FR 3025213 A1 20160304 FR 1401919 A 20140828 1 PROCEDE D'INDUCTION DE LA SYNTHESE DES PHYCOBILIPROTEINES La présente invention concerne un procédé de préparation d'une biomasse de microalgues photosynthétiques présentant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 20% du poids sec de ladite biomasse, comprenant les étapes de blocage de la 5 croissance de ladite biomasse et d'induction de la synthèse des phycobiliprotéines. Les phycobiliprotéines sont des protéines pigmentaires photosynthétiques présentes chez les microalgues des groupes des rhodophycées, des cryptophycées et des cyanobactéries (algues bleues). Ce sont des pigments protéiques ayant une capacité colorante allant du rouge au bleu. 10 Parmi les phycobiliprotéines, on en distingue la phycocyanine, la phycoérythrine, l'allophycocyanine et la phycoérythrocyanine. La phycocyanine est un pigment protéique naturel bleu trouvé exclusivement chez les algues bleues: les cyanobactéries. La phycocyanine est un composant de la chaine de transfert d'électrons située dans les phycobilisomes, dont le rôle est la collecte de 15 l'énergie lumineuse dans la zone rouge du spectre visible et son transfert au centre réactionnel du photosystème II du complexe photosynthétique. Dans certaines conditions de stress qui inhibent l'activité photosynthétique, la phycocyanine participe aux mécanismes de protection qui consistent à dissiper l'excès d'énergie par fluorescence. Ces conditions aboutissent à une augmentation de la synthèse de ce 20 pigment et son accumulation sous forme de réserve azotée pour la cellule. Les facteurs essentiels qui régissent la synthèse de la phycocyanine chez plusieurs espèces de cyanobacteries sont la teneur en azote et en fer, la lumière et la température. Il est démontré que les cyanobactéries peuvent réguler leur teneur en phycocyanine en fonction de ces paramètres dans une gamme de variation propre à chaque espèce 25 (Hemlata, 2009). La phycocyanine est dotée de propriétés anti-oxydantes et fluorescentes qui lui permettent d'avoir des applications pharmaceutiques et médicales diverses (Erikson, 2008 et Liu et al, 2000). Son caractère naturel, son extraction en solution aqueuse et en absence de tout solvant organique en plus de ses propriétés thérapeutiques et de sa 30 couleur bleue unique sont autant d'avantages qui lui permettent de s'intégrer aisément dans les exigences des normes européennes et américaines, liées aux marchés alimentaires et thérapeutiques. 3025213 2 En plus, la résolution des problèmes liés à la stabilité de la phycocyanine en solution aqueuse, à sa forte photosensibilité et à la difficulté de sa conservation, a permis au cours de ces dernières années la prospérité du marché de la phycocyanine de par le monde. La phycocyanine commercialisée sur le marché mondial est extraite, exclusivement, à partir d'une cyanobactérie : Arthrospira platensis (la spiruline). La spiruline est une cyanobactérie produite à grande échelle et a l'avantage de synthétiser jusqu'à 25% de son poids sec en phycocyanine, dans certaines conditions, d'après la littérature. La production de la phycocyanine est en général affectée par différents facteurs environnementaux (Niels T. Eriksen.2008, Remziye Aysun Kepekçi & Saadet Demireirs Saygideger, 2012). L'azote et la lumière en particulier, sont les facteurs les plus importants. Le premier est nécessaire pour la synthèse des acides aminés constituant les protéines et d'autres composés cellulaires dont les phycocyanines (Samy Boussiba and Amos E. Richmond.1980 and Remziye Aysun Kepekçi & Saadet Demiffirs Saygideger, 2012) alors que la luminosité est la source d'énergie pour toute activité photosynthétique Il est connu de l'homme du métier que la productivité en biomasse est liée à la densité de la culture par une relation de forme parabolique passant par un optimum. La densité optimale favorise le métabolisme primaire et donc l'orientation de l'énergie de la photosynthèse vers la croissance et la reproduction. Lorsque la densité est élevée au-delà d'un certain seuil la croissance s'arrête et l'énergie collectée par la photosynthèse est orientée vers le