FR 3025424 A1 20160311 FR 1458348 A 20140905 1 PRINCIPE ACTIF OBTENU A PARTIR DE CALENDULA OFFICINALIS ET UTILISATION DANS LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DE MANIFESTATIONS CUTANEES DUES A UN DEREGLEMENT DE L'EPIGENOME DANS LES CELLULES DE LA PEAU La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de Calendula Officinalis, dans la prévention et le traitement de manifestations cutanées dues à un dérèglement de l'épigénome dans les cellules de la peau. L'invention vise également un hydrolysat particulier de Calendula Officinalis, les compositions comprenant cet hydrolysat et un procédé cosmétique de soin de la peau comprenant l'application topique d'une telle composition. L'épigénétique est une science définie comme l'ensemble des modifications héréditaires dans la fonction des gènes qui n'est pas due à une modification de la séquence d'ADN. En effet, l'épigénome, sous l'influence de l'environnement (comme la pollution, le stress, l'alimentation, le tabac et le climat), conditionne l'expression des gènes et gère l'information génétique. Pour cela, l'organisme fait appel à plusieurs mécanismes parmi lesquels : la méthylation de l'ADN, la modification des histones et l'expression des ARN non-codants comme l'ARN « miRNA ». Grâce à la mise en place de ces mécanismes, la cellule est capable de s'adapter à son environnement et ainsi accroître sa longévité. Les dérèglements de ces mécanismes et les modifications de l'épigénome sont par conséquent impliqués dans de nombreuses manifestations. En particulier, l'épigénétique a récemment été identifiée comme élément majeur contribuant au vieillissement. L'objectif de l'invention est de proposer un produit adapté pour une utilisation sur la peau, capable de dynamiser l'épigénome et d'agir sur des mécanismes épigénétiques, pour prévenir et lutter contre les manifestations cutanées causées par un dérèglement de l'épigénome dans les cellules de la peau. A cet effet, l'invention vise l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis. Calendula Officinalis, connue également sous le nom de Souci, est une plante de la famille des Asteracées originaire de Macaronésie (îles canarien, Madère, Açores, Cap-Vert) qui est 3025424 2 aujourd'hui majoritairement cultivée dans les pays du pourtour méditerranéen. Elle est connue pour ses propriétés antibactériennes, anti-inflammatoires et cicatrisantes et est utilisée dans les domaines alimentaire, médicinale et cosmétique. Traditionnellement les fleurs de Souci sont utilisées en usage interne pour traiter les inflammations mineures de la 5 bouche et de la gorge ainsi qu'en usage externe pour traiter les inflammations de la peau et aider à la cicatrisation des plaies mineures. En outre, divers extraits de cette plante ont été développés pour des applications cosmétiques. En particulier, il existe des extraits riches en polyphénols et principalement en rutine qui présentent des efficacités cosmétiques antiradicalaire, anti-glycation, anti-oxydant et par conséquent anti-vieillissement. 10 De façon surprenante, appliqué sur la peau un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis présente des effets sur les mécanismes épigénétiques et dynamise l'épigénome des cellules cutanées. Il peut ainsi être utilisé pour dynamiser l'épigénome dans les cellules de la peau, en particulier pour prévenir ou lutter contre les manifestations cutanées liées à un dérèglement 15 de l'épigénome dans les cellules de la peau. Avantageusement son action dynamisante de l'épigénome permet en particulier de lutter contre les effets délétères du vieillissement cutané et notamment d'augmenter l'élasticité et la tonicité de la peau, de lisser le microrelief, d'améliorer l'homogénéité et le grain de surface de la peau et d'améliorer l'âge perçu. 20 L'invention a également pour objet un principe actif particulier à savoir un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis comprenant des oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose et glucose. Cet hydrolysat peut être intégré dans des compositions adaptées pour une application topiques sur la peau en particulier des compositions comprenant au moins 0,5% de 25 l'hydrolysat selon l'invention. Ces compositions peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre d'un procédé cosmétique de soin de la peau. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails de l'invention qui va suivre. L'invention a donc pour objet un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula officinalis, pour son utilisation comme produit à application topique sur la peau dans la prévention ou le traitement de manifestations cutanées causées par un dérèglement de l'épigénome dans les cellules de la peau. 3025424 3 Par principe actif on entend un ensemble de plusieurs molécules obtenues à partir de fleurs de Calendula officinalis (extraites ou obtenues par transformation de la matière première par exemple par hydrolyse) présentant un effet sur les cellules de la peau. L'épigénétique fait intervenir de nombreux mécanismes parmi lesquels la méthylation de 5 l'ADN, la modification des histones et les ARN non-codants. La méthylation de l'ADN est une modification stable et constitue une composante héritable dans la régulation épigénétique. Cette modification est essentielle pour le développement de l'organisme. Elle correspond à l'ajout d'un groupement méthyle au niveau des cytosines présentes sur l'ADN et plus particulièrement dans des zones appelées ilots CpG. Ces 10 nucléotides CpG sont hautement concentrés dans les régions promotrices des gènes. Ainsi, après méthylation de ces résidus, la transcription est inhibée. La modification des histones est un mécanisme associé à l'activation ou la répression de l'expression génique. En effet, les histones sont des protéines qui régulent la compaction de l'ADN et verrouillent son accessibilité. La molécule d'ADN s'enroule autour des histones qui 15 elles-mêmes s'arrangent et se replient en chapelets de perles afin de former une fibre : la chromatine. Elle est composée de nucléosomes : octamère protéique composé de deux copies des histones H2A, H2B, H3 et H4, autour desquelles s'enroulent la molécule d'ADN. La lecture d'un gène nécessite l'ouverture de la chromatine afin de permettre l'accès à la structure nue de l'ADN. C'est ainsi que se mettent en place des cycles de compaction / 20 décompaction ou les histones exerce la fonction de verrous. Elles conditionnent l'accès de la machinerie cellulaire à l'ADN. Sans leur signal initiateur, la chromatine ne peut pas s'ouvrir et l'ADN ne peut être traduit en protéine. Afin de réguler la compaction de la chromatine, les histones subissent plusieurs modifications telles qu'une acétylation, méthylation, ubiquitinylation ou phosphorylation. Ces modifications ciblent des résidus spécifiques et 25 sont catalysées par des enzymes particulières. Ainsi la chromatine peut être fonctionnellement classée en deux formes : - la chromatine active ou euchromatine qui est caractérisée par une abondance de groupements acétyles et une faible proportion de groupements méthyles. Cette chromatine présente une conformation dites ouverte et accessible et est transcriptionnellement active. 