FR 3012014 A1 20150424 FR 1360347 A 20131023 Procédé de lutte biologique contre Naegleria fowleri, et agent désinfectant contenant des protozoaires de l'espèce Willaertia magna La présente invention concerne un nouveau procédé de lutte biologique contre la présence du genre Naegleria et en particulier de l'espèce Naegleria fowleri, et sa prolifération. Naegleria fowleri (N.f.) est une amibe libre appartenant à la famille des Vahlkampfiidaes. Cette amibe est responsable chez l'homme d'une gravissime pathologie, fort heureusement extrêmement rare (235 cas décelés en 2007) : la méningo-encéphalite amibienne primitive (MEAP) (Cervantes-Sandoval I, 2008 ;Kemble SK, 2012 ; TW, 2010 ; Su MY, 2013). L'infection par ces amibes libres est de pronostic catastrophique en une semaine environ et de quelques semaines sous traitement antibiotique (Su MY, 2013). Il n'existe pas de traitement véritablement efficace contre cette infection, fort heureusement la maladie est rare et demande que des conditions spécifiques soient réunies pour déclencher la MEAP. Ces conditions particulières ainsi que l'inoculum requis sont encore méconnues à l'heure actuelle. Cependant certains médicaments et antibiotiques semblent influer sur l'évolution de l'infection comme l'amphotéricine B, la rifampicine et la miconazole qui associés ont prouvés leur efficacité sur 2 ou 3 personnes. En 1992, la littérature ne rapportait que 7 cas de survie avérée à la MEAP (Gautam PL, 2012) et uniquement chez des sujets très jeunes de 2 à 14 ans et dont le traitement et l'infection ont laissé des séquelles neurologiques plus ou moins importantes. Le taux de survie est donc encore plus bas que pour l'infection au virus Ebola. Aussi, la surveillance et le contrôle de cette amibe libre constituent une préoccupation de plus en plus importante. De façon générale, il est connu que dans l'environnement, Naegleria fowleri présente une répartition ubiquitaire (Martinez AJ, 1997), puisque cette amibe a été isolée du sol, des eaux de rivière et de lac (Jamerson M, 2009) ou des eaux de rejets industriels, et des biofilms (Goudot S, 2012 ; S.A. Huws, 2005), caractéristiques qu'elle partage avec d'autres amibes libres. Plusieurs bactéries potentiellement pathogènes dont Legionella pneumophila, ont développé des mécanismes pour survivre et se répliquer à l'intérieur des amibes libres (Huang SW, 2010 ; De Jonckheere, 2011). De plus, il a été démontré que les centrales nucléaires participaient fortement au développement de l'amibe Naegleria fowleri par un réchauffement de plusieurs degrés de l'eau de rivière. En effet, l'amibe Naegleria fowleri est thermophile avec des gammes de températures de développement allant de 25°C à 45°C (Visvesvara GS, 2007 ). EDF exploitant plus de 11 centrales nucléaires en France a quantifié le risque relatif au taux de Naegleria fowleri détecté dans les eaux. Pour mieux appréhender ce risque, la Direction des Etudes et Recherches et le Service des Etudes Médicales d'EDF ont calculé les risques de décès par MEAP lors d'une baignade, en fonction de la concentration en Naegleria fowleri dans l'eau. Ce risque peut se décomposer de la façon suivante : risque pour 1 baignade = probabilité d'inhaler "n" Naegleria fowleri lorsque l'on se baigne dans une eau où les Naegleria fowleri sont présentes à la concentration "c" (10 ml d'eau inhalée par baignade) multiplié par probabilité de décès lorsque l'on a inhalé "n" Naegleria fowleri (modélisation d'après les données animales). En choisissant le modèle log normal, qui donne les estimations les plus basses, et qui est en bonne adéquation avec les données réelles (USA, Australie, Nouvelle-Zélande), on obtient les risques suivants : Concentration Risque pour une quantité n de N.f. dans l'eau de baignade 1 Naegleria fowleri / litre, risque = 10-8 soit un décès pour 100 millions de baignades 10 Naegleria fowleri / litre, risque = 1,45 x 10-7 soit un décès pour 7 millions de baignades 100 Naegleria fowleri I litre, risque = 7,24 x 10-6 soit un décès pour 140 000 baignades 1000 Naegleria fowleri / litre, risque = 1,34 x 10-3 soit un décès pour 746 baignades Conformément aux recommandations du Conseil supérieur d'hygiène publique de France (CSHPF), le dépassement de la valeur limite de 100 Naegleria fowleri (N.f.) par litre doit conduire à une interdiction de la pratique de la baignade (cf. notamment avis du CSHPF du 4 mai 2004 relatif au retour d'expérience des traitements anti-amibiens à la monochloramine réalisés en 2003 par EDF sur les centrales nucléaires de production d'électricité (CNPE) de Bugey, Chooz, Dampierre, Golfech et Nogent). Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence, de façon totalement inattendue, que le genre amibien Willaertia magna (W.m.) éradique les amibes libres Naegleria fowleri. Cet effet biocide est doublé de la capacité de prédation déjà démontrée de Willaertia magna envers d'autres agents bactériens tels que les bactéries legionella pneumophila, Pseudomonas et Listéria (Bodennec Jacques 2006). La présente invention a donc tout d'abord pour objet un procédé de lutte contre la prolifération des Naegleria, en particulier Naegleria fowleri, qui utilise des protozoaires du genre Willaertia, de préférence Willaertia magna. Les procédés conformes à l'invention n'incluent pas les méthodes de traitement appliquées au corps humain ou animal. Dans le procédé selon l'invention, c'est le plus souvent un flux gazeux ou liquide qui est traité avec des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. Mais il peut s'agir aussi d'une surface solide. Le procédé selon l'invention trouve, en particulier application, dans la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissement par exemple de type nucléaire, des installations industrielles, ou des réseaux de climatisation. Il peut être mise en oeuvre pour lutter contre la formation de biofilms dans les canalisations d'eau, les surfaces en contact ou non avec des denrées alimentaires humaines ou animales. Les protozoaires pourront être directement ajoutés aux eaux ou aux liquides circulant dans les canalisations ou dans les réseaux à traiter. Il est également possible de les pulvériser, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse en aérosol, dans les réseaux, les cheminées, les installations et les surfaces industrielles à désinfecter. De façon avantageuse, les protozoaires utilisés dans le cadre de l'invention correspondent à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC, ces deux souches ayant été 3012 014 4 déposées aux noms du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16 / France et UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex / France. 5 Les protozoaires appartenant au genre Willaertia correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC font partie intégrante de l'invention. Lesdites souches déposées sont également décrites dans la publication de la demande internationale PCT W02008/043969. 10 De tels protozoaires pourront donc être utilisés dans des agents désinfectants, en particulier destinés à l'élimination des amibes Naegleria fowleri et à lutter contre la prolifération et la contamination par Naegleria fowleri. D'autre part, l'invention a pour objet un agent désinfectant contenant des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. 15 Les protozoaires correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC seront préférés. De façon avantageuse, l'agent désinfectant selon l'invention se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, par exemple dans de l'eau distillée. L'agent désinfectant pourra se présenter sous une forme 20 pulvérisable, par exemple en aérosol ou tout autre moyen d'application. L'activité des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna, inhibant la prolifération de Naegleria fowleri a été mise en évidence par les inventeurs en comparant la réplication de Naegleria fowleri en présence et en absence des genres Willaertia, et en particulier de l'espèce 25 Willaertia magna. Les inventeurs ont également démontré le caractère unique de cette inhibition de la croissance de Naegleria fowleri par le genre Willaertia magna en utilisant une autre espèce d'amibe libre Acanthamoeba comme souche contrôle ne provoquant aucune inhibition de la croissance de Naegleria fowleri. 30 Etant donné l'absence de traitement curatif ou prophylactique du risque Naegleria fowleri pour l'homme d'un taux de mortalité de plus de 95% en moins d'une semaine, cette invention est une avancée scientifique majeure pour lutter contre ce fléau amibien avec un impact neutre sur l'environnement et sur l'homme. En effet, la souche Willaertia magna est actuellement reconnue sans classe ni catégorie de danger, de mentions de danger ou de conseil de prudence selon le règlement CE n°1271/2008 à l'inverse de la monochloramine, actuellement utilisée. De plus, la présente invention vise l'utilisation de l'agent désinfectant selon l'invention et/ou les protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna et les protozoaires correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC comme biocide sur les Naegleria. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. 1. MATERIEL ET METHODES 1.1. Souches utilisées: - Amibes : les souches utilisées appartiennent à trois espèces amibiennes différentes : o Naegleria fowleri (ATCC 30809) o Acanthamoeba castellanii (ATCC 30010) o Willaertia magna (souches déposées à ATCC sous les n° PTA 7824 et PTA 7825). Ces trois souches sont cultivées axéniquement, en présence de 10% de sérum de veau foetal, sur milieu SCGYEM (Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium), réparti en tubes GREINERTM à raison de 3m1 par tube. En entretien, les formes végétatives sont repiquées tous les 8-9 jours. Pour les co-cultures, on utilise des repiquages de 3 à 4 jours de manière à disposer de trophozoïtes en pleine phase de croissance exponentielle. Le milieu SCGYEM est obtenu comme suit : > Caséine (MERCK 1.02244.010) 10 g > Na2HPO4 1,325 g > KH2PO4 0,8 g > Glucose 2,5 g > Extrait de levure (DIFCO 0127-17-9) 5 g30 - Eau distillée 900 ml - Sérum de veau foetal 100 ml Aux 900 ml d'eau distillée, sont ajoutés 2,5 ml de NaOH (1 N), puis Na2HPO4 et KH2PO4. Après avoir chauffé légèrement sur plaque chauffante, la caséine est ajoutée progressivement sous agitation magnétique. Après dissolution de la caséine, le glucose et l'extrait de levure sont incorporés. Après dissolution complète, le milieu est filtré successivement sur fibre de verre (SARTORIUS SM 6513400), puis sur membrane de 1pm (WHATMAN 7190 004). Le milieu est ensuite aliquoté en flacons de verre. Les flacons sont stérilisés à l'autoclave 20 minutes à 120°C. Avant l'utilisation définitive et répartition du milieu, le sérum de veau foetal à raison de 10% du volume final est ajouté stérilement sous hotte à flux laminaire. 1.2. Préparation des suspensions mères amibiennes Willaertia magna et Naegleria fowleri: La préparation de chaque suspension amibienne initiale (suspension mère) s'effectue à partir de 4 flasques (T 175 ml) de culture axénique de chaque amibe cultivée en milieu SCGYEM. Ces suspensions amibiennes mères de Naegleria fowleri, Acanthamoeba et Willaertia magna sont récoltées en fin de phase de croissance exponentielle qui est généralement obtenue 4 à 5 jours après le démarrage de la culture. Afin d'augmenter la concentration amibienne récoltée, les flasques sont passées sur un bain de glace pendant 5 à 10 minutes, puis agitées manuellement afin de collecter le plus d'amibes possible. Le contenu de ces 4 flasques est réuni pour énumérer la suspension amibienne obtenue sur une cellule de THOMA ([C]/ml). Les suspensions amibiennes sont transférées dans un tube de 50 ml de type FALCON® afin d'éliminer le milieu de culture SCGYEM par centrifugation à 1500g pendant 10 minutes. Les culots amibiens issus de la première centrifugation sont rincés deux fois par lavage à l'eau distillée stérile et centrifugés à 1500g pendant 10 minutes. A l'issue des 2 lavages, le culot final est repris dans un volume d'eau stérile de 40 ml. 1.3. Mise en évidence de l'effet biocide des Willaertia magna sur les Naegleria fowleri (souche ATCC 30809) : Les co-cultures amibiennes sont réalisées dans des flasques T 25 ml contenant 10 ml de milieu PAS (Page's Amoeba Saline) stérile. L'ensemencement des flasques de co-culture amibiennes se fait à raison de 1 x 105 Willaertia magna/ml et 1 x 105 Naegleria fowleri/ml à partir des suspensions amibiennes axénique préalablement dénombrées sur un hématimètre de Malassez. L'infestation des Willaertia magna par Naegleria fowleri est réalisée en fixant un ratio Naegleria fowleri / Willaertia magna de 1. Les flasques T25 ml sont mises en incubation à l'étuve à 30°C. Le milieu PAS est obtenu comme suit : Solution 1: Quantité pour 500m1 d'H20 Fournisseur [M] NaCI (Poids moléculaire:58.44) 12.0 g Fisher S271-3 0.41 MgSO4.7H20 (Poids moléculaire eptahydrate: 246.47) 0.40 g Sigma 63138 (eptahydrate) 0.0032 CaCl2.6H20 (Poids moléculaire: 219.08) 0.60 g Sigma 442909- 1kg 0.0055 Solution 2: Na2HPO4 (Poids moléculaire anhydre:141.96) 14.20 g Fluka 71629- 100g 0.2 KH2PO4 (Poids moléculaire anhydre: 136.09) 13.60 g Sigma P5655 0.2 Filtrer stérilement les solutions 1 et 2 à l'aide d'un filtre 0.22 pM. Afin d'obtenir 1 litre de milieu PAS: ajouter 5.0 ml de la solution 1 et 5.0 ml de solution 2 puis