FR 3014103 A1 20150605 FR 1361823 A 20131129 Composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement de leishmanioses, peptides immunogènes et procédé d'obtention L'invention a pour objet une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement de leishmanioses chez les mammifères. Elle est également relative à des peptides immunogènes et à leur procédé de production. Les grandes endémies parasitaires sont, de très loin, 10 les causes les plus importantes de morbidité et de mortalité non seulement pour l'espèce humaine, mais pour toutes les autres espèces animales tant domestiques que sauvages. Les leishmanioses sont parmi les plus graves infections parasitaires affectant l'Homme dans le monde. Trois cents 15 cinquante millions d'individus sont exposés dans quatre-vingt-huit pays répartis sur quatre des cinq continents et seize millions d'entre eux sont porteurs du parasite. Elles sont responsables d'un large spectre de manifestations cliniques :cutanées, muco-cutanées et viscérales. 20 La leishmaniose viscérale (LV) est causée par les parasites du complexe Leishmania donovani (L. infantum, L. chagasi et L. donovani) qui sont des parasites intracellulaires du macrophage. Contrairement aux autres espèces de Leishmania causant les formes tégumentaires de la 25 maladie (L. major, L. brasiliensis, ...) qui affectent le derme ou les muqueuses, les leishmanies du complexe donovani présentent une capacité à se disséminer à l'ensemble des organes profonds (foie, rate, ganglions et moelle osseuse) où elles se multiplient. Les patients atteints de LV présentent 30 alors un tableau clinique associant une fièvre modérée mais persistante, une hépatosplénomégalie et une pancytopénie conduisant généralement au décès si aucun traitement spécifique n'est initié suffisamment rapidement ou en cas d'échec au traitement. Même si la LV à L. infantum/chagasi est un problème important en Europe du Sud avec l'extension de la pandémie du SIDA et l'apparition d'un nombre croissant de co-infections Leishmania/HIV, elle est loin d'être contrôlée et devient très préoccupante en termes de problème de santé publique dans les pays d'Amérique du Sud. Dans d'autres parties du monde, notamment dans les zones d'endémie à L. donovani, des épidémies meurtrières ont fait des centaines de milliers de victimes ces dernières décennies, particulièrement au Soudan et en Inde. De plus, la situation devient critique en Inde avec l'émergence de souches résistantes aux dérivés pentavalents de l'antimoine (médicaments de première intention). L'incidence annuelle des leishmanioses humaines est estimée entre 2 et 2,5 millions de nouveaux cas, parmi lesquels plus de 500 000 sont atteints de leishmaniose viscérale et 1,5 à 2 millions de leishmanioses tégumentaires 20 dont certaines sont très défigurantes et mutilantes comme les leishmanioses muco-cutanées (LMC). Ceci a pour conséquence une morbidité globale supérieure à deux millions de DALYs (pour Disability Adjusted Life Years) et le décès de près de soixante mille personnes chaque année. Ces maladies 25 constituent encore aujourd'hui un véritable problème de santé publique en Amérique latine, en Asie, en Afrique, au proche et Moyen Orient et dans le sud de l'Europe. La leishmaniose viscérale touche également la population canine, qui constitue un réservoir de parasites 30 approvisionnant de manière continue le cycle de transmission. Elle est due à L. infantum/chagasi, espèce responsable d'une zoonose des canidés domestiques et sauvages largement répandue dans le monde. Elle affecte des millions de chiens en Europe, Asie, Afrique du Nord et Amérique du Sud. Les chiens symptomatiques, mais aussi asymptomatiques, constituent une source de parasites pour la transmission de la LV chez l'Homme. Les mesures de prévention contre les leishmanioses sont nombreuses. Pendant longtemps, elles ont été fondées sur la lutte contre l'insecte vecteur et l'objectif principal visait à contrôler leur multiplication par l'utilisation d'insecticides et à éviter le contact entre le vecteur (phlébotome) et leurs hôtes (chien, Homme, ...). Le contrôle des leishmanioses, une fois diagnostiquées, passe aussi par les traitements chimiothérapeutiques. Ces derniers sont malheureusement mis en péril par un arsenal thérapeutique ancien et très limité, des traitements longs, toxiques et onéreux s'accompagnant de nombreux cas de rechute et par l'émergence des phénomènes de chimiorésistance. En l'absence de traitements efficaces et devant l'ampleur du problème, il devient donc nécessaire de mettre à la disposition des populations les plus gravement touchées des moyens de prévention applicables à grande échelle, dont le plus adapté serait la vaccination. Plusieurs arguments sont en faveur de la faisabilité d'un vaccin chez l'Homme. Cependant, chez l'Homme, aucun vaccin n'est 25 actuellement disponible contre les leishmanioses. En fait, seule une approche pragmatique utilisant des parasites entiers tués a été rendue possible à ce jour. Historiquement, les vaccins de première génération, basés sur l'utilisation de parasites entiers atténués ou 30 morts (notamment autoclavés) combinés ou non à des adjuvants, avaient pour but de protéger principalement contre les leishmanioses cutanées en essayant de reproduire les niveaux de protection obtenus avec les parasites vivants. Cependant, les nombreux essais cliniques menés sur des milliers d'individus en Amérique du sud, mais aussi en Iran, ont donné des résultats plus que mitigés, voire décevants. De nombreux vaccins à sous-unités constituées de 5 protéines natives purifiées (vaccin de première génération) ou recombinantes (vaccin de seconde génération) ont ainsi été testés Certains candidats vaccins ont conféré un bon niveau de protection à l'encontre d'une infection expérimentale chez la souris. 