FR 3035410 A1 20161028 FR 1553731 A 20150424 1 L'invention a trait au domaine de la classification de microorganismes, notamment de bactéries, au moyen de la spectrométrie. L'invention trouve particulièrement application dans l'identification de microorganismes au moyen de la spectrométrie de masse, par exemple de type MALDI-TOF (acronyme de « Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight »). Il est connu d'utiliser la spectrométrie ou la spectroscopie pour identifier des microorganismes, et plus particulièrement des bactéries. Pour ce faire, un échantillon d'un microorganisme inconnu à identifier est préparé puis un spectre de masse de l'échantillon est acquis et pré-traité, notamment pour éliminer le bruit, lisser le signal et soustraire la ligne de base (communément appelé « baseline »). Une étape de détection des pics présents dans les spectres acquis est ensuite réalisée. Les pics du spectre ainsi obtenus sont alors classifiés à l'aide d'outils de classification associés à des données d'une base de connaissance construite à partir de listes de pics de référence chacune associés à un microorganisme ou à un groupe de microorganismes (souche, classe, ordre, famille, genre, espèce, etc...) identifié. Plus particulièrement, l'identification de microorganismes par classification consiste classiquement : - en une première étape de construction, à l'aide d'un apprentissage supervisé, d'un modèle de classification associé à une base de connaissance en fonction de spectres de masses dits « d'apprentissage » de microorganismes dont on connaît au préalable les groupes, plus particulièrement les espèces, le modèle de classification et la base de connaissance définissant un ensemble de règles distinguant ces différents groupes ; - en une seconde étape d'identification d'un microorganisme particulier inconnu en : o faisant l'acquisition d'un spectre de masse de celui-ci ; et o en appliquant au spectre acquis le modèle de classification en relation avec la base de connaissance associée construits préalablement afin de déterminer au moins un 3035410 2 groupe, plus particulièrement une espèce, auquel le microorganisme inconnu appartient. Typiquement, un appareil d'identification par spectrométrie de masse comporte un spectromètre de masse et une unité de traitement d'information recevant les spectres mesurés et mettant en 5 oeuvre la seconde étape précitée. La première étape est quant à elle mise en oeuvre par le constructeur de l'appareil qui construit la base de connaissance, ainsi que le modèle de classification et l'intègre dans la machine avant son exploitation par un client. D'autre part certains appareils permettent à leurs utilisateurs de mettre au point leurs propres bases de connaissance et modèles de classification associés. 10 Afin de procéder à l'acquisition d'un spectre de masse d'un échantillon par spectrométrie MALDI-TOF, celui-ci est déposé sur un support comprenant différents emplacements de réception, également appelé plaque. L'échantillon est ensuite recouvert d'une matrice qui permet la cristallisation de l'échantillon. 15 L'utilisation d'appareil d'identification par spectrométrie de masse nécessite un étalonnage régulier afin de garantir l'exactitude et la précision sur la mesure des masses-sur-charges attendues dans le spectre analysé. Deux techniques classiques existent et sont réalisées en routine afin de garantir ces paramètres. 20 L'étalonnage ou calibration externe est une technique réalisée en routine sur la plupart des appareils de spectrométrie de masse. Pour cette technique, le dépôt d'un mélange étalon (ou calibrant externe) est réalisé en un emplacement distinct de celui de l'échantillon sur la plaque, support de l'échantillon dans l'appareil. L'étalonnage externe consiste à ajuster l'axe masse sur 25 charge (m/z) des spectres de masse du mélange étalon, dont le contenu est connu, de manière à ce que les pics observés coïncident avec leur position théorique, une liste de pics de référence correspondant à des masses-sur-charges caractéristiques ayant au préalable été définie pour cet étalon. Lors de l'étalonnage externe, la présence des pics de référence correspondant à ces masses-sur-charges caractéristiques est recherchée dans la liste de pics du spectre du mélange 3035410 3 étalon, avec une tolérance donnée sur la position attendue. Le spectre du mélange étalon est ensuite réaligné en fonction de la position observée de chacune des masses-sur-charges de référence trouvée. Par la suite, la transformation appliquée afin de réaligner le spectre du mélange étalon est appliquée au spectre de l'échantillon à analyser afin de réaligner sa position sur l'axe 5 m/z. Cette méthode présente l'avantage de pouvoir travailler sur de très faibles quantités d'échantillons sans risque de suppression du signal. Cependant l'étalonnage externe n'est pas assez précis pour la classification de microorganismes, notamment à des niveaux taxonomiques inférieurs au niveau espèce. 10 L'étalonnage ou calibration interne est utilisé pour obtenir un maximum de précision de mesure. Cette technique peut être complémentaire à l'étalonnage externe afin d'apporter plus de précision sur la position des masses-sur-charges du spectre. Cet étalonnage est qualifié d'interne car un mélange étalon (ou calibrant interne) est incorporé à l'échantillon à analyser avant l'acquisition. 15 Dans le cadre de la spectrométrie MALDI-TOF, la matrice (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (a-HCCA), etc... ) est déposée sur l'ensemble échantillon et étalon afin de les co-cristalliser. Ainsi, lors de l'analyse du spectre de masses acquis, l'assignation des masses-sur-charges connues des composés du mélange étalon permet de calculer des constantes de calibration. Ces constantes sont ensuite utilisées pour le calcul des masses-sur-charges des composés inconnus. 