FR 2988721 A1 20131004 FR 1252703 A 20120327 784-texte dépôt 2988721 1 NANOPARTICULES DE SILICIUM POREUX FONCTIONNALISEES ET LEURS UTILISATIONS EN THERAPIE PHOTODYNAMIQUE La présente invention concerne des nanovecteurs permettant simultanément de réaliser le ciblage, l'imagerie et le traitement par thérapie photodynamique de cellules cancéreuses. En particulier elle concerne de nouvelles nanoparticules biodégradables à base de silicium contenant une variété de molécules photosensibilisantes, qui ont la capacité de cibler les cellules pathologiques et d'induire la mort cellulaire sous l'action d'une excitation dans le proche infra-rouge (> 600 nm) en mono et biphotonique. L'invention concerne également un procédé de traitement de certaines pathologies, et notamment des cancers, comprenant l'administration de nanoparticules biodégradables à base de silicium contenant au moins une molécule photosensibilisante et au moins une molécule de ciblage, cette administration étant suivie d'un traitement par une irradiation dans l'infra-rouge. La thérapie photodynamique se fonde sur l'utilisation de certaines molécules thérapeutiques appelées photosensibilisateurs qui, lorsqu'elles sont activées à l'aide d'une source lumineuse de longueur d'onde appropriée, dans le domaine du visible ou du proche infra-rouge, transmettent leur énergie en excès à l'oxygène moléculaire les environnant. Ces photosensibilisateurs sont habituellement associés à des molécules de ciblage de telles sorte qu'elles vont préférentiellement se localiser dans les tissus malins. L'agent thérapeutique photosensensibilisant, lorsqu'il est activé par la lumière, convertit l'oxygène moléculaire à l'état fondamental triplet (302) en oxygène singulet (102) hautement cytotoxique, et en autres espèces oxydantes réactives (02.-, OH-). Ces espèces oxygénées réactives, et plus particulièrement l'oxygène singulet, sont toxiques pour les cellules qui les entourent et entraînent la destruction des tissus cancéreux dans leur proche environnement : elles oxydent les membranes cellulaires et entraînent ainsi des lésions irréversibles des cellules contenant le photosensibilisateur. C'est un traitement prometteur utilisé en clinique depuis une dizaine d'années. Les avantages de la thérapie photodynamique sont la possibilité de répéter les traitements sans toxicité cumulée (comparée à la radiothérapie), son faible coût, sa simplicité de mise en oeuvre, et son applicabilité à un grand nombre de maladies (cardiovasculaires, dermatologiques et ophtalmiques). Puisque le traitement nécessite de la lumière pour être effectif, il est localisé et présente peu de toxicité systémique. Pour les tumeurs malignes, la thérapie photodynamique peut être plus efficace et moins pénible que d'autres thérapies. La thérapie photodynamique se fonde sur une double sélectivité : en premier lieu l'irradiation sélective des tissus concernés et en second lieu la sélectivité relative du 33784-texte dépôt 2988721 2 photosensibilisateur pour les tissus cibles. En l'absence d'irradiation, les photosensibilisateurs étant peu toxiques pour les cellules, leur diffusion dans l'organisme n'entraîne que peu d'inconvénients. Un photosensibilisateur, pour pouvoir être employé in vivo doit posséder 5 plusieurs qualités, et notamment, il doit pouvoir être facilement vectorisé vers les tissus cancéreux, il doit être hydrosoluble, facile à produire, non toxique en l'absence d'irradiation, stable vis-à-vis des enzymes circulantes, présentant un bon tropisme pour les cellules tumorales et il doit être éliminé rapidement des tissus sains. Une autre contrainte de ces formulations est de pouvoir conserver l'efficacité des 10 photosensibilisateurs, c'est-à-dire leur capacité à transformer l'oxygène moléculaire qui les entoure en espèces oxygénées réactives. En effet, certaines formulations interagissent avec les états excités du photosensibilisateur et réduisent son efficacité. Etat de la technique antérieure Les traitements actuels de maladies et cancers par thérapie utilisant la génération 15 d'espèces oxydantes (ROS et oxygène singulet), tels que la thérapie photodynamique procèdent par photoexcitation de molécules organiques photosensibilisantes de type porphyrines. L'utilisation des ces molécules organiques photosensibilisantes est toutefois soumise aux limites suivantes: les molécules organiques photosensibilisantes sont hydrophobes et nécessitent un système de délivrance pour une application 20 clinique, notamment des formulations particulières, en particulier sous forme de suspensions colloïdales, de liposomes, de nanoparticules. Ces molécules ne ciblent pas efficacement les cellules tumorales, elles présentent un temps de résidence important dans les tissus "normaux" et peuvent être activées par la lumière visible, ce qui engendre des effets secondaires de destruction des cellules saines des tissus 25 superficiels (peau, oeil) par exposition à la lumière ambiante et une photo-sensibilité prolongée des patients. Le système photosensilisateur idéal doit présenter 1/ un rendement quantique en oxygène singulet et ROS élevé, 2/ une conversion optique importante aux grandes longueurs d'onde (700-1200 nm), 3/ une toxicité minimale dans l'obscurité et une 30 toxicité à la lumière visible et UV minimale dans le temps, 4/ une localisation préférentielle dans les cellules malades. Une approche prometteuse développée par bon nombre de chercheurs pour surmonter les difficultés énumérées ci-dessus consiste à incorporer les molécules photosensibilisantes (porphyrines et autres) dans des nanoparticules de céramique, de 35 silices, d'oxydes ou de polymères. Les nanoparticules de ces matériaux utilisées comme système hôte permettent en particulier d'améliorer la biodisponibilité des 33784-texte dépôt 2988721 3 molécules photosensibilisantes hydrophobes, et le ciblage par des ligands spécifiques dont les récepteurs sont sur-exprimés dans les cellules malades. Plusieurs documents décrivent des nanostructures de silice mésoporeuses pour des applications thérapeutiques et de ciblage. Notamment, WO 2011073054 et FR 5 2935974 décrivent des nanoparticules de silice poreuses obtenues par voie sol-gel pour des applications thérapeutiques et en thérapie photodynamique, mais n'ayant pas les propriétés physiques des nanoparticules de silicium poreux de l'invention. Les porphyrines utilisées dans FR 2935974 sont similaires aux porphyrines utilisées dans la présente invention, mais dans le dispositif FR 2935974 les nanostructures 10 auxquelles ces porphyrines sont incorporées ne peuvent pas être excitées dans le proche infra-rouge (en mono et bi-photonique). Plusieurs documents décrivent des micro et nanostructures à base de silicium poreux pour des applications thérapeutiques et de ciblage. Notamment WO 2010096733, WO 2009009563 et WO 2006050221 décrivent des micro et 15 nanostructures de silicium poreux pour des applications thérapeutiques, vectorisation de molécules et imagerie, mais ne décrivent pas de transfert d'énergie du silicium poreux à des molécules photosensibilisantes, ni d'application en thérapie photodynamique. Ji-Ho Park et al., Nature Materials, 8, April 2009, 331-336 décrit l'utilisation de nanoparticules de silicium poreux pour la visualisation par 20 luminescence de tissus tumoraux. Les nanoparticules de silicium poreux luminescent peuvent être excitées dans l'infra-rouge et notamment par excitation biphotonique. Un photosensibilisant à base de Qdot CdSe et de porphyrine a été décrit dans J. Mater. Chem., 2011, 21, 2455-2458. Ce matériau peut être utilisé en irradiation biphotonique pour des applications en photothérapie dynamique. Toutefois, 25 l'utilisation de cadmium pose des problèmes de toxicité. La communication Euromat, 2011, Montpellier, France, E. Secret et al., « Porous silicon nanoparticles functionalized for photodynamic therapy » décrit le greffage du mannose sur les nanoparticules de silicium poreux, et le greffage d'une porphyrine sur les nanoparticules de silicium poreux hydrosilylé fonctionnalisé par l'acide 30 undécènoïque. Toutefois, la méthode de greffage employée n'est pas satisfaisante dans la mesure où il a été constaté que le greffage de la porphyrine n'était pas suffisamment stable et ne permettait pas l'acheminement satisfaisant du photosensibilisateur jusqu'aux cellules cibles. En outre, il n'est ni mentionné ni suggéré dans ce document de transfert d'énergie du silicium poreux à des molécules photosensibilisantes et/ou la 35 possibilité d'une excitation biphotonique. C'est donc avec étonnement que les inventeurs ont découvert que des nanoparticules de silicium poreux comportant au moins une molécule 33784-texte dépôt 2988721 4 photosensibilisante greffée de façon covalente, telle qu'une porphyrine par exemple, étaient susceptibles d'être excitées dans le proche infra-rouge, en mode mono et biphotonique, et pouvaient donc être utilisées dans des traitements de thérapie photodynamique. En particulier, les inventeurs suggèrent que dans de telles 5 nanoparticules, lorsqu'elles sont soumises à une excitation dans le proche infra-rouge, un transfert d'énergie est opéré du silicium poreux vers les molécules photosensibilisantes. En outre, ces nanoparticules peuvent également être greffées par des molécules de ciblage qui permettent une spécificité d'action à l'encontre des cellules cancéreuses. 