FR 2997705 A1 20140509 FR 1202997 A 20121108 Les acides nucléiques anti-sens sont des séquences complémentaires d'une partie codante d'un ARNm et sont généralement utilisés pour bloquer la traduction en protéines d'une séquence ARNm donnée dans un système eucaryote ou procaryote. La spécificité de la reconnaissance ARNm anti-sens conduit à la spécificité de l'inhibition. Les systèmes procaryotes ou eucaryotes visés peuvent être soit des systèmes in vitro reconstitués, soit des cellules. Dans le cas de cellules, si le gène est essentiel à la vie de la cellule, l'anti-sens entraînera la mort cellulaire par carence de la protéine correspondante. En revanche, pour des gènes non essentiels, la cellule continuera à se développer. L'utilisation de pareilles molécules comme traitement est limitée par la difficulté de trouver des gènes qui soient à la fois essentiels à la vie de la cellule, tout en étant spécifique à la cellule visée. En effet, les gènes conférant une spécificité à une cellule sont très souvent non essentiels, la cellule pouvant vivre lorsqu'ils sont entièrement réprimés. Les gènes essentiels à la vie d'une cellule sont souvent ubiquitaires et il est très difficile dans un système pluricellulaire, par exemple dans un organisme ou dans un écosystème, de réprimer ces gènes uniquement dans des cellules cibles, sans toucher les autres cellules. Dans les méthodes de production de protéines dans un système eucaryote ou procaryote, les anti-sens utilisés pour bloquer la traduction d'un gène sont difficilement réversibles à volonté, il est nécessaire d'attendre la dégradation de l'acide nucléique anti-sens, qui dépend du temps de vie de la molécule anti-sens, ou les divisions cellulaires, la descendance n'héritant pas de l'anti-sens. II est donc difficile d'étudier le rôle fonctionnel d'une protéine (inhibition d'expression/ expression) sur un même système, par exemple une même génération de cellule, la levée de l'inhibition étant aléatoire. Nous proposons un nouveau type d'acide nucléique anti-sens bloquant SASB et une nouvelle conception systématique de séquence anti-sens permettant de bloquer l'expression en protéine (traduction) de gènes cibles dans un système eucaryote et/ou procaryote in vitro et/ou in vivo, tel que les ribosomes du système et les protéines en cours de synthèse soient séquestrés sur les ARNm. Lorsque les SASB sont en quantité suffisante, toute la synthèse protéique d'un système sera bloquée. Cette synthèse peut être relancée à volonté par ajout dans le système de puromycine ou éventuellement d'une autre molécule résultant de la fusion d'un nucléoside avec un acide aminé. L'utilisation de la puromycine permet d'introduire dans la protéine synthétisée des inserts avec de nouvelles fonctionnalités ou fonctions. Principe de fonctionnement Nous entendons ici par système, des systèmes cellulaires reconstitués composés d'un mélange de constituants cellulaires, des cultures cellulaires, des organismes, des biotopes etc... L'invention consiste en un procédé et en des dispositifs permettant de bloquer de manière réversible l'expression en protéine d'un gène. 501.1) Le procédé consiste en une combinaison d'au moins un acide nucléique dit « anti sens bloquant> (SASB) d'une taille N comprise entre 3 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 nucléotides Fig1.1, tel que chaque acide nucléique bloquant SASB présente à l'extrémité 3' trois nucléotides formant un anti-codon « anti-ter » Fig1.2 (par exemple 5'UUA3', 5'CUA3', 5'UCA3' pour les 55 mitochondries 5'UCU3', 5'CCU3') de séquence complémentaire à un codon de terminaison de traduction Fig1.3 «codon ter » (par exemple 5'UAA3', 5'UAG3', 5'UGA3' et pour les mitochondries , 5'AGA3', 5'AGG34 ) et plus particulièrement complémentaire au codon ter d'un ARNm cible Fig1.4, les N-3 nucléotides restant à l'extrémité 5' ou N' dudit SASB (Fig1.5) étant complémentaires à l'extrémité 3' 60 des N-3 acides nucléiques suivant le codon stop de l'ARNm cible. Un SASB en s'hybridant sur son ARNm cible va bloquer l'action des facteurs de relargage du ribosome, interrompant la synthèse protéique en séquestrant le ribosome dans un complexe ARNm/SASB/peptide en cours de synthèse. Le ribosome et le peptide en cours de synthèse pourront être relargués par l'action de la puromycine ou 65 éventuellement d'une autre molécule équivalente résultant de la fusion d'un nucléoside et d'un acide aminé. 1.2) dans un mode de réalisation préférentiel les anti-sens bloquant SASB comprennent des nucléotides de haute affinité pour l'ARN tels que PNA (peptide 70 nucléique acide), LNA (lock nucléique acide ), TNA (Thyonucléique Acide), SiNA (Silicium nucleique Acide) ou tout autre analogue d'acide nucléique présentant un affinité plus forte pour l'ARN que celle des acides nucléiques normaux. 