FR 3002543 A1 20140829 FR 1351762 A 20130228 La présente invention a pour objet un procédé de synthèse enzymatique de flavonoïdes de formule (I) : HO (1) dans laquelle ..- représente une simple liaison ou une double liaison, RA représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy, RB représente un groupement hydroxy ou méthoxy ainsi que son application à la synthèse de dérivés de diosmétine, plus particulièrement le dérivé de diosmétine de formule (II) : (H) et les dérivés de diosmétine de formule (III) : -2- dans laquelle RI, R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou le groupement de formule (A).: HO -----,,:;_-_, 0 (A) OH Le composé de formule (I) pour lequel représente une double liaison, RA est un groupe hydroxy et RB est un groupe méthoxy est la diosmétine. Le composé de formule (I) pour lequel , Le dérivé de diosmétine de formule (II), ainsi que son activité dans le traitement de l'insuffisance veineuse et sa préparation à partir de diosmétine, ont été décrits dans le brevet EP 0 709 383. -3- Les dérivés de diosmétine de formule (III), ainsi que leur activité dans la prévention et le traitement des maladies veineuses et leur préparation à partir de diosmétine, ont été décrits dans le brevet EP 2 107 055. La diosmétine, un composé de la famille des flavones, est donc un intermédiaire-clé dans la préparation de principes actifs utiles pour la prévention et le traitement de maladies veineuses. La publication Ber. 1943, 76B, pp 452-7, décrit l'obtention de la diosmétine par bromation du triacétate de l'hespérétine puis réaction avec la soude. La publication Archiv der Pharmazie 1983, 316(3), 219-22 décrit la préparation de la diosmétine par chauffage de l'hespérétine dans la pyridine, en présence d'iode. La publication Liebigs Annalen der Chemie 1991, (12), 1285-9, décrit l'obtention de la diosmétine par pyrolyse à 300°C de la diosmine, son 7-0-rutinoside. Cependant, la diosmétine est obtenue en mélange avec de la diosmine non réagie et le monoglycoside de formule (IV) : OH OCH3 (W) Le problème de la présente invention était d'accéder à l'aglycone de formule (I) à partir de son 15 rutinoside avec un procédé performant, notamment avec un bon rendement, en minimisant la quantité de monoglycoside dans le produit final et dans des conditions moins drastiques qu'en chimie traditionnelle. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé de synthèse d'un flavonoïde de formule (I) : -4- HO (D dans laquelle représente une simple liaison ou une double liaison, RA représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy, RB représente un groupement hydroxy ou méthoxy par hydrolyse enzymatique du rutinoside correspondant de formule (V) : RB (V) OH 0 dans laquelle représente une simple liaison ou une double liaison RB représente un groupement hydroxy ou méthoxy, Rc représente un groupement hydroxy ou rutinose, RD représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy ou rutinose, l'un au moins des groupements Rc et RD étant un groupement rutinose, à l'aide d'une enzyme rutinase, dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6, préférentiellement environ 4, à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L, à un ratio E/S de 50/1 à 1/50, préférentiellement environ 1/5, à une température de 25°C à 50°C, suivie de l'isolement du composé de formule (I) ainsi obtenu. -.5- Le composé de formule (V) pour lequel représente une double liaison, RD est un groupe hydroxy, RB est un groupe méthoxy et Rc est un groupe rutinose est la diosmine. Le composé de formule (V) pour lequel représente une double liaison, RD est un atome d'hydrogène, RB est un groupe hydroxy et Rc est un groupe rutinose est risorhoifoline. Le composé de formule (V) pour lequel représente une double liaison, RD est un atome d'hydrogène, RB est un groupe méthoxy et Rc est un groupe rutinose est