FR 2891744 A1 20070413 FR 0510205 A 20051006 L'invention concerne la chimioprophylaxie du paludisme. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à l'association de deux molécules connues séparément pour leur activité antipaludique. Les parasites responsables du paludisme sont des hématozoaires du genre Plasmodium. Ils se divisent en 4 espèces dont la plus dangereuse et qui peut entraîner le décès est Plasmodium falciparum, suivie de Plasmodium vivax et de deux espèces rares que sont Plasmodium malariae et Plasmodium ovale. L'extension de la chimiorésistance de Plasmodium falciparum dans la plupart des pays tropicaux est une préoccupation majeure pour les pays du Sud et pour les voyageurs se rendant en zone d'endémie palustre. Pour les armées appelées à intervenir régulièrement sur des théâtres extérieurs, la chimioprophylaxie actuellement en vigueur montre une efficacité limitée. L'efficacité de la méfloquine est obérée par un défaut d'observance lié à de nombreux effets adverses digestifs et 20 neuropsychiatriques. La doxycycline, actuellement recommandée pour les militaires en opération dans les pays d'Afrique intertropicale, est bien tolérée, mais son efficacité est limitée par sa courte durée de vie qui est inférieure à 36 heures. 25 La chloroquine présente peu d'effets indésirables mais elle est peu utilisée en raison de son manque d'efficacité dans les zones de multi-résistance, dont l'Asie. La résistance croissante aux différentes molécules antipaludiques utilisées amène à rechercher de nouvelles 30 associations. Une meilleure connaissance du Plasmodium falciparum et de son comportement au sein de la cellule parasitée ont permis d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. On associe plusieurs molécules ayant des cibles cellulaires différentes et/ou une synergie d'action. Les cibles thérapeutiques sont essentiellement représentées par la vacuole digestive de Plasmodium falciparum et le cytoplasme qui comporte deux organites essentiels, les mitochondries et l'apicoplaste. La vacuole digestive est le siège de la digestion de l'hémoglobine et de la cristallisation de l'hème. L'apicoplaste, récemment identifié chez P.falciparum, serait le siège de nombreuses voies métaboliques essentielles à la survie du parasite. Il interviendrait aussi sur la réplication et la transcription de l'ADN. Les dérivés quinoléiques, tels que les amino-4-quinoléines comme la chloroquine et les amino-alcools comme la quinine et l'halofantrine, agissent sur la vacuole nutritive en interférant avec l'utilisation de l'hémoglobine. Les inhibiteurs des acides nucléiques ou antimétabolites, bloquent la division du noyau du parasite. Ce proupe comprend les antifolates, les naphtoquinones et les antibiotiques. Les antifolates, comme le proguanil, agissent au niveau de la voie de synthèse des folates qui sont essentiels à la biosynthèse des acides nucléiques. Les naphtoquinones, comme l'atovaquone, sont des inhibiteurs puissants des fonctions mitochondriales. Les antibiotiques appartenant, notamment, à la classe des tétracyclines comme la doxycycline ou à la classe des macrolides, comme la clindamycine, peuvent inhiber la synthèse protéique par inhibition de certaines fonctions de l'apicoplaste. L'association de l'atovaquone et du proguanil, récemment commercialisée, présente un coût élevé, induit de fréquents effets indésirables digestifs et facilite l'apparition de gènes de résistance au cycloguanil, principal métabolite du proguanil. D'autres associations de molécules ont été essayées mais elles sont onéreuses. Cependant, les données récentes montrent une remontée de la sensibilité de souches plasmodiales à la chloroquine dans de nombreux pays d'Afrique subsaharienne. Cette amélioration est en grande partie liée à la baisse de l'utilisation de cette molécule depuis plusieurs années. On a combiné la chloroquine au proguanil mais cette association est limitée par l'émergence de gènes de 10 résistance au cycloguanil. La chloroquine a été associée à la clindamycine et à la doxycycline. Une 'ère étude au Gabon mentionnée par Kremsner PG, Wildling E, et al. dans Am J Trop Med Hyg 1994;50:790-795 montre que 15 l'association doxycycline/chloroquine est moins efficace (75% de guérison et 25% de recrudescence) qu'un traitement par halofantrine (100% de guérison et 0% de recrudescence) ou par clindamycine/chloroquine (97% de guérison et 3% de recrudescence). L'halofantrine doit, cependant, être utilisée 20 avec précaution, en raison de possibles effets cardiaques. Une autre étude effectuée en Indonésie, par Taylor WR, Widj aj a H, Richie T . L et al., Am J Trop Med Hyg 2001;64:223-228 montre que ces deux molécules