FR 2984358 A1 20130621 FR 1161862 A 20111216 METHODES POUR LE DIAGNOSTIC DE DYSTROPHIES MUSCULAIRES DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne une méthode de diagnostic et de suivi thérapeutique des dystrophies musculaires de Duchenne et Becker, par détection de microARN dans l'urine des patients. ETAT DE LA TECHNIQUE Les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD) sont causées par des mutations ou des délétions du gène codant la dystrophine (Muntoni, Torelli et al. 2003). Dans le premier cas, où le phénotype est le plus sévère, la dystrophine est totalement absente. Le complexe DAPC (Dystrophine Associated Protein Complex), qui permet de relier les filaments intracellulaires d'actine à la matrice extracellulaire (Le Rumeur, Winder et al.), est également manquant. Ce complexe protège habituellement la membrane des fibres musculaires qui sont soumises aux contractions et aux relâchements. En son absence, les fibres ne sont plus protégées, on observe dans les muscles des cellules musculaires en dégénérescence et des nouvelles cellules qui témoignent d'une régénération tendant à contrebalancer le phénomène (Batchelor and Winder 2006). A terme, la régénération est insuffisante et les fibres sont remplacées par du tissus adipeux. Sur le plan thérapeutique, de grands espoirs reposent actuellement sur la technique du saut d' exon (Cirak, Arechavala-Gomeza et al.; Lu, Yokota et al.). En effet, la BMD, qui mène à un phénotype moins grave, est également due à une ou plusieurs mutations dans le gène codant pour la dystrophine mais les domaines fondamentaux de la protéine sont conservés : - un domaine N-terminal de liaison aux filaments d'actine, - un domaine C-terminal riche en cystéines qui se lie au complexe DAPC. Pour les patients DMD, il est donc possible d'obtenir un phénotype Becker en excluant les exons porteurs de mutations non-sens au sein des ARN messagers (ARNm) et ainsi rétablir le cadre de lecture ouvert. La protéine produite, plus courte, est alors partiellement fonctionnelle. Cette stratégie est actuellement testée via plusieurs essais cliniques. Une surveillance médicale régulière, pluridisciplinaire, permet d'évaluer l'évolution de la pathologie et de proposer une prise en charge permettant d'améliorer la vie des patients. Il s'agit de prévention des rétractions, d'apport d'aides techniques, kinésithérapie, surveillance cardiaque, orthopédie et aide respiratoire. Le suivi diagnostique est réalisé entre autre par l'évaluation des fonctions motrices, par des biopsies musculaires ou par le dosage d'une enzyme sécrétée dans la circulation, la créatine kinase (Bushby, Finkel et al.). L'analyse de biopsie musculaire permet d'observer les fibres lésées, des fibres plus petites témoignant de la régénération musculaire, ainsi que des zones de nécrose remplacées par du tissu adipeux. Cette méthode a pour inconvénient d'être très invasive pour le patient. Une autre méthode consiste à doser la créatine kinase (CK) dans le sang. Cette enzyme est liée au métabolisme énergétique présent dans plusieurs types de cellules. L'augmentation de sa concentration dans le sang témoigne de l'état de dégradation des fibres musculaires. Cependant, ce biomarqueur n'est pas totalement fiable car son niveau dépend également de stress comme l'activité physique (Nicholson, Morgan et al. 1986). Il existe d'autres enzymes telles que l'aldolase ou la lactate déshydrogénase mais, comme pour la CK, leur abondance n'est pas uniquement dépendante de l'état pathologique (Lott and Landesman 1984). Par conséquent, il apparait nécessaire d'identifier de nouveaux biomarqueurs plus fiables dans le cadre de la dystrophie musculaire de Duchenne, marqueurs qui pourraient être dosés à partir de prélèvements non invasifs, comme le prélèvement d'urine. Les microARN (ou miARN) sont des biomarqueurs prometteurs. Ils sont exprimés dans tous les tissus de l'organisme et notamment dans le muscle squelettique. On sait également qu'ils existent à l'état « circulant » dans tous les fluides biologiques (Weber, Baxter et al.). Des travaux récents de la littérature ont montré qu'il existait une signature spécifique de la myopathie de Duchenne dans le muscle (Cacchiarelli, Martone et al.; Greco, De Simone et al. 2009) et dans le sérum (Cacchiarelli, Legnini et al.). Les miARN existent également dans l'urine et il a été montré qu'ils pouvaient être utilisés, entre autres, comme biomarqueurs de cancers rénaux (Hanke, Hoefig et al.; Weber, Baxter et al.; Yamada, Enokida et al.), de la grossesse (Weber, Baxter et al.), du lupus (Wang, Tam et al.) ou d'atteintes cardiaques (Gidlof, Andersson et al.). A ce jour, aucune étude n'a montré l'utilisation potentielle des miARN comme marqueurs de dystrophies musculaires dans l'urine. Les inventeurs ont étudié le profil de présence de miARN dans l'urine de patients DMD afin d'identifier une signature spécifique de la pathologie. RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont étudié des échantillons d'urine de patients DMD afin de déterminer si des miARN spécifiques de cette pathologie pouvaient être identifiés. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une signature spécifique relative à l'abondance de certains miARN dans l'urine de patients DMD par rapport à l'urine de donneurs sains. La constatation d'une telle variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN chez un individu malade par rapport à un individu sain trouve une application dans le domaine du diagnostic. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un miARN choisi parmi les miARN du tableau 1, pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire. Tableau 1: miARN sous représentés DMD miARN séquence SEQ ID NO: hsa-miR-668 UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC 1 hsa-miR-1244 AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 2 hsa-miR-494 UGAAACAUACACGGGAAACCUC 3 miARN sur représentés DMD hsa-miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 4 hsa-miR-502-3p AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 5 hsa-miR-30e-3p UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 6 hsa-miR-151-5p UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 7 hsa-miR-335 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 8 hsa-miR-548d-5p AAAAGUAAUUGUGGUUUUUGCC 9 hsa-miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG 10 hsa-miR-206 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 11 hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 12 hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 13 hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 14 hsa-miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 15 hsa-miR-942 UCUUCUCUGUUUUGGCCAUGUG 16 hsa-let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 hsa-miR-505 * GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU 18 hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 19 hsa-miR-224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU 20 hsa-let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 21 hsa-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 22 hsa-let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 23 hsa-miR-200b * CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA 24 hsa-miR-628-3p UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 25 hsa-miR-659 CUUGGUUCAGGGAGGGUCCCCA 26 hsa-miR-182 UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 27 hsa-miR-192* CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG 28 miARN fortement sur représentés DMD hsa-miR-520a-3p AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU 29 hsa-miR-33a* CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC 30 hsa-miR-590-3p UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 31 hsa-miR-490-3p CAACCUGGAGGACUCCAUGCUG 32 hsa-miR-183 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 33 hsa-miR-487b AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 34 hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 35 hsa-let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 36 L'invention concerne également un procédé pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire, comprenant la détermination dans un échantillon d'urine d'un sujet de la présence ou du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi dans le groupe constitué des miARN listés dans le tableau 1. La présente invention se rapporte notamment à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire, en particulier de la dystrophie musculaire de Duchenne, comprenant la comparaison: a) du niveau d'expression d'au moins un miARN dans un échantillon d'urine d'un sujet (échantillon test), le miARN étant choisi dans le groupe constitué des miARN du tableau 1, et b) du niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, une différence statistiquement significative entre le niveau d'expression dans l'échantillon test par rapport à l'échantillon de référence étant indicative d'une dystrophie musculaire chez le suj et. Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte à un procédé de diagnostic d'une dystrophie musculaire comprenant les étapes suivantes: - mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi parmi les miARN du tableau 1, dans un échantillon d'urine provenant d'un sujet à tester (par exemple un sujet suspecté de présenter une dystrophie musculaire); et - la comparaison: - entre le niveau d'expression d'au moins un desdits miARN dans ledit échantillon et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, ou - entre le niveau d'expression d'au moins un premier desdits miARN dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et le niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire, en particulier une DMD. Ainsi, la comparaison des niveaux d'expression des miARN peut être réalisée entre un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et un échantillon sain de référence, ou un échantillon de référence provenant d'un patient présentant une dystrophie musculaire. L'existence dans l'urine de miARN spécifiques d'une dystrophie musculaire, et en particulier de la DMD, n'a jamais été rapportée par des publications antérieures. Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau d'au moins un miARN choisi dans le groupe constitué de miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a miR-28-5p, miR-502-3p, miR- 30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR200b*, miR-628-3p, miR-659, miR-182 et miR-192*, la mesure d'une augmentation statistiquement significative du niveau dudit miARN dans l'échantillon du sujet par rapport à l'échantillon de référence sain étant indicative d'une possible dystrophie musculaire. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau d'au moins un miARN choisi dans le groupe constitué de miR-668, miR-1244 et miR494 la mesure d'une diminution statistiquement significative du niveau dudit miARN dans l'échantillon du sujet par rapport à l'échantillon de référence sain étant indicative d'une possible dystrophie musculaire. L'invention concerne également un procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et un procédé pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire. Dans ce cas, le procédé comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins l'un des miRNA mentionnés ci-dessus dans un second échantillon d'urine d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé au niveau dudit miARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un échantillon prélevé antérieurement sur le même sujet. Dans le cas du suivi de l'efficacité d'un traitement, le premier échantillon pourra avoir été prélevé avant l'administration du traitement thérapeutique au sujet, et le second échantillon sera prélevé après administration du traitement thérapeutique (par exemple plusieurs jours/semaines/mois après administration du traitement thérapeutique). Alternativement, les premier et second échantillons peuvent être prélevés tous les deux après administration du traitement thérapeutique (par exemple, le premier échantillon est prélevé après traitement, le même jour que ce traitement, ou plusieurs jours/semaines/mois après le traitement, et le second échantillon est prélevé plusieurs jours/semaines/mois après le premier échantillon). L'invention concerne par ailleurs une trousse utile pour le diagnostic d'une dystrophie 30 musculaire. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les "microARN" (ou miARN) sont des ARN simple brin non codants d'environ 17 à 26 nucléotides de long, qui régulent l'expression génique en réprimant la traduction de leur ARNm cible. Les miARN qui ont été identifiés sont enregistrés dans la base de données miRB as e (http ://mi croarn. saner. ac.uk). Dans le cadre de l'invention, un "échantillon de référence", lorsqu'il est fait mention d'un "échantillon sain", correspond à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs sujets, de préférence deux ou plus, qui ne souffrent pas de dystrophie musculaire. L'échantillon de référence peut également correspondre à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs patients souffrant d'une dystrophie musculaire. Les niveaux d'expression de référence peuvent être déterminés en mesurant le niveau d'expression des miARN à explorer dans un ou plusieurs sujets. Ces niveaux de référence peuvent également être ajustés en fonction de populations de sujets spécifiques. Dans un mode préféré de réalisation, l'échantillon de référence est obtenu à partir d'un pool de sujets sains. Le profil d'expression des miARN dans l'échantillon de référence peut, de préférence, être généré à partir d'une population de deux ou plus de deux sujets. Par exemple, la population peut comprendre 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 sujets, ou plus. Dans le cadre de méthodes pour le suivi d'une dystrophie musculaire ou pour le suivi de l'efficacité d'un traitement, l'échantillon de référence est un échantillon prélevé sur le sujet qui sera suivi, mais avant que le suivi ait débuté. Par "dystrophie musculaire", on désigne notamment la dystrophie musculaire de Duchenne, la dystrophie musculaire de Becker, les dystrophies musculaires des ceintures et les alpha- et gamma-sarcoglycanopathies. L'invention se rapporte plus particulièrement à l'étude d'une dystrophie musculaire de Duchenne. On entend par "sujet" un mammifère, humain ou non humain, de préférence humain. Le sujet peut présenter une prédisposition pour une dystrophie musculaire (révélée par exemple par analyse génétique, ou une suspicion pouvant résulter d'antécédents familiaux) ou souffrir d'une dystrophie musculaire déclarée. L'invention peut également être appliquée en dépistage, le sujet ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. En particulier, la méthode selon l'invention peut être appliquée au dépistage de masse chez les jeunes enfants. L'invention peut notamment être appliquée au suivi de chiens modèles, notamment au chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), lors de la mise au point préclinique de traitements. Le terme "niveau d'expression" d'un miARN dans un échantillon correspond à une valeur de mesure propre à un miARN, mais exprimé soit en unité arbitraire, soit en unité de masse, de molécules ou de concentration, ou en valeur normalisée par rapport à une autre mesure, en particulier en valeur normalisée par rapport aux quantités du même miARN dans un échantillon de référence (sain ou d'un patient atteint d'une dystrophie musculaire). Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par toute méthode conventionnelle, telle que - l'hybridation sur "puces à ADN", - des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN individualisés, - la PCR en temps réel, - le Northern blot, - ou encore par toute autre méthode spécifique des miARN. Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par la technique de la "puce à ADN". La technique de la "puce à ADN" est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit de l'hybridation de miARN extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une surface de silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant des oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à celui-ci. La complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARN ou de leurs produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de générer un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...) selon les techniques de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les supports (puces à ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur d'intensité de ce signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de puces destinées à la détection des miARN sont déjà mis sur le marché, comme par exemple les GeneChip(R) miRNA commercialisés par Affymetrix, miRcury arrays par Exiqon, miRXplore microarrays par Miltenyi. Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARN sont extraits et purifiés d'un échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les fournisseurs d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse consiste à individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape d'amplification et de séquencer les produits (" clones d'acides nucléiques ") ainsi générés. La réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces " clones " (plusieurs milliers) permet de générer une liste des microARNs présents dans un échantillon et de quantifier chacun de ces miARN en comptant tout simplement combien de fois chaque séquence est retrouvée dans la liste détaillée. Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, les dosages de miARN sont réalisés par PCR quantitative (PCR en temps réel). La PCR en temps réel permet d'obtenir des valeurs, appelées Ct, correspondant au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence émise dépasse un certain seuil, le seuil étant fixé par l'utilisateur en début de phase exponentielle. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de cDNA (provenant de la transcription inverse des miARN en cDNA par la Reverse Transcriptase) présent initialement dans l'échantillon. En l'absence de gamme-étalon spécifique pour chaque cDNA, seule une quantification relative entre échantillons est possible. Dans un premier temps, afin de pouvoir comparer le contingent de chaque miARN pris individuellement et présent dans les échantillons, les valeurs de dosage pour chaque miARN sont normalisées avec les données obtenues pour un ARN non-codant. Il est également possible de normaliser l'expression d'un miARN par rapport au Ct moyen de tous les miARNs d'une plaque de PCR (plaques TLDA à 384 puits, comprenant un miARN différent détecté par puits - cf les exemples pour plus de détails). Ainsi, les résultats peuvent être normalisés par rapport à plusieurs miARN références dont l'abondance varie peu dans l'urine. La quantification relative d'un miARN entre 2 types d'échantillons est obtenue ensuite grâce par exemple aux logiciels SDS2.3, RQ manager (Applied Biosystems), et par la méthode de delta delta de Ct sur feuille de calcul Miscrosoft Excel. Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par hybridation sur "puces à ADN", ou par Northern blot, ou par séquençage, ils peuvent être exprimés par la formule I : (I) Quantité de miARNx = intensité du signal de détection pour miARNx Où "intensité de signal" signifie quantité de fluorescence, de radioactité ou de luminescence enregistrée sur les "puces à ADN" par le détecteur adapté, ou nombre de séquences identiques détectées par l'analyse à haut débit par séquençage. Les quantités sont exprimées en unités arbitraires. Les quantités de miARN peuvent être normalisées par rapport à un autre dosage, notamment un ARN (ARN..) dont la concentration ne varie pas dans les différents types d'échantillons analysés. Cette normalisation permet de garantir que l'on compare les niveaux d'expression des miARN détectables dans des extraits dont les concentrations en ARN sont similaires entre ces différents extraits purifiés. Dans ce cas, le niveau d'expression normalisé pour un miARN dans un échantillon est exprimé par la formule II : (II) Quantité de miARNx normalisée = intensité du signal de détection pour miARNx / intensité du signal pour ARNnoml Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par la PCR en temps réel, ils peuvent être exprimés par la formule III, qui définit la quantité de miARN présente dans le milieu réactionnel de dosage lorsque le nombre de cycles d'amplification est égal à Ct (Quantité de miARNx à Ct) : (III) Quantité de miARNx à Ct = Quantité de miARN à tO x Efficacité-. Où "Quantité de miARN à tO" désigne la quantité de miARN, ou son équivalent en cDNA, au moment où la réaction de dosage par amplification PCR est initiée. L'expression "efficacité" dans la formule (III) signifie la valeur de l'efficacité de PCR (fixée arbitrairement à 2 dans le cas de calculs par la méthode delta delta Ct). Cette valeur dépend de divers paramètres expérimentaux, et notamment de l'appareil effectuant la PCR en temps réel mis en oeuvre. Une fois que cette valeur est mesurée pour un protocole particulier et une machine de PCR configurée, il n'est plus nécessaire de mesurer cette valeur chaque fois avant le calcul, sauf si le protocole expérimental et/ou la condition de fonctionnement de la machine ont été modifiés pour l'expérience donnée. Dans un mode particulier de réalisation, le niveau d'expression des miARN est dosé par PCR en temps réel. Le tableau 1 ci-dessus décrit le profil d'expression de miARN dont l'expression est modifiée chez des patients atteints d'une DMD, par rapport au profil d'expression observé chez des sujets sains. Ainsi, une première catégorie comprenant 33 miARN correspond à ceux qui sont sur-représentés dans l'urine de patients DMD, (désignés "sur représentés DMD" ou « fortement sur représentés DMD » dans le tableau 1). Si un ou plusieurs miARN de cette première catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention: - une expression supérieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic); - une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire); - dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire). Une