FR 3025802 A1 20160318 FR 1402077 A 20140916 1 DISPOSITIF BIOREACTEUR ANAEROBIE AVEC MODULE D'OBSERVATION ESCAMOTABLE. 1. Domaine de l'invention. L'invention se rapporte au domaine des équipements de culture et d'études de micro-organismes en milieux extrêmes et plus particulièrement à aux dispositifs bioréacteurs anaérobies. 2. Etat de l'art. La biosphère océanique profonde représente l'écosystème le plus vaste de notre planète. Elle se caractérise par des conditions physiques et chimiques extrêmes et notamment par des fortes pressions hydrostatiques. Des procaryotes, organismes unicellulaires dépourvus de noyau, de différents types métaboliques ont été isolés de différents types d'environnement, froids, tièdes et chauds. Très peu sont piézophiles, c'est-à-dire n'étant adaptés qu'à vivre en pression hyperbare, avec des très grands niveaux de pression, de l'ordre de plusieurs centaines de bars. Des organismes piézophiles appartiennent aux domaines du vivant Archaea et Bacteria. Parmi les soixante procaryotes piézophiles isolés à ce jour, plus de 88% sont des bactéries psychrophiles. Des travaux de recherche ont permis d'arriver à l'isolement de procaryotes piézophiles hyper/thermophiles. En 1999, a été isolée l'archée hyperthermophile piézophile Thermococcus barophilus. En 2002, c'est l'unique bactérie thermophile et piézophile Marinitoga piezophila qui a été obtenue en culture pure par une équipe de recherche et, enfin, en 2009, a été isolée la première et l'unique archée hyperthermophile piézophile stricte Pyrococcus yayanosii CH1. La présence des procaryotes piézophiles dans les environnements chauds et froids des fonds océaniques pose des questions relatives à leur métabolisme et à des physiologies particulières leur permettant de jouer un 3025802 2 rôle dans les cycles biogéochimiques des environnements océaniques profonds, leur processus d'évolution et d'adaptation, ainsi qu'aux mécanismes d'adaptation à la pression. 5 L'étude des mécanismes d'adaptation à la pression se fait sur les différents modèles hyper/thermophiles piézophiles. Leur manipulation est bien maitrisée par des laboratoires de recherche spécialisés dans ce domaine. La culture est l'observation de ces organismes en laboratoire, 10 c'est-à-dire dans un environnement où la pression atmosphérique est bien en deçà de la pression propre au milieu d'origine, requiert des équipements spécifiques. Des bioréacteurs anaérobies sont utilisés pour la culture des micro-organismes. Les microorganismes prélevés dans des fonds sous- 15 marins peuvent être introduits sous pression dans le conteneur de ces bioréacteurs. Les micro-organismes sont ensuite extraits du bioréacteur à l'issue d'une phase de culture, aux fins d'être observés au moyen de dispositifs d'observation connus, tels que, par exemple un microscope électronique, un spectromètre ou encore des outils d'analyse biologique ou 20 de révélation d'éléments constituants. L'observation des micro-organismes après extraction implique toutefois aujourd'hui d'opérer à une pression environnante moindre que la pression du milieu d'origine ou encore de la pression à l'intérieur du 25 conteneur du bioréacteur utilisé pour la culture. Cet abaissement de la pression est préjudiciable aux microorganismes sans que l'on puisse déterminer précisément dans quelle mesure, le cas échéant. 30 Les solutions existantes présentent donc des inconvénients. 3025802 3 3. Résumé de l'invention. 5 L'invention permet d'améliorer l'état de l'art en proposant un dispositif bioréacteur comprenant un conteneur principal adapté à une culture de micro-organismes soumis à une première pression, le conteneur principal comprenant au moins une ouverture principale, ledit dispositif bioréacteur. Le conteneur principal du bioréacteur comprend en outre une première 10 ouverture secondaire et une seconde ouverture secondaire, et le bioréacteur comprend, entre la première ouverture secondaire et la seconde ouverture, une circuiterie comprenant une cellule d'observation adaptée à la circulation d'un contenu de microorganismes sous une lentille d'observation translucide, à une seconde pression sensiblement identique à la première pression, et au 15 moins deux éléments d'isolement adaptés à une séparation mécanique de la cellule d'observation de sorte que la cellule d'observation puisse être détachée du bioréacteur tout en contenant une partie des micro-organismes soumis à la seconde pression. 