FR 3011471 A1 20150410 FR 1359751 A 20131008 VECTEUR D'EXPRESSION DE LA PROTÉINE PUMA ET SON UTILISATION EN THÉRAPIE GÉNIQUE La présente invention concerne un vecteur viral d'expression de la protéine PUMA (pour «p53 up-regulated modulator of apoptosis »), inductrice de mort cellulaire, pour son utilisation en thérapie génique, en particulier de la polyarthrite rhumatoïde. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie autoimmune qui entraîne une inflammation chronique des articulations et des tissus environnants. L'inflammation est entretenue par des cytokines produites par les macrophages synoviaux et les fibroblastes, telles que le facteur alpha de nécrose tumorale (TNF-a) et l'interleukine 1 (IL-1), et par d'autres cellules comme les lymphocytes T, telle que l'interleukine 17 (IL-17). La prolifération des synoviocytes fibroblastiques (FLS, pour « fibroblast-like synoviocytes »), ou synoviocytes de type B (ci-après désignés « synoviocytes »), contribue au processus inflammatoire par accumulation de cellules dans la couche intimale de la synoviale (Firestein, Arthriti.s Rheum., 39:1781-90, 1996). En effet, alors que dans une articulation saine, les synoviocytes participent à l'équilibre biochimique par la sécrétion de différentes protéines et cytokines, dans une articulation arthritique, ils subissent des modifications se traduisant par leur prolifération, la libération de protéines antiapoptotiques, de cytokines proinflammatoires et d'enzymes protéolytiques, telles que des collagénases. Les traitements actuels de la PR impliquent des biothérapies en particulier anti-TNF. Cependant, 40% des patients ne répondent pas au traitement ou y répondent par un effet thérapeutique transitoire. Il a été suggéré que les traitements locaux impliquant l'induction de l'apoptose des synoviocytes pourraient représenter un traitement efficace de la PR (Firestein, Nature, 423 :356-61, 2003). A ce titre, plusieurs gènes codant pour des protéines pro-apoptotiques ont été évalués en tant que gènes thérapeutiques potentiels, par exemple les gènes codant pour les protéines Fas (Okamoto et al., Gene Ther., 5 :331-8, 1998), TRAIL (pour « tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand ») (Yao et al., Arthr. Res. Ther., 8 :1R16, 2006), p53 (Yao et al., Mol. Ther., 3(6) :901-10, 2001). Parmi ces protéines pro-apoptotiques, on citera notamment les protéines « BH3-only » de la famille Bd-2. La Demande PCT WO 2007/035494 propose l'utilisation de ces protéines pour induire l'apoptose dans les synoviocytes. Des résultats préliminaires ont montré que la transduction in vitro de synoviocytes avec un vecteur plasmidique exprimant la protéine PUMA (PCT WO 2007/035494 ; Cha et al., Arthritis & Rheumatism, 54(2) :587-92, 2006; You et al., 2006, précité) permettait d'induire l'apoptose des cellules transduites. D'autres expérimentations du même type ont montré que la protéine « BH3-only » BNIP3 possédait les mêmes propriétés pro-apoptotiques, mais des essais complémentaires effectués en présence de cytokines proinflammatoires, telles que TNF-a et IL-113, ont montré que cet effet pro-apoptotique était partiellement inhibé par ces cytokines proinflammatoires, qui sont présentes abondamment dans les articulations touchées par la PR (Kammouni et al., Arthritis & Rheum., 56(9) :2854-63, 2007). Les Inventeurs ont entrepris d'étudier de manière plus approfondie les effets de la protéine PUMA sur l'apoptose des synoviocytes dans un contexte inflammatoire, afin de déterminer si l'utilisation de cette protéine in vivo dans le cadre du traitement de la PR était ou non effectivement envisageable. Dans ce but, ils ont dans un premier temps, pour obtenir une expression efficace in vivo, cherché une alternative aux vecteurs plasmidiques utilisés dans l'art antérieur. Les adénovirus recombinants sont parmi les vecteurs les plus utilisés in vivo, pour l'expression de gènes à but thérapeutique. Cependant, certaines cellules, dont font partie les synoviocytes, sont réfractaires à la