2) Dans un autre mode de réalisation, un jeu de séquences anti-sens bloquantes 75 sera dirigé contre une ou plusieurs séquences ARNm d'une cible microbe tel que virus, bactérie, cellule eucaryote... de manière que les séquences SASB soit préférentiellement spécifiques d'un ARNm présent de la cible mais absentes de l'hôte éventuel ou des autre types cellulaires présents dans le système. Par exemple les séquences SASB seront dirigées contre une combinaison 80 quelconque de des ARNm du virus du sida I ou II, comprenant les gènes gap pol vif tag et VRP tel que pour: HIV 1 85 les SASB retenus sont : SASB-gag 5' C CTATCTTTA3' SASB-Ppol 5'CCATGTGTTA3' Sasb-vif 5'AGAAGCTCTA3' Sasb-VRP 5'CTCTAGTCTA3' 90 H1V2 2 les SASB retenus sont : Sasb- gag 5' ATAAGTGCTA 3' Sasb-vif 5'TTGTTCATCA3' 95 Sasb-tat 5'ACATAGTTTA3' Ces séquences n'étant pas significativement présentes dans le génome humain, et correspondent aux 10 bases complémentaires des ARNm à partir du codon stop ou du ter des ARNm. 100 3 3) Dans un autre mode de réalisation un jeu de SASB sera dirigé contre une combinaison quelconque d'ARNm de gènes induisant des tumeurs et plus particulièrement contre les 10 bases incluant le codon stop ou ter et les 7 bases suivant le codon stop de leur ARNm. 105 3.1) Dans un mode de réalisation particulier les SASB seront greffés sur des particules. Dans un mode de réalisation préférentielle, le greffage se fera au travers de liaisons labiles en milieu réducteur, tel que les milieux rencontrés dans le milieu 110 intra cellulaire. Dans ce mode de réalisation chaque SASB sera par exemple fonctionnalisé à une de ses extrémités 3' ou 5' (N' ou C' pour les PNA) avec une fonction thiol et greffé au travers d'un pont di-sulfure sur des particules fonctionnalisées également par des fonctions thiol. Les particules seront préférentiellement chimiquement inertes, il pourra s'agir de 115 nano-particules de diamant ou de tout autre nano-particule non toxique recouverte de fonctions thiol ou de toute autre particule fonctionnalisable. Dans un mode de réalisation particulier les nano-particules seront des peptides riches en cystéine. Par exemple il pourra s'agir d'un polymère de 5 à 100 120 cystéines, les fonctions latérales sh des cystéines jouant le rôle d'accepteur de ponts disulfures. 3.3) dans un mode de réalisation particulier, les particules seront fonctionnalisées par un jeu de séquences anti-sens bloquant SASB dirigé contre plusieurs ARNm 125 différents, tel que une particule donnée soit fonctionnalisée avec une stoechiométrie donnée de séquences anti- sens bloquant SASB . En pénétrant dans une cellule, une particule emporte avec elle un stoechiométrie donnée d'antisens qui vont bloqué la traduction des ARNm cibles. 130 3.4) dans un mode de réalisation particulier les particules fonctionnalisées par des séquences SASB seront également fonctionnalisées part un effecteur d'adressage tel qu'un anticorps, un ligand ou tout autre effecteur spécifiquement complémentaire à un antigène, à un récepteur ou toute autre élément se trouvant sur la membrane d'une cellule à cibler. Les particules en se fixant 135 préférentiellement sur les dites cellules au travers de l'effecteur d'adressage, favorisent la pénétration des SASB à l'intérieur des cellules. 3.5) Dans un mode de réalisation particulier le greffage de l'effecteur d'adressage sur la particule se fera par l'intermédiaire d'un séquence nucléique ou analogue 140 telle que LNA, PNA, TNA, SiNA ou tout autre type d'analogue d'acide nucléique formant une séquence d'adressage fixée sur la particule. La séquence d'adressage sera complémentaire à une séquence tag, également acide nucléique ou analogue, greffée sur l'effecteur d'adressage. En s'hybridant la séquence d'adressage et la séquence tag permettent la fixation de l'effecteur d'adressage 145 sur la particule. Cette stratégie permet de fonctionnaliser en une fois et de manière stoechiométrique les particules avec toutes les séquences anti-sens bloquant SASB et les adressages, puis de fixer les effecteurs d'adressage sur la particule par simple mise en contact de l'effecteur d'adressage avec la particule. Ce mode de réalisation sera particulièrement utilisé avec des molécules 150 chimériques anticorps/acide nucléique ou avec des heptamères. 2 99 7 70 5 4 3.6) Dans un certain mode de réalisation, le nombre SASB introduit dans le système sera tel qu'il monopolisera tous les ribosomes disponibles dans le système, de telle manière à bloquer la transcription de tous les type d'ARNm dans 155 le système. 4) dans un mode de réalisation particulier le ou les peptides en cours de synthèse et les ribosomes bloqués sur des ARNm seront libérés par introduction dans le milieu de puromycine ou éventuellement de molécules équivalentes résultant de la 160 fusion d'un nucléotide et d'un acide aminé, par exemple par la substitution d'une des fonctions hydroxy du sucre du nucléotide par une des fonctions N et une fusion avec l'acide aminé par la fonction carboxylique, pour former une amide ou une liaison peptidique. Dans cette configuration les peptides et protéines produites présenteront en C terminal une molécule de puromycine ou d'équivalent de 165 puromycine par la réaction d'une fonction amine de l'acide aminé de la puromycine avec une fonction COOH terminale du peptide en cours de synthèse bloqué sur le ribosome par la séquence SASB. Cette procédure utilisant un SASB permet d'étudier les effets d'une inhibition 170 sélective de la traduction d'un ARNm donné comme le permettrait un ARN antisens classique, mais elle permet en plus de pouvoir lever à volonté l'inhibition de la traduction, par introduction de puromycine ou d'un équivalent. Les protéines obtenues après levée de l'inhibition seront toutefois modifiées en C terminal par l'ajout d'une puromycine ou de l'équivalent. Ce système sera par exemple 175 utilisable pour analyser le rôle d'une protéine donnée dans une même génération de cellules. 