FR 3020874 A1 20151113 FR 1454222 A 20140512 [1] La présente invention concerne le domaine technique de la cytométrie et dans une application préférée le domaine de la cytométrie en flux. [2] Dans le domaine de la cytométrie, il est mis en oeuvre les molécules fluorescentes, dites fluorochromes, qui ont la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse, dite d'excitation, à une longueur d'onde donnée ou dans une gamme de longueur d'onde et d'en restituer une partie au moins en émettant un rayonnement lumineux, dite de fluorescence, à une autre longueur d'onde ou dans une gamme de longueur d'onde, généralement plus grande que la longueur d'onde d'excitation. [3] La cytométrie en flux est une technique d'analyse de routine de cellules ou particules en suspension qui traversent les unes après les autres une chambre de mesure dans laquelle elles sont soumises à un ou plusieurs rayonnements d'excitations. La cellule de mesure est alors associée à un ou plusieurs capteurs adaptés pour mesurer des rayonnements de fluorescence des particules fluorescentes dont la présence et la quantité est recherchée. La cellule de mesure peut aussi être associée à des moyens de mesure de la lumière diffusée. La cytométrie en flux permet alors de caractériser chacune des cellules ou particules passées dans la chambre de mesure en taille (lumière diffusée dans l'axe d'incidence), granularité (lumière diffusée à 90° de l'axe d'incidence) et fluorescence. La cytométrie en flux est effectuée au moyen d'un appareil qui comprend tous les dispositifs nécessaires pour réaliser les opérations évoquées précédemment. [04] Par ailleurs, certains couples de fluorochromes, formés d'un fluorochrome donneur et d'un fluorochrome accepteur, ont la particularité lorsque les fluorochromes donneur et accepteur sont suffisamment proches l'un de l'autre et sous l'effet d'un rayonnement dans la gamme d'excitation du fluorochrome donneur d'induire un phénomène de transfert résonant d'énergie de fluorescence, dit FRET pour en anglais fluorescence ou Fôster resonance energy transfert, qui génère un rayonnement lumineux à une longueur d'onde ou gamme de longueur d'onde dite de FRET. L'observation et la quantification du rayonnement ou de l'énergie de FRET permet, notamment, d'étudier l'interaction entre molécules, les associations ou transformation macromoléculaires intervenues dans des cellules vivantes. [05] Un article « Computer programme for determining fluorescence resonance energy tranfert efficency from flow cytométrique data on a cell-by-cell basic de Gergerly Szentesi et al. publié en 2004 dans la revue Computer Methods and Programs in Biomedicine (2004) 75, 201-211 a proposé d'utiliser et de détecter du FRET dans le cadre de la cytométrie en flux. Cependant, la mise en oeuvre de la méthode décrite dans l'article s'est avérée très difficile voire impossible à mettre en oeuvre dans des conditions d'exploitation en laboratoire de cytométrie et il n'existe à ce jour aucun appareil ou aucune méthodologie permettant d'exploiter le FRET de manière régulière et automatisée dans les laboratoires de cytométrie et cela malgré l'intérêt évident de l'usage du FRET pour la compréhension et l'analyse des phénomènes biologique intra et extra cellulaires. [6] Il est donc apparu le besoin d'un procédé permettent de détecter des phénomènes de FRET de manière régulière et fiable dans le cadre d'une instrumentation de laboratoire de cytomèrie en flux. [7] Afin d'atteindre ces objectifs, l'invention concerne un procédé de détection d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, dit également FRET pour Fôster Resonance Energy Transfer, d'un couple de fluorochromes comprenant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur dans une suspension cellulaire à tester au moyen d'un cytomètre en flux comprenant au moins : une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, des moyens de détection de fluorescence adaptés pour détecter de manière distincte des émissions au moins : dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur et dans la longueur d'onde du FRET, et des moyens de traitement et d'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection. Selon l'invention, le procédé détection comprend les opérations suivantes : une phase d'étalonnage comprenant les opérations suivantes : - dans une étape de normalisation de la capture des signaux : - mise en oeuvre d'une suspension de normalisation comprenant des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET lors d'excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage et de l'excitation dans le cytomètre de la suspension de normalisation en faisant varier la sensibilité des moyens de détection, dans les longueurs d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, de fluorescence du fluorochrome accepteur et dans la longueur d'onde du FRET, entre une valeur minimale et une valeur maximale, dans une étape de calibrage et de correction des signaux de fluorescence: mise en oeuvre d'une première suspension de calibrage comprenant des fluorochromes donneurs mais pas de fluorochrome accepteur, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la première suspension de calibrage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur, et à la longueur d'onde excitation du fluorochrome accepteur. mise en oeuvre d'une deuxième suspension de calibrage comprenant des fluorochromes accepteurs mais pas de fluorochrome donneur, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la deuxième suspension de calibrage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur et à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur. dans une étape d'étalonnage des valeurs d'efficacité de FRET: mise en oeuvre d'une première suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un premier