FR 3021668 A1 20151204 FR 1454944 A 20140530 1 AUGMENTATION DE LA RECOMBINAISON MEIOTIQUE CHEZ LES PLANTES PAR INHIBITION D'UNE PROTEINE RECQ4 OU TOP3A DU COMPLEXE RTR La présente invention est relative à une méthode pour augmenter la recombinaison méiotique chez les plantes. La recombinaison méiotique est un échange d'ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle intervient pendant la prophase de la première division méiotique. Un des produits de la recombinaison est le crossing-over, qui entraine un échange réciproque de continuité entre deux chromatides homologues. Cette prophase (prophase I) comprend 5 stades successifs : leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Au leptotène les chromosomes s'individualisent, chaque chromosome étant formé de deux chromatides soeurs issues de la duplication intervenue préalablement à la prophase. Durant le zygotène, les chromosomes homologues s'apparient, formant une structure appelée « bivalent » qui contient quatre chromatides, deux chromatides soeurs maternelles et deux chromatides soeurs paternelles, homologues des chromatides maternelles. Au pachytène les chromosomes sont totalement appariés, et des nodules de recombinaison se forment entre les chromatides homologues étroitement reliées entre elles par le complexe synaptonémal (SC) ; au diplotène, le SC se dissocie progressivement, et les chromosomes homologues commencent à se séparer, mais restent joints au niveau des chiasmas, qui correspondent aux sites de crossing-overs (COs). Les chromosomes se condensent au cours de la diacinèse ; les chiasmas subsistent jusqu'a la métaphase I pendant laquelle ils maintiennent l'appariement des bivalents de part et d'autre de la 2 0 plaque équatoriale. La recombinaison méiotique est déclenchée par la formation de cassures double-brin (CDB) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, et résulte de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue. 2 5 La recombinaison méiotique a pour conséquence de provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la diversité génétique. Elle présente donc un intérêt particulier dans les programmes d'amélioration des plantes (Wijnker & de Jong, Trends in Plant Science, 2008, 13, 640-646 ; Crismani et al., Journal of Experimental Botany, 2013, 64, 55-65). 30 Notamment, la possibilité d'augmenter le taux de recombinaison peut permettre d'obtenir 3021668 2 de nouvelles combinaisons de caractéristiques ; elle peut permettre aussi de faciliter l'introgression de gènes d'intérêt d'une lignée à l'autre, ainsi que la cartographie génétique et le clonage positionnel de gènes d'intérêt. Diverses méthodes pour contrôler la recombinaison méiotique ont été 5 proposées, basées sur la sur-expression ou l'extinction de l'un ou l'autre des très nombreux gènes identifiés comme étant impliqués ou potentiellement impliqués dans ce mécanisme. Par exemple, la Demande PCT WO/0208432 propose la surexpression de la protéine RAD51, qui est impliquée dans la recombinaison homologue, pour stimuler la recombinaison méiotique ; la Demande US 2004/023388 propose de surexprimer un 10 activateur de la recombinaison méiotique choisi parmi : SP011, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DMC1, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, une résolvase, une protéine liant l'ADN simple brin, une protéine impliquée dans le remodelage de la chromatine, ou une protéine du complexe synaptonémal, pour augmenter la fréquence de recombinaison entre chromatides 15 homologues ; la Demande PCT WO 200/4016795 propose d'augmenter la recombinaison entre chromosomes homologues en exprimant une protéine SPO1 1 fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN ; la Demande PCT WO 03/104451 propose d'augmenter le potentiel de recombinaison entre des chromosomes homologues par la surexpression d'une protéine (MutS) impliquée dans la réparation des mésappariements ; La Demande PCT WO 2010/071418 propose de réduire l'expression ou l'activité de la protéine RecQl5 (RECQ5). Cependant, dans la plupart des cas, l'effet de ces gènes candidats sur la formation de COs méiotiques in planta n'a pas été confirmé, et il est donc nécessaire d'identifier d'autres gènes intervenant dans ce phénomène. L'un des facteurs connus pour agir sur le taux de recombinaison méiotique est le phénomène d'interférence: la formation d'un CO à un endroit du chromosome inhibe la formation d'autres COs à proximité. Toutefois, il a été montré qu'il existait en fait 2 voies distinctes de formation des COs méiotiques (Hollingsworth & Brill, Genes Dev., 2004, 18,117-125; Berchowitz & Copenhaver, Current genomics, 2010, 11, 91-102). La première génère des COs interférents dénommés COs de type I (COI), et fait intervenir un ensemble de gènes collectivement désignés sous les appellations de gènes ZMM (ZIP1, ZIP2/SHOC1, ZIP3, HETI 0, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5, PTD) ainsi que les protéines MLH1 et MLH3 ; la seconde voie génère des COs non-interférents, dénommés COs de type II (COII), et dépend du gène MUS81. 3021668 3 L'utilisation de l'une et/ou l'autre de ces deux voies est variable d'un organisme à l'autre. Chez les végétaux supérieurs, représentés par la plante modèle Arabidopsis thaliana, les 2 voies coexistent, celle des COs de type I étant prédominante ; il a été observé que l'inactivation des gènes AtMSH4, AtMSH5, AtMER3, SHOC1, PTD, 5 AtHEI10 ou AtZIP4 induisait jusqu'à 85% de réduction de la fréquence des COs (Higgins et al., Genes Dey., 2004, 18, 2557-2570; Mercier et al., Curr. Biol., 2005, 15, 692-701; Chelysheva et al., PLoS Genet. 2007, 3, e83 ; Higgins et al., Plant J., 2008, 55, 28-39 ; Macaisne et al., Current Biology, 2008, 18, 1432-1437; Wijeratne et aL, Molecular Biology of the Cell, 2006, 17, 1331-43; Chelysheva et al., PLoS Genetics, 2012, 8, 10 e1002799). Certains chromosomes homologues ne sont de ce fait plus appariés sous forme de bivalents, mais apparaissent sous forme d'univalents. Cette diminution du nombre de bivalents s'accompagne d'une forte réduction de la fertilité. Précédemment, les Inventeurs ont identifié un gène, dénommé FANCM (pour « Fanconi Anemia Complementation Group M») dont l'inhibition compensait les 15 effets de celle d'AtMSHS, de SHOC1, ou d'AtZIP4 et permettait d'augmenter le nombre de COs méiotiques (Demande PCT WO 2013/038376 ; Crismani et al., Science 2012, 336, 6088, 1588-90). En poursuivant leurs recherches, les Inventeurs ont maintenant identifié deux autres gènes dont l'inhibition produit des effets similaires à celle de FANCM. 