4.1) Dans un mode de réalisation particulier la molécule de puromycine ou équivalent sera elle même fusionnée, par exemple par l'extrémité 5' du sucre de la 180 puromycine, avec une molécule appelée insert tel que l'insert soit un PEG, un court peptide, acide succinique, acide aminé, ethyl diamine, ethyl amine ou tout autre molécule destinée à être fusionnée en C terminal d'un peptide bloqué en cours de traduction par un SASB. Dans un certain mode de réalisation l'insert comporte à son autre extrémité une fonction chimique particulière, une nano 185 particule ou tout autre élément lui conférant des propriétés particulières. D'une manière générale, au moment de la levée du blocage de traduction par la puromycine ou équivalent, l'insert permet d'introduire en C terminal d'un peptide en cours de synthèse, une molécule, une séquence, une nanoparticule ou toute autre structure, ladite structure étant reliée au peptide par l'intermédiaire d'une 190 puromycine ou équivalent. 4.2) Dans un certain mode de réalisation les séquences SASB, la puromycine ou équivalent ou encore l'insert relié à la puromycine ou équivalent seront greffées sur des particules en respectant préférentiellement une stoechiométrie entre les 195 différentes entités greffées. Toutes sortes de particules peuvent être utilisées pour cela et notamment des nano-particules telles que nano-diamant, protéine ou peptide riche en cystéine, Qdot, etc. Le greffage sur les particules sera préférentiellement réalisé au travers de liaisons labiles, par exemple par l'intermédiaire de ponts disulfures. Ainsi dans un milieu réducteur, comme celui 200 rencontré dans le milieu intra cellulaire, les éléments greffés sur les particules seront libérés dans le milieu lorsque les dites particules seront introduites dans ledit milieu. L'utilisation de particules permet de maitriser la stoechiométrie entre les SASB et la puromycine ou équivalent et le cas échant l'insert qui seront introduits dans le milieu avec chaque particule. Les mêmes modes d'adressage 205 que ceux décrits en 3.4 peuvent être utilisés. 4.2.21) Dans un certain mode de réalisation les séquences SASB, la puromycine ou équivalent ou encore l'insert relié à la puromycine ou équivalent seront greffés sur des particules au travers de liaisons labiles inductibles tel que la rupture de la 210 liaison à la particule soit induite par l'action d'un rayonnement électromagnétique, une irradiation radioactive ou toute autre radiation ionisante,un champs électrique, un champs magnétique etc. notamment la liaison à la particule pourra se faire au travers de fonction Nitrto Benzolic, ces composés étant clivés sous l'action de radiations électromagnétiques. 215 4.3) Dans un certain mode de réalisation les inserts ou éventuellement la puromycine ou équivalent, comprendront des éléments présentant une fonction exogène par exemple une fonction d'inhibition de certaine activité cellulaire, une fonction de toxicité pour le système dans lequel lesdits éléments sont introduits. 220 Plus particulièrement l'élément d'inhibition ou de toxicité sera préférentiellement dirigée contre l'activité du peptide fusionné ou contre l'activité d'une organelle, d'un organe, ou d'un complexe dans lequel intervient le peptide fusionné. Par exemple l'insert ou la puromycine ou équivalent peuvent comprendre un antibiotique. Ainsi dans un mode de réalisation particulier, un SASB dirigé contre 225 un ARNm conférant à une bactérie une résistance à un antibiotique donné et un insert greffé avec ledit antibiotique peuvent être introduits dans le système bactérien. Un insert de PEG (poly éthylène glycol) d'acide nucléique ou d'un analogue d'acide nucléique ou de tout autre espaceur, comprendra par exemple à une des extrémités, une puromycine fusionnée en 5', et à l'autre extrémité ledit 230 antibiotique. Le peptide de fusion avec l'insert, obtenu après levée du blocage de traduction, comportera donc à son extrémité C terminale un antibiotique. Dans cet exemple de résistance de la bactérie à l'antibiotique est conféré par des canaux expulsant les antibiotiques, la présence d'un antibiotique lié à au moins une sous unité du canal entrainera le blocage du canal par blocage du site de 235 reconnaissance du canal et donc l'inhibition de ce dernier qui entrainera la diminution ou la disparition de sa fonction d'expulsionion de l'antibiotique conduisant la bactérie à une plus grande sensibilité à l'antibiotique. 