FR 3004726 A1 20141024 FR 1353543 A 20130418 MUTANTS THERMOSENSIBLES DE VIRUS INFLUENZA La présente invention est relative à des mutants thermosensibles de virus influenza Les virus influenza, agents de la grippe, sont parmi les principaux pathogènes respiratoires de l'homme et des animaux. Il existe trois types de virus influenza : A, B et C, les deux premiers, et notamment l'influenza A étant les plus important du point de vue de la pathologie humaine, de par sa fréquence et la gravité potentielle des pathologies associées. Les virus influenza appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae. Ils ont un génome à ARN monocaténaire négatif segmenté, composé de 8 segments chez influenza A et B, 15 et de 7 segments chez influenza C. Chez les virus influenza des types A et B, les segments 1, 2, et 3 codent respectivement pour les 3 sous-unités de l'ARN polymérase RNA dépendante : les 2 sous unités acides PB2 et PB1, et la sous-unité acide PA ; le segment 4 code pour l'une des 2 20 glycoprotéines de surface, l'hémagglutinine ; le segment 5 code pour la nucléoprotéine NP, qui s'associe aux ARNs viraux pour former la nucléocapside ; le segment 6 code pour l'autre glycoprotéine de surface, la neuraminidase NA ; le segment 7 code pour les protéines de matrice M1 et M2, et le segment 8 25 pour les protéines non-structurales NS1 et NS2. Chez les virus de type C, il n'y a qu'une seule glycoprotéine de surface : l'hémagglutinine estérase (HE), qui est codée par le segment 4, et qui remplace l'hémagglutinine et de la neuraminidase. 30 La prévention de la grippe repose principalement sur la vaccination. Le type de vaccin le plus couramment commercialisé est le vaccin inactivé, basé sur des virus cultivés sur oeufs embryonnés de poule, puis inactivés chimiquement. Plus récemment sont apparus des vaccins vivants 35 atténués, construits à partir de souches virales donneuses présentant des mutations qui atténuent leur pathogénicité. Les souches vaccinales sont des virus dits « réassortants », dont les 6 gènes internes sont ceux de la souche donneuse, et les 2 gènes HA et NA sont ceux de la souche virale vis-à-vis de laquelle on souhaite induire une protection Les vaccins vivants atténués, qui sont administrés par voie intranasale, présentent l'avantage de simuler 5 l'infection naturelle, et de permettre d'induire une réponse immune à la fois locale et systémique. Ces vaccins vivants atténués ont été initialement développés à partir de souches donneuses dites « adaptées au froid », obtenues par une série de passages en culture à 25°C. 10 II a été observé que les mutants en résultant présentaient un phénotype particulier, associant adaptation au froid (ca pour : « cold adapted), thermosensibilité (ts), et atténuation de la virulence (att). La thermosensibilité est une caractéristique très 15 intéressante pour l'obtention de vaccins vivants atténués. En effet, les mutants thermosensibles sont capables de se multiplier normalement à des températures correspondant à celles rencontrées dans le tractus respiratoire supérieur des animaux infectés (généralement de 30 à 33°C selon la 20 température de l'air inhalé), et de permettre ainsi l'initiation d'une réponse immunitaire muqueuse et sérique ; en revanche, leur thermosensibilité limite leur réplication au niveau des voies respiratoires inférieures et des poumons. A titre d'exemples, on citera la souche ca A/Ann Arbor/6/60, OU 25 la souche ca B/Ann Arbor/1/66 qui sont utilisées comme souches donneuses dans le vaccin atténué FluMistTm : la première de ces souches se réplique normalement jusqu'à 37°C, mais sa réplication est inhibée à 39°C, contrairement aux souches sauvages d'influenza A, qui se répliquent efficacement jusqu'à 30 40-41°C ; la seconde se réplique normalement jusqu'à 33°C, mais, contrairement aux souches sauvages d'influenza B, sa capacité de réplication diminue à des températures supérieures, et est inhibée à 37°C. Des approches de génétique inverse ont permis 35 d'identifier des déterminants génétiques impliqués dans la thermosensibilité de ces souches, et de les transférer à d'autres souches pour reproduire le phénotype thermosensible. Ainsi, il a été observé que la souche ca B/Ann Arbor/1/66 contenait 8 substitutions d'acides aminés, localisées dans PB2, NP, PA et Ml, et il a été montré que 3 d'entre elles (V114A et P410H sur NP et V431M sur PA) étaient impliquées dans sa thermosensibilité, et que 2 mutations supplémentaires