30 - la chromatine inactive ou héterochromatine qui présentent des marques inverse à l'euchromatine : peu de groupements acétyles et une abondance de groupements méthyles. Cette chromatine est stablement fermée et silencieuse. 3025424 4 Ces structures sont hautement dynamiques permettant le passage d'un état à un autre. Cette gymnastique est indispensable à la mise en place de processus tels que la transcription, la réplication de l'ADN et sa réparation. En réponse à des changements physiologiques, la modification des histones modulent la structure de la chromatine et 5 permetttent l'adaptation des fonctions cellulaires. Au cours du vieillissement, une détérioration progressive de la stabilité de la chromatine et de l'expression génique se met en place. Plusieurs origines sont possibles : un défaut de maintenance des télomères mais aussi l'apparition de dommages au niveau de l'ADN et la redistribution de foyers d'héterochromatine. En effet, le vieillissement s'accompagne de 10 l'accumulation d'anomalies génétiques telles que les cassures double brins. En réponse à cette anomalie, H2AX (un variant de l'histone H2) est phosphorylée en yH2AX et établit une modification de la chromatine. Ces cassures résultent de l'érosion des télomères ou bien de stress radicalaires (UV, stress métabolique). Elles vont activer une signalisation des dommages qui ultimement peut déboucher sur une entrée en sénescence. En effet, les 15 cellules sénescentes sont caractérisées par une accumulation des foyers yH2AX. D'autre part, la sénescence est associée à de profondes modifications de la structure chromatinienne qui se traduisent par une condensation globale et la formation de structures appelées foyers d'héterochromatine associés à la sénescence (SAHF : Senescence Associated Heterochromatin Foci). Ces SAHF renferment des modifications d'histones et des protéines 20 caractéristiques d'une chromatine silencieuse telle que l'histone H3 tri-methylé au niveau de la lysine 9 (H3K9me3). Ces SAHF sont décrits comme inhibant l'expression des gènes liés à la prolifération et contribue à l'arrêt de la croissance qui est associé à la sénescence. Par ailleurs, la méthylation des histones régule les gènes de la matrice extracellulaire et particulièrement l'expression du COL1A1. L'expression de ce gène passe par une réduction 25 de la méthylation de l'histone H3K9. Avantageusement selon l'invention, un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis appliqué sur la peau, limite les modifications de la chromatine en empêchant la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 ainsi que la phosphorylation de l'histone H2 dans les cellules cutanées. De plus, il protège la chromatine des altérations induites par 30 l'environnement en réduisant la phosphorylation de l'histone H2 et en préservant le procollagène. 3025424 5 En favorisant la stabilité et l'activité de la chromatine il stabilise et active la synthèse de pro collagène 1, protéine majeure de la matrice extracellulaire. L'invention vise donc l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis dans la prévention ou le traitement de manifestations cutanées causées par une 5 modification de la chromatine des chromosomes des cellules de la peau. Par ailleurs, on sait que les ARN peuvent réguler les gènes. Cet effet passe par les ARN non codants, molécules de moins de 200 nucléotides qui incluent les miRNA, les siRNA, les piRNA et les snoRNA. Parmi ces ARN, les miRNA sont en particulier connus pour leur implication dans le vieillissement. 10 Les miRNA, petits ARN simple brin sont composés de 18 à 25 nucléotides. Ils résultent d'un processus cellulaire multi-étapes initié au niveau nucléaire avec la production d'un précurseur : le pré-miRNA. Sous l'action de plusieurs complexes enzymatiques, ce pri-miRNA donne naissance à un miRNA mature qui va : - inhiber la traduction en protéine, 15 - ou bien entrainer le clivage de l'ARNm cible et sa destruction. Ces deux degrés de régulation sont dépendants du niveau de complémentarité entre l'ARNm et le miRNA. Plus la complémentarité est importante, plus l'ARNm sera dégradé. D'autre part, les miRNA pouvant inhiber la traduction protéique en dépit d'une complémentarité imparfaite, ils vont pouvoir cibler plusieurs ARNm et plusieurs miRNA vont pouvoir réguler la 20 même cible. De nombreuses études ont montré que le niveau des miRNA est modifié avec l'âge et que ces modifications peuvent être à l'origine de désordres. En activant l'expression de miRNA, les cellules vont profondément modifier leurs capacités de synthèse. En effet, ils constituent un mécanisme régulateur qui contrôle la composition de la matrice extracellulaire mais aussi le comportement des cellules qui y résident. Les 25 miRNA exercent cet effet par l'intermédiaire de deux mécanismes : - directement, en ciblant les ARNm spécifiques de la matrice ; - indirectement, en modulant l'expression des gènes impliqués dans la synthèse ou la dégradation de cette dernière. C'est ainsi qu'une trentaine de miRNA ont pu être décrit pour leur implication dans la 30 régulation de la matrice extracellulaire. Une étude réalisée par la demanderesse sur des miRNA (voir essais du point A.2) exprimés par les fibroblastes SAHF a permis de prouver que les fibroblastes agressés sous simulateur 3025424 6 solaire présentent un profil miRNA modifié : l'expression de 18 miRNA est augmentée tandis que 7 miRNA sont inhibés. Parmi les miRNA modulés, certains sont impliqués dans la matrice extracellulaire : - les miR-29a et miR-29b, régulateurs de l'expression du COL1A1, COL5A1, de 5 l'élastine et de la fibrilline sont augmentés. - le miR-22-5p qui est associé à l'expression du gène MMP1 est inhibé. Avantageusement selon l'invention, un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis appliqué sur la peau, régule l'expression des miRNA et ainsi normalise le profil d'expression des fibroblastes SAHF. En particulier il est capable de restaurer les gènes de la 10 matrice en limitant l'expression des miR-29a de 14% et miR-29b de 20%, et de réduire l'expression des MMP1 en restaurant l'expression du miR-22-5p (+18%). Il préserve ainsi les réseaux de fibrilline et d'élastine et restaure la synthèse de procollagène 1. Ainsi, via la modulation des miRNA, l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis favorise la synthèse des protéines matricielles et limite les effets 15 délétères du