FR 3032447 A1 20160812 FR 1551075 A 20150210 Procédé de fabrication de vecteurs d'ADN à partir de briques moléculaires contenant des séquences d'intérêt DOMAINE TECHNIQUE La présente invention porte sur un procédé de fabrication de vecteurs « sur mesure » d'ADN double brin, à partir de briques moléculaires comportant des séquences d'intérêt. ETAT DE LA TECHNIQUE A l'heure actuelle, les manipulations d'ADN sont largement toujours basées sur l'utilisation de vecteurs de clonage ou d'expression. L'insertion ou l'extraction de fragments d'ADN correspondants à des éléments fonctionnels (gènes de résistance aux antibiotiques, sites de clonage, étiquettes moléculaires, promoteurs, origines de réplication dans d'autres organismes, cassettes de sélection, etc...) dans des plasmides, molécules d'ADN circulaire naturellement présentes chez certaines bactéries, a permis le développement d'une multitude de vecteurs différents, adaptés à diverses utilisations, chaque vecteur étant développé pour une application particulière et spécifique. L'utilisateur final choisit donc un vecteur adapté à ses besoins et introduit dans celui-ci son propre fragment d'ADN d'intérêt, par des méthodes de clonage de l'ADN. Ces méthodes sont traditionnellement basées sur l'utilisation d'une part d'enzymes de restriction, le plus souvent de type Ilp (c'est-à-dire des enzymes qui reconnaissent et coupent l'ADN au niveau de courtes séquences palindromiques) et d'autre part de DNA ligases, qui sont capables de recoller des fragments d'ADN générés par les enzymes de restriction. Ces méthodes nécessitent des étapes multiples, dont le nombre augmente le risque d'exposition à des contaminants exogènes susceptibles de dégrader l'ADN, le risque d'auto appariement ou d'appariements erronés. De même, ces méthodes nécessitent l'utilisation d'enzymes multiples et plus ou moins performantes, ce qui constitue un inconvénient difficile à contourner. Des difficultés peuvent aussi être rencontrées selon la compatibilité des plasmides donneurs et accepteurs. En effet, de très nombreux vecteurs différant par leurs composants fonctionnels sont commercialement disponibles pour répondre à la grande variété d'utilisations possibles. Cependant chaque vecteur n'est pas nécessairement compatible avec les autres et en particulier l'existence ou l'absence de sites de restriction dans la séquence plasmidique peut rendre les transferts de séquence d'un vecteur à un autre relativement complexe. L'extraction et l'insertion de fragments d'ADN 3032447 2 d'un plasmide à un autre plasmide présentent un certain nombre d'inconvénients et engendrent une forte réduction des rendements de réaction et un coût important en temps et en réactifs Les activités de clonages basées sur les méthodes de restriction ligation et les méthodes en dérivant sont basées sur l'utilisation d'un vecteur d'arrivée, le plus souvent d'origine commerciale, ce qui entraine 5 un manque de contrôle sur la nature et le nombre de composants fonctionnels des vecteurs d'arrivée. De plus, l'utilisation de la méthode de restriction ligation nécessite de disposer de sites de restriction utilisables de part et d'autre du fragment à insérer dans le vecteur ainsi que de ces mêmes sites dans le vecteur lui-même. Il faut donc s'assurer pour pouvoir introduire un fragment d'ADN par restriction-ligation qu'aucune des enzymes utilisées ne coupe à l'intérieur du fragment d'ADN d'intérêt et que chacune de 10 ces enzymes ne coupe qu'a un seul endroit dans le vecteur qui est l'endroit auquel le fragment doit être inséré. C'est pour cette raison que les vecteurs développés contiennent des sites de clonage multiples (MCS). La présence et l'utilisation de ces MCS pour insérer des fragments d'ADN dans des vecteurs laissent des traces dans la séquence d'ADN hybride obtenu, il s'agit de séquences pouvant aller de quelques nucléotides à plusieurs dizaines de nucléotides avant et après l'insert. Ces 'cicatrices' nucléotidiques ne 15 sont pas nécessaire à la fonction du plasmide et sont parfois même délétères (par exemple dans le cas de deux séquences contenant des protéines que l'on souhaite fusionner Le système Gateway est présenté comme une solution aux problèmes de transfert d'insert d'un plasmide à l'autre. Cependant, le système Gateway peut également être perçu comme un système clos, peu compatible avec les autres outils moléculaires disponibles. De plus, dans le système Gateway, la 20 séquence de recombinaison est fixe et laissera toujours des traces dans le vecteur final. L'assemblage Golden Gate est également basé sur un plasmide donneur et un plasmide receveur, très comparable au système Gateway. Certaines des méthodes décrites dans l'art antérieur sont proposées comme des solutions pour pallier ces limitations. Par exemple, les méthodes de clonage indépendante de la ligation ou indépendante 25 de la séquence et de la ligation (LIC/SLIC ou de Gibson Assembly) permettent aux utilisateurs de ne pas avoir à utiliser de multiples enzymes de restriction et de lever ainsi un certain nombre de limitations techniques liées à ces dernières (compatibilité, présence de sites dans les séquences ou plasmides d'intérêt). Elles ne permettent pas cependant un plus grand contrôle des fonctionnalités du vecteur final qui dépend toujours des outils moléculaires commercialement disponibles. 30 Pour s'affranchir d'un vecteur de départ et d'un vecteur final, Wang T. et al. (2012). Appl Microbiol Biotechnol (2012) 93: 1853-1863, ou encore (Weber E. (201 1), la revue PLoS ONE 6 (2): e16765 et 3032447 3 EP2395087), ont proposé le clonage modulaire comme GoldenBraid (Sarrion-Perdigones A. (2012), la revue PLoS ONE 6 (7): e21622) ou Golden Gate. La méthode Golden Gate est décrite dans le document WO 2008/095927 ainsi que l'article d'Engler et al. PLoS ONE 4 (2009) e5553. Cette méthode est compatible avec de nombreux outils moléculaires (plasmides) commercialement disponibles et repose sur l'utilisation 5 d'un type d'enzyme de restriction disponible chez de nombreux fournisseurs. Les utilisateurs de cette méthode ne sont donc pas captifs d'une gamme de produit dédiés. Le revers de cette versatilité est le travail à réaliser pour vérifier que tous les éléments des constructions souhaitées soient compatibles avec la méthode. Autrement dit, ils doivent être naturellement dépourvus de site de restriction d'enzymes de type Ils, ou être modifiés pour éliminer les sites potentiellement présents, 10 Pour fabriquer un vecteur selon les besoins, un squelette plasmidique 'modulaire' a été développé par la société Oxford Genetics (http://oxfordgenetics.com/). Ce squelette, baptisé SnapFast ®, contient des sites de restriction introduits dans la séquence de sorte à flanquer les composants fonctionnels du plasmide. Ainsi, chaque composant peut être remplacé par un autre de la même catégorie (ex : promoteur, étiquette) en appliquant la méthode de restriction-ligation pour chaque modification souhaitée par 15 l'expérimentateur. Cependant cette technique nécessite une relativement grande quantité d'ADN. Même si le système SnapFast® est probablement l'outil de biologie moléculaire qui propose aux utilisateurs la plus grande marge de manoeuvre concernant le contrôle des fonctionnalités du vecteur d'arrivée, des défauts subsistent. Cette alternative présente les inconvénients inhérents à l'usage des enzymes de restriction multiples (ex : présence éventuelle des sites dans les séquences d'intérêt, cicatrices 20 nucléotidiques) et un coût de prestation élevé. Autre limitation, la modularité demeure restreinte aux substitutions rendues possibles par le squelette défini de ce vecteur. D'autres approches ont été développées pour surmonter cette limitation. Il s'agit notamment de clonage basé sur l'activité recombinase. Cette technique réduit les problèmes provenant de la présence de plusieurs sites de restriction dans les grandes constructions, mais est limitée par le fait que les sites de 25 recombinaison sont laissés dans le produit d'assemblage final, ce qui empêche l'assemblage sans soudure de séquences codant pour des protéines (Weber E. (201 1), PLoS ONE 6 (2): e16765 et EP2395087). De plus, seuls un petit nombre de fragments peuvent être assemblés dans une construction selon cette méthode. En outre, le contrôle total de la composition du vecteur final (séquence d'intérêt et modules fonctionnels) n'est pas atteint. 30 La technologie de synthèse de gène le permettrait. Cependant cette technologie nécessite de son utilisateur qu'il effectue le design complet de son vecteur avant sa préparation, la moindre erreur étant 3032447 4 synonyme de perte totale et irréversible de l'investissement. De plus, cette fabrication à façon est très coûteuse et un processus long. Le document US 2014 0038240 décrit un procédé d'assemblage réalisé en plusieurs étapes successives. Cette méthode nécessite l'utilisation soit d'une agrafe d'ADN simple brin soit d'un adaptateur. 5 Les inconvénients liés aux agrafes sont qu'elles peuvent adopter une structure secondaire, s'auto apparier ou encore être masquées par des protéines. Cela peut entrainer des difficultés d'assemblage et des rendements faibles. Selon un autre mode de réalisation, le document US2014 0038240 décrit un procédé d'assemblage réalisé à l'aide d'un adaptateur. Ce mode de réalisation requiert l'utilisation de plusieurs enzymes de restriction pour générer des extrémités simple brin 10 De manière générale, toutes les techniques de clonage par recombinaison laissent des séquences qui ne sont pas voulues dans le vecteur final, qui sont les séquences utilisées pour la recombinaison. Aucune des méthodes ou technologie existantes ne permet aux utilisateurs de générer facilement, (en une seule étape) à faible coût (en présence d'une seule enzyme) et en peu de temps, des vecteurs 15 d'expression entièrement modulaires à façon. Il existe donc un réel besoin de proposer une méthode permettant d'assembler des molécules d'ADN complexes et d'obtenir facilement, avec un bon rendement, et sans erreur, une construction que l'on aura choisie entièrement, c'est-à-dire dont on pourra contrôler la nature et le nombre des composants, en particulier de composants fonctionnels. 20 Il est donc nécessaire de mettre au point un nouveau procédé permettant de résoudre tous ces problèmes qui soit plus efficace, moins coûteux, et plus rapide. La présente invention propose de résoudre ces problèmes. 25 EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention porte sur un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin comportant au moins deux séquences d'intérêt, comprenant : a) une étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de 30 l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction, la dite seule enzyme de restriction étant une enzyme de restriction de type Ils, chaque brique moléculaire étant une molécule d'ADN linéaire double brin, et contenant : 3032447 5 (I) une séquence d'intérêt dépourvue de site de reconnaissance spécifique de fa sus-dite enzyme de restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une unité non fonctionnelle, et comprenant au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, 5 (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin, flanqués en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, laquelle contient un seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en amont de la dite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de 10 l'adaptateur en aval de la dite séquence spécifique étant convergents, laquelle étape conduisant : - à l'élimination par coupure des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée, - la formation d'une suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités de la dite séquence d'intérêt, 15 ladite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont d'une des au moins deux séquences d'intérêt étant complémentaire à la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval d'une autre séquence d'intérêt, ladite étape du procédé selon l'invention conduisant : -à l'appariement par complémentarité nucléotidique des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 20 2 nucléotides et - au positionnement des séquences d'intérêt, de façon contigüe les unes aux autres, selon un ordre et un sens unique et déterminé, ledit procédé comprenant en outre, b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides, 25 pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention porte sur un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin comportant au moins deux séquences d'intérêt, comprenant : a) une étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de 30 l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction, la dite seule enzyme de restriction étant une enzyme de restriction de type Ils, 3032447 6 chaque brique moléculaire étant une molécule d'ADN linéaire double brin à extrémités non cohésives, et contenant : (I) une séquence d'intérêt dépourvue de site de reconnaissance spécifique de la sus-dite enzyme de restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une 5 unité non fonctionnelle, et comprenant au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin, flanqués en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, laquelle contient un seul et unique site de reconnaissance de la sus dite enzyme de restriction de type Ils, 10 le site de reconnaissance de la sus dite enzyme de restriction de type ils de l'adaptateur en amont de la dite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de la sus dite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en aval de la dite séquence spécifique étant convergents, laquelle étape conduisant : - à l'élimination par coupure des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type ils utilisée, 15 - la formation d'une suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités de la dite séquence d'intérêt, la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont d'une des au moins deux séquence d'intérêt étant complémentaire à la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval d'une autre séquence d'intérêt, 20 -à l'appariement par complémentarité nucléotidique des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides et - au positionnement des séquences d'intérêt, de façon contigüe les unes aux autres, selon un ordre et un sens unique et déterminé, b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides, 25 pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. Le procédé selon l'invention ne requiert l'utilisation que d'une seule enzyme de restriction, qui est une enzyme de restriction de type Ils. Selon un aspect particulier de l'invention, les vecteurs selon l'invention, obtenus en particulier selon le 30 procédé de l'invention, sont dépourvus de sites de clonage multiples. 3032447 7 Les conventions selon lesquelles un ADN double brin est lu de 5' en 3' sont respectées dans la présente invention. L'invention décrite permet d'abolir totalement l'usage des enzymes de restriction classiques dans la 5 fabrication de vecteurs et donc de l'ensemble de leurs inconvénients. Il en résulte un temps de réalisation des vecteurs beaucoup plus courts et une diminution dramatique des risques d'erreurs. Le coût de fabrication donc devrait être fortement réduit ; la constitution et le maintien d'un stock d'enzymes de restriction variées dans chaque laboratoire devenant aussi moins nécessaire. 10 On entend par enzyme de restriction classique une enzyme de restriction de type llp. L'invention permet de s'affranchir d'utiliser des vecteurs d'arrivée pour les techniques de sous-clonage. Cela veut dire qu'il n'est plus besoin d'acquérir ou d'entretenir une collection de multiples vecteurs pour procéder à des activités de sous-clonages. Cela représente une économie en temps (culture bactérienne 15 et purification de plasmides) conséquente. Par ailleurs, la méthode selon l'invention permet de concevoir des vecteurs comprenant des cassettes d'expression multiples. Dans un contexte de modification génétique de cellules ou d'organisme cela permet aux utilisateurs de n'utiliser qu'un seul vecteur, et donc une seule étape de sélection pour 20 transférer plusieurs gènes d'intérêt simultanément dans leur système d'intérêt. L'invention permet aussi de restreindre le contenu des vecteurs aux seules séquences d'intérêt choisies par le demandeur. Il n'y a aucune séquence plasmidique résiduelle, ou cicatrice nucléotidique, due à l'utilisation des enzymes de restrictions classiques et à la nécessité d'utiliser des sites de clonage multiples. 25 L'invention permet donc aux utilisateurs d'exercer un contrôle total sur les composants du vecteur produit. L'invention est appropriée pour générer des gènes chimères par appariements combinatoires, et est tout à fait compatible avec des applications basée sur ces approches (ex : étiquetage intramoléculaire ou analyse de promoteur). Dans ces contextes, l'invention permet la création simultanée de nombreux 30 vecteurs d'expression différents en une seule étape. Elle permet donc de produire rapidement (en 3032447 8 parallèle) une gamme de vecteur se différenciant par l'un ou l'autres des composants choisis (ex : gène de résistance, marqueur moléculaire), sans modifier l'ensemble de l'architecture du vecteur. Pour l'ensemble de ces raisons, l'invention décrite constitue une méthode techniquement et 5 économiquement attractive comparée aux méthodes les plus performantes connues. On entend par vecteur selon l'invention, une molécule d'ADN comportant des informations génétiques, susceptible de transmettre lesdites informations génétiques. Un vecteur peut également être une molécule d'origine plasmidique, ou un plasmide, modifié par génie génétique et destiné à transférer des 10 séquences d'ADN dans une cellule ou un organisme de choix. Selon l'invention, un plasmide est une molécule d'ADN, distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome. Les plasmides sont généralement circulaires et bicaténaires (d'ADN double brin). 15 Une molécule d'origine plasmidique selon l'invention est une molécule constituée au moins en partie d'acide nucléique provenant d'un plasmide. On entend par vecteur d'expression tout vecteur utilisé pour comprendre, et/ou permettre l'expression de l'information génétique d'un gène dans une cellule ou un organisme de choix. 20 Selon l'invention, la fonctionnalité de chaque vecteur est définie selon la combinaison des fonctions basiques portées par le ou les module(s) constituant le vecteur et/ou l'utilisation qui en est faite. En général on entend par séquence d'intérêt une séquence d'acides nucléiques que l'expérimentateur 25 souhaite utiliser et/ou assembler à une autre séquence d'intérêt. On entend aussi par séquence d'intérêt selon l'invention, une séquence d'acides nucléiques qui contient l'information génétique correspondant à une ou plusieurs unités fonctionelles. 30 Selon l'invention, une unité fonctionnelle (bactérienne, d'expression, d'intégration) en général, comprend un ensemble de modules (au moins un module) nécessaires à une fonction décrite. Une unité fonctionnelle selon l'invention se suffit à elle-même pour conférer une fonction biologique au vecteur. 3032447 9 Selon l'invention, une unité fonctionnelle comprend au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel. 5 En général, on entend par module fonctionnel une séquence d'acides nucléiques qui confère une fonction au vecteur en participant à la fonction d'une Unité fonctionnelle. Un module fonctionnel est une entité physique, représentée par une séquence qui participe, en combinaison avec d'autres modules, à la fonction de l'unité. 10 Selon l'invention, un module fonctionnel est une séquence qui contient une information génétique nécessaire et suffisante à la réalisation d'une fonction basique impliquée dans la fonctionnalité du vecteur d'expression, en particulier une origine de réplication, un promoteur, un terminateur, une séquence de recombinaison, une séquence codante ou non codante, une séquence régulatrice de traduction, etc... 15 Un module non fonctionnel selon l'invention n'a pas de fonction dans un contexte (dans une cellule hôte particulière par exemple) déterminé, mais peut en avoir s'il est combiné à d'autres modules fonctionnels ou non fonctionnels ou s'il est utilisé dans un contexte approprié. Par exemple, dans une unité d'expression (ou cassette d'expression) fonctionnelle, les modules minimum 20 nécessaires sont un promoteur, une séquence codant un produit d'expression et un terminateur. D'autres modules peuvent intervenir dans cette unité afin d'en modifier la fonction. Les modules ont donc des fonctions singulières et définies qui, par combinaison produisent les fonctions biologiques des unités. 25 Un vecteur d'expression peut contenir plusieurs unités, dont au moins une unité fonctionnelle bactérienne et une unité fonctionnelle d'expression. On entend par brique moléculaire une séquence d'ADN double brin linéaire. Selon un mode de réalisation 30 avantageux, une brique moléculaire est une séquence d'ADN double brin linéaire ayant un nucléotide (Adénine) débordant en 3' sur chacun des deux brins d'ADN. Selon un mode de réalisation plus avantageux, une brique moléculaire est une séquence d'ADN double brin linéaire à bout franc. 3032447 10 Une brique moléculaire selon l'invention est composée d'une séquence d'intérêt flanquée de part et d'autre d'un adaptateur. 5 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une brique moléculaire comprenant une séquence d'intérêt flanquée de part et d'autre d'une suture monobrin. Selon l'information contenue dans la séquence d'intérêt, une brique moléculaire utilisée dans l'assemblage selon l'invention apporte une ou plusieurs fonctions au vecteur final, par exemple ; 10 Plusieurs unités fonctionnelles Une unité fonctionnelle Une unité non fonctionnelle Un module fonctionnel Un module non fonctionnel 15 On entend par enzyme de restriction, une protéine pouvant se lier à, et couper un acide nucléique. En général, les enzymes de restriction de type Ils sont des enzymes qui se lient de façon spécifique à L'ADN double brin, au niveau d'un site de reconnaissance non palindromique, donc orienté, et clivent les deux brins de l'ADN double brin à une distance fixe du site de reconnaissance. Le site de reconnaissance et le 20 site de clivage sont donc différents. Par convention, fe site d'une enzyme de type Ils est orienté de sorte que son site de coupure soit situé après son site de reconnaissance. 25 Selon l'invention, une enzyme de type Ils se lie à l'ADN et coupe en aval du site de liaison. La longueur de l'extrémité cohésive générée -ou la distance entre le site de reconnaissance de l'enzyme de type Ils et le site de clivage- dépend de ['enzyme de type Ils utilisée. 30 Les nucléotides du site de clivage ne faisant pas partie du site de reconnaissance, ils peuvent être choisis parmi les 4 nucléotides qui composent l'ADN. 3032447 11 L'enzyme de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention est choisie parmi l'une quelconque des enzymes de type Ils référencées dans http://rebase.neb.com/rebaseirebase.htnni. 5 Avantageusement, des enzymes de type Ils ayant un site de reconnaissance à une distance de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucléotides du site de clivage de l'un des brins d'ADN telles que décrites dans (Lippow et al, 2009, Nucleic Acides Res, 37:. 3061-3073) sont utilisées. Le site de clivage, selon l'invention, étant défini comme la séquence comprise entre les coupures réalisées sur chacun des deux brins d'ADN. 10 Selon l'invention, les séquences d'intérêt sont entièrement définies et ne contiennent aucun site de restriction (site de reconnaissance) reconnu par l'enzyme de type Ils utilisée dans l'étape (a) du procédé selon l'invention. 15 Selon l'invention, on entend par sites convergents, des sites permettant à l'enzyme de type Ils de générer une suture monobrin en amont et en aval de la séquence d'intérêt. Selon un mode de réalisation avantageux, on entend par sites de reconnaissance de l'enzyme de type Ils convergents, deux sites de reconnaissance de l'enzyme de type Ils convergents et localisés sur l'un et 20 l'autre des deux brins complémentaires d'ADN de telle façon que l'enzyme de type Ils se lie de part et d'autre de l'ADN et coupe l'ADN en amont et en aval (voir figure 1) pour générer une extrémité simple brin en amont et en aval. On entend par adaptateur selon l'invention une séquence d'ADN d'au moins 8 nucléotides ou plus, en 25 particulier de 8 à 100 nucléotides, de préférence 12 nucléotides, flanquant de part et d'autre une séquence d'intérêt dans une brique moléculaire. Un adaptateur contient au moins : une séquence de 5,6, 7 ou plus nucléotides correspondant au site de fixation de l'enzyme à activité 30 de type Ils utilisée pour l'assemblage selon l'invention, 3032447 12 une séquence de 1 à 8 et plus nucléotides correspondant à l'espacement entre le site de fixation et le site de coupure de l'enzyme utilisée. La longueur de cette séquence dépend des caractéristiques intrinsèques de l'enzyme de type Ils utilisée, Une séquence de 2 à 5 ou plus nucléotides correspondant à l'extrémité simple brin générée par 5 l'action de l'enzyme de type Ils utilisée. Cette séquence permettant l'appariement des fragments à assembler, elle correspond de facto à la définition de suture. Selon l'invention, les adaptateurs contiennent un seul site de restriction (site de reconnaissance) reconnu par l'enzyme de type Ils utilisée dans l'étape (a) du procédé selon l'invention. 10 On entend par suture une séquence simple brin (ou monobrin) de 2 à 5 ou plus, nucléotides. Selon l'invention, une suture est une séquence de 2 à 5 ou plus, nucléotides correspondant à l'extrémité simple brin générée par l'action de l'enzyme de type Ils utilisée pour l'assemblage, la dite séquence simple 15 brin étant générée en amont et aval de la séquence d'intérêt. Cette séquence de 2 à 5 ou plus, nucléotides, appariée à sa séquence complémentaire, est présente dans les adaptateurs, et donc dans les briques moléculaires, ainsi que dans le produit de réaction final (le vecteur). 20 Complémentaire ou complémentarité signifie que 100%, de deux séquences s'apparie. Selon l'invention, 100% de la séquence de la suture monobrin en aval de la brique n-1 s'apparie avec 100% de la séquence de la suture monobrin en amont de la brique n et les sutures sont donc complémentaires. 25 L'appariement des deux séquences de sutures monobrins va constituer une suture double brin. On entend aussi par suture selon l'invention, une séquence monobrin en aval de la brique n-1 appariée à la séquence monobrin en amont de la brique n. 30 Selon l'invention, une suture est une séquence d'ADN double brin dans le vecteur obtenu par le procédé. 3032447 13 La séquence des sutures générées au cours de l'invention est entièrement définie pour permettre d'une part le bon ordonnancement des séquences d'intérêt lors de l'assemblage et leur fonctionnement et d'autre part un rendement optimum. Par conséquent, la séquence des sutures générées est une caractéristique de chaque brique moléculaire (choix intra-brique de la séquence des sutures) et dépend 5 également de l'ordre dans lequel chacune des briques moléculaires sont agencées les unes aux autres (choix inter-brique de la séquence des sutures). Les sutures ne sont pas des cicatrices, en particulier des cicatrices introduisant des dysfonctionnements dans le vecteur. 