FR 2984081 A1 20130621 FR 1162098 A 20111220 PROCEDE DE LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE LES PSEUDOMONAS La présente invention concerne un nouveau procédé de lutte biologique contre la présence de Pseudomonas, et sa prolifération. Pseudomonas est une bactérie Gram négatif appartenant à la famille des Pseudomonadaceae. Cette bactérie est responsable chez l'homme de diverses infections cutanées, viscérales et pulmonaires, notamment les fibroses cystiques (4, 19). Ces bactéries sont capables de résister à de nombreux antiseptiques et antibiotiques (2) (7) expliquant sans doute en partie leur présence de plus en plus fréquente en milieu hospitalier où elles peuvent être isolées de l'environnement humide (éviers, siphons, vases, linge et objets de toilette, récipients contenant de l'eau etc). Certaines espèces présentent aussi un pouvoir pathogène envers les végétaux (8), les nématodes (10) et les amibes (1, 11, 16). Aussi, la surveillance et le contrôle de cette bactérie constituent une préoccupation de plus en plus importante. De façon générale, il est connu que dans l'environnement, Pseudomonas présente une répartition ubiquitaire (5), puisque cette bactérie a été isolée du sol, des eaux d'égouts ou des eaux de rejets industriels, et des biofilms, caractéristiques qu'elle partage avec les amibes libres. Plusieurs bactéries potentiellement pathogènes (Legionella pneumophila, Mycobacterium spp., et Escherichia coli 0157 :H7) ont développé des mécanismes pour survivre et se répliquer à l'intérieur des amibes libres (15). De plus, il a été démontré que les bactéries, dont Pseudomonas, peuvent développer différentes stratégies leur permettant d'échapper à la prédation par les amibes libres (12, 13, 18). En particulier, la formation du biofilm par Pseudomonas aeruginosa est un des mécanismes permettant à la bactérie d'échapper efficacement à la prédation par les amibes libres comme Acanthamoeba polyphaga (18). Bien qu'il soit connu que certaines amibes libres comme Acanthamoeba soient capables de développer une réponse chémotactique envers Pseudomonas et de se nourrir sur ces bactéries (17, 18), il a aussi été démontré que Pseudomonas aeruginosa inhibe rapidement la croissance de ces amibes et induit leur enkystement et leur mort en sécrétant des toxines (11-13, 17, 18). L'effet toxique des Pseudomonas a aussi été démontré sur des protozoaires ciliés (9). Il apparaît donc clairement que les protozoaires et amibes libres constituent un élément important de l'écologie de Pseudomonas. De plus, la capacité de Pseudomonas à infecter et de survivre intracellulairement dans les protozoaires est un puissant indicateur que ces protozoaires sont des facteurs favorisant la résistance des Pseudomonas aux traitements biocides actuellement utilisés, comme indiqué par Michel et al., (14). Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence, de façon totalement inattendue, que le genre amibien Willaertia magna éradique les bactéries Pseudomonas. Cet effet biocide, est doublé de la capacité de prédation déjà démontré de Willaertia magna envers d'autres agents amibiens qui peuvent servir de vecteur à Pseudomonas (3). La présente invention a donc tout d'abord pour objet un procédé de lutte contre la prolifération des Pseudomonas, qui utilise des protozoaires du genre Willaertia magna. Les procédés conformes à l'invention n'incluent pas les méthodes de traitement appliquées au corps humain ou animal. Dans le procédé selon l'invention, c'est le plus souvent un flux gazeux ou liquide qui est traité avec des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. Le procédé selon l'invention trouve, en particulier application, dans la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissement des installations industrielles, ou des réseaux de climatisation. Les protozoaires pourront être directement ajoutés aux eaux ou aux liquides circulant dans les canalisations ou dans les réseaux à traiter. Il est également possible de les pulvériser, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse en aérosol, dans les réseaux, les cheminées, les installations et les surfaces