FR 3024984 A1 20160226 FR 1459895 A 20141015 1 PROCEDE DE PRODUCTION D'HYDROGENE PAR FERMENTATION OBSCURE A PARTIR DE BIOMASSES ISSUES DE LA FILIERE VITIVINICOLE, SANS APPORT DE CONSORTIUM MICROBIEN DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à la production d'hydrogène par fermentation obscure à partir de biomasses issues de la filière vitivinicole (bourbes, marcs, gâteaux de filtration, lies, marcs épuisés, eaux de rinçage des matériels de récolte, de tri et de vinification). La présente invention trouve notamment une application dans le secteur de l'énergie avec la production d'un vecteur énergétique (hydrogène) à partir d'une biomasse agricole. Une autre application possible est la production d'hydrogène pour tout industriel utilisant l'hydrogène comme réactif sur son site et disposant de biomasses métabolisables. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte. Etat de la technique La France est le plus gros producteur de vin : 50 millions d'hectolitres produits en moyenne par an entre 2000 et 2011 [1]. La génération de déchets organiques, y compris les sous-produits tels que les marcs de raisin, les bourbes, les lies, les rafles et boues déshydratées, est considérée comme l'un des problèmes les plus importants auxquels doit faire face l'industrie mondiale du vin [2]. Les marcs de raisin représentent 27% du rendement moyen du vignoble qui se situe autour de 7000 kg.ha-1 en France, et sont composés de 4,5% de pépins de raisin, 19,5% de peau de raisin et 3% de rafles [3, 4]. Selon le règlement du Conseil européen 1234/2007, les marcs de raisin et lies de vin doivent être envoyés aux distilleries d'alcool sauf les petites industries vinicoles. Environ 850 000 tonnes de marcs de raisin sont envoyés chaque année aux distilleries françaises [5]. Compte tenu des quantités élevées produites chaque année par l'industrie du vin, du décalage croissant entre problèmes environnementaux et pénurie de combustibles fossiles, la valorisation des sous-produits et des déchets est inévitable. Les valorisations actuelles sont : les polyphénols, les tanins comme 3024984 2 colles à bois, l'acide tartrique, les substrats végétaux, l'alimentation animale, le bioéthanol, etc... A l'heure actuelle, 95% de l'hydrogène est produit à partir des combustibles fossiles par des procédés thermiques (ex. vaporéformage du gaz naturel). Parmi 5 les possibilités de valorisation et dans le cadre de l'exploration de nouvelles sources d'énergie renouvelable, l'hydrogène (H2) produit à partir des biomasses est un vecteur d'énergie propre et prometteur. En effet, l'hydrogène peut être utilisé en tant que vecteur énergétique dans des piles à combustible. Les technologies de production d'hydrogène à partir de la biomasse peuvent se 10 décliner en deux catégories : (i) les processus thermochimiques : gazéification (procédé direct de production de H2), pyrolyse, liquéfaction hydrothermale, et (ii) les processus biochimiques : photolyse directe/indirecte, fermentation [6], estérification, digestion. Ces derniers, bien que peu énergivores par rapport aux processus thermochimiques, produisent respectivement de l'éthanol, du biodiesel 15 et du biogaz qui devront subir un traitement de reformage, étape thermique catalytique, pour produire de l'hydrogène. Parmi ces procédés, la photolyse de l'eau utilisant des algues ou des cyanobactéries et la fermentation obscure (dark fermentation) de composés organiques avec des micro-organismes, agissant comme des biocatalyseurs, permettent de produire de l'hydrogène à basse 20 température (37°C) en évitant les étapes de reformage catalytique ou de gazéification qui sont très énergivores. Le rendement énergétique maximum (conversion de la biomasse en hydrogène) du procédé de fermentation obscure est de 67% (en pratique de 15 à 33%), valeur bien supérieure à celle du procédé de photolyse de l'eau. 25 La production de H2 par des procédés biologiques, tels que la fermentation obscure, est moins énergivore et peut être réalisée dans des conditions non stériles, en utilisant des cultures mixtes et des déchets organiques peu coûteux comme substrats [7]. La conversion de déchets organiques en H2 implique une communauté microbienne complexe utilisant différentes voies métaboliques. Le 30 rendement théorique maximal en H2 à partir de 1 mol d'hexose est de 4 molE12.mol- 1 hexose via la voie acétate (équation 1) et 2 molE12.morinexose via la voie butyrate (équation 2) [8,9]. Le rendement expérimental peut atteindre une limite de 2,5 MOIH2. M 011 hexose (équation 3) lorsque différentes voies métaboliques sont impliquées (combinaison de la voie acétate et butyrate) [10]. Le rapport molaire 35 butyrate/acétate (B/A) peut estimer la conformité de l'équation 3 où l'optimum est 3024984 3 3/2. Ces rendements sont possibles seulement si la