FR 2886298 A1 20061201 FR 0505219 A 20050524 ANTICORPS OU FRAGMENT D'ANTICORPS COUPLE A UN AGENT IMMUNOGENE La présente invention concerne le domaine de l'immunologie, et a pour objet un nouveau composé apte à induire au moins une réponse immunitaire chez un mammifère. Un tel composé est appelé composé immunogène. La présente invention concerne également un procédé pour l'obtention d'un tel composé immunogène. Enfin, elle concerne l'utilisation de ce nouveau composé immunogène dans une composition pharmaceutique, notamment pour le traitement des cancers. Il existe actuellement une quinzaine d'anticorps monoclonaux thérapeutiques utilisés dans des pathologies aussi diverses que les cancers, le rejet de greffe, les maladies infectieuses, ou le traitement de pathologies inflammatoires ou allergiques. Le Rituximab a été le premier anticorps monoclonal approuvé par la FDA (Foods and Drugs Administration) pour le traitement des lymphomes (DEC pharmaceuticals). Cet anticorps chimérique est dirigé contre une molécule cible très spécifique des lymphocytes B, l'antigène CD20 qui est exprimé en grande quantité à la surface des lymphocytes pré-B et des lymphocytes B matures mais est absent des cellules souches hématopoïétiques et des plasmocytes. Cet anticorps est formé des régions variables d'un anticorps murin anti-CD20 fusionné avec des fragments constants Fc d'une chaîne lourde humaine IgG. L'efficacité et la bonne tolérance de cet anticorps en font un outil thérapeutique de choix dans le traitement des lymphomes. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques, notamment le Rituximab induisent une activité cytotoxique du fait de leur fixation à la surface de cellules tumorales cibles. Cette activité cytotoxique se traduit par une activation du système du complément (CDC) et/ou l'induction d'une cytotoxicité anticorps-dépendante (ADCC). Pour augmenter leur activité cytotoxique dans le cadre de thérapies antitumorales, les anticorps monoclonaux peuvent être couplés à des agents actifs, par exemple des radio-isotopes ou à des toxines. Contrairement aux anticorps monoclonaux non couplés qui induisent une réponse cytotoxique du seul fait de leur fixation à la surface des cellules cibles, les anticorps couplés ont essentiellement un rôle de vecteur d'agents actifs. Les anticorps radio-marqués ont un effet cytolytique sur les cellules tumorales essentiellement par l'émission radioactive du radio-isotope. Leur mécanisme d'action réside d'une part dans la reconnaissance spécifique des cellules tumorales ciblées par l'anticorps et d'autre part dans l'irradiation des cellules tumorales par le radio-isotope véhiculé par l'anticorps. Les immunotoxines correspondent à des anticorps couplés à des toxines ou à des sous-unités de celles-ci. Les toxines sont non spécifiques et d'une extrême puissance, létales pour les cellules à des concentrations très faibles. Après liaison à la surface de la cellule cible, le complexe anticorps-toxine est internalisé dans les cellules. C'est en inhibant la synthèse protéique indispensable à la survie des cellules que les immunotoxines détruisent les cellules cibles. Si des études cliniques ont montré des résultats positifs, le développement des traitements anti-tumoraux par des radio-isotopes ou des immunotoxines se heurtent à deux problèmes majeurs: une faible efficacité et une toxicité non spécifique et difficilement contrôlable. La faible efficacité des anticorps monoclonaux couplés à des radio-isotopes ou des toxines pourrait être due au fait que leur mécanisme d'action est essentiellement indépendant du système immunitaire. En effet, la destruction des cellules cibles n'est pas principalement induite par le recrutement du système immunitaire mais par l'irradiation des cellules ou par l'inhibition de la synthèse protéique. A ce jour, seuls des anticorps ou des fragments d'anticorps ont été 25 utilisés comme molécules circulantes pour véhiculer les radio-isotopes ou les toxines vers les cellules tumorales cibles. Un objectif de l'invention est de véhiculer, à des fins thérapeutiques, au moins un agent immunogène vers des cellules cibles, dans le but d'induire ou d'amplifier une réponse immunitaire spécifique contre ces cellules cibles. Selon l'invention, l'agent immunogène peut être véhiculé par toute molécule circulante appropriée, à laquelle il est couplé, ayant au moins un site de fixation spécifique à la cellule cible. Par molécule circulante , on entend toute molécule capable de circuler dans le système sanguin et/ou lymphatique, de diffuser à travers la barrière hématoencephalique et/ou les organes. A titre d'exemples de molécules circulantes appropriées aux fins de l'invention, on peut citer