FR 3028528 A1 20160520 FR 1557917 A 20150825 1 INTRODUCTION L'optimisation de l'expression des gènes hétérologues est d'une grande importance pour la production industrielle de protéines pour des applications pharmaceutiques ou techniques. Les protéines recombinantes forment une part toujours plus grande des produits biologiques commercialisés. Elles sont utilisées dans un nombre toujours croissant d'applications, depuis le traitement de l'hémophilie jusqu'aux immunothérapies anticancéreuses les plus récentes. Les systèmes d'expression utilisant la levure combinent la facilité de manipulation et la croissance des organismes unicellulaires avec les modifications post- traductionnelles des eucaryotes. Les levures non conventionnelles ont été utilisées pour produire des protéines hétérologues comme alternative à Saccharomyces cerevisiae (Dominguez et al., 1998), notamment pour la levure Yarrowia lipolytica (Nicaud et al., 2002, Madzak et al., 2004). Parmi ces levures, Yarrowia lipolytica fournit une plate-forme d'expression attrayante (Nicaud, 2012). Elle possède plusieurs avantages pour produire des protéines hétérologues par rapport à d'autres levures (Madzak et al., 2004). Tout d'abord, c'est une levure non pathogène capable de croître sur des substrats variés. Son génome a été complètement séquence (Dujon et al., 2004). Plusieurs procédés utilisant celle-ci ont ainsi été classifiés GRAS (generaily recognized as safe) par la FDA. Elle est d'ailleurs devenue récemment un microorganisme majeur pour la production et la bioconversion de lipides (Beopoulos et al., 2011, Blazeck et al., 2014, Coelho et al., 2010). En outre, Y. lipolytica est dotée naturellement une forte capacité sécrétoire. De nombreux outils de génétique et de biologie moléculaires sont à la disposition de l'homme du métier pour exprimer des protéines dans Y. lipolytica. En particulier, des cassettes d'expression épisomales ou intégratives ont été construites. Plusieurs promoteurs, constitutifs ou inductibles (TEF, hp4d, promoteur hybride, TEF-hp4d etc.), permettent d'exprimer des protéines hétérologues avec des niveaux d'expression plus ou moins importants. Ces promoteurs peuvent être associés avec différents marqueurs de sélection (URA3, LEU2, ADE2, LYS5, etc.) pour transformer des souches réceptrices. 3028528 2 De nombreuses méthodes de transformations ont été mises au point (Gaillardin et al., 1985 ; Barth and Gaillardin, 1996 ; Davidow et al., 1985 ; Chen et al., 1997, Xuan et al., 1988 ; Barth and Gaillardin, 1996). A l'heure actuelle, la méthode de transformation à l'acétate de lithium est la plus utilisée, que ce soit pour inactiver 5 des gènes endogènes ou pour transformer des cassettes d'expression (Le Dalt et al., 1994). Grâce au développement d'outils d'automatisation et des approches génomiques fonctionnelles, des méthodes de criblage haut débit de grandes collections de souches ont été mises au point (Bordes, et al., 2007, Mauersberger, et al., 2001, 10 Neuveglise et al., 1998). Cependant, les études de surexpression systématique d'un grand nombre de phases ouvertes de lecture, comme par exemple toutes les phases ouvertes d'un génome, nécessitent de créer un grand nombre de vecteurs différents. En effet, certaines souches peuvent ne présenter qu'un nombre restreint d'auxotrophies. Si les gènes d'intérêt sont dans un vecteur qui ne porte pas de 15 marqueur compatible avec ces souches, il faut recloner tous ces gènes dans un autre vecteur. D'autre part, il est connu qu'une expression trop forte de certains gènes hétérologues peut être toxique dans la levure (Le Dalt et al., 1994 ; Ogrydziak et Nicaud 2012). Pour éviter cela, il faut disposer d'une batterie de vecteurs dans lesquels le gène d'intérêt est contrôlé par différents promoteurs, chacun permettant 20 d'exprimer la protéine d'intérêt à un niveau plus ou moins élevé. Les études de génonnique fonctionnelle nécessitent donc de créer un grand nombre de vecteurs et ce, pour pouvoir tester l'expression de chaque phase ouverte de lecture dans plusieurs souches et avec plusieurs niveaux d'expression. Or cette étape de construction de vecteurs d'expression nécessite beaucoup de temps et de travail 25 par rapport à l'étape d'analyse proprement dite. De fait, si on veut utiliser différent marqueurs ou différent promoteurs, cela nécessite des clonages dans les différents vecteurs, mais pas nécessairement avec les même enzymes de restriction. En outre, quand il s'agit de transformer le grand nombre de vecteurs différents ainsi obtenus, les méthodes de transformation actuelles sont rapidement limitantes. Par exemple, 30 si on veut obtenir des souches de production avec différents niveaux de production, il faut transformer la souche receveuse avec chacun des différents vecteurs, sélectionner les transformants et tester les niveaux de production individuellement. Le temps et le travail nécessités par cette étape sont sans commune mesure avec l'analyse proprement dite. 3028528 3 Il existe donc un besoin pour des outils permettant de construire et d'analyser un grand nombre de clones rapidement. DESCRIPTION Les inventeurs ont mis au point un ensemble d'outils et de méthodes pour pouvoir 5 générer aisément et rapidement un grand nombre de vecteurs d'expression permettant d'exprimer des protéines d'intérêt dans les levures oléagineuses, notamment Yarrowia lipolytica. Ils ont ainsi mis au point un système d'expression de protéines dans les levures oléagineuses, notamment Yarrowia lipolytica, basé sur un groupe de vecteurs 10 donneur et accepteurs. Dans ce système, il n'est besoin que de simples recombinaisons pour générer un groupe de vecteurs d'expression portant différentes cassettes d'expression d'un gène d'intérêt et différents marqueurs de sélection. Contrairement aux techniques de l'art antérieur, il n'y a pas ici besoin de recourir à des sous-clonages longs et délicats pour créer chacun de ces différents vecteurs. Il 15 est donc possible d'obtenir rapidement un ensemble de cassettes d'expression portant toutes le même gène d'intérêt, ce qui permet de tester aisément plusieurs niveaux d'expression de celui-ci grâce aux différents promoteurs. En outre, chaque cassette d'expression peut facilement être introduite dans des souches variées de levure, grâce aux différents marqueurs de sélection portés. 20 On entend au sens de la présente invention par le terme - levure » les souches de levure en général, c'est-à-dire que ce terme comprend, entre autres, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Schizzosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia 25 lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans. Les levures préférées au sens de l'invention sont les levures oléagineuses (Ratledge, in : Ratledge C, Wilkinson SG editors, Microbial lipids, Vol 2. London : Academic press 30 1988). Le terme «oléagineux» désigne les organismes qui ont tendance à stocker leur source d'énergie sous la forme d'huile (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, rd Ed., Plenum, 1980). Plus précisément, une - levure oléagineuse » selon l'invention est une 3028528 4 levure qui peut faire de l'huile. Les levures oléagineuses les plus connues incluent les genres Candida, Cryptoccocus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lypomyces, Yarrowia. Les levures particulièrement préférées au sens de l'invention comprennent Yarrowia lipolytica, Rhodotura glutinis et Rhodosporidium toruloides. Une levure 5 préférée au sens de la présente invention est Yarrowia lipolytica. Le terme - vecteur », tel qu'utilisé ici, désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter une autre molécule d'acide nucléique à laquelle elle a été liée. Les vecteurs utiles dans l'invention comprennent, mais ne sont pas limités aux plasmides, phagemides, virus, ainsi que tout autre véhicule dérivé de source virale 10 ou bactérienne qui a été manipulé par insertion ou incorporation d'une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques d'intérêt. Certains vecteurs sont capables de réplication autonome dans la levure oléagineuse, par exemple Y. lipolytica, dans laquelle ils sont introduits : ce sont des - vecteurs épisonnaux ». De tels vecteurs contiennent les éléments nécessaires au maintien et à la réplication dudit vecteur 15 dans la cellule, y compris un centromère (Vernis, L., et al., 1997) et une origine de réplication (Fournier, et al., 1991 ; Matsuoka et al., 1993). D'autres vecteurs sont dits intégratifs », car ils peuvent être intégrés dans le génome d'une levure oléagineuse après introduction dans la cellule, et sont ainsi répliqués avec le génome de l'hôte. Plus préférablement, le vecteur de l'invention est un vecteur d'expression. Le terme 20 - vecteur d'expression » tel qu'utilisé ici désigne une séquence d'ADN capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique particulière à laquelle ledit vecteur d'expression est lié de manière fonctionnelle, dans la cellule hôte appropriée. Avantageusement, le vecteur d'expression de l'invention est fonctionnel dans les levures oléagineuses, notamment Y. lipolytica, c'est-à-dire que ledit vecteur 25 d'expression est capable de diriger la transcription de l'acide nucléique d'intérêt dans des levures oléagineuses, dont Y. lipolytica en particulier. Plus avantageusement, le vecteur d'expression de l'invention comprend une - cassette d'expression », à savoir une séquence nucléotidique codant une protéine d'intérêt, liée de manière fonctionnelle à des séquences régulatrices telles que, par exemple, des séquences 30 promotrices et/ou des séquences de terminaison de transcription. La présente invention fournit dans un premier aspect un couple de vecteurs qui permet de générer un vecteur d'expression d'intérêt par simple recombinaison. Plus précisément, l'invention a pour objet un couple de vecteurs, dans lequel le premier 3028528 5 vecteur est le vecteur donneur et le second vecteur le vecteur accepteur. Le vecteur donneur est un vecteur dans lequel le polynucléotide d'intérêt est cloné dans une première étape, tandis que le vecteur accepteur est un vecteur dans lequel ledit polynucléotide d'intérêt est ensuite transféré par recombinaison. Le polynucléotide 5 peut ainsi être transféré de façon simple et efficace d'un vecteur à l'autre sans utiliser d'enzymes de restriction. Pour cela, le premier et le second vecteur comprennent préférablement des sites de recombinaison. En particulier, chacun des vecteurs donneur et accepteur de l'invention porte donc des sites de recombinaison, les sites de recombinaison 10 présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. Par - site de recombinaison », on entend ici, une section discrète d'une molécule d'acide nucléique qui est reconnue et liée par une ou des protéines de recombinaison spécifique durant les phases initiales d'une réaction d'intégration ou d'excision. On entend ici par - protéine de 15 recombinaison » ou - reconnbinase », une protéine qui est impliquée dans une réaction de recombinaison impliquant un ou plusieurs sites de recombinaison. Les protéines de recombinaison au sens de l'invention comprennent aussi bien les protéines permettant l'intégration d'un polynucléotide dans un autre que celles permettant l'excision dudit polynucléotide. Ce sont aussi bien des tyrosine 20 recombinases que des sérine recombinases. Les protéines de recombinaison sont aussi bien des protéines sauvages que des protéines mutantes ou des fragments desdites protéines, ou encore des variants de celles-ci. De tels sites de recombinaison sont présents dans des génomes de phages, comme les phages A ou P1, de plasmides, comme le plasmide de S. cerevisiae 2p, ou encore de 25 transposon, comme les transposons Tn3 et yô, et sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple Landy, 1993) Parmi les sites de recombinaison les plus connus, on citera notamment les séquences attB, attP, attL et attR. Les séquences attB et attP sont reconnues par l'enzyme recombinase (intégrase ou Int) pour permettre l'intégration du phage A dans le chromosome de E. coli. Après intégration, 30 le génome de A est flanqué par des sites attL et attR. Ceux-ci sont générés par la recombinaison entre les séquences attB et attP, ce qui signifie que leurs séquences proviennent pour partie de attB et pour partie de attP. Les sites attL et attR ne peuvent pas recombiner entre eux sans l'aide de l'intégrase et l'excisionase (Xi) du phage, ainsi que des protéines Fis et IHF de E. coli. 3028528 6 Comme