la linarine. Le composé de formule (V) pour lequel représente une liaison simple, RD est un groupe hydroxy, RB est un groupe méthoxy, Rc est un groupe rutinose et dont la configuration est (S) est l'hespéridine. Par enzyme rutinase, on entend enzyme capable d'hydrolyser le composé de formule (V) en son aglycone de formule (I), soit en formant directement le composé de formule (I) et le rutinose, soit par hydrolyse successive des parties rhamnose et glucose, par une double activité enzymatique alpha-L-rhamnosidase et beta-D-glucosidase, les produits formés étant alors le composé de formule (I), le rhamnose et le glucose. Les enzymes rutinases sont préférentiellement choisies parmi les naringinases, hespéridinases et aromases, plus particulièrement les naringinases et hespéridinases de Penicillium decumbens et Aspergillus piger- et les aromases de Penicillium multicolore. Le ratio solvant organique/tampon est préférentiellement compris entre 1 /50 et 1/5 (exprimé en L/L). Le solvant organique est préférentiellement choisi parmi le DMSO, le DMF, le THF, les alcools tels que le méthanol ou l'éthanol et l'acétone. La concentration en substrat est préférentiellement comprise entre 1 et 25 g/L, plus préférentiellement entre 2 et 7 g de composé de formule (V) par litre de mélange de solvants. La présente invention s'étend également à la préparation du composé de formule (II) par hydrolyse enzymatique de la diosmine en diosmétine selon l'invention, la diosmétine ainsi -6- obtenue étant ensuite traitée par un halogénure d'allyle, pour conduire au composé de formule (VI) : La présente invention s'étend également à la préparation du composé de formule (II) par hydrolyse enzymatique de l'hespéridine en hespérétine selon l'invention, l'hespérétine ainsi obtenue étant ensuite déshydrogénée en diosmétine par chauffage avec de l'iode dans la pyridine ou la morpholine, la diosmétine ainsi obtenue étant transformée en composé de formule (II) comme décrit précédemment. La présente invention s'étend également à la préparation du composé de formule (III) par hydrolyse enzymatique de la diosmine en diosmétine selon l'invention, la diosmétine ainsi obtenue étant ensuite mise en réaction avec le bromure de méthallyle, pour conduire au composé de formule (VII) : 0 (VI) OCH3 CH, H2 C Il C H 2 O dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (II). (VII) dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (Ma), cas particulier des composés de formule (III) pour lequel R1, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène : que l'on fait réagir, lorsque l'on souhaite accéder aux autres composés de formule (III), avec le composé de formule (VIII) : H3 CO CH2 I I OCH3 -7- HO O OH CH3 OH O CH, CH3 (VIII) OAc dans laquelle Ac représente le groupement acétyle, pour conduire, après déprotection de la fonction acide et des fonctions alcool du groupement (A), aux composés de formule (III) pour lesquels au moins l'un des RI, R2 et R3 est différent de H. La présente invention s'étend également à la préparation du composé de formule (III) par hydrolyse enzymatique de l'hespéridine en hespérétine selon l'invention, l'hespérétine ainsi obtenue étant ensuite déshydrogénée en diosmétine par chauffage avec de l'iode dans la pyridine ou la morpholine, la diosmétine ainsi obtenue étant transformée en composé de formule (III) comme décrit précédemment. CH 3 Les exemples suivants illustrent la présente invention. Les structures des composés décrits dans les exemples ont été déterminées selon les techniques spectrophotométriques usuelles (infrarouge, résonance magnétique nucléaire, spectrométrie de masse). -8- ABREVIATIONS ACN ACétoNitrile ATFA Acide TriFluoroAcétique DMF : DiMéthylFormamide 5 DMSO : DiMéthylSulfOxyde E/S : ratio Enzyme/Substrat exprimé en g/g HPLC : Chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance RMN : Résonance Magnétique Nucléaire THF : TétraHydroFurane 10 TMS : TétraMéthylSilane tr/min tours/min EXEMPLE 1 : Diosmétine par hydrolyse enzymatique de la diosmine avec Penicillium multicolor Dans un fermenteur réacteur double enveloppe de 5L (Sartorius), 15g (c=5g/L) de diosmine sont 15 solubilisés dans 150mL de DMSO et ajoutés à 3L de tampon acétate 20mM pH=4,0. 