10 Selon l'invention, les sutures font donc partie intégrante de chacune des briques moléculaires et peuvent, en outre entièrement ou partiellement faire partie de l'information génétique constitutive d'un module fonctionnel. 15 Les sutures sont choisies de façon raisonnée, avec une assistance informatique, pour assurer le bon ordonnancement des séquences d'intérêt lors de l'assemblage et un rendement optimum. Selon l'invention, la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprend une séquence choisie parmi « ilz combinaisons possibles 20 excluant les z * z combinaisons qui résultent en un palindrome d'ADN dans laquelle z est compris de 2 à 10 et z est le nombre de nucléotides de la suture mono brin ». Le procédé selon l'invention comprend une réaction enzymatique combinant l'action d'une enzyme de restriction de type Ils définie selon l'invention et d'une ligase définie selon l'invention. Selon un mode de 25 réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé d'assemblage. Le produit de la réaction est une molécule d'ADN, de préférence circulaire contenant le nombre d'exemplaires de chaque brique moléculaire voulu, assemblés de façon ordonnée, sur la base des complémentarités des sutures. Le bon ordonnancement des briques assure de facto le bon ordonnancement des modules quel que soit le nombre de modules contenus dans chaque brique. 30 Selon un mode avantageux de réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé d'assemblage sans cicatrice. 3032447 14 Selon un mode de réalisation, l'adaptateur selon l'invention comprend au moins un autre site de reconnaissance d'une enzyme de type lis, ledit site est reconnu par une enzyme de type Ils différente de celle utilisée dans le procédé selon l'invention et n'est pas reconnu par l'enzyme de type II s utilisée dans 5 le procédé selon l'invention. Selon un mode avantageux, l'adaptateur selon l'invention comprend, en outre, au moins un site de restriction, et plus avantageusement au moins un site de restriction choisi parmi les sites rares de restrictions, et plus avantageusement encore, un site de restriction parmi les sites rares de restrictions 10 choisis parmi Notl, Pad, Pmel, Swal, Smil, Sgsl, SgrDI, SgrAl, Sbfl, Fsel, Ascl, AsiSI, Mrel, Mssl. Dans tous les modes de réalisation selon l'invention, le site de reconnaissance de l'enzyme de type Ils qui est utilisée dans le procédé selon l'invention, présent, dans chaque adaptateur, consiste en un site unique et se localise uniquement dans les adaptateurs, les séquences d'intérêt selon l'invention n'en comprenant 15 aucun. Le procédé selon l'invention ne met en oeuvre qu'une seule enzyme de type Ils; la dite enzyme de type Ils reconnaissant une séquence d'ADN, en particulier une séquence d'ADN unique. 20 L'invention ne saurait se limiter à une seule enzyme de type Ils reconnaissant une séquence unique. Toute enzyme de type Ils présentant l'activité de restriction voulue, c'est-à-dire pouvant se lier à la dite séquence unique et générer les séquences d'ADN monobrin attendues, fait partie de la présente invention. 25 De même, toute séquence présentant une variation n'affectant pas ou peu la reconnaissance et /ou l'activité de l'enzyme de type Ils fait partie de l'invention. Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des 30 briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO : 36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37), hFUT3 Bsa I A (SEQ ID NO : 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), et shRNA B3GALT6 A (SEQ ID NO: 40), pour obtenir le vecteur V1 (SEQ ID NO : 41). 3032447 15 Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO :36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37), hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 5 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO : 39), shRNA B3GALT6 BSA IB (SEQ ID NO : 46) , et hygroR Bsal A (SEQ ID NO : 47), pour obtenir le vecteur V1.1 (SEQ ID NO : 48). Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des 10 briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), rosa265' Bsal A (SEQ ID NO: 49), pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50), hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO: 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), hygroR Mal B (SEQ ID NO: 51), et rosa263' USAI A (SEQ ID NO: 52), pour obtenir le vecteur V1.2 (SEQ ID NO : 53). 15 Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), rosa265' Bsal A (SEQ ID NO: 49), pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50), hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO: 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), shRNA I33GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51), rosa263' BSAI B (SEQ ID NO: 54), pEE1a Bsa I A (SEQ ID NO: 55), TK Bsal A 20 (SED ID NO: 56), et Tkter Bsa I A (SED ID NO: 57), pour obtenir le vecteur V1.3 (SEQ ID NO : 58). Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37), TO3G Bsal A (SED ID NO: 25 59), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), pTRE3G Bsa I A (SED ID NO: 60), mb3BALT6 Usa I A (SED 1D NO: 61), et Tkter Bsa I A (SEQ ID NO: 57), pour obtenir le vecteur V2 (SEQ ID NO: 62). Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin tel que défini précédemment comprenant une étape de mise en contact simultanée des 30 briques moléculaires OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37),TO3G Bsal A (SEQ ID NO: 59), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39),pTRE3G Bsa I A (SEQ ID NO: 60), mb3BALT6 Bsa I B (SEQ ID NO:63),Tkter Bsa I B (SEQ ID NO:64), et shRNA B3GALT6 C (SEQ ID NO:65), pour obtenir le vecteur V3 (SEQ ID NO : 66). 3032447 16 Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'AND double brin tel que défini précédemment pour obtenir un vecteur choisi parmi le groupe de vecteurs de séquence SEQ ID NO : 30, 31, 32, 33, 34 et 35. 5 Selon un aspect particulier, la présente invention porte sur un procédé tel que celui décrit ci-dessus comprenant : a) une étape de mise en contact simultanée de n briques moléculaires, chaque brique moléculaire étant une molécule d'ADN linéaire double brin, en particulier une molécule d'ADN linéaire double 10 brin à extrémités non cohésives, et contenant : (i) Une séquence d'intérêt (S0i dépourvue de site de reconnaissance spécifique de la susdite enzyme de restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une unité non fonctionnelle, la dite unité fonctionnelle comprenant au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, et (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin A(i-1,i) et A(i,i+1), 15 différents l'un de l'autre, flanqués respectivement en amont et en aval de ladite séquence d'intérêt (SI)i, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, - la séquence d'au moins 12 nucléotides de l'adaptateur d'ADN double brin A(i-1,i) contenant un 20 seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, et une suture d'au moins 2 nucléotides, s(i-1, i) en aval du site de reconnaissance de la dite enzyme de restriction de type Ils, la séquence d'au moins 12 nucléotides de l'adaptateur d'ADN double brin A(i,i+1) contenant 25 ^ un seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, et ^ une suture d'au moins 2 nucléotides, s(i,i+1), en amont du site de reconnaissance de ladite enzyme de restriction de type Ils, le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur d'ADN double brin 30 A(i-1,i) en amont de ladite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur d'ADN double brin A(i,11-1) en aval de la dite séquence spécifique étant convergents, 3032447 17 (S1)1 étant la séquence d'intérêt (SI)i dans laquelle i=1 (SI)n étant la séquence d'intérêt (SI)i dans laquelle i=n n étant un nombre entier allant de 2 à 100, i allant de 1 à n, i étant différent de n quand i=1 et quand i=n alors i+1 est 1 5 et lorsque i=1, alors i-1 =n, de sorte que la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont de (SI)1, si-1, est la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval de (51)n, sn +1, et lorsque i=n alors la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval de (SI)n, sn+1, est la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en 10 amont de (SI)1, si-1, laquelle étape conduit : - à l'élimination des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée, - à la formation d'une extrémité cohésive constituée par une suture monobrin d'au moins 2 nucléotides, à chacune des extrémités amont et aval de chacune des (SI)i et 15 - à l'appariement par complémentarité nucléotidique de la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de (SI)i avec la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont de la (SI)i+1, et de la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont de la (SI)i avec la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de (S1)1-1 - et au positionnement des susdites (SI)i de façon contigüe les unes aux autres, selon un ordre et un sens 20 unique et déterminé, b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. 25 Selon l'invention, le site de reconnaissance de l'enzyme de type Ils de l'adaptateur en aval de la SI, est localisé et orienté de sorte que l'enzyme coupe l'ADN de telle façon que le site de reconnaissance est éliminé, et une suture monobrin est générée (figure 1). Selon l'invention le procédé est mis en oeuvre en présence d'une ligase. 30 On entend par ligase, une enzyme de la classe des ligases (EC6) qui lie les brins d'acides nucléiques, en particulier les ADN ligase (EC 6.5.1.1). Une ligase selon l'invention lie des extrémités d'ADN, 3032447 18 d'oligonucléotides, d'ARN et d'hybride ARN-ADN. De préférence, une ligase selon l'invention lie des molécules d'acides nucléiques à extrémités cohésives. La ligase utilisée dans le procédé selon l'invention est une ligase choisie parmi une ligase T3, T4 T7 ou Taq 5 ligase, préférentiellement une ligase T3 et plus préférentiellement une ligase T7 (T7 DNA ligase) et encore plus avantageusement, une T4 ligase. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention est un procédé dans lequel l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, en 10 présence d'une seule enzyme de restriction de type Ils, est effectuée à une température allant de 20°C à une température de 55°C, pendant une période allant de 2 minutes à une période de 30 minutes, l'étape (b) de ligation est effectuée à une température allant de 10°C à une température de 40°C pendant une période allant de 2 min à un période de 30 min, (a) et (b) pouvant être répétées de 1 à 49 fois, 15 le dit procédé comprenant en outre, (c) au moins une étape d'incubation à une température de 41 à 60°C pendant une période allant de 0.5 à 15 min et (d) une étape d'incubation à une température de 61 à 90°C pendant une période allant de 0.5 à 15 minutes. 20 Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé dans lequel l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction de type Ils, est effectuée à une température allant de 20°C à une température de 55°C, pendant une période allant de 2 minutes à une période de 30 minutes, l'étape 25 (b) de ligation s'effectue à une température supérieure à 40°C en présence de TAq Ligase. Selon ce mode de réalisation particulier, l'étape (b) de ligation s'effectue à une température inférieure à 95°C, de préférence inférieure à 65 °C. L'étape (b) de ligation est effectuée pendant une période allant de 2 min à un période de 30 min, et (b) pouvant être répétées de 1 à 49 fois, 30 le dit procédé comprenant en outre, (c) au moins une étape d'incubation à une température de 41 à 60°C pendant une période allant de 0.5 à 15 min et 3032447 19 (d) une étape d'incubation à une température de 61 à 90°C pendant une période allant de 0.5 à 15 minutes. Selon un autre mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin selon l'invention est un procédé dans lequel l'une des au moins deux SI comprend au moins une unité non 5 fonctionnelle. Selon un autre mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé comportant au moins deux séquences d'intérêt dans lequel lesdites au moins deux séquences d'intérêt sont constituées d'une unité non fonctionnelle et dans lequel le positionnement 10 desdites séquences d'intérêt de façon contigüe les unes aux autres conduit à une entité fonctionnelle d'ADN double brin. Selon un mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin dans lequel l'une des au moins deux SI 15 comprend au moins une unité fonctionnelle. Selon l'invention une unité fonctionnelle peut être une unité fonctionnelle d'expression ou un gène, une unité fonctionnelle d'intégration en cellule eucaryote, une unité fonctionnelle bactérienne. 20 Selon l'invention une unité fonctionnelle d'expression ou un gène comprend une séquence codante et des éléments non codants tels qu'un promoteur, un terminateur, chacun pouvant être considéré individuellement comme un module fonctionnel. Un gène selon l'invention est une séquence d'acide désoxyribonucléique (ADN) qui spécifie la synthèse 25 d'une chaîne de polypeptides ou d'un acide ribonucléique (ARN). On peut également définir un gène comme une unité d'information génétique. Un gène comprend une séquence de nucléotides appelée promoteur, dont le rôle est de permettre l'initiation mais surtout la régulation de la transcription de l'ADN en ARN. Dans le cas d'ARN dit codant, la molécule d'ARN ainsi produite peut être traduite en protéine. La séquence d'ADN correspondant à l'information qui sera traduite en protéine est appelée cadre ouvert de 30 lecture. Un ARN non traduit peut également être fonctionnel (ex : ARN ribosomaux, ARN de transfert, ARN interférant). Un gène peut se terminer par une séquence terminatrice appelée terminateur, qui marque la fin de la transcription. 3032447 20 Selon un mode de réalisation le vecteur selon l'invention permet d'apporter au moins une information génétique à la cellule hôte, en permettant l'expression ou l'inhibition d'au moins un gène, la fabrication ou le blocage d'au moins un ARN, d'au moins une protéine. 5 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel au moins une unité fonctionnelle est une unité fonctionnelle choisie parmi les éléments suivants : (i) une unité fonctionnelle bactérienne, (ii) une unité fonctionnelle d'expression, ou 10 (iii) une unité fonctionnelle d'intégration en cellule eucaryote, (iv) ou une combinaison. Selon l'invention, un vecteur d'expression peut contenir au moins trois éléments fonctionnels, 1. Origine de réplication bactérienne, 2. Un marqueur de sélection bactérien, 3. Une cassette d'expression. 15 Le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin selon l'invention est un procédé dans lequel l'une des au moins deux SI comprend au moins une unité non fonctionnelle. On entend par unité fonctionnelle bactérienne, une unité fonctionnelle comprenant une origine de 20 réplication bactérienne et/ou un marqueur de sélection bactérien. Une origine de réplication selon l'invention peut être d'origine bactérienne ou artificielle (aussi appelée « ori »). C'est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle, en particulier dans une cellule bactérienne. La réplication est le processus au cours duquel 25 l'ADN est synthétisé grâce à l'ADN polymérase. Ce mécanisme permet d'obtenir, à partir d'une molécule d'ADN, deux molécules d'ADN identiques à la molécule initiale, sauf erreur de l'enzyme. La structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre. Dans l'unité fonctionnelle de réplication bactérienne, l'origine de réplication est d'origine bactérienne. Des exemples d'origine de réplication incorporés ici par référence sont ceux décrits dans la Table 1 page 30 49 de l'article de Wang et al., 2009 (Zhijun Wang a' Li Jin a,b, Zhenghong Yuan c, Grzegorz We'grzyn d, 3032447 21 Alicia We'grzyn. Classification of plasmid vectors using replication origin, selection marker and promoter as criteria. Plasmid, 61 (2009) 47-51). Selon un aspect de l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un 5 procédé dans lequel l'unité fonctionnelle bactérienne contient au moins une origine de réplication bactérienne choisie parmi les éléments figurant dans la publication de Wang et al., 2009 qui est incorporée dans sa totalité, ici par référence. Selon autre un aspect avantageux de l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN 10 double brin est un procédé dans lequel l'unité fonctionnelle bactérienne contient au moins un élément choisi parmi tous les plasmides de la Table 4 de Wang et al., 2009. De préférence les plasmides sont pMB1, pUC, ColE1, p15A, pSC101, R1, RK2, R6K, pA81, pRAS3.1, pTi, pBPS1, pU01, pKH9, pWKS1, pCD1, pMAK3, pBL63.1, pTA1060, p4M, pHT926, pCD6, piB01, pIME300, pMD5057, pTE44, pDP1, ou pT38. 15 Un marqueur de sélection selon l'invention est un gène dont l'expression confère à son hôte une propriété mesurable comme par exemple la capacité à fabriquer un pigment ou à résister à un antibiotique. Un marqueur de sélection bactérien est un gène dont l'expression confère à des bactéries transformées (qui ont incorporé le vecteur permettant l'expression du marqueur d'intérêt) une propriété mesurable. 20 Un marqueur de sélection bactérien permet par exemple de sélectionner des bactéries selon un crible défini. Il peut s'agir d'un gène de résistance à un antibiotique, d'un gène permettant la complémentation d'une auxotrophie, d'un gène codant l'expression d'une molécule détectable optiquement (colorant, marqueur chimio-luminescent, fluorochrome) ou de tout autre gène dont le produit permettrait de 25 discriminer les colonies bactériennes. Par définition, un marqueur de sélection bactérien est donc par exemple un gène de résistance à un antibiotique, ou un gène de criblage. 30 Selon encore un autre aspect de l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'unité fonctionnelle bactérienne comporte au moins un module 3032447 22 fonctionnel, le module fonctionnel étant un marqueur, en particulier un marqueur de sélection, et de préférence un marquer de sélection qui est un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de criblage. Des exemples de marqueurs de sélection bactériens sont des gènes codant des éléments permettant 5 une résistance à un antibiotique tels que: - gène bia (AmpR) permettant la résistance à l'ampicilline, - gène neo permettant la résistance à la néomycine, - gène aph (kanR) permettant la résistance à la kanamycine, - gène cat permettant la résistance au chloramphénicol, 10 gène aadA7 permettant la résistance à la spectinomycine, gène aacC1 permettant la résistance à la gentamicine, - gène tetA permettant la résistance à la tétracycline, - gène erm permettant la résistance à l'érythromycin, - gène van permettant la résistance à la Vancomycin 15 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel dans lequel le gène de résistance à un antibiotique est choisi parmi le gène Ampicillin bla, Ampicillin blaA, Ampicillin blaZ, Kanamycin aph, Neomycin neo, Chloramphenicol cat, Chloramphenicol cmlA, Chloramphenicol catAlll, Chloramphenicol catB2, Chloramphenicol cmx, Gentamycin aacC1, 20 Gentamycin aacC2, Tetracycline tetA(A), Tetracycline tetA(C), Tetracycline tetA(D), Tetracycline tetA(E), Tetracycline tetA(G), Tetracycline tetA(H), Tetracycline tetA(_), Tetracycline tetA(Q), Tetracycline tetA(S), Tetracycline tetA(Y)Tetracycline tetA(Z), Erythromycin erm, Vancomycin van, Spectinomycin aadA7, Streptomycin str. (Table 2, Wang et al., 2009). 25 De préférence, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel le gène de résistance à un antibiotique est choisi parmi les gènes permettant une résistance à l'Ampicilline la kanamycine à la néomycine à la gentamycine à la spectinomycine. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans 30 lequel le gène de criblage est le gène lac Z. 3032447 23 Une unité fonctionnelle d'expression selon le procédé de l'invention est une unité qui comprend au moins un module fonctionnel, ledit module fonctionnel étant constitué par l'un des éléments suivant. (i) une séquence régulatrice de l'expression des gènes ou séquence régulatrice de l'activité des 5 séquences régulatrices des gènes, choisie parmi : un promoteur, un terminateur, une séquence « Internai ribosome entry site » (IRES), (ii) une séquence nucléotidique codant un produit, en particulier une séquence nucléotidique codant un produit d'expression, et plus particulièrement une séquence nucléotidique codant une protéine, 10 (iii) une séquence codant une étiquette moléculaire ou (iv) une combinaison de ces éléments. Selon l'invention, un promoteur, ou séquence promotrice, est une région d'ADN constituante d'un gène et indispensable à la transcription de l'ADN en ARN. Le promoteur est la zone de l'ADN sur laquelle se 15 fixent initialement les facteurs de transcriptions et l'ARN polymérase, avant de démarrer la synthèse de l'ARN. Les séquences promotrices sont en général situées en amont du site de démarrage de la transcription. Les promoteurs utilisés dans le procédé selon l'invention sont constitutifs ou inductibles. Selon l'invention une séquence codante ou cadre de lecture est une séquence d'ADN qui lorsqu'elle est 20 transcrite par une enzyme qui est une ARN polymerase correspond à un ARN, en particulier un ARN messager (ARNm). La dite séquence codante se situe en aval du promoteur et en amont du terminateur dans le sens de lecture de la molécule. L'ARNm transcrit peut aussi correspondre sans être limité à une ou plusieurs phase ouverte de lecture 25 (ARN traductible en peptide ou protéine), à un ou plusieurs ARN non codant (ex : petit ARN interférant, micro-ARN, Arn catalytique). Selon l'invention un terminateur ou terminateur de transcription est une séquence d'ADN qui marque la fin de la transcription d'un ARN par l'enzyme responsable de la transcription. Selon l'invention un 30 terminateur est un terminateur procaryote ou eucaryote. 3032447 24 Selon l'invention une séquence IRES (de l'anglais Internai ribosome entry site), est une séquence qui, dans les cellules eucaryotes, permet le démarrage de la traduction d'un ARN messager de manière interne. Le processus conventionnel de la traduction des ARN m eucaryotes repose sur un mécanisme de balayage par le ribosome à partir de la coiffe située à l'extrémité 5', qui scrute l'ARNm jusqu'au premier codon de 5 démarrage. Les IRES permettent le recrutement direct du ribosome au niveau de ce codon de démarrage, indépendamment de la présence de la coiffe et du mécanisme de balayage. Les IRES sont des régions structurées de I'ARNm qui interagissent directement avec le ribosome ou avec les facteurs d'initiation de la traduction. 10 Selon l'invention une étiquette moléculaire est une séquence d'ADN, en particulier codant un peptide ou une protéine qui sera fusionné à une protéine d'intérêt. La séquence de l'étiquette est insérée, ou assemblée selon l'invention, en phase, en amont -élu premier codon de la protéine d'intérêt ou bien en aval du dernier codon de la protéine d'intérêt, ou à l'intérieur du cadre ouvert de lecture de la protéine d'intérêt. Les propriétés intrinsèques de l'étiquette permettent 15 de visualiser et ou de purifier la protéine d'intérêt soit directement (fluorochrome) soit indirectement (épitope reconnu par un anticorps ou par une autre protéine, activité enzymatique, ). Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'unité fonctionnelle d'expression comprend un module fonctionnel, ledit module fonctionnel ou 20 casette fonctionnelle comprend : un promoteur, une séquence nucléotidique codant une protéine et un terminateur. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'unité fonctionnelle d'expression comprend un module fonctionnel d'expression, ledit module 25 fonctionnel ou casette fonctionnelle comprend: un promoteur, une séquence nucléotidique codant une protéine, une étiquette moléculaire et un terminateur. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'unité fonctionnelle d'expression comprend un module fonctionnel d'expression, ledit module 30 fonctionnel d'expression ou casette fonctionnelle comprend: un promoteur, une séquence nucléotidique codant une protéine, une séquence IRES et un terminateur. 3032447 25 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel au moins un module fonctionnel est un module fonctionnel d'expression contenant une séquence nucléotidique codant une protéine de fusion. 5 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel un module fonctionnel est un promoteur. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel un module fonctionnel est un promoteur et le dit promoteur est un promoteur du cytomégalovirus 10 (CMV), un promoteur EFIa, un promoteur du virus SV40, un promoteur de la béta-actine ou un promoteur de l'ubiquitine C.De préférence, le promoteur selon l'invention est un promoteur choisi parmi les promoteurs décrits table 3 de Wang et al., 2009. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans 15 lequel un module fonctionnel est un gène codant un produit d'expression. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel un module fonctionnel est un gène codant un produit d'expression choisi parmi les gènes référencés dans la base de donnée « Gene » du NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.govigenen et le dit gène codant un produit d'expression est un gène dont la 20 séquence peut appartenir aux espèces, homo sapfens, mus musculus, rattus norvegicus, Danio rerio, Caenorhabditis elegans, Saccharomyces Cerevisiae, Arabidopsis thaliana, drosophila melanogaster, ou à toute autre espèce référencée. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans 25 lequel un module fonctionnel est un terminateur, Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel un module fonctionnel est un terminateur et le dit terminateur est une séquence de polyadénylation. 30 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel au moins module fonctionnel est un marqueur ou étiquette moléculaire choisie parmi la séquence AviTag, Calmodulin-tag, polyglutamate tag, E-tag, FLAG-tag, HA-tag, His-tag, Mc-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 3032447 26 1, Softag 3, Strep-tag, TC tag, V5 tag, VSV-tag, Xpress tag, lsopeptag , SpyTag, BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein), Glutathione-S-transferase-tag, Green fluorescent protein-tag, Maltose binding protein-tag, Nus-tag, Thioredoxin-tag, Fc-tag, Designed lntrinsically Disordered tags containing disorder promoting amino acids (P,E,S,T,A,Q,G,...) and Ty tag. 5 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel au moins un module fonctionnel est un marqueur moléculaire (ou étiquette moéluculaire) ledit marqueur moléculaire étant une protéine d'affinité, choisie parmi la maltose binding protein (MBP), et glutathione-S-transferase (GST), ou la protéine Tandem affinity purification (TAP)-Tag, TAP-Tag, ou une 10 séquence codant une protéine fluorescente, de préférence la GFP ou l'un de ses nombreux variants (BFP, CFP, YFP, mCherry...). Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel au moins une unité fonctionnelle est une unité fonctionnelle d'intégration en cellule eucaryote. 15 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel ladite unité fonctionnelle d'intégration en cellule eucaryote comprend au moins un module fonctionnel comprenant au moins un élément choisi parmi : -un gène de sélection, 20 -une séquence de maintien en cellule eucaryote, -une séquence d'intégration, en particulier une séquence d'intégration homologue -une ou plusieurs séquences impliquées dans l'édition d'ADN et/ou une ou plusieurs séquences impliquées dans la recombinaison homologue ciblée, - ou une combinaison de ces éléments. 