20 Il s'agit des gènes TOP3A (pour ADN TOPOISOMERASE III alpha) et RECQ4 codant pour deux des protéines du complexe RTR. Le complexe RTR est un complexe conservé, constitué d'une hélicase de la famille RecQ, d'une ADN Topoisomérase III (Topoisomérase de type I, sous-type IA) et d'une protéine structurale de la famille RMI1. Ce complexe, qui est impliqué dans la 25 résolution des intermédiaires de recombinaison de l'ADN chez tous les eucaryotes, est essentiel pour le maintien de l'intégrité du génome(Mankouri et Hickson, Trends Biochem Sci., 2007, 32, 538-46). Les hélicases de la famille RecQ sont des protéines impliquées dans le maintien et la stabilité du génome chez tous les organismes tels que les bactéries, les 30 levures, les animaux et les plantes. Chez les eucaryotes, le nombre de gènes RecQ (ou RECQ) et la structures des protéines RecQ (ou RECQ) varient énormément entre les organismes. Chez Arabidopsis thaliana, on dénombre 7 gènes RECQ dont AtRECQ4A qui code pour une protéine homologue à l'hélicase RecQ d'Escherichia coli, Sgsl de levure et 3021668 4 BLM humaine (Hartung F. et Puchta, H., J. Plant. Physiol., 2006, 163, 287-296 ; Hartung et al., Nucleic Acids Res., 2000, 28, 4275-4282). Le gène AtRECQ4B, un paralogue d'AtRECQ4A issu probablement d'une duplication génique survenue uniquement chez les Brassicacae, code pour une protéine qui présente 70 % d'identité avec AtRECQ4A 5 (Figure 1). Les protéines AtRECQ4A et AtRECQ4B comprennent 3 domaines conservés ; un domaine hélicase, qui est le plus important, et comprend huit motifs (0, I, la, II, III, IV, V et VI), d'une longueur totale d'environ 300 à 450 acides aminés, contenant les séquences nécessaires pour la liaison de l'ATP, l'hydrolyse et le déroulement de l'ADN (NCBI cd00079 et cd00046) ; un domaine RQC (smart00956), conservé chez presque toutes les 10 protéines RECQ ; un domaine HRDC (pfam00570), conservé chez plus de 50 % des protéines RECQ et également en C-terminal de la RNase D. Alors que chez la levure S. cerevisiae, la recombinaison méiotique est augmentée en l'absence de l'hélicase Sgsl d'un facteur 1.17-1.6 (Jessop et al., PLoS Genetics, 2006, 2, e155 ; Oh et al., Cell, 2007, 130(2), 259-272), la mutation d'AtRECQ4A 15 (recq4a-5/SALK_069672) ou AtRECQ4B est décrite comme ne produisant aucun effet significatif sur la formation de COs méiotiques (Higgins et al., The Plant Journal, 2011, 65, 492-502). Il a notamment été observé que la mutation de d'AtRECQ4A (recq4a5/SALK_069672) ou d' AtRECQ4B était incapable de restaurer la fertilité et la formation de bivalents chez un mutant msh4 de la souche Columbia. En revanche, il a été suggéré que 20 RECQ4A jouait un rôle dans le maintien des télomères, un rôle dans l'intégrité du génome, auparavant inconnu pour une protéine de la famille RecQ. La protéine AtTOP3A (TOP3a, TOP3, Top3a, Top3 alpha, TOP3 alpha ou TOP3a, pour ADN TOPOISOMERASE III alpha ou ADN TOPOISOMERASE 3-alpha) contient 4 domaines conservés: dans sa région N-terminale, un domaine TOPRIM 25 (NCBI cd03362) et un domaine ADN Topoisomerase de sous-type IA (NCBI cd00186), tous deux conservés chez tous les homologues de TOP3 ; dans sa région C-terminale, deux domaines en doigt de zinc (pfam01396 et pfam06839) , qui sont conservés chez les plantes et les animaux mais pas chez les levures (Figure 2). Deux allèles mutants de top3a (top3a-1 and top3a-2) ont précédemment 30 été décrits chez Arabidopsis (Hartung et al., PLoS Genet., 2008, 4, el 000285, Hartung et al., PNAS 2007, 104, 47, 18836-41 ). La mutation top3a-1 est vraisemblablement nulle étant donné qu'elle conduit à une létalité précoce au cours du développement. Le second allèle, top3a-2, est un mutant hypo morphe qui est viable mais montre des défauts de 3021668 5 croissance somatique, et est complètement stérile (Hartung et al., PLoS Genet., 2008, 4, e1000285). Les phénotypes sévères associés à l'inactivation de TOP3A chez Arabidopsis et des espèces variées (Goodwin et al., Nucleic Acids Res., 1999, 27, 4050-8; Kim et al., Nucleic Acids Res., 2000, 28, 2012-7; Li et Wang, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1998, 5 95, 1010-3 Plank et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 3564-73) soulignent un rôle essentiel de TOP3A dans la résolution des intermédiaires mitotiques et méiotiques de réparation de l'ADN mais ne suggèrent pas une activité anti-CO méiotique de cette protéine. Au contraire, comme démontré dans la présente invention, l'inhibition des gènes AtRECQ4A et AtRECQ4B ou TOP3A augmente le nombre de COs méiotiques, 10 et ce non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes de type sauvage pour les gènes ZMM. En effet, les inventeurs ont montré que l'inhibition d' AtRECQ4A et d' AtRECQ4B compense les effets de celle d' AtMSH4 ou d' AtZIP2/SHOC1 et permet d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm 15 Atmsh4-/- et shocl-/-. L'inhibition de TOP3A compense les effets de celle d'AtHEI10 ou d' AtMSH5 et permet d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm Athei10-/-et Atmsh5-/- . Les Inventeurs ont également découvert que les effets de l'inhibition du 20 gène TOP3A ou RECQ4 sur l'augmentation du nombre de COs méiotiques se produisaient non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes possédant des gènes ZMM fonctionnels. Les protéines FIDG appartiennent à la famille des AAA-ATPases (ATP- ases Associated with various Activities), et plus particulièrement au sous-groupe 7 (Beyer, 25 Protein Sci., 1997, 6, 2043-58 ; Frickey & Lupas, J. Struct. Biol., 2004,146, 2-10,). Un seul représentant de cette famille a été identifié dans le génome de la plupart des plantes. Les protéines FIDG présentent deux domaines protéiques conservés : un domaine AAAATPase, avec un rôle putatif d'hydrolyse de l'ATP ; ainsi qu'un domaine VSP4, connu pour jouer un rôle important dans la liaison aux microtubules. Ces deux domaines sont 30 respectivement répertoriés sous les références PF00004 et PF09336 dans la base de données PFAM (Punta et al., Nucleic Acids Res., 2012 , Database Issue 40:D290-D301). Les protéines FIDG sont décrites comme des enzymes de sectionnement des microtubules, impliquées dans la régulation du nombre et de la taille de microtubules 3021668 6 chez des nombreuses espèces animales et végétales (C. elegans (Yakushiji et al., FEBS Lett., 2004, 578, 191-7) ; D. melanogaster (Zhang et al., J. Cell. Biol., 2007, 177, 231-42); H. sapiens (Mukherjee et al., Cell Cycle, 2012, 11, 2359-66); A. thaliana (Stoppin-Mellet et al., Biochem J., 2002, 365, 337-42)). 