FR 2988843 A1 20131004 FR 1253057 A 20120403 Méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur d'un fragment d'organe solide humain ou animal La présente invention concerne une méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur d'un fragment 5 d'organe solide humain (adulte ou enfant) ou animal d'un individu donné. On entend ici par « tumeur », une pathologie impliquant une prolifération cellulaire de cellules nouvelles d'aspect anormal, entrainant une modification physique locale de la texture dans le cas d'organe 10 solide. Il peut s'agir de tumeur dont les cellules sont cancéreuse c'est- à-dire une tumeur ayant le pouvoir d'envahir les structures voisines comme explicité ci-après ou d'une tumeur non cancéreuse dite « bénigne » ou encore une tumeur d'origine infectieuse ou autre. Ce phénomène tumoral peut conduire à une augmentation de 15 volume d'organe. Lorsque la tumeur à une forme arrondie ou sphéroïdale, on parle de nodule. Lorsque la formation arrondie comporte une réaction inflammatoire en sa périphérie on parle de granulome. Une cause fréquente de tumeur bénigne est l'inflammation (tumeur inflammatoire), laquelle peut se produire en réaction à l'introduction 20 d'un corps ou organisme étranger dans le tissu (tumeur à corps étranger, tumeur en réponse à une infection, etc). Certains agents infectieux ont la particularité d'induire volontiers la formation de tumeurs d'allure nodulaire et granulomateuse dans l'organe qu'ils infectent, c'est le cas par exemple de la tuberculose. Certains cas sont à 25 la limite de ces définitions, on parle alors de pseudo-tumeurs ou de lésion (lésion cornéenne par exemple). Il apparait donc que la connaissance de la nature d'une tumeur est cruciale pour répondre aux questions suivantes: - faut-il l'enlever chirurgicalement (éxérèse) ? - quels médicaments donner : faut-il un traitement antibiotique, antituberculeux, anti-inflammatoire, anticancéreux ? - faut-il compléter la chirurgie du cancer d'une chimiothérapie ou d'une radiothérapie Les organes peuvent être le poumon (parenchyme pulmonaire ou bronches), mais aussi le système colo-digestif (organes creux et glandes annexes, foie, vésicule, pancréas glandes salivaires), ainsi que tout organe de l'organisme (appareil urogénital et reproducteur, muscles, peau, cerveau, glandes endocrines, glandes exocrines, os, ou encore le tissu lymphatique (rate et ganglions), notamment des ganglions de la chaine thoracique. Plus particulièrement, la présente invention est utile pour réaliser un diagnostic rapide de la qualité d'une ablation de tumeur, notamment dans la chirurgie du cancer. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la spectrométrie de masse par désorption-ionisation laser assistée par matrice et temps de vol (en anglais « matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ») dite type MALDI-TOF pour le diagnostic extemporané d'exérèse chirurgicale totale (c'est-à-dire l'ablation de tout ou partie d'un organe) notamment en cas de cancer, à partir de broyats pour lesquels aucune purification protéique et aucune localisation morphologique des cellules cancéreuses n'est effectuée. Le cancer est caractérisé par la prolifération de cellules anormales en aspect et en fonctionnement au sein d'un tissu normal. Lorsque ceci se produit au sein d'un tissu solide, une formation se développe, plus ou moins bien limitée mais identifiable par sa différence d'aspect et de consistance avec le tissu voisin. On parle de « tumeur ». Ainsi les cellules cancéreuses vont se développer d'abord localement le plus souvent, puis de manière régionale en envahissant les tissus et organes voisins en particulier les ganglions. Mais les limites de cette formation sont plus ou moins nettes par rapport au tissu voisin. Lorsqu'une tumeur comporte des cellules cancéreuses dont l'origine est la même que celle du tissu dans lequel elles prolifèrent, on parle de «cancer primitif». Les cellules cancéreuses peuvent aussi essaimer et se développer à distance pour former une tumeur dite secondaire au sein d'un autre organe que l'organe primitif : ce sont les métastases. Lorsqu'une tumeur comporte des cellules cancéreuses dont l'origine est distincte de celles du tissu dans lequel elles prolifèrent, on parle en effet de «métastase». La quasi-totalité des organes de l'organisme peuvent être le siège de tumeurs cancéreuses appelées aussi « tumeurs malignes ». Lorsque l'organe malade est un organe lymphoïde (ganglions et /ou organe lymphoïdes autres tels que la rate), le cancer porte le nom de lymphome. Les organes qui seront la cible de métastases sont principalement le poumon, le cerveau, le tissu osseux et les ganglions. Ainsi les ganglions peuvent être de nature tumorale maligne soit en raison d'un cancer lymphoïde primitif (lymphome) soit en raison d'une métastase ganglionnaire d'un cancer dont le point d'essaimage est un autre tissu. Dans le cas de cancers de tissus solides, l'acte chirurgical de l'exérèse vise la suppression totale de toute cellule anormale et passe en général par l'exérèse de l'ensemble de la tumeur avec une marge de sécurité suffisante de l'ensemble vasculaire et cellulo-lymphatique de voisinage susceptible de contenir des métastases régionales. Un des problèmes au moment de la chirurgie du cancer est donc de savoir où s'arrête l'envahissement tumoral. Pour les organes non-vitaux (par exemple la thyroïde), une ablation totale de l'organe est possible. Pour les organes vitaux, la détermination des limites de l'exérèse est une question cruciale. Elles sont d'abord guidées par la visualisation à l'oeil nu de l'aspect « tumoral » différent de l'aspect « non tumoral » ainsi que par une logique basée sur l'organisation anatomique de l'organe. En cas de doute, un examen microscopique d'un fragment tissulaire prélevé sur les limites de l'exérèse permettra de dire si la résection est passée en zone saine ou pas (cf infra). Dans les deux cas, il est également nécessaire de déterminer avec certitude l'existence d'un envahissement ganglionnaire car la voie lymphatique est souvent le principal mode de diffusion dans la circulation générale favorable aux métastases. Le pronostic étant plus sévère en cas d'envahissement ganglionnaire, la prise en charge thérapeutique sera souvent renforcée par une radiothérapie et /ou chimiothérapie. Au-delà de l'objectif curatif, l'étendue de l'ablation est d'une importance majeure : trop large, la résection prive inutilement le patient d'une partie de ses fonctions, trop restreinte, elle fait encourir un risque élevé de résection incomplète avec pour corollaire un pourcentage élevé de récidives, d'essaimage et finalement de décès. En effet, les récidives sont plus agressives, infiltrantes et sont moins accessibles à un traitement curatif que les tumeurs initiales. Parce que des cellules cancéreuses invisibles pour l'oeil peuvent migrer depuis la tumeur visible vers des zones voisines, les contours de la résection doivent être plus larges que ceux de la tumeur visible. L'examen anatomopathologique ou histologique, c'est-à-dire l'examen au microscope du fragment d'organe enlevé (dit « réséqué »), est le moyen principal actuellement utilisé pour affirmer la nature de la tumeur, déterminer la qualité de l'ablation tumorale et déterminer l'existence d'un envahissement ganglionnaire ou d'un tissu de voisinage. Souvent un examen extemporané per-opératoire est requis pour les tumeurs d'origine douteuse, en particulier pour confirmer le diagnostic de cancer d'une part, puis pour déterminer et guider les limites de l'exérèse, c'est-à-dire pour analyser les zones avoisinantes appelées « berges de résection », mais aussi les des ganglions lymphatiques. Une reprise immédiate pourra alors être requise pour compléter l'exérèse. Il est d'un appui majeur dans la chirurgie vidéo-assistée pour déterminer l'existence d'un envahissement ganglionnaire lequel, au cas où il est présent, conduira à convertir l'opération chirurgicale en ouverture conventionnelle. Cette observation microscopique doit se faire rapidement ce qui implique de ne pas conditionner le prélèvement selon les techniques habituelles ni d'utiliser des colorations capables de bien discriminer les éléments architecturaux des tissus. Cette observation microscopique peut se faire sur les lieux de l'intervention chirurgicale donc dans le bloc opératoire avant fermeture de la paroi (analyse histologique extemporanée). Cet examen requiert toutefois l'ablation d'un fragment relativement gros, à savoir au moins 5 g (environ 2 cm2) et une durée d'au moins 30 minutes voire 1 heure par un spécialiste anatomopathologiste expert sur l'organe concerné, éventuellement présent dans le bloc opératoire. Enfin, cette analyse demeure délicate dans son interprétation et le risque de faux négatifs et/ou de réponses douteuses est relativement élevé. C'est pourquoi une étude plus précise éventuellement complétée d'un marquage cellulaire est ensuite réalisée sur la pièce de résection et permet, a posteriori, la caractérisation précise du type de tumeur et de son degré de différentiation en cas de cancer, mais aussi de porter un diagnostic définitif de la présence ou pas de cellules cancéreuses visibles en microscopie sur les berges de la résection. Les résultats de cette analyse a posteriori sont disponibles en général dans les 10 jours post-opératoires. Confronté à ces données définitives, il n'est pas exceptionnel que l'analyse extemporanée ait rendu un résultat faussement négatif (données non disponibles, estimées par expérience à 1-2%). Dans ce cas, un traitement adjuvant par exemple par chimiothérapie sera mis en place. Il est plus fréquent d'obtenir des faux positifs. La présente invention concerne plus particulièrement l'analyse de fragments de poumon dans le cas de cancer pulmonaire. Les tumeurs malignes du poumon relèvent de la chirurgie dite thoracique dans un grand nombre de cas, laquelle vise l'ablation totale de la zone cancéreuse et des ganglions envahis. En raison des caractéristiques du parenchyme pulmonaire, il n'existe pas de limite nette cloisonnant bien l'organe de manière visible pour Si une tumeur est cancéreuse, sa localisation fera décider le chirurgien d'étendre l'exérèse sur la base de l'organisation du poumon en lobes et segments. Si une tumeur est non cancéreuse, elle peut être l'objet d'une exérèse très circonscrite voire d'une absence d'exérèse avec prélèvement à but diagnostic. Ainsi, la prise en charge d'une tumeur pulmonaire peut aller de l'exérèse non-anatomique (selon les contours de la tumeur ou « wedge resection ») à but diagnostic, ou bien, par ordre croissant : segmentectomie, lobectomie, pneumonectomie. Afin d'améliorer la sensibilité et la spécificité des techniques asservies à la microscopie optique, des techniques fournissant des informations à l'échelle cellulaire ont été mises à disposition des cliniciens. Parmi elles, la protéomique étudie le grand ensemble des protéines exprimées à un moment donné par une cellule. La protéomique permet par exemple de mettre en évidence des régulations protéiques survenant lors de la différenciation cellulaire, telles qu'au cours des cancers, notamment par spectrométrie de masse. Depuis ses débuts à la fin des années 1990 [1], cette science a dû s'accompagner du développement d'outils bioinformatiques ultra performants et sophistiqués capables de décrypter la myriade d'informations résultant du catalogue protéique qu'elle permet d'établir. En effet, plus que l'identification d'un marqueur protéique spécifique, c'est la recherche de réseaux de régulations qui sont mis en lumière. Toutefois, si l'information qui découle de ce type d'analyse est particulièrement riche, elle n'a été jusqu'alors évaluée qu'après purification/extraction du contenu protéique total de l'échantillon cellulaire analysé, et l'information est d'autant plus spécifique que la lignée cellulaire est pure. C'est pourquoi en règle générale, avant l'analyse par spectrométrie de masse, les protéines sont séparées par électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide par exemple (2-D PAGE) [2]. Il existe également d'autres techniques permettant de sélectionner un groupe de protéines d'intérêt sur un critère physico-chimique (hydrophobicité, valence...). Ces techniques sont exploitées sous deux systèmes d'analyse et de traitement bio-informatique dénommés spectrométrie de masse de type SELDI-TOF comprenant une séparation sur une surface (de l'anglais « Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time Of Flight ») ou sur des billes magnétiques. Ces deux derniers types de séparation sont fréquemment appliqués à l'analyse des liquides biologiques complexes tels le sérum, les urines, le lavage broncho-alvéolaire ou les suspensions cellulaires, mais ne peuvent pas valablement être appliqué de manière rapide et simple sur un tissu complet. Ainsi, le préalable des analyses protéomiques proposées jusqu'alors en cancérologie est-il principalement basé sur des manipulations longues, complexes et coûteuses de purification-extraction, écartant toute possibilité d'application à l'analyse