FR 2990514 A1 20131115 FR 1254398 A 20120514 - 1 - DESCRIPTION La présente invention se rapporte au domaine des marqueurs de diagnostic de maladie, et plus particulièrement au domaine des marqueurs de différenciation de diagnostic permettant une discrimination anticipée entre deux maladies. La maladie de Devic (NMO) et la sclérose en plaques (SEP) sont deux maladies démyélinisantes inflammatoires qui touchent le système nerveux central et se caractérisent par des attaques sévères de névrite optique et de myélite. Bien que ces deux maladies présentent des symptômes similaires, le traitement adapté à chacune d'entre elles est différent. Aussi, lorsqu'un patient présente certains symptômes, il est indispensable de pouvoir effectuer une discrimination efficace entre ces maladies afin de proposer les soins nécessaires. Actuellement, la différenciation de ces maladies est effectuée par l'utilisation de marqueurs anticorps sériques hautement spécifiques (NMO-IgG) qui différencient la maladie de Devic (NMO) de la sclérose en plaques (SEP). Cet anticorps sérique cible l'aquaporine-4, une protéine qui forme le principal canal de régulation de l'homéostase de l'eau au travers de membranes cellulaires du système nerveux central. L'aquaporine-4 est exprimée au niveau des extrémités de rameaux de cellules astrogliales et de membranes périvasculaires et subpiales. Cependant, la sensibilité de cet anticorps sérique est relativement peu importante. Il est donc nécessaire que la maladie soit suffisamment avancée et l'aquaporine-4 suffisamment exprimée pour que l'utilisation de cet anticorps soit efficace. La maladie ne pouvant être déterminée suffisamment tôt, le traitement de celle-ci s'en trouve alors retardé en conséquence. La présente invention a pour but de surmonter un tel inconvénient en proposant une méthode de diagnostic différentiel permettant une discrimination anticipée par rapport à celle existante entre un profil sérique de patient atteint de sclérose en plaques et un profil sérique de patient atteint de la maladie de Devic. Cet objectif est atteint grâce à une méthode de diagnostic différentiel permettant une discrimination entre un profil atteint de sclérose en plaques et un profil atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que cette méthode comprend au moins : -2- - une étape de préparation d'au moins un échantillon de sérum à partir d'un prélèvement auprès d'un patient atteint d'une maladie à déterminer, - une étape d'utilisation de l'acétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de la maladie de Devic, - une étape d'utilisation du scyllo-inositol et/ou de l'oxaloacétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, - une étape de corrélation entre la présence d'au moins un marqueur dans l'échantillon préparé et le profil de l'échantillon et une étape de détermination de la maladie du patient prélevé. L'invention a également pour objet un dispositif de mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic différentiel caractérisé en ce que le dispositif comprend : - un moyen de mesure de la concentration d'au moins un marqueur, scyllo-inositol et/ou oxaloacétate et/ou acétate, dans un échantillon de sérum, - un moyen de comparaison de la concentration mesurée avec 20 au moins une valeur seuil. L'invention porte également sur un marqueur différentiel d'un échantillon de sérum correspondant à un profil atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que ce marqueur est formé par l'acétate, ainsi que sur un marqueur différentiel d'un échantillon de sérum correspondant à un 25 profil atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce que ce marqueur est formé par le scyllo-inositol et/ou l'oxaloacétate. L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci-après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins 30 schématiques annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la représentation schématique d'une molécule d'acétate, - la figure 2 illustre la représentation schématique d'une molécule de scyllo-inositol, 35 - la figure 3a présente des exemples de spectre RMN HR-MAS d'échantillons de sérum provenant respectivement d'un profil sain, d'un - 3 - profil atteint de sclérose en plaques et d'un profil atteint de la maladie de Devic, - la figure 3b présente une expansion du spectre présentant la zone de l'acétate, - la figure 3c présente une expansion du spectre présentant la zone du scyllo-inositol, - les figures 4a, 4b et 4c présentent différents modèles de matrices déterminées par PLS-DA permettant une corrélation entre des échantillons de sérum analysés se rapportant à un profil sain, un profil 10 atteint de la maladie de Devic et un profil atteint de sclérose en plaques, - les figures 5a, 5b et 5c présentent les mesures comparées de concentration d'acétate, de scyllo-inositol et d'oxaloacétate présentent respectivement dans un profil sain, un profil atteint de la maladie de Devic et un profil atteint de sclérose en plaques. 