20 Cependant, le principal inconvénient de cette méthode est le risque de suppression du signal des ions analytes présents dans l'échantillon par une trop forte concentration du mélange étalon. Dans le cadre d'une méthode de préparation d'échantillon biologique par digestion trypsique les positions des masses-sur-charges correspondant à la trypsine peuvent également être utilisée comme calibrant interne. 25 Il est connu que l'identification de certaines espèces ou sous-espèces de microorganismes par spectrométrie MALDI-TOF nécessite une précision élevée sur les spectres acquis afin de différencier des groupes d'espèces proches. Plus particulièrement, la distinction d'espèces proches, l'identification de microorganismes au niveau sous-espèce ou au niveau souche (souches de sérotypes différents, souches de pathotypes différents, souches de génotypes 3035410 4 différents, etc... ) sont notoirement complexes. Ces sous-groupes présentent en effet des spectres très proches ne rendant pas leur distinction possible avec les bases de connaissances et algorithmes de classification mis au point pour l'identification au niveau groupe, par exemple au niveau taxonomique supérieur. Cette limite est notamment due à la résolution atteinte par les 5 appareils de spectrométrie de masse mais également à la variabilité des acquisitions sur un même appareil ainsi qu'entre appareils différents. Par exemple, un décalage de la position des pics des spectres pour plusieurs acquisitions d'un même échantillon, peut être observé. Ce décalage peut être visible par exemple pour des acquisitions d'un échantillon déposé sur un unique emplacement ou sur plusieurs emplacements du support d'échantillon. Cette variabilité entraine 10 une incertitude sur la mesure de masse-sur-charge, non gênante pour l'identification au niveau groupe mais qui empêche d'exploiter une discrimination à des niveaux inférieurs au groupe tel que des sous-groupes, typiquement à des niveaux inférieurs à l'espèce du microorganisme. L'invention a pour objectif de réduire cette variabilité en améliorant la précision de la position 15 des pics des spectres de masse acquis. L'invention a également pour objectif de proposer un procédé ne modifiant pas les méthodes de préparation d'échantillon existantes et pouvant être directement utilisé avec les protocoles existants, notamment sans utilisation d'étalon externe ou interne supplémentaire. Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé permettant l'identification de 20 microorganisme au niveau sous-groupe à la suite d'une identification au niveau groupe. L'invention a ainsi pour objet un procédé d'identification du groupe d'un microorganisme inconnu suivie de l'identification du sous-groupe de ce même microorganisme par spectrométrie 25 de masse. Dans ce but, l'invention concerne un procédé d'identification par spectrométrie de masse d'un sous-groupe de microorganisme inconnu parmi un ensemble de sous-groupes de référence, comportant : 3035410 5 - Une première étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par groupe associé à partir d'un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiées comme appartenant au dit groupe - Une seconde étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de 5 classification par sous-groupe associé à partir de l'acquisition d'au moins un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiées comme appartenant aux dits sous-groupes du groupe comprenant : 0 La construction d'un modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge des spectres acquis à partir de masses-sur-charges de 10 référence communes aux différents sous-groupes o L'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble des listes de pics des spectres d'apprentissage. o La construction d'un modèle de classification par sous-groupe et de la base de connaissance associé à partir des spectres d'apprentissage ajustés 15 - Une troisième étape de classification à un sous-groupe d'un microorganisme inconnu comportant : o L'acquisition d'au moins un spectre du microorganisme inconnu o La classification dans un groupe dudit spectre selon ledit modèle de classification par groupe et ladite base de connaissance par groupe 20 o L'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble de la liste de pics dudit spectre selon le modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge du spectre du microorganisme inconnu o La classification dans un sous-groupe dudit groupe par ledit modèle de classification par sous-groupe et la base de connaissance par sous-groupe 25 L'invention permet ainsi l'identification du groupe d'un microorganisme inconnu suivie directement de l'identification du sous-groupe (sous espèce, type de souche...) de ce même microorganisme par spectrométrie de masse, le tout sans procéder à une seconde acquisition du 3035410 6 spectre de masse de l'échantillon contenant le microorganisme inconnu ni d'ajout d'étalon interne. L'invention a ainsi le même effet sur la précision des masses-sur-charges que l'usage d'un étalon interne, et permet de proposer un mode opératoire en routine pour l'utilisateur de l'appareil de 5 spectrométrie de masse identique à une identification au niveau groupe simple. De plus, l'invention se révèle particulièrement économe en temps nécessaire au développement de la base de connaissance au niveau sous-groupe et à la classification en routine de microorganismes inconnus et ce sans couts supplémentaires d'étalon externe ou interne. La majorité des étapes du procédé selon l'invention sont également automatisables