dans M1 lui conféraient son caractère atténué; l'introduction de ces mutations dans la souche sauvage B/Yamanashi/166/98 a en outre permis de transférer à cette caractéristiques phénotypiques (HOFFMANN Virology, 79, 11014-21, 2005), De même, dernière les mêmes al., Journal of souche ca A/Ann (N34G sur et A661T et la Arbor/6/60 contient 5 substitutions en acides aminés la nucléoprotéine NP, N265S sur PB2, K391E, E581G, sur PB1) impliquées dans son caractère thermosensible et/ou dans l'atténuation de sa pathogénicité (JIN et al., Virology, 306, 18-24, 2003) ; l'introduction de ces mutations dans le 15 génome de la souche A/Puerto Rico/8/34 a permis de conférer à cette dernière le phénotype thermosensible de la souche caA/Ann Arbor/6/60 (JIN et al., Journal of Virology, 78, 995- 98, 2004) ; les mêmes mutations, introduites dans le génome de la souche A/New York/1682/2009 ont également permis 20 l'acquisition par cette dernière d'un caractère thermosensible, qui a encore été accentué par l'introduction de mutations complémentaires (P112S, N556D, Y658H) dans PB2 (ZHOU et al., Vaccine, 30, 3691-702, 2012). Ces mutants thermosensibles constituent également 25 des outils très utiles pour l'étude du cycle viral. Par exemple, l'étude d'un mutant thermosensible dans la protéine non-structurale NS1 a permis de montrer que cette protéine était impliquée dans un événement tardif de la morphogénèse virale (GARAIGORTA et al., J Virol, 79, 15246-57, 2005). Plus 30 récemment, l'étude d'une mutation thermosensible dans la nucléoprotéine NP a permis l'identification du rôle joué par NP dans la formation des particules infectieuses (NOTON et al., J Virol, 83, 562-71, 2009). Les Inventeurs ont entrepris l'identification mutations pouvant conférer un phénotype influenza, et se sont plus la polymérase virale, et 35 d'autres thermosensible chez des virus particulièrement intéressés à notamment à la sous-unité PA. L'ARN polymérase ARN dépendante des virus influenza est un hétérotrimère constitué d'une sous-unité acide, PA, et de deux sous-unités basiques, PB1 et PB2 (pour revue, cf. BOIVIN et al., J Biol Chem, 285, 28411-7, 2010). Ces sous- unités sont codées par les trois segments les plus longs du génome viral. En association avec les protéines NP et NS2 (ROBB et al., J Gen Virol, 90, 1398-407, 2009), ces trois sous-unités assurent la transcription et la réplication du génome viral. PB1, qui est codée par le segment 2, constitue la sous-unité catalytique de la polymérase, et contient les motifs caractéristiques des ARN polymérases ARN dépendantes (POCH et al., EMBO J, 8, 3867-74, 1989; MULLER et al., J Gen Virol, 75 ( Pt 6), 1345-52, 1994). Deux produits de traduction 15 mineurs du segment 2 ont également été décrits: l'un résultant d'un codon d'initiation interne, et produisant une forme de PB1 tronquée en N-terminal, et l'autre résultant d'un décalage de cadre de lecture et produisant une forme dénommée PB1-F2 qui est associée à la virulence de certaines souches (WISE et 20 al., J Virol, 83, 8021-31, 2009 ; CHEN et al., Nat Med, 7, 1306-12, 2001). La sous-unité P52, codée par le segment 1, est impliquée dans la liaison à la coiffe située à l'extrémité 5' des ARNs messagers de la cellule hôte (BLAAS et al., Nucleic 25 Acids Res, 10, 4803-12, 1982; ULMANEN et al., Proc Natl Acad. Sci U S A, 78, 7355-9, 1981). Cette coiffe sera ensuite clivée pour être utilisée comme amorce pour initier la synthèse des ARNs viraux. La sous-unité PA, codée par le segment 3, a une 30 longueur de 716 acides aminés chez influenza A, 726 acides aminés chez influenza B, 709 acides aminés chez influenza C ; elle contient deux domaines bien définis structurellement: un domaine N-terminal (acides aminés 1-196 chez influenza A, 1-195 chez influenza B, 1-178 chez influenza C) et un domaine 35 C-terminal (acides aminés 258-716 chez influenza A, 255-726 chez influenza B, 239-709 chez influenza C). Ces deux domaines sont séparés par une région charnière de 60 acides aminés. Le domaine N-terminal de la sous-unité PA est apparenté à la famille de nucléases PD-(D/E)XK (DIAS et al., Nature, 458, 914-8, 2009; YUAN et al., Nature, 458, 909-13, 2009) et possède une activité endonucléase impliquée dans le 5 clivage de la coiffe des ARNm de la cellule-hôte. Le domaine C-terminal se lie aux 15 premiers résidus de la sous-unité PB1, et il est supposé être impliqué dans la transcription de l'ARN viral: il a été observé qu'une substitution