FR 2976949 A1 20121228 FR 1155462 A 20110621 Procédé de préparation de levures génétiquement transformées capables de produire une molécule d'intérêt à haut titre La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une levure génétiquement modifiée par intégration multicopie d'au moins quatre cassettes d'expression, permettant la production d'une molécule d'intérêt à haut titre. La présente invention a aussi pour objet des levures transformées selon ledit procédé, et leur utilisation pour la production d'hydrocortisone. Production de protéines recombinantes La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae a été choisie comme organisme hôte pour produire des protéines recombinantes du fait de ses caractéristiques cellulaires eucaryotes apparentées à celles des mammifères dont les modifications post-traductionnelles des protéines synthétisées telles que l'acétylation, la phosphorylation et la glycosylation , mais aussi de sa manipulation génétique aisée, de la disponibilité de sa séquence génomique, de la maîtrise de procédés de fermentation à grande échelle de ce type de microorganisme et de l'absence de dangerosité vis-à-vis des hommes, animaux ou végétaux (classée GRAS, Generally Recognized As Safe). Ces caractéristiques en ont fait un organisme de choix largement exploité en agro-alimentaire et plus récemment dans le domaine pharmaceutique. Saccharomyces cerevisiae peut être utilisé comme microorganisme producteur de composés d'intérêts industriels variés de part sa capacité à synthétiser à l'état naturel divers métabolites tels que enzymes, acides organiques, polysaccharides ou composés organoleptiques. En particulier, une variété de stérols et acides gras endogènes peuvent être employés pour produire des agents cosmétologiques ou pharmaceutiques tels que la provitamine D2 produite à partir de l'ergosterol. Les composés stérols endogènes sont aussi précurseurs de molécules hétérologues pouvant être obtenues après ingénierie génétique de souches de Saccharomyces cerevisiae ; à titre d'exemples, le taxadien-5-aceoxy-10-o1 précurseur du taxol, l'acide artémisinique composé entrant dans la composition d'un agent anti-malarien et les hormones stéroïdes. Production d'hydrocortisone dans la levure Saccharomyces cerevisiae L'hydrocortisone est encore, une cinquantaine d'années après sa mise sur le marché, une molécule thérapeutique utilisée pour ses propriétés anti-inflammatoires ou comme intermédiaire de synthèse de substances stéroïdes dérivées. La production de stéroïdes est actuellement liée à des procédés d'extraction ou de synthèse coûteux et polluants comprenant une étape de bioconversion et plusieurs étapes de synthèse chimique. Le développement d'un procédé alternatif, moins onéreux a été recherché. Le développement d'un tel procédé a été initié dans les années 90. Il consiste à mettre en oeuvre une souche de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée. La preuve du concept a été démontrée en 1999 et confirmée par la suite (WO 02/061109 ; Ménard Szczebara et al., 2003). Les levures modifiées par expression de plusieurs protéines hétérologues et inactivation de protéines d'endogènes pour éliminer les réactions parasites, sont capables de produire par fermentation à partir d'une source carbonée simple, l'hydrocortisone via la voie de biosynthèse des mammifères reconstituée dans cet organisme (Brocard-Masson et Dumas, 2006 ; Dumas B. et al., 2006). Toutefois, les premières souches montraient une faible capacité à produire l'hydrocortisone et ne répondaient donc pas aux exigences d'une production 20 industrielle. Différentes stratégies peuvent être adoptées pour augmenter la productivité des souches, parmi lesquelles l'amélioration des procédés de transformation. Ces procédés de transformation s'accompagnent d'une sélection, selon une méthode adaptée, des meilleurs transformants. 25 Méthodes de transformation des levures Parmi les procédés classiques de transformation des souches de levure, on peut citer notamment celui proposé par Ito et al. (1983), ou par Klebe et al. (1983). Dans le cas particulier de transformation avec des fragments d'ADN linéaires, une technique de transformation de sphéroplastes telle que celle proposée par Becker et Lundblad 30 (2001) sera préférentiellement utilisée. Afin d'exprimer fortement une protéine, une stratégie consiste à introduire dans la levure plusieurs copies du gène d'intérêt. Usuellement, on utilise comme vecteur un plasmide réplicatif autonome ayant la particularité d'être maintenu en multiples exemplaires par cellule grâce à son origine de réplication de levure 2pm (Broach, 1983) en pression de sélection c'est-à-dire dans un milieu pauvre, chimiquement défini. Cette condition n'est pas applicable dans un certain nombre de procédés industriels de production engageant des matières premières complexes. De plus, le nombre de gènes pouvant être clonés sur un tel vecteur plasmidique est généralement limité à deux ou trois cassettes d'expression, la taille du plasmide 10 impactant sur l'efficacité de transformation et de réplication. Une autre stratégie a été décrite par Lopes et al. (1989 et 1991). Elle consiste en la construction d'un vecteur d'intégration multiple, nommé pMIRY2 pour Multiple Integration into the Ribosomal DNA from Yeast, ciblant l'ADN ribosomal (ADNr) du génome de Saccharomyces cerevisiae. Le gène d'intérêt à exprimer véhiculé par le 15 plasmide pMIRY2 s'insère dans l'ADN ribosomal composé d'environ 100 à 200 unités répétées associées en tandem situées sur le chromosome XII. Il s'intègre au locus ADNr tout d'abord en faible nombre de copies puis peut s'amplifier en appliquant une forte pression de sélection (Lopes et al. 1991). Cette méthode n'a été décrite que pour l'introduction d'un seul gène d'intérêt accompagné d'un marqueur de sélection. 