FR 3031988 A1 20160729 FR 1500163 A 20150128 1 Détection sélective de bactéries lactiques etiou acétiques ou de champignons La présente demande concerne la détection sélective de bactéries ou la détection sélective de champignons dans un mélange de ces bactéries et de ces champignons. La présente demande concerne ainsi la détection, la mesure ou l'estimation de la présence de bactéries lactiques ou acétiques, dans un mélange comprenant ces bactéries lactiques ou ces bactéries acétiques et comprenant des champignons, notamment des levures ou des moisissures. Un tel mélange se rencontre dans des boissons comme la bière, le vin, dans l'industrie sucrière lors de la pression du jus de betteraves sucrières ou de canne à sucre et les boissons carbonatées sucrées comme la limonade, ou les jus de fruit lors de leur fabrication. La présente demande concerne aussi la détection, la mesure ou l'estimation de la présence de champignons, dans un mélange comprenant des bactéries lactiques ou des bactéries acétiques et comprenant lesdits champignons, notamment des levures ou des moisissures. La présente demande concerne encore plus particulièrement, l'estimation, dans un milieu contenant des champignons, de la présence de bactéries lactiques ou acétiques, par mesure de l'adénosine triphosphate ou ATP de ces bactéries, ou ATPmétrie, notamment en utilisant de la luciférine, de la luciférase et une mesure de bioluminescence. La présente demande concerne également ladite estimation par l'ajout d'un réactif de luminescence, tel le luminol ou un marqueur de viabilité, permettant aux microorganismes viables d'émettre une luminescence mesurable ou détectable, avec ou sans excitation, par tout moyen optique. Une bactérie acétique désigne ci-dessous une bactérie aérobie à Gram négatif capable de transformer l'éthanol en acide acétique. Les bactéries acétiques sont présentes dans le vin et le cidre et rarement dans la bière saturée en dioxyde de carbone. Le développement des bactéries acétiques est indésirable dans le vin après fermentation alcoolique et ou malolactique, ainsi que dans la bière, et dans les boissons carbonatées et sucrées. Une bactérie lactique désigne ci-dessous une bactérie à Gram positif, anaérobie facultative ou microaérophile, se présentant notamment sous forme de coques ou de bâtonnets ou de tétrades et capable de fermenter les sucres en acide lactique. Les bactéries lactiques sont présentes dans le vin, le cidre, les jus de betteraves sucrières et de canne à sucre et peuvent l'être dans les boissons carbonatées notamment de sodas et les jus de boissons sucrées. Le développement de bactéries lactiques est indésirable après la fermentation du vin et sulfitage, et dans le cidre sans fermentation malo-lactique car elles peuvent altérer les qualités organoleptiques du vin et du cidre. Les bactéries lactiques sont indésirables dans la bière, sauf pour certaines bière types lambics ou Berliner VVeisse ou les bactéries lactiques sont ajoutées en phase de fermentation. Dans l'industrie sucrière, le développement de certaines bactéries lactiques, tel «leuconostoc mesenteroides» consomment le saccharose dans les jus de betterave sucrière engendrant problèmes de filtration et pertes financières. Les mots « des bactéries lactiques ou des bactéries acétiques » doivent être compris dans toute la demande comme signifiant soit des bactéries lactiques, soit des bactéries acétiques, soit des bactéries lactiques et des bactéries acétiques. 3031988 2 Les termes « bactéries » ou « flore bactérienne » doivent être compris dans la demande comme synonyme de « bactéries lactiques ou acétiques », à moins qu'il n'en soit disposé autrement. Les termes « champignons » ou « flore fongique » doivent être compris dans la demande 5 comme synonyme de « moisissures ou levures », Le terme « matrice », doit être compris dans la demande comme une composition de matière (« Composition of matter » en anglais) qui comprend des bactéries et des champignons. Un tel mélange peut être solide, notamment lorsqu'il sec en tant que filtrat ou après centrifugation, ou humide s'il est dispersé dans un liquide, ou gazeux, par exemple un 10 prélèvement d'air. Les termes « matrice agro-alimentaire», doivent être compris comme un support solide ou liquide ou gazeux contenant en volume ou à sa surface, une flore microbienne rencontrée dans l'industrie agro-alimentaire y compris l'agriculture, ou lors de la production artisanale d'aliments ou de boissons. 15 Les mots « application en phase liquide d'un produit A sur un produit B » signifient dans la demande une opération dont le résultat est un liquide contenant A et B en solution ou en dispersion. Une application en phase aqueuse signifie une application en phase liquide pour un liquide qui est de l'eau ou un liquide compatible avec la survie des bactéries dans la solution obtenue par l'application. 20 Les mots ATP ou adénosine triphosphate désignent dans la demande, la molécule qui, dans la biochimie de tous les organismes vivants connus, fournit par hydrolyse, l'énergie nécessaire aux réactions chimiques du métabolisme. Les mots « ATP libre » désignent l'ATP hors de toute cellule, que cet ATP soit disponible ou non pour une réaction de bioluminescence. 25 Les mots luminescence désignent toute luminescence non présente à l'état naturel dans l'échantillon analysé, mais provoqué par l'ajout d'un ou plusieurs réactifs indispensables à cette réaction de luminescence, ladite luminescence étant détectable dans les cellules microbiennes viables de l'échantillon notamment par tout système optique avec ou sans excitation de cette luminescence. 30 Le mot « bactéricide » désigne un traitement ayant pour effet de réduire une population bactérienne d'au moins trois logarithmes décimaux d'unités formant colonies/ml lors d'un comptage sur gélose d'un échantillon après traitement. L'ergostérol désigne un composant de la membrane ou paroi des champignons. Un « précurseur stérolé de l'ergostérol » désigne une molécule ayant la structure chimique 35 d'un stérol à savoir un lipide possédant un noyau de stérane dont le carbone 3 est porteur d'un groupe hydroxyle produit lors de la biosynthèse de l'ergostérol dans la cellule fongique. Les mots « bêta-glucanes » désignent des polysaccharides constitués de D-glucose liés par des liaisons bêta qui peuvent être p(1-3), p(1-4) ou [3(1-6), les chiffres indiquant les atomes de D-glucose concernés. 