industrielles à désinfecter. De façon avantageuse, les protozoaires utilisés dans le cadre de l'invention correspondent, à la souche déposée le 26 août 2006 sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC, ou à la souche déposée le 26 août 2006 sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC, ces deux souches ayant été déposées aux noms du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16 / FRANCE - et UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex / FRANCE. Les protozoaires appartenant au genre Willaertia correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC font partie intégrante de l'invention. De tels protozoaires pourront donc être utilisés dans des agents désinfectants, en particulier destinés à l'élimination des bactéries Pseudomonas et à lutter contre la prolifération et la contamination par Pseudomonas. D'autre part, l'invention a pour objet un agent désinfectant contenant des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. Les protozoaires correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC seront préférés. De façon avantageuse, l'agent désinfectant selon l'invention se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, par exemple dans de l'eau distillée. L'agent désinfectant pourra se présenter sous une forme pulvérisable, par exemple en aérosol ou tout autre moyen d'application. L'activité des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna, inhibant la prolifération de Pseudomonas a été mise en évidence par les inventeurs en comparant la réplication de Pseudomonas chez les genres Acanthamoeba et Hartmannella utilisés en tant que modèles amibiens avec celle observée chez le genre amibien Willaertia. L'activité des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna, est aussi mise en évidence en démontrant l'effet de prédation de Willaertia magna sur des biofilms formés par Pseudomonas aeruginosas. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un agent désinfectant ou d'un protozoaire comme décrit plus haut comme biocide sur les Pseudomonas. Etant donné le rôle essentiel joué par les amibes dans la prolifération et le maintien de Pseudomonas dans le milieu extérieur, le procédé et l'agent désinfectant selon l'invention présentent de nombreux avantages, en termes de coût, d'efficacité et de respect de l'environnement, notamment. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figure 1 montre l'évolution spontanée des populations respectives d'amibes Hartmannella vermiformis (symbole « carré » ^), Acanthamoeba castellanii (symbole « losange » -) et Willaertia (Willaertia magna - symbole « triangle » A) après mise en coculture avec Pseudomonas à un ratio amibe/bactérie initial de 10. Les différentes amibes libres sont mises en cocultures (temps 0 heure=TO) avec Pseudomonas à un ratio de 10 (10 bactéries / une amibe) comme décrit dans la partie matériels et méthodes. Des aliquotes des suspensions de coculture sont prélevés toutes les 3 heures : soit TO, T0+3h, T0+6h. Le pourcentage d'amibes vivantes est déterminé par un test d'exclusion au bleu trypan et une observation microscopique à l'aide d'une cellule de Mallasez. Les données sont exprimées en % de cellules vivantes, négatives au test d'exclusion au bleu trypan. La Figure 2 montre la croissance de Pseudomonas en cocultures avec 15 Acanthamoeba et Hartmannella mais pas avec Willaertia. Les amibes (5 x 104) ont été resuspendues dans l'eau et ensemencées dans les puits. Après 1 heure, Pseudomonas est ajouté dans les puits de façon à atteindre différents MOI comme indiqué sur le panel A. Les cocultures sont incubées à 30°C 20 et examinées après 24 et 48 heures. A. Noter l'absence de prolifération bactérienne dans le puits contenant Willaertia avec Pseudomonas. B. 100 lai de surnageant des puits contenants 100 bactéries/1 amibe et 10 bactéries / 1 amibe (M01 100 et MOI 10 respectivement) sont successivement dilués (dilutions allant de 10-6 à 10-8 avec de l'eau désionisée stérile) et ensemencés sur gélose TSA. 25 Noter l'absence de développement de colonies bactériennes dans le surnageant des cocultures avec Willaertia magna (W), et à