FR 2975608 A1 20121130 FR 1253812 A 20120425 i Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à un système micro-fluidique pour une réaction en chaîne de polymérase, comportant un substrat avec trois chambres reliées en série du point de vue fluidique pour différents niveaux de température et un film élastique sur le substrat pour fermer les chambres reliées en série dont les extrémités de la liaison en série peuvent être fermées du point de vue fluidique L'invention concerne les réactions en chaîne de polymérase (encore appelées réactions PCR). Etat de la technique Dans le diagnostic moléculaire, on effectue souvent une réaction en chaîne de polymérase (réaction PCR) pour multiplier des brins d'ADN. Dans le cas de la réaction PCR, on ajoute un mélange maître PCR à l'ADN, ce mélange contenant les substances nécessaires pour la réaction PCR. L'ADN et le mélange maître PCR forment la solution PCR. La solution PCR est mise plusieurs fois successivement à trois niveaux de température différents. De façon normale, on utilise pour cela des appareils de thermocyclage. Selon la littérature, on connaît des systèmes dans les- quels la réaction PCR est exécutée dans un système micro-fluidique. Ainsi le document WO 2001/007159 A2 décrit un dispositif micro-fluidique dans lequel on fait passer un unique réservoir successivement aux différents niveaux de température. Le document Yao et al., Biomedical Microdevices 2005, 7, 253, utilise un canal micro-fluidique long dans un système micro-fluidique. Lors du premier passage du canal, la solution d'ADN est con-duite plusieurs fois à travers différentes zones de température. On utilise pour cela une pompe externe. Le document Chung et al., dans IEEE MEMS 2011, 865, Cancun, Mexique, Janvier 23-27-2011, utilise un canal circulaire dans un système micro-fluidique avec trois zones de température. Le système ne comporte pas de pompe mais utilise les forces ascensionnelles. Exposé et avantages de l'invention La présente invention a pour objet un système micro- fluidique pour une réaction en chaîne de polymérase comportant un 2 substrat avec trois chambres reliées en série du point de vue fluidique pour différents niveaux de température et un film élastique sur le substrat pour fermer les chambres reliées en série dont les extrémités de la liaison en série peuvent être fermées du point de vue fluidique. Le film au-dessus d'une chambre peut être enfoncé dans chaque chambre pour la vider. En d'autres termes, selon l'invention, on utilise trois chambres de procédé micro-fluidique dont chacune est à un niveau de température déterminé, nécessaire pour l'étape correspondante du pro- lo cédé PCR. Par pompage la solution PCR est mise dans la chambre de procédé dans laquelle règne le niveau de température prévu pour mettre la solution à ce niveau de température. La solution PCR contient l'ADN et le mélange maître PCR contenant les substances nécessaires à l'exécution du procédé PCR. Le pompage de la solution PCR entre les 15 chambres se fait à l'aide du film couvrant les chambres car ce film est déformé de manière commandée dans une chambre pour en modifier le volume. L'invention a également pour objet un procédé de mise en oeuvre d'une réaction en chaîne de polymérase dans un système micro- 20 fluidique comportant une première, une seconde et une troisième chambres reliées en série de manière fluidique, procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en température chacune des chambres à une température prédéfinie, 25 b) prédéfinir un nombre de cycles de réaction PCR pour le nombre des cycles PCR, c) pomper une solution PCR dans la première chambre, d) tenir la solution PCR dans la première chambre pendant un premier intervalle de temps, 30 e) pomper la solution PCR dans la seconde chambre, f) tenir la solution PCR dans la seconde chambre pendant un second intervalle de temps, g) pomper la solution PCR dans la troisième chambre, h) tenir la solution PCR dans la troisième chambre pour un troisième 35 intervalle de temps, 3 * les étapes a) et b) et la première exécution de l'étape c) pouvant se faire dans un ordre quelconque, * le pompage d'une chambre de sortie dans une chambre de destina- tion se faisant par le débattement commandé