FR 2980365 A1 20130329 FR 1158565 A 20110926 Nanoémulsions, leur procédé de préparation, et leur utilisation comme agent de contraste La présente invention concerne de nouvelles nanoémulsions et de nouveaux procédés de préparation de nanoémulsions, et leur utilisation comme agents de contraste notamment en IRM. Dans le domaine de l'imagerie diagnostique, un grand nombre de recherches ont concerné des nanosystèmes lipidiques de type émulsion. Typiquement les émulsions utilisées sont sous forme de vésicules préparées à l'aide de constituants lipidiques (huile en particulier) et de tensioactifs (également désignés surfactants) servant d'interface entre la phase aqueuse et le noyau lipidique de la nanogouttelette. Les émulsions lipidiques huile dans eau incorporent une phase huileuse lipophile, formant des gouttelettes en solution aqueuse. Une catégorie particulière d'émulsions décrite notamment dans W003/062198 ou US 6 676 963 est celle de nanoémulsions fluorées comprenant, intégrés à l'intérieur des vésicules lipidiques, des composés fluorés comportant des atomes de fluor F19 utilisés pour l'Imagerie de Résonance Magnétique IRM. En effet le fluor a notamment l'intérêt par rapport à l'IRM du proton d'être quasiment absent en dans les systèmes biologiques à l'état libre ce qui lui permet d'être reconnu comme une excellente sonde quantitative sous la forme fluor F19. Le coeur est formé d'une huile fluorée, et entouré d'une couche lipidique formée par un tensioactif (lécithine par exemple). Ces émulsions fluorées peuvent comprendre en outre un nombre très élevé de complexes de métaux paramagnétiques, en particulier de lanthanides, pour associer l'IRM du fluor 19F et du proton 1H. On connaît ainsi des émulsions fluorées pour IRM incorporant des chélates capables de complexer des lanthanides en particulier le gadolinium. Les chélates utilisés sont notamment des dérivés du DTPA, DOTA, DOSA, HPDO3A et autres chélates largement décrits dans l'art antérieur. Ces chélates hydrophiles sont rendus lipophiles en leur greffant une zone lipophile telle qu'un phospholipide, ce qui permet de les intégrer dans la membrane lipidique que forme le tensioactif lipidique de la composition. Plusieurs milliers (5000 à 100 000 environ) de ces complexes sont intégrés dans la membrane lipidique de ces vésicules, ce qui permet d'obtenir une relaxivité (signal IRM) élevée pour une détection de la zone physiologique étudiée et modifier le temps de relaxation du 19F. La partie hydrophile (la partie hydrophile que représente le chélate auquel est attaché un groupe lipophile de manière à prendre le chélate lipophile) est localisée à la surface externe des nanogouttelettes, en contact avec la phase aqueuse de la solution de nanogouttelettes. On connaît aussi des émulsions huile dans eau et non fluorées, comprenant des chélates de lanthanides pour l'IRM uniquement du proton. En outre, afin d'obtenir un signal spécifique de zones pathologiques, par exemple associés à une surexpression d'un marqueur de ces zones (récepteurs par exemple), des molécules de ciblage (ou biovecteurs, peptide par exemple ayant une affinité pour le récepteur) ont été greffés sur les nanogouttelettes des ces émulsions fluorées. W003/062198 décrit en particulier l'utilisation de composés peptidomimétiques pour cibler des intégrines surexprimmées dans des zones tumorales. Pour l'incorporation à la membrane lipidique, les biovecteurs sont rendus lipophiles en les associant à des chaînes lipophiles. Toutefois, malgré des avancées prometteuses, les agents de contraste fluorés et le cas échéant vectorisés décrits n'ont pas encore démontré totalement leur efficacité clinique, et posent des difficultés notamment en matière de stabilité dans la durée. En particulier une durée de conservation de plus de 9 mois est difficile à atteindre, alors que la stabilité recherchée est d'au moins un an et de préférence de l'ordre de 2 à 3 ans. Un problème technique complexe reste l'optimisation des constituants, notamment l'huile et les surfactants. Il s'agit ici d'émulsions directes de type huile dans eau (H/E), dont la phase dispersée est lipophile et la phase continue hydrophile. La non miscibilité des deux phases a pour conséquence l'existence d'interface entre l'eau et l'huile, ce qui coûte de l'énergie au système. Cette énergie est quantifiée par la tension interfaciale notée y (énergie par unité de surface). Grâce à leur double affinité, les molécules amphiphiles utilisées comme tensioactif (ou surfactant) peuvent s'adsorber aux interfaces et ainsi diminuer la tension interfaciale. Les molécules amphiphiles particulièrement considérées ici sont des phospholipides. Lorsque de l'énergie mécanique est fournie au système, la quantité d'interface entre les deux fluides non miscibles est augmentée et l'une des deux phases est fragmentée sous forme de gouttelettes. La présence des molécules amphiphiles à l'interface va ralentir le retour à la séparation de phase (voir figure 1). Ces agents de surface peuvent être de natures différentes : tensioactif classique, polymère, phospholipide, particule... Ils induisent des répulsions stériques ou électrostatiques entre les gouttes. Généralement, les