20 Il serait intéressant de combiner les avantages de l'introduction d'un gène en de multiples exemplaires via plasmide de réplication 2p à celui de l'intégration stable d'un gène via plasmide d'intégration, pour permettre la co-expression efficace de plusieurs protéines. Les inventeurs ont montré qu'il est possible d'obtenir des levures produisant de hauts 25 titres de molécules d'intérêt adaptés à une production à l'échelle industrielle, en intégrant de manière stable et en multicopie au moins quatre cassettes d'expression de gènes d'intérêt. Résumé de l'invention La présente invention propose une méthode simple et rapide permettant d'obtenir des 30 levures produisant une molécule d'intérêt à haut titre après intégration stable et multicopie d'au moins quatre cassettes d'expression. L'intégration multicopie permet, après sélection des meilleurs transformants, l'expression à un niveau élevé des transgènes d'intérêt. Une telle méthode permet de modifier une levure en lui apportant différents gènes d'une même voie métabolique ou de voies métaboliques différentes. Ainsi modifiée, la levure acquiert la capacité de convertir des molécules endogènes ou des substrats exogènes en un produit d'intérêt. Une telle levure transformée peut donc être utilisée à façon en tant qu'outil biologique de production de protéines recombinantes. Un objet particulier selon l'invention, est une levure exprimant la 3R-hydroxy stéroïde déshydrogénase (3R-HSD), la 11P-stéroïde hydroxylase aussi appelée P450c11 (CYP11B1), la cytochrome P450 side-chain cleavage (ou P450scc) (CYP11A1) et l'Adrénodoxine (ADX) obtenue en appliquant le procédé selon l'invention. Une levure exprimant la A7 stérol réductase, la 17-a stéroïde hydroxylase (CYP17A1), la 21-stéroïde hydroxylase (CYP21A1) en plus des quatre gènes précitées peut être utilisée pour convertir les stérols endogènes en hydrocortisone. Description détaillée de l'invention La présente invention a pour objet un procédé de préparation de levures transformées génétiquement et productrices à haut titre de molécules d'intérêt consistant à (i) intégrer de manière stable et multicopie au moins quatre cassettes d'expression puis à (ii) sélectionner les levures qui sont les meilleurs producteurs. L'étape d'intégration stable et multicopie d'au moins 4 cassettes d'expression selon l'invention est basée sur la co-transformation de deux plasmides d'intégration comportant chacun au moins deux cassettes d'expression de transgènes d'intérêt et éventuellement un marqueur de sélection. Par « cassette d'expression », on entend une séquence d'ADN endogène ou exogène (aussi appelée « transgène ») flanquée d'éléments nécessaires à son expression, à savoir au minimum un promoteur et un terminateur. Afin d'assurer une bonne expression chez la levure, les promoteurs ou terminateurs sont choisis parmi les séquences provenant de la levure. Parmi les promoteurs utilisables, on peut citer des promoteurs dérivant de gènes impliqués dans la glycolyse tels que : le promoteur du gène PGK (codant pour la 3-phosphoglycérate kinase), le promoteur du gène GAPDH (TDH3) (codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), le promoteur du gène ADH1 (codant pour l'alcool déshydrogénase 1), le promoteur du gène ENO1 (codant pour l'énolase 1), le promoteur du gène TP11 (codant pour la triose phosphate isomérase). On peut aussi citer l'usage de promoteurs inductibles tels que : un promoteur d'un des gènes GAL régulés par le galactose ou encore le promoteur hybride GAL10/CYC1, le promoteur du gène CYC1 (codant pour l'iso1-cytochrome C, transporteur d'électron mitochondrial), régulé par l'oxygène et réprimé par le glucose, le promoteur du gène MET25 (codant pour l'O-acétylhomosérine (thiol)lyase) réprimé par la méthionine, le promoteur du gène MET3 (codant pour l'ATP sulfurylase) induit par la méthionine, le promoteur du gène CUP1 (codant pour la chélatine du cuivre) et induit par le cuivre, les promoteurs des gènes CTR1 et CTR3 (codant pour des transporteurs membranaires du cuivre) réprimés par le cuivre en forte concentration et induits par le cuivre en faible concentration. Peuvent également être utilisés, le promoteur du gène TEF1 (codant pour un facteur 15 d'élongation de la transcription), le promoteur du gène PMA1 (codant pour une ATPase transporteur membranaire de proton). Parmi les terminateurs utilisables, on peut citer NCP1, PGK, ADH1 ou bien d'autres terminateurs