deuxième catégorie de miARN sont sous représentés dans l'urine de patients DMD, par rapport au sujets sains (désignés "sous représenté DMD" dans le tableau 1). Ils sont au nombre de 3. Si un ou plusieurs miARN de cette deuxième catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention: - une expression inférieure chez le sujet testé par rapport à une référence obtenue dans un échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire (méthode de diagnostic); - une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par 30 rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de pronostic, ou méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire); - dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient, une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2 chronologiquement) sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire). Par "niveau d'expression supérieur" ou "niveau d'expression inférieur", on entend un niveau d'expression dont la variation est statistiquement significative, selon des procédures bien connues de l'homme du métier. La description faite ci-dessus des deux catégories de miARN identifiées et leur exploitation dans une méthode de diagnostic selon l'invention met en oeuvre un échantillon de référence provenant d'un sujet sain. Bien entendu, les variations d'expression recherchées seront inversées lorsque l'échantillon de référence proviendra d'un patient malade atteint d'une dystrophie musculaire. Le diagnostic, pronostic ou l'efficacité du traitement pourra par ailleurs être confirmé dans des procédures suivant les procédés selon l'invention, comprenant des étapes connues d'évaluation d'une dystrophie musculaire (par exemple, détermination du niveau de créatine kinase, recherche de marqueurs spécifiques dans des biopsies musculaires, etc.) L'invention concerne également une trousse de diagnostic d'une dystrophie musculaire, cette trousse comprenant les moyens de détection ou de dosage d'au moins un miARN choisi parmi miR-28-5p, miR-502-3p, miR-30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR-659, miR-182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*. Selon un mode particulier de réalisation, la trousse comprend les moyens de détection ou de dosage de tous les miARN de cette liste. A titre illustratif, la trousse selon l'invention peut être une trousse pour la réalisation d'une PCR en temps réel et également contenir une reverse transcriptase, une ADN polymérase, un ou plusieurs tampon(s) adaptés aux réactions à mettre en oeuvre, des sondes spécifiques des régions amplifiées (par exemple sondes Taqmane), ou des marqueurs spécifiques de l'ADN double brin comme le SYBR Green. L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques, cet ensemble comprenant des paires d'amorces utilisables pour amplifier spécifiquement au moins deux miARN choisi parmi miR-28-5p, miR-502-3p, miR-30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR-659, miR-182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR668, miR-1244, miR-494 et miR-192* dans une expérience de PCR. Selon un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques comprend des paires d'amorces permettant l'amplification spécifique de tous les miARN listés ci-avant. Selon une variante de réalisation, l'ensemble de séquences nucléotidiques peut également comprendre une séquence nucléotidique utilisable comme sonde marquée pour la détection et quantification des fragments amplifiés (par exemple une sonde utilisable dans le système de PCR en temps réel TaqMan). L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques comprenant un ou plusieurs oligonucléotides marqués utilisables pour la détection spécifique d'au moins deux miARN du tableau 1, par exemple dans une expérience de Northern Blot. Dans un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences contient des oligonucléotides spécifiques de chacun des miARN du tableau 1. L'invention concerne également un support multipuits pour PCR, comprenant au moins deux paires d'amorces PCR spécifiques chacune d'un miARN différent du tableau 1, chacune des paires d'amorce étant disposées dans un puits différent du support. Selon un mode particulier de réalisation, le support multipuits comprend des paires d'amorces spécifiques de tous les miARN du tableau 1, chacune de ces paires d'amorces étant disposées dans un puits différent. La présente invention est illustrée par les figures et exemples suivants. Légende des figures Figure 1 : (haut) nombre de miARN différents détectés par échantillon après profil d'expression par cartes TLDA A et B. (bas) Ct moyen par échantillon. 9 échantillons sont représentés (4 DMD et 5 sains) Figure 2 : variabilité inter-individuelle de l'abondance des différents miARN dans l'urine. Pour chaque groupe (sain ou DMD) et pour chaque carte TLDA (A ou B), chaque point représente un miARN, défini par son Ct moyen et son écart-type au sein du groupe et de la carte donnée. Figure 3 : miARN fortement sur représentés dans la pathologie DMD. miARN non détectés chez tous les donneurs sains testés et uniquement détectables chez 4 patients sur 4 ou chez 3 patients sur 4 (liste : haut, bas ; exemple de 3 miARN) selon la technique TLDA. La quantité relative ne peut être déterminée car ces miARN sont non détectables dans l'échantillon référence. Les données sont donc représentées en Ct bruts. Figure 4 : miARN surreprésentés dans l'urine de patients DMD, avec un facteur d'augmentation supérieur à 4. (gauche) : liste des miARN