extemporanée pour aide au geste chirurgical au bloc opératoire. La première application de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF au cancer date des années 2000 [3]. Par souci de trouver un marqueur plus sensible et plus spécifique que le marqueur biologique habituel (l'alphafoeto-protéine circulante dans ce travail) pour l'aide au diagnostic ainsi que le suivi thérapeutique du carcinome hépatocellulaire, ces auteurs ont mis en évidence un ensemble de 20 protéines candidates associés au carcinome hépatocellulaire et détectables à partir du sérum sanguin prétraité par électrophorèse bidimensionnelle. Depuis, l'application du MALDI-TOF précédé d'une électrophorèse s'est répandu en cancérologie des cancers du sein, prostate, colon, foie, poumon [4, 5, 6] à des fins de localisation de cellules tumorales au sein d'un tissu, de recherche de facteurs pronostiques ou de suivi thérapeutique. Il est aussi utilisé pour prédire le risque de métastases [5]. Récemment, il a été proposé de déterminer l'origine tumorale d'une tumeur d'origine incertaine, à partir de coupes d'organes, en visualisant les cellules tumorales par imagerie de type imagerie MALDI [8]. Il s'agit donc dans ces travaux de l'analyse d'extraits protéiques de sérums sanguins basée sur l'analyse des spectres de protéines circulantes non issues de cellules tumorales, c'est-à-dire des marqueurs non spécifiques de cellules cancéreuses ou sur l'analyse d'un groupe protéique issu d'une lignée cellulaire purifiée ou encore d'un groupe de protéines sélectionnées à partir d'un tissu isolé du reste de l'organe (épithélium, par exemple). Sur des tissus solides, on recherche et étudie une protéine particulière, ou un spectre spécifique émis par un type cellulaire tumoral donné co-localisant le spectre et les cellules anormales sur des coupes fines de tissu pré-traité pour fixation. Dans une revue générale, Ardekani et al. [4] fait un état de l'art sur la question de la recherche de profils protéiques détectables dans le sérum humain par SELDI-TOF pour différencier les patients porteurs des non porteurs de cancer de l'ovaire. Dans un but de dépistage précoce, Ward DG et al. ont également recherché par SELDI-TOF une liste de protéines candidates (non spécifiques du cancer en question) qui différencient des patients porteurs de cancer colo-rectal de sujets sains. De même pour la détection sérique de profils protéiques associés au cancer du poumon tel qu'effectué par exemple par Yang SY et al. [6]. Ces recherches sur le plasma auraient donc pour but une application à large échelle sur l'ensemble d'une population à risque à laquelle la technique serait appliquée. Ce type d'application se heurte alors aux questions de rapport coût/bénéfice attendu ainsi qu'à l'absence de confirmation sur de larges effectifs. De façon plus ciblée, l'équipe de Oshita et al [7] a utilisé la spectrométrie de masse sur les protéines extraites de tumeurs cancéreuses décongelées dans le cadre du cancer pulmonaire d'un seul type (adénocarcinome) et bien différencié de 16 patients opérés 5 ans plus tôt. Le but était de rechercher un profil protéique associé à la récidive cancéreuse après ablation sur la base d'une comparaison entre des tumeurs de patients n'ayant pas récidivé à 5 ans et d'autres étant décédés du fait d'une récidive. Une liste de 11 protéines a été établie comme associée aux tumeurs des patients ayant récidivé à 5 ans. L'intérêt de ce type de recherche serait donc de savoir dès l'opération, à partir de l'analyse de la tumeur, quels sont les sujets à risque de récidive. Dans le travail récent de Meding et al [8], le profil spectral spécifique des cellules cancéreuses de 6 types d'adénocarcinomes de localisation différentes (sein, colon, foie, estomac, oesophage, thyroïde) a été établi pour chacune, à partir d'une cohorte de 171 échantillons pour lesquels une technique d'imagerie sur des coupes de zones identifiées au préalable par microscopie comme étant tumorales, a été effectuée pour déterminer le type de tumeur. A partir de ces données, l'origine d'une métastase hépatique a pu être diagnostiquée avec une sensibilité insuffisante de 81 à 91% et une spécificité de 85 à 87% selon l'algorithme choisi, le diagnostic du type « carcinome hépatocellulaire» d'une tumeur du foie a pu être porté avec une sensibilité de 73 à 74% et une spécificité de 96 à 97% selon l'algorithme. Sur sérum ou sur tissu, ces précédentes utilisations de la spectrométrie de masse-MALDI-TOF utilisent des techniques longues et complexes d'extraction protéique ou de traitement du fragment d'organe. A ce jour, aucun travail n'a suggéré qu'une détection simple et directe, sans passer par un gel de séparation ni par une technique d'extraction et purification des seules protéines et/ou désalinisation de l'échantillon, et sans chercher à identifier les protéines détectées ni à localiser les cellules anormales pour en recueillir le spectre spécifique, pouvait apporter une information suffisante pour l'analyse de fragment d'organe comportant plusieurs types de tissus par spectrométrie de masse. Compte tenu de la difficulté à isoler des marqueurs spécifiques du cancer primitif ou du risque de récidive ou de métastases, on a cherché selon la présente invention à fournir une nouvelle méthode d'analyse de fragments d'organes tumoraux, notamment pour déterminer la qualité et les limites d'une ablation chirurgicale, qui soit plus rapide, plus simple et moins coûteuse à réaliser. Selon la présente invention, on a découvert de façon accidentelle et surprenante qu'il était possible d'utiliser une spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour définir des profils spectraux suffisamment sensibles et spécifiques permettant d'affecter un fragment d'organe à une classe tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur, notamment cancéreuse ou au contraire non cancéreuse, à partir de l'analyse directe d'échantillon de fragments d'organe, sans séparation des cellules ou tissus qui le composent et sans présélection et étude d'un groupe protéique particulier. Selon la présente invention, on met en oeuvre un échantillon de fragments d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et pluritissulaire de cellules entières obtenues par dilution, de préférence dans de l'eau distillée, et broyage. La spectrométrie de masse est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/Z). Elle utilise un faisceau L.A.S.E.R. pulsé dans l'UV (337 nm) afin de désorber et d'ioniser un mélange de matrice/échantillon co-cristallisé sur une surface métallique. Une matrice évite une trop importante dégradation de l'échantillon, elle absorbe l'énergie et cet apport d'énergie provoque l'expansion en phase gazeuse. La spectrométrie de masse sous sa variante MALDI-TOF est récemment entrée dans les laboratoires de microbiologie. Elle permet d'identifier et de classifier différents types bactériens en utilisant des bactéries intactes. En effet, parmi les divers composants identifiés dans un spectre de spectrométrie de masse MALDI/TOF de type Biotyper®, certains semblent spécifiques d'une espèce bactérienne précise [9, 10]. Il a ainsi été possible d'identifier un grand nombre d'espèces bactériennes isolées à partir des prélèvements cliniques en utilisant des banques de données élaborées à partir de chacune de ces espèces. Enfin, l'analyse MALDI-TOF a été appliquée avec succès pour l'identification de types cellulaires eucaryotes conservés par congélation. Elle a permis d'étudier la présence de différentes populations lymphocytaires au sein d'un tissu complexe tel que le sang humain et de constituer une banque de données [10]. Cependant, Il n'a encore jamais été proposé d'analyser directement un échantillon de fragment d'organe soumis à une préparation rapide et simple pour la détection de tumeurs, notamment de cancers, par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF par étude d'un spectre global d'un organe pluritissulaire et pluricellulaire. La raison principale découle de ce qu'un tissu solide présente une nature complexe pluricellulaire pouvant comprendre selon l'organe concerné des fibres élastiques ou collagènes ou autres, du sang, des vaisseaux, des muscles, de la lymphe ou autre liquide biologique et un grand nombre de composants protéiques non spécifiques de sorte qu' aucun spectre modèle ne peut être défini. Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur et/ou du type de cancer d'un fragment d'organe solide humain ou animal d'un individu donné, par analyse de spectre(s) de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ledit type de tumeur appartenant à au moins l'une des classes et sous-classes de tumeurs suivantes : a) la classe des tumeurs cancéreuses, b) la sous classe des tumeurs cancéreuses de type cancer primitif, c) la sous-classe des fragments cancéreux de type métastase, d) la classe des tumeurs non cancéreuses, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : 1) on prépare un premier échantillon d'une suspension homogène 25 de broyat de dit fragment d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et/ou pluritissulaire de différents types de cellules entières non lysées, dilué de préférence dans de l'eau distillé, et 2) on réalise au moins un spectre d'au moins un dit premier échantillon et on analyse ledit spectre par comparaison avec au moins un profil de référence, ledit profil de référence étant constitué par au moins une liste de pic(s) de référence de spectre(s) établi(s) sur respectivement au moins un échantillon de référence de broyat de respectivement au moins un fragment de référence brut de même tissu d'au moins un individu, le(s) dit échantillon(s) de référence étant préparé(s) de manière identique audit premier échantillon, le(s) dit(s) fragment(s) de référence étant connu(s) pour être de nature tumorale ou non tumorale , ou, en cas de nature tumorale, étant connu(s) pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et 3) on détermine si ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon. A l'étape 1), la mise en oeuvre d'un dit mélange pluricellulaire et pluritissulaire de cellules entières non lysées signifie que l'on ne réalise pas de traitement d'extraction et/ou séparation de protéines, cellules ou tissus particuliers, et on ne réalise pas de traitement désalinisation ou purification préalable spécifique des protéines ou d'un type cellulaire ou tissulaire particulier. En particulier, les inventeurs avaient tout d'abord cherché à analyser des échantillons de broyat ayant subi des étapes de lyse cellulaire, chimique ou enzymatique, ainsi que des échantillons traités pour extraire et purifier certains composants, notamment des protéines. Mais ces échantillons n'ont pas permis d'obtenir une classification pertinente sur la base de spectre de masse de type MALDI-TOF. En revanche, les inventeurs ont découvert que, de façon surprenante, des fragments d'échantillon bruts et, même, non débarrassés des débris tissulaires de grosse taille ni des résidus sanguins, permettaient d'obtenir des spectres exploitables, c'est-à-dire reproductibles et de qualité acceptable selon les critères de score de qualité discuté ci-après, en travaillant- à l'origine, par erreur, sur un échantillon brut simplement dilué à l'eau distillée. De même, les échantillons dilués par des solvants autres que de l'eau distillée ne permettaient pas d'obtenir des spectres de qualité suffisante, probablement car ils contenaient des espèces ioniques provenant des réactifs et solvants mis en oeuvre qui saturaient la détection par spectrométrie de type MALDI-TOF, compte tenu que cette dernière détecte des ions comme rappelé ci-dessus. Plus particulièrement, à l'étape 1), on réalise une dilution dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension aqueuse d'une concentration de 0,05 à 5 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml. Une telle concentration est requise pour obtenir des spectres exploitables tel que défini ci-dessus avec les matériels de spectrométrie de masse MALDITOF disponibles actuellement dans le commerce. Sans être lié par cette théorie, les inventeurs formulent l'explication selon laquelle en dessous de la limite inférieure de cette fourchette, il pourrait manquer des composants caractéristiques de l'organe et au-dessus, la quantité de composants non caractéristiques pourrait être trop importante et crée un bruit de fond couvrant le signal des composants caractéristiques. Cette concentration peut être obtenue à partir de fragments de 0,05 à 2 g, de préférence de 0,1 à 0,5 g (environ 1 à 5 mm), dilués dans de l'eau distillée au 1/100 à 1/200è", notamment 1/160è". De façon connue, à l'étape 1), on réalise le broyage d'un fragment d'organe par dilacération fournissant des particules de taille inférieure à 100 microns à l'aide d'un dispositif de dispersion/homogénéisation du type à rotor et stator, induisant des forces de cisaillement et de traction et de hautes turbulences dans le fluide notamment un dispositif du commerce de marques ULTRA TURRAX®. Toutefois, avantageusement, ladite suspension de dit broyat est débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm, de préférence supérieure à 50 pm, de préférence par centrifugation et récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension. De préférence encore, ladite suspension de broyat comprend un solvant de solubilisation de protéines, de préférence de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile. Plus particulièrement encore, pour éliminer les débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm, de préférence de taille supérieure à 50 pm, on réalise les étapes suivantes : - une première centrifugation lente, avec une accélération inférieure à 100 g de ladite suspension de broyat diluée, et - une deuxième centrifugation plus rapide du surnageant de première centrifugation, à une accélération de plus de 10 000 g, plus particulièrement de 10 000 à 20 000 g, puis - de préférence, une troisième centrifugation rapide de plus de 10 000 g, de préférence de 10 000 g, du culot de deuxième centrifugation dilué dans de l'eau distillée, et - récupération dudit culot de deuxième ou, de préférence, troisième centrifugation, que l'on dilue dans des dissolvants de solubilisation de protéines. Ces échantillons, débarrassés des débris tissulaires grossiers et dilués dans des solvants favorisant la solubilisation des protéines, sont avantageux dans certains modes de réalisation décrits ci-après. La solubilisation des protéines vise à éviter la coagulation éventuelle des protéines, éventuellement libérées par certaines cellules lors du broyage et/ou dilution décrits ci-dessus. Le procédé selon la présente invention est simple et rapide à réaliser, n'ayant pas d'étape d'extraction protéique préalable à l'analyse ou autre traitement à réaliser. A l'étape 2), ledit profil de référence peut être choisi parmi: 2.1) un spectre complet ) d'un échantillon de référence de broyat d'un fragment de référence brut de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique audit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et 2.2) une liste de pic(s) de référence comportant un nombre inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la série de(s) dit(s) pic(s) de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon. Et, à l'étape 3) on détermine si ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon l'une des deux manières suivantes respectivement : 3.1) si le spectre dudit premier échantillon est identique-à un dit spectre complet de référence d'un dit échantillon de référence du même organe du même individu, on détermine que ledit fragment dudit premier échantillon est de même nature tumorale ou respectivement non tumorale connue, ou le cas échéant appartient à la même classe ou sous-classe de tumeur ou cancer connue provenant du même individu que ledit fragment de référence, et 3.2) le spectre dudit premier échantillon permet de classer le fragment comme étant de nature tumorale ou inversement de nature non tumorale ou encore appartenant à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence d'une dite liste de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon. De préférence, à l'étape 2.1), le spectre complet est un spectre moyen résultant d'une moyenne entre plusieurs spectres effectués à partir de plusieurs dépôts analysés sur la même plaque de spectromètre, issus d'un même fragment d'un même individu, notamment au moins 4 spectres, de préférence au moins 10 spectres. A l'étape 2.2), ledit profil différentiel de référence est établi à partir d'un ensemble d'échantillons de référence de fragments de référence d'un dit organe d'une pluralité d'individus, lesdits fragments de référence étant connus pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus. Plusieurs profils différentiels de références pour différentes natures de fragments connues pour un organe particulier et/ou pour différents organes peuvent être enregistrés dans une base de donnée. Pour la méthode des étapes 2.2) et 3.2) ci-dessus, on utilise de préférence des échantillons de broyats dilués et débarrassés des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm, tels que décrits ci-dessus, et de préférence avec des solvants de solubilisation de protéines. Les inventeurs ont mis en évidence la possibilité de définition de signatures spécifiques de différents types d'organes solides tumoraux par analyse des spectres complets obtenus par spectrométrie de masse 30 MALDI-TOF. Selon la présente invention, la démonstration de la spécificité a été réalisée sur des analyses comparatives de 32 fragments de tissus pulmonaires tumoraux de toutes classes et 32 fragments pulmonaires non cancéreux comme explicité ci-après. On entend par « fragment de nature tumorale », une tumeur quelconque à savoir: une tumeur cancéreuse aussi bien que non cancéreuse. On entend par « classe des fragments de tumeur de nature cancéreuse », un cancer primitif ou un cancer de type secondaire, c'est- à-dire de métastases (cellules cancéreuses provenant d'un autre tissu ou organe). On entend par « sous classe des fragments cancéreux de type de cancer primitif », un cancer de prolifération des cellules d'origine dudit tissu, et ce pour tout type cellulaire du dit organe tel que adénocarcinome, carcinome épidermoïde, carcinome indifférencié, mélanome, sarcome, lymphome et tout autre type de cancer. On entend par «sous-classe des fragments cancéreux de type de métastase», un cancer provenant de prolifération de cellules provenant d'un autre type d'organe que celui au sein duquel elle est identifiée. En particulier, lorsque ledit organe est un ganglion, celui-ci est le siège privilégié de métastases provenant d'un organe voisin (proche ou distant) comme indiqué ci-dessus. On entend par « classe de fragment tumoral de nature non cancéreuse », une tumeur inflammatoire (infectieuse ou non infectieuse), une tumeur non inflammatoire (infectieuse ou non infectieuse). Dans un mode préféré de réalisation, les organes analysés sont choisis parmi le parenchyme pulmonaire et les ganglions thoraciques régionaux. Dans un autre mode de réalisation préféré, les échantillons analysés sont choisis parmi les bronches et les ganglions. Pour les raisons exposées précédemment on analysera attentivement les ganglions à proximité de l'organe principal analysé. En particulier les ganglions régionaux suivants pour les organes voisins suivants : - pour les poumons, les bronches ou l'oesophage : les ganglions thoraciques, médiastinaux hilaires, para-oesophagiens, abdominocoeliaques et cervicaux ; - pour les seins : les ganglions axillaires, thoraciques et cervicaux ; - pour les viscères intra-abdominaux : les ganglions abdominopelviens et sus-claviculaires ; - pour les organes de la tête et du cou : les ganglions cervicaux et thoraciques ; - pour la prostate, les testicules et la vessie et autres organes de l'appareil uro-génital et reproducteur féminin ou masculin : les ganglions abdomino-perlviens; -Pour les tissus cutanés et musculaires y compris des membres inférieurs : les ganglions inguinaux, axillaires et/ou du territoire concerné. A l'étape 3), de façon connue, on entend par « la valeur de l'aire desdits pics », une valeur normalisée de l'aire sous la courbe du pic, à savoir l'intégrale correspondant à l'intégration de toutes les intensités correspondant à la région du pic située entre la courbe du pic et une ligne droite passant par le premier et le dernier point d'inflexion (la ligne de base du spectre étant la ligne d'intensité relative de pic nulle), ladite intégrale étant divisée par l'intensité moyenne du pic de même m/z dans l'ensemble des spectres de la classe N considérée. Ce mode de calcul est décrit dans le manuel d'utilisation du logiciel ClinProtools® 2.1. Aux étapes 2.2) et 3.2), en fonction de la diversité des échantillons de référence provenant d'une pluralité d'individus constituant la banque d'échantillons pour déterminer lesdits profils différentiels, on pourra différentier davantage de sous-classes, notamment les sous classes additionnelles suivantes : - les sous-classes des cancers primitifs dudit organe de respectivement différents types cellulaires de cancer, en particulier pour le poumon les cancers primitifs des différents types listés dans la classification OMS 2004 et 2011 cités ci-après , notamment les types cellulaires de cancers tels que adénocarcinome, carcinome épidermoïde, carcinome indifférencié, mélanome, sarcome, lymphome ; et - les sous-classes de métastases provenant respectivement de différents autres organes, en particulier pour le poumon, les sous-classes respectives des métastases provenant par exemple de tout cancer localisé dans un autre organe comme par exemple des cancers du sein, du côlon, de la prostate, du pancréas, du rein, de la thyroïde, de l'estomac, des mélanomes, de l'ovaire, des sarcomes. - les sous-classes de tumeurs non cancéreuses suivantes : tumeur inflammatoire infectieuse, tumeur inflammatoire non infectieuse), tumeur non inflammatoire infectieuse et tumeur non inflammatoire non infectieuse. On peut citer les tumeurs non cancéreuses telles que nodule tuberculeux, sarcoïdose, Histiocytose X, mycose, pneumoconiose, parasitose, granulomatose de Wegener ou toute autre anomalie non cancéreuse. A l'étape 2), comme mentionné précédemment, de façon connue, on réalise une pluralité de spectres d'une pluralité d'échantillons de ladite suspension, au moins 4 spectres, de préférence au moins 10 spectres, pour déterminer un spectre moyen dudit échantillon. A l'étape 2), de façon connue encore, on ne prend en compte dans lesdits spectres : i- les seuls pics dont l'intensité relative, exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité, est supérieure à au moins 3 fois celle du bruit de fond, et ii- lesdits spectres présentant un score de qualité supérieure à 2, ledit score de qualité étant constitué de l'addition des deux notes n1 et n2 ayant chacune une valeur de 0 à 6 avec : - n1 est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques dudit spectre n, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après, et - n2 est la note attribuée en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité dudit spectre, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après ; et iii- on retient dans le spectre au moins les 50, de préférence au moins les 70 pics de plus grandes intensités. Les critères i à iii ci-dessus sont pris en compte à l'aide notamment du logiciel de marque BIOTYPER® RTC et CLINPROTOOLS® développés par le fabricant de spectromètre de masse Bruker Daltonik® GmbH, Leipzig, Germany de référence Microflex LT. Les pics desdits spectres étant définis par une paire de coordonnées composées d'une abscisse constituée du rapport masse/charge (m/z) de 2 000 à 15 000 Da, plus particulièrement de 3 000 à 9 000 Da, la coordonnée en ordonnée étant une intensité relative ou en unité arbitraire. On entend ici par "intensité relative", une intensité exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité ou autrement exprimée par le rapport de (intensité du pic/ intensité du bruit de fond). A l'étape 3), on considère qu'un pic est commun entre le spectre analysé et un profil ou spectre de référence, si le pic présente les critères de validation et de recalibration définis pour chaque modèle et connus de l'homme de l'art, et dont le paramétrage peut être modifié par l'opérateur selon les consignes explicitées dans les manuels d'utilisateur spécifiques des logiciels Bruker Daltonics® et tels que listés plus loin dans les méthodes. A l'étape 3), lorsque l'on compare un nouveau spectre à un autre spectre, comme à l'étape 3.1), ou à un profil de référence présent dans la base de données, comme à l'étape 3.2) ci-dessus, on prend en compte un autre score, appelé score d'identification décrit plus loin, qui est calculé par le logiciel BIOTYPER®. Le logiciel BIOTYPER® peut identifier ainsi des spectres inconnus par comparaison avec des spectres de référence stockés dans une base de données. A l'étape 2.2), de façon connue, le logiciel CLINPROTOOLS® de la société BRUCKER DALTONICS® permet, lorsque cela est possible, à partir d'une banque de spectres établis sur des d'échantillons classés en plusieurs groupes correspondant à des catégories différentes de fragments, d'identifier un dit profil différentiel consistant en un (ou des) pic(s) discriminant(s), apte(s) à différentier les spectres des catégories différentes de fragments. La différentiation entre les différents groupes par comparaison avec un dit profil différentiel peut résulter de ce que : - à partir de ladite banque de spectres, le logiciel a été capable d'identifier un pic discriminant d'un dit groupe de fragment et/ou une valeur d'aire du pic, et/ou - à partir de ladite banque de spectres, le logiciel a été capable d'identifier plusieurs dits pics de référence dont la présence ou l'absence des différents pics et/ou dont les valeurs de l'aire de certains desdits pics de référence, permet de différentier différents dits groupes. La présence ou absence d'un pic dudit profil de référence se caractérise par la présence d'un signal ou non à une valeur de m/z particulière donnée. Un pic peut être discriminant