FR 3002634 A1 20140829 FR 1351787 A 20130228 Procédé d'observation d'au moins un objet, tel qu'une entité biologique, et système d'imagerie associé La présente invention concerne un procédé d'observation d'au moins un objet, tel qu'une entité biologique. Le procédé est mis en oeuvre à l'aide d'un système d'imagerie, et comporte l'éclairement du ou des objets par une source de lumière, et l'acquisition d'une figure de diffraction à l'aide d'un photodétecteur matriciel, la figure de diffraction correspondant à une image des ondes diffractées par le ou les objets lorsqu'ils sont éclairés selon une direction d'éclairement. Le ou les objets sont disposés entre la source de lumière et le photodétecteur matriciel selon la direction d'éclairement. La présente invention concerne également un système d'imagerie comprenant une source de lumière propre à éclairer selon une direction d'éclairement au moins un objet, tel qu'une entité biologique, un photodétecteur matriciel propre à acquérir une figure de diffraction, la figure de diffraction correspondant à une image des ondes diffractées par le ou les objets lorsqu'ils sont éclairés selon ladite direction d'éclairement, et un support de réception du ou des objets, le support étant disposé entre la source de lumière et le photodétecteur matriciel selon la direction d'éclairement. L'invention s'applique par exemple à la reconstruction d'une image d'un échantillon comportant les objets, notamment à la reconstruction de propriétés optiques des objets, tels que des entités biologiques, par exemple des cellules, des bactéries ou encore des virus. Ces entités biologiques, également appelées particules biologiques, présentent une taille de l'ordre de 10 lm pour les cellules et de l'ordre 1 lm pour les bactéries. L'échantillon baigne, par exemple, dans un milieu liquide contenu dans le support, le support étant disposé entre la source et le photodétecteur matriciel, le support comportant une surface transparente positionnée face au photodétecteur matriciel. En variante, l'échantillon est disposé sur le support au contact de l'air. Par propriétés optiques, on entend notamment l'absorption de l'objet ou le déphasage optique introduit par chaque objet, le déphasage optique étant également appelé retard de phase, sachant que ces paramètres représentent respectivement le module et l'argument de la fonction d'opacité complexe de l'objet. L'invention permet notamment de déterminer la distribution spatiale de ces paramètres. L'invention concerne l'imagerie sans lentille, également appelé imagerie de contact, c'est-à-dire l'acquisition, par le photodétecteur matriciel, d'images formées par le rayonnement transmis directement par l'échantillon, en l'absence d'une optique de grossissement disposée entre l'échantillon et le photodétecteur matriciel. Le photodétecteur matriciel est également appelé dans ce cas dispositif d'imagerie sans lentille, et apte à former une image de l'échantillon tout en étant placé à une faible distance de celui-ci. Par faible distance, on entend une distance comprise entre 100 lm et quelques centimètres, de préférence inférieure à 1 cm. On connait un procédé du type précité de l'article « Lensfree super-resolution holographic microscopy using wetting films on a chip » d'O. Mudanyali, de W. Bishara et d'A. Ozcan, publié en 2011 dans la revue Optics Express. Cet article décrit l'imagerie sans lentille de particules biologiques, en particulier de particules biologiques présentant des dimensions inférieures à 0,5 telles que des particules d'Escherichia coli, des spermatozoïdes, des trophozoïtes lamblia Gardia, ou encore des érythrocytes, également appelés globules rouges. Cet article décrit en particulier l'utilisation d'un film mouillant afin d'améliorer les images obtenues. Le film mouillant présente une très faible épaisseur, et est disposé au-dessus de l'échantillon contenant les particules biologiques. Toutefois, les images des figures de diffraction acquises par le photodétecteur matriciel sont des images en champ large pour l'observation de milliers de particules, mais ne permettent pas de discriminer facilement les particules les unes par rapport aux autres. Le but de l'invention est donc de proposer un procédé d'observation et un système d'imagerie permettant d'améliorer l'observation de certains objets de l'échantillon, tout en observant toujours des milliers d'objets à l'aide des images des figures de diffraction acquises. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé d'observation du type précité, dans lequel le procédé comprend en outre, préalablement à l'étape d'éclairement, l'ajout d'au moins un marqueur au contact du ou des objets, le ou chaque marqueur étant apte à se fixer sur un objet correspondant, la fixation dudit marqueur sur ledit objet étant propre à augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet. Suivant d'autres aspects avantageux de l'invention, le procédé d'observation comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément ou suivant toutes les combinaisons techniquement possibles : - la fixation dudit marqueur sur ledit objet est propre à augmenter l'absorption dudit objet d'au moins 1%, de préférence d'au moins 10% ; - la fixation dudit marqueur sur ledit objet est propre à augmenter le déphasage optique dudit objet d'au moins rr/1 0 radians ; - le ou chaque marqueur est choisi parmi le groupe constitué de : un agent colorant, un agent fluorescent, une particule métallique et une particule organique ; - le ou chaque marqueur présente une dimension, telle qu'un diamètre, de valeur inférieure à la moitié de la dimension correspondante, telle qu'un diamètre, du ou de chaque objet, de préférence inférieure au tiers de ladite dimension, de préférence encore inférieure au dixième de ladite dimension ; - la distance entre le ou les objets et le photodétecteur matriciel selon la direction d'éclairement est inférieure à 10 mm, de préférence inférieure à 5 mm ; - la source de lumière est une source de lumière spatialement cohérente ; - le ou chaque objet présente une dimension, telle qu'un diamètre, de valeur inférieure à 1 mm, de préférence de valeur comprise entre 100 nm et 100 lm ; - le procédé comprend en outre, après l'étape d'acquisition, la reconstruction de propriétés optiques du ou des objets suivant un algorithme de reconstruction à partir d'une intensité mesurée par le photodétecteur matriciel, l'algorithme de reconstruction étant fonction de la distance entre le ou les objets et le photodétecteur matriciel selon la direction d'éclairement. L'invention a également pour objet un système d'imagerie du type précité, dans lequel le support de réception comporte en outre au moins un marqueur agencé au contact du ou des objets, le ou chaque marqueur étant apte à se fixer sur un objet correspondant, la fixation dudit marqueur sur ledit objet étant propre à augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple non limitatif, et faite en référence aux dessins annexés, sur lesquels : - la figure 1 est une vue en perspective d'un système d'imagerie selon l'invention, - la figure 2 est une vue éclatée du système d'imagerie de la figure 1, - la figure 3 est une représentation schématique du système d'imagerie de la figure 1, le système d'imagerie comprenant une source de lumière propre à éclairer un échantillon et un photodétecteur matriciel propre à établir une figure de diffraction transmise par l'échantillon éclairé, - la figure 4 est un organigramme d'un procédé d'observation selon l'invention, - la figure 5 est une image d'une figure de diffraction de l'échantillon, acquise suivant un procédé d'observation de l'état de la technique, - la figure 6 est une image d'une figure de diffraction de l'échantillon, acquise suivant un procédé d'observation selon l'invention, - la figure 7 est un agrandissement de la zone encadrée VII de la figure 5, - la figure 8 est un agrandissement de la zone encadrée VIII de la figure 6, - la figure 9 est un agrandissement, pour la zone correspondant à la zone encadrée VII de la figure 5, d'une image de l'échantillon obtenue par reconstruction suivant le procédé de l'état de la technique, - la figure 10 est un agrandissement, pour la zone correspondant à la zone encadrée VIII de la figure 6, d'une image de l'échantillon obtenue par reconstruction suivant le procédé selon l'invention, - la figure 11 est un agrandissement, pour la même zone que celle des figures 9 et 10, d'une image de référence de l'échantillon, obtenue à l'aide d'un système d'imagerie par fluorescence, et - la figure 12 est une vue de l'image de l'échantillon obtenue par reconstruction suivant le procédé selon l'invention, ladite vue comportant la zone encadrée X dont un agrandissement est représenté à la figure 10. De façon conventionnelle, dans la présente demande, l'expression « sensiblement égale à » exprimera une relation d'égalité à plus ou moins 5%. Sur la figure 1, un système d'imagerie 20 destiné à l'observation d'un échantillon 22 comprend une source de lumière 24 propre à éclairer l'échantillon 22 et un photodétecteur matriciel 26 propre à établir une figure de diffraction transmise par l'échantillon 22 éclairé selon une direction d'éclairement, par exemple une direction sensiblement verticale Z. Le système d'imagerie 20 comprend un support 28 de réception de l'échantillon 22, le support de réception 28 étant disposé entre la source de lumière 24 et le photodétecteur matriciel 26 selon la direction d'éclairement Z. Le support de réception 28 est destiné à recevoir l'échantillon 22 à analyser. Le système d'imagerie 20 comprend également une unité de traitement d'informations 30, visible sur la figure 