FR 2983215 A1 20130531 FR 1160851 A 20111128 La présente invention concerne une méthode de dosage de la capacité de contrôle de la serpine (SERineProteaselNHhibitor) Cl inhibiteur (Cl Inh) plasmatique à partir d'un échantillon de sang d'un patient. L'invention concerne également un kit spécialement conçu pour ce dosage. La coupure du kininogène de haut poids moléculaire (HK) par la kallicréine (KK) plasmatique (également appelée kininoformation) conduit à la libération de bradykinine (BK). La bradykinine exerce ensuite ses effets par la stimulation du récepteur B2 des kinines exprimé sur les cellules endothéliales. La serpine (SERineProteaselNHhibitor) Cl inhibiteur (Cl Inh) est un inhibiteur plasmatique de protéase à sérine qui est impliqué dans le contrôle de la formation de BK. Un défaut dans le contrôle exercé par la protéine Cl Inh entraîne une surproduction de BK et l'angioedème (AO), s'exprimant par une fuite capillaire avec gonflement des tissus sous-cutanés ou sous-muqueux. La perméabilité vasculaire entraîne chez le patient en situation de crise des oedèmes au niveau de la face et des membres supérieurs, des crampes abdominales accompagnées parfois de vomissements et de diarrhées. La crise provoque également une gêne respiratoire qui peut aller jusqu'à l'asphyxie en cas de localisation laryngée. Dans certains cas sévères d'cedème laryngé, l'angioedème peut conduire à la mort du patient. Le dosage de la capacité de contrôle de Cl Inh permet de diagnostiquer l'angioedème lié au déficit de l'inhibition par Cl Inh. Ce dosage permet ensuite de déterminer la quantité de Cl Inh à administrer au patient pour rétablir le contrôle de la formation de BK par Cl Inh. Il permet également le suivi au cours du temps de la réponse du patient au traitement administré. Aujourd'hui, la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh est mesurée dans le plasma des patients par sa capacité à inhiber l'activité estérase de la protéase Cl s. Ce dosage est décrit dans l'article de Drouet et al., 1988. L'activité Cls est déterminée par mesure de l'éthanol généré par le clivage d'un substrat synthétique de Cl s, l'ester éthylique du benzoyl-L- arginine (BAEe). Néanmoins, Cls n'est pas une protéase impliquée dans la synthèse des kinines et est sans impact dans le processus pathologique d'angioedème. En outre, cette méthode de dosage présente l'inconvénient majeur en terme expérimental de nécessiter le prélèvement d'aliquotes au cours de l'incubation, ce qui empêche l'utilisation de la méthode en analyse à haut débit ou en lecture automatisée. Le principal contrôle de l'activation et de l'activité de la kallicréine (KK) est assuré par deux protéines plasmatiques inhibitrices, à savoir les protéines Cl Inh et a2-Macroglobuline (a2-M). Ainsi, a2-M présente la même capacité de contrôle sur la kallicréine (KK) plasmatique que Cl Inh et est donc susceptible d'interférer dans une méthode visant le dosage spécifique de la fonction inhibitrice de Cl Inh. La présente invention propose une méthode de dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh dans le plasma, qui répond aux attentes susmentionnées. La présente invention propose une méthode de dosage de la capacité de contrôle de Cl Inh qui est corrélée à la pathologie d'angioedème et qui est plus spécifique que celle décrite dans l'article de Drouet et al., 1988. Plus précisément, la méthode proposée est basée sur une mesure de la capacité de la kallicréine (KK) d'hydrolyser un substrat chromogène ou fluorogène. La kallicréine étant une protéase directement impliquée dans la libération de bradykinine, la méthode de dosage objet de la présente invention est directement corrélée à la pathologie d'angioedème. En outre, la méthode objet de la présente invention est réalisée dans des conditions telles à permettre le dosage de la protéine Cl Inh active, 20 tout en s'affranchissant de l'activité potentielle de l'a2-M également présente dans le plasma. En outre, la méthode de la présente invention permet de doser la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh, c'est-à-dire la concentration en Cl Inh active, c'est-à-dire susceptible d'exercer son activité d'inhibition de la 25 libération de bradykinine. Ceci constitue un avantage important de la présente méthode de dosage, en particulier pour les patients porteurs d'une mutation du gène codant la protéine Cl Inh et qui rend la protéine inactive. En effet, dans ce cas, les tests classiques peuvent conduire à des concentrations en Cl Inh élevées, alors que la protéine n'est pas active et ne joue pas son rôle dans le 30 contrôle de l'inhibition. Enfin, la méthode de dosage de la présente invention se fait en un temps, sans transfert après incubation de l'échantillon avec la protéase-cible. Elle est réalisable sur de faibles volumes de plasma. Elle s'applique donc à l'analyse automatisée. 35 Méthode de dosage de la capacité de contrôle de Cl Inh La présente invention concerne donc une méthode de dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl inhibiteur plasmatique (Cl Inh) à partir d'un échantillon de plasma d'un patient. La méthode de dosage selon 5 l'invention comprend les six étapes suivantes : a) on prépare un mélange réactionnel à partir de prékallicréine (pKK), de kininogène de haut poids moléculaire (HK) et de protéase facteur Hageman activée (FXIIa), le mélange réactionnel étant ajusté de manière à présenter un pH supérieur à 7 ; 10 b) on incube l'échantillon de plasma du patient avec un inhibiteur de protéase à sérine pendant une durée au moins égale à 5 minutes, de manière à obtenir un échantillon de plasma sans activité protéasique spontanée ; c) on incube l'échantillon de plasma obtenue à l'étape b) avec le mélange réactionnel préparé à l'étape a) pendant