FR 3002453 A1 20140829 FR 1351813 A 20130228 Nouvelles combinaisons comprenant un extrait polyphénolique de marc de raisin avec un antihypertenseur et leurs utilisations La présente invention concerne une combinaison comprenant un extrait polyphénolique de marc de raisin avec un antihypertenseur, et son utilisation dans le traitement de l'hypertension. La présente invention concerne également un extrait polyphénolique de marc de raisin et son utilisation en tant que complément alimentaire et/ou en tant qu'aliment destiné à des fins médicales spéciales, dans le traitement de l'hypertension. L'hypertension artérielle (HTA) constitue l'un des problèmes majeurs de santé publique dans les pays développés et émergents. Il s'agit de la plus fréquente des affections cardio-vasculaires. Chez les personnes de 20 ans, le pourcentage d'hypertendus est très faible mais augmente ensuite régulièrement pour atteindre 40 % à 65 ans et 90 % à 85 ans. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé, le nombre d'individus hypertendus est en perpétuelle croissance et est estimé à 1,56 billion de personnes dans le monde d'ici 2025. Il existe deux types d'hypertension : l'hypertension essentielle et l'hypertension secondaire. Dans 95 % des cas, l'hypertension est dite essentielle ou primaire, c'est-à-dire qu'elle est de cause inconnue, mais fortement reliée à l'hérédité ou à l'environnement. L'âge, le sexe et la race sont des facteurs de risques importants dans le développement de l'hypertension essentielle. Il existe également des facteurs de risques liés au mode de vie dont l'obésité, la consommation d'alcool, la consommation en sel, le tabagisme, le stress et le manque d'exercice physique (Carretero, O. A., & Oparil, S. (2000) Circulation, 101(3), 329-335). Les autres cas d'hypertension sont dit secondaires et sont causés par une autre pathologie identifiable comme les atteintes rénales, les tumeurs des glandes surrénales ainsi que des déséquilibres hormonaux (Sukor, N. (2011). Postgraduate Medical Journal, 87(1032), 706-713). L'hypertension est aussi considérée comme un facteur de risque dans le développement de maladies cardiovasculaires. Une élévation de la pression artérielle peut causer des changements sur le coeur et les vaisseaux pouvant aller jusqu'à un accident vasculaire cérébral, des cardiopathies ischémiques (angor, infarctus du myocarde), une insuffisance cardiaque (hypertrophie du ventricule gauche) et rénale (hyperactivité du système Rénine-Angiotensine-Aldostérone) ainsi que des anévrismes (Leifert, W. R., & Abeywardena, M. Y. (2008). Nutrition Research, 28 (11), 729-737). L'effet altérant de l'hypertension sur les parois des artères favorise le dépôt de graisse et 2 3002453 l'accumulation de plaques associés à l'athérosclérose, notamment au niveau des coronaires. Actuellement, la prise en charge de l'hypertension comprend l'administration de principes actifs hypotenseurs -ou antihypertenseurs- de synthèse, ainsi que des mesures 5 hygiénico-diététiques (diminution de la consommation de sel par exemple). Plusieurs classes d'antihypertenseurs de synthèse sont connues tels que les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine, les antagonistes des récepteurs de l'angiotensine, les inhibiteurs de la rénine, les anticalciques (également appelés inhibiteurs calciques), les diurétiques et les bétabloquants. 10 Cependant, l'efficacité de ces antihypertenseurs n'est pas totalement satisfaisante. En effet, la plupart des patients hypertendus nécessitent une polythérapie, c'est-à-dire l'association de plusieurs principes actifs issus de classes différentes, à plus ou moins long terme pour obtenir un niveau tensionnel satisfaisant : une bithérapie est souvent nécessaire, voire une trithérapie. Une résistance à certains antihypertenseurs peut 15 également apparaitre, rendant ceux-ci inefficaces. C'est le cas notamment des inhibiteurs calciques. Il existe donc un besoin de trouver de nouveaux traitements de l'hypertension. Il existe également un besoin d'améliorer les traitements de l'hypertension existants. Enfin, il existe un besoin de diversifier la prise en charge de l'hypertension. 20 Le but de la présente invention est de fournir un nouveau traitement de l'hypertension. Un second but de la présente invention est de fournir un traitement amélioré de l'hypertension. 25 Un troisième but de la présente invention est d'éviter et/ou de retarder le recours à une polythérapie dans le traitement de l'hypertension. Un quatrième but de la présente invention est de diminuer les doses efficaces requises des principes actifs actuellement utilisés dans le traitement de l'hypertension. Un cinquième but de la présente invention est de permettre de vaincre les 30 résistances acquises envers les principes actifs antihypertenseurs de synthèse. La présente invention a également pour but de diversifier la prise en charge de l'hypertension. Un but de la présente invention est donc de fournir un aliment destiné à des fins médicales spéciales, notamment destiné au traitement de l'hypertension. 35 Un but de la présente invention est donc de fournir un complément alimentaire à un traitement antihypertenseur. 3 3002453 Un autre but de la présente invention est de fournir un complément alimentaire et/ou un aliment destiné à des fins médicales spéciales, afin d'améliorer l'effet antihypertenseur d'un principe actif antihypertenseur de synthèse. Un autre but de la présente invention est de fournir un complément alimentaire 5 et/ou un aliment destiné à des fins médicales spéciales en prévention de l'hypertension artérielle. Selon la présente invention, ces différents buts sont atteints au moyen d'extraits polyphénoliques issus de marc de raisin. 10 De façon surprenante, les présents inventeurs ont en effet découvert que des extraits polyphénoliques issus de marc de raisin potentialisent l'activité antihypertensive de principes actifs antihypertenseurs de synthèse, et plus particulièrement des antihypertenseurs de la famille des inhibiteurs calciques. Lesdits extraits polyphénoliques, en combinaison avec un inhibiteur calcique, 15 permettent en particulier d'obtenir un niveau tensionnel satisfaisant chez le patient hypertendu. Lesdits extraits polyphénoliques, en combinaison avec un inhibiteur calcique ont un effet synergique : l'activité antihypertensive de la combinaison est supérieure à la somme des effets antihypertenseurs obtenus séparément avec un extrait polyphénolique 20 seul et avec un inhibiteur calcique seul. Cette synergie présente l'avantage d'éviter et/ou de retarder la prise de plusieurs principes actifs antihypertenseurs de synthèse pour obtenir un niveau tensionnel satisfaisant. Cette synergie permet notamment de vaincre la résistance à certains principes actifs antihypertenseurs de synthèse. 25 Cette combinaison a également l'avantage de pouvoir maintenir et/ou diminuer les doses de l'inhibiteur calcique. Un autre avantage réside dans le fait que les effets secondaires sont diminués par la prise de ladite combinaison : un seul principe actif de synthèse est prescrit, éventuellement à dose réduite. 30 Enfin, l'extrait polyphénolique permet de diversifier la prise en charge de l'hypertension, lorsqu'il est, par exemple, présenté en tant que complément alimentaire, et/ou en tant qu'aliment destiné à des fins médicales spéciales dans le traitement de l'hypertension. 35 La présente invention concerne donc une combinaison comprenant un extrait polyphénolique de marc de raisin et un antihypertenseur. La présente invention concerne 4 3002453 plus particulièrement une combinaison comprenant un extrait polyphénolique de marc de raisin et un antihypertenseur de la famille des inhibiteurs calciques. On entend par « extrait polyphénolique de marc de raisin », ci-après appelé « extrait polyphénolique », un extrait obtenu par extraction aqueuse ou extraction 5 alcoolique d'un ou plusieurs marc(s) de raisin. On entend par « marc de raisin » les pellicules et/ou les pépins obtenus après pressurage du raisin lors de la préparation du vin, après séparation du moût. Selon un mode de réalisation particulier, les extractions aqueuses sont réalisées en plaçant des pépins et/ou des pellicules de marc de raisin (par exemple 3 kg), dans de 10 l'eau distillée (par exemple 10 kg), généralement pendant une durée de 30 minutes à 1h30, à une température généralement comprise entre 80°C et 120°C, de préférence pendant 1 heure à 100°C. Selon un mode de réalisation particulier, les extractions alcooliques sont réalisées en plaçant des pépins de marcs (par exemple 3 kg) dans l'éthanol à 70%vol (par exemple 15 10 kg) généralement pendant une durée de 30 minutes à 1h30, à une température généralement comprise entre 80°C et 120°C, de préférence pendant 1 heure à 100°C. Selon un mode de réalisation particulier, les extractions alcooliques sont réalisées en plaçant des pellicules de marcs (par exemple 3 kg) dans de l'éthanol à 70%vol. (par exemple 10 kg) pendant une durée de 30 minutes à 1h30, à une température comprise 20 entre 30°C et 70°C, de préférence pendant 1 heure à 50°C. Selon un mode de réalisation particulier, suite à l'extraction, les solvants aqueux ou alcooliques sont ensuite évaporés afin d'obtenir un résidu sec d'extrait polyphénolique de marc de raisin. Les techniques d'évaporation susmentionnées sont des techniques généralement connues de l'homme du métier. 25 Selon un mode de réalisation particulier, la concentration des extraits, c'est-à-dire l'évaporation du solvant aqueux ou alcoolique, est menée au rotavapor (soit sous vide) avec une température maximum de 35°C. Ledit extrait polyphénolique est notamment caractérisé par la présence de 30 polyphénols. On entend par « polyphénols », également appelés « composés phénoliques », une famille de molécules organiques présente dans le règne végétal. Les polyphénols naturels regroupent un vaste ensemble de substances chimiques comprenant au moins un noyau aromatique, portant un ou plusieurs groupes hydroxyles. Ils peuvent 35 comprendre des molécules simples, comme les acides phénoliques (acide gallique par exemple), et des composés hautement polymérisés, de plus de 30000 Dalton, comme les 5 3002453 tanins. Les composés phénoliques sont dotés de propriétés antioxydantes qui protègent l'organisme contre la production excessive de radicaux libres. De plus, les composés phénoliques semblent pouvoir jouer un rôle dans la prévention de l'hypertension artérielle et le dysfonctionnement endothélial induit par l'angiotensine Il en partie en prévenant le 5 stress oxydant vasculaire-dépendant de la NADPH oxydase et la formation de métabolites vasoconstricteurs. Les polyphénols contenus dans le raisin, le vin ou les végétaux sont généralement classés en flavonoïdes et non-flavonoïdes. On trouve ainsi les stilbènes et les acides phénoliques (non-flavonoïdes) d'une part, les flavones, flavonols, flavan-3-ols et 10 anthocyanes (flavonoïdes) d'autre part: - phénols simples, acides phénoliques (dérivés de l'acide benzoïque ou cinnamique), - coumarines, - naphtoquinones, 15 - stilbénoïdes ou stilbènes, - flavonoïdes, - isoflavonoïdes, - anthocyanes ; - lignanes, 20 - lignines, - tanins condensés et proanthocyanidines. Les extraits selon l'invention comprennent notamment des procyanidines et/ou des anthocyanes. 