3, comportant un processeur 32 et une mémoire 34 apte à stocker un logiciel 36 de reconstruction des propriétés optiques de l'échantillon 22, les propriétés optiques étant reconstruites suivant un algorithme de reconstruction à partir d'une intensité I mesurée par le photodétecteur matriciel 26. Le système d'imagerie 20 comprend un boîtier de protection 38, à l'intérieur duquel sont disposés notamment le photodétecteur matriciel 26 et l'unité de traitement d'informations 30, comme représenté sur la figure 2. L'échantillon 22 comporte des objets 40, tels que des entités biologiques, également appelées particules biologiques, c'est-à-dire des cellules (par exemple des globules rouges, des globules blancs ou des plaquettes) ou agrégats de cellules, des bactéries ou colonies bactériennes, ou encore des virus. L'échantillon 22 baigne, par exemple, dans un milieu liquide contenu dans le support 28, le support 28 comportant une surface transparente 42 et les objets 40 étant par exemple au contact de la surface transparente 42 du support. En variante, l'échantillon 22 est disposé sur le support 28 au contact de l'air, les objets 40 étant agencés sur la surface transparente 42 du support. La source de lumière 24 est propre à émettre un faisceau lumineux 44 selon la direction d'éclairement, par exemple la direction verticale Z, afin d'éclairer l'échantillon 22 comprenant les objets 40. La direction d'éclairement est la direction selon laquelle l'échantillon 22 est éclairé par le faisceau lumineux 44. La direction d'éclairement n'est pas nécessairement la direction selon laquelle le faisceau lumineux 44 est issu de la source de lumière 24, notamment dans le cas où le faisceau lumineux 44 ne suit pas un trajet rectiligne depuis la source de lumière 24 jusqu'à l'échantillon 22, le faisceau lumineux 44 étant alors par exemple réfléchi par un miroir lors de son cheminement entre la source de lumière 24 et échantillon 22. La source de lumière 24 est disposée à une première distance D1 du support de réception 28 selon la direction d'éclairement Z. La première distance D1 présente de préférence une valeur comprise entre 1 mm et 30 cm. La source de lumière 24 est de préférence une source spatialement cohérente et comporte, par exemple, une source ponctuelle telle qu'une diode électroluminescente 46, également appelée LED (de l'anglais Light-Emitting Diode), et, avantageusement, un diaphragme 48 disposé au contact de la LED 46. Cela permet d'augmenter la cohérence spatiale du rayonnement lumineux. Lorsque la source de lumière 24 comporte la LED 46, la première distance D1 est, par exemple, égale à 5 cm. En variante, la source de lumière 24 est une source de lumière spatialement et temporellement cohérente, telle qu'une diode laser (DL) ou encore une diode laser de type VCSEL (de l'anglais Vertical Cavity Surface Emitting Laser). La diode laser présente une longueur d'onde par exemple sensiblement égale à 670 nm. Lorsque la source de lumière 24 est une diode laser, la première distance D1 est, par exemple, égale à 1 cm. L'homme du métier notera que la valeur de la première distance D1, c'est-à-dire de la distance entre la source de lumière 24 et l'échantillon 22, n'a aucune incidence sur l'image de diffraction, étant donné que l'onde émise par la source de lumière 24 est une onde plane, et ce quelle que soit la position de la source de lumière 24. En variante encore, la source de lumière 24 est constituée de la diode électroluminescente 46, et ne comporte pas de diaphragme. La diode électroluminescente 46 présente alors des dimensions suffisamment réduites pour être considérée comme spatialement cohérente, le diamètre de la diode électroluminescence 46 étant inférieur au dixième de la première distance D1 séparant cette diode électroluminescente 46 du support de réception 28. Le photodétecteur matriciel 26 est propre à établir une figure de diffraction produite par l'échantillon 22, la ou chaque figure de diffraction correspondant à une image des ondes diffractées par un ou plusieurs objets 40, l'image étant formée au niveau du photodétecteur matriciel 26 lors de l'éclairement de l'échantillon 22. Plus précisément, chaque figure de diffraction comprend une image formée par les interférences des ondes diffractées par un objet. Le photodétecteur matriciel 26 et la source de lumière 24 sont situés de part et d'autre de l'échantillon 22 selon la direction d'éclairement Z. Le photodétecteur matriciel 26 comporte une pluralité de pixels, non représentés. Chaque pixel du photodétecteur matriciel 26 présente des dimensions inférieures ou égales à 10 voire 4 Chaque pixel est, par exemple, en forme d'un carré dont le côté est de valeur inférieure ou égale à 10 voire à 4 En variante, chaque pixel est en forme d'un carré de 2,2 lm de côté. Le photodétecteur matriciel 26 est disposé à une