FR 2889873 A1 20070223 FR 0508609 A 20050818 L'objet de l'invention concerne une méthode de détection qualitative et semi-quantitative rapide d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester par (1) dilution d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé dans ledit échantillon, (2) incubation de l'échantillon pour la mise en oeuvre d'une méthode immuno- enzymatique et (3) observation de la coloration obtenue. Selon un autre objet, l'invention concerne un kit pour la détection qualitative et semiquantitative d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester. Art antérieur Plusieurs méthodes immuno-enzymatiques ou immuno-chimiques ont été développées à ce jour afin de détecter la présence éventuelle de ligands dans des milieux. La méthode ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) consiste en la détection de ligands antigéniques au moyen d'anticorps spécifiques conjugués à une enzyme (phosphatase, peroxydase, etc.). La méthode RIA (Radiolmmuno Assay) consiste en le dosage d'un antigène par utilisation d'un antigène radioactif, l'antigène à doser déplaçant la liaison de l'antigène radioactif à l'anticorps en proportion de sa concentration. La méthode ARIS (Apoenzyme Reactivation Immunoassay System), décrite dans la demande de brevet français n 79 15951 en date du 21 juin 1979, consiste en la détection d'un ligand par utilisation d'un ligand conjugué à un groupement prosthétique et d'anticorps spécifiques, le ligand à doser déplaçant la liaison du conjugué à l'anticorps en proportion de sa concentration, le conjugué sous forme libre activant alors une apoenzyme produisant directement ou indirectement une réaction colorée. Ces méthodes sont mises en oeuvre, notamment, pour la détection de molécules présentes dans les milieux biologiques. A titre d'exemple, des méthodes ont été développées afin de détecter la concentration de la progestérone. La demande de brevet européen EP 0 671 006 en date du 26 novembre 1993 concerne une méthode ELISA pour la détection de la progestérone dans le lait de vache. La demande de brevet britannique GB 2 354 069 en date du 8 avril 1999 concerne une méthode de détection de la concentration de progestérone dans le lait de vache prélevé 4, 5 ou 6 jours après insémination par mise en oeuvre des méthodes ELISA ou RIA. A contrario, la méthode ARIS n'a pas été appliquée jusqu'à ce jour à la détection de la progestérone. Ces méthodes, dans leur mise en oeuvre actuelle, présentent de nombreux inconvénients. Elles nécessitent généralement la mise en oeuvre de plusieurs étapes et notamment des étapes d'incubation, de lavage et de révélation de la réaction. Cette mise en oeuvre nécessite souvent l'utilisation d'un équipement spécifique dans le cadre d'un laboratoire d'analyse, notamment pour la mesure de la radioactivité, pour la mesure de la réaction enzymatique ou pour la mesure de la réaction colorée. Enfin, ces méthodes ne peuvent être mises en oeuvre que par l'homme du métier. La mise en oeuvre actuelle de ces méthodes n'est donc pas adaptée à une détection simple, fiable et rapide d'un ligand dans un milieu. Objet de l'invention La présente invention résout les inconvénients inhérents à la mise en oeuvre des méthodes détaillées ci-dessus et est adaptée à la détection simple, fiable et rapide d'un ligand dans un milieu. Description de l'invention L'invention a pour objet une méthode de détection qualitative et semiquantitative rapide d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester par (1) dilution d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé dans ledit échantillon, (2) incubation de l'échantillon pour la mise en oeuvre d'une méthode immuno- enzymatique et (3) observation de la coloration obtenue. De façon particulièrement avantageuse, l'invention a pour objet ladite méthode de détection au cours de laquelle l'observation de la coloration obtenue est effectuée à l'oeil nu. Ladite méthode est simple et rapide d'utilisation en ce qu'elle ne nécessite pas une multitude d'étapes d'incubation et/ou de lavage et en ce qu'elle ne nécessite pas une expertise dans ce domaine technique pour la mettre en oeuvre. En effet, ladite méthode nécessite uniquement le mélange de l'échantillon du milieu à tester (dénommé ci-après l'échantillon) avec le les) milieu(x) réactionnel(s) lyophilisé(s), l'incubation du(des) mélange(s) et l'observation de la coloration obtenue, éventuellement à I'ceil nu. Cette utilisation rapide, simple et fiable de ladite méthode est rendue possible grâce à l'utilisation de milieux réactionnels préparés sous la forme de milieux réactionnels lyophilisés. Lesdits milieux réactionnels lyophilisés comprennent notamment les composés nécessaires à la mise en oeuvre de la méthode immuno-enzymatique (dénommés ci-après les composés réactionnels) et une matrice vectorielle comprenant au moins un composé servant de vecteur aux lo composés réactionnels (dénommé ci-après composé vecteur). Selon un mode particulier de réalisation, ledit milieu réactionnel lyophilisé est obtenu par (1) le mélange des composés réactionnels avec une solution matricielle comprenant au moins un composé vecteur, (2) la formation de milieux réactionnels solides par immersion de faibles volumes dudit mélange dans l'azote liquide et (3) la formation de milieux réactionnels lyophilisés par sublimation des milieux réactionnels solides par lyophilisation sous vide. Les milieux réactionnels lyophilisés, obtenus selon ledit procédé, sont des matrices solides de forme sphérique et présentent un diamètre de quelques millimètres et un poids de quelques microgrammes. Préférentiellement, leur diamètre est inférieur à 20 mm. Très préférentiellement, le diamètre est inférieur à 5 mm. Ces milieux réactionnels lyophilisés présentent une grande stabilité puisqu'ils peuvent être conservés plusieurs années à 4 C et plusieurs mois à température ambiante dans un environnement dépourvu de lumière et d'humidité. Préférentiellement, ces milieux sont stables, en l'absence de lumière et d'humidité, au minimum pendant 18 mois à 4 C et pendant 2 mois à température ambiante. Ces milieux se diluent complètement et rapidement dans un milieu liquide, notamment le milieu à tester. Préférentiellement, les milieux réactionnels lyophilisés se dissolvent dans l'échantillon de milieu à tester en moins de cinq minutes et, très préférentiellement, entre 10 et 30 secondes. Les propriétés de stabilité et de dissolution des milieux réactionnels lyophilisés sont étroitement liées à la nature et à la quantité des composés vecteurs utilisés. Avantageusement, lesdits composés vecteurs sont choisis de telle sorte qu'ils assurent une bonne stabilité des milieux réactionnels lyophilisés et qu'ils n'interfèrent pas sur la qualité et/ou la rapidité de la méthode immuno-enzymatique. Lesdits composés vecteur sont choisis en fonction du ligand à doser et des milieux à tester. Préférentiellement, les composés vecteurs sont choisis notamment parmi les composés glucidiques. Très préférentiellement, les composés glucidiques sont choisis parmi les sucres solubles simples ou complexes et notamment les monosaccharides (oses, aldoses, cétoses, glucose, etc.) et les polysaccharides (disaccharides, oligoholosides, hétérosides). Encore préférentiellement, les composés vecteurs sont le tréhalose, le dextrane, le mannitol et le sérum albumine bovin. Encore préférentiellement, les composés vecteurs correspondent de 65 à 95% en volume des milieux réactionnels lyophilisés. En effet, l'utilisation des composés vecteurs dans des proportions réduites peut être préférable afin de limiter les interactions des composés vecteurs avec les composés réactionnels et/ou les composés présents dans l'échantillon de milieu à tester. De manière particulière, la méthode immuno-enzymatique mise en oeuvre dans ladite méthode de détection est la méthode de réactivation d'une apoenzyme inactivée (ou méthode ARIS). Cette méthode comprend les étapes de mise en contact de l'échantillon dudit milieu à tester avec au moins un milieu réactionnel lyophilisé comprenant (1) un conjugué formé par liaison covalente d'un groupement prosthétique avec un ligand, (2) un anticorps monoclonal se liant de manière spécifique et compétitive au ligand à doser ou au conjugué et (3) une apoenzyme inactivée, activable par liaison avec le groupement prosthétique des conjugués non liés à un anticorps monoclonal; ladite apoenzyme activée catalysant de manière directe ou indirecte une réaction colorée proportionnelle à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester. Encore préférentiellement, l'anticorps monoclonal se lie de manière spécifique sur le ligand lié au conjugué. La méthode immuno-enzymatique de réactivation d'une apoenzyme inactivée est basée sur la compétition entre le ligand à doser et le ligand lié au conjugué (dénommé ci-après ligand conjugué) pour la liaison spécifique avec l'anticorps monoclonal. L'apoenzyme correspond à la partie protéique des holoenzymes qui assure la fixation du substrat et assure la spécificité de la réaction enzymatique. Le groupement prosthétique correspond à un cofacteur enzymatique non protéique qui se fixe de manière non covalente à l'apoenzyme, le groupement prosthétique est indispensable à la réaction enzymatique. En l'absence de fixation du groupement prosthétique à 1 o I'apoenzyme, ladite apoenzyme est sous forme inactivée (dénommée ci-après l'apoenzyme inactivée) et aucune réaction catalytique n'a lieu. A contrario, lorsque le groupement prosthétique est lié à l'apoenzyme, l'apoenzyme est activée (dénommée ci-après l'apoenzyme activée ou holoenzyme) et le substrat est catalysé. En outre, contrairement à la méthode ELISA par exemple, I'apoenzyme inactivée est sous forme libre et n'est donc pas conjuguée à d'autres molécules tels que des anticorps monoclonaux. Parmi les holoenzymes (groupement prosthétique), on peut citer la glucose oxydase (FAD). Le