15 L'objet de l'invention repose sur l'utilisation de marqueurs particuliers à chacune des deux maladies que sont, d'une part, la sclérose en plaques et, d'autre part, la maladie de Devic pour permettre une différenciation anticipée de l'une de ces maladies par rapport à l'autre. L'invention porte ainsi, d'une part, sur un premier marqueur 20 différentiel d'un échantillon de sérum qui correspond à un profil atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que le marqueur est formé par l'acétate, et, d'autre part, sur un second marqueur différentiel d'un échantillon de sérum qui, lui, correspond à un profil atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce que le marqueur est formé par le scyllo-inositol 25 et/ou l'oxaloacétate. Les marqueurs considérés dans la présente invention sont des molécules ou métabolites absents ou présents naturellement dans les échantillons analysés. Ces éléments de marquages considérés sont endogènes. 30 La présente invention se rapporte alors aussi à une méthode de diagnostic différentiel permettant une discrimination entre un profil sérique de patient atteint de sclérose en plaque et un profil sérique de patient atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que cette méthode comprend au moins : 35 - une étape de préparation d'au moins un échantillon de sérum à partir d'un prélèvement auprès d'un patient atteint d'une maladie à déterminer, -4- - une étape d'utilisation de l'acétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de la maladie de Devic, - une étape d'utilisation du scyllo-inositol et/ou de 5 l'oxaloacétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, - une étape de corrélation entre la présence d'au moins un marqueur dans l'échantillon préparé et le profil de l'échantillon préparé et une étape de détermination de la maladie du patient prélevé. 10 Selon une particularité de réalisation, la méthode de diagnostic fait intervenir en outre : - une étape d'utilisation de l'acétate comme marqueur différentiel consistant en une étape de détermination d'une concentration d'acétate dans l'échantillon de sérum prélevé, 15 - une étape d'utilisation du scyllo-inositol et/ou de l'oxaloacétate comme marqueur différentiel consistant en une étape de détermination d'une concentration de scyllo-inositol et/ou d'oxaloacétate dans l'échantillon de sérum prélevé, - une étape de comparaison d'au moins une des valeurs de 20 concentration mesurée avec au moins une valeur seuil. Un exemple de réalisation non-limitatif de l'invention consiste à utiliser la technologie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) pour effectuer une détermination de la concentration d'au moins un des marqueurs. Cette technologie est connue et un exemple d'excitation et 25 d'acquisition de signaux de RMN dans un solvant est détaillé dans la publication du brevet d'invention FR 2698177. Dans le cadre d'une mesure de concentration à partir de la technologie RMN, de façon non limitative, le procédé comprend notamment un prélèvement de sérum sanguin selon un processus classique. 30 A titre d'exemple, ce processus fait intervenir une étape de centrifugation du sang prélevé à 2000 rpm pendant 10 minutes pour permettre la récupération du sérum, suivi d'un échantillonnage de ce sérum. L'échantillonnage est réalisée dans un tube adapté pour une analyse RMN ou dans un rotor pour une analyse RMN HR-MAS (High Resolution Magic 35 Angle Spirming) Dans le cadre de l'analyse, le champ magnétique du spectromètre est stabilisé par addition d'eau lourde (D20) aux échantillons. - 5 - Ce stabilisant est particulièrement adapté à l'analyse d'échantillons biologiques. De même, le calibrage en fréquence du spectre RMN mesuré est effectué à partir d'une molécule de référencement. Un exemple non-5 limitatif de molécule utilisée est le lactate qui a comme avantage d'être une molécule ayant un spectre RMN caractéristique facilement identifiable correspondant à un pic à la fréquence 1,33 ppm et d'être présente naturellement en quantité dans les solutions biologiques telles que les échantillons de sérum étudiés. Cette molécule de référencement permet 10 ainsi le calibrage du spectre mesuré avec un alignement des pics de fréquence 1,33 ppm. Dans le but d'effectuer des mesures de concentration absolue, par exemple en Ilmol/L, des différents métabolites présents dans les sérums, le spectromètre RMN est préalablement calibré grâce à un échantillon de 15 référence. Cet échantillon de référence est réalisé, par exemple, par un échantillon de lactate de concentration connue en solution dans un solvant par exemple de l'eau deutérée D20. Dans le cadre d'une spectroscopie RMN des échantillons de sérum, l'analyse du spectre est effectuée en faisant intervenir une séquence 20 CPMG (Carr, Purcell, Meiboom, Gill) d'impulsions RMN. Cette séquence d'impulsions facilite l'obtention d'un spectre d'analyse des petites molécules de la solution étudiée au détriment des molécules plus grosses telles que les lipides dont le poids moléculaire est sensiblement plus important. 