux ou rondelles 21, 22 (en fonction du sens de rotation de la vis 19), pendant que le mouvement de translation, parallèlement à la direction 5, de l'anneau ou 10 rondelle supérieur(e) 21 par rapport à l'anneau ou rondelle inférieur(e) 22 est guidé par l'au moins une tige de guidage 20. Ces deux variantes sont combinables. On peut ainsi avoir plusieurs dispositifs 101, 102, ... interchangeables, chaque dispositif 101, 102, ... 15 étant équipé des moyens de réglage 13 précédemment décrits. Dans un procédé d'utilisation du dispositif 1 maintenant décrit, on procède aux étapes suivantes dans n'importe quel ordre : - on remplit le réservoir 3 avec du liquide à immersion 4, 20 - on insère une extrémité distale 7 (i.e. l'extrémité prévue pour être orientée vers un échantillon 11 pour son observation) de l'objectif 8 de microscope dans le réservoir 3 par l'extrémité ouverte 6 du réservoir 3, de sorte que l'extrémité distale 7 de l'objectif 8 et la lame 2 soient reliées (de préférence uniquement) 25 par le liquide 4, - on place le dispositif d'espacement 10 contre une surface de l'échantillon 11 (ou autour de l'échantillon, par exemple dans une variante où sur les figures 4 à 6 la référence 11 serait un support (comme une lame de microscope) et la référence 18 l'échantillon 30 posé sur ce support) de manière à créer l'espace intermédiaire 12 entre la lame 2 et l'échantillon 11. L'espace intermédiaire 12 est un espace de gaz, de préférence d'air. Ensuite, on transporte au moins un signal optique à travers l'objectif 8, ce transport d'au moins un signal optique comprenant : 3028962 -11- - une acquisition d'un signal optique en provenance de l'échantillon 11 via l'objectif 8 (par exemple un signal de fluorescence de l'échantillon, un signal Raman de l'échantillon, un signal d'observation de l'échantillon en lumière blanche, etc.), et aussi de préférence une mémorisation 5 (typiquement dans une mémoire informatique ou électronique) de données relatives à ce signal et/ou un affichage de ces données (typiquement sur un écran, ou sur un affichage digital ou sur un cadran analogique à aiguille, etc.) ; et/ou - un acheminement d'un signal optique jusqu'à l'échantillon 11 via 10 l'objectif 8, (par exemple un signal optique d'excitation de l'échantillon). La lame 2 est transparente, c'est-à-dire qu'elle laisse passer au moins 50% (de préférence au moins 90%) de l'intensité lumineuse du signal optique. Ce mode de réalisation de procédé selon l'invention ne comprend 15 aucune dépressurisation (en particulier aucune aspiration de gaz ou aucune aspiration de gaz sans le remplacer par un autre gaz) dans l'espace intermédiaire 12 entre l'étape de placement du dispositif d'espacement 10 (c'est-à-dire le moment de la création de l'espace intermédiaire 12) et le transport du signal optique. Par dépressurisation, on entend de préférence 20 toute étape de diminution de la pression à l'intérieur de l'espace 12 à une valeur inférieure à 0,8 atmosphère. On conserve le volume de l'espace intermédiaire 12 inchangé : - entre l'étape de placement du dispositif d'espacement 10 (c'est-à-dire le moment de la création de l'espace intermédiaire 12) et le 25 transport du signal optique, et - pendant le transport du signal optique. Ainsi, on améliore l'adaptabilité de l'invention à l'échantillon 11, notamment concernant : - les effets négatifs de la pression de la lame 2 sur l'échantillon 11 30 si l'espace intermédiaire 12 n'existait pas, notamment pour les échantillons qui peuvent souffrir d'une pression ou les échantillons « mous » dont on veut éviter la déformation, 3028962 - 12 - les besoins de « respirer » de l'échantillon (par exemple échantillon biologique, de peau ou autre), d'être à l'air libre ou sous une certaine atmosphère. Ainsi, le dispositif selon l'invention évite une interaction de la partie 5 observée de l'échantillon 11 avec un élément extérieur tel qu'un liquide d'immersion, ou la lame 2, ce qui est important par exemple dans le cas de diffusion de lumière par de la peau. On évite ainsi de créer des interactions « non naturelles » avec l'échantillon 11 et donc de générer des artefacts de mesure, ce qui est important par exemple pour l'étude de l'absorption de 10 médicaments ou de cosmétiques sur un échantillon 11 de peau. Ce mode de réalisation de procédé selon l'invention ne comprend aucune déformation de la lame 2 entre la création de l'espace intermédiaire 12 et le transport du signal optique. 15 Selon une première variante, on peut interchanger différents dispositifs d'espacement 101, 102 comme expliqué précédemment. Selon une deuxième variante, le procédé selon l'invention comprend un réglage de la hauteur 14, le long de la direction d'alignement 5, du 20 dispositif d'espacement 10, cette étape de réglage étant réalisée via les moyens de réglage 13 comme expliqué précédemment. L'indice de réfraction est utilisé dans la présente description pour parler de l'indice de réfraction. 