FR 2978458 A1 20130201 FR 1156939 A 20110729 Procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence des transporteurs ABC L'invention décrit un procédé in vitro utilisant de la peau humaine d'épaisseur totale pour évaluer l'influence des transporteurs ABC (tel que MDR1, MRP1, MRP2 ou BCRP) sur 5 l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. Contexte Les transporteurs de cassettes de liaison à l'ATP (ABC) sont une famille de protéines membranaires complètes présentes dans toutes les cellules de toutes les espèces d'archées, 10 d'eubactéries et d'eucaryotes. Des procédés destinés à évaluer l'influence des transporteurs ABC (tel que MDR1, MRP1, MRP2 et/ou BCRP) sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique ont été décrits, mais ne sont pas optimaux. 15 Résumé Des modes de réalisation exemplaires proposent un procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence de transporteurs ABC cutanés sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. Le procédé comprend en général les étapes suivantes : 20 (1) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes ; (2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture d'organes ; 25 (3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes ; (4) Mettre en contact à la fois les échantillons de peau témoins et ceux traités avec l'inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes ; 30 (5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse recueillie dans le liquide récepteur (absorption) après pénétration à travers la peau ; (6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et (7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur). La grande majorité des protéines transporteurs ABC contrôlent le transport de molécules, allant de petits ions à des substances médicamenteuses, lipides et protéines, à travers les membranes cellulaires. Le génome humain code pour 48 gènes de transporteurs ABC. La plupart des 48 transporteurs ABC humains jouent un rôle dans l'exportation de substrats physiologiques (acides aminés, peptides, lipides, ions inorganiques, etc.) et, parmi ceux-là, neuf sont associés à un phénotype de résistance multiple (MDR), dû à leur faculté à extruder hors des cellules une grande variété de substances xénobiotiques. Celles-ci sont la glycoprotéine P (ABCB1, P-gp ou MDR1), les protéines associées à une résistance multiple ou MRP (MRP1-MRP7, auxquelles on se réfère aussi comme ABCC1-6 et ABCCIO) et la protéine de résistance au cancer du sein ou BCRP (ABCG2). Comme les transporteurs ABC en particulier, MDR1 ou P-gp sont largement distribués dans l'organisme [Thiebaut F, Tsuruo T, Hamada H, & al. Cellular localization of the multidrugresistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 1987; 84: 7735-8.], ils jouent également un rôle important dans la modulation de l'absorption, la distribution tissulaire et l'élimination de leurs substrats. Par conséquent, les transporteurs ABC MDR sont considérés comme étant des intervenants majeurs dans la pharmacocinétique de plusieurs substances médicamenteuses, qui peuvent moduler à leur tour leur activité pharmacologique ou leur toxicité. Sur la base de ces propriétés et d'un point de vue cellulaire, le transporteur ABC transfère, de manière extracellulaire, les substances médicamenteuses en se couplant avec elles et régule le profil de disposition des substances médicamenteuses (concentration efficace en substance médicamenteuse dans l'absorption, la distribution, le métabolisme, l'excrétion, emplacement sur la cible), ce qui détermine à son tour l'effet pharmacologique total des substances médicamenteuses. Par exemple, un transporteur ABC, qui est exprimé dans des cellules épithéliales de l'intestin et dans des cellules de l'endothélium vasculaire cérébral, a une grande influence sur la biodisponibilité de substances médicamenteuses administrées par voie orale et sur la migration de substances médicamenteuses vers le système nerveux central. Comme autre exemple, il est bien connu dans le domaine de la thérapie chimique du cancer que, quand la glycoprotéine P et la MRP1 sont surexprimées, les cellules cancéreuses deviennent tolérantes en excrétant de nombreuses substances médicamenteuses anti- cancéreuses hors des cellules. Ce rôle fonctionnel des transporteurs ABC peut s'appliquer quand les substances médicamenteuses sont administrées par voie orale ou entérale. Mais dans le cas de produits dermatologiques, dans lequel les substances médicamenteuses sont appliquées par voie topique, on en sait peu sur le rôle fonctionnel des protéines de transport qui sont exprimées constitutivement dans la peau et spécifiquement dans la peau humaine. On a rapporté que les protéines associées à une résistance multiple ou MRP sont exprimées dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), dont la fonction n'est pas claire [Baron J M, Holler D, Schiffer R & al. J Invest Dermatol, 2001; 116; 541-548.], et le MRP1 a été le plus fortement exprimé parmi les gènes transporteurs de substances médicamenteuses analysés par PCR en temps réel dans la peau humaine [Smith G, Dawe R S &al. J Invest Dermatol, 2003; 121; 390-398]. Plus récemment, en utilisant la même analyse par PCR en temps réel , l'expression d'un ARNm de MDR1 a démontré qu'elle était jusqu'à 360 fois supérieure dans des spécimens de peau humaine complète par comparaison avec l'expression dans des NHEK. Une forte expression d'ARNm de MDR1 a été particulièrement détectée dans le derme humain ($ 300 fois supérieure à celle dans des NHEK), tandis que l'expression d'ARNm épidermique n'a été que légèrement supérieure (12 fois) à l'expression dans des NHEK [Shazik C, Wenzel J & al, Experimental Dermatology, 2011; 1-3]. En fait, les transporteurs ABC fonctionneraient dans une couche cutanée viable (derme et épiderme viables) mais pas dans la couche cornée, qui est composée de cellules mortes. D'un autre côté, on a révélé, en utilisant