FR 2925053 A3 20090619 FR 0807092 A 20081217 REACTIFS DE MARQUAGE La présente invention concerne de nouveaux réactifs de marquage capables de se lier à des substances bioactives soit en solution, soit sur la surface d'un support solide. Différentes propriétés physiques et chimiques particulières sont attendues de la part d'u:l chélate de lanthanide luminescent. Dans son état de base comme dans son état excité, la molécule doit être stable du point de vue thermodynamique, cinétique et photo- chimique. Le transfert d'énergie du ligand à l'ion central doit être rapide et efficient. Fréquemment, le chélate doit aussi être soluble dans l'eau. Le chélate doit conserver ses propriétés positives y compris après son couplage à une molécule bioactive. Un bon réactif de marquage ne modifie pas les propriétés de la substance bioactive à laquelle il est lié. De nombreuses applications nécessitent une liaison covalente de la molécule de marquage à la substance bioactive. Pour le marquage de molécules cibles telles que des protéines, des oligonucléotides et des oligopeptides, on utilise souvent des dérivés isothiocyanate, N-hydroxysuccinimide, haloacétamide, dichlorotriazine ou maléimide d'un chélate. Étant donné que la réaction de marquage se fait en présence d'un excès de réactif de marquage activé, des procédures de purification qui demandent beaucoup de travail sont inévitables. Les problèmes de purification peuvent être évités lorsque la réaction de marquage se fait sur la surface d'une phase solide. Dans ce cas, une grande partie des 2 impuretés peut être éliminée par lavage pendant que le conjugué de biomolécule adhère encore à son support solide. Une multitude de réactifs permettant de coupler de la manière précitée des chélates de lanthanides à des molécules bioactives a déjà été rendue accessible au public. Le marquage en solution est inévitable dans le cas de molécules bioactives de grande taille telles que les protéines. La réaction de marquage doit alors être aussi efficiente et aussi spécifique a.l site que possible. On a observé que les groupes donneurs d'électrons d'un noyau aromatique améliorent les propriétés photo-physiques de certains chélates de lanthanides (III) dérivés de 4-phényl-2,6-bis[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridines (US 4 761 481). Par la suite, on a découvert que les propriétés précitées peuvent être améliorées en chélatant plusieurs groupes aromatiques sur un ion de lanthanide (demande de brevet américain 11/004 061). Ceci augmente également la stabilité de la structure du chélate. Par ailleurs, des ohromophores aromatiques pourraient aussi diminuer la solubilité dans l'eau du chélate. La présente invention a pour principal objet de proposer l'utilisation de réactifs de marquage dérivés de 4-phénylpyridine qui permettent de marquer des substances bioactives aussi bien en solution que sur la surface d'un support solide. Pour le marquage sur la surface du support solide, on peut utiliser des synthétiseurs d'oligonucléotides et d'oligopeptides en tant que modèles standard. La solubilité dans l'eau des 3 molécules de l'invention a pu être améliorée par l'ajout d'un seul ou d'une pluralité de groupes acide carboxylique, acide phosphorique ou acide sulfonique aux chromophores. Les bioconjugués ainsi obtenus sont particulièrement adaptés à la détermination basée sur la fluorescence à résolution temporelle. La présente invention a pour objet un chélate de formule (I) adéquat pour marquer une substance bioactive en solution. Un autre objet de la présente invention est le réactif de marquage de formule (II) adéquat pour marquer une substance bioactive sur la surface d'un support solide. Par conséquent, la présente invention concerne un chélate adéquat pour le marquage en solution d'une molécule biospécifique et présentant la formule développée (I) . (^'':^.. / N X N i A dans laquelle A est un groupe réactif de liaison à la substance bioactive, choisi dans un groupe constitué par des radicaux isothiocyanate, bromacétamido, iodoacétamido, maléimide, 