FR 3010527 A1 20150313 FR 1358740 A 20130911 La présente invention concerne le domaine de la caractérisation de nanoparticules. L'invention concerne plus particulièrement un procédé et une installation de caractérisation de particules, mettant en oeuvre un 5 chromatographe en phase liquide à haute précision couplé à un spectrométre de masse. La chromatographie en phase liquide est un procédé de caractérisation de particules, qui permet en particulier de séparer plusieurs composés d'un mélange pour les identifier. Elle permet notamment de 10 réaliser des analyses non possibles avec des techniques telles que la chromatographie sur couche mince ou en phase gazeuse. La figure 1, représente une installation 1 de chromatographie en phase liquide pour la mise en oeuvre d'un procédé connu de caractérisation de particules. Une telle installation comporte 15 - un réservoir 2 qui contient un échantillon des composés à séparer, appelé « solutés » ; - un ou plusieurs réservoirs 3 qui contiennent un solvant, ou éluant à des concentrations différentes ; - une pompe P qui permet de délivrer en continu l'éluant à pression, à 20 débit, et à stabilité de flux maîtrisés ; - un système d'injection 4 qui permet d'introduire l'échantillon dans le solvant, ce que l'on appelle « phase mobile » ; - une colonne 5 qui contient un agrégat de particules solides, appelées « phase solide », dans laquelle est injectée la phase mobile ; 25 - à la sortie de la colonne 5, un détecteur 6 permet de suivre en continu l'apparition des solutés ; et - un système de calcul et intégration CI qui permet de quantifier et/ou analyser les différents composés de l'échantillon. 30 En particulier, il est courant d'utiliser comme détecteur un spectrophotomètre d'absorption UV-visible (190-600 nm) relié à la sortie de colonne 5. D'autres détecteurs peuvent être utilisés, comme des réfractomètres différentiels. Depuis une vingtaine d'années, on assiste à un véritable essor des nanotechnologies pour les applications biomédicales. Le marché global pour ces applications est évalué entre 70 et 160 billions de dollars aux alentours de 2015. Les nanoparticules présentent en effet des avantages indéniables par rapport aux composés moléculaires - multi modalité : les nanoparticules peuvent incorporer au sein d'un même objet plusieurs agents potentiellement actifs en imagerie et/ou en 10 thérapie, - les nanoparticules peuvent intégrer de nombreux agents thérapeutiques ou d'imagerie au sein de la nanostructure permettant d'obtenir un meilleur signal et une meilleure efficacité thérapeutique, - les nano-objets peuvent présenter de nouvelles propriétés originales 15 à l'échelle nanométrique (optiques, magnétiques...), - un contrôle précis de la taille et de la surface des nanoparticules permet de moduler leur biodistribution permettant d'atteindre de manière efficace les sites malades tout en évitant leur reconnaissance par le système immunitaire. 20 Néanmoins, assez paradoxalement au vu de ces avantages, seules quelques formulations à base de nanoparticules ont obtenu pour le moment l'approbation de mise sur le marché de la FDA (Food and Drug Administration). La plupart de ces nanoparticules sont à base de liposome, de protéine, de polymère (pour la délivrance de médicaments) ou encore 25 d'oxyde de fer (pour l'IRM). En effet, ces nanoparticules présentent l'avantage d'être biocompatibles et/ou éliminables, Certaines stratégies visant à éliminer ces nanoparticules consiste à synthétiser des nanostructures biodégradables dont les produits de dégradation sont facilement excrétés. Ces conditions sont des prérequis pour le développement de nouvelles 30 nanoparticules destinées à la clinique. Il faut donc être en mesure de prouver que la nanoparticule ainsi que les fragments potentiellement dégradés qui la composent présentent une toxicité limitée ou bien sont éliminés rapidement dans leur intégralité. Un grand nombre de travaux ont été réalisés pour essayer de rationaliser le comportement des nanoparticules après injection intraveineuse en fonction de leur taille, leur revêtement de surface, leur charge. Même s'il reste difficile d'extrapoler des lois générales, il semble que la taille des nanoparticules soit au minimum un élément déterminant. Il est maintenant admis que les nanoparticules qui possèdent un diamètre hydrodynamique inférieur à 5-6 nm sont éliminées par les reins après injection intraveineuse. Pour des tailles supérieures, les nanoparticules sont généralement rapidement captées par le système immunitaire à moins de les rendre furtives, par exemple, par l'apport de polymères hydrophiles de types PEG. Afin d'éviter l'accumulation de nanoparticules dans le