FR 3024775 A1 20160212 FR 1457736 A 20140811 1 PROCEDE D'IDENTIFICATION ET DE CARACTERISATION DE COMPOSES POLYPEPTIDIQUES La présente invention concerne l'identification et la caractérisation de composés conjuguant au moins un polypeptide et au moins une autre molécule. Les composés polypeptidiques sont constitués d'un ensemble d'unités d'acides aminés homologues ou hétérologues sur lesquels sont greffées des molécules dont l'activité biologique et/ou pharmacologique est conservée. Il peut s'agir par exemple de composés poly-lysine. Ces composés ont été décrits notamment dans le brevet FR9413861. Les composés polypeptidiques comme la poly-lysine peuvent être utilisés pour de nombreuses applications biologiques, agroalimentaires, médicales, pharmaceutiques, cosmétiques et environnementales. Pour que ces composés soient distribués en tant que matières premières pour ces applications, en particulier comme matières premières à usage pharmaceutique (MPUP), il est nécessaire de pouvoir délivrer des bulletins d'analyse fiables permettant leur identification et leur caractérisation. Or, aujourd'hui il n'existe aucune méthode spécifique qui permette d'identifier et de caractériser de façon fiable les composés polypeptidiques substitués en général, et des composés poly-lysine en particulier. Des propositions d'analyses ont été effectuées pour ces composés, mais aucune n'est satisfaisante. On peut citer par exemple l'étude réalisée en 2002 par la société Waters (St Quentin en Yvelines (78), d'après le rapport d'analyses concernant la poly-lysine greffée et l'identification des composants par couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse en électrospray positif et négatif. Néanmoins, cette méthode ne permet pas de séparer les analytes correctement. De même, une étude effectuée en 2003 par RMN Dosy ("Diffusion Ordered Spectroscopy"), le laboratoire NMRtec de la faculté de pharmacie de Montpellier (34), d'après le rapport d'analyse RMN Dosy de GEMSEPO1b, référence 20030739, décrit une méthode qui permet de détecter la présence de composés poly-lysine attendus dans le mélange, d'identifier le 3024775 2 squelette de la poly-lysine, mais cette méthode ne permet pas d'identifier de façon fiable les différentes molécules greffées aux faibles concentrations de la préparation. L'utilisation de la technique de chromatographie liquide par électrospray couplée à un spectromètre de masse (HPLC/ESI/QTOF-MS) a été réévaluée et également décrite dans le 5 rapport de l'Université René DESCARTES Paris V, Faculté de Pharmacie (75) en 2003-2004. Là encore, cette méthode ne permet pas de quantifier les molécules greffées des composés poly-lysine. La vérification du greffage des haptènes sur la poly-lysine a été aussi réalisée par un spectromètre de masse MALDI-TOF et MALDI/MS au laboratoire de l'Institut des Sciences 10 Moléculaires de l'Université de Bordeaux (33) en 2005 et 2008. Cette technique a permis de confirmer la présence de petites molécules greffées mais n'a pas permis de les identifier et de les caractériser. La méthode par chromatographie d'exclusion stérique (ECS) a également été testée d'après les résultats de l'Université de Bordeaux, mais elle n'a pas de donné de résultats significatifs 15 concernant la poly-lysine et ses composés. Il est possible de citer également la réalisation d'un dosage immuno-enzymatique par test Elisa des composés poly-lysine greffés avec des acides aminés d'après un rapport de la société Gemacbio, pour l'essai clinique de 2003, n°2002SEP01. Si cette méthode a permis de calculer la courbe du dosage du composé greffé sur la poly-lysine, elle n'a pas permis 20 d'identifier et doser correctement le rapport molécules greffées/poly-lysine. De plus, cette méthode ne met pas en évidence d'éventuels artéfacts moléculaires. D'autres techniques ont été expérimentées mais aucune de ces méthodes n'est fiable et ne peut s'appliquer à tous les composés polypeptidiques greffées avec diverses molécules. L'objectif de l'invention est par conséquent de combler le manque de méthodes analytiques 25 et de proposer un procédé permettant d'identifier et de caractériser des composés polypeptidiques de façon fiable, simple, reproductible et universelle, en vue de leur certification et de leurs applications. A cet effet l'invention vise un procédé d'identification et de caractérisation de composés conjuguant au moins un polypeptide et au moins une autre molécule choisie parmi les acides, les acides gras, les vitamines, les acides aminés, les neurotransmetteurs, les principes actifs comprenant au moins : - une étape d'identification par spectroscopie infra-rouge, et 3024775 3 - au moins une étape de caractérisation choisie parmi : ^ la spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet-visible, ^ la chromatographie en phase gazeuse, ^ la chromatographie en phase liquide haute performance. 