endogènes de levure. Par « marqueur », on entend tout marqueur de sélection utilisable dans la levure, par 20 exemple les marqueurs d'auxotrophie tels que URA3, ADE2, HIS3, LEU2, TRP1, LYS2 et les marqueurs de résistances tels que natMX, de résistance à la nourséothricine, le gène hphMX de résistance à l'hygromycine, le gène KanMX de résistance à la généticine (G418). De tels marqueurs sont présents sur les plasmides pour s'assurer de la réussite de la 25 transformation de la souche par ledit plasmide. Les marqueurs d'auxotrophie permettent aussi d'éliminer les souches qui perdraient ce plasmide. Par « origine de réplication », on entend une séquence qui permet au plasmide d'être reconnu et répliqué par la levure alors qu'il est présent dans la levure sous forme circulaire. Chez la levure, on peut utiliser une origine de réplication de type 2p 30 provenant des plasmides circulaires endogènes extrachromosomiques de levure ou l'origine de réplication ARS CEN composée d'une des séquences ARS d'origine de réplication chromosomique et d'une des séquences centromériques CEN. Une cassette d'expression peut être introduite dans la levure soit via un plasmide d'intégration ou via un plasmide réplicatif autonome. Par « plasmide d'intégration », on entend l'usage de séquences linéaires d'ADN de transformation comprenant de préférence un marqueur de sélection et au moins une cassette d'expression de gènes d'intérêt, destinées à être insérées dans des régions du génome de Saccharomyces cerevisiae. Par « plasmide réplicatif autonome », on entend un système d'expression comportant : une origine de réplication levure 2 fia, un ou deux marqueurs de sélection d'origine levure et au moins une cassette d'expression. Ce type de vecteur se présente sous la forme d'un ADN circulaire double brin et se réplique de façon autonome dans le noyau de la levure. Le procédé selon la présente invention repose sur l'utilisation simultanée de plusieurs, au moins deux, plasmides d'intégration pour transformer une souche de levure. Il s'agit donc d'une co-transformation. Ce procédé a l'avantage d'être simple et rapide puisque l'intégration multicopie est réalisée en une seule étape. Par « intégration multicopie », on entend l'intégration d'au moins deux copies d'une même séquence. Le nombre de copies qui s'intègrent lorsque le procédé selon l'invention est mis en oeuvre peut varier de 2 à 20, de préférence de 5 à 20, de manière encore plus préférée, de 8 à 12. La deuxième étape du procédé selon l'invention consiste à sélectionner les meilleurs transformants, à savoir ceux qui expriment les molécules d'intérêt au meilleur titre. Elle s'effectue en deux temps. Dans un premier temps, il faut sélectionner les souches ayant intégré les transgènes dans leur génome, soit par la détection de la présence des cassettes d'expression, soit par l'observation phénotypique du marqueur de sélection lorsqu'un tel marqueur est présent. Cette étape nécessite de sélectionner un nombre suffisant de transformants. Un nombre suffisant est évalué comme étant au moins égal à 30, de préférence au moins égal à 40, et de manière encore plus préférée au moins égal à 50 clones. En effet, il a été démontré que le niveau de productivité est très hétérogène au sein de la population de transformants obtenus par le procédé selon l'invention. Par conséquent, pour être capable de sélectionner les clones hauts producteurs, il est nécessaire de partir d'une population assez large. Ne conserver qu'une dizaine de clones, voir moins, comme cela est classiquement fait, ne permettra pas d'identifier de manière sure et reproductible les meilleurs producteurs. Cet aspect est développé ci-après. Dans un second temps, il faut sélectionner les meilleurs producteurs à l'aide d'un test qui sera généralement un test fonctionnel. Ce test fonctionnel est typiquement basé sur la productivité des souches et la pureté de la molécule d'intérêt produite. En effet, ces deux critères sont indissociables lorsque l'on cherche à sélectionner une souche présentant les propriétés nécessaires à son industrialisation. Par « productivité de la souche », on entend sa capacité à produire de grandes quantités de molécules d'intérêt. Par « pureté de la molécule d'intérêt produite », on entend la proportion de molécule d'intérêt produite par rapport à celles des intermédiaires ou impuretés associés à la production en tant que produits secondaires. La molécule d'intérêt doit pouvoir être séparée des ces produits. Un tel test fonctionnel pourra être mis en oeuvre selon les techniques connues de l'homme du métier. Lorsque la production d'une molécule d'intérêt est recherchée, la quantification de cette molécule sera un moyen simple de cribler les souches (Western blot, test ELISA, test colorimétrique, tests microbiologiques, chromatographies liquides ou gazeuses...). De même si l'on recherche la production d'une enzyme, il suffira de doser l'activité enzymatique dans le milieu de culture. La 25 pureté peut typiquement être évaluée grâce à des tests chromatographiques. Les meilleurs transformants obtenus par la méthode selon l'invention présentent une