deuxième distance D2 du support de réception 28 selon la direction d'éclairement Z. La deuxième distance D2 présente une valeur comprise entre 100 lm et quelques centimètres, de préférence inférieure à 10 mm, de préférence inférieure à 5 mm, et de préférence encore comprise entre 200 lm et 2 mm. Dans l'exemple de réalisation décrit, la deuxième distance D2 est sensiblement égale à 500 Le fait de privilégier une deuxième distance D2 de faible valeur, c'est-à-dire une distance courte entre le photodétecteur matriciel 26 et le support de réception 28, permet de limiter les phénomènes d'interférence entre différentes figures de diffraction produites par différents objets lorsque l'échantillon 22 est éclairé. Le photodétecteur matriciel 26 est un capteur d'images en deux dimensions, à savoir dans un plan perpendiculaire à la direction d'éclairement Z. Le photodétecteur matriciel 26 est un capteur d'images pixélisé, par exemple un capteur CMOS (de l'anglais Complementary Metal-Oxyde Semiconductor). En variante, le photodétecteur matriciel 26 est un capteur CCD (de l'anglais Charged-Coupled Device). Le photodétecteur matriciel 26 comporte en complément des microlentilles, non représentées, chaque microlentille étant disposée au-dessus d'un pixel correspondant. De telles microlentilles sont intégrées au capteur. Elles permettent d'améliorer le rendement de collecte et ne forment pas une optique de grossissement disposée entre le support de réception 28 et le photodétecteur matriciel 26. Les images acquises par le photodétecteur matriciel 26 sont formées par le rayonnement transmis directement par l'échantillon 22, en l'absence d'une optique de grossissement disposée entre le support de réception 28 et le photodétecteur matriciel 26. Le photodétecteur matriciel 26 est également appelé dispositif d'imagerie sans lentille, et est apte à former une image de l'échantillon 22, tout en étant placé à une faible distance de ce dernier. Par faible distance, on entend, comme indiqué précédemment, une distance inférieure à quelques centimètres, de préférence inférieure à 1 cm, la deuxième distance D2 étant par exemple égale à 500 Le support de réception 28 comporte la surface transparente 42 supportant l'échantillon 22. La première distance D1 correspond alors à la distance entre la source de lumière 24 et la surface transparente 42 selon la direction d'éclairement Z. La deuxième distance D2 correspond alors à la distance entre le photodétecteur matriciel 26 et la surface transparente 42 selon la direction d'éclairement Z. Le support de réception 28 est disposé entre la source de lumière 24 et le photodétecteur matriciel 26, et la surface transparente 42 est sensiblement perpendiculaire à la direction d'éclairement Z correspondant à la direction d'éclairement de l'échantillon 22 par la source de lumière 24, comme représenté sur la figure 3. Le support de réception 28 comporte en outre, selon l'invention, au moins un marqueur 50 agencé au contact du ou des objets 40, le ou chaque marqueur 50 étant apte à se fixer sur un objet 40 correspondant, la fixation dudit marqueur 50 sur ledit objet 40 étant propre à augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet 40. De préférence, il s'agit d'un marquage spécifique à l'objet 40 destiné à être analysé, le marquage de l'objet consistant à adjoindre à l'objet 40 une molécule, une particule, une cellule par couplage biologique. Ainsi, d'une façon générale, l'échantillon 22 est éclairé selon une direction donnée, le photodétecteur matriciel 26 étant disposé perpendiculairement à ladite direction. Le logiciel de reconstruction 36 est propre à reconstruire les propriétés optiques de l'échantillon 22, suivant un algorithme de construction, à partir de l'intensité mesurée I Un exemple d'algorithme de reconstruction, connu en soi, et vérifie l'équation suivante : ) où I représente l'intensité mesurée par le photodétecteur matriciel 26, x, y représentent les coordonnées dans un plan perpendiculaire à la direction verticale Z, * désigne le produit de convolution, Zr représente une hauteur de reconstruction, 1(X, Y)* h-zr (X, Y) = e 22r -Zr ( 2Zr .a* (x, Y)* h-2z, (x, Y) (1) - 1- a(x, y) - ej2K 2 j 2 À représente la longueur d'onde de la source de lumière 24, j représente le nombre imaginaire unitaire, a représente la fonction d'opacité complexe d'un objet 40, a* représente le complexe conjugué de a, et h, est défini par l'équation suivante : 1 z ./271- x2 2 \ hz (x, y) = e exp( y ) . (2) L'équation (1) est obtenue à l'aide des équations suivantes : Az (x, y) = t(x, y) * hz (x, y) (3) où Az est la transformée de Fresnel de la transmittance t(x,y). Un coefficient de transmission t(x,y) est alors défini de la manière suivante : t(x, y) = (1- a(x, y)) (4) Az (x, y) = t(x, y)* hz(x, y) = (1 - a (x, y)) * hz(x, y) (5) =1* hz(x, y) - a(x, y)* hz(x, y) = e 2 -a(x,y)*hz(x,y) L'intensité I est alors définie de la manière suivante : \ I = A.A* =1- e .a* * hz* - e .a * hz + * hz).