système réticulo- endothélial, on observe donc de plus en plus le développement de nanoparticules présentant des diamètres hydrodynamiques inférieurs ou proches de 5-6 nm tout en conservant des propriétés d'imagerie et de thérapie : nanoparticules à base de poly-siloxane ou de silice, nanoparticules d'or, nanoparticules d'oxyde de fer, quantum dots. De récents travaux ont également montré l'intérêt des nanoparticules de moins de 5-6 nanomètres pour une administration par les voies aériennes. Il a en effet été montré qu'après administration, les nanoparticules passaient 25 rapidement des poumons à la circulation sanguine permettant une élimination par les reins. Le développement de nanoparticules présentant une taille inférieure à 5 nm est donc amené à s'accroître encore dans les années qui viennent afin de pallier les problèmes de toxicité inhérents au développement de plus grosses 30 nanoparticules pour les applications biomédicales. De nombreuses publications s'intéressent actuellement à la toxicité des nanoparticules, l'apport d'une technologie permettant de séparer et d'analyser les différents fragments d'une nanoparticule biodégradable représente une réelle avancée pour ces études et le futur développement de nanoparticules. Aujourd'hui, les particules nanométriques détiennent un potentiel important dans le diagnostic et dans le traitement de certaines maladies. Pour ce faire, il est important que ces nanoparticules soient inoffensives et éliminées dès la fin du diagnostic ou la fin du traitement. L'article de Park & Al : « Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications », Nature Materials 8, 331 - 336 (2009), décrit le fait que malgré d'importants efforts, nombreuses sont les 10 nanoparticules qui sont administrées en vue d'un diagnostic ou un traitement, et qui sont absorbées par le système phagocytaire mononucléaire avant de trouver leur cible. Or, les nanoparticules engendrent en vieillissant des produits de dégradation, plus petits que les nanoparticules elles-mêmes et dont la toxicité est inconnue. En conséquence, ces nanoparticules 15 administrées augmentent les risques d'intoxication aiguë ou chronique non désirés. Il existe donc un besoin croissant de détecter des particules de plus en plus petites, i.e. de l'ordre du nanomètre. Néanmoins, les technologies actuelles sont limitées en termes de définition. Le document US2008173808 décrit un procédé pour la détection, 20 l'identification et la quantification de composés chimiques ou de biomolécules résultant de la biotransformation ou la dégradation d'un composé chimique parent ou d'une biomolécule parente. Les composés chimiques ou biomolécules sont présents sous forme d'impuretés formées dans la formulation pharmaceutique du composé chimique parent ou biomolécule 25 parente, et cela sans nécessairement les préparer, ou sans utiliser d'autres étalons de référence, simplement en utilisant une réponse normalisée à la chromatographie liquide de haute précision couplée à un spectromètre de masse avec une source d'électro-nébulisation. De manière similaire, l'article de Chen & Al "Study on the Photocatalytic Degradation of Methyl Orange in 30 Water Using Ag/ZnO as Catalyst by Liquid Chromatography Electrospray Ionization Ion-Trap Mass Spectrometry" Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 19, 997-1003 (2008) décrit un couplage entre la spectrométrie de masse et la chromatographie liquide pour étudier les produits de dégradation de la molécule méthyl orange dans des suspensions aqueuses contenant des nano-cristaux d'Ag/ZnO. Malheureusement, les dispositifs et procédés décrits ci-dessus utilisant la chromatographie en phase liquide de haute précision couplé à un spectromètre de masse avec une source d'électro-nébulisation ne permettent de séparer que les produits de dégradation de particules sous forme de molécules et uniquement quand ceux-ci ont des poids moléculaires inférieurs à 1000 Da. C'est pourquoi le but de l'invention est de proposer un procédé de caractérisation de particules qui remédie aux inconvénients cités ci-dessus. Ainsi, l'objet de l'invention est un procédé de caractérisation de particules contenues dans une solution, mettant en oeuvre un chromatographe en phase liquide à haute précision couplée avec un spectromètre de masse à l'aide d'une colonne de séparation externe et d'une source d'électro- nébulisation, consistant à : - faire passer la solution desdites particules par le chromatographe en phase liquide à haute précision comprenant une phase mobile aqueuse, et par la colonne contenant une phase stationnaire pour la séparation de ladite solution en éléments séparés, - faire passer les éléments