FR 3031987 A1 20160729 FR 1550571 A 20150126 PROCEDE DE FRACTIONNEMENT DES COMPOSANTS D'UNE BIOMASSE DE MICROALGUES RICHES EN PROTEINES La présente invention concerne un procédé de fractionnement des composants de la biomasse de microalgues riches en protéines. Présentation de l'état de l'art Il est bien connu de l'homme du métier que les chlorelles sont une source potentielle de nourriture, car elles sont riches en protéines et autres nutriments essentiels. Elles sont décrites comme renfermant 45% de protéines, 20% de matières grasses, 20% de glucides, 5% de fibres et 10% de minéraux et de vitamines. Etant donné leur abondance et leur profil en acides aminés, les protéines de microalgues sont ainsi considérées comme une source alternative aux protéines de soja ou de pois en Alimentation. La fraction protéique peut être également valorisée comme agent fonctionnel dans les industries cosmétiques, voire pharmaceutiques. Cependant, les développements en applications alimentaires des protéines de microalgues n'ont pas été significatifs, car la présence, dans lesdites fractions, de composés indésirables (telle la chlorophylle) conduit à des changements non souhaités de couleur, goût et structure des compositions alimentaires en contenant. Pour augmenter leur potentialité en applications alimentaires et pour augmenter également leur valeur commerciale, ces protéines doivent donc être extraites des microalgues sans impacter leur structure moléculaire. Les techniques « douces » d'extraction seraient donc nécessaires pour isoler les protéines de grandes solubilités et de bonnes propriétés technico-fonctionnelles, mais la rigidité des parois des microalgues, notamment des microalgues vertes, s'y oppose fondamentalement car elle perturbe l'extraction et l'intégrité des protéines intracellulaires. C'est ainsi qu'au contraire des conditions physiques ou chimiques classiquement « dures » sont mises en oeuvre pour rompre la paroi des microalgues. De nombreuses études proposent ainsi des technologies de type dissolution alcaline, extraction par solvants organiques, ou homogénéisation haute pression. Dans ces choix technologiques, la dénaturation des protéines n'était cependant pas considérée comme gênante, puisque la plupart de ces méthodes étaient développées pour des finalités d'analyses ou destinées à fournir un substrat pour la digestion enzymatique productrice d'hydrolysats protéiques. Or, un procédé de désintégration efficace préservant l'intégrité des composants cellulaires se doit de maximaliser non seulement le rendement mais aussi la qualité des produits extraits. 3031987 2 En d'autres termes, un procédé de désintégration optimisé de la paroi doit par exemple éviter : - la contamination chimique des produits ciblés, - la mise en oeuvre d'énergie de rupture trop importante ; celle-ci pouvant 5 occasionner une dégradation ou dénaturation irréversible des molécules intracellulaires d'intérêt. Par ailleurs, pour des productions à grande échelle, il est important que le procédé choisi soit transposable à cette échelle. Enfin, l'introduction de cette étape de désintégration cellulaire doit être aisée et ne 10 doit pas avoir un impact négatif sur les étapes de procédé/traitement subséquentes. Toutes ces limitations influencent l'efficacité du procédé de désintégration et par là-même sa consommation énergétique. C'est la raison pour laquelle la technologie de broyage à billes est préférée, car elle est considérée comme efficace pour libérer les protéines intracellulaires sous leur forme 15 native. Dans un broyeur à billes, les cellules sont agitées en suspension avec de petites particules sphériques. Le cassage des cellules est provoqué par les forces de cisaillement, le broyage entre les billes, et les collisions avec des billes. La description d'un broyeur à billes approprié est par exemple faite dans le brevet 20 US 5.330.913. Ces billes cassent les cellules pour en libérer le contenu cellulaire. On obtient alors une suspension de particules de plus petite taille que les cellules d'origine sous la forme d'une émulsion « huile dans eau ». Cette émulsion est généralement atomisée et l'eau est éliminée, laissant une poudre sèche contenant cependant un mélange hétérogène composé de débris cellulaires, 25 de composés solubles interstitiels et d'huile. La difficulté à résoudre dans l'emploi de ces technologies de désintégration cellulaire est l'isolement du seul contenu intracellulaire (à l'exclusion des débris membranaires, des sucres, des fibres et des matières grasses) et la préservation, notamment, de la qualité de la charge protéique. 