FR 2887457 A1 20061229 FR 0506412 A 20050623 Vaccination par ciblage transcutané La présente invention est relative à un procédé de vaccination par la voie des follicules pileux permettant de cibler vers les cellules présentatrices d'antigène des 5 composants vaccinaux afin d'induire une réponse immunitaire protectrice et efficace contre les pathogènes. La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès de campagnes de vaccination dans ces domaines a 10 permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. La vaccination par des voies dites "classiques" : intramusculaire, intradermique en solution, comporte de nombreuses contraintes lors de sa mise en pratique. Les techniques classiques de vaccination présentent en effet les désavantages de nécessiter l'utilisation d'aiguilles et par là même d'induire des problèmes de stérilité et de blessures, et sont également problématiques en termes d'instabilité des vaccins après reconstitution en solution et en cas de non-respect de la chaîne du froid lors de leur stockage et transport. De plus, la préparation vaccinale doit ensuite alors atteindre les organes lymphoïdes secondaires qui sont les sites de la réponse immunitaire. Au cours du trajet de la préparation vaccinale vers ces organes, l'antigène de la préparation peut être dilué dans les liquides corporels, piégé dans des tissus non compétents pour la réponse immunitaire attendue, ou dégradé, ce qui entraîne une perte importante de la préparation vaccinale initialement injectée. En conséquence, les quantités de vaccins injectées doivent être importantes afin de compenser ces pertes. La peau est un organe particulièrement riche en cellules présentatrices d'antigène, cellules absolument nécessaires à l'induction de réponses vaccinales puissantes et efficaces. Leur localisation et leur fonction sont particulièrement bien étudiées et connues. Il est en effet connu depuis longtemps qu'une réponse immunitaire efficace et forte peut être induite à la suite d'une dégradation de la barrière de la peau telle qu'une scarification dans le cas de la variole chez l'homme par exemple. Cependant, des études montrent qu'une vaccination par ADN plasmidique nu codant un antigène de surface de l'hépatite B en solution aqueuse sur la peau intacte de souris conduit également à des réponses immunitaires spécifiques et fortes (Fan 1999). Il a été récemment montré qu'il est possible d'induire des réponses immunitaires chez des souris à la suite d'applications topiques de vaccins sur la peau de ces animaux préalablement débarrassée des kératinocytes (Ishii N, et al., (2001) J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. Nov 6(1) pp 76-80). De même, il a été possible d'induire une réponse à de l'ADN du virus HIV chez des singes infectés par ce virus (Lisziewicz J., et al. 9' conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Seattle, February 2002). Des études ont été effectuées à la suite de la vaccination de singes avec des particules de 0,1 m de diamètre constituées de polyéthylèneimine et mannose recouvertes d'ADN. Une surface d'au moins 40 cm2 de la peau des singes a été nécessaire pour effectuer cette expérimentation. Une estimation grossière évalue à 1% le nombre de cellules de Langerhans (cellules présentatrices d'antigènes) exprimant l'ADN introduit (Derma-vir) (Lisziewicz, J., et al., (2005) J. Invest. Dermatol., Jan 124(1), pp160-9). Ces études ont ainsi démontré que la vaccination par la voie transcutanée dans des modèles animaux permet l'induction d'une réponse immunitaire efficace. Les méthodes de vaccination par voie transcutanée disponibles à ce jour impliquent cependant des procédures de préparation vaccinale souvent complexes, un mode d'administration le plus souvent invasif (rasage, scarification, abrasion des couches supérieures de l'épiderme, etc...) associé à l'utilisation d'une grande surface de peau du patient. De plus, le risque de perte du produit par voie sanguine n'est absolument pas pris en compte. L'absorption percutanée de composés appliqués sur la peau intacte est en fait limitée par le stratum corneum qui forme une barrière très structurée à la surface de la peau ce qui explique l'obligation jusqu'à présent d'altérer ce stratum corneum par les méthodes physiques. Le passage de molécules à travers la couche cornée de la peau s'effectue à un taux de diffusion très bas et les molécules les plus grosses, dont font partie les protéines, ne réussissent que très difficilement à passer cette barrière. Il est cependant connu des brevets US 5,910,306 et US 5,980, 898 (US Army) qu'une approche par application transcutanée de vaccin est également applicable aux humains. En effet, les auteurs du brevet US 5, 980, 898 ont par exemple induit une réponse immunitaire robuste à la suite d'une immunisation transcutanée d'une entérotoxine labile de la bactérie E. coli en utilisant un système de timbre. Mais l'inconvénient de cette approche est qu'elle nécessite l'application de la préparation vaccinale sur une grande surface de peau du sujet. Dans des conditions physiologiques, les concentrations de produits actifs appliqués de façon topique sont basses, particulièrement s'ils sont formulés sous la forme de préparations pharmaceutiques diluées. Ceci est dû en partie au fait que les préparations conventionnelles de composés actifs en solution se dispersent à la surface de la peau ce qui conduit à des concentrations locales faibles de composé actif. Et plus la concentration locale efficace est faible, plus grands sont les risques que ces composés actifs se lient à des protéines de la peau de façon non spécifique ce qui réduit d'autant plus la concentration libre disponible pour la vaccination. Des plus, l'épiderme se renouvelant