FR 3036406 A1 20161125 FR 1554522 A 20150520 1 IDENTIFICATION DES BACTERIES RESISTANTES AUX CARBAPENEMES PAR IMPERMEABILITE MEMBRANAIRE La présente invention appartient au domaine technique de la microbiologie clinique, et a trait aux techniques de dépistage et de diagnostic des maladies infectieuses. Elle concerne plus particulièrement le profilage des bactéries résistantes aux antibiotiques et à l'identification des mécanismes moléculaires impliqués dans cette résistance. Les antibiotiques sont employés à des fins médicales depuis la Seconde Guerre Mondiale. Du fait d'une utilisation massive, répétée et parfois inconsidérée, tant au niveau thérapeutique qu'au niveau industriel (notamment pour le traitement préventif des animaux d'élevage destinés à l'alimentation), ces molécules et leur efficacité thérapeutique se trouvent aujourd'hui menacées de déclin par l'émergence et l'expansion de souches bactériennes de plus en plus résistantes. En vue de minimiser les diagnostiques erronés et les errances thérapeutiques, les industriels du domaine de la santé oeuvrent pour assister les praticiens dans leur fonction, en mettant à leur disposition des méthodes et outils analytiques de plus en plus performants pour détecter et identifier les microorganismes infectieux. La présente invention s'inscrit dans le développement de tels méthodes et outils analytiques et, plus spécifiquement, ceux qui sont dédiés au profilage des bactéries qui sont dites résistantes aux antibiotiques. Plus précisément, elle concerne les méthodes et les outils qui ont vocation à caractériser le type de mécanisme moléculaire développé par certaines bactéries pour réduire leur sensibilité aux antibiotiques. Les mécanismes de résistance aux antibiotiques sont multiples. De façon générale et schématique, ils peuvent être classés selon les catégories de résistance suivantes : - mutation ou surexpression de la cible de l'antibiotique, - inactivation enzymatique de l'antibiotique, - réduction de la perméabilité de la paroi cellulaire, - modification de l'efflux actif des antibiotiques, - formation d'un biofilm. La prévalence de ces mécanismes diffère d'une bactérie à une autre, mais également d'un type d'antibiotique à un autre. 3036406 2 Dans le cas des antibiotiques de la famille des carbapénèmes (tels que l'imipénème, le méropénème, l'ertapénème, le doripénème, le tébipénème, le faropénème), les bactéries ont principalement développé deux types de résistance : 1) une résistance par hydrolyse de l'antibiotique, qui se caractérise par la production 5 d'enzymes à activité carbapénémase, et 2) une résistance par réduction de la perméabilité membranaire ; on parle aussi d'imperméabilité membranaire. La présente invention s'intéresse plus particulièrement à la sensibilité/résistance 10 des bactéries aux carbapénèmes. Plus spécifiquement, elle vise à déterminer si une résistance aux carbapénèmes développée par une bactérie peut oui ou non être attribuée à une réduction de sa perméabilité membranaire. Autrement dit, elle vise à distinguer/discriminer parmi les bactéries présentant une résistance aux carbapénèmes, celles qui le sont grâce à un mécanisme de résistance par imperméabilité membranaire. 15 Plusieurs méthodes analytiques tendant vers ce même objectif ont déjà été décrites dans l'état de l'art. La plupart cible les porines, des protéines membranaires constitutives de canaux qu'empruntent les antibiotiques (ainsi que d'autres molécules) pour pénétrer dans les bactéries. Un défaut d'expression des porines est ainsi utilisé comme un indicateur d'une 20 résistance aux antibiotiques par imperméabilité membranaire. Pour leur mise en oeuvre, ces méthodes font appel notamment à des techniques d'immuno-détection (test ELISA, Western blot), de biologie moléculaire (Southern blot, Northern blot, séquençage de séquence nucléiques), de spectrométrie de masse, notamment la spectrométrie de masse MALDI-TOF (Cai et al., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 25 (2012), 50(6): 2179-82), en vue soit d'une détection physique des porines, soit d'une évaluation de la capacité des bactéries testées à exprimer ces protéines. Ces méthodes analytiques, qui ciblent les porines, présentent un inconvénient majeur ; les porines existent sous de nombreuses isoformes (notamment Ompl, Omp2, Omp35, Omp36, Omp37, OmpC, OmpD, OmpF, OmpN, OmpK35, OmpK36, OmpK37...) dont 30 l'occurrence dépend et est fonction du genre bactérien et de l'espèce bactérienne. Ainsi, à moins de disposer d'anticorps, de sondes nucléiques et/ou de spectres SM de référence permettant la détection/identification de la totalité des isoformes de porines existant, une mise en oeuvre fiable de ces méthodes nécessite non seulement une identification préalable et précise du genre bactérien à analyser, mais également, une connaissance exacte des isoformes particulières 3036406 3 exprimées dans ce genre bactérien, et de disposer d'anticorps, de sondes nucléiques et/ou de spectres SM de référence appropriés à la détection/identification de ces isoformes particulières. Un autre inconvénient, qui joue également sur la fiabilité de ces méthodes, réside dans le fait qu'une détection positive de l'expression des porines ne permet pas d'écarter de 5 façon certaine une possible résistance par imperméabilité membranaire. En effet, il faudrait pour cela vérifier également que cette expression des porines soit à un niveau suffisant et s'assurer que les protéines exprimées soient assemblées de manière fonctionnelle dans la membrane. La présente invention vise à pallier les désagréments, les désavantages et la 10 lourdeur rencontrés avec les méthodes antérieures. En particulier, elle vise à proposer une méthode de détection et/ou d'identification de bactéries ayant développé une résistance aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire, qui puisse s'affranchir de la grande variabilité des isoformes des porines et de la nécessité d'une vérification de leur expression à un niveau fonctionnel et opérationnel. 15 Un autre objectif de la présente invention consiste à proposer une méthode analytique qui puisse être de mise en oeuvre relativement simple et rapide, et ne nécessitant pas d'installations techniques lourdes, sophistiquées et coûteuses (telles que par exemple du matériel de spectroscopie de masse...). Un autre objectif de la présente invention consiste à proposer une méthode et des 20 outils associés qui puissent être adaptés et applicables à un grand nombre de genres, d'espèces et de souches bactériennes. La présente invention propose ainsi une méthode de discrimination de bactéries résistantes aux carbapénèmes, selon qu'elles développent ou non une résistance par 25 imperméabilité membranaire, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - disposer d'une souche bactérienne résistante à au moins un carbapénème, - évaluer la sensibilité de ladite souche bactérienne à l'égard d'au moins un antibiotique indicateur ; d'une part, en absence de polymyxine B nonapeptide (PMBN) et, d'autre part, en présence de PMBN à une concentration non-inhibitrice ; 30 - poser un pronostic de résistance par imperméabilité membranaire dans le cas où, la présence de PMBN permet d'accroitre de manière significative la sensibilité de ladite souche bactérienne à l'égard d'au moins un antibiotique indicateur utilisé. Dans le cas où il est constaté que la présence de PMBN ne permet pas d'accroitre de manière significative la sensibilité de ladite souche bactérienne au(x)dit(s) antibiotique(s) 3036406 4 indicateur(s), un pronostic de résistance autre qu'une imperméabilité membranaire est alors posé. Il s'agit alors très vraisemblablement d'une résistance par production d'enzymes à activité carbapénémase. 