l'immunohistochimie, une forte expression de protéine P-gp dans différents compartiments de la peau humaine, tels que les canaux sudoripares, les vaisseaux, les gaines des nerfs et les muscles de la peau humaine. Seule une expression modérée de la protéine P-gp a été observée dans la couche basale de l'épiderme [Shazik C, Wenzel J & al, Experimental Dermatology, 2011; 1-3]. Ainsi, à la lumière de ce que l'on sait sur le fait que certains transporteurs ABC, tels que le MDR1 ou la protéine P-gp, aient une vaste spécificité de substrat, leur expression dans différents compartiments de la peau humaine peut être une considération importante pour le développement de substances médicamenteuses, en particulier de substances médicamenteuses dermatologiques topiques. En effet, on a besoin d'obtenir un procédé d'évaluation, directement sur la peau humaine, de l'influence de transporteurs ABC sur la pénétration de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. Un tel procédé appliqué à la peau humaine est requis pour mieux comprendre le rôle de transporteurs dans la disposition des substances médicamenteuses topiques disponibles actuellement, ainsi que pour développer l'aptitude à prédire la contribution des transporteurs ABC dans la disposition de nouvelles entités moléculaires en cours de développement. Le besoin de développer un procédé applicable directement sur la peau humaine semble être plus essentiel, tout en sachant qu'il existe des différences dans la reconnaissance d'un substrat et l'activité de transport entre les transporteurs orthologues animaux (tels que la souris) et humains (tels que le MRP1, par exemple), ce qui indique qu'il existe des différences significatives inter-espèces [Stride BD & al in Mol. Pharmacol. 1997 Sep; 52(3):344-53] . Description détaillée Dans un aspect, un mode de réalisation exemplaire propose un procédé in vitro utilisant de la peau humaine d'épaisseur totale pour évaluer l'influence de transporteurs ABC cutanés, tels que les MDR1, MRP1, MRP2 et/ou BCRP, sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. Le procédé comprend généralement les étapes suivantes : (1) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine d'épaisseur totale, sans graisse 15 sous-cutanée, et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes, de préférence à 37°C pendant une durée allant de 1 minute à 72 heures ; (2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture 20 d'organes, de préférence pendant une durée allant de 1 minute à 1 heure ; (3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes, de préférence pendant la même durée que celle de l'étape (2) ; (4) Mettre en contact à la fois l'échantillon de peau témoin et celui traité avec un 25 inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes, de préférence pendant une durée allant de 1 heure à 72 heures et, plus préférablement, autour de 16 heures ; (5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse recueillie dans le récepteur liquide (absorption) après pénétration 30 à travers la peau ; (6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et (7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin 35 (sans inhibiteur). Pour la préparation ex vivo d'échantillons de peau humaine d'épaisseur totale, on obtient la peau à partir d'une chirurgie plastique. Les échantillons de peau proviennent aussi bien d'hommes que de femmes. Ils peuvent être obtenus à partir de tissus abdominaux ou mammaires, mais également à partir d'autres sites anatomiques du corps. Des échantillons de peau frais ou congelés peuvent être utilisés. De préférence, on utilise des échantillons de peau fraîche puisque l'activité des transporteurs ABC et d'autres enzymes est mieux conservée. Par "échantillons de peau fraîche" nous entendons des échantillons de peau obtenus juste après l'excision de la peau, jusqu'à 24 heures environ après l'excision, de préférence environ 4 heures après l'excision. En variante, les échantillons de peau peuvent être maintenus dans des conditions de culture d'organes jusqu'à 72 heures environ après l'excision et avant que le procédé d'évaluation de l'implication du transporteur ABC ne débute. Des échantillons de peau saine ainsi que de peau avec lésions sont utilisés. La graisse sous-cutanée de la peau est retirée délicatement par dissection avant de l'utiliser dans le 15 procédé. Des échantillons de peau d'épaisseur totale peuvent être utilisés sans traitement quelconque de la couche cornée, la couche la plus externe de la peau qui agit comme barrière imperméable aux substances médicamenteuses hydrophiles ou de poids moléculaires élevés. 20 En variante, des échantillons de peau peuvent être utilisés après avoir réduit ou interrompu la couche cornée, dans le but de maîtriser les propriétés barrières de cette couche et d'augmenter la pénétration de la substance médicamenteuse. Deux approches différentes sont utilisées pour réduire ou interrompre la fonction de barrière de la couche cornée : le décapage ou le Dermaroller®. 25 Pour la première étape (1) du procédé, après excision de l'échantillon de peau humaine et retrait de la graisse sous-cutanée, des morceaux de peau (2 X 2 cm ou moins) sont découpés et placés, face dermique vers le bas, dans un insert Transwell® logé à l'intérieur du puits d'une plaque de culture multi-puits. Le support sur lequel sont placés les 30 échantillons de peau humaine est un support perméable avec des membranes microporeuses. De préférence, la membrane utilisée est faite d'un matériau en polycarbonate mais d'autres matériaux pour membranes peuvent être utilisés. De tels supports sont commercialisés par Corning sous le nom de Transwell® mais d'autres dispositifs semblables disponibles sur le marché peuvent être utilisés dans cette étape. 