FR 3032448 A1 20160812 FR 1550959 A 20150206 1 ENRICHISSEMENT ET CULTURE SELECTIVE DE MYCOBACTERIES La présente invention a trait aux méthodes de culture et d'isolement des mycobactéries. Plus précisément, elle concerne les méthodes de microbiologie et les milieux de culture pouvant être utilisés pour la détection, l'identification, l'isolement et/ou l'étude analytique de mycobactéries, par exemple celles présentes dans les échantillons et les prélèvements biologiques. Appartenant à l'ordre des actinomycètes, les mycobactéries sont des bacilles fins, de forme droite ou parfois légèrement incurvée. Du fait d'une paroi riche en lipides qui limite la pénétration des colorants, la coloration des mycobactéries par les techniques et les colorants traditionnels est difficile. Mais une fois colorées, leur coloration résiste à la décoloration aussi bien par l'acide que par l'alcool. Pour cette raison, elles sont qualifiées de bactéries « acido-alcoolo-résistantes ». Selon une classification élémentaire, les différentes espèces de mycobactéries sont répertoriées selon deux grandes catégories. La première catégorie regroupe les mycobactéries pathogènes strictes, qui parasitent aussi bien les animaux que l'homme. Ces mycobactéries sont responsables de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, 20 Mycobacterium micron et Mycobacterium canetti) ou de la lèpre (Mycobacterium leprae). La seconde catégorie regroupe les mycobactéries saprophytes ou commensales, qui sont habituellement non-pathogènes. On parle alors de mycobactéries « atypiques » ou « non-tuberculeuses » (MNT). Ubiquitaires dans notre environnement, ces dernières se trouvent disséminées un peu partout dans le sol, les végétaux, la poussière, l'eau et les réseaux 25 de distribution, notre alimentation... Généralement inoffensives pour l'homme, certaines mycobactéries non-tuberculeuses peuvent causer, chez les sujets immunodéprimés, des infections opportunistes atteignant principalement les poumons, la peau et le système lymphatique. Ainsi, sur le plan clinique mais aussi sanitaire, qu'elles soient pathogènes ou 30 non-tuberculeuses, la détection et/ou l'identification des mycobactéries revêtent une importance substantielle. Une détection précoce et spécifique de ces bactéries permet de 3032448 2 proposer une solution adaptée, en termes de traitement thérapeutique, de décontamination sanitaire... Différentes techniques existent à cet égard, par exemple, l'amplification génique (par PCR) de séquences nucléiques spécifiques, l'immuno-détection d'antigènes, la spectrométrie de masse, la détection microbiologique d'activités enzymatiques... 5 Quelles qu'elles soient, ces méthodes de détection/identification nécessitent généralement la mise en culture des mycobactéries éventuellement présentes dans les échantillons/prélèvements à analyser, pour obtenir une quantité propice à leur détection. Quelles qu'elles soient, ces méthodes détection/identification souffrent d'un même handicap : la lenteur de croissance et de développement des mycobactéries. 10 En effet, comparées à d'autres bactéries, aux levures et aux champignons, les mycobactéries, aussi bien pathogènes que saprophytes, se caractérisent par une croissance et un développement relativement lents. Par ailleurs, dans les échantillons biologiques dans lesquels la présence de mycobactéries est recherchée, les mycobactéries se trouvent rarement isolées ; elles sont usuellement contaminées par une flore accompagnatrice dont la croissance 15 et le développement sont beaucoup plus rapides. Au fur des cycles de divisions cellulaires, la proportion des mycobactéries dans l'échantillons décroit, et la difficulté de pouvoir les visualiser et les identifier s'en trouve accentuée. Pour remédier à cette lenteur de croissance et de développement et/ou à cette contamination par d'autres microorganismes, de nombreux milieux de culture et bouillons d'enrichissement, plus ou moins sélectifs pour les mycobactéries ou pour une espèce particulière de mycobactérie, ont été développés. Parmi les plus fréquemment utilisés, le milieu Lôwenstein-Jensen est un milieu de culture coagulé (non gélose), comprenant une composante nutritive à base d'oeuf entier, de fécule de pomme de terre, d'asparagine, de glycérol et de minéraux. Ce milieu contient aussi du vert malachite, en vue d'inhiber la flore accompagnatrice (plus particulièrement, les bactéries à Gram négatif). Une adjonction de pénicilline et/ou d'acide nalidixique a également été proposée pour en augmenter la sélectivité à l'égard des mycobactéries. De composition similaire, le milieu gélose Coletsos renferme en plus, du pyruvate et du glutamate, du bleu de tournesol et de la gélatine. 3032448 3 Plus récemment apparus, les milieux Middlebrook 7H9, 7H10 et 7H11 sont des milieux semi-synthétiques ayant une composante nutritive à base d'acides aminés, d'acides gras, de pyruvate et de sels minéraux. Ces milieux contiennent également de la catalase et de l'albumine bovine (fraction V), qui apportent aux mycobactéries une protection contre divers 5 agents nocifs (notamment des peroxydes toxiques) éventuellement présents dans les échantillons et prélèvements biologiques. Le milieu Middlebrook 7H10 diffère du milieu Middlebrook 7H9, par la présence de vert malachite. Le milieu Middlebrook 7H11 diffère du milieu Middlebrook 7H10 en ce qu'il est enrichi avec une peptone pancréatique de caséine. De nombreuses variantes à ces trois milieux Middlebrook ont aussi été envisagées pour en 10 augmenter la sélectivité à l'égard des mycobactéries, par exemple en y ajoutant les agents sélectifs suivant : polymyxine, amphotéricine B, acide nalidixique, triméthoprime, azlocilline et vancomycine. Dernièrement, le milieu BCSA (pour « Burkholderia cepacia selective agar »), initialement développé pour la culture et la détection de Burkholderia cepacia, a été décrit 15 comme étant particulièrement propice au développement et à la croissance des mycobactéries, plus particulièrement des mycobactéries