séparés en sortie de colonne par la source d'électro-nébulisation, et - détecter les éléments séparés avec le spectromètre de masse, caractérisé en ce qu'il consiste à : - séparer sur la colonne des particules présentant un diamètre hydrodynamique appartenant à la gamme allant de 1 nm à 10 nm, selon leur temps d'élution par chromatographie sur colonne, et - établir le chromatogramme des éléments séparés à l'aide du spectromètre de masse. Ainsi, la détection en sortie de colonne est réalisée au moyen du spectromètre de masse qui peut donc mesurer la masse en ions totale. De plus, le couplage entre un chromatographe en phase liquide à haute précision et le spectromètre de masse est réalisé grâce à la combinaison d'une colonne et d'une source d'électro-nébulisation, pour détecter les particules. L'invention permet également la séparation de plusieurs constituants présentant un diamètre hydrodynamique appartenant à la gamme allant de 1 nm à 10 nm et présents dans la solution. De plus, le procédé selon l'invention peut présenter en outre en combinaison au moins l'une et/ou l'autre des caractéristiques additionnelles suivantes consistant à : - séparer les éléments avec une colonne d'exclusion stérique ; - analyser les éléments séparés en sortie de colonne par spectrométrie de masse à intervalles réguliers prédéterminés et à les enregistrer ; - identifier des pics d'élution et déterminer pour chaque pic la masse de l'élément correspondant ; - identifier des pics d'élution et identifier, pour chaque pic, la structure de l'élément correspondant par spectrométrie de masse ; - utiliser un spectromètre de masse haute résolution et/ou en tandem ; - réaliser les mesures de au moins trois échantillons de la solution de particules, à des stades de vieillissement différents pour établir une loi de cinétique de vieillissement des particules dans la solution en fonction du temps ; - identifier au moins un pic d'élution des éléments séparés correspondant à des produits de dégradation des particules et un pic d'élution correspondant auxdites particules ; - déterminer au moins un produit de dégradation des particules correspondant audit pic d'élution ; - calculer le temps caractéristique de dégradation des particules de la solution ; - quantifier les particules et/ou celle des produits de dégradation en fonction du vieillissement de la solution ; et - séparer des particules hybrides. En d'autres termes, la présente invention offre l'avantage de pouvoir caractériser simultanément les nanoparticules et des produits de dégradation de ces nanoparticules contenus dans la solution. De plus, en réalisant les mesures des au moins trois échantillons de la solution de particules, à des stades de vieillissement différents, la présente invention permet d'établir une loi de cinétique de vieillissement des particules dans la solution en fonction du temps. Cette loi de cinétique de vieillissement de la solution permet ensuite de prévoir l'évolution des nanoparticules dans un organisme. Un second objet de l'invention est une installation de caractérisation de particules, comprenant un chromatographe en phase liquide à haute précision, comportant une colonne de séparation externe à la sortie de laquelle les particules sont détectées, caractérisé en ce qu'elle comprend : - une colonne adaptée pour la séparation des nanoparticules 15 présentant un diamètre hydrodynamique appartenant à la gamme allant de 1 nm à 10 nm, selon leur temps d'élution par chromatographie sur colonne, et - des moyens pour nébuliser et charger électriquement lesdites particules en sortie de colonne pour qu'elles soient détectables à l'aide d'un spectromètre de masse. 20 L'installation de caractérisation de particules objet de l'invention peut comporter une colonne du type colonne d'exclusion stérique et/ou un spectromètre de masse haute résolution et/ou en tandem. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci- dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples 25 non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention. La figure 1 représente une installation de caractérisation de particules de l'art antérieur. La figure 2 représente schématiquement une installation de caractérisation de particules selon l'invention. 