25 - Parmi les procyanidines on peut citer : les Monomères d'(Epi)catéchine, l'(Epi)Catechine gallate, les Dimères d'(Epi)catéchine, les Dimères gallate, les Trimères d'(Epi)catéchine, les Gallo (epi)Catechine trimères, les Trimères gallate, les Tetramères d'(Epi)catéchine, les Gallo (epi)Catechine tetramères, les Tetramères gallate, les Pentamères d'(Epi)catéchine, les Gallo (epi)Catechine pentamères, et les Hexamères, 30 Heptamères, Octamères, Nonamères et Decamères d'(Epi)catéchine. - Parmi les anthocyanes on peut citer : la Delphinidine-3-O-glucoside, la Cyanidine-3-O-glucoside, la Petunidine-3-O-glucoside, la Peonidine-3-O-glucoside, la Malvidine-3-O-glucoside, la Malvidine-3-O-glucoside-acetaldehyde (vitisine B), la Delphinidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside, le Dimère Mv-Cat, le Malvidine-3-O-glucoside- 35 pyruvate (vitisine A), la Dimère Mv-Cat, le Dimère Mv-Cat, Péonidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside, la Malvidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside, la Delphinidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) 6 3002453 glucoside, la Malvidine-3-O-(6"-O-caffeoyl) glucoside, la Cyanidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside, la Pétunidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside et la Malvidine-3-0-(6"-Ocoumaroyl) glucoside. Parmi les procyanidines, on peut notamment citer les monomères, les dimères, les 5 trimères, les tétramères et les pentamères d'(Epi)catéchine. Selon un mode particulier, les extraits aqueux et/ou alcooliques de pépins présentent une concentration en monomères entre 25 et 80 mg/g de matière sèche en équivalent d'(-)-épicatéchine. Selon un autre mode de réalisation, les extraits aqueux et/ou alcooliques de pellicules présentent une concentration en monomères de 1 à 30 10 mg/g de matière sèche en équivalent d'(-)-épicatéchine. Plus particulièrement, les extraits aqueux et/ou alcooliques de pépins présentent une concentration en dimères entre 5 et 33 mg/g de matière sèche en équivalent d'(-)-épicatéchine. Plus particulièrement, les extraits aqueux et/ou alcooliques de pellicules présentent une concentration en dimères de 1 à 10 mg/g de matière sèche en équivalent d'(-)-épicatéchine. 15 Parmi les anthocyanes, on peut notamment citer les anthocyanes glycosylées, les anthocyanes acétylées et les anthocyanes coumaroylées, et plus particulièrement la Delphinidine-3-O-glucoside, la Malvidine-3-O-glucoside, la Petunidine-3-O-glucoside et la Malvidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside. Selon un mode de réalisation, les extraits aqueux et/ou alcooliques de pépins 20 présentent une concentration en anthocyanes glycosylées totales entre 0,15 et 29 mg/g de matière sèche en équivalent de malvidine-3-O-glucoside. Selon un autre mode de réalisation, les extraits alcooliques de pellicules de marc comprennent entre 9 et 29 mg/g de matière sèche en équivalent de malvidine-3-O-glucoside. 25 On entend par « antihypertenseurs » ou « hypotenseurs », des principes actifs administrés pour réduire l'hypertension artérielle. L'hypertension artérielle se définit par une pression artérielle systolique supérieure à 140 mmHg et/ou une pression artérielle diastolique supérieure à 90 mmHg. De préférence, les mesures doivent être effectuées au cabinet médical et confirmées au minimum par deux mesures par consultation, au cours 30 de trois consultations successives. On entend par « niveau tensionnel satisfaisant », des chiffres tensionnels en dessous de 140 mmHg pour la pression artérielle systolique et en-dessous de 90 mmHg pour la pression artérielle diastolique. Plus particulièrement, la pression artérielle systolique est supérieure à 90 mmHg, de préférence comprise entre 90 mmHg et 140 35 mmHg (une pression artérielle systolique inférieure à 90 mmHg étant généralement considérée comme une hypotension). Le niveau tensionnel satisfaisant est déterminé par 7 3002453 le médecin, en fonction du patient (par exemple, pour un patient diabétique ou un patient insuffisant rénal, le niveau tensionnel satisfaisant est une pression artérielle systolique inférieure à 130 mmHg et/ou une pression artérielle diastolique inférieure à 80 mmHg). Les inhibiteurs calciques sont une classe de principes actifs de synthèse utilisés 5 dans le traitement de l'hypertension. Cette classe comprend notamment : - les dihydropyridines telles que la nifédipine, l'amlodipine, la félodipine, l'isradipine, la lacidipine, la nicardipine et la nitrendipine ; - les phénylalkylamines tel que le vérapamil ; - les benzothiazépines tel que le diltiazem. 10 Dans un mode de réalisation de l'invention, l'inhibiteur calcique est choisi parmi l'un des inhibiteurs calciques spécifiques cités ci-dessus. Dans un mode de réalisation préféré, l'inhibiteur calcique est le vérapamil. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait polyphénolique est un extrait 15 aqueux ou un extrait hydroalcoolique, de préférence hydroalcoolique. Selon un mode de réalisation particulier, l'extrait hydroalcoolique est réalisé avec de l'alcool éthylique à 70%vol. Selon un mode de réalisation, la combinaison telle que définie ci-dessus, comprend un extrait polyphénolique tel que défini ci-après. 20 Selon un mode de réalisation, dans la combinaison telle que définie ci-dessus, l'antihypertenseur est le vérapamil. L'invention concerne également un extrait polyphénolique de marc de raisin susceptible d'être obtenu par extraction aqueuse et/ou extraction alcoolique par mise en 25 contact avec le marc de raisin, notamment par les extractions aqueuses ou alcooliques telles que définies ci-dessus. Plus particulièrement, l'extrait de polyphénolique de marc de raisin est un extrait sec, dont le solvant (par exemple l'eau distillée ou l'alcool éthanolique à 70%vol) a été évaporé. L'extrait sec peut ensuite être traité selon des méthodes généralement connues 30 de l'homme du métier : il peut notamment être broyé, pulvérisé et/ou tamisé. Il se présente sous forme de comprimé, de granulés, ou de poudre, de préférence sous forme de poudre. Selon un mode de réalisation, l'extrait polyphénolique est issu d'un ou plusieurs 35 marc(s) de raisin de pépins et/ou de pellicules de raisin. 8 3002453 Selon un mode de réalisation, l'extrait polyphénolique de marc de raisin est issu des raisins appartenant à la variété Vitis viniferas. Selon un mode de réalisation, l'extrait polyphénolique de marc de raisin est issu d'un ou plusieurs raisin(s) appartenant à l'un des cépages choisi parmi le Grenache Long 5 du Coudoulet, le Grenache Face aux Pins, le Syrah du Plantier, le Syrah du Haut de Julien, le Carignan, le Mourvèdre, le Counoise et l'Alicante. Dans un mode de réalisation particulier, le marc de raisin est choisi parmi : - le marc de pépins du Grenache Long du Coudoulet, - le marc de pépins de Syrah du Plantier, 10 - le marc de pellicules de Syrah du Haut de Julien, - le marc de pépins de Carignan, - le marc de pellicules de Mouvèdre, - le marc de pellicules d'Alicante, et leurs mélanges. De façon préférée, l'extrait polyphénolique de marc de raisin est choisi parmi le 15 marc de raisin de pépins du Grenache Long du Coudoulet, le marc de pellicules de l'Alicante et leurs mélanges. La présente invention concerne également la combinaison telle que définie ci- dessus, pour son utilisation en tant que médicament, et plus particulièrement pour son 20 utilisation dans le traitement de l'hypertension. La présente invention concerne l'utilisation de la combinaison telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament pour traiter l'hypertension. La présente invention concerne plus particulièrement, la combinaison telle que définie ci-dessus, pour son utilisation chez des patients hypertendus, de préférence traités 25 par un inhibiteur calcique. La combinaison selon l'invention peut donc être une spécialité pharmaceutique au sens de la Directive Européenne 2001/83/CE. La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la combinaison telle que définie ci-dessus avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. On peut notamment citer comme 30 excipients pharmaceutiquement acceptables, les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides, le beurre de cacao ou les stéarates de polyéthylèneglycol, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques, etc. 35 9 3002453 L'invention concerne également l'extrait polyphénolique de marc de raisin tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans le traitement de l'hypertension, de préférence dans le traitement de patients hypertendus traités par inhibiteur calcique. 5 La présente invention concerne également un complément alimentaire comprenant l'extrait polyphénolique de marc de raisin tel que défini ci-dessus. Le complément alimentaire est entendu au sens de la Directive Européenne 2002/46/CE. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un complément alimentaire tel que défini ci-dessus, dans le traitement de l'hypertension. 10 La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un complément alimentaire tel que défini ci-dessus, dans le traitement de l'hypertension, en complément d'un inhibiteur calcique et plus particulièrement chez des patients traités par un inhibiteur calcique. L'extrait polyphénolique selon l'invention peut être notamment un aliment ou un aliment fonctionnel (ou alicament). 