FR 2981156 A1 20130412 FR 1159096 A 20111010 DISPOSITIF D'ETUDE DE LA PERMEABILITE DE MEMBRANES BIOLOGIQUES, ARTIFICIELLES OU SYNTHETIQUES L'invention relève des domaines pharmaceutiques, médicaux, vétérinaires et cosmétiques. Elle a pour objet un dispositif d'étude de la perméabilité de membranes biologiques, artificielles ou synthétiques à des composés chimiques, désigné par la suite « cellule de diffusion ». Dans la suite de la description et dans les revendications, on entend par : - membranes biologiques : des tissus isolés (e.g., épithélium ; endothélium, tissu conjonctif) ou des échantillons d'organes (e.g., peau ; estomac ; intestin ; vessie ; poumons) humains, animaux ou végétaux ; - membrane artificielle : une couche mince de matière naturelle modifiée chimiquement ou physiquement (e.g., éthers de cellulose) ; - membrane synthétique : une couche mince de matière obtenue par synthèse chimique (e. g. , polysilo xanes ; po lytétrafluoro éthylène) . Chacune de ces membranes présente une perméabilité et une sélectivité différentes à des composés chimiques. L'étude de la perméabilité membranaire à des composés chimiques est une étape clef pour l'élaboration de produits de santé humains ou vétérinaires, et de cosmétiques. En effet, ces études de perméabilité permettent d'estimer, en partie, la pharmacocinétique (i.e., absorption ; distribution ; élimination) tissulaire d'un composé chimique. Dans ces études, un ou plusieurs composés chimiques d'intérêt sont dispersés dans des formulations ou véhicules liquides, semi solides ou solides, puis sont mis en contact avec la surface membranaire. Ils subissent alors une pénétration (i.e., transport dans la membrane) et une perméation (i.e., transport à travers la membrane). La détermination de la pénétration et de la perméation caractérise la perméabilité d'une membrane biologique, artificielle ou synthétique à un composé chimique. Comme déjà mentionné, les dispositifs utilisés pour l'étude in vitro ou ex vivo de la perméabilité membranaire sont dénommés cellule de diffusion (CDD). Différents types de CDD sont actuellement décrits en fonction de leur géométrie. Les CDD comportent un compartiment donneur et un compartiment receveur séparés par une membrane biologique, artificielle ou synthétique. L'ensemble du dispositif peut être positionné verticalement (CDD dite de Franz) ou horizontalement (e.g., CDD dite chambre de Ussing). Les compartiments receveurs sont remplis d'un liquide (e.g., solution d'électrolytes ou colloïdale) dont la composition est adaptée en fonction des propriétés du composé chimique (ou perméant) à étudier. Ainsi, l'étude de la perméabilité d'un composé chimique présentant une hydrophobie marquée nécessite l'ajout dans le liquide récepteur d'adjuvants tels que : (i) des co-solvants (e. g. , éthanol ; méthanol ; po lyéthylèneglyco ls), (ii) des surfactants (e.g., polysorbates ; poloxamers), (iii) des macromolécules (e.g., serum albumine ; hydroxyethylamidon). Afin d'assurer l'étanchéité du dispositif, une pince est placée entre les compartiments donneur et receveur. La membrane placée entre les deux compartiments maintenus par la pince assure le rôle de joint torique pour l'ensemble du dispositif. Un exemple de CDD de Franz est représenté sur la Figure 1. Par ailleurs, afin de se rapprocher des conditions physiologiques, le compartiment receveur des CDD est maintenu à une température constante de 37°C. La température à la surface de la membrane face au compartiment donneur est alors voisine de 33°C. Selon les applications visées, le compartiment donneur peut être maintenu à une température constante. La géométrie du compartiment donneur est adaptée au dépôt de formulations liquides, semi solides et solides. La fin de la procédure de dépôt coïncide avec le début de l'étude de perméabilité. A intervalle de temps régulier, un aliquote de la solution réceptrice est prélevé au moyen