FR 3002237 A1 20140822 FR 1351295 A 20130215 1VIETHODES POUR LA PRODUCTION DE PARTICULES VIRALES AAV DOUBLE BRIN DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des méthodes pour la production de particules virales AAV double brin utilisant le système de cellules d'insecte / baculovirus pour la fabrication de quantités suffisantes de produit pour des applications thérapeutiques telles que la thérapie génique et/ou la vaccination à ADN, dans des utilisations lors d'essais cliniques ou commerciales. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les principaux types de vecteurs utilisés aujourd'hui en thérapie génique sont les vecteurs viraux, dont les vecteurs recombinants de virus adéno associé ("recombinant adeno-associated virus" ou "rAAV"). De nombreux essais chez l'animal ont démontré que ces vecteurs peuvent transduire efficacement des tissus tels que le système nerveux central, le muscle, le foie, la rétine et que l'expression du transgène persiste à long termel'2'3. De plus, les vecteurs rAAV présentent l'avantage d'être non pathogènes pour l'homme donc peu dangereux. Dans les vecteurs rAAV, les gènes rep et cap encadrés par les séquences ITR (inverted terminal repeat) codant respectivement pour les protéines régulatrices de la réplication et les protéines structurales de la capside sont excisés et remplacés par le transgène (gène thérapeutique). Les séquences ITR sont conservées et sont les éléments nécessaires pour la réplication et l'encapsidation du génome viral. Pour produire des vecteurs rAAV, la procédure classique consiste à co-transfecter des cellules humaines 293 adhérentes avec un plasmide vecteur rAAV, le plasmide rep-cap sans les ITR et le plasmide auxiliaire contenant les gènes adénoviraux nécessaires à la réplication du virus AAV. Les vecteurs sont généralement purifiés et concentrés par centrifugation ou par chromatographie4'5'6. Cette procédure est lourde à mettre en oeuvre et relativement inefficace pour générer des lots d'AAV à haut titre, sans contamination et en grande quantité nécessaires pour des essais précliniques chez des modèles animaux de grande taille ou pour des essais cliniques. Les vecteurs rAAV sont actuellement utilisés dans de nombreux essais cliniques de thérapie génique en phase I/II pour le traitement de l'hémophilie B, le déficit en alpha-1 antitrypsine, la maladie de Parkinson, les maladies de dystrophie musculaire comme l'alphasarcoglycanopathie et l'amaurose congénitale de Leberi'7". De nouveaux modes de production et de purification ont été développés pour augmenter à la fois le titre, c'est-à-dire la concentration relative en vecteurs et la qualité des vecteurs tout en assurant une adaptation à grande échelle pour un procédé GMP. A ce jour, les systèmes les plus utilisés reposent sur 1) l'utilisation de lignées stables d'encapsidation, 2) l'infection en suspension des cellules d'insectes sf9 par des vecteurs baculovirus d'expression, ou 3) l'infection en suspension des cellules d'hamster BHK par des vecteurs HSV (herpès simplex)1"1. Les cellules sf9 sont notamment utilisées aujourd'hui pour produire des vecteurs AAV simple brin à l'échelle industrielle. Le génome de l'AAV est composé d'une molécule d'ADN simple brin de 4,7 kb (inactif) dont la conversion en conformation double brin (forme active) est une étape limitante qu'il est possible de contourner en produisant des vecteurs AAV « double brin » notés scAAV (self complementary)12,13. Bien que ce nouveau type de vecteur soit très efficace et expérimenté en phase I/II pour l'essai clinique dans l'hémophilie B, la production des vecteurs scAAV n'est encore à ce jour réalisée qu'en utilisant le système traditionnel de transfection transitoire des cellules HEK293 en adhérence, un système de production inefficace pour le traitement par thérapie génique d'un grand nombre de patients atteints d'hémophilie6. De plus, dus à des problèmes inhérents au vecteur double brin : i) la proportion de particules virales AAV vides, c'est-à-dire de particules dépourvues d'ADN viral est largement prédominante et représente plus de 90%, un produit inactif contribuant à l'immunogénicité du vecteur ; ii) le génome viral n'est pas exclusivement sous forme d'ADN double brin. La présente invention vise à pallier