FR 2983483 A1 20130607 FR 1161125 A 20111202 Procédé de substitution et réticulation simultanées d'un polysaccharide via ses fonctions hydroxyles [0001] La présente invention concerne de nouveaux polysaccharides biocompatibles réticulés et substitués, caractérisés par des propriétés rhéologiques améliorées et présentant éventuellement des propriétés d'intérêt apportées par les substituants comme par exemple une action hydratante ou lipophilisante, par rapport à un polysaccharide réticulé classique et pouvant être utilisés comme biomatériaux notamment dans le domaine de la chirurgie de comblement, la réparation tissulaire ou comme matériau ou fluides articulaires. [0002] On connait de l'art antérieur de nombreux polysaccharides substitués et réticulés, mais aucun des procédés de l'art antérieur n'a permis d'obtenir des polysaccharides présentant les propriétés rhéologiques améliorées de façon synergique selon la présente invention. [0003] On cannait de EP 0 256 116, au nom de FIDIA, des composés réticulés et substitués via des fonctions esters sur les fonctions -COOH du polysaccharide. Les chaines d'acide hyaluronique sont en effet réticulées via des ponts ester formés par la réaction intra- ou intermoléculaire entre des polyalcools aliphatiques et les fonctions acide carboxylique du polysaccharide. La substitution se fait également via les fonctions ester du polysaccharide par le greffage de petites molécules porteuses de fonctions hydroxyles comme l'éthanol ou l'alcool benzylique par exemple. [0004] Dans EP 0 341 745, au nom de FIDIA également, le polymère est dit « auto- réticulé » dans le sens que les fonctions esters sont formées entre les fonctions carboxyles du polysaccharide et les fonctions hydroxyles d'une même chaine ou d'une autre chaine, sans réticulant. Le brevet divulgue également des polymères réticulés et substitués. Les substituants sont ici aussi des chaines alcool telles que de l'éthanol ou l'alcool benzylique et sont greffés sur le polysaccharide via les fonctions carboxyles de celui-ci. [0005] La demande de brevet WO 99/43728, au nom de FIDIA, fait état d'acide hyaluronique sulfatés en N-position ou 0-position. Ces polysaccharides, qui peuvent comme dans les demandes de brevet citées ci-dessus être auto-réticulés ou réticulés via des ponts ester (EP 0 256 116 et EP 0 341 745), sont ensuite greffés avec des polyuréthanes. On obtient ainsi une matrice complexe de différents polymères co- réticulés. Cependant, ces produits sont ici aussi réticulés via des fonctions ester et nécessitent de plus la mise en oeuvre d'au moins trois étapes de synthèse dans le cas d'une matrice de polysaccharide 0- ou N-sulfatés et de polyuréthane. Ils ne présentent ainsi pas une solution satisfaisante. [0006] Le brevet EP 0 749 982, au nom de HERCULES, enseigne la préparation de polymères substitués par des composés phénols encombrés, aux propriétés antioxydantes qui peuvent éventuellement être réticulés. La réticulation est réalisée par des moyens classiques de l'art antérieur à l'aide d'époxydes polyfonctionnels ou halohydrines correspondantes (US 4,716,224, US 4,863,907, EP 0 507 604 A2, US 4,716,154, US 4,772,419, US 4,957,744), d'alcools polyhydriques (US 4,582,865, US 4,605,691), de divinylsulfone (US 5,128,326, US 4,582,865) et d'aldéhydes (US 4,713,448). Selon le mode de réalisation préféré, le polymère est réticulé par réaction avec des acides carboxyliques ou des polyanhydrides d'acide, pour conduire à nouveau à la formation d'esters. Les composés décrits dans l'art antérieur ont ainsi une forte densité en fonctions ester dans la plupart des cas. [0007] On connait également de l'art antérieur des polymères co-réticulés, par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 2005/012364, au nom de ANTEIS, qui présentent une rémanence améliorée, par la formation d'une matrice par co-réticulation d'un ou plusieurs polymères. Ces polysaccharides co-réticulés peuvent en outre être substitués par des polymères de masse moléculaire moyenne basseou des petites molécules non-polymériques. Ces composés sont d'une manière générale de l'acide hyaluronique co-réticulé avec de la cellulose, composé sur lequel seront ensuite greffés, via l'agent réticulant, par des polymères de petite taille comme de l'héparine ou de l'acide hyaluronique porteur d'esters benzyliques (Mw Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio molaire entre le précurseur du substituant et le polysaccharide mis en oeuvre, est égal à 0,35. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio molaire entre le précurseur du substituant et le polysaccharide mis en oeuvre, est égal à 0,90. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio molaire entre le précurseur du substituant et le polysaccharide mis en oeuvre, est égal à 1,00. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio molaire entre le précurseur du substituant et le polysaccharide mis en oeuvre, est égal à 1,60. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio molaire entre le précurseur du substituant et le polysaccharide mis en oeuvre, est égal à 2,00. Le procédé selon l'invention est caractérisé principalement en ce que les réactions de réticulation et de substitution sont mises en oeuvre de manière simultanée, dans les mêmes conditions expérimentales et sur les mêmes sites réactionnels du polysaccharide et ce, sans qu'il y ait compétition entre les différentes espèces mises en jeu. Les taux de substitution et de réticulation sont les mêmes que ceux des réactions réalisées de manière isolée. [00090] Le procédé permet ainsi de pouvoir contrôler la réticulation indépendamment de la substitution pour faciliter la préparation des gels et pouvoir adapter facilement le produit en fonction de son utilisation. [00091] La présente invention, de par la simultanéité de la substitution et de la réticulation, permet de limiter le temps de présence du polysaccharide dans un milieu alcalin qui le dégrade si le séjour est prolongé. Il est en effet bien connu que dans le cas d'une substitution simple en milieu alcalin par exemple, l'acide hyaluronique se dégrade rapidement et perd toutes ses propriétés gélifiantes et viscoélastiques. Un effet surprenant de l'invention est que la simultanéité des réactions de réticulation et de substitution protège le polysaccharide en cours de réaction et permet d'obtenir un effet synergique sur les propriétés rhéologiques, notamment l'élasticité du polysaccharide qui est fortement augmentée. [00092] Les avantages liés à la simultanéité des réactions de réticulation/substitution ne se limitent pas à des avantages visibles sur le produit final tels qu'une meilleure élasticité, une bonne homogénéité du gel, une répartition homogène des substituants ou bien encore la limitation de la dégradation du polysaccharide lors de la réticulation/substitution, mais aussi la durée de réaction et surtout le nombre d'étapes réactionnelles. Le procédé de l'invention permet l'introduction simultanée de tous les réactifs. Une seule et unique étape réactionnelle offre non seulement un gain de temps considérable, mais limite aussi les pertes de temps et de solvants. Toutes les réactions mises en jeu, à savoir réactions de réticulation et de substitution, se produisant dans les mêmes conditions, le catalyseur introduit sera actif pour les deux réactions sans qu'if soit nécessaire d'augmenter sa quantité par rapport à une réticulation simple. L'absence de compétition entre réticulation et substitution évite de devoir ajouter un excédant de réactif pour compenser sa dégradation ou sa consommation trop rapide. [00093] Le procédé de l'invention n'utilise pas de catalyseurs autres que des acides ou des bases simples, pas de solvants organiques, pas d'agents d'activation, et le bilan atomique de la réaction est bon, étant donné l'absence de formation de produit secondaire. [00094] Ce dernier point est l'autre avantage de l'invention : le procédé de l'invention ne produit pas de produits secondaires devant être éliminés lors de la purification. Il s'agit simplement de rincer le produit pour éliminer l'excédent d'agent réticulant et de catalyseur. Compte tenu des applications des polysaccharides obtenus, notamment comme biomatériaux, cette absence de produits secondaires est un réel avantage comptétitif. [00095] Le procédé permettant d'obtenir les composés de la présente invention se différencie de l'art antérieur en ce que sa mise en oeuvre simple permet de façon surprenante de substituer et de réticuler un polysaccharide de façon simultanée sans que la substitution soit en compétition avec la réticulation. On contrôle ainsi mieux le taux de réticulation ou le degré de substitution. [00096] Le procédé permettant d'obtenir les produits de la présente invention offre une totale liberté quant au paramétrage de chacune des réactions intervenant de façon simultanée et indépendante dans le milieu réactionnel. Il est ainsi possible de modifier le taux de réticulation sans influer sur la substitution ; et inversement, il est possible de modifier le degré de substitution