ligand correspond à tout type de molécule pouvant être reconnue spécifiquement par un anticorps monoclonal (dénommé ci-après le ligand à doser). Préférentiellement, ladite molécule est de petite taille. Dans le cas de milieux biologiques, il s'agit notamment d'haptènes, de peptides, d'oligopeptides ou de polypeptides de petite taille, de fragments de protéines, de glycoprotéines, de lipoprotéines et de stéroïdes. Ces ligands peuvent appartenir à différentes classes de molécules notamment les antigènes, les hormones, les vitamines, les métabolites, les antibiotiques. Ces molécules peuvent être endogènes ou exogènes. Les molécules exogènes peuvent être notamment des molécules médicamenteuses ou des molécules d'origine bactériennes, virales, parasitaires. Le conjugué comprend un groupement prosthétique lié directement ou indirectement au ligand ou à son analogue par une liaison covalente. La liaison covalente peut être obtenue par l'utilisation d'un composé intermédiaire lié au groupement prosthétique et au ligand. La liaison du groupement prosthétique au ligand n'altère pas, d'une part, la spécificité et l'affinité de la liaison entre le ligand et l'anticorps monoclonal et, d'autre part, la spécificité et l'affinité de la liaison non covalente entre le groupement prosthétique et I'apoenzyme. De manière alternative, le ligand à doser peut être le groupement prosthétique de l'apoenzyme. Dans cette hypothèse, le conjugué/ligand conjugué correspond au groupement prosthétique sous forme modifiée ou pas. L'anticorps monoclonal doit reconnaître avec spécificité et affinité le ligand à doser et le ligand conjugué. La reconnaissance du ligand conjugué par l'anticorps monoclonal induira généralement des modifications conformationnelles du conjugué et/ou un encombrement stérique empêchant la liaison entre le groupement prosthétique et l'apoenzyme inactivée. En outre, les anticorps ne sont pas fixés sur un support inerte, ils sont sous forme libre puisqu'ils ne sont pas conjugués à des molécules telles que des enzymes et ils ne participent pas directement à la réaction colorée. Lorsque le ligand conjugué est lié à l'anticorps, le groupement prosthétique du conjugué ne peut pas se lier de manière spécifique et non covalente à l'apoenzyme inactivée, ladite apoenzyme ne pouvant pas alors catalyser le substrat. Après dilution dudit au moins un milieu réactionnel lyophilisé dans l'échantillon de milieu à tester, le taux de liaison de l'anticorps monoclonal au ligand conjugué est d'autant plus faible que la quantité de ligand à doser dans l'échantillon est élevée. En corollaire, plus le taux de liaison de l'anticorps monoclonal au ligand conjugué est faible et plus l'activation de l'apoenzyme inactivée est élevée et plus la réaction colorée obtenue est intense. Préférentiellement, ladite réaction colorée est obtenue par catalyse d'au moins un substrat par l'apoenzyme activée pour donner au moins un réactif, ledit réactif étant nécessaire à l'activation d'une seconde enzyme dégradant un chromogène proportionnellement à la quantité de réactif formé et, indirectement, proportionnellement à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester. L'intensité de la réaction colorée (dénommée également la coloration) sera fonction de la quantité de chromogène catalysé par la seconde enzyme, la quantité de chromogène catalysé étant proportionnelle à la quantité de réactif produit par I'apoenzyme et la quantité de réactif produit étant directement corrélée au taux d'activation de l'apoenzyme et donc au taux de fixation du groupement prosthétique sur l'apoenzyme inactivée. Ledit chromogène peut être un chromogène non couplé ou un chromogène couplé à un co-facteur (dénommé ci-après le chromogène couplé). Dans le cas d'un chromogène couplé, la présence du cofacteur sera indispensable à la réaction catalysée par la seconde enzyme. 1 o Parmi les enzymes utilisables à titre de seconde enzyme, on peut citer les peroxydases. Parmi les chromogènes non couplés, on peut citer le tétraméthyle de benzidine (TMB) et le 2,2'-Azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique] (ATBS). Parmi les chromogènes couplés, on peut citer le 3,5dichloro-2- hydroxybenzene sulfonate (DHSA) couplé à de la 4-aminoantipyrine (4-AP), le 3-méthyl-2-benzothiazoline d'hydrochlorure d'Hydrazone (MBTH) couplé à de la diméthyl amino benzaldéhyde (DMAB), du MBTH couplé à de la DMAB et à de la 4-AP, de la DMAB couplée à de la 4-AP. La réaction colorée est obtenue par catalyse d'un chromogène non couplé ou couplé par une enzyme peroxydase en présence de peroxyde d'hydrogène produit par l'apoenzyme activée. La présence de peroxyde d'hydrogène est indispensable à la catalyse du chromogène par la peroxydase. En outre, ladite catalyse est proportionnelle à la quantité de peroxyde d'hydrogène produit et la coloration obtenue est donc proportionnelle à la quantité de chromogène catalysé et donc à la quantité de peroxyde d'hydrogène produit. La coloration obtenue est spécifique à chaque chromogène, couplé ou non, utilisé. Le DHSA couplé à de la 4-AP développe une coloration rosée à rouge. Le TMB développe une coloration bleue. L'ABTS développe une coloration verte. Le MBTH couplé à de la DMAB développe une coloration violette. Le MBTH couplé à de la DMAB et à de la 4-AP développe une coloration violette-rosée. Le DMAB couplé à de la 4-AP développe une coloration violette-rosée. La liaison du groupement prosthétique sur I'apoenzyme inactivée et donc l'activation de l'apoenzyme ne sont possibles que si le conjugué est sous forme libre. La liaison des anticorps aux ligands conjugués est fonction de la quantité de ligand à doser, lesdits anticorps présentant une grande spécificité et une affinité élevée tant pour le ligand à doser que pour le ligand conjugué. En l'absence de ligand à doser, les conjugués sont très majoritairement liés aux anticorps. Inversement, en présence d'une quantité élevée de ligand à doser, les conjugués sont très majoritairement sous forme libre. L'activation de I'apoenzyme est directement proportionnelle au ratio conjugué libre/conjugué lié et donc à la quantité de ligand à doser. Plus la quantité de ligand dans l'échantillon est élevée, plus le ratio conjugué libre/conjugué lié est élevé et plus la réaction colorée est intense. A contrario, plus la quantité de ligand dans l'échantillon est faible, moins le ratio conjugué libre/conjugué lié est élevé et plus la réaction colorée est faible. Encore préférentiellement, ledit milieu réactionnel lyophilisé comprend au moins un composé neutralisant. Les milieux à tester sont des milieux complexes comprenant un grand nombre de composés différents. Certains de ces composés peuvent interagir avec les composés réactionnels et/ou les composés vecteur et/ou le ligand à doser et/ou les produits des réactions enzymatiques. De telles interactions peuvent modifier la rapidité et la fiabilité de la méthode de détection. Pour limiter les effets de ces composés, il est préférable d'ajouter au milieu réactionnel lyophilisé des composés neutralisants. Il est possible de préparer les composés réactionnels dans un seul milieu réactionnel lyophilisé, mais préférentiellement, les composés réactionnels sont préparés dans au moins deux milieux réactionnels lyophilisés différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment l'apoenzyme inactivée, l'anticorps monoclonal, le cofacteur du chromogène, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment la seconde enzyme, le chromogène, le conjugué et éventuellement le substrat. Alternativement, les composés réactionnels sont préparés dans au moins deux milieux réactionnels lyophilisés différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment l'apoenzyme inactivée, l'anticorps monoclonal, le chromogène non couplé, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment la seconde enzyme, le conjugué et éventuellement le substrat. L'utilisation d'au moins deux milieux réactionnels lyophilisés différents est préférable afin d'optimiser la méthode de détection; des composés réactionnels pouvant réagir entre eux par simple contact. Ainsi, il est préférable 1 o que l'apoenzyme inactivée et le conjugué ne soient pas dans le même milieu réactionnel lyophilisé afin d'éviter une activation de l'apoenzyme inactivée avant l'ajout de l'échantillon. En outre, il est préférable que le conjugué et les anticorps ne soient pas dans le même milieu afin d'éviter leur liaison avant l'ajout de l'échantillon. Par ailleurs, il est préférable que la seconde enzyme et le chromogène non couplé ne soient pas dans le même milieu pour éviter une catalyse du chromogène avant l'ajout de l'échantillon. Alternativement, il est préférable que la seconde enzyme et le chromogène couplé, d'une part, et le cofacteur du chromogène, d'autre part, ne soient pas dans le même milieu pour éviter une catalyse du chromogène avant l'ajout de l'échantillon. Alternativement, lorsqu'au moins deux milieux réactionnels différents sont utilisés, lesdits milieux peuvent être dilués dans l'échantillon de milieu à tester concomitamment ou de façon séquentielle. La dilution séquentielle des milieux réactionnels lyophilisés est préférable afin que ledit au moins un composé neutralisant neutralise les composés présents dans l'échantillon et susceptibles d'altérer la mise en oeuvre de la méthode de détection. En outre, dans les cas où des composés présents dans le milieu à tester sont susceptibles de dégrader et/ou de réagir avec les produits formés au cours de la réaction catalysée par I'apoenzyme activée, il est préférable que le substrat soit placé dans le second milieu réactionnel lyophilisé afin que la réaction enzymatique ne soit initiée qu'après la neutralisation des composés présents dans le milieu à tester. Selon un mode particulier de réalisation, ladite méthode de détection 1) comprend en outre la mise en oeuvre d'une méthode de référence par (1) dilution