FR 3021219 A1 20151127 FR 1454592 A 20140521 OLIGO-PORPHYRANES, PROCÉDÉ ET MÉDICAMENT Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'oligo-porphyranes, à des oligo-porphyranes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, ainsi qu'à des utilisations de ces oligoporphyranes. La présente invention se rapporte également aux oligoporphyranes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention, comme médicament, notamment comme médicament destiné à moduler l'immunité. La présente invention trouve par exemple des applications en santé humaine et animale, par exemple en immuno-modulation, dans le domaine pharmaceutique, ainsi que dans les domaines cosmétique et 15 nutraceutique. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique 20 L'intérêt des oligosaccharides sulfatés extraits des algues est largement reconnu dans le monde scientifique, notamment pour des applications en santé humaine et animale et en cosmétique. Actuellement, l'obtention de ces molécules repose sur des procédés d'hydrolyse chimique qui ne permettent pas de préserver les 25 motifs de sulfatation naturels (« Natural sulfatation pattern »), ce qui altère le potentiel d'activité biologique des molécules générées. D'autres méthodes consistent à sulfater des oligosaccharides afin de les fonctionnaliser. Ce procédé chimique ne permet cependant pas, sinon très difficilement, de maîtriser finement un état de sulfatation propice 30 à une activité biologique précise. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveau moyens de synthèse de ces molécules, palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, et qui à la fois préservent et permettent de contrôler les motifs de sulfatation naturels, soient économiques en coût de fabrication, écologiques et permettent de produire des oligosaccharides exempts de produits réactionnels toxiques Description de l'invention La présente invention pallie les inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé de fabrication d'un oligoporphyrane, ledit procédé comprenant une étape (a) d'hydrolyse enzymatique de porphyrane au moyen de béta-agarase B. Les expérimentations mettant en oeuvre le procédé de la présente invention et les résultats correspondants, par exemple ceux présentés dans la partie « Exemples » ci-dessous, démontrent en effet les nombreux avantages du procédé de l'invention par rapport à ceux de l'art antérieur, notamment en fournissant : - Un procédé d'hydrolyse finement contrôlable - Des produits générés de taille et de structure chimique précisément contrôlés ; - Des produits générés de meilleure qualité que les procédés connus de l'art antérieur, notamment chimiques, en particulier par un état de sulfatation préservé par rapport aux molécules naturelles et par l'absence de résidus réactionnels potentiellement toxiques ; - La possibilité de tirer profit d'un réservoir de biodiversité naturelle aisément renouvelable afin d'isoler des molécules bioactives ; et - Un procédé biotechnologique très respectueux de l'environnement Selon l'invention, la bêta-agarase B peut être par exemple la beta-agarase B exprimée par la bactérie marine Zobellia galactanivorans. Il peut s'agir également de celle exprimée par Zobellia neoagarotetraose ou neoagarobiose. Selon l'invention, le porphyrane est de préférence extrait par exemple à partir de l'algue rouge marine Porphyra sp.. ou macro-algue rouge Porphyra umbilicalis, en particulier à partir de leur paroi. Le porphyrane peut également être extrait à partir d'autres algues rouges agarophytes. Selon l'invention, le porphyrane peut être par exemple un polysaccharide hétérogène présentant une alternance de beta-Dgalactopyranose-(1,4)-3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranoside (motif G-LA) et de beta-D-galactopyranose-(1-4)-alpha-L-galactose-6-sulfate (motif G- L6). Ces molécules sont schématisées dans les exemples ci-dessous. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape (b) de purification de l'oligo-porphyrane, par exemple par ultrafiltrations successives de l'hydrolysat sur membrane et/ou par tout autre procédé connu de l'homme du métier pour la purification d'un oligo- porphyrane, par exemple par chromatographie d'exclusion préparative, par exemple avec trois colonnes Superdex 30 (26/60) (marque de commerce) de GE HealthCare en série, intégrées sur un système HPLC System injecteur/collecteur liquide (Gilson). Les oligosaccharides peuvent être détectés par exemple comme exposé dans les exemples ci-dessous, ou encore par leur index réfractif, par exemple au moyen d'un détecteur Spectra System RI-50, et l'intégration des données (Gilson et détecteur réfraction) par le logiciel Unipoint (Gilson). Le procédé d'hydrolyse enzymatique des polysaccharides de la présente invention est donc contrôlé, doux et propre. Ce procédé est un procédé biotechnologique qui permet de tirer profit d'une biodiversité riche, d'exploiter largement son potentiel en générant un éventail de molécules naturelles, accentuant ainsi les possibilités d'identifier des nouvelles molécules bioactives. En effet, à l'inverse des procédés d'hydrolyse chimiques conventionnels, le procédé de la présente invention présente l'avantage de préserver le large potentiel bioactif que possèdent les polysaccharides d'algues marines et tout particulièrement leurs produits d'hydrolyse en préservant la complexité structurale naturelle et initiale des oligosaccharides générés. De plus, le procédé de la présente invention s'inscrit parfaitement dans le cadre des efforts mondiaux mis en oeuvre pour s'orienter vers des procédés de production respectueux de l'environnement. En outre, en