dans ce domaine (His -*Ala en position 510 de PA) inhibait fortement 10 cette transcription, sans affecter la réplication virale (FODOR et al., J Virol, 76, 8989-9001, 2002). Le segment 3 contient un second cadre ouvert de lecture accessible par décalage ribosomal (JAGGER et al., Science, 337, 199-204, 2012). Le produit de traduction 15 résultant, dénommé PA-X, contient le domaine endonucléase, suivi d'un domaine C-terminal de 61 résidus, codé par l'OFF X, et intervient dans la répression de l'expression des gènes de la cellule-hôte. L'ORF X se chevauche avec une grande partie du cadre de lecture codant pour la charnière séparant le 20 domaine endonucléase du domaine de liaison à PB1 de PA. La structure de la sous-unité PA est représentée sur la Figure 1 : Haut de la figure : cadres de lecture du segment 3 : le cadre 0 correspond à la protéine PA, et le cadre 1 à 25 PA-X ; Milieu de la figure : Alignement des séquences en acides aminés des régions charnières des protéines PA des virus influenza A, B, et C ; les résidus conservés sont listés. 30 Bas de la figure : structure tri-dimensionnelle de la protéine PA, montrant le domaine endonucléase et le domaine de liaison à PB1 connectés par la région charnière. A titre d'exemples, les séquences polypeptidiques complètes des sous-unités PA de virus influenza A (souche 35 A/WSN/1933(H1N1) ; GenBank ACF54605.1), B (souche B/Ann Arbor/1/1986 ; GenBank ABF21265.1), et C (souche C/Ann Arbor/1/50 ; GenBank Y9089654.1) sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1, 2, et 3. Les séquences des régions charnières représentées sur la Figure 1 correspondent respectivement aux acides aminés 197-257 de SEQ ID NO: 1, aux acides aminés 196-254 de SEQ ID NO: 2, et aux acides aminés 179-238 de SEQ ID NO: 3. A l'heure actuelle, la plupart des mutations de la polymérase des virus influenza conférant un phénotype thermosensible ont été identifiées au niveau des sous-unités Phi et PB2. En ce qui concerne la sous-unité PA, outre la 10 mutation V431M, située dans le domaine de liaison à PB1 chez la souche B/Ann Arbor/1/66, deux autres mutations conférant un phénotype thermosensible ont récemment été identifiées chez des souches d'influenza A : l'une (L226P) est située dans la région charnière (KAWAGUCHI et al., J Virol, 79, 732-44, 15 2005), et l'autre (F35S) dans le domaine endonucléase (ZHANG et al., Virology Journal, 9, 97, 2012). Les Inventeurs ont maintenant effectué diverses mutations, toutes localisées dans la région 197-225 chez influenza A (correspondant à la région 196-222 de la sous- 20 unité PA chez influenza B, et à la région de la sous-unité PA 179-205 chez influenza C), et conférant aux souches virales qui les portent un phénotype thermosensible. On définit ici comme mutant thermosensible d'un virus influenza, un mutant dont la température permissive 25 maximale (c'est-à-dire la température jusqu'à laquelle il peut se répliquer normalement) est plus faible que celle du virus sauvage dont il est issu. En deçà de la température permissive maximale, ce mutant thermosensible a une réplication similaire à celle du virus sauvage dont il est issu ; au-delà de la 30 température permissive maximale, sa réplication est réduite d'au moins 2 fois, de préférence au moins 5 fois, avantageusement au moins 10 fois, et de manière tout à fait préférée au moins 100 fois par rapport au virus sauvage dont il est issu. 35 La présente invention a en conséquence pour objet un procédé de préparation d'un mutant thermosensible d'un virus influenza caractérisé en ce que l'on introduit dans le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase dudit virus une ou plusieurs mutation(s) caractérisée(s) en ce qu'elle est (sont) localisée(s) dans la région dudit gène codant pour la région de la sous-unité PA correspondant à la région 197-225 de la sous-unité PA d'influenza A, ladite ou lesdites 5 mutation(s) étant choisie(s) parmi : une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 210 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une thréonine, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la 10 phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la valine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine et l'arginine et de façon tout à fait préférée par une proline ; - une mutation résultant dans la substitution de 15 l'acide aminé correspondant à la position 213 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une