d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé de référence dépourvu d'anticorps monoclonaux dans un second échantillon de milieu à tester, (2) incubation du second échantillon, (3) observation de la coloration de référence obtenue et éventuellement (4) comparaison de ladite coloration de référence et de la coloration obtenue avec le premier échantillon. Préférentiellement, la coloration de référence obtenue correspond à une concentration donnée du ligand dans le milieu à tester. La dilution puis l'incubation d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé de 1 o référence dans un second échantillon de milieu à tester permettent de mettre en oeuvre une méthode de détection de référence et d'obtenir une réaction colorée de référence. Pour ce faire, ledit au moins un milieu réactionnel lyophilisé de référence est dépourvu d'anticorps monoclonaux. En l'absence d'anticorps monoclonaux, le conjugué est sous forme libre et le groupement prosthétique se lie à I'apoenzyme inactivée. L'activation de l'apoenzyme inactivée et l'intensité de la coloration de référence obtenue sont maximales et indépendantes de la concentration de ligand présent dans le milieu à tester. Il s'agit alors d'un contrôle positif qui facilite la comparaison et l'interprétation à I'ceil nu des résultats colorimétriques obtenus entre le premier et le second échantillons. En fait, ledit au moins un milieu réactionnel de référence peut être étalonné par ajustement de la quantité de conjugué de telle sorte que la coloration de référence obtenue corresponde à une concentration connue de ligand. Afin de pouvoir comparer valablement la coloration obtenue avec le premier échantillon et celle de référence, les premiers et second échantillons sont issus du même aliquote et/ou subissent le même traitement. En outre, la méthode de détection et la méthode de référence sont mises en ceuvre simultanément et dans les mêmes conditions expérimentales. Préférentiellement, les composés réactionnels sont préparés dans au moins deux milieux réactionnels lyophilisés de référence différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant notamment I'apoenzyme inactivée, le cofacteur du chromogène, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant notamment la seconde enzyme, le chromogène couplé, le conjugué et éventuellement le substrat. Le milieu à tester peut être de différente nature. Il peut s'agir d'un milieu naturel ou d'un milieu artificiel. Préférentiellement, le milieu à tester est un milieu biologique, ledit milieu étant testé tel quel ou étant testé après un traitement préalable, notamment une dilution. Alternativement, il peut s'agir d'un milieu biologique liquide traité ou non ou un milieu biologique liquide obtenu à partir d'un milieu solide (tissu, etc.) par application d'un traitement spécifique (dissolution, extraction, etc.). Encore préférentiellement, ledit milieu biologique est prélevé chez un animal ou chez un être humain par des méthodes bien connues. Alternativement, ledit animal peut-être un animal de rente, un animal de compagnie. Les animaux de rente comprennent notamment les porcs, les bovins, les ovins, les caprins, les lagomorphes et les poissons d'élevage. Les animaux de compagnie comprennent notamment les chiens, les chats, les chevaux, les poissons et les reptiles. Encore préférentiellement, ledit milieu biologique est choisi parmi la salive, le lait, l'urine, la sueur, le liquide lacrymal, les sécrétions mucosales, le plasma, le liquide amniotique, le liquide céphalorachidien, l'eau et le sérum. Très préférentiellement, ledit milieu biologique est le lait. Le ligand à doser dans ledit milieu biologique est choisi parmi les haptènes, peptides, oligopeptides ou polypeptides de petites tailles fragments de protéines, de glycoprotéines, de lipoprotéines, de stéroïdes. Ces ligands peuvent appartenir à différentes classes de molécules notamment les antigènes, les hormones, les vitamines, les métabolites, les antibiotiques. Ces molécules peuvent être endogènes ou exogènes. Les molécules exogènes peuvent être notamment des molécules médicamenteuses ou des molécules d'origine bactériennes, virales, parasitaires. Nombre de ligands peuvent être dosés via cette méthode. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer, d'une part, d'un conjugué comprenant le groupement prosthétique lié de manière covalente audit ligand ou à un analogue et d'autre part, un composé reconnaissant de manière spécifique et non covalente le ligand conjugué. A ce titre, le composé reconnaissant le ligand à doser ou conjugué n'est pas nécessairement un anticorps monoclonal. II pourrait s'agir d'un récepteur moléculaire. Préférentiellement, ledit ligand est une hormone. Très préférentiellement, ladite hormone est la progestérone sous forme libre. La détermination de la concentration de la progestérone dans le lait de vache est utile à la détermination de la phase du cycle sexuel de la vache (ovulation, etc.). Alternativement, ledit ligand est un antibiotique, un de ses résidus ou un 1 o de ses produits de dégradation. La détermination de la concentration d'antibiotiques dans le lait de vache ou dans un autre milieu biologique est utile notamment lorsque l'animal est un animal dont le lait et/ou la viande est destinée à la consommation humaine ou animale. Alternativement, ledit ligand est un anticorps. La détermination de la concentration en anticorps dans le sang et/ou le sérum est utile pour apprécier l'efficacité d'une vaccination pratiquée par exemple chez la volaille. Alternativement, ledit ligand est un traceur biologique. Préférentiellement, ledit traceur biologique est la flavénine adénine dinucléotide (FAD). La détermination de la concentration de la FAD dans le sang, préalablement traité pour rompre les cellules et libérer le FAD dans le milieu, est utile à l'identification des animaux souffrant de mastite chronique. De même, la détermination de la concentration de la FAD dans l'urine est utile à l'identification des animaux souffrant d'infection urinaire chronique. Alternativement, ledit ligand est une protéine ou un fragment d'une protéine spécifique d'un état physiologique et/ou pathologique donné. Préférentiellement, ladite protéine est la PBPS. La détermination de la concentration dans le sang, le sérum et/ou le lait est utile pour la détermination d'un état de gestation chez l'animal. Alternativement, ledit ligand est tout ou partie d'un pesticide ou l'un de ses produits de dégradation. La détermination de la concentration dans l'eau de boisson est utile pour la détermination du niveau de pollution de ladite eau. Alternativement, ledit ligand est tout ou partie d'une substance stupéfiante ou l'un de ses produits de dégradation. La détection de ces substances dans les sang et/ou la salive est utile pour établir un diagnostic d'urgence. Dans un mode de réalisation particulier, I'apoenzyme est une oxydase s catalysant le substrat en présence du groupement prosthétique pour produire au moins du peroxyde d'hydrogène. Préférentiellement, I'apoenzyme est l'apo-glucose oxydase (dénommée ci-après apo-GOD), le groupement prosthétique est la flavine adénine dinucléotide (dénommée ci-après FAD) et le substrat est le glucose. Le 1 o glucose, substrat de l'apo-GOD, correspond à un composé vecteur et à un composé réactionnel lorsqu'il est incorporé au(x) milieu(x) réactionnel(s) lyophilisé(s). En outre, la seconde enzyme est la Horse Radish peroxydase (dénommée ciaprès HRP) et le chromogène est la 5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate couplé à de la 4-amino antipyrine. La HRP est active uniquement en présence de peroxyde d'hydrogène. En outre, cette enzyme catalyse le chromogène DHSA uniquement en présence de 4-AP. La catalyse du DHSA couplé à de la 4-AP développe une coloration rosée à rouge. Par ailleurs, le ligand à doser dans ledit milieu biologique est la progestérone sous forme libre. Les hormones interviennent dans la régulation d'un grand nombre d'états physiologiques. Ainsi, le dosage des hormones dans les liquides biologiques permet généralement de déterminer précisément un état physiologique ou pathologique. A ce titre, le dosage de la progestérone sous forme libre (dénommée également ci-après P4) dans le lait de vache permet de déterminer précisément l'état de cyclicité (dénommé également le cycle sexuel) ou l'état de gestation de la vache. Ainsi, le taux de P4 dans le lait variera en fonction de la phase de l'état de cyclicité. Le cycle de reproduction d'une vache en l'absence de fécondation a une durée moyenne de 21 (à 24 jours). Ce cycle se divise en quatre phases. La première phase, dénommée pro-oestrus, coïncide avec la phase folliculaire pré-ovulatoire d'une durée de 2 à 3 jours. Cette première phase correspond au développement des follicules, à la maturation et la croissance des follicules secondaires et à l'obtention d'un follicule dominant nommé follicule de De Graaf. La deuxième phase, dénommée oestrus ou chaleur, est d'une durée moyenne de 1 à 2 jours au cours de laquelle le follicule dominant secrète beaucoup d'oestrogènes induisant des manifestations comportementales (ou chaleur) avec acceptation du chevauchement et de la saillie. C'est la période de réceptivité sexuelle et elle est suivie par l'ovulation ( ponte)> de l'ovocyte hors du follicule) vers 30 heures après le début des chaleurs, suivie du développement du corps jaune à 1 o partir du follicule et la migration de l'ovule dans les trompes de Fallope pendant approximativement 6 heures puis sa localisation in fine dans l'ampoule des trompes de Fallope où l'ovule est fécondable pendant 2 à 3 heures. La troisième phase, ou méto-oestrus, a une durée de 3 à 5 jours et correspond à la maturation du corps jaune. La quatrième phase, ou dio- oestrus, a une durée de 13 à 14 jours et correspond à la sécrétion de la progestérone par le corps jaune actif puis la régression du corps