utilisées en association sont plus efficaces que chacune d'elles utilisée isolément 25 dans le traitement du paludisme à P.falciparum non compliqué. Cette étude, réalisée sur un échantillon de 85 patients, indique que 91% des patients traités par l'association chloroquine/doxycycline sont sensibles à ce traitement, contre 65% pour la doxycycline seule et seulement 20ô pour la 30 chloroquine seule. Vis-à-vis de P vivax, l'association est efficace à 71%, contre 33% pour la doxycycline seule et 29% pour la chloroquine seule. Les études précitées concernant le traitement du paludisme avec l'association chloroquine-doxycycline n'ont porté que sur des échantillons réduits de populations. De plus, l'efficacité d'un traitement curatif ne garantit pas celle du même traitement administré à titre préventif, étant donné que la prophylaxie suppose une administration à posologie plus faible et sur une plus longue période. On a donc cherché une prophylaxie antipaludique présentant un bon rapport efficacité/tolérance, simple et peu onéreuse. On a eu l'idée d'associer la chloroquine à la doxycycline, non pas pour le traitement antipaludique, comme précédemment, mais pour une prophylaxie antipaludique. La chloroquine et la doxycycline sont associées dans une même forme galénique. De préférence, la chloroquine est utilisée sous forme de sulfate de chloroquine et la doxycycline sous forme de monohydrate de doxycycline. Pour la simplicité de la mise en oeuvre, l'association de la chloroquine et de la doxycycline se présente sous la forme 20 d'un comprimé unique. Avantageusement, le comprimé contient 100mg de chloroquine base et 100mg de doxycycline base. A titre d'excipients, on utilise trois composés : un agent liant comme excipient majoritaire, associé à un agent 25 lubrifiant et à un agent d'écoulement. L'excipient majoritaire est de la cellulose microcristalline, connue sous la dénomination commerciale AVICEL pH 302, l'agent lubrifiant est du stéarate de magnésium et l'agent d'écoulement est de la silice colloïdale, connue sous la 30 dénomination commerciale AEROSIL 200. La chloroquine est une amino-4 quinoléine dont le site d'action est la vacuole digestive du parasite. Elle s'accumule dans la vacuole des plasmodies et modifie le pH vacuolaire qui est maintenu acide à l'état basal. Elle inhibe ainsi la digestion de l'hémoglobine dans la vacuole. Toutefois, étant une base faible, la chloroquine n'est pas efficace contre les souches possédant un pH très acide et qui peuvent devenir, de ce fait, chloroquino-résistantes. La doxycycline est un antibiotique de la classe des tétracyclines qui agit sur l'apicoplaste de Plasmodium falciparum. La combinaison de la chloroquine et de la doxycycline met à profit leur association additive, afin d'améliorer leur efficacité thérapeutique et de retarder l'apparition d'une résistance à chacun des constituants. Le mode d'action de chacun d'eux est indépendant et leurs cibles biochimiques intraparasitaires sont différentes. Leur durée de demi-vie sont de 10 à 30 jours pour la chloroquine et 19 heures pour la doxycycline. De plus, si les souches de P.falciparum ne sont pas résistantes à la chloroquine, l'association assure une 20 protection complémentaire de 3 à 4 semaines. Cette association est également plus efficace vis-à-vis des rechutes plasmodiales à P. vivax du fait d'une action probable de la doxycycline sur les stades hépatocytaires de cette variété plasmodiale. 25 Exemple de réalisation d'une formulation : Plusieurs écueils ont dû être surmontés pour la fabrication de cette formulation. 30 Le recours à une gélule biocompartimentée était interdit, en raison de la toxicité oesophagienne de la doxycycline. Il fallait donc recourir à une association fixe délivrée en comprimé. La réalisation d'une association fixe de ces deux principes actifs nécessitait l'élaboration d'une formule galénique spécifique permettant d'obtenir un comprimé dont la taille et la forme permettent une prise quotidienne au cours d'une période prolongée liée à la durée d'exposition au risque palustre. Cette mise au point galénique a été dans le processus de fabrication particulièrement difficile à obtenir car il fallait empêcher la tendance au collage des deux composants lors de la phase de compression. La forme galénique retenue pour l'étude de bioéquivalence est un comprimé de 12mm de diamètre et de 16mm de rayon de courbure. Ce comprimé contient 100mg en base de sulfate de chloroquine base, 100mg en base de monohydrate de doxycycline, et, à titre d'excipients, un complément de l'Avicel PH 302, du stéarate de magnésium et de l'Aérosil 200. On réalise une étude de bioéquivalence afin de démontrer que