FR 3025605 A1 20160311 FR 1402016 A 20140908 1 DESCRIPTION La production d'anticorps et les méthodes de développement de nouveaux 35 anticorps représentent des enjeux fondamentaux que ce soit en biologie ou en médecine. Ainsi, de plus en plus de tests de biologie impliquent des étapes faisant appel à des anticorps, mais aussi la plupart des traitements novateurs contre les cancers mettent en jeu des molécules d'anticorps ou des analogues de ces molécules. A côté de ces applications déjà connues pour les anticorps, 40 la résistance des bactéries aux antibiotiques ouvre la voie des traitements combinés, Anticorps / Antibiotique, l'action des anticorps ayant pour but de bloquer la résistance aux antibiotiques. Toutes ces applications impliquent de disposer d'anticorps monoclonaux ou pseudo-monoclonaux, c'est à dire un ensemble d'anticorps dirigés exactement contre un épitope donné avec une 45 affinité similaire. La production de nouveaux anticorps se heurte à la complexité de manipulation des antigènes, que ce soit pour l'étape d'immunisation ou pour les étapes de production et de sélection des anticorps, et ce quel que soit le mode de 50 production, hybridome, phage display ou autre. Pour l'immunisation d'un animal ou d'un individu contre un épitope donné, les antigènes de grande taille bénéficient généralement d'un pouvoir immunogène supérieur. En revanche, contrairement à un antigène de taille plus petite, les 55 grands antigènes favorisent la production d'anticorps et de lymphocytes B ayant des paratopes plus variés, En effet, plus un antigène est grand, plus il comporte d'épitopes potentiels : la réponse immunitaire peut donc ne pas être uniquement focalisée sur l'épitope souhaité. Dans le pire des cas, des paratopes produits peuvent se fixer près de l'épitope d'intérêt, le masquer et 60 donc gêner la fixation d'anticorps dirigés contre l'épitope d'intérêt. Au contraire, l'utilisation d'antigènes de plus petite taille, dont l'haptène est centré sur l'épitope de l'antigène permettent la production d'anticorps et ou de lymphocytes B moins variés mais mieux focalisés sur l'épitope, en revanche ces antigènes de plus petite taille sont moins immunogènes. Pour compenser cette 65 plus faible immunogénicité, les petits antigènes sont souvent couplés à des protéines de transport ou « carrier », chargées de favoriser la réponse immunitaire. Cependant, ces protéines de transport représentent une source d'épitopes supplémentaire, qui défocalise la réponse immunitaire sur eux-mêmes plutôt que sur l'antigène couplé. 70 Une autre approche généralement utilisée pour contourner ces problématiques de focalisation et de stimulation de l'immunisation consiste à compenser la faible immunogénicité des petits antigènes en co-injectant des adjuvants immunogènes tel que l'aluminium, des micelles lipidiques etc. Néanmoins, les 75 protocoles de vaccination utilisant de tels adjuvants peuvent déclencher des réponses immunitaires indésirables telles que : macropathie, maladies auto-immunes, inflammations importantes, etc. Ces effets secondaires complexifient et défocalisent la réponse immunitaire. Ils peuvent donc compromettre la sélection et l'expansion clonale des lymphocytes B exprimant des anticorps de 80 surface dirigés contre l'épitope souhaité. Cette défocalisation est également 3025605 2 problématique dans le cadre de la vaccination humaine ou animale en générant des réponses immunitaires indésirables, conduisant à la raréfaction des adjuvants dans les vaccinations et à la recherche d'alternatives. 85 La question de la focalisation sur l'antigène se pose aussi au niveau de la sélection des anticorps à partir d'un mélange complexe, tels que ceux rencontrés par exemple dans les extraits de lymphocyte B activés ou plasmocytes après immunisation, ou encore dans les banques de phages, obtenues par les méthodes de phage display. Cette dernière technique 90 consiste à cloner dans des phagemides (vecteurs pour bactériophages) des séquences nucléotidiques de chaines lourdes et légères d'anticorps issues d'un mélange de lymphocyte B (activés ou non par immunisation) ou plasmocytes. Grâce à ces constructions, il est possible de produire des phages contenant ces séquences ADN et portant à leur surface les fragments variables 95 d'anticorps correspondants à ces séquences. Les phages portant des anticorps spécifiques de l'antigène d'intérêt sont alors sélectionnés et retenus sur l'antigène, impliquant plusieurs cycles de criblages et de lavages. Là encore, l'importance de la focalisation de la sélection sur l'antigène d'intérêt est cruciale. Celle-ci dépend de la méthode de sélection, de la nature de 100 l'antigène utilisé pour le criblage, mais aussi du moyen d'isolement. Ce dernier comprend : Le support et les molécules (peptides, protéines ou tout autres molécules) utilisées pour lier l'antigène au support. En effet, pour capturer les anticorps d'intérêt, ces techniques de sélection nécessitent l'immobilisation de l'antigène d'intérêt sur un support (Ex : Billes magnétiques). Cette 105 immobilisation repose généralement sur l'interaction forte d'un couple de molécules ou séquences peptidiques, l'une fusionnée à l'antigène d'intérêt, l'autre présente à la surface du support. Exemple : 6 histidines/Nickel, Streptavidine/Biotine, domaine de liaison à la chitine/Chitine. Cependant, ces molécules, ainsi que le support en lui-même représentent également une 110 source potentielle d'épitopes parasites, pouvant biaiser et défocaliser la sélection en sélectionnant des anticorps contre le moyen d'isolement, plutôt que sur l'antigène d'intérêt. Durant la sélection, cette défocalisation peut aller jusqu'à l'élimination de 115 l'anticorps ciblant l'antigène d'intérêt au profit d'anticorps dirigés contre d'autre régions de l'antigène que celle du paratope ou contre les moyens d'isolement. En raison des tailles souvent incompressibles des moyens d'isolement tels que ceux généralement utilisés pour fixer l'antigène sur un support (d'isolement ou de ségrégation) ainsi que la nature physique des supports d'isolement 120 généralement utilisés (verre, latex, stiren...), la focalisation n'est pas forcément améliorée par la diminution de la taille de l'antigène, même réduite à celle d'un haptène (contrairement à l'immunisation). Enfin, les séquences des anticorps utilisés en phage display étant souvent issues de lymphocytes immunisés, tout défaut de focalisation pendant 125 l'immunisation se répercute fatalement sur le phage display. Pour contourner, les problèmes de focalisation durant la sélection de l'anticorps 130 monoclonal résultant de la compétition entre, d'une part l'épitope de l'antigène, 3025605 3 et d'autre part les autres cibles immunogènes présentes tels que le reste de l'antigène et les moyens d'isolements, une approche couramment utilisée consiste à d'une part, durcir les conditions de sélection par plusieurs cribles comprenant des étapes successives de capture par affinité des anticorps dans 135 des conditions de plus en plus stringentes, et d'autre part en alternant différents moyens d'isolement : l'antigène est alors fixé successivement sur différents supports par différents peptides ou molécules. Ces mesures ont pour but, au cours des cribles, d'éliminer les anticorps dirigés contre d'autres cibles que l'antigène d'intérêt. De plus, le phage display classique nécessite plusieurs 140 étapes de précipitations suivies de purifications et d'infections bactériennes par les phages, afin de conserver des quantités suffisantes de phages. Habituellement, les moyens d'isolement réduisent l'infectiosité (la capacité à infecter et se multiplier dans des bactéries) y étant capturés (via l'antigène), Par conséquent, pour récupérer les phages capturés sur l'antigène, une étape de 145 clivage de l'anticorps par une protéase est généralement réalisée. Ces protéases ayant une spécificité de clivage relative selon les conditions de réaction, elles peuvent endommager les phages sélectionnés et nuire à la qualité du résultat de la sélection et entrainer une défocalisation de la sélection sur les phages exprimant l'anticorps d'intérêt. 