une durée inférieure ou égale 15 à 20 minutes ; d) on ajoute à l'échantillon de plasma obtenue à l'étape c) un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine (KK) susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par KK; e) on détecte l'éventuelle libération du chromophore ou fluorophore 20 obtenue à l'étape d) au cours du temps; et f) on détermine la capacité de contrôle de Cl Inh à partir de la détection réalisée à l'étape e). La méthode de dosage de la présente invention est basée sur l'hydrolyse d'un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine, protéine 25 dont la présence dans le plasma est directement dépendante de l'activité de Cl Inh. Plus précisément, l'activité inhibitrice de Cl Inh peut être dosée dans le plasma des patients par mesure de l'activité amidasique de la kallicréine sur un substrat de choix. Un défaut dans le contrôle de Cl Inh entraîne une augmentation de libération de kallicréine (KK) dans le plasma. Le plasma 30 contient plus de kallicréine et son substrat chromogène ou fluorogène est alors plus fortement hydrolysé. Cette hydrolyse conduit à la libération d'un chromophore ou d'un fluorophore dont la quantité dans l'échantillon peut être détectée. La quantité de chromophore ou fluorophore est directement dépendante de l'activité de la kallicréine et est proportionnelle à celle-ci. Par 35 contre, la quantité de chromophore ou fluorophore dans l'échantillon est indirectement dépendante de l'activité inhibitrice de Cl Inh et inversement proportionnelle à celle-ci. Si l'échantillon contient une concentration de Cl Inh active importante, celle-ci joue son rôle dans le contrôle de l'inhibition de l'activation de la prékallicréine. Dans ce cas, le plasma contient peu de kallicréine, le substrat de celle-ci est faiblement hydrolysé et la quantité de fluorophore ou chromophore dans l'échantillon est faible. La méthode de la présente invention nécessite la préparation d'un mélange réactionnel et la mise en contact de ce mélange avec un échantillon de plasma dont on souhaite évaluer la capacité de contrôle par Cl Inh. Selon l'invention, le mélange réactionnel contient notamment de la prékallicréine (pKK) et du kininogène de haut poids moléculaire (HK) qui s'associent pour former le complexe pKK/HK. La présence de FXIIa conduit à convertir la pro-enzyme pKK en enzyme active, la kallicréine (KK) avec pour conséquence le clivage de HK et la libération de BK. Dans le plasma, l'activation et l'activité de la KK sont sous le contrôle de Cl Inh. Cl Inh forme un complexe covalent de stoechiométrie 1:1 avec la kallicréine, entraînant la perte complète de l'activité protéolytique et amidolytique. Ainsi, selon la présente invention, on mesure la capacité de contrôle de Cl Inh sur l'activité d'hydrolyse de KK. Pour cela, on utilise un composé qui est un substrat de KK et dont l'hydrolyse libère un agent détectable (par exemple chromophore ou fluorophore). Ainsi, par « capacité de contrôle de Cl Inh », on entend activité inhibitrice ou fonction inhibitrice de la protéine Cl Inh. Cette activité inhibitrice peut notamment être exprimée en mg/I de plasma du patient. La protéine Cl Inh est un inhibiteur plasmatique qui est impliqué dans le contrôle de la formation de BK. Un défaut dans le contrôle de Cl Inh entraîne une augmentation de la concentration de bradykinine dans le plasma et potentiellement l'angioedème. La protéine Cl Inh est donc directement impliquée dans le processus d'angioédème. Par « patient », on entend un individu humain, qui peut être sain ou malade. La méthode de dosage est réalisée à partir d'un échantillon de plasma 30 du patient. Selon une première étape de la méthode de dosage selon la présente invention, on prépare un mélange réactionnel à partir des trois réactifs suivants : prékallicréine (pKK), kininogène de haut poids moléculaire (HK) et protéase facteur Hageman activée (FXIIa). 35 Selon l'invention, le rapport molaire (mol/mol) pKK/HK est compris entre 0,1 et 10. Selon un aspect de l'invention, le rapport molaire pKK/HK est compris entre 1/2 et 2/1. Selon un autre aspect de la présente invention, le rapport molaire pKK/HK du milieu réactionnel est compris entre 3/4 et 3/2. Par exemple, le rapport molaire pKK/HK est de 1. Selon un aspect de la présente invention, le rapport molaire 5 (mol/mol) pKK/FX1la est compris entre 1/5 et 1/25. De préférence, le rapport molaire pKK/FX1la est de 1/5. Le mélange réactionnel est ajusté de manière à présenter un pH supérieur à 7, par exemple compris entre 7 et 8,5. On utilise par exemple des solutions tampons pour ajuster le pH du milieu réactionnel. A titre d'exemple, 10 on peut citer l'utilisation des solutions tampons suivantes : NaCI, Tris-HCI et NaH2PO4. Pour préparer un mélange réactionnel qui présente un pH supérieur à 7, on peut par exemple utiliser une solution de NaCI (150 mM) et une solution de Tris-HCI (50 mM) ; alternativement, on peut utiliser une solution de NaCI (150 mM) et une solution de NaH2PO4 (25 mM). 