FR 2986802 A1 20130816 FR 1251340 A 20120213 DISPOSITIF ET PROCEDE DE MANIPULATION ET TRAITEMENT DE CELLULES PAR CHAMP ELECTRIQUE L'invention porte sur la manipulation et le traitement de cellules par un champ électrique. Une application est la thérapie cellulaire. Le processus de thérapie cellulaire est divisé en 5 phases principales : le prélèvement des cellules, la réception des cellules, le traitement des cellules, la distribution, l'administration et le suivi. Chacune de ces étapes présente divers enjeux spécifiques. L'invention concerne précisément le traitement cellulaire par champ électrique, en particulier l'électroporation, la transfection et l'électrofusion pour lesquelles des difficultés techniques persistent. Les différents effets d'un champ électrique sur une cellule sont montrés dans la figure 1. L'optimisation des conditions de transfection et la recherche de nouveaux mécanismes d'action de molécules accessibles par l'insertion ou l'inhibition de l'expression d'un gène, reste dans la biologie et la biotechnologie une question cruciale pour la qualité ainsi que pour la quantité produite et la stabilité des lignes cellulaires. Les limites de toutes les actions menées sur les cellules eucaryotes ou procaryotes sont liées à la barrière chimique induite par la membrane plasmique des cellules et sa grande sélectivité. Ainsi, seules les molécules hydrophobes traversent la membrane passive (transport passif), tandis que d'autres molécules comme les sucres ou les ions nécessitent l'intervention de protéines transnriernbranaires (transport actif). Toutefois, il est important de pouvoir introduire des molécules extracellulaires qui normalement ne pénétreraient pas la membrane cellulaire. Les méthodes classiques de transfert moléculaire utilisent des vecteurs viraux, l'électroporation, la fusion des liposomes, micro-injection, etc. Ces méthodes n'ont pas la capacité de sélectionner et de manipuler les cellules d'intérêt particulier. En général, elles utilisent une grande quantité de cellules sans sélectivité du traitement, en comptant sur l'effet statistique du nombre de transfection cellulaire. Cependant, dans de nombreux cas, leur efficacité est 1 réduite car il n'y a aucun contrôle sur cette quantité de cellules et le contrôle des agents externes permettant la transfection. L'électroporation fait partie de ces méthodes de transfection, utilisées dans la thérapie génie et la biologie moléculaire. Cette technique consiste à appliquer à une grande quantité de cellules des impulsions électriques d'amplitude importante (kVicm), ce qui rend la membrane plasmique perméable et permet le passage des macromolécules externes à l'intérieur de la cellule. Ce processus est généralement réversible. Cependant, deux problèmes majeurs résident dans l'application de cette technique à une grande quantité de cellules. Beaucoup de cellules sont détruites par l'utilisation de forts potentiels et beaucoup sont peu ou pas concernées par la transfection au cours du processus. Il en résulte une réduction significative du ratio d'efficience du nombre de gènes transfectés. Dans ce cas, la solution consiste à réduire la quantité de cellules traitées et à diminuer la tension appliquée pour éviter tout stress possible et pour augmenter les performances. La fusion cellulaire permet la formation in vitro d'une cellule hybride par l'union de deux cellules de lignées différentes mises en contact. La cellule hybride résultante renferme le contenu des deux cellules initiales au sein d'une membrane unique. Les techniques classiques de fusion utilisent des agents chimiques présentant des inconvénients (toxicité, faible rendement de fusion de l'ordre de 15-20%). L'électrofusion est une alternative qui comporte trois étapes mise en contact des cellules à fusionner par diélectrophorèse, application d'un champ électrique pulsé intense pour initier le processus de fusion, maintien en contact des cellules pendant la maturation des membranes fusionnées. Cette technique est complémentaire de la technique d'électroporation. Dans ce document, la manipulation des cellules est distinguée du traitement en ce que la manipulation concerne des opérations qui n'altèrent pas les propriétés biochimiques des cellules, comme par exemple leur déplacement, leur regroupement dans un piège, le contrôle de la 2 2 9 86 802 population d'un groupement. Le traitement de cellules désigne ainsi des procédés de transfection, perméabilisation, de fusion. Avec le développement des moyens de micro et nanofabrication, il est possible de miniaturiser les dispositifs de manipulation 5 et de traitement. Par exemple, l'article « Cell Reactions to Dielectrophoretic Manipulation », Biochemical and Biophysical Research Communications 257, 687-698 (1999) décrit un dispositif microfabriqué de piégeage diélectrophorétique de cellules. L'étude se porte notamment sur les effets de diélectrophorèse positive ou négative. La diélectrophorèse est dite positive 10 lorsque les objets déplacés sont attirés vers les zones ou le champ électrique est fort. Inversement, elle est dite négative lorsque les objets sont attirés par les zones de champ faible. Il est intéressant de noter que cet article rapporte que la diélectrophorèse de cellules est négative à basse fréquences, et devient positive au-delà du MHz. 15 Un autre dispositif microfabriqué pour piéger des cellules est décrit dans le document EP 1438140. Ce dispositif permet de piéger dans un réseau d'électrodes et de traiter des cellules en appliquant un champ électrique avec les mêmes électrodes. Parce que tous les pièges du réseau sont reliés aux mêmes potentiels, ce dispositif ne permet pas de gérer 20 plusieurs groupes de cellules à traiter sur un substrat, tout autant qu'il offre des moyens limités pour augmenter les rendements des traitements cellulaires. Par ailleurs, ce dispositif ne permet que le piégeage de cellules non-adhérentes. Ces dernières années, de nombreux dispositifs miniaturisés 25 d'électrodes ont vu le jour pour l'électroporation cellule par cellule, à faible tension, et avec un faible stress cellulaire. Tous ces dispositifs, plus ou moins complexes à fabriquer, comprennent et intègrent une microfluidique par des techniques de microfabrication en vue de manipuler de manière plus ou moins sophistiquée des cellules. Les références suivantes illustrent par des 30 réalisations particulières certaines de ces techniques. 