FR 2976180 A1 20121214 FR 1155090 A 20110610 Peptides pour leur utilisation dans le traitement du cancer L'invention se rapporte à des peptides pour leur utilisation dans le traitement du cancer et en particulier des leucémies. Au cours des vingt dernières années plusieurs peptides antimicrobiens ont été décrits pour posséder une activité anticancéreuse (pour revues voir (Hoskin and Ramamoorthy 2008; Schweizer 2009. 10 Ces activités ont été essentiellement décrites pour des peptides produits par des organismes supérieurs (insectes, batraciens, mammifères) et dans un cas au moins, la plantaricine A, par une bactérie (Sand et al. 2007). Deux catégories sont à distinguer parmi ces peptides anticancéreux. La première catégorie 15 correspond aux molécules qui ont une activité cytotoxique et agissent contre les cellules saines autant que sur les cellules tumorales (mellitine, défensines et plantaricine A par exemple). Les peptides de la seconde catégorie se caractérisent par une activité spécifique, à faible concentration, contre les cellules cancéreuses sans action contre les cellules saines. Les cécropines d'insectes et magainines de batraciens font partie de ce groupe. Le mode 20 d'action de la plupart de ces peptides est membranolytique. C'est-à-dire que la membrane des cellules cibles est perméabilisée par les peptides, qui conduit à la mort cellulaire. Les cellules cancéreuses présentent des modifications importantes de leur composition membranaire en particulier concernant leur charge. En effet, une augmentation du contenu en phosphatidyl-sérine de ces cellules a été montrée (Utsugi et al. 1991; Dobrzynska et al. 25 2005). Cette modification implique une augmentation de la charge négative de surface de la membrane et donc facilite l'adsorption des peptides, cationiques pour la plupart, sur celle-ci. Les travaux des inventeurs ont porté sur un peptide de 22 acides aminés, la warnéricine RK, secrété par Staphylococcus warneri RK (Héchard et al. 2005; Verdon et al. 2008). Ce peptide, 30 comme les delta-lysines I et II de S. warneri, présente une forte activité anti-Legionella, avec une concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'ordre du micromolaire. Son spectre d'activité est très spécifique du genre Legionella et de quelques rares Bad/lus spp, mais avec5 une CMI plus élevée. De plus, toutes les souches de Legionella spp testées à ce jour se sont avérées sensibles à l'action de ce peptide (Berjeaud and Héchard 2007). D'autre part ce peptide présente également une activité hémolytique importante puisqu'une concentration de 2 µM entraîne 10% d'hémolyse sur érythrocytes humains. De manière surprenante, il est apparu que ce peptide n'exerçait pas d'effet de perméabilisation sur des cellules monocluées isolées à partir de sang de donneurs sains, mais qu'une perméabilisation importante était observée, aux mêmes doses, sur des lymphocytes T malins isolés de patients leucémiques. Des peptides naturels ou synthétiques, de structure primaire proche de celle de la warnéricine RK, se sont également révélé de grand intérêt. L'invention a donc pour but de fournir de tels peptides pour une utilisation pour le 15 traitement de cancers. Elle vise également à fournir une méthode de traitement d'un patient atteint d'un cancer à l'aide desdits peptides. 20 Conformément à l'invention, les peptides pour une telle utilisation sont choisis dans le groupe comprenant la warnéricine ou un dérivé de warnéricine, dont la structure répond à la séquence SEQ ID N°1 MQFITDLIKKAVDX1X2KGLX3X4NK dans laquelle 25 . X1 représente F ou V . X2 représente F ou I . X3 représente F ou V . X4 représente G ou D 30 Des peptides préférés répondent aux séquences SEQ ID N°2 à 7 ci-dessous (leurs désignations donnant la modification d'acide(s) aminé(s) et sa position par rapport à la warnéricine est indiquée entre parenthèses: 10 SEQ ID N°2 :MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK (Warn) SEQ IDN°3 : MQFITDLIKKAVDFFKGLVGNK (Warn 