25 Alternativement, la mesure de concentration peut faire intervenir la technologie RMN-HRMAS. Cette technologie est également connue. Une première solution non-limitative pour la réalisation de l'étape de corrélation entre le marquage d'un échantillon et le profil de 30 l'échantillon préparé consiste en : - une étape de mesure d'une concentration d'acétate comprise dans un intervalle correspondant à trois fois et quatre fois celle d'une concentration d'acétate d'un échantillon correspondant à un profil sain, ou bien 35 - une étape de mesure d'une concentration de scyllo-inositol comprise dans un intervalle correspondant à deux fois et trois fois celle - 6 - d'une concentration de scyllo-inositol d'un échantillon correspondant à un profil sain, ou bien - une étape de mesure d'une concentration d'oxaloacétate comprise dans un intervalle correspondant à entre 3,5 fois et 4,5 fois celle d'une concentration d'oxaloacétate d'un échantillon correspondant à un profil sain. Selon une particularité de réalisation, lors de l'étape de corrélation, la mesure de concentration de l'acétate dans un échantillon correspondant à un profil atteint de la maladie de Devic, est préférentiellement comprise dans un intervalle correspondant à 3,25 fois et 3,75 fois la mesure de concentration du marqueur d'un échantillon correspondant à un profil sain, voire idéalement comprise dans un intervalle correspondant à 3,3 fois à 3,5 fois la mesure de concentration de l'acétate d'un échantillon correspondant à un profil sain. Selon une particularité de réalisation complémentaire, lors de l'étape de corrélation, la mesure de concentration du scyllo-inositol dans un échantillon correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, est préférentiellement comprise dans un intervalle correspondant à 2,25 fois et 2,95 fois la mesure de concentration du marqueur d'un échantillon correspondant à un profil sain, voire idéalement comprise dans un intervalle correspondant à 2,5 fois à 2,7 fois la mesure de concentration du scylloinositol d'un échantillon correspondant à un profil sain. Selon une particularité de réalisation complémentaire, lors de l'étape de corrélation, la mesure de concentration de l'oxaloacétate dans un échantillon correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, est préférentiellement comprise dans un intervalle correspondant à 3,5 fois et 4,5 fois la mesure de concentration du marqueur d'un échantillon correspondant à un profil sain, voire idéalement comprise dans un intervalle correspondant à 3,9 fois à 4,1 fois la mesure de concentration de l'oxaloacétate d'un échantillon correspondant à un profil sain. Une seconde solution non-limitative pour la réalisation de l'étape de corrélation consiste en l'utilisation de la régression PLS (Partial Least Squares régression) intégrant une variante connue sous le nom PLS- DA. (Partial Least Squares régression Discriminant Analysis). Une explication de cette méthode PLS connue se trouve notamment détaillée - 7 - dans l'ouvrage La régression PLS : Théorie et Pratique - Tenenhaus M (1998). Cette technologie fait intervenir un traitement et une analyse statistique multivariée des données qui ont été enregistrées par RMN. Cette approche statistique permet de prendre en considération non seulement l'acétate le scyllo-inositol et l'oxaloacétate, comme marqueur des maladies, mais également, accessoirement, d'autres métabolites secondaires discriminants tels que, par exemple, le glutamate, le lactate, la glutamine, la lysine, et la valine. A partir d'échantillons de sérum issus de groupes d'une quarantaine de patients pour lesquels soit la maladie de Devic, soit la sclérose en plaques a été diagnostiquée, trois modèles de matrices PLS ont été réalisés discriminant, d'une part, les patients NMO et les patients MS (figure 2a), d'autre part, les patients NMO et les patients d'un groupe de contrôle (figure 2b) et, d'autre part encore, les patients MS et les patients d'un groupe de contrôle (figure 2c). Ces différentes matrices font apparaitre une discrimination notable des groupes de patients analysés. Ces matrices ont été élaborées sur la base d'échantillons de sérum obtenus à partir de 42 patients MS, 40 patients NMO et 42 patients sains. L'analyse RMN d'un nouvel échantillon de sérum puis son traitement statistique par PLS-DA permettent de le positionner dans chacun des différents modèles de matrices. A partir de ce positionnement dans les matrices, une corrélation entre l'échantillon de sérum analysé et une des maladies, sclérose en plaques ou maladie de Devic, peut être établie en vue d'une étape ultérieure de diagnostic. Selon une réalisation préférée mais non-limitative, la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic selon l'invention fait intervenir un dispositif comprenant - - un moyen de mesure de la concentration d'au moins un 30 marqueur, scyllo-inositol et/ou oxaloacétate et/ou acétate, dans un échantillon de sérum, - un moyen de comparaison de la concentration mesurée avec au moins une valeur seuil, et/ou - un moyen de comparaison de l'échantillon de sérum analysé 35 avec un ou plusieurs modèles préétablis par PLS-DA. Ce dispositif est préférentiellement arrangé pour mettre en oeuvre au moins une étape d'une méthode de diagnostic selon l'invention. - 8 - Par ailleurs, ce dispositif est arrangé pour mettre en oeuvre la technologie RMN et/ou la technologie RMN HRMAS et/ou une unité d'analyse PLS-DA. Un exposé des étapes de recherche ayant permis d'aboutir au marqueur de l'invention est détaillé ci-après : La neuromyélite optique de Devic (NMO) est une maladie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central