surreprésentés. (droite) : exemple de 3 miARN de cette liste. L'abondance des miARN est représentée en quantité relative par rapport à la moyenne des échantillons sains. Figure 5 : miARN sous représentés dans l'urine de patients DMD, avec un facteur de diminution supérieur à 10. (haut) : liste des miARN sous représentés. (bas) : représentation des quantités relatives pour les 3 miARN de cette liste. L'abondance des miARN est représentée en quantité relative par rapport à un échantillon sain. EXEMPLES Matériel et Méthodes : L'urine est collectée dans des récipients stériles. Dans la demi-heure qui suit, elle est centrifugée à 2000rpm pendant 5min afin d'éliminer les cellules présentes. Le surnageant est ensuite récupéré, aliquote et congelé à -80°C. L'étude sur la carte A est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 6 sujets sains. L'étude sur la carte B est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients DMD et 5 sujets sains. 10m1 d'urine sont utilisés afin d'extraire les ARN totaux contenant les microARN grâce au kit « Urine total RNA maxi kit, slurry format » de Norgen Biotek, selon le protocole du fournisseur. Les ARN sont élues dans 2 élutions successives de 10011E. Ils sont ensuite précipités sur la nuit à -20°C en présence d'acetate de sodium, d'éthanol absolu et d'acrylamide linéaire (Ambion) selon le protocole d'Ambion. Les ARN sont ensuite resuspendus dans de l'eau sans RNAse. Un contrôle qualité des ARN est ensuite réalisé en 3 étapes : 1) dosage par l'absorbance à 260nm (Nanodrop 8000, Thermo Scientific) 2) électrophorèse capillaire sur puce RNA small et pico (Agilent Technologies) 3) amplification de 3 petits ARN urinaires contrôles par RTqPCR (miR-16, miR-377*, U6). 10Ong d'ARN total sont ensuite soumis à une transcription inverse multiplexe (Megaplex pools, Applied biosystems). Nous réalisons 2 transcriptions inverses à partir de 2 pools d'amorces différents : pools A et B. A eux deux, ils couvrent la détection de 762 microARN différents, ce qui représente environ la moitié des 1424 miARN humains connus (miRbase, www.mirbase.org, release 17, avril 2011). Les ADN complémentaires obtenus subissent ensuite une étape de préamplification (preAmp master mix et preAmp primer pools, Applied Biosystems) avant d'être déposés sur des plaques TLDA (Taqman Low Density Array). Cette technologie a été développée par Applied Biosystems, et consiste en la détection simultanée de 381 miARN sur plaque 384 puits par RT-qPCR. La quantité relative de chaque miARN est déterminée en normalisant par le Ct (cycle threshold) moyen de chaque échantillon (Mestdagh, Genome Biol 2009), et en utilisant un échantillon de donneur sain comme référence (méthode du ddCt). On détermine ensuite les ratios des quantités relatives de chaque miARN entre la population de donneurs sains et la population de patients DMD. Les quantités relatives sont calculées selon la méthode des delta delta de Ct. Avec dCt (miR) = Ct miR - Ct calibrateur; ddCt (miR) = dCt (référence) - dCt (miR); et Quantité relative (miR) = 2^delta delta Ct (miR). La référence correspond à la valeur moyenne obtenue pour un miR donné chez les donneurs sains. Le calibrateur correspond au Ct moyen de toute la plaque TLDA. Resultats : Nous avons considéré uniquement les miARN détectés avec un Ct inférieur à 35 pour un seuil de 0,1, selon le logiciel RQ manager (Applied Biosystems). Pour chaque échantillon urinaire, nous avons détecté une moyenne de 337 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant égal à 28,1 (figure 1). Nous observons donc une abondance et une variété assez importantes de miARN dans l'urine. Nous avons ensuite évalué la variabilité inter-individuelle au sein d'un même groupe et d'une même carte TLDA (figure 2). Pour chaque miARN, nous avons calculé l'ecart type au sein d'un même groupe (n=5 ou 6 pour les donneurs sains ; n=4 pour les patients DMD). Nous montrons que pour la plupart des miARN, l'expression est peu variable d'un individu à l'autre. Nous avons enfin déterminé la liste des miARN différemment représentés dans l'urine des patients DMD par rapport aux donneurs sains. Une première catégorie de miARN sont fortement sur représentés chez les patients DMD, uniquement détectés ici chez tous les patients testés, et absents chez tous les donneurs sains, ils sont au nombre de 3 (figure 3, haut). Ils sont assez fortement représentés chez les patients (Ct autour de 30) et représentent de très bons candidats biomarqueurs. 5 autres miARN ont été détectés chez 3 patients sur 4 et non retrouvés chez les 3 donneurs sains (figure 3, bas). Une deuxième catégorie de miARN sont sur-représentés dans l'urine de patients DMD, mais tout de même présents chez les sains, ils sont au nombre de 25 (figure 4). Les facteurs de surreprésentation, calculés en faisant le ratio des quantités relatives, sont compris entre 4 et 23. Enfin une troisième catégorie de miARN sont sous représentés dans l'urine de patients DMD. Ils sont au nombre de 3. Les facteurs de sous représentation sont compris entre 10 et 60. REFERENCE S Batchelor, C. L. and S. J. Winder (2006). "Sparks, signais and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy." Trends Cell Biol 16(4): 198-205. Bushby, K., R. Finkel, et al. "Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management." Lancet Neurol 9(1): 77-93. Cacchiarelli, D., I. Legnini, et al. "miRNAs as serum biomarkers for Duchenne muscular dystrophy." EMBO Mol Med 3(5): 258-65. Cacchiarelli, D., J. Martone, et al. "MicroRNAs involved in molecular