25 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel le gène de sélection est un gène de sélection positive ou un gène de sélection négative. Selon un mode avantageux, un gène de sélection est un gène de sélection positive ou un gène de sélection négative et peut dépendre ou non de la présence de substrats externes. 30 Selon l'invention, un gène de sélection positive est un gène qui permet la survie voire la croissance de la cellule ou de l'hôte dont le génome a été génétiquement modifié en présence d'agents normalement 3032447 27 toxiques pour la cellule ou l'hôte (par exemple un antibiotique, un herbicide ou un médicament). Certains gènes de sélection positive ne sont pas conditionnés à des substrats extérieurs, mais modifient des processus physiologiques régissant le développement des cellules (bactéries, champignons, animaux ou plantes le cas échéant). 5 Selon l'invention, un gène de sélection négative provoque la mort des cellules ou de l'hôte génétiquement modifiés dans certaines conditions, contrôlables et connues de l'expérimentateur. Selon l'invention une séquence de maintien en cellule eucaryote est une séquence d'ADN utilisable dans 10 le cas ou le vecteur est destiné à se maintenir dans la descendance cellulaire de la cellule récipiendaire, en absence d'intégration au génome hôte. Il peut s'agir d'origine de réplication propre à l'espèce de la cellule modifiée (exemple séquence Autonomous Replicating Sequence (ARS) pour la levure), de séquence de centromère permettant la ségrégation des molécules d'ADN dupliquées dans chacune des cellules filles. 15 Selon l'invention, une séquence homologue au génome eucaryote est une séquence permettant l'intégration par recombinaison homologue. Le vecteur d'expression peut contenir des séquences d'ADN correspondant à l'ADN génomique de l'organisme ou de la cellule ciblée. Ces séquences sont déterminées expérimentalement et peuvent correspondre à des locus connu pour leur susceptibilité à la recombinaison homologue. 20 Selon l'invention une séquence impliquée dans l'édition d'ADN est une séquence d'ADN spécifiquement reconnue par une recombinase qui permet la modification ciblée de la molécule d'ADN. Par exemple la séquence LoxP1 reconnues par la recombinase Cre, ou la séquence FRT reconnues par la recombinase Flp. 25 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel le gène de sélection et un gène de sélection positive, en particulier un gène de sélection positive en cellule eucaryote. Selon un mode de réalisation, un gène de sélection positive est un gène de résistance aux antibiotiques 30 choisi parmi : les gènes de résistance à l'Hygromycine B ou à ses dérivés, les gènes de résistance au G418 ou à ses dérivés, les gènes de résistance à l'ampicilline ou à ses dérivés , les gènes de résistance à la 3032447 28 tétracycline ou à ses dérivés, les gènes de résistance à la Puromycine ou à ses dérivés, ou les gènes de résistance à la Zéocine ou à ses dérivés. Selon un autre mode de réalisation, un gène de sélection positive en cellule eucaryote est un gène de 5 résistance aux antibiotiques choisi parmi : les gènes de résistance à l'Hygromycine B ou à ses dérivés, les gènes de résistance au G418 ou à ses dérivés, les gènes de résistance à la Puromycine ou à ses dérivés, ou les gènes de résistance à la Zéocine ou à ses dérivés. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans 10 lequel le gène de sélection négative est un gène de sélection négative codant la thymidine kinase dans la levure. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la séquence de maintien en cellule eucaryote est une séquence de réplication autonome 15 (Autonomous Replicating Sequence- ARS) ou une séquence de centromère telle que définie pour la levure. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la séquence d'intégration homologue est un locus Rosa 26 ou un locus hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT). 20 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la séquence impliquée dans l'édition d'ADN et/ou la séquence impliquée dans la recombinaison homologue ciblée est une séquence de 34 nucléotides du bactériophage Pl. « locus of X over P1 » (LoxPl) de séquence générique ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT (SEQ ID NO : 67) dans laquelle N 25 est A, T, G ou C, de préférence une séquence Cre recombinase-LoxP. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la séquence impliquée dans l'édition d'ADN et/ou la séquence impliquée dans la recombinaison homologue ciblée est une séquence FRT Flp-FRT en particulier une séquence 30 .GAAGTTCCTATTCtetagaaaGtATAGGAACTTC (SEQ ID NO : 68). 3032447 29 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'enzyme de restriction de type Ils est une enzyme de restriction de type Ils choisie parmi Bsal, Eco31I, Bbsl, Bpil, BsmBl, Esp3l, BspMl, BfuAl et Bvel. 5 De préférence, la seule enzyme de restriction de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention est Bbsl et plus préférentiellement la seule enzyme de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention est Bsal. Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel l'adaptateur d'ADN double brin en aval ou en amont de la dite séquence d'intérêt, comprend en 10 outre au moins un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ilp, avantageusement au moins un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction rare telles que Non Pacl, Pmel, Swal, Smil, Sgsl, SgrDI, SgrAl, Sbfl, Fsel, Ascl, AsiSI, Mrel, Mssl et plus avantageusement deux sites de reconnaissance d'enzymes de restriction choisis parmi Kpnl et Agel, EcoRl et BstBI, Sall et Mlul. 15 En général, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel les adaptateurs d'ADN double brin en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt comprennent au moins un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type lis dont un seul et unique site de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils présente dans l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, enzyme qui coupe l'ADN des adaptateurs et génère des 20 extrémités simple brin d'au moins deux nucléotides de part et d'autre des SI, (ou l'enzyme de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention à l'étape a). Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé dans lequel les adaptateurs d'ADN double brin en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt ne comprennent aucun 25 site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ils autre que celui de l'enzyme de restriction de type Ils, présente dans l'étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double 30 brin selon l'invention est un procédé dans lequel chaque adaptateur d'ADN double brin en amont et en aval de ladite séquence d'intérêt, ne comprend qu'un seul (et unique) site de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils présente dans l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques 3032447 30 moléculaires, différentes l'une de l'autre, et chaque adaptateur ne comprend aucun autre site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ils. Plus précisément, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin selon l'invention est 5 un procédé dans lequel chaque adaptateur d'ADN double brin en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt, ne comprend qu'un seul (et unique) site de reconnaissance d'une seule enzyme de restriction de type Ils qui est l'enzyme de restriction de type Ils présente dans l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, enzyme qui coupe l'ADN des adaptateurs et génère des extrémités simple brin d'au moins deux nucléotides de part et d'autre des 10 SI ou encore l'enzyme de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin selon l'invention est un procédé dans lequel le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ils présent dans chaque adaptateur consiste en un site unique de reconnaissance de l'enzyme de type 15 Ils utilisée dans le procédé selon l'invention. En particulier, le site unique de reconnaissance de l'enzyme de type Ils utilisé dans le procédé selon l'invention, est un site reconnu par Bbsl et plus préférentiellement par Bsal. 20 Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel les adaptateurs d'ADN double brin en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt comprennent un seul (et unique) site de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils présente dans l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, et au moins un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ils, la dite 25 enzyme de type Ils étant une enzyme, autre que celle présente dans l'étape a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires différentes l'une de l'autre. Selon l'invention, la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprend de 2 à 10 nucléotides, de préférence de 2 à 5 nucléotides, et 30 plus particulièrement 4 nucléotides. 3032447 31 Le procédé selon l'invention est un procédé dans lequel la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprend de 2 à 10 nucléotides, de préférence de 2 à 5 nucléotides, et plus particulièrement 4 nucléotides. 5 Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel les sutures monobrin cohésives d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprennent indépendamment l'une de l'autre, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 nucléotides. 10 Dans le procédé selon l'invention, chaque suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à partir d'une brique moléculaire s'apparie avec une seule suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à partir d'une autre brique moléculaire. Selon encore un autre aspect de l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double 15 brin est un procédé dans lequel la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides ne peut s'apparier qu'avec une seule autre suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides présente dans le mélange réactionnel. Selon l'invention le milieu réactionnel est un milieu dans lequel le procédé selon l'invention est mis en 20 oeuvre. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la suture mono brin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont et en aval de la séquence d'intérêt, est conçue à l'aide d'une matrice de score. 25 Selon l'invention, le procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin est un procédé dans lequel la dite enzyme de restriction de type Ils coupe l'ADN à une distance allant de 2 à 15 nucléotides, 2 à 14, 2 à 13, 2 à 12, 2 à 11, 2 à 10, 2 à 9, 2 à 8, 2 à 7, 2 à 6, 2 à 5, 2 à 4, 2 à 3 nucléotides du site de reconnaissance spécifique de la dite enzyme de type Ils. 30 3032447 32 Avantageusement, la dite enzyme de restriction de type Ils l'un des deux brins d'ADN à une distance de 2 nucléotides, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 nucléotides du site de reconnaissance spécifique de la dite enzyme de type Ils. 5 Selon le procédé de l'invention, la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont n'est pas complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval d'une même brique, la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont de la (SI)1, (si-1), (de la première brique) est complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de la séquence (SI)n, 10 (sn+1) (de la dernière brique). Selon l'invention, le procédé comprend, avant l'étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, une étape de préparation de chacune des briques moléculaires, par synthèse chimique ou par une étape d'amplification par PCR de la séquence d'intérêt contenue dans une brique à 15 l'aide d'une amorce sens comprenant, de 5' en 3', une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur, et au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt et d'une amorce anti-sens comprenant de 5' en 3' au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt et au moins une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur. 20 Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, avant l'étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, une étape de préparation de chacune des briques moléculaires, par synthèse chimique ou par une étape d'amplification par PCR de la séquence d'intérêt contenue dans une brique à l'aide d'une amorce sens comprenant, de 5' en 3', une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur, et au moins 14 à 20 nucléotides de la séquence d'intérêt et d'une amorce anti-sens 25 comprenant de 5' en 3' au moins 14 à 20 nucléotides de la séquence d'intérêt et au moins une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur. Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, avant l'étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, une étape de préparation de chacune des briques moléculaires, par 30 synthèse chimique ou par une étape d'amplification par PCR de la séquence d'intérêt contenue dans une brique à l'aide d'une amorce sens comprenant, de 5' en 3', une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur, et au moins 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucléotides de la séquence d'intérêt et d'une amorce 3032447 33 anti-sens comprenant de 5' en 3' au moins 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucléotides de la séquence d'intérêt et au moins une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur. La PCR est une réaction en chaine par polymérase et permet de reproduire l'ADN en quantité. 5 La présente invention porte également sur un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin comprenant, une étape de préparation de chacune des briques moléculaires, laquelle étape étant constituée par une étape d'amplification par réaction en chaine par polymérase (PCR) d'une séquence d'intérêt contenue dans une brique à l'aide d'une amorce sens comprenant de 5' en 3', au moins une 10 séquence correspondant à un adaptateur et au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt et d'une amorce anti-sens comprenant de 5' en 3' au moins au moins une séquence correspondant à un adaptateur et au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt, une étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction, la dite seule enzyme de restriction étant une enzyme de restriction de type Ils, chaque brique moléculaire 15 étant une molécule d'ADN linéaire double brin à extrémités non cohésives, et contenant : (i) une séquence d'intérêt dépourvue de site de reconnaissance spécifique de la susdite enzyme de restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une unité non fonctionnelle, ladite unité fonctionnelle comprenant au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, 20 (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin, flanqués en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, laquelle contient: un seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en amont 25 de la dite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en aval de la dite séquence d'intérêt étant convergents, laquelle étape conduit : - à l'élimination par coupure des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée, - la formation d'une suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités de 30 ladite séquence d'intérêt, 3032447 34 la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont d'une des au moins deux séquences d'intérêts étant capable de s'apparier à la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval d'une autre séquence d'intérêt, - à l'appariement par complémentarité nucléotidique des susdites sutures monobrins cohésives d'au 5 moins 2 nucléotides et - au positionnement des séquences d'intérêt, de façon contigüe les unes aux autres, selon un ordre et un sens unique et déterminé, b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides, pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. 10 La PCR est une réaction en chaine par polymérase et permet de reproduire l'ADN en quantité. MODES DE REALISATION PARTICULIERS DE L'INVENTION 15 II existe de nombreuses variantes potentielles de l'invention. Plusieurs enzymes de restriction peuvent être utilisées pour réaliser l'assemblage. Cela inclut des enzymes de restriction de type lIS comme Bsal, Bpil, Esp3l, BspMl. En fait n'importe quelle enzyme de type Ils qui possède un site de coupure éloigné de son site de reconnaissance et qui génère une séquence débordante de 2 ou 3 nt ou plus peut être utilisée pour l'assemblage. Selon l'enzyme utilisée les conditions d'incubation pour l'assemblage (tampon, 20 température, temps, nature de la DNA Ligase) sont optimisables. Pour chaque enzyme utilisée dans l'assemblage, une collection de fragments d'ADN et de séquences d'intérêt dépourvus de sites de reconnaissance de cette enzyme est générée. 1. Préparation des briques d'ADN. 25 La préparation de briques d'ADN à partir d'une matrice est faite par la technique de Polymerase Chain Reaction (PCR), en utilisant des amorces oligonucléotidiques soigneusement choisies. La synthèse de gène (synthèse chimique) peut également être utilisée comme méthode alternative d'obtention de brique. Par PCR, les amorces permettent l'amplification du fragment d'ADN par une polymérase à haute-fidélité, afin de limiter au maximum le nombre de mutations qui pourraient être introduites aléatoirement par 30 ['ADN polymérase. D'autre part, ces amorces permettent d'introduire les adaptateurs contenant notamment le(s) site(s) de reconnaissance de l'enzyme de type Ils utilisée pour l'assemblage ainsi que les sutures qui permettront d'obtenir un assemblage orienté. Une brique contiendra donc une séquence 3032447 d'intérêt flanquée de deux adaptateurs (en 5' et 3' de ladite séquence d'intérêt). Les sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée pour l'assemblage, potentiellement présents dans la séquence d'intérêt, sont indésirables et doivent au préalable être éliminés par mutagenèse dirigée ou par tout autre méthode appropriée.. 5 1.1.. Définition des amorces Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour la création de briques, contiennent 2 parties essentielles. 10 En partie 5' ces amorces contiennent la séquence d'un adaptateur. L'adaptateur contient une séquence comprenant : - une séquence de 2 nucléotides minimum, pouvant contenir ou participer à 1 ou plusieurs sites de restriction d'endonucléase de type II , - une séquence de 5, 6, 7 ou plus nucléotides correspondant au site de fixation de l'enzyme à activité 15 de type Ils utilisée pour l'assemblage, - une séquence de 1 à 8 et plus nucléotides correspondant à l'espacement entre le site de fixation et le site de coupure de l'enzyme utilisée. La longueur de cette séquence dépend des caractéristiques intrinsèques de l'enzyme de type Ils utilisée, Une séquence de 2 à 5 ou plus, nucléotides correspondant à l'extrémité simple brin générée par l'action 20 de l'enzyme de type lis utilisée. Cette séquence permettant l'appariement des fragments à assembler, elle correspond de facto à la définition de suture. En partie 3', les amorces contiennent une séquence de 14 à 100 nucléotides correspondant aux extrémités 5' de la séquence d'intérêt, qui permettra l'hybridation des amorces à des zones complémentaires de la 25 matrice et l'amplification de la séquence d'intérêt. Cette séquence est de taille variable mais supérieure ou égale à 14 nt. De plus elle est choisie de manière à i) respecter des Tm (température de fusion) pour deux amorces assez proches et ii) finir l'amorce sur au moins un G ou un C et pas plus de 2 G ou C consécutifs. 3032447 36 On entend par matrice selon l'invention une molécule d'ADN contenant la séquence d'intérêt à amplifier. Il peut s'agir par exemple d'ADN génomique, d'ADN complémentaire obtenu par transcription reverse d'un ARNm ou d'un plasmide. 5 Selon un autre mode de réalisation, des séquences supplémentaires peuvent être insérées entre la séquence de l'adaptateur et la séquence complémentaire de la matrice. Il peut d'agir par exemple de séquence codant des acides aminés supplémentaires qui seront fusionnés au produit protéique codé par la séquence d'intérêt. 10 1.2. : PCR (haute fidélité) avec protocole et contrôle des produits obtenus Chaque module est amplifié avec une ADN polymérase à haute-fidélité. La phusion taq DNA polymérase (Therrno Scientific), est utilisée selon le protocole du fournisseur, mais n'importe quelle DNA polymérase à haute-fidélité pourrait être utilisée. La quantité de matrice utilisée est réduite au minimum (10pg à lng 15 selon la brique). Les produits de PCR sont alors déposés sur un gel d'agarose en Tampon TAE ( Tris 40mM p1-18, Acétate 20mM, EDTA 1mM) et après migration, les morceaux de gel d'agarose contenant les produits de PCR sont découpés et l'ADN en est extrait à l'aide d'un kit (ex : Macherey Nagel PCR and gel cleanup kit °). L'ADN 20 est alors quantifié en utilisant un Nanospectrophotomètre (ex : nanodrop ®) 1.3.Stratégie d'élimination de sites d'enzymes de type Ils (exemple Bsal) potentiellement présents : 25 Pour que ['assemblage des briques puisse être mis en oeuvre, et que le procédé selon l'invention soit effectif, il ne faut pas qu'il y ait de site de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée dans le procédé selon l'invention, (pour l'assemblage) à l'intérieur des séquences d'intérêt. Pour cela la technique de mutagenèse par Golden Gate a été utilisée telle qu'elle a été décrite par Engler et al., 2008 mais n'importe quelle technique de mutagenèse dirigée peut être employée. (Cormack, B. 2001. Directed Mutagenesis 30 Using the Polymerase Chain Reaction. Current Protocols in Molecular Biology. 37:8.5:8.5.1-8.5.10.) Le cas 3032447 37 échéant, les mutations nécessaires sont introduites de sorte à conserver la(les) fonction(s) biologique(s) de la séquence d'intérêt (ex : sites de fixation à l'ADN, structures secondaires, produit d'expression). 1.4 Méthode de choix des sutures 5 Grâce à l'utilisation des adaptateurs selon l'invention, l'assemblage des briques moléculaires peut se faire à la base nucléotidique près. Ce niveau de précision permet d'éliminer toute cicatrice nucléotidique. On entend par cicatrice, tout nucléotide ou groupe de nucléotides dont la présence dans le vecteur final 10 serait rendue obligatoire de par l'utilisation de la technique d'assemblage sans toutefois assurer de fonction au sein du vecteur lui-même. Le choix des sutures est crucial pour favoriser un assemblage correct. Il doit respecter plusieurs critères simples. Tout d'abord une suture ne doit pas être palindromique : en effet une suture palindromique peut 15 se lier avec ou sur elle-même ce qui pourrait conduire à des difficultés d'assemblages, à la formation de dimères de modules liés tête bêche. Selon l'invention, la suture ne doit pas être palindromique (ex : ACGT dont la séquence anti-parallèle ACGT est identique) pour éviter un auto-appariement correspondant à un assemblage de plusieurs exemplaires 20 de la même brique , tête-bêche, pour former des chaînes. On appelle une séquence palindromique une séquence qui se lit de la même manière de 5' vers 3' sur chacun des deux brins d'ADN. 25 Dans le procédé selon l'invention, il ne peut y avoir « d'auto-circularisation » puisque les sutures en 5' et 3' sont choisie pour ne pas être complémentaires entre elles. La séquence anti-parallèle résultant d'un clivage est l'extrémité non cohésive de l'adaptateur libéré. Ensuite le choix d'une suture à une position de l'assemblage élimine la possibilité de l'utiliser à une autre 30 position. Enfin le choix de sutures trop similaires (ne différant que d'une seule paire de base) à deux positions dans un assemblage est évité car pourrait conduire à des assemblages et ligations illégitimes. En effet un appariement partiellement complémentaire (3/4 nucléotides seulement interagissant) ou 3032447 38 'mismatch' ou mésappariement peut être suffisant pour l'activité de certaines DNA ligases et donc conduire à l'apparition de constructions aberrantes. Ce critère diminue la fréquence d'obtention de constructions aberrantes. 5 Afin de respecter ces consignes, un programme simple a été développé qui, en fonction des sutures déjà choisies, élimine des sutures jugées incompatibles. Le programme est basé sur l'utilisation d'une matrice de combinaisons de sutures : pour chacune des 240 combinaisons non palindromiques possibles, un score de compatibilité est calculé avec chacune des 239 autres. Le mode de calcul de ce score est indiqué dans 10 le schéma (figure. 2) : Par conséquent chaque appariement de deux séquences de 4 nucléotides non palindromiques (soit 57 600 combinaisons) se voit attribué un score allant de 0 à 10 où 0 correspond à une absence totale de complémentarité (0%) et 10 indique une complémentarité totale (100%). Complémentarité signifie 15 complémentarités inter-sutures. Ces scores sont intégrés à une matrice illustrée (figure. 3). Pour un vecteur donné, l'ensemble des sutures nécessaire est choisi de sorte à ce que chaque suture ait un score de complémentarité minimale avec chacune des autres sutures nécessaires à l'assemblage. 1.5 Protocole général d'assemblage 20 Afin d'assembler les briques entre elles pour obtenir le vecteur désiré, il faut les mélanger à des ratios équimolaires en présence d'une seule enzyme de restriction de type Ils et d'une ligase. Avantageusement, les briques sont mélangées à des ratios équimolaires en présence d'une seule enzyme 25 de restriction de type Ils et d'une ligase, dans un tampon approprié. La quantité en ng de chaque brique moléculaire est calculée comme suit : Q(ng) = tailie(pb) x 649(rtg.neno1-1.pb-1) x (20 à 100).10-6(.0 et le volume est calculé comme suit : Vu) = Q(ng) / concentrationtre04), 30 Le mélange s'effectue à une température allant de 0 à 6°C, de préférence à 4°C. 3032447 39 Le mélange est ensuite soumis à une température de 37°C pendant une période allant de 30' à 6 heures, pour un nombre de briques moléculaires à assembler inférieur à 5, Le mélange est soumis à des cycles d'incubation de 2' à 37°C puis 3' à 16°C (25 à 50 cycles) si fe nombre de 5 briques moléculaires est supérieur à 4. Le mélange est ensuite incubé à 50°C pendant 5' {coupure des sites d'endonucléase de type Ils subsistants (non coupés) puis à 80°C pendant 5' (inactivation des enzymes). 10 Le mélange réactionnel est ensuite utilisé pour transformer des bactéries compétentes qui sont ensuite sélectionnées. 1.6.Vérifications des constructions 15 Deux niveaux de vérifications peuvent être considérés : 1)- la vérification de la molécule produite en termes de séquence 2)- la vérification du vecteur en termes de fonctionnalité 1)- Parallèlement à l'assemblage in vitro, un assemblage virtuel des fragments est effectué 20 informatiquement pour reconstituer la séquence du vecteur souhaité. Ceci permet l'établissement d'une carte de restriction du vecteur. Afin de vérifier les clones obtenus, les mini préparations d'ADN circulaire sont digérées par une ou plusieurs enzymes choisies de sorte à générer au moins trois fragments de taille distincte. De préférence le choix des enzymes se fait de sorte qu'il y ait au moins un site présent dans chacun des fragments assemblés. L'analyse du profil de restriction après électrophorèse en gel d'agarose 25 permet de vérifier que les fragments ont tous été réassemblés dans l'ordre souhaité. D'autres procédés de vérification des clones obtenus peuvent être envisagés, notamment une vérification par PCR pour vérifier par des mesures de taille de fragments les constructions. De plus l'intégralité du vecteur ou une partie de celui-ci peut être séquencée (Prober JM, Trainor GL, Dam Ri, Hobbs FW, 30 Robertson CW, Zagursky Ri et al. (16 Oct 1987). "A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides". Science 238 (4825): 336-4.). 