transduction par un vecteur adénoviral. Aucun vecteur permettant une transduction efficace des synoviocytes pour délivrer le gène codant pour la protéine PUMA à ces cellules n'a à ce jour été décrit. Plusieurs études ont montré que le statut réfractaire de certaines cellules à une transduction par adénovirus tenait principalement à l'absence de la glycoprotéine CAR (pour « coxsackie-adenovirus receptor ») à la surface des cellules primaires humaines ou des lignées cellulaires continues (Gaden et al., Am. J Respir. Cell Mol. Biol., 27 :628-40, 2002), ou à la faible accessibilité de CAR au pôle apical de l'épithélium humain (Granio et al., Hum. Gene Ther., 21:1-19, 2010; Walters et al., J Biol. Chem., 274 :10219-226, 1999). CAR est le récepteur cellulaire de haute affinité pour le vecteur adénoviral de type 5, HAdV5 (Bergelson et al., Science, 275 :1320-23, 1997; Tomko et al., Froc. Nati Acad. Sci. USA, 94 :3352-6, 1997), ainsi que pour d'autres sérotypes d'adénovirus (Amberg, Rev. Med. Virol., 19 :165-78, 2009). HAdV5 est le sérotype d'adénovirus modèle, le plus utilisé pour la construction de vecteurs thérapeutiques. Différentes stratégies ont été développées pour rediriger les vecteurs HAdV5 vers d'autres récepteurs que CAR (Amberg, 2009, précité ; Russell, J Gen. Virol., 90 :1-20, 2009). La plupart de ces stratégies ont consisté en des modifications de la fibre de la particule virale d'adénovirus (Amberg, 2009, précité ; Corjon et al., Mol. Ther., 16, 1813-24, 2008; Henning et al., Gene Ther., 12:211- 24, 2005; Henning et al., Hum. Gene Ther., 13 :1427-39, 2002; Hong et al., Mol. Ther., 7 :692-9, 2003 ; Law et al., Mol. Ther., 12 :599-609, 2005 ; Magnusson et al., Cancer Gene Ther., 14 :468-79, 2007; Magnusson et al., J. Virol., 75 :7280-9, 2001 ; Magnusson et al., J Gene Med., 4 :356-70, 2002 ; Russell, 2009, précité), la fibre étant la protéine de capside impliquée dans la reconnaissance des récepteurs de surface cellulaire par l'adénovirus. Cependant, certaines modifications génétiques du gène de la fibre d'adénovirus ont été identifiées comme étant préjudiciable à la viabilité ou au taux de croissance des vecteurs résultants (Henning et al., J Gen. Virol., 87 :3151-60, 2006; Magnusson et al., 2002, précité). Dans d'autres cas, les modifications du vecteur ont seulement faiblement amélioré la transduction. Par exemple, des vecteurs HAdV5 modifiés génétiquement, conçus pour cibler les molécules d'intégrine à la surface des synoviocytes, n'ont abouti qu'à une amélioration modeste de l'efficacité de transduction de ces cellules in vitro et ex vivo (Toh et al., J Immunol., 175(11) :7687-98, 2005). D'autres stratégies proposées ont impliqué des modifications génétiques et chimiques de HAdV5 (Kreppel et al., Mol. Ther., 12 :107-117, 2005), ou le revêtement de la capside virale par un ligand peptidique ou protéique utilisé en tant qu'adaptateur bifonctionnel, à la fois pour le virus et pour la molécule de surface cellulaire spécifique (Hong et al., Hum. Gene Ther., 10 :2577-86, 1999; Dreier et al., J Mol. Biol., 405 :41026, 2011). Récemment, il a été rapporté que l'incorporation de la glycoprotéine CAR humaine (GenBank NP 001329) dans l'enveloppe d'un baculovirus produisait un baculovirus recombinant, nommé BVcAR, capable de former avec HAdV5 un complexe stable, et d'augmenter significativement l'efficacité de transduction par HAdV5 de cellules réfractaires à cette transduction (Demande PCT WO 2011/042769; Granio et al., J of Virology, 83(12) :6048-66, 2009). Les Inventeurs ont testé si l'utilisation d'un baculovirus recombinant BVc.AR pouvait pewiettre d'augmenter l'efficacité de transduction des synoviocytes par un vecteur adénoviral portant le gène codant pour la protéine PUMA. Ils ont observé que le complexe HAdV5-BVcAR ainsi formé permettait de transduire très efficacement des synoviocytes primaires, et d'induire leur apoptose. En outre, les Inventeurs ont constaté que, contrairement à ce qui avait été observé par Kammouni et al. avec la