métabolisme secondaire et donc vers la synthèse de métabolites de défense (ou de stress). Dans certaines conditions de stress (excès d'azote, faible luminosité) les phycocyanines constituent les métabolites de défense les plus synthétisés (Chen et al.1996; Tomaselli et al. 1997). Les inventeurs adoptent l'hypothèse que l'énergie collectée par la photosynthèse est partagée entre l'énergie nécessaire à la croissance de la microalgue et celle nécessaire à la synthèse des phycocyanines. Par ailleurs, dans l'art antérieur, les conditions de culture permettant d'optimiser la 30 synthèse de phycocyanines et celles qui permettent d'optimiser la croissance de la biomasse sont assez opposées. En effet, les conditions optimales de croissance des 3025213 3 microalgues varient généralement de 100 à 200 !moles photons m2 s-1 (3300 à 6600 Lux). Une culture de microalgues réalisée à une intensité lumineuse optimale permettra une rapide croissance de la biomasse mais une synthèse de phycocyanine peu importante. A l'inverse, une culture de microalgues réalisée à de plus faibles intensités 5 lumineuses, (10 à 40 gnioles photons m-2 s-1) croit lentement et engendre donc une faible productivité de la biomasse. Cependant, dans ces mêmes conditions de faible intensité lumineuse, les teneurs en phycocyanines peuvent doubler ou tripler de valeur. Par ailleurs, les plus fortes synthèses de phycocyanine sont obtenues dans des conditions d'excès d'azote et donc des teneurs en azote qui dépassent celles 10 administrées dans les cultures industrielles. Il existe différents systèmes de production des microalgues, des systèmes dits ouverts, naturels dans des lagunes ou des étangs et des systèmes dits fermés, constitués de photobioréacteurs. Les systèmes ouverts, le plus souvent des étangs de faible profondeur (30 cm 15 maximum) sont les plus utilisés car ils sont simples à mettre en oeuvre et peu onéreux. Néanmoins, ils ont le désavantage d'être soumis aux variations des conditions climatiques, à l'évaporation de l'eau, et le brassage de la culture est souvent insuffisant pour permettre une bonne exposition à la lumière. Ils présentent ainsi deux principaux inconvénients : l'absence de contrôle de la culture et la faible productivité. 20 Les systèmes fermés en photobioréacteurs sont des systèmes contrôlés, s'agissant de l'eau ou des nutriments. Néanmoins, ce sont des systèmes très couteux et dont la mise en oeuvre n'est pas facile, notamment en ce qui concerne l'accès à la lumière. Dans toutes les analyses réalisées par les inventeurs sur de la poudre de spiruline ou sur de la biomasse fraiche provenant de différentes origines et issues de différentes cultures 25 en croissance, que ce soit en étang ou en photobioréacteur, le taux de phycocyanine maximal obtenu est de 12% du poids sec de la biomasse. Les teneurs sont variables d'un échantillon à l'autre et sont comprises entre 3% à 12% du poids sec de la biomasse. Les teneurs en phycocyanines obtenues sont donc toujours en deçà des valeurs maximales (20 à 25% du poids sec), qui ne sont atteignables que sur des temps de croissance longs. Tous les travaux antérieurs visant à augmenter la synthèse des phycocyanines ont été réalisés durant la phase de croissance. Par ailleurs, dans toute la littérature scientifique 3025213 4 touchant la synthèse de la phycocyanine les différents facteurs de stress qui favorisent cette synthèse sont étudiés indépendamment les uns des autres. Dans un processus de production, les facteurs interagissent ensemble d'une manière synergique ou antagoniste sur la synthèse de la phycocyanine, en fonction de l'intensité 5 de chaque facteur. Trouver la zone focale des facteurs de stress, dans un processus multifactoriel, est nécessaire pour maximiser la synthèse de ce métabolite. En conséquence, le problème technique que cherche à résoudre l'invention est d'optimiser la synthèse des phycobiliprotéines à partir d'une biomasse de microalgues photosynthétiques sans altérer la croissance de ladite biomasse, en définissant des 10 conditions de croissance de la microalgue et de synthèse des phycobiliprotéines optimales. Le problème technique