FR 2890743 A1 20070316 FR 0509209 A 20050909 MÉTHODE DE DOSAGE DES AMINES PRIMAIRES À TRÈS FAIBLE CONCENTRATION La présente invention appartient au domaine de l'analyse chimique de haute sensibilité des molécules aminées présentes dans les fluides biologiques, en particulier des protéines et des peptides. Plus précisément l'invention se rapporte à un kit et une méthode de marquage des amines primaires dans des échantillons complexes tels que des échantillons issus de milieux biologiques. L'invention permet d'identifier et de doser des amines à des concentrations très faibles dans des échantillons de très petite taille. L'invention permet aussi de détecter et de quantifier les amines primaires de façon simple, rapide et précise. Grâce à l'excellente sélectivité de la méthode sur laquelle elle repose, l'invention permet notamment de distinguer les différentes amines primaires d'un même échantillon, mais aussi d'identifier les amines primaires identiques présentes dans des échantillons différents. L'étude des fluides biologiques rend indispensable la séparation et la détection de molécules en très faible concentration, c'est-à-dire à des concentrations micromolaires, nanomolaires voire picomolaires. Les méthodes de séparation de ces molécules sont maintenant bien établies. Elles reposent toutes sur les techniques de chromatographie liquide (ou LC) telles que la chromatographie HPLC, la chromatographie liquide capillaire, la nano-LC, ou sur les techniques d'électrophorèse (électrophorèse capillaire de zone, chromatographie micellaire électrocinétique, électrochromatographie capillaire, l'électrophorèse sur veine liquide). Par contre, les méthodes de détection et de dosage à ces très faibles concentrations sont beaucoup moins développées, ce qui constitue un limite importante à la progression des connaissances et à la mise au point de nouvelles méthodes thérapeutiques. On sait que la protéomique étudie l'ensemble des protéines présentes dans un organisme. Elle peut avoir par exemple pour objet d'étudier l'expression génique en se fondant sur le profil protéique d'une cellule ou plus largement d'un système biologique. On peut aussi chercher à établir une comparaison entre cellules normales et de cellules anormales, afin de connaître quelles sont les protéines dont les proportions varient entre un organisme sain et un organisme malade. Une telle comparaison permet d'identifier certaines protéines comme cibles thérapeutiques et d'élaborer de nouveaux médicaments. Pour ce faire, des méthodes de séparation telles que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel haute résolution sont employées. Puis, un travail d'identification des protéines est nécessaire ainsi qu'une étude quantitative des protéines identifiées (c'est ce qu'on appelle la protéomique quantitative). A l'heure actuelle on utilise communément deux méthodes d'analyse, à savoir la spectrométrie de masse (MS), et l'électrophorèse sur gel, avec la méthode appelée DIGE pour DIfferential Gel Electrophoresis (Somiari R.I., Somiari S., Russell S., Shriver C.D., J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2005; 815, pp. 21525.), associée à la fluorimétrie classique ou la fluorimétrie induite par laser (LIF). La peptidomique est quant à elle une discipline encore balbutiante, mais qui connaît un succès grandissant en marge de la protéomique (Svensson M., Skold K., Svenningsson P., Andren P.E., J. Proteome Res., 2003, 2, pp. 213-9). Elle a pour objet de doser de manière relative et absolue les peptides contenus dans un milieu. Une de ses applications est, par exemple, en neurochimie, la mesure dans des microdialysats de cerveaux de rats, de la variation en fonction du temps de la concentration de différents neuropeptides (substance P, neurotensine, angiotensine, ...). Il s'agit là d'analyser un grand nombre d'échantillons de faible volume (de l'ordre du pl) contenant des peptides, connus ou inconnus, ainsi que d'autres amines telles que des acides aminés et des catécholamines, ces molécules étant présentes à des concentrations nanomolaires. Il faut donc avoir recours à des méthodes de séparation et de détection qualitatives et quantitatives performantes en terme de sélectivité et de sensibilité. Les microtechniques de séparation telles que la HPLC, la nanoLC, l'électrophorèse capillaire, sont adaptées à ces petits volumes d'échantillons et sont en principe susceptibles d'être associées à la spectrométrie de masse et à la fluorimétrie. Qu'ils soient dédiés à la protéomique ou à la peptidomique, les dosages quantitatifs peuvent être réalisés soit par fluorimétrie soit par spectrométrie de masse tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectrométrie de masse. Ces deux techniques d'analyse sont donc complémentaires et doivent être réalisées de concert pour disposer de données complètes. Dans les deux cas, les molécules à étudier doivent être marquées avant de pouvoir être détectées. Dans la technique de DIGE/fluorescence, on utilise des marqueurs caractérisés par leurs propriétés de fluorescence tels que des cyanines, les marqueurs pouvant être excitées respectivement à 532 nm et à 633 nm (par exemple les marqueurs Cy3 et Cy5 commercialisés par Pharmacia). Pour comparer des protéines issues d'organismes différents (par exemple l'un sain et l'autre malade), on utilise une paire de marqueurs fluorescents excitables (et donc émettant) à des longueurs d'onde distinctes, communément les colorants Cy3 et Cy5. La comparaison des intensités des signaux de fluorescence donne la concentration relative pour la même protéine entre l'organisme sain et l'organisme anormal. La fluorimétrie et la fluorimétrie induite par laser (LIF) sont maintenant bien maîtrisées pour permettre la détection de molécules fluorescentes à très faibles concentrations (Somiari, id.). Dans les techniques de spectrométrie de masse, on utilise des marqueurs isotopiques non radioactifs, c'est à dire des marqueurs différant uniquement par leur masse, leur formule chimique restant identique. Dans un des deux marqueurs, n atomes de deutérium ont pris la place de n atomes d'hydrogène, la différence de masse entre les deux marqueurs étant donc égale à n. Le même principe peut être réalisé en remplaçant des atomes de carbone C12 avec du carbone lourd C13. Par exemple pour étudier deux populations différentes de protéines en spectrométrie de masse, on associe chaque population à un des marqueurs. Dans le spectre de masse, la fragmentation des molécules aboutit à la formation de certains ions caractéristiques des marqueurs et des molécules étudiées. Les pics correspondant à des ions qui différent de n unités de masse sont repérés et leur intensité relative représente la proportion d'une protéine donnée dans chaque population. On peut ainsi effectuer des comparaisons relatives entre les populations protéiques de cellules ou d'organes sains et anormaux. Les données de spectrométrie de masse permettent ainsi de reconstituer la structure des molécules. On peut aussi utiliser la spectrométrie de masse pour la réalisation des dosages quantitatifs, à condition de disposer d'un étalon interne isotopique, c'est-à-dire de la même molécule que celle qui est étudiée, mais marquée isotopiquement avec plusieurs atomes de deutérium ou de C13. De la sorte, d'une part la molécule à doser et son étalon isotopique interne peuvent être obtenus dans les mêmes conditions par les techniques de séparation chimique (par co-migration en chromatographie liquide ou par les techniques électrophorétiques), et d'autre part, en revanche ils peuvent être identifiés et distingués sur le spectre de masse, grâce à leur différence de masse moléculaire. Aujourd'hui la méthode de spectrométrie de masse faisant appel à un étalon interne la plus utilisée pour la protéomique quantitative est la méthode dite ICAT pour "Isotope-Coded Affinity Tag" (Gygi S.P., Rist B., Griffin T.J., Eng J., Aebersold R., J. Proteome Res. 2002, 1, pp. 47-54). Cependant, cette méthode présente un certain nombre d'inconvénients. D'une part, la réaction d'association avec le marqueur ICAT n'est jamais totale, ce qui est un problème en soit, mais aussi implique une étape de purification de l'échantillon avant le passage en MS