FR 3003871 A1 20141003 FR 1352932 A 20130329 PROTEINE KINASE AURORA A 1VIUTEE SENSIBLE A UN INHIBITEUR La présente invention concerne une protéine kinase Aurora A possédant une mutation spécifique, ainsi que son utilisation comme outil de recherche, et plus particulièrement 5 pour permettre la validation de molécules anticancéreuses. Le cancer est un problème de santé publique majeur qui touche un homme sur deux et une femme sur trois avant 85 ans en France. Certains cancers présentent un taux de mortalité pouvant atteindre 25%, comme par exemple dans le cas d'un cancer du 10 poumon chez l'homme. Le cancer se caractérise par la prolifération incontrôlée de cellules. Cette maladie est liée à un échappement des mécanismes de régulation qui assurent le contrôle de la division cellulaire. La régulation de la division cellulaire est assurée par des protéines de signalisation. 15 La protéine Aurora A est une protéine kinase de signalisation majeure impliquée dans la régulation de la progression de la division cellulaire. Pendant les premières phases de la mitose, les fonctions d'Aurora A sont strictement liées à sa localisation. Aurora A se localise au niveau des centrosomes pour assurer la 20 maturation du centrosome, puis aux pôles du fuseau pour assurer l'assemblage du fuseau bipolaire. La perte de la fonction d'Aurora A entraîne ainsi des anomalies du fuseau et ensuite, un arrêt du cycle cellulaire en prométaphase. Après la transition métaphase vers anaphase, Aurora A est retrouvée sur le fuseau central en anaphase et sur le corps intermédiaire en télophase et en cytokinèse, bien 25 qu'aucune fonction n'ait pu être clairement identifiée à ce jour. La protéine kinase Aurora A contrôle ainsi de nombreux événements clés de la division cellulaire. Pour cette raison, le dérèglement de l'expression de la protéine kinase Aurora A est oncogénique, et cette protéine kinase est fréquemment trouvée surexprimée dans 30 de nombreux cancers. A ce titre, la protéine kinase Aurora A est devenue une cible prioritaire pour le développement d'inhibiteurs à visée thérapeutique (Kollareddy et al. 2012. Invest New Drugs. 30 :2411-2432). Cependant, il n'existe à l'heure actuelle aucun inhibiteur d'Aurora A permettant 5 d'inhiber spécifiquement son activité kinase in vivo. Cette absence d'inhibiteur spécifique a pour conséquence de fermer l'accès à l'étude des fonctions d'Aurora A impliquées dans les processus cellulaires les plus dynamiques. La recherche d'inhibiteurs sélectifs d'Aurora A est généralement basée sur des tests in 10 vitro de criblages de banques de molécules chimiques. Ces tests réalisés in vitro ne prennent toutefois pas en compte la complexité du contexte moléculaire de la kinase in vivo, comme par exemple la présence de cofacteurs activateurs. Les molécules potentiellement inhibitrices identifiées in vitro doivent donc ensuite être testées sur des modèles cellulaires de cellules en culture pour vérifier que les effets observés sont 15 réellement dus à l'inhibition spécifique de l'activité kinase d'Aurora A. Ces tests ont pour but d'évaluer les effets indésirables inévitables (inhibition de l'activité d'autres protéines kinase qu'Aurora A par exemple) de ces drogues et donc leur spécificité. A l'heure actuelle, l'effet inhibiteur de ces molécules sur les cellules est comparé à 20 l'effet d'un retrait de la kinase Aurora A par interférence ARN. De cette manière, la cellule n'exprime pas de kinase Aurora A. Or il a été montré que la protéine Aurora A possède des fonctions indépendantes de son activité kinase (Anderson et al. 2007. Biochemistry. 46:10287-10295). La présence de la protéine kinase Aurora A inactive suffit d'ailleurs à assurer certaines de ces fonctions (Kress et al. 2011. Nat Cell Biol 25 13(6) :638-9; Toya et al. 2011. Nat Cell Biol 13(6) :708-14). Les effets de l'inhibition de l'activité kinase d'Aurora A et du retrait de la protéine par interférence ARN ne sont donc pas comparables. Aussi, ces tests cellulaires présentent un biais et ne sont pas satisfaisants. 30 Une autre stratégie vise, quant à elle, à élaborer des mutants de la protéine Aurora A sensibles à certains inhibiteurs. Toutefois, bien que certains mutants sensibles aient déjà pu être produits, ceux-ci demeurent partiellement résistants aux drogues utilisées (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576). En effet, il s'avère qu'il est particulièrement difficile de maintenir l'activité complète d'une kinase après l'introduction de mutations dans le site actif Aussi, la nécessité d'un vrai contrôle d'inhibition d' Aurora A demeure. Un des buts de l'invention est ainsi de fournir une protéine Aurora A mutée dont l'activité kinase peut être inhibée spécifiquement par un inhibiteur. Un autre but de l'invention est de fournir un outil de recherche permettant l'étude de la protéine Aurora A. Un autre but de l'invention est également de fournir un outil de recherche permettant de 10 tester les effets d'inhibiteurs de kinase Aurora A. Un autre but de l'invention est de fournir un outil de recherche permettant de caractériser des molécules anticancéreuses. Par conséquent, l'invention concerne une protéine mutée dérivée d'une protéine kinase 15 Aurora A et dont la séquence possède au moins 80 % de similarité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1. ladite protéine mutée possédant au moins une substitution de l'acide aminé situé en position 210 ou équivalente, par rapport à la séquence SEQ ID NO : 1, par un acide aminé naturel ou non naturel différent de la leucine. 20 La séquence de référence SEQ ID NO : 1 correspond à la séquence protéique de la protéine Aurora A humaine sauvage. La séquence nucléotique codant cette protéine correspond à la séquence SEQ ID NO : 2. SEQ ID NO: 1 Protéine Aurora A humaine MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS GQAQRVLCP SNS SQRIPLQAQKLVS SHKPVQNQKQKQL QAT S VPHP V SRPLNNT QK SKQPLP S APENNPEEEL A S K QKNEE SK KRQWALEDFEIGRPLGKGKF GNVYLAREKQ S KF IL ALKVLF KAQLEKAGVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATRV YLILEYAPLGTVYRELQKL SKFDEQRTATYITELANAL SYCH S KRVIHRD IKPENLLL G S AGELKIADF GW SVHAP S S RRT TL C GTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGKPPFEA NTYQETYKRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNP SQRPM LREVLEHPWITANS SKP SNCQNKESASKQ S (UniProt 014965) 25 Dans l'invention, les pourcentages de similarité donnés, c'est-à-dire « au moins 80%» et « de préférence au moins 90% », correspondent aux pourcentages d'acides aminés de la séquence complète SEQ ID NO : 1 qui sont similaires ou identiques dans la séquence de la protéine Aurora A complète. De manière surprenante, les Inventeurs ont constaté que le remplacement d'un acide aminé du site actif de la protéine Aurora A permet la fixation d'une molécule dérivée ou analogue de l'ATP, et que la fixation de cette molécule est capable d'inhiber de manière spécifique l'activité kinase de la protéine Aurora A mutée. L'acide aminé remplacé par mutation correspond à la Leucine située en position 210 par rapport à la séquence de la protéine Aurora A humaine (SEQ ID NO : 1). In vitro, as-AurA conserve une activité kinase complète et est spécifiquement inhibée par le 1-Na-PP1 (1-Naphtyl-PP1) 10 [tM (qui n'a pas d'effet sur la kinase Aurora A sauvage). La sur-expression d'Aurora A déclenche des anomalies mitotiques, alors les Inventeurs ont produit la kinase Aurora A mutée sous le contrôle de la région minimale de régulation de la transcription de l'Aurora A endogène. Cette construction a permis la production de la kinase Aurora A mutée à des quantités physiologiques, lorsque l'Aurora A endogène a été préalablement retirée par ARN interférant. La localisation de la protéine Aurora A mutée est similaire à celle de la protéine Aurora A sauvage, et les expériences de complémentation in vivo indiquent que la protéine mutée est complètement fonctionnelle dans les cellules cultivées. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite protéine mutée possédant une activité kinase pouvant être inhibée complètement ou partiellement en présence d'un composé inhibiteur, ledit composé inhibiteur étant inactif vis-à-vis de la protéine kinase Aurora A dont dérive la protéine mutée. Le site actif de la protéine Aurora A étant particulièrement conservée, le résidu leucine est également retrouvé dans des positions équivalentes au sein de la protéine Aurora A d'autres organismes, notamment les mammifères. 30 De manière non limitative, des exemples de ces protéines Aurora A sauvages issues de différents organismes sont présentés ci-dessous : SEQ ID NO: 3 Protéine Aurora A de chimpanzé MDR SKENC I S GPVKATAPVGGPKRVLVT Q QFPC QNPLPVN S GQAQRVLCP SN S SQRVPLQAQKLVS SHKPVQNQKQKQLQA TSVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEES KKRQWALEDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKQ SKFILALKVL FKAQLEKAGVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATR VYLILEYAPLGTVYRELQKL SKFDEQRTATYITELANAL SYC HSKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADFGW SVHAP S SRRT TL CGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLW SLGVLCYEFLVGKPPFE ANTYQETYKRISRVEF TFPDFVTEGARDLISRLLKHNP SQRP MLREVLEHPWITANS SKP SNC QNKE S A SKQ S SEQ ID NO: 5 Protéine Aurora A de souris MAVEGEPGCCKRIGKAVWRRGDMDRCKENCVSRPVKTTVP FGPKRVLVTEQIP SQNLGSAS S GQ AQRVL CP SNSQRVP SQAQ KLGAGQKPAPKQLPAASVPRPVSRLNNPQKNEQPAASGND S EKEQASLQKTEDTKKRQWTLEDFDIGRPLGKGKFGNVYLA RERQ SKFILALKVLFKTQLEKANVEHQLRREVEIQ SHLRHPN ILRLYGYFHDATRVYLILEYAPLGTVYRELQKL SKFDEQRTA TYITELANAL S YCH SKRVIHRDIKPENLLLGSNGELKIADF G W SVHAP S SRRTTMCGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLW SL G VLCYEFLVGMPPFEAHTYQETYRRISRVEF TFPDFVTEGARD L I SRLLKHNA S QRL TL AEVLEHPW IKAN S SKPPTGHT SKEPT S KS S SEQ ID NO: 7 Protéine Aurora A de rat MDRCKENCV SRPVK S TVPF GPKRVLVTEQIP S QHP GS A S SGQ AQRVLCPSNSQRVPPQAQKPVAGQKPVLKQLPAASGPRPAS RL SNPQKSEQPQPAASGNNSEKEQTSIQKTED SKKRQWTLE DFDIGRPLGKGKFGNVYLAREKQ SKFILALKVLFKVQLEKA GVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATRVYLILEYAP LGTVYRELQKL SKFDEQRTATYITELANAL SYCHSKRVIHRD IKPENLLLGSNGELKIADFGW SVHAPS SRRTTLCGTLDYLPP EMIEGRMHDEKVDLW SLGVLCYEFLVGMPPFEAHTYQETY RRISRVEF TFPDFVTEGARDLISRLLKHNS SQRLTLAEVLEHP WIKANS SKPPTGHNSKEATSKS S SEQ ID NO: 9 Protéine Aurora A de drosophile MSHP SDHVLRPKENAPHRMPEKSAAVEINMQKNLLLGKKPN SENMAPASKPLPGSSGALIRKPGLGGSNSIASSEGNNFQKPM VP SVKKTT SEFAAPAPVAPIKKPESL SKQKPTAAS SES SKEL G AAS S SAEKEKTKTET QP QKPKKTWELNNFD IGRLL GRGKF G NVYLAREKESQFVVALKVLFKRQIGESNVEHQVRREIEIQ SH LRHPHILRLYAYFHDDVRIYLILEYAPQGTLFNALQAQPMKR FDERQSATYIQALCSALLYLHERDIIHRDIKPENLLLGHKGVL KIADFGW SVHEPNSMRMTLCGTVDYLPPEMVQGKPHTKNV DLW SLGVL CFELLVGHAPF Y SKNYDETYKKILKVDYKLPEH ISKAASHLISKLLVLNPQHRLPLDQVMVHPWILAHTQ5 Les séquences nucléotidiques codant les protéines SEQ ID NO : 3, 5, 7 et 9 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 4, 6, 8 et 10. Dans l'invention, les termes « protéine mutée », « protéine Aurora A mutée » ou « asAurA » (analogue-sensitive Aurora A) correspondent tous à une protéine Aurora A 5 possédant une mutation de la leucine en position 210. Dans l'invention, les termes « protéine kinase Aurora A », « Aurora A» ou « wt-AurA » (wild-type Aurora A) correspondent, quant à eux, à la protéine kinase ne possédant pas de mutation de la leucine en position 210. 10 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite protéine mutée assurant de manière identique les mêmes fonctions cellulaires que celles assurées par ladite protéine kinase Aurora A dont elle dérive. 15 Les Inventeurs ont également constaté de manière surprenante que ladite protéine Aurora A mutée conserve les mêmes fonctions que la protéine Aurora A sauvage dont elle dérive. En d'autres termes, en l'absence dudit inhibiteur spécifique, une cellule exprimant uniquement la protéine Aurora A mutée présente le même phénotype qu'une cellule exprimant uniquement la protéine Aurora A non mutée. 20 Dans l'invention, le terme « phénotype » correspond à n'importe quelle caractéristique cellulaire observable. De manière non limitative, il peut s'agir par exemple de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, de la destruction du fuseau mitotique, ou encore de la ségrégation mitotique. 25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO : 1, est substitué par une alanine. 30 Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO : 1, est substitué par un acide aminé neutre, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : l'alanine, la proline, la valine, l'isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine, la sérine, la thréonine, la cystéine, l'asparagine et la glutamine. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne plus particulièrement une protéine mutée telle que définie ci-dessus, ladite protéine mutée correspondant à la séquence 5 SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 19. SEQ ID NO: 11 Protéine Aurora A mutée humaine MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS GQAQRVLCP SN S SQRIPLQAQKLVS SHKPVQNQKQKQL QAT S VPHP V SRPLNNT QK SK QPLP S APENNPEEEL A SK QKNEE SK KRQWALEDFEIGRPLGKGKF GNVYLAREKQ SKFILALKVLF KAQLEKAGVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATRV YLIAEYAPL GT VYREL QKL SKF DEQRTAT YITEL ANAL SYCH SKRVIHRD IKPENLLL G S AGELKIADF GW SVHAP S SRRT TL C GTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLW SLGVLCYEFLVGKPPFEA NT YQET YKRI SRVEF TF PDF VTEGARDLI SRLLKHNP SQRPM LREVLEHPW IT ANS SKP SNC QNKES A SKQ S SEQ ID NO: 13 Protéine Aurora A mutée de chimpanzé MDR SKENC I S GP VKATAP VGGPKRVLVT Q QF P C QNPLP VN S GQAQRVLCP SN S SQRVPLQAQKLVS SHKPVQNQKQKQLQA TSVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEES KKRQWALEDFEIGRPLGKGKF GNVYLAREKQ SKFILALKVL FKAQLEKAGVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATR VYLIAEYAPLGTVYRELQKL SKF DE QRT AT YI TELANAL SYC HSKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADF GW SVHAP S SRRT TL CGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLW SLGVLCYEFLVGKPPFE ANTYQETYKRISRVEF TFPDFVTEGARDLISRLLKHNP SQRP MLREVLEHPWIT ANS SKP SNC QNKES A SKQ S SEQ ID NO: 15 Protéine Aurora A mutée de souris MAVEGEPGCCKRIGKAVWRRGDMDRCKENCVSRPVKTTVP F GP KRVL VTEQ IP S QNLGS A S S GQ AQRVL CP SNSQRVP SQAQ KLGAGQKPAPKQLPAASVPRPVSRLNNPQKNEQPAASGND S EKEQASLQKTEDTKKRQWTLEDFDIGRPLGKGKF GNVYLA RERQ SKFILALKVLFKTQLEKANVEHQLRREVEIQ SHLRHPN ILRLYGYFHDATRVYLIAEYAPLGTVYRELQKL SKFDEQRTA T YITEL ANAL S YC H SKRVIEIRD IKPENLLL G SNGELKIADF G W SVHAP S SRRTTMCGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLW SL G VLCYEFLVGMPPFEAHTYQETYRRISRVEF TFPDFVTEGARD L I SRLLKHNA S QRL TL AEVLEHPWIKAN S SKPPTGHT SKEPT S KS S SEQ ID NO: 17 Protéine Aurora A mutée de rat MDRCKENCVSRPVKSTVPF GPKRVLVTEQIP S QHP GS A S SGQ AQRVLCPSNSQRVPPQAQKPVAGQKPVLKQLPAASGPRPAS RL SNPQKSEQPQPAASGNNSEKEQT SIQKTED SKKRQWTLE DFDIGRPLGKGKFGNVYLAREKQ SKFILALKVLFKVQLEKA GVEHQLRREVEIQ SHLRHPNILRLYGYFHDATRVYLIAEYAP LGTVYRELQKL SKF DE QRT ATYI TEL ANAL SYCHSKRVIHRD IKPENLLL G SN GELKIAD F GW SVHAP S SRRT TL C GTLD YLPP EMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGMPPFEAHTYQETY RRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNSSQRLTLAEVLEHP WIKANSSKPPTGHNSKEATSKSS SEQ ID NO: 19 MSHPSDHVLRPKENAPHRMPEKSAAVHNMQKNLLLGKKPN Protéine Aurora A SENMAPASKPLPGSSGALIRKPGLGGSNSIASSEGNNFQKPM mutée de drosophile VPSVKKTTSEFAAPAPVAPIKKPESLSKQKPTAASSESSKELG AASSSAEKEKTKTETQPQKPKKTWELNNEDIGRLLGRGKEG NVYLAREKESQFVVALKVLFKRQIGESNVEHQVRREIEIQSH LRHPHILRLYAYFHDDVRIYLIAEYAPQGTLFNALQAQPMK RFDERQSATYIQALCSALLYLHERDIIHRDIKPENLLLGHKGV LKIADFGWSVHEPNSMRMTLCGTVDYLPPEMVQGKPHTKN VDLWSLGVLCFELLVGHAPFYSKNYDETYKKILKVDYKLPE HISKAASHLISKLLVLNPQHRLPLDQVMVHPWILAHTQ Les séquences nucléotidiques codant les protéines SEQ ID NO : 11, 13, 15, 17 et 19 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18 et 20. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite activité kinase correspondant à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ledit composé inhibiteur étant une molécule analogue de l'ATP. Dans l'invention, le terme « analogue de l'ATP» correspond à une molécule dérivée de l'ATP ou possédant une structure chimique proche de l'ATP. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ledit composé inhibiteur étant le 1-Na-PP1. Par exemple et de manière non limitative, les Inventeurs ont déterminé qu'une 20 concentration de 10 [IM de 1-Na-PP1 inhibe complètement la protéine Aurora A mutée dans les cellules, mais n'a aucun effet sur la protéine Aurora A sauvage. Un autre aspect de l'invention concerne un acide nucléique codant la protéine mutée définie ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique défini ci-dessus possédant des mutations silencieuses par rapport à la séquence de l'acide nucléique codant la protéine Aurora A dont dérive la protéine mutée. L'introduction de mutations silencieuses dans la séquence nucléotidique codant la protéine Aurora A mutée permet de rendre l'expression de celle-ci, dans une cellule, insensible à une interférence ARN qui a pour cible la protéine Aurora A endogène. A titre d'exemple et de manière non limitative, les Inventeurs ont remplacé le motif CCTGTCTTACTGT, entre les positions 729 et 741, dans la séquence SEQ ID NO: 12 par le motif ACTATCATATTGC, pour obtenir la séquence SEQ ID NO : 21. Les deux séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 21 codent donc la même protéine Aurora A mutée SEQ ID NO: 11, mais la séquence SEQ ID NO: 21 15 n'est pas sensible à un ARN interférant ayant le motif ACTATCATATTGC et visant la protéine endogène, contrairement à la séquence SEQ ID NO : 12. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique défini ci-dessus correspondant à la séquence SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20 ou 21. 20 Un autre aspect de l'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un vecteur d'expression tel que 25 défini ci-dessus, ledit vecteur d'expression correspondant à la séquence SEQ ID NO : 22. Un autre aspect de l'invention concerne aussi une cellule exprimant la protéine Aurora A mutée définie ci-dessus. 30 Un autre aspect de l'invention concerne également l'utilisation in vitro, ex vivo ou in vivo d'une protéine mutée définie ci-dessus, comme outil de recherche pour déterminer l'effet inhibiteur d'une molécule chimique vis-à-vis d'une protéine kinase Aurora A possédant au moins 80 % de similarité de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1. Différents inhibiteurs d'Aurora A avec une bonne efficacité in vitro sont maintenant disponibles. Cependant, il est important d'être prudent dans l'interprétation des résultats obtenus avec ces outils car l'environnement moléculaire de la kinase peut considérablement modifier l'activité et la sensibilité de la kinase vis-à-vis de molécules inhibitrices. Par exemple, la fixation de TPX2 à Aurora A réduit fortement l'effet d'inhibiteurs chimiques sur Aurora A (Anderson et al. 2007. Biochemistry. 46:10287-10295). Les laboratoires Millenium ont par exemple identifié la molécule MLN8054 comme un inhibiteur intéressant. Cependant, cette drogue est plus de 40 fois moins sélective pour Aurora A que pour Aurora B in vitro, une inhibition importante d'Aurora A nécessite 1 !AM de M1LN8054 : une concentration qui affecte également Aurora B (Manfredi et al. 2007. Proc Natl Acad Sci USA. 104 :4106-4111). En conséquence, il est compliqué d'interpréter les résultats d'inhibition d'Aurora A par de telles molécules à cause de l'inhibition d'Aurora B (Taylor et Peters. 2008. Curr Opin Cell Biol. 20 : 77-84). Un problème avec ce type d'approche est l'absence de contrôle négatif pour identifier les effets collatéraux. Une étude récente a tenté de résoudre ce problème en mutant Aurora A pour empêcher l'inhibition par M1LN8054 ou son analogue proche MLN8237. Bien que cette étude suggère fortement que la cible principale de ces molécules est Aurora A, ces mutants ne sont que partiellement sensibles aux drogues, de telle sorte qu'ils ne sont pas satisfaisants en biologie cellulaire (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576). La protéine mutée selon l'invention présente l'avantage de permettre une inhibition 30 forte, rapide et spécifique d'Aurora A. En conséquence, la protéine mutée constitue un vrai contrôle négatif permettant de déterminer si les effets observés par le traitement avec une molécule chimique résultent ou non de l'inhibition d'Aurora A. La protéine mutée selon l'invention représente donc un outil de recherche puissant pour étudier les fonctions d'Aurora A. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle : un premier échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine kinase Aurora A en présence de ladite molécule chimique, et un second échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine mutée, mais n'exprimant pas ladite protéine kinase Aurora A, en présence d'un inhibiteur de l'activité kinase, sont comparés l'un à l'autre, ledit second échantillon étant représentatif d'une inhibition spécifique de l'activité kinase de ladite protéine Aurora A. La kinase Aurora A a un rôle central dans la mitose et est fréquemment surexprimée dans de nombreux types de tumeurs. En conséquence, son inhibition spécifique est une stratégie majeure pour combattre le cancer (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576). De nouveaux médicaments sont donc nécessaires pour traiter les différentes variétés de cancers qui résistent à la chimiothérapie classique. Il est donc important d'identifier des inhibiteurs spécifiques d'Aurora A ou B qui peuvent être utilisés en chimiothérapie. Dans ce contexte, la protéine Aurora A mutée peut être utilisée pour étudier la spécificité de molécules candidates et permettre de valider de nouvelles molécules 25 pharmaceutiques. Il est en effet très simple de l'utiliser comme témoin d'inhibition de la protéine Aurora A, et ainsi de déterminer, par comparaison avec les échantillons tests, si les phénotypes des cellules consécutifs au traitement avec une molécule chimique résultent ou non 30 d'une inhibition de la protéine kinase Aurora A. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation selon la revendication définie ci-dessus dans laquelle l'échantillon correspondant aux cellules exprimant la protéine Aurora A mutée est utilisée comme témoin de comparaison pour mesurer la spécificité d'un inhibiteur de la protéine Aurora A sauvage. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans 5 laquelle une activité kinase est mesurée dans les deux échantillons. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle ladite activité kinase correspond à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, 10 Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle la prolifération cellulaire est mesurée dans les deux échantillons. 15 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle lesdites cellules sont observées par microscopie dans les deux échantillons. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle ladite molécule chimique est une molécule à visée anticancéreuse. 20 Un autre aspect de l'invention concerne un kit comprenant une protéine mutée définie ci-dessus et un composé inhibiteur. Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en 25 limiter sa portée. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 30 La protéine Aurora A mutée (as-AurA) conserve son activité kinase in vitro et se comporte comme wt-AurA quand elle est exprimée dans les cellules U205. (A) 0,5 pmoles de chaque protéine Aurora A sauvage et Aurora A mutée sont incubées avec 20 pmoles deTPX2 et les quantités indiquées de 1-Na-PP1. La phosphorylation du TPX2 (TPX2*) est examinée par autoradiographie (haut), et la présence de TPX2 et Aurora A est examinée par coloration au bleu de Coomassie (centre) et par Western blot (bas). (B) La structure chimique de l'inhibiteur spécifique de as-AurA : le 1-NA-PP1. (C) Séquence nucléotidique de la région promotrice de 189 à +311 de Aurora A Les sites putatifs de fixation des facteurs de transcription sont soulignés. Le site d'initiation majeur (cercle) est désigné +1. (D) Western blot montrant l'expression de GFP-as-AurA et de Aurora A endogène dans les cellules U205 cells. Chaque ligne correspond à un point de cinétique (en heures) 10 après libération du double bloque thymidine. La béta-Tubuline sert de contrôle de charge. (E) Microscopie par Immuno-Fluorescence des cellules as-AurA à chaque phase de la mitose. Les encarts montrent un agrandissement de la région des centrosomes. Les barres d'échelle font 10 !am. 15 (F) Les lysats protéiques préparés à partir de cellules contrôles U205 et de cellules ASAurA, dans lesquelles Aurora A endogène a été retirée ou non, sont marquées avec des anticorps anti-Aurora A (haut) et des anti-béta-tubuline (bas) Figure 2 20 La protéine mutée Aurora A (as-AurA) est complètement fonctionnelle in vivo dans des cellules en cultures et est efficacement inhibée par le 1-Na-PP1. (A) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules U205 contrôles ou dépourvues d'Aurora A endogène (Si AurA) en métaphase. Les barres d'échelle représentent 5 !am. (B) Histogramme présentant le pourcentage de cellules avec des pôles de fuseau 25 fragmentés ou multiples. Les valeurs représentent 3 expériences indépendantes; 100 cellules sont comptées dans chaque expérience. (C) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec des pôles de fuseau fragmentés ou multiples, en fonction de la concentration de 1-Na-PP1, dans des cellules WT-AurA or AS-AurA dépourvues en Aurora A endogène. Les valeurs représentent 3 30 expériences indépendantes; 100 cellules sont comptées dans chaque expérience. (D) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA ou AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène traitées pendant 24 heures avec 10 !AM de 1-Na-PP1. Les cellules sont marquées avec des anticorps anti-PLK1 (haut) ou anti-T210 P-PLK1. Les encarts montrent des agrandissements des régions des centrosomes. Les barres d'échelle représentent 7 !am. (E) Histogramme représentant l'intensité du marquage de PLK1 aux centrosomes en pourcentages, rapportés au contrôle (WT-AurA + 1-Na-PP1). (F) Histogramme présentant l'intensité du marquage T210 P-PLK1 aux centrosomes, en pourcentages, rapportés au contrôle (WT-AurA + 1-Na-PP1). Les valeurs représentent 3 expériences indépendantes; 20 cellules sont comptées dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent les déviations standard. Figure 3 L'inhibition de Aurora A à l'entrée de l'anaphase entraîne des défauts de l'assemblage du fuseau central. (A) Images de microscopie à intervalles réguliers montrant les phases tardives de mitose dans des cellules WT-AurA et AS-AurA déplétées en Aurora A endogène et traitées avec 10 mM 1-Na-PP1. Le temps est donné en minutes. Les deux flèches indiquent les lots de chromosomes qui se séparent. Les flèches doubles indiquent la distance mesurée et reportée en B. Les barres d'échelle représentent 10 !am. (B) Graphique montrant l'évolution de distance (in microns) entre les deux lots de chromosomes des cellules WT-AurA and AS-AurA présentés en A. Chaque courbe est 20 l'enregistrement d'une expérience représentant 13 et 9 expériences, respectivement. (C) Images à intervalles réguliers de microscopie à Fluorescence et par contraste interférentiel différentiel (DIC) montrant des phases tardives de mitose de cellules WTAurA et AS-AurA exprimant la GFP-tubuline, dépourvues de Aurora-A endogène et traitées avec 10 !AM 1-Na-PP1 . Les deux flèches indiquent les deux groupes de 25 chromosomes qui se séparent. Le temps est donné en minutes. Les barres d'échelle représentent 10 !am. (D) Microscopie à Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues en Aurora A endogène et traitées avec 10 !AM 1-Na-PP1 à l'entrée en anaphase. La flèche montre la désorganisation des microtubules dans le fuseau central. 30 Figure 4 L'inhibition de Aurora A à l'entrée de l'anaphase entraîne une mauvaise localisation de 1VIKLP1 et une accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau. (A) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec 10 1.1M de 1-Na-PP1 à l'entrée de l'anaphase. La barre d'échelle représente 10 !am. (B) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec une mauvaise localisation de MKLP1 ou de P150Glued dans les cellules WT- et AS-AurA montrées en A. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 30 cellules sont comptées dans chaque expérience. Les barres d'erreurs représentent les déviations standard. (C) Western blot montrant l'absence de P150Glued dans les cellules U20S. siRNA 10 Luciferase sert de contrôle négatif La béta-tubuline sert de contrôle de charge. (D) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules dépourvues de P150Glued par siRNA pendant 24 heures. Les barres d'échelle représentent 10 !am. Figure 5 15 P150Glued est phosphorylée par Aurora A sur la Ser 19 in vitro. (A) 50 pmoles de MBD de P150Glued (MBD) sont incubés avec 20 pmoles de protéines wt-AurA ou as-AurA. La phosphorylation de MBD (MBD*) est observée par autoradiographie (bas), et la présence de MBD et AurA est observée par coloration au bleu de Coomassie (haut). La flèche indique la place de MBD sur l'autoradiographie. Le 20 nombre sous la figure représente le taux de phosphorylation dans le premier, le troisième et la quatrième puits en comparaison au troisième puits. (B) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules montrant la localisation de P150Glued endogène (haut) et HA-P150Glued (bas, expression de HA-P150Glued dans des cellules exprimant P150Glued endogène) dans les phases tardives de la mitose. Les 25 flèches blanches montrent les pôles de fuseaux mitotiques dans des cellules en anaphase ou télophase sans accumulation de HA-P150Glued, alors que les flèches noires indiquent une accumulation de HA-P150Glued dans des cellules AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec 10 1.1M 1-Na-PP1 à l'entrée de l'anaphase. Les barres d'échelle représentent 10 !am. 30 Figure 6 La phosphorylation par Aurora A de la Serine 19 (Ser19) de P150Glued est requise pour l'assemblage du fuseau central. (A) Images de microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules montrant la localisation de HA-P150Glued S 19A (haut) ou HA-P150Glued S 19D (bas) pendant l'interphase, la métaphase ou l'anaphase. Les flèches blanches montrent les pôles du fuseau mitotique dans des cellules en anaphase, télophase sans accumulation de HA- P150Glued, alors que les flèches noires indiquent une accumulation de HA-P150Glued. Les barres d'échelles représentent 5 !am. (B) Western blot montrant l'absence de Aurora A endogène des cellules exprimant le mutant S19 de P150Glued. La coloration Ponceau sert de contrôle de charge. (C) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec des défauts d'assemblage 10 du fuseau central. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 50 cellules sont comptées à chaque expérience. (D) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 50 cellules sont comptées pour chaque expérience. Les barres d'erreur 15 représentent les déviations standard. EXEMPLES EXEMPLE 1: Production d'une kinase Aurora A mutée (ou as-AurA, analogue 20 sensitive AurA). Pour produire un variant d'Aurora A avec une sensibilité augmentée vis-à-vis d'analogues de l'ATP, nous avons modifié la spécificité de la poche de fixation de l'ATP en remplaçant un acide aminé avec une chaîne latérale volumineuse (l'acide aminé gardien ou gatekeeper) par un résidu alanine. 25 A partir de la structure cristalline, le résidu gatekeeper a été identifié comme correspondant à l'acide aminé Leucine en position 210. Une construction génétique a été produite codant un mutant L210A. Cette protéine Aurora A mutée est également dénommée as-AurA. In vitro, la protéine recombinante as-AurA est aussi active que la protéine Aurora A sauvage (dénommée wt-AurA) et est toujours capable de 30 phosphoryler TPX2, un substrat connu de Aurora A (Figure 1A). Nous avons ensuite recherché et testé des analogues de l'ATP comme inhibiteurs adéquats de as-AurA. Le 1-Naphtyl-PP1 (1-Na-PP1, Figue 1B) est l'un des plus puissants inhibiteurs d'as-AurA et n'a pas d'effet sur wt-AurA : à 10 1..tM, le 1-Na-PP1 inhibe complètement l'activité d' as-AurA mais n'a pas d'effet sur l'activité de wt-AurA (Figure 1A). EXEMPLE 2: Clonage du promoteur d'Aurora A et caractérisation de 5 l'expression de wt-AurA et de as-AurA dans les cellules humaines U20S. Pour étudier l'effet de l'inhibition spécifique de l'as-AurA par le 1-Na-PP1 durant la mitose, les allèles wt-AurA et as-AurA ont besoin d'être exprimés à un niveau physiologique. Toutefois, la sur-expression d'Aurora A à partir du promoteur CMV conduit à des 10 caractéristiques non physiologiques durant la division cellulaire et même à la mort cellulaire (Anand et al. 2003. Cancer Cell. 3 : 51-62; Dutertre et al. 2004. J Cell Sci. 111 : 2523-2531 ; Goepfert et al. 2002. Cancer Res. 62 : 4115-4122). En conséquence, nous avons utilisé la région minimale de régulation de la transcription d'Aurora A décrite par Tanaka et al. (2002. J Biol Chem. 277: 10719-10726) (Figure 15 1C). Ce fragment d'ADN a été amplifié par PCR et ajouté en amont des gènes codant wt-AurA ou as-AurA (fusionné à la séquence codant la GFP) dans un plasmide peGFPCl, remplaçant le promoteur CMV. Les cellules U2OS ont été transfectées avec ces constructions, et les niveaux d'expression de Aurora A, GFP-wt-AurA et GFP-as-AurA ont été déterminés durant le 20 cycle cellulaire dans des cellules synchronisées. Bien que le niveau d'expression de GFP-as-AurA est légèrement plus faible que celui de la protéine Aurora A endogène, les cinétiques d'accumulation dans la cellule sont similaires : les niveaux sont bas entre 0 et 4 heures après la sortie du double blocage par thymidine, correspondant à la phase S, ils augmentent entre 8 et 12 heures après la 25 sortie, durant les phases G2/M, et ensuite reviennent au niveau basal (Figure 1D). Nous avons déterminé la localisation cellulaire de l'as-AurA (Figure 1E) : la GFP-asAurA est associée aux centrosomes durant la phase G2, elle est ensuite associée avec les centrosomes et le fuseau mitotique de la prophase à la télophase et avec le corps intermédiaire durant la télophase et la cytokinèse. Ce modèle est entièrement en accord 30 celui décrit pour AUrora A (Marumoto et al. 2005. Nat Rev Cancer. 5 : 42-50). Des mutations silencieuses ont ensuite été introduites dans les constructions wt-AurA et as-AurA afin de les rendre résistantes à l'ARN interférant utilisé pour empêcher l'expression de la protéine Aurora A endogène : la séquence ACTATCATATTGC, entre les positions 729 et 741, a été remplacée par CCTGTCTTACTGT. Nous avons ensuite produit des cellules U2OS exprimant de manière stable les constructions GFP-wt-AurA (nommée WT-AurA) et GFP-as-AurA (nommée As-5 AurA). EXEMPLE 3 : Validation cellulaire de l'approche de chimie génétique Tout d'abord, nous avons validé notre approche de chimie génétique. Le fait d'empêcher l'expression de Aurora A par l'utilisation d'ARN interférant ou par 10 l'utilisation d'anticorps anti-Aurora A entraîne une amplification du centrosome conduisant à de multiples pôles du fuseau, ou à une fragmentation des pôles du fuseau (De Luca et al. 2008. Oncogene. 27 : 6539-6549; Marumoto et al. 2003. J Biol Chem. 278 :51786-51795). Nous avons donc comparé l'effet d'une inhibition de l'expression d'Aurora A endogène 15 par ARN interférant dans les cellules U2OS et les cellules WT-AurA ou As-AurA avec ou sans traitement au 1-Na-PP1. L'Aurora A endogène est absente en raison de l'ARN interférant dans toutes les cellules U2OS, WT-AurA et AS-AurA. De manière intéressante, le niveau de protéines GFP-wt-AurA et de GFP-as-AurA a augmenté légèrement pour atteindre le niveau d'expression de l'Aurora A endogène 20 (Figure 1F et 6B). Comme observé précédemment (Asteriti et al. 2011. Mol Cancer. 10 : 131), l'absence d'Aurora A pendant 24 heures dans les cellules U2OS conduit à l'apparition de cellules métaphasiques avec des pôles de fuseau multiples ou fragmentés (56 ± 7%, Figure 2A et 2B). 25 L'absence d'Aurora A endogène dans les cellules WT-AurA ou As-AurA n'entraîne aucune augmentation significative des anomalies au niveau du pôle du fuseau mitotique (Figure 2B), montrant que la GFP-wt-AurA et la GFP-as-AurA complémente chacun efficacement l'absence de l'Aurora endogène. Nous avons ensuite testé l'efficacité du 1-Na-PP1 sur les cellules WT-AurA et AS- 30 AurA dépourvues d'Aurora A endogène (Figure 2C). Le 1-Na-PP1 (de 0,1 1.1M à 20 1.1M) n'a pas d'effet significatif sur les pôles du fuseau mitotique dans les cellules WTAurA, mais il augmente de manière substantielle le pourcentage de pôles multiples ou fragmentés chez les cellules AS-AurA. L'effet maximum est atteint à 1-Na-PP1 101.1M. Cette concentration a été systématiquement utilisée pour les expériences présentées ensuite. Pour confirmer l'inhibition de la protéine mutée As-AurorA par le 1-Na-PP1 in vivo, nous avons vérifié l'état de phosphorylation d'un substrat bien connu d'Aurora A, le résidu thréonine 210 (T210) de PLK1. II a été démontré que ce résidu est phosphorylé par Aurora A dans les centrosomes dans les cellules en phase G2 (Macurek et al. 2008. Nature. 455 : 119-123). Les figures 2D (haut) et 2E montrent que le traitement des cellules WT-AurA ou ASAurA dépourvues d'Aurora A endogène avec le 1-Na-PP1 pendant 24 heures ne modifie pas le niveau de PLK1 au niveau des centrosomes dans les cellules en phase G2. Par contre, la phosphorylation du résidu T210 est considérablement réduite dans les cellules AS-AurA en comparaison des cellules WT-AurA (Figure 2D (bas) et 2F), ce qui indique une forte inhibition de l'activité kinase d'AS-AurA par le 1-Na-PP1. EXEMPLE 4: L'inhibition spécifique de l'activité d'Aurora A en début 15 d'anaphase entraîne un défaut d'assemblage du fuseau central Nous avons utilisé la microscopie vidéo à intervalle réguliers pour filmer la prolifération des cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec du 1-Na-PP1 101.iM (Figure 3A). L'ajout de 1-Na-PP1 pour contrôler les cellules WT-AurA au moment du démarrage de 20 l'anaphase n'a aucun effet : les deux groupes de chromosomes se séparent et les cellules subissent une télophase et une cytokinèse normales (n=13). Dans les cellules AS-AurA traitées avec du 1-Na-PP1 à l'anaphase, les chromosomes se séparent mais s'arrêtent rapidement, et les cellules ne subissent pas la télophase ou la cytokinèse, ce qui conduit à des cellules binuclées (60 ± 6 %, n = 9). 