arginine ou une lysine, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la valine, 20 l'acide aspartique et l'acide glutamique, et de façon tout à fait préférée par une proline ; - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 216 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine 25 ou un acide aspartique, de préférence par un acide aminé choisi parmi la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la valine, la lysine et l'arginine, et de façon tout à fait préférée par une proline ; 30 - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 219 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une leucine ou une valine, de préférence par un acide aminé choisi parmi l'alanine, la proline, la cystéine, l'asparagine, la 35 glutamine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline ; - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 221 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une proline dans le cas d'influenza A, une alanine dans le cas d'influenza B, et une leucine dans le cas d'influenza C ; de préférence, cet acide aminé sera choisi parmi l'alanine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d'influenza A ; parmi la proline, la phénylalanine, la glycine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la glycine, 10 l'isoleucine, la leucine, la valine, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d'influenza B ; et parmi l'alanine, la proline, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, la phénylalanine, la glycine, l'histidine, le 15 tryptophane, et la tyrosine dans le cas d'influenza C; de manière tout à fait préférée il s'agira d'une alanine dans le cas d'influenza A, d'une proline dans le cas d'influenza B, et d'une alanine ou d'une proline dans le cas d'influenza C ; - une mutation résultant dans la substitution de 20 l'acide aminé correspondant à la position 222 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine dans le cas d'influenza A, une glycine dans le cas d'influenza B, et une proline dans le cas d'influenza C ; de préférence, cet acide aminé sera choisi parmi la proline, l'alanine, la 25 glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la lysine et l'arginine dans le cas d'influenza A ; parmi la proline, l'alanine, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, 30 l'isoleucine, la leucine, la valine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, et la tyrosine dans le cas d'influenza B ; et parmi l'alanine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, le tryptophane, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la 35 sérine, la thréonine, et la tyrosine dans le cas d'influenza C ; de manière tout à fait préférée il s'agira d'une alanine ou d'une proline dans le cas d'influenza A et d'influenza B, et d'une alanine dans le cas d'influenza C ; une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 223 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une phénylalanine, de préférence par un acide aminé choisi parmi l'alanine, la proline, la cystéine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, la tyrosine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, et la valine, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline. une mutation résultant dans la substitution de 10 l'acide aminé correspondant à la position 225 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une sérine dans le cas d'influenza A, une asparagine dans le cas d'influenza B, et une thréonine dans le cas d'influenza C, de préférence par un acide aminé choisi parmi l'alanine, la proline, l'acide 15 aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la lysine, l'arginine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, et le tryptophane dans le cas d'influenza A ; parmi l'alanine, la proline, l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'histidine, la 20 lysine, l'arginine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, la valine, et le tryptophane dans le cas d'influenza B ; et parmi l'alanine, la proline, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine et 25 l'arginine dans le cas d'influenza C, et de façon tout à fait préférée par une alanine ou une proline. Les acides aminés correspondant aux positions 210, 213, 216, 219, 221, 222, 223 et 225 de la sous-unité PA de la polymérase du virus influenza A sont respectivement situés aux 30 positions 207, 210, 213, 216, 218, 219 220 et 222 de la sous-unité PA de la polymérase du