FR 2980363 A1 20130329 FR 1102880 A 20110922 COMPOSITION À TOXICITÉ RÉDUITE D'AU MOINS UN COLORANT STABLE ET POUVANT ÊTRE STÉRILISÉE L'invention concerne une composition comprenant au moins un colorant dans une solution aqueuse. Dans tout le texte, on désigne par « colorant », toute substance présentant la propriété de communiquer une coloration durable à au moins une matière avec laquelle elle a été mise en contact. Les colorants utilisés en solution aqueuse (qu'ils soient ou non entièrement solubles dans l'eau) sont des composés organiques, notamment organométalliques, comprenant au moins un groupe chromophore (par exemple azoïque, triphényleméthane, thiazidique, phénylamine...) et qui sont donc toxiques pour les tissus cellulaires et les êtres vivants à partir d'un certain niveau de concentration et/ou de temps d'exposition. Or, de nombreux colorants sont utilisés au contact des tissus cellulaires, notamment à titre d'agent de coloration sélective à des fins de diagnostic, à titre thérapeutique pour des traitements curatifs ou préventifs, dans le domaine de l'expérimentation clinique ou pharmacologique... Dans ces applications, il est nécessaire d'une part de minimiser la toxicité de la composition susceptible de venir au contact de tissus cellulaires, d'autre part d'assurer la stérilisation de la composition et sa stabilité dans le temps. Il a été par exemple démontré que le vert d'indocyanine est toxique pour les cellules de la rétine ; ou que le bleu de trypan ou le bleu d'aniline sont toxiques vis-à-vis des cellules endothéliales ou épithéliales. Pour pallier ce problème, et pour densifier une composition comprenant du bleu brillant G, il a été proposé d'y ajouter du glucose à une concentration de 5 %. Néanmoins, il s'avère qu'une telle composition glucosée n'est pas stable aux températures de stérilisation à l'autoclave, et ne peut pas être stérilisée. En outre, l'inventeur a déterminé qu'avec une concentration de glucose aussi faible, la composition n'est pas non plus stable sur une longue période à température ambiante entraînant la dégradation du colorant. Également, la publication « Comparative toxicology of trypan blue, brillant blue G, and their combination together with polyethyleneglycol on human pigment épithelial cells » Investigative Ophthamology & Visual Science, June 2011, Vol 52, No 7 enseigne la possibilité de réduire la toxicité d'une composition de bleu de trypan par addition de PEG. Néanmoins, ce polymère est synthétisé à partir d'oxyde d'éthylène très toxique, notamment pour les structures internes de L'obtention d'une composition de PEG pur et parfaitement exempte d'oxyde d'éthylène est en pratique quasi impossible, et en tout cas extrêmement onéreux. En outre, ce polymère est un tensioactif susceptible de favoriser la diffusion de la solution colorée sous la rétine, au risque d'augmenter sa toxicité clinique. L'invention vise donc à pallier l'ensemble de ces inconvénients en proposant une composition comprenant au moins un colorant qui présente une toxicité réduite vis-à-vis des cellules humaines ou animales, qui puisse être stérilisée, qui soit stable -notamment à l'état stérilisé- sur une longue période (notamment plusieurs mois) à température ambiante, prête à l'emploi et peu coûteuse. L'invention vise plus particulièrement à proposer une telle composition dans laquelle le pouvoir colorant de chaque colorant est préservé et non modifié. L'invention vise aussi à proposer une telle composition qui puisse être utilisée in vivo, notamment qui présente un pH et une osmolarité physiologiques. Plus particulièrement, l'invention vise à proposer une telle composition qui soit compatible avec son utilisation en milieu chirurgical, notamment au cours d'opérations de chirurgie ophtalmique. Dans tout le texte, le terme « polyol » désigne un composé de 25 formule H(HCOH)'1-1, c'est-à-dire un composé hydrocarboné comprenant un groupe hydroxyle lié à chaque atome de carbone. Il est à noter que les oses, qui sont des hydrates de carbone, ne sont pas des polyols au sens de cette définition. L'invention concerne donc une composition comprenant dans une solution aqueuse : 30 - au moins un colorant, - au moins un polyol soluble dans l'eau de formule H(HCOH)'Fl, n étant un entier supérieur à 3 (supérieur ou égal à 