35 L'insert Transwell® utilisé peut être adapté à une plaque de 6 puits, 12 puits ou 24 puits. Les puits sont pré-remplis avec un volume approprié de milieu de culture de peau de longue durée. En fonction de la plaque de culture utilisée, le volume de milieu varie de 2,0 mL à 0,2 mL. Un cylindre, de préférence fabriqué en verre mais qui peut être aussi fabriqué dans un autre matériau approprié, est placé au sommet de l'échantillon de peau dans le but de délimiter la surface à traiter de l'échantillon de peau. Ainsi, la surface à traiter dépend de la taille du cylindre utilisé, lequel est adapté à son tour à la taille de l'insert utilisé. La surface de peau à traiter varie de 0,125 cm' environ jusqu'à 3 cm2 environ. A ce stade, la plaque Transwell® est placée sur un agitateur orbital et est maintenue dans des conditions de culture d'organes. Par "conditions de culture d'organes" nous comprenons une température de culture allant de 32°C environ jusqu'à 38°C environ, de préférence de 37°C environ, avec une concentration en CO2 allant de 4% environ jusqu'à 10% environ, de préférence 5% environ, et avec une hygrométrie saturée dans un incubateur pour culture cellulaire. En variante, des cellules de diffusion, comme des cellules de diffusion de Franz, peuvent être utilisées également à la place du modèle décrit ci-dessus. Dans ce cas, les conditions 15 préférées utilisées sont comme suit : Des coupes de peau sont montées sur des cellules de diffusion en verre, avec des superficies nominales d'environ 1 ou 2 cm2 environ et des compartiments receveurs ayant des capacités de 3 mL. La face épidermique de la peau est exposée aux conditions atmosphériques alors que la face dermique est immergée dans du milieu de culture de peau 20 de longue durée. Le milieu de culture est maintenu entre 30°C environ et 38°C environ, de préférence à 32 °C environ, par une chemise d'eau contrôlée par un bain d'eau. Une agitation constante du fluide récepteur est maintenue par agitation magnétique à environ 500 tr/min. On prend soin de retirer toutes les bulles d'air comprises entre la surface inférieure de la peau (derme) et le milieu de culture dans le compartiment receveur. 25 En variante, quand on a besoin de maîtriser la couche cornée, on utilise deux approches différentes : le décapage ou une perforation par Dermaroller®. Dans le cas d'un décapage, on place des morceaux de peau, préparés tel que décrit ci-dessus, sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à 30 leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. La surface de la peau est décapée à l'aide de 5 à 50 morceaux de bande adhésive successives, de préférence 30 morceaux de bande adhésive. La bande adhésive est d'une taille suffisante pour couvrir la totalité de la surface de la peau qui sera en contact avec le composé à tester. En cas de perforation avec le Dermaroller®, les morceaux de peau sont placés sur un papier 35 filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. Le Dermaroller®, par exemple un modèle CIT8 avec des longueurs d'aiguille de 500 pm, est roulé dans quatre directions sur la surface de la peau, en exerçant une pression avec la main sur celui-ci. Dans la deuxième étape (2) du procédé, un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC, solubilisé dans un véhicule, est appliqué sur la surface du premier échantillon de peau. Plusieurs inhibiteurs peuvent être utilisés en fonction des transporteurs ABC étudiés. Des exemples d'inhibiteurs de transporteurs ABC sont présentés dans le Tableau 1 mais ils ne sont pas restreints à cette liste. Tableau 1 : Exemple d'inhibiteurs de transporteurs ABC : Gène Appellation Inhibiteur ABCB1 P-gp, MDR1 Ritonavir, Cyclosporine, Vérapamil, Érythromycine, Kétoconazole, Itraconazole, Quinidine, Elacridar (GF120918) LY335979 Valspodar (PSC833) ABCC1 MRP1 Probénécid Cyclosporine MK571 ABCC2 MRP2, cMOAT Cyclosporine Probénécid ABCG2 BCRP, MXR Estrone, 17(3-oestradiol, Fumitrémorgine C Elacridar (GF120918), Géfitinib Par exemple, une solution de Vérapamil, un inhibiteur spécifique d'un ABCB1 (P-gp ou MDR1), est préparé avec une concentration finale de 10 mM dans un véhicule constitué, par exemple, par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v) environ. Des échantillons de peau sont traités avec 10 pUcm2 environ d'une solution de Vérapamil à environ 10 mM pendant à peu près 30 minutes. Dans le cas où des inserts Transwell sont utilisés, les incubations sont conduites, de préférence, à 37°C environ avec 5% de CO2 sur un agitateur orbital dans un incubateur humidifié, pendant 30 minutes environ. Dans la troisième étape (3) du procédé, seul le véhicule est appliqué à la surface du deuxième échantillon de peau (témoin). En parallèle au traitement avec l'inhibiteur, différents échantillons de peau (même traitement de surface de la peau, intacte, décapée ou passée au Dermaroller®) sont traités avec le véhicule à 10 pL/cm2 environ, par exemple constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v) environ, pendant 30 minutes environ. Ces échantillons sont utilisés comme échantillons témoins sans inhibiteur. Dans la quatrième étape (4) du procédé, une substance médicamenteuse est appliquée à la fois sur le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) et sur les deuxièmes échantillons de peau (témoins) (sans inhibiteur). La substance médicamenteuse qui est utilisée pour évaluer l'implication des transporteurs ABC dans son absorption et sa distribution cutanées peuvent être un composé fluorescent, un composé radio-marqué ou un composé non marqué. Cette substance médicamenteuse est utilisée à une concentration appropriée, allant généralement de 0,01 mM environ à 100 mM environ, dans un véhicule approprié en fonction des caractéristiques de la substance médicamenteuse testée. À la fin de la période de traitement avec l'inhibiteur ou avec le véhicule, les échantillons de peau sont traités avec un volume/une quantité défini(e) de substance médicamenteuse pendant une durée allant, de préférence, de 1 heure environ à 72 heures environ et, plus préférablement, de 16 heures environ. Dans la cinquième étape (5) du