FR 3021975 A1 20151211 FR 1455095 A 20140605 « Procédé de production, notamment d'éthanol, par hydrolyse enzymatique séquencée de la cellulose et des hémicelluloses d'une matière première lignocellulosique» La présente invention concerne un procédé de production, notamment éthanol, comportant un prétraitement de la matière première végétale lignocellulosique (MPVLL) pour séparer la cellulose, les hémicelluloses et les lignines, et comportant une hydrolyse enzymatique des polysaccharides en C5 (pentoses) et en C6 (hexose). D'une manière générale, les compositions des différentes sources de biomasses présentent une forte hétérogénéité d'anatomies et de structures, mais elles présentent aussi un degré d'invariance, à savoir la présence de trois composés macromoléculaires majeurs, la cellulose, les hémicelluloses et les lignines. La cellulose est un polymère linéaire de glucose, donc une source potentielle de sucres fermentescibles ; les hémicelluloses sont des hétéropolymères dont les monomères les plus représentés sont des sucres en C5 à cinq atomes de carbone (xylose, arabinose) qui sont facilement métabolisés par de nombreux micro-organismes ; tandis que les lignines sont des hétéropolymères tridimensionnels complexes dont la dégradation naturelle est un processus long et complexe et pour lesquels il est considéré aujourd'hui qu'il serait illusoire de vouloir en dériver un procédé industriel quelconque de production par hydrolyse. La spécificité des lignocelluloses nécessite, notamment en vue par exemple de la production d'éthanol à partir des sucres fermentescibles mentionnés ci-dessus, de réaliser un prétraitement permettant de régler le problème d'accessibilité de la cellulose à des réactifs enzymatiques visant notamment à la solubilisation des hémicelluloses et des lignines. Le demandeur, CIMV, est une société spécialisée dans le traitement et la valorisation de la matière première végétale lignocellulosique. A cet égard, le demandeur est le déposant et titulaire de 5 différentes demandes de brevets et brevets concernant un procédé de production de pâte à papier, lignines, sucres et acide acétique, par fractionnement de matière végétale lignocellulosique en milieu acide formique/acide acétique (WO-A1-00/68494). Le demandeur est aussi le titulaire de demandes de 10 brevets et/ou de brevets concernant un procédé de prétraitement d'une matière végétale lignocellulosique en vue de la production de bioéthanol (WO-A2-2010/006840). Un tel procédé de prétraitement permet notamment d'obtenir, à partir de la matière première végétale lignocellulo- 15 sique (MPVL), dans des conditions économiques industrielles, d'une part un substrat constitué essentiellement par de la cellulose défibrée présentant des conditions optimales pour son hydrolyse enzymatique ultérieure, et un deuxième substrat constitué par une mélasse sucrée provenant des hémicellulose 20 dont les hydrolysats sont dépourvus de furfural. Le demandeur a donc déjà proposé un procédé de production de bioéthanol à partir d'une matière première végétale lignocellulosique comportant les étapes successives de prétraitement de la MPVL, d'hydrolyse enzymatique de la matière 25 prétraitée et de fermentation alcoolique des produits issus de l'étape d'hydrolyse. Le demandeur a notamment proposé un procédé de production de bioéthanol à partir d'une matière première végétale lignocellulosique, comportant les étapes successives de : 30 - a) prétraitement de la matière première végétale lignocellulosique pour séparer la cellulose, les hémicelluloses et les lignines contenues dans cette matière première végétale lignocellulosique, le prétraitement comprenant les étapes successives suivantes consistant à : - (i) déstructurer la matière première végétale lignocellulosique en la mettant en présence d'un mélange contenant de l'acide formique, de l'acide acétique et de l'eau, à une température de réaction comprise entre 95°C et 110°C ; - (ii) puis, à la pression atmosphérique et préalablement à toute action d'hydrolyse puis de fermentation, à séparer: 10 * d'une part la phase solide constituée essentiellement de ladite cellulose (sucres en C6) apte à être ensuite