pression partielle en H2 est basse et si les micro-organismes consommant H2 sont inhibés, tels que les archées méthanogènes ou les bactéries homoacétogènes (équation 4). Le traitement thermique est l'un des traitements les plus utilisés pour inhiber les 5 micro-organismes consommant H2 et augmente spécifiquement la croissance de bactéries sporulées produisant H2. En dehors des voies de production et de consommation de H2, les voies compétitives telles que la voie éthanolique (équation 5) peuvent être impliquées au cours de la fermentation anaérobie. C6H1206 + 2H20 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 (AG°295 = -21 5kJ.rnol-1) (1) C6H1206 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 (AG°295 = -264kJ.mol-1) (2) 4C6H1206 + 2H20 3CH3CH2CH2COOH + 2CH3COOH + 8CO2 + 10H2 (AG°295 = - (3) 252kJ.mol-1) (4) 2CO2 + 4H2 CH3COOH + 2H20 (AG°298 = -94kJ.mol-1) (5) C6H1206 2CH3CH2OH + 2CO2 (AG°295 = -235kJ.mol-1) Cependant, dans la littérature, les boues ou eaux usées sont souvent 10 utilisées comme inoculum, et très peu d'auteurs ont étudié la fermentation obscure à partir de déchets organiques sans l'utilisation de cultures mixtes additionnelles. Par ailleurs, le coût de l'hydrogène est principalement lié à son transport. En effet, le coût de production industrielle de l'hydrogène s'élève à 2 E par kg d'hydrogène obtenu par vaporéformage du méthane ; à ce coût s'ajoute toutefois 15 celui de la distribution jusqu'à l'utilisateur, lui-même fonction des distances à parcourir et de la densité des lieux de livraison. C'est dans une optique de décentralisation de la production de l'hydrogène que le procédé de fermentation obscure de biomasses ou d'autres procédés de production d'hydrogène pourrait devenir compétitif ; la production décentralisée d'hydrogène à partir du gaz naturel 20 aurait dans cette configuration un coût minimum de 6 E par kg d'hydrogène [11]. Il existe donc un réel besoin de mettre au point un nouveau procédé de production d'hydrogène écologique, efficace et peu énergivore palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de produire de l'hydrogène avec un bon rendement, sans production 25 de méthane, sans avoir à faire l'usage d'inoculum de cultures mixtes, et de réduire les coûts. Description de l'invention Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence de manière tout à fait inattendue 3 0 une production efficace d'hydrogène sur diverses biomasses vitivinicoles issues 3024984 4 de plusieurs terroirs sans apport d'inoculum microbien, sans apport nutritionnel additionnel ni prétraitement thermique ; alors que les travaux décrits dans la littérature utilisent systématiquement un inoculum de cultures mixtes avec des rendements inférieurs à ceux obtenus avec le procédé de l'invention. 5 Le procédé de l'invention est constitué des premiers travaux de valorisation de biomasses vitivinicoles, non encore explorées pour certaines à ce jour (par exemple, bourbes, marcs, eaux de rinçage des pressoirs, eaux de rinçage des cuves de débourbage), pour la production d'hydrogène par le processus biologique de fermentation obscure. De façon globale, le procédé de fermentation 10 obscure est peu énergivore comparativement aux procédés de valorisation actuels comme la distillation des marcs et des bourbes pour la production d'éthanol. La consommation énergétique pour la mise en oeuvre de la fermentation repose essentiellement sur le maintien du réacteur en isotherme (température à 37°C) et la mise en suspension de la biomasse par agitation. 15 Le procédé de l'invention permet ainsi de produire de l'hydrogène avec de bons rendements sans production de méthane, sans avoir à faire usage d'inoculum de cultures mixtes mais en utilisant le consortium microbien endogène présent dans la biomasse vitivinicole, et sans prétraitement thermique. En effet, le procédé de production met en évidence une sélection de micro-organismes 20 producteurs d'hydrogène forcée par les conditions de mise en oeuvre du bioréacteur semi-batch (extraction des gaz produits, fonctionnement en anaérobiose et à l'obscurité, conditions de pH et température contrôlées). Les résultats montrent que les consortia microbiens présents dans la biomasse sont les plus adaptés pour métaboliser les sucres constitutifs de celle-ci en hydrogène 25 (bourbes : rendement moyen de 2,0 mol H2/mol hexose ; marc de raisin : rendement moyen de 1,4 mol H2/mol hexose). En effet, les données de la littérature sur la fermentation obscure de raisins mûrs en présence de cultures mixtes (consortium microbien exogène) rapportent un rendement de seulement 0,1 mol H2/mol hexose [12], très largement inférieur à ceux obtenus par le procédé 30 de l'invention. Par ailleurs, hormis la régulation du pH du milieu réactionnel à une valeur optimisée, aucun traitement thermique n'est