20 Selon un mode de réalisation de l'invention, le dispositif bioréacteur comprend un dispositif mélangeur adapté au mélange et/ou brassage des microorganismes. Avantageusement, le dispositif bioréacteur est un bioréacteur 25 anaérobie. Selon un mode de réalisation de l'invention, chacun des deux éléments d'isolement comprend au moins une vanne ainsi qu'au moins un dispositif mécanique fixation d'éléments de la circuiterie comprenant la 30 cellule d'observation. 302 5 802 4 Selon un mode de réalisation de l'invention, la cellule d'observation et la circuiterie du bioréacteur disposée entre les ouvertures secondaires sont adaptées à contenir une mélange de microorganisme sous une pression supérieure 1000 bars. 5 Selon un mode de réalisation de l'invention, la lentille de la cellule d'observation est constituée d'un verre traité pour supporter des pressions de plusieurs centaines de bars. 10 Avantageusement, la circuiterie est constituée d'un matériau inoxydable et/ou traité pour résister à une oxydation provenant des conditions intérieures au bioréacteur pendant la culture de micro-organismes prélevés dans des fonds marins et cultivés à une pression supérieure à plusieurs centaines de bars. 15 4. Liste des figures. L'invention sera mieux comprise, et d'autres particularités et 20 avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, la description faisant référence aux dessins annexés parmi lesquels : La figure 1 représente un bioréacteur anaérobie adapté à la culture de micro-organismes selon l'état de l'art. La figure 2 représente un bioréacteur anaérobie adapté à la culture et à l'observation de micro-organismes selon un mode particulier et non limitatif de l'invention. MM 25 30 5. Description détaillée de modes de réalisation de l'invention. 3025802 5 Sur les figures 1 à 2, les modules représentés sont des unités fonctionnelles, qui correspondent ou non à des unités physiquement distinguables. Par exemple, ces modules ou certains d'entre eux sont 5 regroupés dans un unique composant. A contrario, selon d'autres modes de réalisation, certains modules sont composés d'entités physiques séparées. La figure 1 représente un bioréacteur AB1 adapté à la culture de micro-organismes selon l'état de l'art. La culture de micro-organismes dans 10 ce type de bioréacteur est réalisée entre des opérations d'insertion sous pression, par une ouverture principale MI1 d'un conteneur principal R,1 et une extraction ultérieur de tout ou partie des micro-organismes cultivés, par la même ouverture MI1, notamment à des fins d'observation et en utilisant un ou plusieurs types de microscopes (microscopes électroniques, par 15 exemple). Un tel bioréacteur permet de cultiver les micro-organismes à une pression P1 de plusieurs dizaines de bars. Le mécanisme de verrouillage et de déverrouillage de l'ouverture MI1 est adapté à assurer une bonne étanchéité du conteneur R1 à ce niveau de pression. Le plus généralement, un tel bioréacteur comprend un dispositif de mixage et de brassage MIX1 , 20 mû par un moteur MOT1 associé. Les éventuelles parties mobiles traversant la cloison du conteneur R1 sont associées à des éléments garantissant le maintien de la pression P1 et la mobilité des pièces concernées (par exemple, des joints et/ou des paliers ou encore des coussinets sont utilisés autour d'un arbre tournant. Selon des variantes, d'autres types de systèmes 25 de brassage peuvent comprendre des éléments adaptés à un couplage magnétique de pièces tournantes dont l'une ou plusieurs peuvent être extérieures au conteneur R1 et l'une ou plusieurs autres peuvent êtres intérieures au conteneur R1. Des sondes PROB sont utilisées pour caractériser le milieu à 30 l'intérieur du conteneur R1, notamment et par exemple, la pression et la température. Avantageusement, un jeu de sondes peut comprendre un capteur d'hygrométrie ou encore un ou plusieurs capteurs sensibles à la 302 5 802 6 présence et/ou à la concentration de gaz émis par la culture des microorganismes. Les sondes PROB sont reliées à un dispositif extérieur de contrôle et de monitoring CTRL1. Un tel dispositif CTRL1 comprend usuellement un ou plusieurs indicateurs représentatifs de grandeurs 5 mesurées par les sondes PROB, parfois regroupés dans un module de monitoring MON1 du dispositif CTRL1. Selon des variantes, une unité de monitoring telle que l'unité MON1 peut être interne ou externe au dispositif de contrôle CTR1. On entend ici, par le terme « monitoring », un mise à disposition 10 d'informations utiles à la surveillance du milieu intérieur au conteneur R1, et notamment une pression et une température, ainsi que, par exemple, une présence et une concentration d'un ou plusieurs gaz susceptibles d'être générés par la culture des micro-organismes placés à l'intérieur du conteneur R1 du bioréacteur AB1. 