3031988 3 Les mots « inhibition non compétitive » désignent une inhibition d'une enzyme réduisant l'activité de cette enzyme en se fixant avec autant d'affinité pour cette enzyme que cette enzyme soit ou non fixée à son substrat. Le mot MRS désigne soit un bouillon ou une gélose de Man, Rogosa et Sharpe. 5 Le mot Luminol désigne une molécule de formulation chimique C8H7N302 qui produit une chimiluminescence avec un éclat bleu caractéristique, lorsqu'il est mélangé à certains oxydants. Cette réaction de luminescence avec le luminol peut aussi être catalysée par ajout d'un catalyseur, tel le ménadione. Un certains nombres d'études montrent une corrélation entre le signal de luminescence du luminol et le nombre de cellules bactériennes dans 10 l'échantillon. Le mot marqueur de viabilité désigne tout marqueur utilisé soit pour vérifier l'état de la paroi cellulaire des cellules mortes, endommagées ou intègres tel que le iodure de propidium, ou le bromure d'ethidium, soit pour détecter l'activité enzymatique intracellulaire tel que par exemple l'activité estérase d'une cellule viable microbienne souvent mesuré en introduisant 15 une molécule non luminescente qui devient luminescente après conversion enzymatique dans la cellule viable, soit pour vérifier simultanément l'intégrité de la paroi cellulaire et l'activité enzymatique intracellulaire de la cellule viable. Le marquage est non spécifique à une espèce particulière de microorganismes et ne comprend ni les sondes nucléiques, ni les amorces Adn ou Arn. Ce marqueur de viabilité est détectable par luminescence. Il peut être 20 utilisé avec un contre-marqueur pour améliorer la détection par luminescence des cellules marquées. L'art antérieur connaît la technique de l'ATPmétrie qui permet une mesure de l'ATP libre dans une solution pour estimer la biomasse présente dans la solution. Cette technique suppose premièrement de rendre disponible, par libération dans la solution, l'ATP de la 25 biomasse, par exemple par un agent de lyse qui provoque la mort des organismes vivants et libère leur ATP dans la solution, puis suppose d'effectuer une mesure de luminescence proportionnelle à la quantité d'ATP libre dans la solution. À cette fin, on utilise une réaction connue de bioluminescence utilisant le complexe substrat-enzyme luciférine-luciférase. La réaction de bioluminescence a lieu grâce à une activation préalable de la luciférine par 30 l'hydrolyse d'adénosine triphosphate. L'intensité lumineuse produite peut être rendue proportionnelle à la quantité d'ATP libre dans le mélange et il est ainsi possible, grâce à un luminomètre, d'obtenir optiquement une évaluation de la quantité d'ATP dans un échantillon. On entendra par agent de lyse : un produit apte à ouvrir la membrane des bactéries ou des champignons. Toutefois, la plupart des agents de lyse ne donnent accès qu'à la quantité 35 totale d'ATP intracellulaire de la biomasse totale présente dans une solution. Pour un mélange de bactéries et de champignons, il est ainsi impossible d'obtenir séparément une mesure de la valeur d'ATP intracellulaire de la flore bactérienne ou une mesure de la valeur d'ATP intracellulaire de la flore fongique. Il est alors utilisé une filtration mécanique pour retenir les champignons quand ils sont de 40 plus grande taille que les bactéries. Toutefois, pour un mélange de bactéries lactiques et acétiques, la filtration n'est pas efficace. En effet, il existe un recouvrement entre les tailles des levures et des champignons et les tailles des amas de bactéries lactiques et acétiques dont certaines bactéries lactiques se forment naturellement en chaînettes de longueur très 3031988 4 variables, en tétrades, ou en amas aussi bien pour les bactéries acétiques que les bactéries lactiques. Les levures Brettanomyces bruxellensis présentes dans le vin et le cidre exposées au sulfite réduisent, par exemple, leur taille pour avoisiner celle des bactéries acétiques et lactiques unicellulaires. Certaines bactéries lactiques se fixent aussi sur les levures rendant 5 impossible leur séparation mécanique. En pratique, la mesure sélective par ATPmétrie de la biomasse bactérienne lactique ou acétique dans un mélange d'une flore bactérienne et d'une flore fongique est donc pour l'art antérieur un problème difficile. Il en est de même de l'obtention de la mesure sélective de la biomasse fongique dans un tel mélange, sauf à négliger la biomasse bactérienne. 10 Dans ce contexte l'invention concerne un procédé pour la détection de bactéries lactiques et/ou acétiques dans une matrice agro-alimentaire comprenant une flore microbienne, la flore microbienne comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et comprenant 15 une flore fongique, la flore bactérienne contenant un adénosine triphosphate d'origine bactérienne, la flore fongique contenant un adénosine triphosphate d'origine fongique, qui comprend les étapes suivantes: - appliquer à la matrice, un antifongique possédant une action antifongique létale à une première échéance, sur la flore fongique, et une action antibiotique non létale à une seconde 20 échéance postérieure à la première échéance, sur la flore bactérienne, - détecter la flore microbienne entre la première échéance et la seconde échéance. Dans des variantes du procédé : - l'action antifongique létale libère, dans la matrice, pour la première échéance, l'adénosine triphosphate d'origine fongique et la flore microbienne est détectée entre la première 25 échéance et la seconde échéance au moyen des étapes suivantes: - éliminer de la matrice l'adénosine triphosphate libre puis, - appliquer à la matrice un agent de lyse, pour libérer de la matrice l'adénosine triphosphate d'origine bactérienne puis, - mesurer l'adénosine triphosphate libéré. 30 - l'antifongique est un inhibiteur de l'ergostérol. - l'antifongique est un inhibiteur d'un précurseur stérolé de l'ergostérol. - l'antifongique possède un groupe fonctionnel glutarimide et est un inhibiteur de l'étape de translocation de la phase d'élongation de la synthèse protéïque des eucaryotes. - l'inhibiteur de l'ergostérol est une molécule de la famille des polyènes. 35 - l'inhibiteur d'un précurseur stérolé est une molécule de la famille des morpholines. - l'inhibiteur d'un précurseur stérolé est une molécule de la famille des azotés. - l'antifongique est un inhibiteur de la synthèse des bêta-glucanes. 