30 Dans le cas de la microalgue du genre Tetraselmis sp, Anja Schwenzfeier et al (Bioresource Technology, 2011, 102, 9121 - 9127) ont proposé un procédé garantissant la solubilité et la qualité de l'aminogramme des protéines isolées et débarrassées des contaminants (telles les substances colorantes) comprenant les étapes suivantes : - désintégration cellulaire par broyage à billes, 35 - centrifugation de la suspension de microalgues broyées, - dialyse du surnageant, - passage sur résine échangeuse d'ions, - dialyse de l'éluat, 3031987 3 - décoloration, puis - lavage et remise en solution. Cependant, ce procédé de laboratoire (pour traiter 24 g de biomasse) n'est pas transposable à l'échelle industrielle, où le procédé de broyage à billes est plutôt mis en 5 oeuvre pour récupérer une biomasse complète. Des solutions alternatives ont été proposées en changeant complètement la technologie de libération du contenu intracellulaire des microalgues, comme le traitement électrique à champ pulsé. 10 L'exposition des cellules biologiques à un champ électrique pulsé de haute intensité peut en effet altérer la structure de la membrane cellulaire. Le champ externe provoque le chargement de la membrane. A une tension transmembranaire suffisante (0,5-1 V), l'arrangement moléculaire des phospholipides change, ce qui conduit à faire perdre à la membrane son rôle de barrière, la rendant 15 perméable. En fonction des conditions mises en oeuvre, cette perméabilisation membranaire peut être réversible ou irréversible. Pour une extraction efficace des composés intracellulaires, il reste cependant conseillé à l'homme du métier utilisateur de cette technologie de provoquer une perméabilisation irréversible de la membrane, ce qui conduit à sa désintégration. 20 Cette rupture de la membrane facilite alors la libération du contenu cellulaire et, en cas d'utilisation d'une technique complémentaire d'extraction par solvant, facilite également la pénétration du solvant dans la cellule. Cette technique, quoique prometteuse, n'est malheureusement pas extrapolable à une échelle industrielle pour traiter une biomasse produite en réacteur de 1 à 200 m3. 25 Il résulte qu'il demeure un besoin non satisfait de disposer d'une technologie de fragilisation des parois des microalgues apte à libérer le contenu intracellulaire sans désintégrer la cellule ni altérer la qualité de ses composants. 30 Objet de l'invention La société Demanderesse a trouvé que ce besoin pouvait être satisfait en combinant un procédé de perméabilisation thermique des cellules de microalgues avec des étapes de centrifugation et de précipitation en modulant les propriétés du milieu. 35 La société Demanderesse va ainsi à l'encontre d'un préjugé technique qui veut que les méthodes thermiques de disruption cellulaire, tout comme les forces de cisaillement provoquées par la désintégration mécanique, soient des technologies plutôt mises en oeuvre pour dégrader ou dénaturer les produits issus des microalgues (Richmond, 1986, 3031987 4 Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc - Molina Grima et al., 2003, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics, BiotechnoL Adv. 20:491-515). Par ailleurs, une fois libérées du compartiment intracellulaire, la récupération de 5 l'isolat peptidique est réalisée aisément, étant donné que le traitement thermique développé par la société Demanderesse ne conduit pas à la désintégration de la paroi cellulaire. Enfin, le procédé de l'invention permet surtout de récupérer et de valoriser la biomasse résiduelle, de même que les coproduits de l'isolat peptidique. 10 Description détaillée de l'invention La présente invention est donc relative à un procédé de de fractionnement des composants de la biomasse de microalgues riches en protéines : - par la mise en oeuvre d'un procédé de perméabilisation thermique de la membrane cellulaire, suivi 15 - de la récupération et de la valorisation de la biomasse résiduelle ainsi perméabilisée et de ses coproduits. Plus précisément, le procédé selon l'invention est un procédé de Procédé de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en protéines du 20 genre Chlorelle, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - fourniture d'une biomasse de microalgues produite par fermentation, - de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels, - perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 25 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 1 minute, - séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique de centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, 30 - de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, - purification de la fraction soluble précédente par précipitation, afin d'obtenir un isolat peptidique et un concentrat peptidique. Par « environ » est entendu une gamme de valeur comprenant + ou - 10 % de la 35 valeur indiquée, de préférence + ou - 5 % de celle-ci. Par exemple, environ 10 signifie entre 9 et 11, de préférence entre 9,5 et 10,5. 