FR 3015521 A1 20150626 FR 1363547 A 20131224 PROCEDE DE DETERMINATION DU GRADE D'AGRESSIVITE CELLULAIRE DE CELLULES CANCEREUSES OU DE CELLULES SOUCHES CANCEREUSES La présente invention concerne un procédé de détermination du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de cellules souches cancéreuses. En dehors de l'examen visuel des cellules, les praticiens sont relativement démunis pour déterminer le grade d'agressivité de cellules cancéreuses. II n'existe pas actuellement de marqueurs liés à l'agressivité de cellules cancéreuses, du moins pas de marqueurs de certitude permettant de déterminer l'agressivité de cellules cancéreuses. Pour la suite de la description, on utilisera le terme "grade" pour le niveau d'agressivité de la cellule tumorale et le terme "stade" pour le niveau d'agressivité et d'organisation au niveau tissulaire. On sait que les tumeurs cancéreuses sont classées suivant plusieurs catégories reposant sur la classification TNM, du stade tumoral le moins agressif au stade tumoral le plus agressif. Dans le cas du cancer colorectal, il existe cinq (5) stades : Stade 0 : la tumeur est superficielle et n'envahit pas la sous-muqueuse, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase à distance. Stade I : la tumeur envahit la sous-muqueuse ou la couche musculaire de la paroi du côlon ou du rectum, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase. Stade II : les cellules cancéreuses ont traversé plusieurs couches de la paroi du côlon ou du rectum, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints, pas de métastase à distance. Stade III : les cellules cancéreuses ont envahi les ganglions lymphatiques proches de la tumeur. Stade IV : le cancer s'est propagé au-delà du côlon ou du rectum vers des organes éloignés. Le stade le plus agressif est celui qui correspond à la formation de métastases. De ce fait, l'examen visuel consiste à analyser les anomalies de morphologie des cellules, ce qui est une méthode pour le moins laborieuse, très chronophage qui ne peut en aucun cas être automatisée. Le coût résultant est nécessairement très élevé. On comprend donc qu'il puisse y avoir un besoin crucial d'un procédé alternatif. Une publication "Label-free colorectal cancer line bio-sensing using RF resonator" XLIM UMR 7252 CNRS/ Université de Limoges, Homéostasie Cellulaire et Pathologies EA3842, Université de Limoges, ONCOMEDICS Juin 2013, mentionne l'utilisation de micro-capteurs électromagnétiques micro-ondes, résonnants, permettant de déterminer l'agressivité de cellules cancéreuses à partir de valeurs de mesure des propriétés diélectriques des cellules grâce à ces micro-capteurs. Cette analyse par spectroscopie diélectrique à l'échelle de la cellule est basée sur l'utilisation de la différence de fréquence de résonnance de ces micro-capteurs lorsqu'ils sont vierges de toute cellule et lorsqu'une cellule ou quelques cellules reposent sur ledit micro-capteur. On note que cette analyse ne requiert aucun marquage préalable des cellules. II faut indiquer que les ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes, utilisées pour interroger les cellules, conduisent à un résultat discriminant du fait que les cellules cancéreuses étudiées présentent une forte permittivité vis-à-vis de ces ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes. En effet, la conductivité et la permittivité d'une cellule normale sont inférieures à celle d'une cellule cancéreuse. Ces variations de la fréquence de résonnance et donc des réponses des micro-capteurs sont notamment liées à la taille des cellules, au volume et à la permittivité du contenu intracellulaire, à la concentration en ions significatifs comme les ions potassium, sodium, calcium, et à la quantité de chromatine dans le noyau par rapport au volume cellulaire. Néanmoins, la difficulté de mise en oeuvre du procédé réside dans le fait que la mesure à l'aide de micro-capteurs électromagnétiques fonctionnant en résonateur nécessite un nombre de cellules très limité. Or, tout procédé de détermination du grade d'agressivité d'une cellule avec une visée industrielle et commerciale nécessite une reproductibilité, une qualité et des mises en oeuvre simples et rapides en comparaison avec un procédé de laboratoire de recherche. C'est le but de la présente invention qui propose un procédé de détermination du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de cellules souches cancéreuses qui répond aux besoins d'analyses en nombre. A cet effet l'invention vise un procédé de détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins les étapes suivantes : a. Dissociation de l'amas cellulaire constituant l'échantillon en une suspension de cellules isolées, intègres et viables, b. Tri macroscopique des cellules pour obtenir des sous-populations homogènes, c. Calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant à sa fréquence de résonnance propre, d. Présentation des cellules dissociées et triées selon les étapes a. et b. sur le au moins un capteur préalablement calibré, e. Interrogation