notamment les anticorps, les fragments d'anticorps, dont notamment les fragments Fab. En particulier, un objectif de la présente invention est d'amplifier l'activité cytotoxique spécifique des anticorps monoclonaux ou des fragments d'anticorps en les couplant à des agents immunogènes aptes à induire au moins une réponse immunitaire chez un mammifère. Les expressions agents immunogènes ou agents aptes à induire au moins une réponse immunitaire sont utilisés dans la présente demande de façon interchangeable. Les agents immunogènes préférés de l'invention sont des oligosaccharides comprenant au moins un épitope, c'est-à-dire au moins un motif capable d'être reconnu par au moins un anticorps et/ou une protéine soluble du complément humain et/ou par au moins un récepteur exprimé à la surface de cellules effectrices du système immunitaire. A titre d'exemples d'oligosaccharides appropriées aux fins de l'invention, on peut citer notamment, les oligosaccharides comprenant l'épitope GalaGal, plus préférentiellement des disaccharides, notamment le a-Dgalactopyranosyl-(1,3)-D-galactopyranose ou Gal-a(1-3)Gal ou des trisaccharides, notamment le Gal-a(1-3)Ga1GlcNac. Cet épitope GalaGal a été identifié comme étant responsable du rejet hyperaigu de xénogreffe qui est observé dès les premières minutes de la transplantation. Le rejet est dû à la reconnaissance, par des anticorps humains naturels circulants de type IgG et IgM, de l'épitope présent à la surface des cellules de l'organe transplanté. Cet épitope est donc particulièrement toxique pour les cellules qui l'expriment puisque sa reconnaissance par les anticorps naturels humains active le système du complément et le recrutement de cellules effectrices, aboutissant à la lyse cellulaire. Dans le cadre de l'invention, des structures carbohydrates des groupes sanguins (A, B, lewis) peuvent être utilisées comme agents immunogènes. Egalement, des agents actifs dans le chimiotactisme des cellules effectrices du système immunitaire tels que les analogues du platelet activating factor peuvent également être utilisés comme agents immunogènes. Selon la présente invention, il est nécessaire de contrôler la toxicité de ces agents immunogènes, c'est-à-dire de dissimuler cette toxicité au système immunitaire jusqu'à la reconnaissance de la molécule cible par la molécule circulante à laquelle les agents immunogènes sont couplés. La toxicité des agents immunogènes conforme à l'invention est contrôlée de façon à être dirigée spécifiquement contre la cellule cible exprimant la molécule cible. Par molécule cible , on entend une molécule impliquée dans les maladies auto-immunes et/ou cancéreuses, dont notamment un antigène, un haptène, un récepteur, une protéine. La présente invention a donc pour objet un composé immunogène comprenant une molécule circulante ayant au moins un site de fixation à une molécule cible, ladite molécule circulante étant de préférence un anticorps, un anticorps monoclonal, un fragment d'anticorps, notamment un fragment Fab, une hormone, et au moins un agent apte à induire au moins une réponse immunitaire chez un mammifère, ledit agent étant masqué, de préférence par un motif clivable afin de contrôler sa toxicité non spécifique. Par agent immunogène masqué , on entend un agent apte à induire au moins une réponse immunitaire dont la toxicité non spécifique est contrôlée. L' agent immunogène masqué doit rester invisible pour le système tant que la molécule circulante à laquelle il est couplé, n'a pas reconnu la molécule cible. Avantageusement, l'agent immunogène selon l'invention est masqué par un motif clivable, de préférence un sucre, notamment un glucose. Par motif clivable , on entend toute molécule qui sous l'action d'une enzyme se détache de l'agent immunogène. Le motif clivable est couplé à l'agent immunogène de manière à masquer ledit agent au système immunitaire. Préférentiellement, le motif clivable est en position terminale de l'agent immunogène. Le clivage peut être réalisé par tout moyen approprié, notamment une enzyme ou en modifiant le pl-l. Lorsque le motif clivable est un glucose, le clivage sera de préférence réalisé grâce à une enzyme, notamment l'Acide-beta-glucosidase (GlucCerase). Suivant l'invention, le composé immunogène induit au moins une réponse immunitaire après reconnaissance de la molécule cible par ledit composé et clivage subséquent du motif clivable. Le clivage expose alors l'agent immunogène au système immunitaire. Une fois exposé, l'agent immunogène sera reconnu par des anticorps et/ou par des récepteurs sur des cellules immunocompétentes, ces derniers induisant alors au moins une réponse immunitaire, notamment une réponse de type CDC et/ou une réponse