4,6-dichloro-1,3,5-triazinyl-2-amino, pyridyldithiol, thioester, aminooxy, azide, N Ra Rb Ln3+ R Rd (r) alcyne, hydrazide, amino, acide carboxylique, ester ou halogénure d'acide, Z1 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z2 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z3 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z9 est un groupe donneur d'électrons, Z5 est un substituant qui contient un groupe acide carboxylique, un groupe acide phosphorique ou un groupe acide sulfonique, X est un lieur formé d'une à dix parties dont chacune est choisie dans un groupe constitué par des radicaux phényle, alkyle de 3 à 12 atomes de carbone, éthynediyle (-CC-), éthènediyle (-C=C-), éther (-0-), thioéther (-S-), amide (-CO-NH-, -CO-NR'-, -NH-CO- et - NR'-CO-), carbonyle (-CO-), ester (-COO- et -O0C-), disulfure (-SS-), sulfonamide (-SO2-NH-, -NH-SO2-, -NR'-SO2- et -SO2-NR'-), sulfone (-SO2-), phosphate (-0-PO2-O-), diaza (-N=N-) et amine tertiaire (-NR'-) où R' est un alkyle comprenant moins de cino atomes de carbone. Ra, Rb, Rd et Rd sont des substituants identiques ou différents choisis dans un groupe constitué par un acide carboxylique (-COOH; ou son sel et par un amide (-CO-NH2 et -CO-NHR', où R' est un alkyle comprenant moins de cinq atomes de carbone. Ln est le terbium, le dysprosium, le samarium ou l'europium. Z1, z2, Z3 et/ou Z4 sont des groupes méthyle, éthyle, i-propyle, n-propyle, n-butyle, sec-butyle, t-butyle, méthoxy, éthoxy, i-propoxy, n-propoxy ou tert-butoxy. Le substituant Z5 est un groupe carboxyméthoxy. L'invention concerne aussi un réactif de marquage de formule (II) qui est adéquat pour le marquage de substances bioactives sur la surface d'un support solide : I~ ~I Â N r R R R R (II) dans laquelle R est -COOR" ou -CONHR", où R" est un radical alkyle, phényle ou benzyle de 1 à 4 atomes de carbone, le phényle ou benzyle étant substitué ou non substitué, Z1 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, z2 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z3 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z4 est un groupe donneur d'électrons, r"~ Z5 est un substituant qui contient un groupe ester d'acide carboxylique, ester d'acide p:-losphorique, acide sulfonique ou ester d'acide sulfonique, X est un lieur formé d'une à dix parties dont chacune est choisie dans un groupe constitué par des radicaux phényle, alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, éthynediyle (-C=C-), éthènediyle (-C=C-), éther (-0-), thioéther (-S-), amide (-CO-NH-, -CO-NR'-, -NH-CO-et - NR'-CO-), carbonyle (-CO-), ester (-COO- et -O0C-), disulfure (-SS-), sulfonamide (-SO2-NH-; -NH-SO2-, -NR'-SO2- et -SO2-NR'-), sulfone (-SO2-), phosphate (-0-P02-O-), diaza (-N=N-) et amine tertiaire (-NR'-), où R' est un alkyle comprenant moins de cinq atomes de carbone, A est un groupe réactif de liaison à la substance bioactive, choisi dans un groupe constitué par un acide carboxylique ou son sel, un halogénure d'acide, un ester ou un résidu acide aminé -CH(NHR2)R3, où R2 est un groupe protecteur transitoire et R3 est un acide carboxylique ou son sel, un halogénure d'acide ou un ester actif, ou bien A est -E-O-PZ-0-R4, où un atome d'oxygène est remplacé facultativement par un atome de soufre, Z est le chlore ou NR5R6, R9 est un groupe protecteur, R5 et R6 sont des groupes alkyle, E est absent ou est un radical d'une base purine ou pyrimidine lié à l'atome d'oxygène i) soit par le biais de la chaîne hydrocarbonée substituée par un groupe hydroxyéthyle protégé, ii) soit par le biais d'un noyau furarie ou pyrane ou de leurs dérivés modifiés permettant la synthèse d'un oligonucléotide. Le groupe R" est de préférence un méthyle, éthyle, tert-butyle, allyle ou benzyle. Lorsque le substituant Z5 contient des esters d'acide carboxyliques, un substituant avantageux est -OCH2C00-t-Bu, -OCH2COOEt, -OCH2COOMe ou -OCH2COOCH2Ph. Le lanthanide Ln est de préférence le terbium, le dysprosium, l'europium ou le samarium. Des lanthanides particulièrement avantageux