FR 3030039 A1 20160617 FR 1462315 A 20141212 1 La présente demande concerne le domaine de l'analyse par cytométrie de flux, et plus particulièrement un procédé d'analyse automatisé pour évaluer la quantité et le type de cellules répondant à un ou des marqueur(s) spécifique(s). Avantageusement, cette méthode est conçue pour des essais de marquage de cytokine intracellulaire ou « Intracellular Cytokine Staining » (ICS). Ce type d'essais est d'habitude réalisé sur des échantillons de sang incubés avec des antigènes (ay) dérivés de virus, de bactéries ou de cellules cancéreuses. Après cette incubation, les cellules (Ce) capables de reconnaître les antigènes (ay), commencent à produire des molécules (Mo) différentes (usuellement des cytokines) qui sont détectées au moyen d'anticorps (aC). Chaque anticorps (aC) est spécifique à une molécule (Mo) donnée et est couplé à une sonde fluorescente (Sf) donnée. Ce mécanisme est schématisé sur la figure 1. Ainsi, l'analyse de la fluorescence associée à une cellule permet d'identifier quelles molécules ont été produites par cette cellule. Un courant fluide et un rayon laser sont les composants principaux d'un cytomètre de flux, instrument capable de lire la fluorescence associée à chaque cellule. Les cytomètres de flux peuvent aujourd'hui détecter jusqu'à dix-huit sondes fluorescentes par cellule. Un anticorps couplé à une sonde fluorescente forme ainsi un 25 marqueur, noté (Mj), pour une molécule correspondant à un antigène donné. En ICS une cellule (Ce) est déclarée positive si elle a produit en quantité « détectable », c'est-à-dire en quantité supérieure à un seuil prédéterminé, au moins une molécule (Mo) d'intérêt. Les méthodes utilisées couramment pour identifier les cellules « positives », donc réagissant à au 30 moins l'un des marqueurs, reposent sur le jugement visuel de l'expert. L'ensemble des données d'un échantillon à analyser peut en effet se représenter sous la forme d'un nuage de points, dans un espace 3030039 2 multidimensionnel, de dimension donnée par le nombre de marqueurs. Chaque point correspond à une cellule et est composé des expressions de tous les marqueurs pour cette cellule. Comme l'illustre la figure 2, l'utilisateur, c'est-à-dire généralement l'expert, visualise des coupes bidimensionnelles d'un des 5 marqueurs (Mj) par rapport à un autre (MF) dans cet espace multidimensionnel et se réfère à un échantillon dit « de référence » (c'est-à-dire un échantillon de négatifs connus), avant incubation, dans lequel toutes les cellules sont négatives. L'expert dessine alors manuellement des intervalles de sélection autour de ce qu'il juge être des cellules positives, c'est-à-dire qui se 10 démarquent visuellement du nuage de points le long de l'un ou l'autre des 2 axes, et donc de l'un ou l'autre des 2 marqueurs représentés. Ceci est par exemple représenté par le contour en pointillés sur la figure 2. Un inconvénient de cette procédure est qu'elle est subjective et rend les résultats de différents utilisateurs ou laboratoires difficiles à comparer. En 15 outre, une telle procédure est difficilement reproductible. Pour résoudre au moins en partie les inconvénients précités, la présente demande a pour objet de proposer un procédé d'analyse automatisé qui permette notamment de rendre robustes et reproductibles les analyses des réponses en fluorescence obtenues par cytométrie de flux. 20 A cet effet, est proposé, selon un premier aspect, un procédé d'analyse de cellules d'un échantillon réagissant à au moins un marqueur spécifique comportant : une étape de fourniture d'un échantillon de référence et d'un échantillon à analyser ; - une étape de fourniture d'un ensemble (E+) de cellules déclarées positives par un expert parmi les cellules de l'échantillon à analyser ; une étape de détermination d'un coefficient vectoriel (0) à partir de l'échantillon à analyser et de l'ensemble (E+) ; - une étape de détermination d'au moins un ensemble de cellules positives dans l'échantillon de référence en fonction du coefficient vectoriel (0) ; et 3030039 3 une étape de calcul d'un taux de faux positifs dans l'échantillon de référence (a) à partir du nombre de cellules positives de l'échantillon de référence. Est également proposé, selon un deuxième aspect, un procédé 5 d'analyse de cellules d'un échantillon réagissant à au moins un marqueur spécifique comportant : - Une étape de fourniture d'un échantillon de référence et d'un échantillon à analyser ; Une étape de fourniture d'un taux de faux positifs (a) dans 10 l'échantillon de référence ; - une étape de détermination d'un coefficient vectoriel (0) à partir de l'échantillon de référence et du taux de faux positifs (a) ; et une étape de détermination d'au moins un ensemble (S+) de cellules positives dans l'échantillon à analyser en fonction du 15 coefficient vectoriel (0). Un tel procédé permet ainsi : - D'une part, de traduire par un « taux d'erreur » le classement