type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire un fret de forte intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la première suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, mise en oeuvre d'une deuxième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un deuxième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire aucun fret ou un fret de faible intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la deuxième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, - calcul de paramètres de correction des mesures des moyens de détection au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de normalisation, - calcul des coefficients d'un système d'équations modélisant le FRET au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de calibrage et des paramètres de correction, - calcul des coefficients d'un système de modélisation de l'énergie de FRET au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de d'étalonnage, du système d'équations modélisant le FRET, des coefficients calculés et des paramètres de correction, - enregistrement des coefficients calculés, des paramètres de correction et de la valeur de référence, dans une phase de mesure : - enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la suspension à tester et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur dans le cytomètre en flux, - évaluation de l'efficacité du FRET dans la suspension à tester en utilisant les mesures enregistrées à partir de la suspension à tester, le système d'équation modélisant le FRET ainsi que les coefficients calculés, les paramètres de correction et la valeur de référence déterminés lors de la phase d'étalonnage. [08] Les inventeurs ont eu le mérite de concevoir trois étapes d'ajustements dans le processus. Une phase de normalisation pour la capture des signaux, une phase de calibrage et de correction des signaux, et une phase d'étalonnage des valeurs d'efficacité qui permettent de rendre possible la détection de FRET sur tout type de cytomètre en flux et en tenant compte de la manière dont un cytomètre en flux est généralement utilisé et réglé par son opérateur. Un avantage du procédé proposé par les inventeurs réside dans l'automatisation du calcul d'efficacité de FRET, tout en conservant et en utilisant les données brutes issues de la cytométrie en flux. En effet, il est apparu que la méthode proposée par Gergerly Szentesi et al. ne pouvait être mise en oeuvre facilement. Le procédé selon l'invention efface les sources d'erreur inhérentes à la manière dont l'opérateur acquière les signaux et permet d'utiliser le calcul du FRET comme une technique de routine en cytométrie en flux. [09] Selon une variante de mise en oeuvre, le procédé de détection selon l'invention comprend en outre les étapes suivantes : pendant la phase d'étalonnage : mise en oeuvre d'une troisième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un troisième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire un fret de moyenne intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la troisième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, calcul d'au moins une valeur de référence de FRET élevé et d'une valeur de référence de FRET modéré au moyen des mesures réalisées lors de la phase d'étalonnage, du système d'équations modélisant le FRET, des coefficients calculés et des paramètres de correction, enregistrement des valeurs de référence de FRET élevé et de FRET modéré, pendant la phase de mesure : - évaluation de l'efficacité du FRET dans la suspension à tester en utilisant le système d'équation modélisant le FRET ainsi que les coefficients calculés, les paramètres de correction et les valeurs de référence de FRET élevé et de FRET modéré déterminés lors de la phase d'étalonnage. [10] Selon une caractéristique de l'invention, la suspension de normalisation comprend des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET comprenant des micro-billes de calibration en polystyrène. [11] Selon une autre caractéristique de l'invention, la première suspension de calibrage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant au moins un fluorochrome donneur. [12] Selon une autre caractéristique de l'invention, la deuxième suspension de calibrage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant au moins un fluorochrome accepteur. [13] Selon encore une autre caractéristique de l'invention, chaque suspension de d'étalonnage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur. [14] Selon une caractéristique de l'invention, les moyens de détection du cytomètre en flux comprennent pour chaque longueur d'onde de détection un photomultiplicateur (PMT) associé à au moins un filtre optique. Dans une forme préférée de réalisation les moyens de détection comprennent pour chaque longueur d'onde un photomultiplicateur associé à des filtres et/ou miroirs dichroïde et passe bande. [15] L'invention concerne également une trousse d'étalonnage d'un cytomètre en flux en vue de la détection de FRET comprenant : une première suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un premier type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire un fret de forte intensité, une deuxième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un deuxième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire aucun fret ou un fret de faible intensité, une première suspension de calibrage comprenant des fluorochromes donneurs mais pas de fluorochrome accepteur, une deuxième suspension de calibrage comprenant des fluorochromes accepteurs mais pas de fluorochrome donneur, [16] Selon une caractéristique de l'invention, la trousse d'étalonnage comprend une suspension de normalisation comprenant des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET. [17] Selon une autre caractéristique de l'invention, la trousse d'étalonnage comprend