FR 3016290 A1 20150717 FR 1400059 A 20140113 COMPOSITION AVEC EXTRAITS DE PLANTES POUR LUTTER CONTRE LE VIEILLISSEMENT CELLULAIRE 4 DOMAINE DE L'INVENTION Le champ de cette invention se situe dans la mise au point d'un mélange à partir d'extraits de 8 plantes pour agir directement sur le vieillissement cellulaire, en particulier en facilitant la protection des télomères. Un télomère est une région hautement répétitive, donc non codante, d'ADN à l'extrémité d'un chromosome. À chaque fois qu'un chromosome est dupliqué, le complexe enzymatique de l'ADN 12 polymérase s'avère incapable de copier les derniers nucléotides : l'absence de télomère signifierait la perte rapide d'informations génétiques nécessaires au fonctionnement cellulaire. Il est donc impératif de protéger la partie distale des brins d'ADN car toute altération de cette partie distale, appelée télomère, entraîne un ralentissement dans la périodicité des divisions cellulaires. 16 Les télomères raccourcissent avec l'âge, l'inflammation et le stress. Des études ont montré que des télomères courts sont associés à un risque plus élevé de maladies liées à l'âge. En 1971, le biologiste russe Alekseï Olovnikov émet pour la première fois l'hypothèse que la durée 20 de vie maximale des cellules en culture (limite de Hayflick) est corrélée à la perte progressive de séquences télomériques. En effet, lors de chaque division cellulaire, les télomères s'érodent jusqu'à atteindre une taille critique qui déclenche alors une entrée en sénescence de la cellule. Les télomères agissent comme une horloge biologique régissant la durée de vie des cellules. Cette 24 théorie est connue sous le nom de théorie télomérique du vieillissement. Il prédit également l'existence d'une enzyme capable d'inverser le processus en synthétisant de nouvelles séquences d'ADN télomériques: il s'agit de la télomérase. L'identification de la télomérase est faite en 1985 par Elizabeth Blackburn et Carol Greider. Ce travail est récompensé par le prix Nobel de 28 physiologie ou médecine en 2009. Les télomères comportent des séquences répétitives d'ADN, qui assurent une protection des terminaisons chromosomiques. Ils évitent que le chromosome ne s'effiloche et que son extrémité ne soit considérée comme une rupture du double brin d'ADN, ce qui pourrait conduire à des 32 soudures de chromosomes par fusion de leurs télomères respectifs. De plus, la réplication de l'ADN (par l'ADN polymérase) n'est pas parfaite à ses extrémités: le segment répliqué est en règle générale plus court que l'original. La présence de télomères, sans information génétique, préviendrait ainsi la perte de données. Ces séquences sont répétées plusieurs centaines de fois 36 sur chaque chromosome humain. Les télomérases, enzymes transcriptases inverses spécialisées, assurent la synthèse et la croissance des télomères, chez l'humain et chez la plupart des autres organismes. Ces enzymes sont très actives surtout pour les cellules qui se divisent de nombreuses fois (exemple : les cellules-souches). Ainsi, dans beaucoup de types cellulaires humains, la réplication de l'ADN et l'expression du gène 4 hTERT (Human Telomerase reverse transcriptase), codant la télomérase inverse transcriptase, sont réprimés. De ce fait, les télomères de ces cellules se raccourcissent donc progressivement à chaque division: on dit qu'ils constituent des horloges biologiques. Au contraire, dans les tissus à multiplication cellulaire intense, comme les cellules-souches ou les 8 globules blancs du sang, le gène hTERT est exprimé et la longueur des télomères reste constante. Chez l'humain, la séquence répétitive des télomères est TTAGGG, sur une longueur de 3 à 20 kilobases. De 100 à 300 kilobases supplémentaires de répétition relient le télomère au reste du chromosome. Ces répétitions varient d'une espèce à l'autre mais comportent beaucoup de bases 12 guanine-cytosine. Quand le télomère devient trop court, il ne joue plus son rôle protecteur: la partie enroulée se déroule. La cellule va interpréter ceci comme une corruption de son ADN, entrer en sénescence et 16 stopper sa croissance. De tels télomères trop raccourcis peuvent aussi provoquer une fusion de deux chromosomes. Comme de telles altérations ne sont pas réparables dans les cellules somatiques ordinaires, elles peuvent provoquer une apoptose. Plusieurs maladies du vieillissement (dont la progeria, caractérisée par un vieillissement très 20 précoce) sont provoquées par un raccourcissement télomérique excessif. Les organes se détériorent d'autant plus que leurs cellules constitutives meurent ou entrent en sénescence. Un raccourcissement plus important des télomères serait un marqueur de risque de maladies cardio-vasculaires chez les hommes d'âge moyen. 