3032447 2)- Selon les SI intégrées dans les vecteurs selon l'invention, il est possible également de mesurer et ou quantifier directement ou indirectement la fonctionnalité des unités et/ou modules composant le vecteur. Par exemple, l'extraction d'un vecteur à partir d'une culture de bactéries transformées réalisée en 5 présence d'un antibiotique approprié (ex : kanamycine, ampicilline, chlorarnphénicol) ce qui permet de valider la fonctionnalité de modules composant l'unité bactérienne. De même, l'obtention de clones eucaryotes issus d'une sélection effectuée par une drogue appropriée (ex : G418, hygrornycine, puromycine) permet de valider la fonctionnalité de modules composant une unité d'intégration aux cellule eucaryote. Enfin, la présence d'un produit d'expression (mRNA, micro-ARN, long ARN non codant) peut 10 être détectée à partir des ARN totaux extrait de la cellule cible ayant reçu le vecteurs, par PCR ou par toute méthode permettant de mesurer la présence d'ARN dans une cellule comme le RNA-Fish (La nger-Safer PR, Levine M, Ward DC (July 1982). "Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes". Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 79 (14): 4381-5. doi:10.1073/pnas.79.14.4381) ou le SmartFlare (Prigodich, A. E.; Randeria, P. S.; Briley, W. ; Kim, N.; Daniel, W. L.; Giljohann, D. A.; Mirkin, C. 15 A. "Multiplexed Nanoflares: mRNA Detection in Live Cells," Anal. Chem. 2012, 84 , 2062-2066, doi: 10.1021/ac202648w). Le cas échéant l'expression d'un ARN interférant peut être détectée en mesurant la diminution de l'expression (ARNm) du gène endogène ciblé par ledit ARN interférant. Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur sélectionné parmi un vecteur V1, V1.1, V1.2, 20 V1.3, V2 et V3. Avantageusement, l'invention porte sur un vecteur sans site de clonage multiple et sans cicatrice, et encore plus avantageusement un vecteur sans cicatrice et sans site de restriction de l'enzyme de type Ils ayant servi à son assemblage. Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V1, en particulier un vecteur V1 obtenu selon 25 le procédé de l'invention. Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V1.1, en particulier un vecteur V1.1 obtenu selon le procédé de l'invention. 30 Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V1.2, en particulier un vecteur V1.2 obtenu selon le procédé de l'invention. 3032447 41 Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V1.3, en particulier un vecteur V1.3 obtenu selon le procédé de l'invention. Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V2, en particulier un vecteur V2 obtenu selon 5 le procédé de l'invention. Selon un aspect avantageux, l'invention porte sur un vecteur V3, en particulier un vecteur V3 obtenu selon le procédé de l'invention. 10 Un vecteur V1 (SEQ ID NO : 41) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques OA Bsal A (SEQ ID NO : 36), pCMV Bsa I A (SEQ ID NO : 37), hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), et shRNA B3GALT6 A (SEQ ID NO: 40). Un vecteur V1.1 (SEQ ID NO : 48) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques 15 OA Bsal A (SEQ ID NO :36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37), hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO : 39), shRNA B3GALT6 BSA lB (SEQ ID NO : 46) et hygroR Bsal A (SEQ ID NO : 47). Un vecteur V1.2 (SEQ ID NO : 53) ) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), rosa265' Bsal A (SEQ ID NO: 49), pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50), hFUT3 Bsal A 20 (SEQ ID NO: 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51) et rosa263' BSAI A (SEQ ID NO: 52). Un vecteur V1.3 (SED ID NO : 58) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), rosa2651 Bsal A (SEO, ID NO: 49), pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50); hFUT3 Bsal A 25 (SEQ ID NO: 38), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51), rosa263' BSAI B (SEQ ID NO: 54), pEFla Bsa I A (SEQ ID NO: 55), TK Bsal A (SED ID NO: 56) et Tkter Bsa I A (SED ID NO: 57). Un vecteur V2 (SED ID NO : 62) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques 30 OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37), B TO3G Bsal A (SED ID NO: 59), BPA Bsal A 3032447 42 (SEQ ID NO: 39), pTRE3G Bsa 1A (SED ID NO: 60), mb3BALT6 Bsa I A (SED ID NO: 61) et Tkter Bsa IA (SEQ ID NO: 57). Un vecteur V3 (SED ID NO : 66) selon l'invention est construit à partir d'une combinaison des briques OA 5 Bsal A (SEQ ID NO: 36), pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37), TO3G Bsal A (SEQ ID NO: 59), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), pTRE3G Bsa I A (SEQ ID NO: 60), mb3BALT6 Bsa I B (SEQ ID NO:63), Tkter Bsa I B (SEQ ID NO:64) et shRNA B3GALT6 C (SEQ ID NO:65). Un vecteur selon l'invention est un vecteur ayant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 10 41, 48, 53, 58, 62 et 66. Un autre vecteur selon l'Invention est un vecteur ayant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 30, 31, 32, 33, 34 et 35. 15 Les vecteur obtenus selon le procédé de l'invention sont les vecteurs de séquence SEQ ID NO : 30 31 32 33 34 et 35. Selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet un vecteur circulaire d'ADN double brin tel 20 qu' obtenu par mise en oeuvre selon le procédé de l' invention. L' invention a aussi pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant l'expression simultanée de multiples transgènes et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : U1, nxU2a et mxU2b, 25 Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase II et dont le produit d'expression est une protéine, U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant, 30 n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n-l-m.>.2, l'unité Ui pouvant être contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2b; 3032447 43 l'unité Ul étant de préférence contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2b. Ces vecteur constituent un groupe de vecteurs Vl. Ce groupe de vecteurs V1 peut etre préparé selon le procédé de l'invention. 5 Selon encore un autre aspect , l' invention a pour objet un groupe devecteurs V1 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de l' invention. L'invention a également pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant de sélectionner l'intégration des transgènes par recombinaison non homologue dans le 10 génome cible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : U1, nxU2a, mxU2b et U3a, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Il et dont le produit d'expression est une protéine, 15 U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Ill et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n+m.>2, U3a représentant un gène de sélection positive, 20 l'unité U1 pouvant être contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes pouvant être contiguës à U3a; l'unité Ul étant de préférence contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant de préférence contiguës à U3a. Ces vecteur constituent un groupe de vecteurs V1.1. 25 Ce groupe de vecteurs V1.1 peut etre préparé selon le procédé de l' invention. Selon encore un autre aspect , invention a pour objet un groupe devecteurs V1.1 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de I invention. L'invention a également pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple 30 et permettant de sélectionner l'intégration simultanée de multiples de transgènes par recombinaison homologue dans le génome cible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ul, U3b, nxU2a, mxU2b, U3a et U3c, 3032447 44 U1 représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U3b représentant motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Il et dont le produit d'expression est une protéine, 5 U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n+rn_>_2, U3a représentant un gène de sélection positive, 10 U3c représentant motif 3' d'une séquence de recombinaison homologue X, l'unité U1 étant contiguë à U3b, elle-même étant contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant contiguës à l'unité U3a, elle-même étant contiguë à l'unité U3c. Ces vecteur constituent groupe de vecteurs V1.2 Ce groupe de vecteurs V1.2 peut etre préparé selon le procédé de l' invention. 15 Selon encore un autre aspect, invention a pour objet un groupe devecteurs V1.2 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de l' invention. L'invention a également pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant d'éliminer les cellules hôtes ayant intégré un ou des transgènes par recombinaisons non-20 homologue et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ul, U3b, nxU2a, mxU2b, U3a, U3c et U3d, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U3b représentant motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN 25 polymerase II et dont le produit d'expression est une protéine, U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n+rn.>_.2, 30 U3a représentant un gène de sélection positive, U3c représentant motif 3' d'une séquence de recombinaison homologue X, U3d représentant un gène de sélection négative, 3032447 l'unité Ul étant contiguë à l'unité U3b, elle-même étant contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant contiguës à l'unité U3a, elle-même étant contiguë à l'unité U3c, elle-même étant contiguë à l'unité U3d. Ces vecteur constituent un groupe de vecteurs V13. 5 Ce groupe de vecteurs V1.3 peut etre préparé selon le procédé de l'invention. Selon encore un autre aspect , l' invention a pour objet un groupe devecteurs V1.3 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de l'invention. L'invention a également pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple 10 et permettant d'exprimer un ou plusieurs transgènes de façon inductible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ul, U2c, nxU2d, et mxU2e, U1 représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2c représentant un gène codant un transactivateur transcriptionel, U2d représentant un gène dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, 15 U2e représentant un gène dont le promoteur n'est pas dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, n étant supérieur ou égal à 1, m étant supérieur ou égal à 0, l'unité Ul pouvant être contiguë à l'unité U2c, elle-même pouvant être contiguë aux unités nxU2d, elles- 20 mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2e; l'unité U1 étant de préférence contiguë à l'unité U2c, elle-même étant de préférence contiguë aux unités nxU2d, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2e. Ces vecteur constituent un groupe de vecteurs V2. Ce groupe de vecteurs V2 peut etre préparé selon le procédé de l' invention. 25 Selon encore un autre aspect, V invention a pour objet un groupe devecteurs V2 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de l'invention. L'invention a également pour objet un vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant de réaliser de la complémentation génétique sous contrôle inductible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : U1, U2f, U2c, et U2g, 30 Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2c représentant un gène codant un transactivateur transcriptionel, 3032447 46 U2f représentant un gène dont le promoteur est un promoteur à ARN polymérase III et dont le produit d'expression est un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) précurseur d'un petit ARN interférant ciblant un gène X, U2g représentant un gène dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c et 5 dont le produit d'expression est une version mutée du produit du gène X de sorte à être insensible au produit du gène U2f ; l'unité Ul pouvant être contiguë à l'unité U2f, elle-même pouvant être contiguë à l'unité U2c, elle-même pouvant être contiguë à l'unité U2g; l'unité Ul étant de préférence contiguë à l'unité U2f, elle-même étant de préférence contiguë à l'unité 10 U2c, elle-même étant de préférence contiguë à l'unité U2g. Ces vecteur constituent un groupe de vecteurs V3. Ce groupe de vecteurs V3 peut etre préparé selon le procédé de I' invention. Selon encore un autre aspect , l' invention a pour objet un groupe devecteurs V3 tels qu obtenus par mise en oeuvre du procédé de l'invention. 15 3032447 47 LÉGENDES DES FIGURES Figure 1 A : Schéma représentant une brique moléculaire sur laquelle une enzyme de type Ils (rond) liée à un 5 adaptateur (A) de part et d'autre d'une séquence d'intérêt (SI) est liée à l'ADN au niveau de son site de reconnaissance et coupe l'ADN à distance du site de reconnaissance (flèche) pour générer une SI ayant deux extrémités simple brin d'au moins 2 nucléotides (sutures) qui permettront un assemblage ordonné. B. Exemple de coupure induite par une enzyme de type Ils produisant une extrémité monobrin pouvant 10 s'apparier avec une autre extrémité monobrin et s'assembler sans cicatrice. Figure 2 : Schéma représentant le mode de calcul de score de compatibilité de choix des sutures (choix intersutures). 15 Figure 3 : Matrice des scores obtenus pour l'ensemble des combinaisons possibles Figure 4 : Schéma de représentation des plasmides réalisés selon l'invention (réalisation 1) et des sutures d'assemblage des briques 20 Figure 5 : Carte de restriction du plasmide pHCsiaT-EGFP de la réalisation 1 et vérification de l'assemblage Figure 6 : Schéma du vecteur V1 (SEQ ID NO : 41) selon l'invention et des sutures permettant l'assemblage des Briques OA Bsal A (SEQ ID NO : 36), Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37), Brique hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 38), Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), Brique shRNA B3GALT6 A (SEQ ID NO: 40). 25 Figure 7 : Empreinte de restriction théorique par double digestion, BamHI, Pvul du vecteur Vl. La digestion produit 5 fragments de 1616, 1288, 625, 568 et 124 paires de base respectivement. Figure 8 : Schéma du vecteur V1.1 (SEQ ID NO : 48) selon l'invention et des sutures permettant 30 l'assemblage des Brique OA Bsal A (SEQ ID NO :36), Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37), Brique hFUT3 3032447 48 Bsal A (SEQ ID NO : 38), Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO : 39), Brique shRNA B3GALT6 BSA IB (SEQ ID NO : 46) et Brique hygroR Bsal A (SEQ ID NO : 47). Figure 9 : Vérification structurelle du vecteur V1.1 (réalisation 3) par analyse du profil de restriction de 5 vecteurs extraits de bactéries compétentes transformées et sélectionnées. Figure 10 : Vérification fonctionnelle du vecteur V1.1 (SEQ ID NO : 48): profil d'expression de hFUT3 et mB3GALT6 mesurés par qRT-PCR à partir d'ARN totaux extraits d'un clone de cellules de souris 4T1 stablement transfectées par le vecteur V1.1. 10 Figure 11 : Schéma du vecteur V1.2 (SEQ ID NO : 53) selon l'invention et des sutures permettant l'assemblage des Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), Brique rosa265' Bsal A (SEQ ID NO: 49), Brique pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50), Brique hFUT3 Bsa I A (SEQ ID NO: 38), Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), Brique shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), Brique hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51) et Brique rosa263' BSAI 15 A (SEQ ID NO: 52). Figure 12 : Empreinte de restriction théorique par double digestion, BamHI, Pvul du vecteur V1.2. La digestion produit 7 fragments de 3781, 2711, 1656, 1288, 1015, 625 et 124 paires de base respectivement. 20 Figure 13 : Schéma du vecteur V1.3 (SED ID NO : 58) selon l'invention et des sutures permettant l'assemblage des Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), Brique rosa2651Bsal A (SEQ ID NO: 49), Brique pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50); Brique hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO: 38), Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), Brique shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46), Brique hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51), Brique rosa263' BSAI B 25 (SEQ ID NO: 54), Brique pEF1a Bsa I A (SEQ ID NO: 55), Brique TK Bsal A (SED ID NO: 56) et Brique Tkter Bsa I A (SED ID NO: 57). Figure 14 : Empreinte de restriction théorique par digestion de BamHI du vecteur V1.3. La digestion produit 6 fragments de 4796, 4686, 1432, 1288, 625 et 124 paires de base respectivement 30 3032447 49 Figure 15 : Schéma du vecteur V2 (SED ID NO : 62) selon l'invention et des sutures permettant l'assemblage des Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), Brique pCMV BsaI A (SEQ ID NO: 37), Brique TO3G Bsal A (SED ID NO: 59), Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), Brique pTRE3G Bsa I A (SED ID NO: 60), Brique mb3BALT6 Bsa I A (SED ID NO: 61) et Brique Tkter Bsa I A (SEQ ID NO: 57). 5 Figure 16 : Empreinte de restriction théorique par triple digestion, BamHI, Pvul et Scal du vecteur V2. La digestion produit 3 fragments de 4570, 457 et 111 paires de base respectivement. Figure 17 : Schéma du vecteur V3 (SED ID NO : 66) selon l'invention et des sutures permettant 10 l'assemblage des Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36), pCMV BsaI A (SEQ ID NO: 37), TO3G BsaI A (SEQ ID NO: 59), BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39), pTRE3G Bsa I A (SEQ ID NO: 60), mb3BALT6 Bsa 1B (SEQ ID NO:63), Tkter Bsa I B (SEQ ID NO:64) et shRNA B3GALT6 C (SEQ ID NO:65). Figure 18 : Empreinte de restriction théorique par triple digestion, Barn Hl, Pvul et Scal du vecteur V3. 15 La digestion produit 4 fragments de 5160, 1616, 457 et 111 paires de base respectivement. 3032447 5 10 15 20 25 EXEMPLES 1. Exemples de briques fabriquées Module Matrice initiale fournisseur OriAmp pCDNA3.1(+)Hygro Invitrogen-Life technologies LacZ pUC19 Invitrogen-Life technologies ZeocinR pCDNA3.1(-)Zeo invitrogen-Life technologies HygromycinR pCDNA3.1(+)l-lygro Invitrogen-Life technologies CMVp pEN_CmiRc2 ATCC (MBA-284) EF1p pEN_EmiRc3 ATCC (MBA-286) Ubi-Cp pEN_UbmiRc3 ATCC (MBA-288) EYFP-Ctag pEYFP-C1 Clontech discd ECFP-Ctag pECFP-C1 Clontech discd EGFP-Ctag pEGFP-C1 Clontech discd E1GFP-Ctag pEGFP-C1 Clontech discd mCherry-Ctag pmCherry-C1 M. Coppey-Moisan TagBFP-Ctag pTagBFP-C Evrogen BGHpolyA pCDNA3.1(+)Hygro In vitrogen-Life technologies Tablel : Liste des briques fabriquées 3032447 51 BGH-PolyA signal : bovine growth hormone polyadenyfation signal CMV: Cytomegalovirus EGFP: enhanced green fluorescent protein EYFP : enhanced yellow fluorescent protein 5 Exemple de protocole d'assemblage selon l'invention : 20 à 100 fmol de chaque brique moléculaire sélectionnée pour réaliser un vecteur sont mélangés dans un volume de 20 ul d'une solution comprenant: 10 - 2 ial de tampon de ligation 10X, -10U (1 III) d'enzyme de restriction de type Ils e Bsaf , - 3U (1 ul) de Ligase si le nombre de fragments est inférieur à 4 ou de 20U (1 ul) de Ligase Haute concentration (HC) si le nombre de fragments est supérieur à 4. qsp : eau distillée ultrapure 15 Le mélange est réalisé sur glace, c'est à dire à une température de 4°C environ. Le mélange est ensuite soit incubé à 37°C (30' à 6h), si le nombre de briques à assembler est inférieur à 5, soit soumis à des cycles d'incubation de 2' à 37°C et de 3' à 16°C (25 à 50 cycles) si le nombre de fragments est supérieur à 4. 20 A la fin de cette période d'incubation, les réactions sont incubées à 50°C pendant 5' (coupure des sites Bsa I subsistants) puis à 80°C pendant 5' (inactivation des enzymes). 2 à 10 III de chaque assemblage sont ensuite utilisés pour transformer 50 à 100 gl de bactéries 25 compétentes, et l'intégralité des bactéries transformées sont étalées sur une boîte de pétri contenant une gélose LB complémentée de l'antibiotique de sélection (correspondant au module de résistance de l'unité bactérienne). Réalisation 1 30 Dans ce premier exemple, le but est de réaliser 6 constructions permettant d'exprimer des protéines fluorescentes de différentes couleurs dans le compartiment Golgien de cellules de mammifères (figure 4). 3032447 52 Les vecteurs doivent pouvoir être utilisés pour créer des lignées stables, ce qui impose l'introduction d'un module de sélection dans l'unité d'intégration. Afin de repérer visuellement les plasmides où l'assemblage est correct et d'estimer la proportion de contaminants ou de clones incorrects, une cassette bactérienne exprimant lac Z est également ajoutée. 5 Les vecteurs souhaités contiennent : o Une unité de réplication bactérienne : ^ un module contenant une origine de réplication suivi du gène de résistance bila (Ampli) ^ un module (en deux fragments) permettant le criblage bleu blanc par l'activité du gène 10 IacZ o Une cassette d'expression des protéines de fusion contenant : ^ un module promoteur (CMV), ^ un module d'adressage au compartiment Golgien (première partie de l'ORF) constitué des 111 premiers acides aminés codés par le cDNA du gène humain ST6GAL1, 15 ^ un module codant une protéine fluorescente fusionnée à la séquence d'adressage en C- terminal (six modules interchangeables), ^ un module correspondant à un terminateur de transcription (BGHpolyA) o Une unité d'intégration en cellule eucaryote : ^ Un module contenant le gène de résistance à l'Hygromycine B sous le contrôle du 20 promoteur SV40. Le choix de chaque suture a été fait selon l'invention, et le plasmide reconstitué est représenté figure. 4. Préparation des briques moléculaires NOM SEQU E N CE ID BGH polyA_CW-F GAGGTACCGGTCTCATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCC SEQ ID NO : I BGH polyA_CCW-F GAGGTACCGGTCTCCAGAAGCCATAGAGCCCACCGC SEQ ID NO : 2 lacZ-up_CW-F GAGGTACCGGTCTCGTTCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAA SEQ ID NO : 3 CCGCC 3032447 53 la a- up_CCW- F GAGGTACCGGTCTCCTGTCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC SEQ ID NO : 4 lacZ-down_CW-F SEQ ID NO : 5 GAGGTACCGGTCTCGGACAGCCTGGCCGTCG III IACAACG IacZ- GAGGTACCGGTCTCACTGGCCCTGCAGGTCTATGCGGCATCAGA SEQ ID NO : 6 d own_new_CCW_F GCAGATTGTAC 51/40pori CW F GAGGTACCGGTCTCCCCAGCAG G CAGAAGTATGCAAAGC SEQ ID NO : 7 SV4Oterm CCW F GAGGTACCGGTCTCGATAAGATACATTGATGAGTTTGGAC SEQ ID NO : 8 CoIE1-oriCW2F GAGGTACCGGTCTCATTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGT SEQ ID NO : 9 AGAGAAGCAACCG Am pR_CCW_2_F GAGGTACCGGTCTCGTCCTTGAGACGCTAGTCCTCGTTCCCGATG SEQ ID NO : 10 CTCTCGTCCTATCC pEN_Prom_CW_F GAGGTACCGGTCTCAAGGAACCAATTCAGTCGACTGG SEQ ID NO : 11 pEN_Pro m_CCW_F GAGGTACCGGTCTCAGGTGGCGGCCCTGTTATCCCTAGTCGACTA SEQ ID NO : 12 G SiaT_CW_F GAGGTACCGGTCTCCCACCATGATFCACACCAACCTGAAG SEQ ID NO : 13 SiaT_CCW_F SEQ ID NO : 14 GAGGTACCGGTCTCACCCC I I I I GCAGCCTAGGGATAAGG XFP_Ctag_CW_F GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGA SEQ ID NO : 15 G XFP_Ctag_CCW_F GAGGTACCGGTCTCCATCACTFGTACAGCTCGTCCATGC SEQ ID NO : 16 Table 2 : Liste des amorces utilisées pour amplifier les modules indiqués (Bsal souligné et sutures en gras) 3032447 54 Composé volume Matrice (2ng/pi) 1 pl 5X HF buffer 10µI dNTP (25mM) 0,5 pl 5 Oligo_CW_F 1,25 pl Oligo_CCW_F 1,25 pi Phusion Taq pol. 0, 5 pi H20 35,5 /1110 Table 3: Exemple de composition du mix réactionnel pour la réalisation des PCR Température Durée Cycl 15 e 95°C 30" - 95°C 10" X25 20 =Tm+3°C 30" 72°C 7-130"/ kb 72°C 5' 4°C . - Table 4: Cycles d'Amplification 25 * Les modules fluorescents ont tous été ajustés à la même concentration 3032447 Nom de la brique Taille (pb) Température d'hybridation Temps Concentration après d'élongation purification (nghtl) OriAmp 2005 60 1' 42 pCMV 677 65 20" 24 SiaT 370 61 10" 104 XFP 758 63 20" 75* BGHpA 267 63 8" 52 LacZ-up 278 67 8" 38 LacZ-down 299 65 8" 36 HygromycineR 1650 63 45" 60 Table 5 : Caractéristiques des briques et des conditions de PCR Rendement 3032447 56 Module Volume (0) OriAmp 2,4 CMVp 1,4 Sie 0,2 5 BGHpA 0,25 LacZ-Up 0,4 LacZ-Down 0,4 HygromycineR 1,4 10 XFP 0,5 Ligase HC 1 Bsal 1 LigationlOX Br 2 15 H20 9,05 Table 6 : Composition des mix d'assemblage : A la fin de la PCR les produits sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose et les bandes découpées du gel sont purifiées et quantifiées, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. 20 L'assemblage a été réalisé par 50 cycles d'incubation à 37°C pendant 2' puis 16°C pendant 3', suivis d'une incubation à 50°C pendant 5' et enfin d'une incubation à 80°C pendant 5'. Pour chaque construction, l'ADN de 3 colonies obtenues après transformation a été extrait et analysé par 25 restriction par les enzymes pvulHF et Sca HF (figure. 