jaune. La progestérone secrétée par le corps jaune circule dans le sang puis se concentre dans le lait. En dosant cette progestérone, il est possible d'observer les fluctuations sur la quantité de progestérone produite au cours du cycle sexuel. Pendant la période de chaleur, la concentration en P4 dans le lait est proche de 0 ng/mL. A partir de l'ovulation, le corps jaune va secréter de la progestérone dont la concentration dans le lait va augmenter progressivement jusqu'à atteindre 5ng/mL, voire 9 ng/mL. En l'absence de fécondation de l'ovule, le corps jaune régresse et la concentration de progestérone diminue. En cas de fécondation de l'ovule, la concentration de P4 reste stable et augmente au cours de la gestation. En corollaire, l'anticorps monoclonal est un anticorps anti-progestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire déposée le 17 mars 2005 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro I3403 au nom de CEVA. Les anticorps 2B5 sont des anticorps monoclonaux de type immunoglobulines IgG1 produits par une lignée cellulaire déposée à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-3403. Les anticorps 2B5 ont une grande affinité et une grande spécificité pour la progestérone sous forme libre et pour la progestérone liée au conjugué. A contrario, lesdits anticorps ne reconnaissent pas les molécules stéroïdes proches de la progestérone et, notamment, la 5a-pregnone-3,20-dione; la pregnenolone; la 11a-desoxi-corticostérone; la 5a-androstone-3,17-dione; la 513androstone-3,17-dione; la corticostérone; l'atiocholanol; l'oestradiol; la testostérone; le cortisol et l'oestrone. Cette affinité stricte pour la progestérone, conjuguée ou pas, et non pour les molécules apparentées garantie la 1 o sensibilité et la spécificité de la méthode mise en oeuvre. Enfin, le milieu réactionnel lyophilisé comprend en outre de I'ascorbate oxydase. Afin d'optimiser la détection de la progestérone dans le lait de vache, il est préférable d'incorporer de I'ascorbate oxydase au milieu réactionnel lyophilisé en tant que composé neutralisant. En effet, le lait contient naturellement une forte concentration d'acide ascorbique. L'acide ascorbique peut biaiser la méthode de détection en ce qu'il dégrade le peroxyde d'hydrogène formé et le chromogène. L'ajout d'ascorbate oxydase catalyse donc l'acide ascorbique et permet d'optimiser le dosage du ligand à doser. Préférentiellement, la coloration de référence obtenue correspond à une concentration de 2 ng/mL de progestérone dans le lait de vache. Il est intéressant d'étalonner le(s) milieu(x) réactionnel(s) lyohilisé(s) de référence de telle sorte que la coloration de référence obtenue corresponde à une concentration seuil fixée de progestérone, ladite concentration étant corrélée à un état physiologique donné, en l'espèce l'oestrus. L'étalonnage de la méthode de référence de telle sorte à ce que la coloration de référence corresponde à une concentration de 2 ng/mL permet de déterminer si la vache est en période de chaleur. En effet, si l'intensité de la coloration du premier échantillon incubé est moindre que celle de référence, le lait testé présente une concentration de progestérone inférieure à 2 ng/mL et la vache est en période de chaleur. A contrario, si l'intensité de la coloration du premier échantillon incubé est supérieure ou égale à celle de référence, le lait testé présente une concentration de progestérone supérieure à 2 ng/mL et la vache n'est pas en période de chaleur. Selon un autre objet, la présente invention concerne un kit pour la détection qualitative et semi-quantitative d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester comprenant au moins un milieu réactionnel comprenant (1) un conjugué formé par liaison covalente d'un groupement prosthétique avec un ligand, (2) un anticorps monoclonal se liant de manière spécifique et compétitive au ligand à doser ou au ligand conjugué, (3) une apoenzyme inactivée, activable par liaison avec le groupement prosthétique des conjugués 1 o non liés à un anticorps monoclonal, (4) un composé chromogène, (5) une seconde enzyme catalysant ledit composé chromogène proportionnellement en présence d'au moins un réactif produit par l'apoenzyme activée, ledit chromogène catalysé générant une coloration proportionnelle à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester et éventuellement un substrat catalysable par l'apoenzyme activée, éventuellement un co- facteur du chromogène et éventuellement un ou plusieurs composés neutralisants. Préférentiellement, le kit, destiné à la détection qualitative et semiquantitative de la progestérone sous forme libre dans un échantillon de lait de vache, comprend au moins un milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment I'apo-glucose oxydase inactivée, le conjugué FADprogestérone, l'anticorps monoclonal antiprogestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire 1-3403, I'ascorbate oxydase, la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate, le cofacteur 4 amino-antipurine et le glucose. Très préférentiellement, ledit kit comprend (1) du glucose, (2) un premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant l'apo-glucose oxydase inactivée, 4 amino-antipurine (cofacteur du chromogène), l'ascorbate oxydase et l'anticorps monoclonal antiprogestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire 1-3403 et (3) un second milieu réactionnel lyophilisé comprenant la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2hydroxybenzène sulfonate, le conjugué FAD-Progestérone. Encore préférentiellement, ledit kit comprend (1) du glucose, (2) un premier milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant I'apoglucose oxydase inactivée, 4 amino-antipurine et l'ascorbate oxydase et (3) un second milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate, le conjugué FAD-Progestérone. Indifféremment, le glucose est incorporé au premier milieu réactionnel lyophilisé et/ou au second milieu réactionnel lyophilisé et/ou n'est pas incorporé auxdits milieux réactionnels lyophilisés. De même, le glucose est incorporé indifféremment au premier milieu réactionnel lyophilisé de référence et/ou au second milieu réactionnel lyophilisé de référence et/ou n'est pas incorporé auxdits milieux réactionnels lyophilisés de référence. Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une apo-GOD purifiée, stabilisée et inactivée à partir d'une GOD lié à du FAD par (1) purification et élimination des contaminants, (2) stabilisation par réaction avec du diméthyl adipimidate et (3) inactivation par élimination du groupe prosthétique FAD. La préparation d'une apo-GOD purifiée, stabilisée et inactivée est préférable pour obtenir une méthode de détection fiable et précise. L'apo-GOD purifiée est obtenue par élimination des contaminants et inactivation de la catalase, enzyme catalysant le peroxyde d'hydrogène. L'élimination de la catalase est indispensable car elle biaiserait les résultats obtenus. En effet, lorsque les milieux réactionnels lyophilisés sont dissous avec l'échantillon de milieu à tester, l'apo-GOD inactivée est activée par fixation du FAD et catalyse du glucose en présence d'oxygène pour produire du gluconolactone et du peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène sert alors de réactif à la Horse Radish peroxydase qui catalyse le chromogène. Si le milieu réactionnel lyophilisé comprend de la catalase, il catalyse le peroxyde d'hydrogène et la réaction colorée produite par la HRP est de moindre intensité que celle attendue. Préférentiellement, l'inactivation irréversible de la catalase est réalisée par utilisation de bisulfite de sodium et l'élimination des contaminants est réalisée par filtration. L'apo-GOD est stabilisée par le greffage de diméthyl adipimidate (dénommé ci-après DMA) par une liaison covalente, ledit greffage compensant l'instabilité intrinsèque de l'apo-GOD en l'absence de FAD. La liaison covalente non clivable à six atomes se forme entre les groupes imidoesters de DMA et les fonctions amine libre de l'apo-GOD. L'apo-GOD est inactivée par élimination du FAD. Le FAD est un groupement prosthétique se liant de manière non covalente sur l'apo-GOD inactivée. Cette liaison induit des modifications conformationnelles de l'apo-GOD entraînant son activation. Préférentiellement, l'élimination du FAD est obtenue par dissociation de l'apo-GOD et du FAD en présence d'adénine 1 o dinucléotide diphosphate (dénommée ci-après AMP) et de glycérol puis par filtration. Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué P4-FAD par (1) activation de la progestérone par liaison avec de l'hémisuccinate (HNS) pour donner une P4-HNS puis (2) par liaison du P4-NHS avec de la N6-(6-aminohexyl)-FAD (AHFAD) pour donner du P4-FAD. Selon un autre objet, la présente invention concerne le conjugué P4- FAD. Dans le mode de réalisation préférée, on utilise un kit afin de déterminer 20 si la vache est en période de chaleur. Selon un mode de réalisation préférentiel, le kit utilisé, miniaturisé et à usage unique, comprend une zone fixe (1) et un tiroir (2) pouvant coulisser dans ladite zone fixe. La zone fixe présente quatre compartiments (3), (3') et (4), (4') comprenant chacun l'un des quatre milieux réactionnels lyophilisés respectivement. Les quatre milieux réactionnels lyophilisés sont donc conditionnés individuellement dans des compartiments étanches à l'humidité et ils ne sont pas manipulés directement par l'utilisateur du kit. Le tiroir présente deux puits (5) et (5') destinés à recevoir le premier ou le second échantillon de lait. Avant utilisation, le tiroir est en position ouverte. Les milieux réactionnels lyophilisés de référence sont étalonnés de telle sorte à ce que la coloration de référence obtenue corresponde à une concentration de 2 ng/mL de progestérone, concentration en dessous de laquelle une vache est considérée comme étant en période de chaleur. Pour doser la quantité de progestérone dans le lait, le tiroir est immergé dans du lait n'ayant subi aucun traitement préalable afin que les puits soient remplis avec le premier et le deuxième échantillon de lait. Pour des raisons de fiabilité du test, il est préférable d'utiliser un lait frais ayant une température de 20 à 39 C et n'ayant pas été réfrigéré au préalable. En-deçà de 15 C, les réactions catalytiques sont ralenties et le temps d'incubation est plus élevé. En outre, la progestérone est une molécule présentant une faible stabilité dans le lait. 1 o Après l'immersion, le tiroir est coulissé de telle sorte (1) que le puits comprenant le premier échantillon de lait se place en vis-à-vis du compartiment comprenant le premier milieu réactionnel lyophilisé et (2) que le puits comprenant le second échantillon de lait se place en vis-àvis du compartiment comprenant le premier milieu réactionnel lyophilisé de référence. Le kit est agité pendant approximativement 30 secondes afin que lesdits premiers milieux se dissolvent complètement dans leur échantillon respectif. Le tiroir est alors à nouveau coulissé de telle sorte (1) que le puits comprenant le premier échantillon de lait se place en vis-à-vis du compartiment comprenant le second milieu réactionnel lyophilisé et (2) que le puits comprenant le second échantillon de lait se place en vis-à-vis du compartiment comprenant le second milieu réactionnel lyophilisé de référence. Le kit est agité à nouveau pendant approximativement 30 secondes afin que lesdits seconds milieux se dissolvent à leur tour complètement dans leur échantillon respectif. Les échantillons sont alors incubés pendant 3 à 5 minutes puis la coloration obtenue avec le premier échantillon est observée et comparée à la coloration de référence du second échantillon. Si la coloration rosée obtenue est plus intense ou égale à la coloration de référence, le lait testé contient une concentration en progestérone supérieure à 2 ng/mL et la vache n'est pas en période chaleur. A contrario, si la coloration rosée obtenue est moins intense que la coloration de référence, le lait testé contient une concentration en progestérone inférieure à 2 ng/mL et la vache est considérée comme étant en période chaleur. La méthode de détection selon l'invention présente de nombreux avantages. Cette méthode permet d'obtenir des résultats qualitatifs et semiquantitatifs d'une grande précision par la réaction colorée induite par la 5 méthode immuno-enzymatique. Cette méthode peut être miniaturisée et intégrée complètement sous la forme d'un kit prêt à l'emploi et à usage unique ne nécessitant pas d'être stocké à basse température, les milieux réactionnels étant lyophilisés et très stables à température ambiante. 1 o Cette méthode est simple d'utilisation. Conditionnée sous la forme d'un kit selon l'invention, cette méthode consiste simplement en l'ajout de l'échantillon de milieu à tester dans les compartiments, la dilution des milieux réactionnels lyophilisés dans ledit échantillon et l'observation de la coloration à l'aide d'une règle colorée et/ou par comparaison avec une coloration de ls référence. Cette méthode peut donc être mise en oeuvre par toute personne autre que l'homme du métier (technicien). Ainsi, dans le cas d'une méthode de détection de la progestérone dans le lait de vache, celle-ci peut être mise en oeuvre notamment par l'éleveur ou le vétérinaire. Cette méthode est rapide d'utilisation. Cette méthode ne nécessite pas de multiples étapes de lavage et/ou d'incubation. Après ajout de l'échantillon et dilution des milieux réactionnels lyophilisés, la réaction colorée est observable en quelques minutes, généralement en moins de 10 minutes. Le temps d'incubation sera variable notamment selon la nature du milieu à tester, la cinétique des enzymes utilisées, les conditions environnementales (température, etc.). Cette méthode peut être utilisée in situ. Conditionnée sous la forme d'un kit selon l'invention, cette méthode est conçue pour être mise en oeuvre sur le lieu même de prélèvement du milieu à tester. Cette méthode permet de tester des milieux dont seuls de faibles 30 volumes peuvent être obtenus, notamment la sueur, le liquide lacrymal et les sécrétions mucosales. Cette méthode n'est pas appliquée directement à l'animal dont on souhaite tester l'un des milieux biologiques. L'animal n'est donc jamais en contact avec les composés vecteurs et réactionnels, éventuellement toxiques, entrant dans la composition du dispositif. La méthode selon l'invention peut être utilisée pour la détermination de l'état de cyclicité ou de gestation d'un animal ou humain comprenant la mise en oeuvre de la méthode de détection et de dosage de la progestérone dans un milieu biologique prélevé chez ledit animal ou humain. La présente invention sera mieux comprise au vu de l'exemple lo cidessous qui est donné à titre illustratif et non limitatif de l'invention et se réfère au dessin annexé dans lequel: la figure 1 représente le kit selon l'invention Exemple 1. Obtention des anticorps monoclonaux 2B5 anti-progestérone Les anticorps monoclonaux 2B5 anti-progestérone de type Immunoglobuline IgG1 sont produits par la lignée cellulaire CNCM 1-3403. Cette lignée cellulaire a été obtenue par fusion de lymphocyte B de rate de souris alinos Balb/c et de myélome Sp2/Ag. Cette lignée été sélectionnée (1) par mesure de l'affinité des anticorps produits pour le conjugué FAD-P4 par la méthode ELISA avec coating de la FAD-progestérone et (2) par mesure de l'affinité des anticorps pour la P4 sous forme libre par la méthode ELISA de compétition avec coating de la FAD-progestérone. 2. Préparation de l'apo-glucose oxydase inactivée Inactivation de la catalase 500 mL de la solution GenencorOxy GO HPL 5000 (25,7 mg/mL de protéine à A280 et 224 000 unités enzymatiques) est ajoutée à 1 L d'eau 30 déminéralisée. 6,0 g de bisulfite de sodium est alors ajouté sous agitation jusqu'à complète dissolution. La solution de glucose oxydase (dénommée ci- après solution GOD) est incubée sous faible agitation pendant 24h à 2889873 22 température ambiante. La solution GOD est alors traitée par ultrafiltration et diafiltration par utilisation d'une membrane 6 Ft2, 10K PES à température ambiante. La membrane est nettoyée au préalable avec de la soude 0,1 N. La solution GOD s est concentrée dans un volume final de 500 mL en 10 minutes. La solution est alors diafiltrée contre 7 diavolumes d'eau déminéralisée et contre 5 diavolumes d'une solution d'acétate de sodium 0,05 M, pH 4,5 pendant 2h30. Une solution GOD de 830 mL est obtenue et comprenant 14,2 mg/mL de protéines (A280) et une activité enzymatique de 2540 U/mL. i o La solution GOD est alors filtrée avec un entonnoir Buchner en verre frité de 9 cm de diamètre comprenant un papier filtre chargé au préalable avec 5 g de C300. 830 mL de solution GOD filtrée est collecté. Le pH de la solution est ajusté à 6 avec une solution de soude IN pour un volume final de 853 mL. Une colonne de chromatographie de 7,5 cm par 19 cm est chargée avec is 730 mL de résine Sephacel DEAE puis équilibrée avec une solution d'équilibrage d'acétate de sodium 0,05 M, pH 6,0. La solution GOD (853 mL) est chargée sur la colonne et la colonne est rincée avec un volume de solution d'équilibrage. L'échantillon est alors élué avec un gradient d'acétate de sodium de 0,8 M, pH 6,0, 2,2 L à 0,2 M, pH 3,5, 2,2 L à une vitesse d'élution de 20 mL/min et l'éluat est collecté par fractions. Le ratio A450/A405 est alors mesuré pour chaque fraction, seules les 6 fractions ayant un ratio supérieur à 1,55 étant conservées et réunies. Une solution (ou pool) de GOD de 1100 mL est obtenue. Sous agitation, le pH de la solution est ajusté à 4,5 par ajout de 10 mL de soude 2,0 N puis l'absorbance est mesurée à A280 et A450. La solution GOD présente 10,4 g de protéines et une activité enzymatique de 1785 U/mL. Elle est stockée entre 2 et 8 C. Stabilisation de la glucose oxydase La solution GOD est divisée en trois portions traitées séparément avec le diméthyl-adipimidate (dénommé ciaprès DMA). Une fraction GOD de 367 mL est diluée avec de l'eau déminéralisée froide, qsp 2,5 L. Le pH est ajusté à 8,52 par ajout de Néthyl morpholine (dénommée ci-après NEM) 1,58 M. 5,5 g de DMA est dissous dans 13,75 mL d'une solution tampon de carbonate de potassium 1,0 M, pH 9, 5. La solution de DMA obtenue est ajoutée à la fraction GOD diluée sous agitation rapide et pendant 5 min. Le pH s de la solution GOD obtenue est ajusté à 8,5 avec la solution de NEM 1,58 M. La solution tamponnée est stockée à 4 C pendant 4 heures. Les deux autres fractions sont traitées de la même manière. Les fractions traitées sont concentrées et diafiltratées dans du glycérol à 50% par utilisation d'une membrane 0,5 m2 Biomax B-10A, 10 000 MWCOS 1 o PES. Les trois fractions sont ajoutées successivement. Ces fractions sont diafiltrées contre 10 diavolumes d'eau déminéralisée froide puis 4 diavolumes de glycérol 50%. 560 mL de solution GOD à 18,5 mg/mL et 3700 U/mL est obtenue puis stockée à 5 C. Inactivation de l'apo-GOD 390 mL d'une solution de glycérol 50%, pH 4,0 comprenant 10% p/v d'AMP est ajouté à 560 mL de la solution de GOD réticulée sous agitation. Le pH de la solution est ajusté à 1,65 par ajout de glycérol 50%, pH 0,9 sous agitation rapide. La solution est mélangée à 2-8 C pendant 20 min. La solution GOD est concentrée et diafiltrée par utilisation d'une membrane Millipore 1,0 M2 10K PES. La solution de GOD réticulée est concentrée en un volume de 675 mL et diafiltrée avec 2,7 mL d'une solution de glycérol 50% / AMP 0,04 M, pH 1, 65 et 7 L d'une solution de glycérol 50%, pH 1,65. 