sont le teroium et le dysprosium. Les groupes donneurs d'électrons Z1, Z2, Z3 et/ou Z4 sont de préférence des groupes alkyle linéaires ou ramifiés tels que les méthyle, éthyle, n--propyle, i-propyle, n-butyle, sec-butyle, t-butyle ou des groupes alcoxy tels que méthoxy, éthoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, sec-butoxy, t-butoxy. D'autres groupes tels que des groupes hydroxy, des groupes amino, des groupes carboxamido, des groupes acide phosphorique et leurs esters, des groupes acide carboxylique et leurs esters ou des groupes acide sulfonique et leurs esters peuvent aussi être rattachés aux groupes alkyle et alcoxy. Lorsque le substituant Z5 contient un groupe acide carboxylique, un substituant avantageux est un groupe carboxyméthoxy. L'ester d'acide carboxylique R est de préférence un ester de méthyle, d'éthyle, d'allyle, de benzyle ou de tert-butyle. Lorsque le groupe A tel que défini ci-dessus est 5 un halogénure d'acide, l'halogénure le plus préféré est un chlorure. Le groupe protecteur transitoire R2 préféré est un groupe fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), nitrobenzène- sulfonyle (Ns), tert-butoxycarbonyle (Boc) ou 1,1- 10 dioxobenzo[b]thiophén-2-ylméthyloxycarbonyle (Bsmoc). Lorsque R3 est un ester actif d'un acide carboxylique, cet ester est de préférence le N-hydroxysuccinimide, le p-nitrophénol ou le pentafluorophénol. Lorsque R3 est un halogénure d'un acide 15 carboxylique, cet halogénure est de préférence un chlorure ou un fluorure. Le groupe protecteur R4 est de préférence un groupe cyanoéthyle. Les groupes alkyle R5 et R6 sont de préférence des 20 groupes isopropyle. Lorsque A est -E-O-PZ-O-R4, il est de préférence choisi parmi les groupes 9 DMTrO DMTrO 0 (1-Pr)2 NP.OruCN 0 (, Pr)2 NOivC o 0 (i Pr)2N"P'Or~CN DMTrO 1 o N,i'-1 JCHa ON /ù( O OM7ro DMTr 0 DMTrO DMTrO O CN (i Pr)ZN.P.O/CCN (i Pr)2N"PRO--/CN (i-Pr)2Nk-0,.`-,CN (i-Pr)N 0"-- dans lesquels - représente le site de liaison du lieur X et DTMr est un groupe diméthoxytrityle. La molécule bioactive à marquer est par exemple un oligopeptide, un oligonucléotide, un polypeptide, un polynucléotide, une protéine, un oligosaccharide, un polysaccharide, un phospholipide, un PNA, un LNA, un anticorps, un haptène, un médicament, une molécule qui se lie à un récepteur, ou une lectine. L'invention est illustrée au moyen de la partie expérimentale non limitative ci-dessous. L'invention est expliquée plus en détail au moyen des exemples suivants. Exemple 1. Préparation de chromophores La synthèse du composé la utilisé comme substance de départ est décrite dans la publication US 5 055 578 (colonne 14, ligne 35-47, composé 24 ; cf. le schéma VI, figure 6). Le composé lb a été préparé par le même procédé en utilisant du 2,6-diméthoxy-4-hydroxybenzaldéhyde comme substance de départ. Le o O~N N %~CH3 10 groupe hydroxy en position 4 des composés la et lb a été alkylé avec du bromoacétate de tert-butyle dans de l'acétonitrile en présence de carbonate de potassium. Les diesters 2a et 2b ont été réduits en diméthanols 3a et 3b avec du borohydrure de sodium, ainsi que décrit dans la publication [Acta Chem. Scand, 1988, B42, 373]. La bromation avec du tribromure de phosphore dans du DMF anhydre a donné les dihalogénures 4a et 4b. Ce procédé est décrit dans la publication [Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700]. OH R OMe BrCH2000-t-Bu ./ MeOOC N COOMe i a, b 2a,b O-t-Bu R -OMe a: R = H b: R = OMe Exemple 2. Préparation de chélates de terbium Les composés 4a et 4b ont été mis à réagir avec une quantité équivalente d'iminodiacétate de di-tertbutyle ainsi que décrit dans la publication de la demande de brevet américain 11/004 061 (cf. la synthèse du composé 24, page 15, chapitre [0101]). La réaction PBr3 11 des produits 5a et 5b avec de l'hexane-1,6-diamine ainsi que décrit dans la Sei. 12, 2006, 199], a donné 6b. L'enlèvement des groupes protecteurs à l'acide suivi du traitement au chlorure de terbium a donné les chélates 7a et 7b, qui ont été activés avec de