productivité supérieure d'au moins + 30 % comparée à celle du meilleur transformant obtenu par la méthode classique de transformation par un plasmide réplicatif autonome. Ce gain de productivité est très significatif d'un point du vue industriel, 30 d'autant plus intéressant que la qualité en terme pureté est équivalente à celle obtenue avec une transformation classique. Les analyses statistiques réalisées sur les populations de transformants ont montré que la co-transformation d'au moins deux plasmides d'intégration est un événement relativement rare. D'un point de vue pratique, ceci signifie qu'il faut cribler une population large (comme mentionné précédemment) afin d'identifier les souches transformées présentant les meilleures productivités. Une investigation moléculaire a démontré que l'intégration se fait en de multiples copies et que celle-ci est stable. Le procédé selon l'invention permet donc de résoudre un problème fréquemment rencontré à savoir qu'il est difficile d'obtenir de hauts producteurs. La solution consiste à proposer un procédé simple et rapide permettant l'intégration stable de plusieurs transgènes dans une même levure. Le présent procédé peut être utilisé pour introduire des gènes autologues ou des gènes hétérologues pour la levure en fonction du but recherché. De telles applications peuvent être : (i) la biosynthèse, par une levure à partir d'une source de carbone simple, comme le glucose ou l'éthanol, d'enzymes entrant dans une voie métabolique - soit endogène lorsque ceux-ci sont limitants, à titre d'exemple HMG1 et ERG1 pour la production de stérols ou précurseurs de stérols, - soit exogène par combinaison de transgènes pour générer une nouvelle voie 20 métabolique, à titre d'exemple CYP71A1 pour la production de l'acide artémisinique, ou les cytochromes P450 taxoïdes hydroxylases pour la production de taxoïdes. Ce système est aussi applicable aux productions par bioconversion. (ii) la production directe de protéines recombinantes en tant que molécule d'intérêt, à titre d'exemple n'importe quelle protéine que l'on souhaite produire à un 25 niveau élevé comme l'invertase... ou des protéines capables d'interagir entre elles, comme les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines. Cette méthode peut être appliquée à différentes souches de levures notamment Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris et Kluyveromyces lactis. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé décrit précédemment est appliqué à la production de stéroïdes/hydrocortisone. Pour ce faire, le premier plasmide comprend une cassette d'expression pour les enzymes 36-HSD et P450c11 et le deuxième plasmide comprend une cassette d'expression pour les enzymes P450scc et ADX, les transformants ayant intégré les quatre transgènes sont sélectionnés pour leur capacité à produire des stéroïdes/hydrocortisone. La productivité est mesurée directement sur la quantité d'hydrocortisone produite et l'évaluation de la pureté est basée sur le pourcentage en hydrocortisone par rapport aux stéroïdes totaux. La préparation des souches produisant de l'hydrocortisone est décrite dans les 10 exemples qui suivent. Un autre objet de l'invention est constitué par les souches transformées productrices d'hydrocortisone directement obtenues grâce au procédé selon l'invention. La présente invention concerne aussi l'utilisation des souches pour produire de l'hydrocortisone, ainsi qu'une méthode de production d'hydrocortisone consistant à 15 cultiver les souches transformées selon l'invention. Brève description des figures Figure 1 : Histogramme de répartition des souches BYM 16 transformées avec le plasmide réplicatif autonome pFM10 Figure 2 : Histogramme de répartition des souches BYM 16 transformées avec les 20 plasmides réplicatif d'intégration pFM7 et pCB12 Figure 3 : Histogramme de répartition des souches BYM 16 transformées avec les plasmides réplicatif d'intégration pFM7 et pBXL1505 Figure 4 : Principe du Southern blot. A. Intégration en simple copie. B. Intégration en multiples copies en tandem. x : signal correspond à une copie. y : signal 25 caractéristique du fragment inséré correspondant à une intégration multicopie, l'intensité du signal étant proportionnelle au nombre de copies insérées. Exemples Exemple 1 : Obtention de levures génétiquement modifiées capables de produire de l'hydrocortisone après transformation à l'aide de plasmides réplicatifs autonomes a- Description des plasmides réplicatifs autonomes Le plasmide pFM10 possède quatre cassettes d'expression et deux marqueurs de sélection dits d'« auxotrophie » : une cassette d'expression du gène hétérologue P450scc d'origine bovine (CYP11A1) sous sa forme mature c'est-à-dire sans séquence d'adressage mitochondriale, une cassette d'expression pour le gène hétérologue ADX d'origine bovine sous sa forme mature ainsi qu'un marqueur de sélection dit d'« auxotrophie » URA3, une cassette d'expression du gène hétérologue 3[3HSD d'origine bovine, une cassette d'expression pour le gène hétérologue chimérique P450c11 (CYP11 B1) ainsi qu'un marqueur de sélection dit d'« auxotrophie » ADE2, deux