150 Au delà des problématiques posées par la focalisation de la réponse immunitaire sur l'épitope de l'antigène et par la focalisation de la sélection des anticorps monoclonaux par l'épitope, se pose en plus, pour la méthode phage display, la question d'une défocalisation de la sélection de l'anticorps souhaité 155 au moment du clonage des séquences codantes des chaines lourdes et légères des anticorps dans le phagemide En effet, la perte de l'anticorps dirigé contre l'épitope souhaité, peut survenir même après une immunisation réussie, durant les étapes de création de la 160 banque de séquences codantes des chaines légères (L) et lourdes (H) À savoir, la rétrotranscription des ARNm en ADNc, et le clonage des ADNc des chaines légères (L) et lourdes (H) dans un phagemide, constituant alors une banque d'ADNc. Habituellement, les ADNc des deux chaines H et L sont clonés indépendamment de sorte que les ADNc des deux chaines sont associées de 165 manière aléatoires. Cela crée donc des combinaisons aléatoires de chaines H et L au sein des anticorps produits à la surface des phages durant le phage display. Par conséquent, après clonage, il est rare que les chaines H et L (formant l'anticorps spécifique de l'épitope d'intérêt) se retrouvent à nouveau combinées ensemble dans le même phagemide au cours du phage display. 170 Ces réappariements aléatoires peuvent donc entrainer la perte de l'anticorps d'intérêt. 175 Dans la suite de ce document nous définissons la défocalisation par les phénomènes entraînant la perte et/ou la dilution d'un ou plusieurs anticorps d'intérêt ou partie d'un anticorps, notamment durant les étapes faisant intervenir l'antigène pour : - la stimulation ou immunisation, 180 - la production, 3025605 4 - la sélection, - l'isolement, des cellules ou virus produisant le ou lesdits anticorps ou toute partie du ou desdits anticorps. 185 Nous définissons la focalisation par les phénomènes permettant l'augmentation de la proportion d'un ou plusieurs anticorps d'intérêt ou partie d'un anticorps dans un mélange, au travers de la sélection, stimulation, amplification, isolement, d'un clone exprimant ou sécrétant des anticorps ou 190 fraction d'anticorps, de type cellulaire, viral, bactérien, ou dudit/ desdits anticorps ou fraction d'anticorps. Cette focalisation peut être réalisée dans un organisme in vivo, ou hors d'un organisme ex vivo, ou encore in vitro sur des cellules ou virus. 195 Pour améliorer la focalisation de l'immunisation et/ou la sélection et/ou l'isolement et/ou la production d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux ou pseudo-monoclonaux (anticorps différents dirigés contre un même épitope) ou de toutes parties d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux ou pseudomonoclonaux reconnaissant un antigène d'intérêt, nous proposons un support 200 polyvalent d'immunisation et de sélection et un nouveau procédé utilisant ce support, pour la production d'anticorps monoclonaux et pseudo monoclonaux. 1-a) le support polyvalent d'immunisation et de sélection, comprend une phase de carbone diamant SP3 fixant des antigènes tels que peptide, poly-saccaride, 205 lipide, alcaloïde, acide nucléique, une combinaison quelconque de ces composés, ou toute autre type de molécules susceptibles de déclencher une réaction immunitaire ou d'être reconnue par un anticorps, de manière à ce que la liaison entre le support et l'antigène se fasse au travers d'une liaison covalente, préférentiellement une liaison carbone/carbone entre un carbone de 210 la phase diamant et un carbone de l'antigène. Le support de diamant n'est que très peu immunogène, les antigènes étant fixés par une liaison carbone/carbone (non peptidique ou autre), la réponse immunitaire est focalisée sur l'antigène uniquement. Dans certains modes de réalisation l'antigène est réduit à un haptène comportant uniquement le motif reconnu par 215 l'anticorps. 1-b ) Dans un mode de réalisation préférentiel le support polyvalent d'immunisation et de sélection sera saturé par l'antigène de manière à ce que tout le site de greffage accessible pour l'antigène soit occupé. En effet comme le 220 montre la Fig3 : un support de nano-diamants constitué de particules de diamants de 2pm fonctionnalisées par des sondes Poly A et déposées sur lame . Après fonctionnalisation par des sondes poly A non marquées, l'ajout de poly A fluorescent ou de BSA fluorescente montre que la surface diamant est saturée 225 et que l'absorption non spécifique est très faible (signal fluorescent très faible). En revanche, l'hybridation d'un brin complémentaire poly T fluorescent sur les sondes greffées, montre que le niveau de fonctionnalisation de la particule de diamant par la sonde poly A est très élevé, 230 3025605 1-c) Dans un mode de réalisation préférentiel, la fixation des antigènes sur le support polyvalent d'immunisation et de sélection en diamant est réalisé au travers d'une phase de carbone hydrogéné CHx (x=1,2,3) telle que le carbone hydrogéné réagit avec un carbone de l'antigène adjacent d'une fonction 235 nucléophile telle que NH2, COOH, SH, OH (éventuellement électrophile). Dans d'autre mode de réalisation la liaison covalente est réalisée au travers d'un carbone SP2 à la surface du support diamant. 1-d) Dans un mode de réalisation particulier les sites de greffage du support 240 polyvalent d'immunisation et de sélection laissés libres par l'antigène pourront être saturés par une molécule non immunogène telle que la glycine, les molécule PEG, etc. 1-e) Dans un mode de réalisation particulier le support polyvalent 245 d'immunisation et de sélection est comppsé ou comprend des particules de diamant dont la taille est comprise entre IQ'. nm et 500 pm préférentiellement 2 pm. Les particules seront préférentiellement hydrogénées CHx pour fixer les antigènes de manière saturante. 250 2-a) Dans un mode de réalisation particulier le support polyvalent d'immunisation et de sélection fonctionnalisé par un antigène, est utilisé pour immuniser un animal ou un humain par une injection sous-cutanée, une injection intramusculaire, une injection intra-péritonéale, une injection intraveineuse et plus généralement par tout moyen d'administration, ingestion, 255 injection ou autre moyen de pénétration dans l'organisme. 