FR 3025517 A1 20160311 FR 1458469 A 20140910 1 LIGANDS POTENTIALISANTS DE LA BIOACTIVITE DES GONADOTROPHINES DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à des anticorps dirigés contre l'hormone folliculo-stimulante (FSH) capables de potentialiser la bioactivité des gonadotrophines. La présente invention trouve ses applications principalement en médecine humaine et vétérinaire, pour induire l'ovulation chez un mammifère femelle. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les gonadotrophines (ou gonadotropines) sont des hormones glycoprotéiques complexes jouant un rôle central dans la régulation de la reproduction chez les vertébrés en agissant sur les fonctions des gonades (ovaires et testicules). Deux de ces hormones sont sécrétées chez tous les vertébrés : l'hormone lutéinisante (LH) et l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Chez deux groupes de mammifères, équidés et primates, il existe en outre une gonadotrophine chorionique (CG) sécrétée par le placenta : la choriogonadotropine humaine (hCG) et la choriogonadotropine équine (eCG) qui agissent toutes deux via des récepteurs LH. L'hormone lutéinisante (LH) est produite par les cellules gonadotropes du lobe antérieur de l'hypophyse sous stimulation de la GnRH, elle-même produite par l'hypothalamus. La LH stimule la production de testostérone chez les mâles, tandis qu'elle intervient dans les modifications du cycle ovarien chez les femelles où elle est responsable de la croissance folliculaire terminale et de l'ovulation puis de la transformation du follicule ovulatoire rompu en corps jaune. Pendant la phase lutéale du cycle menstruel, la LH stimule la sécrétion de progestérone par le corps jaune, indispensable au développement précoce et à l'implantation de l'embryon. La LH est constituée d'une sous-unité a commune à toutes les hormones glycoprotéiques d'une même espèce (comme la FSH, la CG et l'hormone thyréostimulante, la TSH) et d'une sous-unité [3 responsable de la 3025517 2 spécificité d'activité de l'hormone ; activité qui n'existe que si les deux sous-unités sont associées de manière non covalente sous-forme d'un dimère. L'hormone folliculo-stimulante (ou FSH) est produite par l'anté-hypophyse sous stimulation de la GnRH produite par l'hypothalamus. Chez les mâles, elle 5 stimule les cellules de Sertoli indispensables à la spermatogénèse. Chez les femelles, elle est responsable du recrutement des follicules primordiaux, immatures, de leur croissance et de leur différentiation en follicules pré-ovulatoires en stimulant les récepteurs FSH des cellules de la granulosa. La FSH est constituée de deux sous-unités a et [3, et a une structure semblable à celle de 10 la LH. Seul le dimère est capable de stimuler les récepteurs FSH. Chez les femelles, les taux de LH et de FSH sont cycliques : très faibles en période de repos sexuel ou en dehors de la période ovulatoire, avec un pic de sécrétion en période préovulatoire. Les gonadotrophines sont utilisées en médecine vétérinaire et humaine, 15 pour induire l'ovulation chez les mammifères femelles. Bien qu'efficaces, ces traitements présentent un risque sanitaire du fait de l'utilisation d'hormones extraites à partir de fluides biologiques (sang, urine) ou de tissus (hypophyses), particulièrement dans le domaine vétérinaire. C'est le cas de la chorionic gonadotropine équine (eCG) extraite à partir de sang de juments gravides, et de 20 la LH et FSH porcines extraites à partir d'hypophyses de porc. Dans le domaine vétérinaire, on utilise également une hCG extraite à partir d'urine de femmes enceintes, le Chorulon® (Laboratoire MSD). Dans le domaine de la clinique humaine, et particulièrement de la Procréation Médicalement Assistée (ou PMA), on utilise des hormones extraites à 25 partir d'urine de femmes ménopausées telles que Fostimon® (Laboratoire Genévrier) qui est une FSH purifiée et Menopur® (Laboratoire Ferring Pharmaceuticals) qui est une hMG (human menoposal gonadotropin), mélange de FSH et de LH et la Gonadotropine Chorionique Endo5000 qui est une hCG purifiée (Laboratoire Schering-Plough). On utilise également des FSH humaines 30 recombinantes, telles que Gonal-F® (Laboratoire Merck Serono) et Puregon® (Laboratoire Merck Shering-Plough); des hCG et LH recombinantes telle que Ovidrel® et Luveris® (Laboratoire Merck Serono). En outre l'usage répété de ces hormones induit le plus souvent une réaction immunitaire qui vient neutraliser l'effet des hormones conduisant ainsi à une 35 baisse d'efficacité thérapeutique. Cependant, il a également été mis en évidence 3025517 3 dans quelques cas que la réaction immunitaire pouvait produire des anticorps capables de potentialiser l'activité de l'hormone lorsqu'elle était co-administrée (Brevet EP 1518863) [1]. Depuis, il a également été mis en évidence trois anticorps monoclonaux anti-LH capables de potentialiser son action ainsi que 5 celle de la FSH pour deux d'entre eux (Demande Internationale WO 2012/066519) [2]. Description de l'invention Les Inventeurs ont maintenant obtenu des anticorps monoclonaux produits 10 contre la sous-unité [3 de la FSH, capables de potentialiser son action ainsi que celle de la LH et de la hCG. Ces anticorps monoclonaux sont respectivement dénommés CA5, CH10 et CF12. L'hybridome qui a produit l'anticorps CA5 a été déposé conformément au 15 Traité de Budapest, le 03/10/2013 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM 1-4801. L'hybridome qui a produit l'anticorps CH10 a été déposé conformément au Traité de Budapest, le 03/10/2013 auprès de la CNCM (Collection Nationale de 20 Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM 1-4802. L'hybridome qui a produit l'anticorps CF12 a été déposé conformément au Traité de Budapest, le 03/10/2013 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 25 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM 1-4803. Les séquences nucléotidiques des régions variables des chaines lourdes et légères des anticorps CA5, CH10 et CF12 ont été déterminées, les séquences peptidiques correspondantes déduites. Elles sont présentées respectivement dans les tableaux 1 à 3 ci-dessous. 30 Tableau 1 Anticorps monoclonal CA5 Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCT GGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTT CAGTGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAG nucléotidique (SEQ ID NO : 1) 3025517 4 AGACTGGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAAGGATT ATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGT CTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAATG CCCTGAGAGCTGAGGACACTGCCATTTATTTCTGTGCAAGAGAT GCAAGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCT CTGCA Séquence EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEVVVRQPPGKR LEWIAASRNKAKDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRA EDTAIYFCARDARFAYWGQGTLVTVSA peptidique (SEQ ID NO : 2) Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGT TGGAGAGAAGATTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTT TATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAG AAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCAC TAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAG ACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTCGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA nucléotidique (SEQ ID NO : 3) Séquence DIVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQK PGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAV YYCQQYYSYPRTFGGGTKLEIK peptidique (SEQ ID NO : 4) Tableau 2 Anticorps monoclonal CH10 Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTA AAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTC AATACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGG GTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTAT GCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTC CAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACT TGAAAACTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTGAGACAGGAT TACTACGGTAGTAGCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCA CTCTCACAGTCTCCTCA nucléotidique (SEQ ID NO : 5) Séquence EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNVVVRQAPGKG 3025517 5 peptidique LEVVVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLK TEDTAMYYCVRQDYYGSSYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO : 6) Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCC AGGAGATAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATT AGCGACTACTTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCC AAGGCTTCTCATCAAATATGCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCC CCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACTCT CAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTGGAGTGTATTACT GTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAA nucléotidique (SEQ ID NO : 7) Séquence DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPR LLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNG HSFPYTFGGGTKLEIK peptidique (SEQ ID NO : 8) Tableau 3 Anticorps monoclonal CF12 Chaîne lourde (VH) Séquence CAGGGTCAGATGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCT GGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTTCACCT TCAGCAGTAGCTATATAAGTTGGTTGAAGCAAAAGCCTGGACAG AGTCTTGAGTGGATTGCATGGATTTATGCTGGAACTGGTGGTAC TAGCTATAATCAGAAGTTCACAGGCAAGGCCCAACTGACTGTAG ACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAATTCAGCAGCCTGAC AACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGACACGGGTCCT ACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTC A nucléotidique (SEQ ID NO : 9) Séquence QGQMQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISWLKQKPGQS LEVVIAVVIYAGTGGTSYNQKFTGKAQLTVDTSSSTAYMQFSSLTTE DSAIYYCARHGSYFDYWGQGTTLTVSS peptidique (SEQ ID NO : 10) Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCT nucléotidique AGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTT (SEQ ID NO : 11) GATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACC 3025517 6 AGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAG AATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC AGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCT GCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTT CGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA Séquence DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPG peptidique QPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC (SEQ ID NO : 12) QQSNEDPYTFGGGTKLEIK Les séquences codant pour les CDRs (régions déterminant la complémentarité) ont été déterminées à partir des séquences des régions variables des chaînes lourdes (VH-CDR) et légères (VL-CDR) des anticorps CA5, CH10 et CF12 ci-dessus. Les séquences peptidiques correspondantes ont été 5 déduites, et sont présentées respectivement dans les tableaux 4 à 6 ci-dessous. Tableau 4 Anticorps monoclonal CA5 VH-CDR1 (SEQ ID NO : 13) GFTFSDFY VH-CDR2 (SEQ ID NO : 14) SRNKAKDYTT VH-CDR3 (SEQ ID NO : 15) ARDARFAY VL-CDR1 (SEQ ID NO : 16) QSLLYSSNQKNY VL-CDR2 WAS VL-CDR3 (SEQ ID NO : 17) QQYYSYPRT Tableau 5 Anticorps monoclonal CH10 VH-CDR1 (SEQ ID NO : 18) GFTFNTYA VH-CDR2 (SEQ ID NO : 19) IRSKSNNYAT VH-CDR3 (SEQ ID NO : 20) VRQDYYGSSYFDY VL-CDR1 (SEQ ID NO : 21) QSISDY VL-CDR2 YAS VL-CDR3 (SEQ ID NO : 22) QNGHSFPYT Tableau 6 Anticorps monoclonal CF12 VH-CDR1 (SEQ ID NO : 23) GFTFSSSY VH-CDR2 (SEQ ID NO : 24) IYAGTGGT VH-CDR3 (SEQ ID NO : 25) ARHGSYFDY 3025517 7 VL-CDR1 (SEQ ID NO : 26) QSVDYDGDSY VL-CDR2 AAS VL-CDR3 (SEQ ID NO : 27) QQSNEDPYT La présente invention a pour objet un ligand de l'hormone folliculostimulante (FSH) potentialisant la bioactivité de la FSH, de l'hormone lutéinisante (LH) et de la gonadotropine chorionique (CG), caractérisé en ce qu'il comprend le paratope d'un anticorps anti-sous-unité [3 de la FSH. 5 On entend par « anticorps anti-sous-unité [3 de la FSH » au sens de la présente invention, tout anticorps obtenu par immunisation d'un animal à partir de premières injections de FSH suivies de plusieurs rappels avec injection de la sous-unité [3 de la FSH. Les injections peuvent être réalisées à partir de FSH de différents mammifères, par exemple de FSH ovine, humaine, bovine, caprine ou 10 porcine, équine, canine, murine etc... et des sous-unités [3 de la FSH d'origine homologue ou hétérologue. Ainsi les anticorps monoclonaux CA5 et CH10 ont été obtenus suite à une immunisation à partir de FSH ovine et de sous-unité [3 de la FSH ovine, alors que l'anticorps monoclonal CF12 a été obtenu suite à une immunisation à partir de FSH humaine et de sous-unité [3 de la FSH humaine. 15 En particulier, la présente invention a donc pour objet un ligand selon l'invention, caractérisé en ce que : le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFSDFY (SEQ ID NO : 13) ; - VH-CDR2, défini par la séquence SRNKAKDYTT (SEQ ID NO : 14) ; 20 - VH-CDR3, défini par la séquence ARDARFAY (SEQ ID NO : 15) ; et le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : - VL-CDR1, défini par la séquence QSLLYSSNQKNY (SEQ ID NO : 16) ; - VL-CDR2, défini par la séquence VVAS ; - VL-CDR3, défini par la séquence QQYYSYPRT (SEQ ID NO : 17). 25 En particulier, la présente invention a donc pour objet un ligand selon l'invention, caractérisé en ce que : le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFNTYA (SEQ ID NO : 18) ; - VH-CDR2, défini par la séquence IRSKSNNYAT (SEQ ID NO : 19) ; 30 - VH-CDR3, défini par la séquence VRQDYYGSSYFDY (SEQ ID NO : 20) ; et le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : - VL-CDR1, défini par la séquence QSISDY (SEQ ID NO : 21) ; 3025517 8 - VL-CDR2, défini par la séquence YAS ; - VL-CDR3, défini par la séquence QNGHSFPYT (SEQ ID NO : 22). En particulier, la présente invention a donc pour objet un ligand selon l'invention, caractérisé en ce que : 5 le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFSSSY (SEQ ID NO : 23) ; - VH-CDR2, défini par la séquence IYAGTGGT (SEQ ID NO : 24) ; - VH-CDR3, défini par la séquence ARHGSYFDY (SEQ ID NO : 25) ; et le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : 10 - VL-CDR1, défini par la séquence QSVDYDGDSY (SEQ ID NO : 26) ; - VL-CDR2, défini par la séquence AAS ; - VL-CDR3, défini par la séquence QQSNEDPYT (SEQ ID NO : 27). On entend par « CDR » au sens de la présente invention, les trois régions hypervariables des régions variables des chaînes lourdes et légères d'un 15 anticorps qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l'anticorps avec l'épitope de l'antigène. Ces trois régions hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la « charpente » (FR ou framework regions) et donnent une configuration stable au domaine variable. 20 Un ligand selon la présente invention est par exemple : - l'anticorps monoclonal CA5 produit par l'hybridome CNCM 1-4801; - l'anticorps monoclonal CH10 produit par l'hybridome CNCM 1-4802 ; - l'anticorps monoclonal CF12 produit par l'hybridome CNCM 1-4803 ; - un fragment Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv ou scFv, un nanobody d'un anticorps 25 ci-dessus. De préférence, il s'agit d'un fragment Fab ou d'un fragment scFv ; - une forme bi-, tri- ou tétravalente (diabodies, triabodies, tétrabodies) de deux, trois ou quatre fragments de scFv, respectivement ; - un anticorps recombinant comprenant le paratope d'un anticorps ci-dessus et dont les régions constantes ont été modifiées de sorte à minimiser 30 l'immunogénicité vis-à-vis de l'animal ou de l'homme auquel il est destiné. Par exemple, il s'agit d'un anticorps chimérique (humanisé, ovinisé, caprinisé, bovinisé, porcinisé etc...) ou entièrement humanisé, ovinisé, caprinisé, bovinisé, porcinisé A titre d'exemple non limitatif, les séquences nucléotidiques de scFv dérivés 35 des anticorps CA5, CH10 et CF12 ont été déterminées, les séquences 3025517 9 peptidiques correspondantes déduites, et sont présentées respectivement dans les tableaux 7 à 9 ci-dessous. Tableau 7 scFv CA5 CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGCGGCGGCCTGGTACAACCT GGTGGCTCACTGCGCCTGAGCTGCGCAACCAGCGGTTTTACCT TTAGCGATTTCTACATGGAATGGGTTCGCCAACCGCCGGGTAA GCGTCTGGAATGGATCGCGGCGAGCCGTAACAAGGCGAAAGA TTATACCACTGAATATAGCGCGTCGGTGAAAGGTCGCTTCATTG TCTCGCGCGATACCAGCCAGTCGATTCTGTATCTGCAAATGAAT GCCCTGCGTGCCGAAGACACGGCCATCTACTTCTGTGCGCGTG ATGCACGCTTTGCCTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGT Séquence nucléotidique TAGCGCCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGTGGCGGTAGCGGTGG CGGTGGCTCAGATATTCAGATGACCCAGACCCCGTCAAGCCTG (SEQ ID NO : 28) GCGGTGTCAGTCGGCGAAGAGATTACTATGAGCTGTAAAAGCT CGCAGAGCCTGCTGTACTCATCGAACCAGAAAAATTACCTGGC ATGGTATCAACAGAAGCCGGGTCAGTCGCCGAAACTGCTGATC TACTGGGCCTCAACCCGTGAGAGCGGCGTACCGGATCGCTTTA CTGGCAGCGGCAGCGGCACGGACTTTACGCTGACGATTAGCTC GGTGAAGGCCGAAGACCTGGCGGTTTATTATTGCCAACAGTAC TATAGCTACCCTCGTACCTTCGGCGGCGGCACGAAACTCGAGA TTAAACATCACCATCACCATCACTAACTCGAGATCAAGTAA QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEVVVRQPPGK RLEWIAASRNKAKDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALR Séquence peptidique AEDTAIYFCARDARFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQTPSSLAVSVGEEITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQK (SEQ ID NO 29) PGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAV YYCQQYYSYPRTFGGGTKLEIKHHHHHH Tableau 8 scFv CH10 Séquence CAGGTGCAGCTGCAGCAATCAGGCGGCGGCCTGGTCCAACCG AAAGGTAGCCTGAAACTGTCGTGCGCCGCCAGCGGCTTTACGT TCAACACTTACGCGATGAATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGTAA AGGCCTGGAATGGGTGGCACGCATCCGTTCAAAAAGCAACAAT TACGCGACGTATTATGCAGACAGCGTAAAAGATCGCTTTACCAT nucléotidique (SEQ ID NO : 30) 3025517 Zo CAGCCGTGATGATTCACAGTCAATGCTGTACCTGCAAATGAATA ACCTGAAAACTGAAGACACTGCGATGTATTATTGTGTTCGCCAG GACTATTACGGTAGCTCGTATTTCGATTACTGGGGCCAAGGCA CCACCCTGACGGTGAGCTCGGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGTG GTGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGATATCCAGATGACCCAGA CCCCGGCAACCCTGAGCGTTACCCCTGGTGACCGCGTTTCGCT GAGCTGCCGTGCCTCGCAGAGCATTTCGGACTATCTGCACTGG TATCAGCAAAAATCACACGAATCACCGCGTCTGCTGATTAAGTA CGCCAGCCAATCGATTAGCGGTATTCCGAGCCGCTTTTCGGGC TCGGGTTCGGGCTCGGATTTTACCCTGTCAATTAATAGCGTAGA GCCGGAAGATGTAGGCGTCTACTATTGTCAGAACGGCCATTCA TTCCCGTACACGTTTGGCGGCGGCACCAAGCTCGAGATTAAGC ATCACCATCATCACCATTAACTCGAGATCAAGTAA QVQLQQSGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGK GLEWVARI RSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNL Séquence peptid iq ue KTEDTAMYYCVRQDYYGSSYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDIQMTQTPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQ (SEQ ID NO 31) KSH ESP RLL I KYASQS I SG I PSRFSGSGSGSD FTLS I NSVEP EDVGV YYCQNG HSF PYTFGGGTKLE I KH HHHH H Tableau 9 scFv CF12 CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCGGGTGGCGCAGAGCTGGTGAAA CCGGGTGCGAGCGTTAAACTGAGCTGCAAAACTAGCGGCTTTA CCTTTAGCTCGTCATATATTTCGTGGCTGAAGCAGAAACCGGGC CAGTCACTGGAATGGATTGCGTGGATCTACGCAGGCACGGGTG GCACCTCATATAATCAGAAATTCACCGGTAAAGCGCAACTGACG GTCGATACCAGCAGCAGCACGGCGTACATGCAGTTCAGCTCGC Séquence nucléotidique TGACCACTGAAGATAGCGCAATCTACTATTGTGCACGCCATGGT TCGTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTTT (SEQ ID NO : 32) CAAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGCG GCGGCTCAGATATTCAGATGACCCAGACCCCTGCGAGCCTGGC AGTGTCACTGGGCCAACGCGCAACCATCTCGTGTAAAGCCTCG CAGAGCGTGGATTATGACGGCGATAGCTACATGAACTGGTATC AGCAAAAGCCTGGTCAACCGCCGAAGCTGCTGATTTACGCCGC CAGCAACCTGGAATCGGGCATCCCGGCCCGTTTTAGCGGCTCA 3025517 11 GGCTCGGGTACTGACTTCACGCTGAACATTCACCCGGTAGAAG AAGAAGACGCGGCCACGTATTACTGCCAGCAAAGCAATGAAGA CCCGTACACTTTTGGCGGCGGCACGAAACTCGAGATCAAACAC CATCACCATCACCATTAACTCGAGATCAAGTAA QVQLQQSGGAELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISVVLKQKPGQS LEVVIAVVIYAGTGGTSYNQKFTGKAQLTVDTSSSTAYMQFSSLTTE Séquence peptidique DSAIYYCARHGSYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPG (SEQ ID NO 33) QPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QQSNEDPYTFGGGTKLEIKHHHHHH La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique codant pour un ligand selon l'invention. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, en particulier un vecteur d'expression, comprenant une séquence nucléotidique 5 selon l'invention. La présente invention a également pour objet une cellule hôte comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention ou un vecteur recombinant selon l'invention. Par exemple, il s'agit des hybridomes CNCM 1-4801, CNCM 1-4802 et CNCM 1-4803 ou d'une cellule transformée par une séquence nucléotidique ou un 10 vecteur recombinant selon l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un ligand selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture dans un milieu approprié de cellules hôte selon l'invention, et la récupération dudit ligand à partir de ladite culture. 15 Les Inventeurs ont mis en évidence que l'anticorps CA5 potentialise fortement la FSH porcine, ovine, bovine et de façon moindre bien que significativement la FSH humaine, alors que l'anticorps CF12 potentialise peu bien que significativement la FSH porcine, ovine et bovine contrairement à la FSH humaine qu'il potentialise fortement. En outre, les Inventeurs ont mis en évidence 20 que les scFv dérivés des anticorps CA5, CH10 et CF12, possèdent les mêmes propriétés de liaison et de potentialisation que les anticorps dont ils dérivent. La présente invention a également pour objet un ligand selon l'invention pour une utilisation comme médicament, en particulier pour potentialiser la bioactivité de la FSH, de la LH, et de la gonadotropine chorionique (CG) pour 25 induire l'ovulation chez un mammifère femelle et pour réduire les problèmes 3025517 12 d'infertilité ou d'hypofertilité hormono dépendants chez un mammifère mâle ou femelle. La présente invention a également pour objet un complexe formé d'un ligand et d'une gonadotrophine, ou d'un peptide actif de celle-ci, capable de se 5 lier audit ligand et dont l'activité est potentialisée par ledit ligand. Par exemple, il s'agit du complexe d'un ligand avec la LH, avec l'hormone gonadotropine chorionique (CG), ou avec la FSH extraites de tissus ou de fluides biologiques, ou recombinantes, ou d'un peptide actif de celles-ci capable de se lier audit ligand et dont l'activité est potentialisée par ledit ligand. 10 La présente invention a également pour objet un ligand ou complexe selon l'invention pour utilisation comme médicament, en particulier pour potentialiser la bioactivité de la FSH, de la LH, et de la gonadotropine chorionique (CG) pour induire une ovulation voire une polyovulation chez un mammifère femelle ou pour réduire les problèmes d'infertilité ou d'hypofertilité hormono dépendants chez un 15 mammifère mâle ou femelle. Ledit médicament permet également d'augmenter le taux de progestérone endogène circulant sécrété par un ou plusieurs corps jaunes chez un mammifère femelle, favorisant ainsi le développement embryonnaire précoce et diminuant le risque d'avortement. La présente invention a également pour objet un procédé de production 20 carnée, où ledit procédé comprend l'administration de ligand et/ou de complexe de l'invention à un mammifère femelle animal non humain. La présente invention a également pour objet un ligand et/ou complexe de l'invention pour une utilisation dans le traitement de l'infertilité ou de l'hypofertilité hormono dépendante chez un mammifère. Dans le cas d'un mammifère femelle 25 souffrant d'infertilité ou d'hypofertilité, l'administration du ligand ou complexe de l'invention va permettre de stimuler une procréation naturelle, médicalement assistée ou artificielle. Il est à noter que l'administration du ligand ou complexe de l'invention à un mammifère femelle sain va également permettre de déclencher l'ovulation dans le cadre d'une procréation naturelle ou artificielle. 30 On entend par « infertilité/hypofertilité hormono dépendante » au sens de la présente invention, une infertilité/hypofertilité due à une insuffisance hormonale par exemple de faibles concentrations circulantes de FSH et LH ou une absence de ces hormones résultant par exemple d'une cause externe (par exemple les pesticides) ou interne (par exemple, insuffisance hypophysaire ou 35 hypothalamique ou d'un problème de réceptivité des gonades à la LH et/ou la 3025517 13 FSH due à une anomalie des récepteurs ou des gonadotropines LH, FSH, CG par exemple une mutation ou un polymorphisme des récepteurs). Les ligands et complexes de l'invention peuvent être utilisés chez l'homme ou l'animal, en particulier les ovins, bovins, caprins, équins, porcins, murins, 5 canins, camelins etc... Les ligands, les hormones ou les complexes selon l'invention peuvent être administrés soit séparément, soit séquentiellement, soit conjointement, par injection, par exemple intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, transcutanée, intradermique, intraorbitaire, intraoculaire, ophtalmique, 10 ou par voie transoculaire, sans altérer leur effet potentialisant. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un ligand ou complexe de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ladite composition pharmaceutique peut comprendre en outre une FSH et/ou une LH et/ou une hormone gonadotropine 15 chorionique (CG). D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 20 Brève description des figures - La figure 1 illustre l'effet potentialisant in vitro des anticorps monoclonaux CA5 (A) et CH10 (B) sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH), et de l'anticorps monoclonal CF12 (C) sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) sur des cellules de granulosa bovines. 25 - La figure 2 représente l'effet potentialisant in vitro des anticorps monoclonaux CA5 (A) et CH10 (B) sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH), et de l'anticorps monoclonal CF12 (C) sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain. - La figure 3 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CA5 30 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 4 représente l'effet potentialisant de l'anticorps monoclonal CA5 sur la bioactivité de la FSH porcine (pFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 3025517 14 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 5 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CA5 (A à E) et du scFv CA5 (F) sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) sur une 5 lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 6 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CH10 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur 10 Glosensor®. - La figure 7 représente l'effet potentialisant de l'anticorps monoclonal CH10 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) in vitro sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. 15 - La figure 8 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 9 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal 20 CF12 et du scFv CF12 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 10 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 25 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur Glosensor®. - La figure 11 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité de la FSH porcine (pFSH) sur une lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur FSH humain et le vecteur 30 Glosensor®. - La figure 12 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Gonal-F® (B) et Fostimon® (C) sur des cellules de granulosa humaines. 