dites à croissance rapide (Esther et al. - Journal of Chnical Microbiology ; 2011, 1421-1425). Il s'agit là d'un milieu de culture gélose, formulé à partir d'une composante nutritive comprenant de la peptone de caséine, des sucres (lactose et saccharose), un extrait de levure, et des agents sélectifs tels que la gentamicine, la 20 vancomycine, le cristal violet et la polymixine B. La présente invention vise à améliorer les méthodes et techniques utilisées pour détecter, identifier et/ou isoler les mycobactéries présentes dans un échantillon biologique. Pour ce faire, la présente invention vise à améliorer les milieux de culture et bouillons 25 d' enrichissement mis en oeuvre dans ces méthodes et techniques, tant au niveau de leur fertilité que de leur sélectivité à l'égard des mycobactéries. Egalement, elle vise à proposer de nouvelles compositions de milieu de culture et/ou de bouillon d' enrichissement, aptes à permettre la culture et la multiplication des mycobactéries, et ayant des performances améliorées en termes de fertilité et/ou de sélectivité à l'égard des mycobactéries. 30 3032448 4 Avant de présenter l'invention, les définitions suivantes sont données pour permettre une meilleure compréhension de l'invention. Par « milieu de culture », on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le 5 milieu de culture peut être solide, semi-solide ou liquide. Par « milieu solide », on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. Par « bouillon d'enrichissement », on désigne plus spécifiquement un milieu de 10 culture liquide. Un milieu de culture est qualifié de milieu minimum, lorsque sa composition comporte uniquement les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance et la multiplication des microorganismes à cultiver. On y trouve classiquement : - de l'eau (généralement, de l'eau distillée ou désionisée) ; 15 - une composante nutritive comprenant généralement : - une source carbonée et d'énergie (généralement du glucose) ; - une source de calcium (par exemple CaCl2) ; - une source d'azote (par exemple (NH4)2SO4) - une source de soufre (par exemple (NH4)2SO4) ; 20 - une source de magnésium (par exemple MgCl2) ; - une source de fer (par exemple du citrate de fer) ; - une source d'oligo-éléments (par exemple sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti) ; - éventuellement un tampon pH pour maintenir le milieu à un pH approprié ; et pour les milieux solides ou semi-solides, éventuellement un agent gélifiant (par exemple 25 l'agar, la gélatine ou l'agarose). L'adjonction de facteurs de croissance particuliers et/ou de nutriments divers permet de renforcer les attributs de la composante nutritive et d'accroitre le pouvoir fertilisant du milieu. On parle alors de milieu « enrichi ». L'adjonction de ces facteurs de croissance et/ou de ces nutriments peut être réalisée au moyen de composés ou de compositions 30 chimiquement définis, ou alors au moyen de compositions complexes (par exemple, sang frais, sérums, extrait de levure, oeuf entier, jaune d'oeuf, peptones... ). 3032448 5 Un milieu de culture est dit sélectif lorsqu'il comprend au moins un agent sélectif permettant audit milieu de favoriser la croissance d'un microorganisme-cible ou d'un groupe-cible de microorganismes, plutôt que celle de la flore accompagnatrice. Il s'agit essentiellement de composés aux effets antibiotiques et/ou antifongiques, et présentant une 5 spécificité de toxicité (toxicité plus faible pour les microorganismes-cibles que pour la flore accompagnatrice). Par « échantillon biologique », on entend un échantillon clinique issu d'un prélèvement d'origine humaine ou animale, ou un échantillon alimentaire issu de tout type d'aliment. Cet échantillon biologique peut être liquide ou solide et on peut citer d'une manière 10 non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fèces, des prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, de liquide bronchoalvéolaire, d'expectoration, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage, de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que 15 notamment un échantillon issu de farines animales. A des fins de simplification de vocabulaire, on utilisera indifféremment les expressions « échantillon biologique » et « prélèvement biologique ». La présente invention concerne ainsi un procédé (une méthode) 20 d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries contenues dans un échantillon biologique, dans lequel on ensemence tout ou partie dudit échantillon dans/sur un milieu de culture comprenant une composante nutritive propice au développement et à la croissance de mycobactéries, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend également de l'hydrochlorure de 9-chloro-9-(4'-diéthylamino)phény1-9,10-dihydro-10-phenylacridine, 25 titre d'agent sélectif. La présente invention repose sur le principe général d'incorporer, dans des compositions de milieux de culture envisagés pour la culture de mycobactéries, le 9-chloro-9- (4'-diéthylamino)phény1-9,10-dihydro-10-phenylacridine, pour en accroitre la sélectivité à l'égard des mycobactéries. Cet agent sélectif est aussi connu sous la dénomination générique 30 C-390 (CAS 77769-31-4). En l'occurrence, les inventeurs ont démontré que l'utilisation d'un tel composé dans les milieux de culture conduisait à un bon isolement des mycobactéries et 3032448 6 une bonne élimination de la flore accompagnatrice, notamment des microorganismes appartenant aux genres Pseudomonas, En terobacteriaceae , Streptococcus, Burkholderia, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Enterocoecus, Achromobacter, Acinetobacter, Pandoraea, Bacillus, Elizabethkingia miricola, Haemophilus , Moraxella, Neisseria, 5 Aspergillus, Scedosporium, Candida et Geosmithia. Egalement et de façon surprenante, les inventeurs ont constaté que le C-390 conférait aussi aux milieux de culture, une légère teinte bleutée supplémentaire qui peut améliorer notablement la visualisation et la détection visuelle des colonies poussant sur ces milieux. 