FR 3002745 A1 20140905 FR 1351853 A 20130301 02 745 1 Parmi les particules colloïdales à haute valeur ajoutée développées pour des application biotechnologiques et médicales, comme par exemple des particules de polymère, d'hydrogel ou des capsules artificielles (polymersomes) et naturelles (liposomes), les émulsions sont le matériau qui a potentiellement la gamme d'applications la plus large dans ces domaines [1]. En effet, les émulsions peuvent être réalisées à partir d'à peu près n'importe quel mélange de deux liquides immiscibles, synthétiques ou naturels ; leur stabilité peut être ajustée pour pouvoir durer plusieurs années ; les gouttes sont capables de solubiliser et transporter des molécules hydrophiles ou hydrophobes avec des taux de charge importants ; et la taille des gouttes peut varier entre quelques dizaines de nanomètres et plusieurs dizaines de microns avec une bonne monodispersité et pour des volumes d'échantillons importants. Toutefois, peut-être à cause de la difficulté que représente leur nature liquide et leur relative instabilité associée, peu de travaux [2-4] ont été réalisés jusqu'à aujourd'hui pour tenter de faire appartenir les émulsions à la grande famille des «colloïdes intelligents», capables de cibler des organes spécifiques d'un organisme grâce à leur fonctionnalisation de surface et de délivrer un principe actif suite à l'application d'un stimulus à distance comme une variation de pH, de température ou d'onde lumineuse [4]. Prenant inspiration de la séquence peptidique des protéines adhésives entrant dans la composition du byssus qui permet à la moule, Mytilus Edulis, d'adhérer sur une grande variété de substrats, de nombreux travaux ont récemment montré que la condensation de molécules de catécholamines dans des conditions faiblement alcalines et oxydantes peut être utilisée pour recouvrir à peu près n'importe quel type de surface solide [5] d'une couche de polymère qui peut être utilisée comme couche intermédiaire de fonctionnalisation par des biomolécules [6, 15, 16] ou du métal [7, 8, 15, 16]. 3002 745 2 Le polymère formé par la condensation de polydopa mine dans ces conditions a une structure similaire à celle des polymères de la famille de la mélanine [9], composé de groupes dihydroxyindole connectés entre eux dans des orientations variées. Ces couches de polydopamine ont des 5 propriétés rédox [7], d'absorption lumineuse [9] et sont sensibles au pH [10] Jusqu'à aujourd'hui, la polycondensation de dopamine a été réalisée avec succès à la surface d'émulsions dans le but de fabriquer des capsules polymériques du type coeur - écorce sensibles aux variations de pH [10- 10 12]. Toutefois, soit les capsules obtenues avaient un coeur en diméthyldiéthoxysilane (DMDES) qui sert de gabarit sur lequel se polymérise la dopamine, ce gabarit pouvant être ultérieurement éliminé pour donner des capsules de polydopamine creuses [12], soit les émulsions utilisées étaient très particulières puisqu'elles étaient stabilisées 15 seulement par des interactions électrostatiques répulsives sans l'aide d'aucun agent tensioactif. Il s'agit d'émulsions appelées « pristine ». Ces émulsions nécessitent l'utilisation d'huiles ne présentant aucune activité de surface (telles que par exemple des huiles ne contenant pas de triglycérides ou d'acides libres). En outre ce type d'émulsion est stabilisé 20 par la présence d'OH- à l'interface huile/eau. Donc, il est nécessaire d'utiliser des huiles qui ne réagissent pas trop avec ces ions et donc qui n'ont pas besoin d'être protégées à leur interface par des tensioactifs. Ainsi, en général seuls les alcanes tels que par exemple l'hexadécane sont utilisés dans les émulsions « pristine ». Les huiles végétales en revanche 25 ne peuvent pas être utilisées dans ce type d'émulsion car outre le fait qu'elles ont une activité de surface due à la présence des triglycérides et des acides libres (environ 0,1% en poids) qu'elles contiennent, elles auraient tendance à saponifier à l'interface avec l'eau. L'interface huile/eau des émulsions huile-dans-eau obtenues avec des huiles végétales est donc différente de celle obtenue avec les alcanes comme divulgués dans ce document. L'enseignement de ce document ne peut donc pas être extrapolé aux huiles végétales. Les émulsions « pristine » sont donc limitées aux huiles ne présentant aucune molécule susceptible d'avoir un effet sur la tension de surface, comme des alcanes ou des silicones. Les émulsions « pristine » se déstabilisent quand le pH diminue et quand la force ionique de la solution augmente car l'effet des charges est écranté et ces dernières ne permettent plus la stabilité du colloïde. Ces émulsions ont donc un domaine d'application très restreint. L'unique résultat trouvé dans la littérature qui fait état de l'utilisation de surfactants dans la phase continue n'a pas permis de maintenir la stabilité colloïdale de la suspension de gouttes et a donné lieu à la formation d'un solide macroporeux. Les surfactants utilisés étaient le SDS (dodécylsulfate de sodium) et le CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) qui sont respectivement des surfactants anioniques et cationiques, et l'huile utilisée était de l'hexadécane, une huile minérale [11]. Certes dans ce document l'auteur semble suggérer la possibilité d'utiliser des tensioactifs non-ioniques pour stabiliser des émulsions à base d'hexadécane, mais il indique que tous les tensioactifs non ioniques ne sont pas utilisables, puisque seuls ceux pouvant adsorber et enrichir sélectivement en ions 0 hr la surface des gouttes d'huile devraient être utilisés, ce qui dépend donc fortement de la nature chimique des groupes hydrophiles des tensioactifs par exemple de leur affinité avec les protons. Or si ces remarques sont peut être justifiées dans le cas des huiles minérales telles