nécessaire pour sélectionner les micro-organismes recherchés dans le procédé de l'invention. Alors que d'une façon générale, dans les procédés de fermentation de l'art en présence d'un consortium microbien complexe (tel que l'on peut le rencontrer dans les boues de 35 de station d'épuration (STEP)), un traitement thermique avant fermentation est 3024984 5 nécessaire afin d'inhiber l'activité des organismes hydrogénotrophes ou compétiteurs de la production d'hydrogène et ainsi augmenter le rendement de production en hydrogène. La présente invention a donc pour objet un procédé de production 5 d'hydrogène comprenant la fermentation obscure de biomasses vitivinicoles, sans ajout d'inoculum microbien et sans prétraitement thermique. On entend par « fermentation obscure » au sens de la présente invention, la fermentation anaérobie qui consiste en la transformation par fermentation de substrats organiques en biohydrogène. Il s'agit d'un processus complexe réalisé 10 par divers groupes de micro-organismes, impliquant une série de réactions biochimiques utilisant trois étapes similaires de la digestion anaérobie. La fermentation obscure diffère de la photofermentation en ce qu'elle se déroule en l'absence de lumière. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, aucun 15 apport nutritionnel additionnel n'est apporté à la biomasse. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la biomasse vitivinicole est choisie parmi les bourbes de raisin, les marcs de raisin, les lies de vin, les marcs épuisés, les gâteaux de filtration, les eaux de rinçage des matériels de récolte, de tri et de vinification. La biomasse vitivinicole peut provenir 2 0 d'une ou plusieurs sources différentes, par exemple de bourbes de raisin et d'eaux de rinçage. Cette biomasse, issue de la filière viticole, concerne tous les raisins utilisés pour la vinification par pressurage de la vendange quelque soit la couleur du raisin sans restriction de cépage ou de terroir. Par exemple, la biomasse vitivinicole est choisie parmi les bourbes ou marcs de raisin d'Alsace ou de 25 Bourgogne, et/ou eaux de rinçage des pressoirs ; le raisin d'Alsace provenant des cépages de Muscat, Auxerrois, Pinot gris, Gewurztraminer ou Riesling et le raisin de Bourgogne provenant des cépages de Pinot noir, Chardonnay, Pinot noir/Chardonnay ou Aligoté. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la 30 fermentation est réalisée à 37°C ± 2°C. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la biomasse vitivinicole peut être conservée par réfrigération ou par congélation avant utilisation. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, le pH de 35 la biomasse est maintenu supérieur à 5,5 ± 0,2 pendant la fermentation. 3024984 6 Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, le gaz produit par la fermentation de la biomasse est extrait par un gaz de balayage (azote par exemple). Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, ledit 5 procédé peut comprendre en outre une étape d'isolement du consortium microbien contenu dans la biomasse fermentée ou en fermentation. La présente invention a également pour objet le consortium microbien, issu de la biomasse vitivinicole, susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention. Par exemple, le consortium microbien de l'invention comprend majoritairement 10 une flore microbienne appartenant aux genres Enterobacter/Klebsiella/Kluyvera/Buttiauxella pour les marcs et aux espèces Clostridium saccharobutylicum, Clostridium spp. (saccharoperbutylacetonicum, beijerinckii, puniceum, diolis, roseum), Streptococcus spp. (lutetiensis, infantarius, equinus, luteciae), Clostridium butyricum pour les bourbes. 15 La présente invention a également pour objet l'utilisation du consortium microbien selon l'invention, pour la production d'hydrogène par fermentation obscure de biomasses agricoles, notamment vitivinicoles. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous. 20 3024984 7 EXEMPLES EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES 5 La fermentation obscure a été réalisée dans un réacteur de 1L à double enveloppe placé à l'obscurité et doté d'un système d'extraction des gaz, qui permet à la fois d'assurer les conditions d'anaérobiose et de réduire au minimum la pression partielle en hydrogène, celui-ci étant inhibiteur de l'activité microbienne. 