550 mL de solution apo- GOD avec une concentration protéique de 11,8 mg/mL et une activité enzymatique résiduelle de 0,22 U/mL est obtenue. Quand le FAD est ajouté, l'activité enzymatique est de 1880 U/mL. Cela montre que la majorité du FAD a été éliminée de la solution apo-GOD. En outre, un ratio A280/A260 de 1,5 démontre une quantité résiduelle d'AMP. Les quantités résiduelles de FAD et d'AMP sont éliminées par ajout à la solution apo-GOD réticulée d'une pâte comprenant 2,4 g de dextrane, 16 g de carbone dans 40 mL de phosphate de sodium 0,2 M, 50% glycérol pH 8,0. Le pH est ajusté à 7 avec de la soude 1 N. La suspension est agitée pendant la 2889873 24 nuit à basse température. La pâte dextrane-charbon est centrifugée pendant 15 minutes à 16 000 g pendant 5 C. Le surnageant légèrement trouble est récolté et filtré sur filtre de 0,8, 0,45 et 0,2 pm. 540 mL de solution apo-GOD comprenant 5,45 g de protéines est obtenu. Pour éliminer le glycérol et réactifs résiduels, on utilise une colonne de 11,28 x 45 cm chargée avec 4,5 L d'une résine Sephadex G25. Le débit d'élution est de 40 mL/min et elle est équilibrée avec le tampon Sephadex G-25 comprenant du phosphate de sodium 0,1 M, de la BSA 0,1 % et du mannitol 5 mg/mL, pH 7,0. La solution apo-GOD est chargée sur la colonne et elle est éluée avec cette solution Sephadex G-25 à basse température. Les fractions sont collectées lorsque A280>0,5. Une solution apo-GOD (ou pool) de 1,2 L est obtenue, filtrée avec des filtres de 0,2 p et lyophilisée. On obtient un solide blanc de 30,6 g comprenant 4,93 g de protéines et une cativité enzymatique résiduelle de 0,008 U/mg.. 3. Préparation du conjugué FAD-progestérone La FAD et/ou ses précurseurs sont synthétisés selon une cascade réactionnelle bien connue de l'homme du métier et largement documentée. Ainsi, à partir de l'inosine, il est possible de synthétiser en cascade (1) du 2',3',5'-tri-O-acétylinosine selon Bredereck et al., Chem Ber (1947) 40: 401-405, (2) du 6-chloro-9-(2',3',5'-tri-O-acétyl-B-Dribofuranosyl)purine selon Gerster et al. J Org Chem (1963) 28: 945-948, (3) du 6-chloro-9-B-D-ribofuranosyl purine selon Brown et al. J Biol Chem (1953) 204: 1019-1024, (4) du 6-chloro-9-B-D-ribofuranosyl purine-5'phosphate puis du N6-(6-aminohexyl)-adénosine-5'-monophosphate (AHAMP) selon Guilford et al. Chemica Scripta (1972) 2: 165-170, (5) de la Ntrifluoroacetyl-AHAMP (N-TFAAHAMP), (6) de la N-TFA-6-aminohexyl-FAD (TFA AHFAD), (7) de la N6-(6-aminohexyl)-FAD (AHFAD), le AHFAD étant alors utilisé dans la réaction de couplage à la progestérone. 103 mg de P4-HNS (0,24 mmol) sont dissous dans 1,5 mL de DMF et la solution obtenue est refroidie sur glace à -10 C. 27 uL de N-méthyl morpholine 0,24 mmol (NMM) puis 32 uL d'isobutylchloroformate 0,24 mmol sont alors ajoutés sous vive agitation pendant plusieurs minutes. En parallèle, 108 mg de AHFAD (0,12 mmol) sont dissous dans 10 mL de DMF/DMSO 1/1, le pH est ajusté à 8 avec de la NMM et la solution obtenue est refroidie sur glace. La solution de AHFAD est ajoutée lentement à la solution de P4-NHS puis 5 mL d'eau est ajouté pour dissoudre complètement les produits. Après 90 minutes, un second aliquote de 103 mg de P4-HNS est activé par ajout de 27,uL de NMM et 32,uL d'isobutylchloroformate et agitation à 10 C pendant 4 minutes. Ce second aliquot de P4-NHS est alors ajouté à la solution P4-HNS. Après trois heures, la réaction de couplage est stoppée par ajout de bicarbonate de sodium. Le produit obtenu est purifié par chromatographie préparative sur une colonne Delta-Pak C18 RCM 25 x 210 mm (Waters) sous un débit de 40 mL/min. Un gradient d'élution linéaire est appliqué de 20 % à 80 % de solvant B, sur 30 min. (solvant A: tampon phosphate 0.02M pH 5,5 solvant B: acétonitrile/tampon phosphate 1/1). Les fractions principales obtenues entre 17 et 19 minutes d'élution sont combinées et concentrées à l'évaporateur rotatif. Le produit final est enfin desséché par lyophilisation. Le dosage du produit final par spectrophotométrie à 450 nm (E=11.300/M.cm) donne une teneur en conjugué de 94,4 mg correspondant à un rendement de 60%. L'analyse chromatographique par LC-MS (ion spray +) et UV confirme l'identité du conjugué avec une Mr de 1296.7 (Mr calculée: 1297,3) et un Tr de 5.92 min., la pureté chromatographique déterminée à 215 nm étant supérieure à 90% s/s. Les conditions opératoires sont les suivantes: colonne Atlantis C18, 4,6 x 50 mm, 3pm (Waters) - Phase mobile: gradient d'élution linéaire de 5% à 65% solvant B en 10 min. (solvant A: acide trifluoracétique 0.05% dans eau, solvant B: acétonitrile) - Système Waters Alliance HT 2790 couplé à un spectromètre de masse Waters ZQ4000 et un détecteur Waters 996 PDA. 2889873 26 4. Préparation des milieux réactionnels lyophilisés A. Préparation des solutions matricielles Les solutions matricielles sont obtenues par dissolution de 25 g de tréhalose, 75 g de mannitol, 25 g de dextran T40 et 5 g de sérum albumine 5 bovine dans une solution tampon de phosphate de sodium à 0,1 M, pH 7, qsp IL. B. Préparation des solutions mères de composés Solution mère d'apoglucose oxydase à 6 mg/mL (136 U) par dissolution 1 o d'apo-glucose oxydase lyophilisée dans la solution matricielle. Solution mère de glucose à 50 mg/mL. Solution mère d'anticorps 2B5 anti-progestérone à 2 mg/mL. Solution mère de HRP à 5 mg/mL: 5 mg de HRP (Sigma) est dissous dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0, qsp 1 mL. Solution mère de conjugué FAD-progestérone à 0,2,uM: 1,2 mg de FAD-P4 est dissous dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M, qsp 1 mL. La concentration molaire de cette solution mère est déterminée par le rapport [absorbance à 450 nm / 0,0113]. La solution mère est diluée afin que le FAD-P4 soit présent dans une concentration finale de 0,2 pM. Solution mère de chromogène DHSA à 200 mM: dissolution de 53 mg de DHSA (Sigma) dans 1 mL d'eau distillée. Solution mère de 4 amino-antipyrine à 8 mM: 1,6 mg de 4 AP (Sigma) est dissous dans 1 mL d'eau distillée. Solution mère d'ascorbate oxydase à 2000/mL par reconstitution de 25 I'ascorbate oxydase (Sigma) dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH = 7. C. Préparation des mélanqes 4 mélanges différents sont préparés à partir des solutions mères 30 conformément aux quantités volumiques détaillées dans les tableaux I et II ci- dessous. Ces quatre mélanges correspondent effectivement à un premier 2889873 27 mélange (correspondant in fine au premier milieu réactionnel lyophilisé), un second mélange (correspondant in fine au second milieu réactionnel lyophilisé), un premier mélange de référence (correspondant in fine au premier milieu réactionnel lyophilisé de référence) et un second mélange de référence (correspondant in fine au second milieu réactionnel lyophilisé de référence). ApoGOD 4-AP Asc. Ox. Ac. 2B5 Sol. Matr. Volume (pL) (,uL) (,uL) (AIL) (AIL) total 1 er milieu 11,00 3,375 1,75 0,110 qsp 50,00 1 e milieu 11,00 3,50 1,75 Néant qsp 50,00 référence Tableau I: Compositions du premier mélange et du premier mélange de référence exprimées en volume (microlitre) de solutions mères utilisées. HRP DHSA FAD-P4 Sol. Matr. Volume (pL) (AIL) (pL) (pL) total 1,887 4,6 2ème 0,30 100,ug 1,19 ng qsp 50 milieu 1,5,ug 370 nmol 0,92 pmol 1,887 1, 88 2ème mil. 0,30 100,ug 0,45 ng qsp 50 référence 1,5 pg 370 nmol 0,38 pmol 1 o Tableau II: Compositions du second mélange et du second mélange de référence exprimées en volume (microlitre) de solutions mères utilisées. D. Préparation des milieux réactionnels solides Des aliquotes de 50,uL des mélanges sont immergés dans un bain 15 d'azote liquide, les aliquotes prenant immédiatement la forme d'une matrice sphérique. E. Préparation des milieux réactionnels lyophilisés L'humidité des milieux réactionnels solides est sublimée par lyophilisation sous vide et selon un gradient de température comprenant un exposition sous vide pendant 4 heures à -40 C puis pendant 2,5 heures de -40 C à -10 C, puis pendant 3 heures à -10 C puis pendant 3 heures de -10 C à +30 C, pendant 5 heures à 30 C. Les 4 milieux réactionnels lyophilisés différents obtenus et les quantités massiques de composés réactionnels sont détaillés dans les tableaux III et IV ci-dessous. (jig) (Ng) (U) (ng) (,uL) 66 5,4 1er milieu 0,35 110 50 (1,5 U) (27 nmol) 1er milieu 66 5,6 0,35 Néant 50 référence (1,5 U) (28 nmol) Référence ApoGOD 4-AP Asc. Ox. Ac. 2B5 Vol. total Tableau III: Compositions du premier milieu réactionnel lyophilisé et du premier milieu réactionnel lyophilisé de référence. HRP DHSA FAD-P4 Vol. total (/ig) (Ng) (ng) (pL) 1,19 26n-1e milieu 1,5 50 (370 nmol) (0,92 pmol) 2eme mil. 100 0,45 1,5 (370 nmol) (0,38 pmol) 50 Tableau IV: Compositions du second milieu réactionnel lyophilisé et du second milieu réactionnel lyophilisé de référence. 5. Préparation du glucose 1s Le glucose n'est pas incorporé aux quatre milieux réactionnels lyophilisés. 100,uL de la solution mère de glucose (5 mg de glucose) est déposé dans chacun des deux puits destinés à recevoir le premier et le second échantillons de lait. Avant ajout du milieu réactionnel, l'eau de la solution de glucose est évaporée passivement jusqu'à ce que le glucose cristallise au fond du compartiment. 2889873 29 6. Conditionnement des milieux réactionnels lyophilisés dans le kit Au préalable à la mise en oeuvre de la méthode de détection, les quatre milieux réactionnels selon l'exemple 4E sont conditionnés dans le kit, objet de l'invention. Ledit kit schématisé à la figure 1 présente deux parties formées chacune de deux compartiments indépendants et d'un puits. La première partie sert à la mise en oeuvre de la méthode proprement dite et la seconde partie sert à la mise en oeuvre de la méthode de référence. 