FR 2885809 A1 20061124 FR 0504980 A 20050518 MEDICAMENT ANTI-STEATOHEPATIQUE A BASE DE LAMINARINE OU D'OLIGOLAMINARINES L'invention concerne un médicament à base de laminarine, ou d'oligolaminarines, propre au traitement de la stéatose hépatique dite alcoolique, c'est-à-dire provoquée par l'éthylisme. Cette stéatose particulière se traduit par une infiltration lipidique dégénérative du foie, autrement dit par une accumulation pathologique de triglycérides dans les hépatocytes qui évoluerait vers une composante inflammatoire, toxique pour le foie. La stéatose hépatique alcoolique qui ne peut être combattue que par le sevrage du malade, évolue par la cirrhose vers une issue fatale. Le but de l'invention est, surtout, de donner au monde médical un moyen de lutter contre cette maladie. Or, il a été constaté que la quantité d'une cytokine particulière, dénommée TNF-a (Tumor Necrosis Factor- a) augmentait dans le sérum et dans le foie des malades atteints de stéatose hépatique alcoolique ; cette cytokine est produite par les monocytes ; elle serait responsable des altérations des hépatocytes qui, par ailleurs, sont déjà fragilisés par l'accumulation pathologique de triglycérides. Il a également été constaté que chez les malades atteints de stéatose hépatique alcoolique, le rapport de la teneur du sérum en ALT (alanine aminotransferase) et en AST (aspartate aminotransferase), autrement dit ALT/AST, augmentait, traduisant la souffrance du foie qui est reflétée par la teneur du sérum en ALT. Le raisonnement qui est à la base de l'invention était donc, notamment, de trouver un moyen permettant de diminuer d'une part la teneur du sérum des malades en TNF- a et d'autre part la valeur du rapport ALT/AST. Et il est du mérite de la Société Demanderesse d'avoir trouvé que, de façon surprenante et inattendue, l'administration au malade, notamment par la voie orale, d'une quantité efficace de beta -1,3-glucanes connus, s'agissant de la laminarine, notamment sous sa forme soluble et des oligolaminarines, permettait d'agir, dans le sens d'une diminution, sur les deux facteurs rappelés ci-dessus à savoir la concentration en TNF- a et le rapport ALT/AST, tout en augmentant le nombre de cellules de Kupffer. L'invention a donc pour objet l'utilisation de la laminarine, de préférence sous sa forme soluble ou d'oligolaminarines, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la stéatose hépatique alcoolique. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet l'utilisation de la laminarine, ou d'oligolaminarines, pour la préparation d'un médicament pour l'administration par voie orale destiné au traitement de la stéatose hépatique alcoolique, ledit médicament étant administré au patient en une quantité suffisante pour apporter par jour à l'organisme une quantité de laminarine ou d'oligolaminarines, de 2 à 21 mg de préférence de 6 à 15 mg par kg de poids du corps. Avant de donner la description des travaux qui ont permis à la Société Demanderesse de parvenir à l'invention, il est rappelé que par le terme laminarine on désigne des mélanges de polysaccharides du type beta -1,3glucane, extraits des algues brunes et dont le poids moléculaire est d'environ 2 500 à environ 6 000. Les oligolaminarines sont, quant à elles un mélange d'oligo saccharides de type p-glucan issu de l'hydrolyse de la laminarine caractérisé par un degré de polymérisation entre 2 et 10, c'est à dire un poids moléculaire compris entre 350 et 2000. La laminarine est constituée d'une chaîne principale linéaire de 15 à 35 unités glucopyranose réunies par des liaisons acétaliques beta -1,3, cette chaîne principale portant une faible proportion de ramifications. Le degré de polymérisation moyen est proche de 25. La laminarine se présente sous une forme soluble et sous une forme insoluble. Pour l'extraire des algues brunes et pour séparer en tant que de besoin les formes solubles et insolubles de la laminarine on peut se reporter notamment à la demande de brevet internationale WO 03/045 414 de la Société Demanderesse, publiée le 5 juin 2003. La laminarine particulière qui a été utilisée dans le cadre des travaux décrits ci-après et qui ont permis de parvenir à l'invention, avait un poids moléculaire de 4500, un degré de polymérisation moyen de 25, et était consitituée essentiellement par des polysaccharides de degrés de polymérisation allant de 20 à 30. Elle se présentait sous