3 2 986 802 Un dispositif combinant un traitement par champ électrique avec un moyen de manipulation cellulaire microfluidique est décrit dans l'article de Kim et al., Anal. Chem. 79, 7761-7766 (2007). Si ce dispositif permet d'électroporer un flux contrôlé de cellules, il ne permet de contrôler 5 des groupes de cellules sur un substrat. En outre, lors de l'électroporation les cellules ne sont pas immobilisées ; il faut donc adapter leur vitesse de déplacement au temps d'électroporation, ce qui n'est pas toujours facile. Par ailleurs, rien ne garantit l'homogénéité de l'électroporation. Un autre dispositif combinant traitement cellulaire par champ 10 électrique et manipulation microfluidique est décrit dans le document WO 2006004558. Les électrodes de cette invention servent non seulement à appliquer un champ électrique à des cellules mais aussi à réaliser un canal microfluidique. De plus, elles ont la particularité d'être munies de cavités, ce qui permet de créer (i) des zones de champ électrique fort et des zones de 15 champ faible, et (ii) des zones de flux microfluidique fort et des zones de flux faible. C'est ainsi que ce dispositif permet d'isoler avec un flux microfluidique fort des cellules confinées dans un champ électrique fort. Si ce dispositif permet de trier des cellules entre elles, il ne permet pas la gestion de groupes de cellules sur un substrat. En outre, aucune visualisation des cellules n'est 20 possible, et il n'est même pas possible de garantir leur présence. Un autre dispositif combinant manipulation microfluidique et électroporation est illustré dans le film joint aux informations supplémentaires de l'article de Valero et al,. Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device, Lab Chip 8, 62-67 25 (2008). Ce dispositif ne permet pas non plus de manipuler simplement des groups de cellules. En outre, lors de l'électroporation les cellules ne sont pas immobilisées ; il faut donc adapter leur vitesse de déplacement au temps d'électroporation, ce qui n'est pas toujours facile. Par ailleurs, rien ne garantit l'homogénéité de l'électroporation. 30 Palier à ces inconvénients de l'état de l'art est un objectif de l'invention. 4 Un autre objectif de l'invention est de pouvoir réaliser des traitements cellulaires séquentiels ou parallèles sur une même lignée cellulaire ou sur différentes lignées cellulaires pour comparaison. Un autre objectif est de pouvoir, avec une seule alimentation électrique, manipuler et traiter individuellement une pluralité de groupes de cellules. Un autre objectif est de pouvoir changer simplement la forme d'un groupement de cellules pour optimiser le traitement par champ électrique. Un autre objectif est_ de pouvoir aligner des cellules pour optimiser la transfection ou la fusion cellulaire. Un autre objectif est de pourvoir déplacer simplement des groupes de cellules entre plusieurs régions. Un autre objectif est d'accroitre le rendement d'un traitement cellulaire par une simple manipulation. Un autre objectif est de pouvoir réaliser un traitement cellulaire sur une cellule unique. Un autre objectif est de pouvoir réaliser des électroporations cellulaires sur une pluralité de groupes de cellules. Un autre objectif est de pouvoir réaliser un calibrage de l'électroporation dans des conditions répétables et reproductibles. Un autre objectif est de pouvoir calibrer les formes d'ondes appliquées pour l'électroporation dans des conditions aussi reproductibles et répétables que possibles. Un autre objectif est de pouvoir réaliser une électroporation homogène des cellules. Un autre objectif est d'avoir un levier de contrôle sur l'électroporation qui est indépendant de la forme d'onde des potentiels appliqués. Un autre objectif est de pouvoir réaliser efficacement la transfection sur des groupes de cellules individuels. 5 Un autre objectif est de pouvoir réaliser la fusion cellulaire sur des groupes individuels de cellules. Un autre objectif est de pouvoir avoir des groupements de cellules individuels et robustes. Un autre objectif est de pouvoir avoir un contrôle optique de l'état de plusieurs groupes de cellules. Un autre objectif est de pourvoir visualiser au microscope à champ proche des groupements de cellules particuliers. Conformément à l'invention, au moins un des buts précités peut être atteint par un procédé de manipulation et de traitement de cellules comprenant une étape de piégeage de cellules dans un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes microfabriquées sur un substrat, et une étape de traitement cellulaire par un champ électrique appliqué par les électrodes des pièges, et caractérisé en ce que lesdits pièges ont un adressage électrique qui est individuel. Selon des modes de réalisation avantageux du procédé de l'invention : - Le procédé peut comprendre un multiplexage des potentiels appliqués aux électrodes des pièges. - La manipulation cellulaire peut comprendre une modification de l'adressage électrique pour contrôler la forme d'un groupement cellulaire. - La manipulation cellulaire peut comprendre une étape d'alignement des cellules. - La manipulation cellulaire peut comprendre un déplacement de cellules entre une pluralité de pièges ; - La manipulation cellulaire peut comprendre un ajustement du nombre de cellules piégées dans un piège au moyen d'un contrôle de la durée du champ diélectrophorétique appliqué, et/ou d'un contrôle de sa valeur crête à crête, et/ou d'un microscope optique, et/ ou d'un ajustement de la taille du piège. 