15 Les aliments fonctionnels, ou alicaments sont généralement définis comme un aliment conventionnel, ou qui en a l'apparence, qui fait partie de l'alimentation normale, et qui a pour caractéristique de procurer des effets physiologiques bénéfiques dépassant ses fonctions nutritionnelles habituelles ou de réduire le risque de maladies chroniques. L'extrait polyphénolique selon l'invention peut préférentiellement être un « aliment 20 diététique destiné à des fins médicales spéciales » tel que défini par la Directive 1999/21/CE. Ce type d'aliment est défini comme appartenant à une catégorie d'aliments destinés à une alimentation particulière, qui sont spécialement traités ou formulés et destinés à répondre aux besoins nutritionnels des patients et qui ne peuvent être utilisés que sous contrôle médical. Ils sont destinés à constituer l'alimentation exclusive ou 25 partielle des patients dont les capacités d'absorption, de digestion, d'assimilation, de métabolisation ou d'excrétion des aliments ordinaires ou de certains de leurs ingrédients ou métabolites sont diminuées, limitées ou perturbées, ou dont l'état de santé détermine d'autres besoins nutritionnels particuliers qui ne peuvent être satisfaits par une modification du régime alimentaire normal ou par un régime constitué d'aliments destinés 30 à une alimentation particulière ou par une combinaison des deux. Parmi ces aliments, on distingue plusieurs catégories suivant que ceux-ci peuvent ou non constituer la seule source d'alimentation des personnes auxquelles ils sont destinés. Les extraits polyphénoliques selon l'invention sont particulièrement considérés 35 comme appartenant à la catégorie des aliments incomplets du point de vue nutritionnel qui, avec une composition normale ou adaptée pour répondre aux besoins propres à une 10 3002453 pathologie, un trouble ou une maladie, ne peuvent pas constituer la seule source d'alimentation. Ils peuvent également être utilisés pour remplacer une partie du régime alimentaire du patient ou servir de complément. Dans le cadre de la présente invention, l'extrait polyphénolique tel que défini ci- 5 dessus peut être un aliment diététique destiné à des fins médicales spéciales, plus particulièrement destiné aux patients hypertendus, encore plus particulièrement aux patients hypertendus dont le traitement comprend un inhibiteur calcique. De préférence, l'inhibiteur calcique est le vérapamil. 10 La présente invention concerne également un kit comprenant la combinaison telle que définie ci-dessus, pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement de l'hypertension. La présente invention comprend également un kit comprenant : - l'extrait polyphénolique tel que défini ci-dessus, et 15 - un inhibiteur calcique, pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement de l'hypertension. Selon un mode de réalisation du kit défini ci-dessus, l'inhibiteur calcique est le vérapamil. 20 Au sens de l'invention, « simultanée » signifie que l'extrait polyphénolique et l'inhibiteur calcique sont administrés par la même voie, de préférence la voie orale et en même temps (ils peuvent par exemple être mélangés), « séparée » signifie qu'ils sont administrés par des voies différentes et/ou à des temps différents, et « étalée dans le temps » signifie qu'ils sont administrés séparément, à des temps différents. 25 La présente invention vise également une méthode de traitement de l'hypertension, comprenant l'administration à un patient hypertendu d'une combinaison telle que définie ci-dessus. La présente invention vise également une méthode de traitement de l'hypertension, comprenant l'administration à un patient traité par un inhibiteur calcique de l'extrait polyphénolique tel que défini ci-dessus. 30 Lesdits combinaison, extrait et kit selon l'invention sont utiles à titre préventif et/ou curatif, thérapeutique et/ou nutritionnel, pour usage humain et/ou animal. Les excipients nécessaires à leur mise en forme industrielle peuvent être choisis parmi toutes les matières acceptables selon la réglementation (aliment, complément alimentaire, aliment fonctionnel, composé pharmaceutique) qui régit ce produit. 11 3002453 La combinaison et/ou l'extrait polyphénolique selon l'invention peuvent être présentés sous des formes destinées à l'administration par voie orale, sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale ou rectale, notamment orale. Ils peuvent donc être notamment présents sous forme de solutés ou flacons multi- 5 doses, ou sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules molles ou dures, de granules, pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions, ou encore de crèmes, gels, pommades, pâtes, patch, etc. Ledit complément alimentaire est avantageusement formulé sous forme de dose, 10 à savoir dans une forme de présentation définie par la Directive Européenne 2002/46/CE, telle que « les gélules, les pastilles, les comprimés, les pilules et autres formes similaires, ainsi que les sachets de poudre, les ampoules de liquide, les flacons munis d'un compte-goutte et les autres formes analogues de préparations liquides ou en poudre destinées à être prises en unités de faible quantité ». 15 Les extraits polyphénoliques selon l'invention peuvent notamment être utilisés sous forme lyophilisée dans les compositions pharmaceutiques ou alimentaires selon l'invention. La présente invention vise particulièrement les formulations gastrorésistantes telles que les pâtes ou les gélules, notamment les gélules gastrorésistantes comprenant 20 la combinaison et/ou l'extrait polyphénolique selon l'invention. La dose et/ou posologie de la combinaison et/ou de l'extrait polyphénolique peut varier dans les limites importantes et peut dépendre de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet. 25 II peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque sujet est déterminé selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit sujet. Selon un mode de réalisation, l'extrait polyphénolique est formulé sous une forme 30 unitaire comprenant par exemple entre 0,5 gramme et 5 grammes de polyphénols, notamment entre 0,5 gramme et 2 grammes. 35 12 3002453 Description des figures : La figure 1 montre l'effet d'extraits polyphénoliques selon l'invention sur la pression artérielle de rats SHR. 5 La figure 2 montre les effets du vérapamil sur la pression artérielle systolique des rats. La figure 3 montre l'effet de la combinaison des extraits polyphénoliques avec le vérapamil sur la tension artérielle des rats SHR. 10 EXEMPLES : Exemple 1 : Préparation d'extraits selon l'invention 1. Matériels et méthodes : 1. A. Solvants : 15 Alcool éthylique à 70%vol (70% volume), Eau déionisée purifiée avec un système Milli-Q (Millipore, Bedford, MA),Les solvants ont fournis par Prolabo VWR ®. 1. B. Matières premières végétales : 20 Les extraits ont été réalisés sur des marcs de raisins (V.vinifera) du millésime 2010 provenant du Château de Beaucastel situé dans la vallée-du-Rhône sous l'appellation de Châteauneuf-du-Pape. Les cépages sélectionnés sont le Grenache (provenant de deux locations différentes: Grenache Long du Coudoulet-GLC et Grenache face aux PinsGFP), la Syrah (provenant de deux locations différentes : Syrah Plantier-SyR et Syrah 25 Haut de Julien-SyH), le Carignan (CAR), le Mourvèdre (MOU), la Counoise (COU) et l'Alicante (ALI). 1. C. Préparation des échantillons et extraction : Préalablement à l'extraction, une séparation pépins-pellicules a été effectuée au 30 Château de Beaucastel à l'aide d'une machine d'épépinage. 13 3002453 L'extraction des pépins et pellicules de marc de chaque cépage a été réalisée selon le protocole d'extraction suivant : 1) Extraction aqueuse : Les pépins de marcs (3 kg), sont placés dans l'eau distillée (10 kg) pendant 1 heure à 5 100°C. Les pellicules de marcs (3 kg) sont placées dans l'eau (10 kg) pendant 1 heure à 100°C. 2) Extraction alcoolique : Les pépins de marcs (3 kg), sont placés dans l'eau (10 kg) pendant 1 heure à 100°C. Les pellicules de marcs (3 kg) sont placées dans l'éthanol à 70%vol. (10 kg) pendant 1 10 heure à 50°C. La concentration des extraits est menée au rotavapor (soit sous vide ) avec une température maximum de 35°C . Les pépins et pellicules de chaque cépage ont subi deux types d'extractions différentes. Pour un même échantillon, un extrait aqueux (EAQ) et un extrait hydro- 15 alcoolique 70% (EA70) (alcool éthylique à 70%vol) ont été synthétisés, comme le montre le tableau ci-dessous : Pellicules Pépins EAQ EA70 EAQ EA70 GLC Grenache long du Coudoulet X X GFP Grenache face aux pins X X SyP Syrah plantier X X X X SyH Syrah Haut de Julien X X CAR Carignan Joseph X X X X MOU Mourvèdre X X COU Counoise ALI Alicante X X 20 14 3002453 Exemple 2: Activité anti-oxydante et composition des extraits polyphénoliques selon l'invention 1 Matériels et méthodes : 5 1. A. Solvants et réactifs : Eau déionisée purifiée avec un système Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). Les solvants sont de qualité HPLC et proviennent de Prolabo-VWR (Fontenay-sous-Bois, France) : acétonitrile, acétate d'éthyle, chloroforme, méthanol, éthanol et acétone. 10 Les réactifs proviennent de Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France) et Polyphenols Biotech (Villenave d'Ornon, France) : (+)-Catéchine, (-)-épicatéchine, B1 [(-)-épicatéchine-(4b-8)-(+)-catéchine], B2 [(-)- épicatéchine-(4b-8)-(-)-épicatéchine], B3 [(+)-catéchine-(4a-8)-(+)-catéchine] and B4 [(+)- catéchine-(4a-8)-(-)-épicatéchine], cyanidine-3-O-glucoside chloride, delphinidine-3-0- 15 glucoside chloride, malvidine-3-O-glucoside chloride, péonidine-3-O-glucoside chloride, acide gallique, 2,2-Dipheny1-1-picrylhydrazyl (DPPH), acide 6-hydroxy-2,5,7,8- tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid) diammonuim sait (ABTS), persulfate de potassium, fluorescéine, 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH), sodium dihydrogenophosphate 20 dihydrate, disodium hydrogenophosphate dodecahydrate, 2,4,6-tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), chlorure de fer hexahydraté, sulfate de fer heptahydraté, réactif de Folin Ciocalteu (2N), carbonate de sodium, sodium bisulfite, phloroglucinol, acide L(+)-tartrique, acide L-ascorbique, hydroxyde de sodium, acide chlorhydrique (37%), acide formique et acide acétique. 