FR 3025796 A1 20160318 FR 1458551 A 20140911 0 2 5 7 9 6 1 La présente invention concerne des conjugués glucidiques fluorescents, leurs procédés de préparation, et leur utilisation notamment pour le criblage à haut-débit sur microplaque des interactions glucide-protéine par fluorescence et pour étudier les interactions sucre-récepteur protéique. Comparativement aux autres biomolécules, les glycothérapies constituent un champ d'investigation et de recherche qui mérite d'être exploité beaucoup plus largement. Il existe donc un intérêt incontestable vers le développement de molécules glucidiques à visée thérapeutique qui sont actuellement sous-exploitées et possèdent des champs d'application importants. Sont ciblées plus spécifiquement notamment les composés glucidiques qui trouvent un vaste champ d'application en recherche biomédicale (substrats, inhibiteurs d'enzymes, ligands de récepteur) dans les domaines de la diabétologie, de la médecine régénératrice (en particulier les pathologies rhumatismales d'origine dégénérative), de l'infectiologie (antibiotique, antibactérien, antifongique), du diabète ou encore celui de la cosmétologie. Les molécules glucidiques sont en effet dotées d'une large variété de propriétés biologiques et pharmacologiques. A titre d'exemple, l'héparine (glycosaminoglycane sulfaté) à propriété anticoagulante représente un marché mondial estimé à près de 4 milliards d'euros en 2010. Cependant, l'exploitation thérapeutique des molécules de structure glucidique reste actuellement limitée en raison du manque de tests simples et rapides d'évaluation de leur activité biologique. L'étude d'enzymes à substrats glycosidiques a conduit à l'élaboration de techniques basées sur la fluorescence pouvant être adaptées à la mise au point de criblage à haut-débit sur microplaque du fait de la sensibilité à la détection. Ainsi, pour l'étude de certaines glycosidases, de nombreux substrats chromogéniques sont aujourd'hui élaborés et commercialisés par des sociétés biotechnologiques (Invitrogen®). Dans l'étude cinétique des glycosyltransférases, un kit de détection par fluorescence des nucléosides biphosphates (coproduits lors de la réaction enzymatique) est commercialisé par la société R&DSystem®. Dans un autre contexte, deux analogues fluorescents du glucose, le 2-NBDG et le 6-NBDG, reconnus par certains 3025796 2 transporteurs protéiques spécifique du glucose ont largement été exploités dans l'étude de l'assimilation du glucose par les cellules, mais ont vu leur utilisation détournée dans le cadre de la mise au point d'un protocole de criblage (Jung D.-W. E et al., (2011) Mol. BioSyst. 7, 346-358). Ensemble, 5 ces exemples montrent la difficulté de mettre au point un procédé de criblage pouvant être appliqué à un plus large panel de couples ligands glycosidiques/récepteurs. Pour pallier à ce manque, les utilisateurs doivent systématiquement mettre en place des systèmes de criblage spécifiquement adaptés aux protéines/enzymes sur lesquelles ils travaillent. 10 La demande WO 94/2842 décrit des composés obtenus par réaction de saccharides modifiés de la forme oligo-CH2-NHR' avec de l'anhydride isatoïque où l'azote peut porter un groupe méthyle. Ces composés sont utilisés dans des procédés de séparation par électrophorèse. Toutefois, le procédé décrit dans ce document consiste à dériver l'extrémité réductrice du 15 sucre à marquer de façon à obtenir un intermédiaire de type hydrazone puis hydrazine de façon à ce qu'elle puisse par la suite réagir avec l'anhydride d'acide isatoïque (ou l'un de ses dérivés). Cette stratégie implique l'ouverture du cycle du sucre à marquer passant de la forme hémi-acétal à la forme aldéhyde sous laquelle il réagit, rendant alors ce dernier inapte pour des 20 expériences nécessitant son interaction avec une éventuelle protéine-cible. Adaptée pour le suivi par fluorescence de la séparation des oligosaccharides (sur gel d'électrophorèse par exemple), cette technique reste donc trop invasive vis-à-vis de la structure du sucre marqué par ces méthodes et n'est donc pas adaptée pour des études impliquant leur interaction avec des 25 protéines cibles. Dans l'article proposé par Niranjan et al. "Analysis of steady-state Fôrster resonance energy transfer data by avoiding pitfalls: interaction of JAK2 tyrosine kinase with N-methylanthraniloyl nucleotides". Anal Biochem. 15 nov 2013;442(2):213-222, la fluorescence d'une molécule d'adénosine-5'- 30 triphosphate (ATP) marqué par le groupement N-méthyl-anthraniloyl- (MANT) est utilisée dans le cadre du suivi de son interaction avec une protéine nommée JAK2 appartenant à la famille des Janus kinases au 3025796 3 moyen de la technique de FRET. Les auteurs montrent qu'il est possible d'estimer avec précision l'affinité de ce conjugué pour JAK2. Cependant, il est à préciser que le conjugué utilisé pour ces expériences consiste dans les faits en un mélange d'ATP marqué par le MANT en position 2' et 3' du ribose. 5 Or, l'article de Suryanarayana et al. "Distinct interactions of 2'- and 3'-O-(N- methyl)anthraniloyl-isomers of ATP and GTP with the adenylyl cyclase toxin of Bacillus anthracis, edema factor. Biochem Pharmacol. 1 août 2009;78(3):224-230" démontre que la position du ribose sur laquelle est greffé le MANT influence l'affinité de la protéine-cible (ici le facteur 10 oedematogène de la toxine de l'anthrax) vis-à-vis de l'ATP ou du GTP marqué par le MANT, mais également le comportement spectroscopique du conjugué fluorescent. Ainsi, la constante d'affinité (Kd) observée par Niranjan et al., traduit sans doute une affinité moyenne de JAK2 vis-à-vis du mélange d'ATP marqué en 2' et 3' du ribose par le MANT. En effet, il n'est pas 15 possible de distinguer lequel du conjugué marqué en 2' ou 3' est le principal contributeur dans le suivi de cette interaction des ATP-MANT avec JAK2, dans la mesure où : i) le pourcentage relatif d'ATP-MANT marqué en 2' du ribose par rapport à celui marqué en 3' n'est pas précisé ii) l'affinité de JAK2 vis-à-vis de l'ATP-MANT marqué en 2' du ribose et celui marqué en 3' n'est 20 pas connu iii) le comportement spectroscopique de l'ATP-MANT marqué en 2' du ribose et celui marqué en 3' en présence de la protéine JAK2 n'est également pas connu. Ces problèmes proviennent de la réactivité des groupements -OH en position 2' et 3' du ribose vis-à-vis du MAN. Ceci montre qu'il n'existe pas de méthodes simplifiées pour l'étude des 25 propriétés des protéines (enzymes, récepteurs, lectines...) interagissant avec des sucres. L'objet de la présente invention est de proposer une méthodologie simple, rapide et peu coûteuse de criblage basé sur la fluorescence applicable aux molécules saccharidiques d'intérêt biomédical. 