10 Avantageusement et selon l'invention, la concentration en C-390 du milieu de culture utilisé pour mettre en oeuvre le procédé d'enrichissement et de culture sélective selon l'invention est comprise entre 2 mg/L et 1 000 mg/L, préférentiellement entre de l'ordre de 20 mg/L et de l'ordre de 200 mg/L. 15 Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, ledit milieu de culture comprend en outre, au moins un agent sélectif additionnel choisi parmi : - l'amphotéricine B, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 1 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 2 mg/L et 50 mg/L ; 20 - l'acide nalidixique, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 5 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 15 mg/L et 100 mg/L ; - la vancomycine, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 1 mg/L et 50 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 2 mg/L et 20 mg/L ; - le méthanesulfonate de colistine, notamment à une concentration préférentiellement 25 comprise entre 10 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 15 mg/L et 150 mg/L ; - la fosfomycine, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 100 mg/L et 3 000 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 200 mg/L et 2 000 mg/L ; et 30 - le vert de malachite, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 0,05 mg/L et 2 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 0,2 mg/L et 1 mg/L. 3032448 7 Selon un mode préféré de l'invention, ledit milieu de culture comprend à titre d'agents sélectifs additionnels : - l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L, 5 - le méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L, - la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2 000 mg/L. Selon un mode préféré de l'invention, en complément de la fosfomycine, ledit 10 milieu de culture comprend avantageusement du glucose-6-phosphate, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L. Selon un aspect particulier, la présente invention vise à améliorer les méthodes de culture et/ou d'isolement de mycobactérie qui ont actuellement cours, en intervenant sur la 15 composition des milieux de culture usuels (tels que des milieux Middlebrook, le milieu Columbia, le milieu BCSA) pour en accroitre la sélectivité en inhibant les non-mycobactéries. A cet effet, la présente invention propose de parfaire la composition de ces milieux de culture par un apport de C-390, et éventuellement d'autres agents sélectifs comme précédemment énoncés. Egalement, la présente invention propose d'en améliorer la fertilité grâce à l'apport 20 de divers nutriments tels que : le glycérol, un supplément à base d'acide oléique, d'albumine, de dextrose et de catalase (ou supplément OADC), le charbon actif, le sang frais, un extrait de levure, l'alpha-cétoglutarate, la caséine, le pyruvate, des peptones, l'amarante, le jaune d'oeuf, de l'ARN, le polyoxyéthylène stéarate, le tyloxapol Dans ce contexte, le procédé d'enrichissement et de culture sélective de 25 mycobactéries selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre avec un milieu de culture dont la composante nutritive reprend celle d'un milieu de culture choisi parmi : - un milieu Middlebrook (en particulier un des milieux Middlebrook 7H9, 7H10 et 7H11) éventuellement complémenté avec du glycérol et/ou un supplément OADC ; - un milieu Columbia, éventuellement complémenté avec un supplément OADC et/ou 30 du sang frais, notamment du sang de cheval ; et - un milieu BCSA. 3032448 8 Selon un mode encore plus préféré, le procédé d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries selon l'invention est mis en oeuvre avec un milieu de culture comprenant une composante nutritive reprenant celle d'un milieu Middlebrook, complémentée avec : 5 - du glycérol, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 2 mL/L et 20 mL/L, - un supplément OADC, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et éventuellement - un ou plusieurs nutriments choisis parmi : le sang frais, un extrait de levure, l'alpha- 10 cétoglutarate, la caséine, le pyruvate, des peptones, l'amarante, le jaune d'oeuf, de l'ARN, le polyoxyéthylène stéarate, le tyloxapol. Avantageusement et selon l'invention, ledit supplément OADC est un composition aqueuse comprenant 50 g/L d'albumine bovine, 20 g/L de dextrose, 0,04 g/L de catalase et 0,5 g/L d'acide oléique. 15 Avantageusement et selon ce mode préféré de l'invention, le procédé d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries selon l'invention est mis en oeuvre avec un milieu de culture comprenant une composante nutritive reprenant celle d'un milieu Middlebrook, complémentée avec : - du glycérol, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 2 mL/L 20 et 20 mL/L, - un supplément OADC, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et - un extrait de levure, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 0,1 g/L et 20 g/L. 25 Avantageusement et selon l'invention, ledit procédé s'applique plus particulièrement à l'enrichissement et à la culture sélective des mycobactéries appartenant aux espèces M abscessus, M bolletii, M massiliense, M chelonae, M immunogenum, M salmoniphilum, M avium, M tuberculosis, M intracellulare, M malmoense, M gordonae, 30 M kansasii et M. fortuitum. 