FR 3027679 A1 20160429 FR 1460349 A 20141028 La présente invention concerne le domaine technique des membi-,Dries lipidiques attachées à un support d'analyse. En parJculier, inventft:in concerne un support po Leur d'une biecuche Mne , la liaison er support et la bicouc e ipichque étant établte par l'intermédiaire d'u 7 , - .dde particulier, un procédé de préparation dun tel support et son utilisatoi, en tant du -te et dam' "'rentes techniques d'analyse. Les ro:ene5 embr>Dnaires jouen7, un rôle majeur dans ce Iule vivante. Ces proténes sont !es pivots du métabcdsme cehuaire et de la t uction des siqnaux bictogiques. A cause de leurs fonctions 10 impo*mes, nues sont P cibles thérapeutiques orT,viotges. Cependant, la reconstitution des protéines membranawes, reste un défi car ale te un environnement membranaire pour être fonctionnelle, Peur surmonter ce problème, es membranes bkxrimétiques correspondant à des bîcouches Ipictoues attache r en suPPort sont considérées comme un ncieck-s. 15 phare peur Vétude des membranes biebeues dans ciiversps branches de a recherche fondamen a e. nos :Jours, 1 au.gration de membranes biornirnéttques incorporant des preIélries transmemb.ranaires au concept des hopuces reste ufl chatenue important pour le crihaqe à haut déLIt de médicaments et le dévekmrpoment de tests de disnostAs rapides. membranes prése:: nt donc tin puten ressaut, notamment pour deux apw abois,- principales. Après "e se rtion ai ines rnernbranaires Inténât (notamment un récepteur th-..msrniarnbrana e) dans les membranes présentes sur es zones d'analyse (eplement nommées « plots ) d'une biopues est possible : 25 - soitd'étudier l'effet de différents lige dS notamment agonistes/antagonistes) sur la fonctionnatté de la protéïne. réinsérée - soft de cribler l'action d'une molécule thérapeufnue sur différents récepteurs dans le cas où différents récepteurs ont été insérés sur les plots membranaires de la puce. 30 En dépit de ces applications et des performances analytiques qui pourraient être associées à l'utilisation de biopuces à membrane, l'obstacle majeur à surn- pour la recorstItuftn de protéines transmf?.mb riaires et pour le développement de biopuces à membranes réside dans la formation in vitro dune bicouche lipidique robuste offrant la capacité d'insertion de proté ne.s transmem ranaires intégrales, sans altérer les pro pi res intrinsèques de telles protéines. La plupart des bicouches Loiciiques reconstituées in vite-, a surf de supoons, de type or notammenç sont en contact direct avec e sult c'est-à-dire que seule une fine couche d'eau de deux a trots naitionnetres n sépare la bicouche lipidique du suppot Au méme si cea bicouches 1îp1dîques dites supportées sont faciles à manipuler dc ffft qu'eUes sont déposées sur un support solide, la présence 10 de ce dernier à proximite, avec un écart insuffisant, empêche la reconstitution onctionnelle de protéines transmembranakes, du fait de présence d'ectodomaines extra-membranaires bien souvent volumineux renc beoucr 15 mobilit d, s directeMent de et le support engendre oteines membrane-es le support, e plus souvent une perte de !a inre ans cés structures prote es, nie plus;, rt insuffisant entre la Pour 15,Lourner ce bPme, différer-di.; .,olutions ont été proposées dans l'art antérleur, visant s écarter Fa membrane lipicque du support et à obtenir- des ens-ernP1es constitués d'une ia1couche que attaciiée au 20 support sdkit oa nter. aie d'un bras espaceur moléculaire hydrophile, Pour ce a - été proposé de lier la bicouche piffquu au support par l'intern-liaire d'une couche reeléculaire flexible et hydroore assurant ainsi une e ration entre la bidoe Hle lipidique et le support. Une telle couche interné- - ire agt éç nt rme un réservoir aqueux entre le support et 25 la merabracie et fournit un espace suffisant ,rudi audrriénter !ra moirtiiiité des pro r esréinsérée7. Différentes tacts toues de fabrication de membranes e lur fixetiol eur des supwr-s pour bidpoce out été proposées dans l'ar antérieur. Des .espareurs du type poi - eee thioalcanes, protéines, ont e' :e envisagés. La 30 pubi aation de Cou ab e et al. 201.4 décrit, par exemp e, l'utilisation d'un PEG (pciy 1) pour e - le: lien entre la bicouche lipidique et le support. Cette technique utiiise un- 7inctionnalisé par!-icu1icr qui est le 1,2-ç éaroyl-sn-g. céro-3-phosphothanCE,, OYC:-[,-(2-pyrid,fdithio)pror (DSPE-PEG-PDP) r iiu POPC (1-pairritcy:/1-2-oléoyi-sn-glycere-3-phosphocholr Le pyridylütniopropionate (PDP) permet la formation xe liaison 5-Au sur la surface d'or. Dans cet article, seul le POPC est utsé en plus du lipide fonctionnaUsé. De plus, le DSPE présente aines hydrophobes saturées qui peuventinfu.--.:ncer la fluidité de la membi-ane: p e CibLeFiLle. Le PEG :sembie -=..q-nent avoir un impact-,ur la énercr de la nnine mernbrana re, Piirmi !es stratégies pmbo r 'utilisation de peptides: polaires comme bras espaceut7 est cOilSciérée corne la plus prcmnnnn, pour faciliter ery,wite dYljn rnrein fc.)1,,ctionne pro.,e, mcrnbranalres. Ils offrent `.Ï.Jv - constttuer un milieu biocompatible de même nature que oténe « n «t «i ejouer e rôle de _ytosquelette. Typiquement, attacnes n (?.spaceu peptidiquesiks ii qu'à présent sont consttués 1) d'un gruupe fonctionnel tel ou u e fond-jon ' un dlsude ou un silar ey qui peut se 'panière covaente à un sub;:,- e e rôle de bras ',drophohe qui permet, euillet proxirria de la membrane l'or,. 2 d'une parl- d'uri e la bicouche ,rcrmaut lipicriJireconstituée Ce membranaire proximal est obtenu par auto- asstui t u ir le support durre solution Ce,.c de peptides espaceurs comporta' -J-le composante chtu2. Ln bison covalente Au support 25 permet une -attache s.table CE_ couche proxlmale et donc de h. che. Le feuillet distiV de la rnernu .st ensuite forme= soit par dépôt d'une. MOPOCC)Une. de Langmuir p uuifcrt de L7ngrnuir-Bic,..., ,olt par fusion iiD direct rrriert: lu surface lipidique hydre feuillet prox.rnai préalablement formé sur le support par auto-assern e. La fusion 30 :des r.,K.Dsorres est, en partculier, sélectionnée pour obte:Tft la fusiu dte de prc:Jtpcsomes et favohser, ensuite, la reconstitution de protânes mernbranaires dans la bicouche suspenciue attachée. 