protéine « BH3- only » BNIP3, la présence de cytokines proinflammatoires n'inhibait pas l'effet pro- apoptotique de PUMA dans les synoviocytes, mais qu'au contraire, de manière surprenante, ces cytokines induisaient une augmentation de l'effet pro-apoptotique de PUMA, ce qui est particulièrement intéressant dans un contexte inflammatoire. La présente invention a en conséquence pour objet un complexe constitué 30 a) d'un adénovirus recombinant exprimant le gène codant pour la protéine PUMA sous contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère et b) d'un baculovirus recombinant contenant un récepteur coxsackie-adénovirus (CAR) de mammifère inséré dans son enveloppe, pour l'utilisation comme médicament induisant l'apoptose des synoviocytes pour le traitement local d'une maladie articulaire liée à un défaut d'apoptose 35 des synoviocytes. Ladite maladie articulaire peut être notamment une maladie inflammatoire. Le complexe selon l'invention peut en particulier être utilisé pour le traitement de l'inflammation articulaire due à la polyarthrite rhumatoïde ou à un autre rhumatisme inflammatoire, ou intervenant au cours des poussées d'arthrose, de la chondrocalcinose, de la goutte, de l'arthropathie hémophilique, du descellement de prothèses articulaires, ou d'une tumeur synoviale telle que rencontrée notamment dans le cas de la synovite villo-nodulaire. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite maladie articulaire est la polyarthrite rhumatoïde. Le complexe selon l'invention sera administré par voie intra-articulaire ou péri-articulaire, par exemple par injection ou infiltration. Les complexes adénovirus-BVcAR utilisables pour exprimer la protéine 10 PUMA dans le cadre de la présente invention sont ceux décrits dans la Demande PCT WO 2011/042769. La protéine PUMA est de préférence la protéine humaine. La séquence de la protéine PUMA humaine a été déterminée par Yu et al. (Mol. Cell., 7(3) :673-82, 2001) et par Nakano et al. (Mol. Cell.; 7(3) :683-94, 2001). La séquence de l'ADNc et de la protéine PUMA humaine est enregistrée dans GenBank, sous le numéro AF332558. 15 La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de mise en oeuvre de l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 montre le complexe HadV5-GFP-BVG1 observé en microscopie immuno-électronique. Le vecteur HadV5-GFP apparaît comme une particule 20 icosaédrique de 80 nm de diamètre, lié à 13VcAR en forme de barre de 300-350 nm de longueur. Dans la Figure la, les molécules CAR sont révélées par leur immunoréactivité avec un anticorps monoclonal anti-CAR (CAR mAb) et un anticorps secondaire marqué à l'or, apparaissant sous forme colloïdale de 20 nm. Dans la Figure lb, les glycoprotéines d'enveloppe gp64 du BV sont à leur tour marquées avec un anticorps anti-gp64 (Gp64 25 mAb) et un anticorps secondaire marqué à l'or. La Figure 2 illustre la transduction de synoviocytes humains primaires, observée par microscopie à fluorescence, par un vecteur HAdV5-GFP seul (Figure 2a) ou par le complexe HAdV5-GFP-BVc1R (Figure 2b). La Figure 3 montre le pourcentage des cellules positives à GFP, 30 quantifiées par cytométrie de flux, dans les échantillons de synoviocytes des Figures 2a et b, soit non prétraitées (w/o TNFa & IL-17), soit prétraitées avec les cytokines pro-inflammatoires TNF-a et IL-17 (+ TNFa & IL-17). La Figure 4 illustre l'effet de l'expression de la protéine PUMA sur les synoviocytes humains, observés au microscope. Les 3 photos de la ligne du dessus (a, b, c) 35 correspondent aux cultures de synoviocytes non prétraités et celles de la ligne du dessous (d, e, f) aux synoviocytes prétraités avec les cytokines proinflammatoires TNF-a, IL-17 et IL-113. La colonne de gauche (a et d) montre les cellules pseudo-infectées (« mockinfected » en anglais), c'est-à-dire ayant subi le protocole d'infection mais en l'absence de vecteur (0 vp/cell), la colonne du milieu les cellules infectées avec HAdV5-GFP-BVcAR (b et e), et la colonne de droite les cellules infectées