2-b) dans un mode de réalisation particulier, dans le cadre d'une injection sous cutanée ou intramusculaire, la zone d'injection sera soumise à une irradiation aux rayons X ou gamma de manière à générer une inflammation locale 260 susceptible de stimuler la réponse immunitaire. Cette irradiation sera utilisée préférentiellement avec un support polyvalent d'immunisation et de sélection diamant hydrogéné CHx ou éventuellement SP2, capable de générer des radicaux libres susceptibles de déclencher une inflammation locale. 265 2-c) Dans un mode de réalisation particulier, les supports polyvalents d'immunisation et de sélection en diamant, typiquement des particules de 10 nm à 500 pm, seront sensibles à un champs magnétique ou électrique de manière à ce que lesdits champs exercent sur les particules une force 270 susceptible de les déplacer ou de les attirer. Dans un mode de réalisation particulier les particules constituant le support seront des particules comportant un coeur magnétique ou paramagnétique par exemple un coeur de fer ou d'oxyde de fer, de nickel, de bore, de silice magnétique, de néodyme etc. ou une quelconque combinaison de ces éléments. Dans certain mode de réalisation, 275 une quelconque combinaison de ces éléments peut être directement intégrée à la structure cristalline SP3 ou SP2 de la particule de diamant. 2-d) dans un mode de réalisation particulier, la vaccination sera réalisée avec des supports polyvalents d'immunisation et de sélection sensibles à un champ 280 magnétique ou électrique, telle que la zone d'injection soit soumise à un champ 3025605 6 variant magnétique, éventuellement électrique ou une combinaison des deux, de manière à provoquer une agitation des particules générant un échauffement apte à déclencher une réaction d'inflammation, favorisant ainsi la réponse immunitaire. 285 2-e) dans certain mode de réalisation, la zone de vaccination sera soumise à un champ magnétique constant éventuellement pulsé, de sorte que les particules magnétiques du support polyvalent d'immunisation et de sélection, soient maintenues dans la zone d'injection. Ainsi, des particules magnétiques pourront 290 être, par exemple, injectées dans un tissu ou un organe, tel que la rate, la moelle osseuse, ou encore un ganglion lymphatique, etc., de manière à ce qu'un champ magnétique puisse retenir lesdites particules magnétiques dans le tissu ou l'organe afin d'y déclencher une réaction immunitaire spécifique. Dans certain mode de réalisation les particules pourront être guidées et 295 confinées dans un tissu ou un organe grâce à un champ magnétique pulsé ou continu. 3-a) Après la vaccination et la mise en place de la réponse immunitaire, les lymphocytes B et ou plasmocytes pourront être récupérés par n'importe quel 300 moyen déjà utilisé en biologie, tels que Ficoll, sédimentation etc. Toutefois dans un mode de réalisation particulier, les lymphocytes et/ou plasmocytes répondant à la vaccination pourront être récupérés grâce à des supports polyvalents d'immunisation formés de particules de diamant éventuellement sensibles à un champ électrique ou magnétique et recouvertes de l'antigène 305 relié par une liaison covalente avec la phase diamant. 4-a-1) Les lymphocytes et plasmocytes pourront être immortalisés en hybridomes et subir une sélection classique pour obtenir un hybridome monoclonal. 310 Dans d'autres modes de réalisation, les ARN messagers des lymphocytes et plasmocytes seront extraits, rétrotranscrits et clonés dans des phagemides, tel que chaque phagemide comporte une combinaison aléatoire entre une séquence du fragment lourd H variable provenant d'un des lymphocytes et ou plasmocytes extraits et une séquence du fragment variable léger L provenant 315 d'un des lymphocytes et plasmocytes extraits. Les séquences sont reliées par la séquence codante d'un peptide linker. Ainsi après introduction des phagemides dans des bactéries une banque de phages recombinants est produite telle que les phages expriment toutes les combinaisons entre les séquences lourdes et légères rencontrées entre les lymphocytes et/ou les 320 plasmocytes d'une extraction. L'expression des anticorps combinés se fera à la surface de la capside du phage grâce à la fusion de la séquence H-linker-L de l'anticorps recombiné avec tout ou partie de la séquence d'au moins une protéine de la capside du phage. Cette banque de phages pourra être criblée de manière traditionnelle pour sélectionner un anticorps ou encore être criblée de 325 manière vectorielle selon la stratégie de focalisation décrite plus bas dans ce document. Une alternative au clonage avec recombinaison, qui risque de défocaliser la sélection obtenue après une vaccination, consiste à cloner de manière séparée les chaînes lourdes et les chaînes légères sans recombinaison, de manière à obtenir deux banques distinctes de phages : une 330 pour les parties variables des chaînes lourdes et une autre pour les parties 3025605 7 variables des chaines légères. Dans certains modes de réalisation, la partie variable des chaînes lourdes seront clonées dans des phagemides tel que les parties variables soient reliées à un peptide linker et/ou à un peptide stabilisant tel que les parties constantes de la partie variable d'un anticorps par exemple 335 de type IgG. Le peptide stabilisant pourra comprendre tout ou partie de la région constante d'un anticorps excluant la partie variable de l'anticorps tel que la reconnaissance de l'antigène ne se fasse que par une seule chaîne. L'invention comprendra donc une banque de phages exprimant sur la capside soit uniquement tout ou partie de la chaîne lourde H d'anticorps, soit tout ou partie 340 des chaînes L d'anticorps. Lesdits anticorps correspondent par exemple aux anticorps codés par les ADNc issus des ARN messagers d'un extrait de Lymphocytes ou de plasmocytes résultants d'une immunisation. Les chaînes légères ou lourdes sont fusionnées avec tout ou partie d'au moins une protéine de la capside des phages et présentent éventuellement un peptide stabilisateur 345 de la chaîne telle que respectivement tout ou partie des parties non variables des chaînes légères ou lourdes. 4-a-2) Dans un mode de réalisation préférentiel, deux banques de phages simple-chaîne provenant : 350 - d'une part, de phagemides comportant les séquences des chaînes H fusionnées avec un peptide linker et tout ou partie des chaînes constantes d'une chaînes L elle-même fusionnée avec tout ou partie de la séquence d'une protéine de capside d'un phage par exemple la protéine P3, 355 - et d'autre part, de phagemides comportant les séquences des chaînes L fusionnées avec un peptide linker et tout ou partie des parties constantes d'une chaînes H elle même fusionnée avec tout ou partie de la séquence d'une protéine de capside d'un phage par exemple la protéine P3 (l'ordre des 360 fusions pouvant varier), Tel que lesdites banques sont criblées de manière successive par l'antigène d'intérêt contre lequel un anticorps est recherché. Dans un mode de réalisation particulier, l'antigène ciblé est fixé de manière covalente sur un support 365 polyvalent d'immunisation et de sélection, telles que des particules de diamant comprises entre 10nm et 500 dam, typiquement 2pm. Dans un mode encore plus préférentiel la fixation des antigènes est obtenue par une mise en contact directe des antigènes avec les particules de diamant hydrogénés CHx de manière à ce qu'une liaison carbone-carbone se forme