5 Les Inventeurs ont en outre découvert que lorsque l'inhibition du gène TOP3A ou RECQ4 était combinée à celle du gène FANCM ou FIDG, le nombre de COs méiotiques était encore augmenté par rapport à ceux observés lorsque ces gènes étaient inactivés séparément. La présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la 10 fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inhibition dans ladite plante, d'au moins une protéine du complexe RTR choisie parmi une protéine dénommée RECQ4 et une protéine dénommée TOP3A, ladite protéine RECQ4 ayant au moins 40 %, et par ordre de préférence croissante, au moins, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de 15 séquence avec la protéine RECQ4 de séquence SEQ ID NO: 1, et ladite protéine TOP3A ayant au moins 50 %, et par ordre de préférence croissante, au moins, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence avec la protéine TOP3A de séquence SEQ ID NO: 2 Les identités de séquences des protéines RECQ4 et TOP3 sont calculées 20 sur la totalité de la longueur de la plus longue des deux protéines que l'on compare après alignement à l'aide de T-Coffee (v6.85) avec les paramètres par défaut (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/t coffee). Le pourcentage d'identité est obtenu à partir de cet alignement en utilisant Bioedit 7.2.5 (Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. 2 5 Acids. Symp. Ser. 41:95-98). Les séquences des gènes et protéines RECQ4 et TOP3A sont disponibles sur les bases de données publiques, telles que de façon non-limitative la base de données PLAZA (http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/) et phytozome http://www.phytozome.net/ (phytosome v9.1). 3 0 Au sens de la présente invention, l'expression protéine RECQ4correspond aux protéines RECQ4A et RECQ4B chez les plantes de la famille des Brassicacae (Brassica sp) qui possèdent deux gènes RECQ4 (RECQ4A et RECQ4B), et à la protéine RECQ4 chez les plantes autres que les Brassicacae, qui ne possèdent qu'un seul 3021668 7 gène RECQ4. Toutefois, chez certaines lignées de Brassicacae dans lesquelles l'une des protéines RECQ4 n'est pas fonctionnelle, seule la protéine RECQ4 qui est fonctionnelle est inhibée. La séquence SEQ ID NO : 1 représente la séquence de la protéine 5 RECQ4A d' Arabidopsis thaliana (AT1G10930 dans la base de données PLAZA). Les séquences d'orthologues de RECQA et de paralogues RECQB chez différentes espèces de plantes à fleurs sont indiquées dans le Tableau ci-après : Tableau I : Séquences de RECQ4 Plante Numéro d'accès* SEQ ID NO: Arabidopsis thaliana AT1G10930 1 Arabidopsis lyrata AL1G11090 3 Arabidopsis lyrata AL2G05030 4 Arabidopsis thaliana AT1G60930** 5 Brachypodium distachyon BD5G10432 6 Brassica rapa Bra031741 7 Brassica rapa Bra027115 8 Brassica rapa Bra018418 9 Carica papaya CP00031G00490 10 Thellungiella halophila Thhalv10006602m 11 Thellungiella halophila Thhalv10023226m 12 Eucalyptus grandis Eucgr.G00562.1 13 Glycine max G1yma12g29151 14 Glycine max Glyma08g20070 15 Gossypium raimondii Gorai.013G038600 16 Manihot esculenta ME02817G00160 17 Oryza sativa OSO4G35420 18 Phaseolus vulgaris Phvu1.006G216200 19 Prunus persica ppa000416m.g 20 Ricinus communis RC28725G00120 21 Sorghum bicolor Sb04g003070.1 22 Setaria italica Si016138m.g 23 Solanum lycopersicum 01g103960.2 24 Theobroma cacao ThecclEG006933t1 25 Vitis vinifera VV12G07620 26 *dans la base de données PLAZA ou phytozorne 10 **RECQ4B Conformément à l'invention, ladite protéine RECQ4 comprend 3 domaines conservés : un domaine hélicase, qui est le plus important, et comprend huit motifs (0, I, Ia, II, III, IV, V et VI), d'une longueur totale d'environ 300 à 450 acides aminés, contenant les séquences nécessaires pour la liaison de l'ATP, l'hydrolyse et le 3021668 8 déroulement de l'ADN (NCBI cd00079 et cd00046) ; un domaine RQC (smart00956) ; un domaine HRDC (pfam00570). La séquence SEQ ID NO : 2 représente la séquence de la protéine TOP3A d'Arabidopsis thaliana (AT5G63920 dans la base de données PLAZA). Les 5 séquences d'orthologues chez différentes espèces de plantes à fleurs sont indiquées dans le Tableau ci-après : Tableau II : Séquences de TOP3A Plante Numéro d'accès* SEQ ID NO: Arabidopsis thaliana AT5G63920 2 Arabidopsis lyrata AL8G30570 27 Brachypodium distachyon BD1G74120 28 Fragaria vesca FV0G21450 29 Oryza sativa OS03G06900 30 Populus trichocarpa PT05G06620 31 Ricinus communis RC30149G00070 32 Sorghum bicolor SBO1G046210 33 Zea mays ZMO1G04670 34 Thellungiella halophila Thhalv10003618m. g 35 Capsella rubella Carubv10025845m 36 Brassica rapa Bra031944 37 Gossypium raimondii Gorai.007G066700. 38 Theobroma cacao ThecclEG001553t1 39 Eucalyptus grandis Eucgr.H05141.1 40 Glycine max Glyma06g16175.1 41 Mimulus guttatus mgvla000984m.g 42 Aquilegia caerula Aquca 069_00036.1 43 Setaria italica Si034218m.g 44 *dans la base de données PLAZA ou phytozome Conformément à l'invention, la protéine TOP3A comprend 4 domaines 10 conservés: dans sa région N-terminale, un domaine TOPRIM (NCBI cd03362) et un domaine ADN Topoisomerase de sous-type IA (NCBI cd00186) ; dans sa région C-terminale, deux domaines en doigt de zinc (pfam01396 et pfam06839 ; Figure 2). Le premier domaine en doigt de zinc est situé dans la région de ladite protéine TOP3A qui s'étend des positions 639 à 677 de la séquence SEQ ID NO : 2. Le deuxième domaine en 15 doigt de zinc est situé dans la région de ladite protéine TOP3A qui s'étend des positions 804 à 844 de la séquence SEQ ID NO : 2. L'invention englobe l'inhibition simultanée des protéines RECQ4 et/ou TOP3A. 3021668 9 L'inhibition de la protéine RECQ4 et/ou TOP3A est obtenue par l'abolition, le blocage ou l'inhibition de l'expression du gène RECQ4 ou TOP3A ou bien de la fonction de ladite protéine RECQ4 ou TOP3A. En outre, l'inhibition de la protéine TOP3A dans la plante est effectuée de façon à ce que la plante exprime nécessairement, à 5 partir du gène TOP3A muté ou d'un transgène, une protéine TOP3A mutée comprenant une mutation dans sa région C-terminale qui inhibe au moins l'un des deux domaines en doigt de zinc alors que sa région N-terminale comprenant les domaines TOPRIM et ADN topoisomerase IA est intacte. L'inhibition peut notamment être obtenue par mutagenèse du gène 10 RECQ4 ou TOP3A. Par exemple, une mutation dans la séquence codante peut induire, selon la nature de la mutation, l'expression d'une protéine inactive, ou d'une protéine à activité réduite; une mutation au niveau d'un site d'épissage peut également altérer ou abolir la fonction de la protéine ; une mutation dans la séquence promotrice peut induire l'absence d'expression de ladite protéine, ou la diminution de son expression. 