3031988 L'invention concerne aussi un dispositif qui comprend un antifongique possédant après application une activité antifongique létale à une première échéance, sur une flore fongique, et une activité antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur une flore bactérienne lactique et/ou acétique, et qui comprend un moyen de 5 détection d'une flore microbienne comprenant la flore fongique et la flore bactérienne lactique et/ou acétique. Dans une variante du dispositif : - le moyen de détection de la flore microbienne comprend un agent de lyse. L'invention concerne aussi une application du procédé ci-dessus à l'estimation séparée de 10 l'adénosine triphosphate d'origine fongique et de l'adénosine triphosphate d'origine bactérienne dans une matrice comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et une flore fongique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: - prélever un premier aliquote de la matrice; - prélever un second aliquote de la matrice; 15 - appliquer ledit procédé au premier aliquote pour obtenir une première mesure représentative de la quantité d'adénosine triphosphate d'origine bactérienne dans la matrice; - appliquer un agent de lyse au second échantillon puis mesurer l'adénosine triphosphate libre dans le second aliquote pour obtenir une seconde mesure représentative de la quantité 20 d'adénosine triphosphate d'origine bactérienne et fongique dans la matrice; - former la différence entre la seconde mesure et la première mesure pour obtenir une troisième mesure représentative de la quantité d'adénosine triphosphate d'origine fongique dans la matrice. L'invention concerne aussi un procédé pour la détection de champignons dans une matrice 25 agro-alimentaire comprenant une flore microbienne, la flore microbienne comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et comprenant une flore fongique, la flore bactérienne contenant un adénosine triphosphate d'origine bactérienne, la flore fongique contenant un adénosine triphosphate d'origine fongique, qui comprend les étapes suivantes: - appliquer à la matrice, un antifongique possédant une action antifongique létale à une 30 première échéance, sur la flore fongique, et une action antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur la flore bactérienne, - mesurer l'adénosine triphosphate libéré dans la matrice entre la première échéance et la seconde échéance. 35 3031988 L'invention apparaîtra plus clairement à la lumière des modes de réalisation décrits ci-dessous. Dans un premier mode de réalisation, un antifongique de la famille des polyènes est sélectionné, il s'agit de l'antifongique nommé : 10 Molécule Al= Amphotéricine B Cette famille des polyènes cible l'ergostérol membranaire des champignons. La famille des polyènes comprend notamment l'amphotéricine B, la nystatine, la natamycine. Les résultats de toxicité sur les levures et sur les bactéries sont présentés dans le tableau ci-dessous présentant la durée d'exposition de la flore fongique à la molécule Al et la mesure 15 de fluorescence associée: La lyse des levures après exposition au fongicide a été confirmée par examen microscopique et coloration au bleu de méthylène. Les mots « temps de contact » désignent ci-dessous le temps d'exposition des microorganismes au produit fongicide, ici la molécule Al. Ci-dessous : « Sacch. » est l'abréviation de « Saccharomyces ». 20 Ci-dessous : « Abs. colonies » est l'abréviation de « absence de colonies sur la mise en culture». 6 5 25 30 3031988 7 Molécule Al Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Sacch. Cerevisae DSM 8.104 UFC/mL Abs. colonies 70449 Sacch. Cerevisae Saflager 9.104 UFC/mL abs colonies S23 Sacch. Diastaticus IFBM 2.105 UFC/mL abs colonies Brettanomyces bruxellensis 3.105 UFC/mL abs colonies Wyeast Iabs Dekkera anomala IFBM 1.105 UFC/mL abs colonies Zyggosaccharomyces bailli 3.105 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 3.105 UFC/mL Lactobacillus lindneri DSM 6.105 UFC/mL 7.104 UFC/mL 20690 Lactobacillus paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 1.107 UFC/mL Lactobacillus parabuchneri 1,4.10e UFC/mL 3.105 UFC/mL DSM 5708 Pedicoccus damnosus IFBM 1,1.105 UFC/mL 2.107 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 4.107 UFC/mL 5.107 UFC/mL 20252 Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.107 UFC/mL 9.107 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.10' UFC/mL 3.107 UFC/mL 5 On constate que pour la molécule Al de la famille des polyènes utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 400 mg/litre reste non-bactéricide. 3031988 8 Molécule Al : Dosage : 200 m /L temps de contact 4 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 6.106 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 2,9.10 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.106 UFC/mL 2.106 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 2,4.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 1.106 UFC/mL Pedicoccus clamnosus IFBM 7,2.105 UFC/mL 8.105 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 4.109 UFC/mL 6.109 UFC/mL 20252 Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.108 UFC/mL 1.109 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 8.108 UFC/mL On constate que pour la molécule Al de la famille des polyènes utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 200 mg/litre reste non-bactéricide pour les 5 bactéries lactiques et les bactéries acétiques. Il est estimé que pour la molécule Al le seuil de concentration permettant d'obtenir l'effet de l'invention d'être non-bactéricide pour les bactéries lactiques et acétiques tout en étant antifongique pour les populations de levures, est compris entre 50 mg/L ou 50mg/I et 100 10 mg/l. Pour déterminer si une molécule particulière est adaptée à l'invention, l'homme du métier pourra constituer une première liste des produits antifongiques et une seconde liste de produits non bactéricides pour les bactéries et sélectionner les produits apparaissant dans la première et la seconde liste pour lesquels la fongicidie intervient avant la bactéricidie. 15 Toutefois, une vérification expérimentale de la fongicidie sera indispensable pour déterminer la concentration minimale de l'antifongique en mg/L ou en microgramme par millilitre en fonction de la flore fongique ciblée. Afin d'utiliser la propriété de la molécule Al de sélectivité envers les bactéries et les champignons, mentionnée ci-dessus, il est alors procédé de la façon ci-dessous. 