10 Plus récemment, les vaccins ADN, dit de troisième génération, ont été développés avec les séquences nucléotidiques codant pour les protéines utilisées dans les vaccins de seconde génération (Références 1, 2 et 3). Enfin, d'autres pistes vaccinales ont été explorées 15 avec succès chez la souris comme les vaccins à base d'antigènes présents dans la salive du phlébotome (Références 4 et 5), qui ont permis d'obtenir une relative résistance à l'infection expérimentale à Leishmania major. Toutefois, à ce jour, peu de candidats vaccins ont 20 dépassé le stade expérimental (souris, hamsters) en raison de la difficulté à développer un modèle animal approprié reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine et à mettre en oeuvre des essais cliniques chez des hôtes naturels de l'infection qui nécessitent des cohortes importantes, des 25 infrastructures lourdes et qui peuvent prendre des années avant de donner un résultat définitif. De plus, il est difficile d'extrapoler directement des résultats obtenus chez la souris à des hôtes naturels de l'infection, tels que le chien ou l'Homme. Enfin, les réponses immunitaires 30 protectrices contrôlant une infection d'épreuve peuvent ne pas refléter celles requises pour prévenir les leishmanioses en zones endémiques. Deux candidats vaccinaux sont en cours de développement clinique : - Le Leish 111 f MPL SE du Infections Disease Research Institute (IRDI) à Seattle est un vaccin chimérique appelé 5 LEISH-F1 constitué de 3 protéines recombinantes en fusion (TSA-LmSTI1-LeIF) formulées avec un lipide monophosphorylé et du squalène dans une émulsion stable (MPL-SE). Toutefois, si la protection contre la leishmaniose cutanée semble en bonne voie, des études ont montré que Leish-111 f MPL-SE ne protège 10 pas des chiens exposés à une infection naturelle à L. infantum. - Le HASPB + KMP-11 de l'Université de York (Grande Bretagne) sur lequel les résultats des essais cliniques ne sont pas connus à ce jour. 15 Chez le Chien, il existe une solution efficace avec CaniLeish®, qui est un produit composé d'antigènes d'excrétion sécrétion (AES) de promastigotes de L. infantum (basé sur WO 9426899 et ses extensions, au nom de l'IRD). La leishmaniose canine voit ainsi ses mesures préventives 20 profondément modifiées et complétées. La vaccination contrôle non seulement le développement de la maladie, mais diminue aussi significativement la charge parasitaire chez le chien et contribue ainsi à l'interruption du cycle de transmission de la LV chez le phlébotome, le 25 chien et l'Homme. Toutefois les rendements de production des AES ne permettent pas une production à l'échelle industrielle d'un vaccin humain. Dans ce contexte, il existe à ce jour un besoin urgent 30 d'investir dans de nouvelles pistes proposant une alternative plus efficace aux vaccins existants, afin de permettre la vaccination prophylactique et/ou thérapeutique de patients contre les leishmanies, notamment les patients résistants aux thérapies existantes, et de fournir une molécule vaccinale reproductible, thermostable et facile à produire à bas prix dans les zones d'endémie. La solution apportée par l'invention s'appuie sur les 5 travaux réalisés par certains des co-inventeurs sur l'immunogène majeur des antigènes naturellement excrétés sécrétés (AES). Ces travaux, concernant la caractérisation biochimique, immunologique et plus récemment moléculaire des AES de 10 L. amazonensis ou L. infantum, ont démontré clairement qu'ils renferment des immunogènes majeurs constitués par des protéines appelées PSA (pour « Promastigote Surface Antigen »). Dans le cadre de l'étude de ces protéines comme 15 candidats vaccinaux, une nouvelle stratégie de production a été développée par les inventeurs, permettant de disposer de produits excrétés/sécrétés fortement immunogènes et de les obtenir sous forme native,recombinante, avec des rendements élevés, rendant ainsi possible leur exploitation à échelle 20 industrielle. De plus, il s'est avéré que des parties de telles molécules présentaient de manière inattendue également un grand intérêt pour les applications prophylactiques et thérapeutiques visées. 25 L'invention a donc pour but l'utilisation, en tant que molécule vaccinale, d'une PSA, telle qu'obtenue en mettant en oeuvre la dite stratégie et/ou l'utilisation d'une partie de cette molécule, et leurs applications prophylactiques et/ou immunothérapeutiques chez les mammifères. 30 Elle vise également une méthode de production en milieu complètement défini d'une PSA, assurant son obtention de manière reproductible dépourvue de toutes protéines étrangères et à un coût permettant une exploitation à l'échelle industrielle, ainsi que la production d'une partie de cette PSA. L'invention vise également, en tant que nouvelles molécules, des immunogènes majeurs d'AES, et une partie de ces immunogènes, tels que produits selon le procédé de l'invention. Selon encore un autre aspect, l'invention vise en outre une composition vaccinale à visée préventive et/ou thérapeutique, renfermant une telle molécule immunogène et/ou une partie de cette molécule et les anticorps dirigés contre cette molécule. L'invention vise ainsi l'utilisation, comme molécule vaccinale chez un mammifère, d'une PSA telle qu'issue de leishmanie,ou une partie de cette PSA, désignée ci-après par ES PSAr, possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA se présentant sous forme soluble, native, recombinante. Dans la description et les revendications, - « PSA soluble » désigne une PSA soluble excrétée/secrétée dans le surnageant de culture de 20 leishmanies. - « PSA native » désigne une PSA telle que produite dans un surnageant de culture par une leishmanie, comportant les modifications co-et post traductionnelles d'une PSA telle qu'issue de leishmanie, ou une partie de 25 cette PSA possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA désignée ci-après par ES PSAr se présentant sous forme soluble, native de par sa conformation, recombinante. - « PSA recombinante » désigne une PSA telle qu'exprimée par recombinaison génétique, intégrée au génome 30 des cellules hôtes du système d'expression. - « ES PSAr » désigne de manière générale une PSA de leishmanie, sous forme soluble, native, recombinante ou une partie d'une telle PSA. On rappelle que la séquence d'une PSA comporte un peptide signal impliqué dans les voies de sécrétion situé à l'extrémité de la partie amino-terminale de la molécule, un nombre variable de domaines répétés riches en leucine (motifs LRR, pour « Leucine Rich Repeats ») et une partie carboxyterminale de la molécule riche en proline, thréonine et cystéine (voir Figure 1). L'extrémité de la partie carboxyterminale comporte un signal hydrophobe d'ancrage GPI ou ancre GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol). La PSA possède aussi la particularité d'être présente chez toutes les espèces de leishmanies (tégumentaires et viscérales), ce qui représente un réel avantage en termes de vaccination croisée vis-à-vis des différentes expressions cliniques de la leishmaniose. Selon un mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de la molécule de ES PSAr entière,. L'expression « ES PSAr entière » signifie que la protéine possède les modifications co- et post-traductionnelles de la molécule native, telle que produite par le parasite et n'est pas tronquée. En variante, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr ne comportant pas la totalité des modifications co-et post-traductionnelles. En particulier, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr déglycosylée. Selon une autre variante, l'utilisation selon l'invention comprend une ES PSAr glycosylée. Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr dépourvue de l'ancre GPI de la 30 partie hydrophobe dans l'extrémité C-terminale. Dans une autre variante de réalisation,l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr dépourvue de la partie carboxyterminale. Selon encore un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de la partie C-terminale d'une molécule de PSA ou de ES PSAr(désignée ci-après par C-ter PSA ou C-ter ES PSAr)telle qu'isolée d'une surnageant d'excrétion/sécrétion de culture de leishmaniose.Il s'agit d'une molécule non native, telle que codée par une séquence d'ADN tronquée de PSA ou de ES PSAr De manière avantageuse, l'invention vise l'utilisation comme molécule vacinale d'une ES PSAr telle qu'obtenue à partir de la PSA de L.amazonensis ou d'une leishmanie du complexe donovani, notamment de L.infantum ou de L.donovani,ou du complexe braziliensis et tropica. L'invention vise ainsi notamment l'utilisation d'une ES PSAr de séquence SEQ ID N°1. Cette ES PSAr est obtenue plus particulièrement à partir de la PSA produite par L.amazonensis délétée de son peptide hydrophobe d'ancrage membranaire. En variante, la ES PSAr est plus particulièrement obtenue à partir de la PSA de L.infantum de séquence SEQ ID N°2 ou L.donovani de séquence SEQ ID N°3, ces séquences étant aussi délétées à l'extrémité carboxy-terminale de leur peptide hydrophobe d'ancrage à la membrane. La molécule vaccinale utilisée peut correspondre à une 25 partie de la ES PSAr, en particulier à l'extrémité C-terminale. Une telle molécule présente notamment la séquence SEQ ID N°4. Plus spécifiquement, l'invention vise l'utilisation,comme molécule vaccinale, d'une ES PSAr sous 30 forme soluble, telle que produite par insertion d'un vecteur comprenant le gène codant pour la ES PSAr dans un système d'expression recombinant eucaryote de leishmanie. De préférence, le système d'expression recombinant utilisé est celui d'une leishmanie non pathogène chez les mammifères. L'invention vise tout spécialement l'utilisation, comme molécule vaccinale, de la ES PSAr sous forme soluble, telle que produite par insertion du gène codant pour la ES PSAr, dans un système d'expression recombinant eucaryote REV13 constitué par Leishmania tarentolae ou en variante du gène codant pour une partie de ES PSAr, en particulier une partie dépourvue de sa partie hydrophobe comme indiqué plus haut. Avantageusement, ce système permet l'intégration du vecteur d'expression contenant le gène codant pour ES PSAr dans le locus 18S rRNA du chromosome de Leishmania tarentolae qui possède un taux de transcription très élevé et ainsi l'obtention d'une quantité abondante de la PSA recombinante. La protéine peut être produite avec tout ou partie des modifications co- et post-traductionnelles des protéines des leishmanies. L'invention vise également un procédé de production de 20 ES PSAr sous forme soluble, comportant les caractéristiques définies ci-dessus. Ainsi, ce procédé comprend l'intégration d'un vecteur d'expression comportant le gène codant pour la ES PSAr dans un système recombinant eucaryote non pathogène pour l'Homme 25 ou l'animal. De manière avantageuse, la transfection par le vecteur est réalisée dans le locus d'un chromosome d'une leishmanie non pathogène possédant un taux de transcription élevé. Une leishmanie particulièrement appropriée est constituée 30 par L. tarentolae, au stade promastigote. L'insertion dans le locus 18 s rRNA du chromosome dont le taux de transcription est élevé permet d'obtenir des rendements de production élevés. Le vecteur d'expression utilisé est avantageusement un plasmide. Comme illustré dans les exemples, pF4X1.4 est particulièrement approprié pour la mise en oeuvre de l'invention. Les séquences nécessaires aux modifications post-traductionnelles chez L. tarentolae sont introduites de part et d'autre de la cassette de clonage. La protéine de ES PSAr ainsi produite est une protéine soluble dans les surnageants de culture des leishmanies, possédant les propriétés de la protéine native, en particulier une ou plusieurs des modifications co- et posttraductionnelles des protéines des leishmanies, comme l'acétylation, l'hydroxylation, les ponts disulfure , la glycylation, la glycosylation, la phosphorylation, l'ancrage lipidique et autres. Ainsi, la ES PSAr déglycosylée, dans une variante de l'invention, est produite à partir de la culture des formes promastigotes de L.tarentolae en présence de tunicamicyne. La tunicamycine est un antibiotique qui inhibe l'enzyme GlcNAc phosphotransférase (GPT). Elle inhibe ainsi la N- glycosylation nécessaire à la fixation des précurseurs des Nhétérosides sur le dolichol diphosphate (voir Figure 3). La culture des transgènes de promastigotes de L. tarentolae est réalisée avec avantage dans le milieu de culture totalement défini tel que décrit dans la demande internationale précitée au nom de l'IRD et ses extensions, ce qui permet de récupérer la PSA produite sans contaminants sériques et cellulaires apportés par les milieux de culture classiquement utilisés,. être réalisée par exemple gel. Une étape de purification peut 30 par chromatograhie d'affinité sur La production de la partie avantageusement réalisée dans C-ter de la PSA est un système bactérien recombinant, suivie de préférence d'une étape de purification. Le vecteur d'expression utilisé, qui comprend l'ADNc du gène codant pour la partie carboxy-terminale de la PSA est en 5 particulier un plasmide. Une construction de plasmide convenant pour la mise en oeuvre de l'invention comprend les éléments pour produire une protéine recombinante avec un tag 6-Histidine en position NH2-terminale et un site de clivage du tag. 10 Les colonies produisant les protéines recombinantes recherchées sont sélectionnées et après amplification en culture sont avantageusement purifiées. La protéine recombinante, sous forme native, avantageusement avec une ou plusieurs des modifications co- 15 et post-traductionnelles décrites ci-dessus, constitue un produit nouveau et à ce titre entre dans le champ de l'invention. L'invention vise en particulier une ES PSAr glycosylée ou en variante une ES PSAr déglycosylée. 