30 A cet effet, et conformément à la présente invention, il est proposé de nouveaux conjugués fluorescent de formule (I) 3025796 4 CG - (I) où CG est un composé glucidique choisi parmi les résidus d'oses, les oligosides (comprenant de 2 à 10 oses) et les polyosides (comprenant 5 plus de 10 oses) comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique, substitué ou non, L est un unique groupement greffé sur une seule position de marquage dudit ose et est choisi parmi -O-NH-, -0-(CH2)nNH-, -0-(CH2)nS-, où n est un entier égal à 1 ou 2, un groupement dérivé d'une glycosylamine, un 10 groupement dérivé d'un thioglycoside, l'atome d'azote ou de soufre étant lié au carbone carboxylique du groupement anthraniloyle, R est H, CH3, R' occupe les 4 positions libres du cycle benzénique du groupement anthraniloyle et est choisi indépendamment parmi H, CH3, -CH-(CH3)2, F, 15 Cl, Br. CG est donc un composé glucidique comprenant au moins un résidu d'ose issu d'un ose sous forme hémi-acétal et qui a conservé sa forme cyclique, préservant sa structure de base fermée. CG ne comprend pas de base azotée, ni de chaine phosphate. Ainsi, CG 20 n'est pas issu d'un nucléotide. De préférence, CG est choisi parmi un résidu d'ose, un diholoside, un triholoside comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique. Plus préférentiellement, CG est un résidu d'ose ou un diholoside comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique. 25 Ainsi, CG est choisi par exemple parmi un résidu de xylose, le maltose, le lactose comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique. Les positions libres du résidu d'ose peuvent être indépendamment non substituées portant H ou OH ou substituées par un groupement choisi parmi 3025796 5 -O-PO3Na2, -O-SO3Na, -0-00-CH3, -N-CO-CH3, -NH2, -CH3, -CH2-CH3, -F, Cl, -Br, -SH. De préférence, L est choisi parmi -0-NH-, -O-(CH2)2NH-, -O-(CH2)2S-, un groupement dérivé d'une glycosylamine, un groupement dérivé d'un 5 thioglycoside, l'atome d'azote ou de soufre étant lié au carbone carboxylique du groupement anthraniloyle. D'une manière particulièrement avantageuse, L est -O-(CH2)2NH- ou -0- (CH2)2S-. L peut être greffé sur n'importe quelle position libre du résidu d'ose selon les 10 techniques de greffage connues de l'homme du métier, mais de préférence, L est greffé en position 1 anomère du résidu d'ose. Pour le groupement anthraniloyle, R est de préférence H et les 4 positions R' sont occupées par un atome H ou R est de préférence CH3 et les 4 positions R' sont occupées par un atome H. 15 Un conjugué préféré de l'invention est celui pour lequel CG est un résidu d'ose ou un diholoside comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique, L est -0-NH- ou -O-CH2-CH2-NH- greffé en position 1 anomère du résidu d'ose et R' est H et R est CH3. Ainsi, un composé (A) de l'invention, issu du xylose et d'un précurseur du 20 groupement L de type éthanolamine, est OH (A) 25 Un autre composé (A') de l'invention, issu du xylose et d'un précurseur du groupement L de type hydroxylamine, est 3025796 6 (A') Un autre composé (B) de l'invention, issu du maltose et d'un précurseur du groupement L de type éthanolamine, est OH OH (B) 5 10 Un autre composé (C) de l'invention, issu du lactose et d'un précurseur du groupement L de type éthanolamine, est La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un conjugué fluorescent de formule (I) tel que défini ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes de : 15 - préparation d'un composé glucidique activé CG-LH à partir d'un composé glucidique CG complet et d'un précurseur du groupement L, OH HO OH 3025796 7 - marquage du composé glucidique activé CG-LH par réaction avec un composé de formule (II) pour obtenir le conjugué fluorescent de formule (I), 5 CG, L, R, R' étant tels que définis ci-dessus. Plus spécifiquement, l'étape de préparation du composé glucidique activé CG-LH comprend les étapes de : - activation de la position de marquage d'un composé glucidique CG complet, ladite position de marquage étant de préférence la position 10 1 anomère de l'ose complet sous forme cyclique ou hémi-acétal, - greffage chimique sur la position de marquage activée du groupement L, - éventuellement substitution d'une ou plusieurs positions libres de l'ose, 15 - éventuellement lyophilisation du composé glucidique activé CG-LH obtenu. Avantageusement, l'extrémité réductrice de l'ose complet est libre. CG sera « activé » le plus souvent en position 1, au niveau de l'extrémité réductrice de la molécule. « Activer » signifie accroître la réactivité de la 20 position 1 du composé glucidique vis-à-vis de l'anhydride d'acide N-méthyl- isatoïque ou de l'anhydride d'acide isatoïque. Cette étape d'activation nécessite le greffage chimique de L sur le composé glucidique, de préférence à la position 1. Cette étape de préparation du composé glucidique activé CG-LH est 25 résumée dans le schéma I ci-dessous appliqué à un résidu xylose activé en position 1, le précurseur de L étant l'éthanolamine : 302 5 796 8 D-Xylose a 0 Ac0 HO Ac0 HOHO Oy.CC13 NH Ac0 0 d R4 R3 R2 R2 R2 = OH, H, OPO3Na,, etc R3, R4 = OH, H, etc Schéma 1 Le greffage de L démarre par une série d'étapes de protection des oxygènes 5 en position 2, 3 et 4 du xylose par des groupements acétyles puis d'activation de l'atome d'oxygène en position 1 du xylose par du trichloroacétonitrile (a). Le greffage de L se fait ensuite par réaction du composé formé avec l'éthanolamine protégé sur l'amine primaire par un groupement carbobenzoxy (Z) (b). 10 La nature du groupement L (longueur et groupement réactif) peut-être adaptée suivant les besoins de l'utilisateur. De préférence, le précurseur du groupement L est choisi parmi les composés HO-NH2, HO-(CH2)n-NH2, HO-(CH2)n-SH, une glycosylamine , un thioglycoside. 15 Le choix d'un précurseur court (HO-NH2) ou long (HO-(CH2)2-NH2, HO- (CH2)2-SH) dépendra de la technologie de criblage par fluorescence employée par l'utilisateur (FRET, intensité de fluorescence ou encore anisotropie de fluorescence). En fonction des besoins de l'utilisateur, la partie glucidique du conjugué 20 pourra être modifiée à l'étape (c). Des molécules glucidiques « activées » et substituées par différents groupements à certaines positions pourront ainsi être proposées. Par exemple, une molécule de D-xylose « activée » en position 1 par un précurseur de L de type éthanolamine peut être substituée en position 2 par un groupement phosphate (Composé D) ou en position 4 25 par un fluor (Composé E). 