visuel auquel aboutit un expert en analysant un échantillon (comprenant potentiellement des cellules positives) par rapport à un échantillon de référence 20 (ne comprenant que des cellules négatives) ; ce taux d'erreur est le taux de fausses cellules positives détectées, fausses si l'on en croit l'échantillon de référence. On peut ainsi caractériser « ken » de chaque expert par un « taux d'erreur » qui lui est propre et comparer les jugements de différents experts sur le même échantillon, c'est-à-dire le taux de « fausses cellules positives » qu'ils 25 s'autorisent à accepter dans le processus de classification. - D'autre part, d'utiliser systématiquement un même jugement, c'est-à-dire un même taux d'erreur, pour classer des échantillons de provenances différentes. Adapté à l'ICS, ce procédé permet d'analyser automatiquement la réponse immunitaire de cellules mises en contact avec des virus, des bactéries 30 et/ou des cellules cancéreuses. 3030039 4 En d'autres termes, pour comparer différentes analyses, à partir de classement réalisés par des utilisateurs différents, il est possible de déterminer une grandeur représentative du classement, le taux (a). La corrélation entre le taux (a) et le classement des cellules positives 5 de l'échantillon à analyser est en outre quasi bijective, c'est-à-dire qu'en imposant le taux (a) déterminé à partir d'un tri réalisé par un utilisateur, et grâce au processus d'optimisation de la présente invention, il est possible de retrouver un ensemble de cellules positives (S+) correspondant très fortement au tri initial de l'utilisateur. En d'autres termes, le procédé selon l'invention 10 permet de retrouver une solution unique. Il est important de noter que les deux approches sont parallèles. Dans le premier cas, le procédé dispose en entrée d'un échantillon de référence, c'est-à-dire de cellules négatives connues, d'un échantillon à analyser, ainsi que d'un sous-ensemble de cellules de l'échantillon à analyser 15 jugées positives par un utilisateur (c'est-à-dire un ensemble appelé E+), appelé également expert. Le procédé comporte alors une étape de détermination d'un seuil (ou de manière générale d'une valeur d'intérêt), pour chacun des marqueurs, au-delà duquel une cellule est considérée positive pour le marqueur considéré. Ces seuils sont déterminés pour reproduire au mieux le jugement 20 d'expert sur l'échantillon à analyser. En sortie, le procédé retourne un taux de faux positifs dans l'échantillon de référence et un classement de l'échantillon à analyser, analysé, c'est-à-dire un ensemble de cellules positives (S+) et un ensemble de cellules négatives (S-). Une cellule est déterminée positive si son expression pour au moins un marqueur est supérieure au seuil retenu pour ce 25 marqueur. Dans le second cas, le procédé dispose, en entrée, de l'échantillon de référence, de l'échantillon à analyser ainsi que d'un taux de faux positifs a tolérable. Le procédé comporte alors une étape de détermination, pour chacun des marqueurs, du seuil au-delà duquel une cellule est considérée positive vis- 30 à-vis de ce marqueur. Ces seuils sont déterminés pour maximiser le nombre de positifs détectés dans l'échantillon à analyser, sous la contrainte de reproduire le taux de faux positifs imposé dans l'échantillon de référence. En sortie, le 3030039 5 procédé retourne un classement de l'échantillon analysé c'est-à-dire un ensemble de cellules positives (S+) et un ensemble de cellules négatives (S-). Dans les deux cas, il s'agit de déterminer, à partir de l'un des échantillons de cellules (soit l'échantillon à analyser soit l'échantillon de 5 référence) et avec l'un des paramètres additionnels (soit ensemble (E+) de cellules déclarées positives par un expert parmi les cellules de l'échantillon à analyser soit le taux de faux positifs (a) dans l'échantillon de référence), un coefficient vectoriel (0), puis d'appliquer le coefficient vectoriel à l'autre des échantillons de cellules (soit l'échantillon de référence s'il s'agissait de 10 considérer l'échantillon à analyser soit l'échantillon à analyser s'il s'agissait de considérer l'échantillon de référence). Dans le premier cas, il est ainsi possible de déterminer le taux (a) alors que dans le deuxième cas le procédé renvoi au moins l'ensemble (S+) de cellules considérées comme positives parmi les cellules de l'échantillon à analyser. 