302 76 79 4 Les peptides espaceurs utilisés comme attaches rnchcures sont préparés à partir de thiopeptides ou de th!c4opeptides naturels ou synthétiques. Dans Robelek et al. 2007 ou Yildiz et al. 2013'es H'-'-s sont attachés à un substrat d'or par l'intermédiaire d'un acide ou d'un, grouemert sunvdr./le d'une cystéine en position hl-terri-iipale et leur terminale est ensutte activée pour coupler chimiquement un 7orrespona à une molécule de DMPE (D My ristoyl- Phosphatidyi-Etharclamine via la fonction NI+, d la tété polahe de ce phosohotpide. Pour cela, le groupement -COÛH terenInal des thlooeptides est 10 activé par EDC: NHS (ALEthyl-N-(Diméthylaminopro. arh,cdiniiïde/N- ctrincle pour .former une liaison ester co,i,r,iente avec a fonction NI-12 de ia Di\IPE, Cependnt, cette uriéthocte impose nde feuiqet proximal d hcouchesolt principalement, voire un'QuLr rli nposé - r7ll',1PE.Il «est do - pas possiL ans ce cas, de faite varier mpos [que 15 de ce damier, ce qu peut C' e un inconvénient majeur (t_irs de la reconstitution de 10 proteine r ibranaire d'intérêt, En et est bien tes os mer P #n C5 biologicr as!en,ires, termes de nature des lipides et de leurs proportions De plus, t antérieur, les bicouches piciiques sont seulement ancrées au niveau de leur teuitetproximal par interaction hydrophobe,via un noyau Ge &destin des chaînes acides hydrophobes saturées notamment les chaînes masses de DMPE attachées à extrernA C-termina e drJe espaceur) qui p i?t,rent dans le Ilposorre !ors de a formation du 25 te u Ilet i'.fist.;:31. Ce mode dtntsc action peut introduire des désordres locaux au sein de !a bicouche linlC: ce lors de sa formation, ce qui peut conduire à une destrudion partielle ce rarchitecture rnernbranaire lors de la manipulatmn de. la membrane en milieu aqueux. Aussi, dans l'art antérieur, la couche proximale est d'abord construite 30 via un procédé d'auto-ossemblage d'une solution diluée des molécules d'attache qui correspondent généralement à des thiolinopeptides, c'est-à-dire à des pepbdes fonctionnalisés par un domaine lipidue hyrircahobe. La connu que rntochondrisi chbrepla t[ prés rent des compositions ri dons les solutions couche distale de la membrane est ensuite formée, soit ppr fusion de liposomes, soit par dépôt de Langmuir-Elodgett sur la monocouche hydrophobe auto-assL Dans ce cas, même si l'Fncrage de la couche proximale hydphobe omet de renforcer la 5',2,bHté mécanique de la membrane liï..)iciique obtenue par rapport à une bicouche lipidique _supportée uniquement adsorbée sur le substrat, ce mode de formation en deux étapes ne garantit n' la formation d'une bicouc:he plane et continue, al !a versatilité ce composition lipidique de la membrine !a présence de la couche [algique ait du mode d'ancrage utiliséa nt le choix de la composition du feuillet oroximL De pius, la chimie de synthèse des ge7.-Jtides utilisés pour obtenh in premier feu ilet comportant le Hpde hyciropinobe peut comportement dynamique de la bicouche lipidique ancrée être compexe, es par son feuillet isrexim la bicolidle en deux nadisdnctes est donc un inticirifiénient rnaeur pour mcdifé. La formation des eux feuillets de la reconstitution de protéines transigembranaires tre qu nécessitent un environ uniforme pour airirben de murs fonctionnaP,:é. Les avancées technologiques concernent la fabrication et les appilcations indastrielles des biopuces rinernbranes à la rieconstitabOrl de protéines transmembranaires sont donc encore très mitées, S,ictjf que se propose d résoudre a présente invention est de proposer are solution qui soit adar de lipides et donc, à la fixation l'attachement d'une larce-.. LPrreie (.1férerites bicouches lipidiques compatibes avec l'insertion d'une grande gamme de protéines, de manière notamment à proposer de nouvelles solutions adaptées su développement de biepuces. autre objectif de l'invention est de proposer un Yprocédé qui soit à la fois simpa et versatile, qui permette la formation de biceuches lipques attachées sur un support, la liaison entre la bicoucine ioldique et le - Tient devant être robuste et adaptée à différentes compositions lipdeqL.sa:, de manière à pouvoir faire varier et moduler à souhait composition de la bicouch pcnq, attachée.et ainsi permettre l'incorpoi-en protéines men-ibrainaires, et notamment de protéines membranaires inte'.raLs, sans altérer leurs propriétés intrinsèques. Dans ce contexte, l'invention concerne un ensemble constitué d'un port sur ue! au moins une bico..,-he lipidique est fivér, par l'intermédiairs, d'un peptide, PO mmé. pept Idjan eSrr é j s sp ilotis poJe une e.:sLéral a-cermilaUe moins 4 histidines conseTLtîuve7, et en euue la bicouche nd une part de Np dant unetLn qla re chélatrice A'talHqJusssurant. h aiSOF1 avec le peptide pLd des inte abolis métal-chélate entre P cabdnu JLlhque et au moins une partie des itidines constitumt extr mité e du paptind- b.Istis. Dans le cadre ' nvention, le mode de alson atil pour 15 liei et la bicoutnu punque p arrnet cJe moutier à souhait la corna ltior de a n'sauche Hp du u uL iDourra - orrespondre à de r mbrarls Sslaires, étsrd: CP1nut, oe dan5 le cadre de 25 .imant l'exué ité C rninale rj qeutio otis. Certain e des imidazoFies de peptide LH cuuu: donc égaiement le u. iie chélate pour '7 rr présent, comme h partie chéiatante préîente sur le lipide che 2e. La liaison ainsi «thl confère à l'ensemble une grande stab té et une grande robustesse qui sont supérieures à celles 30 obtenues 'irec les solutions de l'art antérieur, permettant ainsi sa manipulation. Virlyention 20 utltis pou compositlen n'est COPCM0a p a r" 0 '.""je gal seralt "'e sehe s espace.ur fbnctionnalisé par un dornalase linidicre former la couche fipidvaue pfoxlsn proche lu supo mais par Vël nature des lipide qrn nr le cadre de in,ifention, latr,c,ourl-rie lipidique es'i: staci qui sert de In nu; spaceur grâce à une interaction t l'ion rétalliL et le noyau imidazoie moiris certaines ci2s caractérisé en ce que le y cc, 1, e comp 10 emprisenrian La bica)uch,. que est donc attachée au support par l'intermLVre du .peptide pilotis, en étant maintenue à distance du si,J ;port et pe.ii,1 être considérée comme suspendue du fait de la flexbiM des peptides pilotis, Différents lipides chélateurs emprisonnant un cation métallique sont disponibles comrnerciaiemed e par exemple, cornmercaiisés par la société Polar Lip ,iabasies. 