procédé, après une incubation pendant la durée prédéterminée à l'étape (4), le fluide récepteur est recueilli, analysé immédiatement ou stocké à une température appropriée (comprise entre +4°C et -80°C) avant d'être analysé. La quantité de substance médicamenteuse qui a atteint le fluide récepteur (absorption) est déterminée alors avec l'appareil d'analyse approprié. Par exemple, une HPLC avec une détection UV,, fluorescence, radioactive ou spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour mesurer la quantité de substance médicamenteuse dans le fluide récepteur. Dans le cas d'une substance médicamenteuse radio-marquée, la radioactivité dans le fluide récepteur est analysée par comptage de scintillation liquide. Dans le cas d'une substance médicamenteuse fluorescente, l'intensité de fluorescence dans le fluide récepteur est mesurée directement avec un spectrofluorimètre pour microplaques. Dans certains cas, le fluide récepteur peut être analysé directement sans une quelconque procédure d'extraction. Dans d'autres cas, une étape d'extraction peut être effectuée avant l'analyse du fluide récepteur. Dans la sixième étape (6) du procédé, après une incubation pendant la durée prédéterminée à l'étape (4), la quantité de substance médicamenteuse distribuée dans la peau (distribution) est déterminée. L'excès de substance médicamenteuse est retiré en essuyant la peau avec 5 coton-tiges imprégnés avec un solvant approprié. Dans certains cas, un décapage des échantillons de peau peut être effectué en utilisant 6 bandes adhésives. Les échantillons de peau sont congelés à -80°C environ avant analyse. Afin de déterminer la quantité de substance médicamenteuse dans les différentes couches de peau (distribution), des échantillons de peau congelés sont découpés en petits morceaux, fixés sur un porte-échantillon de microtome refroidi préalablement. La peau est découpée perpendiculairement à la surface en coupes d'environ 5 à 10 pm environ d'épaisseur en utilisant un cryomicrotome. Dans certains cas, on peut effectuer des coupes parallèles à la surface de la peau. Les coupes de peau, découpées perpendiculairement à la surface de la peau, sont analysées par autoradiographie ou micro-autoradiographie, dans le cas d'une substance médicamenteuse radio-marquée, ou bien par microscopie confocale ou à épifluorescence dans le cas d'une substance médicamenteuse fluorescente. Les coupes de peau découpées parallèlement à la surface de la peau sont analysées par comptage de scintillation liquide, dans le cas d'une substance médicamenteuse radio-marquée, ou par HPLC avec un mode de détection approprié après extraction de la substance médicamenteuse des coupes de peau. Dans la septième étape (7) du procédé, on effectue une comparaison du niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur). La quantité de substance médicamenteuse qui a atteint le fluide récepteur (absorption) dans les échantillons de peau traités à la fois avec l'inhibiteur des transporteurs ABC et la substance médicamenteuse est comparée à celle dans les échantillons de peau traités seulement avec la substance médicamenteuse. Si la plus faible quantité de substance médicamenteuse est observée dans les échantillons de peau traités avec l'inhibiteur des transporteurs ABC, ceci indique que le transporteur ABC est impliqué dans l'absorption cutanée de la substance médicamenteuse. Si aucune différence n'est observée entre les deux conditions (avec et sans inhibiteurs), ceci indique que l'absorption cutanée n'est pas liée aux transporteurs ABC. Ce procédé permet d'améliorer la sélection de substances médicamenteuses appliquées par voie topique en fonction à la fois de l'affinité pour le transporteur ABC et de l'emplacement du site d'action ciblé, qui dépend de la pathologie à traiter. Des substances médicamenteuses appliquées par voie topique sont utilisées généralement dans le traitement de maladies cutanées. Cependant, des substances médicamenteuses appliquées par voie topique peuvent être utilisées également dans le traitement d'autres troubles cutanés non apparentés, dans lesquels une voie systémique ne pourrait pas être utilisée. Dans certains cas, des traitements systémiques sont utilisés dans le traitement de maladies de la peau. II existe 5 types courants de maladies de la peau : - Maladies inflammatoires Celles-ci comprennent l'eczéma, une dermatite, le psoriasis, l'érythème fessier et l'acné. Certaines de ces maladies peuvent durer pendant des périodes prolongées. Des pommades topiques sont prescrites habituellement pour diminuer la démangeaison et le gonflement. - Maladies virales Celles-ci comprennent la varicelle, la rougeole, l'herpès 1, l'herpès 2 et le zona. Des remèdes topiques et sur ordonnance sont disponibles pour les maladies cutanées 25 virales. - Maladies fongiques Des champignons microscopiques sont la cause d'infections fongiques. Les Candida, le pied d'athlète et la teigne sont toutes des infections virales. Les traitements peuvent comprendre des médicaments oraux, des pommades topiques, des poudres 30 et des antiseptiques oraux. - Maladies bactériennes Celles-ci comprennent l'impétigo, la cellulite, le MRSA, une folliculite, la gale et une fasciite nécrosante et sont toutes des maladies de peau bactériennes. Le traitement peut faire intervenir des antibiotiques pour un drainage de la zone ou, dans des cas 35 extrêmes, le retrait de la zone infectée. - Maladies cancéreuses de la peau Le cancer baso-cellulaire, le carcinome à cellules squameuses et les mélanomes sont des types de maladies cancéreuses de la peau. Des lésions cutanées ou des taches qui changent de forme ou de couleur sont des signes d'un cancer de la peau. Des exemples de substances médicamenteuses appliquées par voie topique utilisées pour le traitement de maladies de la peau sont énumérés ci-dessous : - Acné : Trétinoïne, peroxyde de benzoyle, clindamycine, doxycycline, isotrétinoïne, tétracycline, minocycline, acide