FR 2989385 A1 20131018 FR 1201110 A 20120413 L'invention concerne un procédé de sélection de clones de souches microbiennes ou de cellules animales, de souches microbiennes ou de cellules animales, pour la production de protéines ou de protéines recombinantes. Le procédé est particulièrement applicable au screening à haut débit. ART ANTERIEUR Lors du développement d'un procédé mettant en oeuvre des micro-organismes, il n'est pas possible de tester à l'échelle industrielle toutes les souches disponibles dans toutes les conditions possibles. Il est donc nécessaire de disposer d'un matériel miniaturisé pour réaliser des tests au laboratoire. Pour aboutir à un procédé (souche et conditions) compatible avec l'échelle industrielle, il est impératif que le matériel miniaturisé utilisé reproduise fidèlement les conditions industrielles, au moins pour les contraintes identifiées comme les plus importantes. Dans le cadre de cette invention, les contraintes considérées sont la capacité à alimenter en nutriments (fed-batch) et la capacité à mesurer et contrôler le pH. Classiquement le pH est mesuré par des sondes constituées d'une électrode de verre, mais ces sondes ne peuvent pas être miniaturisées pour des volumes inférieurs à 50mL. Pour des volumes inférieurs, on peut utiliser des patchs contenant un colorant fluorescent, qui sont placés dans le milieu de culture, la lecture étant faite par l'extérieur à l'aide d'une sonde équipée d'une fibre optique. Cependant ces patchs fonctionnent uniquement pour des pH entre 5.5 et 8.5 (Bareiter et Pollard (2010)). Les fioles agitées sont le système le plus classiquement utilisé en laboratoire, avec un volume allant de 10mL à 3L. Classiquement elles ne proposent ni suivi ni contrôle du pH, ni possibilité de réaliser un fed-batch. Le système Fedbatch-Pro (Dasgip) propose une mesure de pH avec des sondes classiques et un contrôle du pH avec des pompes à bas débit, mais pour des volumes minimum de 50mL. Ce système permet aussi de réaliser des fed-batch, mais nécessite alors 1 sonde et 2 pompes par fiole. Sensolux (Sartorius) et SFR (PreSens) sont deux systèmes commerciaux de fioles agitées pré-stérilisées contenant des patchs optiques pour la lecture du pH, mais uniquement pour des pH entre 5.5 et 8.5. De plus des fioles doivent être placés dans un système d'agitation spécial contenant le système de lecture par fibre optique. Pour réaliser un fed-batch en fiole classique sans utiliser de pompe, EnBaseFlo (BioSilta) et Feed-ln-Time (M2p-Labs) sont deux milieux de culture commerciaux dans lequel du glucose est généré progressivement par hydrolyse enzymatique à partir d'un polysaccharide. Cependant ce système ne fonctionne qu'avec le glucose, donc ne peut pas être utilisé pour une autre composition de fed-batch, par exemple pour une autre source de carbone, ou pour un fed-batch contenant plusieurs nutriments. De plus la vitesse du fed-batch n'est pas contrôlée car est dirigée par la réaction enzymatique. De même le système proposé par Jeude et al. (2006), dans lequel le substrat (cas d'un fed-batch) ou des cristaux de Na2CO3 (cas du contrôle de pH) sont générés par diffusion lente à partir d'un polymère, ne permettent pas un contrôle de la vitesse d'alimentation. Pour miniaturiser les fioles classiques, des microplaques ont été développées, qui permettent de comparer une centaine de conditions en parallèle, dans des volumes entre 1 et 5mL environ. Les systèmes commerciaux vendus par exemple sous les dénominations Micro 24 (Applikon) ou Sim Cell (Seahorse BioScience) permettent une lecture du pH (et éventuellement son contrôle) grâce à des patchs optiques, avec les limitations déjà évoquées ci-dessus (pH>5.5 pour Micro 24, pH>6.5 pour SimCell). Le système SimCell propose une possibilité d'alimentation, mais uniquement par ajouts par intermittence, puisque un seul système de pompe est utilisé pour alimenter une par une chaque cassette de culture. Des approches de microfluidique ont été utilisées pour diminuer encore le volume de culture (environ 50 à 500pL), elle est alors réalisée sur une puce en polymère plastique dans lequel sont gravés des réservoirs et des