FR 3005163 A1 20141031 FR 1353755 A 20130424 DISPOSITIF DE FILTRATION ET CONCENTRATION AUTOMATIQUE DE MICROORGANISMES Domaine de l'invention La filtration sous vide est utilisée de manière classique dans les laboratoires. Elle est utilisée de deux manières : soit pour clarifier un liquide (le filtrat est alors gardé et le filtre jeté), soit pour collecter et concentrer des particules ou microorganismes d'intérêt (le filtrat est jeté, la membrane est gardée). La figure 1 présente un dispositif de l'état de l'art, à savoir un entonnoir Büchner. Ce dispositif a pour inconvénients : - Le filtre peut se boucher rapidement si le liquide contient trop de particules/microorganismes ce qui peut empêcher la filtration de la totalité du volume - La collecte des particules/microorganismes est difficile (filtre à plat) sauf par un écouvillon de manière manuelle. La récupération par écouvillon de manière automatique n'est pas évidente à réaliser de manière reproductible et entraine un deuxième rendement de relargage défavorable si le concentrât bactérien doit être délivré sous forme liquide pour les besoins du protocole d'analyse. - La séquence du protocole de filtration et les dispositifs de l'état de l'art ne peuvent être automatisés facilement - La grande surface de filtration (pour pouvoir filtrer une quantité suffisante d'échantillon) à plat ne permet pas d'avoir un rapport de concentration optimal 20 Objet de l'invention L'invention a pour objet un dispositif de prétraitement d'échantillons biologiques permettant de collecter 25 les microorganismes contenus dans l'échantillon en éliminant des constituants de la matrice de l'échantillon (sels dissouts, protéines, cristaux, mucus, cellules humaines ) Les fonctions de ce dispositif sont : 30 1- la purification rapide du contenu microbien pour analyse ultérieure (ie. Lavages possibles de la membrane de collecte) 2- la concentration des microorganismes 3- la resuspension des microorganismes dans un volume de tampon limité (une partie du dispositif étant inclinée) 35 4- Un arrangement du dispositif tel que les étapes du protocole de prétraitement puissent être réalisées de façon totalement automatisées par un robot de pipetage approprié (e.g starlet d'Hamilton Robotics). C'est-à-dire notamment une séparation des fonctions de préfiltration et de collecte sur membrane. 1-L'art antérieur utilise le principe de collecte sur membrane et de préfiltration. Les dispositifs existants ne permettent pas d'accéder directement à la membrane de capture des microorganismes car celle-ci est soit recouverte par le préfiltre, soit inaccessible par une pipette ou un écouvillon dans le dispositif. Le dispositif inventé permet un accès aisé à la membrane afin de pouvoir exécuter des lavages ou collecter les microorganismes, par exemple par resuspension à la pipette ou par écouvillonnage. 2-L'art antérieur utilise le principe d'aspiration sous vide. Mais le vide est appliqué par le même conduit sur le préfiltre et la membrane. Lorsque la membrane commence à se boucher il n'y a presque plus d'aspiration au niveau du préfiltre. Le système inventé résout ce défaut grâce à une double aspiration contrôlable par une vanne qui permet d'aspirer indépendamment au niveau du préfiltre et au niveau de la membrane. 3-L'art antérieur utilise des membranes sur un support plan horizontal. Lors des étapes de lavages de la membrane ou de reprise des microorganismes avec une pipette, le liquide dispensé s'étale sur toute la surface de la membrane. Il est donc difficile de l'aspirer de nouveau. Notre dispositif résout cet inconvénient car la membrane est penchée d'un angle d'environ 30 °. Cette inclinaison peut être obtenue par l'angle du support du bloc de filtration et/ou par inclinaison de la membrane. Ainsi, lorsque le liquide est dispensé, en provenance du préfiltre et/ou directement sur la membrane, il coule naturellement vers le bas de la membrane où il peut être de nouveau aspiré sans perte significative de volume. Au fur et à mesure de la délivrance des jets de tampon de collecte, les microorganismes vont se concentrer vers la partie basse de la membrane formant un angle fermé avec la paroi du réservoir de collecte. Le concentrât bactérien peut donc être concentré dans un volume de tampon propre de 300 à 700pL soit un facteur 10 à 20 fois le volume initial d'échantillon 4-Le dispositif a également été conçu pour être facilement utilisable sur un pipeteur automatisé. Dans ce but, la paroi du réservoir de collecte présente au moins une partie inclinée, adaptée pour pouvoir présenter verticalement une pipette, en aplomb du concentrât bactérien. Cette géométrie facilite également les opérations de pipetage et/ou d'écouvillonnage, manuelles et/ou automatiques. L'intérêt d'un tel dispositif est de pouvoir être utilisé pour différents types d'échantillons (urines, hémocultures,....) de volumes différents (10 mL à 1mL) en sélectionnant un protocole de prétraitement adapté au spécimen considéré. Ainsi pour les hémocultures le protocole est une lyse sélective suivie d'une unique filtration sur membrane alors que pour des urines cliniques, le protocole consiste en une préfiltration suivie d'une filtration sur membrane. Par ailleurs, pour l'approche Identification Typage Résistance Virulence (ITRV) par une technologie de spectrométrie de masse par Ionisation ElectroSpray (ESI), disposer des microorganismes en suspension liquide est plus pratique pour la suite du protocole (lyse + extraction des protéines ou lyse + digestion trypsique des protéines). L'intérêt