entre au moins un 370 carbone de l'antigène et au moins un carbone de la surface. Après mise en contact de la banque simple-chaîne H et des particules de diamant, les particules seront isolées et criblées avec des lavages de stringences croissantes. Dans un mode de réalisation encore plus préférentiel les particules de diamant seront sensibles à un champ magnétique de sorte à 375 pouvoir les isoler en utilisant un aimant constant ou induit. Les auteurs ont mis en évidence le fait de pouvoir infecter directement des bactéries avec les phages retenus sur les particules d'un support polyvalent d'immunisation de diamant Figure 2. Ceci permet d'amplifier les phages capturés directement à partir de la capture sur les particules. Ce procédé évite le recours à un clivage 380 protéasique, ce qui simplifie la manipulation des phages après sélection d'une 3025605 8 part, en supprimant l'étape de séparation des phages du support de sélection, et ainsi minimise la défocalisation habituellement provoquée par la séparation protéasique. En effet, une étape de digestion peptidique telle que la digestion protéasique 385 est normalement nécessaire pour séparer le phage de l'anticorps capturé par l'antigène fixé sur le moyen d'isolement. Pour réaliser l'infection par les phages-anticorps sélectionnés, les particules ayant capturé des phages par affinité sont alors directement incubées avec une culture bactérienne en phase exponentielle de croissance à 37 °C. La passivité du diamant ainsi que 390 l'absence de peptide de liaison garantissent de collecter des phages très spécifiques en un seul cycle de crible, avec des rinçages de stringence croissante sans avoir à changer ni les supports de sélection, ni la nature de la fixation de l'antigène sur le support. Les séquences des chaînes lourdes offrant la meilleure affinité sont alors 395 clonées dans les phagemides des banques simple-chaîne légère, de manière à obtenir une banque par séquence lourde sélectionnée. Le clonage est réalisé de telle manière qu'il permet la reconstitution d'un anticorps chaine H, linker, chaîne L, (les séquences étant continues) et à former une fusion avec une séquence totale ou partielle d'une protéine de capside de phage. Chaque 400 banque est alors criblée de la même manière que pour la chaine lourde afin de déterminer le couple HL avec la meilleure affinité. La sélection peut éventuellement démarrer avec la banque de chaîne L. 4-a-3) Dans un mode de réalisation particulier, un criblage en parallèle est 405 utilisé. Il consiste à chaque étape de rinçage des particules, avec un tampon de stringence croissant au cours du criblage, d'archiver une fraction 1/X (x=2...5,...10 ect) des particules ayant capturé les phages spécifiques. La fraction archivée peut être stockée par exemple dans une plaque à puits, mais 410 est préférentiellement utilisée pour infecter une culture de bactéries éventuellement dans une plaque à puits pour amplification des phages. Lorsque toutes les conditions de stringence ont été testées, un échantillon normalisé de chaque puits est alors spoté ou déposé sur un support solide préférentiellement plat, de manière à obtenir une matrice de spots ou dépôts 415 dont les coordonnées XY permettent d'identifier le puits de provenance de la plaque et donc le niveau de stringence utilisé. La surface du support permet de fixer les phages du dépôt : par exemple surface diamant hydrogénée ou recouverte de particules de diamant hydrogénées, verre recouvert d'époxy, d'aldéhyde, de kapton, ou tout autre support capable de fixer les phages de 420 manière stable. Après la fixation des phages, la surface du support est passifiée pour neutraliser les fonctions qui n'ont pas réagi, puis la matrice est mise à complexer ou hybridée avec une solution d'antigène éventuellement marqué par un marqueur fluorescent, colorimétrique ou pour tout autre moyen de détection. L'intensité de signal, fluorescent ou de toute autre mesure 425 physique permettant de quantifier les antigènes capturés telles que SPR, LIBS Etc, relevée au niveau de chaque spot de la matrice est proportionnelle à l'affinité des anticorps ou du fragment d'anticorps présent à la surface des capsides des phages retenus sur le spot. Les spots les plus intenses permettent de déterminer les étapes de criblage les plus efficaces et de 430 sélectionner ces étapes pour isoler les phages exprimant les molécules de 3025605 9 plus grande affinité. Plus généralement le criblage d'une banque exprimant tout ou partie d'un anticorps tel que la dite banque, phage simple chaine, phage display, mélange cellulaire, bactérien, viral ou toute autre type cellulaire eucaryote ou procaryote, 435 exprime tout ou partie d'un anticorps comprend : Au moins une mise en contact de la banque et d'un support polyvalent d'immunisation et de sélection, fonctionnalisé par un antigène d'intérêt, Au moins une étape d'isolement, des supports polyvalents d'immunisation et de sélection qui ont réagit avec les éléments de la banque exprimant un 440 anticorps ou une fraction d'anticorps reconnaissant l'antigène et donc fixé sur le support polyvalent d'immunisation et de sélection Au moins une étape de mise en culture, d'infection bactérienne, d'amplification, des éléments de banque exprimant un anticorps ou une fraction d'anticorps reconnaissant l'antigène et fixée sur le support polyvalent d'immunisation, 445 Au moins une étape de dépôt sur un support solide préférentiellement plat, des éléments isolés de la banque de manière à obtenir une matrice de spots ou dépôts dont les coordonnées XY permettent d'identifier les éléments isolés de la banque, Au moins une étape de mise en contact, complexation, hybridation de la matrice 450 avec une solution d'antigènes éventuellement marqués par au moins un marqueur fluorescent, colorimétrique, permettant une détection par tout moyen de détection sans marquage tel que l'intensité de signal, fluorescent ou de toute autre mesure physique permet de quantifier les antigènes, au niveau de chaque spot de la matrice 455 Au moins une étape de séquençage Acide nucléique, quantitative, semiquantitative, des éléments isolés de la banque, de leur culture, des résultant d'infections bactériennes par lesdits éléments isolés. Dans un mode de réalisation particulier le support polyvalent d'immunisation et 460 de sélection comprendra en plus de l'antigène une séquence tag acide nucléique ou analogue telle que PNA (peptide nucléique Acide) ou toute autre analogue. Après capture des phages, les particules pourront alors être retenues sur une surface plane recouverte d'un acide nucléique complémentaire du tag, de 465 manière à permettre lors du dépôt de chaque spot de particule l'hybridation entre le tag et la séquence complémentaire du tag fixé sur la surface. Dans un mode de réalisation particulier la surface sera recouverte de diamant hydrogéné permettant d'établir une liaison carbone-carbone entre le diamant et la séquence complémentaire du tag par simple mise en contact. Après dépôt 470 de spot de particule ayant éventuellement capturé des phages, les acides nucléiques complémentaires du tag qui ne se sont pas hybridés avec le tag d'une particule seront éventuellement neutralisés par des séquences tag libre. 