FR 3033576 A1 20160916 FR 1500500 A 20150313 1 Méthode d'inactivation d'un agent infectieux dans un échantillon biologique La présente invention concerne une méthode de traitement d'un échantillon biologique de prélèvement clinique de patient humain ou animal contenant ou susceptible de contenir un agent pathogène infectieux. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de traitement d'inactivation de microorganismes pathogènes notamment de bactéries, virus ou parasites pathogènes contenus dans un dit échantillon biologique de prélèvement clinique humain ou animal. Les prélèvements cliniques de patients infectés contenant des agents infectieux notamment les prélèvements sanguins présentent un risque pour les personnels chargés de leur manipulation en vue des tests de diagnostic. En particulier, les virus à enveloppe de glycoprotéine et génome ARN, notamment les virus des fièvres hémorragiques tel que par exemple les virus de la fièvre jaune, virus de la dengue, virus Crimée-Congo, virus de la fièvre de la vallée du Rift, virus de fièvre de Lassa, virus Ebola, virus Marburg, posent les problèmes les plus fréquents de contamination lors de manipulation des échantillons de prélèvement sanguin dans la mesure où ces virus sont transmissibles par contact et/ou par voies aériennes. On connait des traitements de désactivation à l'aide d'agents chaotropiques tel que l'isothiocyanate de guanidine que l'on trouve dans les réactifs les plus fréquemment utilisés (TRIzol® LS Reagent [Invitrogen Corp., Carlsbad, CA] et tampon AVL [Qiagen]). Mais, ces sels chaotropiques dénaturent les macromolécules (von Hippel and Wong, 1964), ce qui empêche la réalisation de test de détection antigéniques ou de détection d'anticorps. Un autre traitement de désactivation connu se fait avec la bétapropiolactone laquelle peut subir une autopolymérisation et s'hydrolyser facilement après exposition à la lumière, l'humidité ou la chaleur ; cette instabilité requérant une préparation extemporanée et une utilisation rapide. 3033576 2 Mais, après les traitements de désactivation connus tel que décrit ci-avant, les propriétés de réaction immunologiques et donc les possibilités de détection immunologique par réaction avec des anticorps spécifiques se trouvent altérées rapidement, voir dans certains cas les propriétés de 5 détection d'acide nucléique après amplification de type PCR. C'est pourquoi dans les traitements d'inactivation connus, ceux-ci sont réalisés immédiatement avant la réalisation du test de détection notamment le test de détection d'acide nucléique impliquant une amplification de type PCR et non pas au lit du patient directement lors du prélèvement clinique de 10 l'échantillon biologique. Il en résulte un risque car - du fait que l'inactivation se fait dans un second temps - l'échantillon reste infectieux entre le moment du prélèvement et celui de la manipulation. Le but de la présente invention est donc de fournir un nouveau traitement d'inactivation du microorganisme pathogène qui puisse être mis 15 en oeuvre dès le prélèvement dudit échantillon biologique, au lit du patient, de façon à éviter les risques d'infection lors de la manipulation et transport dudit prélèvement. Un autre but de la présente invention est de fournir une méthode de traitement d'inactivation de microorganisme pathogène qui permette de 20 conserver la capacité de détection immunologique avec des anticorps dudit microorganisme et/ou conserver la capacité de détection de l'acide nucléique spécifique dudit microorganisme par amplification par PCR et détection par sonde d'ADN notamment pour le diagnostic d'infection virale en médecine humaine ou vétérinaire en dépit de la perte de la capacité infectieuse dudit 25 microorganisme d'une part et d'autre part en dépit du fait que la détection n'est pas réalisée immédiatement après la mise en oeuvre du traitement de désactivation. Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de traitement d'un échantillon biologique de prélèvement clinique de patient humain ou 30 animal contenant ou susceptible de contenir un agent pathogène infectieux caractérisé en ce qu'on mélange ledit échantillon biologique avec un alcool pour inactiver le ou lesdits microorganismes pathogènes qu'il contient. 