FR 3028955 A1 20160527 FR 1461510 A 20141126 PROCEDE DE PREDICTION DE LA SENSIBILITE D'UN PATIENT A UN TRAITEMENT INHIBITEUR DE LA VOIE mTOR La présente invention se situe dans le domaine de la prédiction de la sensibilité de patients atteints d'une tumeur à une thérapie anti-tumorale comprenant l'administration d'un inhibiteur de la voie mTOR. L'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité de patients atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, dans lequel le niveau d'expression de ménine est déterminé dans un échantillon test de ladite tumeur, un faible niveau d'expression de ménine dans ledit échantillon test étant indicateur de la sensibilité du patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. Les inhibiteurs de mTOR, pour « mammalian target of rapamycin » constituent une 10 nouvelle classe de thérapie anti-tumorale ciblée. La protéine mTOR est une sérine/thréonine kinase appartenant à la famille des phosphoinositide 3-kinase (PI3K). Elle interagit avec plusieurs protéines pour former deux complexes protéiques distincts : mTORC1 et mTORC2 (Laplante et Sabatini, 2012). La protéine mTOR humaine ("Serine/threonine-protein kinase mTOR» ou « FK506-binding protein 12- 15 rapamycin complex-associated protein 1 » peut être trouvée dans la banque de données UniProtKB sous la référence P42345, révisée le 3 septembre 2014. mTOR joue un rôle de régulateur central de la croissance et de la prolifération cellulaires, de l'angiogenèse et du métabolisme cellulaire. La voie PI3K / AKT / mTOR, ou « voie mTOR» est fréquemment dérégulée dans les cellules cancéreuses, une dérégulation entrainant une suractivation de mTOR conduit à une plus grande 20 disponibilité en nutriments et permet ainsi la croissance et la survie de la tumeur. La rapamycine est un antibiotique, initialement développé pour ses propriétés immunosuppressives, et pour lequel des propriétés antitumorales, par son action inhibitrice sur mTOR, ont été montrées. Différents analogues de la rapamycine sont actuellement utilisées en cancérologie, notamment l'everolimus et le temsirolimus. Des essais cliniques, associant ou non les 25 inhibiteurs de mTOR à d'autres molécules de thérapie ciblée ou à des traitements tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie ont été réalisés. Des essais de phase III ont obtenu des résultats cliniques très prometteurs chez des patients atteints de carcinome rénal. La protéine mTOR est donc une cible thérapeutique particulièrement intéressante et l'inhibition de la voie mTOR constitue l'une des approches thérapeutiques anti-tumorales prometteuse. 30 Par ailleurs, étant donné que l'activation de la voie mTOR est impliquée dans le cancer du sein hormono-résistant, l'association de deux molécules de thérapie ciblée aux mécanismes d'action différents, comme un inhibiteur de la voie mTOR et une molécule utilisée en hormonothérapie, 3028955 2 permet d'envisager un éventuel contournement d'un mécanisme de résistance impliquant l'une de ces voies. Afin d'optimiser les essais cliniques et les traitements thérapeutiques dans ce domaine, l'identification de biomarqueurs prédictifs de la sensibilité des patients à traitement comprenant 5 l'administration d'un agent inhibiteur de mTOR, utilisé seul ou en combinaison avec d'autres approches thérapeutiques, demeure un objectif important pour le développement futur de ces traitements (Laplante et Sabatini, 2012 ; Baselga et al., 2012). Il est donc nécessaire de disposer de procédés toujours plus efficaces pour prédire la sensibilité des patients à un tel type de traitement. La ménine est une protéine nucléaire ubiquitaire impliquée dans de multiples interactions protéine-protéine et décrite comme un suppresseur de tumeurs contrôlant directement la croissance cellulaire dans différents organes endocrines, comme les parathyroïdes, les ilots pancréatiques et la glande pituitaire. La ménine est codée par le gène MEN1 (pour Multiple Endocrine Neoplasia, type 1). Les mutations de MEN1 prédisposent les patients à une néoplasie endocrine multiple de type 1. La publication de Seigne et al. (2010) enseigne que l'inactivation du gène Menl pourrait jouer un rôle dans la tumorigenèse de la prostate. La publication de Seigne et al. (2013) enseigne que le gène Men] joue un rôle dans la prédisposition des souris aux lésions mammaires précancéreuses. Ce dernier document divulgue aussi qu'une diminution de l'expression de ménine est observée dans une grande proportion chez des patientes atteintes de cancer du sein, avec 95 tumeurs sur 121 (78,5%) présentant un faible niveau d'expression de ménine. Cependant, ces documents ne divulguent pas l'altération des voies mTOR et/ou ER suite à l'inactivation de la ménine. Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité de patients atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. Ce procédé comprend la détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon test de tumeur du patient, un niveau d'expression inférieur de ménine dans l'échantillon test par rapport à un échantillon de référence étant indicateur de la sensibilité du patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. Les inventeurs ont également montré que la diminution de l'expression de ménine constitue un nouveau biomarqueur de sensibilité d'un patient à un traitement par un inhibiteur de la voie mTOR et peut donc être utilisée en tant que marqueur de sélection des patients susceptibles de bénéficier d'un traitement inhibiteur de la voie mTOR, le cas échéant en association avec un autre traitement antitumoral, tel que notamment une hormonothérapie. L'invention sera maintenant décrite de manière détaillée à l'aide d'exemples destinés à l'illustrer sans la limiter. 3028955 3 La présente invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) La détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon test de 5 ladite tumeur, b) La prédiction de la sensibilité dudit patient d'après le résultat de l'étape a), un faible niveau d'expression de ménine dans l'échantillon test étant indicatif de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de 10 prédiction de la sensibilité à un traitement inhibiteur de la voie mTOR d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle la voie mTOR est dérégulée, ou suractivée, ledit procédé comprenant la détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon test de ladite tumeur, un faible niveau d'expression de ménine dans l'échantillon test étant indicatif de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. 15 Par « sensibilité d'un patient à un traitement », on entend l'observation d'un effet thérapeutique tel que l'amélioration de la survie d'un patient ayant reçu ledit traitement thérapeutique. L'absence de réponse d'un patient, ou l'absence de sensibilité du patient à un traitement thérapeutique, est au contraire définie par le terme de « résistance » d'un patient audit traitement thérapeutique, dans laquelle aucun effet thérapeutique n'est observé. Un procédé in vitro 20 de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, selon l'invention, permet de sélectionner un patient susceptible de bénéficier d'un tel traitement. Par « traitement inhibiteur de la voie mTOR » on entend l'application d'un traitement destiné à inhiber la voie de transduction comprenant la sérine/théronine kinase mTOR (mammalian 25 target of rapamycin). Par « détermination du niveau d'expression de ménine » (ou « menin » en anglais), on entend la détermination du niveau d'expression de l'ARNm ou de la protéine ménine humaine codé(e) par le gène MEN], quelle que soit l'isoforme de ménine. La protéine ménine (Référence UniProtKB/SwissProt : 000255 révisée le 11 janvier 2011) 30 comprend trois isoformes : isoforme 1 (référence 000255-1, SEQ ID N°1, 615 acides aminés), isoforme 2 (référence 000255-2, 610 acides aminés, dans laquelle les acides aminés 149-153 de la séquence en acides aminés de l'isoforme 1 sont manquants) et isoforme 3 (référence 000255-3, 575 acides aminés, dans laquelle les acides aminés 149-153 et 189-223 de la séquence de l'isoforme 1 sont manquants). 35 Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie 3028955 4 mTOR, dans lequel la détermination du niveau d'expression de ménine comprend la détermination du niveau d'expression de l'ensemble des isoformes de la protéine ménine. Plus particulièrement, dans un procédé de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR selon l'invention la détermination du 5 niveau d'expression de la protéine ménine est réalisée quantitativement ou semi-quantitativement par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique et/ou la quantification d'une protéine particulière dans un échantillon. Un tel procédé est notamment choisi parmi les procédés utilisant des anticorps liant ménine, incluant en particulier l'immunohistochimie (IHC), une détection par immunofluorescence (IF), par immuno-précipitation, par une technique 10 ELISA ou par une méthode de type western-blot. Par « immunohistochimie », on entend d'une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection d'un antigène particulier au moyen d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux liant cet antigène. Le couple anticorps-antigène peut être visualisé par exemple par la conjugaison à une enzyme qui peut catalyser une réaction de production de 15 couleur, par l'utilisation d'anticorps marqués, notamment par un fluorophore, ou par l'utilisation d'anticorps dits « secondaires » capables de lier les anticorps liant l'antigène. Dans une méthode d'immunohistochimie, le tissu est placé sur un support solide. Un anticorps primaire lié à un système de détection (ou un anticorps primaire suivi d'un anticorps secondaire) est ajouté. Le signal est observé par des techniques de microscopie. 20 Le niveau d'expression de ménine peut être défini à l'aide d'un score histologique prenant en compte, d'une part, l'intensité de marquage observée et, d'autre part, le pourcentage de cellules marquées, ou en combinant le pourcentage de cellules marquées et l'intensité de marquage. Selon ce procédé, des sections d'échantillon tumoral sont analysées par microscopie après avoir mis en présence lesdites sections avec un anticorps liant spécifiquement ménine. 