15 Selon un aspect de la présente invention, on prépare un mélange réactionnel qui présente un pH compris entre 7,5 et 8,0, par exemple un pH de 7,6 ou de 7,8. Selon un aspect de la présente invention, la première étape de la méthode de dosage consiste à déposer une quantité déterminée (ou un volume 20 déterminé) de chaque réactif du mélange réactionnel dans un récipient adapté, par exemple dans chaque puits d'une plaque de microtitration (e.g. 96-puits ou 384-puits). Ainsi, à la fin de cette étape, et dans la mesure où le récipient utilisé est une plaque de microtitration, chaque puits de la plaque contient un volume identique déterminé de mélange réactionnel. Alternativement, on prépare 25 extemporanément un volume global de mélange réactionnel puis on dépose une quantité déterminée (ou un volume déterminé) de mélange réactionnel dans un récipient adapté, par exemple de façon séquentielle dans une plaque 96-puits. Selon un aspect de l'invention, le mélange réactionnel est conservé à 30 une température à laquelle les protéines (c'est-à-dire les réactifs du mélange réactionnel) ne présentent pas ou peu d'activité, par exemple à une température inférieure ou égale à 10°C, par exemple à 4°C. Selon cet aspect de l'invention, avant mélange avec le ou les échantillons de plasma du patient en vue du dosage, on incube le mélange réactionnel à une température qui 35 permet l'activation des protéines pendant au moins 5 minutes, par exemple pendant au moins 10 minutes. A titre d'exemple, on place le mélange réactionnel à température ambiante pendant 10 minutes. Cette sous-étape de cet aspect du procédé selon l'invention permet l'activation des protéines du mélange réactionnel. Ainsi, selon cet aspect de l'invention, la méthode de dosage comprend notamment : - une étape qui consiste à préparer un mélange réactionnel à partir de prékallicréine (pKK), de kininogène de haut poids moléculaire (HK) et de protéase facteur Hageman activée (FXIIa), le mélange réactionnel étant ajusté de manière à présenter un pH supérieur à 7, le mélange étant conservé à une température inférieure à 10°C ; et - une étape additionnelle qui consiste à placer le mélange réactionnel à température ambiante pendant au moins 5 minutes avant l'ajout de l'échantillon de plasma. Selon une seconde étape de la méthode de dosage selon la présente invention, on incube l'échantillon de plasma du patient avec un inhibiteur de protéase à sérine pendant une durée au moins égale à 5 minutes, de manière à obtenir un échantillon de plasma sans activité protéasique spontanée. En effet, l'échantillon de plasma est susceptible de contenir des protéases, notamment de la kallicréine, de la trypsine et de l'élastase. De part leur activités amidasiques, ces protéases sont susceptibles d'hydrolyser le substrat chromogène ou fluorogène utilisé dans le cadre de la présente méthode de dosage. Notamment, la présence de kallicréine présente dans le plasma (ou kallicréine plasmatique) est susceptible d'interférer avec le dosage de la kallicréine obtenue à partir de pKK du mélange réactionnel. Il est donc nécessaire d'inhiber ces protéases du plasma dans la mesure où leur activité sur le substrat ne peut pas être corrélée à la présence/absence de Cl Inh. Pour s'affranchir de cette activité spontanée du plasma vis-à-vis de ce substrat chromogène ou fluorogène qui n'est pas représentative de la capacité de contrôle de Cl Inh, on utilise un inhibiteur de protéase à sérine. L'échantillon de plasma du patient est donc incubé avec un inhibiteur de protéase à sérine avant d'être incubé avec le milieu réactionnel. L'incubation du plasma avec l'inhibiteur de protéases dure au moins 5 minutes. Le temps d'incubation est par exemple d'environ 10 minutes, c'est-à-dire de 10 +/- 1 minutes. Selon un aspect de la présente invention, on incube l'échantillon de plasma avec un inhibiteur de protéases à sérine pendant un temps compris entre 5 et 20 minutes. Selon un autre aspect de la présente invention, on incube l'échantillon de plasma avec un inhibiteur de protéases à sérine pendant au moins 10 minutes. Selon un aspect de la présente invention, l'inhibiteur de protéases sériques est choisi parmi le di-isopropylfluorophosphate (DFP) ou le 5 phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF). Selon un autre aspect encore de la présente invention, la température d'incubation de l'échantillon de plasma avec un inhibiteur de protéase à sérine varie entre 25 et 40°C, par exemple entre 25 et 35°C. La température d'incubation est par exemple d'environ 30°C, c'est-à-dire de 30 +/- 10 2°C. Une telle température permet un temps d'incubation court. Il est à noter que selon la présente invention, l'ordre des étapes a) et b) est indifférent. On peut réaliser d'abord l'étape a) puis l'étape b). Alternativement, on réalise l'étape b) puis l'étape a). Selon une troisième étape de la méthode de la présente invention, 15 on incube l'échantillon de plasma obtenue à la deuxième étape (étape b)) avec le mélange réactionnel préparé à la première étape pendant une durée inférieure ou égale à 20 minutes. Ainsi, selon cette étape de la méthode de la présente invention, l'échantillon de plasma qui a été incubé (ou pré-incubé) en présence 20 d'inhibiteur de protéase à sérine, est incubé en présence du mélange réactionnel tel que précédemment préparé. Selon un aspect de la présente invention, on choisit à l'étape b) de la méthode de la présente invention un inhibiteur de protéase à sérine qui est inactivé ou devient inactif lorsqu'il entre au contact du mélange réactionnel. A 25 titre d'exemple, le DFP devient inactif lorsqu'il entre en contact du mélange réactionnel présentant un pH supérieur à 7. Ainsi, selon cette étape de la méthode selon l'invention, la protéine Cl Inh éventuellement présente dans le plasma du patient est mise au contact du mélange réactionnel contenant les protéines dont les activités sont régulées 30 par Cl lnh. Le temps d'incubation de l'échantillon de plasma avec le milieu réactionnel est inférieur ou égal à 20 minutes, par exemple inférieur ou égal à 15 minutes. Le temps d'incubation est par exemple d'environ 10 minutes, c'est-à-dire de 10 +/- 1 minutes. En effet, les inventeurs se sont rendus compte 35 qu'en incubant le plasma avec le milieu réactionnel pendant une durée inférieure à 20 minutes, il est possible de s'affranchir de l'activité de la protéine a2-Macroglobuline (a2-M) qui assure le contrôle de l'activation et de l'activité de la kallicréine au même titre que Cl Inh. Ceci est dû au fait