courtes séquences R1 et R2 d'Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 respectivement). b- Co-transformation des plasmides Préparation des plasmides : Le plasmide pFM10 ne possédant pas d'origine de réplication pour E. coli est préparé par amplification dans la souche S. cerevisiae w303. L'extraction et la purification du plasmide s'effectuent à partir de la souche w303 pFM10 préalablement traitée de telle sorte à obtenir des sphéroplastes et selon les méthodes usuelles appliquées par l'homme de l'art à S. cerevisiae comme décrit par Becker et Lundblad (2001). Une amplification par PCR avec des oligonucléotides spécifiques du gène hétérologue 3[31-ISD (SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4) permet de vérifier l'efficacité et la qualité de cette extraction. Transformation : La souche BYM16 auxotrophe vis-à-vis de l'adénine et de l'uracile 25 est transformée par le plasmide circulaire pFM10 par méthode classique de transformation de S. cerevisiae conduisant à une bonne efficacité de transformation. c- Sélection des souches transformées Crible primaire : Ce crible de sélection directe consiste à sélectionner les souches transformées sur milieu sélectif, c'est-à-dire un milieu ne comportant pas les éléments pour lesquels la levure est auxotrophe. Il est nécessaire de disposer d'un nombre significatif d'au moins 30 transformants pour procéder au crible secondaire. Dans le cas particulier de la co-transformation avec un fragment d'ADN linéaire issu du plasmide pBXL1505 et un fragment linéaire d'ADN du plasmide pFM7, ce crible de sélection consiste à sélectionner les souches sur un milieu sélectif supplémenté en adénine et exempt d'uracile et nécessite un crible supplémentaire afin de sélectionner l'intégration du fragment linéaire pBXL1505. Il consiste à amplifier par PCR le gène hétérologue 3RHSD avec des oligonucléotides spécifiques (SEQ ID NO. 3 et SEQ ID NO. 4) soit par radiographie avec une sonde spécifique du gène 3RHSD (SEQ ID NO. 8). Ce crible nécessite de disposer d'un nombre significatif d'au moins 500 à 1000 souches transformées sélectionnés sur milieu minimum supplémenté en adénine. Crible secondaire dit fonctionnel : Après une étape d'amplification sur milieu sélectif, les souches transformées sont évaluées pour leur niveau de production d'hydrocortisone à l'échelle de la fiole d'Erlenmeyer dans un milieu dit Kàppeli contenant comme source de carbone du glucose et de l'éthanol. Après 3 jours d'incubation à 30°C sous agitation, un ajout de 2 % en éthanol est réalisé. L'incubation se poursuit jusqu'à 7 jours. 50 souches transformées ont été évaluées pour réaliser une étude statistique du niveau de production en hydrocortisone et sélectionner les meilleurs producteurs selon leur niveau de production en hydrocortisone et pourcentage en hydrocortisone par rapport aux stéroïdes totaux. En fin de production, la concentration en hydrocortisone et en stéroïdes intermédiaires est mesurée par une méthode HPLC appropriée. La sélection des meilleurs candidats s'effectue sur des critères de forte productivité en hydrocortisone et de faible taux d'impuretés stéroïdes, critère de qualité exigé en vue de l'exploitation industrielle de la souche d'un point de vue réglementaire. d- Résultat de la caractérisation fonctionnelle des souches obtenues par le procédé selon l'Exemple 1 Le plasmide réplicatif autonome pFM10 a été extrait de la souche w303 pFM10. La souche BYM16 a été transformée à partir de cette préparation. Les souches transformées ont été sélectionnées en appliquant le cribles primaire et 48 d'entre elles ont été évaluées pour leurs productivités en hydrocortisone en appliquant le crible secondaire. Les résultats sont présentés sur la Figure 1. Le titre moyen en hydrocortisone observé est de 43 mg/I pour une dispersion de 142 %. La meilleure souche productrice présente une production de 79 mg/I et un pourcentage en hydrocortisone de 89 %, répondant aux critères d'une souche industrialisable à savoir, forte productivité et faible taux d'impuretés stéroïdes. Exemple 2 : Obtention de levures génétiquement modifiées capables de produire de l'hydrocortisone après transformation à l'aide de plasmides d'intégration a- Description des plasmides d'intégration Deux plasmides d'intégration peuvent être introduits simultanément dans le génome 15 de S. cerevisiae, chacun permettant d'exprimer au moins deux gènes hétérologues. Dans la présente invention, les plasmides utilisés sont : le plasmide pFM7, le plasmide pCB12 et le plasmide pBXL1505. Le plasmide pFM7 possède une cassette d'expression du gène hétérologue P450scc d'origine bovine (CYP11A1) sous sa forme mature, une cassette d'expression pour le 20 gène hétérologue ADX d'origine bovine sous sa forme mature ainsi qu'un marqueur de sélection dit d'« auxotrophie » URA3 (Duport et al., 1998). Le plasmide pCB12 possède une cassette d'expression du gène hétérologue 3PHSD d'origine bovine, une cassette d'expression pour le gène hétérologue chimérique P450c11 (CYP11 B1) ainsi qu'un marqueur de sélection dit d'« auxotrophie » ADE2 25 (Dumas et al., 1996). Le plasmide