6 - Le traitement cellulaire peut comprendre l'électroporation de cellules. - Le procédé peut comprendre une étape de calibrage du produit durée * amplitude des impulsions de potentiels qui sont appliquées pour réaliser le traitement cellulaire par champ électrique. - L'électroporation peut être réalisée par une pluralité d'impulsions qui ont des amplitudes positives et négatives. Le procédé peut comprendre une étape d'ajustement de la concentration d'ions pour contrôler la taille des pores des cellules au cours de l'électroporation. - Le traitement cellulaire peut comprendre la transfection de cellules. - Le traitement cellulaire peut comprendre l'électrofusion de cellules. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules par microscopie à champ proche. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules avec un microscope optique par transmission grâce à la mise en oeuvre d'un substrat transparent. - La manipulation ou le traitement cellulaire peut comprendre un contrôle de l'état des cellules par mesure d'un courant entre les électrodes. Un autre objet de l'invention apportant des solutions aux problèmes précités est un dispositif pour manipuler et traiter des cellules par champ électrique comprenant un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes, dont les extrémités ont une taille inférieure au millimètre, sur un substrat, et caractérisé en ce que les pièges ont un adressage électrique qui est individuel. Selon des modes de réalisation avantageux du dispositif de l'invention : 7 - Le dispositif peut comprendre un multiplexeur connecté aux électrodes des pièges. - Les extrémités des électrodes d'un piège peuvent s'arranger selon les côtés d'un parallélogramme. - Le dispositif peut comprendre un microscope optique ou de champ proche pour contrôler l'état des cellules dans les pièges. - Le substrat peut être transparent. - Le dispositif peut comprendre un moyen de mesure du courant circulant entre les électrodes. - Le dispositif peut comprendre une solution aqueuse et un moyen de contrôle de sa concentration d'ions pour ajuster la cinétique du traitement cellulaire par champ électrique. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins suivants donnés à titre d'exemple : - La figure 1 montre un schéma des différents effets du champ électrique sur une cellule ; - La figure 2 montre une vue d'artiste d'un piège diélectrophorétique et un de ses procédés de fabrication ; - La figure 3 illustre le principe du piégeage diélectrophorétique, et les résultats de 4 expériences de piégeage diélectrophorétique réalisées selon l'invention ; - La figure 4 montre 8 photographies de 8 géométries d'électrodes pouvant réaliser un piège diélectrophorétique ; - La figure 5 montre un adressage individuel d'une pluralité de pièges diélectrophorétiques ; La figure 6 illustre un multiplexage entre une pluralité de pièges diélectrophorétiques et une alimentation ; - La figure 7 montre un déplacement de cellules entre une pluralité de pièges diélectrophorétiques ; 8 - La figure 8 montre deux vues de piéges diélectrophorétiques de tailles différentes qui contiennent peu de cellules, ou une cellule, ce qui peut permettre d'améliorer le rendement d'un traitement cellulaire ; - La figure 9 montre une modification de la forme d'un groupement de cellules par la modification de l'adressage des électrodes ; - La figure 10 montre un alignement de cellules par un contrôle de la forme et de la population d'un groupement de cellules ; - La figure 11 montre une forme d'onde élémentaire des potentiels électriques des électrodes à l'origine du traitement par champ électrique - l'électroporation, la transfection ou l'électrofusion ; - La figure 12 montre trois mesures en microscopie confocale de cellules transfectées par des molécules fluorescentes où l'électroporation est réalisée avec des impulsions de potentiel de durée croissante ; - La figure 13 montre la lyse (celle des cellules marquées par un cercle) induite par l'application d'impulsions de potentiels dont la durée ou l'amplitude est trop forte ; - La figure 14 illustre d'une part la méthode de calibrage des formes d'ondes de potentiel appliqué sur les électrodes, et montre d'autre part des rendements de survie et de transfection cellulaire ; - La figure 15 montre une forme d'onde de potentiel appliqué aux électrodes limitant la lyse ; - La figure 16 montre une forme d'onde de potentiel appliqué qui homogénéise l'électroporation des cellules entre cathode et anode ; - La figure 17 illustre un résultat de l'invention par l'observation en microscopie confocale de la transfection de nanoparticules relativement grosses ; - La figure 18 décrit un procédé de thérapie cellulaire comprenant une étape de d'électrofusion. 