que les alcanes comme l'hexadécane (même si aucun test ne prouve la véracité de cette affirmation et qu'il ne s'agit donc que d'une hypothèse non vérifiée), elles ne peuvent être extrapolées à des huiles végétales car l'interface huile/eau est totalement différente en raison de la présence de triglycérides et d'acides libres dans ces huiles. Or il serait intéressant de pouvoir utiliser des huiles végétales pour obtenir des particules du type coeur-écorce dans lequel le coeur contiendrait ces huiles. En effet ces huiles sont intéressantes au niveau écologique car elles proviennent de végétaux, produits renouvelables. En outre la majorité d'entre elles sont tout à fait acceptables au niveau cosmétique et pharmaceutique, c'est-à-dire qu'elles n'ont pas d'effets secondaires, et peuvent incorporer de nombreux actifs liposolubles. Elles peuvent même, comme l'huile de soja, être administrées par voie intraveineuse. Il s'agit en outre en général des huiles qui sont ingérables par voie orale. Or l'inventeur a découvert de façon surprenante qu'il était possible d'arriver à polycondenser la dopamine sur des gouttelettes d'huile végétale en émulsion dans de l'eau, sans utilisation de gabarit, avec un mode de dépôt similaire à ce qui a déjà été montré pour les dépôts de polydopamine sur des supports solides [7] et à maintenir la stabilité colloïdale des particules de type coeur - écorce obtenues en utilisant un surfactant non ionique. Le procédé obtenu est donc simple à mettre en oeuvre puisqu'il ne nécessite pas l'utilisation d'un gabarit et donc la suppression du gabarit une fois la polycondensation obtenue (ceci permet d'éviter une étape de procédé supplémentaire). Par ailleurs la suspension colloïdale obtenue reste stable et la taille des gouttes n'est pas affectée par le procédé. En outre les huiles végétales ont l'avantage de provenir de végétaux et donc de matériaux renouvelables. En outre sont en général acceptable niveau cosmétique et pharmaceutique, c'est-à-dire qu'elles n'ont pas d'effets secondaires et peuvent incorporer de nombreux actifs liposolubles. Elles sont de plus en général administrables par voie orale. Enfin n'importe quel surfactant non ionique peut être utilisé dans le cadre du procédé selon la présente invention. La présente invention concerne donc un procédé de fabrication de particules de type coeur - écorce, le coeur comprenant une huile végétale et l'écorce comprenant un polymère de polydopa mine, le procédé comprenant les étapes suivantes : a - préparation d'une émulsion monodispersée d'une huile végétale dans une solution aqueuse ; b - mise en contact dans des conditions oxydantes de l'émulsion obtenue à l'étape a) avec une solution tamponnée ayant un pH supérieur à 7 et comprenant un surfactant non ionique et un composé de formule I suivante : R3 NH OH (I) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6 et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH de façon à polycondenser un polymère à la surface des gouttes de l'émulsion; c - récupération des particules de type coeur - écorce obtenues à l'étape b). Au sens de la présente invention on entend par « polymère de polydopa mine » tout polymère obtenu par polycondensation du composé de formule (I) selon l'invention dans des conditions oxydantes avec un pH > 7. Avantageusement dans le composé de formule (I), au moins l'un des 5 groupes R1 et R4 représente un atome d'hydrogène. Encore plus avantageusement, le groupe R2 représente un groupe -OH. De façon avantageuse il est choisi parmi la dopamine, la L-DOPA, l'épinéphrine et la norépinéphrine. De façon encore plus avantageuse il s'agit de la dopamine (R1, R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène et R2 représente un 10 groupe -OH). Ainsi la polymérisation de la dopamine de formule 1 suivante : OH OH (1) donne la polydopamine de formule (2) suivante : 3002 74 5 7 n HO (2). Dans le cas où le composé de formule (I) est tel que R2 représente un atome d'hydrogène, comme par exemple la L-tyrosine, le composé s'oxyde en composé de formule (I) dans laquelle R2 représente un groupe -OH, avant sa polymérisation. Au sens de la présente invention on entend par « huile végétale », toute huile qui n'est pas une huile minérale. En particulier les huiles végétales selon l'invention sont riches en triglycérides. Avantageusement elles contiennent des acides libres, de façon avantageuse pouvant aller jusqu'à 0,1% en poids par rapport au poids total de l'huile, en particulier compris entre 0,03 et 0,1% en poids, particulièrement entre 0,05 et 0,1% en poids, de façon plus particulière entre 0,05 et 0,09% en poids. De façon avantageuse l'huile végétale selon la présente invention est de l'huile de soja, avantageusement contenant en poids par rapport au poids total de l'huile - entre 5 et 10 % d'acide alpha linolénique, avantageusement entre 7 et 10 % d'acide alpha linolénique; - entre 50 et 57 % d'acide linoléique, avantageusement entre 50 et 54 °A) d'acide linoléique ; 3002 74 5 8 - entre 17 et 26 % d'acide oléique, avantageusement entre 23 et 24 °A) d'acide oléique ; - entre 9 et 13 % d'acide palmitique, avantageusement entre 10 et 11 °A) d'acide palmitique ; 5 - entre 3 et 6 % d'acide stéarique, avantageusement 4 % d'acide stéarique. Elle est disponible commercialement chez la société Sigma-Aldrich sous la référence S7381. 10 Au sens de la présente invention on entend par « groupe alkyle en en C1-C6 », tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou ramifiés, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, iso-butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s'agit d'un groupe méthyle. 