la forme d'une poudre blanc cassé, sans odeur et sans saveur. Les travaux expérimentaux dont il a été question ci-dessus ont permis de montrer que la laminarine administrée notamment par voie orale exerçait un effet protecteur à l'égard des répercussions sur l'organisme d'un choc endotoxique. En raison de ces résultats, on peut raisonnablement penser que la laminarine exerce un effet immuno-stimulant sur des cellules immunocompétentes telles que les macrophages et les cellules NK ("natural killer"). Dans le cadre des travaux en question,le choc endotoxique créé dans les organismes soumis aux expériences, a été provoqué par l'administration de lipopolysaccharides ou LPS dont l'effet s'apparente, comme connu, à une attaque bactérienne. Les animaux sélectionnés pour les susdits travaux étaient des rats mâles Wistar Han (Harlem, Pays-Bas). Les expériences ont été effectuées sur deux groupes de huit rats chacun. Les rats de l'un des deux groupes -- "groupe contrôle" -- avaient à leur disposition "ad libitum" une nourriture standard de marque A04 (UAR, France) ; les rats de l'autre groupe avaient à leur disposition la même nourriture mais complétée en la susdite laminarine, commercialisée sous la marque "Dectinan" ; dans une première phase et pendant quatre jours (- 4 à 1), la nourriture était enrichie à 5% en poids en Dectinan, puis à 10% en poids dans une deuxième phase de 21 jours (jours 0 à 21) ; ce deuxième groupe e rats est désigné par "groupe Dectinan". C'est le 21ème jour qu'a été provoqué sur les rats des deux groupes le choc endotoxique par injection intrapéritonéale de LPS en une quantité correspondant à 10mg par kg de poids du corps. Aux jours 22 et 23, les rats ont été privés de nourriture et d'eau ; ils ont été sacrifiés au jour 24. On a étudié les paramètres suivants : Tableau I la consommation en eau et en nourriture l'évolution du poids corporel le bilan lipidique et glucidique la température rectale le nombre de globules blancs les médiateurs inflammatoires (PGE2 ou prostaglandine E2 et TNF-a sériques) les marqueurs histologiques des macrophages résidents du foie c'est-à-dire les cellules de Kupffer (ED-2 et/ou activité peroxydase) les marqueurs de toxicité du traitement LPS (activités ALT, AST et LDH sériques ; histologie du foie, de la rate, du thymus et des poumons) la fermentation caeco-colique (poids des fèces et prolifération caecale) Dans le tableau 1 ci-après, on identifie les jours auxquels il est procédé aux différents prélèvements et mesures Plus particulièrement, on a procédé aux déterminations suivantes :a) Avant l'injection de LPS poids corporel poids des fèces humides et après lyophilisation (récoltés durant 24 h) poids de la diète et de l'eau de boisson prise de sang de la veine caudale : dosage des triglycérides et du glucose b) Après l'injection de LPS (aux heures 0-2-4-6-8 et 24) température rectale prise de sang dans la veine caudale : dosage des triglycérides, du glucose, du PGE2 , du TNF-a, des acides gras libres, des activités ALT, AST et LDH (lactase deshydrogenase) c) Au moment du sacrifice : sang de la veine porte : dosage des acides gras libres sang de la veine cave : détermination de la formule sanguine (comptage cellulaire, hématocrite et hémoglobine) et dosage des acides gras libres, des triglycérides, du PGE2 , du TNF-a, des activités ALT, AST et LDH dans le sérum. foie : poids, congélation de morceaux pour les études histologiques (hématoxyline-éosine, détection de cellules de Kupffer via l'activité peroxydase et l'antigène ED-2) rate : poids et conservation de morceaux dans le formol pour les études histologiques (hématoxyline-éosine) caecum : poids du caecum plein et du caecum vide thymus et poumons : morceaux conservés dans le formol pour une étude histologique (hématoxyline-éosine) Les résultats enregistrés ont été soumis à un traitement statistique. A cet égard, les valeurs mentionnées plus loin représentent la moyenne ESM (Ecart Standart Moyen). Les résultats obtenus avant l'administration de LPS et au moment du sacrifice ont été analysés avec le test t de student (décrit dans : Appareils et Méthodes en Biochimie de Pierre Kamoun - 3ème édition - médecine sciences Flammarion 1987) entre les 2 groupes en utilisant le programme EXCELL ( décrit dans More Excell html +intro java +cd Auteur(s) GOTTLEBER - 01-2000). Les études cinétiques des différents paramètres mesurés après