9 Un piège diélectrophorétique microfabriqué est montré dans la figure 2 a. Des électrodes 4 reposent sur un substrat 2. Ces électrodes ont des plots de contact 1 qui permettent de les connecter à un potentiel électrique établit par une alimentation électrique. La zone 3 délimite un piège diélectrophorétique. Un potentiel électrique appliqué sur les électrodes créé un champ électrique qui possède un extremum, un maximum ou un minimum, dans la zone 3. Ceci permet, lorsque le substrat est en présence d'une solution contenant des cellules, de préférence un milieu physiologique, de regrouper des cellules au sein de la zone 3, comme illustré dans la figure 3 a. Des cellules 5 au voisinage du piège formé par les électrodes 4 se déplacent au centre du piège 6 sous l'effet de la force de diélectrophorèse. Les résultats de quatre essais montrant l'efficacité de cet effet sont montrés dans la figure 3 b. Les inserts 1, 3, 5 et 7 montrent une vue prise au microscope optique avant application d'un potentiel électrostatique sur les électrodes. Les inserts 2, 4, 6 et 8 montrent une vue prise après. Les cellules au voisinage du piège s'y sont regroupées. Les 4 réalisations avant / après montrées ici diffèrent principalement par les concentrations et positions initiales de cellules. Elles illustrent de plus la fiabilité de l'opération. Les électrodes planaires sont réalisées par des techniques de microfabrication ; par exemples celles qui sont mises en oeuvre en salle blanche pour la fabrication de dispositifs micromécaniques ou à semiconducteurs. Le substrat est de préférence constitué d'un isolant électrique. Il a de préférence une faible réactivité chimique ou électrochimique avec une solution de cellules. Il peut aussi être transparent pour pouvoir le contrôler à l'aide d'un microscope optique par transmission. Les électrodes sont réalisées dans un matériau conducteur, comme un métal ou un semi-conducteur dopé ; certains métaux comme le cuivre étant sujets à corrosion, il peut être opportun de les protéger au moyen d'une couche organique, par exemple un polymère biocompatique tel que m- PEG (methoxypoly(éthylèneglycol)). Il est également possible de greffer des molécules protectrices des électrodes comme la caféine, la puridine ou 10 2 986 802 l'adénine. La résistance de ces électrodes doit être inférieure à celle du substrat et de la solution. Les électrodes (références 4 sur la figure 2a) peuvent présenter une longueur comprise entre 10 pm et 1 mm, et de préférence entre 150 et 300 pm ; leur largeur peut également être comprise 5 entre 10 pm et 1 mm, et de préférence être de l'ordre de 50 prn. Bien que les électrodes soient qualifiées de « planaires », elles présentent une épaisseur non nulle. Il a été observé que cette épaisseur doit de préférence être supérieure ou égale à 1,5 pm ; dans le cas contraire, les cellules sont trop sensibles au mouvements convectifs du milieu, et leur 10 piégeage n'est pas satisfaisant. Les électrodes ont des extrémités qui s'arrangent selon les côtés d'un parallélogramme. Un carré est montré à titre d'exemple dansla figure 3. Ceci permet d'avoir un extremum local de champ électrique stable, et confère au piégeage de cellules de la robustesse. 15 En variante, d'autres réalisations possibles sont montrées dans la figure 4. Des études de piégeage diélectrophorétique de cellules dans de telles configurations suggèrent que le piégeage dans des électrodes symétriques deux à deux, comme celles de la figure 3, est bien plus stable. Selon encore une autre variante, la géométrie des extrémités 20 des électrodes peut bénéficier des idées développées dans le document EP0946709 pour optimiser la forme des lignes de champ. Par exemple, des géométries en forme de flèche sont décrites pour améliorer la stabilité du piège diélectrophorétique de cellule. Un exemple de procédé de fabrication particulier est illustré 25 dans la figure 2b. Les électrodes planaires, constituées par un mélange de Cr / Cu (chrome / cuivre), sont fabriquées sur des substrats transparents (par exemple une lame de verre) en utilisant une technique de dépôt de couches standard (PVD) et la photolithographie comme le montre la figure 4 b). La couche de chrome a pour fonction de promouvoir l'adhésion. Après un spin- 30 coating de la résine photosensible positive S1813 (Shipley), l'exposition aux UVs est effectuée à l'aide d'un aligneur de masque (type MJB21 Karl Süss). 11 2 986 802 La résine photosensible est ensuite développée avec de l'hydroxyde de tétraméthylammonium (MF319). Enfin, une gravure chimique est effectuée pour le Cu avec une solution de peroxodisulfate de sodium (Na2S2O8) et une gravure physique pour Cr. Le masque des électrodes est conçu et modifiable 5 à volonté par lithographie par faisceau d'électrons. Par ailleurs, l'épaisseur de métal afin d'assurer le bon fonctionnement du dispositif doit être supérieure à 1 pm. Les flans des électrodes doivent être parfaitement perpendiculaires au substrat de manière à ce que les lignes de champ électrique soient parallèles au substrat sur une hauteur suffisante pour piéger les cellules. 10 Selon une variante, les aires actives peuvent être fonctionnalisées individuellement pour aider au maintien des contacts intercellulaires lors du processus d'électrofusion. La fonctionnalisation peut être obtenue en déposant, dans l'aire comprise entre les électrodes, un dépôt d'or ayant une épaisseur de quelques nanornètres, qui est ensuite 15 fonctionnalisée par une solution diluée de protéines telle que l'albumine de sérum bovin (ABS, ou BSA en anglais) ou l'ovalbumine (OVA). La couche d'or est nécessaire, au moins dans le cas d'un substrat en silice, car elle présente des interactions hydrophobes, ce qui n'est pas le cas de la silice. Les cellules portant des anticorps anti-OVA ou anti-X vont se fixer dans l'aire 20 fonctionnalisée après adressage de l'ensemble des cellules. Puis, par un simple rinçage ou par adressage d'autres électrodes, on évacue les cellules qui ne sont pas fixées. Ainsi, seules les cellules d'intérêt restent dans l'être des électrodes, et peuvent subir un traitement, par exemple (voir la figure 18) une électrofusion avec des cellules mutantes de myélome. Un tel procédé 25 garantit que presque 100% des cellules fusionnées produiront des anticorps anti-X. Un réseau de piège diélectrophorétique est illustré dansla figure 5. Ce réseau est composé de cinq pièges (références 10 à 14), chacun composé de quatre électrodes. Les