stabilisants sont des tensioactifs et ne sont pas ancrées irréversiblement à l'interface. Au dessus de la concentration micellaire critique (CMC) les molécules amphiphiles s'auto-assemblent dans la phase continue et elles adoptent des formes variées fonction de plusieurs facteurs. Il existe alors un équilibre dynamique avec échange continuel entre les molécules adsorbées à l'interface et en excès dans la phase continue. Il existe deux mécanismes de destruction des émulsions (déstabilisation irréversible) qui font évoluer le système vers la séparation macroscopique des phases. Ces deux instabilités sont la coalescence et le mûrissement d'Ostwald. La coalescence correspond à la rupture du film de surfactants séparant deux gouttes en contact, entraînant ainsi la fusion de celles-ci (Voir figure 2). Le mûrissement d'Ostwald est dû au transfert de la phase dispersée à travers la phase continue, des petites gouttes vers les plus grosses sous l'effet de leur différence de pression interne : la pression dans les gouttes est en effet d'autant plus grande que leur rayon est faible (loi de Laplace : PLaplace= 2y/R). Ce transfert a lieu afin d'égaliser les pressions internes (Voir figure 3). Le mûrissement d'Ostwald domine pour les gouttes de petite taille tandis que la coalescence est le mécanisme majoritaire pour les gouttes de grande taille. Lors de la déstabilisation de la nanoémulsion, l'augmentation de la taille des gouttes s'accompagne d'une diminution de la quantité d'interface eau-huile S : (S=6V/D), où V est le volume d'huile et D le diamètre des gouttelettes et d'une désorption du stablisant. Dans une émulsion, les deux mécanismes de déstabilisation ont lieu, avec murissement d'ostwald puis coalescence au cours du temps. L'objectif est de réaliser des nanoémulsions directes stables dans le temps, dont les interfaces sont recouvertes par un mélange de phospholipides naturels (PL) et de phospholipides modifiés (PLM). Le demandeur a réussi à obtenir des nanoémulsions comprenant des gouttelettes le cas échéant vectorisées : - suffisamment stables pour être produites et conservées une longue durée (plusieurs mois à plusieurs années), en particulier en limitant les problèmes de coalescence des gouttelettes lipidiques entre elles - suffisamment stables in vivo pour ne pas être dégradées - adaptées sur le plan de la pharmacocinétique - suffisamment efficaces en terme de signal pour l'imagerie clinique (IRM en particulier) chez le patient. A cet effet, la demande fournit des nanoémulsions huile dans l'eau comprenant une phase aqueuse et une phase huile fluorée. Au sens de la présente demande, par nanoémulsion, on entend que la taille des gouttelettes est comprise entre 1 et 1000 nm. La taille des gouttelettes est typiquement de 50 à 400 nm, avantageusement 100 à 350 nm, notamment 150 à 300 nm, en particulier 200 à 250 nm. Les gouttelettes sont également appelées « gouttes » ci-après. Les gouttelettes ont une taille suffisamment petite pour leur permettre de circuler dans les milieux biologiques sans dégradation du produit. Dans les nanoémulsions selon l'invention, la phase aqueuse est avantageusement de l'eau ou une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable telle qu'une solution saline, une solution tampon. Dans les nanoémulsions selon l'invention, pour la phase huile fluorée, toute huile fluorée appropriée peut être utilisée, en particulier les huiles fluorées déjà utilisées en imagerie médicale. L'huile fluorée est notamment un huile choisie parmi les huiles incluant des perfluorocarbones linéaires ou ramifiés, ou cycliques ou polycycliques, saturés ou insaturés, des amines tertiaires cycliques perfluorées, des perfluoro esters ou thioesters, des haloperfluorocarbones et composés connus analogues ou dérivés. Avantageusement au moins 60% des atomes d'hydrogène de l'huile hydrocarbonée correspondante sont remplacés par un atome de fluor. Typiquement ces huiles fluorées sont des chaînes de 2 à 16 atomes, perfluoroalkanes, bis(perfluoroalkyle)alcènes, perfluoréthers, perfluoroamines, perfluoroalkyle bromures, perfluoroalkyle chlorures. Selon des réalisations avantageuses, la nanogouttelette lipidique inclut des perfluorocarbones tels que décrits dans US 5,958,371, la nanoémulsion liquide contenant des nanogouttelettes comportant un perfluorocarbone à point d'ébullition assez élevé (par exemple entre 30 et 150 °C, de préférence entre 50 et 150°C) entouré d'un revêtement composé d'un lipide et/ou d'un surfactant. Les huiles perfluorées pour nanoémulsions de perfluorocarbone pour imagerie IRM sont rappelées notamment dans les documents US 6 676 963, US 4,927,623, US 5,077,036, US5,114,703, US5,171,755, US5,304,325, US5,350,571, US5,393,524, US5,403,575 ; notamment les huiles : perfluorooctylbromide PFOB, C8F17Br (PFOB ou perfluorobron), perfluorooctyléthane (C8F17C2H5 PFOE), perfluorodecalin FDC, perfluorooctane C8F18, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyl, perfluoroheptane, perfluorodécane Cl 0F22, perfluorododécyle bromide Cl OF22Br PFDB, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, perfluorodiméthylcyclohexane, perfluorotriméthylcyclohexane, ester de