5) Les phages des puits de la plaque de stockage ou de culture correspondant 475 au spot avec les signaux les plus intenses sont séquencés par des méthodes vectorielles sur lame telle que celles commercialisées par les sociétés Ion Torent ou Illumina. Pour chaque puits séquencé, l'abondance de chaque séquence H et L dudit puits permettent de déterminer les anticorps ou le fragment d'anticorps présentant la plus grande abondance donc la plus grande 480 affinité. 3025605 6) Dans des applications particulières un transfert par application de la matrice de spot de particules ayant capturé des phages sur un tapis bactérien tel que ceux réalisés dans les puces à cellules permet la transfection directement par 485 la lame spotée avec les particules de capture de phages. 11) Les séquences H et L candidates identifiées pourront être clonées dans des organismes eucaryotes, procaryotes, ou encore être utilisées dans des dispositifs acellulaires dits cell free afin de produire l'anticorps. Dans 490 certains modes de réalisation les séquences seront clonées dans des algues soit au niveau nucléaire, soit au niveau chloroplaste afin d'obtenir, les séquences H, L, H et L reliées par un linker, éventuellement sécrétées par l'algue. 495 10) Dans certains modes de réalisation et en complément du brevet N°FR 1001516, après sélection les chaînes H et L seront produites séparément, un motif peptidique LPXTG (ou x = un des 20 acides aminés) sera greffé en C terminal de chacune des chaînes. Le motif LPXTG en C terminal des chaînes H et L permettra la fusion enzymatique de ces chaînes, grâce à la 500 sortase, en C' et N' terminal de deux PNA, ou tout autre analogue d'acide nucléique complémentaire comportant une séquence de peptide d'au moins une glycine liée par son extrémité C terminal à l'extrémité N' d'un PNA et respectivement à l'extrémité C' de l'autre PNA. Par exemple la liaison entre la séquence de peptide d'au moins une glycine et le PNA se fera d'une part, 505 grâce à une liaison peptidique entre le C' terminal de la séquence de peptide d'au moins une glycine et le N' terminal du PNA et d'autre part une liaison imide entre les C et C' terminus de la séquence de peptide d'au moins une glycine et du PNA. Les PNA seront appelés PNA de structure. 510 11) Dans certains modes de réalisation la recherche focalisée d'un anticorps utilisera deux banques indépendantes de phages simple chaîne L et H issues d'immunisations différentes. La combinaison de chaines H/L sera donc hétérogène éventuellement inter-espèces. Dans un mode de réalisation encore plus particulier la recherche focalisée d'un anticorps 515 utilisera deux banques de phages simple chaîne H et H indépendantes issus d'immunisations différentes. La combinaison de chaines H/H sera donc hétérogène éventuellement inter-espèces. Dans d'autres modes de réalisation la recherche focalisée d'un anticorps utilisera un banque de phages simple chaîne clonant des nanobodies et une banque de phages 520 simple chaîne clonant soit des chaînes L, soit des chaînes H soit les deux éventuellement une autre chaîne nanobody. La combinaison de chaînes nanobody/H ou L sera donc hétérogène éventuellement inter-espèces. 525 8) Dans certains mode de réalisation une première banque de phages simple chaînes correspondant à des peptides comportant tout ou partie des chaînes H, L ou nanobody sera criblé par un antigène d'intérêt tel que décrit au chapitre 4 afin de sélectionner les n séquences dont la chaîne respective présentent les plus grandes affinités pour l'antigène donné. Après 530 production de ces chaînes, chaque chaîne a(i) est fusionnée à m PNA a(j) de 3025605 11 structure tel que chaque PNA_a(j) présente une séquence différente et spécifique, et que chacun des PNA_a(j) se continue par une séquence tag_a(j) qui lui est propre de manière qu'un dit PNA_a(j) soit identifiable par ce tag_a(j). Une seconde banque b de phage simple chaîne correspondant 535 à des peptides comportant tout ou partie de chaînes H, L ou nanobody est criblé contre le même antigène, tel que décrit au chapitre 4, afin de sélectionner les m séquences dont les chaînes_b(j) sont les plus affines pour ledit antigène. Après production de ces m chaînes, chacune d'elle est fusionnée antiparallèlement à un PNA_b(j) choisi parmi m PNA de structure 540 tel que pour chaque PNA_a(j) il existe un PNA_b(j) complémentaire et que le dit PNA_b(j) soit spécifique de la chaîne_b(j) et d'elle seule. Une combinaison de m chaîne_a(i)-PNA_a(j) de structure sont alors mélangées aux m chaînes b(j) à associer à leur m PNA b (j) respectif, tel que chaque combinaison de chaîne_a(i)-PNA_a(j) s'apparie à sa combinaison 545 complémentaire chaîne_b(j)-PNA_b(j) pour former m complexes entre une dite chaîne_a(i) et les m chaînes_b(j). Les m complexes chaîne_a(i)- PNA_a(j)/chaîne_b(j)-PNA_b(j) sont alors mélangés à m supports polyvalents d'immunisation différents choisis parmi nxm, tel que chaque particule de diamant formant lesdits supports porte une double 550 fonctionnalisation d'une part une des m séquences (j) complémentaires au tag_a et d'autre part une séquence PNA ou analogue d'acide nucléique unique choisi parmi nxm séquences de PNA et permettant d'identifier formellement la particule. Ainsi chaque particule pourra fixer un complexe chaîne_a(i)-PNA_a(j)/chaîne_b(j)-PNA_b(j) donné qui sera identifiable de 555 manière unique par son tag de particule. L'opération est répétée pour les n chaînes_a(i) sélectionnées au cours de l'étape phage simple chaîne a, afin d'obtenir nxm particules fonctionnalisées par nxm combinaisons de chaînes a et b tel que chaque particules comporte une 560 combinaison unique chaîne_a(i)-PNA_a(j)/chaîne_b(j)-PNA_b(j) identifiable par un tag de particule unique. Les nxm complexes sont mis alors en contact avec l'antigène d'intérêt marqué. Après élimination éventuelle des antigènes libres, les complexes fixés à leur particule sont hybridés sur une matrice de spots ou chaque spot représente un acide nucléique, PNA, ou analogue d'acide 565 nucléique complémentaire d'une des séquences tag de particule unique, de manière à ce que les particules présentes puissent être capturées sur le spot complémentaire de leur séquence tag de particule. Une fois rincé le niveau de signal permet de déterminer l'affinité relative des complexes. 570 Dans certains modes de réalisation une stratégie identique peut être utilisée pour des chaînes produites par une même banque. Pour une complexité n=1 les complexes peuvent directement hybrider sur une matrice de spots sans l'utilisation des particules. 575 7) Dans certains modes de réalisation la sélection de l'anticorps d'intérêt utilisera l'antigène d'intérêt fixé éventuellement de manière covalente sur des supports polyvalents d'immunisation et de sélection tel que des particules de diamant, lesdites particules posséderont au moins une séquence tag, 580 qui pourra être une séquence de PNA, d'acide nucléique, ou de tout autre 3025605 12 analogue d'acide nucléique. La séquence tag spécifique permettra identifier sans ambiguïté la particule ainsi que le peptide d'intérêt. Des antigènes altérés de l'antigène d'intérêt seront fixés sur d'autres particules ou supports polyvalents d'immunisation et de sélection tel que lesdites particules soient 585 identifiables par un tag acide nucléique ou PNA unique pour une altération ou un type d'altération donné, ou par classe d'altération. Par exemple les altérations pourront être des modifications de l'antigène d'intérêt par des glycosylations, des modifications ou suppressions ou ajouts de fonctions chimiques, des substitutions ou délétions d'acides aminés ou de résidus, 590 ou une combinaison de ces modifications. 