ces problèmes et à fournir un procédé pour la production de particules rAAV double brin avec une amélioration du ratio de particules contenant de l'ADN viral par rapport aux particules vides avec une proportion augmentée de particules contenant un génome double brin. RESUIVIE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé pour la production d'un vecteur AAV double brin (scAAV) à haut titre et à grande échelle, comprenant la mise en culture en suspension de cellules d'insectes infectées par un ou plusieurs baculovirus recombinants codant les protéines Rep et Cap d'AAV et codant pour un génome viral d'AAV contenant un transgène d'intérêt, ledit génome viral d'AAV étant susceptible de former un génome double brin dans la particule virale. L'invention permet la production à grande échelle de vecteurs de thérapie génique de grade humain dans le respect des bonnes pratiques de fabrication. Ce procédé permet d'envisager une production industrielle de vecteurs scAAV de thérapie génique. L'invention concerne plus particulièrement un procédé pour la production d'un vecteur scAAV, comprenant: a) l'introduction, dans une cellule d'insecte, des séquences nucléotidiques suivantes au moyen d'au moins un vecteur baculoviral: - une séquence codant un transgène d'intérêt compris entre des ITR d'AAV, la séquence étant choisie de manière à produire un génome AAV double brin; - au moins une séquence codant des protéines de capside d'AAV; et - au moins une séquence codant des protéines Rep d'AAV; b) la culture de ladite cellule d'insecte dans des conditions permettant la production d'un vecteur rAAV et la récolte dudit vecteur rAAV. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la cellule d'insecte est une cellule sf9. Selon un autre mode particulier de réalisation, les séquences nucléotidiques sont introduites dans la cellule d'insecte au moyen d'au moins deux vecteurs baculoviraux. Selon un autre mode de réalisation, les protéines de capside produites sont des protéines de capside d'un AAV de sérotype 9. Selon un mode de réalisation supplémentaire, des protéines de Rep de sérotype 2 sont mises en oeuvre. Selon un autre mode de réalisation, le vecteur rAAV est un vecteur pseudotypé (par exemple un vecteur scAAV2/9, c'est-à-dire un vecteur AAV comprenant un génome viral double brin de sérotype 2 encapsidé dans une particule virale AAV de sérotype 9. Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention permet de générer plus de 20 % de particules virales rAAV pleines, en particulier plus de 30 %, plus de 40 %, plus de 50 %, plus de 60, 70 %, voire plus de 80 % de particules virales rAAV pleines, c'est-à-dire comprenant un génome AAV encapsidé à l'intérieur desdites particules. Selon une autre caractéristique avantageuse, le procédé de l'invention permet la production de particules rAAV pleines essentiellement composées de génome viral sous forme double brin (par exemple au moins 20, 30, 40 ou au moins 50 % des particules contiennent un génome double brin). La production d'une telle proportion de particules pleines, qui plus est contenant de l'ADN double brin, n'a jamais été montrée au suggérée dans l'état de la technique. LEGENDE DES FIGURES La figure 1 présente (A) une photographie d'un gel SDS-Page coloré au nitrate d'argent et (B) une photographie d'un western blot réalisé sur une membrane de nitrocellulose avec un anticorps monoclonal B1 permettant l'identification des protéines virales Vp. Les échantillons sont déposés en duplicat à 5.109 vg et 101° vg, le puits 1 et 2 correspondent à un lot contrôle interne (ssAAV8-GFP, produit avec le système sf9), les puits 3 et 4 correspondent au lot de scAAV 9 n°A.11003.DEV produit dans les cellules sf9, les puits 5 et 6 correspondent à un autre lot (n°12D0106) de scAAV9 produit dans les cellules sf9 et les puits 7 et 8 correspondent au lot de scAAV9 produit dans des cellules HEK293F (lot n°12D0055). La figure 2 est un graphique montrant le profil de distribution en ultracentrifugation analytique du lot de scAAV9 n°A.12026.DEV#4 produit avec le système sf9 (trait pointillé) et du lot 12D0055 produit avec le système HEK293 (en trait plein) La figure 3 est un graphique montrant le profil de distribution en ultracentrifugation analytique de 3 lots scAAV9-SMN produits avec le système sf9. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne des procédés pour la production d'un vecteur rAAV recombinant double brin (ou self-complementary AAV - scAAV - en anglais). Le procédé repose sur l'utilisation du système cellule d'insecte / baculovirus qui est utilisé aujourd'hui pour la production de vecteurs AAV simple brin à l'échelle industrielle mais qui n'avait jamais été utilisé pour la production de vecteurs scAAV. Les inventeurs ont pu montrer que ce système permet la production de particules virales scAAV de meilleure qualité lorsque qu'elles sont comparées à celles produites par le système classique utilisant des cellules HEK293 transfectées au moyen de plasmides codant tous les éléments nécessaires pour la production d'un rAAV. Les inventeurs ont notamment pu montrer que le procédé selon l'invention permet de générer une proportion élevée de particules virales rAAV pleines et que les particules produites sont essentiellement composées de génome viral sous forme double brin. Une telle qualité dans la production de vecteurs scAAV était totalement inattendue et présente des avantages pour la production à grande échelle de virus scAAV destinés à la thérapie génique. Les éléments du vecteur produit selon l'invention peuvent être dérivés de tout sérotype d'AAV. En particulier, chaque élément peut être dérivé d'un AAV de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Par ailleurs, les éléments constitutifs du vecteurs rAAV ne sont pas nécessairement tous dérivés du même sérotype. Ainsi, un vecteur rAAV peut être composé d'un génome dérivé d'un AAV de sérotype 2, par exemple, encapsidé par des protéines de capside dérivées d'un AAV de sérotype 9. On parle alors d'un vecteur pseudotypé. Les séquences codant pour les protéines Rep peuvent également être dérivées de tout sérotype d'AAV. Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant les protéines de capside est dérivée d'un AAV de sérotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, la séquence code des protéines de capside d'AAV de sérotype 9 (AAV9). Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant les protéines Rep est dérivée d'un AAV de sérotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, la séquence code des protéines de capside d'AAV de sérotype 2 (AAV2). Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant le génome viral d'AAV contenant le transgène d'intérêt est dérivée d'un AAV de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, le génome viral est dérivé d'un génome d'AAV2. Le génome viral d'AAV est codé par une séquence comprenant le transgène d'intérêt flanqué de séquences ITR d'AAV. Les moyens d'obtenir un génome AAV double brin sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra notamment se référer aux informations des références 12 et 13 ci-dessous, de McCarty et al. et de Wang et al. En résumé, la suppression du Site Terminal de Résolution (trs) au niveau d'un des deux ITR a pour autre caractéristique de ne pas séparer le brin formé du brin néonatal et ainsi de permettre la production d'un génome viral AAV sous forme double brin. Néanmoins, ce système n'est pas efficace et la cellule humaine, qui est la cellule hôte naturelle du système de régulation de l'AAV, est capable de séparer et de former un génome viral AAV simple brin. Par ailleurs, il a été décrit que dans ce système, la production de particules AAV contenant un génome AAV est faible et ne représente que 20% de la totalité des particules virales6. Le transgène d'intérêt peut correspondre à une protéine ou à un ARN dont l'expression est souhaitée dans une cellule de mammifère. Le transgène d'intérêt peut en particulier coder une protéine ou un ARN ayant un intérêt thérapeutique. L'homme du métier a à sa disposition une grande quantité d'information sur les protéines ou ARN dont l'expression peut avoir un intérêt pour compenser l'absence d'expression ou l'expression anormale de ladite protéine, ou pour réguler l'expression d'une telle protéine ou d'un ARN. A titre illustratif, les exemples montrent la production d'une particule rAAV double brin dont le transgène d'intérêt est la protéine SMN. Cette protéine est mutée dans l'amyotrophie spinale. Un scAAV produit selon l'invention