FR 3031115 A1 20160701 FR 1463513 A 20141231 1 La présente invention concerne un procédé de préparation de chitine et/ou de chitosan à partir d'insectes. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de préparation de chitine et/ou de chitosan par hydrolyse enzymatique de cuticules d'insectes. Selon l'invention, par « chitine », on entend tout type de dérivé chitinique, c'est- à-dire de dérivé de polysaccharides comportant des unités N-acétyl-glucosamine et des unités D-glucosamines, en particulier les copolymères chitine-polypeptides (parfois désignés sous l'appellation « composite chitine-polypeptides »). La chitine serait le deuxième polymère le plus synthétisé dans le monde vivant après la cellulose. En effet, la chitine est synthétisée par de nombreuses espèces du monde vivant: elle constitue en partie l'exosquelette des crustacés et des insectes et la paroi latérale qui entoure et protège les champignons. Plus particulièrement, chez les insectes, la chitine constitue ainsi 3 à 60% de leur exosquelette. Par « chitosan », on entend selon la présente invention les produits de désacétylation de la chitine. La limite usuelle entre le chitosan et la chitine est déterminée par le degré d'acétylation : un composé ayant un degré d'acétylation inférieur à 50% est nommé chitosan, au-delà, un composé ayant un degré d'acétylation supérieur à 50% est nommé chitine. Les applications de la chitine et/ou du chitosan sont nombreuses: cosmétique (composition cosmétique), médicale et pharmaceutique (composition pharmaceutique, traitement des brûlures, biomatériaux, pansements cornéens, fils chirurgicaux), diététique et alimentaire, technique (agent filtrant, texturant, floculant ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau), etc. En effet, la chitine et /ou le chitosan sont des matériaux biocompatibles, biodégradables et non toxiques. L'extraction traditionnelle de la chitine s'effectue par voie chimique à partir de crustacés, de céphalopodes, mais aussi, de manière plus exceptionnelle, de champignons. Cette voie emploie de grandes quantités de réactifs (tel que l'acide chlorhydrique, l'hydroxyde de sodium et des agents de blanchiment) qui ont pour effet de dénaturer la structure de la chitine telle qu'elle existe à l'état naturel, par exemple telle que présente dans la carapace des crustacés. En outre, la plupart des réactifs chimiques sont nocifs pour l'homme et l'environnement et génèrent d'importants 3031115 2 volumes d'effluents à traiter. Enfin, la chitine et/ou le chitosan issu(s) de crustacés peuvent générer des réactions allergiques chez les personnes sensibles. Une autre voie d'extraction de la chitine est la voie enzymatique. Cette voie est considérée comme plus douce, permettant ainsi de mieux préserver la chitine et/ou 5 le chitosan. Toutefois, la chitine obtenue par cette voie est d'une couleur brunâtre, nécessitant des étapes de purification afin d'obtenir une poudre valorisable, c'est-à-dire de couleur blanche. Les procédés existants comportent donc généralement une ou plusieurs étape(s) visant à débarrasser la chitine de ses impuretés, telle qu'une étape de déminéralisation à l'acide réalisée préalablement à l'hydrolyse enzymatique et/ou 10 une étape de blanchiment de la chitine avec un agent oxydant, réalisée de manière subséquente à l'hydrolyse enzymatique. Ces deux étapes de purification de la chitine ont malheureusement pour effet d'altérer la structure chimique de la chitine. Le travail des inventeurs a permis de mettre en évidence qu'il était possible d'obtenir une chitine à la fois plus pure et de structure plus proche de la structure 15 originelle de la chitine en effectuant une combinaison spécifique d'étapes préalables à l'hydrolyse, à savoir une étape de pressage et une étape de traitement des cuticules d'insectes par un agent oxydant. L'invention concerne donc un procédé de production de chitine et/ou de chitosan à partir de cuticules d'insectes, comportant les étapes suivantes : 20 (i) le pressage des cuticules d'insectes, puis, (ii) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, un traitement des cuticules avec un agent oxydant ayant été effectué préalablement à l'hydrolyse enzymatique. 25 Par « insectes », on entend des insectes à n'importe quel stade de développement, tel qu'un stade adulte, larvaire ou un stade de nymphe. De préférence, les insectes mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention sont comestibles. Plus particulièrement, les insectes peuvent être choisis parmi le groupe constitué par les coléoptères, les diptères, les lépidoptères, les isoptères, 30 les orthoptères, les hyménoptères, les blattoptères, les hémyptères, les hétéroptères, les éphéméroptères et les mécoptères, de préférence, parmi les coléoptères, les diptères, les orthoptères et les lépidoptères. Préférentiellement, les insectes sont choisis parmi le groupe constitué par Tenebrio molitor, Hermetia illucens, Galleria mellonella, Alphitobius diaperinus, 35 Zophobas morio, Blattera fusca, Musca domestica, Chrysomya megacephala, 3031115 3 Locusta migratoria, Schistocerca gregaria, Acheta domestica et Samia ricini, et plus préférentiellement encore, T molitor. Une ou plusieurs espèces d'insectes peuvent être utilisées dans le procédé selon l'invention, de préférence une seule espèce d'insecte. Si plusieurs espèces sont 5 utilisées, on choisira avantageusement deux espèces proches telles que par exemple, Hermetia illucens et Musca domestica. Les insectes sont de préférence élevés et non prélevés dans la nature. Par exemple, les insectes sont élevés dans une ferme d'insectes. L'élevage des insectes dans une ferme spécifique permet non seulement de contrôler et d'éliminer 10 les risques associés aux maladies véhiculées par des insectes, mais également de limiter les risques associés à la toxicité des produits alimentaires dérivés des insectes due par exemple à la présence d'insecticides. En outre, l'élevage permet de contrôler la qualité de l'approvisionnement en insectes et de limiter les coûts d'approvisionnement. 15 Par « cuticules d'insectes », on vise non seulement les cuticules une fois celles- ci séparées des insectes, mais également les cuticules incluant tout ou partie des autres constituants de l'insecte, y compris l'insecte dans son intégralité. En effet, il est possible d'appliquer le procédé selon l'invention à l'insecte complet, tels que des insectes broyés, ou bien à seulement une partie des insectes comportant les cuticules, 20 par exemple les exuvies et/ou les mues d'insectes, séparées naturellement et collectées par un procédé adéquat. La cuticule est la couche externe (ou exosquelette) sécrétée par l'épiderme des insectes. Elle est en général formée de trois couches : - l'épicuticule, qui est la couche la plus fine et la plus externe de la cuticule 25 (inférieure à 4 pm) ; cette couche est imperméable à l'eau et comporte une couche de cire imperméabilisante, ainsi que des protéines et de la chitine, en quantité moindre ; - l'exocuticule, qui est la couche intermédiaire de la cuticule ; elle est composée essentiellement de protéines durcies, les tannées, qui sont responsables de la 30 rigidité de la cuticule, de chitine et éventuellement de mélanine ; et - l'endocuticule, qui est une couche fine, flexible, constituée d'un mélange de protéines et de chitine. Le pressage des cuticules d'insectes a pour objectif principal d'éliminer un jus de presse riche en matière grasse et/ou d'enrichir le gâteau de presse en substrat pour 35 l'hydrolyse. 