5 Dans le cadre de la conception de la présente invention, il a été expressément mis en évidence qu'une bactérie résistante aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire, voit sa sensibilité aux carbapénèmes croître de façon significative, lorsqu'elle est traitée par un agent perméabilisant particulier et ce, à des concentrations particulières de cet agent perméabilisant. A contrario, ce même traitement de perméabilisation, lorsqu'il est appliqué à une bactérie 1() développant une autre forme de résistance, ne produit nullement un tel effet. La présente invention propose ainsi une méthode de discrimination de bactéries ayant une résistance par imperméabilité membranaire, dont le principe consiste à constater qu'il est effectivement possible de conférer à ces bactéries un niveau de perméabilité apte à rétablir chez elles une « sensibilité naturelle » aux carbapénèmes. 15 Ainsi, pour chaque bactérie testée, la mise en oeuvre de la méthode de discrimination selon l'invention permet l'obtention d'une information relative à la sensibilité de la bactérie à un antibiotique indicateur, une sensibilité évaluée en absence et en présence d'une concentration non-inhibitrice de PMBN. En fonction de cette information, un pronostic est posé quant à la nature du mécanisme de résistance développé par la bactérie. 20 Au-delà de l'originalité du concept qui sous-tend la méthode proposée, il est également du mérite des inventeurs d'avoir identifié, chez la PMBN, des propriétés de perméabilisation membranaire particulièrement adaptées à la concrétisation de cette méthode et d'avoir ainsi détourné l'utilisation de cette molécule, initialement développée pour un usage 25 exclusivement thérapeutique, pour en faire un outil analytique. En effet, jusqu'à présent, la PMBN est connue comme étant un antibiotique dérivé de la polymyxine B. Comme toute polymyxine, il s'agit d'un peptide cyclique doté d'une queue hydrophobe, et dont l'action antibiotique se traduit par une déstructuration dénaturante de la paroi bactérienne. La queue amino-acyl de la PMBN est plus courte que celle de la 30 polymixine B. Comme toute polymyxine ou autre agent perméabilisant membranaire, son utilisation thérapeutique combinée à d'autres antibiotiques a également été envisagée (WO 2008/017734). Ce faisant, outre une accumulation des effets thérapeutiques de chacun des 3036406 5 antibiotiques utilisés (y compris la PMBN), une meilleure pénétration des antibiotiques autres que la PMBN est également recherchée. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont su mettre à profit le 5 pouvoir perméabilisant relativement « modéré » de cette molécule ; un pouvoir perméabilisant modéré qui la rend adaptée à une utilisation à des concentrations non-inhibitrices dans des compositions complexes, tels que des milieux de culture. Les quantités de PMBN nécessaires à l'obtention de telles concentrations restent en effet compatibles avec les techniques traditionnelles de mélange et de formulation de compositions complexes, homogènes tant au 10 niveau chimique que biologique. Dans le cadre de la présente invention, le caractère significatif de l'accroissement de la sensibilité aux carbapénèmes peut être laissé à l'appréciation de l'opérateur. Celui-ci, à l'instar de tout homme du métier, est à même de distinguer une augmentation de sensibilité dont 15 l'amplitude est suffisamment importante pour l'attribuer/imputer à un effet de la PMBN, plutôt qu'à un « bruit de fond » et/ou à des incertitudes de mesure ou d'interprétation qui affectent les méthodes traditionnelles d'évaluation de sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Plus objectivement, au sens de la présente invention, il est considéré que l'accroissement de la sensibilité d'une souche bactérienne à un antibiotique indicateur est 20 significatif dès lors qu'il est constaté une diminution de la CMI correspondante (mesurée ou évaluée) d'au moins un facteur 2, voire d'au moins un facteur 3-4. Avant d'aller plus loin dans la description de l'invention, les définitions ci-après sont données afin de faciliter la compréhension et l'exposé de l'invention. 25 Par « milieu de culture », on entend un milieu comprenant les éléments nécessaires à la survie et la multiplication de microorganismes, en l'occurrence des bactéries. La composition d'un milieu de culture peut comprendre divers constituants tels que : acides aminés, peptones, hydrates de carbone, nucléotides, minéraux, vitamines, facteurs de croissance (par exemple du sang de mouton, de cheval)... et, éventuellement, colorants (par exemple, le bleu 30 d'Evans, du rouge neutre), opacifiants (par exemple, l'oxyde de titane), indicateurs métaboliques, régulateurs métaboliques... Un milieu de culture peut être solide, semi-solide ou liquide. Par « milieu de culture solide » ou « milieu solide », on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des 3036406 6 microorganismes, mais il est également possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. Les milieux de culture disponibles dans le commerce sont nombreux, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Mueller Hinton ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of 5 Microbiological Media (CRC Press). Par « bactérie résistante aux carbapénèmes » ou plus simplement « bactérie résistante », on entend une bactérie ayant une résistance avérée pour au moins un carbapénème, peu importe le mécanisme de résistance développé à l'égard de cet antibiotique. Par « concentration non-inhibitrice de PMBN », on entend une concentration de 10 PMBN produisant sur une bactérie une déstructuration/dénaturation de la membrane qui ne soit pas de nature à lyser la bactérie ou à inhiber sa multiplication. Objectivement, au sens de la présente invention, cette concentration « non-inhibitrice » ou « sub-inhibitrice » est plus ou moins inférieure ou égale à la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la PMBN pour ladite bactérie. 15 Par « antibiotique indicateur », on entend un antibiotique appartenant à la classe des carbapénèmes, qui est utilisé pour la mise en oeuvre de la présente invention et à l'égard duquel la susceptibilité/sensibilité de la bactérie à tester est évaluée. Le carbapénème choisi pour être un antibiotique indicateur, au sens de la présente invention, ne correspond pas nécessairement au carbapénème ou à l'un des carbapénèmes pour le(s)quel(s) la bactérie à tester 20 a développé une résistance avérée. Il est préférentiellement choisi pour son large spectre d'action, sa bonne stabilité chimique et enzymatique. Avantageusement et selon l'invention, chaque antibiotique indicateur est préférentiellement choisi parmi : l'imipénème, l'ertapénème et le méropénème. 25 Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, la sensibilité de la souche bactérienne à tester est évaluée à l'égard d'un antibiotique indicateur unique. Une résistance par imperméabilité membranaire est donc attribuée à cette souche bactérienne dès lors qu'il est constaté que la présence de PMBN permet d'accroitre de manière significative la sensibilité de cette souche bactérienne à cet antibiotique indicateur particulier. 