termes de coûts, un autre aspect important vient renforcer l'intérêt du procédé de la présente invention : alors que les procédés chimiques demandent en permanence des intrants chimiques coûteux, les enzymes utilisés par les inventeurs pour l'accomplissement de la présente invention sont stables et peuvent être réutilisées pour plusieurs cycles de production, ce qui permet avantageusement d'adapter un protocole de production en continu. Egalement, comme démontré dans la partie « Exemples » ci-dessous, les oligo-porphyranes susceptibles d'être obtenus grâce au procédé de l'invention présentent un degré de sulfatation préservé et contrôlé par rapport à l'état naturel de la source de ces oligo-porphyranes. Ces molécules présentent donc un intérêt tout particulier pour la santé humaine et animale et pour l'agro-alimentaire. Ainsi, la présente invention se rapporte donc également à un oligo-porphyrane susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention. Selon l'invention, l'oligo-porphyrane peut avoir une masse moléculaire de 780 à 1600 g/mol. La présente invention se rapporte également à l'oligoporphyrane, susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention, comme médicament, notamment comme médicament destiné à moduler l'immunité, par exemple comme médicament destiné à stimuler l'immunité. Les inventeurs ont en effet constaté de manière surprenante qu'au moins un oligo-porphyrane possède des propriétés de modulation de l'immunité qui présente une utilité importante dans le domaine de la santé. Selon l'invention, il peut s'agir d'un oligo-porphyrane seul ou d'un mélange d'oligo-porphyrane comme médicament, notamment destiné à moduler l'immunité, notamment la stimuler. Selon l'invention, il peut également s'agir d'une combinaison d'un oligo-porphyrane seul ou d'un mélange d'oligo-porphyrane avec un autre principe actif médicamenteux. Selon l'invention, l'autre principe actif médicamenteux peut être par exemple une molécule agissant également sur l'immunité, ou immunomodulateur, d'un patient ou sur la ou les causes produisant variation non désirée d'immunité. Il peut s'agir par exemple : - d'un antiviral ou d'un mélange d'antiviraux, par exemple choisi parmi des adamantanes ou des inhibiteurs de neuramidinases, - d'un actif de traitement du cancer, par exemple des agents de chimiothérapie comme le taxotère, la doxorubicine, la cisplatine ou des anticorps monoclonaux, - d'un actif utilisé comme vaccin antimicrobien, par exemple à base de micro-organismes vivants atténués ou morts ou de nouveaux vaccins protéiques ou conjugués ou produits par génie génétique, - d'un actif pour le traitement d'allergies, par exemple à base d'histamines ou de corticostéroïdes. Ainsi, la présente invention permet non seulement de préparer des molécules actives implémentables au stade pré-industriel et industriel, mais fournit également ses molécules préparées qui sont utilisables comme principe actif, mélange de principe actif ou principe(s) actif(s) 2 0 associable à un ou plusieurs autres principes actifs, avec tout l'éventail d'applications dans les domaines de l'immunomodulation en santé humaine et animale, par exemple parmi celles précitées. Les inventeurs démontrent à travers les expérimentations présentées ci-dessous que les oligo-porphyranes dérivés du porphyrane 25 selon la présente invention, présentent une activité immunomodulatrice sur un modèle cellulaire animal d'étude in vitro, notamment une lignée monocytaire humaine. Ces oligo-porphyranes sont obtenus par un processus innovant d'hydrolyse enzymatique des polysaccharides par l'Agarase B, conformément au procédé de la présente invention. 30 Les inventeurs sont les premiers à démontrer que l'Agarase B peut être utilisée sur un autre substrat que celui habituellement décrit dans l'art antérieur, ce nouveau substrat étant le porphyrane, afin de produire des composés biologiquement actifs. Un des aspects majeurs innovants de la présente invention repose sur le processus d'hydrolyse enzymatique qui permet de préserver cet état de sulfatation, contrairement aux méthodes conventionnelles d'hydrolyse chimique des polysaccharides. Les résultats expérimentaux décrits ci-dessous suggèrent un rôle important de l'état de sulfatation des d'oligosaccharides de la présente invention. L'effet immunomodulateur des oligo-porphyranes de la présente invention comprend notamment la stimulation des caractères de différenciation des monocytes en macrophages, acteurs essentiels de l'immunité et de la réponse inflammatoire, ainsi que la stimulation de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha par ces cellules. Ces résultats sont le reflet d'une réponse extracellulaire des macrophages dans un contexte d'enclenchement du processus immunitaire et inflammatoire. Enfin, une autre originalité de la présente invention vient du type de molécules que les inventeurs valorisent grâce au procédé de l'invention : les oligo-porphyranes. Celles-ci peuvent être libérées à partir du porphyrane d'algues marines par une famille d'enzymes exprimées par certaines bactéries associées à ces algues, les porphyranases. Des études récentes ont montré qu'un certain nombre de gènes codant pour ces enzymes et autres assimilées sont fréquemment retrouvées dans le génome de bactéries isolées de la flore intestinale de populations japonaises alors que ce n'est pas le cas pour les populations, entre autres, nord-américaines. Ces résultats suggèrent qu'il y a eu un transfert de gènes des bactéries marines vers les bactéries de la flore intestinale des populations japonaises. Ceci peut s'expliquer par le régime alimentaire traditionnel