FR 3024237 A1 20160129 FR 1457219 A 20140725 1 La présente invention concerne un procédé de mesure dynamique de la structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique. La coagulation sanguine est un phénomène complexe qui fait intervenir plusieurs facteurs, dont notamment : - le facteur tissulaire, qui est responsable de la génération de thrombine, et - le fibrinogène, transformé en fibrine sous l'activation de la thrombine. La fibrine conduit, par son accumulation, à la formation d'un caillot, qui arrête l'hémorragie. La coagulation sanguine est régulée par différents composés, dont le plasminogène, responsable de la génération de plasmine. En effet, le caillot formé par la fibrine est lysé sous l'effet de la plasmine : c'est la fibrinolyse. La fibrinolyse joue un rôle important sur la stabilité du caillot et le risque hémorragique ou thrombotique, si elle commence après la formation du caillot. Si elle est initiée en même temps, il y a compétition entre la liaison thrombine-fibrine et la liaison plasmine-fibrine, donc entre formation et lyse de la fibrine, en fonction de la capacité fibrinolytique endogène au niveau du tissu concerné. Un très grand nombre de méthodes d'évaluation du risque hémorragique ou thrombotique d'un patient sont décrites depuis longtemps. Ces méthodes sont basées sur la génération de thrombine (GT) et/ou de plasmine (GP), sur la fibrinolyse, sur les propriétés viscoélastiques du caillot (thromboélastographie ou TEG) ou sur ses propriétés optiques (turbidimétrie). Parmi les méthodes disponibles, certaines comme le temps de céphaline activée (TCA, ou PTT ou aPTT en anglais) comprennent la mesure de la viscosité en méthode électro-magnétique, et ne sont pas précises pour définir la gravité clinique liée au risque hémorragique ou thrombotique (JJ. van Veen, Br J Haematol 2008 ; M. Adams, Semin Thromb Hemost 2009 ; M. Smid, J Thromb Haemost 2011 ; E. Castoldi, Thromb Res 2011 ; O.R. Zekavat, Clin and Applied Thromb Haemost 2013). Le Test de Génération de Thrombine (TGT) est reconnu comme un outil diagnostic versatile pour investiguer les patients avec des phénotypes hypo- ou hypercoagulables. Quant à l'évaluation du potentiel thrombinique par méthode optique, elle nécessite d'éliminer le fibrinogène et les plaquettes de l'échantillon. La 3024237 2 mesure de GT par méthode chromogénique ou en fluorescence nécessite d'utiliser un instrument dédié en raison de la durée longue de mesure (90 min), et un logiciel spécifique d'analyse du signal et de son interprétation ; par conséquent elle est utilisée en recherche. 5 La GT s'arrête à la thrombine, elle ne reflète pas la stabilité du caillot de fibrine ni sa résistance à la lyse. La mesure de la qualité du caillot de fibrine couplée à la GT apporte des informations complémentaires pour évaluer l'efficacité d'un traitement (Y Dargaud, Haemophilia 2011). En particulier, la structure du caillot est un déterminant important du risque hémorragique et thrombotique (Wolberg, Blood Reviews 2007 ; Wolberg et 10 al, Transfus Apher Sci 2008). La détermination des propriétés viscoélastiques du caillot pendant la coagulation en thromboélastographie par mesure électronique (TEG) ou optique (ROTEM) est utilisée en temps réel pour des décisions cliniques ou transfusionnelles en peropératoire. Cette méthode souffre cependant de son manque de reproductibilité bien connue et n'est pas adaptée à la gestion de plusieurs échantillons en 15 routine. Quant aux autres méthodes, elles utilisent un appareillage spécifique et volumineux, et leur mise en oeuvre est limitée aux laboratoires de recherche, car les tests ne sont pas automatisables et requièrent un grand volume d'échantillons. 20 Notamment, un test de mesure simultanée de la génération de thrombine et de plasmine à l'aide de deux substrats fluorescents (Novel Haemostasis Assay NHA) a été décrit, mais n'est réalisable que sur un fluorimètre dédié à la GT (A. van Geffen, Hematology 2011, W02011/057143). La combinaison des deux tests TGT et TEG modifié par l'ajout de t-PA pour refléter la qualité du caillot de fibrine, apporte des informations 25 complémentaires (Y Dargaud, Haemophilia 2011), mais la mise en oeuvre n'est réalisable que sur 2 instruments spécifiques et manque de praticabilité. Les méthodes structurelles disponibles (microscopie électronique, microscopie confocale, diffusion électrophorétique de la lumière, diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) ou diffusion de neutrons aux petits angles (SANS)) peuvent être utilisées pour suivre l'effet 30 de la structure du caillot de fibrine sur la sensibilité à la fibrinolyse, mais ces méthodes sont non automatisables, longues et complexes à mettre en oeuvre. 3024237 3 Les méthodes turbidimétriques et de diffusion de la lumière disponibles sont limitées au système purifié fibrinogène et thrombine. Récemment une méthode physique de spectrophotométrie multi-longueurs d'onde a été proposée pour déterminer quantitativement la nanostructure du caillot de fibrine (dont le 5 rayon des fibres, le nombre de protofibrilles par fibre, la distance inter-protofibrilles et la densité des fibres) pendant la formation du caillot mais elle est manuelle, requiert un grand volume d'échantillon (600 pt), et ne se prête pas à une automatisation de par la durée de mesure longue (90 min) et le manque de disponibilité de toutes les longueurs d'onde sur l'instrument de routine (C. Yeromonahos, Biophysical J 2010 ; Thèse 12 10 octobre 2011 et ATVB 2012). Un grand nombre d'études ont montré qu'il existe des différences fondamentales dans la formation du caillot de fibrine entre les tests en système purifié (thrombine + fibrinogène) et les situations où la thrombine est générée in situ, car la présence de 15 cellules et d'autres protéines modifie la GT et la formation de fibrine. Enfin, l'analyse du profil optique de formation de fibrine (ou « waveform analysis ») peut être effectuée, mais elle reste qualitative et laborieuse. 