FR 3035408 A1 20161028 FR 1553755 A 20150427 Procédé de Culture Organotypique de Tumeur Cancéreuse et Utilisations des Cultures Organotypiques Obtenues par le Procédé Domaine de l'Invention La présente invention concerne un procédé de culture organotypique de tissu de tumeur cancéreuse, en particulier de tumeur cancéreuse rénale, et l'utilisation des cultures organotypiques ainsi obtenues dans différentes applications, en particulier pour la mise en place d'une thérapie anticancéreuse personnalisée. Contexte de l'Invention L'Organisation Mondiale de la Santé liste plus de 50 différents types de cancer du rein. Le carcinome à cellules rénales (CCR) est le cancer du rein le plus commun chez les adultes (hommes et femmes confondus) et représente en moyenne plus de 90% de toutes les tumeurs malignes rénales. 11 a été estimé que, chaque année dans le monde, environ 209 000 nouveaux cas de CCR sont diagnostiqués, et le CCR cause 102 000 décès. L'incidence du carcinome à cellules rénales n'a cessé d'augmenter, et le taux de mortalité atteint aujourd'hui les 40%. Ce cancer est caractérisé par un manque de symptômes avant-coureurs, des manifestations cliniques diverses et une résistance à la chimiothérapie cytostatique classique et à la radiothérapie. Ainsi, la chirurgie reste le pilier de la prise en charge de la thérapie curative. L'émergence de nouvelles approches thérapeutiques utilisant les concepts de pharmaco-génomique fondés sur les gènes et leurs fonctions, a permis la mise en oeuvre de nouvelles stratégies médicamenteuses à prescrire après la chirurgie. Ces nouvelles thérapeutiques dites "ciblées" s'attaquent à certains processus plus spécifiquement "malins" comme la prolifération cellulaire et l'angiogénèse. Dans les carcinomes à cellules claires richement vascularisés, des molécules anti-angiogéniques (anti-VEGF, anti-PDGR ou anti-EGFR), en combinaison ou non avec des inhibiteurs de l'angiotensine, ont fait la preuve de leur efficacité, et ont totalement bouleversé la prise en charge des patients atteints de carcinome à cellules rénales. Toutefois, si ces thérapies peuvent s'avérer efficaces pour certains patients, nombre d'entre eux souffrent d'effets secondaires qui nécessitent une suspension du traitement avec tous les inconvénients liés à la reprise de la croissance de la tumeur. Certains patients peuvent également échapper rapidement au traitement et devenir résistants. 1 3035408 Actuellement, la prise de décision de la mise en place du traitement médicamenteux se fait après analyse des paramètres cliniques du patient atteint de carcinome à cellules rénales et des paramètres histologiques de la tumeur. Or, ces paramètres ne permettent pas de prédire la réponse d'un patient au traitement. 11 existe donc toujours, dans l'art, un 5 besoin de disposer de nouveaux outils pour faciliter la sélection d'un protocole de traitement médicamenteux qui soit spécifiquement adapté à la tumeur cancéreuse rénale développée par un individu donné. Résumé de l'Invention Les présents inventeurs ont mis au point un procédé de culture organotypique de 10 tissu de tumeur cancéreuse rénale, un projet qui, à la connaissance des inventeurs, n'avait pas abouti jusqu'à présent. Ce procédé permet d'obtenir des échantillons de culture de tumeur cancéreuse rénale qui contiennent tous les types de cellules du tissu tumoral dans leur environnement naturel, avec des interactions intercellulaires et des interactions cellules-matrice qui demeurent intact. De ce fait, les cultures organotypiques obtenues 15 par le procédé sont plus représentatives de la situation in vivo qu'une lignée cellulaire ou qu'une culture cellulaire primaire. Les inventeurs ont démontré qu'après 10 jours de culture, les cultures organotypiques obtenues par le procédé présentent un aspect histologique parfaitement conservé sur l'ensemble de l'échantillon, un réseau vasculaire maintenu, un pourcentage de cellules en prolifération stable au cours du temps et une 20 absence d'apoptose et de protéolyse cellulaire. En conséquence, dans un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de culture organotypique de tissu de tumeur cancéreuse comprenant une étape consistant à cultiver un échantillon du tissu de tumeur cancéreuse dans un milieu de culture organotypique comprenant un mélange consistant en : entre 90% et 80% en volume d'un 25 milieu de culture pour cellules endothéliales et entre 10% et 20% en volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales. Par exemple, le mélange peut consister en 90% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et 10% en volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales, ou 89% et 11%, 88% et 12%, 87% et 13%, 86% et 14%, 85% et 15%, 84% et 16%, 83% et 17%, 82% et 18%, 81% et 19% ou 80% et 20%, 30 respectivement. Dans certains modes de réalisation préférés, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse rénale. Cependant, le procédé de culture organotypique selon l'invention peut 2 3035408 être mis en oeuvre pour cultiver des échantillons de tissu d'autres types de tumeurs cancéreuses. Ainsi dans certains modes de réalisation, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse du poumon, de l' oesophage, de l'estomac, du foie, de pancréas, du colon, du sein, de l'ovaire, du col de l'utérus, de la prostate, des testicules, de la peau, de 5 la thyroïde, des glandes surrénales, etc... Dans certains modes de réalisation préférés, le procédé de culture organotypique de tissu de tumeur cancéreuse comprend une étape consistant à cultiver un échantillon du tissu de tumeur cancéreuse dans un milieu de culture organotypique comprenant un mélange consistant en 90% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales 10 et 10% en volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales. Dans certains modes de réalisation, le procédé est caractérisé en ce que le milieu de culture organotypique comprend en outre du sérum de veau foetal (SVF), de la streptomycine, de la pénicilline, et du glycérol. Par exemple, le milieu de culture organotypique peut comprendre en outre 10% en volume de sérum de veau foetal, 100 15 mg/mL de streptomycine, 100 units/mL de pénicilline et 1% en volume de glycérol. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon de tumeur cancéreuse, en particulier l'échantillon de tumeur cancéreuse rénale, est découpé en tranches d'environ 300 iim, d'environ 400 iim, d'environ 500 iim, ou d'environ 600 iim. Dans certains modes de réalisation, le procédé est caractérisé en ce que la culture 20 organotypique est effectuée pendant moins de 7 jours, par exemple : 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours ou 7 jours. Dans d'autres modes de réalisation, le procédé est caractérisé en ce que la culture organotypique est effectuée pendant 7 à 13 jours, par exemple : 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours ou 13 jours. 25 Dans encore d'autres modes de réalisation, le procédé est caractérisé en ce que la culture organotypique est effectuée pendant plus de 13 jours. Dans certains modes de réalisation, la culture organotypique est effectuée dans un environnement stérile à 37°C dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée de 95% d'air et de 5% de CO2. 30 Généralement, l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse provient d'un sujet souffrant d'une tumeur cancéreuse. Le sujet peut être n'importe quel mammifère pouvant 3 3035408 développer une tumeur cancéreuse. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse provient d'un patient souffrant d'une tumeur cancéreuse. L'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse peut être obtenu par n'importe quelle technique appropriée connue dans l'art. Par exemple, l'échantillon de tissu de tumeur 5 cancéreuse rénale est prélevé lors de la chirurgie (par exemple une tumorectomie ou une néphrectomie dans le cas d'une tumeur cancéreuse rénale), ou bien par biopsie (par exemple par biopsie percutanée à l'aiguille fine guidée par exemple par échographie ou tomodensitométrie). L'invention concerne également les cultures organotypiques obtenues par un 10 procédé de l'invention. Au vu des propriétés des cultures organotypiques obtenues par le procédé de la présente invention, ces dernières conviennent particulièrement bien pour des études pharmacologiques permettant la mise en place de thérapies personnalisées chez les patients atteints d'un cancer, comme par exemple chez les patients atteints d'un cancer du 15 rein. Ainsi, dans un second aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé selon l'invention à partir d'un échantillon prélevé sur un patient souffrant d'un cancer, pour sélectionner une thérapie anticancéreuse personnalisée pour ledit patient. 20 Dans ce même aspect, la présente invention concerne aussi un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée comprenant une étape consistant à incuber une culture organotypique de tumeur cancéreuse, obtenue par un procédé selon l'invention à partir d'un échantillon prélevé sur un patient souffrant d'un cancer, en présence d'un agent thérapeutique ou d'une combinaison d'agents thérapeutiques et une 25 étape consistant à observer les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique. Dans certains modes de réalisation préférés de ce second aspect, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse rénale. Cependant, la sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon l'invention peut être effectuée pour d'autres types de 30 tumeurs cancéreuses. Ainsi dans certains modes de réalisation, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse du poumon, de l' oesophage, de l'estomac, du foie, de pancréas, du 4 3035408 colon, du sein, de l'ovaire, du col de l'utérus, de la prostate, des testicules, de la peau, de la thyroïde, des glandes surrénales, etc... Dans certains modes de réalisation préférés, l'étape d'incubation est effectuée dans un milieu organotypique selon l'invention. 5 Dans certains modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée dans un environnement stérile à 37°C dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée de 95% d'air et de 5% de CO2. Dans certains modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée pendant moins de 7 jours, par exemple : 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours ou 7 jours. 10 Dans d'autres modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée pendant 7 à 13 jours, par exemple : 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours ou 13 jours. Dans encore d'autres modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée pendant plus de 13 jours. Dans certains modes de réalisation, l'étape consistant à observer les effets de 15 l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique comprend effectuer au moins un essai ou test pour évaluer (qualitativement ou quantitativement) une modification de la morphologie et/ou de la composition de la culture organotypique au niveau tissulaire (par exemple au niveau des vaisseaux), au niveau cellulaire et/ou au niveau moléculaire (protéine, ADN, ARN, etc) 20 par immunohistochimie ou Western Blot, par une technique de microscopie ou par analyse protéique. En fonction des résultats obtenus, une thérapie anticancéreuse personnalisée est identifiée. Dans certains modes de réalisation, le procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée comprend en outre une étape consistant à prescrire au 25 patient la thérapie anticancéreuse personnalisée sélectionnée. Le fait que les cultures organotypiques obtenues par le procédé de l'invention sont plus représentatives de la situation in vivo qu'une lignée cellulaire ou qu'une culture cellulaire primaire fait de celles-ci un excellent modèle pour le criblage de composés thérapeutiques. 30 Ainsi, dans un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé de l'invention pour 5 3035408 le criblage de composés susceptibles de présenter des propriétés thérapeutiques contre le cancer. Dans ce même aspect, l'invention concerne également un procédé de criblage de composés susceptibles de présenter des propriétés thérapeutiques contre le cancer 5 comprenant une étape consistant à incuber une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé de l'invention en présence d'un composé test et une étape consistant à observer les effets du composé test sur la culture organotypique. Dans certains modes de réalisation préférés de ce troisième aspect, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse rénale. Cependant, le ciblage selon l'invention 10 peut être mis en oeuvre pour d'autres types de tumeurs cancéreuses. Ainsi dans certains modes de réalisation, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse du poumon, de l' oesophage, de l'estomac, du foie, de pancréas, du colon, du sein, de l'ovaire, du col de l'utérus, de la prostate, des testicules, de la peau, de la thyroïde, des glandes surrénales, etc... 15 Dans certains modes de réalisation préférés, l'étape d'incubation est effectuée dans un milieu organotypique selon l'invention. Dans certains modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée dans un environnement stérile à 37°C dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée de 95% d'air et de 5% de CO2. 20 Dans certains modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée pendant moins de 7 jours, par exemple : 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours ou 7 jours. Dans d'autres modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée pendant 7 à 13 jours, par exemple : 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours ou 13 jours. Dans encore d'autres modes de réalisation, l'étape d'incubation est effectuée 25 pendant plus de 13 jours. Dans certains modes de réalisation, l'étape consistant à observer les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique comprend effectuer au moins un essai ou test pour évaluer (qualitativement ou quantitativement) une modification de la morphologie et/ou de la 30 composition de la culture organotypique au niveau tissulaire (par exemple au niveau des vaisseaux), au niveau cellulaire et/ou au niveau moléculaire (protéine, ADN, ARN, etc) 6 3035408 par immunohistochimie ou Western Blot, par une technique de microscopie ou par analyse protéique. En fonction des résultats obtenus, le composé testé est identifié ou non comme un composé susceptible de présenter des propriétés thérapeutiques contre le type de cancer testé. 