entre deux ou plusieurs groupes de fragments d'organe du fait de sa présence ou du fait de son absence dans le spectre analysé, du fait de la valeur de son aire, ou encore du fait de sa présence ou absence en combinaison avec la présence ou absence d'autres dits pics de référence ou de la valeur de son aire par rapport à celle d'autres dits pics de référence dudit profil différentiel. Ledit profil de référence est ici établi à partir d'une banque de spectres établis sur au moins des échantillons de nature tumorale connue et des échantillons non tumoraux et le cas échéant des échantillons de fragments tumoraux des différentes dites classes et sous classes connues, lesdits échantillons provenant du même organe et d'une pluralité d'individus. Selon la présente invention on a donc découvert qu'il était possible de déterminer desdits profils de référence consistant en tout ou partie d'un spectre spécifique d'un fragment de nature tumorale, ou inversement spécifique d'un fragment de nature non tumorale, ou encore spécifique d'une dite classe ou sous-classe de tumeur ou de cancer de dits fragments du même organe au moins, tels que définis ci-dessus fiables, à partir d'une banque de spectres établis à partir d'échantillons de nature tumorale et des échantillons non tumoraux et le cas échéant des échantillons de fragments tumoraux des différentes dites classes et sous classes, provenant du même organe et d'une pluralité d'individus, notamment au moins 40 échantillons provenant d'au moins 20 individus, à la condition que tous lesdits échantillons soient préparés conformément à l'étape 1) ci-dessus et selon le même protocole de broyage et dilution, avec ou sans élimination des débris tissulaires grossiers et solubilisation du contenu protéique. On entend donc par « échantillon préparé de manière identique », un échantillon préparé notamment dans les mêmes conditions de broyage, à la même dilution avec ou sans élimination des débris cellulaires et solubilisation du contenu protéique total. A l'étape 3.1), la nature tumorale ou respectivement non tumorale voire le type de tumeur ou de cancer connu dudit deuxième fragment peut être établie par simple examen visuel à l'oeil nu ou microscopique ou avoir été déterminée indépendamment par une autre analyse par spectrométrie de type MALDI-TOF d'extrait protéique ou autre comme celle de l'étape 3.2) ou par histologie et anatomopathologique ou autre analyse encore. A l'étape 3.1), on n'a pas recours à une comparaison avec une banque de données de spectres ou séries de pics spécifiques de référence spécifiques de type(s) donné(s) de tissu(s) tumoral(aux) ou respectivement non tumoral(aux). Dans un premier mode de réalisation : - à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par un spectre complet d'un échantillon de référence de broyat d'un dit fragment de référence de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique audit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale , ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus (correspondant à l'étape 2.1) ci-dessus), et - à l'étape 3), on détermine que ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, lorsque le spectre dudit premier échantillon est identique audit spectre complet de référence dudit échantillon de référence (correspondant à l'étape 3.1) ci-dessus). Ainsi, dans ce premier mode de réalisation, à l'étape 3), on compare ledit spectre analysé, ci-après dénommé « premier spectre », avec un spectre de référence réalisé comme ledit premier spectre à l'étape 2) sur un échantillon d'un deuxième fragment du même organe du même individu dont la nature non tumorale ou sous classe cancéreuse est connue ci-après dénommé «échantillon de référence » , ledit premier échantillon étant préparé de la même manière que ledit échantillon de référence, et on détermine la nature tumorale ou respectivement cancéreuse dudit premier fragment si ledit premier spectre est identique au dit deuxième spectre, et inversement on détermine la nature tumorale ou respectivement non cancéreuse de ladite sous classe si les deux spectres sont différents . Dans ce mode de réalisation, ledit profil de référence est donc un dit spectre complet du même individu comprenant un nombre de pics défini par l'utilisateur (ou fixé par défaut à 70), à savoir le spectre complet du deuxième échantillon ou échantillon de référence, et lesdits pics spécifiques se caractérisent par la présence de chacun des pics dudit spectre complet de référence, le nombre de pics communs étant déterminé en fonction d'un score d'identification, et enfin les intensités et valeurs normalisées d'aire étant quantifiées puis comparées avec celles du spectre complet de référence selon un algorithme décrit en détail dans le manuel d'utilisation du logiciel Biotyper® 3.0. A l'étape 3.1), de préférence, ledit type de fragment tumoral connu est connu quant au type de tissu et éventuellement en outre quant au type de tumeur. Dans un deuxième mode de réalisation : - à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par une liste de pic(s) de référence, le nombre de pic(s) de référence étant inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la liste de(s) dit(s) pic()s de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon (correspondant à l'étape 2.2) ci-dessus), et - à l'étape 3), on détermine que ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon (correspondant à l'étape 3.2) ci-dessus). Une méthode selon la présente invention sera particulièrement utile en cas d'opération chirurgicale pour aider le chirurgien à déterminer rapidement l'étendue d'une ablation d'organe solide à réaliser. Pour ce faire, la méthode 3.2) pourra être mise en oeuvre pour vérifier la nature de la tumeur de la pièce de résection, notamment sa nature de cancer primitif par comparaison avec la banque de données. La méthode 3.1) sera plus particulièrement mise en oeuvre pour définir ultérieurement la limite de l'exérèse à réaliser en faisant tester des fragments périphériques suspects du foyer tumoral plus manifeste déjà réséqué et/ou déterminé comme tumoral. A l'étape 3.2), la comparaison des spectres au regard de la présence en commun d'un nombre donné de pics en commun peut être réalisée notamment avec le logiciel de marque CLINPROTOOLS® développé par le fabricant de spectromètre de masse Bruker Daltonik® GmbH, Leipzig, Germany, de référence Microflex® LT. Dans un mode de réalisation plus particulier, on analyse un fragment de poumon humain. Dans un mode de réalisation particulier, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux, en fonction des valeurs d'aire des différents pics . Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature tumorale non cancéreuse ou un fragment d'un autre organe. Plus particulièrement, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux ,ledit profil de référence comprenant au moins les 15 pics de référence aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées 51 et S2 suivantes, 51 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments de cancers et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments non tumoraux pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation de protéines : TABLEAU A m/z S1 S2 4569,91 2,51 4,01 6436,77 2,67 1,91 10044,34 0,61 0,5 4860,63 1,44 1,32 6818,2 2,93 5,73 4750,85 1,04 1,9 3784,07 2,34 2,22 11656,49 0,58 0,51 4137,74 2,41 1,39 9243,83 0,78 0,9 8569,41 0,98 0,55 5093,37 3,21 1,73 7886,51 1,06 0,85 3632,93 2,37 2,86 12297,47 1,93 1,59 Dans un autre mode de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée (c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature tumorale non cancéreuse ou de cancer mais non primitif, ou un fragment d'un autre organe). Plus particulièrement, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 5 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées suivantes Si et S2 suivantes, 51 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments de cancers primitifs et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments non tumoraux, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation des protéines TABLEAU B m/z S1 S2 6853,33 2,58 7,72 3488,16 43,54 46 8298,71 0,35 0,81 3329,54 5,85 6,24 3711,08 4,45 4,8 Ce critère permet d'obtenir une détermination de cancer pulmonaire primitifs de classes adénocarcinome et carcinome épidermoïde, à des degrés de différentiation variables avec une spécificité de 97,8% et une sensibilité de 96% quant à la présence de cancer, pour des échantillons provenant de fragments d'individus ayant servi à déterminer ledit profil de référence. Dans une variante préférée de réalisation, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 11 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées Si et S2 suivantes, Si représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux ) et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments à cancers primitifs, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation des protéines : TABLEAU C m/z S1 S2 6853,33 2,58 7,72 3488,16 43,54 46 6281,07 2,47 3,98 4673,61 0,95 2,42 12306,81 2,07 1,33 5363,98 3,25 2,61 8298,71 0,35 0,81 3329,54 5,85 6,24 3711,08 4,45 4,8 10213,2 1,33 1,02 4124,34 2,09 1,71 Ce critère permet d'obtenir une détermination de cancer pulmonaire primitif de classes adénocracinome et carcinome épidermoïde à des degrés de différentiation variables avec une spécificité de 100% et une sensibilité de plus de 99% quant à la présence de cancer, pour des échantillons provenant de fragments d'individus ayant servi à déterminer ledit profil de référence. Dans une autre variante de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la catégorie des fragments d'organe de nature tumorale et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus de nature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée (c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature pathologique particulière tel qu'une lésion tissulaire non tumorale, ou un fragment d'un autre organe). Dans les tableaux A à C ci-dessus, les valeurs des masses moléculaires m/z peuvent varier jusqu'à ± 1 Da de la valeur moyenne mentionnée et les valeurs d'aire peuvent varier jusqu'à ±1%, voire ±5%, de la valeur moyenne d'aire normalisée mentionnée. On fait état de la valeur m/z, z représentant la charge électrique de l'espèce ionisée. Mais, en pratique, m/z peut être assimilé à la masse moléculaire m, avec z=1, car la quantité de protéines qui s'ionisent 2 fois (z=+2), voire 3 fois (z=+3), est négligeable, compte-tenu de la limite de sensibilité des techniques de mesures. Les valeurs rapportées ont été obtenus par une analyse de suspension de broyat mélangée de façon connue à une solution de matrice d'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique. Plus précisément, les suspensions aqueuses de broyat tissulaire ont été mélangées, volume à volume, avec une solution de matrice d'acide a-cyano-4- hydroxycinnamique, lors de ladite analyse par spectrométrie de masse et pas avant. Le logiciel CLINPROTOOLS est capable, le cas échéant, de définir un profil différentiel apte à différentier de 2 à 20 groupes de spectres. Selon une autre variante de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les quatre groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments d'organe de nature tumorale non cancéreuse, le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif, le groupe (3) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de métastase et le groupe (4) de la catégorie des fragments de tissus de nature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée des exemples 5 de réalisation suivants, présentés de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 représente des spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF après protocole d'extraction/séparation (profils 1 à 6 : A2 et B2) ou sur broyat brut (profils 7 à 10 : Al etB1) de poumons 10 sains (accolades Al et A2) ou infectés (accolades B1 et B2) avec des bactéries (espèce : rat) ; - la figure 2 représente des spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF à partir de broyats bruts de poumons de rat sains dilué dans de l'eau pure (spectres 1-5 du haut ) ou un milieu 15 électrolytique tamponné type PBS (spectres du cadre C) ; - la figure 3 représente des spectres obtenus à partir d'un même fragment de tissu pulmonaire infecté dilué 10 fois (D1), 20 fois (D2) et 40 fois (D3) ; - la figure 4 représente des spectres obtenus sur des échantillons 20 de broyats de poumon de rat dilués 40 fois, sains (spectres 1-3 à partir du haut), les spectres avec des échantillons de dit broyat avec une pneumonie à Acinetobacter baumannii confirmée en culture (spectres 58 à partir du haut) en comparaison avec le spectre obtenu d'après une colonie pure de la même bactérie (spectre 9 du bas) ou avec le spectre 25 obtenu après adjonction de 3 colonies de la même bactérie dans un broyat de poumon sain (spectre 4 à partir du haut). - la figure 5 est une représentation par dendrogramme des différences entre les spectres obtenus à partir d'un poumon de rat sain (groupe du bas : A) et inflammatoire