FR 3034992 A1 20161021 FR 1553344 A 20150415 1 MILIEU PLASMATIQUE EX VIVO AUTOLOGUE RICHE EN PLASMINE ET PROCÉDÉ D'OBTENTION L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament et un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament pour le traitement de traction vitréo-maculaire en ophtalmologie. L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Le traitement de trous maculaires en ophtalmologie résultant de contraintes par tractions tangentielles différentielles survenant entre le corps vitré et la rétine, nécessitent de libérer la rétine de ces contraintes. Des traitements connus sont principalement de nature chirurgicale et visent à séparer mécaniquement la rétine et le corps vitré. On connaît en particulier (WO 2004/052228) une composition comprenant une forme tronquée d'une plasmine comprenant un domaine catalytique de la plasmine et l'utilisation d'une telle plasmine tronquée dans une méthode de traitement ou de prévention d'un trouble visuel. Une telle plasmine tronquée est une plasmine recombinante et ne peut pas être une protéine autologue. En outre, une telle plasmine recombinante est complexe dans sa fabrication. Son coût est élevé, de sorte que des solutions alternatives à l'utilisation d'une plasmine recombinante dans une méthode de traitement thérapeutique sont recherchées, avec lesquelles par ailleurs, les risques inflammatoires seraient minimisés. On connait aussi de WO 2010/125148 une composition de traitement ophtalmique obtenue par addition d'urokinase à un milieu plasmatique aux fins de conversion de plasminogène d'un plasma sanguin en plasmine. Un traitement ophtalmique mettant en oeuvre une telle composition provoque une réaction immunitaire chez le patient et décrit l'utilisation de dexaméthasone à titre de composé anti-inflammatoire. Une alternative à l'utilisation d'une telle composition est proposée par l'invention. 3034992 2 L'invention vise donc à pallier à l'ensemble de ces problèmes. Pour ce faire, l'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine -notamment de 5 plasminogénase- hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de 10 milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 15 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de paranitro-aniline (en iumole de de para-nitro-aniline) par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Dans tout le texte, on adopte la terminologie suivante : 20 - l'expression « milieu plasmatique sanguin » désigne tout milieu liquide sensiblement exempt de cellules sanguines résultant directement d'une centrifugation de sang -notamment de sang humain- liquide non coagulé, dans des conditions adaptées pour permettre une séparation des cellules sanguines (hématies, leucocytes, plaquettes) et du milieu plasmatique sanguin ; 25 - le terme « plasminogénase » désigne toute enzyme présentant une activité enzymatique de conversion de plasminogène en plasmine par clivage d'une liaison peptidique du plasminogène ; 3034992 3 - l'expression « au moins sensiblement » indique, de façon habituelle, qu'une caractéristique structurelle -telle qu'une valeur- ou fonctionnelle, ne doit pas être prise comme marquant une discontinuité abrupte, qui n'aurait pas de sens physique, mais couvre non seulement cette structure ou cette fonction, mais 5 également des variations légères de cette structure ou de cette fonction qui produisent, dans le contexte technique considéré, un effet de même nature, sinon de même degré ; - le terme « hétérologue » qualifie une substance biologique provenant d'un tiers organisme vivant et susceptible d'être reconnue par le système 10 immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire. Cette définition s'étend à un milieu plasmatique « hétérologue », c'est-à-dire un milieu plasmatique comprenant au moins un composé susceptible d'être reconnu par le système immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire chez ledit 15 patient ; - le terme « autologue » qualifie un composé et s'étend à une composition, notamment à un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin prélevé chez un patient unique, sensiblement exempt(e) de matière biologique issue d'un tiers organisme et 20 susceptible d'être administré(e) à ce même patient -notamment par voie intraveineuse- sans induire de réaction immunitaire et/ou inflammatoire significative chez ce patient. Un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est obtenu à partir du sang d'un patient unique et est propre et destiné au traitement exclusif de ce patient unique. 25 L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, c'est-à-dire un milieu plasmatique extrait du corps humain ou animal, qui est autologue, c'est-à-dire qui est obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin d'un individu unique et administré au même individu sans apport irréversible de composé hétérologue dans le milieu plasmatique sanguin ex 30 vivo autologue riche en plasmine. Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de substance -notamment de substance 3034992 4 biologique- hétérologue. Le milieu plasmatique ex vivo autologue est riche en plasmine, c'est-à-dire dont l'activité plasmine est supérieure à un niveau basal d'activité plasmine du milieu plasmatique sanguin à partir duquel a été obtenu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. 