pour éliminer les molécules non marquées. Par ailleurs, du fait de la faible réactivité chimique des marqueurs ICATs, elle ne permet pas de doser les molécules à faible concentration (nanomolaire). En outre, ce type de marqueurs ne réagit que sur les groupements thiols des cystéines. Plus généralement, une autre limitation importante des méthodes de dosage par spectrométrie de masse est qu'en pratique, il n'est pas toujours possible de disposer d'un étalon isotopique interne car cela nécessite de réaliser une synthèse avec des isotopes lourds des composés à doser. Aussi une méthode a-t-elle été proposée, consistant à dériver les composés avec un groupement contenant lui-même des isotopes lourds. Par exemple la demande de brevet US 2003 0054570 propose de modifier les cystéines par des composés contenant un groupement arginine et pouvant se lier à la fonction thiol des cystéines grâce à une chaîne carbonée contenant des isotopes légers ou lourds. Dans la demande US 2003 0087322, le marqueur peut contenir différents isotopes lourds et possède une fonction ayant une affinité biologique donnée permettant d'isoler sélectivement les molécules dérivées sur colonne d'affinité. Néanmoins, ces marqueurs isotopiques souffrent tous d'un déficit de réactivité et ne permettent pas de doser des molécules en très faible concentration. Ils demandent un protocole de préparation long et délicat. D'autres marqueurs isotopiques ont été décrits dans la littérature, mais tous sont limités quant à la sensibilité à atteindre. De telles méthodes ne s'adressent au demeurant qu'à certaines familles chimiques et fournissent donc des résultats partiels sur le protéome ou le peptidome étudié. Comme déjà indiqué, les dosages quantitatifs sont réalisés soit par fluorimétrie soit par spectroscopie de masse, tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectroscopie de masse, ces deux techniques d'analyse complémentaires devant être réalisées ensemble pour disposer de données utiles complètes. Or, outre les inconvénients précédemment exposés, elles sont longues et complexes à mettre en oeuvre et rien n'existe pour mener ce travail en régime de routine. En particulier, l'emploi de marqueurs spécifiques, chacun étant susceptible d'être détecté par une technique, augmente encore la lourdeur du travail préparatoire des analyses. Pour éviter ce problème, il a été proposé de réaliser un marquage à l'aide d'un colorant de fluorescence lui-même dérivé par un groupement fonctionnel détectable après fragmentation en spectrométrie de masse. Le marqueur fluorogène utilisé est le naphthalène 2,3 dialdéhyde (NDA), marqueur bien connu pour réagir avec les amines primaires en donnant des composés fluorescents. Celui-ci est dérivé, selon la méthode retenue, soit par un ion cyanure, soit par un groupement 13-mercaptoéthanol. Cependant, sur les peptides, la réaction de marquage utilisant le NDA et le cyanure n'est pas totale. Le cyanure réagit lentement et incomplètement avec le NDA. Ceci conduit à un taux de substitution médiocre et à des résultats d'analyse biaisés: l'analyse quantitative est difficile, et en outre des espèces en faible concentration peuvent tout simplement ne pas être identifiées. Le groupe CN présente au demeurant des risques liés à sa toxicité lors des manipulations, et il est de toutes façons d'un intérêt très limité. D'une part il ne peut pas fournir un marqueur isotopique car un seul atome de carbone pourrait être remplacé, ce qui est insuffisant pour obtenir des résultats interprétables en spectrométrie de masse. D'autre part, contrairement aux marqueurs de la présente invention, on ne peut pas modifier sa structure par dérivation pour avoir deux marqueurs différents utilisables dans la même analyse, l'un pouvant par exemple servir à fournir un étalon interne. En ce qui concerne le 13-mercaptoéthanol, les possibilités de substitutions isotopiques sont encore extrêmement réduites, tout comme les possibilités de dérivation. De plus, le rendement d'ionisation de l'espèce marquée avec le 13-mercaptoéthanol est faible. On évite de au demeurant autant que possible son emploi du fait de sa forte et désagréable odeur. Ainsi, à l'heure actuelle, ces méthodes n'ont pas donné de résultats probants, ni apporté d'amélioration notable en spectrométrie de masse. La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients. Plus précisément, un objectif de la présente invention est de disposer de moyens de marquage moléculaire permettant aussi bien le dosage quantitatif que la détermination structurale des entités étudiées. Un second objectif de la présente invention est de disposer d'un marqueur de haute réactivité chimique autorisant l'analyse de substances biologiques en concentration micromolaire ou moindre encore. Un autre objectif de la présente invention est de disposer d'une méthode de grandes sélectivité et sensibilité vis-à-vis des molécules cibles. Un objectif de l'invention est aussi de permettre le dosage de la plus grande partie des molécules représentatives du profil protéique ou peptidique d'un milieu étudié, à savoir celles portant une fonction amine primaire. Encore un autre objectif de l'invention est de pouvoir réaliser le dosage simultané des amines primaires présentes dans deux milieux d'origine différente, par une seule série de mesures réalisée sur un échantillon unique, pour comparer directement les profils protéiques ou peptidiques des deux milieux. Ce but est atteint d'une part grâce à un procédé et à un kit de marquage des amines primaires et d'autre part grâce à un procédé d'analyse des amines primaires, objets de l'invention. Plus précisément l'invention se rapporte à un procédé de marquage d'entités portant une fonction amine primaire (N) en vue de leur analyse quantitative et structurale consistant essentiellement à faire réagir en une étape lesdites amines primaires avec: - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites amines primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. Un autre objet de l'invention est un kit comprenant au moins: - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec les amines primaires (N), - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. Les trois composants, à savoir l'amine primaire à analyser, le réactif colorant (F) et le réactif de substitution (S) réagissent en une étape, avec un rendement réactionnel proche de 100%. Les composés obtenus sont fluorescents. Ils donnent par ionisation une fragmentation préférentielle résultant en la perte de la chaîne latérale apportée par le réactif de substitution (S) facilement identifiable en spectrométrie de masse. Cette fragmentation très spécifique permet par exemple de réaliser des expériences de suivi dans le temps de la fragmentation unique ou multiple ("single réaction monitoring" ou "multiple réaction monitoring") très efficaces, sélectives et sensibles. Il a pu être développé également sur la base du procédé de marquage et du kit selon l'invention, un procédé d'analyse des amines primaires, de haute sensibilité, fiable, rapide et facile à mettre en oeuvre, destiné à l'étude des peptides et des protéines ou encore des acides aminés, contenus dans de très faibles volumes et/ou à très faibles concentrations, à la fois en termes quantitatifs (dosage) et en termes de structure (identification). Certains des colorants de fluorimétrie utilisables en tant que marqueurs des amines primaires dans la présente invention sont déjà connus. Cependant, ces marqueurs de fluorescence n'ont été utilisés jusqu'à présent que pour une détermination quantitative de molécules connues (par comparaison à un étalon), l'émission à la longueur d'onde de fluorescence étant proportionnelle à la concentration dans l'échantillon. L'utilisation de ce type de réactifs est proposée ici pour l'étude à la fois quantitative et structurale des amines primaires, en vue d'une identification complète de molécules d'intérêt. Ce résultat particulièrement intéressant est obtenu notamment grâce à la dérivation de ces molécules fluorogènes par des groupements ionisables, rendant ainsi ces marqueurs utilisables pour le dosage en spectrométrie de masse des très faibles concentrations d'amines primaires. On obtient alors un marqueur