d'un film au-dessus de la chambre de sortie s'enfonçant dans cette chambre de sortie. Avantages de l'invention Selon l'invention, les chambres micro-fluidiques sont à un niveau de température constant. Seul le liquide sera chauffé ou refroidi. On réduit ainsi fortement la masse thermique du système et la io réaction PCR peut s'exécuter beaucoup plus rapidement que dans des systèmes équipés de dispositifs de thermocyclage. Dans les appareils usuels, il faut mettre en oeuvre des moyens considérables pour arriver à un refroidissement rapide, par exemple en refroidissant par des éléments Peltier. Un appareil de com- as mande thermique de l'invention peut en revanche être réalisé d'une manière significativement plus simple et plus économique, par exemple en modifiant les éléments chauffants par résistance. Grâce au film couvrant les chambres de procédé pour assurer le pompage, il ne faut aucune pompe supplémentaire, ce qui ré- 20 duit l'encombrement et évite que le liquide ne se vaporise. Dessins La présente invention sera décrite ci-après de manière plus détaillée à l'aide d'exemples de systèmes micro-fluidiques et de procédés pour la mise en oeuvre d'une réaction en chaîne de polymérase 25 représentés dans les dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une vue en perspective d'un détail d'un système micro-fluidique correspondant à un mode de réalisation de l'invention avec un actionnement externe de pompage, - la figure 2 est une vue schématique d'une couche de substrat avec 30 des éléments fluidiques selon la figure 1 dans plusieurs états d'actionnement correspondant aux parties A-D de la figure, - la figure 3 est une vue éclatée d'un détail d'un système micro-fluidique selon un autre mode de réalisation intégré de l'invention avec un actionnement de pompage interne, 4 - la figure 4 montre schématiquement un dispositif de chambre de procédé d'un système micro-fluidique correspondant à un autre mode de réalisation de l'invention avec remplissage cyclique des chambres de procédé, - la figure 5 montre schématiquement un dispositif de chambres de procédé d'un système micro-fluidique selon un autre mode de réalisation de l'invention avec remplissage des chambres par pompage dans un sens et dans l'autre, - la figure 6 montre un ordinogramme du procédé de mise en oeuvre io d'une réaction en chaîne de polymérase dans un système micro- fluidique selon un mode de réalisation de l'invention. Description de modes de réalisation de l'invention La figure 1 montre en perspective un système micro-fluidique 10 selon un mode de réalisation de la présente invention. Un 15 substrat 11 constitué ici par un substrat de polymère présente sur son côté supérieur 12, une structure fluidique 13 comportant un canal d'entrée 14, un canal de sortie 15 et trois chambres reliées en série du point de vue fluidique, à savoir une première chambre 16, une seconde chambre 17 et une troisième chambre 18. La première chambre 16 est 20 reliée à la seconde chambre 17 par un court canal de liaison 20 ; la seconde chambre 17 est reliée à la troisième chambre 18 par un court canal de liaison 21. Le canal d'entrée 14 comporte une soupape d'entrée 22 et le canal de sortie 15 comporte une soupape de sortie 23. La sou-pape d'entrée 22 et la soupape de sortie 23 constituent des fermetures 25 commandées aux extrémités d'une liaison en série 24 composées des chambres 16, 17, 18 branchées en série. Le système micro-fluidique 10 comporte un film élastique 25 sur le substrat 11 ; ce film élastique est par exemple un élastomère thermoplastique TPE. Le film 25 relié au côté supérieur 12 du substrat 30 11 ferme les cavités de la structure fluidique 13. Le film élastique 25 au-dessus des chambres 16, 17, 18 peut être déplacé dans chaque chambre pour la vider. Dans ce mode de réalisation, la commande de la position des segments de film au-dessus des chambres 16, 17, 18 ou le débat- 35 terrent des segments de film pénétrant dans les chambres se fait de manière externe chaque fois par un poussoir pour chaque segment de film. Le poussoir est par exemple entraîné par de l'air comprimé ; on peut toutefois envisager également un entraînement thermomagnétique et/ou magnétique. De même, les soupapes 22 et 23 