5 Avantageusement, ce procédé comprend la mise en oeuvre de méthodes analytiques connues et simples, qui combinées entre elles permettent l'identification, la quantification et la reproductibilité de façon universelle et fiable de conjugués polypeptidiques, ainsi que la caractérisation d'impuretés organiques résultant de leur fabrication et purification. La mise en oeuvre de ce procédé permet d'établir des bulletins d'analyse des conjugués 10 polypeptidiques et par conséquent autorise leur utilisation pour des usages réglementés en particulier dans le domaine pharmaceutique, des compléments alimentaires, ce qui n'était pas possible jusqu'alors. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails de l'invention qui va suivre, en regard des figures annexées sur lesquels : 15 - la figure 1 représente un spectre infra-rouge de la poly-L-lysine - la figure 2 représente plusieurs spectres infra-rouges : la poly-L-lysine (1), le composé lauryl-poly-L-lysine (2), un mélange poly-L-lysine + acide laurique (3) et l'acide laurique (4) - la figure 3 représente plusieurs spectres infra-rouges : la poly-L-lysine (1), le 20 composé acide urique-anhydride glutarique-poly-L-lysine (2), un mélange poly-L- lysine + acide urique (3) et l'acide urique (4) - la figure 4 représente plusieurs spectres infra-rouges : la poly-L-lysine (1), le composé acide ascorbique-poly-L-lysine (2), un mélange poly-L-lysine + acide ascorbique (3) et l'acide ascorbique (4) 25 - la figure 5 représente plusieurs spectres infra-rouges : la poly-L-lysine (1), le composé 5-hydroxytryptamine-G-poly-L-lysine (2), un mélange poly-L-lysine + 5- hydroxytryptamine (3) et 5-hydroxytryptamine (4) - la figure 6 représente des spectres infra-rouge de structures secondaires de la poly-L-lysine 30 - la figure 7 représente des spectres infra-rouge de structures secondaires du lauryl-poly-L-lysine - la figure 8 représente le chromatogramme du composé Lauryl-poly-L-lysine. 3024775 4 L'invention vise donc un procédé d'identification et de caractérisation de composés ayant au moins un polypeptide et au moins une autre molécule choisie parmi les acides, les acides gras, les vitamines, les acides aminés, les neurotransmetteurs, les principes actifs, comprenant au moins : 5 - une étape d'identification par spectroscopie infra-rouge, et - au moins une étape de caractérisation choisie parmi : ^ la spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet-visible, ^ la chromatographie en phase gazeuse, ^ la chromatographie en phase liquide haute performance. 10 Par polypeptide au sens de l'invention on entend une macromolécule constituée d'unités de plus de 20 acides aminés. Préférentiellement le polypeptide est parmi le poly-glutamate, la poly-arginine, la polyornithine, la poly-DL-sérine. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le polypeptide est la poly-lysine. La 15 poly-lysine est une macromolécule d'unités de lysines, préférentiellement de L-lysine, linéaire ou ramifié dont le nombre (n) de sous-unités est au moins de 20 lysines : n 20 lysines. Le procédé selon l'invention comprend une étape d'identification du composé par spectroscopie infra-rouge. 20 La spectroscopie infra-rouge (IR) est une technique connue aussi bien en industrie qu'en recherche, en tant que contrôle qualité ou mesure de recherche. Son utilisation est simple et rapide, reproductible et fiable. Cette technique ne détruit pas l'échantillon, avec peu ou pas de préparation de l'échantillon. Les échantillons peuvent être analysés sous forme de poudre, liquide, film ou gaz, selon les accessoires du compartiment échantillon. 25 L'appareillage et le logiciel sont facilement utilisés en analyse de routine. Son utilisation dans le procédé selon l'invention permet l'identification de tous les composés polypeptidiques, la détermination de la composition de l'échantillon et la quantification des constituants. L'objectif de la caractérisation est d'identifier l'empreinte spectrale du composé polypeptidique. L'étape d'identification par spectroscopie infra-rouge consiste à 30 comparer le spectre obtenu pour le conjugué poly-lysine/molécule au spectre de la poly- lysine et au spectre de la molécule seule. En effet, le greffage de la molécule sur le polypeptide est vérifié par comparaison avec l'empreinte infra-rouge du polypeptide, de la 3024775 5 petite molécule seule et d'un contrôle du type mélange de la molécule libre avec la polylysine libre. Les pics spécifiques à la petite molécule sont ainsi identifiés. Tous les composés polypeptidiques sont identifiables et reconnaissables par leur empreinte infra-rouge. D'après le spectre infra-rouge, l'empreinte spectrale générale et majoritaire d'un composé 5 polypeptidique est celui du polypeptide. De façon préférée, la spectroscopie infra-rouge est une spectroscopie infra-rouge à Transformée de Fourier. Les composés Poly-L-Lysine sont ainsi analysés par un appareillage Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IR-TF) et notamment grâce à l'accessoire ATR (« Attenuated Total Reflectance »). 