d'un tel dispositif est également de pouvoir être jetable. Les matériaux utilisés pour sa réalisation étant peu couteux, le dispositif ou le bloc de filtration peuvent être à usage unique pour le prétraitement d'un échantillon. Le dispositif peut également être utilisé en vue de la préparation automatique de plaque MALDI-TOF après extraction des microorganismes à partir des échantillons biologiques. Les microorganismes pouvant par exemple être collectés directement sur la membrane par un outil robotisé pour être déposés sur une plaque MALDI-TOF. De la même manière, les microorganismes peuvent être disposés dans une suspension liquide qui sera centrifugée afin de pouvoir récupérer un culôt de microorganismes. Ce culôt de microorganismes sera alors déposé sur une plaque MALDI-TOF. Description du dispositif : Les buts et avantages du dispositif selon la présente invention seront mieux compris à la lumière des exemples nullement limitatifs qui suivent, en référence au dessin, dans lequel : La figure 1 est un dispositif de l'art antérieur La figure 2 est une représentation schématique en coupe d'un premier mode de réalisation du bloc de filtration (2) sur un support fixe (1) incliné à 300 . La figure 3 est une représentation schématique en coupe du premier mode de réalisation du bloc de filtration (2). La figure 4 est une représentation schématique en perspective du premier mode de réalisation du bloc de filtration (2) sur un support fixe (1) incliné à 30°. La figure 5 est une représentation schématique en vue de dessous du premier mode de réalisation du bloc de filtration (2). La figure 6 est une représentation schématique en vue de dessus du premier mode de réalisation du bloc de filtration (2). La figure 7 est une représentation schématique en perspective du premier mode de réalisation du support fixe (1) incliné à 30°. La figure 8 est une photographie du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention. La figure 9 est une représentation schématique en perspective d'un second mode de réalisation du dispositif sur un support à coulisseau La figure 10 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif La figure 11 est une représentation schématique en coupe du Détail A du second mode de réalisation du dispositif La figure 12 est une représentation schématique en coupe du Détail B du second mode de réalisation du dispositif La figure 13 est une représentation schématique en perspective du support de préfiltre du second mode de réalisation du dispositif La figure 14 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif présentant les flux d'aspiration « aspiration A » et « aspiration B ». La figure 15 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration présentant le flux d'aspiration Flux B dans cette utilisation. La figure 16 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration. Selon un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention En référence aux figures 2 et 3 - Le dispositif est composé d'un support fixe (1) inclinée à 300 sur lequel est installé un bloc de filtration (2) pouvant être amovible. Le bloc de filtration (2) comprend un préfiltre ou un empilement de préfiltres (3) contenu dans un réservoir de préfiltration (4) et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration comprend également un réservoir de collecte (5) avec une membrane (6) disposée dans le fond du réservoir. Alternativement, l'angle de 30° est obtenu par une inclinaison du support fixe (1) et/ou du bloc de filtration (2) et/ou de la membrane (6). Le réservoir de collecte (5) présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée (11) En référence à la figure 4 - Le dispositif est relié à un système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre (7) et de la membrane (8) situés sur le support fixe (1). - L'étanchéité entre le bloc de filtration (2) et le support fixe (1) peut être obtenue par tout moyen. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration (2) est vissé sur le support fixe (1) et un joint, non représenté, est placé entre le bloc de filtration (2) et le support fixe (1) - Une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant soit au niveau du préfiltre, soit au niveau de la membrane (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre). La vanne peut être intégré au système d'aspiration sous vide ou faire partie intégrante du dispositif de filtration. En référence aux figure 5 et 7: Le bloc de filtration (2) pouvant être amovible, l'orifice d'aspiration du préfiltre (7) coopère alors avec un orifice (7') sur le bloc de filtration (2). De même l'orifice d'aspiration de la membrane (8) coopère avec la partie débouchante du réservoir correspondant (8'). En référence à la figure 6: Le réservoir de collecte (5) présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée (11). Afin de réaliser une étape de préfiltration d'un échantillon utilisant le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention et en référence aux figures 4 et 5: - Une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant soit au niveau du préfiltre, soit au niveau de la membrane (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée sur en aval du préfiltre). - Le liquide à traiter (ex : urine) est pipeté dans le réservoir de préfiltration (4) au-dessus du préfiltre (3). La pompe à vide fonctionne. La vanne est réglée pour aspirer à travers le préfiltre par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration du préfiltre (7) et, le cas échéant, l'orifice (7') . Une fois le liquide