qui est caractérisée par des attaques sévères des nerfs optiques et de la moelle épinière. Le fait que la NMO soit une variante de la sclérose en plaques (SEP) ou une maladie distincte a été longuement débattu [Annexe 1, Annexe 2]. De nos jours, la NMO est reconnue comme une entité clinique distincte, différenciée de la sclérose en plaques par des critères cliniques, neurologiques et sériques [Annexe 3]. La présence d'un anticorps marqueur hautement spécifique (NMO-IgG) permet de différencier la NMO de la SEP et a permis de définir un spectre NMO [Annexe 4]. Cet anticorps cible l'aquaporine-4 (AQP4), une protéine qui forme le principal canal de régulation de l'homéostasie de l'eau au travers des membranes cellulaires du système nerveux central [Annexe 5]. AQP4 est exprimée au niveau des extrémités des rameaux des cellules astrogliales et des membranes périvasculaires et subpiales [Annexe 5]. Cependant, la sensibilité de cet anticorps est relativement basse, entre 50 et 70% [Annexe 6] et il existe un réel besoin de trouver d'autres marqueurs de cette pathologie. Les traitements utilisés dans le cas de NMO et SEP étant différents, un diagnostic différentiel entre ces deux pathologies est essentiel [Annexe 7]. Aujourd'hui, il n'existe pas d'autres outils de diagnostic biologique que la détection de NMO-IgG pour effectuer cette différentiation. Nous avons donc développé une approche métabolomique dans le but de trouver des marqueurs de substitution pour distinguer NMO de SEP et de contrôles sains. Notre étude démontre l'utilité de la RMN HR-MAS du proton en tant que nouvel outil analytique pour distinguer deux populations de patients affectées par la NMO et la SEP en se basant sur leur profil métabolique sérique respectif MATERIELS ET METHODES Population de patients : 43 patients atteints de SEP et 46 patients atteints de NMO ont été inclus dans cette étude. Ils ont été cliniquement évalués dans le - 9 - Département de Neurologie des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg entre 2005 et 2011 selon plusieurs critères cliniques et biologiques [Annexe 8, Annexe 9]. Le groupe contrôle est constitué de 44 sujets sains, échantillonnés uniformément en âge et en sexe, et choisis parmi le personnel des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg. Tous les sujets sains sélectionnés ne sont affectés d'aucune pathologie aigüe ou chronique. L'autorisation pour cette étude a été obtenue auprès du comité éthique de recherche et tous les sujets impliqués ont donné leur consentement écrit. Echantillons de Sérum : Les échantillons de sang ont été collectés dans des tubes de 5 ml et transportés sur de la glace avant d'être centrifugés à une vitesse de 2000 rpm pendant 10 min puis aliquotés. Tous les échantillons ont ensuite été stockés à une température de -80°C et analysés après un maximum de deux cycles de congélation-décongélation. Les échantillons destinés à l'analyse par RMN HR-MAS ont été préparés en introduisant 18 !al de sérum de patient préalablement décongelé à température ambiante dans un insert jetable en KelF de 30 !al Afin de stabiliser le champ magnétique du spectromètre RMN, 8 lut d'oxyde de deutérium (D20) ont ensuite ajoutés dans l'insert. Analyse Métabolomique : Acquisition des données : Les spectres RMN HRMAS lil ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance III fonctionnant à une fréquence lil de 500,13 MHz. Le spectromètre est équipé d'une sonde HRMAS 4 mm double résonance (1H, 13C) munie de gradients pulsés. Une unité de refroidissement Bruker de type BCU est utilisée pour réguler la température de l'échantillon de sérum à 3°C en refroidissant le gaz qui circule à l'intérieur de la sonde. Toutes les expériences RMN ont été enregistrées sur des échantillons tournant à une vitesse de 3502 Hz afin de positionner les bandes de rotation en dehors de la zone spectrale d'intérêt. Pour chaque spectre, une expérience monodimensionnelle proton de type Carr-Purcell-MeiboomGill (CPMG) a été enregistrée (séquence d'impulsions Bruker cpmgprld). Cette séquence permet une meilleure observation des métabolites en réduisant l'intensité des signaux des lipides dans le spectre. Le délai de la séquence CPMG qui se trouve entre les impulsions de 180° est synchronisé - 10 - avec la vitesse de rotation à une valeur de 285 Ils (1/w, = 1/3502 = 285 lus) afin d'éliminer les pertes de signal dues aux inhomogénéités de champ magnétique B1 [Annexe 10], [Annexe 11]. Le nombre de boucles de la séquence CPMG est fixé à 328 ce qui conduit à un train d'impulsions CPMG de durée 93 ms. La séquence CPMG a été acquise avec les paramètres suivants: largeur spectrale 14,2 ppm, nombre de points 32 k, délai de relaxation 2 s et temps d'acquisition 2,3 s. Un total de 1024 passages a été enregistré par échantillon ce qui résulte en un temps d'acquisition total de 76 minutes. Ce nombre de passages élevé se justifie par la faible quantité d'échantillon de sérum étudié (18 pl). Les signaux RMN ont ensuite été multipliés par une fonction exponentielle de 0,3 Hz avant d'être traités par transformée de Fourier. Le spectre résultant est alors phasé et la ligne de base corrigée (Topspin2 0, Bruker BioSpin). Le spectre est référencé en