15 Dans les deux cas, le procédé procède ainsi à un classement en un ensemble de cellules positives et un ensemble de cellules négatives des cellules de l'autre l'échantillon en fonction du coefficient vectoriel (0). Comme ceci sera détaillé par la suite en référence aux figures, dans un mode de réalisation particulièrement intéressant, soit le procédé permet 20 donc de déterminer a à partir de l'ensemble S+, qui dans le premier cas est superposé au mieux sur l'ensemble E+, soit le procédé permet de déterminer l'ensemble S+ à partir du taux la lorsqu'il est imposé en donnée d'entrée. Bien entendu, disposer de l'échantillon à analyser et de l'échantillon de référence signifie que l'utilisateur (pour réaliser lui-même son classement ou 25 pour mettre en oeuvre le procédé) dispose ici des expressions de chacune des cellules de chacun des échantillons à chacun des marqueurs. Des mesures préalables d'une valeur d'intérêt (ici les expressions de chacun des marqueurs) sont donc réalisées. Un tel procédé vise ainsi à mieux assurer la reproductibilité du 30 processus de détection et est robuste, c'est-à-dire adaptable à la variabilité inhérente aux essais biologiques. Il permet en outre de comparer les résultats de scientifiques différents sur des échantillons différents si ceux-ci adoptent une 3030039 6 valeur commune de « taux d'erreur », ou bien de relativiser les conclusions d'un scientifique sur un échantillon particulier si son taux de faux positifs sort des valeurs admises par la communauté d'experts. Dans les deux cas, le procédé comporte ainsi par exemple une étape 5 d'identification d'un modèle mathématique et une étape de détermination d'un coefficient vectoriel, appelé ici 0, à partir d'un échantillon de référence ou d'un échantillon à analyser selon la version mise en oeuvre. Selon un exemple intéressant, le coefficient vectoriel (0) est le vecteur des valeurs seuils pour l'expression de chacun des marqueurs, c'est à 10 dire un ensemble de valeurs seuils d'expression de chacun des marqueurs, au-delà de chacune desquelles une cellule est déclarée positive. Cette détermination du coefficient vectoriel 6 peut s'effectuer par une méthode d'optimisation : - pour reproduire une classification faite par un utilisateur (premier cas), 15 - ou pour maximiser le nombre de cellules positives détectées dans un échantillon à analyser, sous la contrainte de respecter un taux de faux positifs donné dans un échantillon de référence (second cas). En d'autres termes, l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte par exemple une minimisation d'une quantité de faux 20 positifs et une minimisation d'une quantité de faux négatifs dans la population à analyser. Ou par exemple, l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte une maximisation d'une quantité de cellules positives dans la population à analyser respectant le taux de faux positifs (a) donné. 25 Selon un exemple intéressant de mise en oeuvre, l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte : - une étape de définition, pour chacun des marqueurs j, d'un siquantile yf, quantile d'une fonction de distribution cumulée pitest associée à une fonction de distribution de probabilité lissée est 30 déterminée par lissage d'une distribution marginale du Pme marqueur dans l'échantillon à analyser ; - une étape de définition de l'ensemble (S+) de cellules déclarées 3030039 7 positives par rapport au srquantile yf pour chaque marqueur j dans l'échantillon à analyser ; - une étape de définition et détermination d'un cardinal de la différence symétrique entre S+ et E'; 5 une étape de détermination de chacune des valeurs du coefficient vectoriel (0) de chacun des marqueurs la plus grande par minimisation du cardinal par rapport à la valeur si de chaque marqueur j dans l'intervalle [0,1], pour tous les marqueurs. Selon un autre exemple intéressant de mise en oeuvre, l'étape de 10 détermination d'un coefficient vectoriel (0) comporte : - une étape de définition, pour chacun des marqueurs j, d'un siquantile 31, quantile d'une fonction de distribution cumulée Piref associée à une fonction de distribution de probabilité lissée plie! déterminée par lissage d'une distribution marginale du jièrne 15 marqueur dans l'échantillon de référence ; une étape de définition d'une fonction F(s) représentant un taux de cellules négatives dans l'échantillon de référence, croissante de [0,1] à [0,1], par F(s) =carcl(iNs), où VNS est définie par VNS = { i=1,...,n tel que yirief 1-a; et 25 - une étape de détermination des valeurs du coefficient vectoriel (0). Selon un mode intéressant de mise en oeuvre, le procédé comporte une étape d'analyse dans laquelle au moins un marqueur auquel au moins une cellule réagit positivement est identifié. 30 Accessoirement, le procédé peut comporter une étape de vérification par évaluation d'une matrice de confusion. Ceci permet de vérifier une qualité 3030039 8 d'apprentissage. Par exemple, pour l'échantillon de référence, pour une certaine valeur du coefficient 0, considérant par exemple qu'il comporte l'ensemble des valeurs seuils d'expression de chacun des marqueurs au-delà desquelles une cellule est déclarée positive, la matrice de confusion se 5 présente de la manière suivante : Echantillon de référence prédit Echantillon de référence réel Cellules négatives Cellules positives Cellules négatives VN' f Vrai négatifs FPref Faux positifs Cellules positives 0 0 La matrice de confusion permet de confronter des valeurs observées avec