4). Contre toute attente, et alors même que les oses tels que le glucose ne permettent pas d'obtenir une composition présentant les qualités 5 requises, l'inventeur a constaté que la simple adjonction dans la composition d'un polyol soluble dans l'eau (de structure proche, mais différente de celle des oses) permet de réduire considérablement sa cytotoxicité, sans nuire en aucune façon ni à sa stabilité, ni aux propriétés de chaque colorant, tout en étant compatible avec une stérilisation à l'autoclave et avec l'adjonction d'adjuvants appropriés pour 10 l'utilisation de la composition au contact des tissus physiologiques, notamment au contact des cellules endothéliales ou épithéliales de Ce résultat est d'autant plus surprenant que si les polyols peuvent faire l'objet en eux-mêmes de certaines applications au contact des tissus physiologiques, ils ne sont pas eux-mêmes inoffensifs pour les cellules à partir d'une certaine concentration. Par exemple, le 15 mannitol est au contraire connu pour avoir des effets de rétrécissement des cellules endothéliales au moins à certaines concentrations. Aucune explication ne peut donc être donnée à ce résultat inattendu. L'invention peut s'appliquer pour tout colorant pouvant être utilisé dans une solution aqueuse et compatible avec son utilisation conjointe avec 20 au moins un polyol. Néanmoins, avantageusement une composition selon l'invention comprend au moins un colorant choisi dans le groupe formé du bleu de trypan, du bleu brillant G, du bleu Evans, du bleu patenté V, du bleu de méthylène, du bleu de bromophénol et du bleu d'aniline. Ces colorants sont en effet particulièrement stables en solution aqueuse, supportent une stérilisation à 25 l'autoclave, et peuvent être utilisés dans de nombreuses applications, notamment par voie topique à des fins de diagnostic ou au cours d'une opération de traitement chirurgical, en particulier dans la chirurgie ophtalmique. Leur combinaison à un polyol selon l'invention en réduit par ailleurs considérablement leur toxicité. La proportion de chaque colorant dans une composition selon 30 l'invention peut varier en fonction de l'application et de l'effet recherché, notamment de l'intensité de la couleur, dans la limite de la toxicité admissible dans l'application, compte tenu de l'adjonction d'au moins un polyol selon l'invention. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend une proportion de chaque colorant acceptable pour une application topique à titre de cosmétique et/ou à titre pharmaceutique et/ou à titre de diagnostic et/ou dans une opération chirurgicale -notamment dans une opération chirurgicale ophtalmique à titre de composition de coloration sélective-. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend une proportion de chaque colorant en poids sur volume comprise entre 0,001 % et 2,5 %. De même, la proportion de chaque polyol dans une composition selon l'invention peut varier, et peut notamment être optimisée en fonction de chaque colorant, de chaque polyol considéré et de l'application envisagée de la composition. Les polyols sont en eux-mêmes physiologiquement acceptables à titre cosmétique, pharmaceutique, ou plus généralement en application topique sur les milieux cellulaires, dans une large gamme de concentrations. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend une proportion en polyols acceptable pour une application topique à titre de cosmétique et/ou à titre pharmaceutique et/ou à titre de diagnostic et/ou dans une opération chirurgicale -notamment dans une opération chirurgicale ophtalmique à titre de composition de coloration sélective-. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend une proportion de polyol(s) en poids sur volume comprise entre 0,1 % et 5 %. Par ailleurs, les meilleurs résultats ont été obtenus avec des polyols pour lesquels n est inférieur ou égal à 9. De préférence, chaque polyol est choisi dans le groupe formé de l'érythritol (n=4), du xylitol (n=5), de l'arabitol (n=5), du ribitol (n=5), du sorbitol (n=6), du dulcitol (n=6), du mannitol (n=6), du volemitol (n=7), du maltitol (n=9), de l'isomaltipol (n=9) et du lactitol (n=9). En particulier, avantageusement et selon l'invention au moins un polyol est choisi dans le groupe des hexols (n=6). Encore plus préférentiellement, une