sans influer sur la réticulation. [00097] La mise en oeuvre du procédé de réticulation de l'invention permet d'obtenir un produit d'une grande homogénéité, facilement injectable. De façon surprenante, le procédé selon l'invention permet d'augmenter les propriétés rhéologiques des polysaccharides réticulés sans avoir à mettre en oeuvre plus de réticuiant. If permet en outre d'apporter d'autres propriétés telles que l'hydratation, la lipophilie. [00098] Le procédé de l'invention est tel qu'il est envisageable de faire jusqu'à trois réactions simultanément. On entend par « trois réactions simultanées » une réticulation en simultané d'une double substitution. [00099] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le polysaccharide obtenu par le procédé est substitué sur ses fonctions hydroxyles. [000100] Le degré de substituant introduit (DSI) est défini comme étant (Nombre de moles de fonctions réactives du substituant introduites dans le milieu réactionnel) DSI - (Nombre de moles de motif disaccharidique introduites dans le milieu réactionnel) [000101] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le degré de substituant introduit est compris dans un intervalle de 0,001 à 4,00 (0,001 5 DSI 5 4,00). [000102] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le degré de substituant introduit est compris dans un intervalle de 0,20 à 2,20 (0,20 5 DSI Etape c) Neutralisation, purification [000165] Le gel final chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA (acide hyaluronique), ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autoclavage, On obtient ainsi un hydrogel G1A de NaHA chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF1A [000166] Le gel REF1A est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G1A décrit ci- dessus, en remplaçant le VSA par de l'eau pour injection parentérale (EPPI) - Caractérisation des modifications chimiques des gels GIA et REF1A par RMN 1H liquide: [000167] Le spectre RMN du Gel G1A est représenté à la figure 1. [000168] Le spectre RMN du Gel REF1A est représenté à la figure 2. [000169] La comparaison des spectres de figures 1 et 2 permet de confirmer la substitution chimique (par liaison covalente) du VSA sur la fonction hydroxyle du Na HA. - Synthèse Gel G1B : Réticulation du NaHA par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) Etape a) : Identique à l'étape a) de synthèse du gel GIA Etape b) : Réticulation [000170] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) est ajouté au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14. Etape c) : Neutralisation, purification [000171] Le gel final chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être rempli en seringues qui sont stérilisées par autoclavage. On obtient ainsi un hydrogel G1B de Nal-IA réticulé. - Synthèse Gel G1C Substitution du VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA en simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) Etape a) : Identique à l'étape a) de synthèse du gel G1A Etape b) : Réticulation et Substitution [000172] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) et du VSA (102 mg soit 0.78 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,35. Etape c) : Neutralisation, purification [000173] Le gel final chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autoclavage, On obtient ainsi un hydrogel G1C de NaHA réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel GlD : Substitution du VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA suivi d'une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) Etape a) : Identique à l'étape a) de synthèse du gel G1A Etape b) : Substitution [000174] Du VSA (102 mg soit 0.78 mmol) est ajouté au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 40°C pendant 1h00. Le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,35. Le temps et la température ont été réduits par rapport à l'essai G1A, afin de conserver un gel assez consistant pour l'étape suivante de réticulation. Etape c) : Réticulation [000175] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) est ajouté au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé et chimiquement modifié obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 1214°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14. Etape d) : Neutralisation, purification [000176] Le gel final chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autociavage. On obtient ainsi un hydrogel G1D de Nal-IA chimiquement modifié puis réticulé. - Mise en évidence de l'effet synergique des propriétés rhéologiques apportées par la substitution simultanément à la réticulation [000177] La viscosité ri des gels stériles est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, en contrainte imposée à 25°C. La valeur de viscosité est relevée à une contrainte de 0,02 [000178] La composante élastique G' et la composante visqueuse G" des gels stériles sont caractérisées sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, en oscillation à 25°C, les valeurs des composantes élastiques et visqueuses étant relevées à une fréquence de 1 Hz. [000179] Les résultats rhéologiques sont présentés dans le tableau I ci-dessous Tableau I G1A G1B G1C G1D Viscosité : n (Pa.