3025796 9 cl NH2 Na2O3P (D) o NH2 (E) OH 5 L'« activation » du xylose se termine par l'élimination du groupement protecteur (d). Ces étapes seront réalisées au laboratoire. Le marquage sur d'autres positions du composé glucidique pourra être considéré « à façon » en fonction des demandes de l'utilisateur, de manière à ne pas interférer 10 avec l'activité biologique étudiée. Le composé glucidique activé CG-LH est ensuite utilisé pour la réaction de marquage avec le composé de formule (Il). Le composé de formule (Il) est disponible dans le commerce. Toutefois, d'une manière particulièrement avantageuse, le composé de 15 formule (Il) est préalablement purifié à un degré de pureté supérieur ou égal à 90%, de préférence 95%. Par exemple, lorsque le composé de formule (Il) est l'anhydride d'acide Nméthyl-isatoïque, il peut être repurifié pour assurant un contrôle sur le degré de pureté du réactif et permettre ainsi d'améliorer les conditions de la 20 réaction de marquage. Le procédé de repurification consiste par exemple en une double recristallisation du précurseur dans l'acétone. Ce procédé permet l'obtention d'un anhydride d'acide N-méthyl-isatoïque avec un degré de pureté supérieur à 95% caractérisé par une texture de type cristaux crème et une température de fusion comprise entre 166°C et 167°C. 25 Selon l'invention, l'étape de marquage du composé glucidique activé CG-LH par réaction avec le composé de formule (Il) comprend les étapes de : 3025796 10 - mélange du composé glucidique activé CG-LH en solution aqueuse, de préférence tamponnée, avec le composé de formule (II) dans un solvant organique adapté à l'étape de marquage, - agitation, 5 - concentration et séchage sous vide du conjugué fluorescent de formule (I). En possession du composé glucidique activé CG-LH, l'utilisateur réalise lui-même la réaction de marquage dudit composé glucidique avec le composé de formule (II), par exemple l'anhydride d'acide N-méthyl-isatoïque. La 10 réaction de marquage s'effectue sur la paillasse du laboratoire à température ambiante, en mélangeant une solution aqueuse du composé glucidique activé CG-LH avec une solution du composé de formule (II), par exemple l'anhydride d'acide N-méthyl-isatoïque, en léger excès molaire, concentrée dans un solvant organique en présence d'un tampon basique tel que 15 NaHCO3. Les opérations principales du marquage peuvent être schématisées comme indiqué ci-dessous dans le schéma 2 : R4 R4 R2 R2= -OH, -H, -OPD.-Na2, etc... R3, R4= -OH, -H, etc... Schéma 2 Le procédé selon l'invention permet d'utiliser le composé glucidique activé CG-LH directement, la réaction de marquage se faisant en une seule étape, sans étape de protection/déprotection du composé glucidique. La réaction se fait avec un très bon rendement (environ 82%). 20 302 5 796 11 La présente invention concerne également un kit pour criblage de composés glucidiques par fluorescence à partir d'un conjugué fluorescent de formule (I) tel que décrit ci-dessus, ledit kit comprenant : - au moins un composé glucidique activé CG-LH tel que défini ci- 5 dessus, de préférence sous forme lyophilisée, - un composé de formule (II) tel que défini ci-dessus, de préférence sous forme lyophilisée, - un solvant organique adapté à l'étape de marquage. La possibilité de stocker séparément un composé de formule (II) constituant 10 la sonde et le/les composé(s) glucidique(s) activé(s) permet une facilité d'usage, un stockage prolongé et de réserver la sonde pour d'autres marquages. La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés glucidiques par fluorescence utilisant un conjugué fluorescent de 15 formule (I) tel que défini ci-dessus. Ce procédé de criblage peut utiliser l'une des techniques choisies parmi le FRET, l'intensité de fluorescence et l'anisotropie de fluorescence. Un avantage de la présente invention réside d'abord dans la possibilité pour l'utilisateur de disposer séparément d'au moins un composé glucidique activé 20 CG-LH de son choix et du composé de formule (II) dérivé d'anhydride d'acide N-méthyl-isatoïque ou d'anhydride d'acide isatoïque. Ces produits peuvent avantageusement être proposés sous forme lyophilisée et peuvent être conservés à -20°C plusieurs mois sans risque majeur de dégradation par hydrolyse. Cette présentation permet à l'utilisateur de n'investir que dans 25 le(s) composé(s) glucidique(s) activé(s) CG-LH dont il trouverait l'utilité. La présente invention présente également un avantage de par le caractère simple de son application. En effet, une fois qu'il dispose du composé glucidique activé CG-LH synthétisé, l'utilisateur peut, de façon simple et rapide, disposer de son conjugué fluorescent en suivant le protocole simplifié 30 préétabli. Ainsi, l'utilisateur peut disposer de plusieurs séries de molécules glucidiques simples ou complexes marquées et utilisables pour le criblage des interactions avec des protéines réceptrices par fluorescence. 3025796 12 De plus, la sonde à l'origine du caractère fluorescent du conjugué, dérivée du N-méthyl-anthranilate ou de l'anthranilate, est une sonde peu onéreuse, de petite taille dont l'encombrement stérique au sein de la poche de fixation d'une protéine réceptrice peut-être minimisée en modulant la taille du 5 groupement L, ce qui permet son utilisation sur un très grand nombre de systèmes ligand glucidique-récepteur protéique. En outre, les dérivés du Nméthyl-anthranilate présentent un spectre d'absorption qui permet le criblage à haut débit par trois techniques de fluorescence: 10 1) FRET (« Fôrster Resonance Energy Transfer »). 2) Intensité de fluorescence. Les dérivés du N-méthyl-anthranilate ont pour particularité spectroscopique de voir leur rendement quantique et donc leur intensité de fluorescence augmenter dans un environnement hydrophobe. Ainsi, il est envisageable d'exploiter cette propriété dans 15 le cas d'un récepteur protéique possédant une poche de fixation hydrophobe prenant en charge le conjugué entier ou uniquement la partie glucidique à condition que le groupement dérivé du N-méthylanthranilate soit à proximité de la surface de la protéine réceptrice. En conséquence, le conjugué selon l'invention est peu fluorescent en 20 solvant aqueux lorsqu'il est séparé de son récepteur protéique. Lorsque le récepteur fixe le ligand marqué, la sonde se trouve à proximité de la surface protéique ou dans le meilleur des cas à l'intérieur de la poche de fixation du ligand. Si cette surface est hydrophobe ou si l'intérieur de la poche de fixation du ligand est 25 hydrophobe, le conjugué voit son intensité de fluorescence augmenter. Dans ces conditions, le conjugué selon l'invention pourra être excité dans des longueurs d'ondes comprises entre 320nm et 360nm, tandis que l'augmentation de l'émission de fluorescence après ajout de la protéine cible sera suivie entre 400 et 500nm. L'exploitation 30 de la méthode en compétition est possible. L'ajout d'un compétiteur déplaçant le conjugué selon l'invention s'accompagne d'une chute de 3025796 13 l'intensité de fluorescence entre 400 et 500nm, rendant l'exploitation possible dans le cadre d'un criblage haut-débit. 3) Anisotropie de fluorescence. Dans les conditions pour lesquelles il n'est pas possible d'exploiter la particularité spectroscopique de la 5 sonde dérivée du N-méthyl-anthranilate telle que présentée en 2), l'interaction du conjugué fluorescent selon l'invention avec sa cible protéique peut être suivie par augmentation du niveau d'anisotropie de fluorescence. Dans ce cas, l'expérience par compétition est également envisageable. Ainsi, en présence d'un compétiteur efficace, le 10 déplacement du conjugué fluorescent du site de fixation de la protéine réceptrice sera suivi par une baisse du niveau d'anisotropie. Ainsi, les conjugués fluorescents selon l'invention sont particulièrement bien adaptés au criblage haut-débit. En effet, quelle que soit la stratégie envisagée (FRET, intensité de fluorescence (IF), anisotropie de fluorescence 15 (A)), la fixation du conjugué sur la protéine cible s'accompagnera d'une augmentation d'un signal de fluorescence (FRET, IF ou A) entre 400 nm et 500 nm tandis que le déplacement efficace du conjugué opéré par un compétiteur pourra être suivi par une