FR 2985830 A1 20130719 FR 1250298 A 20120112 Procédé de classification supervisée de cellules comprises dans des images de microscopie DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [001] La présente invention concerne un procédé de classification supervisée de cellules comprises dans des images pouvant être multimodales ou multiparamétriques et provenant par exemple de microscopes. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE [002] Grâce aux évolutions technologiques de ces dernières années dans le domaine de l'imagerie cellulaire de plus en plus de phénomènes biologiques peuvent aujourd'hui être étudiés. [3] La plupart, de ces études induisent des analyses 15 simultanées de plus d'un paramètre utilisant différentes sondes. [4] Mais les effets biologiques sur une population de cellules peuvent être hétérogènes. Par exemple, un changement pourrait se produire avec une intensité différente dans 20 plusieurs cellules ou dépendre de l'expression d'autres protéines. Dès lors, des analyses statistiques sur de grandes populations de cellules, plus d'un millier par exemple, deviennent alors nécessaires. [5] Des techniques de l'état de l'art telles que la 25 cytométrie en flux permettant de faire défiler des cellules à grande vitesse dans un faisceau laser, en les comptant et en les caractérisant, sont des outils bien utiles pour la réalisation de telles analyses. Ces techniques sont particulièrement adaptées pour la 30 réalisation d'analyses puissantes sur un grand nombre de cellules isolées, mais ne peuvent être utilisées dans le cadre de localisation subcellulaire ou lorsque l'analyse doit être effectuée pour un groupement de cellules, par exemple pour une section de tissu. [6] Par ailleurs, on connaît dans l'état de l'art des appareils d'imagerie cellulaire à haut-débit tels que de puissants microscopes capables de produire des milliers d'images multiparamétriques, pouvant être utilisés notamment lors de recherches incluant de nombreuses conditions expérimentales ou d'échantillons. Cependant, le nombre important d'images produites dans le cadre de ces recherches requiert de puissant dispositif pour la mise en oeuvre de leur analyse et leur classification. Une telle analyse exige en particulier une identification des cellules afin de pouvoir effectuer une classification de celles-ci en fonction de critères relatifs à leur aspect morphologique, à l'intensité de la coloration ou encore la localisation subcellulaire. [7] On comprend dès lors qu'un inconvénient majeur de l'art antérieur réside dans le fait qu'il est difficile d'effectuer une classification précise de cellules dès lors qu'elle porte sur un grand nombre d'entre elles. [8] Une solution usuelle est d'avoir recours à un opérateur humain expérimenté, voire plusieurs, pour réaliser une telle classification de cellules. Toutefois, l'inconvénient majeur d'une telle solution est d'être chronophage et surtout peu reproductible. En effet, le nombre de cellules à classer est souvent de l'ordre de plusieurs dizaine de milliers voire de millions de cellules et rend alors le comptage irréalisable par un expert humain. De plus la variabilité de la classification intra et inter-opérateurs rend l'évaluation humaine peu reproductible et peu fiable. EXPOSE DE L'INVENTION [009] L'invention vise à résoudre le problème lié aux difficultés techniques rencontrées dans l'identification et la classification cellulaire portant sur un nombre important de cellules. [0010]Dans ce dessein, un aspect de l'invention se rapporte à un procédé de classification supervisée de cellules comprises dans un premier et un deuxième format différent d'images de microscopie, comprenant les étapes suivantes : - prétraitement réalisée à partir du premier et deuxième format différent d'images visant à caractériser leur contenu visuel se rapportant aux cellules et à le transformer en données numériques; - exécution d'un code relatif à un algorithme UNN visant à traiter lesdites données numériques. [0011]Selon des modes de réalisation particuliers : -l'étape de prétraitement comprend : - une détection de localisation dans le contenu de régions susceptibles de se rapporter à des cellules ; - une segmentation de ces dites régions cellulaires ; - une extraction de ces régions cellulaires; - l'étape de prétraitement comprend : - une détection de localisation dans le contenu de régions susceptibles de se rapporter à des cellules ; - une segmentation de ces dites régions cellulaires ; - une extraction de ces régions cellulaires; -l'étape de détection comporte les sous-étapes de : - vérification consistant à valider les régions cellulaires identifiées dans le premier format d'image se trouvant également dans le deuxième format d'image ; - conservation des régions cellulaires vérifiées dont la moyenne d'intensité est suffisamment grande par rapport à la moyenne d'intensité du contenu entier du premier format d'image ; -l'étape de segmentation consiste : - en une superposition d'une image gradient préalablement déterminée de ladite image de deuxième format et un masque logique des régions cellulaires détectés ; - application d'un algorithme de ligne de partage des eaux (watershed) au résultat de cette superposition ; -l'étape d'extraction consistant en un encodage du contenu de chaque segmentation de régions cellulaires détectées à partir de descripteurs définissant les textures de ce contenu; -l'image est multimodale ou multiparamétrique, et - le premier et deuxième format différent d'images se rapportant respectivement à une image dite du noyau et une image de fixation. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées : - Figure 1 représente un organigramme se rapportant au procédé de classification selon un mode de réalisation de l'invention, - Figure 2 illustre l'étape d'apprentissage du procédé selon un mode de réalisation de l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE D'UN MODE DE REALISATION [0012]Légendes des figures 1 et 2 : 1 : Etape de détection ; 2 : Segmentation de noyau ; 3 : Segmentation cellulaire ; 4 : Classification ; 5 : Base de données de cellules ; 6 : Base de données d'images de fixation ; 7 : Base de données d'images de noyau ; 8 : Base de données de test ; 9 : Base de données d'apprentissage ; 10 : Descripteurs bio-inspiré ; 11 : Descripteurs bio-inspiré ; 12 : Apprentissage ; 13 : Classification ; 14 : Validation ; 15 : Coefficients de différence de gaussienne; 16 : Prototypes pondérés. [0013]Ainsi que l'illustre la figure 1, dans un mode de réalisation de l'invention le procédé de classification supervisée de cellules comprises dans deux formats d'images différents, comprend une étape de prétraitement réalisée à partir des deux formats d'images. [0014]Dans ce mode de réalisation, le type d'image susceptible d'être traitée se rapporte par exemple à une image multimodale ou encore multiparamétrique de microscopie en fluorescence. [0015] Dans le cadre de ce prétraitement, le premier format d'image se rapporte à une image dont le contenu comprend essentiellement des noyaux de cellules qui sont ici mis en évidence. Une telle image est nommée « image de noyau » et se rapporte à un fichier de données numériques stocké dans une base de données. [0016]Le second format d'image correspond à une image dont le contenu se rapporte à une vue globale des cellules correspondant aux cellules dont les noyaux sont mis en évidence dans « l'image de noyau ». Une telle image est ici nommée « image de fixation ». Cette image comporte les informations utiles pour la réalisation de ce type de classification et correspond à un format d'image qui permet d'identifier la fixation d'un marqueur telle qu'une protéine dans une zone de la cellule. Cette image de fixation se rapporte à un fichier de données numériques stocké dans une base de données. [0017]Cette étape de prétraitement vise à caractériser le contenu visuel se rapportant aux cellules présentes dans ces deux formats d'images, en convertissant ainsi ce contenu en données numériques. [0018]Pour ce faire, cette étape de prétraitement comporte une étape de détection de cellules dans l'image de noyau de sorte à obtenir par la suite une segmentation de noyau de ladite image. Cette étape de détection vise à identifier l'emplacement des cellules ou régions cellulaires de l'image de noyau, et ensuite à vérifier que ces emplacements sont fiables de sorte à les utiliser pour déterminer la segmentation cellulaire à partir du contenu de l'image de fixation et d'exécuter alors l'étape d'extraction. [0019]Cette étape de détection vise à localiser dans l'image de noyau les régions de son contenu qui sont susceptibles de se rapporter à des cellules. Un traitement particulier mettant en oeuvre des opérateurs morphologiques, est alors réalisé sur cette image de noyau. [0020]Dans un premier temps, lors d'une étape de calcul l'image de noyau est convertie en une image binaire par seuillage automatique. Dans l'optique de détecter lesdites cellules, cette image binaire est alors traitée lors des étapes de calculs morphologiques mathématiques : - érosion avec un élément structurant en forme de disque ; - pour chaque objet connecté, calcul de quelques caractéristiques élémentaires (superficie, solidité et position du centroïde); - sélection des objets avec une grande solidité ou de petite surface, puis stockage de la position du centroïde et leur suppression de l'image binaire; - calcul de la superficie moyenne des objets et, si trop petit, diminution du rayon du disque et réitération de l'étape d'érosion afin d'obtenir une érosion fine. [0021]Une fois les cellules identifiées sur la base de cette image binaire du noyau, l'étape de détection prévoit une sous étape de vérification consistant à valider les régions cellulaires identifiées dans l'image de