préfiltré celui-ci est dirigé naturellement par la géométrie du dispositif et stocké au-dessus de la membrane de rétention des microorganismes (6).Le liquide préfiltré transite ainsi par un réservoir intermédiaire (9) disposé entre le préfiltre (3) et le réservoir de collecte (5). Afin de réaliser une étape de filtration sur la membrane (6) d'un échantillon et en référence aux figures 4 et 5: - La vanne est réglée pour aspirer au niveau de la membrane (6) par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration de la membrane (8) et, le cas échéant, l'orifice (8'). Les microorganismes sont collectés sur cette membrane (6). La porosité de cette membrane est inférieure au diamètre des microorganismes à collecter. Préférentiellement, la porosité est comprise entre 0,22 et 0.45 pm. La membrane peut être lavée afin de purifier les microorganismes. La paroi du réservoir de collecte (5) comprend au moins une partie inclinée (11) ou au moins une partie en forme d'ogive. Cette forme de la paroi permet, en coopération avec l'inclinaison de la membrane (6) de favoriser la rétention des microorganismes dans un zone préférentielle (formant un angle aigu) permettant ainsi dans une étape ultérieure de récupération des microorganismes d'effectuer une remise en suspension dans un volume réduit de liquide. Avantageusement, cette rétention des microorganismes dans une zone préférentielle permet de localiser les microorganismes dans une zone délimitée ce qui favorise un rendement plus élevé de récupération par un automate ne disposant pas de système de vision permettant de localiser un tapis bactérien sur la surface de la membrane. A la suite de cette étape de filtration sur la membrane (6) et en référence à la figure 8: - La pompe à vide est éteinte afin de ramener la pression en aval de la membrane (6) à pression atmosphérique. Les microorganismes adhèrent alors à la membrane (6) et peuvent être récupérés / collectés de différentes façons et de manière non limitative : - par resuspension à la pipette (10) avec un liquide (éjection rapide d'un liquide, par exemple un tampon neutre ou solvant), voir figure 8. Dans ce but, le réservoir de collecte (5) présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée (11) de manière à permettre à une pipette (10) présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane (6) sans heurter la paroi du réservoir de collecte (5). - par écouvillonnage de la surface de la membrane (6) : soit avec un écouvillon seul soit avec un dispositif combinant un cône de pipetage comprenant un écouvillon à son extrémité. Un tel dispositif comprend un cône de pipetage dont l'extrémité débouchante venant aspirer le liquide est enveloppée par la partie poreuse d'un écouvillon. L'avantage d'un tel dispositif est de pouvoir aspirer le liquide grâce au cône de pipetage, au travers de la partie poreuse de I 'écouvillon, puis de venir au contact de la membrane pour « décoller » le rétentât de microorganismes par abrasion, cette opération n'étant pas réalisable avec l'extrémité classique d'un cône de pipetage. - En récupérant directement la membrane (6) (pour resuspension dans un tube ou lyse directe des microorganismes), la membrane (6) étant alors montée de manière amovible dans le réservoir de collecte (5). - Par rinçage : arrivée du liquide par la face arrière de la membrane (6). La face arrière de la membrane étant la face dirigée en regard de l'orifice d'aspiration (8'). Alternativement, le liquide (tampon neutre ou solvant) est déposé sur la membrane (6) dans le réservoir de collecte (5), aspiré, puis refoulé par la face arrière de la membrane (6). Les différentes méthodes de récupération / collecte pourront être adaptées en fonction des microorganismes recherchés. En effet, certains rétentâts de microorganismes présentent une adhérence très forte à la membrane qui rend impossible la collecte par éjection rapide d'un liquide, le jet de liquide n'étant pas suffisant pour décoller le rétentât. Seule une technique par abrasion (écouvillonage ou cône de pipetage enveloppé par la partie poreuse d'un écouvillon à son extrémité) étant alors efficace pour décoller le rétentât de la membrane. Selon un second mode de réalisation du dispositif selon l'invention En référence à la figure 9, dans un second mode de réalisation, le dispositif est composé d'un support fixe (20) sur lequel est installé un bloc de filtration (22) pouvant être amovible. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration (22) est maintenu sur le support par l'intermédiaire de deux coulisseaux (23). Le dispositif est relié à une système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre (24) et de la membrane (25) situés sur le support fixe (20). Le support fixe (20) comprend ainsi plusieurs orifices d'aspiration formant deux circuit d'aspiration matérialisés par les flèches « aspiration A » et « aspiration B ». Les deux circuits d'aspiration permettent ainsi d'aspirer sous la membrane et sous le préfiltre indépendamment. Alternativement, si l'aspiration est suffisante sous la membrane, le dispositif peut être maintenu sur le support sans l'utilisation de coulisseaux. L'étanchéité entre le bloc de filtration (22) et le support fixe peut être obtenue par tout moyen. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration (22) est maintenu sur le support fixe (20) et deux joints toriques, non représentés, sont placés entre le bloc de filtration (22) et le support fixe (20) afin d'assurer l'étanchéité des circuits d'aspiration « aspiration A » et « aspiration B ». Une vanne, non représentée (intégrée ou non au dispositif), permet de gérer le protocole en aspirant soit au niveau du préfiltre, soit au niveau de la membrane (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre). En référence à la figure 10 : Le bloc de filtration (22) comprend un préfiltre ou un empilement de préfiltres (26) contenu dans un réservoir de préfiltration (28) et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration comprend également un réservoir de collecte (30) avec une membrane (32) disposée dans le fond du réservoir (30). La membrane (32) est inclinée d'un angle de 30° par rapport au plan formé par le support fixe (20), soit de 60° par rapport à la verticale. Le réservoir de collecte (30) présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée (34) ou en forme d'ogive. Le bloc de filtration (22) pouvant être amovible, l'orifice d'aspiration du préfiltre (24) coopère alors avec un orifice (24') sur le bloc de filtration (22). De même l'orifice d'aspiration de la membrane (25) coopère avec la partie débouchante du réservoir correspondant (25'). En référence à la figure 11 correspondant au Détail A. Le réservoir de collecte (30) peut être réalisé en deux parties assemblées (36) et (38). Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure (36) et la partie inférieure (38) coopèrent pour maintenir la membrane (32) en position, par exemple par l'intermédiaire de deux ergots (40). Avantageusement, les deux pièces (36) et (38) sont soudées pour maintenir la membrane. En référence à la figure 12 correspondant au Détail B. Le réservoir de préfiltration (28) peut être réalisé en deux parties assemblées (42) et (44). Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure (42) et le support de préfiltre (44) coopèrent pour maintenir le préfiltre (26) en position. Avantageusement, la partie supérieure (42) comprend un moyen (33) susceptible de coopérer avec un outil porte pipette pour robot pipeteur (représenté sur la figure 14). Alternativement, ce moyen (33) comprend une forme adéquate (orifice, ergot) permettant d'être manipulée de manière automatique par un éléments mécanique (pince) ou directement par l'embout d'un canal de pipetage intégré dans le robot. Avantageusement, ce moyen (33) peut comprendre une partie cylindrique dans laquelle l'outil porte pipette peut venir s'insérer et être maintenu de manière à soulever le réservoir de filtration (28) et dégager ainsi l'accès à la membrane (32). Dans un mode de réalisation particulier, cette partie cylindrique est maintenue par un ensemble de nervures disposées radialement sur la partie cylindrique de manière à définir au moins un moyen d'accès au préfiltre ou à l'empilement de préfiltres (26). Ce moyen d'accès permettant à un appareil tel qu'un robot pipeteur de présenter un outil à la verticale du préfiltre ou de l'empilement de préfiltre pour venir y dispenser un liquide. En référence à la figure 13, le support de préfiltre (44) peut présenter des rainures (46) s'étendant radialement par rapport à l'orifice d'aspiration (45) du support de préfiltre (44). Les rainures (46) sont disposées sur la face en regard du préfiltre, afin de maintenir le préfiltre en position tout en facilitant l'écoulement du filtrat. Avantageusement, les saillies (46) s'étendent radialement par rapport à l'orifice d'aspiration (45) et selon un ou des cercle(s) concentriques ayant pour centre l'orifice d'aspiration (45). La support de préfiltre (44) permet à la fois de supporter le préfiltre ou l'empilement de préfiltres (26) et d'assurer l'étanchéité du réservoir de collecte lors de la mise au vide de ce réservoir, permettant ainsi le passage efficace de l'échantillon à travers le préfiltre ou l'empilement de préfiltres (26). En référence à la figure 14, un protocole de filtration d'échantillon d'urine utilisant le second mode de réalisation du dispositif comprend les étapes suivantes 1 ère étape : Déverser l'urine sur le préfiltre (26). Dans le cas d'un protocole automatisé, l'urine peut être déversée par un robot pipeteur venant se présenter à la verticale du préfiltre (26) au travers du moyen d'accès au préfiltre de la partie supérieure (42). Alternativement, l'urine peut être déversée, manuellement ou automatiquement, directement sur le préfiltre (26) dans le cas où la partie supérieure (42) n'est pas présente. 2ème étape : Activer l'aspiration A (« aspiration A ») par l'intermédiaire des orifices d'aspiration (24) et (24'). L'urine passe à travers le préfiltre (26) et se dépose sur la membrane (32). 3ème étape : Activer l'aspiration B (« aspiration B ») par l'intermédiaire des orifices d'aspiration (25) et (25'). Les microorganismes restent sur la membrane (32). pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle. 4ème étape : Retirer le réservoir de préfiltration (28) pour accéder à la membrane (32), par exemple à l'aide d'un moyen automatisé tel qu'un outil de robot utilisé pour manipuler des pipettes. 5ème étape : Récupérer les microorganismes. Les microorganismes étant alors concentrés par la force de pesanteur et l'action de l'aspiration dans la partie basse de la pente formée par la membrane (32) ainsi que par la forme inclinée (34) ou d'ogive d'une partie de la paroi du réservoir de collecte (30). Les microorganismes étant alors concentrés dans une zone délimitée pour permettre la récupération des microorganismes par un robot de pipetage automatique dans un volume réduit de liquide. L'étape de récupération / collecte de microorganismes sur la membrane (32) peut être réalisée par les même moyens que ceux énoncés pour le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.40 En référence à la figure 15, un protocole de filtration d'échantillon de sang utilisant le second mode de réalisation du dispositif sans le réservoir de filtration (28) comprend les étapes suivantes 1 ère étape : Déverser le sang sur la membrane (32). 