de type ADCC. L'intérêt thérapeutique du composé immunogène selon l'invention est qu'il est apte à induire au moins une réponse immunitaire spécifiquement dirigée contre une cellule exprimant une molécule cible afin de la détruire, notamment en induisant ou amplifiant une réponse de cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et/ou une réponse de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Par réponse de cytotoxicité dépendante du complément , on entend une réponse immunitaire impliquant le système du complément. Le système du complément est un ensemble de protéines du plasma dont l'activation en cascade (par la voie classique dans le cas d'anticorps), notamment les composants Cl, C2 et C4 et génère une C3-convertase. L'activation du complément permet entre autre la libération de molécules chimiotactiques et l'activation de cellules inflammatoires. La cytotoxicité dépendante du complément est une cascade de réactions enzymatiques comprenant une vingtaine de protéines. Ces protéines s'activent en une série de réactions de protéolyse en chaîne qui engendre une lyse par choc osmotique de la cellule ciblée (CDC) et produisant des peptides doués d'activités biologiques (CDCC) Par réponse de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps , on entend une réponse dans laquelle des cellules tueuses porteuses de récepteurs du Fc, notamment les cellules tueuses naturelles (NK) et les macrophages reconnaissent les cellules cibles recouvertes d'anticorps spécifiques. Selon un mode de réalisation particulier, le composé conforme à l'invention est un anticorps, de préférence un anticorps monoclonal couplé au motif 25 immunogène, qui est de préférence oligosaccharidique. Les anticorps ou immunoglobulines (Ig) sont composés de 2 chaînes lourdes identiques (chaînes H) et 2 chaînes légères (chaînes L) formant une structure en forme d'un Y stabilisé par des liaisons disulfures. Les extrémités des bras du Y contiennent des régions variables des chaînes lourdes et légères qui se lient à l'antigène. Les régions sont dites variables en raison de la grande différence de structure existant entre deux anticorps. C'est cette grande variabilité qui explique la capacité des anticorps à reconnaître divers antigènes. La base du Y correspond à la région constante et n'est pas impliquée dans la reconnaissance et la fixation de l'antigène. Cette région constante a des fonctions effectrices, et est notamment impliquée dans la fixation de l'anticorps à des récepteurs cellulaires et à la fixation du complément. Selon la structure de cette région Fc, les immunoglobulines (Ig) sont divisées en classes et en sous-classes. Il existe 5 classes d'immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD, certaines étant elles mêmes divisées en sous-classes IgG: IgGI, IgG2, IgG3 et IgG4. Ainsi, les immunoglobulines IgGI, IgG2, IgG3 et IgM sont capables d'activer le système du complément, tandis que les immunoglobulines IgGl et IgG3 semblent activer l'ADCC plus efficacement que les immunoglobulines IgG2 et IgG4. C'est l'étude des fragments obtenus après digestion d'enzymes protéolytiques sur les immunoglobulines qui a permis d'élucider les relations existant entre la structure et la fonction des anticorps. Le fragment d'anticorps utilisé comme molécule circulante dans l'invention est généralement obtenu après action d'enzymes protéolytiques, préférentiellement la pepsine ou la papaïne. La pepsine coupe généralement la molécule d'anticorps en dessous du ou des ponts disulfures qui relie les deux chaînes lourdes. Après action de la pepsine, le fragment (Fab')2 obtenu correspond aux deux fragments Fab reliés par un ou plusieurs ponts disulfures, et des produits de dégradation du fragment Fc. En revanche, sous l'action de la papaïne, la molécule d'anticorps est généralement scindée en trois fragments correspondant à deux fragments Fab et un fragment Fc. Chaque fragment Fab (ab pour antigen binding) est composé d'une chaîne légère et d'un fragment de la chaîne lourde. La propriété essentielle d'un fragment Fab est de se lier à un antigène. Le fragment Fc (c pour cristallizable) correspondant à la région constante est donc porteur des capacités effectrices de l'anticorps, notamment à fixer le composant Clq du complément (CDC) et les récepteurs Fc des cellules effectrices. Ainsi, les anticorps sont capables non seulement de reconnaître spécifiquement une molécule cible, notamment un antigène et de s'y lier par leur région variable (Fab), mais également d'activer le système du complément et de recruter des cellules immunocompétentes par leur région constante (Fc). Les anticorps sont caractérisés par leur plasticité moléculaire qui les rend capable de