sont actionnées de 5 l'extérieur. Dans une variante de réalisation non représentée, les sou-papes ne sont pas intégrées dans le système mais sont réalisées comme des composants externes. En fonctionnement, les chambres 16, 17, 18 sont main-tenues à différents niveaux de température pour les réactions PCR et Io sont tenues à ces niveaux de température. La mise en température se fait ici de manière externe, par en dessous, mais elle peut également se faire de manière interne, par exemple à l'aide d'éléments chauffants, d'éléments résistants, par micro-ondes, et/ou par rayonnement thermique. Pour l'isolation thermique des chambres 16, 17, 18 les unes des 15 autres, il y a non seulement les canaux de liaison 20, 21 mais chaque fois de part et d'autre, des perçages 26 réalisés dans le substrat 11. La figure 2 présente dans ses différentes parties A, B, C, D, un mode de réalisation du fonctionnement du système micro-fluidique 10, selon lequel, pour la mise en oeuvre de réactions PCR dans 20 la solution PCR, on pompe dans un sens et dans l'autre dans les trois chambres 16, 17, 18 reliées fluidiquement en série les unes derrière les autres. Pour cela, la couche de substrat 11 connue selon la figure 1 est représentée avec les éléments fluidiques dans les différents états d'actionnement A-D à la figure 2. Une chambre de réaction se trouve 25 respectivement dans une zone de température et elle est chauffée par en dessous et/ou par au-dessus par un élément chauffant qui lui est propre, par exemple un élément de résistante chauffante ou un élément Peltier. Les chambres voisines sont reliées par des canaux de liaison 20 et 21. Les chambres extérieures 16, 18 sont mises en contact par le ca- 30 nal d'entrée 14 et le canal de sortie 15 par lesquels la solution PCR est introduite ou extraite. Les canaux d'entrée et de sortie peuvent être fermés par les soupapes 22, 23. Pour une meilleure isolation thermique des zones de température les unes des autres, des perçages 26 séparent les chambres. Le volume des chambres 16, 17, 18 est modifié par le dé- 35 battement du film élastique 25 dans chacune des chambres. L'état sans 6 débattement du film dans une chambre sera appelé ci-après « chambre ouverte ». L'état du débattement le plus poussé du film dans une chambre sera appelé ci-après « chambre fermée ». Dans cet état, le liquide pour lequel PCR, c'est-à-dire la solution PCR, est principalement refoulée du volume d'une chambre avec toutefois des résidus de liquide. Le fonctionnement du système micro-fluidique 10 est le suivant : L'état d'actionnement A sert à préparer la réaction PCR. Les soupapes 22 et 23 et les chambres 16, 17, 18 sont ouvertes. La solution PCR io passe pour rincer la première chambre 16 à travers le canal d'entrée 14. Les deux autres chambres 17 et 18 restent pratiquement vides. Les zones de température sont mises à une température cible. Des températures données à titre d'exemples sont les suivantes : 15 Première chambre : 95°C, seconde chambre : 72°C, troisième chambre : 55°C. On ferme maintenant successivement la soupape d'entrée 22, la seconde chambre 17, la troisième chambre 18 et la soupape de sortie 23. Dans cet état d'actionnement B, la solution PCR se trouve 20 principalement dans la première chambre 16 et après un court instant, elle prend la température de la chambre. La liaison en série 24 des chambres 16, 17, 18 reliées en série reste pratiquement sans bulle. La solution PCR est laissée dans la première chambre 16 pour la durée de maintien souhaitée, par exemple pour 10 s. Il y a alors 25 dénaturation du brin d'ADN. Si maintenant on ouvre la seconde chambre 17 et on ferme la première chambre 16, on arrive à l'état d'actionnement C. Dans cet état, la solution PCR se trouve principalement dans la seconde chambre 17. 