FR 3000960 A1 20140718 FR 1350374 A 20130116 Nouveaux agents complexants hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants La présente invention a pour objet des agents complexants ou ligands hydrosolubles, des complexes de lanthanides obtenus à partir de ces agents complexants, et l'utilisation de ces complexes de lanthanides pour marquer des molécules et les détecter par des techniques de fluorescence en temps résolu. Etat de la technique Les complexes de lanthanide ont vu leur utilisation augmenter de manière très importante depuis une vingtaine d'années dans le domaine des sciences de la vie. Ces composés fluorescents présentent en effet des caractéristiques spectroscopiques intéressantes, qui en font des marqueurs de choix pour détecter des molécules biologiques. Ces composés fluorescents sont particulièrement appropriés pour être utilisés en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fôrster resonnance energy transfer »), dont l'application pour étudier les interactions entre biomolécules est exploitée de manière commerciale par plusieurs sociétés, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La durée de vie relativement longue des complexes de lanthanides permet également d'effectuer des mesures de fluorescence en temps résolu, c'est-à-dire avec un délai après excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interférences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette dernière caractéristique est d'autant plus utile que le milieu de mesure se rapproche d'un milieu biologique, qui comprend de nombreuses protéines dont la fluorescence pourrait interférer avec celle des composés étudiés. De nombreux complexes de lanthanides ont été décrits. Latva et al par exemple, ont divulgué 41 complexes d'Eu(III) et de Tb(III), dont ils ont étudié la luminescence (Journal of Luminescence Volume 75, n° 2, Septembre 1997, Pages 149-169). Le composé 39 en particulier, est constitué d'un cycle 1,4,7-triazacyclononane (ci-après « TACN »), dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores dérivés de phényléthynylpyridine. Bien que le rendement quantique du complexe constitué de ce chromophore et d'Eu(III) soit considéré comme bon par les auteurs, ce complexe n'est pas adapté au couplage avec une biomolécule. Par ailleurs, l'utilisation de ce composé en milieu aqueux peut être problématique puisque il est très hydrophobe. Enfin, l'absorption de ce complexe est optimale à 315 nm, alors que les lampes laser souvent utilisées dans les dosages biologiques émettent à la longueur d'onde de 337 nm. D'Aléo et al ont décrit la synthèse de complexes de lanthanides constitués de trois ligands dérivés de l'acide dipicolonique (Inorg Chem. 2008 Nov 17;47(22)1 0258-68). L'un de ces ligands (L1) est constitué d'une molécule d'acide dipicolinique substituée par un groupe phényléthynyl, lui-même portant un éther-oxyde de polyéthylèneglycol (ci-après « PEG ») sur le groupe phényle. D'après les auteurs, le groupe PEG confère à ce produit une bonne solubilité en milieux aqueux et dans les solvants organiques. Toutefois, ces complexes ne sont pas suffisamment stables en milieu aqueux et ne sont pas utilisables dans une réaction de bioconjuguaison. La demande de brevet W02005/058877 est relative à des complexes de lanthanides dont certains sont basés sur un cycle TAON dont trois atomes d'azote sont substitués par des chromophores constitués d'un dérivé de pyridine, notamment de phénylpyridine. Les inventeurs proposent par ailleurs d'inclure dans ces composés un groupe réactif pour pouvoir les conjuguer facilement avec des biomolécules. Il est ainsi proposé d'inclure ce groupe réactif via un bras d'espacement soit au niveau d'un carbone du cycle TAON, soit au niveau de la pyridine du chromophore. Plusieurs autres complexes de lanthanides ont été divulgués et certains sont exploités de manière commerciale : on peut citer en particulier les cryptates macropolycycliques de lanthanides (EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 , W02001/96877, W02008/063721), les complexes de lanthanide comportant un motif dérivé de la coumarine lié à un motif diéthylènetriamine penta- acide (US 5,622,821), et ceux comprenant des dérivés de pyridine (US 4,920,195, US 4,761,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, US 5,202,423, US 5,324,825). La demande de brevet W089/01475 décrit la préparation de macrocycles triazotés dont l'un des atomes de carbone porte un groupe L-Z, et notamment du 2-(4-N-benzamidyl)buty1-1,4,7- triazacyclonane (intermédiaire 12). La synthèse d'hétéromacrocycles azotés dont l'un des atomes de carbone est substitué est également décrite par Cox et al (J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1990, 2567-2576) et Craig et al (J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1989, 794-796). La demande de brevet PCT/FR2012/051691 déposée le 17 juillet 2012 décrit des agents complexants de formule : CH chroma, /Chrome c N N r Chroma La présente invention vise à pallier aux inconvénients des composés de l'art antérieur, et à fournir des complexes de lanthanides fluorescents présentant une meilleure brillance que les composés de l'art antérieur lorsqu'ils sont excités aux alentours de 337 nm, une bonne solubilité en milieu aqueux, un spectre d'émission adapté à leur utilisation dans des expériences de FRET, ainsi qu'une bonne praticité pour le marquage de biomolécules. Description de l'invention Les problèmes mentionnés précédemment ont été résolus grâce à des agents complexants constitués d'un macrocycle triazoté (1,4,7-triazacyclononane, ci-après TAON) dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores de type phényléthynylpyridine, ces chromophores comprenant un groupes affectant la densité électronique de la molécule (ci-après groupe « 0- donneur ») directement lié au groupe phényle, et lesdits agents complexant comportant par ailleurs au moins un groupe conférant à la molécule un caractère relativement hydrophile. Ces composés peuvent également comporter un groupe réactif permettant leur conjugaison avec une molécule à marquer. Les agents complexants selon l'invention forment des complexes stables avec les lanthanides, et peuvent être utilisés pour produire des conjugués fluorescents de molécules d'intérêt. Les complexes de lanthanides selon l'invention présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. La présence de trois chromophores augmente de façon significative le coefficient d'absorption molaire (epsilon) et par conséquent la brillance du complexe. La brillance (rendement quantique x coefficient d'absorption molaire) de ces complexes dans des milieux biologiques est également meilleure que celle des composés de l'art antérieur, et leur solubilité en milieu aqueux les rend très adaptés à une utilisation en milieu biologique. AGENTS COMPLEXANTS Les agents complexants selon l'invention sont les composés de formule (I) : Chrom3 ( Chroml Chrom2 (I) dans laquelle : A représente -CH2- ou -CH(L2-G)- chrom1, chrom2 sont identiques et sont choisis parmi les groupes de formule : 0- R2 s - chrom 3 est soit identique à chrom1 et chrom2, soit un groupe de formule : 0 -E' s Ri N- s s R2, R2', qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi: H ; -Alk; phényle ; -CH2-CO-N-AIk ; -CH2-CO-O-AIk ; -CH2-CO-NH2 ; -CH2-CO-OH ; L1, L2 sont des groupes de liaison divalents identiques ou différents ; E, E', qui peuvent être identiques ou différents, sont des groupes augmentant l'hydrosolubilité de l'agent complexant, choisis parmi : -SO3H, -P(0)(OH)2, -COOH, -N+Alk1Alk2A1k3, un résidu carbohydrate ; - R1, R1', qui peuvent être identiques ou différents sont choisis parmi : -COOH, -PO(OH)R6, R6 étant choisi parmi les groupes: phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; - G est un groupe réactif; - Alk, Alki, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1C6)alkyle ; 15 sous réserve que: - lorsque R1 ou R1' représentent un groupe -COOH, E ou E' ne représentent pas un groupe -COOH ; - l'agent complexant comporte au moins un groupe E ou -SO3H ; 20 - lorsque chrom1 , chrom2 et chrom3 comportent chacun un groupe R2 ou R2', alors A est un groupe -CH(L2-G)- dans lequel L2 comprend au moins un groupe -SO3H. Par carbohydrate, on entend un groupe de formule -(CHOH)k-CH2OH, k étant un nombre entier allant de 3 à 12, de préférence, égal à 4 25 En fonction du pH, les groupes -SO3H, -COOH et -PO(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas . Ces groupes désignent donc dans la suite du texte également les groupes -S03-, -000- et -PO(OH)0-, et vice-versa. 30 Une première sous famille d'agents complexant préférés est celle constituée de composés selon la formule (I), dans laquelle A est le groupe -CH2- et chrom1 , chrom2, chrom3 sont identiques et représentent un groupe de formule : O-L1-E Ri N-^ s Une deuxième sous famille d'agents complexant préférés est celle constituée de composés selon la formule (I), dans laquelle A est le groupe -CH2- et chrom3 est différent de chroml et chrom2. Une troisième sous famille d'agents complexant préférés et celle constituée de composés selon la formule (I), dans laquelle A est le groupe -CH(L2-G)- et chroml , chrom2, chrom3 sont identiques. Une quatrième sous famille d'agents complexant préférés et celle constituée de composés selon la formule (I), dans laquelle A est le groupe -CH(L2-G)- et chrom3 est différent de chroml et chrom2. Les différentes combinaisons de chromophores chroml, chrom2 et chrom3 appartenant à ces différentes sous-familles préférées sont résumées dans la table ci-après : I 0 - L 1 - E i O-R2 ../\ R 1 4 I 4 chroml I ../\ Ri I --7,..,.. N chroml /7"...,.. N = chrom2 = chrom2 I 0-L2G Deuxième sous-famille préférée : A: -CH2- Deuxième sous-famille préférée : A : -CH2- ...--", Ri /../."-\. / Quatrième sous-famille préférée A : -CH(L2-G)- Quatrième sous-famille préférée A : -CH(L2-G)- chrom3 N I o-Li'-E' Composés symétriques Deuxième sous-famille préférée : A : -CH2- I I I Première sous-famille préférée : A: -CH2- Quatrième sous-famille préférée A : -CH(L2-G)- Ri'N / Troisième sous- famille préférée : A : -CH(L2-G)- chrom3 Ri'N 0-R2 Deuxième sous-famille préférée : A: -CH2- Composés symétriques chrom3 I I Quatrième sous-famille préféré A : -CH(L2-G)- Première sous-famille préférée : A: -CH(L2-G)- , L comprend au moins un groupe SO3H / Pour chacune de ces sous familles, les composés dont les groupes R1 ou R1' sont des groupes -PO(OH)R6 sont préférés, en particulier lorsque R6 représente un groupe méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, le groupe méthyle étant particulièrement préféré. Pour chacune de ces sous familles, les composés dont les groupes E ou E' sont des groupes -SO3H sont préférés. Les composés dont les groupes R1 ou R1' sont des groupes -PO(OH)R6 et dont les groupes E ou E' sont des groupes -SO3H constituent également des composés préférés. Les composés selon l'invention comportant un groupe -L2-G, qui peut être utilisé pour coupler le chélate ou complexe selon l'invention avec une molécule que l'on souhaite marquer, sont particulièrement utiles et sont donc également préférés. Le groupe réactif G porté par un bras d'espacement L2, permet de coupler les composés selon l'invention avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine. Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Typiquement, le groupe réactif est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est respectivement mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. De préférence, le groupement réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)- propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier les groupes de formule : 0 NH)-(CH2) 0 NH)-(CH2)-NCO O w NCS 0 NH)-(CH2) NH)-(CH2)-N3 V w NH2 V W 0 NH)-(CH2)-SH 0 NH)-(CH2) w S S Ar V W N=( CI dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. De manière préférée, le groupement réactif G est une amine (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -COOMe, -COOtBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile. O NH-Ar IlNH)-(CH2) V W NH /v(CH2)\7N O NCS NH-)-(CH2) NCO V W 503- Il O 0 N NH)-(CH2) CI N(\ NH)-(CH2) w \ N Les groupes réactif G et les groupes solubilisant E et E' peuvent être directement liés à l'agent complexant par une liaison covalente ou bien via un bras d'espacement constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent. Ainsi, les bras d'espacement L2, L1 et L1' peuvent être choisis parmi : une liaison covalente; un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons et éventuellement substitué par un nombre de groupe -SO3H compris entre 0 et 3 ; un groupe cycloalkylène en C5-08 ; un groupe arylène en C6-014; lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en Cl-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : -(CH2) , ;-(CH 2)n-0-(CH 2)m-0-(CH 2)p- 0 0 -(CH2)n-0-(CH2)m-0-(CH2)p-NH-L(CH2)q 11 0 0 0 -(CH2)n-NHI(CH2)m-LL ; (CH2)n-NHiL(CH2)n,- 0 >i 0 0 -(CH2),-NH-L(CH2)m S 0 -(CH2)n-NHJL(CH2)m-N). S (CH2)p- 0 N-(CH2)p -(CH2)n-NH (CH2)m- 0 (CH2)m-N 0 -(CH2),-NH S (CH2)p- -(CH 2)n-N1-1- ; 0 -(CH2) n-N H -(CH2) m- ;-11-(CH2)n- ; [SO3 0 -(CH2), I NHIL(CH2)m e dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. De manière préférée, le groupe -L2-G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe -COOMe, -COOtBu), une amine (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, et d'un bras d'espacement L2 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule : 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m- ; où n, m, sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. De la même façon, le bras d'espacement L1 ou L1', conférant le caractère hydrosoluble aux composés selon l'invention, est de manière préférée constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule : 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m- ; où n, m, sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe E ou E' étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. SO3 0 -(CH2), I NHI(CH2)m e SO3 0 -(CH2), I NHIL(CH2)m25 COMPLEXES L'invention concerne également les complexes de lanthanides constitués d'un atome de lanthanide complexé par un agent complexant tel que décrit ci-dessus, le lanthanide étant choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Gd3+, Dy3+, Nd3+, Er3+. De préférence, le lanthanide est Tb3+ ou Eu3+ et de manière encore plus préférée Eu3+. Ces complexes sont préparés en mettant en contact les agents complexants selon l'invention et un sel de lanthanide. Ainsi la réaction entre un équivalent d'agent complexant et 1 à 5 équivalents de sel de lanthanide (europium ou terbium sous forme de chlorures, d'acétates ou de triflates) dans un solvant (acétonitrile, méthanol ou autre solvant compatible avec ces sels) à reflux pendant plusieurs heures conduit au complexe correspondant. Comme indiqué précédemment, les complexes fluorescents obtenus présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. De plus la répartition des bandes de leurs spectres d'émission est centrée autour de 620 nm conférant ainsi aux complexes des propriétés exceptionnelles et très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). Du fait de la grande stabilité de ces complexes dans les milieux biologiques contenant des cations divalents (Mn2+, Ca2+, Mg2+...) ou de l'EDTA, leur luminescence reste excellente comparée aux complexes de l'art antérieur. CONJUGUES Les agents complexants et complexes de lanthanides selon l'invention comportant un groupe -L2-G, sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation des complexes de lanthanides pour le marquage de molécules d'intérêt (protéines, anticorps, enzymes, hormones etc...). L'invention concerne également les molécules marquées par un complexe selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un complexe selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un complexe selon l'invention et une molécule choisie parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme (en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisées sous les dénominations Snaptag et Cliptag)), un chloroalcane (substrat de l'enzyme commercialisée sous la dénomination Halotag), le coenzyme A (substrat de l'enzyme commecialisée sous le nom ACPtag ou MCPtag). SYNTHESE La préparation des agents complexants (ligands) et des complexes selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après, et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale. Synthèse des macrocycles Schéma 1 : Synthèse du TACN substitué NHCOPh NH2 NHBoc i) CuCl2 / Me0H s j.- ii) Boc20 / H20 : dioxane /------NH HCI, 6 M r"..."-"NH iii) H2S / H20r"....---NH HN ) HN HN ) N \\_N) 4 HCI N H H H 1 2 3 Le macrocycle triazacyclononane comportant un bras latéral dont l'extrémité est une fonction NHBoc protégée a été obtenu selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 1. Le composé 1, obtenu en utilisant les procédures décrites par Parker et al. (J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1990-2567)), est hydrolysé en utilisant une solution 6M HCI conduisant au composé 2 qui est immédiatement complexé avec des sels de cuivre. Cette approche permet de protéger sélectivement les atomes d'azotes intracycliques et de laisser libre la fonction amine primaire qui est ensuite protégée par un groupement Boc. La décomplexation des sels de cuivre est réalisée en présence de sulfure d'hydrogène conduisant ainsi au composé 3. Schéma 2 : Synthèse du TACN-Mono protégé ("NH Dioxane N) H20, Et3N 3 HCI HN\ *"- H Moz Moz-N \\*"-N) H Moz-ON 4 5 Boc-OSu CH2Cl2 2HCI HN \\-N) 'Bac 7a Moz 1) H2, Pd(OH)2/C 2) HCI, EtOH Me0H \\-N) 'Boc 6 Le triazacyclononane Boc monoprotégé 7a n'est pas disponible commercialement. Il a été préparé selon la suite réactionnelle décrite dans le schéma 2. Deux équivalents de Moz-ON (((2-(4- méthoxybenzyloxycarbonyloxy imino)-2-phénylacétonitrile)) ont été condensés sur le macrocycle triazoté 4 pour donner le composé disubstitué avec des rendements convenables. La purification de ces produits s'est avérée délicate car le groupement Moz est sensible à l'acidité. Même celle de la silice est suffisante pour entraîner une dégradation des produits lors de la purification sur colonne de chromatographie. Pour éviter cette dégradation, les milieux réactionnels ont été purifiés sur colonne d'alumine neutre ce qui a permis de conduire au composé 5 avec un rendement de 74%. Dans l'étape suivante, le groupement Boc est introduit à l'aide du N-(tertbutoxycarbonyloxy)succinimide (Boc-OSu) pour donner le macrocycle triazoté trisubstitué 6. Enfin les amines portant les groupements Moz sont déprotégées par hydrogénolyse. L'utilisation du Pd/C à 10% comme catalyseur n'a pas permis de déprotéger les amines lorsque le milieu réactionnel est hydrogéné pendant 48 h sous 3,45 bars de pression. En revanche, l'utilisation du catalyseur de Pearlman (Pd(OH)2/C) a permis l'obtention du macrocycle triazoté monoprotégé. Pour isoler facilement ce produit, les sels d'hydrochlorure ont été formés par addition d'une petite quantité d'acide chlorhydrique à froid, ce dernier étant recueilli par précipitation dans l'éther diéthylique. Cette méthodologie permet de préparer à l'échelle de plusieurs grammes le composé monoprotégé avec un groupement Boc 7a. Synthèse des alcynes Schéma 3 : Synthèse des alcynes 0-propylénique-fonctionnalisées BOC20, Et3N, CH2Cl2 HBr BocHNBr 7b 8 9 = Me02CBr (Disponible commercialement) 10 = (BuO2CBr (J.Am.Chem.Soc 2011, 133, 958-963) OH Conditions A OR SiMe3 OR K2CO3 OR Composés 8-10 Pd(PPh3)C12, Cul Et3N, THF Me0H Na2CO3 MeCN 11 Conditions B MOMCI, DIPEA,CH2Cl2 Conditions C NaH, DMF O. *0 'S, 0 n 12a, n=0 12b, n=1 Conditions A 13a, R= -(CH2)3NHBoc 13b, R= -(CH2)3CO2Me 13c, R= -(CH2)3CO2tBu Conditions B 13d, R= -CH2OMe Conditions C 13e, R= -(CH2)3S03H 13f, R= -(CH2)4S03H SiMe3 14a, R= -(CH2)3NHBoc 14b, R= -(CH2)3CO2Me 14c, R= - CH2)3CO2tBu 14d, R= Me (commercial) 15a, R= -(CH2)3NHBoc 15b, R= -(CH2)3CO2Me 15c, R= -(CH2)3CO2tBu 15d, R= Me (commercial) Les alcynes (vrais ou protégés par un groupement TMS) qui ne sont pas disponibles dans le commerce, ont été synthétisés en utilisant un couplage de Sonogashira avec le triméthylsilylacétylène qui a largement été décrit dans la littérature (Sonogashira et al Tetrahedron Letters, 50 (1975) 4467-4470, Rossi et al Organic Preparation and Procedure International 27 (1995) 129-160). Cette réaction permet de coupler un alcyne vrai avec un halogénure aromatique (de préférence un dérivé iodé ou bromé) ou un groupe tosyle. Leur synthèse est décrite dans les schémas 3 et 4 et détaillée dans la partie expérimentale. La protection par un groupement protecteur Boc de l'amine 7b a été nécessaire pour éviter la polyalkylation. Le dérivé bromé 10 a été préparé en suivant les procédures décrites dans la littérature (J. Am. Chem. Soc 2011, 133, 958). Les réactions d'alkylations de l'iodophénol 11 ont conduits aux éthers phénoliques 13a-c avec des rendements convenables. Le phénol 13d est protégé avec du méthylchlorométhyl éther dans le dichlorométhane en présence de diisopropyléthylamine. Les composés 13e-f ont été obtenus en effectuant une réaction entre l'iodophénol 11 et la sultone correspondante (1,3 propane sultone 12a et 1,4-butane sultone 12b). Les couplages de Sonogashira ont été réalisés dans les conditions classiques ce qui a permis d'obtenir les alcynes triméthylsilylés 14a-c qui ont été ensuite, suivant les besoins, déprotégés pour conduire aux alcynes vrais 15a-d. Les alcynes 14d et 15d sont disponibles dans le commerce. Schéma 4 : Synthèse des alcynes O-CH2R OH 11 CI OtBu O K2CO3, acétone 0 Me0H OR Pd(dppf)C12, Cul Et3N, THF rrOMe OMe 0 Et3N . 3HF THF Br HCI SiMe3 X 17a, R= Me, X= Br 16 17b, R= tBu, X= I TMS 19a 18a OH OH OH O D-glucamine O OH OH Py, Ac20 DMF, HATU Br DIPEA Br 0 0 O 0" ` 0 0 H 101 ,c (v\ 0 0 DMAP Br -SiMe3 16 20 21 Pd(dppf)C12, Cul Et3N, THF 0 0 Et3N . 