reconnaître les antigènes et de recruter les cellules effectrices. Le composé immunogène selon l'invention comprenant un anticorps et un agent immunogène, notamment un oligosaccharide, a une activité cytotoxique amplifiée par rapport à l'anticorps non couplé, qui se traduit par une augmentation de l'activation du système du complément et du recrutement des cellules effectrices impliquées dans l'ADCC. Selon un mode de réalisation particulier, la molécule circulante du composé immunogène de l'invention est un anticorps entier ou fragment d'anticorps, préférentiellement un fragment ayant un site de reconnaissance et de fixation à une molécule cible, plus préférentiellement un fragment Fab. Contrairement à un anticorps monoclonal de type IgG dont la taille moléculaire est approximativement de 160 kDa, un fragment d'anticorps Fab a un poids moléculaire approximatif de 50 kDa, et pourrait être efficace pour la diffusion du composé immunogène selon l'invention. L'utilisation d'un fragment d'anticorps Fab non couplé n'induit pas de réponse immunitaire. En effet, seul le fragment Fc a une fonction effectrice et est donc responsable de l'activation du système du complément et du recrutement des cellules effectrices impliquées dans l'ADCC. Cependant, selon l'invention et de manière surprenante, le couplage de l'agent immunogène sur le fragment Fab induit une activation du système du complément et un recrutement des cellules effectrices impliquées dans l'ADCC. Un avantage de ce mode de réalisation de l'invention est que les fragments d'anticorps Fab couplés selon l'invention deviennent alors capables d'induire de fortes réponses de types CDC et ADCC, tout en gardant leurs propriétés pharmacocinétiques avantageuses, en particulier la rapidité d'action et la diffusion du composé dans le système. Le composé immunogène de l'invention est susceptible d'être obtenu selon un procédé de préparation comprenant une réaction de couplage de la molécule circulante avec l'agent apte à induire au moins une réponse immunitaire. 30 Généralement, cette réaction de couplage sous-entend que la molécule circulante et l'agent à coupler possèdent des fonctions réactives naturellement présentes ou artificiellement créées. Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, par fonctions réactives , on désigne tout groupe fonctionnel capable de se lier par liaison covalente avec au moins un autre groupe fonctionnel. A titre d'exemples de fonctions réactives appropriées aux fins de l'invention, on peut citer notamment les groupes amino, thiol, hydroxyle, carboxyle, NHS. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, le composé et/ou l'agent doivent être modifiés afin de créer artificiellement au moins une fonction réactive avant l'étape de couplage. Par créer , on entend introduire une fonction réactive ou transformer un groupe naturellement présent en un groupe fonctionnel. Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, la molécule circulante et l'agent sont sous forme lyophilisée. Ils sont donc solubilisés avant d'être 15 utilisés pour la préparation du composé immunogène. La modification du composé est réalisée de préférence par addition d'un réactif permettant de créer artificiellement au moins une fonction réactive sur le composé. Le réactif est de préférence choisi parmi des réactifs disponibles commercialement, notamment le SATA (N-Succinimidyl-Sacetylthioacetate) ou le réactif de Traut. Ces deux réactifs permettent l'introduction de fonctions thiols (SH) libres. Lorsque la réaction de modification est terminée, le composé modifié est de préférence dialysé, plus préférentiellement à un seuil de coupure de 5 000 Da. La modification de l'agent apte à induire au moins une réponse immunitaire est de préférence une réaction de désacétylation permettant de mettre en évidence des groupements amines primaires sur l'agent. L'étape de désacétylation est réalisée, de préférence, par addition d'une solution de borohydrate de sodium, sous agitation. L'agent modifié peut être recueilli par ultrafiltration sur membrane, puis éventuellement être lyophilisé. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, les fonctions réactives présentes naturellement ou artificiellement créées sur la molécule circulante et l'agent sont complémentaires. Par complémentaires , on entend des fonctions réactives qui sont capables de créer des liaisons covalentes entre elles. L'étape de couplage est alors réalisée par la mise en réaction du composé et de l'agent dans des conditions qui permettront la création de liaisons covalentes entre des fonctions réactives complémentaires. Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, les fonctions réactives présentes naturellement ou artificiellement créées sur le composé ne sont pas complémentaires de celles présentes sur l'agent. Dans ce mode de réalisation, la réaction de couplage est réalisée de préférence en présence d'un lieur. Par lieur , on entend toute molécule ayant au moins une fonction réactive capable de former une liaison avec au moins une fonction réactive de la molécule circulante et au moins une fonction réactive capable de former une liaison avec au moins une fonction réactive de l'agent. Préférentiellement, le lieur est le sulfo SMCC comprenant une fonction réactive maléïmide réagissant spécifiquement avec les fonctions réactives thiols (SH) libres, de préférence créées sur la molécule circulante et une fonction réactive NHydroxySuccinimide (NHS) ester réagissant spécifiquement avec les amines primaires (NH2), de préférence créées sur l'agent. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la réaction de couplage comprend plusieurs étapes successives afin d'éviter que des liaisons non souhaitées ne se forment entre la molécule circulante et/ou l'agent et/ou le lieur. La réaction de couplage comprend préférentiellement les étapes successives suivantes: - une première étape de couplage de l'agent et du lieur, - une deuxième étape de couplage du composé et de l'agent préalablement couplé au lieur. Plus préférentiellement, l'agent préalablement couplé au lieur est présent en excès lors de la deuxième étape. La réaction de couplage, qu'elle comprenne une ou plusieurs étapes, est de préférence réalisée dans une solution saline standard dont le pH varie entre 7 et 8.5, notamment un tampon PBS, sous agitation, pendant une durée comprise entre 2h et 24 heures à température ambiante. Io Selon un mode de réalisation particulier, la solution comprenant le composé immunogène est de préférence ensuite dialysée, plus préférentiellement à un seuil de coupure de 10 000 Da, puis éventuellement lyophilisé. L'invention concerne l'utilisation d'un composé immunogène de l'invention pour induire et/ou amplifier une réponse de cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et/ou une réponse de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). L'invention concerne également l'utilisation d'un composé immunogène de l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter de façon appropriée soit les cancers, notamment le myélome, le cancer du sein, les lymphomes, soit les maladies auto-immunes notamment en ciblant un lymphocyte auto-réactif. L'invention concerne également l'utilisation d'une enzyme apte à cliver le motif clivable d'un agent immunogène d'un composé immunogène de l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'une enzyme, préférentiellement l'acide-beta-glucosidase (GlucCerase), plus préférentiellement le Cérézyme, apte à cliver un sucre, notamment le glucose, afin d'exposer l'agent immunogène au système immunitaire, induisant ainsi l'activation du système du complément et/ou le recrutement des cellules effectrices impliquées dans l'ADCC. L'invention concerne l'utilisation de l'acide-beta-glucosidase, préférentiellement le Cérézyme apte à cliver un sucre, de préférence un glucose, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter de façon appropriée soit les cancers, notamment le myélome, le cancer du sein, les lymphomes, soit les maladies auto-immunes. L'invention concerne encore la combinaison d'un composé immunogène selon l'invention et d'une enzyme préférentiellement l'acide-betaglucosidase, plus préférentiellement le Cérézyme apte à cliver le motif clivable, comme médicament(s) pour une utilisation séparée dans le temps en thérapie anti-cancéreuse. L'invention concerne également une méthode de traitement, notamment des cancers et des maladies auto-immunes comprenant l'administration à un mammifère, de préférence à l'homme en quantité efficace d'au moins un composé immunogène conforme à l'invention et d'une enzyme apte à cliver le motif clivable dudit composé immunogène, préférentiellement l'acidebeta-glucosidase, plus préférentiellement le Cérézyme. Le composé immunogène de l'invention et l'enzyme peuvent être administrés de façon simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps. Comme il a déjà été mentionné dans la présente demande, il est essentiel que le motif clivable permettant de masquer un agent immunogène du composé immunogène soit clivé après reconnaissance des cellules cibles par le composé immunogène. Par conséquent, l'enzyme apte à cliver le motif clivable devra être administrée après que le Fab couplé au xénoantigène a été reconnu et se soit fixé sur les cellules cibles. La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent; ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Fragmentation