$) à 0,02 s-' 7 1822 1959 1502 Composante élasticité : G' (Pa) à 1 Hz 0,5 107 131 78 Composante visqueuse : G" (Pa) à 1 Hz 3 27 29 22 [000180] La substitution sur un gel simultanément à la réticulation (essai G1C) apporte des propriétés viscoélastiques supérieures par rapport aux gels: o simplement substitués (gel G1A), o simplement réticulés (gel G1B), O d'abord substitués puis réticulés (gel G1D). [000181] De façon surprenante, la substitution mise en oeuvre simultanément à une réticulation améliore de façon synergique les propriétés rhéologiques des gels obtenus. Exemple 2 : Substitution VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4- buta nedioldig lycidyle) [000182] Cet exemple permet la mise en évidence par la mesure des propriétés rhéologiques : o de la substitution de la fonction vinyle sur le NaHA en cours de réticulation et de la différence de structure apportée par la substitution, o de la meilleure résistance à la dégradation radicalaire du gel chimiquement modifié. - Synthèse Gel G2 Etape a) : Hydratation des fibres de hyaluronate de sodium sous forme de gel non réticulé [000183] Des fibres de hyaluronate de sodium de qualité injectable ( 0.9 g soit 2.24 mmol ; masse moléculaire : environ 2,7 MDa) sont pesées dans un récipient. Une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1 % dans l'eau (7,4 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 1 heure à la spatule, à température ambiante et 900 mmHg. Etape b) Réticulation et Substitution [000184] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) et du VSA (70 mg soit 0.54 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,24. Etape c) : Neutralisation, purification [000185] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI IN, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autoclavage. On obtient ainsi un hydrogel G2 de NaHA réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF2 [000186] Le gel REF2 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G2 décrit ci- dessus, en remplaçant le VSA par de l'eau pour injection parentérale (EPPI). - Caractérisation de la force d'extrusion ou « injectabilité » et de l'élasticité des gels G2 et REF2 [000187] La force d'extrusion est caractérisée sur banc de traction Mecmesin sous vitesse de compression 50 mm/min avec des aiguilles 27G 1/2", les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous. [000188] L'élasticité des gels stériles est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, en oscillation à 25°C, la valeur de l'élasticité étant relevée à une fréquence de 1 Hz, les résultats sont présentés dans le tableau II ci-dessous. Tableau II G2 REF2 Force d'extrusion (N)Aig 27G 1/2" Vitesse 50 mm/min 35 38 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 116 105 [000189] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante (+10 %) pour des niveaux d'injectabilité légèrement plus faibles (-8 °/0). Ces données rhéologiques confirment la modification chimique du NaHA, donc la substitution de la fonction vinyle sur le NaHA en cours de réticulation. - Test de dégradation radicalaire des gels G2 et REF2 [000190] Les gels ont également été caractérisés par un test de dégradation 30 radicalaire in vitro à 37°C. Ce test permet de simuler la rémanence ultérieure in vivo (intra-dermique, intra-articulaire, '.) des gels injectés. [000191] Ii a été mis au point sur la base du test décrit dans la publication « Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds », Rocha de Souza, 7. Appl. Phycol. (2007) 19 :153-160. 