hydrolysée et fermentée pour la production d'éthanol ; * et d'autre part, la phase liquide, contenant notamment en solution de l'eau, l'acide formique, de l'acide 15 acétique, les lignines, et les hémicelluloses (sucres en C5) ; - b) hydrolyse enzymatique de ladite phase solide ; - c) fermentation alcoolique des produits issus de ladite étape d'hydrolyse aptes à être fermentés pour la production 20 d'éthanol. Ce procédé est notamment décrit en détails dans le document EP-2.235.254 (WO-A1-2009/0927498). Ce procédé propose une approche radicalement différente de celle de l'art antérieur en procédant à une séparation des trois 25 biopolymères par solvolyse en milieu acide/eau qui permet la séparation de lignines linéaires non recombinées de bas poids moléculaires à haute valeur ajoutée, en préalable à toute action d'hydrolyse puis de fermentation de la cellulose et des hémicelluloses. 30 Ce procédé qui permet d'obtenir des performances industrielles quelle que soit la nature des plantes utilisées, et qui est donc particulièrement intéressant dans le cas des plantes annuelles pour ouvrir la voie à une nouvelle valorisation, notamment dans le cas des pailles de céréales et de la bagasse de canne à sucre, ou de sorgho sucrier, valorisation qui vient s'ajouter à celle déjà proposée par le demandeur dans la demande internationale WO-A1-00/68494 qui concerne procédé de production de pâte a papier, lignines, sucres et acide acétique par fractionnement de la matière végétale lignocellulosique en milieu acide formique / acide acétique. Ces inventions (Procédés CIMV) visent à améliorer les conditions industrielles de la production d'éthanol à partir de MPVL, et notamment l'hydrolyse de la cellulose en sucres fermentescibles. D'une manière générale et de manière connue, les procédés de production d'éthanol à partir de MPVL prennent en compte plusieurs paramètres. Parmi ces paramètres, il a notamment été identifié que la lignine peut être un inhibiteur des enzymes et que la matrice lignocellulosique doit être prétraitée pour rendre la cellulose et les hémicelluloses hydrolysables. De par leur composition chimique, les polymères de lignines sont insolubles et très réactifs. De ce fait, la présence de lignines renforce le réseau cellulose - hémicelluloses et elles entravent la pénétration et l'action des enzymes, nécessitant la présence d'eau. L'hydrolyse enzymatique de la cellulose est une voie préconisée pour l'obtention de sucres fermentescibles pour diverses raisons, et notamment parce que les résultats des évaluations économiques sont en faveur de l'hydrolyse enzymatique, lorsqu'elle est comparée à l'hydrolyse chimique. De plus, l'hydrolyse enzymatique génère peu d'effluents à traiter et pas de problèmes de corrosion. L'hydrolyse enzymatique proprement dite s'effectue par simple mise en contact de la matière première végétale prétraitée avec une solution enzymatique en assurant l'homogénéité de la suspension et en maintenant des conditions optimales qui sont, par exemple pour les cellulases de T.reesei, une température comprise entre 45°C et 50°C et un pH de l'ordre de 4,8. Le temps d'action des enzymes est fonction de la quantité d'enzymes utilisée et de l'activité spécifique des enzymes. Pendant l'hydrolyse enzymatique, les sucres réducteurs sont essentiellement libérés sous forme de glucose. Les enzymes impliquées dans la dégradation de la cellulose, qui sont appelées communément cellulases, sont de différents types et de différentes origines et elles se caractérisent notamment par leur activité. Le coût des cellulases est relativement élevé et constitue un facteur souvent estimé comme étant le plus onéreux dans la production de bioéthanol à partir de MPVL. De ce fait, des efforts importants ont été consacrés à la connaissance du mécanisme d'hydrolyse enzymatique en vue de son amélioration, s'agissant d'un processus complexe d'action de protéines solubles sur un substrat insoluble et "récalcitrant". Un autre paramètre de l'efficacité et de la rentabilité d'un procédé d'hydrolyse enzymatique est le temps d'hydrolyse qui peut être relativement long, de 48 à 72 h. Afin d'améliorer l'efficacité de