est résolu par le procédé selon la présente invention qui comprend une étape de blocage de la croissance de la biomasse et une étape d'induction de la synthèse des phycobiliprotéines, ledit procédé étant adaptable à tout système de 15 culture classique de microalgues, compte tenu qu'il est réalisé après récolte d'une partie d'une culture de microalgue. La présente invention a donc pour objet principal un procédé de préparation d'une biomasse de microalgues photosynthétiques présentant une teneur en phycobiliprotéines 20 au moins égale à 20% du poids sec de ladite biomasse, comprenant les étapes de a) collecte d'une partie d'une biomasse de microalgues, b) blocage de la croissance de ladite biomasse, c) induction de la synthèse des phycobiliprotéines et d) collecte de la biomasse enrichie en phycobiliprotéines. Le procédé selon l'invention étant réalisé en dehors du bassin de culture, il permet de ne 25 pas altérer la productivité de la biomasse. On entend par « biomasse », la masse totale des microalgues, vivantes à un moment donné dans une culture. Elle est exprimée en gr/L. On entend par « phycobiliprotéines », les protéines pigmentaires hydrosolubles de la photosynthèse telles que l'allophycocyanine (APC), la famille des phycocyanines (C-PC 30 et R-PC), la famille des phycoérythrines (R-PE et C-PE) et la phycoérythrocyanine (PEC), isolées de certaines microalgues ou de cyanobactéries. 3025213 5 On entend par « induction de la synthèse », la stimulation par tout moyen de la production de phycobiliprotéines par une biomasse de microalgues. On entend par « milieu d'induction » tout milieu de culture de microalgues contenant un ou plusieurs sels en excès ou en déficit par rapport à la concentration en sels nécessaire 5 à la croissance optimale. Dans le cadre de l'invention ce milieu contient un excès d'azote obtenu par l'ajout de NaNO3 au milieu de culture Zarrouk, à une concentration supérieure à 2.5 g/L et de préférence comprise entre 3 et 4 g/L. On entend par « blocage de croissance », le fait de stopper la multiplication de la microalgue. Ce blocage est réalisé dans le cadre de l'invention par l'introduction de la 10 biomasse à une densité comprise entre 1 à 5g/1 dans un bassin d'induction, mais ce moyen est non limitatif et tout moyen de blocage de la croissance de la biomasse peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé se caractérise en ce que le blocage de la croissance de ladite biomasse de microalgues est réalisé dans un bassin 15 d'induction, ladite concentration de ladite biomasse dans ledit bassin étant de 3 à 5 fois plus élevé que la densité permettant la croissance optimale des microalgues en culture La biomasse est collectée dans des bassins de cultures usuels, lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance, c'est à dire lorsque la productivité en biomasse est maximale.. 20 Le volume récupéré est filtré sur toile (ou par décantation ou par centrifugation) pour obtenir la biomasse fraiche. La biomasse obtenue est transférée dans le bassin d' induction. Le bassin d'induction peut être un bassin de culture intermédiaire ou un bassin de récupération ou tout autre tout autre système clos de stockage de microalgues vivantes. 25 Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la concentration de ladite biomasse dans le bassin d'induction est comprise entre une valeur sensiblement égale ou supérieure à 1 g/L et une valeur sensiblement égale ou inférieure à 5 g/L. Cette concentration est obtenue en additionnant du milieu d'induction dans le bassin d' induction. 30 La concentration de 1 g/L à 5g/L correspondant à une densité de 3 à 5 fois supérieure à la densité de la biomasse en croissance au moment de la collecte. A cette concentration, la croissance est bloquée pour favoriser le métabolisme de défense de la microalgue 3025213 6 La biomasse peut également subir un lavage avant son dépôt dans le bassin d'induction. Le lavage permet d'éliminer les sels en excès et permet ainsi un meilleur contrôle de la concentration en azote de la solution d'induction. Dans ce cas la biomasse est lavée 3 fois en utilisant une eau physiologique ou la 5 solution du milieu d'induction fraichement préparée. Dans ces conditions, la biomasse initiale n'est pas affectée par le procédé et l'induction de la synthèse des phycocyanines n'est pas dépendante des conditions de culture de la biomasse. Cette procédure présente l'avantage de pouvoir être facilement intégrée dans la chaine 10 de production d'une ferme traditionnelle de culture de spiruline. Elle peut être appliquée dans un bassin de culture intermédiaire ou dans un bassin de récupération pour une durée de trois à 3 à 5 heures. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape d'induction de la synthèse des phycobiliprotéines comprend : 15 1) l'exposition de la biomasse de microalgues photosynthétiques à un flux lumineux, ledit flux ayant une intensité lumineuse comprise entre une valeur sensiblement égale ou supérieure à 10 micromoles m-2 s-1 et une valeur sensiblement égale ou inférieure à 13 micromoles 111-2 S-1; 2) l'ajout d'une source d'azote de manière à obtenir une concentration en NaNO3 20 dans le milieu d'induction supérieure à 2.5 g/L A noter que 10 micromoles rn-2 s-1 correspondent à 330 Lux et que 13 micromoles m 2 s1 correspondent à 429 Lux. La concentration en NaNO3 dans le milieu d'induction est notamment comprise entre 3 à 4g/L. 25 La combinaison idéale a été définie expérimentalement, par l'utilisation d'un modèle multifactoriel basé sur la technique des plans d'expérience. La combinaison d'une intensité lumineuse comprise entre 10 à 13 micromoles M-2 s-1 et d'une solution de culture contenant 3 à 4g/L de NaNO3 (comme source d'azote) permet l'obtention d'une biomasse contenant de 20 à 24% de phycocyanine, ce qui est 30 particulièrement élevée par rapport à l'intervalle 3 à 12% obtenu dans les expériences mises en oeuvre sans application du procédé de l'invention. 3025213 7 La lumière peut être assurée par des lampes à incandescence simple de puissance 40W ou par des tubes fluorescents. La solution d'induction préférée est constituée par le milieu de culture Zarrouk, mais tout autre milieu de culture adapté à la spiruline peut être utilisé. Dans tous les cas, la 5 concentration en azote de la solution d'induction est modifiée par l'ajout de nitrate de sodium (NaNO3) en excès. La concentration finale doit être comprise entre 3 à 5g/1 de NaNO3, ce qui représente une concentration 1.2 à 2 fois supérieure à celle présente dans le milieu Zarouk initial (2.5g/1 de NaNO3). Dans les conditions de culture définies ci-dessus, une durée d'induction de 3 à 5 heures 10 est suffisante pour induire la synthèse des phycocyanines à une teneur stable comprise entre 20 et 24% de la biomasse sèche. Le procédé selon l'invention utilise les microalogues photosynthétiques choisies parmi les cyanobactéries, les rhodophytes ou les cryptophytes. De manière préférée, la microalgue photosynthétique Arthospira Platensis, aussi 15 appelée spiruline, est utilisée. Les phycobiliprotéines synthétisées dans le cadre du présent procédé peuvent être de la phycocyanine, de l'allophycocyanine, de la phycoérythrine ou de la phycoérythrocyanine ou un mélange d'au moins deux de ces phycobiliprotéines. La présente invention concerne également la biomasse de microalgues 20 photosynthétiques présentant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 20% du poids sec de ladite biomasse, susceptible d'être obtenue par le procédé des revendications 1 à 9. La biomasse de microalgues photosynthétiques susceptibles d'être obtenue par le procédé des revendications 1 à 9 peut être utilisée comme complément alimentaire dans 25 le cadre d'une préparation de produit nutraceutique ou comme constituant de préparation cosmétiques. On entend par produit nutraceutique, tout produit fabriqué à partir de substances alimentaires, mais rendu disponible sous forme de comprimé, de poudre, ou d'autre formes médicinales habituellement non associées à des aliments, et qui s'est avéré avoir 30 un effet physiologique bénéfique ou protecteur contre des maladies. A la fin du traitement de la biomasse selon le procédé de l'invention, ladite biomasse enrichie en phycobiliprotéines peut être filtrée et lavée. Elle peut être incorporée dans le 3025213 8 circuit d'essorage et de séchage de la chaine de production. Elle peut être commercialisée dans des formulations parapharmaceutiques comme par exemple des suppléments alimentaires destinés à renforcer le système immunitaire chez le nourrisson ou des produits cosmétiques à fort pouvoir antioxydant. 