composition selon 30 l'invention comprend le mannitol à titre de polyol. Par ailleurs, avantageusement, une composition selon l'invention est aussi caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une quantité de chlorure de sodium adaptée pour que la composition présente une osmolarité comprise entre 260 mOsmole/KgH2O et 360 mOsmole/KgH2O. Avantageusement et selon l'invention la proportion de chlorure de sodium est choisie pour ajuster l'osmolarité de la composition à une valeur comprise entre 280 mOsmole/KgH2O et 350 mOsmole/KgH2O, notamment de l'ordre de 310 mOsmole/KgH2O. Avantageusement et selon l'invention, la proportion en poids sur volume de chlorure de sodium est choisie entre 0,4 % et 0,9 %. Par ailleurs, avantageusement, une composition selon l'invention est aussi caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un tampon adapté pour maintenir un pH entre 7 et 7,5. Avantageusement et selon l'invention ledit tampon est H2PO4/HPO4. Avantageusement, une composition selon l'invention 15 comprend également de l'eau en quantité qsp. Ainsi, dans une formulation préférentielle, une composition selon l'invention est constituée de 0,001 % à 2,5 % (poids/volume) d'au moins un colorant -de préférence un colorant ou deux colorants-, de 0,1 % à 5 % % (poids/volume) d'au moins un polyol soluble dans l'eau -de préférence un hexol tel 20 que le mannitol-, d'une proportion de chlorure de sodium permettant d'ajuster l'osmolarité de la composition à une valeur comprise entre 280 mOsmole/KgH2O et 350 mOsmole/KgH2O, d'un tampon adapté pour maintenir le pH de la composition entre 7 et 7,5, et d'eau en quantité qsp. Une composition selon l'invention peut être stérilisée à 25 l'autoclave. En conséquence, une composition selon l'invention est avantageusement caractérisée en ce qu'elle est stérile. Une composition selon l'invention peut être utilisée en particulier en application topique, c'est-à-dire au contact de fluides physiologiques ou de tissus cellulaires ou organes humains ou animaux, ou de cellules humaines ou 30 animales, et ce aussi bien in vivo, ex vivo, ou in vitro. En particulier, une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus peut être utilisée à titre de composition cosmétique, destinée à une application topique sur la peau ou les phanères, et peut alors incorporer en outre au moins un autre agent présentant un intérêt cosmétique (maquillage, coloration des lèvres, vernis à ongles, parfums, coloration des cheveux, des poils, des ongles ou de la peau...) et/ou au moins un additif et/ou un excipient approprié selon la forme galénique envisagée. En particulier, une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus peut être utilisée à titre de composition thérapeutique, destinée à une application topique sur un milieu physiologique -notamment la peau ou les phanères-, et peut alors incorporer en outre au moins un autre agent présentant un intérêt thérapeutique et/ou au moins un additif et/ou un excipient approprié selon la forme galénique envisagée. Une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus peut être utilisée pour le diagnostic, en permettant de distinguer par coloration différentielle certaines portions spécifiques de tissus cellulaires, notamment des cellules mortes ou des tissus cellulaires pathogènes ou détériorés, de tissus cellulaires sains. En conséquence, l'invention s'étend à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou animal (in vivo ou ex vivo), et en particulier pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic par coloration différentielle de certaines portions spécifiques de tissus cellulaires, notamment des tissus pathologiques tels que les membranes épirétiniennes de façon à permettre de les distinguer des tissus cellulaires vivants tels que la rétine. Une telle composition selon l'invention comprend alors avantageusement au moins un colorant vital, par exemple le bleu de trypan. Ainsi, l'invention s'étend en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la rétine pour distinguer les membranes pathologiques de la rétine au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique de traitement des membranes pathologiques de la rétine. L'invention s'étend également à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une telle méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou animal. L'invention s'étend également à une méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou animal (in vivo ou ex vivo) dans laquelle une composition selon l'invention est appliquée au contact d'un tissu cellulaire afin d'identifier par coloration sélective certaines portions spécifiques de ce tissu cellulaire, notamment des cellules mortes lorsque la composition selon l'invention comprend au moins un colorant vital tel que le bleu de trypan ou le bleu Evans, ou d'éventuelles portions pathologiques de ce tissu cellulaire. Une composition selon l'invention peut aussi avantageusement être utilisée dans une méthode de traitement chirurgical en permettant de visualiser par coloration sélective certains fluides physiologiques ou tissus cellulaires. En conséquence, l'invention s'étend à une composition pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical appliquée au corps humain ou animal (in vivo). L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical appliquée au corps humain ou animal (in vivo). L'invention s'étend donc aussi à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une méthode de traitement chirurgical appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un fluide ou d'un tissu physiologique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de le visualiser au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale. Elle s'étend donc en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un fluide ou d'un tissu physiologique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective au cours de la réalisation d'au moins une opération chirurgicale. L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical appliquée au corps humain ou animal dans laquelle une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus est appliquée au contact d'un fluide ou d'un tissu physiologique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de le visualiser au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale. L'invention s'étend aussi à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un milieu ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de le visualiser au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique. Elle s'étend donc en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un milieu ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective au cours de la réalisation d'au moins une opération chirurgicale ophtalmique. L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus est appliquée au contact d'un milieu ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de le visualiser au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique. L'invention s'étend aussi à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la surface externe de la capsule antérieure de l'oeil de façon à réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective de la capsule antérieure par rapport au tissu lenticulaire sous-jacent facilitant la réalisation de l'ouverture contrôlée de la capsule antérieure au cours d'une opération chirurgicale d'extraction de la cataracte. Elle s'étend donc en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la surface externe de la capsule antérieure de l'oeil de façon à réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective de la capsule antérieure par rapport au tissu lenticulaire sous-jacent facilitant la réalisation de l'ouverture contrôlée de la capsule antérieure au cours d'une opération chirurgicale d'extraction de la cataracte. L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la surface externe de la capsule antérieure de l'oeil de façon à réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective de la capsule antérieure par rapport au tissu lenticulaire sous-jacent facilitant la réalisation de l'ouverture contrôlée de la capsule antérieure au cours d'une opération chirurgicale d'extraction de la cataracte. L'invention s'étend aussi à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la rétine pour distinguer les membranes pathologiques de la rétine au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique de traitement des membranes pathologiques de la rétine. Elle s'étend donc en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la rétine pour distinguer les membranes pathologiques