perfluorodicyclohexyl, perfluoro-n- butyltétrahydrofurane. On inclut dans la définition des huiles fluorées les huiles de formule C, F 2n+1 X, XOn F2n X, où n est un nombre entier variant de 2 à 10, X = Br, Cl ou I notamment : 1bromo-F-butane (n-C4 F9 Br), 1-bromo-F-hexane (n-C6 F13 Br), 1-bromo-Fheptane (n-C7 F15 Br), 1,4-dibromo-F-butane et 1,6-dibromo-F-hexane. On inclut aussi des composés fluorés avec des substituants chlorés par exemple: perfluorooctyl chloride (n-C8 F17 Cl), 1,8-dichloro-F-octane (n-CI C8 F16 Cl), 1,6-dichloro- F-hexane (n-CIC6 F12 Cl), et 1,4-dichloro-F-butane (n-CI C4 F8 Cl). On inclut aussi les huiles fluorées de formule C, F 2n+1 OCrn F 2m±1, C, F 2n+1 CH=CHCm F 2m+1, par exemple : C4 F9 CH=CHC4 F9 (F-44E), i-C3 F9 CH=CHC6 F13 (F- i36E), C6 F13 CH=CHC6 F13 (F-66E)) où n et m sont identiques ou différentes, et sont des entiers compris entre 2 et 12. On inclut aussi des composés polycycliques ou cycliques tels que : 010 F18 (F- decalin ou perfluorodecalin), et des mélanges de perfluoroperhydrophenanthrene et de perfluoro n-butyldecalin. On inclut aussi des amines perfluorées, telles que : F-tripropylamine ("FTPA"), Ftributylamine ("FTBA"), F-4-methyloctahydroquinolizine ("FMOQ"), F-N-methyldecahydroisoquinoline ("FMIQ"), F-N-methyldecahydroquinoline ("FHQ"), F-Ncyclohexylpyrrolidine ("FCHP"), F-2- butyltetrahydrofuran ("FC-75" or "FC-77"). Selon un premier aspect, l'invention concerne une nanoémulsion (également désignée composition de nanoémulsion) huile dans eau, notamment pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, le tensioactif formant une couche de tensioactif entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, la dite nanoémulsion comprenant en outre un agent compatibilisant formant une couche supplémentaire s'intercalant entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif. Selon des réalisations préférées, l'agent compatibilisant est une huile hydrocarbonée (non fluorée) comprenant au moins 70%, avantageusement au moins 80%, de façon avantageuse au moins 95% en poids, notamment au moins 97 %, d'acides gras saturés en C6-C18, avantageusement en C6-C14, plus avantageusement en C6-C10. On entend par le terme acide gras désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 6 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones. On parle au contraire d'acide gras à courte chaîne pour une longueur de 6 à 10 carbones, en particulier 8 ou 10 atomes de carbone. L'homme du métier connaît la nomenclature associée et en particulier utilise : - Cn-Cp pour désigner une fourchette d'acides gras en Cn à Cp - et Cn+Cp, le total des acides gras en Cn et des acides gras en Cp Par exemple : - les acides gras entre 14 et 18 atomes de carbone s'écrivent acides gras en C14-C18 - le total des acides gras en C16 et des acides gras en C18 s'écrit C16 +C18 Très avantageusement, l'huile hydrocarbonée comprend moins de 10%, de préférence moins de 5% d'acides gras insaturés, en particulier moins de 5%, et de préférence moins de 2%, moins de 1% d'acides gras insaturés en C14-018 ou en C14- C22. Par exemple l'huile est le MIGLYOL®, 0 )\---R 0 0 , OH R-0 0 \r0 R c (R = C8+ C10) >95% P03040 ou l'un des ses dérivés connus, par exemple le MIGLYOL® 810 ou MIGLYOL® 812 (caprylic/capric triglyceride), MIGLYOL® 818 (caprylic/capric/linoleic triglyceride), le MIGLYOL® 612 (glyceryl trihexanoate), d'autres dérivés MIGLYOL® propylène glycol dicaprylate dicaprate. Par exemple le Miglyol® 812 a la composition suivante : Acide Caproïque (06_0) : max 2 % Acide Caprylïque (C8_0) : 50 à 65 % Acide Caprique (Cio_o) : 30 à 45 % Acide Laurique (C12_0) : max 2 % Acide Miristique (014_0) : max 1 % Acide Linoleique (018_2) : Selon des variantes, l'huile hydrocarbonée saturée est un mélange d'huiles saturées comprenant chacune au moins 70%, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 6 à 10 atomes de carbone. Selon des réalisations, l'huile hydrocarbonée saturée est une huile saturée comprenant au moins 70%, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 12 à 18 atomes de carbone, ou comprenant un mélange d'huiles saturées comprenant chacune au moins 70%, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 12 à 18 atomes de carbone. De préférence, les acides gras saturés des huiles saturée utilisées par le demandeur sont utilisés sous forme de mono, di ou triglycérides, de préférence triglycérides. De manière préférée, l'huile hydrocarbonée des nanoémulsions du demandeur comprend des acides gras saturés dans les variantes suivantes : C6-C18 > 70%, de préférence C6-C18 > 80% de préférence C6-C18 >95%, et encore de préférence C6-C18 > 98% C6-C14 > 70%, de préférence C6-C14 > 80% de préférence C6-C14 >95%, et encore de préférence C6-C14 > 98% C8+C10 > 70%, de préférence C8+C10 > 80% de préférence C8+C10 >95%, et encore de préférence C8+C10 > 98% C8 compris entre 40 et 70% de préférence 50 à 65% et/ou 010 compris entre 20 et 50% de préférence 30 à 45%, le total C8+C10 étant supérieur à 80%. Par souci de simplification, il est indiqué que la nanoémulsion comprend un tensioactif. Il est clair pour l'homme du métier qu'il s'agit d'au moins un tensioactif (par exemple un mélange de tensioactifs) formant une couche de