permettrait l'expression d'une protéine sauvage restaurant la fonction absente due à la mutation chez un patient. Les différentes séquences codant les éléments constitutifs d'une particule virale AAV sont introduites dans un ou plusieurs baculovirus recombinants différents. Ainsi, selon une alternative, les différentes séquences listées ci-dessus peuvent être introduites dans un seul et même baculovirus recombinant. Selon un mode de réalisation alternatif, deux baculovirus recombinants sont utilisés, l'un codant les protéines Rep et Cap d'AAV (de sérotype(s) identique ou différents) et l'autre portant le génome viral de l'AAV. Selon un autre mode de réalisation, trois baculovirus sont utilisés, chacun portant l'une des trois séquences mentionnées ci-avant. Les gènes codant les protéines de l'AAV peuvent être placés sous le contrôle des promoteurs du baculovirus, régulés par les cellules d'insectes16' 17. La cellule d'insecte utilisée peut être toute cellule permettant la production d'un rAAV. On peut citer à titre d'exemple les cellules sf9 et sf21. Selon un mode particulier de réalisation, la cellule utilisée est une cellule sP9. La production des vecteurs AAV est basée sur l'infection des cellules avec un ou plusieurs des baculovirus décrits ci-dessus. La culture peut être réalisée en suspension, dans un milieu approprié. A titre de milieu approprié pour la culture de cellules sP9, on peut citer le milieu SP900III (Life technologies/Invitrogen). Les cellules sont cultivées dans un bioréacteur de volume approprié, par exemple supérieur à 100 mL, notamment supérieur à 500 mL, à 1 L, à 2 L, à 5 L, à 10 L, voire supérieur à 50 L. Selon un mode particulier de réalisation, les cellules sont infectées par le ou les baculovirus recombinant à une densité comprise entre 0,01.106 et 5.106 cellules/mL, en particulier à une densité cellulaire comprise entre 0,8.106 et 2.106 cellules/mL, et à une multiplicité d'infection (MOI) comprise entre 0,01 et 0,1 en particulier à une MOI de 0,05. La culture cellulaire est ensuite maintenue en suspension dans des conditions de culture permettant la production d'un AAV recombinant. Si la cellule d'insecte utilisée est une cellule 09, elles seront maintenues en suspension à environ 27°C pendant 96 à 144 heures. Les vecteurs sont ensuite purifiés. La purification peut comprendre une première étape de lyse des cellules. La lyse peut comprendre des étapes de lyse chimique, mécanique ou enzymatique, notamment chimique. Selon une variante de réalisation, une lyse chimique est mise en oeuvre, par addition d'une solution de détergent aux cellules, notamment de Triton-X100. L'ADN est ensuite dégradé par digestion enzymatique, notamment par addition de benzonase. L'étape de purification peut notamment également comprendre une étape de clarification (e.g. sur filtre 0,45 pm). Les particules virales peuvent ensuite être davantage purifiées sur colonne(s) de chromatographie ou par ultracentrifugeuse ou par une combinaison des deux approches. Selon un mode particulier de réalisation, cette étape de purification sur colonne(s) comprend une ou plusieurs chromatographies échangeuses d'ions. Selon un mode spécifique de réalisation, les chromatographies échangeuses d'ions emploient successivement: 1) une résine cationique, par exemple SP sepharose (GE Healthcare); 2) une résine anionique en mode négatif, par exemple Fractogele EMDTMAE, MerckMillipore), puis 3) une résine anionique telle que la résine POROS 50HQ (Life Technologies Invitrogen). Les particules virales rAAV peuvent ensuite être concentrées et formulées dans un tampon, notamment tampon PBS, par exemple par filtration tangentielle (TFF) pour être à une concentration finale d'environ> 1-11 u vg/ml. Ces particules concentrées peuvent être filtrées, notamment sur un filtre de 0,2 p.m. Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte donc également à un procédé de purification de particules rAAV comprenant la soumission d'un lysat cellulaire contenant des particules rAAV aux étapes successives suivantes: - une étape de chromatographie sur résine cationique en mode capture; - une étape de chromatographie sur résine anionique en mode négatif; puis - une étape de chromatographie sur résine anionique en mode capture. Le lysat cellulaire soumis à ces étapes de chromatographie peut être issus des étapes de production développées ci-dessus. Selon un autre aspect, l'invention concerne également un ensemble de particules scAAV, en particulier scAAV9, produit et éventuellement purifiées selon les modalités décrites ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne une composition comprenant des particules rAAV double brin, au moins 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, voire au moins 80 % des particules étant pleines, c'est-à-dire comprenant un génome AAV encapsidé à l'intérieur desdites particules et ces particules étant essentiellement composées de génome viral sous forme double brin, i.e. au moins 30 %, en particulier au moins 40 %, voire au moins 50% des particules contiennent un génome viral sous forme double brin. L'invention sera davantage détaillée dans les exemples ci-dessous qui décrivent un mode de réalisation particulier, non limitatif, de l'invention. EXEMPLES Matériels et Méthodes 1. Culture cellulaire a. Système de cellules d'insecte (sf9) La production des vecteurs scAAV9-SMN avec le système sf9/baculovirus est basée sur l'infection des cellules d'insectes sf9 dont la culture est réalisée en suspension dans le milieu SP900III. Brièvement, dans un bioréacteur de 10L, lorsque la concentration cellulaire est comprise entre 0,8.106 à 2.106 cellules/ml, les cellules sont infectées à une MOI de 0,05 par deux baculovirus, l'un codant pour les protéines Rep de sérotype 2 et Cap de sérotype 9 du vecteur AAV et l'autre pour le génome viral de l'AAV (transgène scSMN). La culture cellulaire est maintenue en suspension à 27°C entre 96h et 144h. b. Système de cellules humaines (HEK293F) La production des vecteurs scAAV9-SMN avec le système HEK293F/plasmide est basée sur la transfection de ces cellules dont la culture est réalisée en suspension dans un milieu dépourvu en protéine animale (F17). Brièvement, dans un bioréacteur de 10L, les cellules sont transfectées à la concentration cellulaire de 106 cellules/mi par 3 plasmides: - le plasmide auxiliaire pXX6 contenant les gènes de l'adenovirus essentiels pour la réplication du vecteur AAV - le plasmide codant pour les protéines Rep de sérotype 2 et Cap de sérotype 9 du vecteur AAV - le plasmide codant pour le génome viral du vecteur AAV (transgène scSMN) avec 20 mg total de plasmide en quantité équimolaire et 25 mL de PEIpr0TM à 1 mg/m1 (Polyplus). La culture cellulaire est maintenue en suspension à 37°C pendant 72h. 2. Purification La purification des vecteurs AAV est réalisée à partir de 2 L de culture et se déroulent en 2 grandes étapes dont la première est légèrement différente pour les 2 types de culture. a) Etape 1 Système cellules d'insecte (sf9) : Les cellules et les baculovirus sont lyses chimiquement par addition d'une solution de Triton-X100 à 0,5% puis l'ADN cellulaire est dégradé par addition de benzonase (25U/m1 de culture). La solution est ensuite clarifiée sur filtre 0,45p.m. A cette étape, l'échantillon est dénommé « vrac » et titré par qPCR en utilisant une sonde et deux amorces spécifiques du génome viral AAV. La séquence nucléotidique de la sonde est 5'- TAGTTAATGATTAACCC-3' (SEQ ID NO:1), celle de l'amorce 1 (sens) est 5'- CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3' (SEQ ID NO:2) et de l'amorce 2 (antisens) est 5'- GTAGATAAGTAGCATGGC-3' (SEQ ID NO:3). Système cellules humaines (HEK293F) : La culture est concentrée, formulée dans 500 ml par filtration tangentielle (TFF), les cellules sont ensuite lysées mécaniquement et l'ADN cellulaire est dégradé par addition de benzonase (SOU/mi de culture). La solution est ensuite clarifiée sur filtre 0,45p.m. A cette étape, l'échantillon est dénommé « vrac » et titré par qPCR en utilisant la sonde et les amorces dont les séquences sont fournies ci-dessus. b) Etape 2 Les étapes de chromatographies échangeuses se décompose en trois parties : Le lysat filtré sur membrane 0,45 i.tm est dilué dans un tampon MES 50 mM pH 6.0 puis chargé sur une résine cationique (SP sepharose, GE healthcare) ; l'élution est effectuée, avec variante de réalisation, à forte concentration en sel jusqu'à 200 mM. L'éluât de chromatographie est dilué dans un tampon Trizma base 50 mM afin d'avoir une concentration