sources de potentiel V11 à V45 sont des 30 sources de potentiel indépendantes. Un autre réseau de pièges est montré 12 dans la figure 7. Il comporte deux pièges de 4 électrodes. De manière générale, un réseau de pièges est constitué d'au moins deux pièges. Selon l'invention, chaque piège d'un réseau possède des bornes électriques dont les potentiels peuvent être adressés individuellement ; une borne peut également être connectée à une haute impédance, de telle sorte que le potentiel de l'électrode correspondante est flottant. Dans le cadre de l'exemple de la figure 5, 20 bornes d'alimentation sont disponibles et peuvent être connectées à 20 potentiels électriques différents. Dans l'exemple de la figure 7, 8 bornes sont disponibles. Ainsi, chaque piège et chaque électrode de chaque piège peuvent être adressés électriquement individuellement. L'avantage est donc que chaque piège peut réaliser des traitements séquentiels ou parallèles sur une même lignée cellulaire ou sur différentes lignées cellulaire pour comparaison. Un autre avantage de l'invention est que les mêmes électrodes assurent la manipulation cellulaire et le traitement cellulaire par champ électrique. Ceci permet d'augmenter le rendement de transfection cellulaire parce que le groupe de cellules manipulé est confiné dans une région de l'espace où le champ électrique est relativement significatif et homogène. En d'autres termes, toutes les cellules traitées sont regroupées dans un piège et peuvent, par suite, être manipulées. Le multiplexage entre les alimentations externes et un réseau de pièges est illustré dans la figure 6. Le multiplexeur est un module indépendant dont les bornes sont connectées aux bornes d'adressage des pièges diélectrophorétiques fabriquées sur le substrat. Le multiplexeur interconnecte alors des sources de potentiels électriques à une pluralité de pièges d'un réseau. Ceci permet d'adresser une pluralité de pièges avec une seule alimentation électrique, ou un seul ensemble d'alimentations électriques. Selon une variante, le multiplexeur peut échanger les potentiels appliqués entre différents pièges. Cela permet, par exemple, de 13 déplacer des groupes de cellules entre différents pièges, comme d'écrit ci-dessous à l'occasion de la description de la figure 7. Selon une autre variante, le multiplexeur peut échanger les potentiels appliqués aux électrodes d'un piège. Cela permet, par exemple, d'homogénéiser l'électroporation, ou changer la forme du groupement de cellule, comme décrit ci-dessous. Selon une autre variante, le multiplexeur est commandé par un opérateur qui pilote par l'intermédiaire d'un programme informatique le déroulement de la manipulation cellulaire ou du traitement cellulaire. Cela permet d'ajuster le déroulement de la manipulation ou du traitement cellulaire. Selon une autre variante, le multiplexeur peut additionner les potentiels d'une pluralité de sources de potentiels et diriger le résultat sur une électrode particulière. Il peut par exemple additionner un signal continu avec un signal alternatif, ou encore additionner une pluralité de trains d'impulsions différentes. Selon une autre variante, le multiplexage applique des impulsions de potentiel aux électrodes à partir de sources de potentiel constant. Ceci permet de réaliser des impulsions à partir d'une source de tension continue partagée entre différents pièges. La manipulation de cellules, selon l'invention, consiste non seulement à piéger des cellules dans un piège diélectrophorétique, mais aussi à modifier les propriétés d'un groupement de cellules, sans altérer l'état des cellules elles même. En d'autres termes, la manipulation de cellules comprend des opérations visant à déplacer sur le substrat la position des groupes de cellules, visant à modifier le nombre de cellules qui sont dans un groupe, et visant à contrôler la forme d'un groupe de cellule. Ces différentes opérations ont pour intérêt d'améliorer le traitement cellulaire - comme la transfection par électroporation ou l'électrofusion, ou de permettre de gérer plusieurs groupements cellulaires sur un unique substrat. Le piégeage diélectrophorétique est avantageusement réalisé avec le dispositif décrit ci-dessus, notamment parce qu'il permet l'adressage 14 individuel de pièges. L'effet de diélectrophorèse dépend de la fréquence f des potentiels périodiques appliqués, de la durée d'excitation, de la valeur crête à crête du potentiel. De bons résultats sont typiquement obtenus avec une tension périodique (sinusoïdale ou carré) d'amplitude 5-10 V crête à crête et une gamme de fréquences autour du mégahertz. Il est important de noter que la fréquence de diélectrophorèse est propre à la lignée cellulaire. De plus, l'amplitude et la fréquence dépendent des paramètres du dispositif mis en oeuvre et du milieu physiologique utilisé. Ainsi, l'amplitude et la fréquence doivent être déterminées expérimentalement, par une étape dite de calibrage. Un avantage de l'invention est qu'en fonction de la durée du champ appliqué et de la valeur crête-crête du potentiel, le nombre de cellules biologiques introduites dans un piège peut être contrôlé à l'unité près à l'aide d'un microscope optique. Une fois que le champ cesse d'être appliqué, les cellules restent en position dans le piège. A titre d'exemple, pour adresser une centaine de cellules il faut en moyenne 2 à 3 minutes. Les cellules cessent presque instantanément de bouger lors de l'extinction du champ électrique et restent en place dans l'aire délimitée par les électrodes aussi longtemps qu'aucune action n'est exercée sur elles. Le déplacement d'un groupement de cellules est illustré dans la figure 7. Lors de cette opération, des cellules en solution (insert a) sont d'abord piégées (insert b). Pour cela, les électrodes du