virus influenza B, et aux positions 190, 193, 196, 199, 201, 202, 203 et 205 de la polymérase du virus influenza C. Des mutations particulièrement préférées sont 35 celles induisant la substitution d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 210, 216, 219, 221, 222, 223 et 225 et de manière tout à fait préférée d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 216 et 219 de ladite sous-unité PA chez influenza A. Une ou plusieurs des mutations conformes à l'invention décrites ci-dessus peu(ven)t éventuellement être 5 combinée(s) avec d'autres mutations, afin d'améliorer encore les propriétés phénotypiques du virus muté dans le cadre d'une utilisation vaccinale, par exemple afin d'augmenter sa thermosensibilité et/ou d'accroître l'atténuation de sa virulence. Ces mutations peuvent être localisées dans d'autres 10 régions de la sous-unité PA, et/ou dans une ou plusieurs des autres protéines virales, notamment PBI, PB2, NP ou NS1. On peut par exemple introduire une mutation conforme à l'invention dans le génome d'une souche atténuée, telle que la souche A/Ann Arbor/6/60, ou B/Ann Arbor/1/66 15 mentionnées ci-dessus. Cependant, les mutations conformes à l'invention ne peuvent généralement pas être combinées avec certaines mutations additionnelles dites de réversion qui ont été identifiées par les Inventeurs. En effet, ces mutations de 20 réversion compensent les effets phénotypiques des mutations conformes à l'invention, et ont donc pour conséquence la restauration totale ou partielle d'un phénotype sauvage. Il s'agit des mutations suivantes : - une combinaison de mutations identifiées sur le 25 virus thermosensible possédant la substitution T210P : l'une de ces mutations localisée sur le codon 377 du gène PA, induit la substitution d'un acide glutamique en lysine dans le domaine d'interaction de PA à PB1, et l'autre, localisée sur le codon 20 du gène PA induit la substitution d'une alanine en 30 thréonine dans l'endonucléase de PA ; - une mutation de réversion également identifiée sur le virus thermosensible possédant la substitution T210P est localisée sur le codon 287 du gène P31, et induit la substitution d'une arginine en méthionine ; chez le mutant 35 thermosensible D216P, cette substitution R287M n'induit qu'une réversion partielle vers le phénotype sauvage. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en oeuvre en utilisant les techniques classiques de production de virus influenza recombinants par génétique inverse. Ces techniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier (cf. par exemple(NEUMANN & KAWAOKA, Virology, 287, 24350, 2001; FODOR et al., Journal of Virology, 73, 9679-82, 1999; JACKSON et al., Journal of General Virology, 92, 1-17, 2011; NEUMANN et al., Influenza Virus : Methods and Protocols, 865, 193-206, 2012; ZHOU & WENTWORTH, Methods Mol Biol, 865, 175-92, 2012). La présente invention a également pour objet les 10 virus influenza mutants obtenus par un procédé conforme à l'invention. Ces virus sont caractérisés en ce qu'ils contiennent dans le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase au moins une mutation conforme à l'invention telle que définie ci-dessus. 15 Des virus influenza mutants conformes à l'invention peuvent être utilisés notamment comme souches donneuses pour l'obtention de vaccins vivants atténués anti-grippaux. Les virus réassortants obtenus à partir de ces souches donneuses, ainsi que les vaccins vivants atténués contenant ces virus 20 réassortants font également partie de l'objet de la présente invention. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'obtention de virus influenza 25 thermosensibles conformes à l'invention. EXEMPLES: Matériel et méthodes: Souches virales : La souche virale A/WSN/1933(H1N1) a été utilisée comme support pour réaliser les mutations dans PA. 30 Cultures de cellules : Les cellules 293 T ont été cultivées en milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal. Les cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney) ont été cultivées en milieu essentiel minimum, contenant 5% de sérum de veau foetal. 