4.4) Dans un certain mode de réalisation la séquence SASB et ou la puromycine 240 ou l'équivalent et ou l'insert, comprendront un élément conférant une fonction exogène de toxique inductible. L'induction de l'élément toxique pourra se faire au travers de l'application, d'un rayonnement électromagnétique, d'une radiation radioactive, d'un champ électromagnétique, l'ajout dans le système d'un composé induisant la toxicité de 245 l'élément toxique induit. Cette élément toxique pourra comprendre des nano-particules, des molécules ou toute autre élément photo-sensible, radio-sensible, sensible à un champ électromagnétique, à un champs magnétique, à un champs électrique... Dans un cas particulier, l'élément toxique inductible comprendra une molécule de 250 graphène (carbone bidimentionnel), ou de bore bidimentionnel dont les atomes sont organisés en plans pour former un plan bi-dimensionnel ; sous l'action d'un rayonnement électromagnéitque ou radioactif, d'une iradiation radioactive ou ionisante, d'un champ magnétique ou électrique éventuelement variable, les courants induits dans les structures bidimensonnelles généreront des radicaux 255 libres toxiques pour la cellule. Dans ce mode de réalisation une fois les éléments toxiques inductibles introduits à l'intérieur d'un système, par exemple des cellules ciblées après une éventuelle chasse réalisée pour éliminer les molécules libres. L'excitation des toxiques inductibles permettra de détruire les cellules ayant inclus les SASB et/ou l'insert avec leur fonction exogène toxique. Dans le cas des 260 graphènes ou des bores bidimensionnels, l'application d'un champ magnétique ou électrique excitera les plans bidemensionnels. L'excitation électronique induite générera des radicaux libres endommageant les systèmes dans lesquels ils sont introduits. L'excitation de l'élément toxique inductible peut amplifier l'action létale d'un traitement, par exemple d'un traitement radiatif et plus particulièrement d'un 265 traitement radiatif utilisant des rayons X ou des lasers à rayon X. Dans un mode de réalisation particulier lorsque l'élément toxique inductible est introduit sur la puromycine ou équivalent, ou sur l'insert, la protéine de fusion résultant pourra permettre de viser des organelles particulières ou des organes particuliers vers lesquels est routée et/ou accumulée la protéine de fusion celle-ci 270 permettra de détruire particulièrement ces organelles ou ces organes. 4.5) Dans un certain mode de réalisation la séquence SASB et ou la puromycine ou l'équivalent et ou l'insert, comprendront un élément conférant une fonction exogène de contraste pour la tomographie ou l'IRM ou les scanners. 275 Tous les éléments de contraste pourront être employés y compris des nanoparticules, toutefois dans un réalisation particulière les éléments de contraste comprendront des graphènes ou du bore organisés en plan bidemensionnel. Les éléments de contraste permettront de cibler et de localiser des ARNm particuliers, des peptides particuliers, et ou les organelles et ou les organes dans lesquelles ils 280 sont exprimés ou routés ou accumulés. 4.6) Dans un mode de réalisation particulier, les agents de contraste et de toxicicité inductibles seront utilisés ensemble d'une part pour faire la cartographie des systèmes tels que cellules d'organe, organisme, tumeur... en termes de 285 traduction d'un ou plusieurs ARNm ou d'abondance du dit ARNm et le cas échéant pour détruire préférentiellement et spécifiquement les systèmes présentant lesARNm ou les protéines cibles. Dans un certain mode de réalisation préférentielle les agents de contraste et de toxicité inductibles seront les mêmes, il pourra s'agir de la même molécule notamment les molécules planes 290 bidimensionnelles telles que les graphènes ou le bore, molécules pouvant servir aux deux rôles. Dans un certain mode de réalisation les agents de contraste et ou de toxicité pourront être composés d'une particule de nano-particule Fe02 FeS2, d'une nano-particule de diamant, d'un peptide éventuellement riche en cystéine ou de n'importe quel type de particule biologiquement neutre, tel que la dite particule 295 soit préférentiellement recouverte de graphène ou de bore monoplan bidimensionnel. 4.7) en utilisant des agents de contraste présentant des propriétés différentes pour marquer les SABS et les inserts, il est possible d'évaluer dans un système le taux 300 d'un ARNm donné et le taux de traduction du dit ARNm ainsi que la cinétique de traduction. 4.8) Dans un mode de réalisation particulier un rayonnement laser optique sera utilisé (IR, visible, UV) pour cartographier la position des cellules présentant les 305 ARNm et/ou les protéines ciblées par un SASB et/ou un insert et les autres et un rayon X de type laser focalisé (utilisation d'un laser X) sera utilisé pour détruire les cellules ciblées. 