10 Résumé de l'invention Un premier objet de l'invention consiste en des nanoparticules répondant à la formule (I) : R' 15 20 R' (I) 25 dans laquelle : 0 représente une nanoparticule de silicium poreux, x représente un entier choisi parmi : 0 et 1, M représente un atome de métal choisi parmi les métaux de transition, 30 X représente un groupement choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, R représente un groupement choisi parmi : une urée (-NH-CO-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), W représente un groupement alcane di-yle en C1-C12, 35 R' représente un groupement choisi parmi : 33784-texte dépôt 2988721 5 A R1 Z+ représente un cation organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable, 5 Y- représente un groupement qui peut être choisi parmi : -000-, -S03- A- représente un anion qui peut être choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, R1 représente un alkyle en Cl à C10. Selon un mode de réalisation préféré les nanoparticules répondent à la formule 10 (Ia) : 15 Cbg R' (Ia) 20 Dans laquelle Cbg représente une molécule de ciblage spécifique des tissus néoplasiques. Selon un mode de réalisation préféré les nanoparticules ont une taille allant de 20 à 200 nm, avantageusement de 50 à 190 nm, encore mieux, de 100 à 175 nm, et de préférence de 140 à 160 nm et la taille des pores va de 5 à 50 nm, avantageusement de 25 10 à 30 nm. Selon un mode de réalisation préféré dans les formules (I) et (Ia) x représente 0. Selon un mode de réalisation préféré dans les formules (I) et (Ia) l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes sont vérifiées : X représente un groupement choisi parmi : CL, Br, f, acétate, propionate, 30 butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, W représente un groupement -(CH2)3-. R1 représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C1-C3, Z+ représente un cation qui peut être choisi parmi : K+, Li+, Na+, NH4+, 35 A représente un anion qui peut être choisi parmi : CL, Br-, I-, acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, 33784-texte dépôt 2988721 6 R' est choisi parmi : -\ + S03- NH4+ //N-CH3 5 Cbg, lorsqu'il est présent, est choisi parmi les sucres et les dérivés de sucres. Les nanoparticules préférées sont choisies parmi : CH N-+ I H H 10 15 20 S03- NH4+ 25 H H 11 N 0 L'invention concerne encore un procédé de fabrication de nanoparticules comprenant les étapes de : 30 (i) fourniture de nanoparticules de silicium poreux, (ii) fonctionnalisation des nanoparticules de silicium poreux par des groupements comportant au moins une fonction NH2 ou au moins une fonction isocyanate ou isothiocyanate, (iii) fourniture et greffage d'une molécule photosensibilisante, porteuse d'un 35 groupement complémentaire de celui porté par la nanoparticule, de façon à former une liaison urée ou thiourée, et éventuellement (iv) greffage par au moins une molécule de ciblage. 33784-texte dépôt 2988721 7 Selon une variante préférée, le procédé comporte les étapes de : (i) a- gravure électrochimique de plaquettes de silicium monocristallin dans une solution éthanolique d'acide fluorhydrique (HF), b- élimination du film poreux et traitement par ultrasons, 5 (ii) a- oxydation ménagée suivie d'une silanisation de façon à produire des groupements Si-OH et des espèces SiO2 à la surface des nanoparticules de silicium poreux, et/ou b- hydrosilylation, (iii) greffage des nanoparticules par une molécule photosensibilisante de type 10 porphyrine répondant à la formule (II) dans laquelle Q représente un groupement choisi parmi : -N=C=O, -N=C=S, R' 15 20 (II) (iv) greffage des nanoparticules par un sucre ou un dérivé de sucre à l'aide d'un groupement phénylsquarate. 25 L'invention concerne encore des nanoparticules décrites ci-dessus, pour leur utilisation pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires, les maladies de la peau. Elle concerne également une composition de médicament comprenant des 30 nanoparticules telles que décrites ci-dessus dans un support pharmaceutiquement acceptable. Elle concerne également une composition cosmétique comprenant des nanoparticules telles que décrites ci-dessus dans un support pharmaceutiquement acceptable. 35 Elle concerne encore un kit pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : 33784-texte dépôt 2988721 8 - des nanoparticules de silicium poreux greffées par l'intermédiaire d'une liaison covalente par au moins une molécule photosensibilisante, ou une composition de médicament les comprenant et 5 - des moyens permettant une irradiation biphotonique dans l'infra-rouge. En particulier l'invention concerne un kit pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : 10 - des nanoparticules telles que définies ci-dessus, ou une composition telle que définie ci-dessus, et - des moyens permettant une irradiation dans l'infra-rouge. L'invention concerne des dispositifs et agents thérapeutiques pour le traitement 15 non invasif d'un grand nombre de maladies et de cancers. L'invention concerne en particulier des nanostructures ou nanoparticules de silicium poreux biodégradables et non toxiques portant des molécules organiques photosensibilisantes. Les nanostructures de silicium poreux permettent aux molécules photosensensibilisantes de produire des espèces oxydantes, dont l'oxygène singulet, 20 fortement cytotoxiques, lorsqu'elles sont irradiées par de la lumière proche infra-rouge (en mode mono et/ou biphotonique) pour le traitement non invasif de maladies diverses incluant le cancer. La présence des nanostructures hôtes de silicium poreux, permet aux molécules photosensibilisantes de générer des espèces oxydantes par photo-excitation dans le proche infra-rouge. Lorsqu'elles sont isolées ou encapsulées 25 dans d'autres types de matériaux hôtes, tels que les matériaux auxquels elles sont associées dans l'art antérieur, ces molécules photosensibilisantes sont pas excitables dans le proche infra-rouge à des puissances acceptables pour un organisme vivant. On peut les exciter en biphotonique mais à des puissances très élevées ce qui produit des photo-dommages au niveau des tissus. L'utilisation de la lumière proche infra-rouge a 30 l'avantage de permettre une pénétration dans les tissus vivants plus importante que d'autres longueurs d'ondes de lumière, pour un traitement thérapeutique non invasif. Les nanostructures de silicium poreux de taille et de texture contrôlées sont préparées par voie électrochimique, sonication et filtration. Les molécules photosensibilisantes sont liées aux nanostructures hôtes de manière covalente par des chimies de greffage 35 nouvelles sur ce type de matériau hôte. Des agents de ciblage des cellules malades peuvent être également greffés ou pas sur les nanostructures de silicium poreux par des méthodes originales. Ces nanostructures multifonctionnelles sont internalisées par les 33784-texte dépôt 2988721 9 cellules cancéreuses in vitro. Les espèces oxydantes et l'oxygène singulet générés par excitation dans le proche infra-rouge (750 nm, biphotonique) détruisent de manière irréversible les cellules malades. L'invention permet l'utilisation de la lumière proche infra-rouge (> 600 nm) pour 5 l'excitation de nanoparticules de silicium poreux contenant des molécules photosensibilisantes génératrices d'espèces oxydantes (dont l'oxygène singulet) dans le but d'induire la mort cellulaire. Grâce à ses propriétés de confinement quantique, le silicium poreux peut subir des réactions de transfert d'énergie. Ces processus de transfert d'énergie peuvent être très efficaces en raison du temps de vie élevé 10 (microsecondes) des excitons et de sa surface spécifique importante. Le silicium poreux peut aussi générer lui-même des espèces oxydantes (ROS et oxygène singulet). L'intérêt d'une excitation dans le proche infra-rouge est la pénétration plus importante des tissus par la lumière, ce qui permet le traitement de diverses maladies et du cancer dans des tissus plus profonds, avec la possibilité d'une thérapie non 15 invasive. L'excitation dans le proche infra-rouge permet aussi de limiter les effets secondaires dus à la lumière dans les tissus traités par thérapie photodynamique. L'invention permet l'encapsulation et la vectorisation de la molécule photosensibilisante. Les molécules photosensibilisantes sont liées de manière covalente aux nanoparticules de silicium poreux. Cette liaison a été rendue possible 20 par la mise au point d'une méthode de greffage covalent appropriée. Les nanoparticules de silicium poreux sont également modifiées par des molécules de ciblage qui leur permettent de reconnaitre sélectivement