une troisième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un troisième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire aucun fret ou un fret de moyenne intensité. [18] Selon encore une autre caractéristique de l'invention, les couples de fluorochrome donneur - accepteur sont choisis parmi les couples donneur-accepteurs suivants : Fluorescein et Tetramethylrhodamine Cy-3 et Cy-5, Alexa 488 et Alexa 568, Alexa 546 et Alexa 594, Alexa 594 et Alexa 647, CFP et YFP, GFP et DsRed, EGFP et YFP, EGFP, Cy 3, sans que cette liste ne soit ni limitative ni exhaustive. [19] Selon encore une autre caractéristique de l'invention, la trousse d'étalonnage comprend une suspension de plasmides contenant chacun à la fois une séquence codante pour le fluorochrome donneur et une séquence codante pour le fluorochrome accepteur, séparés par un multi site de clonage destiné à recevoir une séquence nucléotidique de la molécule à tester. La fourniture d'un tel plasmide offre un support d'expression de la protéine à tester en signal FRET, dans un contexte homologue et en cohérence avec le système de calibration, normalisation et d'étalonnage conforme à l'invention. [20] L'invention concerne aussi un cytomètre en flux adapté pour détecter un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, dit également FRET pour Fôster Resonance Energy Transfer, d'un couple de fluorochromes comprenant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur, cytomètre comprenant au moins : une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière au moins à la longueur d'onde d'excitation du flurochrome donneur, une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière au moins à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, des moyens de détection de lumière adaptés pour mesurer de manière distincte des émissions de lumière au moins dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur, dans la longueur d'onde du FRET - et des moyens de traitement et d'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection, caractérisé en ce que les moyens de traitement sont adaptés pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention de manière automatique ou semi-automatique. [21] Selon une caractéristique du cytomètre conforme à l'invention, chaque source de lumière d'excitation comprend un laser. [22] Selon une autre caractéristique du cytomètre conforme à l'invention, les moyens de détection de lumière comprennent pour chaque longueur d'onde de détection un photomultiplicateur (PMT) associé à des filtres optiques tels que par exemple des filtres et/ou miroirs dichroïdes et passe-bande. De manière préférée le système optique de filtrage associé au détecteur de FRET possède les mêmes caractéristiques optiques que le système optique de filtrage associé au détecteur de la fluorescence de l'accepteur. [23] Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres. [24] De même, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres. [25] Par ailleurs, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence à la figure 1 qui illustrent une forme non limitative de réalisation d'un cytomètre pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. [26] Un cytomètre en flux, tel qu'illustré de manière schématique à la figure 1, comprend généralement une chambre de prélèvement 1 dans laquelle est placée une suspension de cellules ou particules biologiques à analyser. Le cytomètre comprend alors un système de prélèvement 2 adapté pour prélever la suspension à analyser et l'amener jusqu'à une chambre de mesure 3. Il est mise en oeuvre dans la chambre de mesure 3 un système d'hydrofocalisation de manière que chaque cellule ou particule est focalisée individuellement devant le rayonnement d'un générateur de lumière d'excitation 5 pour être excitée. [27] Le générateur de lumière d'excitation 5 est adapté pour émettre des rayonnements aux longueurs d'onde ou dans les gammes de longueur d'onde d'adsorption des particules fluorescentes à détecter. Selon l'exemple illustré, générateur de lumière d'excitation 5 comprend au moins deux sources de lumière 51 et 52 comprenant chacune un laser piloté par une unité de commande UC qui pilote également le système de prélèvement 2 et la chambre de mesure 3. De manière préférée, le générateur de lumière 5 comprend un système optique 6 adapté pour diriger ou focaliser le faisceau lumineux 7 émis vers la chambre de mesures 3. [28] Afin de pouvoir détecter et analyser la lumière issue de chaque cellule à analyser, le cytomètre comprend des moyens de détection de lumière 10. Selon l'exemple illustré, les moyens de détection de lumière comprennent un capteur 11 et son optique associée 12 située dans l'alignement du faisceau lumineux 7 de manière à pouvoir analyser la lumière diffusée dans l'axe ayant traversé chaque particule. [29] Les moyens de détection 10 comprennent également un système optique 15 adapté pour récupérer et analyser à 90°, la lumière d'excitation diffusée et la fluorescence. Selon l'exemple illustré, le système optique 15 comprend trois ensembles de détections 21, 22, 23 qui comprennent chacun un détecteur de lumière 24 associée à des filtres optiques dichroïques et passe-bandes 25 permettant le passage de la longueur d'onde qui sera détectée ou traitée par l'ensemble de détection correspondant. Selon l'exemple illustré les détecteurs de lumière 11 et 24 sont constitués par des photomultiplicateurs, PMT en abrégé. [30] Chacun des ensembles de détection 21 à 23 est piloté indépendamment par l'unité de commande UC qui est adaptée pour permettre notamment un réglage de la sensibilité de chaque détecteur de lumière 11, 24. L'unité de commande UC comprend en outre des moyens 25 de traitement et d'enregistrement des mesures ou captation effectuée par les détecteurs de lumière 11 et 20. [31] Un cytomètre