d'un anticorps Fab et Fc 20 mg d'un anticorps sont digérés par 0.5m1 de papaïne immobilisée (pierce) dans un tampon phosphate EDTA Nat (10mM, pH 7) en présence d'un catalyseur tel que la cystéine (10mM). La papaïne utilisée est immobilisée sur billes d'agarose afin de faciliter son élimination en fin de réaction enzymatique.Des cinétiques enzymatiques ont permis de déterminer un temps de digestion optimal de 24 heures. La réaction enzymatique est terminée par ajout de 3m1 de tampon Tris-HC1 (10mM, pH 7.5). La papaïne immobilisée sur billes d'agarose est séparée des différents fragments par une centrifugation de 10 minutes à 5000g. Ces fragments sont ensuite purifiés sur une colonne de protéine A puis concentrés par centricon dont le seuil de coupure de 5000 Da. Les fragments d'anticorps issus de la digestion enzymatique sont visualisés par électrophorèse SDS-PAGE en conditions dénaturantes. EXEMPLE 2: Modification d'un trisaccharide Gala-(1-3)Ga1G1cNAc Le trisaccharide est déacétylé afin de mettre en évidence des groupements amines (NH2) sur lesquels seront greffés des bras de liaison. Le trisaccharide, préférentiellement sous forme lyophilisée est solubilisé dans une solution d'hydroxyde de sodium (1M) contenant 1% de tétrahydroborate de sodium (NaBH4). Après 1 heure à 80 C, une solution d'acide acétique glacial puis de l'eau sont ajoutés au mélange réactionnel afin de neutraliser le NaBH4. Le trisaccharide désacétylé est ensuit purifié par exclusion stérique sur colonne P2 avec de l'eau milliQ comme éluant. Afin de vérifier sa capacité à être reconnu par des immunoglobulines, le trisaccharide désacétylé, un test d'immunoprécipitation sur gel d'agarose (Outcherlowny) est réalisé en utilisant du sérum humain normal. Sa capacité d'activation du système du complément est également vérifiée par un test de lyse des globules rouges de moutons activés, en sérum déficient en protéine C4 du complément. EXEMPLE 3: Préparation des fragments Fab pour le greffage Des fonctions thiols (SH) libres sont introduites sur des amines primaires des fragments Fab. Des réactifs disponibles commercialement tels le SATA (NSuccinimidyl-S-acetylthioacetate) ou le réactif de Traut peuvent être utilisés. Préférentiellement, deux fonctions thiols libres par molécule de Fab sont introduites. Ces fragments Fab modifiés sont ensuite dialysés (seuil de coupure 5000 Da) contre un tampon PBS pH 7.2 contenant 5mM d'EDTA. Un dosage des SH libres par réactif d'Ellman est réalisé [pierce ref: 22582]. EXEMPLE 4: Couplage du trisaccharide désacétylé sur les fragments Fab modifiés Le couplage du trisaccharide et des fragments Fab est réalisé en présence d'un lieur: le sulfo SMCC comprenant une fonction maléïmide réagissant spécifiquement avec les fonctions thiols libres des Fab et une fonction N- HydroxySuccinimide (NHS) ester réagissant spécifiquement avec les amines primaires du trisaccharide désacétylé. Afin d'éviter des réactions croisées entre les fonctions amines primaires du trisaccharide et ceux des fragments Fab, la réaction de couplage est 5 réalisée de la façon suivante: une solution de trisaccharide désacétylé est mis en réaction avec le sulfo SMCC dans un tampon PBS pH 8.5, pendant une durée de 2h, à température ambiante, Ce motif greffé est séparé du trisaccharide désacétylé et du 0 10 lieur non greffé sur colonne d'exclusion stérique P2. - le mélange réactionnel de l'étape précédente est mis en réaction avec les fragments Fab pendant 2h à température ambiante dans du PBS pH 7. 2,ce dernier étant en défaut par rapport au trisaccharide-sulfo SMCC, -une fois couplé, le composé immunogène Fab-Gal est dialysé 15 contre du tampon PBS pH 7,2 (seuil de coupure 10 000Da). La concentration en composé immunogène Fab-Gal est déterminée par absorbance à 280nm et par la méthode de Bradford (Kit Biorad). Immunoprécipitation sur gel d'agarose: méthode d' Outcherlony Cette technique est basée sur le fait que des protéines, et notamment des immunoglobulines sont capables de migrer plus ou moins rapidement dans un gel d'agarose (1% dans PBS pH 7.2). Les immunoglobulines immunoprécipitent lorsqu'elles reconnaissent l'antigène. Le complexe immun formé par une immunoglobuline et son antigène est visualisé après coloration au bleu de coomassie, par un arc de précipitation. En utilisant cette technique, il est possible de vérifier que les trisaccharides modifiés ou non sont effectivement reconnus par des immunoglobulines du sérum humain (sérum humain normal dilué au 1/50e dans du PBS et environ 50 g de Fab Gal versus Fab dans chaque puits) (cf. figure 1). 