diminution du signal (FRET, IF ou A) dans cette même gamme de longueur d'onde. Dans le cadre du criblage d'un 20 effecteur ciblant spécifiquement une protéine d'intérêt, il sera aisément possible de détecter un « hit » en sélectionnant le compétiteur correspondant au puits pour lequel le signal de fluorescence (FRET, IF ou A) aura été abaissé. En présence des compétiteurs, les puits fluorescents correspondent aux molécules n'ayant pas été capables de déplacer le conjugué fluorescent 25 du récepteur protéique. Au contraire, les puits non fluorescents ou faiblement fluorescents correspondent à des « hits ». La présente invention peut être exploitée notamment dans le domaine des applications biomédicales: les composés glucidiques de l'invention peuvent être utilisés dans la recherche d'effecteurs d'enzymes (substrat, inhibiteurs, 30 activateurs) par criblage à haut débit (en interaction directe ou par compétition) et dans l'étude qualitative des interactions entre un ligand glucidique et une cible (récepteur). Les cibles des glycanes sont multiples et 3025796 14 le champ d'exploitation de la technologie de l'invention est donc très vaste. Ainsi, en plus du criblage haut-débit sur microplaque d'effecteurs glycosidiques à visée industrielle, la présente invention peut également être utilisée en recherche fondamentale dans le cadre d'études qualitatives et 5 quantitatives pour l'étude des interactions ligands sucrés - récepteurs protéiques. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. 10 1) Etude du composé A Xyl-MANT (précurseur de L : éthanolamine) a) Préparation Du D-xylose est activé par un précurseur du groupement L de type 15 éthanolamine en position 1. En référence au schéma 1 ci-dessus, pour lequel R2, R3 et R4 sont des groupes OH, le greffage du groupement L démarre par une étape de protection et d'activation de l'atome d'oxygène en position 1: a) (1) : Ac20-AcONa, 100°C, 30 min. ; (2) : Hydrazine acétate, DMF, TA, 30 min. ; (3) CI3C-CN, DBU, CH2Cl2, TA, 20 min. L'activation de l'oxygène en 20 position 1 permet le greffage du précurseur éthanolamine préalablement protégé par un groupement carbobenzoxy (Z) : b) (1) : N,Z-Ethanolamine, TMSOTf, 0°C, 30 min. Puis le groupement protecteur Z est éliminé: d) H2, Pd/C 10%, Me0H, TA, 16 h. Ces étapes sont toutes réalisées au laboratoire. On obtient le composé glucidique activé, qui est ensuite marqué par 25 l'anhydride d'acide N-méthyl-isatoïque. Le marquage est simple et pourra être effectué par l'utilisateur lui-même selon un protocole préétabli. Pour cela, une solution aqueuse de xylose (39 mg, 20 pmol dans 1,5mL) préalablement activé en position 1 au moyen d'un précurseur du groupement L de type éthanolamine est mélangée à une solution de NaHCO3 (1M, 30 30 pmol dans 30 pL) et est agitée à température ambiante. Une solution d'anhydride N-méthyl isatoïque (recristallisé, 59 mg, 30 pmol) dans du 1,4- dioxane (0.8 mL) est ajoutée au mélange précédent. Le nouveau mélange 3025796 15 réactionnel est alors agité pendant 2 h à température ambiante. L'avancement de la réaction est suivi par chromatographie sur couche mince (ccm) de silice dans le mélange de solvants cité précédemment. La disparition complète du xylose activé au moyen du précurseur éthanolamine 5 (Rf = 0, positif à la ninhydrine, spray révélateur des composés aminés; Rf désigne le rapport frontal) a pu être visualisée au profit du produit (Rf = 0.4, positif en UV). Le réactif excédentaire, l'anhydride d'acide N-méthylisatoïque, se présente sur ccm sous la forme d'une tâche caractérisée par un Rf de 0,9. La vérification par ccm de l'avancement de la réaction après 2h de 10 réaction montre une disparition presque totale du composé glucidique activé associé à l'apparition du réactif marqué tandis que l'on note une nette résorption de la tache associée à l'excédent d'anhydride d'acide N-méthylisatoïque (données non-montrées). Confirmation a été donnée que le produit de la réaction est bien le xylose 15 marqué en position 1 par le N-méthyl-anthranilate via un précurseur du groupement L de type éthanolamine (composé A). Pour ce faire, le mélange réactionnel, a été concentré et séché sous vide afin que l'échantillon obtenu puisse être quantifié, puis analysé par spectroscopie de masse et par RMN. Ainsi, le résidu est extrait par un mélange CH2C12:Me0H (9:1) (2 x 5 mL), 20 puis chromatographié sur une colonne de gel de silice (10 g). L'excédent d'acide N-méthyl-isatoïque est élue avant le composé A (donnée non-montrée). La phase mobile utilisée est constituée par le même mélange de solvants que cité précédemment. Ces conditions ont permis de recueillir environ 54 mg de produit, soit un rendement réactionnel de 82%. Le produit 25 se présente sous l'aspect d'une mousse crème. Le composé A obtenu a ensuite été analysé par spectroscopie de masse à haute résolution. Le ratio m/z calculé pour C15H23N206 [M + H]+ est de 327.15506 tandis que celui trouvé expérimentalement est de 327.15512. Le composé A a également été analysé par RMN 1H et par RMN 13C. Les 30 deux spectres RMN sont conformes avec la structure attendue. RMN 1H (400 MHz, CD30D-CDC13) : Ô 7.42 (m, 1 H, Ar-H,, 7.28 (m, 1 H, Ar-H), 6.61 (m, 1 H, Ar-H), 6.55 (m, 1 H, Ar-H), 4.22 (d, 1 H, ,A,2 7.4 Hz, H-1), 3025796 16 5 3.93 (m, 1 H, 0-CH), 3.95 (dd, 1 H, J4,5eq 5.2, ./ -5ax,5eq 11.5 Hz, H-5eq), 3.71 (m, 1 H, 0-CH), 3.60 (m, 1 H, N-CH), 3.52. 3.42 (m, 2 H, N-CH, H-4), 3.31 (t, 1 H, ,b,3 = J3,4 = 8.9 Hz, H-3), 3.21 (dd, 1 H, H-2), 3.18 (dd, 1 H, ./ R n J4,5ax -. _ Hz, H-5ax), 2.80 (s, 3 H, N-CH). RMN 130 (100 MHz, CD30D-CDC13) : Ô 171.40 (1 C, NH-CO), 150.58, 133.11, 126.43, 116.25, 115.28, 111.36 (6 c, Ar-C), 104.37 (1 C, C-1), 76.74 (1 C, C-3), 73.88 (1 C, C-2), 70.19 (1 C, C-4), 69 .37 (1 C, 0-CH2), 66.17 (1 C, C-5), 39.93 (1 C, N-CH2), 29.64 (1 C, N-CH). 10 b) Application au FRET La figure 1 représente les spectres d'absorption (A, B respectivement) et d'émission (D, C respectivement) de fluorescence normalisés du composé A et d'un résidu tryptophane appartenant à une protéine cible dans un solvant aqueux. Le spectre d'absorption normalisé du composé A est le spectre A. 15 Aux environs de 274nm, longueur d'onde d'excitation caractéristique des résidus d'acides aminés aromatiques (spectre B), l'absorption de la lumière par le conjugué est négligeable tandis qu'elle est significative entre 290 et 375nm, gamme de longueur d'onde d'émission des résidus d'acides aminés aromatiques (spectre C). Ainsi, les conjugués préparés par l'utilisateur 20 pourront donc être employés pour toute étude quantitative des interactions ligand glycanique - récepteur protéique par FRET par excitation des tyrosines et tryptophanes (à 274nm) présents dans le site de fixation en suivant l'évolution de l'émission du conjugué fluorescent entre 400 et 500nm après ajout des compétiteurs dans le cadre d'un criblage haut-débit (spectre D). 