20 Aucune méthode de l'art antérieur n'est donc capable de mesurer la stabilité du caillot de fibrine, pour prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose, en pratique courante. L'essentiel de ces méthodes est réservée à un usage de recherche ou au lit du patient car : - elles sont limitées à un échantillon purifié à cause de l'interférence du 25 fibrinogène du plasma, ou à l'étape de formation de fibrine après ajout de thrombine au plasma, - elles requièrent des équipements spécialisés, une grande quantité de plasma, et une grande expertise, - elles manquent de reproductibilité, de praticabilité ou sont trop longues à mettre 30 en oeuvre, et/ou - elles ne reflètent pas la stabilité du caillot de fibrine ou sa résistance à la lyse. 3024237 4 11 existe donc un besoin de disposer d'une méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité à partir d'un échantillon de patient, ladite méthode étant capable de prédire le risque hémostatique dudit patient, car seule la méthode de recherche par microscopie confocale, considérée comme référence à ce 5 jour, le permet (JP. Collet, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000). Une telle méthode doit en outre permettre de mesurer quantitativement la fibrinolyse dans l'échantillon, et doit être fiable, automatisée, reproductible, simple et rapide à mettre en oeuvre. 10 Les inventeurs ont mis au point une méthode capable de prédire le risque hémostatique et de mesurer quantitativement la fibrinolyse dans un échantillon non purifié. Cette méthode permet en outre la détermination automatisée de la structure du caillot de fibrine. Elle est fiable, simple et rapide à mettre en oeuvre, et reproductible. Enfin, elle complète l'information donnée par la génération de thrombine avec la stabilité du caillot 15 de fibrine. La présente invention concerne donc une méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique de patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 20 a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides. Le facteur tissulaire et les phospholipides peuvent éventuellement être en mélange avec un activateur de plasminogène, de préférence l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ; b) incubation, notamment à 37°C, du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions 25 calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ; c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et d) détermination du profil du caillot analysé en c), de préférence exprimé en nombre de 30 protofibrilles, densité et rayon, par la formule T.k5 = A[Fg].(k2 - B), où T est la turbidité du caillot ou l'expression de la densité optique en turbidité, à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et 3024237 5 A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot. Une telle méthode permet de prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re- 5 thrombose, pour le patient concerné, et ce, en un temps très court (i.e. moins d'une heure) comme décrit notamment dans l'exemple 6. En effet, le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulant, hypo- et hyper-fibrinolytique permet de discriminer ces plasmas en 30 minutes sur leur profil de structure pendant la génération de thrombine, la formation de fibrine et la lyse. 10 La discrimination des profils hypercoagulant, normal et hypocoagulant, est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau. Le plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, dure plus de 20 minutes, 10 à 20 minutes et moins de 10 minutes respectivement pour un profil hypercoagulant, 15 normal et hypocoagulant, en présence de facteur tissulaire et t-PA. Le plateau de protofibrilles est raccourci proportionnellement à la concentration d'anticoagulant antiFXa (rivaroxaban) du plasma hypocoagulant, et est prolongé proportionnellement à la concentration d'inhibiteur de l'activateur du plasminogène (PAI-1) du plasma hypofibrinolytique. 20 La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide ; cela est le cas des plasmas hyperfibrinolytiques (déficient en PAI-1 ou contenant du rivaroxaban). En revanche, elle est nulle quand le caillot est résistant à la lyse ; cela est le cas des plasmas hypercoagulants (déficient en protéine S ou en inhibiteur du facteur tissulaire TFPI). 25 Comme montré en exemples, la disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte en 33 minutes pour tous les échantillons, excepté un des plasmas hypercoagulants, déficient en protéine S. Par « profil d'un caillot de fibrine », on entend la structure dudit caillot reflétant sa 30 stabilité. La méthode selon l'invention permet de déterminer la structure du caillot formé, et notamment le nombre de protofibrilles constituant le caillot, leur densité et leur rayon. 3024237 6 La méthode selon l'invention utilise un simple échantillon biologique du patient. Cet échantillon biologique est utilisé non dilué dans la méthode. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en 5 plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes (PPP). Dans ce cas, il est notamment obtenu par centrifugation du tube citraté comprenant l'échantillon de sang de patient pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C. Si l'échantillon doit être conservé, le protocole suivant peut être utilisé : 10 - décanter rapidement le plasma, en laissant environ 0.5cm de plasma au-dessus de la couche cellulaire des globules blancs et plaquettes ; - récupérer le plasma dans un tube à hémolyse ou un tube plastique; - centrifuger ce tube pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C ; 15 - aliquoter en fractions de 0,5 à 1 mL sans prendre le fond du tube (débris cellulaires) ; puis - congeler rapidement à -70°C, mieux à -80°C. L'échantillon biologique non dilué est utilisé dans la présente invention en faible 20 volume. De préférence, l'échantillon biologique a un volume compris entre 50 pt et 400 pt, de préférence compris entre 100 pt et 300 pt, de préférence d'environ 200 pt pour un volume final de 300 p.L. Un tel volume suffit en effet pour l'analyse sur instrument de routine, mais peut être réduit à condition de respecter le rapport de volume d'échantillon sur le volume final (i.e. rapport d'environ 2 : 3). Il peut être réduit 25 davantage dans le cas d'un microsystème pour une utilisation au lit du malade, pourvu que cette contrainte de rapport de volume soit respectée. L'étape a) comprend le mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides. L'échantillon biologique non dilué est de préférence 30 utilisé tel quel dans le cas de plasma. Il est mélangé à du facteur tissulaire (FT), de préférence humain, et des phospholipides (PL), de préférence semi-purifiés ou purifiés. 