10 Dispositif expérimental - Equipements Les tests ont été réalisés dans un réacteur de 1L (Büchi AG) agité, fonctionnant à pression atmosphérique. Il est équipé d'une double enveloppe connectée à un bain thermostaté (Bioblock Scientific) permettant de contrôler la 15 température dans le bioréacteur. Le pH du milieu réactionnel est suivi in situ à l'aide d'une sonde pH-métrique et est ajusté avec un régulateur de pH (Hanna Instruments BL 7916) connecté au réacteur, par injection d'une solution de soude. Le réacteur est alimenté par un gaz de balayage (azote) dont le débit est régulé par un débitmètre massique (Brooks 5850E) connecté à un régulateur (Brooks 20 Instruments 0254). Les gaz produits au cours de la fermentation, entrainés par le flux d'azote en sortie du bioréacteur, circulent dans deux pièges placés en série, réfrigérés à 0°C à l'aide d'un cryostat (Huber TC40) afin de piéger par condensation les composés volatils provenant du milieu réactionnel liquide. La production de gaz est analysée en ligne par un micro-chromatographe en phase 25 gazeuse (Agilent M200). Le réacteur est équipé d'une vanne de purge pour réaliser les prélèvements nécessaires à la quantification des métabolites identifiés et analysés à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme (Agilent GC 7890Q). 3 0 Protocole de mise en oeuvre et conditions expérimentales Conditionnement et préparation de la biomasse Les échantillons (marcs, bourbes, eaux de rinçage) ont été collectés sur différents terroirs, puis stockés à -20°C pour limiter le démarrage des processus 35 fermentaires, sauf pour le lot d'échantillons «frais » stockés à 4°C. 3024984 8 Pour les eaux de rinçage, un volume de 700mL d'eaux de rinçage a été placé dans le bioréacteur. Pour les bourbes, un volume de 650mL d'eau du réseau de la Communauté Urbaine de Strasbourg (CUS) ou d'eaux de rinçage a été ajouté à 50mL de 5 bourbes préalablement placées dans le bioréacteur pour obtenir un volume final de 700mL. Pour les essais préliminaires, des boues activées (zone anoxie) de la station d'épuration (boues STEP) de la Communauté Urbaine de Strasbourg ont substituées l'eau du réseau de la CUS afin d'ajouter un inoculum externe. Pour les marcs, un volume de 650mL d'eau du réseau de la CUS ou d'eaux 10 de rinçage a été ajouté à 50g de marcs de raisin préalablement placés dans le bioréacteur pour obtenir un volume final de 700mL. Test de fermentation Le pH du milieu réactionnel (bourbes diluées, marcs dilués ou eaux de 15 rinçage) a été initialement ajusté à 7,0 dans le bioréacteur à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium à 3M. Lorsqu'un prétraitement thermique (ht) a été appliqué (essais préliminaires et marcs dilués), le milieu réactionnel a subi une montée en température de 15min jusqu'à 70°C sous atmosphère d'air statique et un palier d'une heure à cette température, au bout duquel la température a décru 20 jusqu'à 37°C. Le milieu réactionnel a alors été placé sous flux d'azote avec un débit de 50mLN2/min, à une température contrôlée à 37°C et sous agitation à 220tr/min puis à l'obscurité. Ce flux d'azote a permis à la fois d'assurer des conditions anaérobies et d'extraire les gaz produits. Ainsi, la pression partielle en hydrogène n'a pas excédé 0,05bar. Lorsque la régulation de pH a été appliquée, 25 0,5mL de solution de soude à 1M (sauf pour les essais à 3M) a été injecté quand la valeur de pH a été inférieure à 5,50±0,2. Les tests de fermentation ont été réalisés sans aucun apport de milieu nutritif additionnel (hormis la biomasse vitivinicole). 30 Analyses Analyses des gaz L'analyse en ligne des gaz a été assurée par un microchromatographe Agilent M200 composé de deux modules équipés de détecteurs à conductivité 35 thermique (TCD). Le premier module a permis la détection de N2, 02, CH4 et H2 et 3024984 9 est constitué d'une colonne de type tamis moléculaire 5A (10m x 0,32m x 30pm) utilisant l'argon comme gaz vecteur. Le deuxième module a permis de détecter et quantifier CO2 et CH4 grâce à une colonne capillaire PoraPlot U (8m x 0,32m x 10pm) constituée de divinylbenzène éthylèneglycol comme phase stationnaire et 5 utilisant l'hélium comme gaz vecteur. Analyses des métabolites La composition en acides gras volatils (AGV) et en alcools de la phase liquide : acétate (C2), propionate (C3), butyrate et iso-butyrate (C4 et iC4), 10 valérate et iso-valérate (C5 et iC5), éthanol et butanol, a été analysée par chromatographie en phase gazeuse (Agilent 7890Q GC) avec un détecteur à ionisation de flamme (FID) et une colonne FFAP (15m x 0,1m x 0,1pm) utilisant le polyéthylène glycol modifié avec de l'acide nitrotérephtalique comme phase stationnaire. 15 Les échantillons ont été préalablement centrifugés à 15000tr/min pendant 15min, puis les surnageants ont été filtrés sur des filtres seringues (diamètre de pores de 0,22pm). Chaque échantillon, dilué au 1/4, a ensuite été mélangé à de l'acide trifluoroacétique à une concentration de 0,03M en ratio volumique 1:1 avant toute injection dans le GC-FID pour être à un pH inférieur à 2. L'hélium a été 20 utilisé comme gaz vecteur à un débit de 0,4m L/mn et une pression de 3,6bar. Analyses des sucres L'analyse des sucres totaux a été réalisée par dosage colorimétrique à l'anthrone. La quantité de sucres consommés a été calculée en effectuant la 25 différence entre la quantité initiale et la quantité finale mesurées dans les surnageants obtenus par centrifugation à 4500 tr/min pendant 30 min des prélèvements issus du bioréacteur. Pour la mesure de la quantité initiale en sucres contenues dans les marcs de raisin, un traitement de 4 heures aux ultrasons a été réalisé. 