noyau se trouvant également dans l'image de fixation. [0022]De plus, afin d'éliminer les identifications erronées de régions cellulaires, l'étape de détection comporte une sous- étape de conservation des régions cellulaires vérifiées dont la moyenne d'intensité est suffisamment grande par rapport à la moyenne d'intensité du contenu entier de l'image de noyau. [0023]Les régions cellulaires détectées constituent un masque logique de régions cellulaires, qui est alors superposé à une image gradient préalablement déterminée de ladite image de fixation. [0024]Un algorithme de ligne de partage des eaux (plus connu sous le terme de « watershed ») est alors appliqué à l'image résultante de cette superposition, de sorte à obtenir une image segmentée. [0025]Une fois la segmentation effectuée, une étape d'extraction est alors mise en oeuvre consistant en un encodage du contenu de chaque segmentation de régions cellulaires détectées à partir de descripteurs définissant les textures de ce contenu. [0026]Cette étape d'extraction vise à encoder le contenu visuel de chaque cellule ou région segmentée. Les descripteurs représentent de manière compacte la texture localisée à l'intérieur d'une région cellulaire et également celle située à la frontière d'une cellule. Cette manière compact signifie que pour une cellule correspond un descripteur. [0027]Ainsi, dans le cadre de cette étape d'extraction, et à partir d'une étape de calcul mettant en oeuvre des opérateurs morphologiques, les régions cellulaires d'intérêt sont divisées en sous régions correspondant : à la membrane, au cytoplasme et au noyau de la cellule. Dans cette étape d'extraction une étape de filtrage par différence de gaussienne (DOG) est alors appliquée à ces sous régions à quatre échelles différentes, de sorte à créer des détails de texture à différentes résolutions spatiales. Cette création de détails de texture àdifférentes résolutions spatiales permet de réaliser une représentation de la texture telle qu'elle est susceptible d'être vue par la vision humaine. [0028]L'étape d'encodage de chaque sous régions est alors réalisée par la concaténation des histogrammes de coefficients de différence de gaussienne sur des régions calculés à des échelles considérées, créant ainsi un descripteur visuel spécifique de cellules. Ce descripteur correspond ici à un descripteur bio-inspiré subcellulaires basés région. Ce type d'encodage offre l'avantage de ne pas consommer de ressources matérielles du système susceptible de le mettre en oeuvre, au regard de mécanismes de l'état de l'art utilisant des histogrammes de direction de gradient sur des blocs. [0029]Dès lors, les coefficients de filtre par histogrammes sont directement encodés sur les régions cellulaires segmentés. [0030]Cette étape d'encodage permet d'obtenir pour une cellule donnée les données numériques se rapportant à un descripteur bio-inspiré subcellulaire basé région et un coefficient de classification linéaire. [0031] Lors d'une étape de traitement le dispositif - équipement informatique de traitement automatique de données - susceptible de mettre en oeuvre ce procédé exécute à partir de ses moyens de traitement - microprocesseur et moyens de mémoire - un code visant à classer une cellule comprise dans ladite image à partir de ces données numériques. [0032]Ce code se rapporte à l'algorithme suivant : avec : - cxic : correspond aux coefficients de classification linéaire des prototypes, qui fournissent une règle de vote pondéré au lieu d'un vote uniformes ; - X7,21 : désigne la requête ; - x : désigne le descripteur du prototype; - Yjc: est le label défini par l'expert du prototype (positif/négatif) appartenant à la classe c avec c=1,2,....0 ; - T: correspond à la taille de l'ensemble des prototypes qui sont autorisés à voter ; - h,: est le score d'un classificateur linéaire généralisant k-NN _ M.;.): est un poids associé au rang du jèmekNN pour la requête X(21 Où NNI,(Xi)désigne le k-plus proches voisins du prototype [0033]Le résultat obtenu grâce à l'application de la règle de classification fix',21) permet alors de réaliser le classement de la cellule (la classe retenue est celle qui obtient le meilleur score), afin de la stocker dans une base de données de cellules. [0034]Le procédé décrit est un procédé de classification supervisée qui requiert par conséquent dans le cadre de son fonctionnement une étape d'apprentissage. [0035]En référence à la figure 2, cette étape d'apprentissage permet d'améliorer la pertinence de la classification à partir du calcul de prototypes d'un classificateur supervisé résultant de cellules annotées par un expert en minimisant une fonctionnelle de misclassification. [0036]Pour ce faire, des images de cellules annotées par un expert biologiste et stockées dans une base de données d'apprentissage permettent alors de calculer les paramètres du procédé de classification supervisée