FR 3018357 A1 20150911 FR 1451740 A 20140304 Nouvelles lectines et applications pour la détection de marqueurs d'états pathologiques L'invention a pour objet des nouvelles lectines, utilisables, notamment, pour détecter spécifiquement des marqueurs d'états pathologiques. Les lectines sont des protéines, d'origine eucaryote ou procaryote, qui se lient aux sucres, mono-, oligo- et polysaccharides, de manière généralement réversible, avec une forte spécificité, sans les modifier. Sur la surface des cellules, les sucres sont présents dans des glycoconjugués résultant de leur liaison à des protéines ou à des lipides. Le terme « glycane » est généralement employé pour désigner les sucres des glycoconjugués. Les lectines sont habituellement des protéines multimériques, par oligomérisation ou répétition en tandem de motifs monomériques (également désignés ci-après par le terme « modules »), ce qui leur confère un rôle clé dans l'agglutination, l'affinité pour la surface cellulaire, le recrutement de glycolipides, ou encore le marquage de tissus. Les chaînes peptidiques de chaque module présentent des extrémités C-ter et N-ter et comprennent des sites de fixation aux glycanes. De nombreuses fonctions biologiques, par exemple la signalisation cellulaire, la migration cellulaire, la reconnaissance immunitaire ou encore l'interaction avec des pathogènes, mettent en jeu des interactions entre protéines et glycanes. La mise à profit de ces interactions se heurte toutefois aux difficultés rencontrées dans la détermination de la structure des sucres impliqués. Un effort important a été apporté ces dernières années à l'étude de leurs 30 fonctions et des mécanismes de leur association avec des ligands spécifiques. La production de nouvelles lectines par bio-ingénierie reste cependant à ce jour un défi. Mettant à profit leur expérience dans ce domaine, les inventeurs ont orienté leurs recherches vers la production de nouvelles lectines non-naturelles, appelées ci-après néolectines, en utilisant le concept de la multivalence naturelle des lectines et en partant de lectines ayant une architecture de base adaptée pour la reconnaissance de sucres à la surface externe des cellules. Cette démarche a permis de créer, à partir des lectines existantes, des néolectines de valence et/ou de spécificité modulables, de grand intérêt pour des applications de diagnostic, en particulier en cancérologie. L'invention vise donc de nouvelles lectines ou néolectines, de grande pureté avec une spécificité optimisée. Elle vise également un procédé d'obtention de ces néolectines, basé sur l'ingénierie moléculaire de lectines d'origine procaryote ou eucaryote, permettant de disposer en grande quantité, de manière reproductible et à moindre coût, comparé à la production d'anticorps dirigés contre des épitopes oligosaccharidiques, de produits de grande spécificité. L'invention a également pour but de fournir de nouveaux marqueurs oligosaccharidiques de grande spécificité, pour la reconnaissance des cellules, en particulier de certains états pathologiques, tels que la 25 cancérisation. Elle vise également leur application pour la détection spécifique de glycoconjugués, marqueurs d'autres états pathologiques. 30 Les néolectines peuvent aussi être appliquées pour identifier des glycanes dans d'autres domaines d'application : caractérisation de molécules ou de cellules en laboratoire de recherche, contrôle de qualité dans les productions pharmaceutiques ou alimentaires. Les lectines constituant l'architecture de base pour les néolectines de l'invention sont également désignées ci-après par « lectines de référence ». Il s'agit des protéines multimériques avec une architecture de type p-propeller, formées de modules monomères d'environ 30 à 60 acides aminés, dans lesquels les sites de fixation aux glycanes sont situés d'un même côté des protéines et les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques de l'autre côté des protéines, ce qui leur confère de très fortes propriétés de fixation sur les glycanes des surfaces cellulaires. L'invention vise des néolectines de ce type, caractérisées en ce qu'elles sont formées de 4 à 7 modules monomères, un seul, ou plusieurs ou la totalité des modules adjacents étant reliés entre eux par des linkers liant l'extrémité N-terminale d'un module à l'extrémité C-terminale du module adjacent. Selon ce mode de réalisation, l'invention vise une néolectine monomérique, formée d'une seule chaîne peptidique avec respectivement une extrémité C- ter et une extrémité N-ter libres, et comportant des linkers reliant les autres extrémités C-ter et N-ter des modules adjacents constitutifs de la lectine. Les linkers sont identiques ou différents, et comprennent des séquences peptidiques de taille suffisante pour relier les extrémités C-ter et N-ter et 25 comportent avantageusement de 2 à 10 acides aminés. On mesurera que cette disposition fournit des néolectines de différentes valences, allant de la monovalence à la multivalence. 