30 Immédiatement après, on ouvre la troisième chambre 18 et on ferme la seconde chambre 17 de sorte que l'on se trouve dans l'état d'actionnement D. Par cette séquence, la solution PCR est refoulée dans la troisième chambre 18 et très rapidement, elle prend la température qui règne dans cette chambre. A titre d'exemple, un volume 7 d'environ 1 - 10 gl de solution PCR est à la température de la chambre dans environ 100 ms. La solution PCR est laissée pendant la durée de maintien souhaitée, par exemple pendant 10 s dans la troisième chambre 18 et les brins d'ADN s'hybrident avec des primaires. Ensuite, on ouvre la seconde chambre 17 et on ferme la troisième chambre 18. Ainsi, la solution PCR est refoulée dans la seconde chambre 17 et on arrive à l'état d'actionnement C. La solution PCR prend rapidement la température régnant dans cette chambre. io La solution PCR est laissée pendant la durée de maintien souhaitée, par exemple égale à 10 s dans la seconde chambre 17 et il se produit l'élongation. Finalement, on ouvre la première chambre 16 et on ferme la seconde chambre 17. Ainsi la solution PCR est refoulée dans la pre- ss mière chambre 16 et on arrive de nouveau à l'état d'actionnement B. Cela correspond à la description d'un cycle PCR complet. Ce cycle PCR est répété maintenant à un nombre prédéfini de fois de cycles PCR, par exemple 30 fois. Après avoir atteint le nombre souhaité de cycles PCR, on 20 ouvre les soupapes 22, 23 et les chambres 16, 17, 18 pour rincer de nouveau la solution PCR. Les zones de température peuvent également être organisées dans un ordre différent. Dans ce cas, la séquence de temps de commande sera modifiée de manière correspondante. La disposition dé- 25 crite ci-dessus a toutefois l'avantage de minimiser les gradients de température. La figure 3 montre une vue éclatée d'un détail d'un système micro-fluidique 30 correspondant à un autre mode de réalisation, intégré de la présente invention. Dans ce mode de réalisation, on intègre 30 un actionnement de pompe. La structure des couches a été représentée avec les différentes couches, éclatées. Le système micro-fluidique 30 comporte les éléments connus selon la figure 1 munis des mêmes références. Il s'agit du substrat 11 avec ses éléments et du film élastique 25. Une autre couche de substrat 31 avec une structure pneumatique 35 32 et une couche de couverture 33 sont prévues sur le film 25. 8 L'actionnement des soupapes et le débattement du film sur les chambres se fait dans ce mode de réalisation non pas de manière ex-terne mais de manière interne à l'aide des éléments de la structure pneumatique 32. L'autre couche de substrat 31 comporte la structure pneumatique 32 réalisée par emboutissage et alignée sur la structure fluidique 13 du substrat 11 ; les éléments actionnés du substrat 11 ont des éléments correspondants dans l'autre couche de substrat 31. Les éléments actionnés du substrat 11 et les éléments correspondants sont io superposés de part et d'autre du film élastique 25. Ainsi, aux soupapes 22, 23 correspondent les chambres de soupapes pneumatiques 34, 35 et aux chambres 16, 17, 18 correspondent les chambres pneumatiques 36, 37, 38. Une sollicitation pneumatique des chambres 36, 37, 38 pro-duit chaque fois un débattement du film élastique 25 dans les éléments 15 actionnés du substrat 11 et ainsi l'actionnement de ces éléments. Chaque chambre de soupape pneumatique 34, 35 est reliée à un canal pneumatique associé 40, 41 ; chacune des chambres pneumatiques 36, 37, 38 est reliée à un canal pneumatique associé 42, 43, 44. Ces canaux actionnent les chambres des soupapes pneumatiques 34, 35 et les 20 chambres pneumatiques 36, 37, 38. L'autre couche de substrat 31 comporte en outre des perçages 45 en regard des perçages 26 et séparés de ceux-ci par le film 25. La couche de couverture 33 constitue le moyen de scellement pneumatique de la structure pneumatique 32 et protège méca- 25 niquement le système micro-fluidique 30. A la place du mode de fonctionnement pneumatique de la structure pneumatique, on peut également avoir un mode de fonctionnement hydraulique avec la même structure. La figure 4 montre schématiquement une disposition de 30 chambres de procédé 50 d'un système micro-fluidique selon un autre mode de réalisation de la présente invention avec remplissage des chambres de procédé par un pompage alterné. Le dispositif de chambres de procédé 50 correspond au dispositif de chambres de la figure 1 et au mode de fonctionnement des chambres décrit à l'aide de la 35 figure 2. Les chambres 51, 52, 53 sont reliées par une liaison fluidique ; 9 l'ensemble comporte un canal d'entrée 54, une soupape d'entrée 55, un canal de