25 La distance entre les deux groupes de chromosomes augmente jusqu'à la fin de la télophase dans les cellules WT-AurA contrôles, mais s'arrête rapidement d'augmenter dans les cellules AS-AurA, ce qui indique une probable anomalie en anaphase B (Figure 3B). Durant l'anaphase A, le mouvement des chromosomes dans les cellules HeLa est généré 30 par des forces de traction dues à la dépolarisation des microtubules du kinétochore. En anaphase B, les pôles du fuseau se séparent plus encore par l'action des microtubules du corps intermédiaire qui grandissent par polymérisation à leurs extrémités plus, tandis que les protéines motrices transversales migrent vers les extrémités plus, repoussant ainsi les microtubules polaires se chevauchant les uns sur les autres et les pôles du fuseau séparés de plus en plus. Cet événement nécessite un fuseau central fonctionnel, nous avons donc étudié l'assemblage du fuseau central dans le contexte d'une inhibition d'Aurora A. Nous avons généré des cellules WT-AurA et AS-AurA exprimant la GFP-tubuline de manière stable et nous les avons filmées avec un microscope vidéo con-focal. Comme décrit précédemment, les cellules ont d'abord été dépourvues d'Aurora A endogène et ensuite traitées avec du 1-Na-PP1 en début d'anaphase (Figure 3C). Les fuseaux centraux se forment normalement dans les cellules WT-AurA, mais pas 10 dans les cellules AS-AurA, ce qui implique une activité d'Aurora A dans l'assemblage du fuseau central. De manière intéressante, l'ajout de 1-Na-PP1 dans les cellules AS-AurA déjà engagées en anaphase B (avec les premiers microtubules du fuseau central qui grandissent) ne perturbe pas l'assemblage du fuseau. Pour mieux caractériser ce phénotype de manière 15 morphologique et statistique, nous avons synchronisé les cellules en anaphase et les avons observées par immunofluorescence (IF). Pour cela, les cellules WT-AurA ou ASAurA dépourvues d'Aurora A endogène ont été bloquées en fin de G2 par ajout de l'inhibiteur de CDK1, RO 3306 (Vassilev. 2006. Cell Cycle. 5 : 2555-2556), et relâchées en mitose par lavage avec du milieu frais. Une fois la majorité des cellules 20 entrées en tout début d'anaphase (75 minutes), celles-ci ont été traitées avec du 1-NaPP1. Douze minutes après la transition de la métaphase à l'anaphase, les cellules WTAurA sont entrées en télophase, tandis que les cellules AS-AurA ont présenté des anomalies substantielles concernant l'assemblage du fuseau central (Figure 3A et 3C). Nous avons donc bloqué les cellules à ce point précis et analysé l'état 25 anaphase/télophase par infrarouge. La figure 3D montre que l'inhibition d'Aurora A en début d'anaphase entraîne des défauts substantiels dans l'assemblage du fuseau central (42 ± 6% dans les cellules AS-AurA en comparaison avec 10 ± 3% pour les cellules WT-AurA contrôles, similaires aux cellules U2OS non traitées). Parmi les cellules présentant ce phénotype, 45% ont montré une désorganisation importante du fuseau 30 central et 55 % une absence totale de fuseau central. Dans celles ayant des fuseaux désorganisés, quelques microtubules sont présents et les microtubules du corps intermédiaire ne sont pas transversaux pour former un fuseau central fonctionnel (Figure 3D, comparer i et ii avec iii). Dans les cellules sans fuseau central, les deux groupes de chromosomes apparaissent très proches l'un de l'autre et mal orientés (Figure 3D, iv). Nous n'avons pas noté la présence de cellules avec des chromosomes retardataires. EXEMPLE 5: L'inhibition d'Aurora A en début d'anaphase altère fortement la localisation de MKLP1 et de P150Glued L'assemblage du fuseau central est un processus complexe impliquant différentes molécules avec des fonctions très spécifiques. Le « Centralspindlin complex », très conservé en termes d'évolution, est central dans ce processus. Il est composé d'une protéine kinésine 6 orientée plus, appelée MKLP1 chez les mammifères et protéine kinesin-like Pavarotti (Pav-KLP) chez la drosophile, et une protéine de type Rho activatrice de la GTPase (GAP), nommée RacGAP1 chez les mammifères et RacGAP50C chez la drosophile (Adams et al. 1998. Genes Dey. 12 : 1483-1494; Hirose et al. 2001. J Biol Chem. 276 : 5821-5828; Mishima et al. 2002. Dey Cell. 2 : 41-54). La localisation correcte du Centralspindlin chez la drosophile dépend du complexe de la dynactine et le retrait de la sous-unité dynactine de la P150Glued par ARN interférant dans les cellules S2 de drosophile perturbe la localisation de Pav-KLP et l'organisation du fuseau central (Delcros et al. 2006. J Cell Sci. 119 : 4431-4441). P150Glued est une protéine associée aux microtubules qui se lie à la dynéine (Vaughan et Vallee. 1995. J Cell Biol. 131 : 1507-1516) et est impliquée dans le transport bidirectionnel de cargo le long des microtubules (Deacon et al. 2003. J Cell Biol. 160 : 297-301). Récemment, il a été démontré que le domaine de fixation aux microtubules (MBD) de 25 P150 chez la drosophile est phosphorylé par Aurora A pendant la prométaphase. Cet événement est nécessaire pour que P150Glued soit relâchée des microtubules mitotiques et pour un assemblage correct du fuseau mitotique en métaphase. Le retrait d'Aurora A par ARN interférant dans les cellules S2 ou cellules embryonnaires de drosophile déclenche l'accumulation de P150Glued aux pôles du 30 fuseau (Rome et al. 2010. J Cell Biol. 189 : 651-659). Nous avons donc étudié la localisation cellulaire de P150Glued et MKLP1 pendant l'anaphase/télophase en conditions d'inactivation d'Aurora A. Nous avons observé par infrarouge que l'inhibition de l'activité d'Aurora A en début d'anaphase déclenche une mauvaise localisation de MKLP1 et l'accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau mitotique (55 ± 8 % et 77 ± 5% respectivement, figure 4A et 4B). De manière intéressante, l'absence de P150Glued par ARN interférant déclenche l'apparition de cellules présentant un fort défaut d'assemblage du fuseau central(Figures 4 C et D). Nous avons également testé l'effet d'une inhibition d'Aurora B car il a été démontré que cette kinase est impliquée dans l'organisation du fuseau central à travers le recrutement de facteurs d'empaquetage tels que Pav-KLP (Giet et Glover. 2001. J Cell Biol. 152 : 669-682; Glotzer. 2009. Nat Rev Mol Cell Biol. 10: 9-20) et dans la ségrégation des chromosomes en collaboration avec Aurora A (Hegarat et al. 2011. J Cell Biol. 195 : 1103-1113). Comme décrit plus haut, nous avons traité les cellules du R03306 et les avons relâchées en mitose tardive après lavages. Une fois une majorité des cellules entrées en anaphase, celles-ci ont été traitées avec du ZM447439 3 !AM. Bien que l'inhibition d'Aurora B à ce moment précis ait déclenché l'apparition de chromosomes retardataires et une désorganisation du fuseau central, nous n'avons pu détecter aucune accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau, ni aucune cellule sans microtubule dans le corps intermédiaire. EXEMPLE 6: La phosphorylation du résidu Serine 19 de la P150Glued est nécessaire pour l'assemblage du fuseau central. Chez la drosophile, huit sérines dans le MBD de P150Glued sont phosphorylées par Aurora A (Romé et al. 2010. J Cell Biol. 189 : 651-659), mais ces huit sérines ne sont pas conservées chez l'Homme. Pour identifier les résidus qui sont phosphorylés par Aurora A chez la P150Glued humaine, nous avons réalisé une Aurora A et un MBD de P150Glued recombinants (acides aminés 1 à 213). Nous avons utilisé une analyse phosphoprotéomique pour déterminer quels résidus de MBD sont phosphorylés par Aurora A in vitro. Nous avons obtenu plus de 85% de 30 couverture de séquence avec des analyses MS/MS, et ainsi identifié le résidu sérine 19 (Ser19) comme étant le seul résidu du MBD