ajuster le volume à 1 litre avec de l'eau distillée stérile. Les monocultures amibiennes témoins Willaertia magna et Naegleria fowleri sont séparément cultivées dans des flasques T 25 ml dans 10 ml de milieu PAS stérile. L'ensemencement des flasques se fait à raison de 1 x 105 Willaertia magna/ml pour le témoin Willaertia magna et 1 x 105 Naegleria fowleri/ml pour le témoin Naegleria fowleri à partir des suspensions amibiennes axénique préalablement dénombrées sur un hématimètre de Malassez. Les flasques T25 ml témoins sont mises en incubation à l'étuve à 30°C. Chaque condition est réalisée en triplicata. Chaque comptage sur cellule de Mallassez est répété 5 fois. L'expérience a été renouvelée trois (3) fois sur une période de 3 mois. Les devenirs des amibes Naegleria fowleri et Willaertia magna en co-culture et dans les flasques témoins sont déterminés de la façon suivante : Les concentrations amibiennes sont suivies pendant 120 heures après l'infestation par Naegleria fowleri. A chaque intervalle de temps (à 3 heures puis toutes les 24 heures), les flasques de co-culture et des témoins sont prélevés et examinés à la fois du point de vue de la croissance cellulaire des deux amibes et de leur état morphologique et dynamique. Pour chaque flasque examinée: - La numération des amibes s'effectue directement sur cellule de Malassez. - A 120 heures, le faible taux d'amibes Naegleria fowleri ne permet plus un comptage fiable sur cellule de Mallassez d'où l'utilisation conjointe de la méthode NPP (Nombre le Plus Probable). Cette méthode très utilisée pour le comptage amibien a l'avantage d'être plus précise mais également de discriminer les amibes intègres et vivantes des amibes intègres mais mortes. 2. RÉSULTATS Les Figures 1, 2 et 3 montrent des expériences de co-culture ( Willaertia magna / Naegleria fowleri) et de monocultures témoins d'amibes. Elles montrent l'évolution spontanée des populations respectives d'amibes Willaertia magna et Naegleria fowleri après mise en co-culture à un ratio Willaertia/Naegleria initial de 1 versus l'évolution des populations respectives d'amibes en monoculture. Les Figures 4a et 4b montrent l'état physiologique des amibes Naegleria fowleri au cours du temps en présence d'amibes Willaertia magna. La figure 4a correspond à des images de la dégradation physiologique rapide des Naegleria fowleri en co-cultures avec Willaertia magna. La figure 4b correspond à des image illustrant le phénomène du "baiser de la mort" d'une Willaertia magna sur une Naegleria fowleri. La Figure 5 montre une expérience de co-culture (Acanthamoeba castelanii / Naegleria fowleri) et de monocultures témoins d'amibes. Sur les figures 1, 2 et 3, la courbe avec des points en forme de losange (-) nommée Willaertia magna décrit la concentration mesurée de Willaertia magna seule en culture dans un milieu PAS stérile. La courbe avec des points en forme de carrée (^) nommée Naegleria fowleri décrit la concentration mesurée de Naegleria fowleri seule en culture dans un milieu PAS stérile. La courbe avec des points en forme de triangle (A) nommée W +NF décrit la concentration mesurée de Willaertia magna en co-culture avec Naegleria fowleri dans un milieu PAS stérile. La courbe avec des points en forme de croix (X) nommée NF + W décrit la 30 concentration mesurée de Naegleria fowleri en co-culture avec Willaertia magna dans un milieu PAS stérile. Les données sont exprimées en concentration de cellules intègres par millilitres (ml), comptées sur cellules de Mallassez. Sur la figure 4a, les flèches noires indiquent la présence de Willaertia magna et les flèches blanches la présence de Naegleria fowleri entières ou en morceaux. Sur la figure 4b, la flèche noire indique la présence de Willaertia magna et la flèche blanche de Naegleria fowleri. Le rond blanc matérialise les contours de la cellule de Naegleria fowleri. Ce phénomène de "baiser de la mort" a été décrit dans la littérature (Berke G. Source Department of Cell Biology, 1995) comme un contact permettant le passage de granzyme conduisant à l'apoptose de la cellule cible. Sur la figure 5, la courbe A composée de points en losange (-) représente une mono-culture d'Acanthamoeba castellanii. La courbe A + NF composée de points en triangle (A) représente la concentration d'Acanthamoeba castellanii en co-culture avec Naegleria fowleri. La courbe NF composée de points en carré (^) représente une mono-culture de 15 Naegleria fowleri. La courbe NF +A composée de points en croix (X) représente la concentration de Naegleria fowleri en co-culture avec d'Acanthamoeba castellanii. 