3024237 7 Ledit facteur tissulaire et les PL sont, de préférence, préalablement mélangés à une solution d'activateur du plasminogène notamment affin pour la fibrine, de préférence d'activateur tissulaire de plasminogène (t-PA), puis le tout est ajouté à l'échantillon biologique non dilué. Dans ce cas, le FT et les phospholipides sont d'abord reconstitués 5 en solution par mélange avec une solution de t-PA, puis le mélange obtenu est ajouté à l'échantillon biologique non dilué. L'activateur du plasminogène utilisé est de préférence affin pour la fibrine. De préférence, l'activateur du plasminogène utilisé est le t-PA, notamment l'altéplase, commercialisé sous la référence Actilyse® par Boehringer Ingelheim. Tout activateur 10 affin pour la fibrine, comme les dérivés de la streptokinase spécifiques de la fibrine, peuvent être utilisés. Le mélange de l'étape a) peut comprendre une concentration de phospholipides de 2 à 5 p.M dans le mélange, de préférence une concentration d'environ 4 p.M. 15 De préférence, le FT est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 1 et 5 pM, de préférence entre 2 et 5 pM. Lorsque du t-PA est présent, il est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec le FT et l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.1 20 et 0.3 p.g/mL, de préférence entre 0.1 et 0.2 p.g/mL. De préférence, le mélange de l'activateur tissulaire de plasminogène (t-PA) dans le facteur tissulaire (FT) de l'étape a) est réalisé dans un ratio respectif massique [t-PA / FT] compris entre 800 et 1700, de préférence compris entre 1000 et 1300. Le facteur 25 tissulaire et le t-PA ont été utilisés aux concentrations finales de 2 pM et 150 ng/mL respectivement dans l'exemple 6, pour la discrimination des différents échantillons. De préférence, le t-PA et le FT sont utilisés dans un ratio de 75 à 150 ng/mL de t-PA pour 1 à 5 pM de FT. 30 Le mélange de l'étape a) peut comprendre également des ions calcium. Les ions calcium peuvent être présents à une concentration de 15 à 20 mM final, de préférence à 17 mM final. 3024237 8 De préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend : al) l'introduction de FT dans une solution de phospholipides et éventuellement de calcium, puis 5 a2) le mélange de la solution obtenue en al) avec l'échantillon biologique non dilué. Alternativement, de préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend : al) l'introduction de t-PA dans une solution de FT, a2) l'ajout de phospholipides et optionnellement l'ajout de calcium à la solution obtenue 10 en al), puis a3) le mélange de la solution obtenue en al) ou a2) avec l'échantillon biologique non dilué. A la fin de l'étape a), un mélange d'au moins le FT avec l'échantillon biologique non 15 dilué est obtenu pour la détermination du profil de structure pendant la coagulation et un mélange d'au moins le FT et t-PA avec l'échantillon biologique non dilué est obtenu pour la détermination du profil de stabilité du caillot et du profil de structure pendant la lyse. 20 S'ensuit une étape b) d'incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la génération de thrombine et la formation d'un caillot. Préférentiellement, l'étape b) initie la génération de thrombine et la formation d'un caillot. L'étape b) comprend ainsi l'incubation du mélange obtenu à l'étape a). Cette incubation 25 peut typiquement se faire pendant un temps compris entre 60 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 200 secondes et 350 secondes, de préférence de 300 secondes sur l'instrument, à une température comprise entre 30°C et 40°C, de préférence d'environ 37°C. Ce temps d'incubation peut être raccourci avec une réduction des volumes, en particulier avec l'utilisation d'un microsystème. Puis des ions calcium sont 30 ajoutés au mélange incubé. Ces ions calcium peuvent être ajoutés sous forme de solution de CaC12, à une concentration d'environ 0.1 M. 3024237 9 Par l'ajout de calcium, en présence de FT, la génération de thrombine et la formation d'un caillot de fibrine sont initiées. La structure du caillot de fibrine est ensuite suivie de façon dynamique, c'est-à-dire 5 toutes les 2 secondes ou moins lors de l'étape c), par mesure de la turbidité à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes. De préférence, la mesure de turbidité se fait au moins aux deux longueurs d'onde les plus proches des valeurs extrêmes, par exemple 540 nm et 780 nm, ou mieux 540 nm et 760 nm. De préférence, la durée de mesure de l'étape c) 10 est comprise entre 1 minute et 35 minutes pour le profil à la fois de coagulation et de lyse, de préférence elle est d'environ 15 minutes pour le profil de coagulation (FT seul) et d'environ 30 minutes pour le profil de lyse (FT+t-PA). Pendant cette durée, la structure du caillot de fibrine est donc analysée, notamment par la formation de protofibrilles, de rayon et de densité variables. 15 La structure du caillot de fibrine peut également être suivie de façon dynamique lors de l'étape c), par mesure de la densité optique à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes. De préférence, la mesure de la densité optique se fait au moins aux deux 20 longueurs d'onde les plus proches des valeurs extrêmes, par exemple 540 nm et 780 nm, ou mieux 540 nm et 760 nm. De préférence, la durée de mesure de l'étape c) est comprise entre 1 minute et 35 minutes pour le profil à la fois de coagulation et de lyse, de préférence elle est d'environ 15 minutes pour le profil de coagulation (FT seul) et d'environ 30 minutes pour le profil de lyse (FT+t-PA). 25 L'expression de T au temps t, à une longueur d'onde donnée k, applicable avec une mesure de densité optique, est logarithmique selon la formule T(t) = [DO(t) - DO(ini)] ln (10), où DO(t) et DO(ini) sont respectivement la densité optique à l'instant t et la densité optique initiale (à t=0). La détermination du profil du caillot analysé en c) est obtenue à partir d'un modèle reliant la structure du caillot à ses propriétés optiques, de 30 préférence par la formule T.k5 = A[Fg].