10 EXEMPLE 5: CHSO L'activation du système du complément dans un sérum humain normal (NHS) est déclenchée par l'introduction de globules rouges de mouton (EA) recouverts au préalable d'anticorps de lapin. En présence de sérum humain, les anticorps de lapin reconnaissent les globules rouges de mouton comme étrangers et déclenchent l'activation de la voie classique du complément. Cette activation entraîne la formation de la C3 convertase classique qui déclenche l'activation de la voie alterne. L'activation de ces deux voies aboutit à la formation du complexe final de lyse créant des pores dans la membrane cellulaire de la cellule cible à la surface des globules rouges. Ce complexe permet l'éclatement des globules rouges et la libération d'hémoglobine. L'activation du système du complément est mesurée dans ce système expérimental par dosage de la quantité d'hémoglobine libérée en absorbance à une longueur d'onde de 414nm. Dans ce test, l'activateur qui correspond aux globules rouges de mouton sert aussi de révélateur de l'activation grâce à l'hémoglobine libérée. La dilution du sérum humain est ajustée pour une quantité donnée de globules rouges, de façon à ce que 50% des cellules soient lysées. Dans un premier essai, une gamme de quantités croissantes (1.25, 2. 5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 10 g) de composé immunogène Fab-Gal tel que préparé dans l'exemple 4 est dilué au 1/100e dans du tampon VBS2+ pendant 30 min à 37 C. Le mélange est mis à en réaction avec les EA pendant 45min â 37 C. Si le composé immunogène Fab-Gal active le système du complément, il y aura consommation des protéines du complément et donc moins de lyse des EA par la suite. C'est ce que nous observons. Dans un deuxième essai, les composés immunogènes Fab-Gal sont ajoutés au NHS en même temps que les EA. Dans ce cas, l'activation du complément 5 entraînera une lyse cellulaire des EA comme notre témoin à 50%. Ce dernier test permet de déterminer l'activité anti-complémentaire du composé immunogène Fab-Gal. En effet, celui-ci n'inhibe pas le système du complément, lorsque tout est incubé en même temps, il n'y a pas moins de lyse des EA. CHSO sans incubation Expériences Sérum seul (Témoin) Fab Fab Gal 1 17 17 20 2 17 18 25 3 30 29 50 CHSO avec préincubation Expériences Sérum seul (Témoin) Fab Fab Gal 1 33 16 5 2 24 5 1 3 86 83 73 4 95 53 3 96 54 2 EXEMPLE 6: Activation de la voie classique du complément Pour compléter la démonstration que ces nouveaux composés immunogènes Fab-Gal ont une capacité à activer la voie classique du complément, des tests de lyse des EA en sérum déficient en une des protéines de la cascade: la protéine C4, ont été effectués. Ce test repose sur la capacité d'un sérum, en présence ou absence de concentrations croissantes de composés immunogènes Fab-Gal, à restaurer la capacité hémolytique d'un autre sérum déficient en protéine C4. Cette protéine est indispensable à l'activation de la voie classique du complément. Pour ce faire, des concentrations croissantes en composés immunogènes Fab-Gal sont incubées avec du "-N 10 k. j NHS pendant 45min à 37 C. Ensuite, le tout est ajouté à du sérum déficient en protéine C4 et à des EA pendant 45 min à 37 C. L'activation de la voie classique du complément dans le NHS entraînera la consommation des protéines de la cascade, notamment de la protéine C4. Cette dernière n'étant plus présente ni dans le NHS activé, ni dans le sérum déficient, il n'y aura plus de lyse des EA et par conséquent moins d'hémoglobine libérée. Les pourcentages d'activation de la voie classique du complément en fonction des concentrations de composés immunogènes Fab-Gal sont déterminés. 6.1. Résultat: Activation de la voie classique du système du complément par des fragments Fab seuls et le composé immunogène FabGal conforme à l'invention Activation nouveau Fab Gal revelation SH C4déf NHS 1/20 FabGal à 0,5mg/ml SHC4def 1/100 Préincubation Préincubation 1 2 3 4 5 6 7 NHS 1/20 15 15 15 15 15 15 15 activateur 0 5 10 20 5 10 20 Révélation DO DO DO DO % de %d'activation Essai 1 Essai 2 moyenne corrigée lyse T 0,422 0,411 0,4165 0,366 1 0,325 0,31 0,3175 0,267 100 0 2: Fab 0,298 0,291 0, 2945 0,244 91 9 3: Fab 0,282 0,286 0,284 0,233 87 13 4: Fab 0,27 0,271 0, 2705 0,220 82 18 5: Fab-Gal 0,244 0,236 0,24 0,189 71 29 6: Fab-Gal 0,164 0,147 0,1555 0,105 39 61 7: Fab-Gal 0,152 0,153 0, 1525 0,102 38 62 LO 0, 053 0,049 0,051 L100 0,397 0,403 0,4 0,349 Cet essai révèle que le pourcentage d'activation du complément est beaucoup plus élevé lorsque les fragments Fab sont couplés à des motifs immunogènes oligosaccharidiques. Fab Fab Fab Fab Gal Fab Gal Fab Gal 6.2. Résultat: Activation du complément en fonction de la concentration en corn immunogène Fab-Gal conforme à l'invention. Qté FabGal % activation % activation