pBXL1505 dérive du plasmide pCB12 dans lequel le marqueur de sélection ADE2 a été tronqué de telle sorte à l'inactiver. L'un ou l'autre des plasmides pCB12 et pBXL1505 peuvent être utilisés indifféremment. b- Co-transformation des plasmides Préparation des plasmides : Les plasmides pFM7, pCB12 et pBXL1505 possédant une origine de réplication pour E. coli sont préparés par, amplification dans E. coli et extraction/purification, selon les méthodes usuelles mises en oeuvre par l'homme de l'art (Sambrook et al., 1989). Le plasmide pFM7 est coupé par une enzyme de restriction Aat II de telle sorte à le linéariser. On obtient ainsi un unique fragment d'ADN linéaire double brins de 10.5 kb comprenant une cassette d'expression du gène hétérologue P450scc d'origine bovine (CYP11A1) sous sa forme mature, une cassette d'expression pour le gène hétérologue ADX d'origine bovine sous sa forme mature ainsi qu'un marqueur de sélection URA3 ainsi que deux séquences R1 et R2 (Duport et al., 1998). Le plasmide pCB12 est coupé par une enzyme de restriction BamHl. On obtient deux 15 fragments d'ADN linéaire double brins : - un fragment de 2.7 kb, - le fragment d'intérêt de 9.3 kb contenant une cassette d'expression du gène hétérologue 3[31-ISD d'origine bovine, une cassette d'expression du gène hétérologue chimérique P450c11 (CYP11 B1), un marqueur de sélection ADE2 20 ainsi que deux séquences R1 et R2 (Dumas et al., 1996). Le fragment d'ADN de 9.3 kb est purifié selon les techniques classiques de biologie moléculaire après migration du produit de restriction enzymatique par électrophorèse en gel d'agarose. Si l'on choisi d'utiliser le plasmide pBXL1505 plutôt que le plasmide pCB12, le 25 traitement est identique et l'on obtient : - un fragment de 2.7 kb, le fragment d'intérêt de 8.1 kb comprenant une cassette d'expression du gène hétérologue 3[31-ISD d'origine bovine, une cassette d'expression du gène hétérologue chimérique P450c11 (CYP11 B1), une séquence tronquée du marqueur ADE2 ainsi que deux séquences R1 et R2. Transformation : La souche appropriée présentant une double auxotrophie vis-à-vis de l'adénine et de l'uracile est transformée en une étape dite de co-transformation : - par un fragment d'ADN linéaire de 10.5 kb du plasmide pFM7, - et par le fragment linéaire de 9.3 kb issu du plasmide pCB12. Dans ce cas, la souche est rendue prototrophe. La souche appropriée présentant une double auxotrophie vis-à-vis de l'adénine et de l'uracile est transformée en une étape dite de co-transformation : - par un fragment d'ADN linéaire de 10.5 kb du plasmide pFM7, - et par le fragment linéaire de 8.1 kb issu du plasmide pBXL1505. Dans ce cas, la souche reste auxotrophe pour l'adénine. Cette méthode de co-transformation permet d'introduire simultanément quatre cassettes d'expression. c- Sélection des souches transformées La sélection des souches produisant les plus hauts titres d'hydrocortisone est réalisée comme décrit dans l'Exemple 1, c. d- Résultat de la caractérisation fonctionnelle des souches obtenues par le procédé selon l'Exemple 2. Après co-transformation de la souche BYM16 avec les plasmides d'intéqration pFM7 et pCB12 : La souche BYM16 a été co-transformée à partir du fragment d'ADN linéaire de 10.5 kb du plasmide pFM7 et du fragment linéaire de 9.3 kb issu du plasmide pCB12. Les souches transformées ont été sélectionnées en appliquant le crible primaire et 36 25 d'entre elles ont été évaluées pour leurs productivités en hydrocortisone en appliquant le crible secondaire. Les résultats sont présentés sur la Figure 2. Ils montent que le titre moyen en hydrocortisone observé est de 28 mg/I pour une dispersion de 212 %. La meilleure souche productrice présente une production de 103 mg/I d'hydrocortisone et un pourcentage en hydrocortisone de 85 % répondant aux critères d'une souche industrialisable à savoir, forte productivité et faible taux d'impuretés stéroïdes. Après co-transformation de la souche BYM16 avec les plasmides d'intégration pFM7 et pBXL1505 La souche BYM16 a été co-transformée à partir du fragment d'ADN linéaire de 10.5 kb du plasmide pFM7 et du fragment linéaire de 8.1 kb issu du plasmide pBXL1505. Les souches transformées ont été sélectionnées en appliquant le crible primaire adapté à la sélection du fragment linéaire issu du plasmide pBXL1505 et 74 d'entre elles ont été évaluées pour leurs productivités en hydrocortisone en appliquant le crible secondaire. Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Ils montent que le titre moyen en hydrocortisone observé est de 20 mg/I pour une dispersion de 344 %. La meilleure souche productrice présente une production de 110mg/I d'hydrocortisone et un pourcentage en hydrocortisone de 85 % répondant aux critères d'une souche 20 industrialisable à savoir, forte productivité et faible taux d'impuretés stéroïdes. Il a été constaté que les meilleurs producteurs obtenus par le procédé selon l'invention résultent de la combinaison des plasmides tels qu'utilisés dans cet exemple. Ces souches comportent donc la meilleure combinaison génétique parmi les combinaisons de plasmides testées. 