4.9) Dans un mode de réalisation particulier une IRM sera utilisée pour 310 cartographier la position des cellules présentant les ARNm et/ou les protéines ciblées par un SASB et/ou un insert et d'autres et un rayon X de type laser focalisé (utilisation d'un laser X) sera utiliser pour détruire les cellules ciblées. 5) Dans un certain mode de réalisation la séquence SASB et ou la puromycine ou 315 l'équivalent et/ou l'insert, comprendront une fonction exogène facilitant la traversée de la membrane cellulaire telle que la fonction exogène soit assurée par un PEG, un acide gras, un steroïde, une hormone stéroïde, une hormone non stéroïde ou tout autre molécule lipophile ou capable de faciliter la traversée de la membrane cellulaire. Les molécules lipophiles seront greffées sur les SASB, 320 l'insert et/ou la puromycine éventuellement par l'intermédiaire d'un pont disulfure. Dans d'autre mode de réalisation, les séquences lipophiles pourront comprendre de courtes séquences peptidiques ou des hormones permettant de traverser la membrane cellulaire mais aussi d'adresser les SABS, les inserts et/ou la puromycine vers des organelles spécifiques de la cellule ou vers des organes 325 spécifiques. 6) Dans un certain mode de réalisation les SABS et éventuellement les puromycine ou les équivalents de puromycine seront inclus dans un compartiment 330 vésiculaire ou micellaire. 6.1) Dans un certain mode de réalisation les micelles ou les vésicules comportent des vecteurs de déstabilisation permettant d'induire la rupture de la structure micellaire ou vésiculaire sous l'action par exemple d'une radiation radioactive, d'un 335 rayonnement électromagnétique, d'un champ électromagnétique, d'un champ électrique ou magnétique, de manière à libérer le contenu. Les vecteurs d'induction de rupture pourront être inclus dans la membrane ou la lumière des micelles ou des vésicules. 3406.1.1) Dans un certain mode de réalisation les vecteurs d'induction de rupture comprendront des polymères thermo-sensibles, y compris des polymères comprenant de la silice ou du silicone, introduit sur 0,0000005 à 30 % des lipides formant les parois des micelles ou vésicules en lieu et place d'un ou deux acides gras d'un phospholipide. Une augmentation de la température génèrera des 345 modifications de conformation des polymères thermosensibles entrainant la déstructuration des membranes de micelles ou des vésicules libérant le contenu des dites micelles ou vésicules dans le milieu du système. 6.1.2) Dans un certain mode de réalisation, les vecteurs d'induction de rupture 350 comprendront des polymères électro-sensibles introduits sur 0,0000005 à 30 % 8 des lipides formant les membranes des micelles ou vésicules en lieu et place d'un ou deux acides gras d'un phospholipide. Soumis à un champ électrique, les polymères électro-sensibles changeront de conformation déstabilisant la paroi des micelles ou des vésicules permettant la libération de leur contenu dans le milieu 355 du système. 6.1.3) Dans un certain mode de réalisation, les vecteurs d'induction de rupture comprendront des lipides parmi les lipides de la membrane, dont au moins un acide gras ou le cas échéant un polymère tel que PEG sera relié au glycérol par 360 une fonction photo-labile ou radio-labile, par exemple un dérivé de nitro-benzoide, ou toute molécule coupée par une radiation lumineuse ou radioactive. La lyse entre l'acide gras et le glycérol ou le cas échéant le polymère et le glycérol, déstabilisera la membrane des micelles ou des vésicules qui libéreront leur contenu dans le milieu du système. 365 6.1.4) Dans un certain mode de réalisation les vecteurs d'induction de rupture comprendront au moins un acide gras relié à un graphène ou à du bore bidimentionel introduit dans la menbrane des micelles ou des vesicules, tel que soumis à un champ éléctrique, ou à un champ magnétique , les courants induits 370 dans les plans bidimentionels déstabilisent les micelles ou les vésicules. 6.1.5) Dans un certain mode de réalisation les vecteurs d'induction de rupture comprendront des phospholipides avec une polarité telle que l'action d'un champ électrique ou magnétique déstabilise la membrane des micelles ou des vésicules 375 entrainant la libération de leur contenu dans le milieu du système. Notamment le champ pourra être appliqué par introduction de deux électrodes dans le système pour appliquer le champ électrique. 6.1.6) Dans un certain mode de réalisation le vecteur d'induction de rupture 380 comprendra des nano-particules de 10 à 100 nm sensibles à un champ magnétique disposées dans la lumière des vésicules telle que l'agitation de ces particules, sous l'action d'un champ magnétique, augmente la température à l'intérieur des micelles ou des vésicules entrainant la désorganisation de la membrane et la libération du contenu dans le milieu du système. 