l'opposé le fort développement de Pseudomonas en présence d' Hartmanella (H). La Figure 3 montre les cinétiques comparées du développement de 30 Pseudomonas (symbole « losange » -) obtenues en coculture avec différents genres amibiens, dont le genre Willaertia (Willaertia magna - symbole « croix » Les différentes amibes libres sont séparément mises en cocultures (temps 0 35 heure=TO) avec Pseudomonas à un ratio de 10 (10 bactéries / une amibe). Des aliquotes des suspensions de coculture sont prélevés toutes les 3 heures : soit T0, T0+3h, T0+6h et les concentrations en Pseudomonas déterminées comme décrit dans la partie matériels et méthodes. Un témoin positif, comprenant uniquement la bactérie Pseudomonas en concentration équivalente à celle des cocultures servira de contrôle de la croissance de Pseudomonas dans le milieu. Noter la multiplication bactérienne dans les cocultures avec Acanthamoeba castellanii (symbole « carré » ^) et Hartmannella vermiformis (symbole « triangle » A). La Figure 4 montre l'effet biocide des Willaertia magna sur un biofilm formé par 10 Pseudomonas. Les Pseudomonas et Willaertia magna ont été ensemencées sur gélose TSA, et incubées à 30°C pendant 24h. A. Les plages de lyse du biofilm de Pseudomonas se forment sur et au delà des dépôts de Willaertia magna comme indiqué par les 15 flèches sur la Figure 4 A. B. Front d'une plage de lyse du biofilm indiqué par la flèche. Noter à droite, le lieu de dépôt de Willaertia magna et l'absence de film bactérien. Noter à gauche le tapis de Pseudomonas. 1. MATERIEL ET METHODES 20 1.1. Souches utilisées: Pseudomonas : la souche utilisée est la souche CL 5210 (Oxoid, France). - . Elle est entretenue sur gélose TSA (Tryptone Soja Agar) (ref PO 5012, 25 Oxoid, France) à raison d'un repiquage par semaine. La souche est ensemencée en stries larges sur boîte de gélose TSA et incubée 2 jours à 30°C. - Amibes : les souches utilisées appartiennent à trois espèces amibiennes différentes : 30 o Hartmannella vermiformis, o Acanthamoeba castellanii , (ATCC 30010) o Willaertia magna (souches déposées à ATCC sous les n° PTA7824 et PTA 7825), 35 Ces trois souches sont cultivées axéniquement , en présence de 10% de sérum de veau foetal, sur milieu SCGYEM (Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium), réparti en tubes FALCON® (3033) à raison de 3m1 par tube. En entretien, les formes végétatives sont repiquées tous les 8-9 jours. Pour les cocultures, on utilise des repiquages de 3 à 4 jours de manière à disposer de trophozoites en pleine phase de croissance exponentielle. Le milieu SCGYEM est obtenu comme suit : - Caséine (MERCK 1.02244.010) 10 g - Na2HPO4 1,325 g - KH2PO4 0,8 g - Glucose 2,5 g - Extrait de levure (DIFCO 0127-17-9) 5 g - Eau distillée 900 ml - Sérum de veau foetal 100 ml Aux 900 ml d'eau distillée, on ajoute 2,5 ml de NaOH (1N), puis Na2HPO4 et 15 KH2PO4. On chauffe légèrement sur plaque chauffante, puis on ajoute progressivement la caséine sous agitation magnétique. Après dissolution de la caséine, on incorpore le glucose et l'extrait de levure. Après dissolution complète, on filtre successivement sur fibre de verre 20 (SARTORIUS SM 6513400), puis sur membrane de 1pm (WHATMAN 7190 004). Le milieu est ensuite aliquoté en flacons de verre. Les flacons sont stérilisés à l'autoclave 20 minutes à 120°C. Avant l'utilisation définitive et répartition du milieu, on ajoute stérilement sous hotte à flux laminaire le sérum de veau foetal à raison de 10% du volume final. 25 1.2. Coculture monoamibienne de Pseudomonas. 