25 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, dans lequel la détermination du niveau d'expression de ménine comprend la détermination du pourcentage de cellules tumorales marquées. Par «faible niveau d'expression » on entend un niveau d'expression dans un tissu dans lequel le pourcentage de cellules tumorales marquées est inférieur 30 ou égal à 80% des cellules tumorales présentes dans le tissu. Un niveau d'expression élevé correspond à un tissu dans lequel le pourcentage de cellules tumorales marquées est supérieur à 80% des cellules tumorales présentes dans le tissu. De façon avantageuse, dans un procédé selon l'invention, le niveau d'expression de la protéine ménine peut être déterminé par comparaison avec le niveau d'expression de la protéine 35 ménine dans un échantillon contrôle. L'échantillon contrôle peut notamment être choisi parmi : le niveau médian d'expression de ménine dans un tissu sain, le niveau médian d'expression de 3028955 5 ménine dans un échantillon de tumeur et le niveau médian d'expression de ménine dans un échantillon de tumeur hormonodépendante choisie parmi une tumeur mammaire, une tumeur gynécologique et une tumeur de la prostate. Selon un autre mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé in vitro 5 de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, dans lequel la détermination du niveau d'expression de ménine comprend la détermination du niveau d'expression d'un ARNm codant pour la protéine ménine. Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend la détermination de la quantité d'un ARNm codant pour la protéine ménine. La détermination de la quantité de l'ARNm codant pour la protéine ménine est 10 réalisée par tout procédé connu par l'homme du métier permettant la détection spécifique d'un ARNm dans un tissu. Un tel procédé comprend notamment la détection spécifique d'un ARNm à l'aide de sondes d'acide nucléique complémentaires de la séquence dudit ARNm, notamment par RT-PCR, par un procédé de type Northern-Blot ou par hybridation sur une sonde immobilisée. La PCR quantitative permet de mesurer la quantité initiale d'acide nucléique. Les acides 15 nucléiques amplifiés, et notamment les ARNm, peuvent être détectés et quantifiés par tout procédé connu par un homme du métier, tel que notamment par spectrométrie à 260 nm ou par Northern blot en utilisant un procédé d'hybridation de sondes radioactives ou fluorescentes sur l'acide nucléique amplifié. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la 20 sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, comprenant la détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon test de tumeur, dans lequel l'échantillon test de tumeur est choisi parmi : un tissu tumoral, une pièce opératoire et une biopsie. Selon un autre aspect particulier, dans un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité 25 d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, le traitement inhibiteur de la voie mTOR consiste en l'administration d'au moins un agent choisi parmi : les inhibiteurs de la voie mTORC1, les inhibiteurs de la voie mTORC2, les inhibiteurs de la voie mTORC1 et de la voie mTORC2, les inhibiteurs de la voie PI3K/mTOR (phosphatidylinositol 3- kinase/mTOR), les inhibiteurs de la voie mTOR de nouvelle génération, les analogues de la 30 rapamycine, l'évérolimus et le temsirolimus. Selon un aspect encore plus particulier, dans un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR selon l'invention, ledit traitement inhibiteur de la voie mTOR est un traitement inhibiteur de la voie PI3K/mTOR. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement inhibiteur 35 de la voie mTOR consiste en l'administration d'évérolimus. 3028955 6 Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, combiné à un autre traitement anti-tumoral. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement anti-tumoral est choisi parmi : l'hormonothérapie, la chimiothérapie et 5 un traitement ciblant les récepteurs aux facteurs de croissance. L'hormonothérapie peut être utilisée dans le but de diminuer les risques de récidive du cancer après la chirurgie, et peut également être utilisée pour traiter les cancers récidivants après un premier traitement antitumoral. En effet, rcestrogène favorise la croissance des cellules tumorales positives pour les récepteurs à rcestrogène (ER+). 10 Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie. Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie 15 mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, ladite tumeur étant une tumeur hormonodépendante. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ladite tumeur hormono-dépendante est choisie parmi les tumeurs mammaires, les tumeurs gynécologiques et les tumeurs de la prostate. Par tumeur gynécologique on entend notamment tumeur de l'ovaire ou de l'utérus. 