que l'a2-M ne devient active qu'après un certain temps d'incubation en présence des protéines qu'elle régule. Ainsi, en réalisant le dosage après un temps d'incubation inférieur à 20 minutes, on évite les interférences avec l'activité de l'a2-M ; le dosage objet de la présente invention correspond à la seule activité de Cl Inh. La méthode de dosage selon la présente invention correspond donc uniquement à la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh. Ceci constitue une caractéristique avantageuse de la présente méthode de dosage. Selon un autre aspect de la présente invention, la température d'incubation de l'échantillon de plasma avec le milieu réactionnel varie entre 15 et 25°C. La température d'incubation est par exemple celle de la température ambiante. Selon un aspect de la présente invention, on ajoute un volume 15 déterminé de plasma dans chaque puits d'une plaque de microtitration (e.g. 96-puits ou 384-puits) contenant un volume défini de milieu réactionnel. Selon un autre aspect encore de la présente invention, le volume de plasma nécessaire pour réaliser le dosage est inférieur ou égal à 2 pL. Par exemple le volume de plasma est de 0,25 pI, 0,5 pI, 0,75 pI, 1 pI, 1,25 pI ou 20 1,5 pI. Ceci constitue une caractéristique avantageuse de la présente méthode de dosage qui s'applique à de faibles volumes d'échantillons de plasma. Le faible volume de plasma nécessaire pour réaliser le dosage, ainsi que le fait que cet échantillon de plasma soit ajouté à un seul mélange réactionnel permet la mise en oeuvre de la méthode en analyse automatisée. 25 Selon un autre aspect de la présente invention, le volume de plasma utilisé est supérieur à 2pl ; par exemple, le volume de plasma est de l'ordre du ml (e.g., 1 ml, 10m1, 100m1) ou de l'ordre du litre. Dans ce cas, le rapport volume:Molarité du plasma:prékallicréine est compris entre 1:1 et 4:1 ; par exemple, ce rapport est de 2:1. 30 Selon une quatrième étape, on ajoute un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine (KK) susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par KK. Par « substrat chromogène de la kallicréine», on entend une molécule pouvant être clivée ou modifiée par la kallicréine et qui comprend ou 35 est couplée à un chromophore. Par « chromophore », on entend un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable des propriétés d'absorption et/ou d'émission de lumière dans le domaine de l'ultraviolet, du visible ou de l'infrarouge de cette molécule. Ces propriétés résultent d'une capacité à absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d'onde sont transmises ou diffusées. Le substrat chromogène selon l'invention peut être coloré ou incolore. Ce substrat chromogène libère son chromophore sous l'action de la kallicréine. Par « substrat fluorogène », on entend une molécule pouvant être clivée ou modifiée par la kallicréine et qui comprend ou est couplée à un fluorophore. Ce substrat fluorogène libère son fluorophore sous l'action de KK. Par « fluorophore », on entend un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable de la capacité de cette molécule d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Ce sont généralement des substances composées de plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou encore des molécules planes et cycliques qui possèdent une ou plusieurs liaisons n. Par « substrat fluorogène », on entend également « substrat FRET » (Fluorescence Resonance Energy Transfer ou transfert d'énergie par résonnance de fluorescence), c'est-à-dire une molécule constituée de deux éléments (un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur) qui lorsqu'ils sont en résonnance, c'est-à-dire au contact l'un de l'autre avant hydrolyse par la kallicréine, émettent de la fluorescence à une certaine longueur d'onde suite à une excitation. L'action de la kallicréine sépare les deux éléments, ce qui conduit à une perte d'émission de lumière fluorescente à ladite longueur d'onde. Selon un mode réalisation de la présente invention, l'un des deux éléments constitutif du substrat FRET peut, indépendamment de l'autre élément, émettre de la fluorescence à une deuxième longueur d'onde distincte de la fluorescence émise par le substrat FRET. Ainsi le substrat FRET hydrolysé selon l'invention n'émet plus de fluorescence à la première longueur d'onde mais le fluorophore en tant qu'élément indépendamment du substrat FRET émet de la fluorescence à une seconde longueur d'onde. Les chromophores et fluorophores sont connus de l'homme du métier. La libération du chromophore ou fluorophore peut être due directement ou indirectement à l'hydrolyse du substrat par la kallicréine. Ainsi, 35 la kallicréine peut hydrolyser la liaison couplant le substrat au chromophore ou fluorophore, libérant ainsi le chromophore ou fluorophore du substrat. KK peut également hydrolyser un domaine du substrat n'impliquant pas le chromophore ou fluorophore. De préférence, la libération du chromophore ou du fluorophore entraîne un changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Par conséquent, la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore peut en particulier être mise en oeuvre en observant le changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. De préférence, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé d'un substrat naturel de la kallicréine. Selon un aspect de la présente invention, le substrat choisi est un substrat chromogène de la kallicréine et il s'agit du peptide H-D-Pro-Phe-Argpara-nitroanilide. Selon une cinquième étape, on détecte l'éventuelle libération du chromophore ou fluorophore obtenue à la quatrième au cours du temps. Cette étape de la méthode de dosage de la présente invention permet d'obtenir une cinétique de l'activité