circuitries relevant for 30 the Duchenne muscular dystrophy pathogenesis are controlled by the dystrophin/nNOS pathway." Cell Metab 12(4): 341-51. Cirak, S., V. Arechavala-Gomeza, et al. "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study." Lancet. Gidlof, O., P. Andersson, et al. "Cardiospecific microRNA Plasma Levels Correlate with Troponin and Cardiac Function in Patients with ST Elevation Myocardial Infarction, Are Selectively Dependent on Renal Elimination, and Can Be Detected in Urine Samples." Cardiology 118(4): 217-226. Greco, S., M. De Simone, et al. (2009). "Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage and regeneration induced by Duchenne muscular dystrophy and acute ischemia." Faseb J 23(10): 3335-46. Hanke, M., K. Hoefig, et al. "A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer." Urol Oncol 28(6): 655-61. Le Rumeur, E., S. J. Winder, et al. "Dystrophin: more than just the sum of its parts." Biochim Biophys Acta 1804(9): 1713-22. Lott, J. A. and P. W. Landesman (1984). "The enzymology of skeletal muscle disorders." Crit Rev Clin Lab Sci 20(2): 153-90. Lu, Q. L., T. Yokota, et al. "The status of exon skipping as a therapeutic approach to duchenne muscular dystrophy." Mol Ther 19(1): 9-15. Muntoni, F., S. Torelli, et al. (2003). "Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes." Lancet Neurol 2(12): 731-40. Nicholson, G. A., G. J. Morgan, et al. (1986). "The effect of aerobic exercise on serum creatine kinase activities." Muscle Nerve 9(9): 820-4. Wang, G., L. S. Tam, et al. "Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus." Lupus 20(5): 493-500. Weber, J. A., D. H. Baxter, et al. "The microRNA spectrum in 12 body fluids." Clin Chem 56(11): 1733-41. Yamada, Y., H. Enokida, et al. "MiR-96 and miR-183 detection in urine serve as potential tumor markers of urothelial carcinoma: correlation with stage and grade, and comparison with urinary cytology." Cancer Sci 102(3): 522-9.30 REVENDICATIONS1. Procédé pour le diagnostic d'une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression dans un échantillon d'urine dudit sujet d'au moins un microARN et la comparaison dudit niveau d'expression mesuré dans ledit échantillon d'urine à un niveau obtenu dans un échantillon de référence sain, une différence entre le niveau d"expression par rapport au contrôle étant indicative d'une dystrophie chez le sujet. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le au moins un microARN est choisi parmi les microARN du tableau ci-dessous: miARN Catégorie hsa-miR-520a-3p Fortement sur représenté DMD hsa-miR-33a* Fortement sur représenté DMD hsa-miR-590-3p Fortement sur représenté DMD hsa-miR-490-3p Fortement sur représenté DMD hsa-miR-183 Fortement sur représenté DMD hsa-miR-487b Fortement sur représenté DMD hsa-let-7f Fortement sur représenté DMD hsa-let-7a Fortement sur représenté DMD hsa-miR-668 sous représenté DMD hsa-miR-1244 sous représenté DMD hsa-miR-494 sous représenté DMD hsa-miR-192* sur représenté DMD hsa-miR-28-5p sur représenté DMD hsa-miR-502-3p sur représenté DMD hsa-miR-30e-3p sur représenté DMD hsa-miR-151-5p sur représenté DMD hsa-miR-335 sur représenté DMD hsa-miR-548d-5p sur représenté DMD hsa-miR-196b sur représenté DMD hsa-miR-206 sur représenté DMD hsa-miR-26b sur représenté DMD hsa-let-7b sur représenté DMD hsa-let-7g sur représenté DMD hsa-miR-30d sur représenté DMD hsa-miR-942 sur représenté DMD hsa-let-7c sur représenté DMD hsa-miR-505* sur représenté DMDhsa-miR-15b sur représenté DMD hsa-miR-224 sur représenté DMD hsa-let-7d sur représenté DMD hsa-miR-23b sur représenté DMD hsa-let-7e sur représenté DMD hsa-miR-200b* sur représenté DMD hsa-miR-628-3p sur représenté DMD hsa-miR-659 sur représenté DMD hsa-miR-182 sur représenté DMD le procédé comprenant préférentiellement la détection de l'ensemble de ces miARN. 2. Procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins un miRNA choisi dans le tableau ci-dessous dans un second échantillon d'urine d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé au niveau dudit miARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un échantillon prélevé antérieurement sur le même sujet; l'évolution du niveau d'expression du ou des miRNA choisis étant indicative d'une progression de la dystrophie musculaire: miARN Catégorie évolution de l'expression liée à une progression de la dystrophie hsa-miR-668 sous représenté DMD diminution hsa-miR-1244 sous représenté DMD diminution hsa-miR-494 sous représenté DMD diminution hsa-miR-192* sur représenté DMD augmentation hsa-miR-28-5p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-502-3p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-30e-3p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-151-5p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-335 sur représenté DMD augmentation hsa-miR-548d-5p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-196b sur représenté DMD augmentation hsa-miR-206 sur représenté DMD augmentation hsa-miR-26b sur représenté DMD augmentation hsa-let-7b sur représenté DMD augmentation hsa-let-7g sur représenté DMD augmentation hsa-miR-30d sur représenté DMD augmentation hsa-miR-942 sur représenté DMD augmentation hsa-let-7c sur représenté DMD augmentation hsa-miR-505* sur représenté DMD augmentation hsa-miR-15b sur représenté DMD augmentationhsa-miR-224 sur représenté DMD augmentation hsa-let-7d sur représenté DMD augmentation hsa-miR-23b sur représenté DMD augmentation hsa-let-7e sur représenté DMD augmentation hsa-miR-200b* sur représenté DMD augmentation hsa-miR-628-3p sur représenté DMD augmentation hsa-miR-659 sur représenté DMD augmentation hsa-miR-182 sur représenté DMD augmentation hsa-miR-520a-3p Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-miR-33a* Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-miR-590-3p Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-miR-490-3p Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-miR-183 Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-miR-487b Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-let-7f Fortement sur représenté DMD augmentation hsa-let-7a Fortement sur représenté DMD augmentation le nrocédé comnremant nrAfArAntie1l.