25 1. B. Analyses chimiques : a. Préparation des échantillons : Les extraits analysés sont ceux de l'exemple 1. Les extraits ont été solubilisés et 30 dilués de manière appropriée dans une solution modèle composée d'eau/éthanol (90:10, v/v, pH 3, 5 ajusté avec de l'acide tartrique). b. Dosage des composés phénoliques totaux : La concentration en polyphénols totaux des extraits a été déterminée par le réactif de 35 Folin-Ciocalteu qui est un mélange d'acides phosphotungstique (H3PVV12014) et phosphomolybdique (H3PMo12040). Les groupements hydroxyles des phénols sont oxydés et les acides réduits en tungstène et en molybdène. En fonction de la quantité de phénols 15 3002453 présents et en milieu alcalin, une coloration bleue apparaît (V.L. Singleton and Joseph A. Rossi, J. (1965). 1965. In American Journal of Enology and Viticulture, vol. 16 (pp. 144158)). Les solutions d'extraits (500pL) ont été mises en présence du réactif de Folin- 5 Ciocalteu (2,5 mL) et de solution de carbonate de sodium (10 mL). Le milieu réactionnel a été complété jusqu'au trait de jauge (50 mL) avec de l'eau distillée. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance des échantillons est mesurée à 760 nm sous 10 mm de parcours optique par rapport à l'eau distillée (UV-vis spectrophotometer, Genway-6305). Un blanc est analysé dans les mêmes conditions. 10 L'absorbance des échantillons est rapportée à une gamme d'étalon d'acide gallique. La concentration en polyphénols totaux des extraits est exprimée en équivalent acide gallique (mg/g d'extrait). c. Dosages des tannins totaux : 15 La teneur en tannins totaux des extraits a été déterminée à l'aide du test de Bate- Smith (Ribéreau-Gayon, P. S., E. (1966). Chimie Analytique (48), 188-196) qui est basée sur la propriété des proanthocyanidines à se transformer en anthocyanines colorées en milieu acide, chauffé à 100°C et quantifiable par spectrophotométrie à 550nm. La solution d'extrait à tester a été mise dans deux tubes (2mL dans chaque) et sont mis en présence 20 de 1mL d'eau distillée et 3 mL d'acide chlorhydrique (12N). Un des deux tubes, hermétiquement fermé, a été placé au bain marie à 100°C pendant 30 minutes puis refroidi dans la glace pendant 10 minutes. Dans chaque tube, 500 pL d'éthanol ont été ajouté dans chacun des deux tubes. La différence d'absorbance a été mesurée à 550 nm par rapport à l'eau sous 1cm de parcours optique. La concentration a été calculée en mg 25 de matière sèche par la formule : [Tannins totaux] = 19,33/50 x (D055onm tube témoin - DOssonm tube hydrolysé) d. Dosages des anthocyanes totales : Les anthocyanes totales ont été déterminées grâce à la méthode de décoloration au 30 bisulfite proposée par Ribéreau Gayon, P. a. S., E. . (1965). Bulletin de la Société Chimique de France (9), (2649-2652). Les anthocyanes totales se trouvent sous plusieurs formes : les anthocyanes à l'état libre et les anthocyanes combinées aux tannins dont une fraction est décolorable par le SO2 et l'autre insensible. Une première solution a été préparée par addition de 1 mL d'extrait à doser, 1 mL d'éthanol acidifié à 0,1% d'acide 35 chlorhydrique (12N) et 20 mL à 2% d'acide chlorhydrique (12N). 16 3002453 Dans un premier tube à essai, 10 mL de la solution précédente ont été ajoutés à 4 mL d'eau distillée (tube témoin) puis dans un deuxième tube à essai, 10 mL de la première solution ont été ajoutés à 4 mL de bisulfite de sodium à 15% (tube bisulfite). L'absorbance a été mesurée à 520 nm sous un parcours optique de 1 cm par rapport à 5 l'eau après 20 minutes d'incubation à température ambiante. La concentration a été calculée en mg/g de matière sèche par la formule suivante : [Anthocyanes totales] = 875 x (D055onm tube témoin - D055onm tube bisulfite) e. Identification et quantification des proanthocyanidines par HPLC-fluo 10 Les extraits à doser ont été solubilisés dans une solution eau/méthanol (50/50. v/v), filtrés (0, 45 pM) et analysés selon la méthode adaptée par Silva, M. A., Ky, I., Jourdes, M., & Teissedre, P. L. (2011). European Food Research and Technology, 1-5.). Les analyses ont été réalisées sur un appareil Thermo-Finnigan Surveyor (Thermo, electron Corporation) composé d'un module de pompes (Surveyor LC pump Plus), d'un 15 passeur (Thermo-Finnigan autosampler) et d'un détecteur UV-Vis à barrette de diodes (250-700nm) (Surveyor PDA Plus). Ce système est couplé à un Fluorimètre (FL plus Detector). Le détecteur UV est piloté par le logiciel XCalibur et celui de fluorescence par le logiciel ChromQuest 4.2 (Thermo, Electron corporation). La séparation a été effectuée en utilisant une colonne Lichrospher C18 phase inverse (250 mm x 4 mm, 5 pm) éluée 20 avec un débit de 1 mL/min et dont le volume d'injection fixée à 20 pL. Les deux solvants sont eau/acide formique (99/1, v/v) (solvant A) et acétonitrile/acide formique (99/1, v/v) (solvant B). Le gradient de la phase mobile est le suivant : 8% de B à 0 min, 18% de B à 21 min et 100% de B à 22 min. La colonne est lavée avec 100 % de B pendant 3 min et rééquilibrée avec 8 % de B pendant 5 min avant la prochaine injection. La détection par 25 fluorescence est fixée pour une valeur d'excitation à 280 nm et d'émission à 320 nm. L'identification des molécules a été réalisée par comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des standards commerciaux (C, EC, B1, B2, B3, B4 et Cl avec C étant la catéchine, EC étant l'Epicatéchine, B1 étant le Procyanidine dimère B1, B2 étant le Procyanidine dimère B2, B3 étant le Procyanidine dimère B3, B4 étant le Procyanidine 30 dimère B4 et Cl le Procyanidine trimère C1). Les résultats sont exprimés en mg/g de matière sèche. f. Identification et quantification des anthocyanines par HPLC-UV : Avant injection, les extraits à doser ont été solubilisés dans une solution 35 eau/méthanol (50/50, v/v) et filtrés (0,45 pM). L'appareil de séparation consiste en un système UPLC Thermo-Accela composé par un détecteur UV-Vis (Accela PDA detector), 17 3002453 d'un passeur d'échantillon (Thermo-Accela autosampler) et d'un module de pompe (Accela 600 pump). L'ensemble est piloté par le logiciel Xcalibur. L'analyse a été effectuée en utilisant une colonne Kinetex C18 (100 mm x 2.1 mm, 1.7 pm) avec un volume d'injection fixé à 2 pL et une élution de 200 pL/min. Les deux solvants sont 5 eau/acide formique (95/5, v/v) (solvant A) et acétonitrile/acide formique (95/5, v/v) (solvant B). Le gradient de la phase mobile est le suivant : 7% de B à 0 min, 26% de B à 18 min et 100% de B à 19 min. La colonne est lavée avec 100 % de B pendant 3 min et rééquilibrée avec 7 % de B pendant 5 min avant la prochaine injection. La détection UV-visible est réalisée à 520 nm. 10 L'identification des molécules a été réalisée par comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des standards commerciaux (cyanidine-3-O-glucoside, delphinidine3-O-glucoside, malvidine-3-O-glucoside, péonidine-3-O-glucoside). Les anthocyanes acétylées et coumaroylées sont exprimées en équivalent malvidine-3-O-glucoside. Les résultats sont exprimés en mg/g de matière sèche. 15 g. Evaluation des propriétés antioxydantes Test ORAC Le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) a été appliquée selon la 20 méthode décrite dans Ou, B., Hampsch-Woodill, M., & Prior, R. L. ((2001). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(10), 4619-4626) modifiée par Dàvalos, A., GômezCordovés, C., & Bartolomé, B. ((2004). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(1), 48-54). L'analyse a été réalisée à l'aide d'un lecteur de plaque BMG FLUOstar Omega muni d'un détecteur à fluorescence. La dilution des extraits ainsi que la réaction ont été 25 réalisées avec du tampon phosphate (75 mM, pH 7,4). Les solutions d'extraits à tester (30 pL) sont mises en contact avec la fluorescéine (180 pL, 117 nM) et l'AAPH (90 pL, 40 mM). La fluorescence est enregistrée pendant 1 heure, à 37°C, aux longueurs d'onde d'excitation de 485 nm et d'émission de 530 nm. Un blanc et une gamme étalon de standard Trolox ont été analysés dans les mêmes conditions. L'aire sous la courbe a été 30 calculée pour chaque échantillon et une droite de régression a été établie entre l'aire sous la courbe et la concentration en Trolox. Le pouvoir antioxydant des échantillons est exprimé en équivalent pM Trolox par gramme de matière sèche. Test FRAP 35 Le test FRAP (Free Radical Scavenging Potential) a été adapté selon la procédure de Benzie, I. F. F., & Strain, J. J. ((1996). Analytical Biochemistry, 239(1), 70-76.(1996)). La procédure est basée sur la réduction, à faible pH, du complexe ferrique incolore (Fe3+ - 18 3002453 tripyridyltriazine) en complexe ferreux bleu (Fe2+ -tripyridyltriazine) par action d'antioxydant donneur d'électron. La réduction est mesurée par un changement d'absorbance à 593 nm. Le réactif FRAP est fraichement préparé à chaque utilisation en mélangeant 10 volumes de tampon acétate de sodium (300mM, pH 3.6), 1 volume de 5 TPTZ (2,4,6-tri(2-pyridyl)-s-triazine) (10mM dans de l'acide chlorhydrique 40mM) et 1 volume de solution aqueuse de chlorure de fer hexahydraté (20mM). 300pL de réactif FRAP sont ajoutés à 40 pL d'extrait à tester préalablement disposés sur une plaque 96 puits. Après 4 minutes d'incubation à 37°C, l'absorbance des échantillons est mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque BMG FLUOstar. Un blanc est analysé dans les mêmes 10 conditions. Le pouvoir antioxydant est obtenu par la différence entre l'absorbance des échantillons et du blanc. Les résultats sont rapportés à une gamme étalon de sulfate de fer (Fe2+) et sont exprimés en équivalent mmol Fe2+/g de matière sèche. Test ABTS 15 Le pouvoir antioxydant des extraits a aussi été évalué à l'aide du test ABTS ( Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-Evans, C. (1999). Free Radical Biology and Medicine, 26(9-10), 1231-1237.1999). En réagissant avec le persulfate de potassium (K2S208), l'ABTS (acide 2,2'-azino-bis(3éthylbenz-thiazoline-6- sulfonique)) forme le radical ABTS*+ de couleur verte après 12 à 16 d'incubation à 20 l'obscurité. L'ajout d'antioxydants va réduire ce radical et provoquer la décoloration du mélange qui est proportionnelle à la concentration en antioxydants contenu dans l'extrait. Pour les analyses, la solution ABTS*+ est diluée avec de l'eau distillée jusqu'à obtention d'une absorbance Do = 0,7 ± 0,02 à 734 nm. 200 pL d'ABTS*+ sont ajoutés à 10 pL d'échantillon préalablement disposés sur une plaque à 96 puits. Après 10 minutes 25 d'incubation à température ambiante, l'absorbance des échantillons est mesurée grâce au lecteur de plaque BMG FLUOstar à 734 nm. Un blanc est analysé dans les mêmes conditions. Le pouvoir antioxydant est obtenu par la différence entre l'absorbance des échantillons et du blanc. Les résultats sont rapportés à une gamme étalon de Trolox et sont exprimés en équivalent pmol Trolox/g de matière sèche. 