déplacement chimique en utilisant les protons du groupe méthyle du lactate à 1,33 ppm. Afin de confirmer les attributions des résonances, des expériences bidimensionnelles homonucléaires et hétéronucléaires ont été enregistrées sur 8 échantillons. Les spectres 2D DIPSI2 ont été acquis avec un temps d'acquisition de 170 ms, un temps de mélange de 60 ms, une fenêtre spectrale de 14,2 ppm et un délai de relaxation de 1,5s [Annexe 12]. Un total de 64 passages a été enregistré pour chacun des 512 incréments en tl, ce qui correspond à un temps d'acquisition total de 7h. Lors du traitement, les données sont complétées par des zéros pour générer une matrice de 2k x lk points. Après multiplication par une fonction cos2, les données sont traitées par une transformée de Fourier dans les deux dimensions. Les expériences 2D HSQC 1H-13C utilisant une sélection de type écho-antiécho dans la dimension indirecte ont été acquises avec un délai de relaxation de 1,5 s et un temps d'acquisition de 73 ms avec découplage des spins carbones à l'aide d'une séquence GARP [Annexe 13]. Un total de 70 passages a été enregistré pour chacun des 512 incréments tl, ce qui correspond à un temps d'acquisition total de 16h. Deux gradients sinusoïdaux de 1 ms et de puissance respective 40 et 10,05 G/cm ont été utilisés dans l'expérience. Lors du traitement, les données sont complétées par des zéros pour former une matrice de 2k x lk points. Après multiplication par une fonction cos2, les données sont traitées par une transformée de Fourier dans les deux dimensions. Analyse Statistique Multivariée : La région spectrale entre 4,7 et 0,5 ppm de chaque spectre 1D CPMG a été automatiquement convertie en régions de 0,01 ppm en utilisant le logiciel AMIX 3.8 (Bruker BioSpin). Cette procédure minimise les effets de décalage en fréquence des pics dus à des variations de pH ou de concentration saline. L'intégrale de chaque région de 0,01 ppm a été calculée et normalisée par rapport à l'intégrale totale du spectre entre 4,7 et 0,5 ppm. Ce processus génère une matrice X qui contient 421 colonnes (déplacements chimiques) et 133 rangées (correspondant à 43 échantillons de sérum de patients affectés par la SEP, 46 échantillons de sérum de patients affectés par la NMO et finalement 44 échantillons de contrôle). Cette zone spectrale a été sélectionnée parce qu'elle est la plus riche en information. Les données sont ensuite importées dans le logiciel SIMCA P 11.0 (Umetrics AB, Umeâ, Suède) et prétraitées en utilisant une mise à l'échelle de type Pareto de chacune des colonnes de la matrice X. Cette procédure attribue un poids égal à chacun des métabolites présents à haute et basse concentration tout en minimisant la contribution du bruit. La matrice X a ensuite été soumise à une analyse en composantes principales (ACP) à l'aide du logiciel SIMCA P 11. Cette procédure permet d'évaluer rapidement la qualité des données et d'identifier de possibles échantillons discordants. Après l'analyse ACP, trois analyses différentes basées sur l'analyse discriminante PLS ont été effectuées afin de construire un modèle statistique qui optimise la séparation entre les deux classes de patients et entre chaque classe de patients et le groupe de contrôle [Annexe 14]. Un tableau Y représentant l'appartenance de chaque échantillon à une classe donnée est alors créé. Typiquement, pour un modèle à deux classes les valeurs de Y seront de 0 ou de 1. A chaque fois, le nombre de composantes du modèle PLS-DA a été déterminé par validation croisée. L'appartenance de chaque échantillon à une classe donnée est prédite de façon itérative et le résultat est utilisé pour générer une mesure de la qualité de la représentation (Q2=1-PRESS/SS) pour la totalité du modèle. Le paramètre PRESS représente la somme des erreurs des différences au carré entre les valeurs Y observées et prédites lorsque chaque échantillon est tour à tour exclu du développement du modèle. SS représente la somme résiduelle au carré de la composante précédente. Puisque les modèles PLS-DA sont habituellement construits en utilisant un nombre relativement réduit d'échantillons, la validation croisée du modèle est obligatoire afin d'éviter de surmodéliser - 12 - les données [Annexe 15]. La valeur théorique maximale pour Q2 est égale à 1 pour une parfaite prédiction. Cependant, une valeur de Q2 supérieure à 0,5 est généralement considérée comme un prédicteur acceptable. Afin de valider le modèle, une procédure de validation circulaire/croisée a ensuite été effectuée. Les valeurs Y de chaque biopsie (NMO, SEP, contrôle) sont permutées de façon aléatoire et pour chaque permutation, une nouvelle valeur de Q2 est calculée. Cette procédure est répétée pour un grand nombre de permutations et la valeur de Q2 et tracée en fonction du nombre de permutations de Y. Un modèle est considéré comme satisfaisant si la droite de régression obtenue par permutation circulaire possède une pente négative et si toutes les valeurs estimées de Q2 sont inférieures à la valeur originale. Cette propriété montre qu'aucune des valeurs des matrices permutées Y n'est meilleure que le modèle original. Quantification des Metabolites : La quantification des deux métabolites les plus discriminants