30 Plus particulièrement, l'invention vise des néolectines telles que définies ci- dessus, caractérisées en ce qu'elles comportent, par rapport à la lectine de référence, des chaînes peptidiques avec zero, une ou plusieurs mutations dans le site de fixation aux glycanes d'un ou plusieurs modules monomériques. Ces mutations dans les lectines ont pour effet de moduler la spécificité en invalidant, comme souhaité, zéro, 1 ou plusieurs sites de fixation aux glycanes. La néolectine monomérique de ce mode de réalisation est multivalente, possédant plusieurs sites de fixation aux glycanes, ou monovalente possédant un seul site de fixation aux glycanes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la néolectine monomérique, multivalente ou monovalente, est une protéine recombinante incluant des linkers entre modules et pouvant également comprendre une ou plusieurs mutations dans un ou plusieurs sites de fixation aux glycanes d'au moins 1 module constitutif, par rapport à la lectine de référence. Cette disposition confère à la néolectine une spécificité donnée, qui peut être modulée ou modifiée comme décrit ci-après an rapport avec leur procédé d'obtention. Ces néolectines recombinantes présentent l'avantage d'une grande pureté et reproductibilité. L'architecture de base de ces néolectines correspond avantageusement à 25 celle de lectines eucaryotes ou procaryotes dont les structures cristallographiques sont connues. Il s'agit de lectines multimériques présentant une proximité spatiale des extrémités N-terminales et C-terminales de monomères adjacents, 30 appropriées pour être transformées en néolectines conformément à l'invention. On citera par exemple les lectines RSL (lectine de Ralstonia solanacearum), BambBL (lectine de Burkholderia ambifaria), BC2LC-nt (lectine de Burkholderia cenocepacia), HPA (lectine de Helix pomatia), discoïdine (lectine de Dictyostelium discoideum), CTX-B (lectine de la toxine de choiera) et d'autres toxines bactériennes de type B5, AAA (lectine d'Anguilla anguille) et la lectine d'adénovirus. Les structures cristallographiques de RSL et de HPA, résolues par les inventeurs, sont données sur la figure 1. Selon une disposition de l'invention, prise en combinaison avec l'une quelconque des définitions ci-dessus, la néolectine comprend, du côté comportant les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques, un ou plusieurs groupes fonctionnels de type Lysine comportant un groupement amine qui peuvent être couplés à des molécules permettant le marquage tels que les fluorophores et la biotine ou qui peuvent être activés pour fixer la lectine sur une surface par exemple plaque Elisa, puce d'or, puce de verre. L'invention vise également un procédé d'obtention des néolectines définies ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, l'ajout, dans une lectine de référence telle que définie ci-dessus, de séquences linkers reliant les extrémités C-ter et N-ter des motifs monomères adjacents, au moins deux modules adjacents conservant leurs extrémités respectives C-ter et N-ter libres. Une néolectine monomérique multivalente, constituée d'une seule chaîne peptidique est obtenue lorsque toutes les extrémités C-ter et N-ter ont été reliées entre elles à l'exception d'un site formé par 2 motifs adjacents avec leurs extrémités C-ter et N-ter, respectivement, libres. Les linkers sont introduits par ingénierie protéique en insérant une séquence d'acides nucléiques entre les séquences codant pour les chaînes peptidiques des modules constitutifs de la lectine de référence. L'étape de passage d'une lectine multimérique multivalente à une lectine monomérique monovalente est avantageusement couplée à une étape d'invalidation d'au moins un site de fixation des chaînes peptidiques aux glycanes, ce qui permet de modifier l'affinité de la lectine. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape d'invalidation est réalisée par mutagénèse ponctuelle dans la chaîne peptidique en modifiant la séquence nucléique codante pour un ou plusieurs des acides aminés impliqués dans la liaison au sucre tel qu'identifié par analyse cristallographique et en la remplaçant par la séquence codante des acides aminés souhaités. Les données structurales acquises pour les lectines ciblées apportent une connaissance fine de leurs sites de fixation aux oligosaccharides. Les acides aminés impliqués dans la liaison aux sucres (liaison hydrogène, contact hydrophobe, interaction electrostatique) peuvent être très précisément ciblés. Par mutagenèse dirigée, il est par conséquent aisé de remplacer le ou les acides importants pour la fixation au sucre par un autre qui n'interagira pas. Grâce à la mise au point du gène avec dégénérescence controlée, il est possible d'invalider sélectivement le ou les site(s) de fixation sur la chaine protéique pour atteindre la valence choisie. En invalidant tous les sites de fixation pour les glycanes, à l'exception d'un seul, on obtient une néolectine monovalente et monomérique qui peut être manipulée par les outils classiques d'ingénierie protéique. A partir de la connaisance de la structure cristallographique de la protéine, une spécificité envers un glycanne d'intérêt biologique peut alors être obtenu. Si souhaité, la multivalence de la lectine peut être rétablie partiellement ou en totalité. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'évolution dirigée se fait en créant par phage display une librairie de lectines avec une grande diversité d'acides aminés dans les boucles formant le site de reconnaissance. Il est ensuite possible de sélectionner les mutants intéressants, par example sur billes magnétiques portant l'épitope cible, puis de caractériser leur spécificité. Différentes techniques (ELISA, puce à sucre..) permettent de vérifier la spécificité des néolectines. Leur affinité pour les épitopes oligosaccharides cibles peutt être mesurée par exemple par microcalorimétrie de fixation et résonance plasmonique de surface. Les néolectines monovalentes dont la spécificité a été modifiée peuvent être utilisées dans l'état, après marquage par molécules fluorescentes sur les boucles accessibles sur la face éloignée du site à glycanne. Elles peuvent être également transformées en lectines multivalentes par mutagénèse en modifiant chacun des sites précédemment invalidés pour leur attribuer la nouvelle spécificité. Ces néolectines multivalentes ont une affinité très forte pour les glycoconjugués présents à la surface des membrance cellulaires. Leur marquage sur la face opposées aux sites de fixation permet de les utiliser ensuite pour la reconnaissaince optimale de la glycosylation de surface cellulaire. En fonction de la valence et de la spécificité, ces néolectines peuvent être utillisées dans plusieurs domaines d'application impliquant la reconnaissance d'épitopes de glycosylation à la surface de cellules, comme le marquage de cellules et de tissus, le ciblage et la vectorisation, ou l'inhibition de l'infection virale par exemple de VIH. Elles peuvent être également utlisées pour la reconnaissance de la glycosylation de protéines naturelles ou recombinantes avec un champ d'application dans les laboratoires de recherche ou dans le contrôle de qualité dans la production de protéines recombinantes telles que les anticorps thérapeutiques. Ces domaines d'application vont de la recherche en glycobiologie (analyse de glycome par puces à lectine, colonne de purification pour glycoconjugués, marquage de cellules modifiées...), au diagnostic médical (identification de changement de glycosylation associé à certaines états pathologiques tels que l'inflammation et le cancer), à la biotechnologie (contrôle de la glycosylation de protéines recombinantes produites en cellules eucaryotes, tels que les anticorps thérapeutiques), jusqu'aux applications thérapeutiques (ciblages de composés actifs et internalisation cellulaire, inactivation de sites d'entrée de certains virus). L'application des néolectines pour le diagnostic et le suivi de certaines tumeurs cancéreuses s'avère de grand intérêt pour la détection des tumeurs et de leurs marges, ainsi que le suivi de leur amélioration ou de leur dégradation dans le cas d'un traitement. Ces néolectines peuvent également être utilisées sur des puces afin d'affiner et de standardiser les diagnostics. Il convient de noter que les néolectines de l'invention peuvent être comparés aux anticorps dirigés contre des épitopes glucidiques, mais présentent l'avantage de pouvoir être produites plus facilement, en plus grandes quantités et donc à coût réduit. Les néolectines seront produites en bactéries ou en cellules eucaryotes par les techniques classiques de biotechnologie. Des étiquettes ou domaines protéiques supplémentaires pourront être fusionnés avec les néolectines pour aider à leur production ou à leur purification. Ces domaines pourront être clivés des néolectines ou non, en fonction des applications envisagées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et sont illustrés par les Figures 1 à 5, qui représentent respectivement, - la Figure 1, des lectines multimériques utilisées selon l'invention, présentant leurs sites de fixation du même côté de la protéine - les Figures 2A à 2D, le schéma de production de néolectines de valence et de spécificité