en flux, tel que décrit ci-dessus, présente une structure bien connue de l'homme du métier de sorte qu'il n'est pas nécessaire de la décrire plus avant. De plus, un tel cytomètre dans sa structure générale est disponible dans le commerce et il est possible d'utiliser pour la mise en oeuvre de l'invention les matériels de la société BD Biosciences commercialisés sous les dénominations suivantes FacsAria, FacsCanto, LSRII, Fortessa. De manière générale, il est possible d'utiliser comme base pour la mise en oeuvre de l'invention tout instrument de cytométrie en flux ayant une source de lumière d'excitation dans la longueur d'onde du fluorochrome donneur et une source de lumière d'excitation dans la longueur d'onde du fluorochrome accepteur, ainsi que des ensembles de détection permettant de détecter et mesurer de manière indépendante la fluorescence du donneur, la fluorescence de l'accepteur et la fluorescence du Fret, chaque ensemble de détection ayant son ou ses filtres de longueur d'onde associée. Bien entendu, il est également possible de concevoir un cytomètre spécifique pour la mise en oeuvre de l'invention. [32] L'invention vise à pouvoir détecter, au moyen d'un tel cytomètre en flux, des phénomènes de FRET susceptibles de pouvoir apparaître lorsqu'un fluorochrome donneur se trouve excité en étant à proximité d'un fluorochrome accepteur. [33] Chaque fluorochrome possède une longueur d'onde d'excitation de sorte que lorsqu'il est soumis à un rayonnement à cette longueur d'onde il émet un rayonnement de fluorescence à une longueur d'onde de fluorescence donnée. De plus, en cas de FRET lorsqu'un fluorochrome donneur est soumis à un rayonnement à sa longueur d'onde d'excitation en étant situé à proximité d'un fluorochrome accepteur il est émis un rayonnement à une longueur d'onde dite de FRET. Au sens de l'invention, le terme longueur d'onde englobe également une gamme étroite de longueur d'onde comprenant ladite longueur d'onde. [34] Dans le cas présent et à titre d'exemple il est utilisé le couple Cyan fluorescent protein (CFP) et Yellow fluorescent protein (YFP). Selon cet exemple, le fluorochrome CFP donneur excité à une longueur d'onde de 405 nm émet un rayonnement de fluorescence détecté à la longueur d'onde de 490 nm, le fluorochrome YFP accepteur excité à la longueur d'onde de 488 nm émet un rayonnement de fluorescence détecté à la longueur d'onde de 525 nm. Enfin, le couple CFP-YFP en configuration de FRET excité à une longueur d'onde de 405nm génère un FRET capté à la longueur d'onde de 525 nm. [35] Pour l'utilisation du couple CFP-YFP, la première source de lumière Si comprend donc un laser émettant un rayonnement à la longueur d'onde du donneur ici un laser violet à 405 nm et la deuxième source de lumière S2 comprend donc un laser émettant un rayonnement à la longueur d'onde de l'accepteur ici un laser bleu à 488 nm. De même le premier ensemble de détection 21 est adapté pour mesurer le rayonnement de fluorescence du donneur à 490 nm, le deuxième ensemble de détection 22 est adapté pour mesurer le rayonnement de FRET à 525 nm et le troisième ensemble de détection 23 est adapté pour détecter le rayonnement de fluorescence de l'accepteur à 525 nm. [36] Pour l'évaluation de l'efficacité de FRET une publication [Pub1] de Gergely Szentesi, Gàbor Horvàth, Imre Bori, Gyôrgy Vàmosi, Jànos Szollosi, Rezso Gàspàr , Sàndor Damjanovich , Attila Jenei , Làszl'o Màtyus , Computer program for determining fluorescence resonance energy transfer efficiency from flow cytometric data on a cell-bycell basis, Computer Methods and Programs in Biomedicine (2004) 75, 201-211 propose le modèle suivant : Il = I DO - E)+ I As 4 + L' I DEa s2 12 = I D(1- E)Si + I AS2+ I DEa 13 = I D(1- E)S3 ± 1A+ I DEa L si [37] Ce modèle exploite l'intensité des signaux émis par les deux fluorochromes donneur et accepteur lorsque le donneur est excité par une source de lumière ad hoc. Pour cela trois ensembles de détection doivent être utilisés. Le premier ensemble de détection 21 mesure l'intensité 11 du rayonnement de fluorescence émis par le fluorochrome donneur, en abrégé donneur, le deuxième ensemble de détection 22 pour mesure l'intensité 12 du rayonnement de FRET, et le troisième ensemble de détection 23 mesure l'intensité 13 du rayonnement de fluorescence émis par le fluorochrome accepteur, en abrégé accepteur. Dans le modèle E est la valeur d'efficacité de transfert d'énergie du FRET ou énergie de FRET, ID est l'intensité qui aurait était mesurée par le détecteur dédié au donneur en l'absence d'accepteur tandis que IA est l'intensité qui aurait était mesurée par le détecteur dédié à l'accepteur en l'absence de donneur. Les coefficients S1, S2, S3, S4 ainsi que le coefficient a sont des coefficients de correction. [38] Cependant, à l'usage le modèle ci-dessus s'est révélé inexploitable et fait apparaître des incohérences. Les inventeurs ont eu le mérite d'identifier une des sources de ces incohérences comme étant le réglage des sensibilités des détecteurs. Or, il doit être remarqué qu'un opérateur d'un cytomètre règle toujours de manière indépendante la sensibilité des différents détecteur afin d'optimiser pour chacun d'entre eux les mesures réalisées. [39] Afin de conférer une répétabilité de la détection du FRET de manière à permettre un usage de cette technique en analyse de routine au moyen de cytomètres en flux, l'invention propose de mettre en oeuvre le modèle corrigé suivant : 1 - \ al U - Ii = ID (1-E)+IAs4+s IDEa U1/ s2 (U \a2 - /2 = I DO - E)S 1 + I AS2 + I DEC( U \ 2/ 1 \ a3 U S - 13 = I DO - E)S 3 + I A + IDEec U 3/ Si complété par la relation suivante : F AD =( 1+ eAC' EF A e DCD ) issue de la publication [Pub2] de Charles R Cantor, Paul R Schimmel, Biophysical Chemistry, Part Il : Techniques for the Study of Biological Structure and