25 c) Etude quantitative de l'interaction du composé A avec la 134GalT7 par les méthodes de FRET, et d'anisotropie de fluorescence 1 - Détermination de l'affinité (Kd) du composé A pour la 134GalT7 par 30 FRET sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par FRET de l'affinité (Kd) de la liaison entre la 134GalT7 et le composé A, il est considéré que le donneur de FRET est 3025796 17 constitué par la p4GalT7 tandis que le receveur de FRET est le composé A compte tenu des propriétés spectrales de chacun des partenaires (Fig. 1). L'expérience est réalisée dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 5 353293). 160pM de p4GalT7 sont mis en présence de concentrations croissantes de composé A (0 à 2mM), dans un tampon BisTris 50mM pH6, MnCl2 0.05mM, UDP 2mM. Après agitation 1 min, la lecture du FRET est effectuée à température ambiante en excitant le mélange à la longueur d'onde de 274nm et en suivant le spectre d'émission obtenu entre 290 et 10 500nm. L'appareil utilisé est un Xenius (SAFAS) équipé d'un portoir adapté pour des lectures en plaque. La figure 2A représente les spectres d'émission du composé A entre 290 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm en absence de p4GalT7 pour différentes concentrations. 15 La figure 2B représente les spectres d'émission du composé A obtenu entre 290 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm en présence de p4GalT7. La figure 2C représente la courbe de saturation obtenue par report des valeurs du signal de fluorescence à 430nm en fonction de la concentration de composé A. 20 Les spectres d'émission permettent la mise en évidence du FRET entre les résidus d'acides aminés aromatiques de la p4GalT7 et le composé A (Fig. 2B). Des mesures ont également été effectuées sur des contrôles sans protéine pour chaque concentration de composé A (Fig. 2A). Les valeurs d'émission de fluorescence « brutes » lues à la longueur d'onde de 430 nm 25 pour chaque concentration de composé A en présence de l'enzyme (Fig. 2B) ont ainsi été réduites de celles obtenues pour chaque concentration de composé A en absence de l'enzyme. Les valeurs d'émission de fluorescence « nettes » à 430 nm ont ensuite été reportées en fonction de la concentration de composé A. La courbe de saturation est présentée en figure 2C. Cette 30 courbe a ensuite été ajustée par une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. Une valeur préliminaire de la constante d'affinité 3025796 18 (Kd) de la p4GalT7 pour le composé A a pu être déterminée aux alentours de 202 ± 68 pM. 2 - Détermination de l'affinité (Kd) de la 134GalT7 pour le composé A 5 par anisotropie de fluorescence sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par anisotropie de fluorescence de l'affinité (Kd) de la p4GalT7 pour le composé A, nous suivons la formation du complexe entre le composé A et l'enzyme grâce à l'évolution du niveau d'anisotropie de fluorescence du composé A en fonction de concentrations croissantes en 10 p4GalT7. Pour ce faire, dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293), 10pM de composé A sont mis en présence de différentes concentrations en p4GalT7 (0 à 1 mM) dans un tampon BisTris 50mM pH6, MnCl2 0.05mM, UDP 2mM. Après agitation 1min, la lecture en anisotropie est 15 effectuée à température ambiante en excitant à une longueur d'onde 354nm et faisant une mesure en point final à une longueur d'onde d'émission de 430nm. L'appareil utilisé est l'Infinite® 200 pro (TECAN), équipé d'un filtre optique (TECAN) centré à l'excitation à 360 nm (± 35 nm) et centré à l'émission à 430 nm (± 20 nm). 20 Une mesure en anisotropie est effectuée sur un témoin sans protéines et la valeur est directement soustraite des valeurs obtenues en présence de p4GalT7 par l'appareil. La figure 3 représente la courbe de saturation obtenue à partir des valeurs d'anisotropie de fluorescence à 430nm en fonction de la concentration en 25 p4GalT7. Les valeurs d'anisotropie lues à 430nm pour chaque concentration de p4GalT7 ont été reportées en fonction de ces dernières. La courbe de saturation obtenue a ensuite été ajustée par une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. Une valeur préliminaire de la constante d'affinité (Kd) de la p4GalT7 pour le composé A a pu être 30 déterminée aux alentours de 455 ± 51pM. 3025796 19 2) Etude du composé A' Xyl-MANT (précurseur de L : hydroxylamine) a) Préparation Le composé A' est préparé de la même façon que le composé A mais en 5 utilisant comme précurseur du groupement L un précurseur de type hydroxylamine. Cela permet de rapprocher la structure osidique du corps aromatique de la sonde de façon à positionner ce dernier à proximité des résidus d'acides aminés hydrophobes présents dans la poche de fixation au substrat accepteur. Le composé A' est recristallisé dans EtOH. 10 F 206-208°C (décomposition) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) : Ô 7.68 (m, 1H, H arom.), 7.60 (m, 1H, H arom), 7.18 (m, 1H, H arom), 7.12 (m, 1H, H arom), 4.65 (d, 1H, J1,2 9.0 Hz, H-1), 3.97 (dd, 1H, ./ -4,5ax - q 0 .-, - .1 4,5eq 3.0 Hz, H-5eq), 3.96 (dd, 1H, ,h,3 9.0 Hz, H-2), 3.82 (dd, 1H, J3,4 9.0 Hz, H-3), 3.54 (m, 1H, H-4), 3.35 (dd, 1H, H-5ax), 3.08 15 (s, 3H, N-CH3). 13C RMN (100 MHz, CD30D) : Ô 172.01 (1C, NH-C=O), 146.44, 134.66, 131.79, 125.82, 123.35, 120.94 (6C, C aromatiques), 93.33 (1C, C-1), 79.05 (1C, C-2), 78.74 (1C, C-3), 78.41 (1C, C-4), 68.26 (1C, C-5), 37.17 (1C, NCH3). 20 b) Détermination de l'affinité (Kd) de la p4GalT7 pour le composé A' par fluorescence directe sur microplaque 96 puits Au cours de cette expérience, nous suivons la formation du complexe formé entre le composé A' et l'enzyme grâce à l'augmentation du signal de 25 fluorescence émis par le composé A' interagissant avec la p4GalT7. Pour cette étude, 25pM de composé A' ont été mis en présence de concentrations croissantes en p4GalT7 allant de 100 à 1000pM. L'expérience a été réalisée dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293) en utilisant un tampon 30 BisTris 50mM pH6, MnCl2 0.05mM et contenant 2mM d'UDP. Après agitation 1min, la lecture en intensité de fluorescence est effectuée à température ambiante en excitant à une longueur d'onde 354nm et en suivant le spectre 3025796 20 d'émission obtenu entre 370 et 600nm. L'appareil utilisé est un Varioskan® Flash (Thermo Scientific). La figure 4 représente les spectres d'émission du composé A' entre 370 et 600nm à partir d'une excitation à 354nm en présence de concentrations 5 croissantes en p4GalT7. Les résultats présentés en figure 4 montrent que le signal de fluorescence du composé A' augmente à mesure que croît la concentration en p4GalT7 (Fig.4). L'évolution du signal semble saturer à partir de 750pM (Fig.4), présumant d'un Kd compris entre 100 et 300pM ce qui reste en accord avec 10 les données de la littérature. c) Expérience de compétition du xylose tert-butylcyclohexane sur le composé A' impliqué dans le complexe avec la p4GalT7 par FRET sur microplaque 96 puits On suit la compétition du composé A' en complexe avec la p4GalT7 par le xylose tert-butylcyclohexane, ligand non naturel et non fluorescent de la p4Ga1T7, par FRET. Le xylose tert-butylcyclohexane (composé F) a pour formule : OH (F) A cet effet, 200pM de p4GalT7 et 600pM de composé A' ont été mis en présence de xylose tert-butylcyclohexane à 600pM, dans un tampon BisTris 50mM pH6, MnCl2 0.05mM, UDP 2mM. Après agitation 