binaire associé à la molécule cible, les produits de réaction étant détectables tels quels par deux méthodes d'analyse distinctes, même à des concentrations micromolaires, voire nanomolaires. En effet, de manière inattendue, la réaction des amines primaires avec le marqueur binaire selon l'invention présente un rendement et une spécificité excellents, la totalité des amines primaires et elles seules réagissant avec les réactifs de marquage. Les techniques d'analyse employées montrent également une sensibilité exceptionnelle vis-à-vis des amines marquées selon l'invention, ce qui permet d'atteindre le résultat souhaité. Sans chercher à fournir une théorie explicative à l'effet synergique observé, l'hypothèse peut être formulée que la présence d'un réactif apportant un groupement ionisable favorise l'association des trois composants amine primaire-réactif fluorogène-réactif de substitution. Il semble même que la présence de l'amine soit décisive pour la fixation du réactif de substitution ionisable sur le réactif fluorogène. Dans la description qui va suivre et sauf indication contraire explicite, l'invention s'étendra à toute entité portant une fonction amine primaire, c'est-à-dire aussi bien aux protéines, aux peptides et aux acides aminés, qu'à d'autres molécules portant une telle fonction pouvant exister dans un milieu, biologique ou non, à étudier. La fonction amine primaire est une des fonctions les plus répandues parmi les molécules biologiques. Cette prévalence est mise à profit par la présente invention, qui a ainsi pour objet un procédé de dosage des amines primaires, destiné à l'étude des entités aminées. Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (F) correspond à une molécule capable de former un composé fluorescent avec les amines primaires. Le réactif (F) est de préférence un dialdéhyde aromatique fluorogène, qui peut être choisi avantageusement parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles. De façon non limitative, il est choisi parmi les réactifs suivants naphthalène2, 3dialdéhyde (NDA), orthophthal-dialdéhyde (OPA), anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués. O naphthalène2,3dialdéhyde (NDA) orthophthal-dialdéhyde (OPA) O anthracène dialdéhyde (APA) Ces réactifs dorment avec les amines primaires des dérivés ayant de bons rendements de fluorescence. La stabilité des composés formés a été vérifiée par des études de spectrométrie de masse: elle est suffisante pour conduire les analyses dans de bonnes conditions (Manica D.P., Lapos J.A., Jones A.D., Ewing A.G. , Anal. Biochem., 2003, 322, pp.68-78). Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (S) correspond à une molécule capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. La faculté d'ionisation du groupement apporté par le réactif (S) est considérée avant fixation sur le réactif (F). Dans la présente invention, un groupement ionisable est défini comme un groupe dont le pKa est compris entre 2 et 12. Les expressions "groupement ionisable", "thiol ionisable", ... feront quant à elles référence à la faculté d'ionisation dudit groupement avant ou après sa fixation au réactif (F). Le réactif (S) est de préférence capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'amine primaire (N). C'est avantageusement un thiol ionisable, qui peut être choisi parmi les composés de formule R SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire. De tels thiols de formule générale R SH sont en effet facilement ionisables. Utilisés en combinaison avec le dialdéhyde aromatique ils forment, après réaction avec l'amine à étudier, des composés fluorescents dérivés par un groupement soufré. La perte spécifique de la chaîne thiol lors de la fragmentation du composé marqué aboutit à la formation d'un ion caractéristique majoritaire, bien identifiable en spectrométrie de masse, ce qui explique la haute sélectivité de la méthode. Il est recommandé, pour éviter les confusions avec les amines à étudier, de ne pas utiliser un composé de formule R SH où R porterait un groupement fonctionnel amine primaire. De manière préférée, le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée du type (CH2)x A, avec x 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe amine primaire. Selon un mode de réalisation préféré non limitatif de l'invention, le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes amine secondaire, amine tertiaire, amine quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H. La présence d'un tel groupement fonctionnel sur le thiol accroît la polarité du thiol, ce qui d'une part augmente sa réactivité vis-à-vis du réactif (F) et d'autre part favorise la formation d'un ion caractéristique majoritaire jouant excellemment son rôle de marqueur en spectrométrie de masse. Les aminothiols et les carboxythiols sont particulièrement préférés. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit de marquage est utilisé pour le marquage d'amines dans des échantillons différents, souvent en vue de réaliser une comparaison entre les milieux desquels proviennent ces échantillons, qui peuvent par exemple être prélevés sur deux organismes différents à comparer du point de vue de leur profil protéique ou peptidique. Cette paire d'échantillons peut aussi être constituée d'un échantillon provenant d'un milieu à étudier et d'un échantillon étalon. Les réactifs de substitutions (S) du type R SH sont facilement synthétisés et il est facile d'obtenir un réactif (S) marqué isotopiquement soit par des atomes de deutérium soit par des atomes de C 13 (réactif lourd) et gardant les mêmes qualités chromatographiques que le réactif léger. C'est le cas en particulier des aminothiols (par exemple aminothiols linéaires de formule BIB2N (CH2)x SH, où BI et B2 ne sont pas l'hydrogène en même temps) et des carboxythiols (par exemple carboxythiols linéaires de formule HOOC (CH2)x SH) qui permettent d'obtenir des étalons isotopiques bons marchés, pouvant être utilisés en fluorimétrie, en fluorimétrie induite par laser et en spectrométrie de masse. Il est également aisé de synthétiser des réactifs (S) du type A (CH2)x SH dont le groupement A (CH2)x est différent: on peut par exemple faire varier la valeur de x pour avoir des chaînes (CH2)x plus ou moins longues, ou bien faire varier B I et B2 portés par l'amine dans les aminothiols. Ainsi, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (S) peut être remplacé par un isotope stable. Le kit de marquage correspondant comprend alors i) un premier réactif (S) et ii) un second réactif (S') de même formule que le premier réactif (S) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable. De préférence, en spectrométrie de masse, quatre atomes au moins sont substitués par leur isotope lourd. De manière alternative ou simultanée, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (F) peut également être remplacé par un isotope stable. Dans ce cas, le kit de marquage correspondant comprend i) un premier réactif (F) et ii) un second réactif (F') de même formule que le premier réactif (F) dont au moins un atome est remplacé par un isotope stable. Lorsque l'on utilise deux versions (S) et (S') du réactif de substitution ou deux versions (F) et (F') du réactif colorant, on appelle "réactif léger" celui qui ne contient pas d'isotope et "réactif lourd" celui qui contient au moins un isotope lourd stable d'un de ses atomes. Par extension, on appellera "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire présentes dans deux échantillons comprend un premier réactif (Si) et un second réactif (S2) de formules respectives RI SH et R2 SH, dans lesquels RI et R2 sont des chaînes carbonées linéaires ou ramifiées portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire, et où RI et R2 ont des masses différentes. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il évite d'avoir recours à la synthèse d'un composé lourd servant d'étalon interne en spectrométrie de masse. Lorsque l'on utilise deux versions (Si) et (S2) du réactif de substitution, on appelle "réactif léger" celui qui a la chaîne carbonée la plus courte, et "réactif lourd" celui qui a la chaîne carbonée la plus longue. Par extension on appelle "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd. Selon un autre mode particulier de réalisation du procédé et du kit de marquage selon l'invention, le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique et il est optiquement pur. On peut de la sorte facilement séparer les couples d'énantiomères d'une amine primaire optiquement active. En effet, ce réactif forme avec une amine primaire ayant un carbone asymétrique un couple de diastéréoisomères dont certaines propriétés physiques sont différentes, notamment leur hydrophobie. Les diastéréoisomères, élués à des vitesses différentes, pourront donc être séparés et analysés individuellement. Selon une caractéristique intéressante du procédé de marquage selon l'invention, les réactifs (F) et (S) peuvent être introduits dans un échantillon biologique pour marquer les entités portant une fonction amine primaire dudit échantillon biologique. En effet, comme déjà indiqué, dans le procédé selon l'invention, les deux réactifs sont capables de réagir sélectivement avec les amines primaires, en une étape, pour donner des composés détectables tels quels, par fluorimétrie et par spectroscopie de masse. Cette réaction présente le grand avantage de conserver un bon rendement et une grande sélectivité vis-à-vis des amines primaires même dans un milieu complexe tel qu'un milieu biologique. Les entités marquées, formées avec l'ensemble des amines primaires présentes dans ledit milieu, peuvent ensuite être séparées, identifiées et quantifiées grâce au procédé d'analyse selon l'invention qui sera décrit plus loin. Le procédé de marquage et le kit conformes à l'invention ci-dessus décrite peuvent être appliquées au marquage des amines primaires provenant de toutes sortes de milieux biologiques, par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral et de tout type d'environnement et de prélèvements,d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie. Ils sont particulièrement adaptés au marquage des amines primaires dans un échantillon biologique. Enfin, un autre objet de l'invention est un procédé d'analyse des amines primaires présentes dans un échantillon, mettant en oeuvre le procédé de marquage précédemment décrit. Ce procédé d'analyse comprend essentiellement les étapes consistant à : a) marquer les amines primaires par le procédé de marquage tel que décrit ci-dessus, b) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir des fractions, c) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. Le kit de marquage selon l'invention peut bien entendu être avantageusement utilisé pour la mise en oeuvre du procédé d'analyse cidessus. Le procédé d'analyse selon l'invention permet aussi l'analyse des amines primaires présentes dans deux échantillons, en ayant recours à deux réactifs de substitutions ou à deux réactifs colorants formant les couples "léger-lourd" décrits précédemment notés [(F),(S)] à savoir un couple S-S', S1-S2, ou F-F'. Ce procédé comprend essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux échantillons par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) traiter les échantillons par au moins une technique séparative pour obtenir deux séries de fractions distinctes, c) soumettre les deux séries de fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. Bien entendu, le procédé d'analyse peut être réalisé à l'aide du kit de marquage des amines primaires décrit précédemment en utilisant différents couples de réactifs. De manière particulièrement avantageuse, le procédé d'analyse selon l'invention permet de réaliser l'analyse des amines primaires présentes dans deux milieux distincts, en une seule série de mesures sur un échantillon unique obtenu par réunion des deux milieux. Le procédé comprend alors essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux milieux par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) réunir les deux milieux en un échantillon unique, c) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir une série unique de fractions, d) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. On appellera "milieu" une solution contenant des substances connues ou indéterminées en plus ou moins grand nombre, pouvant provenir par exemple d'un prélèvement biologique, ou encore préparée pour les besoins expérimentaux, et on appellera "échantillon" la fraction prélevée sur un milieu en vue de la soumettre à l'analyse. A noter que dans le cas général, un échantillon donné est prélevé à partir d'un milieu donné et les deux termes pourront être synonymes. On forme ainsi après marquage, un échantillon unique à partir de deux prélèvements sur des milieux distincts, pour obtenir par une seule série de mesures des informations qualitatives et quantitatives sur les deux milieux, qu'il est alors possible de comparer de manière directe. Ce mode d'analyse est de ce fait extrêmement puissant et constitue un résultat particulièrement important de la présente invention. Le procédé d'analyse selon l'invention peut être mis en oeuvre selon divers protocoles présentant différents avantages, ce que permet parfaitement la méthode de marquage des amines primaires revendiquée. Selon un mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention le second échantillon comprend au moins une amine primaire connue à une concentration connue. Il peut ainsi constituer un étalon interne vis-à-vis du premier échantillon, permettant un dosage quantitatif. Selon un autre mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention, les étapes de marquage sont réalisées après l'étape de séparation. Selon encore un autre mode de réalisation intéressant du procédé de l'invention, seules les fractions fluorescentes sont analysées par spectrométrie de masse. Ceci permet de n'enregistrer que les résultats utiles provenant des fractions contenant une molécule d'intérêt et d'optimiser le travail de traitement des données en aval. Le procédé d'analyse selon l'invention s'applique particulièrement à l'analyse quantitative et structurale des amines primaires présentes dans des échantillons biologiques. L'échantillon peut provenir de différentes origines. Il peut être par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral. Il peut provenir de tout type d'environnement et de prélèvements, d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie. L'intérêt de disposer d'un marqueur unique de haute réactivité chimique pour les études en spectrométrie de masse et fluorimétrie classique ou induite par laser est multiple, du fait des potentialités offertes par le double marquage permettant un puissant couplage de ces techniques, notamment: - distinguer et identifier des molécules ayant les mêmes temps de migration en techniques séparatives: elles donnent des pics identiques en fluorimétrie, alors que la spectrométrie de masse permettra leur séparation et leur quantification grâce à la mesure de l'abondance des ions de ratios m/z différents. - avoir deux méthodes de détection totalement différentes permettant de confirmer l'exactitude et la précision du résultat obtenu par une des méthodes et ainsi diminuer le risque d'erreur. - signaler à l'expérimentateur que des molécules en très faible concentration, détectées par fluorimétrie induite par laser, ne pourront pas l'être en spectrométrie de masse (dont les seuils de détections des concentrations sont supérieurs). - lorsque le détecteur de fluorescence est installé entre l'étape de séparation et la source d'ionisation ou la plaque de dépôt (MALDI), on pourra effectuer des acquisitions de données en spectrométrie de masse uniquement pour les molécules marquées: les molécules fluorescentes peuvent être détectées et orientées rapidement vers la source d'ionisation ou la plaque de dépôt. - pouvoir identifier plus facilement des molécules autres que les amines primaires (et donc non marquées) à partir d'un même spectre de masse, par analyse d'abord des données se rapportant aux amines primaires puis des données restantes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples suivants qui illustrent des modes de réalisations possibles de la présente invention sans toutefois la limiter à ceux-ci. La puissance et l'universalité de la méthode de marquage et d'analyse des amines primaires seront particulièrement mis en relief. Exemple 1 Marquage, séparation