d'hydrolyse (ou activité amidasique) de la kallicréine au cours du temps. Plus la capacité de contrôle de Cl Inh est élevée, plus la cinétique d'hydrolyse est lente et, en particulier, plus la vitesse maximale d'hydrolyse est basse. Au contraire plus la capacité de contrôle de Cl Inh est basse, plus la cinétique d'hydrolyse est rapide et, en particulier, plus la vitesse maximale d'hydrolyse est élevée. La vitesse maximale d'hydrolyse est exprimée en valeur absolue ou en pourcentage. La détection (ou mesure) de la libération du chromophore ou du fluorophore peut par exemple être mise en oeuvre en observant le changement 25 de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Selon un aspect de la présente invention, la détection consiste en une lecture de la DO de l'échantillon à la longueur d'onde pertinente. Dans le cas où l'on choisit comme substrat chromogène de la 30 kallicréine le peptide H-D-Pro-Phe-Arg-para-nitroanilide, on détecte l'éventuelle libération du chromophore par lecture de la déviation optique (DO) de l'échantillon à une longueur d'onde de 405nm. En effet, la présence du groupe para-nitroanilide ou pNA jouant le rôle de chromophore est détecté par mesure/lecture spectrophotométrique à 405nm. 35 Selon un aspect de la présente invention, on mesure l'éventuelle libération du chromophore ou fluorophore, à partir de l'ajout du substrat chromogène ou fluorogène qui constitue le temps TO et pendant un temps déterminé, par exemple jusqu'à l'obtention d'une cinétique constante au cours du temps (valeur de cinétique sensiblement constante et correspondant à une phase de plateau sur la courbe de cinétique au cours du temps). A titre d'exemple, on mesure l'éventuelle libération du chromophore ou fluorophore pendant une heure. Selon une sixième étape, on détermine la capacité de contrôle de Cl Inh à partir de la détection réalisée à la cinquième étape. Cette étape peut être réalisée de manière manuelle ou au moyen 10 d'un programme d'ordinateur, pour la fonction Vmax (%) = J(ng Cl Inh). Selon un aspect de l'invention, cette étape consiste à reporter la valeur de la vitesse maximale d'hydrolyse déduite de la cinétique d'hydrolyse obtenue à la cinquième étape de la méthode de dosage sur une courbe de titration (courbe de référence). Par « courbe de titration », on entend une 15 courbe de référence obtenue à partir de mesures de vitesse maximale d'hydrolyse effectuées avec des quantités de protéine Cl Inh connues, par exemple comprises entre 40 ng et 200 ng de protéine Cl Inh. Selon un autre aspect de l'invention, cette étape consiste à entrer la valeur dans un programme d'ordinateur et à déduire la capacité de contrôle 20 de Cl Inh, par exemple au moyen d'un algorithme. La capacité de contrôle de Cl Inh peut par exemple être exprimée en mg/I ou en U/ml, U étant l'unité arbitraire telle que définie dans l'article de Drouet et al., 1988. 25 Kit ou trousse pour la mise en oeuvre du dosage La présente invention concerne également un kit ou une trousse pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, comprenant : - de la prékallicréine (pKK), du kininogène de haut poids moléculaire (HK) et de la protéase facteur Hageman activée (FXIIa), 30 - des solutions permettant d'obtenir un pH supérieur à 7, - un inhibiteur de protéase à sérine, et - un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine (KK). Autres méthodes La présente invention concerne également une méthode de détermination de la quantité de Cl Inh plasmatique nécessaire pour stopper les effets d'un angioedème chez un patient, comprenant : a) le dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh à partir 5 d'un échantillon de plasma du patient, selon l'invention, et b) la détermination de la quantité de Cl Inh à administrer au patient. La présente invention concerne aussi une méthode de détermination de la quantité de stimulateur de Cl inhibiteur plasmatique 10 nécessaire pour stopper les effets d'un angioedème chez un patient, comprenant : a) le dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh à partir d'un échantillon de plasma du patient selon l'invention, et b) la détermination de la quantité de stimulateur de Cl Inh à 15 administrer au patient. L'étape b) des deux méthodes de détermination également objets de la présente invention, peut être réalisée par comparaison à des valeurs de référence (patient sain ou même patient en situation non pathologique). 20 La présente invention concerne également une méthode de suivi de la capacité de contrôle de Cl Inh chez un patient au cours du temps consistant à doser, à deux temps différents, la capacité de contrôle de Cl Inh à partir d'un échantillon de plasma de ce patient selon la méthode de dosage de 25 la présente invention. Cette méthode de suivi peut notamment être mise en place dans les situations suivantes : a) après administration de médicaments destinés au traitement ou à la prophylaxie de l'angioedème (inducteur de la biosynthèse tels que danazol et stanazolol) ; b) après administration excessive dans des 30 situations d'angioedème acquis traités par Cl Inh purifié ou recombinant ; c) après administration de concentrés de Cl Inh appliqués dans des situations inflammatoires (sepsis) ou pour contrer les effets adverses des thérapeutiques antihypertensives (inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-I ; sartans) ; d) après administration de gliptines dans le cadre du traitement du 35 diabète de type II. Description des figures Figure 1 :Formation de la bradykinine endothéliale (kininoformation). Cl Inh occupe une position stratégique dans le contrôle de la kininoformation. Figure 2 : Courbe de titration de la fonction de contrôle de Cl Inh. La cinétique 5 de l'activation de la pKK (Vmax) est mesurée en présence de doses