10 Cette étape d'identification par spectroscopie infra-rouge est préférentiellement mise en oeuvre avec au moins une des caractéristiques suivantes : - une gamme spectrale comprise entre 400 et 4000 cm-1, - une intensité spectrale en transmission ou en absorbance, - une résolution comprise entre 1 et 8 cm-1, 15 - un nombre de scans effectués par l'appareil compris entre 10 et 20, pour chaque échantillon analysé. L'analyse des composés polypeptidiques et des matières premières se fait sous forme de poudre ou liquide sur une gamme spectrale allant préférentiellement de 400 à 4000 cm-1. Un background est réalisé avant chaque analyse, les paramètres des spectres sont en nombre 20 d'onde (cm-1) pour l'abscisse et en absorbance ou transmittance pour l'ordonnée. Préférentiellement au moins 2 analyses sont réalisées sur chaque échantillon. Un spectre est enregistré dans une bibliothèque créée pour chaque famille de composés polypeptidique, en vue d'une recherche ultérieure. Le procédé selon l'invention, en plus de l'étape d'identification par spectroscopie infra- 25 rouge, comprend au moins une étape de caractérisation choisie parmi : ^ la spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet (UV) et le visible, ^ la chromatographie en phase gazeuse, et ^ la chromatographie en phase liquide haute performance. Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape de détection de 30 solvants résiduels et/ou au moins une analyse microbiologique. L'étape de spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet et le visible est une méthode basée sur la propriété qu'ont certaines molécules d'absorber des radiations lumineuses de 3024775 6 longueur d'onde déterminée. L'absorbance de la petite molécule greffée au polypeptide dans le domaine de l'ultra-violet va permettre de calculer sa concentration, grâce à la loi de Beer-Lambert, A=ECI, A étant l'absorbance ou densité optique (DO), C étant la concentration en mol/L, E étant le coefficient d'absorption molaire en mol-1.L.cm-1, et I étant le trajet 5 optique cm-1. La spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet et le visible est particulièrement adaptée pour les composés polypeptidiques avec un greffage de petites molécules ayant un cycle, comme l'acide ascorbique, la phénylalanine, la L-Dopa, l'acide rétinoïque, l'alpha-tocophérol, la 5-méthoxytryptamine, etc. Le coefficient d'absorption molaire est calculé grâce à une gamme de concentrations de la 10 petite molécule seule. Ce coefficient est appliqué au composé polypeptidique, sachant qu'un shift de la petite molécule est parfois identifié lorsqu'elle est greffée sur un transporteur. Préférentiellement l'étape de spectroscopie dans l'UV et le visible est réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : mise en oeuvre sur un spectromètre à double faisceau, 15 une gamme spectrale comprise entre 200 et 700 nm, une intensité spectrale en absorbance, une bande passante comprise entre 1 et 4 nm, une vitesse d'acquisition comprise entre 120 et 480 nm/min, un volume utilisé compris entre 700 ul et 2 ml. 20 La chromatographie est définie comme une méthode qui permet de séparer les composants d'un mélange à analyser grâce à leur migration différentielle le long d'un dispositif séparateur. Ce dispositif séparateur est dans tous les cas une colonne chromatographique ; elle peut avoir la forme d'un cylindre plus ou moins long. Des processus d'équilibre physico-chimique réversibles sont à l'origine des séparations chromatographies, et plus 25 particulièrement les liaisons chimiques covalentes et surtout non-covalentes. En fait la chromatographie utilise toutes les formes possibles d'interactions réversibles entre les molécules de la phase fixe et celles du soluté. La chromatographie en phase gazeuse nécessite de vaporiser l'échantillon à analyser avant son injection dans la colonne. Pour cela, l'échantillon doit être chauffé. Cela suppose que les 30 molécules d'intérêt ne soient pas dégradées à la température utilisée pour vaporiser l'échantillon. En général, le gaz utilisé est le plus neutre possible. Le plus souvent, on utilise de l'hélium ou de l'azote. L'hydrogène possède également des caractéristiques très 3024775 7 intéressantes, mais s'agissant d'un gaz dangereux (risque d'explosion) il est beaucoup moins utilisé. Une hydrolyse acide est nécessaire avant la mise en oeuvre de la chromatographie en phase gazeuse, afin de couper la liaison covalente entre l'acide gras, l'acide par exemple et le 5 polypeptide. Pour cela, il est possible d'utiliser l'acide méthane