3031987 5 Choix de la microalgue De préférence, les microalgues du genre Chlorella sont choisies dans le groupe constitué de Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorella protothecoides. 5 Dans un mode de réalisation particulier, la souche est Chlorella protothecoides (souche UTEX 250 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin USA). Dans un autre mode de réalisation, la souche est la souche CCAP211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK). 10 Choix des conditions de fermentation La culture en conditions hétérotrophiques et en l'absence de lumière conduit classiquement à la production d'une biomasse de chlorelles présentant une teneur en protéines (évaluée par la mesure du taux d'azote N x 6,25) de 45 à 70 % en poids de cellules sèches. 15 Il est préféré de partir d'une biomasse de microalgues enrichies en protéines, par exemple présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 `Vo. En ce cas, la société Demanderesse recommande d'utiliser un procédé original qu'elle a développé, et qui comprend : - une première étape de fermentation, limitée en azote, où la régulation du pH 20 est réalisée par un mélange NH3/KOH puis, - une deuxième étape de levée de cette limitation en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul. Ces conditions opératoires permettent ainsi d'obtenir rapidement une biomasse présentant une teneur en protéines supérieure à 60 % en N.6,25, de l'ordre de 65 % en 25 N.6,25, et une faible coloration. Le rendement est de 45 à 50 % en poids de matière sèche, et la concentration finale en biomasse est comprise entre 80 et 120 g/I. Traitement de la biomasse La biomasse est ensuite collectée par séparation solide-liquide, par filtration 30 frontale ou tangentielle ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. De manière optionnelle, la société Demanderesse recommande ensuite de laver la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels par une succession de concentration (par centrifugation) / dilution de la biomasse. Au sens de l'invention, on entend par « composés solubles interstitiels » tous les 35 contaminants organiques solubles du milieu de fermentation, par exemple les composés hydrosolubles tels les sels, le glucose résiduel, les oligosaccharides de degré de polymérisation (ou DP) 2 ou 3 ou les peptides. 3031987 6 Cette biomasse ainsi purifiée de ses composés solubles interstitiels est ensuite ajustée préférentiellement à une matière sèche comprise entre 15 et 30 % en poids, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %. 5 Perméabilisation thermique de la biomasse On réalise alors le traitement thermique à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150°C, pelant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 10 secondes et environ 1 minute. Dans un mode de réalisation préféré, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 140°C pendant environ 10 secondes. Dans un autre mode de réalisation préféré, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C pendant environ 1 minute Ce traitement permet de laisser diffuser les composants intracellulaires dans le 15 milieu réactionnel. Enfin, au terme de ces étapes, la biomasse est refroidie de préférence à une température inférieure à 40°C, voire réfrigérée aubur de 4°C. Sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse considère que le traitement thermique, réalisé dans ces conditions opératoires, pourrait agir ainsi 20 comme un procédé de fragilisation membranaire qui autorise le relargage spontané des composants solubles du compartiment intracellulaire, voire de la matrice extracellulaire. En plus des substances ioniques, des substances organiques tels que les hydrates de carbone (majoritairement DP1 et DP2), les peptides et les polypeptides sont drainés hors de la cellule. 25 Au contraire, les lipides et composés organiques hydrophobes restent dans les cellules, ce qui démontre bien que les cellules sont perméabilisées et non lysées ou détruites. Le procédé selon l'invention ne conduit donc pas à la formation d'une émulsion, mais bien à une suspension aqueuse. 