3 ma, Etats-Unlet peuve,rit être utilisés dans e cadre de l'invention. i peut citer l'acide Imyrisby?-sn-silycéro- ssphoéthanolamine-N-diéthylenetriamine pentaac (14:0 PE-DTPA) 50 1u forme du se, de cuivre ou uF 3adolinî u 10 gycéro-3 uhospnoéhurolar3e-N-diétnylènetriam taacétique (16:0 PE-D- a fcuue de sel de cuivre ou distéearcyl-s'a-g;ycéro-3-nhosph ianolarnine-N- Ltétnyienetriaminepenta 18:0 PE-DTPA) cus 7.1 forme ce sel de c.L.Évre ou de nuiolin acide. 15 carboxypentyi)incer tu uhiccinyl] (DGS-N'A.) sousu forme de sel de DTPPL P shéarylr-nide sous 1: forrne, de sel degach1nium, 7-dimyristni, nosphoét.nianplann n E4na mi nepentaaLnth ue ..4:0PE)-DTPA) inOUS la forr-sie de sel. de 'Hesianolamine)- y-c(- os- fatri a m u -ta a cé'ljcs: L b ;5( 6 : p E f3 ous tornu dei di pull h,nri",acid' Put .,P-durio y :phoe-éthancibmine ,'iithylènetrinss taar (bisT DTPA) c b -orme de sel de Dans le caciçie du l'invention e cation .rnUa:,quu est, par exemple, un 25 catici J Nickel "Ni2+), de Cadolinii,..im (Gd3 0 Cuivre (Cu2+). Le groi.i.ornerit NTA nitiniotriac:s pirgeant ur cation Nic Angewandte CheriliP InerreLonI Edition, le cadre de tli vention, le peptide sera de prerrice à établir un tement entre e rlrort e 10 nm, et préfére fUellement de 2 à 7 nm, et i rticulie.r decipire de 6 n e cE-dre de Vinvention, l'en:. - pourra contenir uneprotreé embrana!rE- réfE=o-ence une scntene. membranaise De façon générale, les peptides utilisés jusqu'à présent. .dans littérature en ren.: un espace de 2 nm. Un espace de 6 nm est da our la reconstitution d'une large gamme de protüne rnembranaire (Schilier S.M., .Reisinger-Frieb'sA., Giitz H., Hawker C.)., F :n CV Naumann R., and Knoll W. ominntc Upoglycopolymer Membranes: Photochen-iica' Surface Attachrnent c Supramolecuar Architectures ,,vit h Lrtnrc C tation. dans rn7nière de 1 à 10 IsInsr oidouche lipidique:3.. Une traverSC au mons une entière,men bicoucn'n 15 membrane cePulaire Comme expli crAu'elle _ une membranaire pou::: -tre introdu rte a pres formation ,cle r bicoucheipii r: ru dïrecr nt ion; de ^ t'on-nation de cer.de d e eru Les ensecnbk ndon pourront sesfsir cAu constitution de biopucnc En u:: L Lu rimer o'»,n''"; une 5couch.e 'ue des protéines bran' (e ce nature de Ira otéine mu' le le cupper pourra servir d'oui:H c1analys2, mimant, une --r-ernt.'srrisir-e notamlent, pou 'étur(s.,, ou le criblrnr de nouveaux - aî-it-ascriistes ou p-Dur l'Utude de nouveaux agents thérapeutiques à visée 25 mernbranaire.. 1,d"'hHsabori d'un SU part en or permettra, en particulier, de réaliser un rie par i7,-ésonance Plasmonue de SU la Ce (SpRi e nécessite aucun marquage préalable des entités rnoieJ17,ires à e manière à pouvC servir de biopuces, l'ensemble selon 'l'invention 30 comprendra un support q présente plusieurs zones sur lesquelles tne hicouche lipidique est fixée pr l'intermédiaire d'un nomma s lui-même lié au support, ledit peptide pilotis possédant. une extrémité C-terminale constituée d'au moins 4 histidines consécutives et la hicouche lipidique comprenant une part de lipides possédant une tête pLiialre chélatrice qui emprisonne un cati.on métallique et assure la liaison avec peptide pcus grâce à des inteiractions de type métal chélate entre Îe cation métallique et au moins une partie des histidines situées dans la partie C-terminale du peptide pilotis. Dans ce cas, l'ensemble correspond à une binpuce. De préférence, au moina deux, vc plus, des zones qui correspondront à différentes zones diranialiiiiise o sont porteuses d'une bicoucvnie iidique différente, 10 perrrettan de réaliser diffentes anaPse, simernén Les différentes caractértWquas mentionnées dans le cadre ce Vinveritioi elation avec la définition du pepti.:-.1- nidds, de la abouche memoranare, du procédé préparation des ancemnle cuoport peptide otis/bicouche lipidique s'appliquent à chacune de ciié,i; zones, 15 L'invention e étialemeri obfft unprocédé de détection par lmagene par eso[ rice est-il-ionique de sur, utWsant un ensemble selon rinventbn -'7.3ns légué le support: est en 07. L'invention concerne e akanent un pi, 'at:ori d'un suprx selon (invention riprend leS étapes su sslives suivantes 20 a) la 'xFitàer du jeotide pilotis à la surface du support, b) la fixation sur la p lipides possédant une métallique, ladite fixatbn osorres ccv ornant une part de haire crielatrice ,,-.1,,..gisonnant un cation etiant par éteihissement d'interactions métal chélate entre le cation retal igue et au moins une 25 partie de or nec jtuées dans la partie C-terminale ; . d'un agent fusonène pour induire la fusion des liposomes et la -formation d'une bicauche PpidPaue continu Dans le cadre de l'invntion, le mode de fixation de la bicouche lipidique sur le 5 upport est compatibie avec différentes compositions de 30 membranes bilipidiques qui pourront donc être modulées, en fonctton de la protéine transmembranaire à réinsérer. D.i7-3n5 e procédé selon l'invention, les cieux f,,.,:.;uilets de la bicouche lipidique sont formés simultanément, contrairen2nt aux. protocoles r:i..urir.Ls dans l'art antérieur, dans lesquels les deux feuilkus ét7ilent formés indépendamm- en dey,: disbnctes, Dans le cadre Du un, le procédé est simp:ifié, u Li formation des