30 Test DPPH : Le test DPPH a été appliquée selon la méthode de Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. ((1995). LWT - Food Science and Technology, 28(1), 25-30) modifiée par Miliauskas, G., Venskutonis, P. R., & Van Beek, (T. A. (2004). Food Chemistry, 85(2), 35 231-237 & Van Beek, (2004)). Sous sa forme libre et stable, le radical DPPH- possède une couleur violette intense décolorable lorsqu'il est réduit par un antioxydant. 200 pL de 19 3002453 DPPH- sont ajoutés à 10 pL d'échantillon préalablement disposés sur une plaque à 96 puits. Après 20 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance des échantillons est mesurée grâce au lecteur de plaque BMG FLUOstar à 515 nm. Un blanc est analysé dans les mêmes conditions. Le pouvoir antioxydant est obtenu par la 5 différence entre l'absorbance des échantillons et du blanc. Les résultats sont rapportés à une gamme étalon de Trolox et sont exprimés en équivalent pmol Trolox/g de matière sèche. 2. Résultats des tests in vitro : 10 Pour tous les échantillons, les analyses globales telles que les polyphénols totaux, les tannins totaux et les anthocyanes totales ont été effectués. Une analyse poussée par HPLC-UV-Fluo a permis d'obtenir la composition en tannins et anthocyanes individuels. Le pouvoir antioxydant des extraits a été évalué à l'aide de quatre tests antioxydants 15 différents : l'ORAC, le FRAP, l'ABTS et le DPPH. 2. A. Compositions globales des extraits : Les extraits aqueux (EAQ) et hydro-alcoolique 70 % (EA70) ont été caractérisés globalement par l'analyse des polyphénols totaux, tannins totaux et anthocyanes totales 20 après avoir été solubilisés et dilués à la bonne concentration. Les résultats montrent que globalement, l'extraction à l'éthanol 70 %vol permet notamment une extraction très satisfaisante des composés phénoliques que cela soit au niveau des pépins ou des pellicules. Parmi les pépins de marc, les pépins de Syrah Plantier et de Carignan sont 25 particulièrement riches en polyphénols, tannins et anthocyanes que cela soit dans les EAQ ou dans EA70. Dans ces derniers, les pépins de Syrah Plantier sont plus riches en tannins totaux (jusqu'à 455,42 mg/g MS) alors que ceux de Carignan renferment une plus grande quantité d'anthocyanes totales (57,34 mg/g MS). Concernant les pellicules, les analyses statistiques ont montré que dans les EAQ, 30 les pellicules d'Alicante présentent les taux les plus élevés en composés phénoliques pour les trois analyses confondus (polyphénols totaux : 196,71 mg GAE/g MS ; tannins totaux : 221,40 mg/g MS et anthocyanes totales : 21,40 mg /g MS) alors que dans les EA70, ce sont les pellicules de Syrah Plantier qui en contiennent le plus (polyphénols totaux : 224,92 mg GAE/g MS ; tannins totaux : 312,46 mg/g MS et anthocyanes totales : 35 86,68 mg/g MS). 20 3002453 Comme constaté précédemment, dans les EA70, les quantités en polyphénols totaux, tannins totaux et anthocyanes totales sont plus importants. Ce résultat illustre que l'éthanol à 70% par rapport à l'eau, permet une meilleure extraction. L'éthanol pourrait faciliter la solubilisation des tissus et ainsi la libération d'une 5 plus grande quantité de polyphénols. En effet, entre les extraits EAQ et EA70, le taux de polyphénols totaux et de tannins totaux sont respectivement de 1,5 à 2,5 et de 1 à 3 fois plus élevés selon les cépages dans les EA70. Les anthocyanes sont les composées dont l'extraction varie le plus selon les cépages : de 2,5 à 25,8 fois dans les pellicules d'Alicante (21,40 mg/g MS dans EAQ et 54,41 mg/g MS dans EA70) et de Syrah haut de 10 Julien (1,76 mg/g MS dans EAQ et 45,38 mg/g MS dans EA70) respectivement. 2. B. Composition en tannins individuels des extraits (HPLC-Fluo) : Les monomères de flavan-3-ol (catéchine et épicatéchine) ainsi que les dimères (B1, B2, B3 et B4) et le trimère Cl ont été identifiés et quantifiés dans les extraits aqueux 15 et hydro-alcoolique 70% des pépins et des pellicules de raisin par HPLC-Fluo. Pour les deux types d'extraits, les pépins de Syrah Plantier sont les plus riches en tannins que cela soit au niveau des monomères (8,88 mg/g MS dans EAQ et 13,84 mg/g MS dans EA70), des dimères (6,87 mg/g MS dans EAQ et 7,10 mg/ g MS dans EA70) et du trimère Cl (2,00 mg/g MS dans EAQ et 1,253 mg/g MS dans EA70). Dans les 20 pellicules, les résultats varient dans les EAQ de 0,89 mg/g MS à 3,4 mg/g MS pour la somme des monomères, de 0,91 mg/g MS à 2,34 mg/g MS pour la somme des dimères et dans les EA70 de 1,88 mg/g MS à 7,71 mg/g MS pour les sommes des monomères et de 1,61 mg/g MS à 4,83 mg/g MS pour la somme des dimères. Les cépages contenant le plus de tannins individuels sont l'Alicante et la Syrah 25 (Syrah Plantier) pour les deux types d'extraits. 2. C. Composition en anthocyanes individuels des extraits (HPLC-UV) : Le profil anthocyanique a été établi par HPLC-UV. Dans tous les cépages et les deux types d'extraits, la malvidine-3-0-glucoside apparait comme étant l'anthocyane 30 majoritaire. Parmi les extraits aqueux, ce sont les pépins de Syrah (Syrah Plantier) qui renferment le plus d'anthocyanes (3,24 mg/g MS d'anthocyanes glycosylées, 2,20 mg/g MS d'anthocyanes acétylées et 1,86 mg/g MS d'anthocyanes coumaroylées). Les pépins de Carignan sont particulièrement riches en anthocyanes glycosylées (3,16 mg/g MS au 35 total) et constitués majoritairement de la malvidine-3-O-glucosides (1,35 mg/g MS) et la delphinidine-3-O-glucoside (0,63 mg/g MS). Leurs taux en anthocyanes acétylées et 21 3002453 coumaroylées sont plus faible que dans les pépins du Grenache (Grenache Long du Coudoulet) qui est constitué de 2,03 mg/g MS d'anthocyanes acétylées et de 1,37 mg/g MS d'anthocyanes coumaroylées. Pour les extraits hydro-alcooliques 70%, les pépins de Carignan possèdent une 5 grande quantité d'anthocyanes glycosylées (14,66 mg/g MS) et de coumaroylées (4,15 mg/g MS). Les pépins de Syrah (Syrah Plantier) sont particulièrement riches en anthocyanes acétylées (jusqu'à 2,98 mg/g MS). Concernant les pellicules, dans les extraits aqueux et parmi les anthocyanes glycosylées, la pétunidine-3-O-glucoside et la paeonidine-3-O-glucoside sont les deux 10 anthocyanes majoritaires après la malvidine-3-O-glucoside alors que dans les extraits hydro-alcooliques 70% ce sont la pétunidine-3-O-glucoside et la delphinidine-3-0- glucoside. Les extraits les plus riches sont les pellicules de Syrah (Syrah Plantier), de Carignan et d'Alicante dans les EAQ et les pellicules de Grenache (Grenache Face aux Pins) et de Carignan dans les EA70. 15 2. D. Evaluation de l'activité antioxydante : Le pouvoir antioxydant des extraits a été évalué par l'intermédiaire de quatre différents tests. Trois tests spectrophotométriques : le FRAP, l'ABTS et le DPPH et un test spectrofluorométrique : l'ORAC. 20 Pour les pépins, que cela soit au niveau des EAQ et des EA70, les résultats des différents tests antioxydants sont corrélés. D'une part, les plus forts pouvoir antioxydant ont été retrouvés dans les extraits de pépins de Syrah (Syrah Plantier). Celui-ci possède, en effet, la plus grande quantité en tanins et en anthocyanes d'après les analyses globaux et la caractérisation par HPLC-UV-Fluo. 25 Les résultats obtenus pour les pellicules sont plus hétérogènes que ceux des pépins surtout au niveau des extraits EA70. Dans les extraits aqueux, les cépages les plus élevés en pouvoir antioxydant sont la Syrah (Syrah Plantier) et l'Alicante. Cette constatation a été confirmée par les quatre tests antioxydants. De plus, il existe une corrélation entre les résultats obtenus auparavant qui ont montré que les pellicules de 30 Syrah (Syrah Plantier) et l'Alicante renferment les plus grandes quantités en tannins et en anthocyanes. Concernant les extraits EA70, les pellicules de Syrah (Syrah Plantier) peuvent être retenues comme ayant un potentiel antioxydant important parmi les autres. La Syrah (Syrah Plantier) est classée comme étant soit le premier, soit le deuxièmes cépage avec 35 le plus d'activité selon les tests (ORAC : 1912,56 pmol TE/g MS, FRAP : 1,52 mmol Fe2+/g MS, ABTS : 2614,50 pmol TE/g MS, DPPH : 1391,69 pmol TE/g MS). 22 3002453 Dans les extraits aqueux, les tests ORAC, FRAP, ABTS et DPPH donne des résultats plus comparables que dans les extraits hydro-alcooliques 70 % où l'hétérogénéité est plus grande notamment au niveau des pellicules. Ceci pourrait être du à une extraction de composées différentes et plus riches par l'éthanol 70 %. 5 Comme décrit précédemment, les extraits renferment différents composés phénoliques présents à des concentrations différentes selon les cépages, les parties (pépins ou pellicules) et les procédés d'extraction (eau ou éthanol 70%). Avec des principes de fonctionnement différents ainsi que des sensitivités différentes des tests utilisés, l'hétérogénéité des résultats semble normale. 10 3. Conclusions des expériences in vitro : Dans cette étude in vitro, les extraits aqueux et hydro-alcooliques 70% de pépins et de pellicules de marcs de six cépages caractéristiques de la Vallée du- 15 Rhône ont été caractérisés. Les concentrations en polyphénols totaux, anthocyanes totales et tanins totaux ont été évaluées ainsi que l'identification et la quantification en tannins et anthocyanes individuelles. Les pouvoirs antioxydants des extraits ont été par la suite appréciés. 20 Les résultats ont montré que l'éthanol 70% permet généralement une meilleure extraction des composés phénoliques. Parmi les extraits aqueux, les pépins de Syrah (Syrah Plantier) et de Carignan et les pellicules d'Alicante présentent de forts taux en polyphénols. Ces résultats sont en corrélation avec l'évaluation de leur pouvoir antioxydant. 