(k2 - B), où T est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et 3024237 10 A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot. Cette mesure de turbidité ou de densité optique peut être effectuée par tout appareil 5 existant, et notamment par un turbidimètre ou un spectrophotomètre. De préférence, cette mesure est réalisée en cinétique sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation. Plus préférentiellement, cette mesure est effectuée sur l'automate STA-R® Evolution Expert Series du groupe Stago. Elle peut également être utilisée avec un microsystème optique. 10 In fine, le profil du caillot étudié à l'étape c) est déterminé par un modèle reliant la structure du caillot à ses propriétés optiques. De préférence, ce modèle relie la turbidité à la structure par la formule (C. Yeromonahos, Biophysical J 2010) : T.k5 = A[Fg].(k2 - B) 15 où : T est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot. 20 Ainsi, lors de l'étape d), des informations sont obtenues sur la structure du caillot de fibrine, et donc sur ses propriétés, en fonction du temps. Avec ces informations, on obtient un suivi de la structure du caillot pendant la coagulation et la fibrinolyse, reflétant sa stabilité. Il est donc possible de prédire le 25 risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose, du patient dont l'échantillon biologique a été analysé, d'autant qu'on tient compte de la concentration de fibrinogène intrinsèque du patient, qui est un facteur de risque hémostatique connu. On parle de « re-thrombose » dans le cas où le patient a déjà été victime d'une thrombose, et fait l'objet d'un suivi médical particulier pour éviter les récidives. 30 En particulier, au moins les étapes c) et d) de la méthode selon l'invention sont réalisées sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation. 3024237 11 Plus préférentiellement, toutes les étapes de la méthode selon l'invention sont mises en oeuvre sur un tel automate. Plus préférentiellement, la méthode selon l'invention est mise en oeuvre sur l'automate STA-R® Evolution Expert Series du groupe Stago. Un tel automate permet de charger simultanément les échantillons, d'effectuer les mélanges et 5 l'incubation, de mesurer les densités optiques à au moins deux longueurs d'onde et de déterminer le profil du caillot obtenu de plusieurs échantillons en simultané. Le tout est réalisé en 15 minutes environ pour la coagulation et 30 minutes environ pour la coagulation suivie de la fibrinolyse. Cela en fait une méthode rapide, fiable, reproductible et prédictive du risque hémorragique ou thrombotique chez un patient. La 10 méthode est utilisable sur instrument de routine et complète l'information donnée par la génération de thrombine avec la structure du caillot de fibrine, reflet de sa stabilité alors que cette structure n'est disponible que par la microscopie confocale et est qualitative. La présente invention a également pour objet une méthode de prédiction du risque de 15 saignement, de thrombose ou de re-thrombose à partir d'un échantillon biologique d'un patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange 20 obtenu, pour initier la formation d'un caillot ; c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et d) détermination du profil du caillot analysé en c) par la formule T.k5 = A[Fg].(k2 - B), 25 où T est la turbidité du caillot ou la densité optique calculée selon la formule T(t) = [DO(t) - DO(ini)] ln (10) à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot, et e) comparaison du profil obtenu en d) à un contrôle. 30 3024237 12 Les étapes a) à d) sont telles que décrites ci-dessus. Notamment, l'étape a) peut également comprendre l'addition d'activateur de plasminogène, de préférence l'activateur tissulaire de plasminogène, comme cela est décrit ci-avant. 5 Quant à l'étape e), elle correspond à une comparaison entre le profil obtenu pour l'échantillon biologique du patient considéré, et un profil obtenu pour un contrôle. Ledit contrôle peut notamment être : - un échantillon biologique d'un ou plusieurs individus sains, de préférence un plasma de référence, 10 - un échantillon biologique d'un ou plusieurs contrôles de qualité pour mimer les conditions de patients. Cela peut être un ou plusieurs contrôles de qualité fabriqués à partir d'un pool de plasmas normaux traités ou non traités pour rendre le plasma déficient en un facteur de la coagulation donné ou de la fibrinolyse pour mimer les conditions de patients, comme dans l'exemple 1, 15 - un échantillon biologique d'un patient hémorragique, - un échantillon biologique d'un patient thrombotique, ou - un échantillon biologique d'un patient ayant re-thrombosé, notamment comme dans l'exemple 6. 20 Cette simple étape e) permet de déduire directement et rapidement le risque de thrombose ou d'hémorragie du patient considéré, d'autant qu'on tient compte de la concentration de fibrinogène intrinsèque du patient, qui influence la stabilité du caillot, comme montré dans l'exemple 6. 25 Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention. Les légendes des figures sont les suivantes : 30 Figure 1 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour un plasma normal, pour un plasma hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 Ul/mL) et pour un plasma hypercoagulant (plasma contrôle déficient en protéine S). 3024237 13 Figure 2 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas normaux (plasma contrôle CCN et pool normal PN), hypocoagulant (plasma déficient congénital en FVIII:C DEF VIII) et hypercoagulant (plasma déficient en protéine S 5 DPS). Figure 3 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas normaux (plasma contrôle CCN et pool normal PN), hypocoagulant (plasma déficient congénital en FVIII:C DEF VIII) et hypercoagulant (plasma déficient en protéine S 10 DPS). A : t-PA à 100 ng/mL ; B : t-PA à 150 ng/mL ; C : t-PA à 175 ng/mL. 15 Figure 4 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 4 plasmas témoins normaux comprenant 2,52g/L, 2,32g/L, 3,34g/L et 2,50g/L respectivement de fibrinogène avec tPA 150 ng/mL. Figure 5 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas 20 témoins (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS) avec tPA 150 ng/mL. Figure 6 : mesure du nombre de protofibrilles pour un plasma normal (Normal), un plasma hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et un plasma 25 hypercoagulant (plasma déficient en protéine S) à 2, 3, 7 ou 20 longueurs d'onde en fonction du temps. Figure 7 : mesure du nombre de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma 30 contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction du pourcentage de fibrinogène. 