de ces populations, riche en algues marines, notamment du type porphyra (nori), à la base de la préparation des makis, et que l'ingestion des bactéries marines se fasse via l'ingestion d'algues non stériles. Les bactéries de la flore intestinale permettant à l'homme d'assimiler notamment des polysaccharides issus de son régime en plantes terrestres, un transfert de gènes de bactéries marines chez les populations japonaises suggère pour ces derniers la possibilité de digérer les polysaccharides issus de leur régime enrichi en algues marines. Ce gain conduit à un avantage nutritionnel avantageux pour l'homme du fait des bénéfices bioactifs reconnus des oligosaccharides issus de la digestion des polysaccharides d'algues. La présente invention permet donc de proposer aux populations occidentales le même bénéfice nutritionnel en valorisant les oligo-porphyranes générés comme compléments d'aliments fonctionnels dans le domaine de la nutraceutique. Ce concept est également valable pour la nutrition animale ou des applications dans le domaine de la cosmétique. Ainsi, certains composés de la fraction d'oligosaccharides en mélange obtenue ici pourraient être développés comme nouveaux agents texturants pour l'agroalimentaire et la cosmétique. Ainsi, la présente invention se rapporte également à un additif alimentaire ou à un aliment ou à un produit cosmétique comprenant un oligoporphyrane susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention qui présente des propriétés pré-biotiques de modulation de la flore intestinale ou des propriétés anti-oxydantes et anti-vieillissement. Il peut aussi s'agir par exemple d'additifs alimentaires destinés à l'homme ou à l'animal, dans 2 0 le but de stimuler les défenses immunitaires. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. 25 Brève description des figures Figure 1 : résultats d'analyse par chromatographie d'exclusion de taille des oligo-porphyranes obtenus par hydrolyse enzymatique du porphyrane par la beta-AgaB suivant le procédé de la présente invention. 30 Figure 2: résultats d'analyse en FACE des oligo-porphyranes obtenus par digestion du porphyrane par l'enzyme AgaB suivant le procédé de la présente invention. 3 02 12 1 9 8 Figure 3 : photographies d'observation microscopique de monocytes THP-1 après traitement au PMA pour leur différenciation en macrophages. Les flèches indiquent les extensions cytoplasmiques (grossissement x200). 5 Figure 4: photographies d'observation microscopique de la morphologie des macrophages THP-1 après 24 heures de traitement avec les oligo-porphyranes. (grossissement x200). Figure 5: graphique de régression linéaire du logarithme de l'absorbance (ordonnées) en fonction du logarithme de la 10 concentration de TNF-alpha (abscisses). Figure 6 : graphique d'étude de l'effet des oligo-agaroses (oligo-aga) et des oligo-porphyranes (oligo-por) sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Figure 7: effet de doses croissantes d'oligo-porphyranes sur la 15 sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Les concentrations d'oligo-porphyranes sont indiquées en g/I. Figure 8 : 1H RMN (500 MHz) spectre des oligosaccharides L6S-GLA-G-L6S-G non-méthylé (A) et méthyle (B), tel que comparé à la fraction haut poids moléculaire des oligosaccharides hybrides (C), et du neo-agarotetraose (D). EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'oligo-porphyranes A. Production et purification de l'enzyme beta-agarase B (beta-AgaB) de Zobellia galactanivorans Cette enzyme est produite sous forme recombinante selon le procédé décrit dans le document FR 2 779 738 [1] publié le 17 décembre 1999. La flavobactérie marine Zobellia galactanivorans utilisée a été acquise auprès de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Leibniz, Allemagne) sous la référence DSMZ-12802. Le protocole de production de l'enzyme est celui décrit dans l'exemple 3 du document [1], E. coli BL21DE3 ayant été transformé avec le gène codant pour l'agaB de Zobellia galactanivorans. B. Purification du porphyrane de Porphyra umbilicalis L'algue rouge Porphyra umbilicalis est récoltée sur la zone intertidale de la baie de Perharidy (Roscoff, France). Elle est rincée à l'eau douce afin de la débarrasser du sable et autres débris contaminants. L'excès d'eau est éliminé par essorage puis par pressage de l'algue entre plusieurs couches de papier absorbant. L'algue est ensuite séchée en la plaçant 2 jours à 35°C. Le rendement de masse sèche obtenu est de 20% de la masse initiale d'algue essorée. L'algue est alors réduite en poudre à l'aide d'un robot « blender » broyeur à bille commercialisé par la société Retsch (De) sous la référence MM200. La poudre obtenue est incorporée en une quantité représentant 2% en poids à de l'eau distillée, % exprimé par rapport au poids de l'eau distillée utilisée, et le mélange est autoclave 1 heure à 105 Pa (1 bar) à 115°C afin d'extraire les polysaccharides d'intérêt. Le mélange est ensuite refroidi à la température du laboratoire (25°C) puis filtré à travers une membrane de nylon présentant une taille de pore de 0.5 mm afin d'éliminer les résidus d'algue les plus gros. Le filtrat résultant contient les polysaccharides de la présente invention. Il est clarifié par centrifugation pendant 20 minutes à 20 000 G pour éliminer les résidus indésirables plus petits. L'extrait clarifié est concentré 5 fois par évaporation en utilisant un rotavapor. Les polysaccharides sont alors précipités par ajout de 4 volumes d'éthanol absolu pour un volume d'extrait clarifié. Le précipité polysaccharidique obtenu est filtré et lavé à l'éthanol absolu dans un Büchner. Le précipité est