et analyse d'un échantillon Dans cet exemple, un protocole type est décrit, avec les indications nécessaires à son adaptation à différents types de milieux à étudier. Le réactif fluorogène est le NDA. Le réactif de substitution est le N,Ndiméthylaminoéthylthiol de formule HS-CH2--CH2-N(Me)2. Le marquage d'un échantillon d'un volume de 1 l contenant des peptides ou des protéines à des concentrations de l'ordre de la nM, est réalisé en une étape, à température ambiante. On ajoute 5 l d'une solution de NDA à 5 pmol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 l d'une solution d'aminothiol à 15 'amolli dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On mélange au vortex pendant une minute, on laisse réagir au moins 10 minutes. Pour une bonne fiabilité des résultats, on considère que la quantité de NDA doit être au moins 3 à 10 fois plus importante que la quantité totale des amines primaires. La concentration en aminothiol doit être de préférence au moins 2 à 3 fois plus importante que celle du NDA. Pour un échantillon particulièrement concentré en protéines, peptides et acides aminés, on peut augmenter les volumes des solutions de NDA et de thiol afin que toutes les molécules contenant des fonctions amines primaires soient marquées, le reste des manipulations restant identique. Dans un second temps, l'échantillon marqué est soumis aux techniques séparatives connues avant analyse. Par exemple, 1 l d'échantillon marqué est injecté en HPLC phase inverse (colonne C18, 3 pm, 3 mm de diamètre interne, 15 cm de longueur) à un débit de 5 l/mn. On utilise un solvant tel que acétonitrile/eau acidifiée avec 0,1% de TFA (acide trifluoroacétique) selon un gradient du type suivant: Temps (min) % H2O; 0,1% TFA; pH = 2 % AcN 0 64 36 9 64 36 30 70 Un autre solvant, par exemple un solvant méthanol / eau avec un gradient adapté en fonction des différentes molécules à analyser peut aussi être utilisé pour faire migrer les différentes molécules. Tout type de colonne chromatographique peut être employé, les colonnes de phase inverse étant très habituellement choisies pour ce sujet, mais des colonnes échangeuses d'ions peuvent aussi être utilisées sans difficulté avec des conditions d'élution adaptées. La séparation peut également être réalisée par électrophorèse capillaire (CE). Dans un troisième temps, l'échantillon est analysé par fluorimétrie etlou par spectrométrie de masse. Un détecteur de fluorescence induite par laser (ZETALIF 2000TM, modèle 410 ou 442, Picometrics, Ramonville, France) est connecté en sortie de colonne chromatographique pour recevoir les fractions obtenues. L'excitation de l'échantillon est réalisée à une longueur d'onde de 442 nm ou de 410 nm qui sont les deux longueurs d'onde proches des maxima d'absorption dans le visible des composés isoindoles. L'émission fluorescente est détectée au dessus de 460 nm ou de 430 nm. A la sortie du fluorimètre, est connectée la source ESI d'un spectromètre de masse (ESIQtof, UltimaTM, Micromass Waters), ou un "spotter" (déposeur automatique d'échantillons) pour l'ionisation MALDI. Exemple 2 Étude quantitative sans standard isotopique par analyse en infusion directe en spectrométrie de masse (MS) ionisation electrospray (ESI). Le but est de déterminer la masse d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, sans séparation préalable. Principe On utilise un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (S 1 et S2). Dans cet exemple le marqueur (F) est le NDA. Les marqueurs S1 et S2 sont des aminothiols portant des substituants différents, à savoir le marqueur léger N,Ndiméthyl-aminoéthylthiol (Sigma) , noté G1, et le marqueur lourd N,N diéthylaminoéthylthiol (Sigma), noté G2. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704, 6. Réalisation d'un courbe étalon Une gamme de concentration du peptide à doser est réalisée à partir d'une préparation standard du commerce. Le marquage du peptide est réalisé avec NDA+G2 comme décrit à l'exemple 1. Le peptide marqué avec G1, à une concentration fixe, est aussi présent dans chaque solution. Les différentes solutions sont analysées. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704,6. A partir du spectre de masse, on repère les pics et on calcule le rapport de la hauteur des pics correspondant au peptide marqué avec NDA+G1, et avec NDA+ G2. En faisant varier la concentration du peptide marqué avec NDA+G2 et en gardant constante la concentration du peptide marqué avec NDA+G1, on obtient une droite d'étalonnage: le rapport des teneurs mesurées expérimentalement (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) est porté en ordonnée. Le rapport calculé à partir des valeurs de la gamme utilisée est porté en abscisse. Dosage du peptide dans un échantillon Pour déterminer la concentration du peptide dans un échantillon quelconque, il suffit de faire réagir les marqueurs NDA+G1 (de rapport m/z = 809,7) avec les amines primaires dudit échantillon, d'y ajouter une quantité connue du peptide marqué avec NDA+ G2 (de rapport m/z = 837,8) puis de déterminer le rapport (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) expérimental à partir des valeurs obtenues sur le spectre de masse. On lit alors le rapport théorique correspondant d'où on tire la concentration du peptide dans l'échantillon étudié. Illustration: dosage de la leucine-enképhaline Le dosage a été réalisé sur un échantillon test de composition connue, afin de valider la méthode. É Protocole de marquage - Solution 1: 10 pl de marqueur G1 à 2 mmol/1(diluée dans H2O), 10 pl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/l, 2 pl de NEt3 à 1.00 mmol/l (Sigma) et 80 l de leucine-enképhaline standard (Sigma) à 10 molli dans l'eau. - Gamme de solutions 2:10 l de marqueur G2 à 2 mmol/l (diluée dans H2O), 10 gl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/l, 2 l de NEt3 à 100 mmol/l (Sigma) et 80 l de leucine-enképhaline standard (Sigma) aux concentrations de 0,5 mmol/l à 50 mol/l dans l'eau. É Protocole de dilution -10 l de solution 1 et 10 l de solution 2 sont introduits dans 980 l de solution acétonitrile/eau (1:1) avec 0.1% de HCOOH. La solution diluée est introduite par infusion dans la source ESI du spectromètre de masse ESIQtof (Ultima, Micromass Waters), grâce à une pompe à seringue. La concentration en leucine-enképhaline marquée G2 des différentes solutions diluées se situe donc entre 5 nmoll et 500 nmol/1 et la concentration en leucine-enképhaline marquée G1 est de 100 nmol/1 dans toutes les solutions diluées. É La courbe étalon obtenue est présentée Figure 1. C'est une droite d'équation y = 0,982 x 0,061, avec un coefficient de régression linéaire R2 = 0,996. La pente est très proche de 1 et l'ordonnée à l'origine est proche de zéro. Ce résultat montre d'une part que la méthode de dosage est linéaire sur une échelle de concentration de deux décades, la limite de quantification en spectrométrie de masse simple étant inférieure à 5 nmole/1 niveau inégalé à ce jour , et d'autre part que la dérivation des marqueurs n'affecte pas les propriétés d'ionisation du peptide marqué. Cette propriété très importante permet d'atteindre des seuils de sensibilité inédits, et qui n'ont pas pu être atteints en utilisant comme co-réactif le KCN (voir les études menées de façon comparable, par exemple K. Linnemayr et al., J. Mass Spectrom., 1999, 34, pp. 427-434). Le spectre de masse présenté Figure 2 à titre d'exemple, illustre le type de graphe que l'on obtient. Il s'agit ici du spectre de la leucineenképhaline à 10-6 molli, marquée avec NDA+G 1 et NDA+G2 dans la proportion de 1:2. - Le pic de rapport m/z = 837,8 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G2. - Le pic de rapport m/z = 809,7 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G1. - Le pic de rapport m/z = 704,6 est celui du fils des deux ions moléculaires précédents; il représente le total de la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G 1 et NDA+G2, et ayant perdu le co-réactif aminothiol (G1 ou G2). - On constate que le pic de rapport m/z = 809,7 est environ deux fois supérieur au pic de rapport m/z = 837,8, ce qui correspond bien au rapport des concentrations injectées de G1 et G2. Le fait que la fragmentation donne une