canaux (Zanzotto (2004), Lee et al. (2006), Funke et al. (2010)). Encore une fois, ces systèmes utilisent une lecture du pH par patch optique, qui ne fonctionne pas pour des pH inférieurs à 5.5. De plus le volume final récupéré en fin de culture est très faible, et ne permet pas forcément des mener toutes les analyses nécessaires. Par ailleurs, des réacteurs miniaturisés ont été développées par scale-down des bioréacteurs de laboratoire, pour des volumes entre 10 et 500mL, et sont commercialisés par exemple sous les dénominations: Stirrer-Pro (Dasgip), Biostat Q+ (Sartorius), Ambr (TAP), Multifors (Infors), Explorerl5 (Medicel). Ces systèmes permettent une alimentation de fed-batch par ajout intermittent (par exemple Ambr), par micropompe calibrée (par exemple Stirrer-Pro), ou par gravité (par exemple Biostat Q+). Le pH est lu classiquement grâce à une électrode de verre miniaturisée, et contrôlé par ajout de base ou acide par une pompe dédiée. Ces systèmes nécessitent donc une pompe et une sonde pour le contrôle du pH, et éventuellement une pompe supplémentaire dans le cas d'un fed-batch. La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. Le procédé selon l'invention est simple, économique, facile à mettre en oeuvre et il permet d'avoir des résultats très rapidement . DESCRIPTION DE L'INVENTION 10 La présente invention concerne un procédé de sélection de clones de souches microbiennes ou de cellules animales placées dans des conditions d'induction de la production de protéines avec un apport continu d'une solution contenant les composés suivants: au moins un substrat carboné, au moins un composé azoté, et d'un ou plusieurs 15 sels minéraux, et la composition de la solution étant choisie de manière à ce que les éléments desdits composés soient en proportion stoechiométrique par rapport à la composition du produit attendu , et que lesdits composés soient sous une forme telle que le pH est maintenu constant sans régulation. De préférence, l'apport a lieu en mode fed-batch. 20 De préférence, la souche est choisie parmi les genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Schizophyllum, Clostridium. De façon particulièrement préférée, la souche est Trichoderma reesei. L'invention est relative à la miniaturisation des protocoles d'étude de souches microbiennes 25 afin de réaliser des études à haut-débit à l'échelle du laboratoire. Le procédé développé peut servir à cribler (screener) différents clones issus d'une même souche mère ou cellule mère (appelé généralement souche mère ci-après), et ainsi identifier un clone hyperproducteur, ou encore il peut être utilisé pour sélectionner différentes conditions opératoires et ainsi permettre d'optimiser les conditions de 30 production. Les clones peuvent par exemple provenir d'un travail de génie génétique réalisé sur la souche mère (délétion d'un gène, surexepression d'un gène, introduction d'un gène hétérologue, ...) Dans l'invention, contrairement aux approches classiques qui partent du matériel, le procédé repose sur une étude de la physiologie de la souche mère, afin d'établir la stoechiométrie précise de la réaction biologique dans les conditions de référence. En particulier il est très important de déterminer les besoins en tous les nutriments, que ce soient des substrats carbonés, des composés azotés, des sels minéraux, ou des bases , acides, espèces anioniques, espèces cationiques, complexes.... La composition de la solution apportée aux souches ou cellules est alors calculée pour apporter tous les nutriments dans les proportions adaptées à la production du produit d'intérêt (par exemple des protéines), et avantageusement à la production maximisée dudit produit (par ex des protéines). Pour cela, on peut par exemple mesurer la composition élémentaire moyenne du produit d'intérêt (protéines par exemple) produit avec la souche mère dans les conditions de référence, et en déduire le besoin en chacun des éléments chimiques pour la production de ce produit. Un moyen proposé est le suivant: tout d'abord, la souche mère est étudiée au laboratoire afin de définir ses conditions de culture optimales, en particulier pour la composition