30 Analyse qualitative de la microflore par séquençage haut débit (réalisée en externe par INRA Transfert Environnement, Narbonne) L'étude des populations bactériennes présentes dans les matrices ADN a été effectuée par pyroséquençage Roche 454 (séquenceur : Roche GS FLX + System 35 XLR 70 sequencing chemistry) du gène d'ARN ribosomique 16S, présent dans 3024984 10 tous les génomes microbiens. Les analyses bioinformatiques ont permis de traiter les fichiers de séquences brutes et de réaliser l'identification de chaque séquence sur la base de la taxonomie SILVA. Un regroupement a été effectué sur la base de 100% d'homologie entre deux séquences et la séquence la plus proche dans la 5 base de données Genbank a été identifiée. EXEMPLE 2 : POTENTIALITE DE LA BIOMASSE « BOURBES » EN TANT QUE SUBSTRAT ET MISE EN EVIDENCE DE LA PRESENCE D'UN CONSORTIUM MICROBIEN ENDOGENE PRODUCTEUR D'HYDROGENE 10 La potentialité de la biomasse « bourbes » a été étudiée pour la production d'hydrogène en tant que substrat avec pour inoculum les cultures mixtes (CM) urbaines issues des boues activées (zone anoxie) de la station d'épuration (boues STEP) de la Communauté Urbaine de Strasbourg. L'effet du prétraitement thermique (ht) de la biomasse « bourbes » avec cultures mixtes et sans cultures 15 mixtes sur la production d'hydrogène a été testé. La première approche liée à notre expérience de l'utilisation des boues de STEP a été de diluer la biomasse « bourbes » dans les boues de station d'épuration (MES = 4 g/L) et d'appliquer un prétraitement thermique à 70°C permettant l'inhibition de bactéries hydrogénotrophes, consommatrices 20 d'hydrogène ou d'archées méthanogènes, productrices de méthane ; en effet, sans traitement thermique les cultures mixtes avec ajout d'un substrat modèle sont très peu productives d'hydrogène (rendement en H2 de 0,23 mol H2/mol d'hexoses consommés). Les résultats obtenus, présentés dans le tableau 1, sur des bourbes 25 provenant d'Alsace (cépage Pinot gris) (PG+CMht) (test 1) et de Bourgogne (B+CMht) (test 5) ont montré non seulement un volume produit d'hydrogène élevé lié à une concentration en matières métabolisables (sucres) importante mais surtout un rendement plus élevé respectivement de 2,31 et 2,21 mol H2.mo1-1 d'hexoses consommés, que celui obtenu avec un substrat modèle (2,10 mol 30 H2. morl hexoses). La seconde approche a alors été de tester la biomasse « bourbes » diluée dans les boues de STEP sans appliquer de traitement thermique (échantillons PG+CM et B+CM) (tests 2, 6). Il a été observé un rendement en hydrogène certes plus faible que pour la biomasse traitée thermiquement mais tout de même très 35 significatif, de 2,1 à 3,6 fois plus élevé que celui obtenu pour les cultures mixtes 3024984 11 additionnées d'un substrat modèle et non traitées thermiquement ; la production en gaz étant en faveur du dioxyde de carbone (rapport molaire H2/CO2 faible). Tableau 1 : Performances en production d'hydrogène pour des bourbes d'Alsace (cépage Pinot 5 gris (PG) et de Bourgogne (B) (vendanges 2012) avec cultures mixtes (CM) ou sans (eau du réseau de la CUS) et avec prétraitement thermique à 70°C (ht) ou sans prétraitement. Test# 1 2 3 4 5 6 7 Variété de bourbes PG+CMhi PG+CM PG PG B+CMht B+CM Productivité H2 (mmolrl.h-1) 8,18 1,43 5,05 3,80 8,91 4,54 2,38 2,97 Rendement (mol H2.mo1-1 hexoses consommés) 2,31 0,49 1,85 1,18 2,21 0,83 2,12 1,99 Rapport Butyrate/Acétate 0,30 0,18 2,78 >.» 0,81 0,37 0,33 1,38 (B/A) Rapport H2/CO2 0,80 0,24 0,91 0,86 0,95 0,42 1,08 0,88 P (L H2.1=1 réacteur) 2,09 0,46 3,59 2,78 2,41 0,71 2,57 2,25 P (L H21-1 bourbes) 29,19 6,45 50,31 38,90 33,72 9,87 35,97 31,56 >>> : acétate non détecté Cette production d'hydrogène révélatrice d'une activité microbienne autre que celle des boues de STEP et productrice d'hydrogène a orienté les 10 expériences vers une troisième approche par la mise en oeuvre de la biomasse « bourbes » dans le bioréacteur en l'absence de cultures mixtes et diluées dans l'eau du réseau de la Communauté Urbaine de Strasbourg. Les résultats de la biomasse « bourbes » diluées avec prétraitement thermique (PGht et Bht) (tests 3, 7) sans aucun apport d'inoculum microbien ont 15 montré une activité remarquable avec un rendement en hydrogène inférieur mais proche de celui obtenu pour la biomasse « bourbes » avec cultures mixtes, avec de plus, un volume d'hydrogène produit par litre de réacteur très supérieur spécifiquement pour la biomasse d'Alsace (+72%). Ces résultats ont mis en évidence une activité fermentaire endogène dans ce type de biomasse, non 2 0 explorée dans la littérature. Le rapport molaire H2/CO2 plus élevé (+ 13,7% pour les deux types de bourbes) a révélé la présence d'un consortium bactérien sélectif à la production d'hydrogène. 