20 On réalise d'abord un mélange initial de bactéries lactiques et/ou acétiques et d'une flore fongique représentative d'une flore du vin en phase d'élevage après sulfitage, qu'on 3031988 g ensemence dans un vin artificiel ou d'un mélange de bactéries lactiques et d'une flore fongique qu'on ensemence dans une bière pasteurisée dans sa bouteille, et constituant une solution aqueuse artificielle. Ou bien, on prélève un échantillon d'une bière filtrée ou non filtrée, présentant un trouble 5 et/ou une amertume, généralement provoqués par des bactéries lactiques ou d'un vin en phase d'élevage après sulfitage, ou après embouteillage et filtration mais ayant subi une altération de ses qualités organoleptique tel une amertume ou un caractère huileux en bouche, ou un bouquet avec une légère odeur de vinaigre, généralement provoqué par des bactéries lactiques ou acétiques. L'application de la méthode est alors faite lors de l'élevage 10 du vin post-sulfitage pour surveiller la croissance anormale des bactéries lactiques et acétiques dont le nombre doit décroitre au fur et à mesure des différents soutirages, ou en brasserie lors de la phase de fermentation alcoolique des moûts de brasserie, après et avant filtration de la bière, pour la surveillance de croissance indésirable de bactéries lactiques aux fins d'un contrôle de qualité. 15 On expose dans une première étape, le mélange initial à un antifongique, ici Al, à une concentration, par exemple de 100mg/I, par application en phase aqueuse, par exemple, pendant 8h. Pour réaliser cette application en phase aqueuse : si l'antifongique et le mélange initial sont chacun en phase aqueuse, ils seront mélangés ; Si l'un seulement des deux est en poudre, il 20 sera mélangé dans la phase aqueuse de l'autre et si les deux sont en poudre, ils pourront être mélangés à un tampon aqueux. Après exposition du mélange initial à l'antifongique, les cellules fongiques ont libéré leur ATP dans la phase aqueuse et il est possible d'éliminer cet ATP fongique de la phase aqueuse par différents moyens connus (filtration, ATPase, ...). 25 Les bactéries sont les seuls microorganismes viables restant à ce stade et elles sont d'une taille supérieure aux molécules d'ATP, ce qui permet par exemple une filtration. La méthode de l'invention pourra donc, après élimination de l'ATP fongique, utiliser toute méthode de comptage des bactéries restantes, pour peu que cette méthode soit insensible à la présence dans la phase aqueuse, des débris des membranes des cellules fongiques 30 mortes. Toute méthode de comptage des bactéries vivantes (par exemple culture et dénombrement cytométrie en phase solide ou en flux, impédancemétrie, cytométrie en flux coudé, en anglais « fountain flow cytometry », encore marqueur de viabilité, luminol, réactif de luminescence ...) pourrait ainsi être utilisée de façon équivalente à la mesure sur bactéries 35 mortes décrite maintenant. Pour compter les bactéries, il sera utilisé ci-dessous une mesure de leur ATP bactérien. On pourra ainsi filtrer la phase aqueuse au moyen d'un filtre de diamètre de pores de l'ordre 40 de 0.2micron ou de 0,45 micron, c'est-à-dire d'une taille supérieure aux molécules d'ATP 3031988 10 mais inférieure à la taille des bactéries, pour obtenir un résidus de filtrage sur le filtre contenant des membranes de cellules fongiques mortes, dépourvues d'ATP et des bactéries vivantes contenant de l'ATP. On pourra aussi éliminer l'ATP par une enzyme comme une ATPase qui élimine l'ATP libre, 5 tout moyen permettant d'éliminer l'ATP libre dans la phase aqueuse à ce stade est un moyen équivalent pour l'invention. Comme méthode de choix, pour le comptage des bactéries, il sera ensuite utilisé avec l'invention une méthode combinant une lyse totale et une ATPmétrie. Pour cela, on provoquera la mort des cellules par exposition à un agent de lyse en phase liquide, 10 généralement aqueux, mais surtout apte à libérer l'ATP des cellules, leur survie n'étant plus utile à ce stade. D'autres liquides que l'eau, sont donc envisageables pour cette application d'un agent de lyse pour peu que ces liquides n'inhibent pas de façon substantielle la réaction enzymatique de bioluminescence de l'ATP. L'application en phase liquide de l'agent de lyse étant, par exemple, non spécifique aux 15 bactéries, elle provoquera la lyse de toutes les cellules microbiennes présentes dans la phase aqueuse donc a priori des cellules bactériennes lactiques et acétiques présentes majoritairement dans le mélange initial, en libérant leur ATP bactérien dans la phase liquide. Si d'autres bactéries sont présentes, elles constitueront une erreur systématique et l'invention est ainsi applicable tout particulièrement aux boissons en phase de fermentation 20 (notamment bière, vin, cidre) dans lesquelles la présence d'autres bactéries que lactiques et acétiques est faiblement envisageable, à cause des pH de ces boissons ou de la présence de gaz carbonique dans la bière. À ce stade où l'ATP des bactéries constitue principalement l'ATP libre dans la phase aqueuse du procédé de l'invention, on pourra alors de façon équivalente, utiliser toute 25 méthode de quantification de l'ATP libre dans la solution et notamment l'ATPmétrie. À cette fin, on utilisera commodément le couple luciférine/luciférase et la réaction de bioluminescence avec [ATP de ce couple, pour déterminer optiquement l'ATP bactérien et en déduire une estimation de la biomasse d'origine bactérienne dans le mélange initial. Pour la molécule Al on a procédé à une vérification par ATPmétrie de la destruction de la 30 flore fongique et de l'innocuité du traitement antifongique sur la flore bactérienne lactique ou acétique pour un temps de contact de 4 heures ou 8h et sur différentes souches. Souches testées : Oenococcus oeni DSM Gluconobacter oxydans, B. bruxellensis, S. cerevisae, préparées dans un bouillon MRS 1m1 d'échantillon est prélevé et mélangé à 9 ml de traitement fongicide préparé en solution 35 aqueuse, dont 500 pl_ est ensuite analysé Matériel : un appareil d'ATPmétrie Lum-1 (modèle analogue au bioluminomètre Profile-1 de New Horizons Diagnostics) a été testé avec des réactifs de bioluminescence de Biothema Ab à savoir les réactifs « ATP Eliminating Buffer », « Extractant B/S »x ATP Reagent HS »et des FiltravetteTM cuvettes filtres de 0,45 lm de porosité Filtravette de New Horizons Diagnostics. 