15 Avantageusement la solution aqueuse de l'étape a) du procédé selon la présente invention contient un tensioactif pour stabiliser l'émulsion, de façon avantageuse il s'agit du poloxamer tel que le Poloxamer 188 de formule (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) commercialisé par la société 20 Croda France SAS. De façon encore plus avantageuse la teneur en tensioactif est comprise entre 1 et 30 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon particulièrement avantageuse elle est d'environ 15 % en poids. La solution aqueuse de l'étape a) du procédé selon la présente invention peut également comprendre un épaississant, tel que par exemple de l'alginate de sodium. De façon avantageuse l'épaississant est présent en une teneur comprise entre 0,5 et 5 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon avantageuse elle est d'environ 2 % en poids. 3002 74 5 9 Avantageusement la teneur en huile végétale de l'émulsion obtenue à l'étape a) est comprise entre 50 et 90 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, avantageusement entre 60 et 85 % en poids, de façon encore plus avantageuse entre 70 et 80 % en poids, en particulier entre 5 72 et 77 % en poids, par exemple entre environ 74 et 75% en poids. Dans un mode de réalisation particulier les gouttes de l'émulsion obtenue à l'étape a) ont un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500 pm, en particulier compris entre 400nm et 50 pm, de façon avantageuse comprise entre 900 nm et 20 pm, en particulier entre 1 et 15 pm, de façon 10 particulière d'environ 8±2 pm. Au sens de la présente invention, on entend par « diamètre moyen » la moyenne des diamètres de la population de gouttes ou de particules. Puisque les gouttes de l'émulsion sont monodispersées, la moyenne et la médiane sont quasi-identiques. Le diamètre de la population de gouttes 15 ou de particules est caractérisé par vidéomicroscopie, avantageusement à l'aide d'un microscope inversé Zeiss AxioObserver D1 équipé d'une caméra CCD de modèle Andor Clara E. Les images sont avantageusement acquises à l'aide du logiciel open-source Micro-Manager (Vale Lab, UCSB). 20 L'étape a) du procédé selon la présente invention peut être tel que décrit dans la demande de brevet FR2747321 [17]. Elle peut ainsi comprendre les deux sous étapes suivantes : - Etape aa) de fabrication d'une émulsion polydispersée de l'huile végétale dans une solution aqueuse, avantageusement par ajout de l'huile végétale 25 dans la solution aqueuse sous agitation, de façon avantageuse la solution aqueuse contenant un tensioactif, en particulier non ionique, tel que décrit ci-dessus et éventuellement un épaississant tel que décrit ci-dessus, en particulier dans les proportions indiquées ci-dessus ; 3002 74 5 10 - Etape bb) de fabrication d'une émulsion monodispersée à partir de l'émulsion polydispersée obtenue à l'étape aa), avantageusement par utilisation d'un cisaillement constant de 5000 s-1, en particulier dans une cellule de Couette, de façon particulière en utilisant la méthode 5 développée par Mason et al [14]. Dans un autre mode de réalisation particulier, une étape supplémentaire cc) peut être ajoutée après l'étape bb) qui consiste en la dilution de l'émulsion monodispersée obtenue à l'étape bb) dans une solution aqueuse, avantageusement contenant un surfactant, en particulier non 10 ionique, particulièrement du poloxamer tels que le Poloxamer 188 de formule (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) commercialisé par la société Croda France SAS. De façon encore plus avantageuse la teneur en surfactant est comprise entre eux 0,1 et 5 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon particulièrement avantageuse elle est 15 d'environ 1 % en poids. De façon avantageuse la dilution est mise en oeuvre de façon à obtenir une émulsion contenant 5% en poids d'huile végétale par rapport au poids total de la solution. Après cette dilution, en général seule la crème qui contient 64% d'huile st récupéré, le sous-nageant étant jeté car il ne contient que de toutes petites gouttes et de la 20 solution de tensioactif, et c'est la crème qui est ensuite utilisée à l'étape b) du procédé selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon 25 borate et de permanganate de potassium ou en l'utilisation d'un tampon tris HCI, avantageusement en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium. De façon avantageuse dans le cas où le composé de formule (I) est la dopamine, le ratio molaire permanganate de potassium / dopamine est compris entre 0,2 et 1, en particulier entre 0,4 et 0,8, plus particulièrement entre 0,4 et 0,6, encore plus particulièrement il est d'environ 0,5. De façon avantageuse à l'étape b) le pH est compris entre 7,5 et 9,5, avantageusement il est de 8,5. Le pH est maintenu constant pendant toute la réaction de polymérisation grâce à l'utilisation du tampon. De façon encore plus avantageuse, le surfactant non ionique de l'étape b) est un polysorbate tel que par exemple le Tween 20 commercialisée par la société Sigma-Aldrich ou un polymère tribloc, avantageusement dont la chaîne centrale est hydrophobe (par exemple il s'agit d'une chaîne polyoxypropylène) et les deux chaînes latérales sont hydrophiles (par exemple il s'agit de chaînes polyoxyéthylène), tel qu'un poloxamer comme le Poloxa mer 188 de formule (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) commercialisé par la société Croda France SAS. Avantageusement le tensioactif non ionique est présent en une teneur comprise entre sa CMC et 1 % en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée, de façon avantageuse comprise entre 0,1 et 0,5% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée, en particulier entre 0,2 et 0,3% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée. En particulier, la teneur en huile végétale de l'étape b) est comprise entre 10 et 30 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, 25 avantageusement entre 15 et 20 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion. Avantageusement, la teneur en composé de formule I dans l'étape b) est comprise entre 5 et 18mM, en particulier lorsque le composé de formule (I) est de la dopamine, l'épaisseur du film augmentant avec la teneur en composé de formule (I). Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) consiste en la dilution 5 de l'émulsion obtenue à l'étape a) dans la solution tamponnée dans des conditions oxydantes. De façon avantageuse la solution tamponnée est obtenue par dissolution du composé de formule (I) dans de l'eau tamponnée contenant le tensioactif non ionique dans des conditions oxydantes. En particulier, après dilution, l'émulsion diluée obtenue est 10 mise à incuber de façon à ce que le polymère se forme à la surface des gouttes de l'émulsion, de façon avantageuse à température ambiante, de façon particulièrement avantageuse pendant au moins 30 minutes, de façon encore plus particulièrement avantageuse sous agitation. 15 Dans un autre mode de réalisation particulier, l'étape c) consiste en une centrifugation. En effet les particules ont une densité plus faible que celle de la solution aqueuse tamponnée et les particules remontent à la surface. Il est donc possible de les prélever et/ou de prélever la phase sous nageante et de la remplacer par un autre tampon aux caractéristiques 20 physico-chimiques différentes. Les particules peuvent éventuellement être lavées avant ou après avoir été récupérées. De façon avantageuse les particules obtenues par le procédé selon la présente invention sont des microparticules ou des nanoparticules, 25 avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500pm, en particulier compris entre 400nm et à 50 pm, de façon avantageuse comprise entre 900 nm et 20 pm, en particulier comprise entre 1 et 15 pm, de façon particulière d'environ 8±2 pm. Les particules selon l'invention sont des particules de type coeur - écorce. Il s'agit donc de capsules dont l'intérieur est liquide. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d) de greffage d'une couche fonctionnelle sur la peau des particules, avantageusement la couche fonctionnelle est une couche de métallisation, une couche nucléophile telle que des protéines, des acides nucléiques, des molécules fluorescentes ou de l'acide hyaluronique ou une couche polymérique, et de récupération des particules fonctionnalisés obtenues. Il existe différents procédés pour greffer la couche fonctionnelle. En particulier ils sont décrits dans les demandes de brevet W02008/049108 et W02012/160120 et dans l'article de Lee et al. [7]. Il peut ainsi s'agir d'une métallisation sans courant pour ajouter une couche de métal sur la peau des particules, d'une réaction de la peau des particules avec des thiols ou des amines par addition de Michael ou réaction avec une base de Schiff, par exemple pour former une couche d'alcanethiol ou pour former une couche PEG à partir de PEG greffé par des amines ou des thiols ou pour former une couche d'acide hyaluronique à partir d'acide hyaluronique partiellement thiolaté ou encore pour former une couche de molécules fluorescente en utilisant une molécule fluorescente aminée (par exemple la fluoresceinamine) en particulier à une concentration de 1mM dans un tampon phosphate ou un tampon Tris à un pH de 8.0. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon la présente invention comprend une étape supplémentaire e) d'induction de fluorescence par illumination des particules obtenues à l'étape c) ou d) avec une lumière UV, avantageusement à une longueur d'onde dans la gamme des UVA ( 365 nm par exemple), da façon avantageuse pendant 3002 74 5 14 au moins 250s, en particulier pendant au moins 300s, plus particulièrement pendant au moins 400s. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon 5 l'invention comprend une étape préalable ai) avant l'étape a) de mélange de l'huile végétale avec un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E ou la lidocaine, en particulier la vitamine E. 10 Ce qui est remarquable grâce au procédé selon la présente invention, est que la taille des gouttes obtenues à l'étape a) n'est pas affectée lors de la polymérisation de l'étape b). En outre lors de l'étape b), la stabilité colloïdale de la suspension est préservée: les gouttes revêtues de polymères restent individuelles et aucun agrégat adhésif n'apparaît. 15 Toutefois la forme des gouttes peut évoluer de façon importante lors du dépôt de polymère, surtout au cours du vieillissement de la suspension des particules et en cas d'oxydation de l'huile de soja au stockage par l'oxygène de l'air. Cependant, la forme sphérique des particules peut être retrouvée par simple illumination dans les gammes de l'UV - visible des 20 particules obtenues à l'étape b) ou à l'étape c). Il semble que cette reprise de forme soit irréversible. La température n'a pas d'influence sur la forme des gouttes et finalement seul l'effet d'absorption lumineuse est en jeu. Bien que l'inventeur ne comprenne pas les détails de ce phénomène, les polymères comme la mélanine sont connus pour être de bons 25 convertisseurs d'absorption lumineuse en chaleur et aussi pour changer de structure par formation et recombinaison de radicaux sous illumination UV [9]. L'inventeur pense donc que l'absorption lumineuse et la dissipation de chaleur sont suffisantes pour ramollir le film de polymère et laisser la tension de surface du coeur redonner sa forme sphérique à la particule 3002 745 15 La présente invention concerne en outre des particules susceptibles d'être obtenues par le procédé selon la présente invention. Les particules selon l'invention sont des particules de type coeur - écorce. Il s'agit donc de 5 capsules dont l'intérieur est liquide et est constitué par une huile végétale, éventuellement comprenant un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E. L'écorce