ensuite séché à 30°C toute la nuit (10 heures). Ce protocole permet d'obtenir un rendement en polysaccharide selon l'invention de 15% de la masse traitée d'algue sèche initiale, soit 3% de la masse initiale d'algue essorée. C. Hydrolyse enzymatique du porphyrane L'enzyme beta-AgaB présente une spécificité d'hydrolyse du substrat agarose au niveau de la liaison beta-1,4 entre le beta-Dgalactopyranose (motif G) et le 3,6-anhydro-alpha-L-galactopyranose (motif LA). La structure des motifs G et LA constitutifs de l'agarose est représentée ci-dessous. L'enzyme béta-AgaB hydrolyse la liaison entre ces deux motifs. G Le porphyrane naturel extrait est un polysaccharide hétérogène constitué d'une alternance entre ces motifs disaccharidiques G-LA et des motifs G-L6S où L6S correspond à l'alpha-L-galactose-6-sulfate lié en 4 au motif G comme représenté ci-dessous : AgaB 3 0 2 1 2 1 9 11 L'enzyme béta-AgaB peut hydrolyser la liaison entre ces deux motifs. L'enzyme béta-AgaB accepte la présence de motifs L6S au niveau de certains de ses sous-sites de liaison à son substrat. Ainsi cette 5 enzyme peut générer des oligosaccharides hybrides avec enchainements variables de motifs G-LA et de motifs G-L6S. Le substrat porphyrane est préparé à 1 % en poids dans l'eau distillée (`)/0 exprimé par rapport au poids de l'eau distillée utilisée). La digestion enzymatique est effectuée par ajout de l'enzyme 10 AgaB en une concentration de 1pg/mlfinal et incubation 24 heures à 30°C. D. Purification et analyse des oligo-porphyranes La purification des oligosaccharides est effectuée par ultrafiltrations successives de l'hydrolysat sur membrane de seuil de 15 filtration fixé à 30 kDa puis sur deuxième membrane au seuil fixé à 10 kDa. Les membranes utilisées sont disponibles en vente dans le catalogue Millipore, sous la référence Centricon Catalog no. 4206 (10 kDa) et 4209 (30 kDa), commercialisé par la société Millipore. A l'issue de ces étapes de filtrations, selon la masse molaire théorique moyen du porphyrane hybride (400 Da pour un disaccharide), le profil théorique du mélange oligosaccharidique correspond à des oligosaccharides d'un degré de polymérisation (DP) inférieur à 25 répétitions disaccharidiques (DP50). L'analyse du profil est effectuée par chromatographie d'exclusion de taille en injectant une solution oligosaccharidique à 0,4% dans l'eau mQ sur un appareillage Dionex ultimate (marque déposée) 3000 commercialisé par la société DIONEX (Sunnyvale, Californie) et une colonne Superdex peptide (marque déposée) 10/300 commercialisé sous la référence GE17-5176-01 dans le catalogue SIGMA-ALDRICH. La séparation s'effectue en 60 minutes sous éluant nitrate de lithium (LiNO3) à 100 mM. D'autres analyses sont menées par séparation électrophorétique des oligosaccharides préalablement marqués par un 3 0 2 1 2 1 9 12 fluorophore. La comparaison de ce mélange d'oligo-porphyranes avec des oligo-agaroses de l'art antérieur a été effectuée par la technique d'électrophorèse de saccharides assistée par un fluorophore (technique FACE) (« FACE » pour « Fluorophore-Assisted Carbohydrate 5 Electrophoresis » ; par le procédé décrit dans le document Studies on the hydrolytic condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, G. L., Liu, M. X., and Mei, X. Y. (2005), Anal. Lett. 38, 477-485 ou dans le document "The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted 10 carbohydrate electrophoresis", Huang, G. L., Zhang, H. C., and Wang, P. G. (2007), Food Chem. 101, 392-396 [2]. Les inventeurs ont utilisé deux types de marqueurs fluorescents. Un premier marqueur, l'ANTS (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate), qui apporte une charge globalement négative aux oligosaccharides permettant 15 ainsi leur migration. Un deuxième marqueur, l'AMAC (2-aminoacridone), qui n'est pas chargé comme représenté ci-dessous. Dans ce cas, seuls les oligosaccharides intrinsèquement chargés peuvent migrer et se séparent alors selon leurs masses et de leurs charges respectives. 0- Na+ NH2 H_N ^-s- Na+ i I ° 0- 0 I Na+ 20 Formule chimique de l'ANTS Formule chimique de l'AMAC Les résultats d'analyse par chromatographie d'exclusion de taille obtenus sont représentés sous forme de chromatogramme sur la figure 1 annexée. Ce chromatogramme permet de faire une première analyse visuelle du profil du mélange d'oligo-porphyranes purifiés. Ceux-ci se répartissent de façon assez homogène sur une échelle de tailles allant jusqu'aux oligosaccharides d'un degré de polymérisation de 20 (DP20). Par ailleurs, on peut constater la présence d'un oligosaccharide majoritaire éluant à 32,3 minutes. Comme indiqué ci-dessus, les résultats d'analyse FACE permettent de comparer, sur une même expérience, les profils de migration de différents mélanges oligosaccharidiques entre eux. Ces résultats sont présentés sur la figure 2 annexée. Sur cette figure, on analyse en FACE des oligo-porphyranes obtenus par digestion du porphyrane par l'enzyme AgaB (Panel A : marquage ANTS, panel B : marquage AMAC. Les parties grisées ne sont pas exploitées ici mais conservées afin de ne pas tronquer l'image du gel d'électrophorèse. L'analyse du gel d'électrophorèse des oligosaccharides marqués à l'ANTS montre des profils de migration très différents entre le mélange d'oligo-agaroses et le mélange d'oligo-porphyranes, tous deux issus d'une digestion avec l'enzyme AgaB (sur l'agarose panel A, ligne 3, et sur le porphyrane ligne 4). Le deuxième présente en effet une migration électrophorétique plus importante, suggérant que dans ce cas, l'enzyme AgaB a libéré des oligosaccharides hybrides contenant des motifs porphyranes