tensioactif entre la phase huileuse et la phase aqueuse, et désigné également « tensioactifs totaux » dans la demande. Le tensioactif comprend généralement un ou plusieurs lipides amphiphiles, qui comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Avantageusement le lipide amphiphile est un phospholipide, de préférence choisi parmi : phosphatidylcholine dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, sphingomyéline, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol. La lécithine est un lipide amphiphile préféré. Le Lipoïde, par exemple E80 est aussi un lipide préféré. Le lipide amphiphile peut aussi être choisi aussi parmi les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan ; les lipides polymérisés ; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits lipides amphiphiles pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. Avantageusement le lipide amphiphile est un lipoïde, notamment le lipoide E80. Selon un mode de réalisation particulier, tout ou partie du lipide amphiphile peut posséder une fonction réactive, telle qu'un groupe maléimide, thiol, amine, ester, oxyamine ou aldéhyde. La présence de fonctions réactives permet le greffage de composés fonctionnels au niveau de l'interface entre les nanogouttelettes et la phase aqueuse continue. On pourra utiliser pour la couche de tensioactif, en plus du lipide amphiphile, de manière non obligatoire, et en particulier afin d'agir sur le caractère furtif du produit dans l'organisme, des lipides pégylés c'est à dire porteurs de groupes oxyde de polyéthylène (PEG), tels que le polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE). Par « polyéthylèneglycol » PEG, au sens de la présente demande, on désigne de façon générale, des composés comprenant une chaîne -CH2-(CH2-0-CH2)k-CH2OR3 dans laquelle k varie de 2 à 100 (par exemple 2, 4, 6, 10, 50), et R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)Alk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Le terme « polyéthylèneglycol » tel qu'employé ici englobe notamment les composés aminopolyéthylèneglycols, tels que des DSPE-PEG (DSPE : Distéaroyle phosphatidyle éthanolamine). On citera notamment les PEG 350, 750, 2000, 3000, 5000, modifiés par ajout de groupements amphiphiles pour s'insérer au sein de la couche de tensioactif de la nanogouttelette, notamment : -1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-350] -1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)- 550], - 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-20 750] On utilisera notamment le lipide pégylé : 0 ) 4. H 11 o f---___0 / .0 ''N 0 _ _45 0 Dans un mode de réalisation préféré, le tensioactif comprend (ou est constitué 25 de) un mélange de lipoïde (lipide amphiphile) et de DSPE-PEG (lipide pégylé), en particulier de Lipoïd E80 et de DSPE-PEG 2000. Avantageusement la couche de tensioactif inclut au moins un ligand de ciblage amphiphile d'une zone physiologique (également appelé biovecteur), le ligand de ciblage amphiphile représentant 0,1 à 10% en mole du total de la couche de tensioactif, 30 avantageusement 0.05 à 5%, notamment 1 à 2 %. Les gouttelettes des nanoémulsions comprennent typiquement chacune un nombre de ligands de ciblage amphiphile de l'ordre de 100 à 5000, notamment 500 à 2000, ce qui permet le ciblage efficace selon l'affinité et la multivalence du ligand de ciblage. 35 Dans un mode de réalisation, le tensioactif de la nanoémulsion selon l'invention est un agent tensioactif anionique. Ainsi, l'invention concerne une nanoémulsion huile dans eau, notamment pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, le tensioactif étant un agent tensioactif anionique. Le demandeur a en effet constaté que l'utilisation d'au moins un agent tensioactif anionique (dont la partie hydrophile est chargée négativement, typiquement par un groupe carboxylate ou sulfonate) permet d'augmenter la stabilité de la nanoémulsion. Le tensioactif anionique est choisi parmi les tensioactifs connus et utilisables selon la Pharmacopée, notamment le SDS (dodécyle sulfate de sodium). Ce mode de réalisation est avantageux notamment dans le cas des nanoémulsions décrites dans la demande qui comprennent un agent compatibilisant formant couche entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif. Selon des réalisations très avantageuses, la nanoémulsion huile dans eau comprend : une phase aqueuse, représentant de préférence 29.3 à 80 % en poids de la composition, avantageusement 55 à 65%, plus avantageusement de 58 à 62%, une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée, représentant 19.3 à 70% en poids de la composition, avantageusement 35 à 45%, plus avantageusement 37 à 42%, un tensioactif (formant la couche de tensioactif) à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, un agent compatibilisant formant une couche entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif, la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à l'huile étant comprise entre 3 et 15%, avantageusement entre 6 et 12 % ; la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à la composition étant comprise entre 0.6 et 10 %, avantageusement entre 1 et 3 % ; la teneur totale en agent compatibilisant