continuellement, les composés actifs liés sont inévitablement perdus lors de ce renouvellement. Les éléments de la peau cependant, et en particulier les follicules pileux, sont des sites de discontinuité importants dans la fonction barrière de la peau. Différentes études ont montré que les follicules pileux étaient, malgré leur petite taille comparée à celle de l'épiderme entre deux follicules, une voie d'accès prédominante pour une absorption percutanée de matériel étranger dont des composés actifs (Hueber 1994, Tenjarla 1999) . De plus, l'insertion de follicules pileux dans une peau modifiée augmente le taux de pénétration de l'hydrocortisone (Michel 1999). La demanderesse a développé un procédé de vaccination par la voie des follicules pileux permettant de cibler vers les cellules présentatrices d'antigène des composants de la préparation vaccinale afin d'induire une réponse immunitaire protectrice et efficace contre les pathogènes. La demanderesse a ainsi découvert que ce procédé de vaccination ciblée permet de rendre accessible aux vaccins les cellules professionnelles présentatrices d'antigène localisées autour des follicules pileux L'invention a ainsi pour objet une méthode de vaccination ciblée ainsi que l'accès préférentiel des composants de la préparation vaccinale aux cellules présentatrices d'antigène. Le ciblage de la vaccination conduit à de grandes concentrations de préparation vaccinale dans le follicule pileux, à proximité des cellules présentatrices d'antigènes présentes dans le follicule, cellules qui contrairement à celles de l'espace interfolliculaire, sont très accessibles à des composés actifs appliqués de façon topique. La demanderesse a ainsi découvert l'utilisation thérapeutique et préventive d'un vaccin optimisé par spécialisation de la voie d'entrée transcutanée de la préparation vaccinale et ciblage des cellules présentatrices d'antigène de la peau (derme et épiderme) permettant de réduire la surface d'inoculation du vaccin. Un objet de l'invention est ainsi l'utilisation, pour une préparation vaccinale, de particules dont la taille est déterminée. En effet, après déformation éventuelle, ces particules présentent au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,2 m. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de telles particules pour la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique. D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lumière de la description, des exemples qui suivent ainsi que des dessins annexés à la présente demande. La figure 1 montre la pénétration désordonnée des particules en cas de destruction de la couche de l'épiderme dûe à des applications répétées de glu. Les deux figures du haut montrent les particules fluorescentes après une application de glu (flèche). Les deux figures du bas montrent l'entrée de particules fluorescentes après trois applications de glu. La figure 2 montre la pénétration en profondeur des particules fluorescentes de taille 0,04 tm dans les follicules pileux. Les astérisques représentent le tissu adjacent. La figure 3 montre la pénétration de particules de différentes tailles de 1,5 et de 0,75 gm dans la partie superficielle des follicules pileux. La figure 4 met en évidence par l'utilisation de fluorescence, l'expression spécifique du marqueur des cellules de Langerhans CD 1 a autour des follicules pileux. Le grossissement montre une cellule de Langerhans marquée par fluorescence. La figure 5 montre la pénétration des particules fluorescences dans les cellules de Langerhans après application par voie transcutanée à 37 C. Les pointillés représentent les contours des cellules de Langerhans. La figure 6 montre la mesure de la réponse immunitaire T spécifique du vaccin TETAGRIP (Aventis Pasteur) dans un modèle murin de vaccination transcutanée. Les réponses cellulaires spécifiques d'antigène induites par la vaccination sont déterminées ex vivo par la technique EliSpot à partir de cellules du sang périphérique à différents temps post- vaccination. Les carrés noirs représentent les réponses immunitaires T efficaces après immunisation transcutanée avec le vaccin humain TETAGRIP (n=11) et les ronds vides représentent le témoin négatif (n=6). La figure 7 montre la mesure de la réponse proliférative T spécifique du vaccin TETAGRIP dans un modèle murin de vaccination transcutanée. La figure 8 montre la mesure de la réponse humorale spécifique du vaccin TETAGRIP dans un modèle murin de vaccination transcutanée. Le n 1 correspond à une administration témoin de PBS( n=5), le n 2 correspond à la protéine OVA (n=6), le n 3 correspond à la protéine OVA avec de la toxine cholérique marquée au FITC (n=7), et le n 4 correspond à de l'ADN plasmidique de OVA La figure 9A montre la localisation des particules fluorescentes dans un modèle de vaccination transcutanée à différentes profondeurs 5 heures après immunisation. La figure 9B est le témoin négatif à différentes profondeurs en l'absence de particules 5 heures après immunisation. La figure 10A montre la localisation des particules fluorescentes dans un modèle de vaccination transcutanée à l'aide d'une sonde permettant l'observation de la fluorescence à différentes profondeurs 24 heures après immunisation et la diffusion de cette fluorescence aux environs du follicule pileux. La figure 10B est le témoin négatif avec une sonde permettant l'observation à différentes profondeurs en l'absence de particules 24 heures après immunisation. La figure 11 montre la localisation des particules dans les ganglions à la suite d'une vaccination transcutanée. A: ganglion contrôle, B: ganglion inguinal, C: ganglion axial. La figure 12 montre la mesure de la réponse protectrice T spécifique du vaccin TETAGRIP dans un modèle murin de