des particules est quant à elle constituée par un polymère de polydopamine, avantageusement de la polydopamine, 10 éventuellement greffée avec une couche fonctionnelle telle que décrite ci-dessus par des procédés bien connus de l'homme du métier. De façon avantageuse les particules selon la présente invention sont des microparticules ou des nanoparticules, avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500pm, en particulier compris 15 entre 400nm et 50 pm, de façon particulièrement avantageuse comprise entre 900 nm et 20 pm, en particulier comprise entre 1 et 15 pm, de façon particulière d'environ 8±2 pm. Les inventeurs se sont aperçus de façon surprenante que la couche de polymère présente à la surface des particules est photosensible. Une 20 fluorescence des particules dans un domaine très large de longueurs d'onde peut être induite par illumination prolongée dans l'UV A (365 nm), par exemple par une illumination de 100mW/cm2. Il semble par ailleurs que les particules absorbent fortement la lumière, en particulier dans la gamme des UV. 25 En outre, dans le cas où lors du procédé de fabrication les particules deviennent rugueuses, il est possible de leur faire retrouver leur forme sphérique par simple illumination dans l'UV - visible avec une cinétique qui dépend de la longueur d'onde. La présente invention concerne en outre l'utilisation des particules selon l'invention pour encapsuler des principes actifs hydrophobes pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptables et/ou en tant que traceurs fluorescents, par exemple pour la biologie, et/ou pour le relargage contrôlé par la lumière ou par des conditions physico-chimiques telles que le pH, de principes actifs hydrophobes. Dans le cas de traceurs fluorescents pour la biologie, il est possible de rendre les particules fluorescentes grâce à une stimulation lumineuse externe. Elle concerne de plus une composition pharmaceutique, cosmétique ou de diagnostique comprenant des particules selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement, cosmétiquement ou diagnostiquement acceptable. De façon avantageuse cette composition est destinée à l'administration 15 par voir topique, avantageusement elle est sensible aux UVA. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples et au vu des figures qui suivent qui sont donnés de façon indicative. 20 La figure 1 représente le spectre d'absorption UV-Visible d'une lamelle couvre-objet recouverte d'une couche de mélanine déposée dans des conditions expérimentales similaires à celles de l'exemple 1 La figure 2 représente l'évolution du profil d'intensité d'une particule obtenue selon l'exemple 1 le long d'un de ses diamètres au cours du 25 temps, avant illumination par des UVA et après illumination. La figure 3 représente la cinétique d'induction de la fluorescence du polymère de polydopamine déposée sur les particules selon l'exemple 1. La figure 4 représente le temps moyen nécessaire à la remise en forme des particules obtenues à l'exemple 1 en fonction de la longueur d'onde 3002 74 5 17 utilisée (360 nm, 488nm et 560 nm), à une intensité d'illumination constante. Exemple 1 : mise en oeuvre du procédé selon la présente 5 invention Produits chimiques utilisés : L'huile de soja (Ref. S7381), l'alginate de sodium (Ref. 180947), le chlorhydrate de dopamine (chlorhydrate de 2- (3,4-Dihydroxyphenyl)éthylamine, Ref. H8502), le permanganate de potassium (KMnO4), le borate de sodium, le tensioactif Tween 20 10 (Polysorbate 20) proviennent de la société Sigma-Aldrich. Le tensioactif copolymère tribloc Poloxa mer 188 (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) a été fourni par Croda France SAS. Tous les produits chimiques ont été utilisés tels que livrés, sans aucun traitement ni purification ultérieure. Dans toutes les expériences, de l'eau milliQ doublement déminéralisée a été utilisée (Millipore, 18,2 MQ.cm-1). Fabrication des émulsions. La fabrication des gouttes s'effectue en deux étapes : la première consiste en la fabrication d'une émulsion polydispersée en ajoutant peu à peu en cisaillant de l'huile de soja jusqu'à une fraction massique de 74%w/w dans une solution aqueuse contenant 15%w/w de tensioactif Poloxamer 188 et 2%w/w d'alginate de sodium préalablement dissous utilisé comme épaississant. La seconde étape est mise en oeuvre pour avoir une dispersion en taille monodispersée : l'émulsion préalablement préparée est cisaillée dans une cellule de Couette sous un cisaillement constant de 5000 s-1, en suivant la méthode développée par Mason et al. [14]. Caractérisation de la distribution de taille des gouttes : En sortie de l'appareil de fragmentation et après dilution de la suspension dans une solution aqueuse contenant 1%w/w de Poloxamer 188 pour la stabilité, la 3002 74 5 18 distribution en taille des gouttes a été caractérisé par vidéomicroscopie et leur diamètre moyen final est de 8 ± 2 microns. Condensation de la mélanine à la surface des gouttes. La solution réactive est réalisée en dissolvant du chlorhydrate de dopamine à une 5 concentration de 2 mg/mL (10 mmol/L) en présence d'une concentration de 5 mmol/L de permanganate de potassium (soit un ratio molaire permanganate de potassium/dopamine de 0,5) dans une solution tampon de borate de sodium (pH=8.5, 20mM) contenant 0,2 %w/w de tensioactif Tween 20 pour aider à la stabilisation des gouttes. Les gouttes 10 d'émulsions sont ensuite lavées plusieurs fois avec le tampon borate + Tween 20 (noté dans la suite tampon BT) puis mélangées à une fraction massique en huile de 20%w/w dans le tampon de réaction. La suspension est mise à incuber à température ambiante et dans l'obscurité sur un mélangeur rotatif pendant 12h au moins. A la fin de la réaction, la 15 suspension de gouttes est rincée plusieurs fois (au moins