vieillissement. L'invention vise donc l'utilisation d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula Officinalis dans la prévention ou le traitement de manifestations cutanées causées par des dérèglements de l'expression des miRNA dans les cellules de la peau. Par « manifestations cutanées causées par un dérèglement de l'épigénome dans les cellules 20 de la peau », ou « manifestations cutanées causées par une modification de la chromatine des chromosomes des cellules de la peau » ou « manifestations cutanées causées par des dérèglements de l'expression des miRNA dans les cellules de la peau », au sens de l'invention on entend toutes manifestations sur la peau qui découlent d'un dérèglement de l'épigénome dans les cellules de la peau / d'une modification de la chromatine des 25 chromosomes des cellules de la peau / de l'expression des miRNA dans les cellules de la peau, en particulier : perte de l'élasticité et de la tonicité de la peau, modifications du microrelief de la peau, modification du grain de surface de la peau, signes du vieillissement cutané en général. Selon l'invention, un principe actif obtenu à partir de fleurs de de Calendula Officinalis peut 30 donc être utilisé sur la peau pour dynamiser l'épigénome, en particulier pour réguler les modifications de la chromatine, pour empêcher la modification des histones notamment H3K9 et H2AX, et pour réguler la production de miRNA. Il favorise ainsi la synthèse et 3025424 7 préserve les protéines matricielles, en particulier il normalise la synthèse de procollagène 1, il préserve l'organisation des fibres d'élastine et de fibrilline, il inhibe l'expression et le relargage des MMP1. Il permet donc notamment de lutter contre les effets délétères du vieillissement, particulièrement d'augmenter l'élasticité et la tonicité de la peau, lisser le 5 microrelief, améliorer l'homogénéité et le grain de surface de la peau, améliorer l'âge perçu. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le principe actif obtenu à partir de fleurs de de Calendula Officinalis utile selon l'invention est un principe actif ne contenant pas de polyphénols (c'est-à-dire contenant moins de 0,02% en poids de matière sèche, teneur en polyphénols déterminée par HPLC), en particulier pas de flavonoïdes de type 10 rutine, ni de terpènes. Préférentiellement il s'agit d'un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis, particulièrement d'un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis comprenant des oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose et glucose. Encore plus préférentiellement il s'agit d'un hydrolysat enzymatique de fleurs de Calendula officinalis. 15 L'invention vise également spécifiquement un tel hydrolysat. En particulier l'invention a pour objet un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis comprenant des oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose et glucose. Préférentiellement, l'hydrolysat contient au moins 2,5% d'oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose 20 et glucose. Par « hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis» on entend un ensemble de molécules obtenues par hydrolyse d'une solution aqueuse de fleurs de Calendula officinalis. les pourcentages étant donnés en poids par rapport au poids de matières sèches de l'extrait. 25 L'hydrolysat peut être un hydrolysat chimique mais de façon préférée, il s'agit d'un hydrolysat enzymatique. De façon préférée, il contient au moins 13 % de sucres en poids de matières sèches, en particulier au moins 20 % de sucres en poids de matières sèches. Selon un mode de réalisation adapté, il se présente sous forme liquide et présente au moins 30 une des caractéristiques suivantes : - Un taux de matières sèches compris entre 28 et 43g/I, 3025424 8 - Une teneur en sucres totaux comprise entre 6 et 11 g/I, soit entre 13% et 40% en poids par rapport à la matière sèche, préférentiellement entre 21 et 26%. Le taux de matière sèche peut être mesuré par passage à l'étuve à 105°C en présence de sable d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. 5 La teneur en sucres totaux peut être mesurée par la méthode de DUBOIS (en présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune orangé ; à partir d'une gamme étalon, on peut alors déterminer le taux de carbohydrates). La fraction glucidique de l'hydrolysat selon l'invention est principalement constituée par des mono et oligosaccharides de fructose et glucose, de degré de polymérisation 10 majoritairement compris entre 1 et 10 (détermination des masses molaires par HPLC avec détection RI et composition en sucres simples déterminée par chromatographie liquide ionique). L'hydrolysat contient entre 0 et 51.1g/m1 de polyphénols (teneur en polyphénols exprimée en rutine déterminée par HPLC, avec une limite de quantification de 51.1g/m1), soit moins de 15 0,02% de polyphénols en poids par rapport à la matière sèche. L'hydrolysat peut contenir également des protéines. La fraction protéique est préférentiellement composée très majoritairement de peptides ayant une masse moléculaire inférieure à 2000Da (quantification par dosage spectrophotométrique, méthode de Lowry). 20 L'hydrolysat selon l'invention peut être obtenu par un procédé comprenant la succession des étapes suivantes : Solubilisation de poudre de fleurs de Calendula officinalis dans l'eau, Hydrolyse, de préférence hydrolyse enzymatique, Séparation des phases soluble et insoluble, par décantation, filtration, centrifugation, 25 Traitement thermique pour inactivation de l'activité enzymatique, Filtration sélective des carbohydrates, Concentration et filtration stérilisante. Les paramètres des différentes étapes doivent être ajustés afin d'obtenir des principes actifs présentant les caractéristiques de l'invention. 30 Ces étapes sont usuelles dans le domaine des extractions d'actifs à partir de plantes ou de levures et l'homme du métier est à même d'en ajuster les paramètres réactionnels sur la base de ses connaissances générales. 3025424 9 La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis tel que décrit précédemment, dans différentes formes galéniques, adaptées à l'administration par voie topique cutanée. Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d'émulsions huile-dans-eau, 5 émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide. 10 II peut s'agir de compositions comprenant au moins 0,5% d'hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis selon la présente invention, préférentiellement entre 0,5 et 3%. Ces compositions comprennent, outre l'actif, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort inacceptables pour l'utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou 15 picotements. Les compositions selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi : - les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles ; 20 - les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba, - les élastomères de silicone, - les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, 25 - les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires, - les épaississants et/ou gélifiants, - les humectants, tels que les polyols comme la glycérine, - les filtres organiques, - les filtres inorganiques, 30 - les colorants, les conservateurs, les charges, - les tenseurs, 3025424 10 - les séquestrants, - les parfums, - et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative. Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA 5 (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council). Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction 10 envisagée. Ces compositions sont notamment destinées à être utilisées pour le soin de la peau humaine. En particulier, l'invention vise un procédé cosmétique de soin de la peau humaine, destiné à lutter contre les effets du vieillissement cutané, notamment pour augmenter l'élasticité et la 15 tonicité de la peau et/ou lisser le microrelief et/ou améliorer l'homogénéité et le grain de surface de la peau et/ou améliorer l'âge perçu. Le procédé consiste à appliquer sur la peau un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis ou une composition en contenant, préférentiellement au moins une fois par jour. Afin d'illustrer les effets cosmétiques sur la peau d'un principe actif obtenu à partir de fleurs 20 de Calendula officinalis, les exemples suivants avec leurs résultats d'essais sont présentés. I. EXEMPLES 1.1 Exemple 1 : Principe actif selon l'invention Un exemple de procédé d'obtention d'un principe actif selon l'invention, comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes : 25 Solubilisation de 40g de poudre de fleurs de Calendula officinalis dans 11 d'eau sous agitation, Ajout d'une enzyme de type carbohydrase, sous agitation pendant 1h, Séparation des phases soluble et insoluble par décantation, Traitement thermique pour inactivation de l'activité enzymatique, 30 Filtration sélective des carbohydrates, Concentration et filtration stérilisante. 3025424 11 Le principe actif obtenu est un liquide limpide transparent présentant une matière sèche de 35.4g/I et un pH de 5. Il contient 8.02 g/I de protéines, soit 23% de la matière sèche et 7.1g/I de carbohydrates, soit 20% de la matière sèche. 5 1.2 Exemple 2 : Principe actif selon l'invention Un exemple de procédé d'obtention d'un principe actif selon l'invention, comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes : Solubilisation de 20g poudre de fleurs de Calendula officinalis dans 11 d'eau sous agitation, 10 Ajout d'une enzyme de type carbohydrase, sous agitation pendant 4h, Séparation des phases soluble et insoluble par centrifugation, Traitement thermique pour inactivation de l'activité enzymatique, Filtration sélective des carbohydrates, Concentration et filtration stérilisante. 15 Le principe actif obtenu est un liquide limpide de couleur jaune clair présentant une matière sèche de 36.9g/l et un pH de 5. Il contient 8.5 g/I de protéines, soit 23% de la matière sèche et 9.6g/l de carbohydrates, soit 26% de la matière sèche. 20 1.3 Exemple 3 : Utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une lotion purifiante A. Eau qsp 100% Glycérine 3% Dub Diol (Stéarinerie Dubois) 3% Butylène Glycol 5% Carbopol Ultrez 20 (Lubrizol) 0,3% 25 B. Fluidanov 20X (Seppic) 1% DUB Zenoat (Stéarinerie Dubois) 1,5% Sepimat HBV (Seppic) 1% C. Principe actif exemple 1 4% Conservateur 1% 30 Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Ce gel, blanc, opalescent brillant, à l'odeur légère et la texture souple présente un pH de 5,9. 3025424 12 Il présente une application aisée, avec une pénétration rapide et un fini sec et ne laisse pas de sensation de gras. Il peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - Mélanger A sans le Carbopol Ultrez 20, 5 - Mettre sous hélice et ajouter progressivement le Carbopol Ultrez 20, - Emulsionner B dans A, sous rotor stator à 1500 tr/min, - Ajouter C, - Laisser agiter (à 1200 tr/min) jusqu'à refroidissement pour une homogénéisation complète. 10 1.4 Exemple 4 Utilisation d'un principe actif selon l'invention dans une crème nourrissante A. Eau qsp 100% Glycérine 2% B. Rice Bran Wax (Strahl and Pitsch Inc) 0,5% Phytowax Olive (Sophim) 0,2% 15 Dub Liquide 85 (Stéarinerie Dubois) 2% Lanette N (Sidobre/Sinnova) 1% Montanov 202 (Seppic) 3% IPM (Stéarinerie Dubois) 2% C. Sepinov EMT 10 (Seppic) 1% 20 D. Principe actif exemple 2 4% Conservateur 1% Les quantités indiquées sont données en pourcentage de poids. Cette émulsion blanche et brillante présente un pH de 6,6. Elle présente un étalement aisé, elle fond sur la peau, et présente une pénétration rapide 25 sensation de gras, avec un fini doux. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - Mélanger A et chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation magnétique, - Mélanger B et chauffer au bain-marie à 80°C sous agitation magnétique, - Quand A est arrivé à 80°C, ajouter C hors plaque chauffante, 30 - Emulsionner B dans A, sous rotor stator à 1800 tr/min, - A 30 °C, ajouter D, dans l'ordre indiqué, sous rotor stator à 1500 tr/min. 3025424 13 II. ÉVALUATION DE L'EFFICACITE COSMÉTIQUE D'UN PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION II. A. Tests in vitro A.1 - Etude des modifications chromatiniennes a) Modélisation 5 L'objectif de cette étude est de modéliser l'impact des irradiations solaires répétées (SSR) sur la chromatine dans les fibroblastes normaux. Cette modélisation se déroule en deux étapes : - Première étape : obtention de fibroblastes SAHF (« Senescence-Associated Heterochromatin Foci ») suite à un traitement par des irradiations solaires répétées. 10 - Deuxième étape : étude de la modification des histones : - phosphorylation de l'histone H2 (yH2AX), - di et triméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me2/3). Le protocole opératoire est le suivant. A JO, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés et incubés. 15 Pendant plusieurs jours, une induction du phénotype SAHF est réalisée par irradiations solaires répétées (SSR) à l'aide d'un simulateur solaire « CPS+». Ensuite, on récupère les cellules, pour réaliser un immunomarquage de yH2AX et un Western Blot H3K9. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-après : 20 Tableau 1 : Pourcentage de cellules positives de yH2AX et taux de H3K9me/3 dans des fibroblastes normaux et SAHF. Ces résultats montrent que les irradiations solaires répétées sur les fibroblastes entraînent l'acquisition d'un phénotype SAHF caractérisé par des modifications chromatiniennes : - augmentation de la forme phosphorylée de l'histone H2 (yH2AX), 25 - augmentation de la di et triméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me2/3). Fibroblastes SAHF +303% 4,76 +335% 11,58 yH2AX H3K9me2/3 Cellules Variation Taux Variation positives (%) SAHF/ H3K9me2/3 SAHF/ normaux (%) (UA) normaux (%) Fibroblastes normaux 2,66 1,18 3025424 14 b) Effet d'un principe actif selon l'invention sur la modification des histones L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula officinalis (principe actif de l'exemple 2) à limiter les modifications chromatiniennes. 