5). Le procédé selon l'invention permet d'assembler en une seule étape et en présence d'une seule enzyme au moins 6 briques moléculaires (et plus préférentiellement au moins 8 briques) sans aucune erreur. Le procédé selon l'invention permet d'assembler en une seule étape et en présence d'une seule enzyme 30 au moins 6 briques moléculaires avec un rendement de 100% 3032447 57 Le procédé selon l'invention permet d'assembler en une seule étape et en présence d'une seule enzyme au moins 6 SI et jusqu'à 30 SI. La présente invention permet donc selon un procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double 5 brin à partir de modules fonctionnels linéaires d'ADN double brin comprenant une seule étape d'assemblage des dits modules, en présence d'une seule enzyme de restriction, la dite seule enzyme de restriction étant une enzyme de type Ils. Séquences des briques utilisés pour les différentes constructions de la réalisation 1 : 10 OriAmp (2005 bp) (SEQ ID NO : 17) GAGGTACCGGTCTCATTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACAT G GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC CAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCG i i il I CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGA 15 CGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGT GC GCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCT CATA GCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTT CA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG CA GCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA C 20 TACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGE TA GCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG iIIIIII GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAA AGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGA TT uGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCC I III AAATTAAAAATGAAG LIFI AAATCAATCTAAAGT ATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATT TCG 25 TTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG CTG CAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAG C GCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGT TCG CCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGMGGTATGGMC ATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCT TCG 30 GTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTFATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATFCT CTT ACTGTCATGCCATCCGTAAGATGC IIII CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCG GCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACMAAAAGTGCTCATC 3032447 58 ATTG GAAAACGTTCTTCG G G G CGAAAACTCTCAAG GATCTTACCG CTG TTGAG ATCCAGTTCGATGTAACCCACTC GTG CACCCAACTGATCTTCAG CATCTTTTACTTTCACCAG CGTTTCTG G GTG AG CAAAAACAG G AAG G CAAAATG C CG CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC IIIII CAATATTATTGAAG CATTT ATCAG G GTTATTGTCTCATGAG CG GATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAG G G GTTCCG CG CAC 5 ATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTATGAGACGTGAGG CTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAG CG TCTCAAGGACGAGACCG GTACCTC pCMV (677pb) (SEQ ID NO : 18) GAG G TACCG GTCTCAAG G AACCAATTCAGTCG ACTG GATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATFACG G G GTCATTAG 10 TTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC CCC CG CCCATTGACGTCAATAATGACGTATETTCCCATAGTAACG CCAATAG G GACTTTCCATTG ACGTCAATG G GTG G AGTATTTACGGTAAACTG CCCACTTG G CAGTACATCAAGTGTATCATATG CCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAAT GACG GTAAATG G CCCG CCTG G CATTATG CCCAGTACATG ACCTTATG G G ACTTTCCTACTTG G CAGTACATCTACGT ATTAGTCATCG CTATTACCATG GTGATG CG GTTTTG G CAG TACATCAATG G G CGTGGATAG CG GTTTG ACTCACG G 15 G GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATG G GAGTTTGTTTTG G CACCAAAATCAACG G GACTTTCCAAAATG TCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGG CG GTAGG CGTGTACGGTG GGAGGTCTATATAAGCAGAG CTG G MAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAG GGATAACAG G GCCG CCACCTGAGACCG GTACCTC SiaT (370pb) (SEQ ID NO : 19) 20 GAGGTACCGGTCTCCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTC TGT TTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAG GAAAAGAAGAAAG G GAGTTACTATGATTCCTTTAAATTG CAAACCAAG GAATT CCAG GTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGG CCATGG G GTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAG CAGCACCCAGGAC CCCCACAGG G GCCG CCAGACCCTCG GCAGTCTCAGAGG CCTAG CCAAG G CCAAACCAGAGG CCTCCTFCCAGGTG TG G AACAAG GACAG CTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAG G CTG CAAAAG G G GTGAGACCG GTACCTC 25 E1GEP (758pb) (SEQ ID NO : 20) GAGGTACCG GTCTCCGGGGTCG GG G GTGAGCAAG GG CGAG GAG CTGTTCACCGG GGTG GTG CCCATCCTG GTCG AG CTG GACG GCGACGTAAACG GCCACAAGTTCAGCGTGTCCGG CGAGGGCGAGG GCGATGCCACCTACGGCAAG CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTG G CCCACCCTCGTGACCACCCTgtccTACG GC 30 GTG CAG TG CTECAGCCG CTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAG TCCG CCATGCCCGAAG G CTACG TCCAG GAG CG CACCATCTTCTTCAAG GACGACG GCAACTACAAGACCCG CG CCGAGGTGAAGTTCGAG G GCGACA CCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACG GCAACATCCTG G G GCACAAG CTG GAG 3032447 59 TACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG CCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCC G CCACAACATCGAGG ACGG CAGCGTGCAG CTCGCCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCG G CGACGG CCCCG TG CTG CTG CCCGACAACCACTACCTG AG cta cCAGTCCG CCCTG AG CAAAG ACCCCAACGAGAAG CG CGATCACATG GTCCTG CTGGAGTTCGTGACCG CCGCCG GGATCACTCTCG GCATGGACG AG CTGTACAAGTGATGGAGACCGGTA 5 CCTC EGFP (758pb) (SEQ ID NO : 21) GAG GTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAG CAAG GGCGAGGAGCTGTTCACCG GGGTGGTGCCCATCCTGGTCG AG CTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAG CGTGTCCGG CGAG GG CGAG G GCGATGCCACCTACGG CAAG 10 CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTG CCCGTGCCCTG G CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGG CGTGCAGTG CTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATG CCCGAAGGCTAC GTCCAG GAG CGCACCATCTTCTTCAAG GACGACG GCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGG GCG AC ACCCTGGTGAACCG CATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACG GCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGA GTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATG G CCG ACAAG CAGAAGAACG G CATCAAG GTGAACTTCAAGAT 15 CCGCCACAACATCGAGGACG GCAGCGTG CAGCTCG CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG G CGACG GCCC CGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG CAAAGACCCCAACGAGAAG CGCGATCAC ATGGTCCTG CTGGAGTTCGTGACCGCCG CCG G G ATCACTCTCG G CATGGACGAG CTGTACAAGTGATGGAGACCG GTACCTC 20 ECFP (758pb) (SEQ ID NO : 22) GAG GTACCG GTCTCCGG G GTCGGGGGTGAG CAAGG GCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTG CCCATCCTG GTCG AGCTGGACGGCGACGTAAACGG CCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGG CGAGGGCGATGCCACCTACGG CAAG CTG ACCCTGAAGTTCATCTG CACCACCG G CAAG CTG CCCG TG CCCTG G CCCACCCTCGTGACCACCCTG ACCTG G G G CGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAG CACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTA 25 CGTCCAGG AG CGCACCATCTTCTTCAAG GACGACG GCAACTACAAGACCCG CG CCGAGGTGAAGTTCGAG GGCG A CACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAG G GCATCGACTTCAAG GAG G ACGG CAACATCCTG GG G CACAAG CTG G AGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAG CAGAAGAACG G CATCAAG G CCAACTFCAAG AT CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTG CAGCTCG CCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCGG CG ACGG CCC CGTG CTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCG CCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAG CG CGATCAC 30 ATGGTCCTGCTG GAGTTCGTGACCGCCG CCG G GATCACTCTCGG CATGGACGAGCTGTACAAGTGATG G AGACCG GTACCTC 3032447 EYFP(758pb) (SEQ ID NO : 23) GAG GTACCGGTCTCCG G G GTCG G GG GTGAGCAAG GGCGAG GAG CTGTTCACCGGG GTGGTG CCCATCCTGGTCG AG CTGGACGG CGACGTAAACG GCCACAAGTTCAG CGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCG G CAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACG G 5 CCTGCAGTGCTTCG CCCG CTACCCCGACCACATGAAG CAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAG GCTAC GTCCAG GAG CGCACCATCTTCTTCAAG GACGACGGCAACTACAAGACCCGCG CCGAGGTGAAGTTCGAG G GCGAC ACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGG CAACATCCTGGGGCACAAGCTG GA GTACAACTACAACAG CCACAACGTCTATATCATG G CCG ACAAG CAG AAGAACG G CATCAAG G TG AACTTCAAG AT CCGCCACAACATCGAGGACG GCAGCGTGCAGCTCG CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCC 10 CGTG CTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAG CTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCAC ATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACC G GTACCTC mCherry (749pb) (SEO. ID NO : 24) 15 GAGGTACCGGTCTCCGGGGTCGGGGGTGAGCAAGGGCGAG GAG GATAACATG GCCATCATCAAG GAGTTCATGC G CTTCAAG GTGCACATGGAG G GCTCCGTGAACGG CCACGAGTTCGAGATCGAGG GCGAG G GCG AGG GCCGCCCC TACGAG GG CACCCAGACCGCCAAG CTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCC CCTCAGTTCATGTACG G CTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCG CCGACATCCCCGACTACTTGAAG CTGTCCTTCCC CGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACG GCG G CGTG GTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCT 20 GCAGGACGG CGAGTTCATCTACAAGGTGAAG CTG CG CGG CACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATG CAGAA GAAAACCATG G G CTG G GAGG CCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACG G CGCCCTGAAGG G CGAGATCAAGC AGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAG GCCAAGAAG CCCGTG CAGCTG CCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAG GACTACACCATCGTGGAAC AGTACGAACGCGCCGAGGGCCG CCACTCCACCG G CG GCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGGAGACCGGTACCT 25 C TagBFP (746pb) (SEQ ID NO : 25) GAG GTACCGGTCTCCGGGGTCGG G GAG CGAGCTGATrAAGG AGAACATG CACATGAAGCTGTACATGGAGGG CA CCGTGGACAACCATCACTTCAAGTG CACATCCGAG G GCGAAGG CAAGCCCTACGAGG GCACCCAGACCATGAGAA 30 TCAAGGTGGTCGAG G GCG GCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTG GCTACTAGCTTCCTCTACGG CAGCAAGACC TTCATCAACCACACCCAG G G CATCCCC GACTTCTTCAAG CAGTCCTTCCCTG AG G G CTTCACATG G G AG AG AGTCAC CACATACGAGGACGGG GGCGTG CTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACG G CTG CCTCATCTACAACGT 3032447 61 CAAGATCAGAG GG GTGAACTTCACATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTTCAC CGAAACGCTGTACCCCGCTGACG GCG G CCTG GAAGGCAGAAACGACATG GCCCTGAAG CTCGTG G G CG G GAGCC ATCTGATCGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCTGGCGTCTAC TA TGTGG ACTACAGACTGGAAAGAATCAAG GAG GCCAACAACGAAACCTACGTCGAG CAG CACGAGGTGGCAGTG G 5 CCAGATACTG CGACCTCCCTAG CAAACTG G G G CACAAG CTTAATTCCG GATGATGGAGACCGGTACCTC BGHpA (267pb) (SEQ ID NO : 26) GAGGTACCGGTCTCATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTG I F I GCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTG ACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG TCA 10 TTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGG GATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGGAGACCGGTACCTC LacZ-up (278) ) (SEQ ID NO : 27) GAGGTACCGGTCTCGITCTCCCTGCAGGTGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTrGGCCGATTCA TTA 15 ATGCAGCTGGCACGACAGGMCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTrAGCTCAC TCATTAGGCACCCCAGGCMACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATFGTGAGCGGATAACAAMC ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGGAGACCGGTACCTC LacZ-clown (299pb) ) (SEQ ID NO : 28) 20 GAGGTACCGGTCTCGGACAGCCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACT TA ATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAA CA GTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTAIIIICTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACC GCA TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGACCTGCAGGGCCAGTGAGACCGGTACCTC 25 HygromycineR (1650pb) ) (SEQ ID NO : 29) G AG GTACCG GTCTCCCCAG CAG G CAG AAG TATG CAAAG CATG CATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAG TCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCT AA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAAIIIIIIIIATT TATGC AGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC 111111 GGAGGCCTAGGC 1111 GC 30 AAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCA I I I rCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA CGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCG GAG G G CGAAGAAT CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGG G CGTGGATATGTCCTGCG GGTAAATAG CTG CGCCGATG GTTTCTACAA 3032447 62 AGATCG TTATGTTTATCG G CACTTTG CATCG G CCGCG CTCCCGATTCCG GAAGTG CTTGACATTG G G G AATTCAG C GAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTGCC CG CTGTTCTGCAG CCGGTCGCG GAG G CCATG GATG CG ATCGCTGCGG CCGATCTTAG CCAGACGAG CG G GTTCGG CC CATTCG GACCG CAAG G AATCG GTCAATACACTACATG G CG TGATTTCATATG CG CGATTG CTGATCCCCATGTGTAT 5 CACTG G CAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTG CGTCCGTCG CG CAGGCTCTCGATGAG CTGATG CTTTG GG CC GAG GACTGCCCCGAAGTCCG G CACCTCGTG CACG CGG ATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACG GACAATG G CCG C ATAACAGCG GTCATTGACTG GAGCGAGG CGATGTTCG GGGATTCCCAATACGAG GTCGCCAACATCTTCTTCTG GA GGCCGTGGTTG GCTTGTATGG AG CAG CAGACG CG CTACTTCGAG CG GAGG CATCCG GAG CTTGCAG GATCGCCGC G G CTCCG G G CGTATATG CTCCG CATTG GTCTTGACCAACTCTATCAG AG CTFG GTTG ACG G CAATTTCGATGATG C 10 AGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGG GACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCC GCAGAAG CG CGG CCGTCTGGACCGATG GCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAG CACTC GTCCG AG G G CAAAG GAATAG CACGTG CTACG AGATFTCGATTCCACCG CCG CCTTCTATGAAAGGTTG G G C1TCG GAATCGMTCCGGGACGCCG GCTGGATGATCCTCCAGCGCG G GGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAA CTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTFACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA IIIIIII CACT 15 GCATTCTAGTTGTG G1TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCGAGACCGGTACCTC Séquence des vecteurs obtenus dans la réalisation 1 pFiCsiaT-EiGFP) (SEQ ID NO : 30) 20 TGAGGCTAGGGATAGGACGAGAGCATCGGGAACGAGGACTAGCGTCTCAAGGAACCAAITCAGTCGACTGGATC CTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTF ACG GTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTFCCCATAGT AA CGCCAATAG G GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACG GTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGT GTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTAITGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACA TG 25 ACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATFAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG IIII GGCA GTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCICCACCCCATTGACGTCAATGGGA GT TTG IIII GGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAITGACGCAAATGGGCGGTA GGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATA A CAGGGCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTG CAG 30 TCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGG GAGTTACTATGATTCCMAAATTGCAAACCAAG GAGTTCCAG GT GTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCC AC AG G GGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAG GCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAG GCCTCCTFCCAG GTGTGGAAC 3032447 63 AAGGACAG CTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTG CAAAAGGG GTCGGGGGTGAGCAAG G GCGAG GAG CTGTTC ACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGG CGAGGGCGATGCCACCTACG GCAAG CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGG CAAGCTG CCCGTGCCCTGGCCC ACCCTCGTGACCACCCTGTCCTACG GCGTGCAGTG CTTCAGCCG CTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTT 5 CAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC GC GCCGAG GTGAAGTTCGAGGG CG ACACCCTGGTG AACCGCATCGAG CTGAAG GG CATCGACTTCAAG GAGG ACG G CAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGA A CGG CATCAAG GTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAG CGTGCAG CTCGCCGACCACTACCAG CA GAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCA AA 10 G ACCCCAACGAGAAGCG CGATCACATGGTCCTG CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGG GATCACTCTCGGCATGGAC G AGCTGTACAAGTGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTG ACC CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCITTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCA TTC TATTCTGGGGGGTG G G GTG G GG CAGGACAG CAAGG GG GAG GATTGGGAGGACAATAG CAG G CATGCTGG G GAT G CG GTGGGCTCTATGGCTFCTCCCTGCAGGTG CG CCCAATACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCCGATTCA 15 TTAATGCAG CTGG CACGACAGG1TTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCT CACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC AAT TTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGACAGCCTGGCCGTCG I III ACAACGTCGTGACTGGGAAAACC CTGG CGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTFCG CCAG CTGGCGTAATAG CGAAGAGG CCCG CAC CGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATMCTCCITACGCATCTG T 20 G CG GTATTTCACACCG CATATG GTGCACTCTCAGTACAATCTG CTCTGATGCCG CATAGACCTG CAG G G CCAG CAG G CAGAAGTATG CAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAG GTGTG G AAAGTCCCCAG G CTCCCCAG CAG G CA GAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTA ACT CCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA IIIIIIII AMATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCC TCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC 111111 GGAGGCCTAGGCTMGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTA 25 TATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTG ATC GAAAAGTTCGACAG CGTGTCCGACCTGATGCAG CTCTCG GAG GG CG AAGAATCTCGTGCMCAG CTTCGATGTAG G AG G G CGTGGATATGTCCTG CG G GTAAATAGCTG CG CCG ATG GTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCG G CACTT 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CTTGTATGGAGCAGCAGACGC G CTACTTCGAGCGGAG GCATCCG GAG CTTGCAG GATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTG GTCTTG 30 ACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACG GCAATTTCG ATGATGCAGCTTG GG CG CAGGGTCGATG CGACG CAATCGT CCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGG G CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGG CCGTCTGGACCGATGGCTGTGT AGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAG 3032447 77 ATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATC CTC CAG CG CG G G G ATCTCATG CTG G AGTTCITCGCCCACCCCAACTTGMATTG CAG CTTATAATGGTTACAAATAAAG CAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCAIIIIIIICACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCA ATGT ATCTTATGCGTCTTCTAGGGTTAAGGTTAGTGTAGAGAAGCAACCGAAGATTGAGAAGACATGGCGGTAATACG G 5 TTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAA AAAGGCCGCGTTGCTGGCG 11111 CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAG AGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGT TC CGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGC I I 1 CTCATAGCTCACGCTGT AG GTATCTCAGTTCG GTGTAG GTCGTTCG CTCCAAG CTG G G CTGTGTG CACG AACCCCCCGTTCAGCCCG ACCGCT 10 GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACT GG TAACAGGATTAGCAG AG CGAG GTATGTAG G CG G TG CTACAGAGTTCTTGAAGTG GTG G CCTAACTACG GCTACAC TAG AAG AACAGTATTTG GTATCTG CG CTCTG CTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTG GTAGCTCTTGATCC GGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG 1111111 GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA GAAGATCCTTTG ATCTTTTCTACG G G GTCTGACG CTCAGTG G AACGAAAACTCACGTTAAG G GATTTTG GTCATGA 15 GATTATCAAAAAG GATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGIIIIAAATCAATCTAAAGTATATATGAGT AAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAG G CACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAG TTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATA CC GCGTGACCCACG CTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGG CCGAGCGCAGAAGTG G TCCTG CAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTG CCG G G AAG CTAG AGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATA 20 GTTTG CG CAACGTTGTTG CCATTG CTACAG G CATCGTG GTGTCACG CTCGTCGTTTG GTATG G CTTCATTCAGCTCC GGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCC GA TCGTTGTCAG AAGTAAGTFG G CCGCAGTGTTATCACTCATGGTRTGG CAG CACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG CCATCCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTG GTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG AGAATAG TGTATG CG G CG ACCGA GTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGA AA 25 ACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTFGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCAC CCA ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTUCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAA A G G GAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC 11111 CAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTT ATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTFCCGCGCACATTTCCC CGA AAAGTGCCACCTATGAGACG 30 Dans les exemples suivants l'objectif est de créer un vecteur permettant d'exprimer un transgène humain (cDNA) de façon stable dans une lignée cancéreuse de souris et/ou d'inhiber l'expression d'un second gène 3032447 78 (shRNA) de souris, toujours de façon stable. La série de vecteurs décrite ci-dessous illustre l'implémentation de différents modules fonctionnels permettant de développer les fonctionnalités d'intégration à partir d'une architecture princeps (vecteur V1) qui se caractérise par la présence des deux unités d'expression décrites ci-dessus et par l'absence d'un site de polyclonage (inhérente au procédé 5 décrit). Les briques décrites ci-dessous ont été obtenues par PCR selon un protocole usuel tel que celui décrit pour la réalisation 1. Les assemblages ont été réalisés à l'aide de l'enzyme Bsa I (NEB) et de la ligase T4 HC (Promega) dans le tampon de la ligase T4 HC, conformément au protocole décrit plus haut. 10 Réalisation 2 V1 : vecteur permettant l'expression simultanée de multiples transgènes (et ne contenant pas de site declonages multiples) 15 Ul + nxU2a + mxU2b Ul : Unité fonctionnelle bactérienne U2a : Unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Il et dont le produit d'expression est une protéine 20 U2b : Unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant n._0, ni._0 et n-Ern2 Exemple : Vecteur permettant d'exprimer l'enzyme hFUT3 tout en réprimant l'expression de mB3GALT6 25 Briques composant les unités: U1 ori-Amp U2a promoteur CMV hFUT3 cDNA Terminateur BPA U2b cassette shRNA mB3GALT6 Brique OA (ori-Amp) BSal A (SEQ ID NO : 36) 3032447 79 GAG GTACCGGTCTCATATTGTAATACG GTTATCCACAG AATCAG GG G ATAACG CAG GAAAGAACATGTG AG CAAA AGG CCAG CAAAAG GCCAGGAACCGTAAAAAG G CCGCGTTGCTG GCG I H 1 I CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCC C TGGAAG CTCCCTCG TG CGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCG CTTACCGGATACCTGTCCGCCMCTCCCTTCG GGAA 5 GCGTGG CGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAG G TATCTCAGTTCG GTGTAG GTCGTTCGCTCCAAGCTGG G CTGTGT GCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGAC AC G ACTTATCGCCACTG GCAG CAGCCACTGGTAACAG GATTAG CAGAGCGAGGTATGTAGGCG GTG CTACAGAGTTC TTGAAGTGGTGG CCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTG CG CTCTG CTG AAGCCAGTTACCT TCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCG CTGGTAGCG GIIITI I I GTTTGCAAGCAG CA 10 G ATTACG CG CACA AA AAA AG GATCTCAAGAAG ATCCTTTGATCTTTTCTACG G G GTCTGACG CTCAGTG G AACGA A AACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGG ATCTTCACCTAGATCC IIII AAATrAAAAATGAAG TTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGTTACCAATG CTTAATCAGTG AG G CACCTATCT CAG CGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCG TCGTG TAG ATAACTACG ATACGG G AG GG CTTA CCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGACCCACG CTCACCGGCTCCAG ATTTATCAGCAATAAACCAGCC 15 AGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGITGCCGGG AA GCTAGAGTAAGTAGTTCG CCAGTTAATAGTTTGCG CAACGTTGTTGCCATTG CTACAGGCATCG TG GTGTCACG CT CGTCGTTTGGTATG G CTTCATTCAG CTCCG G1TCCCAACGATCAAG GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAA AAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTAT GGC AG CACTG CATAATTCTCTTACTGTCATG CCATCCGTAAGATG CTTTTCTGTGACTGGTG AGTACTCAACCAAGTCATT 20 CTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCG G CGTCAATACGG GATAATACCGCGCCACATAGCAG AACTTTAAAAGTG CTCATCATTG G AAAACETTC11-CGG GGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCA GTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATC 1 1 1 i ACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAA ACAGGAAG G CAAAATG CCGCAAAAAAGGGAATAAG G GCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC I II IIC AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAA CAA 25 ATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAAGGACGAGACCGGTACCTC Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37 ) GAGGTACCG GTCTCAAG G AACCAATTCAGTCGACTG GATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG GGTCATTAG TTCATAGCCCATATATGGAGTTCCG CGTTACATAACTTACG G TAAATG GCCCG CCTGGCTGACCG CCCAACGACCCC 30 CG CCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACG CCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG AGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTC AAT GACGGTAAATGGCCCG CCTG G CATTATG CCCAG TACATGACCTTATGG G ACTTTCCTACTTG G CAGTACATCTACGT 3032447 ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATG CG G I 1 F 1G GCAGTACATCAATG GG CGTG GATAG CGGTITGACTCACG G G G ATITCCAAGTCTCCACCCCATTG ACGTCAATG G GAGTTTGMTG G CACCAAAATCAACG G GACTTTCCAAAATG TCGTAACAACTCCG CCCCATTGACGCAAATGGGCG GTAGGCGTGTACGGTGGGAG GTCTATATAAGCAGAGCTG G MAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCCGAGACCGGTACCTC 5 Brique hFUT3 Bsa I A (SEQ ID NO: 38) GAG GTACCGGTCTCACACCATG GATCCCCTGGGTGCAGCCAAG CCACAATGG CCATGG CGCCG CTETCTGGCCGC ACTGCTATTTCAGCTGCTGGTGGCTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTGCGTGTGTCCCGAGACGATGCCACTGGAT CCC CTAGGGCTCCCAGTGGGTCCTCCCGACAGGACACCACTCCCACCCG CCCCACCCTCCTGATCCTGCTATGGACATGG 10 CCMCCACATCCCTGTG G CTCTGTCCCG CTGTTCAG AGATG GTG CCCG G CACAG CCG ACTG CCACATCACTG CCG A CCG CAAG GTGTACC CACAG G CAGACACG GTCATCGTG CACCACTG G GATATCATGTCCAACCCTAAGTCACG CCTC CCACCTTCCCCGAGG CCG CAG GG G CAG CGCTG GATCTGGTTCAACTTG GAG CCACCCCCTAACTGCCAG CACCTGG AAG CCCTG GACAGATACTTCAATCTCACCATGTCCTACCG CAG CGACTCCGACATCTTCACG CCCTACG G CTG G CTG GAG CCGTG GTCCGGCCAGCCTGCCCACCCACCG CTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTG GTGGCCTGG GCGGTG 15 TCCAACTG GAAGCCGGACTCAGCCAG GGTGCG CTACTACCAGAGCCTGCAGGCTCATCTCAAGGTG GACGTGTAC GGACGCTCCCACAAG CCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCG AGAACTCC1TGCACCCCGACTACATCACCGAGAAG CTGTG GAG GAACGCCCTG GAG G CCTG GG CCGTGCCCGTG G TG CTG GG CCCCAGCAGAAGCAACTACG AGAGGTE-CCTGCCACCCGACG CCTTCATCCACGTG GACGACTTCCAGAG CCCCAAG GACCTGGCCCG GTACCTGCAGGAGCTG GACAAG GACCACGCCCG CTACCTGAG CTACTTTCG CTGG CG 20 G GAG ACG CTG CG G CCTCG CTCCTTCAG CTG G G CACTG GATITCTGCAAG G CCTG CTGGAAACTGCAG CAGGAATC CAG GTACCAGACGGTG CG CAG CATAGCG GCTTGGTTCACCTGATCGAGACCGGTACCTC Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39). GAGGTACCGGTCTCATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTC CTTG 25 ACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG TCA TTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGG GATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCGCGAGACCGGTACCTC Brique shRNA mB3GALT6 A (SEQ ID NO: 40) 30 GAGGTACCGGTCTCATTCGACAGGGTCGACAAGC 1111 CCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTA TCTMGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGA A ATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACC CAA 3032447 81 GAAATATTACTfTCTACGTCACGTAIIIIGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCT CTCTA ACAG CCTTGTATCGTATATG CAAATATGAAG GAATCATG G GAAATAG G CCCTCTTCCTG CCCG ACCTTG G CG CG CG CTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCG lir! GTATFCGAGACCGGTACCTC 5 Vecteur V1 (SFQ ID NO : 41). TATTGTAATACG G TTATCCACAG AATCAG G G GATAACG CAG G AAAGAACATG TG AGCAAAAG G CCAG CAAAAG G CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGIIIIICCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAT CG ACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGITFCCCCCTG GAAGCTCCCTCGT G CG CTCTCCTG TTCCGACCCTG CCG CTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAG CG TG GCG CTTTCTCA 10 TAG CTCACG CTGTAG GTATCTCAGTTCG GTGTAG GTCGTTCG CTCCAAGCTG G G CTGTGTG CACGAACCCCCCGTTC AGCC CGACCG CTGCGCCTTATCCG G TAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCCACTG GC AGCAG CCACTG GTAACAGGATTAG CAG AG CG AG GTATGTAGG CGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA CTACG G CTACACTAG AAGAACAGTATTTG GTATCTG CG CTCTG CTGAAG CCAGTTACCTFCG G AAAAAGAGTTG GT AGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGFTTIIIIGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAA AA 15 AAG G ATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACG G G GTCTGACG CTCAGTG GAACG AAAACTCACG TTAAG G GAT TTTGGTCATGAG ATTATCAAAAAG GATCTTCACCTAGATCC I FFI AAATTAAAAATGAAG 1 Ir 1 AAATCAATCTAAAG TATATATG AGTAAACTTG G TCTGACAGTTACCAATG CTTAATCAGTGAG G CACCTATCTCAG CGATCTGTCTAITFC GTTCATCCATAGTTG CCTGACTCCCCG TCGTGTAGATAACTACG ATACG G G AG G G CTTACCATCTG G CCCCAGTG CT GCAATGATACCGCGTGACCCACG CTCACCGGCTCCAGATTTATCAG CAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAG 20 CG CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCG CCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTG CCG G GAAG CTAGAG TAAGTAG TTC GCCAGTTAATAG IIIGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTT CATTCAG CTCCG GTTCCCAACG ATCAAG G CG AGTTACATGATCCCCCATGTTGTG CAAAAAAG CG GTTAG CTCCTTC G G TCCTCCGATCGTTG TCAGAAGTAAGTTG G CCG CAGTGTTATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAATTCTCT TACTGTCATGCCATCCGTAAG ATGC 11 1 CTGTGACTG GTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG AG AATAGTG TATG C 25 G G CG ACCGAGTTG cTcrrG CCCG G CGTCAATACG G GATAATACCG CG CCACATAG CAG AACITTAAAAGTG CTCAT CATTG G AAAAC G TTCTTCG G G G CGAAAACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGATCCAGITCGATGTAACCCACTC GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATC 1111 ACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC CG CAAAAAAG GG AATAAGGG CG ACACGG AAATGTTGAATACTCATACTCTTCC 1 1 1 I I CAATATTATTGAAGCATTT ATCAG G GTFATTGTCTCATGAG CG G ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAG G G G TTCCG CG CAC 30 ATTTCCCCGAAAAG TG CCA AG GAACCAATTCAGTCGACTG GATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG G G GTCATTAGTTCATAGCCCATATAT GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCG CCCATTGACGTCA 3032447 82 ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACG CCAATAG G GACTTTCCATTG ACGTCAATG G G TG G AGTATTTACG GTAAA CTG CCCACTTG G CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACG CCCCCTATTGACGTCAATGACG GTAAATG G CCC G CCTG G CATTATG CCCAGTACATGACCTTATG G G ACTTTCCTACTTG G CAGTACATCTACG TATTAGTCATCG CTATT ACCATG GTGATGCGGTTTTGG CAGTACATCAATG G GCGTG GATAG CG G1TTGACTCACGG GGAMCCAAGTCTCC 5 ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG GCACCAAAATCAACGGGAC I I I CCAAAATGTCGTAACAACTCCG CC CCATTGACG CAAATG G GCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAG CAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG ATCACTAGTCGACTAGG GATAACAG GG CACCATG G ATCCCCTG G GTG CAG CCAAG CCACAATG G CCATG G CG CCG CTGTCTG G CCGCACTG CTATTTCAG CTG CTG GTG G CTGTGTGTTTCTTCTCCTACCTG CGTGTGTCCCG AGACGATG CCACTG GATCCCCTAG G G CTCCCAGTG G 10 GTCCTCCCGACAG G ACACCACTCCCACCCG CCCCACCCTCCTGATCCTG CTATG G ACATG G CCTfTCCACATCCCTGT GGCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCGGCACAGCCGACTGCCACATCACTGCCGACCGCAAGGTGTACC CA CAG G CAGACACG GTCATCGTG CACCACTGG GATATCATGTCCAACCCTAAGTCACG CCTCCCACCTTCCCCG AG G C CG CAG G G G CAG CG CTG GATCTG GTTCAACTTG GAG CCACCCCCTAACTG CCAG CACCTG GAAG CCCTG GACAGAT ACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACG CCCTACG G CTG G CTG GAG CCGTG GTCCG G C 15 CAG CCTGCCCACCCACCG CTCAACCTCTCGG CCAAGACCG AG CTG GTGG CCTGG G CGGTGTCCAACTGGAAGCCG GACTCAGCCAG G GTGCG CTACTACCAGAG CCTG CAG GCTCATCTCAAGGTGGACGTGTACG GACGCTCCCACAAG CCCCTGCCCAAGGGGACCATGATGGAGACGCTGTCCCGGTACAAGTTCTACCTGGCCTTCGAGAACTCCTTGCA CC CCGACTACATCACCGAGAAGCTGTGGAGGAACGCCCTGGAGG CCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGG GCCCCAGC AGAAGCAACTACGAGAGGTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAGCCCCAAGGACCT GG 20 CCCGGTACCTGCAG G AGCTG GACAAGGACCACG CCCG CTACCTGAGCTACMCGCTGG CG GGAGACG CTG CG G C CTCG CTCCTTCAG CTG G G CACTG G ATTTCTG CAAG G CCTG CTG GAAACTG CAG CAG G AATCCAG GTACCAGACG GT GCG CAG CATAG CGGCTTG GTTCACC TG ATCGACTGTG CCTTCTAGTTG CCAG CCATCTGTTGTTTG CCCCTCCCCCGTG CCTTCCTTGACCCTG GAAGGTG CC ACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGG 25 TG GG GTGG G GCAG GACAGCAAGGG G G AGGATTG G GAG GACAATAGCAGGCATGCTGG G GATGCGGTGG GCTCT ATGGC TTCGACAG G GTCG ACAAG CTTTTCCAAAAAAAAAG CATGAG G TG CAGTTG CG CCTTTCCTATCTCTTGAATAG GAA AG G CG CAACTG CACCTCATG CTG G ATCCCG CGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCA AGTTACGGTAAG CATATGATAGTCCATTTTAAAACATAAMTAAAACTG CAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCT 30 ACGTCACGTATTTTGTACTAATATCMGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAG CCTTGTATCGT ATATGCAAATATGAAG GAATCATG G GAAATAG G CCCTCTrCCTG CCCGACCTTG GCG CG CGCTCGG CGCG CGGTC ACGCTCCGTCACGTGGTGCG i i i 1G. 3032447 83 L'Empreinte de restriction par double digestion (validation structurelle), BamHl, Pvul, de la réalisation 2 est illustrée Figure 7. 