initiale du milieu de culture, la plage de pH optimal, la température optimale. Puis on caractérise sa mise en oeuvre en bioréacteur pour la production de protéines ou tout autre produit d'intérêt afin de définir des conditions de culture , dites de référence, en bioréacteur. Le produit d'intérêt (par ex protéines) est purifié et sa composition élémentaire est déterminée. Avantageusement, on procède à plusieurs productions dans des conditions identiques ou proches de façon à avoir une composition moyenne. Dans l'art antérieur, généralement (et c'est le cas notamment des conditions de référence en bioréacteur), les nutriments sont apportés séparément (par exemple le substrat carboné dans l'alimentation, l'azote sous forme d'ammonium dans le milieu initial ou sous forme ammoniaque basique dans la solution séparée utilisée pour la régulation du pH) ce qui augmente le matériel nécessaire. Dans le cas de la présente invention, tous les composés nécessaires à la production (par ex de protéines) sont apportés à la souche ou à la cellule dans une seule solution. Ces composés sont donc compatibles entre eux. Après croissance sur le milieu de culture initial, les clones à tester sont alimentés par un apport continu de ladite solution, de préférence en mode dit fed-batch (alimentation en continu sans soutirage) afin d'induire la production (par ex de protéines). Pour les clones très producteurs par ex de protéines), on observe que tout le substrat carboné est consommé (pas de carbone résiduel) et que le pH se maintient constant de façon inhérente, sans besoin de régulation. Les clones moins producteurs (par ex de protéines) réagissent par croissance (production de biomasse) , ce qui se manifeste par une élévation du pH. Il est ainsi facile de screener (sélectionner) les clones intéressants simplement par l'évolution du pH. Sur les clones sélectionnés, il est possible alors de déterminer les conditions opératoires optimum en faisant varier les différentes conditions en parallèle. La solution apportée contient généralement un seul substrat carboné ,qui est de préférence un sucre, un seul composé azoté et éventuellement des sels minéraux. Les sels minéraux contiennent par exemple du soufre, du phosphore, du magnésium, du fer ou tout autre élément. Après la phase de démarrage de la réaction biologique, la composition de cette solution reste la même dans le temps, elle ne varie pas. Ce procédé est décrit pour la production de protéines, mais il peut tout aussi bien être utilisé pour screener des souches ou cellules aptes à produire d'autre molécules ou composés intéressants (par exemple des anticorps monoclonaux produits par des cellules animales), dans la mesure où ces souches ou cellules produisent dans des milieux de culture proches. En particulier, le procédé s'applique au screening à haut débit de souches microbiennes ou de cellules animales ou de clones de souches microbiennes ou de cellules animales. La description détaillée du procédé sera faite pour la souche Trichoderma reesei, mais il convient également pour screener des clones d'autres souches. Avantageusement, ce sont des microorganismes, comme les champignons appartenant aux genres Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium. Ces microorganismes ou bactéries produisent des enzymes contenant notamment les cellulases et les hémicellulases; elles sont adaptées à l'hydrolyse totale de la cellulose et des hémicelluloses. Leur intérêt est de pouvoir être utilisé pour la production d'éthanol à partir de biomasse lignocellulosique. Application à Trichoderma Dans le cas de la production de protéines par Trichoderma reesei, les conditions de références sont décrites dans le brevet EP0448430 B1. Le flux de sucre (ou substrat carboné, on utilisera l'une ou l'autre appellation) à appliquer est inférieur à la capacité de consommation de la souche ou cellule. Il est déterminé par une étude préalable telle que décrite précédemment. Pour Trichoderma, le flux optimal qui permet la maximisation de la production de protéines se situe entre 35-45 mg de sucre par gramme de souche et par heure (EP-B1-0448430 B1). Les différents éléments (azote, soufre, phosphore, ...) sont ajoutés au sucre en quantité stoechiométrique , proportionnellement à la teneur mesurée dans les protéines. Dans le cas présent, tout l'azote nécessaire à la production de protéines ne peut pas être apporté dans le milieu de culture initial car il risquerait d'être inhibiteur pour la souche: il est donc apporté avec la solution de sucre. On choisit alors la forme ammoniaque basique neutre, qui est consommé sans baisse de pH associée, ce qui permet de maintenir constant le pH de la culture au cours de la production. Ce ne serait pas le cas avec de l'azote sous forme ammonium qui est consommé conjointement à un relargage d'ion H+, entrainant une acidification du milieu de culture. La quantité de soufre n'est pas cruciale, il suffit d'en avoir suffisamment et en général, elle est en excès. Une quantité de l'ordre de 0.5% pds/pds de sucre est généralement utilisée; le plus souvent, elle peut varier entre 0.1-1.0%. La solution est amenée à un débit tel qu'il n'y a pas accumulation de sucre, en particulier dans le mode fed-batch . Le débit est donc déterminé et éventuellement ajusté par l'homme du métier en fonction de la vitesse de production des protéines et du rendement attendus ou mesurés préalablement pour la souche mère dans les conditions de référence Le pH optimal pour T. reesei est situé entre 4 et 5.5. Dans les conditions du procédé décrit, le pH reste constant dans cette plage. Une caractéristique du procédé est d'opérer sans système annexe de régulation de pH en cours de réaction. Si le clone a une bonne capacité de production de protéines, le pH reste constant . Pour d'autres souches ou cellules, la valeur du pH serait différente mais ne varierait pas lorsque le clone est performant. L'avantage de ce procédé est qu'il peut être opéré dans un appareillage très simple, tel que des fioles. Il n'y a pas besoin de matériel supplémentaire (par exemple sonde ou pompe) pour la régulation de pH, alors que les appareils de l'art antérieur qui opèrent avec des procédés différents nécessitent une régulation de pH avec au minimum une sonde et une pompe. La seule contrainte pour l'appareil est l'apport de la solution, d'où la nécessité d'une seule pompe. Une autre contrainte est d'avoir un transfert d'oxygène suffisant, ce qui influence le choix du réacteur (fiole, plaque munie de puits, ...) et du volume réactionnel. Enfin le volume de travail doit être d'au moins 0.1 ml et de préférence d'au moins 2mL , voire d'au moins 10mL pour permettre de réaliser les analyses hors ligne (activités enzymatiques, dosages des protéines, hydrolyses sur substrats réels...). La solution des nutriments (composés carboné, azoté, et sels minéraux) peut contenir un ou des acides ou bases, mais leur quantité ne variera pas après la phase de démarrage. Pour réaliser le fed-batch, il est possible d'utiliser des fioles et des pompes classiquement utilisées dans les laboratoires. En effet, les débits nécessaires se situent dans des gammes classiques donc ne nécessitent pas de pompe de haute précision, comme ce serait le cas pour le contrôle du pH avec une solution concentrée séparée. De façon générale, ce procédé est applicable lorsqu'il existe un fed-batch avec un apport limitant. Ce procédé est très intéressant pour sélectionner des souches utilisées pour la production 25 d'enzymes à partir de champignons filamenteux. Le procédé est particulièrement intéressant dans le cas où lesdites enzymes sont utilisées pour la production d'éthanol à partir de biomasse ligno-cellulosique. De préférence on utilise le genre Trichoderma et de préférence Trichoderma reesei. EXEMPLES 30 L'exemple 1 montre les performances obtenues pour la souche mère en conditions de référence en bioréacteur avec fed-batch et contrôle du pH par un système de régulation (une sonde de mesure et une pompe supplémentaire). 