3024984 12 Dans une optique de minimiser les dépenses énergétiques liées au prétraitement thermique lors du procédé, des tests ont été réalisés avec la biomasse « bourbes » diluée dans l'eau sans traitement thermique (échantillons PG et B) (tests 4, 8). 5 Les résultats ont mis en évidence un rendement en hydrogène nettement plus élevé, de 58,5% et 58,3% respectivement pour la biomasse d'Alsace et de Bourgogne que ceux des bourbes additionnées des boues de la STEP, avec une production en hydrogène par litre de réacteur plus importante (test 4 par rapport à test 2) ou équivalente (test 8 par rapport à test 6). Ces premiers essais probants 10 ont attesté de l'existence de consortia microbiens dans la biomasse vitivinicole de type « bourbes » ; celle-ci jouant le rôle à la fois de substrat et d'inoculum microbien lors de la réaction de fermentation, non nécessairement mésophile et sans sélection microbienne spécifique. Cette forte potentialité, démontrée pour la première fois, a donné lieu aux essais suivants pour lequel aucun traitement 15 thermique à 70°C n'a été nécessaire. EXEMPLE 3 : PERFORMANCE EN PRODUCTION D'HYDROGENE POUR LA BIOMASSE « MARCS » Les marcs de raisin issus des vendanges 2012 provenant de différents 20 cépages issus de différents terroirs (Alsace (Domaine Pfister, Dahlenheim) et Bourgogne (Domaine de l'Université de Bourgogne)) ont été utilisés en tant que substrat et inoculum microbien. Les paramètres testés sont l'impact des composés ligno-cellulosiques provenant des rafles des grappes de raisin sur la production d'hydrogène ainsi que le prétraitement thermique à une température de 25 70°C. Les résultats de production sont consignés dans le tableau 2. 3024984 13 Tableau 2 : Production d'hydrogène pour différents marcs de raisin (vendanges 2012), stockés à -20°C et sous différentes conditions : Muscat d'Alsace (AM), Muscat d'Alsace sans rafles (Am-sr), Muscat d'Alsace prétraité thermiquement (AMht), Auxerrois d'Alsace (A,), Pinot Noir de Bourgogne (BpN), mélange Pinot Noir/Chardonnay de Bourgogne (Bpc) et Aligoté de Bourgogne 5 (BA). Test # Echantillon de marcs de raisin Concentration NaOH 3M 3M 3M 1M 1M 1M 1M 1M Productivité en H2 (mmolrl.h-1) 3,86 4,75 3,46 4,75 4,16 4,45 5,33 5,05 Rendement en H2 1,61 1,13 1,62 1,02 1,45 1,33 1,42 (mol H2. M01-1 1,34 hexoses consommés) Rapport molaire Butyrate/Acetate 0,07 0,12 0,29 0,11 » 1,09 0,96 (B/A) Rapport H2/CO2 0,82 0,75 0,86 0,90 0,88 0,81 0,74 P (L H21-1 réacteur) 3,02 1,91 2,78 3,67 4,45 3,53 2,86 P (L H21-1 bourbes) 42,33 26,68 38,90 51,41 62,28 49,44 40,01 Acétate (mmol.L-1) 37,5 33,0 0 26,6 43,9 Butyrate (mmol.L-1) 36,5 17,0 24,6 28,9 42,0 Ethanol (mmol.L-1) 10,1 22,7 10,3 5,8 8,8 >>> : acétate non détecté *: en cours d'analyse Les bourbes de Pinot Gris conservées à -20°C pendant plus de 6 mois ont été mises en oeuvre dans deux bioréacteurs différents ayant des configurations 10 proches, l'un étant celui utilisé pour tous les essais réalisés (PGtfbis), l'autre nouvellement installé étant situé dans un autre bâtiment (Peter). Les premières données (tableau 6) ont attesté du fait que la biomasse stockée plus de 6 mois à 20°C est toujours active pour la production d'hydrogène et d'autre part, que la biomasse mise en oeuvre dans un réacteur neuf a également été active écartant 15 ainsi toute hypothèse de contamination. La production d'hydrogène pour les tests 6, 7 a été plus faible que pour l'essai (test 5), explicable potentiellement par une quantité moindre de matières à métaboliser (réduction de la teneur en sucres) ou par un vieillissement de la biomasse (hypothèses à lever par les analyses ultérieures). Le test réalisé dans le nouveau réacteur (test 7) a mis en évidence en 20 première approche une production d'hydrogène moins efficace ; ceci étant attribuable à un mode d'extraction des gaz non optimisé et l'existence d'une pâle de cisaillement supplémentaire dans le bioréacteur. Les bourbes de Chardonnay de Bourgogne issues de différents modes de traitement des cultures (tableau 7) (tests 1, 3, 5) ont eu un impact plus mesuré sur 25 le rendement en hydrogène (allant de 1,80 à 2,18 mol.mo1-1), que pour les marcs de 3024984 20 raisin correspondants. Le meilleur rendement en hydrogène a été, comme pour les marcs de raisin, obtenu pour l'échantillon ayant subi le traitement écophytosanitaire avec le rapport molaire butyrate/acétate le plus élevé (2,32). Il est à noter pour les 3 échantillons une production par litre de bourbes très proches 5 (50,58 ± 2,87 L H21-1 bourbes) et des productivités du même ordre de grandeur (3,52 ± 0,37 mmol.L-1.11-1). Tableau 7 : Performances en production d'hydrogène pour des bourbes de Bourgogne (vendanges 2013) (cépage Chardonnay), stockés à -20°C, issus de différents modes de traitement des cultures : 10 durable (Bdurable), éco-phytosanitaire (Bé'_phyto) et biologique(Bb,o) avec (ww) et sans les eaux de rinçage. 