l'injection de LPS ont été traitées par une analyse ANOVA à 2 voies : analyse de variance, décrite dans for the Behavorial Sciences Researcher de Rudolph N.Cardinal publié, par les éditions LAWRENCE, via le programme SPSS (décrit dans Traitement de données avec SPSS pour Windows (édition 8.0, 9.0) Auteur(s) : OUELLET Fernando, BAILLARGEON Gérald Date de parution: 01-2000. Une transformation logarithmique des valeurs individuelles a été réalisée pour les paramètres TNF-a et PGE2 avant le traitement statistique. Les différences sont considérées statistiquement significatives lorsque p Une semaine après leur arrivée, les rats avaient un poids moyen de 136 + 1 g et on été répartis de façon randomisée en 2 groupes de 8 animaux : le groupe contrôle et le groupe Dectinan . La prise de poids corporel ainsi que les consommations totales en eau et en nourriture du premier jour de traitement jusqu'au jour de l'injection de LPS sont indiquées dans le tableau 1. Le régime alimentaire n'a aucun effet sur ces 3 paramètres, ce qui est une preuve de l'absence de toxicité de la laminarine. Les données enregistrées ont été réunies dans le tableau Il ci-après : Tableau II. Prise de poids et consommation n = 8 . p > 0,05 test t de student Des prises de sang hebdomadaires ont été effectuées afin de suivre l'évolution de la glycémie et de la triglycéridémie au cours du traitement alimentaire. Le régime enrichi en Dectinan diminue significativement la glycémie et la triglycéridémie au bout de 25 jours de traitement (4 jours à 5% et 21 jours à 10%) ainsi qu'il résulte respectivement des figures 1 et 2 qui illustrent l'évolution de la glycémie et de la triglycéridémie au cours du traitement Les fèces de 24 heures ont été récoltées et pesées 1 fois par semaine. Ainsi qu'il résulte du tableau montré à la figure 3, le régime enrichi en Dectinan augmente la masse fécale dès la première semaine de traitement à 10%. La perte d'eau dans les fèces est également plus importante ; à la troisième semaine d'administration de nourriture enrichie en Dectinan à 10%, le pourcentage d'eau des fèces est de 24.7 1.4% alors qu'il est de 17.8 + 1.5% pour le groupe contrôle (*p Le traitement préalable pendant 25 jours avec le Dectinan mélangé à la nourriture empêche, ou pour le moins aménuise, les effets métaboliques résultant de l'inflammation aiguë générée par le LPS. Autrement dit le Dectinan aménuise l'hypothermie, l'hypertriglycéridémie et l'hyperglycémie des premières heures qui suivent l'injection de LPS ainsi qu'il résulte des courbes apparaissant sur les graphiques des figures 4 (hypothermie), 5 (hypertriglycéridémie) et 6 (hyperglycémie). En d'autres termes, l'administration d'une nourriture enrichie en Dectinan protège le foie contre les effets toxiques liés à l'inflammation aiguë, mimée par l'injection au LPS, un phénomène qui va de pair avec une modulation des cellules immunitaires du foie. Par ailleurs, l'administration de cette nourriture agit contre l'augmentation du marqueur spécifique d'une souffrance hépatique, ce marqueur étant constitué par l'activité sérique de l'alanine aminotransférase (ALT) ; elle corrige également d'autres paramètres sériques qui peuvent refléter les altérations tissulaires dans plusieurs organes, dont le foie, à savoir les activités aspartate aminotransférase (AST) et lactate déhydrogénase (LDH). Les résultats enregistrés se traduisent par les courbes montrées aux figures 7 (évolution de l'AST), 8 (évolution du LDH) et 9 (évolution de l'ALT). On a également mesuré la concentration dans le sérum (en pg/ml) - de la cytokine TNF-a aux temps 2 heures, 4 heures, 6 heures, 8 heures et 24 heures après l'administration de LPS. - de la prostaglandine PGE2 aux temps 2 heures et 24 heures après l'administration de LPS. Les résultats sont reportés respectivement sur les graphiques des figures 10 (TNF-a) et 11 (PGE2). On note que le TNF-a n'est pas détectable au temps 0 heure en raison de l'absence de stimulus inflammatoire. On note par ailleurs que la présence de Dectinan dans la nourriture diminue le taux de TNF-a et de PGE2 dans le sérum des rats soumis au choc endotoxique. Les rats ont été mis à jeun après l'administration de LPS afin d'éviter des problèmes d'interprétation liés à l'effet anorexigène de ce traitement. Après le sacrifice, on a procédé aux différentes pesées dont les résultats sont réunis dans le Tableau III. Tableau