deux Liiiiets de la bit:ouche est réalisée oui: e une e Je, Les bic/hes piques obtenues consent leur comportement dvnmque et leur fluidité puisque la bicouche aun'est D e. as ancrée par son te oxVnaln'est atach ' aDuie que pui quelques pau: cents (notai-ft-rient de e e ce de 1 à 2 molaire) de Hjs à tète :' ce hotus dans ta compost' des esemes. De , les bicouches flpidiques correspondantes pourront être fnotiernent pour !a reinsertion de prcD n r n ru s' par expression acellubire ifi) vitro de la protéine en présc:.nce de L Lu. un plane et eoryi robtenue, Un autre as/ ntage Li made Jiie I I I Sé dr S C. ad 7e de M etr oeuvre :rice emr Donnant r ce,tic.)n laUiclip.:=2. établissent des liaisons du e avec. les Hstfti ns iD pue des interactions sont réversiiiiiisis il est s sibh ci: n'pl L-lasurface ens :n ant1.)C:h é.' idée et de réutiliser sation po -icrm I ii 3flCL ru ltD pee . qui Ht'. donc clent r rtie Oe l'invention, Dans . - d'une exp.oltatîon indrestiiiie"h celle régénération conclula terme à une rJLitiOn dort -....).rabie ts de production des blopuces et ' des échantillons échelle. c'est-à-dire qu'api:, iiner bicouc L r urt ril ne - et p 0 lequel ext ext 'invention a donc ga -emelt pour objet u, : ippurt interiméd ire sur PePe lomm : tide préférence pu r son -ternina e caracteeSé en ce que le peptide pilotis possède une terminale ibre constît.ué-e d'au moins 4 1-1.td.ines consécutives. Les caractéristiques du sui.y,-0: -et du :peptide décrites dans le cadre. de l'rïvention satDpiique à ce -t interr.: _.. 302 76 79 16 Dans le cadre de l'invention, la bicouche lipidique est, plus souvent, obtenue par fusion de liposomes unilarnela:res, de diamètre moyen compris entre 30 et 500 nm. Le diamètre moyen des liposomes )eut êt:re défini comme le diamètre moyen en nombre da la population der' son-ies utilisée, déterminé par diffusion quasi-élastique de la 'urrii?re, égaemeut appelée diffusion dynamique de lumière («. Dynamic Light Scatteruig , DLS). liposome unilamellaire », on entei-id un liposome qui n'est constitué que d'une seule bicoudisie de lipide, Une telle technique ssion sonnes ention d'une 10 coud ntère, homoqène, pira continue. Les frosomes ne son dési r s lors oc leur fixation , ide pilotis, ensuilx.- :action dc peptiUe fusogène qui entraîne la fi- ration de la biccuche. 'ouverture du liposome et formation de la bicouche sont connuEs sous le terme de « fusion des liposomes », 15 La fus once, bten un pepiide fusogene, de ,nce Q 1D N 2 SGSViLR[)\îvdDWICRLTDFKTVLQSKLD KFT3, *it!ele eurr-esipond Quence Ni-terreinaie de 31 acides aminés de l'hélice alpha-arn hipati t de la protéine non structural iNS5A) du virus de C néLu-sbde à l'association ivierrin ro ouy'i-us lors de 20 sa rcHsfcution: tel pepticie fusooène a notamm,. t et décrit et utilisé dans les publicz.. ,ns de C:he et a/ 2107, 2009 et 2012, de Coutable e et 2014 et Cens e brevet itb 8221,7 12, et ce pour la fusion de liposomes de différentes coma dltions. Ce r:1-71,-.de est éllminé et ne se reitre- pas dans l'ensemble 25 roy 2012',, plus, la publica Je Coutuble et al. a et'jmn que l'utilisu'Uon de ce peptide fusogf.c e cut compab 21e avec la rSnsertior des pr ines membra-. D'autres pel fusogèn-,(7,bv,-,2ilt être envisagés : des issus des protéines Je la capside virale, tels que h madglutinine (H gp41 30 (VIH), gp 30, gp 32, P15E (V de la Leuee- Pour plus ris concernant de tels peptides, on pourra se référer à A. Lorin et al. 2007. restent intacts. (7est clu iosome et la 302 76 79 17 ans le cadre de l'invention, il est possible que les liposomes soient des protécéposomes. Dans ce cas, l'insertion de la protéine d'intérêt est réalisée simultanément avec la formation de la tïcouche lipidique, puisque cette dernière sera directement in luso (luis fts protéo!iposomes. L'obtention de liposomes unilemellabes est décrite dans la littérature : on pourra notamment se référer à Donald et al. 2007. Pour cela, un .flim formé de la composition Ppidinue sélectionnée est toutabord formé sur la paroi d'un tube ou d'un balon en verre par ,,dporation notamment à l'argon du solvant organique dans lequel le melp é formé. 10 Ensuite, ce film est avec une solution tampon, notamment tamponnée à un pH appartenant à la gamme allant de 6 à 8 idéalement de 7,4. Ces deux premières étapes par ex:emple, eDectuetes à une température appartenant à D L amme allant de 10 à 35°C, et typiquement à température arnbàrite °El noteirem ent). Un tampon lelEPES: ou PU5 pourra, 15 par exemtte, étre nal Des vé s multi- arriel aires sont alors obtenues et sont transforrnee,s paréos répétés de congélation (par exempF dans 'azote de d ciongeicalor à une temperature de 30 b 10C, suivis au final d'une étaped'extrusion permettant d'ajuster liposomes ntnme oDesor obus. 20 Li pes a) de nixatten du peptlde plotis en sUrrace du support, b) de fTxation sur pepttte p u, des liposomes comprenant une part de lipides possédant une )(plaire (-Matrice emprisonnant un cation méta h iq ue, par ctiabiisziiirti C'interactions métai-chéiate entre 25 le cation métaliicue et au moins une partie des histidines situées en position C-ter'minT. c) dao d'un agent usogène pour induire !a )usori des liposomes et la fornrus - :l'une bireoc, ie continue, sont. souvent, réalisées à une température r'artenant à la 30 gamme a: 10 à 35°C, et typiquement à tem:aérait:une ambiante (22°C not.'insirne et à pression atmosphérique (en particulier à 1r13 En nérl, le support est placé dans une chambre et les différents réactifs seront successivement nlectés avec une étape de lavage entre chacune des étapes a) à c) avec une -71 tampon, notamment tamponnée à un pH appartenant à la a orna aP-rit de 6 à 97, idéalement de 7,4, permettant ainsi d'élimner toutes les molécules qui ne se seraient pas fixées. Pour l'étape a), le support est mis en contact avec une solution aqueuse tamponnée du peptide pilestypiquement à une concentration rni\I à lOpM, notamment, c'.e 25 