avec HAdV5-PUMA-BVcAR (c et f). La Figure 5 montre l'expression de la protéine PUMA dans plusieurs échantillons de synoviocytes humains (échantillons issus des patients 1, 2 et 3) prétraités par le INF-a, l'IL-17 et l'IL-113, soit non-infectés (échantillons témoins, trois pistes de gauche), soit infectés par le complexe viral HAdV5-PUMA-BVcAR (trois pistes de droite). La protéine PUMA (18 kDa) présente dans les lysats cellulaires a été mise en évidence par électrophorèse en gel de polyacrylarnide-SDS suivi d'immunotransfert et révélation par un anticorps spécifique anti-PUMA. La Figure 6 montre la dépendance à la dose de vecteurs de la mort cellulaire induite par PUMA. Des synoviocytes humains non traités et traités avec les cytokines INF-a, IL-17 et IL-113, ou en combinaison INF-a + IL-17 et INF-a + IL-l3, ont été infectées à des doses croissantes de HAdV5-PUMA-B-VcAR. La mort cellulaire a été évaluée en utilisant un test MTT, et le nombre de cellules survivantes a été exprimé comme le pourcentage par rapport aux cellules contrôle, pseudo-infectées (0 vp/cell), dont le nombre définit la valeur 100%. La Figure 7 illustre la cinétique de mort cellulaire due à l'expression de PUMA. Des synoviocytes non traités (A) ou traités avec INF-a (B), IL-17 (C), ou un mélange de INF-a et IL-17 (D), ont été infectés à une dose de vecteur constante de 20 vp/cell, la viabilité cellulaire a été suivie pendant 48h. HAdV5-GFP-BVcAR a été utilisé à la même dose de vecteur en tant que contrôle. La mort cellulaire a été évaluée par test MTT et le nombre de cellules survivantes exprimé comme le pourcentage par rapport au nombre de cellules contrôle pris à temps 0 d'infection, auquel on attribue la valeur 100%. La Figure 8 montre la fragmentation nucléaire des synoviocytes humains 25 infectés avec HAdV5-PUMA-BVcAR. Microscopie à fluorescence des synoviocytes pseudo-infectés (0 vp/cell) (a) et des synoviocytes infectés par HAdV5-PUMA-BVc1 à 50 vp/cell, et récoltés bh après infection (pi). La Figure 9 illustre la quantification de la libération cytoplasmique des nucléosomes dans les synoviocytes humains infectés avec HAdV5-PUMA-BVcAR. Des 30 synoviocytes, traités ou non avec des cytokines (TNF-a seul, 1L-17 seul, ou TNF-a et IL-17 en mélange), ont été infectés à des doses croissantes de HAdV5-PUMA-BVcAR, et récoltés 24h après infection. La fragmentation de l'ADN et la libération des nucléosomes dans le cytoplasme ont été déterminés en utilisant la détection immunologique des fragments d'ADN complexés aux histones. Les lysats des cellules pseudo-infectées 35 (0 vp/cell) ont servi de contrôle négatif pour évaluer le niveau basal, c'est-à-dire le contenu physiologique du cytoplasme en nucléosomes. Les résultats ont été exprimés en multiples du niveau basal, auquel a été attribuée la valeur 1. La Figure 10 représente les résultats de l'infection de synoviocytes obtenus à partir d'échantillons de patients, par HadV5-PUMA-BVcAR. Ces synoviocytes, traités ou non par des cytokines (TNF-a seul, IL-17 seul, ou TNF-a et IL-17 en mélange), ont été infectés avec HAdV5-PUMA-BVc1 à une dose constante de vecteur adénoviral de 50 vp/cell. La viabilité cellulaire a été suivie pendant 40h, en utilisant le test MTT. Le nombre de cellules survivantes a été exprimé comme le pourcentage de cellules contrôle, pris au temps 0 de l'infection, auquel a été attribuée la valeur 100%. EXEMPLE 1 : TRANSDUCTION DE SYNOVIOCYTES PAR HADV5-BVcAR Les synoviocytes utilisés dans les présents exemples ont été obtenus à partir de tissu synovial de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) subissant une chirurgie de l'articulation et qui remplissaient les nouveaux critères de définition de la PR, établis par le Collège américain de rhumatologie (Aletaha et al., Arthritis & Rheumatism, 2569-81, 2010), puis ont été préparés comme décrit dans la Demande PCT WO 2011/042769. Des vecteurs HAdV5 non réplicatifs, exprimant la protéine verte fluorescente (GFP, pour green fluorescent protein), sous le contrôle