40 Description du Protocole initial : 3031988 11 Ajout de 500 !IL de suspension sans traitement fongicide ou avec traitement fongicide dans une seringue plastique de 10 mL contenant à son extrémité un concentrateur cellulaire incorporant une FiltravetteTM Filtration au travers de la FiltravetteTM 5 Dépôt de la FiltravetteTM sur un support de FiltravetteTM en dessous duquel se trouve du papier buvard Ajout de 50 pL d' « ATP Eliminating Buffer » dans la Filtravette Incubation 10 minutes à température ambiante Evacuation du Réactif « ATP Eliminating Buffer »à travers le buvard par pression positive 10 Ajout de 30 piL d' « Extractant B/S ». Homogénéisation et incubation 1 minute. Rajout de 2401.11. d'« ATP Reagent HS ». Homogénéisation. Insertion de la Filtravette dans le tiroir du Lum-1 et fermeture du tiroir 125 secondes après la fermeture du tiroir du Lum-1 enregistrement de la valeur affichée (en URL, Unité Relative de Lumière) 15 Bioluminescence de l'Atp sans traitement fongicide et avec traitement fongicide Oenococccus oeni DSM 0,9.10' UFC/500 ktl_ sans fongicide 4.106 UFC/500 ptL avec fongicide 4 h de contact URL 42766 175354 104893 72542 Gluconobacter oxydans 1.10' UFC/500 ptL 4,1 .106 UFC/500 gL URL 115966 62074 77057 Brettanomyces bruxellensis 2,8.106 UFC/500 i..LL sans fongicide 0 UFC/500 [..tL avec fongicide 4 h de contact URL >1000000 Pas de test 584 170 Saccharomyces cerevisae DSM 5.103 UFC/500 pl. Fongicide 4 h de contact pas de comptage sur gélose URL >1000000 >1000000 4665 Saccharomyces cerevisae DSM 5.102 UFC/500 .tl_ Fongicide 4 h de contact pas de comptage sur gélose URL 206949 149508 642 3031988 12 Pour la molécule Al les souches ont été aussi testées B. bruxellensis, S. diastaticus, préparées dans une solution de Ringer Lactate. Protocole simplifié : 1m1 d'échantillon est prélevé et mélangé à 9 ml de traitement fongicide préparé en solution 5 aqueuse, dont 100 pL est ensuite analysé Utilisation de cuvettes transparentes de 300 microlitres Greiner Bio One stérile a fonds plat à usage unique avec les réactifs de bioluminescence de Biothema AB 1. Ajout de 100 pl_ de la suspension à tester dans la cuvette déjà en place dans la chambre de lecture de l'appareil. 10 2. Si nécessaire, ajout de 30 ptl_ d' « Extractant B/S » puis homogénéisation. 3. Ajout de 150 !IL d'« ATP Reagent HS ». Homogénéisation. 4. Lecture de l'émission de lumière (en URL, Unité Relative de Lumière) à 65 secondes après fermeture du tiroir du bioluminomètre. Brettanomyces bruxellensis avant et après traitement.fongicide. Bioluminescence de l'Atp après ajout de luciférine-luciférase bruit de fonds en duplicata bioluminescence totale en bioluminescence totale avec agent de lyse sans agent de lyse avec duplicata avec agent de lyse luciférine luciférase Concentration 2,7.103 UFC/100pL 2,7. 103 UFC/100pL 0 UFC/100g Non traité Non traité Traité 8 heures de contact fongicide Valeurs de bioluminescence en unités relative de lumière (URL) 5346 5390 242958 265513 4441 4433 Concentration 2,7.102 UFC/1001.tL 2,7.102 UFC/1001.11_ 0 UFC/100i.i.L Non traité Non traité Traité 8 h de contact fongicide Valeurs de bioluminescence en unités relative de lumière (URL) 862 718 26990 31661 933 553 15 Les valeurs de bioluminescence avant et après traitement démontrent l'efficacité du trai emen 3031988 13 Saccharomyces diastaticus avant et après traitement.fongicide. Bioluminescence de l'Atp après ajout de luciférine-luciférase bruit de fonds luminescent luminescent en totale en bruit de fonds bioluminescence en duplicata sans agent de bioluminescence totale en duplicata sans agent de duplicata avec lyse avec luciférine duplicata avec agent de lyse lyse après ajout de agent de lyse luciférase luciférine luciférase Concentration 7,5.102 UFC/10OLLL 7,5.102 UFC/100gL 0 UFC/100..t.L Traité (4h) 0 UFC/1000_ Non traité Non traité + extractant Traité (4h) Valeurs de bioluminescence en unités relative de lumière (URL) 211 223 16239 16707 3803 3837 4393 Concentration 7,5.101 UFC/104.1_ 7,5.101 UFC/1041 0 UFC/104.1._ 0 UFC/100j.d.. Non traité Non traité + extractant Traité (4h) Traité (4h) Valeurs de bioluminescence en unités relative de lumière (URL) _ 34 34 1934 1241 457 436 482 . . Les valeurs de bioluminescence avant et après traitement démontrent e . icac te du traitemen Le procédé ci-dessus est applicable avec tous les modes de réalisation de l'invention, c'est- 5 à-dire avec tout antifongique sélectif pour les bactéries lactiques ou acétiques. De même dans tous les modes de réalisation de l'invention, il sera possible d'utiliser sur deux aliquotes, c'est-à-dire deux prélèvements de même quantité du mélange initial supposé homogène, le procédé ci-dessous afin de déterminer sélectivement la biomasse fongique dans le mélange initial: 10 le procédé ci-dessus sur le premier aliquote pour obtenir une première mesure de la valeur de la biomasse bactérienne Effectuer une lyse du second aliquote pour libérer l'ATP fongique et bactérien Mesurer l'ATP fongique par ATPmétrie, pour obtenir une seconde mesure de la valeur de la biomasse fongique et bactérienne 15 Soustraire la première mesure de la seconde mesure pour obtenir une troisième mesure de la valeur de la biomasse fongique seule. La molécule Al est donc adaptée à l'invention. 3031988 14 Dans un second mode de réalisation, un antifongique de la famille des Morpholines est sélectionné, il s'agit de l'antifongique nommé : Molécule A2=-: Amorolfine Cette famille de morpholines cible un précurseur stérolé de l'ergostérol membranaire des 5 champignons. Les résultats de toxicité sur les levures et sur les bactéries sont présentés dans le tableau ci-dessous présentant la durée d'exposition de la flore fongique à la molécule A2 et sont obtenus par dénombrement sur gelose MRS. Molécule A2 10 dosage : 400 m L temps de contact 4 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Sacch. Cerevisae DSM 70449 5,8.105 UFC/mL abs colonies Sacch. Cerevisae Saflager S23 3,2.105 UFC/mL abs colonies Sacch. Diastaticus IFBM 2.106 UFC/mL abs colonies Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 1,8.106 UFC/mL abs colonies Dekkera anomala IFBM 5.103 UFC/mL abs colonies Zyggosaccharomyces bailii 2,2.106 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 8.105 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.105 UFC/mL 5.105 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 4.