vaccination transcutanée en fonction du temps. Les ronds vides symbolisent les souris ayant reçu les cellules EL-4 sans antigène (n=4) et les ronds noirs symbolisent les souris ayant été vaccinées avec les cellules EG-7 (n=4). L'utilisation de cette préparation vaccinale selon l'invention comporte les étapes suivantes: a) Le prétraitement de la peau afin d'améliorer l'ouverture des follicules pileux par ablation d'au plus 50 % de la couche cornée b) l'utilisation, pour la préparation de cette préparation de vaccin, de particules qui, après déformation éventuelle, présentent au moins une section de diamètre inférieur ou égal à 0,2 m. c) L'entrée spécifique de cette préparation vaccinale via les follicules pileux, la petite taille des particules permettant leur diffusion à travers l'épithélium du follicule pileux. d) L'induction, la stimulation ou l'augmentation des réponses immunitaires et cellulaires protectrices. Le ciblage des composés actifs directement au coeur des follicules pileux s'effectue par l'intermédiaire de particules d'une taille déterminée. Il était en effet connu que des billes de taille de l'ordre de 3 à 10 m appliquées de façon topique sur la peau humaine s'agrègent au niveau des orifices folliculaires alors que les billes de taille supérieure à 10 pm restent à la surface de la peau (Rolland 1993). Cependant, des billes ou cristaux d'une taille jusqu'à quelques micromètres peuvent en fait être introduits dans le conduit du follicule. Ainsi, alors que des solutions se répandent à la surface de la peau de façon non spécifique, Toll et son équipe ont montré que les billes s'agrègent dans les orifices folliculaires en fonction de leur taille. En effet, ils ont observé une pénétration préférentielle des particules de taille de 1,5 à 6 m de diamètre dans le conduit folliculaire de follicules pileux de scalp humain mais des particules de ces tailles ne pénètrent cependant pas dans l'épithélium (Vogt, résultats non publiés). Or, des particules plus petites, de l'ordre de 0,2 m de diamètre pénètrent par contre profondément dans les follicules pileux. Des particules de cette taille peuvent contenir ou être recouvertes d'antigènes par exemple. Ces particules sont alors capables de pénétrer dans les cellules épidermiques de Langerhans dans des conditions physiologiques normales et permettre la délivrance de la préparation vaccinale directement au contact des cellules concernées. Les cellules de Langerhans qui sont des cellules dendritiques immatures épidermiques, constituent, avec les cellules dendritiques localisées au niveau du derme, un réservoir de cellules sentinelles du système immunitaire (Kupper T., et al., (2004), Nat. Rev. Immunol. 4(3) pp 211222). Elles sont étroitement impliquées dans la réponse immunitaire par voie transcutanée. Suite à leur activation, elles vont ensuite migrer vers les ganglions drainants et participer à la réponse immunitaire. Les cellules de Langerhans sont concentrées aux abords du follicule pileux chez l'homme. Cette propriété fait des cellules de Langerhans des cibles de choix pour l'administration cutanée de préparations antigéniques. Les particules selon l'invention sont ainsi des particules qui après déformation éventuelle présentent au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,2 gm. On peut également utiliser des particules solides dont le diamètre est compris entre 0,1 nm et 0,2 gm. Alternativement, des particules déformables jusqu'à ce qu'une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,2 gm se crée sont également comprises dans l'invention, comme par exemple des particules virales. De préférence, les particules selon l'invention présentent, après déformation éventuelle, au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,1 gm. Plus préférentiellement, ces particules présentent, après déformation éventuelle, au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,05 gm. Contrairement aux méthodes précédemment décrites, le ciblage des composants de la préparation vaccinale aux follicules pileux permet l'application des composants de cette préparation de vaccin sur une surface réduite (inférieure à 20 cm2) de la peau. Les composants de la préparation vaccinale pénètrent de façon spécifique grâce à leur taille par la voie des follicules pileux et ciblent essentiellement les cellules présentatrices d'antigène qui sont cruciales dans l'induction d'une réponse immunitaire. L'utilisation selon l'invention comporte ainsi l'étape préalable de prétraitement c'est-à-dire d'ouverture des follicules pileux en effectuant une ablation d'au plus 50 % de la couche cornéenne. Cette étape peut être réalisée à l'aide de rubans adhésifs ou "tape stripping". En effet, sur une peau glabre, à peu près un tiers des follicules pileux est ouvert dans des conditions normales. Afin d'améliorer l'entrée ciblée de la préparation vaccinale, on utilise des rubans adhésifs tels que ceux de la marque TESA non-agressifs pour la peau permettant l'ouverture des follicules pileux et l'enlèvement des cellules mortes de la couche cornéenne supérieure (au plus 50 %) de la peau tout en conservant l'intégrité de la peau au niveau de l'épiderme et du derme. Il a été démontré que le tape stripping en soi induit une activation des cellules présentatrices d'antigènes et le maintien d'un pool de cellules de Langerhans autour des follicules pileux (J Exp Med 1982). Alternativement, on peut effectuer un traitement à la colle ou glu. Ceci consiste à appliquer sur la peau quelques gouttes de colle instantanée (glu à base de cyanocrylate), d'appliquer en pressant un matériau couvrant (ruban adhésif, linge, ...) et de le retirer au bout de quelques minutes. Cette action ôte la partie supérieure du follicule fermé. Ce traitement