3033576 3 On entend ici par « agent pathogène infectieux », un agent pathogène susceptible de se transmettre au personnel chargé de la manipulation dudit échantillon biologique en contenant, par contact et/ou par voie aérienne. On entend ici par « inactiver le microorganisme pathogène » que ledit 5 microorganisme perd son pouvoir infectieux ce qui se reflète par la perte de réplication dudit microorganisme en culture cellulaire. La capacité de réplication dudit microorganisme en culture cellulaire est un témoin plus fiable de l'infectivité du virus que la présence résiduelle d'ARN viral. Les inventeurs émettent l'hypothèse que l'inactivation par l'alcool 10 résulte probablement d'altérations des structures lipidiques présentes au niveau de l'enveloppe des virus ce qui supprime l'infectivité des virus tout en préservant leurs capacités de détection moléculaire reposant sur la mise en évidence du génome viral ainsi que par immunodétection qui ne sont pas altérées par l'alcool. 15 Cette méthode de traitement est avantageuse en ce qu'elle permet l'inactivation dudit microorganisme par simple mélange tout en conservant les capacités d'amplification et détection moléculaire d'ADN ou ARN d'une part et d'autre part conserver des propriétés de détection par réaction immunologique avec des anticorps spécifiques et ce même si la détection est 20 réalisée après un certain laps de temps de transport de l'échantillon jusqu'au laboratoire d'analyse par exemple un laps de temps de 30 minutes à 24 heures. Selon la présente invention, les propriétés de détection immunologique sont conservées pendant un laps de temps de 24 heures pour la dengue. 25 Selon la présente invention, les propriétés de détection des acides nucléiques du microorganisme désactivé sont conservées pendant un laps de temps d'au moins 48h. De préférence, on réalise ladite étape de mélange dudit échantillon biologique et dudit alcool immédiatement après ou simultanément à la 30 réalisation dudit prélèvement sur le patient 3033576 4 Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux en ce qu'il supprime les risques de transmission d'agents pathogènes actifs au personnel lors des étapes de manipulation pour la conservation et le transport dudit échantillon biologique avant de réaliser le test de détection 5 du diagnostic d'un dit microorganisme contenu dans ledit échantillon biologique. Plus particulièrement, après l'étape de mélange dudit échantillon biologique avec un dit alcool, on réalise un test de détection dudit microorganisme inactivé dudit échantillon par détection moléculaire d'acide 10 nucléique spécifique dudit microorganisme amplifié par réaction d'amplification de type PCR, notamment après extraction des acides nucléiques dudit échantillon, et/ou on réalise un test de détection immunologique dudit microorganisme et/ou d'anticorps spécifique dudit microorganisme présents dans ledit échantillon par détection d'une réaction 15 immunologique entre au moins un anticorps spécifique dudit microorganisme et un antigène spécifique dudit microorganisme, de préférence par réaction des immunoglobulines spécifiques dudit microorganisme contenues dans ledit échantillon et un antigène spécifique dudit microorganisme, notamment un antigène spécifique dudit microorganisme revêtu sur support solide. 20 Dans un mode particulier de réalisation, on réalise ledit prélèvement dans un tube contenant déjà ledit alcool. Plus particulièrement encore, ledit tube contient également un milieu de transport et/ou de conservation dudit échantillon biologique. Dans un mode préféré de réalisation, ledit alcool est choisi parmi le 25 méthanol et de préférence l'éthanol. De préférence encore, la concentration en alcool d'au moins 50% en volume d'alcool pur par rapport au volume dudit échantillon biologique prélevé. Plus particulièrement, ledit échantillon biologique prélevé est un 30 prélèvement de sang total. A cet égard, il y a lieu d'observer qu'en dépit de 3033576 5 la tendance à la coagulation induite par l'alcool des propriétés de détection immunologique du microorganisme désactivé sont conservées. D'autres types de prélèvement cliniques peuvent être concernés tel que sérum, plasma, urine et prélèvement nasal tel que aspiration naso- 5 pharyngée, par écouvillon nasal ou oro-pharyngé. Plus particulièrement, ledit microorganisme pathogène est choisi parmi les bactéries, les virus et les parasites. Plus particulièrement encore, ledit microorganisme est choisi parmi les virus. 