sulfonique. Une décantation est ensuite préférentiellement réalisée par lavage avec un solvant organique, avant d'effectuer l'analyse par chromatographie. L'étape de chromatographie en phase gazeuse est préférentiellement réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : 10 - mise en oeuvre sur une colonne semi-capillaire en silice fondue ou capillaire, - utilisation d'un gaz vecteur d'hydrogène ou d'hélium avec un débit compris entre 1 et 4 ml/min, - une pression comprise entre 2 et 3bars, - un mode Split, une température de l'injecteur et du détecteur comprise entre 80 15 et 300°C, une température du four comprise entre 200 et 250 °C, - une montée en température comprise entre 10 et 20°C/min, - un volume injecté de 2 à 20 ill, - un détecteur à ionisation de flamme ou spectromètre de masse. La chromatographie en phase liquide haute performance est préférentiellement utilisée en 20 phase inverse. Les caractéristiques sont d'avoir une phase stationnaire apolaire, une phase mobile polaire ou peu polaire et les composés les plus apolaires sont élués en dernier. Les colonnes de séparation utilisées sont souvent de fines particules de gel de silice ayant des groupements -OH sur les chaînes apolaires (alkyles en C4, C6, C8, C18, Phényl, Cyano, etc...). Outre le fait que cela rend le support apolaire, cela permet également de le stabiliser dans le 25 temps. En fonction des chaînes greffées, on obtient des colonnes plus ou moins hydrophobes que l'on choisira en fonction de la nature des molécules à séparer. Les analyses en chromatographie liquide (HPLC), doivent préférentiellement être précédées d'une hydrolyse acide et/ou dérivatisation, notamment avec un acide méthane sulfonique. L'étape de chromatographie en phase liquide haute performance est préférentiellement 30 réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : - mise en oeuvre sur une colonne en phase normale ou inversée de diamètre compris entre 4 et 20 mm, de longueur entre 15 et 30 cm, 3024775 8 - utilisation d'une phase mobile polaire ou peu polaire, - un mode en isocratique ou gradient, - un volume injecté de 10 à 100 i.il, - un détecteur fluorescence ou UV-visible. 5 Selon un premier mode de réalisation, les composés à identifier et à caractériser sont des composés ayant au moins un polypeptide et au moins un acide et/ou au moins un acide gras, et le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et une étape de chromatographie en phase gazeuse précédée d'une hydrolyse acide. Selon un deuxième mode de réalisation, les composés à identifier et à caractériser sont des 10 composés ayant au moins un polypeptide et au moins une vitamine, et le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et : - une étape de spectroscopie d'absorption dans l'UV et le visible, et/ou - une étape de chromatographie en phase gazeuse ou une étape de chromatographie en phase liquide haut performance. 15 Selon un troisième mode de réalisation, les composés à identifier et à caractériser sont des composés conjuguant au moins un polypeptide et au moins un acide aminé, et le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge et une étape de chromatographie en phase liquide haute performance. Selon un quatrième mode de réalisation, les composés à identifier et à caractériser sont des 20 composés conjuguant au moins un polypeptide et au moins un neurotransmetteur, et le procédé selon l'invention comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et : - une étape de spectroscopie d'absorption dans l'UV et le visible, et/ou - une étape de chromatographie en phase liquide haute performance. Les différents modes de réalisation préférés du procédé selon l'invention sont résumés dans 25 le tableau ci-après : 3024775 9 Acides gras Vitamines Acides aminés Neurotransmetteurs Acides Identification IR Quantification CPG UV-visible HPLC UV-Visible et/ou CPG ou et/ou HPLC HPLC IR = Infra-Rouge UV-Visible = Spectroscopie d'absorption dans l'UV et le visible CPG = Chromatographie en phase gazeuse HPLC = Chromatographie Liquide Haute Performance Ces différentes variantes peuvent également comprendre en plus des étapes déjà décrites, une étape de recherche de solvants résiduels et/ou au moins une analyse microbiologique. Les substances actives doivent faire l'objet d'un contrôle des solvants résiduels selon les exigences relatives aux préconisations ICH (International Conference on Harmonization), 5 répondant aux limites en teneur de solvants sous forme de traces pouvant subsister après synthèse et purification. Selon la classification des solvants résiduels en fonction de l'évaluation du risque : - classe 1 : solvants à éviter, - classe 2 : solvants à utilisation limitée pour usage pharmaceutique, 10 - classe 3 : solvants à utilisation limitée par les Bonnes Pratiques de Fabrication. Par exemple, le diméthyl sulfoxide est de classe 3, le méthanol est de classe 2, l'éthyl chloroformiate est de classe 3, le triéthylamine est de classe 2 et le glutaraldéhyde est de classe 2. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la caractérisation des molécules 15 greffées sur des polypeptides et leur validation analytique de ces composés en vue d'applications industrielles notamment dans les domaines biologiques, agroalimentaires, cosmétiques, médicales, pharmaceutiques et environnementales. L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs du procédé selon l'invention permettant d'identifier et de caractériser spécifiquement des composés 20 conjuguant au moins une poly-L-lysine (PLL) et au moins une autre molécule. Plusieurs composés ont été analysés : Conjugué PLL + acide laurique : l'acide laurique (lauryl) est activé par le chloroformiate d'éthyl (ECF) qui réagit comme agent couplant par activation de l'acide carboxylique de l'acide gras. L'activation est facilitée par l'ajout de 3024775 10 triéthylamine. Le produit intermédiaire (lauryl-ECF) réagit sur le groupement c-aminé du résidu lysyl par la formation d'une liaison amide. Puis le composé lauryl-PLL est purifié, idéalement par ultra-filtration tangentielle, puis lyophilisé si nécessaire. L'acide laurique est alors greffé par liaison covalente à la PLL. 5 Conjugué PLL + acide urique : l'acide urique est activé par son groupement amine grâce au groupe carboxyle de l'anhydride glutarique (AG). Puis ce produit intermédiaire acide urique-AG est activé par le chloroformiate d'éthyl (ECF) qui réagit comme agent couplant par activation de l'acide carboxylique de l'acide. L'activation est facilitée par l'ajout de triéthylamine. Le deuxième produit intermédiaire (acide 10 urique-AG-ECF) réagit sur le groupement c-aminé du résidu lysyl par la formation d'une liaison amide. Puis le composé acide urique-AG-PLL est purifié idéalement par ultra-filtration tangentielle, puis lyophilisé si nécessaire. L'acide urique est alors greffé par liaison covalente à la PLL. Conjugué PLL + acide ascorbique : l'acide ascorbique est activé par le carbodiimide 15 (EDC) qui réagit comme agent couplant par activation de l'acide du composé. Cette activation est facilitée par l'ajout de N-hydroxysuccinimide (NHS). Le produit intermédiaire réagit sur le groupement c-aminé du résidu lysyl par la formation d'une liaison amide. Puis le composé ascorbate-PLL est purifié idéalement par ultrafiltration tangentielle, puis lyophilisé si nécessaire. L'acide ascorbique est alors greffé 20 par liaison covalente à la PLL. Conjugué PLL + 5-hydroxytryptamine (5HT): la 5HT est activée par le glutaraldéhyde (G) qui réagit comme agent couplant par activation de l'amine de l'acide aminé. Le produit intermédiaire (5HT-G) réagit sur le groupement c-aminé du résidu lysyl par la formation d'une liaison amide. Puis le composé 5HT-G-PLL est purifié idéalement par 25 ultra-filtration tangentielle, puis lyophilisé si nécessaire. La 5HT est alors greffée par liaison covalente à la PLL. Identification de composés poly-L-lysine par infra-rouge Tous les composés Poly-L-Lysine sont analysés au moyen de l'appareillage Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IR-TF Bruker) grâce à l'accessoire ATR (Attenuated Total 30 Reflectance). L'objectif de la caractérisation est d'identifier l'empreinte spectrale du composé PLL. Le greffage des petites molécules sur la PLL est vérifié par comparaison avec l'empreinte infra-rouge de la PLL, des petites molécules seules et d'un contrôle. Les pics 3024775 11 spécifiques dus aux petites molécules sont ainsi identifiés. Tous les composés PLL sont identifiables et reconnaissables par leur empreinte infra-rouge. D'après le spectre infra- rouge, l'empreinte infra-rouge générale et majoritaire d'un composé PLL est celui de la PLL. L'analyse des composés PLL et des molécules greffées se fait sous forme de poudre ou 5 liquide sur une gamme spectrale allant de 400 à 4000 cm-1. Un background est réalisé avant chaque analyse, les paramètres des spectres sont en nombre d'onde (cm-1) pour l'abscisse et en absorbance pour l'ordonnée. La résolution est de 4 cm-1. 16 scans sont effectués par l'appareil pour chaque échantillon analysé. 2 analyses sur chaque échantillon sont réalisées. Un spectre est enregistré dans une bibliothèque créée pour chaque famille de composés PLL. 10 Le tableau ci-après décrit des normes infra-rouge qui permettent d'accepter ou de refuser un lot de composés poly-L-lysine : Normes IR Range de conformité Valeur basse admise en absorbance : 0,05 Abs à 3300 cm-1 0,180 Abs à 1650 cm-1 Avec correction de ligne de base Valeur haute admise en absorbance : 0,150 Abs à 3300 cm-1 0,450 Abs à 1650 cm-1 Avec correction de ligne de base Vérification du greffage : Shift de 2 à 10 cm-1 sur les pics amides à 1650 et 1540cm-1 Zone des pics spécifiques des petites molécules : Zone de 3000 à 3200 cm-1 Zone de 1500 à 600 cm-1 Le spectre de la figure 1 est celui de la Poly-L-lysine seule, représentée par la formule : Sur la figure 1, la zone de 2600 à 3600 cm-1- correspond aux groupements CH et CH2 présents dans la PLL. Pour chaque groupe fonctionnel, on identifie une bande. Les bandes des CH2 des 15 chaînes latérales des résidus lysyl sont visibles de 2850 à 3000 cm-1. La liaison N-H des amines primaires se situent entre 3100 et 3300 cm-1- (2 bandes). 