25 Parmi les extraits hydroalcooliques, les extraits de pépins et de pellicules de Syrah Plantier et de Carignan présentent un important pouvoir antioxydant. Exemple 3 : Analyse complémentaire des compositions en procyanidines des extraits de marc de raisin 30 1 Méthodes : Les extraits de pellicules et pépins de marcs selon l'exemple 1 ont été solubilisés dans une solution eau/méthanol (50/50, v/v) acidifiée avec 1% d'acide formique. Les analyses ont été réalisées sur un appareil Thermo-Finnigan Surveyor (Thermo, electron 35 Corporation) composé d'un module de pompes (Surveyor LC pump Plus), d'un passeur régulé à 4°C (Thermo-Finnigan autosampler), d'un détecteur UV-Vis à barrette de diodes 23 3002453 (200-600nm) (Surveyor PDA Plus) et d'un détecteur à fluorescence (FP-920m Jasco (U.K.) Ltd.). La détection en fluorescence a été fixée à une longueur d'onde d'excitation et d'émission de 230 et 320 nm respectivement. Après passage dans la cellule de mesure du détecteur à barrette de diode, l'éluat est séparé et 0,2 mL sont envoyés dans un 5 spectromètre de masse à trappe ionique Finnigan LCQ Duo mass équipé d'une interface d'ionisation par électrospray. Les analyses sont effectuées en ionisation négative avec un mode de balayage de l'ensemble des masses entre m/z 200 et 1000. L'ensemble est piloté par le logiciel Xcalibur. La séparation est effectuée sur une colonne Develosil Diol 100A (250 x 4.6 mm i.d. 5 pm) (Phenomenex, Cheshire, UK) maintenue à 35 °C avec un 10 volume d'injection fixé à 10 pL pour les extraits de pépins et 20 pL pour les extraits de pellicules et une élution de 1 mL/min. Les deux solvants sont l'acétonitrile acidifiée ((A), CH3CN:HOAc, 98:2; v/v) et méthanol/eau/acide acétique ((B), CH3OH:H20:HOAc, 95:3:2; v/v/v). La phase mobile est constituée d'un gradient de 7% de B durant 3min puis de 7% à 37.6% en 57 min. La colonne est lavée avec 100% de B durant 7 min avant d'être 15 reconditionnée à 7% de B durant 6 min. La colonne est rééquilibrée avec 7% de B durant 10 min. La détection des molécules est réalisée grâce à la fluorescence et confirmée par spectromètre de masse. Les ions recherchés sont décrits dans le tableau 1. Deux gains différents en fluorescence ont été utilisés : d'une part pour la quantification des monomères et dimères et d'autre part pour la quantification des molécules à Dpm 2 20 (Dpm supérieur à 2). Les concentrations sont exprimées en équivalent (-)-épicatéchine et exprimés en mg/g de matière sèche (MS). 2. Résultats Tableau 1 : Caractéristiques des procyanidines détectés dans les extraits de pépins et 25pellicules de marcs Pics Rt Procyanidines [NI] (m/z) (min) 4.92 Monomères (epi)C 289 2 6.98 (Epi)Catechine gallate (epi)Cg 441 3 8.67 Dimères (epi)C-(epi)C 577 13.26 Dimères gallate (epi)C-(epi)Cg 729 15.5 Trimères (epi)C-(epi)C-(epi)C 865 6 17.25 Gallo (epi)Catechine trimères (epi)C-(epi)-(epi)GC 881 24 3002453 7 20.69 Trimères gallate (epi)C-(epi)C-(epi)Cg 1017 8 22.59 Tetramères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C 1153 9 23.52 Gallo (epi)Catechine tetramères (epi)C-(epi)C-(epi)-(epi)GC 1169 10 27.08 Tetramères gallate (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)Cg 1305 11 29.28 Pentamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C 1441 12 30.23 Gallo (epi)Catechine pentamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)-(epi) GC 1457 13 34.79 Hexamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C- 1729 (epi)C 14 39.74 Heptamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C- 2017 (epi)-(epi)C 15 43.78 Octamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C- 2305 (epi)C-(epi)C-(epi)C 16 47.16 Nonamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C- 2593 17 50.21 (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C Decamères (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)C- 2881 (epi)C-(epi)C-(epi)C-(epi)-(epi)C Tableau 2 : Composition en procyanidines dans les extraits aqueux (EAQ) de pépins de marcs Pics Procyanidines GLC SyP CAR 1 Monomères 37.74 ± 0.06 76.30 ± 0.39 45.42 ± 0.93 2 (Epi)Catechine gallate 0.70 ± 0.00 0.77 ± 0.01 0.66 ± 0.01 3 Dimères 11.65 ± 0.13 21.52 ± 0.16 15.82 ± 0.22 4 Dimères gallate 0.22 ± 0.00 1.20 ± 0.01 0.40 ± 0.02 4.94 ± 0.07 5 Trimères 3.81 ± 0.04 17.76 ± 0.21 6 Gallo (epi)Catechine trimères 0.25 ± 0.01 1.27 ± 0.03 0.21 ± 0.04 7 Trimères gallate 0.27 ± 0.02 0.68 ± 0.02 0.18 ± 0.01 8 Tetramères 1.56 ± 0.06 7.05 ± 0.05 1.89 ± 0.00 9 Gallo (epi)Catechine tetramères 0.91 ± 0.04 2.66 ± 0.07 0.92 ± 0.01 10 Tetramères gallate 0.01 ± 0.00 0.15 ± 0.00 0.04 ± 0.00 25 3002453 11 Pentamères 0.79 ± 0.01 3.95 ± 0.06 1.29 ± 0.02 12 Gallo (epi)Catechine pentamères 0.12 ± 0.01 0.61 ± 0.01 0.26 ± 0.00 13 Hexamères 0.55 ± 0.02 1.64 ± 0.06 0.67 ± 0.02 14 Heptamères 0.22 ± 0.01 1.01 ± 0.01 0.39 ± 0.02 15 Octamères 0.10 ± 0.00 0.43 ± 0.01 0.16 ± 0.01 16 Nonamères 0.02 ± 0.00 0.17 ± 0.01 0.07 ± 0.01 17 Decamères nd 0.07 ± 0.00 0.02 ± 0.00 Tableau 3 : Composition en procyanidines dans les extraits hydro-alcoolique 70% (EA70) de pépins de marcs Pics Procyanidines CAR 1 Monomères (Epi)Catechine gallate Dimères Dimères gallate Trimères Gallo (epi)Catechine trimères Trimères gallate Tetramères Gallo (epi)Catechine tetramères Tetramères gallate 72.11 ± 0.93 1.34 ± 0.05 28.15 ± 0.11 1.94 ± 0.00 20.74 ± 0.03 2.18 ± 0.02 1.42 ± 0.01 9.46 ± 0.19 4.5 ± 0.04 0.82 ± 0.05 29.72 ± 0.35 0.79 ± 0.02 9.22 ± 0.15 0.34 ± 0.00 3.49 ± 0.04 0.58 ± 0.01 0.28 ± 0.00 1.69 ± 0.04 0.8 ± 0.01 0.06 ± 0.00 32.59 ± 0.6 1.01 ± 0.02 10.63 ± 0.17 Pentamères Gallo (epi)Catechine pentamères 1.30 ± 0.01 6.27 ± 0.15 1.37 ± 0.05 25 ± 0.00 0.2 ± 0.00 13 Hexamères 14 Heptamères 15 Octamères 16 Nonamères 17 Decamères 0.51 ± 0.00 0.28 ± 0.00 0.13 ± 0.01 0.09 ± 0.00 3.43 ± 0.05 1.82 ± 0.01 0.90 ± 0.00 0.43 ± 0.00 0.24 ± 0.01 0.83 ± 0.02 0.51 ± 0.00 0.24 ± 0.01 0.15 ± 0.01 0.07 ± 0.00 4.16 ± 0.23 0.33 ± 0.01 0.63 ± 0.01 0.30 ± 0.00 1.98 ± 0.06 0.97 ± 0.13 0.04 ± 0.01 26 3002453 Tableau 4 : Composition en procyanidines dans les extraits aqueux (EAQ) de pellicules de marcs Pics Procyanidines GFP SyP SyH MOU ALI 1 Monomères 13.01 ± 26.3 ± 17.44 ± 14.2 ± 10.19 ± 12.2 ± 0.34 0.05 0.00 0.03 0.15 0.00 (Epi)Catechine 0.20 ± 0.37 ± 0.28 ± 0.31 ± 0.17 ± 0.24 ± gallate 0.01 0.01 0.02 0.02 0.00 0.01 Dimères 4.17 ± 7.96 ± 5.32 0.1 0.06 0.05 Dimères gallate 0.37 ± 0.83 ± 0.35 ± 0.01 0.03 0.02 Trimères 5.48± 11.24± 6.13± 0.00 0.29 0.15 Gallo 0.82 ± 1.45 ± 0.90 ± (epi)Catechine 0.01 0.01 0.02 trimères 3.92± 3.73± 0.06 0.07 0.37 ± 2.25 0.01 0.01 5.64± 19.44± 0.09 0.11 0.48± 2.15± 0.01 0.01 Trimères gallate 0.23 ± 0.35 ± 0.17 ± 0.20 ± 0.16 ± 0.94 ± 0.01 0.07 0.00 0.03 0.01 0.00 Tetramères 1.94± 4.19± 2.14± 2.50± 2.33± 7.13± 0.06 0.00 0.01 0.04 0.02 0.01 Gallo 0.89± 1.17± 0/0± 1.06± 0.73± 2.64± (epi)Catechine 0.02 0.00 0.02 0.04 0.00 0.09 tetramères Tetramères gallate Pentamères 1.03 ± 2.41 ± 1.05 ± 0.00 0.08 0.02 Gallo 0.69 ± 0.66 ± 0.66 ± (epi)Catechine 0.00 0.01 0.03 pentamères 1.32± 3.42± 0.01 0.01 0.66± 1.26± 0.02 0.01 1.68 ± 0.00 0.86 ± 0.01 0.30 ± 0.27 ± 0.01 nd Hexamères 0.80 ± 0.00 0.92± 1.90± 0.01 0.01 0.34± 0.39± 0.92± 0.01 0.03 0.01 0.15 ± 0.07 ± 0.29 ± 0.36 ± 0.01 0.08 ± Heptamères Octamères 27 3002453 0.00 0.02 0.01 0.01 0.03 16 Nonamères nd 0.1 ± nd nd 0.10 ± 0.01 0.00 17 Decamères nd 0.04 ± 0.00 Tableau 5 : Composition en procyanidines dans les extraits hydro-alcoolique 70% (EA70) de pellicules de marcs Pics Procyanidines GFP SyP SyH CAR MOU 1 Monomères 9.89 19.28 9.62 ± 12.58 ± 3.80 ± 0.08 ± 0.28 0.05 0.05 0.07 2 (Epi)Catechine 0.28 ± 0.47 ± 0.64 ± 0.49 ± 0.02 ± gallate 0.00 0.01 0.02 0.03 0.00 3 Dimères 4.05 ± 6.76 2.70 ± 4.65 1.9 ± 0.03 0.09 0.02 0.02 0.05 4 Dimères gallate 0.40 ± 0.89 ± 0.49 ± 0.61 ± 0.17 ± 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 5 Trimères 6.31 ± 10.51 4.35 7.91 ± 2.34 0.08 ± 0.01 0.06 0.14 0.01 6 Gallo 0.62 ± 0.78 ± 0.49 ± 0.35 ± 0.07 ± (epi)Catechine trimères 0.00 0.01 0.04 0.01 0.00 7 Trimères gallate 0.27 ± 0.47 ± 0.23 ± 0.38 ± 0.06 ± 0.00 0.01 0.01 0.01 0.00 Tetramères 2.79 4.79 1.94 ± 3.58 1.14 ± 0.01 0.01 0.01 0.04 0.00 Gallo 1.03 ± 1.16 ± 0.45 ± 1.30 ± 0.33± (epi)Catechine tetramères 0.00 0.01 0.01 0.03 0.02 10 Tetramères gallate nd 0.11 ± 0.09 ± 0.40 ± nd 0.01 0.01 0.01 11 Pentamères 1.87 ± 2.78 1.10 ± 2.42 ± 0.84 ± 0.00 0.00 0.02 0.01 0.01 12 Gallo 0.56 ± 0.36± 0.37± 0.80 ± 0.18± (epi)Catechine 0.00 0.00 0.01 0.04 0.00 ALI 12.71 ± 0.03 0.67± 0.03 0.16± 0.00 28 3002453 pentamères 13 Hexamères 1.16± 1.61 ± 1.02 ± 1.74 ± 0.47 ± 0.69 ± 0.01 0.00 0.02 0.01 0.00 0.01 14 Heptamères 0.87 ± 0.93 ± 0.32 ± 1.00 ± 0.30 ± 0.28 ± 0.00 0.01 0.01 0.07 0.01 0.00 15 Octamères 0.18 ± 0.44 ± 0.19 ± 0.59 ± 0.16 ± 0.17 ± 0.00 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 16 Nonamères 0.16 ± 0.20 ± nd 0.26 ± 0.07 ± 0.08 ± 0.00 0.01 0.01 0.00 0.00 17 Decamères 0.03 ± 0.11 ± 0.03 ± 0.04 ± 0.03 ± 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Exemple 4 : Analyse complémentaire des compositions en anthocyanes des extraits de marcs 5 1. Méthodes : Les extraits de pellicules et pépins de marcs selon l'exemple 1 ont été solubilisés dans une solution eau/méthanol (50/50, v/v) acidifiée avec 1% d'acide formique. Les analyses ont été réalisées sur un appareil Thermo-Finnigan Surveyor (Thermo, electron 10 Corporation) composé d'un module de pompes (Surveyor LC pump Plus), d'un passeur régulé à 4°C (Thermo-Finnigan autosampler) et d'un détecteur UV-Vis à barrette de diodes (200-600nm) (Surveyor PDA Plus). L'ensemble est piloté par le logiciel Xcalibur. La séparation est effectuée en utilisant une colonne RP-Max column (4 pm, 250 x 4.6 mm) maintenue à 40 °C avec un volume d'injection fixé à 10 pL et une élution de 1 15 mL/min. Les deux solvants sont eau/acide formique (99/1, v/v) (solvant A) et méthanol/acide formique (99/1, v/v) (solvant B). La phase mobile est constituée d'un gradient allant de 10% à 45% de B en 65 minutes. Après passage dans la cellule de mesure du détecteur à barrette de diode, l'éluat est séparé et 0,2 mL sont envoyés dans un spectromètre de masse à trappe ionique LCQ Deca XP équipé d'une interface 20 d'ionisation par électrospray. Les analyses sont effectuées en ionisation positive avec un mode de balayage de l'ensemble des masses entre m/z 100 et 1000. Les ions recherchés sont décrits dans le tableau 6. La détection des molécules est réalisée à 520 nm et par comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des standards commerciaux. Les concentrations sont exprimées en équivalent malvidine-3-O-glucoside et exprimés en 25 mg/g de matière sèche (MS). 