perte abondante du marqueur aminothiol permet de caractériser avec certitude le peptide marqué et non pas un autre ion isobare, ayant le même rapport m/z, mais non marqué (des molécules ne portant pas de fonction amine primaire). Par exemple, pour un marqueur aminothiol donnant un ion de masse 133, il est facile de repérer un couple de pics distants de 133 unités, correspondant à l'ion moléculaire d'un peptide et à son marqueur. La fragmentation des peptides marqués selon l'invention au niveau de l'aminothiol étant particulièrement importante, la perte du groupe marqueur est bien visible et facilement identifiable, ce qui confère une sélectivité quasi totale à la méthode. Le fait de pouvoir distinguer avec certitude les amines primaires des autres molécules apporte un avantage très appréciable pour l'étude des milieux complexes. Enfin, cet exemple montre bien la relation linéaire, établie par la droite étalon, entre le rapport des hauteurs de pic et le rapport des concentrations, même lorsque les deux co-réactifs (G1 et G2) sont différents. Dans cet exemple, G1 et G2 peuvent être aussi une molécule de même structure chimique, avec G2 contenant 6 atomes de deutérium, ou de C13. Sur les mêmes échantillons, en reportant le rapport d'intensité des deux pics des composés lourds sur les deux pics des composés légers en fonction de la concentration de l'enképhaline marquée avec la chaîne lourde, on obtient une courbe d'étalonnage qui est une droite. Le dosage de l'enképhaline peut aussi être fait en CE/LIF, en HPLC/fluorescence, ou en HPLC/fluorescence. Exemple 3 Étude quantitative sans standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie laser (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne. Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie. On peut faire appel aussi bien à la chromatographie liquide (LC) qu'à la technique d'électrophorèse capillaire (CE). Le détecteur LIF est connecté à la sortie de la colonne chromatographique (ou sur le capillaire). A la sortie du fluorimètre, est connectée la source d'un spectromètre de masse Le but est de déterminer la quantité d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, avec séparation préalable. L'espèce à doser doit être identifiée avec certitude avant analyse quantitative. Plusieurs espèces peuvent être étudiées dans un même échantillon. Selon la méthode proposée, la MS permet d'identifier les espèces amines primaires préalablement séparées, et notamment de nouveaux peptides, protéines ou acides aminés marqués. Ces peptides ou protéines ou acides aminés marqués, sont aisément identifiables par la perte de neutre du marqueur ionisable (S) (dans le présent exemple, un aminoacylthiol). La détection LIF permet de quantifier les amines primaires correspondantes grâce à la surface des pics. La MS permet en outre la détermination structurale des nouvelles molécules détectées. Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par le dosage d'une solution modèle d'arginine. Préparation des échantillons L'arginine (Sigma) est marquée par le NDA et l'aminothiol G1 (N,N diméthyl2aminoéthylthiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prend 1 l d'échantillon d'arginine à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/1), puis on ajoute 5 l de solution de NDA à la concentration de 5 pmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 l d'aminothiol G1 à 15 mol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. Séparation et analyse La séparation a lieu en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 m, 2,1x150 mm (Waters X-Terra RP-182E), avec un débit de 400 l/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de 1acétonitrile. Le gradient d' élution est de 64% de tampon A / 36% d'acétonitrile pour le To en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent être choisis sans difficulté par l'homme de l'art. Le volume d'injection est de 5 l (ou plus petit). A la sortie de la colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF. Sur le spectre de masse, on repère l'ion moléculaire (M+H)+, on note le rapport masse/charge (m/z). Cet ion est obtenu par la perte importante et sélective par l'arginine marquée par le NDA+GI d'un groupe (M+H-105) correspondant à l'aminothiol G1. La perte est sélective de l'ion parent (M+H)+. On répète l'analyse avec les échantillons à différentes concentrations en arginine et on établit la courbe étalon mettant en relation la concentration en arginine (exprimée en nmol/1) et la surface du pic chromatographique. La courbe étalon (non représentée) est une droite d'équation y = 6.710-4 [arginine] + 0.089. Pour un échantillon à étudier, la MS permet d'abord d'identifier l'arginine sans ambiguïté grâce à l'ion de masse (M+H-105) associé à l'ion moléculaire, tandis que la fluorescence détectée par le détecteur LIF permet de doser l'acide aminé identifié grâce à la courbe étalon. Le spectre MS apporte aussi des données quantitatives, permettant la confirmation du dosage par fluorimétrie. Exemple 4 Étude quantitative avec standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne. Principe Le principe et le but du dosage sont les mêmes qu'à l'exemple 3, le dispositif d'analyse est identique (colonne de séparation, fluorimètre, MS). Par contre, on travaille ici avec un étalon interne (donc sans recourir à une courbe étalon). Le composé à doser étant connu (l'arginine dans le présent exemple), on effectue la réaction de marquage avec un couple de marqueurs (F)+(S léger) dans le milieu à étudier, et on prépare une solution contenant ledit composé à une concentration définie, celui-ci étant marqué avec un couple de marqueurs (F)+(S lourd). Les deux solutions sont réunies en un échantillon unique qui est analysé. Préparation des échantillons L'arginine à doser est marquée par le NDA et l'aminothiol léger Gl (N,N diméthyl2aminoéthylthiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prépare en parallèle une solution d'arginine standard à 100 nmol/l, qu'on marque avec le NDA et l'aminothiol lourd G2 (N,N diéthyl2aminoéthylthiol). - NDA: 5 pl de solution à 5 mol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7; - aminothiol: 5 l à 15!amolli dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume pour former un échantillon unique qui est soumis à analyse comme décrit à l'exemple précédent. Les composés marqués sont élués à des vitesses différentes selon le marqueur associé, et donnent deux signaux fluorescents distincts proportionnels à leur concentration. Le spectre de masse permet de vérifier la nature du composé dosé par la masse des deux ions moléculaires associés un ion fils unique, le rapport des hauteurs des pics donnant le rapport des concentrations en arginine "lourde" (étalon interne) et "légère" (à doser). On peut ainsi faire un dosage quantitatif de l'arginine dans un milieu quelconque. Exemple 5 Analyse comparative d'échantillons provenant de deux milieux différents par spectrométrie de masse ESI-MS et détection LIF, avec marquage précolonne. Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie liquide (LC) ou électrophorèse capillaire (CE). Comme dans l'exemple 3 le détecteur LIF est connecté en sortie de colonne LC ou sur le capillaire de CE, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse. Le but est de fournir un outil permettant de comparer des milieux complexes, tels que des milieux biologiques, par exemple des microdialysats, l'un issu d'un organisme sain et l'autre d'un organisme présentant une anomalie (maladie ou autre). Ils contiennent un mélange de peptides dont on souhaite connaître la proportion relative dans chaque milieu. Les différences relevées entre les deux milieux permettront de sélectionner certains peptides pour les étudier quantitativement et qualitativement en vue par exemple de mieux connaître les mécanismes de la maladie et la traiter, ou de disposer d'une molécule indicatrice de son évolution. Un fois ce ou ces peptides sélectionnés, on pourra appliquer les méthodes décrites dans les exemples précédents, ou des variantes de celles-ci adaptées au type d'information recherchée, pour approfondir leur étude spécifique. Principe On utilise ici un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (S) et (S'). Les marqueurs (S) et (S') seront chimiquement identiques, mais dans (S'), certains atomes d'hydrogène ou de carbone ont été remplacés par un isotope lourd stable. Selon la méthode proposée, le premier milieu (Ml) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S) (léger), le deuxième milieu (M2) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S') (lourd). Tous les composés portant une fonction amine primaire présents dans les milieux vont être marqués par l'un ou l'autre couple de marqueurs. Après marquage, les milieux sont mélangés pour former un échantillon mixte, qui est analysé. 