a été effectuée en calibrant le spectromètre à l'aide d'un échantillon référence contenant 1.93 pmoles de lactate en solution dans du D20 puis en utilisant la procédure de quantification basée sur Eretic [Annexe 16] et Pulcon [Annexe 17]. Les spectres sont localement réalignés et corrigés en ligne de base sur les deux régions spectrales d'intérêt en utilisant un programme écrit dans notre laboratoire fonctionnant sous MATLAB 7.0 (Mathworks). Les spectres sont ensuite normalisés selon la quantité de sérum utilisée. Les pics d'intérêt sont automatiquement définis en utilisant un autre programme MATLAB 7.0. L'intégrale de chaque pic est ensuite comparée à celle obtenue avec la référence de lactate et corrigée en fonction du nombre de protons. Les résultats sont ensuite calculés en lamol.L-1 de sérum. Pour chacun des deux métabolites d'intérêt, la région spectrale et le nombre de protons (qui est fonction de la nature du groupement chimique) sont définis comme suit: scyllo-inositol (ScI; [3.346; 3.362], CH), acétate (Ace; [1.915; 1.925], CH3), oxaloacétate (OA ; [2.365 ; 2.375], CH2). RESULTATS : Les caractéristiques essentielles des groupes patients SEP, 35 patients NMO et contrôle sont résumées en Table 1. Les spectres 1D lil représentatifs de chaque classe sont présentés en Figure 1. - 13 - Analyses statistiques multivariées préliminaires : L'analyse ACP des données de l'expérience CPMG appliquée à la zone 4,7-0,5 ppm et à la population entière de patients n'a pas permis de discriminer les deux groupes pathologiques du groupe contrôle de façon significativement statistique. Un certain nombre d'échantillons discordants ont cependant pu être identifiés par le biais de cette analyse. Les d'échantillons discordants peuvent apparaître pour un certains nombre de raisons: référence incorrecte, pollution de l'échantillon par de l'EDTA, signaux importants des lipoprotéines. Dans notre étude, 16 échantillons de sérum (6 SEP, 5 NMO et 5 contrôles) sur un total de 133 échantillons ont été éliminés de l'analyse, ce qui conduit à une cohorte comportant 117 échantillons de sérum. L'analyse PLS-DA des données CPMG a été initialement conduite sur la même population de 117 échantillons de sérum (37 SEP, 41 NMO, 39 contrôles). Comme pour l'analyse ACP, la région de 4,7-0,5 ppm a été utilisée. Pour identifier les métabolites les plus discriminants entre les profils métaboliques de deux groupes de patients pour trois hypothèses différentes (NMO vs SEP, NMO vs contrôle, SEP vs contrôle), les variables d'importance (VIP) ont été calculées pour chaque modèle en utilisant SIMCA-P. Les variables avec un VIP >1,0 sont considérées importantes pour le pouvoir discriminant du modèle. Modèle PLS-DA pour la discrimination entre patients NMO et patients SEP: Les échantillons de sérum ont tout d'abord été classés dans un vecteur colonne Y en tant que NMO (valeur de 0) ou SEP (valeur de 1). L'analyse a alors généré un modèle PLS-DA à deux composantes caractérisé par une bonne représentation des données Y (R2Y = 0,85) et, de façon plus importante, par un excellent critère de confiance de prédiction (Q2 = 0,80). Le tracé des résultats (« score plot ») du modèle PLS-DA (Fig. 2A) montre une séparation très claire entre les deux cohortes d'échantillons de sérum. Le groupe SEP est caractérisé principalement par les métabolites discriminants suivants: scyllo-inositol, oxaloacétate et glutamine. Le groupe NMO est caractérisé quant à lui par les métabolites discriminants suivants: acétate, glutamate, lactate et lysine. Modèle PLS-DA pour la discrimination entre patients NMO et patients de contrôle : - 14 - Les échantillons de sérum ont tout d'abord été classés dans un vecteur colonne Y en tant que NMO (valeur de 0) ou échantillons de contrôle (valeur de 1). L'analyse a alors généré un modèle PLS-DA à deux composantes caractérisé par une bonne représentation des données Y (R2Y=0,77) et par un excellent critère de confiance de prédiction (Q2=0.72). Le tracé des résultats (« score plot ») du modèle PLS-DA (Fig. 2B) montre une séparation très claire entre les deux cohortes d'échantillons de sérum. Le groupe NMO est caractérisé principalement par les métabolites discriminants suivants: acétate, glutamate et lactate. Le groupe contrôle est caractérisé principalement par les métabolites discriminants suivants: glutamine, lysine et valine. Modèle PLS-DA pour la discrimination entre patients SEP et patients de contrôle : Les échantillons de sérum ont tout d'abord été classé dans un vecteur colonne Y en tant que SEP (valeur de 0) ou échantillons de contrôle (valeur de 1). L'analyse a alors généré un modèle PLS-DA à deux composantes caractérisé par une bonne représentation des données Y (R2Y=0.84) et par un très bon critère de confiance de prédiction (Q2=0.66). Le tracé des résultats (« score plot ») du modèle PLS-DA (Fig. 2C) montre une séparation très claire entre les deux cohortes d'échantillons de sérum. Le groupe SEP est caractérisé principalement par les métabolites discriminants suivants: scyllo-inositol, oxaloacétate et lysine. Le groupe contrôle est caractérisé principalement par les métabolites discriminants suivants: glutamine et valine. Parmi les métabolites discriminants, nous