Function 1980, paper, 365 pages, 158 illustrations 0-7167-1190-7. [40] Dans ces équations: U1, U2, U3 sont les valeurs des sensibilités, respectivement, de l'ensemble de détection 21 associé au donneur, de l'ensemble de détection 22 associé au FRET et de l'ensemble de détection 23 associé à l'accepteur, U est une valeur de sensibilité théorique commune aux trois détecteurs choisis arbitrairement, - a1, a2 et a3 sont des paramètres de correction liés aux ensembles de détection 21 à 23 mis en oeuvre, FAD= 12 - Sill, est le vecteur des intensités de fluorescence relatives de l'échantillon avec le donneur et l'accepteur ensemble, FA = S2IA est le vecteur des intensités de fluorescence relatives de l'échantillon avec le donneur et l'accepteur ensemble, CD et EA sont les coefficients d'absorption molaire respectivement du donneur et de l'accepteur, - CD et CAsont les concentrations molaires de l'accepteur et du donneur. [41] Le modèle corrigé selon l'invention permet d'automatiser les mesures et de systématiser l'usage du FRET en cytométrie en flux. [42] En vue de permettre l'utilisation du cytomètre en flux décrit précédemment pour la détection de FRET, les ensembles de détections 21 à 23 voient leurs filtres 25 réglés de manière à laisser passer de manière sélective, filtrer, les longueurs d'onde d'intérêt. Par exemple, les filtres 25 de l'ensemble 21 sont adaptés pour laisser passer la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur et arrêter les autres longueurs d'onde étant entendu que lesdits filtres peuvent laisser passer une gamme ou bande étroite contenant ladite longueur d'onde de fluorescence du donneur. De la même manière, les filtres de l'ensemble 22 sont adaptés pour laisser passer la longueur d'onde de FRET et arrêter les autres longueurs d'onde étant entendu que lesdits filtres peuvent laisser passer une gamme ou bande étroite contenant ladite longueur d'onde de FRET. Enfin, les filtres de l'ensemble 23 sont adaptés pour laisser passer la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur et arrêter les autres longueurs d'onde étant entendu que lesdits filtres peuvent laisser passer une gamme ou bande étroite contenant ladite longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur. [43] L'invention propose dans une phase d'étalonnage de procéder à des mesures permettant de déterminer différents paramètres du modèle corrigé. [44] Tout d'abord, il est procédé à une étape normalisation au cours de laquelle il est procédé à des mesures permettant de calculer les paramètres a1, a2 et a3 liés aux ensembles de détection 21 à 23 mis en oeuvre. [45] A cet effet, il est mis en oeuvre une suspension de normalisation comprenant des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET lors d'une excitation par les sources de lumière 51 et 52. Les particules fluorescentes de normalisation sont par exemple constituées par de micro billes de calibration en polystyrène, mesurant la taille des cellules, dans le cas présent, 10p.m. [46] La suspension de normalisation est alors placée dans la chambre de prélèvement et l'unité de commande UC pilote le système de prélèvement 2 de manière à amener les particules de normalisation dans la chambre de mesure 3. En parallèle, unité de commande UC pilote les sources de lumière 51 et 52 de manière à exciter les particules de normalisation. Simultanément, l'unité de commande UC pilote les ensembles de détection 21 à 23 de manière à enregistrer leur mesure de la fluorescence des particules de normalisation tout en faisant varier, par paliers, leur sensibilité de détection entre une valeur de sensibilité minimale et une valeur de sensibilité maximale. A chaque palier, il est par exemple effectué des mesures pour au moins 10 000 particules. Les mesures réalisées sont alors enregistrées. [47] Les paramètres de correction a1, a2 et a3 sont calculés par l'unité de commande UC et plus particulièrement par les moyens de traitement et d'enregistrement, pour chaque ensemble de détection, à partir des mesures effectuées en partant de l'hypothèse que l'intensité mesurée par un détecteur vérifie l'équation suivante : / = Mia,,mr Avec : I l'intensité mesurée, P est l'intensité que l'on peut observer à la sensibilité la plus faible, soit pour un PMT à un voltage ou gain de 0 V, a un paramètre qui varie d'un détecteur à l'autre. [48] Il est également nécessaire de calculer les coefficients de correction 51, S2, S3, S4 qui dépendent du couple de fluorochromes donneur-accepteur. [49] A cet effet l'invention propose, dans une étape de calibrage, de mettre en oeuvre d'une première suspension de calibrage comprenant des fluorochromes donneurs mais pas de fluorochrome accepteur. La première suspension de calibrage est alors placée dans la chambre de prélèvement et l'unité de commande UC pilote le système de prélèvement de manière à amener les cellules portant les fluorochromes donneurs une à une dans la chambre de mesure. En parallèle, unité de commande UC pilote, d'une part, les deux sources de lumière 51 et 52 pour qu'elles émettent un rayonnement à longueur d'onde d'excitation des fluorochromes donneurs et accepteur et exciter ces derniers. D'autre part, l'unité de commande pilote les ensembles de détection de manière à enregistrer leur mesure pour un nombre de cellules suffisant et, par exemple, supérieur ou égal à 10 000. [50] Toujours dans l'étape de calibrage, il est mis en oeuvre une deuxième suspension de calibrage comprenant des fluorochromes accepteurs mais pas de fluorochrome donneur. La deuxième suspension de calibrage est alors placée dans la chambre de prélèvement et l'unité de commande UC pilote le système de prélèvement de manière à amener les cellules de portant les fluorochromes accepteurs une à une dans la chambre de mesure. En parallèle, unité de commande UC pilote d'une part