20 Elle vise également une ES PSAr délétée, en particulier dépourvue de l'ancre GPI et donc du peptide hydrophobe en position C-terminale , ce qui permet d'éviter les phénomènes d'agrégation et la formation de corps d'inclusion lors de la production de la ES PSAr. 25 De même, l'invention vise en tant que nouveau produit, la molécule constituée par la partie C-ter PSA de la protéine telle que définie ci-dessus. Les méthodes de production décrites ci-dessus sont illustrées dans les exemples en partant de la ES PSAr de 30 L.amazonensis et avec C-ter PSA de L.amazonensis. Comme le montrent également les exemples, la protéine ES PSAr ainsi que sa partie carboxy-terminale (C-ter PSA), en combinaison avec un adjuvant, confèrent chez le chien un très fort niveau de protection à l'encontre d'une infection expérimentale à L. infantum. Cette protection s'accompagne de : - la production d'anticorps spécifiques principalement 5 d'isotype IgG2 qui apparaissent jouer un rôle non négligeable dans la protection (effets leishmanicide et neutralisant); - la polarisation de la réponse à médiation cellulaire vers une voie de type Thl révélé par une augmentation de la production par les lymphocytes T d'IFN-y, conduisant à 10 l'activation par la voie classique des macrophages, caractérisée par la synthèse accrue de NO et donc l'élimination des leishmanies intracellulaires (activité leishmanicide des macrophages canins). Les propriétés remarquables de la ES PSAr ainsi que de 15 sa partie C-ter sont aussi révélées par : - l'effet inhibiteur d'un hyperimmunsérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la C-ter PSA sur la croissance des formes promastigotes de L. infantum ; - l'effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal 20 monospécifique anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA (non native)sur la capacité des promastigotes à infecter ex vivo les macrophages, - l'effet « facteur de croissance » de la ES PSAr sur la prolifération des formes promastigotes. 25 Les exemples montrent également une immuno-réaction protectrice et induite sur les cellules humaines, ce qui conforte les résultats obtenus chez le chien et permet d'envisager le développement d'un vaccin à visée humaine.Cette immunoréactivité s'accompagne de la production 30 de cytokines de type TH1 et d'une réponse T-cytotoxique mise en évidence par la production du granzyme B. L'invention vise donc également une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement des leishmanioses chez l'Homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend : . une protéine ES PSAr, sous forme soluble, de leishmanie et/ou une ES PSAr tronquée, en particuler dépouvue de l'ancre 5 GPI,et/ou la partie peptidique C-ter de la PSA telle qu'issue de leishmanie, ou de la ES PSAr et un ou plusieurs adjuvants et/ou un ou plusieurs immunomodulateurs. L'adjuvant est avantageusement choisi parmi ceux 10 capables d'induire une réponse à médiation cellulaire conduisant à l'élimination du parasite. Des adjuvants appropriés comprennent ceux des classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les 15 polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly électrolytes. Des immunomodulateurs appropriés comprennent les protéines de salive de phlébotomes, les cytokines et les protéines de choc thermique ou HSP (pour Heat Shock Protein). 20 La composition vaccinale de l'invention se présente en particulier sous une forme permettant l'administration par différentes voies, comme la voie sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, parentérale, orale, endonasale ou mucosale. La composition vaccinale définie ci-dessus est tout 25 spécialement appropriée pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin, d'un réactif de diagnostic in vivo ou in vitro pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'une activation de l'immunité à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes de type Thl et/ou de l'immunité 30 humorale effectrice. Cette composition convient pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère du passage d'un état immunitaire de type Th2 vers un état immunitaire de type Thl, ou encore pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'anticorps spécifiques d'isotype IgG2 neutralisants et/ou lytiques qui reconnaissent les déterminants antigéniques des parasites. De tels anticorps et les immunsérums les renfermant font également partie de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, avec référence aux Figures 1 à 18, qui représentent, respectivement, - Figure 1 : une représentation schématique de la protéine PSA de Leishmania, - Figure 2 : l'analyse polypeptidique de la ES PSAr purifiée en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices, Figure 3 : profils électrophorétiques obtenus après coloration des protéines (A) et des sucres (B) des ES PSAr produites en présence (piste 3) ou en l'absence (piste 2) de tunicamycine, - Figure 4 : l'analyse polypeptidique de la C-ter PSA purifiée en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices, - Figure 5 : Analyse électrophorétique des glycoprotéines solubles ES PSAr déglycosylées (1 et 3); ES PSAr native (2 et 4) , Figure 6 : ELISA optique (DO), Figure 7 : ELISA optique (DO), Figure 8 : ELISA optique (DO), IgG2 versus AES exprimé en densité IgG2 versus ES PSAr exprimé en densité IgG2 versus C-ter PSA exprimé en densité - Figure 9 : Effet des sérums de chiens vaccinés (CaniLeish®, ES PSAr et C-ter PSA) sur la viabilité et la prolifération des promastigotes de L.infantum,comparativement à celles des sérums de chiens placébos : TO : sérums pré-immuns ; T5 : sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin, Figure 10 : Effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA (utilisés à différentes dilutions (1/10, 1/50 et 1/100), Figure 11: Effet d'un sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la partie C-ter PSA (partie carboxy -terminale de la PSA) utilié à différentes dilutions (1/25 et 1/50) sur la croissance des formes promastigotes de 15 L. infantum, Figure 12 : Evaluation, comparée à un témoin, du nombre de promastigotes/mL avec des concentrations en ES PSAr de 17,8pM et de 0,22pM, à différents temps d'addition, Figure 13 : Activités leishmanicides des macrophages 20 canins du groupe placébo versus le groupe vacciné avant (TO), un mois après l'administration de 2 doses de vaccin (T3) et deux mois après l'injection de 3 doses (T5), Figure 14: Détermination des taux d'interféron (IFN)-y présents dans les surnageants de co-culture des cellules 25 provenant de chiens placébos et de chiens vaccinés (ES PSAr ou C-ter PSA). TO: sérums pré-immuns ; T5: sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin, Figure 15 : Evaluation des taux d'oxyde nitrique (NO) produits dans les surnageants de co-culture des cellules 30 provenant de chiens placébos et de chiens vaccinés (ES PSAr ou C-ter PSA). TO : sérums pré-immuns ; T5 : sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin, Figure 16 : Détermination des pourcentages de chiens parasitologiquement positifs dans les groupes de chiens placébos et les groupes de chiens vaccinés avec la ES PSAr, Figure 17 : Détermination des pourcentages de chiens 5 parasitologiquement positifs dans les groupes de chiens placébos et les groupes de chiens vaccinés avec la C-ter PSA, Figure 18 : Détermination des charges parasitaires par RT-PCR chez les chiens des groupes placébos et vaccinés. 