du promoteur fort précoce-immédiat du cytomégalovirus (CMV), ont été obtenus comme décrit dans la Demande PCT WO 2011/042769 sauf que les cellules de rein d'embryon humain HEK293, ou « cellules 293» (ATCC n° CRL-1573), ont été préalablement maintenues en monocouches en milieu DMEM (Invitrogen) supplémenté de 10% de SVF (Invitrogen), pénicilline (100 U/m1) et streptomycine (100 mg/mi) à 37°C et 5% CO2. Le vecteur baculovirus (BV) recombinant exprimant la protéine CAR (BVcAR) a été obtenu comme décrit dans la Demande PCT WO 2011/042769. Les complexes de vecteurs adénovirus et baculovirus et les cellules pour 25 les essais de transduction ont été préparés comme décrit dans la Demande PCT WO 2011/042769. L'expression cellulaire de GFP a été observée 36h après infection en microscopie à fluorescence et quantifiée par cytométrie de flux. Plus précisément, les cellules transduites ont été observées directement à partir de la plaque de culture, en 30 utilisant un microscope inversé Axiovert (Zeiss). Les images de fluorescence ont été prises avec un appareil photographique digital Axiovert (Zeiss) et analysé à l'aide du programme Axio Vision (Zeiss). Puis, pour l'analyse en cytométrie de flux, les cellules ont été fixées aux temps appropriés avec 2% de paraformaldéhyde dans du PBS une nuit à 4°C, puis rincées une fois avec du PBS et analysées pour la fluorescence GFP à l'aide d'un 35 cytomètre FACSCant0TM II et du logiciel DIVA 6 (Becton Dickinson Biosciences). Les complexes HAdV5-BVcAR ont été observés par microscopie électronique à transmission avec des échantillons colorés négativement et marqués à l'aide d'anticorps couplés à des particules d'or (marquage « immunogold »). Des anticorps monoclonaux dirigés contre la glycoprotéine CAR humaine (clone E1.1, Hemmi et al., Hum. Gene Ther., 9 :2363-2373, 1998) et contre la glycoprotéine gp64 du baculovirus (clone AcV1, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ont été utilisés pour marquer respectivement la présence de molécules CAR extrinsèques sur l'enveloppe de BVcA-R (Figure la), et de la glycoprotéine d'enveloppe gp64 intrinsèque du baculovirus (Fig. lb). Lorsque les synoviocytes ont été infectés avec HAdV5-GFP seul à une dose de vecteurs de 20 particules virales par cellule (vp/cell), l'efficacité de transduction est faible, avec moins de 2% de cellules positives GFP (Figures 2a et 3). En revanche, lorsque la même dose de vecteur HAdV5-GFP a été complexée avec BVcAR, on observe plus de 50% de cellules positives GFP (Figures 2b et 3). De manière surprenante, quand les synoviocytes ont été prétraités avec des cytokines proinflammatoires (TNF-a et IL-17) pour mimer les conditions inflammatoires dans les articulations touchées par l'arthrite, 70% des cellules infectées avec HAdV5-GFP-BVc1 ont été positives GFP (Figure 3). EXEMPLE 2: EXPRESSION DE LA PROTEINE PUMA DANS DES SYNOVIOCYTES A L'AIDE DE HADV5-PUMA ET MORT DES CELLULES Un vecteur basé sur HAdV5, portant le gène PUMA sous le contrôle du promoteur CMV, et couplé au vecteur recombinant BVcAR, a été construit, en suivant le protocole décrit dans l'Exemple 1, en remplaçant GFP par PUMA, le gène PUMA étant ainsi inséré à la place de la région génique El elle-même délétée du génome d'HAdV5. La fonctionnalité de ce vecteur HAdV5-GFP-BVcAR a été évaluée in vitro dans des synoviocytes primaires humains. -Observation au microscope- Les effets cytologiques de l'expression de la protéine PUMA sur les synoviocytes ont d'abord été étudiés en comparant les synoviocytes infectés par HAdV5- PUMA et le vecteur contrôle HAdV5-GFP. Les deux vecteurs ont été utilisés à la même dose (50 vp/cell), et complexés à BVcAR. L'aspect des cellules en monocouche a été observé, 24 h après infection, au microscope (Figure 4). Il n'y a pas eu de changement dans la morphologie des synoviocytes pseudo-infectés (Figure 4a) ou infectés avec HAdV5-GFP-BVcAR (Figure 4b). L'infection avec HAdV5-PUMA-BVcAR a montré une mort massive des cellules (Figure 4c). Ces résultats