3025517 15 - La figure 13 représente l'effet potentialisant in vitro de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal-F® sur des cellules de granulosa humaines. - La figure 14 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal 5 CA5 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) (A) et sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Gonal-F®, Puregon® et Fostimon® (B) chez le rat femelle. - La figure 15 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal CA5 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal-F® (A) et l'effet potentialisant du scFv CA5 sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Gonal-F® 10 (A), Puregon® et Fostimon® (B) chez le rat femelle. - La figure 16 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal CH10 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) (A) et sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal-F® (B) chez le rat femelle. - La figure 17 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal 15 CH10 sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Puregon® et Fostimon® (A) et l'effet potentialisant du scFv CH10 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal-F® (B) chez le rat femelle. - La figure 18 représente l'effet potentialisant in vivo de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Gonal-F®, Puregon® et 20 Fostimon® (A) et de la FSH ovine (oFSH) (B) chez le rat femelle. - La figure 19 représente l'effet potentialisant in vivo du scFv CF12 sur la bioactivité des FSH humaines (hFSH) Gonal-F® (A et B), Puregon® et Fostimon® (A) et de l'anticorps monoclonal CF12 sur la bioactivité de la FSH humaine (hFSH) Gonal-F selon différents modes d'administration (C) chez le rat femelle. 25 EXEMPLES EXEMPLE 1 : OBTENTION DES LIGANDS DE L'INVENTION, ET LEUR CARACTERISATION 30 1/ Stratégie d'immunisation des souris Les injections ont toutes été réalisées par voie intra-péritonéale sur des souris (Balb/C). Cinq souris ont été utilisées pour chaque stratégie 35 d'immunisation. 3025517 16 Stratégie d'immunisation des souris pour l'anticorps CA5 et l'anticorps CH10 Une première injection (JO) a été réalisée avec 100pg de FSH ovine purifiée 5 avec adjuvant de Freund complet. Plusieurs injections de rappel ont été ensuite réalisées selon la séquence suivante : - J21 et J44 : 100pg de FSH ovine purifiée avec adjuvant de Freund incomplet ; - J134 et J204 : 50pg de sous-unité béta de FSH ovine avec adjuvant de Freund incomplet ; 10 - J217, J218 et J219 : 30pg de sous-unité béta de FSH ovine sans adjuvant ; - J220 : fusion. Stratégie d'immunisation des souris pour l'anticorps CF12 L'immunisation a été réalisée avec plusieurs injections de FSH humaine 15 recombinante (hFSHr). Une première injection (JO) a été réalisée avec 50pg de hFSHr avec adjuvant de Freund complet. Plusieurs injections de rappel ont été ensuite réalisées selon la séquence suivante : - J21 et J35 : injection de rappel de 50pg de hFSHr avec adjuvant de Freund incomplet ; 2 0 - J55, J56 et J57 : injection de 30pg de sous-unité béta de hFSHr sans adjuvant ; - J58 : fusion. 2/ !son/parle 25 L'isotypage des anticorps CA5, CH10 et CF12 a été réalisé avec le kit d'isotypage FastElysa commercialisé par RD Biotech (référence RDB 3255) en suivant les recommandations du fabriquant. L'anticorps CA5 est une immunoglobine de classe IgG2a et d'isotype Kappa. Les valeurs des densités optiques (DO) obtenues ont été 0,335 et 0,371 3 0 respectivement. L'anticorps CH10 est une immunoglobine de classe IgM et d'isotype Kappa. Les valeurs des densités optiques (DO) obtenues ont été 0,2 et 0,124 respectivement. 3025517 17 L'anticorps CF12 est une immunoglobine de classe 1gM et d'isotype Kappa. Les valeurs des densités optiques (DO) obtenues ont été 0,639 et 0,6 respectivement. 5 3/ Séquençage Les séquences nucléotidiques de la partie variable des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) des anticorps CA5, CH10, CF12 sécrétés par les hybridomes CNCM 1-4801, CNCM 1-4802 et CNCM 1-4803, respectivement, ont été 10 déterminées à partir de leur ARN messager (ARNm) selon le protocole ci-après. Les ARN ont été extraits des cellules à l'aide du kit Nucleospin® RNA (Macherey Nagel, Allemagne) en suivant les recommandations du fabriquant. Les concentrations en ARN purifiés ont été estimées par mesure de l'absorbance (A) à 260 nm et leur qualité par le rapport A260nm/280nm et visuellement après 15 migration électrophorétique sur gel d'agarose. Les ADN complémentaires des ARNm ont alors été synthétisés à l'aide d'un oligo-dT18 comme amorce par réaction de rétrotranscription avec l'enzyme M-MLV (Réf. M1701,Promega, USA) en suivant les recommandations du fabriquant. La synthèse du second brin d'ADN a été réalisée par une réaction de 20 polymérisation en chaîne (PCR) selon le protocole suivant : à 4 pI de la réaction de rétrotranscription sont ajoutés dans un volume final de 50 pI ; le tampon de réaction (1X final), 200 pM de chaque dNTPs, 300 nM d'amorces sens et antisens, 1,25 U de GoTaq polymérase (Ref M3175, Promega, USA). Pour l'amplification de la partie variable des chaînes légères, 9 couples 25 d'amorces différents ont été utilisés (MKRev2 à 8 + MKC5For) et 3 couples différents pour celles des chaînes lourdes (CA5: VHRev1 + VHFor, CH10 : VHRev1 + MpCFor, CF12 : VHRev1 ou VHRev2 + MpCFor ). Tableau 10 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CA5. Anticorps CA5 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO VHRev1 CGGGATCCTCTAGAGGTCCAACTGCAGGAGTCA GG SEQ ID NO : 34 VHFor CAGGGGCCAGTGGATAGAC SEQ ID NO : 35 3025517 18 Chaîne légère (VL) MKRev5 GACATTGTGATGACCCAGTCT SEQ ID NO : 36 MKC5For GGATACAGTTGGTGCAGCATC SEQ ID NO : 37 Tableau 11 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer la partie 5' des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CA5. Anticorps CA5 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO CA5VH_Fw CACTTTTACATGGTATCCAGTG SEQ ID NO : 38 CA5VH_Rev GTTTCTACTTGCAGCAATCCACT SEQ ID NO : 39 Chaîne légère (VL) CA5VL_Fw GAWTCACAGRCCCAGGTYC SEQ ID NO : 40 CA5VL_Rev CCCAGTAAATCAGCAGTTTAGGA SEQ ID NO : 41 Tableau 12 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CH10. Anticorps CH10 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO VHRev1 CGGGATCCTCTAGAGGTCCAACTGCAGGAGTCA GG SEQ ID NO : 34 MpCFor GGGGAAGACATTTGGGAAGG SEQ ID NO : 42 Chaîne légère (VL) MKRev2 GATATTGTGATGACGCAGGCT SEQ ID NO : 43 MKRev3 GATATTGTGATAACCCAG SEQ ID NO : 44 MKRev4 GACATTGTGCTGACCCAATCT SEQ ID NO : 45 MKRev6 GATATTGTGCTAACTCAGTCT SEQ ID NO : 46 MKRev8 GACATCCAGCTGACTCAGTCT SEQ ID NO : 47 MKC5For GGATACAGTTGGTGCAGCATC SEQ ID NO : 48 5 Tableau 13 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer la partie 5' des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CH10. Anticorps CH10 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO CH1OVH_Fw ATGGTGTTGGGGCTGAAGTG SEQ ID NO : 49 3025517 19 CH1OVH_Rev CAGTTCATGGCGTAGGTATTGA SEQ ID NO : 50 Chaîne légère (VL) CH1OVL_Fw TTCTGGAYTTCAGCCTCCAG SEQ ID NO : 51 CH1OVL_Rev GATTGGGAAGCATATTTGATGAG SEQ ID NO : 52 Tableau 14 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CF12. Anticorps CF12 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO VHRev1 CGGGATCCTCTAGAGGTCCAACTGCAGGAGTCA GG SEQ ID NO : 34 VHRev2 AGATCTAGAAAGCTTAGGTCAAGCTGCAGCAGTC AGG SEQ ID NO : 53 RilliCFor GGGGAAGACATTTGGGAAGG SEQ ID NO : 42 Chaîne légère (VL) MKRev2 GATATTGTGATGACGCAGGCT SEQ ID NO : 43 MKRev3 GATATTGTGATAACCCAG SEQ ID NO : 44 MKRev4 GACATTGTGCTGACCCAATCT SEQ ID NO : 45 MKRev5 GACATTGTGATGACCCAGTCT SEQ ID NO : 36 MKRev8 GACATCCAGCTGACTCAGTCT SEQ ID NO : 47 MKC5For GGATACAGTTGGTGCAGCATC SEQ ID NO : 48 Tableau 15 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour séquencer la artie 5' des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps CF12. Anticorps CF12 Chaîne lourde (VH) Nom Séquence 5'-3' SEQ ID NO CF12VH_F CAGKAACTGCAGGTGTCCWCT SEQ ID NO : 54 CF12VH_Rev CTGGAGGATGTGTCTACAGTCAG SEQ ID NO : 55 Chaîne légère (VL) CF12VL_Fw CTGCTATGGGTGCTGCTGCTC SEQ ID NO : 56 CF12VL_Rev AGATTGGATGCAGCATAGATGAG SEQ ID NO : 57 5 Le programme de PCR utilisé est composé d'une dénaturation initiale de 2 min à 95°C suivie de 30 cycles de dénaturation 30 sec à 95°C, hybridation 30 sec à 47°C et amplification 1 min à 72°C et enfin d'une amplification finale de 5 min à 3025517 20 72°C. Les produits de PCR obtenus ont été dessalés avec le kit QlAquick®Gel extraction kit (Ref 28704, Qiagen GmbH, Allemagne) puis ligaturés avec le plasmide pGEMT easy vector (Ref A1360, Promega, USA) pour être transformés en bactéries. L'ADN plasmidique extrait de différents clones bactériens a été 5 envoyé pour analyse par séquençage (Macrogen Europe, Pays-Bas). Les séquences nucléotidiques 5' terminales des VH et VL des 3 anticorps ont par la suite été déterminées grâce à la conception d'amorces spécifiques ancrées dans les séquences leader des ADNc (amorce Fw). Ces amorces ont été conçues suite à l'identification d'homologie par alignement entre les séquences 10 VL et VH obtenues précédemment et la base de données du logiciel IMGT/V- QUEST (Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36 : W503-508, 2008; Giudicelli