29 3002453 Tableau 6 : Caractéristiques des composés identifiés dans les extraits de pépins et pellicules de marcs 5 Tableau 7 : Composition en anthocyanes dans les extraits aqueux (EAQ) de pépins de marc 520 520 520 520 520 520 520 520 520 520 Composés Delphinidine-3-O-glucoside Cyanidine-3-O-glucoside Petunidine-3-O-glucoside Peonidine-3-O-glucoside Malvidine-3-0-glucoside Malvidine-3-O-glucoside-acetaldehyde (vitisine B) À max MW [m/z]+ MS2 (m/z) 520 464 465 303 520 448 449 287 520 478 479 317 520 462 463 301 520 492 493 331 520 516 517 355, 331 Rt (min) 20.46 24.33 27.58 31.09 33.32 Delphinidine-3-0-(6"-0-acetyl) glucoside Dimère Mv-Cat Malvidine-3-O-glucoside-pyruvate (vitisine A) Dimère Mv-Cat Dimère Mv-Cat Péonidine-3-0-(6"-0-acetyl) glucoside Malvidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside Delphinidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside Malvidine-3-O-(6"-O-caffeoyl) glucoside Cyanidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside Pétunidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside Malvidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 506 507 303 808 809 560 561 339,331 808 809 808 809 504 505 301 534 535 331 610 611 303 654 655 331 594 595 287 624 625 317 638 639 331 39.97 44.47 46.01 46.63 49.71 50.3 51.01 54.31 55.75 57.89 59.34 62.77 0.02 ±0 0.05 ±0 0.11 ± 0 0.39 ±0 nd Composés (mg éq malvidine/g MS) Delphinidine-3-O-glucoside Cyanidine-3-O-glucoside Pétunidine-3-O-glucoside Péonidine-3-O-glucoside Malvidine-3-O-glucoside Malvidine-3-O-glucoside-acétaldehyde SyP 0.08 ±0 0.02 ±0 0.14 ±0 0.12 ±0 0.93 ±0 0.02 ±0 CAR 0.4 ±0 0.05 ±0 0.43 ±0 0.15 ± 0.01 1.48 ± 0.02 0.02 ±0 GLC 0.03 ±0 30 3002453 (vitisine B) Delphinidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside nd 0.02 ± 0 nd Dimère Mv-Cat 0.01 ±0 0.03±0 nd Malvidine-3-O-glucoside-pyruvate (vitisine A) 0.02 ± 0 0.04 ± 0 0.04 ± 0 Dimère Mv-Cat 0 ± 0 0.07 ± 0 0.05 ± 0 Dimère Mv-Cat 0.01 ±0 0.03 ± 0 0.02 ± Péonidine-3-0-(6"-0-acetyl) glucoside 0.01 ± 0.07 ± 0 nd Malvidine-3-O-(6"-0-acetyl) glucoside 0.02 ± 0.32 ± 0 0.09 ± 0 Delphinidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0 ± 0 0.06 ± 0 0.1 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-O-caffeoyl) glucoside 0.01 ± 0.04 ± 0 0.02 ± 0 Cyanidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.01 ±0 0.02 ± 0 0.02 ± Pétunidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.01 ± 0 0.11 ± 0 0.11 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.06 ± 0 1.14 ± 0.01 0.65 ± 0 Anthocyanes glycosylées totales 0.6 ± 0 1.3 ± 0 2.52 ± 0.03 Anthocyanins acétylées totales 0.03±0 0.41 ±0 0.09±0 Anthocyanins coumaroylées totales 0.08 ± 1.32 ± 0.01 0.88±0 Anthocyanes totales 0.76 ± 3.26 ± 0.01 3.63 ± 0.03 Tableau 8 : Composition en anthocyanes dans les extraits hydro-alcoolique 70% (EA70) de pépins de marc Composés (mg éq malvidine/g MS) GLC SyP CAR Delphinidine-3-O-glucoside 0.19±0 0.31 ± 0 3.11 ± 0.02 Cyanidine-3-O-glucoside 0.09 ± 0.05 ± 0.23 ± Pétunidine-3-O-glucoside 0.33 ± 0.01 0.58 ± 0.02 3.18 ± 0.01 Péonidine-3-O-glucoside 0.56 ± 0.03 0.47 ± 0.02 1.11 ± 0 Malvidine-3-O-glucoside 2.36 ± 0.12 3.57 ± 0.08 10.52 ± 0.11 Malvidine-3-O-glucoside-acétaldehyde (vitisine B) 0.01 ± 0 0.05 ± 0.03 ± Delphinidine-3-0-(6"-0-acetyl) glucoside nd 0.09 ± 0.06 ± Dimère Mv-Cat 0.04 ± 0.05 ± 0.06 ± Malvidine-3-O-glucoside-pyruvate (vitisine A) 0.12 ± 0 0.07 ± 0 0.14±0 Dimère Mv-Cat nd 0.13 ± 0.17±0 Dimère Mv-Cat 0.1 ± 0 0.13 ± 0.16±0 Péonidine-3-0-(6"-0-acetyl) glucoside 0.07 ± 0.32 ± 0.01 0.12 ± 31 Malvidine-3-O-(6"-O-acetyl) glucoside 0.06 ± 0 Delphinidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.05 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-O-caffeoyl) glucoside 0.08 ± 0 Cyanidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.07 ± 0 Pétunidine-3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.08 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-O-coumaroyl) glucoside 0.8 ± 0 Anthocyanes glycosylées totales 3.53 ± 0.16 Anthocyanins acétylées totales 0.13 ± 0 Anthocyanins coumaroylées totales 1 ± 0 Anthocyanes totales 5 ± 0.17 5 10 15 .9 ± 0.03 0.18 ± 0 0.11 ± 0 0.07 ± 0 0.35 ± 0.01 2.85 ± 0 4.99 ± 0.12 1.3 ± 0.02 3.44 ± 0.01 10.28 ± 0.14 0.31 ± 0 0.58 ± 0.01 0.33 ± 0 0.49 ± 0 5.86 ± 0.02 32 3002453 Tableau 9 : Composition en anthocyanes dans les extraits aqueux (EAQ) de pellicules de marcs Composés (mg éq malvidine/g MS) GFP 0.01 ± CAR MOU ALI Delphinidine-3-0- 0.24 ± 0.53 ± glucoside 0.01 0.15 ± 0 0 0.2 ± 0.31 ± 0 0.05 ± Cyanidine-3-O-glucoside 0.09 ± 0 0.01 ± 0 0 ± 0 0 0.07 ± 0.11 ± 0 0.33 ± 0.25 ± 0.03 ± 0.54 ± 0.47 ± Pétunidine-3-O-glucoside 0.01 0.01 0 0 0.3 ± 0.02 0.35 ± 0.2 ± 0.02 ± 0.19 ± 1.49 ± Péonidine-3-O-glucoside 0.01 0.01 0 0 0.22 ± 0 0.03 1.78 ± 1.54 ± 0.11 ± 1.74 ± 1.01 ± 3.14 ± Malvidine-3-0-glucoside 0.05 0.05 0 0.02 0.01 0.03 Malvidine-3-O-glucoside- 0.02 ± acétaldehyde (vitisine B) 0.01 ± 0 0.02 ± 0 nd 0 0.01 ± 0 nd DeIphinidine-3-0-(6"-O- 0.02 ± acetyl) glucoside nd 0.05 ± nd 0 nd nd Dimère Mv-Cat 0.01 ± 0 0.03 ± nd nd 0.01 ± 0 0.03 ± Malvidine-3-O-glucoside- 0.02 ± 0.04 ± pyruvate (vitisine A) 0.05 ± 0.04 ± 0 0 0.06 ± 0.1 ± 0 0.05 ± Dimère Mv-Cat nd 0.08 ± 0 ± 0 0 0.01 ± 0 0.05 ± 0.01 ± 0.01 ± Dimère Mv-Cat 0.01 ± 0 0.03 ± 0 0 0.01 ± 0 0.03 ± Péonidine-3-0-(6"-0- 0.01 ± 0.02 ± acetyl) glucoside 0.02 ± 0 0.1 ± 0 0 0 0.01 ± 0 0.09 ± Malvidine-3-0-(6"-0- 0.02 ± 0.07 ± acetyl) glucoside nd 0.52 ± 0 0 0 0.04 ± 0 0.19 ± 0 Delphinidine-3-0-(6"-O- 0.13 ± coumaroyl) glucoside nd 0.09 ± nd 0 0.02 ± 0 0.06 ± Malvidine-3-O-(6"-O- 0.03 ± caffeoyl) glucoside 0.02 ± 0 0.05 ± nd 0 0.02 ± 0 0.05 ± Cyanidine-3-O-(6"-O- 0.03 ± coumaroyl) glucoside 0.01 ± 0 0.02 ± 0 nd 0 0.03 ± 0 0.03 ± 0 33 3002453 Pétunidine-3-0-(6"-0- coumaroyl) glucoside 0.04 ± 0.16±0 nd 0.12 ± 0.03 ± 0.07 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-0- 0.01 ± 0.68 ± 1.11 ± coumaroyl) glucoside 0.22 ± 0 1.59 ± 0 0.01 0.15±0 0.01 Anthocyanes 2.8 2.15 ± 0.17 ± 3.05 ± 1.8 ± 5.52 glycosylées totales 0.07 0.06 0 0.02 0.01 0.08 Anthocyanins 0.03 ± 0.11 ± acétylées totales 0.02 ± 0 0.67±0 0 0 0.05 ± 0.27 ± 0 Anthocyanins 0.01 ± 0.96 ± 1.27 ± coumaroylées totales 0.27 ± 0 1.86 ± 0 0 0.24 ± 0 0.01 0.01 3.19 ± 4.92 0.24± 4.25 2.2 ± 7.32 Anthocyanes totales 0.08 0.06 0 0.03 0.01 0.08 Tableau 10 : Compositions en anthocyanes dans les extraits hydro-alcoolique 70% (EA70) de pellicules de marcs 34 3002453 Composés (mg éq malvidine/g MS) GFP SyR SyH CAR MOU ALI 0.78 ± 5.35 1.06 ± Delphinidine-3-O-glucoside 1.43 ± 0 0.97 ± 0 0.21 2.35 ± 0 0.01 0.34 ± 0.05 ± 0.39 ± Cyanidine-3-O-glucoside 0.02 0 0.12 ± 0 0.01 0.52 ± 0 0.24 ± 0 2.05 ± 1.29 ± 5.04 ± 3.38 1.65 ± Pétunidine-3-O-glucoside 0.08 0 1.53 ± 0 0.21 0.02 0.03 1.91 ± 0.87± 0.94± 1.71 ± 5.32 ± Péonidine-3-O-glucoside 0.02 0.01 0.02 0.03 2 ± 0.01 0.01 10.96 ± 7.59 ± 6.76 14.82 ± 10.55± 11.18± Malvidine-3-0-glucoside 0.22 0.04 0.09 0.42 0.03 0.05 Malvidine-3-O-glucoside- 0.06 ± acétaldehyde (vitisine B) 0.03 ± 0 0.07 ± 0 0.05 ± 0.04 ± 0 0.03 ± 0 Delphinidine-3-0-(6"-0- 0.16 ± acetyl) glucoside 0.04 ± 0 0.13 ± 0 0.09 ± 0.05 ± 0 0.05 ± 0 0.07 ± Dimère Mv-Cat 0.05 ± 0 0.11 ± 0 nd 0.1 ± 0 0.06 ± 0 Malvidine-3-O-glucoside- 0.22 ± 0.17 ± 0.18 ± pyruvate (vitisine A) 0.01 0.01 0.39 ± 0 0.01 0.32 ± 0 0.2 ± 0 0.27 ± Dimère Mv-Cat 0.12 ± 0.01 0.21 ± 0 0.16±0 0.07 ± 0 0.14 ± 0 0.11± 0.21± Dimère Mv-Cat 0.1 ± 0 0 0.01 0.1 ± 0 0.08 ± 0 0.23 ± 0 Péonidine-3-0-(6"-0-acetyl) 0.52± 0.39± 0.52 ± glucoside 0.17 ± 0 0.01 0.01 0.1 ± 0 0.19 ± 0 0.14 Malvidine-3-O-(6"-O-acetyl) 0.46 ± 2.11 ± 0.41 ± glucoside 0.01 0.05 1.06 ± 0 0.02 0.39 ± 0 0.61 ± 0 Delphinidine-3-0-(6"-0- 0.25 ± 0.12± 0.35± coumaroyl) glucoside 0.01 0 0.01 0.75 ± 0 0.3 ± 0 0.27 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-0- 0.34 ± 0.15 ± caffeoyl) glucoside 0.01 0 0.56 ± 0 0.24 ± 0 0.32 ± 0 0.25 ± 0 Cyanidine-3-0-(6"-0- 0.05± 0.17± coumaroyl) glucoside 0.13 ± 0 0.01 0.13 ± 0.52 ± 0 0.14 ± 0 Pétunidine-3-0-(6"-0- 0.51 ± 0.82 ± coumaroyl) glucoside 0.36 ± 0.2 ± 0 0.01 0.01 0.65 ± 0 0.55 ± 0 Malvidine-3-0-(6"-0- 3.09 ± 1.53 ± 3.8 ± 6.25 coumaroyl) glucoside 0.02 0 4.12 ± 0 0.03 3.24 ± 0 0.04 35 3002453 Anthocyanes glycosylées totales 16.68 ± 10.59 10.33 ± 27.3 18.79 ± 19.45 ± 0.34 ± 0.05 0.1 0.88 0.02 0.08 Anthocyanins acétylées 0.67 ± 2.79 1.59 ± 0.6 ± 1.18 ± totales 0.01 0.04 0.01 0.02 0.62 ± 0.14 Anthocyanins 3.82 ± 1.89 ± 5.14 ± 5.494 ± 7.21 ± coumaroylées totales 0.01 0 0.01 0.035 4.71 ± 0 0.04 22.03 ± 16.1 ± 18.6 ± 34.11 ± 25.06 ± 28.74 ± Anthocyanes totales 0.35 0.1 0.11 0.95 0.01 0.01 Ces données montrent que les monomères d'épicatéchine et les anthocyanes glycosylées totales, plus particulièrement la malvidine-3-O-glucoside, sont majoritaires dans les extraits selon l'invention. Elles confirment également que les extraits alcooliques permettent une extraction plus importante des polyphénols par rapport aux extraits aqueux. Exemple 5 : Effet de la combinaison selon l'invention sur des rats Les expériences in vivo suivantes ont été réalisées sur un modèle animal de rat génétiquement hypertendus communément appelé SHR pour Spontaneaously Hypertensive Rats. Parmi les modèles de rats hypertendus, le SHR constitue le modèle de choix pour le criblage des agents anti-hypertenseurs (Wagner, A. et al. (2011). Journal of Hypertension, 29(1), 43-50 et Yang, N.-C. et al. (2012). Food Chemistry, 132(4), 1796- 1801) et il est l'animal actuellement le plus utilisé pour étudier l'hypertension. Leurs contrôles normotendus sont les rats Wistar-Kyoto (WKY). Les extraits polyphénoliques de marc choisis pour réaliser cette étude in vivo sont des extraits hydro-alcooliques (EA70) tels que définis dans l'exemple 1. 1. Matériels et méthodes : 1. A. Animaux et traitements : Les rats SHR et leur contrôle normotendu WKY proviennent du laboratoire Janvier (Le Genest St. Isle, France). Les animaux ont été maintenus à une température de 23°C, avec un cycle de 12 heures de lumière/12 heures d'obscurité. L'eau et la nourriture ont été administrées ad libitum. Les extraits polyphénoliques ont été administrés à une dose de 21mg/kg de polyphénols par jour ce qui équivaut à une consommation de polyphénols contenus dans 36 3002453 500m1 de vin rouge par un adulte de 70kg. Les extraits sont solubilisés dans 3% d'éthanol puis administrés par gavage. Trois groupes expérimentaux ont été établis : Etude 1 : Criblage des effets anti-hypertenseurs de 6 extraits polyphénoliques sur 5 les rats SHR Des rats mâles de souche SHR et leurs contrôles normotendus WKY âgés de 9 semaines ont été répartis de la façon suivante : -un groupe de six rats contrôles (WKY) ; -un groupe de cinq rats SHR traités par 3% d'éthanol (SHR contrôle) ; 10 -six groupes de quatre SHR traités par les extraits polyphénoliques hydroalcooliques EA 70% suivants: *n°1 : pépins de Grenache Long du Coudoulet (SHR 1) ; *n°2 : pépins de Syrah Plantier (SHR 2) ; *n°3 : pellicules de Syrah Haut-Julien (SHR 3) ; 15 *n°4 : pépins de Carignan (SHR 4) ; *n°5 : pellicules de Mourvèdre (SHR 5) ; *n°6 : pellicules d'Alicante (SHR 6). L'étude 1 s'est déroulée sur six semaines avec trois semaines de traitement, une semaine d'arrêt et deux semaines de traitement. 