confirment que l'induction de la mort cellulaire des synoviocytes est due à la protéine PUMA. Pour mimer les conditions inflammatoires rencontrées dans les articulations atteintes d'arthrite, la même expérience a été faite sur des synoviocytes préalablement traités avec 3 cytokines proinflammatoires différentes : TNF-a, IL-17 et IL- 1[3. Une mort cellulaire massive a eu lieu dans les synoviocytes infectés avec HAdV5- PUMA-BVcAR (Figure 40, alors qu'aucun changement visible n'a pu être observé dans les cellules pseudo-infectées (Fig. 4d) et les cellules infectées avec HAdV5-GFP-BVcAR (Fig. 4e). - Évaluation du niveau d'expression de PUMA Trois isolats différents de synoviocytes humains prétraités par le TNF-a, l'IL-17 et l'IL-1f1 ont été infectés ou non (témoins non-infectés) par le complexe HAdV5-PUMA- BVcAR afin d'analyser le niveau d'expression de la protéine PUMA. Les cellules ont été récoltées après 24h d'infection et les lysats cellulaires analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS et immunotransfert ('SDS-PAGE & Western blotting'). Pour mettre en évidence la protéine PUMA, ont été utilisés successivement : (1) un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la protéine PUMA humaine (obtenu de la firme Epitomics), suivi (2) d'un anticorps anti-IgG de lapin marqué à la peroxydase (obtenu de la firme Sigma) ; (3) la réaction enzymatique de la peroxydase à été visualisée grâce à un substrat chimioluminescent (kit West-Pico, commercialisé par la firme Pierce). Les échantillons de cellules témoins non-infectées montrent un niveau très faible d'expression de la protéine PUMA dans les synoviocytes humains (expression dite `basale'). En revanche, dans les échantillons de cellules infectées par le complexe HAdV5-PUMABvcAR, on constate un niveau d'expression significativement élevé de la protéine PUMA, visible comme une bande majoritaire migrant à la position attendue pour une protéine de masse moléculaire de 18,000 daltons (18 kDa ; Fig. 5). -Mesure de la survie cellulaire à différentes doses de vecteur- Les résultats d'observation au microscope ci-dessus montrent que l'utilisation de HAdV5-PUMA-BVcAR à une dose de vecteur de 50 vp/cell a entraîné la mort de la quasi-totalité des synoviocytes en monocouches, 24h après infection. L'efficacité de la mort cellulaire induite par PUMA a été déterminée pour plusieurs doses de vecteurs, par numération des cellules vivantes par test MTT. Pour cela, des cellules cultivées sur plaques 96 puits à fond plat ont été infectées, et analysées 36 heures après infection. Le milieu de culture cellulaire a ensuite été retiré, et 30 aL de solution MTT (7,5 mg/m1 de bromure de thiazolyl-tétrazolium (Sigma-Aldrich) dans du PBS) ont été ajoutés dans chaque puits et le tout a été incubé à 37°C pendant 4h. La solution MTT a alors été enlevée et 100 !AL de DMSO (diméthylsulfoxyde, Sigma-Aldrich) ont été ajoutés dans chaque puits. La densité optique des surnageants dans la plaque 96 puits a été lue à 570 nm. Les résultats sont indiqués à la Figure 6 et sont exprimés en pourcentage de survie cellulaire par rapport au contrôle. Pour les synoviocytes non traités aux cytokines, le pourcentage de cellules viables a diminué de manière dépendante à la dose de vecteur, avec 90% de cellules viables à 5 vp/cell, 75% à 20 vp/cell, et 15% à 50 vp/cell. Les synoviocytes infectés par HAdV5-PUMA-BVcAR et traités avec TNF-a ont montré une baisse similaire de la viabilité cellulaire, de 83% de survie cellulaire à 5 vp/vell à environ 10% à 50 vp/cell. De manière surprenante, les synoviocytes prétraités à 1'IL-17 ou 1' IL-1 ont montré une susceptibilité significativement plus importante à PUMA à des faibles doses de vecteurs (5 à 20 vp/cell). Le traitement des synoviocytes avec TNF-a en combinaison avec IL-17 ou IL-1f3 a résulté en une plus grande sensibilité à la mort cellulaire induite par PUMA, comme observé avec les traitements avec IL-17 seul ou IL-1f3 seul. Ces résultats démontrent que le niveau de mort cellulaire induit