10 Le spectre de masse permet d'identifier les pics correspondants aux composés lourds et légers associés à un même peptide présent dans les deux milieux, et de calculer le ratio lourd/léger pour faire un dosage relatif, en se fondant sur la différence d'intensité des ions dont le rapport m/z diffère du nombre d'atomes de deutérium ou de C13 introduits dans le marqueur de substitution (S'). En effet, comme précédemment expliqué, chacun des composés marqués est identifié grâce à sa perte spécifique à haut rendement du marqueur de substitution. La détection LIF permet quant à elle de quantifier de façon absolue la concentration totale des composés marqués (F)+(S) et (F)+(S') (lourd + léger) qui co- migrent. Illustration: analyse de deux solutions contenant de la met-enképhaline Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par l'analyse de deux solutions modèles de met-enképhaline. Dans cet exemple le marqueur (F) sera le NDA. Le marqueur (S) sera l'aminothiol G1 (HS-CH2CH2-N(CH3)2) et (S') sera l'hexadeutérodiméthyl2 aminoéthylthiol (HS-CH2CH2-N(CD3)2), noté G1D. Ces deux marqueurs ont une différence de masse = 6. É Analyse qualitative Préparation des échantillons On prépare les deux solutions modèles de met-enképhaline représentant les milieux M1 et M2 de concentrations Cl et C2 inconnues (ici de 500 nmol/1 et 100 nmol/1, respectivement), qui devront être déterminées. On prend 1pl de milieu M1, on ajoute 5 pl de solution de NDA à 5 pmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7 avec 5 pl d'aminothiol léger G1 à 15 gmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On répète l'opération avec le milieu M2, le NDA et l'aminothiol G1D. Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume. Séparation et analyse La séparation est effectuée en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 m, 2,1 x150 mm (Waters X-Terra RP-18k), avec un débit de 400 gl/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de lacétonitrile. Le gradient d'élution est de 64% de tampon A / 36% d'acétonitrile pour le To en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent 10 15 être définis sans difficulté par l'homme de l'art. Le volume d'injection est de 5 pl (ou plus petit). A la sortie de la colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est aussi connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF. Le spectre de masse obtenu (non représenté) montre des ions (M+H)+ (pic m/z = 827,6) et (M+H+6)+ (pic m/z = 833,6) correspondant au composé marqué avec l'un ou l'autre des couples de marqueurs. A ces ions on peut associer un ion fils unique obtenu après la perte d'une part de la molécule marquée de NDA + Gl (à M+H-105 pour la perte de l'aminothiol léger G1) et d'autre part de la molécule marquée NDA + G1D (à M+H-6-105 pour la perte de daminothiol lourd G1D). Insistons encore une fois sur le fait que la perte est massive et est sélective de l'ion parent (M+H)+ ou (M+6+H)+. Le repérage de couples de pics présentant une différence de rapport m/z = 105 ou 105+6, permet d'affirmer que le composé détecté a bien été soumis au marquage et est donc bien une amine primaire. La masse de cet ion fils est de 827,7 ce permet d'identifier la méthionine enképhaline avec certitude. Le rapport des hauteurs des deux pics (M+H)+ / (M+H+6)+ mesuré sur le spectre est de 5. On conclut donc que le rapport des concentrations de la met-enképhaline dans le deux milieux étudiés est de 5. É Analyse quantitative Réalisation d'une courbe étalon Le composé étudié étant identifié, on peut maintenant préparer des solutions de différentes concentrations avec un produit du commerce pour établir une courbe étalon. Le protocole de dosage de la met-enképhaline marquée par NDA+G1 est le suivant. On mélange 111l de solution de met-enképhaline (Sigma) à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/l), avec 5 pl de solution de NDA à 5 p.mol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, 5 l d'aminothiol G1 à 15 mol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. Les différentes solutions sont analysées en HPLC-LIF selon le même mode opératoire que ci-dessus. La fluorescence détectée par le détecteur LIF au niveau du pic du chromatogramme correspondant au composé étudié est fonction de la concentration en met-enképhaline. La courbe étalon obtenue est une droite d'équation (avec la concentration exprimée en nmol/l) : y = 310-4 [met-enképhaline] + 0,170. Dosage dans l'échantillon mixte Les couples de marqueurs utilisés pour préparer l'échantillon mixte de cet exemple étant chimiquement identiques, les molécules de met-enképhaline marquées comigrent et forment un pic unique en chromatographie, dont la fluorescence est proportionnelle à la concentration de met-enképhaline. La valeur de la fluorescence mesurée est de 0,350 RFU (Relative Fluorescence Unit). Il suffit de reporter l'intensité de la fluorescence mesurée au niveau du pic chromatographique sur la courbe étalon pour obtenir la valeur absolue de la concentration totale en met-enképhaline de l'échantillon mixte. Elle est égale à 600 nmol/l en tenant compte de la dilution. La concentration respective dans chaque milieu est calculée à partir du rapport 1:5 précédemment obtenu. Le résultat du calcul indique que le milieu M1 contient 500 nmol/l, tandis que le milieu M2 contient 100 nmol/l, ce qui est conforme aux concentrations fixées pour les solutions modèles de cet exemple. Ainsi, le dosage relatif en MS et absolu en fluorescence permet de déterminer la concentration absolue du peptide léger dans le mélange lourd plus léger. La MS permet de le doser et de l'identifier sans ambiguïté grâce à la masse des ions (M+H-105), et M+H-111). Remarque Pour améliorer la sensibilité de détection on peut doser la molécule en MS/MS par la méthode dite "père recherche fils" (single ion monitoring ou multiple ion monitoring) ou encore "fils recherche père", bien connues de l'homme du métier. Ceci permet de disposer d'une valeur obtenue par une technique distincte à partir d'un même échantillon. Exemple 6 Marquage post colonne Les molécules portant une fonction amine primaire peuvent être marquées après la séparation chromatographique. Dans ce cas, le flux de liquide est soumis à la réaction de marquage en sortie de colonne chromatographique, puis dosé par détection LIF, et enfin entre dans la source ESI-MS. Cette méthode évite à l'expérimentateur d'effectuer la réaction de marquage précolonne. Cette technique est illustrée par le marquage avec le marqueur de fluorescence (F)=aminothiol Gl et marqueur de substitution (S)=NDA. La séparation se fait en milieu pH=8,7 dans une micro-colonne C18 de 0,3 mm de diamètre avec un débit de 5 l/mn. A la sortie de la colonne est disposée une puce de réaction (Upchurch) à deux entrées-une sortie comportant une chambre de mélange. Le flux de liquide provenant de la colonne chromatographique entre dans l'entrée 1, un mélange NDA (4,3!mol) et d'aminothiol G1 (12,9 pmol/l) entre dans l'entrée 2 avec un débit de 5 pl/mn. La réaction de marquage se fait dans la puce de réaction. La sortie de la puce de réaction est raccordée au détecteur de fluorescence ou au détecteur LIF puis au spectromètre de masse, pour réaliser l'analyse comme précédemment décrit. Exemple 7 Marquage par des couples de réactifs [(F),(S)] différents, de même hydrophobie. L'objectif ici est de mimer la technique d'électrophorèse DIGE (Dlfferencial Gel Electrophoresis) c'est-à-dire de d'utiliser deux agents fluorogènes excitables à deux longueurs d'onde différentes, mais ayant la même hydrophobie (Marouga R., David S., Hawkins E., Anal. Bioanal. Chem., 2005, 382, pp. 