autres exemples de sites de recombinaison les plus connus, on mentionnera la séquence loxP de P1 qui est reconnue par la recombinase Cre et la séquence FRT de S. cerevisiae qui est reconnue par l'enzyme FLP. De préférence, chaque vecteur comprend deux sites de recombinaison, les sites de 5 recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. De préférence, ces sites de recombinaison sont mutés afin de ne pas recombiner avec un site ne présentant pas la même spécificité, comme par exemple un site sauvage. Par exemple, les sites attB et attP mutés (désignés respectivement attB1 et attP1) ne peuvent plus recombiner 10 avec les sites sauvages attP et attB, respectivement. De même, les sites attL et attR mutés (désignés respectivement attL1 et attR1) ne peuvent plus recombiner avec les sites sauvages attL et attR, respectivement. Des sites de recombinaison mutés pour éliminer substantiellement toute recombinaison avec des sites ne présentant pas la même spécificité ont été décrits dans l'art antérieur (voir par exemple WO 15 96/40724A1, WO 99/21977A1, WO 00/12729A1, WO 00/29000A1, WO 00/52027A1, WO 01/42509A1, WO 02/16594A2, WO 0246372A1, WO 02/061034A2, WO 02/095055A2, WO 03/103600A2). Plus préférentiellement, les sites de recombinaison des vecteurs de l'invention sont choisis de telle sorte qu'un site de recombinaison d'un vecteur donneur ne pourra recombiner qu'avec un des deux sites du vecteur 20 accepteur. Il ne pourra en particulier pas recombiner avec l'autre site de recombinaison du vecteur donneur ou l'autre site de recombinaison du vecteur accepteur. Cela permet, en choisissant habilement les sites de recombinaison des vecteurs donneur et accepteur(s), de générer des vecteurs portant un insert avec une orientation spécifique. Plus préférentiellement encore, les sites de recombinaison 25 des vecteurs de l'invention sont choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2, dont les séquences respectives sont représentées par SEQ ID NO. 1-8. Ces sites sont bien connus de l'homme du métier car ils ont été décrits fréquemment dans la littérature et sont couramment utilisés en laboratoire depuis plus de dix ans. Ces sites sont particulièrement intéressants du fait de leur 30 spécificité : les sites attB1 ne réagissent qu'avec les sites attP1, les sites attB2 ne réagissent qu'avec les sites attP2, les sites attL1 ne réagissent qu'avec les sites attR1 et les sites attL2 ne réagissent qu'avec les sites attR2. Toujours plus préférentiellement, un des deux vecteurs porte les séquences attL1 et attL2, tandis que l'autre porte les séquences attR1 et attR2. 3028528 7 Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison. En effet, l'homme du métier notera que la recombinaison entre deux sites de recombinaison 5 peut permettre de générer de nouveaux sites de recombinaison. Ainsi, la recombinaison entre attB1 et attP1 génère un site attL1, tandis que la recombinaison entre attB2 et attP2 génère un site attL2. Selon un mode de réalisation très préféré, un des deux vecteurs porte les séquences attB1 et attB2 ou les séquences attP1 et attP2, tandis que l'autre vecteur porte les séquences attR1 et attR2. Il est 10 particulièrement avantageux que le vecteur donneur porte les séquences attB1 et attB2 ou les séquences attP1 et attP2, car cela permet le clonage du gène d'intérêt par simple recombinaison. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir 15 préalablement subi une étape de recombinaison avec des sites de recombinaison présents sur le gène d'intérêt. Pour faciliter le clonage du polynucléotide d'intérêt, le vecteur donneur peut aussi contenir une multiplicité de sites de clonage, chacun étant spécifique d'une enzyme de restriction. Le polynucléotide peut ainsi être facilement cloné dans le vecteur 20 donneur. De façon préférée, le gène d'intérêt est cloné dans une orientation telle qu'il se retrouve sous le contrôle des séquences régulatrices de transcription portées par le vecteur accepteur après recombinaison dans ce dernier. L'utilisation de deux enzymes de restriction pour cela permet un clonage directionnel, comme il est bien connu de l'homme du métier. De préférence, les sites de clonage multiples du 25 vecteur donneur sont bordés de chaque côté par un site de recombinaison. Il peut être utile, pour sélectionner les vecteurs donneurs ayant inséré le polynucléotide d'intérêt, de disposer d'un marqueur de contre-sélection. Par marqueur de contre-sélection », on entend ici un marqueur dont la présence sur ledit vecteur donneur est délétère dans certaines conditions et qui est destiné à être 30 éliminé par un clonage réussi. Ce marqueur peut par exemple être un gène toxique pour les cellules dans lesquelles le produit de la réaction de clonage est introduit. Cette toxicité peut être causée directement par ledit gène, mais peut aussi être liée à un produit dudit gène. Les gènes toxiques sont bien connus dans le domaine : on citera par exemple les endonucléases de restriction (par exemple, Dpnl), les gènes 3028528 8 liés à l'apoptose (par exemple, ASK1 ou des membres de la famille bcl-2 / ced-9 ), les gènes rétroviraux, notamment ceux du virus de l'immunodéficience humaine (VIN), les défensines, telles que NP-1, les répétitions inversées ou les séquences appariées palindromiques, les gènes lytiques de bactériophages tels que ceux des 5 bactériophages (DX174 ou T4, les gènes de sensibilité aux antibiotiques tels que rpsL, les gènes de sensibilité aux antimicrobiens tels que pheS, des gènes tueurs de plasmides, des gènes de vecteur de transcription eucaryotes qui produisent un produit de gène toxique à des bactéries, tels que GATA-1, et des gènes qui tuent les hôtes en l'absence d'une fonction de suppression, par exemple, kicB, ccdB, (DX174 E 10 (Liu et al, 1998), et d'autres gènes qui affectent négativement la stabilité et / ou la réplication d'un réplicon. De façon préférée, le gène toxique est le gène ccdB. Le gène ccdB fait partie de l'opéron ccd d'E. coui avec le gène ccdA. La protéine CcdB est un inhibiteur de la topoisomérase II bactérienne, dont l'activité est normalement contrée par son 15 antidote CcdA. Dans le mode de réalisation préférée de l'invention, le vecteur donneur comprend le gène ccdB, mais pas le gène ccdA. Un vecteur porteur du gène ccdB permet donc une sélection positive des clones ayant intégré l'ADN d'intérêt, ne laissant survivre dans le milieu de culture que les cellules ayant incorporé le nouveau gène. Les vecteurs portant le gène ccdB peuvent être maintenus en routine sur des 20 souches bactériennes résistantes à la protéine CcdB. Par exemple, des souches exprimant la protéine CcdA permettent la réplication de tels vecteurs. Les souches résistantes à CcdB sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple Bernard, 1996). Certaines sont disponibles commercialement, comme par exemple les souches ccdB Survival et DB3.1 (Life Technologies, Carslbad, CA). 25 Dans le vecteur donneur, le marqueur de contre-sélection, préférablement ccdB, est situé entre les sites de clonage multiples, c'est-à-dire entre les deux sites de recombinaison du vecteur donneur. Le clonage réussi du gène d'intérêt dans le vecteur donneur permet d'éliminer le marqueur de contre-sélection et d'obtenir un plasmide dans lequel le gène d'intérêt se retrouve entre les deux sites de 30 recombinaison. Un tel plasmide peut maintenant se répliquer dans une souche bactérienne normalement sensible à ccdB, c'est-à-dire une souche dans laquelle l'expression de CcdB est létale. 3028528 9 De façon encore plus préférée, les vecteurs donneurs selon l'invention comprennent un second marqueur de contre-sélection. Ce second marqueur est contigu du premier, entre les sites de clonage multiples. Il permet de s'assurer que la perte du marqueur CcdB est bien liée à un clonage réussi : dans ce cas en effet, ledit second 5 marqueur de contre-sélection est lui aussi éliminé. De préférence, ledit second marqueur de contre-sélection est un marqueur de résistance à un antibiotique. De façon plus préférée, ledit second marqueur de contre-sélection est le gène de résistance au chloramphénicol. De préférence, le vecteur accepteur permet l'expression du gène d'intérêt dans la 10 levure. Pour cela, il est avantageux que le vecteur accepteur contienne des séquences régulatrices qui permettent de contrôler cette expression. Préférablement, ces séquences régulatrices ne sont pas placées entre les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur : ainsi elles ne sont pas éliminées par recombinaison quand le gène d'intérêt est introduit dans le vecteur accepteur. 15 Selon ce mode de réalisation, l'insertion du gène d'intérêt par recombinaison dans le vecteur accepteur met donc celui-ci sous le contrôle de ces séquences régulatrices et crée ainsi une cassette d'expression. Par - cassette d'expression », on entend ici un fragment d'ADN comprenant un polynucléotide d'intérêt lié de façon fonctionnelle à plusieurs éléments régulateurs contrôlant l'expression des séquences géniques, 20 comme, par exemple, les séquences promotrices et les séquences terminatrices. Par - séquences régulatrices » ou - éléments régulateurs », on entend ici des séquences polynucléotidiques qui sont nécessaires pour affecter l'expression et la maturation des séquences codantes auxquelles elles sont liées fonctionnellement. De telles séquences régulatrices comprennent les séquences d'initiation et de 25 terminaison de la transcription, les séquences promotrices et les séquences enhancer » ; les signaux de maturation efficace des ARN, comme les signaux d'épissage et de polyadénylation ; les séquences stabilisant les ARNm cytoplasmiques ; les séquences améliorant l'efficacité de la traduction (par exemple, les séquences de Kozak) ; les séquences qui augmentent la stabilité des protéines ; 30 et, si nécessaire, des séquences qui augmentent la sécrétion des protéines. De préférence, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences promotrices, c'est-à-dire que le gène d'intérêt est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur qui permet l'expression de l'ARNm correspondant. Un 3028528 10 gène d'intérêt est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur quand il est situé en aval de ce dernier, formant ainsi une cassette d'expression. Un polynucléotide est - lié de façon fonctionnelle » à des éléments régulateurs quand ces différentes séquences d'acides nucléiques sont associées sur un seul 5 fragment d'acide nucléique de telle façon que la fonction de l'une est affectée par les autres. Par exemple, une séquence d'ADN régulatrice est - liée de façon fonctionnelle » à une séquence d'ADN codant un ARN ou une protéine si les deux séquences sont situées de telle façon que la séquence d'ADN régulatrice affecte l'expression de la séquence d'ADN codante (autrement dit, que la séquence d'ADN 10 codante soit sous le contrôle transcriptionnel du promoteur). Les séquences codantes peuvent être liées de façon fonctionnelle à des séquences régulatrices aussi bien dans une orientation sens que dans une orientation antisens. Préférablement, les séquences codantes de l'invention sont liées de façon fonctionnelle aux séquences régulatrices dans l'orientation sens. 15 On entend ici par - promoteur » une séquence nucléotidique, le plus souvent située en amont (5') de la séquence codante, qui est reconnue par l'ARN polymérase et les autres facteurs nécessaires pour la transcription, et ainsi contrôle l'expression de ladite séquence codante. Un - promoteur » tel qu'on l'entend ici comprend en particulier les promoteurs minimaux, c'est-à-dire de courtes séquences d'ADN 20 composées d'une boite TATA et d'autres séquences qui permettent de spécifier le site de démarrage de la transcription. Un - promoteur » au sens de l'invention comprend aussi des séquences nucléotidiques incluant un promoteur minimal et des éléments régulateurs capables de contrôler l'expression d'une séquence codantes. Par exemple, les séquences promotrices de l'invention peuvent contenir des 25 séquences régulatrices comme des séquences - enhancer » pouvant influencer le niveau d'expression d'un gène. Avantageusement, les promoteurs selon l'invention sont ceux qui fonctionnent dans les cellules de l'organisme d'intérêt. Par exemple, plusieurs promoteurs sont connus pour fonctionner dans les levures 30 oléagineuses et, en particulier, dans Y. lipolytica. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'expression de la protéine d'intérêt est contrôlée par un promoteur qui fonctionne dans les levures oléagineuses, notamment dans Y. lipolytica. 