injé à 4 pr r10 ensuite peptide pilotis. Les liposomes sont sous la forme d'une suspension dans une 50iudon aqueuse ta -,1pon dans n 15 une concentre:on de 10 Eisj ils sont .rormes -borine' ce .'avec le rriL.. Ensuite, ana on-' réactionnel en contact t. e suppt.gt es m4nes types de tampon que ceux. noncentredcin de Cb ..711,1(-,,nt: dans ur obtenir s'st une uté pour orécciern man pare la Préparation sornes uniiamellaires -e mis en oeuvre à chacune des étapes a) à c) ufl5 les D:Anions. d'introduction ces rés -nntnatbn de ,a hicouche, il est également possible d dans 20 : milieu on n e des n divalents comme le cAcium Ca u un agent . e:ur comme l'E, A à une concentration, par exemple, de 0,5 à 5 sans que l'ensemble ne soit pertudre, tmdi ré sansqu'un ochage sa bicouchc.1 après fixation au oepécla pilotis ne soli:. En conclusion, lir- on combine .différe.a.b avantages : 25 - tout :,Jaard el, à robustesse des bic-- ches igues a',,:acwie:,z sur par haa3on réversIble sur ur- Ode on de 9lson qui est, lui-mérne, greffé pr halson covalente sur le - la possibilité de moduler à façon la composition de la bicouche 30 lipidttue qui peut donc être adaptée à la protéHe rnemb7.--Tiaire d'intérêt qui dot être insérée, - la p former différentes zones, de manière à elptenlr des micro-réseau]; tgions porteuses de bicouches lipidiques différentes et donc le déve op de biopuces à membranes a5-sociées, - la putb Lé de réaliser une détection rnultiplexée sari et en terne mesure en imagerie par résonnance plasmonique de surface (SIT]) dan e cas ce;': ctttsen or. L'invention offre donc la possibilité de développer un outi haut débit pour l'étude tes interactio membisanere., potvaent y 10 , aux Fiquren annexeee, permettent: d'illustrer ,Va-ft'j 0 ri tain n'ont alt'pun cota limitatif, La F, .ene roprdnnntotion sch.Watique d'un ersembfià veptior . c présente % de réflexivité en fonction du temps, suivi en 15 asmonique de surface dans Lr Ca 3 de la Composld, - . DOPC, L-PS et. Le dans )maire 7t:24/2. L :'Luente a.rnLrinedo ri du prore. ftmrmatlon r .5lcauci none 3 1onn d ne par mlc:Toscopie à force -nique - 20 B et C du par .-,e(jp,;trlaution de fiL.pa: ;cence 0 1:0 1S) a mcltirrent - FRP,P u has 'a' 25 d'une _se recouverl::e a r des liposomes non fusionnées à 0 rrIrt (Er 1h aptes phritobLDnchirnent (E) et d'une rér,!inn de la surface :)rmatioi e la bicouch: a 'gène à 0 min min ar t nhoteDlapefilspen » . -sente réflexivité en fOI mttion du temps 5..'.1vi 30 par--ntion d'une me lrOdque constituée de DOPCPDO::"'S 3/1 en présence ou en absence de 150 nm NaCI' suivie de l'intern,,,ron de B de la Nucléoside ÎLDP'nosphate Kinase (NDPK-E) à une (1e le surface d'or 1 C. .Deptide nt, TA( L (B) et après a rLrmaou de Pc25 tdP.,.:tributlor de fluopercerce photoblanchiment concenti-Dtion fhiale de 30 nNi, La e4111 présente le % de rePnu. 'ité en foncti mps suivi pr SPRi sorpton de la iiiiiDPK-Ff à une cc un laie de 30 nM sur surface d'or en présence ou en absence de 15o mil Nef:, Lc nrésentent les images en microscopie de fluorescence d'un prisru-3c. r ups dépôt d'une matrice de peptide pilo (;mage de gauche) dans CE-3.5d un ormat biopuce, après incubation ;Deur des liposomes coreerart eu sonde fluorescente rsiErf-PE (image du et après 'fusion Pu eosornes image de droite 10 U e 5B er uurte Vévolutior effun fu:ivité au cours d proces:- -s forma en une peceucl -4'ie Hvie pour chaque de pe[-ptid pHocas p P dans as CaS deur, rmat biopuce.. La -correspond au r n Jr(>,:s [peptide oiiebs njecticu. des liposornee. Profi nuuntat Je Venseee51e ds égiured de 15 cs -Lu ri des ut r ro,Jiennert Avant i PerL. Ppareii SPFe 17P utilisé (c,PRidE3i0, 20 correspondant au si'ippert en or sont c:ommerciai '-r société reffead - Lu ainniDor HF" et le clic rrrie proviennent de la suuuL Jgrna Aldrich®, Le ta HEPF4.'irf^iaCI est convr d'HEPES (10 20 rnfie à 150 MM à pH 7,4. Le rnpon PBS est 7Onstitué de ,3te (10 rcil\l NeOCI (12S0 rnM) et KCI (2,7 1-1iM), et ajUS1: nH 7,4. 25 -1'..e Mineatruder aind r:ue ringues, membranes en polycarbonate et pré-filtres utilisés pour 1a pré_ des liposomes proviennent uianti Lïpds®. -Le grandie re à diffusion si-eae: e de la lumière (Diffusion Light Scattering, DLS) est un Malvern© Zetasizer Nano S. 30 ,%bréviatiou.;- 1-p.d'rn -2-oléoyl-sn-glycéro- losphoc ,o. n 2-dioléoyl-glycéro-3-phuprine Phosphatidyléth.andiine-[-:-(4-nitrü-,> 2 xa-1 diazole) PL: : ph: tïdysérine PIP2: phospnatidylinositol.-- DOGS Acide --)5phate -sn- r-(5-amino-1- carboxypen nod' uccinyll NTA acide nitrib,D., APF ,n',il-sn-glycéro-3-phosphoE 10 flim nidique est, t d'un tube en verre par evaporaiTon, l'argon du --ânique dans lei-40:::1 le mélai lipides, prép ans du chl dans un mélange chlorof 15 méthannl (9 /1; v/v)) selon l :hoisie, a été déposé. La - lipides évaporés e de r ieurs composition!,lpidi. ont et:. -1-ées - inélr,ige de POPC eL de DOGS-NIA- ) darn -.in rapport 98/2, 20 un mélange d et de DOGS-Nï , dans u. molaire 98/2, - un méla ?OPC, DOPE-Biotine et de DOG:-Lii-A-(Ni), dans un rapport r e 88/10/2, un méla e DOPC, DOPS et de DOGS-UTA rapport 25 molaire 7r,24/2, un mélange dL luorescent) et de DOGS- NTA-(Ni), dans u rr 70/2,,, 42, - un mélangE PS extraite de cerveau et de DOGS-NTA ,77/31/2, 30 - un mélange de PC extraite de jaune diceuf, P5 extraite de cerveau, PIP2, extrait de cerveau, et de DOGS-KIi), dans un molaire 67/39/2/2, 302 76 79 22 un mélange de 5 composants iipques : POPC / nhLiyrnyéline /Cholestérol /POPE /DOGS-q\-, un rapport mol7eire : 37 / 33 / 19 / 9 1 2, qui mime i composition du feuiLu1. externe de la membrane pLr 3mique des ceques eucaryotes. Un ifirr lipidique est, tout d'elaard 'armé sur paroi d'un tube en verre par évaporation à l'ar77n du solvant organlque - equel rreerige de iipque obten[J est ensuite hydraté. avec un a Jen_ mpon PBS afin d'avoir ur.e lipi formé, tampon HEPES-NaCI concentration en arabes de 1 .L. uttséta ndut à la séparatior de, 10 r ne. r e lIcoucnes qui vont fumer des NiLVs Çvlub Lpmelar de": pAlesu L u, es MLv sont alors trarsform par des clea .reu con p.e,i dans l'azoteCJEut de à 38'Cl (fix5 rran de cuir- on et 6x1.0 min loaa- marie , qui sont SUMS .cljune étane d'extru u; atretve!