5 Pour cela, ont été étudiées sur fibroblastes SAHF : - la phosphorylation de H2AX (yH2AX) par immunocytologie, - la di et triméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 par Western Blot (H3K9me2/3). De plus la phosporylation H2AX (yH2AX) par immunohistofluorescence a également été étudiée sur explants de peaux stressés par des irradiations solaires répétées (SSR). 10 Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Traitement des fibroblastes SAHF A JO, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés et incubés. Pendant plusieurs jours, on réalise une activation du phénotype SAHF par irradiations solaires répétées (SSR) à l'aide d'un simulateur solaire « CPS+». A la fin de l'irradiation, les 15 cellules sont traitées ou non avec le principe actif de l'exemple 2 à 0,10%, 0,25% et 0,50% (V/V). Ensuite, après 24 heures d'incubation : - les cellules sont soit fixées pour l'immunomarquage yH2AX - les cellules sont soit extraites et congelées en attente du Western Blot H3K9me2/3. 20 Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 2 et 3 ci-après : Phosphorylation H2AX Efficacité/ fibroblastes SAHF témoin (%) Cellules positives (%) Fibroblastes normaux Témoin 2,66 Principe actif issu de Calendula officinalis 0,50% 2,08 Fibroblastes SAHF Témoin 11,58 Principe actif issu de Calendula officinalis 0,10% 8,10 -30% Principe actif issu de Calendula officinalis 0,25% 5,73 -51% Principe actif issu de Calendula officinalis 0,50% 4,77 -59% Tableau 2 : Effet d'un principe actif selon l'invention sur la phosphorylation de H2AX de fibroblastes normaux et SAHF. 3025424 15 Taux H3K9me2/3 (UA) Efficacité/ Fibroblastes SAHF témoin (%) Fibroblastes normaux Témoin 1,18 Principe actif issu de Calendula officinalis 0,50% 1,10 Fibroblastes SAHF Témoin 4,76 Principe actif issu de Calendula officinalis 0,10% 3,13 -34% Principe actif issu de Calendula officinalis 0,25% 2,27 -52% Principe actif issu de Calendula officinalis 0,50% 2,21 -54% Tableau 3 : Effet d'un principe actif selon l'invention sur la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 de fibroblastes normaux et SAHF. Traitement des explants de peaux humaines A J0, des punchs de 8 mm de diamètre sont réalisés à partir de plastie humaine et maintenus en survie dans du milieu de culture. Pendant plusieurs jours, on effectue des irradiations solaires répétées (SSR) à l'aide d'un 5 simulateur solaire « CPS+» pendant 30 minutes avec une intensité de 330 W (soit 52 J/cm2). A la fin de l'irradiation, les explants sont traités en topique avec le principe actif de l'exemple 1 formulé à 0,25% et 1% (V/V) ou avec le placebo. Ensuite, les explants sont récupérés 24h après la dernière irradiation et sont fixés, déshydratés et inclus en paraffine. Des coupes (4 um) sont réalisées à l'aide d'un microtome 10 et on réalise un marquage immunohistologique de yH2AX. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4 : 3025424 16 Phosphorylation H2AX Capacité à limiter Cellules positives la phosporylation H2AX (%) (%) Expiants normaux Témoin 0,77 Expiants SSR Témoin 16,51 Placebo 8,88 48% Principe actif issu de Calendula officinalis 0,25% 5,01 73% Principe actif issu de Calendula officinalis 1,00% 3,66 82% Tableau 4 : Effet d'un principe actif selon l'invention sur la phosphorylation de H2AX sur expiants de peaux stressés par des irradiations solaires répétées. Ces différents résultats montrent tout d'abord (tableaux 2 et 3) que testé à 0,50% sur fibroblastes humains SAHF, un principe actif selon l'invention permet de diminuer significativement : - la forme phosphorylée de l'histone H2 de 59%, 5 - la méthylation de la lysine 9 de l'histone 3 de 54%. Ces résultats sont confirmés sur des explants SSR, puisque le principe actif selon l'invention testé à 1% permet de diminuer significativement la forme phosphorylée de l'histone H2 de 82%. Ainsi, en réduisant significativement la phosphorylation de l'histone H2 et la méthylation de 10 l'histone 3, le principe actif selon l'invention limite les modifications de la chromatine induites par le vieillissement. Un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula officinalis est donc capable de maintenir la chromatine active. A.2 - Etude de la régulation du miRnome 15 a) Modélisation L'objectif de cette étude est de caractériser un profil d'expression des miRNA (miRnome) induits par des irradiations solaires répétées (SSR) sur des fibroblastes humains normaux. 3025424 17 Afin de pouvoir cibler les miRNA intervenant dans le modèle SAHF (caractérisation non décrite), il a fallu établir une corrélation entre le profil transcriptomique et le profil miRNA en suivant le design d'étude suivant : - première étape : étude du profil des miRNA sur des fibroblastes SAHF, 5 - deuxième étape : étude du profil des ARNm sur ces mêmes fibroblastes SAHF, - troisième étape : analyses bioinformatiques in silico afin de corréler miRNA/ ARNm, - quatrième étape : vérification et validation par PCR quantitative. Il a pu être mis en évidence que 5 miRNA ont une influence sur le profil d'expression génique dans le modèle des fibroblastes SAHF. 10 Le phénotype SAHF est caractérisé par une modification du miRnome impactant : - sur la chromatine : diminution de l'expression des miR-199a-5p, miR-424-5p régulant HDAC11 et EHMT2 - sur la matrice : * Diminution de l'expression du miR-22-5p régulant MMP1, 15 * Augmentation de l'expression des miR-29a, miR-29b régulant Col1A1, Col5A1 et FBN1. Les résultats des PCR quantitative sur ces miRNA et ARNm confirment les études du miRnome et du transcriptome. b) Effet d'un principe actif selon l'invention sur la régulation du miRNome 20 L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité d'un principe actif selon l'invention (exemple 2) à réguler le miRnome. Pour cela l'expression des miRNA intervenant dans la régulation de la matrice extracellulaire et de la chromatine ainsi que leurs gènes cibles par PCR quantitative ont été étudiées sur fibroblastes SAHF. 25 Le protocole opératoire est décrit en suivant. Traitement des fibroblastes SAHF A JO, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés et incubés. Pendant plusieurs jours, on procède à l'activation du phénotype SAHF par irradiations solaires répétées (SSR) à l'aide d'un simulateur. A la fin de l'irradiation, les cellules sont 30 traitées ou non avec le principe actif selon l'invention à 0,25% et 0,50% (V/V). Ensuite, on récupère des cellules 6h après l'irradiation : les cellules sont récupérées et les ARN totaux (petits et grands) extraits. 