20 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur mammaire primaire à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, ledit procédé comprenant la détermination du niveau d'expression de ménine. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ladite tumeur mammaire est classée ER+/HER2-. ER et HER2 sont des marqueurs conventionnels de tumeurs mammaires désignant 25 respectivement la présence de récepteurs aux oestrogenes (ER) et la surexpression, ou pas, du « Human Epidermal Growth Factor 2 (HER2/ErbB-2). Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur mammaire ayant fait l'objet d'une étape de chirurgie destinée à retirer ladite tumeur. 30 Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, ledit patient n'ayant pas reçu de traitement par hormonothérapie préalablement au procédé selon l'invention. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction 35 de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, ledit patient ayant reçu un traitement par 3028955 7 hormonothérapie préalablement au procédé selon l'invention. Plus particulièrement, ledit patient a reçu un traitement par hormonothérapie préalablement au procédé selon l'invention et présente une résistance audit traitement par hormonothérapie. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration d'un traitement choisi 5 parmi : au moins un agent anti-oestrogène, au moins un agent anti-aromatase, et au moins un agent anti-oestrogène et au moins un agent anti-aromatase. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration d'au moins un agent anti-oestrogène choisi parmi : les SERM (pour Selective Estrogen Receptor Modulators), les SERD (pour Selective Estrogen Receptor Degradation), le tamoxifène, le toremifène et le fulvestrant. 10 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, dans lequel ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration de tamoxifène. Selon un autre aspect particulier, l'invention a également pour objet un procédé in vitro de 15 prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, dans lequel le traitement inhibiteur de la voie mTOR consiste en l'administration d'évérolimus et ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration de tamoxifène. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un 20 patient atteint d'une tumeur mammaire à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, dans lequel le traitement inhibiteur de la voie mTOR consiste en l'administration d'évérolimus et ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration de tamoxifène. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un 25 patient atteint d'une tumeur mammaire à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, dans lequel le traitement inhibiteur de la voie mTOR consiste en l'administration d'évérolimus et ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration de tamoxifène, et caractérisé en ce que ledit patient présente une résistance à un premier traitement par hormonothérapie. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un 30 patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, dans lequel ledit traitement par hormonothérapie consiste en l'administration d'au moins un agent anti-aromatase. Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ledit agent anti-aromatase est choisi parmi : le létrozole, l'anastrozole et l'exémestane. L'invention a également pour objet une composition comprenant un agent inhibiteur de la 35 voie mTOR pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur, ladite utilisation comprenant - 3028955 8 a) La sélection d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle l'expression de ménine est faible b) L'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur de la voie mTOR. 5 Plus particulièrement, l'invention a également pour objet une composition comprenant un agent inhibiteur de la voie mTOR, pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle la voie mTOR est dérégulée, ladite utilisation comprenant la sélection d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle l'expression de ménine est faible, et l'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur de la voie mTOR. 10 Plus particulièrement encore, dans une composition comprenant un agent inhibiteur de la voie mTOR pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur, selon l'invention, ladite tumeur est une tumeur mammaire ou une tumeur de la prostate, plus particulièrement une tumeur mammaire primaire, et encore plus particulièrement une tumeur mammaire définie comme ER+. 15 Selon un aspect particulier, dans une composition selon l'invention comprenant un agent inhibiteur de la voie mTOR pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle la voie mTOR est dérégulée, ladite tumeur a fait l'objet d'une première étape de chirurgie destinée à retirer ladite tumeur. Selon un aspect particulier, dans une composition selon l'invention comprenant un agent 20 inhibiteur de la voie mTOR pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle la voie mTOR est dérégulée' ledit agent inhibiteur de la voie mTOR est l'évérolimus. Selon un autre aspect particulier, dans une composition selon l'invention comprenant un agent inhibiteur de la voie mTOR pour une utilisation dans le traitement d'un patient atteint d'une tumeur dans laquelle la voie mTOR est dérégulée, ledit agent inhibiteur de la voie mTOR est 25 administré en combinaison avec un traitement par hormonothérapie. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro d'identification d'une tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la voie mTOR, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) La détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon de tumeur 30 préalablement prélevé sur un patient, b) L'identification de ladite tumeur comme susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la voie mTOR, si le niveau d'expression de ménine dans ladite tumeur est faible. Plus particulièrement, dans un procédé d'identification d'une tumeur susceptible de 35 répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la voie mTOR selon l'invention, ladite tumeur est une tumeur mammaire, plus particulièrement ladite tumeur est une 3028955 9 tumeur mammaire définie comme ER+. Encore plus particulièrement, dans un procédé d'identification d'une tumeur susceptible de répondre à un traitement comprenant l'administration d'un agent inhibiteur de la voie mTOR selon l'invention, ledit traitement comprend l'administration d'un traitement inhibiteur de la voie mTOR en combinaison avec un traitement par 5 hormonothérapie. L'invention a également pour objet l'utilisation de ménine en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. 10 Selon un aspect particulier, l'invention a également pour objet l'utilisation de ménine en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie. Selon un aspect particulier, l'invention a également pour objet l'utilisation de ménine en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un 15 traitement inhibiteur de la voie /mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie. Selon un autre aspect particulier, l'invention a également pour objet l'utilisation de ménine en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement par hormonothérapie, en combinaison avec l'utilisation d'au moins un autre biomarqueur choisi parmi les récepteurs aux 20 oestrogènes, le récepteur à la progestérone et le GATA3. Listage de séquences : SEQ ID N°1 : isoforme 1 de ménine, référence UniProtKB/SwissProt : 000255-1 révisée le 11 janvier 2011. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et figures suivants : 25 BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : La probabilité de survie des patients est représentée en fonction du temps (TTP, time to progression, en mois). La courbe en pointillés représente les patients ayant un faible taux de 30 ménine, la courbe continue représente les patients ayant un taux normal de ménine. Figures 2A et 2B : Activation de la S6K1 dans la ligné MCF7 stimulée par l'insuline et le sérum. Figure 2A : La forme phosphorylée de la S6K1 a été détectée par western blot à partir des d'échantillons extraits protéiques obtenus des cellules MCF7 à 5, 10, 30 minutes, et à 1, 2, 4, 6 et 24 heures après une stimulation à l'insuline 100nM. La migration de protéines a été effectuée sur un 35 gel de SDS-PAGE à 10%. Les anticorps primaires ont été utilisé aux concentrations suivantes : 1/50 000 pour l'actine et 1/ 1 000 pour S6K1 phosphorylée, et l'anticorps secondaire au 1/10 000. 3028955 10 Deux isoformes de la S6K1 phosphorylées, p75 et p85, ont été révélées. Figure 2B : La S6K1 phorphorylée a été détectée par western blot à partir des d'échantillons extraits protéiques obtenus des cellules MCF7 après une stimulation du sérum à 10% pendant 30 minutes. Figures 3A à 3C : Effets de l'expression réduite de ménine sur l'activation de la voie mTORC1. 5 Les formes phosphorylées de la S6K1 et de la S6RP ont été analysées par western blot à partir des extraits protéiques obtenus des cellules MCF7 (Fig. 3A) et T47D (Fig. 3B) transfectées par Si-Contrôles ou Si-MEN1 et traitées ou non par l'insuline et par Rad 001. Fig. 3C. Les analyses des formes phosphorylées de la S6K1 ont été également effectuées dans les cellules MCF7 stimulées ou non par le sérum. 10 Figure 4 : Analyse par immunohistochimie montrant l'augmentation de la phosphorylation de la S6K1 et S6RP dans les insulinomes déficients en Men] . Les images représentatives de l'IHC en utilisant les anticorps contre la S6K1 (en bas) et de la S6RP (en haut) sur les pancréas issus des souris contrôles (Men1F/FRipCre) et des souris mutantes PMen1 (Men1F/FRipCre+). 