2. 1. Willaertia magna inhibe totalement la croissance de Naegleria 20 fowleri. Comme indiqué par les courbes en croix des figures 1, 2 et 3 représentant l'évolution des Naegleria fowleri en co-culture avec des Willaertia magna, très rapidement vers 24 heures un décrochage intervient dans la courbe de population des Naegleria fowleri. Cette décroissance de la population des Naegleria fowleri 25 est observée uniquement en présence de Willaertia magna. Les courbes témoins (courbes avec des points carrés) de Naegleria fowleri en monoculture dans les expériences 1, 2 et 3 (figures 1, 2 et 3) à 24 heures sont toutes en croissance. D'ailleurs, le taux de Naegleria fowleri en monoculture double quasiment à 24 heures. 30 Fait remarquable, l'observation microscopique, confirme un changement morphologique cruciale des Naegleria fowleri en co-culture avec des Willaertia magna dès 24 heures (figure 4). L'état physiologique de la cellule Naegleria fowleri passe d'une forme trophozoïte étalée à une forme plus ronde stressée, mais non encore apparentée à la forme kystique. L'intérieur de la cellule de Naegleria fowleri devient opaque, masquant les vacuoles internes, signe de croissance des amibes. Les cellules de Naegleria fowleri en présence de Willaertia magna ont une taille inférieure de moitié à celle en monoculture dès 3 heures de co-culture (figure 4a). Le mode de prédation des amibes Willaertia magna est basé sur la phagocytose. La figure 4b démontre dans les 24 premières heures un phénomène d'inhibition proche « du baiser de la mort ». La phagocytose de Naegleria fowleri par Willaertia magna intervient bien, mais seulement après 25 heures de co-culture corroboré par la présence de Willaertia magna contenant dans ces phagosomes des Naegleria fowleri (données non reportées). L'ensemble des expériences conduites démontre un effet maximum d'inhibition avec une élimination complète des Naegleria fowleri en 120 heures. La lecture en cellule de Mallassez à 120 heures dénombre les cellules de Naegleria fowleri présentes et intègres mais il n'est pas possible de discriminer par ce comptage, les cellules mortes des cellules vivantes. Une double lecture sur gélose NNA + E.coli permet le comptage des cellules de Naegleria fowleri vivantes uniquement issues de forme trophozoïtes et/ou de formes kystiques. Le tableau ci-dessous indique la concentration amibiennes (Naegleria fowleri) obtenues par lecture sur cellules de Mallassez et celles obtenues par la méthode NPP. Un aliquot de chaque flasque issue des expériences 1, 2 et 3 (cf. figures 1 à 3) de co-culture Willaertia magna / Naegleria fowleri pris à 120 heures post infection est ensemencé sur des géloses NNA recouverte d'un tapis d'E-coli. La détermination de la concentration de chaque espèce est mesurée par le comptage du nombre de fronts repérés par boites, et renseignés dans la table NPP pour en déduire la concentration amibienne. Nf = Naegleria fowleri W .m = Willaertia magna30 Mesure à 120 heures par la méthode NPP Mesure à 120 heures (limite de par comptage sur quantification = 4 NUI) cellule de Malassez (limite de quantification = 0,2 104 Nf/1) Expérience 1 co-culture Nf et Les inventeurs ont mis en évidence que le caractère inattendu d'un effet biocide de Willaertia magna sur le genre Naegleria et plus particulièrement sur l'espèce Naegleria fowleri n'est pas partagé par d'autres espèces amibiennes. Comme indiquée par la figure 5, une co-culture des genres amibiens Acanthamoeba castellanii et Naegleria fowleri n'induit aucune incidence sur la concentration respective des deux espèces versus la concentration mesurée de ces espèces en monoculture. Cette figure montre l'absence d'action réciproque d'un autre genre amibien, de type Acanthamoeba sur l'évolution de la population de Naegleria fowleri lors d'une mise en co-culture de ces deux amibes. Willaertia magna possède bien seule cette caractéristique d'inhibition de la croissance des amibes Naegleria et plus particulièrement l'espèce Naegleria fowleri.20 Bibliographie Bodennec Jacques, Pernin Pierre, Dey Rafick. Novel method for biologically combating the proliferation of Legionella pneumophila, and novel disinfecting agent containing amoebic protozoa of the Willaertia genus. France Brevet 2906968. 12 10 2006. 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