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 3.104 UFC/mL Pedicoccus damnosus IFBM 1,1.105 UFC/mL 1.104 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 20252 4.107 UFC/mL 5.107 UFC/mL Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.107 UFC/mL 9.107 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 9.106 UFC/mL 3031988 15 On constate que pour la molécule A2 de la famille des Morpholines utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 400 mg/litre n'est ni bactéricide pour les flores lactiques ni bactéricide pour les flores acétiques. Molécule A2 : Dosage : 200 mg/L temps de contact 4 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 6.106 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 1.106 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.106 UFC/mL 1.106 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 5.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 5.105 UFC/mL Pedicoccus damnosus IFBM 7,2.105 UFC/mL 1,5.105 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 20252 4.109 UFC/mL 6.109 UFC/mL Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.108 UFC/mL 1.109 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 6.106 UFC/mL 5 On constate aussi que pour la molécule A2 de la famille des Morpholines utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 200 mg/litre n'est ni bactéricide pour les flores lactiques ni bactéricide pour les flores acétiques et est donc adaptée à l'invention. Il est estimé que pour la molécule A2 le seuil de concentration permettant d'obtenir l'effet de 10 l'invention d'être non-bactéricide pour les bactéries lactiques et acétiques tout en étant antérieurement antifongique pour les populations de levures, est compris entre 100 mg/I et 200 mg/I. Les mêmes procédés que dans le premier mode de réalisation sont applicables pour déterminer la biomasse bactérienne ou fongique. 15 20 3031988 16 Dans un troisième mode de réalisation, un antifongique de la famille des Azolés est sélectionné, il s'agit de l'antifongique nommé : Molécule A3= voriconazole. Cette famille des azolés cible un précurseur stérolé de l'ergostérol membranaire des 5 champignons. Les résultats de toxicité sur les levures et sur les bactéries sont présentés dans le tableau ci-dessous présentant la durée d'exposition de la flore fongique à la molécule A3. 3031988 17 Molécule A3 Dosage: 400 mg/L temps de contact 18 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 18 h Levures Sacch. Diastaticus IFBM 1.104 UFC/mL Absence de colonies Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 8.104 UFC/mL Absence de colonies Dekkera anomala IFBM 7.105 UFC/mL Absence de colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 1.106 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.105 UFC/mL 7.104 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 2.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 6.105 UFC/mL Pedicoccus damnosus IFBM 1,1.105 UFC/mL 2.104 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 20252 4.107 UFC/mL 1.108 UFC/mL Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.107 UFC/mL 1.108 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 4.107 UFC/mL On constate que pour la molécule A3 de la famille des azolés utilisée, on a pu trouver un 5 antifongique qui administré à des doses de 400 mg/litre n'est ni bactéricide pour les flores lactiques ni bactéricide pour les flores acétiques. La molécule A3 est donc adaptée à l'invention à une concentration de 400 mg/L. 3031988 18 Molécule A3 : Dosage : 200 mg/L temps de contact 18 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 18 h Levures Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 6.106 UFC/mL 9.101 UFC/mL Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 1.106 UFC/mL L. Iindneri DSM 20690 6.106 UFC/mL 1.106 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 5.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 5.105 UFC/mL Pedicoccus damnosus IFBM 7,2.105 UFC/mL 1,5.105 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 20252 4.109 UFC/mL 6.109 UFC/mL Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.108 UFC/mL 1.109 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 6.106 UFC/mL On constate que pour la molécule A3 de la famille des azolés utilisée, on a pu trouver un 5 antifongique qui administré à des doses de 200 mg/litre n'est ni bactéricide pour les flores lactiques ni bactéricide pour les flores acétiques. Il est estimé que pour la molécule A3 le seuil de concentration permettant d'obtenir l'effet de l'invention est compris entre 200 mg/I et 300 mg/I. Les mêmes procédés que dans le premier mode de réalisation sont applicables pour 10 déterminer la biomasse bactérienne ou fongique. La molécule A3 est donc adaptée à l'invention à une concentration de 200 mg/L. 3031988 19 Dans un quatrième mode de réalisation, un antifongique qui possède un groupe fonctionnel glutarimide et est un inhibiteur de l'étape de translocation de la phase d'élongation de la synthèse protéïque des eucaryotes est sélectionné, il s'agit de l'antifongique nommé : 5 Molécule A4= cycloheximide Cette famille comprend notamment aussi le composé suivant: lactimidomycine. Les résultats de toxicité sur les levures et sur les bactéries sont présentés dans le tableau ci-dessous présentant la durée d'exposition de la flore fongique à la molécule A4. Molécule A4 Essai 2 : 400 mg/L Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 18 h Levures Sacch. Cerevisae DSM 70449 5.104 UFC/mL abs colonies Sacch. Diastaticus IFBM 4.104 UFC/mL abs colonies Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 7,3.105 U FC/ m L abs colonies Dekkera anomala IFBM 1.105 UFC/mL 1,2.10' UFC/mL Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 2.106 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.105 UFC/mL 1.105 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 3.107 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL 6.106 UFC/mL Pedicoccus damnosus IFBM 1,1.105 UFC/mL 4.104 UFC/mL Oenococcus oeni DSM 20252 4.107 UFC/mL 1.108 UFC/mL Bactéries lactiques G.oxydans DSM 7145 8.107 UFC/mL 1.108 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 9.107 UFC/mL On constate que pour la molécule A4, de la famille définie fonctionnellement ci-dessus, utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 400 mg/litre ou plus respecte néanmoins l'intégrité des bactéries. 