15 EXEMPLES Exemple 1 : Etude TAMRAD L'étude TAMRAD (Bachelot et al., 2012) est une étude multicentrique de phase II randomisée évaluant la tolérance et l'efficacité du tamoxifène seul versus association tamoxifène20 rad001 (évérolimus), chez les patientes atteintes de cancer du sein métastatique résistant aux antiaromatases. Les patientes incluses étaient ménopausées, avec un adénocarcinome mammaire histologiquement prouvé, ayant reçu en lère ou 2ème ligne une hormonothérapie en situation métastatique et ayant reçu un traitement par anti-aromatase en situation adjuvante ou métastatique, 25 avec des récepteurs hormonaux positifs aux oestrogènes et/ou à la progestérone et ne surexprimant pas HER2 et n'ayant pas reçu de traitement antérieur par tamoxifène sauf en situation adjuvante et arrêté au moins un an avant la rechute métastatique Des patientes en première rechute métastatique après traitement par anti-aromatase ont été randomisées dans deux bras de traitement : Tamoxifène seul (20 mg/jour) versus Tamoxifène (20 30 mg/jour) + Evérolimus (Rad001) (10 mg/jour). Exemple 2 : Analyse par immuno-histochimie de l'expression de ménine sur tissu fixé L'expression de ménine a été analysée par IHC sur tissu fixé, en utilisant les anticorps antiménine (Cat Num A300-105A, BL342, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), selon le 35 protocole décrit dans Seigne et al., 2010. Ces anticorps polyclonaux ont été obtenus en utilisant un peptide synthétique représentant une portion de la protéine codée par l'exon 10 de Multiple 3028955 11 Endocrine Neoplasia humaine (Menl, Locus Link ID 4221) et après purification des anticorps sur un support solide sur laquelle le peptide a été immobilisé. Des sections de tumeurs primaires de patients inclus dans l'étude TAMRAD ont été récupérées. Les tumeurs du sein incluses dans la paraffine ont été sectionnées, avec une épaisseur 5 de 4 microns. Brièvement, après inactivation de la péroxydase endogène, le démasquage des antigènes (« antigen retrieval ») et la dilution des anticorps (DAKO, Capintaria, CA, USA), les sections ont été incubées pendant la nuit avec les anticorps primaires. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire correspondant (Vector Lab, 1 :200), le signal a été amplifié à l'aide du kit ABC 10 Vectastain elite (Vector Lab) et révélé avec les DAB (Vector Lab). Dans toutes les analyses, le contrôle en absence d'anticorps primaire a été systématiquement inclus pour éliminer le marquage non spécifique dû aux anticorps secondaires. Les anticorps primaires utilisés sont les anticorps antiménine (Cat Num A300-1015A, BL342, anticorps polyclonal de lapin, Bethyl Laboratories, dilution 1 :2000). L'étape de démasquage des antigènes n'a pas été effectuée pour la détection de 15 l'hormone de croissance et la prolactine. Dans chaque cas, le pourcentage de cellules tumorales dont le noyau est marqué est déterminé, et les tumeurs ont été réparties en deux groupes : faible expression lorsque moins de 80%, ou 80%, des cellules sont marquées, et forte expression lorsque plus de 80% des cellules sont marquées. 20 Analyse statistique La probabilité de survie (Time To Progression, ou TTP) a été définie à partir de la date de randomisation des patients jusqu'à la date de la première progression documentée ou du décès due au cancer, estimée selon la méthode de Kaplan-Meier. Les courbes de survie ont été comparées en utilisant le test log-rank. Les modèles de régression proportionnelle de hasards Cox ont été utilisés 25 pour estimer la proportion dûe au hasard (Hazard Ratios). Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant SAS 9.3 (SAS Institute, CaryNC). Conclusion Dans l'analyse des biomarqueurs associés à la restauration de l'hormonosensibilité, il est montré qu'un faible taux d'expression de ménine dans la tumeur mammaire est associé à une 30 meilleure survie sans rechute dans le bras Tamoxifène + Everolimus (traitement TamRad) (Figure 1, courbe en pointillés) indiquant une restauration de l'hormonosensibilité c'est-à-dire une meilleure réponse à l'addition d'Everolimus au Tamoxifène. Exemple 3 : Analyse de l'interaction fonctionnelle et physique entre ménine et mTORC1. 35 Les données décrites dans l'exemple 1 et l'exemple 2 suggèrent que la diminution de l'expression de ménine dans les cancers du sein favoriserait l'activation de la voie mTORC1. Pour 3028955 12 confirmer cette hypothèse et disséquer l'action de ménine sur la voie mTORC1, des analyses ont été effectuées afin de révéler les effets de la diminution de l'expression de ménine sur la voie mTORC1 dans des modèles cellulaires et murins. 3.1. Matériels et méthodes 5 Lignées cellulaires MCF7 (Michigan Cancer Fondation-7) et T47D, toutes deux dérivées de métastases pleurales de cancer du sein, sont des lignées humaines ayant des caractéristiques de l'épithélium mammaire luminal. Ces cellules ont été maintenues dans le milieu DMEM complet composé de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Gibco) supplémenté avec 10% de sérum bovin 10 foetal (FBS) (de Biowhittaker) et de la pénicilline streptomycine (P / S) solution (100 unités / ml pénicilline, 100 lag / ml de streptomycine, Gibco), à 37 ° C, dans un incubateur avec 5% CO2. Stimulation des cellules par l'insuline et le sérum Les cellules ont été incubées tout d'abord dans un milieu sans sérum pendant 24h avant la stimulation, puis, traitées avec 100 nM d'insuline (Sigma) dans du milieu sans sérum avec des 15 durées différentes, respectivement pour 0 ', 5', 10 ', 30', lh, 2h, 4h, 6h et 12h. La stimulation par le sérum à 10% a été réalisée avec le même procédé. Traitement des cellules par Evérolimus (RAD001) Cellules ont été tout d'abord incubées dans un milieu sans sérum pendant 24h avant stimulation par l'insuline Les cellules ont été traitées, avec Evérolimus (RAD001, SIGMA- 20 ALDRICH, 20 nM) ou d'un véhicule (diméthylsulfoxyde, DMSO) dans du milieu sans sérum pendant une heure. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 100 nM d'insuline et 20 nM Evérolimus (RAD001) pendant une heure dans du milieu sans sérum. Transfection par Si-RNA Des cellules ont été ensemencées à 500.000 cellules / puit dans des plaques à 6 puits et 25 cultivées dans du DMEM complet pendant 24 h. Les cellules ont été transfectées avec le Si-RNA contrôle à 100 nmol / 1 (contrôle négatif, de faible complexité de GC, INVITROGEN), ou avec le siRNA ciblant le transcrit du gène MEN1 humain (Si-MEN1 hsl 106 468, Invitrogen) à 100 nmol / 1, en utilisant les réactifs de transfection DharmaFECT (Thermo Scientific) dans le milieu sans sérum, sans P/S pendant 48h. 30 Préparation des extraits protéiques Pour préparer des extraits totaux de protéines, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et lysées dans un tampon contenant du PBS sans Ca2 + et Mg2 +, deoxychlorate de sodium à 0,5%, 1% NP40, 0,1% de SDS et du cocktail des inhibiteurs de protéases et phosphatases (100 nM Na3VO4, 500 nM NaF, 100 nM Na pyropohosphate, 10 nM 35 PiC). Les échantillons ont été bouillis dans un tampon SDS-échantillon (lameli) pendant 5 min à 95 ° C avant l'analyse sur l'immunoblot. 3028955 13 Immunoblotting Les extraits protéiques ont été séparés sur des gels SDS-PAGE à 8%, et transférés sur des membranes PVDF (Polyvinylidene fluoride). Les membranes ont été saturées avec l'albumine bovine de sérum à 5% dilué dans du PBS avec 0,3 % de Tween 20 pendant 1 heure, et ensuite 5 lavées trois fois (10 minutes chacun) avec de la PBS + 0,3 % de Tween 20. Membranes ont été incubées avec les anticorps primaires suivants pendant une nuit à 4°C : anti-ménine (1 : 8000, lapin Acm, Bethyl), anti-phospho-S6K1 (1:4000, Thr389, 108D2, CellSignaling), anti-phospho-AKT (1:4000, Ser473, CellSignaling), anti-phospho-S6-protéine ribosomique (1:2000, Ser2351236, D57.2.2E, CellSignaling) , anticorps polyclonaux anti-topoisomérase 1 (1:1000, BD Pharmingen). 10 Les membranes ont été ensuite lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS) avec 0,3 % de Tween 20 (10 minutes chacun), et incubés avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (CellSignaling) pendant 1 h à température ambiante. Les protéines ont été visualisées selon le protocole du fabricant. 3.2. Résultats expérimentaux 15 1.1 Activation de la voie mTORC1 dans les cellules mammaires par l'insuline et le sérum Pour mieux comprendre l'activation de la voie mTORC1, il est nécessaire de déterminer la cinétique de cette activation par différents stimuli dans les cellules à étudier. La cinétique de l'activation de la voie mTORC1 par l'insuline, dans les cellules MCF7 a été évaluée en analysant les formes phosphorylées de S6K1, une des cibles les plus connues de la 20 voie mTORC1, par western blot. Par rapport au contrôle des dépôts protéiques, une augmentation de l'intensité des bandes correspondant aux iso-formes de la S6k1 a été observée dès 5 minutes (5'). Cette augmentation s'est poursuivie pour atteindre un plateau à 2 heures (2h) (Fig. 2A). Un résultat similaire a été obtenu dans les cellules T47D (Figure 3B). L'activation de la voie mTORC1 par le sérum à 10% dans les cellules MCF7 a été également déterminée (Fig. 2B). 25 1.2 Effet de ménine sur l'activation de la voie mTORC1 dans les cellules mammaires Inhibition de l'expression de ménine par l'interférence d'ARN Les cellules ont été transfectées soit par Si-Contrôles, soit par Si-MEN1 , puis stimulées à l'insuline 100 nM pendant 40 minutes avant la récolte de cellules. Les analyses en western blot ont montré qu'une diminution de ménine en présence de Si MENT a été détectée, avec et sans 30 stimulation à l'insuline, avec une efficacité satisfaisante (Fig. 3A à 3C). Augmentation de la phosphorylation de S6K1 et de S6RP après l'inactivation de ménine Les mêmes expériences ont permis d'analyser, dans les cellules MCF7 (Fig. 3A) et T47D (Fig. 3B), la phosphorylation de la S6K1 et celle de sa cible S6RP sous les influences, d'une part de l'expression de ménine, et d'autre part de la stimulation par l'insuline ou par le sérum. Il a été 35 démontré qu'en présence de la stimulation de l'insuline, une nette augmentation de l'intensité de deux isoformes phosphorylées de la S6K1 peut être observée dans les cellules traitées par Si MENT 3028955 14 par rapport aux celles traitées par Si-contrôles. Parallèlement, il a été observé que les cellules MCF7 transférées