3032448 9 La présente invention s'étend également à un milieu de culture adapté à la mise en oeuvre d'un procédé d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries selon l'invention. En l'espèce, un milieu de culture selon l'invention comprend une composante nutritive propice au développement et à la croissance de mycobactéries, et est caractérisé en ce 5 qu'il comprend également de l'hydrochlorure de 9-chloro-9-(4'-diéthylamino)phény1-9,10- dihydro-10-phenylacridine, à titre d'agent sélectif. Selon un mode particulier de réalisation, ledit milieu de culture est exempt de cristal violet. Avantageusement et selon l'invention, ledit milieu de culture comprend une 10 composante nutritive propice au développement et à la croissance de mycobactéries, et de l'hydrochlorure de 9-chloro-9-(4'-diéthylamino)phény1-9,10-dihydro-10-phenylacridine, titre d'agent sélectif, et se caractérise également par tout ou partie des caractéristiques techniques suivantes : - la concentration en C-390 est comprise entre 2 mg/L et 1 000 mg/L, préférentiellement 15 entre de l'ordre de 20 mg/L et de l'ordre de 200 mg/L ; - ledit milieu de culture comprend au moins un agent sélectif additionnel choisi parmi : - l'amphotéricine B, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 1 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 2 mg/L et 50 mg/L ; 20 - l'acide nalidixique, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 5 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 15 mg/L et 100 mg/L ; - la vancomycine, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 1 mg/L et 50 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 2 mg/L et 25 20 mg/L ; - le méthanesulfonate de colistine, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 10 mg/L et 200 mg/L, et plus préférentiellement encore entre 15 mg/L et 150 mg/L ; et - la fosfomycine, notamment à une concentration préférentiellement comprise 30 entre 100 mg/L et 3 000 mg/L, plus préférentiellement encore entre 200 mg/L et 2 000 mg/L, et éventuellement du glucose-6-phosphate, 3032448 10 notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L ; - ledit milieu de culture comprend à titre d'agents sélectifs additionnels : - l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L ; 5 - le méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L ; - la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2000 mg/L, et du glucose-6-phosphate, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L ; 10 - ledit milieu de culture comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu de culture choisi parmi : - un milieu Middlebrook, éventuellement complémenté avec du glycérol et/ou un supplément OADC ; - un milieu Columbia, éventuellement complémenté avec un supplément 15 OADC et/ou du sang frais, notamment du sang de cheval ; et - un milieu BCSA ; - ledit milieu de culture comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu Middlebrook, et complémenté avec : - du glycérol, notamment à une concentration préférentiellement comprise 20 entre 2 mL/L et 20 mL/L, - un supplément OADC, notamment à une concentration préférentiellement comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et éventuellement - un ou plusieurs nutriments choisis parmi : le sang frais, un extrait de levure, l'alpha-cétoglutarate, la caséine, le pyruvate, des peptones, l'amarante, le 25 jaune d'oeuf, de l'ARN, le polyoxyéthylène stéarate, le tyloxapol. Avantageusement, la présente invention porte sur un milieu de culture comprenant une composante nutritive consistant en milieu Middlebrook 7H9, complémentée avec : 30 - du glycérol, à une concentration comprise entre 2 mL/L et 20 mL/L, - un supplément OADC, à une concentration comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et 3032448 11 - un extrait de levure, à une concentration comprise entre 0,1 g/L et 20 g/L ; et comprenant à titre d'agents sélectifs : - du C-390, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L, - de l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L, 5 - du méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L, - de la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2000 mg/L, accompagnée de glucose-6-phosphate, à une concentration comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L. 10 Selon un mode avantageux de mise en oeuvre de l'invention, la composition dudit milieu de culture peut inclure un ou plusieurs marqueurs aptes à permettre une détection et/ou une identification visuelles des mycobactéries se développant dans ou sur ledit milieu. Il peut s'agir notamment de substrats enzymatiques synthétiques, aux propriétés chromogéniques 15 et/ou fluorogéniques. L'invention concerne également une méthode, un procédé d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries, une utilisation du C-390 à des fins de culture et/ou d'isolement de mycobactéries, ainsi qu'un milieu de culture, caractérisés par tout ou partie de 20 caractéristiques techniques exposées ci-dessus et ci-dessous. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-dessous, qui ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention et de sa mise en oeuvre. Ces exemples sont donnés à 25 titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. EXEMPLES : Elaboration et évaluation de milieux sélectifs selon l'invention 1/ - Sélection d'une composition « de base » pour la culture des mycobactéries 3032448 12 Différentes compositions de milieux de culture, connues de la littérature comme fertiles aux mycobactéries, ont été testées et comparées pour leur capacité à faire croître les mycobactéries. Certains ont été enrichis au préalable. Les milieux testés sont les suivants : - milieu A : agar Middlebrook, 5 - milieu B : agar Midllebrook enrichi en glycérol (4 mL/L), - milieu C : agar Middlebook avec du Tween 80 (1 g/L), - milieu D : agar Midllebrook enrichi à la fois avec du glycérol (4 mL/L) et un supplément OADC (100 mL/L), - milieu E : agar Midllebrook complémenté/enrichi à la fois avec du Tween 80 et le 10 supplément OADC, - milieu F : gélose Columbia (Oxoid), - milieu G : gélose Columbia (Oxoid), enrichi avec le supplément OADC, - milieu H : agar Columbia au sang, - milieu I : milieu BCSA (bioMérieux, France). 15 a) Préparation des milieux A à E Les milieux référencés A à E ont été préparés à partir d'une solution-mère consistant en un bouillon de culture Middlebrook 7H9, ayant pour composition : - sulfate d'ammonium (5 g/L), 20 - acide L-glutamique (5 g/L), - phosphate disodique (25 g/L), - phosphate monopotassique (10 g/L), - citrate de sodium (1 g/L), - sulfate de magnésium (0,5 g/L), 25 - chlorure de calcium (0,005 g/L), - sulfate de zinc (0,01 g/L), - sulfate de cuivre (0,01 g/L), - ammonium ferrique citrate (0,4 g/L), - pyridoxine (0,01 g/L), et 30 - biotine (0,005 g/L). 