croissantes de Cl Inh. Incubation de 10 minutes. (A) Cinétique de l'activité amidasique en fonction du temps. En abscisse, absorbance (DO à 405nm) ; en ordonnées, temps en minutes. (B) Titration de la fonction de Cl Inh par la Vmax de l'activation de la 10 prékallicréine. En abscisses, Vmax en nmol-ml-'-min-1 ; en ordonnées, échantillons FPH avec/sans Cl Inh. FPH : Produit de l'incubation Facteur XII (F) + Prékallicréine ou PKK (P) + Kininogène de haut poids moléculaire ou HK (H). Figure 3 : Courbe de titration de la fonction de l'a2M. La cinétique de 15 l'activation de la pKK (Vmax) est mesurée en présence de doses croissantes d'a2M. (A) Cinétique de l'activité amidasique en fonction du temps.En abscisses, absorbance (DO à 405nm) ; en ordonnées, temps en minutes. (B) Titration de la fonction de l' a2M par la Vmax de l'activation de la pKK. En 20 abscisse, Vmax en ; en ordonnées, échantillons FPH avec/sans a2M. Figure 4 : Vitesse maximale de la cinétique d'activation de la pKK en présence de volumes croissants de plasma non soumis à la pré-incubation par le DFP (A) et soumis à la pré-incubation par le DFP (B).En abscisse, Vmax en 25 nmol-ml ; en ordonnées, échantillons FPH avec/sans plasma avec/sans DFP. Figure 5 :(A) Reproductibilité du test d'inhibition de l'activation de pKK par des concentrations croissantes de Cl Inh. (B)Courbe de titration de Cl Inh. Des quantités croissantes de Cl Inh sont appliquées dans le test d'activation de la 30 pKK, la Vmax résiduelle Vmax % est calculée par le rapport Vmaxexp/Vmax 100 et la courbe Vmax (%) = J(ng Cl Inh) est tracée pour la série de mesure de la fonction de Cl Inh dans les échantillons. Figure 6 : Mesure de la fonction de Cl Inh chez une patiente porteuse de la mutation Arg444Ser. (A) Répétabilité des mesures de la Vmax en présence de 35 l'échantillon (patiente et témoin). (B) Gamme d'étalonnage avec les valeurs de la Vmax résiduelle observée en A. Exemples Matériels et méthodes 1. Echantillonnage 2 x 4,5 mL de sang sont prélevés par ponction veineuse et recueillis dans des tubes contenant du citrate de sodium (0,1 mol/L). Le plasma est recueilli après centrifugation (22°C, 10 min, 2 500g). Le plasma est aliquote en volumes de 0,5 ml et congelé à -80°C. 2. Protéase et protéines utilisées La protéase facteur Hageman activée (FXIIa), la prékallicréine (pKK), le kininogène de haut poids moléculaire (HK) proviennent de la société Enzyme Research Laboratories Ltd (Swansea UK). 2 pmol de pKK correspondent à 150 ng de protéine (PM 75 000 Da). 2 pmol de HK correspondent à 206,25ng de protéine (PM 110 000 Da). La gamme d'étalonnage est établie à partir de Cl Inh purifié (BERINERT®, CSL Behring). 2 pmol de Cl Inh correspondent à 200 ng de Cl Inh purifié (PM 105 000 Da). L'a2-Macroglobuline humaine provient de BIOMAC (Leipzig, Allemagne). 0,4 pmol d'a-2 Macroglobuline correspondent à 300 ng de protéine (PM 720 000 Da). L'activité de la kallicréine est évaluée par une méthode amidolytique à l'aide d'un substrat chromogène de la kallicréine, le tripeptide H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (résidus P3-P1 de la coupure du kininogène, accession ID P01042, positions 387-389). L'hydrolyse du groupe para-nitroanilide (pNA) par la KK est détecté par mesure spectrophotométrique à 30°C à 405 nm (c 405 nm = 8 800 M-1-cm1). Ce tripeptide provient de la société BACHEM. 3. Préparation du mélange réactionnel Le mélange réactionnel (également appelé FPH) est préparé tel que décrit ci-après : chaque puits de la plaque de microtitration est préalablement saturée par 1% PEG 6000 pendant 1h à température ambiante. Dans chaque puits d'une plaque de microtitration (plaque 96-puits) à 4 °C, sont déposés successivement 150 ng de pKK et 206,25 ng de HK (rapport mol/mol de pKK/HK = 1), puis25 ng de la protéase FXIIa. Il est préférable de conserver la plaque de microtitration à 4°C de manière à bloquer l'activité des protéines dans le mélange réactionnel. Le volume final dans chaque puits est de 230 pl, ajusté avec du tampon Tris NaCI (NaCI 150 mM, Tris-HCI 50 mM) de manière à ce que le mélange réactionnel présente un pH de 7.8. Avant l'ajout de Cl Inh ou d'échantillon de plasma, on soumet la plaque à une 5 préincubation de 10 minutes à température ambiante. 4. Préparation d'une courbe de titration de la capacité de contrôle de Cl Inh La gamme de Cl Inh est établie en concentration décroissante à partir de la concentration stoechiométrique 1/1 (mol/mol) entre Cl Inh et pKK. 10 Dans chaque puits de la plaque de microtitration (plaque 96-puits) préparée selon le paragraphe 3 ci-dessus, sont déposés 200 ng, 160 ng, 120 ng, 80 ng et 40 ng de Cl Inh. Le mélange est ensuite soumis à un temps de pré-incubation de 10 minutes à 30°C. La réaction est déclenchée par l'ajout du tripeptide H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (0,83 15 mM final), et l'absorbance est suivie pendant 60 minutes à 30°C à 405 nm sur l'appareil THERMOFISCHER MULTISKAN GO. 5. Impact de l'a2-Macroglobuline sur l'activation de la phase contact Dans chaque puits de la plaque de microtitration (plaque 96-puits) préparée 20 selon le paragraphe 3 ci-dessus, sont déposés des concentrations décroissantes de : - a2-Macroglobuline seule (300 ng, 240 ng, 180 ng, 120 ng et 60 ng), et - un mélange de Cl Inh et d'a-2 Macroglobuline (concentrations décroissantes de chaque serpine). 