3031115 4 Dans le procédé selon l'invention, le pressage des cuticules d'insectes permet d'obtenir un gâteau de presse comportant une teneur en huile inférieure ou égale à 20%, préférentiellement, inférieure ou égale à 15%, plus préférentiellement, inférieure ou égale à 12%, encore plus préférentiellement, inférieure ou égale à 10%. 5 Dans la présente demande, les gammes de valeurs s'entendent bornes incluses. De même, lorsqu' « environ » ou « de l'ordre de » précède un nombre, cela équivaut à plus ou moins 10% de la valeur de ce nombre. Par ailleurs, afin d'enrichir le gâteau de presse en substrat pour l'hydrolyse, le pressage des cuticules d'insectes permet d'obtenir un gâteau de presse présentant 10 une teneur en matière sèche comprise entre 30% et 60%, préférentiellement, comprise entre 40% et 55%, et plus préférentiellement comprise entre 45% et 50%. Tout système de presse peut être utilisé pour réaliser le pressage des cuticules d'insectes, tel que par exemple, une presse mono-vis ou bi-vis (presse bi-vis de type Angel), un filtre-presse (filtre-presse de type Choquenet), une presse à plateaux, etc. 15 Ces systèmes sont bien connus de l'homme du métier qui est à même de déterminer les conditions de pressage afin d'obtenir les teneurs en huile et/ou en eau mentionnées ci-avant. Dans le procédé selon l'invention, le pressage des cuticules d'insectes est suivi d'une hydrolyse enzymatique. 20 De préférence, l'hydrolyse enzymatique est effectuée par au moins une enzyme protéolytique, de préférence une protéase. Dans la présente demande, les noms ou suffixes « peptidase » et « protéase » sont utilisés indifféremment pour désigner une enzyme lysant une liaison peptidique des protéines. Avantageusement, celle-ci est effectuée pendant une durée de 4 à 8h, préférentiellement, pendant 4 à 5h, 25 à une température de 40 à 60°C, préférentiellement, 45 à 55°C et à un pH compris entre 6 et 8, préférentiellement entre 6,5 et 7,5. L'hydrolyse enzymatique peut être réalisée avec une seule protéase ou alternativement avec un mélange d'enzymes contenant au moins une protéase, plus préférentiellement un mélange d'enzymes contenant plusieurs protéases, tel qu'un 30 mélange contenant une endoprotéase et une exoprotéase, ou une protéase et une polysaccharase. De préférence, la protéase est choisie parmi le groupe constitué par les aminopepdidases, les métallocarboxypeptidases, les endopeptidases sérine, les endopeptidases cystéine, les endopeptidases aspartiques, les métalloendopeptidases. 35 Avantageusement, les enzymes peuvent être choisies parmi les suivantes : 3031115 5 Enzyme(s) Classe Numéro Fournisseur Ville Pays EC Flavourzyme Amino- EC Novozyme Bagsvaerd Danemark peptidases 3.4.11.1 Fungal protease EC Bio-Cat Troy Etats-Unis 500 3.4.11.1 Kojizyme EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.11.1 Protex P Endo- EC 3.4.21 Genencor Leiden Pays-Bas peptidases International sérine B.V. Chymotrypsine EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.1 Protamex EC 3.4.21 Novozyme Bagsvaerd Danemark Elastase EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.14 Trypsine EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.36 Alcalase EC Novozyme Bagsvaerd Danemark 3.4.21.4 Papaïne Endo- EC Bio-Cat Troy Etats-Unis peptidases 3.4.22.2 cystéine Bromelaine EC Bio-Cat Troy Etats-Unis (ananase) 3.4.22.32 Prolyve NP Endo- EC 3.4.23 Lyven Colombelles France peptidases aspartique Pepsine EC Sigma Aldrich Saint- France 3.4.23.1 Quentin- Fallavier Neutral protéase Métallo- EC Bio-Cat Troy Etats-Unis endo- 3.4.24.28 peptidase Protex 50FP Endo- EC 3.4.21 Genencor Leiden Pays-Bas peptidase International B.V. Pancrealyve Exo & endo n.a.* Lyven Colombelles France peptidase (cocktail protéases + 3031115 6 Enzyme(s) Classe Numéro Fournisseur Ville Pays EC amylases) Izyme BA Protéase EC 3.4.23 Novozyme Bagsvaerd Danemark aspartique Sumizyme Cocktail n.a.* Takabio - Shin Aichi Japon enzymatique Nihon *n.a. : non applicable L'enzyme ou le mélange d'enzymes est introduit(e) à une quantité allant de 0,2 à 10 % en poids de matière sèche estimé, préférentiellement de 0,4 à 8% en poids et plus préférentiellement de 0,5 à 2%. Par « poids de matière sèche estimé », on vise 5 plus particulièrement le poids de matière sèche d'insectes ou de partie(s) d'insectes, tel qu'on peut l'estimer lors de l'entrée en étape d'hydrolyse enzymatique. Avantageusement, l'étape d'hydrolyse enzymatique s'effectue en présence d'eau, telle que de l'eau douce. La quantité d'eau mise en oeuvre lors de l'hydrolyse enzymatique est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL 10 sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. On notera que ce ratio correspond également au ratio du poids d'eau sur le poids d'insecte, la masse volumique de l'eau étant de 1,0 g/mL dans les conditions normales de température et de pression. 15 Dans le procédé selon l'invention, l'hydrolyse enzymatique est précédée d'une étape de traitement des cuticules avec un agent oxydant. De préférence, dans le procédé selon l'invention, l'agent oxydant mis en oeuvre lors du traitement des cuticules est choisi parmi le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène, le permanganate de potassium, l'ozone et l'hypochlorite de sodium, 20 plus préférentiellement encore, le peroxyde d'hydrogène. Avantageusement, lorsque l'agent oxydant est le peroxyde d'hydrogène, la quantité introduite de cet agent pour le traitement des cuticules d'insectes est telle que la teneur en peroxyde d'hydrogène est comprise entre 1 et 33% en poids sur le poids total d'insectes, préférentiellement comprise entre 2 et 12% en poids 25 sur le poids total d'insectes, préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. Préférentiellement, le traitement de cuticules d'insectes par l'agent oxydant s'effectue en présence d'eau, telle que de l'eau douce. Avantageusement, la quantité d'eau mise en oeuvre lors du traitement des cuticules est déterminée de la façon 3031115 7 suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une chitine ayant un haut 5 degré de pureté, tel qu'un degré de pureté compris entre 55 et 95%, préférentiellement compris entre 60 et 95%, plus préférentiellement encore entre 70 et 90%, et encore plus préférentiellement entre 80 et 90% (voir l'Exemple 5 et la Figure 7). De préférence, le procédé selon l'invention comporte une étape de broyage préalable à l'étape de pressage. 