3025424 18 PCR quantitative : miRNA Les ARN ont été reverses-transcrits et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. L'expression des miRNA a été étudiée : miR-199-5p, miR-424-5p, miR-22-5p, miR-29a, miR-29b. 5 En parallèle, ont été analysés comme témoins internes de référence pour la normalisation : small nucleolar RNA C/D box 68 (SNORD68), small nucleolar RNA C/D box 96A (SNORD96A), RNA U6 small nuclear 2 (RNU6-2). PCR quantitative : ARNm Les ARN ont été reverses-transcrits et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés 10 par la technique de PCR quantitative. L'expression des ARNm a été étudiée: HDAC11, EHMT2, COL1A1, COL5A1, FBN1, MMP1. En parallèle, les ARNm de la Ribosomal Protein S27 (RPS27), de l'Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), de la Glucuronidase beta (GUSB) comme témoins internes de référence pour la normalisation, ont été analysés. 15 La quantification de l'incorporation de fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l'aide d'un thermocycleur. L'analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l'aide d'un logiciel. Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 5 à 8 ci-après : miR-22-5p Expression de miR-424-5p Expression de miR-199a-5p Expression de (%) miR-22 / Témoin (%) miR-424 / (%) miR-199 / (%) Témoin (%) Témoin (%) Fibroblastes normaux Témoin 100 100 100 Principe actif selon l'invention 0,50% 92 94 105 Fibroblastes SAHF Témoin 79 56 62 Principe actif selon l'invention 0,25% 89 +13% 71 +27% 72 +16% Principe actif selon l'invention 0,50% 93 +18% 77 +38% 81 +31% Tableau 5 : Effet d'un principe actif selon l'invention sur l'expression des miRNA sous-régulés de fibroblastes 20 SAHF. 3025424 19 miR-29a (%) Expression de miR-29b (%) Expression de miR-29b / miR-29a / Témoin Témoin (%) (%) Fibroblastes normaux Témoin 100 100 Principe actif selon l'invention 0,50% 105 105 Fibroblastes SAHF Témoin 117 161 Principe actif selon l'invention 0,25% 115 -2% 161 Principe actif selon l'invention 0,50% 101 -14% 129 -20% Tableau 6 : Effet d'un principe actif selon l'invention sur l'expression des miRNA sur-régulés de fibroblastes SAHF. Col1A1 (%) Expression de Col5A1 (%) Expression de FBN1 (%) Expression de Col1A1 / CoI5A1 / FBN1 / Témoin Témoin (%) Témoin (%) (%) Fibroblastes normaux Témoin 100 100 100 Principe actif selon l'invention 0,50% 97 91 107 Fibroblastes SAHF Témoin 14 14 24 Principe actif selon l'invention 0,25% 18 +29% 17 +21% 31 +29% Principe actif selon l'invention 0,50% 20 +43% 19 +36% 33 +38% Tableau 7 : Effet d'un principe actif sur l'expression des ARNm sous-régulés de fibroblastes SAHF 5 II. B. Tests in vivo B.1 - Description du panel sélectionné et des études in vivo L'objectif de ces études a été d'évaluer in vivo l'effet anti-âge du principe actif selon l'invention formulé à 3% en émulsion après 42 jours d'application sur des volontaires sélectionnés comme faisant « plus âgés que leur âge » et dont l'impact de la composante 10 environnemental au cours de leur vie (évaluée à l'aide d'un questionnaire permettant d'étudier des aspects tels que photoexposition, tabac, habitudes alimentaires, facteur psychosocial...) a été le plus défavorable. Les signes de vieillissement permettant de discriminer des personnes paraissant « plus âgées que leur âge» de personnes paraissant « plus jeunes que leur âge » ont été déterminés à 3025424 20 l'aide d'une étude préalable menée sur deux groupes de volontaires : le premier groupe (11 volontaires) correspondant à des personnes faisant « moins que leur âge », le second groupe (15 volontaires) correspondant à des personnes faisant « plus que leur âge ». Parmi les paramètres étudiés, ceux pour lesquels des différences significatives entre les deux 5 groupes ont pu être observées sont les suivants : Variation groupe faisant plus âgé / groupe faisant plus jeune (%) Paramètres caractéristiques des propriétés biomécaniques de la peau : Tonicité : -47,5% Fermeté : -7,6% Elasticité : -7,3% Paramètres ayant trait au relief des pattes d'oie et du sillon nasogénien : Patte d'oie : +17,5% Sillon nasogénien : +44% Paramètres impliqués dans la notion d'éclat du teint Grain de peau : -15,1% Transparence : -13,9% Rayonnement : -10,4% Couleur rose : -17,0% Effet bonne mine : -12,0% L'étude suivante a été réalisée sur le principe actif selon la présente invention (exemple 2) formulé à 3% en émulsion en comparaison à une émulsion placebo. Les volontaires sélectionnés comme « faisant plus que leur âge » ont été répartis en deux groupes de la façon suivante : 10 - Groupe A - Placebo : groupe de 19 volontaires d'âge compris entre 48 et 62 ans (âge moyen 54 ± 4 ans), ayant appliqué matin et soir la formule placebo en visage entier pendant 42 jours selon la randomisation établie - Groupe B - Principe actif : groupe de 20 volontaires d'âge compris entre 47 et 60 ans (âge moyen 53 ± 4 ans), ayant appliqué matin et soir le principe actif selon 15 l'invention formulé à 3% en émulsion en visage entier pendant 42 jours selon la randomisation établie. Le protocole de l'étude est le suivant. Entre J14 et JO : Applications biquotidiennes d'une crème placebo sur l'ensemble du visage. A JO : 20 - réalisation des mesures des propriétés biomécaniques de la peau à l'aide d'un Cutomètre® au niveau des joues, 3025424 21 - réalisation d'acquisitions en 3D de la patte d'oie par projection de franges au niveau des pattes d'oie, - réalisation de photos numériques, - évaluation de l'éclat du teint par deux jurys expert. 5 Entre JO et J41 : Applications biquotidiennes du placebo ou du principe actif selon l'invention sur l'ensemble du visage. A J42 : - réalisation des mesures des propriétés biomécaniques de la peau à l'aide d'un Cutomètre® au niveau des joues. 10 - réalisation d'acquisitions en 3D de la patte d'oie par projection de franges au niveau des pattes d'oie - réalisation de photos numériques - évaluation de l'éclat du teint par deux jurys expert B.2 - Effet d'un principe actif selon l'invention sur les propriétés biomécaniques 15 de la peau L'objectif de cette étude est d'évaluer, in vivo, l'effet raffermissant d'un principe actif de la présente invention, au niveau des joues, par cutométrie, en comparaison à un groupe placebo. L'évaluation des propriétés biomécaniques de la peau a été réalisée avant et après 42 jours 20 d'applications biquotidiennes du placebo ou du principe actif à l'aide d'un Cutomètre®. L'étude des propriétés biomécaniques de la peau est réalisée à l'aide d'un Cutomètre® au niveau des joues. La peau est aspirée dans l'orifice d'une sonde de diamètre 6 mm par une dépression constante pendant une durée constante. Plusieurs aspirations successives sont effectuées. La profondeur de pénétration de la peau dans la sonde est mesurée par le biais 25 de deux prismes optiques placés à l'ouverture de la sonde (pas de friction, pas d'effet mécanique). A partir des courbes obtenues il est possible de calculer divers paramètres caractéristiques des propriétés biomécaniques de la peau. Parmi les paramètres calculés à partir des courbes obtenues, le paramètre élasticité est retenu pour quantifier l'évolution des propriétés biomécaniques au niveau des joues : 30 - La fermeté de la peau est appréciée par le paramètre RO : RO = Uf 3025424 22 Si -RO augmente, la fermeté de la peau est plus importante. - L'élasticité de la peau est appréciée par le paramètre R5 : Elasticité nette R5 = Ur / Ue Si R5 augmente, l'élasticité de la peau augmente. 