1min, la lecture du 25 FRET a été effectuée comme précédemment. L'appareil utilisé est un Xenius (SAFAS) équipé d'un portoir adapté pour des lectures en plaque. La figure 5A représente les spectres d'émission du composé A' obtenu entre 300 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm. Les spectres ont été effectués sur deux références réalisées sans p4GalT7 en absence (courbe 30 E) et en présence de composé A' (courbe F). L'expérience de compétition a 15 20 3025796 21 été réalisée en présence de 200pM d'enzyme et de 600pM de composé A' en absence (courbe G) puis en présence de Xylose tert-butylcyclohexane (courbe H). Les spectres d'émission permettent la mise en évidence du FRET entre les résidus d'acides aminés aromatiques de la p4GalT7 et le 5 composé A' (Fig. 5A) Des mesures ont également été effectuées sur des contrôles sans protéine d'une part et sans conjugué fluorescent ni protéine d'autre part. La figure 5B représente l'histogramme obtenu par report des valeurs du signal de fluorescence du composé A' à 430nm en fonction de mesures effectuées. 10 Les valeurs d'émission de fluorescence « brutes » lues à la longueur d'onde de 430 nm pour essais ont ainsi été reportées dans le graphique (Fig. 5B). Le pourcentage de compétition à 600pM de xylose tert-butylcyclohexane est calculé en utilisant comme référence la valeur de fluorescence obtenu en absence de xylose tert-butylcyclohexane. Une valeur préliminaire du 15 pourcentage de compétition du xylose tert-butylcyclohexane à 600pM sur le composé A' a pu être déterminée aux alentours de 20%. 3) Etude du composé B Maltose-MANT (précurseur de L : éthanolamine) a) Préparation 20 Le protocole de synthèse est identique à celui décrit pour le composé A ci-dessus. La réaction est effectuée à partir de l'amine correspondante (200 mg, 0.5 mmol). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (20 g) dans le mélange dichlorométhane-méthanol (5 :2, v/v) pour donner le composé B sous forme d'une mousse incolore (205 mg, 25 79%). [MD = +57 (c 1, Me0H) RMN 1H (400 MHz, CD3OD, acétone interne) : Ô 7.44 (m, 1 H, Ar-H), 7.32 (m, 1 H, Ar-H), 6.64 (m, 1 H, Ar-H), 6.56 (m, 1 H, Ar-H), 5.12 (d, 1 H, J1,2 3.8 Hz, H-1'), 4.31 (d, 1 H, J1,2 7.8 Hz, H-1), 3.97 (m, 1 H, 0-CH), 3.80 30 (m, 3 H, H-4, H-6'a,b), 3.73 (m, 1 H, 0-CH), 3.62 (m, 3H, H-6a,b, N-CH), 3.60 (m, 2 H, H-3, H-4'), 3.50 (dd, 1 H, h',3' = ../3',4' = 9.0 Hz, H-3'), 3.48 3025796 22 (m, 1 H, N-CH), 3.42 (dd, 1 H, H-2'), 3.36 (m, 1 H, H-5'), 3.28 (m, 1 H, H5), 3.23 (dd, 1H, ,b,3 9.0 Hz, H-2), 2.78 (s, 3 H, N-CH3). RMN 130 (100 MHz, CD3OD, acetone interne) : Ô 172.05 (1 C, NH-CO), 151.08, 133.47, 129.05, 116.96, 115.69, 111.66 (6 C, Ar-C), 104.16 (1 C, 5 C-1) 102.60 (1 C, C-1'), 80.90 (1 C, C-4), 77.34 (1 C, C-3), 76.28 (1 C, C- 5), 74.71, 74.46, 74.33 (3 C, C-2', 3', 5'), 73.78 (1 C, C-4'), 71.22 (1 C, C2), 69.51 (1 C, 0 CH2), 62.39, 61.76 (2 C, C-6, C-6'), 40.38 (1 C, N-CI-12), 29.68 (1 C, N-CI-13). HRMS: m/z calculé pour C22H35N2012 [M+H]+ 519.71205. Trouvé ; 10 519.71228. b) Etude quantitative de l'interaction du composé B avec la MBP par FRET et par anisotropie de fluorescence 1 - Détermination de l'affinité (Kd) du composé B pour la MBP par 15 FRET sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par FRET de l'affinité (Kd) de liaison de la MBP (Maltose Binding Protein) et le composé B, le donneur de FRET est constitué par la MBP tandis que le receveur de FRET est constitué par le composé B au vu des propriétés spectrales de chacun des partenaires (Fig. 1). 20 L'expérience a été réalisée dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293). Pour ce faire, 50pM de MBP sont mis en présence de concentrations croissantes de composé B allant de 0 à 200pM, dans un tampon Sodium de Phosphate 100mM, pH 7.2 en présence d'imidazole 25 18.75pM. Après agitation 1min, la lecture du FRET est effectuée à température ambiante en excitant à la longueur d'onde de 274nm et en suivant le spectre d'émission obtenu entre 290 et 500nm. L'appareil utilisé est un Xenius (SAFAS) équipé d'un portoir adapté pour des lectures en plaque. Les mesures peuvent être effectuées à la longueur d'onde 30 d'émission unique de 430nm. La figure 6A représente les spectres d'émission du composé B obtenu entre 290 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm en absence de MBP. 3025796 23 La figure 6B représente les spectres d'émission du composé B obtenu entre 290 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm en présence de MBP. La figure 6C représente la courbe de saturation obtenue par report des valeurs du signal de fluorescence à 430nm en fonction de la concentration 5 de composé B. Les spectres d'émission permettent la mise en évidence du FRET entre les résidus d'acides aminés aromatiques de la MBP et le composé B (Fig. 6B). Des mesures ont également été effectuées sur des témoins sans protéine pour chaque concentration de composé B (Fig. 6A). Les valeurs d'émission 10 de fluorescence « brutes » lues à la longueur d'onde de 430 nm pour chaque concentration de composé B en présence de la MBP (Fig. 6B) ont ainsi été réduites de celles obtenues pour chaque concentration de composé B en absence de la MBP. Les valeurs d'émission de fluorescence « nettes » à 430nm ont ensuite été reportées en fonction de la concentration de composé 15 B. La courbe de saturation est présentée en figure 6C. Cette courbe de saturation a ensuite été ajustée par une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. La constante d'affinité (Kd) de la MBP pour le composé B a pu être déterminée aux alentours de 25 ± 9 pM. 20 2 - Détermination de l'affinité (Kd) du composé B pour la MBP par anisotropie de fluorescence sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par anisotropie de fluorescence de l'affinité (Kd) de la MBP pour le composé B, la formation du complexe entre le composé B et la protéine est suivie grâce à l'évolution du niveau d'anisotropie de 25 fluorescence du composé B en fonction de concentrations croissantes en MBP. Pour ce faire, dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293), 10pM de composé B sont mis en présence de différentes concentrations en MBP (0 à 400 pM) dans un tampon Sodium de Phosphate 100mM, pH 7.2. 30 Après agitation 1min, la lecture en anisotropie est effectuée à température ambiante en excitant à une longueur d'onde 354nm et faisant une mesure en point final à une longueur d'onde d'émission de 430nm. L'appareil utilisé est 3025796 24 l'Infinite® 200 pro (TECAN), équipé d'un filtre optique (TECAN) centré à l'excitation à 360 nm (± 35 nm) et centré à l'émission à 430 nm (± 20 nm). Une mesure en anisotropie est effectuée sur un témoin sans protéines et la valeur est directement soustraite des valeurs obtenues en présence de MBP 5 par l'appareil. La figure 7 représente la courbe de saturation obtenue à partir des valeurs d'anisotropie de fluorescence à 430nm en fonction de la concentration en MBP. Les valeurs d'anisotropie lues à 430nm pour chaque concentration de MBP ont été reportées en fonction de ces dernières. 