du au moins un capteur et détermination de la nouvelle fréquence de résonnance dudit au moins un capteur ayant reçu les cellules, f. Calcul de la variation de permittivité diélectrique globale des cellules en fonction de la variation de la fréquence de travail, qui constitue leur signature électromagnétique. L'invention est maintenant décrite en détail. Le procédé d'analyse sur des biocapteurs électromagnétiques résonnants nécessite la préparation des cellules à partir d'un échantillon de tissu vivant prélevé. Cet échantillon doit être conservé entre 2 et 8°C, dans un milieu adapté et on connaît à cet effet notamment une composition commercialisée sous la dénomination OncoWave-Via, de la société Oncomédics (France). En effet, il faut pouvoir dissocier les cellules afin d'obtenir des cellules individualisées car les biocapteurs visent des mesures à l'échelle monocellulaire voire à l'échelle de quelques cellules, le nombre étant inférieur à 10 pour donner un ordre d'idée. L'étape de dissociation consiste préférentiellement à réaliser au moins une dissociation mécanique et une dissociation enzymatique. La dissociation mécanique consiste en particulier à couper l'échantillon prélevé en des fragments tissulaires de 1 à 3 mm3 environ préférentiellement d'une taille inférieure à 2 3 mm. La dissociation enzymatique est préférentiellement réalisée à l'aide d'au moins deux enzymes. Elle peut consister à plonger ces fragments dans une solution de dissociation, telle que la solution commercialisée sous la dénomination OncoWava-Diss, société Oncomédics (France). Préférentiellement la dissociation enzymatique est réalisée à l'aide d'au moins : la collagénase de type Il : Cette enzyme assure un clivage des liaisons peptidiques des protéines de collagène en dégradant la matrice extracellulaire et en libérant les cellules dans le milieu environnant, et/ou la trypsine qui est une endoprotéase aspécifique qui dégrade indifféremment les protéines qu'elle rencontre et renforce l'action de la collagénase. Cette endoprotéase assure aussi l'individualisation des cellules à partir des éventuels amas de cellules non individualisées, générés par la collagénase, ceci en coupant les liaisons directes cellule-cellule. Une telle dissociation est obtenue en 1 à 2 heures pour donner un ordre d'idée. La solution est ensuite préférentiellement filtrée à l'aide d'un tamis cellulaire de 40um afin d'éliminer les fragments tissulaires non digérés par l'action enzymatique. Une solution inhibitrice, notamment de la trypsine, permet de stopper la dissociation et de préserver les cellules et plus particulièrement d'éviter de dégrader la membrane. Le filtrat est ensuite centrifugé afin de récupérer le culot cellulaire. On note que 80% des cellules environ sont ainsi conservées vivantes. Une fois les cellules isolées, après l'étape de dissociation, il convient de trier les cellules tumorales hétérogènes en fonction de leurs propriétés physico-chimiques intrinsèques, en particulier la taille, la densité, la forme ou la déformabilité. Il est nécessaire que ce tri soit obtenu sans marquage immunologique fluorescent ou magnétique, susceptible de modifier l'état d'activation cellulaire. Le tri est donc préférentiellement réalisé par la méthode SdFFF (Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation). Cette méthode et le dispositif nécessaire pour sa mise en oeuvre sont amplement décrits dans la thèse du 28 septembre 2007, Gaëlle BEGAUD, ayant pour sujet : "Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation : applications au tri cellulaire dans le domaine de l'oncologie", p 84-92 et dans le brevet EP 1 679 124. Les populations de cellules conservent leur viabilité et leur intégrité. Les fractions cellulaires obtenues sont homogénéisées. Après cette étape b. de tri macroscopique des cellules, le procédé comprend une étape c. de calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant de sa fréquence de résonnance propre. Les capteurs de permittivité diélectrique utilisés sont des biocapteurs électromagnétiques résonnants de géométries planaires et de dimensions millimétriques. Ces capteurs sont réalisés en recourant aux substrats utilisés en microélectronique, notamment des plaques de silice de 500 iim d'épaisseur. Un mince film métallique d'or, d'une épaisseur très faible de 4 à 5 iim d'épaisseur pour préciser la plage de valeurs, défini par gravure chimique permet de réaliser le circuit résonnant, inductance associée en parallèle avec une capacité, muni d'électrodes inter-digitées. L'or est utilisé pour son excellente conductivité électrique, pour sa stabilité face à l'oxydation et pour sa biocompatibilité. Les espaces inter-digités du circuit reçoivent lesdites cellules. Des revêtements polymères biocompatibles peuvent être déposés sur les capteurs, autour de leurs électrodes afin de délimiter des chambres d'analyse, de taille microscopique destinées à recevoir les cellules afin qu'elles réagissent avec ledit capteur. En fonction de la géométrie du capteur, il