chargés. Ces résultats sont confortés par l'analyse des profils de migration des oligosaccharides marqués à l'AMAC. Ce fluorophore n'étant pas chargé, seuls les oligosaccharides intrinsèquement chargés peuvent migrer en électrophorèse. On constate en effet que le mélange d'oligo- agaroses ne migre pas (panel B, ligne 1) alors que le mélange d'oligosaccharides issu de la digestion de porphyrane avec AgaB est séparé par cette technique (panel B, ligne 2). On peut donc conclure qu'il s'agit bien dans ce cas d'un mélange d'oligosaccharides hybrides contenant des motifs porphyranes L6S-G. Ce mélange est qualitativement et quantitativement différent du mélange d'oligo-porphyranes obtenus après digestion du porphyrane par la porphyranase A. Cette enzyme hydrolyse en effet spécifiquement le porphyrane au niveau des motifs G- L6S, expliquant l'enrichissement en oligosaccharides de petite taille (panels A et B, cercles bleus). Le profil oligosaccharidique du mélange obtenu par digestion du porphyrane par AgaB indique par ailleurs la présence d'un composé majoritaire (panel A, flèche rouge). En marquage ANTS, ce composé migre à une hauteur comparable à celle du néoagarotétraose (panel A, ligne 2, DP4). Ce composé majoritaire est également retrouvé dans le profil de migration du même mélange marqué avec l'AMAC (panel B, flèche rouge). Ceci suggère donc que ce composé majoritaire ne correspond pas à de l'agarose auquel cas il ne pourrait pas migrer dans cette expérience. Il est en outre intéressant de voir qu'après marquage à l'ANTS, ce composé migre à une distance comparable de celle observée pour des hexasaccharides préalablement identifiés, H1-Me et H3, respectivement de composition L6S-G(Me)_LA-G_L6S-G et L6S-G_L6S-G_LA-G (panel A, lignes 6 et 7, respectivement H1-Me et H3). Ceci suggère donc que ce composé majoritaire correspond à un hexasaccharide de porphyrane. La comparaison des migrations sur gel après marquage à I'AMAC montre une co-migration des hexasaccharides H1-Me et H3 (panel B, lignes 4 et 5, respectivement H1-Me et H3) alors que le composé majoritaire du mélange d'intérêt montre avec cette technique un retard de migration. Ce retard est classiquement observé pour un hexasaccharide de type H2 de composition L6S-G LA-G LA-G du fait de la présence d'un seul motif sulfaté contre deux pour H1 et H3. La masse moléculaire de H2 est de 1 128 g/mol. Ces résultats suggèrent donc que le composé majoritairement produit dans le mélange oligosaccharidique issu de la digestion de porphyrane avec AgaB est un hexasaccharide de porphyrane de type H2. Ces oligo-porphyranes ont été obtenus par un processus d'hydrolyse enzymatique du porphyrane par l'enzyme agarolytique beta Agarase B. E. Analyses RMN Une analyse 1H RMN (500 MHz) spectre des oligosaccharides L6S-G-LA-G-L6S-G non-methylé (A) et methylé (B), tel que comparé à la fraction haut poids moléculaire des oligosaccharides hybrides (C), et du neo-agarotetraose (D) est réalisée suivant le procédé décrit dans les documents [3] et [4] indiqués ci-dessous. Les résultats d'analyse sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous, et sur la figure 8 annexée. Tableau 1 : 1H RMN signaux en (Ô) ppm des unités L6S et G, observé à 25°C tel que dans le disaccharide (L6S-G), tetrasaccharide (L6S-G)2 et le polymère (L6S-G)n. Tableau 1 (L6S-G) (L6S-G)2 (L6S-G)n (L6S-G) (L6S-G)2 (L6S-G)n Gra H-1 5.29 5.30 L6SCa H-1 5.25 5.30 GrI3 H-1 4.65 4.65 L6SCI3 H-1 5.24 5.30 Gnr' H-1 - 4.49 L6Snr H-1 5.25 G H-1 - 4.50 L6S H-1 5.33 Gra H-2 3.99 4.00 L6SCa H-2 3.84 3.90 GrI3 H-2 3.66 3.68 L6SCI3 H-2 3.84 3.90 Gnr' H-2 - 3.76 L6Snr H-2 3.84 G - - 3.76 L6S H-2 3.92 Gra H-3 3.94 3.95 L6SCa H-3 3.95 3.98 GrI3 H-3 3.73 3.75 L6SCI3 H-3 3.95 3.98 Gnr' H-3 - 3.75 L6Snr H-3 3.95 G - - 3.76 L6S H-3 3.98 Gra H-4 4.25 4.26 L6SCa H-4 4.05 4.31 GrI3 H-4 4.19 4.20 L6SCI3 H-4 4.05 4.31 Gnr' H-4 - 4.20 L6Snr H-4 4.06 G - - 4.21 L6S H-4 4.31 Gra H-5 4.12 4.13 L6SCa H-5 4.31 4.42 GrI3 H-5 3.72 3.76 L6SCI3 H-5 4.31 4.42 Gnr' H-5 - 3.74 L6Snr H-5 4.30 G - - 3.82 L6S H-5 4.42 Gra H-6a 3.75 3.78 L6SCa H-6a 4.16 4.32 GrI3 H-6a 3.75 3.76 L6SCI3 H-6a 4.16 4.32 Gnr' H-6a - 3.74 L6Snr H-6a 4.16 G - - 3.78 L6S H-6a 4.31 Gra H-6b 3.77 3.78 L6SCa H-6b 4.23 4.32 GrI3 H-6b 3.77 3.76 L6SCI3 H-6b 4.23 4.32 Gnr' H-6b - 3.74 L6Snr H-6b 4.23 G - - 3.78 L6S H-6b 4.31 Structure des oligosaccharides hybrides L6S-G/LA-G : Pour la mesure des spectres en RMN du proton, tous les échantillons ont été solubilisés en D20 et deux fois échangés. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre 500 MHz Bruker NMR (Service de RMN, Université Bretagne10 Occidentale, Brest, France). Les spectres d'oligosaccharide ont été enregistrés à 25°C avec 16 scans. Les déplacements chimiques sont indiqués en ppm par rapport à un standard externe TSP (trimethylsilylpropionic acid). Tous les signaux RMN des protons et carbones ont pu être entièrement attribués en utilisant des spectres COSY (doublequantum-filtered correlation spectroscopy), HMQC (heteronuclear multiple quantum correlation) et HMBC (heteronuclear multiple bond correlation). D'autres oligosaccharides peuvent donc être caractérisés en comparaison avec ces structures obtenues sur les oligo-porphyranes pures (Correc G., Hehemann J.H., Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans 13-porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283) [3]. D'autres structures ont été caractérisées par les mêmes techniques et en comparaison avec la structure obtenue pour le disaccharide porphyrane. Les spectres 1H-NMR des hexa-oligosaccharides hybride H2 et H3, produits par l'enzyme AgaB de la figure 8 démontrent les caractéristiques de la présence des oligosaccharides L6S-G, tels que décrits et attribués selon Correc et al. Nous avons ainsi pu identifier les signaux qui 2 0 correspondent à ceux des protons a-anomeric des terminaisons non- réductrice (L6S-H1nr) dans la partie la plus éloignée du spectre (vers les 5.3 ppm). En revanche, les protons I3-anomeric du côté réducteur des chaînes hexa-saccharidiques sont ceux du LAT et G (Lar-H1= 5.13 ppm GrI3-H1= 4.65 ppm), comparables à ceux déterminés pour l'agarose décrite 25 dans Kazlowski, B.,Pan,C.L.,&Ko,Y.T.