30 Le relargage de toutes ces substances solubles à travers la membrane perméabilisée s'apparente à un procédé de diffusion libre de type dialyse. Par voie de conséquence, un temps de latence peut être nécessaire pour permettre une diffusion suffisante après le traitement thermique qui perméabilise la membrane. 35 Dans la littérature, le procédé de perméabilisation par champ pulsé des membranes de levures pour en extraire les protéines demande de 4 h à 6 h (Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84). 3031987 7 Selon l'invention, un temps de réaction beaucoup plus court est mis en oeuvre, compris entre environ 5 secondes et environ 5 minutes. Séparation de la biomasse perméabilisée et de la fraction soluble 5 On procède ensuite à la séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée. Si nécessaire, la fraction soluble ainsi obtenue peut être clarifiée par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels et selon sa matière sèche, une 10 concentration par évaporation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier peut être réalisée avant la purification qui s'en suit. La fraction soluble résultante est finalement composée essentiellement de protéines (50 - 80 % p/p) et d'hydrates de carbone (5 - 25 % p/p). 15 Valorisation de la biomasse résiduelle La biomasse résiduelle dont les solubles ont été séparés peut faire l'objet d'une valorisation en tant qu'ingrédient complet dont le profil nutritionnel est rééquilibré. En effet, la teneur en protéines est diminué - car en partie entrainée sous forme de peptides dans les solubles - et cela rééquilibre la balance au profit de la fraction glucidique 20 et lipidique. La biomasse résiduelle après séparation par centrifugation peut être «également broyée (selon les propriétés applicatives recherchées), préférentiellement broyage mécanique. Classiquement, la biomasse est stabilisée (pH réajusté (autour de 7), ajout 25 d'antioxydants...), elle est ensuite traitée thermique (pasteurisation à vocation de maitrise bactériologique) avant séchage par atomisation. Une étape de concentration par évaporation peut précéder le traitement thermique (optimisation couplé avec le séchage). Purification de l'isolat protéique par précipitation 30 Le procédé de l'invention conduit ici à l'isolement de peptides d'intérêt, par précipitation en modulant les propriétés du milieu. La société Demanderesse recommande ainsi de procéder comme suit : en favorisant la précipitation de tout ou partie de la fraction peptidique en modulant les propriétés physico-chimiques du milieu. 35 Le refroidissement des solubles bruts, obtenus comme décrit dans les étapes précédentes, enclenche un phénomène de précipitation d'une partie des peptides solubles. 3031987 8 Il est observé que la précipitation est plutôt sélective sur les plus hauts poids moléculaires. La température de refroidissement est inférieure à 10°C, de préférence, inférieure à 4°C. Certaines conditions opératoires permettent de favoriser ce phénomène : outre 5 la température, le pH doit être situé entre 2,5 et 6,5 et de préférence être proche du pHi, soit entre 3 et 5. De la même manière la force ionique du milieu peut être adaptée pour favoriser la précipitation. Ainsi, en diminuant fortement la force ionique, on peut atténuer le phénomène de « Salting in » et ainsi diminuer la solubilité des protéines (par 10 diminution de la couche de solvatation). Ainsi, une opération de déminéralisation préalable à la précipitation peut être ajoutée. Celle-ci est réalisée sur résines cationiques et anioniques, dialyse, filtration ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. Inversement, en augmentant fortement la force ionique, l'eau disponible 15 diminue par le phénomène de « Salting out », de cette manière les protéines ont tendance à précipiter. Ce mode n'est pas préféré puisqu'une déminéralisation prononcée serait ensuite nécessaire sur l'isolât protéique ainsi extrait. Dans la même optique de modulation de la couche de solvatation, la polarité du 20 milieu peut être diminuée (avec déshydratation du milieu) par ajout d'un solvant de type éthanol qui permettra de générer une précipitation plus quantitative de la fraction protéique en diminuant fortement sa solubilité. en récupérant la fraction précipitée qui est ensuite éventuellement concentrée 25 avant séchage La séparation de la fraction précipitée est réalisée par simple décantation et récupération de la phase lourde ou éventuellement par centrifugation dans les conditions de température optimales. Le pH peut éventuellement être réajusté avant séchage. 