avons décidé de sélectionner deux candidats : le scyllo-inositol (pour le groupe SEP) et l'acétate (pour le groupe NMO) parce que ces deux métabolites possèdent les VIP les plus élevés dans les trois modèles considérés dans notre étude et parce que l'enjeu principal est la distinction entre ces deux maladies neurologiques sur la base de leur profil métabolique sérique respectif Ces deux métabolites ont alors été quantifiés dans les 133 échantillons de sérum étudiés. Profil métabolique du sérum de patients SEP: le scyllo-inositol La figure 5a présente les concentrations de scyllo-inositol circulant dans les patients SEP, NMO et contrôle. Le scyllo-inositol des - 15 - patients SEP (concentration moyenne: 250 !mon) présente une augmentation importante de la concentration égale à 2,4 fois celle observée chez les patients NMO (concentration moyenne: 105 !mon) et à 2,6 fois celle observée chez les contrôles (concentration moyenne: 95 amol/L). Profil métabolique du sérum de patients NMO: l'acétate La figure 5b présente les concentrations d'acétate circulant dans les patients NMO, SEP et de contrôle. L'acétate dans les patients NMO (concentration moyenne: 31 !mon) présente une augmentation importante de la concentration égale à 1,8 fois celle observée chez les patients SEP (concentration moyenne: 17 !mon) et à 3,4 fois celle observée chez les contrôle (concentration moyenne: 9 !mon). Profil métabolique du sérum de patients SEP: l'oxaloacétate La figure 5c présente les concentrations d'oxaloacétate circulant dans les patients SEP, NMO et de contrôle. L'oxaloacétate dans les patients SEP (concentration moyenne: 1,2 !mon) présente une augmentation importante de la concentration égale à 3 fois celle observée chez les patients NMO (concentration moyenne: 0,4 !mon) et à 4 fois celle observée chez les contrôle (concentration moyenne: 0,3 !mon). Par conséquent, ces trois métabolites permettent d'obtenir un diagnostic différentiel entre des patients SEP et NMO qui sont caractérisés par des protocoles thérapeutiques différents. Dans cette étude, nous avons démontré pour la première fois les potentialités de la spectroscopie RMN HRMAS lil en tant que nouvel outil analytique pour discriminer deux maladies neurologiques proches cliniquement : NMO et SEP. Nous avons détecté trois métabolites qui sont importants pour une bonne discrimination entre ces pathologies et un groupe de contrôle : le scyllo-inositol et l'oxaloacétate qui permettent de classifier un échantillon inconnu (de type SEP/NMO/Contrôle) en tant que SEP ou NMO/Contrôle et l'acétate qui permet ensuite de déterminer si l'échantillon appartient au groupe NMO ou Contrôle. La prochaine étape sera de valider ces trois marqueurs prometteurs sur une cohorte de patients plus conséquente et de déterminer une valeur seuil pour les concentrations dans le sérum de ces trois métabolites afin d'aider les cliniciens dans le - 16 - choix du protocole thérapeutique le plus approprié pour traiter les patients atteints de SEP et de NMO. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. ANNEXES: Wingerchuk DM, Lennon VA, Lucchinetti CF et al. (2007) The spectrum of neuromyelitis optica. Lancet Neurology 6:805-815. de Seze J, Lebrun C, Stojkovic T et al. (2003) Is Devic's neuromyelitis optica a separate disease? A comparative study with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis 9:521-525. Wingerchuk DM, Lennon VA, Pittock SJ et al. (2006) Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica. Neurology 66: 1485-1489. Lennon VA, Wingerchuk DM, Kryzer TJ et al. (2004) A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet 364: 2106-2112. Lennon VA, Kryzer TJ, Pittock SJ et al. (2005) IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. Journal of Experimental Medicine 202: 473-477. Marignier R, de Seze J, Vukusic S, et al. (2008) NMO-IgG and Devic's neuromyelitis optica: a French experience. Multiple Sclerosis 14: 440-445. Papeix C, Vidal JS, de Seze J, et al. (2007) Immunosuppressive therapy is more effective than interferon in neuromyelitis optica. Multiple Sclerosis 13: 256-259. Kurtzke JF (1983). Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology, 33(11): 1444-1452. Svestkova 0, Angerova Y, Sladkova P et al. (2010). Functioning and disability in multiple sclerosis. Disability and Rehabilitation 2: S 59-S 67. Elbayed K, Dillmann B, Raya J, Piotto M, & Engelke F (2005). Field modulation effects induced by sample spirming- application to high- - 17 - resolution magic angle spirming NMR. Advances in Magnetic Resonance 174: 2-26. Piotto M, Bourdonneau M, Furrer J, et al. (2001). Destruction of magnetization during TOCSY experiments performed under magic angle 5 spirming. Effects of Radial B1 inhomogeneities. Journal of Magnetic Resonance (San Diego, Calif.) 149: 114-118. Shaka AJ, Lee CJ, & Pines A (1988). Iterative schemes for bilinear operators: Application to spin decoupling. Journal of Magnetic Resonance (San Diego, Calif.) 77: 274-293. 10 Davis AL, Keeler J, Laue E D, & Moskau D. (1992). Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients. Journal of Magnetic Resonance (San Diego Calif), 98(1): 207-216. Tenenhaus M. (1998). La régression PLS: Théorie et Pratique. 