25 Le mélange est soumis à une incubation pendant 10 minutes à 37°C. La réaction est déclenchée par l'ajout du tripeptide H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (0,83 mM final), et l'absorbance est suivie pendant 60 minutes à 30°C à 405 nm sur l'appareil THERMOFISCHER MULTISKAN GO. 30 6. Volumes de plasma nécessaire, présence d'un inhibiteur de protéase à sérine Dans un premier temps, des volumes de plasma d'un patient ou d'un sujet sain (contrôle) variant entre 0,25 et 1 pl sont déposés dans chaque puits de la plaque de microtitration (plaque 96-puits) préparée selon le paragraphe 3 ci-35 dessus. Dans un second temps, les dosages sont répétés après incubation avec dudiisopropylfluorophosphate (DFP), un inhibiteur de protéase à sérine. En effet, pour s'affranchir de la présence de kallicréine dans le plasma du patient (également appelée activité spontanée du plasma) vis-à-vis du tripeptide H-D- Pro-Phe-Arg-pNA, on soumet les échantillons plasmatiques à unepréincubation en présence de 0,5 mM de DFP (Sigma), à température ambiante pendant 10 minutes. Le DFP bloque les activités enzymatiques des protéases à sérine, en particulier KK, trypsine et élastase, qui seraient présentes dans le plasma et pourraient interférer avec le dosage (activité spontanée des protéases à sérine, en particulier KK). L'utilisation du DFP est possible dans le cadre de la présente méthode de dosage du fait que cet inhibiteur est hydrolysé lorsqu'il est en contact d'un milieu présentant un pH supérieur à 7 et optionnellement des amines. Les mélanges sont soumis à l'incubation de 10 min à 37°C. La réaction est déclenchée par l'ajout du tripeptide H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (0,83 mM final), et l'absorbance est suivie pendant 60 minutes à 30°C à 405 nm sur l'appareil THERMOFISCHER MULTISKAN GO. Résultat et discussion Courbe de titration Cl lnh, temps d'incubation de Cl lnh dans le mélange réactionnel La figure 2A présente les résultats des cinétiques aux différentes concentrations de Cl lnh. La mesure de la Vmax la plus favorable est obtenue pour le temps d'incubation 25 de 10 minutes à 37°C (résultats non montrés).0n mesure la vitesse maximale pour chaque concentration. Tel que montré à la figure 2B, la décroissance de la Vmax est quasi-linéaire avec l'augmentation de la concentration de Cl Inh (40-200 ng) : de 233 nmol-ml-'-min-1 (pour 40 ng de Cl Inh) à 68 nmol-ml-'-min-'(pour 200 ng de 30 Cl Inh). Le contrôle réalisé sans Cl Inh donne une Vmax de 280 nmol-ml-'-min-1. Courbe de titration a2-Macroalobuline (a2-M) seul ou en présence de Cl Inh Sachant le contrôle possible de l'activation de la pKK par l'a2-M, et du fait de la 35 forte concentration de la serpine a2-M dans le plasma, son impact sur le système a été testé avec les concentrations 2 fois supérieures à celle de Cl Inh pour respecter les conditions du plasma humain. Les figures 3, en particulier la figure 3B, montrent que, quelle que soit la concentration de l'a2-M, la Vmax est de l'ordre de 260 nmol-ml-'-min-1, valeur observée régulièrement comme celle de l'activation de la phase contact dans les conditions retenues. Cette valeur n'est donc pas modifiée par ajout de doses croissantes de l'a2-M. L'impact de l'a2-M sur l'activation de la phase contact est négligeable pour le temps d'incubation de 10 minutes. Pour montrer que la fonction de contrôle de l'activation de la pKK par Cl Inh, cible du test, n'est pas affectée par la présence de l'autre serpine a2-M, le même test que précédemment est exécuté en présence du mélange des deux serpines Cl Inh et a2-M et en respectant le rapport Cl Inh:a2-M (mol:mol) de 1:2. La Vmax décroît de façon quasi-linéaire comme pour la figure 2, sans effet ajouté de l'a2-M (résultats non montrés). Comparativement aux résultats de la cinétique d'activation de la pKK en l'absence de l'a2-M, l'effet de l'a2-M n'est pas détectable. Ceci confirme les données de la figure 3. En conséquence, dans le temps d'incubation de 10 min, l'impact de l'a2-M sur le contrôle de l'activation de la pKK est négligeable. Evaluation de la quantité optimale de plasma pour la mesure du contrôle par Cl Inh Le même test que précédemment a été exécuté en présence de plasma de sujets sains et de patients pour lesquels la fonction de Cl Inh a été reconnue 25 pour être abaissée. Des volumes croissants (0.25-10 pl) ont été appliqués au lieu de l'ajout de l'une ou l'autre des serpines. L'équivalent Cl Inh, utilisé dans le test, du plasma de sujets sains est de 1 pl de plasma représentant 200 à 300 ng de Cl Inh. Cette situation correspond au point le plus faible de la Vmax (figure 2B). 30 La figure 4A montre que l'application du volume de 0,5 pl du plasma patient augmente la Vmax. Cette augmentation est attribuée à la forte activité kininogénase spontanée (74 nmol-ml-'-min-1 ; référence 2.4-10.7 nmoI-mf-'-min1). Tel que montré à la figure 4B, cette activité est inhibée par la pré-incubation du plasma avec 0,5 mM de DFP pendant 10 min à température ambiante. 35 Cette pré-incubation ne modifie pas la Vmax de l'activation de la pKK en 2 9832 15 18 présence du plasma. Le DFP ne perturbe pas l'activation de la KK, ni la fonction de contrôle par Cl Inh dans les conditions du test (figures 4A et B). Reproductibilité des résultats, préparation d'une courbe de titration et 5 application aux échantillons patients Le test d'inhibition de l'activation de pKK par des concentrations croissantes de Cl Inh a été reproduit dans 6 tests indépendants. Voir Figure 5A. Les valeurs obtenues sont toutes groupées autour de la moyenne avec variabilité de 2.5 à 5.5%. 10 Données relevées de la Vmax (nmol-ml-'-min-1) pour chaque quantité de Cl Inh ajoutée: (0) moyenne 256,9, écart-type 7,6 ; (40 ng) moyenne 196,7, écart-type 9,31 ; (80 ng) moyenne 132,6, écart-type 5,45 ; (120 ng) moyenne 97,4, écart-type 5,39 ; (160 ng) moyenne 65,5, écart-type 2,97 ; (200 ng) moyenne 42,2, écart-type 1,08. 