25 Pour la longueur d'onde À du signal optique (cas monochromatique) ou au moins une longueur d'onde d'intérêt À du signal optique (cas polychromatique), l'écart de l'indice de réfraction n, du liquide 4 (à À,), par rapport à l'indice de réfraction ns (à À) de la partie de l'échantillon 11 dans lequel se trouve le plan focal (position du plan focal à À) de l'objectif 8 au 30 moment du transport du signal, est inférieur à vingt pour cent : n -n s m ns REVENDICATIONS1. Dispositif (1) pour objectif de microscope, comprenant : - une lame (2), - un réservoir (3) agencé pour contenir du liquide (4) et muni de deux extrémités opposées alignées le long d'une direction d'alignement (5), dont : o une extrémité ouverte (6), prévue pour l'insertion d'une extrémité distale (7) d'un objectif (8) de microscope, et o une extrémité fermée (9) par la lame (2), - un dispositif d'espacement (10), situé du côté opposé de la lame (2) par rapport au réservoir (3), et agencé pour, lorsque le dispositif d'espacement (10) est placé contre une surface plane d'un échantillon (11), créer un espace intermédiaire (12) entre la lame (2) et l'échantillon (11), caractérisé en ce qu'il est dénué de moyens pour créer une dépression dans l'espace intermédiaire (12). 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lame (2) est rigide, c'est-à-dire avec un module d'Young supérieur à 3 GPa. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le dispositif d'espacement (10) comprend des moyens (13) pour régler une hauteur (14), le long de la direction d'alignement (5), de ce dispositif d'espacement (10). 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif d'espacement (10) est un premier dispositif d'espacement (101) et est interchangeable, et en ce que le dispositif (1) est en outre accompagné d'au moins un autre dispositif d'espacement (102) de hauteur différente de celle du premier dispositif d'espacement (101). 3028962 -20- 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lame (2) a une épaisseur (16) supérieure ou égale à 130 micromètres. 5 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lame (2) a une épaisseur (16) inférieure ou égale à 500 micromètres. 7. Procédé d'utilisation d'un dispositif (1) selon l'une quelconque des 10 revendications précédentes, caractérisé en ce que : - on remplit le réservoir (3) avec du liquide à immersion (4) et on insère une extrémité distale (7) d'un objectif de microscope (8) dans le réservoir (3) par l'extrémité ouverte (6) du réservoir (3), de sorte que l'extrémité distale (7) de l'objectif et la lame (2) 15 soient reliées par le liquide (4), - on place le dispositif d'espacement (10) contre une surface d'un échantillon (11) ou autour de l'échantillon (18) de manière à créer un espace intermédiaire (12) entre la lame (2) et l'échantillon (11, 18), 20 - on transporte un signal optique à travers l'objectif (8), ce transport de signal optique comprenant une acquisition du signal en provenance de l'échantillon (11, 18) via l'objectif (8) ou un acheminement du signal optique jusqu'à l'échantillon (11, 18) via l'objectif (8), 25 caractérisé en ce qu'il ne comprend aucune dépressurisation dans l'espace intermédiaire (12) entre la création de l'espace intermédiaire (12) et le transport du signal. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il ne 30 comprend aucune déformation de la lame (2) entre la création de l'espace intermédiaire (12) et le transport du signal. 3028962 -21- 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend un réglage d'une hauteur (14), le long de la direction d'alignement (5), du dispositif d'espacement (10). 5 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'écart de l'indice de réfraction du liquide (4), par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon (11, 18) dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif (8) au moment du transport du signal, est inférieur à vingt pour cent. 10 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'écart de l'indice de réfraction de la lame (2), par rapport à l'indice de réfraction de la partie de l'échantillon (11, 18) dans lequel se trouve le plan focal de l'objectif (8) au moment du 15 transport du signal, est inférieur à vingt pour cent. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que l'indice de réfraction du liquide (4) est compris entre 1,3 et 1,7. 20 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que la distance (15) entre la lame (2) et l'échantillon (11, 18) est supérieure ou égale à 10 micromètres. 25 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce que la distance (15) entre la lame (2) et l'échantillon (11, 18) est inférieure ou égale à 1 millimètre. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, 30 caractérisé en ce qu'il comprend une mesure d'une épaisseur (17) de l'échantillon à partir de l'acquisition du signal.35