15 La mutagenèse peut être effectuée par exemple par la délétion de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de RECQ4 ou TOP3A, ou par l'insertion d'une séquence exogène, par exemple un transposon ou un ADN-T, au sein de ladite séquence codante ou dudit promoteur. Elle peut également être effectuée en induisant des mutations ponctuelles, par exemple par mutagénèse EMS, par radiations, ou par 2 0 mutagénèse dirigée, par exemple à l'aide de nucléases TALENs (Transcription Activator- Like Effector Nucleases), des systèmes CRISPR-CAS ou de nucléases à doigt de zinc (CHRISTIAN et al., Genetics, 186, 757-61, 2010; CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012). Les allèles mutés peuvent être détectés par exemple par PCR, en utilisant 2 5 des amorces spécifiques du gène RECQ4 ou TOP3A. Différentes méthodes de mutagénèse et de criblage à haut débit sont décrites dans l'art antérieur. A titre d'exemples, on peut citer des méthodes de type « TILLING » (Targeting Induced Local Lesions In Genome), décrites par McCallum et al., Plant Physiol., 2000, 123, 439-442). L'absence de fonctionnalité de RECQ4 ou TOP3A 3 0 chez les mutants peut être vérifiée sur la base des caractéristiques phénotypiques de leur descendance ; les plantes homozygotes pour une mutation inactivant le gène RECQ4 ou TOP3A ont un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne portant pas la mutation dans le gène RECQ4 ou TOP3A) dont elles sont issues. Généralement ce 3021668 10 taux de COs méiotiques est supérieur d'au moins 50%, de préférence au moins 2 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, elle comprend l'introduction, dans un allèle du gène TOP3A, d'une mutation qui résulte dans 5 l'inhibition d'au moins un domaine en doigt de zinc de la protéine TOP3A, ledit domaine étant situé dans la région de ladite protéine qui s'étend des positions 639 à 677 ou 804 à 844 de la séquence SEQ ID NO : 2. La mutation préserve les domaines TOPRIM et ADN topoisomerase IA mais inhibe, et de préférence inactive, au moins l'un des deux domaines en doigt de zinc. Il s'agit notamment d'une insertion ou d'une délétion dans la région 10 C-terminale de TOP3A comprenant lesdits domaines. De préférence, ladite mutation est une délétion de la séquence C-terminale de ladite protéine TOP3A, à partir d'un des résidus de ladite protéine situé des positions 610 à 803 de la séquence SEQ ID NO : 2, de manière préférée à partir du résidu de ladite protéine situé en position 640 de la séquence SEQ ID NO : 2 (production d'une protéine TOP3A tronquée en C-terminal). 15 Alternativement, l'inhibition de la protéine RECQ4 ou TOP3A est obtenue par extinction (silencing) du gène RECQ4 ou TOP3A. Différentes techniques d'extinction de gènes dans les plantes sont connues en elles-mêmes (pour revue voir par exemple : Watson & Grierson, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York : Marcel Dekker, 255-281, 1992 ; Chicas & Macino, EMBO reports, 20 2001, 21, 992-996 ; Puchta, H et Fauser, F, Int. J. Dey. Biol., 2013, 57, 629-37 ; Ali et al., GM crops, 2010, 1, 207-213).. On peut citer l'inhibition antisens ou co-suppression, décrites par exemple dans les Brevets US°5190065 et US°5283323. Il est également possible d'utiliser des ribozymes ciblant l'ARNm de la protéine RECQ4 ou TOP3A. De préférence, l'extinction du gène RECQ4 ou TOP3A est induite par 2 5 interférence ARN ciblant ledit gène. Un ARN interférent (ARNi) est un petit ARN qui peut éteindre un gène cible de manière séquence spécifique. Les ARN interférents comprennent en particulier les « petits ARN interférents » (siRNA) et les micro-ARN (miRNA). Initialement, les constructions d'ADN pour exprimer des ARN 3 0 interférents dans les plantes contenaient un fragment de 100 pb ou plus (généralement de 100 à 800 pb) de l'ADNc du gène ciblé, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Des constructions largement utilisées sont celles qui peuvent produire un transcrit d'ARN en épingle à cheveux (hpRNA). Dans ces constructions, le fragment du 3021668 11 gène cible est inversement répété, avec généralement une région d'espacement entre les répétitions (pour revue, cf. Watson et al., FEBS Letters, 2005, 579, 5982-5987). On peut également utiliser des micro-ARN artificiels (amiRNAs) dirigés contre le gène RECQ4 ou TOP3A (Ossowski et al., The Plant Journal, 2008, 53, 674-690, ; Schwab et al., Methods 5 Mol Biol., 2010, 592, 71-88; Wei et al., Funct Integr Genomics., 2009, 9, 499-511). Pour inhiber la protéine TOP3A, la méthode de l'invention est avantageusement mise en oeuvre avec l'une des plantes génétiquement modifiées suivantes : (i) une plante mutante homozygote pour la mutation de TOP3A, telle que 10 définie ci-dessus, qui résulte dans l'expression d'une protéine TOP3A mutée dans le domaine C-terminal, par exemple une protéine TOP3A tronquée, dont les domaines TOPRIM et Topoisomérase IA sont intactes mais l'un au moins ou les deux domaines en doigt de zinc sont inhibés, et de préférence inactivés. (ii) une plante mutante et transgénique, homozygote pour une mutation 15 qui inhibe le gène TOP3A et comprenant un transgène TOP3A codant pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal, par exemple une protéine TOP3A tronquée, telle que définie ci-dessus, et (iii) une plante double transgénique, comprenant un premier transgène codant pour un ARNi qui cible le gène TOP3A et un deuxième transgène comprenant un 20 gène TOP3A recombinant codant pour une protéine TOP3A mutée, par exemple une protéine TOP3A tronquée en C-terminal, telle que définie ci-dessus ; le deuxième transgène n'étant pas sensible au RNAi produit par le premier transgène. Pour ce faire, on peut, utiliser, de façon non-limitative, un RNAi ciblant la région C-terminale de TOP3A L'inhibition de la protéine RECQ4 ou TOP3A peut également être obtenue par l'abolition, 25 le blocage ou la diminution de la fonction de ladite protéine. Pour inhiber l'activité de ladite protéine ont peut utiliser des inhibiteurs qui se lient spécifiquement à un domaine fonctionnel de ladite protéine et bloquent son activité. Il s'agit notamment d'inibiteurs protéiques, tels que des peptides ou des anticorps ou fragments fonctionnels d'anticorps, ou bien des petites molécules. A titre d'exemple non-limitatif on peut citer les petites 30 molécules inhibitrices de RecQ telles que décrites dans Nguyen et al., Chemistry & Biology, 2013, 20, 1, 24, 55-62; De manière avantageuse, ces inhibiteurs sont appliqués sur les plantes. 3021668 12 La présente invention a pour objet des constructions d'ADN recombinant, et notamment des cassettes d'expression, produisant : (i) un ARNi permettant d'éteindre le gène RECQ4 ou TOP3A et/ou (ii) une protéine TOP3A mutée en C-terminal, notamment une protéine TOP3A tronquée telle que défini ci-dessus. 5 Une cassette d'expression conforme à l'invention comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARNi, notamment un hpRNA ou un amiRNA, ciblant le gène RECQ4 ou TOP3A ou un ARN codant pour la protéine TOP3A mutée telle que définie ci-dessus, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale. La protéine TOP3A mutée peut notamment être exprimée à 10 partir d'un promoteur de gène TOP3A, notamment de plante, tel que le promoteur du gène TOP3A de la plante transgénique dans laquelle ladite protéine TOP3A mutée en C-terminal est exprimée. Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes hétérologues dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans Part. 15 Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans 20 certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques. Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par Kay et al. (Science, 1987, 236, 4805), ou ses dérivés, le promoteur du 25 virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur « Actine-Intron-actine » du riz (McElroy et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 231, 150-160; GenBank numéro d'accès S 44221). Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on choisira un promoteur fonctionnel dans les méiocytes. 30 Dans le cadre de la présente invention on pourra aussi utiliser un promoteur spécifique de la méiose (c'est-à-dire actif exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose). A titre d'exemple non limitatif on peut citer le promoteur DMC1 (Klimyuk & Jones, Plant J., 1997, 11, 1-1.). 3021668 13 Les cassettes d'expression de l'invention comprennent généralement un terminateur transcriptionnel, par exemple le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 561-573,), le terminateur 3'CaMV (Franck et al., Cell, 1980, 21, 285-294) ou le teuninateur d'un gène TOP3A, notamment de plante 5 tel que le promoteur du gène TOP3A de la plante transgénique dans laquelle ladite protéine TOP3A mutée est exprimée. Elles peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs. Les constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent comprendre plusieurs cassettes d'expressions codant respectivement pour l'un des ARNi 10 ciblant le gène RECQ4 ou TOP3A et une protéine TOP3A mutée en C-terminal, notamment deux cassettes d'expressions, l'une codant pour un ARNi ciblant le gène TOP3A et l'autre pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal. Les constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention englobent également des vecteurs recombinants contenant une ou plusieurs cassettes d'expression 15 conformes à l'invention telles que définies ci-dessus. Ces vecteurs recombinants peuvent également inclure un ou plusieurs gènes marqueurs, qui permettent la sélection des cellules ou plantes transformées. Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses 20 méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc. 25 L'invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant au moins une construction d'ADN recombinant conforme à l'invention. Ladite cellule peut comprendre deux constructions d'ADN recombinant, l'une codant pour un ARNi ciblant le gène TOP3A et l'autre pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote, par exemple une cellule d'Agrobacterium, ou une cellule 30 eucaryote, par exemple une cellule végétale génétiquement transformés par au moins une construction d'ADN de l'invention. La construction peut être exprimée transitoirement, elle peut aussi être incorporée dans un réplicon extrachromosomique stable, ou intégrée dans le chromosome. 3021668 14 L'invention fournit également un procédé pour produire une plante mutée ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'introduction dans un allèle du gène TOP3A, d'une mutation qui 5 résulte dans l'inhibition d'au moins un domaine en doigt de zinc de la protéine TOP3A, et ladite plante étant hétérozygote pour cette mutation ; b) l'autofertilisation de la plante de l'étape a) de façon à obtenir une plante homozygote pour ladite mutation. L'invention fournit également un procédé pour produire une plante 10 transgénique ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la transformation d'une cellule végétale avec au moins un vecteur contenant au moins une cassette d'expression produisant un ARNi permettant d'éteindre le gène RECQ4 ou TOP3A conforme à l'invention ; 15 - la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape de transformation est réalisée avec deux cassettes d'expressions, l'une codant pour un ARNi ciblant le gène TOP3A et l'autre pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal, 20 conformes à l'invention ; les dites cassettes étant dans le même vecteur ou dans deux vecteurs différents et dans le cas où elles sont dans deux vecteurs différents, la transformation étant réalisée simultanément avec les deux vecteurs ou successivement avec un vecteur puis avec l'autre. L'invention englobe également les plantes mutantes comprenant une 25 mutation de TOP3A qui résulte dans l'expression d'une protéine TOP3A mutée dans le domaine C-terminal, telle que définie ci-dessus. L'invention englobe également des plantes génétiquement transformées par au moins une construction d'ADN de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des plantes transgéniques, dans laquelle la ou lesdites constructions sont contenues dans un 30 transgène intégré dans le génome de la plante, de sorte qu'il est transmis aux générations successives de plantes. L'expression de la construction d'ADN de l'invention résulte en une régulation négative de l'expression du gène RECQ4 et/ou TOP3A, la régulation négative de l'expression du gène TOP3A étant combinée à l'expression d'une protéine 3021668 15 TOP3Amutée en C-terminal, qui confère auxdites plantes transgéniques un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne contenant pas la construction d'ADN de l'invention) dont elles sont issues. Généralement ce taux de COs méiotiques est supérieur d'au moins 50%, de préférence au moins 2 fois supérieur à celui des plantes 5 sauvages dont elles sont issues. De manière particulièrement avantageuse, le taux de COs méiotiques peut encore être augmenté en combinant dans une même plante, l'inhibition de la protéine RECQ4 et /ou TOP3A avec celle de la protéine FANCM et/ou FIDG. Dans ce cas, le taux de COs méiotiques est au moins 3 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur à 10 celui des plantes sauvages dont elles sont issues. L'augmentation du taux de COs méiotiques par inhibition de la protéine FANCM est décrite dans la Demande PCT W02013038376, dont le contenu est incorporé par référence à la présente description. La protéine FANCM est définie comme une protéine ayant au moins 15 30% et par ordre de préférence croissante, au moins 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM d'Arabidopsis thaliana (GenBank : NP_001185141 ; UniProtKB : F4HYE4), et contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un 20 domaine hélicase HELICc (cd00079). De préférence, le domaine hélicase DEXDc a au moins 65%, et par ordre de préférence croissante, au moins 70,75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 75%, et par ordre de préférence croissante, au moins 80,85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc (acides aminés 129-272) de la protéine AtFANCM, et le domaine hélicase HELICc a au moins 60%, et par 25 ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine HELICc (acides aminés 445-570) de la protéine AtFANCM. La séquence polypeptidique de la protéine AtFANCM est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 45. 