l'hydrolyse enzymatique de la cellulose, le demandeur CIMV a proposé dans le document WO-A2-2012/049054, un procédé de production d'éthanol, caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement à l'étape d'hydrolyse enzymatique de la cellulose, une étape d'élimination partielle des lignines de manière à obtenir un taux global résiduel de lignines, exprimé en pourcentage massique, qui est non nul et qui est compris dans une plage déterminée par une borne inférieure, et une borne supérieure, respectivement égales à 0,30% et 4%. L'efficacité globale de ce procédé est proche, ou quasi égale, à la production du taux maximal théorique d'éthanol à partir de la MPVL et, de plus, cette efficacité étant la même selon que le procédé global fait appel d'abord à une étape d'hydrolyse enzymatique selon le procédé, puis à une étape de fermentation, ou bien selon que l'on met en oeuvre un procédé d'hydrolyse et de fermentation simultanées (procédé SSF). Une telle efficacité identique est due au fait que l'hydrolyse enzymatique de la cellulose selon ce procédé ne produit pas d'inhibiteurs de la fermentation. De plus, il a été démontré que les avantages du procédé (taux global de lignines et conditions particulières de la ré-acidification), ne sont pas modifiés, c'est-à-dire sont de même nature et de mêmes valeurs, quelles que soient les cellulases utilisées, et notamment qu'il s'agisse de cellulases de plus ou moins grande efficacité Une fois la cellulose hydrolysée en glucose par hydrolyse enzymatique, le glucose est fermenté de la même façon que par exemple le glucose issu de l'amidon. Il demeure des problèmes connus spécifiques à l'utilisation de MPVL comme substrat initial, tels que la présence éventuelle de composés toxiques et inhibiteurs issus des hémicelluloses et la lignine, ainsi que la possibilité d'effectuer l'hydrolyse enzymatique et la fermentation en une seule étape. Les inhibiteurs présents dans les hydrolysats proviennent 25 de la dégradation des sucres (en furfural), de groupements présents dans les hémicelluloses, de la lignine. La présence des inhibiteurs dépend de la nature de la MPVL et des conditions de son prétraitement. Outre l'inhibition des enzymes par le furfural, on a constaté 30 des effets conjugués des différents inhibiteurs. On a déjà proposé la mise en oeuvre simultanée, dans un même réacteur, des opérations d'hydrolyse et de fermentation selon un procédé dit SSF (Simultaneous Saccharification Fermentation) dont l'intérêt premier paraît évident puisqu'il fait appel à une seule installation, mais qui nécessite l'utilisation d'enzymes et de levures travaillant dans le même environnement physicochimique. Or, leurs optima de température sont relativement éloignés (30°C pour la levure et 50°C pour les cellulases). Ainsi, le développement de la SSF implique le développement de souches de levures capables de fermenter à température beaucoup plus élevée. S'agissant de la fermentation et de l'hydrolyse simultanées selon le procédé dit "SSF" ("Simultaneous Saccharification and Fermentation") qui consiste à effectuer l'hydrolyse enzymatique et la fermentation éthanolique en une seule étape, ses principaux avantages sont la diminution des investissements en supprimant les opérations nécessaires à l'hydrolyse enzymatique effectuée au préalable et l'absence d'inhibition des cellulases par le glucose qui est consommé par les microorganismes fermentaires au fur et à mesure de son apparition. Il en résulte une augmentation des taux et des vitesses d'hydrolyse et des productivités globales en éthanol. Par ailleurs, les risques de contamination microbienne de l'hydrolysat riche en glucose sont amoindris. Il est cependant aussi apparu que les gains apportés par le procédé SSF, notamment du point de vue économique, nécessitent d'optimiser certains aspects, notamment la concentration en matière sèche initiale pour obtenir des concentrations élevées d'éthanol. Selon un autre concept de co-fermentation, il peut être proposé de combiner en une seule étape la saccharification et la 30 co-fermentation des sucres en C5 issus du prétraitement avec les sucres en C6 générés par l'hydrolyse enzymatique. Un