385 6.1.7) dans certains modes de réalisation les vecteurs d'induction de rupture comprendront au moins une molécule de cristaux liquides sur 0,0000005 à 30 % des lipides formant les membranes des micelles ou vésicules en lieu et place d'un ou deux acides gras d'un phospholipide ou tel que les chaînes latérales d'un ou 390 deux acides gras du phospholipide comprennent au moins une molécule de cristaux liquides. Soumis à l'action d'un champ électrique, les cristaux liquides s'orienterons en déstabilisant la paroi des micelles ou des vésicules permettant la libération de leur contenu dans le milieu du système. 395 6.1.8) Dans un certain mode de réalisation le vecteur d'induction de rupture comprend une combinaison quelconque des moyens décrits de 6.1.1 à 6.1.7 7) Dans un certain mode de réalisation les SASB le cas échéant la puromycine ou équivalent ou l'insert fixés sur des particules avec des liaisons labiles sont 400 disposés à l'intérieur de micelles ou de vésicules. 8) Dans un certain mode de réalisation un anticorps ou un autre effecteur d'adressage sera fixé sur les micelles ou les vésicules afin de cibler plus particulièrement les cellules ou tout autre système exprimant ces effecteurs. 405 8.1) Dans un certain mode de réalisation des phospholipides glycosylés seront introduits dans le milieu et les effecteurs d'adressage seront fixés sur les glucides des phospholipides. 410 8.2) Dans un certain mode de réalisation les effecteurs d'adressage fixés sur les vésicules ou les micelles seront des molécules chimériques acide nucléique (ou analogue) / segment d'anticorps 8.3) Dans un certain mode de réalisation les effecteurs d'adressage fixés sur les 415 vésicules ou les micelles seront des heptamères. 8.4) Dans un certain mode de réalisation les molécules chimériques seront greffées sur les micelles au travers d'une séquence tag acide nucléique ou analogue complémentaire d'une partie d'acide nucléique de la chimère ou de 420 l'heptamère. 8.4.1) Dans un certain mode de réalisation la séquence tag sera greffée sur les micelles ou les vésicules au travers d'une liaison avec un des hydroxy- d'un glucide d'un phospholipide glycosylé. 425 8.4.2) Dans un certain mode de réalisation la séquence tag sera greffée sur les micelles ou les vésicules au travers d'une liaison phosphate avec le phosphore d'un phospholipide. 430 9) Dans un certain mode de réalisation les séquences SASB, la puromycine ou analogue et ou les inserts seront greffés éventuellement par une fonction labile directement sur des molécules chimériques ou des heptamères. 435 10) Dans un certain mode de réalisation l'anticorps anti GP120 du VIH sera utilisé comme effecteur d'adressage. 11) Dans un certain mode de réalisation la protéine GP120 sera la cible des effecteurs d'adressage. 440 12) Dans certain mode de réalisation la puromicyne pourra être remplacée par toutes molécules présentant tout ou partie des propriétés de la puromicyne, et plus spécifiquement les propriétés de pouvoir lever le blocage de la traduction par un SASB et/ou la propriété d'être ajoutée en C' d'un peptide ou d'une protéine lors 445 de la levée du blocage. Il pourra s'agir notamment des analogues synthétiques de la puromicyne par exemple sans être exhaustif des molécules de conformation north, south dans laquelle le cycle ribose est substitué par des cycles carbonés divers. 450 13) Dans certains modes de réalisation, la puromicyne pourra être introduite en 3' ou en 5' de molécule SASB par exemple par l'intermédiaire d'un insert de manière à ce que le SASB soit lié à la protéine cible produite. Ceci permet par exemple d'identifier et de quantifier très rapidement les protéines cibles produites dans un système, ou encore de préparer des molécules chimériques 455 protéine/acide nucléiques. 14) exemple d'une réalisation d'une séquence SASB contre un ARNm codant pour une protéine de 25 KD. Dans un milieu permettant la transcription d'ARNms et leur traduction en protéines 460 à partir d'une matrice d'ADN d'expression, sont introduites des matrices d'expression codant pour une protéine de 25 KD. Chaque matrice comprend un promoteur du phage T7 Fig2.6, une séquence codant pour des histidines (tag his) Fig2.7, permettant de purifier la protéine de synthèse, un site de clivage Fig2.8 ,permettant de séparer la protéine du tag 465 histidine, et la séquence de synthèse de la protéine de 25KD Fig2.9. Une première matrice comprend (Construction A ) un codon ter 5'TAA3' Fig2.10 suivi d'une séquence telle que SAAGGGTG F 3' Fig1.11 de 7 nucléosides consécutifs à ladite séquence ter sur l'ARNm. Une seconde (construction B) s'arrête avant la séquence ter. Lorsque la construction A est introduite dans le milieu d'expression, 470 après purification la protéine attendue de synthèse de 25 KD est identifiée par analyse électrophorétique et marquage immunologique Fig3.12. En introduisant un LNA SASB de séquence 5'CUCCCUUUUT3' Fig2.13 complémentaire de la séquence ter et des 7 nucléosides consécutifs à ladite séquence ter sur l'ARNm, la synthèse de la protéine est inhibée par l'hybridation du SASB sur les ARNm. 475 L'hybridation du SASB sur le site ter des ARNm bloque les facteurs de terminaison de la traduction et séquestre les risosomes, les protéines en cours de synthèse et les ARNm dans le complexe