des cellules cibles in-vivo. Le greffage covalent des molécules photosensibilisantes par des chimies originales décrites dans l'invention permet le contrôle de la vectorisation de ces 25 molécules photosensibilisantes jusqu'aux cellules cibles grâce au ciblage par des ligands spécifiques dont les récepteurs sont sur-exprimés dans les cellules malades et il permet également d'améliorer la biodisponibilité des molécules hydrophobes par leur encapsulation Les nanoparticules de silicium poreux offrent une grande surface spécifique avec 30 la capacité de lier et d'être chargées avec plusieurs molécules ou complexes, identiques ou différents qui sont délivrés dans les tissus in vivo. En outre, leurs propriétés luminescentes permettent un suivi de leur présence dans l'organisme et une utilisation dans le diagnostic. Lorsqu'elles sont présentes en quantité compatible avec des applications 35 thérapeutiques, les nanoparticules de silicium poreux peuvent circuler dans le sang plusieurs jours sans évidence de toxicité. Les particules de silicium poreux non 33784-texte dépôt 2988721 10 fonctionalisées seules n'induisent pas de réponse toxique rédhibitoire pour envisager leur utilisation en clinique. Les nanoparticules de silicium poreux sont biocompatibles et biodégradables et se dégradent en composés éliminés par clairance rénale avec une absence de toxicité. 5 Le silicium poreux est une alternative très attractive aux autres semi-conducteurs nanostructurés de types Qdots, à base de métaux lourds, ayant des propriétés de confinement quantique intéressantes, mais qui sont très toxiques. Le silicium à l'état de trace est un élément nécessaire à la croissance des os et au collagène. Les produits ultimes de dégradation du silicium poreux sont des oxo anions d'acide orthosilicique, 10 Si(OH)4. Ils constituent les formes biodisponibles du silicium. L'acide orthosilicique est naturellement présent dans de nombreux tissus et un excès d'acide silicique sera éliminé efficacement du corps par les reins. Le silicium poreux possède des propriétés très avantageuses pour des applications in vivo: sa faible toxicité, sa surface spécifique, ses pores et son volume de pores de taille modulable, sa compatibilité avec 15 la croissance de cellules. Les nanoparticules de silicium poreux répondent au cahier des charges du système photosensilisateur idéal (encapsulation, vectorisation, excitation dans le proche infra-rouge, sensibilité limitée à la lumière). L'invention permet la biodégradation et l'élimination avec une cinétique contrôlée des particules hôtes vecteurs du silicium poreux. 20 Les synthèses nécessaires à la fabrication de l'invention sont courtes dans le temps et faciles à mettre en oeuvre. Description détaillée - Les nanoparticules : 25 L'invention concerne des nanoparticules répondant à la formule (I) ci-dessous R' 30 35 (I) dans laquelle : 33784-texte dépôt o représente une nanoparticule de silicium poreux, x représente un entier choisi parmi : 0 et 1, M représente un atome de métal choisi parmi les métaux de transition, X représente un groupement choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, R représente un groupement choisi parmi : une urée (-NH-CO-NH-), une thiourée (-NH-CS-NH-), W représente un groupement alcane di-yle en C1-C12, R' représente un groupement choisi parmi : A R1 Z+ représente un cation organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable, Y- représente un groupement qui peut être choisi parmi : -000-, -S03-A- représente un anion qui peut être choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, R1 représente un alkyle en Cl à C10. Sur la formule (I), seul le greffage par une porphyrine est représenté, toutefois la définition de cette formule inclut la possibilité d'un greffage par d'autres groupements tels que des molécules de ciblage par exemple. Par nanoparticules de silicium poreux on entend des structures poreuses de taille allant de 1 nm à 900 nm, à base de silicium. Les nanoparticules de silicium poreux sont connues ainsi que des procédés permettant leur fabrication. Les documents suivants décrivent des nanoparticules de silicium poreux utilisables dans la présente invention ainsi qu'un procédé pour leur préparation : WO 2010096733, WO 2009009563 et WO 2006050221, Ji-Ho Park et al., Nature Materials, 8, April 2009, 331-336. De façon préférentielle, la taille des nanoparticules de silicium poreux est de 20 à 200 nm, avantageusement de 50 à 190 nm, encore mieux, de 100 à 175 nm, et de préférence de 140 à 160 nm. La taille des nanoparticules est mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (TEM). La taille des pores est préférentiellement d'une valeur allant de 5 nm à 50 nm, avantageusement de 10 nm à 30 nm. La taille des pores peut être mesurée par microscopie électronique à balayage (MEB) et analyse d'adsorption/désorption d'azote. 33784-texte dépôt 2988721 12 Un groupement alkyle en C1-C10 est une chaîne hydrogénocarbonée, linéaire, ramifiée ou cyclique comportant de 1 à 10 atomes de carbone. Lorsque x représente 0, le composé de formule (I) est un dérivé de porphyrine et les groupements (M-X) sont remplacés par deux atomes d'hydrogène. 5 Lorsque x représente 1, le composé de formule (I) est un dérivé de métalloporphyrine. Selon une variante de l'invention représentée par la formule (Ia), la nanoparticule de formule (I) comporte en outre au moins une molécule de ciblage Cbg. 10 Cbg 15 (Ia) Cbg est préférentiellement choisie parmi les molécules de ciblage spécifiques 20 des tissus néoplasiques, c'est-à-dire des biomolécules dont les récepteurs sont surexprimés par les cellules cancéreuses, ou à la surface des cellules cancéreuses. D'une façon générale, les molécules de ciblage Cbg peuvent être choisies parmi : l'acide folique, les peptides, les hydrates de carbone, les anticorps. Pour simplifier la représentation, seulement une porphyrine et une molécule de 25 ciblage sont représentées sur les formules (I) et (Ia). Toutefois, l'invention définie par les formule (I) et (Ia) inclut le greffage de plusieurs porphyrines, identiques ou différentes, et de plusieurs molécules de ciblage, identiques ou différentes, sur une nanoparticule de silicium. Dans les formules (I) et (Ia), les variables définies ci-dessus sont 30 avantageusement choisies, de façon indépendante, suivant les règles suivantes : Selon une première variante préférée x représente 0. Lorsque x représente 1, de préférence, M représente un atome de métal choisi parmi : Zn, Pt, Pd, Mn, Gd, Ni, Cr, Ru. De préférence M est choisi parmi Pd et Zn. De préférence, X représente un groupement choisi parmi : CL, Br-, I-, acétate, 35 propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, et encore plus préférentiellement : CL, Br, I-, acétate, tosylate. 33784-texte dépôt 2988721 13 De préférence W représente un groupement -(CH2)3-. Avantageusement R1 représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C 1- C3, comme par exemple un méthyle, un éthyle, un n-propyle, un isopropyle, et encore plus avantageusement un méthyle. 5 De préférence, Z+ représente un cation qui peut être choisi parmi : K+, Li+, Na+, NH4 +. De préférence A- représente un anion qui peut être choisi parmi : CL, Br-, I-, acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, et encore plus 10 préférentiellement. CL, Br, F-, acétate, tosylate. De préférence R' est choisi parmi : - +I //N -CH3 SO3- NH4+ 15 Parmi les molécules de ciblage Cbg qui peuvent être greffées sur les nanoparticules de l'invention on peut mentionner : - des sucres et des dérivés de sucre comme le mannose, qui peut être greffé sur des nanoparticules de silicium poreux à l'aide d'un linker polyéthylèneimine ou polyéthylène glycol PEG. Une autre voie de greffage consiste à utiliser un dérivé 20 phénylsquarate de sucre, tel que le phénylsquarate-[alpha]-mannose comme illustré sur la figure 10 et dans la partie expérimentale. - des peptides tels que des peptides CREKA iRGD ou des peptides à cible hormonale (LH-RH). - des glycodendrimères portant plusieurs dérivés monosaccharides ou 25 disaccharides tels que le mannose, le mannose-6-phosphate, le glucose, le galactose,... Les nanoparticules de formule (I) préférées appartiennent à la liste suivante : CH, N\ I 30 // H3C-N H +\- H il FIN" 35 CH, 33784-texte dépôt 2988721 S0,- NH4+ 14 5 10 NH4+ S0,- N H HN H il 0 S0,- NH4+ 15 - La fabrication des nanoparticules de l'invention : Les nanoparticules de l'invention peuvent notamment être fabriquées par un procédé illustré sur les figures 1 et 20. Dans une première étape on prépare des nanoparticules de silicium poreux, suivant des méthodes connues de l'homme du métier. 