5 Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous. Description Détaillée de l'Invention Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne un procédé de culture organotypique de tumeur cancéreuse, et l'utilisation des cultures organotypiques dans la 10 mise en place d'une thérapie personnalisée chez les patients atteints d'un cancer ou dans le criblage de composés susceptibles de présenter un intérêt thérapeutique dans le traitement du cancer. Dans ce qui suit, la grande majeure partie de la description est centrée sur les tumeurs cancéreuses rénales, mais l'invention s'applique également à d'autres types de tumeurs cancéreuses (voir ci-dessous). 15 I - Méthode de Culture Organotypique de Tissu de Cancer de Rein Une méthode de culture organotypique selon l'invention comprend une étape consistant à cultiver un échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale dans un milieu de culture organotypique bien particulier. Tel qu'utilisé ici, le terme "culture organotypique" désigne le fait de cultiver une 20 partie d'un tissu sans procéder à une dissociation cellulaire, et donc de manière à maintenir la cohésion entre les cellules et les tissus. Ainsi les cultures organotypiques sont soumises à un maintien de la différenciation morphologique et fonctionnelle. Ce type de culture comporte de nombreux avantages. Il permet de conserver l'architecture tridimensionnelle du tissu et les interactions paracrines entre différents types cellulaires. 25 Cette conservation des interactions paracrines est primordiale pour reproduire fidèlement le développement d'un tissu et est généralement perdue lors de cultures primaires de cellules différenciées. Les cultures organotypiques rendent possible l'évaluation des caractéristiques cellulaires, moléculaires, phénotypiques, biochimiques et de développement du tissu. Dans le domaine du cancer, l'intérêt des cultures 30 organotypiques, qui reproduisent des tumeurs telles qu'elles se présentent dans l'organisme, est de pouvoir expérimenter sur les tumeurs malignes (en particulier les tumeurs malignes humaines) dans des conditions rarement réalisables sur l'organisme 7 3035408 entier. Le terme "culture organotypique" est également utilisé ici pour désigner l'échantillon de tissu obtenu par culture organotypique. Echantillon de Tissu de Tumeur Cancéreuse de Rein Dans le procédé de culture organotypique selon l'invention, la culture est effectuée 5 sur un échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale. D'une manière générale, l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale utilisé est prélevé sur un sujet souffrant d'un cancer du rein. Tel qu'utilisé ici, le terme "sujet" désigne un être humain ou un animal, en particulier un mammifère (par exemple un primate, un chien, un chat, une chèvre, un cheval, un porc, une souris, un rat, un lapin, et analogues) qui peut développer 10 un cancer du rein. Dans de nombreux modes de réalisation de la présente invention, le sujet est un être humain. Dans ces modes de réalisation, le sujet est souvent appelé "individu". Le terme "individu" ne désigne pas un âge particulier, et englobe donc les enfants, les adolescents et les adultes. Le terme "patient" est plus particulièrement utilisé lorsque l'individu est atteint d'un cancer du rein. 15 L'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale peut être prélevé par n'importe quelle méthode appropriée connue dans l'art. Par exemple, un échantillon ou plusieurs échantillons d'une tumeur cancéreuse rénale peuvent être obtenus lors de la chirurgie (que cette chirurgie soit une tumorectomie, c'est-à-dire l'ablation de la tumeur en préservant le rein, ou une néphrectomie, c'est-à-dire l'ablation de la totalité du rein). 20 Alternativement, un échantillon ou plusieurs échantillons d'une tumeur cancéreuse rénale peuvent être obtenus par biopsie, par exemple biopsie percutanée à l'aiguille fine guidée par exemple par échographie ou par tomodensitométrie (TDM). Généralement, après prélèvement, un échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale est conservé au froid (par exemple à au plus 37°C ou à au plus 38°C, par exemple 25 dans une solution de HBSS (Hank' s Balanced Salt Solution). L'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale est préférablement conservé au froid pendant au plus 2 heures. Dans certains modes de réalisation préférés, avant culture, l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale prélevé est coupé en fines tranches (appelées coupes ou slices). Les coupes de tumeur sont généralement réalisées au vibratome, ce qui permet de ne pas 30 abîmer la structure du tissu. L'épaisseur des coupes est préférablement d'environ 300 i.tm, d'environ 400 i.tm, d'environ 500 i.tm ou d'environ 600 i.tm. 8 3035408 Milieu de Culture Organotypique Comme indiqué plus haut, les présents inventeurs ont découvert qu'il était possible d'obtenir des cultures organotypiques de tumeur cancéreuse rénale en utilisant un milieu de culture organotypique particulier. Ce milieu de culture organotypique comprend un 5 mélange consistant en : entre 90% et 80% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et entre 10% et 20% en volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales. Tel qu'utilisé ici, le terme "milieu de culture pour cellules endothéliales" désigne tout milieu de culture connu dans l'art pour convenir à la culture des cellules 10 endothéliales (c'est-à-dire les cellules qui tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et lymphatiques). Le milieu de culture pour cellules endothéliales utilisé dans le procédé de culture organotypique selon l'invention peut être choisi parmi les milieux de culture pour cellules endothéliales qui sont commercialement disponibles chez de nombreux fournisseurs comme par exemple Sigma-Aldrich, EMD Millipore, AllCells, 15 Life technologie, Lonza, ScienCell Research Laboratories, PromoCell, ATCC, Gibco, etc... . L'homme du métier sait sélectionner un milieu de culture pour cellules endothéliales. Des exemples de tels milieux incluent, sans limitation, EndoGRO-LS Complete Media Kit (EMD Millipore), HUVEC Basal Medium CB HUVEC (AllCells), 20 Human Endothelial-SFM (Life Technologies), Endothelial Cell Medium (ScienCell Research Laboratories) et Endothelial Cell Growth Media (Lonza), etc..... Dans certains modes de réalisation, le milieu de culture pour cellules endothéliales est l'EGM-2 Bullet kit Tm (Lonza), qui est celui utilisé dans les Exemples décrits dans le présent document. En plus des constituants de base des milieu de culture cellulaire (sels 25 minéraux, carbohydrates, acides aminés, vitamines, acides gras et lipides, protéines et peptides, et oligo-éléments), l'EGM-2 Bullet kitTM contient, selon le fournisseur, de l'hEGF (human epidermal growth factor - 0,5 mL/L - l'EGF a un effet sur la différenciation de certaines cellules in vivo et est un facteur mitogène puissant pour une variété de cellules endothéliales), de l'hydrocortisone (0,2 mL/L - l'hydrocortisone est 30 utilisée dans la culture des cellules endothéliales adhérentes car elle module la capacité des cellules à se lier à l'EGF), du GA1000 (gentamicine-amphotéricine-B - 0,5 mL/L), du sérum foetal bovin (2%), du VEGF (vascular endothelial growth factor - 0,5 mL/L - le VEGF est un mitogène spécifique des cellules endothéliales), de l'hFGF (human 9 3035408 fibroblast growth factor - 0,2 mL/L), du R3 IGF1 (récepteur 3 de l'insulin like growth factor 1 - 0,5 mL/L - les actions métaboliques de ce facteur de croissance incluent la stimulation de l'absorption du glucose, des acides gras et des acides