tel procédé SSCF (Simultaneous Saccharification Co-Fermentation) nécessite toutefois que soit abolis les mécanismes qui, chez pratiquement tous les microorganismes, sont en place pour, en présence d'un mélange de sucres, favoriser systématiquement l'assimilation du glucose avant celles des autres sucres. Ainsi, à partir des combinaisons possibles des différentes options connues de l'état de l'art, deux schémas de procédés industriels différents émergent naturellement. Le premier schéma prévoit une séparation des sucres en C5 en fin d'étape de prétraitement, ce flux de sucre en C5 étant fermenté séparément et une fraction pouvant éventuellement être utilisée pour la production de cellulases, une fraction insoluble (cellulose + lignine) issue d'un prétraitement pouvant être traitée par la méthode SSF. Un deuxième schéma, apparemment beaucoup plus simple, est basé sur la SSCF requiert la disponibilité d'un microorganisme (ou un mélange de microorganismes) capable de fermenter simultanément et avec exactement la même efficacité les sucres en C5 et en C6. En effet, une différence dans les vitesses de métabolisation obligerait à prolonger la fermentation jusqu'à l'épuisement du sucre métabolisé le plus lentement, ce qui aboutit à sous utiliser l'ensemble de l'équipement industriel de production, notamment de fermentation dans le cas de la production de bioéthanol. Afin de franchir un pas décisif dans la faisabilité et la rentabilité de telles méthodes, l'invention propose un nouveau procédé se fondant, de manière connue, sur une première partie de prétraitement aboutissant à une séparation de la cellulose, des hémicelluloses et des lignines puis, de manière surprenante, à une hydrolyse séquencée des polysaccharides en C6 et en C5 aboutissant à l'obtention d'un hydrolysat (ou co-hydrolysat) final, notamment apte à être fermenté pour la production de bioéthanol, ou de tout autre produit, notamment en fonction des levures utilisées. Dans ce but, la présente invention propose un procédé de production d'un produit, tel que par exemple le bioéthanol, à partir 5 d'une matière première végétale lignocellulosique, (MPVL) comportant des étapes : - a) de prétraitement de la matière première végétale lignocellulosique pour séparer la cellulose (C6), les hémicelluloses (C5) et les lignines contenues dans cette matière 10 première végétale lignocellulosique, le prétraitement comprenant les étapes successives consistant à déstructurer la matière première végétale lignocellulosique puis, à séparer d'une part la cellulose (C6) apte à être ensuite hydrolysée (et fermentée pour la production de bioéthanol) et, d'autre part, les hémicelluloses 15 (oligosaccharides C5) aptes à être ensuite hydrolysées; - b) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose (C6) ; - c) d'hydrolyse enzymatique des hémicelluloses (C5); caractérisé en ce que l'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses est réalisée de manière séquencée selon les 20 étapes successives suivantes consistant à : - i) commencer l'hydrolyse enzymatique de la cellulose (C6) au moyen d'au moins une enzyme (hémicellulase) pendant une première durée (T1) en vue de l'obtention d'un hydrolysat intermédiaire ; 25 - ii) ajouter des hémicelluloses (C5) dans ledit hydrolysat intermédiaire ; - iii) poursuivre l'hydrolyse enzymatique du mélange jusqu'à l'obtention d'un hydrolysat final à l'issue d'une durée totale (T2) d'hydrolyse enzymatique. 30 A titre d'exemple, pour une tonne de paille constituant la matière première végétale lignocellulosisue, le procédé selon l'invention permet d'augmenter d'environ 20% la quantité d'éthanol produite. Ainsi, on voit clairement l'intérêt de « rassembler » de manière séquencée et contrôlée les deux flux initialement distincts issus du raffinage de la biomasse, en augmentant le rendement global et en supprimant une partie des équipements et des coûts de fonctionnement d'une unité de production qui traiterait de manière séparée les deux flux de sucres. Avantageusement, et afin notamment de pouvoir mettre le procédé aisément en oeuvre, en s'affranchissant des problèmes de viscosité tout en travaillant une cellulose à forte