de la rétine au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique de traitement des membranes pathologiques de la rétine. L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle la composition est appliquée au contact de la rétine pour distinguer les membranes pathologiques de la rétine au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique de traitement des membranes pathologiques de la rétine. L'invention s'étend aussi à l'utilisation d'une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus dans une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un fluide ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de visualiser la diffusion du fluide ophtalmique au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique. Elle s'étend donc en particulier à une composition telle que mentionnée ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un fluide ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de visualiser la diffusion du fluide ophtalmique au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique. L'invention s'étend également à une méthode de traitement chirurgical ophtalmique appliquée au corps humain ou animal dans laquelle ladite composition est appliquée au contact d'un fluide ophtalmique de façon à en réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective permettant de visualiser la diffusion du fluide ophtalmique au cours de la réalisation d'une opération chirurgicale ophtalmique. Dans cette application, ladite opération chirurgicale ophtalmique est avantageusement choisie dans le groupe constitué de la chirurgie du glaucome par sclérectomie, de la chirurgie du glaucome par trabéculectomie, de la chirurgie du glaucome par trabéculoplastie, de la chirurgie du glaucome par canaloplastie, et de la chirurgie du glaucome par iridectomie. L'invention s'étend à l'utilisation d'au moins un colorant et d'au moins un polyol -notamment comme mentionné ci-dessus-pour la fabrication d'une composition thérapeutique appliquée au contact de la surface externe de la capsule antérieure de l'oeil de façon à réaliser dans des conditions physiologiquement acceptables une coloration sélective de la capsule antérieure par rapport au tissu lenticulaire sous-jacent facilitant la réalisation de l'ouverture contrôlée de la capsule antérieure au cours d'une opération chirurgicale d'extraction de la cataracte. L'invention s'étend à l'utilisation d'au moins un colorant et 30 d'au moins un polyol -notamment comme mentionné ci-dessus- pour la fabrication d'une composition thérapeutique pour le diagnostic des membranes pathologiques de la rétine par coloration sélective lors d'une opération de traitement des membranes pathologiques de la rétine. Dans les applications ophtalmiques (méthodes de diagnostic et/ou de traitement chirurgical appliquées au corps humain ou animal), avantageusement une composition selon l'invention contient à titre de colorant au moins un colorant choisi dans le groupe formé du bleu de trypan, du bleu brillant G, du bleu Evans, du bleu patenté V, du bleu de méthylène, du bleu de bromophénol et du bleu d'aniline. En outre, avantageusement dans cette même application, une composition selon l'invention comprend au moins le mannitol à titre de polyol. L'invention concerne également une composition selon l'invention telle que mentionnée ci-dessus ; son utilisation pour la coloration sélective des fluides physiologiques ou des tissus cellulaires ou de cellules in vivo, ex vivo, ou in vitro, notamment dans une méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou animal ou dans une méthode de traitement chirurgical appliqué au corps humain ou animal ; une telle méthode ; et l'utilisation d'au moins un colorant et d'au moins un polyol pour la fabrication d'une composition caractérisées en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif. Exemple 1 Trois solutions référencées respectivement solution 1, solution 2, solution 3 sont préparées. La solution 3 (non conforme à l'invention) est constituée de Bleu de trypan dissout à 0,15% (poids sur volume) dans une solution saline aqueuse 25 tamponnée comprenant 0,8% (poids sur volume) NaC1 et le tampon H2PO4/HPO4, sous forme NaH2PO4, 2H20 à 0,03% ; Na2HPO4, 2H20 à 0,18%. La solution 1 selon l'invention correspond à la solution 3 à laquelle