24 ETAT DE L'ART Il existe sur le marché plusieurs produits qui sont censés favoriser l'activité de la télomérase. Ces 4 produits sont connus sous le nom commercial de CounterAgingWise, SmartCity et Jeunesse (marques déposées). Il n'existe aucun brevet relatif à ces différents produits. L'usage des plantes médicinales au profit d'une meilleure hygiène de vie est connu depuis la plus haute antiquité. Néanmoins la recherche expérimentale est récente et prend sa place au début du 8 20Ieme siècle avec le développement de la biologie moléculaire et de la médecine expérimentale. Au début du siècle dernier, ce furent les vitamines alliées à des antioxydants qui connurent la promotion la plus importante en matière d'additifs alimentaires. En effet, pour favoriser la prolongation de la durée de vie il était recommandé aux gens sains de consommer de fortes doses 12 de vitamines antioxydantes. Depuis, de nombreuses études ont été publiées documentant le rôle des antioxydants dans la protection contre la maladie. Les antioxydants extraits de plantes ont montré des résultats cliniques sur l'homme en matière de prévention des troubles liés à l'âge. C'est dans les années 80 que l'hormone DHEA (Dehydroepiandrosterone), hormone naturelle, a 16 été promue comme protectrice cellulaire contre le vieillissement. Cette hormone est devenue l'un des plus populaires suppléments pour prolonger la durée de vie. Souvent cette hormone a été associée à des vitamines du groupe B pour diminuer le risque de maladie cardiaque et d'accident vasculaire cérébral. De nombreux travaux ont démontré que le prise régulière de vitamine B12, de 20 la Trimethylglycine (TMG) et de vitamine B6 maintenait le niveau d.'Homocystéine à une valeur faible. Cette faible valeur est corrélée à un risque faible d'accident cardiaque et d'accident cérébral. Plus récemment, de nombreux travaux ont montré l'impact du Coenzyme Q10 sur la durée de vie 24 ainsi que sur l'amélioration de l'état de santé de personnes souffrant d'insuffisance cardiaque car ce nutriment améliore sensiblement l'énergie cardiaque de sortie. Il a été également montré que de fortes doses de Q10 contribuent à ralentir considérablement la progression de la maladie de Parkinson. Une percée dans le domaine de la médecine 28 antivieillissement s'est produite en 2006 avec la publication d'une étude montrant que l'Ubiquinol sous forme de Q10 a considérablement ralenti le vieillissement chez la souris. Vers la fin du siècle dernier, suite à de nombreux travaux, la mélatonine, hormone naturelle produite par le cerveau, a été utilisée en tant qu'outil efficace de lutte contre le vieillissement. 32 Très récemment, suite aux progrès dans le domaine de l'ingénierie génétique, la recherche sur le vieillissement s'est portée sur le gène lui-même. La partie distale du brin d'ADN, le télomère, a été identifiée comme directement impliqué dans le processus de vieillissement cellulaire. L'objet de notre invention réside en la mise au point d'un cocktail principalement composé à partir 36 de produits naturels extraits de plantes dont le but est de protéger le télomère contre son propre délitement. Notre composition contribue, comme le montre nos résultats expérimentaux, à maintenir les télomères à leur longueur initiale en référence au début de la prise des extraits de notre composition. Dans la plupart des cas observés nous avons obtenu non pas un maintien de la longueur des télomères mais un allongement de ceux ci. 4 PRESENTATION DES FIGURES EN ANNEXE FIGURE 1 : Mise en évidence de l'allongement de la durée de vie sur des cellules humaines. La population cellulaire traitée avec notre produit présente un taux de mortalité deux fois plus faible que la population témoin. 