ribosome/ARNM/protéine. Les ribosomes prisonniers ne peuvent continuer de synthétiser les protéines, de ce fait, la protéine de 25KD attendue est absente après analyse électrophorétique Fig3.14. En introduisant de 480 la puromicyne dans le milieu, les protéines synthétisées, les ARNms et les ribosomes sont libérés du complexe ribosome/ARNM/protéine en fin de synthèse. En présence de puromicyne et de SASB, les ribosomes du milieu peuvent dont synthétiser la protéine de 25KD attendue, mise en évidence par marquage immunologique après purification sur gel électrophorétique F1g3.15. La 485 construction B, ne possédant pas de codon ter, ne permet pas la synthèse de la protéine attendue Fig3.16. En effet l'absence de codons stop est décrite dans la littérature comme bloquant la protéine en cours de synthèse, les ribosomes,l'ARNm étant séquestrés dans un complexe ribosome/ARNm/portéine en cours de synthèse. En introduisant de la puromicyne dans le milieu les 490 éléments du complexe sont libérés ce qui permet au ribosome de synthétiser la protéine attendue Fig3.17. La séquence SASB agit donc comme un masque des séquences ter et permet de bloquer à volonté dans un complexe ribosome/ARNm/protéine les ribosomes et les ARNm d'un système, inhibant ainsi la traduction de l'ARNm cible et le cas échéant, la traduction de tous les ARNm 495 d'un système si la quantité de SASB est suffisante pour bloquer tous les ribosomes d'un système dans des complexes. 500 11 2 99 7 70 5 505 LEGENDES DE L'ENSEMBLE DES FIGURES 510 1) acide nucléique dit « anti sens bloquant (SASB) 2) anti-codon « anti-ter » 3) codon stop de terminaison de traduction «codon ter » 4) ARNm cible 5) N-3 nucléotides à l'extrémité 5' ou N' d'un SASB 515 6) Promoteur du phage T7 7) tag histidines 8) Site de clivage TEV 9) séquence de synthèse d'une protéine cible de 25KD 10) codon ter 520 11) 7 nucléosides consécutifs du ter d'ARNm. 12) protéine attendue de 25 KD identifiée par analyse électrophorétique et marquage immunologique 13) SASB 5'CUCCCUUUUT3' complémentaire de la séquence ter et des 7 nucléosides consécutifs à ladite séquence ter sur un ARNm 525 14) absence de la protéine de 25KD en analyse électrophorétique 15)SASB, les ribosomes du milieu peuvent dont synthèse la protéine de 25KD attendue en présence de SASB et de puromicyne 16) absence de synthèse de la protéine de 25KD à partir d'une matrice ne possédant pas de codon stop 530 17) synthèse de la protéine de 25KD à partir d'une matrice ne possédant pas de codon stop en présence de puromicyne 18) marqueur de poids moléculaire à 25Kd REVENDICATIONS1) Procédé de blocage de traduction d'ARNm dans un système in vitro, 570 caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'au moins un acide nucléique dit anti sens bloquant SASB d'une taille N comprise entre 3 à 50 nucléotides, préférentiellement 10 nucléotides, tel que au moins un SASB (Fig1.1) présente à l'extrémité 3' trois nucléotides formant un anti-codon « anti-ter » (Fig1.2) de séquence complémentaire à un codon de 575 terminaison de traduction (Fig1.3) «codon ter » et plus particulièrement complémentaire au codon de ter d'un ARNm cible, les N-3 nucléotides restant en 5' dudit SASB (Fig1.5) étant complémentaires des N-3 acides nucléiques en 3' suivant le codon stop de l'ARNm cible, et que le blocage de la traduction d'un ARNm cible tel que le piégeage de ribosomes sur 580 l'ARNm par l'hybridation d'un SASB soit réversible par l'action d'une molécule de fusion d'un nucléoside et d'un acide aminé tel que la puromycine. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les anti-sens 585 bloquant SASB comprennent des nucléotides de haute affinité pour l'ARN tels que PNA peptide nucléique acide, LNA lock nucléique acide, TNA « Thyonucléqiue Acide », silice nucléique Acide ou tout analogue d'acide nucléique présentant une affinité plus forte pour l'ARN que celle des acides nucléiques classiques. 590 3) Procédé selon l' une des revendications revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'un jeu d'au moins une séquence anti-sens bloquante SASB soit dirigée contre une ou plusieurs séquences ARNm d'une cible, microbienne, cellulaire eucaryote telle que au moins une séquence SASB soit 595 spécifique de la cible mais absente des autres types cellulaires présents dans un système. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'un jeu d'au moins une séquence anti-sens bloquante comprend une combinaison 600 quelconque de séquences SASB dirigées contre les ARNm des gènes gag pol, vif tat et VRP du virus du sida tel que chaque séquence SASB soit choisi parmi l'un quelconque de séquence SASB-gag 5'CCTATCTTTA3' 605 SAS B-Ppol 5'CCATGTGTTA3' Sasb-vif 5'AGAAGCTCTA3' Sasb-VRP 5'CTCTAGTCTA3' Sasb- gag 5' ATAAGTGCTA 3' Sasb-vif 5'TTGTTCATCA3' 610 Sasb-tat 5'ACATAGTTTA3' 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'un blocage de traduction par un SASB d'au moins un peptide en cours de synthèse et d'au moins un ribosome sur un ARNm est levé par une 615 molécule résultant de la fusion d'un nucléoside et d'un acide aminé tel que 12 25une molécule de puromycine de manière à ce que les peptides produits soit fusionnés en C terminal avec la molécule résultant de la fusion du dit nucléoside et dudit acide aminé. 