les éléments pharmacocinétiques de l'administration des deux principes actifs associés dans un même comprimé sont équivalents à ceux obtenus lors de l'administration isolée de chloroquine et de doxycycline. L'évaluation de l'efficacité et de la tolérance de l'association chloroquine-doxycycline versus doxycycline seule en chimioprophylaxie du paludisme est réalisée sur un échantillon de 1100 militaires français, hommes ou femmes, âgés de 18 ans ou plus, effectuant une mission d'une durée inférieure ou égale à 6 mois en zone de transmission du paludisme. A la suite des évènements politiques de Côte d'Ivoire, une recrudescence du paludisme a été observée chez des militaires théoriquement sous chimioprophylaxie par doxycycline. A ce jour, 59 militaires ont déclaré un paludisme à leur retour en France. Les doxycyclinémies plasmatiques ont été réalisées par chromatographie liquide à haute performance (HLPC). Trente quatre prélèvements correspondent à des paludismes déclarés dans les 28 jours après le retour et, donc, à la période pendant laquelle la prise journalière de doxycycline est de rigueur. Sur 34 sujets, 41% ont une doxycyclinémie nulle ; 29,5% ont une doxycyclinémie inférieure au seuil minimum accepté pour un sujet sous chimioprophylaxie à 100mg par jour ; et, seuls 10 sujets ont une concentration compatible avec un suivi régulier de la prophylaxie. La doxycycline a une demi-vie plasmatique courte, de 16 à 22h. Après la dernière prise, en 36 heures, la concentration plasmatique est inférieure à 0,6 g/ml, seuil défini comme protecteur . En 4 jours, elle est voisine de 0 g/ml, contrairement à la chloroquine qui perdure plus d'un mois après son arrêt. D'autre part, 16 de ces prélèvements ont pu être testés avec succès en chimiosensibilité in vitro. Aucun ne semble présenter une diminution de sensibilité à la doxycycline (seuil de 30 M) et seulement 6 (soit 38%) sont résistants in vitro à la chloroquine. Il ne semble pas y avoir eu une diminution de l'activité de la doxycycline due à un phénomène de résistance, mais plutôt un problème d'observance. Pour servir de prophylaxie relais, lors de l'oubli occasionnel ou de l'arrêt de la chimioprophylaxie par doxycycline, il paraît donc intéressant d'associer à cette dernière une molécule de demi-vie plasmatique plus longue, comme la chloroquine. Il n'existe, dans la littérature, aucune étude ayant évalué l'activité in vitro de l'association chloroquine-doxycycline en prophylaxie ou en thérapeutique. Les données de la surveillance épidémiologique des deux dernières années montrent que le taux d'incidence du paludisme chez les militaires français au Gabon et en Côte d'Ivoire variait entre 5 et 9 cas pour 100 hommes.année . A partir de ces données , le nombre de sujets nécessaires pour l'étude d'efficacité/tolérance de doxycyclinechloroquine versus doxycycline seule est estimé à 948 personnes.année, en prenant un taux d'incidence de 10 personnes.année et un risque de paludisme d'un sujet sous chloroquine-doxycycline par rapport à un sujet sous doxycycline seule de 5% Pour la comparaison de la tolérance, dans une étude récente, la proportion de sujets présentant au moins un effet indésirable sous monohydrate de doxycycline à la dose de 100mg/jour était évaluée à 33% pour une prise d'une durée de 6 semaines environ. On peut distinguer deux types d'effets indésirables : • Les effets bénins, dont le taux de prévalence peut être élevé, pour lesquels l'effectif choisi doit permettre de montrer une variation de l'ordre de 10% de ce taux, • Les effets graves, dont le taux de prévalence est plus faible, pour lesquels l'effectif choisi doit permettre d'en montrer de faibles variations, de l'ordre de 3%. Le nombre de 950 sujets inclus semble pertinent pour répondre à cet objectif avec une puissance de 80%. Les dosages inopinés réalisés chez les militaires en mission outre-mer ont montré une prévalence de non observants de 15%. Pour cette raison, le nombre de sujets à inclure dans l'étude a été fixé à 1100. Les sujets sont divisés en deux groupes. Les sujets des deux groupes prennent un comprimé de 100mg/j de monohydrate de doxycycline. Dans le groupe doxycycline seule, les sujets prennent un comprimé de placebo de chloroquine 100mg inséré dans une gélule, à raison d'une gélule par jour. Dans le groupe chloroquine-doxycycline, la chloroquine est prise sous forme d'un comprimé de nivaquine inséré dans une gélule, à raison d'une gélule par jour. L'espace entre le comprimé et la gélule est comblé par du lactose pour éviter un effet dit grelot du comprimé placé dans la gélule. Afin de maintenir l'aveugle en cas d'ouverture de la gélule par les sujets inclus dans