15 Il est estimé que pour la molécule A4 le seuil de concentration permettant d'obtenir l'effet de l'invention est supérieur à 300 mg/I. 3031988 20 Les mêmes procédés que dans le premier mode de réalisation sont applicables pour déterminer la biomasse bactérienne ou fongique. La molécule A4 est adaptée à l'invention. 5 La molécule A4 est notamment plus adaptée au vin en phase d'élevage après sulfitage, ciblant les levures sauvages présentes dans et au voisinages des lies. Dans un cinquième mode de réalisation, un antifongique de la famille des échinocandines, 10 inhibiteurs de la synthèse des bêta-glucanes des cellules fongiques, il s'agit de l'antifongique nommé : Molécule A5= caspofongine Cette famille de composés inhibe la synthèse des bêta-glucanes de la cellule fongique, par une inhibition non compétitive de l'enzyme 1,313 « glucan synthase » et comprend au moins 15 les composés suivants : les pneumocandines, l'échinocandine B, la cilofungine, la caspofongine(ou casponfungine), la micafongine ou micafungine, l'anidulafongine ou l'anidulafungine. 20 Les résultats de toxicité sur les levures et sur les bactéries sont présentés dans le tableau ci-dessous présentant la durée d'exposition de la flore fongique à la molécule A5: 25 30 3031988 21 Molécule A5 temps de contact 4 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Sacch. Cerevisae DSM 2.105 UFC/mL abs colonies 70449 Sacch. Cerevisae Saflager 3.105 UFC/mL abs colonies S23 Sacch. Diastaticus IFBM 4.10 UFC/mL abs colonies Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 1,7.104 UFC/mL abs colonies Dekkera anomala IFBM 1,4.104 UFC/mL abs colonies Zyggosaccharomyces bailii 2.105 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 2.102 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.105 UFC/mL 1.102 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 1.102 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL abs colonies Pedicoccus damnosus IFBM 1,1.105 UFC/mL abs colonies Oenococcus oeni DSM i 4.107 UFC/mL 5.107 UFC/mL 20252 Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.107 UFC/mL 9.107 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 2.106 UFC/mL On constate que pour la molécule A5 de la famille des échinocandines utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 400 mg/litre reste non-bactéricide pour les bactéries acétiques et pour la bactérie lactique oenooccus oeni. 5 10 3031988 22 Molécule A5 Dosage : 200 m /L temps de contact 4 heures Dénombrements Dénombrement temps de contact 0 h temps de contact 4 h Levures Brettanomyces bruxellensis Wyeast labs 6.106 UFC/mL abs colonies Bactéries lactiques Lactobacillus brevis IFBM 7.105 UFC/mL 1.102 UFC/mL L. lindneri DSM 20690 6.106 UFC/mL 9.101 UFC/mL L. paracasei IFBM 1,4.107 UFC/mL 1,1.104 UFC/mL L. parabuchneri DSM 5708 1,4.106 UFC/mL abs colonies Pedicoccus damnosus IFBM 7,2.10 UFC/mL abs colonies Oenococcus oeni DSM 4.109 UFC/mL 6.109 UFC/mL 20252 Bactéries acétiques G.oxydans DSM 7145 8.108 UFC/mL 1.109 UFC/mL Acetobacter aceti DSM 3508 2,9.107 UFC/mL 1.105 UFC/mL 5 On constate que pour la molécule A5 de la famille des échinocandines utilisée, on a pu trouver un antifongique qui administré à des doses de 200 mg/litre reste non-bactéricide pour les bactéries acétiques et pour la bactérie lactique oenooccus oeni. 10 Il est estimé que pour la molécule A5 le seuil de concentration permettant d'obtenir l'effet de l'invention d'être non-bactéricide pour les bactéries acétiques tout en étant antifongique pour les populations de levures, est compris entre 100 mg/I et 200 mg/I. 15 L'invention permet donc par application de certains antifongiques, à une boisson ou un jus contenant une flore lactique et/ou acétique et contenant des champignons, de mesurer la biomasse bactérienne de façon fiable et indépendante de la biomasse fongique. L'invention permet aussi de déterminer la biomasse fongique par soustraction de la biomasse bactérienne de la biomasse totale. 20 L'invention permet donc de façon simple, à la précision de la mesure d'ATP bactérien effectuée ou à la précision de toute méthode de comptage de bactéries utilisée en remplacement de l'ATPmétrie appliquée aux bactéries restantes après l'application de l'antifongique non bactéricide, de détecter ou d'estimer la valeur de la biomasse bactérienne dans un mélange d'une flore fongique et d'une flore bactérienne, lactique et/ou acétique. 3031988 23 À cette fin, un homme du métier pourra rechercher pour un composant membranaire fongique, telles les mannnanes ou les chitines, parmi les antifongiques inhibiteurs de ce composant ou d'un de ses précurseurs sur le chemin de biosynthèse dudit composant de la 5 façon suivante: La sélection pourra porter en général sur un inhibiteur d'une réaction de biosynthèse spécifique au règne fongique, c'est-à-dire sur une branche du chemin de biosynthèse du composant. Dans le cas du composant ergostérol pour le chemin de biosynthèse pour Saccharomyces cerevisiae, la sélection est ainsi faite sur la branche spécifique à partir du 10 lanostérol Les membres de la famille des Allylamines ne font, par exemple, pas partie des inhibiteurs des précurseurs stérolés de la biosynthèse de l'ergostérol. Une molécule de cette famille a ainsi été testée sans qu'un effet levuricide ni bactéricide ne soit constaté en moins de vingt quatre heures de temps de contact. La sélection pourra porter sur tout autre réactif de luminescence, tel que l'utilisation du 15 luminol, ou de tout marqueur de viabilité des cellules, rendues détectables par tout moyen optique. D'une façon générale, l'invention concerne aussi pour son enseignement et la définition de « produit antifongique à action bactéricide postérieure à une action antifongique létale », un inhibiteur d'une réaction de biosynthèse d'un composant de la membrane fongique, c'est-à- 20 dire que cet inhibiteur inhibe une réaction intervenant dans le chemin de biosynthèse du composant. L'invention est notamment susceptible d'application industrielle dans l'élaboration du vin, de la bière, de cidre, de sodas et de boissons carbonatées et dans la production de sucre à partir de jus de betterave ou de jus de canne à sucre. 