620 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'une molécule résultant de la fusion d'un nucléoside et d'un l'Acide Aminé, utilisée pour lever le blocage par un SASB de la traduction en peptide d'un ARNm, est fusionnée à une molécule appelée insert telle que ledit insert soit une molécule destinée à être ajoutée en C terminal du peptide traduit, 625 tel que l'insert comprenne par exemple, un PEG, un court peptide, un acide succinique, acide aminé, ethyldiamine, ethylamine tel que dans certains modes de réalisation l'insert comporte une fonction chimique , une nanoparticule. 630 7) Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les inserts et le cas échéant les séquences SASB portent une fonction exogène telle que la fonction peut être, une fonction d'inhibition d'une activité enzymatique, une activité de reconnaissance sonde cible et telle que la fonction peut également être, une fonction de toxicité et préférentiellement une fonction 635 de toxicité induite par exemple sous l'action d'une radiation électromagnétique, d'une radiation radioactive, d'un champ électrique, d'un champ magnétique, de rayons X, et tel que la fonction peut être encore une fonction de contraste par exemple utilisée en tomographie, en IRM, en radiographie. 640 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que des fonctions exogènes portées par un insert, par une séquence SASB, et ou par une puromicyne comprennent une molécule plan bidimensionnelle telle que des molécules de graphène, des molécules de bore ou toute autre 645 molécule plan bidimensionnelle présentant des courants induits sous l'action d'un champ électrique, d'un champ magnétique, d'un rayonnement électromagnétique, d'un rayonnement radioactif. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que des 650 fonctions exogènes portées par un insert et le cas échant par une séquence SASB comprennent des nano-particules telles que diamant, silice, oxyde de fer, sulfure de fer, peptide riche en cystéines, polymère, les nanoparticules étant éventuellement fonctionnalisées par des molécules plan bidimensionnelles telles que des molécules de graphène, des 655 molécules de bore. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'un jeu d'au moins une séquence anti-sens bloquant SASB, le cas échéant un jeu d'au moins un insert fusionné à une puromycine et éventuellement 660 comportant une fonction exogène, soit greffé sur des nanoparticules, avantageusement par des liaisons labiles en milieu réducteur, ou labil par une induction telle que les nano-particules comprennent, des particules de nano-diamant, des peptides riches en cystéines, des protéines riches en cystéines, et plus généralement des nanoparticules fonctionnalisables. 665 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que des nanoparticules, comportant des SASB et éventuellement des inserts, comportent des effecteurs d'adressage tels que anticorps, molécule chimérique anticorps acide nucléique, heptamère, et plus généralement 670 tout effecteur capable de réaliser une reconnaissance sonde/cible avec un élément se trouvant spécifiquement à la surface d'une cellule.. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que des séquences anti-sens bloquant SASB, le cas échéant des inserts fusionnés 675 chacun à une puromycine et ou éventuellement comportant une fonction, exogène, sont inclus dans des compartiments de type vésiculaire ou micellaire telle que lesdits compartiments soient déstabilisables de manière induite par exemple sous l'action d'une radiation électromagnétique, d'une radiation radioactive, d'un champ électrique , d'un champ magnétique, de 680 rayons X. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que des compartiments de type vésiculaire ou micellaire, incluant des séquences SASB et le cas échéant des inserts fusionnés chacun à une puromycine 685 avec éventuellement une fonction exogène, comportent des effecteurs d'adressage tels que anticorps, molécule chimérique anticorps acide nucléique, heptamère, et plus généralement tout effecteur capable de réaliser une reconnaissance sonde/cible avec un élément se trouvant spécifiquement à la surface d'une cellule. 690 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que des séquences SASB et le cas échéant des inserts fusionnés chacun à une puromycine et éventuellement comportant une fonction exogène sont fusionnés avec des molécules lipophiles. 15) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que des inserts fusionnés chacun à une puromycine et éventuellement comportant une fonction exogène sont fusionnés avec des molécules d'adressage telles que des peptides ou des hormones. 16) Anti sens bloquant SASB tel que défini selon les revendications précédentes, utilisé pour bloquer la traduction d'ARN dans un système. 695 700 30