11-a ) dans certains modes de réalisation un mélange de particules, éventuellement sensibles à un champ magnétique, et fonctionnalisées soit par l'antigène d'intérêt, soit par des antigènes altérés tels que lesdites particules 595 parfaitement identifiables au travers de tags pour l'antigène d'intérêt et pour chaque différent type d'altération, sont mises en contact avec une banque de phages simple chaîne ou éventuellement une banque de phage display. Puis les particules sont isolées par hybridation spécifique de leur tag, par exemple sur une puce comportant une matrice de spots de séquences ou de sondes 600 acide nucléique ou analogue complémentaire des tag, un peigne où chaque dent est fonctionnalisée par un type de sonde ou séquence acide nucléique ou analogue complémentaire d'un type de tag ou par l'action successive de barreaux ou de baguettes fonctionnalisées par un type de sonde ou séquence acide nucléique ou analogue complémentaire d'un type de tag. Après 605 séquençage et quantification des séquences des différents types de chaînes retenues au travers des phages et l'étude des altérations et de leur position dans la séquence, la chaîne la plus affine et la plus spécifique pour l'antigène d'intérêt et pour ces altérations pourra être déterminée. Une séquence consensus pourra être également déterminée. 610 11-b) Dans d'autres modes de réalisation des antigènes et des antigènes altérés fixés sur des billes possédant un tag permettant d'identifier spécifiquement l'antigène ou les antigènes altérés, sont utilisés pour sélectionner des lymphocytes B et ou des plasmocytes d'un mélange cellulaire. 615 Le séquençage des ARNm ou des ADNc provenant des chaînes L et H des lymphocytes ou plasmocytes isolés permet d'identifier les chaînes les plus affines. L'analyse de séquences consensus permet de définir de nouveaux anticorps. 620 12) dans certains modes de réalisation un mélange d'antigènes différents sont fixés sur des billes, éventuellement sensible à un champ magnétique et possédant un tag tel que chaque tag permet d'identifier spécifiquement un antigène donné. Le mélange de particules est utilisé pour cribler une banque de phages simple chaîne ou éventuellement une banque de phages display. Les 625 particules sont alors isolées grâce à leur tag tel que décrit en chapitre 11, chaque type de particules est alors traité séparément de manière à identifier par séquençage les séquences H et L des phages retenus sur chacune des particules. Dans certains modes de réalisation les particules ségréguées par leur tag grâce à une matrice de sondes de séquences complémentaires au tag 630 ou par des peignes sont utilisées pour infecter des phages en tapis cellulaire 3025605 13 ou en plaques 96 puits. 13) dans un mode de réalisation particulier, un mélange d'antigènes provenant par exemple d'un type cellulaire 1 est utilisé d'une part, pour 635 fonctionnaliser un support polyvalent d'immunisation et de sélection A tel que des particules de diamant hydrogénées et d'autre part pour fonctionnaliser un support polyvalent d'immunisation tagué B tel que des particules de diamant hydrogénées marquées avec un tag B acide nucléique ou équivalent tel que un tag de PNA permet d'identifier les particules donc l'origine des antigènes. Un 640 second mélange d'antigènes provenant par exemple d'un autre type cellulaire 2 est utilisé d'une part pour fonctionnaliser un support polyvalent d'immunisation et de sélection C tel que des particules de diamant hydrogénées et d'autre part pour fonctionnaliser un support polyvalent d'immunisation tagué D tel que des particules de diamant hydrogénées marquées avec un autre tag D acide 645 nucléique ou équivalent tel que un tag de PNA permettant d'identifier les particules donc l'origine des antigènes. Les particules de diamant fonctionnalisées A C non taguées sont alors 650 mélangées et utilisées pour vacciner au moins un animal. Après isolement des lymphocytes B et des plasmocytes d'au moins un animal et extraction, amplification et clonage de tout ou partie des séquences codant pour les chaînes H et L éventuellement H de nanobody. Une banque de phages display ou deux banques de phages simple chaîne L et 655 H ou une banque de phages simple brin H nanobody sont ou est réalisées tels que les phages de la ou des banques expriment sur leur capside tout ou partie des chaînes H et/ou L ou H nanobody codé par les ARNm des lymphocytes B ou plasmocytes extraits. La ou les banques sont alors criblées par les particules B et C taguées par leur 660 PNA spécifiques fonctionnalisées par les mélanges d'antigènes, successivement ou de préférence avec un mélange équimolaire ou « equiparticulaire » des deux types de particules taguées, de manière que les anticorps ou fraction d'anticorps exprimés à la surface des phages et présentant une affinité pour des antigènes fixés sur les particules taguées puissent être 665 spécifiquement capturées par les particules taguées, en même temps que les phages supportant lesdits anticorps ou fragment d'anticorps. Les antigènes présents sur les particules B et C captureront les anticorps de manière concurrentielle entre les particules de type B et de type C. Après isolement des particules B et des particules C grâce aux tags PNA B et C différents, l'ADN des 670 phages capturés sur les particules grâce à l'affinité des anticorps ou fragment d'anticorps pour les antigènes fonctionnalisant est séquencé de manière quantitative. La différence d'abondance et la nature des séquences H et ou L provenant des phages des particules B et des phages des particules C permet de déterminer l'abondance relative entre les antigènes présents à la surface 675 des deux types de particules B et C. Les séquences d'anticorps ou portions d'anticorps les plus pertinentes par exemple celles qui présentent un différentiel d'abondance le plus élevé entre les deux types de particules taguées donc entre les deux types cellulaires pourront être transformées en anticorps ou en fragment d'anticorps puis greffées spécifiquement sur des particules taguées 680 tel que à un anticorps ou fragment d'anticorps corresponde un tag et un seul. 3025605 14 Lesdites particules taguées pourront alors être utilisées pour capturer et isoler dans les mélanges d'antigènes, leur antigène spécifique par exemple selon un des modes de réalisation décrit précédemment, tel que ségrégation sur une matrice de sondes dirigées contre les tag, peigne ou baguette comportant des 685 sondes dirigées contre les tags ou tout autre mode de réalisation mettant en jeu lesdits anticorps ou fragments. Les antigènes isolés par les particules fonctionnalisées par des anticorps pourront être analysés et identifiés par des méthodes d'analyse classiques telles que la spectrométrie de masse, la RMN, etc. 690 13-a) dans certains modes de réalisation le procédé décrit en 13) pourra être utilisé pour rechercher des marqueurs de maladie tel que le cancer, les maladies dégénératives, etc. En comparant la signature anticorps ou fragment d'anticorps obtenus entre une cellule saine et une cellule malade. 