25 Exemple 3 : Comparaison des souches transformées Les meilleures souches résultant des co-transformations, « BYM16 pFM7 pCB12 » et « BYM16 pFM7 pBXL1505 », citées dans l'Exemple 2, d- , présentent des productivités en hydrocortisone au moins supérieures de + 30 °/U comparé à la 15 meilleure souche transformée avec le plasmide réplicatif autonome pFM10, citée dans l'Exemple 1. Exemple 4 : Investigations moléculaires des souches produisant les plus hauts titres d'hydrocortisone Pour caractériser le génotype des meilleures souches productrices transformées avec les plasmides d'intégration pFM7 et pCB12 ou pFM7 et pBXL1505, deux méthodes sont appliquées : 1. Hybridation de chromosomes séparés par électrophorèse en champs pulsés, 2. Hybridation de fragment d'ADN génomique dite technique de Southern blot. 10 1. Hybridation de chromosomes séparés par électrophorèse en champs pulsés Grâce à une hybridation sur chromosomes entiers, il est possible de vérifier l'intégration d'un gène mais aussi de le localiser. Cela consiste en une séparation des chromosomes en utilisant la technique des « Champs alternés homogènes fixés » dite CHEF (contour clamped homogenous electric fields) suivie d'une hybridation 15 spécifique à la recherche des cassettes d'expressions intégrées (Maule 1994). Pour cela, une sonde spécifique à la cassette d'expression P450scc (SEC) ID NO. 7) du plasmide d'intégration pFM7 et une sonde spécifique à la cassette d'expression 3[3HSD (SEC) ID NO. 8) du plasmide d'intégration pCB12 ou pBXL1505 sont construites par amplifications PCR puis radiomarquées au dCTP-a-32P. 20 Cette technique révèle que le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression P450scc ainsi que le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression 3[3HSD sont localisés sur les chromosomes XII ou IV (co-migration). 2. Hybridation par Southern Blot Le Southern Blot permet de repérer la présence d'une séquence d'ADN endogène ou 25 exogène dans de l'ADN génomique partiellement coupé par des enzymes dites de restriction. Ce repérage se fait par hybridation de cette séquence avec une sonde spécifique marquée (Southern, 1975). Selon le type de restriction enzymatique appliqué à l'ADN génomique, on peut révéler de quelle manière est intégrée cette séquence : intégration simple, multiple en différentes régions ou loci du génome, ou multiple en tandem dans un unique locus (Figure 4). Pour caractériser les souches surproductrices, une sonde spécifique à la cassette d'expression P450scc (SEO ID NO.7) et une sonde spécifique à la cassette d'expression 3[3HSD (SEO ID NO.8) sont utilisées. Les ADN génomiques extraits de ces souches sont coupés soit, avec Hpal pour révéler la présence de la cassette d'expression 3[3HSD, soit avec EcoRV pour révéler la présence de la cassette d'expression P450scc (voir Figure 4). Cette technique révèle que, le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression P450scc ainsi que le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression 3[31-ISD, se sont intégrés en tandem d'au moins dix copies. Ces profils d'intégration ont été observés chez plusieurs descendants des meilleurs 15 producteurs et s'avèrent identiques. Ces intégrations sont donc génétiquement stables. Ces Intégrations multiples aléatoires confèrent donc à la fois une stabilité des souches et un gain de fonction en termes de production d'hydrocortisone. Description du matériel biologique utilisé 20 Liste des plasmides décrits dans la présente demande [pFM7 : ori E.coli ori 2p levure R1 PGal1o/cYC1-matADXbov-TPCK, URA3 PCailoicvcl-P450sccbov-TPCK, R2] [pCB12 : ori E.coli R2 Pcvc,-P450c11 hybride-TPCK, ADE2 PmH3-3[3HSDbov-TPCK1 R1] [pBXL1505 : ori E.coli R1 PmH3-3[3HSDbov-TPCK1 ade2 Pcvc,-P450c11 hybride-TPCK, 25 R2] [pFM10 : ori 2p levure R1 PGal1o/cYC1-matADXbov-TPCK, URA3 PGal1o/cYC1-P450sccbov-TPGK1 R2 Pcvci-P450c11 hybride-TPCK1 ADE2 PmH3-3[3HSDbov-TPCKI] Liste des souches décrites dans la présente demande o BYM 16 Génotype MATa, ura3-52, LEU2::Pcvc1-ARH1-TPGK1, TRPI::PmH3-c17bov-TNCp1_PTEF1-ADRbov-5 TPGK1 ypr1::PTEF1-(c21 human)n-TpGK1, gcy1::PmH3-c21 human-TpGK1 , atf2::PTEF1-KanMXTTEF1, ade2::PGALlo/cvcl-stérol A7REDArabidopsis-TpGK1, HIS3::PTEF1-cl7bov-TpGK1_PMH3-COXVI yeast ADXbov-TNCP1, ga180 10 Phénotype a-mater Leu+ His+ Trp+ Ura- Ade- G418R o BYM16 transformée avec les plasmides d'intégration pCB12 et pFM7 Génotype MATa, ura3-52, LEU2::Pcvc1-ARH1-TPGK1, TRPI::PmH3-c17bov-TNCp1_PTEF1-ADRbov-15 TpGK1 ypr1::PTEF1-(c21 human)n-TpGK1, gcy1::PmH3-c21 human-TpGK1 , atf2::PTEF1-KanMXTTEF1, ade2::PGALlo/cvcl-stérol A7REDArabidopsis-TpGK1, HIS3::PTEF1-cl7bov-TpGK1_PMH3-COXVI yeast ADXbov-TNCP1, ga180 20 Intégration aléatoire en multiples copies de : (PGAL1o/CYC1-ADX-TPGK1)n, (PGAL1o/CYC1-P450scc-TpGK1)n, (PmH3-3[3HSD -TNCp1)n, (Pcvc1- P450c11 hybride -TPGK1)n , URA3n, ADE2n Phénotype a-mater Leu+ His+ Trp+ Ura+ Ade+ G418R o BYM16 transformée avec les plasmides d'intégration pBXL1505 et pFM7 Génotype MATa, ura3-52, LEU2::Pcvc1-ARH1-TPGK1, TRPI::PmH3-c17bov-TNCp1_PTEF1-ADRbov-TPGK1 ypr1::PTEF1-(C21 human)n-TPGK1, gcy1::PmH3-C21 human-TPGK1 , atf2::PTEF1-KanMXTTEF1, ade2::PGALloicvcl-stérol