3024237 14 Figure 8 : mesure de la densité de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction du pourcentage de fibrinogène. Figure 9: mesure de la densité de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction de la concentration de fibrinogène. Figure 10: mesure du nombre de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction de la concentration de fibrinogène. Figure 11 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas normaux (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA. 20 Figure 12 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1 (P-PAI 4A, 4B et 4C respectivement), un plasma déficient en PAI-1 (P-DPAI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA. 25 Figure 13 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas surchargés en rivaroxaban à 0, 100 et 200 ng/mL (P-R0, P-R100 et P-R200 respectivement), un plasma déficient en TFPI (P-DTFPI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA. 30 Figure 14 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas normaux (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL. 5 10 15 3024237 15 Figure 15 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1 (P-PAI 4A, 4B et 4C respectivement), un plasma déficient en PAI-1 (P-DPAI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle 5 hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL. Figure 16 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas surchargés en rivaroxaban à 0, 100 et 200 ng/mL (P-R0, P-R100 et P-R200 respectivement), un plasma déficient en TFPI (P-DTFPI), un plasma contrôle normal 10 (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL. Exemples : Mise en oeuvre de la méthode selon l'invention Protocoles expérimentaux 15 Les protocoles suivant sont utilisés dans les exemples qui suivent : - Protocole A (comparatif, méthode manuelle) : Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement : - 667 !IL d'échantillon de plasma pur, 20 - 167 !IL d'un mélange [FT 1 à 5pM final + PL 41..IM final]. Puis on agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37°C. On ajoute manuellement 1671..IL de CaC12 à 16.7 mM final. On agite manuellement. 25 Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm en fonction du temps pendant 90 minutes. - Protocole B (sans t-PA, méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire) : Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés 30 simultanément par l'instrument : - 200 µL d'échantillon de plasma pur, - 50 µL d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 41..IM final]. 3024237 16 L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. 11 ajoute ensuite 50 !IL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille du réactif déclenchant. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm 5 et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes. - Protocole C (avec t-PA, méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène) : Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés 10 simultanément par l'instrument : - 200 !IL d'échantillon de plasma pur, - 50 !IL d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 41..IM final+ tPA 0.1 à 0.2µg/mL final]. L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. 11 ajoute ensuite 50 !IL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille du réactif 15 déclenchant. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. 20 Exemple 1 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, hypo- et hypercoagulant : la) Protocole A : méthode manuelle Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement : 25 - 667 !IL d'échantillon de plasma pur : normal (pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 Ul/mL) ou hypercoagulant (plasma contrôle déplété en protéine S), - 167 !IL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..IM final], puis on agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37°C. 30 On ajoute manuellement 1671..IL de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement. Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, en fonction du temps pendant 90 minutes. 3024237 17 Les résultats sont en Figure 1. Le nombre de protofibrilles mesuré en fonction du temps pour les différents plasmas normal, hypo- et hyper-coagulant, permet de discriminer ces plasmas pendant la 5 génération de thrombine et la formation du caillot. lb) Protocole B : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire FT Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument : 10 - 200 1..IL d'échantillon de plasma pur : normaux (plasma contrôle Coag Control N et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et hypercoagulants (plasma déplété en protéine S et plasma déficient congénital en FVIII:C), - 50 µL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..IM final]. 15 Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 µL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes. Les résultats sont en Figure 2. 20 Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulants, en fonction du temps permet de discriminer ces plasmas en moins de 6 minutes dans cet exemple, pendant la génération de thrombine et la formation du caillot. La discrimination est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le 25 plateau et la vitesse d'atteinte du plateau. 1c) Protocole C : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène FT + t-PA - Influence de la concentration de t-PA 30 Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument : - 200 !IL d'échantillon de plasma pur : normaux (plasma contrôle Coag Control N et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et 3024237 18 hypercoagulants (plasma déplété en protéine S et plasma déficient congénital en FVIII:C), - 50 1..IL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..t.M final + tPA 100, 150 ou 175 ng/mL final]. 