permet ainsi d'ôter 30 % de l'épaisseur de la couche cornéenne à chaque application de glu. Il est ainsi possible de retirer jusqu'à 50 % de l'épaisseur de la couche cornéenne sans affecter la spécificité de l'entrée des particules dans le follicule pileux. Les particules selon l'invention contiennent l'antigène, c'est-à-dire qu'elles peuvent comprendre ou être recouvertes d'antigène. Il est entendu que les particules selon l'invention sont recouvertes d'antigène ou encapsulées par des moyens connus d'adsorption et de lyophilisation afin de ne pas dépasser au moins pour une section, un diamètre de 0,2 m pour des particules éventuellement déformables. Par antigène, on entend des protéines, glycoprotéines, peptides ou fractions peptidiques, polysaccharides, polyosides, lipopolysaccharides, anatoxines, protéines conjuguées porteuses, extraits cellulaires, extraits viraux, extraits bactériens, extraits parasitaires, particules virales, bactériennes ou parasitaires vivantes, atténuées, tuées, inactivées ou recombinantes, pseudoparticules virales, ADN, polynucléotides, acides nucléiques recombinants de pathogènes, molécules impliquées dans les maladies orphelines et les cancers, extraits de cellules cancéreuses. Par antigène, on entend également des fragments de protéines entières à condition que ces fragments possèdent au moins un déterminant épitopique immunogène. La quantité d'antigène dans une dose de préparation vaccinale est la quantité qui induit une réponse immunitaire protectrice sans effet secondaire. De telles quantités varient en fonction de l'antigène utilisé et peuvent être déterminées par des études classiques incluant l'observation des titres d'anticorps obtenus chez les sujets vaccinés. Typiquement, les doses chez un humain sont de 0,1 à 1000 gg pour un antigène sous forme d'acide nucléique. De façon alternative, la préparation vaccinale peut être incorporée dans des particules de cire ayant un point de fusion de 37 à 40 C et les particules ou billes d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0, 2 tm sont ainsi formées par des méthodes connues de l'homme de l'art. Des préparations aqueuses de ces billes de cire sont préparées par des moyens connus de l'homme de l'art. Ces particules de cire peuvent être appliquées sur la peau du sujet à vacciner. Une fois à l'intérieur du follicule pileux, elles fondront à la chaleur de celui-ci en libérant la préparation vaccinale in situ. Alternativement, les particules peuvent être des liposomes, lipopeptides, virosomes ou glycoliposomes incluant les phospholiposomes. On peut également utiliser des nanoparticules polymériques soit recouvertes soit encapsulant des antigènes vaccinaux et basées sur la polymérisation de polyesters, comme par exemple le poly(lactic-coglycolic-acid) (PLGA), l'acide polylactique (PLA), le polyéthylenimine (PEI). L'utilisation de nanoparticules comprenant des nanoparticules d'acide polylactique chargées de peptides et/ou protéines et/ou d'ADN et/ou d'acide nucléiques est également comprise dans l'invention. Des micro-éponges de taille appropriée sont également incluses dans les particules selon l'invention. De préférence, ces micro-éponges sont d'une couleur absorbant la chaleur. On charge ces micro-éponges avec les préparations vaccinales par saturation avant de les lyophiliser. Les micro-éponges chargées sont ensuite resuspendues dans une huile appropriée et appliquées sur la peau du patient à traiter. Ainsi, à cause de leur taille réduite, ces micro-éponges chargées de préparation vaccinale pénètrent profondément dans le conduit folliculaire. Des micro- éponges appropriées sont par exemple celles vendues par Cardinal Health Pharmaceutical Technologies & Services, Somerset, NJ, USA. Des dispersions de charbon, de dioxyde de titane, d'oxyde de zinc, d'oxydes de fer et de talc d'une taille appropriée sont également envisageables. Une fois chargées avec la préparation vaccinale, ces particules sont préparées dans des transporteurs non- aqueux tel que de l'huile et utilisés de la même manière que les micro-éponges. Toute huile hydrophobe cosmétique ou pharmaceutique, de préférence parmi les huiles de la pharmacopée, est utilisable. Les particules selon l'invention peuvent aussi comprendre ou être constituées d'ADN nu codant une partie du génome de HIV. Les particules selon l'invention comprennent également les particules virales éventuellement déformables. De préférence, les particules virales sont des particules de HIV inactivées recombinantes ou non. Ces particules peuvent également être des particules virales de Pox virus atténués. Il est possible, pour accélérer la libération de la préparation vaccinale et faciliter sa diffusion au contact des cellules de Langerhans, de chauffer de façon modérée la zone de peau traitée par exemple au moyen de lampe rouge, infra-rouge, d'appareil émettant des micro-ondes ou un dispositif similaire.... On peut ajouter à la préparation vaccinale à administrer des adjuvants sous forme par exemple d'émulsion huileuse ou de corps gras tel que la vaseline, de cytokines, de chimiokines, de facteurs de croissance, de dérivés de pathogènes, de lipides, de polysacharides, de polypeptides, de lipopolysaccharides, d'oligosaccharides, de co-polymères, de PAMs (motifs permettant l'activation des pathogènes), de ligands des toll-like receptor , de MPL-A (Monophosphoryl lipide A), de Quil-A, d'ISCOM, du Diméthyl Dioctyacétyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), des motifs CpG, de la Leif, des anatoxines comme par exemple la toxine cholérique (CT), la LT (Heat Labil Toxin) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT, 15...etc. Toutes les autres molécules de types adjuvants décrites dans la littérature peuvent être