teneur en matière séché, ladite étape i) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose consiste à : il) introduire dans un réacteur ladite au moins une première enzyme ; i2) ajouter une première partie de la cellulose jusqu'à l'obtention d'un mélange dont la teneur en matière sèche (MS) est comprise entre 10% et 15% en poids ; i3) laisser hydrolyser le mélange pendant une durée comprise entre six heures et quinze heures ; i4) ajouter la partie restante de la cellulose en plusieurs 20 fois de manière à obtenir une teneur finale en matière sèche (MS) comprise entre 20% et 25% en poids. Ladite première durée (T1) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose est comprise entre vingt heures et quarante heures en fonction de l'enzyme, ou du mélange d'enzymes, utilisée. 25 Ladite première étape i) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose est par exemple effectuée à une température comprise entre 45°C et 55°C. La teneur en matière sèche de la cellulose est comprise entre 10% et 25%. 30 La teneur en matière sèche de la cellulose est de préférence supérieure à 20%. Ladite étape ii) d'ajout des hémicelluloses est réalisée en une seule fois, après introduction de la totalité de la cellulose à hydrolyser. Ladite étape ii) d'ajout des hémicelluloses consiste de plus 5 à ajouter simultanément une autre enzyme, notamment apte à hydrolyser les hémicelluloses. Ladite étape iii) consistant à poursuivre l'hydrolyse enzymatique est effectuée à une température comprise entre 45°C et 55°C. 10 La teneur en matière sèche des hémicelluloses est comprise entre 20% et 35% en poids. La durée totale (T2) d'hydrolyse enzymatique séquencée de la cellulose et des hémicelluloses est comprise entre quarante-huit heures et soixante-douze heures. 15 Ladite au moins une enzyme est une enzyme apte à hydrolyser la cellulose, notamment une cellulase telle que par exemple Cellic CTecTM plus HtecTM de Novozyme ou CMAXTM de Dyadic. Ladite au moins une enzyme est un mélange d'enzymes 20 aptes à hydrolyser la cellulose et les hémicelluloses telles que par exemple Cellic CTecTM plus HtecTM de Novozyme ou CMAXTM de Dyadic. Ladite autre enzyme est une enzyme apte à hydrolyser les hémicelluloses telle que par exemple Cellic HtecTM de Novozyme 25 ou CMAXTM de Dyadic. Le procédé comporte une étape d'élimination au moins partielle des lignines de la phase contenant les hémicelluloses, préalablement à ladite étape ii) d'ajout des hémicelluloses (C5) dans ledit hydrolysat intermédiaire. 30 Le procédé selon l'invention comprend les étapes successives suivantes consistant à : - (j) déstructurer la matière première végétale lignocellulosique en la mettant en présence d'un mélange contenant de l'acide formique, de l'acide acétique et de l'eau, à une température de réaction comprise entre 95°C et 110°C ; - (jj) puis, à la pression atmosphérique et préalablement à toute action d'hydrolyse, à séparer : * d'une part une phase solide, constituée essentiellement de ladite cellulose, constituant un premier cosubstrat, apte à être ensuite hydrolysé; et * d'autre part, une phase liquide, contenant notamment en solution de l'eau, l'acide formique, l'acide acétique, les lignines, et les hémicelluloses, constituant un deuxième cosubstrat apte à être ensuite hydrolysé après séparation des acides et des lignines. Pour la production de bioéthanol, le procédé comporte une étape supplémentaire de fermentation alcoolique de l'hydrolysat final. REVENDICATIONS1. Procédé de production d'un produit, à partir d'une matière première végétale lignocellulosique, (MPVL) comportant des étapes : - a) de prétraitement de la matière première végétale lignocellulosique pour séparer la cellulose (C6), les hémicelluloses (C5) et les lignines contenues dans cette matière première végétale lignocellulosique, le prétraitement comprenant les étapes successives consistant à déstructurer la matière première végétale lignocellulosique puis, à séparer d'une part la cellulose (C6) apte à être ensuite hydrolysée (et fermentée pour la production de bioéthanol) et, d'autre part, les hémicelluloses (oligosaccharides C5) aptes à être ensuite