30 Le séchage est effectuée par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. Préalablement au séchage, l'incorporation d'une étape de concentration par évaporation peut permettre d'optimiser énergétiquement l'opération. Elle peut être notamment justifiée si un solvant du type éthanol est utilisé pour permettre 35 son recyclage. L'exploitation de ces voies permet de purifier une fraction à haute teneur en peptides et polypeptides des sels et sucres résiduels. On obtient alors un isolat de protéines solubles supérieur à 90 % en poids. 3031987 9 Valorisation du résidu Lorsque l'isolat a ainsi été extrait, la phase soluble (phase légère après séparation) peut être valorisé en tant que telle comme concentrât protéique (selon sa teneur résiduelle 5 en protéines) ou subir à nouveau un processus de purification pour en extraire les peptides résiduels. Cela peut notamment être justifié selon les conditions expérimentales lorsque la précipitation est partielle (ex. précipitation partielle en phase aqueuse). Dans ce cas, les peptides résiduels, généralement de plus faible poids moléculaire (plus solubles) peuvent 10 être extraits par modulation de l'environnement physico-chimique de la même manière que décrit pour l'isolât protéique. Par exemple, l'incorporation d'un solvant du type éthanol peut être réalisée à ce stade pour générer une précipitation de cette fraction protéique résiduelle en diminuant fortement sa solubilité. 15 L'action du solvant sera d'autant plus efficace que le résidu est déshydraté au préalable. Cela peut être effectué jusqu'à une certaine matière sèche par évaporation ou jusqu'à un séchage complet (par exemple, par atomisation). Après précipitation, le pH de cette fraction peut éventuellement être réajusté puis, une concentration par évaporation (qui peut permettre le recyclage du solvant) est 20 éventuellement opérée avant séchage par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES Exemple 1. : Production de Chlorelle protothecoides à haute teneur en protéines La souche utilisée est une Chlorella protothecoides (souche CCAP211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK). Préculture : 35 - 150 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ; - Composition du milieu : 40 g/L de glucose + 10 g/L d'extrait de levure. L'incubation se déroule dans les conditions suivantes : - durée : 72 h ; 25 30 3031987 10 - température : 28°C ; - agitation : 110 rpm (Incubateur Infors Multitron). Culture en mode batch puis fed batch 5 Préparation et milieu batch initial préparer et filtrer un mélange KOH à 400 g/I (41 %) / NH3 à 20 % v/v (59 %) ; stériliser fermenteur 20 L à 121 °C/ 20 min ; inoculer avec 2 erlenmeyers de préculture de 500 ml (D0600 nm de 15) ; mise au pH de 4,5 avec NH3 20% v/v ; 10 agitation de 300 rpm départ ; aération : 20 L/min d'air ; régulation p02 à 30 (3/0 ; Alimentation glucose : 500 g/I 15 sulfate d'ammonium : 5 g/I phosphate de diammonium : 20 g/I acide phosphorique : 16 g/I sulfate de magnésium heptahydrate : 12 g/I sulfate de fer : 170 mg/I 20 calcium nitrate : 610 mg/I solution d'oligoéléments : 45 m1/1 solution de vitamines : 4,5 m1/1 Il est important de noter que la charge en sels d'ammonium, sels de magnésium et acide phosphorique a été élaborée de manière à limiter la teneur en sels du milieu de 25 fermentation et a été optimisée de manière à maintenir la teneur en N.6,25 de la biomasse finale décolorée. Solution d'oligoéléments Ingrédients (g/1) CuSO4 0,22 ZnSO4. 7 MnSO4 4 Acide citrique 30 Solution de vitamines Ingrédients (g/1) Thiamine HCI 2,25 Biotine 0,11 Pyridoxine 1.1 3031987 11 Conduite de la fermentation apporter l'équivalent de 20 g/I avant inoculation quand la concentration en glucose est = 0 g/I, démarrer l'alimentation en profil 5 exponentiel (i = 0,07 h-1) ; régulation du pH à 5,2 avec le mélange 41 % KOH / 59 % NH3 quand 2 kg de glucose sont consommés par la microalgue, on passe en régulation du pH par NH3 seul. 10 Résultats : Cette conduite de fermentation permet d'obtenir une biomasse présentant plus de 65 % de protéines exprimées en N.6,25. Exemple 2. Perméabilisation thermique de la biomasse de Chlorelle 15 protothecoides et récupération de la fraction soluble par précipitation La biomasse produite selon l'exemple 1 est récoltée à une matière sèche cellulaire de 105 g/L avec une pureté de 80% (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale). 