10 La courbe de saturation obtenue a ensuite été ajustée par une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. La constante d'affinité (Kd) de la MBP pour le composé B a pu être déterminée aux alentours de 66 ± 7 pM. 15 c) Expérience de compétition du maltose sur le composé B impliqué dans le complexe avec la MBP par anisotropie de fluorescence sur microplaque 96 puits On suit la compétition par le maltose, ligand naturel de la MBP, avec le composé B en complexe avec la MBP par anisotropie de fluorescence. A cet 20 effet, 50pM de MBP et 10pM de composé B ont été mis en présence de concentrations de maltose allant de 50nM à 300pM dans un tampon Sodium de Phosphate 100mM, pH7.2. La dissociation du composé B est suivie par l'évolution de la valeur d'anisotropie de fluorescence à 430nm sous une longueur d'excitation de 354 nm. L'appareil utilisé est l'Infinite® 200 pro 25 (TECAN), équipé d'un filtre optique (TECAN) centré à l'excitation à 360 nm (± 35 nm) et centré à l'émission à 430 nm (± 20 nm). Une mesure en anisotropie est effectuée sur un témoin sans protéines et la valeur obtenue est directement soustraite des valeurs obtenues en présence de MBP par l'appareil. 30 La figure 8 représente le niveau d'anisotropie de fluorescence en fonction de concentration croissante de maltose, substrat naturel de la MBP. Les valeurs 3025796 25 d'anisotropie lues à 430nm pour chaque concentration de maltose ont été reportées en fonction de ces dernières. La courbe de compétition obtenue a ensuite été ajustée selon une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. La constante d'inhibition 5 médiane (CI50) caractérisant l'efficacité avec laquelle le maltose déplace le composé B complexé avec la MBP a pu être déterminée aux alentours de 15 ± 1 pM dans les conditions de l'expérience. La valeur d'anisotropie de fluorescence du composé B dans sa forme complexée est environ 5 fois supérieure à celle de sa forme libre. Ceci 10 confirme que le niveau de sensibilité des conjugués selon l'invention permet leur emploi dans le cadre d'un criblage haut-débit par lecture en anisotropie de fluorescence 4) Etude du composé C Lactose-MANT (précurseur de L : éthanolamine) 15 a) Préparation Le protocole de synthèse est identique à celui décrit pour le composé A ci-dessus. La réaction est effectuée à partir de l'amine correspondante (160 mg, 0.4 mmol). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de 20 silice (20 g) dans le mélange dichlorométhane-méthanol (5 :2, v/v) pour donner le composé C sous forme d'une mousse incolore (156 mg, 75%). [a]p = +9 (c 1, Me0H) RMN 1H (400 MHz, CD3OD, acétone interne) : Ô 7.45 (m, 1 H, Ar-H), 7.36 (m, 1 H, Ar-H), 6.66 (m, 1 H, Ar-H), 6.54 (m, 1 H, Ar-H), 4.35 (d, 1 H, J1,2 8.0 25 Hz, H-1'), 4.34 (d, 1 H, J1,2 7.5 Hz, H-1), 3.98 (m, 1 H, 0-CH), 3.82 (m, 3 H, H-4, H-6'a,b), 3.75 (m, 1 H, 0-CH), 3.62 (m, 2H, H-6a,b), 3.61 (m, 1 H, NC/), 3.60 (m, 3 H, H-2',4', H-5), 3.48 (dd, 1 H, ..k,3' 11.0 , ../3',4' 3.6 Hz, H-3'), 3.45 (m, 1 H, N-CH), 3.42 (m, 1 H, H-5), 3.36 (m, 1 H, H-5'), 3.26 (dd, 1H, H2), 2.80 (s, 3 H, N-CH3). 30 RMN 130 (100 MHz, CD3OD, acétone interne) : Ô 171.94 (1 C, NH-CO), 151.0, 133.37, 128.97, 116.91, 115.59, 111.56 (6 C, Ar-C), 104.73 (1 C, C-1) 103.96 (1 C, C-1'), 80.29 (1 C, C-4), 76.66 (1 C, C-3), 76.11 (1 C, C-5), 75.87, 74.41, 74.36, 74.33, 72.14 (5 C, C-2, C-2', 3', 4', 5'), 69.92 (1 C, 302 5 7 9 6 26 0 CH2), 62.14, 61.49 (2 C, C-6, C-6'), 40.31 (1 C, N- CI-12), 29.58 (1 C, NCH3). HRMS: m/z calculé pour C22F135N2012 [M+H]+ 519.71205. Trouvé ; 519.71232. 5 b) Etude quantitative de l'interaction du composé C avec la Galectine-3 par FRET et par anisotropie de fluorescence 1 - Détermination de l'affinité (Kd) du composé C pour la Galectine-3 par 10 FRET sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par FRET de la constante de dissociation (Kd) caractérisant l'affinité de la Galectine3 pour le composé C, il est considéré que le donneur et le receveur de FRET sont respectivement représentés par la Galectine3 et le composé C compte tenu de leurs propriétés spectrales 15 (Fig. 1). L'expérience est réalisée dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293). Nous mettons en présence de 50pM de Galectine-3 des concentrations croissantes de composé C (0 à 200pM). La Galectine-3 utilisée lors de ces essais a été exprimée dans des bactéries E. Coli à partir 20 d'une séquence d'ADN complémentaire codante pour le domaine de fixation du lactose, insérée dans un vecteur pET-41a avant transformation bactérienne. Le solvant utilisé est un tampon phosphate salin, pH7. Après agitation 1min, la lecture du FRET est effectuée à température ambiante en excitant à la longueur d'onde de 274nm et en suivant le spectre d'émission 25 obtenu entre 290 et 500nm. L'appareil utilisé est un Xenius (SAFAS) équipé d'un portoir adapté pour des lectures en plaque. Les mesures peuvent être effectuées à la longueur d'onde d'émission unique de 430nm. La figure 9A représente les spectres d'émission du composé B obtenu entre 290 et 500nm à partir d'une excitation à 274nm en absence puis en présence 30 de concentration croissante de Galectine-3. 3025796 27 La figure 9B représente la courbe de saturation obtenue par report des valeurs du signal de fluorescence à 430nm en fonction de la concentration de composé B. Les spectres d'émission permettent la mise en évidence du FRET entre les 5 résidus d'acides aminés aromatiques de la Galectine-3 et le composé B (Fig. 9A). Les valeurs d'émission de fluorescence lues à la longueur d'onde de 430 nm pour chaque concentration de composé C en présence de la Galectine-3 ont ensuite été reportées en fonction de la concentration de composé C. La courbe de saturation est présentée en figure 9B. Cette 10 courbe de saturation a ensuite été ajustée par une régression non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. La constante d'affinité (Kd) de la Galectine-3 pour le composé C a pu être déterminée aux alentours de 35pM. 2 - Détermination quantitative de l'affinité (Kd) du Lactose-MANT pour 15 la Galectine-3 par anisotropie de fluorescence sur microplaque 96 puits Dans le cadre de l'évaluation par anisotropie de fluorescence de l'affinité (Kd) de la Galectine-3 pour le composé C, la formation du complexe entre le composé C et la protéine est suivie grâce à l'évolution du niveau d'anisotropie de fluorescence du composé C en fonction de concentration 20 croissante en Galectine-3. Pour ce faire, dans une plaque 96 puits (BD Falcon Microtest 96 well, Assay plate optilux, Black/Clear bottom surface standard REF : 353293), 10pM de composé C sont mis en présence de concentrations croissantes en Galectine-3 (0 à 400 pM) dans un tampon Phosphate salin, pH7. La Galectine-3 utilisée lors de ces essais a été 25 exprimée dans des bactéries E. Coli à partir d'une séquence d'ADN complémentaire codante pour le domaine de fixation du lactose, insérée dans un vecteur pET-41a avant transformation bactérienne. Après agitation 1min, la lecture en anisotropie est effectuée à température ambiante en excitant à une longueur d'onde 354nm et faisant une mesure en point final à 30 une longueur d'onde d'émission de 430nm. L'appareil utilisé est l'Infinite® 200 pro (TECAN), équipé d'un filtre