les deux source de lumière 52 et 51 pour qu'elles émettent un rayonnement à longueur d'onde d'excitation des fluorochromes accepteurs et donneurs. D'autre part, l'unité de commande UC pilote les ensembles de détection de manière à enregistrer leur mesure pour un nombre de particules suffisant et, par exemple, supérieur ou égal à 10 000. La valeur de réglage de la sensibilité des ensembles de détection lors de ces mesures est également enregistrée. [51] L'unité de commande UC calcule ensuite les coefficients de correction S1, S2, S3, S4 à partir des mesures réalisées à l'étape de calibrage et normalisées au moyen des paramètres de corrections a1, a2 et a3 calculés préalablement. [52] Pour ce faire, il est utilisé les définitions données par [Pub1] à savoir : S = /2 S3 = /sur la base des mesures effectuées au moyen de la première Il /I suspension de calibrage, s2 - / s4 = sur la base des mesures effectuées au moyen de la deuxième /3 /3 suspension de calibrage, [53] Les inventeurs ont mis en évidence une bonne corrélation linéaire deux à deux entre 11,12, /3 ce qui permet d'exprimer les dits paramètres de la manière suivante : si - cov(/1, /2) COVUI, /3) S3 sur la base des mesures effectuées au moyen de la var(h) var(h) première suspension de calibrage, COV(/2, /3) COVUI, /3) et s2 - S4 - sur la base des mesures effectuées au moyen de la var(I3) var(h) deuxième suspension de calibrage. [54] Les coefficients de correction Si, S2, S3, S4 sont calculés au moyens de ces équations. [55] Il est également nécessaire de calculer a et EACA qui dépendent du couple de EDCD fluorochromes donneur-accepteur. [56] A cet effet l'invention propose, dans une étape d'étalonnage, de mettre en oeuvre une première suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un premier type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire un FRET de forte intensité. De telles molécules chimère sont par exemple des plasmides obtenus selon des techniques de clonage moléculaire bien connues de l'homme du métier pour être décrites notamment dans [Pub3] L.He, P.Douglas Oison, Wiaoli Wu, Tatiana S. Karpoya ; James G. Mc Nally, And Peter Lipsky. Cytometry Part A 55A:71-85. [57] Cette suspension est analysée au moyen du cytomètre en flux et l'unité de commande UC procède à l'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la première suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur. [58] De la même manière, au cours de l'étape d'étalonnage, il est mis en oeuvre une deuxième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un deuxième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire aucun FRET ou un FRET de faible intensité. [59] Cette suspension est analysée au moyen du cytomètre en flux et l'unité de commande UC procède à enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la deuxième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur. [60] A partir des enregistrements de l'étape d'étalonnage, il est calculé et enregistré des valeurs ou seuil de référence pour un FRET de forte intensité et pour un FRET de faible intensité. [61] Afin d'affiner les calculs, l'étape d'étalonnage peut également mettre en oeuvre troisième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un troisième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire un FRET de moyenne intensité. [62] Cette suspension est analysée au moyen du cytomètre en flux et l'unité de commande procède à enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la troisième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur. [63] A titre d'exemple, dans la molécule chimère à fort FRET les fluorochromes donneur et accepteur sont séparés par un peptide de 2 d'acides aminés alors que dans une molécule chimère à faible ou pas de FRET les fluorochromes donneur et accepteur sont séparés par un peptide de 232 acides aminés. Dans le cas d'une molécule chimère à FRET modéré, les fluorochromes donneur et accepteur sont séparés par un peptide d'environ 80 d'acides aminés [64] L'unité de commande UC calcule ensuite les coefficients a et EA CA en utilisant le EDCD raisonnement ci-dessous. Nous avons : RF -1+ EACA E et Ri-a E EDCD 1-E En partant du principe que E est la même dans les deux équations ci-dessus, on obtient la relation suivante 1 a eACA 1 eACA RF -1 EDCD RI+ EDCD Cette équation traduit une relation affine entre 1 1 E AC A et .11 obtenu ainsi a et RF-1 R1 EDCD [65] Le calcul de R1 et RF est effectué de la manière suivante : A partir des équations du paragraphe [38], il est obtenu K = R 1J où ( S1 - S2S3 ( K = SI (/2 - S213 ) S1 - S2S3 ( ) S2/1 - S4/2) et J - (s211 - s412 ) \ S2 - S4S1 S2 - S4S1 L'expression de R1 n'étant pas du tout clair dans la littérature, il est alors choisi comme valeur de R1 la solution optimale du problème de minimisation suivant min 2 -1lx -air :6 o (K , J)l soit RI - V112 [66] En suivant le même principe, il est déduit la valeur de RF à partir de la relation FAD =RFFA1 en considérant la solution optimale du problème : 1 ii (FAD,FA) min -11FAD-3FA112 :15 ()} soit RI - 2 F 112 A [67] La détermination des différents coefficients permet de calculer l'efficacité de FRET E et les inventeurs ont mis en évidence qu'un échantillon donné manifeste un FRET si les relations suivantes sont vérifiées : -K > 0 etF '=') > 0 avec : J FA K - s1 ( (12- s213) V2/1 \ SI - S2S3 ( s4/2) \ S1 - S2S3 7 - S4/2) J = \ ) et s211- S2 - S4SI S2 - S4SI [68] L'invention a donc le mérite de proposer un modèle de calcul qui caractérise les cellules avec un signal en FRET. En effet, ce modèle ne sélectionne que les cellules vérifiant les deux critères de sélection cités ci-dessus. [69] Au terme de la phase d'étalonnage, les différents coefficients et paramètres de 10 correction et valeur de référence sont enregistrées pour leur usage lors d'une phase de mesure dans laquelle une