d'une seringue, puis est remplacé par un volume équivalent de solution réceptrice, afin de maintenir un volume constant dans le compartiment receveur. A la fin de la période de traitement, les compartiments donneur et récepteur sont vidés. Le perméat est extrait de la membrane par un traitement mécanique ou chimique adapté. Les dosages de perméat dans les aliquotes de phase réceptrice et dans les extraits de membrane permettent de déterminer les paramètres de perméabilité du perméat (i.e., coefficient de perméabilité ; masse de composé chimique diffusant à travers la membrane par unité de temps et de surface ou flux transmembranaire) et la distribution membranaire (e.g., distribution tissulaire dans un épithélium) du perméat.35 Les CDD disponibles actuellement présentent un certain nombre d'inconvénients déjà connus et rapportés dans la littérature en particulier dans le document Levintova, Y., F.M. Plakogiannis, and R.A. Bellantone, «An improved in vitro method for measuring skin permeability that controls excess hydration of skin using modified Franz diffusion cells ». Int J Pharm, 2011. Ainsi, l'utilisation d'une solution aqueuse dans le compartiment receveur est susceptible d'induire : (i) une hyperhydratation des membranes biologiques, (ii) une extraction de composés endogènes aux membranes biologiques, (iii) une prolifération microbienne au cours de l'étude, (iv) la migration d'électrolytes, de co-solvants, de surfactants dans les membranes biologiques susceptibles de modifier la perméabilité initiale des membranes, (v) la formation de bulles d'air contre la membrane lors de l'échauffement de la solution aqueuse. Par ailleurs, la production de CDD comportant des éléments en verre soufflé présente un coût économique important. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est de mettre au point une cellule de diffusion ne présentant pas les inconvénients ci-dessus évoqués. Pour ce faire, le Demandeur a mis au point un nouveau milieu récepteur, qui se présente non plus sous forme liquide mais sous forme semi-solide. Un milieu semi-solide est un milieu dont les propriétés mécaniques (élasticité, plasticité, déformation) et rhéologiques (viscosité, écoulement) sont intermédiaires entre celles d'un liquide et d'un solide. Le milieu semi-solide n'entraîne pas d'hyperhydratation de la membrane et n'altère donc pas sa perméabilité. L'échauffement à 37°C du milieu semi-solide ne donne pas naissance à la formation de bulles gazeuse entre le milieu et la membrane. L'utilisation d'un milieu semi-solide simplifie la conception des CDD en éliminant les dispositifs de prélèvement et la nécessité d'agitation mécanique du fluide receveur, de plus il n'est plus nécessaire d'utiliser des pinces de serrage. Par ailleurs, la migration des adjuvants vers la membrane est avantageusement diminuée de part les propriétés rhéologiques du milieu receveur et les interactions moléculaires adjuvants-gélifiants. En d'autres termes, l'invention a pour objet une cellule de diffusion comprenant, séparés par une membrane biologique, artificielle ou synthétique, un compartiment donneur comprenant une solution de composés chimiques à doser et un compartiment receveur destiné à collecter la quantité de composés chimiques ayant traversé la membrane biologique, artificielle ou synthétique. L'invention se caractérise en ce que le compartiment receveur contient un milieu receveur sous forme semi solide. Le milieu receveur semi-solide selon l'invention est défini au sens de la 7' Edition de la Pharmacopée européenne comme une crème, un gel, une pommade ou encore une pâte. Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, le milieu semi-solide est un gel, c'est-à-dire une matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel dans un milieu liquide. Il s'agit plus précisément d'un mélange de solvant et de polymère gélifiant. Le polymère ou la combinaison de polymères utilisés (aussi appelés gélifiants) représentent entre 1% et 30% du poids total du gel. Ce gel, de nature hydrophile (i.e., hydrogel) ou lipophile (i.e., oléogel), a une composition adaptée aux caractéristiques physicochimiques du perméant, notamment par l'ajout d'adjuvants. Les hydrogels comprennent avantageusement : - en tant que solvant : de l'eau, un mélange eau/cosolvants polaires ou encore eau/surfactants, - en tant qu'agent gélifiant, seuls ou en combinaison : o des gélifiants naturels : e.g., collagène, hyaluronane, chondroitine sulfate, agarose, gélatine o des gélifiants artificiels : e.g., chitosane, ethers de cellulose (e.g., méthylcellulose), des dérivés cellulosiques (e.g., carboxyméthylcellulose), o des gélifiant synthétiques : e.g., carbopol ; polyethylène glycols ; alcool polyvinylique Les oléogels comprennent avantageusement : - en tant que solvant : des huiles minérales (e.g., huile de paraffine), ou végétales (e.g., huile d'amande douce), - en tant qu'agent gélifiant, seuls ou en combinaison : o des gélifiants naturels : e.g., ester de cholesterol, o des gélifiant synthétiques : e.g., ester de sorbitan. Comme déjà dit, la migration des adjuvants vers la membrane est avantageusement diminuée de part les propriétés rhéologiques du milieu receveur et les interactions moléculaires adjuvants-gélifiants. Aussi, la viscosité du milieu receveur devra être telle que l'on n'observe pas d'écoulement pendant la durée de l'expérimentation, i.e. 24h, et ce même après conservation à +4°C ou -18°C. Dans un premier mode de réalisation, la cellule de l'invention se présente sous la forme d'un dispositif unitaire. Une telle cellule peut être qualifiée de « monocompartimentale » en ce sens qu'elle ne comprend qu'un compartiment receveur associé à un seul compartiment donneur. Selon l'invention, les compartiments donneur et receveur sont tubulaires et associés par des moyens de solidarisation. Dans un premier mode de réalisation, les moyens de solidarisation se présentent sous la forme d'un filetage mâle agencé à la base du compartiment donneur destiné à coopérer avec un filetage femelle correspondant, agencé à l'extrémité supérieure du compartiment receveur. Avantageusement, chaque compartiment présente, au niveau du filetage, un orifice d'évacuation d'air. En pratique, la membrane est maintenue entre les deux compartiments par le filetage, ce qui permet d'assurer l'étanchéité du dispositif lors de l'assemblage. Dans un mode de réalisation alternatif, les moyens de solidarisation se présentent sous la forme d'une bague de serrage dite également « d'étanchéité » qui s'ajuste aux compartiments donneur et receveur soit par coulissement, soit au moyen de filetages. Avantageusement, la bague présente au moins un orifice pour permettre l'évacuation de l'air au moment de l'assemblage. De manière générale, une surface de membrane de moins de 2.5 cm est suffisante. Le milieu semi solide est quant à lui inséré directement dans le compartiment receveur à l'état semi solide. Dans tous les cas, le milieu semi solide est en contact avec toute la surface de la 35 membrane. Dans un second mode de réalisation, la cellule de diffusion est multi compartimentale en ce sens qu'elle contient plusieurs compartiments donneurs et autant de compartiments receveurs, chaque fois séparés par une membrane. Dans ce cas, le compartiment receveur se présente sous la forme d'une plaque multi puits, chacun des puits étant rempli d'un milieu semi solide précoulé prêts à l'emploi. Chaque puit est destiné recevoir une bague d'étanchéité sur toute sa périphérie, avantageusement par coulissement, dont l'extrémité supérieure coopère avec l'extrémité inférieure du compartiment donneur au moyen d'un filetage ou par coulissement. La membrane est maintenue entre la bague et le compartiment donneur par le filetage ou par recouvrement à l'issue du coulissement. De même que précédemment, la bague présente au moins un orifice agencé au niveau de son filetage ou de la zone de recouvrement pour permettre l'évacuation de l'air au moment de l'assemblage. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. La figure 1 est une représentation schématique d'une cellule de Franz La figure 2 est une représentation schématique d'une cellule de diffusion de l'invention selon un premier mode de réalisation où l'étanchéité du dispositif est assurée par un système de filetage. La figure 3 est une représentation schématique d'une cellule de diffusion de l'invention selon un second mode de réalisation où l'étanchéité du dispositif est assurée par un système de filetage. La figure 3bis est une représentation schématique d'une cellule de diffusion de l'invention selon le même mode de réalisation que celui de la figure 3 où l'étanchéité du dispositif est assurée par un système de coulissement. La figure 4 est une représentation schématique d'une cellule de diffusion de l'invention selon un troisième mode de réalisation. La figure 5 est une courbe de dosage de lidocaine effectuée par 3 cellules différentes respectivement cellule de Franz, système Quixsep® et cellule de l'invention. La figure 6 est une courbe de dosage de méthylprédnisolone effectuée par 3 cellules différentes respectivement cellule de Franz, système Quixsep® et cellule de l'invention. La figure 7 est une courbe de dosage de mitomicyne C effectuée par 3 cellules différentes respectivement cellule de Franz, système Quixsep® et cellule de l'invention. Exemple 1 : Cellule de Franz Sur la figure 1, on a représenté schématiquement une cellule verticale statique dite cellule de Franz. Cette cellule se compose d'un compartiment receveur (1) contenant un fluide receveur maintenu à 37°C agité au moyen d'un agitateur magnétique (2) et un compartiment donneur (3), surmonté le cas échant, pour le dosage des substances volatiles, par un filtre au charbon actif (4). Les deux compartiments sont séparés par une membrane biologique, artificielle ou synthétique (5) reposant sur une grille (6). Le compartiment receveur présente en outre un col (7) destiné à permettre la prise d'échantillon au cours du temps, soit manuellement, soit de manière automatisée. La procédure mise en oeuvre pour ces dosages est notamment décrite dans les deux références suivantes : OECD/OCDE, OECD Guideline for the testing of chemicals. Skin Absorption :in vitro method, in 428, O.f.E.C.-o.a. Development, Editor. 2004: Paris. OECD/OCDE, OECD Guidance Notes on Dermal Absorption, in Draft 22 october 2010, O.f.E.C.-o.a. Development, Editor. 2010. Exemple 2: cellule de diffusion monocompartimentale de l'invention selon un premier mode de réalisation Comme représenté sur la figure 2, la cellule comprend un compartiment donneur (8) se présentant sous la forme d'un cylindre creux destiné à recevoir le ou les composés chimiques à tester. Le cylindre (8) présente à son extrémité inférieure un filetage mâle (9) destiné à coopérer avec le filetage intérieur femelle (non apparent sur la figure) du compartiment receveur (10). La membrane (11) est maintenue entre le compartiment donneur (8) et le compartiment receveur (10). Le compartiment receveur (10) contient un milieu semi solide (12) destiné à venir en contact avec la face inférieure de la membrane (11).30 Exemple 3 et 3bis : cellule de diffusion monocompartimentale de l'invention selon un second mode de réalisation Comme représenté sur la figure 3, la cellule comprend une bague d'étanchéité (13) munie d'un filetage femelle et d'un ou plusieurs orifices (14) au niveau de ce filetage pour permettre l'évacuation de l'air lors de l'assemblage de la CDD. Le compartiment donneur est un cylindre (8) muni d'un filetage mâle (9) permettant d'assurer l'étanchéité. Le compartiment receveur est un socle creux (15) destiné à contenir le milieu récepteur semi -solide. Dans un mode de réalisation alternatif (Figure 3bis), la bague d'étanchéité est dépourvue de filetage et la solidarisation avec les compartiments se fait par coulissement (16). Exemple 4 : cellule de diffusion multicompartimentale de l'invention Dans ce mode de réalisation représenté sur la figure 4, le compartiment receveur se présente sous la forme d'une plaque (17) multi puits (18.1-5). Chaque puits contient un milieu semi solide précoulé. Les compartiments donneurs (19) sont assemblés sur les bagues d'étanchéité (20) en insérant la membrane (21), puis mis en place sur le milieu semi-solide (22). Le compartiment donneur (19) est rempli d'une préparation liquide, semi-solide ou solide d'un ou de plusieurs composés chimiques. L'utilisation de CDD de l'invention en mode multi-puits comporte cinq étapes. Etape 1 : Un couvercle protégeant la plaque multi-puits et les milieux semi-solides précoulés (a) est retiré. Etape 2: On dispose devant chacun des puits des bagues d'étanchéité (b) et des compartiments donneurs (c). Etape 3 : Un échantillon de membrane (d) est inséré sur la partie supérieure de la bague (b). Etape 4 : Le compartiment (c) est vissé dans la bague (b) surmontée de l'échantillon de membrane (d). Etape 5 : L'ensemble (b-c-d) est assemblé dans le puits (f). L'insertion est facilitée par la présence d'orifice sur la bague (b) permettant de chasser l'air lors de la mise en place de l'ensemble (b-c-d) dans le puits (f). Le compartiment (c) est rempli d'une préparation liquide, semi-solide ou solide d'un ou de plusieurs composés chimiques (g). Exemple 5 Etude de perméabilité avec la cellule selon le premier mode réalisation Le but de cette étude était de déterminer et de comparer la perméabilité de trois molécules à travers paroi vésicale maintenue dans trois dispositifs différents (tableau 1) : 1. CCD dite de Franz 2. CCD de l'invention 3. Dispositif de dialyse (Quixsep®) Tableau 1 : Caractéristiques des dispositifs d'étude de la perméabilité. CDD de CDD de Dispositifs QuixSep® Franz l'invention Vdonneur (cm3) 1.00 5.00 0.40 Vreceveur (cm3) 9.00 2.77 60 Surface (cm2) 0.78 6.16 1.54 » receveur (CM-1) 0.09 2.22 0.03 Surface/V Les échantillons de paroi vésicale utilisés étaient issus de vessie de porc. Des solutions aqueuses de lidocaïne (1,67 mg.mL-1), méthylprednisolone (0,33 mg.mL-1) et mitomycine C (1,33 mg.mL-1) ont été préparées dans du sérum physiologique (NaC1 0,9%) puis ont été introduites dans les compartiments donneurs (figure 2 ; tableau 2). Le milieu receveur des CDD de Franz et le liquide de dialyse du dispositif Quixsep® est une solution de chlorure de sodium à 0,9%. Le milieu semi-solide du CDD de l'invention était un gel d'agar (composition : peptone 5,0 g ; extrait de levure 2,5 g ; glucose 1,0 g ; Agar : 15,0 g ; qsp. 1 litre d'eau purifiée). Les profils de perméation de la lidocaïne, de la méthylprednisolone et de la mitomycine C à travers des échantillons de vessie de porc maintenus dans trois dispositifs différents sont présentés dans les figures 5, 6 et 7, respectivement. Les profils de perméation présentent de nombreuses analogies confirmant la faisabilité technique d'une étude de perméabilité sur CDD pourvue d'un milieu receveur semi-solide. Les coefficients de perméabilité de la lidocaïne, de la méthylprednisolone et de la mitomycine C sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 : Coefficients de perméabilité de la lidocaïne, de la méthylprednisolone et de la mitomycine C à travers la vessie de porc calculés à partir de profils de perméation obtenus en utilisant trois dispositifs de diffusion. Chaque valeur est la moyenne ± écart-type de 3 à 5 déterminations expérimentales. Dispositifs 106 x Coefficient de perméabilité (cm.s -1) Lidocaïne Méthylprednisolone Mitomycine C CDD de Franz CDD de l'invention QuixSep® 5.33 ± 0.9 2.99 ± 0.82 8.23 ± 1.20 6.62 ± 0.57 7.34 ± 3.16 5.35 ± 0.35 9.30 ± 1.15 4.01 ± 1.48 13.95 ± 5.66 En d'autres termes, l'invention permet de proposer une cellule de diffusion simple à fabriquer et comprenant en tant que milieu receveur, une substance semi solide, en pratique un gel, permettant de faciliter la mise en oeuvre. 