(a* * h z* ) (6) Les propriétés duales de la transformée de Fresnel correspondant aux équations suivantes : h** h = h * h z z -z z (7) hz * hz = h2z permettent alors d'obtenir l'équation de reconstruction (1) : ( * 2A-- 1 -e 2.a* *hz -e 2.a *hz I * h_z * h-z j2z--z j2z-z * -.127,-- I * hz = e 2 -e 2.a *hz * z - - e 2 .a * h * h z -z j2A---z - e j2z-z z I * h = ez 2 2 .a * h * h -z -z - e j2A-2.a j2ii-z 1 .127z2z I * h_z =e 2 1- a - e 2.a h_2z ) La hauteur de reconstruction Zr correspond à la distance entre le photodétecteur matriciel et l'objet analysé. Selon une variante, lorsque les objets analysés sont placés au contact de la paroi transparente 42, la hauteur de reconstruction Zr présente, par exemple, une valeur (8) strictement inférieure à celle de la deuxième distance D2 entre la surface transparente 42 et le photodétecteur matriciel 26 selon la direction d'éclairement Z. La hauteur de reconstruction Zr est de préférence inférieure à 0,9 fois la deuxième distance D2, de préférence encore inférieure à 0,8 fois la deuxième distance D2. Le boitier de protection 38 est, par exemple, en forme d'un cylindre, comme représenté sur les figures 1 et 2. Le boitier de protection 38 présente une hauteur H selon la direction verticale Z, et un rayon R selon une direction radiale perpendiculaire à la direction verticale Z. La hauteur H et le rayon R du boitier 38 sont, par exemple, centimétriques. Les objets 40 présentent une taille inférieure à 1 mm, de préférence comprise entre 100 nm et 100 iim. La taille des objets 40 correspond à leur plus grande dimension selon une direction donnée. Lorsque les objets 40 sont en forme d'une sphère, la taille des objets 40 est égale au diamètre de la sphère correspondante. Les bactéries présentent un diamètre de l'ordre de 1 lm et les cellules présentent un diamètre de l'ordre de 1 0 lm. La taille de l'objet 40 est généralement comprise entre 0,1 et 25 fois la longueur d'onde À du faisceau 44 produit par la source de lumière 24. Dans l'exemple des figures 5 à 12, la longueur d'onde À du faisceau 44 est égale à 555 nm, et la taille des objets 40 est de l'ordre de 10 um, c'est-à-dire égale à environ 20 fois la longueur d'onde À. Les objets 40 sont, par exemple, des entités biologiques, telles que des bactéries ou autres micro-organismes, ou encore des cellules, comme cela a été décrit précédemment. Les cellules sont, par exemple, des cellules sanguines, c'est-à-dire des globules rouges ou des globules blancs, des thrombocytes ou encore toutes autres cellules présentes dans un fluide biologique. La surface transparente 42 est, par exemple, en forme d'une lame transparente, présentant une épaisseur sensiblement égale à 170 lm selon la direction d'éclairement Z. Le faisceau lumineux 44 est propre à éclairer directement l'échantillon 22, en l'absence d'une optique de grossissement disposée entre la source de lumière 24 et le support de réception 28. La diode électroluminescente 46 est, par exemple, monochromatique avec une bande passante de largeur par exemple comprise entre 1 nm et 40 nm, de préférence égale à 5 nm. La diode électroluminescence 46 présente, par exemple, une longueur d'onde d'émission comprise entre 500 nm et 600 nm et une puissance de l'ordre du Watt. Le diaphragme 48 a un diamètre compris entre 50 um et 500 um, et est placé au contact de la source de la LED 46. Chaque marqueur 50 est choisi parmi le groupe constitué de : un agent colorant, un agent fluorescent, une particule métallique et une particule organique. Lorsque le marqueur 50 est un agent fluorescent, il s'agit, par exemple, du 4',6- diamidino-2-phénylindole, également appelé DAPI. Lorsque le marqueur 50 est une particule métallique, c'est-à-dire une particule inorganique de type métallique, il s'agit par exemple, de particules d'or, de particules de platine, ou encore de billes magnétiques. Les billes magnétiques sont, par exemple, des nanoparticules magnétiques, en particulier celles commercialisées par la société Miltenyi Biotec avec la référence 130-045-801. Enfin, lorsque le marqueur 50 est une particule organique, il s'agit par exemple, de particules polymériques, de micelles, de particules lipidiques de type nano-émulsions, ou encore de liposomes encapsulant un agent de contraste. L'agent de contraste est, par exemple, un fluorophore, un colorant, une particule nanométrique semi-conductrice, également appelée nanocrystal (de l'anglais quantum dot), ou encore un complexe métallique. La fixation du marqueur 50 sur l'objet 40 correspondant est propre à augmenter l'absorption dudit objet 40 d'au moins 1%, de préférence d'au moins 10%, notamment lorsque le marqueur 50 est un agent colorant ou un agent fluorescent. La