-5 d'une .-ilembrane de 15 ,400 ro.e, in -Jos au travers d.une membrane Je 100 dm OU. moins). e.apes ctextral r) C tiCj Se ni t iention de LU di. :1r \,sicle lvCosorne.s un 7,11,7ire,JScaHbreddi (Dc dlL, L.3.3lum, 3. J. ,J' T. E77 NICKtiler, rard-E,Jot, and S. M. Valerziela. 2007. Nimoblotechndiiof E3,fomime:-,k7 Memhranes. Lvdi .u1 20 Blodgett Technique or SyrLsesis of Biorninede Jpid rembranes. p. 25-37. Liposome Tee ta clu es r nimetîc Lpii Ld iaranes. p. 77- 79). La talle d .posomes est contrôlée par diffusion L d'n--tu a (iie la lumière, égaiement appelée diffusion dynamique de iune. Dynamic 25 Light Scattering », DLS). 2. Formatoide la bçLJpjgj Pour '-ormerla Dicouche, isjecte, en premier, dans la ci--inDre réactionnelle, le vot'de en solution aqueuse tamponnée en tampon HEU:5 30 de 10 à 20 mM pH 7,4 supplérreeté de NaC1 150 roM à une coventratien initiale de 9,74.10-4 M (soit 2,5 mg/mL) pour obtenir concentro7,,,,,n finale dans la cuve comprise entre 25 nM et 4 pM de SEQ ID ri 302 76 79 23 CSRARKQAASIKVA qui va serr de lien entre la biccuche et la se fixer sur l'or grke à ses l[Eirirls thiol surface du support (cysteine N-terminale). La concentrati OP de 4 01 en peptide pilotis. corr_spond à la concentration minimal pour obtenir une saturation de la .surface en peptcle Vnîs greffé. Les liposomes, à la concentration lipidique e de 1 mc I mL, '=.0 ri: ensuite njeces dans la chambre rEnrJonnelIe à une concentration fnnle de 100 pc1 et se greffent sur le _. Le peptidE isogene ID N°7 : 57-7,11LRD\10' 'D, °',1 lVL1U774 DYKD en dans du tf..7111pon HEPES 10 à 20 TiM ph 7,i suppVr 10 !\!,7r-- 'vl es;: alors injecté :à une concentraton finale cornprieo ,rre 10 à 2 iV, I n hitnr., - vec les liposomes et peteriefitte e passa, - LUV à une V't. nn piar. Entre chaque dépôt, des la\.i7(Ies avec du mpon de travaii iriEPES 10 à 20 nl.mi pl 7,4 suppkV nnLln n NaCi 150 M oit effecist 0 rois le voly-ne, de la chambre pit'eactionnelle), perrnettent ainsi 15 d'eh -ha optes es mol -Llies qui ne se 'seraient pas t se( i'ment. De 5 essisaigi on en utilisant des concentrations finales en peptide p stiz de 7L VA et ie",pM. iadserptfikin jt, ur la trâce d'or suivie p enance plastrionique de su apiareil de Ri (SPRi-Lal:H le ";;PR-Biachi nt commerciali 20 par la socié- Hop 'incubation de à :cace cl'or ave S 0 'On contenant urie concentration eï rb-31e de 4 1,,t1 ce induiT une variation cl e téilectivité de 0f..' 5 C') cornm ri-IP:litant idence l'adsorption du pi :ide sur l'or. Cette vafiatnan est a variation maximale que on peut obtenir quand :a peptide 25 rHctis sature la surface. Elle n'est pas mcyjii0-7, - --près ci es ntensifS. L77 analyses effectuées à partir des valeucs de variation du réflectivité en pourc-en",-. permette. déterrnner la deuité de nniécules greffé '7 en surface. Cette densité pcn tre estïmée en utliisant l'équation de callicration de l'apparÈllac,,_ utilisé (SPRi-Lab+) : 302 76 79 24 Sp,R où AR est la variation de flectivité el pourcent, Lzc la profondeur de pénétration de l'onde plasmoniqu .10-4mm), le rapport Ôn/bC est fixé à 1,9.1tY mrn3pg', le Sp,R désigne la siensib 'il?' de la SPR en pourcent par Unité n'index de réfraction (2,25. 1Û OC.RIUt) et r correspond la densité en pmo .mm ula e déterminée pour une ion maximale de 5% snu 'tour une concentration tinaie de 4 pNl neOtide pilotis dans ia anion elie et correspondant au signai On saturstDn, est de 2,8.1013 10 .rfiolécu:e5: d.'-TUdes ptods crn2. A 25 nM, Fa densité est de 2..1012 molécules de eptides protts cm2 condutmnt o un assomment théorique ,e 5,8 nrn entre cl .lotis, si ces derniers sent répartis de façon homogène sur e support_ Des l nosomes contons rit 1 à 2% d'un 15 (1-81, da rboxyoe e NTA( ) pur la formation piLciique. Le processus s étC testé mess dos liposomes de tailles comprises entre 50 et et de compositions jeS varlabies Co nt bLés PC PC, COPC / POPO. i! -tins variables), 20 eiiri.-traits naturels de pc et ps j de choss- os va , en absence ou or err`,-;ence n de hoosomas à une concentration finale de 100 pg /mL de compositions ttarlabi s conrenaiii;t a lipide tour DOGS-NTA(Ni moult une furte ouqmentstiosn de la réflectivité, comme illustré re -'ei, ce qui traduit - iniCE:r-r'iPrlt, naos 25 opt de D surface du prisme SPR. Cette vleu r da réflectivité omet rias nyDdifiée eprès rinçage. La tata Plie ince Ni-NTA qFt donc ÇrAcifiquerne.nt avec l'étiquette .poiy-histidine du peptide psnnettant la fxstioin des liposomes. out du peptide fusogène de 51,7Q ir _ nduft, comme le montre a Fguve 2, dans un premier temps, .. légère augmentation de la, réflectivité qui traduit son insertion dans les liposomes, suivie, dans un second temps, une diminution du spna qui a été précédemment interprétée, pour des liposomes directement déposés sur la surface d'or sans ajout: de peptide pHotis, comme l'éclatement des liposomes et formation d'une bicouche lipidique homogène à la surface du prisme (Chah and Zare 2008). Ce prorii caractédsbque présenté Fi'gure 2 a été. obtenu avec toutes les compoebons pidiaues litées précédemment. 10 Les .,' pes de fomaton de la bicouch atb r le pilotis, tuememe h ur la surface d'or, o r caactertsees par mTcnDscopie force atomic AFM SOLVF,R-PRO© ,,e '.nez-MDTC.1-::i balayage maximum de, 50x50x2.5 prn ±10% ; les pontes dAFM utiHsées sont de,c,; CS0 ,,,, de chez Ni---virfii ü : 0,03 ro N fn per mesure de redistribution fluorescence après pho oblanchirrept F - Zeiss Obsewer Z 1 ne Fipure 3 montre ies imaqes obtenues dans le cas d'une 20 bicouch: formée de PÛPC,: DOGS-NT.e rnoa re Ce cas a ne»pi pour montrer que ïe per de fusoqène urifsde par Cho cf cf. était aussi eftcace pour former des, membranes sur « étude ») que direcemntsne ft support (« étude de! Cho et al. sans ptetis5>) Les images d'AFM de la surface avant et après incubation avec le 25 pepbde lIpt, ;Figure. IA) montrent une .surrace ri'.1 aune avec des rayures caracb 3 des prismes d'or commerciaux du prisme poorer uu pu,pilotis avec- la suspension de Hposomes u lIaires, on observe une surface recouverbo de l'adsorption de liposomes sur la surface. 