3HF THF 0 0 -'11".0 0-II"- 0 H 0), ........i N°) i II ° O 11 0r 0 0 O O 1011( 0 I I 23 TMS 22 En ce qui concerne les alcynes 19a et 23, ils ont été obtenus selon les suites réactionnelles décrites dans le schéma 4. Les composés 17a et 17b ont été respectivement obtenus par réaction d'estérification ou réaction d'alkylation à partir des précurseurs 16 et 11. La triple liaison a été introduite par un couplage de Sonogashira comme précédemment (voir schéma 3). En ce qui concerne le composé 23, il a été obtenu à partir de l'acide 4-bromophénoxyacétique 16 via une réaction de couplage avec la D-glucamine. Les groupements hydroxyles ont ensuite été protégés sous forme d'acétates pour diminuer la polarité de la molécule, faciliter les extractions et les purifications. L'introduction de la triple liaison puis la déprotection du TMS a conduit au composé 23. Synthèse des pyridines trisubstituées Schéma 5 : Synthèse de la pyridine 2-carbométhoxyester OH CI i) SOCl2, DMF ii) Me0H HO2C N CO2H Me02C N CO2Me 24 25 i) Nal, MeCN ultrasons ii) AcCI, ultrasons NaBH4 Me0H / CH2Cl2 (Inorganic Chemistry 50 (2011) 4987-4999). L'échange chlore-iode a été réalisé en présence d'iodure de sodium sous ultrasons, pour conduire au composé 26. La réduction sélective du diester 26 en présence de borohydrure de sodium à 0°C a permb d'obtenir le monoalcool monoester 27a avec un rendement de 60%. Schéma 6 : Pyridine 2-phosphinoxyester m-C P BA CHCI3 H2SO4 PBr3 THF HNO3 Br Br 28 X= Ph, Me Br OEt N' PAX 0] Ô 35a, X= Ph 35b, X= Me 29 pEt N p-x O 34a, X= Ph 34b, X= Me 30 Br ,OH N p-x 0 33a, X= Ph 33b, X= Me [Pd], Et3N PhMe 0 -"JI' Br CH(OEt)3 m-CPBA CHCI3 Br OEt 0 32a, X= Ph 32b, X= Me 31 0 (CF3C0)20 ii) EtOH - H2O Br HO HO CO2Me Me02C N CO2Me 27a 26 L'acide chélidamique 24 a été converti en diester chloré 25 comme décrit par Maury et al 36a, X= Ph 36b, X= Me L'objectif de la synthèse est d'obtenir un dérivé de la pyridine trisubstitué par des groupes différents. Pour cela, la 2-bromo-6-méthylpyridine disponible commercialement a été oxydée en analogue N-oxyde 29 simplement par oxydation en présence d'acide métachloroperbenzoïque (m- CPBA). L'activation de cet hétérocycle azoté a permis d'introduire facilement le groupement nitro en position 4, correspondant au troisième groupement fonctionnel. Le N-oxyde a ensuite été supprimé en utilisant le tribromure de phosphore, pour conduire au dérivé pyridinyle libre. L'introduction du groupement phosphinate a été réalisée en utilisant un couplage au palladium en présence d'acide phényl phosphinique commercial. En ce qui concerne la pyridine méthylphosphinate, elle a été obtenue par couplage du dérivé éthylméthyl phosphinate, lui-même obtenu par hydrolyse du diéthylméthyl phosphonite en utilisant 1 équivalent d'eau. La mise au point de ces couplages s'est avérée particulièrement difficile mais a finalement permis d'obtenir les composés souhaités 32a et 32b. La substitution du groupement nitro par un atome de brome a été réalisée en présence de bromure d'acétyle. Bien que ce réactif soit efficace dans cette réaction, il engendre la formation d'acide bromhydrique qui hydrolyse le groupement phosphinate. Celui-ci a été réintroduit immédiatement après en utilisant l'orthoformiate d'éthyle. La fonctionnalisation du méthyle en position 6 de la pyridine a été réalisée en utilisant un réarrangement décrit par Ginsburg et al (Journal American Chemical Society 79 (1957) 481-485). La pyridine a été oxydée une seconde fois en utilisant les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Cette fonction N-oxyde est suffisamment nucléophile pour réagir avec l'anhydride trifluoroacétique qui subit intermédiairement un réarrangement permettant ainsi d'introduire un groupement trifluoroacétate en position 6 conduisant aux acétates correspondants. Ces derniers ne sont pas isolés mais directement hydrolysés pour conduire ainsi aux intermédiaires clés de la synthèse 36a et 36b. Synthèse des chromophores Schéma 7 : Synthèse des chromophores de type « carboxylate » Voie A OR MsCI, THF Et3N HO MsO N CO2Me Voie B Alcyne 15a,c-d Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF 27a HO OR TMS Pd(PP113)4 /Cul Et3N ,THF 17b, 13d TMS Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF TBAF HO 27b ,IfTBAF, THF 13e-f Pd(PPh3)4/ Cul Et3N ,THF HO N CO2Me 37a, R= -(CH2)3NHBoc 37b, R= -(CH2)3CO2tBu 37c, R= Me 37d, R= -CH2CO2tBu 37e, R= -CH2-OMe 37f, R= -(CH2)3S03H 37g, R= -(CH2)4S02H 38a, R= -(CH2)3NHBoc 38b, R= -(CH2)3CO2tBu 38c, R= Me 38d, R= -CH2CO2tBu 38e, R= -CH20Me 38f, R= -(CH2)3S03H 38g, R= -(CH2)4S021-1 MsCI, THF Et3N MsCI, THF Et3N 27c Les chromophores de type carboxylate 38a-g ont été synthétisés selon les suites réactionnelles décrites dans le schéma 7. Pour les chromophores 38a-c (voie A), une seule réaction de Sonogashira est mise en jeu ce qui permet d'obtenir les squelettes des chromophores en une seule étape. Pour éviter de préparer les alcynes dont les substituants sont des 0-alkyle carboxylate, 0-alkyle-sulfonates ou MOM, une stratégie de synthèse linéaire a été utilisée : le dérivé iodé a été couplé avec l'acétylène triméthylsilylé grâce à un couplage de Sonogashira ce qui permet d'obtenir l'intermédiaire clé 27b. Une réaction de Sila-Sonogashira (déprotection in situ du groupement triméthylsilyle) a conduit aux squelettes des chromophores 37d-e qui ont été activés comme précédemment sous forme de dérivés mésylés. Dans le cas des dérivés 0-alkyle sulfonates, il s'est avéré utile de se débarrasser du TMS de 27b car les sels de fluorure de tétrabutylammonium ont été difficiles à éliminer lors de la purification par chromatographie sur colonne de silice ou par HPLC préparative. Ainsi l'alcyne vrai 27c a été couplé avec les différents iodophényl sulfonate (13e-f) pour conduire aux composés 37f-g qui ont ensuite été mésylés de manière classique. Schéma 8 : Synthèse des chromophores de type « phosphinate Conditions A Alcyne 15a,15d Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF OR Conditions B Alcyne 14c-d Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF TBAF Conditions C Alcyne 19a, 23 Pd(dppf)Cl2 / Cul Et3N ,THF Voie A Br HO HO THF, Et3N MsCI Ms0 36a, X= Ph Me Conditions A 40a, R= -(CH2)3NHBoc, X = Ph 36b, X= 39a, R= -(CH2)3NHBoc, X = Ph Conditions B 40b, R= -(CH2)3NHBoc, X = Me Voie B 39b, R= -(CH2)3NHBoc, X = Me 40c, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Ph TMS 39c, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Ph 40d, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Me 39d, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Me Pddppf)Cl2 / Cul Conditions A DIPEA ,THF 39e, R= Me, X = Ph 40e, R= Me, X = Ph 39f, R= Me, X = Me 40f, R= Me, X = Me Conditions C 39g, R= -CH2CO2Me, X = Ph 40g, R= -CH2CO2Me, X = Ph 39h, R= -CH2CO2Me, X = Me 40h, R= -CH2CO2Me, X = Me 39i, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X = Me 40i, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X = Me 13d 39j, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X = Ph 40j, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X = Ph TMS Pd(PPh3)4 / Cul MsCI, THF Et3N ,THF Et3N TBAF 40k, R= -CH2OMe, X= Me ft- 39k, R= -CH2OMe, X= Me 401, R= -CH2OMe, X= Ph 391, R= -CH2OMe, X= Ph HO OEt 1j,"-X O 36c, X= Ph 36d, X= Me TBAF, THF 13e-f MsCI, THF Pd(dppf)Cl2 / Cul 39m, R= -(CH2)3S03H, X= Me Et3N 40m, R= -(CH2)3S03H, X= Me Et3N 39n, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 40n, R= -(CH2)3S03H, X= Ph ,THF 39o, R= -(CH2)4S03H, X= Me 40o, R= -(CH2)4S03H, X= Me 39p, R= -(CH2)4S03H, X= Ph 40p, R= -(CH2)4S03H, X= Ph HO ,OEt PX 0 36e, X= Ph 36f, X= Me OAc OAc Glut-Ac= OAc OAc ÔAc Les chromophores de type phosphinate (P-Me et P-Ph) 40a-p ont été préparés selon les mêmes stratégies que celles décrites pour les chromophores de type carboxylate. Les séquences réactionnelles sont reportées dans le schéma 8 et les synthèses sont détaillées dans la partie expérimentale. Synthèse des complexes Schéma 9 : Synthèse des complexes symétriques de type « carboxylate » dérivés du TACN Les complexes symétriques de type carboxylate ont été synthétisés selon la suite réactionnelle décrite dans le schéma 9. La première étape a consisté à alkyler le triazacyclononane commercial avec les différents chromophores mésylés 38a-g. Les fonctions esters méthyliques ont ensuite été hydrolysées pour conduire aux carboxylates correspondants, et les produits obtenus ont été mis en contact avec les sels d'europium pour donner lieu à la formation des complexes d'europium 43a-g. Me02C Z Z HNNH Ms0 3 HCI H 4 Z= RO Me02C CO2Me 41a, R= -(CH2)3NHBoc 41b, R= -(CH2)3CO2tBu 41c, R= Me Z 41d, R= -CH2CO2tBu 41e, R= -CH20Me 41f, R= -(CH2)3S03H 41g, R= -(CH2)4S031-1 O EuCI3 HO2C Me0H / H20 43a, R= -(CH2)3NHBoc 43b, R= -(CH2)3CO2tBu 43c, R= Me 43d, R= -CH2CO2tBu 43e, R= -CH20Me 43f, R= -(CH2)3S03H 43g, R= -(CH2)4S03H THF / LION 1 M Z N CO2H 42a, R= -(CH2)3NHBoc 42b, R= -(CH2)3CO2tBu 42c, R= Me 42d, R= -CH2CO2tBu 42e, R= -CH20Me 42f, R= -(CH2)3S03H 42g, R= -(CH2)4S03H HO2C K2CO3, MeCN Schéma 10 : Synthèse des complexes symétriques de type « phosphinate » dérivés du TACN HN,^NH J N 3 HCI H 4 Z= RO Ms0 N P-X 40a-p 6Et K2CO3, MeCN OAc OAc Glut-Ac= OAc OAc OAc OH OH Glut-OH= OH OH OH 0 R N-.......N/' 0 ssP...., , i.-".:::..! P ' X' 0- ---- Al } 0 x - \ ,j-k^I °' " X-P Eu(OAc)3 Me0H, H2O R 44a, R= -(CH2)3NHBoc, X = Ph 44b, R= -(CH2)3NHBoc, X = Me 44c, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Ph 44d, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Me 44e, R= Me, X = Ph 44f, R= Me, X = Me 44g, R= -CH2CO2Me, X = Ph 44h, R= -CH2CO2Me, X = Me 44i, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X = Ph 44j, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X = Me 44k, R= -(CH2)3S03H, X = Ph 441, R= -(CH2)3S031-1, X = Me 44m, R= -(CH2)4S031-1, X = Ph 44n, R= -(CH2)4S03H, X = Me 440, R= -CH20Me, X = Ph 44p, R= -CH2OMe, X = Me R 46a, R= -(CH2)3NHBoc, X = Ph 46b, R= -(CH2)3NHBoc, X = Me 46c, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Ph 46d, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Me 46e, R= Me, X = Ph 46f, R= Me, X = Me 46g, R= -CH2CO2H, X = Ph 46h, R= -CH2CO2H, X = Me 46i, R= -CH2CONH-GIut-OH, X = Ph 46j, R= -CH2CONH-GIut-OH, X = Me 46k, R= -(CH2)3S031-1, X = Ph 461, R= -(CH2)3S03H, X = Me 46m, R= -(CH2)4S03H, X = Ph 46n, R= -(CH2)4S0311, X = Me 46o, R= -CH2OMe, X = Ph 46p, R= -CH20Me, X = Me 45a, R= -(CH2)3NHBoc, X = Ph 45b, R= -(CH2)3NHBoc, X = Me 45c, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Ph 45d, R= -(CH2)3CO2tBu, X = Me 45e, R= Me, X = Ph 45f, R= Me, X = Me 45g, R= -CH2CO2H, X = Ph 45h, R= -CH2CO2H, X = Me 45i, R= -CH2CONH-GIut-OH, X = Ph 45j, R= -CH2CONH-GIut-OH, X = Me 45k, R= -(CH2)3S03H, X = Ph 451, R= -(CH2)3S03H, X = Me 45m, R= -(CH2)4S03H, X = Ph 45n, R= -(CH2)4S031-1, X = Me 450, R= -CH2OMe, X = Ph 45p, R= -CH20Me, X = Me Les complexes symétriques de type phosphinates ont été synthétisés selon la suite réactionnelle décrite dans le schéma 10. La première étape a consisté à alkyler le triazacyclononane avec les différents chromophores mésylés 40a-p. Les esters phosphinates ont ensuite été hydrolysés pour conduire aux acide phosphiniques correspondants et les produits obtenus ont été mis en contact sans purification préalable avec les sels d'europium, donnant lieu à la formation des complexes d'europium 46a-p. Schéma 11 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « carboxylate » dérivés du TACN mono-protégé Boc H HN \\*-N K2CO3, MeCN 2 HCI Boc 7a Z= RO Z= FO Z"= 48a, R= Me 48b, R= -(CH2)3S03H 48c, R= -(CH2)4S03H MeCN K2CO3 47a, R= Me 47b, R= -(CH2)3S03H 47c, R= -(CH2)4S03H N CO2Me 38c,f-g MsO O EuCI3 Me02C ii) DCM, TFA Z' CO2Me Z" Z" 51a, R= Me, R"= -(CH2)3NH2 51b, R= -(CH2)3S03H, -(CH2)3NH2 51c, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3NH2 51d, R= Me, R'= -(CH2)3CO2H 51e, R= -(CH2)3S03H, R'= -(CH2)3CO2H 51f, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3CO2H R= Me, R"= -(CH2)3NH2 50g, R= -(CH2)3S03H, -(CH2)3NH2 50h, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3NH2 50i, R= Me, R'= -(CH2)3CO2H 50j, R= -(CH2)3S03H, R'= -(CH2)3CO2H 50k, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3CO2H R= Me, R'= -(CH2)3NHBoc 49l, R= -(CH2)3S03H, -(CH2)3NHBoc 49m, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3NHBoc 49n, R= Me, R'= -(CH2)3CO2tBu 49o, R= -(CH2)3S03H, R'= -(CH2)3CO2tBu 49p, R= -(CH2)4S03H, R'= -(CH2)3CO2tBu Les complexes d'europium ont été préparés selon les schémas 11 et 12. A partir du macrocycle mono-substitué, deux unités « chromophores carboxylates » ou « phosphinates » ont été condensées pour conduire aux dérivés 47a-c ou 52a-f. Le groupement protecteur Boc a été éliminé en présence d'acide trifluoroacétique, et le troisième chromophore comportant un groupement amino ou carboxyle masqué a été alkylé pour permettre la conjugaison ultérieure à une biomolécule. Les trois fonctions esters méthyliques (carboxylates) ou éthyliques (phosphinates) ont ensuite été hydrolysées et le groupement Boc ou tBu éliminé en milieu acide. La formation du complexe de lanthanide a été réalisée en faisant réagir les ligands 50 et 55 avec les sels de lanthanides correspondants et en l'occurrence le chlorure ou l'acétate d'europium, pour conduire aux complexes 51 et 56. Schéma 12 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « phosphinate » dérivés du TACN mono-protégé Ms0 DCM, TFA Z"(Z') Solvant z ç NH HN K2CO3 MeCN 2HCI Boc 7a Z= RO Z'= RO Z"= N R. X Eu(OAc)3 52a, R= Me, X= Me 52b, R= Me, X= Ph 52c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 52d, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 52e, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me 52f, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Ph HO-P X Z"(Z') 53a, R= Me, X= Me 53b, R= Me, X= Ph 53c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 53d, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 53e, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Me 53f, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Ph Conditions A 0 i) THF, LiOH 1 M 11) DCM, TFA P 0, \ -OH « EtO-P X Conditions B X KOH, CD3OD / D20 ,p pçoEt X 40a-d,g-h os HO 2P X N 9 P\-0Et X 40e-f,i-j,m-n OAc OAc OAc OAc OAc OH OH OH OH OH Glut-Ac= Glut-OH= K2CO3 MeCN Ms0 56m, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me, R'= -(CH2)3-NH2 56n, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R'= -(CH2)3-NH2 56o, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me, R= -(CH2)3-CO2H 56p, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2H 56q, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me,R'= -CH2-CO2H 56r, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R'= -CH2-CO2H Conditions A 55a, R= Me, X= Me, R". -(CH2)3-NH2 55b, R= Me, X= Ph, R"= -(CH2)3-NH2 55c, R= Me, X= Me, R'= -(CH2)3-CO2H 55d, R= Me, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2H Conditions B 55e, R= Me, X= Me, R'= -CH2-CO2H 55f, R= Me, X= Ph, R'= -CH2-CO2H Conditions A 55g, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -(CH2)3-NH2 55h, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-NH2 55i, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -(CH2)3-CO2H 55j, R= -(CH2)3S031-1, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2H Conditions B 55k, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -CH2-CO2H 551, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R= -CH2-CO2H Conditions A 55m, R= -CH2CONH-GIut-OH, X= Me, R= -(CH2)3-NH2 55n, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R= -(CH2)3-NH2 55o, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me, R'= -(CH2)3-CO2H 55p, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2H Conditions B 55q, R= CH2CONH Glut OH, X= Me,R'= -CH2-CO2H 55r, R= -CH2CONH-GIut-OH, X= Ph, R= -CH2-CO2H 54m, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Me, R'= -(CH2)3-NHBoc 54n, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Ph, R= -(CH2)3-NHBoc 54o, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Me, R'= -(CH2)3-0O2tBu 54p, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Ph, R= -(CH2)3-0O2tBu 54q, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Me,R'= -CH2-0O2Me 54r, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Ph, R= -CH2-0O2Me 56a, R= Me, X= Me, R"= -(CH2)3-NH2 56b, R= Me, X= Ph, R"= -(CH2)3-NH2 56c, R= Me, X= Me, R= -(CH2)3-CO2H 56d, R= Me, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2H 56e, R= Me, X= Me, R= -CH2-CO2H 56f, R= Me, X= Ph, R= -CH2-CO2H 56g, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -(CH2)3-NH2 56h, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-NH2 56i, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -(CH2)3-CO2H 56j, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2H 56k, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= CH2 CO2H 561, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -CH2-CO2H 54a, R= Me, X= Me, ft= -(CH2)3-NHBoc 54b, R= Me, X= Ph, R= -(CH2)3-NHBoc 54c, R= Me, X= Me, ft= -(CH2)3-0O2tBu 54d, R= Me, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2tBu 54e, R= Me, X= Me, R'= -CH2-0O2Me 54f, R= Me, X= Ph, R'= CH2 CO2Me 54g, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -(CH2)3-NHBoc 54h, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-NHBoc 54i, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -(CH2)3-0O2tBu 54j, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R= -(CH2)3-0O2tBu 54k, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -CH2-0O2Me 541, R= (CH2)3S03H, X= Ph, R= -CH2-0O2Me Schéma 13 : Synthèse des complexes symétriques de type « carboxylate » dérivés du TACN C-substitué 57a, R= Me 57b, R= -(CH2)3S03H 57c, R= -(CH2)4S03H Z 57d, R= -(CH2)3CO2tBu 57e, R= -CH2CO2tBu 57f, R= -CH2OMe DCM, TFA NH2 NHBoc i) Base ii) Eu(OAc)3 Me02C CO2Me 0 Me02C 59a, R= Me 58a, R= Me 59b, R= -(CH2)3S03H 58b, R= -(CH2)3S03H 59c, R= -(CH2)4S03H 58c, R= -(CH2)4S03H 59d, R= -(CH2)3CO2H 58d, R= -(CH2)3CO2H 59e, R= -CH2CO2H 58e, R= -CH2CO2H 59f, R= -H 58f, R= -H Les synthèses des complexes symétriques comportant la chaîne Boc alkyle sur le macrocycle ont été décrites dans les schémas 13 (version carboxylate) et 14 (version phosphinate). Cette fois le groupe fonctionnel permettant la bioconjugaison est placé sur le macrocycle. Ce nouveau système rend la synthèse plus aisée dans la mesure où les trois chromophores peuvent être identiques. Comme décrit dans la synthèse des complexes symétriques carboxylates ou phosphinates, le triazacyclononane 3 a été alkylé par les différents chromophores 38 et 40, puis les fonctions esters (carboxylate et phosphinate) ont été hydrolysées. Enfin la complexation avec les sels d'europium a conduit aux complexes 59a-f et 62a-l. NHBoc N CO2Me 38b-g HN \\-N K2CO3, MeCN H 3 Z= RO MsO Schéma 14 : Synthèse des complexes symétriques de type « phosphinate » dérivés du TACN C-substitué NHBoc MsO 9 N P-X 40c-n OEt K2CO3, MeCN DCM, TFA OAc OAc OAc OAc OAc OH OH OH OH OH HN H 3 Z= RO X= Me, Ph Glut-Ac= Glut-OH= 60a, R= Me, X= Me 60b, R= Me, X= Ph 60c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 60d, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 60e, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me 60f, R= -CH2CONH-Glut-Ac, X= Ph 60g, R= -(CH2)3CO2tBu, X= Me 60h, R= -(CH2)3CO2tBu, X= Ph 60i, R= -CH2CO2Me, X= Me 60j, R= -CH2CO2Me, X= Ph 60k, R= -CH2OMe, X= Me 601, R= -CH2OMe, X= Ph NH2 P=0 i) NaOH CD3OD / D20 ii) Eu(OAc)3 x d 'P 8 62a, R= Me, X= Me 62b, R= Me, X= Ph 62c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 62d, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 62e, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me 62f, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph 62g, R= -(CH2)3CO2H, X= Me 62h, R= -(CH2)3CO2H, X= Ph 62i, R= -CH2CO2H, X= Me 62j, R= -CH2CO2H, X= Ph 62k, R= -H, X= Me 621, R= -H, X= Ph 61a, R= Me, X= Me 61b, R= Me, X= Ph 61c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 61d, R= -(CH2)3S031-1, X= Ph 61e, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me 61f, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Ph 61g, R= -(CH2)3CO2H, X= Me 61h, R= -(CH2)3CO2H, X= Ph 611, R= -CH2CO2H, X= Me 61j, R= -CH2CO2H, X= Ph 61k, R= -H, X= Me 611, R= -H, X= Ph a, R= Me, R'= -(CH2)3CO2tBu 65a, R= Me, R'= -(CH2)3CO2tBu 66b, R= -(CH2)3S03H, -(CH2)3CO2tBu 65b, R= -(CH2)3S03H, R'= -(CH2)3CO2tBu 66c, R= -(CH2)4S03H, R= -(CH2)3CO2tBu 65c, R= -(CH2)4SO3H, R= -(CH2)3CO2tBu L'encombrement stérique (présence d'un méthylène) autour de l'atome d'azote en position alpha du substituant du cycle triazacyclononane 3 diminue la réactivité de cet atome. Ainsi lorsque le triazacyclononane 3 est alkylé dans les conditions classiques (K2003, MeCN), les deux premiers atomes d'azote sont alkylés en moins de 24h. En revanche la troisième substitution est cinétiquement plus longue ce qui permet, d'un point de vue pratique, d'isoler par purification les composés disubstitués 63a-c et 67a-f. Ce résultat permet d'obtenir des macrocycles portant deux types de chromophores (deux chromophores identiques et un troisième différent) sans utiliser de groupements protecteurs orthogonaux comme cela a été décrit dans les expériences précédentes (schémas 11 et 12). Le choix des troisièmes chromophores s'est porté sur des substituants dont la déprotection est orthogonale au groupement Boc. Les troisièmes chromophores ont été introduits en présence de K2003 dans l'acétonitrile ce qui a conduit après 48h aux composés trialkylés. La suite réactionnelle est identique à ce qui a été décrit dans les expériences précédentes, à savoir hydrolyse des fonctions ester (carboxylate ou phosphinate) puis traitement du ligand par des sels d'europium conduisant aux différents complexes 66a-c et 70a-1 (schémas 15 et 16). 38b CO2Me Me02C Mc02C HN K2CO3, MeCN 3 Z = RO 63a, R= Me 63b, R= -(CH2)3S03H 63c, R= -(CH2)4S031-1 64a, R= Me, R'= -(CH2)3CO2tBu 64b, R= -(CH2)3S031-1, R'= -(CH2)3CO2tBu 64c, R= -(CH2)3S03H R= -(CH2)3CO2tBu MsO N CO2Me 38c,f-g NHBoc MsO 24 Schéma 15 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « carboxylate » dérivés du TACN C-substitué BocHN = RO LiOH 1\1CO2Me ; NHBoc Z' CO2Me K2CO3, MeCN Me02C Schéma 16 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « phosphinate » dérivés du TACN C-substitué BocHN N P-X OEt 40e-f,i-j,m-n HN / K2CO3, MeCN N H 3 MsO NHBoc NHBoc MsO ° NH X' 'OEt Ç..... j Et0 X N N..... pt- 1.......c.. \ / N P-X 40c-d,g-h OEt X OEt K2CO3, MeCN 67a, R= Me, X= Me 67b, R= Me, X= Ph 67c, R= -(CH2)3S03H, X= Me 67d, R= -(CH2)3S03H, X= Ph 67e, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me 67f, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Ph OAc OAc OAc OAc ÔAc OH OH X= Me, Ph Z = RO Z' = R.0 Glut-Ac= Glut-OH= 68a, R= Me, X= Me, R'= -(CH2)3-CO2tBu 68b, R= Me, X= Ph, -(CH2)3-CO2tBu 68c, R= Me, X= Me, R'= CH2 CO2Me 68d, R= Me, X= Ph, R= -CH2-CO2Me 68e, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R'= -(CH2)3-CO2tBu 68f, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2tBu 68g, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -CH2-CO2Me 68h, R= -(CH2)3S031-1, X= Ph, R'= CH2 CO2Me 68i, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me, R= -(CH2)3-CO2tBu 68j, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Ph, -(CH2)3-CO2tBu 68k, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Me,R'= CH2 CO2Me 681, R= -CH2CONH-GIut-Ac, X= Ph, R= -CH2-CO2Me OH OH 15H NaOH NHBoc 70a, R= Me, X= Me, R= -(CH2)3-CO2tBu 70b, R= Me, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2tBu 70c, R= Me, X= Me, R= -CH2-CO2H 70d, R= Me, X= Ph, R- -CH2-CO2H 70e, R= -(CH2)3S03H, X= Me, ft= -(CH2)3-CO2tBu 70f, R= -(CH2)3SO3H, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2tBu 70g, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -CH2-CO2H 70h, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R- -CH2-CO2H 70i, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me, ft= -(CH2)3-0O2tBu 70j, R= -CH2CONH-GIut-OH, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2tBu 70k, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me,R'= -CH2-CO2H 701, R= -CH2CONH-GIut-OH, X= Ph, R'= -CH2-CO2H 69a, R= Me, X= Me, -(CH2)3-CO2tBu 69b, R= Me, X= Ph, R= -(CH2)3-CO2tBu 69c, R= Me, X= Me, R= -CH2-CO2H 69d, R= Me, X= Ph, R= -CH2-CO2H 69e, R= -(CH2)3S03H, X= Me, R= -(CH2)3-CO2tBu 69f, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R'= -(CH2)3-CO2tBu 69g, R= -(CH2)3SO3H, X= Me, R= -CH2-CO2H 69h, R= -(CH2)3S03H, X= Ph, R= -CH2-CO2H 69i, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me, R= -(CH2)3-0O2tBu 69j, R= -CH2CONH-GIut-OH, X= Ph, R'. -(CH2)3-CO2tBu 69k, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Me,R'= -CH2-CO2H 691, R= -CH2CONH-Glut-OH, X= Ph, R'= CH2 CO2H Caractéristiques des complexes d'europium Les caractéristiques des différents complexes d'europium préparés ci-dessus sont spécifiées dans la table X : Comp. Possède un ou Le complexe Pour améliorer la Peut-être conjugué plusieurs groupes hydrosoluble possède un groupe (amine ou COOH) solubilité, doit être avec une autre solubilisants permettant la conjugaison avec une autre molécule modifié par molécule, par introduction de introduction d'un groupes solubilisant bras portant un via un groupe groupe solubilisant amine, COOH ET un groupe (après activation) ou réactionnel, via un phénol groupe amine, COOH (après activation) 43a - - + 43b + - - - 43c - - - - 43d + - - 43 e - - + - 43f + - - - 43g + - - 51a - - + + 51b + + - - 51c + + - - 51d + - + + 51 e + + - - 51f + + - - 59a - - + + 59b + + - - 59c + + - - 59d + + - - 59 e + + 59f - + + - 66a + + - - 66b + + - - 66c + + - - 46a - - + - 46b - - + - 46c + - - - 46d + - - - 46 e - - - - 46f - - - - 46g + _ - - 46h + - - - 46i + - - - 46j + _ - - 46k + - - - 461 + - - - 46m + - - - 46n + - - - 46o - - + - 46p _ - + - 56a - - + + 56b - - + + 56c + - - + 56d + - - + 56 e + - - + 56f + - - + 56g + + - - 56h + + - - 56i + + - - 6j + + - - 56k + + - - 561 + + - - 56m + + - - 56n + + - - 56o + + - - 56p + + - - 56q + + - - 56r + + - - 62a - - + + 62b - - + + 62c + + - - 62d + + - - 62e + + _ - 62f + + - - 62g + + _ - 62h + + - - 62i + + - - 62j + + _ - 62k - + + - 621 - + + - 70a + + - - 70b + + - - 70c + + - - 70d + + - - 70e + + _ - 70f + + - - 70g + + _ - 70h + + - - 70i + + - - 70j + + _ - 70k + + - - 701 + + - - - Les composés satisfaisant (+) au critère de la première colonne sont des composé selon l'invention comportant des groupes augmentant leur hydrosolubilité. Ils ne peuvent pas être conjugués à une autre molécule mais peuvent être utilisés comme composés fluorescents classiques. - Les composés satisfaisant (+) au critère de la deuxième colonne possèdent un groupe réactif permettant la conjugaison du complexe d'europium avec une molécule que l'on souhaite marquer. Dans les exemples de cette table, ces groupes réactifs sont des groupes amine, protégées ou pas, ou des groupes carboxylates, protégés ou pas, ces derniers devant être activés, par exemple sous forme d'ester de N-hydrosuccinimide. L'homme du métier peux utiliser les techniques classique de chimie pour utiliser ces groupes amines ou carboxylates pour conjuguer ces complexes avec une molécule d'intérêt. Lorsque le groupe réactif est une amine, des réactifs de couplage peuvent être utilisés, comme par exemple le DCC (dicyclohexylcarbodiimide) et le NHS (N- Hydroxysuccinimide), pour former une espèce capable de réagir avec une amine présente sur une molécule que l'on souhaite marquer. D'autres réactifs connus de l'homme du métier peuvent être utilisés, comme le TSTU (0-(N-succinimidy1)-1,1,3,3- tetramethyluronium tetrafluoroborate). - Les composés satisfaisant (+) au critère de la troisième colonne ne sont pas des composés selon l'invention mais des intermédiaires conduisant à ces composés : ils possèdent en effet des groupes réactifs carboxylates (qui doivent être activés, par ex. sous forme d'esters de NHS), amines ou phénols (chacun éventuellement protégés) permettant l'introduction de groupes qui augmenteront l'hydrosolubilité des complexes concernés. Après déprotection des groupements Boc, CO2tBu ou MOM, l'homme du métier peut utiliser les techniques classiques pour obtenir les composés selon l'invention à partir de ces complexes d'europium. En particulier, lorsque les groupes réactionnels sont des amines, il pourra les faire réagir par exemple avec les composés électrophiles suivants, comportant une fonction ester de NHS et un groupe augmentant le caractère hydrophile (ammonium quaternaire, phosphonate ou sulfonate ) : I 0 0 00 0 I- N+)-L0 1-10-1' HÔ 0 -o,$)-L0 0 - O, O La synthèse du premier composé est décrite dans Analytical Chemistry, 2006, 78, 41754183, celle du second composé est décrite dans European Journal of Chemistry, 2001, 349-352, et cell du troisième composé est décrite dans la demande de brevet W002/095412. Lorsque les groupes réactionnels sont des carboxylates activés sous forme d'ester de NHS, les groupes nucléophiles suivants peuvent par exemple être utilisés pour introduire les groupes conférant une meilleure solubilité : Br r\l-FNH2 ; O 0 HO-PENH ÇNH2-03S N H --2 n= 1, 2 n=0,1,2. NH2 S03- n= 1, 2 Le premier réactif est disponible dans le commerce (Toronto Research Chemicals), comme le second et le troisième (Sigma). Enfin lorsque le groupe réactionnel est un phénol ou une amine primaire, secondaire ou tertiaire, un groupe sulfonate peut être introduit dans le complexe par réaction avec une sultone de formule suivante (disponible dans le commerce, Sigma): )S,n n=0,1 -M-n - Les complexes satisfaisant (+) au critère de la quatrième colonne ne comportent qu'un seul groupe réactif amine ou carboxylate, protégé ou pas. Des complexes selon l'invention avec une hydrosolubilité améliorée et pouvant être conjugués à une autre molécule peuvent être préparés en faisant réagir les complexes comprenant une amine (éventuellement après déprotection des groupes Boc) avec des composés de formule : 00 0 00 Fmoc,N Fmoc, O" H OU La synthèse de ces deux composés est décrite dans Bioconjugate Chemistry, 2008, 19, 279-289. -03S H S03- 0 o' H H S03- S03-25 Ces différents aspects sont représentés dans les schémas 17 et 18. Schéma 17 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « carboxylate » hydrosolubles fonctionnalisés Z1= Ri0 Z2= R20 X1= H, -(CH2)4-NHBoc, X2= -(CH2)4-NH2 R1 R2 = -Me -(CH2)3-NHBoc -(CH2)3-NH2 -(CH2)3-0O2tBu -(CH2)3-CO2H -(CH2)3B03H -(CH2)4503H -CH2CONH-GIut-OH -MOM -H -CH2CO2tBu -CH2CO2H -(CH2)3-CO2H -(CF12)3S03F1 -(CH2)4S031-1 -CH2CONH-GIut-OH -H -CH2CO2H Réactifs hydrosolubilisants NHS ou espèce electrophile 0 r Réactifs hydrosolubilisants NH2 ou espèce nucléophile Br I Z5 Complexes 72 hydrosolubles 0 0 0 2) DCC NHS BG-MB-NH2 cAMP-NH2 Z1 Complexes 43, 51, 59, 66 Z3 X2 Déprotection des groupements Boc, CO2tBu et MOM ---- 0 Z3 Complexes 71 Z3= R30 Z4= R40 IR.3 R4 = -Me -(CH2)3-NH2 Couplage avec un réactif hydrosolubilisant R5LO Z6= R6LO R5 R6 = -Me -(CH2)3-NH2 -(CH2)3-CO2H -(CH2)3S03H -(CH2)4S03H -CH2CONH-Glut-OH -CH2CO2H -(CH2)3-NMe3+ -(CH2)2-NMe3. -(CH2)3-P(0)(OH)0- -CH(SO3H)CH2-NH2 -CH(S031-1)-CH2-NHCO-(SO3H)-CH2-NH2 Complexes 73 hydrosolubles fonctionnalisés 0 HÔ "n n= 1, 2 0 HO,S H NH2 SO3H n= 1,2 H SO3H 0 SO3H 0'0 Fmoc, Schéma 18 : Synthèse des complexes dissymétriques de type « phosphinate » hydrosolubles fonctionnalisés ,Xi - ---N N 0 Y 4P\ 0 y Complexes 46, 56, 62, 70 Z2 Déprotection des groupements Boc, CO2tBu et MOM z3 ---- Y ; --0 y Ô O z3 Complexes 74 X1= H, -(CH2)4-NHBoc, X2= -(CH2)4-NH2 Z1= Ri 0 Z2= R20 R1, R2 = -Me -(CH2)3-NHBoc -(CH2)3-NH2 -(CH2)3-0O2tBu -(CH2)3-CO2H -(CH2)3S 03H -(CH2)4S 03H -CH2CONH-Glut-OH -MOM -H -CH2CO2tBu -CH2CO2H Y= Ph, Me Z3= R30 Z4= R40 R3, R4 = -Me -(CH2)3-NH2 -(C H2)3-CO2H -(CH2)3S03H -(C H2)4S03H -CH2CONH-Glut-OH -H -C Fl2CO2F1 Couplage avec un réactif hydrosolubilisant -CH2CO2H -(CH2)3-NMe4. -(CH2)2-NMe4' -(CH2)3-P(0)(OH)0- -CH(SO3H)CH2-NH2 -CH(S03H)-CH2-NHCO-(S03H)-CH2-NH2 Complexes 75 hydrosolubles z5 X - _ --P -- P-,o ;N 0 Y o' ÔP z5 4=R51_0 4=R51_0 R5, R6 = -Me -(CH2)3-NH2 -(CH2)3-CO2H -(CH2)3S03H -(CH2)4S 03H -CH2CONH-Glut-OH 6 Réactifs hydrosolubilisants NHS ou espèce electrophile 0 r Fmoc'N 0 H SO3HH SO3H Réactifs hydrosolubilisants NH2 ou espèce nucléophile Br ".-**"*-"NH2 0 HO- OP NH H n BG-MB-N H2 CAMP-NH2 Complexes 76 hydrosolubles fonctionnalisés HO3S H2 n= 1,2 n 0 HO3S rH NH2 SO3H n= 1,2 Dans une mise en oeuvre particulière de l'invention, le bras d'espacement L (L1, L1' ou L2) comprend un ou plusieurs motifs sulfonates. La préparation de tels composés à partir de complexes d'europium décrits plus hauts, ainsi que celle de conjugués de ces complexes avec l'AMP cyclique ou un dérivé de la benzylguanine est résumée dans les schémas 19 et 20. BG-MB 0 NH2 0 SO,H NH BG-MB- 0 HO-p. NH2 O ,0NvN 0 CAMP-NH2 33 Schéma 19 : exemples de fonctionnalisation avec linker mono et disulfonate Z, 0-;"--'0 OMe ii) pipéridine 5%, DMF 0 N)FiBG-MB ii) pipéridine 5%, DMF 81 Schéma 20 : exemples de fonctionnalisation avec linker mono et disulfonate ,cAMP N H Schéma 21 : exemples de fonctionnalisation maléimide, biotine et peptidique La préparation de conjugués de complexes d'europium selon l'invention avec des peptides cationiques (polyarginine ou polylysine) et avec la biotine est représentée dans le schéma 21. z1= OMe 0 ii) DCC, NHS NH SO3H YNHz cAMP-NH2 = ° ° NvN 81 NH-cAMP HO O N 0 O PyBOP, DIPEA DMSO HN" "O DMF, HaN-CGPKISKREVCOaH Tampon phosphate O 35 46h DIPEA, DMF, PyBOP OMe 0 0 HHN-e H)/\/^5NH H MeO 90 Hahl,rNHa0 Hohly.NHa0 HoNyN0Ha HaNyNNa NH NH _NH NH 0 0 0 Ho S H 0f H HN Elnhe.+NHa Holnol.NHa HaIneINHa O HN HN MeO OH DMSO, PyBOP DIPEA, HaN-GRRRRRRR-COsH 0,4_0 N --0 ^1 é), N --P 89 0 56e MeO H Schéma 22 : exemple de fonctionnalisation avec une structure TACN substituée L'utilisation de complexes selon l'invention portant un groupe LG au niveau du macrocylce TAON pour la préparation de conjugués est illustrée dans le schéma 22, avec l'exemple d'un conjugué avec l'AMPc. MeO o sP - --- Me /1), j -0 Me N , N Me- d 62a OMe o HO, '0 / N 2 01/ NON HN y ,- 0 O °"P\ ° Me/ 0 \1\ -----O Me if/ N 91 OMe OMe 0 0 0 i) ii) TSTU \ /-.^ 0, ,N,,---N o 'P .e--i 1,'' , ) --- ----- , \ Me 0---- \.,\ j -- -0 Me 1N- 00 N OMe NH o Me-2p o 92 OMe OMe MeO MeO CO2- i) DMF, PyBOP, DIPEA P- --- -- Me 0-- ---- O Me ii) DCM, TFA PARTIE EXPERIMENTALE Abréviations utilisées : Boc : tert-butyloxycarbonyle Boc-OSu: N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide cAMP : adénosyl monophosphate cyclique CCM : chromatographie en couche mince Ô: déplacement chimique DCC : dicyclohexylcarbodiimide DCM : dichlorométhane DCU: dicyclohexylurée DIPEA: diisopropyléthylamine DMAP : diméthylaminopyridine DMF : diméthylformamide DMSO : diméthylsulfoxyde ESI - : ionisation par électronébulisation en mode négatif ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif EtOH : éthanol h : heure HATU : (0-(7-azabenzotriazol-1-y1)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate) HPLC : chromatographie liquide à haute performance HRMS : spectroscopie de masse à haute résolution HTRF: Fluorescence Homogène en Temps Résolu Hz : Hertz LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectromètrie de masse LRMS : Spectre de masse basse résolution m-CPBA : acide métachloroperbenzoïque MeCN : acétonitrile Me0H : méthanol min : minute MOM : méthyl méthyl éther Mops : acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique Moz : p-méthoxybenzyloxycarbonyle Moz-ON : ((2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxy imino)-2-phénylacétonitrile) Ms : mésyle NBS: N-bromosuccinimide NHS : N-hydroxysuccinimide NIS : N-iodosuccinimide Pd(dppf)C12 : bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(II) PEG : polyéthylène glycol Ph: phényl ppm : partie par million PtF: point de fusion Py : pyridine PyBOP : hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium RMN : résonance magnétique nucléaire SM : spectrométrie de masse TBAF : fluorure de tétrabutylammonium TEA / Et3N: triéthylamine TEAAc : tampon acétate de triéthylammonium TFA : acide trifluoro acétique THF : tétrahydrofurane TMS = triméthylsilyle Ts : tosyle TSTU: tétrafluoroborate de 0-(N-Succinimidy1)-1,1,3,3-tétraméthyluronium Chromatographie Les chromatographies sur couches minces (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254 sur feuille d'aluminium ou sur des plaques d'oxyde d'aluminium neutre Merck 60 F254 (type E) sur feuille d'aluminium. Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils : HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm. HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. C18, 5 lm: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. Spectroscopie - Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) Les spectres RMN (1H, 130 et 31 P) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d'une sonde de mesure BBFO, multi noyaux de diamètre de 5 mm, de gradient Z et de lock 2H. Les déplacements chimiques (Ô) sont exprimés en partie par million (ppm). Les abréviations suivantes sont utilisées : s : singulet, s I : singulet large, s app : singulet apparent, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : doublet dédoublé, td : triplet dédoublé, qd : quadruplet dédoublé, ddd : doublet de doublet dédoublé, AB : système AB. - Spectrométrie de masse (LRMS) Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Waters ZQ 2000 simple quadipôle à source multimode ESI/APCI équipé de colonne Waters XBridge C18, 3,511m, 4,6 x 100 mm. - Spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse QStar Elite (Applied Biosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (API) assistée pneumatiquement. L'échantillon a été ionisé en mode electrospray positif dans les conditions suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d'orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de nébulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute résolution (HRMS) a été obtenu avec un analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a été effectuée en triplicat avec un double étalonnage interne. Point de fusion Appareil à point de fusion : les points de fusion ont été réalisés en utilisant un appareil BUCHI melting point B-540. Composé (2) NHCOPh NH2 /--"Nry HCI, 6 M NH HNN ) 4 HCI ''`-tq) H \\*"-N H H 1 2 Le compose 1 (182 mg, 0,6 mmol) (J. Chem. Soc Perkin Trans 1, 1990, 2567) a été dissous dans une solution aqueuse hydrochlorhydrique 6 M (3 mL) qui a ensuite été agitée à 100°C pendant 72 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était complète. La solution a été refroidie à température ambiante et diluée avec de l'eau (3 mL) puis a été extraite avec du diéthyl éther (3 x 10 mL). La phase aqueuse a été concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 2 sous forme de sels d'hydrochlorure (100 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, D20) ô : 3,42-3,13 (m, 10H), 3,96-2,87 (m, 3H), 1,64-1,37 (m, 6H). RMN 130 (100 MHz, D20) ô : 53,3; 46,1; 43,2; 41,8; 39,2; 39,1; 39,0; 30,6; 26,5; 22,1. HRMS (ESI+) calculée pour C1oH251\14 [M+H]+, m/z 201,2079, trouvée: 201,2068. Composé (3) NF-12 NHBoc HN i) DOWEX ) 4 HCI ii) CuCl2 / Me0H H iii) Boc20 H2O - dioxane iv) H2S / H2O v) pH 11 2 3 La tétraamine 2 a été convertie en amine libre (66 mg, 0,33 mmol) par chromatographie échange d'ions en utilisant de la résine DOWEX 1x2-200. L'amine libre a été dissoute dans du méthanol (4 mL) et à cette solution a été ajouté du chlorure de cuivre monohydraté (56 mg, 1,33 mmol). La solution initialement incolore a virée au vert intense. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 h puis le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à un solide verdâtre qui a été redissous dans de l'eau (2 mL). A cette solution a été ajoutée une solution ditert-butyl dicarbonate (140 mg, 0,66 mmol) dans du dioxane (2 mL) puis a été agitée à température ambiante pendant 3 h. Après cette période, la réaction n'était pas complète. Un deuxième ajout d'une solution de di-tert-butyl dicarbonate (70 mg, 0,33 mmol) dans du dioxane (1 mL) a été réalisé puis cette solution a été agitée à température ambiante pendant 16 h supplémentaires. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était complète. La solution verte a été traitée en faisant buller du sulfure d'hydrogène sur une période de 5 min et le mélange a été centrifugé pour éliminer le précipité noir. Le surnageant a été lavé avec du dichlorométhane puis la solution aqueuse a été ajusté à pH 11 avant de réaliser une extraction intensive avec du dichlorométhane (8 x 10 mL). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium puis filtrées et concentrées sous pression réduite pour conduire à une huile incolore (27 mg, 27%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) Ô: 6,46 (s I, 1H), 3,13 (m, 2H), 2,89-2,67 (m, 10H), 2,47 (m, 1H), 2,35 (s I, 3H), 1,47 (s, 9H), 1,49-1,35 (m, 6H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) : 156,3; 79,3; 55,2; 49,9; 46,2; 45,3; 44,3; 40,6; 40,3; 33,9; 30,4; 23,7; 28,6. HRMS (ESI+) calculée pour C15H33N402 [M+H]+, m/z 301,2604, trouvée: 301,2603. Composé (5) Me0 0 OMe Me0 Et3N, Dioxane/H20 0 0 ,N N 0 o H 5 H'N N-H 3HCI 4 A une solution d'hydrochlorure de 1,4,7-triazacyclononane 4 (188 mg, 0,78 mmol) dans un mélange dioxane / eau (10 mL, 8:2) a été ajouté le 2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxyimino)-2- phénylacétonitrile (Moz-ON) (477 mg, 1,5 mmol). Le mélange réactionnel a été homogénéisé par une agitation vigoureuse puis à ce mélange a été ajoutée une solution de triéthylamine (540 gL, 3,8 mmol) dans un mélange dioxane / eau (10 mL, 8:2). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 24 h, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane. Cette solution a été lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (3 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (dichlorométane / méthanol 98:2 jusqu'à 90:10 par incréments de 1%) pour conduire au composé souhaité 5 sous la forme d'une huile (266 mg, 74 %). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 7,32-7,25 (m, 4H), 6,88-6,85 (m, 4H), 5,09 (m, 4H), 3,80 (s, 6H), 3,56-3,47 (m, 4H), 3,31-3,25 (m, 4H), 2,87 (m, 4H). RMN 130 (100 MHz, CDC13) b : 159,68; 156,76; 130,05; 128,92; 114,03; 67,15; 55,41; 52,20; 51,98; 51,26; 50,31; 50,07; 49,19; 48,18; 47,73; 47,66. LRMS (ESI+) calculée pour C24H32N308 [M+H]+, m/z 458,2291, trouvée: 458,08. Rf = 0,48 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (6) Me0 6 OMe 0 CH2Cl2 OMe Me0 A une solution de macrocycle diprotégé 5 (50 mg, 0,1 mmol) dans du dichlorométhane (7 mL), a été ajouté le N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide (Boc-OSu) (36 mg, 0,15 mmol). La solution a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 24 h, la réaction était totale. La solution a été directement lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (3 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (dichlorométhane / méthanol 90:10 jusqu'à 70:30 par incrément de 5%) pour conduire au composé 6 sous la forme d'une huile de couleur brune (44 mg, 72%). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 7,30-7,19 (m, 4H), 6,88-6,83 (m, 4H), 5,06-4,92 (m, 4H), 3,77 (s, 6H), 3,46-3,39 (m, 12H), 1,55 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDC13) b : 159,65; 156,56; 155,76; 130,04; 128,98; 114,00; 80,01; 67,15; 55,38; 49,74; 49,64; 49,47;49,37; 49,12; 48,92; 48,80; 28,53; 27,75; 25,60. HRMS (ESI+) calculée pour C29H39N308 [M+H]+, m/z 558,2815, trouvée: 558,2808. R,= 0,28 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 50:50). Composé (7a) Me0 OMe i) H2, Pd(OH)2/C, Me0 H Boc,N2,F1 2HCI 7a ii) HCI 1 M, Et20 A une solution de macrocycle diMOZ-monoBoc 6 (300 mg, 0,5 mmol) dans le méthanol (25 mL) a été ajouté de l'hydroxyde de palladium adsorbé sur charbon (environ 100 mg). Le milieu réactionnel a été placé dans un hydrogénateur et a été maintenu sous une vive agitation et sous atmosphère d'hydrogène (3,45 bars soit 50 PSI). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM d'alumine. Après une nuit, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été filtré sur Celite puis concentré sous pression réduite. L'huile incolore obtenue a été dissoute dans du méthanol (3 mL). A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 1 M (pH 2-3). Le mélange a été concentré sous pression réduite et a été redissous dans un minimum de méthanol (2 mL). A cette solution, a été ajouté de l'éther diéthylique (35 mL). Le précipité blanc obtenu a été recueilli par filtration pour donner un solide blanc correspondant à l'hydrochlorure 7a (102 mg, 62%). PtF: 172-174°C. RMN1H (500 MHz, D20) 15 : 3,74 (t, J= 4,5 Hz, 4H), 3,63 (s, 4H), 3,48 (t, J = 4,5 Hz, 4H), 1,47 (s, 9H). RMN 130 (125 MHz, CDCI3) 15:136,0; 62,9; 25,9; 22,2 ; 21,7; 6,7. HRMS (ESI+) calculée pour c11H23N302 [m+H]+, m/z 230,1869, trouvée: 230,1863. Rt = 10,92 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v)) comme éluant, gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (19 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV de 280 nm. Composé (8) .HBr Boc,20 7b Et3N, CN2Cl2 8 A une solution d'hydrobromure de 3-bromopropylamine 7b (3,72 g, 16,9 mmol) dans du dichlorométhane (100 mL) ont été ajoutés du dicarbonate de di-tert-butyle (3,71 g, 16,9 mmol) et de la triéthylamine (10 mL). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionnée une solution saturée de chlorure de sodium (100 mL) et le mélange a été extrait avec de l'éther diéthylique (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution saturée de chlorure de sodium (3 x 50 mL) et séchées sur sulfate de sodium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 8 sous forme d'un solide légèrement brun. Le composé était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (3,50 g, 87%). PtF: 32-33°C. RMN1H (200 MHz, CDCI3) 15 : 4,63 (s, 1H), 3,42 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 3,26 (td, J = 6,5; 6,5 Hz, 2H), 2,03 (m, J = 6,5 Hz, 2H), 1,43 (s, 9H) ; RMN 130 (125 MHz, CDCI3) 15 : 156,09; 79,54; 39,96; 32,82; 30,90; 28,48. HRMS (ESI+) calculée pour C81-116NO2Br [M+H]+, m/z 255,0703, trouvée: 255,0695. R,= 0,59 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 50:50). Composé (10) : La synthèse de ce composé a été décrite par S. Machida et al. (Journal American Chemical Society 2011-133-958-963, supplementary material). Composé (13a) i) Na2CO3, MeCN OH ii) 8 11 13a NHBoc A une solution de 4-iodophénol 11 (3,00 g, 13,6 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (100 mL) a été ajouté le carbonate de sodium (5,65 g, 40,9 mmol). La réaction a été chauffée à reflux pendant 1 h puis à cette suspension a été ajouté le dérivé bromé 8 (2,60 g, 10,9 mmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à reflux pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionnée de l'eau (100 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium et filtrées. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant du dichlorométhane pour conduire au composé 13a sous forme d'un solide blanc (3,10 g, 75%). PtF : 79-80°C. RMN 1H(500 MHz, CDCI3) Ô: 7,52 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,64 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,95 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2; 6,2 Hz, 2H), 1,94 (m, J = 6,2 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H), RMN 130 (125 MHz, CDCI3) Ô: 158,7; 155,9; 138,2; 116,9; 82,9; 65,9; 37,9. HRMS (ESI+) calculée pour C14H2oN031 [M+H]+, m/z 378,0561, trouvée: 378,0559. Rf = 0,58 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 50:50). Composés (13b) et (13c): Ces composés ont été synthétisés selon la même procédure que celle utilisée pour la préparation du composé 13a. Composé (13d) OH OMe Cho' DIPEA, CH2Cl2 11 13d A une solution de iodophénol 11 (606 mg, 3 mmol) dans du dichlorométhane (8 mL) refroidie à 5°C, ont été ajoutés de la diisopropyléthylamine (1,045 mL, 6 mmol) puis goutte à goutte du chloro(méthoxy)méthane (MOMCI) (607 gL, 8 mmol) sur une période de 5 min. Après la fin de l'addition, le mélange a été réchauffé à température ambiante puis à 60°C pendant 4 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange a été refroidi à température ambiante puis à cette solution a été ajouté du dichlorométhane (20 mL). La phase organique a été lavée avec de l'eau (2 x 20 mL), séchée avec du sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec du dichlorométhane comme éluant pour conduire au produit souhaité 13d (605 mg, 76%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 7,57 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,83 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,14 (s, 2H), 3,46 (s, 3H). RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b :157,09; 138,28; 118,61; 94,33; 84,39; 56,05. LRMS (ESI+) calculée pour C8H10102 [M+H]+, m/z 264,97, trouvée: 264,03. R,= 0,73 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 30:70). Composé (13e) SO3H A une solution de iodophénol 11 (200 mg, 1 mmol) dans du diméthylformamide anhydre (3 mL) a été ajouté de l'hydrure de sodium à 60% en dispersion dans de l'huile minérale par petites portions (52 mg, 2,1 mmol) sur une période de 5 min et sous courant d'azote. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 30 min puis à cette suspension a été ajouté du 1,3-propane sultone 12a (115 gL, 1,3 mmol). Le mélange a ensuite été agité pendant 2 h 30 à température ambiante sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était complète. La suspension a été filtrée, et le solide a été lavé avec du dichlorométhane (30 mL) puis séché sous pression réduite pour conduire à un solide blanc qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire (309 mg, 91%). PtF : 350°C (déc). RMN1H (400 MHz, DMSO-d6) b : 7,56 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,76 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 4,03 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,59 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,00 (q, J = 6,5 Hz, 7,4 Hz, 2H). RMN 130 (100 MHz, DMSO-d6) b : 158,55; 137,96; 117,33; 82,86; 66,81; 47,81; 25,11. HRMS (ESI+) calculée pour C9H15N041S [M+NH4]+, m/z 359,9766, trouvée: 359,9760. Rt = 12,28 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v)) comme éluant,[isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (19 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV de 280 nm. Composé (13f) : Ce composé a été synthétisé selon la même procédure que celle utilisée pour la préparation du composé 13e, en utilisant la sultone 12b Composé (14a) = TMS O-'NHBoc 13a Et3N / THF TMS 14a Cul PdC12(PPI-13)2 11 13e 9.o s. OH 12a NaH,DMF Une solution de dérivé iodé 13a (2,50 g, 6,6 mmol) dans un mélange de solvant de tétrahydrofurane (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du triméthylsilylacétylène (1,95 g, 19,8 mmol) suivi du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (46 mg, 0,06 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (25 mg, 0,13 mmol). La réaction a été agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies et lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis par une solution de saturée de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de sodium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / pentane 1/1 puis dichlorométhane) pour conduire au composé 14a sous forme d'un solide blanc (1,50 g, 65%). PtF : 92-93°C. RMN1H (200 MHz, CDCI3) b : 7,37 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,78 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,99 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2; 6,2 Hz, 2H), 1,95 (m, J = 6,2 Hz, 2H), 1,42 (s, 9H), 0,22 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 159,08; 156,13; 133,61; 115,54; 114,44; 105,28; 92,63; 79,41; 65,92; 38,06; 29,66; 28,54; 0,20. HRMS (ESI+) calculée pour C19H29NO3Si [M+H]+, m/z 348,1989, trouvée: 348,1993. R,= 0,77 (silice; dichlorométhane - méthanol 95:5). Composés (14b et 14c) : Ces composés ont été synthétisés selon la même procédure que celle utilisée pour la préparation du composé 14a, en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (15a) 0"` NHBoc I NHBoc TMS 14a K2CO3 I 15a Me0H/THF A une solution de dérivé silylé 14a (1,27 g, 3,7 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (30 mL) et de méthanol (30 mL) a été ajouté du carbonate de potassium (1,52 g, 11,0 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (pentane / dichlorométhane 50/50 jusqu'à 100% par incréments de 10%) pour conduire au composé 15a sous forme d'un solide blanc (0,86 g, 85%). RMN 1H (200 MHz, CDCI3) b : 7,39 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,99 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2 Hz et J = 6,2 Hz, 2H), 2,97 (s, 1H), 1,95 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 1,42 (s, 9H). LRMS (ESI+) calculée pour C16H22NO3 [M+H]+, m/z 276,1600, trouvée: 276,18. R,= 0,90 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). Composés (15b et 15c) : Ces composés ont été synthétisés selon la même procédure que celle utilisée pour la préparation du composé 15a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (17a) OCO2Me Me0H HCI Br 17a Br 16 A une solution méthanolique d'hydrochlorure 3 M (3 mL) a été additionné l'acide 2-(4- bromophénoxy)-acétique 16 (1,0 g, 4,3 mmol). Le mélange a été agité pendant 20 h à température ambiante sous atmosphère inerte. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et l'huile résiduelle a été dissoute dans du dichlorométhane (15 mL) et a été lavée successivement avec de l'eau (10 mL), une solution de bicarbonate saturée (10 mL) puis à nouveau avec de l'eau (10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 17a sous forme d'une huile incolore qui était suffisamment pure pour être utilisée dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (1 g, 95%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,78 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 4,55 (s, 2H), 3,80 (s, 3H); RMN 130 (176 MHz, CDCI3) ô : 169,3; 157,1; 132,7; 116,7; 114,3; 65,6; 52,6; HRMS (ESI+) calculée pour C9H9O3BrNa [M+Na]+, m/z 266,9633 trouvée: 266,9622; Rf = 0,65 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 1:1). Composé (17b) OH ci,)L 0 K2CO3, Acétone 17b A une solution de iodophénol 11 (3,0 g, 15 mmol) dans de l'acétone (100 mL) ont été ajoutés du carbonate de potassium (6,3 g, 45 mmol) et du tert-butyl chloroacétate (2,37 mL, 16,5 mmol). La suspension a été chauffée à reflux pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (60 mL) et a été lavé avec de l'eau (2 x 40 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant du dichlorométhane comme éluant pour conduire à une huile jaunâtre identifiée comme le composé souhaité 17b (4,8 g, 81%). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 7,55 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,66 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 4,47 (s, 2H), 1,47 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDC13) b : 167,70; 157,91; 138,36; 117,06; 83,89; 82,66; 65,73; 28,13. HRMS (ESI+) calculée pour C12H191NO3 [M+NH4]+, m/z 352,0410, trouvée: 352,0400. Rf = 0,57 (silice; dichlorométhane 100%). Composé (19a) 0 pcl(dppf)C12, Cul Et3N, THF -SiMe3 TMS 17a 18a 19a A une solution du compose 17a (1,20 g, 4,89 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (2 mL) dégazée préalablement par trois cycles de congélation-décongélation sous vide ont été additionnés de l'éthynyltriméthylsilane (0,83 mL, 5,87 mmol) et de la triéthylamine (3,40 mL, 24,5 mmol). Le mélange a été dégazé à nouveau par trois cycles de congélation-décongélation sous vide puis on été additionnés du [1,1-Bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(II) (41 mg, 0,49 mmol) et de l'iodure de cuivre (93 mg, 0,49 mmol). La solution marron a été chauffée à 65°C pendant 24 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et l'huile marron a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant (cylohexane - acétate d'éthyle 30-70 jusquà 50-50 par incrément de 5%) conduisant au composé 18a sous forme d'huile jaunâtre (760 mg, 60%). Rf = 0,47 (silice; cyclohexane - acetate d'éthyle 75:25). Ce composé a été directement utilisé dans la suite de la synthèse. A cette huile (140 mg, 0,53 mmol) dissoute dans du tétrahydrofurane anhydre (2 mL) a été additionné de la triéthylamine trihydrofluorure (0,87 mL, 5,35 mmol) puis a été chauffée à 35 °C pendant 24 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit réactionnel brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un éluant cyclohexane - acétate d'éthyle 70-30 pour conduire après évaporation des fractions à une huile incolore identifiée comme le composé 19a (89 mg, 87%). RMN 1H (600 MHz, CDC13) Ô : 7,43 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,64 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,00 (s, 1H); RMN 130 (151 MHz, CDC13) b : 169,1; 158,2; 133,8; 115,6; 114,7; 83,4; 76,3; 65,3; 52,5. LRMS (ESI+) calculée pour C11H903 [M-H]+, m/z 189,06, trouvée: 189,00. Rf = 0,39 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 75:25). Composé (21) 0 D-glucamine H OH OH 0 O 0 OH OH )(0 C)) 0 H Py, Ac20 0 -,y0 0 0 Br DMF, HATU DIPEA Br DMAP Br 16 20 21 A une solution de d'acide 4-bromophénoxyacétique 16 (300 mg, 1,30 mmol) dans du diméthylformamide anhydre (20 mL) ont été additionnés successivement de la D-glucamine (282 mg, 1,56 mmol), du 0-(7-azabenzotriazole-1-y1)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU) (592 mg, 1,56 mmol) et de la diisopropyléthylamine (0,542 mL, 3,90 mmol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. A ce mélange a été ajouté une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,1 M (10 mL) puis le solvant a été éliminé sous pression réduite un solide jaune pâle correspondant au composé 20. A ce solide dissous dans de la pyridine anhydre (40 mL) ont été ajoutés de l'anydride acétique (6,18 mL, 64,9 mmol) et de la 4- diméthylaminopyridine (16 mg, 0,13 mmol). La solution a été agitée à 35°C pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et les dernières traces de réactifs ont été éliminées par distillation azéotropique pour donner une huile jaune qui a été répartie dans du dichlorométhane (30 mL) et une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,5 M (30 mL). La phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3 x 30 mL) et les phases organiques ont été réunies, lavées avec de l'eau (100 mL), séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite pour conduire à huile jaune. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant du dichlorométhane comme éluant pour conduire au composé 22 sous forme de solide blanc (481 mg, 60%). PtF : 125-126°C. RMN 1H (700 MHz, CDC13) Ô: 7,42 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,85 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 5,49 (dd, J = 6,5; 4,7 Hz, 1H), 5,32 (dd, J = 5,8; 4,7 Hz, 1H), 5,17 (m, 1H), 5,02 (ddd, J = 6,5; 5,5; 3,3 Hz, 1H), 4,45 (q AB, 2H), 4,24 (dd, J = 12,5; 3,3 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 12.5; 5,5 Hz, 1H), 3,55 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,03 (s, 3H); RMN 13C (176 MHz, 0D013) ô 170,7; 170,5; 170,2; 170,0; 169,9; 168,3; 156,4; 132,8; 116,7; 114,7; 70,2; 69,2; 69,1; 69,0; 67,6; 61,6; 39,4; 20,9; 20,8; 20,8; 20,7. HRMS (ESI+) calculée pour C24H30BrNNa012 [M+Na]+, m/z 626,0849, trouvée: 626,0848. R,= 0,29 (silice, dichlorométhane). Composé (22) 0 0 = SiMe3 )CL0 o )L0 0) 0 Et3N, Pd(dppf)Cl2,THF Cul 0 -11,0 (51(- 0 y 0 Ey 0 Br 21 TMS 22 A une solution du composé 21 (290 mg, 0,48 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (6 mL) dégazée préalablement par trois cycles de congélation-décongélation sous vide ont été additionnés de l'éthynyltriméthylsilane (82 mg, 0,58 mmol) et de la triéthylamine (0,67 mL, 4,81 mmol). Le mélange a été dégazé à nouveau par trois cycles de congélation-décongélation sous vide puis ont été additionnés du [1,1-Bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (39 mg, 0,048 mmol) et de l'iodure de cuivre (9 mg, 0,048 mmol). La solution marron a été chauffée à 65°C pendant 18 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et l'huile marron a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un éluant (cylohexane - acétate d'éthyle 30-70) conduisant au composé 22 comme un solide blanc (182 mg, 63%). PtF : 152- 154°C. RMN1H (700 MHz, CDCI3) ô : 7,42 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,86 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,48 (dd, J 6,5; 4,8 Hz, 1H), 5,33 (dd, J = 5,8; 4,8 Hz, 1H), 5,17 (ddd, J = 6,8; 5,8; 4,8 Hz, 1H), 5,02 (ddd, J = 6,5; 5,5; 3,4 Hz, 1H), 4,47 (q, AB, 2H), 4,25 (dd, J = 12,5; 3,4 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 12,5; 5,5 Hz, 1H), 3,55 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 0,24 (s, 9H); RMN 130 (176 MHz, CDCI3) ô : 170,7; 170,5; 170,2; 170,0; 169,9; 168,3; 157,2; 133,9; 117,2; 114,7; 104,6; 93,5; 70,2; 69,2; 69,1; 69,0; 67,3; 61,6; 39,4; 20,9; 20,8(4); 20,8(3); 20,7; 0,15. HRMS (ESI+) calculée pour C29H39NNa012Si [M+Na]+, m/z 644,2139, trouvée: 644,2158. Rf = 0,63 (silice; cyclohexane - acétate d'éthyle 75:25). Composé (23) TMS A une solution de composé 22 (109 mg, 0,17 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (2 mL) a été additionnée de la triéthylamine trihydrofluorure (0,29 mL, 0,17 mmol) qui a ensuite été chauffée à 35 °C pendant 24 h sous atmosphère inerte. L'avarcement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un éluant cyclohexane- acétate d'éthyle 50-50 pour conduire après évaporation des fractions à un solide blanc identifié comme le composé 23 (75 mg, 78%). PtF : 148-150°C. HRMS (ESI+) calculée pour C26H31N012Na [M+Na]+, m/z 572,1744, trouvée: 572,1757. Rf = 0,45 (silice, cyclohexane - acétate d'éthyle 70:30). Composé (25) OH CI i) SOCl2, DMF HO2C CO2H Me0H Me02C N CO2Me 24 25 A une solution d'acide chélidamique 24 (17 g, 93 mmol) dans du chlorure de thionyle (95 mL) ont été additionnées quelques gouttes de diméthylformamide anhydre. Cette solution a été chauffée à 100°C pendant 48 h. Le chlorure de thionyle a été diminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionné du dichlorométhane (50 mL) et le mélange a été refroidi à 0°C. A ce mélange, a été additionné goutte à goutte sur une période de 10 min du méthanol anhydre (40 mL) et le mélange a été réchauffé à température ambiante puis a été agité pendant une nuit. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite et à ce résidu a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 mL). Le mélange a été filtré et le filtrat a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 50 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur sultate de magnésium, filtrées et 0 0 Et3N . 3HF r.- orNilr o ....,y0 8.1( THF o c,)o 0...y 0 0 0 0 22 0 23 évaporées sous pression réduite pour donner un solide blanc identifié comme le composé 25. Le produit était suffisament pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (13,3 g, 63%). PtF : 141-142°C. RMN1H (300 MHz, CDCI3) b : 8,32 (s, 2H), 4,06 (s, 6H). RMN 130 (75 MHz, CDCI3) b : 163,59; 149,06; 145,45; 127,78; 52,95. HRMS (ESI+) calculée pour C9H9NO4C1 [M+H]+, m/z 230,0215, trouvée: 230,0216. Rf = 0,75 (silice, dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (26) Cl i) Nal, MeCN ultrasons ii) AcCI, ultrasons Me02C N CO2Me 25 26 A une solution du composé 25 (6,0 g, 26,2 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (140 mL) a été additionné de l'iodure de sodium (39 g, 262 mmol) et le mélange a été soumis à des ultrasons pendant 20 min. A ce mélange a été additionné du chlorure d'acétyle (5,55 mL, 78,6 mmol) et le mélange a été soumis à des ultrasons pendant 5 h. A cette solution refroidie à 0°C a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (75 mL) puis de l'eau (100 mL). Le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 50 mL), et les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution de thiosufalte 0,2 M et enfin séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées sous pression réduite. A ce résidu a été additionné du méthanol (40 mL), le mélange a été agité pendant 20 min puis a été filtré pour donner un solide blanc identifié comme le composé 26. Le produit était suffisament pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (6,9 g, 82%). PtF : 165-167°C. RMN1H (300 MHz, CDCI3) Ô: 8,68 (s, 2 H), 4,05 (s, 6H). RMN 130 (75 MHz, CDCI3) b 163,48; 149,06; 147,83; 136,29; 108,76; 52,86. HRMS (ESI+) calculée pour C9H9N041 [M+H]+, m/z 321,9571, trouvée: 321,9567. Rf = 0,36 (silice, cyclohexane - acétate d'éthyle 50:50). Composé (27a) Me02C N HOC N CO2Me 26 27a A une solution de diester 26 (7,0 g, 21,8 mmol) dans du dichlorométhane (50 mL) refroidie à 0°C ont été additionnés du méthanol (35 mL) puis du borohydrure de sodium (540 mg, 14,2 mmol). Le mélange a été agité pendant 2 h à 0°C. L'avancementde la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. A ce mélange a été additionnée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M (20 mL). Le solvant a été éliminé sous pression réduite et au résidu a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 mL), puis le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (4 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (cyclohexane / acétate d'éthyle 60/40 jusqu'à 0/100 par incrément de 10%) pour donner le composé 27a comme un solide blanc (3,8 g, 60%). PtF : 119122°C. RMN 1H(300 MHz, CDCI3) ô : 8,41 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,02 (s, 3H). RMN 130 (75 MHz, CDCI3) b : 164,44; 161,44; 147,31; 133,34; 133,06; 106,97; 64,31; 53,29. HRMS (ESI+) calculée pour C8H9N031 [M+H]+, m/z 293,9622, trouvée: 293,9615. Rf = 0,54 (silice, dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (27b) TMS HO HO COOMe 27a 27b A la pyridine iodée 27a (3,22 g, 11 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du triméthylsilyl acétylène (7,8 mL, 55 mmol) et de la diisopropyléthylamine (9,6 mL, 50 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (385 mg, 0,55 mmol) et de l'iodure de cuivre (209 mg, 0,11 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte. Un changement de couleur du jaune très clair au marron foncé a été observé et le mélange a été agité à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 3 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane /méthanol 0 à 4 % par incréments de 0,5 %) pour obtenir le composé 27b (2,61 g, 90 %) ; RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 8,01 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 4,82 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 0,25 (s, 9H); RMN 130 (100 MHz, CDC13) b : 165,2; 160,8; 147,2; 133,4; 126,2; 126,0; 101,9; 101,3; 64,6; 53,1;- 0,3. HRMS (ESI+) calculée pour C13H18NO3Si [M+H]+, m/z 264,1056 trouvée: 264,1050. Rf = 0,68 (silice, dichlorométhane - méthanol, 90:10). Composé (27c) TMS THF, TBAF Il H011 HO N COOMe 27b 27c A une solution de composé 27b (263 mg, 1 mmol) dans du tétrahydrofurane (10 mL) a été additionné une solution de fluorure de tétrabutylammonium dans du THF 1 M (1 mL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (20 mL) et la phase organique a été lavée avec de l'eau (4 x 10 mL), séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 27c (162 mg, 85%). Composé (29) m-CPBA CHCI3 Br 29 N Br 28 A une solution de 2-bromo-6-méthylpyridine 28 (40 g, 232,5 mmol) dans du chloroforme (400 mL) a été additionné à température ambiante de l'acide m-chloroperbenzoïque (82 g, 475 mmol). Le mélange a été chauffé à 65°C pendant 20 h puis a éb refroidi à 0°C pendant 3 h. Après filtration du précipité, le filtrat a été concentré sous pression reduite. A ce résidu a été additionnée une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2 M (100 mL) et cette solution a été extraite avec du dichlorométhane (4 x 100 mL). Les phases organiques ont été regroupées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression reduite pour conduire au composé 29 sous forme d'un solide jaune utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (35,48 g, 81%). PtF: 48-55 °C. RMN (400 MHz, CDCI3) b : 7,55 (dd, J = 7,9; 1,6 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 7,9; 1,6 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) b : 151,2; 133,5; 128,7; 125,3; 125,2; 19,3. HRMS (ESI+) calculée pour C6H7NOBr [M+H]+, m/z 187,9711, trouvée: 187,9698. Rf = 0,33 (silice, dichlorométhane - méthanol 96:4). Composé (30) H2SO4 HNO3 N' Br 29 A une solution de composé N-oxyde 29 (13,2 g, 69,8 mmol) dans de l'acide sulfurique concentré à 96% (18,5 mL, 347,7 mmol) refroidie à 0°C a été addtionné goutte à goutte de l'acide nitrique fumant à 52,5% (13,6 mL, 329,5 mmol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 min puis a été chauffé à 85°C pendant 16 h. La solution a été ensuite refroidie à température ambiante et a été versée dans de la glace pilée (80 g). Après 15 min d'agitation, le précipité a été filtré et a été lavé avec de l'eau (50 mL). Le solide jaune a été dissous dans du dichlorométhane et la solution a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 30 sous forme d'un solide jaune qui a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (15 g, 92%). PtF: 137-138°C. RMN1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,40 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 2,62 (s, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) b : 151,8; 140,7; 134,0; 122,8; 118,9; 19,6. HRMS (ESI+) calculée pour C6H6BrN2O3 [M+H]+, m/z 232,9562, trouvée: 232,9564. Rf = 0,53 (silice, dichlorométhane - méthanol 98:2). Composé (31) NO2 PBr3 THF N. Br Ô- 30 A une solution de composé N-oxyde 30 (16 g, 68,66 mmol) dans le tétrahydrofurane anhydre (500 mL), a été additionné du tribromure de phosphore (22 mL, 234 mmol) et le mélange a été chauffé à 60°C sous atmosphère inerte pendant 16 h. La solutbn a été refroidie à température ambiante et a été concentrée sous pression réduite puis a été versée dans une solution glacée d'hydroxyde de sodium 2 M (300 mL). Le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 100 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur du sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. L'huile résultante a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice en utilisant le dichlorométhane comme éluant conduisant ainsi au composé 31 sous forme d'un solide jaune (5,4 g, 36%). PtF 51-52°C. RMN1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,02 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 2,70 (s, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 162,9; 154,9; 142,4; 118,4; 115,0; 24,6. HRMS (ESI+) calculée pour C6H6BrN202 [M+H]+, m/z 216,9613, trouvée: 232,9621. Rf = 0,75 (silice, dichlorométhane - méthanol 98:2). Composé (32a) ,OEt Yi-Ph O 0 P, 1-16Ep 31 h 32a A une solution de 2-bromo-6-méthyl-4-nitropyridine 31 (1,01 g, 4,68 mmol) dans du toluène anhydre (10 mL), ont été additionnés du phénylphosphinate d'éthyle (0,95 g, 5,60 mmol) et de la triéthylamine (2,6 mL, 19,0 mmol). Le mélange a été dégazé par trois cycles de congélation- décongélation. A cette solution a été ajouté du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (83 mg, 0,07 mmole) et le mélange a été à nouveau dégazé trois fois avant d'être agité à reflux pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie et a été diluée avec du dichlorométhane (20 mL). Le mélange a été lavé avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M (2 x 15 mL) suivi d'un lavage avec de l'eau (3 x 15 mL). La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour obtenir un résidu sombre qui a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0,5%) conduisant ainsi au composé 32a sous la forme d'une huile jaune (645 mg, 45 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,55 (dd, J = 5,6; 1,4 Hz, 1H), 7,97 (ddd, J = 11,2; 7,7 Hz, 1,4 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,55 (td, J = 7,7; 1,4 Hz, 1H), 7,46 (td, J =7,7; 3,5 Hz, 2H), 4,15 (qd, J = 7,0; 4,2 Hz, 2H), 2,72 (s, 3H), 1,38 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ; RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 163,0 (d, J = 21 Hz), 158,1 (d, J = 167 Hz), 154,0 (d, J =13 Hz), 132,9 (d, J = 3 Hz), 132,5 (d, J = 10 Hz), 129,1 (d, J = NO2 N Br Pd(PPh3)4, Et3N PhMe 140 Hz), 128,5 (d, J = 13 Hz), 117,6 (d, J = 24 Hz), 117,5 (d, J = 3 Hz), 62,2 (d, J = 6 Hz), 24,9, 16,4; RMN 31P (162 MHz, CDCI3) Ô: 23,7. HRMS (ESI+) calculée pour C14H16N204P [M+H]+, m/z 307,0848, trouvée: 307,0851. Rf = 0,47 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (32b) NO2 Pd(dppf)Cl2, Et3N PhMe I 0 N Br H Me OEt 31 32b A du diéthylméthyl phosphonite (2 g, 14,7 mmol) a été ajoutée à 0°C de l'eau (264 gL, 14,7 mmol) sans précaution particulière. Le mélange réactionnel a été réchauffé à température ambiante en 1 h puis laissé sous agitation pendant 16 h à température ambiante. A ce mélange ont été ajoutés une solution de 2-bromo-6-méthyl-4-nitropyridine 31 (2,65 g, 12,3 mmol) dans du toluène anhydre (35 mL) puis de la triéthylamine (6 mL, 43,0 mmol). Le mélange a été dégazé par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution a été ajouté du bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(II) (800 mg, 1,1 mmol) et le mélange a été à nouveau dégazé trois fois avant d'être agité à reflux pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie et concentrée sous pression réduite puis diluée avec du dichlorométhane (20 mL). Le mélange a été lavé avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M (2 x 15 mL) puis avec de l'eau (3 x 15 mL). La phase organique a été séchée sur du sulfate de magnésium, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour obtenir un résidu sombre qui a été purifié par chromatographie sur colonne sur silice (dichlorométhane / méthanol 1,6% par incréments de 0,1%) conduisant ainsi au composé 32b sous la forme d'une huile incolore (2,1 g, 59%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,54-8,56 (m, 1H), 7,96-8,01 (m, 1H), 3,68-4,44 (m, 2H), 2,79 (s, 3H), 1,83 (d, J = 15 Hz, 3H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) Ô: 163,2 (d, J = 21 Hz), 158,1 (d, J = 157 Hz), 154,3 (d, J = 157 Hz), 117,9 (d, J = 3 Hz), 117,2 (d, J = 23 Hz), 61,6 (d, J = 7 Hz), 24,9; 16,6 (d, J = 6 Hz), 13,5 (d, J = 105 Hz); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) b : + 37,2. HRMS (ESI+) calculée pour C9H13N204P [M+H]+, m/z 244,0613, trouvée: 244,0607. Rf = 0,26 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (33a) NO2 Br I , »Et N pi-ph OH N p-ph o o 32a 33a Au dérivé nitré 32a (2,00 g, 6,54 mmol) a été ajouté du bromure d'acétyle (15 mL, 0,2 mol) et le mélange a été agité à 70°C pendant 16 h sous argon.Au cours de cette période un précipité brun pâle s'était formé. La suspension a été versée lentement dans du méthanol (100 mL) refroidi à 0°C30 sur une période de 10 min. Le mélange a été agité pendant 10 min à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé souhaité sous la forme d'un solide brun pâle qui a été utilisé directement dans la suite de la synthèse sans purification (1,81 g, 90 %) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) Ô : 8,33 (dd, J = 7,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,95 (ddd, J =13,2 Hz, 7,6 Hz, 1,6 Hz, 2H), 7,63 (1H, td, J = 7,6 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,55 (2H, td, J = 7,6 Hz, 3,6 Hz), 2,77 (3H, s) ; RMN 130 (100 MHz, CD3OD) b : 159,4 (d, J = 20 Hz), 151,7 (d, J = 160 Hz), 145,1 (d, J = 10 Hz), 134,8 (d, J = 3 Hz), 133,3 (d, J = 10 Hz), 131,0 (d, J = 24 Hz), 130,6 (d, J = 3 Hz), 130,2 (d, J = 140 Hz), 129,6 (d, J = 12 Hz), 20,4 ; RMN 31 P (162 MHz, CD3OD) b : 14,3. HRMS (ESI+) calculée pour C12H10NO2P [M+H]+, m/z 309,9633, trouvée: 309,9648. Rf = 0,01 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (33b) pH NO2 pEt N 0 32b Br 33b Au dérivé nitré 32b (5 g, 20,5 mmol) a été ajouté du bromure d'acétyle (40 mL, 541 mmol) et le mélange a été agité à 70°C pendant 16 h sous argon.Au cours de cette période un précipité brun pâle s'était formé. La suspension a été versée lentement dans du méthanol (100 mL) refroidi à 0°C sur une période de 10 min. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 10 min. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé souhaité sous la forme d'un solide brun pâle qui a été utilisé directement dans la suite de la synthèse sans purification (4,57 g, 90 %) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) b : 8,25-8,28 (m, 1H), 8,17-8,18 (m, 1H), 2,76 (s, 3H), 1,80 (d, J= 16 Hz, 3H) ; RMN 31 P (162 MHz, CD3OD) b : + 28,6. HRMS (ESI+) calculée pour C7H10BrNO2P [M+H]+, m/z 249,9633, trouvée: 249,9627. R,= 0,01 (silice, dichlorométhane - méthanol 95 :5). Composé (34a) Br CH(OEB3 0 33a Br OEt P Ph O 34a A l'acide phosphinique 33a (1,80 g, 5,80 mmol) a été ajouté de l'orthoformiate d'éthyle (50 mL) et le mélange a été agité à 140°C pendant 72 h sous àmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0,5 %) pour conduire au composé 34a sous la forme d'une huile jaune (1,08 g, 55 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,04 (dd, J = 6,3 Hz, 1,4 Hz, 1H), 7,95 (ddd, J = 11,2; 7,0; 1,4 Hz, 2H), 7,51 (1H, td, 7,0; 1,4 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,0; 3,5 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 4,11 (qd, J = 7,0; 4,2 Hz, 2H), 2,52 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ; RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 161,2 (d, J = 22 Hz), 155,7 (d, J = 165 Hz), 133,5 (d, J = 15 Hz), 132,7 (d, J = 3 Hz), 132,6 (d, J = 10 Hz), 130,0 (d, J = 139 Hz), 128,5 (d, J = 3 Hz), 128,4 (d, J = 23 Hz), 128,3 (d, J= 13 Hz), 62,1 (d, J = 6 Hz), 24,5, 16,7 ; RMN 31 P (162 MHz, CDCI3) b : 25,5. HRMS (ESI+) calculée pour C14H16NO2BrP [M+H]+, m/z 340,0102, trouvée: 340,0102. Rf = 0,3 (silice, cyclohexane - acétate d'éthyle 30:70). Composé (34b) CH(OEt)3 Br Br O ,OEt P- 8 33b 34b A l'acide phosphinique 33b (4,54 g, 18,4 mmol) a été ajouté de l'orthoformiate d'éthyle (46 mL) et le mélange a été agité à 140°C pendant 42 h sous agon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 1 %) pour conduire au composé 34b sous la forme d'une huile jaune (3,9 g, 68 %) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,04 (dd, J = 5,9; 1,8 Hz, 1H), 7,46 (s app, 1H), 3,82-4,16 (m, 2H), 2,59 (s, 3H), 1,77 (d, J = 15 Hz, 3H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 161,1 (d, J = 21 Hz), 155,4 (d, J = 156 Hz), 133,6 (d, J = 14 Hz), 128,9 (d, J = 3 Hz), 128,2 (d, J = 22 Hz), 61,3 (d, J = 6 Hz), 24,4; 16,5 (d, J = 6 Hz), 13,6 (d, J = 104 Hz); RMN 31 P (162 MHz, CDCI3) b : + 38,0; HRMS (ESI+) calculée pour C9H13NO2BrP [M+H]+, m/z 276,9867, trouvée: 276,9862. Rf = 0,52 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (35a) Br Br m-CPBA CHCI3 35a A une solution de dérivé pyridinyle 34a (1,25 g, 3,68 mmol) dans du chloroforme (20 mL) a été ajouté de l'acide méta-chloroperbenzoïque (1,27 g, 7,35 mmol). La solution résultante a été agitée à 65°C pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour obtenir une huile jaune. Cette huile a été dissoute dans du dichlorométhane (50 mL) et a été lavée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,5 M (50 mL). Les phases ont été séparées et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, ont été séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et le solvant a été éliminé sous pression réduite. L'huile jaune résultante a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 2 % par incréments de 0,1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 35a (1,11 g, 75 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,05 (dd, J = 7,7 Hz, 2,1 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 7,7 Hz, 13,3 Hz, 2H), 7,50 (t, 7,7 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7 Hz, 4,2 Hz, 2H), 4,13 (qd, J = 5,6 Hz, 4,9 Hz, 2H), 2,32 (s, 3H), 1,34 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 151,0 (d, J = 4 Hz), 144,2 (d, J = 149 Hz), 133,2 (d, J = 11 Hz), 133,1 (d, J = 4 Hz), 133,0 (d, J = 11 Hz), 132,2 (d, J = 4 Hz), 129,0 (d, J = 152 Hz), 128,4 (d, J = 14 Hz), 117,4 (d, J = 12 Hz), 62,3 (d, J = 6 Hz), 17,5, 16,7 ; RMN 31P (162 MHz, CDCI3) b : +21,2. HRMS (ESI+) calculée pour C14H16NO3BrP [M+H]+, m/z 356,0051, trouvée: 356,0061. Rf = 0,5 (silice, dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (35b) Br m-CPBA CHCI3 OEt lis 1.0 34b 35b A une solution de dérivé pyridinyle 34b (3,5 g, 11,87 mmol) dans du chloroforme (40 mL) a été ajouté de l'acide méta-chloroperbenzoïque (4,1 g, 23.8 mmol). La solution résultante a été agitée à 65°C pendant 2 h sous argon. L'avancement de la réwtion a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange a été refroidi à température ambiante et le solvant a 15 été éliminé sous pression réduite pour obtenir une huile jaune. Cette huile a été dissoute dans du dichlorométhane (50 mL) et a été lavée avec une solution de bicarbonate de sodium 0,5 M (100 mL). Les phases ont été séparées et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3 x 100 mL). Les phases organiques ont été réunies, ont été séchées sur sulfate de magnésium et le solvant a été éliminé sous pression réduite. L'huile jaune résultante a été 20 purifiée par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 2 % par incréments de 0,1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 35b (2,6 g, 75 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,04 (dd, J = 7,9; 2,9 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 2,9 Hz, 1H), 3,89-4,22 (m, 2H), 2,48 (s, 3H), 1,97 (d, J= 17 Hz, 3H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) : 151,1 (d, J = 4 Hz), 143,8 (d, J= 136 Hz), 133,4 (d, J= 11 Hz), 132,3 (d, J = 2 Hz), 118,0 (d, J= 25 12 Hz), 62,1 (d, J = 7 Hz), 17,5; 16,6 (d, J = 6 Hz), 14,5 (d, J = 111 Hz); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) b : + 32,2; m/z HRMS (ESI+) calculée pour C9H13BrNO3P [M+H]+, m/z 292,9816, trouvée: 292,9811. R,= 0,27 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (36a) Br Br i) CHCI3, (CF3C0)20 OEt ") H2O N Yi-Ph 0- O 30 35a Au dérivé pyridinyl N-oxyde 35a (1,7 g, 4,8 mmol) ont été ajouté du chloroforme (35 mL) et de l'anhydride trifluoroacétique (25 mL). La solution a été chauffée à 60°C pendant 2 h sous agitation. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le HO O 36a résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol de 0 à 5 % par incréments de 1 %) pour obtenir un solide blanc correspondant au composé 36a (1,6 g, 97 °/0). PtF 98-100°C. RMN 1H(400 MHz, CDCI3) b : 8,16 (dd, J = 6,0; 1,3 Hz, 1H), 7,95 (ddd, J = 12,3; 8,3;1,4 Hz, 2H), 7,62 (s, 1H); 7,60-7,56 (m, 1H); 7,53-7,46 (m, 2H); 4,78 (s, 2H); 4,67 (s I, 1H); 4,24-4,10 (m, 2H); 1,40 (t, J = 7,0 Hz, 3H). HRMS (ESI+) calculée pour C14H16NO3BrP [M+H]+, m/z 356,0051, trouvée: 356,0049. Rf = 0,44 (silice, dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (36b) Br Br ,OEt i) CHCI3, (CF3C0)20 Ô- 8 35b ii) H2O - EtOH » HO N ,OEt 0 36b Au dérivé pyridinyl N-oxyde 35b (3,0 g, 10,23 mmol) ont été ajouté du chloroforme (60 mL) et de l'anhydride trifluoroacétique (28 mL). La solution a été chauffée à 60°C pendant 2 h sous agitation. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu ont été ajouté de l'éthanol (5 mL) et de l'eau (5 mL). La solution a été agitée à température ambiante pendant 12 h puis concentrée sous pression réduite. A ce résidu ont été ajoutés du dichlorométhane (70 mL) et de l'eau (70 mL). La phase organique a été séparée puis séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous pression réduite pour conduire au composé brut qui a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol de 0 à 5 % par incréments de 1 %) pour obtenir une huile jaunâtre correspondant au composé 36b (2,2 g, 67 °/0). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,13 (dd J = 5,9; 1,8 Hz, 1H), 7,63 (s app, 1H), 4,80 (s, 2H), 3,70-4,20 (m, 2H), 3,26 (sl, 1H), 1,76 (d, J = 15 Hz, 3H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) b : 162,8 (d, J = 20 Hz), 154,8 (d, J = 154 Hz), 134,5 (d, J = 13 Hz), 129,5 (d, J = 22 Hz), 126,3 (d, J = 3 Hz), 64,2; 61,5 (d, J = 6 Hz), 16,5 (d, J = 6 Hz), 13,6 (d, J = 105 Hz); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) b : + 38,0; HRMS (ESI+) calculée pour C9H13NO3BrP [M+H]+, m/z 292,9816, trouvée: 292,9813. R,= 0,24 (silice, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (36c) TMS Br Pd(dppf)C12 Cul DIPEA, THF HO TMS HO 36c A la pyridine bromée 36a (178 mg, 0,5 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (5 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés le triméthylsilyl acétylène (355 gL, 2,5 mmol) et de la diisopropyléthylamine (227 III_ 2,5 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du [1,1- Bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (37 mg, 0,05 mmol) et de l'iodure de cuivre (10 mg, 0,05 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée sous atmosphère inerte. Un changement de couleur du jaune très clair au marron foncé a été observé et le mélange a été agité à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (60 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (60 mL) puis avec de l'eau (60 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane /méthanol 0 à 6 % par incréments de 1 %) pour obtenir le composé 36c (163 mg, 87 %). HMRS (ESI+) calculée pour C19H25NO3PSi [M+H]+, m/z 374,1336 trouvée: 374,1336. R,= 0,44 (silice; dichlorométhane - méthanol: 90 :10). Composé (36d) TMS Br HO Pd(dppf)C12 Cul DIPEA TMS HO 36d O A la pyridine bromée 36b (250 mg, 0,85 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (5 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés le triméthylsilyl acétylène (600 gL, 4,3 mmol) et de la diisopropyléthylamine (750 gL, 4,3 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du [1,1- Bis(diphénylphosphino)ferrocène]clichloropalladium(11) (63 mg, 0,85 mmol) et de l'iodure de cuivre (16 mg, 0,085 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée sous atmosphère inerte et le mélange a été agité à 65 °C. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (50 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (50 mL) puis avec de l'eau (50 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane /méthanol 0 à 4 % par incréments de 1 %) pour obtenir le composé 36d (265 mg, 98 %). LMRS (ESI+) calculée pour C14H NO PSi 23_ _ 3. _ m/z 312,1185 trouvée: 312,30. R,= 0,48 (silice; dichlorométhane - méthanol: 90 :10). Composé (36e) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 36f, en utilisant le précurseur correspondant.35 Composé (36f) TMS TBAF, THF HO tOE HO N O 36d A une solution du dérivé sililé 36d (200 mg, 643 'mol) dans du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) a été ajoutée une solution de fluorure de tétrabutyle ammonium dans du tétrahydrofurane anhydre 1 M (500 gL, 643 'mol). La solution a été agitée à température ambiante pendant 1 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (50 mL) et a été lavé avec de l'eau (2 x 50 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium et a été filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 36f désiré qui a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (146 mg, 95%). LRMS (ESI+) calculée pour C111-115NO3P [M+H]+, m/z 240,0790 trouvée: 240,33. Rf= 0,42 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (37a) O-'NHBoc HO Et3N / THF Cul PdCl2(PPh3)2 27a HO 15a 37a Une solution de dérivé acétylènique 15a (0,864 g, 3,1 mmol) et de dérivé iodé 27a (0,735 g, 2,5 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane anhydre (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (22 mg, 0,031 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (12 mg, 0,063 mmol). La réaction a été agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis avec une solution saturée de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 98/2) pour conduire au composé 37a sous forme d'un solide blanc (0,91 g, 82%). PtF : 143-144°C. RMN 1H (500 MHz, CDC13) Ô: 8,04 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,45 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,86 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,83 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 4,75 (s, 1H), 4,01 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,31 (td, J = 6,1; 6,1 Hz, 2H), 1,96 (m, J = 6,1 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). RMN 130 (125 MHz, CDC13) Ô: 165,4; 160,8; 160,1; 156,2; 147,3; 134,1; 133,8; 125,8; 125,4; 114,9; 113,9; 95,9; 85,4; 66,1; 64,8; 53,2; 38,1; 29,7; 28,6. HRMS (ESI+) calculée pour C24H28N206 [M+H]+, m/z 441,2020, trouvée: 441,2021. Rf = 0,32 (silice, dichlorométhane - méthanol 96:4). Composé (37b) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 37c en utilisant le précurseur correspondant. Composé (37c) OMe HO 27a N CO2Me 37c Une solution de dérivé acétylènique 15d (133 mg, 1 mmol) et de dérivé iodé 27a (294 mg, 1 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane anhydre (8 mL) et de triéthylamine (5 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (68 mg, 0,1 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (37 mg, 0,2 mmol). La réaction a été agitée à 75°C pendant 12 h L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis avec une solution saturée de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'éluant (dichlorométhane/méthanol 100/0 jusqu'à 95/5 par incrément de 0.5%) pour conduire au composé 37c (241 mg, 68%). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 8,07 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,49 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,85 (s, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,84 (s, 3H). RMN 130 (100 MHz, CDC13) Ô : 165,4; 160,7; 160,6; 147,3; 134,0; 133,8; 125,8; 125,4; 114,4; 113,8; 96,0; 85,3; 64,7; 55,5; 53,1. HRMS (ESI+) calculée pour C1711161\104 [M+H]+, m/z 298,1079, trouvée: 298,1075. Rf = 0,6 (silice, dichlorométhane - méthanol, 90:10). Composé (37d) Etel/THF Cul PdCl2(PPh3)2 15d HO OMe MS 0 Pd(PPh3)2C12 Cul, Et3N HO 17b THF, TBAF HO 37d A une solution de dérivé acétylénique 27b (263 mg, 1 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et de la triéthylamine anhydre (5 mL) a été additionné du dérivé iodé 17b (370 mg, 1 mmol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A cette solution ont été additionnés une solution de fluorure de tétrabutylammonium dans du tétrahydrofurane 1 M (1,5 mL, 1,5 mmol), du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (72 mg, 0,1 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (40 mg, 0,2 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à 75 °C pendant 3 h à l'abri de la lumière. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu noir a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0,5% jusqu'à 5 % par incréments de 1%) pour conduire au composé 37d sous forme d'une huile jaunâtre (203 mg, 54%). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 7,95 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,47 (s, 2H), 3,89 (s, 3H), 1,41 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDC13) b : 167,47; 165,16; 161,32; 158,69; 133,54; 131,93; 131,83; 128,43; 125,31; 114,72; 114,56; 95,26; 85,41; 82,61; 65,43; 65,54; 52,87; 27,91. HRMS (ESI+) calculée pour C18H18N05 [M+H]+, m/z 398,1604 trouvée: 398,1597. Rf = 0,74 (silice, dichlorométhane - méthanol, 90:10). Composé (37e) o"....***OMe TMS Pd(PPh3)2C12 Cul, Et3N HO THF, TBAF HO N COOMe 27b 13d 37e A une solution de dérivé acétylénique 27b (124 mg, 0,4 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (8 mL) et de la triéthylamine anhydre (5 mL) a été additionné du dérivé iodé 13d (105 mg, 0,4 mmol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A cette solution ont été additionnés une solution de fluorure de tétrabutylammonium dans du tétrahydrofurane 1 M (600 gL, 0,6 mmol), du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (28 mg, 0,04 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (15 mg, 0,1 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à 75 °C pendant 2 h 30 à l'abri de la lumière. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu noir a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0,5% jusqu'à 5 % par incréments de 1%) pour conduire au composé 37e sous forme d'une huile jaunâtre (137 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) Ô: 8,05 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,47 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,02 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,19 (s, 2H), 4,86 (s, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,47 (s, 3H). HRMS (ESI+) calculée pour C18H18N05 [M+H]+, m/z 328,1185 trouvée: 328,1177. Rf = 0,66 (silice, dichlorométhane - méthanol, 90:10). Composé (37f) 0_/-1 O3H j Pd(PPh3)2C12 HO Cul, Et3N N) CO2Me THF HO 27c 13e 37f A une solution de dérivé acétylénique 27c (145 mg, 0,76 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (20 mL) et de la triéthylamine anhydre (3,5 mL) a été additionné du dérivé iodé 13e (273 mg, 0,8 mmol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A ce mélange a été additionné du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (68 mg, 0,1 mmol) et de l'iodure de cuivre (I) (36 mg, 0,2 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à 65 °C pendant 3 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC et CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0% jusqu'à 10 % par incrément de 1%) pour conduire au composé 37f sous forme d'une huile jaunâtre (122 mg, 40%). LRMS (ESI+) calculée pour c19H20N07s [m+Fi]+, m/z 406,0960 trouvée: 406,30. Rf = 0,24 (silice, dichlorométhane méthanol - triéthylamine 96:3:1). Rt = 11,1 min (colonne Waters XBridge RP-018, 3,5 lm, 4,6 X 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacetique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (21 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composé (37g) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 37f en utilisant le précurseur correspondant. Composé (38a) MsCI Et3N HO THF Ms0 37a 38a A une solution d'alcool 37a (195 mg, 0,44 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (7 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (0,2 mL, 148 'mol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goute du chlorure de mésyle (67 gL, 0,84 mmol). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 5 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (10 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (2 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (240 mg, quantitatif). Le produit 38a était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. LRMS (ESI+) calculée pour C25H31N208S [M+H]+, m/z 519,1801, trouvée: 519,13. Rf = 0,6 (silice, dichlorométhane - méthanol 96:4). Composé (38b) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 38a en utilisant le précurseur correspondant. Composé (38c) OMe OMe MsCI Et3N HO THF Ms0 37c 38c A une solution d'alcool 37c (241 mg, 0,8 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (10 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (339 mg, 2,8 mmol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goute une solution de chlorure de mésyle (94 gL, 1,2 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (0,2 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 20 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (20 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (3 X 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (314 mg, quantitatif). Le produit 38c était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,16 (d, J = 1,3 Hz, 1H); 7,72 (d, J = 1,3 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 6,93 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 5,43 (s, 2H); 4,03 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 3,18 (s, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCI3) b : 165,00; 160,88; 154,68; 147,95, 134,75; 133,86; 126,77; 126,46; 114,40; 113,54; 96,98; 84,97; 70,76; 55,49; 53,25; 38,16. LRMS (ESI+) calculée pour C18H18N06S [M+H]+, m/z 376,0855, trouvée: 376,04. Rf = 0,52 (silice, cyclohexane - acétate d'éthyle 30:70).30 Composé (38d) MsCI Et3N HO THF Ms0 37d 38d A une solution d'alcool 37d (114 mg, 0,29 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (5 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (120 gL, 0,86 mmol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goute une solution de chlorure de mésyle (33 gL, 0,43 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 10 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (15 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (3 X 5 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (138 mg, quantitatif). Le produit 38d était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 8,14 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,50 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 5,40 (s, 2H), 4,55 (s, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 1,48 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 167,56; 164,98; 159,12; 154,71; 147,97; 133,62; 133,85; 126,79; 126,46; 114,99; 114,49; 96,60; 85,13; 82,85; 70,73; 65,67; 53,26; 38,17; 27,91. LRMS (ESI+) calculée pour C23H26NO8S [M+H]+, m/z 476,14 trouvée: 476,19. Rf = 0,74 (oxyde d'alumine neutre, cyclohexane - acétate d'éthyle 30:70). Composé (38e) HO MsCI Et3N CO2Me THF Ms0 37e 38e A une solution d'alcool 37e (140 mg, 0,25 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (4 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (132 gL, 0,95 mmol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goute une solution de chlorure de mésyle (37 gL, 0,48 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 10 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (15 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (3 X 5 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (152 mg, quantitatif). Le produit 38e était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,14 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,50 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 5,40 (s, 2H), 4,55 (s, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 1,48 (s, 9H). RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 167,56; 164,98; 159,12; 154,71; 147,97; 133,62; 133,85; 126,79; 126,46; 114,99; 114,49; 96,60; 85,13; 82,85; 70,73; 65,67; 53,26; 38,17; 27,91. HRMS (ESI+) calculée pour C13H20N07S [M+H]+, m/z 406,0960 trouvée: 406,0954. Rf = 0,61 (oxyde d'alumine neutre, cyclohexane - acétate d'éthyle, 30:70). Composé (38f) OSO3H OSO3H MsCI Et3N THF HO MsO N CO2Me N CO2Me 37f 38f A une solution d'alcool 37f (39 mg, 84 'mol) dans du tétrahydrofurane anhydre (4 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (40 gL, 0,29 mmol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goute une solution de chlorure de mésyle (14 gL, 0,17 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après 10 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été dissous dans du tampon aqueux d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 6 (5 mL) et cette solution a été purifiée par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec tampon aqueux d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 6 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (18 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit mésylé désiré 38f (41 mg, quantitatif). LRMS (ESI+) calculée pour C201122N09S2 [M+H]+, m/z 484,0736 trouvée: 484,34. Rt = 11,05 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacetique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [gradient linéaire de 5 à 80% MeCN (25 min)], avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composé (38g) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 38f en utilisant le précurseur correspondant. Composé (39a) HO OEt N p-Ph O 36a O' NHBoc 15a Pd(PPh3)4 / Cul HO Et3N, THF 39a Br Au dérivé bromé 36a (142 mg, 0,4 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique 15a (147 mg, 0,4 mmol) et de la triéthylamine (5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (46 mg, 0,04 mmol) et de l'iodure de cuivre (7,6 mg, 0,04 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (25 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (25 mL) puis avec de l'eau (25 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 3 % par incréments de 0,5 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 39a (154 mg, 70 °/0). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) Ô : 8,01 (dd, J = 6,4; 2,0 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,4; 12,4 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,39 (td, J = 8,4; 4,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,73 (s, 1H), 4,69 (s, 2H), 4,08 (qd, J = 5,6; 4,8 Hz, 2H), 3,97 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,26 (m, 2H), 1,92 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H, 1,31 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 160,3 (d, J = 18 Hz), 159,8; 156,0; 153,2 (d, J = 164 Hz); 133,7; 133,0 (d, J = 11 Hz); 132,6 (d, J = 5 Hz); 132,3 (d, J = 10 Hz); 129,6 (d, J = 138 Hz); 128,6 (d, J = 18 Hz); 128,5 (d, J = 9 Hz); 123,8 (d, J = 3 Hz); 114,7; 113,8; 96,0; 85,3 (d, J = 2 Hz); 79,3; 65,9; 63,8; 61,9 (d, J = 6 Hz); 37,9; 29,5; 28,4; 16,6; RMN 31P (162 MHz, CDCI3) Ô: +25,6. HRMS (ESI+) calculée pour C30H36N206P [M+H]+, m/z 551,2306 trouvée: 551,2305. Rf = 0,24 (silice, dichlorométhane - méthanol, 95:5). Composé (39b) cr"--'"-NHBoc Br 14a HO OEt TMS OEt Ô- Pd(PPh3)4 / Cul HO Et3N, THF N P- 11 TBAF O 36b 39b Au dérivé bromé 36b (200 mg, 0,68 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique 14a (260 mg, 0,75 mmol) et de la triéthylamine (5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (79 mg, 0,068 mmol) et de l'iodure de cuivre (13 mg, 0,068 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (25 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (25 mL) puis avec de l'eau (25 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 5 % par incréments de 1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 39b (220 mg, 66 %). HRMS (ESI+) calculée pour C25H34N206P [M+H]+, m/z 489,2149 trouvée: 489,2152. Rf = 0,35 (silice, dichlorométhane - méthanol, 95:5). Composés (39c-d) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 39b en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (39f) OMe OMe HO OEt Pi Br OEt HO N P- Pd(Ph3)4 / Cul 0 Et3N, THF 15d 36b 39f Au dérivé bromé 36b (400 mg, 1,36 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés à l'éthynylanisole 15d (180 mg, 1,36 mmol) et de la triéthylamine (5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (158 mg, 0,136 mmol) et de l'iodure de cuivre (26 mg, 0,136 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans du dichlorométhane (40 mL) et lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium (40 mL) puis avec de l'eau (40 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 8 % par incréments de 1 %) pour obtenir une huile correspondant au composé 39f (480 mg, 96 °/0). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 7,95 (s I, 1H), 7,51 (s I, 1H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,78 (s, 2H), 4,10 - 4,04 (m, 1H), 3,86 - 3,81 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 1,73 (d, J = 14,9 Hz, 3H), 1,23 (t, J = 7 Hz, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 161,2 (d, J = 18 Hz), 160,6; 153,1 (d, J = 156 Hz), 133,6; 132,9 (d, J = 12 Hz), 127,7 (d, J = 19 Hz), 124,1 (d, J = 4 Hz), 114,2; 114,0; 96,0; 85,3; 64,2; 61,2 (d, J = 6 Hz), 55,3; 16,4 (d, J = 6 Hz), 13,4 (d, J = 104 Hz); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) b : +38,6. HRMS (ESI+) calculée pour C18H21NO4P [M+H]+, m/z 346,1203 trouvée: 346,1202. Rf = 0,26 (oxyde d'alumine neutre, dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (39g) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 39h en utilisant le précurseur correspondant. Composé (39h) Br OEt N P- li 0 36b HO 19a Pd(dppf)C12 / Cul Et3N, THF HO Au dérivé bromé 36b (103 mg, 0,35 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (1 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique 19a (80 mg, 0,42 mmol) et de la triéthylamine (0,24 mL, 1,75 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du [1,1- Bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (30 mg, 0,035 mmol) et de l'iodure de cuivre (7 mg, 0,035 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée à 65 °C sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 18 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 3 % par incréments de 0,1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 39h (122 mg, 87 °/0). RMN 1 H (400 MHz, CDCI3) b : 7,98 (s I, 1H), 7,50 (s I, 1H), 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,88 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,80 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,09 (m, 1H), 3,99 (s I, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 1,76 (d, J = 14,9 Hz, 3H), 1,26 (t, J = 6,9 Hz, 3H); RMN 130 (100 MHz, CDCI3) b : 168,9; 161,0 (d, J = 19 Hz), 158,8; 153,3 (d, J = 155 Hz), 133,8; 132,9 (d, J = 12 Hz), 128,1 (d, J = 22 Hz), 124,2; 115,1; 115,0; 95,7; 85,6; 65,2; 64,3; 61,3 (d, J = 5 Hz), 52,5; 16,5 (d, J = 4 Hz), 13,5 (d, J = 104 Hz); RMN 31 P (162 MHz, CDCI3) b : +39,5. HRMS (ESI+) calculée pour C20H22NNaO6P [M+Na]+, m/z 426,1082 trouvée: 426,1063. Rf = 0,44 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). Composé (39i) 0 Br HO 23 Pd(dppf)Cl2 / Cul HO Et3N, THF 36b 39i OAc OAc Glut-Ac gg F OAc OAc OAc A une solution de dérivé 36b (40 mg, 0,14 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1 mL) dégazée par trois cycles de congélation-décongélation sous vide ont été ajoutés du dérivé acétylénique 23 (75 mg, 0,14 mmol) et de la triéthylamine (0,19 mL, 1,36 mmol) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du [1,1- Bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (11 mg, 0,014 mmol) et de l'iodure de cuivre (2,6 mg, 0,014 mmol). Cette nouvelle solution a été agitée à 65 °C sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 16 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 3 % par incréments de 0,5 %) pour obtenir une huile incolore correspondant au composé 39i (71 mg, 68 °/0). RMN 1H (700 MHz, CDCI3) Ô : 8,02 (d, J= 4,6 Hz, 1H), 7,56 (m, 1H), 7,49 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,38 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,48 (dd, J = 6,4; 4,8 Hz, 1H), 5,32 (dd, J= 5,8; 4,8 Hz, 1H), 5,17 (m, 1H), 5,02 (ddd, J = 6,5; 5,6; 3,4 Hz, 1H), 4,81 (s, 2H), 4,50 (q AB, 2H), 4,25 (dd, J = 12,4; 3,4 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 12,4; 5,5 Hz, 1H), 3,86 (m, 2H), 3,79 (sl, 1H), 3,55 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,77 (d, J = 14,9 Hz, 3H), 1,27 (t, J = 6,9 Hz, 3H); RMN 13C (176 MHz, CDCI3) b : 170,7; 170,5; 170,2; 170,0; 169,9; 168,1; 160,9 (d, J= 19 Hz), 158,1; 153,5 (d, J= 156 Hz), 134,0; 132,9 (d, J= 12 Hz), 127,7 (d, J=10 Hz), 128,4 (d, J= 12 Hz), 115,5; 115,1; 95,4; 85,8; 70,2; 69,2; 69,1; 69,0; 67,3; 64,2; 61,6; 61,3 (d, J= 6 Hz), 39,4; 20,8(4); 20,8(3); 20,8(0); 20,7(9); 20,6(6); 16,6 (d, J= 6 Hz), 13,6 (d, J= 105 Hz); RMN 31P (284 MHz, CDCI3) ô +39.0; HRMS (ESI+) calculée pour C33H43N2Na013P [M+Na]+, m/z 785,2299 trouvée: 785,2285. R,= 0,24 (silice; dichlorométhane - méthanol 95:5). Composé (39j) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 39i en utilisant le précurseur correspondant. Composé (39m) SO3H O-/-/ SO3H Pd(dppf)C12 Cul, Et3N 0_/-1 HO THF HO OEt 0 36f 13e 39m A une solution de dérivé acétylénique 36f (146 mg, 610 'mol) dans du tétrahydrofurane anhydre (12 mL) et de la triéthylamine anhydre (6 mL) a été additionné du dérivé iodé 13e (208 mg, 610 'mol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A cette solution ont été additionnés du bis(diphénylphosphino)ferrocène]dichloropalladium(11) (45 mg, 61 'mol) et de l'iodure de cuivre (I) (12 mg, 61 'mol). Le milieu réactionnel a été agité à 65 °C pendant 2 h à l'abri de la lumière. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par : colonne Waters XBridge RP-018, 5 lm, 50 x 150 mm) avec tampon aqueux d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 6 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (18 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm composé 39m. LRMS (ESI+) calculée pour C20H25NNa07PS [M+H+Na]+, m/z 477,0987 trouvée: 477,21. Rt = 6,55 min (colonne Waters XBridge RP-018, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v)) comme éluant, [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (39n) 0_/-1 SO3H SO3H Pd(dppf)C12 Cul, Et3N HO OEt THF HO 0 36e 13e 39n 0 A une solution de dérivé acétylénique 36e (50 mg, 134 'mol) dans du tétrahydrofurane anhydre (10 mL) et de la triéthylamine anhydre (5 mL) a été additionné du dérivé iodé 13e (50 mg, 147 'mol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A cette solution ont été additionnés du bis(diphénylphosphinoyerrocène]dichloropalladium(11) (10 mg, 13 'mol) et de l'iodure de cuivre (I) (2,5 mg, 13 'mol). Le milieu réactionnel a été agité à 65 °C pendant 1 h à l'abri de la lumière et sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu noir a été additionnée une solution saturée de chlorure d'ammonium (40 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 40 mL). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (dichlorométhane - méthanol triéthylamine : 99,75: 0 :0,25 jusqu'à 89,75 : 10 : 0,25 par incréments de 1% de méthanol) pour conduire au composé 39n sous forme d'une huile jaunâtre (9 mg, 13%). LRMS (ESI+) calculée pour C25H27N07PS [M+H]+, m/z 516,1246 trouvée: 516,34. Rf = 0,51 (silice, dichlorométhane - méthanol - triéthylamine 99:9:1). Rt = 7,6 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min 1. Composés (39o-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour les composés 39m-n respectivement en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (40a) MsCI HO Et3N / THF MsO 39a 40a A une solution d'alcool 39a (118 mg 0,21 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (7 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (87 III_ 064 mmol) puis du chlorure de mésyle (24 III_ 0,32 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile marron correspondant au composé 40a (125 mg, 95%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. HRMS (ESI+) calculée pour C31H38N208PS [M+H]+, m/z 629,2081 trouvée: 629,2081. Rf = 0,15 (oxyde d'alumine neutre, cyclohexane acétate d'éthyle 30:70). Composé (40b) MsCI HO Et3N/THF MsO OEt g-- 39b 40b A une solution d'alcool 39b (90 mg 0,18 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (5 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (77 III_ mmol) puis du chlorure de mésyle (21 III_ 0,27 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à 5°C pendant 5 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile marron correspondant au composé 40b (97 mg, 95%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. HRMS (ESI+) calculée pour C26H36N208PS [M+H]+, m/z 567,1925 trouvée: 567,1939. Rf = 0,13 (oxyde d'alumine neutre, cyclohexane - acétate d'éthyle 30:70). Composé (40f) OMe OMe MsCI HO Et3N / THF Ms0 0 39f 40f A une solution d'alcool 39f (214 mg, 0,62 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (5 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (0,26 mL, 1,86 mmol) puis du chlorure de mésyle (71 III_ 0,93 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile incolore correspondant au composé 40f (213 mg, 81%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) Ô : 8,11 (dd, J = 6,0; 1,5 Hz, 1H), 7,65 (sl, 1H), 7,52 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,39 (s, 2H), 4,20 4,10 (m, 1H), 3,95 - 3,88 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 1,80 (d, J = 15,1 Hz, 3H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H); HRMS (ESI+) calculée pour C19H23N06PS [M+H]+, m/z 424,0978 trouvée: 424,0975. R,= 0,17 (oxyde d'alumine neutre, cyclohexane - acétate d'éthyle 30 : 70). Composé (40h) MsCI HO Etel/THF Ms0 39h 40h A une solution d'alcool 39h (122 mg 0,3 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (3 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (0,15 mL, 1 mmol) puis du chlorure de mésyle (35 gL, 0,45 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile incolore correspondant au composé 40h (115 mg, 80%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 8,08 (s I, 1H), 7,63 (s I, 1H), 7,48 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,35 (s, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,12 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 1,76 (d, J = 14,9 Hz, 3H), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 3H); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) :+38,2. HRMS (ESI+) calculée pour C21H241\108NaPS [M+Na]+, m/z 504,0858 trouvée: 504,0859. R,= 0,56 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). OEt N P-Me 0 39i 40i Composé (40i) o.1(NHGlut-Ac 0 MsCI Et3N / THF HO Ms0 OAc OAc Glut-Ac OAc OAc OAc A une solution d'alcool 39i (71 mg, 93 'mol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1,5 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (0,26 gL, Q19 mmol) puis du chlorure de mésyle (11 pL, 0,14 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (10 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 10 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile incolore correspondant au composé 40i (78 mg, quantitatif) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) c5 8,01 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 7,64 (m, 1H), 7,52 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,38 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,49 (dd, J = 6,4; 4,8 Hz, 1H), 5,38 (m, 2H), 5,33 (dd, J = 5,8; 4,6 Hz, 1H), 5,17 (m, 1H), 5,02 (ddd, J = 6,6; 5.6; 3,4 Hz, 1H), 4,50 (m, 2H), 4,25 (dd, J = 12,5; 3,4 Hz, 1H), 4,11 (dd, J = 12,5; 5,6 Hz, 1H), 3,87 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,14 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,77 (d, J = 15 Hz, 3H), 1,28 (t, J = 7,0 Hz, 3H); LRMS (ESI+) calculée pour C36H46N2017PS [M+H]+, m/z 841,2255 trouvée: 841,31. Rf= 0,44 (silice; dichlorométhane - méthanol: 90 :10). Composé (40j) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 40i en utilisant le précurseur correspondant. Composés (40m-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 38f en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (41a) A une solution de dérivé mésylé 38a (235 mg, 0,454 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (10 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (65 mg, 0,471 mmol) et du 1,4,7-triazacyclononane 4 (30 mg, 0,126 mmol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 65°C pendant 18 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période, la réaction 25 était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec une solution d'acide formique 0,1% pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (3 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (25 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au 30 composé 41a (52,7 mg, 30%). LMRS (ESI+) calculée pour C78H94N9015 [M+H]+, m/z 1396,6869, 38a H 0 NH HN 3 HCI 4 K2CO3 , MeCN Ms0 BocHN 0 trouvée: 1396,31. Rt = 14,03 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (41b) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 41a en utilisant le précurseur correspondant. Composé (41c) OMe NH HN / 3 HCI 4 Ms0 38c 41c OMe OMe Me0 A une solution de dérivé mésylé 38c (46,8 mg, 120 'mol) dans de l'acétonitrile anhydre (5 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (34,7 mg, 250 'mol) et du 1,4,7- triazacyclononane 4 (9,6 mg, 40 'mol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 3 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par HPLC préparative : colonne Macherey Nagel (Hilic, 5 gm, 21 x 250 mm) avec une solution de tampon acétate d'ammonium 50 mM pH 5,3 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 97% MeCN (3 min)], gradient linéaire de 97 jusqu'à 80% MeCN (20 min) avec un débit de 14 mL min-1 et une détection UV à 330 nm pour conduire au composé 41c sous forme d'une huile jaunâtre (32,7 mg, 87%). HMRS (ESI+) calculée pour C57H55N609 [M+H]+, m/z 967,4025 trouvée: 967,4022. Rt = 13,73 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (41d) A une solution de dérivé mésylé 38d (88,2 mg, 190 'mol) dans de l'acétonitrile anhydre (4 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (53 mg, 370 'mol) et du 1,4,7- triazacyclononane 4 (14,7 mg, 62 'mol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionné du dichlorométhane (30 mL) et la solution a été lavée avec de l'eau (2 x 15 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par HPLC préparative: colonne Macherey Nagel Hilic, (5 lm, 21 x 250 mm) avec une solution de tampon acétate d'ammonium 50 mM pH 5,3 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 97% MeCN (3 min)], gradient linéaire de 97 jusqu'à 80% MeCN (20 min) avec un débit de 14 mL min-1 et une détection UV à 330 nm pour conduire au composé 41d sous forme (19 mg, 8%). LRMS (ESI+) calculée pour C72H79N6015 [M+H]+, m/z 1267,5603, trouvée: 1267,82. Rt = 14,26 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (41e) Crr NH HN / 3 HCI 4 Ms0 38d 41d 38e 41e 0*****-'0Me Crr NH HN / 3 HCI 4 K2CO3 , MeCN Ms0 A une solution de dérivé bromé 38e (76,3 mg, 190 'mol) dans de l'acétonitrile anhydre (5 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (52,3 mg, 380 'mol) et du 1,4,7- triazacyclononane 4 (14,5 mg, 60 'mol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le volume de solvant a été réduit sous pression réduite à 1 mL et le mélange réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec une solution d'acide trifluoroacétique 1% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (2 min), gradient linéaire de 15 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 41e (10,2 mg, 16%). HMRS (ESI+) calculée pour C601-161N6012 [M+H]+, m/z 1057,4342, trouvée: 1057,4341. Rt = 12,94 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min), gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composés (41f-g) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 41c en utilisant les précurseurs correspondants. La purification a été réalisé selon la méthode décrite pour le composé 47b. Composé (43c) OMe OMe A une solution du ligand 41c (32,7 mg, 33,8 pmol) dans du tétrahydrofurane (3 mL) a été additionnée une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium 1 M (1,5 mL). La solution a été agitée à température ambiante pendant 20 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC analytique. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite puis au résidu a été additionné de l'eau (2 mL) et du méthanol (3 mL). Le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'acide chlorhydrique (4 M). A cette solution a été additionné du chlorure d'europium (36 mg, 98,1 pmol). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite puis au résidu a été Me0 41c 43c i) THF, LiOH 1 M ii) H20 / Me0H EuCI3 6H20 OMe N CO2Me Me02C N\ Me02C OMe MeO additionné de l'acétonitrile (4 mL) et cette solution a été purifiée par HPLC préparative: colonne Macherey Nagel Hilic, (5 gm, 21 x 250 mm) avec une solution de tampon acétate d'ammonium 50 mM pH 5,3 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 97% MeCN (3 min)], gradient linéaire de 97 jusqu'à 80% MeCN (20 min) avec un débit de 14 mL min-1 et une détection UV à 330 nm le composé désiré 43c (4,8 mg, 13%). HMRS (ESI+) calculée pour C54H47N609Eu [M+2H]2+, m/z 537,1296 trouvée: 537,1299. Rt = 10,55 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composés (43a-b, d-g) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 43c en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (44a-g, i, k-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 44h en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (44h) A une solution de dérivé mésylé 40h (150 mg, 0,310 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (2 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (44 mg, 0,321 mmol) et du 1,4,7-triazacyclononane 4 (13,8 mg, 0,107 mmol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 9 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 20 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 0 jusqu'à 20% par incréments de 1%) pour conduire au composé 44h sous forme d'une huile incolore (43 mg, 31%). RMN 1H (700 MHz, CDCI3) 7,96 (d J = 5,5 Hz, 3H), 7,67 (s I, 3H), 7,45 (d, J = 8,7 Hz, 6H), 6,87 (d, J = 8,7 Hz, 6H), 4,63 (s, 6H), 4,25 (m, 6H), 4,09 (dq, J = 17,3; 7,2 Hz, 3H), Crir NH HN / 3 HCI Me F^-.0Et 4 0." Ms0 40h 3,87 (dq, J= 17,3; 7,2 Hz, 3H), 3,78 (s, 9H), 3,24 (m, 12H), 1,73 (d, J= 14,9 Hz, 9H), 1,23 (t, J= 7,2 Hz, 9H); RMN 130 (176 MHz, CDCI3) ô : 168,9; 158,9; 157,0; 154,6 (d, J = 157 Hz); 133,8; 133,4 (d, J= 11 Hz); 128,2 (d, J= 21 Hz); 127,7; 115,1; 115,0; 95,6; 85,3; 65,2; 61,3 (d, J= 6 Hz,); 60,7; 52,5; 52,2; 16,5 (d, J= 4 Hz), 13,5 (d, J= 104 Hz). RMN 31 P (284 MHz, CDCI3) ô : +39,2; m/z HMRS (ESI+) calculée pour C66H76N6015P3 [M+H+], m/z 1285,4582, trouvée: 1285,4598. Rf = 0,43 (silice; dichlorométhane - méthanol 87:13). Composés (46a-g, i, k-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 46h en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (46h) 46h A une solution du ligand 44h (10 mg, 7,8 pmol) dans un mélange de solvant CD3OD/D20 (1,5 mL, 2:1 v/v) a été additionné de l'hydroxyde de potassium (6,6 mg, 118 'mol). La solution a été chauffée à 60°C pendant 18 h sous atmosphère inerte L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1H et 31 P. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. Le mélange a été lyophilisé et le solide blanc obtenu a été dissous dans un mélange de solvant méthanol-eau (1 mL, 1:1 v/v). A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (3 mg, 9,4 pmol) et le pH de la solution a été ajusté à 5,8 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C sous atmosphère inerte pendant 18 h. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium 1 M puis lyophilisé. Le produit brut ainsi obtenu a été purifié par HPLC semi-préparative pour donner le composé désiré 46h sous la forme d'un solide blanc (4,5 mg, 45%). HMRS (ESI+) calculée pour C571153N6015P3Eu m/z 1307,1999, trouvée: 1307,2030. i) KOH 1 M ii) Me0H, H2O, Eu(OAc)3 Me, 0- Composé (44j) A une solution de dérivé mésylé 40i (78 mg, 93 'mol) dans de l'acétonitrile anhydre (1 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (14 mg, 96 'mol) et du 1,4,7- triazacyclononane 4 (4,1 mg, 33 'mol). Le milieu réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 5 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Les sels de potassium ont été éliminés par décantation puis filtration. Le filtrat a été évaporé sous pression réduite et le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 0 jusqu'à 20% par incréments de 1%) pour conduire au composé 44j sous forme d'une huile incolore (20 mg, 26%). RMN 1H (700 MHz, CDCI3) b : 8,00 (m, 3H), 7,74 (m, 3H), 7,55 (m, 3H), 7,50 (d, J = 8,6 Hz, 6H), 6,93 (d, J = 8,6 Hz, 6H), 5,48 (dd, J = 6,4; 4,8 Hz, 3H), 5,33 (dd, J= 5,8; 4,6 Hz, 3H), 5,18 (m, 3H), 5,02 (m, 3H), 4,49 (q AB, 6H), 4,25 (dd, J = 12,4; 3,4 Hz, 3H), 4,11 (dd, J = 12,4; 5,6 Hz, 3H), 3,95 (m, 6H), 3,87 (m, 6H), 3,55 (m, 6H), 2,93 (m, 6H), 2,69 (m, 6H), 2,12 (s, 9H), 2,09 (s, 9H), 2,06 (s, 9H), 2,05 (s, 9H), 2,02 (s, 9H), 1,74 (d, J = 15,0 Hz, 9H), 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 9H); RMN 13C (176 MHz, CDCI3) ô : 170,7; 170,5; 170,2; 170,0; 169,9; 168,0; 158,2; 157,0 (m I); 154,7 (d, J = 154 Hz), 134,1; 133,3; 128,3 (d, J = 21 Hz), 127,9 (m I); 115,3; 115,2; 96,3; 85,5; 70,2; 69,1(4); 69,1(1) 69,0; 67,3; 66,4; 61,6; 61,2; 52,0; 39,4; 20,9; 20,8(2); 20,8(1); 20,7; 16,6 (d, J = 6 Hz); 13,6 (d, J = 103 Hz); RMN 31 P (284 MHz, CDCI3) ô : +38,8; HMRS (ESI+) calculée pour C1111-1139N9042133Na [M+H+Na]2+, m/z 1192,9060 trouvée: 1192,904. Rf = 0,52 (silice; dichlorométhane - méthanol 85:15). '--....1(NH-GlutAc 0 0 NH HN / 3 HCI Me Et 4 ,0 N Et0 Me NH-GluAc K2CO3 , CH3CN AcGlut-HN«....e O O 0-11, -,tro Cy 0 0 EtO, Me-% 0 44j 0 N EtO Me Ms0 40i GlutAc= Composé (46j) /NH-GlutAc 0 _NH-GIutOH 0 i) KOH 1 M ii) Me0H, H20 Eu(OAc)3 0.1r- e) 0 A une solution du ligand 44j (17 mg, 7,2 pmol) dans un mélange de solvant CD3OD/D20 (1,5 mL, 2:1 v/v) a été additionné de l'hydroxyde de potassium (8 mg, 150 'mol). La solution a été chauffée à 60°C pendant 7 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1H et 31P. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. Le mélange a été lyophilisé et le solide blanc obtenu a été dissous dans un mélange de solvant méthanol-eau (2 mL, 1:1 v/v). A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (2,8 mg, 8,6 pmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C sous atmosphère inerte pendant 18 h puis a été refroidi à température ambiante. La suspension a été centrifugée et le solide blanc a été séparé du surnageant puis lavé avec de l'eau (3 x 5 mL). Le surnageant et les filtrats ont été réunis, neutralisés avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium (1 M) puis lyophilisés pour conduire à un solide blanc qui a été purifié par HPLC semi-préparative pour donner le composé désiré 46j sous la forme d'un solide blanc (6 mg, 45%). LRMS (MALDI-TOF) calculée pour C57H93N9O27P3Eu [M+H]+, m/z 1798,5; trouvée: 1799,8. Composé (47a) OMe GlutAc= 00 O 0) Glut0H= L)YrYO° T OH OH OH NH-GIuAc NH-GIutOH 01 O N EtO, Me-% 0 HOGIut-HN-1 0 AcGlut-HN 44j 46j ,0 Me N P' 0,,F;-0Et Etd \Me ,0 N '0 Me 7a 47a ...- ("NH Ms0 N CO2Me HN \ 38c \,_ ) 2 HCI N K2CO3, MeCN Boc Boc A une solution d'hydrochlorure de TAON monoBoc 7a (48 mg, 160 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (20 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (87 mg, 640 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore 38c (150 mg, 300 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange a été chauffé à 65°C pendant 12 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 98 :2 jusqu'à 80 :20 par incréments de 2%) pour conduire au composé 47a (95 mg, 75%). LMRS (ESI+) calculée pour C45H50N508 [M+H]+, m/z 788,3659, trouvée: 788,78. Rf = 0,53 (silice; dichlorométhane - méthanol : 90:10). Rt = 12,89 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (47b) A une solution d'hydrochlorure de TAON monoBoc 7a (14,6 mg, 48,3 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (10 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (20 mg, 144 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore 38f (41 mg, 84 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C pendant 2 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec une solution aqueuse de tampon acétate de triéthylammonium 25 mM pH 6 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (18 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 47b sous forme d'un solide blanchâtre (17,7 mg, 36%). LMRS (ESI+) calculée pour C49H58N5014S2 [M+H]+, m/z 1004,3422, trouvée: 1004,62. Rt = 8,12 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant : gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (19 min), avec un débit de 1 mL min-1. Ms0 Me02C CO2Me 47b HN 2 HCI Boc 7a Composé (47c) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 47b en utilisant le précurseur correspondant. Composé (48a) A une solution de 47a (95 mg, 120 'mol) dans du dichlorométhane anhydre (4 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (0,5 mL). La solution a été agitée sous argon à 5°C pendant 8 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Cette solution a été lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 5 mL). La 10 phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 15 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour 15 conduire au composé 48a sous forme d'un solide blanchâtre (44 mg, 53%). LMRS (ESI+) calculée pour C40H42N506 [M+H]+, m/z 688,3135 trouvée: 688,56. Rt = 11,01 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (pH 1 MeCN (v/v) comme éluant : gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (19 min), avec un débit de 1 mL min-1. 20 Composé (48b) Me0 OMe Me0 OMe 48a Me02C CO2Me Boc 47a N SO3H DCM, TFA Me02C CO2Me 48b HO3S Me02C CO2Me Boc 47b A une solution de 47b (16,7 mg, 16,6 'mol) dans du dichlorométhane anhydre (5 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (200 gL). La solution a été agitée sous argon à 5°C pendant 2 h puis à 25 température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LCMS. Après cette période la réaction était totale. Cette solution a été lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 5 mL). La phase aqueuse a été concentrée sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 6 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 60% MeCN (17 min)] avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 48b. LMRS (ESI+) calculée pour C44H50N5012S2 [M+H]+, m/z 904,2897 trouvée: 904,61. Rt = 6,85 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (48c) : Ce composé a été préparé selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 48b en utilisant le précurseur correspondant. Composé (49a) A une solution du composé 48a (22 mg, 32 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (7 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (17 mg, 120 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore 38a (51,8 mg, 100 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C pendant2 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 50 x 150 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 80% MeCN (43 min) avec un débit de 100 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 49a sous forme d'un solide blanchâtre (7,5 mg, 21%). LMRS (ESI+) calculée pour C64H68N7011 [M+H]+, m/z 1110,4977, trouvée: 1111,22. Rt = 23,74 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 38a MsO K2CO3, MeCN MeO OMe 48a Me02C Me02C CO2Me 49a NHBoc 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant : gradient linéaire de 5 à 80% MeCN (25 min), avec un débit de 1 mL Composés (49b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 49a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (50a) 49a Me0 OMe 1) THF, LiOH 1 M 2) DCM, TFA HO2C CO2H HO2C 50a Me0 OMe NHBocHN 2 A une solution de ligand triester méthylique 49a (1 mg, 0,901 'mol) dans du THF (150 gL), ont été ajoutés de l'hydroxyde de lithium à 1 M (50 'mol) et de l'eau pure (100 gL). A cette suspension blanchâtre, a été ajouté du THF (1 mL) pour parfaire la solubilisation. Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le milieu réactionnel a été alors repris dans de l'eau pure (500 g) et a été acidifié par l'addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (1 M) pour obtenir le pH du mélange compris entre 2-3. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative conduisant au produit souhaité sous la forme d'une huile. A cette huile diluée dans du dichlorométhane (0,5 mL) ont été ajoutés de l'acide trifluoroacétique (150 g) puis un volume supplémentaire de dichlorométhane (2,5 mL). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 10 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 50a sous la forme d'une huile qui a été utilisée dans l'étape suivante sans purification complémentaire. Composés (50b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 50a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (51a) MeO OMe 50a 51a NH2 HN 2 A une solution de ligand 50a (967 4, 1 'mol) dans du méthanol (1 mL) et de l'eau (0,5 mL), ont été ajoutés du carbonate de sodium (0,53 mg, 5 'mol) et du chlorure d'europium hexahydraté (732 p.g, 2 'mol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 50°C pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC analytique. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative conduisant au complexe 51a sous la forme d'une huile incolore (560 nmol, 56%). Composés (51b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 51a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (52a) 7a 52a A une solution d'hydrochlorure de TACN monoBoc 7a (43 mg, 140 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (5 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (117 mg, 850 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore mésylé 40f (120 mg, 280 'mol). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC analytique. Après agitation et chauffage à 65°C pendant 2 h, le milieu réactionnel a été refrddi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (50 mL) et la solution résultante a été lavé avec de l'eau (2 x 50 mL), séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur K2CO3 MeCN Boc 2 HCI HN Boc OMe Ms0 Me0 OMe 40f colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 100 :0 jusqu'à 94 :6 par incréments de 1%) pour conduire au composé 52a sous forme d'une huile (86 mg, 70%). HMRS (ESI+) calculée pour C47H60N508P2 [M+H]+, m/z 884,3912, trouvée: 884,3919. Rf = 0,56 (silice; dichlorométhane méthanol : 90:10). Rt = 10,65 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composés (52b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 52a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (53a) Me0 OMe DCM, TFA Me0 Boc H OMe 52a 53a A une solution de 52a (70 mg, 0,079 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (5 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (0,5 mL). La solution a été agitée sous argon à 5 °C pendant 2 h 30. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été redissous dans du dichlorométhane (1 mL), qui a été à nouveau éliminé sous pression réduite. Cette procédure a été répétée 5 fois pour éliminer l'acide trifluoroacétique en excès. Le résidu a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse de tampon d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (3,5 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (26,5 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 53a (26 mg, 42%). HMRS (ESI+) calculée pour C42 H52N506P2 [M+H]+, m/z 784,3387, trouvée: 784,3388. Rt = 9,88 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composés (53b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 53a en utilisant les précurseurs correspondants.30 Composé (54a) Me0 OMe K2CO3, MeCN EtO Me o, Me I OEt EtO Me-Pt 0 H 53a 54a NHBoc A une solution de composé dialkylé 53a (32 mg, 40 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (5 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (21 mg, 150 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore NH-Boc mésylé 40b (29 mg, 51 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (5 mL). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C pendant 2 h 30. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (40 mL) et a été lavé avec de l'eau (2 x 40 mL), séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par HPLC sur colonne préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse de tampon d'acétate de triéthylammonium 25 mM pH 7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (3,5 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (28,5 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 54a (36 mg, 43%). HMRS (ESI+) calculée pour C67H84N7011P3 [M+2H]2+, m/z 627,7715, trouvée: 627,7718. Rt = 11,08 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (54e) K2003, MeCN H 53a A une solution de TAON dibras 53a (80 mg, 0,102 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (4 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (42 mg, 0,306 mmol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore 40h (54 mg, 0,112 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 15 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. La suspension a été refroidie à température ambiante et les sels ont été séparés par décantation. Le solvant du surnageant a été éliminé sous pression réduite et le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 20 % par incréments de 1 %) pour obtenir une huile incolore correspondant au composé 54e (71 mg, 58 %). RMN 1H (700 MHz, CDCI3) 7,88 (d, J = 5,7 Hz, 3H), 7,52 (s I, 3H), 7,41 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,84 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,83 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 4,60 (s, 2H), 4,13 (m I, 6H), 4,05 (m, 3H), 3,86 (m, 3H), 3,77 (s, 6H), 3,75 (s, 3H), 3,29 (m I, 6H), 3,10 (m I, 6H), 1,71 (d, J = 14,9 Hz, 9H), 1,21 (t, J = 7,0 Hz, 9H); RMN 130 (176 MHz, CDCI3) b : 169,0; 160,8; 158,8; 156,9 (m I); 154,2 (d, J = 159 Hz); 133,8; 133,7; 133,4 (m I); 127,9 (d, J = 22 Hz); 127,4; 114,9; 114,3; 113,4; 97,1; 96,6; 85,1; 84,9; 65,1; 61,5 (d, J = 6 Hz); 60,1 (s I); 55,4; 52,4; 51,3; 16,4 (d, J = 6 Hz), 13,5 (d, J = 104 Hz); RMN 31P (284 MHz, CDCI3) b : +39,1. HRMS (ESI+) calculée pour C621172N6011 P3 [m+H]+, m/z 1169,4470 trouvée: 1169,4430. Rf = 0,28 (silice; dichlorométhane - méthanol 90:10). Composés (54f,k-I,p-r) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 54e en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (54b-d,g-j,m-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 54a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (55a) Au ligand 54a (35,6 mg, 28,4 'mol) ont été additionnés du tétrahydrofurane (4 mL) et une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium (3 mL, 1 M). La solution a été agitée à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période, la réaction i) THF, LiOH 1 M ii) DCM, TFA 55a était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite et utilisé dans la suite de la synthèse sans purification complémentaire. LRMS (ESI+) calculée pour C61 H71 N7011 P3 [m+Fi]+, m/z 1170,4424, trouvée: 1170,99. Rt = 9,17 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 1-1m, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. A une solution du composé obtenu précédemment dans du dichlorométhane (20 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (1,5 mL). La solution a été agitée à 5°C pendant 6 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été redissous dans du dichlorométhane (6 mL). Le solvant a été à nouveau éliminé sous pression réduite. Cette procédure a été répétée 5 fois pour éliminer l'acide trifluoroacétique en excès. Le produit brut a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification complémentaire. LRMS (ESI+) calculée pour C56H63N709P3 [M+H]+, m/z 1070,3900, trouvée: 1070,79. Rt = 6,82 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composés (55b-d,g-j,m-p) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 55a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (56a) HN 2FIN 2 A une solution de TACN tribras asymétrique 55a (28,4 'mol) dans du méthanol (15 mL) et de l'eau (2 mL), a été ajouté du chlorure d'europium hexahydraté (11,1 mg, 31 'mol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 50°C pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC sur colonne préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse de tampon d'acétate de triéthyle ammonium 25 mM pH 7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (3,5 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% OMe Me0 Me0 OMe P\ HO Me Eu(OAc)3 Me0H, H2O N _ ----- me 0, `p i,'.OH Me Me-% 0 56a HO N Me-"F\' 0 55a MeCN (23 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 56a (34 mg, 98%). HMRS (ESI+) calculée pour C56H61EuN709P3 [M+2H]2+, m/z 609,6466, trouvée: 609,6466. Rt = 8,08 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (56e) A une solution du ligand 54e (30 mg, 26 pmol) dans un mélange de solvant CD3OD/D20 (2,5 mL, 2:1 v/v) a été additionné de l'hydroxyde de potassium (5 mg, 100 'mol). La solution a été chauffée à 60°C pendant 24 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1H et 31 P. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (2,8 mg, 8,6 pmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C sous atmosphère irmrte pendant 18 h puis a été refroidi à température ambiante. La suspension a été centrifugée et le solide blanc a été séparé du surnageant, lavé avec du méthanol (3 x 2 mL). Le surgageant et les filtrats ont été réunis et concentrés sous pression réduite pour conduire à un solide blanchâtre qui a été purifié par HPLC semi-préparative pour donner le composé désiré 56e sous la forme d'un solide blanc (13 mg, 45%). HRMS (ESI+) calculée pour C55H55N6011P3Eu [M+2H]2+, m/z 611,1220; trouvée: 611,1247. Composés (56f,k-I,p-r) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 56e en utilisant les précurseurs correspondants. Me0 Me0 o .. - ..! ,N . -...... 0 .. EtO- -Me i) KOH, CD30D, D20 me .... - P. ------- 'me ii) Eu(OAc)3 54e CO2H Composés (57a-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 60a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (60a) OMe Me0 OMe 40f K2CO3, MeCN ,0 F,'""Me OEt NHBoc Ms0 A une solution du macrocycle 3 (21 mg, 0,071 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (4 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (30 mg, 0,21 mmol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore mésylé 40f (70 mg, 0,14 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 48 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était complète. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 98 :2 jusqu'à 80 :20 par incréments de 2%) pour conduire au composé 60a sous forme d'une huile (18 mg, 20%). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) Ô: 7,96 (m, 3H), 7,46 (m, 9H), 6,88 (m, 6H), 5,04 (s I, 1H), 4,11-3,84 (m, 12H), 3,80 (m, 9H), 3,09-2,74 (m, 13H), 1,77-1,70 (m, 9H), 1,39 (s, 9H), 1,421,23 (m, 7H), 1,25 (m, 9H); RMN 31P (162 MHz, CDCI3) Ô: +39,2. HRMS (ESI+) calculée pour C691-187N7011 P3 [M+Fi]+, m/z 1282,5676, trouvée: 1282,5701. Rf = 0,54 (silice; dichlorométhane - méthanol 80:20). Composés (58a-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 61a en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (59a-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 62a en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (60b-I) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 60a en utilisant les précurseurs correspondants.25 Composé (61a) A une solution du composé 60a (12 mg, 9,4 'mol) dans du dichlorométhane (0,8 mL) dégazée pendant 10 min sous atmosphère inerte, a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (0,2 mL). La solution a été agitée à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé souhaité 61a sous forme d'une huile jaune (12 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) b : 7,93 (m, 3H), 7,46 (m, 9H), 6,88 (m, 6H), 4,15-3,84 (m, 12H), 3,76 (m, 9H), 3,00-2,71 (m, 13H), 1,80-1,75 (m, 9H), 1,42-1,23 (m, 7H), 1,25 (m, 9H); RMN 31 P (162 MHz, CDCI3) b : +39,7. HRMS (ESI+) calculée pour C64H79N709P3 [M+H]+, m/z 1182,5152, trouvée: 1182,5178. Composés (61b-I) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 61a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (62a) A une solution du ligand 61a (25 mg, 21 pmol) dans du CD3OD (3 mL) a été additionné une solution aqueuse deutérée d'hydroxyde de sodium (1 mL, 0,1 M). La solution a été chauffée à 60°C pendant 5 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1H et 31 P. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (7,6 mg, 23 pmol). Le mélange réactionnel a NH, N N P ,0 EtO'e N OMe 61a DCM, TFA Me0 Me0 Et0 OMe OMe été chauffé à 65°C sous atmosphère inerte pendant 12 h puis a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane - méthanol - ammoniaque : 89,9: 10 :0,1) pour conduire au composé 62a sous forme d'un solide blanc (8 mg, 30%). HRMS (ESI+) calculée pour C58H64EuN709P3 [M+H]+, m/z 1248,3191 trouvée: 1248,3. Rt = 9,69 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacetique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant, gradient linéaire de 10 à 100% MeCN (20 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composés (62b-I) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 62a en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (63a-c) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 67a en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (64a-c) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 68c en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (66a-c) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 70c en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (67a) OMe MeO NHBoc NHBoc MsO 0 N Pi =me \ OEt 0 40f P ,'' ,,, -I OEt NH HN Jj H 3 K2CO3, MeCN N EtO d 67a OMe A une solution du macrocycle 3 (21 mg, 0,071 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (4 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (30 mg, 0,21 mmol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore mésylé 40f (90 mg, 0,21 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 24 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période les analyses montraient la formation du composé dialkylé accompagné du composé trialkylé. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Les sels ont été séparés par décantation et le surnageant a été concentré sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 98 :2 jusqu'à 80 :20 par incréments de 1%) pour conduire au composé 67a sous forme d'une huile (14 mg, 20%). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b : 7,87 (m, 2H), 7,40 (m, 6H), 6,82 (m, 4H), 5,04 (s 1, 1H), 4,09-3,98 (m, 8H), 3,75 (m, 6H), 3,08-2,60 (m, 13H), 1,82-1,69 (m, 6H), 1,35 (s, 9H), 1,51-1,20 (m, 7H), 1,22 (m, 6H); RMN 31P (162 MHz, CDC13) Ô : +39,4. HRMS (ESI+) calculée pour 051E1691\1608 P2 [M+H]+, m/z 955,4652 trouvée: 955,4622. Rf = 0,51 (silice; dichlorométhane - méthanol 80:20). Composés (67b-f) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 67a en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (68c) Me0 "----0O2Me NHBoc 01 CO2Me 0, N P 0 -\ N FC-me Me' OEt 0Et 40h Et0 me K2CO3, MeCN Et0 N Me-j, d 68c OMe OMe A une solution de TAON dibras 67a (14 mg, 15 'mol) dans l'acétonitrile anhydre (0,7 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (2 mg, 17 'mol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée le chromophore 40h (8 mg, 17 'mol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 24 h sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. La suspension a été refroidie à température ambiante et les sels ont été séparés par décantation. Le solvant du surnageant a été éliminé sous pression pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 68c (19 mg, 95 %). RMN 1H (700 MHz, CDC13) 7,92 (m, 3H); 7,43 (m, 9H); 6,83 (m, 6H); 5,04 (s I, 1H); 4,59 (s, 2H); 4,06-3,77 (m, 12H); 3,75 (m, 9H); 3,00-2,55 (m, 13H); 1,74-1,66 (m, 9H); 1,33 (s, 9H); 1,35-1,16 (m, 6H); 1,19 (m, 9H). RMN 31P (284 MHz, CDC13) b : +41,1. HRMS (ESI+) calculée pour C711-189N7013P3 [M+H]+, m/z 1340,5730 trouvée: 1340,5730. Composés (68a-b,d-I) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 68c en utilisant les précurseurs correspondants. Composés (70c) MeO NHBoc CO2Me 0, i) CD30D, D20, NaOH ;P\ ----- ii) Eu(OAc)3 Me 0--- 11. O Me-4, O OMe 70c OMe --- N P^'0 0 \ Me CO2 A une solution du ligand 68c (7 mg, 5,2 pmol) dans du CD3OD (1,5 mL) a été additionné une solution aqueuse deutérée d'hydroxyde de sodium (0,5 mL, 0,1 M). La solution a été chauffée à 60°C pendant 16 h sous atmosphère inerte. L'avancerrent de la réaction a été suivi par RMN 1H et 31P. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (1,8 mg, 5,7 pmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 65°C sous atmosphère inerte pendant 12 h puis a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par HPLC. LRMS (ESI+) calculée pour C64H71EUN7013P3 [M+H]+, m/z 1390,4 trouvée: 1390,4. Rt = 8,6 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 10 x 100 mm) avec une solution de tampon bicarbonate d'ammonium 0,1 M (pH 9 - Me0H (v/v) comme éluant, [isocratique 10% Me0H (2 min)], gradient linéaire de 10 à 100% Me0H (15 min), avec un débit de 4,4 mL min-1 et une détection UV à 330 nm. Composés (70a-b,d-I) : Ces composés ont été préparés selon la même procédure que celle utilisée pour le composé 70c en utilisant les précurseurs correspondants. Composé (79) MeO OMe OMe 0 i) FmocHN 0 SO3H DMF, DIPEA ii) pipéridine 5%, DMF 0 0 -o' \ O N F12 --- ..r\q , .;^N - O 79 SO3H A une solution de complexe d'europium NH2 56a (500 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (200 g) a été ajoutée de la diisopropyléthylamine (0,2 gL, 1 'mol). A ce mélange a été additionnée une solution de Fmoc-sulfo-P-alanine (500 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (61 gL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. A ce mélange a été ajoutée une solution de pipéridine à 5% dans du diméthylformamide (200 g) et le mélange a été agité à température ambiante pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le brut réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit désiré 79 (442 nmol, 88%). HRMS (ESI+) calculée pour C59H66EuN8013P3S [M+2H]2+, m/z 685,1435 trouvée: 685,1439. Rt = 11,5 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacetique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (20 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composé (80) 0 0)-)L° NH 0 HN OMe oeP, 0- , N e N N NH2 BG-MB-NHS OMe ---N ''0 \ 0 --;)1 79 NH2 SO3H DMF, DIPEA 80 0 NH SO3H A une solution de complexe d'europium NH2 79 (25 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (38 g) ont été ajoutée de la diisopropyléthylamine (0,3 gL, 1,72 'mol) et une solution de BG-MBNHS dans du diméthylformamide (16 gL, 25 nmol). La réaction est agitée à température ambiante pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 10 x 250 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit de 5 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit désiré 80 (16 nmoles, 64%). LRMS (ESI+) calculée pour C85H91EuN15017P3S [M+2H]2+, m/z 935,7432 trouvée: 936,12. Rt = 8,42 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (81) A une solution de complexe d'europium NH2 56a (5 'mol) dans du diméthylformamide anhydre (500 g) a été ajoutée de la diisopropyléthylamine (1,7 gL). A ce mélange a été additionnée une solution de N-Fmoc di sulfo di R alanine NHS (5 'mol) dans du diméthylformamide anhydre (283 gL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. A ce mélange a été ajoutée une solution de pipéridine à 5% (10 'mol) dans du diméthylformamide (20 g) et le mélange a été agité à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le brut réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique 0,1% pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (18 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit désiré 81 (3,6 gmol, 72%). HRMS (ESI+) calculée pour C62H71EuN9017P3S2 [M+2H]2+, m/z 760,6405 trouvée: 760,6402. Rt = 8,15 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. 56a 81 Me0 OMe 0 FmocHN 0 SO3HH SO3H DMF, DIPEA N ii) pipéridine 5%, DMF --P 0 Composé (82) NH Me0 0 HN OMe -P, ° I ^N I OMe N H leLNH2 DMF, DIPEA O 81 A une solution de complexe d'europium NH2 81 (200 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (50 g) ont été ajoutée de la diisopropyléthylamine (1,5 g) et une solution de BG-MB-NHS (200 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (100 gL). La réaction est agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (18 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé 82 (15 nmol, 7%). LRMS (ESI-) calculée pour C88H92EuN16021P3S2 [M-2H]2-, m/z 1009,2245 trouvée: 1009,29. Rt = 11,65 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (18 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV de 320 nm. Composé (83) Me0 N ---N -P -- 79 OMe 0 0,_.0 i) DMF, DIPEA ii) DCC, NHS NH2 SO3H 83 1 A une solution de complexe d'europium NH2 79 (1 'mol) dans du DMF anhydre (200 g) a été ajoutée de la diisopropyléthylamine (0,3 gL). A ce mélange a été additionnée de l'anhydride glutarique (3 'mol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC préparative pour conduire à l'acide correspondant (668 nmol, 67%). LRMS (ESI+) calculée pour C64H72EuN8016P3S [M+2H]2+, m/z 743,1606 trouvée: 742,67. Rt = 7,02 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min) gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. A une solution de complexe fonctionnalisé acide (200 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (15 g) ont été additionnés de la dicyclohexylcarbodiimide (2,2 mg, 11,4 'mol) et du N-hydroxysuccinimide (1,5 mg, 13 'mol). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 28 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié directement par HPLC semi-préparative pour conduire au composé NHS 83 (69 nmol, 35%). LRMS (ESI+) calculée pour C68H75EuN9018P3S [M+2H]2+, m/z 791,6688 trouvée: 791,83. Rt = 7,35 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'un tampon de formiate d'ammonium 10 mM pH 4,7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (1 min) gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (84) so3H A une solution de complexe d'europium NHS 83 (69 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (200 g) ont été ajoutés de la diisopropyléthylamine (0,9 g) et une solution d'AMPc-NH2 (90 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (9 gL). Le milieu réactionnel a été agité pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 10 x 250 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit N NH2 LO NH2 DMF, DIPEA 84 -------- I ° HOC O - 0'P 0 O )-(3 HN N 0 83 ,cAMP N H 2 de 5 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit désiré 84 (10 nmoles, 14%). LRMS (ESI+) calculée pour C811-195EuN15024P4S [M+2H]2+, m/z 985,2279 trouvée: 986,30. Rt = 6,58 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (1 min) gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (85) SO3H A une solution de complexe d'europium NH2 81 (2 'mol) dans du DMF anhydre (500 g) a été ajoutée de la diisopropyléthylamine (2,6 gL, 15 'mol). A ce mélange a été additionnée de l'anhydride glutarique (6 'mol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution d'un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 25 mM pH 5 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min)], gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (25 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire à l'acide correspondant (1,8 gmol, 98%). LRMS (ESI+) calculée pour C67H77EuN9020133S2 [M+2H]2+, m/z 818,6576 trouvée: 818,16. Rt = 6,73 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'un tampon de formiate d'ammonium 10 mM pH 4,7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (1 min)], gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. A une solution de complexe acide (480 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (120 g) ont été additionnés de la dicyclohexylcarbodiimide (1,9 mg, 9,89 'mol) et du N-hydroxysuccinimide (1,7 mg, 14,8 'mol). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 28 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié directement par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution d'un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 25 mM pH 5 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (25 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à Me0 0 0 0 Me0 ---- -R>-0 0 N0) 81 i) DMF, DIPEA ii) DCC, NHS 3 320 nm pour conduire au composé souhaité 85 (40 nmol, 8%). LRMS (ESI+) calculée pour C711-180EuN10022P3S2 [M+2H]2+, m/z 867,1658 trouvée: 866,60. Rt = 6,93 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'un tampon de formiate d'ammonium 10 mM pH 4,7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (1 min) gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. Composé (86) Me0 N --- N --; 0)1 H SO3H A une solution de complexe d'europium NHS 85 (40 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (200 g) ont été ajoutés de la diisopropyléthylamine (0,1 gL, 575 nmol) et une solution d'AMPc- NH2 (50 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (4,8 gL). Le milieu réactionnel a été agité pendant 16 h à température ambiante et sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative : colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 5 x 150 mm) avec une solution d'un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 25 mM pH 5 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 5% MeCN (2 min), gradient linéaire de 5 jusqu'à 100% MeCN (23 min) avec un débit de 5 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au composé souhaité 86 (10 nmol, 25%). LRMS (ESI+) calculée pour C841-1101EuN16028P4S2 [M+2H]2+, m/z 1061,2288 trouvée: 1062,07. Rt = 6,33 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'un tampon de formiate d'ammonium 10 mM pH 4,7 - MeCN (v/v) comme éluant [isocratique 15% MeCN (1 min) gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (14 min), avec un débit de 1 mL min-1. 4 Composé (87) A une solution du complexe 46h (1 mg, 760 nmol) dans du diméthylsufoxyde anhydre (50 pL) ont été additionnés de l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthylamino)- phosphonium (0,13 mg, 250 nmol) et de la diisopropyléthylamine (0,13 pL, 760 nmol). Le mélange a été agité pendant à température ambiante pendant 5 min. A cette solution a été ajoutée une solution de dérivé maléimide (0,16 mg, 760 nmol) dans du diméthylsulfoxyde anhydre (50 pL) puis la solution a été agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 72 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LCMS. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative au produit souhaité 87 (0,41 mg, 41%). HRMS (ESI+) calculée pour C66H67EuN9O17P3 [M+2H]2+, m/z 751,6540 trouvée: 751,6664. Composé (88) HO A une solution de maléimide 87 (0,20 mg, 133 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (50 pL) a été additionné une solution de peptide H2N-CGPKKKRKV-CO2H (0,26 mg, 200 pmol) dans du tampon phosphate 50 mM, pH 7 (20pL). Le mélange a été agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 15 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette H2N H -"\''N 0 N 0 00 0 Me , -,' r---N-7S'-0 Me 0' _N --- N -ZNI02C 0 PyBOP, DIPEA DMSO ,0 N -O Me HN 0 NH 0 46h Md PRO S NH3 O H ON DMF, H2N-CGPKKKRKVCO2H Tampon phosphate NH p 0,, / --0, 88 5 période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative pour conduire au conjugué 88 (0,21 mg, 62%). HRMS (ESI+) calculée pour Cul H154EuN25027P3S [M]3+, m/z 848,9871 trouvée: 848,9963. Rt = 9,9 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 10 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - Me0H (v/v) comme éluant gradient linéaire de 5 à 100% MeCN (15 min), avec un débit de 4,4 mL min-1 et une détection UV à 330 nm. Composé (89) 0 0 0 0 H2N,CH2 H2Nf H2 H2N,riHNH2 H2N.,rHNH2 H N DMSO, PyBOP DIPEA, H2N-GRRRRRRR-CO2H y H FI f H H NNH H4 NH2 H211 NH2 2C1 2 56e MeO 0 0 89 -P 0 MeO Il OMe A une solution du complexe 56e (1 mg, 0,82 'mol) dans du diméthylsufoxyde anhydre (150 pL) ont été additionnés de l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthylamino)- phosphonium (0,65 mg, 1,25 'mol) et de la diisopropyléthylamine (0,3 pL, 1,65 'mol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 min. A cette solution a été ajoutée une solution de H2N-GRRRRRRR-CO2H (1 mg, 0,86 pmol) dans du diméthylsulfoxyde anhydre (50 pL) puis la solution a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 24 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative pour conduire au conjugué 89 (1,2 mg, 62%). HRMS (ESI+) calculée pour C99H144EuN35O19P3 [M+3H]3+, m/z 790,9940 trouvée: 790,9938. 6 Composé (90) OMe A une solution du complexe 56e (1 mg, 0,82 'mol) dans du diméthylsufoxyde anhydre (150 pL) ont été additionnés de l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthylamino)- phosphonium (0,65 mg, 1,25 'mol) et de la diisopropyléthylamine (0,3 pL, 1,65 'mol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 5 min. A cette solution a été ajoutée une solution de d'éthylène diamine-biotine (0,35 mg, 1,23 pmol) dans du diméthylformamide anhydre (50 pL) puis la solution a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 3 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative pour conduire au conjugué biotinylé 90 (1,0 mg, 82%). HRMS (ESI+) calculée pour C67H76EuN10012P3 [M+2H]2+, m/z 745,1899 trouvée: 745,1907. DIPEA, DMF, PyBOP Me0 56e 91 d Me-4, d NH2 Me0 0 HN--/e-C) o 0 OMf HN 0 ° OMe 0 HO- P 0 6, 0 H04;-0 NON NH N/ N 2 0 0, P Me' 1='&3 \Me Composé (91) Me0 NH2 0 P '-'1 .... ..---Eu.'"--. .. ,' \ . ' Me 0----- \,,;\ } -- -0 me ^*,'N I ; OMe DIPEA, DMF nm. A une solution de complexe d'europium NH2 62a (250 nmol) dans du diméthylformamide (50 pL) ont été ajoutés de la diisopropyléthylamine (5 pL, 28 'mol) et une solution AMPc-NHS (250 nmol) dans du diméthylformamide (50 pL). Le mélange a été agité à température ambiante et sous atmosphère inerte pendant 1h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette 7 période la réaction était totale. A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (8 mL) et ce mélange a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,2% pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant, gradient linéaire de 5 jusqu'à 60% MeCN (19 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire au produit désiré 91 (82 nmol, 33%). LRMS (ESI+) calculée pour C801-196EuN14020P4 [M+3H]2+, m/z 924,7544 trouvée: 924,63. Rt = 9,10 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 1-1m, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,2% (pH 1 - MeCN (v/v) comme éluant gradient linéaire de 10 à 100% MeCN (20 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composé (92) NI-12 OMe 62a OMe 0s, N Me ,p' -- --- - N 0 Me -P d ;P\- - - \ Me Me \/:\ i) DMF, DIPEA ii) TSTU Me0 OMe O NH I 0 0 0 92 OMe A une solution de complexe d'europium NH2 62a (650 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (400 g) a été ajoutée de la diisopropyléthylamine (4 gL, 22 'mol). A ce mélange a été additionnée une solution d'anhydride glutarique (780 nmol) dans du diméthylformamide (80 gL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (8 mL) et ce mélange a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique 0,1% pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant, gradient linéaire de 10 jusqu'à 60% MeCN (19 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire à l'acide désiré (400 nmol, 61%). LRMS (ESI+) calculée pour c63H70EuN7012P3 [m+H]+, m/z 1362,3508 trouvée: 1362,91. Rt = 9,14 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 1-1m, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (15 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. A une solution de complexe acide (400 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (400 g) ont été additionnés de la diisopropyléthylamine (4 gL, 22 'mol) puis du tétrafluoroborate de 0-(N-succinimidyI)-1,1,3,3-tétraméthyluronium (0,14 mg, 480 nmol). Le mélange réactionnel a 8 été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (8 mL) et ce mélange a été purifié par HPLC préparative en utilisant le gradient suivant : (colonne Waters XBridge RP-C18, 5 lm, 19 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique 0,1% pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant, gradient linéaire de 10 jusqu'à 60% MeCN (19 min) avec un débit de 20 mL min-1 et une détection UV à 320 nm pour conduire à l'ester de NHS désiré 92 (263 nmol, 65%). LRMS (ESI+) calculée pour C67H74EuN8014P3 [M+1-1]+, m/z 1460,3750 trouvée: 1460,17. Rt = 9,52 min (colonne Waters XBridge RP-C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm) avec une solution aqueuse d'acide formique à 0,1% (pH 2 - MeCN (v/v) comme éluant gradient linéaire de 15 à 100% MeCN (15 min), avec un débit de 1 mL min-1 et une détection UV à 320 nm. Composé (93) MeO i) DMF, PyBOP, DIPEA ii) DCM, TFA A une solution du complexe 70c (0,35 mg, 0,25 'mol) dans du diméthylformamide (50 pL) ont été additionnés de l'hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthylamino)-phosphonium (0,2 mg, 0,37 'mol) et de la diisopropyléthylamine (0,11 pL, 0,65 'mol). Le mélange a été agité pendant à température ambiante pendant 5 min. A cette solution a été ajoutée une solution d'homotaurine (0,05 mg, 0,37 pmol) dans de l'eau (10 pL) puis la solution a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (95 pL) sous atmosphère inerte à 4°C et à cette solution a été ajouté de l'acide trifluoroacétique. Le mélange a été agité pendant 20 min puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC semi-préparative pour conduire au composé 93 (0,3 mg, 85%). HRMS (ESI-) calculée pour C62H69EuN8013P3S [m]-, m/z 1409,3120 trouvée: 1409,3110. REVENDICATIONS1. Agent complexant de formule (I) : Chrom3 Chrom2 (I) dans laquelle : A représente -CH2- ou -CH(L2-G)- chrom1, chrom2 sont identiques et sont choisis parmi les groupes de formule : chrom 3 est soit identique à chrom1 et chrom2, soit un groupe de formule : Ri s s Ri NI" j-"R2 O-L2-G Ri N s Ri N.- s - Ri s R2, R2', qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi : H ; -Alk; -phényle ; -CH2-CO-N-Alk ; -CH2-00-0-Alk ; -CH2-CO-NH2 ; -CH2-CO-OH; L1, L2 sont des groupes de liaison divalents identiques ou différents ; E, E', qui peuvent être identiques ou différents, sont des groupes augmentant l'hydrosolubilité de l'agent complexant, choisis parmi : -SO3H, -PO(OH)2, -COOH, -N+Alk1Alk2A1k3, un résidu carbohydrate ; R1, R1', qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi : -COOH, -PO(OH)R6, R6 étant choisi parmi les groupes: phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; G est un groupe réactif;0 - Alk, Alki, Alk2, Alk3, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un (C1- C6)alkyle ; sous réserve que : lorsque R1 ou R1' représentent un groupe -COOH, E ou E' ne représentent pas un groupe -COOH ; l'agent complexant comporte au moins un groupe E ou -SO3H ; lorsque chrom1, chrom2 et chrom3 comportent chacun un groupe R2 ou R2', alors A est un groupe -CH(L2-G)- dans lequel L2 comprend au moins un groupe -SO3H. 2. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que A est le groupe -CH2- et en ce que chrom1, chrom2, chrom3 sont identiques et représentent un groupe de formule : Ri NI- s 3. Agent complexant selon la revendication 1, caractérisé en ce que A est le groupe -CH2- et en ce que chrom3 est différent de chrom1 et chrom2. 4. Agent complexant selon la revendication 1 caractérisé en ce A est le groupe -CH(L2-G)- et en ce que chrom1, chrom2, chrom3 sont identiques. 5. Agent complexant selon la revendication 1 caractérisé en ce A est le groupe -CH(L2-G)- et en ce que chrom3 est différent de chrom1 et chrom2. 6. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R1 et R1' représentent un groupe -P0(OH)CH3. 7. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que E et E' lorsqu'ils sont présents, représentent un groupe -SO3H. 8. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que R1 et R1' représentent un groupe -PO(OH)R6 et en ce que E et E' représentent un groupe -SO3H.1 9. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un groupe -L2-G. 10. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que L1 et L1' sont choisis parmi : - une liaison covalente; un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; - un groupe cycloalkylène en C5-08 ; un groupe arylène en C6-014; lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. - un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes : -(CH2) , ;-(CH 2)n-0-(CH 2)m-0-(CH 2)p- 0 O -(CH2)n-0-(CH2)-0-(CH2)p-NH-L(CH2)q 0 0 0 -(CH2)n-NH-4CH26-LL ; (CH2)n-NHiL(CH2)n,- 0 0 -(CH2),-NH-L(CH2)m S -(CH2)n-NH 0 N-(CH2)p (CH2)m- -(CH2),-NHJL(CH2)m-N' S (CH2)p- O O >12 0 > (CH2)m-N > 0 -(CH2),-NH S (CH2)p- ;-(CH 2)n-NI-1- ; SO3 0 0 -(CH2), I NH-L(CH2)m -(CH2) n-N H -(CH2) m- ;-(CH2)n- ; e dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. 11. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe réactif G, lorsqu'il est présent, est choisi parmi : un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et un groupe de formule :153 00 (II NH)-(CH2) NCS ( 11 NH)-(CH2)-NCO v w v w O 0 (II NH)-(CH2)-N3 (II NH)-(CH2) NH2 v w V W 0 (II NH)-(CH2)-SH 0 ( 11 NH)-(CH2) w S S Ar v V W ( 11 NH)-(CH2) NH-Ar 0 0 V W >.------ NH )v (CH2)w-N Cl N(\ NH)-(CH2) w NH- \ N N=( Cl dans lequel w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 12. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe -L2-G est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, et d'un bras d'espacement L2 NCS NH-)-(CH2) NCO V W 503- 0 N NH)-(CH2) w v4 constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou d'un groupe choisi parmi les groupes de formule : S03 0 -(CH2), I NHI(CH2)m 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m- ; où n, m sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe G étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. 13. Agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les L1 ou L1', lorsqu'ils sont présents, représentent une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone ou un groupe choisi parmi les groupes de formule : S03 0 -(CH2), I NHIL(CH2)m 0 -(CH2)n-NH-L(CH2)m- ; où n, m sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4, le groupe E ou E' étant lié à l'une ou l'autre extrémité de ces groupes divalents. 14. Complexe de lanthanide comprenant un agent complexant selon l'une quelconque des revendications précédentes et un lanthanide. 15. Complexe de lanthanide selon la revendication 14, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Gd3+, Dy3+, Nd3+, Er3+ 'de préférence le lanthanide est Eu3+. 16. Conjugué fluorescent d'une molécule d'intérêt obtenu par la mise en contact d'un complexe de lanthanide selon l'une des revendications 14 et 15, ledit complexe comprenant un groupe -L2-G, avec une molécule d'intérêt.25