deux) avec le tampon BT par aspiration et remplacement du sous-nageant dans le tube pour enlever les réactifs qui n'auraient pas réagi de la solution. Observation par microscopie: Les images en microscopie optique ont été réalisées à l'aide d'un microscope inversé Zeiss AxioObserver D1 20 équipé d'une caméra CCD de modèle Andor Clara E. Les images sont acquises à l'aide du logiciel open-source Micro-Manager (Vale Lab, UCSB). L'épi-illumination est effectuée avec une lampe à vapeur de mercure (Osram HBO 100W) et trois cubes de filtres pour l'observation en fluorescence (Semrock, Rochester, NY, USA) correspondant à des 25 fluorophores DAPI (Exc: 360 ± 40 nm, Em.: 461 nm), FITC (Exc: 488 ± 40 nm, Em.: 515 nm) et Texas Red (Exc: 560 ± 40 nm, Em.: 620 nm). La température des échantillons a été maintenue constante et égale à 21°C dans les expériences en utilisant une platine de microscope thermoélectrique PE-100 (Linkam, Tadworth, UK) pour éviter une 3002 745 19 augmentation de la température de la suspension lors de l'utilisation de l'épi-illumination. La puissance de sortie du système d'épi-illumination a été calibrée à l'aide d'un puissancemètre spécifiquement développé pour des mesures sous 5 microscope (X-Cite Optical Powermeter, Lumen Dynamics, Canada). Dans les expériences de remise en forme sphérique des gouttes, des filtres à densité neutre ont été utilisés sur le chemin optique d'épi-illumination pour étudier l'effet de la longueur d'onde sur le phénomène, indépendamment de la puissance émise. 10 Spectrométrie d'absorbance UV-Visible des dépôts de mélanine sur des lamelles de verre. La caractérisation par spectrométrie UV-Visible des couches de mélanine n'est pas directement réalisée sur les gouttes à cause d'une trop grande diffusion élastique qui empêche la mesure, mais après dépôt de la mélanine sur des substrats de verre 15 transparents. Des lamelles couvre-objet de dimension 22x22mm sont, rincées à l'éthanol et dans l'eau déminéralisée, puis incubées pendant un temps supérieur à 12h à température ambiante, dans l'obscurité et sous agitation, dans une solution de condensation de dopamine similaire à celle utilisée pour les gouttes (chlorhydrate de dopamine [10 mmol/L] et KMnO4 20 [5 mmol/L] dans un tampon BT). A la fin de la réaction, les lamelles sont rincées délicatement avec de l'eau déminéralisée et séchée à l'aide d'un papier non peluchant de type papier joseph. Les spectres UV-Visible sont réalisés avec un spectrophotomètre à double faisceau Perkin Elmer Lambda 45. 25 3002 745 20 Résultats Dans ces conditions expérimentales, un lot de gouttes d'huile de soja monodispersées ayant un diamètre moyen de 8 ± 2 microns enrobées par de la polydopa mine a été obtenu. Les molécules de dopamine sont donc 5 capables de polycondenser pour former une fine couche de polymère à la surface des gouttes, avec un mode de dépôt similaire à ce qui a été montré pour les dépôts de polydopamine sur des supports solides [8]. Il a été choisi d'utiliser un tampon borate plutôt que le tampon TrisHCI habituellement utilisé dans la littérature car celui-ci n'a pas d'activité rédox 10 connue et qu'il a un effet protecteur pour les groupes catécholamines vis-à-vis de leur oxydation par l'oxygène dissous dans l'eau. Evolution de la couleur de la solution de réaction en l'absence de gouttes: La réaction de condensation des molécules de dopamine dans 15 des conditions aqueuses, alcalines et oxydantes se caractérise par des changements de la coloration de la solution au cours du temps. Lorsque la dopamine et le permanganate de potassium sont mélangés, la solution a une couleur rouge caractéristique, la solution de dopamine étant incolore. Au cours du temps, la solution devient peu à peu marron, grise puis noire 20 pendant la longue incubation. La couleur noire est caractéristique de l'apparition de pigments de mélanine dans la solution. Le spectre d'absorption de la couche de polydopamine déposée sur un substrat de verre a été mesuré (cf. figure 1). Le spectre d'absorption UV-Visible montre un maximum d'absorption aux alentours de 320 nm, soit 25 dans la gamme des UV-A, et une absorbance décroissante en fonction de la longueur d'onde jusqu'à l'infrarouge proche, avec un spectre d'absorption quasi-plat jusqu'à 700 nm qui explique la couleur noire du dépôt. Ce spectre est semblable à ceux obtenus pour des molécules appartenant à la famille de la mélanine, comme l'eumélanine qui est formée biologiquement à partir de la tyrosine [9]. Après une centrifugation douce de la solution réactionnelle, un précipité noir apparait au fond du tube qui correspond à des particules de mélanine formées par la polycondensation de la dopamine. En absence de permanganate de potassium, la solution de dopamine reste parfaitement incolore pendant plusieurs jours grâce à l'effet stabilisant du tampon borate sur les catécholamines. Evolution de la couleur de la suspension au cours de la condensation: Simplement diluée dans un tampon borate, une suspension de gouttes d'émulsion d'huile de soja a une couleur blanche conséquence de la diffusion de la lumière par les gouttes. Après ajout de dopamine et de permanganate de potassium et plusieurs heures d'incubation, la suspension de gouttes obtenues par le procédé selon l'invention prend une couleur gris sombre qui ne varie plus avec le temps. Une centrifugation légère de la suspension fait crémer les gouttes en haut du tube, laissant apparaître une solution légèrement grise due à la présence de petites gouttes insensibles aux trop faibles vitesses de centrifugation. En revanche, la centrifugation de la solution ne fait apparaître aucun précipité noir en bas du tube prouvant que la réaction de polycondensation de la dopamine s'effectue uniquement à la surface des gouttes dans ces conditions expérimentales. En l'absence de