et al.,, Cold Spring Harb Protoc., 2011(6) : 695-715, 2011) [3, 4] et à l'extraction des séquences leader d'intérêt de IMGT/GENE-DB (Giudicelli et al., Nucl. Acids Res., 33 : D256-261, 2005) [5]. Les amorces anti-sens (Rev) ont été conçues dans les 15 séquences VH et VL respectives précédemment déterminées de chacun des anticorps. Le protocole utilisé pour obtenir la partie S'est le même que celui décrit au paragraphe précédent. Les séquences nucléotidiques consensus ont été déduites de l'alignement des séquences en utilisant le logiciel MultAlin (Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22) : 20 10881-10890, 1988) [6]. La transcription en séquences polypeptidiques et l'annotation des CDRs ont été réalisées à l'aide de logiciel IMGT/V-QUEST. Les résultats sont présentés dans les tableaux 16-21. Tableau 16 : Séquences nucléotidiques et peptidiques des parties variables lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps CA5. Anticorps (CA5) Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGG GGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAG TGATTTCTACATGGAGTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGAC TGGAGTGGATTGCTGCAAGTAGAAACAAAGCTAAGGATTATACAA CAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCATCGTCTCCAGAG ACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAATGCCCTGAGAG CTGAGGACACTGCCATTTATTTCTGTGCAAGAGATGCAAGGTTTG CTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA nucléotidique SEQ ID NO : 1 Séquence EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRL 3025517 21 peptidique EVVIAASRNKAKDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDT AIYFCARDARFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO : 2 Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTT GGAGAGAAGATTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTA TATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA CCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGG GAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGC AGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTCGGACGTTCGGT GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA nucléotidique SEQ ID NO : 3 Séquence DIVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAVVYQQKP GQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYY CQQYYSYPRTFGGGTKLEIK peptidique SEQ ID NO : 4 Tableau 17 : Séquences nucléotidiques et peptidiques des parties variables lourdes (VH) et lé ères VL des anticorps CH10. Anticorps CH10 Chaîne lourde (VH) Séquence GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAA AGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAA TACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTT TGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTATGCAAC ATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGA TGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAAACT GAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTGAGACAGGATTACTACGGT AGTAGCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTC TCCTCA nucléotidique SEQ ID NO : 5 Séquence EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNVVVRQAPGKGL EVVVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTE DTAMYYCVRQDYYGSSYFDYWGQGTTLTVSS peptidique SEQ ID NO : 6 Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCA GGAGATAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGC GACTACTTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGG CTTCTCATCAAATATGCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCA nucléotidique SEQ ID NO : 7 3025517 22 GGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCA ACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTGGAGTGTATTACTGTCAAAATG GTCACAGCTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAA ATAAAA Séquence D IVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHVVYQQKSHESPRLL peptidique I KYASQSISG I PSRFSGSGSGSDFTLSI NSVEPEDVGVYYCQNGHSFP SEQ ID NO : 8 YTFGGGTKLEIK Tableau 18 : Séquences nucléotidiques et peptidiques des parties variables lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps CF12. Anticorps CF12 Chaîne lourde (VH) Séquence CAGGGTCAGATGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGG GGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTTCACCTTCAG CAGTAGCTATATAAGTTGGTTGAAGCAAAAGCCTGGACAGAGTCT TGAGTGGATTGCATGGATTTATGCTGGAACTGGTGGTACTAGCTA TAATCAGAAGTTCACAGGCAAGGCCCAACTGACTGTAGACACATC CTCCAGCACAGCCTACATGCAATTCAGCAGCCTGACAACTGAGGA CTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGACACGGGTCCTACTTTGACTA CTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA nucléotidique SEQ ID NO : 9 Séquence QGQMQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISWLKQKPGQSLE WIAWIYAGTGGTSYNQKFTGKAQLTVDTSSSTAYMQFSSLTTEDSAI YYCARHGSYFDYWGQGTTLTVSS peptidique SEQ ID NO : 10 Chaîne légère (VL) Séquence GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTA GGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGA TTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGG ACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCT GGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT CACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCT ATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGG GGACCAAGCTGGAAATAAAA nucléotidique SEQ ID NO : 11 Séquence DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQ PPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQ SNEDPYTFGGGTKLEIK peptidique SEQ ID NO : 12 3025517 23 Tableau 19 : CDR des parties variables lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps CA5 VH-CDR1 (SEQ ID NO: 13) GFTFSDFY VH-CDR2 (SEQ ID NO: 14) SRNKAKDYTT VH-CDR3 (SEQ ID NO: 15) ARDARFAY VL-CDR1 (SEQ ID NO: 16) QSLLYSSNQKNY VL-CDR2 WAS VL-CDR3 (SEQ ID NO: 17) QQYYSYPRT Tableau 20 : CDR des parties variables lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps CH10 VH-CDR1 (SEQ ID NO: 18) GFTFNTYA VH-CDR2 (SEQ ID NO: 19) IRSKSNNYAT VH-CDR3 (SEQ ID NO: 20) VRQDYYGSSYFDY VL-CDR1 (SEQ ID NO: 21) QSISDY VL-CDR2 YAS VL-CDR3 (SEQ ID NO: 22) QNGHSFPYT 5 Tableau 21 : CDR des parties variables lourdes (VH) et légères(VL) de l'anticorps CF12 VH-CDR1 (SEQ ID NO: 23) GFTFSSSY VH-CDR2 (SEQ ID NO: 24) IYAGTGGT VH-CDR3 (SEQ ID NO: 25) ARHGSYFDY VL-CDR1 (SEQ ID NO: 26) QSVDYDGDSY VL-CDR2 AAS VL-CDR3 (SEQ ID NO: 27) QQSNEDPYT 4/ Construction, production et caractérisation des scFv 10 a/ Construction des fragments d'anticorps scFv Les gènes de synthèse des fragments variables simple chaîne (scFv) dérivés des anticorps CA5, CH10 et CF12 ont été synthétisés par ATG:Biosynthetics GmbH (Allemagne). Chaque séquence a été conçue de la fusion des parties variables lourdes et 15 légères (SEQ ID NO : 67/ SEQ ID NO: 69 pour CA5; SEQ ID NO: 71/ SEQ ID NO : 73 pour CH10 et SEQ ID NO: 75/ SEQ ID NO: 77 pour CF12) liées par une séquence codant pour le peptide (Gly4Ser)3 assurant la fonctionnalité de la 3025517 24 protéine et terminées par une séquence codant le peptide His6 (peptide HIS-tag) qui autorisera la purification des scFvs. Afin de permettre leur insertion dans le plasmide d'expression, les séquences ont été flanquées par les sites enzymatiques de restriction Pstl et Sall. Une séquence additionnelle a été ajoutée 5 entre l'extrémité 3' du VL et le site Sall autorisant la suppression du peptide His6 si désiré. Les codons ont été optimisés pour l'expression en E. coll. Une représentation schématique de la construction des gènes de synthèse des scFvs est détaillée ci-dessous : 10 VH Lieur VL LQ I LEIKH6 LEIK VD Pstl Xhol Xhol Sall Les fragments d'anticorps ont été insérés entre les sites enzymatiques Pstl 15 et Xhol du plasmide d'expression pSVV1 (ATG:Biosynthetics GmbH, Allemagne) selon E. S. Ward et collaborateurs (Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) [7] qui contient sous le contrôle d'un promoteur inductible LacZ, une séquence signal PeIB qui fusionnée en phase de lecture avec le gène du fragment d'anticorps recombinant, permet l'adressage de la protéine synthétisée vers le périplasme 20 bactérien. Dans le périplasme, cette séquence signal est éliminée par une peptidase. Après contrôle par séquençage de la qualité des constructions, les plasmides pSVV1-CA5, pSVV1-CH10 et pSVV1-CF12 ont été transformés par choc thermique en bactéries H B2151 (T53040, Interchim, France) rendues 25 compétentes (Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50) : 8549-8554, 2010) [8]. Tableau 22 : Séquences nucléotidique et peptidique du scFv CA5. scFv CA5 Séquence CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGCGGCGGCCTGGTACAACCT nucléotidique GGTGGCTCACTGCGCCTGAGCTGCGCAACCAGCGGTTTTACCT SEQ ID NO : 28 TTAGCGATTTCTACATGGAATGGGTTCGCCAACCGCCGGGTAAG CGTCTGGAATGGATCGCGGCGAGCCGTAACAAGGCGAAAGATT ATACCACTGAATATAGCGCGTCGGTGAAAGGTCGCTTCATTGTC TCGCGCGATACCAGCCAGTCGATTCTGTATCTGCAAATGAATGC CCTGCGTGCCGAAGACACGGCCATCTACTTCTGTGCGCGTGAT GCACGCTTTGCCTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTTA 3025517 25 GCGCCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGCG GTGGCTCAGATATTCAGATGACCCAGACCCCGTCAAGCCTGGC GGTGTCAGTCGGCGAAGAGATTACTATGAGCTGTAAAAGCTCGC AGAGCCTGCTGTACTCATCGAACCAGAAAAATTACCTGGCATGG TATCAACAGAAGCCGGGTCAGTCGCCGAAACTGCTGATCTACTG