30 La figure 3 représente un chromatogramme selon l'invention. Les figures 4 à 8 représentent des spectres de masse selon l'invention. Les figures 9, 10 et 11 représentent des courbes de répartition de masses par déconvolution selon l'invention. La figure 12 représente en parallèle trois chromatogrammes d'une même solution à trois états de vieillissement différents. La figure 13 représente une loi de vieillissement d'une solution selon l'invention. La figure 14 représente les spectres des trois états de vieillissement de la solution. Les figures 15, 16, 17 et 18 représentent les répartitions massiques de particules en solution en Da. La figure 19 représente l'apparition des fragments ou produits de dégradation. La figure 20 représente un spectre de masse d'une solution dans un état de vieillissement d'un mois selon un réglage des masses faibles. La figure 21 représente des spectres de masse de mesures sur des urines de souris. Les figures 22 et 23 représentent les répartitions massiques de particules dans les urines de souris en Da. La figure 2 représente, selon l'invention, une installation de caractérisation de particules d'une solution. Celle-ci comporte : - un chromatographe en phase liquide à haute précision 7, - un réservoir 8 qui contient un échantillon de solution contenant les particules à caractériser; - au moins deux réservoirs 9 et 10 qui contiennent des éluants à des concentrations ou pH différents ; - au moins une pompe P9 et P10 qui permet de délivrer en continu l'éluant à pression, à débit, et à stabilité de flux maîtrisés les deux éluants ; - un système d'injection 11 qui permet d'introduire l'échantillon dans les éluants, pour former la « phase mobile » ; - une colonne 12, qui contient un agrégat de particules solides, appelées « phase solide », dans laquelle est injectée la phase mobile et délivrant en sortie des éléments séparés ; g - à la sortie de la colonne 12, une source d'électro-nébulisation 13 des éléments séparés ; et - un spectromètre de masse 14 relié en sortie à la source d'électro- nébulisation pour détecter les éléments séparés. Selon une caractéristique essentielle, la colonne 12 est particulièrement adaptée à la séparation de nanoparticules présentant un diamètre hydrodynamique (diamètre correspondant à la nanoparticule plus sa première sphère de solvatation) appartenant à la gamme allant de I nm à 10 nm. Selon un mode de réalisation avantageux, la colonne 12 consiste en une colonne du type colonne d'exclusion stérique qui consiste à séparer les produits en fonction de leurs poids moléculaires. Typiquement, un exemple particulier de cette colonne 12 est une colonne de type C4 comportant une porosité comprise entre 100 Â et 300 Â, et constituée de particules de silice dont la surface, comprise entre 170 et 400 sq.m.g-1, a été modifiée avec du RMe2SiCl, R étant une chaîne carbonée alkyle une chaine de quatre carbones pour la colonne C4, la densité de chaîne carbonée étant comprise entre 5% et 20%. Selon l'invention, le chromatographe en phase liquide 7 a été couplé à un spectromètre de masse 14 par la source d'électro-nébulisation 13. Selon un exemple de réalisation particulier, les mesures de masse ont été effectuées en utilisant un spectromètre quadripolaire linéaire d'ions de piège de masse (LTQ, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) avec la gamme de 50-4000 Th. Cela est notamment permis en mettant en oeuvre le procédé décrit ci-dessous. En particulier, ces nanoparticules peuvent être dites hybrides, à savoir comprenant d'une part au moins un atome parmi les éléments non-métalliques ou semi-métalliques, d'autre part au moins un atome choisi parmi les éléments non-métalliques ou semi-métalliques. Selon un exemple de réalisation, la séparation chromatographique d'une solution a été réalisée sur un chromatographe en phase liquide à haute précision Agitent 1260 Infinity avec un dégazeur à vide, une pompe et un échantillonneur automatique. 40 pL d'échantillon de la solution ont été chargés dans l'injection de solvant selon les rapports suivants : 95% de solvant de la pompe P9 - 5% de solvant de la pompe P10. En particulier, le solvant de la pompe P9 est composé d'eau Milli-Q / TFA 99,9:0,1 y / y c'est-à-dire volume/volume, et le solvant de la pompe P10 est composé de CH3CN/eau Milli-Q / TFA 90:9.9: 0,1 y / v / y c'est-à-dire volume/volume/volume. La colonne 12 est du type d'une colonne C4 Jupiter (150 x 4,60 mm, 5 um, de 300 Â, Phenomenex) à un débit de 0,4 mi / min pendant 5 min. La température de la colonne est maintenue à 25°C. Les échantillons ont été élués par un gradient développé à partir de 5 à 90°/© de solvant de la pompe P10 dans le solvant de la pompe P9 pendant 30 min, avant que la concentration de solvant de la pompe P10 ait été maintenue constante pendant 10 min. Ensuite, la concentration du solvant de la pompe P10 a été réduite à 5% sur une période de 10 min afin de rééquilibrer le système, suivi supplémentaire de 10 min à cette concentration finale. Une ligne de base a été réalisée selon les mêmes conditions de chargement de l'eau Milli-Q dans la boucle d'injection. Selon