5 La biomasse peut également servir à l'extraction et à la clarification d'une ou plusieurs phycobiliprotéines. Par exemple, la phycocyanine produite peut être concentrée et stabilisée et être ainsi introduite dans des formulations alimentaires cosmétiques ou médicales. 10 DESCRIPTION DES FIGURES Le tableau 1 représente la composition d'une solution d'induction utilisable dans le cadre de l'invention, et comprenant 4g/L de NaNO3, La Tableau 2 représente la matrice expérimentale : la combinaison des trois niveaux correspondant aux deux facteurs, luminosité et concentration en azote, ainsi que le 15 rendement en phycobiliprotéines obtenu exprimé en pourcentage de poids sec. La figure 1 représente les courbes d'iso-rendement de la synthèse de la phycocyanine en fonction de l'intensité lumineuse (moles photon/m2/s) et de la concentration en azote (g/1) pour une durée d'induction de 3 heures. La figure 2 représente les courbes d'iso-rendement de la synthèse de la phycocyanine en 20 fonction de l'intensité lumineuse (moles photon/m2/s) et de la concentration en azote (g/1) pour une durée d'induction de 24 heures. La figure 3 représente les courbes d'iso-rendement de la synthèse de la phycocyanine en fonction de l'intensité lumineuse (ffloles photon/m2/s) et de la concentration en azote (g/1) pour une durée d'induction de 3 jours. 25 EXEMPLES: La variation du rendement de synthèse de la phycocyanine est étudiée pour différentes concentrations en azote et à différentes intensités lumineuses. L'étude est réalisée selon la méthodologie des plans d'expérience, moyennant un plan factoriel à trois niveaux avec interaction (Goupy, 2001). 3025213 La biomasse fraiche est obtenue à partir d'une culture en phase exponentielle de la cyanobactérie photosynthétique Arthospira Platensis, concentrée 5 fois. La solution d'induction utilisée est le milieu Zarouk modifié : la concentration en NaNO3 comme source d'azote de 1 à 4 g/l. La biomasse concentrée dans le milieu d'induction est 5 soumise à différentes intensités lumineuses dans un intervalle compris entre 10 à 50 ilmoles photon /m2/s. Onze expériences sont réalisées dont neuf représentent la combinaison entres les trois niveaux correspondant aux deux facteurs (minimum, maximum et milieu). Les trois autres représentent les points centraux et permettent d'évaluer l'erreur expérimentale. 10 La matrice expérimentale est représentée dans le tableau n°2. Pour chaque condition, trois prélèvements sont réalisés à des périodes différentes : 3 heures, un jour et 3 jours de traitement. La phycocyanine est extraite à la fin de chacune des 11 conditions expérimentales. L'extraction est refaite deux fois de manière à extraire la totalité de la phycocyanine. 15 Ensuite le rendement en phycocyanine (pourcentage de phycocyanine par gr de matière sèche) est calculé. Le rendement de synthèse de la phycocyanine (Ren Phy) est modélisé en fonction de la concentration de l'azote NaNO3 (N) et de l'intensité lumineuse (Lum). Les différents traitements montrent que l'induction de 3 heures donne les rendements 20 les plus élevés. Le modèle obtenue dans ces conditions est exprimé par l'équation suivante : RenPhy %(2) = 65- 45*Lum + 458*N+ 1.02*Lum2- 51*N2- 3.14*Lum*N Le modèle est valide à 95%, avec un coefficient de corrélation (R2) de 95%. L'erreur standard est de 15%. 25 Les courbes d'iso-rendement de la synthèse de la phycocyanine en fonction de l'intensité lumineuse (itmoles photon/m2/s) et de la concentration en NaNO3 (g/L), et obtenues après 3 heures de traitement, selon le procédé de la présente invention, sont illustrées sur la figure 1. Une intensité lumineuse de 10 !mol photon /m2/s et une concentration en NaNO3 de 4 g/L permet d'obtenir un rendement en phycocyanine 22% 30 à 24% par gramme de matière sèche. 