35 [000192] Les gels sont dégradés par les radicaux libres générés par la réaction de Fenton entre l'eau oxygénée et les ions ferreux. La dégradation est suivie par rhéologie à 37°C, en mesurant la viscosité complexe. Les courbes de tendance des résultats de dégradation de ces 2 gels permettant ensuite d'évaluer le temps de demi- 25 vie de ces différents gels (durée nécessaire pour avoir n* = n*0 / 2, en minutes), avec n*0 = viscosité complexe à to du gel caractérisé. Les temps de demi-vie obtenus sont donnés dans le tableau III ci-dessous. Tableau III G2 REF2 Temps de demi-vie (minutes) 8,0 5,1 [000193] Ainsi, pour une injectabilité légèrement plus faible et permettant de conserver une bonne maitrise du geste chirurgical, les temps de demi-vie des gels modifiés obtenus selon l'invention sont plus longs, garantissant un temps de rémanence in vivo supérieur, et ce même avec le degré de substitution faible testé. Exemple 3 Substitution VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4- butaneclioldiglycidyle) [000194] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de l'augmentation d'élasticité apportée au gel en fonction du degré de substitution. - Synthèse Gels G3A et G3B [000195] La synthèse des gels est identique à celle des gels G1C et G2, avec les quantités de VSA adaptées aux degrés de substituant introduits testés, voir tableau IV ci-après. Tableau IV - Caractérisation de l'élasticité des gels G3A et G3B [000196] L'élasticité des gels est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 35 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau V cl-dessous. DSI G3A 1,00 G3B 2,00 30 Tableau V G2 G1C G3A G3B REF2 Degré de substituant introduit DSI 0,24 0,35 1,00 2,00 - Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 116 131 199 213 105 [000197] Les résultats représentés de façon graphique à la figure 3, montrent que l'élasticité G' des gels augmente avec le degré de substituant introduit: la modification chimique est effectivement responsable de l'optimisation des propriétés viscoélastiques des gels. Exemple 4 : Substitution EB (époxybutane) sur NaHA en simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) [000198] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de la substitution d'une fonction époxy sur le NaHA simulatnément à une réticulation. - Synthèse Gel G4 Etape a) : Identique à l'étape a) de synthèse du gel GIA. Etape b) : Réticulation et substitution [000199] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) et du EB (147 mg soit 2.02 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,90. Etape c) : Neutralisation, purification [000200] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement, pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues. On obtient ainsi un hydrogel G4 de NaliA réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF4 [000201] Le gel REF4 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G4 décrit ci- dessus, en remplaçant le EB par de l'eau pour injection parentérale (EPPI) - Caractérisation de l'élasticité des gels G4 et REF4 [000202] L'élasticité des gels est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau VI ci-dessous. Tableau VI G4 REF4 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 180 150 [000203] La substitution d'une molécule à groupement réactif époxy sur le NaHA est confirmée par les résultats rhéologiques : la modification chimique permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante. [000204] Ces données rhéologiques confirment la substitution de la fonction époxyde sur le NaHA en cours de réticulation. Exemple 5 : Substitution VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA 25 simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4- butanediokliglycidyle) [000205] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de la substitution sur NaHA de faible poids moléculaire 30 - Synthèse Gel G5 Etape a) : Hydratation des fibres de hyaluronate de sodium sous forme de gel non 35 réticulé [000206] Des fibres de hyaluronate de sodium de qualité injectable ( 0.9 g soit 2.24 mmol ; masse moléculaire : environ 1,5 MDa) ; sont pesées dans un récipient. Une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1 % dans l'eau (6,3 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 1 heure à la spatule, à température ambiante et 40 900 mmlig. Etape b) : Réticulation et Substitution [000207] Du BDDE (30 mg soit 0.15 mmol) et du VSA (87 mg soit 0.67 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,07 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,30. Etape c) : Neutralisation, purification [000208] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI IN, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues. On obtient ainsi un hydrogel G5 de NaHA réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF5 [000209] Le gel REF5 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G5 décrit ci- dessus, en remplaçant le VSA par de l'eau pour injection parentérale (EPPI). - Caractérisation de l'élasticité des gels G5 et REF5 [000210] L'élasticité des gels est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau VII ci-dessous. Tableau VII G5 REF5 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 519 433 [000211] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante. Ces données rhéologiques, comme celles de l'exemple 2 (NaHA de poids moléculaire élevé), confirment que la substitution peut être réalisée sur du NaHA de différents poids moléculaires. 