aminés de manière à favoriser la croissance des tissus), de l'acide ascorbique (0,5 mL/L - c'est-à-dire de la 5 vitamine C qui joue un rôle important dans la croissance et la maintenance des cellules saines), et de l'héparine (0,5 mL/L). Tel qu'utilisé ici, le terme "milieu de culture pour cellules épithéliales" désigne tout milieu de culture connu dans l'art pour convenir à la culture des cellules épithéliales (c'est-à-dire les cellules qui forment l'épithélium, le tissu organique dit de "revêtement" 10 car il recouvre la face externe ou interne de divers organes). Le milieu de culture pour cellules épithéliales utilisé dans le procédé de culture organotypique selon l'invention peut être choisi parmi les milieux de culture pour cellules épithéliales qui sont commercialement disponibles chez de nombreux fournisseurs comme par exemple Sigma-Aldrich, EMD Millipore, AllCells, Life technologie, Lonza, ScienCell Research 15 Laboratories, PromoCell, ATCC, Gibco, etc.... L'homme du métier sait sélectionner un milieu de culture pour cellules épithéliales. Des exemples de tels milieux incluent, sans limitation, Epithelial cell medium (ScienCell Research Laboratories), EpiGRO primary Epithelial cells (EMD Millipore) and RPMI1640 (Lifetechnologies) , etc.... 20 Dans certains modes de réalisation, le milieu de culture pour cellules épithéliales est le RPMI-1640 (Lifetechnologies), qui est celui utilisé dans les Exemples décrits dans le présent document. Le RPMI-1640 a été développé par Moore et ses collègues at Roswell Park Memorial Institute en 1966 pour la croissance des cellules leucémiques humaines en culture monocouche ou en suspension. Depuis, le RPMI-1640 est considéré comme un 25 milieu à usage général avec une large gamme d'applications pour les cellules mammaires. Le RPMI-1640 utilise un système tampon au bicarbonate et diffère des autres milieux de cultures de cellules mammaliennes car sa formulation typique présente un pH de 8. Le RPMI-1640 contient des acides aminés, des vitamines, des sels minéraux, et d'autres composés comme le D-glucose, la glutathione, et du rouge de phénol. 30 Dans un procédé selon l'invention, le milieu de culture organotypique comprend un mélange consistant en : entre 90% et 80% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et le reste (c'est-à-dire entre 10% et 20% en volume) d'un milieu de culture - 10 - 3035408 pour cellules épithéliales. Par exemple, le mélange dans le milieu de culture organotypique peut être constitué de 90% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et de 10% volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales, ou des proportions suivantes d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et d'un milieu de 5 culture pour cellules épithéliales : 89% et 11%, 88% et 12%, 87% et 13%, 86% et 14%, 85% et 15%, 84% et 16%, 83% et 17%, 82% et 18%, 81% et 19%, ou 80% et 20%. Généralement, le milieu de culture organotypique utilisé dans le procédé de culture selon l'invention comprend en outre du sérum de veau foetal (SVF), de la streptomycine, de la pénicilline, et du glycérol. 10 Préférablement, le milieu de culture organotypique comprend 10% en volume de sérum de veau foetal, 100 mg/mL de streptomycine, 100 units/mL de pénicilline et 1% en volume de glycérol. Conditions de Culture Organotypique L'étape de culture dans le procédé selon l'invention peut se faire dans n'importe 15 quelles conditions connues dans l'art pour être appropriées à la culture cellulaire, en particulier à la culture cellulaire en 3-dimensions. Par exemple, l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale peut être cultivé dans un récipient approprié (ex. un puits d'une plaque multi-puits) dans un environnement stérile à 37°C dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée de 20 95% d'air et de 5% de CO2. Les techniques de cultures cellulaires sont bien connues dans l'art et des protocoles ont été développés pour les différents types de cultures cellulaires (voir, par exemple, R.I. Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications", 6th Edition, 2010, Wiley Blackwell). Préférablement, le milieu de culture organotypique est changé, partiellement ou 25 entièrement, à intervalle régulier par exemple chaque jour pendant la durée de la culture ou tous les deux ou trois jours pendant la durée de la culture. La culture organotypique de l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale peut être poursuivie pendant 7-15 jours, par exemple 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours ou 15 jours. 30 Alternativement, la culture organotypique de l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale peut être poursuivie pendant moins de 7 jours, par exemple 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours ou 7 jours. 3035408 Alternativement, la culture organotypique de l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse rénale peut être poursuivie plus de 15 jours, par exemple plus de 2 semaines, ou 3 semaines ou plus de 3 semaines. Si désiré, l'état du tissu dans son intégralité, la viabilité et prolifération des cellules 5 dans l'échantillon cultivé, et/ou l'intégrité des protéines peuvent être déterminés au cours de la culture par des techniques standard comme l'histologie (par exemple après coloration à l'hemalun eosine safran ou HES), l'évaluation quantitative de la prolifération avec des radioisotopes, des observations par immunohistochimie utilisant des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales et des cellules tumorales l'aide de microscopes 10 optiques, de microscopes électroniques à balayage ou de microscopes à fluorescence, des analyses protéiques utilisant des marqueurs de prolifération d'apoptose ou de nécrose par Western Blot, des analyses transcriptomiques de l'ARN, etc.... H - Utilisation des Cultures Organotypiques de l'Invention Les cultures organotypiques obtenues par un procédé selon l'invention peuvent être 15 utiles dans diverses applications, en particulier dans le criblage de composés susceptibles de présenter un intérêt dans le traitement du cancer du rein et dans la sélection d'une thérapie personnalisée pour les patients atteints du cancer du rein. Sélection d'une Thérapie Personnalisée Les cultures organotypiques de tissu de tumeur cancéreuse rénale, obtenues selon le 20 procédé de l'invention, à partir d'un échantillon prélevé sur un patient atteint d'un cancer du rein peuvent être utilisées dans le but de sélectionner une thérapie anticancéreuse personnalisée pour ce patient. Généralement un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée comprend une étape consistant à incuber, en présence d'un agent thérapeutique ou d'une combinaison d'agents thérapeutiques, une culture 25 organotypique de tumeur cancéreuse rénale obtenue par un procédé de l'invention à partir d'un échantillon de tumeur prélevé chez le patient, et une étape consistant à observer les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique. Dans le procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée, l'étape d'incubation est effectuée dans le milieu de culture organotypique 30 selon l'invention. Tels qu'utilisés ici, le terme "thérapie personnalisée" et tous ses dérivés ("médicine personnalisée", "traitement personnalisé", etc) désignent un traitement ciblé le mieux - 12- 3035408 adapté à un patient donné (ou à un groupe de patients donnés) et sélectionné parmi plusieurs traitements possibles. La thérapie personnalisée a pour but d'améliorer la performance des soins et l'efficacité de la prise en charge, d'éviter des traitements inutiles et d'améliorer la qualité de vie des patients. Les cultures organotypiques 5 obtenues selon le procédé de l'invention permettent de déterminer de façon plus précise les caractéristiques de la tumeur présente chez un patient, d'identifier les anomalies en cause et de les traiter, lorsque cela est possible, avec une thérapie ciblée. Les thérapies dites "ciblées" utilisées dans le traitement du cancer du rein sont représentées par plusieurs classes d'agents thérapeutiques : 10 - les inhibiteurs du facteur de croissance VEGF (vascular endothelial growth factor), comme le bevacizumab, un anticorps monoclonal recombinant humanisé qui se fixe au VEGF circulant et neutralise sa liaison au récepteur du VEGF (VEGF-R) des cellules endothéliales ; - les inhibiteurs des récepteurs à activité tyrosine kinase, comme le sorafenib, 15 l'erlotinib, le pazopanib et l'axitinib ou le sunitinib qui inhibe les récepteurs 1 et 2 du VEGF, les récepteurs a et 13 du PDGF (Platelet Derived Growth Factor), le stem-cell growth factor (c-kit) et la Fms-like tyrosine kinase 3 (F1t3). En bloquant plusieurs voies de transduction, ces médicaments multicibles ont une action à la fois sur l'angiogenèse, la prolifération tumorale et l'apoptose ; et 20 les inhibiteurs de la Mammalian Target of Rapamycin ou m-TOR comme le temsirolimus ou le everolimus. mTOR est une protéine kinase cytoplasmique active sous forme de complexe et jouant un rôle de régulateur central de la croissance et de la prolifération cellulaires, de l'angiogenèse et du métabolisme cellulaire. Elle se situe au carrefour de 2 grandes voies de signalisation entre angiogenèse et apoptose. 25 Sont également utilisés dans le traitement du cancer du rein, en combinaison avec les molécules anti-angiogéniques, les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (également appelés inhibiteurs ICE ou inhibiteurs de la kinase II) incluent le captopril (Lopril®), l'enalapril (Renitec®), le périndopril (Coversyl®), le quinapril (Acuitel®), et le lisinopril 30 (Zestril®). Peuvent également être utiles dans le traitement du cancer du rein des inhibiteurs des récepteurs aux intégrines, comme par exemple les mimes de RGD. - 13 - 3035408 Dans un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon l'invention, l'échantillon de culture organotypique est incubé en présence d'un agent thérapeutique ou d'une combinaison d'agents thérapeutiques. Ces agents thérapeutiques peuvent être choisis dans les classes d'agents thérapeutiques mentionnées ci-dessus 5 (c'est-à-dire qu'ils peuvent être choisis dans le groupe consistant en les inhibiteurs du facteur de croissance VEGF, les inhibiteurs des récepteurs à activité tyrosine kinase, les inhibiteurs de mTOR, les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et les combinaisons de ces inhibiteurs). Cependant, les agents thérapeutiques qui peuvent être testés dans un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon 10 l'invention ne sont pas limités aux agents cités ci-dessus mais peuvent être choisis dans n'importe quelle autre classe d'agents thérapeutiques connus dans l'art pour être utiles dans le traitement du cancer du rein. Dans certains modes de réalisation, dans un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon l'invention, une seule "thérapie anticancéreuse" est 15 testée (par exemple un seul agent thérapeutique, ou une seule combinaison d'agents thérapeutiques). Mais dans d'autres modes de réalisation, au moins deux "thérapies anticancéreuses" différentes sont testées sur des échantillons du tissu de tumeur cancéreuse rénales (par exemple deux agents thérapeutiques différents, ou bien un seul agent thérapeutique mais à deux doses différentes ou un agent thérapeutique seul et en 20 combinaison avec un autre agent thérapeutique, ou bien deux combinaisons d'agents thérapeutiques différentes, ou bien encore une combinaison des mêmes agents thérapeutiques mais présents dans des proportions différents). L'expression "observer les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique" signifie effectuer au moins un essai 25 ou test pour évaluer (qualitativement ou quantitativement) les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique. Les effets sur la culture organotypique peuvent être toute modification de la morphologie et/ou de la composition de la culture organotypique au niveau tissulaire, au niveau cellulaire et/ou au niveau moléculaire (protéine, ADN, ARN, etc), qui résulte de 30 l'incubation de la culture organotypique en présence de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques. Les analyses qui peuvent être effectuées consistent à étudier les marqueurs de prolifération cellulaire des cellules tumorales et également des cellules endothéliales (prolifération, nécrose, apoptose) par immunohistochimie et par - 14 - 3035408 Western Blot. La maturité des vaisseaux (couverture péricytaire) peut être suivie par des techniques de microscopie ou par analyse protéique. La comparaison des effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique permet d'identifier la thérapie dont le patient 5 est le plus susceptible de bénéficier. Dans certains modes de réalisation, un procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon l'invention comprend en outre une étape consistant à prescrire au patient (dont l'échantillon de tissu a été testé) la thérapie anticancéreuse personnalisée sélectionnée. 10 Criblage Les cultures organotypiques de tissu de tumeur cancéreuse rénale obtenues selon le procédé de l'invention peuvent être utilisées dans des méthodes de criblage dans le but d'identifier des composés susceptibles de présenter un intérêt dans le traitement du cancer du rein. En effet, les cultures organotypiques obtenues selon un procédé de l'invention 15 présentent l'avantage d'être plus représentatives de la situation in vivo que les lignées cellulaires et les cultures cellulaires primaires. Généralement, un procédé de criblage selon l'invention comporte une étape consistant à incuber une culture organotypique décrite ici en présence d'un composé à tester (ou composé test) et une étape consistant à observer les effets du composé à tester sur la culture organotypique. Dans le procédé de 20 criblage, l'étape d'incubation est effectuée dans le milieu de culture organotypique selon l'invention. Dans un procédé de criblage selon l'invention, tout type de composés peut être testé. Ainsi, un composé test peut être un produit naturel ou un produit synthétique ; il peut être une molécule unique ou bien un mélange ou un complexe de différentes 25 molécules. Dans certains modes de réalisation, un composé test appartient à une chimiothèque (c'est-à-dire une banque de données de molécules). Les chimiothèques peuvent contenir de plusieurs dizaines à plusieurs millions de composés chimiques. Des chimiothèques de composés naturels sous la forme d'extraits bactériens ou fongiques, ou sous la forme d'extraits de plantes sont disponibles par exemple chez Pan Laboratories 30 (Bothell, WA) ou MycoSearch (Durham, NC). Des chimiothèques de composés synthétiques sont également commercialement disponibles, par