sortie 56 et une soupape de sortie 57. Les chambres 51, 52, 53 sont chacune à un certain niveau de température qui leur est associé. La solution PCR est toujours transférée selon une réaction PCR, pour des soupapes ouvertes 55, 57 dans les canaux 54, 56, pour un échange dans un sens ou dans l'autre. La solution PCR est pompée alternative-ment entre les chambres 51, 52, 53 pendant une réaction PCR pour plusieurs cycles PCR. Le sens de passage de la solution PCR est indiqué par des flèches. io La figure 5 montre schématiquement un dispositif de chambres de procédé 60 d'un système micro-fluidique correspondant à un autre mode de réalisation de la présente invention avec remplissage cyclique des chambres de procédé. Les chambres 61, 62, 63 sont reliées en série par une liaison fluidique ; un canal d'entrée 64 comporte une 15 soupape d'entrée 65 et un canal de sortie 66 comporte une soupape de sortie 67. Chaque dispositif de chambres de procédé 60 comporte en outre un canal de liaison 68 reliant directement les chambres extérieures 61, 63. Les chambres 61, 62, 63 sont chacune à son niveau de température donné. La solution PCR est toujours échangée dans le cas 20 d'une réaction PCR par des soupapes 65, 67 ouvertes à travers des canaux 64, 66. La solution PCR est pompée de manière cyclique entre les chambres 61, 62, 63 pendant une réaction PCR pour un certain nombre de cycles PCR. Le sens de passage de la solution PCR est indiqué par des flèches. Cette association des niveaux de température aux 25 chambres tient compte de la succession du passage de la solution PCR dans les chambres. La figure 6 montre un ordinogramme 70 du procédé de mise en oeuvre d'une polymérase selon l'invention. Le système micro-fluidique comporte une première, une seconde et une troisième 30 chambres reliées fluidiquement en série les unes aux autres comme par exemple les chambres 51, 52, 53 ou les chambres 61, 62, 63. Le procédé commence par l'étape a) consistant à mettre en température les chambres à la température de consigne prédéfinie. Il s'en suit une étape de procédé b) consistant à prédéfinir le nombre de cycles PCR. Pour ce i0 nombre de cycles PCR, on applique les étapes de procédé c) à h) sui-vantes. Dans un seul cycle PCR, au début, dans l'étape c), on pompe une solution PCR dans la première chambre. Selon l'étape d), on y maintient la solution PCR pendant un premier intervalle de temps. Ensuite, dans l'étape e), on pompe la solution PCR dans la seconde chambre. Selon l'étape de procédé f), on y maintient la solution PCR pendant un second intervalle de temps. Puis dans l'étape g), on pompe la solution PCR dans la troisième chambre. La solution PCR y est main- Io tenue selon l'étape h), pour une durée correspondant à un troisième intervalle de temps. Le cycle PCR est alors terminé. Dans l'étape i), on compare le nombre de cycles PCR par-courus et le nombre de cycles prédéfinis ; si ce dernier n'est pas encore atteint, on revient à l'étape c). Dans le cas contraire, on termine le pro- 15 cédé PCR et on évacue la solution PCR en la pompant selon l'étape j). Les étapes a), b) et la première exécution de l'étape c) peuvent se faire dans un ordre quelconque. Le pompage d'une chambre de sortie dans une chambre de destination se fait en commandant le débattement du film couvrant la chambre de sortie pour l'enfoncer dans 20 cette chambre. Ainsi, la solution PCR est refoulée de cette chambre ou-verte, pleine, la fermant et la solution passe dans la chambre ouverte, vide, voisine, comme cela a été décrit pour le système micro-fluidique 10 de la figure 1 en combinaison avec la figure 2 pour laquelle d'autres détails du procédé ont été décrits. Les soupapes 22 et 23 étant fermées 25 et comme la chambre fermée respective ne participe pas à l'opération de pompage en cours, la solution PCR ne peut s'échapper autrement que vers la chambre ouverte, vide. 30 Il NOMENCLATURE 10 Système micro-fluidique 11 Substrat 12 Côté supérieur 13 Structure fluidique 14 Canal d'entrée 15 Canal de sortie 16 Première chambre io 17 Seconde chambre 18 Troisième chambre 20 Canal de liaison 21 Canal de liaison 22 Soupape d'entrée 15 23 Soupape de sortie 25 Film élastique 26 Perçage 30 Système micro-fluidique 31 Couche