35 Exemple 6 Substitution VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur CMC (carboxyméthylcellulose) simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) [000212] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de la substitution sur un polysaccharide autre que le NaHA - Synthèse Gel G6 Etape a) : Hydratation de la CMC sous forme de gel non réticulé [000213] 0.93 g soit 2.20 mmol de CMC de sodium (fournie par Sigma, masse moléculaire : environ 1,0 MDa) est pesée dans un récipient. Une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1 % dans l'eau (9,0 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 90 minutes à la spatule, à température ambiante et 900 mmlig. Etape b) Réticulation et Substitution [000214] Du BDDE (37 mg soit 0.18 mmol) et du VSA (87 mg soit 0.67 mmol) sont ajoutés au gel de CMC non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 3h35. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,08 et le degré de substituant introduit DST est égal à environ 0,30. Etape c) Neutralisation, purification [000215] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 30 mg/g de CMC, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues. On obtient ainsi un hydrogel G6 de CMC réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF6 [000216] Le gel REF6 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G6 décrit ci-dessus, en remplaçant le VSA par de l'eau pour injection parentérale (EPPI). - Caractérisation de l'élasticité des gels G6 et REF6 [000217] L'élasticité des gels est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau VIII ci-dessous. Tableau VIII 6 REF6 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 524 483 [000218] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante. Ces données rhéologiques, comme celles de l'exemple 2 (NaHA), confirment que la substitution peut être réalisée sur différents squelettes polysaccharidiques, notamment les dérivés cellulosiques. Exemple 7 : Substitution EB (époxybutane) sur CH (chitosane) simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) [000219] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de la substitution en milieu acide, simultanément à la réticulation - Synthèse Gel G7 Etape a) : Hydratation du CH sous forme de gel non réticulé [000220] 0.99 g soit 2.93 mmol de CH de degré de déactétylation de l'ordre de 80% (fournie par Kitozyme, masse moléculaire : environ 120000 Da) est pesée dans un récipient. Une solution aqueuse d'acide glutamique 1 0/0 dans l'eau (9,0 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 90 minutes à la spatule, à température ambiante et 900 mmHg. Etape b) : Réticulation et Substitution [000221] Du BDDE (60 mg soit 0.30 mmol) et du EB (337 mg soit 4.68 mmol) sont ajoutés au gel de CH non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant . Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,10 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 1,60. Etape c) : Neutralisation, purification [000222] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout de soude 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 22 mg/g de CH, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autoclavage. On obtient ainsi un hydrogel G7 de CH réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF7 [000223] Le gel REF7 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G7 décrit ci-dessus, en remplaçant le EB par de l'eau pour injection parentérale (EPPI). - Caractérisation de la viscosité des gels G7 et REF7 [000224] Les 2 gels G7 et REF7 sont de consistance visqueuse plus qu'élastique et sont donc caractérisés en viscosité. [000225] La viscosité des gels stériles est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 1, les résultats sont donnés dans le tableau IX ci-dessous. Tableau IX G7 REF7 Viscosité (Pa.