par PUMA est dépendant de la dose de vecteur, et que les synoviocytes traités avec des cytokines proinflammatoires sont plus sensibles à la mort cellulaire induite par PUMA. EXEMPLE 3: CINETIQUES DE MORT CELLULAIRE APRES INFECTION 10 AVEC HADV5-PUMA-BVcAR Les cinétiques de mort cellulaire induite par PUMA des synoviocytes traités ou non par des cytokines ont été déterminées en mesurant le pourcentage de survie cellulaire aux temps 0, 18, 24 et 48h après infection, en utilisant une dose constante de HAdV5-PUMA-B-VcAR de 20 vp/cell, et analysées par test MTT, de la même manière que 15 dans l'Exemple 2. L'effet cytotoxique basal causé par l'infection avec un vecteur non réplicatif HAdV5 a été déterminé en utilisant HAdV5-GFP-BVcAR à la même dose de vecteur que HAdV5-PUMA-BVcAR. 18h après infection, environ 25% de la mort cellulaire était ainsi due à l'infection par HAdV5, indépendamment de l'effet de PUMA (Figure 7A). 20 Entre 18 et 48h après infection, le pourcentage de cellules viables est resté stable, à environ 70%. L'infection avec HAdV5-PUMA a conduit à une baisse rapide de la proportion des cellules viables, avec 50% de survie cellulaire 18h après infection, et 30% 48h après infection. Le prétraitement des synoviocytes avec TNF-a, IL-17 et la combinaison 25 des deux cytokines a augmenté l'effet sur la mort cellulaire par la protéine PUMA, en obtenant seulement 40% de survie cellulaire 18h après infection contre 90% pour les synoviocytes infectés avec le vecteur contrôle HAdV5-GFP-BVc1\R (Figures 7B à D). Entre 18 et 48h, le pourcentage de survie cellulaire est resté stable à environ 80% pour les cellules infectées par le contrôle HAdV5-GFP-BVcAR, alors qu'il a progressivement 30 diminué jusqu'à 30% pour les cellules infectées par HAdV5-PUMA-BVcAR. Ces résultats sont en accord avec les observations faites au microscope (Figure 4), et confirment que PUMA est directement impliquée dans l'induction de la mort cellulaire rapide des synoviocytes. EXEMPLE 4: FRAGMENTATION NUCLEAIRE ET APOPTOSE DES 35 SYNOVIOCYTES INFECTES PAR HADV5-PUMA-BVcAR L'observation en microscopie à fluorescence des synoviocytes incubés avec le colorant DAPI (4'-6'-diamidino-2-phénylindole) a montré une fragmentation de l'ADN dans les cellules infectées avec HAdV5-PUMA-BVcAR. Une étude cinétique a indiqué que cette fragmentation nucléaire se produisait dès 6h après infection, alors que le nucleus des cellules contrôle, pseudo-infectées, est resté intact et entier (Figures 8a et b). L'induction de la fragmentation de l'ADN et de la mort cellulaire par 5 apoptose dans les cellules infectées par HAdV5-PUMA-BVcAR a été évaluée quantitativement 24h après infection, par quantification des nucléosomes à l'aide d'un kit FUSA (kit « Cell Death Detection », Roche Diagnostics). Pour cela, des aliquotes de synoviocytes (105 cellules) ont été récoltées 24h après infection, et centrifugées pendant 5 minutes à 200 g. Les culots cellulaires ont ensuite été resuspendus dans 250 ul de tampon 10 d'incubation et incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 20000 g pendant 10 minutes et les surnageants ont été utilisés pour les mesures d'apoptose. Pour cela, un dixième de chaque surnageant a été incubé sur une plaque 96 puits préalablement revêtue d'anticorps anti-histone (clone H11-4), marqués à la biotine, pendant 90 minutes à température ambiante. Les puits ont été rincés 3 fois, et 15 100 ul de solution contenant un anticorps anti-ADN (clone M-CA-33) conjugué à la peroxydase ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque 96 puits a ensuite été incubée à nouveau pendant 90 minutes à température ambiante. Les puits ont été à nouveau rincés 3 fois avant l'ajout de 100 ul de solution de substrat (ABTS) dans chaque puits. Enfin, la plaque a été incubée sur un mélangeur (à 250 rpm) pendant environ 20 minutes, et la 20 densité optique (DO) a été mesurée à 405 nm. Ce test a déterminé immunochimiquement les fragments d'ADN complexés aux histones qui ont été libérés dans la