8 En traits verticaux : population de cellules humaines non soumises au produit En traits horizontaux : population de cellules humaines soumises au produit On constate que la durée de vie des cellules soumises au produit est deux fois plus importante que pour les cellules non traitées. 12 FIGURE 2 : Visualisation des télomères sur une image issue d'un échantillon de cellules humaines (Échantillon référencé 437). Les télomères visualisés sont obtenus par la technique HT Q-FISH (Hybridation quantitative in situ à haut débit de la fluorescence). Cellules sanguines humaines 16 mononuclées (PBMC : Peripheral Mononuclear Cell) ou globules blancs (WBC : White Blood Cell). Les segments apparaissant en clair sont les télomères. FIGURE 3 : Figure montrant l'évolution de la longueur médiane des télomères sur des populations de cellules humaines après une année d'utilisation de notre produit. 20 Après une année d'utilisation du produit, on note une augmentation importante de la longueur médiane des télomères au lieu de la diminution naturelle attendue. En traits horizontaux : longueur médiane des télomères en kilobases sur un groupe de 3 populations de cellules humaines non soumises au produit. Ce résultat sert de comparaison pour 24 le test ayant eu lieu une année plus tard. En traits verticaux : longueur médiane des télomères en kilobases sur un groupe de 3 populations de cellules humaines soumises à notre produit. Ce résultat a été obtenu après 12 mois de traitement. Une augmentation des la longueur médiane des télomères est observée dans les 28 différents groupes. Cet allongement peut atteindre 30 à 50 pour cent de la valeur initiale mesurée un an auparavant. 32 EXPOSE DE L'INVENTION Afin de favoriser l'action de la télomérase, différentes extractions de plantes sont réalisées puis utilisées en composition avec d'autres éléments puis ensuite testées en salle blanche de culture 4 cellulaire. Les cellules utilisées sont issues de fibroblastes pulmonaires de foetus de type MRC-5 (Medical Research Council 5), lot 11D007, en phase de division 32 et génétiquement sélectionnées pour atteindre la phase de division 65. 8 Les composants qui ont été expérimentés puis retenus ont rempli les différentes fonctions suivantes : 1- Un acide aminé essentiel L'acide aminé essentiel, non synthétisé par l'organisme humain, qui a été utilisé est la Lysine. 12 Cet aminoacide est très répandu dans de nombreux végétaux. L'utilisation de la Lysine est réalisée dans un intervalle allant de 0.1 à 30 milligr/kg de poids chez l'adulte 2- Un antioxydant cellulaire. 16 De nombreuses vitamines peuvent entrer dans ce groupe fonctionnel. En particulier la vitamine E. La vitamine E possède de nombreuses fonctions enzymatiques, la fonction « antioxydant » étant la plus importante. D'autres fonctions interviennent dans l'expression des gènes et la fonction neurologique. Comme antioxydant, la vitamine E agit comme un capteur de radicaux libres dans 20 les tissus en réagissant avec eux pour former un radical tocophéryl, qui sera ensuite réduit par un donneur d'hydrogène (tel que la vitamine C) et donc de retour à son état réduit. Étant liposoluble, la vitamine E est incorporée dans les membranes cellulaires, ce qui les protège contre les dommages oxydatifs. L'utilisation de la vitamine E est réalisée dans un intervalle allant de 20 nanogr/kg à 10 24 microgr/kg chez l'adulte. 3- Un protecteur de la synthèse de l'ADN cellulaire 28 La vitamine B9, ou folate, remplit cette fonction de protection. Elle est nécessaire pour la production et l'entretien de nouvelles cellules, pour la synthèse de l'ADN et la synthèse d'ARN, et pour empêcher des changements pouvant survenir à l'ADN. Sa présence est particulièrement importante au cours des périodes de division cellulaire fréquentes et de la croissance, tels que la 32 petite enfance et la grossesse. L'acide folique est nécessaire pour les réactions de méthylation et la synthèse de l'acide nucléique (le plus notable étant la thymine, mais aussi la purine base). Ainsi, la carence en folates empêche la synthèse d'ADN et la division cellulaire, affectant les cellules hématopoïétiques et les tumeurs dues en raison de leur plus grande fréquence de division 36 cellulaire. Les adultes et les enfants ont besoin de folate pour les globules rouges et blancs et prévenir l'anémie. L'utilisation de la vitamine B9 est réalisée dans un intervalle allant de 1 à 50 microgr/kg chez l'adulte. 