permanganate de potassium, les gouttes d'émulsion dans une solution de dopamine conservent leur couleur blanche pendant plusieurs jours. Aspect des gouttes et stabilité colloïdale : Les gouttes d'émulsion de soja ont une forme sphérique dans leur état natif, grâce à l'existence d'une tension de surface de quelques mN/m. Après dépôt de 3002 745 22 polydopamine selon l'invention, plusieurs remarques peuvent être faites. Tout d'abord, la distribution de taille des gouttes n'est en aucun cas modifiée par le dépôt de mélanine et la stabilité colloïdale est complètement maintenue puisque les gouttes restent individuelles et ne 5 font apparaître aucun agrégat adhésif. Si la forme des gouttes est observée, il est visible que le dépôt de mélanine à leur surface peut induire des changements de forme assez importants, et notamment de leur rugosité de surface. Suivant l'âge de l'émulsion, et possiblement la modification de la tension de surface après 10 oxydation de l'huile de soja au stockage par l'oxygène de l'air, les gouttes peuvent voir leur surface déformée par la formation du film de polymère. Induction de la fluorescence de la couche de mélanine par illumination UV : Observées par épifluorescence à différentes longueurs 15 d'ondes d'émission et d'excitation, les gouttes ne sont pas fluorescentes avec ce système d'observation. Si l'échantillon est illuminé par épi-illumination à une longueur d'onde dans la gamme UV-A (365 nm), il est à remarquer que le contour des gouttes devient peu à peu fluorescent, comme le montre la Figure 2. La cinétique de cette augmentation de cette 20 fluorescence suit une courbe en S représentée sur la Figure 3 qui peut être correctement ajusté par un modèle de Hill à trois paramètres. Reprise de forme sphérique des gouttes rugueuses : Sans rentrer dans les détails moléculaires difficiles à expliquer, le système d'épi- 25 illumination peut être utilisé pour redonner aux gouttes présentant un aspect déformé et rugueux leur forme sphérique correspondant aux gouttes d'huiles nues d'origine. Cette reprise de forme est irréversible et s'observe pour des longueurs d'onde d'illumination différentes dans le visible, avec toutefois une cinétique très différente suivant si l'illumination 3002 74 5 23 est effectuée dans l'UV ou dans le visible, comme le montre la Figure 4, puisque la reprise de forme est deux ordres de grandeurs plus rapide entre une illumination à 365nm par rapport à une illumination dans le vert, à 535 nm. Il a été confirmé que la température de l'échantillon n'a pas 5 d'influence sur la forme des gouttes, et que finalement seul l'effet d'absorption lumineuse est en jeu. Bien que les détails de ce phénomène ne soient pas compréhensibles, les polymères comme la mélanine sont connus pour être de très bon convertisseurs d'absorption lumineuse en chaleur et aussi pour changer de structure par formation et recombinaison 10 de radicaux sous illumination UV [9]. Il est possible que l'absorption lumineuse et la dissipation de chaleur soient suffisantes pour ramollir le film de polymère et laisser la tension de surface redonner sa forme sphérique à la goutte. 15 Exemple 2 : Effet du pH sur la condensation Le même procédé que dans l'exemple 1 est mis en oeuvre sauf que la quantité de tampon borate est modifiée de façon à réaliser un exemple avec un pH de 7,5 et un exemple avec un pH de 9,5. Quel que soit le pH utilisé, presqu'aucune différence n'est observé dans les 20 particules obtenues, l'aspect de la suspension étant légèrement meilleure pour un pH de 8,5. Exemple 3 : Effet du ratio dopamine/KMnO4 sur la condensation Le même procédé que dans l'exemple 1 est mis en oeuvre sauf que la 25 teneur en KMn04 varie de façon à avoir ratio molaire KMn04/dopamine de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1. Il est à remarquer qu'aucune particule n'est obtenue dans le cas où le ratio molaire KMn04/dopamine et de 0 ou 0,1. À partir de 0,2, des 3002 745 24 particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Il en est de même lorsque le ratio molaire est de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ou 1. Exemple 4 : Effet du tensioactif sur la condensation 5 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, tensioactif anionique (SDS : dodécylsulfate de sodium) en une teneur de 0,2 % en poids ou un tensioactif cationique (CTAB : bromure de cétyltriméthylammonium) en une teneur de 0,1 % en poids ont été testés à la place du tensioactif non ionique Tween 20. 10 Dans le cas de l'utilisation du tensioactif anionique une déstabilisation totale de l'émulsion et la formation d'agrégats solides de polydopamine sont observés. Dans le cas de l'utilisation du tensioactif cationique, l'émulsion est déstabilisée avant même ajout de dopamine. 15 Les tensioactifs anioniques et cationiques ne semblent donc pas pouvoir être utilisés dans le cadre du procédé de la présente invention Exemple 5 : Effet du tampon sur la condensation Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, le tampon TrisHCl à un 20 pH de 8,5 avec ou sans KMnO4 a été testé. Dans les deux cas il est possible d'obtenir des particules comme dans l'exemple 1. Ainsi dans le cas où le tampon TrisHCl est utilisé, il n'est pas nécessaire d'utiliser un même temps du KMnO4. En effet, le tampon TrisHCl n'étant pas capable de complexer le noyau catéchol de la dopamine, celui-ci est donc 25 disponible pour une oxydation par le dioxygène dissous dans le tampon. 3002 74 5 25 Exemple 6 : Effet de la concentration en dopamine sur la condensation Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, en gardant un ratio permanganate/dopamine = 0,5, différentes concentration de dopamine 5 HCI (entre 5 et 18mM) ont été testées. La formation de particules comme dans l'exemple 1 est observée dans tous les cas, la couleur variant du gris clair au gris foncé. La teneur en dopamine semble donc avoir une influence sur l'épaisseur de la peau des particules ainsi formées. 