piège de droite sont excitées par des potentiels électriques oscillants. Le potentiel peut être maintenu ou non : sans champ, les cellules restent en position pendant un moment. Ensuite, ce sont les électrodes de gauche qui sont excitées, tout en connectant les électrodes de droite à la masse, ou en les laissant à un potentiel flottant. Comme le montre la flèche de l'insert c, les cellules se sont déplacées. Cette méthode permet de déplacer des groupes de cellules sur un substrat entre plusieurs régions. Ceci permet aussi de réaliser des calibrages préalables dans des conditions comparables. Ceci permet de plus de traiter plusieurs de groupes de cellules sur un même substrat. L'avantage de ce 15 dernier point est qu'il permet de diviser le nombre total de cellules à traiter en groupes peu peuplés, ce qui améliore les rendements d'électroporation et d'électrofusion. Selon une variante, un groupement de cellules est déplacé entre une pluralité de pièges. Selon encore une autre variante, une pluralité de groupements de cellules sont déplacés entre une pluralité de pièges. Ces méthodes ont l'avantage de permettre d'isoler et de déplacer plusieurs groupes de cellules entre une pluralité de sites d'un substrat où peuvent être réalisés différents traitement cellulaire, séquentiellement ou simultanément. Selon une autre variante, un groupement de cellules est déplacé pour diminuer le nombre de cellules le peuplant. Le contrôle du nombre de cellule dans un piège est illustré dans la figure 8. L'insert a) montre un piège d'une plus grande taille que celui de l'insert b), leurs tailles respectives sont en effet de 300 pm2 et de 150 pm2. 15 Plus le piège est petit, plus le nombre de cellules piégées par diélectrophorèse est faible. Dans l'insert a), un piège peuplé de quelques unités de cellules est obtenu. Un piège peuplé d'une unique cellule est obtenu dans l'insert b). Un contrôle non destructif simultané, par exemple au moyen d'un microscope optique facilite le contrôle de cette étape de procédé. 20 Le dispositif est adaptable sur des platines de microscope à champ proche pour l'imagerie cellulaire haute résolution en vue de faciliter significativement la localisation et la stabilité des objets à observer. On entend par « microscope à champ proche » tout appareillage pour la mise en oeuvre d'une technique de microscopie à sonde locale, comme la microscopie 25 optique en champ proche, la microscopie à force atomique, etc. Selon une variante, le nombre de cellules piégées est contrôlé en ajustant la durée d'application des potentiels permettant le piégeage diélectrophorétique. Plus les potentiels sont appliqués longtemps, plus le groupement de cellules piégées est peuplé. Un contrôle au microscope 30 optique ou au microscope à champ proche améliore la maîtrise de cette méthode. 16 Le contrôle de la forme d'un groupement de cellule est illustré dans la figure 9. Une réalisation avantageuse de l'invention consiste à avoir au moins 4 électrodes, et que ces électrodes soient symétriques deux à deux, c'est-à-dire que leurs extrémités forment un parallélogramme. Il est ainsi possible de contrôler la localisation des extrema de champ électrique soit aux somment du parallélogramme, soit au centre du parallélogramme. Ceci est simplement réalisé en échangeant l'adressage électrique des potentiels appliqués, éventuellement à l'aide d'un multiplexeur. Par exemple, dans la figure 9, le piège est constitué de 4 électrodes, et les extrémités des électrodes forment un losange. Dans l'insert a), les deux électrodes de gauche sont adressées avec un potentiel positif et les deux électrodes de droite avec un négatif. Dans ce cas, le minimum de champ électrique se situe selon l'axe de symétrie horizontal (selon 22, 25 et 24). Comme la diélectrophorèse est négative, les cellules du groupement piégé tendent alors à s'aligner selon cet axe. Dans l'insert b), les potentiels positifs et négatifs sont adressés respectivement sur les électrodes se faisant face. Dans ce cas, le minimum de champ électrique est localisé au centre 25 du losange (et le maximum en 21, 24, 23 et 22), tout comme le groupement de cellule. Au final, la modification de l'adressage entre les inserts a) et b) 20 permet une modification de la forme du groupement de cellules. Ceci est avantageusement réalisé à l'aide d'un multiplexeur. Selon une variante, le nombre de cellules et la forme d'un groupement piégé sont tous les deux contrôlés de sorte que les cellules sont alignées. Un exemple est illustré dans la figure 10. Un tel alignement permet 25 de contrôler un nombre plus réduit de cellules et donc, soit de gérer moins de cellules pour l'électroporation (dans le cas de cellules difficilement transfectables), soit de mieux contrôler les contactes cellulaires dans le cas de l'électrofusion. Le tri des cellules peut être réalisé au moyen du déplacement 30 entre des pièges. Différentes cellules ayant différents facteurs de Clausius- Mossotti au sein d'un piège répondent différemment à une étape de 17 déplacement cellulaire : certaines sont déplacées d'autres non. Ceci réalise un tri cellulaire séparant donc des cellules différentes ayant des propriétés physiques différentes. Le traitement cellulaire par champ électrique comprend 5 plusieurs opérations différentes qui sont résumées dans la figure 1. L'électroporation - un champ électrique de l'ordre du kV/cm appliqué à une cellule rend sa membrane perméable ou poreuse - est un effet précurseur de la lyse, la transfection ou la fusion cellulaire. L'électroporation peut être réalisée par un train d'impulsions 10 de potentiel appliqué aux électrodes. Une forme d'onde de potentiel en train d'impulsions est montrée dans la figure 11. Les impulsions sont caractérisées par une amplitude V, une durée ti et un taux