de substrat 20 32 Structure pneumatique 33 Couche de couverture 34 Chambre de soupape 35 Chambre de soupape 36 Chambre pneumatique 25 37 Chambre pneumatique 38 Chambre pneumatique 40 Canal pneumatique 41 Canal pneumatique 42 Canal pneumatique 30 43 Canal pneumatique 44 Canal pneumatique 45 Perçage 50 Dispositif de chambres de procédé 51 Chambre 35 52 Chambre 53 Chambre 54 Canal d'entrée 55 Soupape d'entrée 56 Canal de sortie 57 Soupape de sortie 60 Dispositif de chambre de procédé 61 Chambre 62 Chambre 63 Chambre 64 Canal d'entrée 65 Soupape d'entrée 66 Canal de sortie 67 Soupape de sortie 68 Canal de liaison 70 Ordinogramme REVENDICATIONS1°) Système micro-fluidique (10, 30) pour une réaction en chaîne de polymérase, comportant un substrat (11) avec trois chambres (16, 17, 18) reliées en série du point de vue fluidique pour différents niveaux de température et un film élastique (25) sur le substrat (11) pour fermer les chambres (16, 17, 18), * les chambres (16, 17, 18) reliées en série et les extrémités de la liaison en série (24) peuvent être fermées du point de vue fluidique, système caractérisé en ce que chaque fois le film (25) au-dessus d'une chambre (16, 17, 18) peut être enfoncé dans la chambre (16, 17, 18) pour la vider. 2°) Système micro-fluidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système micro-fluidique (30) comporte un moyen d'entraînement pour déplacer le film (25) au-dessus de chaque chambre (16, 17, 18). 3°) Système micro-fluidique selon la revendication 2, caractérisé en ce que le système micro-fluidique (30) comporte au-dessus de chaque chambre (16, 17, 18) une chambre de pompage (36, 37, 38) adjacente au film (25). 4°) Système micro-fluidique selon la revendication 3, caractérisé en ce que les chambres de pompage (36, 37, 38) sont sollicitées de manière pneumatique ou de manière hydraulique. 5°) Système micro-fluidique selon la revendication 2, caractérisé en ce que le système micro-fluidique (10) coopère avec un entraînement externe pour bouger le film (25) au-dessus de chaque chambre (16, 17, 18). 6°) Système micro-fluidique selon la revendication 5, caractérisé en ce que 14 l'entraînement externe comporte des poussoirs. 7°) Système micro-fluidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système micro-fluidique (10, 30) comporte aux extrémités de la liai-son en série (24) des soupapes (22, 23). 8°) Système micro-fluidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que Io le système micro-fluidique a un canal de liaison direct (68) entre les chambres extérieures (61, 63). 9°) Procédé de mise en oeuvre d'une réaction en chaîne de polymérase dans un système micro-fluidique comportant une première, une se- 15 conde et une troisième chambres (16, 17, 18) reliées en série de manière fluidique, procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en température chacune des chambres à une température prédéfinie, b) prédéfinir un nombre de cycles de réaction PCR pour le nombre 20 des cycles PCR, c) pomper une solution PCR dans la première chambre (16), d) tenir la solution PCR dans la première chambre (16) pendant un premier intervalle de temps, e) pomper la solution PCR dans la seconde chambre (17), 25 f) tenir la solution PCR dans la seconde chambre (17) pendant un second intervalle de temps, g) pomper la solution PCR dans la troisième chambre (18), h) tenir la solution PCR dans la troisième chambre (18) pour un troisième intervalle de temps, 30 * les étapes a) et b) et la première exécution de l'étape c) pouvant se faire dans un ordre quelconque, * le pompage d'une chambre de sortie dans une chambre de destination se faisant par le débattement commandé d'un film (25) au-dessus de la chambre de sortie s'enfonçant dans cette chambre de 35 sortie. 51015 10°) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'entraînement pour le débattement du film (25) est dans le système micro-fluidique (10). 11°) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'entraînement au-dessus de chaque chambre (16, 17, 18) comporte une chambre de pompage (36, 37, 38) adjacente au film (25). 12°) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la chambre de pompage (36, 37, 38) est sollicitée de manière pneumatique ou hydraulique. 15