afin de limiter le nombre d'interventions 10 nécessaire à la construction du modèle de classification et de la base de connaissance associée, ainsi qu'à l'analyse en routine de microorganismes inconnus. Par groupe et sous-groupe, on entend une représentation hiérarchique sous forme d'arbre des types de microorganismes de référence utilisés dans la construction des bases de connaissance, 15 par exemple en termes d'évolution et/ou de phénotype et/ou de génotype. Le niveau de sous- groupe correspondant toujours à un sous-ensemble du groupe. Dans le cas de bactéries, le groupe peut ainsi être une espèce au sens des techniques classiques d'analyse, un sous-groupe pourra alors être une sous-espèce du groupe ou encore un phénotype particulier du groupe. Cependant, un groupe peut également être constitué de plusieurs espèces qui ne sont pas distinguées par des 20 techniques classiques d'analyse, chaque sous-groupe correspondant pourra ainsi correspondre à une ou plusieurs de ces espèces. Avantageusement, une étape d'optimisation de la liste des masses-sur-charges de référence basée sur la qualité de l'ajustement obtenu suite à au moins une des étapes d'ajustement peut être réalisée. 25 L'identification et la sélection de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous- groupes peut être obtenues à partir de masses-sur-charges connues à priori ou déduites selon des critères statistiques de fréquence de la présence des pics dans chacun des sous-groupes du groupe. Pour cela, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à - Discrétiser l'espace des masses-sur-charges de chacun des spectres de chaque 30 sous-groupe 3035410 7 - Détecter la présence ou l'absence de pics autour des masses-sur-charges définies par l'étape de discrétisation selon un facteur de tolérance - Filtrer lesdites masses-sur-charges en fonction de la fréquence de présence de pics pour chacun des sous-groupes 5 - Approximer la position des masses-sur-charges retenues L'étape de discrétisation peut avantageusement être réalisée sur un intervalle de masses-surcharges restreint par rapport à l'intervalle de masses-sur-charges obtenu suite à l'acquisition du spectre. L'étape d'approximation peut avantageusement consister à rechercher une position représentative de la répartition des positions des pics présents autour de chacune des masses-sur- 10 charges retenues. L'identification des masses-sur-charges de référence du procédé peut ainsi reposer sur une analyse statistique de la fréquence de présence des pics des spectres acquis pour la construction d'une base de connaissance des sous-groupes, à la fois pour la mise au point du modèle de classification et son utilisation en routine. 15 Avantageusement, le procédé comprend lors de l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé : - La construction d'un second modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge des spectres acquis à partir de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes 20 - Une seconde étape d'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble des listes de pics des spectres d'apprentissage à partir du second modèle d'ajustement Avantageusement, le procédé comprend une étape de contrôle de l'ajustement suite à au moins une des étapes d'ajustement des masses-sur-charges lors de l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé. 25 Les paramètres du ou des modèle(s) d'ajustement peuvent avantageusement être obtenus par une méthode d'estimation dite robuste. Avantageusement, les masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes connues sont sélectionnées par une étape consistant à 3035410 8 - Détecter la présence ou l'absence de pics autour des masses-sur-charges de référence selon un facteur de tolérance - filtrer lesdites masses-sur-charges en fonction de la fréquence de présence de pics pour chacun des sous-groupes et/ou approximer la position des masses-sur-charges de référence 5 retenues Avantageusement, l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé comprenant une étape de discrétisation des masses-surcharges des spectres acquis. Avantageusement, l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de 10 classification par sous-groupe associé comprenant une étape de traitement des intensités des spectres acquis. Avantageusement, l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé comprenant une étape de contrôle de la qualité des spectres acquis 15 Selon un mode de réalisation, la spectrométrie de masse est une spectrométrie MALDI-TOF. L'invention a également pour objet un dispositif d'identification d'un microorganisme par spectrométrie de masse, comprenant : - un spectromètre de masse apte à produire des spectres de masse de microorganismes à 20 identifier ; - une unité de calcul apte à identifier les microorganismes associés aux spectres de masse produits par le spectromètre en mettant en oeuvre un procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes. 3035410 9 BREVE DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, en relation avec les dessins annexés, dans lequel : - la figure 1 est un organigramme du procédé selon l'invention ; 5 - la figure 2 est un organigramme de l'étape 100 du procédé selon l'invention ; - la figure 3a est un organigramme de l'étape 200 du procédé selon l'invention ; - la figure 3b est un organigramme de l'étape 240 du procédé selon l'invention ; - la figure 3c est un organigramme de l'étape 300 du procédé selon l'invention ; - la figure 3d est un organigramme de l'étape 400 du procédé selon l'invention ; 10 - la figure 4 est un tracé pour chaque sous-groupe A à E, d'un groupe considéré, de la fréquence de chaque pic obtenus sur les spectres correspondant au dit