5 Vérification fonctionnelle : Des cellules eucaryote (ex : cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur V1 selon un protocole usuel (exemple lipotransfection ou electroporation). Les cellules sont collectées 24 à 48h après transfection et lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel. 10 Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 40 cycles des trios étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s; hybridation 60°C-30s; extension 72°C-30s. 15 Amorces utilisées: mB3GALT6 BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC (SEQ ID NO: 42). BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SEQ ID NO: 43). 20 FUT35 : CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG (SEQ ID NO :44). FUT33 : ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG (SEQ ID NO :45). Réalisation 3 25 V1.1 : Vecteur P1 permettant de sélectionner l'intégration des transgènes par recombinaison non homologue dans le génome cible U1+ U2 + U3a 30 Ul : Unité fonctionnelle bactérienne U2 : nxU2a + mxU2b, n_..0, ryi_O et n+rn.2 U3a est un gène de sélection positive 3032447 84 Vecteur permettant d'exprimer l'enzyme hFUT3 tout en réprimant l'expression de mB3GALT6 Listes des briques utilisées pour construire le vecteur V1.1 (Figure 8 ) 5 Ul ori-Amp U2a promoteur CMV hFUT3 cDNA Terminateur BPA U2b cassette shRNA mB3GALT6 U3a Hygomicin resistance Brique OA Bsal A (SEQ ID NO : 36) Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO : 37) Brique hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 38) 10 Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO : 39) Brique shRNA B3GALT6 BSA I B (SEQ ID NO: 46) GAGGTACCGGTCTCATFCGACAGGGTCGACAAGCMTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTA TCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCC1-TTCCACAAGATATATAAACCCA AGAA 15 ATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAA IIIIAAAACTGCAAACTACCCAA GAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATFAATTCTAATTATC TCTCTA ACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCG CG CTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCG IIIIGCCAGCGAGACCGGTACCTC 20 Brique hygroR Bsal A (SEQ ID NO : 47). GAGGTACCGGTCTCACCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAA G TCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCT AA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA I I FT IIIIATTTATGC AGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC 111111 GGAGGCCTAGGC IiiIGC 25 AAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC GA CGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAA T 3032447 CTCG TG CTTTCAGCTTCGATGTAG G AG G G CGTG G ATATGTCCTG CG G GTAAATAG CTG CG CCGATG GTTTCTACAA AGATCGTTATGTTTATCGG CACTTTGCATCGG CCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGG G GAATTCAGC GAG AGCCTG ACCTATTGCATCTCCCGCCGTG CACAG GGTGTCACGTTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAACTG CCCG CTGTTCTG CAG CCG GTCGCG GAG GCCATGGATGCG ATCG CTGCG GCCG ATCTTAG CCAG ACG AG CGG GTTCGGCC 5 CATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGG CGTGAMCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTAT CACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGG CC GAGGACTG CCCCGAAGTCCGGCACCTCGTG CACGCGGA111CG GCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGC ATAACAG CG GTCATTGACTG GAG CGAG G CGATGTTCG G G GATTCCCAATACG AG GTCG CCAACATCTTCTTCTG G A G GCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTFCGAG CGGAG G CATCCGGAGCTTGCAG GATCG CCGC 10 G G CTCCG G G CGTATATG CTCCG CATTG GTCTTGACCAACTCTATCAG AG CTTGG TTGACG G CAATTTCG ATGATG C AGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCC GCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACT C GTCCGAGGG CAAAG G AATAG CACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCG CCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCG GAATCG1 1 I 1CCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAA 15 CTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAA I 11CACAAATAAAGCA11111 I 1CACT G CATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTATTCGAGACCGGTACCTC V1.1 (SECt ID NO : 48). TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGG GGATAACGCAG GAAAGAACATGTGAGCAAAAG GCCAGCAAAAG G 20 CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCG 1111 1CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCG ACG CTCAAGTCAGAGGTG G CGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGT G CG CTCTCCTGTTCCG ACCCTGCCGCTTACCGG ATACCTGTCCG CCTTTCTCCCTTCGG GAAG CGTG G CGCTTrCTCA TAG CTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG CTGG G CTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC AGCCCGACCGCTGCGCMATCCG G TAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCG GTAAGACACGACTTATCGCCACTGGC 25 AGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAG CGAG GTATGTAG G CGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG GCCTAA CTACG G CTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTG CG CTCTG CTGAAG CCAG TTACCTTCG G AAAAAG AGTTG GT AGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG1 1111II GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGG AT TTTG GTCATGAGATTATCAAAAAG GATCTTCACCTAGATCC 1111 AAATTAAAAATGAAG 1111 AAATCAATCTAAAG 30 TATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAG G CACCTATCTCAG CGATCTGTCTATTTC GTTCATCCATAGTTG CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACG ATACG G G AG G G CTTACCATCTG G CCCCAGTG CT G CAATGATACCG CGTGACCCACG CTCACCG G CTCCAGATTTATCAG CAATAAACCAGCCAG CCGGAAGG G CCG AG 3032447 86 CG CAGAAGTG GTCCTGCAACTTFATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTC GCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTG CCATFG CTACAGGCATCGTGGTGTCACG CTCGTCGTTTGGTATGGCTT CATTCAGCTCCG GTTCCCAACGATCAAG G CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTC G GTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG G CCG CAGTGTTATCACTCATG GTTATG G CAG CACTG CATAATTCTCT 5 TACTGTCATGCCATCCGTAAGATG CTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGC G G CGACCGAGTTGCTCTTGCCCG G CG TCAATACG G GATAATACCG CG CCACATAG CAGAACTTTAAAAGTG CTCAT CATTG G AAAACGTTCTTCG G G G CGAAAACTCTCAAG GATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTG G GTGAG CAAAAACAG G AAG G CAAAATG C CGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC 11111 CAATATTATTGAAGCATTT 10 ATCAG G GTTATTGTCTCATGAG CG GATACATATTTGAATGTAMAG AAAAATAAACAAATAG G G GTFCCG CG CAC ATTTCCCCGAAAAGTG CCA AG GAACCAATTCAGTCGACTG GATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG G G GTCATTAGTTCATAG CCCATATAT GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTG G CTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCAITGACGTCA ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTA I I l'ACGGTAAA 15 CTGCCCACTTG G CAGTACATCAAGTGTATCATATG CCAAGTACG CCCCCTATTGACGTCAATGACG GTAAATG G CCC G CCTG G CAITATG CCCAGTACATGACCTTATG G GACMCCTACTTG G CAG TACATCTACGTATTAGTCATCG CTATT ACCATG GTGATGCGG IIII GG CAGTACATCAATGG G CGTGGATAG CGGTTTGACTCACG G GGATTTCCAAGTCTCC ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTI-G IIII GGCACCAAAATCAACGGGACMCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCC CCATTGACGCAAATG GG CG GTAGG CGTGTACG GTG G GAG GTCTATATAAG CAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG 20 ATCACTAGTCGACTAG G G ATAACAG G G CACCATGGATCCCCTGGGTGCAGCCAAGCCACAATGG CCATGGCGCCGCTGTCTG G CCGCACTG CTATTTCAGCTG CTGGTG G CTGTGTG TTTCTTCTCCTACCTG CGTGTGTCCCG AG ACG ATG CCACTG G ATCCCCTAG G G CTCCCAGTG G GTCCTCCCG ACAG G ACACCACTCCCACCCG CCCCACCCTCCTGATCCTG CTATG GACATG G CCTTTCCACATCCCTGT G GCTCTGTCCCGCTGTTCAGAGATGGTGCCCG GCACAGCCGACTGCCACATCACTG CCGACCGCAAGGTGTACCCA 25 CAG G CAG ACACG G TCATCGTG CACCACTG G G ATATCATGTCCAACCCTAAGTCACG CCTCCCACCTTCCCCGAG G C CG CAGG GG CAG CGCTGGATCTGGTTCAACTTGGAG CCACCCCCTAACTGCCAG CACCTGGAAGCCCTGGACAGAT ACTTCAATCTCACCATGTCCTACCGCAGCGACTCCGACATCTTCACG CCCTACGGCTG G CTG GAG CCGTGGTCCGG C CAG CCTGCCCACCCACCGCTCAACCTCTCGGCCAAGACCGAGCTGGTG G CCTGGG CGGTGTCCAACTGGAAG CCG GACTCAGCCAG G GTG CG CTACTACCAG AG CCTG CAG G CTCATCTCAAG G TG GACGTGTACG GACG CTCCCACAAG 30 CCCCTGCCCAAGGG GACCATGATG G AGACG CTGTCCCG GTACAAGTTCTACCTGG CCTTCG AGAACTCCTTGCACC CCGACTACATCACCGAGAAG CTGTG GAGG AACG CCCTGG AG GCCTGG GCCGTGCCCGTGG TGCTGG G CCCCAGC AGAAGCAACTACGAGAG GTTCCTG CCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAG CCCCAAG GACCTGG 3032447 87 CCCGGTACCTG CAG GAGCTGGACAAGGACCACG CCCGCTACCTGAG CTACTTTCGCTGG CGG GAG ACG CTG CG G C CTCG CTCCTTCAG CTG G G CACTG GAMCTG CAAG G CCTG CTG GAAACTG CAGCAGGAATCCAG GTACCAG ACG GT G CGCAG CATAG CG GCTTG GTTCACC TGATCGACTGTGCCTTCTAGITGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG TG CC 5 ACTCCCACTGTCC1TTCCTAATAAAATG AG GAAATTG CATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGG GG GG TG G GGTGG GGCAGGACAGCAAGGG G GAGGATTG GGAG GACAATAGCAGGCATGCTGGG GATG CGGTGGGCTCT ATGGC TTCGACAGGGTCGACAAG011 I CCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAA AG G CG CAACTG CACCTCATG CTG GATCCCG CG TCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG AAATCGAAATACTTTCA 10 AGTTACGGTAAG CATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCT ACGTCACGTA 1111 GTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGT ATATG CAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAG G CCCTCTTCCTGCCCGACCTTGG CG CG CGCTCG G CG CGCGGTC ACG CTCCGTCACGTGGTG CGTTTTG CCAG CAG G CAGAAGTATG CAAAG CATG CATCTCAATTAGTCAG CAACCAG GTGTG G AAAGTCCC CAG G CTCCCCA 15 G CAGG CAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGC CCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA 11111111 ATTTATGCAGAGGCCGAGGCCG CCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC I I 1 1 1 I GGAGGCCTAGGCTMGCAAAAAGCTCCCGGG AG CTTGTATATCCATTTTCG G ATCTGATCAG CACGTG ATG AAAAAG CCTGAACTCACCG CG ACGTCTG TCG AG AAG TTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAG CTCTCG GAG G G CG AAGAATCTCGTGCTTTCAG CT 20 TCGATGTAG GAG G G CGTG GATATGTCCTG CG G GTAAATAGCTG CG CCG ATG GTTTCTACAAAGATCGTTATG TTTA TCGG CACTTTGCATCGG CCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGG G GAATTCAG CGAGAGCCTGACCTAT TGCATCTCCCGCCGTGCACAG G GTGTCACGTTGCAAGACTTG CCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAG CCG G TCGCG GAG GCCATG GATGCGATCGCTGCGG CCGATCTTAGCCAGACGAG CG G GTTCG G CCCATTCG GACCG CAAG GAATCG GTCAATACACTACATG G CGTG ATTTCATATG CG CGATTG CTGATCCCCATGTGTATCACTG G CAAACTGTG 25 ATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCG CGCAGG CTCTCGATGAG CTGATG CMG G G CCGAGGACTGCCCCGAA GTCCG G CACCTCGTGCACGCGGATTTCGG CTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTG ACTGGAG CGAGGCGATGTTCG GG GATTCCCAATACGAG GTCG CCAACATCTTCTTCTG GAG GCCGTGGTTGGCTT GTATG GAG CAG CAGACGCG CTACTTCGAGCG GAG GCATCCGG AGCTTG CAG GATCG CCGCGGCTCCG G G CGTAT ATG CTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAAMCGATGATG CAGCTT'GGG CG CAG G 30 GTCG ATG CG ACGCAATCGTCCGATCCG GAG CCGG GACTGTCG G G CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCG CG GCC GTCTGGACCG ATG G CTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTG GAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAG G GCAAAG GAATAG CACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAG GTTGG G CTTCG GAATCGTTTTCCGGG 3032447 88 ACG CCG G CTGGATGATCCTCCAGCGCG GG GATCTCATG CTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTG CAGCT TATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA IIIIIII CACTGCATTCTAGTTGTGGT TTGTCCAAACTCATCAATGTATC 5 L'Empreinte de restriction par double digestion, Pvul, Scal (1 lig de D'ADN digéré par 10 unités de chaque enzyme 15 minutes à 37°C) de la réalisation 3 est illustrée figure 9. Vérification fonctionnelle de V1.1: des cellules eukaryote (ex : cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur V1.1 selon un protocole usuel (exemple lipotransfection ou 10 electroporation). Après transfection les cellules sont traitées avec de l'hygromycine (50ug-mL-1 pendant 7 jours). Les cellules sont ensuite collectées et lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel (Figure 10 ). 15 Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 40 cycles des trois étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s; hybridation 60°C-30s; extension 72°C-30s. Amorces utilisées 20 mB3GALT6 BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC (SEQ ID NO : 42). BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SEQ ID NO : 43). 25 hFUT3 FliT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG (SEQ ID NO : 44). FliT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG (SEQ ID NO : 42). Réalisation 4 30 V1.2 : Vecteur V1.1 permettant de sélectionner l'intégration simultanée de multiples de transgènes par recombinaison homologue dans le génome cible 3032447 89 U1 + U3b + U2 + U3a + U3c U1 : Unité fonctionnelle bactérienne U2 : nxU2a + mxU2b, n>_0, m_.0 et ri-Ern..2 5 U3a = gène de sélection positive U3b = motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U3c = motif 3' de la séquence de recombinaison homologue X Vecteur permettant d'exprimer l'enzyme hFUT3 tout en réprimant l'expression de mB3GALT6 10 Ul ori-Amp U3b Rosa265' U2a promoteur CMV hFUT3 cDNA Terminateur BPA U2b cassette shRNA mB3GALT6 U3a Hygomicin resistance U3c Rosa2631 Brique OA Bsal A (SEQ ID NO : 36) Brique rosa265' Bsal A (SEQ ID NO : 49). 15 GAGGTACCGGTCTCAAGGACCCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTAC GAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGA GGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGC ITCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCITC IF1 CCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTG11 I 1GGTT GGCGTAAGGCGCCTGTCAGITAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGG 20 GGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGG AGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGIII1AC C CGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTT CG TGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCC C CGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAG 3032447 TAGGGCTGAGCGG CTG CG GGGCGGGTGCAAG CACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGG GG CGTGCTGAG CC AGACCTCCATCGCGCACTCCG G GGAGTG GAG G GAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTG IIII GGAGGCAGGAAG CACTTG CTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGG GAGCTG CAGTG GAGTAGGCGGGGAGAAG G CCG C ACCCTTCTCCG GAG GG GGGAGG G GAGTGTTG CAATACCTTTCTG G GAGTTCTCTG CTGCCTCCTG GCTTCTGAG GA 5 CCGCCCTG G G CCTG GG AG AATCCCTTG CCCCCTCTTCCCCTCGTGATCTG CAACTCCAGTCTTACAACGAGACCG GT ACCTC Brique pCMV Bsal B (SEQ ID NO : 50) GAGGTACCGGTCTCAACAAACCAATTCAGTCGACTGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATT AGT 10 TCATAG CCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG CCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC G CCCATTG ACGTCAATAATGACG TATGTTCCCATAGTAACG CCAATAG G GACTTTCCATTG ACGTCAATG G G TG GA GTATTTACG GTAAACTG CCCACTTG G CAGTACATCAAGTG TATCATATG CCAAGTACG CCCCCTATTGACGTCAATG ACGGTAAATG G CCCG CCTG G CATTATG CCCAGTACATG ACCTTATG G G ACTTTCCTACTTG G CAGTACATCTACGTA TTAGTCATCGCTATTACCATG GTGATG CG Glii I GG CAGTACATCAATG GGCGTGGATAG CG GTTTGACTCACGGG 15 GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTG IIII GGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGT CGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTG GT TTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAG G GATAACAG G G CCACCG AG ACCG GTACCTC Brique hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO : 38) 20 Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO : 39) Brique shRNA B3GALT6 BSA 1 B (SEQ ID NO : 46) Brique hygroR Bsal B (SEQ ID NO : 51) G AG GTACCG GTCTCACCAG CAG G CAG AAGTATG CAAAG CATG CATCTCAAITAGTCAGCAACCAGGTGTG GAAAG 25 TCCCCAG G CTCCCCAG CAGG CAGAAGTATGCAAAGCATG CATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA 11111111 ATTTATGC AGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC I I ITII GGAGGCCTAGGC IIII GC AAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCA IIII CGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA CGTCTGTCGAGAAGMCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAAT 30 CTCGTG CMCAG CTTCG ATGTAG GAG G G CGTG GATATGTCCTG CG G GTAAATAG CTG CG CCGATGGTTTCTACAA AGATCGTTATGTTTATCGG CACMGCATCG G CCGCG CTCCCGATTCCG G AAGTG CTTGACATTG G GGAATTCAGC GAGAG CCTGACCTATTGCATCTCCCG CCGTGCACAGGGTGTCACGTTG CAAGACTTG CCTGAAACCGAACTGCCCG 3032447 91 CTGTTCTGCAG CCG GTCG CG GAG GCCATG G ATGCGATCG CTG CGG CCGATCTTAG CCAGACG AGCG GGTTCGG CC CATTCG GACCG CAAG G AATCG GTCAATACACTACATG G CGTGATTTCATATG CG CGATTG CTGATCCCCATGTGTAT CACTG G CAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTG CGTCCGTCG CGCAGGCTCTCG ATGAGCTGATG CTTTGG G CC GAG G ACTGCCCCG AAGTCCG GCACCTCGTGCACG CG G ATTTCGG CTCCAACAATGTCCTG ACG GACAATG G CCGC 5 ATAACAG CG GTCATTG ACTG G AG CGAG G CGATGTFCG GG G ATTCCCAATACG AG GTCG CCAACATCTTCTTCTG GA G GCCG TG GTTG GCTTGTATG G AG CAGCAG ACGCG CTACTTCGAG CGGAG GCATCCG G AG CTTGCAGG ATCGCCGC G G CTCCG G G CGTATATGCTCCG CATTG GTCTrGACCAACTCTATCAGAG CTTGGTTGACG G CAATTTCGATG ATGC AGCTTGG GCGCAGGGTCG ATG CG ACG CAATCGTCCGATCCGGAGCCG GGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCC GCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGG CTGTGTAG AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCG ACGCCCCAGCACTC 10 GTCCG AG G G CAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCG CCGCCITCTATGAAAGGTTG G G CTTCG G AATCGMTCCG GGACGCCGG CTG G ATGATCCTCCAGCG CGG G G ATCTCATG CTGGAGTTCTrCGCCCACCCCAA CTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA 1111111 CACT G CATrCTAGTTGTG GTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCGTAG CGAGACCG GTACCTC 15 Brique rosa263' BSAI A (SEQ ID NO: 52) G AG GTACCG GTCTCAGTAGAGATG G GCGGGAGTCTTCTG G GCAGGCTTAAAGGCTAACCTG GTGTGTGGG CG TF GTCCTG CAGG G G AATrGAACAGGTGTAAAATTGG AGG GACAAGACTTCCCACAGATTTTCG GTTTTGTCG GGAAG 111111 AATAGGGG CAAATAGG AAAATG GAG G ATAG GAGTCATCTG G G GTTTATG CAG CAAAACTACAG GTATATT G CTTGTATCCG CCTCGGAGATTTCCATG AG G AG ATAAAGACATGTCACCCG AGTTTATACTCTCCTGCTTAGATCCT 20 ACTACAGTATGAAATACAGTGTCGCG AGGTAGACTATGTAAGCAGATTTAATCA ii il AAAG AGCCCAGTACTTCAT ATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAGGTAMAGAACACTCATTTTAGCCCCATTTTCATTTAT TAT ACTG G CTTATCCAACCCCTAGACAGAG CATTG G CAMTCCCMCCTGATCTTAG AAGTCTG ATG ACTCATGAAACC AGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTrC IIII ATAACTCCTTA GTACAC 11111 GTTGATCCTTTGCCTTGATCCTTAA I I 1 I CAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAGGTGGTGTTCCACAT 25 TTG G GCCTATTCTCAGTCCAGGG AG IIII ACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACT CCCATG AATG CCTCTCTCC 11111 CTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGMCAG G TGG ATGTCTCCTCCCC CAATATACCTGATGTATCTACATATTGCCAGGCTGATA II I I AAGACATAAAAGGTATAMCATTATTG AG CCACAT G GTATTGATTACTG CTACTAAAA IIII GTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCC IIII GGAATGCAAAGTTCA G GTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAG CTTGTA I I I I I I CTATTTAAGCAGTG CMCTCTTG GACTGG 30 CTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTG CTGGTCTAAATGTGA I I I IG CCAAG CTTCTTCAGG ACCTATAA I I I IGC TTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGG I I 1 I- IAGGTTG1TGTGT TGTGTGTG CTTGTG CTCTATAATAATACTATCCAG G G G CTG GAG AG GTG GCTCG G AGTrCAAGAG CACAGACTG CT 3032447 92 CTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAG CAACCACATG GTG G CTCACAACCATCTGTAATG G GATCTGATG CCCTC TTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTCLIIII1ILIIII IAAAG AG AATACTGTCTCCAGTAG AATTACTG AAGTAATGAAATACTTTGTGTFTGTTCCAATATGGAAG CCAATAATCAAA TA CTCTTAAG CA CTG GAAATG TAC CAAGGAACTATTTTAITTAAGTG AACTG TG GACAG AG GAG CCATAACTG CAG 5 ACTTGTGGGATACAGAAGACCAATGCAGACTTAATGTC 1111 CTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAA CTTCTAGTATCCTATTTGTTAAACTGCTAGCTTTACTAACTTTTGTGCTTCATCTATACAAAG CTGAAAGCTAAGTCTG CAGCCATTACTAAACATGAAAG CAAGTAATGATAATTTTGGATFTCAAAAATGTAGG GCCAG AG I I I AG CCAGCCA G TG G TG GTG CTTG CCTTTATGCCTTAATCC CAGCACTCTG G AG G CAGAG AC AG G CAGATCTCTGAGTTTGAGCCCA G CCTGGTCTA CACATC AAGTTCTATCTAGGATAGCCAG GAATACACACAG AAACCCTG TTG GG G AGG GG G G CTCT 10 GAGATTTCATAAAAUATAATMAAG CATTCCCTAATG AG CCACTATG GATGTG G CTAAATCCGTCTACCTTTCTG A TGAGATTTGGGTATTA 111111 CTGTCTCTGCTGTTG GTTG GGTOETTTGACACTGTGGGCMCTTAAAGCCTCCTTC CCTGCCATGTGG ACTCTTGTTTG CTACTAACTTCCCATGGCTTAAATG GCATGGC Iirii GCCTTCTAAGGGCAG CTG CTGAGATTTGCAGCCTGATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCMCAAACACTAAAATrGTCCTTTAA IIIIIIIIIA A AAAATG G G TTATATAATAAAC CTCATAAAATAG TTATGAG G AG TG A G G TG G A CTAATATTA ATG A G TC C CTCCC C 15 TATAAAAGAGCTATTAAGGCl IIIGTCTTATACTAACLIllAITIAAATGTGGTATCTTTAGAACCAAGGGTCTTA GAG II AGTATACAGAAACTGTTG CATCG CTTAATCAGA ITI CTAGMCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCAC AG CCAAAGTCAAATTAAGAATUCTGACTTTAATGTTATTTG CTACTGTG AATATAAAATGATAG CTTTTCCTGAG G CAGGGTATCACTATGTATCTCTG CCTGATCTGCAACAAG ATATGTAGACTAAAGTTCTG CCTGC III] GTCTCCTG AA TACTAAGGTTAAAATGTAGTAATAC I I IGG AACTFG CAG GTCAGATTCTTTTATAG GG GACACACTAAGG G AG CT 20 TG GGTGATAGTTG GTAAATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTATTATCACCGCAACCTAC 11 11 AAAAAAAAA AGCCAGGCCTGTTAG AGCATG CTAAGG G ATCCCTAGG ACTTG CTG AG CACACAAGAGTAGTACTTG G CAG G CTCC TG GTG AGAGCATATTFCAAAAAACAAG GCAGACAACCAAGAAACTAC AG TAAG GTTAC CTG TCTITAAC CATCTG C ATATA CACA G G G ATATTA AAATATTC CAAATAATATTTCATTCAAG TTTTCC CC C ATCAAATFG G G A CATG G ATTTCT CCGGTGAATAGGCAGAGTTGGAAACTAAACAAATGTTGG[ IIIGTGATTTGTGAAATTGIiIICAAGTGATAGTTA 25 AAGCCCATG A G ATA CAG AA CA AAG CTG CTATTTC G AG G TC A CTTG G TTATACTCA G AAG CACTTCTTTG G G TTTC C C TG CACTATCCTG ATCATG TG CTAG G CCTACCTTAG G CTG ATTG TTG TTCAAATAA CTTAA G TTTCCTG TC A G G TG ATG TCATATGAITFCATATATCAAGGCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAGGTO TFG TGG GI I FI GA I 1 1 1 AATTFCAAAACCTGAGCTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTG GTGAATFGTATATTGT GGTTFGCAG G CAAG ACTCTCTG ACCTAGTAACCCTCCTATAG AG CACTTTG CTGGGTCA CAAG TCTAG G AGTCAAG 30 CA I I CACCTTGAAGTTGAGACGTTTTGTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGGACATGTTTATCCAGAAGATAT TCAGGACTA 11111 GACTGGGCTAAGGAATTGATTCTGATTAGCACTGTTAGTGAGCATTGAGTGGCCTTTAGGCTT 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TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAGGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCT ATGGC TTCGACAGGGTCGACAAGCMTCCAAAAAAAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAA 15 AGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTT TCA AGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCA iii I AAAACATAA 1 1-11 AAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCT ACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGT ATCGT ATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGT C ACGCTCCGTCACGTGGTGCGTTTTG 20 CCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCC A GCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCC GC CCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA IIIIIIiI ATTTATGCAGAGGCCGAGGCCG CCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC IIIIII GGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGG AGCTTGTATATCCA 1111 CGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAG 25 TTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTGTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG CT 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GAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCG IIII CCGGG ACGCCG G CTG GATG ATCCTCCAG CG CG G GGATCTCATG CTGGAG TTCTTCGCCCACCCCAACTTG TYTATTG CAG CT TATAATGETTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCA 1111111 CACTGCATTCTAGTTGTGGT TTGTCCAAACTCATCAATGTATC 10 GTAGAG ATG GG CG GGAGTCTTCTGG G CAG GCTTAAAG GCTAACCTGGTGTGTGGG CGTTGTCCTGCAGG G G AATT GAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAG 1 1 I 1 I 1 AATAGGGGCAA ATAG GAAAATGGAGGATAGG AG TC ATCTG GGGTTTATGCAGCAAAACTACAGGTATATTGCTTGTATCCG CCTC G GAG AI I I CCATGAG GAG ATAAAGACATGTCACCCGAGTTTATACTCTCCTG CTTAG ATCCTACTACAGTATGAAATA CA G TG TC G CG AG G TA G ACTATG TAA G CA G ATTTAATCATTTTAAAG AG CCCAG TACTTCATATCCATTTCTCCC G CT 15 CCTTCTGCAGCMATCAAAAGGTATTTAG AACACTCA II II AG CCCCA I I II CATTTATTATACTGGCTTATCCAACC CCTAGACAG AGCATTGG CATTTTCCCTTTCCTG ATCTTAGAAGTCTGATGACTCATGAAACCAGACAGATTAGTTAC ATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTC 1111 ATAACTCCTTAGTACAC 11111 GTTGA TCCTTTGCCTTGATCCTTAA I I 1 I CAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAG GTG G TGTTCCACATTTG G G CCTATTCTCAG TCCAG G G AG TTTTACA A CAATAG ATG TATTG AG AATCCAACCTA A A G CTTAACTTTCCACTCCCATGAATG CCTCTCT 20 CC 11111 CTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGTTTCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATACCTGATGTAT CTACATATTGCCAGGCTG ATA I 1 I 1 AAG ACATAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTG CTA CTAAAATTTFGTCATTGTACACATCTGTAAAAG GTGGTTCC I I I IGGAATGCAAAGTTCAG GTGTTTGTE-GTCTTTCC TGACCTAAG GTCTTGTGAGCTTGTA 111111 CTAMAAGCAGTGCTTTCTCTTG GACTG G CTTG ACTCATG G CATTC TACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGA 1111 GCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAAC 25 ACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTAMGTGAAGCTTGG IIIII AGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTC TATAATAATACTATCCAGGGGCTG G AGAGGTG GCTCG GAG TTCAAG AG CACAG ACTG CTCTTCCAGAAG TCCTG A G TTCAATTCCCAGCAACCA CATG GTGGCTCACAACCATCTGTAATG G G ATCTG ATG CCCTCTTCTG G TG TGTCTG AA GACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTC 1111111111111 AAAGAGAATACTGTCTCCAG TAGAATTACTGAAGTAATGAAATACTITGTEMGTTCCAATATGGAAGCCAATAATCAAATACTCTTAAGCACTG G 30 AAATGTACCAAGGAACTATTTTATTTAAGTGAACTGTGGACAGAG G AGCCATAACTG CAG ACTTG TG GG ATA CAG A AGACCAATGCAGACTTAATGTCTITFCTCTTACACTAAGCAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCT ATTT GTTAAACTGCTAG CTTTACTAAC 1[11 GTGCTTCATCTATACAAAGCTGAAAGCTAAGTCTGCAGCCATTACTAAACA 3032447 97 TGAAAGCAAGTAATGATAA 1111 GGATTTCAAAAATGTAGGGCCAGAGMAGCCAGCCAGTGGTGGTGCTTGCCT TTATGCCTTA ATCCCAG CA CTCTG GAGGCAGAGACAG GCAGATCTCTGAGMGAG CCCAGCCTGGTCTA CA CATC AAGTTCTATCTAG GATAG CCAG GAATACACACAGAAACCCTGTTG GG GAGG GG GG CTCTG AG ATTTCATAAAATT ATAATTG A A G CATTCCCTAATG AG CC A CTATG G ATGTG G CTAAATCCGTCTACC TTTCTG ATGAGATTTG G GTATTA 5 111111 CTGTCTCTGCTGTTGGTTGGGTCMTGACACTGTGGGCTTTCTTAAAGCCTCCTTCCCTGCCATGTGGACTC TTGMGCTACTAACTTCCCATGGCTTAAATGGCATGGC i i 11 1GCCTrCTAAGGGCAGCTGCTGAGATTTGCAGCCT GATTTCCAGGGTGGGGTTGGGAAATCMCAAACACTAAAATTGTCCTTTAA 111111111 AAAAAATGGGTTATATA ATAAACCTCATAAAATAGTTATGAG GAG TGAG GTG GACTAATATTAATGAGTCCCTCCCCTATAAAAG AG CTATTA AGGC it it i GTCTTATACTAAC imillii AAATGTGGTATCMAGAACCAAGGGTCTTAGAG IIII AGTATACAG 10 AAACTGTTGCATCG C1TAATCAG AI III CTAGTTTCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCACAGCCAAAGTCAAATTA AGAATTrCTGACTTTAATGTTAlTrGCTACTGTGAATATAAAATGATAGC IIII CCTGAGG CAG G GTATCACTATGTA TCTCTGCCTGATCTG CAAC AAGATATGTA G A CTAAAG rreTG CCTG CTTTTG TCTCCTG AATACTAA G GTTAA AATG T AG'TAATACMTGGAACTTGCAGGTCAGATTC 1 1 1 1ATAGGGGACACACTAAGGGAGCTTGGGTGATAGTTGGTAA ATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTAITATCACCG CAACCTAC 11111 AAAAAAAAAAGCCAGGCCTGTTAGAG 15 CATG CTAAGG GATCCCTAG G AcrrG CTGAG CA CACAAGAGTAGTA CTTG G CAG GCTCCTG GTGAGAG CATATTTC A AAAAACAAGGCAGACAACCAAGAAACTACAGTAAGGTTACCTGTCTTTAACCATCTGCATATACACAG GGATATTA A A ATATTCCAAATA ATATTTC ATTCAA GTTTTCCCCCATCAAATTG G G ACATG GATTTCTCCG GTGA ATA G G CAG AG TTGGAAACTAAACAAATGTTG G1111 GTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAG CCCATGAGATACAGA A CAAAGCTG CTATTTCGAGGTCACTTG GTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATCATGT 20 G CTAG G CCTACCTTAG G CTGATTGTTGTTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAG GTG ATG TCATATGATTTCATATATC AAG 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AGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCG 111 I GTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGA AATA i I I AGGACATCTAGCTTATC L'Empreinte de restriction par triple digestion, Pvul, Scal de la réalisation 4 est illustrée figure 12. 