15 Paris. Westerhuis JA, Hoefsloot HCJ, Smit S, et al. (2008). Assessment of PLS-DA cross validation. Metabolomics 4(1): 81- 89. Akoka S., Barantin L., Trierweiler M. (1999). Concentration Measurement by proton NMR using the ERETIC method, Analytical 20 Chemistry, 71,2554-2557. Dreier, L. and Wider, G. (2006). Concentration measurements by PULCON using X-filtered or 2D NMR spectra, Magnetic Resonance in Chemistry, 44,206-212. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic différentiel permettant une discrimination entre un profil sérique de patient atteint de sclérose en plaque et un profil sérique de patient atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que cette méthode comprend au moins : - une étape de préparation d'au moins un échantillon de sérum à partir d'un prélèvement auprès d'un patient atteint d'une maladie à déterminer, - une étape d'utilisation de l'acétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de la maladie 10 de Devic, - une étape d'utilisation du scyllo-inositol et/ou de l'oxaloacétate comme marqueur différentiel d'un échantillon correspondant à un profil atteint de sclérose en plaque, - une étape de corrélation entre la présence d'au moins un 15 marqueur dans l'échantillon préparé et le profil de l'échantillon préparé et une étape de détermination de la maladie du patient prélevé. 2. Méthode de diagnostic différentiel selon la revendication 1, caractérisé en ce que la méthode comprend en outre : - une étape d'utilisation de l'acétate comme marqueur 20 différentiel consistant en une étape de détermination d'une concentration d'acétate dans l'échantillon de sérum prélevé, - une étape d'utilisation du scyllo-inositol et/ou de l'oxaloacétate comme marqueur différentiel consistant en une étape de détermination d'une concentration de scyllo-inositol et/ou de l'oxaloacétate 25 dans l'échantillon de sérum prélevé, - une étape de comparaison d'au moins une des valeurs de concentration mesurées avec au moins une valeur seuil. 3. Méthode de diagnostic différentiel selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de détermination d'une concentration d'au 30 moins un marqueur est opérée par au moins : - une étape de stabilisation du champ magnétique du spectromètre par addition d'eau lourde aux échantillons de sérum dans le cadre d'une analyse RMN ou HR-MAS, - une étape d'établissement d'une spectroscopie RMN, et/ou- 19 - - une étape d'établissement d'une spectroscopie RMN HRMAS. 4. Méthode de diagnostic différentiel selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de corrélation entre le 5 marquage d'un échantillon et le profil de l'échantillon préparé comprend : - une étape de mesure d'une concentration d'acétate comprise dans un intervalle correspondant à entre trois fois et quatre fois celle d'une concentration d'acétate d'un échantillon correspondant à un profil sain, ou bien 10 - une étape de mesure d'une concentration de scyllo-inositol comprise dans un intervalle correspondant à entre deux fois et trois fois celle d'une concentration de scyllo-inositol d'un échantillon correspondant à un profil sain. ou bien 15 - une étape de mesure d'une concentration d'oxaloacétate comprise dans un intervalle correspondant à entre 3,5 fois et 4,5 fois celle d'une concentration d'oxaloacétate d'un échantillon correspondant à un profil sain. 5. Méthode de diagnostic différentiel selon une des 20 revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de corrélation entre le marquage d'un échantillon et le profil de l'échantillon préparé intègre au moins une étape de traitement statistique permettant de positionner l'échantillon analysé dans différents modèles de matrices PLS-DA préétablis. 25 6. Dispositif de mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic différentiel caractérisé en ce que le dispositif comprend : - un moyen d'analyse de la concentration d'au moins un marqueur, scyllo-inositol et/ou oxaloacétate et/ou acétate, dans un échantillon de sérum, 30 - un moyen de comparaison de la concentration analysée avec au moins une valeur seuil, et/ou - un moyen de comparaison de l'échantillon de sérum analysé avec un ou plusieurs modèles préétablis par PLS-DA. 7. Dispositif de mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic 35 différentiel selon la revendication 6, caractérisé en ce que le dispositif est arrangé pour mettre en oeuvre au moins une étape d'une méthode de diagnostic selon une des revendications 1 à 5.- 20 - 8. Dispositif de mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic différentiel selon une des revendications 6 à 7, caractérisé en ce que le dispositif met en oeuvre la technologie RMN et/ou la technologie RMN HRMAS et/ou une unité d'analyse PLS-DA. 9. Marqueur différentiel d'un échantillon de sérum correspondant à un profil atteint de la maladie de Devic, caractérisé en ce que le marqueur est formé par l'acétate. 10. Marqueur différentiel d'un échantillon de sérum correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce 10 que le marqueur est formé par le scyllo-inositol. 11. Marqueur différentiel d'un échantillon de sérum correspondant à un profil atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce que le marqueur est formé par l'oxaloacétate.