sous-groupe dans l'intervalle 5330 Th-5410 Th - les figures 5a à Si sont un tracé d'un exemple de calcul itératif en trois itérations de trois masses-sur-charges approximées 15 - la figure 6 est un tracé pour deux masses-sur-charges Alpha et Béta de la fréquence de présence d'un pic pour chaque sous-groupe A à F, la médiane des résidus pour chaque sous-groupe, l'intervalle interquartile des résidus pour chaque sous-groupe - les figures 7a et 7b sont un tracé du résultat d'un premier ajustement et second ajustement selon l'invention 20 - les figures 8a et 8b sont un tracé du résultat d'un premier ajustement et second ajustement selon l'invention - les figures 9a et 9b sont un tracé du résultat d'un premier ajustement et second ajustement selon l'invention - les figures 10a et 10b sont un tracé du résultat sur la précision d'un ajustement selon 25 l'invention - les figures 1 la et 1 lb sont un tracé du résultat sur la précision d'un ajustement selon l'invention - la figure 12 est un tracé du résultat d'identification au niveau sous-groupe de microorganisme 30 3035410 10 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Il va à présent être décrit en relation avec l'organigramme de la figure 1, un procédé selon l'invention. 5 Le procédé comprend une première étape 100 de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par groupe à partir d'un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiés comme appartenant au dit groupe. De façon générale, cette étape peut être réalisée de multiples manières visant à obtenir pour un ou plusieurs groupe(s) donné(s), 10 une base de connaissance et un modèle de classification permettant de déterminer si un spectre de masse de microorganisme inconnu appartient audit groupe à partir de la liste de pics du spectre acquis. Un exemple de réalisation de cette première étape 100 est détaillé sur la figure 2. L'étape 100 15 peut ainsi débuter par une étape 110 d'acquisition d'un ensemble de spectres de masse d'apprentissage d'un ou de plusieurs microorganismes identifiés comme appartenant à un groupe, et d'un spectre de masse d'étalonnage externe, au moyen d'une spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (acronyme de «Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight»). La spectrométrie de masse MALDI-TOF est bien connue en soi et ne sera donc pas décrite plus en 20 détail par la suite. On pourra, par exemple, se référer au document de Jackson O. Lay, « Maldi-tof speetrometry of bacteria », Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 172-194. Les spectres acquis sont ensuite prétraités, afin notamment de les débruiter, les lisser ou encore d'ôter leur ligne de base si nécessaire, d'une manière connue en soi. L'acquisition d'un spectre de masse peut consister en la réalisation de plusieurs tirs du laser sur 25 l'échantillon considéré, et ce à une ou différentes positions de l'échantillon sur le support. Le spectre obtenu consiste alors en un spectre « synthétique » obtenu par la sommation, la moyenne, la médiane ou tout autre méthode visant à pondérer la contribution des intensités de chaque spectre de chacun des tirs pour la formation du spectre « synthétique ». Cette accumulation de tirs, bien connue en soit, permet notamment d'augmenter le rapport signal / bruit en limitant 3035410 11 l'influence de phénomènes non récurrents dus à l'échantillon, l'appareil, aux conditions de réalisation de l'acquisition, etc... Une étape de détection des pics présents dans les spectres acquis est alors réalisée en 120, par 5 exemple au moyen d'un algorithme de détection de pics basé sur la détection de maxima locaux. Une liste des pics pour chaque spectre acquis, comportant la localisation, également appelée la valeur de masse-sur-charge, et l'intensité des pics du spectre, est ainsi produite. De manière avantageuse, les pics sont détectés dans la gamme de Thomson (Th) [m. ; ] 10 prédéterminée, de préférence la gamme [m. ; =[3000;17000] Thomson. En effet, il a été observé que les informations suffisantes à l'identification des microorganismes sont regroupées dans cette gamme de rapport masse sur charge, et qu'il n'est donc pas besoin de tenir compte d'une gamme plus large. 15 Le procédé se poursuit, en 130, par une étape d'étalonnage externe à partir du spectre de masse d'étalonnage acquis. L'étalonnage (ou calibration externe) consiste à ajuster l'axe m/z des spectres de masse d'un échantillon de référence, dont le contenu est connu, de manière à ce que les pics observés coïncident avec leur position théorique. Une souche d'Escherichia Coh sert par exemple d'étalon externe pour détecter les déviations et corriger les décalages de masses-sur- 20 charges. Une liste de pics de référence correspondant à des masses-sur-charges caractéristiques a au préalable été définie pour ce calibrant. Lors de cette étape d'étalonnage, la présence des pics de référence correspondant à ces masses-sur-charges caractéristiques est recherchée dans la liste de pics du spectre, avec une tolérance donnée sur la position attendue. Le spectre est ensuite réaligné en fonction de la position observée. La transformation utilisée pour réaligner les pics de 25 calibrant acquis sur les pics de référence sera ensuite utilisée pour réaligner les pics du spectre de l'échantillon. Selon un exemple de mise en oeuvre de cette étape 130, pour chaque groupe d'acquisition (par exemple 4x4 emplacements sur un support d'acquisition pour un appareil VITEK® MS commercialisé par la demanderesse) une souche Escherichia Coli d'étalonnage (ATCC 8739) est 30 déposée sur l'emplacement réservé à l'étalonnage du dit groupe d'acquisition. Une fois le spectre 3035410 12 de la souche d'étalonnage acquis, la