19V) SEQ ID N°4: MQFITDLIKKAVDFFKGLFDNK (Warn 20D) SEQ ID N°5: MQFITDLIKKAVDVFKGLFGNK (Warn 14V) SEQ ID N°6: MQFITDLIKKAVDFIKGLFGNK (Warn 151) SEQ ID N°7: MQFITDLIKKAVDVIKGLFGNK (Warn14V 151) L'invention vise également des peptides dérivant de la PSMa (Phenol Soluble Modulin), peptide produit par S. epidermidis (Mehlin et al. 1999), de séquence SEQ ID N°8 SEQ ID N°8 : MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK et répondant à la structure de séquence SEQ ID N°9 suivante SEQ ID N°9 : MAX5X6IAKIVEIVKX7LIDQFTQK . X5 représente D ou G 15 . X6 représente V ou F .X7 représente G ou K Ces peptides répondent aux séquences SEQ ID N°10-13 SEQ IDN°10: MADVIAKIVEIVKKLIDQFTQK (PSM 14K) 20 SEQ ID N°11: MADFIAKIVEIVKKLIDQFTQK (PSM 4F) SEQ ID N°12: MAGVIAKIVEIVKGLIDQFTQK (PSM 3G) SEQ ID N°13: MAGVIAKIVEIVKKLIDQFTQK (PSM 3G 14K) D'autres peptides compennent la warnericine inversée 25 SEQ ID N°14: MNGFLGKFFDVAKKILDTIFQK (Warn inv) Comme illustré par les exemples, ces peptides présentent en commun la propriété de pouvoir perméabiliser sélectivement les membranes cellulaires de cellules cancéreuses, conduisant à leur mort. 30 L'invention vise donc la mise à profit de ces propriétés pour l'élaboration de compositions pharmaceutiques. Ces compositions, pour utilisation pour le traitement du cancer, comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte. Ces compositions renferment le cas échéant des principes actifs d'autres médicaments d'intérêt, Les conditionnements en vue de la vente, en particulier l'étiquetage et les notices d'emploi, ainsi que l'emballage sont élaborés en fonction de l'application thérapeutique prévue. Les compositions pharmaceutiques de l'invention pour l'utilisation pour le traitement de cancer sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie injectable. Les formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, 15 sous-cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Ces formes injectables renferment par unité de prise de 1 à 50mg de principe actif, de préférence de 10 à 30 mg. La posologie utilisable chez l'homme sera choisie en tenant compte notamment de l'état du patient et de son âge. Des doses de 10 à 50 mg/jour sont généralement appropriées pour le traitement de cancer. 25 Les peptides ci-dessus sont avantageusement obtenus par voie de synthèse en opérant selon les techniques classiques. En variante, ils peuvent résulter de l'expression de séquences nucléotidiques correspondantes insérées dans des vecteurs d'expression appropriés, notamment des plasmides. On citera notamment la séquence SEQ ID N°15. 30 SEQ IDN°15: atgcaattta tcacagatct tatcaaaaaa gcagtagatt tcttcaaagg tttatttggt aacaaataa L'invention vise donc également ces vecteurs en tant que nouveaux produits. 20 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux Figures 1 à 3, qui représentent, respectivement, - la Figure 1, le % de cellules mononucluées perméabilisées par la warnéricine RK, - la Figure 2, le % de cellules de lignée Jurkat perméabilisées par la warnéricine RK, et - la Figure 3, le % de cellules des lignées K562 et KG1 perméabilisées par la warnéricine RK. Matériels et méthodes 1. Cellules de la lignée Jurkat Les cellules de la lignée Jurkat (ATCC) sont des cellules leucémiques lymphoblastique T. Elles sont cultivées en milieu RPMI (Roswell Park Memorial institute) 1640, complémenté en sérum de veau foetal à 10% pendant 4 à 5 jours à 37°C sous 5% de CO2. 