30 Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, la sensibilité de la souche bactérienne à tester est évaluée à l'égard de plusieurs antibiotiques indicateurs, de préférence deux. Dans ce cas, un pronostic de résistance par imperméabilité membranaire est posé dès lors qu'il est constaté que la présence de PMBN permet d'accroitre de manière significative la 3036406 7 sensibilité de cette souche bactérienne à l'égard d'au moins un des antibiotiques indicateurs utilisés. S'agissant de la concentration non-inhibitrice de PMBN à utiliser pour mettre en 5 oeuvre la présente méthode de discrimination, celle-ci peut être choisie de façon spécifique par rapport à la souche bactérienne à tester, ou de façon non-spécifique si la souche n'est pas identifiée. Lorsqu'elle est choisie de façon spécifique, ladite concentration non-inhibitrice de PMBN à utiliser découle de la valeur de la CMI de la PMBN préalablement déterminée/évaluée 10 pour la souche bactérienne à tester. Avantageusement et selon l'invention, ladite concentration non-inhibitrice de PMBN est comprise entre de l'ordre de un dixième (1/10) et de l'ordre de un demi (1/2) de la CMI de la PMBN pour ladite souche bactérienne. Elle est plus préférentiellement choisie entre un huitième (1/8) et un cinquième (1/5) de ladite CMI. La détermination/évaluation préalable de la CMI de la PMBN peut être réalisée 15 par toute méthode appropriée connue de l'homme du métier, par exemple par : - une méthode de dilution (ou de micro-dilution), en milieu solide ou en milieu liquide, - une méthode de diffusion dans laquelle est utilisé un disque d'antibiotique ou une bandelette de gradient d'antibiotique, imprégnés de PMBN. 20 Lorsque la concentration non-inhibitrice de PMBN à utiliser pour mettre en oeuvre la présente invention est choisie de façon non-spécifique, par rapport à la souche bactérienne à tester, il devient inutile de déterminer/évaluer au préalable la CMI de la PMBN pour cette souche bactérienne. Avantageusement et selon l'invention, on choisira alors une concentration de 25 PMBN « standard », avantageusement comprise entre 25 .ig/mL et 500 .ig/mL, préférentiellement comprise entre de l'ordre de 150 i.tg/mL et de l'ordre 350 i.tg/mL. Pour la plupart des bactéries, en particulier les entérobactéries, de telles concentrations correspondent effectivement à des concentrations non-inhibitrices de PMBN au sens de la présente invention. 30 S'agissant de l'évaluation de la sensibilité de la souche bactérienne à chaque antibiotique indicateur, cette étape peut être réalisée par toute méthode appropriée connue de l'homme du métier. Selon un premier mode de réalisation, cette étape est avantageusement réalisée au moyen d'une méthode de diffusion sur milieu (de culture) solide. Pour ce faire, chaque 3036406 8 antibiotique indicateur est utilisé sous la forme d'un disque d'antibiotique ou sous la forme d'une bandelette de gradient d'antibiotique, notamment des bandelettes Etest® (bioMérieux, France). Selon ce premier mode préféré de réalisation, lorsque l'évaluation de la sensibilité d'une souche bactérienne à un antibiotique indicateur est réalisée en présence de PMBN, la 5 PMBN est initialement présente dans ledit milieu solide à une concentration non-inhibitrice. Selon une variante de réalisation, la PMBN n'est pas initialement présente dans ledit milieu solide, mais y est apportée de façon extemporanée et concomitante avec l'(es) antibiotique(s) indicateur(s). Pour ce faire, avantageusement et selon l'invention, on utilise des disques d'antibiotique ou des bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés à la fois d'un 10 antibiotique indicateur et de PMBN. Avantageusement et selon un mode de réalisation particulier, s'agissant de la PMBN, lesdits disques et lesdites bandelettes ont été préalablement préparés par imprégnation avec une solution de PMBN de concentration en PMBN comprise entre de l'ordre de 300 i.ig/mL et de l'ordre de 500 pg/mL. Selon un second mode préféré de réalisation de l'étape d'évaluation de la 15 sensibilité d'une souche bactérienne à l'égard d'un antibiotique indicateur, on utilise une méthode de micro-dilution en milieu liquide. Pour ce faire, un inoculum standardisé de la souche bactérienne à tester est mis au contact d'une série de réceptacles (tels que par exemple, des tubes ou des cupules) renfermant un milieu de culture liquide avec une concentration croissante d'un antibiotique indicateur. Après incubation, la CMI est donnée par le réceptacle qui contient la plus 20 faible concentration d'antibiotique et dans lequel aucune croissance bactérienne n'est visible. Lorsque cette évaluation est réalisée en présence de PMBN, chaque réceptacle de milieu de culture contient également une concentration non-inhibitrice de PMBN. Cette concentration non-inhibitrice de PMBN peut être identique d'un réceptacle à l'autre. Selon une variante de réalisation, elle varie avantageusement d'un réceptacle à l'autre et, 25 pour un réceptacle donné, sa valeur est indexée sur la concentration d'antibiotique indicateur du milieu de culture contenu dans ce réceptacle. Avantageusement et selon l'invention, l'évaluation de la sensibilité de la souche bactérienne par la méthode de micro-dilution en milieu liquide est réalisée de façon automatisée, 30 par exemple en adaptant des automates, par exemple le VITEK® 2 AST (bioMérieux, France). 3036406 9 La présente invention concerne également un nécessaire (ou kit) permettant la mise en oeuvre d'une méthode de discrimination de bactéries résistantes aux carbapénèmes selon qu'elles présentent ou non une résistance par imperméabilité membranaire. Selon un premier mode de réalisation, un nécessaire selon l'invention comprend 5 au moins : - un milieu de culture solide exempt de PMBN, - un milieu de culture solide comprenant une concentration non-inhibitrice de PMBN, et - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés d'un antibiotique indicateur. 1() Selon un deuxième mode de réalisation, un nécessaire selon l'invention comprend au moins : - un milieu de culture solide exempt de PMBN, - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés d'un antibiotique indicateur, 15 - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés à la fois d'un antibiotique indicateur et de PMBN. Selon un troisième mode de réalisation, un nécessaire selon l'invention comprend au moins : - une première série de réceptacles, dans laquelle chaque réceptacle renferme un 20 milieu de culture exempt de PMBN et comprenant une concentration d'un antibiotique indicateur, les concentrations en antibiotique indicateur des différents réceptacles formant une gamme de concentrations ; - une deuxième série de réceptacles, dans laquelle chaque réceptacle renferme un milieu de culture, comprenant une concentration d'un antibiotique indicateur et une 25 concentration non-inhibitrice de PMBN, les concentrations en antibiotique indicateur des différents réceptacles formant une gamme de concentrations et les concentrations non-inhibitrices de PMBN des différents réceptacles étant identiques les unes aux autres ou indexés sur la concentration en antibiotique indicateur du milieu de culture contenu dans le réceptacle considéré. 30 L'invention s'étend également à une méthode de discrimination de bactéries résistantes aux carbapénèmes selon qu'elles développent ou non une résistance par imperméabilité membranaire, une méthode permettant de pronostiquer une résistance aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire, ainsi qu'un nécessaire (ou kit) permettant la 3036406 10 mise en oeuvre de cette méthode de discrimination et/ou de pronostic, caractérisés par tout ou partie des caractéristiques techniques exposées ci-dessus et ci-dessous. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la 5 description qui va suivre et des exemples, développés ci-dessous, qui ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention et de sa mise en oeuvre. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. 10 EXEMPLES 1. Mise au point de la méthode selon l'invention sur des souches bactériennes de phénotype connu (« porine + » ou « porine - ») 15 Dans un premier temps, des souches bactériennes résistantes aux carbapénèmes ayant un phénotype « porine + » et « porine - », ont été utilisées comme souches modèles pour évaluer la pertinence de la méthode de discrimination selon l'invention, et pour caractériser les conditions opératoires appropriées à sa mise en oeuvre. Il s'agissait en particulier de tester différentes concentrations non-inhibitrices de PMBN et divers carbapénèmes à titre 20 d'antibiotiques indicateurs. a) Souches modèles utilisées Les souches bactériennes utilisées dans cet essai proviennent de collections appartenant aux titulaires du présent Titre de propriété industrielle. Ces collections ont été 25 constituées au fil des années et rassemblent des souches de microorganismes d'origines diverses (prélèvements cliniques, collections internationales, et autres). Ces souches résistantes ont été testées au préalable par rapport à la présence ou non de porines dans leur membrane. Pour ce faire, des analyses en Western blot ont été réalisées 30 pour détecter la présence des isoformes OmpF et OmpC, deux isoformes connues pour être largement exprimées par le genre bactérien auquel appartiennent ces souches. Une souche est ainsi notée « porine - », lorsqu'aucune des deux isoformes précédemment citées n'a pu être détectée. Une résistance par imperméabilité membranaire est alors fortement suspectée. 3036406 11 Une souche est par contre notée « porine + », lorsqu'au moins une des deux isoformes précédemment citées a pu être détectée. Un mécanisme de résistance autre qu'une imperméabilité membranaire est alors envisagé pour cette souche. 5 Egalement, préalablement à la mise en oeuvre de la méthode de discrimination selon l'invention, la sensibilité à la PMBN de chacune des souches modèles utilisées a été évaluée au moyen d'une méthode de micro-dilution en milieu liquide. Pour ce faire, chacune des souches a été cultivée en bouillon Mueller-Hinton (MHII - BECTON DICKINSON®, Etats-Unis). Sur des inocula contenant 2.105 UFC/mL, des 10 dilutions successives de 2 en 2 ont été réalisées pour la PMBN afin de déterminer les concentrations minimales inhibitrices. La lecture de la sensibilité à la PMBN a été réalisée après 18 heures d'incubation à 37°C, par addition de 0,2 mg/mL d'iodonitrotétrazolium chloride (SIGMA-ALDRICH®, Etats-Unis). 15 Dans le Tableau 1 ci-après, sont listées les souches modèles utilisées, leur phénotype constaté, ainsi que leur CMI à la PMBN. Souches testées Phénotype CMIPMBN (µg/mL) Enterobacter aerogenes EA 2 porine + 1024 Enterobacter aerogenes EA 5 porine - 1024 Enterobacter aerogenes EA 27 porine - 256 Enterobacter aerogenes EA 15038 porine + 256 Tableau 1 20 b) Méthode mise en oeuvre avec différents antibiotiques indicateurs selon l'invention et différentes concentrations non-inhibitrices de PMBN Dans un premier temps, deux carbapénèmes ont été testés à titre d'antibiotiques indicateurs selon l'invention : l'imipénème (IM) et l'ertapénème (ETP). Pour chaque souche modèle, la CMI à chacun de ces deux carbapénèmes a été 25 déterminée en absence et en présence de PMBN (à des concentrations non-inhibitrices). Les déterminations de CMI aux antibiotiques ont été réalisées sur des milieux de culture solides avec la méthode Etest®. Pour ce faire, ont été utilisées des bandelettes Etest® (bioMérieux, France) : 3036406 12 - Etest0 Imipenem IM 32, et - Etest Ertapenem ETP 32, ainsi que des milieux de culture solides, différant les uns des autres par leurs concentrations non-inhibitrices en PMBN. 5 Ces milieux de culture solides sont réalisés en boîtes de Petri (0 = 145 mm ; V = 50 mL) sur une base de gélose d'agar MH II (BECTON DICKINSON , Etats-Unis), plus ou moins complémentée en PMBN. Les concentrations en PMBN vont de 0 jusqu'à des concentrations équivalentes à un cinquième de la CMI de la PMBN (1/5 CMIPMBN). A l'aide d'un écouvillon et de l'ensemenceur rotatif Retro C80TM (bioMérieux, 10 France), les milieux de culture ont été ensemencés avec les bactéries, provenant d'un inoculum de 0,5 Mac Farland, préparé en solution NaC1 à 0,85 % à partir de colonies repiquées la veille sur gélose MH II. Les différentes bandelettes Etest® sont alors déposées sur la surface des milieux de culture. Après 16 à 20 heures d'incubation à 35°C, la lecture des CMI a été effectuée. 15 Le Tableau 2 ci-après résume les résultats obtenus (les CMI y sont exprimées en 1.1g/mL). Enterobacter aerogenes EA 2 Enterobacter aerogenes EA 15038 (porine +) (porine +) CMIPMBN = 1024 µg/mL CMIPMBN = 256 µg/mL [PMBN] 0 CMI /10 CMI /8 CMI /5 0 CMI /10 CMI /8 CMI /5 CMlim 0,03 0,06 0,06 0,03 0,25 0,5 0,5 0,25 CMIETP 0,03 0,25 0,25 0,125 0,25 0,125 0,125 0,06 Enterobacter aerogenes EA 27 Enterobacter aerogenes EA 5 (porine -) (porine -) CMIPMBN = 1024 µg/mL CMIPMBN = 1024 µg/mL [PMBN] 0 CMI /10 CMI /8 CMI /5 0 CMI /10 CMI /8 CMI /5 CMlim 8 8 0,06 0,03 4 2 2 2 CMIETP 64 16 0,25 0,125 32 4 4 4 20 Tableau 2 Au vu de ces premiers résultats, il apparait que les bactéries résistantes aux carbapénèmes, exposées à une concentration non-inhibitrice de PMBN, répondent différemment à l'imipénème (IM) et l'ertapénème (ETP), en fonction du mécanisme de résistance qu'elles ont 25 développé à l'égard des carbapénèmes. 3036406 13 A l'exception des résultats obtenus avec la souche EA 15038 évaluée avec l'ertapénème, il est ainsi constaté que les souches ayant développé une résistance par imperméabilité membranaire (souches « porine - ») voient leur sensibilité aux carbapénèmes croître de façon significative en présence d'une concentration non-inhibitrice de PMBN (reflété 5 par une baisse des CMIll\T et CMIETp). A l'inverse, pour les souches ayant développé une autre forme de résistance, leurs CMIll\T et CMIETP restent inchangées ou ont tendance à augmenter. Ces premiers résultats confirment le potentiel qu'il existe à utiliser en combinaison une concentration non-inhibitrice de PMBN et d'un antibiotique indicateur, au sens de la présente invention, pour pronostiquer/identifier le mécanisme de résistance aux 10 carbapénèmes développé par une bactérie, notamment une entérobactérie. 