fraction cytoplasmique des lysats obtenus à partir des synoviocytes infectés avec HAdV5-PUMA-BVcAR à différentes doses de vecteur. Les lysats obtenus à partir des cellules pseudo-infectées ont servi de contrôles 25 négatifs et ont fourni le niveau basal des nucléosomes libérés physiologiquement dans le cytoplasme. En l'absence de cytokines, l'induction de l'apoptose par PUMA a été dose-dépendante, avec une libération de nucléosomes cytoplasmiques 6 fois plus importante que le niveau basal, à la dose de vecteur de 10 particules virales par cellule (vp/cell), et 12 fois plus importante à 20-40 vp/cell (Figure 9). En présence de TNF-a, d'IL-17, ou de ces 2 30 cytokines (TNF-a + IL-17), le niveau des nucléosomes cytoplasmiques a augmenté significativement, jusqu'à 12 à 15 fois le niveau basal à la dose de 10 vp/cell, et est resté à cette valeur plateau pour les plus fortes doses. EXEMPLE 5: EFFET DE HADV5-PUMA-BVcAR SUR LES SYNOVIOCYTES DERIVES D'ECHANTILLONS DE TISSU 35 Des synoviocytes primaires dérivés de 3 patients différents ont été utilisés pour évaluer de manière comparative leur sensibilité à l'apoptose induite par PUMA. L'infection par HAdV5-PUMA-B-VcAR a été réalisée à une dose de vecteur de 30 vp/cell, en l'absence ou en présence de cytokines proinflammatoires, et le niveau de cytotoxicité a été mesuré par test MTT, de manière similaire à l'Exemple 2, sur une période de 40h après infection. Les courbes de survie cellulaire des trois échantillons cliniques différents, représentées à la Figure 10, présentent des profils relativement similaires, avec une baisse rapide dans la survie cellulaire 16h après infection, suivie par une baisse plus progressive jusqu'à 40h. L'infection par HAdV5-PUMA-BVcAR des synoviocytes primaires des patients 1 et 2 a montré un effet sur la mort cellulaire significativement plus important en présence des cytokines, en particulier d'IL-17, par rapport à l'effet observé en l'absence de cytokines (Figures 10A et B). Pour les synoviocytes du patient 3, il n'y a eu aucune différence dans l'induction de la mort cellulaire entre les cellules traitées ou non par les cytokines (Figure 10C). Dans les trois cas, le pourcentage de survie cellulaire 40h après infection a été réduit de manière drastique, jusqu'à 30% ou moins. Ces résultats démontrent que l'apoptose induite par HAdV5-PUMA-BVcAR est efficace et rapide pour les synoviocytes dérivés de patients différents. REVENDICATIONS1. Complexe constitué a) d'un adénovirus recombinant exprimant le gène codant pour la protéine PUMA sous contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère et b) d'un baculovirus recombinant contenant un récepteur coxsackieadénovirus (CAR) de mammifère inséré dans son enveloppe, pour l'utilisation comme médicament induisant l'apoptose des synoviocytes pour le traitement local d'une maladie articulaire. 2. Complexe pour l'utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite maladie articulaire est une maladie inflammatoire. 3. Complexe pour l'utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite maladie articulaire est choisie parmi la polyarthrite rhumatoïde, les rhumatismes inflammatoires, les poussées d'arthrose, la chondrocalcinose, la goutte, l'arthropathie hémophilique, le descellement de prothèses articulaires, et les tumeurs synoviales. 4. Complexe pour l'utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la protéine PUMA est la protéine PUMA humaine. 5. Complexe pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel 1' adénovirus est 1' adénovirus humain de sérotype 5 (HAdV5). 6. Complexe pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le baculovirus est un virus de la polyédrose nucléaire de groupe I choisi parmi le virus de la polyédrose nucléaire multiple d' Autographa californica (AcMNPV) et le virus de la polyédrose nucléaire Bombyx mort (BmNPV). 7. Complexe pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le récepteur CAR est un récepteur CAR de mammifère, et de préférence le 25 récepteur CAR humain.