1 o Le glucose est ajouté à chaque puits comme détaillé ci-avant. Le premier milieu réactionnel lyophilisé est ajouté dans un compartiment de la première partie et le second milieu réactionnel lyophilisé est ajouté dans l'autre compartiment. De même, le premier milieu réactionnel lyophilisé de référence est ajouté dans un compartiment de la seconde partie et le second milieu réactionnel lyophilisé de référence est ajouté dans l'autre compartiment. Pour la mise en oeuvre de la méthode de détection, il est nécessaire de diluer lesdits milieux réactionnels lyophilisés dans l'échantillon de lait de vache. Pour ce faire, un échantillon de lait n'ayant subi aucun traitement préalable est ajouté dans chacun des deux puits. Un mécanisme est alors actionné afin que les deux compartiments et le puits de chaque partie communiquent ensemble et que les deux milieux réactionnels lyophilisés se diluent dans l'échantillon. Résultats obtenus L'efficacité de la méthode de détection de la progestérone dans le lait de vache par observation de la coloration à l'oeil nu est déterminée par comparaison avec la méthode de référence The Ridgeway Milk Progesterone Enzyme-Immuno-assay (dénommée ci-après la méthode Ridgeway) commercialisée par Ridgeway Science Ltd (Lydney, GL15 6QX, Gloucestershire, Royaume-Uni) et avec une méthode colorimétrique utilisant un reflecto-spectrophotomètre (dénommée ci-après la méthode Minolta). 2889873 30 La méthode Ridgeway est une méthode immuno-enzymatique quantitative permettant de déterminer la concentration en progestérone dans le lait de vache. Cette méthode est mise en oeuvre selon les protocoles indiqués par le 5 fabricant. Lorsque la concentration en progestérone dans le lait de vache est inférieure ou égale à 2,0 ng/mL, la vache est en période de chaleur. A contrario, lorsque la concentration en progestérone dans le lait de vache est supérieure à 2,0 ng/mL, la vache n'est pas en période de chaleur. La méthode Minolta est une méthode quantitative mise en oeuvre par utilisation d'un réflecto-spectrophotomère Minolta permettant la mesure du paramètre Absolute [(b-a)Test] des premier et second milieux réactionnels lyophilisés dilués dans un premier échantillon de lait et du paramètre Abs[(b- a)Ref] des premier et second milieux réactionnels lyophilisés de référence dans un second échantillon de lait selon les recommandations de la Commission Internationale de I'Eclairage (CIE) et du manuel d'utilisation Precise color communication Color control from perception to instrumentation (Minolta Co. Ltd. 9242-4830-92; AAKBJ 14 (1998) p.59). Pour la mise en oeuvre de cette méthode, 100 pL d'un premier échantillon de lait est déposé dans un premier puits d'une microplate. 5 mg de glucose est mélangé à cet échantillon. Ce mélange est déposé dans un second puits comprenant le premier milieu réactionnel lyophilisé selon l'exemple 4.E. et incubé pendant 30 sec. Ce mélange est alors déposé dans un troisième puits comprenant le second milieu réactionnel lyophilisé selon l'exemple 4.E. et incubé pendant 5 min. Le paramètre Abs[(b-a)Test] est mesuré. En parallèle, 100 pL d'un second échantillon de lait est déposé respectivement dans un premier puits d'une microplate. 5 mg de glucose est mélangé à cet échantillon. Ce mélange est déposé dans un second puits comprenant le premier milieu réactionnel lyophilisé de référence selon l'exemple 4.E. et incubé pendant 30 sec. Ce mélange est alors déposé dans un troisième puits comprenant le second milieu réactionnel lyophilisé de référence selon l'exemple 4.E. et incubé pendant 5 min. Le paramètre Abs[(b-a)Ref] est mesurée. Lorsque la différence (dénommée A dans le tableau IV ci-après) entre les paramètres Abs[(b-a)rest] et Abs[(b-a)Ref] est inférieure à -1,5, la vache est en période de chaleur. A contrario, lorsque la différence entre ces paramètres est supérieure à -1,5, la vache n'est pas en période de chaleur. La méthode Minolta est utilisée uniquement à titre indicatif. La méthode d'observation à l'ceil nu (dénommée ci-après CEil nu) consiste en la comparaison de la coloration test obtenue par dilution des premier et second milieux réactionnels lyophilisés dans un premier échantillon de lait et de la coloration de référence obtenue par dilution des premier et second milieux réactionnels lyophilisés de référence dans un second échantillon de lait. La méthode CEil nu est mise en ceuvre par utilisation d'un kit selon l'invention. Lorsque l'intensité de la coloration test est inférieure à celle de la coloration de référence (symbole et = dans la table V), la vache n'est pas considérée comme étant en période de chaleur. Les résultats obtenus sont alors comparés avec ceux obtenus avec la méthode Ridgeway. Afin d'obtenir des résultats comparables, les méthodes Ridgeway, Minolta et CEil nu sont effectuées concomitamment sur le lieu même du prélèvement du lait des vaches. Le lait de 95 vaches est testé par les méthodes Ridgeway, Minolta et CEil nu . La comparaison des résultats obtenus permet de déterminer la sensibilité et la spécificité du kit ainsi que les valeurs prédictives positives et négatives. Les vaches sont en chaleur lorsque la concentration en progestérone dans le lait de vache mesurée par la méthode Ridgeway est inférieure ou égale à 2 ng/mL. A contrario, les vaches ne sont pas en chaleur lorsque la concentration en progestérone dans le lait de vache mesurée par la méthode Ridgeway est supérieure à 2 ng/mL. La sensibilité du kit correspond au nombre de tests positifs (dénommés ciaprès les vrais-positifs) obtenus par observation à l'oeil nu par rapport au nombre de tests positifs validés par la méthode Ridgeway. La spécificité du kit correspond au nombre de tests vrais-négatifs obtenus par observation à l'oeil nu par rapport au nombre de tests négatifs 1 o validés par la méthode Ridgeway. La valeur prédictive positive du kit correspond à la probabilité d'avoir une vache en chaleur lorsque le test est positif, c'est-à-dire le nombre de tests vrai-positifs par rapport au nombre de tests positifs obtenus. La valeur prédictive négative du kit correspond à la probabilité d'avoir une vache qui n'est pas en chaleur lorsque le test est négatif, c'est-àdire le nombre de tests vrai-négatifs par rapport au nombre de tests négatifs obtenus. Comme détaillé dans le tableau V ci-dessous, 17 tests sont vrais-positifs et 2 tests sont faux-négatifs. Le kit selon l'invention présente donc une sensibilité de 89,5 %. Par ailleurs, 6 tests sont faux-positifs et 70 tests sont vrais-négatifs. Le kit selon l'invention présente donc une spécificité de 92,1 %. Ainsi, le kit présente une valeur prédictive positive de 73,9 % et une valeur prédictive négative de 97,2 %. L'utilisation du kit selon l'invention permet donc d'identifier la grande majorité des vaches en période de chaleur et inversement. L'utilisation des composés réactionnels sous la forme de milieux réactionnels lyophilisés est donc sans incidence par rapport à une méthode qualitative. Le kit selon l'invention est donc simple, fiable et rapide d'utilisation Ridgeway Minolta CEil nu [P4] Etat A Etat Col. Etat Commentaires ng/mL 1 16,6 N 2,50 N > N Vrai négatif 2 20,0 N 3,30 N > N Vrai négatif 3 20,0 N 2,97 N = N Vrai négatif 4 16,0 N 2,72 N = N Vrai négatif 8,8 N 2, 24 N > N Vrai négatif 6 0,0 P -4,70 P N Vrai négatif 14,9 N 1,06 N > N Vrai négatif 11 16,4 N 1,15 N = N Vrai négatif 12 20,0 N 0,18 N = N Vrai négatif 13 18,2 N 1,17 N = N Vrai négatif 14 20,0 N 2,85 N > N Vrai négatif 18,7 N 1,98 N = N Vrai négatif 16 10,1 N -0,60 N = N Vrai négatif 17 20,0 N 3,24 N > N Vrai négatif 18 0,0 P -4,10 P N Vrai négatif 22 18,9 N 2,04 N > N Vrai négatif 23 20,0 N 1,68 N = N Vrai négatif 24 20,0 N 3,38 N > N Vrai négatif 14,2 N -1,00 N = N Vrai négatif 26 0,0 P 2,62 N > N Faux négatif 27 2,3 N -5,00 P N Vrai négatif 32 14,2 N -0,10 N = N Vrai négatif 2889873 34 33 20,0 N 6,02 N > N Vrai négatif 34 10,5 N 4,76 N > N Vrai négatif 20,0 N 6,55 N > N Vrai négatif 36 20,0 N 3,21 N = N Vrai négatif 37 6,3 N 0,18 N = N Vrai négatif 38 8,0 N 2,46 N = N Vrai négatif 39 2,1 N -2,20 P N Vrai négatif 42 20,0 N 2,78 N > N Vrai négatif 43 0,0 P -5,3 P N Vrai négatif 47 10,2 N 6,46 N > N Vrai négatif 48 15,0 N 3,25 N = N Vrai négatif 49 16,1 N 0,18 N = N Vrai négatif 9,1 N 3,16 N > N Vrai négatif 51 20,0 N 4,29 N > N Vrai négatif 52 10,4 N 2,82 N = N Vrai négatif 53 20,0 N 4,57 N > N Vrai négatif 54 12,5 N 3,52 N > N Vrai négatif 0,0 P -3,90 P N Vrai négatif 59 20,0 N 5,39 N > N Vrai négatif 2,3 N -0,70 N = N Vrai négatif 61 2,0 P -3,60 P N Vrai négatif 64 20,0 N 4,50 N > N Vrai négatif 20,0 N 1,83 N > N Vrai négatif 66 14,5 N 2,96 N > N Vrai négatif 67 18,0 N 3,62 N > N Vrai négatif 68 6,3 N 9,03 N > N Vrai négatif 69 5,6 N -2,20 P N Vrai négatif 73 3,1 N -1,90 P = N Vrai négatif 74 0,0 P -6,70 P N Vrai négatif 78 12,3 N 4,32 N > N Vrai négatif 79 6,0 N 5,31 N > N Vrai négatif 20,0 N 2,67 N > N Vrai négatif 81 20,0 N 4,99 N > N Vrai négatif 82 6,6 N 4,58 N > N Vrai négatif 83 20,0 N 4,76 N > N Vrai négatif 84 18,3 N 3,83 N > N Vrai négatif 9,4 N 5,98 N > N Vrai négatif 86 20,0 N 3,66 N > N Vrai négatif 87 3,6 N 2,92 N = N Vrai négatif 88 1,8 P -6,70 P N Vrai négatif 91 1,3 P -3,60 P Revendications 1. Méthode de détection et de dosage d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester (1) par dilution d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé dans ledit échantillon, (2) incubation de l'échantillon pour la mise en oeuvre d'une méthode immuno-enzymatique et (3) observation de la coloration obtenue. 2. Méthode, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'observation de la coloration obtenue est effectuée à l'eeil nu 3. Méthode, selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit milieu réactionnel lyophilisé est obtenu par (1) mélange des composés réactionnels avec une solution matricielle comprenant au moins un composé vecteur, (2) formation de milieux réactionnels solides par immersion de volumes dudit mélange dans l'azote liquide et (3) formation de milieux réactionnels lyophilisés par sublimation des milieux réactionnels solides par lyophilisation sous vide. 4. Méthode, selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit composé vecteur correspond notamment à un composé glucidique. 