3025213 10 Lorsque l'induction de la synthèse est prolongée à 1 jour les rendements de phycocyanine ne dépassent pas 18% au maximum (figure 2). Un traitement de 3 jours ne permet d'obtenir qu'un rendement maximum inférieur à 12% (figure 3). 5 REFERENCES Erikson N.T, 2008, production of phycocyanin, a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medcine. Appl Microbiol Biotechnol , 80, 1-14. Hemlata T.F, 2009, Screening of cyanobacteria for phycobiliproteins and effect of different environmental Stress on its yield. Bull Environ Contam Toxicol, 83, 509-515. 10 Liu Y, Xu L, Cheng N, Lin L, Zheng Ch, 2000,Inhibitory effect of phycocyanin from Arthrospira platensis on the growth of human leukemia K562 cells. journal of applied phycology, 12, 125-130. Chen F, Zhang Y and GuoS.1996. Growth and phycocyanin formation of Spirulina platensis in photoheterotrophic culture. Biotechnology Letters, 18, Issue 5, pp 60315 608 Remziye Aysun Kepekçi & Saadet Demiffirs Saygideger. 2012. Enhancement of phenolic compound production in Spirulina platensis by two-step batch mode cultivation. J Appl Phycol, 24:897-905. Goupy J., 2001, Introduction aux plans d'expériences, seconde édition Dunod, REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'une biomasse de microalgues photosynthétiques présentant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 20% du poids sec de ladite biomasse , comprenant les étapes suivantes : a) collecte d'une biomasse de microalgues b) blocage de la croissance de ladite biomasse c) induction de la synthèse des phycobiliprotéines d) collecte de ladite biomasse enrichie en phycobiliprotéines 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le blocage de la croissance de ladite biomasse de microalgues est réalisé en concentrant ladite biomasse dans un bassin d'induction, ladite concentration de ladite biomasse dans ledit bassin étant de 3 à 5 fois plus élevé que la densité permettant la croissance optimale des microalgues en culture 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite concentration de ladite biomasse est comprise entre une valeur sensiblement égale ou supérieure à 1 g/L et une valeur sensiblement égale ou inférieure à 5 g/L. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'induction de la synthèse des phycobiliprotéines comprend : - l'exposition de la biomasse de microalgues photosynthétiques à flux lumineux, ledit flux ayant une intensité lumineuse comprise entre une valeur sensiblement égale ou supérieure à 10 micromoles m 2 s 1et une valeur sensiblement égale ou inférieure à 13 micromoles m2 s-1 - l'ajout d'une source d'azote de manière à obtenir une concentration en NaNO3 dans ladite biomasse supérieure à 2.5 g/L de NaNO3. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape d'induction est réalisée sur un intervalle de temps compris entre 3h et 5h. 3025213 12 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les microalgues photosynthétiques sont choisies parmi les cyanobactéries, les rhodophytes ou les cryptophytes. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la microalgue photosynthétique est de 5 préférence Arthospira Platensis, 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les phycobiliprotéines sont choisies parmi la phycocyanine, l'allophycocyanine, la phycoérythrine ou la phycoérythrocyanine ou un mélange d'au moins deux de ces phycobiliprotéines. 10 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'azote est apporté par un milieu de culture comprenant une concentration finale supérieure à 2.5 g/L et inférieure à 5g/L de NaNO3, en particulier le milieu de Zarouk. 10. Biomasse de microalgues photosynthétiques présentant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 20% du poids secs de ladite biomasse, 15 susceptibles d'être obtenue par le procédé des revendications 1 à 9. 11. Utilisation d'une biomasse de microalgues photosynthétiques susceptibles d'être obtenue par le procédé des revendications 1 à 9, présentant une teneur en phycobiliprotéines au moins égale à 20% du poids sec de la dite biomasse comme complément alimentaire ou constituant de préparation cosmétique ou nutraceutique. 20