étant comprise entre 0.1 % et 5% massique par rapport à la phase aqueuse. De manière particulièrement avantageuse, les nanoémulsions du demandeur huile dans eau, notamment pour IRM, comprennent : - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, la phase fluorée comprenant une première huile fluorée et au moins une deuxième huile fluorée. Le demandeur a en effet constaté qu'un mélange d'huiles fluorées permet d'augmenter la stabilité de la nanoémulsion. Avantageusement la première huile fluorée représente entre 70 et 95% massique de la phase huile fluorée et la deuxième huile fluorée représente 5 à 30% massique de la phase huile fluorée. Avantageusement les huiles fluorées sont choisies parmi les huiles fluorées décrites dans la présente demande. Très avantageusement, la première huile fluorée est le PFOB, la deuxième huile fluorée est une huile de plus longue chaîne moléculaire de préférence le perfluorohexadécane PFHD ou le perfluorodécylbromide PFDB. Par exemple le ratio est 10% massique en PFHD ou PFDB et de 90% massique en PFOB. Ce mode de réalisation est avantageux notamment dans le cas des nanoémulsions décrites dans la demande qui comprennent un agent compatibilisant formant couche entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif. L'invention concerne ainsi selon une réalisation une nanoémulsion huile dans eau, notamment pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, le tensioactif formant une couche de tensioactif entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, - la dite nanoémulsion comprenant en outre un agent compatibilisant formant une couche supplémentaire s'intercalant entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif, la phase fluorée comprenant une première huile fluorée et au moins une deuxième huile fluorée. Selon un autre aspect, l'invention concerne une nanoémulsion huile dans eau pour IRM comprenant : - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, la dite nanoémulsion comprenant en outre au moins agent stabilisant choisi parmi les protéines et les polysaccharides, de préférence les protéines. Le demandeur a en effet constaté que l'utilisation d'au moins une protéine ou d'un polysaccharide permet d'augmenter la stabilité de la nanoémulsion. La protéine est choisie parmi les protéines connues et utilisables selon la Pharmacopée, notamment la caséine ou la lactoglobuline et préférentiellement la lactoglobuline. Le polysaccharide est de préférence l'amidon. De préférence la protéine ou le polysaccharide est utilisée en proportion compris entre 0.1 à 5% massique par rapport à la phase aqueuse. Dans un mode de réalisation, la nanoémulsion comprend un agent compatibilisant tel que défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation, la phase huileuse de la nanoémulsion comprend une première huile fluorée et au moins une deuxième huile fluorée. Dans un mode de réalisation, la nanoémulsion comprend un agent compatibilisant tel que défini ci-dessus et la phase huileuse de la nanoémulsion comprend une première huile fluorée et au moins une deuxième huile fluorée. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'émulsions huile dans eau, notamment pour IRM, comprenant une phase aqueuse, une phase huile fluorée, un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et lipidique, le procédé comprenant les étapes : a) mélange des constituants de la phase aqueuse, de la phase fluorée, et du tensioactif, de manière à obtenir une nanoémulsion b) au moins une étape de lavage de la nanoémulsion préparée en a). Dans des réalisations, lors de l'étape de lavage, la nanoémulsion est centrifugée afin de séparer les gouttelettes de la phase continue. L'huile étant plus lourde que l'eau, les gouttes constituent le sous-nageant opaque et visqueux, tandis que la phase continue contenant l'eau et les phospholipides forment le surnageant. Ce surnageant est remplacé par une phase continue (eau ou eau salée) sans phospholipides. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une nanoémulsion telle que définie ci-dessus ou d'une nanoémulsion susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus comme agent de contraste, notamment pour une détection par imagerie par résonance magnétique (IRM). L'invention concerne également un agent de contraste comprenant une nanoémulsion telle que définie ci-dessus ou d'une nanoémulsion susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. Les figures annexées représentent respectivement : Figure 1 : Coupe d'une goutte d'huile stabilisée par des tensioactifs Figure 2 : schéma représentant le mécanisme de la coalescence Figure 3 : schéma représentant le mûrissement d'Ostwald Figure 4 : diamètre des gouttelettes en micromètres en fonction du poids de l'ensemble [lipoide E80 et DSPE-PEG] Figure 5 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange) ou un mélange des deux (triangle), dans le régime pauvre dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 6 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange) ou un mélange des deux (triangle), dans le régime pauvre dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 7 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (losange) ou un