GGCCTCAACCCGTGAGAGCGGCGTACCGGATCGCTTTACTGGC AGCGGCAGCGGCACGGACTTTACGCTGACGATTAGCTCGGTGA AGGCCGAAGACCTGGCGGTTTATTATTGCCAACAGTACTATAGC TACCCTCGTACCTTCGGCGGCGGCACGAAACTCGAGATTAAACA TCACCATCACCATCACTAACTCGAGATCAAGTAA Séquence QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEVVVRQPPGKR peptidique LEVVIAASRN KAKDYTTEYSASVKG RF I VSRDTSQS I LYLQ M NAL RAE SEQ ID NO : 29 DTAIYFCARDARFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQ MTQTPSSLAVSVGEEITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAVVYQQKPGQ SPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYSYP RTFGGGTKLE I KH HHH HH Tableau 23 : Séquences nucléotidique et peptidique du scFv CH10. scFv CH10 Séquence CAGGTGCAGCTGCAGCAATCAGGCGGCGGCCTGGTCCAACCG nucléotidique AAAGGTAGCCTGAAACTGTCGTGCGCCGCCAGCGGCTTTACGT SEQ ID NO : 30 TCAACACTTACGCGATGAATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGTAAA GGCCTGGAATGGGTGGCACGCATCCGTTCAAAAAGCAACAATTA CGCGACGTATTATGCAGACAGCGTAAAAGATCGCTTTACCATCA GCCGTGATGATTCACAGTCAATGCTGTACCTGCAAATGAATAAC CTGAAAACTGAAGACACTGCGATGTATTATTGTGTTCGCCAGGA CTATTACGGTAGCTCGTATTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCA CCCTGACGGTGAGCTCGGGTGGCGGTGGCTCAGGTGGTGGTG GTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGATATCCAGATGACCCAGACCCC GGCAACCCTGAGCGTTACCCCTGGTGACCGCGTTTCGCTGAGC TGCCGTGCCTCGCAGAGCATTTCGGACTATCTGCACTGGTATCA GCAAAAATCACACGAATCACCGCGTCTGCTGATTAAGTACGCCA GCCAATCGATTAGCGGTATTCCGAGCCGCTTTTCGGGCTCGGG TTCGGGCTCGGATTTTACCCTGTCAATTAATAGCGTAGAGCCGG AAGATGTAGGCGTCTACTATTGTCAGAACGGCCATTCATTCCCG TACACGTTTGGCGGCGGCACCAAGCTCGAGATTAAGCATCACC 3025517 26 ATCATCACCATTAACTCGAGATCAAGTAA Séquence QVQLQQSGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNVVVRQAPGKG LEVVVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKT EDTAMYYCVRQDYYGSSYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQTPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSH ESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYC QNGHSFPYTFGGGTKLEIKHHHHHH peptidique SEQ ID NO : 31 Tableau 24 : Séquences nucléotidique et peptidique du scFv CF12. scFv CF12 Séquence CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCGGGTGGCGCAGAGCTGGTGAAA nucléotidique CCGGGTGCGAGCGTTAAACTGAGCTGCAAAACTAGCGGCTTTA SEQ ID NO : 32 CCTTTAGCTCGTCATATATTTCGTGGCTGAAGCAGAAACCGGGC CAGTCACTGGAATGGATTGCGTGGATCTACGCAGGCACGGGTG GCACCTCATATAATCAGAAATTCACCGGTAAAGCGCAACTGACG GTCGATACCAGCAGCAGCACGGCGTACATGCAGTTCAGCTCGC TGACCACTGAAGATAGCGCAATCTACTATTGTGCACGCCATGGT TCGTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTTTC AAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGCGG CGGCTCAGATATTCAGATGACCCAGACCCCTGCGAGCCTGGCA GTGTCACTGGGCCAACGCGCAACCATCTCGTGTAAAGCCTCGC AGAGCGTGGATTATGACGGCGATAGCTACATGAACTGGTATCAG CAAAAGCCTGGTCAACCGCCGAAGCTGCTGATTTACGCCGCCA GCAACCTGGAATCGGGCATCCCGGCCCGTTTTAGCGGCTCAGG CTCGGGTACTGACTTCACGCTGAACATTCACCCGGTAGAAGAAG AAGACGCGGCCACGTATTACTGCCAGCAAAGCAATGAAGACCC GTACACTTTTGGCGGCGGCACGAAACTCGAGATCAAACACCATC ACCATCACCATTAACTCGAGATCAAGTAA Séquence QVQLQQSGGAELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISWLKQKPGQS peptidique LEVVIAVVIYAGTGGTSYNQKFTGKAQLTVDTSSSTAYMQFSSLTTED SEQ ID NO : 33 SAIYYCARHGSYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQ MTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQP PKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQ SNEDPYTFGGGTKLEIKHHHHHH b/ Production des fragments d'anticorps recombinants 3025517 27 - Culture bactérienne Une pré-culture a été réalisée dans 5 ml de milieu 2xYT contenant 50 pg/ml d'ampicilline toute la nuit à 37°C. Le lendemain, 500 pl de cette préculture a été 5 ensemencée dans 500 ml du même milieu et mis à croître à 37°C à 150 RPM jusqu'à obtenir une DO600nm de 1,4. La synthèse du scFv a été induite par l'ajout de 0,1 mM d'IPTG 16 h à 16°C à 150 RPM. - Extraction 10 Le milieu de culture a été centrifugé 30 min à 4500 g à 4°C. La suite de la préparation a été réalisée à 4°C. Pour extraire le périplasme bactérien, le culot a été remis en suspension et incubé dans 10 ml de TES (Tris 0,2 M pH8, EDTA 0,5M, saccharose 0,5 M) pendant 30 min auxquels ont alors été ajoutés 15 ml de TES dilué au 1/4 pour être de nouveau incubé 30 min. L'extrait bactérien a été 15 centrifugé 30 min à 10 000g. Le surnageant a été mis à dialyser contre du PBS pendant une nuit. Le surnageant dialysé a été traité immédiatement pour purifier le scFv ou conservé à -20°C jusqu'à utilisation. La production du scFv dans le périplasme a été analysée par Western blot en utilisant un anticorps anti - His-Tag HRP (Ref R93125 Life technologies, 20 France) selon les conseils d'utilisation du fabricant. - Purification Le périplasme a été centrifugé pendant 20 min à 5 000 g à 4°C. Le surnageant a été incubé avec HIS-Select® Nickel Affinity Gel (Sigma-Aldrich, MO, 25 USA) sous agitation pendant 1h à 4°C. Le gel a été lavé avec un tampon phosphate de sodium 0,05 M, NaCI 0,3 M pH8 puis le même tampon additionné de 20 mM d'imidazole jusqu'à obtenir une D028onm proche de 0. Le scFv a alors été élue avec un tampon phosphate de sodium 0,05 M, NaCI 0,3 M, 250 mM imidazole pH8. L'éluat a été dialysé contre du PBS toute la nuit. Il est conservé à 30 -20°C. - Contrôle qualité Le scFv purifié a été analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15% après coloration au bleu de Coomassie et par chromatographie d'exclusion 3025517 28 sur colonne SephadexTM 75 10 /300 GL (Ref 17-5174-01 GE Healthcare, Allemagne). 5/ Spécificité 5 La spécificité des anticorps et de leur scFv a été étudiée par technique ELISA. Chaque hormone évaluée a été préparée à la concentration de 10 pg/ml dans du tampon carbonate de sodium 0,1M pH 9,6 et distribuée à raison de 100 pl par puits sur une plaque ELISA. Le temps d'adsorption a été de 18 heures 10 à +4°C. Après cinq lavages, les puits ont été traités avec 100 pl de PBS additionné de Tween 0,1% et de BSA 1% pendant 45 min à 37°C, puis chaque anticorps ou scFv a été distribué à raison de 100 pl/puits et incubé 1 heure à 37°C. Sur chaque hormone évaluée, les anticorps et les scFv ont été distribués à différentes concentrations selon une gamme de 10 à 250 pg/ml pour les anticorps 15 et de 10 à 150 ou 200 pg/ml pour les scFv. Après cinq lavages, un anticorps secondaire couplé à la peroxydase (HRP) a été distribué à raison de 100 pl/puits et incubé 1 heure à 37°C. Selon l'isotype de l'anticorps monoclonal étudié, l'anticorps secondaire a été un anti-IgG1 HRP (Réf. 115-035-205, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), un anti-IgG2a 20 HRP (Réf. 115-035-206, Jackson Laboratories) ou un anti-IgM HRP (Réf. 115- 035-075, Jackson Laboratories). Pour les scFv, un anti-His Tag HRP (Réf. R93125 Life technologies, France) a été utilisé. Après cinq lavages, l'activité enzymatique a été révélée avec du TMB distribué à raison de 100 pl/puits. Le temps de révélation a été de 5 à 30 min à température ambiante selon la vitesse 25 de la réaction. Après arrêt de la réaction avec H2504 1M (50 pl/puits) l'intensité de la réaction colorée (Densité Optique) a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre pour plaques ELISA. Pour les anticorps CA5 et CH10 et leur scFv, le pourcentage de réaction croisée a été calculé par rapport aux valeurs obtenues avec la FSH ovine (oFSH) 30 considérée comme la valeur 100% de référence. Le pourcentage de réaction croisée a été calculé de façon classique en comparant les courbes dose-réponse obtenues avec la gamme de concentration de l'anticorps ou du scFv. A partir de la courbe obtenue avec l'hormone référence : - soit A la concentration donnant 50% de la densité optique maximale (ED 50). A 35 partir de la courbe obtenue avec une autre hormone, 3025517 29 - soit B la concentration correspondante à la même valeur de densité optique que celle utilisée pour définir A . Le pourcentage de réaction croisée est égal à A divisé par B et multiplié par 100 : [(A/B) X 100]. 5 - Spécificité de l'anticorps CA5 et de son scFv Le tableau 25 illustre les pourcentages de réactions croisées de l'anticorps CA5 avec les sous-unités (s.u.) a et [3 de la FSH ovine et la sous-unité [3 de la FSH humaine : 10 Tableau 25 CA5 oFSH s.u. a oFSH s.u. 13 oFSH s.u. 13 hFSH Réaction croisée 100% 6% 80% 50% L'anticorps CA5 reconnaît très peu la sous-unité a ovine mais fortement la sous-unité [3 de la FSH ovine (80%) ; il croise également avec la sous-unité [3 de la FSH humaine, moins fortement (50%). Sa spécificité est anti-sous unité [3 FSH. Le tableau 26 illustre les pourcentages de réactions croisées de CA5 et du 15 scFv CA5 avec la FSH porcine (pFSH) et différentes FSH humaines : Tableau 26 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH (Fostimon) hMG (Gonal F) (Puregon) (Menopur) CA5 100% 134% 128% 70% 76% 61% scFv CA5 100% 61% ND ND 10% 10% L'anticorps CA5 présente une forte reconnaissance de la FSH porcine et de la FSH humaine Gonal-F. Il croise également de façon significative avec les autres FSH humaines entre 61 et 76%. L'anticorps CA5 reconnaît mieux les FSH 20 testées sous leur forme dimérique ce qui tend à indiquer une spécificité contre un épitope conformationnel. Le scFv CA5 reconnaît de façon significative la pFSH (61%) et plus faiblement une hFSH (Fostimon) et la hMG (Menopur). La réaction croisée sur les deux autres FSH humaines n'a pu être mesurée (ND) en raison d'une liaison trop 25 faible. La liaison du scFv CA5, tout comme celle de l'anticorps entier, semble donc être dépendante de la conformation de l'hormone, probablement altérée lors de l'adsorption sur le plastique de la plaque ELISA. 