celles qui sont prédites par le modèle mathématique. En effet, un modèle parfait appliqué à l'échantillon de référence ne devrait retourner que de vrais 10 négatifs. Une telle matrice traduit le fait que, bien qu'un échantillon de référence ne soit censé comporter, par définition, que des cellules négatives, le modèle mathématique indiquera que cet échantillon comporte des cellules négatives et des cellules positives. Les cellules identifiées comme négatives par le modèle seront donc considérées comme vraies négatives, alors que les cellules 15 identifiées comme positives par le modèle seront considérées comme étant de fausses positives, puisque par définition l'échantillon de référence n'en comporte aucune. Ceci permet ainsi de définir un taux de faux positifs dans l'échantillon de référence : a = FPref + VNref où FPref représente le nombre de faux positifs et VN'f le nombre de vrais 20 négatifs, tous deux dans l'échantillon de référence. Dans un modèle parfait, ce taux a vaudrait donc zéro. Mais les règles d'apprentissage utilisées dans les deux modes de réalisation conduisent FP' f 3030039 9 à dégrader ce résultat, c'est-à-dire à autoriser une valeur de a différente de zéro, par exemple comprise dans l'intervalle ]0 ; 0,5]. Dans le premier cas, on connait le jugement d'un utilisateur pour l'échantillon à analyser, c'est-à-dire l'ensemble des cellules positives (E+) et 5 l'ensemble des cellules négatives déterminés par un utilisateur sur l'échantillon à analyser. Le procédé détermine alors le coefficient vectoriel 0 permettant de retrouver au mieux le classement de cet utilisateur. La matrice de confusion pour l'échantillon à analyser se présente de la manière suivante : Echantillon à analyser prédit Eclantilion à analyser réel Cellules négatives Cellules positives Cellules négatives Cellules positives VN Vrai négatifs FN Faux négatifs FP Faux positifs VP Vrai positifs 10 L'étape de détermination du vecteur 0 peut alors consister à minimiser la somme des valeurs de FP (faux positifs) et de FN (faux négatifs) de l'échantillon à analyser, ou bien les taux de faux positifs FP/(FP+VN) et de faux négatifs FN/(FN+VP), ce qui revient au même puisque FP+VN=FN+VP. . Il apparaît que ce problème d'optimisation trouve un unique 15 optimum vectoriel 0 (sous réserve que l'échantillon à analyser soit suffisamment grand, critère dont l'appréciation dépend à la fois du nombre de cellules dans l'échantillon ainsi que du contenu d'information de l'échantillon considéré) et que cet optimum peut être caractérisé par le taux de faux positifs a dans l'échantillon de référence, c'est-à-dire en appliquant le procédé avec l'optimum 20 vectoriel 0 déterminé précédemment à un échantillon de référence. Dans le second cas, on impose un taux de faux positifs tolérable a. On ne peut alors pas représenter de matrice de confusion pour l'échantillon à analyser puisqu'on ne connaît pas a priori le classement de l'utilisateur. On cherche alors à déterminer le coefficient vectoriel 0 qui maximise le nombre de 3030039 10 positifs détectés dans l'échantillon à analyser, tout en respectant le taux de faux positifs a, imposé, dans l'échantillon de référence fourni. Ce procédé permet de retrouver la classification qu'aurait pu faire visuellement un utilisateur qui produit le même taux de faux positifs a. 5 L'invention, selon un exemple de mise en oeuvre, sera bien comprise et ses avantages apparaitront mieux à la lecture de la description détaillée qui suit, donnée à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 montre schématiquement un mécanisme de production 10 de molécules (Mo) par une cellule (Ce) excitée par un antigène (ay), chaque molécule étant détectable au moyen d'un anticorps (aC) couplé à une sonde fluorescente (Sf), La figure 2 illustre une représentation en deux dimensions, représentant un premier marqueur (Mj) et un deuxième marqueur (Mj'), d'une 15 répartition des cellules d'un échantillon de référence et d'un échantillon à analyser, La figure 3 représente un exemple de densité de probabilité lissée obtenue pour un marqueur (j) en fonction des mesures réalisées dans un échantillon de référence et un échantillon à analyser, et 20 La figure 4 représente un exemple de fonctions de répartition cumulée obtenues pour un marqueur (j) en fonction des mesures réalisées dans un échantillon de référence et un échantillon à analyser. La présente description se réfère à titre d'exemple aux essais de marquage de cytokine intracellulaire ou « Intracellular Cytokine Staining » 25 (ICS). Bien entendu, le procédé d'analyse décrit dans le cadre de la présente demande est applicable à tout type d'analyse de cellules, voire à tout problème de classification multidimensionnelle. Un essai ICS est d'habitude réalisé sur des échantillons de sang incubés avec des antigènes (ay) dérivés de virus, de bactéries ou de cellules 30 cancéreuses. Comme l'illustre la figure 1, après cette incubation, les cellules (Ce) capables de reconnaître les antigènes (ay) commencent à produire des molécules (Mo) différentes (usuellement des cytokines) qui sont détectées au 3030039 11 moyen d'anticorps (aC). Chaque anticorps (aC) est spécifique à une molécule (Mo) donnée et est couplé à une sonde fluorescente (Sf) donnée. Ainsi, l'analyse de la fluorescence associée à une cellule permet d'identifier quelles molécules ont été produites par cette cellule. 