20 Elle est alors : - lavée et concentrée par dilution en ligne [1 :1] (V'uVmoût) et centrifugée sur centrifugeuse à assiettes Alfa Laval FEUX 510 et amenée à une matière sèche de 220 g/I et à une pureté de 93 % (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale), puis 25 - le pH est ajusté à 7 à la potasse - traitée thermiquement par HTST sur échangeur à plaques à vapeur indirecte amenant la biomasse à 85°C maintenue 1 minute par chambrage puis refroidissement à 4°C sur échangeur à plaques à eauglycolée. Le traitement thermique est réalisé à un barème modéré pour limiter la solubilisation 30 partielle de la biomasse qui voit sa pureté diminuer à 68%. Par définition, le relargage de solubles dans le milieu extracellulaire entraine une diminution de la fraction de matière sèche cellulaire par rapport à la matière sèche totale. A ce stade, la composition de la biomasse est la suivante : - acides aminés totaux : 48,73 (3/0 35 - sucres totaux : 27,02 - acides gras totaux : 15,10 % - cendres et autres : 9,15 %. 3031987 12 Séparation des solubles bruts La séparation des solubles issus du relargage par perméabilisation thermique de biomasse est effectuée par séparation centrifuge. Afin d'optimiser le rendement et la qualité de la séparation, une légère dilution 5 [0,5 :1] (V''V'oût) est effectuée en ligne sur le deuxième étage (sur une configuration à deux centrifugeuses Alfa Laval FEUX 510 en série) avec recyclage du surnageant du deuxième étage vers le premier. Le surnageant du premier étage est ainsi récupéré et concentre les solubles clarifiés. Ces solubles « brut » ont la composition suivante : 10 - acides aminés totaux : 77,3 - sucres totaux : 17,6 - cendres et autres : 5,1 (3/0 Purification de l'isolat protéique 15 Un échantillon de solubles prélevé après séparation est utilisé pour une purification visant à obtenir l'isolât protéique. Afin de précipiter sélectivement la fraction peptidique, 750 g de solubles brut à une matière sèche de 9,5% sont placés dans un réacteur double enveloppe sous agitation. Le pH des solubles bruts est ajusté à 4,5 à l'acide phosphorique. 20 Après arrêt de l'agitation, la température est abaissée à 4°C. Ces conditions sont maintenues pendant 8h. Ainsi s'opère la décantation de la phase lourde enrichie en peptides de plus haut poids moléculaire. La phase lourde est alors extraite par simple séparation de phase en ampoule à 25 décanter avec un rendement massique de 28% et présente une matière sèche de 37,2%. Cet extrait est lyophilisé à une matière sèche de 97%. La composition de cet isolat est détaillée ci-dessous : - acides aminés totaux : 95,9 (3/0 - sucres totaux : 2,44 30 - cendres et autres : 1,66 (3/0 La répartition du profil des acides aminés de l'isolat protéique est le suivant : - acide glutamique : 49,9 (3/0 - arginine : 47,21 35 - autres : 2,89 (3/0 L'isolat est donc caractérisé par une richesse de l'ordre de 95% en acides aminés essentiellement constitué d'arginine et d'acide glutamique (sur la base de l'analyse de répartition des acides aminés totaux). 3031987 13 Purification du résidu La phase légère, après précipitation et séparation de l'isolat peut faire l'objet d'une purification afin de concentrer la fraction protéique n'ayant pas précipité (de plus faible poids 5 moléculaire). Après séparation (avec un rendement massique de 72%), cette phase, initialement à 8,9% de matière sèche est concentrée par évaporation (15mBar - 43°C au rotavapor de laboratoire Buchi R-215) jusqu'à une matière sèche de 45,4% afin de déshydrater partiellement le milieu pour favoriser ensuite l'action de l'éthanol. 10 A ce stade, le concentrât présente la composition suivante : - acides aminés totaux : 68,5 (3/0 - sucres totaux : 23,46 (3/0 - cendres et autres : 8,04 (3/0 15 Afin de précipiter la fraction protéique, une déshydratation par l'ajout d'éthanol est effectuée. Un volume d'éthanol (par volume de concentrât) est ajouté, l'agrégation des protéines suite à la perte de solubilité dans le milieu s'opère quasi instantanément. Le culot est récupéré par centrifugation à 4000g pendant 10 minutes 20 (Beckman Coulter Avanti J-20 XP). Il est ensuite séché à une matière sèche de 92,3% à l'étuve sous vide pendant 24 h. La composition de l'extrait ainsi obtenu est détaillée ci-dessous : - acides aminés totaux : 73,19 % 25 - sucres totaux : 20,45 (3/0 - cendres et autres : 6,36 %. Cet extrait peut alors être valorisé en tant que concentrât protéique. Exemple 3. Traitement de la biomasse résiduelle après solubilisation 30 Les solubles bruts obtenus dans l'exemple 2, riches en protéines, sont séparés de la biomasse résiduelle qui peut être traitée par un procédé permettant sa valorisation. La biomasse extraite à une matière sèche cellulaire de 22% est broyée sur un module de broyage à bille horizontal « Bead Mill » (NETZSCH LME 500 - billes de silicate 35 de zirconium 0,6 mm) à un taux de broyage de 85%. Le pH du broyat cellulaire est alors ajusté à 7 à la potasse 50%. 