35 Mutagenèse de PA : Les plasmides mutés dans le gène PA ont été construits en utilisant le kit « QuickChange mutagenesis kit » (Stratagene) pour muter les codons 197 à 225. Les mutations introduites ont été confirmées par séquençage des plasmides générés. Plasmides utilisés : Le plasmide pPolI-WSN-NA-luciferase produit un ARN similaire à l'ARN viral du segment 6, dans lequel la région codant pour la neuraminidase est remplacée par la séquence codant pour la luciférase de luciole. Génération des virus recombinés : Les virus utilisés ont été générés par génétique inverse, è partir de plasmides portant les 8 segments génomiques de la souche A/WSN/1933(H1N1), et 4 plasmides codant pour les 4 protéines du complexe de réplication (PA, PB1, PB2 et NP), en utilisant le protocole décrit par (FODOR et al., Journal of Virology, 73, 9679-82, 1999). Ces plasmides ont été utilisés pour transfecter des co-cultures de cellules 293T et MDCK. 48 heures après la transfection, les virus ont été récoltés, et utilisés pour inoculer des cellules MDCK pour la production du stock viral. Les gènes PA des virus obtenus 20 ont été séquences pour confirmer la présence des mutations souhaitées et l'absence de mutations non désirées. Essais de réplication virale : Des cellules MDCK ont été infectées à 33°C, 37°C et 39,5°C, avec le virus WSN sauvage ou chacun des mutants PA, à 25 une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01. A différents temps après l'infection, les surnageants de culture ont été récoltés, et le titre viral a été déterminé sur plaques de cellules MDCK. Essais d'activité luciférase : 30 Des cellules 2931 mises à pousser dans des puits de plaques P96 ont été transfectées avec des plasmides dérivant du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) et exprimant les protéines PB1, PB2, NP et PA (type sauvage ou mutants) et le plasmide pPolI-WSN-NA-luciferase. Les quantités de plasmide pour les 35 transfection ont été de 50 ug/puits pour pcDNA3-PA et pcDNA3- PA mutés, pcDNA3-PB1 et pcDNA3-PB2, 85 pg/puits pour pcDNA-NP et 133 ug/puits pour pPolI-WSN-NA-luciferase. Le plasmide pRSV-P-Gal (Promega) a été co-transfecté (50 pg/puits) et le dosage de l'activité P-Gal utilisé comme contrôle interne et normalisation de l'efficacité de transfection. A titre de contrôle négatif, les cellules 293T ont été transfectées avec 5 les mêmes plasmides, à l'exception de celui exprimant PA. Après transfection les cellules ont été incubées à 33°C ou 39,5°C pendant 48 h, puis lysées, et l'activité luciférase dans le lysat a été mesurée en présence de luciferine, substrat de luciférase, à l'aide d'un luminomètre TECAN, en 10 suivant les instructions du fabricant. Essais de pathogénicité : Des souris C57B1/6 (n=10) ont reçu par voie intranasale des dilutions successives de 10 en 10 de virus A/WSN/1933 ou des virus mutants D216P et L219P (de 106 à 102 15 unités formant plaque/souris, dans 50u1 de tampon PBS), et ont été pesées quotidiennement. Les souris ayant une perte de poids supérieure à 25% ont été considérées comme mortes, et euthanasiées. EXEMPLE 1 : GÉNÉRATION ET CARACTÉRISATION DES MUTANTS. 20 Des mutations ont été effectuées dans la région charnière de la protéine PA en sélectionnant les acides aminés conservés entre les virus influenza A, B, et C, ainsi que ceux situés à proximité de ces résidus. Au total, 18 positions d'acides aminés ont été sélectionnées. Deux types de 25 substitutions ont été effectuées : des substitutions par un résidu proline (sauf pour les positions 220 et 221 où figure déjà une proline), ou des substitutions par un résidu alanine. Comme le cadre de lecture de PA et l'ORF-X se chevauchent, plusieurs des substitutions effectuées dans la charnière de PA 30 engendraient également des mutations dans PA-X. Dans ce cas, afin de déterminer si le phénotype observé résultait d'une mutation dans PA ou dans PA-X, des modifications ont été introduites dans le motif de décalage du cadre de lecture ribosomal, de UUU CGU (codons 191 et 192) à DUC AGA afin de 35 réduire l'efficacité du décalage de phase du ribosome et en conséquence l'expression de PA-X. Les mutants contenant ces modifications sont désignés ci-après 191FS. 26 virus mutants, avec ou sans modifications du motif de décalage du cadre de lecture ribosomal, ont ainsi été générés. Les 3 mutants restants n'ont pas pu être produits, suggérant que les mutations correspondantes (L214P, S218P, et E237P) sont létales pour le virus. Les mutations effectuées sont représentées sur la Figure 2A. La séquence d'acides aminés du domaine charnière de PA d'influenza A, et les résidus conservés entre les virus A, B, et C sont indiqués. Les positions choisies pour les 10 mutations sont indiquées par des carrés gris foncé. Les substitutions conférant un phénotype thermosensible sont