aussi utilisé pour cette voie d'immunisation. Ces adjuvants sont des produits qui augmentent les réactions du système immunitaire de l'humain lorsqu'ils sont administrés en présence de l'antigène. Ils accroissent la production d'immunoglobulines spécifiques, les anticorps, et stimulent de nombreuses cellules impliquées dans les mécanismes de la défense immunitaire. Ces particules qui, après déformation éventuelle, présentent une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,2 m peuvent être placées dans un véhicule approprié par exemple de la vaseline qui ne dissout pas la préparation vaccinale et qui est apte à être appliqué sur la peau de préférence sur la joue et au bas du dos de l'humain à vacciner. Une fois déposées à la surface de la peau, préalablement préparée, les particules iront de façon ciblée grâce à leur diamètre réduit, dans les follicules pileux. La préparation vaccinale se dissoudra alors en place grâce au liquide interstitiel en fournissant in situ le vaccin en concentration élevée. Les particules selon l'invention sont ainsi utiles pour la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique les comprenant. La composition vaccinale est destinée à être utilisée chez l'homme chez qui elle peut être à but curatif ou préventif. Cette composition de vaccin thérapeutique est utile pour le ciblage à travers les follicules pileux des composants vaccinaux de la préparation vaccinale vers les cellules présentatrices d'antigènes. Une fois préparée, cette composition vaccinale présente l'avantage d'être thermostable, ce qui permet une utilisation aisée dans des conditions climatiques difficiles. L'utilisation selon l'invention permet ainsi un ciblage des composants de la préparation vaccinale sur les follicules pileux et de ce fait, sur un nombre très important de cellules présentatrices d'antigène du derme et de l'épiderme. Ce mode d'administration spécifique permet une rapidité de prise des composants vaccinaux par les cellules ciblées (cellules de Langerhans et cellules dendritiques) ainsi que la capture et l'expression des composants vaccinaux par les cellules présentatrices d'antigène et activation de ces cellules. On a donc un maintien d'un réservoir principal d'antigène localisé dans les cellules professionnelles présentatrices d'antigène De par la spécificité du ciblage, on obtient une forte concentration en antigènes en une surface d'application sur la peau du patient du vaccin réduite. Ensuite, les cellules présentatrices d'antigène migrent vers les organes lymphoïdes secondaires et on assiste à l'induction d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ceci permettra ainsi l'établissement d'une immunité protectrice à long terme après la vaccination On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base entre autres de leur expression des antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules T CD4 sont généralement impliquées dans les fonctions "helper". En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Les cellules T CD8, majoritairement exprimés, par rapport aux T CD4 correspondent aux cellules impliquées lors d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique dite de type CTL. En particulier une activité cytotoxique directe a été décrite pour certains lymphocytes T CD4+. Il existe deux types de réponse immunitaire effectrice: la réponse humorale due aux anticorps et la réponse cytotoxique due majoritairement aux lymphocytes TCD8. Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL) en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilite CMH de classe I, mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ en association avec les molécules de classe II du CMH. Bien que les anticorps mucosaux et systémiques soient considérés comme jouant un rôle majeur dans la prévention de certaines infections, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire, incluant l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique (CTL) est particulièrementnécessaire pour lutter contre les pathogènes intracellulaires (virus, bactéries ou parasites) et pour le contrôle des processus tumoraux. L'induction et la régulation des CTL sont dépendantes des cytokines (IL-2, etc) produites par la sous-population Thl des cellules helper CD4. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouent un rôle critique dans la "clearance des pathogènes intracellulaires aussi bien que dans le contrôle des tumeurs. Les lymphocytes T CD8 reconnaissent les fragments peptidiques, issus de la dégradation intracellulaire de l'antigène, sous forme d'un complexe avec les molécules du CMH de classe I exprimé à la surface de la cellule. Cette reconnaissance entraîne la lyse des cellules portant le complexe CMH-peptide antigénique. Les CTL génèrent également différentes lymphokines (IFNy et TNF ) qui peuvent en complément être directement cytolytiques. L'induction de CTL est donc considérée comme une composante essentielle de vaccins conçus pour la prévention et le traitement de ces maladies. Parmi les traitements actuellement proposés pour lutter contre les cancers et les infections virales chroniques, la vaccination prend une place de plus en plus importante. L'objectif d'une vaccination thérapeutique est d'induire ou de restimuler in vivo une réponse immunitaire spécifique capable de détruire des cellules infectées ou des cellules tumorales. La réponse immune des patients doit être modulée de telle sorte qu'elle devienne efficace et induise une réponse à médiation cellulaire spécifique d'antigènes exprimés par exemple par la tumeur et capable d'éliminer les cellules cancéreuses. L'utilisation de cette préparation vaccinale par la voie transcutanée induit toutes les réponses immunitaires cellulaires (CD4, CD8...) et