l'exemple de réalisation, le soluté mis en oeuvre est une solution de N-(3-diméthylarninopropy1)-N'-éthylcarbodiimide (EDC,> 98,0%), de Nhydroxysuccinimide (NHS,> 97,0%), d'hexahydrate de chlorure de gadolinium ([GdC13.6H20], 99%), d'hydroxyde de sodium (NaOH , 99.99%), d'acide chlorhydrique (HCI, 36,5 à 38%), de chlorure de sodium (NaCI,> 99,5%), de diméthylsulfoxyde (DMSO,> 99,5%), d'acétonitrile (ACN,> 99,9%) et d'acide trifluoroacétique (TFA, > 99%). Il s'agit de nanoparticules comportant un coeur et une coquille, dont le coeur est en oxyde de gadolinium et la coquille en polysiloxane. Pour la préparation de la solution de nanoparticules, seulement de l'eau Milli-Q (p> 18 M ç'2. Cm) a été utilisée. Ainsi, les nanoparticules ont été synthétisées dans un procédé connu de type « top-down » à partir d'une structure coeur-coquille fonctionnalisée par DOTA c'est-à-dire 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acide en DEG c'est-à-dire du di-éthylène glycol, constituée avec des précurseurs APTES, c'est-à-dire aminopropyl tri-éthoxysilane (H2N(CH2)3- Si(OC2H5)3, et TEOS, c'est-à-dire tétra-éthoxysilane (Si(OC2H5)4 et se terminant par une matrice de silicium avec le chélate de DOTA-Gd. Ce procédé permet classiquement la synthèse de nanoparticules affichant une moyenne de 4 ± 0,1 nm de diamètre hydrodynamique (HD) et une moyenne de 8,8 ± 1,0 kDa de masse moléculaire. La composition de nanoparticules est donnée dans le tableau suivant : ICP-MS Fraction massique (%) 11,2 8,5 8,5 30,7 Calculée La formule chimique moyenne des nanoparticules a été déduite des données du tableau ci-dessus. Ainsi, la formule d'une nanoparticule est Gd7APTESI8TEOSi2DOTAGA10,s. Les dénominations TEOS et APTES correspondent aux fragments de la matrice de polysiloxane issus des précurseurs TEOS et APTES (c'est-à-dire 902 pour le TEOS et Si01.5CH2CH2C1-12NH2 pour l'APTES ou leurs équivalents hydrolysés). DOTAGA est la dénomination de l'acide 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-glutaric anhydride-4,7,10-triacetic. Ces nanoparticules présentent des fonctions acides carboxyliques à partir des ligands DOTA libres disponibles pour le greffage des peptides tels que le cRGDfK. Pour effectuer le greffage, en outre, sur la fonction carboxylique, les ligands DOTA "libres" (par exemple, DOTA molécules qui ne sont pas chélatées par les ions gadolinium) peuvent être utilisées. Ainsi, ces particules, appelées SRP pour small rigid platform et les SRP-cRGDfK couplées au peptide cyclique cRGDfK, ont été purifiées par une membrane d'ultra-purification tangentielle connue sous la dénomination commerciale visvapins ®, afin d'obtenir des nanoparticules sans précurseurs Fraction massique (%) 11,1 8,4 8,6 31,1 et des fragmentations issues de la dégradation. Ces particules ont ensuite été lyophilisées afin de les garder stabilisées au cours du temps. Ainsi que représenté à la figure 3, chaque fois que le spectromètre de masse détecte une particule, il l'incrémente de sorte à tracer le 5 chromatogramme de la solution. Cette figure 3 qui représente le chromatogramme de la solution permet de déduire la présente dans la solution d'exemple, de trois pics d'élution : les points A, B et D, respectivement à 5,5 minutes, 6,5 minutes et 18 minutes. 10 Selon l'invention, le procédé de caractérisation de particules objet de l'invention consiste à analyser les éléments séparés en sortie de colonne par spectrométrie de masse, à savoir les nanoparticules et leurs produits de dégradation. Typiquement, un tel spectromètre de masse comporte une période T de détection avec une vitesse d'analyse de 17 000 Da/s, de telle 15 sorte que tous les T ms, il est apte à effectuer la mesure spectrale des particules qu'il détecte au fur et à mesure. Ces différentes mesures spectrales sont avantageusement sauvegardées à l'aide d'un ordinateur. Deux réglages différents du spectromètre de masse ont été utilisés un pour l'observation de masses élevées, c'est-à-dire avec des rapports 20 masse sur charge m/z allant de 2000 à 4000 et l'autre pour des masses faibles avec des rapports masse sur charge m/z allant de 150 à 2000, Ces réglages sont présentés ici à titre illustratif mais l'homme du métier sait les adapter à son utilisation particulière. En effet, les spectres de masse correspondant aux points A et B 25 représentés aux figures 4 et 5 permettent de déduire que les ions présents dans la solution ont un rapport masse sur charge inférieur à 2000. De plus, la figure 5 présente un pic qui montre une forte densité de rapport de masse sur charge entre 500 et 1000. Donc, les particules présentes dans la solution aux points A et B sont des fragments de particules