mélange lipoide E80 / DSPE-PEG (carré), dans le régime riche dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 8 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (losange) ou un mélange lipoide E80 / DSPE-PEG (carré), dans le régime riche dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 9 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange) dans le régime pauvre en fonction du nombre de lavages dans l'eau pure (exemple II. 1) Figure 10 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange) dans le régime pauvre en fonction du nombre de lavages dans l'eau salée (0,154M NaCI) (exemple II. 1) Figure 11 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 dans le régime riche en fonction du nombre de lavages dans l'eau (exemple II. 1) Figure 12 : taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 dans le régime riche en fonction du nombre de lavages dans l'eau salée (0,154M NaCI) (exemple II. 1) Figure 13: taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange), dans le régime pauvre dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 14: taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (carré) ou du DSPE-PEG (losange), dans le régime pauvre dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 15: taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (12% massique), dans le régime riche dans l'eau pure (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 16: taille en nm des gouttelettes comprenant du lipoide E80 (12% massique), dans le régime riche dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours (exemple II. 1) Figure 17: taille en nm des gouttelettes dans le régime pauvre (3% mass.) dans l'eau pure en fonction du temps en jours, les triangles représentant le système de référence. (exemple II. 1) Figure 18: taille en nm des gouttelettes dans le régime pauvre (3% mass.) dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours, les triangles représentant le système de référence. (exemple II. 1) Figure 19: taille en nm des gouttelettes dans le régime riche (12% mass.) dans l'eau pure en fonction du temps en jours, les triangles représentant le système de référence. (exemple II. 1) Figure 20: taille en nm des gouttelettes dans le régime riche (12% mass.) dans l'eau salée (0,154M NaCI) en fonction du temps en jours, les triangles représentant le système de référence. (exemple II. 1) Figure 21: taille en nm des gouttelettes dans le régime pauvre (3% mass.) dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 2) Figure 22 taille en nm des gouttelettes dans le régime riche (12% mass.) dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 2) Figure 23 : Image de CryoTEM d'une nanoémulsion de PFOB à 20% massique stabilisé par un mélange (90/10) de Lipoide E80 et de DSPE-PEG 2000 avec 0.425% massique de Miglyol par rapport à la phase aqueuse (exemple II. 2) Figure 24: taille en nm des gouttelettes comprenant du des tensioactifs anioniques (losange), cationiques (triangles) et non-ionique (carrés) de chaînes carbonés C12, dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 3) Figure 25: taille en nm des gouttelettes comprenant de la lactoglobuline ou un mélange lipoide E80 / DSPE PEG dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 3) Figure 26: taille en nm des gouttelettes comprenant de l'amidon (losange), de la caséine (carré) ou un mélange lipoide E80 / DSPE PEG (triangle), dans l'eau pure en fonction du temps en jours (exemple II. 3) Les exemples qui suivent illustrent les modes de réalisation de l'invention. PARTIE I : Fabrication et méthode de caractérisation des nanoémulsions 1 Composés utilisés Les produits utilisés pour formuler les nanoémulsions sont les suivants : Phases dispersées : (Huiles fluorées) : perfluorooctylbromide (PFOB), perfluorohexadécane (PFHD), perfluorodécylbromide (PFDB). - Phases continues : Eau distillée ou eau salée (NaCI=0,154M). - Stabilisants : Le Phospholipide naturel Lipoid E80 (PL) issu du jaune d'ceuf, composé majoritairement de Phophatidilcholine ainsi que le phospholipide modifié pégylé DSPEPEG 2000 (PLM). Cette modification du phospholipide apporte de la furtivité à la nanoémulsion, pour que la nanoémulsion ne soit pas immédiatement évacuée par le système imunitaire. Les différentes huiles et stabilisants seront utilisés ensemble ou séparément en fonction des manipulations effectuées. 2 Fabrication et caractérisation des nanoémulsions Les phospholipides (PL) et phospholipides modifiés (PLM) sont dissous sous agitation magnétique et chauffage (45°C) dans la phase continue contenant l'eau pure ou l'eau salée. Dans un premier temps, une nanoémulsion dite grossière est formée en incorporant progressivement l'huile dans la phase aqueuse sous forte agitation à l'aide de l'Ultra-Turax Cette pré-émulsion est ensuite passée au microfluidiseur afin de diminuer la taille des gouttes. La taille moyenne des gouttes dh ainsi qu'un indicateur de la largeur de distribution des tailles de goutte (PDI) sont mesurés par la diffusion dynamique de la lumière PARTIE II : amélioration de la stabilité des nanoémulsions 11.1) Utilisation de techniques de lavage La taille des gouttes obtenues en fonction de la quantité de tensiactif (lipide amphiphile lipoide E80 et lipide pégylé DSPE-PEG) a été étudiée (figure 4). Deux régimes ont été mis en évidence : un régime pauvre en stabilisant où la taille des gouttes est déterminée par la quantité de stabilisant et ne dépend pas de l'énergie mécanique apportée au système lors de l'émulsification (zone 1), ainsi qu'un régime riche en stabilisant où la taille des gouttes dépend essentiellement de l'énergie apportée (zone 2). Il a été recherché dans un premier temps, à déterminer si les phospholipides PL et PLM ont un comportement similaire à des petites molécules de tensioactifs, c'est-à- dire s'ils s'équilibrent avec des molécules en excès dans la phase continue ou si leur adsorption est irréversible. Des nanoémulsions stabilisées uniquement par du PL ou PLM en quantité correspondant au régime pauvre d'une part et au régime riche d'autre part, dans le cas du PL, ont été formulées. Ces nanoémulsions ont été réalisées dans l'eau et dans l'eau salée. Ces six nanoémulsions ont été lavées. Lors d'un cycle de lavage, la nanoémulsion est centrifugée afin de séparer la nanoémulsion de la phase continue. L'huile étant plus lourde que l'eau, les gouttes constituent le sous-nageant opaque et visqueux, tandis que la phase continue contenant l'eau et les phospholipides (en excès dans le cas du régime riche) forment le surnageant. Ce surnageant est remplacé par une phase continue (eau ou eau salée) sans phospholipide. Après homogénéisation de l'ensemble, la taille de la nanoémulsion est mesurée. Trois types d'expériences sont reportés : les nanoémulsions sont stockées et leurs tailles sont mesurées régulièrement au cours du temps (suivi cinétique), les nanoémulsions subissent des lavages afin de favoriser la désorption (désorption forcée) et un suivi cinétique est réalisé à l'issue des lavages (figures 5 à 8). On remarque que le Lipoïd E80 se désorbe très peu de l'interface puisque la taille est quasiment invariante. En revanche, le Dspe-PEG est moins efficace pour stabiliser la nanoémulsion puisque la taille des gouttes ne cesse d'augmenter. De la même manière, le mélange des deux stabilisants correspondant au système de référence (SC67-F2 ; SC46-F3 ; SC31-F2 ; SC22-F2) présente aussi une instabilité liée à la désorption des stabilisants. Lavage - désorption Dans le régime riche comme dans le régime pauvre, les lavages n'ont pas d'effet sur la désorption des phospholipides PL et PLM. Contrairement aux molécules de tensioactifs, il n'y a pas d'équilibre entre l'interface et la phase continue. Il n'y a donc pas de désorption forcée. L'évolution de la taille des gouttes en fonction des lavages est représentée dans les figures 9 à 12. Dans le cas des molécules de tensioactifs, les lavages accélèrent la déstabilisation des nanoémulsions. Dans le cas des phospholipides, au contraire, en comparant les figures [5 à 8] et [13 à 16] on peut conclure que les lavages ont tendance à ralentir la desorption du Dspe-PEG et donc la déstabilisation de la nanoémulsion. Utilisation d'un mélange d'huiles pour éviter le mûrissement d'Ostwald Les gouttes injectables étant de petites tailles, le mécanisme de déstabilisation est vraisemblablement du au mûrissement d'Ostwald. Nous cherchons donc à le stopper. Pour cela, on incorpore une huile de plus longue chaine moléculaire en plus de la PFOB. Le ratio est 10% massique en PFHD ou PFDB et de 90% massique en PFOB. L'étude a été effectuée dans le régime pauvre ainsi que dans le régime riche en utilisant des mélanges PFOB+PFDB et PFOB+PFHD. Ces essais ont été réalisés dans l'eau et dans l'eau salée (0,154M). Un suivi cinétique par DLS de ces nanoémulsions a été fait, les résultats obtenus sont représentés dans les figures 17 à 20. Lorsque l'on compare avec le système de référence (triangle), on remarque que les mélanges d'huiles permettent de bloquer le mûrissement d'Ostwald. 11.2) Ajout d'un compatibilisant Lors de cet étude, l'amélioration de la compatibilité entre le système PL et PLM et l'interface dispersée fluorée a été recherchée. D'après les figures 21 et 22, on remarque que l'ajout d'un compatibilisant en particulier le Miglyol, améliore la stabilité de la nanoémulsion, lorsqu'on compare avec le système de référence (SC67-F1 ou SC31-F2). L'explication retenue est que le Miglyol forme une couche s'intercalant entre l'huile fluorée et les tensioactifs. Ceci a été vérifié grâce à des images de cryoTEM (figure 23). 11.3 charge de l'interface : utilisation de tensioactifs Afin d'orienter les études vers le type de stabilisant le plus approprié, les phospholipides PL et PLM ont été remplacés par des tensioactifs anioniques (losange), cationiques (triangles) et non-ionique (carrés) de chaînes carbonés C12 (figure 24). Les résultats montrent que les tensioactifs anioniques sont ceux qui stabilisent le mieux la nanoémulsion. Les tensioactifs non-ioniques et cationiques ne restent pas à l'interface et la nanoémulsion se déstabilise très vite. 11.4 utilisation de protéines Une étude a été faite en remplaçant, les phospholipides par des protéines telles que la lactoglobuline (figure 25) et la caséine (figure 26). De l'amidon qui est un polysaccharide a aussi été utilisé (figure 26). Lorsque