15 L'ajout de concentrations croissantes de Cl Inh se traduit par la décroissance quasi-linéaire de la Vmax. Ainsi, ceci permet de considérer l'ajout de Cl Inh dans la gamme d'étalonnage du test de l'activation de la pKK en présence de plasma. Pour ce qui est de la courbe de titration Vmax (%) = J(ng Cl Inh) (Figure 5B), 20 elle est tracée en utilisant les moyennes des 6 séries de mesure obtenues avec des quantités connues de Cl Inh (Figure 6A). La Vmax résiduelle Vmax % est calculée par le rapport Vmaxexp/Vmax 100. Ainsi, par exemple, dans l'échantillon FPH+C1 Inh 80 ng, on obtient une valeur de Vmax de 132,6/256,9x100 = 51,6%. Le faible volume de plasma et l'ajout des composants dans un seul milieu réactionnel autorise la méthode pour des applications en chaîne automatisée. L'application de la méthode de dosage est également possible en développant la procédure avec des volumes plus importants, dès lors que sont respectés les contraintes de concentration des protéines FPH et du rapport 2:1, plasma:prékallicréine (volume:Molarité). Dosage comparatif de la capacité de contrôle de Cl Inh par le test de l'art antérieur et par celui de la présente invention a) Sujet Le patient est un sujet féminin de 68 ans, avec AOH type II et porteuse de la mutation Arg444Ser sur Cl Inh. Ce mutant est incapable de contrôler l'activité enzymatique de la kallikréine. b) Concentration en protéine Cl Inh Cette patiente présente une antigénémie (ou concentration) de Cl Inh : 503 mg /1 (NB : valeurs de référence : 210-345 mg/1). L'appareil suivant néphélomètre Dade Behring, BN II est utilisé pour réaliser cette mesure. De cette mesure, on déduit une forte concentration en protéine Cl Inh. Compte 10 tenu du fait que la patiente est néanmoins porteuse d'une mutation Arg444Ser sur Cl Inh, la question se pose de savoir quel est le pourcentage de Cl Inh non mutée, c'est-à-dire en protéine active, dans le sang de la patiente. c) Capacité de contrôle de Cl Inh dosée au moyen de la technique d'inhibition 15 de l'activité estérasique de la protéase Cl s L'activité inhibitrice de Cl Inh a été mesurée au moyen du test de l'art antérieur décrit dans l'article de Drouet et al., 1988 (technique d'inhibition de l'activité estérasique de la protéase Cl s). Cette activité s'avère être inférieure au seuil de détection, c'est-à-dire REVENDICATIONS1. Méthode de dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl 5 inhibiteur plasmatique (Cl Inh) à partir d'un échantillon de plasma d'un patient, comprenant les étapes suivantes : a) on prépare un mélange réactionnel à partir de prékallicréine (pKK), de kininogène de haut poids moléculaire (HK) et de protéase facteur Hageman activée (FXIIa), le mélange réactionnel étant ajusté de manière à présenter un 10 pH supérieur à 7; b) on incube l'échantillon de plasma du patient avec un inhibiteur de protéase à sérine pendant une durée au moins égale à 5 minutes, de manière à obtenir un échantillon de plasma sans activité protéasique spontanée ; c) on incube l'échantillon de plasma obtenue à l'étape b) avec le 15 mélange réactionnel préparé à l'étape a) pendant une durée inférieure ou égale à 20 minutes ; d) on ajoute à l'échantillon de plasma obtenue à l'étape c) un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine (KK) susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par KK; 20 e) on détecte l'éventuelle libération du chromophore ou fluorophore obtenue à l'étape d) au cours du temps; et f) on détermine la capacité de contrôle de Cl Inh à partir de la détection réalisée à l'étape e). 25 2. Méthode de dosage selon la revendication 1, selon laquelle le rapport (mol/mol) pKK/HK du milieu réactionnel est compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1/2 et 2/1. 3. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes, selon laquelle le milieu réactionnel présente un pH compris entre 7 et 8,5. 4. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle l'inhibiteur de protéase à sérine est choisi parmi le 35 di-isopropylfluorophosphate (D FP) ou le phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF). 5. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle à l'étape d) on utilise le peptide H-D-Pro-Phe-Argpara-nitroanilide comme substrat chromogène de la kallicréine et à l'étape e) on détecte l'éventuelle libération du chromophore pNA par lecture spectrophotométrique à 405 nm. 6. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle le volume de plasma nécessaire pour réaliser le 10 dosage est inférieur ou égal à 2 pL. 7. Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant : - de la prékallicréine (pKK), du kininogène de haut poids 15 moléculaire (HK) et de la protéase facteur Hageman activée (FXIIa), - des solutions permettant d'obtenir un pH supérieur à 7, - un inhibiteur de protéase à sérine, et - un substrat chromogène ou fluorogène de la kallicréine (KK). 20 8. Méthode de détermination de la quantité de Cl inhibiteur plasmatique nécessaire pour stopper les effets d'un angioedème chez un patient, comprenant : a) le dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh à partir d'un échantillon de plasma du patient, selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 6, et b) la détermination de la quantité de Cl Inh à administrer au patient. 9. Méthode de détermination de la quantité de stimulateur de Cl inhibiteur plasmatique nécessaire pour stopper les effets d'un angioedème 30 chez un patient, comprenant : a) le dosage de la capacité de contrôle de la protéine Cl Inh à partir d'un échantillon de plasma du patient selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et b) la détermination de la quantité de stimulateur de Cl Inh à 35 administrer au patient. 10. Méthode de suivi de la capacité de contrôle de Cl lnh chez un patient au cours du temps consistant à doser à deux temps différents la capacité de contrôle de Cl Inh à partir d'un échantillon de plasma de ce patient selon la méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 6.5