(2008).Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450 [4]. Le spectre du hexasaccharide H2 contient les signaux du H1-LA interne alors que le 3 0 spectre du H3 des signaux du H1-L65 interne. En conclusion, nous pouvons en déduire que le H2 est le hexasaccharide Po-Ag-Ag et le hexasaccharide H3 Po-Po-Ag. 3 0 2 1 2 1 9 17 Exemple 2: Mesure de l'activité immunostimulante in vitro sur cellules 2.1 Préparation du composé à tester sur cellules A l'issue des étapes d'ultrafiltration du digestat obtenu à 5 l'exemple 1, le filtrat obtenu est lyophilisé. Le composé obtenu est alors repris à 40 g/I dans du tampon phosphate salin (PBS). Cette solution « mère » permet de préparer les dilutions successives qui sont testées sur les cellules. Dans cet exemple, des concentrations de 0,4 g/I, 0,2 g/I et 0,1 g/I d'oligoporphyrane ont été testées. 10 2.2. Mesure de la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages Les inventeurs démontrent ici que les oligoporphyranes de la présente invention stimulent, chez les macrophages, la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha (« Tumor Necrosis factor alpha ») à 15 des niveaux comparables à ceux communément observés lors d'une stimulation par le lipopolysaccharide bactérien (LPS). Les tests sont effectués in vitro sur des cellules humaines en culture. 2 0 2.2.1. Culture cellulaire Les cellules utilisées dans cet exemple sont les monocytes THP-1 isolés à partir du sang d'un enfant âgé d'un an atteint d'une leucémie monocytaire aigüe, comme décrit dans le document « Establishment and characterization of a human acute monocytic 25 leukemia cell line (THP-1) », Tsuchiya S. et al., Int J Cancer 26 : 171-176 (1980) [5]. Elles sont disponibles sous la référence ATCC TIB 202TM (American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108 USA, www.atcc.org Elles sont cultivées dans le milieu de culture RPMI 1640 + 30 Glutamax (marque déposée) (Life technologies) supplémenté avec 10% en volume de sérum de veau foetal (s-RPMI), à 37°C sous une atmosphère enrichie à 5% en volume de CO2 par rapport au volume d'air initial. Les cellules présentent une morphologie ronde et croissent en suspension avec formation de grappes (figure 3, panel de gauche). L'ensemencement se fait à 1 105 cellules/ml et la culture est diluée lorsque que la concentration cellulaire atteint 1x106 cellules/ml. 2.2.2. Obtention des macrophages Les macrophages sont obtenus par différenciation des monocytes THP-1 avec le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme décrit dans le document « Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester », Tsuchiya S. et al., Cancer Res 42 : 1530-1536 (1982) [6]. Les monocytes sont lavés et repris à 1 106 cellules/ml dans le milieu de culture RPMI 1640 + Glutamax (marque déposée) non supplémenté en sérum auquel est ajouté 200nM de PMA (Sigma Aldrich). Les cellules sont alors rapidement transférées dans des plaques de culture cellulaires 12 puits dans lesquels seront effectués les traitements par les oligo-porphyranes de la présente invention. Chaque puit (3,8 cm2) est ensemencé par 1 ml de la suspension cellulaire (1 106 cellules) et les cellules sont incubées pendant 24 à 48 heures à 37°C sous 5% de CO2. A l'issue de cette période de différenciation, la majorité des cellules adhère au fond des puits de culture et les cellules adoptent une morphologie de type macrophage, ce qui est observable sur la figure 3 (panel de droite). Les monocytes en culture sont observables sous formes de cellules rondes en suspension dans le milieu de culture, avec formation de grappes (figure 3, gauche). Le traitement au PMA à une concentration de 200 nM entraîne rapidement l'adhésion des cellules au fond du puits de culture. Les cellules deviennent plus granuleuses et adoptent une forme plus allongée avec des extensions cytoplasmiques (figure 3, droite). Ces caractères morphologiques indiquent, pour ce type cellulaire, une différenciation des monocytes en macrophages. 3 0 2 1 2 1 9 19 Sur cette figure 3, Les flèches indiquent les extensions cytoplasmiques (grossissement x200, observation à 30 heures après traitement au PMA pour la photographie de droite). 5 2.2.3. Traitement des macrophages Le milieu de différenciation est éliminé et les cellules lavées dans 1m1 de PBS puis 1m1 de s-RPMI afin d'éliminer le PMA ainsi que les cellules non adhérentes. Les cellules adhérées au fond des puits sont reprises dans 1 ml 10 de milieu s-RPMI pour les traitements. Les cellules sont traitées pour une durée de 24 heures par les oligo-porphyranes aux concentrations de 0,4 g/I, 0,2 g/I et 0,1 g/I. Le témoin négatif correspond aux cellules incubées sans ajout de composé. Six puits sont utilisés pour chaque concentration testée. 