5 Le substrat chromogène S-2251 est un tri-peptide de formule H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf et distribué par Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par 10 millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique 15 ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement -notamment totalement-exempt de cellules sanguines. Avantageusement et selon une variante de l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de tout composé anti-inflammatoire tel que, par exemple, la dexaméthasone. 20 Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention se distingue : - du sang au moins par le fait qu'il est exempt de cellules sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin in vivo par le fait qu'il est exempt de cellules 25 sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin ex vivo au moins par le fait qu'il est riche en plasmine, et ; - du plasma sanguin riche en plasmine de WO 2010/125148 au moins par le fait qu'il est sensiblement exempte de plasminogénase hétérologue. 30 Selon l'invention, on détermine l'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par mesure de la vitesse initiale 3034992 5 d'hydrolyse à 37°C du substrat chromogène S-2251 et d'apparition de la para-nitroaniline dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par une méthode dans laquelle : - dans une cuvette de mesure d'un spectrophotomètre, on mélange à 5 37°C un volume -notamment 0,4 mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine préalablement dilué 10 fois dans un tampon salin aqueux et un même volume d'une solution de substrat chromogène S-2251 dans l'eau ultra-pure à une concentration de 2 mM de façon à former un milieu de mesure dans lequel la concentration initiale en substrat chromogène S-2251 est de 1 mM, puis ; 10 - à compter du mélange, on mesure et on enregistre (par exemple en continu) l'absorbance (ou densité optique, DO) à 405 nm du milieu de mesure maintenu à la température de 37°C, et ; - à partir de cet enregistrement, on évalue la vitesse initiale Vi de la réaction exprimée en A -abs / min, et on calcule l'activité plasmine -exprimée en 15 U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine- selon la formule (II) ci-après : Vi * Vm *no Activité plasmine = s*L*Vp ' dans laquelle : - Vi est la vitesse initiale -ou la dérivée première à l'origine, ou la pente 20 à l'origine- exprimée en Aabs / Mill ; - Vm est le volume (en mL) total du milieu de mesure ; - c est le coefficient d'extinction moléculaire de la para-nitro-aniline à 405 nm (10 000 M-1.cm-1) ; - L est la longueur (en cm) du trajet optique de la cuve de mesure 25 spectrophotométrique, et ; - Vp est le volume (en mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine introduit dans la cuve de mesure spectrophotométrique. Le cas échéant, on mesure à titre de contrôle l'activité plasmine basale d'un milieu plasmatique sanguin non enrichi en plasmine en 30 remplaçant dans le protocole ci-dessus le milieu plasmatique ex vivo autologue riche (II) 3034992 6 en plasmine par le même volume de milieu plasmatique sanguin duquel est issu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. On déduit de la valeur d'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine la valeur d'activité plasmine basale ainsi calculée. 5 Avantageusement et selon l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 400 iLt.g -notamment inférieure à 200 iug, de préférence inférieure à 100 iug, en particulier inférieure à 50 iug, plus préférentiellement inférieure à 25 iug- par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon 10 l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 10 µg/mL -en particulier inférieure à 5 µg/mL, de préférence inférieure à 2 µg/mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Cette proportion de protéine hétérologue dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est adaptée pour limiter au maximum -voire ne pas 15 induire- de réaction immunitaire et/ou inflammatoire chez le patient donneur du milieu plasmatique sanguin et receveur du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est au moins sensiblement exempt de tout 20 germe microbien, en particulier de tout germe microbien pathogène. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est stérile. On détermine le caractère stérile du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par tout moyen approprié de diagnostic microbiolo gigue. 25 Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement apyrogène. On valide les conditions d'obtention d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine apyrogène par la mesure de la température corporelle d'un lapin ayant reçu une injection de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu à partir 30 d'une quantité de milieu plasmatique sanguin dudit lapin. L'absence d'augmentation de la température corporelle du lapin suite à l'injection traduit le 3034992 7 caractère apyrogène du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et valide les conditions de son obtention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de 5 médicament. L'invention vise donc toute indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention à titre de médicament. L'invention vise la première indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention vise aussi toute deuxième indication 10 thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. L'invention vise aussi toute deuxième indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament lors d'une intervention 15 chirurgicale intra-vitréenne d'un traitement en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. 