30 Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées pour la protéine FANCM sont calculées en utilisant le programme BLASTP ou le programme Needle avec les paramètres par défaut. Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62. 3021668 16 La séquence de la protéine FIDGETIN-LIKE 1 d'Arabidopsis thaliana est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 46. Une recherche dans les bases de données de séquences a pennis d'identifier des orthologues d'AtFIDG chez un large panel d'eucaryotes, et il très probable que cette protéine est 5 conservée dans l'ensemble des plantes terrestres. Des exemples non limitatifs d'orthologues d'AtFIDG sont cités dans le tableau, ci-après. Tableau III : Séquences d'orthologues d'AtFIDG Plante Numéro d'accès Brachypodium distachyon Genbank : XM 003576467 Carica papaya Phytozome : evm.model.supercontig_171.22 PLAZA : CP00171G00260 Fragaria vesca Phytozome : mrna25885.1 PLAZA : FV6G37220 Glycin max Phytozome : Glyma19g18350.2 et Glyma05g14440.2 PLAZA : GM19G18350 et GM05G14440 Oryza sativa GenBank : ABA97741 Populus tricocarpa GenBank : POPTR0001s33870 Ricinus communis Genbank : XM 002509479 Solanum lycopersicum Genbank : XM 004233540.1 Sorghum bicolor Genbank : XM002442067.1 Theobroma cacao Phytozome : ThecclEG017182t1 PLAZA : TCO4G003320 Vitis vinifera GenBank : CBI21358 Zea mays GenBank : DAA54951 Hordeum vulgare Genbank : BAK02801. Triticum urartu Genbank : EMS65393.1. La protéine FIDG a au moins 35%, et par ordre de préférence croissante, 10 au moins 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 50%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFIDG de séquence 3021668 17 SEQ ID NO: 46, et contenant un domaine AAA-ATPase (PF00004) et un domaine VSP4 (PF09336). De préférence, ladite protéine FIDG a au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au 5 moins 80%, et par ordre de préférence croissante, au moins 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec l'un quelconque des orthologues d'AtFIDG dont la liste est indiquée dans le Tableau III, ci-dessus. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le domaine AAA-ATPase de ladite protéine FIDG a au moins 60%, et par ordre de préférence 10 croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine AAA-ATPase de la protéine AtFIDG (acides aminés 431-561 de la SEQ ID NO: 46). Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, 15 le domaine VSP4 de ladite protéine FIDG a au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine VSP4 de la protéine AtFIDG (acides aminés 623672 de la SEQ ID NO: 46). 2 0 Avantageusement, ladite protéine FIDG contient en outre un domaine de liaison à RAD51, ayant au moins 50%, et par ordre de préférence croissante, au moins 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec les acides aminés 268-346 de la SEQ ID NO: 46. 2 5 Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées pour la protéine FIDG sont calculées sur la totalité de la longueur des séquences comparées, en utilisant l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch (programme Needle EMBOSS avec les paramètres par défaut). Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62. 30 La présente invention a donc également pour objet : - un procédé pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, comprenant l'inhibition dans ladite plante, de la protéine RECQ4 et/ou ATOP3A et de la protéine FANCM et/ou FIDG; 3021668 18 - des cassettes et vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène RECQ4 ou ATOP3A, et une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FANCM ou FIDG; 5 - des cellules-hôtes et des plantes transgéniques co-transformées par une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène RECQ4 et/ou ATP3a, et une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FIDG et/ou FANCM ; - des plantes mutantes contenant dans le gène RECQ4 et/ou ATOP3A une 10 mutation induisant l'inhibition de la protéine RECQ4 et/ou ATOP3A, et dans le gène FANCM et/ou FIDG une mutation induisant l'inhibition de la protéine FANCM et/ou FIDG; l'invention englobe notamment les triples et quadruples mutants, notamment les triples mutants RECQ4/FIDG/FANCM. - des plantes mutantes et transgéniques, contenant dans le gène RECQ4 15 et/ou ATOP3A une mutation induisant l'inhibition de la protéine, conforme à l'invention, et transformées par une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FANCM et/ou FIDG, et éventuellement par un séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal, conforme à l'invention , ou bien contenant dans le gène FANCM et/ou FIDG une mutation induisant 20 l'inhibition de la protéine FANCM et/ou FIDG, et transformées par une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène RECQ4 et/ou ATOP3A, et éventuellement par un séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine TOP3A mutée en C-terminal, conforme à l'invention ; l'invention englobe notamment les doubles-mutants et transgéniques, les mutants et doubles ou triples transgéniques, et les 25 doubles mutants et doubles ou triples transgéniques, notamment ceux dans lesquels les protéines RECQ4 et FANCM, et éventuellement, en outre, la protéine FIDG sont inhibées. La présente invention peut s'appliquer notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes, afin d'accélérer l'obtention de nouvelles variétés. Elle permet aussi de faciliter la recombinaison entre espèces apparentées, et donc l'introgression de 30 caractères d'intérêt. Elle permet également d'accélérer l'établissement de cartes génétiques et les clonages positionnels. La présente invention s'applique à un large éventail de plantes d'intérêt agronomique monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on 3021668 19 peut citer le colza, le tournesol, la pomme de terre, le maïs, le blé, l'orge, le seigle, le sorgo, le riz, le soja, le haricot, la carotte, la tomate, la courgette, le poivron, l'aubergine, le navet, l'oignon, le pois, le concombre, le poireau, l'artichaut, la betterave, le choux, le chou-fleur, les salades, l'endive, le melon, la pastèque, le fraisier, le pommier, le poirier, le 5 prunier, le peuplier, la vigne, le coton, la rose, la tulipe, etc. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les effets de mutations du gène AtRECQ4 ou AtTOP3A, seules ou combinées à des mutations du gène FANCM, sur la recombinaison méiotique et le taux de Cos, avec références aux dessins 10 annexés dans lesquels : - figure 1 : Arbre phylogénétique des protéines RECQ4 de plantes à fleurs. L'analyse a été réalisée sur la plate-forme Phylogeny.fr selon les étapes suivantes : les séquences ont été alignées avec T-Coffee (v6.85) en utilisant les méthodes suivantes d'alignement par paires : les 10 meilleurs alignements locaux (Lalign_pair), un alignement 15 global exact (slow_pair). Après l'alignement, les positions avec des espaces ont été supprimées de l'alignement. L'arbre phylogénétique a été reconstruit en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance, mise en oeuvre dans le programme PhyML v3.0 aLRT. Les séquences des protéines ont été collectées dans la base de données PLAZA (http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/) et celle du phytozome 20 (http://www.phytozome.net): At : Arabidopsis thaliana. Al Arabidopsis lyrata. Bra Brassica rapa. Esa: Thellungiella halophila. Cp: Carica papaya. Tcacao : Theobroma cacao. Graimndii: Gossypium raimondii. VV: Vitis vinifèra. Ppersica Prunus persica. RC: Ricinus communis. ME : Manihot esculenta. Solyc: Solanum lycopersicum. Eucgr : Eucalypsus grandis. Phvul:Phaseolus vulgaris. Glyma: Glycine max. OS: Oryza sativa. 25 BD: Brachypodium distachyon. Si: Setaria italica. Zmays: Zea mays. Sbicolor: Sorghum bicolor. - figure 2. Alignement des TOPOISOMERASES 3a d'eucaryotes à l'aide de T-Coffee. Les domaines conservés sont indiqués par une ligne verticale. At: arabidopsis thaliana. Sc. Saccharomyces cerevisiea. Os Oryza sativa. Hs Homo sapiens. 30 Ds Drosophila melanogaster. Coenorabditis elegans. Sp Schizosaccharomyces pombe. L'alignement a été réaliséà l'aide de T-Coffee (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/t coffee) avec les paramètres par défaut. - figure 3. La double mutation de RECQ4A et RECQ4B restaure la 3021668 20 formation de bilents chez les mutants zmm. Nombre moyen de bivalents par méiocyte mâle. Bivalents en anneau (noir). Bivalents droits (gris). Paires d'univalents (points noir). Le nombre de cellules en métaphase I qui ont été analysées est indiqué entre parenthèses. - figure 4. Les hélicases RECQ4A and RECQ4B limitent de façon 5 redondante la formation de CO pendant la méiose. Les distances génétiques dans 4 intervalles, mesurées à l'aide de lignées marquées avec un marqueur fluorescent, ont été calculées avec l'équation de Perkins et sont exprimées en centiMorgans. I2a et I2b sont des intervalles adjacents sur le chromosome 2, et 15c et I5d sur le chromosome 5. - figure 5. La mutation top3a-R640X restaure la formation de 10 bivalents chez les mutants zmm. Nombre moyen de bivalents par méiocyte mâle. Bivalents en anneau (noir). Bivalents droits (gris). Paires d'univalents (points noirs). Le nombre de cellules en métaphase I qui ont été analysées est indiqué entre parenthèses. - figure 6. TOP3A et FANCM limitent de façon redondante la formation de CO pendant la méiose. Les distances génétiques dans 4 intervalles, 15 mesurées à l'aide de lignées marquées avec un marqueur fluorescent, ont été calculées avec l'équation de Perkins et sont exprimées en centiMorgans. I2a et I2b sont des intervalles adjacents sur le chromosome 2, et I5c et I5d sur le chromosome 5. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MUTANTS DU GENE RECQ4 SUPPRESSEURS DE MUTATIONS DE GENES ZMM 2 0 Des graines du mutant msh4 d'Arabidopsis thaliana dans le fond génétique Landsberg eracta (cshl_GT14269 ; Drouaud et al., PLoS Genet., 2013, 9, e1003922; Higgins et al., Genes Dev., 2004, 18, 2557-2570) ont été mutées par EMS (éthylméthane sulfonate). Les plantes issues des graines mutées (population M1, hétérozygotes pour les mutations induites par l'EMS, et homozygotes pour la mutation du 25 gène ZMM) ont un phénotype identique, résultant de l'inactivation du gène ZMM, qui se traduit par une diminution forte de la fréquence de COs, qui mène à une diminution forte du nombre de bivalents, et une baisse très importante de la fertilité (plantes « semi stériles »), résultant en la formation de siliques courtes qui se différencient facilement de celles des plantes sauvages. Les plantes M1 ont été auto-pollinisées, pour produire une 3 0 population de descendants (population M2 ; environ 1000 familles) contenant potentiellement des plantes homozygotes pour les mutations induites par l'EMS. Des plantes de la population M2 ayant des siliques plus longues que celles des plantes zmm 3021668 21 homozygotes de la génération Ml ont été sélectionnées et génotypées afin de vérifier leur statut homozygote pour la mutation msh4. Ce sont des suppresseurs. Deux lignées de mutants suppresseurs de la mutation du gène AtMSH4, dénommées msh4(s)84 et msh4(s)101, font l'objet de cette étude. Le séquençage complet 5 du génome de ces mutants a montré que les mutations correspondantes étaient localisées dans le gène At1g10930 codant pour l'hélicase RECQ4A. Le mutant msh4(s)84 comprend le changement C>T en position TAIR 10 : chrl :3652474 qui introduit un codon stop au niveau du codon W387. Le mutant msh4(s)101 comprend le changement C>T en position TAIR 10 : chr 1 :3650343 qui introduit la substitution G762D. Ces deux suppresseurs sont 10 alléliques, démontrant que les mutations dans RECQ4a sont les mutations causales de la restauration de fertilité. La comparaison de la séquence de l'écotype Landsberg (Gan et al., Nature, 2011, 477, 7365, 419-23) avec celle du génome de l'écotype Columbia 9 a montré que leurs loci RECQ4B différaient par une série de polymorphismes de nucléotide unique 15 et d'insertion/délétion, dont deux qui introduisent un codon stop prématuré (Q430>STOP) et un décalage de phase de lecture (Aa 501) chez Lansdberg. Ceci suggère fortement que le gène RECQ4B gène n'est pas fonctionnel chez Lansdberg. Au vu de ces résultats, il a été émis l'hypothèse que la mutation recq4a chez Columbia n'était pas capable de compenser les effets de celle de msh4 à cause de la 20 redondance avec RECQ4B pendant la méiose. Ceci expliquerait la raison pour laquelle la mutation de REGQ4A seul, serait capable de compenser les effets de celle de msh4 chez Landsberg mais pas Columbia. Par conséquent, les mutations msh4, recq4a, et recq4b ont été combinées dans le fond génétique Columbia. Le nombre de bivalents en métaphase I du triple mutant 25 msh4 recq4a-4 recq4b-2 a été comparé avec celui de plantes sauvages (Col), de plantes zmm (shocl/Atzip2 ou msh4) et de doubles mutants msh4 recq4a-4 et msh4 recq4b-2. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Alors que les plantes sauvages montrent systématiquement 5 bivalents par méiose, les mutants Atmsh4 montrent une forte diminution du nombre de bivalents, et donc l'apparition d'univalents. Chez les plantes 30 sauvages, on observe une ségrégation normale des chromosomes, conduisant à la formation de gamètes équilibrés. En revanche, dans les mutants zmm, on observe une mauvaise ségrégation des chromosomes qui résulte d'une diminution du nombre de 3021668 22 bivalents, induite par la mutation zmm, et qui conduit à des gamètes déséquilibrés, non-viables. De plus, comme, il a été montré précédemment (Higgins et al., The Plant Journal, 2011, 65, 492-502), que les doubles mutants msh4 recq4a-4 et msh4 recq4b-2 5 sont quasi-stériles comme le mutant msh4 et ont un nombre de bivalents en métaphase I, semblable à celui de msh4 (Figure 3). Au contraire, le triple mutant msh4 recq4a-4 recq4b-2 est fertile et son nombre de bivalents est rétabli au niveau de celui du sauvage (Figure 3). De façon similaire, la double mutation recq4a recq4b est également capable de restaurer la fertilité 10 et la formation de bivalents chez un autre mutant zmm, shocl/Atzip2 (Figure 3). Ces résultats montrent que chez Columbia, REG Q4A et RECQ4B ont des fonctions redondantes qui empêchent la formation de COs méiotiques chez les mutants zmm EXEMPLE 2 : INFLUENCE DE L'INACTIVATION DU GENE RECQ4 SUR LA 15 FREQUENCE DE RECOMBINAISON MEIOTIQUE Les effets des mutations recq4 sur la recombinaison méiotique ont ensuite été mesurés chez une plante sauvage (Columbia), i. e, en présence de ZMMs fonctionnels. La fréquence de recombinaison méiotique a été mesurée par l'analyse de tétrades à l'aide de lignées marquées avec un marqueur fluorescent, comme décrit par BERCHOWITZ & 20 COPENHAVER, Nat. Protoc., 2008, 3, 41-50). La distance génétique a été mesurée sur 4 intervalles génétiques différents, 2 intervalles adjacents sur le chromosome 2 (I2a et I2b) et 2 intervalles adjacents sur le chromosome 5 (intervalles 15c et I5d). Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Chez les simples mutants recq4a et recq4b, les distances génétiques 25 n'étaient pas significativement différentes du sauvage pour tous les intervalles testés (p>5%). Au contraire, les distances génétiques étaient considérablement augmentées chez le double mutant recq4a recq4b (p REVENDICATIONS1) Procédé pour augmenter la fréquence des crossovers méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'il comprend l'inhibition dans ladite plante, d'au moins une protéine du complexe RTR choisie parmi une protéine dénommée RECQ4 et une protéine 5 dénommée TOP3A, ladite protéine RECQ4 ayant au moins 40 % d'identité de séquence avec la protéine RECQ4 de séquence SEQ ID NO: 1, et ladite protéine TOP3A ayant au moins 50 % d'identité de séquence avec la protéine TOP3A de séquence SEQ ID NO: 2. 10 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'inhibition dans ladite plante, d'au moins une protéine choisie parmi : - une protéine ci-après dénommée FIDG, ladite protéine ayant au moins 45% d'identité de séquence, ou au moins 60% de similarité de séquence avec la protéine AtFIDG de séquence SEQ ID NO: 46 et contenant un domaine AAA-ATPase et un 15 domaine VSP4, et - une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine ayant au moins 30% d'identité de séquence, ou au moins 45% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 45, et contenant un domaine hélicase DEXDc et un domaine hélicase HELICc. 20 3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine RECQ4 et/ou TOP3A et le cas échéant de la protéine FIDG et/ou FANCM, est obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite protéine ou de son promoteur. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la mutagénèse 25 de la protéine TOP3A comprend l'introduction, dans un allèle du gène TOP3A, d'une mutation qui résulte dans l'inhibition d'au moins un domaine en doigt de zinc de ladite protéine TOP3A. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine RECQ4 et/ou TOP3A et le cas échéant de la protéine 30 FIDG et/ou FANCM, est obtenue par extinction du gène codant pour ladite protéine en exprimant dans ladite plante un ARN interférent ciblant ledit gène. 6) Procédé selon la revendication 3 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend, outre l'inhibition de la protéine TOP3A, l'expression dans ladite plante d'une 3021668 27 protéine TOP3A recombinante comprenant un domaine TOPRIM et un domaine Topoisomérase IA non-altérés et au moins un domaine en doigt de zinc qui est inhibé. 7) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène 5 RECQ4 ou TOP3A, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale. 8) Cassette d'expression selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine TOP3A comprenant un domaine TOPRIM et un domaine Topoisomérase IA non-altérés et 10 au moins un domaine en doigt de zinc qui est inhibé, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale. 9) Cassette d'expression selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FANCM ou FIDG, placée sous contrôle transcriptionnel d'un 15 promoteur fonctionnel dans une cellule végétale. 10) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 7 à 9. 11) Cellule-hôte transformée par un vecteur recombinant selon la revendication 10. 20 12) Plante mutante caractérisée en ce qu'elle contient une mutation dans le gène RECQ4 et/ou TOP3A, ladite mutation induisant l'inhibition de la protéine RECQ4 et/ou TOP3A dans ladite plante. 13) Plante mutante selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle contient en outre une mutation dans le gène FIDG et/ou FANCM, ladite mutation induisant 2 5 l'inhibition de la protéine FIDG et/ou FANCM dans ladite plante. 14) Plante mutante selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle contient en outre au moins une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FIDG ou FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite plante. 30 15) Plante mutante selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce qu'elle contient en outre une séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine TOP3A comprenant un domaine TOPRIM et un domaine Topoisomérase IA non-altérés et 3021668 28 au moins un domaine en doigt de zinc qui est inhibé, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite plante. 16) Plante transgénique contenant un transgène comprenant une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène RECQ4 et/ou TOP3A, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite plante. 17) Plante transgénique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle contient en outre une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FIDG et/ou FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite plante. 18) Plante transgénique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle contient en outre une mutation dans le gène FIDG et/ou FANCM, ladite mutation induisant l'inhibition de la protéine FANCM dans ladite plante. 19) Plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce qu'elle contient en outre une séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine TOP3A comprenant un domaine TOPRIM et un domaine Topoisomérase 1A non-altérés et au moins un domaine en doigt de zinc qui est inhibé, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans ladite plante.