20 Ces nanoparticules sont ensuite fonctionnalisées pour porter à leur surface au moins un groupement NH2 ou au moins un groupement isocyanate ou isothiocyanate. Les nanoparticules sont ensuite greffées par au moins une molécule photosensibilisante, notamment une porphyrine, en utilisant une molécule porteuse d'un groupement complémentaire de celui porté par la nanoparticule, de façon à 25 former une liaison urée ou thiourée. Contrairement à d'autres liaisons covalentes dont la synthèse a été testée sur ce type de structure, les liaisons urée et thiourée se forment dans des conditions de synthèse simples et préférentiellement à d'autres types de liaison entre la nanoparticule et la molécule photosensibilisante, telles que la physisorption par exemple. 30 Les nanoparticules sont ensuite avantageusement greffées par au moins une molécule de ciblage. ^ Préparation des nanoparticules de silicium poreux : Cette étape fait appel à des méthodes bien connues de l'homme du métier. De telles méthodes ont notamment été décrites dans WO 2010096733, WO 2009009563 35 et WO 2006050221, Ji-Ho Park et al., Nature Materials, 8, April 2009, 331-336. Les nanoparticules de l'invention sont à base de silicium 33784-texte dépôt 2988721 15 Le silicium est l'élément chimique de symbole Si et de numéro atomique 14. Le silicium se trouve occasionnellement en tant qu'élément pur libre dans la nature, mais il est plus largement présent sous diverses formes de dioxyde de silicium (silice) ou de silicates. Le silicium est utilisé dans l'industrie électronique sous forme de silicium de 5 haute pureté pour la formation de plaques. Le silicium pur est utilisé pour produire des plaques de silicium ultra-pur utilisées dans l'industrie des semi-conducteurs, dans l'électronique et dans des applications photovoltaïques. Le silicium ultra-pur peut être dopé avec d'autres éléments pour ajuster sa réponse électrique en contrôlant le nombre et la charge (positive ou négative) des porteurs de courant. En photonique, le silicium 10 peut être utilisé comme un support pour laser Raman à onde continue pour produire une lumière cohérente. De préférence, le silicium utilisé dans la mise en oeuvre de l'invention est dopé. Avantageusement, le silicium utilisé dans la mise en oeuvre de l'invention comporte un dopage positif au bore. Par exemple un dopage au bore d'environ 1 atome sur 1000 peut être employé. 15 L'oxyde de silicium consiste généralement en un atome de silicium lié à une seule espèce réactive de l'oxygène (par exemple, un radical). Ces composés d'oxyde de silicium sont utiles pour l'addition de carbone ou d'autres éléments chimiques dans lequel une liaison est formée entre l'oxygène et l'élément réactif ou une chaîne latérale chimique. 20 Le dioxyde de silicium se réfère au composé SiO2 (également appelé silice). Le dioxyde de silicium est formé lorsque le silicium est exposé à l'oxygène (ou de l'air). Une couche mince (environ 1 nm ou 10 A) d'oxyde natif est formée sur la surface lorsque le silicium est exposé à l'air dans les conditions ambiantes. Des températures plus élevées et des environnements alternatifs sont utilisés pour produire des couches 25 de dioxyde de silicium sur du silicium. Le dioxyde de silicium est inerte et inoffensif. Les nanoparticules de silicium poreux utilisées dans la présente invention sont avantageusement préparées par gravure électrochimique de plaques de silicium monocristallin dans une solution éthanolique d'acide fluorhydrique (HF) suivie du détachement du film poreux et le traitement par ultrasons selon une procédure illustrée 30 sur la figure 1 et connue de l'homme du métier (Sailor, M. J. et al., Adv. Funct. Mater. 2009, 19 (20), 3195-3208 ; Bley, R. A. et al., Chem. Mat. 1996, 8 (8), 1881-1888). La taille d'une nanoparticule joue un rôle crucial dans sa biocompatibilité. Par exemple, les particules dans la gamme 20-200 nm ont tendance à présenter les plus longues durées de circulation dans le sang (Park, J.-H. et al., Nature Mater. 2009, 8, 35 331-336 ; Ruoslahti, E. et al., J. Cell Biol. 2010, 188 (6), 759-768 ; Lundqvist, M. et al., Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proceedings of the National Academy of Sciences 33784-texte dépôt 2988721 16 2008, 105 (38), 14265 ; De Jong, W. H. et al., Biomaterials 2008, 29 (12), 1912-1919 ; Akerman, M. E. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99 (20), 12617-21 ; Decuzzi, P. et al., J. Control. Release 2010, 141 (3), 320-327 ; Park, J.-H.et al. Small 2009, 5 (6), 694-700). Les nanoparticules présentent une cinétique d'internalisation cellulaire 5 dépendant de leur taille, (Win, K. Y. et al., Biomaterials 2005, 26 (15), 2713-2722) et une cytotoxicité dépendante de leur taille a été observée pour les concentrations de formulations de nanoparticules de masse équivalente (Choi, J. et al., J. App. Tox. 2009, 29 (1), 52-60)). En outre, le taux de dégradation d'une nanoparticule dépend souvent du diamètre des particules, ce qui affecte à son tour le profil de libération de 10 médicament d'une nanoparticule thérapeutique. Le Si poreux est un produit résultant du traitement électrochimique de simples plaquettes de Si cristallins dans une solution d'électrolyte d'acide fluorhydrique. La morphologie des pores et la taille des pores peuvent être modifiées en contrôlant la densité de courant, le type et la concentration de dopant, l'orientation cristalline de la 15 plaquette de Si, et la concentration d'électrolyte. Le type de dopant dans la plaquette de silicium d'origine est important car elle détermine la disponibilité de la bande de valence des trous. En général les caractéristiques du dopant peuvent être séparées en quatre groupes basés sur le type et la concentration du dopant: de type n, de type p, fortement dopée 20 de type n, et fortement dopée de type p. Par fortement dopée, on entend les niveaux de dopant auxquels le comportement de conductivité du matériau est plus métallique que semiconducteur. L'application d'un courant anodique oxyde un atome de silicium de surface, qui est ensuite attaqué par le fluor. La formation de pores se produit lorsque des atomes de Si sont retirés sous la forme de SiF4, qui réagit avec deux équivalents de 25 F- en solution pour former SiF62-. La porosité d'une couche de Si poreux est proportionnelle à la densité de courant appliquée, et elle est comprise typiquement entre 40 et 80%. Les pores se forment à l'interface Si/Si poreux, et une fois formées, la morphologie des pores ne change pas de manière significative pendant le reste du processus de gravure. Cependant, la porosité d'une couche en croissance peut être 30 modifiée en changeant le courant appliqué. Le film va continuer à croître avec cette porosité nouvelle. Cette propriété permet la construction de nanostructures en couches simplement en modulant le courant appliqué au cours d'une gravure électrochimique. La capacité de contrôler facilement la taille des pores et des volumes poreux en 35 ajustant les paramètres de courant lors de la gravure est une propriété unique de Si poreux qui est très utile pour les applications dans l'administration de médicaments. ^ Fonctionnalisation de la surface des nanoparticules : 33784-texte dépôt 2988721 17 La chimie de surface joue un rôle important dans le greffage des nanoparticules et le contrôle des propriétés de dégradation de Si poreux in vivo. Après un traitement de gravure électrochimique, la surface des nanoparticules de Si est recouverte d'espèces réactives de type hydrure. Ces fonctionnalités chimiques fournissent un point 5 de départ pour diverses réactions qui déterminent les taux de dissolution en milieu aqueux, permettent la fixation des molécules photosensibilisantes, des molécules de ciblage, et contrôlent les taux de libération de médicaments. Les deux réactions de modification les plus importantes sont l'oxydation chimique et le greffage d'espèces Si-C. 10 Modification de la surface des nanoparticules de silicium poreux : Les nanoparticules de silicium poreux sont tout d'abord chimiquement modifiées à l'aide de ligands fonctionnels. Des molécules synthétiques de type porphyrines hydrophiles sont greffées de façon covalente aux nanoparticules de silicium poreux fonctionnalisées par ces ligands 15 à l'aide de réactions chimiques originales. De façon avantageuse, des agents de ciblage sont également fixés aux nanoparticules de silicium poreux. La modification chimique des nanoparticules de silicium poreux par des ligands fonctionnels: Les nanoparticules fraîchement gravées de silicium poreux contiennent des 20 liaisons Si-H sur leur surface et sont très hydrophobes. Deux modifications de surface principales ont été étudiées. L'oxydation ménagée (oxydation thermique, oxydation par l'ozone, le sulfoxyde de diméthyle, ou le borate aqueux) suivie d'une silanisation : Des groupements Si-OH et des espèces SiO2 sont produites à la surface 25 des nanoparticules de silicium poreux. Ces groupements permettent de rendre les surfaces hydrophiles et biocompatibles. Comme illustré sur la figure 6A, une particule de silicium poreux traitée par oxydation présente une couche de SiO2 en surface qui permet, par traitement par un agent silanisant tel que de l'aminopropyl triéthoxysilane, de greffer un 30 groupement aminopropylsilanyl par une liaison covalente à la surface de la