3028528 11 De telles séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le 5 glucose et qui est inductible par les acides gras ou les triglycérides tel que le promoteur PDX2 du gène de l'acyl CoA oxydase 2 de Yarrowia lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. On peut aussi utiliser le promoteur du gène FBA1 du gène de la fructose-bisphosphate aldolase (US 202,356), le promoteur du gène de la phosphoglycerate mutase GPM (WO 10 2006/0019297, US 259,255, US 7,459,456), le promoteur du gène YAT1 du gène du transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102 Al ), le promoteur du gène EXP1 codant une protéine d'export (US 7,932,077), le promoteur du gène GPAT du gène de la glycérol-3-phosphate 0-acyltransferase (US 7,264,949), le promoteur du gène GPDIN du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (US 7,459,546), le 15 promoteur du gène TEF (Müller et al., 1998 ; US 6,265,185), le promoteur hybride hp4d (WO 96/41889), les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Madzak et al. (2000) ou encore les promoteurs hybride UAS1-TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF décrits dans Blazeck et al. (20011, 2013, 2014). Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur porté par le vecteur accepteur est choisi parmi les 20 promoteurs PDX2, LIP2, FBA1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPDIN, TEF hp4d, XPR2, UAS1-TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF. Comme indiqué plus haut, il est avantageux que le promoteur porté par le vecteur accepteur soit placé à l'extérieur des sites de recombinaison dudit vecteur. Préférablement, ledit promoteur est orienté de façon à diriger la transcription d'un 25 gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison. Selon un autre mode de réalisation, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences de terminaison de la transcription. Les - séquences de terminaison », appelées aussi - terminateurs », telles qu'on les entend ici, sont des régions situées en 3' d'une séquence codante dont elles régulent la terminaison de la 30 transcription et qui en outre confèrent la stabilité au transcrit. De telles séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier et on peut citer, à titre d'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène PGK1, la 3028528 12 séquence terminatrice du gène L1P2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. Selon ce mode de réalisation, la cassette d'expression de l'invention comprend donc un terminateur choisi parmi la séquence terminatrice du gène PGK1, la séquence terminatrice du gène L1P2, la séquence terminatrice du gène XPR2, la séquence 5 terminatrice du gène CYC1, ou un terminateur synthétique décrit par Alper et collaborateurs (Curran et al, 2014). Comme indiqué plus haut, il est avantageux que les séquences terminatrices portées par le vecteur accepteur soient placées à l'extérieur des sites de recombinaison dudit vecteur. Préférablement, lesdites séquences terminatrices sont orientées de 10 façon à pouvoir arrêter la transcription d'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison. De façon plus préférée, lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices et des séquences terminatrices, les unes et les autres placées à l'extérieur des sites de recombinaison, lesdites séquences promotrices étant 15 orientées de façon à diriger la transcription d'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison et lesdites séquences terminatrices étant orientées de façon à pouvoir arrêter la transcription dudit gène d'intérêt. De préférence, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée 20 dans le génome de la souche de Yarrowia. Selon le mode de réalisation le plus préféré, les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur sont encadrés par des séquences promotrices et terminatrices, lesdites séquences promotrices étant orientées de façon à diriger la transcription d'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison et lesdites séquences 25 terminatrices étant orientées de façon à pouvoir arrêter la transcription dudit gène d'intérêt. En vue de permettre l'expression de ces gènes d'intérêt, différentes technologies ont été développées, lesquelles ont en commun d'utiliser des vecteurs dits - intégratifs » qui permettent l'insertion d'un segment d'ADN portant le gène d'intérêt dans l'ADN 30 chromosomique, lequel gène d'intérêt est exprimé par la suite. Les vecteurs accepteurs de l'invention sont de préférence des vecteurs intégratifs. 3028528 13 Parmi les séquences de Y. lipolytica utilisées pour la construction de vecteurs intégratifs, on citera notamment les séquences dénommées : - séquences zeta », qui correspondent aux LRT (longues répétitions terminales) du rétrotransposon Yltl de Y. lipolytica. Ces séquences ont été décrites par Schmid-Berger et al. (1994) qui 5 indiquent qu'elles sont présentes en un grand nombre de copies (environ 35 copies du rétrotransposon complet, et environ 30 copies de la séquence zeta isolée) dans l'ADN chromosomique de certaines souches de Y. lipolytica. Les cassettes d'expression peuvent ainsi être intégrées à des locations aléatoires dans le génome à l'aide de ces répétitions terminales Zeta (Mauersberger et al., 2001), lesquelles bordent 10 habituellement les cassettes d'expression utilisées dans le domaine. Plus récemment, une plateforme d'intégration (désignée ci-après une - plateforme d'accueil zeta ») comprenant des séquences zeta dans laquelle il est possible d'intégrer des gènes par un ou deux évènements de recombinaison a été mise au point dans des souches dépourvues du rétrotransposon (Bordes et al., 2007 ; Juretzek et al., 2001 ; 15 WO 00/012729 ; WO 2009/098263). Lorsque des vecteurs portant des inserts flanqués de séquences zeta sont utilisés pour transformer des cellules de levures oléagineuses, notamment Y. lipolytica, contenant dans son génome une telle plateforme d'accueil zeta, l'ADN de l'insert s'intègre très préférentiellement dans le génome au niveau de ces séquences. Dans ce cas, une seule copie est intégrée. 20 De façon préférée, les séquences zeta flanquent les deux sites de recombinaison homologue portés par le vecteur accepteur, de façon à ce qu'après recombinaison, le gène d'intérêt se retrouve entre lesdites séquences zeta et puisse être intégré sur le chromosome. De façon plus préférée, lesdites séquences zeta encadrent non seulement les sites de recombinaison, mais aussi les séquences régulatrices portées 25 par le vecteur accepteur. Cela permet ainsi d'exprimer le gène d'intérêt après qu'il a été intégré par recombinaison dans le chromosome. De façon particulièrement préférée, les séquences zeta sont encadrées par des sites de restriction rares, c'est-à-dire des sites qui ne surviennent que rarement dans le génome : une enzyme dont le site de reconnaissance est de 7 nucléotides ne coupe 30 l'ADN que toutes les 47 pb (16 384 pb), et une dont le site consiste en 8-nucléotides ne coupe que toutes les 48 pb (65,536 pb). De tels sites sont utilisés pour libérer un insert linéaire bordés par les séquences zeta sans risque de coupure à l'intérieur dudit insert. Ils sont bien connus de l'homme du métier. Ils peuvent être naturels ou 3028528 14 synthétiques. On citera par exemple les sites des enzymes Notl , Sfil, Pnnel, Pacl, Ascl et I-Ceul. On notera en outre qu'il peut être avantageux de pouvoir identifier facilement les transformants, c'est-à-dire les cellules qui auront reçu et intégré l'insert dans leur 5 génome. Les vecteurs accepteurs selon l'invention portent préférentiellement un marqueur de sélection qui permet ainsi de sélectionner les levures ayant intégré dans leurs chromosomes l'insert portant ledit marqueur de sélection. Avantageusement, le marqueur de sélection est situé entre les séquences zeta du vecteur accepteur, préférentiellement en contiguïté avec la cassette d'expression d'intérêt, de façon à 10 pouvoir être intégré dans le génome avec celle-ci. Les marqueurs de sélection qui peuvent être utilisés dans les vecteurs accepteurs sont des marqueurs d'auxotrophie ou des marqueurs de résistance. Les marqueurs de sélection permettant la connplénnentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d'auxotrophie, sont bien connus de 15 l'homme du métier. Selon l'invention, il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'art antérieur compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés, toute souche exprimant le gène marqueur choisi étant potentiellement une souche de levure défective dans les gènes ADE2, URA3, LEU2 ou L YS5. 20 Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène URA3 (ladite séquence est aussi accessible par le numéro d'accession YALIOE26719g à l'adresse www.genolevures.org/ ou a l'adresse http://gryc.inra.fr/), codant l'orotidine-5'- phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas 25 capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. 30 lipolytica dont le gène LEU2 (YALIOE26719g), codant la 8-isopropylnnalate déshydrogénase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment. L'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de Y. lipolytica 3028528 15 permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène 5 ADE2 (YAL10823188g), codant la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. 10 Le marqueur de sélection LYS5 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène LYS5 (YALIOB15444g), codant la saccharopine déhydrogènase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en lysine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection LYS5 dans 15 cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en lysine (Xuan et al, 1990). Parmi les gènes de résistance qui pourront être utilisés comme marqueur de sélection pour conférer à la souche de levure oléagineuse, notamment de Yarrowia, un phénotype présentant un caractère dominant, on peut citer : 20 Le gène MDR3 originaire de la souris code pour la P-glycoprotéine et, lorsqu'il est exprimé dans une souche de Yarrowia, confère une résistance au FK520, un agent antifongique et immunosuppresseur (Raymond et al., 1994). Le module KanMX, qui contient la séquence kanr issue du transposon Tn903 d'Escherichia cou fusionnée aux séquences transcriptionnelles du gène TEF du 25 champignon filamenteux Ashbya gossypii, ou à tout promoteur et terminateur de transcription fonctionnels, confère à une souche de Yarrowia la résistance à la généticine (G418 ; Wach et al., 1994). Le gène hph (HYG), originaire d'un plasmide d'Escherichia coli, permet la résistance à l'hygromycineB (Gritz Et Davies, 1983 ; Fickers et al., 2003 ; 30 Cordero Otero Et Gaillairdin, 1996). Le gène TnSble, issu de Escherichia coli, permet à la levure transformée d'acquérir une résistance à la phléomycine (Gaillardin Et Ribet, 1987 ; Wenzel et al., 1992). 3028528 16 D'autres marqueurs de sélection utilisables dans le procédé selon l'invention sont également décrits par Barth Et Gaillardin (The dimoorphic fungus Yarrowia lipolytica. In : Non conventional yeasts in biotechnology (Wolf K. Ed.). Springer-Verlag, Berlin, pages 313-388, 1996). 5 Selon un mode de réalisation préféré selon l'invention, le marqueur de sélection du vecteur accepteur est encadré par des séquences permettant son excision après l'intégration ciblée dudit vecteur recombinant. Ce même marqueur de sélection, notamment un marqueur d'auxotrophie, peut alors être réutilisé pour une autre intégration ciblée lors d'une nouvelle étape de 10 transformation. De telles séquences permettant l'excision et l'élimination, chez une souche de Yarrowia, d'une séquence encadrée sont bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation de deux séquences identiques ou similaires, dites séquences répétées directes (SRD), en vue d'obtenir un évènement 15 de recombinaison comme décrit dans le brevet EP 0 994 192 B1 ou dans le brevet EP 0 635 574 B1. A titre d'exemple, on peut également citer le système - Cre-lox » tel que décrit dans le brevet EP 0 220 009 B1, dans lequel les séquences équivalentes aux séquences répétées directes sont dans ce cas des séquences spécifiques dites - lox » et 20 l'excision de la séquence d'ADN comprise entre les deux séquences - lox » s'effectue en présence d'une reconnbinase - Cre » exprimée par un vecteur d'expression. D'autres systèmes équivalents et utilisant d'autres recombinases spécifiques sont également connus de l'homme du métier notamment le procédé décrit dans le brevet EP 0814165 B1. 