de la solution 30 initiale. Les distributions isotopiques des fragments ont été enregistrées en utilisant le mode de balayage de zoom du spectromètre de masse à piège à ions LTQ. La composition globale des fragments peut s'écrire (DOTAGA)w DOTAGA(Gd)W TE0Sy APTESZ (comme précédemment TEOS et APTES représentent ici les fragments de la matrice de polysiloxane issus des précurseurs TEOS et APTES). De plus, les spectres de masse correspondant aux points C, D et E sont représentés aux figures 6, 7 et 8. En particulier, ces spectres montrent : - d'une part, des particules dont les rapports masse sur charge sont inférieurs à 500 et sous forme de Dirac et, - d'autre part, des répartitions de particules de rapport masse sur 10 charge de type gaussiennes autour de 1500. Ces spectres de masse montrent donc que la solution contient aux points C, D et E des particules de la solution initiale. En ce qui concerne les particules contenant plusieurs groupes susceptibles d'être ionisés par exemple les complexes Gd-DOTA, la source 15 d'électro-nébulisation peut produire des ions fortement chargés. Pour ces molécules qui peuvent être fortement chargées, on observe une distribution des états de charge dans le spectre de masse. Cette multiplicité d'états donne lieu à une « enveloppe » des pics dans le spectre de masse. Bien que l'« enveloppe » de pics dans les spectres de masse soit stable, l'abondance 20 relative des différents sommets a été jugée peu dépendante des conditions d'utilisation du couplage du spectromètre avec la source d'électronébulisation ou du procédé de synthèse. Un algorithme de corrélation multiplicatif est utilisé pour estimer la masse de nanoparticules à partir des spectres produits par spectrométrie de masse à électro-nébulisation. La 25 corrélation multiplicative est conçue pour améliorer le signal déconvolué lorsque la molécule mère est distribuée dans plusieurs états de charge dans le spectre mesuré. Fondamentalement, les intensités du signal ESI-MS pour chacune des positions m/z, pour différents z et m, sont multipliées ensemble pour obtenir un signal qui peut être associé à la masse moléculaire. La 30 formule suivante résume cette approche: sf ( n goniz)/ g '', où f(m) est l'intensité calculée dans le spectre de masse m, g(m/z) est l'intensité dans la masse pour charger le spectre, grills est la valeur quadratique moyenne du signal de mesure. Ainsi, il suffit alors pour les points A à E identifiés de retrouver l'enregistrement de la mesure spectrale qui en a été faite pour identifier la structure du composé correspondant par spectrométrie de masse. Par exemple, pour chaque mesure de spectre de masse des pics d'élution numérotés C, D et E, il est possible de calculer l'intégrale de la courbe pour en déduire la courbe de répartition de masses par déconvolution, les courbes de répartition de masses sont représentées aux figures 9, 10 et 11. Il apparaît grâce à la figure 9, qu'à faible temps de l'élution des nanoparticules, la distribution est centrée à 8680 Da. Il apparaît grâce aux figures 10 et 11, que pour un plus grand temps de rétention, la masse augmente légèrement de 8810 Da à 8930 Da, respectivement pour les points D et E. Comme la rétention des particules dans la colonne 12 dépend de la taille de la colonne C4 non polaire, les résultats observés sont en totale cohérence. Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre, le procédé objet de l'invention consiste à réaliser les mesures d'au moins trois échantillons d'une même solution de nanoparticules, à des stades de vieillissement différents. En effet, le procédé objet de l'invention permet ainsi d'obtenir, comme cela est représenté à la figure 12, au moins trois chromatogrammes en correspondance avec les trois stades de vieillissement de la solution. Or, comme il l'est rappelé plus haut, toute nanoparticule en vieillissant se dégrade en fragments ou produits de dégradation. Donc, ces trois chromatogrammes permettent de mettre en évidence, d'une part la quantité de nanoparticules présente dans la solution en fonction de l'état de vieillissement de la nanoparticule en solution et, d'autre part la quantité des produits de dégradation qu'elle a engendrée en se dégradant. En particulier, une loi de cinétique de vieillissement des nanoparticules peut être établie. De manière particulièrement avantageuse, un quatrième chromatogramme pour un état de vieillissement différent des trois autres est établi de sorte à établir la loi de cinétique de vieillissement de nanoparticules par modélisation par une fonction mathématique adaptée. Tel que cela apparait à la figure 12, les nanoparticules ont un temps d'élution autour de 19 minutes, alors que