exemple, chez Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), Microsource (New Milford, CT), - 15 - 3035408 et Aldrich (Milwaukee, WI) ou chez des grandes sociétés chimiques comme Merck, Glaxo Welcome, Bristol-Meyers-Squibb, Novartis, Monsanto/Searle, et Pharmacia UpJohn. Dans un procédé de criblage selon l'invention l'incubation de la culture 5 organotypique peut se faire en présence d'une seule concentration du composé test. Alternativement, plusieurs échantillons de culture organotypiques peuvent être incubés chacun en présence d'une concentration spécifique du composé test. Préférablement, l'incubation se fera dans les conditions du procédé de culture organotypique selon l'invention (en particulier en utilisant le milieu de culture organotypique décrit ici). De 10 plus, un criblage selon l'invention peut être effectué en utilisant plusieurs échantillons provenant de différents patients atteints d'un cancer du rein pour prendre en compte la variabilité des tumeurs. Comme indiqué plus haut l'expression "observer les effets du composé test sur la culture organotypique" signifie effectuer au moins un essai ou test pour évaluer 15 (qualitativement ou quantitativement) les effets du composé test sur la culture organotypique. Les effets sur la culture organotypique peuvent être toute modification de la morphologie et/ou de la composition de la culture organotypique au niveau tissulaire, au niveau cellulaire et/ou au niveau moléculaire (protéine, ADN, ARN, etc), qui résulte de l'incubation de la culture organotypique en présence du composé test. 20 Un ou plusieurs composés témoins (positifs ou négatifs) peuvent être utilisés pour évaluer, par comparaison, les effets du composé test sur la culture organotypique. Un procédé de criblage selon l'invention a pour but d'identifier des composés susceptibles de présenter un intérêt dans le traitement du cancer du rein. Le mécanisme d'action du composé n'est pas un facteur limitant de l'invention. Ainsi, un composé 25 identifié par un procédé de criblage selon l'invention comme présentant un intérêt dans le traitement du cancer du rein peut appartenir à la classe des agents cytotoxiques (comme par exemple : les agents alkylants et apparentés, les agents de fuseau, les antimétabolites, les inhibiteurs de protéasome, les inhibiteurs de topo-isomérases, les intercalants) ; à la classe des agents antimitotiques ; à la classe des agents antinéoplastiques (comme par 30 exemple : les agents différenciateurs, les agents photosensibilisants, les anti-angiogènes, les inhibiteurs des proteine-tyrosine kinases, les inhibiteurs des protéines kinases, les produits radiopharmaceutiques), etc... Dans certains modes de réalisation, un composé - 16- 3035408 identifié par un procédé de criblage selon l'invention comme présentant un intérêt dans le traitement du cancer du rein peut appartenir à la classe des inhibiteurs du facteur de croissance VEGF, la classes les inhibiteurs des récepteurs à activité tyrosine kinase, à la classe des inhibiteurs de la Mammalian Target of Rapamycin (m-TOR) ou à la classe 5 desinhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Un procédé de criblage selon l'invention peut également être utilisé pour rechercher des combinaisons d'agents thérapeutiques, par exemple pour mettre en évidence les effets synergiques d'un agent thérapeutique connu avec un composé test. III - Types de Tumeurs Cancéreuses Auxquelles s'Applique l'Invention 10 Le procédé de culture organotypique décrit ici peut être appliqué à d'autres types de tumeurs cancéreuses que les tumeurs cancéreuses rénales. Par exemple, Ainsi, par exemple, le procédé de culture organotypique selon l'invention peut être mis en oeuvre pour cultiver des échantillons de tissu d'autres types de tumeurs cancéreuses. Ainsi dans certains modes de réalisation, la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse du 15 poumon, de l' oesophage, de l'estomac, du foie, de pancréas, du colon, du sein, de l'ovaire, du col de l'utérus, de la prostate, des testicules, de la peau, de la thyroïde, des glandes surrénales, etc... La présente invention concerne donc aussi les cultures organotypiques obtenues par un procédé de culture selon l'invention quel que soit le type de tumeur cancéreuse. 20 L'invention concerne également l'utilisation de ces cultures organotypiques obtenues à partir d'un échantillon prélevé sur un patient souffrant d'un cancer, pour sélectionner une thérapie anticancéreuse personnalisée pour ce patient, et le procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée selon l'invention. De même, l'invention concerne l'utilisation des cultures organotypiques obtenues 25 par un procédé décrit ici à partir d'un échantillon de tissu de tumeur cancéreuse autre qu'une tumeur cancéreuse rénale pour le criblage de composés susceptibles de présenter des propriétés thérapeutiques contre le cancer, et le procédé de criblage selon l'invention appliqué aux cultures organotypiques obtenues par un procédé décrit ici à partir d'un échantillon de tissu de tumeur cancéreuse autre qu'une tumeur cancéreuse rénale. - 17 - 3035408 A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés 5 ici sont incorporés par référence. Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains modes de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemples 10 Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Légendes des Figures Figure 1: Histologie contrôle des sections de tumeur après incubation dans le 15 milieu de culture au cours de l'Essai 1 (voir ci-dessous). Les pièces de tissu ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistochimiques. Un marquage hemalun eosine safran (HES) a été effectué à JO (jour du prélèvement du tissu tumoral et mise en culture) et à J3, J5, J8 (3, 5 et 8 jours après incubation du tissu dans le milieu de culture de l'Essai 1) sur 20 des coupes de tissus réalisées au microtome. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Digital Pathology Images NPD view. (X200). Figure 2: Histologie contrôle d'une section de tumeur après incubation 8 jours dans le milieu de culture au cours de l'Essai 1 (voir ci-dessous). La pièce de tissu a été 25 fixée dans le formol puis incluse en paraffine et coupée au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistochimiques. Le marquage hemalun eosine safran (HEs) montre des zones apoptotiques dans et autour des vaisseaux. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X400). 30 Figure 3: Histologie contrôle des sections de tumeur après incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 2 (voir ci-dessous). Les pièces de tissu ont été - 18 - 3035408 fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistochimiques. Un marquage hemalun eosine safran (HEs) a été effectué à JO (jour du prélèvement de la tumeur et mise en culture) puis à J3, J5 et J8 (3, 5 et 8 jours après incubation des coupes de tissus dans le milieu de culture de 5 l'Essai 2) sur des coupes réalisées au microtome. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X200). Figure 4: Histologie contrôle des sections de tumeur après incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 3 (voir ci-dessous). Les pièces de tissu ont été 10 fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistochimiques. Un marquage hemalun eosine safran (HEs) a été effectué à JO (jour du prélèvement de la tumeur et de mise en culture) et J5 (5 jours après incubation du tissue dans le milieu de culture de l'Essai 3) sur des coupes de tissus réalisées au microtome. Les observations ont été réalisées au microscope Leica 15 DM 2000 microscope. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Digital Pathology Images NPD view. (X400). Figure 5: Histologie contrôle des sections de tumeur après incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 4 (voir ci-dessous). Les pièces de tissu ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour 20 effectuer des analyses immunohistochimiques. Un marquage hemalun eosine safran (HEs) a été effectué à J10 (10 jours après incubation des tissus dans le milieu de culture au cours de l'Essai 4) des coupes de tissus réalisées au microtome. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X20). Les lames 3,5 et 7 25 correspondent à différentes positions dans la pièce incubée. Figure 6: Immunohistochime d'un marqueur de prolifération (Ki67) et d'un marqueur des cellules endothéliales (CD-31) sur des coupes de tissu de culture de tumeur (Essai 4 - voir ci-dessous). Les pièces de tissu ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses 30 immunohistochimiques. Les marquages ont été effectués à JO, puis à J8 et J10 (8 et 10 jours après incubation des tissus dans le milieu de culture de l'Essai 4 (voir ci-dessous) sur des coupes de tissus réalisées au microtome. Les analyses immunohistochimiques ont été effectuées sur un système BenchMarkXT-Ventana Medical systems, Kits OMNIMAP - 19- 3035408 DAB Sigma Aldrich-France) anti rabbit (système sans biotine) avec les anticorps (KI67 dil 1:100; CD31 di1:1:50). Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X20). 5 Figure 7: Une fraction des pièces de tissu incubées 10 jours dans le milieu de culture de l'Essai 4 (voir ci-dessous) a été broyée en présence de tampon d'extraction 20 mM Tris-HC1 pH 7.5, 100 mM NaC1, 5 mM MgC12, 10% glycérole, 0.5 mM DTT, 0.2% NP40, 20 mM 3-glycérophosphate, 1 mM NaF, 1 mM AEBSF) et centrifugée à 9000g à 4°C pendant 30 minutes. Les protéines cytoplasmiques (respectivement 40 tg et 601.1g) 10 contenues dans le surnageant de centrifugation ont été analysées par Western Blot. Les membranes ont été incubées en présence des anticorps GSK3 (1:1000) et cyclin Dl (1:200). Après incubation avec l'anticorps secondaire conjugué à la péroxidase (HRP) (1:20,000) les intéractions ont été révélées par chemoluminescence à l'aide du kit Super Signal (West Dura, Rockford, IL). 15 Figure 8: Histologie des sections de tumeur après incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 4 (voir ci-dessous) en présence de sunitinib (inhibiteur de l'angiogenèse). Les pièces de tissu ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistochimiques. Un marquage hemalun eosine safran (HEs) des coupes a été 20 effectué à J10 (10 jours après incubation des tissus dans le milieu de culture de l'Essai 4 en présence de sunitinib (A) et (B) ou de DMSO (C) (diluant du sunitinib). Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X20). Les lames A et B correspondent à différentes positions dans la pièce incubée. 25 Figure 9: Histologie des sections de tumeur après incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 4 (voir ci-dessous) en présence de deux concentrations différentes de sunitinib (20 1..1M et 50 1..1M). Les pièces de tissu ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine et coupées au microtome à paraffine pour effectuer des analyses immunohistologiques. Un marquage hemalun eosine safran (HEs) des coupes a 30 été effectué à J10 (10 jours après incubation des tissus dans le milieu de culture de l'Essai 4 en présence de sunitinib 201..IM ou 501..1M. Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images on été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X20). - 20 - 3035408 Figure 10: Immunohistochimie anti-caspase-3 réalisée sur des sections de tumeur après 10 jours d'incubation dans le milieu de culture au cours de l'Essai 4 (voir ci-dessous) en présence de 20 1..1M sunitinib. L'anticorps anti-caspase 3-actviée a été utilisé à la dilution 1:100. Les immunohistochimies ont été effectuées sur le système 5 BenchMarkXT-Ventana Medical, Kits OMNIMAP DAB (Sigma Aldrich-Franc) anti rabbit (système sans biotine). Les observations ont été réalisées au microscope Leica DM 2000. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Nanozoomer Dgital Pathology Images NPD view. (X400). Matériels et Méthodes 10 Préparation des Echantillons. Les essais ont été réalisés 8 fois indépendamment à partir de pièces opératoires de patients atteints de ccRCC et opérés au Centre Hospitalier de Rennes (service d'urologie). Les échantillons ont été recueillis très tôt après la chirurgie (pas plus de deux heures après) et conservés dans du tampon HBSS à 10°C. Cultures Organotypiques de Tissus. Des tranches minces de tissu (épaisseur de 15 300 i.tm à 500 .tm) ont été préparées en utilisant un Vibratome. Les tranches ont été recueillies dans un tampon physiologique (HBSS sans calcium, ni magnésium - Gibco Life Technology) and placées dans un insert (insert de culture cellulaire Millicell organotypic PFFE - 0,4 i.tm Millipore) contenant un milieu spécifique pendant une période allant jusqu' 240 heures (2 à 3 tranches par insert). Les inserts organotypiques 20 sont des membranes en Téflon avec des pores de 0,4 i.tm que préservent la structure tridimensionnelles du tissue en culture. La culture tissulaire a été effectuée à 37°C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2. Le milieu de culture a été changé tous les jours. Pour les échantillons recevant un traitement thérapeutique, le milieu contenant le ou les molécules thérapeutiques a été changé tous les jours. Dans tous les cas, le milieu 25 contenait : 90% en volume du milieu EGM-2 bulletkitTM (Lonza), 10% du milieu RMPI1610 (Lifetechnologies), 10% SVF, 100 illn/m1 Streptomycine, 100 units/ml pénicilline, et 1% glycérol. Analyse des cultures tissulaires (viabilité, morphologie, etc...). Des tranches minces de tissu ont été obtenues au temps TO et puis toutes les 24 heures pendant 10 30 jours. Une des tranches a été congelée et utilisée pour des extractions d'ADN, d'ARN et de protéines. Les autres tranches ont été fixées au formol et inclues dans de la paraffine pour les évaluations morphologique (H&E) et immunohistochimique. - 21 - 3035408 Immunohistochimie. Des échantillons de tissu fixé au formol et inclus dans la paraffine de 5 microns de section ont été transférés sur des lames de verre avant l'analyse immunohistochimique. Les échantillons ont été incubés dans du TBST en présence de 5% de BSA. Les analyses ont été effectuées sur un microscope Leica DMRXA équipé 5 d'une caméra CoolSnapsHQ ® (Photometrics). Le software Leica (Confocal Software 3D) a été utilisé pour piloter le microscope et pour l'acquisition d'images avant l'analyse d'images par ImageJ (National Institute of Health). Résultats Identification d'un milieu de culture organotypique. Pour chaque 10 expérimentation, les pièces opératoires ont été récupérées auprès du bloc. Un prélèvement a été effectué dans la zone de ccRCC caractérise et monté sur bloc pour être coupé au microtome à raison de 5001..tm par coupe. Les coupes récupérées dans du liquide HBNS Gibco ont été déposées dans des