25 De façon plus préférée, donc, le marqueur de sélection dans la levure, optionnellennent lui-même flanqué de sites permettant son excision, sera situé, ainsi que les deux sites de recombinaison eux-mêmes bordés par les séquences régulatrices, entre les deux séquences zeta portées par le vecteur accepteur. L'invention a plus particulièrement pour objet un groupe de vecteurs, comprenant un 30 vecteur donneur et au moins un vecteur accepteur, dans lequel : 3028528 17 - ledit vecteur donneur comprend deux site de recombinaison choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison flanquant au moins un marqueur de contre-sélection ; et - ledit vecteur accepteur comprend un insert bordé de séquences zeta, ledit 5 insert comprenant : o deux sites de recombinaison choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison encadrant des séquences régulatrices permettant l'expression de protéines dans les levures oléagineuses, et 10 o un marqueur de sélection de levure oléagineuse ; les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur 15 accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison. Il est clair que les différents promoteurs, terminateurs et marqueurs de sélection peuvent être facilement combinés par l'homme du métier. En effet, il est tout à fait à la portée de l'homme du métier de construire, sur la base des indications données plus haut, et à l'aide de techniques de base de biologie moléculaire, les différents 20 vecteurs accepteurs contenant les différentes combinaisons de promoteurs, terminateurs et marqueurs de sélection, ainsi que les deux sites de recombinaison encadrant optionnellement un ou deux marqueurs de contre-sélection. Par - au moins un vecteur accepteur », on entend ici un vecteur accepteur ou plus d'un vecteur accepteur. Dans ce cas, le nombre de vecteurs accepteurs est supérieur 25 ou égal à 2, préférablement à 3, préférablement à 4, préférablement à 5, préférablement à 6, préférablement à 7, préférablement à 8, préférablement à 9, préférablement à 10, préférablement à 11, plus préférablement à 12. Les différents vecteurs accepteurs se distinguent alors avantageusement par les séquences régulatrices et/ou par le marqueur de sélection qu'ils portent. Autrement dit, 30 chaque vecteur accepteur porte alors une combinaison unique de séquences régulatrices et de marqueur de sélection. Une - combinaison unique » signifie que ladite combinaison n'est présente sur aucun des autres vecteurs accepteurs du groupe de vecteurs de l'invention. 3028528 18 Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention porte sur un groupe de vecteurs, ledit groupe comprenant un vecteur donneur et plusieurs vecteurs accepteurs, dans lequel chaque vecteur accepteur comprend un insert bordé de deux séquences zeta, ledit insert comprenant: un couple de sites de recombinaison choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2 ; un promoteur choisi parmi les promoteurs PDX2, L1P2, FBA1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPD1N, TEF hp4d, XPR2, UAS1-TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF, ledit promoteur étant situé à l'extérieur des deux sites de recombinaison et étant préférablement orienté de façon à contrôler l'expression d'un gène situé entre ceux-ci ; un terminateur choisi parmi les terminateurs PGK1, L1P2, XPR2, CYC1, ledit terminateur étant situé à l'extérieur des deux sites de recombinaison et étant préférablement orienté de façon à arrêter l'expression d'un gène situé entre ceux-ci ; - un marqueur de sélection choisi parmi les marqueurs d'auxotrophie et les marqueurs de résistance, le marqueur d'auxotrophie étant choisi parmi ADE2, URA3, LEU2 et LYS5, et ledit marqueur de résistance étant choisi parmi MDR3, KanMX, hph (HYG), et Tn5ble. 20 les sites de recombinaison présents sur les vecteurs accepteurs permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison. 25 Préférablement, chaque vecteur accepteur ne diffère des autres vecteurs accepteurs dudit ensemble que par les séquences régulatrices et/ou par le marqueur de sélection qu'il porte. Spécifiquement, chaque vecteur accepteur peut se distinguer par le promoteur et/ou le terminateur qu'il contient. Autrement dit, chaque vecteur accepteur ne diffère des autres que par son promoteur et/ou par son terminateur 30 et/ou par son marqueur de sélection. Un tel ensemble de vecteurs accepteurs est particulièrement avantageux car il permet de placer le gène d'intérêt sous le contrôle de n'importe quel promoteur et d'associer cette cassette d'expression avec n'importe quel marqueur. Il est donc possible de tester différents niveaux 5 - - 10 - 15 3028528 19 d'expression du gène d'intérêt, tout en transférant aisément la cassette d'expression d'une souche à l'autre. Dans un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de construction d'au moins un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt en utilisant un groupe de vecteurs 5 décrits plus haut. Plus spécifiquement, le procédé de l'invention, comprenant des étapes de : a) clonage dudit gène d'intérêt dans le vecteur donneur, et b) clonage dudit gène d'intérêt par recombinaison entre le vecteur obtenu à l'étape a) et ledit vecteur accepteur. 10 Dans une première étape, le gène d'intérêt est introduit dans le vecteur donneur avant d'être transféré par recombinaison dans le vecteur accepteur dans une seconde étape. Le gène d'intérêt peut être introduit par tout moyen connu de l'homme du métier dans le vecteur donneur. Des techniques pour insérer une séquence d'acide nucléique 15 dans un vecteur sont bien connues dans le domaine technique et comprennent des procédés classiques comme ceux, par exemple, décrits dans Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (2000)), Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)) et Ausubel et al. (Current 20 Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)). En bref, un vecteur donneur possède plusieurs sites de clonage, chacun ayant une spécificité pour un enzyme de restriction donné. Un acide nucléique codant un facteur de transcription peut être cloné en utilisant des enzymes de restriction et positionné dans une orientation compatible avec celle du promoteur 25 et/ou terminateur de transcription du vecteur accepteur pour que le gène d'intérêt puisse être surexprimé après qu'il aura été transféré par recombinaison dans le vecteur accepteur. Une fois le gène d'intérêt cloné dans le vecteur donneur, il peut être transféré dans un vecteur accepteur par recombinaison pour créer un vecteur d'expression. 30 Alternativement, il est possible d'introduire le gène d'intérêt dans le vecteur donneur par recombinaison. 3028528 20 Tout d'abord, le gène d'intérêt est amplifié et des sites de recombinaison sont ajoutés à chacune de ses extrémités. Préférablement, lesdits sites de recombinaison sont attP1 et attP2. Selon un autre mode de réalisation préféré, lesdits sites de recombinaison sont attB1 et attB2. Selon un mode de réalisation préféré, les sites de 5 recombinaison du vecteur donneur sont attB1 et attB2. Selon un autre mode de réalisation préféré, les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attP1 et attP2. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les sites de recombinaison ajoutés aux extrémités du gène d'intérêt sont attP1 et attP2, tandis que les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attB1 et attB2. Selon un 10 mode de réalisation particulièrement préféré, les sites de recombinaison ajoutés aux extrémités du gène d'intérêt sont attB1 et attB2, tandis que les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attP1 et attP2. Ensuite, le gène d'intérêt porteur de sites de recombinaison est mis en contact avec le vecteur donneur porteur des sites de recombinaison appropriés et au moins une 15 enzyme de recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) une (des) protéine(s) capable(s) de se lier aux acides nucléiques et de générer une recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) en particulier spécifique(s) des sites de recombinaison portés par le gène d'intérêt et le vecteur donneur. Notamment, quand ces sites sont choisis parmi attB1, attB2, attP1 et attP2, il est avantageux d'utiliser deux enzymes 20 de recombinaison, c'est-à-dire l'intégrase du phage lambda, la protéine IHF de E. coli. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Des compositions comprenant ces protéines sont disponibles commercialement (Life Science). Dans une deuxième étape, le gène d'intérêt est transféré du vecteur donneur dans au moins un vecteur accepteur par recombinaison. Pour cela, le vecteur donneur 25 contenant ledit gène d'intérêt est mis en contact avec le vecteur accepteur et au moins une enzyme de recombinaison. Cette (ces) enzynne(s) est (sont) une (des) protéine(s) capable(s) de se lier aux acides nucléiques et de générer une recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) en particulier spécifique(s) des sites de recombinaison portés par le gène d'intérêt et le vecteur donneur. Notamment, 30 quand ces sites sont choisis parmi attL1, attL2, attR1 et attR2, il est avantageux d'utiliser trois enzymes de recombinaison, c'est-à-dire l'intégrase et l'excisionase du phage lambda, la protéine IHF de E. coli. Optionnellement, on peut en outre utiliser la protéine Fis de E. coli. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Des compositions comprenant ces protéines sont disponibles commercialement (Life 3028528 21 Science). Le vecteur accepteur porteur du gène d'intérêt peut ensuite être identifié par tout moyen connu de l'homme du métier. L'homme du métier choisira le vecteur accepteur selon ses besoins, comme par exemple le niveau d'expression désiré ou le type de marqueur de sélection. Le 5 procédé de l'invention aboutira à la construction d'un vecteur d'expression dans lequel le gène d'intérêt est sous le contrôle des séquences régulatrices (promoteur et/ou terminateur) spécifiques du vecteur. La cassette d'expression portée par le vecteur peut ensuite être intégrée dans le génome d'une cellule hôte de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica. 10 L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire fréquemment utilisée par l'homme du métier, dont on se contentera de rappeler les principes. Dans cette technique, un fragment d'ADN linéaire portant la cassette d'expression de l'invention est introduit dans la cellule à transformer, lequel fragment d'ADN s'intègre alors par recombinaison homologue 15 dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et al., 1981). De tels procédés de transformation sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, dans Ito et al. (1983), dans Klebe et al. (1983) et dans Gysler et al. (1990). Dans la mesure où cet évènement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de 20 permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Dans le cas présent, la digestion du vecteur accepteur par l'enzyme rare dont les sites sont situés de part et d'autre des séquences zeta libère un fragment d'acide nucléique linéaire bordé par les séquences zeta. Ce fragment comprend la cassette 25 d'expression et un marqueur de sélection, dont la nature varie en fonction du vecteur accepteur. Comme expliqué plus haut, lorsque ce fragment portant la cassette d'expression est utilisé pour transformer une cellule de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, contenant une plateforme d'accueil zeta, il s'intègre très préférentiellement dans le génome au niveau de cette plateforme. Dans ce cas, 30 une seule copie est intégrée. Cela permet de contrôler précisément le niveau d'expression du gène d'intérêt. En revanche, quand la souche réceptrice ne contient pas une plateforme d'accueil zeta, mais plutôt de nombreuses copies du rétrotransposon Ylt1, le fragment linéaire portant la cassette d'expression d'intérêt est intégré au hasard dans le chromosome de nombreuses fois. Une telle situation 3028528 22 peut permettre d'atteindre des niveaux d'expression élevés et de surexprimer facilement la protéine d'intérêt. L'homme du métier notera que la méthode de l'invention permet de construire aisément une banque de vecteurs d'expression comprenant le gène d'intérêt. Il suffit 5 pour cela d'introduire le gène d'intérêt dans plusieurs vecteurs accepteurs par la méthode décrite ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, le procédé de l'invention conduit à des vecteurs d'expression qui portent tous le gène d'intérêt, mais diffèrent entre eux par la nature des séquences régulatrices (par exemple, promoteur et/ou terminateur) et/ou par la nature du marqueur de sélection. Ces vecteurs 10 comprennent en particulier tous des séquences zeta qui permettent l'intégration dans le génome de la cellule hôte. Après libération des cassettes d'expression, celles-ci sont transformées dans une souche réceptrice de Y. lipolytica et les transformants sont criblés. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci porte aussi sur un procédé de 15 construction d'une banque de souches exprimant un gène d'intérêt, ledit procédé comprenant une étape de transformation par la banque d'expression comprenant le gène d'intérêt décrite plus haut. Le procédé de l'invention comprend préférablement une étape préalable de libération de l'insert contenu dans le vecteur accepteur. Préférablement, cette 20 libération s'obtient par digestion par au moins une enzyme rare. Encore plus préférablement, il s'agit la(les) dite(s) enzyme(s) rare(s) est(sont) choisie(s) parmi les enzymes rares dont les sites bordent les séquences zeta dans le vecteur accepteur. Toute méthode de transfert connue de l'art antérieur peut être utilisée pour 25 introduire l'insert contenant la cassette d'expression de la protéine d'intérêt dans la souche de levure. Préférentiellement on pourra utiliser la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol (Gaillardin et al., 1987 ; Le Dalt et al., 1994). De façon préférée, les cellules sont transformées par un protocole de transformation adapté au haut débit. En effet, les méthodes de l'art antérieur pour transformer des 30 levures oléagineuses, et notamment les méthodes de transformation de Y. lipolytica, ne permettent que des transformations individuelles. Par exemple, ces protocoles nécessitent d'utiliser un tube de transformation par souche, ce qui rend difficile la 3028528 23 transformation d'un grand nombre de souches en même temps. De telles méthodes ne sont donc pas adaptées aux contraintes liées au criblage d'une banque de vecteurs d'expression telle que celle décrite ici. Il n'existe pas à ce jour de méthode permettant de transformer un grand nombre de 5 souches de levures oléagineuses, par exemple de Y. lipolytica, en même temps. Or les inventeurs ont mis au point une méthode de transformation de levure oléagineuse à haut débit. Cette méthode permet de transformer simultanément un grand nombre de souches de levure, préférentiellement au moins 50, plus préférentiellement au moins 60, encore plus préférentiellement au moins 70, toujours plus 10 préférentiellement au moins 80, le plus préférentiellement au moins 90. Elle permet en outre de travailler dans des microplaques de 96 puits, ce qui est un avantage Dans un premier mode de réalisation, les cellules de levure en phase exponentielle sont incubées dans un tampon contenant 0,1 M LiAc à pH = 6 pendant au moins 30 minutes, préférablement pendant au moins 45 minutes, plus préférablement pendant 15 au moins 60 minutes, à une température comprise entre 25°C et 30°C, préférentiellement à 28°C. Les cellules sont ensuite mises en contact avec l'acide nucléique à transformer, comme par exemple de l'acide nucléique de vecteur d'expression linéarisé, en présence d'acide nucléique entraineur. Après incubation à une température comprise entre 25°C et 30°C, préférentiellement à 28°C, pendant 20 un temps compris entre 10 et 20 minutes, préférentiellement pendant 10 minutes, deux volumes de tampon contenant du 40 % PEG et 0,1 M LiAc à pH = 6 sont ajoutés au mélange de cellules et d'acides nucléiques. Le mélange est incubé pendant au moins 30 minutes, préférablement pendant au moins 45 minutes, plus préférablement pendant au moins 60 minutes, à une température comprise entre 25 25°C et 30°C, préférentiellement à 28°C, avant d'être transféré à une température d'au moins 37°C, préférablement au moins 38°C, plus préférablement au moins 39°C, pendant un temps compris entre 5 et 15 minutes, préférentiellement 10 minutes. Les cellules sont ensuite directement étalées sur milieu de sélection pour identifier les transformants. 30 L'homme du métier notera que selon la méthode de transformation utilisée et/ou la souche de levure qui aura été transformée, il sera donc possible d'obtenir des transformants présentant une intégration non-spécifique, potentiellement en de multiples endroits du génome, ou une intégration à un locus donné, via la plateforme 3028528 24 d'accueil zeta par exemple. La méthode de l'invention permet ainsi d'obtenir des transformants avec différents niveaux d'expression en une étape. Selon un autre aspect, l'invention a aussi pour objet une banque de cellules de levure obtenues par les méthodes décrites ci-dessus. Plus particulièrement, les 5 cellules de ladite banque contiennent des cassettes d'expression d'un gène d'intérêt qui ne diffèrent entre elles que par les séquences régulatrices qu'elles contiennent. Autrement dit, chaque cassette peut se distinguer d'une autre par le promoteur ou le terminateur qu'elle contient, ou encore par les deux. Les cellules de ladite banque peuvent aussi se distinguer les unes des autres par la nature du marqueur de 10 sélection associé à ladite cassette d'expression. Selon un mode de réalisation préféré, lesdites cellules se distinguent entre elles par leurs cassettes d'expression et par le marqueur de sélection associé à ladite cassette. Les différents transformants obtenus par la méthode de transformation à haut débit de l'invention peuvent être sélectionnés sur la base de l'expression de la protéine 15 d'intérêt. Selon encore un autre aspect, l'invention a donc pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, pour produire des protéines. Dans un aspect plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, 20 dans laquelle une cassette d'expression a été intégrée, ainsi que décrit plus haut, pour la production de protéines. Encore plus préférablement, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle une cassette d'expression a été intégrée, pour la production d'une protéine codée par le gène d'intérêt de la cassette d'expression. 25 Les gènes d'intérêt selon l'invention sont plus particulièrement des gènes dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire. Parmi les gènes d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les gènes codant des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : 30 interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc ; les 3028528 25 apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides : thymidine kinase, 5 cytosine désaminase, etc. ; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc., voir par exemple WO 2011/089527), un ARN ligand (WO 91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences 10 peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le gène d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse 15 immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure 20 oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle une cassette d'expression a été intégrée au hasard, pour la production de protéines. Alternativement, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, chez qui une cassette d'expression a été intégrée en un endroit spécifique du génome en une seule copie, 25 pour la production de protéine. Dans un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production de protéines dans lequel : a) dans une première étape, on cultive une souche de levure transformée selon l'invention dans un milieu approprié et 30 b) dans une seconde étape on récolte les protéines produites par la culture de l'étape a). En particulier, le procédé de l'invention permet de produire une protéine d'intérêt. Comme indiqué plus haut, le choix judicieux de la méthode de transformation 3028528 26 utilisée et/ou la souche de levure qui aura été transformée permettra d'obtenir des transformants présentant une intégration non-spécifique, potentiellement en de multiples endroits du génome, ou une intégration à un locus donné, via la plateforme d'accueil zeta par exemple. 5 La croissance de la levure en milieu liquide se fait en plusieurs phases. Notamment, la phase exponentielle correspond à la phase de divisions actives des cellules de levure, c'est-à-dire à la phase durant laquelle le taux de croissance est le plus important. Durant la phase exponentielle, le nombre de cellules dans la culture de levure augmente rapidement. En revanche, le nombre de cellules de levure dans la 10 culture reste constant durant la phase stationnaire, parce que les cellules ne se divisent plus ou parce qu'un équilibre entre les divisions et de mort cellulaire est atteint. Les milieux permettant la croissance des souches de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, sont bien connus de l'homme du métier. Celui-ci pourra donc déterminer sans difficulté le milieu de culture approprié pour chacune des 15 souches de l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention permet de produire une protéine d'intérêt durant la phase exponentielle. Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention permet de produire une protéine hétérologue durant la phase stationnaire. Les protéines produites peuvent être 20 ensuite purifiées à partir du milieu de culture ou à partir des extraits cellulaires. Elles peuvent être ensuite purifiées à l'aide de n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, comme, par exemple, la chromatographie (échangeuse d'ion, d'affinité, par filtration sur gel, etc.), centrifugation, solubilité différentielle ou par toute autre technique usuelle pour la purification de protéines. Les méthodes 25 appropriées varieront selon la nature de la protéine à purifier, mais seront aisément identifiables par l'homme du métier. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et Figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la 30 portée. LEGENDES DES FIGURES : 3028528 27 Fig. 1. Représentation schématique de la construction d'un vecteur d'expression à partir d'un vecteur donneur contenant un gène d'intérêt et d'un vecteur accepteur. Fig. 2. Représentation schématique de la construction d'une banque de vecteurs d'expression à partir d'un vecteur donneur contenant un gène d'intérêt et de 5 multiples vecteurs accepteurs. Fig 3. A) Représentation schématique de la structure de la cassette de surexpression gateway. B) Structure génonnique de la platefornne Zeta au locus URA3. C) Structure génonnique de la platefornne Zeta au locus URA3 après intégration d'une cassette de surexpression. Les tailles des produits de PCR pour la validation de 'intégration à la 10 platefornne Zeta sont indiquées. Fig 4. Validation du système de surexpression. A) Observation par microscopie à fluorescence de la surexpression de la eYFP dans une souche exprimant constitutivement la Redstar2 (JMY2812). B) Restauration de la formation des halos sur boites de milieu à base lait écrémé (phénotype de dégradation des protéines) 15 d'une souche surexprimant la protéase XPR2 (JMY2813), comparée à une souche sauvage (WT) et à une souche témoin délétée de XPR2 (JMY2810). C) Croissance de la souche témoin et de la souche surexprimant SUC2 (JMY2815) sur saccharose. Fig. 5. Détermination de la croissance à l'aide la protéine fluorescente rapporteur Redstar2. A) Comparaison de l'intensité relative de fluorescence et de la densité 20 optique à D0600 en milieu translucide (YNB 0,5 ou 0,25% glucose +0,1% extraits de levure) de la souche JMY2810. B) Mesure de la fluorescence relative des souches exprimant ou non XPR2 et exprimant la protéine fluorescente rapporteur Redstar2 en milieu opaque (YNBsm +YE 0,1%). Fig. 6. Taux de transformation des protocoles 1 et 2 et ratio d'intégration au locus 25 Zeta par rapport aux intégrations au hasard. Fig. 7. Distribution des Vmax (RFU/min) de l'activité protéase des 96 mutants surexprimant XPR2. L'activité protéase a été mesurée à l'aide de la FTC-caséine en microplaques à une longueur d'ondes d'excitation de 494 net et une longueur d'ondes d'émission de 517 net toutes les minutes pendant 1h avec un lecteur de 30 microplaques (Biotek). La Vmax est calculée avec une fenêtre glissante de 30 points. Le nombre de clones pour chaque gamme de Vmax est indiqué au dessus de chaque barre. 