2ème étape : Activer l'aspiration B (« aspiration B ») par l'intermédiaire des orifices d'aspiration (25) et (25'). Les microorganismes restent sur la membrane (32) pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle. 3ème étape : Récupérer les microorganismes En référence à la figure 16, la récupération des microorganisme peut se faire par resuspension à la pipette (48) avec un liquide (éjection rapide du liquide. Tampon neutre ou solvant). Dans ce but, le réservoir de collecte (30) présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée (34) de manière à permettre à une pipette (48) présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane (32) sans heurter la paroi du réservoir (30). Exemples d'utilisation du dispositif selon l'invention: Le dispositif a été testé sur deux types d'échantillons : urines (cliniques et inoculées ) et hémocultures (cliniques et inoculées ) Une partie des expériences a pour but d'estimer l'efficacité du dispositif à collecter et restituer les microorganismes (rendement de collecte des microorganismes). Une seconde partie des expériences se déroule jusqu'à l'analyse finale en spectrométrie de masse (ESI ou MALDI) pour identifier ces microorganismes. 25 Expériences en urines inoculées: comparaison des préfiltres Le dispositif de double-filtration appliqué aux urines est utilisé tel que décrit précédemment. Expériences en urines inoculées : Résultats sur les trois microorganismes en mode automatique Microorganismes E.0 (Escherichia Coli), S.E (Staphilococcus Epidermidis) et C.A (Candida Albicans). M . 0 EC SE CA Réplicat 1 100 37 12 2 78 44 20 3 88 35 18 4 92 40 9 5 91 38 8 6 7 7 15 Tableau présentant le rendement de récupération des microorganismes E. C, S.E et C.A sur plusieurs réplicats.Le rendement est défini comme le ratio de quantité de microorganisme récupéré sur la membrane à la fin du protocole sur la quantité de microorganisme introduite en solution sur le pré filtre. Version graphique du tableau précédent Cette expérience permet de conclure au bon fonctionnement du dispositif. Il permet de filtrer efficacement 10 mL d'urine et d'en collecter une fraction non négligeable des microorganismes. Dual filtration system préfiltration yield (F=ti?tre 5prrO SE:1ERCFWm1) CA:1E4qCFU:m1} 2 EC-2F CE, 2F CA-1'20 Expériences en urines saines inoculées : sur automate pipeteur (4 dispositifs parallèles). Rendement de filtration sur les microorganismes E.0 (Escherichia Coli) et C.A (Candida Albicans) pour différentes configurations de resuspension. Rendement moyen sur 4 échantillons E.0 C.A Jet faible volume et distance 1 mm 69% 29% Jet faible volume et distance 3 mm 59 `)/0 Jet grand volume 73 `)/0 27 `)/0 et distance 3 mm Jet grand volume 59 `)/0 et distance 5 mm Référence en 82 `)/0 manuel Tableau présentant le rendement de récupération des microorganismes E. C et C.A sur plusieurs réplicats en faisant varier la méthode de resuspension automatisée. Cette expérience nous a permis de conclure sur la faisabilité d'automatisation du dispositif et sur l'impact du type de resuspension sur le rendement de récupération. Expérience avec urines pathologiques : Résultats de détection de peptides E.coli en LC-ESI MS (mode MRM) Un lot de 15 urines pathologiques a été traité par Double-Filtration (DF) avec le dispositif présenté avec comme préfiltre l'empilement (ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide): Nylon 30 pm / 2x VFE 5pm / Filtrona 2mm ou 4mm (ie 2x2mm) et comme filtre une membrane PES 0,45pm (Pall). Après un lavage avec 1mL d'eau, le rétentât a été collecté par remise en suspension dans 400 pl de tampon carbonate puis soumis au protocole de lyse-digestion (version manuelle) pour être injecté en LC-ESI MS avec une méthode d'acquisition développée de façon non optimisée pour rechercher des peptides qu'on retrouve chez E.Coli. La méthode MRM cible 60 peptides dont 7 sont spécifiques de l'espèce E.coli et 9 communs à la famille des entérobactéries, les 44 restant doivent être génériques aux Gram-. Le tableau ci-dessous donne les scores de bonne identification de l'espèce E.coli dans les urines pathologiques (seuil de bonne détection arbitrairement fixés) 15 10*7 u2 400 RAS E.Coli 5000 400 RAS 10*7 u15 E. Cou E.Coli - Enterococcus u3 240 1400 Cellules épithéliales 10*4 3 germes différents u4 850 5000 I NP IRAS 110*6 u9 250 40 RAS 10*7 C.Koseri u10 2600 130 Levures 10*7 E.Cloacue, C.albicans, Cucu olbicans ull I>5000 1670 IRAS 110*3 3 germes différents u12 1390 190 IRAS lo Stérile u13 3700 5000 NP RAS 10*7 E.Coli Résultats bioMérieux méthode MRM EC5 N peptides totaux détectés Aire peptides specifiques E.coli détectés (maxi=7) peptides de la famille des enterobacteries détectés 27 2,09E+06 ESI-MS results 7 specific peptides de E.coli u2, u5, u6, u8 with score .? 3 (/ 7) with 1 score 1e7 ESI-MS results 7 specific peptides de E.coli with score 3 (/ with 1 score 31 DE + HCCA DE+ AF + HCCA c,:.èlèse (at mer ch.,..dise /.ii- recept ion) hi,,jreie.ècide .2iiü.+2e. triple phowl-2:eI. sperme, aluLbS p64 NP R .2 .. P.5++++,p+rpi- s+.5+1.5 _S+.07 P5 à.erugir-pis2.. P5 .ier0clrip5ii ''' p65 700 >5 RAS "_C' 7 Nue p2l n^-_,[0-,e n Nu rD p66 570 RAS " lscherii+i +di +. B Esch.coli Esch.coli p67 > SC 00 5000 5000 5000 S 00 ,Esi.,[1^_Pq HI + .1 Esch.coli Eschcoli 76 1600 3gpfliii 5+:Bi B. 80 >5000 RAS 10 *7 pp"erüli.