2. Validation et optimisation de la méthode selon l'invention Dans un deuxième temps, la méthode de discrimination selon l'invention a été mise en oeuvre, « à l'aveugle », sur diverses souches bactériennes résistantes aux carbapénèmes 15 (parmi ces souches, certaines ont été préalablement identifiées comme productrices de carbapénémases). Pour ce faire, à titre d'antibiotiques indicateurs, l'imipénème et l'ertapénème ont été utilisés. Des concentrations non-inhibitrices de PMBN, équivalentes à des concentrations de un dixième (1/10), un huitième (1/8) et un cinquième (1/5) de la CMI de PMBN, ont été 20 appliquées. Pour chaque souche testée, chaque concentration de PMBN et chaque antibiotique indicateur, la CMI mesurée est comparée à celle obtenue en l'absence de PMBN. Au vu de l'écart éventuel de valeurs de CMI, le mécanisme de résistance développé par la souche testée 25 est pronostiqué en appliquant le postulat général suivant : Une diminution de CMIImigrp en présence de PMBN est l'indice d'une résistance aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire. Dans tout autre cas, un autre mécanisme de résistance est impliqué. A des fins de vérification de la justesse des pronostics posés et la pertinence du 30 postulat général précédemment énoncé : - chaque souche a été testée en Western-blot en vue d'une détection de porines (en l'occurrence, des isoformes OmpF et OmpC), et 3036406 14 pour certaines des souches testées, en particulier celles pour lesquelles il subsiste un doute quant au mécanisme de résistance développé (pronostic posé en contradiction avec les résultats de la détection des porines en Western-blot), un test de détection de carbapénémases au moyen du kit RAPIDEC® CARBA NP (bioMérieux, France) a 5 également été réalisé. S'agissant des résultats ainsi obtenus, la caractérisation des souches dites résistantes aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire est établie, soit par l'absence de porines détectée en Western-blot, soit par une résistance aux carbapénèmes non liée à la présence 10 de carbapénèmase vérifiée par une méthode moléculaire (PCR) et/ou par une méthode phénotypique (RAPIDEC® CARBA NP). Les mesures de CMIIMJETP et les résultats de Western-blot ainsi obtenus, sont compilés dans le Tableau 3 ci-après. 5 3036406 15 E. con 0506040 K. pneumoniae 1002015 (productrice de VIM-1) CMIPMBN = 1024 p.g/mL CMIPMBN = 128 p.g/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 4 4 4 4 Porine + 2 0,5 0,25 0,25 Porine -; Carbapénémases non détectées CMIETP 0,25 0,25 0,25 0,25 32 4 2 1 S. marcescens 1008175 K. pneumoniae 1012335 (productrice d'IMP-1) (productrice d'OXA-48) CMIPMBN = 1024 p.g/mL CMIPMBN = 1024 p.g/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 128 128 256 256 Porine + 2 2 2 2 Porine + CMIETP 256 256 256 256 2 4 4 4 K. pneumoniae 1104053 K. pneumoniae 1108001 (productrice d'OXA-48) (productrice de KPC-2) CMIPMBN = 1024 p.g/mL CMIPMBN = 1024 p.g/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 2 2 2 2 Porine + 8 8 8 4 Porine + CMIETP 4 4 4 4 16 16 8 8 E. aerogenes 1204048 K. pneumoniae 1108016 CMIPMBN > 1024 p.g/mL (productrice de VIM-1) CMIPMBN = 512 p.g/nnL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 16 2 1 0,5 Porine - 4 8 8 4 Porine + CMIETP 32 4 2 2 1 4 4 2 E. coli 1204043 K. pneumoniae 1204034 CMIPMBN = 512 p.g/nnL CMIPMBN = 256 p.g/mL West.b/ot 0 CMI/10 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 8 2 1 1 Porine - 2 0,5 0,5 0,5 Porine -; Carbapénémases non détectées CMIETP 32 1 2 1 64 8 4 4 K. pneumoniae 1108007 C. freundii 1204047 (productrice VIM-1) CMIPMBN = 1024 p.g/mL CMIPMBN = 1024 p.g/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 32 16 16 16 Porine + 1 2 1 1 Porine +; Carbapénémases non détectées CMIETP 8 16 16 8 32 8 8 4 E. aerogenes 9203076 E. cloacae 9304026 CMIPMBN = 1024 p.g/mL CMIPMBN > 1024 p.g/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 8 2 2 2 Porine - 8 4 4 4 Porine +; Carbapénémases non détectées CMIETP 32 4 4 2 16 4 8 8 Tableau 3 (partie 1/2) 10 5 10 3036406 16 E. aerogenes 9306071 E. cloacae 9402034 CMIPMBN = 1024 µg/mL CM IpmBN > 1024 µg/mL [PMBN] o cmI/10 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 8 4 4 2 Porine - ; 16 8 8 8 Porine - ; Carbapénémases Carbapénémases non détectées non détectées CMIETP 32 4 4 4 64 16 16 16 K. pneumoniae 1108002 C. freundii 0403012 (productrice de KPC-3) CMIPMBN = 256 µg/mL CMIPMBN > 1024 µg/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 16 16 16 16 Porine - 4 2 1 1 porine + ; Carbapénémases non détectées CMIETP 16 64 64 64 8 8 4 4 K. pneumoniae 0404024 E. cloacae 0901026 (productrice VIM-1) (productrice KPC-2) CMIPMBN > 1024 µg/mL CMIPMBN = 1024 µg/mL [PMBN] o CMI/10 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 64 64 64 64 Porine+ 16 16 8 8 Porine+ CMIETP 128 32 32 16 16 32 32 8 K. pneumoniae 0901027 E. cloacae 1008073 (productrice KPC-3) (productrice VIM-1) CMIPMBN > 1024 µg/mL CMIPMBN = 1024 µg/mL [PMBN] o CMI/10 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 8 16 8 16 Porine + 0,25 0,25 0,25 0,25 Porine + CMIETP 16 64 64 64 2 1 1 1 E. coli 1008077 E. cloacae 1008079 (productrice VIM-1) (productrice IMP-1) CMIPMBN = 1024 p.g/ mL CMIPMBN > 1024 µg/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 16 8 16 16 Porine + 2 4 2 2 Porine + CMIETP 8 4 4 4 4 8 8 8 E. cloacae 1008096 K. pneumoniae 1108006 (productrice VIM-1) (productrice KPC-2) CMIPMBN = 1024 µg/mL CMIPMBN > 1024 µg/mL [PMBN] o cMI/10 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 4 8 8 4 Porine + 32 32 64 32 Porine + CMIETP 4 4 4 4 64 256 256 256 E. cloacae 1101172 E. con 1012292 (productrice NDM) (productrice KPC) CMIPMBN = 1024 µg/mL CMIPMBN = 1024 µg/mL [PMBN] o cm00 CMI/8 CMI/5 Vérifications 0 CM//10 CMI/8 CMI/5 Vérifications CMIIM 4 8 16 4 Porine + 8 4 4 1 Porine + CMIETP 4 8 8 4 8 4 4 2 Tableau 3 (partie 2/2) 3036406 17 a) Interprétation des résultats obtenus, évaluation des pronostics posés en application du postulat général La notion de « fiabilité » utilisée ci-après, pour qualifier la pertinence de la méthode de discrimination selon l'invention et la justesse de l'interprétation des résultats, fait 5 référence à une corrélation entre l'interprétation des mesures de CMI données par ladite méthode et les résultats d'une détection physique de porines et de carbapénémases. Il ne s'agit donc pas d'une fiabilité « absolue » mais d'une fiabilité relative, une « pseudo-fiabilité ». Il faut aussi garder à l'esprit que la présence de porines dans la membrane des souches criblées apporte seulement une présomption quant à l'absence d'une résistance par 10 imperméabilité membranaire, mais n'en procure pas une preuve incontestable (sauf à obtenir également la confirmation d'une présence suffisante de ces porines, aussi bien en nombre qu'en activité). Par contre, une absence de détection de carbapénémase permet une forte présomption de résistance par imperméabilité membranaire. Malgré tout, la vérification par une détection physique de porines et de 15 carbapénémases, ici mise en oeuvre, fournit un bon standard d'évaluation des performances et de la pertinence de la présente méthode de discrimination des mécanismes de résistance aux carbapénèmes développés par les bactéries. On estime ainsi que la caractérisation des souches dites résistantes aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire est établie, soit par l'absence de porines détectée en Western-blot, soit par une résistance aux carbapénèmes non liée 20 à la présence de carbapénèmase vérifiée par une méthode moléculaire (PCR) et/ou par une méthode phénotypique (RAPIDEC® CARBA NP). Au vu des résultats présentés dans le Tableau 3, il est constaté ce qui suit : - Sur les 168 valeurs de CMIIM et CMIERT, mesurées en présence de PMBN à des 25 concentrations non-inhibitrices, 133 sont conformes au postulat général précédemment énoncé. Une interprétation des résultats obtenus par la méthode de discrimination selon l'invention, basée sur ce postulat général, présente une corrélation de l'ordre de 79 % avec les vérifications effectuées en Western-blot, et éventuellement avec le test RAPIDEC CARBA NP. La corrélation est d'environ 81 % avec l'imipénème et d'environ 77 % avec l'ertapénème. 