en sel d'environ 25 mM et un pH 8.0 avant d'être chargé en mode négatif sur une résine anionique (Fractogele EMDTMAE, Merck-Millipore). La fraction non retenue est collectée et le pH est ajusté à pH 9.0 puis la solution est chargée sur une résine anionique (POROS 50HQ, Life tehnologies Invitrogen) utilisée comme une étape de capture. L'élution est réalisée à forte concentration en sel. Les particules virales AAV sont concentrées et formulées dans un tampon PBS par filtration tangentielle (TFF) utilisant un seuil de coupure de 100KDa pour être à une concentration finale d'environ i0h1 vg/ml et filtrées sur 0,21.1m. 3. Analyses et caractérisation du vecteur scAAV9 a) Titration en génome viral (vg/ml) - qPCR Le titre en génome viral (vg/mL) des échantillons représentant des intermédiaires de purification et des produits purifiés a été déterminé par PCR quantitative en utilisant le couple sonde/amorcel/amorce2 correspondant à un amplicon situé dans la région ITR du plasmide transgène dont les séquences sont fournies ci-dessus. b) Pureté : SDS-PAGE, coloration au nitrate d'argent Le degré de pureté des vecteurs AAV a été évalué en réalisant un gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au nitrate d'argent. Tous les échantillons ont été déposés à vg équivalent (5.109 vg et 1019 vg), la masse molaire des protéines a été déterminée à l'aide d'un marqueur de protéines standards de masses molaires connues. c) Identité des protéines virales Vp de l'AAV: Western blot Les protéines virales de la capside de l'AAV (Vp 1, Vp2 et Vp3) ont été identifiées en réalisant un gel SDS-PAGE suivie d'un transfert sur membrane de nitrocellulose et d'une détection par immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal Bi. Tous les échantillons ont été déposés à vg équivalent (5.10° vg et 1010 vg), la masse molaire des protéines a été déterminée à l'aide d'un marqueur de protéines standards de masses molaires connues. d) Analyse des particules virales AAV vides et pleines : Ultracentrifugation analytique Le coefficient de sédimentation des différentes particules virales d'AAV (vide, pleine, agrégat) et autres populations présentes (subparticules, protéines contaminantes, agrégat) dans les produits purifiés a été déterminé par centrifugation en temps réel. La centrifugation des échantillons a été réalisée à une vitesse de 16000 rpm en utilisant 1041 ou 400 11.1 de vecteurs purs non dilués, la sédimentation a été suivie par absorbance à la longueur d'onde de 276 nm, le coefficient de sédimentation des différentes populations a été obtenu en utilisant le logiciel SEDFIT. Résultats 1. Culture cellulaire et titre en génome viral à l'étape 1 de purification. Dans un volume de bioréacteur de 10L, deux lots de cellules humaines HEK293F (n° 12D0004 et 12D0082) a été transfecté et deux lots de cellules d'insectes sf9 (n° A.12026.DEV et 12D0066) ont été infectés, puis 2L de culture ont été purifiés par filtration. A cette étape, la production des particules virales d'AAV a été quantifiée par PCR quantitative (tableau 1). Le vrac 12D0055 et 12D0082 ont été obtenus respectivement à partir de la culture 12D0004 et 12D0082 (HEK293F), le vrac A.12026.DEV-4 à partir de la culture A.12026.DEV (sf9) et les 3 vracs 12D0066, 12D0070 et 12D0068 à partir de la culture 12D0066 (09). A cette étape de purification, les 2 systèmes de culture montrent une productivité similaire de particules virales d'AAV en termes de génomes viraux produits par cellule (de l'ordre de 104 vg/cellule) et de quantité totale de génomes viraux (environ 1013 vg). 2. Caractérisation du vecteur scAAV9-SMN final (après étape 2 de purification) La purification des vracs a été poursuivie par 3 chromatographies successives à échange d'ions (étape 2) en appliquant un procédé décrit dans la littérature pour l'obtention de vecteurs AAV de grade précliniques et cliniques14. Cependant, la résine anionique POROS 50HQ, décrite comme non appropriée pour purifier les vecteurs AAV9 produits avec la méthode classique (cellules humaines HEK293 adhérentes), s'est révélée efficace pour capturer les vecteurs AAV9 produits en suspension. Nous avons ainsi obtenu des préparations virales scAAV9-SMN dont le titre en génome viral, la pureté, l'identité et la quantification des