20 Etude 2 : Evolution de la pression artérielle chez des rats SHR traités par vérapamil Trois rats mâles de souche Wistar Kyoto (WKY) et trois SHR, âgés de neuf semaines, ont été utilisés. Un suivi des pressions artérielles a été réalisé pendant deux semaines puis les rats SHR ont été traités successivement par trois doses de vérapamil : 25 30 mg/kg/jour, 20 mg/kg/jour et 40mg/kg/jour pendant dix semaines. Etude 3 : Effet des extraits polyphénoliques en combinaison avec le vérapamil Cette étude s'est elle-même déroulée en trois étapes : - Mise au point du modèle avec un extrait polyphénolique : trois rats mâles de souche SHR préalablement traités par le vérapamil de l'étude 1 ont été traités par l'extrait polyphénolique n°1 : pépins de Grenache Long du Coudoulet. - Comparaison des différents extraits polyphénoliques : dans les mêmes conditions que précédemment, les effets des extraits polyphénoliques n°2 à n°6 ont été comparés. - Confirmation des résultats obtenus avec un deuxième extrait polyphénolique : sept rats mâles de souche SHR ont été traités avec l'extrait n°6 (marc d'Alicante). 37 3002453 1. B. Mesure de la pression artérielle : La pression artérielle a été mesurée sur un appareil LETICA LE 5002 par la technique de sphingomanométrie (« tail-cuff »). Le brassard est placé sur la queue du rat à 2 cm de l'extrémité, la température de la pièce doit être entre 29°C et 32°C. L'animal est 5 placé dans une pièce calme et obscure pour minimiser le stress ainsi que manipulé avec précaution et recouvert d'un tissu pendant la mesure. L'animal doit être entraîné à la mesure. Pour chaque rat, la valeur retenue est la moyenne de trois mesures successives si l'écart maximum entre deux mesures est inférieur à 20 mmHg. 10 3. Résultats des tests in vivo : 2. A. Etude 1 : Détermination des effets anti-hypertenseurs des 6 extraits polyphénoliques chez des rats SHR La pression artérielle systolique des rats SHR contrôles est comprise entre 150 15 mmHg au début de l'expérience et 190 mmH g après 5 semaines (cf Figure 1). Les extraits polyphénoliques administrés aux rats SHR ont peu d'effet sur la pression systolique des animaux, qui augmente graduellement (sauf en ce qui concerne le lot 1 après 2 semaines de traitement) (cf Figure 1). Cependant après 3 semaines de traitement, une intolérance au gavage a rendu très difficile les administrations et obligeant 20 l'interruption du traitement pendant 1 semaine (cf. semaine 4 sur la Figure 1). Cet arrêt du traitement a été associé chez les lots de rats SHR 1, 2 et 6 à une augmentation de la pression systolique supérieure au rats SHR contrôle (cf Figure 1). Cette remontée peut être interprétée comme un effet rebond, souvent observée avec les produits antihypertenseurs et pourrait signifier un potentiel anti-hypertenseur des extraits concernés. 25 Toutefois, la reprise de l'administration des polyphénols à la cinquième semaine n'a pas permis de retrouver une baisse significative de la pression artérielle (cf Figure 1), ni un effet rebond à un nouvel arrêt du traitement (non illustré). 2. B. Etude 2: Evolution de la pression artérielle chez des SHR traités par 30 vérapamil La pression artérielle des rats WKY reste stable entre 100 et 110 mmHg. Avant le début du traitement, on observe une augmentation graduelle de la pression artérielle chez les rats SHR de 158 mmHg à 194 mmHg. Le traitement par vérapamil à 30 mg/kg/jour provoque une chute brutale de la pression artérielle à 120 mmHg suivi d'une remontée 35 progressive jusqu'à 217 mmHg à 20 mg/kg/jour. L'augmentation de la dose administrée à 40mg/kg/jour provoque une diminution de la pression artérielle à 180 mmHg suivi d'une 38 3002453 remontée à 200 mmHg en 10 jours (cf Figure 2). Ce résultat illustre la résistance des rats SHR aux traitements anti-hypertenseurs de référence, y compris les antagonistes calciques. 5 2. C. Etude 3 : Détermination des effets presseurs des extraits polyphénoliques en présence de vérapamil L'étude 2 a montré que le vérapamil, un antihypertenseur majeur inhibiteur du calcium, perd peu à peu son activité anti-hypertensive dans le modèle de rats SHR. Cette troisième étude a été réalisée en trois étapes : 10 A) Tout d'abord, un traitement par l'extrait n°1 à 21 mg/kg (pépins de Grenache Long du Coudoulet) associé au vérapamil à 40 mg/kg des trois animaux préalablement traités par le vérapamil a été mis en place (Lot 1). Suite à ce traitement, une baisse progressive de la pression artérielle (maximale après trois semaines de traitement) par rapport aux rats SHR contrôle (cf. Figure 3) ou traités uniquement par le vérapamil a été 15 observée (cf. Figure 2, en comparaison avec la Figure 3). B) Les effets des extraits n°2 à n°6 (21 mg/kg) associé au vérapamil (40 mg/kg) ont été déterminés de façon comparative dans les mêmes conditions expérimentales (cf tableau 1 ci-dessous). C) L'extrait n°6 (pellicules d'Alicante) a été utilisé pour conforter le résultat 20 préliminaire obtenu précédemment. Le nombre d'animaux traités par l'extrait n°6 (21 mg/kg) associé au vérapamil (40 mg/kg) a été augmenté jusqu'à sept au total. Cette expérience a permis de confirmer l'efficacité de l'extrait n°6 en combinaison avec le vérapamil (cf. Figure 3, Lot 6). Un animal a en effet quasiment normalisé sa tension artérielle. Ce phénomène est 25 tout à fait exceptionnel pour ce modèle. 39 3002453 Tableau 1 : Effet des effets des différents extraits polyphénoliques sur les rats SHR traités associés au vérapamil (étude 3B) Lots 6 jours 13 jours 20-23 jours WKY 108,5±1,2 108,5±1,2 108,5±1,2 (102-121) (102-121) (102-121) SHR 200,3±1,8 200,3±1,8 200,3±1,8 (190-214) (190-214) (190-214) SHR+ va 198,0±1,5 198,0±1,5 198,0±1,5 (195-202) (195-202) (195-202) SHR+V+1 a 193,1±3,2 161,4±10,5 146,3±5,9 SHR+V+2a 191,7±3,7 192,5±0,8 SHR+V+3a 188,7±2,7 192±1 SHR+V+4a 187,2±5,8 189,5±5,5 SHR+V+5a 186,3±0,0 185,3±5,7 SHR+V+6a 168,8±10,6 173,0±24,7 171,8±18,8 SHR + 6a 200,9±2,8 195-204 20 aV, Vérapamil ; V+1 à V+6, Vérapamil + extrait n°1 à n°6 ; SHR+6, SHR traité avec l'extrait n°6. Les valeurs entre parenthèses correspondent aux valeurs minimales et maximales enregistrées sur l'ensemble de la période de mesure considérée. 5 10 15 3002453 3. Conclusion des expériences in vivo : Le rat SHR utilisé dans cette étude constitue un modèle d'hypertension artérielle essentielle difficile à corriger, y compris par les antihypertenseurs majeurs de première intention. Cette notion a été retrouvée dans cette étude en utilisant un antagoniste du 5 calcium, le vérapamil. Une résistance au vérapamil s'est même développée chez les rats SHR traités par le vérapamil seul (cf. Figure 2). Utilisés de façon chronique à une dose équivalente à celle ingérée par un homme de 70 kg consommant 500 ml de vin rouge, les extraits polyphénoliques hydro-alcooliques 70% étudiés n'ont pas induit de baisse significative de la pression artérielle. 10 Ni les extraits polyphénoliques, ni le vérapamil n'ont montré une activité antihypertensive suffisante administrés seuls pendant une durée suffisante. De façon surprenante, la combinaison des extraits polyphénoliques avec du vérapamil a permis une diminution de la tension des rats SHR, par rapport aux rats SHR contrôles, sur une période allant jusqu'à 23 jours. De façon encore plus étonnante, la 15 combinaison des extraits polyphénoliques avec du vérapamil a permis de vaincre la résistance développée vis-à-vis du vérapamil chez les rats SHR (cf. Etude 3A). Les extraits polyphénoliques associés au vérapamil ont démontré une synergie d'action, l'effet antihypertenseur de la combinaison étant supérieur à la somme des effets des deux agents, soit l'effet antihypertenseur du vérapamil seul, les extraits 20 polyphénoliques n'ayant pas produit de baisse significative de la tension à eux seuls. REVENDICATIONS1. Combinaison comprenant un extrait polyphénolique de marc de raisin et un antihypertenseur de la famille des inhibiteurs calciques. 2. Combinaison selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait polyphénolique est tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 9. 3. Combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle l'antihypertenseur est le vérapamil. 4. Combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation en tant que médicament. 5. Combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour son utilisation dans le traitement de l'hypertension. 6. Composition pharmaceutique comprenant la combinaison selon l'une des revendications 1 à 5 ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 7. Extrait polyphénolique de marc de raisin susceptible d'être obtenu par extraction aqueuse ou extraction alcoolique d'un ou plusieurs marc(s) de raisin. 8. Extrait polyphénolique de marc de raisin selon la revendication 7, dans lequel le marc de raisin est composé de pépins et/ou de pellicules de raisin. 9. Extrait polyphénolique de marc de raisin selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, dans lequel le raisin appartient à l'un des cépages choisi parmi le Grenache Long du Coudoulet, le Grenache Face aux Pins, le Syrah du Plantier, le Syrah du Haut de Julien, le Carignan, le Mourvèdre, le Counoise, l'Alicante et leurs mélanges. 10. Extrait polyphénolique de marc de raisin selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour son utilisation dans le traitement de l'hypertension. 11. Complément alimentaire comprenant l'extrait polyphénolique de marc de raisin selon l'une quelconque des revendications 7 à 9. 12. Aliment destiné à des fins médicales spéciales comprenant l'extrait polyphénolique de marc de raisin selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'aliment est destiné à des patients hypertendus.