10 Cette étape de broyage a pour objectif de réduire les cuticules et/ou les insectes en particules afin de faciliter l'accès des enzymes au substrat lors de l'hydrolyse enzymatique. Cette étape permet également, lorsqu'elle est suivie d'une étape de pressage, de faciliter l'élimination du jus de presse et l'isolation de la matière solide. 15 Le broyage peut avantageusement être effectué avec un broyeur mixeur, tel qu'un broyeur mixeur à couteaux. De préférence, à l'issue du broyage, la taille des particules d'insectes est inférieure à 1 cm (plus grande taille de particule observable à l'aide d'un microscope), de préférence inférieure à 0,5 cm, plus préférentiellement encore, une taille comprise 20 entre 500 pm et 0,5 cm. Afin de faciliter le broyage, une quantité d'eau peut être ajoutée. Cette quantité d'eau est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement 25 de l'ordre de 1. Avantageusement, dans le procédé selon l'invention, le traitement des cuticules avec un agent oxydant est effectué avant, concomitamment et/ou après l'étape de broyage et/ou de pressage. Le procédé selon l'invention peut également comporter une étape d'abattage 30 des insectes préalable à l'étape de pressage et/ou de broyage. Cette étape d'abattage peut s'effectuer par des méthodes classiques d'élevage d'animaux à sang froid et/ou de petite taille (crustacés, poissons, escargots, etc.), tels que le froid (congélation), le chaud (ébouillantage), la privation d'oxygène, etc. Avantageusement, l'étape d'abattage des insectes est effectuée par ébouillantage. 35 L'ébouillantage permet non seulement d'abattre les insectes, mais également 3031115 8 d'abaisser la charge microbienne (réduction du risque d'altération et sanitaire) et d'inactiver les enzymes internes des insectes pouvant déclencher une autolyse, et ainsi un brunissement rapide de ceux-ci. Cet ébouillantage est réalisé de manière à provoquer la mort le plus rapidement possible, dans le respect du bien-être animal, 5 et selon les préconisations scientifiques. Avantageusement, les insectes sont abattus, par exemple par ébouillantage, puis broyés avant d'être pressés. De préférence, l'étape d'ébouillantage est réalisée dans l'eau, telle que de l'eau douce, à une température de 95 à 105°C, préférentiellement de l'ordre de 100°C 10 et pendant une durée de 2 à 20 min, préférentiellement, 5 à 15 min. La quantité d'eau introduite à cette étape d'ébouillantage est déterminée de la façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. 15 Avantageusement, le traitement des cuticules avec un agent oxydant est effectué concomitamment et/ou après l'étape d'abattage et en particulier concomitamment et/ou après l'ébouillantage. Plus particulièrement, le traitement des cuticules d'insectes avec l'agent oxydant peut être effectué pendant l'une ou plusieurs des étapes ci-après : 20 - concomitamment avec l'ébouillantage et/ou après l'étape d'ébouillantage, plus préférentiellement concomitamment avec l'ébouillantage. Plus particulièrement, lorsque le traitement des cuticules d'insectes est effectué pendant l'ébouillantage, l'agent oxydant peut être avantageusement ajouté à l'eau utilisée pour ébouillanter les insectes. 25 - avant, concomitamment et/ou après le broyage. Plus particulièrement, lorsque le traitement des cuticules d'insectes est effectué pendant le broyage, l'agent oxydant peut être avantageusement ajouté à l'eau utilisée pour le broyage. - avant et/ou concomitamment avec le pressage. - lors d'une étape spécifique de traitement des cuticules d'insectes. 30 Après l'hydrolyse enzymatique, le procédé selon l'invention peut comporter en outre une étape d'inactivation thermique visant à inactiver l'enzyme ou le mélange d'enzymes mis en oeuvre lors de l'hydrolyse enzymatique. A l'issue d'un procédé selon l'invention, la chitine peut être récupérée par pressage ou centrifugation du milieu de réaction de l'hydrolyse enzymatique. 35 A ce stade, un co-produit d'intérêt de la chitine est également récupéré, à savoir 3031115 9 un hydrolysat. Par « hydrolysat», on désigne un produit qui comporte des protéines, des protéines hydrolysées, des peptides, des acides aminés et/ou d'autres composés dérivés d'une protéine, susceptibles d'être obtenus par hydrolyse enzymatique de 5 protéines. L'invention concerne également un hydrolysat susceptible d'être obtenu comme co-produit de l'hydrolyse enzymatique par l'un quelconque des procédés selon l'invention. Cet hydrolysat peut avantageusement être complété avec des additifs pour 10 équilibrer son profil nutritionnel afin d'être adapté à différents types d'animaux. L'hydrolysat peut être concentré puis séché pour obtenir un hydrolysat séché. Alternativement, l'hydrolysat peut être sous forme liquide. Ces hydrolysats peuvent être utilisés comme un aliment ou un ingrédient alimentaire en particulier pour des animaux, ou, alternativement, ils peuvent être traités, par exemple, pour isoler des acides 15 aminés. Un mode de réalisation préférentiel d'un procédé selon l'invention est plus détaillé ci-après. En particulier, ce mode de réalisation préférentiel décrit diverses étapes avantageuses pour un procédé selon l'invention, telles que des étapes de purification 20 douce de la chitine : un second pressage, des lavages, filtration et séchage éventuels. Enfin, la chitine étant généralement commercialisée sous forme de poudre, un second broyage peut également être réalisé. Celui-ci peut également être effectué afin de favoriser la réaction de désacétylation, qui permet de préparer du chitosan à partir de chitine. Les conditions de la réaction de désacétylation sont plus amplement 25 décrites à l'étape 10 du mode de réalisation préférentiel détaillé ci-après. Un procédé particulièrement avantageux de production de chitine à partir d'insectes, comporte les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, 30 c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, e) la récupération de la chitine, les cuticules d'insectes étant traitées avec un agent oxydant, avant l'étape d). 35 Les modes de réalisation préférés des diverses étapes a) à e) et du traitement 3031115 10 des cuticules d'insectes avec un agent oxydant sont tels qu'indiqués ci-avant ou dans l'étape correspondante dans le mode de réalisation préférentiel ci-après. L'invention concerne également une chitine susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention. Grâce aux conditions douces employées dans le procédé 5 selon l'invention, cette chitine possède une structure proche de la chitine telle que présente à l'état naturel dans la cuticule de l'insecte tout en ayant un haut degré de pureté, tel qu'un degré de pureté compris entre 55 et 95%, préférentiellement compris entre 60 et 95%, plus préférentiellement encore entre 70 et 90%, et encore plus préférentiellement entre 80 et 90%. 