salicylique, acide azélaïque, érythromycine topique, drospirénone-éthinyl estradiol, tazarotène, peroxyde de benzoyle-clindamycine, éthinyl estradiol-norgestimate, sulfacétamide sodique ou clindamycine-trétinoïne. - Psoriasis : Cortisone, rétinoïdes dérivés de la vitamine A, analogues de la vitamine D, acides salicylique et lactique. - Acné rosacée : Métronidazole et acide azélaïque. - Vitiligo : Hydroquinone - Impétigo : Érythromycine et mupirocine. Les exemples suivants sont proposés simplement comme illustrations de divers aspects de l'invention et ne devront être interprétés d'aucune manière comme limitant l'invention : EXEMPLE 1 : Expression de transporteurs ABC dans des échantillons de peau humaine Des échantillons de peau humaine obtenus à partir d'une chirurgie plastique abdominale ont 30 été maintenus en culture d'organes pendant 72 heures. Deux biopsies de peau de 6 mm de diamètre ont été cultivées dans 500 pL de milieu de culture de peau de longue durée, dans les puits d'une plaque de 24 puits à 37°C, avec 5% CO2 et hygrométrie saturée. Le milieu de culture a été changé chaque 24 heures. Après 72 heures de culture, les 2 biopsies de peau ont été broyées en utilisant un instrument Presselys 24 (Ozyme) dans 350 pL de tampon pour lyse (Promega). L'ARN total a été extrait ensuite en utilisant une trousse SV Total RNA Isolation System, selon les instructions fournies par le constructeur (Promega). Une réaction par transcription inverse a été effectuée ensuite dans un volume total de 20 pL, en utilisant un mélange Master Mix ARN vers ADNc de capacité élevée fourni par Applied Biosystem. L'expression des gènes ABCB1, ABCC2, ABCC3 et ABCG2 a été analysée en double par une PCR en temps réel, utilisant des amorces sens et antisens et une sonde TaqMan spécifiques fournies par Applied Biosystem. Le gène GAPDH a été utilisée comme gène domestique pour normaliser l'expression de chaque gène. La figure 1 (courbe d'amplification des ABCB1, ABCC1, ABCC2 et ABCG2 dans de la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures) présente la courbe d'amplification de chaque gène amplifié et la Figure 2 (expression des transporteurs ABC dans la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures) présente l'expression relative de chaque gène par comparaison avec le gène ABCB2 codant pour MRP1. Les résultats montrent clairement que, dans la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures, l'ensemble des quatre gènes est exprimé dans la peau humaine. L'expression du gène ABCC1 codant pour le transporteur MRP1 est très élevée par comparaison avec les gènes codant pour MDR1, MRP2 et BCRP, dans lesquels l'expression est relativement faible. Ces résultats montrent que, dans la peau humaine en culture d'organes, les transporteurs ABC sont exprimés et que donc la peau humaine en culture d'organes peut être utilisée pour étudier l'implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. EXEMPLE 2 : Mesure de la perte insensible d'eau dans des échantillons de peau humaine La perte insensible d'eau (TEWL) a été mesurée en utilisant un Tewameter TM 300® (Courage & Khazaka electronic GmbH, Allemagne) avec une chambre de mesure ouverte. Les échantillons de peau ont été montés sur une cellule de diffusion en verre (superficie nominale de 1 ou 2 cm2 et compartiment receveur ayant des capacités de 3 mL). La face épidermique de la peau a été exposée aux conditions atmosphériques alors que la face dermique a été en contact avec le fluide récepteur (milieu de culture de peau de longue durée (Biopredic, France) maintenu à 32 °C). La TEWL initiale a été mesurée en triple (trois échantillons de peau). Pour la perforation de la peau avec le Dermaroller ou pour le décapage de la peau, on a retiré les échantillons de peau des cellules de diffusion, on les a fixés sur des plaques en liège et on les a décapés ou percés tel que décrit ci-dessus. Après le décapage ou la perforation, les échantillons de peau ont été placés à nouveau sur les cellules de diffusion et la TEWL a été mesurée à des intervalles de temps appropriés, sur 19 heures et 25 heures pour le dermaroller et le décapage respectivement. La Figure 3 (effet d'un décapage sur la TEWL dans des échantillons de peau humaine ex vivo) présente l'effet d'un décapage sur la TEWL et la Figure 4 (effet du dermaroller sur la TEWL dans des échantillons de peau humaine ex vivo) présente l'effet du dermaroller sur la TEWL. Les résultats montrent que la valeur de la TEWL augmente proportionnellement au nombre de bandes adhésives utilisées, jusqu'à 20 bandes, puis elle a atteint un plateau. Plus aucune augmentation de la TEWL n'a été observée, même en utilisant 50 bandes. Une augmentation de la valeur de la TEWL de six fois a été observée quand on a utilisé 20 bandes adhésives pour ôter la couche cornée. La valeur de 30 bandes a été utilisée comme valeur standard dans les expériences ultérieures. Les résultats montrent également que la valeur de la TEWL a augmenté après 20 passages de dermaroller et elle a atteint un plateau, sans qu'aucune autre augmentation n'ait été observée après 30 ou 50 passages de dermaroller. Une augmentation de la valeur de la TEWL de quatre fois a été observée quand on a utilisé 20 passages de dermaroller pour interrompre la couche cornée. La valeur de 32 passages de rouleau a été utilisée comme valeur standard dans les expériences ultérieures. EXEMPLE 3 : Implication de transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de Vinblastine 30 dans des échantillons de peau humaine La molécule substrat modèle Vinblastine a été utilisée tout au long de cette expérience. La Vinblastine est connue pour être un substrat spécifique des MDR1. 