10 Exemple 1 : Obtention, production et purification des protéines recombinantes 1. Clonage et séquençage des gènes de PSA 15 Un hyperimmunsérum généré chez le lapin et dirigé conte les antigènes d'excrétion sécrétion (AES) de promastigote de L. amazonensis ainsi qu'un anticorps monoclonal (E2) dirigé spécifiquement contre l'immunogène majeur des AES parasitaires ont été utilisés pour cribler une banque d'ADNc 20 de formes promastigotes et amastigotes (produite en 1ZAPII) de L. amazonensis. L'analyse des séquences des inserts contenus dans les plasmides recombinants a permis d'identifier principalement des clones d'ADNc, situés sélectivement sur le chromosome 12 25 et codant des protéines appartenant à la famille des PSA. La séquence SEQ ID N°1 est issue du gène LaPSA38 codant pour la protéine entière de 45 kDa (372 aa) qui correspond à WO 2005/051989 au nom de l'IRD et la séquence SEQ ID N°4 est issue du gène tronqué LaPSA19 qui code la partie carboxy- 30 terminale de la LaPSA38. Il s'agit de la partie C-ter PSA, de 19kDa (119 aa). La séquence SEQ ID N°2 est issue du gène LiJ11. Le gène LiJ11 a été obtenu en utilisant la séquence C-ter PSA (sonde radiomarquée) pour cribler une banque cosmidique d'ADN génomique de promastigotes de L. infantum , ce qui a permis de caractériser une PSA homologue chez Leishmania infantum (PSA IJ11) de 463 aa (50 kDa). La séquence protéique de la PSAIJ11 de L. infantum présente une forte homologie de séquence avec celle de LaPSA38s de L. amazonensis dans ses parties amino- (73,8%) et carboxy- (77,5%) terminales avec un nombre de motifs répétés riches en leucine plus élevé (9 contre 6) (dans la demande internationale WO 2005/051989 précitée, ledit gène codant pour la protéine non recombinante correspond à SEQ ID N°11 et la protéine codée à SEQ ID N°12). 2. Production de LaES PSAr délétée de l'ancre GPI dans un système recombinant eucaryote et purification Cette étape est réalisée avec un système d'expression de gène chez L. tarentolae commercialisé par Jena Bioscience : « Leishmania tarentolae Gene Expression Starter Kit ». Ce système d'expression utilise le parasite lui-même pour produire sa propre protéine. Ce dernier présente de nombreux avantages pour la production de protéines à visée thérapeutique : - Leishmania tarentolae est un parasite de lézard non pathogène pour l'Homme. Sa manipulation ne nécessite pas de mesures de sécurité contraignantes ; - L. tarentolae se cultive facilement en suspension cellulaire dans des milieux de culture complètement définis (pas de contamination avec d'autres protéines étrangères), à 26°C, avec un bon rendement (de l'ordre de 108 cellules par ml, temps de doublement de population de 4 h.) ; - Ce système d'expression permet de produire des protéines natives de leishmanie. Le parasite contient en effet la machinerie nécessaire pour l'expression de protéines eucaryotes natives ; - Ainsi, la protéine produite possède toutes les modifications post-traductionnelles des protéines de leishmanies telles que la glycosylation et la formation de ponts disulfures ; - Le vecteur utilisé dans ce système permet de réaliser le clonage du gène d'intérêt en système bactérien, puis de faire l'expression de la protéine chez Leishmania tarentolae ; - Il permet l'intégration de la cassette d'expression dans le locus 18S rRNA du chromosome qui possède un taux de transcription très élevé et ainsi l'obtention stable d'une quantité abondante de protéine recombinante. Le gène LaPSA38s a été amplifié, puis modifié par mutagenèse dirigée pour permettre la production d'une protéine avec un tag poly-histidine (5 histidines) en partie carboxy20 terminale, et supprimer le site d'ancrage à la membrane. Le clonage directionnel du gène de la ES PSAr a été réalisé dans le vecteur d'expression pF4X1.4sat. Les plasmides ont été spécifiquement construits pour permettre la production de la protéine recombinante dans le surnageant de 25 milieu de culture à partir duquel elle peut être facilement isolée. Cette construction a été transfectée dans Leishmania tarentolae où elle a été intégrée au génome du parasite, au stade promastigote, par recombinaison homologue, lui conférant par la même occasion une résistance à la 30 nourséothricine (NTC), permettant de sélectionner les individus recombinants. La surexpression est effectuée grâce à l'intégration du gène au sein du locus de l'ARNr 18S, en tirant parti du haut niveau de transcription de l'ARN polymérase I de l'hôte. Ce plasmide contient également autour de la cassette de clonage les séquences nécessaires aux modifications co- et post-traductionnelles chez Leishmania tarentolae, permettant d'obtenir une protéine sous sa forme native. Les transgènes promastigotes de L. tarentolae ont été adaptés dans le milieu complètement défini développé par l'IRD (demande WO précitée et ses extensions) de façon à purifier facilement la protéine parasitaire à partir des surnageants de culture et à la produire en l'absence de toute protéine étrangère (molécules d'origine sérique et cellulaire). La purification à partir des surnageants de milieu de culture de la ES PSAr ainsi produite a été réalisée par 15 chromatographie d'affinité sur gel Agarose-Nickel. Dans ces conditions expérimentales, seule la LaPSA38snr de L. amazonensis a été produite avec un rendement de production de 0,2 à 0,3 mg de protéine purifiée par litre de culture, suffisant pour permettre son utilisation dans le 20 développement de nouvelles méthodes analytiques et son évaluation comme candidat vaccin. Elle correspond à un poids moléculaire apparent de 45 kDa et un poids moléculaire théorique de 37kDa. Elle présente la séquence SEQ ID N°1 visée plus haut.Cette protéine comporte 349 acides aminés ; 25 son pI est de 5,07. L'analyse polypeptidique de la ES PSAr purifiée en gel SDSPAGE (conditions réductrices et non réductrices) est donnée sur la Figure 2. Les profils électrophorétiques obtenus après coloration des 30 protéines (A) et des sucres (B) des ES PSAr produites en présence (piste 3) ou en l'absence (piste 2) de tunicamycine,sont donnés sur la figure 3. 