5 - La tonicité de la peau est appréciée par le paramètre X : tonicité ou rétractation élastique X = (Uf-Ur) = RO (1-R7) Si -X augmente, la tonicité augmente. Le résumé des résultats obtenus est présenté dans le tableau 11 ci-après : Variation / Placebo (%) Fermeté (paramètre -RO) +7,6% Elasticité (paramètre R5) +11,8% Tonicité (paramètre -X) +12,5% Tableau 11 : Effet d'un principe actif formulé à 3% en émulsion sur les propriétés biomécaniques de la peau au 10 niveau des joues. Comparaison au groupe placebo. On constate que dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison à un groupe placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 3% en émulsion augmente significativement : - Le paramètre -R0, caractéristique de la fermeté de la peau, de 7,6%. Cet effet est validé 15 chez 90% des volontaires entre JO et J42. - Le paramètre R5, caractéristique de l'élasticité de la peau, de 11,8%. Cet effet a été validé chez 90% des volontaires entre JO et J42. - Le paramètre -X, caractéristique de la tonicité de la peau, de 12,5%. Cet effet a été validé chez 95% des volontaires entre JO et J42. 20 B.3 - Effet d'un principe actif selon l'invention sur le relief cutané de la patte d'oie L'objectif de l'étude est d'évaluer in vivo l'effet anti-rides d'un principe actif selon l'invention sur le relief cutané de la patte d'oie par projection de franges, en comparaison à un groupe placebo. 25 Des acquisitions en 3D par projection de franges de la patte d'oie ont été réalisées avant et après 42 jours de traitement biquotidien du placebo ou du principe actif. 3025424 23 Les acquisitions au niveau des pattes d'oie ont été réalisées à l'aide d'un appareil de projection de franges dédié à la mesure 3D du relief cutané. Ce système comprend un capteur de mesure associant un projecteur de franges lumineuses et une caméra CCD haute résolution reliée à un logiciel d'acquisition Optocat. 5 Un système de repositionnement de la tête du volontaire selon les 3 axes de déplacement permet de retrouver la même zone de mesure aux différents temps de l'étude. L'effet du produit est mesuré sur une région d'intérêt de 18X18mm découpée automatiquement sur l'acquisition originale. Le microrelief de la peau est étudié par deux paramètres de rugosité en 3D 10 ^ Sq : moyenne quadratique de rugosité de surface. ^ Sa : moyenne arithmétique de rugosité de surface. Le volume de la ride est étudié par un paramètre de volume ^ volume négatif : volume inférieur à la surface de la peau. Une diminution de ces différents paramètres est caractéristique d'un lissage du relief de la 15 surface étudiée et d'une diminution des rides. Un résumé des résultats obtenus est présenté dans le tableau ci-dessous : Variation / Placebo (%) Paramètre Sa -9,0% Paramètre Sq -8,6% Volume négatif -22,6% Tableau 12 : Effet anti-rides d'un principe actif selon l'invention formu é à 3% en comparaison au placebo après 42 jours d'applications biquotidiennes. Comparaison au groupe placebo. Dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison à un groupe placebo, on constate qu'un principe actif obtenu à partir de 20 Calendula formulé à 3% en émulsion : - lisse le relief cutané au niveau des pattes d'oie. En effet, il diminue significativement le paramètre Sa de -9,0%. Cet effet a été validé chez 75% des volontaires entre JO et J42 * le paramètre Sq de -8,6%. Cet effet a été validé chez 70% des volontaires 25 entre JO et J42. 3025424 24 - réduit les rides en permettant une diminution du paramètre volume négatif (- 22,6%). L'étude de la répartition des résultats montre une diminution du volume négatif chez 75% des volontaires entre JO et J42. B.4 - Effet d'un principe actif selon l'invention sur le relief cutané du sillon 5 nasogénien L'objectif de l'étude est d'évaluer in vivo l'effet anti-rides d'un principe actif selon l'invention, par scorage visuel sur photographies numériques, en comparaison à un groupe placebo. Des photographies, permettant d'évaluer le stade de rides du sillon nasogénien ont été 10 réalisées avant et après 42 jours de traitement biquotidien du placebo ou d'un principe acif selon l'invention. Les photographies, permettant d'évaluer le stade de rides au niveau du sillon nasogénien, ont été prises dans des conditions d'éclairage et de repositionnement. Un jury composé de 3 personnes a évalué ensuite le stade de rides de chaque photo du sillon 15 nasogénien sur une échelle de score préalablement définie sur 6 stades. Selon les recommandations pour l'évaluation du relief du sillon naso-génien sont issues du livre Atlas du vieillissement vol 1 (Bazin R., Editions Med'Com). Les recommandations pour réaliser l'évaluation sont les suivantes : - évaluation de la profondeur du pli entre la base du nez et la commissure des lèvres, 20 correspondant au « trait » au fond du sillon visible sur la photographie. - en cas de double ou de triple plis, choisir le pli le plus important - évaluer le pli et non pas l'ombre créée par le « bombé » de la joue, ni la ptôse de la joue sur le sillon. Une diminution du stade de rides moyen est caractéristique d'une réduction du sillon 25 nasogénien. Un résumé des résultats obtenus est présenté dans le tableau ci-dessous : Variation / Placebo (%) J42 -15,2% Tableau 13 : Effet d'un principe actif formulé à 3% en émulsion sur le stade de rides du sillon nasogénien évalué par scorage visuel sur photographies numériques. Comparaison au groupe au placebo. Dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison à un groupe placebo, on constate qu'un principe actif obtenu à partir de 3025424 25 Calendula officinalis formulé à 3% en émulsion réduit significativement de 15,2% le stade de rides moyen au niveau du sillon nasogénien après une évaluation visuelle réalisée en aveugle sur photographies. Cet effet a été validé chez 55% des volontaires ayant participé à cette étude entre JO et J42. 