15 Les cellules sont observées au microscope après 24 heures de traitement avec les oligo-porphyranes, avant traitement secondaire au LPS La photographie de gauche de la figure 4 annexée présente l'une de ces observations. A l'issue de cette étape, pour chaque concentration testée, 3 20 puits sont utilisés afin de poursuivre l'incubation des cellules en présence de lipopolysaccharides bactériens à la concentration de 0,1 pg/ml (LPS d'Escherichia coli sérotype 0111:B4, réf. L2630 Sigma Aldrich) pendant 6 heures suivant le procédé décrit dans le document, Takashiba et al., Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for 25 lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kappaBj 1999, Infect. & Immun. Nov.67(11) 5573-8 [7]. Le LPS est reconnu pour stimuler la sécrétion de TNF-alpha chez ces cellules, comme décrit dans le document, Wright et al., CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS Binding protein, sept. 1990, Science 30 Vol.249:4975 pp 1431-1433 [8]. Ainsi, chaque condition est testée en triplicata indépendants. La photographie de droite de la figure 4 présente l'une des observations faites à l'issue de cette étape. En comparaison avec les macrophages non traités (figure 4, gauche), on remarque une accentuation des caractères morphologiques caractéristiques des macrophages, notamment une proportion plus grande de cellules allongées avec extensions cytoplasmiques (figure 4, droite). Ces observations démontrent que les oligo-porphyranes de la présente invention exacerbent le phénotype macrophagique des cellules. 2.2.4. Mesure du relargaqe de TNF-alpha par les macrophages : test ELISA La mesure de la sécrétion de TNF-alpha se fait dans le surnageant de culture des macrophages par un dosage en ELISA (« enzyme-linked immunosorbent assay »). Le protocole utilisé est celui décrit dans le document E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID : 5135623 [9]. Les conditions opératoires et matériel utilisé sont décrits ci-dessous. Ce test est effectué en plaques 96 puits. Brièvement, le fond des puits est enrobé d'un premier anticorps reconnaissant spécifiquement le TNF-alpha. Cet anticorps va permettre de capturer et d'isoler le TNF- alpha présent dans le surnageant de culture. Un deuxième anticorps biotinylé est ensuite ajouté afin de détecter les molécules de TNF-alpha préalablement capturées. Cet anticorps est alors spécifiquement détecté par l'ajout de la streptavidine couplée à une enzyme peroxydase (HRP). L'ajout d'un substrat chromogénique de la peroxydase permet alors de mesurer en spectrophotométrie la quantité de TNF-alpha initiale présente dans le surnageant testé. Ce calcul se fait par l'établissement, en parallèle, d'une courbe étalon à partir d'une gamme de concentrations de TNF-alpha recombinant allant de 15,6 pg/I à 2000 pg/ml (figure 8). Une mesure étalon est également réalisée en l'absence de TNF-alpha (TNF- alpah = 0 pg/ml). Cette gamme est utilisée afin de définir l'équation de proportionnalité entre les mesures d'absorbances effectuées à l'issue du dosage ELISA et les concentrations de TNF-alpha. La régression linéaire est obtenue en passant les valeurs de concentration de TNF-alpha et d'absorbance correspondantes en échelle log10. La figure 5 annexée montre la courbe étalon ainsi obtenue, de régression linéaire du logarithme de l'absorbance (ordonnées) en fonction du logarithme de la concentration de TNF-alpha (abscisses). La réaction chromogénique est stoppée par l'ajout d'acide sulfurique et la lecture est effectuée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 450nm avec une correction automatique à 540nm. Chaque surnageant de culture à l'issue de l'étape précédente a fait l'objet de deux tests ELISA indépendants. Ainsi, pour chaque condition de traitement nous avons obtenu 6 valeurs d'absorbance. Le matériel, les produits, les tampons, le temps d'incubation, les concentrations d'utilisation des différents réactifs, et les références pour cet exemple sont les suivants : - anticorps de capture (réf. MAB610, R&D Systems) : 2 pg/ml dans le PBS ; 100 pl par puits ; incubation sur la nuit à température ambiante ; - TNF-alpha recombinant (réf. 210-TA, R&D Systems) : dilution dans TBST-BSA ; 100 pl de chaque dilution dans les puits de la gamme étalon ; incubation 2 heures à température ambiante ; - Surnageants de culture : 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante ; - anticorps de détection (réf. BAF210, R&D Systems) : 50 ng/ml dans le tampon Tris NaCI 0,1% BSA 0,05% Tween20 (TBST- BSA) ; 100 pl par puits ; incubation 2 heures à température ambiante ; - Streptavidine-HRP (réf. 43-4323, 1,25 mg/ml, Invitrogen) : utilisation au 1:20000è dans le TBST-BSA ; 100 pl par puits ; incubation de 20 minutes à température ambiante ; - Substrat chromogénique : 3,3',5,5'-Tétramethylbenzidine (TMB) (réf. T5525, Sigma) : dissolution à 0,1 mg/ml dans un tampon phosphate-citrate 0,05 M ; 100 pl par puits ; incubation 20-30 minutes à température ambiante ; - Acide sulfurique : 0,5 M ; 100 pl par puits ; - Lecteur de microplaques : Safire2 (marque de commerce), TECAN Ltd. 2.2.5 Effet des oligo-porphyranes sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages Les inventeurs de la présente on souhaité observer l'effet de la sulfatation des oligosaccharides sur leur activité biologique. Ainsi, ils ont comparé l'effet sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1 d'un traitement des macrophages aux oligo-porphyranes (oligo-por) à l'effet d'un traitement aux oligo-agaroses (oligo-aga), mélange de DP8 à DP22, dans les conditions opératoires décrites ci-dessus. Les traitements sont effectués à la concentration de 0,4 g/L. Le LPS est utilisé à 0,1 pg/m I. Les résultats de ces expérimentations sont présentés sur la figure 6 annexée. Ces résultats montrent qu'alors que des concentrations très discrètes de TNF-alpha sont détectables dans les surnageants de culture des macrophages non traités, un traitement au LPS induit une très forte