hydrolysées; - b) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose (C6) ; - c) d'hydrolyse enzymatique des hémicelluloses (C5); caractérisé en ce que l'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses est réalisée de manière séquencée selon les étapes successives suivantes consistant à : - - i) commencer l'hydrolyse enzymatique de la cellulose (C6) au moyen d'au moins une enzyme (cellulase) pendant une première durée (T1) en vue de l'obtention d'un hydrolysat intermédiaire ; - - ii) ajouter des hémicelluloses (C5) dans ledit hydrolysat intermédiaire ; - - iii) poursuivre l'hydrolyse enzymatique du mélange jusqu'à l'obtention d'un hydrolysat final à l'issue d'une durée totale (T2) d'hydrolyse enzymatique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape i) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose consiste à : il ) introduire dans un réacteur ladite au moins une première enzyme ;i2) ajouter une première partie de la cellulose jusqu'à l'obtention d'un mélange dont la teneur en matière sèche (MS) est comprise entre 10% et 15% en poids ; i3) laisser hydrolyser le mélange pendant une durée comprise entre six heures et quinze heures ; i4) ajouter la partie restante de la cellulose en plusieurs fois de manière à obtenir une teneur finale en matière sèche (MS) comprise entre 20% et 25% en poids. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première duré (T1) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose est comprise entre vingt heures et quarante heures. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première étape i) d'hydrolyse enzymatique de la cellulose est effectuée à une température comprise entre 45°C et 55°C. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en matière sèche de la cellulose est comprise entre 10% et 25%. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape ii) d'ajout des hémicelluloses est réalisée en une seule fois, après introduction de la totalité de la cellulose. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape ii) consiste à ajouter simultanément au moins une autre enzyme. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape iii) consistant à poursuivre l'hydrolyse enzymatique est effectuée à une température comprise entre 45°C et 55°C. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en matière sèche des hémicelluloses est comprise entre 20% et 35% en poids. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite durée totale (T2) d'hydrolyse enzymatique est comprise entre quarante huit heures et soixante douze heures. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme est une enzyme d'hydrolyse de la cellulose. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 5 que ladite au moins une enzyme est un mélange d'enzymes aptes à hydrolyser la cellulose et les hémicelluloses. 13. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite autre enzyme est une enzyme apte à hydrolyser les hémicelluloses. 10 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'élimination au moins partielle des lignines de la phase contenant les hémicelluloses, préalablement à ladite étape ii) d'ajout des hémicelluloses (C5) dans ledit hydrolysat intermédiaire. 15 15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes consistant à : - (j) déstructurer la matière première végétale lignocellulosique en la mettant en présence d'un mélange contenant de l'acide formique et de l'eau, à une 20 température de réaction comprise entre 95°C et 110°C ; - (jj) puis, à la pression atmosphérique et préalablement à toute action d'hydrolyse, à séparer : * d'une part une phase solide, constituée essentiellement de ladite cellulose, constituant un premier_cosubstrat, 25 apte à être ensuite hydrolysé; et * d'autre part, une phase liquide, contenant notamment en solution de l'eau, l'acide formique, l'acide acétique, les lignines, et les hémicelluloses, constituant un deuxième cosubstrat apte à être ensuite hydrolysé, après séparation 30 des acides et des lignines. 16. Procédé selon la revendication 1, pour la production de bioéthanol, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de fermentation alcoolique (co-fermentation) de l'hydrolysat final.