présence de 11 pics de référence correspondant à des masses-sur-charges caractéristiques de Escherichia Coh est recherchée, avec une tolérance de 0.07 % autour de la position attendue des pics. Si au moins 8 pics sur les 11 se trouvent dans l'intervalle de position attendu, les pics du spectre de la souche d'étalonnage vont être réalignés 5 en fonction de leur position de référence. La transformation utilisée pour réaligner les pics de calibrant acquis sur les pics de référence, par exemple une transformation polynomiale d'ordre un ou deux, sera ensuite utilisée pour réaligner les pics des spectres de tous les autres emplacements du groupe d'acquisition. Optionnellement et par précaution, l'opération d'acquisition peut être stoppée si un nombre 10 minimal de pics de référence détectés n'est pas atteint. Par exemple si moins de 8 masses-sur- charges caractéristiques sont détectées. Il est également possible d'étendre la tolérance autour des positions des pics de références attendues à 0.15 %. Dans ce cas, si au moins 5 masses-surcharges caractéristiques sont détectées avec la nouvelle tolérance élargie, il est préférable de réaligner une première fois les pics du spectre de calibrant et de rechercher dans un deuxième 15 temps un nombre de pics de référence plus important avec la tolérance initiale de 0.07 %. Si une quantité plus importante de pics est alors retrouvée, les pics du spectre sont réalignés une seconde fois selon la transformation trouvée. L'acquisition, le prétraitement et la détection des pics des autres échantillons composant le groupe d'acquisition peut également être réalisée après l'étape d'étalonnage en appliquant la 20 transformation trouvée sur les listes de pics correspondant aux spectres des échantillons. Alternativement, l'étape 130 peut consister ou être complémentée par une étape d'ajustement interne à partir d'un calibrant mélangé à l'échantillon lors de l'étape d'acquisition 110. A la suite de l'étape d'étalonnage 130, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de 25 contrôle de la qualité des spectres acquis 140 et/ou une étape de discrétisation des masses-sur- charges 150 et/ou une étape de traitement de l'intensité des spectres 155. L'ordre de réalisation de ces étapes 140, 150, 155 pouvant varier. Optionnellement, le procédé se poursuit donc, en 140, par une étape de contrôle de la qualité des spectres acquis. Par exemple, il peut être vérifié que le nombre de pics identifiés est suffisant : 30 un nombre trop bas de pics ne permettant pas l'exploitation du spectre acquis pour la classification du microorganisme considéré tandis qu'un nombre trop élevé peut être révélateur 3035410 13 de bruit. De façon complémentaire, un test basé sur l'intensité des pics détectés peut également être réalisé lors de cet étape de contrôle de la qualité des spectres. A la suite de l'étape 130, optionnellement de l'étape 140, une étape de discrétisation des massessur-charges, ou « binning », des masses-sur-charges 150 peut être réalisée. Pour ce faire la 5 gamme de Thomson [mi. ; ] est subdivisée en intervalles de largueur ou « bins », par exemple constants ou constants sur une échelle logarithmique. Pour chaque intervalle comprenant plusieurs pics, un seul pic peut être conservé, avantageusement le pic présentant la plus forte intensité. Cette méthode est donc utilisée pour aligner les spectres et réduire les effets des légères erreurs de position des masses-sur-charges, l'alignement obtenu étant directement lié à la taille 10 des intervalles de discrétisation. Une liste réduite est ainsi produite à partir de chacune des listes de pics des spectres mesurés. Chaque composante de la liste correspond à un intervalle de la discrétisation et a pour valeur l'intensité du pic conservé pour cet intervalle, la valeur « 0 » signifiant qu'aucun pic n'a été détecté dans cet intervalle. A la suite de l'étape 130, optionnellement de l'étape 140, optionnellement de l'étape 150, une 15 étape 155 de traitement de l'intensité des spectres peut également être réalisée. L'intensité est une grandeur très variable d'un spectre à l'autre et/ou d'un spectromètre à un autre. Du fait de cette variabilité, il est difficile de prendre en compte les valeurs brutes d'intensité dans les outils de classification. Cette étape peut donc être réalisée sur les spectres bruts, avant discrétisation des masses-sur-charges ou après l'étape 150. Celle-ci peut notamment consister en un étape de 20 seuillage des intensités, les intensités inférieures au seuil étant considérées comme nulles et les intensités supérieures au seuil étant conservées. En variante, les listes d'intensités obtenues par ce seuillage ou suite à une étape de discrétisation peuvent être « binarisées » en posant la valeur d'une composante de la liste à « 1» lorsqu'un pic est supérieur au seuil ou présent dans l'intervalle de discrétisation correspondant, et à « 0» lorsqu'un pic est inférieur au seuil ou 25 lorsqu'aucun pic n'est présent dans cet intervalle de discrétisation. Alternativement, les listes d'intensités obtenues sont transformées selon une échelle logarithmique, en posant la valeur de la composante à « 0» lorsqu'aucun pic n'est présent dans l'intervalle ou lorsqu'un pic est inférieur au seuil. Enfin, une normalisation de chacune des listes d'intensités (ie, brutes, seuillées, « binarisées » ou transformées selon une échelle logarithmique) peut être réalisées. 