l'on compare l'évolution cinétique de la lactoglobuline, on remarque qu'après un léger saut, la nanoémulsion est stabilisée, tandis que le système de référence évolue avec le temps. Le fait de chauffer la lactoglobuline à 90°C pendant 30 minutes, permettrait la formation de pont di-sulfure, qui aurait pour effet de figer la taille des gouttes de la nanoémulsion. La caséine et l'amidon stabilisent la nanoémulsion, puisqu'ils viennent à l'interface eau-huile. Cependant, l'amidon se désorbe très vite ; la taille des gouttes en présence de caséine à tendance à se stabiliser après une augmentation de taille sur les premiers jours. REVENDICATIONS1. Nanoémulsion huile dans eau comprenant : 5 - une phase aqueuse - une phase huile fluorée - un tensioactif à l'interface entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, le tensioactif formant une couche de tensioactif entre la phase aqueuse et la phase huile fluorée, 10 la dite nanoémulsion comprenant en outre un agent compatibilisant formant une couche supplémentaire s'intercalant entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif. 2. Nanoémulsion selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'agent 15 compatibilisant est une huile hydrocarbonée non fluorée comprenant au moins 70%, avantageusement au moins 80%, de façon avantageuse au moins 95% en poids, notamment au moins 97 %, d'acides gras saturés en C6-C18. 3. Nanoémulsion selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'agent 20 compatibilisant est une huile hydrocarbonée non fluorée comprenant au moins 70% d'acides gras saturés en C6-C14, plus avantageusement en C6-C10. 4. Nanoémulsion selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'huile hydrocarbonée saturée est une huile saturée comprenant au moins 70%, de préférence 25 au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 12 à 18 atomes de carbone, ou comprenant un mélange d'huiles saturées comprenant chacune au moins 70%, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 12 à 18 atomes de carbone. 5. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée 30 en ce que l'huile fluorée est une huile choisie parmi les huiles incluant des perfluorocarbones linéaires ou ramifiés, ou cycliques ou polycycliques, saturés ou insaturés, des amines tertiaires cycliques perfluorées, des perfluoro esters ou thioesters, des haloperfluorocarbones ; avantageusement perfluorooctylbromide PFOB, C8F17Br (PFOB ou perfluorobron), perfluorooctyléthane (C8F17C2H5 PFOE), perfluorodecalin FDC, 35 perfluorooctane C8F18, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyl, perfluoroheptane, perfluorodécane C10F22, perfluorododécyle bromide C10F22Br PFDB, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine,perfluorotributylamine, perfluorodiméthylcyclohexane, perfluorotriméthylcyclohexane, ester de perfluorodicyclohexyl, perfluoro-n- butyltétrahydrofurane. 6. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la phase fluorée comprend une première huile fluorée et au moins une deuxième huile fluorée ; avantageusement la première huile fluorée représente entre 70 et 95% massique de la phase huile fluorée et la deuxième huile fluorée représente 5 à 30% massique de la phase huile fluorée. 7. Nanoémulsion selon la revendication 6 caractérisée en ce que la première huile fluorée est le PFOB, la deuxième huile fluorée est une huile de plus longue chaîne moléculaire de préférence le perfluorohexadécane PFHD ou le perfluorodécylbromide PFDB. 8. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle comprend : une phase aqueuse, représentant de préférence 29.3 à 80 % en poids de la composition, avantageusement 55 à 65%, plus avantageusement de 58 à 62%, une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée, représentant 19.3 à 70% en poids de la composition, avantageusement 35 à 45%, plus avantageusement 37 à 42%, un tensioactif (formant la couche de tensioactif) à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, un agent compatibilisant formant une couche entre la phase huile fluorée et la couche de tensioactif, la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à l'huile étant comprise entre 3 et 15%, avantageusement entre 6 et 12 % ; la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à la composition étant comprise entre 0.6 et 10 %, avantageusement entre 1 et 3 % ; la teneur totale en agent compatibilisant étant comprise entre 0.1 % et 5% massique par rapport à la phase aqueuse. 9. Nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le tensioactif est un agent tensioactif anionique. 10. Procédé de préparation de nanoémulsions huile dans eau selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 comprenant une phase aqueuse, une phase huilefluorée, un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et lipidique, le procédé comprenant les étapes : a) mélange des constituants de la phase aqueuse, de la phase fluorée, et du tensioactif, de manière à obtenir une nanoémulsion b) au moins une étape de lavage de la nanoémulsion préparée en a). 11. Agent de contraste comprenant une nanoémulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une nanoémulsion susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 10.