est ajoutée 1,8% de mannitol et la quantité de NaCl ramenée à 0,5%. La solution 2 (non conforme à l'invention) diffère de la 30 solution 1 par le fait que le mannitol est remplacé par du glucose. Les solutions 1, 2 et 3 ont un pH physiologique, c'est-à-dire compris entre 7 et 7,5. Elles ont également une osmolarité physiologique, c'est-à-dire comprise entre 280 et 350 mOsmole/KgH2O. On évalue les effets de ces solutions vis-à-vis de cellules 5 endothéliales cornéennes humaines. On mesure le taux de cytolyse par incorporation d'une sonde fluorescente se fixant sur l'ADN dans les cellules dont la membrane plasmatique est endommagée. La cytolyse est évaluée par le canal de fluorescence approprié d'un cytomètre de flux. 10 En outre, on mesure le taux de cellules conservant une différence de potentiel membranaire (Agi) mitochondrial. Pour ce faire, on utilise des sondes fluorescentes cationiques non toxiques qui sont accumulées par les mitochondries polarisées selon la valeur résiduelle de leur potentiel membranaire mitochondrial. Elles sont extraites des cellules lorsque la membrane mitochondriale 15 disparaît complètement. Les cellules sont analysées dans des plaques à 96 puits par un cytomètre de flux. On utilise une lignée de cellules rétiniennes épithéliales ARPE-19 fournie par ATCC. Ces cellules sont cultivées dans un milieu de culture (mélange 20 en proportion égale de milieu MEM et de milieu de Ham F12 auquel on ajoute 10 % de sérum foetal bovin et 2 mM de L.-glutamine. Ces cellules sont injectées à raison de 10 000 cellules par puits dans les plaques à 96 puits. Les cellules sont ensuite placées pendant 2 min au contact de 50 itL des différentes solutions, de façon à mimer les conditions d'une opération 25 chirurgicale. Les solutions sont ensuite lavées et remplacées par du milieu de culture cellulaire frais. Des mesures de cytolyse et du taux de cellules conservant une différence de potentiel membranaire mitochondrial sont réalisées 1,5 heures et 24 heures après ce traitement. Les mêmes mesures sont effectuées à titre de comparaison sur 30 un milieu de culture cellulaire de référence (milieu MEM). 2 9 80363 13 Trois essais sont réalisés pour chaque test. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant. % de cellules cytolysées en 1,5h essai 1 essai 2 essai 3 Moyenne Milieu MEM 19,3 20,3 6,3 15,30 HBSS 40,4 26,2 6,2 24,27 Solution 3 33,3 33,6 10,6 25,83 Solution 2 33,8 14 7,8 18,53 Solution 1 22,4 8,3 10,5 13,73 % de cellules cytolysées en 24h Milieu MEM 18,3 16,4 10,2 14,97 HBSS 25,4 13,1 6,6 15,03 Solution 3 13,7 7,2 9,6 10,17 Solution 2 19,6 11,2 7,7 12,83 Solution 1 20,2 7,9 9,8 12,63 % de cellules ayant des mitochondries polarisées après 1,5h Milieu MEM 88 93,8 97,7 93,17 HBSS 62,9 70,3 95,9 76,37 Solution 3 65,4 54,2 97,3 72,30 Solution 2 47 95,1 94,7 78,93 Solution 1 83,7 96,2 89,9 89,93 % de cellules ayant des mitochondries polarisées après 24h Milieu MEM 90,6 92,6 95,8 93,00 HBSS 95,6 95,1 98 96,23 Solution 3 96,6 96,2 95,9 96,23 Solution 2 96,9 96,6 97 96,83 Solution 1 95,6 96,1 95,6 95,77 La solution 1 présente une cytotoxicité équivalente à celle du milieu de culture cellulaire de référence (13.7% et 15.3%). De plus le taux de cellules ayant un A'P mitochondrial est très proche de celui du milieu de culture cellulaire de référence (89.9% et 93.2%). On constate donc une absence surprenante de cytotoxicité de la solution 1 selon l'invention. La solution 3, solution saline avec 0.15% de Bleu de trypan sans mannitol, présente une cytotoxicité accrue par rapport au milieu de culture cellulaire de référence (25.8% et 15.3%) ainsi qu'un taux de cellule ayant un Ali mitochondrial, sensiblement diminué par rapport à celui correspondant au milieu de culture cellulaire (72.3% et 93.2%). La solution 2 présente une cytotoxicité intermédiaire entre celle obtenue par le milieu de culture cellulaire de référence et celle par la solution 3 (respectivement.18.5%, 15.3% et 25.8%). De même le taux de cellules ayant un AI' mitochondrial est intermédiaire entre celui du milieu de culture cellulaire de référence et celui de la solution 3 (respectivement.78.9%, 93.2% et 72.3%). Exemple 2 : stabilité après stérilisation La solution 1 a été stérilisée à l'autoclave (121°C 20min) et est ainsi prête à l'emploi. Cette