3025517 30 La spécificité du scFv CA5 a été évaluée vis-à-vis des LH porcine (pLH), ovine (oLH), bovine (bLH), de la eCG et des hCG Chorulon et Endo 5000. Les résultats sont illustrés dans le tableau 27 : Tableau 27 oLH pLH bLH eCG Chorulon Endo 5000 scFv CA5 25% 29% 33% ND 10% ND 5 La liaison du scFv CA5 est significative vis-à-vis des LH animales avec une réaction croisée entre 35 et 40%. A l'inverse, seule la hCG Chorulon est faiblement reconnue (10%). La trop faible liaison sur les deux autres hCG adsorbées n'a pas permis de quantifier une réaction croisée. Ces résultats renforcent l'hypothèse d'une spécificité envers un épitope conformationnel étant 10 donné les effets biologiques de CA5 et de son scFv obtenus in vitro et in vivo sur l'activité des hCG (voir résultats dans Exemple 2 et 3). Cette hypothèse est renforcée par les résultats obtenus par western blot en incubant l'anticorps CA5 sur de la oFSH migrée sur gel de polyacrilamide 5% en conditions dénaturantes ou non-dénaturantes. Seule la bande de [3 oFSH a été 15 reconnue en conditions non-dénaturantes et a donné un signal important. Aucun signal n'a été observé sur la oFSH migrée en conditions dénaturantes. Une estimation de la constante de dissociation Kd du scFv, vis-à-vis des différentes FSH, LH et CG étudiées, a été calculée sur GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5) en utilisant la fonction 20 "One site - Specific binding" dans un modèle de liaison à saturation ("saturation binding experiment model", GraphPad PRISM software). Les différentes valeurs obtenues sont indiquées dans les tableaux 28 et 29. Tableau 28 scFv CA5 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH hMG Gonal-F Puregon Fostimon Menopur Kd (10-6M) 0,54 1,24 1,43 2,67 2,03 2,41 Tableau 29 scFv CA5 oLH pLH bLH eCG hCG hCG Chorulon Endo 5000 Kd (10-6M) 1,95 2,47 2,43 4,07 3,80 3,14 25 La comparaison des constantes de dissociation Kd ainsi estimées indique une plus forte affinité du scFv CA5 pour les FSH ovine et porcine avec une valeur de 0,54 et 1,24 pM respectivement. A l'exception de la FSH humaine 3025517 31 recombinante Gonal F (Kd 1,43 pM), le scFv CA5 présente une affinité moins élevée pour les FSH humaines (Kd de 2,03 à 2,67pM). Comparativement à oFSH et pFSH, le scFv CA5 présente une affinité moyenne vis-à-vis des LH ovine et porcine (Kd de 1,95 et 2,47pM respectivement). Les Kd estimés vis-à-vis des 5 hCG et de la eCG (Kd de 3,14 à 4,07 pM) indiquent une affinité plus faible du scFv CA5 pour ces hormones. - Spécificité de l'anticorps CH10 et de son scFv Le tableau 30 illustre les pourcentages de réactions croisées de l'anticorps 10 CH10 avec les sous-unités (s.u.) a et [3 de la FSH ovine et la sous-unité [3 de la FSH humaine : Tableau 30 CH10 oFSH s.u. a oFSH s.u. 13 oFSH s.u. 13 hFSH Réaction croisée 100% 43% 88% 40% L'anticorps CH10 reconnaît préférentiellement la sous-unité [3 de la FSH ovine (88%) et deux fois moins la sous-unité [3 de la FSH humaine et la sous- 15 unité a ovine (40% et 43%). Selon ces résultats, la spécificité de CH10 est anti- sous unité [3 FSH préférentiellement oFSH. Il reconnaît à un moindre degré, mais de façon non négligeable, la sous-unité a ovine à la différence de l'anticorps CA5. L'ensemble de ces résultats peuvent conduire à l'hypothèse d'un épitope impliquant principalement [3 mais également a, sur la zone d'association des deux 20 sous-unités par exemple. Le tableau 31 illustre les pourcentages de réactions croisées de CH10 et du scFv CH10 obtenus avec la FSH porcine (pFSH) et différentes FSH humaines : Tableau 31 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH (Fostimon) hMG (Gonal F) (Puregon) (Menopur) CH10 100% 24% 50% 71% 100% 48% scFv CH10 100% 175% 32% 67% 30% 61% L'anticorps CH10 et son scFv présentent une forte reconnaissance des FSH 25 animales et une réaction croisée variant de 30 à 100% pour les FSH humaines. La spécificité du scFv CH10 a été évaluée vis-à-vis des LH porcine (pLH), ovine (oLH), bovine (bLH), de la eCG et des hCG Chorulon et Endo 5000. Les résultats sont illustrés dans le tableau 32 : Tableau 32 3025517 32 oLH pLH bLH eCG Chorulon Endo 5000 scFv CH10 68% 63% 52% ND ND ND La liaison du scFv CH10 vis-à-vis des LH animales est significative avec une réaction croisée entre 52 et 68%. A l'inverse, la trop faible liaison sur les hCG et la eCG adsorbées n'a pas permis de quantifier une réaction croisée. Ces résultats renforcent l'hypothèse d'une spécificité envers un épitope 5 conformationel étant donné les effets biologiques de CH10 et de son scFv obtenus in vitro et in vivo sur l'activité des hCG Chorulon et Endo 5000 (voir résultats dans Exemple 2 et 3). Une estimation de la constante de dissociation Kd du scFv CH10, vis-à-vis des différentes FSH, LH et CG étudiées, a été calculée sur GraphPad Prism 10 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5) en utilisant la fonction "One site - Specific binding" dans un modèle de liaison à saturation ("saturation binding experiment model", GraphPad PRISM software). Les valeurs obtenues sont indiquées dans les tableaux 33 et 34. Tableau 33 scFv CH10 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH hMG Gonal-F Puregon Fostimon Menopur Kd (10-6M) 2,85 5,22 1,82 11,5 1,59 7,36 15 Tableau 34 scFv CH10 oLH pLH bLH eCG hCG hCG Chorulon Endo 5000 Kd (10-6M) 1,55 2,47 1,94 1,97 1,47 2,09 Les constantes de dissociation Kd ainsi estimées indiquent une affinité du scFv CH10 tant pour les FSH ovine et porcine (Kd de 7,51 et 5,22 pM) que pour les FSH humaines Gonal F, Fostimon et l'hMG Menopur (Kd de 1,82, 1,59 et 7,36 pM respectivement). Les Kd estimées vis-à-vis des hCG et de la eCG (Kd de 1,47 20 à 2,09 pM) indiquent une bonne affinité du scFv CH10 pour ces hormones comparativement aux FSH. - Spécificité du scFv CF12 Le scFv CF12 a permis d'obtenir une liaison quantifiable par une méthode 25 ELISA, basée sur la révélation de la liaison de l'anticorps préparé à des concentrations croissantes sur différentes hormones adsorbées (liaison jusqu'à 3025517 33 saturation, Bmax). Les résultats sont exprimés en unités de densité optique obtenues après révélation. Le tableau 35 représente les valeurs de densité optique obtenues avec le scFv CF12 incubé à la concentration de 200 pg/ml sur la FSH porcine (pFSH), 5 ovine (oFSH) et sur différentes FSH humaines. Tableau 35 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH (Fostimon) hMG (Gonal F) (Puregon) (Menopur) scFv CF12 2,3 2,5 0,5 0,9 0,5 0,8 Le scFv CF12 presente une forte liaison sur la pFSH et la oFSH adsorbées, et une liaison plus faible sur les hFSH et la hMG (Menopur). Le tableau 36 représente les valeurs de densité optique obtenues avec le 10 scFv CF12 incubé à la concentration de 200 pg/ml sur la LH porcine (pLH), ovine (oLH), bovine (bLH), la eCG et les hCG Chorulon et Endo 5000. Tableau 36 oLH pLH bLH eCG Chorulon Endo 5000 scFv CF12 2 2,2 2,2 0,6 0,35 0,38 La liaison du scFv CF12 sur les LH animales est importante, à l'inverse des hCG et de la eCG adsorbées pour lesquelles la liaison est plus faible. 15 La liaison de CF12 et celle du scFv CF12 semblent donc extrêmement contraintes par la conformation de l'épitope particulièrement pour les hormones humaines. Etant donné les effets biologiques remarquables obtenus avec CF12 et son scFv, in vitro et in vivo sur l'activité des FSH humaines et des hCG Chorulon et Endo 5000 (voir résultats dans Exemple 2 et 3), il est probable que la 20 liaison du scFv CF12 tout comme celle de l'anticorps entier soit totalement dépendante de la conformation de l'hormone. L'hypothèse d'une altération de la liaison de CF12 et du scFv CF12 due à une modification de la conformation des hormones adsorbées sur le plastique de la plaque ELISA peut expliquer ces résultats et renforce l'hypothèse que CF12 et son scFv sont spécifiques d'un 25 épitope extrêmement conformationnel. Une estimation de la constante de dissociation Kd du scFv, vis-à-vis des différentes FSH, LH et CG étudiées, a été calculée sur GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5) en utilisant la fonction "One site - Specific binding" dans un modèle de liaison à saturation ("saturation 3025517 34 binding experiment model", GraphPad PRISM software). Les différentes valeurs obtenues sont indiquées dans les tableaux 37 et 38. Tableau 37 oFSH pFSH hFSH hFSH hFSH hMG Gonal-F Puregon Fostimon Menopur Kd (10-6M) 3,779 2,628 4,874 25,22 2,634 14,01 Tableau 38 oLH pLH bLH eCG hCG hCG Chorulon Endo 5000 Kd (10-6M) 5,813 4,729 5,033 6,116 5,074 6,238 5 La comparaison des constantes de dissociation Kd ainsi estimées indique une plus forte affinité du scFv pour les FSH ovine, porcine et humaines (Gonal-F et Fostimon) avec une valeur de Kd allant de 2,6 pM pour pFSH et hFSH Fostimon à 3,77 pM pour oFSH et 4,87 pM pour hFSH Gonal-F. Les valeurs de Kd pour les LH animales, eCG et les hCG Chorulon et Endo 10 5000 sont relativement homogènes et varient entre 4,72 à 6,23 pM, témoignant d'une affinité un peu plus faible du scFv CF12 pour ces hormones comparativement aux FSH ci-dessus. Vis-à-vis de la hFSH Puregon et de la hMG Menopur, le scFv CF12 présente une affinité encore plus faible avec un Kd de l'ordre de la dizaine 15 de pM : 14 et 25,22 pM respectivement. EXEMPLE 2: MESURE IN VITRO DE L'EFFET POTENTIALISANT DES LIGANDS DE L'INVENTION SUR LA BIOACTIVITE DE LA FSH 2 0 La mise en évidence de l'effet potentialisant des ligands de l'invention sur la bioactivité de la FSH a été réalisée en comparant la réponse biologique obtenue avec différentes types ou lignées cellulaires stimulées soit avec la FSH seule soit avec le complexe FSH / anticorps monoclonal (AcM). Dans chacun des cas, la comparaison des courbes dose-réponse obtenues 2 5 a permis de quantifier l'effet potentialisant in vitro de l'AcM sur l'activité biologique de la FSH complexée. L'analyse statistique des résultats a été faite par le logiciel Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, version 5). 