40 4- Un catalyseur de réactions enzymatiques Le sélénium est un composant de rares acides aminés tels que sélénocystéine et sélénométhionine. Chez les humains, le sélénium est un élément nutritif qui fonctionne comme cofacteur pour la réduction des enzymes anti-oxydantes, telles que le glutathion peroxydase et 44 certaines formes de la thiorédoxine réductase trouvées chez les animaux et certaines plantes. Bien qu'il soit toxique à fortes doses, le sélénium est un oligo-élément essentiel pour les mammifères. L'utilisation du Selenium est réalisée dans un intervalle allant de 0.01 à 1 nanogr/kg chez l'adulte. 4 5- Un acteur de la biosynthèse du coenzyme Q10 La Trimethylglycine est un cofacteur important dans la méthylation, processus qui se produit dans toutes les cellules de mammifères. Ce procédé comprend en particulier la synthèse des neurotransmetteurs tels que la dopamine et la sérotonine. 8 La méthylation est également nécessaire pour la biosynthèse de la mélatonine et de la chaîne de transport d'électrons constituant le coenzyme Q10. L'étape importante dans le cycle de la méthylation est la reméthylation de l'homocystéine, ce qui peut se produire par l'intermédiaire.de l'une des deux voies suivantes: 12 - La voie principale implique la méthionine synthéase de l'enzyme, ce qui dépend aussi indirectement du folate en tant que cofacteur et de diverses autres vitamines du groupe B. - La voie mineure implique la bétaîne-homocystéine méthyltransférase et nécessite la Trimethylglycine comme cofacteur. 16 La Trimethylglycine est un osmolyte organique qui se produit dans des concentrations élevées dans de nombreux invertébrés marins, comme les crustacés et les mollusques. L'utilisation de la Trimethylglycine est réalisée dans un intervalle allant de 50 microgr/Kg à 10 milligr/kg chez l'adulte 20 6- Un acteur favorisant l'activité cellulaire Astragalus Propinquus (appelé également Astragalus Membranaceus) est une plante utilisée 24 depuis la plus haute antiquité en médecine traditionnelle chinoise. Cette plante est connue comme tonique facilitateur de guérison en particulier pour améliorer le fonctionnement des poumons, des glandes surrénales et du tractus gastro-intestinal. Cette plante contribue également à augmenter le métabolisme et à réduire la fatigue. Elle intervient également dans la tonification du système 28 immunitaire. De nombreux produits peuvent être extraits de cette plante, et plus particulièrement des polysaccharides, des saponins (astragalosides aglycone-cycloastragenol), des flavonoïdes, des amino acides (GABA et L-canavanine), et des éléments sous forme de traces : Zinc, fer, 32 cuivre, magnésium, manganèse, calcium, potassium, sodium, cobalt, rubidium, molybdium, chrome, vanadium, étain, argent, pour ne citer que les principaux éléments. L'utilisation du cycloastragenol est réalisée dans un intervalle allant de 1 microgr/Kg à 500 microgr/kg chez l'adulte. 36 L'utilisation de l'astragaloside (I-VII) est réalisée dans un intervalle allant de 5 microgr/Kg à 5 milligr/kg chez l'adulte. A titre d'exemple non limitatif, pour chaque élément décrit ci-dessus, il est possible de choisir le 40 mode d'administration : sous forme de spray, de poudre, de liquide, de tablettes, de capsules gélifiées, de gélules. Pour les groupes décrits ci-dessus il est possible d'utiliser des composés remplissant les mêmes fonctions. 44 Quelques exemples de substitutions possibles : La lysine peut être remplacée par l'un des acides aminés suivants : phenylalanine, valine, threonine, tryptophan, isoleucine, methionine, leucine et histidine. 