+Liér +Ii..i.+>, - 'n' clrii..- +.:. é- ,,L.L.riëe B*= urines bi-microbiennes avec 2 espèces à des concentrations voisines. Les résultats d'identification peuvent être présentés comme suit (voir également tableau 1 ci- dessous) : 13 urines types d'urines sont exploitées : - 4 stériles, - 2 mono-microbiennes, - 4 bi-microbiennes (avec une espèce majoritaire), - Et 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches) Selon le mode de dépôt sur la cible MALDI (HCCA sans AF (Acide Formique) et avec AF avant l'ajout d'HCCA), 90 `)/0 et 100% de bonne identification ont été obtenus au niveau de l'espèce (sur ce panel de 10 urines dont les positives sont à minima à 10e6 CFU/mL). Pour les 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches), seule une espèce peut être identifiée à la fois sur un dépôt. Ces résultats illustrent bien qu'une double filtration rapide des urines brutes à l'aide du dispositif selon l'invention permet de purifier suffisamment et de collecter assez de microorganismes pour une identification exacte de celles-ci par MALDI-ToF.20 Tableau 1 Identification MALDI-TOF correcte vs Vitek2 Protocole nombre Stériles Mono- Bimicrobiennes score intermédiaire Bimicrobiennes d'échantillons microbiennes (stérile, Mono et exploitables bicontaminée avec 1 espèce majoritaire) avec 1 espèce 2 espèces à prédominante concentration identique ID d'une détection des 2 espèces seule espèce P1: DF + HCCA 13 3/4 2/2 4/4 9/10(90%) 3/3 0 P2: DF + AF + HCCA 13 4/4 2/2 4/4 10/10 (100%) 3/3 0 2) Expérience avec hémocultures inoculées : Résultats de détection de peptides en LC-ESI MS (mode MRM) Le protocole de lyse-filtration consiste brièvement en une lyse sélective des cellules du sang par action d'un tampon contenant un tensioactif pendant un temps court. L'avantage apporté par le dispositif ci-décrit est de par sa géomètrie (inclinaison de 300) qui permet la récolte efficace des microorganismes au moyen d'une solution liquide conduisant in fine à une suspension bactérienne. Le protocole Lyse-filtration est le suivant : o La filtration est faite sur filtre 0,2 pm PES utilisé comme membrane sur le dispositif Dual Filtration selon l'invention. o La prise d'essai est de 0,8 mL d'hémoculture qui sont traités par 0,4 mL de tampon CAPS 0,3M/ Brij 0.45% pendant 2 minutes suivi de la filtration pendant 2 minutes. o 3 lavages avec 175 pL de \Nash buffer 1( NaCI 0,45%/ Brij 97 0,005%) o 1 lavage avec 175 pL de \Nash buffer 2 (\Nash Buffer 2: Brij 97 0,005%) o La collecte est faite avec 200pL de tampon carbonate en respectant un nombre constant d'aspirations/refoulements (30). Nous avons testé également ce que donne la répétition de la collecte (une 2nde, une 3ènle et une 4ènle fois sur la même membrane de filtration).La lyse digestion a été faite avec le P2A sur le robot Hamilton. La démonstration a été faite pour E.Coli, S.epidermidis et C.aibicans avec une bonne détection des peptides ciblés par la méthode MRM. Ci-dessous le graphique présente les résultats de détection via une méthode MRM ciblant les peptides de E.coli. Les résultats sont positifs pour les hémocultures E.Coli EC1 et EC2 mais ils les ont également pour les hémocultures notées CA1, 2 et 3 et SE1, 2 et 3 car elles ont été contaminées accidentellement par du E.coli lors de la préparation. Les 2 contrôles négatifs ne donnent pas de détection de peptides de E.Coli, ce qui était attendu. Résultats de détection de peptides en LC-ESI MS (mode MRM) Cumulated Area 16 Lysis-Filtration on spiked blood cultures using Filtration device V6 followed by Lysis-Digestion P2 (Automated version) MRM results (criteria: 3 trans/3 with A>2000 and H>500) 58 59 59 59 58 59 59 58 2,0E+08 e. --- ----- ---- -et -------- - 60 - 1,8E+08 - - 50 1,6E+08 1,4E+08 - 1,4E+08 1,4E+08 - 1,3E+08 1,3E+08 - 40 1,2E+08 - 1,0E+08 1,0E+08 1,0E+08 - 30 - 8,0E+07 7,5E+07 \ 20 6,0E+07 5,0E+0- 4,0E+07 10 2,0E+07 2 0 0,0E+00 P. e" e" (":" 02' 4>" 41" cee C5e:" C.albicans and S.epidermidis Blood cultures -1Cumulated area /semple Ecoll contamination injected in LC-MS Peptides bien détectés Detected Peptides Number D'autre hémocultures ont aussi été traitées de la même façon mais après la collecte des microorganismes, nous avons réalisé le protocole lo afin d'identifier en LC-ESI-MS à l'aide des profils protéiques. Les résultats ci-dessous montrent que les 8 hémocultures E.Coli sont bien identifiées en LC-ESI avec l'algorithme Cross-Cor en interrogeant la base de données urine mais qu'il y a confusion avec Shigella si c'est la base culture qui est interrogée, les espèces étant proches. Les quatre hémocultures avec levures (C.Albicans) sont correctement identifiées (sur quatre). Une seule hémoculture S.epidermidis est bien identifiée (sur 4). Malgré ces quelques cas de mauvaises identifications qui pourront être résolus avec une étude plus large et des bases de données plus riches, ces essais attestent de l'efficacité de la préparation d'échantillon par lyse-filtration réalisée sur le dispositif tel que décrit dans le présent document.15 Résultats d'identification en LC-ESI MS après Lyse filtration sur le dispositif tel que décrit et extraction de protéine lo (mode full scan, profil protéique) dilué.s 10E pic_crossC, Eur E[7L e piz_crossCD, Hm_nnis Cr I :r - I pt-c_crossCor sum nnls 1 I 1 CAN .4.E6_P31206_3D1 CA 1 _ 1 l_h erroc3. cd ' -R^JE 7RUE -RUE JL [j, -H, HP CA:\ .1.:_S_.,..121.26_12-, FA 16 P.,[11,126 CC hel -cc - -, [E L.,,', TH, TRUE -F,LIE -RIJE L -' C4'........._.._?S'121.26_22: CA 16_931:106_JI_her- c c3.cc[- 7RLIE C 7 ,E LE -RUE ,IA - - t4..' ,...