5 Vérification fonctionnelle : des cellules eucaryote (ex : cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur V1.2 selon un protocole usuel (exemple lipotransfection ou electroporation). Après transfection les cellules sont traitées avec de l'hygromycine (50j.tg-mL-1 pendant 7-14 jours). Les cellules sont ensuite collectées et lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN 10 complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel. Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 40 cycles des trios étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s ; hybridation 60°C-30s; extension 15 72°C-30s. Amorces utilisées : mB3GALT6. BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC (SEC/ ID NO: 42). 20 BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SFQ ID NO: 43). hFUT3 FUT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG (SEQ ID NO: 44). FUT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG (SEQ ID NO: 45). Réalisation 5 V1.3 : Vecteur V1.2 permettant d'éliminer les cellules hôtes ayant intégré un ou des transgènes par recombinaisons non-homologue U1 + U3b I- U2 I- U3a + U3c + U3d Ul : Unité fonctionnelle bactérienne 25 30 3032447 99 U2 : nxU2a + mxU2b, n>_0, m.?_.0 et n+rn>.2 U3a = gène de sélection positive U3b = motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U3c = motif 3' de la séquence de recombinaison homologue X 5 U3d est un gène de sélection négative. Exemple : Vecteur permettant d'exprimer l'enzyme hFUT3 tout en réprimant l'expression de mB3GALT6. Ul ori-Amp U3b Rosa26 5' U2a promoteur CMV hFUT3 cDNA Terminateur BPA U2b cassette shRNA mB3GALT6 U3a Hygomicin resistance U3c Rosa26 3' U3d promotor efla Thimidine kinase HSV Tk terminator 10 Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36) Brique rosa265' Bsal A (SEQ ID NO: 49) Brique pCMV Bsal B (SEQ ID NO: 50) Brique hFUT3 Bsal A (SEQ ID NO: 38) Brique BPA Bsal A (SEQ. ID NO: 39) 15 Brique shRNA B3GALT6 BSA I B (SECI. ID NO: 46) Brique hygroR Bsal B (SEQ ID NO: 51) Brique rosa263' BSAI B (SEQ ID NO: 54) GAGGTACCGGTCTCAGTAGAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTT 20 GTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGA I ii 1 CGG It I I GTCGGGAAG 11111 IAATAGGGGCAAATAGGAAAATGGAGGATAGGAGTCATCTGGGGTTTATGCAGCAAAACTACAGGTATATT 3032447 G CTTGTATCCGCCTCGGAGATTTCCATGAGGAG ATAAAGACATGTCACCCGAGTTrATACTCTCCTGCTTAG ATCCT ACTACAGTATGAAATACAGTGTCGCGAGGTAGACTATGTAAGCAGATTTAATCAIIIIAAAGAGCCCAGTACTT CAT ATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAG GTATTTAG AACACTCA 1111 AGCCCCATTTTCATTTATTAT A CTG G CTTATCCAACCCCTA G A CAG AG CATTG G CATTTTCCCTTTCCTG ATCTTAG AA G TCTG ATG A CTCATG AAA CC 5 AGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTC ATAACTCCTTA GTACAC GTTGATCCTTTG CCTTGATCCTTAATTTTCAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAG GTGGTGTTCCACAT TTGG G CCTATTCTCAGTCCAG GGAGIIIIACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAAC11ECCACT CCCATGAATGCCTCTCTCC 11111 CTCCATTATAACTGAGCTATAACCATTAATGGTTTCAGGTGGATGTCTCCTCCCC CAATATACCTG ATG TATCTACATATTG CCAG GCTG ATATTTTAAGAC ATAAAAGG TATATTTCATTATTG AG CCACAT 10 G GTATTG ATFACTG CTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAG GTG GTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCA GGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTAII IIICTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGG CTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATfGCTGGTCTAAATGTGAIIIIGCCAAGCTTCTTCAG GACCTATAA 1 I 1 1GC TTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGG 11111 AGGTTGTTGTGT TG TG TG TG C TTG TG CTCTATAATA ATA CTATCCAG G G G CTG G A G AG G TG G CTC G G AGTTCAA G AG C A CAG ACTG CT 15 CTTCCAGAAGTCCTG AG TTCAATTCCCAG CAACCACATG GTGGCTCACAACCATCTGTAATG GGATCTGATGCCCTC TTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCCTTCTTCTTC 1111111111111 AAAG AG AATACTGTCTCCAGTAG AA1TACTG AA GTAATG AAATACTTTG TG TTTG TTCCA ATATG GAAG CCAATAATCAAA TACTCTTAAGCACTGG AAATG TACCAAGGAACTAMTATTTAAGTGAACTG TGG ACAGAG G AG CCATAA CTG CAG ACTTG TG G GATACAGAAGACCAATG CAGACTTAATGTCTTTTCTCTTACACTAAG CAATAAAG AAATAAAAATTG AA 20 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GCCTGGGCCGTGCCCGTGGTGCTGGGCCCCAGC AG AAG CAACTACGAGAG GTTCCTGCCACCCGACGCCTTCATCCACGTGGACGACTTCCAGAG CCCCAAG G ACCTG G CCCGGTACCTGCAG GAG CTG GACAAGGACCACG CCCG CTACCTGAGCTAC1 I I CGCTGGCGG GAGACGCTGCGGC CTCG CTCCTTCAGCTGGGCACTGGATTTCTG CAAGGCCTGCTGGAAACTG CAGCAGGAATCCAGGTACCAGACGGT G CG CAGCATAG CGG CTTGGTTCACC 25 TGATCGACTGTGCCTTCTAGTTG CCAGCCATCTGTTGTTTG CCCCTCCCCCGTG CCTTCCTTGACCCTGGAAGGTG CC ACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATG AG GAAATTG CATCG CATTGTCTG AGTAG GTGTCATTCTATTCTGG GGG G TGG GGTG G GGCAGGACAGCAAGGGG GAG GATTG GGAGGACAATAGCAGGCATGCTG GGGATGCG G TGGG CTCT ATGGC TTCG ACAG G GTCGACAAG CTTTTCCAAAAAAAAAG CATGAGGTG CAGTTG CG CCTTTCCTATCTCTTG AATAG G AA 30 AG G CG CAACTG CACCTCATG CTGGATCCCG CGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCA AGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAA 1111 AAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCT ACGTCACGTA IIII GTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGT 3032447 ATATG CAAATATGAAG GAATCATGGGAAATAG G CCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGG CG CG 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GTGTTTGTTG TCTTTCC TGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTG TA IIIIII CTATTTAAGCAGTG CTTTCTCTTGG ACTGGCTTGACTCATG G CATTC TACACGTTATTG CTGGTCTAAATGTGATTTTG CCAAG CTTCTTCAGGACCTATAA 1 I 1 1G CTTGACTTGTAGCCAAAC ACAAGTAAAATGATrAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGG irili AGGTTGTTGTGTMTGTGTGCTTGTGCTC TATAATAATACTATCCAG G G G CTG GAGAG GTG G CTCG G AG TTCAAGAG CACAGACTG CTCTTCCAGAAGTCCTG A 10 G TTCAATTC C CAG CA A C CA CATG G TG G CTC A CAAC C ATCTG TAATG G G ATCTG ATG C C CTCTTCTGG TG TG TCTG AA GACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAATCCTCMCTTCTTC riIIIIIIIIIII AAAGAGAATACTGTCTCCAG TAGAATTACTG AAGTAATGAAATACTTrGTG I 1 i GITCCAATATG G AAGCCAATAATCAAATACTCTTAAGCACTG G AAATGTACCAAG G AACTA II II ATTrAAGTGAACTGTGGACAGAGGAG CCATAACTGCAGACTTGTGG GATACAG A AG ACCAATG CAGACTTAATGTC II II CTCTTACACTAAG CAATAAAGAAATAAAAATTGAACTTCTAGTATCCTATTT 15 GTTAAACTGCTAGCTTTACTAAC 1111 GTG CTFCATCTATACAAAG CTG AAAG CTAAGTCTGCAG CCATTACTAAACA TG AAAG CAAGTAATG ATAATTTTG G ATTTCAAAAATGTAG G G CCAG AGMAGCCAGCCAGTGGTGGTG CTTG CCT TTATG CCTTAATCCCAG CACTCTG GAG GCAG AG ACAG G CAGATCTCTGAGTTTGAG CCCAG CCTG G TCTACACATC AAGTTCTATCTAGGATAG CCAGGAATACACACAG AAACCCTGTTG GG G AG GGGGGCTCTGAGATTTCATAAAATT ATAATTGAAGCATTCCCTAATGAGCCACTATG GATGTG GCTAAATCCGTCTACCTTTCTGATG AGATTTG G GTATTA 20 I 1 1 1 1 1 CTGTCTCTGCTGTTGGTTG GGTC Ir I 1 GACACTGTGGGCTTTCTTAAAGCCTCCTTCCCTG CCATGTGG ACTC TTGTTTG CTACTAACTTCCCATG G CTTAAATG G CATG GC 11111G CCTTCTAAG G G CAG CTG CTGAG ATTTGCAG CCT GATTTCCAGGGTGGGGTTGG GAAATCTTTCAAACACTAAAATTGTCCTTTAA 11111111! AAAAAATGGGTTATATA ATAAACCTCATAAAATAGTTATG AG GAG TGAG GTG GACTAATATTAATGAGTCCCTCCCCTATAAAAG AG CTATTA AGGC 11111 GTCTTATACTAAC I 1 1 1 I 1 1 1 1 AAATGTGGTATCTTTAGAACCAAGGGTCTTAGAGTTTTAGTATACAG 25 AAACTGTTGCATCGCTTAATCAGA 1111 CTAGTTTCAAATCCAGAGAATCCAAATTCTTCACAGCCAAAGTCAAATTA AGAATTTCTG ACTTTAATGTTATTTG CTACTGTG AATATAAAATG ATAG CTTTTCCTG AG G CAG G GTATCACTATGTA TCTCTGCCTG ATCTG CAACAAGATATGTAGACTAAAGTTCTGCCTGCTTTTGTCTCCTGAATACTAAGGTTAAAATGT AGTAATAC I 1 1 I GGAACTTGCAGGTCAGATTCTTTTATAGGGGACACACTAAGGGAGCTTGGGTGATAGTTGGTAA ATGTGTTTAAGTGATGAAAACTTGAATTATTATCACCG CAACCTAC 1 1 1 1 1 AAAAAAAAAAG CCAGGCCTGTTAGAG 30 CATGCTAAG G G ATCCCTAG G ACTTG CTGAG CACACAAGAGTAG TACTTG G CAG G CTCCTG GTG AGAG CATATTTCA AAAAACAAG G CAG ACAACCAAGAAACTACAG TAAG G TTACCTGTCTTTAACCATCTG CATATACACAG G GATATTA AAATATTCCAAATAATATTTCATTCAAG 1 1 1 1 CCCCCATCAAATTGGGACATGGATTTCTCCGGTGAATAGGCAGAG 3032447 107 TTGGAAACTAAACAAATGTTGG 1111 GTGATTTGTGAAATTGTTTTCAAGTGATAGTTAAAGCCCATGAGATACAGA ACAAAGCTGCTATTTCGAGGTCACTTGGTTATACTCAGAAGCACTTCTTTGGGTTTCCCTGCACTATCCTGATC ATGT G CTAG G CCTACCTTAG G CTGATTGTTG TTCAAATAACTTAAGTTTCCTGTCAG GTG ATGTCATATGATTTCATATATC AAG GCAAAACATGTTATATATGTTAAACATTTGGACTTAATGTGAAAGTTAG GTCTTTGTGGG I ii I GA 1111 AATTT 5 CAAAACCTGAG CTAAATAAGTCATTTTACATGTCTTACATTTG GTG AATTGTATATTGTG G MG CAG G CAAG ACTC TCTGACCTAGTAACCCTCCTATAGAGCACTTTGCTGGGTCACAAGTCTAGGAGTCAAGCATTTCACMGAAGTTG A GACG 1111 GTTAGTGTATACTAGTTATATGTTGGAGG ACATGTTTATCCAGAAGATATTCAG GACTA IIII-I GACTG G G CTAAG G AATTG ATTCTGATTAG CACTGTTAGTG AG CATTGAGTG G CCTTTAG G CTTGAATTG G AGTCACTTGTA TATCTCAAATAATGCTGGCC 1 1 1 1 1 1 AAAAAGCCCTTGTTCTTTATCACCCTGTTTTCTACATAA IIIii GTTCAAAGA 10 AATACTTGTTTGGATCTCC IIII GACAACAATAGCATGTTTTCAAGCCATA iT1 1 TT I I CC 11111111111111111 GGT 1 I I ICGAGACAGGGMCKTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACITTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCA G AAATCCG CCTG CCTCTG CCTCCTG AGTG CCG G GATTAAAG G CG TG CACCACCACG CCTG G CTAAGTTG G ATAM TGTATATAACTATAACCAATACTAACTCCACTGGGTGGA IIIii AATTCAGTCAGTAGTCTrAAGTGGTCTTTATTGG CCCTTATTAAAATCTACTGTTCACTCTAACAGAGGCTGTTGGACTAGTGGGACTAAGCAACTTCCTACGGATAT ACT 15 AGCAGATAAGGGTCAGGGATAGAAACTAGTCTAGCG 1111 GTATACCTACCAGCTTATACTACCTTGTTCTGATAGA AATAMAGGACATCTAGMATC ATG CAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCCGATG GCTCCGGTG CCCGTCAGTG GG CAG AG CGCACATCG CCCA CAGTCCCCGAGAAGTTGGGGG GAGG G GTCGGCAATTGAACCG GTGCCTAGAGAAG GTG G CG CGG G GTAAACTG GGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCC 11111 CCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGC 20 CGTGAACGTTC H II 1 CGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTCCGCGGCCCCGAACTAGGCCTAGGCGTCTGA TCACTAGTGACTCTAGTCCTAGTCGACTAG GGATAACAGGG G CCCATG GCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTG CGTTCGACCAG G CTGCGCGTTCTCGCGG CCATAGCAAC CGACGTACGGCGTTG CGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTG GAGCAGAAAATGCCCACGCTA CTG CG G GTTTATATAGACG GTCCTCACG G G ATG G G GAAAACCACCACCACG CAACTG CTG GTG G CCCTG G GTTCG 25 CG CGACG ATATCGTCTACG TACCCGAG CCGATG ACTTACTG GCAG GTG CTG G G GGCTTCCGAGACAATCG CGAAC ATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAG GGTGAGATATCG GCCG G GG ACGCG GCG GTG GTAATGACAAG CGCC CAGATAACAATG G GCATG CCTTATG CCGTGACCGACG CCGTTCTG G CTCCTCATATCG GG GG G GAG GCTG GGAG C TCACATGCCCCG CCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCG CCCTCCTGTG CTACCCG G CCGCG CGATACCTTATGG G CAGCATGACCCCCCAG G CCGTG CTG GCGTTCGTG G CCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGG CA 30 CAAACATCGTGTTGGG GGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCG CCTGGCCAAACG CCAGCGCCCCGGCGAGC GGCTTGACCTGGCTATGCTGG CCGCGATTCGCCGCGMACGGG CTGCTTG CCAATACG GTG CG GTATCTG CAGG G CGG CG GGTCGTGG CGG GAG G ATTG G G GACAGCTTTCG GG GACG GCCGTGCCG CCCCAGG GTGCCGAGCCCCAG 3032447 108 AGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTA I I ACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCA ACGGCGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTCCCATGCACGTCTTT ATC CTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCA CG TCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATCTGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAAC T 5 GA CCGCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAA GACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTC G ATACCCCACCGAGACCCCAUGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTFCC I I ICCCCACCCCACCCCCCAAGTFCGGGT GAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC 10 L'empreinte de restriction par triple digestion, Pvul, Scal de fa réalisation 5 est illustrée figure 13. Vérification fonctionnelle : des cellules eukaryote (par exemple des cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur P1.3 selon un protocole usuel (par exemple par 15 lipotransfection ou électroporation). Après transfection, les cellules sont traitées avec de l'hygromycine (50ug-rnL-1 pendant 7-14 jours), puis avec du Ganciclovir (3-6 jours 5-40uM). Les cellules sont ensuite collectées et lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel. 20 Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 40 cycles des trios étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s; hybridation 60°C-30s; extension 72°C-30s. 25 Amorces utilisées mB3GALT6 BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC (SEO, ID NO: 42). BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SEQ ID NO: 43). 30 hFUT3 FUT35 CACTAGTCGACTAGGGATAACAGG (SEQ ID NO: 44). 3032447 109 FUT33 ATGTCCATAGCAGGATCAGGAG (SEQ ID NO: 45). Réalisation 6 5 V2 : Vecteur V1 permettant d'exprimer un ou plusieurs transgènes de façon inductible. iii. + U2c + nxU2d + mxU2e U1 : Unité fonctionnelle bactérienne U2c = gène codant un transactivateur transcriptionelle (example protéine TAT). U2d = gène(s) dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, n ._1 10 U2e = gène(s) dont le promoteur n'est pas dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, m 0 Exemple : vecteur permettant l'expression inductible de l'enzyme mB3GALTG Ul ori-Amp U2e promoteur CMV Teton3G Terminateur BPA U2d promoteur TRE3G mB3GALT6 I-ISV Tk terminator 15 Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36). Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37). Brique TO3G Bsal A (SEQ ID NO: 59). GAGGTACCGGTCTCACACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATG GA 20 GTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTrGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCA C GTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCC CC TGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTCCTCTCACATCGC GA CGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCC T GTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCG TA 3032447 TTG GAG GAACAGGAGCATCAAG TAG CAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATG CCCCCACTTCTG AAACAAG CAATFGAG CTGTTCGACCG G CAGG GAG CCGAACCTG CCTTCCTTTTCG G CCTG GAACTAATCATATG TG G CCTG G AGAAACAG CTAAAGTGCGAAAGCG GCG GG CCGACCGACGCCCTTGACGA il I i GACTrAGACATGCTCC CAGCCGATGCCCTTGACGACTTFGACCTTGATATGCTG CCTG CTG ACG CTCTTG ACG AI I I I GACCTTGACATGCTCC 5 CCGGGTAATGATCGAGACCGGTACCTC Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39). Brique pTRE3G Bsa I A (SEO, ID NO: 60). 10 GAGGTACCGGTCTCATTCGCTTTCGTCTTCAAGAATTCCTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTAT GAA GAGMACFCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGT TTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTT ACT COETATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTG TAC GGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACAC I It I GTCT 15 TATACCAACTTFCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGCGAGACCGGTACCTC Brique mb3BALT6 Bsa I A (SEQ ID NO: 61). CCAGATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTFCTGCGGCA CCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTrCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTFCCGGAGCCGCTCGGCCCCGC GC 20 TAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGT G GCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCT CGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGAC GCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGT G CTCAAGGCGGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACG C 25 CGCCGGCGCCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGC C TGGCAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTA CCT GCGCCTCAGCCGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGG A TGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGA C ACACAAGCAAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATG 30 AGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGC GT TCCCTGACCGC 3032447 111 Brique Tkter Bsa I A (SEQ ID NO: 57). V2 (SEQ ID NO: 62). TATTGTAATACGGTTATCCACAG AATCAG G G G ATAACGCAG G AAAG AACATG TG AG CAAAAG GCCAGCAAAAG G 5 CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTFGCTGGCG I 11 1 I CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCG ACGCTCAAGTCAG AGGTGG CG AAACCCG ACAG G ACTATAAAG ATACCAGG CGTTTCCCCCTG GAAGCTCCCTCGT G CG CTCTCCTGTTCCG ACCCTG CCG CTTACC G GATACCTGTCCG CCTTTCTCCCTTCG G GAAG CGTG G CG CTTTCTCA TAG CTCACG CTG TAG GTATCTCAGTFCG GTGTAG GTCGTTCG CTCCAAG CTG G G CTGTGTG CACG AACCCCCCGTTC AG CCCGACCG CTG CG CCTTATCCG GTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTG G C 10 AGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAG AGCGAGGTATGTAGGCGGTG CTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG G CCTAA CTACGGCTACACTAGAAGAACAGTAMGGTATCTG CG CTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCG GAAAAAG AGTTG GT AGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGG IIIItil GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAG GATCTCAAGAAGATCCTTTG ATCTTTTCTACG G G GTCTGACG CTCAGTG GAACGAAAACTCACGTTAAG G G AT TTTGGTCATGAG ATTATCAAAAAG G ATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATG AAG IIII AAATCAATCTAAAG 15 TATATATG AGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATG CTTAATCAGTG AG G CACCTATCTCAG CGATCTGTCTATTTC GTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG ATAACTACGATACG G GAG G G CTTACCATCTG G CCCCAG TG CT G CAATGATACCG CGTGACCCACG CTCACCG G CTCCAGAMATCAG CAATAAACCAGCCAG CCG GAAG G G CCG AG CG CAGAAGTG GTCCTG CAACTTTATCCG CCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTG CCG G GAAG CTAG AGTAAGTAGTTC G CCAGTTAATAGTTTG CG CAACGTTGTFG CCATFG CTACAG G CATCGTG GTGTCACG CTCGTCGTTTG GTATG G CTT 20 CATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG GCG AGTTACATGATCCCCCATGTFGTGCAAAAAAGCGGTTAG CTCCTTC G GTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAG TTG G CCG CAGTGTTATCACTCATG GTTATG G CAG CACTG CATAATTCTCT TACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG AGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGC GG CG ACCG AGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG CG CCACATAG CAG AACTTTAAAAG TG CTCAT CATTG G AAAACGTFCTTCG G G G CGAAAACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGATCCAGTFCGATGTAACCCACTC 25 GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATC 1 1 1 I ACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC CGCAAAAAAG G GAATAAGGG CGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC 1111! CAATATTATFG AAGCATFT ATCAG G GTTATFGTCTCATGAG CG GATACATATTTGAATGTATTTAG AAAAATAAACAAATAG G G GTTCCG CG CAC ATTTCCCCGAAAAGTG CCAAG GAACCAATTCAGTCG ACTG G ATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG G G GTCAT TAGTTCATAG CCCATATATG G AGTTCCG CGTTACATAACTTACGGTAAATGG CCCGCCTG GCTGACCG CCCAACGA 30 CCCCCG CCCATFGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG G GACTTTCCATTGACGTCAATG G G TG G AGTA1TFACG GTAAACTG CCCACTTG G CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACG CCCCCTATTGACGTC AATGACG G TAAATG G CCCG CCTG G CATTATG CCCAGTACATGACCTTATG G GACTTTCCTACTTG G CAGTACATCTA 3032447 112 CGTATTAGTCATCG CTATTACCATG GTGATG CG GMTG G CAGTACATCAATG G G CGTGGATAG CG GTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGItAATGGGAGMG I I TGGCACCAAAATCAACGGGACMCCAAA ATGTCGTAACAACTCCG CCCCATTGACGCAAATG G G CG GTAG G CGTGTACG GTG G G AG GTCTATATAAG CAG AG C TGG I I AGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGGGATAACAGGGCACCATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAG 5 TCATAAACTCTG CTCTG G AATTACTCAATG GAGTCG GTATCGAAG G CCTGACGACAAG GAAACTCGCTCAAAAGCT GG G AGTTGAGCAG CCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGG CCCTG CTCGATGCCCTG CCAATCGAG AT G CTGGACAG GCATCATACCCACTCCTG CCCCCTG G AAGG CG AGTCATGG CAAGACMCTGCG GAACAACGCCAA GTCATACCGCTGTG CTCTCCTCTCACATCG CGACG G G G CTAAAG TG CATCTCG G CACCCGCCCAACAGAGAAACAG TACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCG CGITCCTGTGTCAGCAAG GCTTCTCCCTG G AGAACGCACTGTACG CTCTGT 10 CCGCCG TG GGCCACTTTACACTG G GCTGCGTATTG GAG GAACAG GAGCATCAAGTAGCAAAAGAG G AAAGAG AG ACACCTACCACCGATTCTATG CCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTG AG CTGTTCG ACCGG CAG GG AG CCGAACCTG CCTTCC 1111 CGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCG AC G CCCTTGACGA1 I I I GACTTAGACATG CTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTG CT G ACG crcrrG ACGA I I I IG ACCTTG ACATG CTCCCCG GGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGT 15 TGMG CCCCTCCCCCGTG CCTTCCTTGACCCTG G AAG G TG CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATG AG G AAAT TG CATCGCATTGTCTGAG TAG GTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTG GGGCAG GACAGCAAG G GG G AG GATT G G GAG GACAATAG CAG G CATG CTG G G G ATG CG GTG G G CTCTATG G cTrcG CTTTCG TCTTCAAGAATTCCTCGAG TTTACTCCCTATCAGTG ATAG AG AACGTATGAAG AGTTTACTCC CTATCAGTG ATAGAGAACGTATG CAGACTTTAC TCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAG GAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCT 20 ATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTAT CAG TGATAG AGAACGTATAAG CTTTAG G CGTGTACG GTG G G CG CCTATAAAAG CAG AG CTCGTTTAGTGAACCGTCAG ATCGCCTGGAGCAATfCCACAACACIIIIGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACITCCTACCCTCGTAAACCAG ATGA AG GTATTCCGGCGCGCTTGGCG G CACCG GGTGG CG CTGG G CCTAGGCGGCCTGGCGTTCTG CG GCACCACTCTGT TG TACCTG G CG CG CTGCGCTTCCG AG GG CGAGACGCCCTCCGCTTCCG G AG CCG CTCGG CCCCG CG CTAAG GCCTT 25 CCTG GCGGTGCTGGTG G CCAGTGCG CCCCG CG CGGTCGAG CG CCG CACCGCAG TG CG CAG CACG TG GCTGG CAC CGGAGAGGCGTGG CG GACCCGAG GACGTGTG GG CGCG CTTCG CCGTGG GCACTG G CG G CTTAG GCTCGGAGGA G CG G CGCGCTCTTGAGCTCGAG CAGG CG CAG CACGGGGACCTGCTGCTG CTG CCCG CCCTGCGCGACGCCTACGA G AACCTCACG GCCAAGGTCCTG G CCATG CTGACCTGG CTG G ATGAG CGCGTG GACTTCGAGTTCGTGCTCAAG G C G GACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTG GACCTACGCGCACGGGAGCCCG CACGCCG CCG G CG 30 CCTCTACTGGGGCTTC II II CCG GG CG CGG GCG CGTCAAG CCG G GAG GTCG CTGG CGAGAAG CAG CCTG GCAACT CTG CGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCG G TGG CTATGTCCTTTCTG CG GACCTG GTG CATTACCTGCGCCTCA G CCG CG AGTACCTG CGCG CGTGG CACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAAC 3032447 113 G G G AG CACGACCCACG CITCGACACG GAGTACAAATCTCG AG G CTG CAACAATCAGTATCTG G TG ACACACAAG C AAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAG TTGCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTFCCCTG ACC GCGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGA 5 CAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGMGITCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATA CCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGT GAA GGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCC L'empreinte de restriction par triple digestion, BamFll, Pvul, Scal de la réalisation 6 est illustrée figure 16. 10 Vérification fonctionnelle : des cellules eukaryote (ex : cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur V2 selon un protocole usuel (exemple lipotransfection ou electroporation). Après transfection les cellules sont traitées avec de 100-1000 ng.mt.-1 de Doxycycline pendant 24 à 48 heures. Les cellules sont ensuite collectées et lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN 15 complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel. Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 40 cycles des trios étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s; hybridation 60°C-30s; extension 20 72°C-30s. Amorces utilisées: BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC (SEO. ID NO: 42). BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SEQ ID NO : 43). 25 Réalisation 7 V3 Vecteur V1 permettant de réaliser de la complémentation génétique sous contrôle inductible. 30 U1 U2f + 112c +1J2g Ul : Unité fonctionnelle bactérienne 3032447 114 U2f = gène dont le promoteur est un promoteur à ARN polymérase III et dont le produit d'expression est un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) précurseur d'un petit ARN interférant ciblant un gène X. U2c = gène codant un transactivateur transcriptionel (exemple : protéine TAT du VII-1-1 ou-2). U2g = gène dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c et dont le produit 5 d'expression est une version mutée du produit du gène X de sorte à être insensible au produit du gène U2f Exemple : Vecteur permettant de réprimer l'expression de l'enzyme mB3GALT6 tout en surexprirna nt de façon inductible l'expression de cette enzyme (complémentation possible). 