fixation du marqueur 50 sur l'objet 40 correspondant est propre à augmenter le déphasage, c'est-à-dire le retard de phase, dudit objet 40 d'au moins rr/10 radians, notamment lorsque le marqueur 50 est une particule métallique ou une particule organique. Chaque marqueur 50 présente une taille de valeur inférieure à la moitié de la taille de l'objet 40 correspondant, de préférence inférieure au tiers de ladite taille, de préférence encore inférieure au dixième de ladite taille. La taille de chaque marqueur 50 correspond à sa plus grande dimension selon une direction donnée. Lorsque le marqueur 50 est en forme d'une sphère, la taille du marqueur 50 est égale au diamètre de la sphère correspondante. Chaque marqueur 50 est fonctionnalisé pour être apte à se fixer sur un objet 40 correspondant. Autrement dit, le marqueur 50 présente une affinité spécifique avec l'objet 40 à marquer. Il s'agit par exemple d'une affinité chimique, d'une affinité électrostatique, ou encore d'une affinité de forme. La fonctionnalisation du marqueur 50 permet de renforcer de manière spécifique le pouvoir diffractant de l'objet 40 par rapport au milieu environnant (fluide, autres objets), c'est-à-dire d'augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet 40. Le marqueur 50 est alors également appelé marqueur diffractant. En effet, la fonctionnalisation du marqueur 50 permet d'obtenir une forte concentration de ce dernier à la surface de l'objet 40 par rapport au milieu environnant. La fonctionnalisation du marqueur 50 est, par exemple, obtenue en greffant un agent de ciblage, tel qu'un oligonucléotide, un polynucléotide, une protéine (par exemple un anticorps), ou encore un fragment d'ADN ou d'ARN. L'agent de ciblage est susceptible d'interagir, par exemple par complexation ou par hybridation, avec une molécule de l'objet 40. La greffe de l'agent de ciblage sur le marqueur 50 permet d'établir une affinité chimique avec l'objet 40 à marquer. En variante, le marqueur 50 est une particule apte à se fixer à l'objet 40 via une force électrostatique. Ces particules présentant une affinité électrostatique avec l'objet 40 à marquer sont par exemple des particules MagPrep® Silica MS commercialisées par la société Merck Millipore avec la référence 1016440001 ou 1016440005. En variante, le marqueur 50 est un matériau à empreinte moléculaire propre à prendre une forme complémentaire d'au moins une partie de l'objet 40 afin d'établir une affinité de forme avec ladite partie de l'objet 40 à marquer. Lorsque les objets 40 sont des globules blancs avec l'antigène CD45, les marqueurs 50 sont par exemple des particules d'isothiocyanate de fluorescéine couplées à un anticorps spécifique de l'antigène CD45, l'isothiocyanate de fluorescéine étant un fluorophore. Ces particules d'isothiocyanate de fluorescéine couplées à l'anticorps spécifique de l'antigène CD45 sont commercialisées par exemple par la société Becton Dickinson (BD) avec la référence 555482, ou par la société Miltenyi Biotec avec la référence 130-098-043, ou encore par la société AbD Serotec du groupe Bio-Rad avec la référence MCA87F. En variante, lorsque les objets 40 sont des globules blancs avec l'antigène CD45, les marqueurs 50 sont des nanoparticules magnétiques, commercialisées par exemple par la société Miltenyi Biotec avec la référence 130-045- 801. En variante encore, lorsque les objets 40 sont des globules blancs avec l'antigène CD45, les marqueurs 50 sont des microparticules fluorescentes Q655 commercialisées par exemple par la société Invitrogen avec la référence Q22154. Lorsque les objets 40 sont des plaquettes avec l'antigène CD61, les marqueurs 50 sont par exemple des particules d'isothiocyanate de fluorescéine couplées à un anticorps spécifique de l'antigène CD61, telles que celles commercialisées par la société Becton Dickinson (BD) avec la référence 555753, ou par la société AbD Serotec avec la référence MCA2588F, ou encore par la société Abcam avec la référence ab78447. En variante, lorsque les objets 40 sont des plaquettes avec l'antigène CD61, les marqueurs 50 sont des nanoparticules, commercialisées par exemple par la société Miltenyi Biotec avec la référence 130-051-101. Le procédé de reconstruction selon l'invention va être à présent décrit à l'aide de la figure 4. Lors de l'étape initiale 100, le ou les marqueurs 50 sont ajoutés dans l'échantillon 22, le ou chaque marqueur 50 étant apte à se fixer sur un objet 40 correspondant de par l'affinité entre chaque marqueur 50 et l'objet 40 correspondant, tel que décrit précédemment. Lors de l'étape suivante 110, l'échantillon 22 est éclairé à l'aide de la source de lumière 22, le faisceau lumineux 44 étant dirigé suivant la direction d'éclairement Z lorsqu'il éclaire l'échantillon 22. L'intensité I du rayonnement transmis par l'échantillon éclairé 22 est alors