III. Poids corporel et poids des organes n = 7. p = 0,07 ; *p La perte de poids n'est pas significativement n'est pas modifiée par l'administration de la nourriture au Dectinan (25 2g versus 22 + 1 g ; rapporté au poids corporel). Le poids des animaux n'est pas différent entre les 2 groupes après 24 heures de jeûne. Le poids du foie augmente légèrement chez le groupe Dectinan avec une valeur p proche de la signification. Le régime enrichi en Dectinan@ induit une prolifération caecale importante comme en attestent les valeurs moyennes du poids du tissu caecal et du contenu caecal (3.2 0.32g pour le groupe Dectinan@ versus 2.15 0.24 g pour contrôles * p Il a également été procédé au comptage des globules rouges et blancs ainsi qu'aux mesures de différents paramètres sanguins qui ont été réalisées dans les prélèvements de sang au niveau de la veine cave. Les résultats sont réunis dans le Tableau IV. Tableau IV. Formule sanguine n = 7.*p La détection de l'antigène membranaire ED2 par une technique immuno-histochimique permet la détection spécifique des cellules de Kupffer dans le foie. Ces cellules se situent surtout au niveau des espaces portes ; elles sont plus rondes et gonflées 24 heures après l'administration de LPS. Afin d'affiner l'observation des coupes de foie, une approche quantitative a été réalisée : 3 champs de 10 x 10 carréscontenant au moins 3 vaisseaux appartenant à un espace porte- ont été sélectionnés par coupe de foie afin de réaliser un comptage des cellules ED2- positives. Le prétraitement avec une diète enrichie en Dectinan augmente le nombre de macrophages hépatiques (259 + 19 cellules ED2 +/ champ versus 217 14 cellules ED2 +/champ, n=6; p= 0.1, test t de student) ; ces macrophages résidents du foie épurent le foie des lipopolysaccharides circulants.Quand la valeur du rat 8 (représentée par un carré blanc) anormalement basse, appartenant au groupe Dectinan@ n'est pas reprise dans la moyenne, la différence est significative. Le résultat des susdites mesures est illustré par la figure 12 qui montre la quantification des cellules de Kupffer par le moyen de la détection de ED2 dans les coupes de foie On sait que l'enzyme peroxydase est présente au sein des macrophages (tels que les cellules de Kupffer), des neutrophiles et des éosinophiles. L'administration de LPS augmente le nombre de cellules positives dans le foie car des cellules immunitaires (neutrophiles) sont recrutées. Le régime supplémenté en Dectinan semble diminuer le nombre de cellules positives. L'analyse histologique après coloration à l'éosine et à l'hématoxyline révèle l'architecture des tissus ainsi que les cellules en souffrance ou les foyers de nécrose. Au niveau du foie les altérations, principalement des foyers nécrotiques, liées à l'injection de LPS ne sont pratiquement pas visibles, tant au niveau du groupe Dectinan@ qu'au niveau du groupe contrôle ; on note que les altérations biochimiques (principalement l'augmentation de l'ALT) sont en général plus précoces et ne se traduisent pas nécessairement par des altérations au niveau du tissu hépatique.Le poumon présente des oedèmes typiquement liés à l'état inflammatoire tandis que le thymus et la rate révèlent des lésions nécrotiques L'ensemble des résultats qui précèdent traduit l'effet protecteur du Dectinan vis-à-vis de l'augmentation des activités AST, LDH et ALT dans le sérum. On observe que la toxicité du LPS est moindre en raison de l'effet protecteur ; elle est corrélée à une moindre sécrétion de TNF-a qui est une cytokine proinflammatoire. On observe également une diminution des concentrations de PGE2, vingt-quatre heures après le stimulus inflammatoire. L'hypothermie constitue une manifestation précoce après l'administration d'une dose importante de LPS. Le TNF-a est en fait considéré comme signal "cryogénique" impliqué dans le maintien d'une hypothermie ; ce phénomène est plus prononcé chez les rats du groupe contrôle qui ont, en l'occurrence des taux de TNF-a plus élevés que ceux du groupe Dectinan . Le choc endotoxique réalisé par l'administration de LPS produit également une hyperglycémie transitoire, due en partie à une glycogénolyse hépatique intense et suivie par une diminution progressive de la glycémie, résultant de l'utilisation du glucose par les tissus périphériques et en particulier par les cellules immunitaires. L'hyperglycémie transitoire étant moins importante chez