leurs produits de dégradation ont un temps d'élution de l'ordre de 6 minutes. En particulier, les trois stades de vieillissement de la solution testés ici sont 3 heures, 5 heures et 1 mois, à titre illustratif. En effet, la figure 13 représente une loi de cinétique de vieillissement de nanoparticules établie grâce aux mesures représentées en figure 12. Pour cela, chaque point de la figure 13 correspond à l'aire sous la courbe de la figure 12 autour du pic d'élution des nanoparticules de la solution, i.e. autour du temps de rétention proche de 19 minutes. Ainsi, la courbe établie permet de calculer le temps caractéristique de dégradation des nanoparticules, sur la figure 13 notamment ce temps est de 3 heures. Avantageusement, selon l'invention, il est donc possible de déterminer 20 grâce au spectromètre de masse, le spectre de masse des nanoparticules au cours des différents états de vieillissement de la solution. Ainsi, les spectres de masse des trois états de vieillissement de la solution sont représentés à la figure 14, obtenus pour un temps d'élution à 19 minutes selon le présent exemple de réalisation. Il s'agit donc des nanoparticules de la solution à 25 caractériser. Le fait que l'intensité des spectres de masse diminue en fonction du temps, montre que les nanoparticules contenues dans la solution sont de moins en moins pures, en ce sens qu'elles se sont dégradées avec le temps. Il suffit alors d'appliquer une déconvolution, figures 15, 16, 17 et 18 à 30 chaque courbe de vieillissement pour déterminer la répartition massique des nanoparticules en solution et ainsi leur concentration dans la solution au cours de son vieillissement. L'intensité de la distribution de masse centrée à environ 9 kDa diminue avec le vieillissement de la solution. En outre, la masse des nanoparticules diminue de 9 kDa à 8,7 kDa. Ces courbes permettent notamment de mettre en évidence que la solution se dégrade au cours du temps. En particulier, la solution représentée à la figure 18 présente peu de nanoparticules de la solution analysée par rapport aux solutions présentées aux figures 15, 16 et 17. Ainsi, l'invention permet donc de déterminer au moins un produit de dégradation ou fragment des nanoparticules dans la solution au cours de son vieillissement et d'établir une courbe de vieillissement des nanoparticules représentée à la figure 19. Ainsi, les courbes G1 et G2 représentent respectivement l'évolution des nanoparticules SPR et SRP-cRGDfK pour le pic d'élution à 19 minutes. De même, les courbes G3 et G4 représentent respectivement l'évolution des produits de dégradation des nanoparticules SPR et SRP-cRGDfK pour le pic d'élution à 6 minutes. Ainsi, la figure 20 représente un spectre de masse pour des masses faibles pour la solution de APTES17 TEOS11.5 DOTAGA10 dans un état de vieillissement d'un mois. Quatre produits de dégradation des nanoparticules de la solution ont été identifiés : le 795 DOTA(Gd)-APTES-Si(OH), le 813 DOTA(Gd)-APTES-Si(OH) + Na, le 1033 DOTA(Gd)-3APTES-Si(OH) et le 1567 Dota(Gd), Dota, 2 APTES, 2 TEOS Si(OH)2. L'invention permet donc dans l'exemple illustré de déterminer les produits de dégradation de la solution pour l'état de vieillissement d'un mois. Typiquement, la caractérisation des particules contenues dans la solution selon le présent exemple a été testée à titre illustratif, in vivo, sur des souris. En effet, les nanoparticules ont été dispersées à 10 mM (concentration exprimée par rapport à l'élément gadolinium) dans une solution tamponnée par I'HEPES à pH physiologique et rendue isotonique par ajout de chlorure de sodium. La solution tampon ainsi obtenue a ensuite été injectée par voie intraveineuse dans des souris saines. Les urines des souris ont été collectées 30 minutes et 60 minutes après l'injection pour être étudiées par spectrométrie de masse, Les spectres de masses des deux urines collectées sont représentés à la figure 21, et mettent en évidence la présence des nanoparticules et de leurs produits de dégradation. En effet, la courbe Cl montre que l'urine collectée à 30 minutes contient les nanoparticules et peu de leurs produits de dégradation. La courbe C2 montre la présence des nanoparticules ainsi que de leurs produits de dégradation. Le produit de déconvolution de l'échantillon prélevé 30 minutes après injection montre, à la figure 22, que la majorité des nanoparticules garde une masse aux alentours de 8.8 kDa correspondant à la nanoparticule non dégradée. Des massifs centrés autour de 6, 7 et 7.8 kDa témoignent de la présence de quelques particules dégradées. Des fragments apparaissant aux plus basses masses ont pu être repérés et identifiés comme ceux apparaissant lors