30 Avantageusement, les listes d'intensités sont transformées selon une échelle logarithmique puis 3035410 14 normalisées. Ceci a pour effet de rendre plus robuste l'apprentissage des algorithmes de classification réalisé ultérieurement. A partir de ces listes de pics correspondant chacune à un spectre d'apprentissage de microorganisme identifié comme appartenant à un groupe, le procédé se poursuit par la création 5 dans l'étape 160 d'une base de connaissance par groupe et dans l'étape 170 d'un modèle de classification par groupe. La base de connaissance comprenant le paramétrage du modèle de classification et les informations sur les groupes de chaque microorganisme utilisé pour l'apprentissage et permettant de classifier un microorganisme inconnu parmi les groupes des microorganismes d'apprentissage. 10 Un modèle de classification par groupe est établi dans l'étape 170 à partir d'algorithmes de classification supervisés connus tel que la méthode des plus proches voisins, la régression logistique, l'analyse discriminante, les arbres de classification, les méthodes de régression de type « LASSO » ou « elastic net », des algorithmes de type SVM (acronyme de l'expression anglo-saxonne « support vector machine »). 15 Selon la figure 1, le procédé se poursuit dans l'étape 200 par la construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe à partir d'un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiées comme appartenant au groupe précédent et à des sous-groupes de ce groupe. 20 L'étape 200 est détaillée sur la figure 3a. Cette étape 200 comprend l'acquisition 210 d'au moins un spectre d'un microorganisme dont le groupe et le sous-groupe sont connus et ce pour chacun desdits sous-groupes. Cette étape d'acquisition est réalisée de façon similaire à l'étape 110. Le spectre acquis est ainsi prétraité, afin notamment de le débruiter, le lisser ou encore d'ôter sa ligne de base si nécessaire. Le procédé se poursuit selon l'étape 220 par l'identification des pics 25 des spectres de façon similaire à l'étape 120, l'étalonnage externe ou interne de chacun des spectres de façon similaire à l'étape 130, optionnellement le contrôle de leur qualité de façon similaire à l'étape 140. De façon préférentielle, l'étape 210 peut être directement réalisée simultanément à l'étape 110 du procédé afin de limiter le nombre d'étapes manuelles nécessaires aux étapes d'acquisition. Les 3035410 15 étapes 110 et 210 consistent alors en une étape unique d'acquisition d'un spectre d'un microorganisme dont le groupe et le sous-groupe sont connus. De la même manière, l'étape 220 est alors réalisée simultanément aux étapes 120 et 130 et éventuellement l'étape 140. 5 A la suite de l'étape 220 les spectres des microorganismes dont le groupe et les sous-groupes sont connus sont alors représentés sous la forme d'un ensemble de listes de pics, chaque liste de pics correspondant à un microorganisme dont le groupe et le sous-groupe sont connus. A partir de ces listes de pics, le procédé se poursuit par une étape 230 de construction d'un modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge des spectres 10 acquis. Cette étape 230 de construction comporte premièrement une étape d'identification et de sélection de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes. En effet, une masse-sur-charge qui ne serait pas communes aux différents sous-groupe du groupe serait une masse-sur-charge discriminante, un modèle d'ajustement qui se baserait sur cette masse-surcharge serait donc biaisé. Idéalement, ces masses-sur-charges sont communes aux différents 15 sous-groupes et ne présentent pas de pics à proximité immédiate dans le spectre afin d'obtenir une liste de masses-sur-charges caractérisant particulièrement le groupe. Selon une première alternative 240, ces masses-sur-charges de références communes aux différents sous-groupes sont déduites à partir de critères statistiques. 20 Comme illustré sur la figure 3b, ces masses-sur-charges de références peuvent notamment être obtenues par : - Une première étape 241 de discrétisation de l'étendue des masses-sur-charges d'intérêt. Cette étape peut être réalisée sur un intervalle de masses-sur-charges des listes de pics restreint par rapport à l'intervalle de masses-sur-charges obtenu suite à l'acquisition, connu pour contenir 25 l'essentiel des masses-sur-charges caractéristiques des microorganismes, par exemple sur l'étendue de masses-sur-charges 3000 à 17000Th. A partir de cet intervalle, celui-ci est discrétisé : o soit par intervalle de masse-sur-charge régulier (par ex 1 Th) o soit par intervalle de masse-sur-charge croissant. 30 On obtient ainsi un ensemble 3035410 16 fm(i)} ; i = 1, / correspondant à l'ensemble des masses-sur-charges obtenues après discrétisation, chaque valeur m(i) étant séparé de la valeur m(i + 1) par une intervalle de masse-sur-charge appelé pas de discrétisation. Il est défini un facteur de tolérance ti définissant un intervalle autour de chacune des masses-sur- 5 charges m(0. Pour la bonne réalisation du procédé il est à noter que la discrétisation choisie doit garantir a minima le recouvrement des intervalles définis par le facteur de tolérance ti d'une masse-sur-charge par rapport à la suivante, idéalement un recouvrement à la moitié de la largeur de l'intervalle. Ainsi, un pas de discrétisation fin est préférable à un pas de discrétisation trop large afin de ne pas écarter une masse-sur-charge qui serait caractéristique des sous-groupes et 10 donc utile pour l'ajustement. Ce pas de discrétisation fin permet donc de limiter la perte d'information. Une manière de garantir le recouvrement des intervalles d'une masse-sur-charge par rapport à la suivante est de définir la discrétisation itérativement par la formule m(i + 1) = m(i) + t1 * m(i) avec ti étant le facteur de tolérance, et l'initialisation de m(1) à la borne minimale de l'étendue 15 des masses-sur-charges d'intérêt. Le pas de discrétisation est ainsi égal à t1 * m(i). Par exemple, pour