l'étude, le placebo de chloroquine est rendu amer par l'utilisation de benzoate de denatonium connu sous la dénomination de bitrex . Dans les deux bras de l'étude, les sujets prennent un comprimé de doxycycline et une gélule (nivaquine ou placebo) par jour. La prise de ces médicaments débute le jour du départ en zone de transmission du paludisme et est poursuivie jusqu'à 4 semaines après le retour de zone de transmission. L'efficacité clinique est évaluée par le taux d'incidence du 20 paludisme dans chacun de deux groupes de l'étude. Un cas de paludisme est retenu par toute manifestation pathologique et confirmation biologique par au moins l'un des résultats suivants : présence de Plasmodium sur un frottis sanguin, test QBC positif, recherche d'HRP2 positive. 25 Les critères d'évaluation de la tolérance sont définis par la proportion de sujets ayant présenté : - au moins un événement indésirable quel qu'il soit, - au moins un événement indésirable neuropsychiatrique (troubles du sommeil, agitation, anxiété, confusion) 30 -au moins un événement indésirable gastro-intestinal (diarrhées, vomissements, douleurs ou brûlures d'estomac) - des maux de tête, une vision floue, des bourdonnements d'oreille, - au moins un événement indésirable cutané (rougeurs, coup de soleil , démangeaisons) -au moins un événement indésirable grave (nécessitant une admission à l'infirmerie ou à l'hôpital, décès), - au moins un événement indésirable ayant entraîné un arrêt de chimioprophylaxie. On prend en compte les évènements indésirables rapportés par 10 les patients et ceux signalés par un médecin. L'évaluation de la tolérance est réalisée au moyen de trois indicateurs . - mesure de l'observance déclarée dans les carnets de surveillance, 15 -validation de l'observance déclarée par le dosage sanguin des antipaludiques au 2èm,e mois de suivi, - récupération des piluliers au moment où ils doivent être théoriquement vides (et décompte des comprimés restants). L'exposition au paludisme est mesurée par le dosage des 20 anticorps dirigés contre les formes pré-érythrocytaires de plasmodies sur des prélèvements sanguins effectués l'un avant le départ, l'autre un mois après le retour de zone de transmission. Les analyses portent sur la recherche dans le serum des 25 réponses anticorps (IgG totaux et IgM) dirigées contre les peptides synthétiques dérivés d'antigènes de stades préérythrocytaires (CSP, LSA1, LSA3, LSA5 et SALSA) par la technique ELISA. Le suivi des sujets s'arrête 4 semaines après le retour en 30 métropole. Le choix de cette date de fin de suivi est dicté par plusieurs points : - le suivi doit concerner toute la période de prise de la chimioprophylaxie par les sujets effectuant un séjour de courte durée, -la possibilité de détecter des effets indésirables survenant 5 après 4 mois de prise de chimioprophylaxie, - la possibilité de mettre en évidence une meilleure efficacité de l'association chloroquine- doxycycline par rapport à la doxycycline seule en cas d'oublis de la chimioprophylaxie. En effet, l'observance est moins bonne 10 après le retour de la zone de transmission du paludisme, période pendant laquelle le sujet doit poursuivre sa prophylaxie pendant au moins 4 semaines. 15 REVENDICATIONS 1-Association pour application à la chimioprophylaxie du paludisme de deux molécules connues séparément pour leur activité antipaludique, caractérisée en ce que les deux molécules antipaludiques sont la chloroquine et la doxycycline. 2-Association selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chloroquine et la doxycycline sont présentes dans une même forme galénique. 3-Association selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chloroquine est utilisée sous forme de sulfate de chloroquine et la doxycycline sous forme de monohydrate de doxycycline. 4-Association selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un comprimé unique. 5-Association selon la revendication 4, caractérisée en ce 20 que le comprimé contient 100mg de chloroquine base et 100mg de doxycycline base. 6-Association selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'excipient majoritaire est un liant associé à un agent 25 lubrifiant et à un agent d'écoulement. 7-Association selon la revendication 6, caractérisée en ce que le liant est constitué par de la cellulose 15microcristalline à haute densité connue sous la dénomination commerciale Avicel PH 302. 8-Association selon la revendication 6, caractérisée en ce 5 que l'agent lubrifiant est du stéarate de magnésium. 9-Association selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'agent d'écoulement est de la silice colloïdale connue sous la dénomination commerciale Aérosil 200.