3032448 13 Le pH de ce bouillon a été ajusté à 6,6 ± 0,2. Le bouillon a ensuite été stérilisé à l'autoclave à 116°C pendant 10 minutes. Il est conservé au réfrigérateur jusqu'à utilisation. Pour obtenir le milieu A, 50 mL de bouillon ont été ajoutés à 450 mL d'eau désionisée. 5 g d'agar bactériologique sont ajoutés à l'ensemble pour obtenir un agar 5 Middlebrook. Le tout a ensuite été stérilisé à l'autoclavage à 116°C, pendant 10 minutes. Les milieux B, C, D et E ont été préparés de façon similaire au milieu A, et renferment en plus : - du glycérol (4 mL/L) et éventuellement un supplément à base d'acide oléique, 10 d'albumine, de dextrose et de catalase (supplément OADC ; 100 mL/L), ou bien : - du Tween 80 (1 g/L) et éventuellement un supplément OADC (100 mL/L), b) Milieux F à I 15 Les milieux F, H et I sont des milieux disponibles dans le commerce. Le milieu G a été préparé de façon similaire au milieu F, et renferme en plus le supplément OADC (100 mL/L). c) Evaluation de la fertilité des milieux A à I à l'égard des mycobactéries 20 La fertilité de chacun des milieux A à I a été évaluée au moyen de 20 souches de mycobactérie : - 12 souches de Mycobacterium abscessus, - 3 souches de Mycobacterium bolletii, - 5 souches de Mycobacterium massiliense. 25 Ces souches, initialement conservées à -20°C dans le glycérol, sont décongelées et cultivées, dans un premier temps sur gélose Columbia au sang de cheval (5 %). Chaque souche est alors mise en suspension dans 1 mL de solution saline (0,85%) jusqu'à atteindre une turbidité équivalente au standard McFarland 0,5 (équivalent à environ 1,5.108 CFU/mL). Pour les mycobactéries ayant tendance à s'agglutiner, les cellules sont 30 dispersées au vortex, dans un tube contenant 3 billes de verre de 3 mm de diamètre, pendant 10 minutes. 3032448 14 Une aliquote de 1 ut, de chaque suspension de mycobactéries est inoculée sur chacun des milieux de culture à évaluer, et étalée de façon à obtenir des colonies isolées. Les cultures sont incubées à 30°C. La croissance des colonies est observée pendant 7 jours. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau 1 ci-après. Milieu A : Milieu B : Middlebrook + glycerol. Milieu C : Middlebrook + Tween 80 Milieu D : Middlebrook + glycerol. Milieu E : Middlebrook + Tween 80 + OADC Middlebrook + OADC Nombre de souches 0/20 0/20 0/20 11/20 0/20 démontrant une croissance (55%) Milieu F : Columbia Milieu G : Columbia + OADC Milieu H : Columbia au sang Milieu I : BCSA 0/20 3/20 1/20 6/20 (15 %) (5 %) (30 %) Tableau 1 2/ - Evaluation de l'effet de divers nutriments sur la croissance des mycobactéries Sur la base de la formulation du milieu D précédemment testée, les effets de divers nutriments sur la culture des mycobactéries ont été évalués : charbon actif, sang de cheval, extrait de levure, alpha-cétoglutarate, caséine, pyruvate, peptones, amarante, émulsion 15 de jaune d'oeuf, ARN (SIGMA, réf. R6625-25G), polyoxyéthylène stéarate, tyloxapol. De manière très similaire au milieu D, les milieux suivant (noté J à V) ont été préparés : - Milieu J : Milieu D + charbon actif (2 g/L), - Milieu K : Milieu D + sang de cheval 5 % (50 mL/L), 20 - Milieu L : Milieu D + extrait de levure (4 g/L), - Milieu M : Milieu D + alpha-cétoglutarate (15 g/L), - Milieu N : Milieu D + caséine (1 g/L), - Milieu 0 : Milieu D + pyruvate de sodium (7 g/L), - Milieu P : Milieu D + peptone (10 g/L), 25 - Milieu K : Milieu D + amarante (0,04 g/L), 5 10 3032448 1 5 - Milieu R : Milieu D + émulsion de jaune d'oeuf (33 mL/L), - Milieu S : Milieu D + ARN (0,05 g/L), - Milieu T : Milieu D + polyoxyéthylène stéarate (0,1 g/L) - Milieu U : Milieu D + tyloxapol (5 mL/L) 5 - Milieu V : Milieu D + émulsion de jaune d'oeuf (33 mL/L) + charbon actif (4 g/L). La fertilité de ces milieux est évaluée au moyen des 20 mêmes souches de mycobactéries utilisées dans le test précédemment décrit, et traitées de façon identique avant ensemencement. 10 Les cultures sont incubées à 30°C. La croissance des colonies est suivie pendant 7 jours. Le Tableau 2 ci-après résume les constatations faites aux 3ème et 7ème jours de culture. Milieu D Milieu J : Milieu D + charbon Milieu K : Milieu D + sang Milieu L : Milieu D + extrait de levure 3eme jour : Nombre de souches démontra nt une 19 13 (65 ne) (95 %) croissance 7`m` jour : Nombre de souches démontrant une 11 9 17 20 (55 %) (45 %) (85 %) (100 %) croissance Milieu M : Milieu D Milieu N : Milieu D + caséine Milieu 0 : Milieu D Milieu P : Milieu D + peptone Milieu Q : Milieu D Milieu R : Milieu D + ot-cétoglut. + pyruvate + amarante + jaune d'ceuf 9 3 13 0 2 (45 %) (15 %) (65 %) (10 %) 14 19 17 19 17 19 (70 %) (95 %) (85 %) (95 %) (85 %) (95%) Milieu S : Milieu D + ARN Milieu T : Milieu D Milieu U : Milieu D Milieu V : Milieu D + polyoxy. st. + tyloxapol + jaune d'oeuf + charbon 1 1 (5 ne) (5 ne) 17 18 15 18 (85 %) (90 %) (75 %) (90 %) Tableau 2 15 3032448 16 3/ - Evaluation de l'effet de différents agents sélectifs à l'égard des mycobactéries Sur la base de la formulation du Milieu L précédemment développée et testée, les effets de différents agents sélectifs ont été évalués pour leur niveau de sélectivité à l'égard des mycobactéries : amphotéricine B (un antifongique), acide nalidixique, vancomycine, 5 méthanesulfonate de colistine, C-390 (BIOSYNTH, Suisse), fosfomycine et vert malachite, à différentes concentrations. Le tableau 3 ci-après résume les résultats de cette évaluation, réalisée sur les 20 souches de mycobactérie utilisées dans les tests précédemment décrits, et sur 95 souches de microorganismes n'appartenant pas au genre Mycobacterium, après 7 jours d'incubation. 