suspension à tester est passée dans le cytomètre comme décrit précédemment. [70] Il est alors procédé à l'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la suspension à tester et de son excitation à la longueur 15 d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur dans le cytomètre en flux. [71] Ensuite, il est procédé à l'évaluation du FRET dans la suspension à tester en utilisant les mesures enregistrées à partir de la suspension à tester, le système d'équation modélisant le FRET ainsi que les coefficients calculés, les paramètres de correction et la 20 valeur de référence déterminés lors de la phase d'étalonnage. [72] Cette évaluation peut être effectuée en temps réel et utilisée pour assurer un tri des particules ou cellules testées selon des techniques classiques mises en oeuvre dans les cytomètres en flux. [73] Selon l'exemple décrit précédemment la mise en oeuvre du procédé selon l'invention 25 est effectuée par l'unité de commande du cytomètre en temps réel. Cependant, le procédé selon l'invention peut être mise en oeuvre différemment et par exemple en post mesure sur la base de fichiers de mesure réalisés par le cytométre sur les différentes suspensions. Ainsi, il peut être enregistré des fichiers de mesure correspondant aux différentes étapes de la phase d'étalonnage. De même, il peut être enregistré des fichiers 30 de mesure correspondant à la phase de mesure. Le procédé selon l'invention est alors mis en oeuvre à partir de ces fichiers pour évaluer l'efficacité de FRET d'une ou plusieurs suspensions cellulaires à tester. Il est alors utilisé une unité de calcul ou encore un logiciel adapté pour exploiter en post traitement le modèle proposé par l'invention. [74] Bien entendu, le mode de mise en oeuvre de l'invention n'est pas limité aux exemples décrits précédemment et différentes modifications peuvent être apportées au procédé selon l'invention dans le cadre des revendications annexées. REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, dit également FRET pour Fôster Resonance Energy Transfer, d'un couple de fluorochromes comprenant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur dans une suspension cellulaire à tester au moyen d'un cytomètre en flux comprenant au moins : une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière à la longueur d'onde d'excitation du flurochrome donneur, et une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, des moyens de détection de lumière adaptés pour détecter de manière distincte des émissions de lumière au moins dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur, dans la longueur d'onde du FRET, et des moyens de traitement et d'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection, procédé de détection comprenant les opérations suivantes : une phase d'étalonnage comprenant les opérations suivantes : dans une étape de normalisation de la capture des signaux : - mise en oeuvre d'une suspension de normalisation comprenant des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET lors d'excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage et de l'excitation dans le cytomètre de la suspension de normalisation en faisant varier la sensibilité des moyens de détection, dans les longueurs d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, de fluorescence du fluorochrome accepteur et dans la longueur du FRET, entre une valeur minimale et une valeur maximale, dans une étape de calibrage et de correction des signaux de fluorescence: - mise en oeuvre d'une première suspension de calibrage comprenant des fluorochromes donneurs mais pas de fluorochrome accepteur,enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la première suspension de calibrage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur, et à la longueur d'onde excitation du fluorochrome accepteur. mise en oeuvre d'une deuxième suspension de calibrage comprenant des fluorochromes accepteurs mais pas de fluorochrome donneur, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la deuxième suspension de calibrage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur, et à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur. dans une étape d'étalonnage des valeurs d'efficacité de FRET: mise en oeuvre d'une première suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un premier type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire un FRET de forte intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la première suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, mise en oeuvre d'une deuxième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un deuxième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire aucun FRET ou un FRET de faible intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la deuxième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, calcul de paramètres de correction des mesures des moyens de détection au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de normalisation, calcul des coefficients d'un système d'équations modélisant le FRET au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de calibrage et des paramètres de correction,calcul des coefficients d'un système de modélisation de l'énergie de FRET au moyen des mesures réalisées lors de l'étape de d'étalonnage, du système d'équations modélisant le FRET, des coefficients calculés et des paramètres de correction, enregistrement des coefficients calculés, des paramètres de correction et de la valeur de référence, dans une phase de mesure : enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la suspension à tester et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur dans le cytomètre en flux, évaluation de l'efficacité du FRET dans la suspension à tester en utilisant les mesures enregistrées à partir de la suspension à tester, le système d'équation modélisant le FRET ainsi que les coefficients calculés, les paramètres de correction et la valeur de référence déterminés lors de la phase d'étalonnage. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : pendant la phase d'étalonnage : mise en oeuvre d'une troisième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un troisième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule à une distance adaptée pour induire un FRET de moyenne intensité, enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection lors du passage de la troisième suspension d'étalonnage et de son excitation à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome donneur et à celle du fluorochrome accepteur, calcul d'au moins une valeurs de référence de FRET élevé et d'une valeur de référence de FRET modéré au moyen des mesures réalisées lors de la phase de calibrage, du système d'équations modélisant le FRET, des coefficients calculés et des paramètres de correction, enregistrement des valeurs de référence de FRET élevé et de FRET modéré, pendant la phase de mesure : - évaluation du FRET dans la suspension à tester en utilisant le système d'équation modélisant le FRET ainsi que les coefficients calculés, les paramètres de correctionet les valeurs de référence de FRET élevé et de FRET modéré déterminés lors de la phase d'étalonnage. 3. Procédé de détection selon l'une des revendications précédente caractérisé en ce que la suspension de normalisation comprend des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET. 4. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la première suspension de calibrage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant au moins un fluorochrome donneur. 5. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième suspension de calibrage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant au moins un fluorochrome accepteur. 6. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque suspension de d'étalonnage comprend des cellules comprenant chacune au moins un plasmide portant un fluorochrome donneur et un flurochrome accepteur. 7. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les moyens de détection du cytomètre en flux comprennent pour chaque longueur d'onde de détection un photomultiplicateur (PMT) associés à des filtres optiques. 8. Trousse d'étalonnage d'un cytomètre en flux en vue de la détection de FRET comprenant : une première suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un premier type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire un FRET de forte intensité, une deuxième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un deuxième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire aucun FRET ou un FRET de faible intensité une première suspension de calibrage comprenant des fluorochromes donneurs mais pas de fluorochrome accepteur, une deuxième suspension de calibrage comprenant des fluorochromes accepteurs mais pas de fluorochrome donneur. 9. Trousse d'étalonnage selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'elle comprend une suspension de normalisation comprenant des particules fluorescentes dans les longueurs d'ondes de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur ainsi que de FRET. 10. Trousse d'étalonnage selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'elle comprend une troisième suspension d'étalonnage comprenant des molécules chimères d'un troisième type, chaque molécule chimère portant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur situés sur la molécule chimère à une distance adaptée pour induire un FRET de moyenne intensité. 11. Trousse d'étalonnage selon l'une des revendication 8 à10, caractérisé en ce que les couples de fluorochrome donneur - accepteur sont choisi parmi les couples suivants : Fluorescein et Tetramethylrhodamine Cy-3 et Cy-5, Alexa 488 et Alexa 568, Alexa 546 et Alexa 594, Alexa 594 et Alexa 647, cyan florescent proteine (CFP) et yellow fluroescent proteine (YFP), GFP et DsRed, EGFP et YFP, EGFP, Cy 3. 12. Trousse d'étalonnage selon l'une des revendication 8 à10, caractérisé en ce qu'elle comprend une suspension de plasmides contenant chacun à la fois une séquence codante pour le fluorochrome donneur et une séquence codante pour le fluorochrome accepteur, séparées par un multi site de clonage destiné à recevoir une séquence nucléotidique de la molécule à tester. 13. Cytomètre en flux adapté pour détecter un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, dit également FRET pour Fôster Resonance Energy Transfer, d'un couple de fluorochromes comprenant un fluorochrome donneur et un fluorochrome accepteur, cytomètre comprenant : une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière au moins à la longueur d'onde d'excitation du flurochrome donneur, une source de lumière d'excitation adaptée pour émettre de la lumière au moins à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome accepteur,des moyens de détection de lumière adaptés pour mesurer de manière distincte des émissions de lumière au moins dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome donneur, dans la longueur d'onde de fluorescence du fluorochrome accepteur, dans la longueur d'onde du FRET et des moyens de traitement et d'enregistrement des mesures effectuées par les moyens de détection, caractérisé en ce que les moyens de traitement sont adaptés pour mettre en oeuvre le procédé selon l'unes de revendications 1 à 7 de manière automatique ou semi-automatique. 14. Cytomètre en flux selon la revendication 12, caractérisé en ce que chaque source de lumière d'excitation comprend un laser. 15. Cytomètre en flux selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que les moyens de détection de lumière comprennent pour chaque longueur d'onde de détection un photomultiplicateur (PMT) associé à des filtres optiques.15