3024775 12 La zone de 700 à 1700 cm-1- correspond aux bandes de déformation des carbonyles C=0 (1700 à 1600 cm-1), appelé amide I. La liaison C-N (1480 à 1520 cm-1) est appelée amide II. La liaison N-H, amide III est comprise dans la zone entre 1300 et 1400cm-1. Ces deux bandes majeures lors de l'analyse de protéines (liaisons amides) évoluent en fonction de la structure 5 bidimensionnelle de ces dernières. En bout de chaîne du polypeptide, il y a un -COOH et un -NH2. La figure 2 représente le spectre de la PLL (n°1), du composé lauryl-PLL (n°2), du mélange PLL+ acide laurique (n°3), de l'acide laurique (n°4). Le composé lauryl-PLL (acide laurique greffé sur une PLL) est représenté par la formule 10 suivante : rH J Pour le composé lauryl-PLL, les résultats permettent d'affirmer la présence d'acide laurique et de PLL, grâce à la comparaison des différents pics. Les pics spécifiques à l'acide laurique greffé sont à 1460 cm-1- (C-CH3) et à 2930 et 2860 cm-1- (CH2). La figure 3 représente le spectre de la PLL (n°1), du composé acide urique-AG-PLL (n°2), du 15 mélange PLL+ acide urique (n°3), de l'acide urique (n°4). Le composé acide urique-AG-PLL est représenté par la formule suivante : Les pics spécifiques à l'acide urique greffé sont à 1255 cm-1- (C-N cycle) et à 1455 cm-1- (NH du cycle). L'augmentation d'intensité des pics 2930 et 2865 cm-1- correspondent au CH2 du linker anhydride glutarique. 20 La figure 4 représente le spectre de la PLL (n°1), du composé acide ascorbique-PLL (n°2), du mélange PLL + acide ascorbique (n°3), de l'acide ascorbique (n°4). Le composé acide ascorbique-PLL est représenté par la formule suivante : 0 NH 3024775 13 Le mélange PLL + acide ascorbique permet d'affirmer, grâce aux différences de pics, que le spectre du composé acide ascorbique-PLL est le spectre de l'acide ascorbique greffé sur la PLL. Les pics spécifiques à l'acide ascorbique greffé sont à 3290 cm-1- (-OH), à 1370 cm-1- (-OH) et à 5 1250 cm-1- (C-O-C). La figure 5 représente le spectre de la PLL (n°1), du composé 5Hydroxytryptamine-G-PLL (n°2), du mélange PLL+ 5HT (n°3), de la 5HT (n°4). Le composé 5HT-G-PLL est représenté par la formule suivante : Les pics spécifiques à la 5HT greffé sont à 1335 cm-1- (C-N cycle azoté), à 1310 cm-1- (-OH lié) 10 et à 1020-1080 (C-0). L'augmentation d'intensité des pics 2930 et 2865 cm-1- correspondent au CH2 du linker glutaraldéhyde. Identification de la structure secondaire par infra-rouge Les composés PLL étant étudiés in vitro et in vivo, leur activité antibactérienne peut être démontrée suivant la structure secondaire. 15 La technique du dichroïsme circulaire par Infra-Rouge permet de déterminer avec précision la structure secondaire d'un composé polypeptidique substitué. La spectroscopie infra-rouge à Transformée de Fourier est une méthode également utilisable pour la détermination expérimentale de la structure secondaire d'un polypeptide. La zone spectrale étudiée allant de 1400 à 1800 cm-1- correspond à l'amide I et II de la PLL ou du 20 composé PLL. Le traitement spectral apporté est d'effectuer la dérivée seconde, étudiant ainsi la conformation désordonnée ou ordonnée des composés PLL. Sur la figure 6, on constate que la PLL a une structure secondaire désordonnée, zoom spectral de la zone amine de la PLL (n°1), zoom de la dérivée seconde de la PLL (n°2). Sur la figure 7, le composé analysé est le lauryl-PLL. La dérivée seconde nous informe d'une 25 structure ordonnée, zoom spectral de zone amine du lauryl-PLL (n°1), zoom de la dérivée seconde du lauryl-PLL (n°2). 