l'anhydride iodoacétique pour donner les composés 8a et 8b. Une description détaillée du procédé se trouve dans la publication [Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278]. NHMMTr protégée par du MMTr, publication [J. Peptide les composés 6a et 4a,b ,-- K2CO3 MeCN H N 2. TbCI3 Anhydride iodoacétique X 1.TFA X ('''L--- Te (N,l 000'000- 6a.b 000-000- 6a X C l K2CO3 X N MeCN (NI Il N R 6a,b R R = COC-t-Bu Exemple 3. Préparation d'un réactif de marquage d'oligopeptide Le groupe MMTr a été enlevé du composé 6a par un traitement de courte durée à l'acide, ainsi que décrit dans la publication [Bioconjugate Chem. 2002, 13, 870]. Le groupe amino déprotégé a été mis à réagir avec du glutamate d'allyle protégé par Fmoc en utilisant du HATU comme catalyseur [Bioconjugate Chem. 2006, 17, 855]. Pour finir, la protection de l'allyle a été enlevée sous catalyse au palladium. NH2 Fmoc-Glu-OAJI HATUI DIPEA IN N 9 R R R R FmocHN 0 ü X X /I~ SO2Na ' /~N^i ~~N V NI 11 (N` R R lR B Pd(Ph3P)4 1% TFA HN OH X= 10 (N1 R R R = C00-t-Bu Exemple 4. Préparation d'un réactif de marquage d' oligonucléotide Le réactif de marquage d'oligonucléotide 15 a été préparé par le procédé décrit dans la publication [Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700]. En bref, la réaction du composé 4a avec de l'iminoacétate de mét:zyle a donné le composé 12, lequel a été mis à réagir avec de l'aminohexanol protégé par du MMTr dans de l'acétonitrile anhydre en présence de carbonate de potassium. Le groupe MMTr du composé 13 a été enlevé par un traitement de courte durée à l'acide puis le groupe hydroxy libre a été phosphitylé. OMMTr H N R R 4a K2CO3 McCN Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et 14 représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Chélate de formule (I) qui est adéquat pour marquer une substance bioactive en solution : i z2Z Zz Z5 Z3 t Z5 Z3 \ Z4 Z X ("1 Ra Rb Ln3+ Rd Rd (1) caractérisé en ce que A est un groupe réactif de liaison à une biomolécule choisi dans un groupe constitué par des radicaux isothiocyanate, bromacétamido, iodoacétamido, maléimide, 4,6-dichloro-1,3,5-triazinyl-2-amino, pyridyldithiol, thioester, aminooxy, azide, alcyne, hydrazide, amino, acide carboxylique, ester ou halogénure d'acide, Z1 est l'hydrogène ou un groupe donneur 15 d'électrons, Z2 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z3 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, 20 Z4 est un groupe donneur d'électrons, Z5 est un substituant qui contier.t un groupe acide carboxylique, un groupe acide phosphorique ou un groupe acide sulfonique,X est un lieur formé d'une à dix parties dont chacune est choisie dans un groupe constitué par des radicaux phényle, alkyle de 3 à 12 atomes de carbone, éthynediyle (-C°C-), éthènediyle (-C=C-), éther (-0-), thioéther (-S-), amide (-CO-NH-, -CO-NR'-, --NH-CO- et - NR'-CO-), carbonyle (-CO-), ester (-COO-et -OOC-), disulfure (-SS-), sulfonamide (-SO2-NH-, -NH-SO2-, -NR'-SO2- et -SO2-NR'-), sulfone (-SO2-), phosphate (-0- P02-0-), diaza (-N=N-) et amine tertiaire (--NR' -) où R' est un alkyle comprenant moins de cinq atomes de carbone, Ra, Rb, Rd et Rd sont identiques ou différents et sont choisis dans un groupe comprenant un acide carboxylique (-COOH) ou son sel et un amide (-CO-NH2 et -CO-NHR', où R' est un alkyle comprenant moins de cinq atomes de carbone. Ln est le terbium, le dysprosium, le samarium ou l'europium. 2. Chélate selon la revendication 1, caractérisé en ce que Z1, Z2, Z3 et/ou Z9 sont des groupes méthyle, éthyle, i-propyle, n-propyle, n-butyle, sec-butyle, t-butyle, méthoxy, éthoxy, i-propoxy, n--propoxy ou tert-butoxy. 3. Chélate selon la revendication 1, caractérisé 25 en ce que le substituant Z5 est un groupe carboxyméthoxy. 