1/ Sur cultures primaires de cellules de pranulosa bovines 3025517 35 L'effet potentialisant des AcM CA5, CH10 sur la bioactivité de la FSH ovine (oFSH) et de l'AcM CF12 sur la FSH humaine (hFSH) a tout d'abord été caractérisé sur des cellules de granulosa bovines exprimant de façon endogène 5 le récepteur FSH bovin. Des surnageants d'hybridomes à la concentration finale de 0,1pg/m1 d'anticorps CA5, CH10 ou CF12 ont été incubés avec une gamme de FSH ovine ou humaine allant de 3 ng/ml à 25 ng/ml, 30 mn à 37°C. Les cellules de granulosa bovines ont été ponctionnées sur des ovaires de 10 vache à partir de follicules de diamètre allant de 2 à 6 mm, selon le protocole décrit par Chopineau et al. (Mol. Cell Endocrinol., 92(2) : 229-39, 1993) [8] et Wehbi et al. (Endocrinology, 151(6) : 2788-2799, 2010) [9]. Les cellules de granulosa bovines en suspension dans un milieu McCoy's 5A (Lonza, Belgique, référence BE12-688F), préparées à raison de 80 000 cellules par 0,5 ml, ont été 15 stimulées pendant 3 heures à 37°C, sous agitation, en présence d'IBMX 48 pg/ml (Sigma Aldrich, France, référence 15879), par une gamme de FSH allant de 3 ng/ml à 25 ng/ml, seule ou préalablement complexée à un anticorps monoclonal selon le protocole ci-dessus. La réponse biologique mesurée a été la sécrétion en AM Pc. 20 Après centrifugation, l'AMPc produit a été dosé dans le surnageant de culture à l'aide d'un kit ELISA (Biomedical Technologies Inc., MA, USA, BT-730). Les résultats sont présentés dans la figure 1. Les résultats montrent une amplification de la sécrétion d'AMPc d'un facteur 1,3 fois pour CA5, d'un facteur 5,5 fois pour CH10 sur l'activité de la FSH ovine. 25 On enregistre une amplification de 2,5 fois pour CF12 sur l'activité de la FSH humaine. L'analyse statistique par analyse de variance à deux variables (two-way ANOVA, GraphPad PRISM software) montre un effet significatif allant de p 30) issus de la compilation de plusieurs bioassays, un test paramétrique (test t de Student non 2 5 apparié) suivi d'une correction de Bonferroni a été appliqué. 1/ Effet potentialisant des anticorps sur la bioactivité de la FSH chez la Ratte L'effet potentialisant des anticorps CAS, CH10 et CF12 et de leur scFv a été 3 0 étudié sur la FSH ovine et sur différentes préparations de FSH humaine utilisées en reproduction humaine dans le cadre des traitements de procréation médicalement assistée : la Gonal-F et la Puregon (FSH recombinantes des laboratoires Merck Serono et Merck Schering-Plough respectivement), la Fostimon et la Menopur (FSH extraites commercialisées par les laboratoires 3 5 Genevrier et Merck Schering-Plough respectivement). 3025517 Comme décrit dans le protocole de Steelman et Pohley, des rattes immatures de 21 jours ont reçu pendant trois jours consécutifs 2 injections matin et soir, de 100 pl d'un mélange de hCG et FSH comportant une quantité constante de hCG (3,5 UI) additionnée d'une quantité variable de FSH allant de 5 0,5 à 1,5 UI pour la FSH humaine (Gonal F, Puregon, Fostimon, Menopur) ou de 0,5 à 2 pg pour la FSH ovine (hormone extraite). Les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée au niveau de la nuque. Chaque expérience comprenait au minimum 4 lots : un lot traité avec du sérum physiologique (sérum cl)), un lot traité avec l'anticorps ou le scFv seul, un lot traité avec le mélange hCG+FSH, un lot 10 traité avec le mélange hCG/FSH additionné de 2 pg d'anticorps ou de scFv purifié. Dans le cas d'un traitement avec le complexe hormone/anticorps ou scFv, avant l'injection, le mélange FSH + anticorps a été préalablement incubé 20 min à 37°C ou à température ambiante indifféremment, puis ajouté à la hCG. La hCG 15 peut indifféremment être mélangée à la FSH pendant l'incubation du complexe. Le quatrième jour, les rattes ont été pesées, et leurs ovaires ont été prélevés, disséqués puis pesés. Les résultats sont exprimés en milligramme d'ovaire/100 grammes de poids corporel. L'augmentation du poids des ovaires est proportionnelle à la quantité de FSH bioactive injectée. Ceci permet de quantifier 2 0 et de comparer la bioactivité d'une même quantité d'hormone injectée seule ou en complexe avec un anticorps. La comparaison de la bioactivité de la FSH injectée seule ou complexée à l'anticorps ou au scFv permet de mesurer le différentiel de la réponse et de quantifier ainsi l'effet potentialisant de l'anticorps ou de son scFv. 25 Effet de l'anticorps CA5 et de son scFv La figure 14A illustre un exemple représentatif de l'effet de l'anticorps CA5 sur la bioactivité FSH ovine. Chaque lot comportait 5 femelles. Le lot traité avec l'anticorps CA5 injecté seul a présenté un même poids moyen des ovaires que les 30 femelles du lot contrôle ayant reçu du sérum physiologique (25,6 mg et 29,15 mg respectivement). Le lot ayant reçu le traitement hormonal classique (hCG 3,5 UI +oFSH 0,5 pg) a donné un poids moyen des ovaires de 85,7 mg significativement plus élevé que le lot contrôle (p REVENDICATIONS1. Ligand de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) potentialisant la bioactivité de la FSH, de l'hormone lutéinisante (LH) et de la gonadotropine chorionique (CG), caractérisé en ce que ledit ligand est un anticorps ou un fragment de celui-ci et en ce que : le domaine variable de la chaine lourde contient les CDRs suivants : - VH-CDR1, défini par la séquence GFTFSSSY (SEQ ID NO : 23) ; - VH-CDR2, défini par la séquence IYAGTGGT (SEQ ID NO : 24) ; - VH-CDR3, défini par la séquence ARHGSYFDY (SEQ ID NO : 25) ; et le domaine variable de la chaine légère contient les CDRs suivants : - VL-CDR1, défini par la séquence QSVDYDGDSY (SEQ ID NO : 26) ; - VL-CDR2, défini par la séquence AAS ; - VL-CDR3, défini par la séquence QQSNEDPYT (SEQ ID NO : 27). 2. Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est choisi dans le groupe constitué de Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, diabodies, triabodies, tétrabodies et nanobodies. 3. Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est l'anticorps monoclonal CF12 produit par l'hybridome CNCM 1-4803. 4. Ligand selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence peptidique du scFv est la séquence SEQ ID NO : 33. 5. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour une utilisation comme médicament. 6. Complexe ligand-gonadotrophine choisi parmi : un complexe d'un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec la FSH ou un peptide actif de celle-ci ; un complexe d'un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec la LH ou l'hormone gonadotropine chorionique (CG) ou un peptide actif de celles-ci. 3025517 7. Complexe selon la revendication 6, pour utilisation comme médicament. 5 8. Ligand selon la revendication 5 ou complexe selon la revendication 7, où ledit médicament est destiné à induire l'ovulation ou une polyovulation chez un mammifère femelle. 9. Ligand selon la revendication 5 ou complexe selon la revendication 10 7, où ledit médicament est destiné à augmenter le taux de progestérone endogène circulant chez un mammifère femelle. 10. Composition pharmaceutique destinée à être utilisée pour l'induction de l'ovulation ou d'une polyovulation chez un mammifère femelle, 15 caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou un complexe selon la revendication 6 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, 20 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une FSH et/ou une LH et/ou une CG. 12. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou complexe selon la revendication 6, pour une utilisation dans le traitement et/ou la 25 prévention de l'infertilité ou de l'hypofertilité chez un mammifère. 13. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou complexe selon la revendication 6, pour une utilisation pour stimuler la procréation chez un mammifère femelle. 30