suite à un stress mécanique 30 (groupe du haut : B) ; - La figure 6 représente un dendrogramme représentant les analyse des spectres obtenus avec des échantillons de poumons humains (A), de rat (B), de mouton (C), de souris D; - La figure 7 représente un dendrogramme représentant les différences de profil spectral obtenu à l'analyse en spectrométrie de masse type MALDI-TOF sur broyats dilués de fragments de poumons humains (2 fragments par patients) ; - La figure 8 représente un dendrogramme obtenu avec les spectres correspondant à des poumons sains (cadre A) et cancéreux 10 (cadre B) après élimination des mal classés et des tumeurs non cancéreuses. Exemple 1 : Protocole de préparation des fragments tissulaires de poumon 1) Prélèvement du tissu 15 Les résections pulmonaires ont été effectuées selon la technique chirurgicale standard. La pièce de résection encore appelée fragment de tissu, a été le siège de 4 biopsies au coeur de la tumeur visible et quatre autres fragments prélevés le plus à distance possible de la tumeur en territoire supposé sain. Un exemplaire de chaque territoire a été adressé 20 pour l'examen histologique extemporané, un autre exemplaire était destiné à l'examen histologique définitif, un autre était adressé pour conservation à la tumoro-thèque, le dernier était destiné aux traitements selon l'invention et études par spectrométrie de masse dans sa variante MALDI-TOF. 25 2) Préparation des échantillons en vue de l'analyse MALDI-TOF Le recueil de matériel a été effectué après broyage du parenchyme dilué dans de l'eau distillée à l'aide du broyeur du type disperseur/homogénéiseur Ultra-turrax® de référence T25 digital de vitesse variable de 3 400 à 24 000 tours par minute (ci-après "tr/min" et de puissance électrique de 500 à 300 W (high-performance disperser), selon la technique décrite dans le protocole résumé ci-dessous. Le broyat a ensuite été utilisé tel quel et déposé sur la plaque du spectromètre MALDI TOF ou à titre comparatif a subi une phase de purification selon différents modalités notamment tel que décrit ci-après en reprenant le protocole de purification/solubilisation simple déjà utilisée pour l'identification des bactéries dans des urines au sein du laboratoire de microbiologie clinique de l'hôpital de la Timone. 2.1) Traitement préalable du fragment pulmonaire (fragmentation et broyage) On a réalisé le protocole suivant comprenant les étapes suivantes de : 1- Division du fragment initial de poumon en 10 portions sensiblement égales, 2- Echantillonnage d'un fragment avec sa pesée pour un travail sur un fragment de 0.08 à 0.3 g sur cette série, 3- Nettoyage du broyeur : par mise en marche de la rotation et plongée de l'outil de dispersion dans un tube d'eau stérile le couvrant jusqu'en haut puis répétition de cette manoeuvre dans de l'alcool et répétition encore dans de l'eau distillée, 4- Pesée du fragment et mise en place dans un tube stérile sec, 5- Adjonction d'un volume d'eau distillée égal à 10 fois le poids du fragment de poumon réalisant ainsi la première dilution à 1/10ème. Maintien du tube contenant le fragment et l'eau dans de la glace pilée pour éviter tout échauffement lors du broyage, 6- Broyage par mise en marche progressive de la rotation jusqu'à 2400 tr/min pendant 1 minute correspondant au temps habituellement nécessaire pour obtenir une suspension homogène, 7- Prélèvement d'une partie de la suspension pour mise en réserve. Ajout d'un volume d'eau distillée à la suspension restante, ajusté au fur et à mesure des résultats (de 1/10è" à 1/160è") jusqu'à ce que l'on se fixe le facteur optimal qui s'est avéré être 1/160 pour obtenir une suspension aqueuse de broyat homogène trouble de concentration de 0,5 à 1 mg/ml à l'issue de l'étape de broyage, 8- Pour certains échantillons : conservation du broyat en plusieurs aliquots entreposés à -80°C, 9- Au moment de l'analyse, dépôt de suspension de de broyat , le cas échéant décongelé sur la plaque du MALDI-TOF (10 dépôts de 1 microlitre par échantillon pour la mise au point du protocole). 2.2) Méthode de séparation des débris cellulaires grossiers de taille supérieure à 100 pm et solubilisation de protéine On a réalisé le protocole suivant comprenant les étapes suivantes consistant à : 1- Centrifuger la suspension de broyat diluée dans de l'eau, obtenue à l'étape 7- de la méthode 2.1) ci-dessus, pendant 5 minutes à 20 g (soit 500 tr/min avec la centrifugeuse de la société THERMOSCIENTIFIC® de référence HERAUS PICO 17), 2- Prélever le surnageant, le centrifuger pendant 5 minutes à 16 500 g (soit 14 000 tr/min avec la centrifugeuse ci-dessus), 3- Rejeter le surnageant, ajouter 1 ml d'eau distillée et remettre le culot en suspension, 4- Agiter (Vortexer) puis centrifuger 5 min à 16 500 g, 5- Rejeter le surnageant et récupérer le culot, 6- Ajouter au culot lavé 5 pl d'acide formique 100%. Bien mélanger avec la pipette et attendre 5 min, 7- Ajouter 5 pl d'acétonitrile à 100%. Bien mélanger, 8- Centrifuger 2 minutes à 16 500 g, 9- Récupérer le surnageant et déposer le surnageant sur la plaque du spectromètre de masse MALDI-TOF (10 spots par échantillons). Exemple 2 : Réalisation des spectres par spectrométrie de type MALDI-TOF L'échantillon est co-cristallisé avec une matrice de type hcca (acide 4-hydroxy alpha-cyano cinnamique) puis les spectres seront obtenus sur l'appareil microflex LT® (Bruker Daltonics) selon la méthodologie suivante : Le protocole de dépôt comprend les étapes suivantes consistant à: 1- déposer 1 pL d'extraction pulmonaire sur une position prédéfinie (cercles appelés « spots ») de la cible MICROFLEX (plaque en acier inoxidable BRUKER DALTONICS, 2- déposer 1 pL de matrice (HCCA à saturation dans 50% d'acetonitrile 2,5% d'acide trifluoroacetique, qsp eau distillée), 3- laisser sécher pendant 5 minutes à température ambiante, 4- introduire la plaque (cible Microflex modèle de référence 224989 dénommé MSP 96) contenant les dépôts dans le spectromètre de masse Microflex LT, 5- Démarrer l'ordinateur associé au spectromètre pour lancer les analyses, et 6- Lancer l'acquisition des spectres de masse MALDI-TOF. Les paramètres appliqués au spectromètre de masse sont les suivants : - Mode linéaire positif - Electrode 151 : 20,00 kV - Electrode IS2 : 16,65 kV - Electrode de focalisation : 7,20 kV - Post-ion-extraction (PIE) : 120 ns - Fréquence du laser : 60Hz - Gain du détecteur : 8,4 X - Gamme de masse : de 2 000 à 20 000 Da Les spectres sont obtenus via une méthode automatique contrôlée par le logiciel FLEXCONTROL® du fabricant BRUKER DALTONICS® les paramètres sont les suivants pour chaque spot : - Somme de 240 tirs par série de 40 tirs - Afin que les tirs aient balayé l'ensemble de l'échantillon de façon homogène l'acquisition se fait sur 6 positions différentes selon une géométrie hexagonale. - Pré-tirs : 10 tirs à 40% de la puissance maximum laser servent à dessaler l'échantillon (contamination par les sels minéraux) - Puissance laser : 30 % à 45 % régulée via le logiciel FLEXCONTROL® - Sélection du spectre : sur une gamme de masse de 4 000 à 10 000 Da. - L'acquisition des spectres est au final réalisée via le logiciel Biotyper-RTC® du fabricant BRUKER DALTONICS® qui permet d'appliquer la méthode automatique décrite ci-dessus à une série d'échantillons en prenant en compte les critères mentionnés précédemment et un score de qualité ou score de validation qui représentent l'addition de 2 notes n1 + n2 (n1 étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond). - n1 est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec . n1 = 0 pour n 8 . n1 = 1 pour 8 D'autre part, le logiciel BIOTYPER® établit un spectre moyen à partir d'au moins 4, de préférence au moins 10, spectres réalisés sur 10 dépôts sur plaque d'un même échantillon. Ledit spectre moyen issu de plusieurs spectres est établi par le logiciel BIOTYPER® à partir des spectres individuels dans lesquels sont recherchés des pics dits « valides » selon une méthode se résumant ainsi : - l'étendue du pic sur l'axe des abscisses ne doit pas excéder 25 Da, - la variation de la ligne de base du pic doit être contenue dans l'intervalle moyen de variation des lignes de base de l'ensemble des pics du spectre, et - l'intensité du pic est considérée lorsque le rapport signal/bruit de fond est supérieur à 3. Une fois les pics d'intérêt ainsi sélectionnés, le logiciel réalise une moyenne des intensités pour chaque valeur de m/z présents dans au moins 25% des spectres individuels. Exemple 3 : analyse des spectres. Les inventeurs ont comparé entre eux deux spectres moyens entre eux ou un nouveau spectre avec les spectres moyens contenus dans la base de données de spectres d'échantillons connus décrits ci-après grâce au logiciel BIOTYPER-RTC® développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF (BRUKER DALTONICS®). Il en résulte des scores de qualité Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par BRUKER DALTONICS® qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Ainsi, un pic identique entre deux spectres ou avec un spectre de la base de données et le spectre analysé, obtient un score positif alors que l'absence d'un pic se traduit par un score négatif. L'ensemble des scores obtenus est exprimé en échelle logarithmique. Les scores obtenus pour identifier et classifier les microorganismes (Fournier PE, Couderc C, Buffet S, Flaudrops C, Raoult D. Rapid and cost-effective identification of Bartonella species using mass spectrometry. J Med Microbiol. 2009, 58:1154-1159) sont ceux que les inventeurs ont utilisés pour identifier et classifier les types de tissus solides cancéreux et non cancéreux. Ainsi, un score d'identification compris entre 0 et 1,699 permet d'exclure l'identité du spectre analysé avec celui d'un type donné présent dans la base de données ou le spectre avec lequel il est comparé. Un score d'identification compris entre 1,700 et 1,999 suggère que le spectre analysé est identique à celui présent dans la base de données et un score d'identification supérieur à 2,0 permet une identification certaine. Dans un premier temps, les spectres de deux échantillons considérés comme identiques sont alignés. On assigne une erreur acceptable pour la masse des pics de chaque spectre (±1 Da) et le logiciel repositionne les deux spectres (autrement dit, si l'écart entre les pics du même spectre et entre les pics de l'autre spectre est trop différent, le logiciel ne pourra pas aligner les spectres). Dans un second temps, la comparaison d'un spectre inconnu avec le spectre de référence (à savoir ici, le spectre moyen présent dans la base de données ou un spectre d'un autre échantillon avec lequel il est comparé) est évaluée en utilisant des scores d'identification dédiés. Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par Bruker Daltonics qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Pour cela, les informations issues de l'analyse du spectre de référence sont converties en une valeur appelée score maximum accessible ("maximum score ou Max. Sc.") calculée de la façon suivante : chaque pic présent avec une fréquence de 100% obtient 100 points; les pics présents avec une moindre fréquence obtiennent un nombre de points équivalent à leur fréquence (par exemple, un petit pic présent dans seulement 8 spectres présents dans la base de données qui en contient 20 obtient un score de 8/20=40). L'addition de tous les points donne le score maximum accessible. Ainsi, par exemple, un spectre de référence qui contient 10 pics avec 100% de fréquence, 5 pics avec une fréquence de 50% et 3 pics avec une fréquence de 10% atteint un score maximum accessible de (10x100)+(5x50)+(3x10)=1 280. Une fois établi ce score concernant les spectres de référence, chaque pic du spectre à analyser est comparé au même pic des spectres de référence. Pour cela, deux fenêtres de masses ajustables ("adjustable mass windows") sont créées. La fenêtre "inner mass window" correspond à des pics parfaitement ajustés, ce qui leur donne un score plein et la fenêtre "outer mass window" correspond à des pics non parfaitement alignés : la valeur du score attribué est proportionnelle à la distance avec le pic "correspondant" du spectre de référence (si la figure 4 était en couleur, on pourrait voir en vert les pics parfaitement ajustés entre les pics de référence et les pics de l'échantillon testé, en jaune les pics partiellement ajustés et en rouge les pics non ajustés). Il en résulte un score cumulatif pour l'échantillon à comparer au spectre de référence. La comparaison de ce score cumulé ("actual score ou Act. Sc.") avec le score maximum accessible ("Max. Sc.") conduit à un score relatif ("Rel. Sc.") ou Rel. Sc.