convient de déterminer la fréquence de résonnance pour laquelle le biocapteur présente un maximum d'absorption de puissance des ondes électromagnétiques du spectre micro-ondes utilisées qui l'interroge. On constate que lorsque des cellules sont présentes sur le biocapteur, la valeur de cette fréquence de résonnance est modifiée. Le décalage de la résonnance est rapporté au nombre de cellules en présence, au volume de ces cellules et aux propriétés diélectriques de ces cellules pour définir une valeur reproductible. Le volume des cellules peut être déterminé par des moyens disponibles dans le commerce 25 comme un compteur de la marque BECKMAN Coulter. En utilisant plusieurs capteurs opérant à différentes fréquences, on peut alors reconstituer une signature électromagnétique, du type cellulaire, analysé par les capteurs. Ainsi, il est possible de recourir à des capteurs ayant une fréquence de résonnance fixe, unique, dans une plage comprise entre 1 et 40 GHz, de préférence entre 5 et 14 GHz. La 30 périodicité des mesures est de l'ordre de 500 MHz à 1 GHz. Néanmoins, pour obtenir une signature plus précise, plus complète, il est possible de recourir à des capteurs électromagnétiques ayant des moyens de réglages de leur fréquence de résonance dans une plage donnée. De tels capteurs sont munis chacun de façon connue d'un composant d'accord, par exemple une diode ou une capacité variable ou encore une banque de capacités commutables, montée en parallèle avec la capacité du résonateur, ledit composant d'accord étant alimenté avec une tension externe. La fréquence utilisée peut ainsi être ajustée en continu pour déterminer les propriétés des cellules analysées sur un spectre continu de fréquences. La détermination des propriétés des cellules est préférentiellement réalisée de la façon maintenant décrite. Au moins une cellule étant déposée dans les espaces inter-digités du circuit, il y a modification de la réponse du capteur résonnant. Les réponses du biocapteur ne permettent pas de déterminer si ce sont le cytoplasme, les concentrations en protéines, les propriétés propres du noyau ou les organelles qui en sont la cause mais il y a détermination des propriétés diélectriques moyennes des cellules qui ont été triées pour déterminer une population homogène. La détermination de la permittivité cellulaire est établie à partir d'un modèle mathématique dans lequel la cellule est assimilée à une particule diélectrique uniforme disposée entre deux électrodes. Chaque cellule agit ainsi comme un élément capacitif supplémentaire C'ii qui augmente la valeur capacitive initiale du capteur. Dans le cas de plusieurs cellules, il y a cumul. Le résonateur LC voit sa fréquence varier de fo, capteur sans cellule, à f1, capteur avec au moins une cellule : 1 fo = 27r-vrL Co 1 fl = _ f 2ff y L Ci Avec C1 = Co + E c'ii et Co et C1 qui représentent les capacités équivalentes d'un capteur sans cellule et avec cellule, on peut déterminer la capacité totale pari la formule : L Ccell - Ncell - Ccell = COU) -1 i)( fo + fi) /12 Ncell représente le nombre de cellules sur le biocapteur. Pour tenir compte du volume des cellules V'ii et si l'on poursuit avec le modèle qui prévoit que chaque cellule complète l'espace WIDC entre deux électrodes alors la permittivité est donnée par la formule suivante, E0 étant la permittivité effective du vide : Ecell = (Ccell -WIDC) I (E0 - Vcell - Ncell) La permittivité de la cellule est ainsi déterminée par la formule de calcul suivante : Ecell - CO -WI2DC ((f0 - h)( f0 + 1.1) I (f12 - E0 - 1/cell - Ncell) Cette formule requiert une puissance de calcul très limitée comparée à celle recourant à des simulations avec des calculs par éléments finis. Les caractérisations sont donc obtenues plus rapidement et plus facilement qu'avec un calcul basé sur une modélisation par éléments finis. On peut donc ainsi déterminer la permittivité des cellules d'un même type et obtenir une signature spécifique correspondant aux différents grades d'agressivité cellulaire en analysant un échantillon prélevé, conservé vivant. On détermine ainsi la permittivité diélectrique des cellules essentiellement à partir des paramètres suivants : nombre de cellules analysées, volume des cellules et décalage de fréquence entre la fréquence de résonnance propre du biocapteur et la fréquence de résonnance mesurée lorsque les cellules ont été déposées dans les électrodes. II est aussi possible de prévoir des analyses avec des capteurs de types différents, non plus de façon statique (cellules déposées ou maintenues figées sur le biocapteur) mais de façon dynamique (cellules se déplaçant dans un flux). Dans ce cas, il est prévu des micro-canaux fluidiques qui permettent de présenter les cellules individuellement aux biocapteurs. Ces cellules sont transportées dans un milieu support approprié jusqu'aux électrodes de détection des biocapteurs. La population est analysée de façon dynamique à la manière d'un cytomètre en flux. Il est aussi prévu un kit associé pour la détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins : - Solutions de conservation et de transport de l'échantillon biologique après prélèvement constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques. - Compositions du milieu de dissociation enzymatique de l'échantillon biologique constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques et d'enzymes - Consommables pour le tri cellulaire macroscopique de l'échantillon biologique par Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation, SdFFF, - Au moins un biocapteur, - Composition pour accueillir les cellules et les présenter au au moins un biocapteur. Le procédé selon la présente invention permet ainsi de déterminer le grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide, sans modification des cellules par un marquage notamment sans marquage immunologique fluorescent ou magnétique, susceptible de modifier l'état d'activation cellulaire. REVENDICATIONS1. Procédé de détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins les étapes suivantes : a. Dissociation de l'amas cellulaire constituant l'échantillon en une suspension de cellules isolées intègres et viables, b. Tri macroscopique des cellules pour obtenir des sous-populations homogènes, c. Calibration d'au moins un capteur électromagnétique micro-ondes résonnant à sa fréquence de résonnance propre, d. Présentation des cellules dissociées et triées selon les étapes a. et b. sur le au moins un capteur préalablement calibré, e. Interrogation du au moins un capteur et détermination de la nouvelle fréquence de résonnance dudit au moins un capteur ayant reçu les cellules, f. Calcul de la variation de permittivité diélectrique globale des cellules en fonction de la variation de la fréquence de travail, qui constitue leur signature électromagnétique. 2. Procédé de détermination selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a. de dissociation comprend au moins une dissociation mécanique et une dissociation enzymatique. 3. Procédé de détermination selon la revendication 2, caractérisé en ce que la dissociation mécanique consiste à réaliser des fragments tissulaires d'une taille inférieure à 2 mm3. 4. Procédé de détermination selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la dissociation enzymatique est réalisée avec au moins deux enzymes. 5. Procédé de détermination selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la dissociation enzymatique est réalisée avec la collagénase et/ou la trypsine. 6. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tri macroscopique de l'étape b. est réalisé par Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation. 7. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise plusieurs capteurs travaillant à différentes fréquences. 8. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise des capteurs à fréquence de résonnance ajustable de façon à limiter le nombre de capteurs à utiliser. 9. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on travaille dans une bande passante de fréquences comprises entre 1 et 40 GHz. 10. Procédé de détermination selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on travaille dans un spectre de fréquences comprises entre 5 et 14 GHz. 11. Procédé de détermination selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on détermine la permittivité diélectrique des cellules à partir des paramètres suivants : nombre de cellules analysées, volume des cellules et décalage de fréquence entre la fréquence de résonnance propre et la fréquence de résonnance mesurée à l'étape e. 12. Procédé de détermination selon la revendication 11, caractérisé en ce que la permittivité d'un type de cellule est obtenue par la formule suivante : Eceu = Co - 1/17/2DE (fo - )( fo + f1) (fi2 - Eo - Vcell - N cell ) Avec : fo = 1 27rVIC0 fl = r = cao - fi)( fo + fi) fi2 2nv L : C1 = Co E Ccell E Ccell = Ncell - Ccell N cell représente le nombre de cellules sur le biocapteur : C0 et C1 capacités d'un capteur sans et avec au moins une cellule : . E0 la permittivité du vide 13. Kit pour la détermination in vitro du grade d'agressivité cellulaire de cellules cancéreuses ou de détection de cellules souches cancéreuses dans un échantillon cellulaire provenant d'un tissu solide soupçonné d'être cancéreux, comprenant au moins : - Solutions de conservation et de transport de l'échantillon biologique après prélèvement constituées notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques. - Compositions du milieu de dissociation enzymatique de l'échantillon biologique constituées de notamment de nutriments organiques et inorganiques sous forme de sels, d'acides aminés, d'acides gras, de peptides, de protéines et lipoprotéines, de carbohydrates de systèmes tampon pour le maintien du pH et d'éléments trace métalliques et d'enzymes - Consommables pour le tri cellulaire macroscopique de l'échantillon biologique par Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation, SdFFF, - Au moins un biocapteur, - Composition pour accueillir les cellules et les présenter au au moins un biocapteur.