phosphorylé par Aurora A. Pour confirmer ce résultat, nous avons généré un MBD mutant S19A (l'alanine ne peut pas être phosphorylée) et réalisé des tests de phosphorylation in vitro (Figure 5A). Le MBD de P150Glued contrôle a été phosphorylé par Aurora A, et la mutation S19A a fortement éliminé la phoshorylation du MBD : le signal 32P est six fois plus faible dans le mutant 519A en comparaison avec le contrôle. Ceci confirme que le résidu S19 du MBD de P150Glued est phosphorylé directement par Aurora A in vitro. Pour vérifier l'effet de la phosphorylation de S19 de P150Glued sur l'assemblage du fuseau central, nous avons construit des mutants sauvage et 519 (519A ne peut pas être phosphorylé, et 519D représente une sérine phosphorylée de manière constitutive) de la protéine complète P150Glued-HAtag (HA-P150Glued) dans les cellules U205. HA-P150Glued est localisée sur les microtubules de manière similaire à la protéine 10 endogène (Figure 5B, haut et bas comparés). L'inhibition d'Aurora A conduit à une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau en anaphase/télophase et à des anomalies dans l'assemblage du fuseau central (Figures 5B (bas), 6C et 6D). Les localisations des mutants 519A et 519D sont significativement différentes. Le 15 mutant 519A s'accumule fortement sur les microtubules de l'interphase et sur les pôles du fuseau en métaphase et anaphase (Figures 6A (haut) et 6C). Contrairement à 519A, la fixation de 519D aux microtubules est fortement réduite en interphase et nous n'avons pu détecter aucune accumulation de Si 9D aux pôles du fuseau en métaphase ou anaphase (Figures 6A (bas) et 6D). 20 De manière intéressante, si l'expression du mutant 519D n'a pas déclenché d'anomalie d'organisation du fuseau central, celle de 519A a été associée à une forte augmentation du pourcentage de cellules présentant des anomalies du fuseau central (54 ± 3%, Figures 6A et 6C). Pour confirmer que la phosphorylation de S19 par Aurora A est nécessaire pour un 25 assemblage normal du fuseau central, nous avons testé si l'expression du mutant Si 9D est capable de corriger l'inhibition d'Aurora A. Les cellules AS-AurA ont été dépourvues d'Aurora A pendant 24, et ensuite transfectées avec des plasmides codant la P150Glued sauvage ou 519D. Après 24 heures, les cellules ont été synchronisées en début d'anaphase avec du R03306, traitées avec du 1-Na-PP1 pendant 12 minutes et 30 ensuite bloquées. Nous avons d'abord vérifié l'absence complète d'Aurora A endogène et vérifié que les protéines HA-P150Glued sont correctement produites quand du 1-NaPP1 est ajouté (Figure 6B). Nous avons ensuite quantifié les cellules en anaphase/télophase présentant des défauts d'assemblage du fuseau central ou une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau (Figure 6C et D). Le pourcentage de cellules en anaphase présentant des défauts d'assemblage du fuseau 5 central ou une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau a été significativement réduit par l'expression de HA-P150Glued S 19D mais pas par l'expression de HA-P150Glued sauvage. Ceci confirme que le mutant mimant la HA-P150Glued phosphorylée (c'est-à-dire le mutant S19D) est capable de corriger l'inhibition d'Aurora A, au moins partiellement. 10 EXEMPLE 7 : Matériels et Méthodes Constructions génétiques et purification des protéines Pour la purification des protéines recombinantes, les ADNc d'Aurora A et de P150 15 Glued correspondant au domaine de fixation du microtubule ont été insérés dans le vecteur pET29. Les mutants Aurora A (L210A) et P150 Glued (S19A, S 19D) ont été réalisés en utilisant le kit de mutagénèse QuickChange (Stratage). Aurora A a été retirée des cellules U2OS de la manière décrite dans l'article de Reboutier et al. (2012. J Cell Biol. 197 : 19-26). En bref, les cellules ont été transfectées pendant 24 heures en 20 utilisant un Jetprime (Polyplus transfection), selon les recommandations du fabriquant, avec un oligonucléotide d'ARN interférant correspondant à la séquence : AUGCCCUGUCUUACUGUCA. L'absence de protéine Aurora A endogène a été systématiquement vérifiée par western blot dans chaque expérience. L'ADNc correspondant à la protéine AurA sauvage et à la protéine aurora A mutée a été inséré 25 dans un vecteur pEGFP-C1 sous le contrôle de la séquence du promoteur d'Aurora A pour contrôler les niveaux physiologiques d'expression. P150 glued sauvage et les séquences mutantes ont été insérées dans un vecteur pCDNA 3.1. Pour la production des protéines recombinantes, des souches d'Escherichia cou BL21 ont été transformées avec des plasmides, induites par 1 mM d'IPTG pendant 4 heures, culottées et congelées 30 à -80°C. Les protéines marquées par His-Tag (Aurora A humaine, TPX2) ont été purifiées selon le protocole décrit dans Roghi et al. (1998. J Cell Sci. 111(5) : 557-772. Les culots bactériens ont été lyses et chargés sur des billes Talon® (Talon Beads, ClonTech), les échantillons ont été lavés et les protéines ont été éluées avec du tampon contenant 50 mM d'imidazole. Les protéines purifiées ont été conservées à -80°C ou dans du glycérol 50% à -20°C. Culture cellulaire, synchronisation et transfection Les cellules humaines U2OS ont été cultivées dans du Milieu de Mc Coy avec de la pénicilline et de la streptomycine (Invitrogen), et 10 % d'albumine de veau foetal (PAA). Les cellules ont été transfectées dans un milieu de culture en utilisant le kit de transfection JetPrime (Polyplus Transfection) selon les instructions du vendeur. Le milieu a été changé après 24 heures. Pour la synchronisation anaphase/télophase, les cellules ont été stoppées en phase G2 par un traitement de 16 heures avec 10 [tM de R0336 (Calbiochem) et ensuite lavées trois fois pendant 30 secondes avec du milieu préchauffé. Les premières cellules entrent en anaphase approximativement 1 heure après le premier lavage. Immuno fluorescence Les cellules ont été d'abord déposées sur des plaques en verre, fixées avec du méthanol à -20°C pendant 10 min (ou avec du paraformaldéhyde 4% pendant 10 minutes pour l'observation de la GFP), et ensuite lavées trois fois dans du PBS et saturées avec du PBS-BSA 1% pendant 1 heure à température ambiante. Des anticorps dans du PBS- BSA 1% ont été ajoutés sur les cellules : anti a-Tubuline de rat 1:1000 (clone YL1/2, Millipore), anti-gamma-tubuline de souris 1:1000 (clone GTU88, Sigma), anti-Aurora A de souris (clone 35C11 :20) (Cremet et al., 2003), anti-MKLP1 de lapin 1:1000 (Santa-Cruz), anti-P150Glued de souris (BD Transduction Laboratories), anti-HA 1/1000 de souris (Covance), anti-PLK1 de souris (Abcam), anti-T210 P-PLK1 de souris (BD Pharmingen). Les cellules ont été incubées avec les anticorps durant une nuit à 4°C, et ensuite lavées trois fois et incubées dans le noir avec des anticorps secondaires (anti-souris, anti-lapin 488 ou 55 1:1000, Alexa, Invitrogen) pendant 1 heure à température ambiante. Après trois derniers lavages avec du PBS, les plaques ont été préparées avec du Prolongold (Invitrogen) avec 11.tg/m1 de DAPI (Sigma). Les cellules ont été examinées en utilisant un microscope à fluorescence LEICA DMRXA2 avec un objectif 63X à immersion dans l'huile, et les images ont été traitées en utilisant le logiciel Metamorph (Universal Imaging). Visualisation des cellules vivantes Les cellules ont été cultivées dans des plaques cloisonnées Lab Tek I (Nunc). Avant la microscopie, le milieu a été remplacé par du milieu indépendant en CO2 complété avec 10% de FBS et 200 mM de L-glutamine (Invitrogen). Pour le traitement avec le 1-Na- PP1, nous avons sélectionné les cellules métaphasiques, nous avons attendu que celles-ci entrent en anaphase, et ensuite nous avons ajouté immédiatement le 1-Na-PP1 . Des images