30 A cet égard, il convient de noter que pour les souches C. freundii 1204047, E. cloacae 9304026 et C. freundii 0403012, compte tenu de l'absence de carbapénémase détectée avec le test RAPIDEC CARBA NP, il existe une forte présomption quant à une résistance par 3036406 18 imperméabilité membranaire. Les porines détectées en Western-blot semblent en effet être qualitativement et/ou quantitativement non-fonctionnelles. - Sur ces 168 valeurs, 87 ne correspondent pas à une diminution de CMIIMJETP et laissent supposer un mécanisme de résistance autre qu'une imperméabilité membranaire, pour les 5 souches concernées. Les vérifications effectuées ont permis de confirmer l'exactitude de 77 de ces pronostics. Ainsi avec cette méthode, un pronostic négatif quant à une résistance par imperméabilité membranaire offre une fiabilité de l'ordre de 89 % (87 % avec l'imipénème et 90 % avec l'ertapénème). - Sur ces 168 valeurs, 81 valeurs correspondent à une diminution CMIllwErp et laissent 10 supposer une résistance par imperméabilité membranaire pour les souches concernées. Les vérifications effectuées ont permis de confirmer l'exactitude de 56 de ces pronostics. Avec la méthode décrite, un pronostic positif quant à une résistance par imperméabilité membranaire présente donc une fiabilité de l'ordre 69 % (73 % avec l'imipénème et 66 % avec l'ertapénème). 15 Ainsi, une méthode de discrimination selon l'invention, à laquelle est appliquée une règle d'interprétation des valeurs de CMI d'antibiotique indicateur relevées, conforme au postulat général précédemment énoncé, devrait pouvoir offrir une fiabilité générale de l'ordre 79 %. Cette fiabilité devrait être de l'ordre de 89 % lorsqu'une résistance autre qu'une imperméabilité membranaire est pronostiquée. Lorsqu'une imperméabilité membranaire est 20 pronostiquée, il est alors recommandé d'entreprendre des tests de confirmation complémentaires. b) Autre mode d'interprétation des résultats obtenus, évaluation des pronostics posés en application d'un postulat affiné Un deuxième mode d'interprétation des résultats compilés dans le Tableau 3 est 25 ici proposé. Le système de pronostic est basé sur le postulat « affiné » suivant : Une diminution de CMIIMJETP, en présence de PMBN, d'au moins un facteur 4 (c'est-à-dire avec un écart de CMI de 2 dilutions de raison 2), est annonciateur d'une résistance aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire. Sinon, un autre mécanisme de résistance est impliqué. 30 En considération de ce postulat affiné et au vu des résultats présentés dans le Tableau 3, il est constaté ce qui suit : - Sur les 168 valeurs de CMIIM et CMIERT, mesurées en présence de PMBN à des concentrations non-inhibitrices, 140 sont conformes au postulat affiné précédemment énoncé. 3036406 19 Une interprétation des résultats obtenus par la méthode de discrimination selon l'invention, basée sur ce postulat général, présente une corrélation de l'ordre de 83 % avec les vérifications effectuées en Western-blot, et éventuellement avec le test RAPIDEC CARBA NP. La corrélation est d'environ 81 % avec l'imipénème et d'environ 86 % avec l'ertapénème. 5 - Sur ces 168 valeurs, 120 ne correspondent pas à une diminution de CMIIMJETP d'au moins un facteur 4 et laissent supposer un mécanisme de résistance autre qu'une imperméabilité membranaire, pour les souches concernées. Les vérifications effectuées ont permis de confirmer l'exactitude de 92 de ces pronostics. Avec cette méthode, un pronostic négatif quant à une résistance par imperméabilité membranaire présente donc une fiabilité de l'ordre de 81 % (77 % 10 avec l'imipénème et 85 % avec l'ertapénème). - Sur ces 168 valeurs, 48 correspondent à une diminution de CMIImiETp d'au moins un facteur 4 et laissent supposer une résistance par imperméabilité membranaire, pour les souches concernées. Les vérifications effectuées ont permis de confirmer l'exactitude de 43 de ces pronostics. Ainsi avec cette méthode, un pronostic positif quant à une résistance par 15 imperméabilité membranaire présente une fiabilité de l'ordre de 90 % (95 % avec l'imipénème et 86 % avec l'ertapénème). Ainsi, une méthode de discrimination selon l'invention, à laquelle est appliquée une règle d'interprétation des valeurs de CMI d'antibiotique indicateur relevées, conforme au 20 postulat affiné précédemment énoncé, devrait présenter une fiabilité globale améliorée, qui serait maintenant de l'ordre 83 %. Cette amélioration est profitable aux pronostics positifs pour une imperméabilité membranaire, dont la fiabilité passe de 69 % à 90 %. Elle est apparemment obtenue au détriment des pronostics négatifs pour une imperméabilité membranaire, dont la fiabilité précédemment 25 annoncée à 89 % recule légèrement et est maintenant de 81 %. c) Remarques complémentaires Au vu des deux postulats précédents, une règle d'interprétation intermédiaire serait susceptible de permettre d'améliorer davantage la fiabilité de la présente méthode, à 30 savoir : une diminution de CMIIMJETP en présence de PMBN, d'au moins un facteur 4 (c'est-à-dire avec un écart de CMI de 2 dilutions de raison 2), est annonciateur d'une résistance aux carbapénèmes par imperméabilité membranaire, 3036406 20 - une absence de diminution de CMIImiErp en présence de PMBN est annonciateur d'un mécanisme de résistance autre qu'une imperméabilité membranaire, - une diminution de CMIIMJETP en présence de PMBN, d'un facteur inférieur à 4, est annonciateur d'un mécanisme de résistance par imperméabilité membranaire, il est 5 néanmoins recommandé de procéder à des tests complémentaires. Par ailleurs, quoique moindres avec l'imipénème, les performances constatées avec l'imipénème et l'ertapénème, dans le cadre de la mise en oeuvre de la méthode de discrimination selon l'invention, sont très similaires et comparables. Ceci laisse présager la 10 possibilité d'utiliser d'autres carbapénèmes à titre d'antibiotiques indicateurs selon l'invention. Les données précédentes démontrent la pertinence de la présente méthode de discrimination du mécanisme de résistance aux carbapénèmes développé par une bactérie. Une certaine modularité est autorisée quant au choix de l'antibiotique indicateur à utiliser, quant à la 15 concentration non-inhibitrice de PMBN à appliquer. Une certaine modularité est également autorisée quant à l'interprétation des variations de CMI constatées, en fonction de l'antibiotique indicateur et de la concentration non-inhibitrice de PMBN appliqués, et éventuellement selon le caractère à mettre en évidence en priorité (résistance par imperméabilité membranaire ou autre mécanisme) et le niveau de fiabilité 20 recherchée pour cette mise en évidence. 3. Simplification et optimisation de la méthode selon l'invention En vue de simplifier la mise en oeuvre de cette méthode, une recherche de généralisation a été entreprise pour identifier une(des) concentration(s) non-inhibitrice(s) de 25 PMBN « standard(s) », pouvant être avantageusement appliquée(s) à un grand nombre de bactéries. La détermination de telles concentrations standards permettraient d'éviter d'avoir à évaluer, pour chaque souche bactérienne à tester, son niveau de sensibilité à la PMBN. Au vu des CMIPMBN précédemment identifiées, très majoritairement bien supérieures à 300 lag/mL, les concentrations standards suivantes ont été retenues et appliquées à 30 aux souches bactériennes à tester : 50, 100, 150, 200 et 300 lag/mL. La validation de ces concentrations standards de PMBN a été réalisée avec des souches bactériennes, issues de collections appartenant aux titulaires du présent Titre de 3036406 21 propriété industrielle, et exprimant un phénotype de perméabilité membranaire, « porine + » ou « porine - ». A titre d'antibiotiques indicateurs selon l'invention, en plus de l'imipénème (IM) et l'ertapénème (ETP), le méropénème (MP) a également été testé. A l'instar des deux autres 5 antibiotiques, le méropénème a été utilisé sous la forme de bandelettes Etest (Eteste Meropenem MP 32 de la société bioMérieux, France). Les méthodes utilisées pour réaliser les nouveaux milieux de culture et les tests de sensibilité aux antibiotiques sont identiques à celles précédemment décrites. Le Tableau 4 ci-après compile les résultats obtenus dans une première série de mesures où seules des souches « porines - » sont testées (les CMI et les concentrations en PMBN y sont exprimées en ùg/mL). 