-'..:_S_P31.2 La5_0.04 [IA.' 16_11111[6 .04 h el- c c3. cd, -R..JE C,,, 7,=:1,P RLIE 7RUE J EH CE' 3J] , E -r 2- ,---,_,I.-..r -TLIE UE E:HG P-,:, r ENT.CLC -,R1TE 1AN.13L13 CAN.61.13 EH'IDIr33-: HT, ,1 7RUE ET 4E SHOE FL,, ENT.CLC - JE EH H_ z J32-g. .-_,D3 c _ 1 ,, , -,,,,,,, .-..,:: -,-F,IIE ENT A.E '5H7. ,=.b' ENT.CLC TtJE CAN. as EN.C, _ ,32."._2_,--1 - T : D.D. 6_1- 1 C A 1. crf --TUE ENT AES ENT.CLC -RUE CAN.W3 E-1 .IL'2IrE 1 _ J -I -_O-2. .27_ i --SUE EUT ASS 'I-,HC: .S, 0 r ENT.CLC -PUE CAN. Ci_B SH[S SCH. -`RUE -RUE CAN. ELB L-1 .1D _ _ I: :Q.P. OS hei-ocl C.û.S'..cd:: TRUE ENT AER ENT.CLC CAN. tû1.13 EH.C.O__ z DE229._21_1 t TF LIE EUTA ES ENT.CLC 5H. C__ 1 77 D E;37_,P P_C I- el- : cl cH -TUE EUT MS. ENT C1C -RUE CAN. Ci_B STA . EP12 D -I D_ DU _S.E.._E.7 L2S2_21 h e i-o c3, ca" C:TA: ,:,1 : A -PUE :', -RUE CAN TRO CAN.TRID STA . EP _ E 11i: J_ il: _SEP_S7L:253_22 hei-oc3 cd- CAN TROP AL [EU LN AL CA.,^ GLR CAN. ras _.71L 1i. 87172S2 3 hel-orlcd' 99T NeIR --H, ,F V[FR Ri- 4 CAN_TRO - ' P-_S.712J,J__,D4 _SEP_S7L2S2_24 hei---oc3,[df -TUE CAN.TROP -7RUE CAN.ALB CAN. B HRUE 7RUE 'FiE -RUE 5^ 'I STR.ORA BAL OEU RAr rrl BAC.CEU BAC.CEU BAC.CEU BAC.CEU BAC.CEU BAC.CEU [AN .ALB BAC.CEU CAN _ALB BAIC.CEU CAN ALB [AN _ALB BAC.CEU BAC.CEU BAC_CELI BAC.CEU CIT.K05 ENT.AER ENT_AER ENT_AER CANTROP CAN.TROP 5TRORA STRIERA RAC.CEU BAC.CEU 5TR.ORA CIT.BRA P [3_11 113453_001 1 113454_001 NA NA 16 13 12 31 Z5 37,5 75 81,25 3) Procédé alternatif sur échantillon d'urine utilisant le dispositif selon l'invention : Les différentes étapes de la manipulation sont données ci-dessous : 1) A réception, les urines sont photographiées. 2) Estimation des volumes dans les tubes (comparé à un tube gradué) 3) 10 pL sont déposés sur gélose CPS pour vérification. 4) 150 pl ont été mis de côté à 4°C pour faire un étalement de 100pL sur COS pour 5H00 de croissance. 5) Le reste de l'échantillon a été traité avec le dispositif selon l'invention. L'empilement des préfiltres utilisés est du bas vers le haut : lx VFE 5pm / Filtrona 2mm. La membrane de Filtration où seront récupérées les bactéries est : PES 0,45pm (Pall) 6) Le volume d'urine filtrée est compris entre 3 et 6 mL pour un temps de filtration de quelques minutes. La collecte du rétentât est fait avec 1000 pL d'eau (Versol). 7) A l'issue du protocole manuel, 10 pl sont étalés sur gélose CPS pour permettre de voir si la population bactérienne est la même entre la fraction collectée et l'urine de départ (couleur des colonies, polymorphisme, comparaison numération avant/après double filtration). 8) Pour le volume restant des fractions collectées, une centrifugation de 5 min 10000g a été faite pour enlever le maximum de surnageant (eau) et garder un culot de quelque pL pour MALDI-ToF. 9) Les dépôts sur plaque MALDI-ToF sont faits en doublons selon la terminologie du Tableau 2. 10) La manipulation par culture courte de 5h00 est faite en déposant 100 pl d'urine et étalement au rateau. Après 5H00 de croissance à 37°C, le biofilm est observé. Ce biofilm est alors collecté avec une oèse de 1pL et déposé sur cible MALDI-ToF. Tableau 2. Codification des protocoles selon le pre-traitement réalisé et le mode de dépôt sur cible MALDI-ToF. Protocole 1 (P1) : double filtration + Protocole 2 (P2) : double filtration + AF + HCCA HCCA Protocole 5 (P5) : culture sur COS 5H + HCCA Protocole 6 (P6) : culture sur COS 5H + AF + HCCA HCCA: (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique) : 1 pl par spot AF: (Acide Formique) : 0,5p1 par spot double filtration : traitement à l'aide du dispositif selon l'invention Autres applications Le dispositif de Double filtration selon l'invention peut également être utilisé avec un écouvillon pour la collection des microorganismes concentrés et retenus sur la membrane. La collection par écouvillon peut être réalisée soit manuellement soit de manière automatique moyennant une adaptation de l'outil de préhension du robot pipeteur - Le dispositif fonctionne également avec diffèrent type de préfiltres seul ou empilés et différentes membranes seules ou empilées. Pour certain liquides peu complexes, l'étage de préfiltration n'est pas utile. Les échantillons sont directement déposés au-dessus de la membrane (6),(32) de filtration, par exemple une membrane de 0,2pm de porosité. 15 - Les matériaux filtres utilisés pour l'étape de préfiltration peuvent être différents. Les préfiltres donnés à titre d'exemples sont les suivants : Code fournisseur matériau Tailles des pores (0 en pm) Filtrona Filtrona > 100 VFE (2mm) Whatman Fibre de verre 5 Pall PAD Pall Cellulose Pall 10 Pall PPE 10 Coton Magasin grand public Coton Coton20 Prat-Dumas coton 20 4 Whatman Cellulose 20-25 40 Whatman Cellulose 8-12 41 Whatman Cellulose 12-16 43 Whatman Cellulose 10-15 113 Whatman Cellulose 20 Les préfiltres ou empilements de préfiltres (3,26) utilisés dans le dispositif selon l'invention sont donnés ci-après : 10 Dans le tableau comparatif 5, pour chaque préfiltre ou combinaison de préfiltres, 9 ml d'un pool d'urines constitué de 10 tubes d'urines pathologiques est introduit dans le compartiment de préfiltration dans lequel on fait le vide doucement au moyen d'une vanne 3 voies. Quand le volume est passé au travers du ou des préfiltres, la vanne 3 voies est basculée lentement en position Filtre pour faire passer l'urine à travers une membrane PES 0,45pm. La