10 Un procédé particulièrement avantageux de production de chitosan à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, 15 d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, e) la récupération de la chitine, f) la désacétylation de la chitine récupérée, g) la récupération du chitosan, 20 les cuticules d'insectes étant traitées avec un agent oxydant, avant l'étape d). Les modes de réalisation préférés des diverses étapes a) à g) et du traitement des cuticules d'insectes avec un agent oxydant sont tels qu'indiqués ci-avant ou dans l'étape correspondante dans le mode de réalisation préférentiel ci-après. L'invention concerne également un chitosan susceptible d'être obtenu par 25 un procédé selon l'invention. La chitine et/ou le chitosan susceptible(s) d'être obtenu(s) par un procédé selon l'invention peu(ven)t avantageusement être utilisé(s) dans diverses applications : - dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou diététiques, 30 - comme biomatériaux pour traiter des brûlures en tant que seconde peau, pour réaliser des pansements cornéens ou des fils chirurgicaux, - comme agent filtrant, texturant, floculant et/ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution de l'eau. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le procédé comporte 35 les étapes suivantes, décrites schématiquement en Figure 1. On notera que certaines 3031115 11 étapes sont indiquées comme facultatives dans ce mode de réalisation préférentiel. - Etape 1 : ébouillantage des insectes Cette étape 1 d'ébouillantage permet d'abattre les insectes tout en abaissant la charge microbienne (réduction du risque d'altération et sanitaire) et en inactivant les 5 enzymes internes des insectes pouvant déclencher une autolyse, et ainsi un brunissement rapide de ceux-ci. Les insectes, de préférence des larves, sont ainsi ébouillantés à l'eau pendant 2 à 20 min, préférentiellement, 5 à 15 min. De préférence, l'eau est à température comprise entre 95 à 105°C, préférentiellement 100°C. La quantité d'eau introduite à cette étape 1 d'ébouillantage est déterminée de la 10 façon suivante : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Lors de cette étape, il est également possible de traiter les cuticules d'insectes en utilisant une eau d'ébouillantage comportant l'agent oxydant selon les modalités 15 indiquées dans l'étape intermédiaire ci-après. - Etape intermédiaire (facultative) : traitement des cuticules par l'agent oxydant Il est possible d'introduire dans le procédé une étape spécifique de traitement des cuticules par l'agent oxydant. Avantageusement, cette étape intermédiaire de 20 traitement des cuticules s'effectue entre l'étape 1 d'ébouillantage et l'étape 2 de broyage. Cette étape intermédiaire s'effectue de préférence avec un agent oxydant choisi parmi le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène (H202), le permanganate de potassium (KMnO4), l'ozone (03) et l'hypochlorite de sodium (NaCIO), plus 25 préférentiellement, le peroxyde d'hydrogène. Selon un premier mode de réalisation, à l'issue de l'étape 1 d'ébouillantage, on introduit directement dans la cuve d'ébouillantage l'agent oxydant, après éventuel refroidissement de l'eau d'ébouillantage à une température de l'ordre de 40 à 60°C, préférentiellement de l'ordre de 50°C. 30 Le peroxyde d'hydrogène tel que commercialisé est usuellement sous la forme d'une solution aqueuse, par exemple une solution à 30% en poids sur le poids total d'eau. La quantité introduite de peroxyde d'hydrogène pour le traitement est telle que la teneur en peroxyde d'hydrogène est comprise entre 1 à 33% en poids sur le poids 35 total d'insectes, préférentiellement, 2 à 12% en poids sur le poids total d'insectes, 3031115 12 préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. Selon un second mode de réalisation, les insectes sont retirés de la cuve d'ébouillantage, tamisés et réintroduits dans une cuve. Le peroxyde d'hydrogène est alors introduit dans la cuve sous la forme d'une 5 solution aqueuse diluée, la teneur en peroxyde d'hydrogène étant alors comprise entre 1 et 33% en poids sur le poids d'eau, préférentiellement, 2 à 12% en poids sur le poids d'eau, préférentiellement de l'ordre de 6% en poids. - Etape 2 : broyage Les insectes sont retirés de la cuve d'ébouillantage ou de traitement, ils sont 10 ensuite tamisés, et placés dans un broyeur, tel qu'un broyeur mixeur à couteaux, permettant de réduire les insectes en particules. Afin de faciliter le broyage, une quantité d'eau peut être ajoutée. Cette quantité d'eau est similaire à celle introduite lors de l'étape 1 d'ébouillantage : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus 15 préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. Il est également possible de garder l'eau d'ébouillantage et/ou l'eau de l'étape intermédiaire pour effectuer cette étape. Cette eau est susceptible de contenir l'oxydant. Dans ce cas, le traitement des cuticules peut avoir lieu durant l'étape 1 d'ébouillantage et l'étape 2 de broyage ou pendant l'étape 20 intermédiaire de traitement des cuticules et pendant l'étape de broyage. De préférence, à l'issue du broyage, la taille des particules d'insectes est inférieure à 1 cm (plus grande taille de particule observable à l'aide d'un microscope), de préférence inférieure à 0,5 cm. Il n'est pas nécessaire de réduire excessivement la taille des particules, par exemple à une taille inférieure à 250 pm. 25 Cette étape 2 de broyage favorise l'accès des enzymes à leur substrat. Lors de cette étape, il est possible d'introduire dans le broyeur l'agent oxydant afin de traiter les cuticules selon les modalités indiquées dans l'étape intermédiaire ci-avant. Lorsque le traitement des cuticules n'est pas effectué de manière concomitante 30 avec le broyage, il est possible d'ajouter lors de cette étape, des additifs antioxydants communément employés pour la conservation et la stabilité du produit. - Etape 3 : pressage des cuticules d'insectes La pâte humide issue de l'étape 2 de broyage est ensuite placée dans une presse selon un mode opératoire qui permet de presser et séparer un jus comportant à 35 la fois une fraction huileuse et une fraction protéique. 3031115 13 De préférence, l'étape de pressage permet d'obtenir un gâteau de presse comportant une teneur en huile inférieure ou égale à 20%, préférentiellement, inférieure ou égale à 15%, plus préférentiellement, inférieure ou égale à 12%, encore plus préférentiellement, inférieure ou égale à 10%. 5 De même, l'étape de pressage permet d'obtenir un gâteau de presse présentant une teneur en matière sèche comprise entre 30% et 60%, préférentiellement, comprise entre 40% et 55%, et plus préférentiellement comprise entre 45% et 50%. Tout système de presse peut être utilisé pour réaliser l'étape de pressage, 10 tel que par exemple, une presse mono-vis ou bi-vis (presse bi-vis de type Angel), un filtre-presse (filtre-presse de type Choquenet), une presse à plateaux, etc. Ces systèmes sont bien connus de l'homme du métier qui est a même de déterminer les conditions de pressage afin d'obtenir les teneurs en huile et/ou en eau mentionnées ci-avant. 