-...-.1- 1. Az.+..,,+:-- -i-. it......_i_i_ J_ _ _ - r A ,»r 3. Procédé pour déterminer l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant a) la mesure du niveau d'expression dans un liquide corporel dudit sujet, en particulier dans un échantillon d'urine, d'au moins un microARN choisi dans le groupe constitué des miARN du tableau ci-dessous, moyennant quoi un niveau de référence est déterminé; puis b) la mesure du niveau d'expression dudit au moins un microARN choisi dans l'étape a) dans un second échantillon biologique prélevé au même sujet à un temps donné après l'administration du traitement thérapeutique, moyennant quoi un niveau de test est déterminé; et c) la comparaison des niveaux contrôle et de test, l'évolution du niveau d'expression des miRNA choisis étant indicative d'un traitement efficace du sujet miARN Catégorie évolution de l'expression liée à une progression de la dystrophie hsa-miR-668 sous représenté DMD augmentation hsa-miR-1244 sous représenté DMD augmentation hsa-miR-494 sous représenté DMD augmentation hsa-miR-192* sur représenté DMD diminution hsa-miR-28-5p sur représenté DMD diminution hsa-miR-502-3p sur représenté DMD diminution hsa-miR-30e-3p sur représenté DMD diminution hsa-miR-151-5p sur représenté DMD diminutionhsa-miR-335 sur représenté DMD diminution hsa-miR-548d-5p sur représenté DMD diminution hsa-miR-196b sur représenté DMD diminution hsa-miR-206 sur représenté DMD diminution hsa-miR-26b sur représenté DMD diminution hsa-let-7b sur représenté DMD diminution hsa-let-7g sur représenté DMD diminution hsa-miR-30d sur représenté DMD diminution hsa-miR-942 sur représenté DMD diminution hsa-let-7c sur représenté DMD diminution hsa-miR-505* sur représenté DMD diminution hsa-miR-15b sur représenté DMD diminution hsa-miR-224 sur représenté DMD diminution hsa-let-7d sur représenté DMD diminution hsa-miR-23b sur représenté DMD diminution hsa-let-7e sur représenté DMD diminution hsa-miR-200b* sur représenté DMD diminution hsa-miR-628-3p sur représenté DMD diminution hsa-miR-659 sur représenté DMD diminution hsa-miR-182 sur représenté DMD diminution hsa-miR-520a-3p Fortement sur représenté DMD diminution hsa-miR-33a* Fortement sur représenté DMD diminution hsa-miR-590-3p Fortement sur représenté DMD diminution hsa-miR-490-3p Fortement sur représenté DMD diminution hsa-miR-183 Fortement sur représenté DMD diminution hsa-miR-487b Fortement sur représenté DMD diminution hsa-let-7f Fortement sur représenté DMD diminution hsa-let-7a Fortement sur représenté DMD diminution le procédé comprenant préférentiellement 1. ,-1,&r.c.,-.44,,., A. lt......,.......1-1- .1- --- -..- A 1-.1. r 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic de la dystrophie musculaire de Duchenne ou de la dystrophie musculaire de Becker, en particulier de la 5 dystrophie musculaire de Duchenne. 5. Trousse comprenant au moins une sonde et/ou paire d'amorces spécifique d'un ou plusieurs miARN choisis dans le groupe constitué de miR-28-5p, miR-502-3p, miR-30e-3p, miR-151- 5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, 10 let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR- 659, miR-182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*. Allea/1111./11. ....,%/V1.1.,J11 %AR./ ensemble de ces 6. Trousse selon la revendication 5, comprenant au moins deux sondes et/ou paires d'amorces spécifique d'au moins deux miARN choisis dans le groupe constitué de miR-28-5p, miR-502- 3p, miR-30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR-659, miR-182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*. 7. Trousse selon la revendication 5, comprenant des sondes et/ou paires d'amorces spécifique de chacun des miARN suivants: miR-28-5p, miR-502-3p, miR-30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR-659, miR182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*. 8. Support multipuits pour PCR comprenant au moins deux paires d'amorces PCR spécifiques d'au moins deux miARN choisis dans le groupe constitué de miR-28-5p, miR-502-3p, miR30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR-505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR- 200b*, miR-628-3p, miR-659, miR-182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*, chacune des paires d'amorce étant disposée dans un puits différent du support. 9. Support selon la revendication 8, comprenant des paires d'amorces spécifiques de tous les miARN du groupe constitué de miR-28-5p, miR-502-3p, miR-30e-3p, miR-151-5p, miR-335, miR-548d-5p, miR-196b, miR-206, miR-26b, let-7b, let-7g, miR-30d, miR-942, let-7c, miR505*, miR-15b, miR-224, let-7d, miR-23b, let-7e, miR-200b*, miR-628-3p, miR-659, miR182, miR-520a-3p, miR-33a*, miR-590-3p, miR-490-3p, miR-183, miR-487b, let-7f, let-7a , miR-668, miR-1244, miR-494 et miR-192*, chacune de ces paires d'amorces étant disposées dans un puits différent.