15 La figure 2 représente un bioréacteur adapté à la culture et à l'observation de micro-organismes selon un mode particulier et non limitatif de l'invention. Le bioréacteur AB1 est architecturé de sorte qu'il comprend un 20 conteneur principal R1 similaire à celui du bioréacteur de la figure 1 (bioréacteur selon l'état de l'art), également équipé d'une ouverture principale MI1 et d'un dispositif de mixage et de brassage MIX1, ainsi que de sondes PROB reliées à un ou plusieurs dispositifs de contrôle et/ou de monitoring CTR1. Avantageusement, et selon un mode de réalisation 25 particulier et non limitatif de l'invention, le bioréacteur AB1 comprend en outre une circuiterie CIR1 comprenant une cellule d'observation VC1, entre deux ouvertures secondaires 511 et SI2 du conteneur principal R1. La circuiterie CIR1 comprend également au moins deux modules d'isolation (ou isolement) IS01 et ISO2 opérant comme des vannes et respectivement 30 disposés entre la première ouverture secondaire SI1 et la cellule d'observation VC1, d'une part, et la seconde ouverture secondaire S12 et la cellule d'observation VC1, d'autre part. Avantageusement, les éléments 3025802 7 d'isolation / isolement (modules) ISO1 et IS02 comprennent chacun, outre une vanne adaptée à garantir une étanchéité entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule d'observation VC1, des éléments de fixation et de verrouillage mécanique adaptés à permettre une séparation (et un couplage) mécanique 5 de la cellule de culture et d'observation VC1 du reste (ou avec le reste) de la circuiterie CIR1. On entend ici par isolation (ou isolement) une capacité à séparer mécaniquement la cellule de culture et d'observation VC1 du reste de la circuiterie CIR1 tout en maintenant le niveau de pression intérieure à la cellule à une pression P2 sensiblement identique à la pression P1 présente 10 dans le conteneur principale R1. Avantageusement, une isolation pneumatique et mécanique (donc une étanchéité de la cellule VC1 ainsi qu'une séparation mécanique par désaccouplement) permet l'observation à travers une lentille d'observation translucide VCL du contenu de la cellule VC1 du contenu de la cellule 15 soumis à une pression P2 sensiblement identique à la pression P1. Selon un mode de réalisation particulier et non limitatif de l'invention, des caractéristiques mécaniques de la cellule VC1 et de sa lentille VCL sont telles que l'observation des micro-organismes soumis à la pression P2 soit réalisable au moyen d'un microscope électronique. On entend ici par 20 pression P2 sensiblement identique à la pression P1 une pression éventuellement légèrement inférieure ou supérieure à la pression P1, du fait de variations liées à des pertes de charge ou à des gradients de température ou de concentration de micro-organismes en fonction de leur localisation précise au sein du conteneur principal R1 ou de la circuiterie CIR1. 25 Avantageusement, et grâce à l'utilisation du bioréacteur AB1 selon un mode de réalisation de l'invention, il est possible d'observer des microorganismes au cours d'une culture sous des pressions équivalentes à leur environnement d'origine et sans altération possible du fait de leur extraction du bioréacteur en vue d'une phase d'observation. En effet, les micro- 30 organismes peuvent être injectés dans le bioréacteur AB1 en conservant la pression de leur environnement d'origine (fonds sous-marins, par exemple) par le biais de l'ouverture principale MI1 du conteneur R1. 