15 Si la pâte humide issue de l'étape 2 de broyage a été obtenue avec une eau comportant l'oxydant, il peut être avantageux d'éliminer au moins une partie de cet oxydant avant l'étape 3 de pressage. Cette étape 3 de pressage peut éventuellement être réalisée avant l'étape 2 de broyage à partir des insectes ébouillantés. Toutefois, il est avantageux d'effectuer 20 l'étape 3 de pressage après l'étape 2 de broyage. Cette étape 3 de pressage permet donc l'obtention d'un jus de presse et d'un gâteau de presse. - Etape 4 : hydrolyse enzymatique La pâte humide issue de l'étape 2 de broyage ou le gâteau de presse issu de 25 l'étape 3 de pressage est placé dans une cuve d'hydrolyse avec de l'eau. Optionnellement, et comme cela sera décrit ci-après, la fraction protéique issue de l'étape 12 de séparation, peut être réintroduite dans cette étape 4 d'hydrolyse enzymatique, en la mélangeant au gâteau de presse. De manière optionnelle et dans le cas où l'eau de l'ébouillantage ne contient 30 pas d'oxydant, l'eau de l'ébouillantage peut être récupérée et réintroduite lors de l'étape d'hydrolyse. En effet, cette eau contient des fractions d'insectes solubilisées de par l'action de cet ébouillantage et l'utilisation de celle-ci lors de l'hydrolyse permet de réduire les pertes. Optionnellement, cette eau issue de l'ébouillantage peut être dégraissée, certaines cires pouvant s'être dissoutes dans l'eau. 35 La quantité d'eau introduite à cette étape 4 d'hydrolyse enzymatique est 3031115 14 similaire à celle introduite lors de l'étape 1 d'ébouillantage : le ratio du volume d'eau en mL sur le poids en g d'insecte est de préférence compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre de 1. 5 L'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une protéase, telle qu'une protéase commerciale pendant 4 à 8h, plus particulièrement pendant 4 à 5h, à un pH de 6 à 8, plus particulièrement de 6,5 à 7,5, à une température de 40 à 60°C, plus particulièrement de 45 à 55°C. La quantité d'enzymes introduite lors de l'étape d'hydrolyse est inférieure 10 à 10 % en poids sur le poids total de matière sèche estimé entrant en hydrolyse, préférentiellement inférieure à 6%, plus préférentiellement de l'ordre de 2 %. L'hydrolyse protéolytique engendre la production d'une phase soluble contenant les peptides, glucosamines et oligochitines et d'un résidu solide formé de chitine, principalement de copolymère chitine-polypeptides. 15 - Etape 5 : inactivation thermique Afin de stopper l'activité des enzymes de la réaction et de stabiliser la phase soluble de l'hydrolyse, on réalise une inactivation thermique en chauffant ce jus entre 80 et 105° pendant 10 à 25 min, préférentiellement, 15 à 20 minutes. Selon un mode opératoire, cette étape 5 d'inactivation thermique est réalisée selon les techniques 20 habituelles de stérilisation de l'industrie agroalimentaire. Selon un autre mode opératoire, l'inactivation enzymatique est réalisée par chauffage sous rayonnement IR ou UV, ou micro-ondes. - Etape 6 : pressage Le résidu solide, majoritairement composé de chitine, est récupéré puis pressé 25 par un pressoir afin d'essorer au maximum ce résidu pour réinjecter dans la phase soluble ce pressât. Le résidu pressé ainsi formé est composé essentiellement de chitine, principalement sous la forme de copolymère chitine-polypeptides. - Etapes (facultatives) 7 et 8 : lavage et séchage Le résidu solide est ensuite lavé, filtré, à nouveau lavé puis séché par les 30 technologies classiques connues par l'homme de métier. Avantageusement, le système de séchage est étudié pour protéger la structure du copolymère de chitine-polypeptides : l'hydrométrie, la ventilation et la composition de l'air sont contrôlés. Avantageusement, le séchage peut s'effectuer dans une étuve ventilée à une température de 60 à 80°C, préférentiellement de l'ordre de 70°C. 35 Optionnellement, ces étapes peuvent comporter une étape de délipidation 3031115 15 terminale : le résidu solide est traité avec du HCI afin d'enlever les derniers résidus lipidiques, notamment les cires cuticulaires. Les étapes 9 à 11 qui suivent, visent à transformer la chitine en chitosan et ne sont donc mises en oeuvre que lorsque le produit souhaité est le chitosan. 5 - Etape 9 (facultative) : bravade Le résidu solide séché, comportant majoritairement de la chitine, est ensuite broyé, par exemple dans un broyeur à couteaux. La production de chitosan à partir de chitine, par la réaction de désacétylation, dépend en grande partie de la taille des particules de chitine. Ainsi un broyage très fin 10 du résidu solide séché avant désacétylation permet d'augmenter significativement les rendements et la vitesse de la réaction de désacétylation, comme cela est illustré dans le Tableau 1 ci-après : Broyage 30 s Broyage 45 s Broyage 60 s Broyage 120 s 50% des C25). La montée en température au-dessus du point de fusion de ces huiles (environ 38°C) lors de la centrifugation permet de solubiliser cette crème et de faciliter la séparation de la fraction huileuse du reste du jus. 25 Le centrifugat passe ensuite en décantation selon un mode opératoire (type décanteur ou tricanteur), afin de séparer au mieux les huiles et les protéines. Ces étapes permettent ainsi l'obtention d'une fraction huileuse. La fraction protéique, une fois séparée de la fraction huileuse, peut être mélangée au gâteau de presse issu de l'étape 3 de pressage juste avant l'étape 4 30 d'hydrolyse. En effet, souvent plus de 20% des protéines sont perdues dans le jus lors de l'étape 3 de pressage, d'où l'intérêt de récupérer cette fraction et de la soumettre à l'étape d'hydrolyse. - Etape 13 (facultative) : concentration Selon un mode opératoire, la concentration est réalisée par évaporation sous 35 vide de la partie aqueuse. Le concentrât présente un extrait sec supérieur à 10%, 3031115 17 de préférence supérieur à 20%. Cette opération facilite le séchage et des additifs communément employés pour la conservation et la stabilité du produit peuvent être ajoutés à cette étape. - Etape 14 (facultative) : séchage 5 Le concentrât est enfin séché par des technologies connues de l'homme du métier, telles que par exemple, par pulvérisation / atomisation (« spray-drying »), qui permet d'obtenir un extrait, c'est-à-dire une poudre sèche de concentrât riche en peptides et glucosamines, les glucosamines étant en particulier issues de l'hydrolyse partielle de la chitine par H202 (essentiellement). 10 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, avec référence aux figures, qui représentent respectivement : - La Figure 1 est un schéma d'un mode de réalisation préférentiel du procédé selon l'invention, 15 - La Figure 2 est un diagramme comparant le degré de pureté de la chitine obtenue par un procédé enzymatique avec et sans le peroxyde d'hydrogène, - La Figure 3 est un diagramme illustrant l'influence du procédé d'extraction (enzymatique ou chimique) et du traitement avec un agent oxydant sur la chitine obtenue, 20 - La Figure 4 est un diagramme comparant le degré de pureté de la chitine obtenue par un procédé enzymatique comportant une ou plusieurs étapes préalables de broyage(s) et pressage, - La Figure 5 est un diagramme comparant le taux de lipides mesuré dans différentes fractions du produit intermédiaire dont la chitine a été extraite, 25 - La Figure 6 illustre la répartition des lipides dans le jus et le gâteau de presse obtenus par un procédé enzymatique comportant des étapes préalables de broyage et de pressage ou une étape préalable de pressage, - La Figure 7 est un diagramme comparant le degré de pureté de la chitine obtenue par un procédé enzymatique comportant une ou plusieurs étapes 30 préalables de broyage(s), pressage et traitement avec un agent oxydant. Dans les exemples qui suivent, toute référence à un règlement ou à une directive concerne ledit règlement ou ladite directive tel qu'en vigueur à la date de dépôt de la présente demande. 