stérilisation ne produit aucune impureté détectable, et ne modifie pas sensiblement les spectres d'absorption aux ultraviolets ou dans le visible. La solution 1 selon l'invention est stable à température 15 ambiante (+4°C /+30°C), la quantité de colorant qu'elle contient mesurée par chromatographie en phase gazeuse restant constante pendant plusieurs mois. La solution 3 contenant uniquement du bleu de trypan est également stable de la même manière, y compris après stérilisation. Au contraire, après stérilisation, la solution 2 contenant du 20 glucose est modifiée : son pH diminue de 7,36 à 6,2 et l'aire de son pic d'absorption à 595 nm diminue d'environ 20 %. Exemple 3 : On a préparé des solutions identiques à la solution 1 mais en remplaçant le bleu de trypan par un colorant choisi parmi le Bleu Evans, le Bleu 25 Brilliant G, le bleu de méthylène et le bleu d'aniline. Toutes ces solutions ont pu être stérilisées à l'autoclave (121°C 20min). Là encore, il a été constaté que chacune de ces solutions est stable à température ambiante (+4°C /+30°C), la quantité de colorant qu'elle contient mesurée par chromatographie en phase gazeuse restant constante pendant plusieurs 30 mois. Par ailleurs, le mannitol peut être remplacé par tout autre polyol biocompatible et stable, notamment choisi dans le groupe formé de l'érythritol (n=4), du xylitol (n=5), de l'arabitol (n=5), du ribitol (n=5), du sorbitol (n=6), du dulcitol (n=6), du volemitol (n=7), du maltitol (n=9), de l'isomaltipol (n=9) et du lactitol (n=9). REVENDICATIONS1/ - Composition comprenant dans une solution aqueuse : - au moins un colorant, - au moins un polyol soluble dans l'eau de formule H(HCOH)nH, n étant un entier supérieur à 3. 2/ - Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un colorant choisi dans le groupe formé du bleu de trypan, du bleu brillant G, du bleu Evans, du bleu patenté V, du bleu de méthylène, 10 du bleu de bromophénol et du bleu d'aniline. 3/ - Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de chaque colorant(s) en poids sur volume comprise entre 0,001 % et 2,5 %. 4/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 3, 15 caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion de polyol(s) en poids sur volume comprise entre 0,1 % et 5 %. 5/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que n est inférieur ou égal à 9. 6/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 5, 20 caractérisée en ce que chaque polyol est choisi dans le groupe formé de l'érythritol (n=4), du xylitol (n=5), de l'arabitol (n=5), du ribitol (n=5), du sorbitol (n=6), du dulcitol (n=6), du mannitol (n=6), du volemitol (n=7), du maltitol (n=9), de l'isomaltipol (n=9) et du lactitol (n=9). 7/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 6, 25 caractérisée en ce qu'elle comprend le mannitol à titre de polyol. 8/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une quantité de chlorure de sodium adaptée pour que la composition présente une osmolarité comprise entre 260 et 360 mOsmole/KgH2O.9/ - Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend une proportion en poids sur volume de chlorure de sodium comprise entre 0,4 % et 0,9 %. 10/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 9, 5 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un tampon adapté pour maintenir un pH entre 7 et 7,5. 11/ - Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que le tampon est H2PO4/1-1PO4. 12/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 11, 10 caractérisée en ce qu'elle est constituée de 0,001 % à 2,5 % (poids/volume) d'au moins un colorant, de 0,1 % à 5 % (poids/volume) d'au moins un polyol soluble dans l'eau, d'une proportion de chlorure de sodium permettant d'ajuster l'osmolarité de la composition à une valeur comprise entre 280 mOsmole/KgH20 et 350 mOsmole/KgH2O, d'un tampon adapté pour maintenir le pH de la composition 15 entre 7 et 7,5, et d'eau en quantité qsp. 13/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est stérile. 14/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 13 pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic appliquée au corps humain ou 20 animal. 15/ - Composition selon l'une des revendications 1 à 13 pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement chirurgical du corps humain ou animal.