de répétition. Par exemple, des impulsions d'une durée de 0,1 s et de 10 V 15 ayant une répétition de 10 s permettent une électroporation suffisante de cellules U937 pour introduire (c'est-à-dire réaliser une transfection) de molécules ayant une taille de l'ordre de deux nanomètres. La durée des impulsions a un effet sur la taille des pores induits par électroporation, comme illustré dans la figure 12. L'efficacité de la 20 transfection est mesurée par microscopie confocale : des molécules introduites dans les cellules fluorescent et révèlent que les pores étaient assez grands pour permettre leur introduction. Pour une impulsion de durée courte, les pores sont fermés : il existe un seuil de durée. Au dessus de ce seuil, le diamètre des pores s'ouvre sensiblement linéairement avec la durée, 25 à tension constante. A durée constante (et répétition constante), le diamètre évolue aussi sensiblement linéairement avec la tension au dessus d'un seuil. En fait, plus généralement, le diamètre des électropores est sensiblement proportionnel au produit durée * amplitude (V* -c) des impulsions, au dessus d'un seuil, et pour un taux de répétition fixé. 30 La détection des cellules ayant subi une électroporation par microscopie confocale est essentiellement utilisée en phase de calibrage et 18 vérification. Au cours de cette phase de calibrage, on mesure également le courant qui circule entre les électrodes ; initialement, ce courant est nul ou très faible, puis il augmente au fur et à mesure que des pores s'ouvrent. Ainsi, par la suite, il devient possible de contrôler le déroulement de l'électroporation 5 et/ou de l'électrofusion simplement au moyen de mesures électriques de tension et de courant, par des moyens de mesure conventionnels. La lyse cellulaire se produit pour des durées ou des amplitudes trop élevées. Par exemple, la figure 13 montre des cellules dont la membrane est irréversiblement altérée. Ces cellules sont marquées par un 10 cercle. Le calibrage de la forme d'onde des potentiels à appliquer pour réaliser le traitement cellulaire par champ électrique est une étape importante et délicate parce qu'il dépend de la géométrie des électrodes, des propriétés du milieu physiologique, et des propriétés du groupement de 15 cellules plongé dans le champ électrique. Le dispositif décrit plus tôt offre des conditions optimisées. Pour réaliser le calibrage, une méthode consiste à déterminer le seuil d'électroporation et de lyse du produit V* t, pour lesquels, respectivement, le diamètre 4pores des pores s'ouvrent et conduisent à la lyse, comme illustré dans l'insert a) de la figure 14. 20 Un exemple est montré dans l'insert b) de la figure 14. La survie des cellules est observée au microscope optique. Le rendement de transfection peut-être mesuré en microscopie confocale par fluorescence d'objets introduits dans les cellules. Cette méthode détermine une gamme de durée pour laquelle le rendement de transfection est conséquent (au-delà de 25 31) tout en limitant la lyse cellulaire (en deçà de 32). Les formes d'ondes des potentiels électriques sont ainsi calibrées pour améliorer le rendement de transfection tout en minimisant la lyse cellulaire. Selon une variante, cette étape pourra être avantageusement réalisée sur plusieurs groupes de cellules piégées et adressés 30 individuellement sur le même substrat, optimisant donc la reproductibilité des conditions d'électroporation entre plusieurs groupes de cellules. 19 Selon une autre variante, le train d'impulsions de potentiel appliqué pour réaliser le traitement cellulaire comporte des impulsions d'amplitudes de moins en moins fortes. Ceci est illustré dans la figure 15. L'avantage est de diminuer l'effet de lyse cellulaire. Selon une autre variante, le train d'impulsions de potentiel appliqué pour réaliser le traitement cellulaire comporte des impulsions d'amplitudes positives et négatives, comme illustré dans l'insert b) de la figure 16. L'avantage est d'homogénéiser les tailles des pores des cellules entre la cathode et l'anode. En effet, lorsque des impulsions d'une unique polarité sont appliquées, les cellules sont préférentiellement perméabilisées près de la l'anode. Ceci est illustré dans l'insert a) de la figure 16 qui montre que la fluorescence des cellules proches de l'anode est plus forte. L'application d'impulsions positives et négatives améliore le rendement d'électroporation tout en minimisant la lyse cellulaire (homogénéisation de l'électroporation). Un autre avantage du calibrage de la forme d'onde des impulsions électriques est qu'il est possible de réaliser la transfection de cellules par des molécules de tailles variables. Par exemple, la figure 17 montre la mesure par fluorescence d'une transfection par des molécules d'un diamètre de l'ordre de 50 nrn. La concentration ionique du milieu de culture des cellules peut être ajustée par l'ajout d'ions (par exemple : ions Na+, K+...) pour augmenter l'efficacité d'électroporation ou d'électrofusion. En effet, le milieu physiologique contenant les cellules, influe sur le potentiel transmembranaire (DDP) de la cellule. Il a été montré que ce potentiel transmembranaire doit être en valeur absolue supérieur à 50 mV. Aussi, si l'application d'impulsions ne permet pas d'atteindre le seuil de perméabilité de la membrane, la concentration d'ions peut être augmentée afin d'atteindre une valeur de potentiel transmembranaire supérieur à celui de la membrane cellulaire. Un autre avantage du dispositif pour l'électroporation, est l'utilisation de faibles potentiels appliqués minimisant les effets thermiques, 20 usuellement présent dans les dispositifs classiques, et garantissant la viabilité des cellules après électroporation. Un autre avantage est que la combinaison de ces différentes manipulations - déplacement, groupement d'un nombre faible de cellule, optimisation de la forme du groupe - avec le calibrage décrit ci-dessus permet d'obtenir un rendement d'électroporation proche de 100%. Un autre avantage de l'invention est que la miniaturisation du dispositif et sa réalisation par des techniques de nano- et micro-fabrication autorisent son implantation au sein d'un système de diagnostique. L'électrofusion cellulaire, comme l'électroporation cellulaire, bénéficie des étapes de procédé de manipulation cellulaire précitée. En particulier, l'efficacité de l'électrofusion s'améliore en diminuant le nombre de cellules par groupe, en les alignant, en assurant le contact entre les membranes des cellules au sein d'un groupe, et calibrant des impulsions de potentiels suffisamment fortes tout en limitant la lyse. De préférence, l'électrofusion est réalisée avec un groupement ayant une forme de ligne comme illustré dans la figure 9 a). Par exemple, l'électrofusion selon l'invention peut être mise en oeuvre pour réaliser l'électrofusion de cellules immortelles de myélomes dépourvues de HGPRT (SP2) et des cellules normales de rates. Ce procédé est illustré dans la figure 18. On injecte d'abord de l'antigène X à une souris. Puis on extrait des cellules dans la rate qui fabriquent un anticorps contre cet antigène X, pour les fusionner avec des cellules mutantes de myélome de souris. Ces dernières peuvent croître sur un milieu HAT (Hypoxanthine Aminopterine Thymidine). Grâce au procédé de manipulation et d'électrofusion décrit dans la présente demande, les cellules mutantes et les cellules ayant un anticorps sont fusionnées. Ces cellules ainsi fusionnées peuvent ainsi croitre sur un milieu HAT. On peut alors ensuite procéder à une recherche de l'anticorps dirigé contre l'antigène X. 21 REVENDICATIONS1. Procédé de manipulation et de traitement de cellules par un champ électrique comprenant une étape de piégeage de cellules dans un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes microfabriquées sur un substrat, et une étape de traitement cellulaire par un champ électrique appliqué par les électrodes des pièges, et caractérisé en ce que lesdits pièges ont un adressage électrique qui est individuel. 2. Procédé selon la revendication précédente comprenant un multiplexage des potentiels appliqués aux électrodes des pièges. 3. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation cellulaire comprend une modification de l'adressage électrique pour contrôler la forme d'un groupement cellulaire. 4. Procédé selon la revendication 3 où la manipulation cellulaire comprend une étape d'alignement des cellules. 5. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation cellulaire comprend un déplacement de cellules entre une pluralité de pièges. 6. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation cellulaire comprend un ajustement du nombre de cellules piégées dans un piège au moyen d'un contrôle de la durée du champ diélectrophorétique appliqué, et/ou d'un contrôle de sa valeur crête à crête, et/ou d'un microscope optique, et/ ou d'un ajustement de la taille du piège. 7. Procédé selon une des revendications précédentes où le traitement cellulaire comprend l'électroporation de cellules. 22. Procédé selon la revendication 7 comprenant une étape de calibrage du produit durée * amplitude des impulsions de potentiels qui sont appliquées pour réaliser le traitement cellulaire par champ électrique. 9. Procédé selon les revendications 7 ou 8 où l'électroporation est réalisée par une pluralité d'impulsions qui ont des amplitudes positives et négatives. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 comprenant une étape d'ajustement de la concentration d'ions pour contrôler la taille des pores des cellules au cours de l'électroporation. 11. Procédé selon une des revendications précédentes où le traitement cellulaire comprend la transfection de cellules. 12. Procédé selon une des revendications précédentes où le traitement cellulaire comprend l'électrofusion de cellules. 13. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation ou le traitement cellulaire comprend un contrôle de l'état des cellules par microscopie à champ proche. 14. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation ou le traitement cellulaire comprend un contrôle de l'état des 25 cellules avec un microscope optique par transmission grâce à la mise en oeuvre d'un substrat transparent. 15. Procédé selon une des revendications précédentes où la manipulation ou le traitement cellulaire comprend un contrôle de l'état des 30 cellules par mesure d'un courant entre les électrodes. 23 2 9 86 802 16. Dispositif pour manipuler et traiter des cellules par un champ électrique comprenant un réseau de pièges diélectrophorétiques ayant des électrodes, dont les extrémités ont une taille inférieure au millimètre, sur un substrat, et caractérisé en ce que les pièges ont un adressage électrique 5 qui est individuel. 17. Dispositif selon la revendication 16 comprenant un multiplexeur connecté aux électrodes des pièges. 10 18. Dispositif selon une des revendications 16 ou 17 où les extrémités des électrodes d'un piège s'arrangent selon les côtés d'un parallélogramme. 19. Dispositif selon une des revendications 16 à 18 15 comprenant un microscope à champ proche pour contrôler l'état des cellules dans les pièges. 20. Dispositif selon une des revendications 16 à 19 où le substrat est transparent. 20 21. Dispositif selon une des revendications 16 à 20 comprenant un moyen de mesure du courant circulant entre les électrodes. 22. Dispositif selon une des revendications 16 à 21 25 comprenant une solution aqueuse et un moyen de contrôle de sa concentration d'ions pour ajuster la cinétique du traitement cellulaire par champ électrique. 24