10g (c=3,3g/L) d'aromase de Penicillium multicolor (Amano-Japon) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 30°C, sous agitation mécanique 220 tr/min pendant 48h. Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (500mL) 20 Une analyse HPLC montre la présence très majoritaire de la diosmétine (voir Figure 1). La suspension est portée au reflux pendant lh, puis abandonnée à température ambiante toute une nuit. Après filtration sous vide des impuretés précipitées, le filtrat est évaporé pour conduire après séchage à 7,3 g de diosmétine (Rendement > 98% - poudre jaune - pureté RMN >90%). Ifl RMN (DMSO-d6, ppm / TMS) : 12,94 (1H, s); 10,7-11,0 (1H, large s); 9,4-9,5 (1H, large s); 25 7,56 (1H, d); 7,44 (1H, s); 7,10 (1H, d); 6,75 (1H, s); 6,45 (1H, s); 6,15 (1H, s); 3,86 (3H, s). SM (ES+) MH+ C16H1206 : 301. -9- EXEMPLE 2 : Diosmétine par hydrolyse enzymatique de la diosmine avec Penicillium decumbens Dans un fermenteur réacteur double enveloppe de 5L (Sartorius), 15g (c=5g/L) de diosmine sont solubilisés dans 150mL de DMSO et ajoutés à 3L de tampon acétate 20mM pH=4,0. 10g (c=3,3g/L) de naringinase de Penicillium decumbens B92 (Sigma) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 30°C, sous agitation mécanique 220 tr/min pendant 24h. Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (1L). Une analyse HPLC montre la présence de diosmétine et du composé partiellement hydrolysé de formule (IV) (monoglycoside) dans un rapport 85/15. Après évaporation de l'acétone, le produit brut est séché sous vide à 30°C pendant 12h. On obtient environ 10g d'une poudre beige/jaune. Le produit brut séché est alors repris dans 500mL d'acétone. La suspension est portée au reflux pendant lh, puis abandonnée à température ambiante toute une nuit. Après filtration sous vide, séchage et évaporation, on obtient 5,5 g de diosmétine (rendement : 79% ; pureté chimique >95%). EXEMPLE 3 : Hespérétine par hydrolyse enzymatique de l'hespéridine Dans un erlenmeyer de 1L , 0,4g (c=2g/L) d'hespéridine sont solubilisés dans 10 mL de DMSO 20 et ajoutés à 0,2 L de tampon acétate 20 mM à pH 4,1. 10 g (c=50 g/L) d'hespéridinase d'Aspergillus piger (Sigma ref H8137) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 40°C, sous agitation orbitalaire 220 tr/min pendant 24H. Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. 25 Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (100 mL) La suspension est portée au reflux pendant 1h, puis abandonnée à température ambiante pendant une nuit. Après filtration sous vide des impuretés précipitées, le filtrat est évaporé pour conduire après séchage à 0,19 g d'hespérétine (Rendement : 96% ). -10- IFT RMN (DMSO-d6, ppm / TMS) : 12,12 (1H, s); 10,74 (1H, s); 9,05 (1H, s); 6,94 (3H, m); 5,90 (2H, 2s); 5,44 (1H, dd); 3,77 (3H, s); 3,19 (1H, dd); 2,71 (1H, dd). SM (ES+) MH+ C16H1406 : 303. EXEMPLE 4 : Diosmétine à partir d'hespérétine La diosmétine est obtenue par chauffage de l'hespérétine avec de l'iode dans la pyridine, selon le procédé décrit sous « Diosmetin (2e) » à la page 221 de la publication Archiv der Pharmazie 1983, Vol 316(3), 219-22. EXEMPLE 5 : 6,8,2'-Tris-(isobut-2-en-1-y1) diosmétine Stade A : 2-{4-Méthoxy-3-1-( isobut-2-en-1-yl)oxylphényl}-5,7-bis-[( isobut-2-en-1-yl)oxyl-4H- chromen-4-one A 30 g de diosmétine sont ajoutés 69,3 g de carbonate de potassium et 450 ml d'acétone. Le mélange est chauffé au reflux pendant 4h30, puis ramené à température ambiante, puis 54 g de bromure de méthallyle sont ajoutés. Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à reflux pendant la nuit, puis ramené à température ambiante et filtré. Le gâteau est rincé à l'acétone puis le filtrat est évaporé pour conduire à un résidu qui est recristallisé dans le toluène pour conduire au produit du titre. Stade B 6,8,2'-Tris-(isobut-2-en-1-y1) diosmétine A 10 g du composé obtenu au stade précédent sont ajoutés 120 ml de N,N-diméthylaniline, puis le mélange est chauffé au reflux pendant 1h. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est recristallisé dans l'isopropanol pour conduire au produit du titre. Point de fusion : 141°C. EXEMPLE 6 : 6,8,2'-Tris-(allyl) diosmétine Stade A : 2-{3-Allyloxy-4-méthoxyphény1}-5,7-bis-(allyloxy)-4H-chromen-4-one 30 g de diosmétine dans 300 ml de diméthylformamide sont ajoutés à une suspension de 11,7 g d'hydrure de sodium dans 150 ml de diméthylformamide. Le mélange est maintenu sous agitation à 40 °C jusqu'à fin du dégagement gazeux. On l'additionne alors de 48 g de bromure d'allyle et maintient l'agitation à 40 °C pendant 22 heures. Les solvants et produits volatils sont distillés sous pression réduite. Le résidu est repris dans le chloroforme pendant 2 heures à 20 °C. On filtre alors le bromure de sodium. On amène à sec la solution de chloroforme et recristallise le résidu dans l'isopropanol. On obtient 29,4 g du composé attendu. Point de fusion : 125 °C. Stade B 6,8,2'-Tris-(ally1) diosmétine 4,2 g du composé obtenu au Stade A sont ajoutés à 30 ml de trichlorobenzène. L'ensemble est porté à reflux pendant 1 heure 30, puis refroidi à température ambiante et additionné d'éther de pétrole jusqu'à précipitation complète. L'huile obtenue se concrétise après quelques heures d'agitation. Les cristaux sont recueillis par filtration et lavés à l'éther de pétrole. Le résidu est dissout dans du dichlorométhane et la solution est filtrée sur 10 g de silice en éluant avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle (90/10). -12- Après récupération du filtrat, les solvants sont éliminés par distillation et le résidu est recristallisé dans un mélange éthanol/éther pour obtenir finalement 3,8 g du composé attendu. Point de fusion : 122-123 °C. EXEMPLE 7 : Acacétine par hydrolyse enzymatique de la linarine Dans un bain marie à 35°C et avec une agitation magnétique, solubiliser la linarine (5 mg) dans le DMSO (50111), puis ajouter cette solution dans une solution d'aromase de Penicillium multicolor (Amano-Japon) (2 mg) dans 1 ml de tampon acétate 20mM à pH=4,1. Une analyse HPLC montre que le substrat est complètement transformé en acacétine au bout de 24h. Après acidification à pH=1 par HC1 1N puis extraction à l'acétate d'éthyle, l'acacétine est 10 obtenue avec un rendement de 95%. 1H RMN (DMSO-d6 + DC1, ppm / TMS) : 8,03 (2H, d); 7,12 (2H, d); 6,84 (1H, s); 6,54 (1H, d); 6,23 (1H, d ); 3,84 (3H, s). SM (ES+) MH+ C16H1305 : 285,1 ; MNa+ : 307,1 Conditions de l'analyse HPLC 15 colonne phenomenex LUNA HST 50*3 C18(2) 2.5 ,um 0% de B à 100% de B en 8min à 40°C A (1000 eau+25 ACN+1 ATFA) B (1000 ACN+25 eau+1 ATFA) EXEMPLE 8 : Apigénine par hydrolyse enzymatique de l'isorhoifoline 20 Dans un bain marie à 35°C et avec une agitation magnétique, solubiliser l'isorhoifoline (5 mg) dans le DMSO (500), puis ajouter cette solution dans une solution d'aromase de Penicillium multicolor (Amano-Japon) (2 mg) dans 1 ml de tampon acétate 20mM à pH=4,1. Une analyse HPLC montre que le substrat est complètement transformé en apigénine au bout de 24h. Après acidification à pH 1 par HC1 1N puis extraction à l'acétate d'éthyle, l'apigénine est 25 obtenue avec un rendement de 92%. -13- RMN (DMSO-d6, ppm +DC1/ TMS) : 7,89 (2H, d); 6,93 (2H, d); 6,75 (1H, s); 6,52 (1H, d); 6,21 (1H, d ); SM (ES+) MH+ C15Hi 105 : 271,1; MNa+ : 293,0. Conditions de l'analyse HPLC : colonne phenomenex LUNA