20 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo-maculaire (TVM) en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à une composition thérapeutique 25 comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. L'invention s'étend aussi à une telle composition thérapeutique : - pour son utilisation comme médicament, 30 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale, 3034992 8 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique, - pour son utilisation comme médicament dans un traitement d'une traction vitréo-maculaire (TVM), - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique 5 en application oculaire intra-vitréenne par injection ou lors d'une intervention chirurgicale à l' oeil. L'invention s'étend aussi à un procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un 10 milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine de plasminogène du 15 milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène, ladite plasminogénase étant liée à un support solide, insoluble en solution aqueuse ; - on met en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin pendant une durée et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique 20 sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; - on réalise une séparation par filtration de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, ladite séparation étant une séparation par filtration sur filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium et adaptée pour former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en 25 plasmine exempt de composition enzymatique. Avantageusement et selon l'invention, pour préparer le milieu plasmatique sanguin, on procède à un prélèvement de sang du patient unique, puis à une séparation -notamment par centrifugation ou par fractionnement dans un procédé de micro-fluidique- du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines 30 (plaquettes, hématies et leucocytes) dans des conditions aptes à empêcher la coagulation du sang. On réalise un tel prélèvement sanguin, par exemple en utilisant 3034992 9 un tube de prélèvement de type Vacutainer® (BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprenant un anticoagulant du type EDTA ou citrate de sodium. On procède ensuite à la séparation On réalise une étape de séparation du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines (plaquettes, hématies et leucocytes) 5 par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min. On prélève le milieu plasmatique sanguin surnageant, par exemple par aspiration. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé des endopeptidases à sérine -notamment des endopeptidases à activité 10 antithrombotiques- de la classe EC 3.4.21 de la classification des enzymes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé d'une urokinase, d'une streptokinase, d'une nattokinase et d'un activateur tissulaire du plasminogène (t-PA). Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase est 15 l'urokinase U0633 (Sigma-Aldrich, Lyon, France). Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée par au moins une liaison stable au support solide lorsque la composition enzymatique est immergée dans le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, au moins une liaison 20 stable est choisie pour résister à une mise en contact avec une solution saline aqueuse de haute force ionique, notamment avec une solution aqueuse de NaCI 0,5 M. Avantageusement et selon l'invention, la composition enzymatique est formée d'une plasminogénase immobilisée sur un support solide 25 par une liaison stable choisie dans le groupe formé d'une liaison covalente, d'une liaison ionique, d'une liaison covalente de coordination (ou liaison dative) et d'une interaction hydrophobe de type van der Waals. Une telle liaison est qualifiée de liaison stable lorsqu'elle ne permet pas sensiblement de libération de plasminogénase dans le milieu plasmatique sanguin dans lequel la composition 30 enzymatique est immergée à 37°C pendant la conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique sanguin. 3034992 10 Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée au support solide par au moins une liaison covalente. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la composition enzymatique est choisi pour pouvoir être immergé dans le milieu 5 plasmatique sanguin et présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu par action de la composition enzymatique sur le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 10 composition enzymatique présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine sur un filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 15 composition enzymatique est à l'état divisé et formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 !am. Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé d'un matériau poreux présentant un diamètre moyen de pores compris entre 5 20 nm et 50 nm, de préférence compris entre 10 nm et 20 nm. Avantageusement et selon l'invention, le support solide -notamment le support solide à l'état divisé- est formé d'un matériau choisi dans le groupe formé des poly-glucosides et des polymères méthacrylates. Avantageusement, le support solide peut être formé des supports SEPABEADS® 25 EC-HFA/S et GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM. Avantageusement, le support solide à l'état divisé est formé de particules sphériques de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Avantageusement et selon l'invention, on réalise la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique 30 par filtration au moyen d'un filtre apte à retenir la composition enzymatique et à former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et sensiblement 3034992 11 exempt de plasminogénase hétérologue. Avantageusement, la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique est une séparation stérilisante et d'obtention du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et stérile. 