vanne est remise en position fermée. Le culot bactérien est lavé sur la membrane avec 1m1 de tampon carbonate 50mM pH8 (vanne filtre ouverte) puis est récupéré avec 400 pl de tampon carbonate (vide stoppé et dispositif remis à pression atmosphérique) ; le volume récupéré varie de 300 à 400 pl. Le volume collecté a été divisé en 2 parts dont une part pour réaliser un dosage de protéines après lyse (protocole lyse P2). Les urines polymicrobiennes contenaient majoritairement : - E.aerogenes 1,2e7 CFU/mL - E.coli: 3e6 CFU/mL - S.aureus: 1e5 CFU/mL Le Tableau comparatif 5 suivant récapitule les observations faites durant les essais ainsi que les résultats de dénombrement du nombre de CFU par comptage sur boites de gélose CPS et les résultats de dosage des protéines. Observations sur géloses CPS Réf. essais Réf. Durée Durée Durée Volume Masse Numération bleu vert rose violet beiges préfiltres préfiltration filtration filtration récupération protéines tampon lavage culot après lyse bactérien P2 (pIg/essai) 1-1 MFE + . lminute 30 secondes 3441 63 >1E+7 nombre env égal nombre env égal qq unes filtrona négligeable préfiltres jaunes pb de vanne (fendue) 9m! filtrés aux rose violet aux bleu vert 1-2 2*VFE + négligeable préfiltres jaunes 3 minutes 50 secondes 3541 61 1E+04 nombre env égal nombre env égal qq unes filtrona 9m! filtrés aux rose violet aux bleu vert 2-1 PALL10+ négligeable préfiltres clairs arrêt à 3min 3min50 avec 3900 45 1E+04 nombre env égal nombre env égal env. 10 COTON20+ lent+colmatage 45m! filtrés assistance aux rose violet aux bleu vert filtrona 2-2 PALL10+ négligeable préfiltres clairs arrêt à 3min 3min50 avec 3900 53 1E+05 nombre env égal nombre env égal env. 10 COTON20+ lent+colmatage assistance aux rose violet aux bleu vert filtrona 5m! filtrés 3-1 Wattman rapide mais mousse ds partie filtration 2min40 50 secondes 4000 26 1E+07 nombre env égal nombre env égal qq unes 43+113+4 9m! filtrés aux rose violet aux bleu vert 3-2 Wattman PF 4 : sale arrêt à 3min 2min avec 4141 45 1E+08 plus que rose violet moins que bleu vert qq unes 43+113+4 PF 113 : sale lent+colmatage assistance PF 43 : sale 83m! filtrés 4-1 Wattman rapide? 2min 30 secondes 3000 21 1E+07 majoritaires bien moins que qq unes 40+41+113+4 présence mousse 9m! filtrés? bleu vert 4-2 Wattman rapide? membrane déchirée : culot non récupéré 40+41+113+4 présence mousse 5-1 PalIPAD+coto nbb négligeable 3min 3min avec 3900 65 1E+07 nombre env égal nombre env égal qq unes 6m! filtrés assistance aux rose violet aux bleu vert 5-2 PalIPAD+coto nbb négligeable 3min 3min avec 4000 59 1E+07 majoritaires moins que bleu vert qq unes 55m! filtrés assistance tableau comparatif 5 : préfiltres20 Préférentiellement, les empilements préfiltres utilisés sont : - 2 *VFE + Filtrona - Whatmann Paper Filter 43+113+4 - Whatmann Paper Filter 40+41+113+4 - PalIPAD + Coton Les membranes pouvant être utilisées à titre d'exemple sont : - Supor PES 450 membrane, (Pall Gelmann) - Supor PES 200 membrane, (Pall Gelmann - Supor 0.2 Mach V membrane (From Nalgen Filtration Unit) - Express 0,45 (Millipore) - GF/F glass fiber depth filter (Whatman) - Des membranes polymeres ayant des porosités entre 0,22 et 0,45pm : en polypropylene, en Polyethersulfone (PES), en Nylon (Polyamide), en Polytetrafluoroethylen (PTFE), en polycarbonate, en polyester, ou a base de cellulose (Cellulose régénérée, acetate de cellulose, nitrate de cellulose, Mbded Cellluose Ester). - Des membranes Type Anopore (Anodisc) en aluminium oxide avec des porosité de 0,02 pm (pour les applications de type purification d'exosomes) - Les membranes de filtration peuvent être des matériaux à basse de silice, polymeres, acetate ou oxide d'alumine à titre d'exemple. - Les écouvillons pouvant être utilisés en combinaison avec l'utilisation d'un cône de pipetage sont : o écouvillon 1 (V\NR) référence 1490241 Flexible swab o écouvillon 2 (Texwipe) référence TX745B Hard swab Dans cette utilisation, la partie poreuse de l'écouvillon est dissociée du manche pour venir envelopper la partie débouchante, venant habituellement pipetter le liquide, d'un cône de pipetage. - La membrane de filtration peut être inclinée d'un angle différent de 30°, soit entre 10 et 60°(qui correspond à un angle entre 30 à 80° par rapport à la verticale) tout en permettant la concentration des échantillons et leur collecte par un moyen de collecte tel qu'une pipette ou un écouvillon. - Le dispositif peut être muni d'un 3ème réservoir permettant de réaliser un nouvel étage de filtration pour des composés recherchés dont la taille est comprise entre 0.02 et 0,2pm tel que des micro-vésicules ou des exosomes. REVENDICATIONS1. Le dispositif et procédé correspondant peut être utilisé pour collecter des microorganismes de manière automatique à partir d'échantillons d'urine et d'hémoculture ainsi que pour extraire des éléments biologiques de petite taille tel que des exosomes ou des microvésicules. Le dispositif peut ainsi être employé dans le domaine de l'oncologie en permettant par exemple de concentrer les exosomes (90 nm de diamétre), connus comme marqueur du cancer. La valeur ajoutée est de proposer un procédé rapide, générique et simple pour extraire des exosomes ou microvesicules à partir d'échantillons de salive, serum ou plasma. Dans ce procédé, la membrane (6,32) est une membrane de porosité 0,02pm. Eventuellement un autre mode de réalisation comprend un troisième réservoir contenant une troisième membrane en aval de la membrane (6,32) avec une seconde membrane de porosité de 0,02pm.