optique (TECAN) centré à l'excitation à 360 nm (± 35 nm) et centré à l'émission à 430 nm (± 20 nm). Une mesure en 3025796 28 anisotropie est effectuée sur un témoin sans protéine et la valeur est directement soustraite des valeurs obtenues en présence de Galectine-3 par l'appareil. La figure 10 représente la courbe de saturation obtenue à partir des valeurs 5 d'anisotropie de fluorescence du composé C à 430nm en fonction de la concentration en Galectine-3. Les valeurs d'anisotropie lues à 430nm pour chaque concentration de Galectine-3 ont été reportées en fonction de ces dernières. La courbe de saturation obtenue a ensuite été ajustée par une régression 10 non-linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism5. La constante d'affinité (Kd) de la Galectine3 pour le Lactose-MANT a pu être déterminée aux alentours de 84 ± 25 pM (N=1). Ces résultats montrent que les conjugués de la présente invention sont 15 efficaces dans le suivi des interactions protéines-sucres. Ils présentent tout d'abord l'avantage de pouvoir être synthétisés simplement, sans utiliser de réactif toxique, en mettant en présence le composé glucidique choisi préalablement « activé » par un précurseur du groupement L avec l'anhydride d'acide isatoïque ou un dérivé dans un 20 mélange pratiquement équimolaire. Le rendement de marquage dans ces conditions avoisine les 82%. La réaction du composé glucidique avec l'anhydride d'acide isatoïque ou un dérivé est pratiquement totale, ce qui permet à l'utilisateur d'éviter des conditions de marquage dans lesquelles l'anhydride d'acide isatoïque doit être mis en excès par rapport à la molécule 25 glucidique. Cela permet de réduire au maximum les bruits de fond associés aux sondes (anhydride d'acide isatoïque ou dérivé) n'ayant pas réagi et d'assurer que le signal fluorescence suivi ne provienne pratiquement que du conjugué glucidique. Le procédé de marquage est donc amélioré ainsi que la capacité des conjugués de l'invention à reporter avec sensibilité leur 30 interaction avec leurs protéines cibles. Par ailleurs, le procédé de préparation des conjugués glucidiques selon l'invention permet de respecter la structure du cycle fermé du résidu d'ose 3025796 29 marqué de sorte que la molécule obtenue reste adaptée pour des études impliquant son interaction avec des protéines cibles. Les conjugués de l'invention présentent également l'avantage de pouvoir être utilisés comme « reporter » fluorescent de leur interaction avec leur 5 protéine cible, les Kd associés aux interactions des couples récepteur protéique-ligand osidique pouvant être déterminés. Les conjugués de l'invention présentent également l'avantage de pouvoir être utilisés dans le cadre des expériences de compétitions, la 0150 pouvant être déterminée. 10 Ainsi, ce résultats démontrent que les conjugués de l'invention sont aussi bien adaptés pour l'étude des interactions protéine-sucre que pour la recherche d'effecteurs pour un criblage haut-débit. REVENDICATIONS1. Conjugué fluorescent de formule (I) 30 10 15 2. 203. 4. 5. 25 CG - (I) où CG est un composé glucidique choisi parmi les résidus d'oses, les oligosides et les polyosides comprenant au moins un résidu d'ose sous forme cyclique, substitué ou non, L est un groupement greffé sur une position de marquage dudit ose et est choisi parmi -O-NH-, -0-(CH2)nNH-, -0-(CH2)nS-, où n est un entier égal à 1 ou 2, un groupement dérivé d'une glycosylamine, un groupement dérivé d'un thioglycoside, l'atome d'azote ou de soufre étant lié au carbone carboxylique du groupement anthraniloyle, R est H, CH3, R' occupe les 4 positions libres du cycle benzénique du groupement anthraniloyle et est choisi indépendamment parmi H, CH3, -CH-(CH3)2, F, Cl, Br. Conjugué fluorescent selon la revendication 1, dans lequel L est greffé en position 1 anomère du résidu d'ose. Conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel CG est choisi parmi un résidu d'ose, un diholoside, un triholoside. Conjugué fluorescent selon la revendication 3, dans lequel CG est choisi parmi un résidu de xylose, le maltose, le lactose. Conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les positions libres du résidu d'ose sont indépendamment non substituées portant H ou OH ou substituées par un groupement choisi parmi -O-PO3Na2, -O-SO3Na, -O-CO-CH3, -N-CO-CH3, -NH2, -CH3, -CH2-CH3, -F, -Cl, -Br, -SH. 3025796 31 6. Conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L est -O-CH2-CH2-NH- greffé en position 1 anomère du résidu d'ose et R' est H et R est CH3. 7. Procédé de préparation d'un conjugué fluorescent de formule (I) selon les 5 revendications 1 à 6 comprenant les étapes de : - préparation d'un composé glucidique activé CG-LH à partir d'un composé glucidique CG complet et d'un précurseur du groupement L, - marquage du composé glucidique activé CG-LH par réaction avec un composé de formule (II) R' R (Il) pour obtenir le conjugué fluorescent de formule (I), CG, L, R, R' étant définis selon les revendications précédentes. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'étape de préparation du composé glucidique activé CG-LH comprend les étapes de : - activation de la position de marquage d'un composé glucidique CG complet, ladite position de marquage étant de préférence la position 1 anomère de l'ose complet sous forme cyclique, - greffage chimique sur la position de marquage activée du groupement L, - éventuellement substitution d'une ou plusieurs positions libres de l'ose, - éventuellement lyophilisation du composé glucidique activé CG-LH obtenu. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'extrémité réductrice de l'ose complet est libre. 3025796 32 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le précurseur du groupement L est choisi parmi les composés HO-NH2, HO-(CH2)n-NH2, HO-(CH2)n-SH, une glycosylamine , un thioglycoside. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel le 5 composé de formule (II) est préalablement purifié à un degré de pureté supérieur ou égal à 90%, de préférence 95%. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans l'étape de marquage du composé glucidique activé CG-LH par réaction avec le composé de formule (II) comprend les étapes de : 10 - mélange du composé glucidique activé CG-LH en solution aqueuse avec le composé de formule (II) dans un solvant organique adapté à l'étape de marquage, - agitation, - concentration et séchage sous vide du conjugué fluorescent de 15 formule (I). 13. Kit pour criblage de composés glucidiques par fluorescence à partir d'un conjugué fluorescent de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit kit comprenant : - au moins un composé glucidique activé CG-LH, de préférence sous 20 forme lyophilisée, - un composé de formule (II), de préférence sous forme lyophilisée, - un solvant organique adapté à l'étape de marquage. 14. Procédé de criblage de composés glucidiques par fluorescence utilisant un conjugué fluorescent de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 25 à 6. 15. Procédé de criblage selon la revendication 14, utilisant l'une des techniques choisies parmi le FRET, l'intensité de fluorescence et l'anisotropie de fluorescence.