mesurée lors de l'étape 120 par le photodétecteur matriciel 26. Plus précisément, le photodétecteur matriciel 26 mesure l'intensité I des figures de diffraction transmises par l'échantillon éclairé 22, chaque figure de diffraction correspondant à des ondes diffractées par les objets 40 lors de l'éclairement de l'échantillon 22, certains objets 40 étant en outre associés à un ou plusieurs marqueurs 50 correspondants. Les ondes diffractées interfèrent avec l'onde incidente. Les propriétés optiques, notamment l'absorption et le retard de phase, également appelé déphasage, des objets 40 sont enfin reconstruites, lors de l'étape 130, à l'aide des moyens de reconstruction 36, suivant l'algorithme de reconstruction décrit précédemment et à partir de l'intensité mesurée I. Le retard de phase correspond à l'argument de la fonction d'opacité complexe a ; l'absorption correspond au module de la fonction d'opacité complexe a précédemment définie. D'une façon générale, une image de reconstruction représente la distribution spatiale de l'absorption ou du retard de phase. Dans l'exemple des figures 5 à 12, la diode électroluminescence 46 présente une longueur d'onde d'émission égale à 555 nm et une puissance égale à 1,7 W. La première distance D1 est sensiblement égale à 5 cm et la deuxième distance D2 sensiblement égale à 500 iim. Dans l'exemple des figures 5 à 12, les objets 40 sont des cellules fibroblastes, à savoir des cellules NIH3T3 référence ATCC CRL 1658, cultivées en milieu complet à base d'un milieu de Eagle modifié, également appelé DMEM (de l'anglais Dulbecco Modified Eagle Medium), comprenant 1% d'antibiotiques, à savoir de Pénicilline et de Streptomycine (commercialisée par la société Gibco) et 10% de sérum de voeu nouveau-né (commercialisé par la société Pan Biotech). 60 000 cellules NIH3T3 sont ainsi fixées sur une lame transparente, telle qu'une lame commercialisée par la société Cytoo Chips, la lame étant ensuite placée en incubateur pendant 3 heures à 37°C. Dans l'exemple des figures 6, 8, 10 et 12, les cellules fibroblastes NIH3T3 ont en outre été marquées par une solution comportant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), commercialisé par exemple par la société Invitrogen avec la référence P36931. Autrement dit, dans l'exemple de réalisation des figures 6, 8, 10 et 12, les marqueurs sont des molécules de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). La figure 5 représente une image 200 de figures de diffraction correspondant aux cellules 40 avant ajout de la solution comportant du DAPI, c'est-à-dire acquise suivant un procédé d'observation de l'état de la technique, la figure 7 est un agrandissement 210 de la zone encadrée VII de la figure 5, et la figure 9 est un agrandissement 220, pour la zone correspondant à la zone encadrée VII de la figure 5, de l'image obtenue par reconstruction, à partir de l'image 200, à l'aide du logiciel de reconstruction 36 et suivant les équations (1) à (8) précédentes. La figure 6 représente une image 230 de figures de diffraction correspondant aux cellules 40 après ajout de la solution comportant du DAPI, c'est-à-dire acquise suivant un procédé d'observation selon l'invention, la figure 8 est un agrandissement 240 de la zone encadrée VIII de la figure 6, et la figure 10 est un agrandissement 250, pour la zone correspondant à la zone encadrée VIII de la figure 6, de l'image 260 obtenue par reconstruction, à partir de l'image 230, à l'aide du logiciel de reconstruction 36 et suivant les équations (1) à (8) précédentes. La figure 10 est un agrandissement de la zone encadrée X de la figure 12, la figure 12 représentant l'image 260 obtenue par reconstruction à partir de l'image 230. Autrement dit, les figures 5,7 et 9 ont été réalisées avant l'ajout des marqueurs au contact des cellules 40, c'est-à-dire suivant le procédé de l'état de la technique, et les figures 6, 8, 10 et 12 ont été réalisées après l'ajout des marqueurs au contact des cellules 40, c'est-à-dire suivant le procédé d'observation selon l'invention. La comparaison des figures 7 et 8 montre alors très distinctement que les figures de diffraction réalisées après marquage suivant le procédé selon invention sont mieux définies que les figures de diffraction réalisées avant marquage suivant le procédé de l'état de la technique. Les figures de diffraction réalisées suivant le procédé selon l'invention permettent alors notamment de localiser, de dénombrer et de mesurer les noyaux des cellules 40. La figure 11 est un agrandissement 270, pour la même zone que celle des figures 9 et 10, d'une image de référence de l'échantillon 22, obtenue à l'aide d'un système d'imagerie par fluorescence. La comparaison des figures 10 et 11 montre alors que l'image 260 reconstruite à partir de la figure de diffraction obtenue suivant le procédé selon invention