par Si MENT présentent une expression plus importante des formes phosphorylées de la S6K1 après une stimulation par le sérum à 10% (Fig. 3C). II. Activation de la voie mTORC1 dans les cellules beta pancréatiques murines déficientes en 5 Men] Les tissus pancréatiques issus de 2 souris contrôles (Men1F/FCre) et 3 souris mutantes ont été analysés pour le gène Men] spécifique des cellules beta pancréatiques (Men1F/F Cre+ , ou /Ment) âgées de 12 mois. Les résultats ont montré une très faible expression de S6K1 phosphorylée dans des ilots issus de souris contrôles, le marquage étant cytoplasmique et diffus de 10 façon homogène dans les ilots. Par contre, il a été observé un marquage largement plus fort de la S6K1 phosphorylée dans les ilots pancréatiques issus de souris /Ment du même âge (Figure 3, rangée du bas). On peut observer un marquage essentiellement cytoplasmique, avec une répartition peu homogène. La forme phosphorylée de la protéine S6RP, la protéine cible principale de la S6K1, a 15 également été analysée dans les tissus pancréatiques issus de 3 souris contrôles Men1F/FCre- et 6 souris f3Menl, âgées de 12 mois. Les analyses des immunohistochimies (IHC) obtenues ont montré une très faible expression, majoritairement cytoplasmique de la S6RP phosphorylée dans les ilots issus des souris contrôles. Par contre, dans les îlots issus de souris mutantes, il a été observé une augmentation importante de l'expression de S6RP phosphorylée (Fig. 2, rangée en haut), le 20 marquage étant essentiellement cytoplasmique et diffus. III. Conclusions Ces études expérimentales ont pu mettre en évidence que la diminution d'expression de ménine dans les cellules humaines cancéreuses mammaires conduit à une augmentation considérable du niveau de phosphorylation de la protéine S6K1 et de sa cible S6RP, connue pour 25 être parmi les principaux effecteurs de la voie mTORC1. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 30 - Bachelot et al., "Randomized Phase II trial of Everolimus in combination with taoxifen in patients with hormone-receptor positive, HER2 negative metastatic breast cancer with prion exprosure to aromatase inhibitors: a GINECO study", J. Clin. Oncol., May 7. - Baselga et al., (2012), « Everolimus in postmenopausal hormone-receptor-positive advanced breast cancer », N. Engl. J. Med., 366, 520-529. 35 - Laplante M. Sabatini DM. (2012), « mTOR signaling in growth control and disease » Cell, 49(2) :274-93. 3028955 15 - Seigne C. et al. (2010), "Characterization of prostate cancer lesions in heterozygous Men] mutant mice" BMC Cancer, 10 : 395. - Seigne C. et al. (2013), "High incidence of mammary intraepithelial neoplasia development in Men] -disrupted mucine mammary glands", J. Pathol., 229: 546-558. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro de prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie mTOR, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. La détermination du niveau d'expression de ménine dans un échantillon test de ladite tumeur, b. La prédiction de la sensibilité dudit patient atteint de ladite tumeur d'après le résultat de l'étape a), un faible niveau d'expression de menine dans l'échantillon test étant indicatif de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR. 2. Prôcédé selon la revendication 1, dans lequel la détermination du niveau d'expression de ménine comprend la détermination du niveau d'expression de la protéine ménine. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le niveau d'expression de menine est déterminé en évaluant le pourcentage de noyaux de cellules tumorales marquées dans ledit échantillon. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la détermination du niveau d'expression de ménine comprend la détermination du niveau d'expression d'un ARNin codant pour la protéine ménine. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel, à l'étape b), un faible niveau d'expression de ménine dans l'échantillon test est indicatif de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR choisi parmi : les inhibiteurs de la voie mTORC1, les inhibiteurs de la voie mTORC2, les inhibiteurs de la voie PI3K/mTOR, l'évérolimus et le ternsirolimus. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel, à l'étape b), un faible niveau d'expression de ménine dans l'échantillon test est indicatif de la sensibilité dudit patient à un traitement inhibiteur de la voie mTOR combiné à un traitement choisi parmi : l'hormonothérapie, la chimiothérapie et un traitement ciblant les récepteurs aux facteurs de croissance. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel ladite tumeur est une tumeur hormonodépendante choisie parmi : une tumeur mammaire, une tumeur gynécologique et une tumeur de la prostate. 3028955 Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, dans lequel ladite tumeur est une tumeur mammaire primaire. Utilisation de ménine en tant que biomarqueur pour la prédiction de la sensibilité d'un patient atteint d'une tumeur à un traitement inhibiteur de la voie niTOR.