695 13-b) Dans certains modes de réalisation les antigènes isolés par le procédé pourront être utilisés pour réaliser une vaccination éventuellement curative en association ou non avec un support polyvalent d'immunisation. 700 13-C) Le procédé décrit en 13) pourra être utilisé pour analyser simultanément plusieurs ensembles ou fractions d'antigènes chaque ensemble d'antigènes étant utilisé pour fonctionnaliser une particule avec un tag spécifique à cet ensemble. Dans certains modes de réalisation, l'ensemble d'antigènes se réduit à un antigène unique. 705 14) Dans certains modes de réalisation un support polyvalent d'immunisation et de sélection, tel que des particules de diamant hydrogéné, éventuellement sensible à un champs magnétique, sont fonctionnalisés par un antigène 710 d'intérêt, alors qu'un autre support polyvalent d'immunisation et de sélection, tel que des particules de diamant hydrogéné, sont fonctionnalisés par des antigènes altérés tel que l'altération supprime l'haptène ou éventuellement l'épitope contre lequel un anticorps est recherché. Les deux types de particules fonctionnalisées seront alors injectées à des zones corporelles différentes d'un 715 sujet afin de déclencher des réactions antagonistes. Par exemple les particules comportant les antigènes altérés seront injectés dans la rate ou dans la moelle osseuse du sujet ou dans tout organe où se produit la présentation des antigènes du moi, autrement dit où les lymphocytes B dirigés contre le moi sont éliminés, alors que les particules fonctionnalisées 720 avec l'antigène d'intérêt seront injectées dans une zone où la réponse immunitaire sera déclenchée tel qu'une zone sous cutanée, muscle, péritoine, sang, ou toute zone corporelle pour laquelle un corps étrange déclenche une réaction immunitaire. 725 15) Dans certains modes de réalisation les phages des banques de phage display ou de phages simple chaînes comporteront au moins une protéine fluorescente parmi les protéines de leur capside permettant de les identifier de les quantifier directement au cours de leur sélection par les supports polyvalents d'immunisation et de sélection. Cette fluorescence sera obtenue par 730 exemple par la présence d'au moins une protéine P9 ou partie de la protéine P9 3025605 fusionnée avec toute ou partie d'une protéine fluorescente telle que la GFP. Ces phages fluorescents permettront d'évaluer immédiatement la quantité de phages présents à la surface d'un support polyvalent d'immunisation. 735 15-a) Dans certains modes de réalisation des banques de phages différentes comportent respectivement des phages présentant une protéine de fusion de leur capside avec fluorescence propre et différentes pour chaque banque permettant le criblage simultané des banques avec un antigène d'intérêt, l'analyse de la fluorescence retenue sur les particules de diamant permet ainsi 740 d'identifier l'origine des phages. Ainsi, dans certains modes de réalisation une banque de phages simple chaîne H possédera des phages avec une fluorescence d'une couleur donnée par exemple vert alors que les phages d'une seconde banque simple chaîne L possédera des phages d'une autre couleur, par exemple rouge. Lors des lavages successifs, la variation de la fluorescence 745 retenue sur les particules permet d'estimer la variation de l'affinité des anticorps ou fragments d'anticorps retenus sur les particules. 16) Dans certains modes de réalisation les phages exprimant un anticorps donné ou fragment d'anticorps et possédant au moins une protéine de fusion 750 de leur capside fluorescente, peuvent directement être utilisés pour faire un marquage immunogène fluorescent. 17) Dans certains modes de réalisation les supports polyvalents d'immunisation et de sélection de particule de diamant sont fixés sur des billes 755 ou microparticules sensibles à un champ, magnétique, électrique, tel que billes de latex, de polystyrène de silicium comportant des éléments magnétiques de manière que lesdits champs exercent sur les billes une force susceptible de les déplacer, les attirer, les immobiliser. 760 18) Dans certains modes de réalisation les surfaces planes utilisées pour réaliser les matrices de spots sera une surface de polymère PMMA, Kapton, styrene, vinyl .. incluant des particules de diamant de 10 nm à 500pm 765 LEGEN DES : Figure-1 : Sélection par phage display - affinité des phages-ScFv pour la CadE fluorescente mesurée par puce. 770 Figure-1.1 : Phages-ScFv issus de la sélection phage display par des supports polyvalents d'immunisation et de sélection recouverts de peptide Cadhérine E . Ces phages sont amplifiés, déposés sur lame et incubés avec du peptide Cadhérine E fluorescent. La quantité de peptides Cadhérine E retenus sur les 775 spots est évaluée par un scanner à fluorescence. Figure-1.2 : Phages-ScFv issus de la sélection phage display par des billes magnétiques (sans peptide de sélection). Ces phages sont amplifiés, déposés sur lame et incubés avec du peptide Cadhérine E fluorescent. La quantité de 780 peptides Cadhérine E retenus sur les spots est évaluée par un scanner à 3025605 16 fluorescence. Figure1.3 : Représentation graphique de la quantité de fluorescence (liée à la quantité de peptides Cadhérine E fluorescents fixés) par dépôt de phages en 785 fonction de la stringence au cours des lavages de la sélection de phage display des supports polyvalents d'immunisation et de sélection recouverts de peptide Cadhérine E ayant capturé des phages. Figurel.4 : Représentation graphique de la quantité de fluorescence (liée à la 790 quantité de peptides Cadhérine E fluorescents fixés) par dépôt de phages en fonction de la stringence au cours des lavages de la sélection phage display par des billes magnétiques (sans peptide de sélection). Figurel.5 : Représentation schématique de l'augmentation de stringence 795 réalisée au cours des étapes de phage display. Figure-2 : Infectivité des phages-ScFv associés aux supports polyvalents d'immunisation et de sélection particules de nanodiamants 2pm. 800 Figure-2.6 : Phages-ScFv capturés par des nanodiamants recouverts de CadE, directement utilisés pour infecter des bactéries. Les phages sont amplifiés, purifiés, normalisés, déposés sur lame et révélés par CadE fluorescente. 805 Figure-2.7 : Phages-ScFv capturés par des nanodiamants recouverts de peptide triGlycine (non immunogène), directement utilisés pour infecter des bactéries. Les phages sont amplifiés, purifiés, normalisés, déposés sur lame et révélés par CadE-fluorescente. 810 Figure-2.8 : Quantification de la fixation de CadE sur le dépôt 6 par scanner. Intensité de fluorescence exprimée en unités arbitraires (UA). Figure-2.9 : Quantification de la fixation de CadE sur le dépôt 7 par scanner. Intensité de fluorescence exprimée en unités arbitraires (UA). 815 Figure-3 : Exemple d'une solution de nano-diamants de 2pm fonctionnalisés par des sondes Poly A et déposés sur lame . 