Moyenne EC essai 1 essai 23 Sur 2 essais 0 0 0 0 0 2,5 30 20 25 7,071067812 63 31 47 22,627417 6 69 54 61,5 10,60660172 7 81 64 72,5 12,02081528 8 100 84 92 11,3137085 9 100 93 96,5 4,949747468 100 89 94,5 7,778174593 100 100 100 0 10 15 Comme le démontre le graphe 1, le motif oligosaccharidique couplé aux fragments Fab permet une activation de la voie classique du système du complément. EXEMPLE 7: Tests d'inhibition de la prolifération cellulaire Ce test permet de déterminer la capacité des composés immunogènes Fab-Gal à inhiber la prolifération d'une lignée de cellules tumorales. Les modèles cellulaires utilisés au cours de cette étude sont les lignées cancéreuses Daudi (E. Klein and G. Klein, 1967)et Raji (R.J.V Pulvertaft, 1963). Les cellules sont ose cultivées en flasques de 50 cm3 ou 275 cm3 à une concentration variant de 3x105 à 1x106 cellules/ml. La lignée Daudi est cultivée dans un milieu RPMI supplémenté avec 1% de glutamine, 1% d'antibiotiques et 20% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) décomplémenté par chauffage à 56 C pendant 30mn. La technique utilisée est une technique de mesure de l'incorporation de thymidine t itiée dans le noyau des cellules qui se divisent. Les cellules sont donc incubées avec des concentrations croissantes de fragments Fab (témoin) et de composés immunogènes Fab-Gal pendant 24h, dans un milieu contenant 20% de NHS et de la thymidine radioactive (la thymidine étant une base de l'ADN) (1 l de thymidine par puits). Les cellules qui prolifèrent normalement vont incorporer de la thymidine radioactive dosable par un compteur à scintillation. Les cellules dont la prolifération cellulaire est affectée vont incorporer moins de thymidine radioactive. Les fragments Fab seuls ne permettent pas d'inhiber significativement la prolifération cellulaire alors que les composés immunogènes Fab-Gal de l'invention permettent d'inhiber la prolifération cellulaire. REVENDICATIONS, 1. Composé immunogène comprenant - une molécule circulante ayant au moins un site de fixation à une 5 molécule cible, ladite molécule circulante étant de préférence un anticorps, un anticorps monoclonal, un fragment d'anticorps, un fragment Fab, - et au moins un agent apte à induire au moins une réponse immunitaire chez un mammifère, ledit agent étant masqué par un motif clivable. 2. Composé immunogène selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le motif clivable est en position terminale de l'agent immunogène. 3. Composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé par le fait que le motif clivable est un sucre, de préférence un glucose. 4. Composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 15 1 à 3, caractérisé en ce que la molécule cible est un antigène, un haptène, un récepteur, une protéine. 5. Composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent apte à induire au moins une réponse immunitaire est un oligosaccharide, préférentiellement un oligosaccharide comprenant un épitope, GalaGal, plus préférentiellement des disaccharides, notamment le Gala(1-3)Gal ou des trisaccharides, notamment le Gala-(1-3) GalGlcNAc. 6. Méthode de préparation d'un composé immunogène comprenant le couplage d'une molécule circulante ayant au moins un site de fixation à une molécule cible, ladite molécule circulante étant de préférence un anticorps, un anticorps monoclonal, un fragment d'anticorps, un fragment Fab ou une hormone, avec au moins un agent immunogène masqué par un motif clivable, ledit couplage étant de préférence réalisé en présence d'un lieur. 7. Méthode de préparation d'un composé immunogène selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la molécule circulante est modifiée par un réactif choisi parmi le SATA (N-Succinimidyl-S-AcetylThioAcetate) ou le réactif de Traut. 8. Méthode de préparation d'un composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée par le fait que le lieur est le sulfo SMCC comprenant une fonction réactive maléïmide réagissant spécifiquement avec les fonctions réactives thiols (SH) libres, de préférence créées sur la molécule circulante et une fonction réactive NHydroxySuccinimide (NETS) ester réagissant spécifiquement avec les amines primaires (NH2), de préférence créées sur l'agent immunogène. 9. Utilisation d'un composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un médicament, notamment pour le 10 traitement du cancer ou des maladies auto-immunes. 10. Combinaison d'un composé immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et d'une enzyme, de préférence l'acidebetaglucosidase, plus préférentiellement le Cérézyme, ladite enzyme étant apte à cliver le motif clivable comme médicament(s) pour une utilisation en thérapie anti-cancéreuse.