669-78). Par la technique DIGE on peut distinguer par fluorimétrie des composés ayant été co-élués. Cependant, une fois la fraction intéressante identifiée sur le gel, sa récupération en vue d'analyse complémentaire est problématique. L'intérêt de la méthode d'analyse selon l'invention est d'obtenir des composés marqués co-élués en sortie de chromatographe, pouvant être analysés par fluorimétrie et par MS sans traitement intermédiaire. On utilise pour cela deux couples de marqueurs [(F1),(SI)] et [(F2),(S2)]. - [(F1),(S1)] : anthracène dialdéhyde (ADA) et aminothiol à chaîne carbonée courte par exemple HSCH2N(CH3)2 - [(F2),(S2)] : naphtalène dialdéhyde (NDA) et aminothiol à chaîne carbonée plus longue par exemple HSCH2N(CH2CH3)2. L'hydrophobie du groupement fluorescent peut être modulée en utilisant des colorants portant des chaînes carbonées plus ou moins ramifiées. Après marquage, on obtient les adduits qui, ayant la même hydrophobie en HPLC en phase inverse, ont le même temps d'élution. La sortie de la colonne HPLC est connectée au détecteur LIF, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse. Le protocole opératoire est similaire à celui qui est présenté dans l'exemple 4. Les composés co-élués ont des propriétés de fluorescence différentes, des propriétés d'ionisation en MS proches, mais des masses différentes. Ainsi, par fluorescence et MS associées, ces composés sont différentiables et identifiables (analyse qualitative). Il sont dosables quantitativement si on dispose des amines primaires étalon interne. 15 20 25 30 REVENDICATIONS 1- Procédé de marquage d'entités portant une fonction amine primaire (N) en vue de leur analyse quantitative et structurale caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à faire réagir en une étape lesdites amines primaires avec: - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites amines primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. 2- Procédé de marquage selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réactif (F) est un dialdéhyde aromatique fluorogène. 3- Procédé de marquage selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles. 4- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi le naphthalène2, 3dialdéhyde (NDA), l'orthophthaldialdéhyde (OPA), l'anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués. 5- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'amine primaire (N). 6- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est un thiol comportant un groupement ionisable. 7- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comportant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire. 8- Procédé de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée du type -(CH2)x A, avec x 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe amine primaire. 9- Procédé de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes amine secondaire, amine tertiaire, amine quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H. 10- Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un au moins des atomes du réactif (S) est remplacé par un isotope lourd stable. 11- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que un au moins des atomes du réactif (F) est remplacé par un isotope lourd stable. 12- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique et est optiquement pur. 13- Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les réactifs (F) et (S) sont introduits ensemble dans un échantillon biologique pour marquer les entités portant une fonction amine primaire dudit échantillon biologique. 14- Kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire (N) présentes dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend au moins: un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites amines primaires, - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. 15- Kit de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le réactif (F) est un dialdéhyde aromatique fluorogène. 16- Kit de marquage selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles. 17- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 16 caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi le naphthalène2,3dialdéhyde (NDA), l'orthophthaldialdéhyde (OPA), l'anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués. 18- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que le réactif (S) est capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'amine (N). 19- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 18 caractérisé en ce que le réactif (S) est un thiol comportant un groupement ionisable. 20- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 19 caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comportant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire. 21- Kit de marquage selon la revendication 14 à 20 caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée du type (CH2)x-A, avec x >_ 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe amine primaire. 22- Kit de marquage selon la revendication 14 à 21 caractérisé en ce que le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes amine secondaire, amine tertiaire, amine quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H. 23- Kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (S) et ii) un second réactif (S') de même formule que le premier réactif (S) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable. 24- Kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (F) et ii) un second réactif (F') de même formule que le premier réactif (F) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable. 25- Kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (Si) de formule R1 SH et ii) un second réactif (S2) de formule R2 SH, dans lesquels RI et R2 sont des chaînes carbonées linéaires ou ramifiées portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire, et RI et R2 sont différents. 26- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 25 caractérisé en ce que le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique. 27- Application du kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 26 au marquage des amines primaires dans des échantillons biologiques. 28- Procédé d'analyse des amines primaires présentes dans un échantillon, caractérisé en ce que il comprend essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, b) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir des fractions, c) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. 29- Procédé d'analyse des amines primaires présentes dans deux échantillons caractérisé en ce que il comprend essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux échantillons par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) traiter les échantillons par au moins une technique séparative pour obtenir deux séries de fractions distinctes, c) soumettre les deux séries de fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. 30- Procédé d'analyse des amines primaires présentes dans deux milieux distincts caractérisé en ce que il comprend essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux milieux par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) réunir les deux milieux en un échantillon unique, c) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir une série unique de fractions, d) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. 31- Procédé d'analyse selon la revendication 29 ou 30 caractérisé en ce que le second échantillon ou le second milieu comprend au moins une amine primaire connue à une concentration connue. 32- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 31 caractérisé en ce que l'étape de marquage est réalisée après l'étape de séparation. 33- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 32 caractérisé en ce que seules les fractions fluorescentes sont analysées par spectrométrie de masse. 34- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 33 caractérisé en ce que l'étape a) de marquage des amines primaires est réalisée à l'aide d'un kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 26. 35- Application du procédé selon l'une des revendications 28 à 34 à l'analyse quantitative et structurale des amines primaires présentes dans des échantillons ou dans des milieux biologiques. 25 30