5 3036406 22 E. aerogenes EA 5 E. aerogenes EA 27 (porine -) (porine -) [PMBN] 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 CMlim 6 4 4 4 3 12 6 3 3 3 CMIETP 6 2 2 1,5 1 > 32 4 1,5 0,75 0,19 CMImp 3 2 1,5 0,75 0,75 4 0,75 0,5 0,19 0,094 K. pneumoniae KP 55 K. pneumoniae KP 63 (porine -) (porine -) [PMBN] 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 CMlim 0,38 0,25 0,25 0,25 0,19 0,25 0,25 0,125 0,125 0,125 CMIETP 0,38 0,25 0,19 0,125 0,064 1 0,50 0,38 0,19 0,125 CMImp 0,19 0,125 0,064 0,064 0,047 0,25 0,25 0,094 0,064 0,023 E. coli SAB 100 E. coli SAB 108 (porine -) (porine -) [PMBN] 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 CMlim 0,5 0,38 0,25 0,19 0,19 0,75 0,38 0,25 0,25 0,19 CMIETP 1,5 0,19 0,19 0,125 0,125 4 0,25 0,19 0,19 0,19 CM I m p 0,125 0,094 0,047 0,032 0,032 2 0,125 0,125 0,094 0,094 E. coli 1204043 E. aerogenes 9203076 (porine -) (porine -) [PMBN] 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 CMlim 24 - - 1 0,25 6 - - 3 3 CMIETP >32 - - 0,38 0,19 24 - - 3 1,5 CMImp 3 - - 0,064 0,008 4 - - 0,5 0,5 K. pneumoniae 1002015 K. pneumoniae 1204034 (porine -) (porine -) [PMBN] 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 CMlim 0,5 - - 0,38 0,25 2 - - 0,38 0,38 CMIETP 4 - - 0,5 0,38 > 32 - - 1,5 1 CMImp 2 - - 0,19 0,19 12 - - 0,5 0,25 Tableau 4 5 10 15 3036406 23 Le Tableau 4bis ci-après compile les résultats obtenus dans une deuxième série de tests, dans laquelle ont été testées aussi bien des souches bactériennes ayant une imperméabilité membranaire avérée que des souches productrices de carbapénémases. K. pneumoniae 1204035 K. pneumoniae 1204036 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM 1,5 0,75 0,5-0,75 0,5-1 2 2 2 1,5 CMIETP >32 8 8-12 6 >32 >32 >32 >32 CMImp 8-12 2 1,5 1,5 32 16 6 4 E. cloacae 1204051 E. cloacae 1204052 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM 1,5 1,5 0,75 0,75 3 3 2 1,5 CMIETP >32 12 4 3 >32 12 8 3 CMImp 4 2 0,25 0,25 6 0,75 1,5 0,5 E. cloacae 1204053 E. cloacae 1204056 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM 3 3 3 3 6 2 1,5 1 CMIETP >32 >32 >32 4 >32 12 3 1 CMImp 4 2 2 1,5 12 2 1 0,75 E. cloacae 1204058 K. pneumoniae 1204039 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM >32 12 4 3 0,38 0,38 0,38 0,38 CMIETP >32 8-12 - 0,75 2 1,5 1,5 1 CMImp >32 2 0,75 0,25 0,75 0,5 0.38 0,38 E. aerogenes 1204050 E. cloacae 1204153 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM >32 >32 >32 >32 4 4 2 4 CMIETP >32 >32 >32 >32 >32 8 4 3 CMImp >32 2-4 1,5-2 1 4 0,75-1 1 0,75 E. cloacae 9402034 E. aerogenes 9306071 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMIIM >32 8 12 12 12 6 3 2 CMIETP >32 >32 12 12 >32 12 8 4 CMImp 16 2 2 3 4 1,5 1,5 0,5 Tableau 4bis (1/2) 3036406 24 E. aerogenes 9203076 K. pneumoniae 1204034 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMlim 8 16 4 4 3 0,5 0,38 0,19 CMIETP >32 16 12 4 >32 12 3 2 CMImp 4 2 1,5 0,5-0,75 16 1,5 0,75 0,38 E. coli 1204043 E. aerogenes 1204048 (imperméabilite membranaire) (imperméabilite membranaire) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMlim >32 6-8 3-6 3 >32 12 6 3 CMIETP >32 6 2-4 1,5 >32 16 16 8 CMImp 4 0,75 0,38 0,19 >32 1,5 1 0,5-1 K. pneumoniae 1012142 E. cloacae 1008080 productrice de KPC-2) (productrice de IMP) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMlim >32 >32 >32 >32 1 12 3 6 CMIETP 32 >32 >32 >32 16 24 >32 12-24 CMImp >32 >32 >32 >32 2 8 6 4-6 E. coli 1008078 K. pneumoniae 1108003 (productrice de VIM) productrice de KPC-3) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMlim 0,38 1,5 0,75 0,38 6 8 12 12 CMIETP 2 0,75 0,5 0,38 8 24 >32 >32 CMImp 0,5 0,5 0,25 0,25 6 >32 >32 4 K. pneumoniae 1103183 E. cloacae 1109137 (productrice de NDM) productrice d'OXA-48) [PMBN] 0 100 200 300 0 100 200 300 CMlim 24 >32 >32 6 1,5 4 2 1,5 CMIETP >32 >32 32 32 24 - 12 >32 CMImp >32 >32 24 >32 3 3 1,5 2 E. cloacae 1008074 (productrice de VIM) [PMBN] 0 100 200 300 CMlim 3 3 8 6 CMIETP 0,38 0,5 0,5 0,5 CMImp 0,38 1,5 1 1,5 Tableau 4bis (2/2) Il ressort des Tableaux 4 et 4bis, que les résultats obtenus montrent une bonne homogénéité entre les variations de CMI obtenues avec les trois carbapénèmes testés (près de 90 % de concordance entre les variations). Cette bonne homogénéité confirme que la mise en 3036406 25 oeuvre de la méthode de discrimination selon l'invention peut être généralisée à d'autres carbapénèmes. L'imipénème (IM) présente toutefois des performances quelque peu moindres. Les résultats les plus fiables sont obtenus aux concentrations non-inhibitrices de PMBN les plus élevées, et plus encore avec le méropénème (MP) et l'ertapénème (ETP). 5 Notamment, en appliquant la règle d'interprétation « affinée » précédemment énoncée, pour des concentrations non-inhibitrices de PMBN, de 150 à 300 lag /mL, le méropénème a conduit à l'obtention de pronostics à 81,8 % attendus, et l'ertapénème 81,5 %. 4. Méthodes d'évaluation de la sensibilité aux antibiotiques autres que la méthode 10 Etest® classique, et validation d'autres modes de réalisation Dans les exemples précédents, la méthode de discrimination selon l'invention a été mise en oeuvre avec une étape d'évaluation de la sensibilité des bactéries à l'antibiotique indicateur réalisée au moyen d'une méthode de diffusion de l'antibiotique sur un milieu de culture (avec ou sans PMBN) solide, et utilisant des bandelettes imprégnées d'un gradient d'un 15 antibiotique indicateur (méthode E-teste). D'autres variantes de réalisation de cette étape d'évaluation de la sensibilité des bactéries à l'antibiotique indicateur ont également été testées, à savoir : - une méthode de diffusion de l'antibiotique sur un milieu de culture solide sans PMBN, et utilisant des bandelettes imprégnées à la fois d'un gradient de carbapénème et d'une 20 quantité standard de PMBN ; - une méthode automatisée de micro-dilution en milieu liquide, effectuée en adaptant la technologie et l'instrumentation VITEK® 2 AST (bioMérieux, France). a) Diffusion de l'antibiotique indicateur et de PMBN à partir d'une même bandelette 25 Etest® . Dans ce mode de réalisation particulier de l'invention, la PMBN n'est pas initialement présente dans le milieu de culture mais, tout comme l'antibiotique indicateur, elle est apportée de manière extemporanée, par diffusion progressive à partir d'une bandelette imprégnée. 