10 Parmi les 95 souches évoquées, on compte : - 50 souches de Pseudomonas aeruginosa, - 10 autres souches de bactéries non-fermentaires : - 1 souche d' Achromobacter xylosoxidans, - 1 souche d' Acinetobacter sp., 15 - 1 souche de Burkholderia multivorans, - 1 souche de Burkholderia cenocepacia, - 1 souche de Burkholderia cepacia, - 1 souche de Burkholderia contaminans, - 1 souche de Pandoraea apista, 20 - 1 souche de Pandoraea pnomenusa, - 2 souches de Stenotrophomonas maltophilia - 7 souches d' entérobactéries : - 1 souche d'Escherichia coh, - 1 souche de Klebsiella pneumoniae, 25 - 1 souche de Providentia rettgeri, - 1 souche d'Enterobacter cloacae, - 1 souche d'Enterobacter aerogenes, - 1 souche de Serratia marcescens, - 1 souche de Citrobacter freundii, 30 - 10 souches d'espèces de bactérie à Gram positif : - 2 souches de Staphylococcus aureus, 3032448 17 - 1 souche de Staphylococcus epidermidis, - 1 souche de Streptococcus pyogenes, - 1 souche de Streptococcus pneumoniae, - 1 souche de Streptococcus salivarius, 5 - 1 souche de Streptococcus gordonii, - 1 souche d'Enterocoecus faecium, - 1 souche d'Enterocoecus faecalis, et - 1 souche de Bacillus subtilis. - 8 souches de champignons/levures : 10 - 1 souche de Candida albicans, - 1 souche de Candida glabrata, - 2 souches d'Aspergillus fumigatus, - 1 souche d'Aspergillus terreus, - 1 souche de Scedosporium apiospermum, 15 - 1 souche de Scedosporium prolificans, - 1 souche de Rasamsonia (Geosmithia) argillacea. Dans ce Tableau 3, les résultats sont présentés en nombre et en pourcentage de souches ayant démontré une croissance sur le milieu considéré après 7 jours de culture. Les 20 mentions NS et NT signifient respectivement « non significatif» (inhibition de bactéries par l'amphotéricine B) et « non testé » (action des antibactériens sur les levures et champignons). 5 3032448 18 Milieu L Milieu L Milieu L + Amphotéricine B + Acide nalidixique 5 mg/L 10 mg/L 20 mg/L 16 mg/L 32 mg/L 64 mg/L Mycobactéries 20 20 20 20 20 20 20 Pseudomonas aeruginosa (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) Autres bactéries non- fermentaires 50 NA NA NA NA NA NA NA 50 43 (100%) Enterobactéries (100 ',) NA NA NA (100? ) (100') 10 Bactéries à Gram positif Champignons/Levures 10 NA 4 3 10 10 (100 %) (100%) NA (50%) (37,5 %) (100%) (100%) 0 7 6 4 0 7 (100%) (75%) (57 %) 8 (70 %) 10 9 (80 ?i,) NT (100%) (90%) NT 8 NT 35 (100%) Milieu L 10 mg/L Milieu L 32 mg/L Milieu L 128 mg/L + Vancomycine + méthanesulfonate de + C-390 2,5 mg/L 5,0 mg/L colistine 64 mg/L 32 mg/L 64 mg/L 128 mg/L 19 19 19 20 20 20 19 19 19 (95%) (95%) (95%) (100 %) (100 %) (100 %) (95%) (95%) (95%) 50 50 50 5 5 5 46 45 35 (100 %) (100%) ) (100 %) (10 %) (10 %) (10 %) (92%) (90 %) (70 %) 9 9 9 10 10 10 7 4 2 (90%) (90 %) (90 %) (100 %) (100 "5) (100 "5) (70 "5) (40 "5) (20 "5) 7 7 7 3 3 3 0 0 0 (100 %) (100 %) (100 %) (43 %) (43 %) (43%) 0 0 0 7 6 5 0 0 0 (70 %) (60%) (50 %) NT NT NT NT NT NT NT NT NT Milieu L Milieu L + Fosfomycine + Vert de malachite 400 mg/L 800 mg/L 1600 mg/L 0,125 mg/L 0,25 mg/L 0,5 mg/L 20 20 20 16 20 20 (100%) (100%) (100%) (80 %) (100 %) (100 %) 15 8 6 50 50 50 (30%) (16%) (12%) (100%) (100 ?.,.) (100 %) 6 6 5 10 10 10 (60 %) (60 %) (50 %) (100%) (100%) (100 %) 3 2 2 7 7 7 (43 %) (29 %) (29 %) (100 %) (100 "5) (100 %) 0 0 0 10 10 9 (100 %) (100°6) (90%) NT NT NT NT NT NT Tableau 3 3032448 19 4/ - Optimisation des milieux sélectifs pour mycobactéries selon l'invention Au vu des données précédentes, deux nouveaux milieux de culture sélectifs, notés Milieu W et Milieu X, ont été mis au point. Ces milieux ont été développés à partir de la composition du Milieu L, un milieu de culture enrichi tel que précédemment décrit, à laquelle 5 une combinaison particulière d'agents sélectifs a été ajoutée. La composition desdits milieux sélectifs est résumée comme suit : - Milieu W : Milieu L + méthanesulfonate de colistine (32 mg/L) + fosfomycine (400 mg/L) + glucose-6-phosphate (25 mg/L) + Amphotéricine B (5 mg/L) 10 - Milieu X : Milieu L + méthanesulfonate de colistine (32 mg/L) + fosfomycine (400 mg/L) + glucose-6-phosphate (25 mg/L) + Amphotéricine B (5 mg/L) + C-390 (32 mg/L). 15 Ces deux milieux ont été testés sur 188 souches de microorganismes : - 98 souches de mycobactéries non-tuberculeuses : - 52 souches de Mycobacterium abscessus, - 3 souches de Mycobacterium bolletii, - 34 souches de Mycobacterium chelonae, 20 - 1 souche de Mycobacterium immunogenum, - 6 souches de Mycobacterium massiliense, - 2 souches de Mycobacterium salmoniphilum, - 94 souches de microorganismes n'appartenant pas au genre Mycobacterium : - 54 souches de Pseudomonas aeruginosa, 25 - 15 autres souches de bactéries non-fermentaires : - 1 souche d'Achromobacter spl , - 1 souche d'Achromobacter xylosoxidans, - 1 souche d'Acinetobacter sp., - 1 souche d'Acinetobacter baumannii, 30 - 1 souche de Burkholderia cepacia, - 1 souche de Burkholderia contaminons, 3032448 20 - 1 souche de Burkholderia multivorans, - 1 souche de Burkholderia stabilis, - 1 souche d'Ehzabethkingia miricola, - 1 souche de Pandoraea apista, 5 - 1 souche de Pandoraea pnomenusa, - 4 souches de Stenotrophomonas maltophilia - 7 souches d'entérobactéries (les mêmes que celles précédemment citées), - 10 souches de bactéries à Gram positif (les mêmes que celles précédemment citées), 10 - 8 souches de champignons/levures (les mêmes que celles précédemment citées). Dans ce Tableau 4, les résultats sont présentés en nombre et en pourcentage de souches ayant démontré une croissance sur le milieu considéré et après 7 jours de culture. Milieu L Milieu W : Milieu L Milieu X : Milieu L + méthanesulfonate de + méthanesulfonate de colistine (32 mg/L) + fosfomycine (400 mg/L) + G6P (25 mg/L) + Amp B (5 mg/L) colistine (32 mg/L) + fosfomycine (400 mg/L) + G6P (25 mg/L) + Amp B (5 mg/L) + C-390 (32 mg/L) M. abscessus (52) 52 52 51 M. boletti (3) 3 3 3 M. chelonae (34) 34 34 34 M. immonogenum (1) 1 1 1 M. massiliense (6) 6 6 6 M. salmoniphilum (2) 2 2 2 Total mycobactéries (98) : 98 (100 %) 98 (100 %) 97 (99 %) P. aeruginosa (54) 54 0 Autres bactéries non- fermentaires (15) 14 9 6 Enterobactéries (7) 7 2 Bactéries à Gram positif (10) 10 0 Champignons/Levures (8) 8 3 Total non-mycobactéries (94) : 93 (99 %) 14 (15 %) 6 (6 %) Tableau 