humorales (production d'anticorps, réponses des cellules B)...) chez l'homme. Ainsi, la vaccination par voie transcutanée est applicable à tous type de vaccins permet d'induire une réponse immunitaire protectrice contre le vaccin en ciblant directement le vaccin vers les cellules professionnelles présentatrices d'antigène Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement. Exemple 1: effet du traitement de la peau à la colle Des échantillons de peau humaine prélevés lors de la chirurgie plastique sont placés et fixés sur un support humide. La colle (glu cyanoacrylate UHIJ) est déposée de manière à recouvrir la surface superficielle de la peau et un ruban adhésif (Tesa) est posé au-dessus. Le ruban adhésif est alors retiré au bout de 10-15 minutes de contact à température ambiante. Des nanoparticules de polystyrène de diamètre 0,04!Lm recouvertes de molécules fluorescentes yellow-green fluorescent (Fluosphère , Molecular probes, Oregon, USA) sont appliquées sur une surface de 1 cm2 pendant 18 heures à 37 C. La peau est alors traitée plus de trois fois de suite avec la glu ou simplement une fois afin d'estimer l'effet de ce traitement sur la destruction de la couche cornéenne. Chaque application de la colle enlève en effet 30% de la couche cornéenne. La figure 1 partie du bas montre que le traitement agressif de la peau à l'aide de la glu cyanoacrylate (supérieur à 3 applications de colle sur la même surface de peau) entraîne la destruction de la couche cornéenne ainsi que de la partie superficielle de l'épiderme. Les particules traversent alors l'épiderme et diffusent dans la couche de kératinocytes de façon non spécifique. Le traitement doux de la peau par la glu cyanoacrylate (ici, une unique application de colle) n'entraîne que le retrait partiel (inférieur ou égal à 50%) de la couche cornéenne comme on peut le voir sur la partie du haut de la figure 1. Exemple 2: Spécificité de taille des particules Les follicules pileux provenant d'expiants de peau humaine retirés après une chirurgie plastique ont été ouverts en utilisant la méthode décrite ci-dessus avec une seule application de colle. Des solutions contenant des billes sphériques solides, identiques à celles utilisées dans l'exemple 1, mais de différentes tailles (taille de 1,5 à 0,04 m) sont soniquées pendant 3 minutes puis déposées sur la peau préalablement traitée, pendant 15 à 16 heures à 37 C. Des rubans adhésifs sont alors appliqués de manière à enlever le restant des billes en surface. L'échantillon de peau est ensuite congelé dans de l'azote liquide puis des coupes de 5 microns d'épaisseur sont préparées en coupant du derme vers l'épiderme. Les techniques de microscopie confocale à l'aide d'un scanner visualisent la pénétration des billes de 0,04 m. La figure 2 montre que les billes de 0,04 m pénètrent en profondeur des follicules pileux et persistent après lavages successifs, alors que des billes de taille de l'ordre de 0,75 m restent à des niveaux superficiels de la voie des follicules pileux (figure 3). Exemple 3: Localisation des cellules de Langerhans Après une étape de saturation à l'aide d'une solution de protéine (DAKO protein block, Dako), des coupes congelées de peau humaine sont incubées dans une solution d'anticorps anti-CDla (dilution 1/50, Dako), anticorps spécifique des cellules de Langerhans et des cellules dendritiques. Ces cellules expriment en effet de manière spécifique les molécules CDla. Les coupes sont lavées dans du tampon phosphate (PBS pH 7,4) et incubées ensuite dans une solution d'anticorps anti-Immunoglobuline de souris (dilution 1/50, Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) couplé à la fluorescéine durant 45 minutes. Après lavage, les lames sont montées dans une solution de montage VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA). Le marquage spécifique de ces cellules de Langerhans permet de visualiser leur localisation par microscopie à fluorescence. La figure 4 montre que la zone inférieure des follicules pileux est particulièrement riche en marqueurs des cellules de Langerhans (cellules présentatrices d'antigène de l'épiderme) et des cellules dendritiques (épiderme et derme) . Exemple 4: Ciblage des billes au niveau des cellules de Langerhans L'exemple précédent a montré que les particules fluorescentes diffusent vers des zones proximales riches en cellules présentatrices d'antigène (CPA). Dans cette zone entourant les follicules pileux, réside en effet la majorité des cellules de Langerhans qui font partie des CPA. La peau est traitée par la technique d'ouverture des follicules pileux décrits ci-dessus après une seule application de la colle cyanoacrylate. Une solution contenant des particules sphériques solides de taille 0,04 m et à une quantité de 2,5 1012, marquées à la fluorescéine est soniquée pendant 3 minutes puis déposée sur la peau préalablement traitée, pendant 15 à 16 heures à 37 C. On effectue une digestion pendant 18 heures dans une solution de dispase (2.4U/ml, Dispase I, Roche) à 37 C puis on trypsinise (0,025 % trypsine (Sigma) et 1,5 mM de CaC12 dans du PBS à pH 7,4) pendant 10 minutes à 37 C avant de remettre les cellules de peau en suspension dans du RPMI 1640 (Gibco, Ecosse) contenant 15 % de sérum de veau foetal (Paa Gmbh, Autriche), de la pénicilline et de la streptomycine. Les cellules de Langerhans présentes dans la suspension cellulaire sont ensuite purifiées à l'aide d'anticorps anti-CD1c par la méthode de purification sur bille selon les indications du fabricant (MACS , Miltenyi). Les cellules purifiées sont ensuite déposées sur une lame. La figure 5 montre que l'on observe la présence de particules sphériques de 0,04 p.m en microscopie à fluorescence au niveau du cytoplasme cellulaire des