30 Les bandelettes utilisées sont imprégnées à la fois d'un antibiotique indicateur et de PMBN. Ces bandelettes ont été préparées à partir de bandelette Etest® de la société bioMérieux (France) : 3036406 26 Eteste Imipenem IM 32, Etest Ertapenem ETP 32, et - Etest® Meropenem MP 32, que l'on a imprégnées d'une solution de PMBN. 5 Plusieurs solutions d'imprégnation, de concentrations différentes en PMBN (100, 200 et 3001.1g/mL) ont été testées. Ces bandelettes qui cumulent PMBN et antibiotique indicateur sont alors testées pour leur capacité à pouvoir mettre en oeuvre la méthode de discrimination selon l'invention. Pour ce faire, des souches bactériennes de phénotype de résistance connu : 10 - imperméabilité membranaire, ou - production de carbapénémase ; ont été utilisées comme modèles. Le Tableau 5 ci-après résume les résultats obtenus. Ces résultats y sont exprimés en [nombre de souches testées positivement pour une résistance par imperméabilité 15 membranaire, sur le nombre de souches testées] et ce, en fonction de l'antibiotique indicateur utilisé et de la concentration en PMBN de la solution d'imprégnation des bandelettes Etest®. Nombre de souches positives / nombre de souches testées Solution d'imprégnation : [PMBN] (pg/mL) 100 200 300 100 200 300 100 200 300 4/9 6/9 6/9 11/15 13/15 14/15 10/16 10/16 13/16 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 0/6 1/6 1/6 Imipénème Méropénème Ertapénème Imperméabilité - IA W CU membranaire _c U -o 0 Production de - E carbapénémase Tableau 5 20 Les résultats ainsi obtenus permettent de valider ce mode particulier de mise en oeuvre de la méthode de discrimination selon l'invention, dans lequel PMBN et antibiotique indicateur sont apportés de manière extemporanée au milieu de culture solide, au moyen d'une bandelette Eteste. 25 b) Evaluation de la susceptibilité à l'antibiotique indicateur par micro-dilution en milieu liquide. 3036406 27 Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention, l'évaluation de la susceptibilité de la souche testée à l'antibiotique indicateur est effectuée au moyen d'une méthode de micro-dilution. Le milieu de culture n'est donc plus un milieu solide, mais un ensemble de milieux liquides, de différentes concentrations en antibiotique indicateur. 5 En l'occurrence, les inventeurs ont choisi d'adapter la technologie et l'instrumentation VITEK® 2 AST (bioMérieux, France), à la présente méthode de discrimination. Ce faisant, l'étape d'évaluation de la sensibilité des souches testées à l'antibiotique indicateur se trouve avantageusement automatisée. Pour ce faire, les cartes VITEK® 2 AST comprennent un ensemble de cupules 10 remplies d'un milieu de culture liquide comprenant une gamme de concentrations d'un antibiotique indicateur selon l'invention, et une concentration fixe non-inhibitrice de PMBN. Le Tableau 6 ci-après résume les résultats obtenus. Ces résultats y sont exprimés en [nombre de souches testées positivement pour une résistance par imperméabilité membranaire, sur le nombre de souches testées] et ce, en fonction de l'antibiotique indicateur et 15 de la concentration non-inhibitrice de PMBN utilisés. Imperméabilité - IA W CU membranaire _c U -o 0 Production de - E carbapénémase Nombre de souches positives / nombre de souches testées [PMBN] (pg/mL) [PMBN] (pg/mL) 100 200 300 100 200 300 11/15 13/15 14/15 3/7 4/7 4/7 0/3 0/3 0/3 1/4 0/4 1/4 Méropénème Imipénème Tableau 6 20 Ces premiers résultats confirment que l'étape d'évaluation de la sensibilité à l'antibiotique indicateur peut être effectuée par micro-dilution en milieu liquide, notamment en revisitant la technologie et l'instrumentation VITEK® 2 AST (bioMérieux, France). REVENDICATIONS1. Méthode de discrimination de bactéries résistantes aux carbapénèmes selon qu'elles développent ou non une résistance par imperméabilité membranaire, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : - disposer d'une souche bactérienne résistante à au moins un carbapénème, - évaluer la sensibilité de ladite souche bactérienne à l'égard d'au moins un antibiotique indicateur ; d'une part, en absence de polymyxine B nonapeptide (PMBN) et, d'autre part, en présence de PMBN à une concentration non-inhibitrice ; - poser un pronostic de résistance par imperméabilité membranaire dans le cas où, la présence de PMBN permet d'accroitre de manière significative la sensibilité de ladite souche bactérienne à l'égard d'au moins un antibiotique indicateur utilisé. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque antibiotique indicateur est choisi parmi : l'imipénème, l'ertapénème et le méropénème. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce ladite concentration non-inhibitrice de PMBN est comprise entre de l'ordre de un dixième (1/10) et de l'ordre de un demi (1/2) de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la PMBN pour ladite souche bactérienne. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite concentration non-inhibitrice de PMBN est comprise entre de l'ordre de ùg/mL et de l'ordre 500 ùg/mL. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'accroissement de la sensibilité de ladite souche bactérienne à un antibiotique indicateur est significatif dès lors qu'une diminution de CMI d'au moins un facteur 2 est 25 constatée. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'évaluation de la sensibilité de la souche bactérienne à chaque antibiotique indicateur est réalisée au moyen d'une méthode de diffusion sur milieu solide. 3036406 29 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite méthode de diffusion sur milieu solide, dans laquelle chaque antibiotique indicateur est utilisé sous la forme d'une bandelette de gradient d'antibiotique. 8. Méthode selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la PMBN est 5 initialement présente dans ledit milieu solide à une concentration non-inhibitrice. 9. Méthode selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la PMBN est apportée audit milieu solide de façon extemporanée et concomitante avec l'(es) antibiotique(s) indicateur(s). 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que 10 l'évaluation de la sensibilité de la souche bactérienne à l'égard de chaque antibiotique indicateur est réalisée au moyen d'une méthode de micro-dilution en milieu liquide. 11. Nécessaire permettant la mise en oeuvre d'une méthode de discrimination selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant au moins : - un milieu de culture solide exempt de PMBN, 15 - un milieu de culture solide comprenant un concentration non-inhibitrice de PMBN, et - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés d'un antibiotique indicateur. 12. Nécessaire permettant la mise en oeuvre d'une méthode de discrimination selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9, comprenant au moins : 20 - un milieu de culture solide exempt de PMBN, - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés d'un antibiotique indicateur, - deux disques d'antibiotique ou deux bandelettes de gradient d'antibiotique, imbibés à la fois d'un antibiotique indicateur et de PMBN. 25 13. Nécessaire permettant la mise en oeuvre d'une méthode de discrimination selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 10, comprenant au moins : - une première série de réceptacles, dans laquelle chaque réceptacle renferme un milieu de culture exempt de PMBN et comprenant une concentration d'un antibiotique indicateur, les concentrations en antibiotique indicateur des différents réceptacles formant une 30 gamme de concentrations ; 3036406 - une deuxième série de réceptacles, dans laquelle chaque réceptacle renferme un milieu de culture comprenant une concentration d'un antibiotique indicateur et une concentration non-inhibitrice de PMBN, les concentrations en antibiotique indicateur des différents réceptacles formant une gamme de concentrations et les concentrations non- 5 inhibitrices de PMBN des différents réceptacles étant identiques les unes aux autres ou indexés sur la concentration en antibiotique indicateur du milieu de culture contenu dans le réceptacle considéré.