10 Ui ori-Amp U2c promoteur CMV Teton3G Terminateur BPA U2g promoteur TRE3G mB3GALT6 - muté HSV Tk terminator U2f cassette shRNA mB3GALT6 Brique OA Bsal A (SEQ ID NO: 36) Brique pCMV Bsal A (SEQ ID NO: 37) Brique TO3G Bsal A (SEO, ID NO: 59) 15 Brique BPA Bsal A (SEQ ID NO: 39) Brique pTRE3G Bsa I A (SEQ ID NO: 60) Brique mb3BALT6 Bsa I B (SEQ ID NO : 63) GAGGTACCGGTCTCACCAGATGAAGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCC 20 TGGCGTTCTGCGGCACCACTCTGTTGTACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTOEGGA GC CGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCG C AGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCITCGCCGTGGGC ACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGGCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCT GCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCG T 3032447 G GACTTCGAGTTCGTGCTCAAG GCGG ACGACGACTCCTTTGCG CG CCTGGACG CTATCCTG GTG GACCTACG CG CA CG GGAGCCCG CACG CCGCCGGCGCCTCTACTGGG GCTTCTTTTCCG GGCGCG G GCG CGTCAAGCCGG GAG GTCGC TG G CGAGAAGCAG CCTGG CAACTCTGCGACTACTACCTGCCCTACG CGTTGGG CG G TG GCTATGTCC I I I CTGCG G ACCTGGTG cArrAccTG CGCCTCAGCCGCGAGTACCTG CG CGCG TG G CACAG TGAAGACGTATCGCTGG G CACCT 5 GG CTG GCACCAGTG GATGTGCAACGGGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGG CTG CAACA ATCAGTATCTG GTGACACACAAGCAAAG CCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCC GGTTGTGCAAACACGAAGTCCAACTG CG G CTCAG CTACGTCTATGACTGG TCAG CTCCACCCTCCCAGTGCTGCCA G CG CAAG GAG GG CGTI.CCCTGACCGCCG AG ACCG GTACCTC 10 Brique Tkter Bsa I B (SEQ ID NO : 64) GAG GTACCGGTCTCACCGCG G G G GAGG CTAACTGAAACACG GAAG GAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTAT GACG G CAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTG G GTCGTTTGTTCATAAACG CG G GGTTCG GTCCCAGG G CTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGG GGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCIiIICCCCACCCCACCC CCCAAGTTCGG GTGAAG GCCCAG G GCTCGCAGCCAACGTCG G GGCGGCAGGCCCTGCCATAG CCACAACGAGAC 15 CGGTACCTC Brique shRNA B3GALT6 C (SEQ ID NO : 65) GAG GTACCGGTCTCAACAAACAG G GTCGACAAG CTTTTCCAAAAAAAAAG CATG AG G TG CAGTTG CG CCTTTCCTA TCTCTTGAATAG GAAAG G CG CAACTG CACCTCATG CTG GATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAA 20 ATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAG CATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAA GAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATC TCTCTA ACAG CCTTGTATCG TATATG CAAATATGAAG GAATCATG G GAAATAG G CCCTCTTCCTG CCCGACCTTG G CG CG CG CTCG G CG CGCG GTCACGCTCCGTCACGTG GTGCGTTTTGTATTCGAGACCG GTACCTC 25 V3 (SEQ ID NO : 66) TATTGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGIIIIICCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAT CG ACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCG T GCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTT CTCA 30 TAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCG TTC AGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTG GC AGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTA A 3032447 116 CTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTG GT AG CTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTG GTAGCGG 1111111 GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATC CTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGAT TTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCC 1111 AAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAG 5 TATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTAT TTC GTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT GCT GCAATGATACCGCGTGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGA G CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAG TTC GCCAGTTAATAGTITGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGG CTT 10 CATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCC TTC G GTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG GCCG CAGTGTTATCACTCATG GTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCT TACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCIIIi CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATG C G G CGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGG GATAATACCG CG CCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCAT CATTG GAAAACGTTCTTCGG GG CG AAAACTCTCAAGGATCTTACCG CTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC 15 GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCJIIJACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAAT GC CGCAAAAAAGG GAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC 11111 CAATATTATTGAAGCATFT ATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCG GATACATATTTG AATG TATITAGAAAAATAAACAAATAG GG GTTCCG CG CAC ATTTCCCCGAAAAGTGCCAAG GAACCAATTCAGTCGACTG GATCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG G GTCAT TAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GA 20 CCCCCG CCCATTGACGTCAATAATG ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTG ACGTCAATGG G TG GAGTATTTACG GTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG CCAAGTACG CCCCCTATTGACGTC AATGACGGTAAATG G CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG GCAGTACATCTA CGTATTAGTCATCG CTATTACCATGGTGATG CG GII II GGCAGTACATCAATGG GCGTG GATAG CG GTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTG 1 1 1 I GG CACCAAAATCAACG G GACTTTCCAAA 25 ATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAG C TG GTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTCGACTAGG GATAACAGG G CACCATGTCTAGACTG GACAAGAG CAAAG TCATAAACTCTG CTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAG G CCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAG CT GGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGA T G CTG GACAGG CATCATACCCACTCCTG CCCCCTGGAAG G CGAGTCATGG CAAGACTUCTGCGGAACAACGCCAA 30 GTCATACCG CTGTGCTCTCCTCTCACATCGCGACGG GGCTAAAGTGCATCTCG G CACCCGCCCAACAGAGAAACAG TACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAG G CTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGT CCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAG 3032447 117 ACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACC TG CCTTCC 1111 CG G CCTGGAACTAATCATATGTGG CCTG GAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGG GCCGACCG ACGCCCTTGACGA 1111 GACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCITGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCT GACGCTCTTGACGA IIII GACCTTGACATGCTCCCCGGGTAATGATCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGT 5 TGMGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAA AT TG CATCG CATTGTCTGAGTAG GTGTCATTCTATTCTGGGGG GTG GGGTGGGG CAGGACAGCAAGGG GGAGGATT G G GAG GACAATAG CAGGCATG CTGGGGATG CGGTG GGCTCTATGGCTTCG CTTTCGTCTTCAAGAATTCCTCGAG TTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAG1TTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTT TAC TCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGITTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGITTACTC CCT 10 ATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAG I I I ACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAG TGATAGAGAACGTATAAGCMAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAG ATCGCCTGGAGCAATTCCACAACAC IIII GTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAACCAGATGA AGGTATTCCGGCGCGCTTGGCGGCACCGGGTGGCGCTGGGCCTAGGCGGCCTGGCGTTCTGCGGCACCACTCTG T TGTACCTGG CG CG CTGCG CTTCCGAG GGCGAGACGCCCTCCG CTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCG CG CTAAG GCCTT 15 CCTGGCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCAC CG GAGAG GCGTGG CGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCG GCTTAGGCTCGGAGGA G CGGCGCGCTCTTGAGCTCGAG CAGGCGCAGCACG GGGACCTGCTGCTG CTGCCCGCCCTGCG CGACGCCTACGA GAACCTCACG GCCAAGGTCCTGG CCATGCTGACCTGGCTGGATGAG CG CGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGC GGACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGC G 20 CCTCTACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAAC T CTG CGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGG GCGGTG GCTATGTCCTTTCTG CG GACCTG GTGCATrACCTGCG CCTCA G CCGCGAGTACCTG CGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTG GG CACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAAC G G GAG CACGACCCACG CTTCGACACG GAGTACAAATCTCGAGG CTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGC AAAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTG CATGAGGGCCG GTTGTG CAAACACGAAGTCCAA 25 CTGCGGCTCAGCTACGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTG AG TACCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTT CC TG G CGGTGCTGGTGGCCAGTG CGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTG G CTGGCACCG GAGAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGC G GCGCGCTCTTGAGCTCGAGCAG G CG CAGCACGG GGACCTG CTGCTGCTG CCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGA 30 ACCTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTrCGAGTTCGTGCTCAAGGCG G ACGACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACG CGCACGGGAG CCCG CACG CCG CCGGCG CC TCTACTGGGGCTTC IIII CCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCT 3032447 118 GCGACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTC AGC CGCGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACG GGAGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGC A AAGCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAGCATGAGGTGCAGT 5 TGCGCCTTTCCTATGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGA GTA CCTGGCGCGCTGCGCTTCCGAGGGCGAGACGCCCTCCGCTTCCGGAGCCGCTCGGCCCCGCGCTAAGGCCTTCC TG GCGGTGCTGGTGGCCAGTGCGCCCCGCGCGGTCGAGCGCCGCACCGCAGTGCGCAGCACGTGGCTGGCACCGGA GAGGCGTGGCGGACCCGAGGACGTGTGGGCGCGCTTCGCCGTGGGCACTGGCGGCTTAGGCTCGGAGGAGCGG CGCGCTCTTGAGCTCGAGCAGGCGCAGCACGGGGACCTGCTGCTGCTGCCCGCCCTGCGCGACGCCTACGAGAA C 10 CTCACGGCCAAGGTCCTGGCCATGCTGACCTGGCTGGATGAGCGCGTGGACTTCGAGTTCGTGCTCAAGGCGGA C GACGACTCCTTTGCGCGCCTGGACGCTATCCTGGTGGACCTACGCGCACGGGAGCCCGCACGCCGCCGGCGCCT CT ACTGGGGCTTCTTTTCCGGGCGCGGGCGCGTCAAGCCGGGAGGTCGCTGGCGAGAAGCAGCCTGGCAACTCTGC GACTACTACCTGCCCTACGCGTTGGGCGGTGGCTATGTCCTTTCTGCGGACCTGGTGCATTACCTGCGCCTCAG CCG CGAGTACCTGCGCGCGTGGCACAGTGAAGACGTATCGCTGGGCACCTGGCTGGCACCAGTGGATGTGCAACGGG 15 AGCACGACCCACGCTTCGACACGGAGTACAAATCTCGAGGCTGCAACAATCAGTATCTGGTGACACACAAGCAA A GCCCAGAGGACATGTTGGAGAAGCAACAGATGTTGCTGCATGAGGGCCGGTTGTGCAAACACGAAGTCCAACTG C GGCTCAGCTACGTCTATGACTGGTCAGCTCCACCCTCCCAGTGCTGCCAGCGCAAGGAGGGCGTTCCCTGACCG CG GGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAG AATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGETTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATAC CC 20 CACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCII IICCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGC CCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCACAAACAGGGTCGACAAGCTTTTCCAAAA A AAAAGCATGAGGTGCAGTTGCGCCTTTCCTATCTCTTGAATAGGAAAGGCGCAACTGCACCTCATGCTGGATCC CG CGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCAI III AAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTA 1111 GTACTAATATCTTTGT 25 GTTTACAGTCAAATTAATTCTAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGG GAA ATAGGCCCTCTTCCTGCCCGACCTTGGCGCGCGCTCGGCGCGCGGTCACGCTCCGTCACGTGGTGCG IG Vérification fonctionnelle de la construction N°7: des cellules eucaryote (ex : cellules cancéreuses mammaire de souris 4T1) sont transfectées avec le vecteur V3 selon un protocole usuel (exemple par 30 lipotransfection ou électroporation). Après transfection les cellules sont traitées ou non avec de 100-1000 ng.m L-1 de Doxycycline pendant 24 à 48 heures. Les cellules sont ensuite collectées lysées pour en extraire les ARN totaux puis générer des ADN complémentaires (ADNc) par transcription inverse selon un protocole 3032447 119 usuel. Ces ADNc sont ensuite utilisés comme matrice pour une analyse en PCR quantitative selon un protocole usuel. Conditions spécifiques de la PCR quantitative: 5 40 cycles des trois étapes suivantes sont réalisés : dénaturation 94°C-30s; hybridation 60°C-30s; extension 72°C-30s. Amorces utilisées: BETA3GALT6ms2-s ACCACTCTGTTGTACCTGGC {SEQ ID NO: 42). 10 BETA3GALT6ms2-s CACACGTCCTCGGGTCC (SEQ ID NO : 43). REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin comportant au moins deux séquences d'intérêt, comprenant : a) une étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction, la dite seule enzyme de restriction étant une enzyme de restriction de type Ils, chaque brique moléculaire étant une molécule d'ADN linéaire double brin; et contenant : (i) une séquence d'intérêt dépourvue de site de reconnaissance spécifique de la susdite enzyme de 10 restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une unité non fonctionnelle, ladite unité fonctionnelle comprenant au moins un module, ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin, flanqués en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, laquelle 15 contient: un seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, - le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en amont de la dite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur en aval de la dite séquence spécifique étant convergents, 20 laquelle étape conduit : - à l'élimination par coupure des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée, - la formation d'une suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités de la dite séquence d'intérêt, la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont d'une des au moins deux séquences 25 d'intérêt étant complémentaire à la dite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval d'une autre séquence d'intérêt, -à l'appariement par complémentarité nucléotidique des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides et - au positionnement des séquences d'intérêt, de façon contiglie les unes aux autres, selon un ordre et un 30 sens unique et déterminé, 3032447 121 b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides, pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. 2. Procédé selon la revendication précédente comprenant : 5 a) une étape de mise en contact simultanée de n briques moléculaires, chaque brique moléculaire étant une molécule d'ADN linéaire double brin, et contenant : (i) Une séquence d'intérêt (S1)1 dépourvue de site de reconnaissance spécifique de la susdite enzyme de restriction de type Ils et comprenant au moins une unité, ladite unité étant une unité fonctionnelle ou une unité non fonctionnelle, ladite unité fonctionnelle comprenant au moins un module, 10 ledit module étant un module fonctionnel ou un module non fonctionnel, et (ii) deux adaptateurs d'ADN double brin A(i-1,i) et A(i,i+1), différents l'un de l'autre, flanqués respectivement en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt (SI)i, chaque adaptateur d'ADN double brin consistant en une séquence d'au moins 12 nucléotides, 15 la séquence d'au moins 12 nucléotides de l'adaptateur d'ADN double brin A(i-1,i) contenant un seul et unique site de reconnaissance de la sus-dite enzyme de restriction de type Ils, et une suture d'au moins 2 nucléotides, s(i-1, i) en aval du site de reconnaissance de la dite enzyme de restriction de type Ils, 20 la séquence d'au moins 12 nucléotides de l'adaptateur d'ADN double brin A(i,i+1) contenant un seul et unique site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils, et une suture d'au moins 2 nucléotides, s(i,i+1), en amont du site de reconnaissance de la dite enzyme de restriction de type Ils, 25 le site de reconnaissance de la susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur d'ADN double brin A(i-1,i) en amont de la dite séquence d'intérêt et le site de reconnaissance de ta susdite enzyme de restriction de type Ils de l'adaptateur d'ADN double brin A(i,i+1) en aval de la dite séquence spécifique étant convergents, (501 étant la séquence d'intérêt (SI)1 dans laquelle i=1 30 (Sl)n étant la séquence d'intérêt (S1)i dans laquelle i=n n étant un nombre entier allant de 2 à 100, i allant de 1 à n, i étant différent de n quand i=1, et quand i=n alors i+1 est 1, 1! 3032447 122 et lorsque i=1, alors i-1=n, de sorte que la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont de (51)1, si-1, est la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval de (SI)n, sn +1, et lorsque i=n alors la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval de (SI)n, sn+1, 5 est la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont de (SI)1, si-1, laquelle étape conduit : - à l'élimination des sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction de type Ils utilisée, - à la formation d'une extrémité cohésive constituée par une suture monobrin d'au moins 2 nucléotides, 10 à chacune des extrémités amont et aval de chacune des (51)i et - à l'appariement par complémentarité nucléotidique de la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de (SI» avec la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont de la (SI)i+1, et de la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont de la (51)i avec la susdite suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de (51)i-1 15 et au positionnement des susdites (SI» de façon contigile les unes aux autres, selon un ordre et un sens unique et déterminé, b) une étape de ligation des susdites sutures monobrins cohésives d'au moins 2 nucléotides pour obtenir un vecteur circulaire d'ADN double brin. 20 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'étape (a) de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre, en présence d'une seule enzyme de restriction de type Ils, est effectuée à une température allant de 20°C à une température de 55°C, pendant une période allant de 25 2 minutes à une période de 30 minutes, l'étape (b) de ligation est effectuée à une température allant de 10°C à une température de 40°C pendant une période allant de 2 min à un période de 30 min, (a) et (b) pouvant être répétées de 1 à 49 fois, le dit procédé comprenant en outre, 30 (c) au moins une étape d'incubation à une température de 41 à 60°C pendant une période allant de 0.5 à 15 min et 3032447 123 (d) une étape d'incubation à une température de 61 à 90°C pendant une période allant de 0.5 à 15 minutes. 4. Procédé de fabrication d'un vecteur circulaire d'ADN double brin selon l'une quelconque des 5 revendications précédentes dans lequel l'une des au moins deux SI comprend au moins une unité non fonctionnelle. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'enzyme de restriction de type Ils est une enzyme de restriction de type Ils choisie parmi Bsal, Eco31I, Bbsl, Bpil, BsmBl, Esp3l, BspMI, 10 13fuAl et Bvel. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'adaptateur d'ADN double brin en aval ou en amont de la dite séquence d'intérêt, comprend au moins un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type Ilp, avantageusement au moins un site de reconnaissance d'une 15 enzyme de restriction rare telles que Notl, Pacl, Pmel, 5wal, Smil, Sgsl, SgrDI, SgrAl, Sbfl, Fsel, Ascl, AsiSI, Mrel, Mssl et plus avantageusement deux sites de reconnaissance d'enzymes de restriction choisis parmi Kpnl et Agel, EcoRI et BstBl, Sall et Mlul. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel [es adaptateurs d'ADN 20 double brin en amont et en aval de la dite séquence d'intérêt ne comprennent aucun site de reconnaissance d'une enzyme de restriction de type ils autre que celui de l'enzyme de restriction de type Ils, présente dans l'étape de mise en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, différentes l'une de l'autre. 25 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprend de 2 à 10 nucléotides, de préférence de 2 à 5 nucléotides, et plus particulièrement 4 nucléotides. 30 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel chaque suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à partir d'une brique moléculaire s'apparie avec une suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à partir d'une autre brique moléculaire. 3032447 124 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée à chacune des extrémités amont et aval de la séquence d'intérêt, comprend une séquence de « 4' combinaisons possibles excluant les z * z combinaisons qui 5 résultent en un palindrome d'ADN dans laquelle z est compris de 2 à 10 et z est le nombre de nucléotides de la suture mono brin. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la suture mono brin cohésive d'au moins 2 nucléotides en amont et aval de la séquence d'intérêt, est conçue à l'aide d'une 10 matrice de score. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la dite enzyme de restriction de type Ils coupe l'ADN à une distance allant de 2 à 15 nucléotides, 2 à 14, 2 à 13, 2 à 12, 2 à 11, 2 à 10, 2 à 9, 2 à 8, 2 à 7, 2 à 6, 2 à 5, 2 à 4, 2 à 3 nucléotides du site de reconnaissance spécifique de 15 la dite enzyme de type Ils. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont n'est pas complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en aval, à l'exception 20 de la séquence complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides générée en amont de la (SI)1, (si-1), qui est complémentaire de la suture monobrin cohésive d'au moins 2 nucléotides en aval de la séquence (SI)n, (sn+1). 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant, avant l'étape de mise 25 en contact simultanée d'au moins deux briques moléculaires, une étape de préparation de chacune des briques moléculaires, par synthèse chimique ou par une étape d'amplification par PCR de la séquence d'intérêt contenue dans une brique à l'aide d'une amorce sens comprenant, de 5' en 3', une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur, et au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt et d'une amorce anti-sens comprenant de 5' en 3' au moins 14 nucléotides de la séquence d'intérêt et au moins 30 une séquence correspondant à la séquence de l'adaptateur. 3032447 125 15. Vecteur circulaire d'ADN double brin tel qu obtenu par mise en oeuvre selon I une quelconque des revendications 1 à 14 16. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant l'expression 5 simultanée de multiples transgènes et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ul, nxU2a et mxU2b, U1 représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase II et dont le produit d'expression est une protéine, U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n-Em_2, l'unité U1 pouvant être contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2b, 15 l'unité Ul étant de préférence contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2b. 17. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant de sélectionner l'intégration des transgènes par recombinaison non homologue dans le génome cible et consistant en une 20 séquence comprenant [es unités fonctionnelles suivantes : Ul, nxU2a, mxU2b et U3a, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase II et dont le produit d'expression est une protéine, U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN 25 polymerase Ill et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n-Fm2, U3a représentant un gène de sélection positive, l'unité U1 pouvant être contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2b, 30 elles-mêmes pouvant être contiguës à U3a, l'unité Ul étant de préférence contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant de préférence contiguës à U3a. 3032447 126 18. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant de sélectionner l'intégration simultanée de multiples de transgènes par recombinaison homologue dans le génome cible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : U1, U3b, nxU2a, mxU2b, 5 U3a et U3c, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U3b représentant motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Il et dont le produit d'expression est une protéine, 10 U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase Ill et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n-Fril_2, U3a représentant un gène de sélection positive, U3c représentant motif 3' d'une séquence de recombinaison homologue X, l'unité Ul étant contiguë à U3b, elle-même étant contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant contiguës à l'unité U3a, elle-même étant contiguë à l'unité U3c. 19. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant d'éliminer les cellules hôtes ayant intégré un ou des transgènes par recombinaisons non-homologue et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ul, U3b, nxU2a, mxU2b, U3a, U3c et U3d, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U3b représentant motif 5' d'une séquence de recombinaison homologue X U2a représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN 25 polymerase Il et dont le produit d'expression est une protéine, U2b représentant une unité fonctionnelle d'expression dont le promoteur est dépendant de l'ARN polymerase III et dont le produit d'expression est un ARN non codant, n étant supérieur ou égal à 0, m étant supérieur ou égal à 0, sous réserve que n+rn2, 30 U3a représentant un gène de sélection positive, U3c représentant motif 3' d'une séquence de recombinaison homologue X, U3d représentant un gène de sélection négative, 3032447 127 l'unité UI étant contiguë à l'unité U3b, elle-même étant contiguë aux unités nxU2a, elles-mêmes étant contiguës aux unités mxU2b, elles-mêmes étant contiguës à l'unité U3a, elle-même étant contiguë à l'unité U3c, elle-même étant contiguë à l'unité U3d. 5 20. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant d'exprimer un ou plusieurs transgènes de façon inductible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : Ui., U2c, nxU2d, et mxU2e, Ul représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2c représentant un gène codant un transactivateur transcriptionel, 10 U2d représentant un gène dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, U2e représentant un gène dont le promoteur n'est pas dépendant du transactivateur codé par le gène U2c, n étant supérieur ou égal à 1, m étant supérieur ou égal à 0, 15 l'unité Ul pouvant être contiguë à l'unité U2c, elle-même pouvant être contiguë aux unités nxU2d, elles-mêmes pouvant être contiguës aux unités mxU2e; l'unité UI étant de préférence contiguë à l'unité U2c, elle-même étant de préférence contiguë aux unités nxU2d, elles-mêmes étant de préférence contiguës aux unités mxU2e. 20 21. Vecteur d'ADN double brin, dépourvu de site de clonage multiple et permettant de réaliser de la complémentation génétique sous contrôle inductible et consistant en une séquence comprenant les unités fonctionnelles suivantes : U., U2f, U2c, et U2g, représentant une unité fonctionnelle bactérienne, U2c représentant un gène codant un transactivateur transcriptionelle, U2f représentant un gène dont le promoteur est un promoteur à ARN polymérase III et dont le produit d'expression est un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) précurseur d'un petit ARN interférant ciblant un gène X, U2g représentant un gène dont le promoteur est dépendant du transactivateur codé par le gène U2c et dont le produit d'expression est une version mutée du produit du gène X de sorte à être insensible au 30 produit du gène U2f ; l'unité Ui pouvant être contiguë à l'unité U2f, elle-même pouvant être contiguë à l'unité U2c, elle-même pouvant être contiguë à l'unité U2g; 3032447 128 l'unité U1 étant de préférence contiguë à l'unité U2f, elle-même étant de préférence contiguë à l'unité U2c, elle-même étant de préférence contiguë à l'unité U2g.