2. Cellules mononuclées humaines Les cellules mononuclées humaines (CMN) ont été récupérées à partir de sang frais, de donneurs sains volontaires, dilué au demi avec du milieu RPMI 1640 complémenté en sérum de veau foetal à 10%. Deux volumes de ce sang dilué ont été déposés sur un volume de Ficoll avant d'être centrifugés à 1200 g pendant 20 minutes à 4°C sans frein. L'anneau blanchâtre produit par le gradient de ficoll et correspondant aux cellules mononuclées humaines a été récupéré dans du RPMI 1640 complémenté en sérum de veau foetal à 10%. Trois séries de lavages et centrifugations permettent d'éliminer les autres cellules. Un comptage est effectué au bleu acétique afin d'énumérer les CMN seulement et un comptage au bleu trypan (0,2%) pour dénombrer les cellules totales mortes et vivantes. Ces deux comptages permettent également de vérifier que l'échantillon n'est pas contaminé par les globules rouges. . Test d'activité des peptides Après centrifugation à 20°C pendant 10 minutes à 400 g, les cellules ont été lavées avec du Phosphate Buffer Saline (PBS)puis centrifugées à nouveau dans les mêmes conditions. La concentration des cellules a alors été ramenée à 106cellules/ml à l'aide d'un comptage au bleu de trypan et au bleu acétique en supplément pour les cellules mononuclées. Les peptides testés aux concentrations finales de : 0, 1, 3, 6, 12,5 et 25 µg/ml ont été ajoutés à la suspension cellulaire (1 ml volume final). Les suspensions ont été incubées pendant 45 minutes à 37°C sous 5% de CO2 avant analyse en cytométrie de flux. 4. Cytométrie en flux Pour chaque type cellulaire les cellules incubées avec les peptides ont été analysées par cytométrie de flux après marquage avec l'Iodure de Propidium (IP). L'IP est un fluorochrome de fluorescence rouge (635 nm), qui s'intercale entre les bases des molécules d'ADN. Le fluorophore ne pénètre que dans les cellules dont la membrane est endommagée. Ainsi les cellules marquées (IP+) sont considérées comme perméabilisées et les cellules non marquées (IP-) sont considérées comme ayant une membrane intègre. Le fluorochrome de concentration 50011g/ml, est ajouté à hauteur de 51.1I pour 1ml de suspension. Les cellules sont analysées à l'aide d'un cytomètre FACSCantoTM II (BD Biosciences). Un total de 100000 évènements (cellules) est mesuré pour chaque échantillon et l'acquisition se fait en utilisant le logiciel BD FACSDiVa 6. Résultats L'activité de la warnéricine RK a été testée vis-à-vis de cellules mononucléées humaines, dont des lymphocytes T, préparées à partir de sang de deux donneurs sains. Pour cela, des suspensions contenant 10E6 cellules par ml ont été incubées pendant 45 minutes à 37°C avec des concentrations croissantes de peptide dans un tampon Phosphate Buffer Saline (PBS). Les supensions ont ensuite été analysées en cytométrie de flux après marquage avec de l'iodure de propidium (IP). L'IP est un fluorophore intercalant de l'ADN qui ne peut pénétrer dans les 6 cellules que si celles-ci ont leur membrane plasmique endommagée donc ont été perméabilisées. La figure 1 présente les résultats obtenus en donnant le pourcentage de cellules perméabilisées, donc marquées à l'IP, en fonction de la concentration en warnéricine RK. Il apparait ainsi que les CMN n'ont pas été perméabilisées par le peptide puisque le pourcentage de perméabilisation reste inférieur à 2% quelle que soit la concentration de peptide utilisée (Fig 1). Les mêmes expériences ont été menées sur des cellules lymphoblastiques de la lignée Jurkat. Il s'agit de lymphocytes T malins isolés d'un patient leucémique. Les résultats sont présentés sur la figure 2. Il apparaît ici que la warnéricine RK entraîne la perméabilisation de ces cellules dès la 15 concentration de 6 µg/ml. De plus à 25 µg/ml la totalité des cellules traitées apparaissent marquées à l'IP. Les mêmes essais ont été réalisés sur deux autres lignées leucémiques : lignée KG1 qui correspond à des: cellules leucémiques aigues myéloïdes (LAM); lignée K562 correspondant 20 à des cellules leucémiques myéloïdes chroniques (LMC). Les résultats de perméabilisation sont présentés sur la figure 3. Pour les trois types cellulaires on observe une perméabilisation révélée par l'internalisation d'iodure de propidium. Cette perméabilisation a été corrélée à la mort cellulaire par 25 comptage des cellules au microscope optique après marquage au Bleu Trypan. De plus il apparaît alors que le nombre total de cellules entières diminue avec la dose de peptide alors qu'apparaissent des débris cellulaires, ce qui semble indiquer une lyse totale des cellules soumises à l'action de la warnéricine RK. Conclusion Les résultats de cette étude montrent que la warnéricine RK agit sur les cellules cancéreuses 5 (Jurkat) en perméabilisant leur membrane et donc à terme en les « tuant » alors qu' aux mêmes doses le peptide est sans action sur des cellules saines. Il est à noter que la PSMa, pour laquelle une activité anti-Legionella a été mise en évidence, n'a pas d'action contre les cellules humaines testées. 