35 3031115 18 Exemple 1 : Exemple de procédé selon l'invention 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 6% 5 préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 100 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis, ce qui résulte en 17,89 ± 0,87 g de gâteau de presse avec un taux de matière sèche de 20,9 ± 1,3% et en 389,49 ± 6,53 g de jus de presse avec un taux de matière sèche de 4,04 ± 0,05%. 10 g (poids 10 humide) de gâteau de presse ainsi obtenu sont transférés dans un Erlen Meyer contenant 50 mL d'eau et 0,1 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi 15 obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 0,64 ± 0,05 g de chitine par ce procédé. Exemple 2 : Influence de la présence du traitement des cuticules avec l'oxydant sur le degré de pureté de la chitine obtenue 20 25 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 25 mL. Dans le cas de la réaction avec le peroxyde d'hydrogène, le liquide ainsi obtenu est placé pendant 1 heure en présence d'une 25 solution de peroxyde d'hydrogène, puis transféré dans un Erlen Meyer de 250 mL contenant une solution de protéase (Sumizyme LP) à 4%, sinon, il est transféré directement dans l'Erlen Meyer contenant la solution de protéase. L'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (pH approximativement à 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C 30 afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. Le résidu sec ainsi obtenu après utilisation du peroxyde d'hydrogène est de 6,3 ± 0,7 % par rapport à la matière sèche initiale, alors que le résidu sec résultant d'un procédé sans le peroxyde d'hydrogène est de 9,75 ± 0,9 % par rapport à la matière 35 sèche initiale. 3031115 19 Le degré de pureté de la chitine est déterminé en comparaison de la masse en résidu sec obtenue par rapport à celle résultant d'une extraction chimique, 5 % de la matière sèche initiale. Il s'établit ainsi à 79,9 ± 9 % pour le produit obtenu après traitement avec le peroxyde et à 51,5 ± 4,9 % en l'absence de peroxyde (voir Figure 2). 5 Exemple 3: Influence de l'ordre de la séquence de réalisation du traitement des cuticules avec l'oxydant et de l'hydrolyse enzymatique Obtention de chitine par voie enzymatique (sans ajout d'oxydant) 10 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 100 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer de 500 mL contenant 150 mL d'une solution de protéase (Prolyve) à 1%, 15 l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (pH approximativement à 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 1,656 ± 0,021 g de chitine par ce procédé. 20 Obtention de chitine -ar voie enz mati-ue avec aout de H202 -endant l'ébouillanta -e 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 50 mL d'une solution de H202 à 6% dans l'eau, préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, 25 les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 100 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer de 500 mL contenant 150 mL d'une solution de protéase (Prolyve) à 1%, l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique. L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 30 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 1,98 ± 0,22 g de chitine par ce procédé. Obtention de chitine -ar voie enz mati-ue avec a out de H202 a rès h drol se 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- 35 marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 3031115 20 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 100 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer de 500 mL contenant 150 mL d'une solution de protéase (Prolyve) à 1%, l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique 5 (pH approximativement à 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. Le résidu est alors placé pendant 1 heure à 65 °C dans une solution de H202 à 6%. La chitine ainsi obtenue est filtrée (0,45-0,5 pm), puis séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 1,304 ± 0,091 g de chitine par ce 10 procédé. Obtention de chitine par voie chimique 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 15 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 60 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré avec 50 mL d'eau dans un flacon de 1 L. On y ajoute 500 mL de HCI 1M et on place l'ensemble sous agitation pendant 1 heure à 90 °C. Le milieu réactionnel est ensuite filtré et lavé avec de l'eau jusqu'à l'obtention d'un résidu clair. Ce résidu est ensuite transféré dans 20 un flacon de 1 L auquel on ajoute 500 mL de NaOH 1M et on maintient le tout sous agitation à 90 °C pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est alors filtré et lavé jusqu'à l'obtention d'un filtrat clair, le résidu est finalement séché 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 0,944 ± 0,005 g de chitine par ce procédé. 25 Détermination (par viscosimétrie) de la masse moléculaire de la chitine obtenue Un flacon contenant 1 g de chitine et 10 mL de NaOH 1M est placé pendant 4 heures à 90 °C. Le mélange est ensuite filtré (0,45-0,5 pm) et le résidu ainsi lavé est placé 24 heures à 70 °C. La préparation du solvant : 5 g de LiCI sont placés dans 100 mL de N,N30 diméthylacétamide, sous agitation et pendant 4-5 heures (jusqu'à complète dissolution). La solution-mère est obtenue en dissolvant 0,2 mg de chitine dans 1 mL de solvant. A partir de cette solution-mère, des solutions-filles, avec des concentrations de 0,1 mg/mL, 0,08 mg/mL et 0,04 mg/mL, sont préparées. La viscosité de ces 35 différentes solutions est ensuite mesurée en triplicata avec un viscosimètre de type 3031115 21 Ostwald et la masse moléculaire est calculée suivant la formule : [111= KM''Q (1) avec : viscosimétrie intrinsèque en cm3/g, 5 M, : masse molaire de la chitine en g/mol (ou Da), et les coefficients de Mark-Houvink a = 0,71 et K = 0,000893, la viscosité intrinsèque étant obtenue selon : [rerir/C (2) avec 10 : viscosité réduite (sans unités), C : concentration en mg/mL, la viscosité réduite étant obtenue selon : qr = t/to (3) avec 15 t : le temps de chute mesuré pour la solution en s, to : le temps de chute mesuré pour le solvant en s. Il peut être observé sur la Figure 3 que la taille de la molécule de la chitine obtenue est fonction de la méthode d'extraction utilisée. Ainsi, la méthode chimique endommage