l'étendue des masses-sur-charges d'intérêt de 3000 à 17000 Th avec une tolérance t1=0.0008, le pas de discrétisation à 3000 Th est de 2.4 Th tandis que le pas de discrétisation à 17000 Th est de 13.6 Th. 20 Une autre manière, plus simple, de garantir le recouvrement des intervalles d'une masse-sur- charge par rapport à la suivante est de définir la discrétisation sur la borne minimale de l'étendue des masses-sur-charges d'intérêt par la formule, m(i + 1) = m(i) + t1 * m(1) Par exemple, pour l'étendue de masse-sur-charge d'intérêt 3000 à 17000Th avec une tolérance t1=0.0008, le pas de discrétisation applicable à l'ensemble de l'étendue de masse-sur-charge est 25 3000*0.0008=2.4 Th. S'en suit une seconde étape 242 de détection de la présence ou absence d'un ou de pics dans l'intervalle selon ti autour de chaque masse-sur-charge m(i) définie par l'étape de discrétisation. 3035410 17 Pour chaque spectre, la tolérance ti permet de tenir compte de l'incertitude sur la position de la masse-sur-charge recherché dans chacun des spectres acquis. Ainsi, soit X = fx(s)} ; s = 1, . , S 5 la liste des masses-sur-charges du spectre considéré et soit ti le facteur de tolérance appliqué sur les masses-sur-charges. L'opération consiste à rechercher la présence d'un pic parmi X = fx(s)} ; s = 1, S dans l'intervalle défini par la tolérance autours de la masse-sur-charge m(i) considérée, à savoir l'intervalle [m(i) - m(i) * t1 ; m(i) + m(i) * t1 Afin d'optimiser le temps de calcul, la présence d'un pic dans l'intervalle considéré peut être noté 10 1, l'absence d'un pic ou la présence de plusieurs pics est noté 0 afin d'obtenir une matrice de présence sous la forme du tableau 1 suivant, T étant le nombre de spectres d'apprentissage acquis: Sous -groupe m(1) m(2) ... m(I-1) m(I) Spectre(1) A 0 0 1 1 Spectre(2) A 0 0 1 1 ... Spectre(T-1) B 0 1 1 1 Spectre(T) B 1 1 1 1 Tableau 1 15 A partir de cette matrice, une troisième étape 243 consiste à filtrer les masses-sur-charges en fonction de la fréquence de présence de pics par sous-groupes. La fréquence de présence d'un pic dans l'intervalle défini par la tolérance autours de chaque masse-sur-charge m(i) définie durant l'étape de discrétisation est calculée par sous-groupe et ramenée à un pourcentage. 20 Cette étape est illustré sur la figure 4. La figure 4 représente pour chaque sous-groupe A à E, du groupe considéré, la fréquence de chaque pic obtenus sur les spectres correspondant au dit sous-groupe dans l'intervalle 5330 Th-5410 Th. Par la suite, les masses-sur-charges m(i) présentant un pourcentage de présence supérieur à un seuil, par exemple de 60%, représenté par un trait horizontal en pointillé sur la figure 4, pour 25 chacun des sous-groupes à discriminer, sont retenues. 3035410 18 On obtient ainsi un ensemble : fm(j)}; j = 1, , J; J / de masses-sur-charges parmi fm(i)}; i = 1, / retenues après l'étape de filtrage sur la fréquence. Par exemple, selon le tableau 2 ci-dessous, seules les masses-sur-charges m(1-1) et m(1) sont retenues après filtrage. Fréquence (%) par sous- m(1) m(2) ... m(I-1) m(I) groupe A 0 0 100 100 B 50 100 100 100 Tableau 2 10 A partir de cette liste de masses-sur-charges filtrées selon un seuil de fréquence, l'étape suivante 244 consiste à approximer la position desdites masses-sur-charges retenues. Les masses-sur-charges retenues ont une précision grossière dépendante de la discrétisation menée à l'étape 241. Une étape d'approximation de la position de ces masses-sur-charges est ainsi réalisée afin d'obtenir une position représentative de la répartition des positions des pics 15 présents autour de la masse-sur-charge m(j). Ce calcul de la position représentative peut par exemple comprendre une étape d'estimation d'une fonction gaussienne représentative de la répartition des pics ainsi que la recherche de la position de l'extremum de cette fonction. Une autre méthode peut consister en la réalisation de plusieurs étapes de calcul itératif de la valeur médiane des positions des pics présents autour de la masse-sur-charge m(j). Pour cette méthode 20 utilisant la médiane, soit MU) la valeur théorique de la position de la masse-sur-charge Soit M(j, 0) = m(j), M(j, n + 1) est obtenue par l'algorithme suivant : Pour chaque spectre, une étape du procédé consiste à rechercher un pic parmi X = fx(s)} ; s = 1, S présente dans l'intervalle autour de la masse-sur-charge M(j, n), à 25 savoir l'intervalle [MU, n) - MU, n) * t2 ; MU, n) + MU, n) * t2] Avec t2 un facteur de tolérance autour de la position de la masse-sur-charge MU, n), la valeur du facteur de tolérance ti étant supérieure ou égale à t2. On obtient ensuite la valeur de M(j, n + 1) 5 3035410 19 en calculant la médiane des valeurs des pics retenus sur l'ensemble des spectres dans l'intervalle autour de M(j, n). Le critère d'arrêt de cette étape d'optimisation peut être par exemple un nombre prédéfini d'itérations et/ou être basé sur un contrôle de l'incrément. 