=Act. Sc./Max. Sc. (avec un maximum de 1 pour une parfaite identité). Sont pris également en compte dans le score final ("overall score") le nombre de pics parfaitement ajustés (PN k), le nombre de pics partiellement ajustés (PN b) et le nombre total de pics (PN m) présents dans le spectre sous la forme d'un nombre de pics relatif ("Rel. P-Num.") qui est calculé de la façon suivante : Rel. P-Num. = (PN k)+(0,5xPN b)/(PN m). Enfin, un calcul de corrélation ("Effective I-correlation value" ou I-Corr.) est effectué. Le score final est calculé comme suit : Rel. Sc. x Rel. P-Num. x I-Corr. x 1000 (avec un maximum de 1000) puis exprimé en Log (l'échelle va donc de 1 = aucune homologie à 3 = identité parfaite). C'est ainsi que l'on obtient des scores à 2,0. Les figures 5 et 6 ci-après sont des représentations en dendrogramme de la proximité de différents spectres de différentes catégories d'échantillons résultant d'une analyse par classification hiérarchique, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe horizontal sont les niveaux de "distance" entre les deux catégories d'échantillons concernés. Les distances (d) entre deux catégories sont d'autant plus petites qu'ils sont proches, c'est-à-dire qu'ils ont d'autant plus de pics caractéristiques communs partagés dans leurs spectres (et vice et versa). Dans un dendrogramme, les traits verticaux indiquent que les catégories ou spectres reliés présentent un certain pourcentage de pics en commun, ce pourcentage étant d'autant plus grand que les traits horizontaux, dessous le trait vertical de liaison qui relie ces catégories ou spectres, sont petits. L'éloignement d'un trait vertical, c'est-à-dire la hauteur des traits horizontaux délimitant le trait vertical les reliant, rend compte de la "distance" entre les catégories de spectres concernés, étant inversement proportionnelle au nombre de pics en commun. La représentation en dendrogramme qui s'affranchit de la représentation en classification hiérarchique est directement issue des données de la classification hiérarchique. La méthode, classique, de détermination d'un "clustering" hiérarchique est explicitée sur le site Internet http://asi.insarouen.fr/enseignement/siteUV/dm/Cours/clustering.pdf et dans l'ouvrage de Husson F., Lê S, Pagès J. Pratique de la statistique, 2009, pages 169-202, chapitre 4 : Classification, aux éditions des Presses Universitaires de Rennes. Le "clustering" hiérarchique consiste en une classification hiérarchique ascendante pour laquelle chaque "cluster" est progressivement "absorbé" par le "cluster" le plus proche pour constituer un cluster d'ancrage destiné à être comparé avec les autres types cellulaires. Ainsi, un spectre A et un spectre D sont comparés avec le cluster d'ancrage des spectres B + C. Si on observe que le spectre A est plus "proche" de l'ensemble B + C que le spectre D, l'ensemble B + C est donc relié par une barre horizontale à une barre verticale reliant A à B+C. La distance séparant la barre verticale reliant A à l'ensemble B + C est plus importante que celle de la barre verticale reliant B et C. L'ensemble A + B + C qui en résulte est comparé à D et l'on voit que la barre horizontale qui lie D à l'ensemble A + B + C a une distance plus importante que les autres, ce qui signifie que le spectre D est le moins "proche" des spectres A, B et C. Cette représentation par fusions successives constitue un dendrogramme. Deux "clusters" réputés "proches" dans le dendrogramme montrent qu'ils partagent le maximum de pics en commun lorsqu'on les compare aux autres "clusters". Leur éloignement progressif signifie qu'ils partagent de moins en moins de pics en commun avec les autres clusters. Deux spectres B et C sont donc considérés comme les plus "proches" s'ils partagent le plus de pics en commun et si leurs barres horizontales sont les plus. Compte tenu que toutes les conditions de réalisation d'un spectre ne sont pas totalement constantes, une variation d'intensité peut être obtenue sur l'ensemble d'un spectre. L'aire sous la courbe d'un pic étant dépendante de la largeur et de la hauteur du pic, elle est dépendante de son intensité. Il est donc nécessaire de normaliser le calcul de l'aire sous la courbe d'un pic. On entend par la « valeur normalisée de l'aire desdits pics », la valeur de l'aire sous la courbe du pic telle que calculée par intégration de toutes les intensités correspondantes à la région du pic, laquelle région est située entre la courbe du pic et une ligne droite passant par le premier et le dernier point d'inflexion (ligne de base du spectre =intensité relative de pic nulle), divisée par l'intensité moyenne du pic de même m/z dans l'ensemble des spectres de la classe N considérée. La description du mode de calcul se retrouve dans le manuel d'utilisation du logicile ClinProtool® 2.1 .Cette valeur normalisée y est appelée AveN dans le rapport de statistiques du logiciel ClinProtools® (Ave pour « average peak area/peak intensity ») qui est produit en fin d'analyse sous la forme d'un fichier compatible Excel : « ClinProstatistic.xml ». Exemple 4 : Essais réalisés 1) Dans une première série d'expérimentations de test de détection d'infections bactériennes pulmonaires chez le rat, il avait été tenté de mettre au point un protocole permettant d'appliquer au tissu pulmonaire, la détection bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF déjà utilisée dans le laboratoire sur le sang et les urines. Les inventeurs se sont heurtés à un défaut de détection de spectres possiblement dû à une saturation du signal liée à la richesse cellulaire. A ce stade, il s'agissait d'échantillons brut de tissus broyés et dilués au 1/40ème. L'application des protocoles de séparation des débris cellulaires de taille supérieure à 100 pm, selon la méthode décrite au paragraphe 2.2) ci-dessus, n'a pas permis d'améliorer la performance. Il a alors été testé plusieurs types de broyage tissulaire, avec plusieurs solvants (eau pure, chlorure de sodium, tampon type PBS), selon plusieurs protocoles de séparation rapide (augmentation des temps de centrifugation, protocole habituellement utilisé pour le sang, protocole habituellement utilisé pour les urines), sans succès. Finalement, contre toute attente, c'est en travaillant accidentellement sur un échantillon brut broyé et dilué dans l'eau 160 fois, mais sans séparation des débris tissulaires grossiers, que des spectres reproductibles et de qualité correcte ont pu être obtenus (figure 1) Sur la figure 1, les 4 profils du bas Al et B1 correspondant à des échantillons de broyat de tissus brut dilués dans l'eau distillée de poumons sains (A1) ou infectés (B1) avec des bactéries (espèce : rat), et les 6 profils du haut A2 et B2 correspondent à différents protocoles d'extraction/sépration de broyats de poumons sains (A1) ou infectés (B1) avec des bactéries (espèce : rat) Sur le poumon sain (B1 et Al) les deux méthodes permettent d'obtenir des pics. La reproductibilité des spectres sur poumon sain a pu être vérifiée pour chaque méthode par le logiciel Biotyper. En B2, la quasi absence de pics conduit à exclure ce spectre de toute possibilité d'analyse et le logiciel Biotyper ne peut identifier la bactérie dont la présence est connue du fait du dessin de l'expérience alors qu'en Bl, le même échantillon, traité sans méthode de séparation des débris tissulaires grossiers, permet d'obtenir des pics et donc d'interroger la base de donnée sur les bactéries. 2) Dans une 2ème série d'expériences les inventeurs ont testé différents milieux de dilution. Les meilleurs signaux ont été obtenus avec un broyat dans l'eau pure (figure 2). Il est possible que l'ajout de solvants au produit testé forme des adduits c'est-à-dire des ajouts d'ions sodium et potassium sur les protéines supposées être détectées ce qui tendrait à diminuer la sensibilité de la détection de la protéine. Sur la figure 2, les spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF à partir de broyats bruts d'un seul et meme broyat de poumon d'un seul rat sain, dilué dans de l'eau pure, sont les spectres 15 du haut et le dernier spectre en bas) et ceux avec un milieu électrolytique tamponné type PBS sont les spectres du cadre C. On voit clairement à l'oeil nu que le nombre de pics et donc la richesse de l'information sont plus importants avec l'eau pure et que chaque spectre est un calque de chacun des autres (1-4 et dernier spectres). En plus de représenter moins de pics, les spectres générés avec un broyat dans le PBS (cadre C) ne se ressemblent pas. Par exemple, on ne trouve aucun pic significatif sur le premier spectre du cadre. Ces similitudes ou différences entre les spectres visibles à l'oeil sont confirmées par le logiciel Biotyper et ont été constatées sur plusieurs séries de contrôles. 3) Des dilutions supplémentaires dans de l'eau distillée ont montré l'amélioration de l'information (figure 3) La figure 3 représente des spectres obtenus à partir d'un même fragment de 200 mg de tissu pulmonaire infecté dilué 10 fois (concentrations de 20 mg/ml, D1), 20 fois (concentrations de 10 mg/ml, D2) et 40 fois (concentrations de 5 mg/ml, D3). On voit clairement par l'observation des spectres, que le nombre, l'intensité et la gamme de masse où apparaissent des pics augmentent avec le facteur de dilution. 4) Dans une 3ème série d'expériences, les inventeurs ont tenté d'identifier les bactéries qu'elles soient déjà présentes dans le poumon du rat (pneumonies) ou qu'elles soient ajoutées à du poumon de rat sain a posteriori, soit au moment du broyage. On a échoué dans la détection de bactéries au sein d'un poumon de rat infecté au préalable (figure 4). Sur la figure 4, les spectres obtenus sur broyat de poumon sain de rat (de dilution 1/160 et sans élimination des débris ni solubilisation protéique) sont les spectres 1-3 à partir du haut, les spectres avec d'échantillons de dit broyat avec une pneumonie à Acinetobacter Baumannii confirmée en culture (spectres 4-8) (dilution 1/160 et sans élimination des débris tissulaires grossiers ni solubilisation protéique) en comparaison avec le spectre obtenu d'après une colonie pure de la même bactérie (spectre 9 du bas). On note une intensité importante des pics, leur nombre important, la séparation nette et leur faible empiètement, surtout dans la zone des m/z Cette capacité de différentiation des spectres réalisés sur des broyats de poumon de rat, entre ceux provenant d'organe sain et ceux d'organe pathologique a été confirmée sur un modèle de poumon inflammatoire de rat non infecté mais exposé à une agression mécanique par la ventilation artificielle, comme illustré par le dendrogramme de la figure 5. La figure 5 est une représentation par dendrogramme des différences entre les spectres obtenus à partir d'un poumon de rat sain (groupe du bas : A) et inflammatoire suite à un stress mécanique (groupe du haut : B). Il a également été testé si le signal était différent selon que l'on travaillait sur un poumon entier ou un fragment. Pour cela, on a comparé les spectres obtenus en analysant le poumon droit et gauche, un poumon entier ou un fragment d'une même espèce. Sur poumon sain la taille de l'échantillon et sa localisation n'a pas modifié le résultat (non illustré ici). 5) Dans une 4è" série d'expérimentations, il a aussi été observé que la signature spectrale obtenue en spectrométrie de masse type MALDI-TOF sur un broyat de poumon dilué était spécifique d'espèce pour le rat, la souris et le mouton qui étaient les 3 espèces testées avec des pics discriminants dans la zone spectrale correspondant aux masses situées entre 7 000 et 8 500 D. p A ce stade, on a noté une différence sur des échantillons humains issus d'un même patient. La recherche a posteriori de renseignements cliniques et des résultats histologiques a révélé qu'il s'agissait d'un fragment pulmonaire porteur d'une tumeur cancéreuse. L'idée est alors apparue que l'analyse rapide par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF non précédé d'une désalinisation ni d'extraction et purification des protéines pouvait permettre de détecter la présence de cellules cancéreuse dans un fragment de poumon et différencier ainsi un fragment sain d'un fragment tumoral. La figure 6 représente un dendrogramme représentant les analyse des spectres obtenus avec des échantillons de poumons humains (A), de rat B, de mouton C, de souris D. 5) Dans une 5ème série d'expérimentations, on a analysé 32 paires de broyats d'échantillons de poumon dilués à environ 0,625 mg/ml dans l'eau distillée issus de fragments de poumons humains prélevés au cours d'une chirurgie thoracique pour tumeur cancéreuses du poumon. Les fragments étaient codés sans révéler lesquels (au nombre de 32) étaient prélevés au sein de la tumeur ni ceux (32) en zones saines. Les résultats bruts ont permis d'observer une séparation des profils spectraux en deux principaux groupes alors que 2 échantillons se rangeaient ailleurs. Plus précisément, un numéro de 1 à 32 était attribué à chaque fragment suivi du numéro 1 ou 2 selon qu'il était à priori prélevé en zone non tumorale (1) ou tumorale (2). Ainsi, une liste de 64 échantillons a été constituée comme suit : 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1,32....32-1, 32-2. L'ensemble a été conservé congelé tel quel à - 80°c. Un petit fragment (poids compris entre 0,010 et 0,3 grammes) de chaque échantillon a été initialement dilué dans une quantité d'eau égale à 10 fois son poids (dilution1/10), à partir de quoi des dilutions par moitié ont été effectuées (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160). Certaines analyses ont été faites avec un broyat dilué à 1/80 ou à 1/160 sans élimination des débris tissulaires grossiers ni solubilisation des protéines. D'autres analyses ont été faites en appliquant la technique de séparation/solubilisation rapide au broyat dilué à 1/160. Les indications de numéro de patient (1 à 32), d'origine présumée du fragment (N pour zone saine/ non tumorale, C pour zone tumorale), de dilution (1/80, 1/160) et de technique (sans séparation, avec séparation selon la méthode standardisées pour les urines), ont été reportées manuellement sur les labels des spectres au moment de la création des images spectrales. Le fragment supposé tumoral a été labellisé C, le fragment supposé non-tumoral a été labélisé N. Deux fragments supplémentaires ont été ajoutés à la liste des 32 paires, labélisés 1SM et 2 SM ou 33 et 34 et correspondant à des fragments de zone saines (non tumorales) de poumons de sujets aux poumons sains. Lorsque l'on a réalisé plusieurs essais avec une même technique, le numéro de l'essai a été indiqué entre parenthèse à partir du 2ème essai. Ainsi par exemple, les spectres générés lors du 2ème essai à partir du fragment supposé non tumoral du patient 5, réalisés à la dilution 1/160 avec séparation simple selon la méthode utilisée en microbiologie pour les urines est repéré selon l'appellation suivante : HL_5 N_1160 _U(2). Lorsqu'on compare l'ensemble des spectres issus de ces 64 + 2 = 66 échantillons préparés et analysés selon la même méthode, on observe une séparation des profils spectraux en deux principaux 20 groupes. Le décodage a posteriori a révélé que les spectres correspondant aux fragments « cancéreux » (indexés C sur la figure 7) étaient regroupés sur le dendrogramme, de même ceux correspondant aux fragments non cancéreux (indexés N) sur la figure 7. Surtout, ces deux 25 groupes étaient séparés par une distance témoignant d'une différence significative (figure 7). Sur la figure 7, le cadre A représente les spectres du Groupe avec prédominance de poumons non cancéreux. La figure 7 représente un dendrogramme représentant les différences de profil spectral obtenu à l'analyse en spectrométrie de 30 masse type MALDI-TOF sur broyat de poumons humains (2 fragments par patients). La levée de l'inconnue diagnostique a été réalisée a posteriori révélant un fragment cancéreux et un fragment sain pour la plupart des sujets et l'absence de cancer pour 3 sujets (diagnostic définitif = 1pseudo-tumeur inflammatoire et 2 pneumopathies infectieuses). Sur la figure 7, on remarque que les 5 spectres de fragments de numéros 9C, 24C, 10C, 5C, 3C sont groupés au sein d'une majorité de N. Egalement, les numéros 12N et 9 N se trouvent au sein d'une majorité de C. L'origine de cette mauvaise répartition peut être due à une erreur de l'étiquetage du fragment au moment de son conditionnement, à une erreur sur le diagnostic à priori (le chirurgien a cru a tort que le fragment était sain par ex) ou à une absence de signature spectrale caractéristique de chaque classe. Toutefois, sur la base d'une majorité de regroupement des fragments tumoraux et non tumoraux entre eux, nous avons supposé que certains éléments du spectre pourraient probablement être dégagés comme signant une appartenance à chaque groupe. Les défauts d'étiquetages ne pourront pas être corrigés. En revanche, il existe un diagnostic définitif de la nature de la tumeur qui a été révélé a posteriori tableau 1. Celui-ci a permis de dire que les fragments 24C et 3C étaient des tumeurs cancéreuses différentes des autre tumeurs car étant une métastase d'un cancer de langue et une métastase d'un cancer colique, pouvant expliquer leur répartition à distance du groupe des autres tumeurs de type cancer primitif sur le dendrogramme. Aucune explication par le diagnostic définitif n'a été possible pour les autres mal regroupés. Tableau 1: liste des sujets à partir desquels les échantillons tumoraux et non tumoraux ont été prélevés. Le diagnostic du fragment tumoral porté d'après l'analyse histologique définitive est porté en colonne 2. L'origine cancéreuse pulmonaire primitive, métastatique ou non cancéreuse de la tumeur est indiquée en colonne 3 et résulte des données cliniques et histologiques définitives. patient type cellulaire cancéreux origine tumorale 1 carcinome épidermoïde Cancer Primitif pulmonaire 2 adénocarcinome Métastase cancer colique 3 adénocarcinome Métastase cancer colique 4 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 6 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 7 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 8 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 9 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 11 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 12 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire 13 0 actinomycose 14 carcinome épidermoïde Métastase cancer oesophagien carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire 16 léiomyosarcome Métastase léiomyosarcome 17 adénocarcinome Primitif pulmonaire 18 adénocarcinome Primitif pulmonaire 19 0 inflammatoire adénocarcinome Primitif pulmonaire 21 adénocarcinome Métastase cancer colique 22 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire 23 adénocarcinome Primitif pulmonaire 24 carcinome épidermoïde Métastase cancer de langue adénocarcinome Primitif pulmonaire 26 0 inflammatoire 27 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire 28 adénocarcinome Primitif pulmonaire 29 adénocarcinome Primitif pulmonaire carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire 31 Carcinome indifférencié Primitif pulmonaire 32 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire En retirant de l'analyse les échantillons mal classés et les tumeurs non cancéreuses, le modèle a révélé une séparation nette en deux groupes .Sur la figure 8, le dendrogramme obtenu montre les spectres correspondant poumons sains dans le cadre A et les spectres d'échantillons cancéreux après élimination des mal classés et des tumeurs non cancéreuses dans le cadre B. Sur le constat d'une majorité de regroupement des spectres issus des fragments pulmonaires tumoraux ensembles et non tumoraux ailleurs, il peut être escompté qu'il soit possible de diagnostiquer la nature tumorale d'une lésion d'un organe à partir du spectre obtenu à partir d'un fragment infime non soumis à une extraction protéique ou a un conditionnement complexe et sans imagerie. Pour vérifier cette hypothèse, il a été tenté de construire un modèle statistique performant permettant de faire le diagnostic de tumeur ainsi que du type de tumeur, sous réserve d'avoir établi au préalable une base de donnée représentative des spectres de chaque type de tissu sain ou tumoral pour au moins 3 grandes classes de lots de tumeurs : cancéreuse primitive, cancéreuse métastatique, tumeur non cancéreuse. Dans l'hypothèse où cela est vérifié pour le poumon, on peut en déduire que cela se vérifiera pour les autres tissus solides et pour davantage de sous-classes selon une précision diagnostique de plus en plus fine. L'application en serait la possibilité d'un diagnostic précis avec une sensibilité et une spécificité compatible avec une application clinique en tant qu'outil diagnostique ultra-rapide pour aide à la décision thérapeutique lors des exérèses chirurgicales. Dans tous les cas on a observé que les deux spectres N et C pour chaque patient étaient distincts. Ces résultats nous ont fait rechercher un système performant permettant de classer un fragment tissulaire en tant que tissu cancéreux ou non cancéreux avec une sensibilité et une spécificité compatible avec une application clinique en tant qu'outil diagnostique ultra-rapide pour aide à la décision lors des exérèses chirurgicales. 6) Méthode d'identification par homologie : utilisation du logiciel BioTyper® version 3.0 Le profil spectral est parfaitement superposable pour des analyses différentes réalisées à partir d'un même échantillon préparé dans les mêmes conditions. Ceci a permis de réaliser une banque de données selon le logiciel BIOTYPER® développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF : BRUKER DALTONICS®. Globalement, les spectres issus des analyses successives effectuées à partir des 32 paires d'échantillons cancer/non-cancer appariés à partir d'un même patient (n = 32 patients) ont été examinés. Une partie d'un sous-ensemble de spectres correspondant au diagnostic « non-cancéreux » a été archivée. De même pour créer la base de données « cancéreux ». La partie des spectres n'ayant pas servi à créer la base de données a été réservée pour les tests de confrontation future (interrogation de la base de donnée). Plus précisément, on a constitué 2 bibliothèques de spectres ou banques de données, l'une tumeur l'autre non-tumeur. Le principe est d'introduire dans ces bases des spectres « valides » d'une série d'échantillons ayant un point commun. De nouveaux spectres pourront être ultérieurement confrontés à chaque base. Dans le cas présent, les nouveaux spectres seront ceux qui ont été générés à partir des mêmes échantillons que ceux de la base, mais qui n'auront pas servis à créer la base (spectres en réserve). Les exigences qualitatives des spectres et le besoin d'en avoir suffisamment pour la base et pour le test expliquent que l'on n'ait pu travailler que sur les spectres de 23 des 32 échantillons tumoraux et de 30 des 34 (32+ 2 issus de malades à poumons sains) échantillons non tumoraux, ce qui correspond à environ 200 spectres dans chaque base de données (200 pour la base poumon tumoral et 200 pour la base poumon non tumoral). En regardant a posteriori leur label, il s'est avéré qu'il pouvait s'agir de spectres d'échantillons traités avec toute technique (séparation ou pas) et pour 2 dilutions (1/80 et 1/160). Pour créer les deux banques, chaque donnée introduite est un spectre moyen (SM) de 70 pics (paramétrage par défaut), généré par le logiciel. Ainsi, à partir des 53 (23+30) échantillons, 53 spectres moyens de référence (SM) ont été créés. On a ici arbitrairement décidé de créer chaque spectre moyen à partir d'au moins 4 spectres choisis au sein de l'ensemble des spectres obtenus au cours des différentes expériences pour un même échantillon. Le résultat de la confrontation informatique à ces banques de données, des spectres mis en réserve, a été rendu sous la forme d'un diagnostic tumeur/ non tumeur dont la pertinence est appréciée par un test statistique exprimé par un score de 0 à 3. Cette valeur statistique est définie par le fabricant via un algorithme spécifique à Brucker Daltonics®. Pour une valeur comprise entre 0 et 1,699, le spectre, donc l'échantillon dont il est issu, est exclu de toute similitude avec ceux de la base de données et rendu comme étant « inclassable ». Un score compris entre 1,700 et 1,999 suggère une similitude de degré moyen, un score supérieur à 2,0 permet une classification certaine comme appartenant au groupe trouvé dans la base de données. Sur ces critères, les spectres testés en aveugle ont été classées correctement pour 13/23 échantillons tumoraux et 18/30 échantillons non tumoraux. Les échantillons incorrectement classés sont repérés par un astérisque sur le tableau 2 ci-après. Une majorité d'erreurs de classement a pu être rapportée à l'introduction de spectres issus de la dilution 1/80 dans la base de données. De façon intéressante, on observe que pour 4 des 10 erreurs de classement des échantillons tumeur, une origine particulière, métastase ou actinomycose était présente. Tableau 2 : résultats obtenus avec une classification par homologie en utilisant le logiciel Biotyper® selon le paramétrage par défaut (70 pics) et des bases de données tumeur et non-tumeur incluant des spectres issus de préparations différentes ANALYSE DES ECHANTILLONS NON-TUMORAUX code patient Nombre de nombre de nombres de inclassables de spectres spectres rendus spectres rendus l'échantillon confrontés NON-CANCER CANCER 1_SM* 10 8 2 1N 12 10 2 2_SM* 14 6 8 2N 3 3 0 3N 4 4 0 5N 4 4 0 9N* 4 0 4 10N* 4 1 3 11N* 4 1 3 12N 4 4 0 13N 4 4 0 14N 4 4 0 15N 4 4 0 16N 5 5 0 17N 4 4 0 18N 4 4 0 19N* 7 4 2 1 20N 4 4 0 21N* 4 3 1 22N* 8 4 1 3 23N 4 4 0 24N* 7 5 2 25N 4 4 0 26N* 8 4 4 27N 4 4 0 28N 4 4 0 29N* 8 7 1 30N 4 4 0 31N* 7 6 1 32N 8 8 0 55 TABLEAU D'ANALYSE DES ECHANTILLONS TUMORAUX (Tumeur/NON tumeur) code Nombre de nombre de nombres de spectres rendus TUMEUR inclassables Diagnostic histo-clinique de d'échantillon spectres spectres rendus référence confrontés NON-TUMEUR 1C 4 0 4 primitif 10C 4 0 4 primitif 11C 4 0 4 primitif 12C 4 0 4 primitif 13C* 4 2 2 actinomycose * 16C 4 0 4 métastase 18C 4 0 4 primitif 20C* 4 1 3 primitif 24C* 4 4 0 métastase * 25C 4 0 4 primitif 27C 4 0 4 primitif 3C* 4 4 0 métastase * 5C* 4 2 2 primitif 9C* 4 3 1 primitif 14C 4 0 4 métastase 15C 4 0 4 primitif 17C* 4 1 3 primitif 2C 4 0 4 métastase 21C 4 0 4 métastase 23C* 4 1 3 primitif 24C* 3 3 0 métastase * 29C 4 0 4 primitif 31C* 3 1 2 primitif 32C 9 0 9 primitif En ne tenant en compte que d'une seule technique de préparation et une seule dilution et avec le paramétrage à 200 pics, il n'a pas été possible d'améliorer la classification par le modèle Biotyper®. Une autre approche méthodologique a alors été décidée tel que rapporté ci-après. 