nanoparticule. Plus généralement, ce type de réaction permet la fixation de groupements aminoalkylsilanyl en surface des nanoparticules de silicium poreux avec un groupement W de taille variable. Hydrosilylation: 35 Des groupes fonctionnels sont fixés à la surface de nanoparticules de silicium poreux à terminaisons Si-H par l'intermédiaire de liaisons Si-C selon la procédure enseignée dans la publication Buriak, J. M., Chem. 33784-texte dépôt 2988721 18 Rev. 2002, 102 (5), 1272-1308. L'hydrosilylation est connue pour améliorer la stabilité chimique des structures de type silicium poreux dans des milieux aqueux. Des groupements fonctionnels isocyanate ou amino sont attachés par hydrosilylation avec de l'allylamine, ou des 5 dérivés allylisocyanate comme illustré sur la figure 6B. De façon analogue on peut à l'aide d'un l'alcénylamine, ou d'un alcénylisocyanate fonctionnaliser des nanoparticules de silicium poreux avec un groupement W de taille variable. On obtient ainsi un silicium poreux fonctionnalisé 10 Q'- W a la même définition que dans la formule (I) et Q' représente un groupement choisi parmi : -N=C=O, -N=C=S. ^ Greffage des nanoparticules par une molécule photosensibilisante de type 15 porphyrine. On utilise des porphyrines fonctionnalisées par un groupement amino, isocyanate ou isothiocyanate répondant à la formule (II) ci-dessous, dans laquelle les paramètres x, M, X, R', R",Z+ A-, R1 ont la même définition que dans la formule (I), Q représente un groupement choisi parmi : -NH2, -N=C=0, -N=C=S. 20 De telles molécules sont notamment décrites avec leur procédé de préparation dans J.M.Sutton et al., Bioconjugate chem. 2002, 13, 249-263 ; Yihui Chen et al., Bioconjugate chem. 2008, 19, 5-9. R' 25 30 (II) 35 La synthèse de porphyrines porteuses de groupements pyridine est décrite notamment dans EP-345171 et dans W02010/029232. 33784-texte dépôt 2988721 19 Lorsque la nanoparticule est greffée par des groupements amino, on utilise une porphyrine greffée par des isocyanates ou isothiocyanates. Lorsque la nanoparticule est greffée par des groupements isocyanates ou isothiocyanates, on utilise une porphyrine greffée par des amines. Le greffage des nanoparticules par la porphyrine se 5 fait par formation d'un groupement urée ou thiourée. ^ Greffage des nanoparticules par une molécule de ciblage. Les molécules de ciblage sont fixées suivant une procédure illustrée sur la figure 9 déjà décrite pour les nanoparticules de silice mésoporeuses (Brevet, D. et al., Chem. Commun. 2009, 12, 1475-1477; Agemy, L., et al., Blood 2010, 116, 2847-2856). 10 De préférence les nanoparticules de l'invention sont greffées sur leur surface par des molécules de ciblage spécifiques des tissus néoplasiques, c'est-à-dire des biomolécules dont les récepteurs sont surexprimés par les cellules cancéreuses, ou à la surface des cellules cancéreuses. Ces molécules de ciblage facilitent le transfert des nanoparticules vers leur cible biologique. D'une façon générale, ces molécules de 15 ciblage peuvent être choisies parmi : l'acide folique, les peptides, les hydrates de carbone, les anticorps. Elles peuvent être greffées sur les nanoparticules de l'invention par l'intermédiaire d'un linker polymérique. Si les formulations présentent des propriétés de circulation réduites, des chaînes PEG peuvent être utilisées pour relier les nanoparticules à la fraction glucidique par 20 couplage à l'aide de fonctionnalités squarate et amide. Le chitosan ou l'albumine sérique peuvent être utilisés pour modifier la chimie de surface des nanoparticules pour améliorer leur biocompatibilité. Le poids moléculaire et la longueur de chaîne de ces espèces peuvent être modulées pour optimiser la biocompatibilité, la pénétration cellulaire, et pour contrôler la cinétique de dégradation des nanostructures de silicium 25 poreux. Les peptides et/ou les agents de ciblage de cellules cancéreuses, peuvent être greffés sur la surface des nanoparticules de silicium poreux suivant des procédés similaires. Des peptides de ciblage peuvent être conjugués à des nanoparticules modifiées à base de silicium poreux par l'intermédiaire du groupe sulfhydryle cystéine 30 en utilisant une allyle groupe de liaison PEG-MAL, qui peut être ajouté à la surface déjà modifiée de la nanoparticule poreuse de Si au moyen d'une d'hydrosilylation. Selon une variante de l'invention, les molécules de ciblage et la porphyrine sont greffées au cours d'une seule étape. - Les utilisations des nanoparticules de l'invention : 35 Les nanoparticules de l'invention peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques et/ou diagnostiques. 33784-texte dépôt 2988721 20 La production d'oxygène singulet et donc la destruction des cellules cancéreuses est induite par excitation photonique : Après irradiation des nanoparticules par une source lumineuse émettant dans l'infrarouge, l'oxygène singulet formé permet de détruire les cellules tumorales. L'irradiation est faite à une longueur d'onde comprise 5 entre 650 nm et 900 nm. L'irradiation est faite préférentiellement par trois à douze scans de ls chacun à une puissance de 20 à 140 mW, avantageusement de 50 à 100mW, et encore mieux aux environs de 80 mW et pour une surface scannée de 1,5x1,5 mm2 soit une fluence de 10,6 J cm-2 à 42,4 J cm-2 Notamment l'irradiation biphotonique de silicium poreux luminescent dans 10 l'infra-rouge suivie du transfert d'énergie du silicium poreux aux molécules photosensibilisantes permet un traitement des cellules cibles efficace et présentant moins d'effets secondaires que les traitements de l'art antérieur, les nanoparticules de l'invention étant inactives en présence de rayonnement visible ou UV. Une irradiation en lumière bleue ou rouge n'a pas conduit à une mort cellulaire significative. 15 En outre, en raison des propriétés luminescentes du silicium poreux ces nanoparticules permettent la visualisation par luminescence des tissus tumoraux ciblés et donc un suivi de l'efficacité du traitement. En outre, les porphyrines incorporées aux nanoparticules (I) sont fluorescentes si les cations métalliques M sont diamagnétiques ou si x = 0, aussi les nanoparticules de l'invention permettent aussi par ce moyen de 20 procéder au marquage par fluorescence des zones où sont localisés les tissus cancéreux. Et certaines molécules de formule (I) comprennent un cation métallique paramagnétique (M dans la porphyrine) qui permet de suivre la répartition des nanoparticules dans l'organisme par RMN et IRJV1. Ces propriétés sont utiles aussi bien pour la détection d'une pathologie que pour le suivi de son traitement. 25 Les résultats obtenus montrent que les nanoparticules synthétisées sont efficaces pour générer de l'oxygène singulet en solution avec un rendement quantique cependant faible. Ces nanoparticules doivent permettre une vectorisation des actifs et leur endocytose dans les cellules tumorales après fonctionnalisation en surface par des biomolécules. 30 Parmi les différents cancers que l'on peut envisager de traiter avec les nanoparticules de l'invention, on peut citer : le rétinoblastome (lignées cellulaires Y79), le cancer du colon (lignées cellulaires HT29), de l'épiderme (A 431), du poumon (A 549), du sein (MDA-MB-231, MCF-7), du col de l'utérus (HeLa) de l'ovaire (PEO 14), du mélanome (MDA-MB-435), de la prostate (LNCaP) ainsi que l'ensemble des 35 tumeurs solides qui inclut, mais n'est pas limité aux cancers du cou et de la tête, aux cancers digestifs et des organes sexuels, et toute tumeur bénigne ou cancéreuse qui peut être illuminée. Le rayonnement infra-rouge pénétrant mieux dans l'organisme que 33784-texte dépôt 2988721 21 le rayonnement visible, les nanoparticules de l'invention permettent d'atteindre de façon efficace des tissus cancéreux non accessibles par les traitements de l'art antérieur. Après endocytose les lignées cellulaires sont irradiées, et l'efficacité des 5 nanoparticules est évaluée par test MTT. Les compositions de nanoparticules de l'invention peuvent être administrées localement ou par voie systémique. L'administration locale peut être effectuée notamment par injection de la composition de nanoparticules à proximité de la zone tumorale. Dans le cas des tumeurs superficielles, les compositions de nanoparticules 10 peuvent être administrées par voie topique, sous une forme galénique appropriée (solution, suspension, pâte, patch). L'administration par voie générale peut être mise en oeuvre par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale ou rectale. De telles formulations et leur mode de mise en oeuvre sont bien connus de l'homme du métier. Le dosage de la composition en actif de formule (I) ou (Ia) est 15 adapté en fonction du poids et de l'âge du patient, de la nature, de la localisation et du stade de développement de la tumeur, de la voie d'administration choisie et de la dose d'irradiation utilisée. La composition peut comprendre tout autre actif connu pour le traitement des tumeurs et/ou de leurs symptômes. Elle comprend les composants classiques de la 20 galénique adaptés au mode d'administration choisi. En particulier, elle peut être sous une forme galénique favorisant la vectorisation vers les tissus cibles. Les nanoparticules de l'invention permettent le traitement de diverses maladies y compris les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires, les maladies inflammatoires et les lésions tissulaires. Elles peuvent être utilisées notamment pour le 25 traitement des maladies de la peau. Les nanoparticules de l'invention peuvent être associées à un support cosmétiquement acceptable pour former une composition cosmétique. Notamment, elles peuvent être formulées sous forme de crème de soin, de patch cosmétique, de masque. 