1.2.1. Préparation de l'inoculum bactérien: 30 A partir d'une culture de 2 jours sur gélose TSA, on prépare une suspension de Pseudomonas dans de l'eau distillée stérile de façon à obtenir 1 unité de Densité Optique à 550nm, soit une concentration de 109 UFC (Unité formant colonie) /ml. 1.2.2. Réalisation des cocultures mono-amibiennes 35 Les cocultures sont réalisées dans des tubes pour cultures cellulaires (FALCON® 3033) contenant 3 ml d'eau stérilisée par autoclave. L'ensemencement des tubes se fait à raison de 1 x 105 amibes/ml, à partir d'une suspension amibienne 10 axénique préalablement dénombrée sur un hématimètre de Malassez. L'infestation des amibes par Pseudomonas est réalisée en fixant un ratio Pseudomonas / amibe de10, soit 1 x 106 bactéries / ml de milieu d'incubation. Aussitôt après l'infestation, les tubes de cocultures sont centrifugés à faible vitesse (760g pendant 10 min) pour favoriser le contact entre amibes et bactéries. Après 10 min, les tubes sont remis en suspension manuellement et sont incubés, en position inclinée, à l'étuve à 30°C. Les devenirs des amibes et de Pseudomonas mis en coculture sont déterminés de la façon suivante : Les cocultures sont suivies pendant 6 heures après l'infestation bactérienne. A chaque intervalle de temps (toutes les 3 heures), les tubes de coculture sont prélevés et examinés à la fois du point de vue amibien et bactérien après agitation vigoureuse au vortex afin de détacher les amibes des parois. Pour chaque tube examiné: - La numération des amibes s'effectue directement sur cellule de Malassez. - La détermination des concentrations en Pseudomonas est effectuée par étalement direct du milieu de culture sur gélose TSA après dilution de 10 en 10 en eau distillée stérile, dans des microtubes Eppendorf. Chaque dilution est étalée en triplicat sur gélose TSA à raison de 100111 par boîte. Les boîtes sont alors mises à incuber à 30°C pendant 48 heures au minimum. Une première lecture des géloses TSA s'effectue 24 heures après l'étalement en dénombrant les colonies; elle est suivie d'une deuxième lecture au 2ème jour pour confirmation. Les concentrations de Pseudomonas sont exprimées en UFC / ml de milieu d'incubation en tenant compte du facteur de dilution et en supposant que chaque colonie correspond à 1 bactérie initialement présente dans la suspension diluée. Pour chaque genre amibien, les courbes de croissance de Pseudomonas, sont représentées en fonction du temps. De plus, l'éventuel effet cytotoxique de Pseudomonas sur les différentes espèces d'amibes est déterminé de la façon suivante : - en comptant la proportion d'amibes présentant une positivité au test d'exclusion au bleu trypan. Ce test est réalisé sous microscope en comptant sous cellule de Malassez le nombre de cellules positives au bleu trypan / au nombre de cellules totales. 1.3. Effet de Willaertia magna sur les biofilm de Pseudomonas. Les Willaertia ont été déposées sur le tapis de Pseudomonas qui venait d'être étalé sur la gélose TSA. Les géloses sont placées à 30°C pendant 24 heures de façon à permettre le développement d'un film bactérien sur la surface de la gélose. Les géloses sont ensuite observées au microscope optique (grossissement x 400) afin d'y détecter la formation d'éventuelles plages de lyse du tapis bactérien. 2. RÉSULTATS 2. 1. Willaertia magna présente une résistance à Pseudomonas. L'effet de Pseudomonas sur la survie des différentes espèces amibiennes testées a été déterminé par un test d'exclusion au bleu trypan. Très rapidement après mise en coculture d' Acanthamoeba castellanii avec la bactérie, il apparaît un effet cytotoxique majeur chez cette espèce amibienne, avec une chute de - 30% de la viabilité après 3 heures de coculture (voir Figure 1). A l'opposé ce phénomène n'est jamais observé lorsque Willaertia magna est mis en coculture avec Pseudomonas, y compris jusqu'à 9 heures d'incubation avec une viabilité se maintenant proche des 100% (Figure 1). Comme Willaertia magna, l'amibe libre Hartmanella vermiformis ne présente pas de chute en termes de viabilité déterminée par exclusion au bleu trypan (Figure 1). L'ensemble de ces observations (pas d'enkystement et pas de cytotoxicité induite par Pseudomonas) démontrent clairement que Willaertia magna et Hartmanella vermiformis, au contraire des autres espèces amibiennes du type Acanthamoeba castellanii, présentent la faculté originale de résister à Pseudomonas. 