10 Exemple 7 : Effet du type surfactant non ionique sur la condensation Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, le Tween 20 a été remplacé par le Poloxamer 188 à une teneur de 0,3%. Des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Ainsi donc le type de tensioactif 15 non ionique ne semble pas avoir d'influence sur l'obtention des particules selon l'invention. Exemple 8 : Effet des conditions réactionnelles (lumière ou obscurité) sur la condensation 20 Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, l'étape de condensation en présence de dopamine à 10mM et de KMnO4 à 5mM a été réalisée en éclairant la réaction pendant toute la durée du dépôt (lumière artificielle la nuit et naturelle le jour). Des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Ainsi donc la réaction peut avoir lieu aussi bien dans l'obscurité 25 qu'à la lumière. 3002 74 5 26 REFERENCES [1] F. Leal-Calderon, V. Schmitt, and J. Bibette, Emulsion Science : Basic Principles, 2nd ed. (Springer, 2007), p. 228. [2] J. Fattaccioli et al., Soft Matter 5, 2232-2238 (2009). 5 [3] S. A. Wickline and G. M. Lanza, Circulation 107, 1092-1095 (2003). [4] M. Motornov, Y. Roiter, I. Tokarev, and S. Minko, Prog. Polym. Sci. 35, 174-211 (2010). [5] Q. Wei, et al. Polym. Chem. 1, 1430 (2010). [6] H. Lee, et al. Adv. Mater. 21, 431-434 (2009). 10 [7] H. Lee, S. Dellatore, W. Miller and Messersmith, Science 318, 426- (2007). [8] W. Wang, et al., J. Colloid Interface Sci. 358, 567-74 (2011). [9] M. D'Ischia, et al., Angew. Chem., Int. Ed. 48, 3914-21 (2009). [10] B. Yu, et al., Chem. Commun. 6789-91 (2009). 15 [11] H. Xu, X. Liu, and D. Wang, Chem. Mater. 23, 5105-5110 (2011). [12] J. Cui, et al., Adv. Funct. Mater. 20, 1625-1631 (2010). [13] J. Kim, et al., Science 335, 1201-1205 (2012). [14] T. Mason and J. Bibette, Phys. Rev. Lett. 77, 3481-3484 (1996). [15] W02008/049108. 20 [16] W02012/160120. [17] FR2747321. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication de particules de type coeur - écorce, le coeur comprenant une huile végétale et l'écorce comprenant un polymère de 5 polydopamine, le procédé comprenant les étapes suivantes : a - préparation d'une émulsion monodispersée d'une huile végétale dans une solution aqueuse ; b - mise en contact dans des conditions oxydantes de l'émulsion obtenue à l'étape a) avec une solution tamponnée ayant un pH supérieur à 7 et 10 comprenant un surfactant non ionique et un composé de formule I suivante : R3 NH OH (I) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R3 représente un 15 atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3 et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH de façon à polycondenser un polymère à la surface des gouttes de l'émulsion; c - récupération des particules de type coeur - écorce obtenues à l'étape b). 20 3002 74 5 28 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium ou en l'utilisation d'un tampon tris HCI, avantageusement en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape b) le pH est compris entre 7,5 et 9,5, avantageusement il est de 8,5. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Ri, R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène et R2 représente un groupe -OH. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules sont des microparticules ou des nanoparticules, avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 400 nm et 20 pm. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le surfactant non ionique de l'étape b) est un polysorbate ou un polymère tribloc, avantageusement présent en une teneur comprise entre 0,2 et 0,3% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'huile végétale est de l'huile de soja, avantageusement contenant en poids par rapport au poids total de l'huile - entre 7 et 10 % d'acide alpha linolénique ; - entre 50 et 54 % d'acide linoléique ; 3002 74 5 29 - entre 23 et 24 % d'acide oléique ; - entre 10 et 11 % d'acide palmitique ; - 4 % d'acide stéarique. 5 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire d) de greffage d'une couche fonctionnelle sur la peau des particules, avantageusement la couche fonctionnelle est une couche de métallisation, une couche nucléophile telle que des protéines, des acides nucléiques, des molécules fluorescentes ou 10 de l'acide hyaluronique ou une couche polymérique, et récupération des particules fonctionnalisés obtenues. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable ai) avant l'étape a) de mélange de 15 l'huile végétale avec un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 caractérisé 20 en ce que les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium et en ce que le ratio molaire permanganate de potassium /dopamine est compris entre 0,2 et 1. 25 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire e) d'induction de fluorescence par illumination des particules obtenues à l'étape c) ou d) avec une lumière UV. 3002 745 12. Particules susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Utilisation des particules selon la revendication 12 pour encapsuler des 5 principes actifs hydrophobes pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptables et/ou en tant que traceurs fluorescents et/ou pour le relargage contrôlé par la lumière ou par des conditions physico-chimiques telles que le pH, de principes actifs hydrophobes. 10 14. Composition pharmaceutique, cosmétique ou de diagnostique comprenant des particules selon la revendication 12 et un excipient pharmaceutiquement, cosmétiquement ou diagnostiquement acceptable. 15. Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle est 15 destinée à l'administration par voir topique, avantageusement en ce qu'elle est sensible aux UVA.