$) 67,1 35,4 [000226] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante. Ces données rhéologiques, comme celles de l'exemple 2 (NaHA en conditions basiques) et 6 (CMC en conditions basiques), confirment que la substitution peut se réaliser sur différents squelettes polysaccharidiques, et dans des conditions aussi bien acides que basiques. Exemple 8 Substitution VSA (sel de sodium d'acide vinylsulfonique) sur NaHA 30 simultanément à une réticulation par du DVS (divinylsulfone) [000227] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie de la substitution sur un NaHA ponté avec différents réticulants. 35 - Synthèse Gel G8 Etape a) : Hydratation des fibres de hyaluronate de sodium sous forme de gel non réticulé 40 [000228] Des fibres de hyaluronate de sodium de qualité injectable ( 0.9 g soit 2.24 mmol; masse moléculaire : environ 2,7 MDa) ; sont pesées dans un récipient. Une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1 % dans l'eau (15,7 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 1 heure à la spatule, à température ambiante et 900 mmlig. Etape b) : Réticulation et Substitution [000229] Du DVS (57 mg soit 0.48 mmol) et du VSA (87 mg soit 0.67 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 40°C pendant 1h00. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,21 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,30. Etape c) : Neutralisation, purification [000230] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues. On obtient ainsi un hydrogel G8 de NaHA réticulé et chimiquement modifié. - Synthèse Gel REF8 [000231] Le gel REF8 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G8 décrit ci-dessus, en remplaçant le VSA par de l'eau pour injection parentérale (EPPI). - Caractérisation de l'élasticité des gels G8 et REF8 [000232] L'élasticité des gels est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau X ci-dessous. Tableau X G8 REF8 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 110 103 [000233] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante. Ces données rhéologiques, comme celles de l'exemple 2 (réticulation avec BDDE), confirment que la substitution peut se réaliser en même temps qu'un pontage du polysaccharide, quelle que soit la nature du réticulant.40 Exemple 9 Substitution ASS (allylsulfate de sodium) sur NaHA simultanément à une réticulation par du BDDE (éther de 1,4-butanedioldiglycidyle) [000234] Cet exemple permet la mise en évidence par la rhéologie : - de la substitution de la fonction allyle sur le NaHA en cours de réticulation et de la différence de structure apportée par la substitution, - de la meilleure résistance à la dégradation radicalaire du gel chimiquement modifié avec un groupement pendant sulfate. - Synthèse Gel G9 Etape a) : Identique à l'étape a) de synthèse du gel GIA. Etape b) Réticulation et Substitution [000235] Du BDDE (65 mg soit 0.32 mmol) et du ASS (111 mg soit 0.68 mmol) sont ajoutés au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé à la spatule pendant environ 30 minutes à température 12-14°C. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50°C pendant 2h10. Le degré de réticulant introduit DRI est égal à environ 0,14 et le degré de substituant introduit DSI est égal à environ 0,30. Etape c) : Neutralisation, purification [000236] Le gel final réticulé et chimiquement modifié est ensuite neutralisé par l'ajout d'HCI 1N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement pour obtenir un gel comprenant 20 mg/g de HA, ce gel est ensuite homogénéisé avant d'être conditionné en seringues qui sont stérilisées par autoclavage. On obtient ainsi un hydrogel G9 de NaHA réticulé et chimiquement modifié, - Synthèse Gel REF9 [000237] Le gel REF9 est synthétisé suivant le mode opératoire du gel G9 décrit ci- dessus, en remplaçant l'ASS par de l'eau pour injection parentérale (EPPI), - Caractérisation de l'élasticité des gels G9 et REF9 [000238] L'élasticité des gels stériles est caractérisée sur rhéomètre TA Instruments AR 2000 Ex, décrit en exemple 2, les résultats sont donnés dans le tableau XI ci-dessous. Tableau XI G9 REF9 Elasticité : G' (Pa) à 1 Hz 123 105 [000239] La substitution permet d'obtenir des produits finis de rhéologie plus importante (+17 0/0). Ces données rhéologiques confirment la substitution de la fonction allyle sur le NaHA simultanément à la réticulation. - Test de dégradation radicalaire des gels G9 et REF9 [000240] Les gels ont également été caractérisés par un test de dégradation radicalaire in vitro à la température, décrit en exemple 2. Les temps de demi-vie obtenus sont donnés dans le tableau XII ci-dessous. Tableau XII G9 