3031987 14 Une concentration sur évaporateur à flux forcé SPX est effectuée par alimentation continue d'une boucle où la température est ajustée à 75°C avant l'entrée du flash sous vide avec la température maintenue à 40°C où s'effectue l'évaporation. La biomasse concentrée est continuellement soutirée du flash vers le module UHT 5 SPX pour réaliser un traitement thermique avec préchauffage à 70°C puis injection vapeur direct sur un barème d'une dizaine de secondes à 140°C et refroidissement à 40°C par flash au vide. La biomasse est alors atomisée à une matière sèche de 95% sur un atomiseur de type GEA Filtermat FMD 200. 10 La biomasse ainsi obtenue présente la composition suivante : - acides aminés totaux : 27,1 % - acides gras totaux : 27,1 % - sucres totaux : 35.8 (3/0 - cendres et autres : 10 (3/0 15 La biomasse ainsi obtenue a l'avantage de présenter un profil nutritionnel équilibré au niveau de la fraction glucidique, protéique et lipidique. Comme présenté ci-dessous, le profil d'acides aminés est d'ailleurs rééquilibré par l'élimination en amont de la fraction soluble sélectivement riche en arginine et acide glutamique La répartition des acides aminés dans la biomasse est la suivante : 20 - acide aspartique : 6,05 - thréonine : 3,91 (3/0 - sérine : 3,56 (3/0 - acide glutamique : 23,84 (3/0 - glycine : 3,56 (3/0 25 - alanine : 5,69 (3/0 - valine : 4,27 - isoleucine : 2,31 % - leucine : 5,87 (3/0 - tyrosine : 2,49 (3/0 30 - phénylalanine : 3,20 (3/0 - lysine : 3,74 (3/0 - histidine : 1,60 % - arginine : 25,98 (3/0 - proline : 3,91 (3/0 35 REVENDICATIONS1. Procédé de fractionnement des composants d'une biomasse de microalgues riches en protéines du genre Chlorelle, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - fourniture d'une biomasse de microalgues produite par fermentation, - de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels, - perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 1 minute, - séparation entre la biomasse ainsi perméabilisée et la fraction soluble par une technique de centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, - de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels, - purification de la fraction soluble précédente par précipitation, afin d'obtenir un isolat peptidique et un concentrat peptidique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microalgues du genre Chlorelle sont choisies dans le groupe constitué de Chlorelle vulgaris, Chlorelle sorokiniana et Chlorelle protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorelle protothecoides. 3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la biomasse de microalgues riches en protéines est préparée par un procédé qui comprend : - une première étape de fermentation, carencée en azote, où la régulation du pH est réalisée par un mélange NH3/KOH puis, - une deuxième étape de levée de cette carence en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le traitement thermique à une température comprise entre environ 80 et 150°C, pendant une durée comprise entre environ 5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute. 3031987 16 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C pendant environ 1 minute ou à une température d'environ 140°C pendantenviron 10 secondes. 5 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la biomasse perméabilisée est traitée ultérieurement par : - broyage, préférentiellement broyage mécanique, - stabilisation à pH 7, - pasteurisation, 10 - atomisation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la purification de fraction soluble est réalisée par - précipitation à une température de refroidissement inférieure à 10°C, de 15 préférence inférieure à 4°C, avec optionnellement, ajustement du pH à une valeur comprise entre 2,5 et 6,5, de préférence entre 3 et 5, - centrifugation ou décantation, afin d'obtenir une phase lourde correspondant à l'isolat peptidique, et une phase légère, - concentration et séchage de l'isolat peptidique ainsi obtenu. 20 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on extrait les peptides résiduels de la phase légère par précipitation éthanolique.