l'intégrité de la molécule (M, obtenue est inférieure à 70000 g/mol), mais 20 le traitement le plus drastique est celui qui consiste à blanchir la chitine par le peroxyde d'hydrogène après hydrolyse, même enzymatique (M, inférieure à 9000 g/mol). Le procédé selon l'invention (hydrolyse enzymatique avec l'ajout du peroxyde d'hydrogène pendant ou juste après l'ébouillantage, c'est-à-dire en début du procédé), certes, diminue la taille de la molécule par rapport à celle que l'on peut trouver 25 initialement dans l'insecte (M, de la chitine par hydrolyse enzymatique simple est de 130000 g/mol), mais dans une bien moindre mesure (M, de près de 80000 g/mol) et le résultat obtenu est supérieur à celui lié à l'extraction chimique traditionnelle. Exemple 4: Influence de l'étape de pressage préalable à l'hydrolyse 30 enzymatique sur le degré de pureté de la chitine obtenue Différents types de prétraitement mécanique ont été testés, le broyage (« broyage 1 ») seul, le broyage suivi du pressage, le broyage suivi du pressage et d'un second broyage (« broyage 2 »), ainsi que le pressage seul. 35 3031115 22 Pour le pressage, une presse de type Angel a été utilisée, dans les conditions suivantes : - Vitesse = 82 tr/min; - VV (énergie) = 3 HP (chevaux vapeur) soit 2,68 x 106 J; 5 - Porosité (approximative) = 0,5 mm dans la première partie et 0,2 mm dans la dernière partie. 1. Matériel et méthodes 10 Production de chitine avec un broyage 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un 15 Erlen Meyer contenant 2 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 8,13 ± 0,27 g de chitine par ce 20 procédé. Production de chitine avec un broyage suivi d'un pressage 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. 25 Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis. 30 g du gâteau de presse ainsi obtenu sont transférés dans un Erlen Meyer contenant 150 mL d'eau et 0,3 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). 30 L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 4,71 ± 0,11 g de chitine par ce procédé. 35 Production de chitine avec un premier broyage (« broyage 1 ») suivi d'un 3031115 23 pressage et d'un second broyage (« broyage 2 ») 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis 5 mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis. Le gâteau de presse ainsi obtenu est séché 24 heures dans une étuve à 70 °C, puis broyé à 250 pm. 10 g de la poudre ainsi obtenue sont transférés dans un Erlen Meyer contenant 50 mL d'eau et 0,1 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). 10 L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 4,93 ± 0,12 g de chitine par ce procédé. 15 Production de chitine avec pressage uniquement 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis passées dans une presse de type bi-vis. 90 g de gâteau de presse ainsi obtenu sont 20 transférés dans un Erlen Meyer contenant 450 mL d'eau et 0,9 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,450,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. 25 On obtient ainsi 6,48 ± 0,28 g de chitine par ce procédé. Production de chitine par voie chimique 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'eau, préalablement portée à ébullition. Après 30 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis mixées avec un volume d'eau de 60 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un récipient de 1 L et 500 mL d'une solution d'HCI 1M sont ajoutés. L'ensemble est placé à 90 °C sous agitation pendant 1 heure. Le contenu est ensuite filtré et le résidu solide est transféré dans un flacon de 1 L contenant 500 mL d'une solution de NaOH 1M, 35 l'ensemble est placé à 90 °C sous agitation pendant 24 heures. Le résidu est ensuite 3031115 24 filtré et placé en étuve ventilée à 70 °C pendant 24 heures. On obtient ainsi 0,944 ± 0,005 g de chitine purifiée par voie chimique. Calcul du degré de pureté 5 Le degré de pureté de la chitine est déterminé en comparaison de la masse en résidu sec obtenu par rapport à celle résultant d'une extraction chimique, 5 % environ de la matière sèche initiale. Mesure du taux de lipides 10 On place 2 g d'échantillon dans un bécher, on y ajoute 0,2 g de Na2SO4 et 15 mL de CHC13/Me0H (2/1 v/v). L'ensemble est placé sous agitation magnétique pendant 20 minutes, ensuite la solution est filtrée, le résidu est placé de nouveau dans le bécher avec 10 mL de CHC13/Me0H (2/1 v/v). L'ensemble est placé sous agitation magnétique pendant 15 minutes, ensuite la solution est filtrée, les phases solvants sont 15 réunies et évaporées à poids constant. La teneur en lipides est déterminée comme pourcentage de masse après extraction-évaporation par rapport à la masse initiale de l'échantillon (2 g). 2. Résultats 20 Comme cela peut être constaté sur la Figure 4, le procédé a une influence sur la pureté de la chitine obtenue, les meilleurs résultats étant obtenus avec un pressage a minima. Le meilleur résultat est obtenu avec le broyage suivi du pressage, à savoir une chitine présentant un degré de pureté de 78% et le moins bon avec le broyage 25 seul, à savoir une chitine présentant un degré de pureté de 48%. Une analyse plus fine du produit intermédiaire dont la chitine a été extraite, permet de constater qu'un bas taux de lipides est favorable à une plus grande pureté de la chitine obtenue (Figure 5). Par « produit intermédiaire », on vise le produit entrant en hydrolyse enzymatique, c'est-à-dire issu de la dernière étape avant hydrolyse, à 30 savoir, selon les procédés de production ci-avant, l'étape de broyage 1 ou 2 ou l'étape de pressage. L'analyse du taux des lipides dans la chitine et le jus d'hydrolyse permet en effet de relever qu'en fonction du taux de lipides initiaux présents dans le produit intermédiaire, le taux des lipides dans la chitine est relativement stable, de 7 à 15%, 35 tandis que le taux des lipides dans l'hydrolysat varie, quant à lui, de 11 à 47% 3031115 25 (Figure 5). Plus particulièrement, si le produit intermédiaire a une teneur en lipides de 35%, alors : - la chitine qui résultera de l'hydrolyse ne sera pure qu'à 50% et comportera 5 10% de lipides, et - la teneur en lipides de l'hydrolysat avoisinera quant à elle les 40%. En revanche, si la teneur en lipides du produit intermédiaire est de 7%, alors : - la chitine obtenue après hydrolyse aura une pureté de 80% et aura une teneur en lipides de 8% et l'hydrolysat présentera également une faible teneur en lipides, de 10 l'ordre de 10%. Cela indique que lorsque le taux des lipides initiaux est élevé, supérieur à 12%, l'enzyme responsable d'hydrolyse est amenée à hydrolyser non seulement les protéines, mais également les lipides par promiscuité catalytique. C'est ainsi qu'un taux de lipides dans la chitine similaire est obtenu à savoir 8,6 et 7,9% dans les cas où les 15 lipides initiaux étaient de 35 et 7% respectivement. En revanche, la pureté de la chitine passe dans ce cas de 48 à 84% respectivement. Ainsi, sur les 52% d'impuretés d'une part et 16% de l'autre, 8% en moyenne sont dus aux lipides, la quantité de protéines restées accrochées à la chitine est donc de 38 points supérieure dans le cas où davantage de lipides étaient présents dans le produit intermédiaire soumis à 20 l'hydrolyse. Finalement, l'importance du broyage en amont du pressage peut également être étudiée (Figure 6). Il apparait ainsi clairement que la répartition des lipides entre le gâteau et le jus de presse est bien plus efficace, 12,9 versus 87,1 contre 42,7 versus 57,3, lorsqu' un broyage préalable a été réalisé. 