3028528 28 Fig. 8. Expression de la protéine RedStar2 sous contrôle de différents promoteurs. Des vecteurs accepteurs dans lesquels le gène codant la protéine RedStar2 est sous le contrôle des promoteurs pTEF, Hp4d, Hp8d, 4UASpTEF et 8UASpTEF ont été construits et intégrés en une seule copie dans une souche de Y. lipolytica. Le niveau 5 d'expression de la protéine est directement dépendant de la force du promoteur. EXEMPLES Matériels et méthodes Souches et milieux 10 Les souches d'Escherichia coli TOP10 et DH5a (Invitrogen) ont été utilisées pour transformation et amplification des plasmides recombinants et ont été cultivées à 37°C sur milieu Luria-Bertani complémenté avec 50 pg/mL de kanamycine ou 100 pg/mL d'ampicilline selon que de besoin. Les souches de Y. lipolytica utilisées dans cette étude sont dérivées de Po1d et sont 15 listées dans le tableau 1. Les souches de levure sont habituellement cultivées sur milieu YPD (1% (w/v) extraits de levure, 1% (w/v) Bacto Peptone, 1% (w/v) glucose), celui-ci étant additionné de 1,5% (w/v) agar pour obtenir du milieu solide le cas échéant. Les transformants URA± sont sélectionnés après incubation à 28°C sur milieu minimal YNB (0,17% (w/v) de Yeast Nitrogen Base sans ammonium et sans acides 20 aminés, 0,5% (w/v) de chlorure d'ammonium, 1% (w/v) glucose, 1,5% (w/v) agar, 50nnM tampon phosphate pH 6,8). D'autres milieux minimaux ont été utilisés en fonction des différentes sources de carbone : YNBsuc (YNB avec 0,5% saccharose au lieu de glucose), YNBoa (YNB avec 0,5% acide oléique au lieu de glucose) or YNBsm (YNB avec 1,6% de lait écrémé au lieu de glucose). 25 Tableau 1 : Souches de Y. lipolytica, souches de E. coli et vecteurs utilisés dans cette étude. Souches Y. lipolytica Génotype Références JMY195 (Pol d) JMY2033 MATa ura3::LEU2ex-Zeta leu2-270 xpr2-322 JMY2101 MATa ura3-302 xpr2-322+pXPR2-SUC2 Barth and Gaillardin (Barth and Gaillardin, 1996) Lazar et al. (Lazar et al., 2013) Barth and Gaillardin (Barth and Gaillardin, 1996) MATa ura3-302 leu2-270 xpr2-322 (pXPR2- SUC2 au locus URA3) JMY2394 JMY2566 JMY2810 JMY2811 JMY2812 JMY2813 JMY2815 JMY4488 JMY4490 JMY4491 JMY4493 JMY4727 29 3028528 MATa leu2-270 ura3-302 xpr2-32 Allu70 Verbeke et al. (Verbeke et MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta al., 2012) leu2-270 xpr2-322 Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- URA3ex-pTEF leu2-270 xpr2-322 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- URA3ex-pTEF-RedStar2 leu2-270 xpr2-322 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- URA3ex-pTEF-eYFP leu2-270 xpr2-322 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- URA3ex-pTEF-XPR2 leu2-270 xpr2-322 MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- URA3ex-pTEF-SUC2 leu2-270 xpr2-322 Zeta-LEU2ex-pTEF-RedStar2 leu2-270 ura3- 302 xpr2-322 Allu70 Zeta-LEU2ex-Hp4d-RedStar2 leu2-270 ura3- 302 xpr2-322 Allu70 Zeta-LEU2ex-4UAS1-pTEF-RedStar2 leu2-270 ura3-302 xpr2-322 Allu70 Zeta-LEU2ex-Hp8d-RedStar2 leu2-270 ura3- 302 xpr2-322 Allu70 Zeta-LEU2ex-8UAS-pTEF-RedStar2 leu2-270 ura3-302 xpr2-322 Allu70 Souches E. coli Plasmide Génotype Références KanR PTura3- Lazar et al. (Lazar, et al., JME1226 JMP1226 LEU2ex-Zeta 2013) JMP1226 pTEf- JME1490 JMP1490 Ce travail RedStar2 JMP62 pTEF JME1521 JMP1521 URA3ex AmpR et Ce travail ORI de PBR322 JMP1521 -cassette JME1529 JMP 1529 Ce travail ccdB Gateway JME1592 JMP 1592 pDONR207-XPR2 Ce travail JME1593 JMP 1593 pDONR207-SUC2 Ce travail JME1594 JMP 1594 pDONR207-eYFP Ce travail pDONR207- JME1595 JMP 1595 Ce travail RedStar2 JME1598 JMP 1598 JMP1529-SUC2 Ce travail JME1599 JMP 1599 JMP1529-eYFP Ce travail JME1600 JMP1600 JMP1529-RedStar2 Ce travail JME1603 JMP1603 JMP1529-XP R2 Ce travail JME1427 JMP 1427 JMP62 LEU2ex- Dulermo et al. (Dulermo et 3028528 30 pTEF-YFP al., 2013) JMP62 LEU2ex Kabran et al. (Kabran, et JME1394 JMP1394 pTEF-RedStar2 al., 2012) JME1469 JMP1469 JMP62 URA3ex- Lazar et al. (Lazar, et al., pTEF-SUC2 2013) Gateway JME1030 PDEST14 I nvitrogen® Destination vector Gateway Donor JME1488 PDONR207 vector I nvitrogen® Croissance en microplaques 96 puits Les cultures en microplaques de 96 puits ont été réalisées comme suit, sauf quand des spécificités sont mentionnées. Les précultures sont réalisées en plaques de 96 5 puits en YPD pendant 48 h. Les cellules sont ensuite inoculées à environ 0,1 à DO600 dans 200 pl de milieu de culture. Les puits à la périphérie de la plaque sont remplis d'eau afin d'éviter l'évaporation des puits de culture. La DO600 est lue toutes les 20 minutes pendant 48h dans un lecteur de nnicroplaque Biotek Synergy MX (http://www.biotek.com) pendant que la plaque est maintenue à 28°C sous agitation 10 constante. En milieu opaque, la croissance est suivie à l'aide de la protéine rapporteuse fluorescente RedStar2 en utilisant une longueur d'ondes d'excitation de 545 nm et une longueur d'ondes d'émission de 585 nm avec le même équipement et les mêmes conditions que ci-dessus. Construction des vecteurs et des souches 15 Construction des vecteurs de destination Gateway Un fragment de pBR322 contenant l'origine de réplication oh et le gène de résistance à l'ampicilline a été amplifié à partir de pDEST14 (Invitrogen) à l'aide des amorces PBRup et PBRdown (Tableau 2). Ces deux amorces comportent deux sites de restriction Noti et Iceul. Après digestion par Notil et purification, le fragment 20 déphosphorylé a été ligaturé avec le fragment Noti purifié du dérivé JMP1047 de JMP62 qui contient la cassette d'expression Noti-zeta-URA3ex-pTef-terra-zeta-Noti. Le vecteur résultant JMP1521 a été vérifié par digestion et séquençage. Tableau 2 : Oligonucléotides utilisés dans cette étude 3028528 31 Nom Séquence F_AGE1_tefred CGCACCGGTAATCGATAGAGACCGGGTTG R_AGE1_tefred GGTGACCGGTCGATTTGTCTTAGAGGAACG 61TEFstart TCCCCGAATTACCTTTCCTC For_in_Dsred ACCCAGCTGACATTCCAGAC uraup_1226 GGTTGGCCGACAACAATATC leudown_1226 GCCCTCCAAGATGAATGGTA Puraextver CCTGCGCAAAACATTGTATG RED2_no_skl TGGTGCCTAGGCTGCTTACAAGAACAAGTGGTGTCTACC VerZetasens CGAGTAACACTCGCTCTGGAGAGTTAGTCATCC Turaextver TGCTGGCTTTACGTTGTCAG pbrup CGCGCGGCCGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAACATCATCAGTAACCC GTATCGTGAGC pbrdown CGCGCGGCCGCTTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTACGGTCAGGTGGCACTTT TCGGGGAAAT bgl2_gate_plus CGCAGATCTATCACAAGTTTGTACAAAAAA gate_avr2_plus GGTGCCTAGGATCACCACTTTGTACAAGAAA Attbl- Redstar2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAGTGCTTCTTCTGAAGA Attb2-Redstar2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACAAGAACAAGTGGTGTC Attbl-eYFP GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Attb2-eYFP GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Attb1-SUC2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCTTTTGCAAGCTTTCC Attb2-SUC2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTTACTTCCCTTACTTGG Attb1-xpr2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAAGCTCGCTACCGCCTT Attb2-xpr2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAATGCCAACACCGTTGTAG ATTR2zetaUP TGATCCTAGGGTGTCTGTGG Turadown TCTTCTGCCTCCAGGAAGTC La cassette Gateway (attR1-ccdb-chlorannphénicol-attR2) qui permet la recombinaison à l'aide de la clonase Gateway® , a été amplifiée par PCR à partir de pDEST14 (Invitrogen) avec les amorces bgl2_gate_plus et gate_Avr2_plus (Tableau 2), 5 en ajoutant des sites de restriction Bgill and Avril qui permettent de cloner dans JMP1521 entre promoteur et le terminateur. Le fragment purifié Bgill-Avril a été cloné dans le vecteur JMP1521 digéré par BamHl et Avril. Le vecteur ainsi obtenu JMP1529 a été partiellement séquence pour vérifier la construction (Figure 1). Un ensemble de vecteurs accepteurs avec différent promoteurs a été construit par 10 digestion Clal-BannHI du vecteur JMP1529, et l'élimination du fragment Clal-BannHI 3028528 32 contenant le promoteur pTEF et le remplacement par un fragment Clal-BannHI portant des promoteurs de force variable (Tableau 3). Des vecteurs d'expression pourront être construits à partir d'un vecteur donneur Gateway contenant un gène d'intérêt pour construire des vecteurs d'expression avec différent promoteurs (Figure 5 2). D'une manière similaire, des vecteurs d'expression de la RedStar2 sous différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3). Tableau 3: Vecteurs accepteurs possédant différents promoteurs et vecteurs d'expression de la RedStar2 sous différents promoteurs. Vecteur Promoteur Terminateur Marqueur Marqueur gene(s) exprimé(s) entre BamHI/Avr11 Taille d'auxotrophie Antibiotique (pb) JMP2471 Hp4d Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6245 JMP2473 Hp8d Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6681 JMP1394 pTEF Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6046 JMP2482 2UAS-pTEF Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6304 JMP2484 3UAS-pTEF Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6413 JMP2397 4UAS-pTEF Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6522 JMP2607 SUAS-pTEF Lip2 LEU2ex KanR RedStar2 6920 JMP3275 Hp4d Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7146 JMP3050 Hp8d Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7582 JMP3030 pTEF Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 6947 JMP3258 2UAS-pTEF Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7205 JMP3273 3UAS-pTEF Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7314 JMP3052 4UAS-pTEF Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7423 JMP3048 SUAS-pTEF Lip2 URA3ex AmpR CmR+CcdB 7858 10 Construction de la souche receveuse pour une intégration à un locus spécifique et l'expression constitutive d'une protéine fluorescente rapporteuse. La cassette pTEF-RedStar2-terra a été amplifiée par PCR à partir du vecteur JMP1394 avec des amorces contenant chacune un site de restriction Agel (F_AGE1_tefred, 15 R_AGE1_tefred; Tableau 2). Le fragment PCR comprend ainsi la sequence de la RedStar2 flanquée par le promoteur pTEF et un terminateur. Ce fragment est ligaturé après digestion par Agel dans le vecteur JMP1226 digéré par Agel et dephosphorylé, donnant ainsi le vecteur JMP1490. L'orientation de l'intégration a été vérifiée par PCR avec deux couples d'amorces externes et internes (61TEFstart, 20 For_in_Dsred, uraup_1226, leudown_1226; Tableau 2). Ce vecteur contient la 3028528 33 plateforme zeta, le marqueur d'auxotrophie LEU2 et un site unique de restriction Agel, le tout entouré par des séquences amont et aval de URA3 pour intégration dans le génome au locus URA3 par recombinaison homologue (Lazar et al., 2013). Dans cette nouvelle construction, le fragment pTEF-RedStar2-terra est situé entre la 5 séquence amont URA3 et le marqueur LEU2. La cassette d'expression extraite du vecteur par digestion Notl a été utilisée pour transformer la souche Po1d. Les séquences amont et aval de URA3 permettent l'intégration au locus URA3 dans le génome par double crossing over. Dans la souche Pold, le gène URA3 a été au préalable inactive par intégration du gène SUC2 de S. 10 cerevisiae (Nicaud et al., 1989). L'intégration de la cassette remplace les séquences ura3 restantes et le gène SUC2 par la construction correspondant à la plateforme pTEF-RedStar2-LEU2-Zeta (voir Figure 3B). Les transformants ont été criblés sur la base de la prototrophie pour la leucine, la fluorescence Red et l'impossibilité de pousser sur saccharose causée par l'élimination de la cassette d'expression SUC2 15 dans Pold. La souche transformante ainsi obtenue a été désignée JMY2566. L'intégration au locus URA3 a été vérifiée par PCR sur ADN génomique avec deux couples d'amorces externes et internes (Puraextver, RED2_no_skl, VerZetasens, Turaextver; Tableau 2). JMY2566 présente la même croissance que la souche sauvage W29 sur YNB. 20 Construction des souches témoins. Construction des vecteurs. Les phases ouvertes de lecture eYFP, RedStar2, SUC2, and XPR2 ont été amplifiées par PCR à partir de l'ADN des vecteurs JMP911 et JMP1394 (Kabran et al., 2012), de l'ADN génomique de W29 et de l'ADN du vecteur JMP1462, respectivement (Lazar, et 25 al., 2013), avec des amorces permettant d'introduire des sites attb à chaque extrémité du produit de PCR (Attb1-nom de gène , Attb2-nom de gène, listés dans le Tableau 2). Chaque fragment PCR a ensuite été cloné dans pDONR207 (Invitrogen) à l'aide de la Gateway® BP Clonase' en suivant les instructions du fabriquant, puis a été transformé dans la souche Mach1T1 de E. coli. La séquence de chacun des 30 vecteurs d'entrée ainsi obtenus JMP1594 (eYFP), JMP1592 (XPR2), JMP1593 (SUC2) et JMP1595 (RedStar2) a été vérifiée. Chaque phase ouverte de lecture a été transférée dans un vecteur de destination JMP1529 spécifique de Y. lipolytica à l'aide de la Gateway® BP ClonaseTM en suivant les instructions du fabriquant, puis a été 3028528 34 transformé dans la souche Mach1T1 de E. coli. Les vecteurs d'expression résultants JMP1598 (SUC2), JMP1599 (eYFP), JMP1600 (RedStar2), JMP1603 (XPR2) ont été vérifié par PCR et par analyse du profil de restriction. Tous les vecteurs construits sont listés dans le Tableau 1. 