indiquées par un carré gris clair. Les substitutions n'ayant pas permis la production de virus sont indiquées par un carré noir, et les substitutions ne conférant pas de phénotype 15 thermosensible aux virus produits sont indiquées par un carré blanc. Les propriétés de réplication en cultures cellulaires des virus mutants ont été examinées par titration sur plaques de cellules MDCK. 20 Les résultats obtenus avec les mutants T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P sont illustrés par la Figure 2B. Plusieurs des mutants testés (T210P, K213P, D216P, F223P, S225P et L226P) montrent une thermosensibilité marquée. Alors qu'ils ne lysent pas ou ne lysent que faiblement les 25 cellules MDCK à 39,5°C, ils ont une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage WSN à 33°C et 37°C. Seul le mutant E227P présente une efficacité lytique comparable à celle du virus sauvage aux 3 températures testées. Pour mieux caractériser la thermosensibilité des 30 mutants, des essais de réplication virale sur cellules MDCK ont été effectués, à 37°C et 39,5°C pour les virus T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P, ainsi qu'à 33°C, 37°C et 39,5°C pour le virus L219P. La production virale (en Unités Formant Plaque (UFP)/m1) a été quantifiée à différents temps 35 après infection (MOI 0,01). Les résultats sont illustrés par la Figure 3 (A : virus T210P, K213P, D216P, F223P, L226P et E227P ; B : virus L219P). Tous les mutants ont a 37°C une cinétique de réplication similaire à celle de la souche sauvage WSN, a l'exception du mutant F223P et L219P dont la réplication apparaît ralentie. A 39,5°C, la réplication est ralentie pour 5 tous les mutants, à l'exception de E227P, par rapport au virus sauvage. Cette inhibition de la réplication apparaît modérée pour K213P et L226P pour lesquels on observe, 56 heures après infection un titre viral équivalent à celui observé avec le virus sauvage. En revanche, elle est importante pour T210P et 10 D216P, et on observe même un blocage complet de la réplication dans le cas des mutants F223P et L219P. Les effets des mutations effectuées sont résumés dans le Tableau I ci-dessous : Tableau I Virus ayant pu être obtenu par Thermosensibilité génétique inverse T210P + ++ T210P 191FS + +A_ T210A + - K213P + + K213A + - L214P - L214A + - D216P + +++ D216P 191FS + +++ D216A + Q217P + - Q217A + - S218P L219P + +++ L219A + +++ P220A + P221A + ++ N222P + + N222A + - F223P + +++ F223A + S224P + - S225P + L226P + ++ L226A + - E227P + - E227A + E237P E237A + - T210P + D216P +++ T210P + D216P 191FS + +++ Le phénotype thermosensible apparait nettement plus marqué dans le cas des substitutions par une praline que dans le cas des substitutions par une alanine. EXEMPLE 2 : ACTIVITÉ POLYMÉRASE DES COMPLEXES DE RÉPLICATION CONTENANT UNE PROTÉINE PA MUTÉE. Pour étudier les effets des substitutions sur la transcription des ARNs viraux, l'activité des protéines PA 5 mutées a été testée à l'aide d'un système de miniréplicon. Le plasmide pPoll-WSN-NA-luciferase produit un ARN viral modifié, dans lequel la région codant pour la neuraminidase est remplacée par la séquence codant pour la luciférase de luciole. Lors de la co-transfection de ce plasmide avec des 10 plasmides exprimant les protéines virales PB1, PB2, NP et PA, la production de luciférase reflète l'activité de transcription et de réplication du complexe de réplication formé par ces protéines. 48 heures après la co-transfection des cellules 15 293T, celles-ci ont été lysées, et l'activité luciférase dans le lysat a été quantifiée. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Ces résultats représentent l'activité luciférase moyenne (+/écart type), mesurée sur 3 expérimentations, et normalisée par 20 rapport à l'activité P-Galactosidase. Panneau du haut : substitutions par une proline ; panneau du bas : substitution par une alanine. Les mutants portent une substitution par une proline montrent toujours des effets plus importants sur la 25 capacité réplicative que leurs homologues substitués par une alanine. Presque toutes les mutations ont un effet moindre à 33°C qu'à 37°C et 39,5°C, ce qui suggère que la conformation de la région charnière de PA a une influence sur l'activité polymérase. Contrairement à tous les autres mutants substitués 30 par une proline, le mutant E227P montre une activité similaire à 33°C, 37°C et 39,5°C, en accord avec l'absence de thermosensibilité du virus portant la même