A7REDArabidopsis-TpGK1, HIS3::PTEF1-C17bov-TpGK1_PMH3-COXVI yeast ADXbov-TNCP1, ga180 Intégration aléatoire en multiples copies de : (PGAL1o/CYC1-ADX-TPGK1)n, (PGAL1o/CYC1-10 P450scc-TPGK1)n, (PmH3-3[3HSD -TNCp1)n, (Pcvc1- P450C11 hybride -TpGK1)n , URA3n, ade2n Phénotype a-mater Leu+ His+ Trp+ Ura+ Ade- G418R o BYM16 transformée avec le plasmide réplicatif autonome pFM10 15 Génotype MATa, ura3-52, LEU2::PCYC1-ARH1-TPGK1, TRPI::PmH3-C17bov-TNCp1_PTEF1-ADRbov-TPGK1 ypr1::PTEF1-(C21 human)n-TPGK1, gcy1::PmH3-C21 human-TPGK1 , atf2::PTEF1-KanMXTTEF1, 20 ade2::PGALloicvcl-stérol A7REDArabidopsis-TpGK1, HIS3::PTEF1-C17bov-TpGK1_PMH3-COXVI yeast ADXbov-TNCP1, ga180 [pFM10 : 2p-URA3-ADE2 PGAL1oiCYC1-ADX-TpGK1 PGAL1o/CYC1-P450SCC-TpGK1 PMH3-3[3HSD -TNCp1 Pcvc1- P450C11 hybride -TpGK1] Phénotype 25 a-mater Leu+ His+ Trp+ Ura+ Ade+ G418R o W303 pFM10 Génotype MA Ta leu2-3,112 trp1-1, can1-100, ura3-1, ade2-1, his3-11,15 [phi+] [pFM10 : 2p-URA3-ADE2 PGAL1oiCVC1-ADX-TpGK1 PGAL10/CYC1-P450SCC-TpGK1 PMH3-5 3[3HSD -TNcp1 Pcvc1- P450cl 1 hybride -TpGK1] Phénotype a-mater Leu- His- Trp- Ura+ Ade+ Références bibliographiques Becker D. and Lundblad V. 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Procédé de préparation d'une levure transformée génétiquement et productrice à haut titre d'une molécule d'intérêt consistant à : o intégrer de manière stable et multicopie au moins quatre cassettes d'expression en réalisant une co-transformation de deux plasmides d'intégration, chaque plasmide comprenant au moins deux cassettes d'expression de transgènes d'intérêt et de préférence un marqueur de sélection, puis à o sélectionner les levures qui sont les meilleurs producteurs en réalisant : a. un crible primaire basé sur la présence des cassettes d'expression ou sur l'observation phénotypique du marqueur de sélection lorsqu'un tel marqueur est présent, le nombre de clones positifs retenus devant être au moins égal à 30, b. un crible secondaire fonctionnel réalisé pour chacun des clones retenus à l'étape a., basé sur la productivité des souches et la pureté de la molécule d'intérêt produite. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'intégration multicopie correspond en l'intégration de 5 à 20 copies, de préférence de 8 à 12 copies du plasmide. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les transgènes d'intérêt sont des gènes autologues ou des gènes hétérologues pour la levure. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les transgènes d'intérêt sont à la fois des gènes autologues et des gènes hétérologues pour la levure. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le nombre de clones retenus à l'issue du criblage primaire de l'étape a. est au moins égal à 40. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la levure génétiquement transformée est du genre Saccharomyces cerevisiae. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'un au moins des plasmides comprend un marqueur de sélection et en ce que le marqueur est choisi parmi ADE2, URA3, HIS3, LEM, TRP1, LYS2, les marqueurs de résistance tels que natMX, de résistance à la nourséothricine, le gène hphMX de résistance à l'hygromycine, le gène KanMX de résistance à la généticine (G418). 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel un des plasmides comprend un 10 marqueur de sélection URA3 et l'autre plasmide comprend une séquence inactive tronquée du marqueur de sélection ADE2. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les transgènes d'intérêt sont des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'hydrocortisone. 15 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sélection des levures qui sont les meilleurs transformants est réalisée à l'aide d'un criblage secondaire basé sur le dosage de la quantité d'hydrocortisone produite. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes utilisé pour obtenir une production élevée de stéroïdes/hydrocortisone consistant à introduire chez la 20 levure un premier plasmide comprenant une cassette d'expression pour la P450scc et l'adrenodoxine (ADX) ii. un deuxième plasmide comprenant une cassette d'expression pour la P450c11 et la 3(3-hydroxy-stéroïde déshydrogénase (3(3-HSD) 25 puis à sélectionner les meilleurs transformants : a. sur la présence des cassettes d'expression puis b. sur leur capacité à produire à haut titre de l'hydrocortisone présentant un faible taux d'impureté. 12. Souche de levure transformée génétiquement et productrice à haut titre d'une molécule d'intérêt obtenue en mettant en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 13. Utilisation d'une souche de levure préparée selon le procédé de la 5 revendication 11 pour produire de l'hydrocortisone. 14. Procédé de préparation d'hydrocortisone comprenant les étapes suivantes : a. Préparer une souche de levure par le procédé selon la revendication 11 b. Mettre en culture la souche obtenue à l'étape a. 10 c. Récolter l'hydrocortisone produite dans le milieu de culture 15. Procédé de préparation d'hydrocortisone selon la revendication 14 comprenant en outre une étape de purification de l'hydrocortisone obtenue.