4 5/ - Validation de la composition du Milieu X pour la culture et la sélection de Mycobacterium tuberculosis 15 3032448 21 Sur la base de la composition du Milieu X précédent, un milieu de culture sélectif liquide, a été formulé. Ce Milieu X liquide (sans agar) a été testé pour la détection de mycobactéries, en particulier de Mycobacterium tuberculosis, dans le cadre d'une analyse d'échantillons de crachat provenant de 32 patients non atteints de mucoviscidose, et de 56 5 patients atteints de mucoviscidose. Pour ce faire, le système de détection microbienne automatisé BacT/ALERT® 3D (bioMérieux, France) a été utilisé. Des flacons contenant le Milieu X liquide (ou Bouillon X) ont été incubés dans l'automate de détection pendant au moins 28 jours, et comparé au réactif BacT/ALERT® MP classiquement préconisé pour la détection de 10 mycobactéries. La composition de la ce réactif correspond schématiquement à un milieu Middlebrook 7H9 supplémenté d'acide oléique, de glycérol, de sérum albumine bovine, d'amarante et d'un cocktail d'antibiotiques (amphotéricine B, azlocilline, acide nalidixique, polymyxine B, triméthoprime et vancomycine). 15 Par un examen au microscope et une coloration à l'auramine, la présence de bacilles acido-alcoolo-résistants a été mise en évidence dans les 32 échantillons de crachat collectés auprès des patients non atteints de mucoviscidose. Préalablement à leur inoculation dans les flacons BacT/ALERT®, renfermant soit le bouillon BacT/ALERT MP soit le Bouillon X, ces 32 échantillons ont été traités à la soude afin d'éliminer des espèces non 20 mycobactériennes présentes dans les échantillons, ou au moins d'en réduire la viabilité, conformément aux méthodes standards britanniques. 64 flacons BacT/ALERT® ont ainsi été préparés puis mis à incuber à 35°C dans un automate BacT/ALERT®. S'agissant des 56 échantillons collectés auprès des patients atteints de mucoviscidose, ceux-ci ont été soumis à deux protocoles de décontamination distincts, un 25 traitement à l'acide et un traitement à la soude, conformes aux méthodes standards britanniques, avant leur ensemencement dans les flacons de BacT/ALERT . 224 flacons ont ainsi été préparés : - 56 flacons contenant le bouillon BacT/ALERT® MP, dans lequel est ensemencé un échantillon préalablement traité à l'acide, 3032448 22 - 56 flacons contenant le bouillon BacT/ALERT MP, dans lequel est ensemencé un échantillon préalablement traité à la soude, - 56 flacons contenant le Bouillon X, dans lequel est ensemencé un échantillon préalablement traité à l'acide, 5 - 56 flacons contenant le Bouillon X, dans lequel est ensemencé un échantillon préalablement traité à la soude. Les résultats de ces différentes cultures sont résumés dans les Tableaux 5, 6 et 7, ci-après. 10 Les Tableaux 5 et 6 renseignent sur la nature des mycobactéries identifiées dans les échantillons (collectés respectivement auprès des patients non atteints de mucoviscidose et auprès des patients atteints de mucoviscidose), et le nombre de flacons dans lesquels elles ont été détectées. Le Tableau 7 présente les temps moyens de détection (en jours) pour chacune 15 des espèces de mycobactéries détectées et identifiées, en fonction du milieu de culture utilisé. Echantillons issus de patients non-atteints de mucoviscidose Bouillon X BacT/ALERT® MP Résultats combinés M. tuberculosis 18 18 18 M. avium 9 9 10 M. intracellulare 2 2 2 M. malmoense 2 2 2 Nombre total de souches 31 31 32 Sensibilité 97 % 97 % Nombre de flacons 0 0 0 contaminés par une flore non-mycobactérienne Tableau 5 3032448 23 Echantillons issus de patients atteints de mucoviscidose Bouillon X BacT/ALERT® MP Résultats combinés M. abscessus 6 3 6 M. avium 1 0 1 Nombre total de souches 7 3 7 Sensibilité 100 % 43 % Nombre de flacons 7 / 112 33 / 112 contaminés par une flore (6,25 %) (29,5 %) non-mycobactérienne Tableau 6 Bouillon X Ba cT/ALE RT® MP M. tuberculosis 14,8 10,8 M. avium 13,1 10,8 M. intracellulare 7,9 6,2 M. malmoense 18,6 15,7 M. abscessus 4,2 5 Tableau 7 Au total, 39 isolats de mycobactéries ont été récupérés à partir des 88 prélèvements initiaux. 34 isolats ont été récupérés au moyen des flacons de réactif 10 « standards » BacT/ALERT MP (soit une sensibilité de 87%), contre 38 avec les flacons de Bouillon X selon l'invention (soit une sensibilité de 97%). Ces données montrent que le milieu sélectif proposé par la présente invention est relativement efficace pour la culture, l'enrichissement et l'isolement des mycobactéries. 15 6/ - Préparation et validation d'un milieu sélectif selon l'invention, Milieu Y a) Composition et préparation du Milieu Y La composition du Milieu Y est la suivante (pour environ 1 600 mL de composition) : - amidon de pomme de terre (30 g), 20 - asparagine (3,6 g), 5 3032448 24 - phosphate monopotassique (2,4 g), - citrate de magnésium (0,6 g), - sulfate de magnésium (0,24 g), - homogénat d'oeufs entiers (1 L), 5 - glycérol (12 mL), et - C-390 (51,2 mg). Cette composition correspond à celle d'un milieu Lôwenstein-Jensen, à laquelle du C-390 y est ajouté, pour obtenir concentration finale de 32 mg/L. A partir de celle-ci, le Milieu Y est préparé en suivant un procédé identique à celle d'un milieu 10 Lôwenstein-Jensen (cf. Handbook of Mierobiological Media, Ronald M. Atlas, 4ème Edition, 2010). b) Evaluation sommaire de la fertilité et de sélectivité du Milieu Y à l'égard des mycobactéries 15 Le Milieu Y, formulé en tubes inclinés, a été testé pour la culture de diverses souches bactériennes : - 1 souche de Myeobacterium fortuitum (inoculum calibré à 0,5 McFarland et dilué au 1/10000), - 4 souches de Staphylococcus aureus (inocula calibrés à 0,5 McFarland et dilués au 20 1/100), et - 3 souches de Pseudomonas aeruginosa (inocula calibrés à 0,5 McFarland et dilués au 1/100). La croissance de ces souches, incubées à 37°C, a été suivie jour après jour. Les résultats obtenus, présentés en pourcentages de recouvrement de la pente, sont compilés dans 25 le Tableau 8 ci-après. Les résultats de ces premiers tests concordent relativement bien avec les résultats constatés avec le Milieu X, formulé sur la base d'une composition Middlebrook, à savoir : une bonne croissance de la souche mycobactérienne, une inhibition totale des souches de S. aureus, et une inhibition partielle avec une sélectivité différentielle à l'égard des souches 30 de P. aeruginosa. 