5 Par exemple, dans le cas où un nombre prédéfini d'itération est défini : Soit N le nombre prédéfini d'itération, M(j) est approximée par 1VT(j) = MU, N) . Dans le cas où le procédé comprend une étape de contrôle de l'incrément, soit E une tolérance fixée pour le calcul approché de M(j) . Les itérations s'achèvent dès que : n + 1) - M(j, n) I REVENDICATIONS1. Procédé d'identification par spectrométrie de masse d'un sous-groupe de microorganisme inconnu parmi un ensemble de sous-groupes de référence, comportant : - Une première étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par groupe associé à partir d'un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiées comme appartenant au dit groupe - Une seconde étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé à partir de l'acquisition d'au moins un ensemble de spectres d'apprentissage de microorganismes identifiées comme appartenant aux dits sous-groupes du groupe comprenant : 0 La construction d'un modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge des spectres acquis à partir de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes o L'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble des listes de pics des spectres d'apprentissage. o La construction d'un modèle de classification par sous-groupe et de la base de connaissance associé à partir des spectres d'apprentissage ajustés - Une troisième étape de classification à un sous-groupe d'un microorganisme inconnu comportant : o L'acquisition d'au moins un spectre du microorganisme inconnu o La classification dans un groupe dudit spectre selon ledit modèle de classification par groupe et ladite base de connaissance par groupe o L'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble de la liste de pics dudit spectre selon le modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge du spectre du microorganisme inconnu o La classification dans un sous-groupe dudit groupe par ledit modèle de classification par sous-groupe et la base de connaissance par sous-groupe 3035410 42 2. Procédé d'identification selon la revendication 1, comprenant lors de l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé : 5 - La construction d'un second modèle d'ajustement permettant la correction des décalages de masse-sur-charge des spectres acquis à partir de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes - Une seconde étape d'ajustement des masses-sur-charges de l'ensemble des listes de pics des spectres d'apprentissage à partir du second modèle d'ajustement 10 3. Procédé d'identification selon la revendication 1 ou 2, comprenant une étape d'optimisation de la liste des masses-sur-charges de référence basée sur la qualité de l'ajustement obtenu suite à au moins une des étapes d'ajustement 15 4. Procédé d'identification selon les revendications 1 à 3, la construction d'un modèle d'ajustement utilisant une liste connue de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes 5. Procédé d'identification selon la revendication 4, les masses-sur-charges de référence 20 communes aux différents sous-groupes connues étant sélectionnées par une étape consistant à - Détecter la présence ou l'absence de pics autour des masses-sur-charges de référence selon un facteur de tolérance - Filtrer lesdites masses-sur-charges en fonction de la fréquence de présence de pics 25 pour chacun des sous-groupes et/ou approximer la position des masses-sur- charges de référence retenues 6. Procédé d'identification selon les revendications 1 à 5, la construction d'un modèle d'ajustement utilisant une liste de masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes déduites selon des critères statistiques de fréquence de la présence des pics dans chacun des sous-groupes du groupe 3035410 43 7. Procédé d'identification selon la revendication 6, les masses-sur-charges de référence communes aux différents sous-groupes étant déduites par une étape consistant à - Discrétiser l'espace des masses-sur-charges de chacun des spectres de chaque 5 sous-groupe - Détecter la présence ou l'absence de pics autour des masses-sur-charges définies par l'étape de discrétisation selon un facteur de tolérance - Filtrer lesdites masses-sur-charges en fonction de la fréquence de présence de pics pour chacun des sous-groupes 10 - Approximer la position des masses-sur-charges retenues 8. Procédé d'identification selon la revendication 7, l'étape de discrétisation étant réalisée sur un intervalle de masses-sur-charges restreint par rapport à l'intervalle de masses-surcharges obtenu suite à l'acquisition du spectre 15 9. Procédé d'identification selon l'une des revendications 5 à 8, l'étape d'approximation consistant à rechercher une position représentative de la répartition des positions des pics présents autour de chacune des masses-sur-charges retenues 20 10. Procédé d'identification selon l'une des revendications précédentes, l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé comprenant une étape de discrétisation des masses-sur-charges des spectres acquis 11. Procédé d'identification selon l'une des revendications précédentes, l'étape de 25 construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé comprenant une étape de traitement des intensités des spectres acquis 12. Procédé d'identification selon l'une des revendications précédentes, l'étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe 30 associé comprenant une étape de contrôle de la qualité des spectres acquis 3035410 44 13. Procédé d'identification selon l'une des revendications précédentes, les paramètres du modèle ou des modèles d'ajustement étant obtenus par une méthode d'estimation dite robuste 5 14. Procédé d'identification selon l'une des revendications précédentes, les spectres acquis pour la première étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par groupe associé étant directement utilisés pour la seconde étape de construction d'une base de connaissance et d'un modèle de classification par sous-groupe associé, les groupes et sous-groupes des microorganisme d'apprentissage étant connus 10 15. Dispositif d'identification d'un microorganisme par spectrométrie de masse, comprenant : - un spectromètre de masse apte à produire des spectres de masse de microorganismes à identifier ; - une unité de calcul apte à identifier les microorganismes associés aux spectres de 15 masse produits par le spectromètre en mettant en oeuvre un procédé conforme à l'une quelconque des revendications précédentes.