35 La molécule inhibitrice modèle Vérapamil a été utilisée tout au long de cette expérience. Le Vérapamil est connu pour être un inhibiteur spécifique des MDR1. De la Vinblastine marquée au tritium a été utilisée. Une solution isotopique de [3H]-vinblastine a été préparée avec une concentration finale de 10 mM dans du méthanol (1 mCi/mL). Le Vérapamil a été préparé avec une concentration finale de 10 mM dans le véhicule constitué par de ('éthanol/NaCl à 0,9% (25/75, v/v). Le véhicule utilisé pour traiter les échantillons de peau témoins était constitué par de l'éthanol/NaCl à 0,9% (25/75, v/v). Les échantillons de peau ont été traités d'abord avec la solution d'inhibiteur vérapamil. Pour ce faire, 20 pL de solution de vérapamil ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau 10 en utilisant une micropipette, correspondant à 10 pL/cm2 de surface cutanée. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes. En parallèle, d'autres échantillons de peau (échantillons témoins) ont été traités avec le véhicule de l'inhibiteur utilisé, constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Pour ce faire, 20 pL du véhicule ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau, en utilisant une 15 micropipette. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes. À la fin de la période de traitement, les échantillons de peau à la fois témoins et ceux traités par l'inhibiteur ont été traités avec une solution de [3H]-vinblastine. Pour ce faire, la solution isotopique de [3H]-vinblastine à 10 mM a été diluée 4 fois dans du NaCl à 0,9%, atteignant une concentration finale de 2,5 mM. Vingt microlitres de cette solution diluée ont été 20 appliqués à la surface de chaque échantillon de peau, correspondant à 10 pL/cmZ. La durée du traitement avec la vinblastine a été de 16 heures. À la fin de la période de traitement avec la Vinblastine, le fluide récepteur a été analysé par comptage de scintillation liquide dans le but de mesurer la quantité de Vinblastine ayant atteint le fluide récepteur (absorption). 25 La distribution de la Vinblastine dans la peau a été analysée par autoradiographie. Des échantillons de peau ont été placés sur un porte-tissus et cryo-montés dans un milieu d'enrobage pour cryo-montages. Les blocs congelés ont été tranchés en coupes de 8 à 10 pm d'épaisseur, perpendiculaires à la surface de l'épiderme, dans un cryomicrotome 30 (Thermo Electron). Les coupes ont été recueillies sur des lames de verre et séchées. Les cryo-coupes ont été placées sur une plaque pour imagerie Fuji de type Bas-III (20 x 40 cm) dans une cassette Fujix Bas 2040, pendant 24 heures jusqu'à 5 jours. La plaque exposée a été scannée avec un analyseur Bio-Imaging (Fujix BAS 2000). Les images scannées ont été analysées en utilisant un logiciel TINA. 35 Dans certaines expériences, l'absorption cutanée in vitro de vinblastine a été réalisée sur des échantillons de peau intacte sans un quelconque décapage adhésif ni perforation par dermaroller. Dans d'autres expériences, l'absorption cutanée in vitro de vinblastine a été réalisée sur des échantillons de peau décapée par bandes adhésives (30 bandes) ou de peau ayant été passée au dermaroller (32 passages de rouleau). Pour la peau décapée par bandes adhésives, des morceaux de peau d'une surface appropriée (environ 2 x 2 cm) ont été placés sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau ont été étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. La surface de la peau a été décapée avec 30 morceaux de bande adhésive. La bande adhésive était d'une taille suffisante pour couvrir la totalité de la surface de la peau devant être en contact avec le composé à tester. Pour la perforation avec le dermaroller, les morceaux de peau d'une surface appropriée (environ 2 x 2 cm ou moins) sont placés sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. Le Dermaroller® modèle CIT8 a été roulé par cycles de huit fois, en exerçant une pression avec la main sur celui-ci, dans quatre directions sur la surface de la peau (32 passages). Le Dermaroller a été fourni par DISTRIMED SARL, Luxembourg. Le modèle CIT8 a été utilisé. Le modèle CIT8 possède 24 arrangements circulaires de 8 aiguilles chacun, d'une longueur de 500 pm (192 aiguilles au total) dans un assemblage cylindrique, le cylindre ayant 2 cm de diamètre et 2 cm de longueur. Les expériences d'absorption cutanée in vitro de vinblastine avec les échantillons de peau intacte et de peau décapée par bandes adhésives ont été effectuées sur des cellules de diffusion en verre, avec une superficie nominale de 2 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 3 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 20 pL, correspondant à 10 pL/cm2. Les expériences avec des échantillons de peau intacte ont été réalisées en triple sur 5 donneurs différents (N = 15), tandis que les expériences avec la peau décapée par bandes adhésives ont été effectuées en triple sur 6 donneurs différents (N = 18). Des expériences d'absorption cutanée in vitro de vinblastine avec des échantillons de peau percée par dermaroller ont été effectuées sur une plaque Transwell à 6 puits, avec une surface de peau traitée de 1 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 1,5 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 10 pL, correspondant à 10 pL/cm2. Les expériences avec des échantillons de peau ayant été passée au dermaroller ont été réalisées en triple sur 4 donneurs différents (N = Il). La Figure 5 (absorption cutanée de vinblastine dans de la peau intacte ainsi que dans des peaux décapées et passées au dermaroller) présente l'effet d'un traitement cutané sur l'absorption cutanée de Vinblastine par la peau humaine. La Figure 6 (distribution cutanée de la vinblastine dans des échantillons de peau humaine non traitée et décapée, analysés par autoradiographie de coupes de peau) présente la distribution de la Vinblastine dans de la peau humaine non traitée et décapée, analysée par autoradiographie. La Figure 7 (effet du Vérapamil sur l'absorption cutanée de Vinblastine dans des échantillons de peau humaine intacte) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption de Vinblastine par la peau humaine