30 la surface apparaît homogène (Figure L.sr:ules (Figure 313) indiquant injection du oeptide .fusogène, ce qui confirme la fusion des vésicules sur la surface et le recouvrement de la surface 3`or par une couche continue de lipides. 302 76 79 26 L'homogénéité et la fluiditv de la bicouche Uooique formée a été vérifiée par microscopie de fluorescence et par redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dans ce cas' des liposomes contenant un lipide fluorescent (5% molaire de NBCPPE: : sel d'ammonium de 1,2-dioléoylsn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-y1) ont été utitr Ces ,7._)sorries cont préparés comme précédemment t en cutant 5% molaire de NBD-PE. Une partie de la surface adré expostre à un au retn du feuiliet miambrarare «est pas «couche pidiqu Pst fluide et cortnue, es molécules ripa .centes «tuées dace, Tor réqions avoisinantes vont (fi:fuser librement au cuirs du temps et di réqion photobianchie redevient progressivement 15 fi (Je rescelte, Lorsque mesure de FP'Aii, est effectuee:, avant ajout de peptide fusoqène, la e pnotobfanctse r u. redevient qas fluorescente 9u .r- neur ps diffuser surfacv nn qui est e rluorophore le une discontinuité due csiractéiasijeue usicn nervi Lorsque ra usure est 20 errectuee des deux populations entre la zone b auchle et fa milieu adjacent a lieu Jusqu'à rition de la z ,hotobiunchie (Fiyuyee. 3Gb Le mH5uLe ''luo;--escente diffuse oc, Tireseent sur la surface attestant la forrr d'une bicoache continue et horpo;ene. 25 L'enafyse de la cinétique recouvremerft de 7,uprescence permet de déduire le covdfcdint rie cifdisïon latérofe D », caractUstique de la f de la bicouche iripidique. Une valeur dia 25i108 /s a été déterminée, ce qui correspond à une «couche cru r uide que celles décrites pour des fixations via des systèmes pi() ries/ligano.s Rosi et al. 2011). 30 L'intégrité de a bicouche tipklnque formée à in surface d'or a, quant à elle, été -'7-,ée 'orme B de la Nuciecside DiPhosphate Kinase (NDPK-B). Cette protéine intespécifiquement avec les molécules de PS ssant faisceau de après ajout du peptide fup,-, 10 subit un e destruction a catrée da, i7_if du microscope, avant et Le fluc re pieeint dans cette rïon hotoblan vin t :'.1 ;e mouiernent du fluorop COntra urées mais non et cette interaction est inhibée en présence de 150 mN1 de NaC1 (FrançosMoutal et al. 2014. L'ajout de NDPK-E3 après formation d'une bicouche fumée sur les peptides pilots constituée de DOPC/DOPS (3/1 en rapport rr en absence de NaCl induit une augmentation de la rCdecdvOd e -egistrée par SPRi, ce qui traduit une interaction spécifique de 'ser,,ce de 1 rnM dc Na Cl, il «y a pas bieeeche. --q'çTnentation Figure ha surface der en présence et en con M. nue cette 7t-,1:éine s'absorbe à nce de N C. rell',1 b S ence (J'adsorption en prMsence de 150 rrirvi de NaCI lorsopr: la 10 est recouverte pai id bicouch apidique suspendue su es peptides pilotis indic:ue que la surface d'or est parfaitement recorivere et que la bicouche :hue :tègre et continue ; cette continuité empêchant l'interatfen, non car de la protéine avec l'or nu. 15 Cons7.0 .LiOn Un e(TICT:Li majeur dans support solide est la possibilité méthodes treeitbnnelles des éù.ia, ois ne peuven 20 lipidiques. Selon le orohocole du procte. sebn l'inverhe « piezoeiect 'ouche cr frr - blopuce : ntien de membranes lipidiques sur un réalse des mesures à hauss débits. Les s utomaUsé impliquant la déshydratation apphq des au dépôt de vésicules a) à c) in dispositif mas-H sur un ont c spotter » (,ca - rLEXARRAXER S3, SCTENIO prisme d'or, Un peptide Nlntis 25 n tout à 4 ng/spot été déposé. (const as de DO /DUS, n rapport moles, lcorporant 51/4 NBD-PE et 2% de DOC'''. NTA(Ni)) sur les -rfaces recouvertes de peptide pilotis a été suive pr Jar rrilcroscopie de fluorescence (Figures SA et 5B), Après dépô, dcs lipo:ccnes, les régions où le nepticie e été déposé 30 deviennent fluorescentes, ce qui atteste M nxetion des liposomes aux peptides pilotis déposés par a.dreiege n, 5 - imeçje tu centre). Cette étape s'accompacire d'une augmentation de la réflectivité au ri iVea tj de 302 76 79 28 chaque d4C,i.!: de peptide lotis ' Après ajout de l'agent fusogène, fa fluorescence persL7te - cue 5 ironge de droite) et la diminution de le réflectivité enregistrée par SPRi hgure 5B) atteste de la format on de la 'ckc.:,uche suspendue au-dessus de chaque région de peptide pilotis e7paceur Annsé par micro-adressage. fi n Chah, S. and . Zare "Surface plasmon resonance study of .upture by virus-mime 3203-3208. 10 Cho, NA., 5.-J. Cho, K. H. Cheong, J.S. Gienn and C. W.zr'- nk (2007). - "Employing an 7phipathic Vii Peptide ta Cpaate or Au and T102." Journal f the American Chemical .c.:;oce 129(33 100 -10051. Cho, N! J. . Wang, N Edvardsson Gien , . Hack and C. W. Frank (2 Alpha-r-lelinq F i aJdeeinduced \R:?,sicle Rupture ReveaIino No ii 15 Ir_ e Vesft:le Firion 'Process As Morftored n Situ hy Qaortz Crystal ucrobalance-Dissipation «I Reflectrome rt. \lai Cherrustry 31(12): 475247E1. \IV H 7 , B. Kase 1-17 7') and h --1C.,-5k (2 crysto microbalar, h,..--,Ïpation monitorrin .Dupported lipii ^ayers 20 on ^ariou 'L'o»oto "b Nature Protocols 5: Cout Chr o:ophe, 3. Chalme 1-M. François' C. Vieu, V. .Noireaux "Preparatior of tet: p d biayers on gold ces for thr puai:Ion of integral membranc- ,teins c uiesized by ce11-free exp Langmur 30(11) 3132-3141. 