10 : sondes poly A non marquées 820 12 : brin complémentaire poly T fluorescent 14 : signal fluorescent saturant 825 13 : signal fluorescent très faible Figure-3.10 : Après fonctionnalisation par des sondes poly A non marquées (10), 830 Figure-3.11 : l'ajout de Poly A fluorescent (11) ou de BSA fluorescente montre 3025605 17 que la surface diamant est saturée et que l'absorbtion non spécifique est très faible (signal fluorescent très faiblel3 ). Figure-3.12 :En revanche, l'hybridation d'un brin complémentaire poly T 835 fluorescent (12) sur les sondes greffées, montre un niveau de fonctionnalisation très élevé des particules (signal fluorescent saturant) (14). REVENDICATIONS1) Dispositif de focalisation pour la sélection, l'isolement, l'amplification ou la stimulation d'un clone cellulaire ou viral ou d'un anticorps ou partie 5d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend un support polyvalent comprenant une phase de carbone diamant SP3 liée à un antigène par une liaison covalente telle que carbone/carbone, entre un carbone de la phase diamant et un élément de l'antigène. 2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support lOpolyvalent d'immunisation et de sélection, comprend des particules de diamant d'une taille comprise entre 10 nanomètres et 500 microns. 3) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'une fixation d'au moins un antigène sur le support polyvalent 15d'immunisation et de sélection en diamant est réalisé au travers d'une phase de carbone hydrogéné CHx (x=1,2,3) telle que le carbone hydrogéné, éventuellement un carbone SP2, réagit avec un carbone de l'antigène adjacent d'une fonction nucléophile telle que NH2, COOH, OH , éventuellement une fonction électrophile. 20 4) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support polyvalent d'immunisation et de sélection en diamant est sensible à un champ, magnétique, électrique, de manière que lesdits champs exercent sur le support polyvalent d'immunisation et de sélection une force susceptible de le déplacer, de l'attirer, l'immobiliser, le repousser, et dans un mode de réalisation particulier ledit support 25polyvalent d'immunisation et de sélection comprendra des particules comportant un coeur magnétique, paramagnétique tel que un coeur de fer, d'oxyde de fer, de nickel, de bore, de silice magnétique, de néodyme, et plus généralement au moins un élément sensible à un champs magnétique, électrique, une quelconque combinaison de ces éléments éventuellement directement intégrée à la structure cristalline SP3 ou SP2 des particules de 3 Odiamant. 5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support polyvalent d'immunisation et de sélection en diamant soit fixé sur des billes ou microparticules sensibles à un champs, magnétique, électrique, de 35manière que lesdits champs exercent sur les billes une force susceptible de les déplacer, les attirer , les immobiliser, les repousser. 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour son 3025605 19 utilisation pour immuniser un animal ou un humain. 7) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour son utilisation pour générer une inflammation sous l'action d'un rayonnement, d'un champ magnétique, d'un champ électrique. 8) Procédé de focalisation in vitro pour la sélection, l'isolement, l'amplification, la stimulation d'un clone, cellulaire, viral, d'un anticorps ou partie d'anticorps mettant en oeuvre un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support polyvalent d'immunisation et de sélection fonctionnalisé 10par un antigène, permet de sélectionner au moins un clone de phage exprimant un type d'anticorps tel qu' au moins un phage fixé sur le support polyvalent d'immunisation conserve une capacité à infecter des bactéries. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'un criblage d'une 15banque exprime tout ou partie d'un anticorps tel que la dite banque, phage simple chaine, phage display, mélange cellulaire, bactérien, viral ou tout autre type cellulaire eucaryote ou procaryote, expriment tout ou partie d'un anticorps, et en ce qu'il comprend : - Au moins une étape de mise en contact de la banque et d'un support polyvalent d'immunisation et de sélection, fonctionnalisé par un antigène d'intérêt, 20 - Au moins une étape d'isolement, des supports polyvalents d'immunisation et de sélection et des éléments de banque exprimant un anticorps ou une fraction d'anticorps reconnaissant l'antigène, fixés sur le support polyvalent d'immunisation et de sélection - Au moins une étape de mise en culture, infection bactérienne, 25amplification, des éléments de banque exprimant un anticorps ou une fraction d'anticorps reconnaissant l'antigène et fixé sur le support polyvalent d'immunisation, - Au moins une étape de dépôts sur un support solide préférentiellement plat, des éléments isolés de la banque de manière à obtenir une matrice de spots ou dépôts dont les coordonnées XY permettent d'identifier les éléments isolés de 301a banque, - Au moins une étape de mise en contact complexation hybridation de la matrice avec une solution d'antigènes éventuellement marqués par un marqueur fluorescent, colorimétrique, détectable par tout moyen de détection physique tel que l'intensité de signal, fluorescent, de toute autre mesure physique permettant de quantifier 351es antigènes, au niveau de chaque spot de la matrice, - Au moins une étape de séquençage Acide nucléique, quantitative semi-quantitative, d'élément isolé, de leur culture, des résultats des infections bactériennes par lesdits éléments isolés. 3025605 20 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce qu'un support polyvalent d'immunisation et de sélection comprendra en plus de l'antigène d'intérêt, au moins une séquence tag acide nucléique ou analogue telle que PNA 5(peptide nucléique Acide) ou toute autre analogue permettant d'identifier, d'adresser spécifiquement le support polyvalent d'immunisation et de sélection sur un surface plane, une plaque, des peignes, tout objet comprenant des acides nucléiques complémentaires du tag, des antigènes comportant le tag. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'un support polyvalent d'immunisation comprend des particules fonctionnalisées par des antigènes différents, tel que un antigène d'intérêt et des variantes de ce même antigène altéré, dans certain mode de réalisation chaque antigène ou type d'antigène fixé à une particule est identifiable par un tag acide nucléique fixé à la dite particule. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que au moins deux banques codant pour des fragments d'anticorps différents, sont criblées pour réaliser un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un antigène d'intérêt, les deux banques pouvant être criblées indépendamment, tel que les résultats 20indépendants sont combinés pour réaliser une molécule, des sous-unités de molécule formant un anticorps, fraction d'anticorps, synergique de manière à ce que la première sélection du criblage d'une première banque soit utilisé dans le criblage d'une seconde banque. 25 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que les banques, phages, cellules, utilisés comportent des éléments tels que phages ou cellules expriment des protéines fluorescentes. 14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé 30en ce que des banques de phage soient focalisées à partir d'extrait cellulaire, éventuellement fractionné, fixé sur un support polyvalent d'immunisation et de sélection.