nacelles elles-mêmes déposées dans de plaques multipuits. Le milieu de culture adéquat (voir ci-dessous) a ensuite été ajouté aux 15 nacelles et la plaque a été déposée à 37°C sous 5% CO2 pendant 24 heures. Une coupe a été réalisée, fixée et incluse en paraffine, pour servir de référence pour les immunomarquages. Une seconde coupe a été extraite pour le contrôle des protéines. Le milieu de culture a été changé au bout de 24 heures et les essais ont ensuite commencé. Essai 1. Dans cet essai, la culture organotypique a été effectuée avec un milieu de 20 culture comprenant du RPMI-1640 contenant 10% en volume de sérum de veau foetal (SVF), 100 iig/mL de streptomycine, et 100 units/mL de péniciline. Les résultats obtenus (voir Figure 1 et Figure 2) montrent que ce milieu de culture ne permet pas la conservation de la structure tissulaire. La présence de nombreuses cellules apoptotiques est observée avec apparition de cellules mortes dans la lumière des 25 vaisseaux sanguins et destruction de la paroi des vaisseaux. Essai 2. Dans cet essai, la culture organotypique a été effectuée avec un milieu de culture comprenant un mélange contant 50% en volume de RPMI-1640 et 50% en volume de EGM-2 BulletkitTM contenant 10% en volume de sérum de veau foetal (SVF), 100 iig/mL de streptomycine, et 100 units/mL de péniciline. - 22 - 3035408 Les résultats obtenus (voir Figure 3) montrent que ce milieu de culture permet une conservation de la structure tissulaire. Cependant de nombreuses cellules apoptotiques ont été observées. Essai 3. Dans cet essai, la culture organotypique a été effectuée avec un milieu de 5 culture comprenant de l'EGM-2 BulletkitTM contenant 10% en volume de sérum de veau foetal (SVF), 100 iig/mL de streptomycine, et 100 units/mL de péniciline. Les résultats obtenus (voir Figure 4) montrent qu'avec ce milieu de culture les cellules endothéliales et la paroi des vaisseaux sanguins sont parfaitement conservées avec aucune modification de leur structure au cours du temps. Par contre, les cellules 10 tumorales sont altérées, les noyaux sont condensés, les membranes cellulaires sont abîmées et le contenu cellulaire est absent. Essai 4. Dans cet essai, la culture organotypique a été effectuée avec un milieu de culture comprenant un mélange contant 10% en volume de RPMI-1640 et 90% en volume de EGM-2 Bullet-kitTM, et comprenant en outre 10% en volume de sérum de veau 15 foetal (SVF), 100 iig/mL de streptomycine, 100 units/mL de péniciline, et 1% en volume de glycérol. Les résultats obtenus (voir Figures 5, 6 et 7) montrent une très bonne conservation du tissu : l'aspect histologique de la coupe est parfaitement préservé après 10 jours de culture. Sur l'ensemble de la coupe (échantillons pris à différents niveaux dans la pièce 20 de tissu incubée), la coloration HES montre une parfaite organisation tissulaire avec préservation de la structure des cellules endothéliales et des cellules tumorales. Les marquages Ki67 (indicateur de prolifération) montrent que les cellules sont en prolifération au sein de la coupe. Le marquage CD31 révèle une parfaite organisation des vaisseaux sanguins et la conservation des types de vaisseaux, matures ou immatures 25 présents dans la tumeur d'origine. Etude pharmacologique du sunitinib sur une culture organotypique. Dans cette étude, les culture organotypiques ont été effectuées, en présence de sunitinib dilué dans du DMSO ou de DMSO seul (comme contrôle), avec un milieu de culture comprenant un mélange contant 10% en volume de RPMI-1640 et 90% en volume de 30 EGM-2 Bullet-kitTM, et comprenant en outre 10% en volume de sérum de veau foetal (SVF), 100 iig/mL de streptomycine, 100 units/mL de péniciline, et 1% en volume de glycérol. -23 - 3035408 Les résultats obtenus sont présentés sur les Figures 8, 9 et 10. Le traitement des coupes avec le sunitinib, ou le DMSO seul, après 10 jours, montre que : - en présence de DMSO seul, la coupe n'est pas affectée dans sa structure ainsi que le montre la coloration HES de la Figure 8 ; 5 en présence de sunitinib, au bout de 10 jours, à des concentrations de 20 iiM on observe une déstructuration du tissu rénal tumoral avec apparition de zones nécrotiques (coloration HES). A la concentration de 50 iiM, les cellules tumorales sont peu visibles : leurs membranes sont détruites et leurs noyaux sont très petits (caractéristiques des noyaux apoptotiques). Il en est de même pour les cellules 10 endothéliales (coloration HES). Le marquage « caspase 3 activé », qui est le reflet d'une activité apoptotique montre dans une zone sélectionnée non totalement détruite (sinon cela rendrait le marquage impossible), une positivité qui est le reflet d'un processus apoptotique enclenché par l'incubation en présence de sunitinib. - 24 - REVENDICATIONS1. Procédé de culture organotypique de tissu de tumeur cancéreuse comprenant une étape consistant à cultiver un échantillon du tissu de tumeur cancéreuse dans un milieu de culture organotypique comprenant un mélange consistant en : entre 90% et 80% en volume d'un milieu de culture pour cellules endothéliales et entre 10% et 20% en volume d'un milieu de culture pour cellules épithéliales. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture organotypique comprend en outre du sérum de veau foetal (SVF), de la streptomycine, de la pénicilline, et du glycérol. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé ce que le milieu de culture organotypique comprend 10% en volume de sérum de veau foetal, 100 mg/mL de streptomycine, 100 units/mL de pénicilline et 1% en volume de glycérol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon de tissu de tumeur cancéreuse est découpé en tranches de 300 i.tm, 400 i.tm, 500 i.tm, ou 600 i.tm. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la culture organotypique est effectuée pendant 7 à 15 jours. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'échantillon du tissu de tumeur cancéreuse provient d'un patient souffrant d'une tumeur cancéreuse. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse rénale. 8. Utilisation d'une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé selon la revendication 6 pour sélectionner une thérapie anticancéreuse personnalisée pour ledit patient. 9. Procédé de sélection d'une thérapie anticancéreuse personnalisée comprenant une étape consistant à incuber une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé selon la revendication 6 en présence d'un agent thérapeutique ou d'une combinaison d'agents thérapeutiques et une étape - 25 - 3035408 consistant à observer les effets de l'agent thérapeutique ou de la combinaison d'agents thérapeutiques sur la culture organotypique. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la tumeur cancéreuse est une tumeur cancéreuse rénale. 11. Utilisation d'une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour le criblage de composés susceptibles de présenter des propriétés thérapeutiques contre le cancer. 12. Procédé de criblage de composés susceptibles de présenter des propriétés thérapeutiques contre le cancer comprenant une étape consistant à incuber une culture organotypique de tumeur cancéreuse obtenue par un procédé selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 en présence d'un composé test et une étape consistant à observer les effets du composé test sur la culture organotypique. - 26 -