25 On remarque aussi que l'invention peut être appliquée dans tous ses modes de réalisation sous forme d'un procédé pour la détection sélective de champignons dans une matrice agro-alimentaire comprenant une flore microbienne, la flore microbienne comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et comprenant une flore fongique, la flore bactérienne contenant un adénosine triphosphate d'origine bactérienne, la flore fongique contenant un 30 adénosine triphosphate d'origine fongique, en respectant les étapes suivantes: appliquer à la matrice, un antifongique possédant une action antifongique létale à une première échéance, sur la flore fongique, et une action antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur la flore bactérienne, ladite action létale libérant l'adénosine triphosphate d'origine fongique pour la première échéance ; mesurer, 35 entre la première échéance et la seconde échéance, l'adénosine triphosphate d'origine fongique libéré dans la matrice. Notamment par ATPmétrie. En effet, dès l'instant qu'un antifongique selon l'invention est identifié, et possède une première action létale sur une flore fongique et une seconde action postérieure à la première action sur une flore bactérienne, il peut être utilisé pour la mesure sélective de 40 bactéries dans un mélange de ces deux flores en mesurant , notamment par ATPmétrie l'ATP des bactéries restantes après l'action létale ou l'ATP des champignons, dans une fenêtre temporelle pendant laquelle les champignons sont morts et les bactéries sont vivantes. REVENDICATIONS1. Procédé pour la détection de bactéries lactiques et/ou acétiques dans une matrice agro- alimentaire comprenant une flore microbienne, la flore microbienne comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et comprenant une flore fongique, la flore bactérienne contenant un adénosine triphosphate d'origine bactérienne, la flore fongique contenant un adénosine triphosphate d'origine fongique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - appliquer à la matrice, un antifongique possédant une action antifongique létale à une première échéance, sur la flore fongique, et une action antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur la flore bactérienne, - détecter la flore microbienne entre la première échéance et la seconde échéance. [2] Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'action antifongique létale libère, dans la matrice, pour la première échéance, l'adénosine triphosphate d'origine fongique et dans lequel la flore microbienne est détectée entre la première échéance et la seconde échéance au moyen des étapes suivantes: - éliminer de la matrice l'adénosine triphosphate libre puis, - appliquer à la matrice un agent de lyse, pour libérer de la matrice l'adénosine triphosphate d'origine bactérienne puis, - mesurer l'adénosine triphosphate libéré. [3] Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'antifongique est un inhibiteur de l'ergostérol. [4] Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'antifongique est un inhibiteur d'un précurseur stérolé de l'ergostérol. [5] Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'antifongique possède un groupe fonctionnel glutarimide et est un inhibiteur de l'étape de translocation de la phase d'élongation de la synthèse protéïque des eucaryotes. [6] Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'antifongique est un inhibiteur de la 30 synthèse des betagiucanes. [7] Procédé selon la revendication 3 dans lequel l'inhibiteur de l'ergostérol est une molécule de la famille des polyènes. [8 Procédé selon la revendication 4 dans lequel l'inhibiteur d'un précurseur stérolé de 35 l'ergostérol est une molécule de la famille des morpholines. [9] Procédé selon la revendication 4 dans lequel l'inhibiteur d'un précurseur stérolé de l'ergostérol est une molécule de la famille des azolés. 3031988 25 [10] Dispositif caractérisé en ce qu'il comprend un antifongique possédant après application sur une matrice agro-alimentaire, une activité antifongique létale à une première échéance, sur une flore fongique, et une activité antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur une flore bactérienne lactique et/ou acétique, et en 5 ce qu'il comprend un moyen de détection d'une flore microbienne comprenant la flore fongique et la flore bactérienne lactique et/ou acétique. [11] Dispositif selon la revendication 10 dans lequel le moyen de détection de la flore microbienne comprend un agent de lyse. [12] Application du procédé selon la revendication 1 à l'estimation séparée de l'adénosine 10 triphosphate d'origine fongique et de l'adénosine triphosphate d'origine bactérienne dans une matrice comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et une flore fongique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: - prélever un premier aliquote de la matrice; - prélever un second aliquote de la matrice; 15 - appliquer ledit procédé selon la revendication 1 au premier aliquote pour obtenir une première mesure représentative de la quantité d'adénosine triphosphate d'origine bactérienne dans la matrice; - appliquer un agent de lyse au second échantillon puis mesurer l'adénosine triphosphate libre dans le second aliquote pour obtenir une seconde mesure représentative de la quantité 20 d'adénosine triphosphate d'origine bactérienne et fongique dans la matrice; - former la différence entre la seconde mesure et la première mesure pour obtenir une troisième mesure représentative de la quantité d'adénosine triphosphate d'origine fongique dans la matrice. [13] Procédé pour la détection de champignons dans une matrice agro-alimentaire 25 comprenant une flore microbienne, la flore microbienne comprenant une flore bactérienne lactique et/ou acétique et comprenant une flore fongique, la flore bactérienne contenant un adénosine triphosphate d'origine bactérienne, la flore fongique contenant un adénosine triphosphate d'origine fongique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - appliquer à la matrice, un antifongique possédant une action antifongique létale à une première échéance, sur la flore fongique, et une action antibiotique non létale à une seconde échéance postérieure à la première échéance, sur la flore bactérienne, ladite action létale libérant l'adénosine triphosphate d'origine fongique pour la première échéance, - mesurer, entre la première échéance et la seconde échéance, l'adénosine triphosphate d'origine fongique libéré dans la matrice.35