modulables par ingénierie protéique, - la Figure 3, des vues de dessous et de côté avec linkers d'une néolectine de RSL et de HPA, - les Figures 4A à 4C, l'inactivation d'un site de reconnaissance dans les chaînes peptidiques de 3 modules de RSL - les Figures 5A à 5C, deux vues orthogonales(5A et 5B) et une vue de dessous de la structure cristallographique d'une néolectine de RSL complexée avec le fucose (5C). Exemple 1 : Schéma de production d'une néolectine monomérique monovalente par transformation d'une lectine de référence Comme illustré sur les Figures 2A à 2D, on utilise une lectine de référence multimérique multivalente (2A) formée de 6 modules répétés, chaque module étant formé d'une chaîne peptidique comprenant 2 extrémités terminales, respectivement, N-ter et C-ter et comportant un site de fixation aux glycanes représenté par «0». Des linkers sont ajoutés pour relier les extrémités C-ter et N-ter de 2 modules voisins, à l'exception de 2 extrémités adjacentes C-ter et N-ter laissées libres, ce qui conduit à une lectine monomérique multivalente (2B), formée d'une seule chaîne peptidique. Par mutagénèse ponctuelle basée sur la connaissance structurale de la lectine, on obtient une lectine monomérique monovalente (2C). La spécificité de la lectine (2C) est modifiée comme souhaité (évolution dirigée par phage display ou mutations ponctuelles basées sur les connaissances structurales) pour obtenir des néolectines de valence et spécificité contrôlées (2D). Exemple 2 : Obtention de néolectines de RSL de valence contrôlée On utilise une néolectine de RSL formée de 3 motifs dimères 1-2, 3-4 et 56. Les motifs 2 ;3 et 4 ;5 sont reliés par un linker de séquence SEQ ID N°1 : SSTVPGD sélectionné en raison de sa similarité avec des linkers naturels. La séquence nucléotidique codant pour ce peptide est insérée entre les séquences codant pour les motifs peptides pour lier entre elles les extrémités C-ter et N-ter en 2 ;3 et 4 ;5. Les séquences nucléotidiques codant pour les motifs 1-2, 2-3 et 4-5 ont été auparavant modifiées pour présenter des différences entre elles. Cette stratégie permet de modifier les sites de liaison, et donc de modifier les valences aux positions choisies, ce qui conduit à différentes topologies. La Figure 3 représente la lectine de référence RSL et vue de dessous et vue de côté avec les linkers. Une représentation est également donnée pour une lectine de HPA avec des linkers. 30 Par mutagénèse dirigée, une Arginine en position 17 de la chaîne peptidique de 3 modules de RSL, a été remplacée par une Alanine afin de supprimer le contact avec le glycane. La Figure 4 montre le site de reconnaissance du sucre (4A : les contributions respectives des acides aminés du site de fixation au sucre en termes d'énergie de liaison), l'invalidation du site Arg en position 17 (4B) et la lectine avec ses 3 sites Arg invalidés (4C). Exemple 3: Structure cristallographique d'une néolectine obtenue par ingénierie protéique. La protéine a été construite à partir de la triple réplication d'un gène de RSL avec inclusion de séquences de liaison comme décrit ci-dessus. La protéine a été produite de manière recombinante dans E. cou/ et a été caractérisée. L'affinité pour le fucose est identique à celle de la lectine de référence, et la stoechiométrie est bien de 6 sites à fucose par protéine. Les Figures 5A et 5B montrent que la néolectine se replie bien en architecture du type p-propel ler, avec six sites à fucose intacts, comme la lectine de référence. Les deux liaisons peptidiques qui ont été insérées présentent une certaine flexibilité : l'une est visible dans la carte de densité électronique alors que l'autre est plus flexible. La structure cristallographique du complexe néolectine/Fucose est donnée sur la Figure 5C avec une résolution de 1,35 Ang. A partir de cette néolectine monomérique monovalente, il est possible de réintroduire un ou plusieurs sites de fixation.30 REVENDICATIONS1 - Lectines multimériques avec une architecture de type 13 -propeller, formées de modules monomères d'environ de 30 à 60 acides aminés, dans lesquels les sites de fixation aux glycanes sont situés d'un même côté des protéines et les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques de l'autre côté des protéines, caractérisées en ce qu'elles sont formées de 4 à 7 modules monomères, un seul, ou plusieurs ou la totalité des modules adjacents étant reliés entre eux par des linkers liant l'extrémité N-terminale d'un module à l'extrémité C-terminale du module adjacent. 2 - Lectines selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comportent des chaînes peptidiques avec zéro, une ou plusieurs mutations dans le site de fixation aux glycanes d'un ou plusieurs modules monomériques. 