3025802 8 Selon un mode de réalisation particulier et non limitatif de l'invention, les éléments ISO1 et IS02 comprennent une ou plusieurs vannes d'étanchéités éventuellement assemblées en série et au moins un système de fixation par vis/écrou couplé à un ou plusieurs joints et susceptibles d'être 5 manoeuvrés manuellement ou au moyen d'un outil classique ou encore d'un outil spécifique. L'usage d'un outil spécifique permet de s'affranchir de manoeuvre accidentelle dès lors que l'outil est maintenu disponible uniquement pour un ou plusieurs utilisateurs habilités à agir sur la circuiterie CIR1 du bioréacteur AB1 et notamment aux fins de séparer la cellule VC1 10 d'observation. Ainsi et selon le mode de réalisation décrit, il est possible de détacher physiquement la cellule de culture et d'observation VC1 pour observer les micro-organismes contenus au moyen d'un microscope électronique et à travers la lentille translucide VCL. 15 La cellule VC1 est de fait un élément escamotable du bioréacteur AB1. Avantageusement, l'invention peut s'appliquer à différents types de bioréacteur et notamment un bioréacteur anaérobie. En d'autres termes, le bioréacteur AB1 comprend un conteneur 20 principal R1 adapté à une culture de micro-organismes soumis à la première pression P1. Son conteneur principal R1 comprend au moins une ouverture principale MI1. Le conteneur principal R1 comprend en outre au moins une première ouverture secondaire SI1 et une seconde ouverture secondaire SI2. 25 De plus, le bioréacteur AB1 comprend, entre la première ouverture secondaire SI1 et la seconde ouverture SI2 : - la circuiterie CIR comprenant la cellule d'observation VC1 adaptée à la circulation d'un contenu sous la lentille d'observation translucide (éventuellement transparente) VCL, à une seconde pression 30 P2 sensiblement identique à la première pression P1, - au moins les deux éléments d'isolement ISO1et IS02, lesquels sont adaptés à une séparation mécanique de la cellule 3025802 9 d'observation VC1 de sorte que cette cellule d'observation puisse être détachée du bioréacteur AB1 tout en contenant une partie des microorganismes soumis à la seconde pression P2 (à l'intérieur de la cellule). 5 L'invention ne se limite pas au seul mode de réalisation décrit ci- avant mais à tout dispositif de culture de micro-organismes sous pression, à une pression pouvant dépasser plusieurs dizaines de bars, comprenant une cellule d'observation escamotable adaptée à être détachée et à permettre le maintien de la pression de culture lors d'une observation au moyen d'un 10 dispositif d'observation distant du dispositif de culture sans dégradation des micro-organismes contenus du fait de leur déplacement utile à une observation au moyen du dispositif d'observation. REVENDICATIONS1. Dispositif bioréacteur (AB1) comprenant un conteneur principal (R1) adapté à une culture de micro-organismes soumis à une première pression P1, ledit conteneur principal (R1) comprenant au moins une ouverture principale (MI1), ledit dispositif bioréacteur (AB1) étant caractérisé en ce que : ledit conteneur principal (R1) comprend en outre: une première ouverture secondaire (SI1), une seconde ouverture secondaire (SI2), et en ce que ledit bioréacteur (AB1) comprend, entre ladite première ouverture secondaire (SI1) et ladite seconde ouverture (SI2), une circuiterie (CIR1) comprenant une cellule d'observation (VC1) adaptée à la circulation d'un contenu de micro-organismes sous une lentille d'observation transparente, à une seconde pression (P2) sensiblement identique à ladite première pression (P1), au moins deux éléments d'isolement (ISO1, IS02) adaptés à une séparation mécanique de ladite cellule d'observation (VC1) de sorte que ladite cellule d'observation (VC1) puisse être détachée dudit bioréacteur (AB1) tout en contenant une partie desdits micro- organismes soumis à ladite seconde pression (P2). 2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif mélangeur (MIX1). 3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que ledit bioréacteur (AB1) est un bioréacteur anaérobie. 3025802 11 4. Dispositif selon l'une quelconques des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que chacun desdits deux éléments d'isolement (ISO1, IS02) comprend au moins une vanne (V1, V2) ainsi qu'au moins un dispositif mécanique (M1, M2) de fixation d'éléments de ladite circuiterie (CIR1). 5 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite circuiterie (CIR 1) est adaptée à contenir une mélange sous une pression (P2) supérieure 1000 bars. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite lentille est constituée d'un matériau d'un verre 10 traité pour résister à des pressions de plusieurs centaines de bars. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite circuiterie (CIR1) est constituée d'un matériau inoxydable.