cellules de Langerhans. Exemple 5: Procédé de vaccination par la voie transcutanée dans des modèles murins: Une solution d'anesthésique est préparée en diluant 30 L de Xylasine à 2% (Bayer, Allemagne) et 160 L de Kétamine (Imalgène 500, Merial) dans 1 mL de NaCI à une concentration de 9g/L. Des souris C57BL6 d'haplotype H-2Kb âgées de 5 à 8 semaines (Iffa-Credo, Charles River, France) sont anesthésiées en injectant une dose de 10 L par gramme de souris de cette solution par voie intra-péritonéale. Le flanc droit est épilé à l'aide de rubans adhésifs (Lyréco, France) sur une surface d'environ 1cm2. L'ouverture des follicules pileux a été effectuée après applications successives de bandes adhésives (plus de 10 applications chez la souris). Ce procédé permet d'ouvrir les pores pileux en éliminant partiellement la couche cornéenne. La préparation vaccinale immunogène (10 gl de vaccin commercial TETAGRIP (Aventis Pasteur)) est alors déposée sur la zone épilée à l'aide d'une pipette sur une surface de 0.5 cm2. Après le temps d'attente de 30 minutes à 1 heure nécessaire à la pénétration de la préparation vaccinale, un patch composé d'acide salicylique (1,5%) (actif exfoliant et désincrustant), de triclosan (0,3%) (anti-bactérien et anti-fongique), et de bisabolol (1%) (antiinflammatoire et apaisant) (SVR, Lysanel patch, France) est appliqué pendant une heure. Le sang prélevé est traité en conditions stériles. Une fois dilué avec 4 volumes de PBS lx, le sang est prélevé avec une pipette et déposé lentement dans un tube contenant 1,5 ml de milieu de séparation des lymphocytes ou FICOLL (Eurobio, France). Une centrifugation à 2200 rpm pendant 20 min à température ambiante sans frein permet d'obtenir la séparation des globules rouges qui sédimentent au fond du tube et l'apparition d'un anneau contenant les PBMCs (cellules mononuclées du sang périphérique). La suspension cellulaire issue de l'anneau est centrifugée à 1500 rpm pendant 5 minutes. La numération des cellules du sang périphérique s'effectue avec l'hématimètre de Mallassez à l'aide du Bleu de trypan. Le but de la technique est de mesurer la quantité de cellules répondeuses contre un antigène donné. L'interféron gamma (IFNy) produit par les cellules lymphocytaires T effectrices (100 000 PBMC/puits) lors de la stimulation antigénique est ainsi capturé durant 48 heures par un anticorps monoclonal spécifique de cet interféron (anticorps de capture: anti-IFNy (IgGl, clone DB-1; Diaclone) et mesuré par la technique d'ELISPOT-IFNy (selon le fabriquant, Diaclone). Les fréquences des cellules immunitaires T spécifiques du vaccin TETAGRIP sont ainsi mesurées à différents jours après immunisation (Figure 6). Afin d'étudier l'effet de la vaccination par voie transcutanée sur la prolifération in vivo des lymphocytes T, l'antigène ovalbumine (ova) en tant qu'agent immunogène a été utilisé. De ce fait, la prolifération des cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène ovalbumine peut être suivi in vivo, après transfert adoptif de cellules T CD8 anti-ova marquées à l'aide d'une molécule fluorescente: le CFSE (5-(et 6)-diacétate de carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle). Brièvement, les lymphocytes CD8 anti-ova naïfs, provenant de la souris OT1 (marqueur congénique CD45.2, transgénique pour le récepteur des cellules T (TCR) spécifique de l'épitope OVA [257-264] de l'ovalbumine dans un fond génétique H2- Kb) sont marqués au CFSE puis injectés par voie intraveineuse à des souris receveuses (marqueur congénique CD45.1) vaccinées par voie transcutanée selon le protocole précédemment décrit, soit par la protéine ovalbumine soit par de l'ADN plasmidique codant cette protéine. Le CFSE, détectable en cytométrie de flux, est un marqueur de la division cellulaire. Il diffuse dans le cytoplasme et se dilue au cours des divisions cellulaires, entraînant de ce fait une diminution de son intensité. Les souris sont sacrifiées 4 ou 7 jours après l'immunisation et les ganglions sont prélevés. Un double marquage, CD8 et CD45.2, permet de sélectionner la population des lymphocytes CD8+ provenant de la souris OT-1. La figure 7 montre que la prolifération cellulaire est significativement supérieure chez les souris immunisées à celle des souris contrôles n'ayant reçu aucun antigène, et ce, quelquesoit la forme d'immunogène utilisée (protéine ou ADN). La réponse immunitaire humorale détectée par la production d'anticorps antiovalbumine est mesurée par des tests ELISA spécifiques d'antigène après vaccination utilisant l'ADN plasmidique codant pour l'antigène ovalbumine ou la protéine en présence d'adjuvant: la toxine cholérique. Brièvement, des souris C57BL6 sont immunisées avec soit 100 gg de protéine ovalbumine (n=6), ou 100 gg de protéine ovalbumine avec 10 gg de toxine cholérique marquée à la FITC (fluoroisothiocyanate), ou 100 ',tg d'ADN plasmidique codant pour la protéine ovalbumine (n=8). Les anticorps ont été dosés par la technique ELISA à partir de sérums provenant du provenant de prélèvements sanguins effectués à J 14 après vaccination. Les déviations standards sont représentées (Figure 8). Exemple 6: Localisation des particules dans un modèle murin Des particules sous forme de microbilles fluorescentes (Fluorosphere de 0.04 m) ont été appliquées sur la peau de souris suivant le protocole décrit dans l'exemple 6. La visualisation de la fluorescence est effectuée par la technique de microscopie laser à différentes profondeurs au niveau de la peau (Cell-Vizio , MaunaKea technologie). Cette méthode permet également de localiser les particules à différents temps in vivo. Le Cell- VizioTM est un système de microscopie confocale à fluorescence par fibre optique. La première sonde optique utilisée pour l'acquisition des images a un diamètre de 1,5 mm (réf. S-1500-5.0), cette sonde permet d'obtenir des images immédiatement sous la surface d'un tissu biologique, avec une épaisseur de 15 gm et une résolution latérale de 5 gm. Les 2 sondes suivantes ont un diamètre de 1,8 mm et permettent une acquisition de 20 gm à une profondeur de 30 gm (réf. HD-1800-2.5/30) ou 80 gm (réf. HD-18002.5/80) avec une résolution latérale de 2.5 gm. Durant la durée de l'acquisition, à différents temps après application des fluorosphères, les souris sont sous anesthésie afin de prévenir tout mouvement. Le flanc épilé est préalablement essuyé avec une solution saline afin de nettoyer la zone des impuretés résiduelles, avant d'y apposer les différentes sondes. Pour analyser les ganglions, l'organe est préalablement dégraissé avant d'appliquer la sonde sur sa surface. 