de l'étude de vieillissement. Le produit de déconvolution de l'échantillon prélevé 60 minutes après injection montre, à la figure 23, que le massif correspondant aux particules initiales s'est considérablement réduit tandis que de nombreux fragments apparaissent aux basses masses. Cette analyse permet donc de suivre l'évolution des particules dans l'organisme. Cette évolution a confirmé les tests par HPLC-MS, notamment pour la description des différents fragments issus du vieillissement des particules. REVENDICATIONS1 - Procédé de caractérisation de particules contenues dans une solution, mettant en oeuvre un chromatographe en phase liquide à haute précision couplée avec un spectromètre de masse à l'aide d'une colonne de séparation externe et d'une source d'électro-nébulisation, consistant à : - faire passer la solution desdites particules par le chromatographe en phase liquide à haute précision comprenant une phase mobile aqueuse, et par la colonne contenant une phase stationnaire pour la séparation de ladite solution en éléments séparés, - faire passer les éléments séparés en sortie de colonne par la source d'électro-nébulisation, et - détecter les éléments séparés avec le spectromètre de masse, caractérisé en ce qu'il consiste à : - séparer sur la colonne des particules présentant un diamètre hydrodynamique appartenant à la gamme allant de 1 nm à 10 nm, selon leur temps d'élution par chromatographie sur colonne, et - établir le chromatogramme des éléments séparés par le spectromètre de masse. 2 - Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à séparer les éléments avec une colonne d'exclusion stérique. 3 - Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à analyser les éléments séparés en sortie de colonne par spectrométrie de masse à intervalles réguliers prédéterminés et à les enregistrer. 4 - Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à : - identifier des pics d'élution, - et déterminer pour chaque pic la masse de l'élément correspondant. 5 - Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il consiste à : - identifier des pics d'élution,- et identifier, pour chaque pic, la structure de l'élément correspondant par spectrométrie de masse. 6 - Procédé de caractérisation de particules selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un spectromètre de masse haute résolution et/ou en tandem. 7 - Procédé de caractérisation de particules selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser les mesures de au moins trois échantillons de la solution de particules, à des stades de vieillissement différents pour établir une loi de cinétique de vieillissement des particules dans la solution en fonction du temps. 8 - Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il consiste à identifier au moins un pic d'élution des éléments séparés correspondant à des produits de dégradation des particules et un pic d'élution correspondant auxdites particules. 9 -Procédé de caractérisation de particules selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer au moins un produit de dégradation des particules correspondant audit pic d'élution. 10 - Procédé de caractérisation de particules selon les revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à calculer le temps caractéristique de dégradation des particules de la solution. 11 - Procédé de caractérisation de particules selon les revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il consiste à quantifier les particules et/ou celles des produits de dégradation en fonction du vieillissement de la solution. 12 - Procédé de caractérisation de particules selon les revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il consiste à séparer des particules hybrides. 13 - Installation de caractérisation de particules, comprenant un chromatographe en phase liquide à haute précision, comportant une colonne de séparation externe à la sortie de laquelle les particules sont détectées, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une colonne adaptée pour la séparation des nanoparticules présentant un diamètre hydrodynamique appartenant à la gammeallant de 1 nm à 10 nm, selon leur temps d'évolution par chromatographie sur colonne, et 0 une source d'électro-nébulisation desdites particules en sortie de colonne pour qu'elles soient détectables à l'aide d'un spectromètre de masse. 14 - Installation de caractérisation de particules selon la revendication 13, caractérisée en ce que la colonne est du type colonne d'exclusion stérique. 15 - Installation de caractérisation de particules selon la revendication 13 10 ou 14, caractérisée en ce que le spectromètre de masse est un spectromètre de masse haute résolution et/ou en tandem.