4. Réactif de marquage de formule (IIr), qui est adéquat pour marquer une substance bioact:ive sur la surface d'un support solide : 30caractérisé 17 en ce que À (1\1,1 R R R ROI) R est -COOR" ou -CONHR", où R" est un groupe alkyle, phényle ou benzyle de 1 à 4 atomes de carbone, le phényle ou benzyle étant substitué ou non substitué, Z1 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z2 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z3 est l'hydrogène ou un groupe donneur d'électrons, Z4 est un groupe donneur d'électrons, Z5 est un substituant qui contient un groupe ester d'acide carboxylique, acide sulfonique ou ester d'acide sulfonique, X est un lieur formé d'une à dix parties dont chacune est choisie dans un groupe constitué par les radicaux phényle, alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, éthynediyle (-C=C-), éthènediyle (-C=C-), éther (-O-), thioéther (-S-), amide (-CO-NH-, -CO-NR'-, -NH-CO- et -NR'-CO-), carbonyle (-CO-), ester (-COO- et -O0C-), disulfure (-SS-), sulfonamide (-SO2-NH-; -NH-SO2-, -NR'-SO2- et -SO2-NR'-), sulfone (-SO2-), phosphate (-0- P02-0-), diaza (-N=N-) et amine tertiaire (--NR' -) où R' 18 est un alkyle comprenant moins de cinq atomes de carbone, A est un groupe réactif de liaison à une biomolécule, choisi dans un groupe const:tué par un acide carboxylique ou son sel, un halogénure d'acide, un ester ou un résidu acide aminé -CH(NHR2)R3, où R2 est un groupe protecteur transitoire et R3 est un acide carboxylique ou son sel, un halogénure d'acide ou un ester actif, ou bien A est -E-O-PZ-O-R4, où un atome d'oxygène est remplacé facultativement 15 par un atome de soufre, Z est le chlore ou NR5R6, R4 est un groupe protecteur, R5 et R6 sont des groupes alkyle, E est absent ou est un radical d'une base 20 purine ou pyrimidine qui est rattaché à l'atome d'oxygène i) soit par le biais de la chaîne hydrocarbonée substituée par un groupe hydroxyéthyle protégé, ii) soit par un noyau furane ou pyrane ou par 25 leurs dérivés modifiés qui permettent la synthèse d'un oligonucléotide. 5. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que R" est un groupe tert-butyle, méthyle, éthyle, allyle ou benzyle. 19 6. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que le substituant Z5 est -OCH2COO-t-Bu, -OCH2COOEt, -OCH2COOMe ou -OCH2CO0CH2Ph. 7. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que Z1, Z2, Z3 et/ou Z4 sont des groupes méthyle, éthyle, i-propyle, n-propyle, n-butyle, sec-butyle, t-butyle, méthoxy, éthoxy, i-propoxy, n-propoxy ou tert-butoxy. 8. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que le groupe protecteur transitoire R2 est un groupe fluorénylméthoxycarbonvle (Fmoc), nitrobenzènesulfonyle (Ns), tert-butoxycarbonyle (Boc) ou 1-1-dioxobenzo[b]thiophén-2-ylméthyloxycarbonyle (Bsmoc). 9. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que le groupe protecteur R4 est un groupe cyanoéthyle. 10. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que les groupes alkyle R' et R6 sont 20 des groupes isopropyle. 11. Réactif de marquage selon la revendication 4, caractérisé en ce que A est -E-O-PZ-O-R4 et est choisi de préférence parmi les groupes20DMTrO 0 (1.Pr)3N. P.O~ vCN O P~ ~~CN (i-Pr).N~ OMTrO. 0 (i Pf)1N,P.O.~~CN 0MTrO O 0 N O O~N~O ~NiIYCH3 pl, v~ Otk ) N `~~CHs N rù\/ DMT Ô 1 DMTrO 0 OMTrO 0 DMTrb~ CN P. CN P. ^/CN (i-Pr)2N F',. CN O^~ (r•Pr)2N (j.Pr)zN 0~~ (1'Pr)2N, 0 dans lesquels - représente le site de liaison du lieur X et DTMr est un groupe diméthoxytrityle. 12. Réactif de marquage selon les revendications 4 à 11, caractérisé en ce que R" est un groupe méthyle, éthyle ou tert-butyle. 13. Chélate selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance bioactive est un oligopeptide, un oligonucléotide, un polypeptide, un polynucléotide, une protéine, un oligosaccharide, un polysaccharide, un phospholipide, un PNA, un LNA, un anticorps, un haptène, un médicament, une molécule qui se lie à un récepteur, ou une lectine. 14. Réactif de marquage selon les revendications 4 à 11, caractérisé en ce que la substance bioactive est un oligopeptide, un oligonucléotide, un polypeptide, un polynucléotide, une protéine, un oligosaccharide, un polysaccharide, un phospholipide, un PNA, un LNA, un anticorps, un haptène, un médicament, une nolécule qui se lie à un récepteur, ou une lectine.