3 - Production dans un système bactérien recombinant et purification de la C-ter PSA Les ADNc du gène LaPSA19s (C-ter PSA) ont été insérés dans le plasmide pQE-31. Les plasmides ont été spécifiquement construits pour permettre la production d'une protéine recombinante possédant un 6-His-tag en position aminoterminale et un site de clivage du tag. La transformation avec le plamide pQE-31-6(His)-COOH LaPSA19s a été effectuée dans des cellules bactériennes E. cou M15 rendues chimiocompétentes. Les colonies recombinantes ont été sélectionnées en vue de produire les protéines recombinantes. Le clone le plus producteur a été amplifié en culture. La protéine correspondante C-ter PSA a été purifiée sur gel Agarose-Nickel. Un rendement d'environ 1 mg de protéine recombinante par litre de culture a été obtenu. Elle comporte 119 acides aminés et présente un poids moléculaire de 18 kDa en conditions réductrices et sous forme dimère, en conditions non réductrices, un poids moléculaire de 36 kDa (voir Figure 4). Les résultats de l'analyse électrophorétique des glycoprotéines solubles sont rapportées sur la Figure 5 : ES PSAr déglycosylées (1 et 3) et ES PSAr native (2 et 4) Exemple 2: Réponses immunoprotectrices induites par la ES 25 PSAr et la C-ter PSA chez le chien Cet essai clinique rapporté ci-après vise à comparer dans un même essai de vaccination chez des chiens « Beagle » les effets protecteurs des deux protéines recombinantes ES PSAr et C-ter PSA sur des groupes de 9 chiens et de 5 chiens 30 respectivement. Un groupe placébo de 5 chiens constitue le groupe contrôle non vacciné. Une infection d'épreuve expérimentale est réalisée 2 mois après le protocole d'immunisation. Des suivis cliniques et parasitologiques sont menés tous les 2 mois jusqu'à 8 mois après l'infection expérimentale. Le QA21 est utilisé à 60 pg par dose de vaccin, quantité d'adjuvant équivalente à celle contenue dans le vaccin CaniLeish. Utilisé seul et à cette concentration, il n'a aucun effet significatif sur le système immunitaire du chien et de la souris. 1 - PROTOCOLE D'IMMUNISATION L'étude a été menée en double aveugle, randomisée et contrôlée. Elle a été approuvée par le comité d'éthique de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon. Le protocole d'immunisation comprend 3 injections par la voie 15 sous-cutanée réalisée à un mois d'intervalle. Trois groupes de chiens ont été sélectionnés comme suit : *Groupe 1 : Placébo (Injection d'eau physiologique pour préparations injectables) ; 20 *Groupe 2 : Injection de 25pg de la LaES PSAr adjuvés avec 60 pg de QA-21 ; *Groupe 3 : Injection de 25pg de C-ter PSA (protéine de séquence SEQ ID N°4) adjuvés avec 60 pg de QA-21. 25 RANDOMISATION Vaccinés Vaccinés Témoins Total ES PSAr C-ter PSA Nombre de Chiens 9 5 5 19 Nombre de femelles 5 2 3 10 Nombre de mâles 4 3 2 9 Moyenne d' Age (an) 2, 69 2, 93 2,87 2,89 Ecart type d'Age (an) 1,12 1,10 1,14 1,08 Moyenne de Poids (Kg) 15,2 15,4 14,8 14,9 Ecart type de Poids (Kg) 2,5 2,2 2,4 2,3 2 - PROTOCOLE DES PRELEVEMENTS Différents prélèvements avant le challenge infectieux ont été réalisés à : TO : avant toute immunisation T3 : un mois après l'administration de deux doses vaccinales T5 : deux mois après l'administration de trois doses du vaccin. 3 - SUIVIS CLINIQUES : Ces suivis sont effectués - à la réception des animaux - 1 fois/mois pendant toute l'étude - quotidiennement pendant 5 jours après le challenge 15 expérimental 4 -SUIVIS IMMUNOLOGIQUES ET PARASITOLOGIQUES: Immunologiques : - sérologie spécifique à TO, T3 et T5 20 - effet leishmanicide à TO et T5 - dosage de l'oxyde nitrique (NO) et détermination de la production d'IFN-y dans les surnageants de co-culture à TO et à T5. Parasitologiques : 25 Une infection d'épreuve expérimentale (injection de 109 promastigotes métacycliques de L. infantum par la voie intraveineuse) a été réalisée 2 mois après le protocole d'immunisation. Des suivis cliniques et parasitologiques ont été menés tous les 2 mois pendant 8 mois après l'infection 30 expérimentale. Des PCR et une mise en culture d'échantillons de moelles osseuses à TO, 2 mois post-challenge (T6), 4 mois post-challenge (T7), et 6 mois post-challenge (T8) ont été réalisées pour mettre en évidence la présence du parasite ou de son ADN. 5 - RESULTATS 5.1 - Réponses à médiation humorale a- Analyse de la réponse anticorps spécifique d'isotype IgG2 Des techniques ELISA ont été mises en oeuvre pour analyser les réponses anticorps chez les chiens de l'étude. Les titres moyens anticorps IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr et anti-Cter PSA ont été comparés par la technique ELISA entre chiens placébos et chiens vaccinés avant immunisation (TO) et à différents temps post-immunisation - un mois après l'administration de deux doses vaccinales (T3) et/ou - deux mois après trois injections (T5). Tous les chiens de l'étude se sont révélés sérologiquement négatifs à TO (figures 5, 6 et 7). Tous les chiens appartenant au groupe placébo présentent des titres anticorps d'isotype IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA inférieurs au cut off correspondant et ceci quelle que soit la période de prélèvement (T3 et T5) (Figures 6,7 et 8). Les réponses anticorps IgG anti-Leishmania déterminées sont négatives chez tous les chiens de l'étude avant immunisation ainsi que chez tous les chiens du groupe placébo à T5. Seule une production significativement élevée d'anticorps d'isotype IgG2 spécifiquement dirigés contre les AES (figure 6), la ES PSAr (figure 7) et la C-ter PSA (figure 8) est mise en évidence chez tous les chiens vaccinés dès le premier mois après l'administration de deux doses vaccinales (T3) et deux mois après l'administration de trois doses du vaccin (T5). Les moyennes des titres anticorps IgG2 sont 5 significativement plus élevées chez les chiens vaccinés que chez les chiens placébos (P La prolifération des parasites non traités était très semblable à celle des parasites traités avec des sérums de chiens du groupe placebo quelle que soit la dilution du sérum utilisée. Moins de 10% de réduction de la croissance était observée. En revanche, les sérums de chiens vaccinés n'ont aucun effet sur la différenciation des promastigotes en amastigotes). b2- Effet neutralisant de sérums de lapin polyclonaux 20 monospécifiques anti-ES PSAr et anti-Cter PSA Des formes promatigotes ont été incubées en présence de différentes dilutions (1/10, 1/50 et 1/100) de sérums de lapin sain ou préalablement immunisé avec la ES PSAr (ou la 25 C-ter PSA puis lavées trois fois par centrifugation pour éliminer l'excédent de sérum. Leurs capacités à infecter les macrophages dérivés de monocytes canins ont été étudiées en déterminant le pourcentage de réduction de l'Indexe Parasitaire (IP) après 72 h d'intéraction. 