10 Plus particulièrement encore, ledit microorganisme désactivé et détecté est un virus à enveloppe de glycoprotéine et génome ARN. Plus particulièrement encore, ledit microorganisme désactivé et détecté est un virus enveloppé à génome ARN appartenant aux familles virales suivantes : Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Filoviridae, 15 Arenaviridae et Orthomyxoviridae Plus particulièrement encore ledit virus est un virus de fièvre hémorragique, notamment les virus de la fièvre jaune (de la famille des Flaviviridae), virus de la dengue (de la famille des Flaviviridae), virus Crimée-Congo (de la famille des Bunyaviridae), virus de la fièvre de la vallée 20 du Rift (de la famille des Bunyaviridae), virus de fièvre de Lassa (de la famille des Arenaviridae), virus Ebola, virus Marburg (de la famille des Filoviridae), virus Kyasanur Forest disease (de la famille des Flaviviridae), virus Alkhurma (de la famille des Flaviviridae) et le virus Chikungunya (de la famille des Togaviridae). 25 Dans un mode préféré de réalisation, on réalise un prélèvement sanguin dans un tube de type vacutainer dans lequel on a ajouté ledit éthanol dans un volume défini et on a refait le vide par aspiration d'un volume d'air identique au volume d'éthanol ajouté dans ledit tube. Plus particulièrement, ledit tube destiné à un prélèvement de sang 30 total un agent anticoagulant, de préférence de l'EDTA. 3033576 6 La présente invention fournit également un tube prélèvement d'échantillon sanguin de type vacutainer contenant un volume défini d'éthanol et de préférence un agent coagulant, sous vide, utile dans une méthode selon l'invention. 5 Ainsi le sang du patient se mélange à l'alcool lors du prélèvement et l'inactivation du microorganisme pathogène est donc réalisée dans le tube de prélèvement, celui-ci pouvant être ainsi transporté et/ou manipulé sans danger pour le personnel et sans nécessiter des conditions de sécurité élevés. 10 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures lA à 1D représentant schématiquement les étapes de préparation et mise en oeuvre d'un tube de prélèvement selon l'invention de l'exemple 1. 15 Exemple 1 : Préparation du tube de prélèvement On a réalisé comme suit un prélèvement sanguin à l'aide d'un tube 2 de prélèvement sanguin sous vide dit vacutainer de 5 mL contenant un agent anticoagulant EDTA sous forme lyophilisée 2a commercialisé par la société Beckton-Dickinson sous la référence 366643. 20 Tout d'abord, à l'aide d'une seringue 1 remplie d'alcool lb, on pique l'aiguille à travers le bouchon 2b du tube 2 contenant l'EDTA lyophilisé 2a (figure 1A).0n injecte (figure 1B) 2.5mL d'alcool lb constitué d'éthanol ou méthanol pur à 100% dans le tube 2 contenant l'EDTA lyophilisé 2a pour obtenir un mélange 2c avec une concentration en alcool de 100% en volume. 25 Toujours avec la dite seringue 1, on aspire (figure 1C) un même volume de 2.5nnL d'air contenu dans le tube 2 pour reconstituer le vide initial du tube lequel conserve ainsi ses propriétés initiales d'aspiration du prélèvement sanguin. Enfin, on pique (figure 1D) l'aiguille 4a d'un cathéter 4 de prélèvement 30 sanguin depuis un patient dans le dit tube 2 pour y introduire 2.5.mL de sang total 4b.Le sang 4a du patient se mélange à l'alcool-EDTA 2c lors du 3033576 7 prélèvement pour obtenir un mélange 4c de 5mL. L'inactivation du virus est donc réalisée dans le tube de prélèvement. L'échantillon peut être ensuite manipulé sans danger car inactivé comme en atteste les essais suivants réalisés sur des échantillons sanguins 5 infectés avec le virus de la dengue (DEN) et le virus chikungunya (CHIK). Exemple 2 : Inactivation des virus par l'éthanol détectée par microscope. Dans un mélange de 200 pl de sang total et 200 pl d'éthanol 100% préparé comme à l'exemple 1, on a ajouté 100 pl de surnageant de culture 10 de virus Chikungunya souche OPY1 à une concentration de 107 doses infectieuses 50% par mL (TCID50 en anglais, c'est à dire dose de virus permettant d'infecter les cellules de 50% des puits inoculés) à des dilutions en cascade de 10-1 à 10-12. Après une mise en contact par agitation pendant 30 min à température 15 ambiante, 20pL des mélanges obtenus à des dilutions en cascade de 10-1 à 10-12 sont ajoutés dans 180pL de milieu de culture, Eagle minimal essential medium (EMEM) (supplénnenté avec 5% de sérum de veau foetal, 1% penicilline-streptomycine, et 1% [200 mM] L-glutamine) sont inoculés (200pL) sur cellules Vero qui sont incubées à 37°C pendant 10 jours. 