30 Ces nanoparticules peuvent être utilisées pour traiter, prévenir, retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires. Elles permettent également la détection de ces pathologies. L'invention a encore pour objet un kit pour la détection, le traitement, la 35 prévention, pour retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : 33784-texte dépôt 2988721 22 - des nanoparticules de silicium poreux greffées de façon covalente par au moins une molécule photosensibilisante, ou une composition de médicament les comprenant et - des moyens permettant une irradiation biphotonique dans l'infra-rouge. 5 Parmi les moyens utilisables pour irradier dans l'infra rouge en biphotonique, on peut mentionner un laser titane saphir femtoseconde focalisé. En effet, les inventeurs ont mis en évidence pour la première fois la capacité des nanoparticules de silicium poreux, greffées de façon covalente par au moins une molécule photosensibilisante, à former des espèces oxydantes capables de détruire des 10 cellules malignes sous l'effet d'une irradiation biphotonique dans le proche infra- rouge. Selon cette variante, les molécules photosensibilisantes peuvent être de tout type, dès lors qu'elles sont greffées par l'intermédiaire d'une liaison covalente aux nanoparticules de silicium poreux. En particulier elles peuvent être choisies parmi les 15 porphyrines, mais aussi parmi les chlorines ou les bactériochlorines Selon cette variante, de préférence les nanoparticules de silicium poreux sont également greffées par au moins une molécule de ciblage permettant de cibler spécifiquement des tissus néoplasiques. L'invention a encore pour objet un procédé de pour traiter prévenir, pour retarder 20 l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : l'administration à un individu à traiter de nanoparticules de silicium poreux greffées par l'intermédiaire d'une liaison covalente par au moins une molécule photosensibilisante et le traitement par irradiation biphotonique dans le proche infra-rouge. 25 L'invention a encore pour objet un kit pour le traitement, la prévention et/ou la détection d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant des nanoparticules de formule (I) ou (Ia) ou des compositions pharmaceutiques les comprenant et des moyens permettant une irradiation dans l'infra-rouge, en particulier des moyens d'irradiation biphotoniques. 30 - Figures : Figure 1 : Représentation schématique de la préparation de nanoparticules de silicium par fracturation ultrasonique. Figure 2 : Photographie d'imagerie SEM des nanoparticules de silicium poreux, 35 en surface (2A) et en coupe (2B). 33784-texte dépôt 2988721 23 Figure 3 : Photographie d'imagerie SEM (3A) et TEM (3B) des nanoparticules de silicium poreux préparées par fracturation ultrasonique et représentées sur la figure 2. Figure 4 : Graphique représentant l'intensité de diffusion de la lumière en kcps 5 en fonction de la taille des nanoparticules (diamètre hydrodynamique mesuré en nm). Figure 5: Graphique représentant l'adsorption et la désorption des nanoparticules de silicium poreux gravé à 200mA/cm2. La quantité adsorbée (Volume adsorbé en mL STP/g) est représentée en fonction de la pression relative P/Po. Figure 6 : Représentation schématique de deux voies de synthèse permettant le 10 greffage de groupes fonctionnels sur des nanoparticules de silicium poreux. Figure 7 : Représentation schématique du couplage d'une porphyrine aminée sur une nanoparticule de silicium poreux fonctionnalisée par un groupement allylisocyanate. Figure 8: Représentation schématique du couplage d'une porphyrine 15 fonctionnalisée par un isocyanate sur une nanoparticule de silicium poreux fonctionnalisée par un groupement allylamine. Figure 9 : Représentation schématique du couplage d'un groupement mannose sur une nanoparticule de silicium poreux par l'intermédiaire d'un groupement squarate. 20 Figure 10 : Graphique représentant le spectre FTIR (nombre d'onde en cm-1) de nanoparticules de silicium poreux à différentes étapes du couplage d'un mannose : silicium poreux fraîchement gravé (en bas), après hydrosilylation par une allylamine (au milieu), après couplage avec le mannose (en haut). Figure 11 : Graphique représentant le spectre UV-VIS d'une solution obtenue 25 après dissolution des nanoparticules de silicium poreux dans KOH, avec 0,24 nmol de porphyrine/mg de nanoparticules (absorbance Log I/Io en fonction de la longueur d'onde en nm). Figure 12 : Graphique représentant le spectre UV-VIS d'une solution obtenue après dissolution des nanoparticules de silicium poreux dans KOH, avec 67,5 nmol de 30 porphyrine/mg de nanoparticules (absorbance Log I/I0, en fonction de la longueur d'onde en nm). Figure 13 : Graphique représentant le spectre UV-VIS d'une solution obtenue après dissolution des nanoparticules de silicium poreux dans KOH (pas d'estimation de la quantité de porphyrine/mg de nanoparticules) (absorbance Log I/Io en fonction de 35 la longueur d'onde en nm). 33784-texte dépôt 2988721 24 Figure 14 : Graphique représentant le spectre UV-VIS des nanoparticules de silicium poreux sans porphyrine (absorbance Log I/I0 en fonction de la longueur d'onde en nm). Figure 15 : Graphique représentant la quantité produite d'oxygène singulet en 5 fonction de la longueur d'onde d'irradiation pour des nanoparticules sans porphyrine (intensité exprimée en unité arbitraire : phosphorescence de l'oxygène singulet en fonction de la longueur d'onde en nm). Figure 16 : Graphique représentant le spectre UV-VIS des nanoparticules de silicium poreux greffées par une porphyrine et par du mannose (absorbance en ... en 10 fonction de la longueur d'onde en nm). Figure 17 : Graphique représentant la quantité produite d'oxygène singulet en fonction de la longueur d'onde d'irradiation pour des nanoparticules de silicium poreux greffées par une porphyrine et par du mannose (intensité en exprimée en unité arbitraire : phosphorescence de l'oxygène singulet en fonction de la longueur d'onde 15 en nm). Figure 18 : Photographies représentant l'internalisation des nanoparticules de silicium poreux dans des cellules de cancer du sein MDA-MB-231. 18 a, b, c : microscopie de contraste de phase. 18d, e, f : microscopie de fluorescence. Excitation à 405nm, Em.>640nm. 18a, d : cellules seules. 18 b, e : cellules incubées avec une 20 porphyrine libre pendant 3h. 18c, f : Cellules incubées avec des nanoparticules de silicium poreux pendant 3h, les nanoparticules étant greffées par du mannose et par des porphyrines. Figure 19 : Graphique représentant le % de cellules MCF7 vivantes en fonction du traitement qui leur a été administré. On mesure l'efficacité TPE-PDT des 25 nanoparticules de silicium poreux. Des cellules confluentes MCF7 ont été traitées par 20 mg ml-1 de nanoparticules de silicium poreux greffées par le mannose (PSiNP-M barre du milieu) ou par la porphyrine (PSiNP-PS barre de droite). Les cellules ont ensuite été soumises à une irradiation biphotonique à 750 nm pendant 3 x 1,25 s. Deux jours après l'irradiation, le % de cellules mortes a été mesuré. Les résultats sont 30 représentés sous formes de barres de mesure faites en triplicats ± écarts-types. La barre de gauche représente le contrôle (pas de traitement des cellules). Figure 20 : Représentation schématique de la préparation des nanoparticules greffées. - Partie expérimentale : 35 1. Synthèse des nanoparticules de silicium poreux biodégradables et fonctionalisation chimique. 33784-texte dépôt 2988721 25 Cette partie décrit la préparation des composants nanostructurés / nanoparticules et le développement de chimies de greffage originales pour l'attachement des porphyrines et des agents de ciblage, pour l'étude de leur efficacité à cibler, pénétrer et délivrer les agents thérapeutiques de type porphyrine dans des cellules cancéreuses 5 ou endothelial in vivo. 1.1. Synthèse et caractérisation des nanostructures/nanoparticules de silicium poreux Les nanoparticules de silicium poreux sont préparées par gravure électrochimique de plaques de silicium monocristallin dans une solution électrolytique 10 d'acide fluorhydrique (HF) dans l'éthanol, suivie d'un décollement de la couche poreuse et d'une fracture par ultrasons d'après une procédure publiée (figure 1), (Sailor, M. J. et al., Adv. Funct. Mater. 