5 Construction des souches Y. lipolytica. Les 4 vecteurs d'expression obtenus ci-dessus ont été digérés par Noti. Les cassettes d'expression purifiées ont été transformées dans JMY2566 par la méthode à l'acétate de lithium. L'intégration dans la plateforme d'accueil Zeta a été vérifiée pour les 4 souches obtenues, JMY2811 (RedStar2), JMY2812 (eYFP), JMY2813 (XPR2) et JMY2815 10 (SUC2) comme expliqué dans la section suivante. Une souche témoin a été construite par transformation de la cassette Noti du vecteur vide JMP1047 qui comporte le promoteur pTEF, le terminateur LIP2 et le site de clonage Bamill-Avril sans insert, dans la souche JMY2566. La souche témoin ainsi obtenue a été dénommée JMY2810. Toutes les souches construites sont listées dans le Tableau 1. 15 PCR pour vérification de l'intégration à la plateforme zeta Les PCR ont été réalisée sur des colonies de Y. lipolytica lysées par 10 pL de 0.2 N NaOH et incubées dans le thermocycler pendant 5 minutes à 99 °C. Les amorces utilisées pour cette vérification étaient ATTR2zetaup et Turadown (Tableau 2). L'amorce ATTR2zetaup a deux sites possibles d'hybridation. En l'absence 20 d'intégration à la plateforme, la PCR donne une bande de 2680 pb, tandis qu'en présence d'une intégration, la PCR donne une bande de 1052 pb (voir les Figures 3B et 1C). Ces amorces permettent donc de détecter aussi bien les signaux négatifs que positifs. Théoriquement, l'amorce - forward » ATTR2zetaup peut s'hybrider en amont du gène LEU2, ce qui conduirait à l'amplification d'un fragment plus grand 25 que 4 Kb, selon la taille de l'insert. En pratique, nous n'avons jamais été en mesure de détecter en gel d'électrophorèse une amplification avec le temps d'extension de 2 minutes 45 secondes que nous avons utilisé. Méthodes de transformation. 30 Les cassettes d'expression ont été transformées dans les souches de Y. lipolytica en suivant les protocoles miniaturisés adaptés au format des plaques de 96 puits qui 3028528 sont décrits ci-dessous. Les méthodes de transformation suivantes sont réalisées en plaques de 96 puits rigides, et les incubations sont faites dans un thermocycler. Les protocoles suivants sont des modifications de la méthode à l'acétate de lithium (LiAC) (Chen, et al., 1997, Le Dalt, et al., 1994). 5 Le protocole 1 est basé sur l'utilisation d'un tampon commercial (YLEX Expression Kit, Yeastern Biotech Co., Ltd.). Les cellules sont striées sur des boites de YPD et incubées pendant 20 à 24 h à 28°C. Les cellules sont ensuite raclées de la surface de la boite d'agar, lavées en tampon TE et centrifugées à 3000 rpm à température ambiante pendant 5 minutes. Pour 100 transformations uniques, 5.109 cellules 10 environ sont resuspendues dans 10 ml de tampon YLOS complet (Yeastern Biotech) comprenant 9,5 ml de tampon YLOS (décrit dans Chen et al., One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. App( Microbiol Biotechnol. 48(2): 232-235, 1997), 500 pl de 2 M DTT, 250 pl d'ADN simple brin entraineur (5 à 10 pg d'ADN de saumon, Dualsystems AG Biotech). Pour chaque 15 transformation, 3 pL d'ADN de vecteur linéarisé (- 50 ng) sont ajoutés à 100 pl de cellules resuspendues en tampon YLOS complet en plaque de 96 puits pour PCR et incubées à 39°C pendant 60 minutes. Les cellules sont étalées directement sur un milieu minimal YNB solide de sélection. Le protocole 2 est basé sur la méthode LiAC standard. Les cellules sont striées sur 20 des boites de YPD et incubées pendant 20 à 24 h à 28°C. Pour 100 transformations uniques, les cellules sont raclées de la surface de la boite d'agar, lavées dans 15 ml de tampon TE et centrifugées à 3000 rpm à température ambiante pendant 5 minutes. Les cellules sont resuspendues dans 10 ml de LiAC 0,1 M pH 6 et incubées pendant 1 heure à 28 °C pour obtenir des cellules compétentes. Les cellules sont 25 centrifugées à 2000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes et resuspendues dans 1 ml LiAC 0,1 M pH 6. Dix microlitres de cellules sont ensuite transférés dans des plaques de 96 puits pour PCR, mélangés doucement avec 3 pL d'ADN de vecteur linéarisé (- 50 ng) et 10 pL d'ADN entraineur (5 à 10 pg, Dualsystems AG Biotech) et incubés 15 minutes à 28 °C. Ensuite, 66 pL de tampon de réaction (40% PEG, 0,1M 30 LiAC pH6) sont ajoutés à chaque mélange de transformation et mélangés doucement. Le mélange est incubé 1 heure à 28 °C. Cette incubation est suivie par un choc thermique de 10 minutes à 39 °C. Les cellules sont étalées directement sur un milieu minimal YNB solide de sélection. 3028528 36 Test d'activité protease. L'activité protéase est mesurée à l'aide du substrat Fluorescein thiocarbamoylCasein (FTC-casein Thermo-Scientific). 50 pl de surnageant de culture (dilué au 1/5) sont incubés avec 50 pl FTC-casein (5 µg/ml en tampon phosphate 50nnM pH 6,8). La 5 fluorescence et la densité cellulaire sont mesurées chaque 1 min pendant 1h en lecteur microplaque (Biotek) avec une longueur d'onde d'excitation à 494 nm et une longueur d'onde d'émission à 517 nm pour la fluorescence. La Vmax est exprimée en fluorescence relative par minute (RFU/min). Microscopie à fluorescence 10 Les images de microscopie sont réalisées avec un microscope Zeiss Imager.M2 équipé d'une lampe HXP 120 C et de filtres pour visualiser la fluorescence de la protéine eYFP (filtre 46-YFP) et de la protéine Redstar2 (filtre 45-Texasred ; http: //www.zeiss.com). 3. Résultats et discussions 15 3.1 Vecteur de surexpression Gateway@ pour Y. lipolytica Afin de tirer parti du système Gateway®, un vecteur destination pour surexprimer dans Y. lipolytica et compatible avec cette méthodologie de clonage a été construit. Le système Gateway® de clonage permet un clonage in vitro avec une haute efficacité fondé sur la recombinaison et ne nécessitant pas d'enzymes de restriction 20 (Walhout et al., 2000). Le gène de résistance à l'ampicilline et l'origine de pBR322 des vecteurs pDEST Gateway® d'Invitrogen ont été utilisés avec la cassette d'expression du vecteur d'expression JMP62 pour Y. lipolytica dans lequel la cassette de recombinaison Gateway® a été intégrée au site de clonage (voir les matériels et méthodes). Ainsi, un vecteur a été obtenu qui comprend le marqueur de résistance à 25 l'ampicilline, le marqueur d'auxotrophie URA3 excisable et le site de clonage Gateway® entre le promoteur pTEF et le terminateur LIP2. La cassette d'expression est entourée par des séquences zeta qui permettent la recombinaison dans le génome de levure après excision par digestion avec Notl ou Iceul (Figure 3A). Les deux sites de restriction peuvent être utilisés pour donner de la flexibilité au 30 système si des sites pour l'une ou l'autre enzyme de restriction sont présents dans le gène cloné. Ce vecteur permet de cloner des gènes amplifiés par PCR auxquels des séquences Attb ont été ajoutés ou des ADNc clonés dans un vecteur Gateway® 3028528 37 pDONR par simple recombinaison au site de clonage Gateway® pour donner les vecteurs de surexpression spécifiques de Y. lipolytica et contenant le gène d'intérêt (Figure 3A). 3.2 Construction de la souche receveuse avec la plateforme Zeta. 5 Une souche a été construite qui contient une plateforme zeta permettant l'intégration spécifique à un locus donné par crossing over simple avec les séquences zeta présentes dans les cassettes d'expression (Bordes, et al., 2007), de façon à éviter les intégrations aléatoires dans le génome. La plupart des souches de Y. lipolytica sont dérivées d'un mutant original auxotrophe ura- dans lequel l'invertase 10 de S. cerevisiae a été introduite au locus URA3. Afin de se débarrasser de ce gène hétérologue, une plateforme d'accueil zeta ciblant le locus ura3 a été construite. La construction précédente a ainsi été remplacée, ce qui a donné la souche JMY2033 (Lazar, et al., 2013). Cette délétion retire complètement toutes les séquences URA3 dans le génome, ce qui élimine toute possibilité de conversion ura3. 15 Y. lipolytica est habituellement cultivée dans des milieux basés sur une émulsion d'acides gras. De tels milieux sont opaques, ce qui empêche d'estimer directement la densité cellulaire en mesurant la densité optique puisqu'il faut laver plusieurs fois les cellules. Afin d'essayer de contourner cette limitation, on peut introduire un gène rapporteur codant une activité mesurable et proportionnelle à la densité 20 cellulaire de la culture. Ici, la protéine fluorescente RedStar2 a été utilisée comme rapporteur sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF. Cela permet de suivre la croissance cellulaire par l'intermédiaire de l'émission de fluorescence, laquelle peut être détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques de 96 puits (Morin N, Crutz-Le Coq A-M, Rossignol T Et Nicaud J-M (2014) Protocols for Monitoring Growth and Lipid 25 Accumulation in Oleaginous Yeasts. in Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols, McGenity TJ, Ed., p. 1-17, Humana Press.). Afin de pouvoir suivre la croissance de la future collection de souches, on a construit une souche similaire à JMY2033 avec la plateforme zeta, mais comprenant en outre le gène de la Redstar2 derrière le promoteur pTEF intégré dans le génome en une seule étape de transformation afin 30 de réduire le nombre d'auxotrophies requises (voir Matériels et méthodes). La souche résultante JMY2566 exprime constitutivement la protéine RedStar2 et offre une plateforme d'accueil zeta au locus URA3 (Figure 3B). Elle sera utilisée ensuite pour toutes les transformations des cassettes de surexpression Gateway®. 3028528 38 3.3 Validation du système de surexpression Gateway. Afin de valider notre système de surexpression basé sur la stratégie Gateway, nous avons tout d'abord clone une série de gènes codant des protéines donnant des phénotypes connus et quantifiables. Quatre gènes ont ainsi été clonés en tant que 5 témoins : deux codent des protéines fluorescentes, eYFP et RedStar2 ; un code l'enzyme hétérologue de S. cerevisiae SUC2 ; le dernier code la protéase XPR2 de Y. lipolytica (voir la partie - Matériel et méthodes » pour la description des constructions). Chaque cassette de surexpression a ensuite été transformée dans la souche receveuse JMY2566 et l'intégration correcte au locus URA3 dans la plateforme 10 d'accueil zeta a été vérifiée par PCR. L'expression correcte des protéines fluorescentes a d'abord été vérifiée par microscopie à fluorescence. Pour la surexpression de la eYFP (JMY2812), on a pu ainsi détecter clairement une fluorescence correspondant aux cellules entières (Figure 4A). La souche receveuse exprime déjà la RedStar2 sous le contrôle du promoteur 15 pTEF. L'intégration d'une seconde copie avec le vecteur Gateway (JMY2811) augmente la fluorescence. La quantification de la fluorescence avec un lecteur de microplaque fait apparaître une augmentation de 40% en comparaison de la souche témoin transformée par le vecteur vide (JMY2810). Ce résultat montre que, même si la souche exprime déjà un gène fortement, l'augmentation de l'expression dudit 20 gène résultant de l'addition d'une seconde copie avec notre système de surexpression est facilement détectable. Le promoteur pTEF étant l'un des plus forts de Y. lipolytica, cela signifie que notre système d'expression est suffisamment fort pour que l'on puisse détecter un phénotype de surexpression, même pour des gènes endogènes qui sont déjà fortement exprimés. 25 La souche JMY2566 est Suc" et Xpr2" (Barth et Gaillardin, 1996). La surexpression de ces gènes devrait donc être détectable par complémentation. La surexpression de la protéase XPR2 (JMY2813) restaure le phénotype de dégradation des protéines qui est mesurable par la formation de halos sur milieu solide à base de lait écrémé à un niveau proche de celui de la souche sauvage (Figure 4B). La légère différence 30 restante est probablement due au fait que le promoteur de XPR2 est lui-même un promoteur fort. De fait, il est même plus fort que pTEF pour la sécrétion des protéines (Müller et al., 1998). Les souches de Y. lipolytica ne sont pas capables naturellement d'assimiler le saccharose. On s'attend donc à ce que la surexpression 3028528 39 de l'invertase SUC2 de S. cerevisiae dans la souche réceptrice fournisse la capacité à pousser sur saccharose. Or comme le montre la Figure 4C, la souche JMY2815 surexprimant SUC2 pousse sur saccharose aussi bien que sur glucose, alors que la souche sauvage ne peut pas pousser sur cette source de carbone, comme attendu. 