10 REVENDICATIONS1/ Cellule de diffusion comprenant, séparés par une membrane biologique, artificielle ou synthétique, un compartiment donneur comprenant une solution de composé chimique à doser et un compartiment receveur destiné à collecter la quantité de composé chimique ayant traversé la membrane biologique, artificielle ou synthétique, caractérisée en ce que le compartiment receveur contient un milieu receveur sous forme semi solide. 2/ Cellule de diffusion selon la revendication 1, caractérisée en ce que le milieu semi solide se présente sous la forme d'un gel contenant entre 1 et 30 % en poids d'un polymère gélifiant. 3/ Cellule de diffusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le milieu semi solide est un hydrogel. 4/ Cellule de diffusion selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'hydrogel comprend : - en tant que solvant : de l'eau, un mélange eau/cosolvants polaires ou encore eau/surfactants, - en tant qu'agent gélifiant, au moins un composé choisi dans le groupe comprenant collagène, hyaluronane, chondroitine sulfate, agarose, gélatine, chitosane, ethers de cellulose, avantageusement méthylcellulose, des dérivés cellulosiques, avantageusement carboxyméthylcellulose, carbopol ; polyethylène glycols ; alcool polyvinylique. 5/ Cellule de diffusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le milieu semi solide est un oléogel. 6/ Cellule de diffusion selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'oléogel comprend : - en tant que solvants, une huile choisie dans le groupe comprenant les huiles minérales, avantageusement l'huile de paraffine, ou végétales, avantageusement l'huile d'amande douce, - en tant qu'agent gélifiant, seuls ou en combinaison :o des gélifiants naturels : avantageusement un ester de cholesterol, o des gélifiant synthétiques : avantageusement un ester de sorbitan. 7/ Cellule de diffusion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la membrane biologique se présente sous la forme d'un tissu isolé (épithélium ; endothélium, tissu conjonctif) ou d'un échantillon d'organe (peau ; estomac ; intestin ; vessie ; poumons) humains, animaux ou végétaux. 8/ Cellule de diffusion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que : - les compartiments donneur et receveur sont tubulaires et associés par des moyens de solidarisation, - le milieu semi solide est quant à lui inséré directement dans le compartiment receveur à l'état semi solide. 9/ Cellule de diffusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que les moyens de solidarisation se présentent sous la forme d'un filetage mâle agencé à la base du compartiment donneur destiné à coopérer avec un filetage femelle correspondant, agencé à l'extrémité supérieure du compartiment receveur et en ce que chaque compartiment présente, au niveau du filetage, un orifice d'évacuation d'air. 10/ Cellule de diffusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que les moyens de solidarisation se présentent sous la forme d'une bague d'étanchéité coopérant avec les compartiments receveurs et donneurs par coulissement ou au moyens de filetages et en ce que la bague présente au moins un orifice d'évacuation d'air. 11/ Cellule de diffusion selon la revendication8, caractérisée en ce que : - le compartiment receveur se présente sous la forme d'une plaque multi puits, chacun des puits étant rempli d'un milieu semi solide précoulé prêts à l'emploi, - chaque puit est destiné à recevoir une bague d'étanchéité sur toute sa périphérie destinée à coopérer au moyens de filetage ou par coulissement avec le compartiment donneur, - la membrane est maintenue entre la bague et le compartiment donneur au moyens des filetages ou par coulissement.