3032448 25 Jour 1 Croissance (% recouvrement de la pente) Jour 8 Jour 4 Jour 5 Jour 6 Jour 7 M. fortuitum (ATCC 6841-4) 0 60 80 80 80 80 S. aureus (ATCC 25923) 0 0 0 0 0 0 S. aureus (ATCC 43300) 0 0 0 0 0 0 S. aureus (NCTC 12493) 0 0 0 0 0 0 S. aureus (1108 078) 0 0 0 0 0 0 P. aeruginosa (ATCC 27853) 98 98 98 98 98 98 P. aeruginosa (08 06 075) 0 2 2 2 5 20 P. aeruginosa (08 06 058) 25 25 25 25 Tableau 8 Le Milieu Y, formulé en tubes inclinés, a également été testé pour la culture de 5 souches mycobactériennes à croissance lente : - 1 souche de Mycobacterium tuberculosis, - 1 souche de Mycobacterium bovis, et - 1 souche de Mycobacterium gordonae. Ces tests ont été réalisés avec des inocula calibrés à 0,5 McFarland et dilués au 10 1/10 000. Les résultats obtenus, présentés en pourcentages de recouvrement de la pente sont compilés dans le Tableau 9 ci-après, et comparés à ceux d'une culture sur le milieu Lôwenstein-Jensen. Croissance (% recouvrement de la pente) M. tuberculosis (ATCC 25177) M. bovis (14-510617-01) M. gordonae (14-233192-01) Lôw.-Jen. Milieu Y Lôw.-Jen. Milieu Y Lôw.-Jen. Milieu Y Jour 7 5 5 0 0 0 0 Jour 12 30 10 0 0 5 0 Jour 19 50 50 5 5 60 80 Jour 26 55 70 10 20 60 80 Jour 40 60 80 50 95 70 80 Tableau 9 15 REVENDICATIONS1) Procédé d'enrichissement et de culture sélective de mycobactéries contenues dans un échantillon biologique, dans lequel on ensemence tout ou partie dudit échantillon dans/sur un milieu de culture comprenant une composante nutritive propice au développement et à la croissance de mycobactéries, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend également de l'hydrochlorure de 9-chlo ro -9-(4 ' -di éthy lamino)phény1-9,10-dihydro-10-phenylacridine (ou C-390), à titre d'agent sélectif. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en C-390 dudit milieu de culture est comprise entre 2 mg/L et 1000 mg/L. 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend au moins un agent sélectif additionnel choisi parmi : l'amphotéricine B, l'acide nalidixique, la vancomycine, le méthanesulfonate de colistine, la fosfomycine et le vert de malachite. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend à titre d'agents sélectifs additionnels : - l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L ; - le méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L ; - la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2000 mg/L. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend également, en complément de la fosfomycine, du glucose-6-phosphate, à une concentration comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu de culture choisi parmi : 3032448 27 - un milieu de culture Middlebrook, - un milieu Columbia, - un milieu BCSA. 5 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu Middlebrook, complémentée avec : - du glycérol, - un supplément OADC, 10 - un ou plusieurs nutriments choisis parmi : le sang frais, un extrait de levure, l'alpha- cétoglutarate, la caséine, le pyruvate, des peptones, l'amarante, le jaune d'oeuf, de l'ARN, le polyoxyéthylène stéarate, le tyloxapol. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit milieu de culture 15 comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu Middlebrook, complémentée avec : - du glycérol, à une concentration comprise entre 2 mL/L et 20 mL/L, - un supplément OADC, à une concentration comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et - un extrait de levure, à une concentration comprise entre 0,1 g/L et 20 g/L. 20 9) Milieu de culture comprenant une composante nutritive propice au développement et à la croissance de mycobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend également de l' hydro chlorure de 9-chlo ro -9-(4 ' -di éthy lamino)phény1-9,10-dihydro -10- phenylacridine (ou C-390), à titre d'agent sélectif, à une concentration comprise entre 2 mg/L 25 et 1000 mg/L. 10) Milieu de culture selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est exempt de cristal violet. 30 11) Milieu de culture selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent sélectif additionnel choisi parmi l'amphotéricine B, l'acide nalidixique, la vancomycine, le méthanesulfonate de colistine et la fosfomycine. 3032448 28 12) Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend à titre d'agents sélectifs additionnels : - l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L ; 5 - le méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L ; - la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2000 mg/L, et du glucose-6-phosphate, à une concentration comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L. 10 13) Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une composante nutritive reprenant celle d'un milieu de culture choisi parmi : - un milieu Middlebrook, - un milieu Columbia, 15 - un milieu BCSA. 14) Milieu de culture selon la revendication 9, comprenant une composante nutritive consistant en milieu Middlebrook 7H9, complémenté avec : - du glycérol, à une concentration comprise entre 2 mL/L et 20 mL/L, 20 - un supplément OADC, à une concentration comprise entre 50 mL/L et 200 mL/L, et - un extrait de levure, à une concentration comprise entre 0,1 g/L et 20 g/L ; et comprenant, à titre d'agents sélectifs : - du C-390, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 1 000 mg/L - de l'amphotéricine B, à une concentration comprise entre 2 mg/L et 50 mg/L, 25 - du méthanesulfonate de colistine, à une concentration comprise entre 15 mg/L et 150 mg/L, - de la fosfomycine, à une concentration comprise entre 200 mg/L et 2000 mg/L, accompagnée de glucose-6-phosphate, à une concentration comprise entre 10 mg/L et 50 mg/L.