mutation. Toutes les mutations induisant un phénotype viral thermosensible (210P, 213P, 216P, 221A, 222P, 223P et 226P) 35 montrent une activité polymérase efficace à 33°C, et une activité plus faible à 39,5°C, et même à 37°C. Plusieurs variants (E198P, I201P, L214P, S218P, P220A, Y232P and M249P) ne montrent pas ou peu d'activité luciférase à 33°C, 37°C and 39.5°C. Ces mutations entrainent probablement la perte de l'activité polymérase, induisant le défaut de réplication observé chez les virus mutants correspondants. Le variant P220A qui ne possède pas le phénotype viral thermosensible a néanmoins pu être produit. EXEMPLE 3 : PATHOGÉNICITÉ DES VIRUS MUTANTS. La pathogénicité des virus mutants par rapport au virus sauvage a été évaluée sur des souris, après administration intranasale des virus testés, par le suivi de 10 la courbe de poids et la prédiction de mortalité. Les résultats sont illustrés par la Figure 5. A des doses de 103 et 104 unités formant plaque/souris, le virus WSN induit une perte de poids marquée alors que les deux virus mutants ne provoquent aucune perte de 15 poids. A une dose de 105 unités formant plaque/souris, alors que le virus WSN provoque une baisse de poids rapide et le mutant 9216P une baisse de poids moins rapide et transitoire, le mutant L219P n'a encore aucun effet le poids des animaux infectés. A 106 unités formant plaque/souris, les virus WSN et 20 D216P induisent une perte de poids rapide et le mutant L219P une perte de poids transitoire. La dose léthale 50 (DL50), basée sur la prédiction de mort ou de survie des animaux est estimée à 3,5 (en Log d'unités formant plaque) pour le virus sauvage, >6 pour le 25 mutant L219P, et 5,5 pour 9216P. Ces résultats montrent que le phénotype thermosensible s'accompagne d'une atténuation de la pathogénicité, particulièrement importante dans le cas du virus L2192. REVENDICATIONS1) Procédé de préparation d'un mutant thermosensible d'un virus influenza caractérisé en ce que l'on introduit dans le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase dudit virus une ou plusieurs mutation(s) localisée(s) dans la région dudit gène codant pour la région de la sous-unité PA correspondant à la région 197-225 de la sous-unité PA d'influenza A, ladite ou lesdites mutation(s) étant choisie(s) parmi : - une mutation résultant dans la substitution de 10 l'acide aminé correspondant à la position 210 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une thréonine ; - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 213 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une arginine ou 15 une lysine ; - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 216 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine ou un acide aspartique ; 20 - une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 219 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une leucine ou une valine ; - une mutation résultant dans la substitution de 25 l'acide aminé correspondant à la position 221 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une proline dans le cas d'influenza A, une alanine dans le cas d'influenza B, et une leucine dans le cas d'influenza C ; - une mutation résultant dans la substitution de 30 l'acide aminé correspondant à la position 222 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une asparagine dans le cas d'influenza A, une glycine dans le cas d'influenza B, et une proline dans le cas d'influenza C ; - une mutation résultant dans la substitution de 35 l'acide aminé correspondant à la position 223 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une phénylalanine.une mutation résultant dans la substitution de l'acide aminé correspondant à la position 225 de la sous-unité PA d'influenza A, par un acide aminé autre qu'une sérine dans le cas d'influenza A, une asparagine dans le cas d'influenza B, et une thréonine dans le cas d'influenza C ; 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite mutation induit la substitution d'au moins l'un des acides aminés correspondant aux positions 216 ou 219 de ladite sous-unité PA chez influenza A par une alanine ou une proline. 3) Virus influenza mutant caractérisé en ce que le gène codant pour la sous-unité PA de la polymérase dudit virus contient au moins une mutation telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Utilisation d'un virus influenza mutant selon la revendication 3 pour la préparation d'un vaccin vivant atténué anti-grippal.