particules virales vides et pleines ont été déterminés. A partir des 6 vracs récoltés à l'étape 1, deux lots avec le système HEK293F et quatre lots avec le système sf9 ont été générés, le lot 12D0106 ayant été obtenu en réunissant les vracs 12D0066 et 12D0070 (tableau 2). a) Titration en génome viral (vg/ml) Les 2 systèmes conduisent à une productivité similaire en ce qui concerne le nombre de génome viral (de l'ordre de 1011 à 1012 vg) et donc de particules virales d'AAV9 contenant le transgène d'intérêt SMN (dénommées particules d'AAV pleines). b) Pureté et identité Le profil en SDS-Page et Western blot de 2 lots 12D0106 et A.12026.DEV-4 (système sf9) sont identiques avec la présence des 3 protéines virales Vpl, Vp2 et Vp3 de masses molaires respectivement de 87 kDa, 72kDa et 62 kDa et les quantités relatives de 1 :1 :10, correspondant à celles attendues et au contrôle interne (figlA et 1B). Ceci montre que les vecteurs scAAV9-produits avec le système sf9 sont purs et que la particule virale est conforme. Le profil en SDS-Page et en Western blot du lot 12D0055 (système HEK293F) montre la présence de très nombreuses protéines dont certaines sont reconnues par l'anticorps B1 et qui correspondent à protéines virales dégradées (figlA et 1B). Ceci indique que le vecteur scAAV9 produit avec le système HEK293F n'est pas pur. Le procédé de chromatographie mis en place aujourd'hui et identique aux 2 systèmes de culture, ne permet pas d'obtenir des lots purs de vecteurs scAAV9 produits avec le système HEK293F. c) Analyse des particules d'AAV vides et pleines Il a été décrit dans la littérature que la densité est approximativement de 1,32 g/cm3 (équivalent à 60S) pour les particules virales AAV vides, c'est-à-dire les vecteurs dépourvus de génome viral et de 1,45 g/cm3 (équivalent à 110S) pour les particules virales AAV pleines, c'est-à-dire ceux contenant un génome viral de taille maximale de 4800 bases15. Sachant que la différence de densité est suffisamment significative pour les distinguer par centrifugation, nous avons aujourd'hui mis en place une méthode pour séparer analytiquement par ultracentrifugation et quantifier les différentes espèces présentes dans une préparation virale d'AAV. L'analyse en ultracentrifugation analytique des vecteurs scAAV9-SMN a été réalisée dans un premier temps en comparant un lot produit en système sf9 (A.12026.DEV-4) avec le lot 12D0055 produit en système HEK293 (figure 2). Le profil de distribution des espèces permet d'identifier 2 catégories de populations: a) 80%) avec une très forte proportion de génome viral sous forme double brin (>50%). Culture cellulaire Purification: Etape 1 Type Lot N° Cellule/mi Vrac N° Volume Titre Titre Total Vg (L) (vg/ml) (vg/cellule) HEK293F 12D0004 1,0E+06 12D0055 0,5 4,0E+10 4,0E+04 2,0E+13 12D0082 1,0E+06 12D0082 2 1,2E+10 1,2E+04 2,4E+13 sf9 A.12026.DEV 1,0E+06 A.12026.DEV-4 2 2,2E+10 1,3E+04 4,5E+13 12D0066 1,9E+06 12D0066 2 1,9E+10 1,0E+04 3,8E+13 12D0070 2 2,0E+10 1,0E+04 4,0E+13 12D0068 2 6,4E+09 3,4E+03 1,3E+13 Tableau 1 : Description de la concentration cellulaire dans le bioréacteur de 10L avant transfection ou infection, des volumes (L) et des titres en génomes viraux (vg/ml) obtenus après la purification (étape 1) de 2L culture cellulaire. Culture cellulaire Purification Type Lot N° Etape 1 Etape 2 Vrac N° Lot N° Vol (ml) Titre Total Vg (vg/mL) HEK293F 12D0004 12D055 12D0055 0,6 1,6E+12 9,5E+11 12D0082 12D0082 12D0082 0,8 5,1E+11 4,1E+11 sf9 A.12026.DEV A.12026.DEV-4 A*12026 DE 1,2 1,4E+12 1,7E+12 V-4 . 12D0066 12D0066 12D0106 0,8 9,4E+11 7,5E+11 12D0070 12D0068 12D0068 0,5 1,6E+12 8,0E+11 Tableau 2 : Description du volume, du titre en génomes viraux (vg/ml), quantité totale de génomes viraux de particules d'AAV9 (vg) obtenus après l'étape 2 de purification Références bibliographiques 1 Grieger JC, Samulski RJ. Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications. Methods Enzymol 2012; 507: 229-254. 2 Asokan A, Schaffer DV, Samulski RJ. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Mol Ther 2011; 20: 699-708. 3 Wright JF, Wellman J, High KA. Manufacturing and regulatory strategies for clinical AAV2-hRPE65. Curr Gene Ther 2010; 10: 341-349. 4 Burova E, Ioffe E. 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