20 L'exemple 2 montre les performances obtenues pour la souche mère avec un protocole de culture classique en fioles agitées, sans fed-batch ni contrôle du pH. L'exemple 3 montre les performances obtenues avec le même protocole classique pour 3 clones issus de la souche mère. L'exemple 4 montre la préparation de la solution contenant les nutriments appliquée à T.reesei . L'exemple 5 montre les performances obtenues pour la souche mère avec le procédé selon l'invention. L'exemple 6 montre le screening d'une collection de clones issus de la souche mère. L'exemple 7 montre l'utilisation du procédé pour tester différentes conditions opératoires. Dans tous ces exemples le critère retenu pour comparer le comportement des microorganismes est la vitesse spécifique de production de protéines, en milligramme de protéines par gramme de cellule de microorganisme et par heure. Les exemples sont accompagnés de figures: la figure 1 représente le suivi du pH au cours de la production de protéines pour la souche mère de T.reesei, selon un protocole classique (triangles) , et selon l'invention (carrés) la figure 2 montre la vitesse spécifique de production de protéines mesurée pour 3 clones (A,B,C) issus de la souche mère de T. reesei, en protocole classique (hachures), et selon l'invention (noir) Exemple 1 (non conforme) Après 30h de croissance de la souche mère de T.reesei sur glucose en bioréacteur, la production de cellulases est réalisée par un fed-batch contenant 250g/L de lactose. Le pH est contrôlé à 4.0 par ajout de NH4OH 21%. Le rendement mesuré en production est de 0.36 gramme de protéines produites par gramme de lactose consommé. La vitesse spécifique de production de protéines est de 12.5mg/g/h. Exemple 2 (non conforme) Après 30h de croissance de la souche mère de T.reesei sur glucose en fioles agitées, la production de cellulases est induite par un pulse de 10g/L de lactose. Le pH, à 5.0 après la croissance, baisse jusqu'à 3.3 en raison de la consommation de NH4+. (Figure 1). La vitesse spécifique de production de protéines est de 5.0mg/g/h, soit 2.5 fois moins qu'en bioréacteur. Exemple 3 (non conforme) 3 clones (A,B,C) issus de la souche mère de T.reesei sont mis en culture selon le protocole de l'exemple 2, on observe un comportement semblable, avec une vitesse spécifique de production de protéines d'environ 2 mg/g/h (Figure 2), et un pH final entre 3.0 et 3.5. Exemple 4 (préparation de la solution de nutriments selon l'invention) 10 A partir de la mesure de la composition élémentaire des protéines produites par T reesei (C1-11.73300.508N0.23) et de la mesure du rendement en bioréacteur, en conditions de référence (exemple 1), on calcule le besoin en azote sous forme d'ammoniaque NH4OH 21%, afin que l'apport d'ammoniaque soit steochiométrique à la quantité de lactose apporté par le fed-batch. La composition de la solution de fed-batch est alors la suivante: lactose: 50g/L; 15 NH4OH 21%: 15mUL. Exemple 5 (alimentation en nutriments selon l'invention) Après 30h de croissance de la souche mère de T.reesei sur glucose en fioles agitées, la production de cellulases est réalisée par un fed-batch dont la composition est celle de l'exemple 4. Une seule pompe est utilisée par fiole, et les fioles ne sont pas équipées de 20 sondes de pH. Le pH reste stable entre 4.8 et 5.2 (Figure 1). La vitesse spécifique de production de protéines est de 12.5mg/g/h, comme en bioréacteur. Exemple 6 (screening selon l'invention) Les 3 clones (A,B,C) issus de la souche mère de T. reesei et précédemment utilisés pour l'exemple 3 sont mis en culture comme dans l'exemple 5. Le pH est resté stable entre 4.0 et 25 5.0, et la vitesse spécifique de production de protéines a été respectivement de 2, 8 et 11 mg/g/h (Figure 2). Ainsi on a pu séparer les clones selon leur performance, ce qui n'avait pas été possible avec le protocole classique comme décrit dans l'exemple 3 Exemple 7 (variation des conditions) Le protocole de l'exemple 5 a été modifié pour tester différentes conditions opératoires. 30 Dans la fiole F0, la composition du fed-batch est inchangée. Dans la fiole F1, 50% du lactose a été remplacé par du xylose. Dans la fiole F2, 100% du lactose a été remplacé par du cellobiose. La vitesse spécifique de production de protéines du microorganisme dans les fioles F0, F1, F2 est respectivement de 8.7, 7.3 et 6.7 mg/g/h. Ainsi on a pu tester le comportement d'un même clone dans différentes conditions opératoires.