2.2. Prédation de Pseudomonas par Willaertia magna Les résultats des cocultures de Pseudomonas réalisées en présence d'amibes appartenant aux genres Hartmannella et Acanthamoeba démontrent une importante multiplication de la bactérie en présence de ces deux genres amibiens puisqu'on note une augmentation des concentrations bactériennes en 6 heures (voir Figure 2). A l'inverse, (alors que les cocultures sont réalisées dans des conditions strictement identiques), on constate en présence de l'amibe Willaertia magna une réduction de l'ordre d'un log des concentrations en Pseudomonas détectables, par rapport au témoin contenant Pseudomonas uniquement (voir Figure 2, et Figure 3). La chute mesurée des concentrations en Pseudomonas, démontre un effet massif de prédation des Willaertia magna envers Pseudomonas. Willaertia magna et Hartmannella vermiformis survivent, mais seule Willaertia magna empêche la prolifération bactérienne. Cet effet des Willaertia magna sur les Pseudomonas est encore illustré Figure 3 et 4. Après 48 heures d'incubation dans de l'eau les cocultures d'Acanthamoeba et Hartmannella avec la bactérie démontrent une prolifération de Pseudomonas (Noter l'aspect troublé des puits contenant Pseudomonas et Hartmanella ou Acanthamoeba, due à la prolifération bactérienne) (Figure 3, panel A). Les concentrations de Pseudomonas déterminées dans le surnageant des puits de coculture démontrent l'absence de bactéries avec Willaertia magna (Figure 3, panel B) lorsque celles-ci ont été incubées à un MOI de 10 (10 bactéries/ une amibe). L'effet de prédation des Willaertia magna sur Pseudomonas est aussi démontré sur la Figure 4. En effet, après 24 heures en présence des Willaertia magna, apparaissent très clairement des surfaces sur la gélose où le tapis bactérien a disparu (ces zones sont appelées ici plages de lyse du tapis/biofilm bactérien-Figure 4 panel A). L'examen microscopique des géloses montre aussi que les Willaertia magna sont concentrées à la limite de cette plage de lyse; cet effet est aussi illustré Figure 4 panel B, où apparaît clairement la disparition du tapis bactérien sous l'action des Willaertia magna. L'ensemble de ces données et observations montrent clairement l'effet de prédation de Willaertia magna envers la bactérie pathogène Pseudomonas ayant développé un biofilm. Références bibliographiques 1. Abd H, Wretlind B, Saeed A, Idsund E, Hultenby K, and Sandstrom G. Pseudomonas aeruginosa utilises its type III secretion system to kill the free-living 35 amoeba Acanthamoeba castellanii. J Eukaryot Microbiol 55: 235-243, 2008. 2. Ashish A, Shaw M, Winstanley C, Ledson MJ, and Walshaw MJ. Increasing resistance of the Liverpool Epidemic Strain (LES) of Pseudomonas aeruginosa (Psa) to antibiotics in cystic fibrosis (CF)-A cause for concern? J Cyst Fibros 2011. 3. Bodennec J, Dey R, and Pernin P. 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REVENDICATIONS1 - Procédé de lutte contre la prolifération de Pseudomonas, à l'exception des méthodes de traitement appliquées au corps humain ou animal, caractérisé en ce qu'il utilise des protozoaires du genre Willaertia. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on traite un flux gazeux ou liquide, ou une surface solide avec des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que ces protozoaires correspondant, avantageusement, à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour la désinfection des réseaux de distribution des eaux sanitaires ou des eaux industrielles, des circuits de refroidissement des installations industrielles, ou des réseaux de climatisation. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour lutter contre la formation de biofilms dans les canalisations d'eau, les surfaces en contact ou non avec des denrées alimentaires humaines ou animales. 6 - Agent désinfectant contenant des protozoaires du genre Willaertia, et en particulier de l'espèce Willaertia magna. 7 - Agent désinfectant selon l'une des revendications précédentes caractérisée 30 en ce que les protozoaires correspondent à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC. 8 - Agent désinfectant selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse. 35 9 - Protozoaires appartenant au genre Willaertia correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC. 15 20 25 10 - Utilisation d'un agent désinfectant ou d'un protozoaire selon l'une des revendications 6 à 9 comme biocide sur les Pseudomonas.