à intervalles réguliers ont été obtenues en utilisant un objectif Plan Apo 60x/1.4 NA avec un microscope (Nikon) équipé d'un disque tournant (CSU-X1 ; Yokogawa), une chambre thermostatique (Life Imaging Service), une plateforme Z Piezo Stage (Marzhauser), et un dispositif de caméra à couplage de charge (CoolSnap HQ2, Roper Scientific). Le logiciel Metamorph (Universal imaging) a été utilisé pour collecter les données. Des prises de vue ont été enregistrées à chaque minute. Les images sont des projections maximales de 20 plans Z séparés par 0,6 mm. Les données à intervalles réguliers ont été traitées par le logiciel Metamorph. Analyses Western Blot Les cellules ont été lysées dans du tampon RIPA contenant de l'anti-protéase (Complete, Roche) et les lysats ont été clarifiés par centrifugation (13000 rpm, 30 min, 4°C). Les protéines ont été dosées par la méthode Bradford (Bradford Assay) (BioRad). Des quantités égales de lysats de protéines dans du tampon Laemmli ont été déterminées par SDS-PAGE 12,5%, et transférées sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées pendant 1 heure à température ambiante avec du TBST avec 4% de lait, et incubées ensuite pendant la nuit avec les anticorps suivants : anti-13- tubuline de souris 1:2000 (Sigma), anti-Aurora A de souris (clone 35C1 1 : 100) (Cremet et al. 2003. Mol Cell Biochem. 243 : 123-131), anti-HA de souris (Covance). Les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires couplés à la HRP (Jackson) pendant 1 heure et la fixation de l'anticorps a été détectée par chimioluminescence améliorée (Pico ou Dura, Pierce). Mesures in vitro de la kinase Des quantités déterminées de protéines recombinantes Aurora A, MBD et TPX2 ont été mélangées dans une solution de 50 mM de Tris HCL pH 7,5, 25 mM NaC1, 1 mM DTT, 0,01% TritonX-100, 10 mM de MgC12. Ensuite, 100 [tM d'ATP et 2 [iCi d'ATP [y-32- P] ont été ajoutés et les mélanges réactionnels ont été incubés à 37°C pendant 10 minutes. Les réactions ont été stoppées par ajout du tampon Laemmli, et les échantillons ont été bouillis pendant 5 minutes, et analysés par SDS-PAGE 12,5%. Les gels ont été marqués au bleu de coomassie, fixés, séchés et autoradiographiés avec un Storm 840 (Molecular Dynamics). Analyse par spectrométrie de masse Les protéines purifiées ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel 12% pré-fabriqué (NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies, Saint Aubin, France). Le gel a été marqué en utilisant le réactif de marquage de gel EZBlue (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), et des morceaux de gel correspondant à P150Glued ont été démarqués et lavés avec une série de solutions d'acétonitrile (ACN) 100 mM NH4HCO3. Les protéines ont été réduites avec du DTT 65 mM pendant 15 minutes à 37°C et alkylées avec 135 mM d'iodoacétamide dans le noir à température ambiante. Les échantillons ont été lavés avec une série de solutions de ACN/100 mM NH4HCO3 et déshydratés avec de l'ACN 100%. Les protéines ont été digérées pendant la nuit à 37°C avec 4 ng/p1 de trypsine modifiée (Promega, Charbonnière-les-Bains, France) dans du NH4HCO3. Les produits protéolytiques ont été extraits du gel par incubations séquentielles dans du ACN/H20/HCOOH, 70:30:0,1 (v/v/v) et ACN 100%, puis concentrés dans un Speed Vac (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France) à un volume final de 40 jil. Les peptides ont été analysés en utilisant un système de chromatographie haute performance nanoflow (Dionex, LC Packings Ultimate 3000) connecté à un LTQ-OrbiTrap XL hybride (Thermo Scientific) équipé d'une source d'ions nanoelectrospray. 30 REVENDICATIONS1. Protéine Aurora A mutée dérivée d'une protéine kinase Aurora A sauvage et dont la séquence possède au moins 80 % de similarité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO: 1, ladite protéine Aurora A mutée, assurant de manière identique les mêmes fonctions cellulaires que celles assurées par ladite protéine kinase Aurora A sauvage dont elle dérive, et possédant : - au moins une substitution de l'acide aminé situé en position 210 ou équivalente, par rapport à la séquence SEQ ID NO: 1, par un acide aminé naturel ou non naturel différent de la leucine, et - une activité kinase pouvant être inhibée complètement ou partiellement en présence d'un composé inhibiteur, ledit composé inhibiteur étant inactif vis-à-vis de la protéine kinase Aurora A sauvage dont dérive ladite protéine Aurora A mutée. 2. Protéine Aurora A mutée selon la revendication 1, dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO: 1, est substitué par une alanine. 3. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite protéine Aurora A mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 19. 4. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite activité kinase correspondant à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA. 5. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications, ledit composé inhibiteur étant une molécule analogue de l'ATP. 6. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications, ledit composé inhibiteur étant le 1-Na-PP1. 7. Acide nucléique codant la protéine Aurora A mutée telle que définie selon l'une quelconque des revendications précédentes. 8. Acide nucléique selon la revendication 7, ledit acide nucléique possédant des mutations silencieuses par rapport à la séquence de l'acide nucléique codant la protéine Aurora A sauvage dont dérive la protéine Aurora A mutée. 9. Acide nucléique selon la revendication 7 ou 8, ledit acide nucléique correspondant à la séquence SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18,20 ou 21. 10. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini selon l'une des revendications 7 à 9. 11. Cellule exprimant la protéine Aurora A mutée telle que définie dans les revendications 1 à 6. 12. Utilisation in vitro ou ex vivo d'une protéine Aurora A mutée telle que définie selon une des revendications 1 à 6 comme outil de recherche pour déterminer l'effet inhibiteur d'une molécule chimique vis-à-vis d'une protéine kinase Aurora A sauvage possédant au moins 80 % de similarité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO: 1: 13. Utilisation selon la revendication précédente dans laquelle : - un premier échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine kinase Aurora A sauvage en présence de ladite molécule chimique, et - un second échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine Aurora A mutée, mais n'exprimant pas ladite protéine kinase Aurora A sauvage, en présence d'un inhibiteur de l'activité kinase, sont comparés l'un à l'autre, ledit second échantillon étant représentatif d'une inhibition spécifique l'activité kinase de ladite protéine Aurora A sauvage.35 14. Utilisation selon la revendication 13 dans laquelle l'échantillon correspondant aux cellules exprimant la protéine Aurora A mutée est utilisée comme témoin de comparaison pour mesurer la spécificité d'un inhibiteur de la protéine Aurora A sauvage. 15. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 14 dans laquelle une activité kinase est mesurée dans les deux échantillons. 16. Utilisation selon la revendication 15, dans laquelle ladite activité kinase 10 correspond à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA. 17. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 16, dans laquelle la prolifération 15 cellulaire est mesurée dans les deux échantillons. 18. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 17, dans laquelle lesdites cellules sont observées par microscopie dans les deux échantillons. 20 19. Kit comprenant une protéine Aurora A mutée telle que définie selon une des revendications 1 à 6 et un composé inhibiteur.