dans des échantillons de peau humaine intacte. La Figure 8 (effet du vérapamil sur l'absorption cutanée de vinblastine dans des échantillons de peau humaine passée au dermaroller) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption de Vinblastine par la peau humaine dans des échantillons de peau humaine passée au dermaroller. Les résultats montrent que, dans des échantillons de peau intacte, l'absorption cutanée de vinblastine est très faible et représente seulement 0,001% de la dose appliquée (correspondant à 0,003 nmol). Le décapage ainsi que la perforation de la peau avec un dermaroller augmentent considérablement l'absorption cutanée de la vinblastine. En effet, l'absorption cutanée de vinblastine représentait 0,07 nmol et 0,6 nmol dans les peaux décapées et passées au dermaroller respectivement. Ceci implique que le décapage par bandes adhésives a augmenté l'absorption cutanée de vinblastine de 20 fois environ et que la perforation de la peau par le dermaroller a augmenté l'absorption cutanée de vinblastine de 200 fois environ. Ces résultats indiquent aussi que, dans les conditions utilisées, la perforation de la peau avec le dermaroller est un meilleur outil que le décapage par bandes adhésives pour le renforcement de l'absorption cutanée de vinblastine. Les résultats montrent que, dans la peau non traitée, un signal très faible apparenté à la vinblastine est observé dans la partie la plus supérieure de la coupe de peau correspondant à la couche cornée. Aucun signal n'a été observé dans les couches plus profondes. Dans la peau décapée par bandes adhésives (30 bandes), où la couche cornée a été ôtée, on a observé une augmentation notoire de l'intensité du signal apparenté à la vinblastine. Ceci indique que le décapage par bandes adhésives fait augmenter la pénétration de la vinblastine dans les couches plus profondes d'un échantillon de peau. Ce résultat est conforme au résultat obtenu à la Figure 5, montrant que le décapage par bandes adhésives fait augmenter, de manière notoire, la quantité de vinblastine absorbée dans le fluide récepteur. Les résultats montrent que, dans les échantillons de peau non traitée, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite par un traitement au vérapamil. En effet, l'absorption de vinblastine a été réduite de 18% par du vérapamil appliqué par voie topique. Comme le vérapamil est un inhibiteur connu du transporteur MDR1, ce résultat suggère que le transporteur MDR1 est impliqué dans l'absorption cutanée de la vinblastine. Le résultat montre que, dans les échantillons de peau humaine perforés au dermaroller, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite par du vérapamil appliqué par voie topique. En effet, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite de 14% par du vérapamil appliqué par voie topique. Comme le vérapamil est un inhibiteur connu du transporteur MDR1, ce résultat suggère que le transporteur MDR1 est impliqué dans l'absorption cutanée de la vinblastine. EXEMPLE 4 : Implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de la Rhodamine123 dans des échantillons de peau humaine La molécule substrat modèle Rhodamine 123 a été utilisée tout au long de cette expérience. 25 La Rhodamine 123 est connue pour être un substrat des MDR1. La molécule inhibitrice modèle Vérapamil a été utilisée tout au long de cette expérience. Le Vérapamil est connu pour être un inhibiteur spécifique des MDR1. 30 La Rhodamine est une molécule fluorescente. Une solution de Rhodamine 123 a été préparée avec une concentration finale de 2,5 mM dans du DMSO à 25%. Le Vérapamil a été préparé avec une concentration finale de 10 mM dans le véhicule constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Le véhicule utilisé pour traiter les échantillons témoins était constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Les échantillons de peau ont été traités d'abord avec la solution d'inhibiteur vérapamil. Pour ce faire, 20 pL de solution de vérapamil ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau, en utilisant une micropipette, correspondant à 10 pL/cm2 de surface cutanée. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes. En parallèle, d'autres échantillons de peau (échantillons témoins) ont été traités avec le véhicule de l'inhibiteur utilisé, constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Pour ce 10 faire, 20 pL du véhicule ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau en utilisant une micropipette. La durée du traitement avec le véhicule a été de 30 minutes. A la fin de la période de traitement, les échantillons de peau à la fois témoins et ceux traités par l'inhibiteur ont été traités avec une solution de Rhodamine 123. Pour ce faire, 20 pL de la solution de Rhodamine 123 à 2,5 mM ont été appliqués à la surface de chaque échantillon 15 de peau, correspondant à 10 pL/cm2. La durée du traitement avec la Rhodamine 123 a été de 16 heures. Les expériences d'absorption cutanée in vitro de la Rhodamine 123 ont été réalisées avec des échantillons de peau intacte. Des échantillons de peau congelés ont été utilisés dans 20 ces expériences. Après les avoir dégelés, les échantillons de peau ont été montés sur des cellules de diffusion en verre, avec une superficie nominale de 2 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 3 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 20 pL, correspondant à 10 pL/cm2. Un total de 4 expériences différentes a été réalisé sur un donneur et chaque expérience a été effectuée en double (N = 8). 25 À la fin de la période de traitement avec la Rhodamine 123, le fluide récepteur a été analysé directement en triple, via un spectrofluorimètre pour microplaques SYNERGY 2 (Biotech) dans le but de mesurer la quantité de Rhodamine 123 qui avait atteint le fluide récepteur (absorption). Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission étaient de 485 et 590 respectivement. L'analyse a été exécutée avec un logiciel Gen5. 