20 Cette expérience est réalisée en quadruplication de la même dilution en plaques de 96 puits. Tous les puits inoculés sont testés. Au tableau 1, l'activité inactivante de l'alcool est mise en évidence pour le virus Chikungunya par une réduction de 6 dilutions (6 10g10) de l'infectivité par rapport au contrôle sans éthanol pour des dilutions de 10-1 à 25 1012. L'infectivité est mesurée par lecture des plaques au microscope inversé et évaluation d'un effet cytopathique du fait de la destruction du tapis cellulaire (TL). Tableau 1 CHIK 101 10-2 le io-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-n 10-12 Virus TL TL TL TL TL TL TL TN TN TN TN TN sans éthanol 3033576 8 Virus + TL TN TN TN TN TN TN TN TN TN TN TN 50% éthanol 50% TL TN TN TN TN TN TN TN TN TN TN TN éthanol Sans virus TN= tapis cellulaire normal; TL= tapis cellu aire lysé. A la dilution de 10-1, on n'observe pas d'effet inactivant de l'alcool car à cette dilution la concentration en alcool est toxique pour les cellules comme attesté par les résultats sur l'échantillon contrôle à la dernière ligne. Exemple 3 : détection par PCR des ARN des virus après inactivation. Une expérimentation identique au paragraphe 1) de l'exemple 2 a été réalisée avec le virus Chikungunya souche OPY1 et avec le virus de la dengue souche DENV (Virus DENV-2 souche New Guinea C). Les 2 souches sont disponibles dans la collection EVA (« European Virus Archive », 10 www.european-virus-archive.com/). L'infectivité est évaluée par détection moléculaire après extraction des acides nucléiques. Des résultats similaires ont été obtenus démontrant une activité virucide de l'éthanol 50% sur le virus de la dengue. On a mélangé parallèlement pour les deux virus : 15 - d'une part ,200 pl de sang total + 200 pl d'éthanol 100% + 100 pl de surnageant de culture de virus, et -d'autre part, 200 pl de sang total + 200 pl de PBS + 100 pl de surnageant de culture de virus. Après mises en contact pendant 30 min à température ambiante, des 20 dilutions en cascade de 10-1 à 10-12 sont réalisées dans du milieu de culture comme décrit à l'exemple 2 et utilisées pour l'extraction des acides nucléiques en utilisant le Kit EZ1 Virus Mini v2.0 (Qiagen) sur automate EZ1- XL (Qiagen). L'élution des acides nucléiques se fait dans 90pL d'eau stérile, dont 25 10pL sont utilisés pour une détection de l'ARN du virus par RT-PCR temps 3033576 9 réel. Les signaux obtenus sont comparés à ceux observés en l'absence d'éthanol. Les séquences des amorces et sondes reprises dans le listage de séquence annexé pour les deux systèmes de détection moléculaire des virus sont indiquées dans le tableau 2. 5 Tableau 2 DENV Amorce sens DF AGG ACY AGA GGT TAG AGG AGA (SEQ.ID.n°1) DENVAmorce reverse DR CGY TCT GTG CCT GGA WTG AT(SEQ.ID.n°2) DENV sonde Dengue1-4DP FAM-ACAGCATA1TGACGCTGGGARAGACC-TAMRA(SEQ.ID.n°3) CHIKV Amorce sens F-CHIK CCA AAT TGT CCY GGT CTT CCT(SEQ.ID.n°4) CHIKVAmorce reverse R-CHIK MG CTY CGC GTC CTT TAC CAA G(SEQ.ID.n°5) CHIKV sonde P-CHIK FAM-CAATGTCY1CMGCCTGGACACC1TT-TAMRA(SEQ.ID.n°6) Dans les séquences ci-dessus, de façon connue, Y = C ou T (mélange de C et T), W = A ou T (mélange de A et T) et M= A ou C (mélange de A et C). On a utilisé le kit iScriptTM One-Step RT-PCR Kit for Probes Biorad (ref 10 catalogue: 170-8895). La réaction se déroule dans un volume final de 30pL: 15pL de réactif 2X, 2pL d'eau stérile, 1pL de chaque amorce, 0.4pL de sonde et 0.6pL d'enzyme, 10pL d'acide nucléique. Les amorces et les sondes sont utilisées à 10pM. Le thermocycleur CFX96 (Biorad) est programmé comme suit:10 min à 15 50°C, 5 min. à 5°C, et 15 sec. à 95°C puis 30 sec à 60°C (45 cycles). L'addition d'éthanol ne modifie pas la sensibilité de la détection de l'ARN viral de manière significative. Les dilutions positives sans éthanol sont aussi retrouvées positive avec éthanol dans les tableaux 3 et 4 ci-après dans lesquels POS= PCR positive; NEG= PCR négative. Le niveau du signal est 20 réduit de moins de 1 Ct en présence d'éthanol pour les deux virus. Tableau 3 CHIK 10-1 10-2 lo_3 10 i' 106 10 lo_. 10 10b0 lo_ii 1012 Virus POS POS POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG NEG sans éthanol Virus + POS POS POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG NEG 50% éthanol 3033576 10 Tableau 4 DEN 10-1 10-2 i0 i0 le 106 le 10-8 le 10-10 10-" 10-12 Virus POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG sans éthanol Virus + POS POS POS POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG 50% éthanol Exemple 4 : détection immunologique des virus après inactivation. On a réalisé une détection immunochromatographique des IgG et IgM 5 spécifiques du virus de la dengue après inactivation en utilisant le Kit SD BIOLINE Dengue Duo Ref11FK45 (ALERE France, 78350 JOUY EN JOSAS) contenant un support solide revêtu d'antigènes permettant la détection des immunoglobulines IgG et IgM spécifiques dudit microorganisme (ci-après IgG/IgM). 