3024775 14 Quantification par UV-visible 1/ Exemple du composé ascorbique-PLL: Un volume de composé acide ascorbique-PLL est dilué dans un solvant organique ou en milieu aqueux puis analysé dans le domaine de l'UV. 5 Le maximum du coefficient d'absorption molaire de l'acide ascorbique est à E=254 nm. Celui du composé acide ascorbique-PLL est à E=254-256 nm. [C254 = (DO254 - D0500) x facteur de dilution £254 DO254 = 0,727 E; D0500= 0 ; E 254 = 13 705 ; Facteur de dilution = 20 [C254] = 0,0010 mol/L 10 D'après l'absorbance des petites molécules en UV, la concentration est calculée grâce à la loi de Beer-Lambert. (DOÀ- DO bruit de fond) x facteur de dilution [CE] = Le tableau suivant décrit des normes UV qui permettent d'accepter ou de refuser un lot de composés poly-L-lysine : Normes UV Plage de conformité Valeur basse admise en concentration : le mon Valeur haute admise en concentration : 5.10-2 mol/L 15 2/ Exemple du composé 5HT-G-PLL: Un volume de composé 5HT-G-PLL est dilué dans un solvant organique ou en milieu aqueux puis analysé dans le domaine de l'UV. Le maximum du coefficient d'absorption molaire du 5HT, est à E1=280 nm et à E2=300 nm Celui du composé 5HT-G-PLL est à E1=275-280 nm et à E2=295-300 nm £À 3024775 [C280] = (D0280 - D0500) x facteur de dilution 15 £280 DO280 = 0,765 ; D0500= 0 ; E 280 = 5290 ; Facteur de dilution = 20 [C280] = 0,00289 mol/L D0300 = 0,649 ; D0500= 0 ; E 300 = 4198 ; Facteur de dilution = 20 5 Et [C300] = 0,00309 mol / L Et [Cmoyen] = 0,00299 mol/L D'après l'absorbance des petites molécules en UV, la concentration est calculée grâce à la loi de Beer-Lambert. (DOÀ- DO bruit de fond) x facteur de dilution [CE] = Quantification de composés PLL-acides gras 10 Après la synthèse du composé Lauryl-PLL et sa purification par ultra-filtration tangentielle (UFT), on procède sur un échantillon du composé à une hydrolyse acide en vue de la quantification du Lauryl lié de façon covalente à la PLL. Exemple du composé Lauryl-PLL. 20 mg de Lauryl-PLL est rajouté à un volume de 2 ml d'une solution à 1 mg/ml d'acide 15 décanoïque (étalon interne) dissout dans l'acide méthane sulfonique à 99%. Cette solution est placée sous agitation magnétique et chauffée à 120°C pendant 3 heures. Dans un volume de 2 ml d'eau purifiée, la solution précédente est versée par fractions, puis chauffée à 65°C pendant 15 minutes. Le mélange est ainsi rincé par 3 ml d'acétate d'éthyle puis 4 ml d'eau. La phase organique est ainsi récupérée et analysée par une technique de séparation 20 chromatographique. Une solution témoin a également été préparée à une concentration de 0,4 mg/ml d'acides gras dans l'acétate d'éthyl. La technique utilisée est la chromatographie en phase gazeuse, avec un détecteur à ionisation de flamme (FID). Il sera possible d'utiliser un détecteur spectromètre de masse, 25 pour plus de précision dans la détermination des pics du chromatogramme. La teneur en acides gras à doser est déterminée grâce à une colonne semi-capillaire en silice fondue (30 mètres et 0,53 mm de diamètre), à un gaz vecteur d'hydrogène (débit 4 ml/min), à une pression de 2,7 bars, à un Split de 22, à une température de l'injecteur et du détecteur de 250°C, à une température du four de 200°C puis une montée en température de 5°C/min 30 jusqu'à 250°C, avec une durée d'exécution de 15 minutes. £À 3024775 16 La solution à examiner est injectée (2 pl) selon les conditions précédentes, ainsi que la solution témoin (20 mg de l'étalon interne et 20 mg d'acides gras à doser dissout dans 50 ml d'acétate d'éthyle). Sur les chromatogrammes, le premier pic est celui de l'acétate d'éthyle, et les pics suivants sont ceux des acides gras de la plus courte à la plus longue chaîne 5 aliphatique. La teneur est comprise entre 5 et 30% d'acides gras dosés. Le chromatogramme du composé Lauryl-PLL obtenu est présenté sur la figure 8. On constate que le temps de rétention de l'acide décanoïque est 7,258 min et le temps de rétention de l'acide laurique greffé est 10,025 min. Le calcul de la teneur en acides gras à doser est le suivant : 10% x PEI X ASE T (% m/m) - AEIE PEX AST x PREI AEIT x PR 10 ASE : aire du pic de l'acide gras sur le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner. AST : aire du pic de l'acide gras sur le chromatogramme obtenu avec la solution témoin. AEIE : aire du pic de l'étalon interne (acide décanoïque) sur le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner. AEIT : aire du pic de l'étalon interne (acide décanoïque) sur le chromatogramme obtenu avec 15 la solution témoin. PE : prise d'essai du composé Lauryl-PLL pour la réalisation de la solution à examiner. PE, : prise d'essai de l'étalon interne (acide décanoïque) pour la réalisation de la solution à examiner. PREI : prise d'essai de l'étalon interne (acide décanoïque) pour la réalisation de la solution 20 témoin. PR : prise d'essai de l'acide gras (acide laurique) à doser pour la réalisation de la solution témoin. D'après les résultats des chromatogrammes sur composés acides gras-PLL, la teneur en acides gras greffés est confirmée par un pourcentage de greffage sur la PLL. 25 T (% m/m) : pourcentage de greffage On peut déterminer une norme et une plage de conformité. 