30 La distribution de la Rhodamine 123 dans la peau a été analysée par microscopie à épifluorescence. Des échantillons de peau ont été placés sur un porte-tissus et cryo-montés dans un milieu d'enrobage pour cryo-montages. Les blocs congelés ont été tranchés en coupes de 4 à 10 pm d'épaisseur, perpendiculaires à la surface de l'épiderme, dans un cryomicrotome (Thermo Electron). Les coupes ont été recueillies sur des lames de verre et séchées. Les cryo-coupes ont été étudiées sous un microscope à épifluorescence avec un filtre TRITC (eclipse, 80i L ; Nikon). Le microscope, équipé d'un appareil photo numérique (DS-5M-Ll, Nikon), a été utilisé pour la capture des images. La Figure 9 (effet du vérapamil sur l'absorption cutanée de Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption cutanée de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine. Ce résultat montre que, dans des échantillons de peau humaine intacte, l'absorption cutanée in vitro de Rhodamine 123 était très faible et représentait environ 0,4% de la dose appliquée. Cependant, par comparaison avec l'absorption cutanée de Vinblastine dans des échantillons de peau intacte, dans lesquels l'absorption cutanée représentait seulement 0,001% de la dose appliquée, la Rhodamine 123 pouvait être considérée comme étant bien absorbée. De plus, le résultat montre que, dans les échantillons de peau humaine intacte, l'absorption cutanée de Rhodamine 123 a été significativement réduite par un traitement au Vérapamil (test t, p La Figure 10 (distribution cutanée de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine) présente la distribution de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine. Figure 10 A : coupe cutanée d'un échantillon de peau témoin sans un quelconque traitement 25 (sans Rhodamine) montrant le niveau basique d'autofluorescence. Figure 10 B : coupe cutanée d'un échantillon de peau traité avec de la Rhodamine 123 montrant une augmentation de la fluorescence rouge due à la Rhodamine 123. Ces résultats montrent que la Rhodamine 123 est distribuée principalement dans les 30 couches supérieures de la coupe de peau, correspondant à l'épiderme et à la couche cornée. Par comparaison avec la coupe de peau témoin, une augmentation de la fluorescence dans le derme peut être également observée, ce qui indique que la Rhodamine 123 est distribuée aussi dans le derme, mais dans une moindre mesure. Ces résultats sont conformes aux résultats présentés à la Figure 9, indiquant que la Rhodamine 123 a été absorbée dans le 35 fluide récepteur. Aucune différence d'intensité de fluorescence n'a été observée dans les coupes d'échantillons de peau traités avec le Vérapamil (données non présentées). Ceci a été probablement dû à la saturation du signal de fluorescence observée dans les couches supérieures des échantillons de peau. Les résultats présentés dans l'exemple 4 et dans l'exemple 5 montrent que l'absorption cutanée de Vinblastine et de Rhodamine 123, deux substrats des transporteurs ABC, a été inhibée par le Vérapamil, un inhibiteur du transporteur ABC. Ceci indique que les transporteurs ABC de la peau, principalement le MDR1, sont impliqués dans l'absorption et la distribution cutanées humaines de la Vinblastine et la Rhodamine 123. Tous les résultats présentés avec les molécules modèles utilisées comme substrat et inhibiteur des transporteurs ABC, couplées à un système d'absorption cutanée humaine, apporte la preuve que le modèle présenté dans ces travaux représente un outil sensible, facile et approprié pour l'étude de l'implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution cutanées de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. REVENDICATIONS1. Procédé pour évaluer l'influence de transporteurs d'une cassette de liaison à l'ATP (ABC) sur la pénétration d'une substance médicamenteuse dans la peau humaine, le procédé comprenant les étapes consistant à : (1) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes ; (2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture d'organes ; (3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes ; (4) Mettre en contact à la fois l'échantillon de peau témoin et celui traité avec l'inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes ; (5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance 15 médicamenteuse recueillie dans le récepteur liquide (absorption) après pénétration à travers la peau ; (6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et (7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier 20 échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel des échantillons de peau humaine sont préparés ex vivo sans graisse sous-cutanée. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les conditions de culture d'organes sont, de préférence, de 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 72 heures environ. 30 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le premier échantillon de peau est mis en contact avec l'inhibiteur du transporteur ABC, de préférence à 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 1 heure environ. 25 10 . Procédé selon la revendication 1, dans lequel le deuxième échantillon de peau est mis en contact avec le véhicule, de préférence à 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 1 heure environ. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel à la fois le premier (inhibiteur) et le deuxième (témoin) échantillons de peau sont mis en contact avec la substance médicamenteuse, de préférence à 37°C environ et pendant une durée allant de 1 heure environ à 72 heures environ et, plus préférablement, de 16 heures environ. 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la substance médicamenteuse utilisée est choisie pour le traitement de maladies de peau telles que des maladies inflammatoires de la peau, maladies de peau virales, maladies de peau fongiques, maladies de peau bactériennes et maladies cancéreuses de la peau.