3 - Lectines selon la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont monomériques, formées d'une seule chaîne peptidique avec respectivement une extrémité C-ter et une extrémité N-ter libres, et comportant des linkers reliant les extrémités C-ter et N-ter des modules adjacents constitutifs de la lectine. 4 - Lectines selon la revendication 3, caractérisées en ce que les linkers, identiques ou différents, comprennent des séquences peptidiques de taille suffisante pour relier les extrémités C-ter et N-ter et comportent avantageusement de 2 à 10 acides aminés. - Lectines selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectines multivalentes, possédant plusieurs sites de fixation aux glycanes, ou monovalentes possédant un seul site de fixation aux glycanes. 6 - Lectines selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'il s'agit de lectines monomériques, multivalentes ou monovalentes, comprenant zéro, une ou plusieurs mutations dans un ou plusieurs sites de fixation aux glycanes d'au moins 1 module constitutif.7 - Lectines selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que leur architecture de base correspond à celle de lectines eucaryotes ou procaryotes. 8 - Lectines selon la revendication 7, caractérisées en ce que leurs séquences peptidiques dérivent des lectines RSL (lectine de Ralstonia solanacearum), BambBL (lectine de Burkholderia ambifaria), BC2LL-nt (lectine de Burkholderia cenocepacia, HPA (lectine de Helix pomatia), discoïdine (lectine de Dictyostelium discoideum), CTX-B (lectine de la toxine de choiera) et d'autres toxines bactériennes de type B5, AAA (lectine d'Anguilla anguilla) et la lectine d'adénovirus. 9 - Lectines selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisées en ce qu'elles comprennent du côté comportant les extrémités C-ter et N-ter des chaînes peptidiques, un ou plusieurs groupes fonctionnels lysine présentant un groupement amine permettant de lier des marqueurs tels que des fluorophores, la biotine et d'attacher les lectines sur une surface par exemple plaque Elisa, puce d'or, puce de verre. 10 - Procédé d'obtention de lectines définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout dans la lectine utilisée de séquences linkers reliant les extrémités C-ter et N-ter des motifs monomères adjacents, au moins deux modules adjacents conservant leurs extrémités respectives C-ter et N-ter libres. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par l'obtention de lectines monomériques multivalentes, constituées d'une seule chaîne peptidique en reliant toutes les extrémités C-ter et N-ter entre elles à l'exception d'un site formé par 2 motifs adjacents avec leurs extrémités c-ter et N-ter, respectivement, libres. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en que lesdits linkers sont introduits par des séquences nucléotidiques insérées entre les séquences nucléotidiques codant pour les chaînes peptidiques des modules constitutifs de la lectine de référence.13 - Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en que l'étape de passage d'une lectine multimérique multivalente à une lectine monomérique monovalente est couplée à une étape d'invalidation d'au moins un site de fixation des chaînes peptidiques aux glycanes, ce qui permet de modifier l'affinité de la lectine. 14 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en que l'étape d'invalidation est réalisée au niveau des acides nucléiques codant pour les chaînes peptidiques des modules répétés de la lectine et comprend l'insertion dans les séquences codantes des nucléotides permettant de coder pour la ou les mutations souhaitées. 15 - Lectines selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation en tant qu'un produit ou médicament pour la reconnaissance d'épitopes de glycosylation à la surface de cellules, comme le marquage de cellules et de tissus, le ciblage et la vectorisation, ou l'inhibition de l'infection virale, par exemple de VIH. 16 -Lectines selon la revendication 15, pour son utilisation en tant qu'un produit ou médicament en glycobiologie pour l'analyse de glycome par puce à lectine, dans des colonnes de purification pour glycoconjugués, pour le marquage de cellules modifiées ; en diagnostic, notamment pour l'identification de changements de glycosylation associés à des états pathologiques, tels que l'inflammation et le cancer ; et en thérapeutique, en particulier pour le ciblage de composés actifs et l'internalisation cellulaire ou l'inactivation de sites d'entrée de virus. 17 - Lectines selon la revendication 16, pour son utilisation en tant qu'un produit ou médicament en biotechnologie pour la caractérisation de la glycosylation de protéines recombinantes produites en cellules eucaryotes, tels que les anticorps thérapeutiques.