5 Chacune des 4 souches témoins prouve donc que notre système permet une expression fonctionnelle correcte aussi bien de protéines de Y. lipolytica que de protéines hétérologues. En outre, les résultats de surexpression de SUC2 et XPR2 démontrent que les protéines surexprimées sont secrétées correctement. 3.4 Utilisation des protéines fluorescentes pour suivre la croissance. 10 L'utilisation d'une souche qui exprime constitutivement une protéine fluorescente permet de suivre la croissance des cellules même dans des milieux opaques comme ceux à base de lait écrémé, les émulsions d'acides gras, les molasses ou tout substrat qui interfère avec la transmission de la lumière et empêche donc la mesure de la densité optique. Les souches construites ici expriment constitutivement la protéine 15 fluorescente RedStar2. On peut ainsi suivre en temps réel la cinétique de croissance des cellules dans de tels milieux en n'ayant besoin que d'un lecteur de fluorescence en microplaques. Tout d'abord, la souche témoin JMY2810 a été utilisée pour montrer que l'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la densité optique dans un milieu translucide. De fait, le cinétiques de la DO600 et de la fluorescence 20 sont très semblables, à ceci près que l'augmentation de la fluorescence est légèrement retardée par rapport à celle de la DO600 (Figure 5A). La figure 5B présente un exemple de souches exprimant ou non XPR2 dans un milieu à base de lait écrémé (milieu opaque) dans lequel la DO600 ne peut pas être mesurée. La surexpression de XPR2 confère clairement un avantage sur milieu à base de lait 25 écrémé par rapport à une souche délétée pour cette protéase. 3.5 Méthodes de transformation à haut debit. La stratégie de clonage Gateway permet de créer un grand nombre de vecteurs. En conséquence, une méthode efficace de transformation à haut débit de Y. lipolytica est nécessaire. Nous avons mis au point et testé des protocoles miniaturisés pour 30 adapter les méthodes de transformation au format des microplaques de 96 puits. Ce format peut être manipulé par la plupart des robots de manipulation de liquides. En outre, il peut être utilisé avec la plupart des kits commerciaux de préparation de 3028528 plasmide haut débit en microplaques de 96 puits. Le volume final de réaction doit se situer aux environs de 200 pL pour permettre la transformation dans des plaques de 96 puits et l'utilisation d'un thermocycleur pour les différentes étapes d'incubation. Trois méthodes ont été mises au point et testées : 5 - un protocole dérivé de Chen et al. (Chen, et al., 1997) et utilisant le kit YLOSTM de Yeastern® (protocole 1) ; - un protocole identique au précédent mais omettant le DTT afin de favoriser l'intégration au locus désiré plutôt que les intégrations au hasard ; et - la méthode standard des inventeurs (Le Dalt, et al., 1994), adaptée au volume 10 des microplaques de 96 puits, c'est-à-dire 200 pl (protocole 2) ; Les protocoles sont décrits dans la section - Matériel et méthodes ». Trois souches ont été utilisées pour ces tests, JMY2566 et JMY2033, qui ont toutes deux une plateforme d'accueil Zeta dans leur génome, et JMY2101 qui n'en possède pas (Tableau 1). Pour chaque protocole de transformation, 2 vecteurs différents Gateway 15 ont été testés, JMP1598, qui surexprime SUC2, et JMP1600, qui surexprinne la RedStar2. En prenant en compte toutes les transformations de souches et de vecteurs, le protocole 1 a produit 2,2.103 transformants par pg d'ADN, alors que le protocole 2 a donné 1,3.103 transformants par pg d'ADN. Le taux de transformation semble 20 meilleur avec le protocole 1 en une étape (Figure 6). Le protocole en une étape sans DTT n'a permis d'obtenir qu'un nombre extrêmement restreint de transformants et n'a pas été étudié plus avant. Des différences liées aux souches sont apparues durant ces tests et ce, quel que soit le protocole utilisé. JMY2033 donne deux fois plus de transformants que JMY2566 qui donne elle-même deux fois plus de transformants que 25 JMY2101. Ces différences ont été observées aussi bien avec le protocole 1 qu'avec le 2. De façon générale, ces deux protocoles adaptés aux microplaques de 96 puits permettent d'obtenir de bons taux de transformation et sont faciles à mettre en oeuvre. Les souches JMY2033 et JMY2566 ont la particularité de posséder une plateforme 30 d'accueil zeta qui permet une intégration spécifique au locus zeta. La proportion d'intégrations spécifiques et d'intégrations au hasard dans chacune de ces deux souches a été testée pour chacune des deux méthodes de transformations décrites 3028528 41 plus haut. Les deux types d'intégration ont été différenciés à l'aide d'un test PCR (voir la section - Matériel et méthodes »). Ce test ne permet pas d'éliminer la possibilité d'une double intégration; toutefois, nous n'avons jamais détecté de cas d'une intégration au locus associée à une intégration au hasard. L'intégration au 5 locus a été évaluée dans 389 transformants parmi les 708 obtenus avec chacune des deux souches JMY2033 et JMY2566 et les deux plasmides testés. Une telle intégration spécifique est observée dans 82,5% des transformants obtenus avec le protocole 2 mais seulement avec 17,3% pour le protocole 1 (Figure 6). Cette différence marquée s'explique sans doute par la présence de DTT dans le protocole 1. Il est connu en 10 effet que celui-ci améliore l'efficacité de transformation mais augmente en contrepartie l'intégration non-spécifique. L'homme du métier privilégiera donc le protocole 1 quand le nombre de transformants est plus important que l'intégration spécifique à un locus donné. Ce type de situations se rencontre quand tous les transformants sont criblés pour le même phénotype ou la même activité, sans que les 15 transformants doivent être caractérisés individuellement. En revanche, s'il est important que l'intégration se fasse à un locus donné, par exemple pour éviter une expression non-spécifique, l'homme du métier utilisera le protocole 2. 3.6 Quantification des niveaux d'activité des transformants intégrés au hasard. Comme mentionné ci-dessus, l'intégration au hasard dans le génome peut être 20 suffisante pour un grand nombre d'utilisations. Toutefois, elle peut aussi conduire à des variations d'expression du gène selon l'endroit où celui-ci est intégré dans le génome. Dans certains cas, l'expression correcte du gène peut même être empêchée. L'intégration non-spécifique peut aussi entrainer des modifications du phénotype de la levure, notamment par inactivation du gène dans lequel la cassette 25 est insérée. Par ailleurs, pour les mêmes raisons, une intégration au hasard dans le génome peut aussi résulter en un accroissement de l'expression du gène en question. Afin d'évaluer la variabilité dans les niveaux d'expression entre les clones obtenus par une intégration non-spécifique, la souche JMY2566 (xpr2") a été transformée selon le protocole 1 par le vecteur JMP1603 qui permet de surexprimer la protéase 30 XPR2. Celle-ci est un bon rapporteur car sa surexpression est facilement mesurable. L'activité protéasique de 96 transformants a ainsi été mesurée en suivant la libération de fluorescence à partir du substrat FTC-caséine (voir la section - Matériel et méthodes »). Le maximum d'activité est détecté après 5 h d'incubation. 3028528 42 Cependant, des différences entre transformants ont été observées, comme on s'y attendait. La figure 7 représente la distribution du nombre de clones par tranches successives de Vmax. Parmi les transformants, 3 avaient peu ou pas d'activité (Vmax REVENDICATIONS1. Un groupe de vecteurs, comprenant un vecteur donneur et plus d'un vecteur accepteur, dans lequel : - ledit vecteur donneur comprend deux site de recombinaison choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison flanquant au moins un marqueur de contre-sélection ; et - chaque vecteur accepteur comprend un insert bordé de séquences zeta, ledit insert comprenant : o deux sites de recombinaison choisis parmi attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison encadrant des séquences régulatrices permettant l'expression de protéines dans les levures oléagineuses, et o un marqueur de sélection de levure oléagineuse, les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur et chaque vecteur accepteur portant une combinaison unique de séquences régulatrices et de marqueur de sélection. 2. Groupe de vecteurs selon la revendication 1, dans lequel la levure oléagineuse est Yarrowia lipolytica. 3. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le promoteur est choisi parmi les promoteurs PDX2, L1P2, FBA1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPD1N, TEF hp4d, XPR2, UAS1-TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStefTEF. 4. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le terminateur est choisi parmi les terminateurs PGK1, L1P2, XPR2 et CYC1. 5. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le marqueur de sélection choisi parmi les marqueurs d'auxotrophie et les marqueurs de résistance. 6. Groupe de vecteurs selon la revendication 5, dans lequel le marqueur 30 d'auxotrophie est choisi parmi ADE2, URA3, LEU2 et LYS5. 3028528 49 7. Groupe de vecteurs selon la revendication 5, dans lequel le marqueur de résistance est choisi parmi MDR3, KanMX, hph (HYG) et Tn5ble. 8. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les séquences zeta sont bordées par des sites de restriction rares. 5 9. Procédé de construction d'un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt en utilisant un groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant des étapes de : a) clonage dudit gène d'intérêt dans le vecteur donneur, et b) clonage dudit gène d'intérêt par recombinaison entre le vecteur donneur 10 obtenu à l'étape a) et le vecteur accepteur. 10. Procédé selon la revendication 9, comprenant, préalablement à l'étape a), les étapes suivantes de : i) ajout de sites de recombinaison aux extrémités du gène d'intérêt par amplification, lesdits sites de recombinaison étant choisis parmi attB1, attB2, 15 attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 et attR2 ; et ii) recombinaison entre le gène d'intérêt amplifié de l'étape i) et le vecteur donneur. 11. Procédé de construction d'une banque de vecteurs d'expression d'un gène d'intérêt, comprenant la construction d'un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt 20 selon l'une quelconque des revendications 9et 10, dans lequel l'étape b) comprend le clonage du gène d'intérêt dans plusieurs vecteurs accepteurs. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel lesdits vecteurs accepteurs diffèrent par leurs séquences régulatrices et/ou leur marqueur de sélection. 13. Banque de vecteurs d'expression obtenue par la méthode de l'une quelconque 25 des revendications 11 et 12. 14. Procédé de construction d'une banque de souches transformantes de levure oléagineuse exprimant un gène d'intérêt, ledit procédé comprenant une étape de transformation d'au moins une souche de levure oléagineuse par la banque d'expression de la revendication 13. 3028528 50 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite souche comprend une seule séquence zeta dans son génome. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, dans lequel au moins 50 transformations, plus préférentiellement au moins 60, encore plus 5 préférentiellement au moins 70, toujours plus préférentiellement au moins 80, le plus préférentiellement au moins 90, sont réalisées simultanément. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, dans lequel les transformations sont réalisées en microplaques. 18. Banque de souches de levure oléagineuse obtenue par le procédé de l'une 10 quelconque des revendications 14 à 17. 19. Utilisation d'au moins une souche de la banque de souches de levure oléagineuse de la revendication 18 pour la production d'une protéine d'intérêt. 20. Procédé de production d'une protéine d'intérêt, comprenant des étapes de : a) culture d'au moins une souche de la banque de souches de levure 15 oléagineuse de la revendication 18 dans un milieu approprié et b) récolte de la protéine d'intérêt produite par la culture de l'étape a).