1 2 Test # Variété de bourbes Chdurable Ch éco-phyto Ch 0 Ch'_,,, durable ph ylo Chblo Productivité H2 (mmo11-1.h-1) 3,86 7,52 3,56 6,53 3,13 5,23 Rendement (mol H2.mo1-1 hexoses consommés) 1,80 1,66 2,18 1,88 1,71 2,00 Rapport Butyrate/Acétate (B/A) 2,21 1,48 2,32 2,24 2,11 2,52 Rapport H2/CO2 0,96 0,91 0,91 0,95 0,89 0,99 P (L H21-1 réacteur) 3,73 3,47 3,73 5,34 3,38 4,07 P (L H21-1 bourbes) 52,24 48,64 52,24 74,76 47,27 57,00 Acétate (mmol.L-1) 19,9 20,8 20,6 28,5 15,9 16,3 Butyrate (mmol.L-1) 43,9 30,9 47,7 63,8 33,6 41,1 Ethanol (mmo11-1) 1,5 7,9 4,7 1,7 10,0 4,2 L'utilisation des eaux de rinçage additionnées aux bourbes de Bourgogne issus de divers modes de cultures de la vigne a eu pour impact d'augmenter très significativement la productivité en hydrogène (6,43 ± 1,15 mmol.L-1.11-1 avec eaux 15 de rinçage). Pour les échantillons ayant subi le traitement éco-phytosanitaire et biologique, il est à noter une augmentation substantielle de la production par litre de bourbes par rapport aux tests sans eaux de rinçage, respectivement de 43.1% et 19,9%. Pour ces échantillons, il a été remarqué également un rapport H2/CO2 élevé, respectivement de 0,95 et 0,99. 20 EXEMPLE 5 : PERFORMANCE EN PRODUCTION D'HYDROGENE POUR LA BIOMASSE « EAUX DE RINÇAGE » Les résultats exposés dans le tableau 8 montrent que les eaux de rinçage d'Alsace (cépage Pinot Gris et Gewurztraminer) peu riches en matières 25 métabolisables (teneur en hexose très faible) (tests 1 et 2) présentent une activité 3024984 21 en production d'hydrogène très faible avec un rapport molaire H2/CO2 très en faveur de la production de dioxyde de carbone, significative d'une production par solvantogénèse. 5 Tableau 8 : Performances en production d'hydrogène pour des eaux de rinçage (ER) d'Alsace (vendanges 2013) pour différents cépages (Pinot Gris (PG), Gewurztraminer (Gw), Riesling (Ri)) et de Bourgogne (vendanges 2012) (tf). 2 3 4 5 6 Test # 1 Variété d'eaux de rinçage ERPG ERGW ERp, ERpN ERB1i ERB2 Productivité H2 (mmol.C.h-1) 0,12 0,01 0,30 1,78 2,73 2,63 Rendement (mol H2.mo1-1 hexoses consommés) 0,08 1,19 0,90 1,77 0,55 Rapport H2/CO2 0,09 0,03 0,42 0,90 0,90 0,91 P (L H21-1 réacteur) 0,03 0,009 0,38 0.72 1,66 1,17 Teneur en hexose (g/L) 0,5 0,9 2,4 6,1 7,1 15,9 Lorsque les eaux de rinçage étaient plus concentrées en sucres (tests 4, 5 et 6) et conditionnées à froid (-20°C), le rendement en hydrogène, certes en général 10 inférieur à celui obtenu sur les divers échantillons de marcs de raisin dilués et d'autant plus sur les bourbes diluées, a révélé l'activité d'un consortium microbien endogène favorable à la production d'hydrogène ; le rapport H2/CO2 étant de 0,90. Ces résultats ont mis en évidence que substrat et consortium microbien sont également présents dans les eaux de rinçage et cela a suggéré la nécessité de 15 récupérer les eaux de premier rinçage des pressoirs afin de concentrer au maximum en matières métabolisables la biomasse à traiter. En résumé : La fermentation selon le procédé de l'invention a été réalisée dans un 20 réacteur de 1L à double enveloppe placé à l'obscurité et doté d'un système d'extraction des gaz mis au point au laboratoire permettant à la fois d'assurer les conditions d'anaérobiose et de réduire au minimum la pression partielle en hydrogène, celui-ci étant inhibiteur de l'activité microbienne. A titre indicatif, pour les bourbes, le rendement moyen en hydrogène obtenu est de 2,0 ± 0,4 mol 25 d'H2/mol hexose avec un volume produit compris entre 1,9 et 5,3 L H2/Lréacteur selon le conditionnement de la biomasse, correspondant potentiellement à une production allant de 26,7 à 74,8 L H2/Lbiomasse. Pour les marcs, le rendement moyen en hydrogène s'élève à 1,3 ± 0,2 mol d'H2/mol hexose et une production 3024984 22 moyenne de 22,4±4,6 L H2/kgbiomasse. Les biomasses ont été testées de façon combinée (bourbes + eaux de rinçage et marcs + eaux de rinçage). Les premières études sur l'identification bactérienne par pyroséquençage mettent en évidence la présence des genres Clostridium et Enterobacter. 