1 à 5 heures après application des microbilles sur la peau, celles-ci se trouvent dans des cavités dans la couche cornéenne à une profondeur de 15 gm à 80 gm (figure 9 A). Au bout de 24 heures, la fluorescence diffuse autour des follicules pileux dans des zones riches en CPA (Figure 10A). Il n'y a cependant aucune trace de fluorescence dans d'autres zones non traitées de la souris (Figure 10B). Les microbilles sont accumulées dans les ganglions proximaux et de manière moins importante dans les ganglions distaux de la zone traitée (Figure 11). Ainsi, les microbilles sont transportées vers le site de la réponse immunitaire dès 24 heures après application par la voie transcutanée. Exemple 7: Mesure de la réponse protectrice spécifique T Les souris ont été immunisées par la méthode décrite suivant l'exemple 5, à l'aide d'ADN codant pour l'ovalbumine. Après vaccination, 200 000 cellules tumorales de la lignée exprimant l'antigène ovalbumine (EG-7) ou ne l'exprimant pas (EL-4) sont injectées par la voie sous-cutanée sur le flanc gauche des animaux. La taille de la tumeur est mesurée à différents temps chez les animaux immunisés. La figure 12 montre que la vaccination par la voie transcutanée induit une réponse immunitaire protectrice chez 90% des souris qui ne développent jamais de tumeur à jour 40, alors toutes les souris contrôles ont déjà développé une tumeur au jour 22. REVENDICATIONS 1. Utilisation, pour la préparation d'un vaccin destiné à être appliqué à la surface d'une peau préalablement traitée pour ouvrir les follicules pileux par ablation d'au plus 50 % de la couche cornée, de particules qui, après déformation éventuelle, présentent au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,2 m, lesdites particules induisant, stimulant ou augmentant une réponse immunitaire protectrice. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les particules, après déformation éventuelle, présentent au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,1 m. 3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle les particules, après déformation éventuelle, présentent au moins une section d'un diamètre compris entre 0,1 nm et 0,05 m. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, de particules solides. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, de particules virales. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'étape de traitement préalable est effectuée par l'utilisation de rubans adhésifs. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'étape de traitement préalable est effectuée par une application de colle instantanée ou glu sur la surface de la peau. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 6 et 7, dans laquelle les particules sont des billes de cire. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 6 et 7, dans laquelle les particules sont constituées de polyéthylèneimine ou d'acide polylactique. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle les particules contiennent un antigène choisi dans le groupe constitué des protéines, peptides, polysaccharides, polyosides, lipopolysaccharides, anatoxines, protéines conjuguées porteuses, extraits cellulaires, extraits viraux, extraits bactériens, extraits parasitaires, particules virales, bactériennes ou parasitaires vivantes, atténuées, tuées, inactivées ou recombinantes, pseudoparticules virales, ADN, acides nucléiques recombinants de pathogènes, molécules impliquées dans les maladies orphelines et les cancers, extraits de cellules cancéreuses. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle les particules peuvent en outre comprendre des adjuvants choisis dans le groupe constitué de cytokines, de chimiokines, de facteurs de croissance, de dérivés de pathogènes, d'anatoxines, d'émulsion huileuse, de lipides, de lipopolysacharrides, de co-polymères, de PAMs, de ligands des toll-like receptor de MPL-A, de Quil-A, d'ISCOM, du Diméthyl Dioctyacétyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), des motifs CpG, de la Leif, des anatoxines détoxifiées ou non. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle les particules comprennent de l'ADN nu codant une partie du génome de HIV. 13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 11, dans laquelle les particules virales sont des particules de HIV inactivées recombinantes ou non. 14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 11, dans laquelle les particules virales sont des particules de Pox virus atténués. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et 6 à 12 dans laquelle les particules comprennent des nanoparticules d'acide polylactique chargées de peptides et/ou de protéines et/ou d'ADN et/ou d'acides nucléiques. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que ladite composition est utile pour le ciblage à travers les follicules pileux des composants vaccinaux vers les cellules présentatrices d'antigènes.