5 En ICS une cellule (Ce) est déclarée positive si elle a produit en quantité « détectable », c'est-à-dire en quantité supérieure à un seuil prédéterminé, au moins une molécule (Mo) d'intérêt. Les méthodes utilisées couramment pour identifier les cellules « positives », donc réagissant à au moins l'un des marqueurs, reposent sur le jugement visuel d'un expert, ou 10 utilisateur. L'ensemble des données d'un échantillon à analyser peut en effet se représenter sous la forme d'un nuage de points, dans un espace multidimensionnel, de dimension donnée par le nombre de marqueurs. Chaque point correspond à une cellule et est composé des expressions de tous les 15 marqueurs pour cette cellule. Comme l'illustre la figure 2, l'utilisateur, c'est-à-dire généralement l'expert, visualise des coupes bidimensionnelles d'un des marqueurs (Mj) par rapport à un autre (Mj') dans cet espace multidimensionnel et se réfère à un échantillon dit « de référence » (c'est-à-dire un échantillon de négatifs connus), 20 avant incubation, dans lequel toutes les cellules sont négatives. L'expert dessine alors manuellement un ou des intervalles de sélection autour de ce qu'il juge être des cellules positives, c'est-à-dire qui se démarquent visuellement du nuage de points le long de l'un ou l'autre des deux axes, et donc de l'un ou l'autre des deux marqueurs représentés. Ceci est par 25 exemple représenté par le contour en pointillés sur la figure 2. Un inconvénient de cette procédure est qu'elle est subjective et rend les résultats de différents utilisateurs ou laboratoires difficiles à comparer. Elle est en outre très difficilement reproductible. Pour résoudre au moins en partie les inconvénients précités, le 30 procédé, selon un exemple de mise en oeuvre de la présente invention, analyse deux échantillons, le premier étant l'échantillon de référence des cellules négatives connues et le second étant l'échantillon à analyser des cellules 3030039 12 inconnues. Il identifie les cellules positives dans l'échantillon à analyser. Autrement dit, les données d'entrée du procédé sont constituées de deux échantillons : - L'échantillon de référence, qui est par exemple représenté par une 5 matrice qui contient les mesures (de fluorescence) d'un échantillon de n cellules négatives (dans lequel aucun marqueur n'est exprimé, car les cellules n'ont pas été sollicitées), « n » étant ainsi la taille des informations exploitées ou le nombre de points. Pour chaque cellule, un nombre d de marqueurs (identifiés par exemple Mj, avec j = 1...d) sont mesurés, «d » étant donc la dimension des 10 cellules négatives. L'échantillon de référence est par exemple notée xref, matrice de taille n x d, où Xfef = [eV (avec i = 1,...,n et j=1,...,d), xrefu correspondant à la mesure (de fluorescence) du jème marqueur pour la fer' cellule. - L'échantillon à analyser, qui est par exemple représenté par une 15 matrice qui contient les mesures (de fluorescence) d'un échantillon de m cellules, lesquelles contiennent des cellules positives et négatives (parmi lesquelles certains marqueurs sont exprimés; les cellules ayant été sollicitées, certaines ont réagi). Pour chaque cellule, les mêmes d marqueurs (fluorescents) sont mesurés. 20 L'échantillon à analyser est par exemple notée Xtest matrice de taille m x d, où Xt"t = est Ki (avec k = 1,...,m et j=1,...,d), xtestki correspondant à la mesure (de fluorescence) du jème marqueur pour la kème cellule. Les données de sortie principales du procédé sont l'ensemble des cellules de l'échantillon à analyser qui sont déclarées comme étant positives. 25 Une cellule de l'échantillon à analyser est déclarée positive si l'expression normalisée de l'un des marqueurs, c'est-à-dire d'au moins l'un des marqueurs, est supérieure à la valeur du seuil correspondant estimée à la troisième étape, détaillée ultérieurement. 30 Première étape : Préparation des données Lors d'une première étape, optionnelle, les expressions des marqueurs (valeurs de fluorescences mesurées) pour l'échantillon de référence 3030039 13 et pour l'échantillon à analyser sont par exemple d'abord normalisées puis dilatées. En d'autres termes, l'étape de préparation comporte par exemple une étape de normalisation et une étape de dilatation des données. Ceci permet de rendre les mesures indépendantes de l'échelle et de la calibration de l'outil de 5 mesure. Un tel conditionnement du problème permet en outre de simplifier le procédé tout en permettant que la classification puisse se faire correctement. On note par exemple les matrices Xref et Xtest précédemment définies une fois normalisées par : Yref = [Yef.j] et Ytest - r..test _.