REF9 Temps de demi-vie (minutes) 12,6 6,6 [000241] Ainsi, les temps de demi-vie des gels modifiés avec un groupement pendant sulfate obtenus selon l'invention sont plus longs, garantissant un temps de rémanence in vivo supérieur. REVENDICATIONS1. Procédé de substitution et réticulation simultanées d'un polysaccharide via ses fonctions hydroxyles, en phase aqueuse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes On dispose d'un polysaccharide en milieu aqueux, On le met en présence d'au moins un précurseur d'un substituant, On le met en presence d'un agent de réticulation, On obtient et on isole le polysaccharide substitué et réticulé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel aqueux est basique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel aqueux est acide. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, le chitosane, la cellulose et leurs dérivés. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la masse moléculaire Mw du polysaccharide est comprise dans un intervalle de 0,01 MDa à 4,0 MDa. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est bi- ou polyfonctionnel. 7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'agent de réticulation bi- ou polyfonctionnel est choisi parmi le groupe constitué par l'éther d'éthylèneglycoldiglycidyle, l'éther de butanedioldiglycidyle, l'éther de polyglycérolpolyglycidyle, l'éther de polyéthylèneglycoldiglycidyle, l'éther de polypropylèneglycoldiglycidyle, un bis- ou polyépoxy tel que 1,2,3,4-diépoxybutane ou 1,2,7,8-diépoxyoctane, une dialkylsulfone, la divinylsulfone, le formaidéhyde ou bien encore le glutaraldéhyde. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le précurseur du substituant est choisi dans le groupe constitué des molécules comprenant une seule fonction réactive choisie dans le groupe constitué des fonctions vinyle substituée ou non, époxyde substituée ou non, allyle substituée ou non, cétone, aldéhyde, thiocyanate, halide, isocyanate, halosilicium, nitrile, sultone. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le précurseur du substituant est choisi dans le groupe constitué des molécules comportant en outre au moins une fonction ou un groupement d'intérêt, choisi dans le groupe constitué par les groupements ou fonctions sulfonate, alkyle linéaire ou ramifié, aromatique substitué ou non, sulfate, thiol, ose, phosphate, phosphonate, carbonate et ester. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le précurseur du substituant est choisi dans le groupe constitué par les allyle- sulfates, les vinyle-sulfonates, les époxy-sulfates et les époxy-alcanes. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le précurseur du substituant est choisi dans le groupe constitué par l'acide vinylsulfonique ou ses sels, l'époxybutane ou l'allyle sulfate de sodium. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide obtenu présente un degré de substituant introduit défini comme étant (Nombre de moles de fonctions réactives du substituant introduites dans le milieu réactionnel) DSI (Nombre de moles de motif disaccharidique introduites dans le milieu réactionnel et compris dans l'intervalle allant de 0,001 à 4,00. 13. Procédé selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide obtenu présente un taux de réticulant introduit DRI défini 30 comme étant : (Nombre de moles de réticulant introduites dans le milieu réactionnel) DRI (Nombre de moles de motif dissacharidique introduites dans le milieu réactionnel) et compris dans l'intervalle allant de 0,001 à 0,5. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il 35 est mis en oeuvre à température ambiante. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à une température supérieure à 25°C. 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pendant une durée comprise dans un intervalle allant de 15 minutes à 48 heures. 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'if comprend en outre une étape de lavage du polysaccharide obtenu. 18. Composition comprenant un polysaccharide obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 19. Utilisation d'un polysaccharide obtenu selon le procédé selon l'une des revendication 1 à 17, pour la formulation d'une composition de viscosupplémentation. 20. Utilisation d'un polysaccharide obtenu selon le procédé selon l'une des revendication 1 à 17, pour la formulation d'une composition pour le comblement des rides. 21. Kit comprenant un polysaccharide obtenu selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 17, conditionné en seringue stérile.25