5. Méthode, selon la revendication 4, caractérisée en ce que les composés glucidiques sont choisis parmi les sucres solubles simples ou complexes et notamment les monosaccharides (oses, aldoses, cétoses, etc.) et les polysaccharides (disaccharides, oligoholosides, hétérosides). 6. Méthode, selon la revendication 4, caractérisée en ce que les composés vecteur sont du tréhalose, du mannitol, du dextrane et du sérum-albumine bovin. 7. Méthode, selon les revendications 4 à 6, caractérisée en ce que les composés vecteur représentent de 65 à 95% en volume des milieux réactionnels lyophilisés 8. Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode irnmuno-enzymatique d'activation d'une apoenzyme inactivée comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon dudit milieu à tester avec au moins un milieu réactionnel lyophilisé comprenant (1) un conjugué formé par liaison covalente d'un groupement prosthétique avec un ligand, (2) un anticorps monoclonal se liant de manière spécifique et compétitive au ligand à doser ou au conjugué, (3) une apoenzyme inactivée, activable par liaison avec le groupement prosthétique des conjugués non liés à un anticorps monoclonal, ladite apoenzyme activée catalysant de manière directe ou indirecte une réaction colorée proportionnelle à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester. 9. Méthode, selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal se lie de manière spécifique sur le ligand lié au conjugué. 10. Méthode, selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite réaction colorée est obtenue par catalyse d'au moins un substrat par l'apoenzyme activée pour donner au moins un réactif, ledit réactif étant nécessaire à l'activation d'une seconde enzyme dégradant un chromogène proportionnellement à la quantité de réactif formé et, indirectement, proportionnellement à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester. 11. Méthode, selon les revendications 8 à 10, caractérisée en ce que ledit milieu réactionnel lyophilisé comprend en outre au moins un composé neutralisant. 12. Méthode, selon les revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend deux milieux réactionnels lyophilisés différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment l'apoenzyme inactivée, l'anticorps monoclonal, le cofacteur du chromogène, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment la seconde enzyme, le chromogène couplé, le conjugué et éventuellement le substrat. 13. Méthode, selon les revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend deux milieux réactionnels lyophilisés différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment I'apoenzyme inactivée, l'anticorps monoclonal, le chromogène non couplé, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment la seconde enzyme, le conjugué et éventuellement le substrat. 14. Méthode, selon les revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la dilution des milieux réactionnels lyophilisés dans ledit échantillon est concomitante. 15. Méthode, selon les revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la dilution des milieux réactionnels lyophilisés dans ledit échantillon est séquentielle. 16. Méthode, selon les revendications 8 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en oeuvre d'une méthode de référence par (1) dilution d'au moins un milieu réactionnel lyophilisé de référence dépourvu d'anticorps monoclonaux dans un second échantillon de milieu à tester, (2) incubation du second échantillon, (3) observation de la coloration de référence obtenue et éventuellement (4) comparaison de ladite coloration de référence et de la coloration obtenue avec le premier échantillon. 17. Méthode, selon la revendication 16, caractérisée en ce que la coloration de référence obtenue correspond à une concentration donnée du ligand dans le milieu à tester. 18. Méthode, selon les revendications 16 et 17, caractérisée en ce que la méthode de référence comprend au moins deux milieux réactionnels lyophilisés de référence différents, (1) le premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment I'apoenzyme inactivée, le cofacteur du chromogène, au moins un composé neutralisant et éventuellement le substrat et (2) le second milieu réactionnel lyophilisé comprenant notamment la seconde enzyme, le chromogène couplé, le conjugué et éventuellement le substrat. 19. Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le milieu à tester est un milieu biologique 20. Méthode, selon la revendication 19, caractérisée en ce que le milieu biologique est prélevé chez un animal ou chez un être humain. 21. Méthode, selon la revendication 20, caractérisée en ce que l'animal est un animal de rente ou un animal de compagnie. 22. Méthode, selon les revendications 19 à 20, caractérisée en ce que le milieu biologique est choisi parmi la salive, le lait, l'urine, Ila sueur, le liquide lacrymal, les secrétions mucosales, le plasma, le liquide amniotique, le liquide céphalorachidien, l'eau et le sérum. 23. Méthode, selon la revendication 21, caractérisée en ce que le milieu biologique est le lait. 24. Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le ligand à doser est une molécule de petite taille choisie parmi les haptènes, peptides, oligopeptides ou polypeptides de petites taille, fragments de protéines, de glycoprotéines, de lipoprotéines, de stéroïdes 25. Méthode, selon la revendication 24, caractérisée en ce que la molécule de petite taille appartient à la classe des antigènes, des hormones, des vitamines, des métabolites et des antibiotiques 26. Méthode, selon la revendication 25, caractérisée en ce que le ligand à doser est la progestérone sous forme libre. 27. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 8 à 26, caractérisée en ce que I'apoenzyme est une oxydase catalysant le substrat en présence du groupement prosthétique pour produire au moins du peroxyde d'hydrogène. 28. Méthode, selon la revendication 27, caractérisée en ce que l'apoenzyme est l'apoglucose oxydase, le groupement prosthétique est la flavine adénine dinucléotide et le substrat est le glucose. 29. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 10 à 28, caractérisée en ce que le second enzyme est la Horse Radish peroxydase et le chromogène est le 5-dichloro-2-hydroxybenzéne sulfonate couplé à de la 4-amino antipyrine. 30. Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le ligand à doser est la progestérone sous forme libre. 31. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 30, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal est un anticorps anti- progestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire déposée le 17 mars 2005 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-3403. 32. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 11 à 31, caractérisée en ce que le composé neutralisant est l'ascorbate oxydase. 33. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 16 à 32, caractérisée en ce que la coloration de référence correspond à une concentration de 2 ng/mL de progestérone dans le lait de vache. 34. Kit pour la détection qualitative et semi-quantitative d'un ligand dans un échantillon d'un milieu à tester comprenant au moins un milieu réactionnel lyophilisé comprenant (1) un conjugué formé par liaison covalente d'un groupement prosthétique avec un ligand, (2) un anticorps monoclonal se liant de manière spécifique et compétitive au ligand à doser ou au ligand conjugué (3) une apoenzyme inactivée, activable par liaison avec le groupement prosthétique des conjugués non liés à un anticorps monoclonal, (4) un composé chromogène, (5) une seconde enzyme catalysant ledit composé chromogène proportionnellement en présence d'au moins un réactif produit par l'apoenzyme activée, ledit chromogène catalysé générant une coloration proportionnelle à la quantité de ligand à doser présent dans l'échantillon de milieu à tester et éventuellement un substrat catalysable par l'apoenzyme activée, éventuellement un cofacteur du chromogène et éventuellement un ou plusieurs composés neutralisants. 35. Kit, selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un milieu réactionnel lyophilisé comprenant l'apo-glucose oxydase inactivée, le conjugué FAD-progestérone, l'anticorps monoclonal antiprogestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire I-3403, l'ascorbate oxydase, la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2hydroxybenzène sulfonate, le cofacteur 4 aminoantipurine, le glucose, ledit kit étant destiné à la détection qualitative et semi-quantitative de la progestérone sous forme libre dans un échantillon d'un lait de vache. 36. Kit, selon la revendication 34 ou 35, caractérisé en ce qu'il comprend du glucose lyophilisé, un premier milieu réactionnel lyophilisé comprenant I'apoglucose oxydase inactivée, le cofacteur du chromogène 4 amino-antipurine, l'ascorbate oxydase et l'anticorps monoclonal antiprogestérone 2B5 produit par la lignée cellulaire 1-3403, un second milieu réactionnel lyophilisé comprenant la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate, le conjugué FADProgestérone. 37. Kit, selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il comprend en outre du glucose lyophilisé, un premier milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant l'apo-glucose oxydase inactivée, le cofacteur du chromogène 4 aminoantipurine et I'ascorbate oxydase et un second milieu réactionnel lyophilisé de référence comprenant la Horse Radish peroxydase, le chromogène 5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate, le conjugué FADProgestérone. 38. Méthode de détermination de l'état de cyclicité ou de gestation d'un animal ou humain femelle comprenant la mise en oeuvre de la méthode de détection et de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 33 de la progestérone dans un milieu biologique prélevé chez ledit animal ou humain. 39. Méthode selon la revendication 38 pour déterminer l'état de cyclicité ou de gestation de la vache à partir du lait prélevé chez ladite vache.