-. ref _test - kil où y et y kj sont les valeurs normalisées des expressions des marqueurs (mesures de fluorescence) xrefii et test 10 xPour cela, les mesures sont ramenées à des valeurs dans l'intervalle unité [0,1] puis elles sont exprimées en échelle log. Par exemple, pour chaque marqueur j dans {1,...,d), l'étape de préparation des données du procédé comporte par exemple les étapes suivantes : 15 - une étape de détermination d'un minimum xo,minj et d'un maximum xemaxi des expressions mesurées du marqueur considéré dans l'échantillon de référence et dans l'échantillon à analyser ; une étape de normalisation et dilatation des données de l'échantillon de référence et de l'échantillon à analyser, qui s'effectue de la manière suivante : 20 Yefu = feefd; i=1,...,n; j=1,...,d ytestki = f( xtestki ) a; k=1,...,m; j=1,...,d où f(x) est par exemple la fonction de dilatation suivante : fi(x) = logio ((x-xemin))/(xu,max)- xerninj) dans laquelle (x-xemin))/(xc,max)- xo,mini) correspond à la normalisation à 25 proprement parler, et où E est le paramètre de dilatation ; avec j dans (1,...,d), et E compris entre 10-3 et 10-6 par exemple, ce nombre pouvant être adapté. Il vaut par exemple 10-6. Deuxième étape : Lissage de la distribution des valeurs obtenues 30 pour un échantillon Cette étape vise à lisser des densités de probabilités des marqueurs de l'échantillon considéré, par exemple l'échantillon de référence pour l'exemple détaillé ici, normalisées, afin qu'elles deviennent continues et 3030039 14 indépendantes des effets de discrétisation. Autrement dit, ceci permet d'avoir une fonction de densité de probabilité continue à partir des valeurs discrètes que sont les résultats de mesures. Il est par exemple possible d'utiliser la méthode de Parzen-Rozenblatt, aussi appelée « estimateur à noyau ». 5 Les densités de probabilités unidimensionnelles (c'est-à-dire pour un marqueur à la fois) sont par exemple obtenues en utilisant la méthode d'estimation à noyau avec un noyau Gaussien et la règle de Silverman pour la largeur du noyau, appelé paramètre de lissage. Pour exemple, ceci est appliqué sur les données normalisées de l'échantillon de référence déterminées dans 10 l'étape 1, c'est-à-dire les ef,i. Pour chaque marqueur j dans (1,...,1), l'étape de lissage du procédé comporte par exemple les étapes suivantes : - une étape de sélection d'un noyau K, par exemple Gaussien ; - une étape de détermination du paramètre de lissage h, qui correspond à 15 la largeur du noyau de lissage, en utilisant par exemple la règle de Silverman : 1 3 h1 = (71-y,n min(cri,irqj) où ai et irqi sont respectivement l'écart-type empirique et l'interquartile de l'ensemble {Yefg, i=1,...,n ). une étape de définition de la fonction de densité de probabilité de la fonction de distribution marginale du fème marqueur de l'échantillon de référence 20 par : piref (x) = nh- (x - yirief) 1 où K est un noyau, par exemple le noyau Gaussien défini par K(x) = 12 eXP (-2x ). A ce stade, les résultats de mesures normalisés pour l'échantillon à analyser et une densité de probabilité de résultat pour chaque marqueur pour 25 l'échantillon de référence sont ainsi connus. Ces densités de probabilité sont par exemple représentées sur la figure 3 pour un marqueur j. 3030039 15 Ensuite, le procédé comporte une étape de définition d'une estimation des densités multivariées, qui correspond au produit des noyaux univariés, par exemple de la façon suivante : a x h FIKJ - n xx h.ref) i=1 j=1 Il est en outre possible de simplifier cette expression en considérant 5 que Ki= K, voire hi= h pour toutes les dimensions. Selon la version du procédé, définie par la suite, qui est mise en oeuvre, l'étape de lissage est réalisée sur au moins l'échantillon à analyser à la place de l'échantillon de référence. 10 Troisième étape : Estimation des seuils L'étape suivante, ici la troisième étape, vise à déterminer les valeurs des seuils pour les expressions des marqueurs au-delà desquels une cellule est déclarée positive. Pour déterminer le seuil associé à chaque marqueur, deux cas sont 15 ici envisagés. Dans un premier cas, dit version 1, une entrée auxiliaire consiste en un sous-ensemble É- de cellules de l'échantillon à analyser que l'utilisateur juge positives. Le procédé produit alors une sortie auxiliaire qui est le taux a de faux positifs correspondant au jugement de l'utilisateur. 