25 Exemple 5: Influence de la combinaison d'étapes préalables à l'hydrolyse enzymatique sur le degré de pureté de la chitine obtenue Différents types de prétraitement ont été testés, le broyage seul, le broyage suivi du pressage, le traitement des cuticules avec un agent oxydant (H202) suivi d'un 30 broyage et le traitement des cuticules avec un agent oxydant (H202) suivi d'un broyage et d'un pressage. Pour le pressage, la presse de type Angel décrite à l'Exemple 4 a été utilisée dans les conditions suivantes : - Vitesse = 82 tr/min; 35 - VV (énergie) = 3 HP (chevaux vapeur) soit 2,68 x 106 J; 3031115 26 - Porosité (approximative) = 0,5 mm dans la première partie et 0,2 mm dans la dernière partie. 1. Matériel et méthodes 5 Production de chitine avec un broyage 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis 10 mixées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer contenant 2 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue 15 est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 8,13 ± 0,27 g de chitine par ce procédé. Production de chitine avec un broyage suivi d'un pressage 200 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un 20 bain-marie à 100 °C et contenant 200 mL d'eau préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 200 mL. Le liquide ainsi obtenu est passé dans une presse de type bi-vis. 30 g du gâteau de presse ainsi obtenu sont transférés dans un Erlen Meyer contenant 150 mL d'eau et 0,3 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est 25 placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 4,71 ± 0,11 g de chitine par ce procédé. 30 Production de chitine avec un traitement des cuticules avec un agent oxydant IL,_12L2) ) suivi d'un broyage 50 g de larves de T molitor sont introduits dans un bécher, placé dans un bain- marie à 100 °C et contenant 50 mL d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 6% 35 préalablement portée à ébullition. Après 5 minutes, le bécher est retiré du bain-marie, 3031115 27 les larves sont essorées, puis broyées avec un volume d'eau de 100 mL. Le liquide ainsi obtenu est transféré dans un Erlen Meyer contenant 150 mL d'eau et 0,5 g de protéase (Prolyve), l'ensemble est placé pendant 4 heures à 45 °C sous agitation magnétique (à un pH d'environ 6,5). L'Erlen Meyer est ensuite placé pendant 5 15 minutes dans un bain-marie à 90 °C afin de désactiver les enzymes, la solution est ensuite filtrée à 0,45-0,5 pm à chaud. La chitine ainsi obtenue est séchée pendant 24 heures à 70 °C. On obtient ainsi 1,98 ± 0,22 g de chitine par ce procédé. Production de chitine avec un traitement des cuticules avec un agent oxydant 10 suivi d'un broyage et d'un pressage Cet essai est réalisé selon l'Exemple 1. Calcul du degré de pureté La pureté de chitine est calculée par gravimétrie en fonction du taux de chitine, 15 initialement contenu dans les larves, i.e. 5% environ du poids sec des larves. 2. Résultats Les résultats sont présentés en Figure 7. La pureté de la chitine obtenue par 20 hydrolyse enzymatique dépend fortement du procédé de prétraitement utilisé. Ainsi, lorsque seul un broyage est réalisé avant l'hydrolyse enzymatique, ce procédé ne donne lieu qu'à une pureté de 48%, alors que l'adjonction d'une étape de pressage ou d'un traitement des cuticules avec un agent oxydant permet d'obtenir une pureté de 50-78%. Enfin, la combinaison d'une étape de pressage avec le traitement cuticules 25 avec un agent oxydant permet d'atteindre une chitine présentant un degré de pureté de 88%. Effet de synergie résultant de la combinaison d'une étape de pressage avec une étape de traitement des cuticules avec un agent oxydant 30 Le Tableau 2 ci-dessous reprend les résultats présentés en Figure 7. 3031115 28 Broyage seul Broyage + H202 + H202 + pressage Broyage broyage + pressage Pureté de la 48% 78% 50% 88% chitine obtenue Amélioration de - + 63% + 4% + 83% la pureté de la chitine par rapport au broyage seul Tableau 2: Amélioration de la pureté de la chitine selon le procédé de prétraitement utilisé 5 Le Tableau 2 met en évidence l'effet synergique de la combinaison d'une étape de pressage et d'une étape de traitement avec un agent oxydant. REVENDICATIONS1. Procédé de production de chitine et/ou de chitosan à partir de cuticules d'insectes, comportant les étapes suivantes : (i) le pressage des cuticules d'insectes, puis, (i) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, un traitement des cuticules avec un agent oxydant ayant été effectué préalablement à l'hydrolyse enzymatique. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant une étape de broyage préalable à l'étape de pressage. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le traitement des cuticules avec un agent oxydant est effectué avant, concomitamment et/ou après l'étape de broyage et/ou de pressage. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'enzyme protéolytique est une protéase. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'agent oxydant est choisi parmi le groupe constitué par le peroxyde d'hydrogène, le permanganate de potassium, l'ozone et l'hypochlorite de sodium. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant une étape d'abattage des insectes préalable à l'étape de pressage et/ou de broyage. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'abattage des insectes est une étape d'ébouillantage. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le traitement des cuticules avec un agent oxydant est effectué concomitamment et/ou après l'étape d'abattage. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le ou les insecte(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe constitué par les coléoptères, les lépidoptères, les orthoptères et les diptères. 10. Procédé de production de chitine à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, 3031115 30 d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, e) la récupération de la chitine, les cuticules d'insectes étant traitées avec un agent oxydant, avant l'étape d). 5 11. Chitine susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Procédé de production de chitosan à partir d'insectes, comportant les étapes suivantes : a) l'abattage des insectes, 10 b) le broyage des insectes, c) le pressage des insectes, d) l'hydrolyse enzymatique des cuticules d'insectes par une enzyme protéolytique, e) la récupération de la chitine, 15 f) la désacétylation de la chitine récupérée, g) la récupération du chitosan, les cuticules d'insectes étant traitées avec un agent oxydant, avant l'étape d).