25 Donak Bum,' J. ). Go() :KingT Mech er P. ard-brjrot, a--,(1 5. F L Valenzuela. (200 r\fandbiotech 'Biornmetîr' Membranes. Langmuir-bludgett Technique foi' -ntnesis of rMmet:ic Upid Membranes. p. 25-37. Liposome Techniques for5yril:hesis o r!rnetic Lipid Membranes. p. 77-79 30 Frariçois-Mou.taL L, rcJllat O. and ,T7.:)iranjon T. (2114). "StruCirral comparo- holly s rrriar nucleoside cliphosphate Uheases: rc*ccular expa-at'on of distinct membrane binding behavior." Biochimie 105:110-118. attFp-ek." Physical Chemistry Chemical Physics 302 76 79 29 Hardy, G. 1, R. Niayak Munir Alam, J. G 5"-;7ipter, F. Heinr!ch and S. Zauscher (2012). « Biomimetic supporte.d liphi bayers with 1-IL h cholesterol content formed by peptide-induced vesicle :,'ournal of Materials Chemistry 22 : 19506-19513. Lorin A., B. Chari:Jt.e...aux, L. Lins and R. Brasseur (2007) « Implication ds ciantIdesde fusion des glycoprotéines d fusion virales de classe i dans la fusion mem braa na i re BASE, vol. il upups.,1 tc-11780- 4507/index,2i1 1740). Robelek, R., E. S. L " KirstL R. Naumann, D. 10 Cesterheit and E.-K. 9nner ,-i. rrp Incorporation of 'la Vitro Syn hesi-z..ed ne ystE-n An andte GPOR r-it:0 a Tether;eci .Chemie inte ,._.H.JnalEditio ounliati, C. 1.117.zare, Ri. Hlecic!ar, D. _adorai:. and J. Chop nE,72 (72011). A Tethered Mayer Asserrd - mrnobilized 15 Calmodulin tu Ceilular C3rnpartmentaP7atior1. Rios One 5(4', A. A, L. H. Yildiz, B. Liedberq 3nd E. K. 5inn (2013). "Bionirne.do membrane pierorm: Febrcation, characterizat;on and appcat:Rnu." CoHoids and Surfaces 3-Biointerfaces 103: 510-516. Cho Cheong K.H., Gien 3,5., Frank C.W. Unfted Stata,--- Patent. 20 No.: US 211, 712 B2 "!',1ethod of Fabilcrat, n g branes On Solid Supports". 1 ible constitué d'un support sur lequel au mains une bicouche lipidique est fixée par l'intermédiaire d'un peptide, nommé .peptide pilotis, lui-même lk. au support, caractérisé en ce que le neptide p lods possède une extrérrii..é. C-terminale constituée d'au moins 4 hStid nos consécutives et en ce que la ccsuhe lipidique comprend une part de lptdes poss-:-Mant une , pcnaoe ,gisonnant un cation métallique assurant la liaison avec le peptide pilous grâce à eractions métal-chélate entre fi, cation e et au moins une pa ie des histidines constituant l'ex mite C- tern-unaie du peptide pilotis. - Er semble selon ia revendinaticin 1 caractérisé en ce que le cation métatt P: .on de Nickei adclinium ou de Cuivre. n la revendication ou 2 curact&is en ce que le rintlon nétailique est cation de Nickel et la tbte polaire chelatrice est l'acide nii.hloCi7m7etque, 4 - Ensemble selon l'une quelconque des ruvendicatiom 1 3 caractsrNb une luire cuaiatrice - `e formant la bi iche risonnant un cation Triatei ri-c-nr.:e de 1 à 2kv molaire de in totalité 20 lipidique. !ne queicorioue des revendications I à 4 caractérisé en ce ca n pept..a pilotis est attan is de manière covalente au support, de égarencre par son extrémiir. t, Ensemble selon l'une quelconque des rever lications 1 à 5 cursscotrtsé 25 en ce P. support est en or, 7 1,ierr-ble selon la revenainiatton 6 caractérisé en ce que ic peptide pilotis comp »te une cystéine à son extrémité N-temvna éa oirssant une liaison S-1' u avec Pe support en or. 8 - Enaorable selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que 30 l'E.xtn_mité C-terrairiala du peptide pilotis est constituée de 4, 5 ou 6 l-lsbciines consécutives. en ce que la part 302 76 79 31 9 - Ensir, nelon l'une quelconque les revendications 1 à 8 caractérisé en ce que liaison avec le pet 'Je pilotis est assurée grâce à des interactions métal-chélate établies entre le cation métallique et deux des histidines situées dans la partie C-terminale du peptide llotis. - Ensemble selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérlsê en ce que !a comoosition de la biccuche flpïdrtua est choisie de mimer une membrane biologique, et notamment cellulaire: 11 - selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce pus la bicouche tpidique est. fluide ,- continss 10 1.: - Ensemble selon l'une quelconque des eveordication caractérisé en ce qu'une qrotéftie membranaire: de préférence une mernbranaire Jans la hicouche tpdique. - Ensemble serti i'unie quelconque des revencications, 1 à 12 caractérisé en ce que ,e support présente plusieurs zones sur Hee une 15 bicouche irilir.ue est fixée par lnterrnédiafte duo peptide, nommé peptrte ,Etde x szeda ntune i; et la bise piinàlne' - latrice d'eu rriolos e histidines corsécut part de lipides posseaant une. cation meto i i eue et assure la liaison avec interactions métalsrélate entre ie. cation comprenant une sonne un les ipue et au moins une paiide -ai histidines situi: - .tins la partie e-termina1e Procéda' e préparation d'un support selon tutus nueLcnque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce quil r id les r .,,)ccessives sri ',./antes : a) la fixation du peptide pct à la surface du su-port, b) la fixation sur le peptide pilotis de liposomes comprenant une [part de lipides possédant une tête polaire cheilioldice emprisonnant un catiorl métallique, ladite fixation étant réalisée par établissement d'interactions métal-chgel e entre le cation riler5 et au moins une. partie des h!s[tidines dans la parte en pc5!tion C-termirinie ; f un agent fusogène pour induira !a fusion des liposomes et la iiiuuuJfl d'une bicouche lipidique continue. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation selon la revendication 14 caractérisé en ce que la bicouche lipidique est obtenue par fusion de liposomes unilamettaires, de diamètre moyen compris entre 30 et 500 nm. 16 Procédé de préparation selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce que les liposomes sont des protéoliposomes. 17 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 caractérisé en ce que la fusion est obtenue grâce à un peptide fusogène, de préférence de SEQ ID N°2. 18 - Procédé de détection par imagerie par résonance plasmonique de 10 surface utilisant un ensemble selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans lequel le support est en or.