5 La reproductibilité a été testée sur des bourbes issues des vendanges 2012 et 2013, les profils de production sont similaires sur des lots congelés, les volumes d'hydrogène produit et les rendements sont du même ordre de grandeur. Les tests de la biomasse marcs avec ou sans rafles donnent lieu à des profils de production très similaires (volume d'hydrogène produit : 1,55 L (avec 10 rafles) et 1,48 L (sans rafles). Le consortium microbien étant composé principalement de bactéries des genres Clostridium ou Enterobacter, l'activité de la charge microbienne à l'issue de la réaction doit être traitée de la même manière que les digestats après méthanisation. C'est pourquoi le procédé de fermentation obscure pourra à terme 15 être employé en aval de toutes opérations d'extraction de molécules d'intérêt de la biomasse initiale afin de conserver les propriétés de ces molécules. Le passage à l'échelle industrielle peut être effectué avec le savoir-faire industriel en matière de bio digesteur pour la méthanisation. En effet, les deux 20 procédés sont proches technologiquement. 3024984 23 Listes des références [1] Organisation Internationale de la vigne et du vin, Rapport statistique sur la vitiviniculture mondiale, 2013 5 [2] Christ et al., Journal of Cleaner Production, 53 : 232-242, 2013 [3] Organisation pour l'Alimentation et l'Agriculture. FAOSTAT database. http://faostat.fao.org, 2013 [4] Toscano et al., Biomass and Bioenergy, 55 : 260-267, 2013 [5] Institut Français de la Vigne et du Vin : Expérimentation nationale dur la 10 valorisation des sous-produits vinicoles. Itinéraires 25, 2013 [6] Muradov et al., International Journal of Hydrogen Energy, 33: 6804-6839, 2008 [7] Guo et al., International Journal of Hydrogen Energy, 35 : 10660-10673, 2010 [8] Hawkes et al., International Journal of Hydrogen Energy, 27 : 1339-1347, 2002 15 [9] Thauer et al., Bacteriol. Rev., 41 : 100-180, 1977 [10] Hawkes et al., International Journal of Hydrogen Energy, 32 : 172-184, 2007 [11] Rapport au nom de l'Office parlementaire d'évaluation de choix scientifiques et technologiques de MM. Laurent Kalinowski et Jean-Marc Pastor, L'hydrogène : vecteur de la transition énergétique ?, Rapport enregistré à la Présidence de 20 l'Assemblée Nationale sous le n°1672 et à la Présidence du Sénat sous le n°253, le 19/12/13 [12] Hwang et al., Bioresource Technology, 102(2): 1051-1058, 2011 [13] Doi et al., International Journal of Hydrogen Energy, 35: 7369-7376, 2010 REVENDICATIONS1. Procédé de production d'hydrogène comprenant la fermentation obscure de biomasses vitivinicoles, sans ajout de consortium microbien et sans prétraitement thermique. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel aucun apport nutritionnel additionnel n'est apporté à la biomasse. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la biomasse vitivinicole est choisie parmi les bourbes de raisin, marcs de raisin, gâteaux de filtration, lies de vin, marcs épuisés, eaux de rinçage des matériels de récolte, de tri et de vinification. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la biomasse utilisée est composée d'une ou plusieurs sources de biomasses vitivinicoles différentes. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 4, dans lequel la biomasse est issue de la filière vitivinicole et concerne les raisins utilisés pour la vinification par pressurage de la vendange, quelque soit le terroir, la couleur du raisin et le cépage. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la biomasse vitivinicole est choisie parmi les bourbes ou marcs de raisin d'Alsace ou de Bourgogne, et/ou eaux de rinçage des pressoirs. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le raisin d'Alsace provient de cépages de Muscat, Auxerrois, Pinot gris, Gewurztraminer, Riesling et le raisin de Bourgogne provient de cépages de Pinot noir, Chardonnay, Pinot noir/chardonnay ou Aligoté. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la fermentation est réalisée à 37°C ± 2°C. 3024984 25 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la biomasse vitivinicole est conservée par réfrigération ou congélation avant utilisation. 5 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le pH de la biomasse est supérieur à 5,5 ± 0,2 pendant la fermentation. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le gaz produit par la fermentation de la biomasse est extrait par un gaz de 10 balayage. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre une étape d'isolement du consortium microbien contenu dans la biomasse fermentée ou en fermentation. 15 13. Consortium microbien susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 12. 14. Consortium microbien selon la revendication 13 comprenant majoritairement une flore bactérienne appartenant aux genres 20 Enterobacter/Klebsiella/Kluyvera/Buttiauxella pour les marcs et aux espèces Clostridium saccharobutylicum, Clostridium spp. (saccharoperbutylacetonicum, beijerinckii, puniceum, diolis, roseum), pour les bourbes. 15. Utilisation du consortium microbien selon les revendications 13 ou 25 14, pour la production d'hydrogène par fermentation obscure de biomasse agricole, notamment viticole.