est fidèle à l'image de référence obtenue par imagerie de fluorescence. La comparaison des figures 9 et 11 montre au contraire que l'image reconstruite à partir de la figure de diffraction obtenue suivant le procédé de l'état de la technique n'est pas exploitable lorsque la densité des cellules est trop élevée. Dans l'exemple des figures 6, 8, 10 et 12, l'ajout de la solution comportant du DAPI, suivant le procédé selon invention, permet d'augmenter l'absorption des cellules 40 et le marquage des cellules 40 permet alors l'observation d'une figure de diffraction exploitable et spécifique des noyaux des cellules 40. On conçoit alors que le procédé d'observation et le système d'imagerie 20 selon invention permettent d'améliorer l'observation de certains objets 40 de l'échantillon 22, tout en observant toujours des milliers d'objets 40 à l'aide des images des figures de diffraction. REVENDICATIONS1.- Procédé d'observation d'au moins un objet (40), le procédé étant mis en oeuvre à l'aide d'un système d'imagerie (20) et comportant les étapes suivantes : - l'éclairement (110), par une source de lumière (24), du ou des objets (40), - l'acquisition (120), à l'aide d'un photodétecteur matriciel (26), d'une figure de diffraction, la figure de diffraction correspondant à une image des ondes diffractées par le ou les objets (40) lorsqu'ils sont éclairés selon une direction d'éclairement (Z), le ou les objets (40), tels que des entités biologiques, étant disposés entre la source de lumière (24) et le photodétecteur matriciel (26) selon la direction d'éclairement (Z), le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre, préalablement à l'étape d'éclairement (110) : - l'ajout (100) d'au moins un marqueur (50) au contact du ou des objets (40), le ou chaque marqueur (50) étant apte à se fixer sur un objet (40) correspondant, la fixation dudit marqueur (50) sur ledit objet (40) étant propre à augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fixation dudit marqueur (50) sur ledit objet (40) est propre à augmenter l'absorption dudit objet d'au moins 1%, de préférence d'au moins 10%. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la fixation dudit marqueur (50) sur ledit objet (40) est propre à augmenter le déphasage optique dudit objet d'au moins rr/1 0 radians. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou chaque marqueur (50) est choisi parmi le groupe constitué de : un agent colorant, un agent fluorescent, une particule métallique et une particule organique. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou chaque marqueur (50) présente une dimension, telle qu'un diamètre, de valeur inférieure à la moitié de la dimension correspondante, telle qu'un diamètre, du ou de chaque objet (40), de préférence inférieure au tiers de ladite dimension, de préférence encore inférieure au dixième de ladite dimension. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la distance (D2) entre le ou les objets (40) et le photodétecteur matriciel (26) selon la direction d'éclairement (Z) est inférieure à 10 mm, de préférence inférieure à 5 mm. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière (24) est une source de lumière spatialement cohérente. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou chaque objet (40) présente une dimension, telle qu'un diamètre, de valeur inférieure à 1 mm, de préférence de valeur comprise entre 100 nm et 100 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le procédé comprend en outre, après l'étape d'acquisition (120), la reconstruction (130) de propriétés optiques du ou des objets (40) suivant un algorithme de reconstruction à partir d'une intensité (I) mesurée par le photodétecteur matriciel (26), l'algorithme de reconstruction étant fonction de la distance (D2) entre le ou les objets et le photodétecteur matriciel (26) selon la direction d'éclairement (Z). 10.- Système d'imagerie (20) comprenant : - une source de lumière (24) propre à éclairer au moins un objet (40), - un photodétecteur matriciel (26) propre à acquérir une figure de diffraction, la figure de diffraction correspondant à une image des ondes diffractées par le ou les objets (40) lorsqu'ils sont éclairés selon une direction d'éclairement (Z), - un support (28) de réception du ou des objets (40), tels que des entités biologiques, le support (28) étant disposé entre la source de lumière (24) et le photodétecteur matriciel (26) selon la direction d'éclairement (Z), caractérisé en ce que le support de réception (28) comporte en outre au moins un marqueur (50) agencé au contact du ou des objets (40), le ou chaque marqueur (50) étant apte à se fixer sur un objet (40) correspondant, la fixation dudit marqueur (50) sur ledit objet (40) étant propre à augmenter au moins une grandeur caractéristique parmi l'absorption et le déphasage optique dudit objet.