2009, 19 (20), 3195-3208 ; Bley, R. A. et al. Chem. Mat. 1996, 8 (8), 1881-1888). Du silicium monocristallin de type p++ (dopé au bore, résistivité 0.8-1.2mS2.cm, 15 orientation, ) est gravé par voie électrochimique dans une solution d'acide fluorhydrique (48%)/éthanol à 3:1 en volume (figure 1, première étape). La gravure est réalisée dans une cellule en téflon, en utilisant une contre-électrode circulaire de platine. Un courant constant de 200mA/cm2 est appliqué pendant 150 secondes, et l'échantillon est rincé trois fois à l'éthanol. La couche poreuse est ensuite électro- 20 dissoute dans une solution d'HF dans l'éthanol à 3.3% en appliquant un courant constant de 4 mA/cm pendant 250 secondes (étape 2 de la figure 1). Après trois rinçages à l'éthanol, la couche poreuse est déposée dans l'éthanol, dans un flacon en verre. L'échantillon, après avoir été dégazé sous flux d'azote pendant 20 minutes, est sonique dans un bain à ultrasons pendant 16 heures (étapes 3 et 4 de la figure 1). La 25 dispersion obtenue de particules dans l'éthanol est filtrée (0,2 !am nylon syringe filter) et centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Des nanoparticules d'une distribution de taille centrée à 115 nm sont obtenues (fig.4). La taille et la texture des nanoparticules est caractérisée par microscopie électronique à balayage (MEB), microscopie électronique à transmission (MET), diffusion de lumière (DLS) et 30 adsorption d'azote (BET). On observe sur la figure 2 l'image MEB d'une surface et d'une section d'un film de Si poreux. On observe sur la figure 3 les images MEB et MET de nanoparticules de Si poreux préparées par fracture ultrasonique du film poreux présenté sur la figure 2. 35 La figure 4 illustre la courbe de diffusion de lumière pour les nanoparticules de Si poreux présentées sur la figure 3. 33784-texte dépôt 2988721 26 La figure 5 représente la courbe isotherme d'adsorption/désorption d'azote pour les nanoparticules de Si poreux présentées sur la figure 3. 1.2. Modification de la surface des nanostructures/nanoparticules de silicium poreux 5 Des porphyrines synthétiques hydrophiles sont ancrées de manière covalente à la surface des nanostructures/nanoparticules de silicium poreux par des chimies de greffage originales. Des espèces ciblantes sont également greffées à la surface des nanostructures/nanoparticules de silicium poreux. En amont du greffage des espèces ciblantes et des porphyrines, les nanostructures/nanoparticules de silicium poreux sont 10 modifiées chimiquement par des ligands fonctionnels 1.2.1. Modification chimique des nanostructures/nanoparticules de silicium poreux par des ligands fonctionnels : Les nanostructures/nanoparticules de silicium poreux fraîchement gravées, présentant des liaisons Si-H à leur surface sont très hydrophobes. Deux modifications 15 de surface sont développées. 1.2.1.1. Oxydation controlée (thermale, ozone, diméthyl sulfoxide, borate aqueux) et silanisation : Des espèces Si-OH et SiO2 sont produites à la surface des nanostructures/nanoparticules. La chimie de silanisation sur des surfaces oxydées de 20 nanostructures/nanoparticles de silicium poreux est développée pour le greffage de chaines carbonnées fonctionnelles telles que l'aminopropyl triethoxysilane, incorporant des groupements amines (comme illustré sur la figure 6A) utilisés ensuite pour le greffage de porphyrines et d'espèces ciblantes. Après oxidation des nanoparticules, elles sont redispersées dans l'aminopropyl 25 triéthoxysilane. La réaction de silanisation est réalisée à 150°C sous flux d'azote pendant 2 heures. Les nanoparticules sont ensuite rincées 4 fois à l'éthanol et deux fois au diéthyléther, avant d'être séchées sous courant d'azote. 1.2.1.2. Hydrosilylation: Des groupes fonctionnels sont greffés de manière covalente à la surface des 30 nanostructures/nanoparticules de Si poreux via des liaisons Si-C selon des procédures publiées (Buriak, J. M., Chem. Rev. 2002, 102 (5), 1272-1308). L'hydrosilylation est un traitement chimique connu pour renforcer la stabilité chimique du silicium poreux en milieu aqueux (15). Des groupes fonctionnels de type amine et isocyanate sont ancrés par hydrosilylation avec des dérivés allylamines et allylisocyanates comme 35 illustré sur la figure 6B. 1.2.2. Greffage des porphyrines 33784-texte dépôt 2988721 27 Des porphyrines aminées et isocyanatées sont greffées aux different types de ligands (amino- et isocyanato-) précédement ancrés à la surface ces nanoparticules de Si poreux. 1.2.2.1. Greffage de la porphyrine -NH2 sur les nanoparticules de Si poreux 5 hydrosilylées avec l'allylisocyanate. Les nanoparticules sont dispersées dans l'allylisocyanate. L'hydrosilylation est réalisée à 90°C sous flux d'azote pendant 3 heures. Les particules sont ensuite rincées trois fois dans du tétrahydrofurane (THF) et redispersées dans 4 ml de THF. 500 1.1,L de porphyrine -NH2 à lmg/mL dans du dimethylformamide (DMF) sont 10 ajoutés à 200 pL d'éthanol. La réaction a lieu à 80°C sous reflux d'azote pendant 4 heures. Les particules sont ensuite rincées deux fois à l'éthanol, deux fois à l'eau, deux fois à l'éthanol, et deux fois au diéthyl ether avant d'être séchées sous courant d'azote. Cette procédure de greffage illustrée sur la figure 7 n'a jamais été décrite auparavant sur des nanoparticules de Si poreux. 15 1.2.2.2. Greffage de la porphyrine -NCS sur les nanoparticules de Si poreux hydrosilylées avec l'allylamine (illustrée sur la figure 8) : Les nanoparticules sont dispersées dans l'allylamine. Cette solution est ensuite dégazée par trois cycles consécutifs de congélation-pompage-décongélation (freeze- 20 pump-thaw cycles). L'hydrosilylation est réalisée à 70°C sous flux d'azote pendant 2 heures et les nanoparticules sont rincées quatre fois dans de l'éthanol. Les particules sont redispersées dans 2 ml d'éthanol. 2.5 mL d'une solution d'H20/éthanol 1:1 (en volume) sont ensuite ajoutés à 500 pL d'une solution de porphyrine -NCS à 1 mg/mL 25 dans l'éthanol. La réaction a lieu à température ambiante sous agitation pendant 18 heures. Les particules sont ensuite rincées quatre fois à l'éthanol, et deux fois au diéthyl ether avant d'être séchées sous courant d'azote. 1.2.3. Ancrage des espèces ciblantes 30 Des molécules de type carbohydrate (mannose) sont couplées à la surface des nanoparticules de Si poreux selon une procédure développée précédemment pour des nanoparticules mésoporeuses de silice et illustrée sur la figure 9. Nous avons montré que des groupements squarate permettent le couplage de molécules de type carbohydrate dans des conditions douces. Le rôle attendu des espèces carbohydrate est 35 la vectorisation des nanoparticules sur les cellules cancéreuses. 33784-texte dépôt 2988721 28 Dans une réaction typique, les nanoparticules de Si poreux sont dispersées dans de l'allylamine. Cette suspension est ensuite dégazée par trois cycles consécutifs de congélation-pompage-décongélation. L'hydrosilylation est réalisée à 70°C sous reflux d'azote pendant 2 heures et les 5 nanoparticules sont rincées quatre fois dans de l'éthanol. Les particules sont redispersées dans 2,5 ml d'éthanol. 2.5 mL d'une solution de mannose-squarate à 6 mg/mL dans H20/éthanol 1:1 (en volume) sont ensuite ajoutés à 250 pL de triéthylamine. La réaction a lieu à température ambiante sous agitation pendant 18 heures. Les 10 nanoparticules sont ensuite rincées quatre fois au diéthyl ether avant d'être séchées sous courant d'azote. 1.2.4. Greffage simultané du mannose et de la porphyrine-NCS: Les nanoparticules de Si poreux sont dispersées dans de l'allylamine. Cette suspension est ensuite dégazée par trois cycles consécutifs de congélation-pompage- 15 décongélation. L'hydrosilylation est réalisée à 70°C sous reflux d'azote pendant 2 heures et les nanoparticules sont rincées quatre fois dans de l'éthanol. Les particules sont redispersées dans 2 ml d'éthanol. 2,5 mL d'une solution de mannose-squarate à 6 mg/mL dans H20/éthanol 1:1 (en volume) sont ensuite ajoutés à 250 pL de triéthylamine, et à 500 pL d'une solution de porphyrine -NCS à 1 mg/mL dans 20 l'éthanol. La réaction a lieu à température ambiante sous agitation pendant 18 heures. Les nanoparticules sont ensuite rincées quatre fois à l'éthanol, et deux fois au diéthyl éther avant d'être séchées sous courant d'azote. Remarques: 1/ Le galactose peut être substitué au mannose, en suivant les mêmes conditions 25 expérimentales. 2/ Si les formulations de nanoparticules présentent de faibles propriétés de circulation, des chaînes de PEG (polyethylène glycol) peuvent être utilisées pour lier les espèces carbohydrate au nanoparticules par via des couplages squarate ou amide. Le chitosan et le sérum albumine peuvent être utilisés comme autre chimie de 30 surface alternative pour améliorer la biocompatibilité des nanoparticules. Le poids moléculaire et la longueur de chaîne des PEGs pourra être ajusté pour maximiser la biocompatibilité, la pénétration cellulaire, et pour contrôler les cinétiques de dégradation des nanostructures de silicium poreux. 