7) Méthode d'identification par recherche des différences. L'existence de tumeurs d'origine et de type cellulaire différentes au sein du panel testé a laissé supposer que la diversité des types tumoraux était à l'origine d'une inefficacité du système d'analyse (nombreux sous types de cancers). Il a alors été décidé de simplifier l'approche en réduisant le panel aux seules paires de tissus cancéreux/non-cancéreux correspondant à un cancer primitif pulmonaire (à l'exclusion des paires comportant des métastases et les tumeurs non cancéreuses). Une approche méthodologique complètement différente de la précédente a ainsi été mise en place, basée sur la recherche de différences entre les spectres. Pour mettre en place un tel test de discrimination selon les deux critères primitif cancéreux/non cancéreux, le logiciel CLINPROTOOLS® RTC développé par la société BRUKER DALTONICS® permet d'identifier un groupe de pics sélectionnés à partir de plusieurs, ici de préférence 2, groupes d'échantillons, au sein d'un profil spectral. Ce groupe de pics est appelé ci-après « profil différentiel ». Pour définir le « profil différentiel », le logiciel met en oeuvre un algorithme génétique selon une méthode validée (J.H. Holland, adaptation in natural and artificial systems, University of Michigan Press, Ann. Arbor. 1975). Par une méthode analytique complexe, cet algorithme va sélectionner un profil différentiel en comparant entre elles des listes de masses (m/z) générées de façon aléatoires à partir des spectres des deux catégories ou classes. Les critères supplémentaires de sélection des pics (autres que ceux établis pour définir la validité d'un pic, tels que décrits ci-dessus) pour créer la liste, peuvent être, pour certains, modifiés par l'opérateur et apparaissent sous la forme d'un rapport édité avec la liste en fin de génération de la liste. Les listes des masses correspondent à un ensemble de pics et sont enregistrées par leur valeur numérique de masse (m/z). Le logiciel interroge ensuite chaque spectre d'origine et établit le pourcentage de détection du profil différentiel. Après une première interrogation, la composition de la liste est modifiée de façon aléatoire par le logiciel et la nouvelle liste est testée à nouveau. Ainsi de suite jusqu'à obtenir le profil différentiel le plus performant possible. Plusieurs profils différentiels ont été générés grâce à ce logiciel. Le choix du nombre de pics donné en consigne au logiciel a été choisi par l'opérateur. Nous avons évalué pas à pas l'efficacité du modèle en testant n=3, puis n'=n+1 jusqu'à n'=20 vis-à-vis de 4 classes de tumeurs : métastases, tumeur non cancéreuse, cancer primitif et tissus sain en introduisant uniquement les spectres générés à partir d'échantillons traités selon la même méthode (dilution au 1/160e, élimination des débris tissulaires grossiers par centrifugation et solubilisation de protéines). Le premier est basé sur une recherche à partir de 5 pics, le second sur une recherche à partir de 11 pics. Le premier profil différentiel comprend les 5 pics spécifiques N° 6, 17, 30, 87 et 103 aux valeurs de m/z respectives suivantes : Tableau B Moyenne de l'aire du pic Moyenne de Déviation Déviation S1 dans la l'aire du pic standard standard M/z Test KW ou classe S2 dans la de S1 dans la classe de S2 dans la classe classe Wilkoxon NON CANCER NON CANCER TUMEUR PRIMITIF TUMEUR PRIMITIF 6853,33 0,5) entre les 2 classes. Cependant, lorsqu'on les retire du modèle, la performance diagnostique s'effondre : leur maintien est nécessaire à la bonne classification. Ce modèle à 15 pics pour les classes tout-cancer et tissu sain à permis de classer correctement les tumeurs dans 100% des cas et le tissu sain dans 100% des cas également. Tableau A : liste des 15 pics différentiels permettant de classer un fragment pulmonaire dans la classe tumeur cancéreuse toute origine confondue (primitifs et métastase) ou dans la classe tissu non tumoral/sain Mass Test KW ou Wilkoxon Moyenne S1 1 du l'aire Moyenne Déviation standard de 51 dans la classe NON TUMEUR Déviation pic c ladanssse la de l'aire S2 du pic dans la classe CANCER standard NON de S2 TUMEUR dans la classe CANCER 4569,91 L'analyse rapide par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, non précédée d'une technique d'extraction ni de purification permet, pour une pathologie donnée, de déterminer si un fragment tissulaire est porteur de la pathologie ou non.5 Références bibliographiques [1] James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. Q Rev Biophys 1997 Nov;30(4):279-331. [2] Jeon YM, Son BS, Lee MY. Proteomic identification of the differentially expressed proteins in human lung epithelial cells by airborne particulate matter. J Appl Toxicol 2011 Jan;31(1):45-52. [3] Poon TC, Johnson PJ. Proteome analysis and its impact on the discovery of serological tumor markers. Clin Chim Acta 2001 Nov;313(1-2):231-9. [4] Ardekani AM, Liotta LA, Petricoin EF, III. Clinical potential of proteomics in the diagnosis of ovarian cancer. Expert Rev Mol Diagn 2002 Jul;2(4):312-20. [5] Ward DG, Suggett N, Cheng Y, Wei W, Johnson H, Billingham LJ, et al. Identification of serum biomarkers for colon cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006 Jun 19;94(12):1898-905. [6] Yang SY, Xiao XY, Zhang WG, Zhang LJ, Zhang W, Zhou B, et al. Application of serum SELDI proteomic patterns in diagnosis of lung cancer. BMC Cancer 2005;5:83. [7] Oshita F, Morita A, Ito H, Kameda Y, Tsuchiya E, Asai S, et al. Proteomic screening of completely resected tumors in relation to survival in patients with stage I non-small cell lung cancer. Oncol Rep 2010 Sep;24(3):637-45. [8] Meding S, Nitsche U, Balluff B, Elsner M, Rauser S, Schone C, et al. Tumor Classification of Six Common Cancer Types Based on Proteomic Profiling by MALDI Imaging. J Proteome Res 2012 Mar 2;11(3):1996-2003. [9] Bittar F, Ouchenane Z, Smati F, Raoult D, Rolain JM. MALDI-TOFMS for rapid detection of staphylococcal Panton-Valentine leukocidin. Int J Antimicrob Agents 2009 Nov;34(5):467-70. [10] Ouedraogo R, Flaudrops C, Ben AA, Capo C, Raoult D, Mege JL. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PLoS One 2010;5(10):e13691. [11] Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier PE, Rolain JM, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 2009 Aug 15;49(4):543-51. REVENDICATIONS1. Méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur et/ou du type de cancer d'un fragment d'organe solide humain ou animal d'un individu donné, par analyse de spectre(s) de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ledit type de tumeur appartenant à au moins l'une des classes et sous-classes de tumeurs suivantes : a) la classe des tumeurs cancéreuses, b) la sous classe des tumeurs cancéreuses de type cancer primitif, c) la sous-classe des fragments cancéreux de type métastase, d) la classe des tumeurs non cancéreuses, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : 1) on prépare un premier échantillon d'une suspension homogène 15 de broyat de dit fragment d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et/ou pluritissulaire de différents types de cellules entières non lysées, dilué de préférence dans de l'eau distillé, et 2) on réalise au moins un spectre d'au moins un dit premier échantillon et on analyse ledit spectre par comparaison avec au moins 20 un profil de référence, ledit profil de référence étant constitué par au moins une liste de pic(s) de référence de spectre(s) établi(s) sur respectivement au moins un échantillon de référence de broyat de respectivement au moins un fragment de référence brut de même tissu d'au moins un individu, le(s) dit échantillon(s) de référence étant 25 préparé(s) de manière identique audit premier échantillon, le(s) dit(s) fragment(s) de référence étant connu(s) pour être de nature tumorale ou non tumorale , ou, en cas de nature tumorale, étant connu(s) pourappartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et 3) on détermine si ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape 1), on réalise une dilution dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension aqueuse d'une concentration de 0,05 à 5 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite suspension de dit broyat est débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm, de préférence supérieure à 50 pm, de préférence par centrifugation et récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite suspension de broyat comprend un solvant de solubilisation de protéines, de préférence de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que : - à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par un spectre complet d'un échantillon de référence de broyat d'un dit fragment de référence brut de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique au dit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale,étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et - à l'étape 3), on détermine que ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, lorsque le spectre dudit premier échantillon est identique audit spectre complet de référence dudit échantillon de référence . 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que : - à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par une liste de pic(s) de référence, le nombre de pic(s) de référence étant inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la liste de(s) dit(s) pic()s de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon, et - à l'étape 3), on détermine que ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupescomprenant le groupe (1) de la classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux, en fonction des valeurs d'aire des différents pics . 8. Méthode selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux ,ledit profil de référence comprenant au moins les 15 pics de référence aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées S1 et S2 suivantes , S1 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments de cancers et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments non tumoraux pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation de protéines : Tableau A : m/z S1 S2 4569,91 2,51 4,01 6436,77 2,67 1,91 10044,34 0,61 0,5 4860,63 1,44 1,32 6818,2 2,93 5,73 4750,85 1,04 1,9 3784,07 2,34 2,22 11656,49 0,58 0,51 4137,74 2,41 1,39 9243,83 0,78 0,9 8569,41 0,98 0,55 5093,37 3,21 1,73 7886,51 1,06 0,85 3632,93 2,37 2,86 12297,47 1,93 1,59 9. Méthode selon l'une des revendications 6 à 7, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 5 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées 51 et S2 suivantes, 51 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments de cancers primitifs et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments non tumoraux, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation de protéines: TABLEAU B m/z S1 S2 6853,33 2,58 7,72 3488,16 43,54 46 8298,71 0,35 0,81 3329,54 5,85 6,24 3711,08 4,45 4,8 11. Méthode selon la revendications 9, caractérisée en ce que 25 ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de poumon àtumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (2) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 11 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées S1 et S2 suivantes, S1 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux ) et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments à cancers primitifs, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 pm et comprenant un solvant de solubilisation de protéines: Tableau C m/z S1 S2 6853,33 2,58 7,72 3488,16 43,54 46 6281,07 2,47 3,98 4673,61 0,95 2,42 12306,81 2,07 1,33 5363,98 3,25 2,61 8298,71 0,35 0,81 3329,54 5,85 6,24 3711,08 4,45 4,8 10213,2 1,33 1,02 4124,34 2,09 1,71 12. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les quatre groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments d'organes de nature tumorale non cancéreuse, le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif le groupe, (3) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de métastase et le groupe (4) de la catégorie des fragments d'organes denature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit organe est un ganglion. 14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit organe est une bronche. 15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, 12, 13 et 14 caractérisée en ce que ledit profil différentiel est apte à différentier les sous classes additionnelles choisies parmi: - les sous-classes des cancers primitifs dudit organe de respectivement différents types cellulaire de cancer, - les sous-classes de métastases provenant respectivement de différents organes voisins, - les sous-classes de tumeurs non cancéreuses suivantes : tumeur inflammatoire infectieuse, tumeur inflammatoire non infectieuse, tumeur non inflammatoire infectieuse et tumeur non inflammatoire non infectieuse telle qu'un nodule.