10 Il s'agit d'une technique qualitative. Les réactions avec les IgG/IgM spécifiques de la dengue sont détectées (« POS » tableau 5) à partir de sang total infectés sans éthanol et à partir de sang total infecté + éthanol sans différence évidente. On ajoute 10 pL de sang total et 120 pL de diluant dans le support 15 solide en forme de puits revêtu de IgG/IgM. Les échantillons testés dans le tableau 5 sont des sérums de patients. L'échantillon A contenait des IgG et IgM de virus de la dengue et des IgG et IgM de la dengue sont effectivement détectés et ce même après inactivation. En revanche, l'échantillon B ne contenait pas des IgG et IgM du virus de la 20 dengue et on a détecté ni IgG ni IgM. Tableau 5 DEN IgM IgG Echantillon A sans éthanol POS POS Echantillon A avec éthanol POS POS Echantillon B sans éthanol NEG NEG Echantillon B avec éthanol NEG NEG REVENDICATIONS1. Méthode de traitement d'un échantillon biologique de prélèvement clinique de patient humain ou animal contenant ou susceptible de contenir un microorganisme pathogène infectieux, caractérisé en ce qu'on mélange ledit échantillon biologique avec un alcool pour inactiver le ou lesdits microorganismes pathogènes qu'il contient. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'on réalise ladite étape de mélange dudit échantillon biologique dans un tube contenant déjà ledit alcool. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'après l'étape de mélange dudit échantillon biologique avec un dit alcool, on réalise un test de détection dudit microorganisme inactivé dudit échantillon par détection moléculaire d'acide nucléique spécifique dudit microorganisme amplifié par réaction d'amplification de type PCR, et/ou on réalise un test de détection immunologique dudit microorganisme et/ou d'anticorps spécifique dudit microorganisme présents dans ledit échantillon par détection d'une réaction immunologique entre au moins un anticorps spécifique dudit microorganisme et un antigène spécifique dudit microorganisme. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3 caractérisée en ce que ledit tube contient également un milieu de transport et/ou de conservation dudit échantillon biologique. 5. Méthode selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit alcool est choisi parmi le méthanol et de préférence l'éthanol. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la concentration en alcool est d'au moins 50% en volume d'alcool pur par rapport au volume dudit échantillon biologique prélevé. 3033576 12 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que ledit échantillon biologique prélevé est un prélèvement de sang total. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que ledit microorganisme pathogène est choisi parmi les bactéries, les virus et les parasites. 9. Méthode selon la revendication 8 caractérisée en ce que ledit microorganisme est choisi parmi les virus. 10. Méthode selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que ledit microorganisme désactivé et détecté est un virus à enveloppe de glycoprotéine et génome ARN. 11. Méthode selon la revendication 10 caractérisé en ce que ledit virus est choisi parmi les virus appartenant aux familles virales suivantes Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, mais aussi Filoviridae, Arenaviridae et Orthomyxoviridae. 12. Méthode selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisée en ce que ledit virus est un virus de fièvre hémorragique, de préférence choisi parmi les virus de la fièvre jaune, virus de la dengue, virus Crimée-Congo, virus de la fièvre de la vallée du Rift, virus de fièvre de Lassa, virus Ebola, virus Marburg, virus Kyasanur Forest disease, virus Alkhurma et le virus Chikungunya. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'on ajoute un volume défini dudit alcool dans un tube de prélèvement sous vide et on refait le vide par aspiration d'un volume d'air identique au volume d'alcool ajouté dans ledit tube et on ajoute un prélèvement sanguin dans ledit tube contenant ledit alcool. 14. Méthode selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'on ajoute ledit alcool dans un tube contenant un agent anticoagulant, de préférence de l'EDTA. 3033576 13 15. Tube de prélèvement d'échantillon sanguin contenant un volume défini d'éthanol et de préférence un agent coagulant, sous vide, utile dans une méthode selon la revendication 13 ou 14.