et de les comparer à ceux résultant du traitement particulier d'images de cellules archivées dans la base de données de test, et ainsi de valider la classification en termes de précision, lors d'une étape de validation. [0037]Cette étape d'apprentissage comporte une sous étape de formation des classificateurs consistant essentiellement en la sélection de sous-ensembles les plus pertinents de données de la base de données d'apprentissage, c'est-à-dire de prototypes dont le cardinal T est généralement plus petit que le nombre m d'instances annotées. [0038]Ces prototypes pondérés sont sélectionnés en ajustant d'abord les coefficients ai, puis en retirant les exemples avec les plus petits coefficients ai, lesquels étant les moins pertinents comme prototypes. [0039]Dans l'optique d'adapter la règle de classification 1,11, (.1C,I)au sous ensemble de données sélectionné, les risques de substitution exponentielle sont minimisées à partir de: avec : qui est la fonctionnelle de risque ; qui est la fonction de misclassification Xi correspondant à un exemple. 20 [0040]On peut ainsi mesurer la qualité de l'ajustement de la règle de classification à partir du prototype (Xl;),i) pour la classe c, en étant positif si la prédiction est d'accord avec l'exemple annoté. [0041]L'algorithme UNN résout ce problème d'optimisation en 25 utilisant un mécanisme itératif où la règle de classification où15 est mise à jour en y ajoutant un nouveau prototype (A7i;yi) (classificateur faible) à chaque étape t (t = 1,2,_,T), dont le coefficient de levier cxi est calculé avec l'expression littérale: w+ a = 0,5 Log Avec : Veettesont les sommes des poids des bons et mauvais inverses kNN de j mis à jour à chaque itération. A noter que pour les méthodes concurrentes comme les SVM (acronyme de Support Vector Machine qui signifie en français machines à vecteurs de support ou séparateurs à vaste marge), le calcul des coefficients requiert la résolution d'un système d'équation. [0042]On comprend clairement que le coût en classification linéaire au regard du nombre d'exemples est moindre que le coût quadratique de l'état de l'art en matière de classification. [0043]Dès lors on comprend bien qu'une telle solution permet de réaliser une classification supervisée automatique. [0044]Cette classification supervisée correspond alors à une technique de classification automatique où l'on cherche à produire automatiquement des règles à partir d'une base de données d'apprentissage contenant des exemples annotés par un expert et d'une base de données de test comprenant des images de cellules. [0045]Ainsi, il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation décrits et illustrés. Elle n'est en outre pas limitée à ces exemples d'exécution et aux variantes décrites. REVENDICATIONS1. Procédé de classification supervisée de cellules comprises dans un premier et un deuxième format différent d'images de microscopie, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - prétraitement réalisée à partir du premier et deuxième format différent d'images visant à caractériser leur contenu visuel se rapportant aux cellules et à le transformer en données numériques; - exécution d'un code relatif à un algorithme UNN visant à traiter lesdites données numériques. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape de prétraitement comprend : - une détection de localisation dans le contenu de régions susceptibles de se rapporter à des cellules ; - une segmentation de ces dites régions cellulaires, et - une extraction de ces régions cellulaires. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite étape de détection comporte les sous-étapes de : - vérification consistant à valider les régions cellulaires identifiées dans le premier format d'image se trouvant également dans le deuxième format d'image, et - conservation des régions cellulaires vérifiées dont la moyenne d'intensité est suffisamment grande par rapport à la moyenne d'intensité du contenu entier du premier format d'image. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite étape de segmentation consiste en :- une superposition d'une image gradient préalablement déterminée de ladite image de deuxième format et d'un masque logique des régions cellulaires détectés, et - une application d'un algorithme de ligne de partage des eaux au résultat de cette superposition. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite étape d'extraction consiste en un encodage du contenu de chaque segmentation de régions cellulaires détectées à partir de descripteurs définissant les textures de ce contenu. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite image est multimodale ou multiparamétrique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 précédentes, caractérisé en ce que le premier et deuxième format différent d'images se rapporte respectivement à une image dite du noyau et une image de fixation. 20 25