4 La vitamine E peut être remplacée par l'un des composés entrant dans le groupe des Tocopherols et Tocotrienols. Il y a quatre Tocotrienols: d-alpha, d-beta, d-gamma, et d-delta-Tocotrienol. Le Tocopherol le plus répandu est l'alpha-tocophérol. 8 Les composes suivants peuvent être également utilisés : ascorbate, retinol, ubiquinol. La vitamine B9 peut être apportée par une alimentation riche en épinards (194 microgr/100 gr), des graines séchées de tournesol (227 microgr/100g), des lentilles (479 microgr/100g). Le sélénium peut être apporté par une alimentation riche en noix du Brésil (254 pg/100 g), chair de 12 crabe (84 pg/100 g) La Trimethylglycine peut être apporté par une alimentation riche en Quinoa (Chenopodium quinoa, 630 mg/100g), en betterave (256 mg/100g) 16 Les Astragales sont des plantes de la famille des Fabacées appartenant au genre Astragalus. Le genre Astragalus contient plus de 2500 espèces de plantes. Les racines séchées et broyées de certaines espèces (Astragalus Membranaceus ) apportent de nombreux composés comme l'Astragaloside (I-VII) et le Cycloastragenol. 20 L'ensemble de ces produits énoncés ci-avant a fait l'objet de différents mélanges puis ce mélange a été testé sur des souches cellulaires humaines génétiquement identiques (fibroblastes pulmonaires de foetus de type MRC-5 (Medical Research Council 5), lot 11D007) 24 Les résultats obtenus confirment un allongement de la durée de vie (FIGURE 1) Ces résultats ont été confirmés par des mesures précises de la longueur des télomères. La technique utilisée est l'hybridation quantitative in situ à haut débit de la fluorescence (HT Q- FISH). Ce procédé utilise une sonde d'ADN marquée avec un colorant fluorescent et appliquée sur 28 les noyaux cellulaires en interphase que cela soit sur des sections de tissus (Telomapping), des cellules sanguines ou n'importe quel type cellulaire qui puisse s'attacher sur une lame de lecture pour microscope. Chaque télomère est hybridé avec une sonde télomérique fluorescente. Chaque sonde reconnait 32 un nombre fixe de séquences télomériques (paires de base). Pour cette raison, l'intensité du signal fluorescent des sondes télomériques hybridées est directement proportionnelle à la longueur des télomères. En conséquence, les valeurs de fluorescence sont transformées en valeur de longueur de télomères tout comme le pourcentage de télomères courts dans une population de cellules. 36 (FIGURE 2) Les résultats obtenus (FIGURE 3) confirment l'efficacité de notre produit. Après une année d'utilisation sur un groupe de cellules humaines, la valeur médiane de la longueur des télomères a augmentée alors que l'évolution naturelle liée à l'âge entraîne inévitablement une diminution de 40 cette valeur médiane. REVENDICATIONS4 1- Composition pour lutter contre le vieillissement cellulaire composée de Astragalus Propinquus, de Lysine , de vitamine E et de Sélénium. 2- Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comporte de la vitamine B9. 8 3- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de la Trimethylglycine. 4- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de la Lysine dans une proportion comprise entre 200 microgr et 3 12 milligr/Kg de poids chez l'adulte 5- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de la Vitamine E dans une proportion comprise entre 0.125 à 0.95 microgr/Kg de poids chez l'adulte 16 6- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de la Vitamine B9 dans une proportion comprise entre 2 à 15 microgr/Kg de poids chez l'adulte 7- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce 20 qu'elle comporte de la Trimethylglycine dans une proportion comprise entre 0.2 à 2 milligr/Kg de poids chez l'adulte 8- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte du Sélénium dans une proportion comprise entre 0.025 à 0,15 nanogr/Kg 24 de poids chez l'adulte 9- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de l'Astragalus Propinquus dont le composé Cycloastragenol se situe dans une proportion comprise entre 10 à 150 microgr/Kg de poids chez l'adulte 28 10- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte de l'Astragalus Propinquus dont le composé Astragaloside se situe dans une proportion comprise entre 100 à 1500 microgr/Kg de poids chez l'adulte 32