20 Dans un deuxième cas, dit version 2, l'entrée auxiliaire est le taux a de faux positifs acceptable, qui correspond à la proportion de cellules qui sont détectées positives par le procédé quand celui-ci est appliqué à un échantillon de cellules négatives, par exemple l'échantillon de référence. Par défaut, si aucune entrée auxiliaire n'est fournie, le procédé 25 effectue la version 2 avec la valeur imposée a=0, qui correspond à minimiser les valeurs des seuils, sous la contrainte que l'algorithme déclare négatives toutes les cellules de l'échantillon de référence. C'est la version dite « sans biais » du procédé. Autrement dit, le procédé comporte une étape de fourniture d'un 30 paramètre additionnel qui est soit l'ensemble E+, soit le taux de faux positif a, n pref (x) = 1 3030039 16 sachant que si aucun paramètre additionnel n'est spécifié, l'étape de fourniture d'un paramètre additionnel consiste à considérer a = O. Autrement dit, dans les deux cas, les principes de calculs sont les mêmes. Dans le premier cas, ceux-ci sont appliqués dans l'échantillon à 5 analyser pour prédire dans l'échantillon de référence, tant que dans le deuxième cas, c'est l'inverse. Troisième étape - version 1 Dans la version 1, l'utilisateur fait d'abord un tri parmi les cellules de 10 l'échantillon à analyser. Les cellules jugées positives par l'utilisateur forment l'ensemble appelé E+' comprenant entre 0 à m cellules de l'échantillon à analyser. Dans cette version, les seuils sont estimés de manière à reproduire au mieux le jugement de l'utilisateur sur l'échantillon à analyser. 15 Autrement dit, la troisième étape selon la version 1 comporte par exemple les étapes suivantes : Pour une valeur si (correspondant alors à une probabilité), une étape de définition d'un srquantile y, quantile de la fonction de distribution cumulée Plest associée à la fonction de distribution de probabilité lissée prt déterminée à 20 l'étape 2 pour chaque marqueur j: pç"t(x)dx = P.t"t(y) I J -ea Ceci est par exemple représenté sur la figure 4 pour un marqueur j. Le srquantile yl correspond donc ici à une valeur seuil d'expression normalisée pour un marqueur j considéré : au-delà, une cellule sera considérée positive pour ce marqueur, en dessous elle sera considérée négative pour ce 25 marqueur. une étape de définition de l'ensemble de cellules déclarées positives par rapport au srquantile y, pour chaque marqueur dans l'échantillon à analyser : en prenant l'union de ces d ensembles, on obtient ainsi l'ensemble S+={k=1,...,m tel que yfist pour un j=1,...,d}. Ceci signifie que l'ensemble 3030039 17 S+ comprend l'ensemble des cellules de l'échantillon à analyser considérées comme positives, c'est-à-dire les cellules analysées dont l'expression d'un marqueur (valeur de fluorescence mesurée) est supérieure à yr pour au moins un marqueur donné. Autrement dit, l'ensemble S+ comporte toutes les cellules qui 5 ont une expression d'un marqueur normalisée supérieure au seuil pour au moins un marqueur. Il y a donc à ce stade deux ensembles définis : E l'ensemble des cellules jugées positives par l'utilisateur, et S+ l'ensemble des cellules définies positives par le procédé. Si El- est connu, S+ reste à déterminer car il dépend 10 des valeurs des seuils de chaque marqueur, qui sont à déterminer. Cette détermination de S+ s'effectue selon les étapes suivantes : - Une étape de définition et détermination d'un cardinal de la différence symétrique entre S+ et E+. Cela signifie déterminer la somme du nombre des cellules qui appartiennent à E+ mais pas à S+ et du nombre des cellules qui ap15 partiennent à S+ mais pas à E4«, c'est-à-dire qui n'appartiennent pas simultané- ment aux deux ensembles S+ et E. - Puis, le procédé comporte une étape de minimisation de ce cardinal par rapport à la valeur si de chaque marqueur j dans l'intervalle [0,1], pour tous les marqueurs. C'est-à-dire déterminer la valeur de seuil de chacun des marqueurs 20 la plus grande parmi les valeurs minimisant le cardinal. Autrement dit, cette étape consiste à déterminer une valeur de seuil yr pour chacun des marqueurs tel qu'un maximum de cellules appartiennent à la fois à et S. Par exemple, dans un cas « parfait » E+ et S+ seraient superposés, identiques. La valeur si et du si-quantile yr pour chaque marqueur j est ainsi 25 connue. Une simplification consiste par exemple à considérer que toutes les valeurs si sont identiques, et valent par exemple une valeur s, et il s'agit alors de déterminer les yr correspondant pour chacun des marqueurs. Une autre étape consiste par exemple ensuite à définir la fonction F 30 (croissante de [0,1] à [0,1]) par F(s) = card(Ve)où VNS est définie par VNS = { tel que yirief 1-a. Connaissant les valeurs si, il est donc ensuite possible de déterminer 10 les seuils associés pour chacun des marqueurs. Ainsi, dans cette version 2, ayant fixé un a tolérable ou égal à 0, on cherche la plus petite valeur de seuil correspondant pour chacun des marqueurs. En appliquant les valeurs de seuils déterminées à l'échantillon à 15 analyser, le procédé peut alors ensuite déterminer l'ensemble S+ de cellules positives, comme ceci est détaillé dans une quatrième étape décrite ci-après. Ainsi, dans cette version, l'ensemble S+ est déterminé à partir du taux a. Quelle que soit la version (1 ou 2), à l'issue de l'étape 3 20 précédemment décrite, on connaît combien de cellules, et lesquelles, sont considérées positives dans l'échantillon à analyser, et quel est le taux de faux positifs (a) dans l'échantillon de référence et de fait, les valeurs sj et les sj_ quantiles yr à considérer pour chacun des marqueurs. 