30 Comme le montre la Figure 10, les promastigotes traités avec du sérum de lapin sain se sont révélés être plus infectieux vis-à-vis des macrophages que ceux non traités. En revanche, l'exposition des parasites aux sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-ES PSAr ou anti-C-ter PSA inhibe leur capacité à infecter ex vivo les macrophages dérivés de monocytes canins. L'effet du sérum anti-C-ter PSA à la dilution 1/100 est plus prononcé que celui du sérum anti-ES PSAr à la même dilution (Figure 10). L'effet du sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la partie C-ter PSA a aussi été évalué sur la croissance in vitro des formes promastigotes de L. infantum. Comme le montre la Figure 11, une inhibition quasi-totale de la multiplication des promastigotes est observée lorsque le sérum est additionné à la dilution de 1/25 tous les deux jours à la culture de parasites. Utilisé à la dilution 1/50, cette inhibition est partielle. En revanche, l'addition tous les deux jours de différentes concentrations de ES PSAr (0,22 pM et 17,8 pM) à la culture des promastigotes de L. infantum active significativement la prolifération des parasites (Figure 12). 5.2 Réponses à médiation cellulaire a-Activités leishmanicides des macrophages canins Les activités leishmanicides révélées par les cellules des chiens du groupe Placebo versus ceux du groupe Vaccinés ont été évaluées avant (TO) et un mois après l'administration de 2 doses de vaccin (T3) et deux mois après l'injection de 3 doses (T5). L'incubation des lymphocytes autologues avec les macrophages infectés provenant des chiens pré-immuns (TO), mais aussi des chiens placebo à différents temps post-immunisation (T3 et T5) induit des activités leishmanicides inférieures à 20% de réduction de l'index parasitaire (Figure 13). De façon remarquable, les effets leishmanicides révélés par la co-culture des cellules isolées des chiens vaccinés avec la ES PSAr ou la C-ter PSA augmentent significativement à T3 (60% et 40% de réduction de l'indexe parasitaire respectivement, 2 Ces effets leishmanicides s'accompagnent à T5 d'une production sélective et significative d'oxyde nitrique (NO) (Figure 15) et d"interféron(IFN)-y(Figure 14) chez les chiens vaccinés avec la ES PSAr ou la C-ter PSA. 5.3 Suivis parasitologiques des chiens après épreuve infectieuse Les suivis parasitologiques ont été réalisés chez les chiens en utilisant deux méthodes d'amplification : - celle visant à détecter la présence des parasites dans la moelle osseuse après mise en culture de prélèvements de moelle osseuse en milieu NNN ; - celle visant à détecter l'ADN parasitaire par une technique d'amplification de gènes (PCR) qui, couplée à la PCRquantitative, présente l'avantage d'évaluer quantitativement la charge parasitaire. Les suivis parasitologiques effectués à TO permettent de montrer que l'ensemble des chiens de l'étude étaient indemmes de leishmanies avant l'épreuve infectieuse expérimentale (Figures 16 et 17) Selon les Figures 16, 17 et 18 et l'étude statistique, les 35 résultats du suivi parasitologique sont les suivants : - 2 mois après l'épreuve infectieuse Aucune différence significative en groupes placébo et vaccinés n'est mis en évidence. Tous les chiens étaient 5 parasitologiquement négatifs. - 4 mois après l'épreuve infectieuse Les résultats sont peu significatifs entre le groupe de chiens placébo et le groupe de chiens vaccinés avec la Cter 10 PSA = 0.04852). Par contre les placebos ont significativement plus de chiens infectés que les vaccinés avec la ES PSAr (p = 0.0256) - 6 mois après l'épreuve infectieuse 15 Tous les chiens du groupe placébo sont infectés alors que seulement 22% et 20% des chiens vaccinés respectivement avec la ES PSAr et la C-ter PSA le sont. Les différences entre groupes placébo et vaccinés sont donc très significatives (p Les propriétés remarquables de la ES PSAr ainsi que de sa partie C-ter sont aussi révélées par : - l'effet inhibiteur d'un sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la C-ter PSA sur la croissance des formes promastigotes de L. infantum ; - l'effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-rPSA et anti-C-ter PSA sur la capacité des promastigotes à infecter ex vivo les macrophages ; - l'effet « facteur de croissance » de la ES PSAr sur la prolifération des formes promastigotes. Exemple 3 - : essais sur cellules humaines L'immunogénicité de la PSA recombinante native (ES PSAr) a été évaluée sur des cellules humaines par l'analyse du profil de la réponse immune cellulaire engendrée ex-vivo chez l'homme. La capacité de la ES PSAr à induire, ex-vivo,sur des cellules humaines, une réponse immune à médiation cellulaire spécifique en activant des lymphocytes T producteurs de cytokines de type Thl et/ou du Granzyme B provenant de donneurs sains comparativement à des individus immuns ou guéris exposés à la leishmaniose viscérale à L. infantum dans le sud de la France, a été évaluée. A cet effet, un ensemble de méthodes immunologique et parasitologique, associées au suivi clinique, a été mis en place. Les résultats sont rapportés dans les tableaux 1 et 2 suivants : Tableau 1 Taux d'IFN-y(pg/m1) dans les surnageants de co-culture de cellules humaines provenant d'individus sains (B, IND 8 à 15) et d'individus immuns asymptomatiques ou guéris (A, IND là 7) exposés dans le sud de la France à la leishmaniose viscérale 10 à L. infantum . A Milieu seul PHA IND 1 115,04 ND IND 2 68,48 ND IND 3 378,56 3147,75 IND 4 398,07 324 ) IND 5 7,37 ND IND 6 109,80 ND IND 7 135,29 17. B Milieu seul PHA IND 8 13,68 N[) IND 9 72,5 ,-)03,(: MD10 0 IND 11 164,18 IND 12 146,07 3512,74 IND 13 172,36 .32 IND 14 0 3) ) IND 15 TSLA Ldi 21 3,07 35,98 104,79 800,64 ,78 97.22 327,47 401,67 385,91 487.64 .165,17 TSLA Ldd8 LoPSAnr 882,36 162,16 841,37 120,52 LaPSAnr TSLA Ldd8 TSLA Ldi 4,46 15,84 0 94,85 180,94 184,48 TSLA Ldd8 : extrait parasitaire total de promastigotes de L. donovani TSLA Ldi : extrait parasitaire total de promastigotes de L. infantum Tableau 2 Production de Granzyme B (pg/ml) dans les surnageants de co- culture de cellules humaines provenant d'individus sains (B, IND 8 à 15) et d'individus immuns asymptomatiques ou guéris (A, IND 1, 3, 5 et 6) exposés dans le sud de la France à la leishmaniose viscérale à L. infantum. A PHA ND ND ND Milieu seul I IND 1 47,42 IND 3 165,05 IND 5 i 4,87 IND 6 10,80 LaPSAnr TSLA Ldd8 TSLA Ldi 188,74 218,4 11,22 20. 29,74 72, 38,73 Milieu seul PHA LaPSAnr i TSLA Ldd8 TSLA Ldi IND 8 4,15 ND 1,70 0 (.3 IND 9 70,56 ' ,' 74.21, 14,67 58.62 IND 10 0 3".),7 0 0 0 IND 11 56,06 '1,05,78 26,46 14,6 17,91 IND 13 29,56 E 927'0,49 14,96 33, 15 44,54 IND 14 0 8819,(39 0 0 0 IND 15 0 3060,99 0 0 0 TSLA Ldd8 : extrait parasitaire total de promastigotes de L. donovani TSLA Ldi : extrait parasitaire total de promastigotes de L. infantum L'analyse des résultats des tests cellulaires montre que la ES PSAr constituant le candidat vaccinal est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique de type Thl, générant des taux significatifs d'IFN-gamma (Tableau 1), et/ou une réponse T-cytotoxique déterminée par une production significative de Granzyme B (Tabeau 2) chez des individus immuns asymptomatiques ou guéris par rapport à des individus sains. Les résultats des tests d'immunogénicité du candidat vaccinal ES PSAr confirment l'intérêt de cette protéine recombinante à être sélectionnée pour entrer dans la composition d'un vaccin contre les leishmanioses humaines. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1-Dumonteil E. et al., Vaccine, 2003 May 16;21(17-18):2161- 8. ; 2 - Rafati S. et al, Vaccine, 2005, May 25 ; 23(28) :3716- 25 ; 3 - Rodriguez-Cortes A.et al, Vaccine, 2007, Nov 14;25 (46) :7962-71; 4 - Morris R.V. et al, J. Immunol., 2001, Nov 1 , 167 10 (9) :5226-30; 5 - Valenzuela J.G. et al, J. Exp. Biol., 2004, Oct 207(Pt21) :3717-29. REVENDICATIONS1 - Protéine PSA, telle qu'issue de leishmanie, ou une partie de cette PSA possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA désignée ci-après par ES PSAr, se présentant sous forme soluble, native, recombinante, pour son utilisation comme molécule vaccinale chez un mammifère. 2 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 10 1, caractérisée en ce que la molécule de ES PSAr est entière. 3 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle une ES PSAr comporte une ou plusieurs modifications co-et post-traductionnelles du groupe comprenant 15 l'acétylation, l'hydroxylation, les ponts disulfure, la glycylation, la glycosylation, la phosphorylation, l'ancrage lipidique, et/ou dépourvue de l'ancre GPI. 4 - Protéine PSA pour son utilisation selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr glycosylée ou d'une ES PSAr déglycosylée. 5- Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la ES PSAr est dépouvue d'ancre 25 GPI. 6- Protéine PSA pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle la ES PSAr est dépourvue de la partie carboxy-terminale. 30 7 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la partie de ES PSAr est la partie C-terminale, désignée ci-après par C-ter PSA, ou la partie C-terminale de la PSA telle qu'isolée d'un surnageant d'excrétion/sécrétion de culture de leishmanie. 8- Protéine PSA pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la ES PSAr ou la partie de cette PSA est telle qu'obtenue à partir de la PSA de L.amazonensis ou d'une leishmanie du complexe donovani, notamment de L.infantum ou de L.donovani, ou du complexe braziliensis et tropica. 9- Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite ES PSAr présente la séquence SED ID N°1. 10 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la partie C-terminale de la PSA présente la séquence SEQ ID N°4. 11 - Protéine PSA pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 8 ou 9, de la ES PSAr telle que produite par insertion d'un vecteur comprenant le gène codant pour la ES PSAr ou une partie de ES PSAr, en particulier une partie délétée de l'ancre GPI, dans un système d'expression recombinant eucaryote de leishmanie. 12 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le système d'expression recombinant utilisé est celui d'une leishmanie non pathogène chez les mammifères. 13 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que le système d'expression recombinant eucaryote est constitué par celui de promastigotes de Leishmania tarentolae. 14 - Protéine PSA pour son utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le vecteur d'expression contenant le gène codant pour ES PSAr PSA est intégré dans le locus 18S 5 rRNA du chromosome de Leishmania tarentolae. 15 - Procédé de production de ES PSAr sous forme soluble, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes définies dans l'une des quelconque des revendications 11 à 14. 10 16 - Procédé de production de la partie C-ter PSA selon l'une des revendications 1, 7, 8 ou 10, caractérisé en ce qu'il est réalisé dans un système bactérien recombinant. 15 17 - Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr sous forme soluble, native, recombinante, comportant le cas échéant une ou plusieurs des modifications co- et post-traductionnelles, telle que l'acétylation, l'hydroxylation, les ponts disulfure, la glycylation, la 20 glycosylation, la phosphorylation, l'ancrage lipidique, et/ou dépourvue de l'ancre GPI . 18- Protéine recombinante selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr glycosylée ou 25 d'une ES PSAr déglycosylée. 19 - Protéine recombinante selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'elle est délétée de l'ancre GPI. 30 20 - Peptide, caractérisé en ce qu'il s'agit de la partie C-ter de la ES PSAr selon la revendication 7, 8 ou 10 . 21 - Composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement des leishmanioses, caractérisée en ce qu'elle comprend : . une protéine ES PSAr de leishmanie et/ou la partie C-ter de 5 la PSA de leishmanie, telle(s) qu'utilisée(s) selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou telle que définie dans l'une des revendications 17 à 20 et un ou plusieurs adjuvants et/ou un ou plusieurs immunomodulateurs. 10 22 - Composition vaccinale selon la revendication 21, caractérisée en ce que l'adjuvant est avantageusement choisi parmi ceux capables d'induire une réponse à médiation cellulaire conduisant à l'élimination du parasite. 15 23 - Composition vaccinale selon la revendication 22, caractérisée en ce que les adjuvants sont choisis parmi ceux des classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, les saponines et leurs dérivés,les émulsions huile dans eau ou eau dans 20 huile, les polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly-électrolytes et les immunomodulateurs sont choisis parmi les protéines de salive de phlébotomes, les cytokines et les protéines de chose thermique HSP20. 25 24 - Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme permettant l'administration par différentes voies, comme la voie sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, parentérale, endonasale, mucosale, ou orale. 30 25 - Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin, d'un réactif de diagnostic in vivo ou in vitro pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'uneactivation de l'immunité à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes de type Thl et/ou de l'immunité humorale effectrice. 26 - Composition selon la revendication 24, pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère du passage d'un état immunitaire de type Th2 vers un état immunitaire de type Th1, ou encore pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'anticorps spécifiques d'isotype IgG2 neutralisants et/ou lytiques qui reconnaissent les déterminants antigéniques des parasites. 27 - Les anticorps spécifiques d'IgG2 et immunsérums les renfermant dirigés contre une ES PSAr ou une partie de ES PSAr selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.15