5 Après agitation et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'instrument ajoute 50 µL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. 10 a) [t-PA] = 100 ng/mL Les résultats sont en Figure 3A. b) [t-PA] = 150 ng/mL Les résultats sont en Figure 3B. 15 c) [t-PA] = 175 ng/mL Les résultats sont en Figure 3C. 20 Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulants, permet de discriminer ces plasmas en un temps dépendant de la concentration de t-PA contenue dans le facteur tissulaire. La discrimination est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau, et également la durée du plateau et sa pente. 25 La durée du plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, n'est atteinte en 30 minutes pour les différents profils, qu'à partir de la concentration de 175 ng/mL de t-PA dans cet exemple. La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide; elle est nulle ou faible quand le caillot est résistant à la lyse (déficient en 30 facteur FVIII:C, et plasma déplété en protéine S respectivement). La disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte à 175 ng/mL de t-PA dans cet exemple. 3024237 19 Exemple 2 - Profil de structure de la fibrine avec les plasmas normaux de donneurs sains ou de patients avec un bilan d'hémostase normal 5 2a) Protocole A : méthode manuelle Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement : - 667 !IL d'échantillon de plasma pur de 4 plasmas normaux congelés de donneurs sains, - 167 !IL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..IM final + t-PA 150 ng/mL], puis on 10 agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37°C. On ajoute manuellement 1671..IL de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement. Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde en fonction du temps pendant 90 minutes. Les résultats sont en Figure 4. 15 Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau est très proche. Par contre la durée du plateau et sa pente varient beaucoup d'un plasma à l'autre à la concentration de t-PA de 150 ng/mL. La disparition des protofibrilles n'est pas atteinte en 50 min pour tous les 20 plasmas. 2b) Protocole C : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène FT + t-PA Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés 25 simultanément par l'instrument : - 200 !IL d'échantillon de plasma pur frais de patients normaux par les tests d'hémostase de routine (Temps de Quick, temps de céphaline activée, fibrinogène), - 50 !IL d'un mélange optimisé [FT 2 pM final + PL 41..IM final + t-PA 150 ng/mL final]. 30 Après agitation et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'instrument ajoute 50 !IL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. 3024237 20 - Bilan d'hémostase des plasmas frais de patients "normaux par les tests d'hémostase de routine" Plasmas de patients Taux de prothrombine Temps de céphaline activée (sec) Fibrinogène (g/L) normaux (%) N-CCN 5586 100 40,5 3,80 N-CCN 5587 99 34,4 2,30 N-CCN 5588 100 31,1 4,00 N-CCN 5589 96 35,7 3,60 N-CCN 5590 94 32,7 3,30 N-CCN 5591 100 37,9 2,90 N-CCN 5592 100 37,8 3,00 N-CCN 5593 99 31,4 3,70 N-CCN 5594 92 32,6 3,50 5 Les résultats sont également en Figure 5. - Nombre de protofibrilles Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux frais varie de 70 à 120 ; le temps pour atteindre le plateau, la vitesse d'atteinte du plateau, varient plus que pour les 10 donneurs sains, en lien avec le risque hémorragique ou thrombotique lié à leur hospitalisation. La durée du plateau et sa pente varient moins que pour les donneurs sains, en lien avec la concentration de t-PA optimisée dans cet exemple. La disparition des protofibrilles est atteinte en 33 min à la concentration de t-PA utilisée 15 pour tous les plasmas. Tous ces plasmas sont discriminés du plasma hypercoagulant déplété en protéine S sur la base du plateau de protofibrilles. 20 3024237 21 Exemple 3 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, hypo- et hypercoagulant : Influence de la longueur d'onde Le protocole A a été réalisé comme suit : 5 Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement : - 667 !IL d'échantillon de plasma pur du plasma normal (pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 Ul/mL) et hypercoagulants (plasma déplété en protéine S), - 167 !IL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..IM final], puis on agite manuellement. 10 On incube pendant 600 secondes à 37°C. On ajoute manuellement 1671..IL de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement. Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 2, 3, 7 ou 20 longueurs d'onde en fonction du temps pendant 90 minutes. Puis l'on compare les résultats obtenus à différents nombres de longueurs d'ondes. 15 Les résultats sont en Figure 6. Les courbes sont superposables pour chacun des plasmas quelque soit le nombre de 20 longueurs d'onde. Le nombre de 2 longueurs d'onde minimum a donc été sélectionné pour la méthode automatisée sur l'instrument de routine. Exemple 4 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, 25 hypo- et hypercoagulant : Répétabilité et reproductibilité de la méthode automatisée sur STA-R® Le protocole B sur STA-R® avec facteur tissulaire FT a été utilisé comme suit : Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés 30 simultanément par l'instrument : - 200 !IL d'échantillon de plasma pur normal (plasma normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 Ul/mL, STA HEP C2) et hypercoagulant (plasma déplété en protéine S, STA DEF PS), 3024237 22 - 50 !IL d'un mélange [FT 2 pM final + PL 41..IM final]. Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 !IL de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm 5 et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes. 4a) Répétabilité de la méthode 24 tests ont été réalisés dans 3 séries de dosages consécutives : Les résultats sont dans le tableau ci-après. 