5 Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, la durée de contact est 10 supérieure à 5 min, notamment comprise entre 5 min et 60 min. Avantageusement et selon l'invention, on met et on maintient en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin sous agitation et à la température de 37°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise au moins une 15 étape du procédé sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on réalise toutes les étapes sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on utilise une composition enzymatique stérile et on met le milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène en contact avec la composition enzymatique stérile 20 dans un récipient hermétiquement clos. On obtient un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine qui est stérile, sensiblement non immunogène et qui est notamment adapté pour pouvoir être utilisé en injection autologue dans le cadre de tout traitement préventif ou curatif d'une pathologie dans lequel une transformation de 25 plasminogénase en plasmine autologue est requise, par exemple dans le cadre du traitement d'une pathologie cardiovasculaire ou dans le cadre d'une intervention chirurgicale, en particulier lors d'une intervention intra-vitréale d'un traitement -notamment lors d'une intervention chirurgicale- de troubles vitréo-maculaires en ophtalmologie. 30 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine susceptible d'être obtenu par un procédé selon 3034992 12 l'invention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu directement par un procédé selon l'invention. L'invention concerne également un milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en 5 plasmine pour son utilisation à titre de médicament, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement de troubles vitréo-maculaires et un procédé de préparation d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après. 10 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et aux exemples illustratifs de l'invention donnés à titre indicatif et non limitatif. Plasminogénase immobilisée sur un support solide On prépare une composition enzymatique formée d'une 15 plasminogénase -notamment une urokinase- immobilisée sur un support solide par un procédé dans lequel on choisit un matériau solide à l'état divisé dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux, notamment dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux présentant des groupements surfaciques réactifs de greffage et de nature époxydique. On choisit par exemple le matériau solide dans le 20 groupe formé du matériau Epoxy-GE Healthcare (GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM) et du matériau SEPABEADS® EC-EP/S (Resindion, Binasca, Italie). À titre d'exemple, le matériau solide est le SEPABEADS® EC-HFA/S (Resindion, Binasca, Italie) formé de particules de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Les particules du SEPABEADS® EC-HFA/S sont 25 formées de polyméthacrylate et fonctionnalisées en surface par des groupements amino-époxyde de formule (III) ci-après : OH H /1\10(i) REVENDICATIONS1/ - Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de para- nitro-aniline par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 2/ - Milieu plasmatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitroaniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 3/ - Milieu plasmatique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de paranitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 4/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 400 iLt.g par 25 millilitre (mL) de milieu plasmatique. 3034992 18 5/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la proportion de protéine hétérologue est inférieure à 10 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 6/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 5 en ce qu'il est stérile. 7/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est apyrogène. 8/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 7, pour son utilisation à titre de médicament. 10 9/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 8, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. 10/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 9, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo15 maculaire (TVM) en ophtalmologie. 11/ - Composition comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10 et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. 12/ - Procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo 20 autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin, ladite plasminogénase étant liée à un support solide insoluble en solution aqueuse et formé d'un matériau poreux ; - on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin pendant une durée de contact et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; 3034992 19 - on réalise une filtration dudit milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine sur filtre présentant un seuil de coupure inférieur ou égal à 0,22 Lam de façon à obtenir un filtrat constituant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine stérile et exempt de composition enzymatique. 5 13/ - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la durée de contact est supérieure à 5 min. 14/ - Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin sous agitation et à température de 37°C.