8 10 Références bibliographiques Berjeaud JM, Hechard Y (2007) Method for preventing and/or treating articles or media contaminated with bacteria of the Legionella genus ed. Poitiers, C-Ud. PCT - W02007/077316. Dobrzynska I, Szachowicz-Petelska B, Sulkowski S, Figaszewski Z (2005) Changes in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells. Molecular and cellular biochemistry 276:113-119. Hechard Y, Ferraz S, Bruneteau E, Steinert M, Berjeaud JM (2005) Isolation and characterization of a Staphylococcus warneri strain producing an anti-Legionella peptide. FEMS microbiology letters 252:19-23. Hoskin DW, Ramamoorthy A (2008) Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochimica et biophysica acta 1778:357-375. Mehlin C, Headley CM, Klebanoff SJ (1999) An inflammatory polypeptide complex from Staphylococcus epidermidis: isolation and characterization. The Journal of experimental medicine 189:907-918. Sand SL, Haug TM, Nissen-Meyer J, Sand 0 (2007) The bacterial peptide pheromone plantaricin A permeabilizes cancerous, but not normal, rat pituitary cells and differentiates between the outer and inner membrane leaflet. The Journal of membrane biology 216:61-71. Schweizer F (2009) Cationic amphiphilic peptides with cancer-selective toxicity. European journal of pharmacology 625:190-194. Utsugi T, Schroit AJ, Connor J, Bucana CD, Fidler IJ (1991) Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes. Cancer research 51:3062-3066. Verdon J, Berjeaud JM, Lacombe C, Hechard Y (2008) Characterization of anti-Legionella activity of warnericin RK and delta-lysin I from Staphylococcus warneri. Peptides 29:978-984.30 REVENDICATIONS1 - Peptides pour une utilisation pour le traitement de cancer, caractérisés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe comprenant la warnéricine ou un dérivé de warnéricine, dont la structure répond à la séquence SEQ ID N°1 MQFITDLIKKAVDX1X2KGLX3X4NK dans laquelle . X1 représente F ou V . X2 représente F ou I . X3 représente F ou V . X4 représente G ou D 2 - Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N°2 :MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK SEQ IDN°3 : MQFITDLIKKAVDFFKGLVGNK SEQ ID N°4: MQFITDLIKKAVDFFKGLFDNK SEQ ID N°5: MQFITDLIKKAVDVFKGLFGNK SEQ ID N°6: MQFITDLIKKAVDFIKGLFGNK SEQ ID N°7: MQFITDLIKKAVDVIKGLFGNK -3 - Compositions pharmaceutiques pour utilisation pour le traitement du cancer, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide selon la revendication 1 ou 2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte. - 4 - Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'elles renferment en outre des principes actifs d'autres médicaments.5 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 3 ou 4, pour l'utilisation pour le traitement de cancer, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous des formes appropriées pour une administration par voie injectable. 6 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 5, pour l'utilisation pour le traitement de leucémies. 7 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 5 ou 6, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous formes de solutions injectables par voie intra-veineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables, ou encore de suspensions ou d'émulsions. 8 - Composition selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles renferment par unité de prise de 1 à 50 mg de principe actif, de préférence de 10 à 30 mg.