10 Répétabilité : n= 24 tests dans 3 séries de dosages consécutives DDO DDO TCOAG TGEL TARRET Np Np RAYON RAYON PENTE 540nm 780nm TARRET TMAX MOYEN MOYEN AUTOUR TARRET TMAX DE TGEL n 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 Pool normal congelé Moyenne 13098RD 0.778 0.362 70.1 92 292 91.1 95.4 80.5 80.4 1.274 CV 1.280 1.966 3.636 6.300 12.351 2.000 2.353 0.637 0.788 4.270 n 24 24 23 23 22 24 24 24 24 24 Moyenne STA HEP C2 0.663 0.376 146.6 208 722 97.4 98.8 90.9 91.0 0.489 CV 1.936 3.997 3.525 4.364 4.034 5.036 4.794 1.157 1.172 6.892 n 23 23 22 23 23 23 23 23 23 22 Moyenne STA DEF PS 0.389 0.178 74.3 94 151 47.6 48.8 79.6 79.4 1.103 CV 1.473 2.146 3.012 3.281 2.950 2.417 2.671 0.705 0.793 3.967 Np : Nombre de protofibrilles Temps de gel : point d'inflexion de la courbe Temps de coagulation : extrapolation sur l'axe des abscisses ou tangente au point d'inflexion Temps d'arrêt : temps auquel la vitesse de réaction correspond à 1% de la vitesse maximale 15 Les coefficients de variation (CV) obtenus sur les paramètres de structure de la fibrine: nombre de protofibrilles, rayon et pente sont inférieurs à 2.5% pour le plasma normal et 3024237 23 inférieurs ou égal à 5% pour les plasmas pathologiques, donc très inférieurs à ceux obtenus par le test de génération de thrombine. Les CV sur les paramètres temporels (temps de coagulation, de gel et d'arrêt) sont plus élevés, en particulier le temps d'arrêt, mais ils ne sont pas utilisés pour la détermination de la structure du caillot, ni pour 5 l'interprétation, à l'inverse des méthodes turbidimétriques utilisées pour mesurer la formation de fibrine ou le temps de lyse. 4b) Reproductibilité de la méthode 20 mesures ont été réalisées dans 10 séries de 2 mesures, pendant 5 jours consécutifs. 10 Reproductibilité de la méthode : n=10 séries de 2 mesures DDO 540nm DDO 780nm TCOAG TGEL TARRET NOMBRE DE RAYON MOYEN DENSITE PENTE PROTOFIBRILLES AUTOUR DE TGEL TARRET ATMAX TARRET TMAX TARRET TMAX Normal Moyenne 0.617 0.301 80.6 103 372 77.0 81.9 83.3 83.5 0.051 0.054 1.052 Ecart-type 0.009 0.006 2.439 4.646 64.806 2.212 2.359 0.702 0.899 0.001 0.001 0.044 CV 1.5% 2.1% 3.0% 4.5% 17.4% 2.9% 2.9% 0.8% 1.1% 2.2% 1.9% 4.2% Hypocoagulant Moyenne 0.684 0.394 150.3 219 745 103.4 104.6 91.7 91.8 0.056 0.057 0.492 Ecart-type 0.010 0.011 4.961 11.803 57.846 3.158 3.133 0.608 0.606 0.001 0.001 0.014 CV 1.5% 2.7% 3.3% 5.4% 7.8% 3.1% 3.0% 0.7% 0.7% 2.1% 1.9% 2.8% Hyper Moyenne 0.398 0.181 76.9 97 157 48.0 49.7 79.3 79.1 0.035 0.036 1.077 coagulant Ecart-type 0.005 0.004 1.719 3.358 5.749 1.208 1.461 0.713 1.034 0.001 0.000 0.040 CV 1.3% 2.0% 2.2% 3.5% 3.7% 2.5% 2.9% 0.9% 1.3% 1.5% 1.4% 3.7% Np : Nombre de protofibrilles Temps de gel : point d'inflexion de la courbe Temps de coagulation : extrapolation sur l'axe des abscisses ou tangente au point d'inflexion Temps d'arrêt : temps auquel la vitesse de réaction correspond à 1% de la vitesse maximale 3024237 24 Les coefficients de variation (CV) obtenus sur les paramètres de structure de la fibrine : nombre de protofibrilles, rayon et pente sont tous inférieurs à 5% quelque soit le plasma. Les CV sur les paramètres temporels (temps de coagulation, de gel et d'arrêt) 5 sont plus élevés, en particulier le temps d'arrêt, mais ils ne sont pas utilisés pour la détermination de la structure du caillot, ni pour l'interprétation, à l'inverse des méthodes turbidimétriques utilisées pour mesurer la formation de fibrine ou le temps de lyse. 10 Exemple 5 - Profil de structure de la fibrine avec 4 plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants : Influence des variations de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil. Le protocole B sur STA-R® avec facteur tissulaire FT a été utilisé comme suit : 15 Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument : - 200 pt d'échantillon de plasma pur normal (plasma normal congelé et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 Ul/mL) et hypercoagulant (plasma déplété en protéine S), 20 - 50 pt d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4p.M final]. Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 pt de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes. 25 Les calculs sont effectués pour chaque plasma à des taux de fibrinogène variant de plus ou moins 20%. Les résultats sont présentés Figures 7 à 10. La structure de la fibrine dépend du taux de fibrinogène intrinsèque de l'échantillon. Le 30 nombre de protofibrilles et la densité diminuent d'autant plus que le fibrinogène augmente et d'autant plus qu'ils sont élevés. 3024237 25 Exemple 6 - Profil de structure de la fibrine avec des plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants, hypo- et hyper-fibrinolytiques : Discrimination des échantillons normaux des échantillons pathologiques 5 6a) Protocole B sur STAR® avec facteur tissulaire FT : Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument : - 200 1..IL d'échantillon de plasma pur de 9 patients avec un bilan d'hémostase normal, 10 d'un plasma déficient en PAI-1 congelé, de 3 plasmas contrôles à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1, d'un plasma déficient en protéine S, d'un plasma déplété en TFPI et de 3 plasmas surchargés à 0, 100 et 200 ng/mL de rivaroxaban, - 50 µL d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 41..IM final]. L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. 15 11 ajoute ensuite 500_, de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes. Les résultats sont présentés Figures 11 à 13. 20 Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants, permet de discriminer ces plasmas en 15 minutes, par contre il ne permet pas de discriminer les plasmas hypo- et hyper-fibrinolytiques des autres plasmas. La discrimination des profils hypercoagulant, normal et hypocoagulant, est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du 25 plateau. - ces paramètres augmentent parallèlement à la concentration d'anticoagulant, témoignant d'une structure plus lâche du caillot. ils sont plus bas pour les plasmas hypercoagulants que pour tous les plasmas normaux, témoignant d'une structure plus compacte du caillot. 30 - ces paramètres sont compris dans la zone des échantillons normaux pour les plasmas hypofibrinolytiques surchargés en PAI-1. Les informations obtenues 3024237 26 pendant la génération de thrombine sont insuffisantes et ne permettent pas de discriminer ce type de plasma. 