1.2.5. Caractérisation 35 Les nanoparticules modifiées chimiquement sont caractérisées par spectroscopie Infra-rouge (F TIR) et analyse élémentaire pour le greffage du mannose, et par spectroscopie d'absorption UV-VIS pour le greffage des différentes porphyrines à la 33784-texte dépôt 2988721 29 surface des nanoparticules de Si poreux. Dans ce cas les nanoparticules de Si poreux sont dissoutes dans une solution de KOH avant de mesurer l'absorbance de la porphyrine (figure 10 à 14 et 16). 1.2.5.1. Greffage du mannose 5 Les résultats des analyses élémentaires après greffage du mannose indiquent ci- dessous le pourcentage d'éléments présents: - 5.25% of C - 0.72% of N - 4.18% of 0 10 Ces valeurs sont cohérentes avec la présence de mannose à la surface des particules de Si poreux. 2. Production de '02 (oxygène) et de ROS (espèces réactives oxydantes) (Figures 15 et 17) Les composés sont solubilisés dans l'éthanol. Les expériences sont réalisées sur 15 la partie soluble de produit. Aucune production d'oxygène singulet n'estobservée pour les nanoparticules de Si poreux ne contenant pas de porphyrine (E119). Une faible production d'oxygène singulet est observée pour les nanoparticules de Si poreux fonctionnalisées avec de la porphyrine et du mannose (E117mp). 3. Ciblage des tumeurs et " homing" 20 Les expériences réalisées sur des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 montrent que les nanoparticules de Si poreux fonctionnalisées avec du mannose et de la porphyrine ont internalisé les cellules après 3 jours d'incubation (figure 18). Nous pensons que le mannose à la surface des nanoparticules assure leur endocytose par les cellules. 25 Des résultats similaires peuvent être obtenus en fonctionnalisant le Si poreux avec des espèces galactose. Une approche particulièrement intéressante consiste à remplacer l'excitation classique à un photon dans le visible par une excitation à deux photons dans le proche infra-rouge, car cela permet de limiter les effets secondaires dus à la lumière dans les 30 tissus traités par thérapie photodynamiques. L'avantage d'une excitation à deux photons est aussi de permettre le traitement de cancers dans des tissus plus profonds. Un des inventeurs a montré précédemment que les nanoparticules de silicium poreux peuvent être excitées par une excitation en 2-photons dans le proche infrarouge (780 nm). Ici dans une experience de PDT à 2-photons, nous montrons que les 35 nanoparticules de Si poreux contenant une porphyrine polycationique excitées en 2- photons (750nm) peuvent tuer des cellules cancéreuses après endocytose des nanoparticules (Figure 19). 33784-texte dépôt 2988721 30 Des cellules MCF7 de cancer du sein sont incubées pendant 6 h avec 20 [tg mL-1 de nanoparticules de silicium poreux. Les PSiNP-M sont les nanoparticules de Si poreux greffées au mannose de manière covalente dans le but de cibler les récepteurs des cellules MCF7. Les PSiNP-M ne portent aucune porphyrine. Les cellules sont 5 irradiées à 750 nm par 3 scans de 1,25 s chacun à une puissance moyenne de 80 mW. La surface de scan est de 1,5 x 1,5 mm2. La mort cellulaire est mesurée 2 jours après irradiation. 22% de mort cellulaire sont observés avec les PSINP-M. Par ailleurs, dans les mêmes conditions d'incubation et d'irradiation les PSINP-PS (nanoparticules de Si poreux fonctionnalisées au mannose et à la porphyrine) génèrent 44% de mort 10 cellulaire. Ce résultat suggère un mécanisme de FRET (fluorescence resonance energy transfer) en excitation à 2-photons des nanoparticules de Si poreux aux porphyrines, et par conséquence la génération d'oxygène singulet et d'espèces réactives oxydantes en irradiation à 2-photons. Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux exemples et au mode de 15 réalisation décrits et représentés, mais elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art. 33784-texte dépôt REVENDICATIONS1. Nanoparticules répondant à la formule (I) : R' 10 15 R' (I) dans laquelle : 0 représente une nanoparticule de silicium poreux, 20 x représente un entier choisi parmi : 0 et 1, M représente un atome de métal choisi parmi les métaux de transition, X représente un groupement choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, R représente un groupement choisi parmi : une urée (-NH-CO-NH-), une 25 thiourée (-NH-CS-NH-), W représente un groupement alcane di-yle en C1-C12, R' représente un groupement choisi parmi : A Z+ y- R1 - 30 Z+ représente un cation organique ou minéral pharmaceutiquement acceptable, Y- représente un groupement qui peut être choisi parmi : -000-, -503A- représente un anion qui peut être choisi parmi : un halogénure, un anion d'un acide carboxylique pharmaceutiquement acceptable, 35 R1 représente un alkyle en Cl à C10. 2. Nanoparticules selon la revendication 1 répondant à la formule (Ia) : 33784-texte dépôt 2988721 R' 32 5 Cbg (Ia) Dans laquelle Cbg représente une molécule de ciblage spécifique des tissus néoplasiques. 3. Nanoparticules selon la revendication 1 ou la revendication 2 dont la taille est de 20 à 200 nm, avantageusement de 50 à 190 nm, encore mieux, de 100 à 175 nm, et de préférence de 140 à 160 nm et la taille des pores allant de 5 à 50 nm, avantageusement de 10 à 30 nm. 4. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lesquelles x représente 0. 5. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lesquelles : X représente un groupement choisi parmi : Cf, Br, I-, acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, W représente un groupement -(CH2)3-. R1 représente un groupement choisi parmi : un alkyle en C1-C3, Z+ représente un cation qui peut être choisi parmi : K+, Li+, Na+, NH4+, A représente un anion qui peut être choisi parmi : Cf, Br-, I-, acétate, propionate, butyrate, ascorbate, benzoate, cinnamate, citrate, fumarate, glycolate, malonate, tartrate, malate, maléate, mandélate, tosylate, R' est choisi parmi : - + S03- NH4+ //N-CH3 Cbg, lorsqu'il est présent, est choisi parmi les sucres et les dérivés de sucres. 6. Nanoparticules selon la revendication 5 choisies parmi : 33784-texte dépôt 2988721 33 5 // H H,C-N Hsll N ilililililililililililil 0 HN 10 15 NH4-, S0,- HN S0,- NE14. 20 7. Procédé de fabrication de nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ce procédé comprenant les étapes de : (i) fourniture de nanoparticules de silicium poreux, (ii) fonctionnalisation des nanoparticules de silicium poreux par des 25 groupements comportant au moins une fonction NH2 ou au moins une fonction isocyanate ou isothiocyanate, (iii) fourniture et greffage d'une molécule photosensibilisante, porteuse d'un groupement complémentaire de celui porté par la nanoparticule, de façon à former une liaison urée ou thiourée, et éventuellement 30 (iv) greffage par au moins une molécule de ciblage. 8. Procédé selon la revendication 7, qui comporte les étapes de : (i) a- gravure électrochimique de plaquettes de silicium monocristallin dans une solution éthanolique d'acide fluorhydrique (HF), b- élimination du film poreux et traitement par ultrasons, 35 (ii) a- oxydation ménagée suivie d'une silanisation de façon à produire des groupements Si-OH et des espèces Si02 à la surface des nanoparticules de silicium poreux, et/ou 33784-texte dépôt 2988721 34 b- hydrosilylation, (iii) greffage des nanoparticules par une molécule photosensibilisante de type porphyrine répondant à la formule (II) dans laquelle Q représente un groupement choisi parmi : -NI-12, -N=C=O, -N=C=S, 5 R' 10 15 (II) (iv) greffage des nanoparticules par un sucre ou un dérivé de sucre à l'aide d'un groupement phénylsquarate. 9. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour leur utilisation pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder 20 l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires, les maladies de la peau. 10. Composition de médicament comprenant des nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans un support pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition cosmétique comprenant des nanoparticules selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 6 dans un support cosmétiquement acceptable 12. Kit pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : - des nanoparticules de silicium poreux greffées par l'intermédiaire d'une liaison 30 covalente par au moins une molécule photosensibilisante, ou une composition de médicament les comprenant et - des moyens permettant une irradiation biphotonique dans l'infra-rouge. 13. Kit pour la détection, le traitement, le suivi, la prévention, pour retarder 35 l'apparition et/ou la récidive d'une pathologie choisie parmi les cancers, les tumeurs, les maladies prolifératives cellulaires comprenant : 33784-texte dépôt 2988721 35 - des nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou une composition selon la revendication 10, et - des moyens permettant une irradiation dans l'infra-rouge.