augmentation de la sécrétion de TNF-alpha à des niveaux supérieurs à 1000 pg/m I de surnageant de culture. Ces contrôles internes à l'expérience montrent que cette approche expérimentale est utilisable pour étudier l'effet de composés sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages. On constate qu'un traitement aux oligo-agaroses entraîne une stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. Cet effet est beaucoup plus marqué lorsque les macrophages sont incubés en présence d'oligo- porphyranes. Dans le cas d'un traitement simultané des macrophages avec les oligo-porphyranes et le LPS, il est intéressant de constater que la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha est amplifiée en comparaison d'un traitement au LPS seul. Ce résultat paraîssent indiquer que les oligo- porphyranes et le LPS agissent de façon additive ou synergique, suggérant l'activation de voies de signalisations intracellulaires identiques ou complémentaires. En conclusion, ces résultats indiquent que les oligo-porphyranes sont capables d'activer une réponse de type inflammatoire chez les macrophages par la stimulation de la sécrétion de TNF-alpha. Par ailleurs, la forte différente de stimulation induite par les oligo-porphyranes par rapport à celle qui est induite par les oligo-agaroses suggère un rôle important joué par les motifs sulfatés présents dans les oligo-porphyranes. Afin de prouver la spécificité de cette stimulation, les inventeurs ont testé l'effet de doses croissantes d'oligo-porphyranes sur la sécrétion de TNF-alpha par les macrophages THP-1. Les résultats obtenus correspondants sont représentés sur la figure 7 annexée sur laquelle les concentrations d'oligo-porphyranes sont indiquées en g/I. Ces résultats confirment que les oligo-porphyranes stimulent la sécrétion de TNF-alpha chez les macrophages, et ce, de façon proportionnelle à la dose de composés utilisée pour effectuer les traitements. En outre, dans cette expérience, dans le cas de co-traitement, malgré les barres d'erreur, nous observons une fluctuation de la réponse des macrophages en fonction des doses croissantes d'oligo-porphyranes testées. Ces variations viennent renforcer le fait que les oligo-porphyranes agissent probablement via des voies de signalisation associées ou identiques. Les activités biologiques que les inventeurs ont pu mettre en évidence seraient le fait d'une molécule unique. Les résultats expérimentaux montrent en effet qu'il pourrait bien correspondre au composé majoritaire mis en évidence dans l'exemple 1, visible sur les analyses électrophorétiques de la figure 2 annexée. Ce composé n'est en effet pas présent dans d'autres fractions d'oligo-porphyranes qui semblent ne pas présenter d'activité biologique dans d'autres tests préliminaires en comparaison avec le mélange étudié ici. 3 02 12 1 9 24 Listes des références [1] FR 2 779 738 déposée par GOEMAR SA LAB, France. [2] Huang, G. L., Liu, M. X., and Mei, X. Y., "Studies on the hydrolytic 5 condition of beta-1,3 glucan from yeast by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis", (2005), Anal. Lett. 38, 477-485 ou dans le document The analysis of oligosaccharides derived from different sources by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, Huang, G. L., Zhang, H. C., and Wang, P. G. (2007), 10 Food Chem. 101, 392-396. [3] Correc G., Hehemann J.H., Czjzek M., Helbert W. (2011) Structural analysis of the degradation products of porphyran digested by Zobellia galactanivorans p-porphyranase A. Carbohydrate Polymers 83, 277-283. 15 [4] Kazlowski, B.,Pan,C.L.,&Ko,Y.T.(2008).Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by beta-agarase and HCI in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450. [5] Tsuchiya S. et al., "Establishment and characterization of a human 20 acute monocytic leukemia cell line (THP-1)", Int J Cancer 26 : 171- 176 (1980). [6] Tsuchiya S. et al., "Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester", Cancer Res 42: 15301536 (1982). 25 [7] kappaBj, Takashiba et al., "Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor", 1999, Infect. & Immun. Nov.67(11) 5573-8. [8] Wright et al., "CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide 30 (LPS) and LPS Binding protein", Sept. 1990, Science Vol.249: 4975 pp 1431-1433. [9] E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID : 5135623.35 REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un oligo-porphyrane, ledit procédé comprenant une étape (a) d'hydrolyse enzymatique de porphyrane au moyen de beta-agarase B. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la bêta-agarase B est la beta-agarase B exprimée par la bactérie marine Zobellia galactanivorans. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le porphyrane est extrait de la paroi de l'algue rouge marine Porphyra sp.. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le porphyrane est un polysaccharide hétérogène présentant une alternance de beta-D-galactopyranose-(1,4)-3,6-anhydro-alpha-L- galactopyranoside (motif G-LA) et de beta-D-galactopyranose-(1-4)-alphaL-galactose-6-sulfate (motif G-L6). 5. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape (b) de purification de l'oligo-porphyrane par ultrafiltrations successives de l'hydrolysat sur membrane. 6. Oligo-porphyrane susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Oligo-porphyrane selon la revendication 6, ledit Oligoporphyrane ayant une masse moléculaire de 780 à 1600 g/mol. 8. Oligo-porphyrane comme médicament. 9. Oligo-porphyrane comme médicament destiné à moduler l'immunité. 10. Oligo-porphyrane comme médicament destiné à stimuler l'immunité.