25 Quatrième étape Classification de l'échantillon à analyser Ensuite, une quatrième étape vise à classer les cellules de l'échantillon à analyser en un ensemble de cellules positives d'une part, et négatives d'autre part. Une cellule de l'échantillon à analyser est déclarée positive si 30 l'expression normalisée de l'un des marqueurs, c'est-à-dire d'au moins l'un des d marqueurs, est supérieure à la valeur du seuil correspondant estimée à la troisième étape. 3030039 20 La quatrième étape comporte par exemple une étape de définition et de détermination d'un ensemble de cellules déclarées négatives dans l'échantillon à analyser par S- = (k=1,...,m tel que ytest/(J REVENDICATIONS1. Procédé d'analyse de cellules d'un échantillon réagissant à au moins un marqueur spécifique comportant : une étape de fourniture d'un échantillon de référence et d'un échantillon à analyser ; une étape de fourniture d'un ensemble (E+) de cellules déclarées positives par un expert parmi les cellules de l'échantillon à analyser ; une étape de détermination d'un coefficient vectoriel (0) à partir de l'échantillon à analyser et de l'ensemble (E+) ; une étape de détermination d'au moins un ensemble de cellules positives dans l'échantillon de référence en fonction du coefficient vectoriel (0) ; et une étape de calcul d'un taux de faux positifs dans l'échantillon de référence (a) à partir du nombre de cellules positives de l'échantillon de référence. 2. Procédé d'analyse de cellules d'un échantillon réagissant à au moins un marqueur spécifique comportant : Une étape de fourniture d'un échantillon de référence et d'un échantillon à analyser ; Une étape de fourniture d'un taux de faux positifs (a) dans l'échantillon de référence ; une étape de détermination d'un coefficient vectoriel (0) à partir de l'échantillon de référence et du taux de faux positifs (a) ; et une étape de détermination d'au moins un ensemble (S+) de cellules positives dans l'échantillon à analyser en fonction du coefficient vectoriel (0). 3030039 23 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le coefficient vectoriel (0) est un ensemble de valeurs seuils d'expression de chacun des marqueurs au-delà de chacune desquelles une cellule est déclarée positive. 5 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte une minimisation d'une quantité de faux positifs et une minimisation d'une quantité de faux négatifs dans la population à analyser. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 4, lo caractérisé en ce que l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte : une étape de définition, pour chacun des marqueurs j, d'un siquantile y, quantile d'une fonction de distribution cumulée ptest associée à une fonction de distribution de probabilité lissée pjest 15 déterminée par lissage d'une distribution marginale du jème marqueur dans l'échantillon à analyser ; une étape de définition de l'ensemble (S+) de cellules déclarées positives par rapport au srquantile 31 pour chaque marqueur j dans l'échantillon à analyser ; 20 une étape de définition et détermination d'un cardinal de la différence symétrique entre S+ et E+ ; une étape de détermination de chacune des valeurs du coefficient vectoriel (0) de chacun des marqueurs la plus grande par minimisation du cardinal par rapport à la valeur si de chaque 25 marqueur j dans l'intervalle [0,1], pour tous les marqueurs. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape de détermination du coefficient vectoriel (0) comporte une maximisation d'une quantité de cellules positives dans la population à analyser respectant le taux de faux positifs (a) donné. 3030039 24 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2, 3 ou 6, caractérisé en ce que l'étape de détermination d'un coefficient vectoriel (0) comporte : une étape de définition, pour chacun des marqueurs j, d'un 5 quantile yr, quantile d'une fonction de distribution cumulée Pire! associée à une fonction de distribution de probabilité lissée p71. déterminée par lissage d'une distribution marginale du jéme marqueur dans l'échantillon de référence ; une étape de définition d'une fonction F(s) représentant un taux 10 de cellules négatives dans l'échantillon de référence, croissante de [0,1] à [0,1], par F(s) = card(VNs) , où VNS est définie par VNS = { i=1,...,n tel que y[ief 1-a; et une étape de détermination des valeurs du coefficient vectoriel (0). 20 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse dans laquelle au moins un marqueur auquel au moins une cellule réagit positivement est identifié. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de vérification par évaluation d'une matrice 25 de confusion.