5 B.5 - Effet d'un principe actif selon l'invention sur l'éclat du teint L'objectif de cette étude est d'évaluer, in vivo, l'effet d'un principe actif selon l'invention, sur l'éclat du teint en comparaison à un groupe placebo. L'évaluation de l'éclat du teint du visage a été réalisée en aveugle, par deux experts entraînés à juger différents paramètres représentatifs de l'éclat du teint, avant et après 42 10 jours d'applications biquotidiennes du placebo ou du principe actif . L'évaluation se fait à partir d'une échelle de scores (de 1 à 10) et les paramètres suivants ont été retenus : - Le grain de peau, en effet l'irrégularité de la surface cutanée est corrélée à l'aspect terne de la peau. 15 - La transparence de la peau permet d'apercevoir les veinules à travers la peau. Plus une peau est fine, plus elle laisse passer la lumière ce qui donne un effet bonne mine. - Le rayonnement de la peau est caractéristique d'un teint éclatant. Plus l'intensité des accroches de lumière sur les zones saillantes du visage est importante plus la peau est lumineuse. 20 - La couleur rose claire permet de caractériser un teint éclatant. Plus le teint est rosé plus il est perçu comme frais. - L'appréciation générale de l'effet bonne mine rend compte de l'homogénéité de couleur et de sa répartition spatiale sur l'ensemble du visage. L'évaluation de ces différents paramètres se fait sur les zones suivantes : 25 Pommettes, Front, Menton, Yeux. 3025424 26 Un résumé des résultats obtenus est présenté dans le tableau ci-dessous : Variation / Placebo (%) Grain de peau +8,3% Transparence +12,3% Rayonnement +10,7% Couleur rose +19,7% Effet bonne mine et bonne santé +11,5% Tableau 14 : Effet d'un principe actif selon l'invention formulé à 3% en émulsion sur les paramètres caractéristiques de l'éclat du teint. Comparaison au groupe placebo. 5 Dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison à un groupe placebo, un principe actif selon l'invention formulé à 3% en émulsion : - Améliore le microrelief cutané en affinant le grain de la peau (+8,3%). Cet effet a été validé chez 80% des volontaires entre JO et J42. 10 - Améliore significativement les paramètres rayonnement et transparence de la peau respectivement de +10,7%, (effet validé chez 95% des volontaires) et de +12,3%, (effet validé chez 70% des volontaires) entre JO et J42. - Augmente significativement la couleur rose, caractéristique d'un teint frais de 19,7% et apporte un effet bonne mine (+11,5%). Cet effet a été validé respectivement chez 80 et 70% 15 des volontaires entre JO et J42. B.6 - Effet d'un principe actif selon l'invention sur la perception de l'âge L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo l'effet du principe actif selon l'invention sur la perception de l'âge des volontaires par un panel d'évaluateurs naïfs, en comparaison à un groupe placebo. 20 Des photographies de face et de profil ont été réalisés dans des conditions standardisées avant et après 42 jours de traitement biquotidien par le Placebo ou par le principe actif selon l'invention A partir de ces photographies, une évaluation de l'âge perçu de chaque volontaire a été réalisée par un panel d'évaluateurs naïfs. 3025424 27 Age Perçu (années) JO J42 Placebo 59 59 Principe actif selon l'invention 3% 59 56 Tableau 15 : Effet du principe actif selon l'invention formulé à 3% sur la perception de l'âge en comparaison au groupe placebo après 42 jours d'applications biquotidiennes. Dans les conditions de cette étude, après 42 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au groupe placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 3% en émulsion permet une amélioration significative de l'âge perçu par un panel d'évaluateurs naïfs. L'ensemble des sujets ayant testé le principe actif selon l'invention a présenté cet effet. 5 Le groupe de volontaires ayant utilisé le principe actif selon l'invention est perçu, en moyenne, plus jeune de 3 ans par rapport à l'âge attribué à ces mêmes volontaires avant traitement. REVENDICATIONS1. Hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis comprenant des oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose et glucose. 2. Hydrolysat selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins 2,5% d'oligosaccharides de degré de polymérisation compris entre 2 et 10 constitués de fructose et glucose. 3. Hydrolysat selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un hydrolysat enzymatique. 4. Hydrolysat selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il ne contient pas de polyphénols ni de terpènes. 5. Hydrolysat selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il contient au moins 13 % de sucres. 6. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir de fleurs de Calendula officinalis, comme produit à application topique sur la peau pour dynamiser l'épigénome dans les cellules de la peau. 7. Utilisation selon la revendication 6, pour réguler les modifications de la chromatine des cellules de la peau. 8. Utilisation selon la revendication 7, pour empêcher les modifications des histones H3K9 et H2AX dans les cellules de la peau. 9. Utilisation selon la revendication 6, pour réguler l'expression des miRNA dans les cellules de la peau. 10. Utilisation selon la revendication 9, pour réguler l'expression des miR-29a, miR29b, miR-22, miR-424, miR-199a dans les cellules de la peau. 11. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que le principe actif ne contient pas de polyphénols ni de terpènes. 12. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le principe actif est un hydrolysat de fleurs de Calendula officinalis. 13. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le principe actif est un hydrolysat enzymatique de fleurs de Calendula officinalis. 14. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le principe actif est un hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 5. 3025424 29 15. Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 0,5% en poids de matière sèche, d'un hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 5. 16. Composition cosmétique selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 0,5 et 10% en poids de matière sèche, d'un hydrolysat selon l'une des 5 revendications 1 à 5. 17. Procédé cosmétique de soin de la peau pour lutter contre les effets du vieillissement cutané, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur la peau un hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 5 ou une composition selon l'une des revendications 15 ou 16. 10 18. Procédé cosmétique de soin de la peau pour augmenter l'élasticité et la tonicité de la peau et/ou lisser le microrelief et/ou améliorer l'homogénéité et le grain de surface de la peau et/ou améliorer l'âge perçu, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer sur la peau un hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 5 ou une composition selon l'une des revendications 15 ou 16.