3024775 17 Normes CPG Plage de conformité Valeur basse admise en concentration : 5% Valeur haute admise en concentration : 20% REVENDICATIONS1. Procédé d'identification et de caractérisation de composés conjuguant au moins un polypeptide et au moins une autre molécule choisie parmi les acides, les acides gras, les vitamines, les acides aminés, les neurotransmetteurs et les principes actifs, comprenant au moins : - une étape d'identification par spectroscopie infra-rouge, et - au moins une étape de caractérisation choisie parmi : ^ la spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet-visible, ^ la chromatographie en phase gazeuse, ^ la chromatographie en phase liquide haute performance. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi les polypeptides d'acides aminés. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polypeptide est la poly-lysine. 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape de détection de solvants résiduels et/ou au moins une analyse micro biologique. 5. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la spectroscopie infra-rouge est une spectroscopie infra-rouge à Transformée de Fourier. 6. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape d'identification par spectroscopie infra-rouge est mise en oeuvre avec au moins une des caractéristiques suivantes : - une gamme spectrale comprise entre 400 et 4000 cm-1, - une intensité spectrale en transmission ou en absorbance, - une résolution comprise entre 1 et 8 cm-1, - un nombre de scans effectués par l'appareil compris entre 10 et 20, pour chaque échantillon analysé. 7. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape d'identification par spectroscopie infra-rouge consiste à comparer le spectre obtenu 3024775 19 pour le conjugué poly-lysine/molécule au spectre de la poly-lysine et au spectre de la molécule seule. 8. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les composés à identifier et à caractériser sont des composés conjuguant au moins une poly- 5 lysine et au moins un acide et/ou au moins un acide gras, et en ce qu'il comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et une étape de chromatographie en phase gazeuse précédée d'une hydrolyse acide. 9. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les composés à identifier et à caractériser sont des composés conjuguant au moins une poly- 10 lysine et au moins une vitamine, et en ce qu'il comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et : - une étape de spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet-visible, et/ou - une étape de chromatographie en phase gazeuse ou une étape de chromatographie en phase liquide haute performance. 15 10. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie en phase gazeuse est réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : - mise en oeuvre sur une colonne semi-capillaire en silice fondue ou capillaire, - utilisation d'un gaz vecteur d'hydrogène ou d'hélium avec un débit compris entre 20 1 et 4 ml/min, - une pression comprise entre 2 et 3 bars, - un mode Split, une température de l'injecteur et du détecteur comprise entre 80 et 300°C, une température du four comprise entre 200 et 250 °C, - une montée en température comprise entre 10 et 20°C/min, 25 - un volume injecté de 2 à 20 ill, - un détecteur à ionisation de flamme ou spectromètre de masse. 11. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les composés à identifier et à caractériser sont des composés conjuguant au moins une polylysine et au moins un acide aminé, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et une étape de chromatographie en phase liquide haute performance. 3024775 20 12. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les composés à identifier et à caractériser sont des composés conjuguant au moins une polylysine et au moins un neurotransmetteur, et en ce qu'il comprend au moins une étape de spectroscopie infra-rouge, et : 5 - une étape de spectroscopie d'absorption dans l'Ultra-Violet-visible, et/ou - une étape de chromatographie en phase liquide haute performance. 13. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie en phase liquide haute performance est précédée d'une hydrolyse acide ou dérivatisation. 10 14. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie en phase liquide haute performance est réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : - mise en oeuvre sur une colonne en phase normale ou inversée de diamètre comprise entre 4 et 20 mm, de longueur entre 15 et 30 cm, 15 - utilisation d'une phase mobile polaire ou peu polaire, - un mode en isocratique ou gradient, - un volume injecté de 10 à 100 ul, - un détecteur fluorescence ou UV-visible, 15. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que 20 l'étape de spectroscopie UV/visible est réalisée avec au moins l'une des caractéristiques suivantes : - mise en oeuvre sur un spectromètre à double faisceau, - une gamme spectrale comprise entre 200 et 700 nm, - une intensité spectrale en absorbance, 25 - une bande passante comprise entre 1 et 4 nm, - une vitesse d'acquisition comprise entre 120 et 480 nm/min - un volume utilisé compris entre 700 ul et 2 ml.