HST 50 *3 C18(2) 2.5 lm 0% de B à 100% de B en 8min à 40°C A (1000 eau+25 ACN+1 ATFA) B (1000 ACN+25 eau+1 ATFA) EXEMPLE 9 : Diosmétine par hydrolyse enzymatique de la 2-(3-{[6-0-(6-déoxy-a-L- mannopyranosyl)-P-D-glucopyranosylioxyl-4-méthoxyphény1)-5,7- dihydroxy-4H-1-benzo [b] pyran-4-one Dans un bain marie à 35°C et avec une agitation magnétique, solubiliser la 2-(34[6-0-(6-déoxya-L-mannopyranosyl)-P-D-glucopyranosyl]oxyl -4-méthoxyphény1)-5,7-dihydroxy-4H-1- benzo[b]pyran-4-one (5 mg) dans le DMSO (50u1), puis ajouter cette solution dans une solution 15 d'aromase de Penicillium multicolore (Amano-Japon) (2 mg) dans 1 ml de tampon acétate 20mM à pH=4,1. Au bout de 3 jours, l'analyse HPLC montre la formation de diosmétine (80%) en mélange avec le composé de départ non réagi (9%) et le composé partiellement hydrolysé (monoglycoside 11%). 20 Conditions de l'analyse HPLC : colonne phenomenex LUNA HST 50*3 C18(2) 2.5 pm 0% de B à 100% de B en 8min à 40°C A (1000 eau+25 ACN+1 ATFA) B (1000 ACN+25 eau+1 ATFA) 25 REVENDICATIONS1. Procédé de synthèse d'un flavonoïde de formule (I) OH O dans laquelle représente représente une simple liaison ou une double liaison, RA représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy, RB représente un goupement hydroxy ou méthoxy. par hydrolyse enzymatique du rutinoside correspondant de fo 'iule (V) : RB (V) dans laquelle représente une simple liaison ou une double liaison RB représente un groupement hydroxy ou méthoxy, Rc représente un groupement hydroxy ou rutinose, RD représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy ou rutinose, l'un au moins des groupements Re et RD étant un groupement rutinose, à l'aide d'une enzyme rutinase, dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6, à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L, 10 à un ratio E/S de 50/1 à 1/50,à une température de 25°C à 50°C, suivie de l'isolement du composé de formule (I) ainsi obtenu. 2. Procédé selon la revendication I, où l'enzyme rutinose est choisie parmi les naringinases et hespéridinases de Penicillium decumbens et Aspergillus figer et les aromases de Penicillium MtlitiC0/01*. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, où le ratio solvant organique/tampon, exprimé en L/L, est compris entre 1 /50 et 1/5. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le solvant organique est choisi parmi le DMSO, le DMF, le THF, les alcools et l'acétone. 5. Procédé de synthèse de la diosmétine, composé de formule (I) pour lequel représente une double liaison, RA est un groupe hydroxy et RB est un groupe méthoxy par hydrolyse enzymatique de la diosmine, composé de formule (V) pour lequel représente une double liaison, RD est un groupe hydroxy, RB est un groupe méthoxy et Rc est un groupe rutinose, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Procédé de synthèse du composé de formule (III) : «ID dans laquelle R1, R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou le groupement de formule (A)HO.,' -3- (A) OH par hydrolyse enzymatique de la diosmine en diosmétine selon la revendication 5, la diosmétine ainsi obtenue étant ensuite mise en réaction avec le bromure de méthallyle, pour conduire au composé de formule (VII) : CH, OCH3 0 (VII) CH2 jC H2 H 0 O CH3 dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (lila), cas particulier des composés de formule (III) pour lequel RI, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène : que l'on fait réagir, lorsque l'on souhaite accéder aux autres composés de formule (III), avec le composé de formule (VIII) : OCH3 OH CH3 C H 3 OOAc -4- H3C0 0 OAc 'OAc (VIII) dans laquelle Ac représente le groupement acétyle, pour conduire, après déprotection de la fonction acide et des fonctions alcool du groupement (A), aux composés de formule (III) pour lesquels au moins l'un des R1, R2 et R3 est différent s de H.