les rats du groupe Dectinan ., la glycogénolyse hépatique pourrait être évoquée comme cible métabolique potentielle. L'administration de fortes doses de LPS induit une hypertriglycéridémie que l'on retrouve dans les deux groupes d'animaux. Les taux de triglycérides sériques sont systématiquement inférieurs après une diète enrichie en Dectinan mais les variations de triglycérides dues à l'injection de LPS sont similaires. Une baisse des taux de triglycérides dans le sang, en dehors du stimulus inflammatoire, constitue un résultat très intéressant. L'étude histologique de l'antigène ED2 met en évidence une augmentation du nombre des cellules de Kupffer sous le régime enrichi en Dectinan ; il pourrait s'agir soit d'un recrutement de cellules souches issues de la moëlle, soit d'une prolifération intrahépatique de cellules de Kupffer existantes. Quant à l'étude histologique de la peroxydase endogène, qui résulte de l'activité des cellules de Kupffer et des cellules immunitaires recrutées lors d'un état inflammatoire, elle semble être moins importante après une diète enrichie en Dectinan . Par ailleurs, il est intéressant de constater que le nombre de monocytes circulants est moins élevé dans le groupe Dectinan que dans le groupe contrôle après l'administration de LPS. En conclusion, il est intéressant de constater qu'une administration de nourriture enrichie en Dectinan permet de diminuer l'inflammation liée au LPS, avec des conséquences favorables sur les enzymes d'origine hépatique, et sur le recrutement du nombre de cellules immunitaires dans le foie, ce phénomène allant de pair avec une augmentation du nombre de macrophages hépatiques. Le médicament obtenu par l'utilisation conforme à l'invention de la laminarine ou d'oligolaminarines peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de sachets ou encore par exemple sous une forme liquide, notamment d'une solution buvable. Exemple 1 : Comprimés Comprimés nus de 450mg à base de Dectinan : Leur formule est comme suit : Les constituants sont tamisés, mélangés puis comprimés sous forme de lingots. Ceux-ci sont ensuite introduits dans un broyeur qui les transforme en granulés de taille convenant à la phase de compression du comprimé final. Les comprimés peuvent être commercialisés sous forme nue, pelliculée ou dragéifiée. Ils peuvent être conditionnés en pilulier ou en plaquettes thermoformées de 15 ou 20 unités. La posologie est de 2 à 4 comprimés par jour, en 2 prises au cours des repas ; à consommer par cures de 15 jours. Exemple 2 : Gélules Gélules d'origine végétale ou marine de 363 mg à base de Dectinan@ : Leur formule est comme suit pour 288 mg de poudre : Ces gélules peuvent être conditionnées en pilulier ou en plaquettes thermoformées de 15 ou 20 unités. La posologie est de 2 à 4 gélules par jour, en 2 prises au cours des repas : à consommer par cures de 15 jours. Exemple 3 : Sachets Sachets doses de 1 g à base de Dectinan@ : Leur formule est comme suit : Un litre d'une solution aqueuse contenant 22.5 g de Dectinan est mélangée avec 27.5g de maltodextrines. Puis les autres constituants sont incorporés. La solution ainsi obtenue est ensuite atomisée puis la poudre granulée. La poudre est ensuite séchée à 60[deg]C pendant une nuit de manière à obtenir une matière sèche inférieure à 3%. Le conditionnement est réalisé ensuite dans des sachets en aluminium, de taille 60 x 30mm contenant 1 g de poudre. La posologie est de 2 à 4 sachets par jour, en 2 prises au cours des repas ; à consommer par cures de 15 jours. Exemple 4 : Solution buvable Cette solution buvable peut être conditionnée en unidoses de 10 ml ou en flacon de 100 ml. La posologie est de 2 à 4 doses de 10 ml ou 2 à 4 cuillères à soupe par jour, en 2 prises au cours des repas ; à consommer par cures de 15 jours. REVENDICATIONS 1. Utilisation de la laminarine, de préférence sous sa forme soluble ou d' oligolaminarines, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la stéatose hépatique alcoolique. 2. Utilisation de la laminarine, ou d'oligolaminarines, pour la préparation d'un médicament pour l'administration par voie orale destiné au traitement de la stéatose hépatique alcoolique, ledit médicament étant administré au patient en une quantité suffisante pour apporter par jour à l'organisme une quantité de laminarine ou d'oligolaminarines, de 2 à 21 mg de préférence de 6 à 15 mg par kg de poids du corps.