6b -Protocole C sur STAR® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène 5 FT + t-PA : Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Series (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument : - 200 1..IL d'échantillon de plasma pur de 9 patients avec un bilan d'hémostase normal, d'un plasma déficient en PAI-1 congelé, de 3 plasmas contrôles à 0, 20 et 40 UA/mL de 10 PAI-1, d'un plasma déficient en protéine S, d'un plasma déplété en TFPI et de 3 plasmas surchargés à 0, 100 et 200 ng/mL de rivaroxaban. - 50 µL d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 41..IM final + t-PA 150 ng/mL] . L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. Il ajoute ensuite 500_, de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. 15 L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. Les résultats sont présentés Figures 14 à 16. Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulant, 20 hypo- et hyper-fibrinolytique permet de discriminer tous ces plasmas en 30 minutes sur leur profil de structure pendant la génération de thrombine, la formation de fibrine et la lyse. La discrimination de tous les profils est obtenue sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau, la durée du plateau et 25 sa pente. Le plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, dure plus de 20 min, 10 à 20 min et moins de 10 min pour un profil hypercoagulant, normal et hypocoagulant, respectivement. le plateau de protofibrilles est raccourci proportionnellement à la concentration 30 d'anticoagulant anti-FXa (rivaroxaban) du plasma hypocoagulant, en lien avec le risque hémorragique dû à l'anticoagulant. 3024237 27 il est prolongé proportionnellement à la concentration d'inhibiteur de l'activateur du plasminogène (PAI-1) du plasma hypofibrinolytique, et avec les déficits en protéine S et TFPI, en lien avec le risque thrombotique lié à ces troubles d'hémostase. 5 La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide, cas des plasmas hyperfibrinolytiques (déficient en PAI-1 ou contenant du rivaroxaban) ; elle est nulle quand le caillot est résistant à la lyse, cas des plasmas hypercoagulants (déficient en protéine S ou en inhibiteur du facteur tissulaire TFPI). La disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte en 33 min 10 pour tous les échantillons, excepté un des plasmas hypercoagulants, déficient en protéine S. REVENDICATIONS1. Méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique de patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ; c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et d) détermination du profil de structure du caillot analysé en c), de préférence exprimé en nombre de protofibrilles, densité et rayon, et calculé par la formule T.k5 = A[Fg].(k2 15 B), où T est la turbidité du caillot ou l'expression de la densité optique en turbidité, à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot. 20 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape a), le facteur tissulaire et les phospholipides sont préalablement mélangés à une solution d'activateur du plasminogène, de préférence d'activateur tissulaire du plasminogène, puis le tout est ajouté à l'échantillon biologique non dilué. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le mélange du facteur tissulaire avec l'activateur tissulaire de plasminogène est réalisé dans un ratio respectif massique [t-PA / FT] compris entre 800 et 1700, ou dans un ratio de 75-150 ng/mL de t-PA pour 1-5 pM de FT. 25 30 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le mélange de l'étape a) comprend des ions calcium. 3024237 29 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes, de préférence de plasma pauvre en plaquettes. 5 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'échantillon biologique a un volume compris entre 50 pt et 400 pt, de préférence compris entre 100 pt et 300 pt, de préférence d'environ 200 p.L. 10 7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que l'activateur du plasminogène est affin pour la fibrine. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'étape b) comprend l'incubation du mélange obtenu à l'étape a) pendant un temps compris entre 60 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 200 secondes et 350 secondes, à une température comprise entre 30°C et 40°C. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'étape b) initie la génération de thrombine et la formation d'un caillot. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la mesure de la turbidité ou de la densité optique de l'étape c) se fait à au moins deux longueurs d'onde les plus proches des extrêmes, de préférence à 540 nm et 760 nm. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la mesure de la turbidité ou de la densité optique de l'étape c) se fait pendant une durée comprise 1 minute et 35 minutes, de préférence d'environ 15 minutes avec le facteur tissulaire seul, et de préférence d'environ 30 minutes avec un mélange de facteur tissulaire et d'activateur tissulaire du plasminogène. 3024237 30 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'au moins les étapes c) et d) sont réalisées sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation. 5 13. Méthode de prédiction du risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose à partir d'un échantillon biologique d'un patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ; 10 b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ; c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et 15 d) détermination du profil du caillot analysé en c) par la formule T.k5 = A[Fg].(k2 - B), où T est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée k, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot, et e) comparaison du profil obtenu en d) à un contrôle. 20 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle présente les caractéristiques selon l'une des revendications 2 à 12. 15. Méthode selon l'une des revendications 13 ou 14 caractérisée en ce que le contrôle 25 de l'étape e) est choisi parmi : - un échantillon biologique d'un ou plusieurs individus sains, de préférence un plasma de référence, - un échantillon biologique d'un ou plusieurs contrôles de qualité pour mimer les conditions de patients, 30 - un échantillon biologique d'un patient hémorragique, - un échantillon biologique d'un patient thrombotique, et - un échantillon biologique d'un patient ayant re-thrombosé.